CN102741292B - 在治疗头和颈鳞状细胞癌中使用的cd44单克隆抗体 - Google Patents
在治疗头和颈鳞状细胞癌中使用的cd44单克隆抗体 Download PDFInfo
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种单克隆抗CD44抗体或其抗原结合片段，其用于治疗哺乳动物中的头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)，其中所述HNSCC以CD44的表达为特征。所述单克隆抗体可以由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成，而且可以是其嵌合或人源化型式。
Description
发明领域
本发明涉及使用一种或多种癌性疾病缓解抗体(cancerous diseasemodifying antibody，CDMAB)来预防、治疗或诊断头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)的方法。在某些方面，CDMAB是对CD44特异性的抗体。还公开了组合治疗方法，其包括使用任选地与一种或多种第二CDMAB和/或化疗剂组合的依照本发明的CDMAB，作为用于预防或治疗癌症的手段。
发明背景
头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)是一种使人虚弱的且致命的疾病，其通常在晚期阶段呈现，并且每年侵袭美国的50,000人和全世界的500,000名个体。HNSCC是一种引起重大病态的疾病，尤其就言语和吞咽功能而言。一般地，手术、放射疗法、化学疗法、或这些的组合可用作治疗选项。
尽管有手术、化学疗法和放射的严格组合，对于晚期阶段疾病，治愈率仅达到30%，并且复发仍然是标准疗法后失败的最常见原因（在40%-50%的患者中）。补救疗法由关于第一线疗法的相同治疗选项组成。然而，姑息性手术常常是困难的且毁容的。此外，放射疗法很少是可行的或有益的，并且化学疗法基本上不改善HNSCC患者中的存活率。这些患者的预后仍然较差，使得复发后的中值存活是仅约6个月。
不良结果可以是由于无效杀伤肿瘤启动细胞或癌症干细胞(CSC)所致。CSC能够自我更新，而且还生成具有分化的表型和有限的自我更新的后代。与正常的干细胞一样，CSC由于存活优点诸如升高的DNA修复性能而对化学疗法和放射疗法有抗性。事实上，标准的化学疗法，例如顺铂，和放射疗法方案实际上扩充干细胞群。
CD44在肿瘤发生中发挥至关重要的作用。跨膜糖蛋白CD44结合胞外基质中的透明质酸(HA)和细胞骨架蛋白。CD44、HA、细胞骨架组分、和信号传导分子诸如细胞周期蛋白D1、EGFR、Rho和Ras间的相互作用促进生长和迁移。另外，CD44被基质金属蛋白酶(MMP)自膜释放成可溶性形式(solCD44)，即一种对于细胞迁移至关重要的事件。还已经发现了CD44是一种存在于乳腺癌、结肠直肠癌和HNSCC中的重要CSC标志物。还已经显示了CD44活性在异种移植物模型中在肿瘤的形成中展现出活性；CD44+HNSCC肿瘤细胞在免疫受损的小鼠中是致瘤的，而对照CD44- HNSCC肿瘤细胞确实在相同模型中生成肿瘤。
VFF-18（又称为BIWA 1）是一种针对CD44的v6变体的高亲和力抗体，对该多肽的360-370区特异性。BIWA 1的各种型式或衍生物已经经历用于治疗癌症的临床测试。特别地，已经在1期临床试验中作为经99m锝标记的缀合物使用BIWA 1，测试在12名头和颈鳞状细胞癌患者中的安全性和靶向潜力。注射后40小时，14%的注射剂量被肿瘤吸收，其中在其它器官诸如肾、脾和骨髓中有极少的积累。虽然高度选择性肿瘤结合提示BIWA 1在放射性免疫疗法中的作用，但是此抗体的格外高的亲和力阻止对肿瘤的更深层的渗透。此外，还发现了BIWA 1是显著免疫原性的。12名研究患者中的11名形成人抗小鼠抗体(HAMA)，其展现出遍及整个肿瘤的异质积累，并且导致抗体-可溶性CD44复合物的形成。
WO 02/094879披露了设计为克服HAMA应答的VFF-18人源化型式，称作BIWA 4和BIWA 8。发现与亲本VFF 18抗体相比，BIWA 4具有显著更低的抗原结合亲和力。然而，相对于较高亲和力的BIWA 8，较低亲和力的BIWA4抗体表明卓越的肿瘤摄取特征。在33名患者1期临床试验中评估经99m锝标记的和经186铼标记的BIWA 4抗体两者以测定安全性、耐受性、肿瘤积累和（对于经186Re标记的BIWA 4）最大耐受剂量。似乎存在有肿瘤相关的对经99mTc标记的BIWA 4的摄取。在任何剂量的经186Re标记的BIWA 4没有观察到肿瘤响应。虽然许多患者贯穿整个研究过程表明稳定的疾病；于60mCi/m2发生剂量限制毒性。还有50-65百分比率的不利事件，其中认为33名患者中的12名具有严重的不利事件（血小板减少、白细胞减少和发热）。另外，这12名患者中的6名（均用经186Re标记的BIWA 4治疗）由于疾病进展在治疗过程或随访中死亡。2名患者还形成人抗人抗体(HAHA)。因而，经放射性标记的VFF-18不能表明任何临床效果。
还在20名患者中实施经186Re标记的BIWA 4的1期剂量增加试验。观察到口粘膜炎和剂量限制血小板减少和白细胞减少；1名患者形成HAHA应答。在以最高剂量60mCi/m2治疗的5名患者中看到稳定的疾病。虽然认为在此剂量范围中在安全性和耐受性两方面是可接受的，但是研究仅导致疾病的稳定化。另外，与临床研究中的其它非放射性同位素缀合的生物学疗法相比，这些研究具有更高比率的不利事件。
美国专利申请US 2003/0103985披露了在肿瘤疗法中使用的与美登木素生物碱(maytansinoid)缀合的VFF-18人源化型式(BIWA 4)，称作BIWI 1。发现BIWI 1在人外阴表皮样癌、咽鳞状细胞癌和乳腺癌的小鼠模型中具有显著的抗肿瘤效果。未缀合的型式，即BIWA 4没有展现出抗肿瘤效果。缀合物BIWI1没有在人中的安全性或效力的证据。
单抗U36是一种通过用UM-SCC-22B人下咽癌(hypopharyngeal carcinoma)细胞免疫开发的鼠单克隆IgG1抗体，并且在癌症和组织特异性方面选择。经由cDNA克隆和序列分析的抗原表征将单抗U36的表位鉴定为在角质形成细胞特异性CD44剪接变体epican的v6域内。免疫组织化学研究显示了识别的表位限于细胞膜。单抗U36强烈地标记94%的头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)，并且在这些肿瘤内，细胞染色方面有一致性。
一项10名患者经99mTc标记的单抗U36研究显示了抗体对HNSCC癌症的选择性积累（2天的20.4+/-12.4%注射剂量/kg）；没有报告不利效果，但是2名患者形成HAMA。在放射性碘化的鼠单抗U36的一项研究中，存在有18名患者中的3例HAMA和HNSCC中的选择性同质摄取。为了降低单抗U36的抗原性并且降低HAMA的比率，构建嵌合抗体，其中嵌合或初始鼠单抗U36都不展现出ADCC活性。然而，研究没有发现未标记的单抗U36的抗癌活性的证据。
使用经186Re标记的嵌合单抗U36来测定单抗U36作为治疗剂的效用。在此1期增加剂量试验中，13名患者接受搜索剂量的经99mTc标记的嵌合单抗U36，接着是经186Re标记的嵌合单抗U36。没有报告急性不利事件。然而，在治疗后，在3名患者之2名中记录剂量限制骨髓毒性(1.5GBq/m2)，并且在用最大耐受剂量(1.0GBq/m2)治疗的1名患者中观察到血小板减少。虽然对肿瘤大小有一些影响，但是这些影响不满足对治疗的客观响应的标准。经186Re标记的嵌合单抗U36的又一项研究采用使用粒细胞集落刺激因子刺激的全血再输注来使最大耐受活性加倍至2.8Gy的策略。在9名各种头和颈肿瘤的患者的此研究中，3名由于药物相关贫血需要输血。其它毒性包括3级骨髓毒性和2级粘膜炎。虽然在5名患者中实现稳定的疾病达3-5个月，但是没有报告客观肿瘤响应。
由于HNSCC患者的不良预后、疾病对生命质量的影响、和有限的治疗选项，相当有兴趣并且迫切需要开发针对HNSCC的新疗法。至今，尚没有在HNSCC中具有效力的所谓的“裸”（即，未缀合的）抗CD44抗体的报告。如此，虽然CD44似乎是一种用于免疫疗法的潜在抗癌靶物，但是抗CD44抗体需要放射性免疫缀合物来实现抗癌效果。然而，经放射性标记的抗CD44研究已经表明与实现的临床效果相关联的与疗法有关的不可接受的毒性。因而，需要开发新的HNSCC特异性疗法。
本发明根本的技术问题是提供使用抗CD44抗体和在一些具体的方面，未标记的抗CD44抗体来预防、治疗或诊断HNSCC的方法和手段。
通过提供权利要求书中表征的实施方案来解决所述技术问题。
发明概述
本发明涉及用于预防、治疗或诊断头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)的新方法，包括使用抗CD44抗体。在某些方面，本发明涵盖使用抗CD44抗体，其结合CD44胞外域的氨基端域和/或免疫特异性结合一种或多种，优选地多种人变体CD44，如人中表达的。在具体的方面，本发明涵盖使用由具有编号PTA-4621的保藏于ATCC的杂交瘤生成的抗CD44抗体及其变体和/或衍生物，例如，PTA-4621的嵌合和人源化型式。本发明进一步涵盖使用与PTA-4621竞争结合的抗体及其抗原结合片段。
依照本发明的方法使用的抗体和片段对CD44，特别是如细胞表面上表达的CD44是特异性的，且优选地，对人CD44的一种或多种变体（例如，如HNSCC癌细胞的表面上表达的）的氨基端胞外域是特异性的。在某些方面，依照本文中公开的方法使用的抗体是由具有编号PTA-4621的保藏于ATCC的杂交瘤生成的抗体的人源化或嵌合型式。在具体的实施方案中，依照本文中公开的方法使用的抗体或其抗原结合片段包含下列一种或多种：
具有氨基酸序列RYWMS(SEQ ID NO:3)的重链可变域(VH)CDR1，
具有氨基酸序列EVNPDSTSINYTPSLKD(SEQ ID NO:4)的VH CDR2，
具有氨基酸序列PNYYGSRYHYYAMDY(SEQ ID NO:5)的VH CDR3，
具有氨基酸序列RASQDINNYLN(SEQ ID NO:6)的轻链可变域(VL)CDR1，
具有氨基酸序列YTSRLHS(SEQ ID NO:7)的VL CDR2，和
具有氨基酸序列QQGSTLPFT(SEQ ID NO:8)的VL CDR3。
如由本发明涵盖的抗体也可以包含两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、且在某些方面，所有下列各种：具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VH CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的VH CDR2、具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VH CDR3、具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的VLCDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VL CDR2和具有氨基酸序列SEQ IDNO:8的VL CDR3。
依照本发明的方法使用的抗体和抗原结合片段可以包含具有以下氨基酸序列EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEVNPDSTSINYTPSLKDQFIISRDNAKNTLDLQMSKVSSEDTALYYCTRPNYYGSRYHYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:1)的VH域和/或具有以下氨基酸序列DIQMTQTTSSLSVSLGDRVTINCRASQDINNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEKEDVATYFCQQGSTLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:2)的VL域。
在某些方面，本发明涵盖抗CD44抗体或抗原结合片段的用途，该抗CD44抗体或抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH域和具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的VL域。
本发明进一步涵盖抗CD44抗体或其抗原结合片段用于治疗、预防或诊断HNSCC的用途，其中所述抗CD44抗体是人源化的。在一些方面，人源化的抗CD44抗体或抗原结合片段包含具有以下氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLVWVGEVNPDSTSINYTPSLKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRPNYYGSRYHYYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)或EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLVWIGEVNPDSTSINYTPSLKDQFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRPNYYGSRYHYYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)的VH域和/或具有以下序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGSTLPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:11)的VL域。
在一个具体的方面，本发明提供了用于预防、治疗或诊断受试者中的HNSCC的人源化抗CD44抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗CD44抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的VH域和具有氨基酸序列SEQ IDNO:11的VL域，或者其中所述抗CD44抗体包含具有氨基酸序列SEQ IDNO:10的VH域和具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL域。在具体的方面，受试者是人。本发明还提供了人源化抗CD44抗体或其抗原结合片段用于预防、治疗或诊断受试者中的HNSCC的用途，其中所述人源化抗CD44抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的VH域和具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL域，或者其中所述抗CD44抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的VH域和具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL域。
在某些方面，依照本发明的方法使用的抗体或抗体片段识别CD44胞外区的氨基端域内的具有氨基酸序列AFDGPITITIV(SEQ ID NO:12)的表位。
依照本发明使用的抗CD44抗体可以与活性模块诸如治疗性或报告模块缀合。抗CD44抗体也可以与来自受试者的生血细胞缀合。在某些方面，治疗性模块是本领域中已知的对于治疗、预防或诊断HNSCC有益的模块，诸如但不限于细胞毒素、酶、放射性元素、细胞因子、抗代谢物或干扰素。
本发明还涵盖将抗CD44抗体或其抗原结合片段作为单一药剂疗法或与一种或多种其它化疗或诊断药剂和/或疗法组合使用。因而，本发明涵盖与HNSCC的标准或实验治疗方案（例如，化学疗法、放射性免疫疗法、或放射疗法）组合使用抗CD44抗体（例如，人源化或嵌合抗体），或其抗原结合片段。依照本文中公开的用于预防、治疗或诊断HNSCC的方法的与CD44特异性抗体或其抗原结合片段组合特别有用的治疗剂的例子包括但不限于如本领域中已知的化疗剂、烷化剂、抗代谢物、天然产物、和激素。如本文中公开的组合疗法可以使较低剂量的抗CD44抗体或其抗原结合片段和/或不太频繁地对患有HNSCC的受试者施用抗CD44抗体或其抗原结合片段能够实现治疗或预防效果。依照本文中公开的方法，抗CD44抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种其它化疗或诊断剂共施用、并行施用、和/或序贯施用，或者可以与放射疗法或手术联合施用。抗体、片段和/或别的药剂或疗法的施用可以通过本领域中已知的适合于对肿瘤部位投递特定药剂或疗法的任何手段进行。此类施用可以是胃肠外（例如，IV、肌肉内或皮下施用）、口服或在某些方面，对肿瘤部位或对受怀疑的肿瘤发生或复发的部位直接投递。抗体、片段和/或组合物也可以以持续释放配制剂施用。
本发明进一步提供了用于预防、治疗或诊断受试者中的HNSCC的药物组合物，其包含(i)治疗有效量的如本文中所公开的抗CD44抗体（例如，嵌合或人源化抗体），或其抗原结合片段；和(ii)药学可接受载体。
本文中还公开了诊断受试者，包括怀疑具有此类疾病的受试者中的HNSCC的方法，包括：(i)使来自所述受试者的生物学样品与有效量的如本文中所公开的抗CD44抗体或其抗原结合片段接触；并(ii)检测所述抗体或其片段的结合，其中高于背景或标准水平的所述抗体或片段的检出指示所述受试者具有HNSCC。可以通过使用本领域中已知的可检测标志物来帮助抗CD44抗体或其抗原结合片段的检测。本发明还涵盖用于检测来自已知或怀疑包含HNSCC细胞的受试者的组织样品中的HNSCC的诊断或预后试剂盒。在某些方面，试剂盒包含用于检测CD44，特别是如由HNSCC细胞和/或来自已知或怀疑含有HNSCC细胞的受试者的组织样品表达的CD44的手段。试剂盒可以包含(1)由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体；(2)与由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体竞争结合的抗体；(3)包含下列一种或多种的抗体：具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VH CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的VH CDR2、具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VH CDR3、具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的VL CDR1、具有氨基酸序列SEQ IDNO:7的VL CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的VL CDR3；或(4)抗体(1)、(2)或(3)的抗原结合片段。试剂盒还可以包含下列一项或多项：用于容纳生物学样品的基片或容器、溶液或固体形式的生物标志的参照标准品（例如，由抗体PTA-4621生成的抗体特异性结合的肽或CD44）、一种或多种对生物标志特异性的抗体（例如，抗体PTA-4621及其抗原结合片段，或其变体或衍生物）、和用试剂盒内容物实施对生物标志的检测测定法的用法说明。
本发明的又一个目的是教导使用抗体PTA-4621或其抗原结合片段来治疗HNSCC的方法。本发明的另一个目的是教导使用抗体PTA-4621或其抗原结合片段来诊断HNSCC。本发明的又一个目的是教导PTA-4621或其抗原结合片段用于HNSCC预后或分期的用途。本发明的又一个目的是教导PTA-4621或其抗原结合片段用于选择进行HNSCC治疗的患者的用途。
在某些方面，依照本文中所公开的方法使用的抗CD44抗体及其抗原结合片段可以包含如下的VH域和/或VL域氨基酸序列，其与由具有编号PTA-4621的保藏于ATCC的杂交瘤生成的小鼠单克隆抗体的VH域和/或VL域氨基酸序列是至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相同的，只要抗CD44抗体或片段展现出对CD44的结合特异性和/或与PTA-4621竞争结合。本发明还涵盖包含如下的VH域和/或VL域氨基酸序列的抗CD44抗体或其抗原结合片段的用途，所述VH域和/或VL域氨基酸序列与具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH域和/或具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的VL域是至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相同的，只要抗CD44抗体或片段展现出对CD44的结合特异性和/或与PTA-4621竞争结合。在某些方面，本发明涵盖特异性结合CD44且包含如下的一个或多个CDR氨基酸序列的抗体或其片段，所述一个或多个CDR氨基酸序列与由具有编号PTA-4621的保藏于ATCC的杂交瘤生成的小鼠单克隆抗体的一个或多个CDR氨基酸序列是至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相同的，只要所述抗体或片段展现出对CD44的结合特异性和/或与PTA-4621竞争结合。本发明还涵盖包含如下的一个或多个CDR氨基酸序列的抗CD44抗体或其抗原结合片段的用途，所述一个或多个CDR氨基酸序列与具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VH CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的VH CDR2、具有氨基酸序列SEQID NO:5的VH CDR3、具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的VL CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VL CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的VL CDR3中的一种或多种是至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相同的，只要所述抗体或片段展现出对CD44的结合特异性和/或与PTA-4621竞争结合。
本发明还涵盖对CD44特异性的或者与抗体PTA-4621竞争结合的人源化抗体和抗体片段的用途，其中已经将人抗体（接受体抗体）的重和/或轻链可变区的一个或多个CDR的一个或多个区域用特异性结合CD44的供体单克隆抗体，例如由克隆PTA-4621生成的鼠单克隆抗体的一个或多个CDR的类似部分替换。优选地，人源化抗体与供体鼠抗体特异性结合相同表位。本领域技术人员会领会，本发明一般涵盖抗体的CDR嫁接。在具体的方面，本发明涵盖特异性结合CD44和/或与PTA-4621竞争结合的人源化抗体或抗体片段的用途，所述人源化抗体或抗体片段包含如下的VH域和/或VL域氨基酸序列，其与具有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的VH域和/或具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL域是至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相同的。
依照本文中所公开的方法使用的抗CD44抗体及其抗原结合片段由如下的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列在严格条件下与编码鼠单克隆抗体PTA-4621的VH域、完整重链、VL域或完整轻链的核苷酸序列杂交。在其它方面，本发明涵盖包含由如下的核酸序列编码的VH域的抗CD44抗体或其抗原结合片段的用途，所述核酸序列在严格条件下与编码氨基酸序列SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核酸序列杂交。在其它方面，本发明涵盖包含由如下的核酸序列编码的VL域的抗CD44抗体或其抗原结合片段的用途，所述核酸序列在严格条件下与编码氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:11的核酸序列杂交。本发明涵盖包含由如下的核苷酸序列编码的一个或多个CDR的抗CD44抗体或其抗原结合片段的用途，所述核苷酸序列在严格条件下与编码鼠单克隆抗体PTA-4621的一个或多个CDR的核苷酸序列，或编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VH CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的VH CDR2、具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VH CDR3、具有氨基酸序列SEQID NO:6的VL CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VL CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的VL CDR3中一种或多种的核酸序列杂交。严格杂交条件包括但不限于(i)在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45℃与滤膜结合的DNA杂交，接着在0.2X SSC/0.1% SDS中于约50-65℃清洗一次或多次；(ii)高度严格条件，诸如在6X SSC中于约45℃与滤膜结合的DNA杂交，接着在0.1XSSC/0.2%SDS中于约60℃清洗一次或多次，或者(iii)本领域技术人员已知的任何其它严格杂交条件。
本发明还涉及包含本文中所公开的核酸（即，编码抗CD44抗体或抗原结合片段的VH域、VL域和/或一个或多个CDR的核酸）的载体的用途。在某些实施方案中，所述载体是表达载体，并且编码如本文中所描述的氨基酸序列的核酸序列与编码的氨基酸序列正确表达所必需的核酸调节序列或编码氨基酸调节序列的序列（例如转录、翻译、移位信号）可操作连接。本发明进一步提供了含有载体或编码本文中所公开的抗体或抗体片段的核苷酸序列的宿主细胞。
从作为例示和例子列出本发明的某些实施方案的以下描述看，本发明的其它目的和优点会变得显而易见。
定义
一般地，下列词语或短语在概述、详述、实施例、和权利要求书中使用时具有指定的定义。
术语“抗体”以最广义使用，并且明确涵盖例如单一单克隆抗体（包括激动性、拮抗性、和中和性抗体、去免疫的(de-immunized)、鼠的、嵌合的、人源化的或人的抗体）、具有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体、双抗体、三抗体、免疫缀合物、合成抗体、骆驼源化(camelized)抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、和抗独特型（抗Id）抗体（包括例如针对本发明抗体的抗Id和抗抗Id抗体）、和上述任一项的表位结合片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即，含有抗原结合位点的分子。本发明涵盖使用任何型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类的免疫球蛋白分子。
“抗体片段”或“抗原结合片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原或表位结合区，或可变区。抗体片段的例子包括小于全长的抗体，例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、以及抗体可变域的构建体，例如，Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；单链抗体、单域抗体分子、自抗体片段形成的融合蛋白、重组蛋白和多特异性抗体。
非人（例如鼠）抗体/免疫球蛋白的“人源化”和/或“嵌合”形式指如下的抗体，其包含与初始抗体相比，导致人抗小鼠抗体(HAMA)、人抗嵌合抗体(HACA)或人抗人抗体(HAHA)应答降低，而且含有再现期望的效果所必需的自所述非人免疫球蛋白衍生的需要部分（例如CDR、抗原结合区、可变域，等等），而同时保留与所述非人免疫球蛋白相当的结合特征的特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合亚序列）。通常，人源化抗体是其中来自接受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望的特异性、亲和力和性能（例如，对CD44的特异性）的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠或家兔的CDR的残基替换的人免疫球蛋白（接受体抗体）。在一些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基通过相应的非人FR残基替换。此外，人源化抗体可以包含既不存在于接受体抗体，也不存在于输入CDR或FR序列中的残基。进行这些修饰以进一步改善及优化抗体性能。一般地，人源化抗体会包含至少一个、通常为两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的，且所有或基本上所有FR残基是人免疫球蛋白共有序列的FR残基。最佳地，人源化抗体还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。
如本文中所使用的，术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基（例如，依照Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)的轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)）和/或那些来自“高变环”的残基（即，轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917）。“框架区”或“FR”残基是如本文中限定的高变区残基以外的那些可变域残基。如本文中所使用的，术语“重链可变域”、“VH域”和/或“VH”可互换使用，并且指抗体重链的高变区（涵盖CDR和框架域两者）；术语“轻链可变域”、“VL域”和/或“VL”可互换使用，并且指抗体重链的高变区（涵盖CDR和框架域两者）。
遍及本说明书，杂交瘤细胞系及自其生成的单克隆抗体以ATCC编号PTA-4621提及。此抗体的内部名称是ARH460-16-2。因此，提及PTA-4621可以指保藏于ATCC的生成抗CD44抗体的杂交瘤细胞克隆，或者可以指由杂交瘤自身生成的抗CD44。提及PTA-4621还指具有内部名称ARH460-16-2的抗体。因而，如本文中所使用的，PTA-4621的嵌合型式可以称为“chPTA-4621”或“chARH460-16-2”，而PTA-4621的人源化型式可以称为“huPTA-4621”或“huARH460-16-2”。本领域技术人员通过上下文会立即认识提及抗体还是杂交瘤克隆。使用美国专利6,180,357中教导的用于生成患者特异性抗癌抗体的方法发现了鼠单克隆抗CD44抗体PTA-4621。使用该方法，用来自患者的肺肿瘤活组织检查和NCI-H460肺癌细胞系两者的细胞免疫小鼠。美国专利7,252,821中披露了抗体，并且表达抗体的杂交瘤细胞系于2002年9月4日以编号PTA-4621保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209。此抗体已经在许多临床前异种移植物模型，包括在人乳腺癌的预防性和已建立的体内模型两者中（如美国专利7,252,821中披露的）、在肝癌中（如美国专利申请11/786,165中披露的）和在前列腺癌中（如美国专利7,507,537中披露的）表明显著的抗肿瘤效果。另外，与化疗性药物（顺铂）组合的PTA-4621处理在已建立的体内前列腺癌模型（同上）中表明抗肿瘤活性。美国专利申请11/807,887中披露了鼠抗体PTA-4621/ARH460-16-2的嵌合和人源化型式。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指自基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可以以少量存在的可能的天然存在的突变外，构成群体的抗体个体相同。单克隆抗体针对单一抗原性位点是高度特异性的。此外，与通常包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在其特异性外，单克隆抗体的有利之处在于它们可以不受其它抗体污染地合成。修饰语“单克隆”指示抗体为自基本上同质的抗体群体获得的特征，并且不应解释为要求通过任何特定的方法来生成抗体。例如，可以通过第一次由Kohler等,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤（鼠的或人的）方法来生成，或者可以通过重组DNA方法（见例如美国专利No.4,816,567）来生成要依照本发明使用的单克隆抗体。也可以使用Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所描述的技术自噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。
“癌性疾病缓解抗体”(CDMAB)指以对于患者有益的方式，例如通过降低肿瘤负荷或延长携带肿瘤的个体的存活缓解癌性疾病过程的单克隆抗体及其抗体配体。
“结合”或“特异性结合”感兴趣的抗原，例如CD44的抗体或抗体片段是能够以足够的亲和力结合所述抗原，使得抗体在靶向表达抗原的细胞中作为治疗或诊断剂是有用的抗体或抗体片段。在抗体是结合CD44的抗体的情况中，与其它受体形成对比，它通常会优先结合CD44，而且不包括偶然的结合诸如非特异性Fc接触，或者对其它抗原常见的翻译后修饰的结合，并且可以是没有显著地与其它蛋白质起交叉反应的。用于检测结合感兴趣抗原的抗体的方法是本领域中公知的，并且可以包括但不限于诸如FACS、细胞ELISA和Western印迹的测定法。
在优选的实施方案中，依照本发明的方法使用的抗体或抗体片段特异性结合CD44，特别是如在HNSCC上表达的，和/或与鼠单克隆抗体PTA-4621竞争对CD44的结合，其使用如本领域中已知的标准方法来进行。CD44经由其保守的胞外HA结合区和胞内锚蛋白结合区介导胞外基质与细胞骨架间的直接连接。CD44蛋白也经由蛋白酶以可溶性形式(solCD44)释放，并且在正常的循环和唾液中可检出。CD44受体包括许多细胞类型中表达的同等型家族。这些同等型源自存在于CD44 mRNA中的可变外显子（外显子5-14）区域的可变剪接，生成连接胞外区的氨基端域与跨膜域的不同“茎”。在正常细胞中以标准CD44(CD44s)、上皮CD44(CD44E)或角质形成细胞中的CD44v8-10、和CD44v3-10找到同等型。其它CD44变体同等型(CD44v)在一些肿瘤中差别表达。在具体的方面，依照本发明的方法使用的抗体及其抗原结合片段免疫特异性结合CD44的胞外区的氨基端域，由此展现出针对人中表达的CD44的多种，且优选地所有功能性同等型的特异性。在具体的方面，本发明涵盖使用抗体及其抗原结合片段，其特异性结合如由HNSCC表达的CD44。在某些方面，依照本发明的方法使用的抗体和抗原结合片段结合CD44胞外区的氨基端域的具有氨基酸序列AFDGPITITIV(SEQ ID NO:12)的表位。优选地，依照本文中所公开的方法使用的抗体与PTA-4621竞争对CD44的结合，如通过本领域中已知的标准方法测定的。
如本文中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代可能在DNA内容物上不精确相同。包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的突变体后代。它从意图独特名称的上下文看会是清楚的。
如本文中所使用的，短语“对癌症或肿瘤部位直接施用”及类似短语指直接或基本上直接导入，包括但不限于对肿瘤直接或在肿瘤周围单次或多次注射抗体、片段或组合物、对肿瘤或在肿瘤周围的连续或不连续的灌注、对肿瘤或在肿瘤周围导入贮存器(reservoir)、对肿瘤或在肿瘤周围导入缓慢释放装置、对肿瘤或在肿瘤周围导入缓慢释放配制剂、直接应用于肿瘤上、对基本上直接供给肿瘤区的动脉的直接注射、对基本上排入肿瘤区的淋巴管的直接注射、在基本上密封的腔（例如，胸膜腔）或内腔（例如，囊内）中直接或基本上直接导入。“肿瘤周围”是描述距认为的肿瘤边界，诸如但不限于可触知的肿瘤边界约10cm内，优选地5cm内，更优选地1cm内的区域的术语。“直接施用”在预防发生或预防复发的背景中定义为对有癌症形成或复发风险的部位直接施用。
如本文中所使用的，术语“核酸”、“核酸序列”和“核苷酸序列”包括DNA分子（例如，cDNA或基因组DNA）、RNA分子（例如，mRNA）、DNA和RNA分子的组合或杂合DNA/RNA分子、和DNA或RNA分子的类似物。可以使用例如核苷酸类似物来生成此类类似物，所述核苷酸类似物包括但不限于肌苷或三苯甲基化(tritylated)碱基。此类类似物还可以包括包含对分子给予有益属性，诸如例如核酸酶抗性或升高的穿过细胞膜的能力的经修饰主链的DNA或RNA分子。核酸或核苷酸序列可以是单链、双链，可以含有单链和双链部分两者，并且可以含有三链部分，但是优选是双链DNA。
如本文中所使用的，术语“杂交”可以指在严格或非严格条件下的杂交。所述杂交条件可以依照记载于例如Sambrook,Russell;“Molecular Cloning,ALaboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(2001);Ausubel;“Current Protocols in Molecular Biology”,Green Publishing Associates andWiley Interscience,N.Y.(1989)，或Higgins和Hames(编);“Nucleic acidhybridization,a practical approach”IRL Press Oxford,Washington DC,(1985)的常规方案建立。条件的设置完全在技术人员的技术内，并且可以依照本领域中描述的方案来确定。如此，仅特异性杂交序列的检测通常会需要严格杂交和清洗条件，诸如于65℃的0.1x SSC、0.1%SDS。用于检测同源或不完全互补序列的非严格杂交条件可以设置为于65℃的6x SSC、1%SDS。如公知的，探针的长度和要测定的核酸的组成构成杂交条件的其它参数。注意到可以依照本领域中常规的方法经由纳入和/或替代用于抑制杂交实验中的背景的备用封闭试剂来实现上述条件的变化。典型的封闭试剂包括登哈特(Denhardt)氏试剂、BLOTTO、肝素、变性的鲑鱼精DNA、和商品化的专有配制剂。纳入特定的封闭试剂可能由于关于相容性的问题而需要修改上文所描述的杂交条件。杂交核酸分子还包括上文所描述的分子的片段。此类片段可以代表编码WAVE1或其功能性片段的核酸序列，其具有至少12个核苷酸，优选地至少15个，更优选地至少18个，更优选地至少21个核苷酸，更优选地至少30个核苷酸，甚至更优选地至少40个核苷酸，且最优选地至少60个核苷酸的长度。此外，与任何上述核酸分子杂交的核酸分子还包括这些分子的互补片段、衍生物和等位变体。另外，杂交复合物指凭借互补的G和C碱基间及互补的A和T碱基间氢键形成的两个核酸序列间的复合物；可以通过碱基堆积相互作用来进一步稳定化这些氢键。两个互补的核酸序列以反平行构型形成氢键。可以在溶液（例如，Cot或Rot分析）中或在存在于溶液中的一种核酸序列与固定化于固体支持物（例如，已经固定细胞的膜、滤器、芯片、针或载玻片）上的另一种核酸序列间形成杂交复合物。术语“互补的”或“互补性”指在容许的盐和温度条件下通过碱基配对实现的多核苷酸的天然结合。例如，序列“A-G-T”结合互补序列“T-C-A”。两条单链分子间的互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸结合，或者它在单链分子间存在总体互补性时可以是完全的。核酸链间的互补性程度对核酸链间的杂交的效率和强度具有显著影响。这在取决于核酸链间结合的扩增反应中是特别重要的。
优选地，术语“杂交序列”指与编码依照本发明的抗CD44抗体或抗原结合片段的VH域或VL域和/或此类抗CD44抗体或片段的CDR的如上文所描述的核酸序列（即，SEQ ID NO:1-11）展现出至少40%，优选地至少50%，更优选地至少60%，甚至更优选地至少70%，特别优选至少80%，更特别优选至少90%，甚至更特别优选至少95%，且最优选地至少97%同一性的序列同一性的序列。
依照本发明，术语“相同的”或“百分比同一性”在两种或更多种核酸或氨基酸序列的上下文中指相同的，或者如使用如本领域中已知的序列比较算法，或者通过手动比对和视觉检查测量的，为了在比较窗里，或在指定区里得到最大对应而比较和比对时具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸（例如，与例如SEQ ID NO:1-11的氨基酸序列或编码SEQ ID NO:1-11的氨基酸序列的核酸序列的60%或65%同一性，优选地，70-95%同一性，更优选地，至少95%同一性）的两种或更多种序列或亚序列。认为具有例如60%至95%或更大序列同一性的序列是基本上相同的。此类定义也适用于测试序列的互补物。本领域技术人员会知道如何使用例如算法，诸如那些基于CLUSTALW计算机程序(Thompson,Nucl.Acids Res.2(1994),4673-4680)或FASTDB(Brutlag,Comp.App.Biosci.6(1990),237-245)的算法来测定序列间的百分比同一性，如本领域中已知的。
虽然FASTDB算法在其计算中通常不考虑序列中的内部不匹配删除或添加，即缺口，但是这可以手动校正以避免%同一性的过度评估。然而，CLUSTALW在其同一性计算中确实考虑序列缺口。本领域技术人员也可用的是BLAST和BLAST 2.0算法(Altschul,Nucl.Acids Res.25(1997)3389-3402;Altschul,J.Mol.Evol.36(1993)290-300;Altschul,J.Mol.Biol.215(1990)403-410)。用于核酸序列的BLASTN程序使用作为缺省的字长度(W)为11、预期(E)为10、M=5、N=4、和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用作为缺省的字长度(W)为3、和预期(E)为10。BLOSUM62评分矩阵(Henikoff，PNAS 89(1989)10915)使用比对(B)为50、预期(E)为10、M=5、N=4、和两条链的比较。
此外，本发明还涉及其序列与上文所描述的杂交分子的序列相比简并的核酸分子。在依照本发明使用时，术语“由于遗传密码而简并的”意指由于遗传密码的冗余，不同核苷酸序列编码同一氨基酸。
使用BLAST的类似计算机技术用于搜索核苷酸数据库诸如GenBank或EMBL中的相同或相关分子。此分析比多种基于膜的杂交快得多。另外，可以改良计算机搜索的灵敏性以确定任何特定匹配是否分类为精确的或类似的。搜索的基础是乘积得分，其定义为：
并且它考虑两个序列间的相似性程度和序列匹配长度两者。例如，在乘积为40的情况中，匹配在1-2%的误差内会是精确的；而在70时，匹配会是精确的。虽然较低的得分可以鉴定相关分子，但是通常通过选择那些显示15和40间乘积得分的分子来鉴定相似的分子。关于能够产生序列比对的程序的另一个例子是CLUSTALW计算机程序(Thompson,Nucl.Acids Res.2:(1994)4673-4680)或FASTDB(Brutlag,Comp.App.Biosci.6:(1990)237-245)，如本领域中已知的。
“治疗或处理”指治疗性处理和预防性或防范性措施两者，其中目的是预防、改善或减缓（减轻）靶定的病理状况或病症（例如，HNSCC），或与其有关的一种或多种症状。该术语在本文中还用于指延迟癌症，特别是HNSCC的发作、抑制（例如降低或阻滞其生长）、减轻其影响、或延长患有癌症，特别是HNSCC的患者的生命。需要治疗的对象包括诊断为有病症的对象、怀疑具有病症的对象、有具有病症的素因的对象以及要预防病症的对象。因此，要在本文中治疗的哺乳动物可以已经诊断为具有病症或者可以有病症的素因或对病症易感。在一些实施方案中，治疗指根除、消除、减轻、或控制原发性、区域性、或转移性癌组织，其源自施用依照本发明的方法的一种或多种治疗剂。在其它实施方案中，此类术语指源自对具有此类疾病的受试者施用一种或多种治疗剂，使癌症的扩散最小化或延迟。在其它实施方案中，此类术语指消除引起疾病的细胞。
如本文中所使用的，术语“预防”指源自施用预防或治疗剂，预防受试者中的癌症疾病的一种或多种症状的发生和/或复发或发作。
特别地，认为有形成癌症的风险的个体可以受益于本发明，这主要是因为预防性处理可以在存在有病症的任何证据（例如，恶化前肿瘤（“癌前”）或发育异常损伤，其对于肉眼可以是可见的或不可见的，但是含有组织学恶化前变化）前开始。“有风险”的个体包括例如，例如通过消费(consumption)，例如通过吸入和/或摄入以统计学显示在易感个体中促进癌症的水平暴露于致癌原的个体。还包括由于暴露于紫外辐射、或其环境、职业、和/或遗传而有风险的个体及那些显示癌前状况诸如息肉的体征的个体。类似地，癌症的非常早期阶段或转移形成（即，仅一个或几个异常细胞存在于个体的身体中或存在于个体组织中的特定部位）的个体可以受益于此类预防性处理。
如本文中所使用的，术语“有效量”和“有效治疗”指在其施用的背景内对于引起意图的效果或生理学后果有效的持续一段时间（包括短期或长期施用和周期性或连续施用）利用抗体的量或浓度。在本发明中使用的抗体的有效量包括例如抑制癌症，例如肿瘤和/或肿瘤细胞生长，改善患有癌症或有癌症风险的患者的后果，和改善其它癌症治疗的结果的量。
术语“患者”和“受试者”可互换使用，并且遍及整个说明书用于描述对其提供依照本发明方法的治疗或诊断的动物，人或非人。
术语“头和颈鳞状细胞癌”或HNSCC包括但不限于口、唇、鼻腔、鼻旁窦、咽、喉、鼻咽、喉和气管癌。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。
出于治疗目的的“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、小鼠、SCID或裸鼠或小鼠品系、家畜和牲畜动物、和动物园、运动、或宠物动物，诸如绵羊、犬、马、猫、牛等。优选地，本文中的哺乳动物是人。
如本文中所使用的，术语“组合”指使用超过一种预防和/或治疗剂，例如在如本文中所描述的抗CD44抗体或其抗原结合片段外的预防或治疗剂。术语“组合”的使用并不限制对患有病症，例如HNSCC的受试者施用预防和/或治疗剂的次序。第一预防或治疗剂可以在对患有或易感病症的受试者施用第二预防或治疗剂之前（例如之前1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周）、同时、或之后（例如之后1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周）施用。以一定的顺序且在一定的时间间隔内对受试者施用预防或治疗剂，使得本发明的药剂可以与其它药剂一起起作用以提供比在它们在其它情况中施用时升高的益处。任何别的预防或治疗剂可以与其它别的预防或治疗剂以任何次序施用。“组合”也可以指与如本领域中已知的标准抗癌治疗形态，例如，放射疗法或手术一起使用如本文中所公开的抗CD44抗体或其抗原结合片段。
如本文中所使用的，“免疫缀合物”意指与细胞毒素、放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶或报告模块、酶、毒素、抗肿瘤药物或治疗剂化学或生物学连接的任何分子或CDMAB诸如抗体。抗体或CDMAB可以与细胞毒素、放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶或报告模块、酶、毒素、抗肿瘤药物或治疗剂在沿着分子的任何位置连接，只要它能够结合其靶物。免疫缀合物的例子包括抗体毒素化学缀合物和抗体-毒素融合蛋白。免疫缀合物可以特别用作诊断剂。
适合于作为抗肿瘤剂和/或与如本文中公开的诊断方法联合使用的放射性药剂是本领域技术人员已知的。例如，可以使用131I或211At。使用常规的技术来将这些同位素附着于抗体（例如Pedley等,Br.J.Cancer 68,69-73(1993)）。或者，附着于抗体的抗肿瘤剂是活化前药的酶。可以施用前药，其会以其无活性形式保留，直至它达到肿瘤部位，在那里一旦施用抗体复合物，它被转化成其细胞毒性形式。实际上，对患者施用抗体-酶缀合物，并且容许定位于要治疗的组织的区域中。然后，对患者施用前药，使得在要治疗的组织区域中发生向细胞毒性药物的转化。或者，与抗体缀合的抗肿瘤剂是细胞因子诸如白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。抗体将细胞因子靶向至肿瘤，使得细胞因子在不影响其它组织的情况中介导对肿瘤的损伤或破坏。使用常规的重组DNA技术在DNA水平将细胞因子与抗体融合。也可以使用干扰素。
附图简述
图显示了：
图1显示了ARH460-16-2抗体针对HNSCC细胞系T.Tn、SCC-15和Detroit-562（图1A）和CAL 27（图1B）的代表性FACS柱状图，显示了ARH460-16-2结合此类细胞系。在图1A中，抗体C225（抗EGFR）充当对照；在图1B中，抗CD20抗体RITUXANTM充当对照。
图2表明chARH460-16-2对已建立的人T.Tn HNSCC模型中的肿瘤生长的影响。垂直虚线标示腹膜内施用抗体的时期。数据点代表均值+/-SEM。
图3表明嵌合PTA-4621对已建立的人T.Tn HNSCC模型中的小鼠体重的影响。数据点代表均值+/-SEM。
图4表明人源化PTA-4621对已建立的SCC-15HNSCC模型中的肿瘤生长的影响。垂直虚线标示腹膜内施用抗体的时期。数据点代表均值+/-SEM。
图5表明人源化PTA-4621对已建立的SCC-15HNSCC模型中的小鼠体重的影响。数据点代表均值+/-SEM。
图6表明人源化PTA-4621对已建立的Detroit 562HNSCC模型中的肿瘤生长的影响。垂直虚线标示腹膜内施用抗体的时期。数据点代表均值+/-SEM。
图7表明人源化PTA-4621对已建立的Detroit 562 HNSCC模型中的小鼠体重的影响。数据点代表均值+/-SEM。
图8表明人源化PTA-4621对已建立的CAL 27 HNSCC模型中的相对肿瘤体积的影响。
图9表明人源化PTA-4621对已建立的CAL 27 HNSCC异种移植物模型中的肿瘤生长的影响。肿瘤体积以组均值±SEM呈现。垂直虚线标示剂量给药的第一天和最后一天。
图10表明人源化PTA-4621对已建立的CAL 27 HNSCC模型中的小鼠体重的影响。体重以组均值±SEM呈现。
图11呈现了鼠单克隆抗体PTA-4621的VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。已经依照Kabat对序列的残基编号。将CDR加下划线，并且另外用序列上方的短划线标识；VH CDR1(SEQ ID NO:3)对应于残基31至35，VH CDR2(SEQ ID NO:4)对应于残基50至65，而VH CDR3(SEQ ID NO:5)对应于残基95至102。
图12呈现了鼠单克隆抗体PTA-4621的VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。已经依照Kabat对序列的残基编号。将CDR加下划线，并且另外用序列上方的短划线标识；VL CDR1(SEQ ID NO:6)对应于残基24至34，VL CDR2(SEQ ID NO:7)对应于残基50至67，而VL CDR3(SEQ ID NO:8)对应于残基89至97。
图13呈现了基于鼠单克隆抗体PTA-4621的两个备选人源化VH域的氨基酸序列（SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10）。已经依照Kabat对序列的残基编号。
图14呈现了基于鼠单克隆抗体PTA-4621的人源化VL域的氨基酸序列(SEQ IDNO:11)。已经依照Kabat对序列的残基编号。
发明详述
本发明解决了鉴定的技术问题，其在于令人惊讶地显示了抗CD44抗体PTA-4621作为裸（即，未缀合的）抗体在治疗HNSCC中是有效的。具体地，在已建立的HNSCC模型中与先前的抗CD44疗法形成对比，PTA-4621的未缀合的嵌合和人源化型式在包含T.Tn、SCC-15、Detroit 562和Cal 27细胞的异种移植物的HNSCC模型中显著抑制和/或降低肿瘤生长。
因而，本发明提供了用于预防、治疗和/或改善患有HNSCC的患者的临床状况的方法，包括使用抗CD44抗体，特别是依照本领域中已知的方法与鼠单克隆抗体PTA-4621竞争结合的抗CD44抗体和/或免疫特异性结合CD44胞外区的氨基端域，并且识别如在人中表达的一种或多种CD44同等型的抗CD44抗体。在某些方面，本发明提供了如下的方法，其用于(i)降低HNSCC肿瘤大小、生长速率、侵入性、恶性等级、和/或复发风险，(ii)延长治疗后的无疾病时间间隔，和/或(iii)改善HNSCC患者中的呼吸、吞咽、和/或言语功能，包括对患者施用有效量的如本文中所公开的抗CD44抗体或其抗原结合片段。可以例如通过评估受试者不太困难地呼吸的能力、受试者吞咽液体对固体的能力、阻塞程度、言语的音质或音量、和临床领域已知的其它指数主观地或客观地测定临床改善。
使用本发明方法的癌症治疗的临床结果是相关领域技术人员，诸如内科医生容易地可辨别的。例如，测量癌症的临床标志物的标准医学测试可以是治疗效力的强烈指标。此类测试可以包括但不限于体格检查、表现量表(performance scale)、疾病标志物、12导联ECG、肿瘤测量、组织活组织检查、细胞检查、细胞学、肿瘤最长直径计算、放射照相术、肿瘤的数字成像、生命征、重量、不利事件的记录、感染性事件的评估、伴随药物的评估、疼痛评估、血液或血清化学、尿液分析、CT扫描、和药动学分析。此外，可以通过经历单一疗法的患者的比较研究测定包含依照本发明的方法的如本文中所公开的抗CD44抗体、片段或组合物和另一种癌症治疗剂的组合疗法的协同效应。
特别在HNSCC的情况中，呼吸、吞咽、言语、和某些生命质量测量的改善是容易地可确定的。另外，可以使用熟练技术人员接受的标准，例如，Therasse等,“New guidelines to evaluate the response to treatment in solidtumors.European Organization for Research and Treatment of Cancer,NationalCancer Institute of the United States,National Cancer Institute of Canada,”J NatlCancer Inst.92(2000)205-16来评估HNSCC的消退。
在某些实施方案中，癌症适合于通过直接施用如本文中所公开的抗CD44抗体、片段或组合物来治疗。例如，靶肿瘤块可以接近皮肤表面。在另一个例子中，患病组织可以被囊肿包囊，或者存在于基本上封闭的腔，包括但不限于内腔中。要施用的如本文中所公开的抗CD44抗体、片段或组合物的有效剂量可以随施用模式而变化。与系统、静脉内施用相比，直接施用（例如，肿瘤内注射）需要小得多的所公开抗CD44抗体或片段的全身剂量。对于熟练技术人员会明显的是，局部施用会导致较低的体剂量，并且在那些情况中，并且会预期并期望所得的免疫毒素的低循环血浆水平。在此类病例中，可以以每个周期等于或低于安全性试验中建立的最大耐受剂量的总剂量在肿瘤内施用如本文中所公开的抗CD44抗体或抗原结合片段，但是剂量相对于肿瘤体积标准化。在某些实施方案中，会在不超过肿瘤体积的约20-50%的体积中施用剂量。
本发明还提供了用于降低术后并发症的风险的方法，包括在治疗HNSCC的手术之前、期间、或之后施用有效量的如本文中所公开的抗CD44抗体、片段或组合物。
本发明还提供了用于预防HNSCC的发生、预防或延迟HNSCC的复发、或降低HNSCC的复发率的方法，包括对有此需要的患者施用（例如，直接施用）有效量的如本文中所公开的抗CD44抗体、片段或组合物。对需要此类治疗的患者直接施用如本文中所公开的抗CD44抗体、片段或组合物可以导致具有临床显著效力的另一种癌症治疗剂的剂量降低。在没有本发明的方法的情况中不可观察到降低剂量的其它癌症治疗剂的此类效力。因而，本发明提供了用于治疗肿瘤或癌症的方法，包括施用降低剂量的一种或多种其它癌症治疗剂。
本发明还提供了用于使肿瘤或癌症对一种或多种其它癌症治疗剂敏感的方法，包括施用如本文中所公开的抗CD44抗体、片段或组合物。在一个非限制性实施方案中，其它癌症治疗剂包括在针对HNSCC的活性方面已知的化疗剂，如本领域中已知的。在另一个非限制性实施方案中，其它癌症治疗剂包括辐射。可以在/与施用如本文中所公开的抗CD44抗体、片段或组合物之前、交叠、并行、和/或之后施用其它癌症治疗剂。在并行施用时，可以将如本文中所公开的抗CD44抗体、片段或组合物和其它癌症治疗剂在单一配制剂中或在分开的配制剂中施用，并且若分开地，则任选地通过不同施用模式施用。因而，一种或多种免疫毒性和一种或多种其它癌症治疗剂的组合可以协同起作用以对抗肿瘤或癌症。
本发明的方法中使用的抗CD44抗体，或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的VH域、具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:11的VL域、和/或下列一种或多种：具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VH CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的VHCDR2、具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VH CDR3、具有氨基酸序列SEQ IDNO:6的VL CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VL CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的VLCDR3。在一个具体的实施方案中，本发明涵盖使用抗CD44抗体或其抗原结合片段，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH域和包含序列SEQ ID NO:2的VL域。在其它实施方案中，本发明涵盖使用抗CD44抗体或其抗原结合片段，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的VH域和包含序列SEQ ID NO:11的VL域，或者包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的VH域和包含序列SEQ ID NO:11的VL域。在某些实施方案中，本发明涵盖使用抗CD44抗体或其抗原结合片段，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VHCDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的VH CDR2、具有氨基酸序列SEQ IDNO:5的VH CDR3、具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的VL CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VL CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的VL CDR3之每个。
可以对本发明的方法中使用的抗CD44抗体或抗原结合片段(i)表征对CD44，特别是对CD44胞外区的氨基端域的特异性结合；(ii)表征对CD44胞外区的氨基端域中具有氨基酸序列AFDGPITITIV(SEQ ID NO:12)的表位的特异性结合；或者(iii)表征与鼠单克隆抗体PTA-4621竞争结合，其使用本领域中已知的任何用于此类表征的基于免疫学或生物化学的方法来进行，包括定量（特异性）抗体与CD44或其表位的相互作用。可以例如使用基于免疫学或生物化学的方法，包括但不限于ELISA测定法、表面等离振子共振测定法、免疫沉淀测定法、亲和层析、和平衡透析来测定本发明的抗体对CD44或其表位的特异性或竞争性结合。免疫测定法包括但不限于使用诸如下列技术的竞争和非竞争测定系统：Western印迹、放射性免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“三明治式”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体固定测定法、免疫放射计量测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法，等等。此类测定法是本领域中常规的且公知的。
也可以使用本领域中已知的用于表征抗体与抗原，例如CD44的相互作用的动力学参数的任何基于表面等离振子共振的测定法来测定本发明的人源化抗体。可以在本发明中使用商品化的任何SPR仪，如本领域中已知的。
本发明进一步涵盖使用与靶或报告模块连接的CDMAB，例如抗CD44抗体或其抗原结合片段。靶模块是结合对的第一成员。例如，抗肿瘤剂与此对的第二成员缀合，并且由此针对抗原结合蛋白结合的表位。此类结合对的一个常见例子是亲合素和生物素。在一个优选的实施方案中，生物素与本发明的CDMAB的靶抗原缀合，并且由此为与亲合素或链霉亲合素缀合的抗肿瘤剂或其它模块提供靶物。或者，生物素或另一种此类模块与本发明的CDMAB的靶抗原连接，并且例如在可检测信号产生剂与亲合素或链霉亲合素缀合的诊断系统中作为报告物使用。此外，依照本发明的方法的CDMAB可以与改变给定的生物学应答的治疗剂或药物模块缀合。治疗剂或药物模块不应解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物模块可以是拥有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括例如毒素（例如，相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、白喉毒素、蓖麻毒蛋白、白树毒蛋白(gelonin)）、和酶、蛋白质（例如，肿瘤坏死因子）、干扰素（例如，α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)）、凋亡剂、血栓形成剂、抗血管生成剂（例如，血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)）、或生物应答改性剂（例如，淋巴因子、巨噬细胞集落刺激因子或生长因子）、蛋白酶、或核糖核酸酶。依照本发明的方法使用的CDMAB也可以与治疗性模块诸如放射性材料或可用于缀合放射性金属离子的大环螯合剂缀合。大环螯合剂的一个常见例子是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”-四乙酸(DOTA)，其可以经由接头分子附着于抗体。此类接头分子是本领域中通常已知的且常规使用的。
可以在为了诊断或预后目的的本发明的方法中使用经标记的抗体，特别是如本文中所公开的抗CD44抗体或其抗原结合片段，以检测、诊断、或监测癌症疾病。如本文中所描述的标记物是与例如在本发明的体内和体外诊断方法中使用的抗CD44抗体、或抗原结合片段偶联的可检测信号。信号产生剂产生可测量信号，其通过外部手段，通常测量电磁辐射可检测。通常，信号产生剂是酶，或生色团或放射性核素，或者通过荧光、磷光或化学发光来发光。生色团包括吸收紫外或可见区的光的染料，并且可以是酶催化反应的底物或降解产物。
此外，本发明的范围内包括CDMAB在体内和在体外进行调查或诊断方法的用途，其是本领域公知的。为了实施如本文中涵盖的诊断方法，本发明可以进一步包括试剂盒，其含有可用于本发明的CDMAB。此类试剂盒会可用于通过检测CDMAB的靶抗原在此类个体的细胞上的过表达来鉴定有某些类型的癌症的风险的个体。
可以使用可用于实施本发明的抗体作为用于预防、治疗或诊断癌症的组合物。这些组合物具有低毒性，并且可以在它们为液体制剂形式，或者作为合适制剂的药物组合物时对人或哺乳动物口服或胃肠外（例如，血管内、腹膜内、皮下等）施用。可用于实施本发明的抗体可以独自施用，或者可以作为合适的组合物施用。此类施用使用的组合物可以含有药理学可接受载体及抗体或其盐、稀释剂或赋形剂。此类组合物以适合于口服或胃肠外施用的药物制剂形式提供。
供胃肠外施用的组合物的例子是可注射制剂、栓剂等。可注射制剂可以包括诸如静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射剂、点滴输注、关节内注射剂等剂量形式。可以通过公众已知的方法来制备这些可注射制剂。例如，可以通过将本发明的抗体或其盐在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化来制备可注射制剂。作为注射用水性介质，例如存在着生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助剂等的等张溶液，其可以与合适的稳定剂诸如醇（例如乙醇）、多元醇（例如丙二醇、聚乙二醇）、非离子型表面活性剂（例如，聚山梨酯80、HCO-50（氢化蓖麻油的聚氧乙烯（50摩尔）加合物））等组合使用。作为油性介质，存在着采用的，例如芝麻油、大豆油等，其可以与稳定剂诸如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。如此制备的注射剂通常装在合适的安瓿中。可以通过混合本发明的抗体或其盐与供栓剂用的常规基质来制备供直肠施用使用的栓剂。用于口服施用的组合物包括固体或液体制剂，具体地，片剂（包括锭剂和薄膜衣片剂）、丸剂、颗粒剂、粉状制剂、胶囊剂（包括软胶囊）、糖浆剂、乳液、悬浮液等。此类组合物通过公众已知的方法来制造，并且可以含有药用制剂领域中常规使用的媒介物、稀释剂或赋形剂。供片剂用的媒介物或赋形剂的例子是乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁，等等。
有利地，将上文所描述的口服或胃肠外使用的组合物以适合于符合活性成分的一个剂量的剂量单位制备成药用制剂。此类单位剂量制剂包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂（安瓿）、栓剂，等等。
包含依照本发明的方法的抗体的前述预防/治疗剂的剂量可以随要施用的受试者、靶疾病、状况、施用路径等而变化。例如，在出于治疗/预防例如成人中的HNSCC的目的使用时，以约0.0001mg/kg至200mg/kg或0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重的剂量静脉内施用本发明的抗体是有利的。在其它方面，对患者施用的剂量是0.0001mg/kg和20mg/kg、0.0001mg/kg和10mg/g、0.0001mg/kg和5mg/kg、0.0001和2mg/kg、0.0001和1mg/kg、0.0001mg/kg和0.75mg/kg、0.0001mg/kg和0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/g或0.01至0.10mg/kg患者体重之间。一般地，人抗体由于对外来多肽的免疫应答而比来自其它物种的抗体具有更长的在人体内的半衰期。如此，较低的人抗体剂量和不太频繁的施用经常是可能的。此外，可以通过改变诸如例如脂质化通过增强抗体的摄取和组织渗透来降低本发明的抗体或其片段的施用剂量和频率。在其它方面，本发明的抗体与其它治疗组合物组合使用，并且对受试者施用的剂量比在所述抗体作为单一药剂疗法使用时低。
术语治疗有效的和预防有效的涵盖本文中提供的施用的剂量量和频率。剂量和频率通常进一步会随每名患者特异性的因素，随施用的特定治疗或预防剂、严重性、施用路径以及患者的年龄、体重、响应、和过去的医学史而变化。本领域技术人员可以通过考虑此类因素并且通过遵循例如文献中报告的和医师案头参考(Physician’s Desk Reference)（第56增补版，2002）中推荐的剂量选择合适的方案。可以将本发明的抗体、片段或组合物的每日剂量以单一推注剂量施用或者分成要在24小时期间里投递的多剂。或者，可以经由例如输注在延长的一段时间里施用总日剂量，使得在12小时、6小时、4小时、2小时、1.5小时、1.0小时、45分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟里施用总剂量。在状况特别严重时，可以依照状况提高剂量。
可以将依照本发明的方法使用的抗体按照实际情况或以合适的组合物形式施用。用于施用的组合物可以含有药理学可接受载体及前述抗体或其盐、稀释剂或赋形剂。此类组合物以适合于口服或胃肠外施用（例如，血管内注射、皮下注射等）的药用制剂的形式提供。上文所描述的每种组合物可以进一步含有其它活性成分。此外，本发明的抗体可以与其它药物，例如烷化剂（例如，环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)，等等）、代谢拮抗剂（例如，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶，等等）、抗肿瘤抗生素（例如，丝裂霉素(mitomycin)、阿霉素(adriamycin)，等等）、植物衍生的抗肿瘤剂（例如，长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、泰素(Taxol)，等等）、顺铂、卡铂、依托泊苷(etoposide)、伊立替康(irinotecan)等组合使用。可以对患者同时或在交错的时间施用本发明的抗体和上文所描述的药物。施用本发明的人源化抗体的方法包括但不限于胃肠外施用（例如，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下）、硬膜外、和粘膜（例如，鼻内和口服路径）。在一个具体的实施方案中，肌肉内、静脉内、或皮下施用本发明的抗体。可以通过任何便利的路径，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里（例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等）的吸收来施用组合物，并且可以与其它生物学活性剂一起施用。施用可以是系统的或局部的。另外，也可以例如通过使用吸入器或喷雾器和具有雾化剂的配制剂来采用肺施用。
利用的化疗剂/其它抗体方案包括认为最佳地适合于治疗患者的状况的任何方案。不同恶性肿瘤可以需要使用特异性抗肿瘤抗体和特异性化疗剂，其会以患者与患者间为基础确定。在本发明的一个优选的实施方案中，与抗体疗法并行地或者，更优选地，在抗体疗法后施用化学疗法。然而，应当强调本发明不限于任何具体的施用方法或路径。
本说明书中提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域技术人员的水平。
应当理解，虽然例示了本发明的某种形式，但是它不应限于本文中所描述和显示的部分的具体形式或排列。对于本领域技术人员会显而易见的是，可以在不偏离本发明的范围的前提下进行各种变化，并且不应认为本发明限于说明书中显示和描述的事物。
本领域技术人员会容易领会，本发明完全适合于实施目标，并且获得提及的目的和优点以及其中固有的。本文中描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物学相关化合物、方法、规程和技术目前代表优选的实施方案，意图为例示性的，而并不意图为对范围的限制。本领域技术人员会想到其中的变化和其它用途，其涵盖在本发明的精神内，并且以所附权利要求书的范围限定。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，如要求保护的本发明不应过度地限于此类具体的实施方案。实际上，对于本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种改变意图在所附权利要求书的范围内。
本发明还涵盖下列各项：
项1：一种用于治疗哺乳动物中的头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)的方法，包括以有效导致所述哺乳动物的肿瘤负荷降低的量对所述哺乳动物施用抗CD44单克隆抗体或其抗原结合片段。
项2：项1的方法，其中所述抗CD44单克隆抗体是ARH460-16-2。
项3：项2的方法，其中所述单克隆抗体与细胞毒性模块缀合。
项4：项1的方法，其中所述单克隆抗体是由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体的人源化型式或自所述人源化抗体生成的抗原结合片段。
项5：项1的方法，其中所述单克隆抗体是由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体的嵌合型式或自所述嵌合抗体生成的抗原结合片段。
项6：抗CD44单克隆抗体或其抗原结合片段用于治疗哺乳动物中的HNSCC的用途，包括以有效导致所述哺乳动物的肿瘤负荷降低的量对所述哺乳动物施用所述抗CD44单克隆抗体或其抗原结合片段。
项7：项6的用途，其中所述抗CD44单克隆抗体是ARH460-16-2。
项8：项7的用途，其中所述单克隆抗体与细胞毒性模块缀合。
项9：项6的用途，其中所述单克隆抗体是由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体的人源化型式。
项10：项6的用途，其中所述单克隆抗体是由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体的嵌合型式。
项11：一种用于治疗哺乳动物中的HNSCC的方法，包括以有效导致所述哺乳动物的肿瘤负荷降低的量与至少一种化疗剂联合对所述哺乳动物施用抗CD44单克隆抗体或其抗原结合片段。
项12：项13的方法，其中所述抗CD44单克隆抗体是ARH460-16-2。
项13：项14的方法，其中所述单克隆抗体或CDMAB与所述化疗剂缀合。
项14：项15的方法，其中所述化疗剂是细胞毒性模块。
项15：项11的方法，其中所述单克隆抗体是由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体的人源化型式。
项16：项11的方法，其中所述单克隆抗体是由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体的嵌合型式。
项17：对于治疗HNSCC有效的组合物，其包含组合的：
由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的抗CD44单克隆抗体或其抗原结合片段；和
需要量的药学可接受载体；
其中所述组合物对于治疗所述HNSCC是有效的。
项18：项17的组合物，其进一步包含所述单克隆抗体或其抗原结合片段与选自下组的成员的缀合物：细胞毒性模块、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶或报告模块和造血细胞。
项19：一种用于检测HNSCC的存在的测定试剂盒，其中所述HNSCC表达特异性结合由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体或其抗原结合片段的抗原的至少一个表位，所述试剂盒包含由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合如下的多肽，该多肽以特定截留水平的存在诊断出所述HNSCC的所述存在。
为了使本文中所描述的发明可以得到更完整地了解，列出了以下非限制性实施例。
实施例
实施例1
对HNSCC细胞系的体外结合。
开发出PTA-4621的嵌合的和人源化的型式，如本文中所公开的。嵌合PTA-4621(“chPTA-4621”)包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的VH和VL域。开发出PTA-4621的两种人源化形式(huPTA-4621)，其在其重链可变域的氨基酸序列中具有微小的差异。huPTA-4621包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的VH域和具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL域。使用如本领域中已知的标准测定法，huPTA-4621的两种型式的抗原结合亲和力和亲合力是不能区别的。
通过流式细胞术(FACS)评估chPTA-4621和huPTA-4621对HNSCC细胞系T.Tn、SCC-15、Detroit-562和CALL 27的结合。通过最初用DPBS（没有Ca++和Mg++）清洗细胞单层来为FACS制备细胞。然后，使用细胞解离缓冲液（INVITROGEN,Burlington,ON；对于T.Tn、SCC-15和Detroit-562）或细胞脱离溶液ACCUTASETM（SIGMA,St.Lois,MO,USA,对于CAL 27）于37℃将细胞自其细胞培养板移去。在离心和收集后，将细胞在含有MgCl2、CaCl2和2%（T.Tn、SCC-15和Detroit-562）或3%(CAL 27)胎牛血清的DPBS中于4℃（染色培养基）重悬，并计数，以合适的细胞密度等分取样，向下旋转以沉淀细胞，并在染色培养基中于4℃在存在测试抗体（嵌合的或人源化的PTA-4621）或对照抗体（同种型对照，抗EGFR（C225；T.Tn、SCC-15和Detroit-562）或抗CD20(RITUXANTM;CAL27)的情况中重悬。以20μg/mL在冰上评估同种型对照和测试抗体达30分钟。对于检测结合的抗体，对T.Tn、SCC-15和Detroit-562细胞使用经Alexa Fluor 546缀合的二抗，并且在CLA 27测试中使用经APC缀合的二抗。在添加二抗前，将细胞用染色培养基清洗一次。然后，依照制造商的指导添加染色培养基中的二抗。然后，将细胞清洗最后一次，并在固定培养基（含有1.5%低聚甲醛的染色培养基）中重悬。使用CellQuest软件(BD Biosciences,Oakville,ON)通过在FACScan上运行样品来评估T.Tn、SCC-15和Detroit-562细胞的流式细胞测量获得，而使用Diva 6系统软件(BD Biosciences,Rockville,MD USA)通过在LSR-II上运行样品来评估CAL 27细胞的获得。通过调节FSC和SSC检测仪上的电压和振幅增益设置细胞的前向(FSC)和侧向散射(SSC)。通过运行未染色的(CAL 27)或仅用经AlexaFluor 546缀合的二抗（T.Tn、SCC-15和Detroit-562）染色的细胞来调节荧光（FITC或APC）通道的检测仪，使得细胞具有有约1-5个单位的中值荧光强度的一致峰。对于每份样品。获得约10,000个经染色的经固定的细胞以进行分析，并且图1A-B中呈现了结果。
总之，获得的数据显示了PTA-4621的嵌合的和人源化的型式结合T.Tn、SCC-15和Detroit-562（图1A）和CAL 27（图1B）细胞系。
实施例2
用人T.Tn细胞的体内实验
为了表明在体内针对人HNSCC癌细胞系的功效，在建立的T.Tn HNSCC异种移植物模型中测试嵌合的PTA-4621(chPTA-4621)。参考图2和3，给6至8周龄雌性SCID小鼠植入右体侧中皮下注射的100微升PBS溶液中的1000万个T.Tn细胞。将小鼠随机分成10只的2个处理组。在小鼠的平均肿瘤体积达到约264-268mm3时，在用含有2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mMNa2HPO4的稀释剂自储液浓度稀释后，在300微升的体积中对每个分组腹膜内施用20mg/kg chPTA-4621测试抗体或缓冲液对照。然后，将抗体和对照样品每周施用3次，持续整个研究。约每7天用测径器测量肿瘤生长。在10剂抗体后完成研究。将动物的体重每周记录一次，持续整个研究。在研究结束时，依照CCAC准则对所有动物实施安乐死。
chPTA-4621降低人HNSCC的T.Tn体内建立模型中的肿瘤生长。与缓冲液处理组相比，用抗体chPTA-4621的处理将T.Tn肿瘤的生长降低54.9%（p=0.0068，t-检验），如在第105天，即研究期的最后一天测定的（图2）。
遍及整个研究没有毒性的临床体征。以每周时间间隔测量的体重是舒适和不能茁壮成长的替代（图3）。在处理期结束时，各组间的均值体重没有显著差异。从研究开始至结束，每组内的均值体重也没有显著差异。
总之，chPTA-4621是耐受良好的，并且显著降低此人HNSCC异种移植物模型中的肿瘤负荷。
实施例3
用人SCC-15细胞的体内实验
为了表明在体内针对人HNSCC癌细胞系的功效，在SCC-15 HNSCC异种移植物模型中测试人源化PTA-4621(huPTA-4621)。参考图4和5，给6至8周龄雌性SCID小鼠植入右体侧中皮下注射的100微升PBS溶液中的300万个SCC-15细胞。将小鼠随机分成10只的2个处理组。在小鼠的平均肿瘤体积达到约233-235mm3时，在用含有20mM盐酸组氨酸、150mM NaCl和0.01%聚山梨酯80，Ph 6.0的稀释剂自储液浓度稀释后，在100微升的体积中对每个分组腹膜内施用30mg/kg huPTA-4621测试抗体或HNT缓冲液对照。然后，将抗体和对照样品每周施用1次，持续整个研究。约每7天用测径器测量肿瘤生长。在4剂抗体后完成研究。将动物的体重每周记录一次，持续整个研究。在研究结束时，依照CCAC准则对所有动物实施安乐死。
huPTA-4621降低人HNSCC的SCC-15体内建立模型中的肿瘤生长。与缓冲液处理组相比，用抗体huPTA-4621的处理将SCC-15肿瘤的生长降低44.5%（p=0.0379，t-检验），如在第23天，即研究期的最后一天测定的（图4）。
遍及整个研究没有毒性的临床体征。以每周时间间隔测量的体重是舒适和不能茁壮成长的替代（图5）。在处理期结束时，各组间的均值体重没有显著差异。从研究开始至结束，每组内的均值体重也没有显著差异。
总之，huPTA-4621是耐受良好的，并且显著降低此人HNSCC异种移植物模型中的肿瘤负荷。
实施例4
用人Detroit 562细胞的体内实验
为了表明在体内针对人HNSCC癌细胞系的功效，在Detroit 562 HNSCC异种移植物模型中测试huPTA-4621。参考图6和7，给6至8周龄雌性SCID小鼠植入右体侧中皮下注射的100微升PBS溶液中的300万个Detroit 562细胞。将小鼠随机分成10只的2个处理组。在小鼠的平均肿瘤体积达到约188-192mm3时，在用含有20mM盐酸组氨酸、150mM NaCl和0.01%聚山梨酯80，Ph 6.0的稀释剂自储液浓度稀释后，在100微升的体积中对每个分组腹膜内施用30mg/kg huPTA-4621测试抗体或缓冲液对照。然后，将抗体和对照样品每周施用1次，持续整个研究。约每7天用测径器测量肿瘤生长。在5剂抗体后完成研究。将动物的体重每周记录一次，持续整个研究。在研究结束时，依照CCAC准则对所有动物实施安乐死。
huPTA-4621降低人HNSCC的Detroit 562体内建立模型中的肿瘤生长。与缓冲液处理组相比，用抗体huPTA-4621的处理将T.Tn肿瘤的生长降低52.1%（p=0.0259，t-检验），如在第42天，即研究期的最后一天测定的（图6）。
遍及整个研究没有毒性的临床体征。以每周时间间隔测量的体重是舒适和不能茁壮成长的替代（图7）。在处理期结束时，各组间的均值体重没有显著差异。从研究开始至结束，每组内的均值体重也没有显著差异。
总之，huPTA-4621是耐受良好的，并且显著降低此人HNSCC异种移植物模型中的肿瘤负荷。
实施例5
用人CAL 27细胞的体内实验
为了表明在体内针对人HNSCC癌细胞系的功效，在CAL 27HNSCC异种移植物模型，包括植入CAL27细胞(ATCC CRL-2095)的裸鼠（NU/J,株#：002019,Jackson Laboratories）中测试huPTA-4621。将CAL 27细胞在补充有10%FBS（ATCC产品目录编号30-2020）的DMEM（ATCC，产品目录编号30-2002）中在75mm2烧瓶中于37℃在5%CO2中在空气气氛中培养，直至细胞是汇合的。使用0.25%(w/v)胰蛋白酶（Invitrogen，产品目录编号25200）自培养烧瓶分离人CAL 27细胞，计数，在PBS中溶解，并在7周龄雄性裸鼠的背部中间区域以3x106个细胞/动物的剂量与MatrigelTM（BD Biosciences，产品目录编号354248）一起在0.2ml体积（100μl在PBS中的细胞+100μlMatrigel）中皮下注射。在注射细胞后，经过一段两周的时间以容许形成肿瘤小结。用数字测径器（VWR，产品目录编号36934-152）测量肿瘤体积(mm3)，并通过椭圆公式评估：[π/6]xaxb2，其中a和b是以mm计的肿瘤的第一和第二最大正交测量。在肿瘤体积达到400-600mm3时，将动物随机化成两组(n=5)。通过每周腹膜内注射3次以3mg/kg施用单克隆抗体huPTA-4621和人IgG1(Sigma,I5154)，总共10剂。使用数字测径器每周监测肿瘤小结三次。通过依照下式计算相对肿瘤体积(RTV)就原发性肿瘤生长抑制而言测定抗肿瘤活性：RTV=TVn/TV0，其中TVn是第n天的肿瘤体积，而TV0是第0天的肿瘤体积。追踪肿瘤大小到第27天。在治疗27天后，通过以T/C%=100x (处理组的均值RTV)/(对照组的均值RTV)计算RTV测定T/C%。在抗体处理组中找到60%肿瘤生长抑制（图8），指示处理在减轻肿瘤负荷中是有效的(P<0.0002)。
这些数据清楚地表明huPTA-4621具有针对此研究中测试的CAL 27异种移植物肿瘤的显著治疗活性。
实施例6
用人CAL 27细胞的体内实验
为了比较PTA-4621抗体疗法与标准的化疗治疗的效力，使用实施例5中所描述的模型系统来比较PTA-4621疗法与用顺铂的治疗。将CAL 27细胞培养并收获，如实施例5中所描述的。通过在背部中间区域中给7周龄雄性裸鼠（NU/J,株#:002019,Jackson Laboratories）皮下注射100μl D-PBS中的5X106个CAL 27细胞及100μl Matrigel来建立CAL 27异种移植物模型。在接种后18天，对小鼠评估肿瘤形成，并且随机化成3个组（对于每个分组，n=6）：用huPTA-4621的处理、用顺铂或对照的处理（用无关对照IgG1抗体的处理）。用数字测径器（VWR，产品目录编号36934-152）测量肿瘤体积(mm3)，并通过椭圆公式评估：[π/6]xaxb2，其中a和b是以mm计的肿瘤的第一和第二最大正交测量。在随机化时，平均肿瘤体积是84mm3（范围79-94mm3）。
在随机化时，给动物i.p.施用3mg/kg剂量的测试或对照抗体，或0.75mg/kg剂量的顺铂。所有处理的施用体积是6.6ml/kg。此后，施用抗体和对照处理，对于第一和第三周每周3次，而对于第二周每周两次，产生总共8次处理。最后一次处理后一周，依照CCAC准则对动物实施安乐死；在第46天完成研究。贯穿整个研究过程，对肿瘤生长和体重每周测量三次。
通过依照下式计算相对肿瘤体积(RTV)就原发性肿瘤生长抑制而言测定抗肿瘤活性：RTV=TVn/TV0，其中TVn是第n天的肿瘤体积，而TV0是第0天的肿瘤体积。追踪肿瘤大小到第46天。在完成研究时，通过以T/C%=100x (处理组的均值RTV)/(对照组的均值RTV)计算RTV测定T/C%。在抗体处理组中找到86%肿瘤生长抑制（图9），指示处理在减轻肿瘤负荷中是有效的(p=0.024)。与对照相比，在顺铂处理组中没有观察到显著的生长抑制（图9）。因而，huPTA-4621降低人HNSCC的CAL 27体内建立模型中的肿瘤生长。
在处理期结束时，各组间的均值体重没有显著差异。自研究开始至结束，每组内的均值体重也没有显著差异（图10）。在第26天时处死对照IgG1组中的1只动物，因为它已经达到研究测定的IACUC终点。
总之，huPTA-4621是耐受良好的，并且相对于标准化疗剂（顺铂），显著降低此人HNSCC异种移植物模型中的肿瘤负荷。
Claims (13)
1.单克隆抗CD44抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗哺乳动物中的头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)的药物中的用途，
其中所述HNSCC以CD44的表达为特征，
其中所述抗CD44抗体和抗原结合片段包含氨基酸序列SEQ ID NO:3所示的VH CDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:4所示的VH CDR2、氨基酸序列SEQ ID NO:5所示的VH CDR3、氨基酸序列SEQ ID NO:6所示的VLCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:7所示的VL CDR2和氨基酸序列SEQ IDNO:8所示的VL CDR3，
且其中所述抗体和抗原结合片段与由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的抗体竞争对CD44的结合。
2.单克隆抗CD44抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗哺乳动物中的头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)的药物中的用途，
其中所述HNSCC以CD44的表达为特征，
其中所述抗CD44抗体和抗原结合片段包含氨基酸序列SEQ ID NO:3所示的VH CDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:4所示的VH CDR2、氨基酸序列SEQ ID NO:5所示的VH CDR3、氨基酸序列SEQ ID NO:6所示的VLCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:7所示的VL CDR2和氨基酸序列SEQ IDNO:8所示的VL CDR3，
且其中所述抗CD44抗体和抗原结合片段包含VH域和VL域，VH域的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的VH域至少85％相同，VL域的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO:11所示的VL域至少85％相同，
且其中所述抗体和抗原结合片段与由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的抗体竞争对CD44的结合。
3.权利要求1的用途，其中所述抗CD44抗体是由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体的嵌合型式。
4.权利要求2的用途，其中所述抗CD44抗体是由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体的嵌合型式。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述抗CD44抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的VH域。
6.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述抗CD44抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:2所示的VL域。
7.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述抗CD44抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的VH域和氨基酸序列SEQ ID NO:2所示的VL域。
8.权利要求1的用途，其中所述抗CD44抗体是由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体的人源化型式。
9.权利要求2的用途，其中所述抗CD44抗体是由以编号PTA-4621保藏于ATCC的杂交瘤生成的单克隆抗体的人源化型式。
10.权利要求1、2、8和9中任一项的用途，其中所述抗CD44抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的VH域。
11.权利要求1、2、8和9中任一项的用途，其中所述抗CD44抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:11所示的VL域。
12.权利要求1、2、8和9中任一项的用途，其中所述抗CD44抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的VH域和氨基酸序列SEQ IDNO:11所示的VL域。
13.人源化抗CD44抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗人中的头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)的药物中的用途，其中所述HNSCC以CD44的表达为特征，且其中所述人源化抗体和抗原结合片段包含氨基酸序列SEQ IDNO:9所示的VH域和氨基酸序列SEQ ID NO:11所示的VL域，或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:10所示的VH域和氨基酸序列SEQ ID NO:11所示的VL域。
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