DE19545472A1 - Verfahren zur Diagnose und Therapie von Plattenepithelkarzinomen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose und Therapie von Plattenepithelkarzi­ nomen, die auf der Expression des variablen Exons v6 des CD44-Gens beruhen, Mittel für solche Verfahren sowie deren Verwendung.

Es wurde kürzlich gezeigt, daß die Expression von Varianten des Oberflächen-Gly­ koproteins CD44 notwendig und hinreichend ist, um sogenanntes spontanes metastatisches Verhalten sowohl in einer nicht-metastasierenden Pankreas-Adenokarzinom-Zellinie der Ratte als auch in einer nicht-metastasierenden Fibrosarkom-Zellinie der Ratte auszulösen (Günthert et al., 1991). Während die kleinste CD44-Isoform, die Standardform CD44s, in einer Reihe verschiedener Gewebe, darunter Epithelzellen, ubiquitär exprimiert wird, wer­ den bestimmte Spleißvarianten von CD44 (CD44v) nur auf einer Untergruppe von Epithel­ zellen exprimiert. Die CD44-Isoformen werden durch alternatives Spleißen so erzeugt, daß die Sequenzen von 10 Exons (v1-v10) in CD44s komplett ausgeschnitten werden, jedoch bei den größeren Varianten in verschiedenen Kombinationen vorkommen können (Screaton et al., 1992; Heider et al., 1993; Hofmann et al., 1991). Die Varianten unterscheiden sich dadurch, daß an einer bestimmten Stelle des extrazellulären Teils des Proteins unterschiedliche Aminosäuresequenzen inseriert sind. Solche Varianten konnten in verschie­ denen menschlichen Tumorzellen und in menschlichem Tumorgewebe nachgewiesen wer­ den. So wurde kürzlich die Expression von CD44-Varianten im Verlauf der kolorektalen Karzinogenese untersucht (Heider et al., 1993). Die Expression von CD44-Varianten fehlt in normalem menschlichem Kolonepithel, und nur eine schwache Expression ist in den proli­ ferierenden Zellen der Krypten nachweisbar. In späteren Stadien der Tumorprogression, z. B. in Adenokarzinomen, exprimieren alle malignen Entartungen Varianten von CD44.

Weiter wurde kürzlich Expression von CD44-Spleißvarianten in aktivierten Lymphozyten sowie in Non-Hodgkin-Lymphomen gezeigt (Koopman et al., 1993).

Es sind verschiedene Ansätze bekannt geworden, die differentielle Expression varian­ ter Exons des CD44-Gens in Tumoren und Normalgeweben für diagnostische und thera­ peutische Verfahren nutzbar zu machen (WO 94/02633, WO 94/12631, WO 95/00658, WO 95/00851, EP 0531300).

Auch die Expression varianter CD44-Moleküle in Plattenepithelkarzinomen ist schon untersucht worden. Salmi et al. (1993) fanden mit dem v6-spezifischen Antikörper Var 3.1 eine Abnahme der v6-Expression in Tumorzellen im Vergleich zu Normalzellen. Brooks et al. (1995) erhielten mit dem v6-speziflschen Antikörper 11.9 eine heterogene Anfärbung nasopharyngealer Karzinome. Lediglich in 2/12 Fällen wurde eine starke Anfärbung erzielt, während in der Mehrzahl der Fälle nur eine schwache fokale v6-Expression immunhistolo­ gisch nachgewiesen werden konnte.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung von neuen Verfahren zur Diagnose und Therapie von Plattenepithelkarzinomen sowie die Bereitstellung von Mitteln für solche Verfahren.

Diese Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Sie betrifft Ver­ fahren zur Diagnose und Therapie von Plattenepithelkarzinomen, die auf der Expression des varianten Exons v6 des CD44-Gens als molekularem Marker beruhen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, die auf der starken und homogenen Expression von v6 in Plattenepithelkarzinomen beruhen, im Gegensatz zu einer sehr heterogenen Expression in Adenokarzinomen (z. B. Kolon, Mamma).

Bevorzugt sind dabei Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß dabei ein Anti­ körpermolekül verwendet wird, das die Aminosäuresequenz QWFGNRWHEGYRQT er­ kennt. Besonders bevorzugt ist dabei der monoklonale Antikörper BIWA-1 (Klon VFF-18), der von einer Hybridom-Zellinie sezerniert wird, die am 7.6. 1994 unter der Hinterle­ gungsnummer DSM ACC2174 bei der DSM-Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt wurde, oder Derivate dieses Antikörpers.

Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind die Verwendung solcher Antikör­ permoleküle bei den erfindungsgemäßen Verfahren sowie Mittel, um diese Verfahren auszu­ führen.

Die erfindungsgemäßen Verfahren können an Proben außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers, z. B. zur Diagnose, oder aber in vivo vorgenommen werden.

Vorteilhaft können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Proben von Patienten un­ tersucht werden, bei denen der Verdacht auf Plattenepithelkarzinom besteht oder die Dia­ gnose bereits vorliegt, der Tumor aber genauer charakterisiert werden soll.

Der Nachweis varianter CD44-Moleküle, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die vom variablen Exon v6 kodiert wird, kann auf Proteinebene mittels Antikörpern oder auf Nukleinsäureebene mittels spezifischer Nukleinsäuresonden oder Primern für die Polymera­ se-Kettenreaktion (PCR) erfolgen. Die Erfindung betrifft demzufolge auch Antikörpermo­ leküle und Nukleinsäuren, die als Sonden bzw. Primer für solche Verfahren geeignet sind, und die Verwendung solcher Antikörper und Nukleinsäuren zur Diagnose und Analyse von Plattenepithelkarzinomen.

Zur in-vivo-Diagnostik können die CD44v6-spezifischen Antikörpermoleküle bei­ spielsweise mit einem detektierbaren Marker, z. B. einem Radioisotop, verknüpft und in das Gefäßsystem eines Patienten injiziert werden. Nach der selektiven Bindung der Antikörper an den Tumor kann dieser mit einem geeigneten Detektionssystem visualisiert werden. Pro­ tokolle für solche immundiagnostischen Verfahren in vivo sind Stand der Technik (Thomas et al., 1989).

Antikörpermoleküle mit der erfindungsgemäßen Spezifität können vorteilhaft zur Therapie von Plattenepithelkarzinomen verwendet werden. Eine therapeutische Anwendung kann beispielsweise analog zu der Verwendung des Antikörpers 1.1 ASML (Seiter et al., 1993) erfolgen. Dabei kann die Applikation systemisch oder topisch erfolgen, beispielsweise durch intravenöse (als Bolus oder Dauerinfusion), intraperitoneale, intramuskuläre, subku­ tane o.a. Injektion/Infusion. Es können auch einzelne Organe oder Glieder perfundiert werden. Protokolle für die Verabreichung von konjugierten oder nichtkonjugerten Anti­ körpern (sei es als komplette Immunglobuline, Fragmente, rekombinante chimäre Moleküle o. ä.) sind Stand der Technik (Mulshine et al., 1991; Larson et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992; Press et al., 1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982).

Die Nuklein- und Aminosäuresequenz des varianten Exons v6 des CD44-Gens ist be­ kannt (Hofmann et al., 1991, Screaton et al., 1992, Tölg et al., 1993). Die Existenz dege­ nerierter oder alleler Varianten ist für die Ausführung der Erfindung nicht von Bedeutung; solche Varianten sind daher ausdrücklich mit eingeschlossen.

Die Sequenz von Exon v6 des menschlichen CD44-Gens ist:

Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die für ein Epitop spezifisch sind, das vom Exon v6 kodiert wird. Für das erfindungsgemäße Verfahren können jedoch auch andere Antikörpermoleküle verwendet werden, z. B. Fab- oder F(ab′)₂-Fragmente von Im­ munglobulinen) rekombinant hergestellte single-chain-Antikörper (scFv), chimäre bzw. humanisierte Antikörper sowie andere Moleküle, die spezifisch an Epitope binden, die durch Exon v6 kodiert werden, insbesondere Epitope innerhalb der Aminosäuresequenz QWFGNRWHEGYRQT. Die Herstellung von Antikörpern gegen bekannte Aminosäure­ sequenzen kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen (Catty, 1989). Beispielsweise kann ein Peptid dieser Sequenz synthetisch hergestellt und als Antigen in einem Immuni­ sierungsprotokoll eingesetzt werden. Ein anderer Weg ist die Herstellung eines Fusions­ proteins, das die gewünschte Aminosäuresequenz enthält, indem eine Nukleinsäure (die synthetisch oder z. B. durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus einer geeigneten Probe hergestellt werden kann), die für diese Sequenz kodiert, in einen Expressionsvektor inte­ griert und das Fusionsprotein in einem Wirtsorganismus exprimiert wird. Das gegebenen­ falls gereinigte Fusionsprotein kann dann als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt und Insert-spezifische Antikörper oder, im Falle monoklonaler Antikörper, Hy­ bridome, die insertspezifische Antikörper exprimieren, mit geeigneten Verfahren selektiert werden. Solche Verfahren sind Stand der Technik. Heider et al. (1993) und Koopman et al. (1993) beschreiben die Herstellung von Antikörpern gegen variante Epitope von CD44.

Außer dem bevorzugten Antikörper BIWA-1 (VFF-18) können gleichermaßen Deri­ vate dieses oder anderer Antikörper verwendet werden. Beispielsweise kann der Fachmann, ausgehend von einer Sequenzanalyse des Antikörpers BIWA-1 (VFF-18) und/oder unter Verwendung der Hybridom-Zellinie, die diesen Antikörper produziert, rekombinante Antikörpermoleküle mit dem gleichen Idiotyp erzeugen, d. h. Antikörpermoleküle, die im Bereich der Antigen-Bindungsstelle (complementarity-determining regions, CDR) die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen wie der Antikörper BIWA-1 (VFF-18). Solche De­ rivate und rekombinanten Antikörpermoleküle sind daher ausdrücklich in die Erfindung eingeschlossen.

Aus dem kompletten Immunglobulin des Antikörpers BIWA-1 (VFF-18) oder anderer Antikörper können beispielsweise Fab- oder F(ab′)₂-Fragmente oder andere Fragmente erzeugt werden (Kreitman et al., 1993). Für diagnostische Verfahren können BIWA-1-Anti­ körpermoleküle, Fragmente davon oder rekombinante Antikörpermoleküle mit dem glei­ chen Idiotyp beispielsweise mit radioaktiven Isotopen wie ¹³¹I, ¹¹¹In, ^99mTc oder radio­ aktiven Verbindungen (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), Enzy­ men wie Peroxidase oder alkalischer Phosphatase (Catty et Raykundalia, 1989), mit Fluo­ reszenzfarbstoffen (Johnson, 1989) oder Biotinmolekülen (Guesdon et al., 1979) verknüpft werden. Für therapeutische Anwendungen können BIWA-1 (VFF-18) oder VFF-18- abgeleitete Antikörpermoleküle mit Toxinen (Vitetta et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), Zytostatika (Schrappe et al., 1992), Prodrugs (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989) oder radioaktiven Substanzen verknüpft werden.

Der Antikörper kann ferner mit einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft sein, z. B. mit Tumornekrosefaktor oder Interleukin-2.

Der Fachmann ist weiterhin in der Lage, nach Analyse der Aminosäuresequenz des Antikörpers BIWA-1 (VFF-18) und/oder unter Verwendung der Hybridom-Zellinie, die diesen Antikörper produziert, insbesondere der darin enthaltenen genetischen Information, rekombinante Antikörpermoleküle mit dem gleichen Idiotyp wie BIWA-1 (VFF-18) herzu­ stellen. Entsprechende Verfahren sind Stand der Technik. Solche rekombinanten Antikör­ permoleküle können z. B. humanisierte Antikörper (Shin et al., 1989; Güssow et Seemann, 1991), bispezifische Antikörper (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989), single-chain-Anti­ körper (scFv, Johnson et Bird, 1991), komplette oder fragmentarische Immunglobuline (Coloma et al., 1992; Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992), oder durch chain shuffling erzeugte Antikörper (Winter et al., 1994) sein. Humanisierte Antikörper können beispiels­ weise durch CDR-grafting (EP 0239400) hergestellt werden. Auch Framework-Regionen können modifiziert werden (EP 0519596). Zur Humanisierung von Antikörpern können heute Methoden wie PCR (s. z. B. EP 0368684; EP 0438310; WO 9207075) oder Compu­ ter-modelling (s. z. B. WO 9222653) angewendet werden. Es können auch Fusionsproteine, beispielsweise single-chain-Antikörper/Toxin-Fusionsproteine (Chaudhary et al., 1990; Friedman et al., 1993) hergestellt werden. Die Verwendung solcher Antikörpermoleküle ist daher ebenfalls in der Erfindung mit eingeschlossen.

Es liegt ebenfalls im Bereich des Könnens des Durchschnittsfachmanns, das exakte Epitop von BIWA-1 (VFF-18) zu ermitteln und mit dessen Kenntnis äquivalente Antikörper mit der gleichen Bindungsspezifität herzustellen. Dies kann beispielsweise durch Peptidbin­ dungsstudien wie in Beispiel 2 geschehen, etwa durch Variation des Peptids Hu1. Solche Antikörper sind daher ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen.

Die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose und/oder Analyse von Plattenepithelkarzinomen kann zweckmäßig durch Untersuchungen von aus dem Kör­ per entnommenen Proben, beispielsweise aus Biopsien, erfolgen. Vorteilhaft können dabei die erfindungsgemäßen Mittel verwendet werden.

Beispielsweise können Gewebsschnitte immunhistochemisch mit Antikörpern mit an sich bekannten Methoden untersucht werden. Aus Gewebeproben gewonnene Extrakte oder Körperflüssigkeiten können ferner mit anderen immunologischen Methoden unter Verwendung von Antikörpern untersucht werden, beispielsweise in Western Blots, Enzyme­ linked Immunosorbent Assays (ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), Radioimmunoassays (RIA, Catty et Murphy, 1989) oder verwandten Immunoassays.

Die Untersuchungen können qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ erfolgen.

Durch Nachweis und/oder Quantifizierung der Expression des varianten CD44-Epi­ tops v6 erhobene Daten können so in die Diagnose und Prognose einfließen. Vorteilhaft kann dabei die Kombination mit anderen prognostischen Parametern sein, etwa mit dem Tumorgrad.

Neben der in-vifro-Diagnostik eignen sich Antikörpermoleküle mit erfindungsgemä­ ßer Spezifität auch zur in-vivo-Diagnostik von Plattenepithelkarzinomen. Trägt das Anti­ körpermolekül ein detektierbares Label, kann eine Detektion des Labels zu diagnostischen Zwecken, z. B. Visualisierung des Tumors in vivo (Imaging), oder beispielsweise zur radio­ unterstützten Chirurgie (radioguided surgery) erfolgen. Für die Verwendung von mit radio­ aktiven Isotopen konjugierten Antikörpern zur Immunszintigraphie (Imaging) beispielsweise gibt es eine Reihe von Protokollen, auf deren Grundlage der Fachmann die Erfindung aus­ führen kann (Siccardi ei al., 1989; Keenan et al., 1987; Perkins et Pimm, 1992; Colcher et al., 1987; Thompson et al., 1984).

Abbildungen

Fig. 1: Bestimmung der Epitop-Spezifität von BIWA-1 durch Bindung an sytheti­ sche Peptide, die aus der humanen CD44v6-Sequenz abgeleitet wurden. Das korrespondie­ rende Peptid von Ratten-CD44v6 wurde mit dem Antikörper 1.1 ASML getestet. Die Bin­ dung wurde in einem ELISA bestimmt, wobei die Peptide auf Mikrotiterplatten immobili­ siert wurden. -: keine Bindung, ±: schwache Bindung, +: starke Bindung.

Fig. 2: Immunhistochemische Analyse eines Plattenepithelkarzinoms des Larynx (a) und einer Lebermetastase eines Karzinoms des Oesophagus (b) mit dem CD44v6-spezifi­ schen monoklonalen Antikörper BIWA-1. In beiden Fällen kann die Reaktivität des Anti­ körpers mit der Membran der Tumorzellen gesehen werden. Originalvergrößerung 40x, Ge­ genfärbung Hämatoxylin.

Beispiele Beispiel 1 Expression von CD44v6 in Plattenepithelkarzinomen Gewebe

Insgesamt 126 Fälle Paraffin eingebetteter Tumorproben wurden immunhistochemisch mit dem mAb BIWA-1 (Klon VFF-18) auf Expression von CD44v6 analysiert. Die Proben schlossen 31 Fälle primärer Plattenepithelkarzinome (15 Fälle Larynx, 16 Fälle Haut), 91 Fälle von Lymphknotenmetastasen (Larynx, n=38; Lunge, n=27; Oesophagus, n=1 1; Mund­ höhle, n=11; Tonsille, n=4), und 4 Fälle von Lebermetastasen (Oesophagus) ein.

Antikörper

Die gesamte variante Region des HPKII-Typs von CD44v (Hofmann et al., 1991) wurde aus menschlicher Keratinozyten-cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die beiden PCR-Primer 5′-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3′, Positionen 25-52, und 5′-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3′, Positionen 1013-984 der LCLC97-varianten Region, wie von Hofmann et al. beschrieben, enthielten eine EcoRI-Erkennungsstelle, die benutzt wurde, um das PCR-Produkt direkt in den Vektor pGEX-2T (Smith et al., 1988) zu klonieren. Das resultierende Konstrukt (pGEX CD44v HPKII, v3-v10) kodiert für ein Fusionsprotein von ∼70 kD, bestehend aus Glutathion-S-transferase von Schistosoma japonicum und den Exons v3-v10 von humanem CD44 (Fig. 1; Heider et al, 1993). Das Fusionsprotein wurde in E. coli exprimiert und anschließend über Glutathion-Agarose affinitätsgereinigt (Smith et al., 1988).

Weibliche Balb/c Mäuse wurden intraperitoneal mit dem affinitätsgereinigten Fusi­ onsprotein nach folgendem Schema immunisiert:

• 1. Immunisierung: 90 µg Fusionsprotein in komplettem Freund′schen Adjuvans
• 2. und 3. Immunisierung: 50 µg Fusionsprotein in inkomplettem Freund′schen Adjuvans.

Die Immunisierungen erfolgten im Abstand von jeweils 4 Wochen. 14 Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere noch an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit je­ weils 10 µg Fusionsprotein in PBS immunisiert. Am darauffolgenden Tag wurden Milzzel­ len eines Tieres mit hohem Antikörpertiter mit P3.X63-Ag8.653-Mausmyelomzellen mit Hilfe von Polyethylenglykol 4000 fusioniert. Die Hybridomzellen wurden dann in Mikroti­ terplatten in HAT-Medium selektioniert (Köhler et Milstein, 1975; Kearney et al., 1979).

Die Bestimmung des Antikörpertiters im Serum bzw. das Screening der Hybridom­ überstände wurde mit Hilfe eines ELISAs durchgeführt. Bei diesem Test wurden zunächst Mikrotiterplatten mit Fusionsprotein (GST-CD44v3-10) oder nur mit Glutathion-S-Transfe­ rase beschichtet. Anschließend wurde mit seriellen Verdünnungen von Serumproben bzw. Hybridomüberständen inkubiert und die spezifischen Antikörper mit Peroxidase-konjugier­ ten Antikörpern gegen Maus-Immunglobulin nachgewiesen. Hybridome, die nur mit Glutathion-S-transferase reagierten, wurden verworfen. Die verbleibenden Antikörper wur­ den zunächst in einem ELISA mit domänenspezifischen Fusionsproteinen (Exon v3, Exon v5 + v6, Exon v6 + v7, Exon v8-v10) charakterisiert (Koopman et al., 1993). Ihre im­ munhistochemische Reaktivität wurde an menschlichen Hautschnitten getestet. BIWA-1 (VFF-18) band nur an Fusionsproteine, die eine Domäne enthielten die durch das Exon v6 kodiert wurde. Um das das Epitop des Antikörpers weiter einzugrenzen, wur­ den verschiedene synthetische Peptide, die Teile der v6-Domäne repräsentierten, in ELISA-Bindungsassays benutzt (Fig. 1). Das 14 Aminosäure-Peptid v6D zeigte die stärkste Bin­ dung. Folglich liegt das Epitop von BIWA-1 ganz oder teilweise innerhalb der Sequenz QWFGNRWHEGYRQT der Domäne, die von Exon v6 kodiert wird. Diese Sequenz ist homolog zum Bindungsepitop des Antikörpers 1.1 ASML, der in einem therapeutischen Rattenmodell verwendet wurde, und der für Ratten-CD44v6 spezifisch ist (Fig. 1).

Immunhistochemie

Vor der Inkubation mit dem Primärantikörper wurden Paraffinschnitte (4 µm) in Ro­ tihistol (Roth, Deutschland) 3 mal für jeweils 10 Minuten deparaffiniert und dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe rehydriert. Die Schnitte wurden kurz mit A. dest. gewaschen und danach in einem Mikrowellenofen (Sharp Model R-6270) 3 mal für jeweils 10 Minuten bei 600 Watt in 0.01 M Na-Citrat-Puffer gekocht. Nach jeder Mikrowellen-Inkubation wur­ den die Schnitte 20 Minuten lang abgekühlt. Nach dem letzten Kühlschritt wurden die Trä­ ger in PBS gewaschen und mit normalem Ziegenserum (10% in PBS) präinkubiert. Nach 3 Waschungen in PBS wurden die Schnitte mit Primärantikörper (BIWA-1 : 5 µg/ml; Maus- IgG (Isotyp-entsprechende Negativkontrolle) 5 µg/ml in PBS/1% BSA) für 1 Stunde inku­ biert. Als Positivkontrolle für die Färbungsreaktion wurden normale menschliche Haut­ schnitte benutzt, da Keratinozyten eine CD44-Isoform exprimieren, die v3-v10 enthält. En­ dogene Peroxidasen wurden mit 0.3% H₂O₂ in PBS blockiert, und die Schnitte wurden mit dem biotinylierten Sekundärantikörper (Anti-Maus IgG-F(ab′)₂, DAKO Corp.) für 30 Minu­ ten inkubiert. Zur Farbentwicklung wurden die Schnitte für 30 Minuten mit Meerrettich-Peroxidase, die an Biotin als Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex gekoppelt war (DAKO Corp.), inkubiert. Die Schnitte wurden dann in 3,3-Amino-9-ethyl-carbazol-Substrat (Sigma Immunochemicals) für 5-10 Minuten inkubiert, die Reaktion wurde mit H₂O gestoppt und die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Auswertung der Färbungen wurden mit einem Zeiss-Axioskop-Lichtmikroskop durchgeführt, und die Fär­ bungsintensitäten wurden wie folgt quantifiziert: +++, starke Expression; ++, moderate Ex­ pression; +, schwache Expression; -, uneindeutige oder keine Expression detektierbar. Nur Tumorzellen mit einer klaren Membranfärbung wurden als positiv bewertet. Der Prozent­ satz positiver Tumorzellen in jedem Schnitt wurde grob abgeschätzt und zwei Gruppen wurden gebildet: fokal positive Tumoren (weniger als 10% der Tumorzellen reagierten mit dem Antikörper) und positive Tumoren (10 oder mehr % der Tumorzellen positiv). Wenn weniger als 80% der Tumorzellen in den positiven Zellen mit dem Antikörper reagierten, wurde die entsprechende Prozentzahl angezeigt.

126 Fälle von Plattenepithelkarzinomen verschiedener Herkunft wurden mit dem CD44v6-spezfischen monoklonalen Antikörper BIWA-1 analysiert. Expression CD44v6 enthaltender Isoformen wurde in allen außer einer Tumorprobe beobachtet. Der Großteil der Proben zeigte eine Expression des Antigens auf 80-100% der Tumorzellen, die Färbung war auf die Membran der Tumorzellen beschränkt. Mit Stromagewebe, Lymphozyten, Muskelzellen oder Endothel wurde keine Reaktion beobachtet.

Um die Expression von CD44v6-Molekülen auf diesen Tumorzellen zu quantifizieren, wurden Schnitte von normaler menschlicher Haut parallel zu den Tumorschnitten gefärbt.

Normale Hautkeratinozyten exprimieren hohe Spiegel von CD44-Isoformen und zählen zu den am stärksten CD44v6 exprimierenden normalen Zellen, die bis heute beschrieben wur­ den. Deshalb wurde die Keratinozytenfärbung als Referenz genommen und als "stark" (+++) in unserem Bewertungssystem klassifiziert. In der Mehrzahl der untersuchten Tumorproben war die Färbung der Tumorzellen vergleichbar oder sogar stärker als die Färbung der Haut­ kertinozyten, nur wenige Fälle zeigten schwache (3 Fälle von Lymphknotenmetastasen) oder moderate (2 Primärkarzinome, 10 Metastasen) Tumorfärbung. Die Färbungsreaktion war innerhalb eines gegebenen Tumorschnittes sehr homogen, wobei die meisten Tumorzel­ len des Schnittes die gleiche Färbungsintensität aufwiesen. Zwischen Primärtumoren und Metastasen wurden keine signifikanten Differenzen im CD44v6-Expressionsmuster beob­ achtet. Eine detaillierte Zusammenfassung der Ergebnisse zeigt Tabelle 1, Beispiele sind in Fig. 2 gezeigt.

Tabelle 1

Expression von CD44v6 in Plattenepithelkarzinomen

80-100% der Tumorzellen reagierten positiv mit BIWA-1. In Fällen, in denen weniger Tu­ morzellen mit dem Antikörper reagierten, ist die entsprechende Prozentzahl angezeigt.

Beispiel 2 Expression von CD44v6 in Nierenzellkarzinomen, Prostatakarzinomen und Lebermetastasen von Kolonkarzinomen Gewebe

Analysiert wurden 19 Fälle von Nierenzellkarzinomen (12 Fälle klarzellig, 5 Fälle chromophil, 1 Fall chromophob, 1 Onkozytom), 16 primäre Adenokarzinome der Prostata und 19 Fälle von Lymphknotenmetastasen von Prostatakarzinomen, sowie 30 Fälle von Lebermetastasen von Kolonkarzinomen.

Antikörper

BIWA-1 (siehe Beispiel 1).

Immunhistochemie

Ausführung siehe Beispiel 1.

Im Gegensatz zu den Plattenepithelkarzinomen konnte in der Mehrzahl der untersuch­ ten Nierenzell- und Prostatakarzinome keine oder nur eine fokale Expression von CD44v6-Isoformen nachgewiesen werden. Im Falle einer mehr als fokalen Expression bei den Pro­ statakarzinomen war die Färbung vorwiegend diffus zytoplasmatisch und schwach bzw. heterogen im Vergleich zur Färbung von normalem Prostataepithel. In 50% der untersuch­ ten Lebermetastasen von Kolonkarzinomen wurde eine mehr als fokale Expression von CD44v6 Isoformen nachgewiesen. Die Färbung in der Mehrheit der Fälle war schwach bis mittelmäßig, wobei meist weniger als 100% der Tumorzellen einer Probe eine Anfärbung mit BIWA-1 zeigte. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

Expression CD44v6 in Prostata-Adenokarzinomen, Nierenzellkarzinomen, und Lebermetastasen von kolorektalen Karzinomen

Literatur

Barbas C F, Björling E, Chiodi F, Dunlop N, Cababa D, Jones T M, Zebedee S L, Persson M A A, Nara P L, Norrby E, Burton D R. Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vifro. Proc. Natl. Acad Sci. USA. 89: 9339-9343 (1992).

Breitz H B, Weiden P L, Vanderheyden J-L, Appelbaum J W, Bjorn M J, Fer M F, Wolf S B, Ratcliff B A, Seiler C A, Foisie D C, Fisher D R, Schroff R W, Fritzberg A R, Abrams P G. Clinical experience with rhenium-186-labeled monoclonal antibodies for radioim­ munotherapy: results of phase I trials. J Nucl. MeJ 33: 1099-1112 (1992).

Brooks, L., Niedobitek, G., Agathanggelou, A., Farrell, P.J. The expression of variant CD44 in nasopharyngeal carcinoma is unrelated to expression of LMP-1. Am. J Pathol. 146(5): 1102-12 (1995).

Catty, D (Hrsg). Antibodies Vols. I und II. IRL Press Oxford (1989).

Catty, D., Raykundalia, C. ELISA and related immunoassays. In: Catty, D (Hrsg). Antibo­ dies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 97-152, s. S. 105-109.

Catty, D., Murphy, G. Immunoassays using radiolabels. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 77-96.

Chatal J-F, Saccavini J-C, Gestin J-F, Th´drez P, Curtet C, Kremer M, Guerreau D, Nolib´ D, Fumoleau P, Guillard Y. Biodistribution of indium-111-labeled OC 125 monoclonal an­ tibody intraperitoneally injected into patients operated on for ovarian carcinomas. Cancer Res. 49: 3087-3094 (1989).

Chaudhary V K, Batra J K, Galdo M G, Willingham M C, Fitzgerald D J, Pastan I. A rapid method of cloning functional variable-region antibody genes in Escherichia coli as single­ chain immunotoxins. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 87: 1066 (1990).

Colcher D, Esteban J, Carrasquillo J A, Sugarbaker P, Reynolds J C, Bryant G, Larson S M, Schlom J. Complementation of intracavitary and intravenous administration of a mono­ clonal antibody (B72.3) in patients with carcinoma. Cancer Res. 47: 4218-4224 (1987).

Coloma M J, Hastings A, Wims L A, Morrison S L. Novel vectors for the expression of an­ tibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction. J Im­ munol. Methods 152: 89-104 (1992).

Friedmann P N, McAndrew S J, Gawlak S L, Chace D, Trail P A, Brown J P, Siegall C B. BR96 sFv-PE40, a potent single-chain immunotoxin that selectively kills carcinoma cells. CancerRes. 53: 334-339 (1993).

Goodwin D A. A new appoach to the problem of targeting specific monoclonal antibodies to human tumors using anti-hapten chimeric antibodies. J Nucl. Med Biol. 16: 645 (1989).

Günthert, U., Hofinann, M., Rudy, W., Reber, S., Zöller, M., Haußmann, I., Matzku, S., Wenzel, A., Ponta, H., and Herrlich, P. A new variant of glycoprotein CD44 confers meta­ static potential to rat carcinoma cells. Cell 65: 13-24 (1991).

Guesdon, J. I., Ternynck, T., Avrameas, S. J Histochem. Cytochem. 27: 1131(1979).

Güssow D, Seemann G. Humanization of monoclonal antibodies. Methods′ Enzymol. 203: 99-121 (1991).

Heider, K.-H., Hofmann, M., Horst, E., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., and Pals, S.T.A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. J CellBiol. 120: 227-233 (1993).

Hofmann, M., Rudy, W., Zöller, M., Tölg, C., Ponta, H., Herrlich P., and Günthert, U. CD44 splice variants confer metastatic behavior in rats: homologous sequences are expres­ sed in human tumor cell lines. Cancer Res. 51: 5292-5297 (1991).

Johnson, G. D. Immunofluorescence. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 179-200, s. S. 180-189.

Johnson S, Bird R E. Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli. Methods Enzymol. 203: 88-98 (1991).

Kearney, J.F., Radbruch A., Liesegang B., Rajewskl K. A new mouse myeloma cell line that has lost imunoglobulin expression but permits construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123: 1548 (1979).

Keenan A M, Weinstein J N, Carrasquillo J A, Bunn P A, Reynolds J C, Foon K A et al. Immunolymphoscintigraphy and the dose dependence of ¹¹¹In-labeled T101 monoclonal an­ tibody in patients with cutaneous T-cell lymphoma. Cancer Res. 47: 6093-6099 (1987).

Köhler, G., Milstein, C. Continous culture of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Nature 265: 495 (1975).

Koopman, G., Heider, K.-H., Horts, E., Adolf, G. R., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., Pals, S. T. Activated human lymphocytes and aggressive Non-Hodgkin′s lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J Exp. Med 177: 897-904 (1993).

Kreitman R J Hansen H J, Jones A L, FitzGerald D J P, Goldenberg D M, Pastan I. Pseu­ domonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibody LL2 or LL2-Fab′ induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice. Cancer Res. 53: 819-825 (1993).

Larson S M, Cheung N-K V, Leibel S A. Radioisotope Conjugates. In: DeVita V T, Hell­ man S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Phila­ delphia, 496-511 (1991).

Mulshine J L, Magnani J L, Linnoila R I: Applications of monoclonal antibodies in the treatment of solid tumors. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 563-588 (1991).

Nesbit M, Fu Z F, McDonald-Smith J, Steplewskl Z, Curtis P J. Production of a functional monoclonal antibody recognizing human colorectal carcinoma cells from a baculovirus ex­ pression system. J: Immunol. Methods 151: 201-208 (1992).

Perkins A C, Pimm M V. A role for gamma scintigraphy in cancer immunology and immun­ otherapy. Eur. J Nucl. Med 19: 1054-1063 (1992).

Press O W, Eary J F, Badger C C, Martin P J, Appelbaum F R, Levy R, Miller R, Brown S, Nelp W B, Krohn K A, Fisher D, DeSantes K, Porter B, Kidd P, Thomas E D, Bernstein I D. Treatment of refractory Non-Hodgkin′s lymphoma with radiolabeled MB-1 (anti-CD37) antibody. J Clin. Oncol. 7: 1027-1038 (1989).

Salmi, M., Grön-Virta, K., Sointu, P., Grenman, R., Kalimo, H., Jalkanen S. Regulated ex­ pression of exon v6 containing isoforms of CD44 in man: Downregulation during malignant transformation of tumors of squamocellular origin. J CellBiol. 122: 431-442 (1993).

Sambrook, J., Fritsch E.E., Maniatis I., Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).

Schrappe M, Bumol T F, Apelgren L D, Briggs S L, Koppel G A, Markowitz D D, Mueller B M, Reisfeld R A. Long-term growth suppression of human glioma xenografts by chemo­ immunoconjugates of 4-desacetylvinblastine-3-carboxyhydrazide and monoclonal antibody 9.2.27. CancerRes. 52: 3838-3844 (1992).

Screaton, G.R., Bell, M.V., Jackson, D.G., Cornelis, F.B., Gerth, U., and Beil, J. I. Geno­ mic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 89: 12160-12164 (1992).

Sears H F, Mattis J, Herlyn D, Häyry P, Atkinson B, Ernst C, Steplewski Z, Koprowski H. Phase-I clinical trial of monoclonal antibody in treatment of gastrointestinal tumours. Lancet 1982 (1): 762-765 (1982).

Seiter, S., Arch, R., Reber, S., Komitowskl, D., Hofinann, M., Ponta, H:, Herrlich, P., Matzku, S., Zöller, M. Prevention of tumor metastasis formation by anti-variant CD44. J Exp. Med 177: 443-455 (1993).

Senter P D, Schreiber G J, Hirschberg D L, Ashe S A, Hellström K E, Hellström I. En­ hancement of the in vifro and in vivo antitumor activities of phosphorylated mitomycin C and etoposide derivatives by monoclonal antibody-alkaline phosphatase conjugates. Cancer Res. 49: 5789-5792 (1989).

Shin 5-U, Morrison S L. Production and properties of chimeric antibody molecules. Me­ thodsEnzymol. 178: 459-476 (1989).

Siccardi A G, Buraggi G L, Callegaro L, Colella A C, DeFilippi P G et at Immunoscinti­ graphy of adenocarcinomas by means of radiolabeled F(ab′)₂ fragments of an anti-carcino­ embryonic antigen monoclonal antibody: a multicenter study. Cancer Res. 49: 3095-3103 (1989).

Smith, D.B., Johnson, K.S. Single-step purification of polypetides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67: 31 (1988).

Srivastava S C (Hrsg). Radiolabeled monoclonal antibodies for imaging and therapy. Life Sciences Series A 152, Plenum New York (1988).

Tölg, C., Hoflnann, M., Herrlich, P., and Ponta, H. Splicing choice ftom ten variant exons establishes CD44 variability. Nucleic Acids. Res. 21: 1225-1229 (1993).

Theuer C P, Kreitman R J, FitzGerald D J, Pastan I. Immunotoxins made with a recombi­ nant form of pseudomonas exotoxin A that do not require proteolysis for activity. Cancer Res. 53: 340-347 (1993).

Thomas, G. D., Dykes, P. W., Bradwell, A. R. Antibodies for tumour immunodetection and methods for antibody radiolabeling. In: Catty, D. (Hrsg.). Antibodies Vol. II. IRL Press Ox­ ford, 223-244 (1989).

Thompson C H, Stacker S A, Salehi N, Lichtenstein M, Leyden M J, Andrews J T. Immu­ noscintigraphy for detection of lymph node metastases from breast cancer. Lancet 1984 (2): 1245-1247 (1984).

Vitetta E S, Thorpe P E. Immunotoxins. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 482-495 (1991)
Vitetta E S, Stone M, Amlot P, Fay J, May R, Till M, Newman J, Clark P, Collins R, Cun­ ningham D, Ghetie V, Uhr J W, Thorpe P E. Phase I immunotoxin trial in patients with B- cell lymphoma. Cancer Res. 51: 4052-4058 (1991).

Wang S-M, Chern J-W, Yeh M-Y, Ng J C, Tung E, Roffler S R. Specific activation of glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzyme conjugates for cancer therapy. Cancer Res. 52: 4484-4491 (1992).

Weiner L M, O′Dwyer J, Kitson J, Comis R L, Frankel A E, Bauer R J, Kopnrad M S, Groves E S. Phase 1 evaluation of an anti-breast carcinoma monoclonal antibody 260F9-re­ combinant ricin A chain immunoconjugate. Cancer Res. 49: 4062-4067 (1989).

Winter, G., Griffith, A. D., Hawkins, R. E., Hoogenboom, H. R. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994).

Claims (15)

1. Verfahren zur Diagnose von Plattenepithelkarzinomen, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren auf dem Nachweis der Expression des variablen Exons v6 des Gens CD44 beruht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es auf dem immunolo­ gischen Nachweis eines Epitops, das von dem variablen Exon v6 des Gens CD44 kodiert wird, beruht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß dabei ein Antikörpermo­ lekül verwendet wird, das die Aminosäuresequenz QWFGNRWHEGYRQT erkennt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß dabei der monoklonale Antikörper BIWA-1 (VFF-18), der von der Hybridomzellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2174 gebildet wird, oder ein Derivat dieses Antikörpers verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül ein monoklonaler Antikörper, ein Fab- oder F(ab′)₂-Fragment eines Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter Antikörper, ein rekombinant hergestellter single-chain-Antikörper (scFv) oder ein chimärer bzw. humanisierter Antikörper ist.

6. Verwendung eines Antikörpermoleküls, das für ein Epitop spezifisch ist, das von dem varianten Exon v6 des CD44-Gens kodiert wird, in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermole­ kül an die Aminosäuresequenz QWFGNRWHEGYRQT bindet.

8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikör­ permolekül der monoklonale Antikörper BIWA-1 (VFF-18), der von der Hybridomazellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2174 gebildet wird, oder ein Derivat dieses Anti­ körpers ist.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül ein monoklonaler Antikörper, ein Fab- oder F(ab′)₂-Fragment eines Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter Antikörper, ein rekombinant hergestellter single-chain-Antikörper (scFv) oder ein chimärer bzw. humanisierter Antikörper ist.

10. Verwendung eines Antikörpermoleküls, das für ein Epitop innerhalb der Amino­ säuresequenz spezifisch ist, die durch das variable Exon v6 des CD44-Gens kodiert wird, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Diagnose und/oder Therapie von Plattenepithelkarzinomen.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermo­ lekül an die Aminosäuresequenz QWFGNRWHEGYRQT bindet.

12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Anti­ körpermolekül der monoklonale Antikörper BIWA-1 (VFF-18), der von der Hybridomzel­ linie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2174 gebildet wird, oder ein Derivat dieses Antikörpers ist.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül ein monoklonaler Antikörper, ein Fab- oder F(ab′)₂-Fragment eines Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter Antikörper, ein rekombinant hergestellter single-chain-Antikörper (scFv) oder ein chimärer bzw. humanisierter Antikörper ist.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül mit einem radioaktiven Isotop, einer radioaktiven Verbindung, einem Enzym, einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Biotinmolekül, einem Toxin, einem Zytostatikum, einem Prodrug, einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft ist.

15. Mittel zur Ausführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da­ durch gekennzeichnet, daß es ein Antikörper oder Antikörpermolekül ist, das für ein Epitop spezifisch ist, das durch das Exon v6 des CD44-Gens kodiert wird.