CZ174198A3 - Molekuly protilátek a způsob diagnózy - Google Patents

Description

- 1 - ........ΑΨιή-^g • ··· · · · * » t« Λ · Φ * * · · * ·♦ · * • · · ··· · * · φφφ ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ·* *·

Molekuly protilátek a způsob diagnózy Oblast techniky

Vynález se týká molekul protilátek a způsobu diagnózy karcinomů,vycházejících z epitelu. Diagnostické postupy jsou založeny na expresi variabilního exonu v6 genu CD44.

Dosavadní stav techniky Před krátkou dobou bylo prokázáno, že exprese variant povrchového glykoproteinu CD44 je nutná a dostatečná k vyvolání tak zvaného spontánního metastatického chování i u nemetastazující buněčné linie adenokarcinomu slinivky břišní u krys i u nemetastazující buněčné linie fibrosarkomu u krys podle publikace GUnthert U. a další, A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carci-noma cells, Cell 65, 13 až 24, 1991. Nejmenší isoforma CD44, standardní forma CD44s je exprimována v řade různých tkání kromě epithelových buněk, určité varianty, CD44v jsou ex-primovány pouze jednou podskupinou epithelových buněk. Iso-formy CD44 jsou různým štěpením vytvářeny tak, že dojde k úplnému vyjmutí sekvencí o 10 exotech VI až vlO z CD44s, takže může docházet k různým kombinacím zejména u větších variant, jak bylo popsáno v publikacích Screaton G. R. a další, Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte horning receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spli-ced exons, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 89, 12160 až 12164, 1992, Heider a další, A human homologue of the rat metasta-sis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polypls, J. Cell. Biol, 20, 227 až 233, 1993 a Hofmann M. a další, CD44 spilce variants confer metastatic behavior in rats: homologous sequences are expressed in human tumor cell lineš, Cancer Res., 51, 5292 2 až 5297, 1991. Varianty se odlišují tak, že na určitém místě mimobuněčné části bílkoviny dojde k zařazení různých sekvencí aminokyselin. Takové varianty bylo možno prokázat v různých lidských nádorových buňkách i v lidských nádorových tkáních. Před krátkou dobou byla prokázána exprese variant CD44 v průběhu vzniku kolorektálního karcinomu (Heider a další, 1993 svrchu). K expresi variant CD44 u normálního lidského epitelu tlustého střeva nedochází, slabou expresi je možno prokázat pouze u proliferujících buněk krypt. V pozdějších stadiích progrese nádoru, například u adenokarci-nomu dochází u všech maligních nádorů k expresi CD44. Krátkodobá exprese variant CD44 byla prokázána například také u aktivovaných lymfocytů a u lymfomu, odlišného od Hodgkinova typu, jak bylo popsáno v publikaci Koopman G. a další,

Activated human lymphocytes and aggressive Non-Hidgkin*s lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associa-ted variant of CD44, J. Exp. Med., 177, 897 až 904, 1993.

Jsou známy různé postupy, využívající diferenciální expresi variant exonu genu CD44 u nádorových a normálních tkání pro diagnostické a léčebné účely, postupy jsou popsány například ve WO 94/02633, WO 94/12631, WO 95/00658, WO 95/00851, EP 0531300.

Také exprese variantních molekul CD44 u karcinomů dlaž-dičkového epitelu již byla zkoumána. Podle publikace Salmi M. a další, Regulated expression of exon v6 containing isoforms of CD44 in man: Downregulation during malignant transformation of tumors of squamocellular origin, J. Cell. Biol., 122, 431 až 442, 1993, dochází v případě v6-specifických protilátek Var3.1 k poklesu exprese v6 v nádorových buňkách ve srovnání s normálními buňkami. Podle publikace Brooks L. a další, The expression of variant CD44 in nasopharyngeal carcinome is unrelated to expression of LMP-1, Am. J. Pathol., 146(5), - 3 - - 3 - * · • ·· 1102 až 1112, 1995, došlo při immunohistologickém vyšetření v případě v6-specifických protilátek 11.9 k heterogennímu zabarvení buněk karcinomu v hrtanové oblasti. Ve dvou z dvanácti případů došlo k silnému zabarvení, kdežto u většiny případů došlo pouze k slabé ložiskové expresi v6.

Vynález si klade za úkol navrhnout nový postup pro diagnostiku i léčení karcinomů z dlaždičkového epitelu a také navrhnout nové prostředky pro léčení.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob diagnózy karcinomů z dlaždičkového epitelu, založený na expresi variabilního exo-nu v6 genu CD44 jako molekulového značení. Vynález se zvláště týká postupů, založených na silné a homogenní expresi v6 u uvedených nádorů, která je prokazatelná zcela neočekávaně vzhledem ke známému stavu techniky. Specifické molekuly protilátek jsou vhodné zejména jako prostředek pro selektivní dosažení buněk karcinomu z dlaždičkového epitelu in vivo. Výhodné jsou zejména takové postupy, při nichž se užívá molekula protilátky, rozpoznávající sekvenci aminokyselin QWFGNRWHEGYRQT a zvláště výhodně sekvenci aminokyselin WFGNRWHEGYR. Zvláště výhodná je monoklonální protilátka BIWA-1 (klon VFF-18), vylučovaná buněčnou linií hybridomu, uloženého 7. června 1994 pod přírůstkovým číslem DSM ACC2174 do veřejné sbírky kultur DSM-Deutsche Sammlung fůr Mikroorga-nismen und Zellkulturen GmbH, Hascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, (W0 95/33771) nebo deriváty této protilátky.

Sekvence aminokyselin nebo nukleových kyselin pro varianty exonu v6 genu CD44 jsou známé z publikací Screaton - 4 -

·♦ G. R. a další, Genomic structure of DNA encoding the lympho-Cyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 89, 12160 až 12164, 1992, TQlg C. a další, Spllclng cholce from ten variant exons establishes CD44 variability, Nucleic Acids. Res., 21, 1225 až 1229, 1993. Existence degenerovaných nebo allelových variant nemá pro uskutečnění předmětu vynálezu podstatný význam, takové varianty jsou rovněž zahrnuty.

Sekvence exonu v6 lidského genomu CD44 je následující: Q A T P S S T T E Ξ T A T Q TC CAG GCA ACT CCT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ACC CAG K E Q W F G N R W H E G Y R Q AAG GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAA T P R E D S H S T T G T A ACA ccc AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT G.

Vynález je možno uskutečnit s použitím polyklonálních nebo monoklonálních protilátek, specifických pro epitop, pro nějž je kódem exon v6, zvláště jde o epitop v sekvenci aminokyselin QWFGNRWHEGYRRQT a zvláště výhodně o epitop v sekvenci aminokyselin WFGNRWHEGYR. Protilátky proti známé sekvenci aminokyselin je možno vytvořit známými postupy, například podle publikace Catty D. (Hrsg), Antibodies sv. I a II, IRL Press Oxford, 1989. Je například možno synteticky připravit peptid s požadovanou sekvencí a použít jej k imunizaci jako antigen. Dalším možným postupem je příprava složené bílkoviny, obsahující požadovanou sekvenci aminokyselin tak, že se nukleová kyselina, která je kódem pro tuto sekvenci a je získána například synteticky pomocí PCR, uloží do vektoru pro expresi a dosáhne se exprese složené bílkoviny - 5 -

• * • · v produkčním organismu. Složenou bílkovinu je možno po případném čištění použít jako antigen k imunizaci, čímž je možno získat specifické protilátky proti požadované sekvenci nebo v případě monoklonálních protilátek je možno vytvořit hybridom, u nějž dochází k expresi protilátek, specifických pro určitou sekvenci. Tyto postupy jsou známé například z publikací Heider a další, 1993 svrchu, Heider K. H. a další, Expression of CD44 isoforms in human renal cell carcinomas, Virchows Arch., 428, 267 až 273, 1996a, Koopman a další, 1993, svrchu pro výrobu protilátek proti variantním epitopům genu CD44.

Pro způsob podle vynálezu je možno využít také molekuly protilátek, odvozené od polyklonálních nebo monoklonálních protilátek, například fragmenty Fab nebo Fíab*^ imunoglobu-linu, rekombinantně připravená protilátky s jednoduchým řetězcem (scFv), chimérní nebo humanizované protilátky a další molekuly, schopné se specificky vázat na epitopy, pro než je kódem exon v6. Z úplného imunoglobulinu protilátky BIWA-1 (VFF-18) nebo jiných protilátek je možno připravit například fragmenty Fab, F(ab')2 nebo jiné fragmenty podle publikace Kreitman R. J. a další, Pseudomonas exotocin-based immuno-toxins containin g the antibody LL2 nebo LL2-Fab' induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice, Cancer Res., 53, 819 až 825, 1993. Každý odborník může připravit rekombinantní molekuly protilátek, specifické proti v6. Zejména je schopen po analýze sekvence aminokyselin protilátky BIWA-1 (VFF-18) a/nebo při použití buněčné linie hybridomu, produkující tyto protilátky a na základě takto získaných genetických informací připravit rekombinantní molekuly protilátek téhož idiotypu jako BIWA-1 (VFF-18), to znamená molekuly protilátek, které v oblasti vazby na antigen, to znamená v oblasti, určující komplementaritu, CDR - 6 -

mají stejnou sekvenci aminokyselin jako protilátka BIWA-1 (VFF-18). Odpovídající postupy jsou známé. V případě takových rekombinantních molekul protilátek může jít například o humanizované protilátky podle Shin S. U. a další,Production and properties of chimeric antibody molecules, Methods Enzy-mal, 178, 459 až 476, 1989, Gíissov D. a další, Humanization of monoclonal antibodies, Methods Enzymol., 203, 99 až 121, 1991, o bispecifické nebo bifunkční protilátky podle Weiner L. M. a další, Phase I evaluation of an anti-breast carcino-ma monoclonal antibody 260F9-recombinant ricin A Chain immu-noconjugate, Cancer Res., 49, 4062 až 4067, 1989, Goodwin D. A., A new approach to the problém of targeting specific monoclonal antibodies to human tumors using anti-hapten chimeric antibodies, J. Nucl,, Med. Biol., 16, 645, 1989, nebo Featherstone C., Bispecific antibodies: the new magie bullets, Lancer 348, 536, 1996, dále protilátky s jednoduchým řetězcem scFv podle Johnson S, Bird R. E., Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli, Methods Enzymol., 203, 88 až 98, 1991, o úplné nebo fragmentární imunoglobuliny podle Coloma M. J. a další, Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase Chain re-action, J. Immunol. Methods, 152, 89 až 104, 1992, Nesbit M. a další, Production of a functional monoclonal antibody re-cogniziny human colorectal carcinoma cells from a baculovi-rus expression systém, J, Immunol. Methody., 151, 201 až 208, 1992 nebo Barbas C. F. a další, Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vitro, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 89, 9339 až 9343, 1992 nebo další synteticky vytvořené protilátky, například podle Winter G. a další, Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol., 12, 433 až 455, 1994. Humanizované protilátky je možno získat také například CDR-roubováním podle EP 0239400. Je možno také modifikovat rámcové oblasti podle EP 0519596 nebo WO 90/07861. K humanizaci protilátek 7 7

• ·· ·♦ · t ··* • · je v současné době možno využít moderních metod, například PCR podle EP 0368684, EP 0438310, WO 92/07075 nebo modelování pomocí počítačem například podle WO 92/22653. Je možno také vytvořit složené bílkoviny, obsahující například protilátku s jednoduchým řetězcem a toxin podle publikace Chaudhary V. K. a další, A rapid method of cloning functional variable--region antibody genes in Escherichia coli as single-chain immunotoxins, Proč, Nati. Acad. Sci. USA, 87, 1066, 1990 nebo Friedmann P. N. a další, BR96 sFv-PE40, a potent single-chain immunotoxin that selectively kills carcinoraa cells, Cancer Res., 53, 334 až 339, 1993. Pod pojmem "protilátka" nebo "molekula protilátky" se rozumí kromě polyklonálních a mono-klonálních protilátek další sloučeniny, které je možno odvodit strukturně od imunoglobulinu a získat známými postupy.

Je také v kompetenci průměrného odborníka vytvořit protilátky s odpovídající specifičností vazby při znalosti epitopů protilátky BIWA-1 (VFF-18), jak je znázorněno například na obr. 1 a obr. 4. Tyto protilátky rovněž spadají do rozsahu vynálezu.

Pro diagnostické účely je možno připravit molekuly protilátek, s výhodou typu BIWA-1, fragmenty této protilátky nebo rekombinantní molekuly protilátek téhož idiotypu, X 2 B X 31 například při použití radioaktivních isotopů I, I, 111 99m

In, Tc nebo jiných radioaktivních látek podle Larson S. M. a další, Radioisotope Conjugates.v jeVita V. T. a další, Biologie therapy of cancer, J. B. Lippincott Comp., Philadel-phia, 496 až 511, 1991, Thomas G. D. a další, Antibodies for tumour immunodetection and methods for antibody radiolabelling, v Catty D., Antibodies sv. II, IRL Press Oxford, 223 až 224, 1989 nebo Srivastava S. C., Radiolabeled monoclonal antibodies for imaging and therapy, Life Sciences Series A 152,

Plenům New York, 1988, při použití enzymů, jako peroxidázy Φ9 ♦ ·* ·· ► · · ♦ » · ·· ··· · ♦ • · · #♦ ·· - 8 - nebo alkalické fosfatázy podle Catty D.f Raykundalia C., ELISA and related immunoassays, v Catty D., Antibodies, sv. II, IRL Press Oxford, 1989, 97 až 152, str. 105 až 109, při použití fluorescenčních barviv podle Johnson G. D., Immunofluorescence, v Catty D., Antibodies sv. II, IRL Press Oxford, 1989, 179 až 200, zejména str. 180 až 189 nebo molekul biotinu podle Gíiesdon J. I. a další, J. Histo-chem. Cytochem, 27, 1131, 1979. Pro léčebné použití je možno spojit molekuly protilátek, specifických pro v6, s výhodou BIWA-1 (VFF-18) nebo molekuly protilátek odvozené od této protilátky nebo odpovídající fragmenty nebo rekombi-nantní molekuly protilátek téhož idiotypu s radioisotopy, například 90Y, 131l, 186Re, 188Re, 153Sm, 67Cu, 212Bi, 213 177

Bi, Lu podleQuadri S. M. a další, Evaluation of indium -111 and yttrium-90 labeled linker immunoconjugates in nudě mice and dogs, J. Nucl. Med., 34, 938 až 945, 1993, Lenhard R. E. a další, Isotopic immunoglobulin. A new systemic thera py for advanced Hodgkin"s Disease, J. Clin. Oncol., 3, 1296 až 1300, 1985, Vriesendorp Η. M. a další, Phase I-II studies of yttrium-labeled antiferritin treatment for end stage Hodkin*s diesease, including Tadiation Therapy Oncology Group 87-01, J. Clin. Oncol., 9, 018 až 928, 1991, Wilbur D. S. a další, Development of a stable radioiodinating agent to label monoclonal antibodies for radiotherapy of cancer, J. Nucl, Med., 30, 126 až 226, 1989, Maraveya A. a další, Radiolabeled antibody combinec with external radiotherapy for the treatment od head and neck cancer: Reconstruction of a theoretical phantom of the larynx for radiation dose cal-culation to local tissues, Cancer Res., 55, 1020 až 1027, 1995a, Jurcic J. G. a další, Recent Developments in the ra-dioimmunitherapy of cancer, Current Opinion in Immunology, 6, 715 až 721, 1994, s toxiny podle Vitetta E. S. a další, Phase I immunotoxin trial in patiens with B-cell lymphoma, Cancer Res., 51, 4052 až 4058, 1991, Vitetta E. S a Thorpe - 9 - - 9 - ·Φ· • « ··« · · • ♦ t ·» «· Ρ. Ε., Immunotoxins, v DeVita V. Τ. a další, Biologie thera-py of cancer, J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 482 až 495, 1991, Kreitman R. J. a další, 1993 svrchu a Theuer C.P. a další, Immunotoxins made with a recombinant form of pseudo-monas exotoxin A that do not require proteolysis for activity, Cancer Res., 53, 340 až 347, 1993, s cytostatiky podle Schrappe M. a další, Long-term growth suppression of human glioma xenografts by chemoimmunoconjugates of 4-desacetylvinblastine--3-carboxyhydrazide and monoclonal antibody 9.2.27, Cancer Res., 52, 3838 až 3844, 1992, s prekursory podle Wang S. M. a další, Specific activation of glucuronide prodrugs by an-tibody-targeted enzyme conjugates for cancer therapy, Cancer Res., 52, 4484 až 4491, 1992 nebo Senter P. D. a další, Enhancement of the in vitro and in vivo antitumor activities of phosphorylated mitomycin C and etoposide derivatives by monoclonal antibody-alkaline phosphatase conjugates, Cancer Res., 49, 5789 až 5792, 1989, s látkami, aktivovatelnými působením světla podle Hemming A. W. a další, Photodynamic therapy of squamous cell carcinoma: an evaluation of an anti--EGFR monoclonal antibody-prophyrin conjugate, Society of Surgical Oncology, 46th Annual Cancer Symposium, March 18 až 21, 1993, Los Angeles, CA, str, 67, s molekulou protilátky s jinou specifičností nebo s jinými radioaktivními sloučeninami. Mimoto je možno molekulu protilátky spojit s cytokinem nebo jiným polypeptidem, modifikujícím reaktivitu imunitního systému, například s faktorem nekrosy nádorů, s lymfotoxinem podle Reisfeld R. A. a další, Involvement of B lymphocytes in the growth inhibition of human pulmonary melanome meta-stases in athymic nu/nu mice by an antibody-lymphotoxin fusion protein, Cancer res., 56, 1707 až 1712, 1996 nebo s interleukinem-2 podle Becker J. C. a další, An antibody--interleukin 2 fusion protein overcomes tumor heterogeneity by induction a cellular immune rsponse, Proč. Nati. Acad.

Sci., USA, 93, 7826 až 7831, 1996. Molekula protilátky může být pro použití v systému pro zacílení modifikována také - 10 -

• ♦ například streptavidinem nebo biotinem podle Goodwin D. A., Tumor pretargeting: almost the bottom line, J. Nucl. Med., 36(5), 876 až 879, 1995. S výhodou mohou být způsobem podle vynálezu vyšetřeny vzorky nemocných, například z biopsií, u nichž je podezření na karcinom z dlaždicového epitelu nebo u nichž je diagnóza již známa, je však ještě zapotřebí nádor dále charakterizovat. Průkaz variantních molekul CD44 s obsahem sekvence aminokyseliny, pro niž je kódem variabilní exon v6, může být proveden na úrovni bílkovin pomocí protilátek nebo na úrovni nukleových kyselin při použití specifických sond nebo pri-merů pro PCR-reakci. Vynález se tedy týká také molekul protilátky a nukleových kyselin, které je možno použít jako sondy nebo primery pro uvedené postupy a použití těchto protilátek a nukleových kyselin k diagnóze a analýze karcinomu z dlaždicového epitelu. Je například možno uvedeným způsobem vyšetřit tkáňové řezy, připravené známými postupy. Mimoto mohou být vzorky tkáně nebo jejich extrakty nebo tělesné tekutiny vyšetřeny dalšími imunologickými postupy za použití protilátek, jde například o metodu Western Blots, metodu ELISA podle publikace Catty a Raykundalia, 1989, uvedené svrchu, metodu RIA podle publikace Catty D., Murphy G., Immunoassays using radiolabels v Catty D., Antibodies, sv. li, irl Press Oxford, 1989, 77 až 96. nebo příbuzné imunologické zkoušky. Analýza může být prováděna kvalitativně, semikvantitativně nebo kvantitativně .

Kromě diagnostiky in vitro je možno použít molekuly protilátky se specifičností podle vynálezu také in vivo pro diagnostiku karcinomu z dlaždocévho epitelu. V případě, že molekula protilátky nese označení, které je možno prokázat, je možno detekcí tohoto označení například zviditelnit nádor in vivo nebo je možno tuto skutečnost využít k chirurgickým 11 zásahům s radiologickým vedením. Pro použití protilátek, konjugovaných s radioaktivními isotopy pro scintigrafii je k dispozici řada postupů, podle nichž je možno postupovat a které byly popsány například v publikacích Siccardi A. G. a další, Immunoscintigraphy of adenocarcinomas by means of radiolabeled F(ab')2 fragments of an anti-carcinoembryonic antigen monoclonal antibody: a multicenter study, Cancer Res., 49, 3095 až 3103, 1989, Keenan A. M. a další, Immunolymphoscin-tigraphy and the dose dependence of "^^In-labeled T101 monoclonal antibody in patients with cutaneous T-cell lymphoma, Cancer. Res., 47, 6003 až 6099, 1987, Perkins A. C., Pimm Μ. V., A role for gamma scintigraphy in cancer immunology and immunotherapy, Eur. J. Nucl. Med., 19, 1054 až 1063, 1992, Colcher D. a další, Complementation of intracavitary and in-travenous administration of a monoclonal antibody (B72.3) in patiens with carcinoma, Cancer Res., 47, 4218 až 4224, 1987, Thompson C. H. a další, Immunoscintigraphy for detection of lymph node metastases from breast cancer, Lancet 1984, (2), 1245 až 1247, 1984.

Zjištěním a/nebo kvantitativním průkazem exprese variant v6 genu CD44 je možno ovlivnit diagnosu i prognosu. Výhodné je v tomto případě kombinovat získané údaje s dalšími prognostickými parametry.

Molekuly protilátky se specifičností podle vynálezu, popřípadě spojené s cytotoxickými látkami je s výhodou možno použít k léčení karcinomů z dlaždicového epitelu. Uvedené molekuly je možno podávat systemicky nebo místně, například nitrožilně ve formě injekce nebo infuze, intraperitoneálně, nitrosvalove, podkožně a podobně. Postupy pro podávání konjugovaných nebo nekonjugovaných protilátek ze skupiny imuno-globulinu, jejich fragmentů, rekombinantních humanizovaných molekul a podobně, jsou známým stavem techniky popsaným v - 12 - - 12 - π • · ·· ** ·· · ·#♦··· • «·» #·· ··

• · · · i « · • · * ·· ··· *t ·· publikacích Mulshine J. L. a další, Applications of monoclo-nal antibodies in the tratment of solid tumors v DeVita V. T. a další, Biologie therapy of cancer, J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 563 až 588, 1991, Larson Ξ. M. a další, 1991 svrchu, Vitetta a Thorpe, 1991 svrchu, Vitetta a další, 1991 svrchu Breitz Η. B. a další, Clinical experience with rhe-nium-186-labeled monoclonal antibodies for rádioimmunotherapy: results of phase I trials, J. Nucl. Med,, 33, 1099 až 1112, 1992 a Breitz Η. B. a další, Pharmacokinetics and normál organ dosimetry following intraperitoneal rhenium-186-labeled monoclonal antibody, J. Nucl. Med., 36, 745, 1995, Press 0. W. a další, 1989 svrchu, Weiner L. M. a další, 1989 svrchu, Chatal J. F. a další, Biodistribution of indium-lll-labeled OC 125 monoclonal antibody intraperitoneally injected into patiens operated on for ovarian carcinomas, Cancer Res., 49, 3087 až 3094, 1989, Sears G. F. a další, Phase-I clinical trial of monoclonal antibody in treatment of gastrointestional tu-mours, Laňcet,1982 (1), 762 až 765, 1982. Léčebné použití může například probíhat analogickým způsobem jako použití protilátky 1.1ASML podle publikace Seiter S. a další, Prevention of tumor metastasis formation ba anti-variant CD44, J. Exp. Med., 177, 443 až 455, 1993. Nemodifikované monoklonální protilátky je možno léčebně použít přímo v případe, že obsahují vnitřní efektorovou funkci, vhodnou pro cytotoxické působení, jak je popsáno například v publikaci Riethmuller G. a další, Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes^C colorectal carcinoma, Lancet, 343, 1177 až 1183, 1994. Vhodné monoklonální protilátky pro toto použití jsou myší protilátky isotypu IgG2a nebo protilátky lidského typu IgGl. Nemodifikované protilátky je možno dále použít k indukci vlastní reakce nemocného proti nádoru přes antiidiotypický mechanismus podle publikací Baum R. P. a další, Clinical course of ovarian cancer patiens under repeated stimulation of HAMA using MAb 0C125 a B43.13, Hybridoma 12(5). - 13 - ·· * ♦ ·· ·· ♦ ·

583 až 580, 1993 a Khazaeli Μ. B. a další, Human immune response to monoclonal antibodies, J. Immunother, 15, 42 až 52, 1994. Výhodné léčebné použití spočívá v tom, že se humanizovaný, v6-specifický imunoglobulin nebo jeho fragment F(ab")9 90 ^ spojí s Y, podle Quadri S. M. a další, Evaluation of indium- -111 and yttrium-90 labeled linker immunoconjugates ín nudě mice and dogs, J. Nucl. Med., 34, 938 až 945, 1993, Vriesendorp „, 131 Η. M. a další, 1995 svrchu, I podle Maraveyas A. a další, 1995a svrchu, Maraveyas A. a další, Pharmacokinetics, biodis- tribution, and dosimetry of specific and contol radiolabeled monoclonal antibodies in patiens with primary head and neck squamouns cell carcinoma, Cancer Res., 55, 1060 až 1069, 1995b,

Juweid M. a další, Treatment of Non-Hodgkins,s lymphon with radiolabeled murine, chimeric, oř humanized LL2, an anti-CD22 monoclonal antibody, Cancer Res., 55, 5899s až 5907s, 1995,

Press 0. W. a další, 1995 svrchu, Thomas G. D. a další, 1985 1 fifi (v Catty 1985 svrchu), Re podle publikací Breitz Η. B., a další, 1992 a 1995 svrchu, nebo s jiným vhodným radioisotopem a použije k radioimunotherapii karcinomu z destičkového epitelu. Například je možno na sebe vázat protilátku BIWA-1, humanizovanou formu BIWA-1 nebo fragment F(ab*)_ 90 této protilátky nebo humanizované protilátky s Y za použití spojovníku, tvořícího chelát, například Isothiokyanátbenzyl-diethylentriaminpentaacetátu ITCB-DTPA, přičemž by málo být dosaženo specifické aktivity 5 až 20 mCi/mg, s výhodou 10 mCi/mg. Tento prostředek je pak možno podávat nemocným s nádorem, positivním na antigen v dávce 0,1 až 1, s výhodou 0,3 až 0,5 mCi/kg hmotnosti. V případě, že se molekula pro-tilátky spojí se I, může být při specifické účinnosti 2 mCi/mg použito schéma dávkování 2 x 150 mCi v odstupu šest týdnů. Odborník může určit známými postupy maximální možné dávkování podle svrchu uvedených publikací Maraveyas A. a - 14 -

další, 1995a a 1995b svrchu. Při množství bílkoviny 2 až 5 mg je možno prostředek podat nitrožilní injekcí. Při vyšším množství bílkovin je vhodou formou infuze. V případě mono-klonálních protilátek může být zapotřebí prostředek před podáním smísit s přebytkem, například desetinásobným molárním přebytkem neradioaktivní protilátky, v tomto případě je pak vhodnou formou podání nitrožilní infuze, například v průběhu 15 minut. Podání je možno opakovat. Léčení je možno kombinovat s ozařováním a také s transplantací kostní dřeně.

To je nezbytné zvláště v těch případech, kdy se při léčení dosahuje dávky více než 1,6 Gy v kostní dřeni.

Molekula protilátky podle vynálezu může být použita také ex vivo k Čištění CD34-pozitivních preparátů s buněčným obsahem. Léčení karcinomu z dlaždicového epitelu ozařováním nebo chemotheraplí může být doplněno také transplantací autologní kostní dřeně. Při tom musí být podaný prostředek s obsahem kmenových krvetvorných buněk prostý nádorových buněk. Toho je možno dosáhnout inkubací s molekulami protilátek podle vynálezu, například s konjugáty protilátek a toxinů podle publikace Myklebust A. T. a další, Comparison of two antibody based methods for elimination of breast can-cer cells from human marrow, Cancer Res., 54, 209 až 214, 1994, nebo podle DE P 196 48 209.7.

Molekuly protilátek podle vynálezu mohou být dále zavedeny do receptoru T-lymfocytů za vzniku rekombinantních konstrukcí. Takové reprogramované T-lymfocyty jsou schopné se selektivně vázat na nádorové buňky, u nichž dochází k expresi antigenu a mají cytotoxický účinek, takže je možno je použít k léčení karcinomu z dlaždicového epitelu podle PCT/EP 9604631, a podle Altenschmidt U,a další, Cytolysis of tumor cells expressing the neu/erbB-2, erbB-3 and erbB-4 receptors by genetically targeted naivě T lymphocytes, Cli-nical Cancer Res., 2, 1001 až 1008, 1996. - 15 - »♦ φ * • · ·

Vynález bude dále osvětlen v souvislosti s přiloženými výkresy. Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněno stanovení specifičnosti epito-pů BIWA-1 vazbou na syntetické peptidy, odvozené z lidské sekvence CD44v6. Odpovídající peptid krysího epitopu CD44v6 byl podroben zkouškám s protilátkou 1.1ASML. Vazba byla stanovena pomocí metody ELISA, přičemž peptidy byly imobilizo-vány na mikrotitracních plotnách podle publikace Heider K.H. a další, Characterization of a high-affinity monoclonal anti-body specific for CD44v6 as candidate for immunotherapy of squamous cell carcinomas, Cancer Immunol. Immunother., 1996, obr. 2. Na výkrese znamená - žádnou vazbu, +/- slabou vazbu a + silnou vazbu.

Na obr, 2 je znázorněn výsledek imunohistochemické anylýzy karcinomu hrtanu (a) z dlaždicového epítelu a me-tastázy karcinomu jícnu (b) v játrech pomocí CD44v6-specifické monoklonální protilátky BIWA-1. V obou případech je možno pozorovat reaktivitu protilátky s membránou nádorových buněk. Barvení je hematoxylinem, zvětšení 40x.

Na obr. 3 je graficky znázorněno srovnání vazby antige-nu u různých CD44v6-specifických mAb. Vazba na lidské buňky SCC A-431 byla stanovena metodou ELISA. Mab BIWA-1 má prokazatelně vyšší afinitu pro nádorové buňky než jiné typy mAb.

Na obr. 4 je uvedeno jemnější rozlišení mAb BIWA-1.

Vazba BIWA-1 na různé překrývající se syntetické peptidy, zahrnující aminokyseliny 18 až 32 CD44v6-kódové oblasti byla stanovena metodou ELISA. Minimální vazná sekvence, peptid v6 (19 až 29) je podtržen. - 16 - «I · ··

Na obr. 5 je graficky znázorněna biologická distribuce 125I-BIWA-1 u bezsrstých myší kmene A-431 s xenotransplantáty. Nahromadění protilátky je uvedeno v % ID/g (průměr ± standardní odchylka) po době 4, 24, 48, 120 a 168 hodin po injekci ,

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady. Příklady provedení vynálezu Příklad 1

Exprese CD44v6 u karcinomu z dlaždicových buněk Tkáň

Celkem 126 vzorků nádorů, zalitých do parafinu bylo analyzováno imunohistochemicky při použití mAb BIWA-1 (klon VFF-18) na expresi CD44v6. Vzorky zahrnovaly 31 případů primárních karcinomů z dlaždicového epitelu, a to 15 případů hrtanu a 16 případů na kůži a 91 případů metastáz v lymfatic-kých uzlinách, z toho 38 v hrtanu, 27 v plicích, 11 v jícnu, 11 v ústní dutině a 4 v mandlích a mimoto 4 případy metastáz v játrech (z jícnu).

Proti látky

Celá variantní oblast typu HPKII z CD44v (Hofmann a další, 1191 svrchu), byla amplifikována z cDNA lidských ke-ratinocytů pomocí PCR. Oba PCR-primery, 5 -CAGGCTGGGAGCCAA-ATGAAGAAAATG-3' v polohách 25 až 52 a 5'-TGATAAGGAACGATTGAC-ATTAGAGTTGGA-3' v polohách 1013 až 984 variantní oblasti LCLC97 byly opatřeny rozpoznávacím místem pro působení enzymu EcoRI, které bylo využito pro přímé uložení produktu PCR - 17 - #·

do vektoru pGEX-2T z publikace Smith D. B. a další, 1988 svrchu pro klonování. Výsledná kódová konstrukce pGEX CD44v HPKII, v3-vlO je kódem pro složenou bílkovinu s molekulovou hmotností přibližně 70 000, která obsahuje glutathion-S--transferázu ze Schistosoma japonicum a exony v3-vl0 z lidského CD44, jak je znázorněno na obr. 1 publikace Heider K. H. a další, 1993 svrchu. Bylo dosaženo exprese složené bílkoviny v E. coli a produkt byl čištěn afinitní chromato-grafií na agarose s glutathionem podle publikace Smith D. B. a další, 1988 svrchu.

Myší samice Balb/c byly imunizovány čištěnou složenou bílkovinou podle následujícícho schématu: 1. imunizace: 90 mikrogramů složené bílkoviny v úplném Freundově pomocném prostředku. 2. a 3. imunizace: 50 mikrogramů složené bílkoviny v neúplném Freundově pomocném prostředku.

Imunizace byly prováděny vždy v odstupu čtyř týdnů. 14 dnů po poslední imunizaci bály zvířata ještě ve třech po sobě následujících dnech imunizována vždy při použití 10 mikrogramů složené bílkoviny v PBS. Následujícího dne byla provedena fuze slezinných buněk zvířete s vysokým titrem protilátek s buněčnou linií myšího myelomu P3.X63-Ag8.653 při použití polyethylenglykolu 4000. Buňky hybridomu pyk byly podrobeny selekci na mikrotitračních plotnách na prostředí HAT podle publikací Kohler G. a další, Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specify, Nátuře, 265, 495, 1975, a Kearney a další, 1979 svrchu.

Stanovení titru protilátek v séru a sledování super-natantu hybridomu bylo prováděno metodou ELISA. Při této zkoušce byly mikrotitraČní plotny nejprve převrstveny složenou bílkovinou GST-CD44v3-10 nebo pouze glutathion-S- - 18 - - 18 -

φφ φφ φφ

• * · φ φ I • · φ φ φφ • * · ΦΦΦ· φ φ · φ φ φ *· φφ φφ -transferázou. Pak byla provedena inkubace se sériovým ředěním vzorků séra nebo supernatantu hybridomu a specifické protilátky s konjugovanou peroxidázou, proti myšímu imuno-globulinu, byly prokázány. Hybridomy, které reagovaly pouze s glutathion-S-transferázou, byly odloženy. Zbývající protilátky byly nejprve dále charakterizovány metodou ELISA s použitím složené bílkoviny, specifické pro určitou oblast (exon v3, exon v5 + v6, exon v6 + v7, exon v8 až vlO) podle publikace Koopman G. a další, 1993 svrchu. Imunohistochemická reaktivita byla sledována na řezech lidské pokožky.

Protilátka BIWA-1 (VFF-18, popsaná ve WO 95/33771) se vázala pouze na ty složené bílkoviny, které obsahovaly oblast, pro niž je kódem exon v6. Aby bylo dále možno ohraničit epitopy protilátky, byly použity různé syntetické pepti-dy, představující Část oblasti v6 a byla s nimi provedena zkouška na vazbu metodou ELISA, jak je znázorněno na obr. 1. Nejsilnější vazbu bylo možno prokázat pro peptid v6D, obsahující 14 aminokyselin. Z toho vyplývá, že epitop pro BIWA-1 leží zcela nebo z části uvnitř sekvence QWFGNRWHEGYRQT, pro niž je kódem exon v6. Sekvence je homologní k epitopu pro vazbu protilátky 1.1ASML, který je specifický pro CD44v6 krysy, jak je zřejmé z obr. 1 a který byl využit k léčebným účelům na krysím modelu.

Imunohistochemie Před inkubací s primární protilátkou byly řezy s tloušt-kou 4 mikrometry, zalité v parafinu třikrát zbavovány parafinu vždy 10 minut v prostředku Rotihistol (Roth, SRN) a pak byly rehydrovány ve vzestupné alkoholové řadě. Pak byly řezy krátce omyty destilovanou vodou a pak povařeny 3 x 10 minut v mikrovlnné troubě (Sharp Model R-6270) při výkonu 600 W v 0,01 M pufru s citrátem sodným. Pak byly řezy 20 minut chlazeny. Po posledním chlazení byly nosiče promyty PBS a předem - 19 - ··

··

inkubovány v 10% kozím séru v PBS. Pak byly řezy třikrát pro-myty v PBS a inkubovány s primární protilátkou 1 hodinu v PBS s 1% ΒΞΑ (BIWA-1-5 mikrogramů/ml, myší IgG isotypu, který odpovídá negativním kontrolám, 5 mikrogramů/ml). Pozitivní kontrolou pro barevnou reakci byly řezy normálně lidskou pokožkou vzhledem k tomu, že u keratinocytů dochází k expresi isoformy CD44, obsahující v3-vl0. Endogenní peroxidáza byla blokována 0,3% peroxidem vodíku v PBS a řezy byly inkubovány 30 minut s biotinylovanou sekundární protilátkou IgG-F(ab,)2 proti myším tkáním (DAK.0 Corp.). Řezy byly vyvíjeny 30 minut působením peroxidázy z křenu, vázané na biotin ve formě komplexu streptavidin-biotin-peroxidáza (DAKO Corp.). Pak byly řezy inkubovány 5 až 10 minut v substrátu, 3,3-amino--9-ethylkarbazolu (sigma Immunochemicals), reakce byla zastavena přidáním vody a řezy byly dobarveny hematoxilinem. Vyhodnocení zbarvení bylo prováděno ve světelném mikroskopu Zeiss, přičemž intenzita zbarvení byla hodnocena následujícím způsobem: +++ silná exprese, ++ středněsilná exprese, + slabá exprese, - stopová nebo žádná exprese. Jako pozitivní byly hodnoceny pouze nádorové buňky s jasně zbarvenou membránou. V každém řezu bylo zhruba odhadnuto procentuální množství pozitivních nádorových buněk a byly vytvořeny dvě skupiny: fokálne pozitivní nádory, v nichž reagovalo méně než 10 % nádorových buněk s protilátkou a pozitivní nádory, v nichž reagovalo 10 nebo více procent nádorových buněk pozitivně. V případě, že reagovalo méně než 80 % nádorových buněk s protilátkou, bylo odpovídající procentuální množství pro jednotlivé případy zaznamenány.

Pomocí CD44v6-specifické monoklonální protilátky BIWA-1, bylo analyzováno 126 případů karcinomu z dlaždicového epitelu různého původu. Exprese CD44v6 s obsahem různých isoforem byla pozorována u všech vzorků nádorových buněk s výjimkou jednoho vzorku. Většina vzorků vykazovala expresi antigenu v * · + ·

- 20 - 80 až 100 % nádorových buněk, přičemž zbarvení bylo omezeno na membránu nádorových buněk. Ve tkáni stromatu, v lymfocy-tech, svalových buňkách nebo endothelu nebylo možno pozorovat žádnou reakci.

Aby bylo možno kvantitativně stanovit expresi molekul CD44v6 v těchto nádorových buňkách, byly současně s řezy nádorové tkáně barveny řezy normální lidské pokožky. U normálních keratinocytů pokožky dochází k expresi řady isoforem CD44 a tyto buňky náleží k těm normálním buňkám, u nichž dochází k nejsilnější expresi CD44v6. Z tohoto důvodu byl vzorek se zbarvenými keratinocyty použit jako referenční vzorek a byl hodnocen ve svrchu uvedeném systému hodnotou +++. Ve většině sledovaných vzorků nádorové tkáně bylo zbarvení nádorových buněk srovnatelné nebo ještě silnější než zbarvení keratinocytů pouze ve třech případech metastáz v lymfatických uzlinách bylo zbarvení slabé a u dvou primárních karcinomů a 10 metastáz bylo středně silné. Barevná reakce byla v celém řezu nádorové tkáně velmi homogenní, přičemž většina nádorových buněk měla stejnou intenzitu zbarvení. Mezi primárními nádory a metastázami nebylo možno pozorovat žádné významné rozdíly v expresi CD44v6. Podrobné shrnutí těchto výsledků je uvedeno v následující tabulce 1, příklady jsou uvedeny na obr. 2. 21

Tahulkal

Exprese CD44v6 v karcinomu z dlaždicového epitelu

Vzorek _ typ nádoru _BIWA-1 reaktivita 46937 86 primární hrtan X +++ 4687 90 primární hrtan +++ 8372 90 primární hrtan +++ 17427 90 primární hrtan +++ 27298 90 primární hrtan ++ + 46908 90 primární hrtan +++ 51334 90 primární hrtan ++ + 51402 91 primární hrtan +++ 60414 91 primární hrtan ++ + 61733 91 primární hrtan +++ 12280 92 primární hrtan + + + 23140 92 primární hrtan +++ 31792 92 primární hrtan + + + 32214 92 primární hrtan +++ 10209 95 primární hrtan + + + 2366 86 primární kůže + + + 2574 86 primární kůže + + + 9916 86 primární kůže ++/+++ 2696 87 primární kůže +++ 8906 87 primární kůže + + + 8191 88 primární kůže +++ 8354 88 primární kůže + + 50% 11963 88 primární kůže ++ - 22 -

5590 90 primární kůže ++/+++ 530 92 primární kůže +++ 2583 94 primární kůže +++ 11337 94 primární kůže +++ 10901 95 primární kůže +++ 11557 95 primární kůže +++ 11744 95 primární kůže +++ 11917 95 primární kůže +++ 4688 90 I metastázy hrtan ++/+++ 4688 90 II metastázy hrtan - 8374 90 metastázy hrtan +++ 17428 90 metastázy hrtan +++ 27300 90 metastázy hrtan +++ 36942 90 metastázy hrtan +++ 46909 90 metastázy hrtan ++ 51336 90 metastázy hrtan +++ 41108 91 metastázy hrtan +++ 51398 91 metastázy hrtan +++ 60416 91 metastázy hrtan +++ 61734 91 metastázy hrtan +++ 1318 92 I metastázy hrtan + + 1318 92 II metastázy hrtan + + + 1318 92 III metastázy hrtan + + + 1318 92 IV metastázy hrtan + + -H 2863 92 I metastázy hrtan + + + 2863 92 II metastázy hrtan + + + 5745 92 I metastázy hrtan + + + - 23 - 9 • · - 23 - 9 • · * 9 99·· • 9 99 a 5745 92 II metastázy hrtan +++ 8969 92 I metastázy hrtan +++ 8969 92 II metastázy hrtan +++ 8969 92 III metastázy hrtan + + 8969 92 IV metastázy hrtan +++ 8969 92 2/1 metastázy hrtan +++ 8969 92 2/II metastázy hrtan +++ 8969 92 2/III metastázy hrtan + + 8969 92 2/IV metastázy hrtan + / + + 9366 92 metastázy hrtan ++ + 9509 92 metastázy hrtan ++ + 9566 92 metastázy hrtan ++ + 12283 92 metastázy hrtan + + + 14046 92 metastázy hrtan +++ 31787 92 metastázy hrtan +++ 49228 92 metastázy hrtan +++ 50% 29228 93 metastázy hrtan +++ 29829 93 metastázy hrtan + + 29804 95 ne tastázy hrtan ++/+++ 15293 91 metastázy plíce + 25% 1667 92 metastázy plíce + 20% 2757 92 I metastázy plíce ++ + 2757 92 II metastázy plíce + + + 2757 92 III metastázy plíce +++ 2757 92 IV metastázy plíce +++ 4790 92 metastázy plíce + 4- + 6168 92 I me tastázy plíce + + 50% Φ * · * ·· *· *· *·· * · · · · ··» ·· »*· ·· · · ·· - 24 - 92 IX metastázy plíce +++ 92 III metastázy plíce +++ 92 IV metastázy plíce +++ 92 metastázy plíce +++ 92 I metastázy plíce +++ 92 II metastázy plíce +++ 92 III metastázy plíce ++/+++ 92 IV metastázy plíce +++ 92 metastázy plíce +++ 92 II metastázy plíce +++ 92 RMII metastázy plíce +++ 92 metastázy plíce +++ 92 I metastázy plíce +++ 92 II metastázy plíce +++ 92 metastázy plíce ++/+++ 92 II metastázy plíce fokální +++ 92 III metastázy plíce +++ 92 metastázy plíce +++ 92 metastázy plíce +++ 91 I metastázy j ícen +++ 91 II metastázy j ícen +++ 91 I metastázy jícen +++ 91 II metastázy j ícen +++ 91 III metastázy j ícen +++ 92 metastázy j ícen + 92 I metastázy jícen +++ 92 II metastázy jícen + + + ·· · · ·· • · · • · · «· ·· I · · · · · • t » · *· • · · ♦#*· · • · · · · • ·# ·· ·· 1710 92 III 11502 92 I 11502 92 II 202 92 6030 92 7335 92 I 7335 92 II 15324 92 II 16164 92 I 16164 92 II 16412 92 16836 92 I 16836 92 II 16836 92 III 6228 92 I 6228 92 II 6618 92 11840 92 14172 91 4 14172 91 5 4131 94 1 8438 94 jícen jícen jícen dutina ústní dutina ústní dutina ústní dutina ústní dutina ústní dutina ústní dutina ústní dutina ústní dutina ústní dutina ústní dutina ústní mandle mandle mandle mendle j ícen jícen j ícen j ícen - 25 - metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastázy metastazy metastázy metastázy metastázy + + + + + + + + ++60% +/++/+++25% +++ +++ +++70% +++ +++ 50% ++/+++ +++ +++ +++ ++ + +++ +++ ++ +++ +++ +/++ fokální ++/+++ M 80-100 % buněk reagovalo s BIWA-1. V případě menšího počtu reagujících buněk je uvedeno příslušné množství v %. M^istázy v játrech, všechny ostatní metastázy se nacházely v mízních uzlinách. 26 * mm

• *

φ· • · • a » · • · a· #* * · · t · * Příklad 2

Exprese CD44v6 v buňkách karcinomu ledvin, prostaty a v metastázách karcinomu tlustého střeva v játrech

Tkáň

Analýzováno bylo 19 případů karcinomu ledvin, z toho 12 případů z jasných buněk, 5 případů z chromofilních buněk, jeden případ z chromofobních buněk a jeden případ onkocytomu, 16 případů primárního adenokarcinomu prostaty a 19 případů metastáz karcinomu prostaty v mízních uzlinách a také 30 případů metastáz karcinomu tlustého střeva v játrech.

Protilátky BIWA-1 (příklad 1)

Imunohistochemie

Popis postupu je popsán v příkladu 1. Na rozdíl od karcinomu z dlaždicového epitelu nebylo možno prokázat ve sledovaných buňkách karcinomu ledvin a prostaty žádnou nebo bylo možno pozorovat jen fokální expresi isoforem CD44v6. V případě jedné, více než fokální exprese u karcinomu prostaty bylo zbarvení převážně difuzně cytoplasmatické a slabé až heterogenní ve srovnání se zbarvením normálního epitelu prostaty. V 50 % sledovaných metastáz karcinomu tlustého střeva v játrech bylo možno pozorovat více než fokální expresi iso-forem CF44v6. Zbarvení bylo ve většině případů slabé až středně silné, přičemž ve většině případů bylo méně naž 100 % nádorových buněk zbarveno při použití sondy s obsahem pritlátky BIWA-1. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 2. - 27 - • • v • · ·* • * m *· • · * · * • • · * · * * • • · · • • « • • ··♦ ·· ·* • ♦ ·»

Tabulka 2

Exprese CD44v6 v buňkách adenokarcinomu prostaty, karcinomu ledvin a metastáz kolorektálního karcinomu v játrech

Typ nádoru n reaktivita k BIWA-1 negat, fokálně posit. posit. adenokarc inom prostaty primární 16 8 3 5 adenokarcinom prostaty metastázy v uzlinách 19 15 2 2 karcinom ledvin primární 19 17 0 2 kolorektální karcinom metastázy v játrech 30 7 8 15 Příklad 3

Charakterizace protilátek, specifických pro CD44v6 Buněčná linie

Buněčná linie SCC A-431 lidského původu (spontánní epidermoidní karcinom vulvy) byla získána z veřejné sbírky kultur American Type (Julture Collection (Rockwell MD) a pěstována podle návodu výrobce. Pomocí analýzy FACS byly určeny isoformy CD44v6, vytvořené expresí, přičemž bylo použito protilátky mAb BIWA-1, vázané na FITC. - 28 - • ·» * ·« ·· • * t* · » • * • « • ··· • · · * * ·· • # • · i • • * if «« ·*· M ·· • *

Analýza kinetických konstant

Stanovení afinity a kinetiky monoklonálních protilátek proti CD44v6 a jejich metabolismu bylo provedeno metodou SPR (povrchová resonance plasmonu), při použití systému BIAcore 2000 (Pharmacia Biocensor). Složená bílkovina s obsahem glutathion-S-transferázy a CD44, obsahující oblast, pro niž je kódem exon v3 až vlO (GST/CD44 v3 až vlQ), byla imobi-lizována na sensorovém čipu CM5, přičemž vazba aminu byla provedena podle návodu výrobce. Protilátka byla v různých koncentracích 8 až 132 nM vstřiknuta v pufru HBS, obsahujícím 10 mM Hepes pH 7,4, 150 mM chloridu sodného, 3,4 mM EDTA, 0,05 % smáčedla P20 (BIAcore) na povrchovou plochu, specifickou pro antigen při rychlosti průtoku 5 mikrolitrů na minutu. Reakce byla zaznamenána jako změna signálu SPR. Disociace protilátky byla pozorována 5 minut v proudu pufru HBS. Povrch čipu byl regenerován jediným pulsem 15 mikrolitrů 30 mM HCl. Analýza získaných údajů a vypočítání kinetických konstant byly provedeny při použití vyhodnocovacího softwaru BIA, verse 2.1 (Pharmacia). Tímto způsobem bylo možno srovnat afinitu BIWA-1 k antigenu s afinitou dalších pritlátek mAbs, specifických proti CD44v6 (VFF4, VFF7, BBA-13 /IgGl, R and D Systems, Abin-gdon, Velká Británie/). Kinetické a afinitní konstanty pro různé protilátky byly vždy dvakrát nezávisle stanoveny. V následující tabulce 3 jsou shrnuty hodnoty pro asociaci ka, disociaci k^ a disociační konstanty pro uvedené čtyři protilátky mAbs. Všechny protilátky měly podobné rychlosti asociace a disociace s výjimkou BBA-13, která měla třikrát nižší k a VFF7, která měla podstatně vyšší rychlost disociace 3. (faktor 5). Důsledkem je nižší afinita vazby pro VFF7 a BBA-13 ve srovnání s VFF4 a BIWA-1. BIWA-1 má nejnižší ze všech sledovaných protilátek. - 29 - • φ φ • · φ • · ·

Tabulka 3

Kinetické a afinitní konstanty různých, pro CD44v6-specifických protilátek mAbs

Protilátka ka (M1*-1) kjfr1) Kd(M) VFF4 1.1 x 105 2.6 x ΙΟ'5 2.4 x ΙΟ'10 VFF7 1.1 x 105 1.2 x lCh4 1.1 x 10-9 BIWA-1 1.3 x 105 2.2 x 1 O*5 1.7 x ΙΟ'10 BBA-13 3.7 x 104 2.3 x 10'5 6.2 x ΙΟ'10

Analýza bílkoviny protilátky metodou ELISA

Buňky A-431, u nichž dochází k expresi CD44v6, byly pěstovány na plotnách s 96 vyhloubeními (Falcon Microtest , 4 III, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) v množství 5x 10 na vyhloubení v prostředí RPMI 1640 s 10 % fetálního telecího séra přes noc při teplotě 37 °C. Po promytí PBS/0,05 % Tween 20 byly buňky 1 minutu fixovány ledově chladným etha-nolem a pak promyty. Inkubace s primárními protilátkami VFF4, VFF7, BIWA-1, BBA-13 v množství 1 až 600 ng/ml vždy v pufru k provedení zkoušek se složením FBS/0,5 % BSA/0,05 % Tween 20, byla prováděná 1 hodinu při teplotě místnosti a a byla následována trojím promytím. Jako sekundární protilátka byla užita protilátka králíka proti myší tkáni, IgG, konjugovaná s per-oxidázou z křenu (DAKO Corporation, Kopenhagen, Dánmark) v ředění 1 : 6000 ve svrchu uvedeném zkušebním pufru, reakce trvala 1 hodinu při teplotě místnosti. Po trojím promytí byla vyvolána barevná reakce roztokem TMB (Kirkegaard + Perry, Gaithersburg, USA). Extinkce byla měřena odečítavím zařízením pro zkoušku ELISA (Hewlett-Packard). - 30 - - 30 -

• « ♦ *» Z obr. 3 je zřejmé, že realtivní afinity protilátek, stanovené svrchu uvedenou analýzou BIAcore se odrážely v jejich reaktivitě s nádorovými buňkami, přičemž pro protilátku BIWA-1 bylo zcela zřejmě možno prokázat nejvyšší afinitu této vazby.

Oblast bílkoviny, pro niž je kódem exon v6 CD44 je tvořena 45 zbytky aminokyselin, jak je zřejmé z obr. 4. Aby bylo možno přesněji definovat epitop, rozpoznávaný protilátkou BIWA-1, byla použita řada syntetických peptidů, zkoun-struovaných pro zkoušku ELISA. Předběžné pokusy ukazovaly na vazbu na centrálně lokalizovaný 14-mer, obsahující zbytky aminokyselin 18 až 31 z obr. 4, avšak nikoliv na peptidy vně této oblasti. Byla proto syntetizována druhá skupina peptidů a tato skupina byla podrobena zkouškám při kompetitivním testu ELISA, jehož výsledky jsou znázorněny na obr. 4. Tyto výsledky prokazují, že peptid 19 až 29, WFGNRWHEGYR představuje minimální strukturu, nezbytnou pro vysoce afinitní vazbu. Při odstranění zbytku argininu na C-konci došlo například k více než lOOx slabší vazbě. Příklad 4

Biologická distribuce protilátky CD44v6, značené radioaktivním jodem u bezsrstých myší s xenotransplantáty

Model xenotransplantátu A-431

Myším samicím bezsrstých myší kmene BALB/c nu/nu ve stáří 8 týdnů (B and K Universal, Renton, WA), byly podkožně vstřiknuty vlevo od střední čáry buňky lidského epidermoid- g ního karcinomu vulvy A-431 v množství 5 x 10 . Zvířata s nádorem A-431 byla pak v průběhu 2 týdnu použita pro pokusy s biologickou distribucí, hmotnost nádoru byla 40 až 50 mg. - 31 -

Značení BIWA-1 radioaktivním jodem

Protilátka mAb BIWA-1 (myší IgGl) byla po čištění proteinem G navázána na streptavidin při použití heterobifunkč-ního spojovníku, sukcinimidyl—4-(N-maleiminomethyl)cyklohexan--1-karboxylátu. Streptavidinlysylové zbytky byly navázány na redukované zbytky cysteinylované protilátky, získané předběžným zpracováním této látky, působením dithiothreitolu. Získané konjugáty 1 : 1 (výtěžek vyšší než 90 %) byly dále čištěny chromatografií na iontoměniči. Pro pokusy na biologickou distribuci byl konjugát BIWA-l/SA značen přes primární aminosku-pinu lysinu pomocí I při použití činidla s obsahem p-jod-fenylové skupiny (PIP, NEN Dupont, Wilmington, DE). Pak byl použit způsob podle publikace Wilbur D. Ξ. a další, Development of a stable radioiodinating agent to label monoclonal antibo- dies for radiotherapy of cancer., J. Nucl. Med., 30, 216 až 125 226, 1989. Značení protilátky BIWA-1 pomoci SA nebo I nemění imunologickou reaktivitu nebo farmakokinetiku protilátky u myší.

Pokusy na biologickou distribuci

Bezsrtým myším s xenotransplantáty lidských nádorů A-431 bylo do laterální ocasní žily vstřiknuto 5 až 7 mikroCi 125 I na 50 mikrogramů mAb BIWA-1 se specifickou aktivitou 0,1 až 0,14 mCi/mg. Sledování biologické distribuce v průběhu Času bylo prováděno ve skupinách po třech zvířatech v době 4, 24, 48, 120 a 168 hodin po injekci. V uvedených časových úsecích byly myši zváženy, přes retroorbltální žilní pleteň byla odebrána krev a myši byly usmrceny zlomením vazu. Pak bylo zváženo devět vzorků oránů a tkání, a to krev, ocas, plíce, jácra, slezina, žaludek, ledviny, střevo a nádorová tkáň. Radioaktivita tkáně byla srovnávána se standardem preparátu protilátky při použití gamma-scir.tilačního počítače (Packard - 32 -

·# **

125

Instrument Company, Meriden, CT), přičemž pro I byla na-stavna energie 25 až 80 keV. Pak bylo vypočítáno množství vstřiknuté dávky v procentech na gram tkáně, % ID/g. Předběžné pokusy ukázaly, že BIWA-1 nevykazuje zkříženou reakci s myším antigenem CD44v6. V tabulce 4 a na obr. 5 jsou srovnávány přijaté hodnoty radioaktivity v nádorové a normální tkáni. Jodovaná protilátka BIWA-1 je rychle přijímána nádorovou tkání (7,6 % vstřiknuté dávky/g po 4 hodinách po injekci), po 48 hodinách stoupne tato hodnota na více než 18 % ID/g a pak zůstává tato hodnota až do 120 hodin konstantní. 7 dnů po injekci po 168 hodinách obsahuje nádorová tkáň stále ještě 15,3 % ID/g tkáně. Poměr nádor:tkán byl vypočítán pro jednotlivé časové úseky a je uveden v tabulce 4. Po 24 hodinách po injekci byl poměr nádor:krev 0,48 a po 7 dnech se zvýšil na 3,16. Příjem u normální tkáně byl nízký a byl pravděpodobně způsoben pozadím, vytvořeným ve sledované tkáni přítomností krve. Selektivní in vito-zacílení lidských SCC-xeno-transplantátů u bezsrstých myší pomocí I značené protilátky BIWA-1 prokazuje, že tato monoklonální protilátka má vysoký potenciál jako nosný materiál pro zacílení při diagnostickém i léčebném využití u SCC-nemocných.

Tabulka 4 125

Poměry nádor:tkán pro I-BIWA-1 u bezsrstých myší s nádory A-431 v různých časových úsecích po injekci - 33 - • · m · ·· » · ····* » · · ··♦ ·♦· ··· ·· «·· «* ·· ··

Poměr nádoru ke 4 h 24 h 48 h 120 h 168 h ' krvi 0.22a 0.48 1.31 2.60 3.16 ocasu 1.18 2.62 7.70 12.28 13.06 plícím 0.40 1.03 2.65 7.04 4.82 játrům 0.94 1.18 2.28 3.57 3.24 slezině 1.40 1.84 4.00 4.86 4.42 žaludku 3.89 7.37 19.40 25.56 33.96 . ledvinám 0.82 1.31 2.72 2.79 2.53 střevu 3.54 6.24 11.94 19.24 27.78 a

Střední hodnota pro n = 3, SD je nižší než 7 %. Příklad 5

Rozdílná exprese CD44v6 u velkého počtu lidských nádorů Při rozšířených pokusech bylo sledováno celkem 544 vzorků nádoru imunohistochemicky při použití monoklonální protilátky BIWA-1, klon VFF-18 na expresi CD44v6. Vzorky byly zality do parafinu nebo okamžitě po chirurgickém vyjmutí zmrazený v kapalném dusíku a až do použití uloženy pří teplotě -70 °C. Tímto způsobem byly analyzovány následující nádory: basaliom, n = 16, adenokarcinom AC mléčné žlázy, n = 55, AC tlustého střeva, n = 83, karcinom z dlaždicového epitelu SCO hlavy a krku, n = 125, karcinom plic, n = 120, karcinom prostaty AC, n = 34, karcinom ledvin, n = 27, SCC kůže, n = 15 a AC žaludku, n = 69. Tkáně byly získány běžnou chirurgií nebo biopsií. Imunohistochemické sledování bylo prováděno způsobem podle příkladu 1. V tabulce 5 je uveden přehled imunohistochemické analýzy 397 různých vzorků nádorů pomocí mAb BIWA-1. - 34 - ► ♦ t* ·» • · · ···· · « » · · · ·· φ· ··

Tabulka 5

Exprese CD44v6 u nádorů lidského původu

Typ n positivní případy* n % basaliom primární nádor 16 10 62 AC mléčné primární nádor 17 15 88 žlázy metastázy v uzlinách 34 31 91 metastázy v játrech 4 4 100 AC tlustého metastázy v uzlinách 51 21 41 střeva metastázy v játrech 26 13 50 metastázy v mozku 6 6 100 SCC hrtanu metastázy v uzlinách 18 18 100 AC plic primární nádor 35 15 43 SCC plic primární nádor 9 9 100 SCC jícnu primární nádor 20 20 100 AC prostaty primární nádor 16 5 31 metastázy v uzlinách 18 0 0 RCC primární nádor 27 5 18 SCLC primární nádor 31 7 23 AC žaludku primární nádor 22 15 68 metastázy v uzlinách 43 16 37 metastázy v játrech 4 4 100 celkem n 397 H 10 % nebo více nádorových buněk je pozitivních AC: adenokarcinom, RCC: karcinom ledvinových buněk SCLC: karcinom plic z malých buněk, SCC: karcinom dlaždicového epitelu. - 35 - - 35 - ·· •i ·· ·* • · · · · * • · · * · · • · · · t # · · ··· · · e « · · ♦ · · * · ·»« ·♦ ··· ·* ·· ·* U plicního karcinomu z malých buněk, karcinomu ledvin a AC prostaty nebylo možno pozorovat žádnou nebo bylo možno pozorovat jen malou reaktivitu. U všech ostatních typů sledovaných nádorů docházelo k expresi isoforem CD44v6 v různé míre. Většina sledovaných AC mléčné žlázy byla reaktivní s BIWA-1 a sledované typy SCC hrtanu, plic a jícnu exprimovaly CD44v6 ve 100 % případů.

Bylo sledováno celkem 185 případů SCC různého typu a klasifikace na reaktivitu s BIWA-1. Šlo o 67 případů primárního SCC, a to 15 případů hrtanu, 16 případů dutiny ústní, 3 případy hrtanu a 5 případů pokožky a mimoto o 77 vzorků metastáz v uzlinách, z toho hrtan n = 12, plíce n = 27, jícen n = 11, dutina ústní n = 6, hrtan n = 7, spodní část hrtanu n = 10, mandle n = 4 a tři vzorky metastáz v játrech z jícnu. Přehled imunohistochemické analýzy všech vzorků SCC je shrnut v tabulce 6.

Exprese isoforem CD44v6 byla pozorována u všech nádorů, s výjimkou tří (jeden případ nádoru hrtanu a dva případy nádoru plic). Většina vzorků vykazovala expresi antigenu v 80 až 100 % nádorových buněk v jediném řezu, přičemž barvivo bylo koncentrováno převážně v membráně nádorových buněk. Nejhomogennější zabarvení bylo možno pozorovat v karcinomech hrtanu, jícnu a spodní části hrtanu, přičemž většina nádorových buněk v řezu měla stejnou intenzitu zbarvení. 36 • ·· ·# ·· ·· « · · * * ♦ « « · * · #· Φ · · *·· » · » t i · · · ·*· ·· «« ·· ·· Μ

Tabulka 6

Exprese CD44V6 v karcinomu z dlaždicových buněk

Typ n negativní fokál.posit. positivní n % n % n % Hypopharynx lnm 10 0 0 0 0 10 100 Oropharynx PT 3 0 0 0 0 3 100 lnm 7 0 0 0 0 7 100 Larynx PT 15 0 0 0 0 15 100 lnm 30 1 3 0 0 29 97 plíce PT 18 2 11 0 0 16 89 LNM 27 0 0 1 4 26 96 jícen PT 20 0 0 1 5 19 95 LNM 11 0 0 0 0 11 100 LM 3 0 0 0 0 3 100 dutina ústní PT 16 0 0 0 0 16 100 LM 6 0 0 0 0 6 100 pokožka PT 15 0 0 0 0 15 100 mandle LNM 4 0 0 0 0 4 100 n 185

Fokálne positivní: méně než 10 % nádorových buněk je positivní LNM: metastázy v uzlinách PT: primární nádor LM: metastázy v játrech. Údaje o sekvencích (1) Obecní údaje: i) Přihlašovatel:

A) Jméno: Boehringer Ingelheim International GmbH B) Ulice: Rheinstrasse C) Místo: Ingelheim E) Stát: Německo F) Poštovní směrové číslo: 66216 G) Telefon: +49-(0)-6132-772770 H) Telefax: +49-(0)-6132-774377

A) Jméno: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH B) Ulice: Postfach 3640 C) Místo: Karlsruhe E) Stát: Německo F) Poštovní směrovací číslo: 76021 A) Jméno: Heider, Karl-Hanz B) Ulice: Hervicusgasse 4/3/21 C) Místo: Vídeň E) Stát: Rakousko F) Poštovní směrovací číslo: 1120 A) Jméno: Adolf Guenther B) Ulice: Stiftgasse 15-17/10 C) Místo: Vídeň E) Stát: Rakousko F) Poštovní směrovací číclo: 1070 - 38 - ·* ·* I · · * » · · · A) Jméno: Ostermann Elinborg B) Ulice: Mauerbachstr. 56/6 C) Místo: Vídeň E) Stát: Rakousko F) Poštovní směrovací číslo: 1140 A) Jméno: Patzelt Erik B) Ulice: HansBuchmueller-Gasse 8 C) Místo: Purkersdorf E) Stát: Rakousko F) Poštovní směrovací číslo: 3002 A) Jméno: Sproll Marlies B) Ulice: Schwenkgasse 3 C) Místo: Vídeň E) Stát: Rakousko F) Poštovní směrovací číslo; 1120 ii) Název vynálezu: Molekuly protilátek a způsob diagnózy iii) Počet sekvencí: 16 iv) Forma, odečitatelná počítačem: A) Nosič dat: Floppy disk B) Počítač: IBM PC compatible

C) Systém: PC-D0S/MS-D0S D) Software: Patent In Release 1,0, Version 1,30 (EPA) 2) Údaje o SEQ ID NO: 1 - 39 - • ·Φ ·· ·· «· » * i ·* * • * ♦ ·* • t · · · ·· « » · t ·«· · * • · ♦ * · »·« ·· ·♦ ·* i) Znaky sekvence: A) délka: 129 párů baží B) druh: nukleotid C) forma řetězce: dvojitá D) topologie: obojí ii) Typ molekuly: DNA genomu ix) Znak: A) Jméno/klíč: exon B) poloha: 1 ... 129 D) zvláštní údaje: (produkt = CD44 /značení = v6 /poznámka = Přístup v databazi GenBank č. L05411 /citace = (/1/) ix) Znak:

A) Jméno/klíč: CDS B) poloha: 3...128 x) Informace o zveřejěnní:

A) Autoři: Screaton, GR

Bell MV Jackson DG Cornelis FB Gerth U Bell JI B) Název: Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons C) časopis: Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. D) svazek: 89 F) strany: 12160 - 12164 G) datum: prosinec 1992 K) významné zbytky v SEQ ID NO: 1: 1 až 129 - 40

··· ♦· *»f

·* »* Μ • · · « ft · ·« ··« · · • · * Μ ·· x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) Den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) Den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1: TC CAG GCA ACT CCT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ACC CAG AAG 4 7 Gin Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys 1 5 10 15 GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAA ACA CCC 95 Glu Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro 20 25 30 AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT G 129

Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala 35 40 2) Údaje o SEQ NO: 2 i) znaky sekvence: A) délka: 42 aminokyselin B) druh: aminokyseliny D) topologie; lineární ii) Druh molekuly: bílkovina xi) Popis sekvence: SEQ NO: 2

Gin Ala Thr Pro 1

Gin Trp Phe Gly 20

Glu Asp Ser His 35

Ser Ser Thr Thr 5

Asn Arg Trp His

Ser Thr Thr Gly 40

Glu Glu Thr Ala 10

Glu Gly Tyr Arg 25

Thr Ala

Thr Gin Lys Glu 15

Gin Thr Pro Arg 30 2) Údaje o sekvenci SEQ NO: 3 i) Znaky sekvence: A) délka: 15 aminokyselin B) Druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) Den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 3

Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr 15 10 2) Údaje o sekvenci SEQ NO: 4 i) Znaky sekvence: A) délka: 27 párů baží B) druh: nukleotid C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: nukleová kyselina A) popis: /desc = PCR primer x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 - 42 - x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 4 CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG 27 2) Údaje o sekvenci: SEQ NO: 5 i) Znak sekvence: A) délka: 30 párů baží B) druh: nukleotid C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: nukleová kyselina A) popis: /desc = PCR primer x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 427.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 7. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 5 TGATAAGGAA CGATTGACAT TAGAGTTGGA 30 2) Údaje o SEQ NO: 6 i) Znaky sekvence: A) délka: 11 aminokyselin B) druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární 43 43

ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 6

Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg 1 5 io 2) Údaje o SEQ NO: 7 i) Znaky sekvence: A) délka: 43 aminokyselin B) aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 7 • * · · * ·

Gin Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu 15 10 15

Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Arg 20 25 30

Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala Ala 35 40 2) Údaje o SEQ NO: 8 i) Znaky sekvence: A) délka: 11 aminokyselin B) druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 8

Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys 15 10 2) Údaje o SEQ NO: 9 i) Znaky sekvence: A) délka: 10 aminokyselin B) druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17, dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 9

Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu Gin Trp 15 10 2) Údaje o SEQ NO: 10 i) Znaky sekvence: A) délka: 11 aminokyselin B) druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 - 46 - ♦ * xi) Popis sekvence: SEQ NO: 10

Thr Ala Thr Gin Lys Glu Gin Trp Phe Gly Asn 1 5 10 2) Údaje o SEQ NO: 11 i) Znaky sekvence: A) délka: 14 aminokyselin B) druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 5. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 11

Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr 1 5 10 2) Údaje o SEQ NO: 12 i) Znaky sekvence: A) délka: 11 aminokyselin B) druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid - 47 -

♦ * x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 12

Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro 1 5 10 2) Údaje o sekvenci: SEQ NO. 13 i) Znaky sekvence: A) délka: 11 aminokyselin B) druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 13

Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Arg Glu Asp Ser 15 10 2) Údaje o SEQ NO: 14 48 i) Znaky sekvence: A) délka: 10 aminokyselin B) druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchá D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 14

Thr Pro Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Gly 1 5 10 2) Údaje p SEQ NO: 15 i) Znaky sekvence: A) délka: 42 aminokyselin B) druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchá D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 49 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 15

Trp Ala Asp Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Ala Ala Thr Gin. Lys Glu 15 10 15

Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gin Gly Lys Asn Pro Pro Thr Pro Ser 20 25 30

Glu Asp Ser His Val Thr Glu Gly Thr Thr 35 40 2) Údaje o SEQ NO: 16 i) Znaky sekvence: A) délka: 14 aminokyselin B) druh: aminokyselina C) forma řetězce: jednoduchá D) topologie: lineární ii) Druh molekuly: peptid x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 195 45 472.3 I) den podání: 6. prosince 1995 x) Informace o zveřejnění: H) číslo spisu: DE 196 15 074.4 I) den podání: 17. dubna 1996 xi) Popis sekvence: SEQ NO: 16

Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gin Gly Lys Asn Pro Pro Thr 1 5 10

Zastupuje:

Claims (12)

1. - 50 * n. lvi - ?<? • · t · • · ·· ·· ·· PATENTOVÉ NÁROKY lVxZpůsob léčení karcinomu z dlaždicového epitelu, založený na vasbě molekuly protilátky na epitop, pro nějž je kódem variabilní, exon v6 genu CD44, vyznačující se t í m , že s^rtí něm užívá molekula protilátky, rozpoznávající sekvenci aminokyselin WFGNRWHEGYR.
2. 2. Způsob podle nárokiXl, vyznačující se t í m , že se užije monoklonálniXprotilátka BIWA-1, VFF-18, vytvářená buněčnou linií hybridomu ACC2174 nebo derivát této protilátky. x.
3. 3. Způsob podle některého z nároků l\ž 2, vyznačující se tím, že se užije monoklonalní protilát-ka, fragment Fab nebo F(ab')2 imunoglobulinu, rekorfrbinantní protilátka, rekombinantní chimérní nebo humanizovaná protilátka nebo bifunkční protilátka scFv, popřípadě s jednoduchým řetězcem.
4. 4. Použití molekuly protilátky, schopné se vázat na sekvenci aminokyselin WFGNRWHEGYR k provádění způsobu podle nároků 1 až 3.
5. 5. Použití podle nároku 4, vyznaču jící se tím, že se užije molekula monoklonální protilátky BIWA-1, VFF-18, produkovaná buněčnou linií hybrídomu DSM ACC2174 nebo derivát této protilátky.
6. 6. Použití podle některého z nároků 4 až 5 vyznačující se tím, že se použije molekula mono-klonální protilátky, fragment Fab nebo F(ab )2 imunoglobulinu, rekombinantní protilátka, rekombinantní chimérní nebo humanizovaná protilátka, bifunkční protilátka scFv nebo protilátka scFv s jednoduchým řetězcem. - 51 - - 51 -

   * φ ·· Μ • · • ··
7. 7. Použití molekuly protilátky, schopné se vázat na sekvenci aminokyselin WFGNRWHEGYR k léčení karcinomu z dlaždicového epithelu.
8. 8. Použití podle nároku 7, vyznaču jící se tím, že se užije molekula monoklonální protilátky BIWA-1, VFF-18, produkovaná buněčnou linií hybridomu DSM ACC2174 nebo derivát této protilátky.
9. 9. Použití podle některého z nároků 7 až 8, v y -značující se tím, že se použije monoklonální protilátka, fragment Fab nebo F(ab')^ imunoglobulinu, re-kombinantní protilátka, rekombinantní chimérní nebo humanizovaná protilátka, bifunkční protilátka scFv nebo protilátka scFv s jednoduchým řetězcem.
10. 10. Použití podle některého z nároků 7 až 9 , v y -značující se tím, že se molekula protilátky spojí s radioaktivním isotopem, se sloučeninou, aktivovatel-nou působením světla, s radioaktivní sloučeninou, enzymem, fluorescenčním barvivém, molekulou biotinu, toxinem, cyto-statickou látkou, prekursorem určité látky, molekulou protilátky s odlišnou specifičností, cytokinem nebo jiným poly-peptidem, modulojícím reakci imunitního systému.
11. 11. Prostředek k provádění způsobu podle některého z nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že je tvořen protilátkou nebo molekulou protilátky, schopnou se vázat na sekvenci aminokyselin WFGNRWHEGYR.
12. 12. Použití molekuly protilátky, schopné se vázat na sekvenci aminokyselin WFGNRWHEGYR pro výrobu farmaceutického prostředku k léčení karcinomu z dlaždicového epithelu. Zastupuje: