DE4431297A1 - Monoklonaler Antikörper gegen CD44v6 - Google Patents

Monoklonaler Antikörper gegen CD44v6

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Description

Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper gegen ein Epitop, das vom varianten Exon v6 des DC44-Gens kodiert wird.
Es wurde kürzlich gezeigt, daß die Expression von Varianten des Oberflächen-Glykoproteins CD44 notwendig und hinreichend ist, um sogenanntes spontanes metastatisches Verhalten sowohl in einer nicht-metastasierenden Pankreas-Adenokarzinom-Zellinie der Ratte als auch in einer nicht-metastasierenden Fibrosarkom-Zellinie der Ratte auszulösen (Günthert et al., 1991). Während die kleinste CD44-Isoform, die Standardform CD44s (oder CD44std), in einer Reihe verschiedener Gewebe, darunter Epithelzellen, ubiquitär exprimiert wird, werden bestimmte Spleißvarianten von CD44 (CD44v, CD44var) nur auf einer Untergruppe von Epithelzellen expimiert. Die CD44-Varianten werden durch alternatives Spleißen so erzeugt, daß die Sequenzen von 10 Exons (v1-v10) in CD44s komplett ausgeschnitten werden, jedoch in den größeren Varianten in verschiedenen Kombinationen vorkommen können (Screaton et al., 1992; Tölg et al., 1993; Hofmann et al., 1991). Die Varianten unterscheiden sich dadurch, daß an einer bestimmten Stelle des extrazellulären Teils des Proteins unterschiedliche Aminosäuresequenzen inseriert sind. Solche Varianten konnten in verschiedenen menschlichen Tumorzellen und in menschlichem Tumorgewebe nachgewiesen werden. So wurde kürzlich die Expression von CD44-Varianten im Verlauf der kolorektalen Karzinogenese untersucht (Heider et al., 1993a). Die Expression von CD44-Varianten fehlt in normalem menschlichen Kolonepithel, und nur eine schwache Expression ist in den proliferierenden Zellen der Krypten nachweisbar. In späteren Stadien der Tumorprogression, z. B. in Adenokarzinomen, exprimieren alle malignen Entartungen Varianten von CD44. Gewebsexpression von variantem CD44 auf hohem Niveau konnte auch in aggressiven Non-Hodgkin-Lymphomen gezeigt werden (Koopman et al., 1993).
Eine besondere Rolle insbesondere bei der metastatischen Ausbreitung scheint das Exon v6 zu spielen (Rudy et al., 1993). Im Tiermodell konnten Antikörper gegen v6-spezifische Epitope die Ansiedlung metastasierender Zellen und das Wachstum von Metastasen verhindern (Seiter et al., 1993). In Kolonkarzinomen korreliert v6-Expression mit der Tumorprogression (Wielenga et al., 1993). In Magenkarzinomen ist die v6-Expression ein wichtiger diagnostischer Marker bei der Differenzierung zwischen Tumoren vom intestinalen und solchen vom diffusen Typ (Heider et al., 1993b). Die v6-Expression wurde in den beiden letztgenannten Arbeiten mit Hilfe von Antikörpern gegen v6-spezifische Epitope gemessen.
Monoklonale Antikörper gegen Epitope, die vom Exon v6 kodiert werden, sind im Stand der Technik bekannt (Hofmann et al., 1991, Wielenga et al., 1993). Wegen des hohen potentiellen Nutzens, den solche Antikörper in Diagnose und Therapie haben können, besteht ein hoher Bedarf an Antikörpern mit verbesserten Eigenschaften.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen Antikörper bereitzustellen, der gegenüber den bekannten v6-spezifischen Antikörpern signifikant bessere Eigenschaften aufweist.
Diese Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Sie betrifft einen monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung VFF-18. Die Erfindung berifft ferner eine Hybridoma-Zellinie, die diesen Antikörper sezerniert, und die unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2174 bei der DSM-Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt wurde.
Der Antikörper wurde mit einem Verfahren gemäß Beispiel 1 hergestellt. Es liegt im Können des Durchschnittsfachmanns, Derivate des erfindungsgemäßen Antikörpers herzustellen oder, ausgehend von einer Sequenzanalyse dieses Antikörpers und/oder unter Verwendung der Hybridoma-Zellinie, die diesen Antikörper produziert, rekombinante Antikörper mit dem gleichen Idiotyp zu erzeugen, d. h. Antikörpermoleküle, die im Bereich der Antigen- Bindungsstelle die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen wie der Antikörper VFF-18. Solche Derivate oder rekombinanten Antikörpermoleküle sind daher ausdrücklich in die Erfindung eingeschlossen.
Aus dem kompletten Immunoglobulin des VFF-18-Antikörpers können beispielsweise Fab- oder F(ab′)₂-Fragmente oder andere Fragmente erzeugt werden (Kreitman et al., 1993). Für diagnostische Verfahren können VFF-18-Antikörpermoleküle, Fragmente davon oder rekombinante Antikörpermoleküle mit dem gleichen Idiotyp beispielsweise mit radioaktiven Isotopen wie ¹³¹I, ¹¹¹In, 99mTc oder radioaktiven Verbindungen (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), Enzymen wie Peroxidase oder alkalischer Phosphatase (Catty et Raykundalia, 1989), mit Fluoreszenzfarbstoffen (Johnson, 1989) oder Biotinmolekülen (Guesdon et al., 1979) verknüpft werden. Für therapeutische Anwendungen können VFF-18- oder VFF-18-abgeleitete Antikörpermoleküle mit Toxinen (Vitetta et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), Zytostatika (Schrappe et al., 1992), Prodrugs (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989) oder radioaktiven Substanzen verknüpft werden. Der Antikörper kann ferner mit einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft sein, z. B. mit Tumornekrosefaktor oder Interleukin-2.
Der Fachmann ist weiterhin in der Lage, nach Analyse der Aminosäuresequenz des Antikörpers VFF-18 und/oder unter Verwendung der Hybridoma-Zellinie, die diesen Antikörper produziert, insbesondere der darin enthaltenen genetischen Information, rekombinante Antikörpermoleküle mit dem gleichen Idiotyp wie VFF-18 herzustellen. Entsprechende Verfahren sind Stand der Technik. Solche rekombinanten Antikörpermoleküle können z. B. humanisierte Mausantikörper (Shin et al., 1989; Güssow et Seemann, 1991), bispezifische Antikörper (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989), single-chain-Antikörper (scFv, Johnson et Bird, 1991), komplette oder fragmentarische Immunglobuline (Coloma et al., 1992); Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992), durch chain shuffling erzeugte Antikörper (Winter et al., 1994), oder Fusionsproteine, beispielsweise single-chain-Antikörper/Toxin-Fusionsproteine (Chaudhary et al., 1990; Friedman et al., 1993) sein.
Es liegt ebenfalls im Bereich des Könnens des Durchschnittsfachmanns, das exakte Epitop von VFF-18 zu ermitteln und mit dessen Kenntnis äquivalente Antikörper mit der gleichen Bindungsspezifität herzustellen. Dies kann beispielsweise durch Peptidbindungsstudien wie in Beispiel 2 geschehen, etwa durch Variation des Peptids Hu1. Solche Antikörper sind daher ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von VFF-18- oder VFF-18- abgeleiteten oder äquivalenten Antikörpermolekülen in Diagnostik und Therapie.
Diagnostische Verfahren können an sich bekannte Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörpermoleküle sein, z. B. Enzym-gekoppelte Immunoassays (ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), Radioimmunoassays (Catty et Murphy, 1989) immunhistochemische Verfahren (Heider et al., 1993b) oder Western Blots. Solche Verfahren können zweckmäßig mit aus dem Körper entnommenen Gewebeproben oder Körperflüssigkeiten, beispielsweise aus Biopsien, durchgeführt werden. Die Untersuchungen können qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ erfolgen.
Eine therapeutische Anwendung kann beispielsweise analog zu der Verwendung des Antikörpers ASML1.1 (Seiter et al., 1993) erfolgen. Dabei kann die Applikation systemisch oder topisch erfolgen, beispielsweise durch intravenöse (als Bolus oder Dauerinfusion), intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane o. a. Injektion/Infusion. Es können auch einzelne Organe oder Glieder perfundiert werden. Protokolle für die Verabreichung von konjugierten oder nichtkonjugierten Antikörpern (sei es als komplette Immunglobuline, Fragmente, rekombinante chimäre Moleküle o. ä.) sind Stand der Technik (Mulshine et al., 1991; Larson et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992, Press et al., 1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982).
Die überlegenen Eigenschaften von VFF-18 gegenüber anderen anti-CD44v6-Antikörpern zeigen die Beispiele 2 bis 4.
Abbildungen
Fig. 1: Schematische Darstellung des GST-CD44(v3-v10)-Fusionsproteins. GST=Glutathion-S-transferase von Schistosoma japonicum. v3-v10=variante Insertion von Keratinozyten-CD44. Der Pfeil markiert eine Thrombin-Spaltstelle.
Fig. 2: Sequenzvergleich von Exon v6 des CD44-Gens zwischen Mensch und Ratte. Die Sequenzen der Peptide Ra1 und Hu1, an die die Antikörper 1.1ASML (anti- Ratte CD44v6) und VFF-18 (anti-human CD44v6) binden, sind fett hervorgehoben. Identische Aminosäuren sind durch einen Stern gekennzeichnet.
Fig. 3: Bindung von CD44v6-spezifischen Antikörpern an synthetische Peptide. Die Bindung der Antikörper an die Peptide wurde in einem ELISA bestimmt, bei dem die Peptide immobilisiert und dann mit Antikörperlösungen inkubiert wurden. Nach entsprechenden Waschschritten wurde gebundener Antikörper mit Peroxidase-konjugiertem anti- Maus-IgG-Antikörper nachgewiesen. (A): Im ersten Experiment wurde die Bindung des für Ratten-CD44v6 spezifischen Antikörpers 1.1ASML an das Peptid Ra1 (KWFEN EWQGK NPPT) nachgewiesen. (B): In einem weiteren Versuch wurde ein zu Ra1 homologes Peptid aus der humanen CD44v6-Sequenz synthetisiert. Verschiedene anti-human-CD44v6-Hybridomüberstände wurden an dieses Peptid Hu1 (QWFGN RWHEG YRQT) gebunden. Dabei zeigt sich, daß VFF-18 wesentlich besser an das Peptid bindet als die übrigen eingesetzten Antikörper. (C): Für eine quantitative Evaluierung wurde dieses Experiment mit verschiedenen Konzentrationen von gereinigten Antikörpern wiederholt. Auch hier zeigt sich, daß VFF-18 eine höhere Bindungsaffinität als die anderen Antikörper aufweist.
Fig. 4: Bindung radioaktiv markierter Antikörper an Tumor-Zellen. Die drei Antikörper VFF-7 (anti-v6), VFF-8 (anti-v5) und VFF-18 (anti-v6) wurden mit N-Succinimyl[2,3-³H]propionat radioaktiv markiert und für Bindungstests an verschiedenen Tumorzellinien eingesetzt. Folgende Zellinien wurden dabei verwendet: CHO-CD44var: rekombinante Hamsterzellinie (Chinese Hamster Ovary), die humanes variantes CD44 (Exons v3-v10) an der Oberfläche exprimiert; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO 205: humane Kolonkarzinom-Linien; A431: humane Plattenepithelkarzinom-Linie. Gezeigt ist die spezifische Bindung der Antikörper an die verschiedenen Zellinien. Während die Bindung der v6- spezifischen Antikörper VFF-7 und VFF-18 an die rekombinante Zellinie CHO-DC44var in der gleichen Größenordnung liegt, zeigen die Antikörper an den Tumorzellinien sehr unterschiedliches Bindungsverhalten. In einigen Fällen beobachtet man nur VFF-18- und in geringerem Umfang VFF-8-Bindung (HT-29, CaCo, COLO 205), bei den anderen Zellinien bindet VFF-18 wesentlich besser als VFF-7.
Fig. 5: Nachweis von löslichen CD44-Varianten, die das Exon v6 enthalten, in humanem Normalserum. In einem Sandwich-ELISA wurden die drei v6-spezifischen Antikörper VFF-4, VFF-7 bzw. VFF-18 als Beschichtungsantikörper eingesetzt. In allen drei Fällen wurde als Nachweisantikörper ein mit Peroxidase konjugierter CD44std-spezifischer Antikörper (BU-52, std=standard) verwendet. Gezeigt ist das Signal von zwei verschiedenen humanen Normalseren bei unterschiedlichen Verdünnungen in diesen Tests ((A) und (B)). In beiden Fällen ist mit VFF-18 ein wesentlich stärkeres Signal zu beobachten als mit den beiden anderen Antikörpern.
Fig. 6: Serumwerte von v6 enthaltenden CD44-Varianten. Mit zwei verschiedenen ELISAs wurde der Gehalt an löslichem CD44var in Seren von 6 gesunden Spendern bestimmt. In einem Test wird VFF-7, im anderen VFF-18 als Beschichtungsantikörper verwendet; beide Antikörper erkennen das Exon v6. Als Vergleichspräparat diente in beiden Fällen eine in CHO-Zellen hergestellte rekombinante lösliche CD44-Variante (Exon v3-v10). Der VFF-18-ELISA zeigt im Durchschnitt um 3,5mal höhere Werte an als der VFF-7- ELISA. Dies bedeutet, daß das im Serum vorkommende lösliche CD44var von VFF-18 besser erkannt wird als von VFF-7.
Beispiele Beispiel 1 Herstellung des monoklonalen Antikörpers VFF-18 Klonierung von pGEX-Fusionsproteinen
Die gesamte variante Region des HPKII-Typs von CD44v (Hofmann et al., 1991) wurde aus menschlicher Keratinozyten-cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die beiden PCR-Primer
5′-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3′, Positionen 25-52, und 5′-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3′,
Positionen 1013-984 der LCLC97-varianten Region, wie von Hofman et al. beschrieben, enthielten eine EcoRI-Erkennungsstelle, die benutzt wurde, um das PCR-Produkt direkt in den Vektor pGEX-2T (Smith et al., 1988) zu klonieren. Das resultierende Konstrukt (pGEX CD44v HPKII, v3-v10) kodiert für ein Fusionsprotein von ∼70 kD, bestehend aus Glutathion-S- transferase von Schistosoma japonicum und den Exons v3-v10 von humanem CD44 (Fig. 1; Heider et al., 1993a). Das Fusionsprotein wurde in E. coli exprimiert und anschließend über Glutathion-Agarose affinitätsgereinigt (Smith et al., 1988).
Immunisierung und Screening
Weibliche Balb/c-Mäuse wurden intraperitoneal mit dem affinitätsgereinigten Fusionsprotein nach folgendem Schema immunisiert:
1. Immunisierung= 90 µg Fusionsprotein in komplettem Freund'schen Adjuvans,
2. und 3. Immunisierung= 50 µg Fusionsprotein in inkomplettem Freund'schen Adjuvans.
Die Immunisierungen erfolgten im Abstand von jeweils 4 Wochen. 14 Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere noch an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit jeweils 10 µg Fusionsprotein in PBS immunisiert. Am darauffolgenden Tag wurden Milzzellen eines Tieres mit hohem Antikörpertiter mit P3.X63-Ag8.653-Mausmyelomzellen mit Hilfe von Polyethylenglycol 4000 fusioniert. Die Hybridomzellen wurden dann in Mikrotiterplatten in HAT-Medium selektioniert (Köhler et Milstein, 1975; Kearney et al., 1979).
Die Bestimmung des Antikörpertiters bzw. Serum bzw. das Screening der Hybridomüberstände wurde mit Hilfe eines ELISAs durchgeführt. Bei diesem Test wurden zunächst Mikrotiterplatten mit Fusionsprotein (GST-CD44v3-10) oder nur mit Glutathion-S-transferase beschichtet. Anschließend wurde mit seriellen Verdünnen von Serumproben bzw. Hybridomüberständen inkubiert und die spezifischen Antikörper mit Peroxidase-konjugierten Antikörpern gegen Maus-Immunglobulin nachgewiesen. Hybridome, die nur mit Glutathion-S-transferase reagierten, wurden verworfen. Die verbleibenden Antikörper wurden zunächst in einem ELISA mit domänenspezifischen Fusionsproteinen (Exon v3, Exon v5 + v6, Exon v6 + v7, Exon v8-v10) charakterisiert (Koopman et al., 1993). Ihre immunhistochemische Reaktivität wurde an menschlichen Hautschnitten getestet. Der Antikörper VFF-18 wurde dann über Bindung an das synthetische Peptid Hu1 (QWFGN RWHEG YRQT) identifiziert. Die Sequenz von Hu1 ist ein Fragment des humanen CD44- Exons v6.
Beispiel 2 Bindung von CD44v6-spezifischen Antikörpern an synthetische Peptide
Die Bindung CD44v6-spezifischer Antikörper an synthetische Peptide wurde in einem ELISA bestimmt.
Lösungen
Beschichtungspuffer:
0,05 M Natriumcarbonat pH 9,6
Assay-Puffer: PBS (Phosphate Buffered Saline
0,5% BSA (Rinderserumalbumin)
0,05% Tween 20
Substratlösung: Fa. Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg MD, USA; TMB Peroxidase Substrat: Peroxidase Lösung B (H₂O₂) 1 : 1
Die Peptide (50 µg/ml in Beschichtungspuffer) wurden an NUNC Maxisorp Immunoplatten (1.1ASML) oder Acti-A-Platten der Fa. Bio Products (VFF-Antikörper) bei 4°C über Nacht immobilisiert. Bei den Acti-A-Platten wird das Peptid kovalent an die Platte gebunden. Anschließend wurde mit PBS/0,05% Tween gewaschen, freie Adsorptionsstellen an der Plattenoberfläche mit Assay-Puffer blockiert (1 Stunde bei Raumtemperatur), und wiederum einmal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Acti-A-Platten wurden nach dem Blockieren mit 10 mM Natriumborhydrid in 20 mM Natriumhydrogencarbonat, pH 9,0, reduziert (1 Stunde bei Raumtemperatur schütteln) und anschließend dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Dann wurden Hybridomüberstände bzw. Antikörperlösungen in Assay-Puffer in Konzentrationen zwischen 0,02 und 10,0 µg/ml in die Näpfe gegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur in einem Plattenschüttler inkubiert. Daran schlossen sich drei Waschschritte mit PBS/0,05% Tween 20 an. Dann wurden 100 µl/Napf mit Meerettichperoxidase konjugierter anti-Maus-IgG-Antikörper in einer geeigneten Verdünnung in Assay-Puffer zugesetzt. Nach zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur am Plattenschüttler wurde dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und mit Substratlösung gefärbt. Nach 10-15 min Entwicklung wurde mit 2 M Schwefelsäure gestoppt, und die Absorption bei 450 nm (Referenz 690 nm) am Photometer gemessen.
In einem ersten Experiment wurde die Bindung des für Ratten-CD44v6-spezifischen Antikörpers 1.1ASML an das Peptid Ra1 (KWFEN EWQGK NPPT) nachgewiesen (Tabelle 1, Fig. 3(A)).
Tabelle 1
In einem weiteren Versuch wurde ein dem Ra1 homologes Peptid aus der humanen CD44v6-Sequenz synthetisiert (Hu1, QWFGN RWHEG YRQT). Verschiedene anti-human- CD44v6-Antikörper wurden an Hu1 gebunden. Dabei zeigt sich, daß VFF-18 eine überraschend höhere Bindungsaffinität aufweist als alle anderen eingesetzten Antikörper (Tabelle 2, Fig. 3(B)).
Tabelle 2
Zur quantitativen Evaluierung wurden außerdem gereinigte anti-human-CD44v6- Antikörper in verschiedenen Konzentrationen an das Peptid Hu-1 gebunden. Auch hier zeigt sich die deutlich bessere Bindungsaffinität im Vergleich mit den anderen Antikörpern (Tabelle 3, Fig. 3(C)).
Tabelle 3
Beispiel 3 Bindung radioaktiv markierter CD44v6-spezifischer Antikörper an Tumor- Zellinien Radioaktive Markierung der Antikörper
1 mCi N-Succinimidyl-[2,3-³H]-propionat ([³H]-NSP, Amersham 1 mCi/ml) wurden in einem silikonisierten Probenröhrchen bei 0°C am Wasserstrahlvakuum bis fast zur Trockne eingedamft. 15 µg Antikörper (1 mg/ml in PBS, pH 7,4) wurden eingesetzt und 48 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde überschüssiges [³H]-NSP durch Reaktion mit 30 µl 1M Glycin in PBS (20 min bei Raumtemperatur) abgefangen. Die Abtrennung des markierten Antikörpers vom (³H]-Glycin erfolgte über eine Sephadex-G-25-M-Säule (Säulenvolumen 15 ml), wobei als Laufpuffer PBS/0,5% BSA verwendet wurde. Der [³H)- markierte Antikörper erscheint im Ausschlußvolumen. Die Menge an Antikörper wurde in einem ELISA zur Detektion von Mäuseimmunglobulin bestimmt und die spezifische Aktivität errechnet.
Bindung der radiomarkierten Antikörper an Tumorzellen
Die drei Antikörper VFF-7 (anti-v6), VFF-8 (anti-v5) und VFF-18 (anti-v6) wurden mit N-Succinimidyl-[2,3-³H]propionat radioaktiv markiert und für Bindungstests an verschiedenen Tumorzellinien eingesetzt. Folgende Zellinien wurden dabei verwendet: CHO- CD44var: rekombinante Hamsterzellinie (Chinese Hamster Ovary), die humanes variantes CD44 (Exons v3-v10) an der Oberfläche exprimiert; HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO 205: humane Kolonkarzinom-Linien; A431: humane Plattenepithelkarzinom-Linie.
Die Zellen wurden in 12-Loch-Gewebekulturplatten angesetzt, über Nacht bei 37°C im CO₂-Brutschrank inkubiert, anschließend einmal mit PBS gewaschen und mit Ethanol fixiert (1 min bei Raumtemperatur). Dann wurde einmal mit Kulturmedium (RPMI 1640/10% fötales Kälberserum) gewaschen und der radioaktive Antikörper (250 000 dpm/Napf in Kulturmedium) gebunden. Nach einer Inkubation von 25 Stunden bei Raumtemperatur am Plattenschüttler wurde dreimal mit PBS/0,5% BSA gewaschen, die Zellen mit 0,1 M NaOH/1% Triton X-100 solubilisiert und die Radioaktivität im Szintillationszähler gemessen. Unspezifische Bindung wurde in Anwesenheit von einem 100fachen Überschuß unmarkiertem Antikörper bestimmt. Die Bindung wurde auf eine einheitliche Zellzahl (400 000 Zellen) bezogen. Nach Bestimmung der spezifischen Aktivität der Antikörper kann die gebundene Antikörpermenge in fmol ausgedrückt werden.
Tabelle 4 und Fig. 4 zeigen die spezifische Bindung der Antikörper an die verschiedenen Zellinien. Während die Bindung der v6-spezifischen Antikörper VFF-7 und VFF-18 an die rekombinante Zellinie CHO-CD44var annähernd gleich ist, zeigen die Antikörper an den Tumorzellen sehr unterschiedliches Bindungsverhalten. In einigen Fällen beobachtet man nur VFF-18- und in geringerem Umfang VFF-8-Bindung (HT-29, CaCo, COLO 205), bei den anderen Zellinien bindet VFF-18 wesentlich besser als VFF-7.
Tabelle 4
Beispiel 4 ELISA zur Bestimmung von löslichem CD44v6 im Serum
Lösungen
Beschichtungspuffer:
0,05 M Natriumcarbonat pH 9,6
Assay-Puffer: PBS (Phosphate Buffered Saline
0,5% BSA (Rinderserumalbumin)
0,05% Tween 20
Sample Diluent Fa. Bender MedSystems, Wien, Österreich
Substratlösung Fa. Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA; TMB Peroxidase Substrat: Peroxidase-Lösung B (H₂O₂) 1 : 1
Mikrotiterplatten (Nunc-Immunoplate MaxiSorp F96) wurden mit 5 µg/ml eines der CD44v6-spezifischen Antikörper beschichtet (Inkubation bei 4°C über Nacht). Anschließend wurde mit PBS/0,05% Tween gewaschen, freie Adsorptionsstellen an der Plattenoberfläche mit Assay-Puffer blockiert (1 Stunde bei Raumtemperatur), und wiederum einmal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Die Serumproben wurden dann mindestens 1 : 5 in Sample Diluent vorverdünnt und in seriellen 1 : 2-Verdünnungen in der Platte in Sample Diluent weiterverdünnt. Anschließend wurden 50 µl/Napf mit Meerettichperoxidase konjugierter anti-CD44std-Antikörper (Klon BU-52, The Binding Site, Birmingham) in einer geeigneten Verdünnung (1 : 3000-1 : 10 000) in Assay-Puffer zugesetzt. Nach dreistündiger Inkubation bei Raumtemperatur am Plattenschüttler wurde dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und mit Substratlösung gefärbt. Nach 10-15 min Entwicklung wurde mit 2M Schwefelsäure gestoppt, und die Adsorption bei 450 nm (Referenz 690 nm) am Photometer gemessen.
Zur Quantifizierung wurde eine serielle Verdünnung in Assay-Puffer eines löslichen CD44-Standardpräparates parallel zu den Serumproben aufgelegt. Dieses Präparat wurde aus einem Überstand von rekombinanten Hamster-Zellen (CHO) aufgereinigt, die lösliches CD44v3-v10 exprimieren. Bei CD44v3-v10 handelt es sich um eine humane CD44-Variante, die durch die Exons v3 bis v10 kodierte Peptidsequenzen enthält.
Tabelle 5 und Fig. 5 zeigen den Nachweis von löslichen CD44-Varianten, die das Exon v6 enthalten, in humanem Normalserum. In einem Sandwich-ELISA wurden die drei v6-spezifischen Antikörper VFF-4, VFF-7 bzw. VFF-18 als Beschichtungsantikörper eingesetzt. In allen drei Fällen wurde als Nachweisantikörper ein mit Peroxidase konjugierter CD44std-spezifischer Antikörper (BU-52, std=standard) verwendet. Gezeigt ist das Signal von zwei verschiedenen humanen Normalseren bei unterschiedlichen Verdünnungen in diesen Tests. In beiden Fällen ((A) und (B)) ist mit VFF-18 ein wesentlich stärkeres Signal zu beobachten als mit den beiden anderen Antikörpern.
Tabelle 5A
Serum 1
Tabelle 5B
Serum 2
Tabelle 6 und Fig. 6 zeigen Serumwerte von v6 enthaltenden CD44-Varianten. Mit zwei verschiedenen ELISAs wurde der Gehalt an löslichem CD44var in Seren von 6 gesunden Spendern bestimmt. In einem Test wurde VFF-7, im anderen VFF-18 als Beschichtungsantikörper verwendet; beide Antikörper erkennen das Exon v6. Als Vergleichspräparat diente in beiden Fällen eine in CHO-Zellen hergestellte rekombinante lösliche CD44-Variante (Exon v3-v10). Der VFF-18-ELISA zeigt im Durchschnitt um 3,5mal höhere Werte an als der VFF-7-ELISA. Dies bedeutet, daß das im Serum vorkommende lösliche CD44var im Vergleich zum rekombinanten Protein von VFF-18 besser erkannt wird als von VFF-7.
Tabelle 6
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Claims (15)

1. Antikörper gegen ein Epitop innerhalb der Aminosäuresequenz, die durch das variable Exon v6 des CD44-Gens kodiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß es der Antikörper VFF-18 ist, der von der Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2174 gebildet wird.
2. Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2174.
3. Antikörper-Derivat, erhältlich durch chemische oder enzymatische Modifikation eines Antikörpers gemäß Anspruch 1.
4. Antikörper-Derivat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fragment eines Antikörpers gemäß Anspruch 1 ist.
5. Antikörper-Derivat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fab- oder ein F(ab′)₂-Fragment ist.
6. Antikörper-Derivat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem anderen Molekül verknüpft ist.
7. Antikörper-Derivat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das andere Molekül ein Polypeptid ist.
8. Antikörper-Derivat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem radioaktiven Isotop verknüpft ist.
9. Rekombinanter Antikörper mit dem Idiotyp eines Antikörpers gemäß Anspruch 1.
10. Rekombinanter Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein chimärer, humanisierter, Einzelketten(single-chain)- oder durch chain shuffling erzeugter Antikörper ist.
11. Antikörper, der das gleiche Epitop erkennt wie der Antikörper gemäß Anspruch 1.
12. Verwendung eines Antikörpers oder Antikörper-Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 11 zu diagnostischen Verfahren außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ein Enzym-gekoppelter Immunoassay oder ein Radioimmunoassay ist.
14. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ein immunhistochemisches Verfahren ist.
15. Antikörper oder Antikörper-Derivat nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 11 zur pharmazeutischen Verwendung.
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