KR100379217B1 - CD44v6에대한모노클로날항체 - Google Patents

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알. 아돌프 귄터
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베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
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Abstract

본 발명은 CD44 유전자의 엑손 v6 변이체(variant)에 의해 코드화된 에피토프에 대해 활성인 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 공지의 항체에 비해 우수한 성질을 지니고 있으며 치료 및 진단에 사용하기 적합하다.

Description

CD44v6 에 대한 모노클로날 항체
본 발명은 CD44 유전자의 변이체(variant) 엑손 v6 에 의해 코드화된 에피토프에 대한 모노클로날 항체, 그로부터 유도된 항체 분자 및 진단 및 치료를 목적으로 하는 항체 또는 항체 분자의 용도에 관한 것이다.
표면 당단백질 CD44 변이체의 발현이 쥐의 비전이성 췌장 선암 세포주(non-metastasizing rat pancreatic adenocarcinoma cell line) 뿐아니라 쥐의 비전이성 섬유성 육종 세포주(non-metastasizing rat fibrosarcoma cell line)의 소위 자발적인 전이를 유발시키기에 필요 충분한 것으로 최근에 밝혀졌다(et al., 1991). 한편, 가장 작은 크기의 CD44 동종형태(isoform)인 표준 형태 CD44s (또는 CD44 std) 는 상피세포를 포함하는 서로다른 조직내의 도처에서 발현되며, 어떤 CD44 슬라이스(slice) 변이체(CD44, CD44var)는 상피세포의 서브셋내에서만 발현된다. CD44 변이체는 10개의 엑손(v1-v10) 서열이 CD44s 에서 완전히 절단되는 방식으로 교차 스플라이싱(splicing)됨으로써 생성되나, 서로다른 조합으로 더 큰 변이체가 나타날 수도 있다(Screaton et al., 1992;et al., 1993; Hofmann et al., 1991). 변이체들은 단백질의 세포외 영역의 특정부위에 서로다른 아미노산 서열이 삽입된다는 점에서 상이하다. 이러한 변이체는 다양한 인간 종양 세포 뿐아니라 인간 종양 조직에서도 검출될 수 있다. 따라서, 최근 결장직장의 발암화 과정에서 CD44 변이체의 발현이 조사되었다(Heider et al., 1993a). CD44 변이체는 정상적인 인간 결장 상피에서 발현되지 않으며, 소낭선(crypt)의 증식 세포내에서 단지 일주일간의 발현이 탐지될 수 있다. 종양, 예를들어 선암 진행의 말기에는 모든 악성 종양들이 CD44 의 변이체를 발현시킨다. 변이체 CD44 의 조직내 발현은 또한 공격적인 비-호지킨 림프중(aggressive Non-Hodgkin lymphomas)에서도 높은 수준으로 나타난다(Koopman et al., 1993).
엑손 v6는 특히 전이과정중에 특별한 역할을 담당하는 것으로 보인다(Rudy et al., 1993). 동물모델에서, v6 특이적 에피토프에 대한 항체는 전이성 세포의 정착 및 전이부의 성장을 억제할 수 있다(Seiter et al., 1993). 결장암에서, v6 의 발현은 종양진행과 관련이 있다(Wielenga et al., 1993). 위암에서, v6 발현은 장타입(intestinal type)종양을 확산타입(diffuse type) 종양과 구분하기위한 중요한 진단 마커이다(Heider et al., 1993b). 나중의 두가지 문헌에서, v6 발현은 v6 특이적 에피토프에 대한 항체를 사용하여 측정되었다.
엑손 v6 에 의해 코드화된 에피토프에 대한 모노클로날 항체는 공지되어있다(Hofmann et al., 1991; Wielenga et al., 1993). 이러한 항체들이 진단 및 치료에 있어서 높은 잠재적 유용성을 갖고 있기 때문에 개선된 성질을 갖는 항체가 크게 요구되어 왔다.
본 발명은 공지의 v6 특이적 항체에 비해 상당히 개선된 성질을 갖는 항체를 제공함을 목적으로 한다.
본 발명에서는 이 목적을 달성하였으며, VFF-18로 명명된 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이며, 이 세포주는 DSM ACC2174 의 수탁번호로 DSM-Deutsche SammlungMikroorg-anismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany 에 기탁되었다.
본 명세서에서 용어 "항체" 또는 "항체 분자" 는 완전한 면역글로블린 뿐아니라 결합특이성 및 친화성에 있어서 이와 균등한 물질, 항체 유도체 및 재조합 항체 분자를 의미하는 것으로 이해된다.
항체 VFF-18 은 실시예 1의 방법에 따라 제조하였다. 이 항체는 또한 기탁된 하이브리도마 세포주로부터도 수득될 수 있다. 당업자라면 항체의 서열분석으로부터 시작하고/하거나 이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 사용함으로써 본 발명에 따른 항체의 유도체를 제조하거나 동일한 유전형(idiotype)을 갖는 재조합 항체분자, 즉 항원결합부위 영역(complementarity-determining regions, CDR)에 항체 VFF-18과 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체 분자, 를 용이하게 제조할 수 있다. 따라서, 이러한 유도체나 재조합 항체 분자는 명백히 본 발명의 범위에 포함된다.
예를들어, VFF-18 항체의 완전한 면역글로블린으로부터 Fab 또는 F(ab')2단편 또는 다른 단편들이 생성될 수 있다(Kreitman et al., 1993). 진단과정에서 VFF-18 항체 분자, 그의 단편, 또는 동일한 유전형을 갖는 재조합 항체 분자들은 예를들어131I,111In,99mTc와 같은 방사성 동위원소 또는 방사성 화합물(Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), 과산화효소 또는 알칼린포스파타제와 같은 효소(Catty et Raykundalia, 1989), 형광염료(Johnson, 1989), 또는 바이오틴 분자(Guesdon et al., 1979)과 연결될 수 있다. 치료목적으로 적용함에 있어서, VFF-18 또는 VFF-18 유래의 항체 분자들은 독소(Vitetta et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), 세포증식억제제(cyt-ostatics)(Schrappe et al., 1992), 약물전구체(prodrugs)(Wang et al., 1992; Senter et al., 1989) 또는 방사성 물질과 연결될 수 있다. 또한, 항체는 사이토카인(cyto-kine) 또는 면역조절성 폴리펩타이드, 예를들어 종양괴사인자 또는 인터루킨-2와 연결될 수 있다.
한편, 항체 VFF-18 의 아미노산 서열을 분석하고/하거나 이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 이용하며, 특히 이들 세포내에 들어있는 유전정보를 분석함으로써 당업자라면 VFF-18과 동일한 유전형을 갖는 재조합 항체 분자를 제조할 수 있다. 이를 달성하는 방법은 당해 기술분야에 있어서 통상의 기술이다. 예를들어, 이러한 재조합 항체는 인간화된(humanized) 항체 (Shin et al., 1989 ;et Seemann, 1991), 이중특이적 (bispecific) 항체 (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989), 단일 쇄 항체(scFv, Johnson et Bird, 1991), 면역글로블린의 전체 또는 단편(Coloma et al., 1992; Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992), 또는 쇄의 셔플링(shuffling)에 의해 생산된 항체(Winter et al., 1994)일 수 있다. 인간화된 항체는 예를들어 CDR 그라프팅(grafting)에 의해 제조될 수 있다(EP 0239400). 뼈대(framework) 부분도 변형될 수 있다(EP 0519596). 항체를 인간화시키기 위하여 예를들어 PCR(참조: 예를들어 EP 0368684; EP 0438310; WO 9207075) 또는 컴퓨터모델링(참조: 예를들어 WO 9222653) 방법이 최근들어 사용되고 있다. 단일 쇄 항체/독소 융합단백질(Chaudhary et al., 1990; Friedman et al., 1993)과 같은 융합 단백질들도 제조될 수 있다. 따라서 이러한 종류의 항체 분자들도 본 발명의 범위에 포함된다.
당업자라면 VFF-18 의 정확한 에피토프를 확인할 수 있으며, 이러한 지식에 의거하여 동일한 결합 특이성을 갖는 균등한 항체를 제조할 수 있다. 정확한 에피토프는 실시예 2에 기재한 펩타이드 결합 연구, 예를들어 펩타이드 Hul 의 서열을 변화시키는 것에 의하여 확인될 수 있다. 따라서, 이러한 항체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 또다른 관점은 VFF-18 또는 VFF-18로부터 유래되었거나 균등한 항체 분자를 진단 및 치료에 이용하는 것이다.
진단은 본 발명의 항체분자를 이용하여 공지의 방법, 예를들어 효소-연결된 면역검정법(ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), 방사선면역검정법(Catty et Murphy, 1989), 면역조직화학법(Heider et al., 1993b), 또는 웨스턴블롯에 기초하여 수행될 수 있다. 적절하게는, 이러한 진단이 예를들어 생체조직검사를 통해 인체로 부터 수득된 조직시료 또는 액체를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 분석은 정성적으로, 반-정량적으로, 또는 정량적으로 수행될 수 있다. 항체 또는 항체 분자들은 선행문헌에 기술되어 있는 바에 따라 다른 v6 특이적 항체(WO 9500851) 대신으로 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 항체 또는 항체 분자들의 유리한 성질은 그러한 방법들에 상당한 개선을 부여한다.
시험관내 진단과는 별도로, 본 발명에 따른 항체 분자들은 또한 생체내 진단, 특히 종양의 진단에 적합하다. 만약 항체 분자가 검출될 수 있는 표지를 갖는다면 그 표지(label)는 진단목적으로, 예를들어 생체내 종양을 형상화하거나 방사능에 의해 지시되는(radioguided) 외과용으로 탐지될 수 있다. 예를들어, 항체를 방사성 동위원소와 결합시켜 면역 섬광계수법(imaging)에 이용하고자 한다면, 이를 실행에 옮길 수 있는 방법은 수없이 많다(Siccardi et al., 1989; Keenan et al., 1987; Perkins and Pimm, 1992; Colcher et al., 1987; Thompson et al., 1984).
치료적 적용은 항체 ASML1.1(Seiter et al., 1993)를 이용하는 경우와 유사하게 수행될 수 있다. 항체 분자는 전신 또는 국소적으로, 예를들어 정맥내(식괴 또는 퍼먼트(permant) 주입), 복강내, 근육내, 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여될 수 있다. 또한, 단일 기관 또는 사지(extremity)에 관류될 수도 있다. 접합되거나 비-접합된 항체(완전한 면역글로블린, 단편, 재조합 키메릭 분자 등)의 적용 수순은 문헌에 기술되어 있다(Mulshine et al., 1991; Larson et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992; Press et al., 1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982).
다른 항-CD44v6 항체들과 비교된 VFF-18의 우수성은 실시예 2 내지 4에서 입증된다.
도면
제 1 도는 GST-CD44(v3-v10) 융합단백질을 도식적으로 나타낸 것이다. 여기서 GST는 쉬스토소마 야포니쿰(Schistosoma japonicum)의 글루타치온-S-트랜스퍼라제를 나타내고, v3-v10은 각질세포성 CD44의 변이체 삽입물을 나타낸다. 화살표는 트롬빈 절단부위를 나타낸다.
제 2도는 인간과 쥐의 CD44 유전자의 엑손 v6 서열을 비교한 것이다. 항체 1.1ASML(항-쥐 CD44v6) 또는 VFF-18(항-인간 CD44v6)에 의해 인식된 펩타이드 Ra1 및 Hu1 의 서열이 각각 굵게 표시되어 있다. 동일한 아미노산은 * 로 표시하였다.
제 3 도는 CD44v6 특이적 항체와 합성 펩타이드와의 결합을 나타낸 것이다. 펩타이드에 대한 항체의 결합은 ELISA 에 의해 측정되었으며, 여기서 펩타이드는 고정된 후 항체용액과 함께 배양되었다. 적절히 세척한 후, 결합된 항체를 퍼옥시다제-접합된 항-마우스 IgG 항체로 탐지하였다. (A): 첫번째 실험에서, 쥐의 특이적 CD44v6 항체인 1.1ASML과 펩타이드 Ra1(KWFEN EWQGK NPPT)과의 결합이 확인되었다. (B): 추후 실험에서, Ra1 과 동종(homologous)이나 인간 CD44v6 서열로부터 유래된 펩타이드를 합성하였다. 서로다른 항-인간 CD44v6 하이브리도마 상등액을 Hu1(QWFGN RWHEG YRQT)라 명명된 상기 펩타이드에 결합시켰다. VFF-18은 시험된 다른 항체들에 비해 펩타이드에 훨씬 잘 결합하는 것으로 나타났다. (C): 정량적으로 평가하기 위하여 서로다른 농도의 정제된 항체를 가지고 실험을 반복하였다. 또한, 이 실험에서는 VFF-18 이 다른 항체들에 비해 더 높은 결합친화성을 갖고 있는 것으로 나타났다.
제 4 도는 방사능 표지된 항체와 종양세포의 결합을 나타낸 것이다. 3 가지의 항체, VFF-7(항-v6), VFF-8(항-v5), 및 VFF-18(항-v6) 를 N-숙신이밀[2,3-3H]프로피오네이트로 방사능 표지하고 서로다른 종양세포주에 대한 결합분석에 사용하였다. 이때, CHO-CD44var: 세포표면에 인간 변이체 CD44(엑손 v3-v10)을 발현시키는 재조합 햄스터 세포주(Chinese hamster ovary); HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO 205: 인간 결장암 세포주; 및 A431: 인간 판상 암세포주(squame-ous cell carcinoma line)와 같은 세포주가 사용되었다. 서로다른 세포주에 대한 항체의 특이적 결합을 나타내었다. 재조합 세포주 CHO-CD44var 에 대한 v6 특이적 항체 VFF-7 및 VFF-18 의 결합이 동일한 크기로 나타난 반면, 이들 항체들은 종양세포주에 대해서는 상호간에 매우 다른 결합 양상을 나타내었다. 어떤 경우에는 VFF-18 및 VFF-8 (적은 정도로)의 결합만이 관찰되는 반면(HT-29, CaCo, COLO 205), 다른 경우에는 VFF-18 이 VFF-7 에 비하여 훨씬 많이 결합한다.
제 5 도는 엑손 v6를 포함하는 가용성 CD44 변이체를 정상적인 인간 혈청에서 검출한 결과를 나타낸 것이다. 3 가지의 v6 특이적 항체 VFF-4, VFF-7 및 VFF-18 를 각각 샌드위치 ELISA 에서 코팅용 항체로 사용하였다. 3 가지 경우 전부에서 퍼옥시다제-결합된 CD44std 특이적 항체(BU-52, std=standard)를 검출용 항체로 사용하였다. 분석 (A) 및 (B) 에서는 각각 서로다른 희석배수에서 2 가지의 서로다른 정상적인 인간 혈청의 시그널을 나타내었다. 양 경우에, VFF-18 은 두가지의 다른 항체들에 비해 상당히 강한 시그널을 나타내고 있다.
제 6 도는 v6 를 포함하는 CD44 변이체의 혈청중 농도를 나타낸 것이다. 6 명의 건강한 공여자(donor)의 혈청에 존재하는 가용성 CD44var 함량을 2 가지의 서로다른 ELISA 로 측정하였다. 한 시험에서는 VFF-7 이 코팅용 항체로 사용된 반면,다른 시험에서는 VFF-18 이 사용되었다. 두 항체 모두 엑손 v6을 인지한다. 양 경우에, CHO 세포에서 생산된 재조합 가용성 CD44 변이체(엑손 v3-v10)를 대조군으로 사용하였다. VFF-18 ELISA 는 VFF-7 FLISA 에 비해 평균해서 3.5배 더 높은 수치를 나타내었는데, 이는 혈청중에 나타나는 가용성 CD44var 이 VFF-7 에 비해 VFF-18 에 의해 더욱 잘 인식됨을 의미한다.
실시예 1: 모노클로날 항체 VFF-18의 제조
pGEX 융합단백질의 클로닝
HPKII 타입 CD44v(Hofmann et al., 1991)의 전체 가변 부분을 인간 각질세포 cDNA 로부터 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭시켰다. 사용된 두개의 PCR 프라이머(호프만 등에 의해 기술된 바에 따라 LCLC97 가변 부분의 25-52 위치에 해당하는및 1013-984 위치에 해당하는)는 EcoRI 인식부위를 가지고 있으며, 이는 PCR 산물을 곧바로 벡터 pGEX-2T(Smith et al., 1988)에 클로닝시키는데 사용되었다. 생성된 작제물(pGEX CD44v HPKII, v3-v10)은 쉬스토소마 야포니쿰의 글루타치온-S-트랜스퍼라제 및 인간 CD44 의 엑손 v3-v10 으로 구성되는 약 70kdal 의 융합단백질을 코드화 한다(제 1 도; Heider et al., 1993a). 융합단백질은 E.coli에서 발현되었으며 계속하여 글루타치온 아가로오스 상의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다(Smith et al., 1988).
면역화 및 스크리닝
친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 융합단백질을 사용하여 암컷 Balb/c 마우스를 하기 방법에 따라 복강내로 면역화시켰다.
1. 면역화: 완전 프로인트 보조액중에 융합단백질 90g
2 및 3. 면역화: 불완전 프로인트 보조액중에 융합단백질 50g
면역화는 각각 4주의 간격을 두고 수행되었다. 마지막으로 면역화한지 14 일째날에 인산 완충된 식염수(PBS)중의 융합단백질 10μg으로 3 일 연속 추가면역시켰다. 다음날, 폴리에틸렌글리콜 4000을 사용하여 높은 항체역가를 갖는 동물의 비장세포와 P3.X63-Ag8.653 쥐의 미엘로마 세포를 융합시켰다. HAT 배지중의 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에서 하이브리도마 세포를 선별하였다(et Milstein, 1975; Kearney et al., 1979).
혈청중 항체역가의 결정 또는 하이브리도마 상등액의 스크리닝은 각각 ELISA 를 이용하여 수행하였다. 이 분석을 수행함에 있어서, 먼저 마이크로타이터 플레이트를 융합단백질(GST-CD44v3-10) 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라제로 코팅하였다. 그 후, 웰(well)을 혈청시료 또는 하이브리도마 상등액의 연속적인 희석액과 함께 배양하고, 마우스 면역글로블린에 대한 퍼옥시다제-커플된 항체로 특이적 항체를 검출하였다. 글루타치온-S-트랜스퍼라제와만 반응하는 하이브리도마는 폐기하였다. 잔존한 항체는 도메인 특이적인 융합단백질(엑손 v3, 엑손 v5+v6, 엑손 v6+v7, 엑손 v8-v10)을 사용하여 특성조사하였다(Koopman et al., 1993). 그 후, 이들 항체의 면역조직화학적 반응성을 인간 피부절편상에서 시험하였다. 항체 VFF-18 은 합성 펩타이드 Hu1(QWFGN RWHEG YRQT)에 결합시킴으로써 확인하였다. Hu1의 서열은인간 CD44 엑손 v6의 단편이다.
실시예 2: 합성 펩타이드에 대한 CD44v6 특이적 항체의 결합
합성 펩타이드에 대한 CD44v6 특이적 항체의 결합을 ELISA를 사용하여 결정하였다.
용액:
코팅 완충액: 0.05M 탄산나트륨, pH 9.6
분석 완충액: PBS(인산 완충된 식염수)
0.5% BSA(소혈청알부민)
0.05% 트윈20
기질 용액: Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg MD,
USA; TMB 퍼옥시다제 기질: 퍼옥시다제 용액 B
(H2O2) 1:1
펩타이드(코팅 완충액중의 50μg/mℓ)를 4℃에서 하룻밤동안 NUNC Maxisorp 면역플레이트(1.1ASML) 또는 Bio Products 의 Acti A 플레이트(VFF 항체)상에 고정시켰다. Acti A 플레이트의 경우에는, 펩타이드가 플레이트에 공유적으로 결합하였다. 그 후, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈20으로 세척하고, 분석 완충액을 사용하여 플레이트 표면상에 남아있는 흡착부위를 차단한 다음(실온에서 1 시간), 다시 PBS/0.05% 트윈20 으로 세척하였다. 20mM 중탄산나트륨(pH 9.0)중의 10mM 소듐보론하이드리드를 사용하여 Acti A 플레이트를 환원시킨 다음(실온에서 1 시간 진탕) 3회 세척하였다. 그 후, 0.02 내지 10.0μg/mℓ 의 농도로 각각 분석 완충액 중의 존재하는 하이브리도마 상등액 또는 항체 용액을 웰에 가하고 실온에서 2시간 동안 진탕하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈20으로 3회 세척하였다. 적절한 회석배수로 분석 완충액중에 들어있는 호울스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish pero-xidase) 접합된 항-마우스 IgG 항체를 웰당 100μℓ씩 가하였다. 실온에서 진탕하면서 2시간동안 배양한 후에 플레이트를 3회 세척하고 기질용액을 웰에 가하였다. 10 내지 15분이 지난 후, 2M 황산으로 전개를 중지시키고, 광도계를 사용하여 450 nm(reference 690nm)에서의 흡광도를 측정하였다.
첫번째 실험에서, 펩타이드 Ra1(KWFEN EWQGK NPPT)에 대한 쥐의 CD 44v6 특이적 항체 1.1ASML 의 결합도를 측정하였다(표 1, 제 3(A) 도)
표 1.
추가의 실험에서, Ra1과 동종의 인간 CD44v6 서열로부터 유래된 펩타이드를합성하였다(Hu1, QWFGN RWHEG YRQT). 서로다른 항-인간 CD44v6 항체가 Hu1 에 결합하였다. 놀랍게도, VFF-18 은 시험된 다른 항체들에 비해 이 펩타이드에 대해 훨씬 높은 결합친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다(표 2,제 3(B) 도).
표 2.
정량적 평가를 위해, 다양한 농도의 정제된 항-인간 CD44v6 항체를 펩타이드 Hu1 에 결합시켰다. 여기에서도 역시, VFF-18 이 다른 항체들에 비해 상당히 우수한 결합친화력을 나타냄을 알 수 있었다(표 3, 제 3(C) 도).
표 3.
실시예 3: 방사능 표지된 CD44v6 특이적 항체의 종양세포주에 대한 결합
항체의 방사능 표지화
1mCi 의 N-숙신이미딜-[2,3-3H]-프로피오네이트([3H]-NSP, Amersham, 1mCi/mℓ)를 실리콘처리된 시료용기내에서 0℃, 수 제트 진공(water jet vacuum) 조건하에 거의 마를때까지 증발시켰다. 항체 15μg(PBS 중의 1mg/mℓ, pH 7.4)을 가하고 4℃에서 48시간동안 배양하였다. 계속하여, 실온에서 20분간 PBS 중의 1M 글리신용액 30μℓ 와 반응시켜 과량의 [3H]-NSP를 제거하였다. PBS/0.5% BSA를 용출액으로 사용하는 세파덱스 G-25-M 칼럼(column volume 15mℓ)을 사용하여 [3H]-글리신으로부터 표지된 항체를 분리하였다. [3H]-표지된 항체는 공극 부피(void volume)에서 나타난다. 마우스 면역글로블린을 검출하기 위해 ELISA를 수행하여 항체량을 측정하였으며, 특이 활성을 계산하였다.
방사능 표지된 항체의 종양세포에 대한 결합
N-숙신이미딜-[2,3-3H]-프로피오네이트를 사용하여 3 가지 항체 VFF-7(항-v6), VFF-8(항-v5) 및 VFF-18(항-v6)을 방사능 표지하고 서로다른 종양세포주와의 결합분석에 사용하였다. 세포주로는 CHO-CD44var: 세포표면에 인간 변이체 CD44(엑손 v3-v10)을 발현시키는 재조합 햄스터 세포주(Chinese hamster ovary); HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLO 205: 인간 결장암 세포주; 및 A431: 인간 판상 암세포주(squameous cell carcinoma line)가 사용되었다.
12-웰의 조직배양 플레이트에 세포들을 접종하고 37℃의 CO2배양기에서 하룻밤동안 배양한 다음, PBS 로 1 회 세척하고 에탄올로 고정시켰다(실온에서 1분). 세포를 배양배지(RPMI 1640/10% 소태아혈청)로 1회 세척하고 방사능 표지된 항체를 가하였다(배양배지중에서 웰당 250000dpm). 실온에서 25시간동안 진탕 배양한 다음 플레이트를 PBS/0.5% BSA로 3회 세척하고, 세포를 0.1M NaOH/1% 트리톤 X-100을 사용하여 가용화시키고, 방사능을 섬광계수기로 측정하였다. 비 특이적 결합은 100배 과량의 표지되지 않은 항체의 존재하에 측정하였다. 결합도를 표준화된 세포수(400000 세포)와 관련지어 나타내었다. 항체의 특이활성을 측정한 후, 결합된 항체량을 fmol로 나타낼 수 있다.
표 4 및 제 4 도는 다양한 세포주에 대한 항체의 특이적 결합을 나타낸다. 재조합 세포주 CHO-CD44var 에 대한 v6 특이적 항체 VFF-7 및 VFF-18 의 결합도가 거의 같은 크기로 나타난 반면, 이 항체들이 종양세포주에 대해서는 상당히 다른 결합양상을 나타내고 있다. 어떤 경우에는 VFF-18 및 VFF-8 (적은 정도로)의 결합만이 관찰되는 반면(HT-29, CaCo, COLO 205),다른 경우에는 VFF-18 이 VFF-7 에 비하여 훨씬 많이 결합하고 있다.
표 4.
실시예 4: ELISA를 이용한 혈청중 가용성 CD44v6의 측정
용액:
코팅 완충액: 0.05M 탄산나트륨, pH 9.6
분석 완충액: PBS(인산 완충된 식염수)
0.5% BSA(소혈청알부민)
0.05% 트윈20
시료희석액: Bender MedSystems, Vienna, Austria
기질 용액: Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg MD,
USA; TMB 퍼옥시다제 기질: 퍼옥시다제 용액 B
(H2O2) 1:1
마이크로타이터 플레이트(Nunc-Immunoplate Maxisorp F96)를 CD44v6 특이적 항체 5μg/mℓ로 코팅하였다(4℃에서 하룻밤동안 배양). 계속하여 플레이트를PBS/0.05% 트윈20으로 세척하고, 분석 완충액을 사용하여 플레이트 표면상에 비어 있는 흡착부위를 차단하고(실온에서 1 시간), 다시금 플레이트를 세척하였다. 혈청시료를 시료희석액으로 적어도 1:5가 되게끔 미리 희석한 다음, 웰중에서 계속하여 1:2 로 추가 희석하였다. 그 후, 웰당 50μℓ의 호울스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 항-CD44std 항체(Clone BU-52, The Binding Site, Birmingham)를 분석 완충액에 적절히 희석하여(1:3000 - 1:10000) 가하였다. 실온에서 진탕배양한지 3 시간 후, 플레이트를 3 회 세척하고 기질용액을 가하였다. 10 내지 15 분 후에, 2M 황산을 가하여 전개를 중지시키고 광도계를 사용하여 450nm(reference 690nm)에서의 흡광도를 측정하였다.
정량분석을 위하여, 혈청시료와 동일하게 가용성 CD44 표준시료의 분석 완충액에 의한 연속 희석액을 제조하였다. 이와 같이 제조된 것을 가용성 CD44v3-v10을 발현하는 재조합 햄스터세포(CHO)의 상등액으로부터 정제하였다. CD44v3-v10은 엑손 v3 내지 v10을 포함하는 인간 CD44 변이체이다.
표 5 및 제 5도에 의해 정상적인 인간혈청중에 엑손 v6를 포함하는 가용성 CD44 변이체가 존재하는 것으로 확인된다. 3가지의 v6 특이적 항체들, VFF-4, VFF-7 및 VFF-18을 각각 샌드위치 ELISA 에서 코팅용 항체로 사용하였다. 3 가지 경우 전부에서 퍼옥시다제-결합된 CD44std 특이적 항체(BU-52, std=stand-ard)를 검출항체로 사용하였다. 서로다른 희석배수에서 2 가지의 서로다른 정상적 인간 혈청의 시그널을 제 5(A) 및 5(B) 도에 나타내었다. 양쪽 경우에 VFF-18 은 2가지의 다른 항체들에 비해 상당히 강한 시그널을 나타내고 있다.
표 5A. 혈청 1
표 5B. 혈청 2
표 6및 제 6도는 v6를 포함하는 CD44 변이체의 혈청수준을 나타낸다. 6명의 건강한 공여자(donor)의 혈청중 가용성 CD44var 함량을 두가지 서로다른 ELISA 로 측정하였다. 첫번째 시험에서는 VFF-7을, 두번째 시험에서는 VFF-18 을 코팅용 항체로 사용하였다. 양 경우에, CHO 세포에서 생산된 재조합 가용성 CD44 변이체(엑손 v3-v10)를 대조군으로 사용하였다. VFF-18 ELISA 는 VFF-7 ELISA 에 비해 평균해서 3.5 배 더 높은 수치를 나타내었는데, 이는 재조합 단백질과 비교할 때, 혈청중에 발생하는 가용성 CD44var 이 VFF-7 보다 VFF-18 에 의해 더욱 잘 인식됨을 의미한다.
표 6.

Claims (18)

  1. 하이브리도마 세포주(기탁번호: DSM ACC2174)에 의해 생산된 항체 VFF-18임을 특징으로 하는, CD44 유전자의 변이체 엑손 v6에 의해 코드화된 아미노산 서열내의 에피토프(epitope)에 대한 항체.
  2. 기탁번호 DSM ACC2174인 하이브리도마 세포주.
  3. 제1항에 따른 항체의 화학적 또는 효소적 변형에 의해 수득될 수 있고, 제1항에 따른 항체의 항원 결합 특이성을 보유하는, 제1항에 따른 항체로 부터 유래된 항체 분자.
  4. 제3항에 있어서, 제1항에 따른 항체의 Fab 또는 F(ab')2단편임을 특징으로 하는 항체 분자.
  5. 제3항에 있어서, 항체가 다른 분자에 연결되어 있음을 특징으로 하는 항체 분자.
  6. 제5항에 있어서, 다른 분자가 폴리펩타이드임을 특징으로 하는 항체 분자.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서, 방사성 동위원소에 연결되어 있음을 특징으로 하는 항체 분자.
  8. 제1항에 따른 항체의 유전형(idiotype)을 갖는 재조합 항체 분자.
  9. 제8항에 있어서, 키메릭(chimeric), 인간화된(humanised), 또는 단일 쇄 항체이거나, 쇄 셔플링(chain shuffling)에 의해 생산된 항체 분자임을 특징으로 하는 재조합 항체 분자.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 다른 분자 또는 방사성 동위원소에 연결되어 있음을 특징으로 하는 재조합 항체 분자.
  11. 제1항에 따른 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 항체 분자.
  12. 제1항, 제3항 내지 제11항중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 분자를 포함하는, 시험관내에서 CD44 유전자의 변이체 엑손 v6의 발현을 검출하기 위한 시약.
  13. 제12항에 있어서, 검출이 효소-연결된 면역검정법(immunoassay) 또는 방사선면역검정법(radioimmunoassay)에 의해 수행되는 시약.
  14. 제12항에 있어서, 검출이 면역조직화학법(immunohistochemical method)에 의해 수행되는 시약.
  15. 제1항, 제3항 내지 제6항, 제8항, 제9항 및 제11항중의 어느 한 항에 있어서, 암의 진단 또는 치료를 위한 항체 또는 항체 분자.
  16. 제1항, 제3항 내지 제10항중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 분자를 포함하는, 생체내에서 CD44 유전자의 변이체 엑손 v6의 발현을 검출하기 위한 시약.
  17. 제8항에 있어서, 제1항에 따른 항체와 상보성 결정부위(CDRs)에서 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체 분자.
  18. 제11항에 있어서, QWFGNRWHEGYRQT의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 Hu1에 특이적으로 결합하는 항체 분자.
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