KR102550489B1 - 암 진단에 유용한 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 예를 들어, 암을 진단하고/진단하거나 암 세포가 CLDN6을 발현하는지 여부를 결정하는 데 유용한, CLDN6의 C-말단 부분 내에 위치한 에피토프에 대해 유도된 항체에 관한 것이다.

Description

암 진단에 유용한 항체
클라우딘(claudin)은 상피와 내피의 타이트 정션(tight junction) 내에 위치한 내재성 막 단백질이다. 클라우딘은 2개의 세포외 루프를 갖는 4개의 막관통 세그먼트, 및 세포질에 위치한 N-말단과 C-말단을 갖는 것으로 예측된다. 클라우딘(CLDN) 막관통 단백질 패밀리는 상피 및 내피 타이트 정션의 유지에서 중요한 역할을 하며, 세포골격의 유지 및 세포 신호전달에서도 역할을 할 수 있다.
클라우딘-6(CLDN6)은 상피 세포 운명으로 수임된 배아체뿐만 아니라 뮤린 및 인간 줄기 세포에서 발현되는 종양태아성 유전자이다(문헌[Turksen, K. et al. (2001) Dev Dyn 222, 292-300]; 문헌[Anderson WJ. et al. (2008) Dev Dyn 237, 504-12]; 문헌[Turksen K. et al. (2002) Development, 129, 1775-84]; 문헌[Assou S. et al. (2007) Stem Cells 25, 961-73]). CLDN6은, 종양-관련 항원으로서, 표피 형태 형성의 초기 단계 동안의 그의 발현으로 인해 분화 항원으로 분류될 수 있으며, 그 단계에서 CLDN6은 표피 분화 및 장벽 형성에 중요하다. 추가적으로, 혀, 피부, 위 및 유방의 상피 조직 또는 신생아 정상 상피 조직에서 발현이 관찰되었다(문헌[Abuazza G. et al. (2006), Am J Physiol Renal Physiol 291, 1132-1141]; 문헌[Troy T.C. et al. (2007), Molecular Biotechnology 36, 166-74]; 문헌[Zhao L. et al. (2008), Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294, 1856-1862]). 게다가, 자체 데이터는 또한 인간 태반, 방광, 자궁 내막, 전립선 및 말초 신경에서의 CLDN6의 낮거나 매우 낮은 발현 및 다양한 암에서의 CLDN6의 빈번한 과발현을 드러낸다. CLDN6은 소아 뇌종양, 위 선암종 및 생식 세포 종양뿐만 아니라 난소 암종과 같은 내장 암종을 포함하는 종양에서 과발현되는 것으로 입증되었다. 위암 세포에서의 CLDN6의 과발현은 증가된 침습, 이동 및 증식을 가져오는 것으로 또한 입증되었고, 이는 CLDN6이 불량한 예후에 대한 마커이며 악성 표현형을 유지하는 데 잠재적인 역할을 할 수 있음을 시사한다. 또한, CLDN6은 유방암 세포주에서 세포 증식의 억제 및 아폽토시스의 유도를 통해 암 억제제로서 기능하는 것으로 밝혀졌다.
도 1b에 도시된 CLDN3, CLDN4, CLDN6 및 CLDN9의 서열 정렬은 다른 클라우딘 단백질들에 대한 CLDN6의 보존 정도가 높음을 예시한다. CLDN6와 다른 클라우딘 단백질들, 특히 CLDN9 및 CLDN4와의 이 높은 상동성은 진단 목적에 적합한 특이성 및 친화력과 같은 특성을 갖는 CLDN6 항체를 제공하는 것을 어렵게 한다. 본 발명자들은 CLDN6의 C-말단 부분 내에 위치한 특정 에피토프에 대해 유도된 항체가 항체의 진단 적용성에 대한, 특히 CLDN6을 발현하는 세포를 검출하고 확인하는 것에 대한 기준을 충족한다는 것을 발견하였다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, 암을 진단하고/진단하거나 암 세포가 CLDN6을 발현하는지 여부를 결정하는 데 유용하다. 바람직하게는, 암 질병 또는 암 세포는 CLDN6의 표면 발현을 특징으로 한다. CLDN6을 발현하는 암 세포가, CLDN6에 대해 유도된 항체를 사용한 요법과 같은 CLDN6을 표적화하는 요법에 적합한 표적이다. 일 구현예에서, 암 세포는 CLDN6을 발현하거나 비정상적으로 발현하는 한편, 상응하는 정상 세포는 CLDN6을 발현하지 않거나 CLDN6을 더 낮은 수준으로 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 다음에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(i) 아미노산 서열 EYPTKNY(SEQ ID NO: 38)를 갖는 펩티드, 및/또는
(ii) 클라우딘 6(CLDN6)으로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 적어도, 아미노산 서열 EYPTKNY(SEQ ID NO: 38)를 갖는 CLDN6 내의 에피토프에 결합함으로써 CLDN6에 결합하는, CLDN6, 및/또는
(iii) 아미노산 서열 EYPTKNYV(SEQ ID NO: 29)를 갖는 펩티드, 및/또는
(iv) 클라우딘 6(CLDN6)으로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 적어도, 아미노산 서열 EYPTKNYV(SEQ ID NO: 29)를 갖는 CLDN6 내의 에피토프에 결합함으로써 CLDN6에 결합하는, CLDN6, 및/또는
(v) 아미노산 서열 AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO: 15)를 갖는 펩티드로서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 TSAPAISRGPSEYPT(SEQ ID NO: 14)를 갖는 펩티드에 결합하지 않는, 펩티드, 및/또는
(vi) 클라우딘 6(CLDN6)로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 적어도, 아미노산 서열 AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO: 15)를 갖는 CLDN6 내의 에피토프에 결합함으로써 CLDN6에 결합하고, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 TSAPAISRGPSEYPT(SEQ ID NO: 14)를 갖는 펩티드에 결합하지 않는, CLDN6.
본원에 기재된 양태들의 구현예들 및 추가의 양태들에서, 본 발명은 다음에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(i) 아미노산 서열 AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO: 15)를 갖는 펩티드 및/또는
(ii) 클라우딘 6(CLDN6)으로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 적어도, 아미노산 서열 AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO: 15)를 갖는 CLDN6 내의 에피토프에 결합함으로써 CLDN6에 결합하는, CLDN6.
본원에 기재된 양태들의 구현예들 및 추가의 양태들에서, 본 발명은 하기 펩티드들 중 하나 이상, 바람직하게는 전부에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 TSAPAISRGPSEYPT(SEQ ID NO: 14)를 갖는 펩티드에 결합하지 않는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
PAISRGPSEYPTKNY(SEQ ID NO: 22), AISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO: 15), ISRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO: 23), SRGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO: 24), RGPSEYPTKNYV(SEQ ID NO: 25), GPSEYPTKNYV(SEQ ID NO: 26), PSEYPTKNYV(SEQ ID NO: 27), SEYPTKNYV(SEQ ID NO: 28), 및 EYPTKNYV(SEQ ID NO: 29).
일 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 낮은 친화력으로 결합하는 펩티드와 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 높은 친화력으로 결합하는 펩티드에 대한 결합 친화력의 차이는 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 또는 10% 이하이다.
본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은, 바람직하게는, 아미노산 서열 EYPTK(SEQ ID NO: 59) 및/또는 아미노산 서열 EYPTKN(SEQ ID NO: 60)을 포함하지만 아미노산 서열 EYPTKNY(SEQ ID NO: 38)는 포함하지 않는 펩티드에 결합하지 않는다. 다시 말하자면, 아미노산 서열 EYPTKNY(SEQ ID NO: 38) 및/또는 아미노산 서열 EYPTKNYV(SEQ ID NO: 29)를 갖는 펩티드에 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은, 아미노산 서열 EYPTK(SEQ ID NO: 59) 및/또는 아미노산 서열 EYPTKN(SEQ ID NO: 60)에 결손된 두 번째 티로신의 존재로 인해 상기 펩티드(들)에 결합한다. 본원에 나타낸 바와 같이, 바람직한 항체들 또는 항원-결합 단편들은 아미노산 서열 YPTKNY(SEQ ID NO: 61) 및/또는 EYPTKN(SEQ ID NO: 60)을 포함하지만 아미노산 서열 EYPTKNY(SEQ ID NO: 38)은 포함하지 않는 펩티드에 결합하지 않으며, 이는 아미노산 서열 EYPTKNY(SEQ ID NO: 38)가 이들 항체의 결합을 위한 최소 에피토프인 것으로 간주될 수 있는 서열임을 시사한다.
본원에 기재된 양태들의 구현예들 및 추가의 양태들에서, 본 발명은 DSMZ(독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7B 소재)에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있고 하기 명칭 및 수탁 번호 중 하나를 갖는 항체에 관한 것이다:
1. 58-4B-2, 수탁 번호 DSM ACC3311, 2016년 11월 29일에 기탁됨;
2. 58-3A, 수탁 번호 DSM ACC3312, 2016년 11월 29일에 기탁됨; 또는
3. 58-1B, 수탁 번호 DSM ACC3313, 2016년 11월 29일에 기탁됨.
본 발명의 항체는 항체의 명칭 및/또는 항체를 생산하는 클론을 지칭함으로써 본원에서 표기된다.
또한, 본 발명은 CLDN6 결합에 대해 전술한 하이브리도마에 의해 생산되고 그로부터 얻을 수 있는 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 전술한 하이브리도마에 의해 생산되고 그로부터 얻을 수 있는 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체에 관한 것이다. 이들 및 다른 구현예들에서, 또한, 본 발명은, 전술한 하이브리도마에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체와 동일하거나 매우 상동인, 항원 결합 부분 또는 항원 결합 부위, 특히 가변 영역을 포함하는 항체에 관한 것이다. 바람직한 항체들은 전술한 하이브리도마에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체의 CDR 영역과 동일하거나 매우 상동인 CDR 영역을 갖는 것들임이 고려된다. "매우 상동"이라 함은, 1개 내지 5개, 바람직하게는 1개 내지 4개, 예컨대 1개 내지 3개 또는 1개 또는 2개의 치환이 각각의 CDR 영역에서 이루어질 수 있음이 고려된다. 특히 바람직한 항체는 전술한 하이브리도마에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체의 키메라화 및 인간화 형태이다.
따라서, 본원에 기재된 양태들의 구현예들 및 추가의 양태들에서, 본 발명은 하기 (i) 내지 (v)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 (i) 내지 (v) 중 어느 하나에 따른 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(i) 수탁 번호 DSM ACC3313(58-1B), DSM ACC3312(58-3A) 또는 DSM ACC3311(58-4B-2)로 기탁된 클론에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체,
(ii) (i)에 따른 항체의 키메라화 또는 인간화 형태인 항체,
(iii) CLDN6 결합에 대해 (i)에 따른 항체와 경쟁하는 항체,
(iv) (i)에 따른 항체의 특이성을 갖는 항체, 및
(v) (i)에 따른 항체의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 부위를 포함하는 항체.
일 구현예에서, (i)에 따른 항체의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 부위는 (i)에 따른 항체의 가변 영역을 포함한다.
본원에 기재된 양태들의 구현예들 및 추가의 양태들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 항체 중쇄를 포함하는 항체:
(i) SEQ ID NO: 40, 42, 또는 44에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 서열,
(ii) SEQ ID NO: 40, 42, 또는 44에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 서열의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모두, 또는
(iii) SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 51 또는 57에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및/또는 SEQ ID NO: 52 또는 58에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
본원에 기재된 양태들의 구현예들 및 추가의 양태들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 항체 경쇄를 포함하는 항체:
(i) SEQ ID NO: 41, 43, 또는 45에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 서열,
(ii) SEQ ID NO: 41, 43, 또는 45에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 서열의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모두, 또는
(iii) SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 54에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및/또는 SEQ ID NO: 55에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
본원에 기재된 양태들의 구현예들 및 추가의 양태들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) 다음을 포함하는 항체:
(I) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 항체 중쇄:
(i) SEQ ID NO: 40, 42, 또는 44에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 서열,
(ii) SEQ ID NO: 40, 42, 또는 44에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 서열의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모두, 또는
(iii) SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 51 또는 57에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및/또는 SEQ ID NO: 52 또는 58에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체, 및/또는
(II) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 항체 경쇄:
(i) SEQ ID NO: 41, 43, 또는 45에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 서열,
(ii) SEQ ID NO: 41, 43, 또는 45에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 서열의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모두, 또는
(iii) SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 54에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및/또는 SEQ ID NO: 55에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
특정 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) 다음을 포함하는 항체:
(I) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 항체 중쇄:
(i) SEQ ID NO: 40에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 서열,
(ii) SEQ ID NO: 40에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 서열의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모두, 또는
(iii) SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 51에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및/또는 SEQ ID NO: 52에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체, 및
(II) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 항체 경쇄:
(i) SEQ ID NO: 41에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 서열,
(ii) SEQ ID NO: 41에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 서열의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모두, 또는
(iii) SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 54에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및/또는 SEQ ID NO: 55에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
특정 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) 다음을 포함하는 항체:
(I) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 항체 중쇄:
(i) SEQ ID NO: 42에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 서열,
(ii) SEQ ID NO: 42에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 서열의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모두, 또는
(iii) SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 57에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및/또는 SEQ ID NO: 58에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체, 및
(II) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 항체 경쇄:
(i) SEQ ID NO: 43에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 서열,
(ii) SEQ ID NO: 43에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 서열의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모두, 또는
(iii) SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 54에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및/또는 SEQ ID NO: 55에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
특정 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) 다음을 포함하는 항체:
(I) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 항체 중쇄:
(i) SEQ ID NO: 44에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 서열,
(ii) SEQ ID NO: 44에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 서열의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모두, 또는
(iii) SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 57에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및/또는 SEQ ID NO: 58에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체, 및
(II) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 항체 경쇄:
(i) SEQ ID NO: 45에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 서열,
(ii) SEQ ID NO: 45에 따른 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 경쇄 서열의 CDR 서열들 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모두, 또는
(iii) SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 54에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및/또는 SEQ ID NO: 55에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
특정 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 항체 중쇄 및 SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그 변이체를 포함하는 항체 경쇄를 포함하는 항체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
특정 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체를 포함하고, SEQ ID NO: 51에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및 SEQ ID NO: 52에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, 항체 중쇄, 및 SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체를 포함하고, SEQ ID NO: 54에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및 SEQ ID NO: 55에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, 항체 경쇄를 포함하는 항체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
특정 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO: 53에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체를 포함하고, SEQ ID NO: 57에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및 SEQ ID NO: 58에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, 항체 중쇄, 및 SEQ ID NO: 56에 따른 CDR3 서열 또는 그의 변이체를 포함하고, SEQ ID NO: 54에 따른 CDR1 서열, 또는 그의 변이체 및 SEQ ID NO: 55에 따른 CDR2 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는, 항체 경쇄를 포함하는 항체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
특정 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO: 40으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 41로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
특정 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO: 42로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 43으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
특정 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO: 44로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 45로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체, 및
(b) CLDN6 결합에 대해 (a)에 따른 항체와 경쟁하고/경쟁하거나 (a)에 따른 항체의 CLDN6에 대한 특이성을 갖는 항체.
바람직한 구현예들에서, 본 발명의 항체는 감마-2a 중쇄 불변 영역, 바람직하게는 인간 감마-2a 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 중쇄를 포함하고/포함하거나 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다.
본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 CLDN6에 결합한다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 바람직하게는, 천연, 즉, 자연 발생 또는 비-변성 상태, 또는 변성 상태의 CLDN6에 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CLDN6에 결합하지만 CLDN9에는 결합하지 않으며, 바람직하게는 CLDN4 및/또는 CLDN3에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CLDN6 이외의 CLDN 단백질에 실질적으로 결합하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CLDN6에 특이적이다.
일 구현예에서, CLDN6은 세포 표면 막-결합 CLDN6이다. 일 구현예에서, CLDN6은 암 세포 상에 존재하며, 상기 암 세포는 바람직하게는 CLDN6 발현 암 세포이다. 일 구현예에서, 상기 암 세포는 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비-소세포 폐암(NSCLC), 특히 편평 세포 폐 암종 및 선암종을 포함하는, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저 세포 암종 및 편평 세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 특히 악성 다형성 선종, 육종, 특히 활액 육종 및 암육종, 담관암, 요로 방광암, 특히 전이 세포 암종 및 유두 암종, 신장암, 특히 투명 세포 신장 세포 암종 및 유두 신장 세포 암종을 포함하는 신장 세포 암종, 결장암, 회장암, 특히 소장 선암종 및 회장 선암종을 포함하는, 소장암, 고환 배아 암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형종 및 배아 고환암, 자궁암, 생식 세포 종양, 예컨대 기형암종 또는 배아 암종, 특히 고환의 생식 세포 종양, 및 이들의 전이 형태로 이루어진 군으로부터 선택된 암으로부터의 세포이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 키메라, 인간 또는 인간화 항체이다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는, SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 그로 이루어진 펩티드, 또는 면역학적으로 동등한 펩티드, 또는 상기 펩티드를 발현하는 핵산 또는 숙주 세포로 동물을 면역화하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 바람직하게는 상기 펩티드는 CLDN6의 110개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 또는 40개 이하의 인접 아미노산을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 검출 가능한 표지와 같은 다른 모이어티(moiety)에 연결, 즉, 공유 결합 또는 비공유 결합될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 검출 가능한 표지에 연결된 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 접합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 생산하는 하이브리도마와 같은 세포에 관한 것이다.
바람직한 하이브리도마는 DSMZ(독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7B 소재)에 기탁되어 있고 하기 명칭 및 수탁 번호 중 하나를 갖는 것이다:
1. 58-4B-2, 수탁 번호 DSM ACC3311, 2016년 11월 29일에 기탁됨;
2. 58-3A, 수탁 번호 DSM ACC3312, 2016년 11월 29일에 기탁됨; 또는
3. 58-1B, 수탁 번호 DSM ACC3313, 2016년 11월 29일에 기탁됨.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 그로 이루어진 펩티드, 또는 면역학적으로 동등한 펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 펩티드는 CLDN6의 110개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 또는 40개 이하의 인접 아미노산을 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 일부, 예를 들어 항체 쇄, 또는 항원-결합 단편, 또는 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산은 진핵 세포 또는 원핵 세포에서의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동적으로 부착된다. 진핵 세포 또는 원핵 세포에서의 발현을 보장하는 제어 요소는 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 핵산은 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 또는 예를 들어 유전 공학에서 통상적으로 사용되는 또 다른 벡터에 포함될 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포에서 및 적합한 조건 하에서 벡터의 선택을 가능하게 하는 마커 유전자와 같은 추가의 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 적합한 숙주에서 코딩 영역의 적절한 발현을 가능하게 하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 그러한 제어 요소는 당업자에게 알려져 있으며, 프로모터, 스플라이스 카세트, 및 번역 개시 코돈을 포함할 수 있다.
핵산 분자의 작제 방법, 핵산 분자를 포함하는 벡터의 작제 방법, 적절히 선택된 숙주 세포 내로의 벡터의 도입 방법, 또는 핵산 분자의 발현을 유발하거나 달성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 추가의 양태는 본원에 개시된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 사용한 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 검출 또는 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 양의 결정에 관한 것이다. CLDN6과 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 사이의 복합체를 검출하거나 그러한 복합체의 양을 결정함으로써 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포가 검출되거나 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 양이 결정된다. 복합체의 형성은 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 존재를 나타낸다. 그러한 검출 또는 양의 결정은, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 사용한 면역검출을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다수의 방식으로 수행될 수 있다. 펩티드 또는 단백질을 검출하기 위해 항체를 사용하는 방법은 잘 알려져 있으며, ELISA, 경쟁적 결합 검정 등을 포함한다. 일반적으로, 그러한 검정은, 검출을 제공하는 표지, 예를 들어 지시 효소, 방사성 표지, 형광단, 또는 상자성 입자에 직접 또는 간접 결합된 표적 펩티드 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 사용한다. 본 발명의 방법은 CLDN6 수준 또는 CLDN6-발현 세포 수준의 정량적 및/또는 정성적 평가, 예를 들어, 절대적 및/또는 상대적 평가를 가능하게 한다.
일 양태에서, 본 발명은 샘플에서 CLDN6을 검출하거나 CLDN6의 양을 결정하는 방법으로서,
(i) 샘플을 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명의 접합체와 접촉시키는 단계 및
(ii) 항체, 항원-결합 단편 또는 접합체와 CLDN6 사이의 복합체의 형성을 검출하거나 그러한 복합체의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 샘플은 세포 샘플, 즉, 암 세포와 같은 세포를 포함하는 샘플이다. 이러한 구현예에서, 복합체는, 바람직하게는, 항체, 항원-결합 단편 또는 접합체와 상기 샘플 내의 세포에 의해 발현된 CLDN6 사이에 형성된다.
일 양태에서, 본 발명은 세포가 CLDN6을 발현하는지 여부를 결정하는 방법으로서,
(i) 세포 샘플을 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명의 접합체와 접촉시키는 단계 및
(ii) 항체, 항원-결합 단편 또는 접합체와, 상기 샘플 내의 세포에 의해 발현된 CLDN6 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 샘플 내의 세포는 암 세포이다. 이러한 구현예에서, 복합체는, 바람직하게는, 항체, 항원-결합 단편 또는 접합체와 상기 샘플 내의 세포에 의해 발현된 CLDN6 사이에 형성된다.
본 발명의 추가의 양태들은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 사용하여 CLDN6을 표적화함으로써 질병을 진단하거나 분류하는 방법들에 관한 것이다. 이들 방법은 CLDN6을 발현하는 세포의 선택적 검출을 제공함으로써, 이러한 세포를 CLDN6을 발현하지 않는 정상 세포 또는 CLDN6을 발현하지 않는 질병 세포와 구별한다. CLDN6을 발현하는 질병 세포를 특징으로 하는 질병은 CLDN6에 대해 유도된 치료용 항체를 사용한 요법과 같은 CLDN6을 표적화하는 요법에 의해 치료될 수 있다. 요법 또는 진단을 위한 바람직한 질병은 CLDN6이 발현되거나 비정상적으로 발현되는 질병, 특히 본원에 기재된 것과 같은 암 질병이다.
일 양태에서, 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 사용한 환자로부터 분리된 생물학적 샘플 내에서의 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 검출 및/또는 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 양의 결정을 포함하는, 암 질병의 진단, 검출 또는 모니터링, 즉, 암 질병의 퇴행, 진행, 경과 및/또는 발병의 결정을 위한 방법에 관한 것이다. 그러한 방법은 대상체가 암 질병이 있거나 암 질병을 발병할 (높은) 위험이 있는지 여부, 또는 예를 들어, 치료 요법이 효율적인지 여부를 검출하는 데 이용될 수 있다.
따라서,일 양태에서, 본 발명은 암의 진단, 검출 또는 모니터링을 위한 방법으로서,
(i) 생물학적 샘플을 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명의 접합체와 접촉시키는 단계 및
(ii) 항체, 항원-결합 단편 또는 접합체와 CLDN6 사이의 복합체의 형성을 검출하고/검출하거나 그러한 복합체의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 샘플, 즉, 암 세포와 같은 세포를 포함하는 샘플이다. 이러한 구현예에서, 복합체는, 바람직하게는, 항체, 항원-결합 단편 또는 접합체와 상기 샘플 내의 세포에 의해 발현된 CLDN6 사이에 형성된다.
본 발명에 따른 모니터링 방법은, 바람직하게는, 제1 시점에서 제1 샘플 내에서의 및 제2 시점에서 추가의 샘플 내에서의 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 검출 및/또는 그러한 세포의 양의 결정을 포함하며, 종양 질병의 퇴행, 진행, 경과 및/또는 발병은 두 샘플을 비교함으로써 결정될 수 있다.
전형적으로, 생물학적 샘플 내의 CLDN6 수준 또는 CLDN6-발현 세포 수준은 기준 수준과 비교되며, 상기 기준 수준과의 편차가 대상체에서의 암 질병의 존재 및/또는 단계를 나타낸다. 기준 수준은 (예를 들어, 건강한 조직 또는 대상체, 특히 암 질병이 없는 환자로부터의) 대조 샘플에서 결정된 바와 같은 수준 또는 건강한 대상체로부터의 중위 수준일 수 있다. 상기 기준 수준과의 "편차"는 적어도 10%, 20% 또는 30%, 바람직하게는 적어도 40% 또는 50%, 또는 그 초과 만큼의 증가와 같은 임의의 유의한 변화를 나타낸다.
바람직하게는, CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 존재 및/또는 기준 수준과 비교하여, 예를 들어 암 질병이 없는 환자와 비교하여 증가된 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 양은 환자에서의 암 질병의 존재 또는 암 질병의 위험(즉, 암 질병의 발병 가능성)을 나타낸다.
환자로부터 이전에 채취된 생물학적 샘플과 비교하여 감소된 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 양은 환자에서의 암 질병의 퇴행, 긍정적 경과, 예를 들어 성공적인 치료, 또는 암 질병의 발병 위험 감소를 나타낼 수 있다.
환자로부터 이전에 채취된 생물학적 샘플과 비교하여 증가된 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 양은 상기 환자에서의 암 질병의 진행, 부정적 경과, 예를 들어 성공하지 못한 치료, 재발생(recurrence) 또는 전이성 거동, 발병 또는 발병 위험 증가를 나타낼 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 CLDN6을 표적화하는 암 요법에 의해 암이 치료될 수 있는지 여부를 결정하는 방법으로서,
(i) 암 세포를 포함하는 샘플을 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명의 접합체와 접촉시키는 단계 및
(ii) 항체, 항원-결합 단편 또는 접합체와 CLDN6 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
복합체는, 바람직하게는, 항체, 항원-결합 단편 또는 접합체와 상기 샘플 내의 암 세포에 의해 발현된 CLDN6 사이에 형성된다.
그러한 방법은, 환자가 세포독성 CLDN6 특이적 항체와 같은 하나 이상의 면역 이펙터 기능을 발휘하는 항체, 예를 들어 독소 또는 방사성 표지와 같은 세포독성 물질로 표지되거나 CDC 또는 ADCC와 같은 세포 사멸 메커니즘을 유도하는 항체를 사용하는 요법과 같은 CLDN6을 발현하는 세포의 표적화를 포함하는 요법에 적합한지 여부를 검출하는 데 이용될 수 있다. CLDN6을 발현하는 질병 세포를 특징으로 하는 질병, 예컨대 암 질병, 특히 본원에 기재된 것은 CLDN6을 표적화하는 요법에 의해 치료될 수 있다.
상기 양태들 중 임의의 것의 일 구현예에서, 샘플, 세포 샘플 또는 생물학적 샘플은 암 질병이 있거나, 암 질병이 있거나 걸린 것으로 의심되거나, 암 질병의 가능성이 있는 환자로부터의 것이다. 일 구현예에서, 샘플, 세포 샘플 또는 생물학적 샘플은 조직 또는 기관으로부터의 것이며, 조직 또는 기관에 암이 없을 때 세포는 CLDN6을 실질적으로 발현하지 않는다. 바람직하게는 상기 조직은 태반 조직 이외의 조직이다. 바람직하게는, 상기 조직은, 예를 들어 상기 조직 또는 기관의 세포의 육안 검사 또는 배양 시험에 의해, 암 질병에 의해 영향을 받은 것으로 이미 진단된 것이다. 이러한 구현예에서, CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 존재 및/또는 기준 수준과 비교하여, 예를 들어 종양 질병이 없는 환자와 비교하여 증가된 CLDN6 또는 CLDN6-발현 세포의 양은, 환자가 CLDN6을 발현하는 세포의 표적화를 수반하는 요법에 적합함을 나타낼 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항체들 및/또는 항원-결합 단편들의 조합물을 포함하는, 조성물, 예를 들어, 진단 조성물, 또는 키트를 제공한다. 그러한 진단 조성물 또는 시험 키트는 본 발명의 진단, 검출 또는 모니터링을 위한 방법과 같은 본 발명의 방법에 유용하다. 이러한 키트는, 선택적으로, 검출 가능한 표지, 예를 들어 지시 효소, 방사성 표지, 형광단, 또는 상자성 입자를 포함할 수 있다. 키트는 정보를 제공하는 팸플릿(pamphlet), 예를 들어, 본원에 개시된 방법을 실시하기 위해 시약을 사용하는 방법을 알려주는 팸플릿을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a: 클라우딘 6 및 클라우딘 9 단백질(인간/뮤린)의 서열 정렬
서열 정렬은 인간 및 마우스 클라우딘 6과 인간 클라우딘 9 사이의 높은 상동성을 나타낸다.
도 1b: 클라우딘 6 및 클라우딘 3, 4 및 9 단백질(인간)의 서열 정렬
서열 정렬은 클라우딘 다중 유전자 패밀리에서 높은 상동성을 나타낸다
도 2a와 도 2b: 웨스턴 블롯 분석으로 시험된 항체의 특이성
모조(mock), 인간 CLDN3, 4, 6 또는 9 및 CLDN6 양성 종양 세포(PA-1 SC12 및 NEC-8)로 트랜스펙션된 HEK293 세포의 세포 용해물을 블롯팅하고, 결합된 항체(토끼-항-CLDN3(Invitrogen) 0.5 μg/mL, 마우스-항-CLDN4(Invitrogen) 1 μg/mL, 토끼-항-CLDN6(IBL) 0.2 μg/mL, 염소-항-CLDN9(Santa Cruz) 0.4 μg/mL 또는 모노클로날 마우스 항체(5 μg/mL))를 퍼옥시다제-접합 2차 항체에 의해 검출하였다.
도 3: 웨스턴 블롯 양성 항체의 조직학적 분석
난소암의 FFPE 절편으로의 rb-항-CLDN6 IBL 항혈청의 결합과 비교한 선도(lead) mumAB 58-1B, 58-3A 및 58-4B의 결합.
도 4a: 합성 중첩 펩티드들을 사용한 에피토프 맵핑
중첩 펩티드들을 미세역가 플레이트 상으로 고정시키고, 항체를 첨가하였다. 결합된 항체를 적절한 퍼옥시다제 접합된 2차 시약으로 발색시켰다.
도 4b: 비오티닐화된 합성 중첩 펩티드들을 사용한 에피토프 맵핑
유연한 친수성 링커를 통해 N-말단 비오티닐화된 고도로 중첩성인 펩티드들을 합성하고, 스트렙타비딘(StrepAvidin) 연결된 미세역가 플레이트 상으로 로딩하였다. 항체(1 ㎍/mL)를 적용하고, 결합된 항체를 검출하고 분석하였다.
mumAB 58-4B-2 대 rb-혈청(IBL)의 신호 강도의 비교를 위해, C-말단 펩티드 19로의 항체의 최대 결합을 100%로 정의하였다.
하나의 펩티드에 대한 각 항체의 결합 강도를 각각의 시험 시스템에 대한 최대 결합에 대해 계산하였다.
mumAB의 결합을 3회의 독립적인 실험에서 3중으로 분석하였다
IBL-혈청의 결합을 2회의 독립적인 실험에서 3중으로 분석하였다
도 4c: 모노클로날 선도 58-4B-2 및 폴리클로날 rb-항CLDN6-혈청(IBL)의 결합 부위.
도 5: 항체 58-1B, 58-3A 및 58-4B의 서열
도 6: 정상 난소 조직 상에서의 다양한 항체의 백그라운드 신호
정상 난소 조직 상에서의 선도 항체 mumAB 58-1B, 58-3A 및 58-4B 대 상업용 IBL 항체의 비교(항체 농도 5㎍/ml; 임상-유사(clinck-like) 프로토콜).
본 발명이 이하에서 상세하게 설명되지만, 본 발명은 본원에 기술된 특정 방법론들, 프로토콜들 및 시약들에 제한되지 않음을 이해해야 하는데, 이는 이들 방법론, 프로토콜 및 시약이 달라질 수 있기 때문이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 구현예들을 설명하기 위한 것일 뿐이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 학술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하에서, 본 발명의 요소들이 설명될 것이다. 이 요소들은 특정 구현예들과 함께 나열되지만, 그러한 요소들은 추가의 구현예들을 생성하기 위해 임의의 방식으로 그리고 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 설명된 실시예들 및 바람직한 구현예들은 본 발명을 명시적으로 설명된 구현예들로만 제한하도록 해석되어서는 안된다. 본 설명은 명시적으로 설명된 구현예들을 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소들과 조합시킨 구현예들을 뒷받침하고 포함하는 것임을 이해해야 한다. 또한, 본 출원에서의 설명된 모든 요소들의 임의의 순열들 및 조합들은 문맥이 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
바람직하게는, 본 발명에 사용된 용어들은 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기재된 바와 같이 정의된다.
달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 해당 분야의 문헌(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989] 참조)에 설명된 생화학, 세포 생물학, 면역학, 및 재조합 DNA 기법의 종래의 방법을 이용한다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 하기 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함한다", 및 "포함하고" 및 "포함하는"과 같은 변화형은, 언급된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함함을 의미하지만 임의의 다른 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제함을 의미하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이지만, 일부 구현예들에서 그러한 다른 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버들, 정수들 또는 단계들의 군은 배제될 수 있으며, 즉, 대상은 언급된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함함에 존재한다. 본 발명을 설명하는 맥락에서(특히 청구범위의 맥락에서) 사용된 단수 용어 및 유사한 언급 대상은 본원에 달리 지시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서의 값의 범위의 열거는 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 간편한 방법으로서 기능하도록 의도될 뿐이다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 그것이 본원에서 개별적으로 열거된 것처럼 명세서에 통합된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에 달리 지시되거나 문맥상 달리 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 표현(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 본 발명을 더 잘 예시하기 위해 의도될 뿐이며, 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 표현도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서의 텍스트 전체에 걸쳐 몇몇 문헌이 인용되어 있다. (모든 특허, 특허 출원, 학술 간행물, 제조업체의 사양, 지침 등을 포함하는) 본원에 인용된 문헌들 각각은, 상기에 인용되어 있든지 하기에 인용되어 있든지 간에, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원에 인용된 어떠한 문헌도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시보다 앞설 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 맥락에서 용어 "재조합"은 "유전자 조작을 통해 만들어짐"을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 재조합 세포와 같은 "재조합 대상(object)"은 자연적으로 발생하지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "자연 발생"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하며 자연에서 공급원으로부터 분리될 수 있고, 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은, 펩티드 또는 핵산은 자연 발생적인 것이다.
용어 "항원"은 면역 반응이 유도되고/유도되거나 생성될 에피토프를 포함하는 작용제와 관련된다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 항원은, 선택적으로 가공 후에, 면역 반응을 유도하는 분자이며, 이는 바람직하게는 항원에 특이적이다. 용어 "항원"은, 특히, 단백질, 펩티드, 다당류, 핵산, 특히 RNA 및 DNA, 및 뉴클레오티드를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항원과 같은 분자 내의 항원 결정기, 즉, 면역계에 의해 인식되는, 예를 들어, 항체에 의해 인식되는 분자 내의 부분을 지칭한다. 예를 들어, 에피토프들은 면역계에 의해 인식되는 항원 상의 별개의 3차원 부위들이다. 에피토프들은 일반적으로 아미노산들 또는 당 측쇄들과 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹들로 이루어지며, 일반적으로 특정 3차원 구조 특성뿐만 아니라 특정 전하 특성을 갖는다. 입체형태(conformational) 에피토프 및 비-입체형태 에피토프는, 후자로의 결합이 아닌 전자로의 결합이 변성 용매의 존재 하에서 상실된다는 점에서 구별된다. CLDN과 같은 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속 또는 불연속 부분을 포함하고, 바람직하게는 5개 내지 100개, 바람직하게는 5개 내지 50개, 더욱 바람직하게는 8개 내지 30개, 가장 바람직하게는 10개 내지 25개 아미노산 길이이며, 예를 들어, 에피토프는 바람직하게는 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 아미노산 길이일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "불연속 에피토프"는 단백질의 1차 서열에서의 적어도 2개의 개별 영역으로부터 형성된 단백질 항원 상의 입체형태 에피토프를 의미한다.
항원은 종양-관련 항원, 예컨대 CLDN6, 즉, 세포질, 세포 표면 및 세포 핵으로부터 유래될 수 있는 암 세포의 구성성분, 특히 세포 내에서, 바람직하게는 대량으로, 생성되거나 암 세포 상의 표면 항원으로 생성되는 항원을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "종양-관련 항원" 또는 "종양 항원"은 정상 조건 하에서 제한된 수의 조직 및/또는 기관에서 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되는 단백질과 관련되며, 예를 들어, 종양-관련 항원은 정상 조건 하에서 위 조직, 바람직하게는 위 점막에서, 생식 기관, 예를 들어 고환에서, 영양막 조직, 예를 들어, 태반에서, 또는 생식 계열 세포에서 특이적으로 발현될 수 있고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현된다. 이와 관련하여, "제한된 수"는 바람직하게는 3개 이하, 더욱 바람직하게는 2개 이하를 의미한다. 본 발명의 맥락에서 종양-관련 항원은, 예를 들어, 분화 항원, 바람직하게는 세포 유형 특이적 분화 항원, 즉, 정상 조건 하에서 특정 분화 단계에 있는 특정 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 단백질, 암/고환 항원, 즉, 정상 조건 하에서 고환에서 및 때때로 태반에서 특이적으로 발현되는 단백질, 및 생식 계열 특이적 항원을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 종양-관련 항원은 바람직하게는 암 세포의 세포 표면과 관련되고, 바람직하게는 정상 조직에서 발현되지 않거나 드물게 발현될 뿐이다. 바람직하게는, 종양-관련 항원 또는 종양-관련 항원의 비정상적 발현은 암 세포를 확인한다. 본 발명의 맥락에서, 대상체, 예를 들어, 암 질병을 앓고 있는 환자에서 암 세포에 의해 발현되는 종양-관련 항원은 바람직하게는 상기 대상체 내의 자가-단백질이다. 바람직한 구현예들에서, 본 발명의 맥락에서 종양-관련 항원은 정상 조건 하에서 비-필수적인 조직 또는 기관, 즉, 면역계에 의해 손상될 때 대상체의 사망을 초래하지 않는 조직 또는 기관에서, 또는 면역계가 접근할 수 없거나 어렵게 접근할 수 있을 뿐인 신체의 기관 또는 구조에서 특이적으로 발현된다. 바람직하게는, 종양-관련 항원의 아미노산 서열은 정상 조직에서 발현되는 종양-관련 항원과 암 조직에서 발현되는 종양-관련 항원 사이에서 동일하다.
종양 면역요법, 특히, 종양 백신접종에서 표적 구조로서의 종양-관련 항원에 대한 기준을 이상적으로 충족하는 분화 항원의 예는 CLDN6과 같은 클라우딘 패밀리의 세포 표면 단백질이다. 클라우딘은 타이트 정션의 가장 중요한 구성 요소인 단백질 패밀리이며, 이들은 상피 세포들 사이의 세포간 공간에서의 분자 흐름을 제어하는 세포주위(paracellular) 장벽을 세운다. 클라우딘은, N-말단과 C-말단이 모두 세포질에 위치한, 막을 4회 스패닝(spanning)하는 막관통 단백질이다.
용어 "클라우딘 6" 또는 "CLDN6"은 바람직하게는 인간 CLDN6과 관련되고, 특히, 서열 목록의 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질과 관련된다. CLDN6과 관련하여, 용어 "변이체"는, 특히, 143번 위치의 Ile가 Val로 대체된, 서열 목록의 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 지칭한다. 용어 "CLDN6"은 번역 후 변형된 변이체 및 입체형태 변이체와 같은 임의의 CLDN6 변이체를 포함한다.
용어 "CLDN9"는 바람직하게는 인간 CLDN9와 관련되고, 특히, 서열 목록의 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질과 관련된다.
용어 "CLDN4"는 바람직하게는 인간 CLDN4와 관련되고, 특히, 서열 목록의 SEQ ID NO: 4에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질과 관련된다.
용어 "CLDN3"은 바람직하게는 인간 CLDN3과 관련되고, 특히, 서열 목록의 SEQ ID NO: 3에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질과 관련된다.
CLDN6은, 예를 들어, 난소암, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 흑색종, 두경부암, 육종, 담관암, 신장 세포 암, 및 요로 방광암에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. CLDN6은, 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비-소세포 폐암(NSCLC), 특히 편평 세포 폐 암종 및 선암종을 포함하는, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저 세포 암종 및 편평 세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 특히 악성 다형성 선종, 육종, 특히 활액 육종 및 암육종, 담관암, 요로 방광암, 특히 전이 세포 암종 및 유두 암종, 신장암, 특히 투명 세포 신장 세포 암종 및 유두 신장 세포 암종을 포함하는, 신장 세포 암종, 결장암, 회장암, 특히 소장 선암종 및 회장 선암종을 포함하는, 소장암, 고환 배아 암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형종 및 배아 고환암, 자궁암, 생식 세포 종양, 예컨대 기형암종 또는 배아 암종, 특히 고환의 생식 세포 종양, 및 이들의 전이 형태에서 검출 가능하며 표적화될 수 있다. 일 구현예에서, CLDN6 발현과 관련된 암 질병은 난소암, 폐암, 전이성 난소암 및 전이성 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 난소암은 암종 또는 선암종이다. 바람직하게는, 폐암은 암종 또는 선암종이고, 바람직하게는 기관지암, 예컨대 기관지 암종 또는 기관지 선암종이다.
본 발명에 따르면, CLDN6을 발현하는 세포는 바람직하게는 세포-표면 막-결합 CLDN6을 특징으로 하며, 즉, CLDN6은 세포 표면과 회합된다. 또한, 본 발명에 따르면, 세포 CLDN6은 바람직하게는 세포-표면 막-결합 CLDN6이다. CLDN6을 발현하는 세포 또는 CLDN6과 그의 세포 표면과의 회합을 특징으로 하는 세포는 바람직하게는 암 세포, 바람직하게는 본원에 기재된 암으로부터의 암 세포이다.
용어 "세포 표면과 회합된"은 CLDN6과 같은 종양-관련 항원이 세포의 원형질 막과 회합되어 그에 위치하고 있음을 의미하며, 종양-관련 항원의 적어도 일부는 상기 세포의 세포외 공간을 향하며 상기 세포의 외부로부터, 예를 들어, 세포의 외부에 위치한 항체에 의해 접근 가능하다. 이와 관련하여, 부분은 바람직하게는 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 8개, 바람직하게는 적어도 12개, 더욱 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산이다. 회합은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 예를 들어, 회합은 하나 이상의 막관통 도메인, 하나 이상의 지질 앵커에 의해 이루어지거나, 세포의 원형질막의 외엽(outer leaflet) 상에서 발견될 수 있는 임의의 다른 단백질, 지질, 당류, 또는 다른 구조와의 상호 작용에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 세포의 표면과 회합된 종양-관련 항원은 세포외 부분을 갖는 막관통 단백질일 수 있거나 막관통 단백질인 또 다른 단백질과 상호 작용함으로써 세포의 표면과 회합된 단백질일 수 있다.
"세포 표면" 또는 "세포의 표면"은 당업계에서의 그의 일반적인 의미에 따라 사용되며, 그에 따라 단백질 및 기타 분자에 의한 결합에 이용될 수 있는 세포의 외부를 포함한다.
본 발명에 따르면, CLDN6은, 발현 수준이 태반 세포 또는 태반 조직에서의 발현에 비해 낮은 경우, 세포에서 실질적으로 발현되지 않은 것이다. 바람직하게는, 발현 수준은 태반 세포 또는 태반 조직에서의 발현의 10% 미만, 바람직하게는 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% 또는 0.05% 미만이거나 심지어 더 낮다. 바람직하게는, CLDN6은, 발현 수준이 태반 이외의 비-암성 조직에서의 발현 수준을 2배 이하, 바람직하게는 1.5배 초과하고, 바람직하게는 상기 비-암성 조직에서의 발현 수준을 초과하지 않는 경우, 세포에서 실질적으로 발현되지 않은 것이다. 바람직하게는, CLDN6는, 발현 수준이 검출 한계 미만이고/이거나 발현 수준이 너무 낮아서 세포에 첨가된 CLDN6-특이적 항체에 의한 결합을 가능하게 하지 않는 경우, 세포에서 실질적으로 발현되지 않은 것이다.
본 발명에 따르면, CLDN6은, 발현 수준이 태반 이외의 비-암성 조직에서의 발현 수준을, 바람직하게는 2배 넘게, 바람직하게는 10배, 100배, 1000배, 또는 10000배 초과하는 경우, 세포에서 발현된 것이다. 바람직하게는, CLDN6은, 발현 수준이 검출 한계를 초과하는 경우 및/또는 발현 수준이 세포에 첨가된 CLDN6-특이적 항체에 의한 결합을 가능하게 하기에 충분히 높은 경우, 세포에서 발현된 것이다. 바람직하게는, 세포에서 발현된 CLDN6은 상기 세포의 표면 상에서 발현되거나 그 표면 상에 노출된다.
용어 "항체"는 이황화물 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 지칭하며, 그의 항원 결합 부분을 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 용어 "항체"는, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 예를 들어, scFv 및 항원-결합 항체 단편, 예컨대 Fab 및 Fab' 단편을 제한없이 포함하는, 모노클로날 항체 및 항체의 단편 또는 유도체를 포함하고, 또한 모든 재조합 형태의 항체, 예를 들어, 원핵 생물에서 발현된 항체, 당화되지 않은 항체, 및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항원-결합 항체 단편 및 유도체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 명명되는 더욱 보존된 영역이 사이에 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은, 다음과 같은 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은, 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체 시스템의 제1 구성 요소(Clq)를 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 기재된 항체는 인간 항체일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "인간 항체"는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 지칭하며, 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 상으로 융합된 완전한 가변 도메인을 포함하거나 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역 상으로 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있으며, 예를 들어 인간 면역글로불린과 더 많이 유사하도록 변형될 수 있다. 인간화 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열을 보존한다(예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개의 CDR 모두를 함유하는 인간화 마우스 항체). 다른 형태는 원래 항체에 대하여 변경된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 각각의 한 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 상동인 한편, 쇄의 나머지 세그먼트는 또 다른 항체 내의 상응하는 서열과 상동인 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 1종의 포유 동물로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 한편, 불변 부분은 또 다른 종으로부터 유래된 항체의 서열과 상동이다. 그러한 키메라 형태의 하나의 명백한 이점은, 가변 영역이, 예를 들어, 인간 세포 제조물로부터 유래된 불변 영역과 조합하여 비-인간 숙주 유기체로부터의 쉽게 이용 가능한 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 알려진 공급원으로부터 편리하게 유래될 수 있다는 것이다. 가변 영역은 제조의 용이성의 이점을 갖고 특이성이 공급원에 의해 영향을 받지 않는 한편, 인간인 불변 영역은, 항체가 주사될 때, 비-인간 공급원으로부터의 불변 영역보다 인간 대상체로부터 면역 반응을 일으킬 가능성이 적다. 그러나, 정의는 이 특정 예에 제한되지 않는다.
항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단히 "결합 부분") 또는 항체의 "항원-결합 단편"(또는 간단히 "결합 단편")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature 341 : 544-546]); (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR), 및 (vii) 선택적으로 합성 링커에 의해 결합될 수 있는, 둘 이상의 분리된 CDR의 조합물을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은, 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 영역이 1가 분자를 형성하도록 쌍을 이루는 단일 단백질 쇄로 만들어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다(단일 쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음; 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242: 423-426]; 및 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883] 참조). 그러한 단일 쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 추가의 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드, (ii) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가로 개시되어 있다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 알려진 통상적인 기법을 이용하여 얻어지며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에 기재된 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자들의 제조물을 지칭한다. 모노클로날 항체는 단일 결합 특이성 및 친화력을 나타낸다. 일 구현예에서, 모노클로날 항체는, 무한증식 세포에 융합된, 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 기재된 항체는 재조합 항체일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 항체, 예컨대 (a) 면역글로불린 유전자에 대하여 트랜스제닉(transgenic)이거나 트랜스크로모조말(transchromosomal)인 동물(예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 분리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어, 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합성 조합 (combinatorial) 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱(splicing)을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "트랜스펙토마"는 항체를 발현하는 재조합 진핵 생물 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 포함하는, 진균을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "이종 항체"는 그러한 항체를 생성하는 트랜스제닉 유기체와 관련하여 정의된다. 이 용어는, 트랜스제닉 유기체로 이루어지지 않으며 일반적으로 트랜스제닉 유기체 이외의 종으로부터 유래된 유기체에서 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 인코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "헤테로하이브리드(heterohybrid) 항체"는 유기체 기원이 상이한 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 뮤린 경쇄와 회합된 인간 중쇄를 갖는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다.
본 발명은, 본 발명의 목적상 "항체"라는 용어에 포함되는 본원에 기재된 바와 같은 모든 항체 및 항체의 유도체를 포함한다. 용어 "항체 유도체"는 임의의 변형된 형태의 항체, 예를 들어, 항체와 또 다른 작용제 또는 항체의 접합체, 또는 항체 단편을 지칭한다.
본원에 기재된 항체는 바람직하게는 분리된 것이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하도록 의도된다. 더욱이, 분리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 발명에 따르면, 항체가 미리 결정된 표적에 대해 유의한 친화력을 가지며 표준 검정에서 상기 미리 결정된 표적에 결합하는 경우, 항체는 상기 미리 결정된 표적에 결합할 수 있다. "친화력" 또는 "결합 친화력"은 종종 평형 해리 상수(KD)에 의해 측정된다. 바람직하게는, 용어 "유의한 친화력"은 10-5 M 이하, 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 또는 10-12 M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 미리 결정된 표적으로의 결합을 지칭한다.
항체가 표적에 대해 유의한 친화력을 갖지 않으며 표준 검정에서 상기 표적에 유의하게, 특히 검출 가능하게, 결합하지 않는 경우, 항체는 상기 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없다. 바람직하게는, 항체는, 최대 2 ㎍/ml, 바람직하게는 10 ㎍/ml, 더욱 바람직하게는 20 ㎍/ml, 특히 50 또는 100 ㎍/ml 또는 그 초과의 농도로 존재하는 경우, 상기 표적에 검출 가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항체가 결합할 수 있는 미리 결정된 표적에 결합하는 것에 대한 KD보다 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 또는 106배 높은 KD로 항체가 표적에 결합하는 경우, 항체는 상기 표적에 대해 유의한 친화력을 갖지 않는다. 예를 들어, 항체가 결합할 수 있는 표적으로의 항체의 결합에 대한 KD가 10-7 M인 경우, 항체가 유의한 친화력을 갖지 않는 표적으로의 결합에 대한 KD는 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M일 것이다.
항체가 미리 결정된 표적에 결합할 수 있는 한편 다른 표적에는 결합할 수 없고, 즉, 다른 표적에 대해 유의한 친화력을 갖지 않으며 표준 검정에서 다른 표적에 유의하게 결합하지 않는 경우, 항체는 상기 미리 결정된 표적에 특이적이다. 본 발명에 따르면, 항체가 CLDN6에 결합할 수 있지만 다른 표적, 특히 CLDN9, CLDN4 및/또는 CLDN3과 같은 다른 CLDN 단백질 및/또는 클라우딘 단백질 이외의 단백질, 바람직하게는 CLDN6 이외의 단백질에는 (실질적으로) 결합할 수 없는 경우, 항체는 CLDN6에 특이적이다. 바람직하게는, 그러한 다른 표적에 대한 친화력 및 그로의 결합이 소 혈청 알부민(BSA), 카제인, 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 클라우딘-비관련 단백질 또는 MHC 분자 또는 트랜스페린 수용체 또는 임의의 다른 특정 폴리펩티드와 같은 비-클라우딘 막관통 단백질에 대한 친화력 또는 그로의 결합을 유의하게 초과하지 않는 경우, 항체는 CLDN6에 특이적이다. 바람직하게는, 항체가 특이적이지 않은 표적으로의 결합에 대한 KD보다 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 또는 106배 낮은 KD로 미리 결정된 표적에 결합하는 경우, 항체는 상기 표적에 특이적이다. 예를 들어, 항체가 특이적인 표적으로의 항체의 결합에 대한 KD가 10-7 M인 경우, 항체가 특이적이지 않은 표적으로의 결합에 대한 KD는 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M일 것이다.
표적으로의 항체의 결합은 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984)], 문헌[Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992)], 및 본원에 기재된 방법을 참조한다. 친화력은, 통상적인 기법을 이용하여, 예컨대 평형 투석에 의해; 제조업체에 의해 약술된 일반 절차를 이용하여 BIAcore 2000 기기를 사용함으로써; 방사성 표지된 표적 항원을 사용하는 방사성 면역 검정에 의해; 또는 당업자에게 알려진 또 다른 방법에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 친화력 데이터는, 예를 들어, 문헌[Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)]의 방법에 의해 분석될 수 있다. 특정 항체-항원 상호 작용의 측정된 친화력은 상이한 조건, 예를 들어, 염 농도, pH 하에서 측정된 경우 달라질 수 있다. 따라서, 친화력 및 다른 항원-결합 파라미터, 예를 들어, KD, IC50의 측정은 바람직하게는 항체와 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액을 사용하여 이루어진다.
"경쟁하다"라는 용어는 표적 항원으로의 결합에 대한 2개의 항체 사이의 경쟁을 지칭한다. 2개의 항체가 표적 항원으로의 결합에 대해 서로를 차단하지 않는 경우, 그러한 항체들은 경쟁하는 것이 아니며, 이는 상기 항체들이 표적 항원의 동일한 부분, 즉, 에피토프에 결합하지 않음을 나타낸다. 표적 항원으로의 결합에 대한 항체들의 경쟁을 시험하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 방법의 예는, 예를 들어 ELISA로 또는 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있는, 소위 교차-경쟁 검정이다. 예를 들어, ELISA-기반 검정은, ELISA 플레이트 웰을 항체들 중 하나로 코팅하고; 경쟁 항체 및 His-태깅 항원/표적을 첨가하고, 예를 들어, 비오티닐화 항-His 항체에 이어 스트렙타비딘-폴리-HRP를 첨가함으로써, 첨가된 항체가 코팅된 항체로의 His-태깅 항원의 결합을 억제하는지 여부를 검출하고, 추가로 ABTS와의 반응을 발색시키고 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어 유세포 분석 검정은, 항원/표적을 발현하는 세포를 과량의 비표지된 항체와 함께 인큐베이션하고, 세포를 준-최적(sub-optimal) 농도의 비오틴-표지 항체와 함께 인큐베이션한 후, 형광 표지된 스트렙타비딘과 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석법에 의해 분석함으로써 수행될 수 있다.
2개의 항체가 동일한 항원 및 동일한 에피토프에 결합하는 경우 이들 항체는 "동일한 특이성"을 갖는다. 시험될 항체가 특정 항원-결합 항체와 동일한 에피토프를 인식하는지 여부, 즉, 항체들이 동일한 에피토프에 결합하는지 여부는, 예를 들어, 동일한 에피토프에 대한 항체들의 경쟁에 기초한, 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 시험될 수 있다. 항체들 사이의 경쟁은 교차-차단 검정에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 경쟁 ELISA 검정이 교차-차단 검정으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원은 미세역가 플레이트의 웰 상에 코팅될 수 있고, 항원-결합 항체 및 후보 경쟁 시험 항체가 첨가될 수 있다. 웰 내의 항원에 결합된 항원-결합 항체의 양은 동일한 에피토프로의 결합에 대해 그와 경쟁하는 후보 경쟁 시험 항체의 결합 능력과 간접적으로 상호 관련된다. 구체적으로, 후보 경쟁 시험 항체의 친화력이 동일한 에피토프에 대해 클수록, 항원-코팅 웰에 결합된 항원-결합 항체의 양이 적어진다. 웰에 결합된 항원-결합 항체의 양은 검출 가능한 또는 측정 가능한 표지 물질로 항체를 표지함으로써 측정될 수 있다.
항원으로의 결합에 대해 또 다른 항체와 경쟁하는 항체, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체, 또는 또 다른 항체의 항원에 대한 특이성을 갖는 항체, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체는, 본원에 기재된 바와 같은 상기 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 변이체, 예를 들어 CDR에서의 변형 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 특정 동일성 정도를 포함하는 항체일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 항체 클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 본 발명에 따른 항체는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 포함하고, IgG2a(예를 들어, IgG2a, κ, λ), IgG2b(예를 들어, IgG2b, κ, λ), IgG3(예를 들어, IgG3, κ, λ) 및 IgM 항체를 포함한다. 그러나, IgG1, IgA1, IgA2, 분비 IgA, IgD, 및 IgE 항체를 포함하는, 다른 항체 아이소타입이 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "아이소타입 전환(switching)"은 항체의 클래스 또는 아이소타입이 하나의 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스들 중 하나로 변경되는 현상을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "재배열된"은 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 구성을 지칭하며, 여기서 V 세그먼트는 각각 완전한 VH 또는 VL 도메인을 본질적으로 인코딩하는 형태로 D-J 또는 J 세그먼트에 바로 인접하여 위치한다. 재배열된 면역글로불린(항체) 유전자좌는 생식계열 DNA와의 비교에 의해 확인될 수 있고; 재배열된 유전자좌는 적어도 하나의 재조합된 6량체/9량체 상동성 요소를 가질 것이다.
V 세그먼트와 관련하여 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "재배열되지 않은" 또는 "생식계열 구성"은 V 세그먼트가 D 또는 J 세그먼트에 바로 인접하여 존재하도록 재조합되지 않은 구성을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 항체는 마우스, 래트, 토끼, 기니피그 및 인간을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 종으로부터 유래될 수 있다. 항체는, 하나의 종, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 항체 불변 영역이 또 다른 종으로부터 유래된 항원 결합 부위와 조합된 키메라 분자를 또한 포함한다. 더욱이, 항체는, 비-인간 종으로부터 유래된 항체의 항원 결합 부위가 인간 기원의 불변 및 프레임워크 영역과 조합된 인간화 분자를 포함한다.
항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)]의 표준 체세포 하이브리드화 기법을 포함하는, 다양한 기법에 의해 생산될 수 있다. 체세포 하이브리드화 절차가 바람직하지만, 원칙적으로, 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기법, 예를 들어, B-림프구의 바이러스 또는 종양 유전자 형질전환 또는 항체 유전자의 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 기법이 이용될 수 있다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장 세포의 분리를 위한 면역화 프로토콜 및 기법은 당업계에 알려져 있다. 융합 파트너(예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 알려져 있다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 다른 바람직한 동물 시스템은 래트 및 토끼 시스템이다(예를 들어, 문헌[Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995)]에 기재되어 있고, 또한 문헌[Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)]를 참조함).
또 다른 바람직한 구현예에서, CLDN6에 대해 유도된 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조말 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스크로모조말 마우스는 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 알려진 마우스를 포함하고, 본원에서 "트랜스제닉 마우스"로 통칭된다. 그러한 트랜스제닉 마우스에서의 인간 항체의 생산은 WO2004 035607에서 CD20에 대해 상세히 설명된 바와 같이 수행될 수 있다.
모노클로날 항체를 생성하기 위한 또 다른 전략은 규정된 특이성의 항체를 생산하는 림프구로부터 항체를 인코딩하는 유전자를 직접 분리하는 것이며; 예를 들어, 문헌[Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities]을 참조한다. 재조합 항체 조작에 대한 세부 내용에 대해서는 문헌[Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8] 및 문헌[Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1]을 또한 참조한다.
CLDN6에 대한 항체를 생성하기 위해, 마우스는, 기재된 바와 같은, 재조합적으로 발현된 CLDN6 항원 또는 그의 단편 및/또는 CLDN6 또는 그의 단편을 발현하는 세포의 농축 제조물인 CLDN6 서열로부터 유래된 담체-접합 펩티드로 면역화될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 전장 인간 CLDN6 또는 그의 단편을 인코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. CLDN6 항원의 정제되거나 농축된 제조물을 사용한 면역화가 항체를 생성하지 않는 경우, 마우스는 면역 반응을 촉진하기 위해 CLDN6을 발현하는 세포, 예를 들어, 세포주로 또한 면역화될 수 있다.
면역 반응은, 꼬리 정맥 또는 후안와 출혈에 의해 얻어진 혈장 및 혈청 샘플을 사용한 면역화 프로토콜 과정에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 충분한 역가의 항-CLDN6 면역글로불린을 가진 마우스가 융합에 사용될 수 있다. 마우스는 희생 및 비장 제거 3일 내지 5일 전에 CLDN6 발현 세포로 복강내 또는 정맥내 부스팅(boosting)하여 특이적 항체 분비 하이브리도마의 비율을 증가시킬 수 있다.
CLDN6에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 얻은 림프절, 비장 또는 골수로부터의 세포를 분리하고 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주에 융합시킬 수 있다. 이어서, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 이어서, 개별 웰을 항체 분비 하이브리도마에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. CLDN6 발현 세포를 사용한 면역형광법 및 FACS 분석에 의해, CLDN6에 특이성을 갖는 항체를 확인할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 리플레이팅하고 다시 스크리닝할 수 있으며, 항-CLDN6 모노클로날 항체에 대해 여전히 양성인 경우 제한 희석에 의해 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 특성 규명을 위해 조직 배양 배지에서 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, 당업계에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기법 및 유전자 트랜스펙션 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 또한 생산될 수 있다(문헌[Morrison, S. (1985) Science 229: 1202]).
예를 들어, 일 구현예에서, 관심 있는 유전자(들), 예를 들어, 항체 유전자는 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 당업계에 잘 알려진 다른 발현 시스템에 의해 사용되는 것과 같은 진핵 생물 발현 플라스미드와 같은 발현 벡터에 라이게이션될 수 있다. 클로닝된 항체 유전자를 갖는 정제된 플라스미드는 진핵 생물 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293T 세포 또는 HEK293 세포 또는 대안적으로 식물 유래 세포, 진균 또는 효모 세포와 같은 다른 진핵 세포에 도입될 수 있다. 이들 유전자를 도입하기 위해 사용된 방법은 전기천공법, 리포펙틴, 리포펙타민 또는 다른 것들과 같은 당업계에 설명된 방법일 수 있다. 숙주 세포로의 이들 항체 유전자의 도입 후, 항체를 발현하는 세포가 확인되고 선택될 수 있다. 이러한 세포는 트랜스펙토마를 나타내며, 이는 이어서 그의 발현 수준에 대해 증폭되고 항체를 생성하도록 업스케일링(upscaling)될 수 있다. 재조합 항체는 이러한 배양 상청액 및/또는 세포로부터 분리되고 정제될 수 있다.
대안적으로, 클로닝된 항체 유전자는, 미생물, 예를 들어 대장균과 같은 원핵 세포를 포함하는, 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, 항체는 트랜스제닉 비-인간 동물에서, 예컨대 양 및 토끼의 젖에서 또는 암탉의 알에서, 또는 트랜스제닉 식물에서 생성될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181]; 문헌[Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157]; 및 문헌[Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839]을 참조한다.
키메라 항체는, 다양한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 뮤린 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 항체의 키메라화는 뮤린 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 인간 중쇄 및 경쇄의 불변 영역과의 결합에 의해 달성된다(예를 들어, 문헌[Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8]에 기재된 바와 같음). 바람직한 구현예에서, 키메라 항체는 인간 카파-경쇄 불변 영역을 뮤린 경쇄 가변 영역에 결합시킴으로써 생성된다. 또한 바람직한 구현예에서, 키메라 항체는 인간 람다-경쇄 불변 영역을 뮤린 경쇄 가변 영역에 결합시킴으로써 생성될 수 있다. 키메라 항체의 생성을 위한 바람직한 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG3 및 IgG4이다. 키메라 항체의 생성을 위한 다른 바람직한 중쇄 불변 영역은 IgG2, IgA, IgD 및 IgM이다.
항체는 주로, 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해, 표적 항원과 상호 작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체들 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호 작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상으로 이식된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327]; 문헌[Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525]; 및 문헌[Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033] 참조). 그러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 이 생식계열 서열은 성숙 항체 유전자 서열과 상이할 것인데, 이는 그러한 서열이 B 세포 성숙 동안 V(D)J 결합에 의해 형성되는 완전히 조립된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문이다. 또한, 생식계열 유전자 서열은 가변 영역에 걸쳐 고르게 개별 위치에서 고친화력 2차 레퍼토리 항체의 서열과 상이할 것이다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역 1의 아미노 말단 부분 및 프레임워크 영역 4의 카르복시-말단 부분에서 비교적 드물다. 또한, 많은 체세포 돌연변이는 항체의 결합 특성을 유의하게 변경시키지 않는다. 이러한 이유로, 원래 항체와 유사한 결합 특성을 갖는 온전한 재조합 항체를 재현하기 위해 특정 항체의 전체 DNA 서열을 얻을 필요는 없다(WO 99/45962 참조). CDR 영역을 스패닝하는 부분 중쇄 및 경쇄 서열이 전형적으로 이 목적을 위해 충분하다. 부분 서열은 어느 생식계열 가변 및 결합 유전자 세그먼트가 재조합된 항체 가변 유전자에 기여하는지를 결정하는 데 사용된다. 이어서, 생식계열 서열은 가변 영역의 결손 부분을 채우는 데 사용된다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 동안 절단되며 최종 항체의 특성에 기여하지 않는다. 결손 서열을 추가하기 위해, 클로닝된 cDNA 서열이 라이게이션 또는 PCR 증폭에 의해 합성 올리고뉴클레오티드와 조합될 수 있다. 대안적으로, 전체 가변 영역은 일련의 짧고 중첩하는 올리고뉴클레오티드들로 합성되고 PCR 증폭에 의해 조합되어 전적으로 합성인 가변 영역 클론을 생성할 수 있다. 이 공정은 특정 제한 부위의 제거 또는 포함, 또는 특정 코돈의 최적화와 같은 특정한 이점들을 갖는다.
하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열은, 천연 서열과 동일한 아미노산 코딩 능력을 갖는 합성 V 서열을 생성하기 위해 합성 올리고뉴클레오티드들의 중첩 세트를 설계하는 데 사용될 수 있다. 합성 중쇄 및 카파쇄 서열은 다음과 같은 3가지 방식으로 천연 서열과 상이할 수 있다: 반복되는 뉴클레오티드 염기의 스트링이 중단되어 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 용이하게 하고; 최적의 번역 개시 부위가 코작(Kozak)의 규칙에 따라 통합되고(문헌[Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870]); HindIII 부위가 번역 개시 부위의 업스트림에서 조작된다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 모두에 대해, 최적화된 코딩 및 상응하는 비-코딩 가닥 서열은 대략, 상응하는 비-코딩 올리고뉴클레오타이드의 중간점에서, 30개 내지 50개 뉴클레오티드로 분해된다. 따라서, 각 쇄에 대해, 올리고뉴클레오티드들은 150개 내지 400개 뉴클레오티드의 세그먼트를 스패닝하는 중첩 이중 가닥 세트로 조립될 수 있다. 이어서, 풀(pool)은 150개 내지 400개 뉴클레오티드의 PCR 증폭 생성물을 생성하기 위한 주형으로서 사용된다. 전형적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 세트는 2개의 중첩 PCR 생성물을 생성하기 위해 개별적으로 증폭되는 2개의 풀로 분류될 것이다. 이어서, 이들 중첩 생성물은 PCR 증폭에 의해 조합되어 완전한 가변 영역을 형성한다. 또한, 발현 벡터 작제물로 쉽게 클로닝될 수 있는 단편을 생성하기 위해 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 중첩 단편을 PCR 증폭에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.
이어서, 재구성된 키메라화 또는 인간화 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 클로닝된 프로모터, 리더, 번역 개시, 불변 영역, 3' 비번역, 폴리아데닐화, 및 전사 종결 서열과 조합되어 발현 벡터 작제물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 작제물은 단일 벡터로 조합되어, 숙주 세포들 내로 공동-트랜스펙션되거나, 연속 트랜스펙션되거나, 개별적으로 트랜스펙션될 수 있으며, 이어서 숙주 세포들은 융합되어 두 쇄 모두를 발현하는 숙주 세포를 형성한다. 인간 IgGκ에 대한 발현 벡터의 작제에 사용하기 위한 플라스미드가 설명된다. 플라스미드는, PCR 증폭된 V 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열이 완전한 중쇄 및 경쇄 미니 유전자를 재구성하는 데 사용될 수 있도록 작제될 수 있다. 이러한 플라스미드는 완전히 인간이거나 키메라인 IgG1, 카파 항체 또는 IgG4, 카파 항체를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 다른 중쇄 아이소타입의 발현을 위해, 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위해 유사한 플라스미드가 작제될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 설명된 항-CLDN6 항체의 구조적 특징은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성, 예컨대 CLDN6로의 결합을 유지하는 구조적으로 관련된 인간화 항-CLDN6 항체를 생성하는 데 사용된다. 더욱 상세하게는, 마우스 모노클로날 항체의 하나 이상의 CDR 영역은 알려진 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합적으로 조합되어 추가의 재조합적으로 조작된 인간화 항-CLDN6 항체를 생성할 수 있다.
CLDN6에 결합하는 항체의 능력은 표준 결합 검정, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광법 및 유세포 분석을 이용하여 결정될 수 있다.
ELISA는 면역화된 마우스의 혈청 내의 항체의 존재 또는 CLDN6 단백질 또는 펩티드로의 모노클로날 항체의 결합을 입증하는 데 이용될 수 있다. 면역화에 사용되는 펩티드 또는 단백질은 하이브리도마 상청액의 특이성을 결정하거나 혈청 역가를 분석하는 데 사용될 수 있다.
면역화된 마우스의 혈청 내의 항체의 존재 또는 살아 있는 세포로의 모노클로날 항체의 결합을 입증하기 위해, 유세포 분석법이 이용될 수 있다. 자연적으로 또는 트랜스펙션 후에 항원 및 항원 발현을 결여한 음성 대조 표준을 발현하는 세포주(표준 성장 조건 하에서 성장됨)은 하이브리도마 상청액 또는 1% FBS를 함유하는 PBS에서 다양한 농도의 모노클로날 항체와 혼합될 수 있고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션될 수 있다. 세척 후, APC- 또는 Alexa647-표지 항 IgG 항체가 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에서 항원-결합 모노클로날 항체에 결합할 수 있다. 샘플은, 단일의 살아있는 세포에 게이팅(gating)하기 위해 광 및 측면 산란 특성을 사용하는 FACS 기기로 유세포 분석법에 의해 분석될 수 있다. 단일 측정에서 항원-특이적 모노클로날 항체를 비-특이적 결합제와 구별하기 위해, 공동-트랜스펙션 방법이 이용될 수 있다. 항원을 인코딩하는 플라스미드 및 형광 마커로 일시적으로 트랜스펙션된 세포는 전술한 바와 같이 염색될 수 있다. 트랜스펙션된 세포는 항체-염색 세포와는 상이한 형광 채널에서 검출될 수 있다. 트랜스펙션된 세포의 대부분이 두 트랜스진(transgene) 모두를 발현함에 따라, 항원-특이적 모노클로날 항체는 형광 마커 발현 세포에 우선적으로 결합하는 반면, 비-특이적 항체는 필적하는 비율로 트랜스펙션되지 않은 세포에 결합한다. 유세포 분석 검정에 추가하여 또는 그 대신에 형광 현미경을 사용한 대안적인 검정이 이용될 수 있다. 세포는 전술한 바와 정확히 동일하게 염색되고 형광 현미경에 의해 검사될 수 있다.
면역화된 마우스의 혈청 내의 항-CLDN6 항체의 존재 또는 CLDN6을 발현하는 살아 있는 세포로의 모노클로날 항체의 결합을 입증하기 위해, 면역형광 현미경 분석이 이용될 수 있다. 예를 들어, 자발적으로 또는 트랜스펙션 후 CLDN6을 발현하는 세포주 및 CLDN6 발현을 결여한 음성 대조 표준을, 10% 소 태아 혈청(FCS), 2 mM L-글루타민, 100 IU/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지에서 표준 성장 조건 하에서 챔버 슬라이드에서 성장시킨다. 이어서, 세포를 메탄올 또는 파라포름알데히드로 고정시키거나 처리하지 않은 채로 방치할 수 있다. 이어서, 세포를 25℃에서 30분 동안 CLDN6에 대한 모노클로날 항체와 반응시킬 수 있다. 세척 후, 세포를 동일한 조건 하에서 Alexa555-표지 항-마우스 IgG 2차 항체(Molecular Probes)와 반응시킬 수 있다. 이어서, 세포를 형광 현미경에 의해 검사할 수 있다.
세포가 메탄올 고정되거나 파라포름알데히드 고정되고 트리톤 X-100으로 투과될 때 세포 내의 총 CLDN6 수준을 관찰할 수 있다. 살아 있는 세포 및 투과되지 않은, 파라포름알데히드 고정된 세포에서, CLDN6의 표면 국소화를 검사할 수 있다. 추가적으로 타이트 정션으로의 CLDN6의 표적화를 ZO-1과 같은 타이트 정션 마커에 의한 공동-염색에 의해 분석할 수 있다. 또한, 세포막 내에서의 항체 결합 및 CLDN6 국소화의 효과를 검사할 수 있다.
CLDN6 항원과의 반응성에 대해 항-CLDN6 IgG를 웨스턴 블롯팅에 의해 추가로 시험할 수 있다. 간략하게 말하면, CLDN6을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물 및 적절한 음성 대조 표준을 준비하여 소듐 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙(probing)할 것이다. 항-마우스 IgG 퍼옥시다제를 사용하여 IgG 결합을 검출하고, ECL 기질로 발색시킬 수 있다.
당업자에게 잘 알려진 방식으로, 예를 들어, 정례적인 수술 절차 동안 환자로부터 얻거나 자발적으로 또는 트랜스펙션 후 CLDN6를 발현하는 세포주로 접종된 이종이식된 종양을 보유한 마우스로부터 얻은 비-암 조직 또는 암 조직 샘플로부터의 파라포름알데히드 또는 아세톤 고정된 동결절편(cryosection) 또는 파라포름알데히드로 고정된 파라핀 포매된 조적 절편을 사용하여, CLDN6 항원과의 반응성에 대해 항-CLDN6 마우스 IgG를 면역조직화학에 의해 추가로 시험할 수 있다. 면역염색의 경우, 공급업체 지침에 따라 CLDN6에 반응성인 항체를 인큐베이션한 후 양고추냉이-퍼옥시다제 접합된 염소 항-마우스 또는 염소 항-토끼 항체를 인큐베이션할 수 있다.
본 발명의 방법에서 CLDN6을 검정하기 위한 하나의 특히 바람직한 방법론은 면역조직화학 또는 IHC이다. 면역조직화학 또는 IHC는 조직 절편의 세포, 예를 들어 본원에 언급된 조직의 세포에서 항원(예를 들어, 단백질)을 검출하는 과정을 지칭한다. 면역조직화학적 염색은 암성 종양에서 발견되는 것과 같은 비정상 세포의 진단에 널리 사용된다. 항체-항원 상호 작용의 가시화는 많은 방식으로 달성될 수 있다. 가장 일반적인 예에서, 항체는 색-생성 반응을 촉매할 수 있는 효소, 예컨대 퍼옥시다제에 접합된다. 대안적으로, 항체는 형광단, 예컨대 플루오레세인 또는 로다민에 또한 태깅될 수 있다.
샘플의 준비는 세포 형태, 조직 구조 및 표적 에피토프의 항원성을 유지하는 데 중요하다. 이는 적절한 조직 수집, 고정 및 절편화를 필요로 한다. 파라포름알데히드는 일반적으로 고정과 관련하여 사용된다. 실험 샘플의 목적 및 두께에 따라, 얇은(약 4 내지 40 μm) 절편이 관심 있는 조직으로부터 슬라이싱(slicing)되거나, 조직이 그다지 두껍지 않고 침투 가능한 경우 전체로 사용된다. 슬라이싱은 일반적으로 마이크로톰(microtome)의 사용을 통해 달성되고, 슬라이스는 슬라이드 상에 놓여진다.
샘플은, 파라핀 제거 및 항원 회수(retrieval)를 포함하는, 에피토프가 항체 결합에 이용 가능하도록 하는 추가의 단계를 필요로 할 수 있다. 트리톤 X-100과 같은 세정제가 면역조직화학에서 표면 장력을 줄이기 위해 일반적으로 사용되며, 이는 샘플의 더 우수하고 더 균일한 커버리지(coverage)를 달성하도록 시약이 적게 사용되게 할 수 있다.
직접적인 면역조직화학 염색 방법은, 염색되는 항원에 직접 결합하는 하나의 표지된 항체를 사용한다. 더욱 일반적인 간접 면역조직화학 염색 방법은 프로빙되는 항원에 대한 하나의 항체, 및 제1 항체에 대한 제2의 표지된 항체를 사용한다.
IHC에서 백그라운드 염색을 감소시키기 위해, 샘플은 1차 또는 2차 항체가 달리 결합할 수 있는 반응성 부위를 차단하는 완충액과 함께 인큐베이션된다. 1차 항체는 관심 있는 항원에 대해 생성되고 전형적으로 비접합(비표지)되는 한편, 2차 항체는 1차 항체 종의 면역글로불린에 대해 생성된다. 2차 항체는 일반적으로, 리포터 분자를 이어서 동원하는 링커 분자, 예컨대 비오틴에 접합되거나, 2차 항체는 리포터 분자 자체에 직접 결합된다. 일반적인 차단 완충액은 정상 혈청, 무-지방 분유, BSA 또는 젤라틴, 및 상업용 차단 완충액을 포함한다.
리포터 분자는 검출 방법의 성질에 따라 달라지며, 가장 호평받는 검출 방법들은 각각 효소- 및 형광단-매개 발색 및 형광 검출을 사용하는 것들이다. 발색 리포터를 사용하면, 효소 표지는 기질과 반응하여 강렬한 색상의 생성물을 산출할 수 있으며, 이는 통상의 광학 현미경으로 분석될 수 있다. 효소 기질의 목록은 광범위하지만, 알칼리성 포스파타제(AP) 및 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 단백질 검출을 위한 표지로 가장 광범위하게 사용되는 두 효소이다. DAB 또는 BCIP/NBT를 포함하는 효소와 함께 사용하기 위해 다양한 발색, 형광 및 화학발광 기질이 이용 가능하다. 형광 리포터는 IHC 검출에 사용되는 작은 유기 분자이다. 발색 및 형광 검출 방법의 경우, 신호의 밀도측정 분석은 리포터 신호의 수준을 단백질 발현 또는 국소화의 수준과 상호 관련시키기 위해 각각 반-정량 및 완전-정량 데이터를 제공할 수 있다.
표적 항원의 면역조직화학적 염색 후, 1차 염색이 두드러지도록 돕는 대비를 제공하기 위해 2차 염색이 종종 적용된다. 이러한 염색들 중 다수는 분리된 세포 구획들 또는 항원들에 대해 특이성을 보이는 한편, 다른 것들은 전체 세포를 염색할 것이다. 모든 실험 설계에 맞는 다수의 광범위한 시약을 제공하기 위해 IHC에 발색 및 형광 염료 둘 모두가 이용 가능하다. 헤마톡실린, 훽스트(Hoechst) 염색제 및 DAPI가 일반적으로 사용된다.
항체에 의해 인식되는 에피토프의 맵핑은 문헌["Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9] 및 문헌["Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay]에 상세히 설명된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "면역 이펙터 기능"은, 종양 파종 및 전이의 억제를 포함하는, 종양 성장의 억제 및/또는 종양 발달의 억제를 가져오는 면역계의 구성 요소에 의해 매개되는 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게는, 면역 이펙터 기능은 암 세포의 사멸을 가져온다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 면역 이펙터 기능은 항체-매개 이펙터 기능이다. 그러한 기능은 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포-매개 식세포작용(ADCP), 예를 들어, 표면 항원으로의 항체의 결합에 의한, 종양-관련 항원을 보유하는 세포에서의 아폽토시스의 유도, 예를 들어, CD40 수용체 또는 CD40 리간드(CD40L)로의 항체의 결합에 의한, CD40L-매개 신호 전달의 억제, 및/또는 종양-관련 항원을 보유하는 세포의 증식의 억제, 바람직하게는 ADCC 및/또는 CDC를 포함한다. 따라서, 하나 이상의 면역 이펙터 기능을 매개할 수 있는 항체는, 바람직하게는, CDC-매개 용해, ADCC-매개 용해, 아폽토시스, 동형 부착(homotypic adhesion), 및/또는 식세포작용을 유도함으로써, 바람직하게는 CDC-매개 용해 및/또는 ADCC-매개 용해를 유도함으로써 세포의 사멸을 매개할 수 있다. 항체는, 단순히 암 세포의 표면 상에 있는 종양-관련 항원에 결합함으로써, 또한 효과를 발휘할 수 있다. 예를 들어, 항체는, 단지 암 세포 표면 상에 있는 종양-관련 항원에 결합함으로써, 종양-관련 항원의 기능을 차단하거나 아폽토시스를 유도할 수 있다.
ADCC는 이펙터 세포, 특히 림프구의 세포-사멸 능력을 설명하며, 이는 바람직하게는 표적 세포가 항체에 의해 표지되는 것을 필요로 한다. ADCC는 바람직하게는 항체가 암 세포 상의 항원에 결합하고 항체 Fc 도메인이 면역 이펙터 세포의 표면 상의 Fc 수용체(FcR)와 결합할 때 발생한다. Fc 수용체의 몇몇 패밀리가 확인되었고, 특정 세포 집단은 규정된 Fc 수용체를 특징적으로 발현한다. ADCC는 가변적인 정도의 즉각적인 종양 파괴를 직접 유도하는 메커니즘으로 간주될 수 있으며, 그러한 종양 파괴는 또한 항원 제시 및 종양-유도 T-세포 반응의 유도로 이어진다. 바람직하게는, ADCC의 생체내 유도는 종양-유도 T-세포 반응 및 추가의 숙주-유래 항체 반응으로 이어질 것이다.
CDC는 항체에 의해 유도될 수 있는 또 다른 세포-사멸 방법이다. IgM은 보체 활성화에 가장 효과적인 아이소타입이다. 또한, IgG1 및 IgG3은 전형적인 보체-활성화 경로를 통해 CDC를 유도하는 데 둘 모두 매우 효과적이다. 바람직하게는, 이 캐스케이드(cascade)에서, 항원-항체 복합체의 형성은 IgG 분자와 같은 참여 항체 분자의 CH2 도메인 상의 아주 근접한 다수의 C1q 결합 부위의 언클로킹(uncloaking)을 가져온다(C1q는 보체 C1의 3개의 하위 구성 요소 중 하나임). 바람직하게는 이들 언클로킹된 C1q 결합 부위는 이전에 친화력이 낮았던 C1q-IgG 상호 작용을 결합력(avidity)이 높은 상호 작용으로 전환시키며, 이는 일련의 다른 보체 단백질을 수반하는 이벤트들의 캐스케이드를 촉발하고 이펙터-세포 화학주성/활성화 작용제인 C3a 및 C5a의 단백질분해 방출로 이어진다. 바람직하게는, 보체 캐스케이드는 막 공격 복합체의 형성으로 끝나며, 이는 세포막에 공극을 생성하여 세포 안팎으로의 물과 용질의 자유로운 통과를 용이하게 하고 아폽토시스로 이어질 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응 동안 이펙터 기능을 발휘하는 세포와 관련된다. 예를 들어, 그러한 세포는 사이토카인 및/또는 케모카인을 분비하고, 미생물을 사멸시키고, 항체를 분비하고, 암성 세포를 인식하고, 선택적으로 그러한 세포를 제거한다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 T-세포(세포독성 T-세포, 헬퍼 T-세포, 종양 침윤 T-세포), B-세포, 자연 살해 세포, 호중구, 대식세포, 및 수지상 세포를 포함한다.
핵산은 본 발명에 따르면 바람직하게는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 더욱 바람직하게는 RNA, 가장 바람직하게는 시험관내 전사된 RNA(IVT RNA)이다. 핵산은 본 발명에 따르면 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 제조되고 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 핵산은 본 발명에 따르면 단일 가닥 또는 이중 가닥이고 선형이거나 또는 공유 결합적으로 폐쇄되어 원을 형성하는 분자 형태일 수 있다. 핵산은, 예를 들어, DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA 형태로, 세포 내로의 도입, 즉 세포의 트랜스펙션에 사용될 수 있다. 더욱이, RNA는 서열 안정화, 캡핑, 및 폴리아데닐화에 의해 적용 전에 변형될 수 있다.
본원에 기재된 핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지와 같은 파지 벡터, 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC), 또는 P1 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체 벡터를 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 발현 벡터뿐만 아니라 클로닝 벡터도 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드뿐만 아니라 바이러스 벡터도 포함하며, 요망되는 코딩 서열, 및 특정 숙주 유기체(예를 들어, 세균, 효모, 식물, 곤충, 또는 포유 동물)에서 또는 시험관내 발현 시스템에서의 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 DNA 서열을 일반적으로 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 특정의 요망되는 DNA 단편을 조작하고 증폭하는 데 사용되며, 요망되는 DNA 단편의 발현에 필요한 기능적 서열을 결여할 수 있다.
항체의 발현을 위한 벡터로서, 항체 쇄들이 상이한 벡터들에 존재하는 벡터 유형 또는 항체 쇄들이 동일한 벡터에 존재하는 벡터 유형 중 어느 하나가 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오티드"는 베타-D-리보-푸라노스 모이어티의 2'-위치에 하이드록실기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 분리된 RNA, 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 달라진 변경된 RNA를 포함한다. 그러한 변경은, 예컨대 RNA의 단부(들)로의 또는 내부로의, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서의, 비-뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. RNA 분자 내의 뉴클레오티드는 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-천연 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "RNA"는 "메신저 RNA"를 의미하는 "mRNA"를 포함하며 바람직하게는 이와 관련되고, 주형으로서 DNA를 사용하여 생성될 수 있고 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 "전사체"와 관련된다. mRNA는 전형적으로 5' 비번역 영역, 단백질 또는 펩티드 코딩 영역 및 3' 비번역 영역을 포함한다. mRNA는 세포에서 및 시험관내에서 제한된 하프타임(halftime)을 갖는다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "전사"는, DNA 서열의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 과정과 관련된다.
본 발명에 따라 기재된 핵산은 바람직하게는 분리된 것이다. 용어 "분리된 핵산"은, 본 발명에 따르면, 핵산이 (i) 시험관내에서, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되었거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생성되었거나, (iii) 예를 들어 절단 및 겔-전기영동 분별에 의해 정제되었거나, (iv) 예를 들어 화학 합성에 의해 합성되었음을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 DNA 기법에 의한 조작에 이용 가능한 핵산이다.
핵산은, 본 발명에 따르면, 단독으로 또는 동종 또는 이종일 수 있는 다른 핵산과 함께 존재할 수 있다. 바람직한 구현예들에서, 핵산은 상기 핵산에 대하여 동종 또는 이종일 수 있는 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된다. "동종"이라는 용어는 핵산들이 또한 자연적으로 기능적으로 연결되어 있음을 의미하고, "이종"이라는 용어는 핵산들이 자연적으로 기능적으로 연결되어 있지 않음을 의미한다.
핵산 및 발현 제어 서열은, 이들이 상기 핵산의 발현 또는 전사가 상기 발현 제어 서열의 제어를 받거나 그의 영향을 받는 방식으로 서로 공유 결합된 경우, 서로 "기능적으로" 연결된 것이다. 이어서, 핵산이 기능성 단백질로 번역될 경우, 발현 제어 서열이 코딩 서열에 기능적으로 연결되어 있을 때, 상기 발현 제어 서열의 유도는 코딩 서열에서 프레임 이동을 유발하지 않으면서 상기 핵산의 전사를 가져오거나, 상기 코딩 서열이 요망되는 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 없게 한다.
용어 "발현 제어 서열" 또는 "발현 제어 요소"는 본 발명에 따르면 유전자의 전사 또는 mRNA의 번역을 조절하는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서 및 다른 제어 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 발현 제어 서열은 조절될 수 있다. 발현 제어 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형에 따라 달라질 수 있지만, 전사 및 번역의 개시에 각각 관여하는 5'-비전사 및 5'- 및 3'-비번역 서열,예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 일반적으로 포함한다. 더욱 상세하게는, 5'-비전사 발현 제어 서열은 기능적으로 연결된 핵산의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 제어 서열은 인핸서 서열 또는 업스트림 활성화제 서열을 또한 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "프로모터" 또는 "프로모터 영역"은 발현되는 핵산 서열의 업스트림(5')에 위치하며 RNA-중합효소에 대한 인식 및 결합 부위를 제공함으로써 서열의 발현을 제어하는 핵산 서열과 관련된다. "프로모터 영역"은 유전자의 전사의 조절에 관여하는 추가의 인자에 대한 추가의 인식 및 결합 부위를 포함할 수 있다. 프로모터는 원핵 생물 또는 진핵 생물 유전자의 전사를 제어할 수 있다. 또한, 프로모터는 "유도성"이어서 유도제에 반응하여 전사를 개시할 수 있거나 전사가 유도제에 의해 제어되지 않는 경우 "항시성"일 수 있다. 유도성 프로모터의 제어를 받는 유전자는 유도제가 부재하는 경우 발현되지 않거나 단지 적은 정도로 발현된다. 유도제의 존재 하에서, 유전자는 스위치 온(switched on)되거나 전사 수준이 증가한다. 이는, 일반적으로, 특정 전사 인자의 결합에 의해 매개된다.
바람직한 프로모터는 본 발명에 따르면 SP6, T3 및 T7 중합효소에 대한 프로모터, 인간 U6 RNA 프로모터, CMV 프로모터, 및 부분 또는 부분들이, 예를 들어, 인간 GAPDH(글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소)와 같은, 그리고 추가의 인트론(들)을 포함하거나 포함하지 않는 다른 세포 단백질의 유전자의 프로모터의 부분 또는 부분들에 융합된, 그의 인공 하이브리드 프로모터(예를 들어, CMV)를 포함한다.
용어 "발현"은 본원에서 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, RNA의 생성 또는 RNA 및 단백질 또는 펩티드의 생성을 포함한다. RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히 펩티드 또는 단백질의 생성과 관련된다. 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 본 발명에 따르면, 발현이라는 용어는 또한 "비정상적 발현" 또는 "비정상 발현"을 포함한다.
"비정상적 발현" 또는 "비정상 발현"은, 본 발명에 따르면, 기준, 예를 들어 종양-관련 항원과 같은 특정 단백질의 비정상적 또는 비정상 발현과 관련된 질병이 없는 대상체에서의 상태와 비교하여 발현이 변경된, 바람직하게는 증가된 것을 의미한다. 발현의 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100%, 또는 그 초과만큼의 증가를 지칭한다. 일 구현예에서, 발현은 질병 조직에서만 발견되는 한편, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다.
"특이적으로 발현되는"이라는 용어는 단백질이 본질적으로 특정 조직 또는 기관에서만 발현됨을 의미한다. 예를 들어, 위 점막에서 특이적으로 발현되는 종양-관련 항원은 상기 단백질이 주로 위 점막에서 발현되고 다른 조직에서는 발현되지 않거나 다른 조직 또는 기관 유형에서는 유의한 정도로 발현되지 않음을 의미한다. 따라서, 오로지 위 점막의 세포에서 발현되고 임의의 다른 조직에서는 유의하게 적은 정도로 발현되는 단백질은 위 점막의 세포에서 특이적으로 발현되는 것이다. 일부 구현예들에서, 종양-관련 항원은, 하나 초과의 조직 유형 또는 기관에서, 예컨대 2개 또는 3개의 조직 유형 또는 기관에서, 그러나 바람직하게는 3개 이하의 상이한 조직 또는 기관 유형에서 정상 조건 하에서 또한 특이적으로 발현될 수 있다. 이 경우, 종양-관련 항원은 이어서 이들 기관에서 특이적으로 발현된다.
본 발명에 따른 용어 "번역"은, 메신저 RNA 가닥이 아미노산 서열의 조립을 유도하여 단백질 또는 펩티드를 만드는, 세포의 리보솜에서의 과정과 관련된다.
본 발명에 따르면, 용어 "~을 인코딩하는 핵산"은, 핵산이, 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재하는 경우, 그것이 인코딩하는 단백질 또는 펩티드를 생성하도록 발현될 수 있음을 의미한다.
용어 "펩티드"는 올리고펩티드 및 폴리펩티드를 포함하며, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된, 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 바람직하게는 6개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 9개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 바람직하게는 13개 이상, 바람직하게는 16개 이상, 바람직하게는 21개 이상이고 바람직하게는 최대 8개, 10개, 20개, 30개, 40개 또는 50개, 특히 100개의 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질"은 큰 펩티드, 바람직하게는 100개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 지칭하지만, 일반적으로 용어 "펩티드" 및 "단백질"은 동의어이며 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 설명된 단백질 및 펩티드는 분리된 것이다. "분리된 단백질" 또는 "분리된 펩티드"라는 용어는 단백질 또는 펩티드가 그의 자연 환경으로부터 분리되었음을 의미한다. 분리된 단백질 또는 펩티드는 본질적으로 정제된 상태일 수 있다. "본질적으로 정제된"이라는 용어는 단백질 또는 펩티드에 그것이 자연적으로 또는 생체내에서 회합하고 있는 다른 물질이 본질적으로 없음을 의미한다.
특정 아미노산 서열, 예를 들어 서열 목록에 제시된 것과 관련하여 본원에 제공된 교시는, 상기 특정 서열과 기능적으로 동등한 서열, 예를 들어, 특정 아미노산 서열의 특성과 동일하거나 유사한 특성을 나타내는 아미노산 서열을 가져오는, 상기 특정 서열의 변형, 즉, 변이체와 또한 관련되도록 해석되어야 한다. 하나의 중요한 특성은 표적으로의 항체의 결합을 유지하는 것이다. 바람직하게는, 특정 서열에 대하여 변형된 서열은, 그것이 항체에서 특정 서열을 대체할 때, 표적으로의 상기 항체의 결합을 유지한다.
당업자는 특히 CDR 서열, 초가변 및 가변 영역의 서열이 표적에 결합하는 능력을 상실하지 않으면서 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, CDR 서열은 본원에 명시된 CDR 서열과 동일하거나 매우 상동일 것이다.
"매우 상동"이라 함은 1개 내지 5개, 바람직하게는 1개 내지 4개, 예컨대 1개 내지 3개 또는 1개 또는 2개의 치환이 이루어질 수 있는 것으로 고려된다.
본 발명에 따른 용어 "변이체"는 또한 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 입체형태, 아이소형, 대립 유전자 변이체, 종 변이체 및 종 동족체, 특히 자연적으로 존재하는 것들을 포함한다. 대립 유전자 변이체는, 유의성이 종종 불분명한, 유전자의 정상 서열에서의 변경과 관련된다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립 유전자 변이체를 확인한다. 종 동족체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과 상이한 기원의 종의 핵산 또는 아미노산 서열이다.
본 발명의 목적상, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에서의 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 트렁케이션(truncation) 변이체로도 일컬어진다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서의 단일 또는 2개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위에 삽입되지만, 생성된 생성물의 적절한 스크리닝을 수반하는 무작위 삽입도 가능하다.
아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개, 또는 그 초과의 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 융합체를 포함한다.
아미노산 결실 변이체는 서열로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거, 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개, 또는 그 초과의 아미노산의 제거를 특징으로 한다. 결실은 단백질의 임의의 위치에 있을 수 있다.
아미노산 치환 변이체는 서열 내의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 또 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로 한다. 변형이 상동성 단백질들 또는 펩티드들 사이에 보존되지 않는 아미노산 서열의 위치에 존재하는 것 및/또는 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 단백질 변이체에서의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉, 유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측쇄가 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 포함한다. 자연 발생 아미노산은 일반적으로 4가지 패밀리, 즉, 산성(아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성(라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비-극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 하전되지 않은 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산으로 나뉜다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 함께 분류된다.
바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 사이의 유사성, 바람직하게는 동일성 정도는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는, 기준 아미노산 서열의 전장의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대해 주어진다. 예를 들어, 기준 아미노산 서열이 200개의 아미노산으로 이루어진 경우, 바람직하게는 유사성 또는 동일성 정도는, 바람직하게는 연속 아미노산인, 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 60개, 적어도 약 80개, 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개, 또는 약 200개의 아미노산에 대해 주어진다. 바람직한 구현예들에서, 유사성 또는 동일성 정도는 기준 아미노산 서열의 전장에 대해 주어진다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 업계에 알려진 도구, 바람직하게는 최상의 서열 정렬을 사용하여, 예를 들어, 표준 설정, 바람직하게는 EMBOSS::니들(needle), 매트릭스(Matrix): Blosum62, 갭 오픈(Gap Open) 10.0, 갭 익스텐드(Gap Extend) 0.5를 사용하는 Align을 사용하여 수행될 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 두 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열들 사이의 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다.
용어 "동일성 백분율"은, 최상의 정렬 후에 수득되는, 비교될 두 서열 사이의 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 나타내도록 의도되며, 이 백분율은 순전히 통계적이며 두 서열 사이의 차이는 무작위로 및 그들의 전장에 걸쳐 분포된다. 두 아미노산 서열 사이의 서열 비교는, 통상적으로, 이들 서열을 최적으로 정렬한 후 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 세그먼트에 의해 또는 "비교 윈도우"에 의해 수행된다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬은, 수동에 의한 것 외에도, 문헌[Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA)에 의해 생성될 수 있다.
동일성 백분율은 비교되는 두 서열 사이의 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 두 서열 사이의 동일성 백분율을 얻음으로써 계산된다.
상동성 아미노산 서열은 본 발명에 따르면 아미노산 잔기의 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 98 또는 적어도 99% 동일성을 나타낸다.
본원에 기재된 아미노산 서열 변이체는 당업자에 의해, 예를 들어, 재조합 DNA 조작에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결실을 갖는 단백질 및 펩티드를 제조하기 위한 DNA 서열의 조작은, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (1989)]에 상세히 설명되어 있다. 또한, 본원에 기재된 펩티드 및 아미노산 변이체는, 예를 들어, 고상 합성 및 유사한 방법에 의해서와 같은 알려진 펩티드 합성 기법의 도움으로 쉽게 제조될 수 있다.
본 발명은 "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어에 포함되는 본원에 기재된 펩티드 또는 단백질의 유도체를 포함한다. 본 발명에 따르면, 단백질 및 펩티드의 "유도체"는 단백질 및 펩티드의 변형된 형태이다. 그러한 변형은 임의의 화학적 변형을 포함하며, 단백질 또는 펩티드와 회합된 임의의 분자, 예컨대 탄수화물, 지질 및/또는 단백질 또는 펩티드의 단일 또는 다중 치환, 결실 및/또는 부가를 포함한다. 일 구현예에서, 단백질 또는 펩티드의 "유도체"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 팔미토일화, 미리스토일화, 이소프레닐화, 지질화, 알킬화, 유도체화, 보호기/차단기의 도입, 단백질분해 절단 또는 항체 또는 또 다른 세포 리간드로의 결합으로부터 생성된 변형된 유사체를 포함한다. "유도체"라는 용어는 또한 상기 단백질 및 펩티드의 모든 기능적인 화학적 동등물로 확장된다. 바람직하게는, 변형된 펩티드는 증가된 안정성 및/또는 증가되거나 감소된 면역원성을 갖는다.
본 발명에 따르면, 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질의 변이체, 유도체, 변형된 형태, 단편, 부분 또는 일부는, 바람직하게는, 각각 그것이 유래되는 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질의 기능적 특성을 가지며, 즉, 그것은 기능적으로 동등하다. 일 구현예에서, 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질의 변이체, 유도체, 변형된 형태, 단편, 부분 또는 일부는 각각 그것이 유래되는 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질과 면역학적으로 동등하다. 일 구현예에서, 기능적 특성은 면역학적 특성이다.
용어 "유래된"은 본 발명에 따르면 특정 엔티티(entity), 특히 특정 서열이 그것이 유래된 대상, 특히 유기체 또는 분자에 존재함을 의미한다. 아미노산 서열, 특히 특정 서열 영역의 경우, "유래된"은, 특히, 관련 아미노산 서열이 그것이 존재하는 아미노산 서열로부터 유래됨을 의미한다.
용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 바람직하게는 온전한 세포, 즉, 효소, 소기관, 또는 유전 물질과 같은 그의 정상 세포내 구성 요소를 방출하지 않은 온전한 막을 갖는 세포이다. 온전한 세포는 바람직하게는 생존 가능 세포, 즉, 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아 있는 세포이다. 용어 "세포"는 본 발명에 따르면 원핵 세포(예를 들어, 대장균) 또는 진핵 세포(예를 들어, 수지상 세포, B 세포, CHO 세포, COS 세포, K562 세포, HEK293 세포, HELA 세포, 효모 세포, 및 곤충 세포)를 포함한다. 포유 동물 세포, 예컨대 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소, 및 영장류로부터의 세포가 특히 바람직하다. 세포는 다수의 조직 유형으로부터 유래될 수 있으며, 1차 세포 및 세포주를 포함한다. 용어 "세포"는 비-암성 세포 및 암 세포, 예컨대 본원에 개시된 암 유형의 세포를 포함한다.
핵산 분자를 포함하는 세포는 바람직하게는 핵산에 의해 인코딩되는 펩티드 또는 단백질을 발현한다.
"표적 세포"는 항체와 같은 면역 반응에 대한 표적인 세포를 의미할 것이다. 표적 세포는 본원에 기재된 바와 같은 암 세포와 같은 임의의 바람직하지 않은 세포를 포함한다. 바람직한 구현예들에서, 표적 세포는 CLDN6을 발현하는 세포이다. CLDN6을 발현하는 세포는 전형적으로 암 세포를 포함한다.
용어 "트랜스제닉 동물"은 하나 이상의 트랜스진, 바람직하게는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 트랜스진, 또는 트랜스크로모좀(transchromosome)(동물의 자연적 게놈 DNA에 통합되거나 통합되지 않음)을 포함하며 바람직하게는 트랜스진을 발현할 수 있는 게놈을 갖는 동물을 지칭한다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스는 인간 경쇄 트랜스진 및 인간 중쇄 트랜스진 또는 인간 중쇄 트랜스크로모좀을 가질 수 있어서, CLDN6 항원 및/또는 CLDN6을 발현하는 세포로 면역화될 때 마우스는 인간 항-CLDN6 항체를 생성한다. 인간 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉 마우스, 예를 들어, HCo7 또는 HCol2 마우스와 같은 HuMAb 마우스의 경우와 같이, 마우스의 염색체 DNA에 통합될 수 있거나, 인간 중쇄 트랜스진은, WO 02/43478에 기재된 바와 같은 트랜스크로모조말(예를 들어, KM) 마우스의 경우와 같이, 염색체외에서 유지될 수 있다. 그러한 트랜스제닉 및 트랜스크로모조말 마우스는, V-D-J 재조합 및 아이소타입 전환을 겪음으로써 CLDN6에 대한 다수의 아이소타입의 인간 모노클로날 항체(예를 들어, IgG, IgA 및/또는 IgE)를 생성할 수 있다.
"면역학적으로 동등한"이라는 용어는 면역학적으로 동등한 아미노산 서열과 같은 면역학적으로 동등한 분자가 동일하거나 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내고/거나, 예를 들어, 체액성 면역 반응의 유도, 유도된 면역 반응의 강도 및/또는 지속 시간, 또는 면역 반응의 특이성과 같은 면역학적 효과의 유형에 대하여, 동일하거나 본질적으로 동일한 면역학적 효과를 발휘함을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "면역학적으로 동등한"은, 바람직하게는, 면역화에 사용되는 펩티드 또는 펩티드 변이체 또는 항체의 면역학적 효과 또는 특성과 관련하여 사용된다. 특정한 면역학적 특성은, 항체에 결합하고, 적절한 경우, 바람직하게는 항체의 생성을 자극함으로써, 면역 반응을 생성하는 능력이다. 예를 들어, 아미노산 서열은, 대상체의 면역계에 노출될 때 상기 아미노산 서열이 기준 아미노산 서열, 예컨대 CLDN6의 일부를 형성하는 기준 아미노산 서열과 반응하는 특이성을 갖는 면역 반응, 바람직하게는 항체를 유도하는 경우, 기준 아미노산 서열과 면역학적으로 동등하다.
본 발명은 샘플에서 CLDN6 항원의 존재를 검출하거나 CLDN6 항원의 양을 측정하는 방법으로서, 샘플, 및 선택적으로 대조 샘플을, CLDN6에 결합하는 본 발명의 항체와, 항체와 CLDN6 사이의 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 이어서, 복합체의 형성이 검출되며, 여기서 샘플과 대조 샘플 사이의 복합체 형성의 차이는 샘플 내의 CLDN6 항원의 존재를 나타낸다.
전술한 바와 같은 방법은, 특히, CLDN6-관련 질병, 예컨대 암 질병, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 암 질병을 진단하는 데 유용하다. 바람직하게는 기준 또는 대조 샘플 내의 CLDN6의 양보다 많은 샘플 내의 CLDN6의 양은, 샘플이 유래된 대상체, 특히 인간에서의 CLDN6-관련 질병의 존재를 나타낸다.
전술한 바와 같은 방법에 사용될 때, 본원에 기재된 항체에는, (i) 검출 가능한 신호를 제공하거나; (ii) 제2 표지와 상호 작용하여 제1 또는 제2 표지에 의해 제공되는 검출 가능한 신호, 예를 들어 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)를 수정하거나; (iii) 전하, 소수성, 형태, 또는 다른 물리적 파라미터에 의해, 이동성, 예를 들어 전기영동 이동성에 영향을 미치거나, (iv) 포획 모이어티, 예를 들어, 친화력, 항체/항원, 또는 이온성 복합체 형성을 제공하는 기능을 하는 표지가 제공될 수 있다. 표지로서 적합한 것은 구조물, 예컨대 형광 표지, 발광 표지, 발색단 표지, 방사성 동위 원소 표지, 동위 원소 표지, 바람직하게는 안정한 동위 원소 표지, 동중(isobaric) 표지, 효소 표지, 입자 표지, 특히 금속 입자 표지, 자성 입자 표지, 중합체 입자 표지, 작은 유기 분자, 예컨대 비오틴, 수용체의 리간드 또는 결합 분자, 예컨대 세포 부착 단백질 또는 렉틴, 결합제를 사용하여 검출될 수 있는 핵산 및/또는 아미노산 잔기를 포함하는 표지-서열 등이다. 표지는 비제한적인 방식으로 바륨 설페이트, 이오세타민산(iocetamic acid), 이오파노산, 칼슘 이포데이트, 소듐 디아트리조에이트, 메글루민 디아트리조에이트, 메트리사미드, 소듐 티로파노에이트, 및 불소-18 및 탄소-11과 같은 양전자 방출제, 요오드-123, 테크네튬-99m, 요오드-131 및 인듐-111과 같은 감마 방출제, 불소 및 가돌리늄과 같은 핵 자기 공명을 위한 핵종을 포함하는 방사성 진단제를 포함한다.
본 발명에 따르면, 기준 샘플 또는 기준 유기체와 같은 "기준"은 시험 샘플 또는 시험 유기체로부터 본 발명의 방법에서 얻은 결과들을 상호 관련시키고 비교하는 데 사용될 수 있다. 전형적으로 기준 유기체는 건강한 유기체, 특히 암 질병과 같은 질병을 앓지 않는 유기체이다. "기준 값" 또는 "기준 수준"은 충분히 많은 수의 기준을 측정함으로써 경험적으로 기준으로부터 결정될 수 있다. 바람직하게는 기준 값은 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 8개, 바람직하게는 적어도 12개, 바람직하게는 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개, 바람직하게는 적어도 50개, 또는 적어도 바람직하게는 적어도 100개의 기준을 측정함으로써 결정된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "감소한다" 또는 "억제한다"는 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상의 수준의 전체적인 감소를 가져오는 능력을 의미한다. 용어 "억제한다" 또는 유사한 문구는 완전한 또는 본질적으로 완전한 억제, 즉, 0으로 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.
"증가한다" 또는 "향상시킨다"와 같은 용어는 바람직하게는 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 100%만큼의 증가 또는 향상과 관련된다.
본원에 기재된 작용제, 조성물 및 방법은 질병이 있는 대상체를 진단하는 데 사용될 수 있다. 진단될 수 있는 질병은 CLDN6을 발현하는 모든 질병을 포함한다. 특히 바람직한 질병은 암 질병, 예컨대 본원에 기재된 암 질병이다.
본 발명에 따르면, 용어 "질병"은, 암 질병, 특히 본원에 기재된 형태의 암 질병을 포함하는, 임의의 병리학적 상태를 지칭한다.
용어 "정상 조직" 또는 "정상 상태"에서 사용되는 바와 같은 용어 "정상"은 건강한 조직 또는 건강한 대상체에서의 상태, 즉, 비-병리학적 상태를 지칭하며, 여기서 "건강한"은 바람직하게는 비-암성을 의미한다.
"CLDN6을 발현하는 세포를 수반하는 질병"은 본 발명에 따르면 CLDN6이 질병 조직 또는 기관의 세포에서 발현됨을 의미한다. 일 구현예에서, CLDN6의 발현은 건강한 조직 또는 기관에서의 상태와 비교하여 증가된다. 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 심지어 그 초과만큼의 증가를 지칭한다. 일 구현예에서, 발현은 질병 조직에서만 발견되는 한편, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다. 본 발명에 따르면, CLDN6을 발현하는 세포를 수반하거나 그와 관련된 질병은 암 질병, 특히 본원에 기재된 형태의 암을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "종양" 또는 "종양 질병"은 세포(신생(neoplastic) 세포 또는 종양 세포로 일컬어짐)의 비정상적 성장에 의해 형성된 팽윤 또는 병변을 지칭한다. "종양 세포"는 신속하고 제어되지 않은 세포 증식에 의해 성장하고 새로운 성장을 개시한 자극이 중단된 후에도 계속 성장하는 비정상 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과의 구조적 조직화 및 기능적 조화의 부분적 또는 완전한 결여를 보이고, 일반적으로 양성, 전-악성 또는 악성일 수 있는 뚜렷한 조직 덩어리를 형성한다.
양성 종양은 암의 3가지 악성 특성 모두를 결여한 종양이다. 따라서, 정의에 의하면, 양성 종양은 무제한적이고 공격적인 방식으로 성장하지 않고, 주변 조직을 침습하지 않으며, 비-인접 조직으로 확산(전이)되지 않는다. 양성 종양의 일반적인 예는 모반 및 자궁 섬유종을 포함한다.
"양성"이라는 용어는 가벼운 비진행성 질병을 의미하며, 실제로 많은 종류의 양성 종양은 건강에 무해하다. 그러나, 암의 침습적 특성을 결여하기 때문에 "양성 종양"으로 정의되는 일부 신생물(neoplasm)은 여전히 건강에 부정적인 영향을 초래할 수 있다. 이의 예는 "덩이(mass) 효과"(혈관과 같은 생명 유지와 관련된 기관의 압박)를 초래하는 종양, 또는 특정 호르몬을 과잉 생산할 수 있는 내분비 조직의 "기능성" 종양(예는 갑상선 선종, 부신피질 선종, 및 뇌하수체 선종을 포함함)을 포함한다.
전형적으로 양성 종양은 악성 방식으로 거동하는 그의 능력을 억제하는 외부 표면에 의해 둘러싸여 있다. 일부 경우에, 특정 "양성" 종양은 나중에 악성 암을 야기할 수 있으며, 이는 종양의 신생 세포의 하위 집단에서의 추가의 유전자 변화에 기인한다. 이 현상의 두드러진 예는 결장암의 중요한 전구체인 일반적 유형의 결장 폴립인 관형 선종이다. 빈번히 암으로 진행하는 대부분의 종양과 같은 관형 선종의 세포는 세포 성숙의 특정 이상 및 총괄하여 이형성증으로 알려진 외관을 보인다. 이러한 세포 이상은 거의 또는 전혀 암성으로 변하지 않는 양성 종양에서는 관찰되지 않지만, 자궁경부의 전-암성 병변과 같은 별개의 덩이를 형성하지 않는 다른 전-암성 조직 이상에서는 관찰된다. 일부 당국은 이형성 종양을 "전-악성"으로 지칭하고 "양성"이라는 용어를 거의 또는 전혀 암을 야기하지 않는 종양에 대해 남겨두는 것을 선호한다.
신생물은 신형성(neoplasia)의 결과로서의 비정상적 조직 덩어리이다. 신형성(그리스어로 새로운 성장임)은 세포의 비정상적 증식이다. 세포의 성장이 과도하여, 그 주위의 정상 조직의 성장과 조화를 이루지 못하게 된다. 성장은 자극이 중단된 후에도 동일하게 과도한 방식으로 지속된다. 이는 일반적으로 종괴(lump) 또는 종양을 유발한다. 신생물은 양성, 전-악성 또는 악성일 수 있다.
본 발명에 따른 "종양의 성장" 또는 "종양 성장"은 종양이 그 크기를 증가시키려는 경향 및/또는 종양 세포가 증식하려는 경향과 관련된다.
암(의학 용어: 악성 신생물(neoplasm))은 일단의 세포가 제어되지 않은 성장(정상 한계를 벗어난 분열), 침습(인접 조직으로의 침투 및 그의 파괴), 및 때때로 전이(림프 또는 혈액을 통한 체내의 다른 위치로의 확산)을 나타내는 질병의 부류이다. 암의 이러한 세 가지 악성 특성은 암이, 자가 제한적이고, 침습하거나 전이되지 않는 양성 종양과 구별되게 한다. 대부분의 암은 종양을 형성하지만, 백혈병과 같은 일부는 그렇지 않다. 본 발명에 따르면, 용어 "암" 및 "종양" 또는 "암 질병" 및 "종양 질병"은, 세포가 제어되지 않은 성장 및 선택적으로 침습 및/또는 전이를 나타내는 질병을 지칭하기 위해 대체로 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 "암 질병"은 CLDN6을 발현하는 세포를 특징으로 한다. CLDN6을 발현하는 세포는 바람직하게는 암 세포, 바람직하게는 본원에 기재된 종양 및 암의 세포이다. 바람직하게는, 그러한 세포는 태반 세포 이외의 세포이다.
암은 종양과 유사한 세포 유형에 의해 분류되며, 그에 따라 조직이 종양의 기원인 것으로 추정된다. 이들은 각각 조직학 및 위치이다.
본 발명에 따른 용어 "암"은 백혈병, 고환종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경모세포종, 신경아교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장암(intestinal cancer), 간암, 결장암, 위암, 장암(intestine cancer), 두경부암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 대장암, 췌장암, 이비인후(ENT)암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이들의 전이를 포함한다. 이의 예로는 폐 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 신장 세포 암종, 자궁경부 암종, 또는 전술한 암 유형 또는 종양의 전이가 있다. 본 발명에 따른 암이라는 용어는 또한 암 전이를 포함한다.
폐암의 주요 유형은 소세포 폐 암종(SCLC) 및 비-소세포 폐 암종(NSCLC)이다. 다음과 같은 비-소세포 폐 암종의 3가지 주요 하위 유형이 있다: 편평 세포 폐 암종, 선암종, 및 대세포 폐 암종. 선암종은 폐암의 대략 10%를 차지한다. 이 암은, 둘 모두 더 중심에 위치하는 경향이 있는 소세포 폐암 및 편평 세포 폐암과 대조적으로, 일반적으로 폐의 말초에서 관찰된다.
본 발명에 따르면, "암종"은 상피 세포로부터 유래된 악성 종양이다. 이 그룹은 흔한 형태의 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암을 포함하는 가장 흔한 암을 나타낸다.
"선암종"은 선 조직(glandular tissue)에서 기원하는 암이다. 또한 이 조직은 상피 조직으로 알려진 더 큰 조직 범주의 일부이다. 상피 조직은 피부, 선 및 신체의 공동 및 기관을 라이닝(lining)하는 다양한 다른 조직을 포함한다. 상피는 발생학적으로 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 유래된다. 선암종으로 분류되기 위해, 세포가 분비 특성을 갖는 한, 세포는 반드시 선의 일부일 필요는 없다. 이 형태의 암종은 인간을 포함하는 일부 고등 포유 동물에서 발생할 수 있다. 잘 분화된 선암종은 그것이 유래한 선 조직과 유사한 경향이 있는 한편, 잘 분화되지 못한 선암종은 그러하지 아니할 수 있다. 생검물로부터의 세포를 염색함으로써, 병리학자는 종양이 선암종인지 아니면 일부 다른 유형의 암인지를 결정할 것이다. 선암종은 신체 내에서의 선의 편재성으로 인해 신체의 많은 조직에서 발생할 수 있다. 각각의 선은 동일한 물질을 분비하지 않을 수 있는 한편, 세포에 대한 외분비 기능이 있는 한 그것은 선으로 간주되고, 따라서 그의 악성 형태는 선암종으로 명명된다. 악성 선암종은 다른 조직을 침습하고, 전이되기에 충분한 시간이 주어지는 경우 종종 전이된다. 난소 선암종은 가장 흔한 유형의 난소 암종이다. 이는 장액성 및 점액성 선암종, 투명 세포 선암종 및 자궁내막양 선암종을 포함한다.
"전이"라 함은 암 세포가 그의 원래 부위로부터 신체의 또 다른 부분으로 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며, 원발성 종양으로부터의 악성 세포의 탈리, 세포외 매트릭스의 침습, 체강 및 혈관에 진입하기 위한 내피 기저막의 침투, 및 이어서, 혈액에 의해 수송된 후, 표적 기관의 침윤에 좌우된다. 최종적으로, 표적 부위에서의 새로운 종양, 즉, 2차 종양 또는 전이성 종양의 성장은 혈관형성에 좌우된다. 원발성 종양의 제거 후에도 종양 전이가 종종 발생하는데, 이는 종양 세포 또는 성분이 남아서 전이력(metastatic potential)을 나타낼 수 있기 때문이다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 용어 "전이"는 원발성 종양 및 국소 림프절 시스템으로부터 멀리 떨어진 전이와 관련된 "원거리 전이"와 관련된다.
2차 또는 전이성 종양의 세포는 원래 종양의 세포와 같다. 예를 들어, 이는 난소암이 간으로 전이된 경우, 2차 종양은 비정상적 간 세포가 아닌 비정상적 난소 세포로 이루어짐을 의미한다. 이어서, 간에서의 종양은 간암이 아닌 전이성 난소암으로 일컬어진다.
재발 또는 재발생은 과거에 영향을 주었던 질환에 의해 사람이 다시 영향을 받을 때 일어난다. 예를 들어, 환자가 종양 질병을 앓은 적이 있고, 상기 질병의 성공적인 치료를 받은 적이 있고, 상기 질병을 다시 발병한 경우, 상기 새로 발병된 질병은 재발 또는 재발생으로 간주될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 암 질병의 재발 또는 재발생은 원래 암 질병의 부위에서 발생할 수 있지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 환자가 난소 종양을 앓은 적이 있고, 성공적인 치료를 받은 적이 있는 경우, 재발 또는 재발생은 난소 종양의 발생일 수 있거나 난소와 다른 부위에서의 종양의 발생일 수 있다. 종양의 재발 또는 재발생은 종양이 원래 종양 부위에서뿐만 아니라 원래 종양과 다른 부위에서도 발생하는 상황을 또한 포함한다. 바람직하게는, 환자가 치료를 받은 적이 있는 원래 종양은 원발성 종양이고, 원래 종양의 부위와 다른 부위에서의 종양은 2차 또는 전이성 종양이다.
"치료하다"라 함은, 대상체에서 종양의 크기 또는 종양의 수를 감소시키는 것을 포함하는, 질병을 예방하거나 제거하기 위해; 대상체에서 질병을 저지하거나 늦추기 위해; 대상체에서 새로운 질병의 발병을 억제하거나 늦추기 위해; 현재 질병이 있거나 또는 과거에 질병에 걸린 적이 있는 대상체에서 증상의 빈도 또는 중증도 및/또는 재발생을 감소시키기 위해; 및/또는 대상체의 수명을 연장, 즉, 증가시키기 위해 화합물 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 의미한다.
특히, 용어 "질병의 치료"는 질병 또는 그의 증상을 치유하거나, 지속 시간을 단축시키거나, 개선시키거나, 예방하거나, 진행 또는 악화를 늦추거나 억제하거나, 발병을 예방하거나 지연하는 것을 포함한다.
"위험이 있는"이라 함은 일반적인 집단과 비교하여 질병, 특히 암을 발병할 가능성이 정상보다 높은 것으로 확인된 대상체, 즉, 환자를 의미한다. 또한, 질병, 특히 암에 걸린 적이 있거나 현재 걸려 있는 대상체는 질병을 발병할 위험이 높은 대상체인데, 이는 그러한 대상체가 질병을 계속 발병할 수 있기 때문이다. 현재 암에 걸려 있거나 걸린 적이 있는 대상체도 암 전이의 위험이 높다.
용어 "면역요법"은 특정 면역 반응을 수반하는 치료와 관련된다.
본 발명의 맥락에서, "보호하다", "예방하다", "예방의", "예방적인" 또는 "보호하는"과 같은 용어는 대상체에서의 질병의 발생 및/또는 전파의 예방 또는 치료 또는 둘 모두와 관련되고, 특히, 대상체가 질병을 발병할 가능성을 최소화하거나 질병의 발병을 지연시키는 것과 관련된다. 예를 들어, 전술한 바와 같은 종양에 걸릴 위험이 있는 사람은 종양을 예방하기 위한 요법에 대한 후보일 것이다. 면역요법은, 작용제가 환자로부터 항원-발현 세포를 제거하는 기능을 하는 임의의 다양한 기법을 이용하여 수행될 수 있다.
특정 구현예들에서, 면역요법은 능동 면역요법일 수 있으며, 여기서 치료는 면역 반응-조절제(예컨대, 면역반응성 펩티드 및 핵산)의 투여에 따른 질병 세포에 대해 반응하기 위한 내인성 숙주 면역계의 생체내 자극에 의존한다.
다른 구현예들에서, 면역요법은 수동 면역요법일 수 있으며, 여기서 치료는 항종양 효과를 직접 또는 간접적으로 매개할 수 있고 반드시 온전한 숙주 면역계에 좌우되지 않는 확립된 종양-면역 반응성을 갖는 작용제(예컨대, 항체)의 전달을 수반한다.
용어 "생체내"는 대상체 내의 상황과 관련된다.
용어 "대상체", "개체", "유기체" 또는 "환자"는 상호 교환적으로 사용되며, 척추 동물, 바람직하게는 포유 동물과 관련된다. 예를 들어, 포유 동물은 본 발명의 맥락에서 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등과 같은 가축, 마우스, 래트, 토끼, 어류, 기니피그 등과 같은 실험실 동물뿐만 아니라 동물원의 동물과 같은 감금 상태의 동물이다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "동물"은 또한 인간을 포함한다. 용어 "대상체"는, 질병, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 질병이 있는 환자, 즉, 동물, 바람직하게는 인간을 또한 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, "샘플"은 본 발명에 따른 유용한 임의의 샘플, 특히 생물학적 샘플, 예컨대 체액을 포함하는 조직 샘플 및/또는 세포 샘플일 수 있으며, 펀치(punch) 생검을 포함하는 조직 생검에 의해, 및 혈액, 기관지 흡인물, 가래, 소변, 대변 또는 기타 체액을 채취하는 것에 의해서와 같은 통상적인 방식으로 얻을 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "샘플"은 생물학적 샘플의 분획 또는 단리물, 예를 들어 핵산 및 펩티드/단백질 단리물과 같은 가공된 샘플을 또한 포함한다. 바람직하게는 샘플은 검사하려는 기관, 예를 들어 암을 진단하려는 기관의 세포 또는 조직을 함유한다. 예를 들어, 진단하려는 암이 폐암인 경우, 샘플은 폐로부터 얻은 세포 또는 조직을 함유할 수 있다.
본 발명에 따르면, 샘플은 종양 또는 암 세포를 함유하거나 함유할 것으로 예상되는 환자로부터 유래된 신체 샘플과 같은 샘플일 수 있다. 신체 샘플은 혈액, 원발성 종양 또는 종양 전이물로부터 얻은 조직 샘플과 같은 임의의 조직 샘플 또는 종양 또는 암 세포를 함유하는 임의의 다른 샘플일 수 있다.
본 발명은 이하에서 도면 및 실시예에 의해 상세히 설명되며, 그러한 도면 및 실시예는 예시 목적으로만 사용되며 제한하려는 것이 아니다. 설명 및 실시예로 인해, 마찬가지로 본 발명에 포함되는 추가의 구현예들이 당업자에게 이용 가능하다.
실시예
본원에 사용된 기법 및 방법은 본원에 기술되어 있거나, 그 자체로 알려진 방식으로 그리고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기술된 바와 같이 수행된다. 키트 및 시약의 사용을 포함하는 모든 방법은 구체적으로 지시되지 않는 한 제조업체의 정보에 따라 수행된다.
실시예 1: 재료 및 방법
항체 결합 부위의 맵핑(도 4a)
항체에 의해 인식되는 에피토프들의 맵핑을 문헌["Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9] 및 문헌["Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay]에 상세히 설명된 바와 같이 수행할 수 있다.
비오티닐화된 펩티드를 사용한 에피토프 맵핑(도 4b)
펩티드-ELISA를 수행하여 모노클로날 뮤린 선도 항체 및 IBL로부터의 폴리클로날 rb-혈청의 항체-결합 부위를 확인하였다. CLDN6의 C-말단 서열을 커버하는 비오티닐화된 중첩 펩티드를 SA 코팅된 플레이트에 연결시켰다. 정제된 mumAB(1㎍/ml) 또는 IBL rb-혈청(1 ㎍/ml)을 항원 코팅된 ELISA-플레이트에 적용하고, 결합되지 않은 항체를 세척해 내었다. 결합된 항체를 상응하는 효소-표지 2차 항체(알칼리성 포스파타제 염소 항-마우스 IgG(1+2a+2b+3) 또는 알칼리성 포스파타제 염소 항-토끼 IgG F(ab)2) 및 ABTS 효소 기질로 검출하고, 신호 강도를 분석하였다.
mumAB 58-4B-2 대 rb-혈청(IBL)의 신호 강도의 비교를 위해, C-말단 펩티드 19로의 항체의 최대 결합을 100%로 정의하였다.
하나의 펩티드에 대한 각각의 항체의 결합 강도를 독립적으로 각각의 시험 시스템(마우스 또는 토끼)에 대한 최대 결합에 대하여 계산하였다.
mumAB의 결합을 3회의 독립적인 실험에서 3중으로 분석하였다
IBL-혈청의 결합을 2회의 독립적인 실험에서 3중으로 분석하였다
아이소타입 결정
정제된 항체의 아이소타입을 결정하기 위해, IsoStrip 마우스 모노클로날 항체 아이소타이핑 키트(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)(Roche, Cat. No. 1493027)를 제조업체에 의해 설명된 바와 같이 사용하였다.
웨스턴 블롯
새로 생성된 항-CLDN6 IgG를 웨스턴 블롯팅에 의해 CLDN6 항원으로의 특이적 결합에 대해 추가로 시험할 수 있다. 간략하게 말하면, CLDN3, 4, 6 또는 9를 발현하는 세포로부터의 세포 추출물 및 적절한 음성 대조 표준을 준비하여 소듐 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙할 것이다. 항-마우스 IgG 퍼옥시다제를 사용하여 IgG 결합을 검출하고, ECL 기질로 발색시킬 수 있다.
조직학
면역조직화학(IHC)을 4% 완충 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 샘플의 슬라이드 상에서 수행하였다. 파라핀 포매는 표준 프로토콜에 따라 수행하였다.
탈파라핀화 및 재수화 후, 모든 슬라이드를, 95℃ 내지 98℃에서 30분 동안 15 mM 소듐 아지드(pH 9.0)가 보충된 0.1M Tris/0.01M EDTA 완충액 중에서의 비등에 의해 항원 회수에 적용하고, 후속하여 15 mM NaN3이 보충된 3% H2O2를 첨가하여 내인성 퍼옥시다제를 켄칭시켰다. 0.05%(w/v) 트윈-20 및 0.005%(w/v) 프로클린(Proclin)이 보충된 150 mM 염화나트륨 완충액(pH 7.6)으로 세척한 후, 슬라이드를 1.0 또는 5.0 ㎍/ml의 진단 모노클로날 마우스 항-CLDN6 항체인 58-4B와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 중합체-기반 양고추냉이-퍼옥시다제-표지 2차 항체(일본 Nichirei의 Histofine MAX PO (M)/UIO MAX PO (M))를 함유하는 즉시 사용 가능 용액을 사용하여 항체 결합을 가시화하였다. 후속하여, 절편을 메이어 헤마톡실린(Mayer's haematoxylin)(독일 카를스루에 소재의 Carl Roth GmbH)으로 대조-염색하고, 평가자들에 의한 평가에 적용하였다.
조직학적 평가
모든 샘플을 각 절편에 대한 모든 가시적 종양 세포에 대한 양성 염색된 종양 세포의 상대적 비율에 관해 분석하였다. 염색의 강도는 음성(-), 약한 양성(1+), 중간 양성(2+) 및 강한 양성(3+)으로 분류되었다. 막 염색만이 양성으로 간주되었다. 난소암 조직은 각 염색에 대해 양성 대조 표준의 역할을 하였다. 추가로, 임신 기간 29일째의 뉴질랜드 흰 토끼의 배아 신장 조직은 강한 양성 염색 강도를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이는 염색 양성(2+ 내지 3+)에 대한 내부 염색 강도 기준으로 사용되었다.
실시예 2 : 모노클로날 항체의 생성
이 프로젝트의 목적은 난소암 또는 원발성 복막 또는 난관 종양 FFPE 조직을 포함하는 임의의 조직학의 임의의 다른 암 조직에서 CLDN6 발현 종양 세포를 검출할 수 있는 뮤린 모노클로날 CLDN6-특이적 항체를 생성하는 데에 있었다.
고특이성의 고친화력 진단 CLDN6 항체를 생성하기 위해서는 다양한 여러 면역원(표 1) 및 애주번트로 면역화 프로토콜을 개시하는 것이 필수적이었다. 프로젝트 동안 약 130마리의 마우스(C57BL/6 및 BALB/c)를 다양한 면역화 전략에 적용하여 α-CLDN6 면역 반응을 촉발시켰다(표 2).
마우스 면역계를 촉발시키고 면역 내성을 극복하기 위하여, 친화도 정제(폴리히스티딘-(HIS)- 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제-(GST)-태그)를 용이하게 하기 위해 다양한 에피토프를 갖는 재조합 융합 단백질로서 발현되는 인간 CLDN6의 다양한 부분을 코딩하는 펩티드-접합체 및 재조합 단백질을 사용하였다(표 1).
20개의 다양한 면역화 전략 중에서, 최상의 결과는 다양한 애주번트(표 2)와 함께 GST-태깅 CLDN6 C-말단 재조합 단백질(표 2)로 마우스를 처리함으로써 달성되었다.
융합 당일에, 마우스 비장 세포를 분리하여 마우스 골수종 세포주인 P3X63Ag8.653(ATCC)에 융합시켰다. 골수종 세포주로의 마우스 세포의 융합을 위해, 문헌[Koehler and Milstein 1975]에 의해 공개된 표준 프로토콜을 따랐다. 히포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 선택 후, 면역화에 사용된 항원을 인식하는 항체의 분비에 대해 ELISA로 상청액을 시험하였다.
69회의 융합을 수행하였고, 25,000개 초과의 하이브리도마 세포 클론을 스크리닝하였다. ELISA 양성 상청액(402)의 하이브리도마 세포를 서브클로닝하여 모노클로날 하이브리도마를 생성시켰다. 서브클로닝된 하이브리도마 세포의 상청액을 클라우딘6 항원으로의 결합에 대해 ELISA로 다시 스크리닝하였다. 88개의 양성 클론(항원에 결합하지만 백본 또는 태그에는 결합하지 않음)의 하이브리도마 세포를 확장시키고, 상청액을 그의 특이성에 대해 웨스턴 블롯으로 추가로 분석하였다.
3개의 선도 후보(58-4B, 58-1B 및 58-3A)는 11 단계-면역화 전략(123일 동안의 면역화 #10)에서 비롯되었다. 비장절제술 3일 전에, 마우스를 표적화된 B-세포를 활성화시키기 위해 부스팅한 후 융합 58을 수행하였다(표 3).
실시예 3 : 모노클로날 항체의 웨스턴 블롯 스크리닝
상청액 중의 ELISA-양성 항체가 재조합 클라우딘 6에 특이적으로 결합할 수 있는지 시험하기 위해 그러한 항체를 웨스턴 블롯으로 분석하였다. CLDN6에 결합하지만 다른 태깅-단백질에 결합하지 않는 항체를 정제하고 세포를 확장시키고 동결 보존하였다. MABselect 단백질 A 친화성 수지를 사용하여 FPLC를 통해 항체를 정제하였다. 웨스턴 블롯 스크리닝에 의해 선택된 정제된 항체를 웨스턴 블롯으로 재분석하여 CLDN6 양성 종양 세포주(PA-1, NEC-8) 및 CLDN3, 4, 6 또는 9 트랜스펙션된 HEK293 세포로의 결합을 평가하였다(도 2). 또한, 항체를 면역조직화학에 의해 포르말린 고정 파라핀-포매 조직(FFPE)에서 그의 항원에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. 클라우딘 6에 특이적으로 결합하는 33개의 하이브리도마의 상청액을 정제하고 면역조직화학으로 추가로 분석하였다.
실시예 4: 웨스턴 블롯 양성 항체의 조직학적 분석
본 실험의 목적은 항체의 CLDN6 특이성 및 민감성을 시험하는 데에 있었다. 이는 CLDN6 발현 FFPE 난소암 조직을 사용함으로써 이루어졌다(도 3).
제1 실험에서, 제1 웨스턴 블롯-스크린에서 양성으로 시험된 정제된 항체를 난소암 FFPE 절편 상에서 1 ㎍/ml 및 5 ㎍/ml의 농도로 분석하였다. 구연산 회수 완충액 및 120℃의 회수 온도를 사용하는 실험실 표준의 확립된 오버나이트(overnight) 염색 프로토콜을 이용하였다. 높은 수준의 비특이적 백그라운드 염색을 생성하지 않고 조직 특이적 CLDN6 염색을 보이는 항체를 다양한 난소암 조직 상에서 0.2, 1, 2 및 5 ㎍/ml로 추가로 적정하여 이들 항체의 민감성 및 특이성을 추가로 평가하였다. 하기 발색 단계에서, 다양한 항체의 염색 강도의 차이를 0.2 μg/ml의 농도에서 명확하게 평가할 수 없었기 때문에 새로 생성된 항체를 1 및 5 μg/ml의 더 높은 농도에서 직접 시험하였다. 선택된 조직 중 난소 종양 조직의 세포막 상에서 강한 신호를 생성하며 인접한 건강한 조직 상에서는 백그라운드를 거의 또는 전혀 생성하지 않는 항체를 추가의 적정 실험 및 특이성 분석을 위해 선택하였다. 다음 3가지 항체가 이러한 기준을 충족시켰으며 추가의 조사를 위한 선도 후보로 선택되었다: 58-1B, 58-3A 및 58-4B.
실시예 5: mumAb의 에피토프 맵핑(도 4)
CLDN6 상의 항체-결합 에피토프를 확인하기 위해 펩티드 ELISA를 수행하였다. 각각의 정제된 항체를, CLDN6의 C-말단 서열을 커버하는 11aa와 중첩하는 펩티드 상에서 시험하였다. 항체 46-5A, 58-1B, 58-3A, 58-4B 및 58-9B는 펩티드 AISRGPSEYPTKNYV(펩티드 7; 도 4a)에 의해 커버되는 에피토프로의 특이적 결합을 보였다. 이러한 항체의 결합 부위를, 15 aa 중 14개가 중첩하는 비오티닐화 펩티드를 사용하여 추가로 특성 규명하였다.
놀랍게도, 서열 EYPTKNY에 결합하는 항체 58-1B, 58-3A 및 58-4B 및 서브클론 58-4B-2(도 4b)는 낮은 백그라운드로 매우 특이적으로 FFPE 암 조직에서 CLDN6에 결합할 수 있다. 대조적으로, 항체 46-5A는 서열 EYPTKNY를 포함하지 않지만 그의 일부, 즉, 서열 EYPTK를 포함하는 펩티드에 결합할 수 있었다(도 4b). 상업적으로 이용 가능한 rb-항-CLDN6 폴리클로날 항혈청(IBL)은 서열 RGPS를 포함하는 펩티드에 결합한다(도 4c).
실시예 6 : 정상 조직 패널을 사용한 항체 특이성의 분석
실험실 표준의 확립된 염색 프로토콜에 따른 시험된 난소암 조직 상에서 강한 신호를 생성하는 항체(58-1B, 58-3A 및 58-4B)를, 높은 CLDN6 표적 특이성을 보장하기 위해, 다양한 관련된, 건강한 공여 조직을 의미하는 정상 조직(예를 들어, 폐, 고환, 자궁 및 난소) 상에서 추가로 분석하였다. 이러한 선택된 조직의 염색을 실험실 표준의 확립된 염색 프로토콜(오버나이트; 120℃ 회수 온도, 시트르산 회수 완충액)을 이용하여 수행하였다.
하나의 난소 조직 샘플의 단일 말초 영역에서의 희미한 비특이적 신호를 제외하고, 선택된 3개의 항체 중 어느 것도 시험된 정상 조직 패널 상에서 비특이적 염색 신호를 생성하지 않았다. 이 약한 신호는 시험된 두 농도(1 & 5 μg/ml) 중 더 높은 농도에서만 가시적이었으며, 난소 하부 구조를 나타내지 않는다.
실시예 7: 난소암 및 정상 조직 패널 샘플을 사용한 항체 감도의 비교
항체 58-3A, 58-1B 및 58-4B의 염색 패턴 및 염색 강도의 유의한 차이는 이전 실험에서 가시적이지 않았다. 따라서, 더욱 시간 효율적임을 의미하는 더욱 임상 지향된 염색 프로토콜을 이용하는 염색 실험에 항체를 적용하였다. 표준 병리학 실험실에서 적용되는 염색 과정을 시뮬레이션하기 위해, 1시간 1차 항체 인큐베이션 단계 및 수조(98℃) 회수 단계를 갖는 원-데이-프로토콜(One-Day-Protocol)을 확립하였다. 또한, 상이한 회수 조건이 CLDN6 검출에 관하여 시험된 항체의 감도에 영향을 줄 수 있는지 여부를 시험하기 위해 2가지 상이한 회수 완충액을 비교하였다.
모든 항체에 대해, 표준 시트르산 회수 완충액과 비교하여, 회수용 Tris-완충액을 갖춘 적응된 원-데이-프로토콜을 이용하여 더 강한 신호 및 더 많은 양의 양성 염색된 종양 세포를 생성시켰다. 가장 강한 염색 신호는 58-4B가 3+ 염색된 종양 세포의 최대 80%에 도달한 경우 생성된 반면, 후보 58-1B의 염색 강도는 3+ 염색된 종양 세포의 단지 30%에 도달한 경우 가장 강하지 않았다.
후속하여, 가장 민감한 염색 신호를 생성하는 회수용 Tris-완충액을 사용한 염색 프로토콜을 정례적인 임상 실험실 조건 하에서 선택된 항체의 특이성을 시험하기 위해 정상 조직 패널의 염색에 적용하였다.
FFPE-조직에서의 CLDN6-특이성 및 감도에 관한 최상의 결과는 58-4B 진단 항체 후보를 사용하여 달성되었다. 정상 조직 상에서는 신호가 검출 가능하지 않았다. 다른 모든 항체는 고환 샘플의 Reinke 결정 상에서 신호를 생성하였다. 또한, 58-3A 항체는 혈관 상에서 약한 염색을 생성하였다. 58-1B 항체는 고환 및 난소 정상 조직 상에서 더욱 강한 신호(1+)를 나타냈다.
모든 분석된 샘플에서, mumAb 58-4B는 관련 종양 조직 상에서 백그라운드 염색은 보이지 않고 강한 염색을 보이는 것과 관련하여 더 우수한 성능을 나타낸 반면, mumAb 58-3A 및 58-1B 후보는 관련 종양 조직 상에서 강한 염색을 보였지만 백그라운드 신호는 더 높았다. 특히 mumAb 58-1B를 사용하여 생성된 신호는 강도가 높았지만 백그라운드 염색이 높은 단점이 있었다.
임상 설정에서 추후 사용을 위해, 진단 항체 후보의 생성을 위한 상응하는 하이브리도마를 무혈청 배지에 적응시켰다. 불운하게도, 클론 58-3A를 무혈청 조건에 적응시키는 것은 불가능했다. 따라서, 항체 후보 58-3A가 또한 추가의 조직학적 연구로부터 제외됨으로써, 58-4B가 최종 선도 후보로 남겨졌다.
실시예 8: 조직학적 심층 분석 및 항체 특성 규명
제1 단계에서, 무혈청 조건 하에서 생산된 58-4B 항체 로트(lot)를 정상 조직 패널 TMA(MNO961)를 사용하여 혈청 조건 하에서 생산된 항체 로트와 비교하여, 로트들 사이의 표적-감도 및 표적-특이성의 차이를 검출하였다. 로열티(royalty)가 없는 구성 요소를 갖는 임상 유사 원-데이-프로토콜(수조 회수, 회수용 Tris-완충액)을 이용하여 염색을 수행하였다.
항체 로트 둘 모두의 경우, 일부 정상 조직 샘플에서 희미한 염색이 검출되었다(표 4 참조). 혈청 조건 하에서 생산된 항체와 비교하여, 무혈청 항체 로트는 분석된 샘플 상의 인공 반점이 적어 더 깨끗했다. 고환에 대해, 염색 신호는 항체 로트 둘 모두의 경우 Reinke 결정 상에서 가시적이었다.
제2 단계에서, 무혈청 생산된 항체를 난소암 TMA 패널 상에서 시험하고 상업적으로 이용 가능한 IBL 항체와 비교하였다. 이 상업용 항체는 이전 연구 염색에서 이미 사용되었다. 폴리클로날 IBL 항체를 연구 프로토콜(오버나이트, 120℃ 회수 온도, 시트르산 회수 완충액)에 따라 사용하였다. 58-4B 항체를 정례적인 임상 유사 프로토콜(원-데이-프로토콜, 수조 회수, 회수용 Tris 버퍼)에 따라 사용하였다.
72건의 발견된 TMA 난소암 사례 중 단지 1건의 샘플이 IBL 항체에 양성이었다. 대조적으로, 72건의 샘플 중 14건이 58-4B 항체로 염색될 때 CLDN6에 대해 양성으로 시험되었다.
불운하게도, 상업적 난소암 TMA 샘플의 품질이 낮았으며, 이는 양성 종양 샘플 상에서 약한 염색 신호를 생성하였다. 따라서, Dhaene 박사로부터 얻은 종양 절제 표본으로 비교를 반복하였고, 이는 폐, 자궁 및 고환 종양 샘플의 고품질 보존과 함께 더 큰 종양 영역을 나타낸다.
58-4B 염색은 폴리클로날 IBL 항체로 수행된 염색과 비교하여 종양 샘플에서 CLDN6의 더욱 민감하고 특이적인 검출을 가져왔으며, 이는 더 많은 종양 세포가 양성이고 염색된 종양 세포의 더 강한 강도가 검출되었음을 의미한다.
실시예 9: 선도 항체의 서열 분석
항체 58-1B, 58-3A 및 58-4B의 서열 분석을 도 5 및 이하에 나타낸다.
Figure 112020020704571-pct00001
Figure 112020020704571-pct00002
Figure 112020020704571-pct00003
[표 1] 면역원 개요
Figure 112020020704571-pct00004
[표 2] 항체 생성을 위한 면역화 프로토콜
Figure 112020020704571-pct00005
[표 3] 선도 항체에 대한 면역화 계획
Figure 112020020704571-pct00006
[표 4] 정상 조직 패널 상에서 시험된 2개의 로트
Figure 112020020704571-pct00007
[수탁번호]
Figure 112020020704571-pct00008
생물학적 물질에 대한 추가 시트
추가 기탁물의 확인:
1) 기탁물에 대한 기탁 기관의 명칭과 주소는 다음과 같다:
라이프니츠-인스티투트(Leibniz-Institut) DSMZ-도이치 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하
독일 38124 브라운슈바이크
인호펜슈트라쎄 7 B
Figure 112020020704571-pct00009
상기 언급된 모든 기탁물에 대한 추가 표시:
- 마우스(Mus musculus) 비장세포와 융합된 마우스(Mus musculus) 골수종 Ag8.653
- 인간 CLDN6에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마
2) 기탁자:
상기 언급된 모든 기탁은, 독일 55131 마인츠 안 데르 골드그루베 12 소재의 가니메드 파마슈티칼스 아게에 의해 이루어졌다.
<110> Ganymed Pharmaceuticals GmbH et al. <120> Antibodies useful in cancer diagnosis <130> PIPB194352EP <150> PCT/EP2017/072386 <151> 2017-09-06 <160> 61 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu 85 90 95 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile 130 135 140 Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr 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105 110 Ala Lys Ala Lys Thr Met Ile Val Ala Gly Val Val Phe Leu Leu Ala 115 120 125 Gly Leu Met Val Ile Val Pro Val Ser Trp Thr Ala His Asn Ile Ile 130 135 140 Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Ser Gly Gln Lys Arg Glu Met 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Asn Cys Pro Pro Arg Thr Asp Lys Pro 180 185 190 Tyr Ser Ala Lys Tyr Ser Ala Ala Arg Ser Ala Ala Ala Ser Asn Tyr 195 200 205 Val <210> 5 <211> 219 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Ala Ser Thr Gly Leu Gln Ile Leu Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Val Asn Ala Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Met Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Val Thr Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Leu 85 90 95 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Asp Arg Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Arg Leu Val Leu Ile Ser Gly Ile Ile Phe Val Ile Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ser Ile Ile 130 135 140 Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Asp Ala Gln Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Ala Cys Ser Ser Gly Gly Thr Gln Gly 180 185 190 Pro Arg His Tyr Met Ala Cys Tyr Ser Thr Ser Val Pro His Ser Arg 195 200 205 Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 210 215 <210> 6 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 6 Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly Pro Ser His 1 5 10 15 Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro 20 25 30 Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 35 40 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 7 Leu Leu Cys Cys Ala Cys Ser Ser Gly Gly Thr Gln Gly Pro Arg His 1 5 10 15 Tyr Met Ala Cys Tyr Ser Thr Ser Val Pro His Ser Arg Gly Pro Ser 20 25 30 Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 35 40 <210> 8 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 8 Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly Pro Ser His Tyr Met Ala 1 5 10 15 Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu Tyr 20 25 30 Pro Thr Lys Asn Tyr Val 35 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 9 Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly Pro Ser His Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 10 Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 11 Ser Gln Gly Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 12 Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 13 Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 14 Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 15 Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 16 Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 17 Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 18 Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu Tyr 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 19 Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 20 Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 21 Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 22 Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr 1 5 10 15 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 23 Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 24 Ser Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 25 Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 26 Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 27 Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 28 Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 29 Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 30 Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 31 Pro Thr Lys Asn Tyr Val 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 32 Pro Thr Lys Asn Tyr 1 5 <210> 33 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 33 Pro Thr Lys Asn 1 <210> 34 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 34 Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly Pro Ser His Tyr 1 5 10 15 Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser 20 25 30 Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 35 40 <210> 35 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 35 Leu Cys Cys Thr Cys Pro Pro Pro Gln Val Glu Arg Pro Arg Gly Pro 1 5 10 15 Arg Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Ser Arg Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp 20 25 30 Lys Arg Asp Tyr Val 35 <210> 36 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 36 Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr Ala Thr Lys 1 5 10 15 Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala Ser Leu Gly 20 25 30 Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val 35 40 <210> 37 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 37 Leu Cys Cys Asn Cys Pro Pro Arg Thr Asp Lys Pro Tyr Ser Ala Lys 1 5 10 15 Tyr Ser Ala Ala Arg Ser Ala Ala Ala Ser Asn Tyr Val 20 25 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 38 Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr 1 5 <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 39 Arg Gly Pro Ser 1 <210> 40 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody chain <400> 40 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Met Ser Cys Arg Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Val Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Phe Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Asp Leu Ser Ser Leu Thr Asp Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Phe Tyr Ala Thr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 41 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody chain <400> 41 Asp Ile Val Leu Thr Gln Asn Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Thr Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Met Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Asn Thr 100 105 110 <210> 42 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody chain <400> 42 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asp Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Phe Tyr Ala Thr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 43 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody chain <400> 43 Asp Val Val Met Thr Gln Asn Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Thr Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Met Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 100 105 110 <210> 44 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody chain <400> 44 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asp Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Phe Tyr Ala Thr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 45 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody chain <400> 45 Asp Ile Val Leu Thr Gln Asn Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Thr Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Met Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ser 100 105 110 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 46 Cys Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu 1 5 10 15 Leu <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 47 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly 1 5 10 15 Pro Ser His Tyr 20 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 48 Cys Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser 1 5 10 15 Glu Tyr Pro Thr Lys 20 <210> 49 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 49 Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly Pro Ser His Tyr Met 1 5 10 15 Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Arg Gly Pro Ser Glu 20 25 30 Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 35 <210> 50 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 50 Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp Ser Lys Ala Arg Leu 1 5 10 15 Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser Gly Val Leu Thr Leu 20 25 30 Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile Arg Asp Phe Tyr Asn 35 40 45 Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu Gly Ala 50 55 60 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR <400> 51 Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Tyr Trp 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR <400> 52 Ile Phe Pro Gly Asn Ser Asp Thr 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR <400> 53 Thr Arg Glu Phe Tyr Ala Thr 1 5 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR <400> 54 Gln Asn Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 55 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR <400> 55 Leu Met Ser 1 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR <400> 56 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR <400> 57 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR <400> 58 Ile Tyr Pro Glu Asn Ser Asp Ala 1 5 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 59 Glu Tyr Pro Thr Lys 1 5 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 60 Glu Tyr Pro Thr Lys Asn 1 5 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 61 Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr 1 5

Claims (23)

  1. 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH):
    서열번호 51로 표시된 아미노산 서열을 가지거나 서열번호 57로 표시된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1;
    서열번호 52로 표시된 아미노산 서열을 가지거나 서열번호 58로 표시된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및
    서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3; 및
    항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(VL):
    서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR1;
    서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및
    서열번호 56으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3; 이고
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 펩티드 또는 단백질에 결합하고:
    (i) EYPTKNY(서열번호 38)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드 및/또는
    (ii) 클라우딘 6(CLDN6)으로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 EYPTKNY(서열번호 38)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 CLDN6 내의 에피토프에 결합함으로써 CLDN6에 결합하고, 및/또는
    (iii) EYPTKNYV(서열번호 29)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드, 및/또는
    (iv) 클라우딘 6(CLDN6)으로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 EYPTKNYV(서열번호 29)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 CLDN6 내의 에피토프에 결합함으로써 CLDN6에 결합하고, 및/또는
    (v) AISRGPSEYPTKNYV(서열번호 15)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 TSAPAISRGPSEYPT(서열번호 14)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드에 결합하지 않으며, 및/또는
    (vi) 클라우딘 6(CLDN6)로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도AISRGPSEYPTKNYV(서열번호 15)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 CLDN6 내의 에피토프에 결합함으로써 CLDN6에 결합하고, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 TSAPAISRGPSEYPT(서열번호 14)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드에 결합하지 않으며, 및/또는
    (vii) 하기 펩티드들 중 하나 이상의 펩티드에 결합하고, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 TSAPAISRGPSEYPT(서열번호 14)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드에 결합하지 않음:
    PAISRGPSEYPTKNY(서열번호 22), AISRGPSEYPTKNYV(서열번호 15), ISRGPSEYPTKNYV(서열번호 23), SRGPSEYPTKNYV(서열번호 24), RGPSEYPTKNYV(서열번호 25), GPSEYPTKNYV(서열번호 26), PSEYPTKNYV(서열번호 27), SEYPTKNYV(서열번호 28), 및 EYPTKNYV(서열번호 29).
  2. 샘플에서 CLDN6을 검출하거나 CLDN6의 양을 결정하는 방법으로서,
    (i) 샘플을 제1항의 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계 및;
    (ii) 상기 항체 또는 항원-결합 단편과 CLDN6 사이의 복합체의 형성을 검출하거나 그러한 복합체의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 세포가 CLDN6을 발현하는지 여부를 결정하는 방법으로서,
    (i) 세포 샘플을 제1항의 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계 및;
    (ii) 상기 항체 또는 항원-결합 단편과, 상기 샘플 내의 세포에 의해 발현된 CLDN6 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. CLDN6을 발현하는 암 세포의 진단을 위한 정보제공방법 또는 검출 또는 모니터링을 위한 방법으로서,
    (i) 생물학적 샘플을 제1항의 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계 및;
    (ii) 상기 항체 또는 상기 항원-결합 단편과 CLDN6 사이의 복합체의 형성을 검출하고/검출하거나 그러한 복합체의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 삭제
  6. 제2항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 방법:
    항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH):
    서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1;
    서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및
    서열번호 53로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3;
    이고
    항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(VL):
    서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR1;
    서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및
    서열번호 56로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3;
    이거나
    항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH):
    서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1;
    서열번호 58로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및
    서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3;
    이고
    항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(VL):
    서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR1;
    서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및
    서열번호 56로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3
  7. 제2항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 방법:
    (i) 수탁 번호 DSM ACC3313(58-1B), DSM ACC3312(58-3A) 또는 DSM ACC3311(58-4B-2)로 기탁된 클론에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체이거나;
    (ii) (i)에 따른 항체의 키메라화 또는 인간화 형태인 항체이거나;
    상기 (i) 또는 (ii)에 따른 항체의 항원 결합 단편.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 수탁 번호 DSM ACC3313(58-1B), DSM ACC3312(58-3A) 또는 DSM ACC3311(58-4B-2)로 기탁된 클론에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편인, 방법.
  9. 삭제
  10. 제3항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 방법:
    항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH):
    서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1;
    서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및
    서열번호 53로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3;
    이고
    항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(VL):
    서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR1;
    서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및
    서열번호 56로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3;
    이거나
    항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH):
    서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1;
    서열번호 58로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및
    서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3;
    이고
    항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(VL):
    서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR1;
    서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및
    서열번호 56로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3
  11. 제3항에 있어서
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 방법:
    (i) 수탁 번호 DSM ACC3313(58-1B), DSM ACC3312(58-3A) 또는 DSM ACC3311(58-4B-2)로 기탁된 클론에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체이거나;
    (ii) (i)에 따른 항체의 키메라화 또는 인간화 형태인 항체이거나;
    상기 (i) 또는 (ii)에 따른 항체의 항원 결합 단편.
  12. 제3항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 수탁 번호 DSM ACC3313(58-1B), DSM ACC3312(58-3A) 또는 DSM ACC3311(58-4B-2)로 기탁된 클론에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편인, 방법.
  13. 삭제
  14. 제4항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 방법:
    항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH):
    서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1;
    서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및
    서열번호 53로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3;
    이고
    항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(VL):
    서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR1;
    서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및
    서열번호 56로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3;
    이거나
    항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH):
    서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1;
    서열번호 58로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및
    서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3;
    이고
    항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(VL):
    서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR1;
    서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및
    서열번호 56로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3
  15. 제4항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 방법:
    (i) 수탁 번호 DSM ACC3313(58-1B), DSM ACC3312(58-3A) 또는 DSM ACC3311(58-4B-2)로 기탁된 클론에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체이거나;
    (ii) (i)에 따른 항체의 키메라화 또는 인간화 형태인 항체이거나;
    상기 (i) 또는 (ii)에 따른 항체의 항원 결합 단편.
  16. 제4항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 수탁 번호 DSM ACC3313(58-1B), DSM ACC3312(58-3A) 또는 DSM ACC3311(58-4B-2)로 기탁된 클론에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편인, 방법.
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편:
    항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH):
    서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1;
    서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및
    서열번호 53로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3;
    이고
    항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(VL):
    서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR1;
    서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및
    서열번호 56로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3;
    이거나
    항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH):
    서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1;
    서열번호 58로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및
    서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3;
    이고
    항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(VL):
    서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR1;
    서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및
    서열번호 56로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL) CDR3.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편:
    (i) 수탁 번호 DSM ACC3313(58-1B), DSM ACC3312(58-3A) 또는 DSM ACC3311(58-4B-2)로 기탁된 클론에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체이거나;
    (ii) (i)에 따른 항체의 키메라화 또는 인간화 형태인 항체이거나;
    상기 (i) 또는 (ii)에 따른 항체의 항원 결합 단편.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편은 수탁 번호 DSM ACC3313(58-1B), DSM ACC3312(58-3A) 또는 DSM ACC3311(58-4B-2)로 기탁된 클론에 의해 생산되거나 그로부터 얻을 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편.
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