KR20120058678A

KR20120058678A - 인간 ｔｅｓｃ 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20120058678A
Application number: KR1020100113592A
Authority: KR
Inventors: 송은영; 이희구; 이정일; 강윤희; 염영일; 원미선; 정경숙; 지나영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2010-11-15
Publication date: 2012-06-08
Also published as: KR101413689B1

Abstract

본 발명은 인간 TESC 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 수탁번호가 KCTC 11790BP인 하이브리도마 세포, 상기 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 인간 TESC 단백질에 대한 단일클론 항체, 상기 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물, 암 진단용 키트 및 암 진단용 단백질 칩에 관한 것이다. 본 발명의 인간 TESC에 대한 단일클론항체는 인간 TESC 단백질에 대한 고친화도의 특이적 결합능력을 가지므로, 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 암 진단용 키트 또는 단백질 칩의 제조에도 매우 유용하다.

Description

인간 ＴＥＳＣ 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도{Monoclonal Antibody Specifically Binding to Human Tescalcin Protein and Its Use}

본 발명은 인간 TESC (Tescalcin) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 이의 암 진단용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 인간 TESC에 대한 단일클론항체, 이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물, 암 진단용 키트 및 암 진단용 단백질칩에 관한 것이다.

암(cancer)은 정상적인 세포가 비정상적인 세포로 되면서 무절제하게 분열 및 증식하여 많은 비정상적인 세포를 만듦으로써 발생하는 질병으로 알려져 있으며, 매년 전 세계적으로 약 600 만명, 미국내에서만 약 140 만명의 환자가 발생하며 약 60 만명 환자가 사망하는 바, 심장질환 다음으로 높은 사망원인질환으로 알려져 있다. 현재 학계, 바이오업계, 정부기관의 주요 연구관심 대상분야이며 현재 발암요인 규명연구 및 암 진행과정의 메카니즘 연구를 통해 보다 빠르고 효과적인 항암치료법개발연구가 활발히 진행되고 있다.

암의 종류에는 주로 조직의 상피조직(epithelium)에서 발생하는 암종(carcinomas, 전체 암의 85% 차지)과, 근육, 뼈, 지방조직 등과 같은 결체조직에서 생성하는 육종(sarcomas, 전체 암의 6% 차지), 골수(bone marrow) 등과 같이 백혈구가 형성되는 조직에서 발생하는 임파종(lymphoma, 전체 암의 5% 차지), 뇌종양(brain tumor)등이 있으며, 성별에 따라 암이 유발되는 신체부위가 다른 양상을 나타낸다.

한국의 경우 중앙 암등록본부의 통계에 의하면 2003년 - 2005년 평균 암발생건수는 132,941건이었으며, 남자는 72,952건, 여자는 59,989건이었다. 연평균 조발생률은 인구 10만명당 274.1건이며, 남자는 300.0건, 여자는 248.2건이었다. 2003년-2005년에 가장 많이 발생하는 암은 위암으로 나타났으며, 이어서 폐암, 대장암, 간암, 갑상샘(선)암, 유방암, 자궁목(경부)암 순으로 많이 발생하는 것으로 나타났다. 남자의 경우 위암이 가장 많이 발생하였으며, 다음으로 폐암, 간암, 대장암, 전립샘(선)암의 순이었으며, 여자의 경우 유방암, 갑상샘암, 위암, 대장암, 폐암의 순이었다. 2006년에 암으로 사망한 사람은 총 65,909명으로 전체 사망자의 27.0%가 암으로 사망하였다. 2006년에 가장 많이 사망한 암은 폐암으로 전체 암사망자의 21.4%인 14,097명이었으며, 다음으로는 간암(16.6%), 위암(16.4%), 대장암(9.5%), 췌장암(5.3%)의 순이었다 (2006년 사망원인통계연보, 통계청). 1996년 대비 사망률이 가장 많이 증가한 암은 폐암이며, 그 다음이 대장암, 전립샘암, 췌장암이다. 반면에 사망률이 가장 많이 감소한 암은 위암이었으며, 그 다음이 자궁암 순이다. 이와 같이 해마다 암 발생 및 이로 인한 사망자수가 늘어나고 있으며 대부분의 암은 예후가 좋지 않아 많은 사람이 암으로 사망하고 있다.

현대 의학에서 암을 진단하는 방법은 각종 방사선 촬영, 조직병리검사, 초음파 진단, 혈액 검사 등 다양하게 시행되고 있다. 가장 채취 및 관리가 용이하고 검사가 간단한 것은 혈액을 이용하여 암에 대한 스크리닝 검사를 하는 것으로서, 이는 암을 사전에 예방하거나 혹은 조기발견하는 것이며, 이미 발견하여 치료중인 경우라면 그 예후를 관찰하기 위한 목적으로 활용되고 있다. 현재 많은 종류의 암 표지자들이 알려져 있으나, 많은 종류의 암표지자는 암이 없어도 증가하거나 검출되는 경우가 있으므로 이것만으로 암 확진에 부적당하다. 또한 암표지자의 종류는 암의 종류에 따라 매우 다양하며 하나의 검사로 사람에게 생기는 암을 모두 찾아낼 수 있는 암표지자는 없으며, 암표지자가 없는 암도 많다. 이와 같은 이유로 암에 보다 특이적이고 민감한 암표지자를 찾기 위한 연구 필요하며 지노믹스(genomics), 프로테오믹스(proteomics) 연구에 의해 몇 가지 종류의 암 마커 후보 단백질과 유전자가 보고되고 있다.

본 발명자들은 이전의 선행연구에서 암에서 특이적으로 과발현되는 일련의 유전자들을 발굴하여 이들 유전자들이 암의 진단 마커로서 활용될 수 있는 가능성을 제시하여 특허출원한 바 있다(특허출원 제10-2008-0120096호). 상기 본 발명자들의 연구결과에는 암의 마커로서 활용될 수 있는 유전자로서 TESC를 개시하였다.

TESC 유전자(NM_017899)는 염색체의 12q24.22 위치에 존재하며 전사과정을 거쳐 발현된 단백질 (214개 아미노산, 25 Kda)은 소디엄/수소 교환체(sodium/hydrogen exchanger)(NHE1)과 상호작용하는 EF-hand calcium binding 단백질을 암호화한다. TESC는 정소(testis)와 난소(ovary)가 결정되는 중요한 시기에 난소가 아닌 정소에서만 발현되는 것으로 알려져 있다. 현재 TESC는 암을 포함한 질병과의 연구는 보고되어 있지 않고 분자 생물학적 기능 연구도 현저히 부족한 상태이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 선행연구에서 TESC (Tescalcin) 유전자가 정상세포에 비해 암세포에서 특이적으로 과발현된다는 것을 확인하여 암마커로서의 유용성을 확인하였으며, 생물학적 시료에서 TESC 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 모노클로날 항체를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 재조합 TESC 단백질을 과발현시켜 분리 및 정제하고, 이를 항원으로 사용한 세포융합법을 통해, TESC 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 생산 하이브리도마 세포주를 성공적으로 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 TESC 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 수탁번호가 KCTC 11790BP인 하이브리도마 세포주를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 수탁번호가 KCTC 11790BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 인간 TESC 단백질에 대한 단일클론 항체를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 단백질 칩을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명에 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 TESC 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 수탁번호가 KCTC 11790BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호가 KCTC 11790BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 인간 TESC 단백질에 대한 단일클론 항체를 제공한다.

본 발명의 단일클론 항체는 인간 TESC (Tescalcin) 단백질에 고친화도를 가지면서 특이적으로 결합한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 단일클론 항체는 서열목록 제 13 서열의 TESC 단백질의 51 - 100 번째 아미노산서열 부위에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 단일클론 항체는 한국생명공학연구원 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 2010년 10월 20일자로 기탁번호 KCTC 11790BP으로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 항체이다.

본 명세서에서 용어 “항체(antibody)"는 인간 TESC (Tescalcin) 단백질에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함하는 의미이다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이이고, 가장 바람직하게는 감마 1(IgG1) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 항체는 카파(κ) 경쇄와 감마1(γ1) 중쇄를 가지는 Fab 형태 또는 IgG1 형태임을 알 수 있다.

본 명세서에서, 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 명세서에서 용어 “단일클론 항체”는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

본 발명의 단일클론항체는 당해 기술분야에서 공지된 세포융합방법에 의해 생성된 하이브리도마 세포로부터 얻을 수 있다. 일반적으로 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이러한 두 가지 세포의 융합은 당업계에서 공지되어 있는 폴리에틸렌클리콜(polyethyleneglycol)을 이용하는 방법을 통해 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 후, 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.

세포 융합에 사용되는 골수종 세포로는 마우스 유래의 p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63 Ag8, V653, S194, 랫트 유래의 R210 등 다양한 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서 사용된 세포주는 골수종 세포 NS-1이다.

상기의 하이브리도마 세포가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다.

TESC 단백질을 선택적으로 인식하는 단일클론을 선별하기 위하여 통상 사용되는 다양한 방법, 예를 들면, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역흡착법(ELISA), 면역형광법(Immunofluorescence), 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 및 유세포 분석법 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 효소면역흡착법(ELISA)에 의해 단일클론을 선별한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 인간 TESC (Tescalcin) 단백질에 대한 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 인간 TESC 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 생물학적 시료에 적용하여 암을 진단하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 진단의 대상이 되는“암”은 예를 들어 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 대장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 (CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 “생물학적 시료”란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜서 항원-항체 복합체의 형성을 검출함으로써 암의 발생에 관한 정보를 얻을 수 있다.

상기한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 또는 섬광계수법(scintillation counting method)으로 검출할 수 있다.

본 명세서에서 “검출”은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용하여 실시할 수 있다. 표지체의 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 또는 방사성 동위원소를 포함한다. 검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³ ⁺, Eu³ ⁺ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르 및 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I 및 ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 본 발명의 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 본 발명의 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 인간 TESC에 대한 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 암 진단용 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 인간 TESC에 대한 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 단백질 칩을 제공한다.

상기 단일클론항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 암의 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 이점을 요약하면 다음과 같다.

(ⅰ) 인간 암에서 과발현되는 TESC (Tescalcin) 단백질에 대한 단일클론항체, 및 이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 인간 TESC에 대한 단일클론항체는 인간 TESC 단백질에 대한 고친화도의 특이적 결합능력을 가지므로, 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

(ⅲ) 본 발명의 인간 TESC에 대한 단일클론항체는 암 진단용 키트 또는 단백질 칩의 제조에도 매우 유용하다.

이상에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명은 인간 TESC 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 수탁번호가 KCTC 11790BP인 하이브리도마 세포, 상기 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 인간 TESC 단백질에 대한 단일클론 항체, 상기 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물, 암 진단용 키트 및 암 진단용 단백질 칩에 관한 것이다. 본 발명의 인간 TESC에 대한 단일클론항체는 인간 TESC 단백질에 대한 고친화도의 특이적 결합능력을 가지므로, 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 암 진단용 키트 또는 단백질 칩의 제조에도 매우 유용하다.

도 1은 pET22b-TESC로 대장균을 형질전환시킨 후, His-TESC의 재조합 단백질 발현을 확인하고, 발현된 단백질을 친화성 컬럼(Ni-NTA column)을 이용하여 정제한 후의 전기영동 결과이다.
도 2는 His-TESC 재조합 단백질을 항원으로 주사한 후 얻어진 융합 세포주에서 생산된 항체가, pET22b-TESC로부터 발현된 재조합 항원에 대하여 반응하는 정도를 검사한 효소면역흡착법 (ELISA) 결과이다.
도 3은 발현시킨 TESC 단백질을 전기영동하고, 이를 TESC 69-18-11 클론의 배양 상등액을 이용하여 웨스턴 블로팅(Western blotting)한 결과이다.
도 4는 TESC 특이적 단일클론항체를 분비하는 것으로 확인한 TESC 69-18-11의 클론을 선정하여 이소타입을 결정한 결과를 보여준다. TESC 69-18-11 클론은 IgG1 이소타입 형태의 항체를 분비한다는 것을 보여주고 있다.
도 5는 TESC 발현 세포주 용해물을 전기영동하여 단백빌을 분리하고, 이에 대해 TESC 69-18-11 클론의 정제된 항체(단일클론항체)와 토끼에서 얻은 항체(폴리클론항체)를 이용하여 웨스턴 블로팅(Western blotting) 하여 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명의 인간 TESC에 대한 단일클론항체를 이용하여 대장암 세포주와 대장암 환자의 조직 샘플에 대해 웨스턴 블로팅(Western blotting)한 결과를 보여준다.
도 7a은 TESC 69-18-11 클론단일클론항체가 결합하는 TESC 단백질 부위를 에피토프 맵핑(epitope mapping)하기 위해, TESC 단백질을 4 부분로 나눈 부위를 보여주는 개략도이다.
도 7b는 TESC 단백질의 4 부분을 클로닝한 pET22b 발현벡터의 구성을 보여주는 도면이다.
도 7c은 TESC 69-18-11 클론단일클론항체가 5.5kDa (1-150bp, 1-50aa)에는 결합하지 않고. 11.1kDa (1-300bp, 1-100aa)에 결합한 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: TESC 의 cDNA 발현벡터 제조

TESC 유전자(GenBank Accession Number: NM_017899)가 발현되는 세포의 cDNA 라이브러리를 주형으로 염기서열이 5'-ATGGGCGCTGCCCACTCC-3'(서열목록 제1서열)과 5'-GTGGCAGAGGGCCATGGTT-3'(서열목록 제2서열)인 프라이머쌍을 사용하여 35 사이클(1사이클 : 94℃ 40초, 57℃ 40초, 72℃ 1분)의 TESC에 대한 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 행하였다. 이어서, 얻어진 PCR 산물 645bp의 TESC 유전자를 회수하여, pTOPO 벡터에 클로닝하고 염기서열을 확인하여 TESC 유전자임을 확인하였다. pTOPO 벡터에 클로닝되어 있는 TESC 유전자를 5'-CGGGATCCGATGGGCGCTGCCCACTCC-3'(서열목록 제3서열)과 5'-CGAAGCTTGTGGCAGAGGGCCATGGTT-3'(서열목록 제4서열)의 프라이머쌍을 이용하여 TESC 단백질의 1 번째 아미노산부터 214 번째 아미노산 까지를 코딩하는 DNA를 PCR로 증폭한 후, BamHI과 HindⅢ으로 잘라내어 대장균 발현 벡터인 pET22b 벡터에 접합하였다.

실시예 2: 대장균 세포내에서 재조합 TESC의 발현분석

TESC 단백질의 1-214 아미노산 서열을 포함하는 TESC 유전자를 포함하는 pET22b-TESC 플라스미드를 BL21 DE3 대장균에 형질전환하여 TESC 단백질이 정상적으로 발현됨을 확인하였다. 이 형질전환체를 500mL 삼각 플라스크에서 1mM IPTG 유도와 함께 4시간 배양하여 TESC 단백질 발현을 유도하였다. 대장균을 원심분리로 수확한 후, 세포 용해(lysis) 완충액을 넣고, 소니케이터(sonicator)로 세포를 파쇄시키고, 원심분리기로 상등액을 획득하였다. 상등액을 Ni-NTA 컬럼으로 처리하여 His-TESC 단백질을 분리 정제한 후, SDS-PAGE로 His-TESC 단백질의 발현과 정제를 분석하였다.

실시예 3: 생쥐의 항원 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화된 생쥐(mouse)를 얻기 위하여, 50 ㎍의 재조합 His-TESC 융합단백질과 동량의 면역보조항원(MPL-TDM Adjuvant)을 혼합하여 40 - 45℃에서 30 분간 중탕한 뒤, 4 내지 6 주된 Balb/c 생쥐의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 25 ㎍씩의 재조합 His-TESC 융합단백질과 동량의 면역보조항원(MPL+TDM Adjuvant)을 잘 혼합하여 생쥐의 복강 내로 부스터(booster) 주사하였다. 이어서, 4 - 5일 후에 생쥐 안구정맥에서 소량의 피를 뽑아내어 역가를 확인한 후 세포융합 실험 3일 전에 TESC 단백질을 복강 내에 마지막 주사하였다.

실시예 4: 세포융합에 의한 하이브리도마 세포의 제조

하이브리도마 세포의 제조에 필요한 세포 융합을 실시하기 위하여, 제조한 면역원인 His-TESC 융합단백질을 주사하여 얻은 생쥐의 비장세포 10⁷개와 골수종 세포(myeloma cell) 10⁶개를 50 ml의 시험관에 모았다. 세포융합의 모(parent) 세포로는 P3/NS/1-Ag4-1(NS-1)을 사용하였다. 이 모세포는 10％ FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 최대밀도 5 X 10⁵/㎖ 정도로 항상 유지시켰다.

상기 실시예 3에서 면역화된 생쥐를 경추탈골 후 몸통의 좌측에 위치한 비장을 꺼내서 그물망(mesh)에 곱게 갈아서 현탁액을 만들고, 이때 얻어진 비장세포를 50 ml의 원심분리관에 넣어서 원심분리하고, 이 과정을 2회 반복하여 비장세포를 충분히 세척하였다. 비장세포와 NS-1 세포를 각각 10 ㎖씩 재현탁시킨 후 각각의 세포의 수를 세어서 비장세포와 NS-1의 세포 수 비율이 10:1이 되도록 하여 50 ㎖의 원심분리관에서 섞고 다시 원심분리하여 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 손가락으로 가볍게 두드려서 분산시키고, 37℃에서 1 분간 유지시킨 후에 한스 완충액(HBSS)에 들어있는 45％ 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 융합촉진물(fusogen) 1 ㎖를 1 분간에 걸쳐 넣고, 또 다시 1 분간 약간 흔들어 주었다. 이어서, 배양배지(DMEM) 5 ㎖을 1 분간 걸쳐 첨가하고, 30 ml이 될 때까지 흔들어 주면서 서서히 DMEM을 첨가하였다. 이 현탁액을 다시 원심분리한 후 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1 - 2 X 10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 0.2 ㎖씩 분주한 후, 37℃ 습윤 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

실시예 5: 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 실시예 4에서 제조한 하이브리도마 세포군 중에서 TESC 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위해 TESC 항원을 이용한 효소면역흡착법(ELISA) 분석 방법으로 스크리닝하였다. 마이크로타이터 플레이트에 TESC 항원을 한 웰당 각각 100 ㎕(1 μg/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 인산 완충용액-트윈 20 (PBST) 용액으로 세척한 후, 1％ BSA(Bovine Serum Albumin)으로 블로킹하였다. 실온에서 한 시간 반응시킨 후 PBST 용액으로 세척하고, 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 100 ㎕씩을 가하여, 실온에서 2 시간 동안 반응시킨 후, PBST 용액으로 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서, 퍼옥시다제의 기질용액 (OPD)을 넣어 반응시키고, 반응의 정도는 490nm에서 흡광도로 측정하였다. 그 결과로 TESC 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 선별하였고, 수회의 반복 실험을 통하여 TESC 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주를 선별한 후, 단일클론이 되도록 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다. 이때 1 개의 클론, TESC 69-18-11를 최종적으로 얻었다. 상기 하이브리도마 세포주 TESC 69-18-11을 2010년 10월 20일자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 수탁번호 KCTC 11790BP로 기탁하였다.

또한, 이들 클론을 클로닝하여 동결하였고, 상등액을 효소면역흡착법으로 역가를 측정하고, 서브클래스 타입(subclass type)을 확인하였다. 단일클론 TESC 69-18-11은 IgG1으로 판명되었으며, TESC에 특이적으로 높은 결합력을 보여주었다. TESC 69-18-11 클론을 마우스에 주사하여 복수액을 만들었다.

실시예 6: 단일클론항체의 대량 생산

상기 실시예 5에서 얻은 계속적으로 항체를 분비하는 하이브리도마 세포로부터 단일클론성 항체를 대량 생산하기 위하여 먼저 마우스(Balb/c)에 0.5 ㎖의 불완전 보조항원(Incomplete Freund Adjuvant)을 복강 내로 주사하였다. 1 주일 후에 각각의 하이브리도마들을 실험쥐의 복강 내에 마리당 2 X 10⁶씩 주사하고, 7 내지 10일 후 복강이 부풀어 오른 실험쥐에서 복수액을 채취하였다. 이 복수액에 함유된 고농도의 하이브리도마 세포를 얻기 위해, 복수액을 10,000 rpm에서 원심분리하여 상층액을 취하고, 일부는 정제될 때까지 -70℃에서 보관하고, 일부는 친화성 컬럼(Protein G agarose column)을 이용 분리 정제하였다.

실시예 7: 단일클론항체의 특이도 검증

상기 실시예 6에서 얻은 단일클론성 항체의 특이도를 폴리클론항체의 것과 비교하였다(도 5). 먼저 30 μg의 세포주의 용해물에 대해 SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 단백질을 분리한 후, PVDF 막(membrane)에 단백질들을 옮긴 후, 여기에 TESC에 대한 단일클론항체와 폴리클론항체를 각각 0.1 μg/㎖의 농도로 사용하여 상온에서 2시간 반응시켰다. HRP가 고정된 마우스 2차 항체를 2차 반응시킨 후, X-레이 필름에 감광시켜, TESC 단백질의 발현 여부를 비교 분석하였다. 도 5의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 단일클론항체는 원래의 TESC 단백질이 위치한 부위(25kD)에서 반응하였으나, 폴리클론항체의 경우 TESC 단백질 위치가 아닌 다른 부위의 단백질과도 반응하였다.

실시예 8: 단일 클론 항체를 이용한 대장암 세포주 및 대장암 조직에서의 TESC 단백질 발현 연구

분리 정제한 단일클론항체 TESC 69-18-11를 이용하여 대장암 세포주와 대장암 환자의 조직에서 TESC 단백질의 발현정도를 분석하였다. 먼저 30 μg의 세포주 및 조직 추출액을 SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 단백질을 분리한 후, PVDF 막(membrane)에 단백질들을 옮긴 후, 여기에 TESC에 대한 단일 클론 항체를 0.1 μg/㎖의 농도로 사용하여 상온에서 2시간 반응시켰다. HRP가 고정된 마우스 2차 항체를 2차 반응시킨후, X-레이 필름에 감광시켜, TESC 단백질의 발현 여부를 비교 분석하였다. TESC 단백질이 대장암 세포주에서 발현되고, 대장암 환자의 암화된 조직에서 특히 과발현됨을 확인하였다(도 6).

실시예 9: 단일클론 항체의 에피토프 맵핑 ( Epitope mapping )

단일클론 항체가 TESC 단백질의 어느 부위와 반응하는지 알아보기 위하여 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 실시하였다. TESC 단백질을 4 부분, 5.5kDa (1-150bp, 1-50aa), 11.1kDa (1-300bp, 1-100aa), 16.5kDa (1-450bp, 1-150aa), 25kDa (1-645bp, 1-214aa)으로 나누어 다음과 같이 재조합 단백질을 만든 후에, 항체의 결합부위를 규명하였다. TESC 부분 재조합단백질의 발현은 다음의 방법으로 행하였다. 먼저, TESC 코딩 전장서열 645bp를 4등분 하여 1-150bp, 1-300bp, 1-450bp, 1-645bp의 길이로 pET22b 발현벡터에 클로닝하였다(도 7a 및 도 7b 참조).

제한효소는 BamHⅠ과 HindⅢ를 사용하였으며, 다음의 프라이머쌍을 제작하여 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행한 후 얻어진 PCR 산물을 회수하여 클로닝하였다:

1-150bp : 프라이머쌍 5′-CGGGATCCGATGGGCGCTGCCCACTCC-3′ (서열목록 제5서열), 5′-CGAAGCTTGACATTGTTCAAGTTCTCCT-3′ (서열목록 제6서열),

1-300bp : 프라이머쌍 5′-CGGGATCCGATGGGCGCTGCCCACTCC-3′ (서열목록 제7서열), 5′-CGAAGCTTGGTGTCGATGGGCCGGAAGT-3′ (서열목록 제8서열),

1-450bp: 프라이머쌍 5′-CGGGATCCGATGGGCGCTGCCCACTCC-3′ (서열목록 제9서열), 5′-CGAAGCTTCTCGATGTGAGGGTTTCCCG-3′ (서열목록 제10서열),

1-645bp: 프라이머쌍 5′-CGGGATCCGATGGGCGCTGCCCACTCC-3′(서열목록 제11서열), 5′-CGAAGCTTGTGGCAGAGGGCCATGGTT-3′(서열목록 제12서열)

상기 프라이머쌍을 사용하여 각각의 부위에 맞는 단백질을 코딩하는 DNA를 PCR (1사이클 : 94℃ 40초, 57℃ 40초, 72℃ 1분)을 이용하여 35 사이클을 진행시켜 증폭시킨 후, 제한효소를 이용하여 pET22b 발현벡터안으로 클로닝하였다(도 7b 참조). 클로닝된 pET22b-TESC 벡터를 BL21 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질전환시켜, 자라난 콜로니를 LB 배양액에서 배양하면서 37℃에서 IPTG 1mM 처리한 후 4시간 동안 다시 인큐베이션하여 단백질을 발현시켰다. 발현시킨 각각의 TESC 부분 단백질에 대해, 본 발명의 단일클론항체를 이용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 그 결과 도 7c에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 단일클론항체 TESC 69-18-11은 TESC 단백질의 151~300bp (51-100 aa)의 부위에 결합함을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC11790

20101020

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Monoclonal Antibody Specifically Binding to Human Tescalcin Protein and Its Use <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgggcgctg cccactcc 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtggcagagg gccatggtt 19 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cgggatccga tgggcgctgc ccactcc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cgaagcttgt ggcagagggc catggtt 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cgggatccga tgggcgctgc ccactcc 27 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cgaagcttga cattgttcaa gttctcct 28 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cgggatccga tgggcgctgc ccactcc 27 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cgaagcttgg tgtcgatggg ccggaagt 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cgggatccga tgggcgctgc ccactcc 27 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cgaagcttct cgatgtgagg gtttcccg 28 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cgggatccga tgggcgctgc ccactcc 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cgaagcttgt ggcagagggc catggtt 27 <210> 13 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Gly Ala Ala His Ser Ala Ser Glu Glu Val Arg Glu Leu Glu Gly 1 5 10 15 Lys Thr Gly Phe Ser Ser Asp Gln Ile Glu Gln Leu His Arg Arg Phe 20 25 30 Lys Gln Leu Ser Gly Asp Gln Pro Thr Ile Arg Lys Glu Asn Phe Asn 35 40 45 Asn Val Pro Asp Leu Glu Leu Asn Pro Ile Arg Ser Lys Ile Val Arg 50 55 60 Ala Phe Phe Asp Asn Arg Asn Leu Arg Lys Gly Pro Ser Gly Leu Ala 65 70 75 80 Asp Glu Ile Asn Phe Glu Asp Phe Leu Thr Ile Met Ser Tyr Phe Arg 85 90 95 Pro Ile Asp Thr Thr Met Asp Glu Glu Gln Val Glu Leu Ser Arg Lys 100 105 110 Glu Lys Leu Arg Phe Leu Phe His Met Tyr Asp Ser Asp Ser Asp Gly 115 120 125 Arg Ile Thr Leu Glu Glu Tyr Arg Asn Val Val Glu Glu Leu Leu Ser 130 135 140 Gly Asn Pro His Ile Glu Lys Glu Ser Ala Arg Ser Ile Ala Asp Gly 145 150 155 160 Ala Met Met Glu Ala Ala Ser Val Cys Met Gly Gln Met Glu Pro Asp 165 170 175 Gln Val Tyr Glu Gly Ile Thr Phe Glu Asp Phe Leu Lys Ile Trp Gln 180 185 190 Gly Ile Asp Ile Glu Thr Lys Met His Val Arg Phe Leu Asn Met Glu 195 200 205 Thr Met Ala Leu Cys His 210

Claims

인간 TESC 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 수탁번호가 KCTC 11790BP인 하이브리도마 세포.
수탁번호가 KCTC 11790BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 인간 TESC 단백질에 대한 단일클론 항체 또는 이의 항원결합단편.
제 2 항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열목록 제 13 서열의 TESC 단백질의 51 - 100 번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원결합단편.
제 2 항 또는 제 3 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 대장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 또는 뇌하수체 선종인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항 또는 제 3 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 대장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 또는 뇌하수체 선종인 것을 특징으로 하는 키트.
제 2 항 또는 제 3 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 암 진단용 단백질 칩.
제 8 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 대장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 또는 뇌하수체 선종인 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
암 진단에 관한 정보를 제공하기 위해, 제 2 항 또는 제 3 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원결합단편을 인체로부터 분리된 생물학적 시료와 접촉시킨 후 항원-항체 복합체를 측정하는 단계를 포함하는 인간 TESC 단백질을 검출하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 대장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 또는 뇌하수체 선종인 것을 특징으로 하는 방법.