JPWO2018135653A1 - 抗epha2抗体及びこれを用いたepha2の免疫学的検出 - Google Patents
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Abstract
EPHA2に特異的な抗体の提供。配列番号20で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号22で表される軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片、並びに配列番号15で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18で表される軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
Description
本発明は、新規な抗体、該抗体の機能断片、該抗体の修飾体、該抗体の有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヌクレオチド、該ヌクレオチドが挿入されたベクター、該ヌクレオチド又はベクターが導入された細胞、該細胞を培養する工程を含む該抗体の製造方法、医薬組成物、診断用又は検査用組成物等に関する。
EPHA2は、分子量130kDaの1回膜貫通構造を有するレセプター型チロシンキナーゼである(非特許文献1)。EPHA2のN末端側の細胞外領域には、リガンド結合ドメインと2ヶ所のフィブロネクチンタイプ3ドメインが存在し、C末端側の細胞内領域にはチロシンキナーゼドメインとsterile−α−motif(SAM)ドメインが存在している。
EPHA2のリガンドとして、GPIアンカー型蛋白質のEphrin−A1〜A5が知られている(非特許文献2)。リガンド結合によるEPHA2のチロシンキナーゼドメインの活性化により、EPHA2の細胞内領域に存在するチロシン残基が自己リン酸化され、細胞内シグナルの伝達が誘導される。また、リガンドと結合した後にEPHA2はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、最終的にプロテアソームで分解されることが報告されている(非特許文献3)。
EPHA2は臨床的に多くの癌、特に乳がん、食道がん、前立腺がん、胃がん、非小細胞肺がん、大腸がん、多形神経膠芽腫での高発現が報告されている(非特許文献4、5、6、7、8、9、10、11)。さらに、食道がんでは、EPHA2発現と局所リンパ節転移、リンパ節転移の数、及び癌の分化度の低さとの間に有意な相関が観察されており、EPHA2陽性の患者の生存率はEPHA2陰性の患者に比べて低いことが報告されている(非特許文献5)。非小細胞肺がんでは、無病生存期間が5年より長い患者に比べ5年未満の患者ではEPHA2の発現レベルが高いこと、再発した患者は再発のない患者に比べてEPHA2の発現レベルが高いこと、脳転移へ進行した患者では、再発のない患者や転移が対側の肺に限局している患者に比べてEPHA2の発現レベルが高いことが報告されている(非特許文献9)。大腸癌においてもEPHA2の発現レベルが、肝転移、リンパ管浸潤及び臨床ステージと有意に相関することが報告されている(非特許文献10)。
また、EPHA2遺伝子を細胞に導入することによって、非がん細胞が足場非依存的増殖能や細胞外基質上での管状形態形成能、in vivoでの腫瘍増殖能といった癌形質を獲得するようになること(非特許文献4)、がん細胞の細胞外基質に対する浸潤性が亢進すること(非特許文献12、13)が報告されている。逆にEPHA2の発現をsiRNAで抑制するとがん細胞の浸潤性や足場非依存的増殖、in vivoでの腫瘍増殖が抑制されること(非特許文献13、14)及び、リガンドであるEphrin−A1とヒトIgGのFc領域との融合蛋白質を使用してEPHA2を活性化し、エンドサイトーシスによるEPHA2の分解を誘導することでがん細胞の浸潤性や足場非依存的増殖、管状形態形成能が抑制されること(非特許文献4、11、12)が報告されている。
一方でEPHA2は、がん細胞のみならず腫瘍内又は腫瘍周囲の血管にも発現していることが報告されている(非特許文献15)。マウスにおいてはEphrin−A1によって誘導される血管新生にEPHA2シグナルが関与していること、特に血管内皮細胞に発現するEPHA2が血管内皮細胞の管腔形成や生存に必要とされることが報告されており(非特許文献16)、EPHA2の細胞外領域とヒトIgGのFc領域との融合蛋白質がin vivoで血管新生を抑制し、抗腫瘍効果を示すことも報告されている(非特許文献17)。
最近、膜1型マトリックスメタロプロテアーゼ(MT1−MMP)がEPHA2を細胞外領域で切断すること、その結果として膜に残っているEPAH2の断片が癌原シグナルを促進することが報告されている(非特許文献18、19)。
さらに、肺がん、前立腺がん患者では、健常人に比較し、可溶性EPHA2の血清中濃度が高いことが報告されている(非特許文献20、21)。
以上より、EPHA2が、がんに対する優れた治療標的となる可能性が示唆されており、実際にEPHA2を標的とした薬剤の臨床試験が実施されているものも存在する(特許文献1〜3)。
これらのことから、EPHA2の発現を検出できる方法の提供は、がんなどEPHA2に関わる疾患、EPHA2発現の検査又は診断に有用である。被検者由来の試料中のEPHA2を測定する方法としてイムノアッセイがあるが、その中でもELISA (Enzyme−Linked Immuno Sorbent Assay)法は簡便且つ迅速な測定方法として汎用されている。これまで、抗EPHA2抗体を用いて被検試料中に含まれるEPHA2を測定する方法(ELISA法)は報告されていたが(特許文献4、5、非特許文献20〜27)、抗EPHA2モノクローナル抗体のみを用いる方法は確立されていなかった。
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第74回日本癌学会学術総会 P15−8 P−3321
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Abnova、EPHA2 (Human) Matched Antibody Pair(H00001969-AP21)、<http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?catalog_id=H00001969-AP21>
Abnova、EPHA2 (Human) Matched Antibody Pair(H00001969-AP11)、<http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?catalog_id=H00001969-AP11>
Abnova、EPHA2 (Human) Matched Antibody Pair(H00001969-AP51)、<http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?catalog_id=H00001969-AP51>
本発明の一つの課題は、EPHA2に特異的な抗体を提供することである。
本発明の他の一つの課題は抗EPHA2抗体を含有する免疫学的診断用組成物、及びそれに用いる抗EPHA2抗体又はその組み合わせを提供することである。
また、本発明の他の一つの課題は、抗EPHA2抗体又はその組み合わせを用いてEPHA2を検出する方法、ならびに該抗体又はその組み合わせを含有する検出用又は診断用キットを提供することである。
本発明者らは、EPHA2を簡便かつ高感度で測定し、がんの診断の精度向上に役立てるべく、EPHA2をサンドイッチ免疫学的測定法で測定するために、多数の抗EPHA2モノクローナル抗体を作製し、サンドイッチ免疫学的測定法に特に適したモノクローナル抗体を選択し、重鎖可変領域、軽鎖可変領域のアミノ酸配列と塩基配列を決定し、さらに、6つのCDR配列を解析した。
本発明者らが開発した2種類に抗体を用いることにより、生体試料中のEPHA2を高感度で測定することができ、がんの検出も高感度かつ高特異性で達成することができることを確認し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[1](a)配列番号29で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH1、
(b)配列番号30で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH2、
(c)配列番号31で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH3、
(d)配列番号32で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL1、
(e)配列番号33で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL2、及び
(f)配列番号34で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL3
を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[2] 配列番号20で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号22で表される軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[3] 配列番号20で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号22で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[4](a)配列番号23で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH1、
(b)配列番号24で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH2、
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH3、
(d)配列番号26で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL1、
(e)配列番号27で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL2、及び
(f)配列番号28で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL3
を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[5] 配列番号15で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18で表される軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[6] 配列番号15で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号18で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[7] [1]から[3]のいずれかに記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[4]から[6]のいずれかに記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体の組み合わせ。
[8] 生体試料中のEPHA2の検出又は測定方法に使用される、[7]記載の組み合わせ。
[9] 生体試料中に含まれるEPHA2を免疫学的測定法により特異的に検出する方法であって、[1]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片を用いる方法。
[10] 生体試料中に含まれるEPHA2をサンドイッチ免疫学的測定法により特異的に検出する方法であって、[1]から[3]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項[4]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体を用いる、方法。
[11] サンドイッチ免疫学的測定法がELISAである[10]の方法。
[12] がんを検出する方法であって、[1]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片を用いて、被験体の血液中EPHA2濃度を免疫学的測定法で測定し、健常人の血液中のEPHA2濃度よりも高い場合に、被験体ががんに罹患していると評価する方法。
[13] がんを検出する方法であって、[1]から[3]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[4]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体を用いて、被験体の血液中EPHA2濃度をサンドイッチ免疫学的測定法で測定し、健常人の血液中のEPHA2濃度よりも高い場合に、被験体ががんに罹患していると評価する方法。
[14] サンドイッチ免疫学的測定法がELISAである、[13]の方法。
[15] がんが胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫及び頭頚部がんからなる群から選択される、[12]〜[14]の方法。
[16] [1]から[3]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[4]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体又は機能的断片を含む、EPHA2を測定するためのキット。
[17] [1]から[3]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[4]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体又は機能的断片を含む、がんを検出するためのキット。
[18] がんが胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫及び頭頚部がんからなる群から選択される、[17]のキット。
[1](a)配列番号29で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH1、
(b)配列番号30で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH2、
(c)配列番号31で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH3、
(d)配列番号32で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL1、
(e)配列番号33で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL2、及び
(f)配列番号34で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL3
を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[2] 配列番号20で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号22で表される軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[3] 配列番号20で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号22で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[4](a)配列番号23で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH1、
(b)配列番号24で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH2、
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH3、
(d)配列番号26で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL1、
(e)配列番号27で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL2、及び
(f)配列番号28で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL3
を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[5] 配列番号15で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18で表される軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[6] 配列番号15で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号18で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[7] [1]から[3]のいずれかに記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[4]から[6]のいずれかに記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体の組み合わせ。
[8] 生体試料中のEPHA2の検出又は測定方法に使用される、[7]記載の組み合わせ。
[9] 生体試料中に含まれるEPHA2を免疫学的測定法により特異的に検出する方法であって、[1]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片を用いる方法。
[10] 生体試料中に含まれるEPHA2をサンドイッチ免疫学的測定法により特異的に検出する方法であって、[1]から[3]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項[4]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体を用いる、方法。
[11] サンドイッチ免疫学的測定法がELISAである[10]の方法。
[12] がんを検出する方法であって、[1]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片を用いて、被験体の血液中EPHA2濃度を免疫学的測定法で測定し、健常人の血液中のEPHA2濃度よりも高い場合に、被験体ががんに罹患していると評価する方法。
[13] がんを検出する方法であって、[1]から[3]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[4]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体を用いて、被験体の血液中EPHA2濃度をサンドイッチ免疫学的測定法で測定し、健常人の血液中のEPHA2濃度よりも高い場合に、被験体ががんに罹患していると評価する方法。
[14] サンドイッチ免疫学的測定法がELISAである、[13]の方法。
[15] がんが胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫及び頭頚部がんからなる群から選択される、[12]〜[14]の方法。
[16] [1]から[3]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[4]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体又は機能的断片を含む、EPHA2を測定するためのキット。
[17] [1]から[3]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[4]から[6]のいずれかのEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体又は機能的断片を含む、がんを検出するためのキット。
[18] がんが胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫及び頭頚部がんからなる群から選択される、[17]のキット。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-009349号の開示内容を包含する。
本発明者らが作製した多数の抗EPHA2モノクローナル抗体の中で57-1抗体及び230-1抗体を固相化抗体と検出用抗体として組合せて用いた場合、他のモノクローナル抗体を用いたときよりも、高感度で生体試料中のEPHA2を検出することができる。さらに、上記の2種類のモノクローナル抗体を組合せて用いたサンドイッチ免疫学的測定法により、EPHA2を測定し、がんを検出する場合、がんを高感度かつ高特異性で検出することができる。
また、57-1抗体又は230-1抗体を用いた免疫学的測定法により、他のモノクローナル抗体を用いたときよりも、高感度で生体試料中のEPHA2を検出することができる。さらに、上記のモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定法により、EPHA2を測定し、がんを検出する場合、がんを高感度かつ高特異性で検出することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、EPHA2に特異的に結合する特定のモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法で被験体の生体試料中のEPHA2を測定する方法、及び測定するための試薬若しくはキットである。
また、本発明は、EPHA2に特異的に結合する特定の2種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ免疫学的測定方法で被験体の生体試料中のEPHA2を測定する方法、及び測定するための試薬若しくはキットである。
また、本発明は、サンドイッチ免疫学的測定方法でEPHA2を測定するに適した抗EPHA2モノクローナル抗体、及び2種類の抗EPHA2モノクローナル抗体の組合せである。
さらに、本発明は、特定の抗EPHA2モノクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法で被験体の生体試料中(好ましくは、血液中)のEPHA2を測定し、生体試料中(好ましくは、血液中)EPHA2濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを検出する方法、及び生体試料中(好ましくは、血液中)EPHA2濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを検出するための試薬若しくはキットである。本発明の方法は、特定の抗EPHA2モノクローナル抗体を用い免疫学的測定方法で被験体の生体試料中(好ましくは、血液中)のEPHA2を測定し、生体試料中(好ましくは、血液中)EPHA2濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを判定するための補助的データを得る方法でもある。
さらに、本発明は、特定の2種類の抗EPHA2モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ免疫学的測定方法で被験体の生体試料中(好ましくは、血液中)のEPHA2を測定し、生体試料中(好ましくは、血液中)EPHA2濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを検出する方法、及び生体試料中(好ましくは、血液中)EPHA2濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを検出するための試薬若しくはキットである。本発明の方法は、特定の2種類の抗EPHA2モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ免疫学的測定方法で被験体の生体試料中(好ましくは、血液中)のEPHA2を測定し、生体試料中(好ましくは、血液中)EPHA2濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを判定するための補助的データを得る方法でもある。
生体試料としては、血液(全血、血清又は血漿)、リンパ液、尿、組織ホモジネート、細胞培養上清、又は細胞可溶化液を用いる。好ましくは血液、より好ましくは血清を用いればよい。
本発明で用いるモノクローナル抗体は、ウマ、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、マウス等の哺乳動物をEPHA2又はその断片を免疫原として免疫し、脾臓細胞等とミエローマとを融合し、ハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生分泌する抗体として得ることができる。ハイブリドーマは公知の方法で作製することができる。
免疫原としてのEPHA2は配列情報に基づいて化学合成することもでき、またタンパク質をコードするDNA配列情報に基づいて公知の方法でリコンビナントタンパク質として得ることもできる。
抗体のスクリーニングは任意の方法で行うことができるが、好ましくは、EPHA2をコードするDNAでトランスフェクトした動物細胞を用いたCell−ELISAによりスクリーニングすればよい。EPHA2の塩基配列を配列番号5に示し、アミノ酸配列を配列番号6に示す。さらに、選択した抗体が特異的にEPHA2に結合するかは、フローサイトメトリー解析等により確認することができる。
本発明の方法で用いるモノクローナル抗体は、抗体230−1及び抗体57−1のいずれかあるいは両方である。抗体230−1は、作製した13種類のモノクローナル抗体の中で最もEPHA2との反応性が高いモノクローナル抗体であり、抗体57−1は抗体230−1と組合せてサンドイッチ免疫学的測定方法でEPHA2を測定するのに最も適した抗体である。
抗体57−1の重鎖可変領域をコードするcDNA配列を配列番号14(図8)に示し、抗体57−1の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号15(図9)に示す。また、抗体57−1の軽鎖可変領域をコードするcDNA配列を配列番号17(図10)に示し、抗体57−1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号18(図11)に示す。
すなわち、本発明の抗EPHA2抗体は、配列番号15で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒトEPHA2に結合する抗ヒトEPHA2モノクローナル抗体である。
また、上記の配列番号14又は17で表される配列からなる塩基配列とBLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール))等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ)を用いて計算したときに、少なくとも85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上、98%以上、あるいは99%以上の配列同一性を有している塩基配列からなるDNAであって、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトEPHA2への結合活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするDNAに含まれる。
また、上記の配列番号14又は17で表される配列からなるDNAと相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAであって抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトEPHA2への結合活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするDNAに含まれる。
また、上記の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、配列番号15又は18で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、1若しくは数個、例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1若しくは2個、さらに好ましくは1個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトEPHA2への結合活性を有するタンパク質からなる重鎖可変領域又は軽鎖可変領域も含む。
このような配列番号15又は18で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号15又は18で表されるアミノ酸配列と、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール))等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ)を用いて計算したときに、少なくとも85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上、98%以上、あるいは99%以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
このような配列番号15又は18で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号15又は18で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
抗体230−1の重鎖可変領域をコードするcDNA配列を配列番号19(図12)に示し、抗体230−1の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号20(図13)に示す。また、抗体230−1の軽鎖可変領域をコードするcDNA配列を配列番号21(図14)に示し、抗体230−1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号22(図15)に示す。
すなわち、本発明の抗EPHA2抗体は、配列番号20で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号22で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒトEPHA2に結合する抗ヒトEPHA2モノクローナル抗体である。
また、上記の配列番号19又は21で表される配列からなる塩基配列とBLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール))等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ)を用いて計算したときに、少なくとも85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上、98%以上、あるいは99%条の配列同一性を有している塩基配列からなるDNAであって、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトEPHA2への結合活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするDNAに含まれる。
また、上記の配列番号19又は21で表される配列からなるDNAと相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAであって抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトEPHA2への結合活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするDNAに含まれる。
また、上記の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、配列番号20又は22で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、1若しくは数個、例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1若しくは2個、さらに好ましくは1個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域の活性、すなわちヒトEPHA2への結合活性を有するタンパク質からなる重鎖可変領域も含む。
このような配列番号20又は22で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号20又は22で表されるアミノ酸配列と、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール))等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ)を用いて計算したときに、少なくとも85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上、98%以上、あるいは99%以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
このような配列番号20又は22で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号20又は22で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
さらに、抗体57−1は、重鎖可変領域のCDR(相補性決定領域)として、配列番号23で表されるアミノ酸配列(NYGMN)からなるCDRH1、配列番号24で表されるアミノ酸配列(WINTDTGEPIFVEEFKG)からなるCDRH2、配列番号25で表されるアミノ酸配列(SMGGFAN)からなるCDRH3を含み、さらに、軽鎖可変領域のCDRとして、配列番号26で表されるアミノ酸配列(RASQNISDYLH)からなるCDRL1、配列番号27で表されるアミノ酸配列(YASQSIS)からなるCDRL2、配列番号28で表されるアミノ酸配列(QNGHTFPT)からなるCDRL3を含む(図16)。
すなわち、本発明の抗EPHA2抗体は、配列番号23で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDRH1、配列番号24で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDRH2、配列番号25で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDRH3、配列番号26で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDRL1、配列番号27で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDRL2、及び配列番号28で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDRL3を含む抗体である。
さらに、抗体230−1は、重鎖可変領域のCDR(相補性決定領域)として、配列番号29で表されるアミノ酸配列(DYYMY)からなるCDRH1、配列番号30で表されるアミノ酸配列(TISDDGSFTHYLDSVKG)からなるCDRH2、配列番号31で表されるアミノ酸配列(DGYRYDRPFAY)からなるCDRH3を含み、さらに、軽鎖可変領域のCDRとして、配列番号32で表されるアミノ酸配列(KASQDVNTAVA)からなるCDRL1、配列番号33で表されるアミノ酸配列(WASTRHT)からなるCDRL2、配列番号34で表されるアミノ酸配列(QQHYSTPYT)からなるCDRL3を含む(図17)。
すなわち、本発明の抗EPHA2抗体は、配列番号29で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDRH1、配列番号30で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDRH2、配列番号31で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDRH3、配列番号32で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDRL1、配列番号33で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDRL2、及び配列番号34で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDRL3を含む抗体である。
上記の各CDRは、それぞれに表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個、好ましくは1若しくは2個、さらに好ましくは1個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるCDRも含む。
前記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗EPHA2モノクローナル抗体は、上記の重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに上記の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、3個のドメインCH1、CH2及びCH3から構成されている。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM又はIgD定常領域であってもよいが、好適には、IgG1又はIgG2定常領域、最も好適には、IgG1定常領域である。軽鎖定常領域は、1個のドメインCLで構成されている。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域である。
本発明の抗体は、抗体の機能的断片又はその修飾物も包含する。例えば、抗体の機能的断片は、抗体の断片であって抗原に特異的に結合し得る断片である。機能的断片としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、ジスルフィド結合Fv (dsFv) 、二量体化V領域(diabody)、一本鎖Fv(scFv)等が挙げられる。
本発明の抗体は、抗体産生ハイブリドーマを用いて産生することもできるが、重鎖可変領域をコードするDNA又は軽鎖可変領域をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、発現用の宿主細胞を該ベクターを用いて形質転換し、宿主細胞を培養することにより、リコンビナント抗体として細胞に産生させることができる。
本発明の抗体は、上記の抗体が結合するエピトープに結合する抗体又は上記の抗体とEPHA2への結合において競合する抗体も包含する。
本発明では、抗ヒトEPHA2モノクローナル抗体を用いて免疫学的測定系を構築する。免疫学的測定法として、イムノブロット法、酵素免疫測定法(EIA、ELISA)、放射線免疫測定法(RIA)、蛍光抗体法、凝集反応を利用した方法、イムノクロマトグラフィー法等が挙げられる。
また、本発明では、抗ヒトEPHA2モノクローナル抗体を用いて、免疫学的測定法の中でもサンドイッチ免疫学的測定系を構築する。サンドイッチ免疫学的測定法としては、サンドイッチ放射免疫測定法(RIA法)、サンドイッチ酵素免疫測定法(EIA法)、サンドイッチ蛍光免疫測定法(FIA法)、サンドイッチ発光免疫測定法(CLIA法)、サンドイッチ発光酵素免疫測定法(CLEIA法)、サンドイッチ法に基づく免疫クロマトグラフ法などの全てのサンドイッチ免疫測定法が挙げられる。この中でも、EIA法であるELISA(Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay)が好ましい。以下ELISAについて説明するが、他のサンドイッチ免疫学的測定法も測定しようとする抗原を2種類の抗体でサンドイッチするという点では同様の方法であり、当業者ならば他のサンドイッチ免疫学的測定法の測定系を構築することができる。捕捉用抗体(一次抗体)として未標識の抗ヒトEPHA2モノクローナル抗体を、96ウェルマイクロタイタープレートやポリスチレンビーズ等の担体に固相化する。また、検出用抗体(二次抗体)には、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)やアルカリフォスファターゼ(ALP)等の酵素、FITC等の蛍光物質、又はビオチン等で標識した抗ヒトEPHA2モノクローナル抗体を用いる。この場合、抗体分子をペプシンで消化して得られたFab’フラグメントに酵素などを標識することもできる。あるいは未標識の二次抗体を反応させた後、該二次抗体に特異的に結合する抗体を酵素や蛍光物質等で標識したものを検出用の三次抗体として用いて反応させることもできる。また、このときに二次抗体をビオチンで標識し、標識したアビジン又はストレプトアビジンをビオチンに結合させて発色させてもよい。抗原抗体反応は4℃〜45℃、より好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、また、反応時間は、10分〜18時間、より好ましくは10分〜1時間、さらに好ましくは30分〜1時間程度である。発色の程度を予め作成しておいたか、あるいは被験体から採取した試料を測定するときに同時に作成した、標準曲線から試料中のEPHA2濃度を算出することができる。サンドイッチ免疫学的測定法において、抗体57−1と抗体230−1の一方をELISA用マイクロタイタープレート等の担体に固相化し固相化抗体として用い、他方を標識して検出用抗体として用いる。抗体57−1を固相化抗体として用い、抗体230−1を検出用抗体として用いてもよく、また、抗体57−1を検出用抗体として用い、抗体230−1を固相化抗体として用いてもよい。これらのモノクローナル抗体を用いた方法の特異性は高く、EPHA2のみを検出し、EPHA1、EPHA3、EPHA4には交差反応性を示さない。
本発明は、少なくとも抗体57−1と抗体230−1の2種類の抗体を含むEPHA2を測定するための検査用キット、あるいは免疫学的診断用組成物を含む。抗体57−1と抗体230−1の一方の抗体は、ELISA用マイクロタイタープレートに固相化され、他方は標識されていてもよい。前記検査用キットは、検体採取器具、検体処理液、発色基質等の試薬を含んでいてもよく、さらに、試験に必要な器具等を含んでいてもよい。
被験体の血液中のEPHA2を測定することにより、被験体ががんに罹患しているか否かを判定することができる。すなわち、被験体の血液中のEPHA2濃度が健常人の血液中EPHA2濃度より高い場合に被験体はがんに罹患していると判断することができる。また、あらかじめ健常人の生体試料中のEPHA2濃度を測定しておき、該測定値に基づいてEPHA2の濃度測定値についてカットオフ値(閾値)を定めておいてもよい。該カットオフ値を基準としカットオフ値を超えた場合に、がんに罹患していると判断することができる。
がんは好ましくは胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫、頭頚部がん等である。
本発明は、血液中のEPHA2濃度を指標にがんを検出する方法を包含する。該方法は、血液中のEPHA2濃度を指標にがんを検出するための補助的データを得る方法でもある。
本発明は、少なくとも抗体57−1又は抗体230−1を含むEPHA2を測定しがんを検出するための検査用キット、あるいは免疫学的診断用組成物を含む。前記検査用キットは、検体採取器具、検体処理液、発色基質等の試薬を含んでいてもよく、さらに、試験に必要な器具等を含んでいてもよい。
さらに、本発明は、少なくとも抗体57−1と抗体230−1の2種類の抗体を含むEPHA2を測定しがんを検出するための検査用キット、あるいは免疫学的診断用組成物を含む。前記検査用キットは、検体採取器具、検体処理液、発色基質等の試薬を含んでいてもよく、さらに、試験に必要な器具等を含んでいてもよい。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及びManiatis,T.著,Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊)に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
[実施例1]
抗ヒトEPHA2モノクローナル抗体の作製
1)−1 ヒトEPHA2をコードするプラスミドの作製
1)−1−1 全長ヒトEPHA2をコードするプラスミドの作製
鋳型としてSK−OV−3細胞のtotal RNAより合成したcDNAとプライマーセット:
プライマー1:5’−ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggggatcggaccgagagcgagaag−3’(配列表の配列番号1)及び、
プライマー2:5’−ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctagatggggatccccacagtgttcacctggtcctt−3’(配列表の配列番号2)
を用いたPCR反応でヒトEPHA2をコードするcDNAを増幅した。PCR断片をBP Clonase(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてpDONR221(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)にクローニングした。クローニングされたEPHA2遺伝子からGeneTailor Site−Directed Mutagenesis System(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)とプライマーセット:
プライマー3:5’−ctgtggggatccccatcgacccagctttc−3’(配列表の配列番号3)及び、
プライマー4:5’−gatggggatccccacagtgttcacctggtc−3’(配列表の配列番号4)
を用いてストップコドンを除去した。このEPHA2遺伝子断片をLR Clonase(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてpcDNA−DEST40 Gateway Vector(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)へ移し替えた。以下、このプラスミドをpcDNA−DEST40−EPHA2と記す(本プラスミドはattB1とattB2配列の間に配列表の配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有する。)。また本プラスミドにクローニングされたEPHA2遺伝子のコーディング配列は配列表の配列番号5のヌクレオチド番号33から2960に示されている。またEPHA2のアミノ酸配列は配列表の配列番号6に示されている。
[実施例1]
抗ヒトEPHA2モノクローナル抗体の作製
1)−1 ヒトEPHA2をコードするプラスミドの作製
1)−1−1 全長ヒトEPHA2をコードするプラスミドの作製
鋳型としてSK−OV−3細胞のtotal RNAより合成したcDNAとプライマーセット:
プライマー1:5’−ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggggatcggaccgagagcgagaag−3’(配列表の配列番号1)及び、
プライマー2:5’−ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctagatggggatccccacagtgttcacctggtcctt−3’(配列表の配列番号2)
を用いたPCR反応でヒトEPHA2をコードするcDNAを増幅した。PCR断片をBP Clonase(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてpDONR221(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)にクローニングした。クローニングされたEPHA2遺伝子からGeneTailor Site−Directed Mutagenesis System(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)とプライマーセット:
プライマー3:5’−ctgtggggatccccatcgacccagctttc−3’(配列表の配列番号3)及び、
プライマー4:5’−gatggggatccccacagtgttcacctggtc−3’(配列表の配列番号4)
を用いてストップコドンを除去した。このEPHA2遺伝子断片をLR Clonase(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてpcDNA−DEST40 Gateway Vector(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)へ移し替えた。以下、このプラスミドをpcDNA−DEST40−EPHA2と記す(本プラスミドはattB1とattB2配列の間に配列表の配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有する。)。また本プラスミドにクローニングされたEPHA2遺伝子のコーディング配列は配列表の配列番号5のヌクレオチド番号33から2960に示されている。またEPHA2のアミノ酸配列は配列表の配列番号6に示されている。
1)−1−2 EPHA2細胞外領域をコードするプラスミドの作製
ヒトEPHA2細胞外領域(配列表の配列番号6のアミノ酸番号1乃至534に示されるアミノ酸配列からなる。以下「EPHA2(ECR)」と記す)をコードする遺伝子をプライマーセット:
プライマー5:5’−aaaaagcttatggagctccaggcagcccgc−3’(配列表の配列番号7)及び、
プライマー6:5’−aaagggccctcagttgccagatccctccgg−3’(配列表の配列番号8)
を用いてPCR反応で増幅した。そのPCR断片をHindIII及びApaIで切断し、pcDNA3.1のHindIII/ApaIサイトにクローニングした(以下「pcDNA3.1−EPHA2(ECR)」と記す。また、以下、pcDNA3.1−EPHA2(ECR)によって発現する組換え蛋白質を「EPHA2(ECR)」と記す。)。
ヒトEPHA2細胞外領域(配列表の配列番号6のアミノ酸番号1乃至534に示されるアミノ酸配列からなる。以下「EPHA2(ECR)」と記す)をコードする遺伝子をプライマーセット:
プライマー5:5’−aaaaagcttatggagctccaggcagcccgc−3’(配列表の配列番号7)及び、
プライマー6:5’−aaagggccctcagttgccagatccctccgg−3’(配列表の配列番号8)
を用いてPCR反応で増幅した。そのPCR断片をHindIII及びApaIで切断し、pcDNA3.1のHindIII/ApaIサイトにクローニングした(以下「pcDNA3.1−EPHA2(ECR)」と記す。また、以下、pcDNA3.1−EPHA2(ECR)によって発現する組換え蛋白質を「EPHA2(ECR)」と記す。)。
1)−2 ヒトERBB2をコードするプラスミドの作製
Human clone collection(STRATAGENE社 #C33830、Agilent Technologies社)を鋳型にプライマーセット:
プライマー7:5’−caccatggagctggcggccttg−3’(配列表の配列番号9)及び、
プライマー8:5’−tcccactggcacgtccagacc−3’(配列表の配列番号10)
を用いPCR反応を行った。得られたPCR断片をpENTR Directional TOPO Cloning kit(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてpENTR/D−TOPO(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)にクローニングした。アミノ酸置換を伴う変異を修復するため、このプラスミドをEcoRI処理して得られた断片の内、pENTR/D−TOPO由来配列を含む断片とHuman clone collection(STRATAGENE社 #C14640、Agilent Technologies社)をEcoRI処理して得られた断片の内、2番目に大きな断片(約1.6kbp)とをライゲーションした。このプラスミドの中のERBB2遺伝子断片をLR Clonaseを用いてpcDNA−DEST40 Gateway vectorへ移し変えた。以下、このプラスミドをpcDNA−DEST40−ERBB2と記す(attB1とattB2配列の間に配列表の配列番号11に示されるヌクレオチド配列を有する。)。
Human clone collection(STRATAGENE社 #C33830、Agilent Technologies社)を鋳型にプライマーセット:
プライマー7:5’−caccatggagctggcggccttg−3’(配列表の配列番号9)及び、
プライマー8:5’−tcccactggcacgtccagacc−3’(配列表の配列番号10)
を用いPCR反応を行った。得られたPCR断片をpENTR Directional TOPO Cloning kit(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてpENTR/D−TOPO(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)にクローニングした。アミノ酸置換を伴う変異を修復するため、このプラスミドをEcoRI処理して得られた断片の内、pENTR/D−TOPO由来配列を含む断片とHuman clone collection(STRATAGENE社 #C14640、Agilent Technologies社)をEcoRI処理して得られた断片の内、2番目に大きな断片(約1.6kbp)とをライゲーションした。このプラスミドの中のERBB2遺伝子断片をLR Clonaseを用いてpcDNA−DEST40 Gateway vectorへ移し変えた。以下、このプラスミドをpcDNA−DEST40−ERBB2と記す(attB1とattB2配列の間に配列表の配列番号11に示されるヌクレオチド配列を有する。)。
1)−3 抗原蛋白質の調製
EPHA2(ECR)を発現させるため、FreeStyle 293−F細胞(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)にpcDNA3.1−EPHA2(ECR)を293fectin(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてトランスフェクションし、37℃、8% CO2で5日間培養した。培養上清を遠心分離により回収し、分子量分画15000の透析チューブを用いて20mM Tris−HCl pH7.5の中で透析した。フィルター(0.45μm,PES)を通した後、培養上清を20mM Tris−HCl pH7.5で平衡化されたHiPrep 16/10 Q XL(GE Healthcare社)にロードした。結合蛋白質はNaClの直線濃度勾配(20mM Tris−HCl pH7.5、0−1M NaCl)で溶出された。次にEPHA2(ECR)を含む画分を集め、PBSで平衡化されたHiLoad 26/60 Superdex 200pg(GE Healthcare社)にロードした。蛋白質はPBSで溶出した。EPHA2(ECR)を含む画分を集め、免疫用抗原に使用した。蛋白質濃度はBCA Protein Assay Reagent(PIERCE社、Thermo Fisher Scientific社)を用いて測定した。
EPHA2(ECR)を発現させるため、FreeStyle 293−F細胞(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)にpcDNA3.1−EPHA2(ECR)を293fectin(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてトランスフェクションし、37℃、8% CO2で5日間培養した。培養上清を遠心分離により回収し、分子量分画15000の透析チューブを用いて20mM Tris−HCl pH7.5の中で透析した。フィルター(0.45μm,PES)を通した後、培養上清を20mM Tris−HCl pH7.5で平衡化されたHiPrep 16/10 Q XL(GE Healthcare社)にロードした。結合蛋白質はNaClの直線濃度勾配(20mM Tris−HCl pH7.5、0−1M NaCl)で溶出された。次にEPHA2(ECR)を含む画分を集め、PBSで平衡化されたHiLoad 26/60 Superdex 200pg(GE Healthcare社)にロードした。蛋白質はPBSで溶出した。EPHA2(ECR)を含む画分を集め、免疫用抗原に使用した。蛋白質濃度はBCA Protein Assay Reagent(PIERCE社、Thermo Fisher Scientific社)を用いて測定した。
1)−4 免疫
BALB/cAnNCrlCrljマウス(日本チャールス・リバー社)に初回免疫としてAdjuvant Complete Freund H37 Rv(和光純薬社)又はTiterMax Gold Adjuvant(SIGMA社)と混合した50μgのEPHA2(ECR)をマウス背部皮下に投与した。2回目、3回目の免疫としてAdjuvant Incomplete Freund(和光純薬社)と混合した50μgのEPHA2(ECR)をマウスの背部皮下に投与した。これらマウスを50μgのEPHA2(ECR)でブーストし、3日後に脾臓を採取した。この脾臓をハイブリドーマ作製に用いた。
BALB/cAnNCrlCrljマウス(日本チャールス・リバー社)に初回免疫としてAdjuvant Complete Freund H37 Rv(和光純薬社)又はTiterMax Gold Adjuvant(SIGMA社)と混合した50μgのEPHA2(ECR)をマウス背部皮下に投与した。2回目、3回目の免疫としてAdjuvant Incomplete Freund(和光純薬社)と混合した50μgのEPHA2(ECR)をマウスの背部皮下に投与した。これらマウスを50μgのEPHA2(ECR)でブーストし、3日後に脾臓を採取した。この脾臓をハイブリドーマ作製に用いた。
1)−5 ハイブリドーマ作製
脾臓細胞とマウスミエローマP3X63Ag8U.1細胞とをPEG4000(IBL社)を用いて細胞融合しハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの培養上清用いて抗EPHA2抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
脾臓細胞とマウスミエローマP3X63Ag8U.1細胞とをPEG4000(IBL社)を用いて細胞融合しハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの培養上清用いて抗EPHA2抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
1)−6 抗体スクリーニング
1)−6−1 抗原発現細胞の調製
293T細胞を5×104細胞/cm2でcollagen type Iコートフラスコ(IWAKI社)に播種し、10% FBS含有DMEM中で37℃、5% CO2の加湿雰囲気下で1晩培養した。翌日、Lipofectamine 2000(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてpcDNA−DEST40−EPHA2とpcDNA−DEST40−ERBB2(ネガティブコントロール)のそれぞれで293T細胞をトランスフェクションし、37℃、5% CO2の加湿雰囲気下でさらに1晩培養した。翌日、トランスフェクションされた細胞をトリプシン処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSに懸濁した。この細胞をCell−ELISA、フローサイトメトリー解析に使用した。
1)−6−1 抗原発現細胞の調製
293T細胞を5×104細胞/cm2でcollagen type Iコートフラスコ(IWAKI社)に播種し、10% FBS含有DMEM中で37℃、5% CO2の加湿雰囲気下で1晩培養した。翌日、Lipofectamine 2000(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてpcDNA−DEST40−EPHA2とpcDNA−DEST40−ERBB2(ネガティブコントロール)のそれぞれで293T細胞をトランスフェクションし、37℃、5% CO2の加湿雰囲気下でさらに1晩培養した。翌日、トランスフェクションされた細胞をトリプシン処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSに懸濁した。この細胞をCell−ELISA、フローサイトメトリー解析に使用した。
1)−6−2 Cell−ELISA
1)−6−1で調製した細胞をハイブリドーマ培養上清と混合し、4℃で1時間インキュベーションした。細胞を5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したGoat anti−Mouse IgG,Peroxidase Conjugated(Millipore(Chemicon)社 #AP181P)で4℃、1時間染色した。細胞を5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、OPD発色液(OPD溶解液(0.05 M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5)にo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬社)、H2O2をそれぞれ0.4mg/ml、0.6%(v/v)になるように溶解)を100μl/ウェルで添加した。攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを100μl/ウェルで添加して発色反応を停止させた。遠心後、上清を新しい96穴平底マイクロプレートに移し、プレートリーダー(ARVO:PerkinElmer社)で490nmの吸光度を測定した。EPHA2に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、ERBB2発現293T細胞(ネガティブコントロール)よりもEPHA2発現293T細胞に対して高い吸光度を示したハイブリドーマを選択した。
1)−6−1で調製した細胞をハイブリドーマ培養上清と混合し、4℃で1時間インキュベーションした。細胞を5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したGoat anti−Mouse IgG,Peroxidase Conjugated(Millipore(Chemicon)社 #AP181P)で4℃、1時間染色した。細胞を5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、OPD発色液(OPD溶解液(0.05 M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5)にo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬社)、H2O2をそれぞれ0.4mg/ml、0.6%(v/v)になるように溶解)を100μl/ウェルで添加した。攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを100μl/ウェルで添加して発色反応を停止させた。遠心後、上清を新しい96穴平底マイクロプレートに移し、プレートリーダー(ARVO:PerkinElmer社)で490nmの吸光度を測定した。EPHA2に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、ERBB2発現293T細胞(ネガティブコントロール)よりもEPHA2発現293T細胞に対して高い吸光度を示したハイブリドーマを選択した。
1)−6−3 フローサイトメトリー解析
Cell−ELISAでの擬陽性を除くため、Cell−ELISAで陽性と判定されたハイブリドーマの産生する抗体がEPHA2に特異的に結合するかをフローサイトメトリー法により確認した。1)−6−1で調製した細胞とハイブリドーマ培養上清を混合し、4℃で1時間インキュベーションした。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで1000倍に希釈したFluorescein−conjugated goat IgG fraction to mouse IgG(Whole Molecule)(ICN Pharmaceuticals社 #55493)で4℃、1時間染色した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、2μg/ml 7−aminoactinomycin D(Invitrogen(Molecular Probes)社、Thermo Fisher Scientific社)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社)で解析した。データ解析はFlowjo(Tree Star社)で行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。ヒストグラムにおいてコントロールであるERBB2発現293T細胞よりもEPHA2発現293T細胞に高い結合性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
Cell−ELISAでの擬陽性を除くため、Cell−ELISAで陽性と判定されたハイブリドーマの産生する抗体がEPHA2に特異的に結合するかをフローサイトメトリー法により確認した。1)−6−1で調製した細胞とハイブリドーマ培養上清を混合し、4℃で1時間インキュベーションした。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで1000倍に希釈したFluorescein−conjugated goat IgG fraction to mouse IgG(Whole Molecule)(ICN Pharmaceuticals社 #55493)で4℃、1時間染色した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、2μg/ml 7−aminoactinomycin D(Invitrogen(Molecular Probes)社、Thermo Fisher Scientific社)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社)で解析した。データ解析はFlowjo(Tree Star社)で行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。ヒストグラムにおいてコントロールであるERBB2発現293T細胞よりもEPHA2発現293T細胞に高い結合性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
1)−7 ハイブリドーマのモノクローン化
抗EPHA2抗体を産生するハイブリドーマはClonaCell−HY Selection Medium D(StemCell Technologies社 #03804)を用いて培養され、出現したコロニーを回収することでモノクローン化された。モノクローン化された細胞の培養上清を用いて、1)−6−3と同じ方法でEPHA2に対する結合性を確認した。その結果、抗EPHA2モノクローナル抗体(57−1、80−21、83−21、113−1、119−1、131−1、141−21、148−1、151−4、230−1、240−4、及び245−21)を産生するハイブリドーマを樹立した。
抗EPHA2抗体を産生するハイブリドーマはClonaCell−HY Selection Medium D(StemCell Technologies社 #03804)を用いて培養され、出現したコロニーを回収することでモノクローン化された。モノクローン化された細胞の培養上清を用いて、1)−6−3と同じ方法でEPHA2に対する結合性を確認した。その結果、抗EPHA2モノクローナル抗体(57−1、80−21、83−21、113−1、119−1、131−1、141−21、148−1、151−4、230−1、240−4、及び245−21)を産生するハイブリドーマを樹立した。
1)−8 モノクローナル抗体のアイソタイプ決定
モノクローナル抗体のアイソタイプは、Mouse monoclonal isotyping kit(Serotec社)により決定された。その結果、IgG1(57−1、113−1、119−1、131−1、141−21、230−1)、IgG2a(80−21、83−21、148−1、151−4、240−4)、IgG2b(245−21)であった。
[実施例2]
EPHA2の測定法の開発
2)−1 ELISA用モノクローナル抗体の選別
2)−1−1 抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
EPHA2を測定するサンドウィッチELISAに使用できる抗EPHA2モノクローナル抗体を選別するために、抗EPHA2モノクローナル抗体SHM41(東洋大学、非特許文献19、20)、57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、230-1、240-4、245-21をコーティング直前に5μg/mlの濃度にPBSで希釈調製し、EIA/RIAプレート高結合型平底96ウェルプレート(Costar社:No.9018)に各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはアッセイ溶液(ASSAY DILUENT: BIOLEGEND社)を脱イオン水で5倍に希釈して用い、4℃で1晩静置した。
2)−1−2 標準タンパク質
ヒトEPHA2標準タンパク質はR&D社から購入したhuman recombinant EphA2-(x6 His)を用いた。希釈濃度は2000pg/ml, 500pg/ml, 125pg/ml, 31.3pg/ml, 0pg/mlの5段階で設定した。2)−1−1のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
2)−1−3 ビオチン標識検出用抗体
反応の終了した2)−1−2のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液(0.05% Tween20 含有PBS溶液)を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサー(アズワン社)で15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、1000倍にアッセイ溶液で希釈したビオチン標識抗EPHA2ポリクローナル抗体(R&D社:BAF3035)を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
2)−1−4 アビジン酵素溶液
反応の終了した2)−1−3のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に4000倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRP(BD Bioscience社)を100μl/ウェルで添加し室温で45分間反応させた。
2)−1−5 基質溶液
反応の終了した2)−1−4のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で5回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)溶液(KPL社)を100μl/ウェルで添加し、室温で15分間反応させ青色に発色させた。
2)−1−6 反応停止
2N(2規定)の硫酸溶液(和光純薬)を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度(Reference波長 570nm)をマイクロプレートリーダーiMark(BIO-RAD社)で計測した。
2)−1−7 結果
SHM41、230−1、57−1、141−21、151−4で反応が認められ、その中でも230−1は最も反応性が高かった(図1)。
2)−2 抗EPHA2モノクローナル抗体230−1を使用したサンドウィッチELISA
2)−2−1 抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
抗EPHA2モノクローナル抗体230−1と組み合わせる抗EPHA2モノクローナル抗体を選ぶため、230−1をビオチン標識し、検出用抗体として使用した。補足用抗体として、57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、240-4、245-21 及びIsotype IgG1をコーティング直前に5μg/mlの濃度にPBSで希釈調整し、EIA/RIAプレート高結合型平底96ウェルプレートに各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはアッセイ溶液を脱イオン水で5倍に希釈して用い、4℃で1晩静置した。
2)−2−2 標準タンパク質
ヒトEPHA2標準タンパク質を、希釈濃度2000pg/ml, 500pg/ml, 125pg/ml, 0pg/mlの4段階で希釈した。2)−2−1のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
2)−2−3 ビオチン化標識
モノクローナル抗体230−1をビオチン標識キット(同仁化学研究所)を用いて実験手順に従ってビオチン化標識をした。
2)−2−4 ビオチン標識検出用抗体
反応の終了した2)−2−2のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサーで15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、1000倍にアッセイ溶液で希釈したビオチン標識抗EPHA2モノクローナル抗体230−1を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
2)−2−5 アビジン酵素溶液
反応の終了した2)−2−4のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に2000倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRP(BIOLEGEND社)を100μl/ウェルで添加し室温で45分間反応させた。
2)−2−6 基質溶液
反応の終了した2)−2−5のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で5回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で15分間反応させ青色に発色させた。
2)−2−7 反応停止
2Nの硫酸溶液を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度(Reference波長 570nm)をマイクロプレートリーダーで計測した。
2)−2−8 結果
ビオチン標識230−1を用いた場合、検討した11種類の抗EPHA2モノクローナル抗体の中で、57−1と組合せが最も反応性が高かった(図2)。
2)−3 抗EPHA2抗体230−1、57−1及びSHM41を使用したサンドウィッチELISA
2)−3−1 抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
EPHA2検出サンドウィッチELISAのコーティング抗体として、57−1、230−1、又はSHM41抗体を5μg/mlの濃度にPBSで希釈調整し、EIA/RIAプレート高結合型平底96ウェルプレートに各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはアッセイ溶液を脱イオン水で5倍に希釈して用い、4℃で1晩静置した。
2)−3−2 標準タンパク質
ヒトEPHA2標準タンパク質を、希釈濃度2000pg/mlから段階的に2倍ずつ8段階希釈し(最小濃度7.8pg/ml)、2)−3−1のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
2)−3−3 ビオチン標識検出用抗体
反応の終了した2)−3−2のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサーで15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、1000倍にアッセイ溶液で希釈したビオチン標識抗EPHA2モノクローナル抗体(57−1又は230−1)を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
2)−3−4 アビジン酵素溶液
反応の終了した2)−3−3のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に2000倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRPを100μl/ウェルで添加し室温で45分間反応させた。
2)−3−5 基質溶液
反応の終了した2)−3−4のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で5回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で15分間反応させ青色に発色させた。
2)−3−6 反応停止
2Nの硫酸溶液を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度(Reference波長 570nm)をマイクロプレートリーダーで計測した。
2)−3−7 結果
補足用抗体としてSHM41、検出用抗体としてビオチン標識57−1を使用した系では、EPHA2はほとんど検出されなかった。また、補足用抗体としてSHM41、検出用抗体としてビオチン標識230−1を用いた系では、EPHA2は検出されるもののバックグランドが高かった。一方で、補足用抗体として57−1又は230−1、検出用抗体としてビオチン標識57−1又はビオチン標識230−1を用いた系では、EPHA2を検出することが可能であり、バックブランドも低かった。以上の結果より、57−1と230−1の組み合わせが、EPHA2の検出に有望であることが示された(図3)。
2)−4 EPHA2サンドウィッチELISA系の構築
57−1と230−1を用いたELISA系を最適化するため、ブロッキング溶液、標準タンパク質希釈溶液及びビオチン標識抗体の希釈溶液を変更した。
2)−4−1 抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
EPHA2検出サンドウィッチELISAのコーティング抗体として、57−1又は230−1抗体を5μg/mlの濃度にPBSで希釈調整し、EIA/RIAプレート高結合型平底96ウェルプレートに各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはSuperBlock Blocking溶液(THERMO SCIENTIFIC社)を用い、4℃で1晩静置した。
2)−4−2 標準タンパク質
ヒトEPHA2標準タンパク質を、Can Get Signal溶液#1(東洋紡ライフサイエンス社)を用いて希釈濃度2000pg/mlから段階的に2倍ずつ8段階希釈し(最小濃度7.8pg/ml)、2)−4−1のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
2)−4−3 ビオチン標識検出用抗体
反応の終了した2)−4−2のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサーで15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、Can Get Signal溶液#2(東洋紡ライフサイエンス社)で1000倍に希釈したビオチン標識抗EPHA2モノクローナル抗体(57−1又は230−1)を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
2)−4−4 アビジン酵素溶液
反応の終了した2)−4−3のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に2000倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRPを100μl/ウェルで添加し室温で45分間反応させた。
2)−4−5 基質溶液
反応の終了した2)−4−4のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で5回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で15分間反応させ青色に発色させた。
2)−4−6 反応停止
2Nの硫酸溶液を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度(Reference波長 570nm)をマイクロプレートリーダーで計測した。
2)−4−7 結果
補足用抗体として57−1、検出用抗体としてビオチン標識230−1を用いた系と補足用抗体として230−1、検出用抗体としてビオチン標識57−1を用いた系の両方で、これらのELISA系はEPHA2を検出することが可能であり、またバックグラウンドは低値であった。さらに補足用抗体として230−1、検出用抗体としてビオチン標識57−1を用いた系では、高濃度領域でより高い吸光度値を示した(図4)。
2)−5 検量線
実施例2)−4の方法に準じて、230−1抗体をサンドウィッチELISAのコーティング用抗体(補足抗体)、ビオチン標識57−1抗体を検出用抗体として使用し、2000pg/mlから7.8pg/mlまでの段階的希釈されたヒトEPHA2標準タンパク質を測定した。検量線はPrism 4(version 4.03, GraphPad Software, Inc.)の3次多項式モデルを用いて作成した。その結果、R2値は0.9998であり、検量線は7.8pg/mlから2000pg/mlの範囲で良好な適合を示した(図5)。
2)−6 検出特異性
実施例2)−4の方法を用いて、EPHA2タンパク質の他に、EPHA1、EPHA3、EPHA4タンパク質(SINO BIOLOGICAL社)を同様に2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/mlに希釈をしてサンドウィッチELISAで測定した。その結果、この方法はEPHA2のみを検出し、EPHA1、EPHA3、EPHA4には交差反応性を示さなかった(図6)。この結果よりこのELISA系はEPHA2に対し高い特異性を有することが示された。
2)−7 ヒト血清中のEPHA2値の測定
2)−7−1 がん患者由来血清
胃がん患者由来凍結保存血清(10例)及び卵巣がん患者由来凍結保存血清(10例)及び健常人凍結保存血清(10例)はBIOSERVE社(代理店:リプロセル社)より入手した。いずれの血清も提供患者の同意が取られたIRBの証明書のある血清を用いた。
モノクローナル抗体のアイソタイプは、Mouse monoclonal isotyping kit(Serotec社)により決定された。その結果、IgG1(57−1、113−1、119−1、131−1、141−21、230−1)、IgG2a(80−21、83−21、148−1、151−4、240−4)、IgG2b(245−21)であった。
[実施例2]
EPHA2の測定法の開発
2)−1 ELISA用モノクローナル抗体の選別
2)−1−1 抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
EPHA2を測定するサンドウィッチELISAに使用できる抗EPHA2モノクローナル抗体を選別するために、抗EPHA2モノクローナル抗体SHM41(東洋大学、非特許文献19、20)、57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、230-1、240-4、245-21をコーティング直前に5μg/mlの濃度にPBSで希釈調製し、EIA/RIAプレート高結合型平底96ウェルプレート(Costar社:No.9018)に各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはアッセイ溶液(ASSAY DILUENT: BIOLEGEND社)を脱イオン水で5倍に希釈して用い、4℃で1晩静置した。
2)−1−2 標準タンパク質
ヒトEPHA2標準タンパク質はR&D社から購入したhuman recombinant EphA2-(x6 His)を用いた。希釈濃度は2000pg/ml, 500pg/ml, 125pg/ml, 31.3pg/ml, 0pg/mlの5段階で設定した。2)−1−1のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
2)−1−3 ビオチン標識検出用抗体
反応の終了した2)−1−2のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液(0.05% Tween20 含有PBS溶液)を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサー(アズワン社)で15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、1000倍にアッセイ溶液で希釈したビオチン標識抗EPHA2ポリクローナル抗体(R&D社:BAF3035)を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
2)−1−4 アビジン酵素溶液
反応の終了した2)−1−3のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に4000倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRP(BD Bioscience社)を100μl/ウェルで添加し室温で45分間反応させた。
2)−1−5 基質溶液
反応の終了した2)−1−4のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で5回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)溶液(KPL社)を100μl/ウェルで添加し、室温で15分間反応させ青色に発色させた。
2)−1−6 反応停止
2N(2規定)の硫酸溶液(和光純薬)を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度(Reference波長 570nm)をマイクロプレートリーダーiMark(BIO-RAD社)で計測した。
2)−1−7 結果
SHM41、230−1、57−1、141−21、151−4で反応が認められ、その中でも230−1は最も反応性が高かった(図1)。
2)−2 抗EPHA2モノクローナル抗体230−1を使用したサンドウィッチELISA
2)−2−1 抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
抗EPHA2モノクローナル抗体230−1と組み合わせる抗EPHA2モノクローナル抗体を選ぶため、230−1をビオチン標識し、検出用抗体として使用した。補足用抗体として、57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、240-4、245-21 及びIsotype IgG1をコーティング直前に5μg/mlの濃度にPBSで希釈調整し、EIA/RIAプレート高結合型平底96ウェルプレートに各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはアッセイ溶液を脱イオン水で5倍に希釈して用い、4℃で1晩静置した。
2)−2−2 標準タンパク質
ヒトEPHA2標準タンパク質を、希釈濃度2000pg/ml, 500pg/ml, 125pg/ml, 0pg/mlの4段階で希釈した。2)−2−1のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
2)−2−3 ビオチン化標識
モノクローナル抗体230−1をビオチン標識キット(同仁化学研究所)を用いて実験手順に従ってビオチン化標識をした。
2)−2−4 ビオチン標識検出用抗体
反応の終了した2)−2−2のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサーで15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、1000倍にアッセイ溶液で希釈したビオチン標識抗EPHA2モノクローナル抗体230−1を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
2)−2−5 アビジン酵素溶液
反応の終了した2)−2−4のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に2000倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRP(BIOLEGEND社)を100μl/ウェルで添加し室温で45分間反応させた。
2)−2−6 基質溶液
反応の終了した2)−2−5のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で5回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で15分間反応させ青色に発色させた。
2)−2−7 反応停止
2Nの硫酸溶液を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度(Reference波長 570nm)をマイクロプレートリーダーで計測した。
2)−2−8 結果
ビオチン標識230−1を用いた場合、検討した11種類の抗EPHA2モノクローナル抗体の中で、57−1と組合せが最も反応性が高かった(図2)。
2)−3 抗EPHA2抗体230−1、57−1及びSHM41を使用したサンドウィッチELISA
2)−3−1 抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
EPHA2検出サンドウィッチELISAのコーティング抗体として、57−1、230−1、又はSHM41抗体を5μg/mlの濃度にPBSで希釈調整し、EIA/RIAプレート高結合型平底96ウェルプレートに各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはアッセイ溶液を脱イオン水で5倍に希釈して用い、4℃で1晩静置した。
2)−3−2 標準タンパク質
ヒトEPHA2標準タンパク質を、希釈濃度2000pg/mlから段階的に2倍ずつ8段階希釈し(最小濃度7.8pg/ml)、2)−3−1のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
2)−3−3 ビオチン標識検出用抗体
反応の終了した2)−3−2のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサーで15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、1000倍にアッセイ溶液で希釈したビオチン標識抗EPHA2モノクローナル抗体(57−1又は230−1)を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
2)−3−4 アビジン酵素溶液
反応の終了した2)−3−3のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に2000倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRPを100μl/ウェルで添加し室温で45分間反応させた。
2)−3−5 基質溶液
反応の終了した2)−3−4のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で5回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で15分間反応させ青色に発色させた。
2)−3−6 反応停止
2Nの硫酸溶液を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度(Reference波長 570nm)をマイクロプレートリーダーで計測した。
2)−3−7 結果
補足用抗体としてSHM41、検出用抗体としてビオチン標識57−1を使用した系では、EPHA2はほとんど検出されなかった。また、補足用抗体としてSHM41、検出用抗体としてビオチン標識230−1を用いた系では、EPHA2は検出されるもののバックグランドが高かった。一方で、補足用抗体として57−1又は230−1、検出用抗体としてビオチン標識57−1又はビオチン標識230−1を用いた系では、EPHA2を検出することが可能であり、バックブランドも低かった。以上の結果より、57−1と230−1の組み合わせが、EPHA2の検出に有望であることが示された(図3)。
2)−4 EPHA2サンドウィッチELISA系の構築
57−1と230−1を用いたELISA系を最適化するため、ブロッキング溶液、標準タンパク質希釈溶液及びビオチン標識抗体の希釈溶液を変更した。
2)−4−1 抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
EPHA2検出サンドウィッチELISAのコーティング抗体として、57−1又は230−1抗体を5μg/mlの濃度にPBSで希釈調整し、EIA/RIAプレート高結合型平底96ウェルプレートに各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはSuperBlock Blocking溶液(THERMO SCIENTIFIC社)を用い、4℃で1晩静置した。
2)−4−2 標準タンパク質
ヒトEPHA2標準タンパク質を、Can Get Signal溶液#1(東洋紡ライフサイエンス社)を用いて希釈濃度2000pg/mlから段階的に2倍ずつ8段階希釈し(最小濃度7.8pg/ml)、2)−4−1のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
2)−4−3 ビオチン標識検出用抗体
反応の終了した2)−4−2のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサーで15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、Can Get Signal溶液#2(東洋紡ライフサイエンス社)で1000倍に希釈したビオチン標識抗EPHA2モノクローナル抗体(57−1又は230−1)を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
2)−4−4 アビジン酵素溶液
反応の終了した2)−4−3のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に2000倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRPを100μl/ウェルで添加し室温で45分間反応させた。
2)−4−5 基質溶液
反応の終了した2)−4−4のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で5回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で15分間反応させ青色に発色させた。
2)−4−6 反応停止
2Nの硫酸溶液を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度(Reference波長 570nm)をマイクロプレートリーダーで計測した。
2)−4−7 結果
補足用抗体として57−1、検出用抗体としてビオチン標識230−1を用いた系と補足用抗体として230−1、検出用抗体としてビオチン標識57−1を用いた系の両方で、これらのELISA系はEPHA2を検出することが可能であり、またバックグラウンドは低値であった。さらに補足用抗体として230−1、検出用抗体としてビオチン標識57−1を用いた系では、高濃度領域でより高い吸光度値を示した(図4)。
2)−5 検量線
実施例2)−4の方法に準じて、230−1抗体をサンドウィッチELISAのコーティング用抗体(補足抗体)、ビオチン標識57−1抗体を検出用抗体として使用し、2000pg/mlから7.8pg/mlまでの段階的希釈されたヒトEPHA2標準タンパク質を測定した。検量線はPrism 4(version 4.03, GraphPad Software, Inc.)の3次多項式モデルを用いて作成した。その結果、R2値は0.9998であり、検量線は7.8pg/mlから2000pg/mlの範囲で良好な適合を示した(図5)。
2)−6 検出特異性
実施例2)−4の方法を用いて、EPHA2タンパク質の他に、EPHA1、EPHA3、EPHA4タンパク質(SINO BIOLOGICAL社)を同様に2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/mlに希釈をしてサンドウィッチELISAで測定した。その結果、この方法はEPHA2のみを検出し、EPHA1、EPHA3、EPHA4には交差反応性を示さなかった(図6)。この結果よりこのELISA系はEPHA2に対し高い特異性を有することが示された。
2)−7 ヒト血清中のEPHA2値の測定
2)−7−1 がん患者由来血清
胃がん患者由来凍結保存血清(10例)及び卵巣がん患者由来凍結保存血清(10例)及び健常人凍結保存血清(10例)はBIOSERVE社(代理店:リプロセル社)より入手した。いずれの血清も提供患者の同意が取られたIRBの証明書のある血清を用いた。
非小細胞肺がん患者由来凍結保存血清(10例)及び健常人凍結保存血清(10例)はProteoGenex社(代理店:ビジコムジャパン社)より入手した。いずれの血清も提供患者の同意が取られたIRBの証明書のある血清を用いた。
2)−7−2 血清中のEPHA2値の測定
実施例2)−4の方法に準じて、各種血清(健常人、胃がん患者及び卵巣がん患者)を5倍にCan Get Signal溶液#1で希釈して、サンドウィッチELISAで測定した。
2)−7−3 統計解析
統計解析は、Steelの検定(SAS System Release 9.2、SAS Institute Inc.)を用いて実施した。
2)−7−4 結果
健常人、胃がん、及び卵巣がん患者の血清中のEPHA2濃度の中央値は372pg/ml、647pg/ml、600pg/mlであった。胃がん患者では健常人に比べ血液中のEPHA2が有意に高かった(P=0.0142)(図7−1)。
2)−7−2 血清中のEPHA2値の測定
実施例2)−4の方法に準じて、各種血清(健常人、胃がん患者及び卵巣がん患者)を5倍にCan Get Signal溶液#1で希釈して、サンドウィッチELISAで測定した。
2)−7−3 統計解析
統計解析は、Steelの検定(SAS System Release 9.2、SAS Institute Inc.)を用いて実施した。
2)−7−4 結果
健常人、胃がん、及び卵巣がん患者の血清中のEPHA2濃度の中央値は372pg/ml、647pg/ml、600pg/mlであった。胃がん患者では健常人に比べ血液中のEPHA2が有意に高かった(P=0.0142)(図7−1)。
健常人及び非小細胞肺がん患者の血清中のEPHA2濃度の中央値は232pg/ml、645pg/mlであった。また平均値は231pg/ml、1,031pg/mlであった。非小細胞肺がん患者では健常人に比べ血液中のEPHA2が有意に高かった(P=0.0024)(図7−2)。
[実施例3]
マウス抗EPHA2モノクローナル抗体の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列の決定
3)−1 マウス抗EPHA2抗体57−1の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列の決定
3)−1−1 57−1産生ハイブリドーマからのtotal RNAの調製
57−1産生ハイブリドーマよりTRIzol Reagent(Ambion社)を用いてtotal RNAを調製した。
3)−1−2 cDNA(5’−RACE−Ready cDNA)の合成
実施例3)−1−1で調製したtotal RNAの1μgとSMARTer RACE 5’/3’ Kit(Clontech社)を用いてcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を合成した。
3)−1−3 5’−RACE PCRによる57−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAの増幅とヌクレオチド配列の決定
57−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、
UPM(Universal Primer A Mix:SMARTer RACE 5’/3’ Kitに付属)、及び
5’−CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG−3’(mG1VR1:配列番号12)を用いた。mG1VR1はデータベースのマウス重鎖(IgG1)の定常領域の配列から設計した。
[実施例3]
マウス抗EPHA2モノクローナル抗体の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列の決定
3)−1 マウス抗EPHA2抗体57−1の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列の決定
3)−1−1 57−1産生ハイブリドーマからのtotal RNAの調製
57−1産生ハイブリドーマよりTRIzol Reagent(Ambion社)を用いてtotal RNAを調製した。
3)−1−2 cDNA(5’−RACE−Ready cDNA)の合成
実施例3)−1−1で調製したtotal RNAの1μgとSMARTer RACE 5’/3’ Kit(Clontech社)を用いてcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を合成した。
3)−1−3 5’−RACE PCRによる57−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAの増幅とヌクレオチド配列の決定
57−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、
UPM(Universal Primer A Mix:SMARTer RACE 5’/3’ Kitに付属)、及び
5’−CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG−3’(mG1VR1:配列番号12)を用いた。mG1VR1はデータベースのマウス重鎖(IgG1)の定常領域の配列から設計した。
これらプライマーと、鋳型として実施例3)−1−2で合成したcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を用い、5’−RACE PCRにより57−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAを増幅した。このPCRは、PolymeraseとしてKOD−Plus−(TOYOBO社)を用い、SMARTer RACE 5’/3’ Kitのマニュアルに記載のタッチダウンPCRプログラムで実施した。
増幅したcDNA断片をMinElute PCR Purification Kit(QIAGEN社)を用いて精製後、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてクローニングした。
クローニングされたcDNA断片のヌクレオチド配列を決定するため、シークエンシングプライマー:
5’−CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG−3’(mG1VR1:配列番号12)、及び
5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT−3’(NUP:配列番号13)が用いられた。
5’−CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG−3’(mG1VR1:配列番号12)、及び
5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT−3’(NUP:配列番号13)が用いられた。
シークエンス反応は、GeneAmp 9700(Applied Biosystems社、Thermo Fisher Scientific社)で行い、DNAの配列決定はABI PRISM 3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems社、Thermo Fisher Scientific社)あるいはApplied Biosystems 3730xl Analyzer(Applied Biosystems社、Thermo Fisher Scientific社)で行った。
決定された57−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号14(図8)に示し、アミノ酸配列を配列番号15(図9)に示した。
3)−1−4 5’−RACE PCRによる57−1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAの増幅とヌクレオチド配列の決定
57−1の可変領域をコードするcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、
UPM(Universal Primer A Mix:SMARTer RACE 5’/3’ Kitに付属)、及び
5’−AGTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCG−3’(mKVR2:配列番号16)を用いた。mKVR2はデータベースのマウス軽鎖の定常領域の配列から設計した。
3)−1−4 5’−RACE PCRによる57−1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAの増幅とヌクレオチド配列の決定
57−1の可変領域をコードするcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、
UPM(Universal Primer A Mix:SMARTer RACE 5’/3’ Kitに付属)、及び
5’−AGTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCG−3’(mKVR2:配列番号16)を用いた。mKVR2はデータベースのマウス軽鎖の定常領域の配列から設計した。
これらのプライマーと、鋳型として実施例3)−1−2で合成したcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を用い、5’−RACE PCRにより57−1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAを増幅した。このPCRは、PolymeraseとしてKOD−Plus−(TOYOBO社)を用い、SMARTer RACE 5’/3’ Kitのマニュアルに記載のタッチダウンPCRプログラムで実施した。
増幅したcDNA断片をMinElute PCR Purification Kit(QIAGEN社)を用いて精製後、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社)を用いてクローニングした。
クローニングされたcDNA断片のヌクレオチド配列を決定するため、シークエンシングプライマー:
5’−AGTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCG−3’(mKVR2:配列番号16)、及び
5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT−3’(NUP:配列番号13)が用いられた。
5’−AGTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCG−3’(mKVR2:配列番号16)、及び
5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT−3’(NUP:配列番号13)が用いられた。
シークエンス反応は、GeneAmp 9700(Applied Biosystems社:現Thermo Fisher Scientific社)で行い、DNAの配列決定はABI PRISM 3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems社、Thermo Fisher Scientific社)あるいはApplied Biosystems 3730xl Analyzer(Applied Biosystems社、Thermo Fisher Scientific社)で行った。
決定された57−1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号17(図10)に示し、アミノ酸配列を配列番号18(図11)に示した。
3)−2 マウス抗EPHA2抗体230−1の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列の決定
3)−2−1 230−1産生ハイブリドーマからのtotal RNAの調製
230−1産生ハイブリドーマより実施例3)−1−1と同様の方法でtotal RNAを調製した。
3)−2−2 cDNA(5’−RACE−Ready cDNA)の合成
cDNA(5’−RACE−Ready cDNA)は、実施例3)−2−1で調製したtotal RNAの1μgを用い、実施例3)−1−2と同様の方法で合成した。
3)−2−3 5’−RACE PCRによる230−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAの増幅とヌクレオチド配列の決定
実施例3)−2−2で合成したcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を鋳型として用いて、実施例3)−1−3と同様の方法で230−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAを増幅してヌクレオチド配列を決定した。
3)−2 マウス抗EPHA2抗体230−1の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列の決定
3)−2−1 230−1産生ハイブリドーマからのtotal RNAの調製
230−1産生ハイブリドーマより実施例3)−1−1と同様の方法でtotal RNAを調製した。
3)−2−2 cDNA(5’−RACE−Ready cDNA)の合成
cDNA(5’−RACE−Ready cDNA)は、実施例3)−2−1で調製したtotal RNAの1μgを用い、実施例3)−1−2と同様の方法で合成した。
3)−2−3 5’−RACE PCRによる230−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAの増幅とヌクレオチド配列の決定
実施例3)−2−2で合成したcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を鋳型として用いて、実施例3)−1−3と同様の方法で230−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAを増幅してヌクレオチド配列を決定した。
決定された230−1の重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号19(図12)に示し、アミノ酸配列を配列番号20(図13)に示した。
3)−2−4 5’−RACE PCRによる230−1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAの増幅とヌクレオチド配列の決定
実施例3)−2−2で合成したcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を鋳型として用いて、実施例3)−1−4と同様の方法で抗体230−1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAを増幅してヌクレオチド配列を決定した。
決定された230−1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号21(図14)に示し、アミノ酸配列を配列番号22(図15)に示した。
3)−2−4 5’−RACE PCRによる230−1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAの増幅とヌクレオチド配列の決定
実施例3)−2−2で合成したcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を鋳型として用いて、実施例3)−1−4と同様の方法で抗体230−1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAを増幅してヌクレオチド配列を決定した。
決定された230−1の軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号21(図14)に示し、アミノ酸配列を配列番号22(図15)に示した。
本発明の抗体は生体試料中のEPHA2をサンドイッチ免疫学的測定法で測定するのに適しており、がんの検出等に利用することができる。
配列番号1〜4、7〜10、12、13及び16 プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (18)
- (a)配列番号29で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH1、
(b)配列番号30で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH2、
(c)配列番号31で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH3、
(d)配列番号32で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL1、
(e)配列番号33で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL2、及び
(f)配列番号34で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL3
を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。 - 配列番号20で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号22で表される軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
- 配列番号20で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号22で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
- (a)配列番号23で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH1、
(b)配列番号24で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH2、
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDRH3、
(d)配列番号26で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL1、
(e)配列番号27で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL2、及び
(f)配列番号28で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDRL3
を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。 - 配列番号15で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18で表される軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
- 配列番号15で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号18で表されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトEPHA2への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、EPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項4から6のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体の組み合わせ。
- 生体試料中のEPHA2の検出又は測定方法に使用される、請求項7記載の組み合わせ。
- 生体試料中に含まれるEPHA2を免疫学的測定法により特異的に検出する方法であって、請求項1から6のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片を用いる方法。
- 生体試料中に含まれるEPHA2をサンドイッチ免疫学的測定法により特異的に検出する方法であって、請求項1から3のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項4から6のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体を用いる、方法。
- サンドイッチ免疫学的測定法がELISAである請求項10記載の方法。
- がんを検出する方法であって、請求項1から6のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片を用いて、被験体の血液中EPHA2濃度を免疫学的測定法で測定し、健常人の血液中のEPHA2濃度よりも高い場合に、被験体ががんに罹患していると評価する方法。
- がんを検出する方法であって、請求項1から3のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項4から6のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体を用いて、被験体の血液中EPHA2濃度をサンドイッチ免疫学的測定法で測定し、健常人の血液中のEPHA2濃度よりも高い場合に、被験体ががんに罹患していると評価する方法。
- サンドイッチ免疫学的測定法がELISAである、請求項13記載の方法。
- がんが胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫及び頭頚部がんからなる群から選択される、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項4から6のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体又は機能的断片を含む、EPHA2を測定するためのキット。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項4から6のいずれか1項に記載のEPHA2に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はEPHA2に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の2種類のモノクローナル抗体又は機能的断片を含む、がんを検出するためのキット。
- がんが胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫及び頭頚部がんからなる群から選択される、請求項16記載のキット。
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