JP2022520383A - 癌細胞上に存在するケラチン１４（ｋｒｔ１４）の細胞外部分を標的とすることによる癌の治療または予防のための方法 - Google Patents

癌細胞上に存在するケラチン１４（ｋｒｔ１４）の細胞外部分を標的とすることによる癌の治療または予防のための方法 Download PDF

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Abstract

癌細胞上に存在するＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストの産生を誘導する薬剤の一定量を対象に投与することを含んでなる、哺乳動物対象における癌の治療または予防のための方法、使用および組成物が開示される。本開示はまた、対象において癌を監視および／または診断する方法にも及ぶ。

Description

本発明は一般に、癌の発生または転移の治療、予防または遅延を含む癌療法、およびそのために有用な薬剤に関する。
本明細書において著者により言及される刊行物の書誌詳細は、本明細書の末尾にアルファベット順にまとめてある。
本明細書におけるいずれの事前掲載（もしくはそれから派生する情報）、またはいずれの既知の事項についての言及も、その事前掲載（もしくはそれから派生する情報）または既知の事項が、本明細書が関連する努力傾注分野における共通の一般知識の一部をなすことを承認または自認または何らかの形で示唆するものではなく、そのように見なされるべきではない。
癌は依然として、高い罹患率および死亡率でヒトおよび動物を侵す最も重大な疾患の１つである。例えば、卵巣癌は、女性に診断される９番目に多い癌である。事実、卵巣癌は、全ての婦人科癌の中で最も致死的である。多大な資源が卵巣癌の早期診断および治療に費やされてきた。外科的および化学療法薬の介入の改善にも関わらず、卵巣癌の生存率はなおおよそ２５％に留まっている(Vaughan et al. (2011) Nat Rev Cancer 11(10):719-725)。
７５％を超える卵巣癌患者が最初の臨床像で後期転移疾患と診断される。治療はもっぱら侵襲的手術および化学療法に限定される。しかしながら、９０％を超える患者が、多くの場合治療後１年以内に再発する。これらの患者の大多数において、再発腫瘍は化学療法耐性を呈する。この現象は治療選択肢をさらに限定し、卵巣癌の極めて高い死亡率の根拠をなす。
潜在的治療標的を同定するための遺伝的スクリーニングの試みは、実質的な努力にも関わらず、往々にして上手くいかなかった。これは卵巣癌組織の性質が極めて不均質なためであると思われる。
ケラチン－１４（ＫＲＴ１４）は、一般に健常成人組織の筋上皮および上皮ニッチに存在する前駆細胞の始原的系統で発現される、細胞骨格の細胞内タンパク質成分である(Chu et al. (2001) Histopathology 39(1):9-16; Paraskevopoulou et al. (2016) Cell Cycle 15(23):3161-3162)。腫瘍組織において、ＫＲＴ１４は、健常組織に侵入するために腫瘍付着能を制御する特殊化した細胞（代わりに「リーダー細胞」、「癌幹細胞」または「腫瘍誘発細胞」とも呼ばれる）の集団のマークとなっている。ＫＲＴ１４発現細胞は、ある範囲の固形腫瘍種（乳癌、膀胱癌および肺癌を含む）における腫瘍浸潤の制御に機構的に関連付けられている。これらの腫瘍において、ＫＲＴ１４を発現する細胞の存在は、腫瘍浸潤能ならびに無病生存期間および全生存期間の短縮に直接的な相関がある(Chu et al. (2001)前掲; Cheah et al. (2015) Proc Natl Acad Sci USA 112(15):4725-4730; Volkmer et al. (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109(6):2078-2083; Ho et al. (2012) Nat Rev Urol 9(10):583-594; Cheung et al. (2016) Proc Natl Acad Sci USA 113(7):E854-863; Cheung et al. (2013) Cell 155(7):1639-1651; Papafotiou et al. (2016) Nat Commun 7:11914)。
患者の予後および生活の質を改善し得る治療的アプローチの差し迫った必要がある。
本発明において、ＫＲＴ１４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは中皮層を経た卵巣癌細胞浸潤に、ｉｎ ｖｉｖｏでは卵巣腫瘍の移植の成功に不可欠であることが確立されている。また、ＫＲＴ１４は結腸直腸癌、子宮内膜癌、脳癌、乳癌および肺癌細胞を含む他の癌細胞種の遊走および浸潤に役割を果たすことも本明細書において確立されている。ＫＲＴ１４は、卵巣および卵管などの正常な生殖管を含む健常組織では発現されない。重要なこととして、ＫＲＴ１４は男性および女性対象の両方においてある範囲の癌に存在する細胞外部分を持つことが決定付けられている。「細胞外」という用語は、細胞の外側に位置する、細胞の外側に露出している、またはそうでなければ細胞の外側から接近可能な、ＫＲＴ１４の一部、セグメントまたはドメインを意味すると理解される。
よって、本明細書において、ヒトおよび動物対象を含む哺乳動物対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在するＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、または癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法が教示される。対象に「投与すること」とは、癌細胞に接触させることを含む。「対象」は、男性または女性であり得る。
ある実施形態において、癌は、限定されるものではないが、卵巣癌またはある形態もしくは病期の卵巣癌を含む婦人科癌である。ある実施形態において、癌は、子宮内膜癌または結腸直腸癌である。ある実施形態において、癌は、脳癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、腸癌、結腸癌、消化管癌、胃癌、咽頭癌、子宮内膜癌および結腸直腸癌から選択される。
ある実施形態において、薬剤は、ペプチド配列（一文字コードで）：ＧＦＧＧＧＹＧＧＧＬＧＡＧＬＧＧＧＦＧＧＧＦＡＧＧＤＧＬ（配列番号１）、または最適アラインメントの後に配列番号１と少なくとも８０％の類似性を有するその機能的ホモログもしくは変異体を含んでなるタンパク質内に含まれるエピトープを標的とする抗体である。配列番号１のアンタゴニストまたは標的化薬剤として働く他の薬剤も本明細書において企図される。配列番号１は、ヒト配列を表す。本明細書においては、他種のホモログも治療標的および診断標的として企図される。「抗体」には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびＫＲＴ１４結合抗血清ならびにＫＲＴ１４の外的部分またはその一部と結合する組換え型、フラグメントおよび誘導体が含まれる。
ある実施形態において、本明細書では、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、ＶＨは、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ２および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ３を含んでなり；かつ、ＶＬは、配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ３を含んでなる薬剤が開示される。
ある実施形態において、ＶＨは、
（ａ）配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨフレームワーク領域１（ＦＲ１）；
（ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ２；
（ｃ）配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ３；および
（ｄ）配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ４
を含んでなり；かつ、ＶＬは、
（ｅ）配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ１；
（ｆ）配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ２；
（ｇ）配列番号１８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ３；および
（ｈ）配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ４
を含んでなる。
ある実施形態において、ＶＨは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＶＬは、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
ある実施形態において、哺乳動物対象は、女性または男性である。しかしながら、本発明は、非ヒト雄または雌哺乳動物での獣医学的適用にも及ぶ。
本明細書において教示されるように、ＫＲＴ１４の新規な機能は、卵巣癌の浸潤および付着の重要な初期レギュレーターであるとして特定されている。ＫＲＴ１４遺伝子の機能的コピーを欠く細胞は、浸潤不能であり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて卵巣腫瘍を確立することができない。配列番号１により特定されるエピトープを外的に加えた配列番号１を標的とする薬剤で標的化すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、機能的ＫＲＴ１４欠損の影響を模倣する癌細胞の浸潤能が完全に排除される。同様に、配列番号１を有する細胞に特異的な免疫応答などのｉｎ ｖｉｖｏ応答の誘導も癌発生の軽減に有効である。
ある実施形態において、本明細書は、ヒト対象における卵巣癌の治療のための方法であって、卵巣癌細胞上に存在する配列番号１により定義されるＫＲＴ１４の細胞外部分を標的とする抗体の、卵巣癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法を教示する。
多くの他の固形腫瘍種（例えば、乳癌、膀胱癌、肺癌およびその他）は、このＫＲＴ１４により媒介される浸潤機序を用いていることが提案され、抗ＫＲＴ１４に向けた療法がある範囲の固形腫瘍種で広く適用可能であることを示している。
配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的化し、それにより癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を排除する薬剤が本明細書において効果的である。ある実施形態において、薬剤は、配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体に特異的な抗体を含んでなる。上記に示されるように、この抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体もしくはＫＲＴ１４結合抗体を含んでなる抗血清であってもよいし、または以上のいずれかの合成（例えば、組換え）抗体またはＫＲＴ１４結合フラグメントもしくは誘導体であってもよい。抗体はまた、軟骨動物由来抗体またはそのＫＲＴ１４結合フラグメントもしくは誘導体であってもよい。この薬剤は、抗体であることに加え、限定されるものではないが、アプタマー、モノボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎおよびナノボディなどを含むいずれのアフィニティー試薬であってもよい。
本発明は、ＫＲＴ１４を標的とする薬剤またはｉｎ ｖｉｖｏ ＫＲＴ１４アンタゴニストを誘導する薬剤が別の抗癌薬および／または放射線療法および／または外科的介入とともに与えられる併用療法に及ぶ。付加的薬剤の例としては、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシンおよびミトキサントロンのうち１以上などの化学療法薬、または白金系薬剤もしくは代謝拮抗剤が挙げられる。代謝拮抗剤は、タンパク質、ＤＮＡ、ならびに細胞増殖および生殖に必要とされる他の化学物質を作り出すなどの身体の化学プロセスに干渉する物質であり、癌治療において、代謝拮抗剤はＤＮＡ産生を妨害し、その後、細胞分裂を妨げる。例としては、アザセリン、Ｄ－サイクロセリン、ニコフェノール酸(nycophenolic acid)、トリメトプリム、５－フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）およびフルダラビンが挙げられる。プライムＴ細胞およびサイトカインなどの他の免疫試薬を投与してもよい。併用療法は、同時にまたはいずれかの順序で互いに数秒以内、数分以内、数時間以内、数日以内もしくは数週間以内に逐次に提供されてよい。
本開示はまた、癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分に特異的に結合する薬剤、またはそのＫＲＴ１４結合フラグメントにも及び、その薬剤は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、ＶＨは、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ２および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ３を含んでなり、かつ、ＶＬは、配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ３を含んでなる。
ある実施形態において、ＶＨは、
（ａ）配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨフレームワーク領域１（ＦＲ１）；
（ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ２；
（ｃ）配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ３；および
（ｄ）配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ４
を含んでなり；かつ、ＶＬは、
（ｅ）配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ１；
（ｆ）配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ２；
（ｇ）配列番号１８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ３；および
（ｈ）配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ４
を含んでなる。
ある実施形態において、ＶＨは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＶＬは、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
アミノ酸配列は、配列識別番号（配列番号）により表される。配列番号は、配列識別番号＜４００＞１（配列番号１）、＜４００＞２（配列番号２）などに数的に相当する。配列表は特許請求の範囲の後に提供される。
本明細書中に使用される配列識別番号の概要を表１に示す。
Figure 2022520383000001
アミノ酸は名称で、または一文字コードもしくは三文字コ－ドで呼称される場合がある（表２）。
Figure 2022520383000002
一部の図面にはカラー表示またはカラーの実体が含まれる。カラー写真は求めに応じて特許権者から、または適当な特許庁から入手可能である。特許庁から入手した場合には費用が課されることがある。
図１Ａ～Ｃは、浸潤性卵巣癌付着前縁におけるＫＲＴ１４の同定を示す写真である。（Ａ）卵巣癌スフェロイドは、腹膜微小環境モデルを用いて培養し、中皮バリアを経た浸潤を監視した。ＬＰ９中皮細胞単層を活発に突き破っているスフェロイドを含む凍結切片は、（Ｂ）ＭＡＬＤＩイメージング質量分析により評価し、これにより浸潤界面においていくつかのタンパク質の中からＫＲＴ１４が同定された。（Ｃ）浸潤突起への局在を示す、ＫＲＴ１４に対する拡散卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ４）の免疫染色。拡大領域が示される（右上）。ＫＲＴ１４染色は、黒い背景に緑に見える。核染色はＤＡＰＩにより青。 図１Ａ～Ｃは、浸潤性卵巣癌付着前縁におけるＫＲＴ１４の同定を示す写真である。（Ａ）卵巣癌スフェロイドは、腹膜微小環境モデルを用いて培養し、中皮バリアを経た浸潤を監視した。ＬＰ９中皮細胞単層を活発に突き破っているスフェロイドを含む凍結切片は、（Ｂ）ＭＡＬＤＩイメージング質量分析により評価し、これにより浸潤界面においていくつかのタンパク質の中からＫＲＴ１４が同定された。（Ｃ）浸潤突起への局在を示す、ＫＲＴ１４に対する拡散卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ４）の免疫染色。拡大領域が示される（右上）。ＫＲＴ１４染色は、黒い背景に緑に見える。核染色はＤＡＰＩにより青。 図１Ａ～Ｃは、浸潤性卵巣癌付着前縁におけるＫＲＴ１４の同定を示す写真である。（Ａ）卵巣癌スフェロイドは、腹膜微小環境モデルを用いて培養し、中皮バリアを経た浸潤を監視した。ＬＰ９中皮細胞単層を活発に突き破っているスフェロイドを含む凍結切片は、（Ｂ）ＭＡＬＤＩイメージング質量分析により評価し、これにより浸潤界面においていくつかのタンパク質の中からＫＲＴ１４が同定された。（Ｃ）浸潤突起への局在を示す、ＫＲＴ１４に対する拡散卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ４）の免疫染色。拡大領域が示される（右上）。ＫＲＴ１４染色は、黒い背景に緑に見える。核染色はＤＡＰＩにより青。 図２ＡおよびＢは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて卵巣癌細胞の遊走および浸潤に必要とされるＫＲＴ１４発現を示すグラフおよび写真である。ＫＲＴ１４遺伝子発現は、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ４およびＣａＯＶ３においてＣＲＩＳＰＲ技術を用いて破壊された。代表的な実験を示す。（Ａ）増殖および浸潤はｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて測定した。ＫＲＴ１４の発現の欠損は増殖には影響がなかったが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて中皮単層からの浸潤を完全に排除した。（Ｂ）ＫＲＴ１４を欠いた細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ掻爬試験を用いて一晩、傷を修復することができない。 図２ＡおよびＢは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて卵巣癌細胞の遊走および浸潤に必要とされるＫＲＴ１４発現を示すグラフおよび写真である。ＫＲＴ１４遺伝子発現は、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ４およびＣａＯＶ３においてＣＲＩＳＰＲ技術を用いて破壊された。代表的な実験を示す。（Ａ）増殖および浸潤はｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて測定した。ＫＲＴ１４の発現の欠損は増殖には影響がなかったが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて中皮単層からの浸潤を完全に排除した。（Ｂ）ＫＲＴ１４を欠いた細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ掻爬試験を用いて一晩、傷を修復することができない。 図３Ａ～Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍移植の成功にＫＲＴ１４発現が必要とされることを示す写真およびグラフである。ＫＲＴ１４を発現する（「野生型」；ＷＴ）またはＫＲＴ１４発現を欠く（「ＫＲＴ１４ＫＯ」）マウスＩＤ８卵巣癌細胞を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの嚢内に移植した。腫瘍成長を、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光を用いてリアルタイムで監視した。（Ａ）ＩＤ８細胞は、各マウスの一卵巣に上手く移植され、移植部位で検出可能であってそこに局在していた。４週間後、Ｋ１４ＫＯ細胞を移植したマウスから蛍光が消失した。（Ｂ）野生型腫瘍細胞を担持するマウスでは約３～４週間で蛍光が増強し、ＫＲＴ１４-ＫＯ細胞を移植したマウスでは、同様の蛍光増強は検出されなかった。（Ｃ）マウスを約７週目に犠牲にし、剖検を行った。野生型ＩＤ８細胞を移植したマウスは大きな原発卵巣腫瘍を形成しており、反対側の卵巣、腹膜壁、肝臓、腸および横隔膜に転移があり、腹腔内に腹水の顕著な蓄積を示した。対照的に、ＫＲＴ１４ＫＯ細胞を移植したマウスには腹水の蓄積はなく、腫瘍は見られなかった。これらのマウスの剖検において腫瘍細胞は検出できなかった。 図３Ａ～Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍移植の成功にＫＲＴ１４発現が必要とされることを示す写真およびグラフである。ＫＲＴ１４を発現する（「野生型」；ＷＴ）またはＫＲＴ１４発現を欠く（「ＫＲＴ１４ＫＯ」）マウスＩＤ８卵巣癌細胞を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの嚢内に移植した。腫瘍成長を、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光を用いてリアルタイムで監視した。（Ａ）ＩＤ８細胞は、各マウスの一卵巣に上手く移植され、移植部位で検出可能であってそこに局在していた。４週間後、Ｋ１４ＫＯ細胞を移植したマウスから蛍光が消失した。（Ｂ）野生型腫瘍細胞を担持するマウスでは約３～４週間で蛍光が増強し、ＫＲＴ１４-ＫＯ細胞を移植したマウスでは、同様の蛍光増強は検出されなかった。（Ｃ）マウスを約７週目に犠牲にし、剖検を行った。野生型ＩＤ８細胞を移植したマウスは大きな原発卵巣腫瘍を形成しており、反対側の卵巣、腹膜壁、肝臓、腸および横隔膜に転移があり、腹腔内に腹水の顕著な蓄積を示した。対照的に、ＫＲＴ１４ＫＯ細胞を移植したマウスには腹水の蓄積はなく、腫瘍は見られなかった。これらのマウスの剖検において腫瘍細胞は検出できなかった。 図３Ａ～Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍移植の成功にＫＲＴ１４発現が必要とされることを示す写真およびグラフである。ＫＲＴ１４を発現する（「野生型」；ＷＴ）またはＫＲＴ１４発現を欠く（「ＫＲＴ１４ＫＯ」）マウスＩＤ８卵巣癌細胞を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの嚢内に移植した。腫瘍成長を、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光を用いてリアルタイムで監視した。（Ａ）ＩＤ８細胞は、各マウスの一卵巣に上手く移植され、移植部位で検出可能であってそこに局在していた。４週間後、Ｋ１４ＫＯ細胞を移植したマウスから蛍光が消失した。（Ｂ）野生型腫瘍細胞を担持するマウスでは約３～４週間で蛍光が増強し、ＫＲＴ１４-ＫＯ細胞を移植したマウスでは、同様の蛍光増強は検出されなかった。（Ｃ）マウスを約７週目に犠牲にし、剖検を行った。野生型ＩＤ８細胞を移植したマウスは大きな原発卵巣腫瘍を形成しており、反対側の卵巣、腹膜壁、肝臓、腸および横隔膜に転移があり、腹腔内に腹水の顕著な蓄積を示した。対照的に、ＫＲＴ１４ＫＯ細胞を移植したマウスには腹水の蓄積はなく、腫瘍は見られなかった。これらのマウスの剖検において腫瘍細胞は検出できなかった。 図４ＡおよびＢは、ＫＲＴ１４のＮ末端が細胞表面に露出しており、外的に加えた抗体に接近可能であることを示すグラフおよび写真である。（Ａ）ＫＲＴ１４のＮ末端領域に対するポリクローナル抗体を用いて、無傷の非透過処理卵巣癌細胞（示されたような属性）でフローサイトメトリーを行った。細胞の３０～５０％が細胞表面ＫＲＴ１４に関して陽性染色された。無傷の培養細胞の免疫染色により、抗ＫＲＴ１４抗体による細胞のサブセットの染色が確認された。（Ｂ）ＫＲＴ１４のＮ末端およびＣ末端に対する抗体の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて卵巣癌細胞による浸潤を阻害する能力を試験した。抗Ｃ末端抗体（Ｃ－ｔｅｒｍ）は浸潤に対する効果がなかったが、抗Ｎ末端抗体（Ｎ－ｔｅｒｍ）は浸潤を完全に遮断した。外的に加えた全長組換えＫＲＴ１４タンパク質（ｒＫ１４）は単独でもＣ－ｔｅｒｍ抗体と組み合わせても効果がなかった。しかしながら、ｒＫ１４は、Ｎ－ｔｅｒｍ抗体と上手く競合してｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて浸潤能を回復させた。 図４ＡおよびＢは、ＫＲＴ１４のＮ末端が細胞表面に露出しており、外的に加えた抗体に接近可能であることを示すグラフおよび写真である。（Ａ）ＫＲＴ１４のＮ末端領域に対するポリクローナル抗体を用いて、無傷の非透過処理卵巣癌細胞（示されたような属性）でフローサイトメトリーを行った。細胞の３０～５０％が細胞表面ＫＲＴ１４に関して陽性染色された。無傷の培養細胞の免疫染色により、抗ＫＲＴ１４抗体による細胞のサブセットの染色が確認された。（Ｂ）ＫＲＴ１４のＮ末端およびＣ末端に対する抗体の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて卵巣癌細胞による浸潤を阻害する能力を試験した。抗Ｃ末端抗体（Ｃ－ｔｅｒｍ）は浸潤に対する効果がなかったが、抗Ｎ末端抗体（Ｎ－ｔｅｒｍ）は浸潤を完全に遮断した。外的に加えた全長組換えＫＲＴ１４タンパク質（ｒＫ１４）は単独でもＣ－ｔｅｒｍ抗体と組み合わせても効果がなかった。しかしながら、ｒＫ１４は、Ｎ－ｔｅｒｍ抗体と上手く競合してｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて浸潤能を回復させた。 図５Ａ～Ｃは、ＫＲＴ１４のＮ末端単一の抗原性領域が露出しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて浸潤を遮断するために標的化され得ることを示すグラフおよび写真である。（Ａ）ＫＲＴ１４のＮ末端の抗原性および疎水性は、公開ＩＥＤＢポータル(http://tools.iedb.org/bcell/)を用いてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで推定した。潜在的抗原性の５領域を推定し、対応する６つのペプチドを合成した。（Ｂ）個々のペプチドを用いた競合アッセイを使用して、ポリクローナル抗体により認識されるＫＲＴ１４の関連領域をマッピングした。アミノ酸８３～１１０（ヒト配列）を包含する２つのペプチドが、Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅアッセイにおいて浸潤能を上手く回復した。（Ｃ）並行した創傷治癒試験では、この同じ２つのペプチド（＃４および＃５）が、抗Ｎ末端ＫＲＴ１４抗体と上手く競合して細胞遊走を回復させ、１６時間で完全な創傷閉鎖を果たした。 図５Ａ～Ｃは、ＫＲＴ１４のＮ末端単一の抗原性領域が露出しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて浸潤を遮断するために標的化され得ることを示すグラフおよび写真である。（Ａ）ＫＲＴ１４のＮ末端の抗原性および疎水性は、公開ＩＥＤＢポータル(http://tools.iedb.org/bcell/)を用いてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで推定した。潜在的抗原性の５領域を推定し、対応する６つのペプチドを合成した。（Ｂ）個々のペプチドを用いた競合アッセイを使用して、ポリクローナル抗体により認識されるＫＲＴ１４の関連領域をマッピングした。アミノ酸８３～１１０（ヒト配列）を包含する２つのペプチドが、Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅアッセイにおいて浸潤能を上手く回復した。（Ｃ）並行した創傷治癒試験では、この同じ２つのペプチド（＃４および＃５）が、抗Ｎ末端ＫＲＴ１４抗体と上手く競合して細胞遊走を回復させ、１６時間で完全な創傷閉鎖を果たした。 図５Ａ～Ｃは、ＫＲＴ１４のＮ末端単一の抗原性領域が露出しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて浸潤を遮断するために標的化され得ることを示すグラフおよび写真である。（Ａ）ＫＲＴ１４のＮ末端の抗原性および疎水性は、公開ＩＥＤＢポータル(http://tools.iedb.org/bcell/)を用いてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで推定した。潜在的抗原性の５領域を推定し、対応する６つのペプチドを合成した。（Ｂ）個々のペプチドを用いた競合アッセイを使用して、ポリクローナル抗体により認識されるＫＲＴ１４の関連領域をマッピングした。アミノ酸８３～１１０（ヒト配列）を包含する２つのペプチドが、Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅアッセイにおいて浸潤能を上手く回復した。（Ｃ）並行した創傷治癒試験では、この同じ２つのペプチド（＃４および＃５）が、抗Ｎ末端ＫＲＴ１４抗体と上手く競合して細胞遊走を回復させ、１６時間で完全な創傷閉鎖を果たした。 図６ＡおよびＢは、抗血清ＡＮ－１７ Ｏ２００２３がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて癌細胞浸潤を効果的に遮断することを示すグラフである。（Ａ）特定のＫＲＴ１４エピトープに対して作製された抗血清は、市販のポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７）に匹敵する有効性で、浸潤を効果的に阻害した。（Ｂ）抗ＫＲＴ１４による浸潤の阻害は、細胞生存率に影響を示さなかった。 図６ＡおよびＢは、抗血清ＡＮ－１７ Ｏ２００２３がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて癌細胞浸潤を効果的に遮断することを示すグラフである。（Ａ）特定のＫＲＴ１４エピトープに対して作製された抗血清は、市販のポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７）に匹敵する有効性で、浸潤を効果的に阻害した。（Ｂ）抗ＫＲＴ１４による浸潤の阻害は、細胞生存率に影響を示さなかった。 図７は、非卵巣癌細胞種の遊走がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗ＫＲＴ１４抗体により損なわれることを示す写真である。抗ＫＲＴ１４抗体は、子宮内膜癌または結腸直腸癌細胞により構成される細胞単層において創傷閉鎖を妨げる。対象とするＫＲＴ１４エピトープを模倣する短いペプチド（ペプチド４および５）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、抗体結合に関して効果的に競合して遊走を再確立することができた。 図８ＡおよびＢは、マウス卵巣癌細胞の遊走がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗ＫＲＴ１４抗体により損なわれることを示す写真およびグラフである。（Ａ）抗ＫＲＴ１４抗体は、マウスＩＤ８卵巣癌細胞から構成される細胞単層において創傷閉鎖を妨げた。対象とするＫＲＴ１４エピトープを模倣する短いペプチド（ペプチド４および５）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、抗体結合に関して効果的に競合して遊走を再確立することができた。（Ｂ）ＲＴＣＡ分析により、抗ヒトＫＲＴ１４抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてマウス卵巣癌細胞の浸潤を遮断したことが確認された。 図８ＡおよびＢは、マウス卵巣癌細胞の遊走がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗ＫＲＴ１４抗体により損なわれることを示す写真およびグラフである。（Ａ）抗ＫＲＴ１４抗体は、マウスＩＤ８卵巣癌細胞から構成される細胞単層において創傷閉鎖を妨げた。対象とするＫＲＴ１４エピトープを模倣する短いペプチド（ペプチド４および５）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、抗体結合に関して効果的に競合して遊走を再確立することができた。（Ｂ）ＲＴＣＡ分析により、抗ヒトＫＲＴ１４抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてマウス卵巣癌細胞の浸潤を遮断したことが確認された。 図９は、モノクローナル抗ＫＲＴ１４抗体ＡＮ－１７（ｍＡｂ ＡＮ－１７）がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて白金化学療法に対する感受性を増強することを示す。ＯＶＣＡＲ４卵巣癌細胞を、ｍＡｂ ＡＮ－１７、シスプラチンまたはこれら２つの組合せとともにインキュベートし、７２時間にわたって細胞増殖を監視した。ｍＡｂ ＡＮ－１７とシスプラチンの組合せで処理した細胞は、シスプラチン単独に比べて有意に低いＩＣ５０を示した。特に、ｍＡｂ ＡＮ－１７は、亜致死用量で使用したシスプラチンの毒性を有意に増強した（ｎ＝３／処理、平均細胞指数）。 図１０は、ｍＡｂ ＡＮ－１７はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて複数のタンパク質抗原と交差反応性を示さないことを示す。ｍＡｂ ＡＮ－１７により潜在的に認識され得る交差反応性タンパク質を同定するためにタンパク質アレイを使用した。明確な交差反応性はなく、ＫＲＴ１４に対するｍＡｂ ＡＮ－１７の高い特異性が示唆された。 図１１は、ｍＡｂ ＡＮ－１７を用いたＫＲＴ１４検出のためのウエスタンブロット法を示す。１：１０００～１：１０，０００の抗体希釈率で、ウエスタンブロット法により上手くＫＲＴ１４タンパク質が検出された。 図１２は、ｍＡｂ ＡＮ－１７がヒトおよびマウス卵巣癌細胞においてＫＲＴ１４＋細胞を同定可能であることを示す。ｍＡｂ ＡＮ－１７またはＫＲＴ１４に対する市販のポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７）を用い、ＯＶＣＡＲ３、ＣＡＯＶ４、ＩＤ８および患者由来３．１９３７－０７細胞株を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターにてＫＲＴ１４＋細胞集団に関して分析した。 図１３は、上皮卵巣腫瘍を担持するマウスにおけるｍＡｂ ＡＮ１７による循環腫瘍細胞検出を示す。１２週齢ＩＤ８ ｉＲＦＰ７２０＋上皮卵巣腫瘍を担持するマウスから心臓血液を採取し、抗ＣＤ４５およびｍＡｂ ＡＮ－１７を用いて染色した。循環ＩＤ８腫瘍細胞はＫＲＴ１４＋ＣＤ４５－細胞と同定され、ｉＲＦＰ７２０＋状態により確認された。血液中に添加したｉＲＦＰ７２０＋ＩＤ８細胞を陽性対照として使用した。 図１４は、免疫蛍光染色によるＫＲＴ１４＋細胞の検出を示す。癌細胞を無傷の（左）または透過処理後の（右）ｍＡｂ ＡＮ－１７とともにインキュベートして、それぞれ表面ＫＲＴ１４または細胞内ＫＲＴ１４を標識した。 図１５は、ｍＡｂ ＡＮ－１７を用いた腫瘍組織の免疫組織化学染色を示す。染色は腫瘍上皮に限定され、市販のポリクローナル抗ＫＲＴ１４抗体（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７）と同様であった。 図１６は、ｍＡｂ ＡＮ－１７の非特異的組織取り込みおよび７日にわたるクリアランスを示す。腫瘍のないマウスに０．５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のｍＡｂ ＡＮ－１７を注射し、組織分布を、蛍光を監視することにより経時的に評価した。非標的ＩｇＧ－κアイソタイプ対照抗体との比較を行った。ｍＡｂ ＡＮ－１７の非特異的保持は見られず、両抗体（ｍＡｂ ＡＮ－１７および対照ＩｇＧ－κ）は７日後にほぼ検出不能であった。検討した組織は、生殖器官（卵巣、卵管、子宮）；腸；肝臓；肝臓；腎臓；脾臓；肺；心臓；および脳（ｎ＝２個体／群、平均＋／－ＳＤ）を含んだ。各時点における測定を軸に対して相殺して重複するデータセットを明らかにした。 図１７は、ｍＡｂ ＡＮ－１７の非特異的組織取り込みおよび７日にわたるクリアランスを示す。腫瘍のないマウスにｍＡｂ ＡＮ－１７を０．５、１．０、２．５、５．０または１０．０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）で注射し、組織分布を、蛍光を監視することにより経時的に評価した。非標的ＩｇＧ－κアイソタイプ対照抗体との比較を行った。評価した組織においてｍＡｂ ＡＮ－１７の非特異的保持は見られず、ｍＡｂ ＡＮ－１７は７日後に大部分、検出不能となった。検討組織は、生殖器官（卵巣、卵管、子宮）；腸；肝臓；肝臓；腎臓；脾臓；肺；心臓；および脳（ｎ＝２個体／群、平均＋／－ＳＤ）を含んだ。 図１８は、ｍＡｂ ＡＮ－１７が腫瘍組織に対して高い特異性を有することを示す。原発卵巣腫瘍が確立したマウス（ｎ＝２／群／時点）に５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ用量のｍＡｂ ＡＮ－１７を腹腔内注射により投与した。対照動物にはアイソタイプが適合した対照抗体を同じ用量で施した。投与後１、３、５および７日目に、マウスを犠牲にし、抗体の局在を蛍光により評価した（上記の通り）。蛍光は、単位組織面積当たりの平均放射蛍光強度として経時的に表した。（Ａ）腫瘍特異的蛍光シグナル。（Ｂ）特異的シグナルの不在を示す非腫瘍生殖組織蛍光。（Ｃ）死後に単離された腫瘍と比較のための非腫瘍生殖組織におけるｍＡｂ ＡＮ－１７蛍光（赤）の画像（ｎ＝２／群／時点；平均＋／－ＳＤ）。 図１９は、ｍＡｂ ＡＮ－１７の投与がマウスにおいて確立された腫瘍塊の直接的退縮を引き起こすことを示す。原発卵巣腫瘍が確立されたマウス（ｎ＝１０／群）に、ｍＡｂ ＡＮ－１７を週２回（月曜および木曜）、５ｍｇ／ｋｇ用量で腹腔内注射により投与した。対照動物には、アイソタイプが適合した対照抗体、またはＰＢＳビヒクル単独を施した。３週間の連続処置の後、総ての動物を犠牲にし、検査し、死後に腫瘍重を測定した。ビヒクルまたはアイソタイプ対照抗体を受容したマウスの６０％が犠牲時に原発卵巣腫瘍を有していた。対照的に、ｍＡｂ ＡＮ－１７で処置したマウスでは腫瘍は確認されなかった（平均＋／－ＳＤ）。 図２０は、（Ａ）モノクローナル抗体ＡＮ－１７（クローンＡＮ－１７Ａ ＲＧ４．Ｅ５ｂ．Ａ７．Ｂ４）の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列およびアミノ酸配列、ならびに（Ｂ）非再配列生殖細胞系マウス抗体配列に対するｍＡｂ ＡＮ－１７のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列間の類似性％（ＩＭＧＴ／Ｖ－Ｑｕｅｓｔプログラムを使用）を示す。Ｎ／Ａ＝適用不可；ｎｔ＝ヌクレオチド。 図２１は、ｍＡｂ ＡＮ－１７のＶＨおよびＶＬの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。 図２２は、フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を強調するために太字および下線付きのテキストで注釈されたｍＡｂ ＡＮ－１７のＶＨ（Ａ）およびＶＬ（Ｂ）アミノ酸配列を示す。 図２３は、非卵巣癌細胞（ＢＴ１６非定型奇形腫様ラブドイド（脳）癌、ＮＣＩ－Ｈ１５７３肺腺癌、ＳＪ－ＧＢＭ２原発多形性膠芽腫、ＡＮ３ＣＡ子宮内膜癌、ＳＷ６２０結腸直腸癌およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８乳癌細胞株）の遊走がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｍＡｂ ＡＮ－１７により損なわれることを示す。
発明の具体的説明
本明細書中、文脈がそうではないことを必要としない限り、「を含んでなる(comprise)」、または「を含んでなる(comprises)」または「を含んでなる(comprising)」などの変形形態は、記載の要素もしくは整数もしくは方法工程または要素もしくは整数もしくは方法工程の群の包含を意味するが、他のいずれの要素もしくは整数もしくは方法工程または要素もしくは整数もしくは方法工程の群の排除は意味しないと理解される。
本明細書で使用する場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数の側面を含む。よって、例えば、「１つの癌細胞」という場合には、単一の癌細胞、ならびに２つ以上の癌細胞を含み；「１つのエピトープ」という場合には、単一のエピトープ、ならびに２つ以上のエピトープを含み；「その開示」という場合には、その開示により教示される単一および複数の側面を含むなどである。本明細書において教示され、可能となる側面は、「発明」という用語によって包含される。本明細書において企図されるいずれの変異体および誘導体も、本発明の「形態」により包含される。本発明の総ての側面は、特許請求の範囲の幅で可能となる。
本発明は、哺乳動物対象において癌を治療するまたは予防するまたはそうでなければその進行を改善するための治療プロトコールを対象とする。この対象は雄または雌であり得る。進行の改善には、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減して、それにより癌を治療、予防するまたはその発生を遅延させる、あるいはその転移能を低減することを含む。用語「癌」および「腫瘍」は、本明細書では互換的に使用される。
よって、本明細書では、哺乳動物対象における癌の治療または予防のための方法が可能となる。その方法は、哺乳動物対象に、
（ｉ）癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を直接標的とする薬剤；薬剤の例としては、ＫＲＴ１４の細胞外部分を直接標的とするフラグメントおよび誘導体を含む抗体、および適宜脱免疫化された抗体または他の標的化部分またはリガンド；あるいは
（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする内因性因子を誘導する薬剤；内因性因子の例としては、限定されるものではないが、抗体、Ｔ細胞およびマクロファージが挙げられる、
を投与することを含んでなる。
いずれの場合でも、薬剤または内因性因子は、ＫＲＴ１４の細胞外部分を有する癌細胞の細胞傷害性または細胞増殖抑制を誘導して、それにより、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減する。例えば、（ｉ）に関して、抗体は、補体媒介またはマクロファージもしくはサイトカイン媒介細胞溶解または老化の誘導と結びつけることができる。あるいは、抗体または他の標的化薬剤は、細胞傷害性分子にコンジュゲートしてもよいし、またはリンパ球をプライムするために使用してもよい。「抗体」という場合には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ＫＲＴ－１４結合抗体を含んでなる抗血清およびＫＲＴ１４の外的部分またはその一部と結合する合成または組換え形態、フラグメントおよび誘導体を含む。薬剤は、抗体であることに加え、限定されるものではないが、アプタマー、モノボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎおよびナノボディなどを含むいずれのアフィニティー試薬であってもよい。
ある実施形態において、ヒトＫＲＴ１４の細胞外部分は、アミノ酸配列（一文字コードで）：ＮＨ２－ＧＦＧＧＧＹＧＧＧＬＧＡＧＬＧＧＧＦＧＧＧＦＡＧＧＤＧＬ（配列番号１）により定義される。
本明細書には、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の機能的ホモログ、およびまたは変異体が包含される。一例として、配列番号１の機能的ホモログまたは変異体は、最適アラインメントの後に配列番号１と少なくとも８０％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を含む。「少なくとも８０％の類似性」とは、配列番号１と少なくとも８０、８１、８２、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００％の類似性または同一性を含む。このような配列は、ＫＲＴ１４ホモログまたは変異体の細胞外部分の配列である。
配列番号１と少なくとも約８０％の類似性を有するホモログの例を表３に示す。
Figure 2022520383000003
Figure 2022520383000004
Figure 2022520383000005
用語「類似性」は、本明細書で使用される場合、比較される配列間でのアミノ酸レベルにおける正確な同一性を含む。アミノ酸レベルで非同一性が存在する場合、「類似性」は、構造レベル、機能レベル、生化学レベルおよび／または立体配座レベルでやはり互いに関連のあるアミノ酸を含む。ある実施形態において、アミノ酸配列比較(amino acid and sequence comparisons)は、類似性ではなく同一性のレベルで行われる。
２以上のポリペプチド間の配列関係を表すために使用される用語としては、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似性パーセンテージ」、「配列同一性パーセンテージ」、「実質的に類似」および「実質的に同一」がある。「参照配列」は、５～２０のアミノ酸長である。「比較ウインドウ」は、参照配列と比較される一般に５～２０の連続する残基の概念的セグメントを指す。比較ウインドウは、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較される場合に、２配列の最適アラインメントのために約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウインドウをアラインするための配列の最適アラインメントは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウエアパッケージリリース７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）中のアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター実装によるか、または検査および選択される様々な方法のいずれかにより生成されるベストアラインメント（すなわち、比較ウインドウに最も高い相同性パーセンテージをもたらす）によって行うことができる。また、例えば、Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389により開示されているようなＢＬＡＳＴ系列のプログラムを参照することもできる。配列分析の詳細な考察は、Ausubel et al. (1994-1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Incのユニット１９．３に見出すことができる。
用語「配列類似性」および「配列同一性」は、本明細書において使用する場合、配列が比較ウインドウにわたってアミノ酸どうしが同一であるか、または機能的もしくは構造的に類似している程度を表す。よって、例えば、「配列同一性パーセンテージ」は、２つの最適にアラインされた配列を比較ウインドウにわたって比較し、両配列に同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を求め、そのマッチした位置の数をその比較ウインドウの位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、その商に１００を掛けて配列同一性パーセンテージを求めることによって計算される。
よって、用語「変異体」よび「誘導体」には、参照アミノ酸配列（すなわち、配列番号１またはその部分配列）と実質的な配列同一性または類似性を示すアミノ酸配列を指す。用語「変異体」および「誘導体」はまた、天然に存在する対立遺伝子変異体が含まれる。
「誘導体」にはまた、配列番号１またはその機能的ホモログと比べた場合の突然変異体、フラグメント、部分、一部またはハイブリッド分子も含まれる。誘導体は、他を排除するものではないが一般に、単一または複数のアミノ酸置換、付加および／または欠失を有する。
「ホモログ」には、別の動物種に由来するまたは同種内の異なる遺伝子座に由来する、少なくとも約８０％類似のアミノ酸配列を有する類似のポリペプチドが含まれる。
変異体にはまた、一般に化学類似体である「類似体」も含まれる。本明細書で企図される配列番号１の化学類似体としては、限定されるものではないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成中の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組み込み、ならびに架橋剤およびタンパク質性分子またはそれらの類似体に立体配座的拘束を課すその他の方法の使用が挙げられる。
本発明により企図される側鎖修飾の例としては、アルデヒドとの反応とその後のＮａＢＨ４による還元による還元的アルキル化；メチルアセトイミダートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸塩によるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサール－５－リン酸塩によるリシンのピリドキシル化とその後のＮａＢＨ４による還元が挙げられる。
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３－ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬による複素環式縮合生成物の形成により修飾され得る。
カルボキシル基は、例えば、Ｏ－アシルイソ尿素の形成によるカルボジイミド活性化とその後の対応するアミドへの誘導体化により修飾され得る。
スルヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；過ギ酸のシステイン酸への酸化；他のチオール化合物による混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸またはその他の置換マレイミドとの反応；４－クロロマーキュリ安息香酸塩、４－クロロマーキュリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２－クロロマーキュリ－４－ニトロフェノールおよびその他の水銀物質を用いた水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアン酸塩によるカルバモイル化などの方法により修飾され得る。
トリプトファン残基は、例えば、Ｎ－ブロモスクシンイミドによる酸化または２－ヒドロキシ－５－ニトロベンジルブロミドもしくはスルフェニルハリドによるインドール環のアルキル化により修飾され得る。他方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化により変化して３－ニトロチロシン誘導体を形成し得る。
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカーボネートによるＮ－カルボエトキシル化によって達成され得る。
架橋剤は、例えば、（ＣＨ２）ｎスペーサー基（ｎ＝１～ｎ＝６）を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ二官能性架橋剤、ならびにＮ－ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性部分およびマレイミドまたはジチオ部分（ＳＨ）またはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）などの別の基特異的反応性部分を通常含有するヘテロ二官能性試薬を用いて、３Ｄ立体配座を安定化させるために使用することができる。加えて、ペプチドは、例えば、ＣαおよびＮα－メチルアミノ酸の組み込み、アミノ酸のＣα原子とＣβ原子の間の二重結合の導入、ならびにＮ末端とＣ末端の間、２つの側鎖の間または側鎖とＮ末端もしくはＣ末端の間にアミド結合を形成するなど、共有結合を導入することによる環状ペプチドまたは類似体の形成によって立体配座的に拘束することもできる。
このような類似体は、合成ワクチンにおいてまたは標的化薬剤として使用するための抗体を生成するために有用であり得る。類似体は、血清半減期の延長などの性質を有し得る。抗体はまた、ＫＲＴ１４結合抗体を含んでなる抗血清中にあってもよい。
本明細書において、哺乳動物対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在するＫＲＴ１４の細胞外部分もしくはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤または癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法が教示される。
本明細書において、哺乳動物対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在する、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくは最適アラインメントの後に配列番号１と少なくとも約８０％の類似性を有するアミノ酸配列により定義される細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法が可能となる。
さらに、本明細書において、哺乳動物対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在する、配列番号１で示されるアミノ酸配列により定義される細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分または癌細胞上のその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法が教示される。
なおさらに、ヒト対象における卵巣癌の治療のための方法であって、卵巣癌細胞上に存在する、配列番号１により定義されるＫＲＴ１４の細胞外部分を標的とする抗体の、卵巣癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法が可能となる。この薬剤は、抗体であることに加え、限定されるものではないが、アプタマー、モノボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎおよびナノボディなどを含むいずれのアフィニティー試薬であってもよい。
用語「対象に投与すること」は、薬剤と癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分を接触させるための任意の手段により癌細胞を接触させることを含む。哺乳動物対象は雄であっても雌であってもよく、いずれの年齢でもよい。
本明細書では、細胞表面に露出したＫＲＴ１４タンパク質の短いエピトープが特定され、外的に加えられた薬剤または特異的に誘導される内因性分子との相互作用ために利用可能である。その露出配列を認識する抗体またはその他の標的化薬剤を用いてこの領域を標的化すれば、ＫＲＴ１４遺伝子アブレーションの効果を模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて癌細胞の浸潤を完全に防ぐことができる。これらのデータは、有向性のアンタゴニスト療法のための、腫瘍細胞上のこれまでに認識されていなかった特異性の高い標的に相当することを示す。
また、マウスにおいて固形腫瘍を形成できないことが認められている。移植した、機能的ＫＲＴ１４遺伝子を欠く癌細胞は数週間後に検出不能となる。このことは、これらの癌細胞がおそらくは例えば免疫介在性クリアランスによって動物から除去されることを示す。従って、本明細書では、抗ＫＲＴ１４療法の使用は腫瘍の安定化（移植／浸潤の障害による）、および腫瘍退縮を促進し得るということが提案される。標的抗ＫＲＴ１４療法は、以下の理由で癌治療に高い能力を有する：
（ｉ）ＫＲＴ１４は広く発現されることはなく、細胞に毒性が無いようにアンタゴニストが選択されるので、抗ＫＲＴ１４療法は毒性が無いと思われる；
ｉｉ）抗ＫＲＴ１４療法は、原発および転移性付着物の両方を標的とするためにあらゆる病期の疾患に適用可能である；
ｉｉｉ）ＫＲＴ１４発現細胞は経時的かつ化学療法に応答して特異的に高密度となり、従って、抗ＫＲＴ１４療法は再発性の化学療法耐性疾患を生じ、これ以上の従来の治療選択肢が利用できない患者に大いに適用可能となる；
ｉｖ）抗ＫＲＴ１４療法は、既存の疾患の安定化に加え、潜在的に腫瘍の退縮を促進することができる。
また、抗ＫＲＴ１４(ani-KRT14)療法にはいくつかのさらなる適用もある：
ｉ）浸潤性癌幹細胞集団に対して向けられる療法では、細胞傷害性「弾頭」とのコンジュゲーション；
ｉｉ）抗腫瘍細胞傷害性Ｔ細胞に腫瘍誘発細胞集団を破壊させるように設計したＣＡＲ－Ｔ療法における使用；
ｉｉｉ）治療用または予防用ワクチン；
ｉｖ）獣医学的適用における「脱ヒト化」抗体産生の形成；
ｖ）例えば、治療応答／化学療法耐性／腫瘍再発または進行を予測するためのセラノスティック適用。
ＫＲＴ１４依存性の腫瘍進行はまた、いくつかの他の固形腫瘍種に関与する重要な機序としても特定されており、腫瘍拡散の基礎にある保存された機序に当たる可能性がある。よって、抗ＫＲＴ１４療法は、卵巣癌以外にも十分適用があり、広範囲の固形腫瘍の治療に適用可能であることが証明できる。本明細書において使用する場合、「癌」は、それらの細胞を特殊化した異なる細胞に分化させることなく、制御を欠いた細胞成長（例えば、腫瘍の形成）を特徴とする一群の疾患および障害を指す。本明細書において治療のために企図される癌としては、限定されるものではないが、卵巣癌などの婦人病態に加え、ＡＢＬ１原癌遺伝子、ＡＩＤＳ関連癌、聴神経腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢癌腫、副腎皮質癌、特発性骨髄化生、脱毛症、胞巣状軟部肉腫、肛門癌、血管肉腫、再生不良性貧血、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調症、基底細胞癌（皮膚）、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳幹膠腫、脳およびＣＮＳ腫瘍、乳癌、ＣＮＳ腫瘍、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、小児脳腫瘍、小児癌、小児白血病、小児軟組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、隆起性皮膚線維肉腫、線維形成性小細胞腫瘍、乳管癌、内分泌癌、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、ファンコーニ貧血、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管癌、消化管カルチノイド腫瘍、尿生殖器癌、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、婦人科癌、血液系悪性腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球増殖症、ホジキン病、ヒト乳頭腫ウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リ・フラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ浮腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、腎臓悪性ラブドイド腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移癌、口腔癌、多発性内分泌腺腫症、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、骨髄増殖性障害、鼻腔癌、鼻咽頭癌、腎芽細胞腫、神経芽腫、神経線維腫症、ナイミーヘン染色体不安定症候群、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、眼癌、食道癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、膵臓癌、副鼻腔癌、副甲状腺癌、耳下腺腺癌、陰茎癌、末梢神経外胚葉腫瘍、下垂体癌、真性赤血球増加症、前立腺癌、希少癌および関連障害、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロスムンド－トムソン症候群、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、小腸癌、軟組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮癌（皮膚）、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌（膀胱）、移行上皮癌（腎盂－／－尿管）、絨毛性癌、尿道癌、尿路系癌、ウロプラキン、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰癌、ワルデンストロームマクログロブリン血症およびビルムス腫瘍が挙げられる。また、子宮内膜癌および結腸直腸癌も治療可能である。これらの癌は男性対象も女性対象も侵すことがあり、本発明においてはいずれも治療可能である。
ある実施形態において、癌は婦人科癌である。ある実施形態において、婦人科癌は、卵巣癌またはある病期もしくは形態の卵巣癌である。あるいは、癌は、男性または女性対象の他の癌の中でもとりわけ、肝臓、膀胱、肺、結腸、消化管、腸、膵臓および／または咽喉の癌である。本発明は、ＫＲＴ１４を標的とする薬剤またはｉｎ ｖｉｖｏにおいてＫＲＴ１４アンタゴニストを誘導する薬剤が別の抗癌薬および／または放射線療法および／または外科的介入とともに与えられる併用療法に及ぶ。ある実施形態において、本明細書において開示される方法は、さらに、対象に付加的抗癌薬を投与することならびに／または患者に免疫療法、放射線療法および／もしくは外科的介入を施すことをさらに含んでなる。付加的抗癌薬の具体例としては、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシンおよびミトキサントロンのうち１以上などの化学療法薬、または白金系薬剤もしくは代謝拮抗剤が挙げられる。代謝拮抗剤は、タンパク質、ＤＮＡ、ならびに細胞増殖および生殖に必要とされる他の化学物質を作り出すなどの身体の化学プロセスに干渉する物質であり、癌治療において、代謝拮抗剤はＤＮＡ産生を妨害し、その後、細胞分裂を妨げる。例としては、アザセリン、Ｄ－サイクロセリン、ニコフェノール酸(nycophenolic acid)、トリメトプリム、５－フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）およびフルダラビンが挙げられる。プライムＴ細胞およびサイトカインなどの他の免疫試薬も投与可能である。併用療法は、同時にまたはいずれかの順序で互いに数秒以内、数分以内、数時間以内、数日以内もしくは数週間以内に逐次に提供されてよい。ある実施形態において、付加的抗癌薬は、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシンおよびミトキサントロン、白金系薬剤、代謝拮抗剤、プライムＴ細胞およびサイトカインからなる群から選択される。ある実施形態において、代謝拮抗剤は、アザセリン、Ｄ－サイクロセリン、ニコフェノール酸(nycophenolic acid)、トリメトプリム、５－フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）およびフルダラビンからなる群から選択される。
ある実施形態において、哺乳動物対象はヒトである。婦人科癌の場合、対象は女性である。しかしながら、他の総ての癌の場合、対象は男性または女性であり得る。
よって、本明細書において、ヒト対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在するＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法が教示される。
本明細書において、ヒト対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在する、配列番号１で示されるアミノ酸配列により定義される細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは前記対象による、癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストの産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法が可能となる。
さらに本明細書において、ヒト対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在する、配列番号１で示されるアミノ酸配列または最適アラインメントの後に配列番号１と少なくとも約８０％の類似性を有するアミノ酸配列により定義される細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法も教示される。
ある実施形態において、癌は卵巣癌であり、対象は女性対象である。
よって、本明細書において、女性対象における卵巣癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在するＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法が教示される。
本明細書において、女性対象における卵巣癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在する、配列番号１で示されるアミノ酸配列により定義される細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは前記対象による、癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストの産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法を可能とする。
さらに本明細書において、女性対象における卵巣癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在する、配列番号１で示されるアミノ酸配列または最適アラインメントの後に配列番号１と少なくとも約８０％の類似性を有するアミノ酸配列により定義される細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法も教示される。
本発明にはまた、伴侶動物（例えば、イヌおよびネコ）または農用動物（例えば、ウマ科動物、ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラマおよびアルパカ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター）および野生捕獲動物（例えば、タスマニアデビル）などの他の非ヒト動物における癌の治療などの獣医学的適用もある。治療に企図される他の動物としては、テナガザル、チンパンジー、アカゲザル、ミドリザル、オランウータン、ヒヒ、トガリネズミ、ゴリラ、ハリネズミ、ガラゴ、カンガルー、ラット、野生ヤク、フィリピンメガネザル、フェレット、ゾウおよびコウモリが挙げられる。ウマ科動物については、これらにはウマ、モウコノウマ、シマウマおよびロバが挙げられる。ウマについては、これらにはサラブレッド種、温血種、クォーター種およびスタンダード種ならびに競走馬およびパフォーマンス馬が挙げられる。
よって、本明細書において、非ヒト哺乳動物対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在するＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法が教示される。
さらに本明細書において、非ヒト哺乳動物対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在する、配列番号１で示されるアミノ酸配列または最適アラインメントの後に配列番号１と少なくとも約８０％の類似性を有するアミノ酸配列により定義される細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは前記対象による、癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法も教示される。
本明細書において、非ヒト哺乳動物対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在する配列番号１で示されるアミノ酸配列により定義される細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分または癌細胞上のその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を対象に投与することを含んでなる方法を可能とする。
非ヒト哺乳動物対象は雄または雌であり得る。ある実施形態において、薬剤は抗体である。抗体は、ヒト由来抗体または脱免疫化抗体または特定の哺乳動物対象に好適な哺乳動物化抗体であり得る。例えば、マウス抗体は、ヒトにおいて使用するためにヒト化することができる。ゆえに、抗体は、ある哺乳動物において使用するためにその哺乳動物種で作製してもよいし、または必要に応じて哺乳動物化もしくは脱免疫化してもよい。疑念を避けるため、「抗体」は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはＫＲＴ１４結合抗体もしくはＫＲＴ１４結合変異体もしくは誘導体を含んでなる抗血清、またはこれらの抗体もしくは合成もしくは組換え型のフラグメント（Ｆ’（ａｂ）結合フラグメントを含む）であり得る。この薬剤は、抗体であることに加え、限定されるものではないが、アプタマー、モノボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎおよびナノボディなどを含むいずれのアフィニティー試薬であってもよい。
ゆえに、本発明はさらに、ある動物に由来する抗体を同種または異種の別の動物において実質的に非免疫原性とするための生化学的技術の適用も提供する。この生化学的プロセスは、本明細書では「脱免疫化」と呼ばれる。本明細書において「脱免疫化」という場合には、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティング、免疫相互作用分子のフレームワーク領域に関する「再形成」および可変（ｖ）領域突然変異などのプロセスを含み、総て、特定の宿主（例えば、ヒト対象）において免疫相互作用分子（例えば、抗体）の免疫原性を低減することを目的とする。ある実施形態において、好ましい免疫相互作用分子は、ＫＲＴ１４の細胞外部分を有する癌細胞に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などの抗体である。ある実施形態において、免疫相互作用分子は、ある動物に由来し、同種または限定されるものではないがヒトなどの異種の別の動物において免疫原性の低減を示すモノクローナル抗体である。
「実質的に非免疫原性」という場合には、親抗体、すなわち、脱免疫化プロセスに曝される前の抗体と比較した場合の免疫原性の低減を含む。用語「免疫原性」は、宿主動物において体液性および／またはＴ細胞媒介性応答を惹起する、誘導するまたはそうでなければ助長する能力を含む。好都合な免疫原性基準としては、抗体の可変（ｖ）領域に由来するアミノ酸配列に対する、ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用して、それにより、Ｔ細胞により補助される体液性応答を含むＴ細胞介在応答を刺激または助長する能力を含む。
「抗体」は、抗原と結合する、相互作用するまたはそうでなければ会合する能力のある免疫グロブリン系列のタンパク質を意味する。従って、抗体は、抗原結合分子である。「抗体」は、免疫相互作用分子の一例であり、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体または抗血清を含む。ある実施形態において、本発明の免疫相互作用分子はモノクローナル抗体である。
用語「抗原」は、本明細書では、その最も広い意味において、免疫応答において反応し、かつ／または免疫応答を誘導する能力を有する物質を指して使用される。「抗原」という場合には、配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体によって定義される抗原決定基またはエピトープまたは癌細胞を含む。
「抗原結合分子」は、標的抗原（すなわち、配列番号１）に対して結合親和性を有するいずれの分子も意味する。この用語は、抗原結合活性を示す免疫グロブリン（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）、免疫グロブリンフラグメントおよび非免疫グロブリン由来タンパク質フレームワークに及ぶと理解される。用語「抗体」および「抗原結合分子」には、これらの分子の脱免疫化形態を含む。
「抗原決定基」または「エピトープ」は、免疫応答が向けられ得る細胞外ドメインを有するＫＲＴ１４の一部を意味する。
本発明の抗体は一般にヒトで使用するためのマウスモノクローナル抗体の脱免疫化形態であるが、本発明は、いずれの供給源に由来するものでもよく、いずれの宿主において使用するために脱免疫化されてもよい抗体に及ぶ。動物源および宿主の例としては、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ロバ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター）および伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ）が挙げられる。
免疫誘導およびその後のモノクローナル抗体の産生は、例えば、Kohler and Milstein (Kohler et al. (1975) Nature 256:495-499およびKohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6(7):511-519;, Coligan et al. Current Protocols in Immunology, 1991-1997またはToyama et al. (1987) Monoclonal Antibody, Experiment Manual, Kodansha Scientificにより刊行)に記載されているような標準的プロトコールを用いて行うことができる。本質的に、動物を、抗体産生細胞、特に、抗体を産生する体細胞（例えば、Ｂリンパ球）を生成するための標準的方法により、抗原（すなわち、配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体を含んでなるタンパク質またはタンパク質類似体）で免疫する。次に、これらの細胞を不死化のために免疫動物から取り出すことができる。抗原はまず担体と会合させる必要がある場合がある。
「担体」は、その免疫原性を増強するために非免疫原性または低免疫原性物質（例えば、ハプテン）が天然にまたは人為的に連結されている、一般に高分子量のいずれの物質も意味する。
抗体産生細胞の不死化は、当技術分野で周知の方法を用いて行うことができる。例えば、不死化は、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）を用いた形質転換法によって達成され得る[Kozbor et al. (1986) Methods in Enzymology 121:140]。好ましい実施形態では、抗体産生細胞は、モノクローナル抗体の産生に広く用いられている細胞融合法を用いて不死化される（[Coligan et al. (1991-1997)前掲]に記載）。この方法では、抗体を産生する能力のある抗体を産生する体細胞、特に、Ｂ細胞を、骨髄腫細胞株と融合させる。これらの体細胞は、マウスおよびラットを含む齧歯類動物などのプライム動物のリンパ節、脾臓および末梢血に由来し得る。本発明の例示的実施形態においては、マウス脾臓細胞が使用される。しかしながら、代わりにラット、ウサギ、ヒツジもしくはヤギ細胞、または他の動物種からの細胞を使用することもできるであろう。
ハイブリドーマ産生融合法において使用するための特殊な骨髄腫細胞株がリンパ球性腫瘍から開発されている(Kohler et al. (1976) 前掲; Kozbor et al. (1986) 前掲;およびVolk et al. (1982) J. Virol. 42(1):220-227)。
例えば、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３－ＡＧ８．６５３、Ｐ３／ＮＳ１－Ａｇ４－１（ＮＳ－１）、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４およびＳ１９４／５．ＸＸＯ．Ｂｕ．１を含む多くの骨髄腫細胞株が融合細胞ハイブリッドの産生に使用可能である。Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８細胞株およびＮＳ－１細胞株が、Kohler and Milstein (Kohler et al. (1976) 前掲)により記載されている。Shulman et al. (1978) Nature 276:269-270は、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４骨髄腫株を開発した。Ｓ１９４／５．ＸＸＯ．Ｂｕ．１株が、Trowbridge (1982) J. Exp. Med. 148(1):220-227により報告されている。
抗体産生脾臓またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞のハイブリッドを作製するための方法は、通常、細胞膜の融合を促進する１または複数の（化学的、ウイルスまたは電気的）因子の存在下で体細胞と骨髄腫細胞をそれぞれ１０：１の割合（ただし、割合は約２０：１～約１：１で変更可能である）で混合することを含む。融合法は記載されている(Kohler et al. (1975)前掲、Kohler et al. (1976)前掲、Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-236およびVolk et al. (1982)前掲)。研究者らによって使用される融合促進因子は、センダイウイルスおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であった。
融合法は生存能のあるハイブリッドを極めて低頻度で生産する（例えば、脾臓が体細胞源として使用される場合には、だいたい１×１０５脾臓細胞に１個のハイブリッドが得られるだけである）ことから、融合細胞ハイブリッドを残存する非融合細胞、特に、非融合骨髄腫細胞から選択する手段があることが望ましい。生じた他の融合細胞ハイブリッドの中から所望の抗体産生ハイブリドーマを検出する手段も必要である。一般に、融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブリドーマの増殖を補助するが、通常は無限に分裂し続ける非融合骨髄腫細胞の増殖を妨げる培地で細胞を培養することによって達成される。融合に使用される体細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養で長期間生存力を維持しないので問題はない。本発明の例では、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠く（ＨＰＲＴ陰性）骨髄腫細胞を使用した。これらの細胞に対する選択は、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地で行われ、この培地では、融合細胞ハイブリッドが脾臓細胞のＨＰＲＴ陽性遺伝子型のために生残する。また、遺伝子型的に適格なハイブリッドの増殖を補助する培地で選択可能な種々の遺伝的欠損（薬剤感受性など）を有する骨髄腫細胞の使用も可能である。
融合細胞ハイブリッドを選択的に培養するには数週間が必要とされる。この期間の早期に、所望の抗体を産生するハイブリッドを同定することが必要であり、これにより、次にそれらをクローン化し、増殖させることができる。一般に、得られるハイブリッドの１０％前後が所望の抗体を産生するが、約１～約３０％の範囲もめずらしくない。抗体産生ハイブリッドの検出は、例えば、Kennet et al. (Chou et al. 米国特許第６，０５６，９５７号)に記載されるような酵素結合イムノアッセイおよびラジオイムノアッセイ技術を含むいくつかの標準的アッセイ法のいずれか１つによって達成することができる。
所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々の抗体産生細胞株にクローニングされており、各細胞株は２つの標準的方法のいずれかで増殖させることができる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を組織適合性動物に注射することができる。注射された動物はその後、融合細胞ハイブリッドにより産生された特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発達させる。この動物の、血清または腹水などの体液を穿刺してモノクローナル抗体を高濃度で得ることができる。あるいは、個々の細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏにて実験用培養容器内で増殖させてもよい。高濃度の単一の特定のモノクローナル抗体を含有する培養培地を傾瀉、濾過または遠心分離によって採取した後、精製することができる。
これらの細胞株を、任意の好適な免疫検出手段により対象とする抗原を検出するためのそれらの特異性に関して試験する。例えば、細胞株を複数のウェルに分注し、インキュベートし、各ウェルの上清を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接蛍光抗体法などによって分析する。標的抗原を認識することができるが非標的エピトープを認識しないモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し、次に、直接ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するか、または組織適合性動物に注射して腫瘍を形成させ、必要な抗体を産生、回収および精製する。
よって、本発明は、第１のステップにおいて、配列番号１またはその変異体またはそのエピトープを含む細胞外部分を含んでなるタンパク質と特異的に相互作用するモノクローナル抗体を提供する。
次に、一般に、モノクローナル抗体を脱免疫化手段に付す。このようなプロセスは、本発明に従って作製されるモノクローナル抗体と同じまたは類似の特異性を有するキメラ抗体の調製を含むいくつかの形態のいずれを採ってもよい。キメラ抗体は、軽鎖および重鎖遺伝子が、一般に遺伝子工学によって、異種に属す免疫グロブリン可変および定常領域遺伝子から構築された抗体である。よって、本発明においては、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られたところで、ある種の結合領域が別種の抗体の非結合領域と組み合わせられている種間モノクローナル抗体を作製するための技術を用いる(Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443)。例えば、非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体由来のＣＤＲをヒト抗体にグラフトし、それにより、マウス抗体を「ヒト化」することができる（欧州特許公報第０２３９４００号、Jones et al. (1986) Nature 321:522-525、Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536およびRichmann et al. (1988) Nature 332:323-327）。この場合、脱免疫化法はヒトに特化している。より詳しくは、ＣＤＲは、ヒト定常領域を有するまたは有さないヒト抗体可変領域にグラフトすることができる。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体は一般に「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト抗体は一般に「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５～９０％、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。ゆえに、ヒト化抗体の、おそらくＣＤＲを除く総ての部分が天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。よって、「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖とヒト化重鎖免疫グロブリンを含んでなる抗体である。得られるヒト化抗体はＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると思われるので、ドナー抗体は「ヒト化」のプロセスによって「ヒト化」されると言われる。本明細書において「ヒト化」という場合には、特定の宿主、この場合には、ヒト宿主に対して脱免疫化された抗体である場合を含む。
脱免疫化抗体は、抗原結合またはその他の免疫グロブリン機能に実質的に影響のない付加的な保存的アミノ酸置換を有してもよいと理解される。
本発明に従って脱免疫化抗体を生産するために使用され得る例示的方法は、例えば、（Richmann et al. (1988) 前掲、Chou et al. 米国特許第６，０５６，９５７号）、Queen et al. （米国特許第６，１８０，３７７号）、Morgan et al. （米国特許第６，１８０，３７７号）およびChochia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901）に記載されている。
別の形態の抗体としては、「免疫グロブリン新抗原受容体」（ＩｇＮＡＲ）が挙げられ、これは、海洋動物（サメおよびエイ）の軟骨にのみに見られる、血流の強い尿素環境中で安定に発現されるように何億年もかけて進化してきた抗体アイソタイプである(Greenberg et al. (1995) Nature 374:168-173; Nuttall et al. (2001) Mol Immunol 38:313-326)。ＩｇＮＡＲ応答はサメでは抗原駆動性であり、ＩｇＮＡＲ可変ドメインの免疫分子ライブラリーおよびナイーブ分子ライブラリーの両方が構築され、抗原特異的結合試薬のスクリーニングに成功している(Greenberg et al. (1995) 前掲; Nuttall et al. (2001) 前掲)。ＩｇＮＡＲは二価であるが、様々な数の定常ドメインと結合した２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ループを提示する単一免疫グロブリン可変ドメイン（約１４ｋＤａ）を介して抗原を標的化する(Nuttall et al. (2003) Eur J Biochem 270:3543-3554; Roux et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:11804-11809)。対照的に、従来の免疫グロブリン（Ｉｇ）抗体は、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン＋軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン形式（約２６ｋＤａ）を有し、最大６つのＣＤＲを介して抗原と結合する(Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Padlan (1994) Mol Immunol 31:169-217)。ＩｇＮＡＲ可変ドメイン（ＶＮＡＲ）の小さなサイズ、および熱力学的・化学的安定性は、従来の抗体に優る明白な利点を与える。さらに、小さなＶＮＡＲサイズは、この異常な抗体ドメインが、異常に長いおよび可変のＣＤＲ３ループを介して潜在性抗原エピトープに接近することを可能とする(Greenberg et al. 1995 前掲; Ewert et al. (2002) Biochemistry 41:3628-2636; Nuttall et al. (2004) Proteins 55:187-197; Stanfield et al. (2004) Science 305:1770-1773; Streltsov et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:12444-12449; Streltsov et al (2005) Protein Sci 14:2901-2909)。ＩｇＮＡＲドメインは、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)の頂端膜タンパク質１（ＡＭＡ－１）(Nuttall et al, 2004 前掲)；ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)由来のＫｇｐプロテアーゼ(Nuttall et al. (2002) FEBS Lett 516:80-86)；コレラ毒素(Goldman et al, Anal Chem 78:8245-8255, 2006)；Ｔｏｍ７０ミトコンドリア膜貫通タンパク質(Nuttall et al. (2003) 前掲)、およびリゾチーム(Streltsov et al. (2004) 前掲)を含む様々な標的抗原を認識することが特定されている。
ＩｇＮＡＲまたはさらに従来の抗体は、それら自体治療薬として使用可能であるか、または癌細胞に細胞傷害性分子を運ぶために使用可能である。それらはまた診断において使用することもできる。
正確および高感受性の結合試薬は、タンパク質系治療薬および診断産業の基礎である。世界で癌の割合が高いことを考えれば、治療および診断プロトコールにおいて使用するための癌抗原を標的とするこのような試薬の差し迫った必要がある。ＫＲＴ１４の細胞外部分およびＫＲＴ１４の役割の特定は、これらの治療および診断適用の開発を可能とする。
別の実施形態において、薬剤は、ＫＲＴ１４の細胞外部分を有する癌細胞に対して免疫応答を生じるのに十分なＫＲＴ１４の細胞外部分を含んでなるペプチド部分を含んでなるワクチンである。
ワクチンは、ＫＲＴ１４もしくはＫＲＴ１４の類似体の細胞外部分および／または配列番号１を含んでなるペプチドワクチンまたはコンポジットもしくはコンジュゲート薬剤であり得る。ある実施形態において、ワクチンは、配列番号１で示されるアミノ酸配列またはその機能的ホモログもしくはその変異体を含んでなるペプチド部分（最適アラインメントの後に配列番号１と少なくとも８０％の類似性を有するペプチド配列を含む）と１種類以上の薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる。本発明はまた、ＫＲＴ１４の細胞外部分に対する抗体を含んでなる医薬組成物を可能とする。
用語「薬学上許容可能な」とは、担体、希釈剤または賦形剤の生理学上および薬学上許容可能な形態を指す。
本発明はまた、ＫＲＴ１４の発現を下方調節するためのアンチセンスまたはセンス化合物を含む医薬組成物および処方物を含む。本発明の医薬組成物は、局所処置が望まれるか全身処置が望まれるかによって、また、処置される領域によって、いくつかの方法で投与することができる。投与は、局所投与（膣送達および直腸送達を含む）、ネブライザーによるものを含む、例えば、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは吹送による肺投与；気管内、鼻腔内、表皮および経皮投与）、経口または非経口投与であり得る。経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入；または頭蓋内、例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内投与が含まれる。局所的投与用の医薬組成物および処方物は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体および散剤を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要な場合または望ましい場合がある。好都合には単位投与形で提供され得る本発明の医薬製剤は、製薬工業において周知の従来技術に従って調製され得る。このような技術としては、有効成分を医薬担体または賦形剤と会合させる工程を含む。一般に、これらの処方物は、有効成分を液体担体または微粉固体担体またはその両方と均一かつ緊密に会合させた後、必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。ある実施形態において、医薬組成物は、付加的抗癌薬をさらに含んでなり、その具体例は当業者に公知であり、本明細書の他所に記載される。ある実施形態において、付加的抗癌薬は、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシンおよびミトキサントロン、白金系薬剤、代謝拮抗剤、プライムＴ細胞およびサイトカインからなる群から選択される。ある実施形態において、代謝拮抗剤は、アザセリン、Ｄ－サイクロセリン、ニコフェノール酸(nycophenolic acid)、トリメトプリム、５－フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）およびフルダラビンからなる群から選択される。
迅速、効率的かつ高感度のアッセイはまた、卵巣癌などの婦人科癌を含む癌の同定も提供する。このアッセイは、癌および特に、卵巣癌の早期検出を可能とする。しかしながら、本発明は、このアッセイが例えば婦人科癌のいずれの病期、またはその処置、またはそれから生じるいずれの合併症においても使用可能であることから、卵巣癌の早期検出にだけ限定されない。
「婦人科病態」に関して「癌」という場合には、卵巣癌ならびに粘液性もしくは子宮内膜卵巣癌などの卵巣癌の亜種または病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶなどの卵巣癌病期を含む。「卵巣癌」、「上皮性卵巣癌」および「卵巣悪性腫瘍」などの用語は、本明細書においては互換的に使用され得る。本発明は症状のある女性の診断に適用する場合に有用であるが、無症状の女性および／または婦人科病態を発症するリスクのある女性の診断にも等しく適用され得る。しかしながら、本発明は男性および女性対象の広範囲の癌を包含する。
本発明は、「リガンド」または「結合剤」および他の類似の用語に及び、ＫＲＴ１４上の細胞外エピトープに特異的にまたは実質的に特異的に（すなわち、限定された交差反応性で）結合し得るいずれの化合物、組成物または分子を指す。「結合剤」は一般に、単一の特異性を有する。しかしながらやはり、２つ以上のエピトープに複数の特異性を有する結合剤もまた本明細書において企図される。結合剤（またはリガンド）は一般に、モノクローナル抗体などの抗体、またはその誘導体もしくは類似体であるが、また、限定されるものではないが、Ｆｖフラグメント；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；ヒト化抗体および抗体フラグメント；ラクダ化抗体および抗体フラグメント；ならびに前記のものの多価形態も含む。また、必要に応じて、限定されるものではないが、単一特異性または二重特異性抗体；例えば、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖタンデム［（ｓｃＦｖ）２フラグメント］、ダイアボディ、トリボディまたはテトラボディを含む多価結合試薬も使用可能であり、これらは一般に共有結合されているか、またはそうでなければ安定化されている（すなわち、ロイシンジッパーまたはヘリックス安定化）ｓｃＦｖフラグメントである。「結合剤」はまた、当技術分野で記載されているようにアプタマーを含む。
抗体の好適な抗原結合フラグメントの他の限定されない例としては、（ｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｉｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離されたＣＤＲ）、または拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドが挙げられる。本開示はまた、ドメイン特異的抗体、シングルドメイン抗体、ドメイン欠損抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、一腕抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬(small modular immunopharmaceuticals)（ＳＭＩＰｓ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作分子にも及ぶ。
ある実施形態において、抗原結合抗体フラグメントは、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインを含んでなる。可変ドメインは、いずれの好適な長さまたは組成のアミノ酸配列を含んでなってもよく、一般に、１以上のフレームワーク配列に隣接するか、または１以上のフレームワーク配列とともにフレーム内にある少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。抗原結合フラグメントがＶＨドメインおよびＶＬドメインを含んでなる場合、ＶＨおよびＶＬドメインは、いずれの好適な配置で互いに相対的に位置してもよい。例えば、可変領域は二量体であり得、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含有する。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有してもよい。
いくつかの実施形態において、抗原結合抗体フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインと共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含んでなり得る。抗原結合フラグメント内に見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの限定されない構成としては、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。上記に挙げた例示的構成のいずれをも含め、可変ドメインおよび定常ドメインのいずれの構成においても、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されてもよいし、あるいは完全もしくは部分的ヒンジ領域またはリンカー領域によって連結されてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメインの間にフレキシブルまたは半フレキシブルな連結を形成する少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個以上）のアミノ酸からなり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような抗原結合フラグメントは、互いのおよび／また１以上の単量体ＶＨまたはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合による）非共有結合的会合で、上記に挙げた可変ドメインおよび定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（またはその他の多量体）を含んでなり得る。多重特異的抗原結合分子は一般に、各可変ドメインが別の抗原にまたは同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合し得る、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含んでなる。二重特異的抗原結合分子形式を含め、多重特異的抗原結合分子形式はいずれも、当技術分野で利用可能な慣例技術を用い、本開示の抗体の抗原結合フラグメントに関する使用向けに適合させることができる。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、標的抗原との結合に関与する免疫グロブリン重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は一般に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含んでなるという類似の構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)参照。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分であり得る。
治療適用のためには、標的種、すなわち、結合剤が投与される種と適合させるために結合剤を改変することが望ましい場合がある。ある実施形態において、結合剤はヒト化結合剤である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む結合剤のＦＲは、標的種（すなわち、結合剤が投与される種）の生殖細胞系配列のＦＲと同一であり得る。いくつかの実施形態において、ＦＲは、天然にまたは人為的に改変され得る。一般に、標的種の対象に投与した際にその結合分子に対して生じる免疫応答を最小化することを含め、ＦＲ配列のそれぞれは標的種の１以上の免疫グロブリン分子に由来するＦＲ配列と同一であることが望ましいが、いくつかの実施形態では、結合剤は、そのＦＲ配列の１以上に、標的種に由来する１以上のＦＲの対応する位置において外来となる１以上のアミノ酸残基を含んでなってもよい。好ましくは、結合剤が、そのＦＲ配列の１以上に、標的種の対応する位置において外来となる１以上のアミノ酸残基を含んでなる場合、その「外来」アミノ酸残基は、（ｉ）結合剤の、その標的抗原（ＫＲＴ１４）に対する結合特異性に悪影響を及ぼさず、かつ／または（ｉｉ）標的種の対象に投与した際にその結合剤に対して惹起される免疫応答を生じない。
本明細書で開示されるある実施形態において、薬剤（本明細書に記載されるように、ＫＲＴ１４の細胞外部分およびそのＫＲＴ１４結合フラグメントに結合する抗体を含む）は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、ＶＨは、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ３を含んでなり；かつ、ＶＬは、配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ３を含んでなる。
ある実施形態において、ＶＨは、
（ａ）配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨフレームワーク領域１（ＦＲ１）；
（ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ２；
（ｃ）配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ３；および
（ｄ）配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ４
を含んでなり；かつ、ＶＬは、
（ｅ）配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ１；
（ｆ）配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ２；
（ｇ）配列番号１８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ３；および
（ｈ）配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ４
を含んでなる。
ある実施形態において、ＶＨは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＶＬは、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
本開示はまた、癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分、またはそのＫＲＴ１４結合フラグメントに特異的に結合する薬剤に及び、その薬剤は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、ＶＨは、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ３を含んでなり、かつ、ＶＬは、配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ３を含んでなる。
ある実施形態において、ＶＨは、
（ａ）配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨフレームワーク領域１（ＦＲ１）；
（ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ２；
（ｃ）配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ３；および
（ｄ）配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ４
を含んでなり；かつ、ＶＬは、
（ｅ）配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ１；
（ｆ）配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ２；
（ｇ）配列番号１８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ３；および
（ｈ）配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ４
を含んでなる。
ある実施形態において、ＶＨは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＶＬは、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
これらのリガンドおよび結合剤は、ＫＲＴ１４を有する細胞の存在を検出するためにアッセイにおいて使用可能である。ＥＣＬＩＡ、ＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘ ＬａｂＭＡＰイムノアッセイは、バイオマーカーのレベルを検出するために好適なアッセイの例である。一例において、第１の結合試薬／抗体は表面に付着させ、検出可能な基を含んでなる第２の結合試薬／抗体がこの第１の抗体に結合する。検出可能な基の例としては、例えば、限定されるものではないが、第２の結合試薬に結合するための蛍光色素、酵素、エピトープ（例えば、第２の結合試薬／抗体がマウス抗体である場合には、蛍光標識された抗マウス抗体により検出される）、例えば、抗原またはビオチンなどの結合対のメンバーが挙げられる。表面は、典型的な格子型アレイ（例えば、限定されるものではないが、９６ウェルプレートおよび平面マイクロアレイ）の場合などの平面、または各「種」のビーズが、例えば、蛍光色素（例えば、米国特許第６，５９９，３３１号、同第６，５９２，８２２号および同第６，２６８，２２２号に記載のＬｕｍｉｎｅｘ技術）、もしくは量子ドット技術（例えば、米国特許第６，３０６．６１０号に記載のとおり）で標識されるコーティングビーズアレイ技術を用いるような非平面であり得る。このようなアッセイは、実験室情報管理システム(laboratory information management systems)（ＬＩＭＳ）と見なすこともできる。
本明細書において使用する場合、「イムノアッセイ」は、免疫アッセイ、一般に、他を排除するものではないが、所望のバイオマーカー、すなわち、ＫＲＴ１４の細胞外部分を検出および定量することができるサンドイッチアッセイを指す。
ＫＲＴ１４の細胞外部分の存在を決定し、この細胞外部分のレベルを、既知の疾患を有する患者における既知量のＫＲＴ１４の第１の知識ベースを用いて作成されたアルゴリズムにおいて第２の知識ベースデータとして使用することにより婦人科病態またはその他の癌を診断するための方法。また、対象のサンプルにおいてＫＲＴ１４の存在および／または速度を決定することを含んでなる、症状発現前の卵巣癌またはその他の癌を検出する方法も提供する。「速度」とは、患者のサンプル中のＫＲＴ１４の濃度の経時的変化を意味する。
上記に示されるように、婦人科病態としては、癌またはその合併症が含まれる。用語「癌」には、本明細書において使用する場合、限定されるものではないが「婦人科癌」を含むあらゆる癌が含まれる。１つの実施形態において、婦人科癌は、限定されるものではないが、卵管化生、卵巣漿液性境界新生物、漿液性腺癌、低悪性度粘液性新生物および子宮内膜腫瘍を含む。特定の実施形態において、婦人科癌は、異常なミューラー管上皮分化を受けている卵巣新生物である。本明細書において企図されるその他の婦人科病態としては、子宮内膜症などの炎症性障害が含まれる。上記に示されるように、本発明は、雄および雌対象による広範囲の癌に及ぶ。
用語「サンプル」は、本明細書において使用する場合、限定されるものではないが、体液（血液、血漿、血清、腹水を含む）、組織抽出液、新たに採取した細胞、および細胞培養物としてインキュベートされた細胞の溶解液を含め、検出しようとする癌細胞を含有するいずれのサンプルも意味する。特定の実施形態において、サンプルは、婦人組織、血液、血清、血漿または腹水である。
上記に示されるように、「対象」は、婦人科病態またはその他の癌を有する疑いのある、または有する任意の哺乳動物、一般にはヒトであり得る。対象は患者と呼ばれることもあり、癌を有する疑いのあるまたは有するまたは癌を発症するリスクのある哺乳動物である。用語「病態」はまた、それから生じる合併症も含む。
用語「対照サンプル」は、既知の病態を有する対象からのデータの第１の知識ベースを確立するために使用可能ないずれのサンプルも含む。
本発明の方法は、卵巣癌を含む婦人科癌などの癌の診断および病期分類で使用され得る。本発明はまた、病態の進行を監視するため、および特定の治療が有効であるか否かを監視するためにも使用可能である。特に、この方法は、手術、化学療法、免疫療法、および／または放射線療法の後などに病態の症状の不在または改善を確認するために使用可能である。これらの方法はさらに、化学療法および異常組織の再発を監視するために使用することもできる。
上記に示されるように、抗体は、バイオマーカーの抗原決定基と抗体の間の結合相互作用によるいくつかのイムノアッセイのいずれにおいても使用可能である。このようなアッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＣＬＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集、血球凝集および組織化学的検査が挙げられる。抗体は、癌におけるその役割を決定することおよび癌を診断する目的で、サンプルにおいてバイオマーカーを検出し、そのレベルを定量するために使用可能である。
特に、本発明の抗体はまた、免疫組織化学分析において、例えば、細胞レベルおよび細胞下レベルで、バイオマーカーを検出するために、それを特定の細胞および組織および特定の細胞下部位に局在させるために、ならびに発現レベルを定量するために使用可能である。この薬剤は、抗体であることに加え、限定されるものではないが、アプタマー、モノボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎおよびナノボディなどを含むいずれのアフィニティー試薬であってもよい。
光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いて抗原を位置決定するための当技術分野で公知の細胞化学的技術は、ＫＲＴ１４の細胞外ドメインを有する細胞を検出するために使用することができる。一般に、本発明の抗体を検出可能な物質で標識することができ、バイオマーカータンパク質を、その検出可能な物質の存在に基づいて組織および細胞内で位置決定することができる。検出可能な物質の例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ ３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン）、ルミノールなどの発光標識；酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ）、ビオチニル基（マークされたアビジン、例えば、光学的方法または熱量計測定方法により検出可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジンにより検出することができる）、二次リポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン；エピトープタグ）。ある実施形態において、標識は、潜在的立体障害を軽減するために様々な長さのスペーサーアームを介して結合される。抗体は、電子顕微鏡により容易に可視化されるフェリチンまたは金コロイドなどの高電子密度物質とカップリングさせることもできる。
抗体またはサンプルは、細胞、抗体などを固定することができる担体または固相支持体上に固定されていてもよい。例えば、担体または支持体は、ニトロセルロース、またはガラス、ポリアクリルアミド、斑れい岩および磁鉄鋼であり得る。この支持体素材は、球形（例えば、ビーズ）、円柱形（例えば、試験管もしくはウェルの内面、またはロッドの外面）、または平坦（例えば、シート、試験紙）を含む、いずれのあり得る構成であってよい。また、一次抗原－抗体反応が、バイオマーカータンパク質に対する抗体反応性に特異性を有する第２の抗体の導入によって増幅される間接的方法も使用可能である。例として、ＫＲＴ１４の細胞外ドメインに対して特異性を有する抗体がウサギＩｇＧ抗体である場合、第２の抗体は、本明細書に記載されるように検出可能な物質で標識されたヤギ抗ウサギγ－グロブリンであり得る。
放射性標識が検出可能な物質として使用される場合、ＫＲＴ１４バイオマーカーは、ラジオオートグラフィーによって位置決定することができる。ラジオオートグラフィーの結果は、ラジオオートグラフにおいて粒子の密度を、様々な光学的方法により、または粒子を数えることによって定量することができる。
ＫＲＴ１４に対する標識抗体は、手術を受けている患者において、すなわち、イメージングにおいて腫瘍組織を位置決定する際に使用可能である。一般に、ｉｎ ｖｉｖｏ適用のためには、抗体は、放射性標識（例えば、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、ガリウム－６７、テクネチウム－９９、およびインジウム－１１１）で標識される。標識抗体調製物は、組織がイメージングされる数時間～４日前に適当な担体で一度、患者に静脈内に投与することができる。この期間中、結合しなかった画分は患者からクリアリングされ、残った抗体だけが腫瘍組織と会合したものである。同位体の存在は好適なγカメラを用いて検出される。標識された組織は、外科医に腫瘍の位置を正確に示すために患者の身体上の既知のマーカーと相関させることができる。
よって、別の実施形態において、本発明は、患者において癌を検出するための方法であって、
（ａ）患者からサンプルを得ること；
（ｂ）前記サンプルをＫＲＴ１４の細胞外エピトープに結合する薬剤と接触させてそのレベルを決定し、そのレベルを、癌を有する患者の確率指数を得るためのアルゴリズムにかけること；および
（ｃ）確率指数に基づき患者が癌を有するリスクを診断すること
を含んでなる方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、患者において循環ＫＲＴ１４陽性癌細胞を検出するための方法であって、
（ａ）患者から血液サンプルを得ること；
（ｂ）前記血液サンプルを、ＫＲＴ１４の細胞外エピトープに結合する薬剤と接触させてサンプル中のＫＲＴ１４陽性癌細胞の存在を判定すること
を含んでなる方法を提供する。
本明細書に記載の方法は、本発明の方法のいずれかを実施するために必要な試薬を含んでなるプレパック診断キットを使用することにより実施することができる。例えば、これらのキットは、ＫＲＴ１４の細胞外部分に特異的な少なくとも１つの抗体を含んでよく、これらは例えば、臨床現場において、患者をスクリーニングおよび診断するため、ならびに癌を発症する素因を示す個体をスクリーニングおよび特定するために好都合に使用され得る。このキットはまた、本発明の方法を実施するための詳細な説明書も含む。
本発明はさらに、患者由来のサンプルをスクリーニングするためのアルゴリズムに基づくスクリーニングアッセイを提供する。一般に、入力データをＫＲＴ１４のレベルに基づいて収集し、レベルの上昇または低下の統計的有意性を評価するためのアルゴリズムにかけ、その後、その情報が出力データとなる。入力データを評価するためのコンピューターソフトウエアおよびハードウエアは本発明に包含される。
本発明のアッセイは、既存のまたは新たに開発された病理アーキテクチャまたはプラットフォームシステムへの統合を可能とする。例えば、本発明は、ユーザーが癌、またはそのサブタイプもしくは病期に関する対象の状態を決定することを可能にする方法を企図し、その方法は、
（ａ）通信ネットワークによってＫＲＴ１４の細胞外部分の存在の形態におけるデータを受信すること；
（ｂ）前記対象データを、疾病指数値を提供するアルゴリズムによって処理すること；
（ｃ）所定の値と比較した疾病指数値の結果に従って対象の状態を決定すること；および
（ｄ）対象の状態の指標を通信ネットワークによってユーザーに伝達すること
を含んでなる。
本明細書に開示される別の実施形態において、患者において癌を監視する方法が提供され、その方法は、
（ａ）第１の時点で患者から血液サンプルを得ること；
（ｂ）（ａ）のサンプルをＫＲＴ１４の細胞外エピトープに結合する薬剤と接触させて、前記サンプル中のＫＲＴ１４陽性癌細胞のレベルを決定すること；
（ｃ）第２の時点で患者から血液サンプルを得ること、この第１の時点は第２の時点と異なる、
（ｄ）（ｃ）のサンプルをＫＲＴ１４の細胞外エピトープに結合する薬剤と接触させて、前記サンプル中のＫＲＴ１４陽性癌細胞のレベルを決定すること；および
（ｅ）前記患者においてＫＲＴ１４陽性癌細胞のレベルが第１の時点と第２の時点の間で変化したかどうかを決定すること
を含んでなり、
第１の時点と第２の時点の間での患者におけるＫＲＴ１４陽性癌細胞のレベルの変化が患者における癌の状態の変化を示す。
このような方法は、癌の状態または病期の（例えば、療法に応答した）変化を監視するためまたは再発（例えば、腫瘍切除後）を検出するために好適に使用され得る。
ある実施形態において、癌は、婦人科癌である。ある実施形態において、婦人科癌は、卵巣癌またはある病期もしくは形態の卵巣癌である。別の実施形態において、癌は、脳癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、腸癌、結腸癌、消化管癌、胃癌、咽頭癌、子宮内膜癌および結腸直腸癌から選択される。
上記に概略を示すように「アルゴリズム」または「アルゴリズム関数」という場合には、多変量解析関数の実行を含む。上記のものの他、ある範囲の異なるアーキテクチャおよびプラットフォームは実施可能である。本発明の実施に好適ないずれの形態のアーキテクチャも使用可能であることが理解されよう。
本明細書に開示される側面を、以下の限定されない例によりさらに説明する。以下の材料および方法が使用可能である。
細胞培養 細胞株ＯＶＣＡＲ－４（ＮＩＨ－ＯＶＣＡＲ４）およびＣａＯＶ－３ ＃ＨＴＢ－７５はＡＴＣＣおよびＮＩＨから購入した。ＯＶＣＡＲ－４細胞はＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ－１６４０（ＲＰＭＩ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１８７００９２）で維持し、ＣａＯＶ－３細胞はダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１１９６５１１８）で維持し、ＳＫＯＶ３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＨＴＢ－７７（商標））はダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムのＦ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１１９６５１１８）で維持し、ＣＯＶ３６２．４、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ ＃０７０７１９０４）は高グルコースダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ－ＨＧ）で維持し、ＢＴ－１６、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＣＶＣＬ＿Ｍ１５６）およびＮＣＩ－Ｈ１５７３肺腺癌（ＮＣＩ－Ｈ１５７３）は両方ともＲｏｓｓｗｅｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８で維持し、トリプルネガティブ乳癌細胞（ＣＶＣＬ＿０４１９）はＤＭＥＭで、ＡＮＥ ＣＡ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１１）はイーグル最小必須培地ＥＭＥＭで維持し、ＳＷ６２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２７）はライボビッツＬ－１５培地で維持した。総ての培地に１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃１６００００４４）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１５２４００６２）を添加した。ＩＤ８マウス上皮ＯＣ細胞株（Ｄｒ． Ｋａｔｈｙ Ｒｏｂｙ、Ｋａｎｓａｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＫＡ、ＵＳＡ）を、１％インスリン－トランスフェリン－セレナイト（ＩＴＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）とともに４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＧｉｂｃｏ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で増殖させた。ヒト中皮細胞株ＬＰ９（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ＃ＡＧ０７０８６）を、１０％ｖ／ｖ ＦＣＳ、１％ｖ／ｖペニシリン－ストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦおよび０．４ｕｇ／ｍｌヒドロコルチゾンを含むＨａｍｓＦ１２／１９９培地で維持した。総ての細胞株を３７℃、５％ｖ／ｖ ＣＯ２で維持し、細胞生存率の計数は、総てのアッセイを始める前にＣｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）ＩＩ ＦＬ自動セルカウンターを用いて行った。患者の同意の後に、確立された精製法(Latifi et al. (2012) PLoS ONE 7(10))を用い、低接着プレートのＭＣＤＢ：Ｆ１２培地および１０％ｖ／ｖ ＦＣＳ中で培養することにより分析する前に低接着条件下で維持した悪性腹水から接着腫瘍細胞は得られなかった。
ＣＲＩＳＰＲ ＫＲＴ１４標的破壊およびＫＲＴ１４の過剰発現 ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子サイレンシングは、遺伝子当たり３つのガイドストランドを用い、Ｚｈａｎｇ ｌａｂプロトコール(Cong et al. (2013) Science 339(6121):819-23)に従って行った。生産者のプロトコールに従い、ＤＭＥＭ中、リポフェクタミン（登録商標）２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１６６８０１９）を用い、細胞をガイドストランド（１－３）、非標的対照またはＫＲＴ１４過剰発現構築物ＫＲＴ１４ＯＥ（Ｏｒｉｇｅｎｅ ＃ＲＣ２１４９０７）でトランスフェクトした。トランスフェクションおよび１２時間の回復期間の後、細胞を選択培地で継代培養し、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｐ８８３３）またはジェネティシン（商標）選択抗生物質（Ｇ４１８硫酸塩）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｕｓｔｒａｌｉａ ＃１０１３１－０３５）の添加により選択圧下で維持した。細胞に制限希釈を行い、選択培地はおよそ２週間、２日毎に置き換えた。個々のコロニーを拡大培養し、標的遺伝子のノックダウンをウエスタンブロット分析により評価し、サンガーシークエンシングによって確認した。
ヒト組織アレイおよび免疫組織化学 免疫組織化学は、ＵＳＢＩＯＭＡＸ（＃ｏｖ２０８５、＃ｏｖ２０８１１）から購入した、または[Bilandzic et al. (2014) Cancer Lett 354(1):107-114; Rainczuk et al. (2013) J Proteome Res; Salamonsen et al. (2013) Fertil Steril 99(4):1086-92] （補足データ６および７)に従前に記載されているように自家生成した（腫瘍および卵管）組織マイクロアレイ(micrarray)（ＴＭＡ）切片で行った。抗原賦活のために、５０ｍＭグリシン（ｐＨ３．５）中、９０℃で１０分間、切片をインキュベートした。これらの切片を０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡ／ＰＢＳ中、Ｒｂ－ＫＲＴ１４抗体（１：１００、Ｓｉｇｍａ、ＳＡＢ４５０１６５７）およびｍＡｂ ＡＮ－１７（１：５００）とともに４℃で一晩インキュベートした。その後の工程は、インキュベーション間にＰＢＳ洗浄を挟んで、室温で行った。切片をヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（１：１０００、Ｄａｋｏ、グロストルプ、デンマーク；カタログアイテムＰＯ４４８）、ビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（１：１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号ＢＡ－５０００）またはビオチン化ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号ＢＡ－９２００）とともに１時間インキュベートした後、生産者の説明書に従い、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキットを用いた（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）。抗体結合は、３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩を用いた現像の後に褐色沈澱として検出され、ハリスヘマトキシリンを対比染色として使用した。これらの切片をカバーガラス下、Ｄｅｐｅｘ（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ、プール、英国）で封入した。陽性免疫染色は、アイソタイプ（ＩｇＧ）対照に曝した並行切片と比較して評価した。腫瘍および間質組織の免疫染色は、記載の通りに(Rainczuk et al. (2013) 前掲)、Ａｐｅｒｉｏ ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（ｖ １２．３．３）を用いて評価した。
ウエスタンブロット分析 ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法は、従前にBilandzic et al. (2013) Mol Endocrinol, 2013. 27(3):466-79に記載されているように行った。ブロットを、ＫＲＴ１４に対する抗体（１：１０００、ＳＡＢ４５０１６５７）、ｍＡｂ ＡＮ－１７およびβ－アクチン（１：２０，０００；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、キャッスル・ヒル、オーストラリア）を用いてプローブした。二次抗体ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス、抗ウサギおよびロバ抗ヤギ（１：５０，０００；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、キルシス、オーストラリア）を使用した(Bilandzic et al. (2013) Mol Endocrinol, 2013. 27(3):466-79)。タンパク質バンドをＣｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬブロッティング基質（Ｂｉｏｒａｄ ＃１７０５０６１）を用いて検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１７０８２８０）を用いて可視化した。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ） リアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＳＰ ９６ウェル装置（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。開始前に細胞株を血清不含培地で一晩インキュベートすることによりＧｏ期に同調させた。増殖アッセイとしては、細胞を０．５×１０３細胞／０．１４ｍｌ／ウェルで播種し（実験テキストに概説される通り）、インピーダンスの読み取りを８時間、５分毎（細胞接着を監視するため）、その後、２４時間、１５分毎（細胞増殖を監視するため）に行った。浸潤アッセイとしては、ＣＩＭ－１６ウェルプレートの上のチャンバーをマトリゲルマトリックス（ＳＦＭ中１：１０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）でコーティングした。細胞を上のチャンバーに播種し（上記の通り）、下のチャンバーには培地＋／－１０％ｖ／ｖ ＦＢＳを加えた。アッセイは総て２反復または３反復で行い、少なくとも３回の独立した実験を行った。
腹膜微小環境モデル 腹膜微小環境のモデルを確立するために、２チャンバーＲＴＣＡ ＣＩＭプレートウェルを、上のチャンバーにマトリゲル（ＳＦＭ中１：１０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をコーティングすることにより準備した後、７×１０４のＬＰ９細胞／ウェルを加え、コンフルエント単層が形成されるまで監視した(Domcke et al. (2013) Nat Commun 4:2126)。スフェロイド（新鮮な患者腹水から取得；１０スフェア／ウェル）を上のチャンバーのＳＦＭに播種し、下のチャンバーには培地±１０％ｖ／ｖ ＦＢＳを加えた。ＭＡＬＤＩイメージング分析の収集点として使用するための最適時間を決定するためにリアルタイム読み取りを用い、サンプルは総て、実験ごとに２反復または３反復のウェルで調製した。さらなる対照として、本発明者らはまた、改変型Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを用い、同時エンドポント浸潤アッセイも並行して行った。この場合、中皮ＬＰ９細胞を、卵巣癌スフェロイドを植え込む前にＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥを用いて標識した。中皮浸潤は、Ｃｙｔａｔｉｏｎ（商標）３マルチモードイメージャー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ウィヌースキ ＵＳＡ）を用い、ＣＳＦＥ標識中皮細胞がスフェロイドの下に退縮していることに従って評価した。
ＭＡＬＤＩ－ＩＭＳのサンプル調製 スフェロイド中皮界面をＴｈｅｒｍａｎｏｘ（商標）セクショナブルカバーガラス上で共培養し、浸潤前、浸潤中および浸潤後（ＲＴＣＡアッセイにより測定される通り）に相当する所定の時点で、寒天で蓋をした。サンプルを５μｍの切片とし、浸潤界面を周期的切片でＨ＆Ｅ染色により位置決定した。識別されたところで、界面における２つの非染色切片をＭＡＬＤＩ処理用のインジウム－酸化スズ（ＩＴＯ）スライド（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ、ＧｍｂＨ）に置いた。
ＭＡＬＤＩ ＩＭＳ 卵巣癌スフェロイド中皮界面におけるトリプシン処理ペプチドを、ＩｍａｇｅＩＤワークフロー（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて識別した。トリプシンは、ＩｍａｇｅＰｒｅｐスプレー装置（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いた噴霧化により連続組織切片に適用した。サンプルを９０分間加湿チャンバーで消化した後、ペプチドを抽出し、Ｃ１８ピペットチップを用いて精製した。ＬＣ－ＭＡＬＤＩ分析は、(Rainczuk et al. (2014) Int J Cancer 134(3):530-41)に記載されているように、ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ）およびＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて行った。次に、続いて消化された連続切片のＭＡＬＤＩイメージング取得を、従前に記載されているように(Rainczuk et al. (2014) 前掲)、ｆｌｅｘＩｍａｇｉｎｇ ４．１（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて行った。ＬＣ－ＭＡＬＤＩデータおよびＭＡＬＤＩイメージングデータを、ＩｍａｇｅＩＤソフトウエア（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて比較およびフィルタリングを行い、イメージングデータとＬＣ－ＭＡＬＤＩ分析の間で質量ピークをマッチさせた。ピークマッチングの質量許容差をＩｍａｇｅＩＤソフトウエアにより自動計算した。
メチルセルロースの重層およびスフェアの形成 卵巣癌細胞をトリプシン化により溶解させ、完全細胞培養培地に再懸濁させた（ｃｏｕｎｔｅｓｓセルカウンターにより決定した場合に最小生存率９８％）。スフェア当たり２，５００細胞を無血清培地中０．２５％ｗ／ｖメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、キャッスル・ヒル、オーストラリア）中で重層し、９６ウェルＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）Ｕ底懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、Ｉｎｔｅｒｐａｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＰＴＹ、ビクトリア州、オーストラリア）の単一のウェルに播種した。各細胞株のスフェロイドの凝集および形成を観察し、定期的に光学顕微鏡を用いて画像を得た。形成したスフェアは、大口径チップおよび遠心分離を用いて採取した。
中皮置換アッセイ ヒト中皮細胞株ＬＰ９を上記のように播種し、コンフルエント単層が形成されるまで３７℃でインキュベートした。卵巣癌スフェア（上記の通り）は採取し、１６スフェアを、コンフルエント中皮単層を含有するウェルに播種した。位相差顕微鏡を用いて定期的に中皮の置換および成長の画像を得た。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷修復アッセイ 卵巣癌細胞（またはその他の癌細胞株－ＢＴ１６、ＮＣＩ－Ｈ１５７３、ＡＮ３ＣＡ、ＳＷ６２０およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８）を１２ウェルプレートにて完全培地中でコンフルエントに達するまで増殖させた後、一晩、血清飢餓状態にしてＧ０で同調させた。翌日、細胞培養培地を除去し、吸引を取り付けたピペットチップで擦過することにより細胞単層に創傷を形成した。ＰＢＳで穏やかに洗浄することにより非接着細胞を除去し、ｍＡｂ ＡＮ－１７（１μｇ／ｍｌ）または市販のＫＲＴ１４ポリクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）を含むまたは含まない完全増殖培地で置換した。０～７２時間の範囲で定期的に位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて創傷領域の画像を得た。創傷の閉鎖はＡｎａｌｙＳＩＳ ＬＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて画像系で測定し、各日の創傷面積を求めた。各増殖条件で観察した少なくとも６か所の創傷領域で３回実験を繰り返した。
マトリゲルおよびコラーゲンＩ増殖アッセイ：染色およびイメージング Nguyen-Ngoc et al. (2012) Proc Natl Acad Sci U S A. 109(39):E2595-604からのプロトコールを適合させた。簡単に述べれば、卵巣癌スフェロイドを採取し、各マトリックス６スフェアの懸濁液を得た。スフェアを３Ｄマトリゲル（３５４２３０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはラットテールコラーゲンＩ（３５４２３６；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかに包埋した。Nguyen-Ngoc et al. (2012)前掲に従い、カバーガラススライド（９４．６１９０．８０２、Ｓｔａｒｓｔｅｄｔ）上、８ウェルに培養を設定した。抗体染色のために、マトリゲルまたはコラーゲンＩのいずれかで培養したスフェアを、４％ｗ／ｖパラホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳ中で１０分間２回すすぎ、ＰＢＳ中０．５％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で２０分間透過処理を施し、ＰＢＳで１０分間２回すすぎ、室温で２時間ＰＢＳ中１０％ｖ／ｖ ＦＢＳでブロッキングした後、一次抗体（１：１０００、抗Ｎカドヘリン抗体［５Ｄ５］ａｂ９８９５２ ＡｂＣａｍおよび１：５００、ＫＲＴ１４）とともに４℃で一晩インキュベートした。翌日、サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体：１：２０００ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４６７、ａｂ１５００８３および１：２０００ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８、ａｂ１５０１１７）とともに室温で３時間インキュベートした後、ＰＢＳで１０分間３回すすいだ。Ｃｙｔａｔｉｏｎ（商標）３ Ｍｕｌｉｔｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ウィヌースキー ＵＳＡ）をＧｅｎ５ Ｉｍａｇｅ＋ソフトウエアまたはＮｉｋｏｎ Ｃ１共焦顕微鏡（Ｍｏｎａｓｈ Ｍｉｃｒｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、モナシュ）とともに用いてサンプルの画像を得た。
リアルタイムＰＣＲ 全ＲＮＡを原発高悪性度漿液性卵巣腫瘍（ｎ＝３）および全正常卵巣（ｎ＝３）から、Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＬＴシステムを５ｍｍステンレス鋼ビーズおよびＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。全ＲＮＡを卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ４およびＣａＯＶ３から抽出し、単層またはスフェロイド（ＫＲＴ１４ＫＯおよび野生型株）；腹水由来卵巣癌（ｎ＝３）または良性線維腫（ｎ＝２）スフェロイド；標的腹膜細胞層ＬＰ－９として、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を生産者のプロトコールに従って用いて増殖させた。ＫＲＴ１４、ＨＮＲＮ、ＦＮＤＣ３Ｂ、１８Ｓ、ＣＤＣＡ８に対するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーを公開ヒト配列に対して設計し、従前に記載されているように確認した(Bilandzic et al. (2009) Mol Endocrinol, 23(4):539-48)。ｃＤＮＡを、スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）を用いて合成した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ＳＹＢＲミックス（Ｓｃｏｒｅｓｂｙ、ビクトリア州、オーストラリア）を用い、リアルタイムＰＣＲサンプルを１０μｌの終容量に調製した。定量的リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ７９００ ＨＴ Ｆａｓｔリアルタイムマシーンを用いて、従前に記載されているように(Bilandzic et al. (2009) 前掲)遂行し、総ての反応を３反復で行った。生成量は各ＰＣＲ産物の標準曲線に基づいてフェムトグラムに変換し、得られるｍＲＮＡレベルを各サンプルの１８Ｓ ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。
統計分析 統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，サンディエゴ、ＣＡ）を用いて行った。細胞アッセイから得られたデータについて、示されているように、平均を一元配置または２元配置ＡＮＯＶＡをボンフェローニ、ダネット、またはテューキーの事後検定とともに用いて比較した。ｍＲＮＡ発現がサンプル間で有意に異なったかどうかを決定するために、マン・ホイットニー－Ｕ検定または対応のないｔ検定を行った。ｐ＜０．０５である場合に平均を有意に異なると見なした。総ての実験を独立に少なくとも３回繰り返した。
カプラン・マイヤー曲線 １５の公開卵巣癌データベースの漿液性卵巣癌患者からのｍＲＮＡデータを用いて生存曲線を作成するために、カプラン・マイヤーオンラインプロッターツール(http://kmplot.com/ analysis/)を使用し、ベストカットオフ値はこのプロッターツールにより自動選択され、ログランク、ｐ値およびハザード比（および９５％信頼区間）を計算した(Lanczky et al. (2016) Breast Cancer Res Treat. 3 (160):439-446)。
実施例１
接着および増殖は細胞の浸潤能の予測にはならない
転移性卵巣癌細胞は、腹腔および器官の内面の中皮単層と相互作用して、浸潤し、基礎にある基質に付着して二次結節を形成する(Kenny et al. (20017) Int J Cancer 121(7):1463-72; Burleson et al. (2006) J Transl Med 4:6; Sodek et al. (2012) Cancer Metastasis Rev 31(1-2):397-414)。初代腹水由来腫瘍細胞を用い、中皮置換は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて長期の時間枠にわたってスフェロイドからの浸潤性糸状仮足の出現により評価した。アッセイ開始時に、良性または悪性サンプルからのスフェロイドは同様のサイズであり、明らかな形態学的違いを示さなかった。広範囲の糸状仮足の成長および下層の中皮層の消失は総ての悪性サンプルで２４時間以内に見られ、対照的に、良性スフェロイドは、成長または浸潤の明らかな証拠を示さなかった。浸潤の欠如は接着不全または細胞増殖の低下によるものではなく、実際に、良性細胞は非コーティングおよびフィブロネクチンコーティング培養プレートへの比較的高い接着を示し、ＲＴＣＡアッセイにおいて悪性細胞サンプルよりも高い増殖性指数を達成した。これらのデータは、悪性細胞だけが浸潤能を示したこと、および浸潤能はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の接着能または増殖能から予測できないことを示す。
実施例２
プロテオミクスプロファイリングは浸潤界面に独特のタンパク質を同定する
活発に浸潤する癌細胞および中皮の間の界面で直接タンパク質を調べた研究はこれまでにはなかった。浸潤関連タンパク質の存在量および局在を評価するために、スフェロイド／中皮共培養物を中皮への接着後、浸潤（ＲＴＣＡアッセイで判定）の開始前に採取した。並行エンドポイントＢｏｙｄｅｎチャンバーアッセイを用い、ＭＡＬＤＩ ＩＭＳ分析に使用したサンプルにおいて中皮接着は見られたが浸潤は見られなかったことを確認した。
細胞－スフェロイド界面培養物をアガロースに包埋し、切片とし、ＩＨＣにより位置決定し（図１Ａ）、次に、連続切片を、浸潤界面に局在したタンパク質を同定するためにＩＭＳにより分析した。分析はまた、サンプル間の異型分散について制御するために、良性線維腫を有する患者からの腹水由来スフェロイドを含んだ（示されていない）。ＭＡＬＤＩ ＩＭＳおよびその後のＬＣ－ＭＡＬＤＩ－ＭＳ／ＭＳは、スフェロイド／中皮界面において、悪性スフェロイドを含有する共培養物には独特に存在するが良性スフェロイドを含有する共培養物には存在しない２６のタンパク質を同定した。これらの中には卵巣癌に従前に関連付けられているいくつかのタンパク質があり（例えば、ＨＳＰ９０、ＡＭＨおよびＯＳＭ）[Vesci et al. (2014) Int J Oncol 45(4):1421-9; Liu et al. (2013) Clin Cancer Res 19(18):5053-67; Kim et al. (2014) Obstet Gynecol Sci .57(5):343-57; Richards (2013) ISRN Inflammation 2013: 23]、このアプローチのバリデーションを行い、それらが浸潤の初期段階に重要な役割を果たす可能性のあることを示唆する。分析にはさらに、（ｉ）総ての悪性高グレード漿液性卵巣癌（ＨＧＳＣ）サンプルで同定されたタンパク質のみを含むこと；および（ｉｉ）中皮細胞単層においても同定されたタンパク質を除くという制限があった。４つのタンパク質（ＫＲＴ１４、ＨＲＮＲ、ＣＤＣＡ８およびＦＮＤＣ３Ｂ）は、高ストリンジェンシーアプローチ後に癌中皮界面において、総ての患者ＨＧＳＣ細胞に独特であることが確認された。また、組織学的に正常な卵巣組織に比べて独立した腫瘍組織における候補の発現および局在を確認するために、ＴＭＡに対する免疫染色および新鮮な凍結組織に対するＲＴ－ＰＣＲも使用した。
実施例３
卵巣癌細胞の浸潤には浸潤界面でＫＲＴ１４が必要とされる
ＨＲＮＲ、ＫＲＴ１４、ＣＤＣＡ８およびＦＮＤＣ３Ｂの存在量を、ウエスタンブロットにより複数のＨＧＳＣ細胞株（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ４およびＣａＯＶ３）において調べた(Domcke et al. (2013) 前掲)。プロテオミクスプロファイリングと一致して、ＨＲＮＲ、ＫＲＴ１４およびＣＤＣＡ８は、癌細胞溶解液において検出されたが、中皮細胞対照においては検出されなかった。ＦＮＤＣ３ＢはＬＰ９中皮細胞において検出されさらなる分析から除外した。次に、ＣＲＩＳＰＲを用いてＫＲＴ１４、ＣＤＣＡ８およびＨＲＮＲをノックアウトし（ＣａＯＶ３およびＯＶＣＡＲ４細胞株）、それらの特異的欠損をクローン集団においてシークエンシングＰＣＲおよびウエスタンブロットにより確認した。細胞増殖および浸潤に対する機能的ＫＲＴ１４、ＣＤＣＡ８またはＨＲＮＲ欠損の効果をＲＴＣＡにより試験した。非処理対照または非標的対照に比べて、ＨＲＮＲまたはＣＤＣＡ８を欠いた細胞は有意に低下した増殖を示し（示されていない）、対照的に、ＫＲＴ１４の欠損は増殖に影響せず（図２）、それは腫瘍細胞の生存率または増殖に必要とされないことが示唆される。また、ＣＤＣＡ８およびＨＲＮＲノックアウト細胞はいずれも浸潤能を保持し、ＣＤＣＡ８ノックアウト細胞は、非処理細胞または非標的細胞と同等の浸潤速度を示したが、ＨＲＮＲノックアウト細胞は、浸潤の開始に遅延を示した。しかしながら、機能的ＫＲＴ１４を欠く細胞は浸潤能の完全な欠損を示し（図２Ａ）、３０時間後に（または最大７日の長期にわたって）浸潤が見られなかった。ＫＲＴ１４により媒介される浸潤能の欠損は２Ｄ創傷治癒アッセイで確認され（図２Ｂ）、ここでは、ＫＲＴ１４ノックアウト（ＫＲＴ１４ＫＯ）細胞は、４８時間後に創傷単層を修復できなかった。従って、さらなる研究では悪性卵巣癌細胞の浸潤能を制御する重要な遺伝子としてＫＲＴ１４に焦点を当てた。
実施例４
腹膜微小環境モデル
腹膜微小環境モデルを用い、ＫＲＴ１４が転移の最も早い段階で浸潤性卵巣癌細胞の「前縁」で発現されることを検出した。これらの細胞は、「リーダー細胞」と定義される。このモデルでは、ＣＩＭ－１６ ＲＴＣＡプレート中で、卵巣癌スフェロイドを中皮単層上に重層し、マトリゲルマトリックス上に確立した。スフェロイドの接着および中皮単層／マトリックスを経た浸潤を、浸潤細胞挙動の動的速写が得られるｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ装置を用いてリアルタイムで監視した。
良性（卵巣線維腫）または悪性（ＨＧＳＣ）疾患のいずれかを有する患者からのスフェロイドを腹水から単離し、浸潤能を評価した。悪性ＨＧＳＣ細胞は急速に中皮単層を経て浸潤し、総てのサンプルが添加４時間以内に活発な浸潤を示した。対照的に、良性線維腫を有する患者から得られたスフェロイドは、中皮単層を破壊することができなかった。よって、癌細胞浸潤の開始はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて中皮単層と接触すると速やかに見られ、浸潤に関与する初期イベントの分析の時間枠が示唆される。
実施例５
リアルタイムｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ
リアルタイムｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ(Bilandzic and Stenvers (2014) J Vis Exp 87)を用いて中皮単層を経た卵巣癌細胞浸潤を測定し、ＫＲＴ１４の遺伝的除去（Ｋ１４ＫＯ）が複数の卵巣癌細胞株（ＣＶＡＲ４およびＣａＯＶ３）（図２）、ならびに腹水から回収された初代卵巣癌細胞（ｎ＝５）（データは示されていない）の浸潤能を完全に排除したことが示された。他の研究と一致して(Papafoliou et al. (2016) 前掲; Rock et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106(31):12771-12775)、ＫＲＴ１４発現の欠損は、細胞生存率および増殖能に対して効果がなかった。ＫＲＴ１４ＫＯ卵巣癌細胞はまた、創傷治癒アッセイにおいて傷害された細胞単層を修復することもできず、遊走能の欠如を示した（図２Ｂ）。また、多細胞スフェロイドとして培養されたＫＲＴ１４ＫＯ卵巣癌細胞は、中皮単層に対する結合の低下を示し、上皮性卵巣癌（ＥＯＣ）浸潤の重要な要件である(Iwanicki et al. (2011) Cancer Discov 1(2):144-157)中皮の排除を開始することができなかった（示されていない）ことも認められた。同系卵巣癌マウスモデル(Roby et al. (2000) Carcinogenesis 21(4):585-591)を用いたｉｎ ｖｉｖｏ研究は、マウスの嚢内に移植したＫＲＴ１４ＫＯ卵巣癌細胞は腫瘍を確立できず（図３）、ＫＲＴ１４ＫＯ細胞を移植したマウスは腹部膨満または他のいずれの症状も生じなかったことを示した。
実施例６
遊走細胞はＫＲＴ１４発現の上昇を示す
（ｉ）原発腫瘍組織；（ｉｉ）腹水由来ＨＧＳＣ細胞；および（ｉｉｉ）良性細胞；（ｉｖ）組織学的に正常な卵巣；および（ｖ）標的腹膜細胞層ＬＰ９単独（各群ｎ＝３）を含む臨床検体からの遊走細胞においてＫＲＴ１４ ｍＲＮＡ発現を測定した。総ての悪性細胞はアッセイ開始時にＫＲＴ１４を発現し、良性線維腫、正常卵巣またはＬＰ９中皮細胞では発現は検出されなかった。細胞株と一致して、遊走細胞は悪性サンプル（すなわち、腫瘍組織または腹水由来）でのみ検出され、良性腹水、正常対照から単離された細胞またはＬＰ９細胞単独は浸潤することができなかった。ＫＲＴ１４発現は、原発腫瘍サンプルでは、遊走前サンプルに比べて、下方チャンバーに遊走した浸潤細胞において有意に高密度であり、腹水由来卵巣癌細胞集団が最高レベルのＫＲＴ１４ ｍＲＮＡを示した。これらのデータを合わせると、ＫＲＴ１４は細胞生存率または増殖に影響を及ぼさないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて遊走癌細胞サブセットの浸潤能を維持するために特に必要とされ、
活発に浸潤している細胞では有意に高密度であることを示す。
実施例７
ＫＲＴ１４はスフェロイドのアセンブリおよび中皮への接着に影響を及ぼすＨＧＳＣ細胞の亜集団に限定される
ＫＲＴ１４の存在量および卵巣癌細胞（不死化および初代腹水由来の両方）における局在を免疫染色により決定した。単層培養において、ＫＲＴ１４は少数の単独細胞に限定されたが、低接着条件下で培養したスフェロイドは、もっぱらスフェロイド外縁に局在したＫＲＴ１４免疫染色を示した。抗Ｎ－カドヘリン抗体はスフェロイド全体に効果的に浸透したことから、内部ＫＲＴ１４染色が存在しないのは、スフェロイドから抗体が閉め出されているためではなかった。ＫＲＴ１４ＫＯおよびＫＲＴ１４過剰発現（ＫＲＴ１４ＯＥ）株を調べることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるスフェロイド形成にＫＲＴ１４発現が必要とされるかどうかを評価した。野生型ＯＶＣＡＲ４細胞および非標的ＣＲＩＳＰＲ対照でトランスフェクトされた細胞は、低接着培養１２時間後にスフェロイドを形成し、対照的に、ＫＲＴ１４ノックアウト細胞は１２時間後も主として分散したままであった。しかしながら、長期インキュベーション（４８時間）は、対照に匹敵するサイズおよび形態のスフェロイドの形成をもたらした。これに対して、ＫＲＴ１４ＯＥ株は、速やかに高密度でコンパクトなスフェアを形成し、１２時間の培養期間の後に元のスフェアからの目に見える成長を明らかに示した。非処理対照に比べて、ＫＲＴ１４ＫＯスフェロイドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて中皮単層に対する接着能が有意に低下していた。
実施例８
ＫＲＴ１４＋細胞は浸潤突起の形成および中皮の排除をもたらす
中皮単層上に植え込んだ場合、野生型ＨＧＳＣスフェロイドは２４時間以内に成長、中皮の排除および広範囲の付着および遊走を示した。Ｋ１４を過剰発現する細胞は速やかに分散し、中皮層に取って代わり、対照的に、ＫＲＴ１４ＫＯ細胞は中皮単層を破壊することができなかった。マトリックスタイプが浸潤に影響を及ぼすかどうかを調べるために、スフェロイド（細胞株および腹水由来ＨＧＳＣ細胞の両方）をマトリゲルまたはコラーゲン－Ｉマトリックスのいずれかに包埋し、浸潤突起の成長を経時的に監視した。コラーゲンＩマトリックスでは１２時間後に野生型スフェロイドからＫＲＴ１４＋浸潤突起が出現したが、マトリゲルでは明らかになるまでに４８～７２時間（細胞種に依存）を要した。免疫染色は、ＫＲＴ１４＋細胞は特に浸潤突起に局在することを示し、非浸潤性スフェロイドコア細胞はＫＲＴ１４－表現型を維持していた。このことは単層掻爬アッセイで確認され、ここでは、ＫＲＴ１４＋細胞は特に創傷閉鎖領域に局在した。それらの浸潤能の欠損と一致して、ＫＲＴ１４ＫＯ細胞は、いずれのマトリックスでも目に見える浸潤突起を形成することはできなかった。これらのデータを合わせると、ＫＲＴ１４の発現は活発に浸潤している細胞の特徴であること、およびその欠損は、腫瘍成長中にスフェロイドが中皮に取って代わり拡散する能力を有意に妨げることが示唆される。
実施例９
ＫＲＴ１４は腫瘍病期に関連し、卵巣癌患者の無増悪生存の負の予測因子となる
ＫＲＴ１４の発現の臨床的関連を確立するために、卵巣癌の複数の組織学的サブタイプ、グレードおよび病期、ならびに正常卵巣および卵管切片を含んでなる組織マイクロアレイ（ｎ＝２９２）をＫＲＴ１４の存在量および局在に関して染色した。ＫＲＴ１４の発現は一般に、正常卵巣組織（５％、１／２０）または卵管組織（０％、０／８）では検出されなかったが、検討した総ての卵巣癌サブタイプによって普遍的に発現された。染色は腫瘍上皮に局在し、間質組織におけるＫＲＴ１４の証拠はほとんどなかった。特に、ＫＲＴ１４は、ＨＧＳＣ組織の１００％に検出され、正常卵巣に比べて有意に上昇していた（ｐ＝０．０３６２、テューキーの事後検定を用いる対応のないｔ検定）。
次に、１５の公開卵巣癌データセット(http://www.cbioportal.org/) [Lanczky et al. (2016) 前掲]において、ＫＲＴ１４の発現と患者の予後の間の潜在的関係を問い合わせた。高いＫＲＴ１４発現は無増悪生存期間（ＰＦＳ）の短縮と関連があり（ＨＲ１．１７；９５％ＣＩ１．０３～１．３３ Ｐ＜０．０１５）、特に、初期段階（病期Ｉ～ＩＩ）の疾患を有すると診断された患者で関連があった（ＨＲ １．９６；９５％ＣＩ１．０８～３．５６ Ｐ＜０．０２５）。高いＫＲＴ１４発現はまた、白金およびタキソールに基づく化学療法後のＰＦＳの短縮とも関連があり（ＨＲ１．２７；９５％ＣＩ１．０７～１．５１ Ｐ＜０．００６）、最適な腫瘍減量後のＰＦＳの負の予測因子であった（ＨＲ１．２４；９５％ＣＩ１．０３～１．５ Ｐ＜０．０２６）。よって、ＫＲＴ１４に軽度の欠失を有する患者は、化学療法に対する感受性がより高くなり、一次療法に対する応答の改善を示した。よって、ＫＲＴ１４の発現は、高悪性度漿液性卵巣癌を有する患者の予後の独立した予測因子である。
実施例１０
マウスへの移植
ＫＲＴ１４ＫＯ細胞を移植したマウスにおいて、剖検において腫瘍の定着、または蛍光腫瘍細胞でさえ検出されなかったが、このことは、腫瘍が移植できなかったことだけでなく、その後、術後に排除されたことを示唆する（図３）。無傷細胞のフローサイトメトリーおよび免疫細胞化学染色を用い、ＫＲＴ１４のＮ末端が細胞表面に露出していることを見出した（図４）。他の研究と一致して(Papafotiou et al. (2016) 前掲; Rock et al. (2009) 前掲)、ＫＲＴ１４＋細胞は、腫瘍細胞集団のあるサブセットだけを表した（図４Ａ）。ＫＲＴ１４のＮ末端またはＣ末端のいずれかに対するポリクローナル抗体を用い、Ｎ末端に対する抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて浸潤を妨げることができ、ＫＲＴ１４遺伝子ノックアウトの効果を模倣することが確認された（図４Ｂ）。抗Ｃ末端抗体は、ＫＲＴ１４のＣ末端領域の十分に確立された細胞内局在と一致して、浸潤に影響を及ぼさなかった（図４Ｂ）。外的に加えた全長組換えＫＲＴ１４タンパク質は抗体結合に関して競合することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて浸潤を回復させた(resprted)（図４Ｂ）。よって、浸潤能の欠損は直接的にＫＲＴ１４の抗体の結合によるものであった。さらに、この効果は、ＫＲＴ１４のＮ末端への抗体結合によって媒介され、このＮ末端は、抗体結合に接近可能な細胞の外側に露出していた。
実施例１１
抗原性および疎水性プロット
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでＫＲＴ１４の最初の２００個のアミノ酸を調べるために抗原性および疎水性プロットを用いた（図５Ａ）。５つの潜在的に抗原性の領域を推定し、これらの領域を包含する６つのペプチドを、さらなる競合アッセイで使用するために合成した。ペプチド＃４および＃５によるＮ末端抗体のブロックは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて卵巣癌細胞の浸潤（図５Ｂ）および遊走（図５Ｃ）を回復させた。ペプチド１、２、３および６は、使用するポリクローナル抗体により認識されるにもかかわらず、完全な浸潤能および／または遊走能を回復させることはできなかった。抗体およびペプチド競合アッセイに基づき、ＫＲＴ１４タンパク質の表面露出領域は、アミノ配列ＮＨ２－ＧＦＧＧＧＹＧＧＧＬＧＡＧＬＧＧＧＦＧＧＧＦＡＧＧＤＧＬ（配列番号１）内に定義された。このアミノ酸配列が、無傷の細胞においてＫＲＴ１４のＮ末端を標的とするモノクローナル抗体の産生を目的にマウスを免疫するために使用された。
実施例１２
ＫＲＴ１４の抗血清
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてブロッキングされる癌細胞浸潤の能力に関して、指定されたＫＲＴ１４エピトープを含有するタンパク質フラグメントに対して本発明者らが作製した自家製マウス抗血清ＡＮ－１７ Ｏ２００２３を評価するために、機能的試験が使用される。
リアルタイム浸潤アッセイを、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）ＤＰ ６ウェル装置（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）を無血清培地（ＳＦＭ）でのインキュベーションによりＧｏ期に同調させ、マトリゲルマトリックス（ＳＦＭ中１：１０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）でコーティングしたＣＩＭ－１６ウェルプレートの上のチャンバーに播種した（４×１０４細胞／ウェル）。１０％ｖ／ｖ ＦＢＳを含有する培地を下のチャンバーに化学遊走物質として添加した。マウスＡＮ－１７ Ｏ２００２３由来の抗血清（ＳＦＭで１：１００希釈）、対照血清またはＫＲＴ１４に対する市販のポリクローナル抗体（（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７；ＳＦＭ中１μｇ／ｍｌ）を上のチャンバーに加え、２４時間、１５分毎に浸潤の測定を行った。アッセイの完了時に細胞生存率をアラマーブルー染色により評価した。総てのアッセイを３反復で行った。抗血清ＡＮ－１７ Ｏ２００２３を、指定されたＫＲＴ１４エピトープを含有するタンパク質フラグメントに対して作製した。
非処理および血清単独対照ウェルでは、植え込み５時間以内に浸潤が見られた（図６Ａ）。市販のポリクローナル抗ＫＲＴ１４（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７；指定されたＫＲＴ１４エピトープを認識し得る）で処理した細胞は、浸潤の阻害を示した。抗血清ＡＮ－１７ Ｏ２００２３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、精製された抗ＫＲＴ１４ポリクローナル抗体に対するものと同様の有効性で効果的に浸潤を遮断し（図６Ａ）、その効果的な標的認識を示した。エンドポイントにおいて非処理細胞と対照または抗血清処理細胞（図６Ｂ）の間に生存率に関する有意差はなく、浸潤の欠如は増殖能の傷害によるものではなかったことが示唆される。
抗血清ＡＮ－１７ Ｏ２００２３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて卵巣癌細胞の浸潤能を、商業的に入手可能な製剤と同等の有効性で効果的に遮断した。この効果は増殖の傷害によるものではなく、従前に見られたように浸潤に特異的なものであった。この抗体は、進行中のリード化合物としての特性決定に好適である。
実施例１３
非卵巣癌細胞に対する効果
抗ＫＲＴ１４抗体を、それらが他の（非卵巣）固形腫瘍種に由来する癌細胞による浸潤を防ぐことができるかどうか試験するために使用した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷修復アッセイは、ＡＮ３ＣＡ子宮内膜癌およびＳＷ６２０結腸直腸癌細胞株を用いて行った。細胞を１２ウェルプレートにて完全培地中でコンフルエントに達するまで増殖させ、次いで、一晩、血清飢餓状態としてＧ０で同調させた。翌日、細胞培養培地を除去し、吸引を取り付けたピペットチップで擦過することにより細胞単層に創傷を形成した。ＰＢＳで穏やかに洗浄することにより非接着細胞を除去した。細胞を、完全増殖培地＋／－市販ＫＲＴ１４抗体（１μｇ／ｍｌ）単独中で、または１μｇ／ｍｌの競合ペプチドと組み合わせてインキュベートした。０～７２時間の範囲で、定期的に位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）下で創傷領域の画像を得た。創傷の閉鎖はＡｎａｌｙＳＩＳ ＬＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて画像系で測定し、各日の創傷面積を求めた。各増殖条件で観察した少なくとも６か所の創傷領域で３回実験を繰り返し、１６時間の収集点からのデータを示した。
子宮内膜癌および結腸直腸癌細胞株は、培養１６時間後に抗ＫＲＴ１４抗体の存在下で創傷治癒の障害を示した（図７）。競合ＫＲＴ１４エピトープの存在下で、創傷治癒能は非処理対照で見られたレベルにまで回復した。
抗ＫＲＴ１４抗体は、卵巣癌細胞で見られた阻害と同様に、結腸直腸癌および子宮内膜癌細胞株の遊走挙動を阻害した。競合アッセイから明らかなように、阻害は定義されたＫＲＴ１４エピトープに特異的である。これらのデータは、抗体により媒介されるＫＲＴ１４の阻害は複数の固形腫瘍種において浸潤を阻害する汎癌機構として働き得ることを示唆する。
実施例１４
抗体の異種間効果
抗ヒトＫＲＴ１４抗体を、非ヒト卵巣癌細胞において浸潤を妨げるそれらの能力に関して評価した。
実験は総て、マウスＩＤ８卵巣癌細胞株を用いて行った。リアルタイム浸潤アッセイ（実施例５の通り）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷修復アッセイ（実施例６の通り）を記載のように行った。
ヒトＫＲＴ１４エピトープに特異的な抗ＫＲＴ１４抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてマウス癌細胞の遊走を効果的に遮断した（図８Ａ）。ペプチド競合アッセイ（実施例６に記載の通り）はこれらの細胞で遊走能を回復させ（図８Ａ）、ＫＲＴ１４エピトープに対する特異性を示す。
リアルタイム浸潤アッセイにより、抗ＫＲＴ１４抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＩＤ８細胞の浸潤を、ヒト細胞株において見られたものと同等の有効性で遮断したことが確認された（図８Ｂ）。
ＫＲＴ１４の抗原エピトープは、複数の種の間で高い相同性（＞８０％）を示す。従って、このヒトエピトープに対する抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、非ヒトタンパク質に効果的に結合して細胞の遊走および浸潤を阻害し得る。これらのデータは、抗ＫＲＴ１４療法が種にわたって適用可能であることを示唆する。
実施例１５
ｍＡｂ ＡＮ－１７はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて標準治療の化学療法と相乗作用する
本研究は、遊走および浸潤を損なうことが示されている（本明細書の他所に示される通り）モノクローナル抗体ＡＮ－１７（ｍＡｂ ＡＮ－１７）により細胞表面抗原ＫＲＴ１４を標的化することが卵巣細胞を標準的な第１選択化学療法薬、シスプラチンに対して感受性とするかどうかを決定するために行った。
リアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）を従前に記載されているように（ＰＭＩＤ：３１４４３４７８；Bilandzic et al., Cancers (Basel). 2019; 11(9), E1228）、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＳＰ ９６ウェル装置（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。細胞株を無血清培地中で一晩のインキュベーションによりＧ０で同調させ、０．５×１０３細胞／０．１５ｍｌ／ウェルで播種した。２４時間後、シスプラチン単独（１．２５ｍｇ／ｍｌ）、ｍＡｂ ＡＮ－１７単独（１ｕｇ／ｍｌ）またはシスプラチンとｍＡｂ ＡＮ－１７のいずれかの組合せを加えた。実験期間に１５分毎にインピーダンスの読み取りを行った。ｍＡｂ ＡＮ－１７は、それぞれ配列番号２および４の核酸配列によりコードされた配列番号３の重鎖可変領域および配列番号５の軽鎖可変領域を含んでなる（図２１および２２もまた参照）。
１５μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌでの細胞のシスプラチン処理は完全な細胞死をもたらしたが、１．２５μｇ／ｍｌの用量は亜致死量であり、細胞は増殖し続けた（図９）。従前に示したように、ｍＡｂ ＡＮ－１７単独は、細胞生存率または増殖に効果を及ぼさなかった。しかしながら、細胞の、ｍＡｂ ＡＮ－１７およびシスプラチンとの同時インキュベーションは、試験した総ての用量で化学療法に比べて細胞生存率および増殖を有意に低下させた（図９）。最も顕著な効果は、シスプラチンが１．２５μｇ／ｍｌの亜致死用量で使用された場合に認められ、ｍＡｂ ＡＮ－１７との同時インキュベーションは、約５０時間後に、１２倍多いシスプラチン用量単独と同様に完全細胞死をもたらした（図９）。よって、ｍＡｂ ＡＮ－１７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける標準的な白金化学療法に対して細胞感受性を少なくとも１０倍高める働きをする。
実施例１６
ｍＡｂ ＡＮ－１７は、約１０，０００抗原のパネルに対して検出可能な交差反応性を示す
ｍＡｂ ＡＮ－１７がタンパク質抗原のパネルに対して交差反応性を示すかどうかを確認するための以下の実験を行った。
ｍＡｂ ＡＮ－１７抗体反応性のプロテオミクスプロファイリングを、２反復でスポットした９，１８４の各組換えヒトタンパク質を含んでなるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）ヒトタンパク質マイクロアレイｖ５．０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム ＭＡ）を用いて行った。総ての手順を従前に記載したように行った(PMID:29141850; Wilson et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018; 27(2):183-192)。アレイを、洗浄バッファーで１：５００希釈したｍＡｂ ＡＮ－１７を用いてプローブした。ＩｇＧ重鎖および軽鎖に対する蛍光検出抗体は、Ａｂｃａｍ（＃ａｂ１５０１１９ ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、予備吸着）からのものであり、使用前に洗浄バッファーで２ｍｇ／ｍｌに希釈した。検出抗体単独とともにインキュベートした単一のアレイを非特異的抗体結合の対照として使用した。
アレイイメージングは、６３５ｎｍ励起レーザーおよびデュアルバンドパスＣｙ３／Ｃｙ５フィルターを用い、記載されているように(PMID: 29141850; Wilson et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018; 27(2):183-192)Ｆｕｊｉ ＦＬＡ５１００マルチ波長スキャナーを使用して行った。画像は、１０００ＶでＰＭＴセットを用いて、１０μｍ分解能で取得した。アレイアラインメント、特徴の抽出およびデータの正規化は、従前に記載されているように行った(PMID: 29141850; Wilson et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018; 27(2):183-192)。アレイ座標は、生産者が提供するダウンロード可能なＧＡＬファイル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；(http://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/biomarker-discovery/protoarray/resources/lot-specific-information.html)か入手した。
ｍＡｂ ＡＮ－１７または二次抗体単独との抗原反応性を示す各アレイ画像は、図１０に示す。対照アレイとｍＡｂ ＡＮ－１処理アレイの間に有意差は無く、ｍＡｂ ＡＮ－１７は供試アレイ上に存在するタンパク質のいずれとも反応なかったことが示唆される。
これらのデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるその標的抗原（ＫＲＴ１４）に対するｍＡｂ ＡＮ－１７の高い特異性を示す。ｍＡＢ ＡＮ－１７は、いくつかの関連のケラチンタンパク質を含む、アレイ上に存在する抗原のいずれとも反応せず、よって、ｍＡｂ ＡＮ－１７はその標的抗原と高い親和性を示す。
実施例１７
ｍＡｂ ＡＮ－１７はウエスタンブロット法によりＫＲＴ１４を検出する
全長組換えＫＲＴ１４タンパク質（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ７３６３７）の１μｇアリコートをＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、標準法（ＰＭＩＤ：２３９５２９８７）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。この膜を１：１０００、１：５０００および１：１０，０００の希釈率のｍＡｂ ＡＮ－１７でプローブした。二次抗体は、ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート（１：５０，０００希釈）であり、標準プロトコール(PMID: 23952987; Rainczuk et al., J Proteome Res. 2013; 12(9):4074-88)に従って化学発光を用いてＫＲＴ１４を検出した。
全長ＫＲＴ１４タンパク質は、一次抗体としてｍＡｂ ＡＮ－１７を用い、ウエスタンブロット法により上手く検出された（図１１）。複数の希釈液から強いシグナルが得られた。
実施例１８
ｍＡｂ ＡＮ－１７はフローサイトメトリーによりＫＲＴ１４＋リーダー細胞および循環腫瘍細胞を識別する
フローサイトメトリーを標準プロトコール（ＰＭＩＤ：３０６０２６６１）に従って行い、データはＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアｖ１０．５．０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。ＫＲＴ１４＋細胞集団に関して評価したサンプルは、ＯＶＣＡＲ３、ＣＡＯＶ４、ＩＤ８マウス卵巣癌細胞、臨床検体（＃３．１９３７－０７と呼称）から得られた腹水由来卵巣癌細胞および上皮卵巣腫瘍を担持する１２週齢のマウスからの心血液を含んだ。細胞株については、細胞株当たり１×１０６細胞を、ｍＡｂ ＡＮ－１７（１：２００希釈）または陽性対照としての市販の抗ＫＲＴ１４ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７；１：５０希釈）とともに、室温、非免疫血清中で４５分間インキュベートした。二次抗体、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７（ｍＡｂ ＡＮ－１７）またはヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８（市販のＡｂ）を１：５００希釈し、３０分間インキュベートした。血液サンプルについては、２×１０６細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートｍＡｂ ＡＮ－１７抗体とともに４５分間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁させ、データはＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを用いて取得した。
ＫＲＴ１４を発現する細胞をフローサイトメトリーにより検出し、細胞株（ヒト－ＯＶＣＡＲ４、ＣＡＯＶ４；マウス－ＩＤ８）および臨床的に得られた卵巣癌細胞（３：１９３６７－０３）において、市販のポリクローナル抗体Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７（図１２）と比較して、ｍＡｂ ＡＮ－１７を用いた場合も同等の検出であった。
細胞外ＫＲＴ１４の発現はまた、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）集団もマークする。従前にＰＭＩＤ：３０６０２６６１(Wilson et al. Cancers (Basel). 2018; 11(1), E32)に記載されているようにマウス卵巣癌モデルを用い、ＣＴＣは、近赤外線蛍光団ｉＲＦＰ７２０を強制的に発現する。卵巣癌を有するマウスからの全血をプローブするためにｍＡｂ ＡＮ－１７を使用し、ＫＲＴ１４＋ｉＲＦＰ＋細胞に関してフローサイトメトリーにより分析した。ｍＡＢ ＡＮ－１７は全血からｉＲＦＰ＋細胞を正しく識別することができ、ＣＴＣを識別および捕捉するためのその有用性を示す。
ｍＡｂ ＡＮ－１７は、フローサイトメトリーにより、市販の抗ＫＲＴ１４ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７）に匹敵する感受性でＫＲＴ１４＋細胞を識別した。さらに、ｍＡｂ ＡＮ－１７は、ＩＤ８ ｉＲＦＰ７２０＋上皮卵巣腫瘍を担持するマウスから、フローサイトメトリーによりＫＲＴ１４＋ ＣＴＣを検出および単離することができた。よって、ｍＡｂ ＡＮ－１７などの抗ＫＲＴ１４結合剤は、ＣＴＣの捕捉および分析を含む診断および／または予後試験における使用に可能性を有する。これらのデータはまた、ｍＡｂ ＡＮ－１７などの抗ＫＲＴ１４結合剤は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてこれらの細胞を治療的に標的とするために使用可能であることも示した。
実施例１９
ｍＡｂ ＡＮ－１７は、免疫蛍光染色によりＫＲＴ１４＋細胞を検出する
卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ－３、Ｏｖｃａｒ４およびＣｏｖ３６２．３は、９６ウェルブラックフルオルトラックイメージングプレートに播種した。無傷細胞または固定細胞（１％パラホルムアルデヒド；ＰＦＡ）および透過処理細胞（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）をｍＡｂ ＡＮ－１７で染色した。固定細胞の場合、サンプルを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）でブロッキングした後、室温で１時間、１μｇ／ｍｌ ｍＡｂ ＡＮ－１７で染色した。その後、室温で１時間、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：２０００のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）－６４７ヤギ抗マウス二次抗体で染色した。無傷細胞の場合、サンプルを １％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中、Ａｌｅｘａ－６４７にコンジュゲートした１μｇ／ｍｌのｍＡｂ ＡＮ－１７で３７℃にて２時間染色し、培地を新鮮なＰＢＳ／１％ＦＢＳで置換し、すぐに細胞の画像を得た。サンプルの画像はＣｙｔａｔｉｏｎ ３マルチモードリーダーを用いて倍率４倍で得た。
ｍＡｂ ＡＮ－１７の特異的細胞内細胞質局在は、透過処理を施した卵巣癌細胞株サンプルで見られた（図１４）。無傷の生細胞において、ｍＡｂ ＡＮ－１７の所定の細胞表面局在を観察した。
これらのデータは、ｍＡｂ ＡＮ１７が細胞において免疫蛍光によりＫＲＴ１４に関して染色するために効果的に使用可能であることを示す。染色は、生きた無傷細胞と固定透過処理細胞の両方で有効である。
実施例２０
ｍＡｂ ＡＮ－１７は癌組織切片において免疫組織化学染色によりＫＲＴ１４＋細胞を検出する
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルに対する免疫組織化学法は、標準プロトコール（ＰＭＩＤ：３１４４３４７８；Bilandzic et al., Cancers (Basel). 2019; 11(9), E1228）を用いて行った。ｍＡｂ ＡＮ－１７の有効性をある濃度範囲（２μｇ／ｍｌ～０．２５μｇ／ｍｌ）で試験し、一晩のインキュベーションの後に、市販の抗ＫＲＴ１４抗体（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７、１：１００希釈）およびマウスＩｇＧ対照と比較した。記載のように二次抗体とのインキュベーションの後、抗体結合および局在を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキットを産生者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、ＣＡ、ＵＳＡ）の説明書に従って用い、褐色沈澱として可視化した。
ｍＡｂ Ａ－１７を用いて染色した組織は、市販の抗ＫＲＴ１４ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７）と同一の局在を示し、染色は腫瘍上皮に特異的に見られた（図１５）。間質組織に染色の証拠はほとんど見られず、マウスＩｇＧ対照に対する染色は見られなかった。シグナル存在量は、市販のポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ４５０１６５７）と比較した場合、拡散が少なかった。
これらのデータは、ｍＡｂ ＡＮ－１７が腫瘍組織切片においてＫＲＴ１４を局在させるために効果的に使用可能であることを示す。
実施例２１
ｍＡｂ ＡＮ－１７はｉｎ ｖｉｖｏにおいて検出可能な急性毒性を持たない
卵巣腫瘍の誘導；従前に記載されているように(PMID:30602661; Wilson et al. Cancers (Basel). 2018; 11(1), E32)、マウスＩＤ８卵巣腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの嚢内に移植し、原発腫瘍を約４週間発達させた。
ｍＡｂ ＡＮ－１７毒性の評価；マウス（ｎ＝２／用量／時点）に腹腔内注射により単一用量のｍＡｂ ＡＮ－１７またはアイソタイプ適合対照ＩｇＧκ抗体（Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ（商標）精製マウスＩｇＧ１、κアイソタイプＣｔｒｌ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０１４１１）を施した後、最大７日間、毒性に関する臨床徴候を監視した。０．５、１．０、２．５、５．０および１０ｍｇ／ｋｇの用量を評価した。７日後、マウスを犠牲にし、毒性の証拠（顕微鏡的組織外観、炎症の存在、または明らかな病変）に関して死後検査した。
総てのマウス（腫瘍および非腫瘍）の試験期間の毒性作用（注射後の初期反応、苦痛の徴候）の証拠、および死後の毒性の証拠（上記の通り）を評価した。いずれの時点でも、またはいずれの供試用量でも、注目される毒性作用の証拠は無かった。
実施例２２
ｍＡｂ ＡＮ－１７はｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍組織に特異的に局在し、健常組織には保持されない
ｍＡｂ ＡＮ－１７またはアイソタイプ適合対照ＩｇＧκ抗体（Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ（商標）精製マウスＩｇＧ１、κアイソタイプＣｔｒｌ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０１４１１）を、製造者の説明書に従い、１：１０比のＡＬＥＸＡ６４７またはＡＬＥＸＡ７５０蛍光色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。マウス（ｎ＝２／群）に、腹腔内注射（１００μｌ）により０．５、１．０、２．５、５．０または１０．０ｍｇ／ｋｇのＡＬＥＸＡ標識ｍＡｂ ＡＮ－１７またはアイソタイプ対照ＩｇＧκ（上記の通り）を施した。対照マウスにはビヒクル（ＰＢＳ）単独を施した。注射後４時間～７日の時点でマウスを犠牲にし、選択された組織（肝臓、腎臓、脾臓、腸、卵巣＋卵管／卵巣腫瘍（該当する場合）、脳、心臓、肺）を採取した。組織分布およびクリアランスを、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＡＬＥＸＡ６４７またはＡＬＥＸＡ７５０蛍光により評価した。明視野（自動露出）および蛍光イメージング（ＡＬＥＸＡ６４７ ｅｘ６４０、ｅｍ６７０；またはＡＬＥＸＡ７５０ ｅｘ７４０、ｅｍ７９０ｎｍ）。スペクトルのアンミキシングおよび画像解析は、従前に記載されているように行った(PMID: 30602661; Wilson et al., Cancers (Basel). 2018 Dec 31;11(1), E32)。各ケースで、ビヒクル処置動物からのバックグラウンド平均放射効率を蛍光測定値から減算し、得られたデータを比較のためにプロットした。
単一用量の０．５ｍｇ／ｋｇの投与の後に、７日間にわたって健常組織（卵巣腫瘍を持たないマウスを使用）におけるｍＡｂ ＡＮ－１７の局在を非標的アイソタイプ対照抗体と比較した。各場合において、死後検出を補助するために、抗体を蛍光標識した。抗体会合蛍光は腸、生殖器官、肝臓、腎臓、脾臓、肺および心臓で見られ、脳では蛍光は検出されなかった（図１６）。しかしながら、ＡＮ－１７とアイソタイプ対照ＩｇＧκ抗体の間に有意差はなく、調べた健常組織のいずれにおいてもｍＡｂ ＡＮ－１７の特異的蓄積は示されなかった。さらに、７日までに、各抗体は総ての器官から大部分クリアランスされており（蛍光シグナルの欠如により判断）、ｍＡｂ ＡＮ－１７は長時間保持されなかったことが示唆される（図１６）。
抗体クリアランスは、低用量で７日までに完了したと思われるので、健常組織からのｍＡｂ ＡＮ－１７のクリアランスは、同様に複数の漸増用量（０．５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）で評価した。最高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）であっても、ｍＡｂ ＡＮ－１７は、総ての器官で７日後に視覚的に検出不能であり、一般に、対照抗体よりも低いレベルで存在した（図１７）。これらのデータは、ｍＡｂ ＡＮ－１７が健常組織において非選択的蓄積または保持を示さないことを示唆する。
次に、ｍＡｂ ＡＮ－１７の分布を、原発卵巣腫瘍を有するマウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの単一用量を用いて評価した。評価は７日間行った。投与後２４時間に、ｍＡｂ ＡＮ－１７は腫瘍組織に強い局在を示した（図１８）。健常組織とは異なり、ｍＡｂ ＡＮ－１７は腫瘍組織に持続し、７日後であってもなお検出可能であった（図１８）。より高い蛍光収量がまず１０ｍｇ／ｋｇ用量を施したマウスに見られたが、注射後３日までに、用量に関わらず同等レベルのｍＡｂ ＡＮ－１７が検出され、腫瘍は５ｍｇ／ｋｇ用量で飽和していた可能性があることが示唆される。さらに、腫瘍組織におけるｍＡｂ ＡＮ－１７検出の初期レベルは、腫瘍を持っていなかったマウスの生殖管において検出されたものよりも２桁高かった（図１８：パネルＡ、Ｂ、Ｃを比較）。
これらのデータは、ｍＡｂ ＡＮ－１７が腫瘍組織に特異的であり、投与後少なくとも１週間、腫瘍部位に持続することを示す。
本明細書に示されたデータは、ｍＡｂ ＡＮ－１７がその標的（ＫＲＴ１４）に対する高い特異性、最小の標的外効果および非標的組織における低い保持を示す。健常な非腫瘍担持マウスでは、ｍＡｂ ＡＮ－１７は健常器官における特異的保持を示さず、急速にクリアランスされると思われた。対照的に、ｍＡｂ ＡＮ－１７は卵巣腫瘍と会合して特異的に検出され、それはそこに少なくとも１週間持続した。いずれの用量またはいずれの時点においても注目される毒性はなく、このｍＡｂ ＡＮ－１７の高い特異性は、注射した際に有利な安全性プロファイルを付与することが示唆される。さらに、最大耐用量には達しなかった。よって、ｍＡｂ ＡＮ－１７は、良好な安全性プロファイルおよび腫瘍組織に対する高いｉｎ ｖｉｖｏ特異性を有する。
実施例２３
ｍＡｂ ＡＮ－１７処置はｉｎ ｖｉｖｏにおいて確立された卵巣腫瘍を上手く退縮する
これらの試験の目的は、ｍＡｂ ＡＮ－１７が同系マウスモデルにおいて確立された原発悪性腫瘍のモデルで腫瘍進行に影響を与えるように使用可能であるかどうか確認することであった。
従前に記載されているように（ＰＭＩＤ：３０６０２６６１）、マウスＩＤ８卵巣腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの嚢内に移植し、原発腫瘍を約４週間発達させた。原発腫瘍（ｎ＝１０／群）を有するマウスに、３週間、週２回の腹腔内注射により５ｍｇ／ｋｇでｍＡｂ ＡＮ－１７を施した。対照動物には等用量のアイソタイプ適合対照ＩｇＧκ抗体（対照群１）または等容量のビヒクル（ＰＢＳ）単独（対照群２）を施した。３週間の週２回の処置（月曜および木曜）の後、総てのマウスを犠牲にし、腫瘍のサイズおよび重量を評価した。２個体のさらなる非腫瘍担持動物を非手術対照として使用した。
ｍＡｂ ＡＮ－１７の週２回投与は、従前に単一用量試験（上記）により示されるように、動物に観察可能な有害作用を及ぼさなかった。３週間の継続的処置の後に、総てのマウスを犠牲にし、腫瘍サイズに対するｍＡｂ ＡＮ－１７投与の影響を評価した。ビヒクル単独で処置したマウス（対照群２）では、６／１０の動物（６０％）が原発卵巣腫瘍を有し（図１９）、同様に、アイソタイプ対照抗体で処置した６／１０個体（６０％）のマウス（対照群１）もまた原発腫瘍を有し、この非標的抗体は腫瘍進行に影響を及ぼさなかったことを示す。
ｍＡｂ ＡＮ－１７を施したマウスを分析した際、右卵巣（移植部位）の内部または表面にもそれらの動物の他所にも腫瘍は特定できなかった（図１９）。さらに、これらのマウスから抽出した卵巣は健常と思われ、非処理、非外科術対照との観察可能な形態学的差違はなかった。
ｍＡｂ ＡＮ－１７によるマウスの処置は、３週間後に検出不能なレベルにまで、確立された原発卵巣腫瘍の完全な退縮をもたらした。処置期間中に注目される有害作用はなく、ｍＡｂ ＡＮ－１７の投与が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて確立された固形腫瘍を治療するための安全かつ高効率の治療アプローチであることを示唆する。
実施例２４
ｍＡｂ ＡＮ－１７は複数の癌細胞において遊走および浸潤を遮断する
上記に概略を示した試験は、卵巣癌、結腸直腸癌および子宮内膜癌細胞株において、ｍＡｂ ＡＮ－１７による細胞遊走および浸潤の抗体特異的阻害を示した。他の癌細胞種の遊走および浸潤に対するｍＡｂ ＡＮ－１７の効果を調べるために以下の試験を行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷修復アッセイを以下の癌細胞株で行った：ＢＴ１６非定型奇形腫様ラブドイド（脳）癌、ＮＣＩ－Ｈ１５７３肺腺癌、ＳＪ－ＧＢＭ２原発多形性膠芽腫、ＡＮ３ＣＡ子宮内膜癌、ＳＷ６２０結腸直腸癌およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８乳癌。細胞を１２ウェルプレートにて完全培地中、コンフルエントに達するまで増殖させ、その後、一晩、血清飢餓状態としてＧ０で同調させた。翌日、細胞培養培地を除去し、吸引を取り付けたピペットチップで擦過することにより細胞単層に創傷を形成した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で穏やかに洗浄することにより非接着細胞を除去し、ｍＡｂ ＡＮ－１７（１μｇ／ｍｌ）の不在下または存在下、各ウェルに完全増殖培地を加えた。０～２４時間、毎時間、創傷領域の画像を得た。創傷の閉鎖はＡｎａｌｙＳＩＳ ＬＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて画像系で測定して各日の創傷面積を求めた。実験は、各増殖条件で観察した少なくとも６か所の創傷領域で３回実験を繰り返した。
図２３に示されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷修復アッセイを用いて刺激した場合、非処理細胞は、１６時間後に遊走し、創傷を閉鎖することができた。対照的に、ｍＡｂ ＡＮ－１７で処理した総ての細胞株は、同じ条件下で創傷を閉鎖することができなかった。これらのデータは、結腸直腸癌、子宮内膜癌および複数の卵巣癌細胞株において同様の効果を示す従前のデータと相応に、ｍＡｂ ＡＮ－１７が癌細胞の細胞遊走および浸潤を阻害することを示す。
これらのデータは、ＫＲＴ１４のアンタゴニストが、少なくとも卵巣癌細胞、子宮内膜癌細胞、脳癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞を含む複数の癌細胞種の遊走挙動を阻害することを示す。これらの癌種の異なる性質は、ｍＡｂ ＡＮ－１７などのＫＲＴ１４のアンタゴニストが癌細胞において保存性の高い経路を標的とし、従って、複数の腫瘍種の診断、予後および治療に適用可能であることを示唆する。
当業者は、本明細書に記載される開示が、具体的に記載されるもの以外の変形および改変を許容することを認識するであろう。本開示はこのような総ての変形および改変を企図すると理解されるべきである。本開示はまた、本明細書に個々にまたは集合的に言及されるまたは示される工程、特徴、組成物および化合物の総て、ならびにこれらの工程または特徴または組成物または化合物の任意の２つ以上のありとあらゆる組合せを可能とする。
参考文献
Figure 2022520383000006
Figure 2022520383000007
Figure 2022520383000008

Claims (59)

  1. 哺乳動物対象における癌の治療または予防のための方法であって、癌細胞上に存在するＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいは癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体のアンタゴニストの産生を誘導する薬剤の、癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を前記対象に投与することを含んでなる、方法。
  2. 前記癌が婦人科癌である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記婦人科癌が卵巣癌またはある病期もしくは形態の卵巣癌である、請求項２の方法。
  4. 前記癌が脳癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、腸癌、結腸癌、消化管癌、胃癌、咽頭癌、子宮内膜癌および結腸直腸癌から選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記哺乳動物対象がヒトである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ＫＲＴ１４の細胞外部分が配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体により定義される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記薬剤が配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体内のエピトープのアンタゴニストである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記アンタゴニストが配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体内のエピトープに特異的な抗体である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記抗体がモノクローナル抗体またはその脱免疫化形態である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記薬剤がＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を含んでなる癌細胞に特異的な免疫応答を誘導するワクチンである、請求項６に記載の方法。
  11. 前記ワクチンが、配列番号１またはその機能的等価物もしくは変異体に特異的な抗体を誘導するアンタゴニスト分子を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記薬剤が、細胞傷害性分子にコンジュゲートされた、配列番号１またはその機能的等価物もしくは変異体に特異的な抗体である、請求項６に記載の方法。
  13. ヒト対象における卵巣癌の治療のための方法であって、卵巣癌細胞上に存在する配列番号１により特定されるＫＲＴ１４の細胞外部分を標的とする抗体の、卵巣癌細胞の浸潤、遊走および／または転移を予防または軽減するために有効な量を前記対象に投与することを含んでなる、方法。
  14. 哺乳動物対象の癌の治療における薬剤の製造における、癌細胞上に存在するＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を標的とする薬剤、あるいはＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的等価物もしくは変異体のアンタゴニストの産生を誘導する薬剤の使用。
  15. 前記癌が婦人科癌である、請求項１４に記載の使用。
  16. 前記婦人科癌が卵巣癌またはある病期もしくは形態の卵巣癌である、請求項１５に記載の使用。
  17. 前記癌が脳癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、腸癌、結腸癌、消化管癌、胃癌、咽頭癌、子宮内膜癌および結腸直腸癌から選択される、請求項１４に記載の使用。
  18. 前記哺乳動物対象がヒトである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の使用。
  19. 前記ＫＲＴ１４の細胞外部分が配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体により定義される、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の使用。
  20. 前記薬剤が配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体内のエピトープのアンタゴニストである、請求項１９に記載の使用。
  21. 前記アンタゴニストが配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体内のエピトープに特異的な抗体である、請求項２０に記載の使用。
  22. 前記抗体がモノクローナル抗体またはその脱免疫化形態である、請求項２１に記載の使用。
  23. 前記薬剤が、ＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を含んでなる癌細胞に特異的な免疫応答を誘導するワクチンである、請求項１９に記載の使用。
  24. 前記ワクチンが、配列番号１またはその機能的等価物もしくは変異体に特異的な抗体を誘導するアンタゴニスト分子を含んでなる、請求項２３に記載の使用。
  25. 前記薬剤が、細胞傷害性分子にコンジュゲートされた、配列番号１またはその機能的等価物もしくは変異体に特異的な抗体である、請求項１９に記載の使用。
  26. 哺乳動物対象における癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分を特異的に標的とする薬剤を含んでなり、前記薬剤は前記癌細胞の細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制を直接誘導するか、または哺乳動物対象の体内で、細胞において前記癌の細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制を誘導するアンタゴニストを誘導する、医薬組成物
  27. 前記癌が婦人科癌である、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 前記婦人科癌が卵巣癌またはある病期もしくは形態の卵巣癌である、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 前記癌が脳癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、腸癌、結腸癌、消化管癌、胃癌、咽頭癌、子宮内膜癌および結腸直腸癌から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
  30. 前記哺乳動物対象がヒトである、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  31. 前記ＫＲＴ１４の細胞外部分が配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体により定義される、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  32. 前記薬剤が配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体内のエピトープのアンタゴニストである、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 前記アンタゴニストが配列番号１またはその機能的ホモログもしくは変異体内のエピトープに特異的な抗体である、請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. 前記抗体がモノクローナル抗体またはその脱免疫化形態である、請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 前記薬剤が、ＫＲＴ１４の細胞外部分またはその機能的ホモログもしくは変異体を含んでなる癌細胞に特異的な免疫応答を誘導するワクチンである、請求項３１に記載の医薬組成物。
  36. 前記ワクチンが、配列番号１またはその機能的等価物もしくは変異体に特異的な抗体を誘導するアンタゴニスト分子を含んでなる、請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 前記薬剤が、細胞傷害性分子にコンジュゲートされた、配列番号１またはその機能的等価物もしくは変異体に特異的な抗体である、請求項３１に記載の医薬組成物。
  38. リポーター分子にコンジュゲートされた、癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分に特異的な抗体を含んでなる、診断試薬。
  39. 患者において癌を検出するための方法であって、
    （ａ）前記患者からサンプルを得ること；
    （ｂ）前記サンプルをＫＲＴ１４の細胞外エピトープに結合する薬剤と接触させてそのレベルを決定し、そのレベルを、癌を有する患者の確率指数を得るためのアルゴリズムにかけること；および
    （ｃ）前記確率指数に基づき患者が癌を有するリスクを診断すること
    を含んでなる、方法。
  40. 患者において循環ＫＲＴ１４陽性癌細胞を検出するための方法であって、
    （ａ）前記患者から血液サンプルを得ること；
    （ｂ）前記血液サンプルを、ＫＲＴ１４の細胞外エピトープに結合する薬剤と接触させてサンプル中のＫＲＴ１４陽性癌細胞の存在を判定すること
    を含んでなる、方法。
  41. 患者における癌を監視する方法であって、
    （ａ）第１の時点で患者から血液サンプルを得ること；
    （ｂ）（ａ）のサンプルをＫＲＴ１４の細胞外エピトープに結合する薬剤と接触させて、前記サンプル中のＫＲＴ１４陽性癌細胞のレベルを決定すること；
    （ｃ）第２の時点で患者から血液サンプルを得ること、この第１の時点と第２の時点は異なる、
    （ｄ）（ｃ）のサンプルをＫＲＴ１４の細胞外エピトープに結合する薬剤と接触させて、前記サンプル中のＫＲＴ１４陽性癌細胞のレベルを決定すること；および
    （ｅ）前記患者においてＫＲＴ１４陽性癌細胞のレベルが第１の時点と第２の時点の間で変化したかどうかを決定すること
    を含んでなり、
    第１の時点と第２の時点の間での患者におけるＫＲＴ１４陽性癌細胞のレベルの変化が患者における癌の状態の変化を示す、方法。
  42. 癌、またはそのサブタイプもしくは病期に関して対象の状態を決定する方法であって、
    （ａ）通信ネットワークによってＫＲＴ１４の細胞外部分の存在の形態におけるデータを受信すること；
    （ｂ）前記対象データを、疾病指数値を提供するアルゴリズムによって処理すること；
    （ｃ）所定の値と比較した疾病指数値の結果に従って対象の状態を決定すること；および
    （ｄ）対象の状態の指標を通信ネットワークによってユーザーに伝達すること
    を含んでなる、方法。
  43. 癌細胞上のＫＲＴ１４の細胞外部分に特異的に結合し、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、ＶＨは、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ２および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ３を含んでなり、かつ、ＶＬは、配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ３を含んでなる薬剤、またはそのＫＲＴ１４結合フラグメント。
  44. ＶＨが、
    （ａ）配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨフレームワーク領域１（ＦＲ１）；
    （ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ２；
    （ｃ）配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ３；および
    （ｄ）配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ４
    を含んでなり；かつ、ＶＬが、
    （ｅ）配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ１；
    （ｆ）配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ２；
    （ｇ）配列番号１８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ３；および
    （ｈ）配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ４
    を含んでなる、請求項４３に記載の薬剤またはそのＫＲＴ１４結合フラグメント。
  45. （ａ）ＶＨが配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、
    （ｂ）ＶＬが配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、
    請求項４４に記載の薬剤またはそのＫＲＴ１４結合フラグメント。
  46. 薬剤が免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、ＶＨが配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ３を含んでなり；かつ、ＶＬが配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ３を含んでなる、請求項７～９、１２および３９～４１のいずれか一項に記載の方法、請求項２０～２２および２５のいずれか一項に記載の使用、または請求項３２～３４および３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  47. ＶＨが、
    （ａ）配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨフレームワーク領域１（ＦＲ１）；
    （ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ２；
    （ｃ）配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ３；および
    （ｄ）配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ４
    を含んでなり；かつ、ＶＬが、
    （ｅ）配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ１；
    （ｆ）配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ２；
    （ｇ）配列番号１８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ３；および
    （ｈ）配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ４
    を含んでなる、請求項４６に記載の方法、使用または医薬組成物。
  48. （ａ）ＶＨが配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ
    （ｂ）ＶＬが配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、
    請求項４７に記載の方法、使用または医薬組成物。
  49. 抗体が免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、ＶＨが、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＣＤＲ３を含んでなり；かつ、ＶＬが、配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＣＤＲ３を含んでなる、請求項１３に記載の方法または請求項３８に記載の診断試薬。
  50. ＶＨが、
    （ａ）配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨフレームワーク領域１（ＦＲ１）；
    （ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ２；
    （ｃ）配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ３；および
    （ｄ）配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＨ ＦＲ４
    を含んでなり；かつ、ＶＬが、
    （ｅ）配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ１；
    （ｆ）配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ２；
    （ｇ）配列番号１８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ３；および
    （ｈ）配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＶＬ ＦＲ４
    を含んでなる、請求項４９に記載の方法または診断薬。
  51. （ａ）ＶＨが配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、
    （ｂ）ＶＬが配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、
    請求項５０に記載の方法または診断薬。
  52. 前記癌が婦人科癌である、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法または請求項４３～４５のいずれか一項に記載の薬剤。
  53. 前記婦人科癌が卵巣癌またはある病期もしくは形態の卵巣癌である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記癌が脳癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、腸癌、結腸癌、消化管癌、胃癌、咽頭癌、子宮内膜癌および結腸直腸癌から選択される、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法または請求項４３～４５のいずれか一項に記載の薬剤。
  55. 前記対象に同時もしくは逐次に付加的抗癌薬を投与すること、ならびに／または前記対象に免疫療法、放射線療法および／もしくは外科的介入を行うことをさらに含んでなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記薬剤が付加的抗癌薬ならびに／または免疫療法、放射線療法および／もしくは外科的介入からなる群から選択される付加的療法との同時または逐次投与のために処方される、請求項１４～２５のいずれか一項に記載の使用。
  57. 付加的抗癌薬をさらに含んでなる、請求項２６～３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  58. 前記付加的抗癌薬がダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシンおよびミトキサントロン、白金系薬剤、代謝拮抗剤、プライムＴ細胞およびサイトカインからなる群から選択される、請求項５５に記載の方法、請求項５６に記載の使用または請求項５７に記載の医薬組成物。
  59. 代謝拮抗剤がアザセリン、Ｄ－サイクロセリン、ニコフェノール酸、トリメトプリム、５－フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）およびフルダラビンからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法、使用または医薬組成物。
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