KR20210126057A - 암세포에 존재하는 케라틴 14(krt14)의 세포외 부분을 표적화함으로써 암을 치료하거나 예방하는 방법 - Google Patents

암세포에 존재하는 케라틴 14(krt14)의 세포외 부분을 표적화함으로써 암을 치료하거나 예방하는 방법 Download PDF

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마리 빌란드지크
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허드슨 인스티튜트 오브 메디컬 리서치
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Abstract

암세포 상에 존재하는(resident) KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 이의 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생성을 유도하는 제제의 양(amount)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 포유류 대상체에서 암의 치료 또는 예방을 위한 방법, 용도 및 조성물이 본원에 개시된다. 본 개시내용은 또한, 대상체에서 암을 모니터링하고/거나 진단하는 방법까지 확장된다.

Description

암세포에 존재하는 케라틴 14(KRT14)의 세포외 부분을 표적화함으로써 암을 치료하거나 예방하는 방법
본 발명은 일반적으로, 암의 발병 또는 전이의 치료, 예방 또는 지연을 포함하여 암 치료법 및 이에 유용한 약제에 관한 것이다.
본 명세서에서 저자에 의해 참조되는 공개문헌의 참고문헌 세부사항은 상세한 설명의 끝부분에 알파벳순으로 기재하였다.
본 명세서에서 임의의 선행 공개문헌(또는 이로부터 유래되는 정보), 또는 알려져 있는 사항에 대한 참조는, 선행 공개문헌(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 기지의 사항이 본 명세서와 관련된 시도(endeavor) 분야에서 보편적인 상식의 파트를 형성한다는 인정 또는 승인 또는 임의의 형태의 시사로 간주되지 않으며, 그런 것으로 간주되어서도 안 된다.
암은 질병률(morbidity) 및 사망률(mortality) 비율이 높아 인간과 동물에게 영향을 미치는 가장 중요한 질환 중 하나로 존재한다. 예를 들어, 난소암은 여성에서 진단되는 9번째로 가장 흔한 암이다. 사실상, 난소암은 모든 부인과 암 중 가장 치명적이다. 난소암의 조기 진단과 치료에 상당한 자원(resource)이 투입되어 왔다. 수술적 및 화학치료적 개입 개선에도 불구하고, 난소암 생존율은 대략 25%로 꾸준하다(문헌[Vaughan 등 (2011) Nat Rev Cancer 11(10):719-725]).
난소암 환자 중 75% 초과 환자가 1차 임상 발표(clinical presentation)로 말기(late stage) 전이성 질환으로 진단된다. 치료는 대체로 공격적인 수술 및 화학치료법으로 제한된다. 치료에도 불구하고, 환자 중 90% 초과 환자는 종종 치료 후 1년 이내에 재발한다. 이들 환자 대다수에서, 재발성 종양(recurrent tumor)은 내화학성(chemoresistence)을 나타낸다. 이 현상은 추가의 치료적 옵션을 제한하고, 난소암에 대한 매우 높은 사망률의 기저를 이룬다.
잠재적인 치료 표적을 식별하기 위한 유전적 스크리닝에서의 시도는 실질적인 노력에도 불구하고 대체로 성공적이지 못하였다. 이는 난소암 조직의 고도로 이질적인 성질로 인한 것인 것 같다.
케라틴-14(KRT14)는 전형적으로 건강한 성인 조직의 근상피 및 상피 틈새에 존재하는(resident) 원시 계통(primitive lineage)의 전구 세포(progenitor cell)에서 발현되는 세포골격의 세포내 단백질 성분이다(문헌[Chu 등 (2001) Histopathology 39(1):9-16]; 문헌[Paraskevopoulou 등 (2016) Cell Cycle 15(23):3161-3162]). 종양 조직에서, KRT14는, 종양 침착물(deposit)이 건강한 조직 내로 침습하는 능력을 제어하는 특수화된 세포(대안적으로 "리더(leader) 세포", "암 줄기세포" 또는 "종양 개시 세포"로 기재됨)의 집단을 표시한다. KRT14-발현 세포는 여러 가지 고형 종양 유형(유방, 방광 및 폐 포함)에 걸쳐 종양 침습을 제어하는 데 기전적으로(mechanistically) 연관되어 있다. 이들 종양에서, KRT14를 발현하는 세포의 존재는 종양 침습 잠재력 및 무질환(disease-free) 생존율과 전체 생존율에서의 감소와 직접 상관관계가 있다(상기 문헌[Chu 등 (2001)]; 문헌[Cheah 등 (2015) Proc Natl Acad Sci USA 112(15):4725-4730]; 문헌[Volkmer 등 (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109(6):2078-2083]; 문헌[Ho 등 (2012) Nat Rev Urol 9(10):583-594]; 문헌[Cheung 등 (2016) Proc Natl Acad Sci USA 113(7):E854-863]; 문헌[Cheung 등 (2013) Cell 155(7):1639-1651]; 문헌[Papafotiou 등 (2016) Nat Commun 7:11914]).
환자 예후 및 삶의 질을 향상시킬 수 있는 치료적 접근법이 시급하다.
본 발명에 따르면, KRT14는 시험관내에서 중피층(mesothelial layer)을 통한 난소암 세포 침습; 및 생체내에서 난소 종양의 성공적인 이식에 필수적인 것으로 규명되었다. 또한 본원에서, KRT14는 결장직장, 자궁내막, 뇌, 유방 및 폐 암세포를 포함하여 다른 암세포 유형의 이동 및 침습에 역할을 하는 것으로 규명되었다. KRT14는 정상적인 생식관, 예컨대 난소 및 나팔관을 포함하여 건강한 조직에서는 발현되지 않는다. 중요하게는, KRT14는 수컷 및 암컷 대상체 둘 다에서 여러 가지 암에 존재하는 세포외 부분을 갖는 것으로 확인되었다. 용어 "세포외"는, 세포의 외부 상에 위치하거나, 이에 노출되거나, 그렇지 않으면 이로부터 접근 가능한 KRT14의 부분, 분절(segment) 또는 도메인을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
이에, 인간 및 동물 대상체를 포함한 포유류 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 교시되며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체(homolog) 또는 이의 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생체내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하기에 효과적이다. 대상체에게 "투여한다"는 것은 암세포와 접촉시키는 것을 포함한다. "대상체"는 수컷 또는 암컷일 수 있다.
일 구현예에서, 암은 비제한적으로 난소암 또는 난소암의 병기(stage) 또는 형태를 포함하는 부인과(gynecological) 암이다. 일 구현예에서, 암은 자궁내막 또는 결장직장 암이다. 일 구현예에서, 암은 뇌, 방광, 간, 유방, 폐, 췌장, 장(bowel), 결장, 위장관(gastrointestinal tract), 위, 인후(throat), 자궁내막 및 결장직장 암으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 제제는, 펩타이드 서열(한글자 코드): GFGGGYGGGLGAGLGGGFGGGFAGGDGL(SEQ ID NO:1), 또는 최적 정렬 후 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 유사성을 갖는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 포함하는 단백질 내에 함유된 에피토프를 표적화하는 항체이다. SEQ ID NO:1의 길항제 또는 표적화 제제로서 작용하는 다른 제제가 또한 본원에 고려된다. SEQ ID NO:1은 인간 서열을 나타낸다. 다른 종에서의 상동체가 또한 본원에서 치료 및 진단 시약으로서 고려된다. "항체"는 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 KRT14-결합 항-혈청, 뿐만 아니라 재조합 형태, KRT14의 외인성 부분에 결합하는 단편 및 유도체 또는 이의 파트를 포함한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 제제는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 상기 VH는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VH CDR1), SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VL CDR1), SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, VH는
(a) SEQ ID NO:12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 프레임워크 영역 1(FR1);
(b) SEQ ID NO:13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2;
(c) SEQ ID NO:14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 및
(d) SEQ ID NO:15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4
를 포함하고, VL은
(e) SEQ ID NO:16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1;
(f) SEQ ID NO:17과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2;
(g) SEQ ID NO:18과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 및
(h) SEQ ID NO:19와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4
를 포함한다.
일 구현예에서, VH는 SEQ ID NO:3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 SEQ ID NO:5와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 포유류 대상체는 인간 여성 또는 인간 남성이다. 주목할 만하게, 본 발명은 인간이 아닌 수컷 또는 암컷 포유류에서의 수의학 적용까지로 확장된다.
본원에 교시된 바와 같이, KRT14의 신규 기능은 난소암 침습 및 침착의 중요한 조기 조절자인 것으로 확인되었다. KRT14 유전자의 기능적 복사체(copy)가 결여된 세포는 침습이 불가능하고, 생체내에서 난소 종양을 확립할 수 없다. SEQ ID NO:1을 표적화하는 외인성 추가 제제로 SEQ ID NO:1에 의해 식별된 에피토프를 표적화하는 것은, 시험관내에서 암세포의 침습 능력을 완전히 무효화시켜, 기능적 KRT14 소실의 효과를 모방한다. 유사하게는, SEQ ID NO:1을 보유하는 세포에 특이적인 생체내 반응, 예컨대 면역 반응을 유도하는 것 또한 암 발병을 감소시키는 데 효과적이다.
일 구현예에서, 본 명세서는 인간 대상체에서 난소암을 치료하는 방법을 교시하며, 상기 방법은 난소암 세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1에 의해 정의된 KRT14의 세포외 부분을 표적화하는 항체의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 난소암 세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
많은 다른 고형 종양 유형(예를 들어, 유방, 방광, 폐 및 기타)은 이러한 KRT14 매개 침습 기전을 이용하는 것으로 제안되며, 이는 항-KRT14 지향적 치료법이 여러 가지 고형 종양 유형에 걸쳐 넓게 적용 가능함을 나타낸다.
SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 표적화하여 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 무효화하는 약제가 본원에서 가능해진다. 일 구현예에서, 약제는 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체에 특이적인 항체를 포함한다. 상기 나타낸 바와 같이, 항체는 다중클론 또는 단일클론 항체, 또는 KRT14-결합 항체를 포함하는 항-혈청일 수 있거나 합성(예를 들어, 재조합) 항체 또는 이들 중 임의의 KRT14-결합 단편 또는 유도체일 수 있다. 항체는 또한, 연골 동물 유래 항체 또는 이의 KRT14-결합 단편 또는 유도체일 수 있다. 항체인 것 외에도, 약제는 비제한적으로 앱타머(aptamer), 모노바디(monobody), 항-칼린(anti-calin), DARPins 및 나노바디(nanobody) 등을 포함하는 임의의 친화성 시약일 수 있다.
본 발명은, KRT14를 표적화하는 제제 또는 생체내 KRT14 길항제를 유도하는 제제가 또 다른 항암제 및/또는 방사선 치료법 및/또는 수술적 개입과 함께 주어지는 병용 치료법까지 확장된다. 추가 제제의 예는 화학치료제, 예컨대 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신, 독소루비신(doxorubicin)(아드리아마이신(adriamycin)), 이다루비신(idarubicin) 및 미톡산트론(mitoxantrone), 또는 백금계 제제 또는 항대사물질 중 하나 이상을 포함한다. 항대사물질은 신체의 화학 과정, 예컨대 세포 성장 및 재생에 필요한 단백질, DNA 및 다른 화학물질의 생성을 방해하는 성분이며; 암 치료에서, 항대사물질 약물은 DNA 생성을 방해하며, 이는 다시 세포 분열을 방지한다. 예로는 아자세린, D-사이클로세린, 니코페놀산(nycophenolic acid), 트리메토프림(trimethoprim), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 카페시타빈(capecitabine), 메토트렉세이트(methotrexate), 겜시타빈(gemcitabine), 시타라빈(cytarabine)(ara-C) 및 플루다라빈(fludarabine)이 포함된다. 프라이밍된 T-세포 및 사이토카인과 같은 다른 면역 시약이 투여될 수 있다. 병용 치료법은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 그리고 서로 수 초(seconds), 수 분(minutes), 수 시간(hours), 수 일(days) 또는 수 주(weeks) 이내에 제공될 수 있다.
본 개시내용은 또한, 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분에 특이적으로 결합하는 제제 또는 KRT14-결합 단편까지 확장되며, 상기 제제는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VH CDR1), SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하며; 상기 VL은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VL CDR1), SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, VH는
(a) SEQ ID NO:12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 프레임워크 영역 1(FR1);
(b) SEQ ID NO:13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2;
(c) SEQ ID NO:14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 및
(d) SEQ ID NO:15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4
를 포함하고, VL은
(e) SEQ ID NO:16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1;
(f) SEQ ID NO:17과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2;
(g) SEQ ID NO:18과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 및
(h) SEQ ID NO:19와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4
를 포함한다.
일 구현예에서, VH는 SEQ ID NO:3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 SEQ ID NO:5와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
아미노산 서열은 서열 식별자 번호(SEQ ID NO)로 지칭된다. SEQ ID NO는 서열목록의 식별번호 <400>1(SEQ ID NO:1), <400>2(SEQ ID NO:2) 등에 상응한다. 서열 목록은 청구항 다음에 제공된다.
주제 명세서 전반에 걸쳐 사용된 서열 식별자의 요약은 표 1에 제공된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
아미노산은 명칭에 의해 한 글자 또는 세 글자 코드에 의해 지칭될 수 있다(표 2).
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 도면은 컬러 대표도 또는 엔터티를 포함한다. 컬러 사진은 요청 시 Patentee로부터 또는 적절한 특허청으로부터 입수 가능하다. 특허청으로부터 수득된다면 요금이 부과될 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 침습적 난소암 침착물의 리딩 엣지(leading edge)에서 KRT14의 식별을 도시하는 사진이다. (a) 난소암 스페로이드(spheroid)는 복막 미세환경 모델을 사용하여 배양되었고, 침습은 중피 장벽(mesothelial barrier)을 통해 모니터링되었다. LP9 중피 세포 단층을 능동적으로 파괴하는 스페로이드를 함유하는 동결절판(cryosection)은 (b) MALDI 이미지화 질량 분광법에 의해 평가되었으며, 이는 침습적 계면에서 몇몇 단백질 중에서도 KRT14를 식별하였다. (c) KRT14에 대해 확산적 난소암 세포(OVCAR4)의 면역염색은 인바도포디아(invadopodia)로의 위치화(localization)를 도시한다. 확대된 영역이 도시되어 있다(상단 우측). KRT14 염색은 검정색 배경 대비 녹색으로 보인다. DAPI에 의한 핵 염색은 청색이다.
도 2a 및 도 2b는 시험관내에서 난소암 세포의 이동 및 침습에 필요한 KRT14 발현을 도시하는 그래프 및 사진이다. KRT14 유전자 발현은 난소암 세포주 OVCAR4 및 CaOV3에서 CRISPR 기술을 사용하여 방해하였다. 대표적인 실험이 도시되어 있다. (a) 증식 및 침습은 xCELLigence를 사용하여 측정되었다. KRT14 발현의 소실은 증식에 아무런 영향을 미치지 않지만, 시험관내에서 중피 단층을 통한 침습을 완전히 무효화하였다. (b) KRT14가 결여된 세포는 시험관내 스크래치 시험에서 밤새 상처(wound)를 회복하는 데 실패하였다.
도 3a 내지 3c는 생체내 성공적인 종양 이식에 필요한 KRT14 발현을 도시하는 사진 및 그래프이다. KRT14를 발현하거나("야생형"; WT) KRT14 발현이 결여된("KRT14KO") 뮤린 ID8 난소암 세포를 야생형 C57BL/6 마우스에 점액낭내로(intrabursally) 이식하였다. 종양 성장은 생체내 형광을 사용하여 실시간으로 모니터링되었다. (a) ID8 세포는 각각의 마우스에서 단일 난소에 성공적으로 인그래프트(engraft)되었고, 검출 가능하였으며 이식 부위로 위치화되었다. 4주 후, 형광은 K14KO 세포가 이식된 마우스로부터 소실되었다. (b) 형광은 약 3-4주째에 야생형 종양 세포를 갖는 마우스에서 증가되었으며; KRT14-KO 세포가 이식된 마우스에서는 유사한 형광 증가가 검출되지 않았다. (c) 마우스는 약 7주째에 도태되었으며, 부검이 수행되었다. 야생형 ID8 세포가 이식된 마우스는 크기가 큰(large) 원발성 난소 종양을 형성하였고, 반대측 난소, 복벽, 간, 창자 및 횡경막으로 전이되었으며, 복강 내 상당한 양의 복수액 축적을 보였다. 대조적으로, KRT14KO 세포가 이식된 마우스는 복수를 발생시키지 않았으며, 종양이 관찰되지 않았다. 이들 마우스의 부검 시 종양 세포는 검출되지 않았다.
도 4a 및 도 4b는, KRT14의 N-말단이 세포 표면에 노출되고, 외인성 추가 항체에 접근 가능함을 도시하는 그래프 및 사진이다. (a) 유세포 분석은 KRT14의 N-말단 영역에 대한 다중클론 항체를 사용하여 무손상(intact), 비-투과된 난소암 세포(지시된 바와 같이 식별됨) 상에서 수행되었다. 30% 내지 50%의 세포는 세포-표면 KRT14에 대해 양성으로 염색되었다. 배양물 중 무손상 세포의 면역염색은 항-KRT14 항체에 의한 세포의 하위세트(subset)의 염색을 확인시켜 주었다. (b) KRT14의 N-말단 및 C-말단에 대한 항체는 시험관내에서 난소암 세포에 의한 침습을 저해하는 상기 항체의 능력에 대해 시험하였다. 항-C-말단 항체(C-말단)는 침습에 아무런 영향을 미치지 않는 한편, 항-N-말단 항체(N-말단)는 침습을 완전히 차단하였다. 외인성 첨가 전장 재조합 KRT14 단백질(rK14)은 단독으로 또는 C-말단 항체와 조합되어 어떠한 영향도 미치지 않았다. 그러나, rK14는 시험관내에서 침습 능력을 회복시키기 위해 N-말단 항체와 성공적으로 경쟁하였다.
도 5a 내지 도 5c는 KRT14의 N-말단에서 단일 항원성 영역이 시험관내에서 노출되고 침습을 차단하도록 표적화될 수 있음을 도시하는 그래프 및 사진이다. (a) KRT14의 N-말단의 항원성 및 소수성은 인실리코에서(in silico) 공개적으로 입수 가능한 IEDB 포털(http://tools.iedb.org/bcell/)을 사용하여 예측되었다. 잠재적인 항원성의 5개 영역이 예측되었고, 6개의 상응하는 펩타이드가 합성되었다. (b) 개별 펩타이드를 사용하는 경쟁 검정은 다중클론 항체에 의해 인식되는 KRT14의 관련 영역을 맵핑(map)하는 데 사용되었다. 아미노산 83-110(인간 서열)을 포괄하는 2개의 펩타이드는 xCELLigence 검정에서 침습 능력을 성공적으로 회복시켰다. (c) 병행하는 상처 치유 실험에서, 동일한 2개의 펩타이드(#4 및 #5)는, 항-N-말단 KRT14 항체와 성공적으로 경쟁하여 세포 이동을 회복시키고 16시간에 걸쳐 완전한 상처 폐쇄(wound closure) 효과를 나타냈다.
도 6a 및 도 6b는 항-혈청 AN-17 O20023이 시험관내에서 암세포 침습을 효과적으로 차단함을 도시하는 그래프이다. (a) 특이적인 KRT14 에피토프에 대해 생성된(raised) 항-혈청은 침습을 효과적으로 저해하였고, 상업적인 다중클론 항체(Sigma SAB4501657)와 비슷한 효능을 가졌다. b) 항-KRT14에 의한 침습의 저해는 세포 생존력에 아무런 영향을 갖지 않았다.
도 7은 비-난소암 세포 유형의 이동이 시험관내에서 항-KRT14 항체에 의해 손상됨을 도시하는 사진이다. 항-KRT14 항체는 자궁내막 또는 결장직장 암종 세포로 이루어진 세포 단층에서 상처 봉합을 방지한다. 관심 KRT14 에피토프를 모방하는 짧은 펩타이드(펩타이드 4 및 5)는 시험관내에서 이동을 재-확립시키기 위해 항체 결합을 위해 효과적으로 경쟁할 수 있었다.
도 8a 및 도 8b는 뮤린 난소암 세포의 이동이 시험관내에서 항-KRT14 항체에 의해 손상됨을 도시하는 사진 및 그래프이다. (a) 항-KRT14 항체는 뮤린 ID8 난소암 세포로 이루어진 세포 단층에서 상처 폐쇄를 방지하였다. 관심 KRT14 에피토프를 모방하는 짧은 펩타이드(펩타이드 4 및 5)는 시험관내에서 이동을 재-확립시키기 위해 항체 결합을 위해 효과적으로 경쟁할 수 있었다. (b) RTCA 분석은 항-인간 KRT14 항체가 시험관내에서 뮤린 난소암 세포의 침습을 차단하였음을 확인시켜 주었다.
도 9는 단일클론 항-KRT14 항체 AN-17(mAb AN-17)가 시험관내에서 백금 화학치료법에 대한 민감성을 증가시킴을 도시한다. OVCAR4 난소암 세포를 mAb AN-17, 시스플라틴(cisplatin) 또는 2개의 조합과 함께 배양하였으며, 세포 증식은 72시간 기간에 걸쳐 모니터링되었다. mAb AN-17 + 시스플라틴의 조합으로 처리된 세포는 시스플라틴 단독과 비교하여 유의하게 더 낮은 IC50을 나타내었다. 주목할 만하게는, mAb AN-17은 준치사(sub-lethal) 용량으로 사용된 시스플라틴의 독성을 유의하게 증강시켰다(n=3/치료, 평균 세포 지수).
도 10은 mAb AN-17이 시험관내에서 다수의 단백질 항원과 교차-반응성을 나타내지 않음을 도시한다. 단백질 어레이는, mAb AN-17에 의해 잠재적으로 인식될 수 있는 임의의 교차-반응성 단백질을 식별하는 데 사용되었다. 교차-반응성은 명백하지 않았으며, KRT14에 대한 mAb AN-17의 높은 특이성을 시사한다.
도 11은 mAb AN-17을 사용하는 KRT14 검출을 위한 웨스턴 블로팅을 도시한다. 1:1000 내지 1:10,000로 항체를 희석하여 KRT14 단백질을 웨스턴 블로팅에 의해 성공적으로 검출하였다.
도 12는 mAb AN-17이 인간 및 뮤린 난소암 세포에서 KRT14+ 세포를 식별할 수 있음을 도시한다. OVCAR3, CAOV4, ID8 및 환자-유래 3.1937-07 세포주는 mAb AN-17 또는 KRT14에 대한 상업적으로 입수 가능한 다중클론 항체(Sigma SAB4501657)를 사용하여 KRT14+ 세포 집단에 대해 BD LSRFortessa X-20(BD Biosciences) 유세포분석기 상에서 분석되었다.
도 13은 상피 난소 종양이 있는 마우스에서 mAb AN17로 순환하는 종양 세포 검출을 도시한다. 12-주령 ID8 iRFP720+ 상피 난소 종양이 있는 마우스에서 심장 혈액을 채혈하였고, 항-CD45 및 mAb AN-17을 사용하여 염색하였다. 순환하는 ID8 종양 세포는 KRT14+ CD45- 세포로서 식별되었고, iRFP720+ 상태에 의해 확인되었다. 혈액 내로 스파이킹된(spiked) iRFP720+ ID8 세포는 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 14는 면역형광 염색에 의한 KRT14+ 세포의 검출을 도시한다. 암세포는 무손상(좌측) 또는 투과 후(우측) mAb AN-17과 함께 배양되어, 표면- 또는 세포내 KRT14를 각각 표지하였다.
도 15는 mAb AN-17을 사용한 종양 조직의 면역조직화학적 염색을 도시한다. 염색은 종양 상피로 한정되었고, 상업적으로 입수 가능한 다중클론 항-KRT14 항체(Sigma SAB4501657)와 유사하였다.
도 16은 mAb AN-17의 비-특이적 조직 흡수(uptake) 및 7-일에 걸친 제거율을 도시한다. 종양이 없는 마우스에게 0.5 mg/kg(i.p.)의 mAb AN-17을 주사하였고, 조직 분포는 시간 경과에 따라 형광을 모니터링함으로써 평가하였다. 비-표적화된 IgG-카파 이소타입 대조군 항체와 비교하였다. mAb AN-17의 비-특이적 유지(retention)는 관찰되지 않았으며, 항체 둘 다(mAb AN-17 및 대조군 IgG-카파) 7일 후 거의 검출 불가능하였다. 검사된 조직은 생식 기관(난소, 나팔관, 자궁); 창자; 간; 간; 신장; 비장; 폐; 심장; 및 뇌(n=2 동물/군, 평균 +/- SD)를 포함하였다. 각각의 시점에서의 측정은 축에 대해 상쇄(offset)되어, 중첩 데이터세트를 분명하게 만든다.
도 17은 mAb AN-17의 비-특이적 조직 흡수 및 7일에 걸친 제거율을 도시한다. 종양이 없는 마우스에게 mAb AN-17을 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 또는 10.0 mg/kg(i.p.)으로 주사하였고, 조직 분포는 시간 경과에 따라 형광을 모니터링함으로써 평가하였다. 비-표적화된 IgG-카파 이소타입 대조군 항체와 비교하였다. mAb AN-17의 비-특이적 유지는 평가된 임의의 조직에서 관찰되었으며, AN-17은 7일 후 대체로 검출 불가능하게 되었다. 검사된 조직은 생식 기관(난소, 나팔관, 자궁); 창자; 간; 간; 신장; 비장; 폐; 심장; 및 뇌(n=2 동물/군, 평균 +/- SD)를 포함하였다.
도 18은 mAb AN-17이 종양 조직에 대해 높은 특이성을 가짐을 도시한다. 확립된 원발성 난소 종양이 있는 마우스(n=2/군/시점)에게 5 mg/kg 또는 10 mg/kg 용량의 mAb AN-17을 복강내 주사로 투여하였다. 대조군 동물은 동일한 용량으로 이소타입이 일치하는 대조군 항체를 받았다. 투여-후 1, 3, 5 및 7일째에, 마우스는 도태되었고, 항체 위치화는 형광(상기와 같음)에 의해 평가되었다. 형광은 시간 경과에 따른 단위 조직 면적당 평균 방사상 형광 강도(radiant fluorescent intensity)로서 표현되었다. (a)는 종양-특이적 형광 신호이다. (b)는 특이적인 신호의 부재를 나타내는 비-종양 생식 조직 형광이다. (c)는 사후 분석시(post-mortem) 분리된 종양에서 mAb AN-17 형광(적색)의 이미지이며, 비-종양 재생 조직은 비교를 위한 것이었다(n =2/군/시점; 평균 +/-SD).
도 19는 mAb AN-17의 투여가 마우스에서 확립된 종양 덩어리(mass)의 직접 퇴행을 야기함을 도시한다. 확립된 원발성 난소 종양이 있는 마우스(n=10/군)에게 mAb AN-17을 5 mg/kg 용량으로 1주-2회(월요일 및 목요일) 복강내 주사에 의해 투여하였다. 대조군 동물은 이소타입이 일치하는 대조군 항체, 또는 PBS 비히클을 단독으로 받았다. 계속된 치료의 3주 후, 모든 동물을 도태시켜 검사하였으며, 종양 덩어리는 사후 분석 시 측정되었다. 비히클 또는 이소타입 대조군 항체를 받은 마우스 중 60%는 도태 시 원발성 난소 종양을 가졌다. 대조적으로, mAb AN-17로 치료된 마우스에서는 어떠한 종양도 확인되지 않았다(평균 +/-SD).
도 20은 (a) 단일클론 항체 AN-17(클론 AN-17A RG4.E5b.A7.B4로부터)의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 핵산 및 아미노산 서열 및 (b) 재배열되지 않은(unrearranged) 생식계열 마우스 항체 서열에 대한 mAb AN-17의 VH 아미노산 서열과 VL 아미노산 서열 사이의 유사성 %(IMGT/V-Quest 프로그램을 사용함)를 도시한다. N/A = 적용 불가능함; nt=뉴클레오타이드.
도 21은 mAb AN-17의 VH 및 VL의 핵산 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 22는 프레임워크 영역(FWR) 및 상보성 결정 영역(CDR)을 강조하기 위해 볼드체 및 밑줄표시로 표시된(annotated) mAb AN-17의 VH(a) 및 VL(b) 아미노산 서열을 도시한다.
도 23은 비-난소암 세포(BT16 비정형 기형 횡문근양(뇌) 암종, NCI-H1573 폐 선암종(lung adenocarcinoma), SJ-GBM2 원발성 다형성 교모세포종(primary glioblastoma multiforme), AN3CA 자궁내막 암종(endometrial carcinoma), SW620 결장직장 암종(colorectal carcinoma) 및 MDA-MB-468 유방 암종 세포주의 이동이 시험관내에서 mAb AN-17에 의해 손상됨을 도시한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 다르게 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 또는 변화형, 예컨대 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 요소 또는 정수 또는 방법 단계 또는 요소들 또는 정수들 또는 방법 단계들의 군(group)을 내포하지만, 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 방법 단계 또는 요소들 또는 정수들 또는 방법 단계들의 군을 배제하는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 나타내지 않는 한, 복수 양태를 포함한다. 그러므로, 예를 들어, "암세포"에 대한 지칭은 단일 암세포, 뿐만 아니라 2개 이상의 암세포를 포함하며; "에피토프"에 대한 지칭은 단일 에피토프, 뿐만 아니라 2개 이상의 에피토프를 포함하고; "개시내용"에 대한 지칭은 개시내용에 의해 교시된 단일 양태 및 다수의 양태를 포함한다. 본원에 교시되고 가능해지는 양태는 용어 "발명"에 의해 포괄된다. 본원에서 고려되는 임의의 변이체 및 유도체는 본 발명의 "형태"에 의해 포괄된다. 본 발명의 모든 양태는 청구항의 범위(width)에 걸쳐 허용된다.
본 발명은 포유류 대상체에서 암을 치료하거나 예방하거나 다르게는 이의 진행을 개선하기 위한 치료 프로토콜에 관한 것이다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 진행의 개선은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시켜, 암의 발병을 치료하거나, 예방하거나 지체시키거나 암이 전이하는 능력을 감소시키는 것을 포함한다. 용어 "암" 또는 "종양"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
그러므로, 본원에서 포유류 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 가능해진다. 상기 방법은 포유류 대상체에게,
(i) 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 직접 표적화하는 제제; 이러한 제제의 예는 KRT14의 세포외 부분을 직접 표적화하는 단편 및 유도체를 포함하여 항체, 및 적절하게 탈면역화된 항체 또는 다른 표적화 모이어티 또는 리간드를 포함하는, 제제; 또는
(ii) 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 표적화하며 생체내에서 내인성 제제를 유도하는 제제; 내인성 제제의 예는 항체, T-세포 및 대식세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 제제
를 투여하는 단계를 포함한다.
어느 경우든지, 제제 또는 내인성 제제는 KRT14의 세포외 부분을 보유하는 암세포의 세포독성 또는 세포성색전을 유도하여, 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시킨다. 예를 들어, (i)과 관련하여, 항체는 결합하여, 보체-매개 또는 대식세포-매개 또는 사이토카인-매개 세포 용해 또는 노화(senescence)를 유도할 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 다른 표적화 제제는 세포독성 분자에 접합되거나, 림프구를 프라이밍하는 데 사용될 수 있다. "항체"에 대한 지칭은 단일클론 항체, 다중클론 항체, KRT-14 결합 항체 및 합성 또는 재조합 형태를 포함하는 항-혈청, KRT14의 외인성 부분에 결합하는 단편 및 유도체 또는 이의 파트를 포함한다. 항체인 것 외에도, 약제는 비제한적으로 앱타머, 모노바디, 항-칼린, DARPins 및 나노바디 등을 포함하는 임의의 친화성 시약일 수 있다.
일 구현예에서, 인간 KRT14의 세포외 부분은 아미노산 서열(한글자 코드): NH2-GFGGGYGGGLGAGLGGGFGGGFAGGDGL(SEQ ID NO:1)에 의해 정의된다.
인간 또는 비-인간 포유류에서의 기능적 상동체 및 또는 변이체가 본원에 포괄된다. 일례에서, SEQ ID NO:1의 기능적 상동체 또는 변이체는 최적 정렬 후 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다. "적어도 80% 유사성"이란, SEQ ID NO:1과 적어도 80, 81, 82, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및 100% 유사성 또는 동일성을 포함한다. 이러한 서열은 KRT14 상동체 또는 변이체의 세포외 부분일 것이다.
SEQ ID NO:1과 적어도 약 80% 유사성을 갖는 상동체의 예는 표 3에 나타나 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
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본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유사성"은 아미노산 수준에서 비교되는 서열 사이의 정확한 동일성을 포함한다. 아미노산 수준에서 동일성이 없는 경우, "유사성"은 그럼에도 불구하고 구조적, 기능적, 생화학적 및/또는 배좌 수준에서 서로 관련되어 있는 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 아미노산 및 서열 비교는 유사성보다는 동일성의 수준에서 이루어진다.
2개 이상의 폴리펩타이드 사이에서 서열 관계를 설명하는 데 사용되는 용어는 "기준 서열", "비교창(window)", "서열 유사성", "서열 동일성", "서열 유사성 백분율", "서열 동일성 백분율", "실질적으로 유사한" 및 "실질적인 동일성"을 포함한다. "기준 서열"은 5 내지 20개 아미노산 길이이다. "비교창"은 기준 서열과 비교되는 전형적으로 5 내지 20 근접(contiguous) 잔기들의 개념적(conceptual) 분절을 지칭한다. 비교창은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 약 20% 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭(gap)을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬시키기 위한 서열의 최적 정렬은 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA에서)의 컴퓨터화된 구현에 의해 또는 선택된 임의의 다양한 방법에 의해 발생되는 검사(inspection) 및 최상 정렬(즉, 비교창에 걸쳐 최고 상동성 백분율을 초래함)에 의해 수행될 수 있다. 또한 예를 들어, 문헌[Altschul 등 (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389]에 의해 개시된 바와 같은 BLAST 패밀리의 프로그램을 참조한다. 서열 분석의 상세한 논의는 문헌[Ausubel 등 (1994-1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc]의 유닛(Unit) 19.3에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "서열 유사성" 및 "서열 동일성"은, 서열이 비교창에 걸쳐 아미노산-대(by)-아미노산 기준으로 동일하거나 또는 기능적으로 또는 구조적으로 유사한 정도(extent)를 지칭한다. 그러므로, 예를 들어, "서열 동일성 백분율"은, 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하며, 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교창에서의 위치의 총수(즉, 창 크기)로 나누며, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산된다.
따라서, 용어 "변이체" 및 "유도체"는 기준 아미노산 서열(즉, SEQ ID NO:1 또는 이의 하위서열)과 실질적인 서열 동일성 또는 유사성을 나타내는 아미노산 서열을 지칭한다. 용어 "변이체" 및 "유도체"는 또한, 천연-발생 대립유전자 변이체를 포함한다.
"유도체"는 또한, SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체를 참조로 하여 돌연변이체, 단편, 파트, 부분 또는 하이브리드 분자를 포함한다. 유도체는 일반적으로 그러나 비배제적으로, 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실을 보유한다.
"상동체"는 또 다른 동물 종으로부터 또는 동일한 종 내에서 상이한 좌위(locus)로부터 적어도 약 80% 유사한 아미노산 서열을 갖는 유사한 폴리펩타이드를 포함한다.
변이체는 또한, 일반적으로 화학적 유사체인 "유사체"를 포함한다. 본원에서 고려되는 SEQ ID NO:1의 화학적 유사체는 측쇄에의 변형, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 합성 동안 비천연 아미노산 및/또는 이의 유도체의 혼입, 및 단백질성 분자 또는 이의 유사체에 형태적 제약(constraint)을 부여하는 가교제 및 다른 방법의 사용을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본 발명에 의해 고려되는 측쇄 변형의 예는 아미노기의 변형, 예컨대 알데하이드와의 반응에 의한 환원적 알킬화, 뒤이어 NaBH4를 이용한 환원; 메틸아세티미데이트를 이용한 아미드화; 아세틱 무수물을 이용한 아실화; 시아네이트를 이용한 아미노기의 카르바모일화; 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)을 이용한 아미노기의 트리니트로벤질화; 숙시닉 무수물 및 테트라하이드로프탈릭 무수물을 이용한 아미노기의 아실화; 및 피리독살-5-포스페이트를 이용한 라이신의 피리독실화, 뒤이어 NaBH4를 이용한 환원을 포함한다.
아르기닌 잔기의 구아니딘기는 시약, 예컨대 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과의 헤테로환식 축합 생성물의 형성에 의해 변형될 수 있다.
카르복실기는 O-아실이소우레아 형성을 통한 카르보디이미드 활성화에 의해 변형된 뒤, 예를 들어, 상응하는 아미드로의 후속적인 유도체화에 의해 변형될 수 있다.
설피드릴기는 요오도아세트산 또는 요오도아세타미드를 이용한 카르복시메틸화; 시스테익산(cysteic acid)으로의 퍼포름산 산화; 혼합된 디설파이드와 다른 티올 화합물의 형성; 말레이미드, 말레익 무수물 또는 다른 치환된 말레이미드와의 반응; 4-클로로메르쿠리벤조에이트, 4-클로로메르쿠리페닐설폰산, 페닐머큐리 클로라이드, 2-클로로메르쿠리-4-니트로페놀 및 다른 머큐리 함유 물질(mercurial)을 사용한 머큐리 함유 물질 유도체의 형성; 알칼리성 pH에서 시아네이트를 이용한 카르바모일화와 같은 방법에 의해 변형될 수 있다.
트립토판 잔기는 예를 들어, N-브로모숙신이미드를 이용한 산화 또는 2-하이드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 설페닐 할라이드를 이용한 인돌 고리의 알킬화에 의해 변형될 수 있다. 한편, 티로신 잔기는 테트라니트로메탄을 이용한 질화(nitration)에 의해 변경되어, 3-니트로티로신 유도체를 형성할 수 있다.
히스티딘 잔기의 이미다졸 고리의 변형은 요오도아세트산 유도체를 이용한 알킬화 또는 디에틸피로카르보네이트를 이용한 N-카르베톡실화(carbethoxylation)에 의해 달성될 수 있다.
가교제는 예를 들어, 호모-이작용성 가교제, 예컨대 n=1 내지 n=6인 (CH2)n 스페이서 기를 갖는 이작용성 이미도 에스테르, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르 및 통상 아미노-반응성 모이어티를 함유하는 헤테로-이작용성 시약, 예컨대 N-하이드록시숙신이미드 및 또 다른 기 특이적-반응성 모이어티 예컨대 말레이미도 또는 디티오 모이어티(SH) 또는 카르보디이미드(COOH)를 사용하여 3D 형태(conformation)을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 게다가, 펩타이드는 예를 들어, Cα 및 Nα-메틸아미노산의 혼입, 아미노산의 Cα 원자와 Cβ 원자 사이의 이중 결합의 도입, 및 N 말단과 C 말단 사이에서, 2개의 측쇄 사이에서 또는 측쇄와 N 또는 C 말단 사이에서 아미드 결합을 형성하는 것과 같이 공유 결합을 도입함으로써 환식 펩타이드 또는 유사체의 형성에 의해 형태적으로 제약을 받을 수 있다.
이러한 유사체는 합성 백신에서 또는 표적화 제제로서 사용하기 위한 항체를 생성하는 데 유용할 수 있다. 유사체는 증가된 혈청 반감기와 같은 속성을 가질 수 있다. 항체는 또한, KRT14-결합 항체를 포함하는 항-혈청에 있을 수 있다.
포유류 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 교시되며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생체내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
포유류 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에서 가능해지며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1로 표시된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 SEQ ID NO:1과 적어도 약 80% 유사성을 갖는 아미노산 서열에 의해 정의된 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 이의 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생체내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
나아가, 포유류 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 교시되며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1로 표시된 아미노산 서열에 의해 정의된 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 이의 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 암세포 상의 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생체내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
더 나아가, 인간 대상체에서 난소암을 치료하는 방법이 가능해지며, 상기 방법은 난소암 세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1에 의해 정의된 KRT14의 세포외 부분을 표적화하는 항체의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 난소암 세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다. 항체인 것 외에도, 약제는 비제한적으로 앱타머, 모노바디, 항-칼린, DARPins 및 나노바디 등을 포함하는 임의의 친화성 시약일 수 있다.
용어 "대상체에게 투여하는" 것은 제제를 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분과 접촉시키는 임의의 수단에 의해 암세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 포유류 대상체는 수컷 또는 암컷 및 임의의 연령일 수 있다.
본원에서, 세포 표면에서 노출된 KRT14 단백질의 짧은 에피토프가 식별되고, 외인성 추가 제제 또는 특이적으로 유도된 내인성 분자와의 상호작용에 이용 가능하다. 노출된 서열을 인식하는 항체 또는 다른 표적화 제제를 사용한 이러한 영역의 표적화는 시험관내에서 암세포 침습을 완전히 방지하여, KRT14 유전자 제거(ablation)의 효과를 모방할 수 있다. 이들 데이터는, KRT14가 지향된(directed) 길항제 치료법을 위한 이전에 인식되지 않고 고도로 특이적인 종양 세포 상의 표적을 나타냄을 가리킨다.
또한, 마우스에서 고형 종양을 형성하는 실패가 관찰된다. 기능적 KRT14 유전자가 결여된 이식된 암세포는 수주 후 검출 불가능하게 된다. 이는, 이들 암세포가 예를 들어, 아마도 면역-매개 제거(clearance)를 통해 동물로부터 제거됨을 나타낸다. 그러므로, 항-KRT14 치료법의 사용은 종양 안정화(손상된 이식/침습을 통해), 및 종양 퇴행(regression)을 촉진할 수 있는 것으로 본원에서 제안된다. 표적화된 항-KRT14 치료법은 하기 이유로 암 치료를 위한 높은 잠재력을 갖는다:
(i) KRT14가 광범위하게 발현되지 않고 길항제가 세포에 대해 무독성인 것으로 선택되기 때문에 항-KRT14 치료법은 무독성인 것으로 예상됨;
ii) 항-KRT14 치료법은 원발성 및 전이성 침착물 둘 다 표적화하기 위해 모든 병기의 질환에 적용 가능함;
iii) KRT14-발현 세포는 시간 경과에 따라 그리고 화학치료법에 반응하여 특이적으로 농화되며; 그러므로, 항-KRT14 치료법은 재발성이고, 화학적 치료에 저항성을 갖고, 이용 가능한 추가의 종래의 치료 옵션을 갖지 않는 환자에게 고도로 적용 가능할 것임;
iv) 항-KRT14 치료법은 기존의 질환을 안정화시키는 것 외에도, 종양의 퇴축을 잠재적으로 촉진시킬 수 있음.
또한, 하기를 포함하여 항-KRT14 치료법에 대한 몇몇 추가 적용이 존재한다:
i) 침습적 암 줄기세포 집단에 대해 지향된 치료법을 위한 세포독성 "페이로드(payload)"에의 접합;
ii) 종양-개시 세포 집단을 파괴시키기 위해 항-종양 세포독성 T-세포를 지향하도록 설계된 CAR-T 치료법에서의 사용;
iii) 치료적 또는 예방적 백신화(vaccination);
iv) 수의학 적용에서 "탈-인간화" 항체 생성의 발생;
v) 예를 들어, 치료적 반응/화학 치료제에 대한 저항성/종양 재발 또는 진행을 예측하기 위한 테라노스틱(theranostic) 적용.
KRT14-의존적 종양 진행은 또한, 몇몇 다른 고형 종양 유형에 관여하는 주된 기전으로서 식별되어 왔으며, 종양 확산의 기저를 이루는 보존된 기전을 나타내는 경향이 있다. 그러므로, 항-KRT14 치료법은 난소암을 훨씬 능가하는 응용 분야를 가지며, 광범위한 고형 종양의 치료에 적용 가능함을 입증할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "암"은 제어가 되지 않는 세포 성장(예를 들어, 종양의 형성)을 특징으로 하는 질환 및 장애 군을 지칭하며, 이들 세포들은 특수화되고 상이한 세포로 분화되지 않는다. 본원에서 치료를 위해 고려되는 암은 비제한적으로, 부인과 병태, 예컨대 난소암 외에도, ABL1 원발암유전자(protooncogene), AIDS 관련 암, 청신경집종(acoustic neuroma), 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 선양낭성 암종(adenocystic carcinoma), 부신피질암(adrenocortical cancer), 원인불명 골수 화생(agnogenic myeloid metaplasia), 탈모, 포상 연부 육종(alveolar soft-part sarcoma), 항문암, 혈관육종(angiosarcoma), 재생불량성 빈혈(aplastic anaemia), 성상세포종(astrocytoma), 모세혈관 확장성-운동실조 증후군(ataxia-telangiectasia), 기저 세포 암종(피부), 방광암, 골암, 장암(bowel cancer), 뇌간 신경교종(brain stem glioma), 뇌 및 CNS 종양, 유방암, CNS 종양, 유암종(carcinoid tumor), 자궁경부암, 소아 뇌종양, 소아암, 소아 백혈병, 소아 연조직 육종, 연골육종(chondrosarcoma), 융모암종(choriocarcinoma), 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장 암, 피부 T-세포 림프종, 융기성-피부섬유육종(dermatofibrosarcoma-protuberans), 결합조직형성-소-원형-세포-종양(desmoplastic-small-round-cell-tumor), 관암종(ductal carcinoma), 내분비암(endocrine cancer), 자궁내막암, 뇌실막세포종(ependymoma), 식도암(esophageal cancer), 에윙 육종(Ewing's sarcoma), 간외 담도암(extra-hepatic bile duct cancer), 안암(eye cancer), 흑색종, 망막아종(retinoblastoma), 나팔관암, 판코니 빈혈(Fanconi anaemia), 섬유육종, 담낭암(gall bladder cancer), 위암, 위장암, 위장관-유암-종양(gastrointestinal-carcinoid-tumor), 비뇨기암(genitourinary cancer), 생식 세포 종양(germ cell tumor), 임신성-융모성-질환(gestational-trophoblastic-disease), 신경교종(glioma), 부인과 암, 혈액학적 악성물(haematological malignancy), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 두경부암, 간세포암, 유전성 유방암, 조직구증(histiocytosis), 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 인간 유두종바이러스(papillomavirus), 포상기태(hydatidiform mole), 고칼슘혈증, 하인두암(hypopharynx cancer), 안구내 흑색종(intraocular melanoma), 섬세포암(islet cell cancer), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 신장암, 랑게르한스-세포-조직구증(Langerhan's-cell-histiocytosis), 후두암(laryngeal cancer), 평활근육종(leiomyosarcoma), 백혈병, 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 입술암(lip cancer), 지방육종(liposarcoma), 간암, 폐암, 림프부종(lymphedema), 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 남성 유방암, 신장의-악성-횡문근양-종양(malignant-rhabdoid-tumor-of-kidney), 수모세포종(medulloblastoma), 흑색종, 메르켈 세포암(Merkel cell cancer), 중피종(mesothelioma), 전이성 암, 입암(moouth cancer), 다발성 내분비샘 신생물(multiple endocrine neoplasia), 균상 식육종(mycosis fungoides), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 골수종, 골수증식성 장애(myeloproliferative disorder), 비강암(nasal cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 신장아세포종(nephroblastoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 신경섬유종증(neurofibromatosis), 네이메헨 절단 증후군(Nijmegen breakage syndrome), 비-흑색종 피부암, 비-소-세포-폐-암(NSCLC: non-small-cell-lung-cancer), 안구암(ocular cancer), 식도암(oesophageal cancer), 구강암, 구인두암(oropharynx cancer), 골육종, 췌장암, 부비강암(paranasal cancer), 부갑상선암, 이하선암(parotid gland cancer), 음경암(penile cancer), 말초-신경외배엽-종양(peripheral-neuroectodermal-tumor), 뇌하수체암(pituitary cancer), 진성적혈구증가증(polycythemia vera), 전립선암, 희귀암-및-관련-장애(rare-cancers-and-associated-disorder), 신세포 암종, 망막아종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 로트문드-톰슨-증후군(Rothmund-Thomson syndrome), 타액선암(salivary gland cancer), 육종, 슈반세포종(schwannoma), 세자리 증후군(Sezary syndrome), 피부암, 소세포 폐암(SCLC: small cell lung cancer), 소장암, 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 척수 종양, 편평-세포-암종-(피부), 위암, 활액 육종(synovial sarcoma), 고환암, 흉선암, 갑상선암, 이행-세포-암-(방광)(transitional-cell-cancer-(bladder), 이행-세포-암-(신우(renal-pelvis)-/-수뇨관(ureter)), 영양막암(trophoblastic cancer), 요도암, 비뇨기계암, 유로플라킨(uroplakin), 자궁 육종, 자궁암, 질암(vaginal cancer), 외음부암(vulva cancer), 발덴스트롬-거대글로불린혈증(Waldenstrom's-macroglobulinemia) 및 윌름 종양(Wilms' tumor)을 포함한다. 자궁내막암 및 결장직장암이 또한 치료될 수 있다. 이들 암은 수컷 또는 암컷 대상체에 영향을 미칠 수 있고, 본 발명에 따라 치료될 수 있다.
일 구현예에서, 암은 부인과 암이다. 일 구현예에서, 부인과 암은 난소암 또는 난소암의 병기 또는 형태이다. 대안적으로, 암은 특히, 수컷 또는 암컷 대상체에서 다른 암 중에서도 간, 방광, 폐, 결장, 위장관, 장, 췌장 및/또는 인후의 암이다. 본 발명은, KRT14를 표적화하는 제제 또는 생체내에서 KRT14 길항제를 유도하는 제제가 또 다른 항암제 및/또는 방사선 치료법 및/또는 수술적 개입과 함께 주어지는 병용 치료법까지 확장된다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 추가 항암제를 투여하고/거나 환자를 면역치료법, 방사선 치료법 및/또는 수술적 개입에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가 항암제의 예시적인 예는 화학치료제, 예컨대 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 이다루비신 및 미톡산트론, 또는 백금계 제제 또는 항대사물질을 포함한다. 항대사물질은 신체의 화학 과정, 예컨대 세포 성장 및 재생에 필요한 단백질, DNA 및 다른 화학물질의 생성을 방해하는 성분이며; 암 치료에서, 항대사물질 약물은 DNA 생성을 방해하며, 이는 다시 세포 분열을 방지한다. 예에는 아자세린, D-사이클로세린, 니코페놀산, 트리메토프림, 5-플루오로우라실 카페시타빈, 메토트렉세이트, 겜시타빈, 시타라빈(ara-C) 및 플루다라빈이 포함된다. 다른 면역 시약, 예컨대 프라이밍된 T-세포 및 사이토카인이 투여될 수 있다. 병용 치료법은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 그리고 서로 수 초, 수 분, 수 시간, 수 일 또는 수 주 이내에 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 추가 항암제는 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 이다루비신 및 미톡산트론, 백금계 제제, 항대사물질, 프라이밍된 T-세포 및 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 항대사물질은 아자세린, D-사이클로세린, 니코페놀산, 트리메토프림, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트, 겜시타빈, 시타라빈(ara-C) 및 플루다라빈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 포유류 대상체는 인간이다. 부인과 암의 경우, 대상체는 인간 여성이다. 그러나, 모든 다른 암의 경우, 대상체는 인간 남성 또는 여성일 수 있다.
이에, 인간 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 교시되며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 시험관내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
인간 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에서 가능해지며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1로 표시된 아미노산 서열에 의해 정의된 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 이의 변이체를 표적화하는 제제 또는 상기 대상체에 의한 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
나아가, 인간 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 교시되며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1로 표시된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 SEQ ID NO:1과 적어도 약 80% 유사성을 갖는 아미노산 서열에 의해 정의된 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 이의 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생체내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
일 구현예에서, 암은 난소암이고, 대상체는 인간 여성 대상체이다.
이에, 인간 여성 대상체에서 난소암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 교시되며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 시험관내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
인간 여성 대상체에서 난소암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에서 가능해지며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1로 표시된 아미노산 서열에 의해 정의된 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 표적화하는 제제 또는 상기 대상체에 의한 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
나아가, 인간 여성 대상체에서 난소암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에서 가능해지며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1로 표시된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 SEQ ID NO:1과 적어도 약 80% 유사성을 갖는 아미노산 서열에 의해 정의된 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 이의 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생체내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
본 발명은 또한, 반려 동물(예를 들어, 개 및 고양이) 또는 다른 비-인간 동물, 예컨대 농장 동물(예를 들어, 말과(equine) 동물, 돼지, 양, 소, 염소, 라마(llama) 및 알파카(alpaca)), 실험실 시험 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 기니피그, 햄스터) 및 야생 포획(wild captive) 동물(예를 들어, 태즈마니아-데빌(Tasmanian-devil))에서의 암 치료와 같이 수의학적 적용도 가능하다. 치료를 위해 고려되는 다른 동물은 긴팔 원숭이(Gibbon monkey), 침팬지, 레수스 마카크(Rhesus macaque), 사바나 원숭이(Green monkey), 오랑우탄, 개코원숭이(baboon), 뾰족뒤쥐(shrew), 고릴라, 고슴도치, 갈라고원숭이(bushbaby), 캥거루 쥐(kangaroo rat), 야생 야크, 필리핀 안경원숭이(Philippine tarsier), 페렛, 코끼리 및 박쥐를 포함한다. 말과 동물과 관련하여, 이들은 말, 프셰발스키 말(Przewalski horse), 얼룩말 및 당나귀(ass)를 포함한다. 말과 관련하여, 이들은 서러브레드 말(thoroughbred horse), 웜블러드 말(Warmblood horse), 쿼터 말(Quarter horse) 및 스탠다드 말(standard horse), 뿐만 아니라 승마용 말(equestrian horse) 및 퍼포먼스 말(performance horse)을 포함한다.
이에, 비-인간 포유류 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 교시되며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생체내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
나아가, 비-인간 포유류 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 교시되며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1로 표시된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 SEQ ID NO:1과 적어도 약 80% 유사성을 갖는 아미노산 서열에 의해 정의된 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 이의 변이체를 표적화하는 제제 또는 상기 대상체에 의한 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생체내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
비-인간 포유류 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에서 가능해지며, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1로 표시된 아미노산 서열에 의해 정의된 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 암세포 상의 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생체내 생성을 유도하는 제제의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적이다.
비-인간 포유류 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 일 구현예에서, 제제는 항체이다. 항체는 인간-유래 항체 또는 탈면역화된 항체 또는 특정 포유류 대상체에 적합한 포유류화 항체일 수 있다. 예를 들어, 마우스 항체는 인간에 사용하기 위해 인간화될 수 있다. 그러므로, 항체는 하나의 포유류 종에 사용하기 위해 해당 포유류에서 생성될 수 있거나, 적절하다면 포유류화 또는 탈면역화될 수 있다. 의심할 여지 없이, "항체"는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체 또는 KRT14-결합 항체 또는 KRT14-결합 변이체를 포함하는 항-혈청 또는 F'(ab) 결합 단편을 포함하여 이들 항체의 유도체 또는 단편 또는 합성 형태 또는 재조합 형태일 수 있다. 항체인 것 외에도, 약제는 비제한적으로 앱타머, 모노바디, 항-칼린, DARPins 및 나노바디 등을 포함하는 임의의 친화성 시약일 수 있다
그러므로, 본 발명은 따라서, 하나의 동물로부터 유래된 항체를 동일한 또는 상이한 종의 또 다른 동물에서는 실질적으로 비-면역원성으로 되게 하는 생화학적 기법의 적용을 추가로 제공한다. 생화학적 과정은 본원에서 "탈면역화"로 지칭된다. 본원에서 "탈면역화"라는 지칭은 모두 특정 숙주(예를 들어, 인간 대상체)에서 면역상호작용성(immunointeractive) 분자(예를 들어, 항체)의 면역원성을 감소시키는 것을 목적으로 하는, 면역상호작용성 분자의 프레임워크 영역과 관련하여 상보성 결정 영역(CDR) 그래프팅, "재형상화(reshaping)" 및 가변(v) 영역 돌연변이와 같은 과정을 포함한다. 일 구현예에서, 바람직한 면역상호작용성 분자는 KRT14의 세포외 부분을 보유하는 암세포에 특이적인 항체, 예컨대 다중클론 항체 또는 단일클론 항체이다. 일 구현예에서, 면역상호작용성 분자는 하나의 동물로부터 유래되고, 동일한 또는 상이한 종으로부터의 또 다른 동물, 예컨대 비제한적으로 인간에서 감소된 면역원성을 나타내는 단일클론 항체이다.
"실질적으로 비-면역원성"이라는 지칭은 모(parent) 항체, 즉, 탈면역화 과정에 노출되기 전의 항체와 비교하여 감소된 면역원성을 포함한다. 용어 "면역원성"은 숙주 동물에서 체액성(humoral) 및/또는 T-세포 매개 반응을 촉발하거나, 유도하거나 그렇지 않다면 용이하게 하는 능력을 포함한다. 통상의 면역원성 기준은, 항체의 가변(v) 영역으로부터 유래된 아미노산 서열이 MHC 클래스 II 분자와 상호작용하여 T-세포-보조(assisted) 체액성 반응을 포함하여 T-세포 매개 반응을 자극하거나 용이하게 하는 능력을 포함한다.
"항체"란, 항원과 조합하거나, 상호작용하거나 그렇지 않다면 회합될 수 있는 면역글로불린 패밀리(family)의 단백질을 의미한다. 따라서, 항체는 항원-결합 분자이다. "항체"는 면역상호작용성 분자의 일례이고, 다중클론 항체 또는 단일클론 항체 또는 항-혈청을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 면역상호작용성 분자는 단일클론 항체이다.
용어 "항원"은 본원에서 가장 넓은 의미에서, 면역 반응에서 반응하고/거나 이를 유도할 수 있는 성분을 지칭하는 데 사용된다. "항원"에 관한 지칭은 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체에 의해 정의된 바와 같은 항원 결정기(antigenic determinant) 또는 에피토프 또는 암세포를 포함한다.
"항원-결합 분자"란, 표적 항원(즉, SEQ ID NO:1)에 대해 결합 친화성을 갖는 임의의 분자를 의미한다. 이 용어는 항원-결합 활성을 나타내는 면역글로불린(예를 들어, 다중클론 항체 또는 단일클론 항체), 면역글로불린 단편 및 비-면역글로불린 유래 단백질 프레임워크까지 확장되는 것으로 이해될 것이다. 용어 "항체" 및 "항원-결합 분자"는 이들 분자의 탈면역화된 형태를 포함한다.
"항원 결정기" 또는 "에피토프"란, 이에 대해 면역 반응이 지향될 수 있는 세포외 도메인을 갖는 KRT14의 파트를 의미한다.
본 발명의 항체가 전형적으로 인간에서 사용하기 위한 뮤린 단일클론 항체의 탈면역화된 형태이긴 하지만, 주제 발명은 임의의 공급원으로부터의 것이고 임의의 숙주에서 사용하기 위해 탈면역화된 항체까지 확장된다. 동물 공급원 및 숙주의 예는 인간, 영장류, 가축 동물(예를 들어, 양, 소, 말, 돼지, 당나귀), 실험실 시험 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 기니피그, 햄스터) 및 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이)을 포함한다.
면역화 및 후속적인 단일클론 항체의 생성은 예를 들어 Kohler 및 Milstein(문헌[Kohler 등 (1975) Nature 256:495-499] 및 문헌[Kohler 등 (1976) Eur. J. Immunol. 6(7):511-519]; 문헌[Coligan 등 Current Protocols in Immunology, 1991-1997] 또는 문헌[Toyama 등 (1987) Monoclonal Antibody, Experiment Manual, Kodansha Scientific에 의해 공개됨])에 의해 기재된 바와 같은 표준 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다. 본질적으로, 동물은 항체-생성 세포, 특히 항체-생성 체세포(예를 들어, B 림프구)를 생성하기 위해 표준 방법에 의해 항원(즉, SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 포함하는 단백질 또는 단백질 유사체)으로 면역화된다. 그 후에, 이들 세포는 불멸화를 위해 면역화된 동물로부터 제거될 수 있다. 항원은 우선 담체와 회합될 필요가 있을 수 있다.
"담체"란, 비-면역원성 또는 불량하게 면역원성인 물질(예를 들어, 합텐(hapten))이 천연적으로 또는 인공적으로 연결되어 이의 면역원성을 증강시키는 전형적으로 고분자량의 임의의 물질을 의미한다.
항체-생성 세포의 불멸화는 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 불멸화는 엡스타인-바 바이러스(EBV: Epstein-Barr virus)를 사용하여 형질전환 방법에 의해 달성될 수 있다[문헌[Kozbor 등 (1986) Methods in Enzymology 121:140]). 바람직한 구현예에서, 항체-생성 세포는 세포 융합 방법(상기 Coligan 등 (1991-1997)에 기재됨)을 사용하여 불멸화되며, 이는 단일클론 항체의 생성을 위해 광범위하게 이용된다. 이 방법에서, 항체를 생성하는 잠재력을 갖는 체세포 항체-생성 세포, 특히 B 세포는 골수종 세포주와 융합된다. 이들 체세포는 프라이밍된 동물, 예컨대 마우스 및 래트를 포함한 설치류 동물의 림프절, 비장 및 말초 혈액으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 예시적인 구현예에서, 마우스의 비장 세포가 사용된다. 그러나, 래트, 토끼, 양 또는 염소 세포, 또는 다른 동물 종으로부터의 세포를 대신 사용하는 것이 가능할 것이다.
특수화된 골수종 세포주는 하이브리도마-생성 융합 절차에서 사용하기 위해 림프구성 종양으로부터 개발되어 왔다(상기 문헌[Kohler 등 (1976)]; 문헌[상기 Kozbor 등 (1986)]; 및 문헌[Volk 등 (1982) J. Virol. 42(1):220-227]).
많은 골수종 세포주는 예를 들어, P3X63-Ag8, P3X63-AG8.653, P3/NS1-Ag4-1(NS-1), Sp2/0-Ag14 및 S194/5.XXO.Bu.1을 포함하여 융합된 세포 하이브리드의 생성에 사용될 수 있다. P3X63-Ag8 및 NS-1 세포주는 상기 Kohler 및 Milstein(문헌[Kohler 등 (1976)])에 의해 기재되어 왔다. 문헌[Shulman 등 (1978) Nature 276:269-270]은 Sp2/0-Ag14 골수종주를 개발하였다. S194/5.XXO.Bu.1 주(line)는 문헌[Trowbridge (1982) J. Exp. Med. 148(1):220-227]에 의해 보고되었다.
항체-생성 비장 또는 림프절 세포 및 골수종 세포의 하이브리드를 생성시키는 방법은 통상, 세포막의 융합을 촉진하는 제제 또는 제제들(화학적, 바이러스 또는 전기적)의 존재 하에 체세포를 골수종 세포와 각각 10 : 1 비율(비율은 약 20 : 1 내지 약 1 : 1로 다양할 수 있음)로 혼합하는 단계를 수반한다. 융합 방법은 기재되어 왔다(상기 문헌[Kohler 등 (1975)], 상기 문헌[Kohler 등 (1976)], 문헌[Gefter 등 (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-236] 및 상기 문헌[Volk 등 (1982)]). 이들 연구자에 의해 사용되는 융합-촉진 제제는 센다이 바이러스(Sendai virus) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이었다.
융합 절차가 생존 가능한 하이브리드를 매우 낮은 빈도로 생성하기 때문에(예를 들어, 비장이 체세포의 공급원으로서 사용될 때, 단지 하나의 하이브리드가 대략 모든 1x105 비장 세포에 대해 수득됨), 잔여 비융합된 세포, 특히 비융합된 골수종 세포로부터 융합된 세포 하이브리드를 선택하는 수단을 갖는 것이 바람직하다. 다른 생성된 융합된 세포 하이브리드 중에서 요망되는 항체-생성 하이브리도마를 검출하는 수단이 또한 필수적이다. 일반적으로, 융합된 세포 하이브리드의 선택은, 하이브리도마의 성장을 지원하지만 통상 무한정 분열하게 될 비융합된 골수종 세포의 성장을 방지하는 배지에서 세포를 배양함으로써 달성된다. 융합에 사용되는 체세포는 시험관내 배양물에서 장기간 생존력(viability)을 유지하지 못하므로, 문제가 되지 않는다. 본 발명의 예에서, 하이폭산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제가 결여된 골수종 세포(HPRT-음성)가 사용되었다. 이들 세포에 대한 선택은 하이폭산틴/아미노프테린/티미딘(HAT) 배지에서 수행되며, 이 배지에서 융합된 세포 하이브리드는 비장 세포의 HPRT-양성 유전자형으로 인해 생존한다. 유전적으로 적격인 하이브리드의 성장을 지원하는 배지에서 선택될 수 있는 상이한 유전적 결함(genetic deficiency)(약물 민감성 등)을 갖는 골수종 세포의 사용이 또한 가능하다.
융합된 세포 하이브리드를 선택적으로 배양하기 위해서는 몇 주가 필요하다. 이 기간 중 초기에, 원하는 항체를 생성하는 하이브리드를 식별하여, 이것이 후속적으로 클로닝되고 증식(propagate)할 수 있도록 해야 한다. 일반적으로, 수득된 하이브리드의 약 10%는 원하는 항체를 생성하지만, 약 1% 내지 약 30% 범위가 드문것은 아니다. 항체-생성 하이브리드의 검출은 예를 들어, 문헌[Kennet 등](Chou 등 미국 특허 제6,056,957호)에 기재된 바와 같이 효소-연결 면역검정 및 방사성면역검정 기법을 포함하여 몇몇 표준 검정 방법 중 임의의 하나에 의해 달성될 수 있다.
일단 원하는 융합된 세포 하이브리드가 선택되고 개별 항체-생성 세포주 내로 클로닝되고 나면, 각각의 세포주는 2개의 표준 방식 중 하나로 증식될 수 있다. 하이브리도마 세포의 현탁액은 조직적합성(histocompatible) 동물에게 주사될 수 있다. 그 후에, 주사를 맞은 동물은, 융합된 세포 하이브리드에 의해 생성되는 특이적인 단일클론 항체를 분비하는 종양이 발병할 것이다. 동물의 체액, 예컨대 혈청 또는 복수액은 단일클론 항체를 고농도로 제공하도록 탭핑(tap)될 수 있다. 대안적으로, 개별적인 세포주는 시험관내 실험실 배양 용기에서 증식될 수 있다. 고농도의 단일 특이적 단일클론 항체를 함유하는 배양 배지는 경사법(decantation), 여과 또는 원심분리에 의해 수합되고, 후속적으로 정제될 수 있다.
세포주는 임의의 적합한 면역검출 수단에 의해 관심 항원을 검출하기 위한 이들 세포주의 특이성에 대해 시험된다. 예를 들어, 세포주는 많은 웰로 분취되고 배양될 수 있으며, 각각의 웰로부터의 상층액은 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 간접 형광 항체 기법 등에 의해 분석된다. 표적 항원을 인식할 수 있지만 비-표적 에피토프를 인식하지 않는 단일클론 항체를 생성하는 세포주(들)가 식별된 다음, 시험관내에서 직접 배양되거나 조직적합성 동물 내로 주사되어 종양을 형성하고 필요한 항체를 생성하며, 수집하고 정제한다.
그러므로, 본 발명은 제1 단계에서 SEQ ID NO:1을 포함하는 세포외 부분 또는 이의 변이체 또는 이의 에피토프를 포함하는 단백질과 특이적으로 상호작용하는 단일클론 항체를 제공한다.
그 후에, 단일클론 항체는 일반적으로 탈면역화 수단에 적용된다. 이러한 과정은 본 발명에 따라 제조되는 단일클론 항체와 동일한 또는 유사한 특이성을 갖는 키메라 항체의 제조를 포함하여 임의의 많은 형태를 취할 수 있다. 키메라 항체는, 경쇄 및 중쇄 유전자가 전형적으로 상이한 종에 속하는 면역글로불린 가변 및 불변 영역 유전자로부터 유전자 조작에 의해 작제되어 온 항체이다. 그러므로, 본 발명에 따르면, 일단 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마가 수득되면, 종간(interspecific) 단일클론 항체를 생성하기 위한 기법이 사용되며, 여기서, 하나의 종의 결합 영역은 또 다른 종의 항체의 비-결합 영역과 조합된다(문헌[Liu 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443]). 예를 들어, 비-인간(예를 들어, 뮤린) 단일클론 항체로부터의 CDR은 인간 항체 상으로 그래프팅되어, 뮤린 항체를 "인간화"할 수 있다(유럽 특허 공보 0 239 400, 문헌[Jones 등 (1986) Nature 321:522-525], 문헌[Verhoeyen 등 (1988) Science 239:1534-1536] 및 문헌[Richmann 등 (1988) Nature 332:323-327]). 이러한 경우, 탈면역화 과정은 인간에 특이적이다. 더욱 특히, CDR은 인간 불변 영역과 함께 또는 없이 인간 항체 가변 영역 상으로 그래프팅될 수 있다. CDR을 제공하는 비-인간 항체는 전형적으로 "공여자"로 지칭되고, 프레임워크를 제공하는 인간 항체는 전형적으로 "수혜자"로 지칭된다. 불변 영역은 존재할 필요는 없지만 존재한다면, 이들 불변 영역은 실질적으로 인간 면역글로불린 불변 영역과 동일해야 하며, 즉, 적어도 약 85% 내지 90%, 바람직하게는 약 95% 이상 동일해야 한다. 그러므로, 가능하게는 CDR을 제외한 인간화 항체의 모든 파트는 실질적으로 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 파트와 동일하다. 그러므로, "인간화 항체"는 인간화 경쇄 및 인간화 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체이다. 공여자 항체는 "인간화" 과정에 의해 "인간화"된다고 하는데, 생성된 인간화 항체가 CDR을 제공하는 공여자 항체와 동일한 항원에 결합하는 것으로 예상되기 때문이다. 본원에서 "인간화"에 대한 지칭은 특정 숙주, 이러한 경우 인간 숙주로 탈면역화된 항체에 대한 지칭을 포함한다.
탈면역화된 항체는, 항원 결합 또는 다른 면역글로불린 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에 따른 탈면역화된 항체를 생성하기 위해 이용될 수 있는 예시적인 방법은 예를 들어, 상기 (문헌[Richmann 등 (1988)]), Chou 등(미국 특허 제6,056,957호), Queen 등(미국 특허 제6,180,377호), Morgan 등(미국 특허 제6,180,377호) 및 문헌[Chothia 등 (1987) J. Mol. Biol. 196:901])에 기재되어 있다.
또 다른 형태의 항체는 "면역글로불린 새로운 항원 수용체"(IgNAR)를 포함하며, 이는 해양 동물(상어 및 가오리)의 연골질(cartilaginous)에서만 발견되는 항체 이소타입이고, 수 억년에 걸쳐 혈류의 강력한 우레아 환경에서 안정하게 발현되도록 진화하였다(문헌[Greenberg 등 (1995) Nature 374:168-173]; 문헌[Nuttall 등 (2001) Mol Immunol 38:313-326]). IgNAR 반응은 상어에서 항원에 의한 것이고, IgNAR 가변 도메인의 면역 및 미접촉(naive) 분자 라이브러리 둘 다는 작제되고 항원-특이적 결합 시약에 대해 성공적으로 스크리닝되었다(상기 문헌[Greenberg 등 (1995)]; 상기 문헌[Nuttall 등 (2001)]). IgNAR은 2가(bivalent)이지만, 다양한 수의 불변 도메인에 부착된 2개의 상보성 결정 영역(CDR) 루프를 나타내는 단일 면역글로불린 가변 도메인(약 14 kDa)을 통해 항원을 표적화한다(문헌[Nuttall 등 (2003) Eur J Biochem 270:3543-3554]; 문헌[Roux 등 (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:11804-11809]). 대조적으로, 전형적인 면역글로불린(Ig) 항체는 가변 중쇄(VH) + 가변 경쇄(VL) 도메인 포맷(약 26 kDa)을 갖고, 6개 이하의 CDR을 통해 항원에 결합한다(문헌[Chothia 등 (1989) Nature 342:877-883]; 문헌[Padlan (1994) Mol Immunol 31:169-217]). IgNAR 가변 도메인(VNARs)의 작은 크기, 및 열역학적 및 화학적 안정성은 종래의 항체를 능가하는 분명한 이점을 부여한다. 더욱이, 작은 VNAR 크기는 비정상적으로 길이가 길고 가변적인 CDR3 루프를 통해 크립틱(cryptic) 항원성 에피토프에 대한 이러한 특이한 항체 도메인 접근을 허용한다(상기 문헌[Greenberg 등 1995]; 문헌[Ewert 등 (2002) Biochemistry 41:3628-2636]; 문헌[Nuttall 등 (2004) Proteins 55:187-197]; 문헌[Stanfield 등 (2004) Science 305:1770-1773]; 문헌[Streltsov 등 (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:12444-12449]; 문헌[Streltsov 등 (2005) Protein Sci 14:2901-2909]). 피. 팔시파룸(P. falciparum)의 정단막(apical membrane) 단백질 1(AMA-1)(상기 문헌[Nuttall 등, 2004]); 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)로부터의 Kgp 프로테아제(문헌[Nuttall 등 (2002) FEBS Lett 516:80-86]); 콜레라 독소(문헌[Goldman 등, Anal Chem 78:8245-8255, 2006]); Tom70 미토콘드리아 막 경우(spanning) 단백질(상기 문헌[Nuttall 등 (2003)]), 및 리소자임(상기 문헌[Streltsov 등 (2004)])을 포함하여 여러 가지 표적 항원을 인식하는 IgNAR 도메인이 식별되었다.
IgNAR 또는 더욱 통상적인 항체는 그 자체가 치료제로서 사용되거나 세포독성 분자를 암세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 이들은 또한 진단에 사용될 수 있다.
정확하고 민감한 결합 시약은 단백질-기반 치료 및 진단 산업의 초석이다. 세계적으로 암의 높은 비율을 고려하면, 치료 및 진단 프로토콜에 사용하기 위해 암 항원을 표적화하는 이러한 시약에 대한 긴급한 필요성이 존재한다. KRT14의 세포외 부분의 식별 및 KRT14의 역할은 이들 치료 및 진단 적용의 개발을 허용한다.
또 다른 구현예에서, 제제는 KRT14의 세포외 부분을 갖는 암세포에 대해 면역 반응을 발생시키기에 충분한 KRT14의 세포외 부분을 포함하는 펩타이드 부분을 포함하는 백신이다.
백신은 KRT14의 세포외 부분 또는 KRT14의 유사체 및/또는 SEQ ID NO:1을 포함하는 펩타이드 백신 또는 복합물(composite) 또는 접합제(conjugate agent)일 수 있다. 일 구현예에서, 백신은 SEQ ID NO:1로 표시된 아미노산 서열, 또는 최적 정렬 후 SEQ ID NO:1과 적어도 80%의 유사성을 갖는 펩타이드 서열을 포함하여 이의 가능적 상동체 또는 이의 변이체를 포함하는 펩타이드 부분, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 본 발명은 또한, KRT14의 세포외 부분에 대한 항체를 포함하는 약학적 조성물을 허용한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한"은 생리학적으로 및 약학적으로 허용 가능한 형태의 담체, 희석제 또는 부형제를 지칭한다.
본 발명은 또한, KRT14의 발현을 하향-조절하기 위해 안티센스 또는 센스 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 제형을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은, 국소 또는 전신 치료가 요망되는지의 여부에 따라 그리고 치료될 영역에 따라 많은 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(topical)(질 및 직장 전달 포함), 예를 들어, 네뷸라이저(nebulizer)에 의한 것을 포함하여 분말 또는 에어로졸의 흡인(inhalation) 또는 흡입(insufflation)에 의해 폐; 기관내(intratracheal), 비내(intranasal), 표피(epidermal) 및 경피(transdermal), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입, 또는 두개내, 예를 들어, 경막내(intrathecal) 또는 뇌실내(intraventricular) 투여를 포함한다. 국소 투여를 위한 약학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적액(drop), 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래의 약학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스(base), 증점제 등이 필수적이거나 바람직할 수 있다. 통상적으로 단위 투약 형태로 제시될 수 있는 본 발명의 약학적 제형은 약학적 산업에 널리 알려진 종래의 기법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기법은 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)와 함께 활성 성분을 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 액체 담체 또는 미분된 고형 담체 또는 둘 다와 함께 활성 성분을 균일하게 그리고 긴밀하게 회합시킨 다음, 필요하다면 생성물을 형상화함으로써 제조된다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 추가 항암제를 추가로 포함하며, 이의 예시적인 예는 당업자에게 알려져 있고 본원 어디에서나 기재될 것이다. 일 구현예에서, 추가 항암제는 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 이다루비신 및 미톡산트론, 백금계 제제, 항대사물질, 프라이밍된 T-세포 및 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 항대사물질은 아자세린, D-사이클로세린, 니코페놀산, 트리메토프림, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트, 겜시타빈, 시타라빈(ara-C) 및 플루다라빈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
난소암과 같은 부인과 암을 포함한 암의 식별을 위해 신속하며 효율적이고 민감한 검정이 또한 제공된다. 상기 검정은 암, 특히 난소암의 조기 검출을 허용한다. 주목할 만하게는, 상기 검정이 예를 들어, 부인과 암의 임의의 병기 또는 이의 치료 또는 이로부터 발생하는 임의의 합병증에 사용될 수 있기 때문에 본 발명은 난소암의 조기 검출에만 제한되지 않는다.
"부인과 병태"와 관련하여 "암"의 지칭은 난소암, 뿐만 아니라 하위-유형의 난소암, 예컨대 점액성(mucinous) 또는 자궁내막 난소암 또는 난소암의 병기, 예컨대 병기 I, II, III 또는 IV를 포함한다. 용어, 예컨대 "난소암", "상피 난소암" 및 "난소 악성물"은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 유증상(symptomatic) 여성의 진단에 적용될 때 유용하지만, 무증상(asymptomatic) 여성 및/또는 부인과 병태를 발병시킬 위험이 높은 여성의 진단에 동일하게 적용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 수컷 및 암컷 대상체에서 넓은 범위의 암을 포괄한다.
본 발명은 "리간드" 또는 "결합제" 및 다른 유사한 용어까지 확장되며, KRT14 상의 세포외 에피토프에 특이적으로 또는 실질적으로 특이적으로(제한된 교차-반응성을 가짐) 결합할 수 있는 임의의 화합물, 조성물 또는 분자를 지칭한다. "결합제"는 일반적으로 단일 특이성을 갖는다. 주목할 만하게는, 2개 이상의 에피토프에 대해 다중 특이성을 갖는 결합제가 또한 본원에서 고려된다. 결합제(또는 리간드)는 전형적으로 항체, 예컨대 단일클론 항체, 또는 이의 유도체 또는 유사체이며, 뿐만 아니라 비제한적으로: Fv 단편; 단일 사슬 Fv(scFv) 단편; Fab' 단편; F(ab')2 단편; 인간화 항체 및 항체 단편; 카멜화(camelized) 항체 및 항체 단편; 및 이들의 다가(multivalent) 버전을 포함한다. 다가 결합 시약이 또한 적절하다면 사용될 수 있으며, 비제한적으로: 단일특이적 또는 이중특이적 항체; 예컨대 이황화 안정화된 Fv 단편, scFv 탠덤(tandem)[(scFv)2 단편], 디아바디(diabody), 트리바디(tribody) 또는 테트라바디(tetrabody)를 포함하고, 이는 전형적으로 공유 연결된 또는 다르게는 안정화된(즉, 류신 지퍼 또는 나선(helix) 안정화된) scFv 단편이다. "결합제"는 또한, 당업계에 기재된 바와 같이 앱타머를 포함한다.
항체의 적합한 항원-결합 단편의 다른 비제한적인 예는: (i) Fd 단편; (ii) dAb 단편; 및 (iii) 항체의 초가변 영역(예를 들어, CDR3 펩타이드와 같은 단리된 CDR), 또는 구속(constrained) FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 다른 조작된 분자, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-그래프팅 항체, 1-아암(one-armed) 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈형 면역약제(SMIP: small modular immunopharmaceutical), 및 상어(shark) 가변 IgNAR 도메인까지 확장된다.
일 구현예에서, 항원-결합 항체 단편은 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 가변 도메인은 임의의 적합한 길이 또는 조성의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접해 있거나 이와 프레임(frame) 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. 항원-결합 단편이 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 경우, 상기 VH 도메인 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로 상대적으로 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체성이고, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체성 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원-결합 항체 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 도메인 및 불변 도메인의 비제한적인 배치(configuration)는 (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3, (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2, (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL을 포함한다. 상기 나열된 임의의 예시적인 배치를 포함하여 가변 도메인과 불변 도메인의 임의의 배치에서, 가변 도메인 및 불변 도메인은 서로 직접 연결될 수 있거나 완전(full) 또는 부분(partial) 힌지(hinge) 또는 링커(linker) 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접 가변 도메인 및/또는 불변 도메인 사이에서 가요성(flexible) 또는 반-가요성(semi-flexible) 연결부(linkage)를 초래하는 적어도 2개(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단편은 서로와 및/또는 하나 이상의 단량체성 VH 또는 VL 도메인과(예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 비-공유 회합되어 있는 상기 나열된 임의의 가변 도메인 및 불변 도메인 배치의 호모-이량체 또는 헤테로-이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다. 다중특이적 항원-결합 분자는 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 각각의 가변 도메인은 별개의 항원에 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 이중특이적 항원-결합 분자 포맷을 포함하여 임의의 다중특이적 항원-결합 분자 포맷은 당업계에서 이용 가능한 일상적인 기법을 사용하여 본 개시내용의 항체의 항원-결합 단편과 관련하여 사용하도록 맞춰질(adapt) 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 표적 항원에의 결합에 관여하는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 네이티브(native) 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가질 것이며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Kindt 등, Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 페이지 91 (2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
치료 적용을 위해, 표적 종; 즉, 결합제가 투여될 종과의 융합성을 위해 결합제를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 일 구현예에서, 결합제는 인간화 결합제이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하여 결합제의 FR은 표적 종(즉, 결합제가 투여될 종)의 생식계열 서열의 FR과 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, FR은 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 표적 종의 대상체에게 투여 시 결합 분자에 대해 발생되는 면역 반응을 최소화하기 위한 것을 포함하여 일반적으로 각각의 FR 서열이 표적 종의 하나 이상의 면역글로불린 분자로부터 유래되는 FR 서열과 동일한 것이 바람직하긴 하지만, 일부 구현예에서, 결합제는, 표적 종으로부터의 하나 이상의 FR 내의 상응하는 위치에서 외래(foreign)일 수 있는 하나 이상의 이의 FR 서열에 걸쳐 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결합제가, 표적 종 내의 상응하는 위치에서 외래일 수 있는 하나 이상의 이의 FR 서열에 걸쳐 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 해당 "외래" 아미노산 잔기는 (i) 표적 항원(KRT14)에의 이의 결합제의 결합 특이성에 악영향을 미치지 않을 것이고/거나 (ii) 표적 종의 대상체에게 투여될 때 결합제에 대해 면역 반응이 발생하는 것을 야기하지 않을 것이다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 제제(본원에 기재된 바와 같이 KRT14의 세포외 부분에 결합하는 항체 및 이의 KRT14-결합 단편을 포함함)는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 상기 VH는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VH CDR1), SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VL CDR1), SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, VH는
(a) SEQ ID NO:12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 프레임워크 영역 1(FR1);
(b) SEQ ID NO:13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2;
(c) SEQ ID NO:14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 및
(d) SEQ ID NO:15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4
를 포함하고, VL은
(e) SEQ ID NO:16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1;
(f) SEQ ID NO:17과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2;
(g) SEQ ID NO:18과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 및
(h) SEQ ID NO:19와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4
를 포함한다.
일 구현예에서, VH는 SEQ ID NO:3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 SEQ ID NO:5와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용은 또한, 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분에 특이적으로 결합하는 제제 또는 이의 KRT14-결합 단편까지 확장되며, 상기 제제는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VH CDR1), SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하며; 상기 VL은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VL CDR1), SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, VH는
(a) SEQ ID NO:12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 프레임워크 영역 1(FR1);
(b) SEQ ID NO:13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2;
(c) SEQ ID NO:14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 및
(d) SEQ ID NO:15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4
를 포함하고, VL은
(e) SEQ ID NO:16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1;
(f) SEQ ID NO:17과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2;
(g) SEQ ID NO:18과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 및
(h) SEQ ID NO:19와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4
를 포함한다.
일 구현예에서, VH는 SEQ ID NO:3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 SEQ ID NO:5와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
리간드 및 결합제는 KRT14를 보유하는 세포의 존재를 검출하기 위한 검정에 사용될 수 있다. ECLIA, ELISA 및 루미넥스 LabMAP 면역검정은 바이오마커의 수준을 검출하기 위한 적합한 검정의 예이다. 일례에서, 제1 결합 시약/항체는 표면에 부착되고, 검출 가능한 기를 포함하는 제2 결합 시약/항체는 제1 항체에 결합한다. 검출 가능한 기의 예는 예를 들어 그리고 비제한적으로: 제2 결합 시약에 결합하기 위한 형광색소, 효소, 에피토프(예를 들어, 제2 결합 시약/항체가, 형광-표지된 항-마우스 항체에 의해 검출되는 마우스 항체일 때), 예를 들어 항원 또는 결합쌍(binding pair)의 구성원, 예컨대 비오틴을 포함한다. 표면은 예컨대 전형적인 그리드-유형 어레이(예를 들어 비제한적으로 96-웰 플레이트 및 평면형 마이크로어레이)의 경우 평면형(planar) 표면 또는 코팅된 비드 어레이 기술에서와 같이 비-평면형 표면일 수 있으며, 비드의 각각의 "종"은 예를 들어, 형광색소(예컨대 미국 특허 제6,599,331호, 제6,592,822호 및 제6,268,222호에 기재된 루미넥스(Luminex) 기술), 또는 양자점(quantum dot) 기술(예를 들어, 미국 특허 제6,306. 610호에 기재된 바와 같음)로 표지된다. 이러한 검정은 또한, 실험실 정보 관리 시스템(LIMS)으로서 간주될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역검정"은 원하는 바이오마커, 즉, KRT14의 세포외 부분을 검출하고 정량화할 수 있는 면역 검정, 전형적으로, 그러나 전적으로는 아니지만, 샌드위치(sandwich) 검정을 포함한다.
부인과 병태 또는 기타 암을 진단하는 방법은 알려진 질환을 갖는 환자에서 KRT14의 알려진 양의 제1 지식 기반으로 생성된 알고리즘에서 KRT14의 세포외 부분의 존재를 확인하고, 세포외 부분의 수준을 제2 지식 기반 데이터로 사용하여 수행된다. 또한, 전임상 난소암 또는 다른 암을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체의 시료에서 KRT14의 존재 및/또는 속도를 결정하는 단계를 포함한다. "속도"란, 시간 경과에 따른 환자 시료에서의 KRT14의 농도 변화를 의미한다.
상기 나타낸 바와 같이, 부인과 병태는 암 또는 이의 합병증을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 비제한적으로 "부인과 암"을 포함하여 모든 암을 포함한다. 일 구현예에서, 부인과 암은 난관 화생(tubal metaplasia), 난소 장액성 경계선 신생물(ovarian serous borderline neoplasm), 장액성 선암종(serous adenocarcinoma), 저-등급 점액성 신생물(low-grade mucinous neoplasm) 및 자궁내막 종양을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 부인과 암은 일탈적인(aberrant) 뮬러관(Mullerian) 상피 분화를 겪고 있는 난소 신생물이다. 본원에서 고려되는 다른 부인과 병태는 염증성 장애, 예컨대 자궁내막증(endometriosis)을 포함한다. 상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 남성 및 여성 대상체에 의한 넓은 범위의 암까지 확장된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시료"는 비제한적으로 생물학적 유체(혈액, 혈장, 혈청, 복수 포함), 조직 추출물, 바로 수집된 세포, 및 세포 배양물에서 배양되었던 세포의 용해물을 포함하여 당업자가 검출하고자 하는 암세포를 함유하는 임의의 시료를 의미한다. 특정 구현예에서, 시료는 부인과 조직, 혈액, 혈청, 혈장 또는 복수이다.
상기 나타낸 바와 같이, "대상체"는 부인과 병태 또는 다른 암을 앓고 있는 것으로 의심되거나 앓고 있는 임의의 포유류, 일반적으로 인간일 수 있다. 대상체는 환자로서 지칭될 수 있으며, 암을 앓고 있는 것으로 의심되거나 앓고 있거나 이를 발병시킬 위험에 있는 포유류이다. 용어 "병태"는 또한, 이로부터 발생하는 합병증을 포함한다.
용어 "대조군 시료"는 기지의 질환 상태를 갖는 대상체로부터의 데이터의 제1 지식 베이스를 확립하는 데 사용될 수 있는 임의의 시료를 포함한다.
주제 발명의 방법은 암, 예컨대 난소암을 포함한 부인과 암의 진단 및 병기결정(staging)에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한, 병태의 진행을 모니터링하고 특정 치료가 효과적이거나 효과적이지 않은지의 여부를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 상기 방법은 예컨대 수술, 화학치료법, 면역치료법, 및/또는 방사선 치료법 후 병태의 증상의 부재 또는 개선(amelioration)을 확인하는 데 사용될 수 있다. 나아가, 상기 방법은 화학치료법 및 일탈적인 조직 재출현을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 항체는 바이오마커의 항원 결정기와 항체 사이의 결합 상호작용에 의존하는 임의의 많은 면역검정에 사용될 수 있다. 이러한 검정의 예는 방사성면역검정, 효소 면역검정(예를 들어, ECLIA, ELISA), 면역형광, 면역침전, 라텍스 응집(agglutination), 혈구응집(hemagglutination) 및 조직화학 시험이다. 항체는 암에 있어서 이의 역할을 결정하고 암을 진단하기 위해 시료에서 바이오마커의 수준을 검출하고 정량화하는 데 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 항체는 또한, 예를 들어, 세포 및 하위세포(subcellular) 수준에서, 바이오마커를 검출하기 위해, 항체를 특정 세포 및 조직으로 그리고 특이적인 하위세포 위치로 위치화시키기 위해, 그리고 발현 수준을 정량화하기 위해 면역조직화학 분석에 사용될 수 있다. 항체인 것 외에도, 약제는 비제한적으로 앱타머, 모노바디, 항-칼린, DARPins 및 나노바디 등을 포함하는 임의의 친화성 시약일 수 있다.
광학 현미경 및 전자 현미경을 사용하여 항원을 위치화시키기 위한 당업계에 알려진 세포화학 기법은 KRT14의 세포외 도메인을 갖는 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 검출 가능한 물질로 표지될 수 있고, 바이오마커 단백질은 검출 가능한 물질의 존재에 기초하여 조직 및 세포에서 위치화될 수 있다. 검출 가능한 물질의 예는 하기 물질: 방사성 동위원소(예를 들어, 3H, 14C 35S, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄계열원소 인광체(lanthanide phosphor)), 발광 표지, 예컨대 루미놀; 효소적 표지(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, 아세틸콜린에스테라제), 비오티닐기(광학적(optical) 또는 열량측정(calorimetric) 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 함유하는 스트렙타비딘과 같은 마킹된 아비딘에 의해 검출될 수 있음), 2차 리포터에 의해 인식되는 예정된 폴리펩타이드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인; 에피토프 태그)를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 표지는 잠재적인 입체 장해(steric hindrance)를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암(spacer arm)을 통해 부착된다. 항체는 또한, 전자 밀집 물질, 예컨대 페리틴(ferritin) 또는 콜로이드 골드(colloidal gold)에 커플링될 수 있으며, 이는 전자 현미경에 의해 쉽게 시각화된다.
항체 또는 시료는 세포, 항체 등을 고정시킬 수 있는 담체 또는 고형 지지체 상에 고정될 수 있다. 예를 들어, 담체 또는 지지체는 니트로셀룰로스, 또는 유리, 폴리아크릴아미드, 반려암(gabbro) 및 자철석(magnetite)일 수 있다. 지지체 물질은 스피어(sphere)형(예를 들어, 비드), 원통형(예를 들어, 시험 관 또는 튜브의 내부 표면, 또는 막대(rod)의 외부 표면), 또는 편평형(flat)(예를 들어, 시트(sheet), 시험 스트립)을 포함하여 임의의 가능한 배치를 가질 수 있다. 바이오마커 단백질에 대한 항체 반응성에 대해 특이성을 갖는 제2 항체의 도입에 의해 1차 항원-항체 반응이 증폭되는 간접적인 방법이 또한 이용될 수 있다. 예로서, KRT14의 세포외 도메인에 대해 특이성을 갖는 항체가 토끼 IgG 항체라면, 제2 항체는 본원에 기재된 바와 같이 검출 가능한 물질로 표지된 염소 항-토끼 감마-글로불린일 수 있다.
방사성 표지가 검출 가능한 물질로서 사용되는 경우, KRT14 바이오마커는 방사선촬영(radioautography)에 의해 위치화될 수 있다. 방사선촬영의 결과는, 방사선촬영 사진에서 입자의 밀도를 다양한 광학적 방법에 의해 결정함으로써, 또는 그레인(grain)을 카운팅함으로써 정량화될 수 있다.
KRT14에 대한 표지된 항체는 수술을 받고 있는 환자에서 종양 조직을 위치화하는 데, 즉, 이미지화에 사용될 수 있다. 전형적으로 생체내 적용을 위해, 항체는 방사성 표지(예를 들어, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 갈륨-67, 테크네튬-99, 및 인듐-111)로 표지된다. 표지된 항체 조제물은, 조직이 이미지화되기 전 수시간 내지 수일째에 적절한 담체 내에서 환자에게 정맥내로 투여될 수 있다. 이러한 기간 동안 비결합된 분획은 환자로부터 제거되고, 잔여 항체만 종양 조직과 관련된 항체이다. 동위원소의 존재는 적합한 감마 카메라를 사용하여 검출된다. 표지된 조직은 외과의사에게 종양 위치를 정확히 가리키기 위해 환자의 신체 상에 있는 알려진 마커와 상관관계가 있을 수 있다.
이에, 또 다른 구현예에서, 본 발명은 환자에서 암을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 환자로부터의 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료를, KRT14의 세포외 에피토프에 결합하는 제제와 접촉시켜 이의 수준을 결정하고, 상기 수준을 알고리즘에 적용하여 암에 걸린 환자의 확률 지수를 제공하는 단계; 및
(c) 상기 확률 지수에 기초하여 암에 걸린 환자의 위험성을 진단하는 단계
를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 환자에서 순환하는(circulating) KRT14-양성 암세포를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 환자로부터의 혈액 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 혈액 시료를, KRT14의 세포외 에피토프에 결합하는 제제와 접촉시켜 상기 시료에서 KRT14-양성 암세포의 존재를 결정하는 단계
를 포함한다.
본원에 기재된 방법은 본 발명의 임의의 방법을 수행하기 위해 필요한 시약을 포함하는 미리 포장된 진단 키트를 이용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 키트는 KRT14의 세포외 부분에 대한 적어도 하나의 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어, 임상 환경에서, 환자를 스크리닝하고 진단하기 위해 그리고 암이 발병할 소인을 나타내는 개체를 스크리닝하고 식별하기 위해 편리하게 사용될 수 있다. 키트는 또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 상세한 설명을 포함한다.
나아가, 본 발명은 환자로부터의 시료를 스크리닝하기 위한 알고리즘-기초 스크리닝 검정을 제공한다. 일반적으로, 입력 데이터는 KRT14의 수준에 기초하여 수집되고 정보가 출력 데이터가 되는 수준에서 임의의 상승 또는 감소의 통계학적 유의성을 평가하는 알고리즘에 적용된다. 입력 데이터를 평가하기 위한 컴퓨터 소프트웨어 및 하드웨어는 본 발명에 포함된다.
본 발명의 검정은 기존의 또는 새로 개발된 병리학 아키텍처(architecture) 또는 플랫폼 시스템 내로의 통합을 허용한다. 예를 들어, 본 발명은 사용자가 암, 또는 이의 하위유형 또는 병기에 관하여 대상체의 상태를 결정할 수 있게 하는 방법을 고려하며, 상기 방법은
(a) 통신 네트워크를 통해 KRT14의 세포외 부분의 존재의 형태의 데이터를 수용하는 단계;
(b) 대상체 데이터를, 질환 지수값(disease index value)을 제공하는 알고리즘을 통해 처리하는 단계;
(c) 예정된 값과 비교하여 질환 지수값의 결과에 따라 대상체의 상태를 결정하는 단계; 및
(d) 대상체의 상태 표시를 통신 네트워크를 통해 사용자에게 전달하는 단계
를 포함한다.
본원에 개시된 또 다른 구현예에서, 환자에서 암을 모니터링하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
(a) 제1 시점에서 환자로부터의 혈액 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 (a)의 시료를, KRT14의 세포외 에피토프에 결합하는 제제와 접촉시켜 상기 시료에서 KRT14-양성 암세포의 수준을 결정하는 단계;
(c) 제2 시점에서 환자로부터의 혈액 시료를 제공하는 단계로서, 상기 제1 시점은 상기 제2 시점과 상이한 것인, 단계;
(d) 상기 (c)의 시료를, KRT14의 세포외 에피토프에 결합하는 제제와 접촉시켜 상기 시료에서 KRT14-양성 암세포의 수준을 결정하는 단계; 및
(e) 상기 제1 시점과 제2 시점 사이에서 환자의 KRT14-양성 암세포의 수준의 변화가 있었는 지의 여부를 결정하는 단계
를 포함하며,
상기 제1 시점과 제2 시점 사이에서 환자에서 KRT14-양성 암세포의 수준의 변화는 환자에서 암의 상태 변화를 나타낸다.
이러한 방법은 적합하게는, 암의 상태 또는 병기(예를 들어, 치료법에 반응하여)에서의 변화를 모니터링하거나 재발(예를 들어, 종양 절제 후)을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 암은 부인과 암이다. 일 구현예에서, 부인과 암은 난소암 또는 난소암의 병기 또는 형태이다. 또 다른 구현예에서, 암은 뇌, 방광, 간, 유방, 폐, 췌장, 장, 결장, 위장관, 위, 인후, 자궁내막 및 결장직장 암으로부터 선택된다.
상기 언급된 바와 같이 "알고리즘" 또는 "알고리즘 함수"의 지칭은 다변량 분석 함수의 성능을 포함한다. 상기 기재된 것 이외에 여러 가지 상이한 아키텍처 및 플랫폼이 실행될 수 있다. 본 발명을 실행하는 데 적합한 임의의 형태의 아키텍처가 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
실시예
본원에 개시된 양태는 하기 비제한적인 실시예에 의해 더 설명된다. 하기 물질 및 방법이 이용될 수 있다.
세포 배양. 세포주 OVCAR-4(NIH-OVCAR4) 및 CaOV-3 #HTB-75를 ATCC 및 NIH로부터 구매하였다. OVCAR-4 세포를 Roswell Park Memorial Institute 배지-1640(RPMI)(Life Technologies, 21870092)에서 유지시켰으며; CaOV-3 세포를 Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM)에서 유지시켰고(Thermo Scientific, #11965118); SKOV3 세포(ATCC® #HTB-77™)를 Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM)/Ham's F-12(DMEM/F12)(Thermo Scientific, #11965118)에서 유지시켰으며; COV362.4, Sigma Aldrich(Sigma #07071904)를 고 글루코스 Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM-HG)에서 유지시켰고; BT-16, 비정형 기형/횡문근양 종양(CVCL_M156)과 NCI-H1573 폐 선암종(NCI-H1573) 둘 다 Rosswel Park Memorial Institute(RPMI), MDA-MB-468에서 유지시켰으며; 삼중 음성 유방 암세포(CVCL_0419)를 Eagle Minimum 필수 배지 EMEM 중 DMEM, ANE CA(ATCC HTB-11)에서 유지시켰고; 그리고 SW 620 세포(ATCC CCL-227)를 Leibovitz's L-15 배지에서 유지시켰다. 모든 배지를 10% 우태 혈청(FCS)(Thermo Fisher, #16000044) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Scientific, #15240062)로 보충하였다. ID8 마우스 상피 OC 세포주(Dr. Kathy Roby, Kansas University Medical Center, Kansas City, KA, USA)를, 4% 우태 혈청(FBS)을 1% 인슐린-트랜스페린-셀레나이트(ITS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(PS)과 함께 함유하는 Gibco DMEM(ThermoFisher Scientific)에서 성장시켰다. 인간 중피 세포주 LP9(Coriell Institute Cell Repository #AG07086)를 10% v/v FCS, 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신, 10 ng/ml EGF 및 0.4 ug/ml 하이드로코르티손을 함유하는 HamsF12/199 배지에서 유지시켰다. 모든 주(line)를 37℃ 및 5% v/v CO2에서 유지시켰고, 모든 검정을 시작하기 전에 Countess(등록 상표) II FL 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포 생존력 카운트를 수행하였다. 환자 동의를 얻은 후, 확립된 정제 방법을 사용하여 비-접착성 종양 세포를 악성 복수로부터 수득하고(문헌[Latifi 등 (2012) PLoS ONE 7(10)]), MCDB:F12 배지 및 10% v/v FCS 중 저접착 플레이트 상에서 배양에 의해 분석 전에 저접착 조건 하에 유지시켰다.
CRISPR KRT14 표적화된 방해 및 KRT14 과발현. CRISPR-매개 유전자 침묵화를 Zhang 실험실 프로토콜(문헌[Cong 등 (2013) Science 339(6121):819-23])에 따라 유전자당 3개 가이드 가닥을 사용하여 수행하였다. 세포를, 제조업체의 프로토콜에 따라 DMEM 중 리포펙타민(등록 상표) 2000 형질주입 시약(Invitrogen, #11668019)을 사용하여 가이드 가닥(1-3), 비-표적화 대조군 또는 KRT14 과발현 작제물 KRT14OE(Origene #RC214907)로 형질주입하였다. 형질주입 및 12시간의 회수 시간 후, 세포를 선별 배지 내로 하위-배양하고, 선택적 압력 하에 1 μg/ml 퓨로마이신(Sigma-Aldrich, #P8833) 또는 게네티신(Geneticin)(상표) 선별 항생제(G418 설페이트)(Life Technologies Australia #10131-035)의 첨가에 의해 유지시켰다. 세포를 한계 희석을 받게 하였으며, 여기서 선별 배지를 대략 2주 동안 2일마다 교체하였다. 개별 결장을 확장시키고, 표적 유전자의 넉다운(knockdown)을 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하고 생거 시퀀싱에 의해 입증하였다.
인간 조직 어레이 및 면역조직화학. 면역조직화학을 USBIOMAX(#ov2085, #ov20811)에서 구매하거나 이전에 기재된 바와 같이 인하우스에서(종양 및 나팔관) 생성된 조직 마이크로어레이(TMA) 절편 상에서 수행하였다. 문헌[Bilandzic 등 (2014) Cancer Lett 354(1):107-114]; 문헌[Rainczuk 등 (2013) J Proteome Res]; 문헌[Salamonsen 등 (2013) Fertil Steril 99(4):1086-92](보충 데이터 6 및 7). 항원 회수(retrieval)를 위해, 절편을 90℃에서 50 mM 글리신(pH 3.5)에서 10분 동안 배양하였다. 절편을 4℃에서 0.1% w/v BSA/PBS 중 Rb-KRT14 항체(1:100, Sigma, SAB4501657) 및 mAb AN-17(1:500)과 함께 밤새 배양하였다. 후속 단계를 배양 사이에 PBS 세척과 함께 실온에서 수행하였다. 절편을: 염소 항-토끼 IgG 퍼옥시다제 접합체(1:1000, Dako, Glostrup, Denmark; 카탈로그 항목 PO448), 비오틴화된 토끼 항-염소 IgG 항체(1:1000, Vector Laboratories 카탈로그 번호: BA-5000) 또는 비오틴화된 토끼 항-마우스 IgG 항체(1:1000, Vector Laboratories 카탈로그 번호: BA-9200)와 함께 1시간 동안 배양하고, 뒤이어 Vectastain Elite ABC 키트(Vector Laboratories, Burlingame, California)와 함께 제조업체의 설명에 따라 수행하였다. 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드에 의한 발색 후 항체 결합을 갈색 침전물로서 검출하였고, Harris 헤마톡실린을 대조염색으로서 사용하였다. 절편을 Depex(BDH Laboratory Supplies, Poole, United Kingdom)에서 유리 커버슬립 아래에 장착(mount)하였다. 양성 면역염색을 이소타입(IgG) 대조군에 노출된 병행 절편에 비해 평가하였다. 종양 및 기질(stromal) 조직에서의 면역염색을 기재된 바와 같이(상기 문헌[Rainczuk 등 (2013)]) Aperio ImageScope(v 12.3.3)를 사용하여 평가하였다.
웨스턴 블롯 분석. SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 문헌[Bilandzic 등 (2013) Mol Endocrinol, 2013. 27(3):466-79]에서 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 블롯을 KRT14에 대한 항체(1:1000, SAB4501657), mAb AN-17 및 β-액틴(1:20,000; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia)을 사용하여 프로브(probe)하였다. 2차 항체 HRP-접합된 염소 항-마우스, 항-토끼 및 당나귀 항-염소(1:50,000; Merck Millipore, Kilsyth, Australia)를 사용하였다(문헌[Bilandzic 등 (2013) Mol Endocrinol, 2013. 27(3):466-79]). 단백질 밴드를, Clarity 웨스턴 ECL 블로팅 기질(Biorad #1705061)을 사용하여 검출하고, ChemiDoc(상표) MP 시스템(Bio-Rad, #1708280)을 사용하여 시각화하였다.
xCELLigence 실시간 세포 분석(RTCA). xCELLigence RTCA SP 96-웰 기기(ACEA Biosciences)를 사용하여 실시간 세포 분석(RTCA)을 수행하였다. 시작 전에 무혈청 배지에서 밤새 배양하여 세포주를 G0 기(phase)에서 동기화하였다(synchronize). 증식 검정을 위해, 세포를 0.5 Х 103 세포/0.14 ml/웰로 접종(seed)하였으며(실험 텍스트에 열거된 바와 같음), 임피던스 판독을 8시간 동안 5분마다 수행하였고(세포 접착을 모니터링하기 위해), 후속적으로 24시간 동안 15분마다 수행하였다(세포 증식을 모니터링하기 위해). 침습 검정을 위해, CIM-16 웰 플레이트의 상단 챔버를 매트리겔(Matrigel) 매트릭스(SFM 중 1:10; BD Biosciences, San Jose, CA)로 코팅하였다. 세포를, 하단 챔버에 첨가된 배지 +/- 10% v/v FBS와 함께 상단 챔버에(상기와 같음) 접종하였다. 모든 검정을 적어도 3개의 독립적인 실험과 함께 2 또는 3회로 수행하였다.
복막 미세환경 모델. 복막 미세환경의 모델을 확립하기 위해, 상단 챔버를 매트리겔(SFM 중 1:10; BD Biosciences)로 코팅함으로써 2-챔버 RTCA CIM 플레이트 웰을 제조한 다음, 7 Х 104 LP9 세포 세포/웰을 첨가하고, 컨플루언트(confluent)하게 단층이 형성될 때까지 모니터링하였다(문헌[Domcke 등 (2013) Nat Commun 4:2126]). 스페로이드(환자 복수로부터 바로 수득함; 10개 스피어(sphere)/웰)를 상단 챔버 내 SFM에 접종하였으며, 배지 ±10% v/v FBS를 하단 챔버에 첨가하였다. 실시간 판독을 사용하여, MALDI 이미지화 분석을 위한 수집점으로서 사용하기 위한 최적 시간(들)을 결정하였고, 모든 시료를 실험당 2 또는 3개 웰에 제조하였다. 추가 대조군으로서, 본 발명자들은 또한 변형된 Boyden 챔버를 사용하여 동시발생(concurrent) 종점 침습 검정에서 병행하여 수행하였다. 이러한 경우, 중피 LP9 세포를 Cell Trace(상표) CFSE를 사용하여 표지한 후, 난소암 스페로이드와 함께 접종(inoculation)하였다. 중피 침습을, Cytation(상표) 3 Multimode Imager(BioTek Instruments, Winooski USA)를 사용하여 CSFE-표지 중피 세포 하부(underneath) 스페로이드의 수축(retraction)에 따라 평가하였다.
MALDI - IMS를 위한 시료의 제조. 스페로이드 - 중피 계면을 Thermanox(상표) 절편 가능한 커버슬립 상에서 공동배양하고, 침습-전, 침습-동안, 및 침습-후에 해당하는 결정된 시점에서 한천(agar)으로 덮었다(RTCA 검정에 의해 측정된 바와 같음). 시료를 5 μm로 절단하고, 침습적 계면을 주기적 절편 상에서 H&E 염색에 의해 위치를 확인하였다. 일단 식별되면, 계면을 통한 2개의 염색되지 않은 절편을 MALDI 가공(Bruker Daltonik, GmbH)용 인듐-주석 옥사이드(ITO) 슬라이드 상에 놓았다
MALDI IMS. 난소 암-스페로이드-중피 계면에서 ImageID 워크플로우(Bruker)를 사용하여 트립틱(tryptic) 펩타이드를 식별하였다. ImagePrep 분무 장치(Bruker)를 사용한 네뷸라이제이션(nebulization)에 의해 트립신을 일련의 조직 절편에 적용하였다. 시료를 습윤화된 챔버에서 90분 동안 분해시킨 다음, 펩타이드를 추출하고, C18 피펫 팁을 사용하여 정제하였다. LC-MALDI 분석을 언급된 바와 같이 ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF(Bruker) 및 Dionex Ultimate 3000 RSLC 시스템(Thermo)을 사용하여 수행하였다(문헌[Rainczuk 등 (2014) Int J Cancer 134(3):530-41]). 그 후에, 후속적인 분해된 일련의 절편의 MALDI 이미지화 획득을 이전에 기재된 바와 같이 flexImaging 4.1(Bruker)을 사용하여 수행하였다(상기 문헌[Rainczuk 등 (2014)]). LC-MALDI 데이터 및 MALDI 이미지화 데이터를 비교하며, ImageID 소프트웨어(Bruker)를 사용하여 여과하였고,질량 피크를 이미지화 데이터와 LC-MALDI 분석 사이에서 매칭시켰다. 피크 매칭에 대한 질량 관용을 ImageID 소프트웨어에 의해 자동적으로 계산하였다.
메틸셀룰로스 오버레이 및 스피어 형성. 난소암 세포를 트립신처리에 의해 해리시키고, 완전 세포 배양 배지(카운티스(countess) 세포 카운터에 의해 결정된 바와 같이 98%의 최소 생존력)에 재현탁시켰다. 스피어당 2,500개 세포를 무혈청 배지 중 0.25% w/v 메틸셀룰로스(Sigma Aldrich, Castle Hill, Australia)에 중첩시키고, 96-웰 CELLSTAR(등록된) U-바닥 현탁 배양 플레이트(Greiner Bio One, Interpath Services PTY, Vic, Australia)의 단일 웰 내로 접종하였다. 각각의 주(line)에 대한 스페로이드 응집 및 형성을 관찰하였고, 광학 현미경을 사용하여 규칙적인 간격으로 이미지화하였다. 형성된 스피어를 와이드 보어 팁(wide bore tip) 및 원심분리를 사용하여 수합하였다.
중피 변위(displacement) 검정. 인간 중피 세포주 LP9를 상기와 같이 접종하고, 컨플루언트하게 단층이 형성될 때까지 37℃에서 배양하였다. 난소암 스피어(상기와 같음)를 수집하고, 16-스피어를 컨플루언트한 중피 단층을 함유하는 웰 내로 접종하였다. 중피 변위 및 성장(outgrowth)을 위상차 현미경을 사용하여 규칙적인 간격으로 이미지화하였다.
시험관내 상처 회복 검정. 난소암 세포(또는 다른 암 세포주 - BT16, NCI-H1573, AN3CA, SW620 및 MDA-MB-468)를 12-웰 플레이트 중 완전 배지에서 컨플루언트하게 성장시킨 다음, 밤새 혈청-고갈시켜 G0에서 동기화하였다. 이튿날 세포 배양 배지를 제거하고, 석션에 부착된 피펫 팁으로 긁어서 세포 단층에 상처를 냈다. PBS로 부드럽게 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하고, mAb AN-17(1 μg/ml) 또는 상업적인 KRT14 다중클론 항체(1 μg/ml)가 있거나 또는 없는 완전 성장 배지를 교체하였다. 상처 부위를 0시간 내지 72시간 범위의 규칙적인 간격으로 위상 현미경(Leica) 하에 이미지화하였다. 상처 폐쇄를 분석 LS 리써치 소프트웨어(AnalySIS LS Research Software)(Olympus)를 사용하여 이미지 시리즈에서 측정하여, 매일 상처 면적을 확인하였다. 성장 조건당 관찰된 적어도 6개의 상처 면적으로 3회 반복하였다.
매트리겔 및 콜라겐 I 성장 검정: 염색 및 이미지화. 프로토콜을 문헌[Nguyen-Ngoc 등 (2012) Proc Natl Acad Sci U S A. 109(39):E2595-604]에 맞추었다. 간략하게는, 난소암 스페로이드를 수집하여, 매트릭스당 6개 스피어의 현탁액을 산출하였다. 스피어를 3D 매트리겔 (354230; BD Biosciences) 또는 래트-테일 콜라겐 I(354236; BD Biosciences)에 포매하였다. 배양을 상기 문헌[Nguyen-Ngoc 등 (2012)]에 따라 커버유리 슬라이드 상에 8웰로 설정하였다(94.6190.802, Starstedt). 항체 염색을 위해, 매트리겔 또는 콜라겐 I에서 배양된 스피어를 4% w/v 파라포름알데하이드로 30분 동안 고정하며, PBS에서 10분 동안 2회 헹구고, PBS 중 0.5% v/v Triton X-100으로 20분 동안 투과시켰으며, PBS에서 10분 동안 2회 헹구고, 실온에서 PBS 중 10% v/v FBS에서 2시간 동안 차단시킨 다음, 1차 항체(1:1000, 항-N 카드헤린 항체 [5D5] ab98952 AbCam 및 1:500, KRT14)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 이튿날 시료를 PBS로 3회 세척하며, 2차 항체: 1:2000, 염소 항-토끼 IgG Alexa 467, ab150083 및 1:2000 염소 항-마우스 IgG Alexa 488, ab150117)와 함께 실온에서 3시간 동안 배양한 다음, PBS에서 10분 동안 3회 헹구었다. 시료를, Gen5 Image + 소프트웨어와 함께 Cytation(상표) 3 Mulitmode Imager(BioTek Instruments, Winooski USA) 또는 Nikon C1 공초점 현미경(Monash Micro Imaging Facility, Monash)를 사용하여 이미지화하였다.
실시간 PCR. 총 RNA를, 5 mm 스테인리스강 비드가 있는 Tissue Lyser LT 시스템 및 RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 원발성 고등급 장액성(serous) 난소 종양(n=3) 및 전체 정상 난소(n=3)로부터 추출하였다. 총 RNA를 난소암 세포주 OVCAR4 및 CaOV3로부터 추출하였으며, 단층 또는 스페로이드(KRT14KO 및 야생형 주)로서 성장시켰다; 복수 유래 난소암(n=3) 또는 양성 섬유종(n=2) 스페로이드; 및 RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하는 표적 복막 세포 층 LP-9. KRT14, HNRN, FNDC3B, 18S, CDCA8에 대한 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 공개된 인간 서열에 대해 설계하고 이전에 기재된 바와 같이 확증하였다(문헌[Bilandzic 등 (2009) Mol Endocrinol, 23(4):539-48]). Superscript III 역전사효소(Life Technologies, Grand Island, NY)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR 시료를, Applied Biosystems ABI SYBR 믹스(Scoresby, Victoria, Australia)를 사용하여 10 μl의 최종 부피로 제조하였다. 정량적 실시간 PCR을 이전에 기재된 바와 같이 3벌로 수행되는 모든 반응으로 Applied Biosystems ABI 7900 HT Fast 실시간 기계를 사용하여 완료하였다(상기 문헌[Bilandzic 등 (2009)]). 각각의 PCR 생성물에 대한 표준 곡선에 기초하여 수율을 펨토그램(femtogram)으로 전환시키고, 생성된 mRNA 수준을 시료당 18S mRNA 수준으로 정규화하였다.
통계학적 분석. GraphPad Prism(Version 6; GraphPad Software Inc., San Diego, CA)을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 세포 검정으로부터 유래된 데이터에 대해, 평균을 지시된 바와 같이 본페로니(Bonferroni's), 던네트(Dunnett's) 또는 터키 사후(Tukey's post hoc) 검정과 함께 일원(one-way) 또는 이원(two-way) ANOVA를 사용하여 비교하였다. mRNA 발현이 시료 사이에서 유의하게 상이하였는지의 여부를 결정하기 위해, 만-휘트니-U 검정 또는 독립 t-검정(unpaired t-test)을 수행하였다. 평균은 p < 0.05인 경우 유의하게 상이한 것으로 간주되었다. 모든 실험을 독립적으로 적어도 3회 반복하였다.
카플란-마이어 곡선. 카플란-마이어 온라인 플로터 툴(http://kmplot.com/ 분석/)을 사용하여, 15개의 공개 난소암 데이터세트로부터 장액성 난소암 환자로부터의 mRNA 데이터를 사용하여 생존율 곡선을 생성하였으며, 최상 컷오프 값을 플로터 툴에 의해 자동-선택하고, 로그 순위(log rank), p 값 및 위험비(hazard ratio)(및 95% 신뢰 구간)를 계산하였다(문헌[Lanczky 등 (2016) Breast Cancer Res Treat. 3 (160):439-446]).
실시예 1
접착 및 증식은 세포의 침습 능력을 예측하지 않는다
전이성 난소암 세포는 복강 및 기관(organ)의 내벽을 이루며(lining) 기저 매트릭스에 침습하고 이에 부착하는 중피 단층과 상호작용하여, 2차 결절(nodule)을 형성한다(문헌[Kenny 등 (20017) Int J Cancer 121(7):1463-72]; 문헌[Burleson 등 (2006) J Transl Med 4:6]; 문헌[Sodek 등 (2012) Cancer Metastasis Rev 31(1-2):397-414]). 1차 복수-유래 종양 세포를 사용하여, 연장된 기간에 걸쳐 시험관내에서 스페로이드로부터 침습적 사상위족(filopodia)의 출현으로 중피 변위를 평가하였다. 검정 시작 시, 양성 또는 악성 시료로부터의 스페로이드는 크기가 유사하였으며, 명백한 형태학적 차이를 나타내지 않았다. 광범위한 사상위족 성장 및 기저 중피층의 제거(clearance)는 모든 악성 시료에 대해 24시간 이내에 발생하였으며; 대조적으로, 양성 스페로이드는 성장 또는 침습의 임의의 시각적인 증거를 보이지 않았다. 침습의 결여는 실패한 접착 또는 감소된 세포 증식으로 인한 것이 아니었으며; 사실상, 양성 세포는 코팅되지 않은 배양 플레이트 및 피브로넥틴 코팅된 배양 플레이트에 대해 비교적 높은 접착성을 보였고 RTCA 검정에서 악성 세포 시료보다 더 높은 증식 지수를 달성하였다. 이들 데이터는, 악성 세포만이 침습 능력을 나타내었으며; 침습 잠재력은 시험관내에서 세포의 접착 또는 증식 능력으로부터 예측될 수 없음을 실증한다.
실시예 2
프로테오믹 프로파일링(proteomic profiling)은 침습 계면에 독특한 단백질을 식별한다
어떠한 선행 연구도, 활성적으로 침습하는 암세포와 중피 사이의 계면에서 직접 단백질을 검사하지 않았다. 침습-관련 단백질 존재비(abundance) 및 위치화를 평가하기 위해, 스페로이드/중피 공동-배양물을 중피에의 부착 후에 그러나 침습 개시 전에 수합하였다(RTCA 검정에 의해 결정된 바와 같음). 병행 종점 Boyden 챔버 검정을 사용하여, MALDI IMS 분석에 사용된 시료에서 침습이 아니라 중피 부착이 발생하였었음을 확인하였다.
세포-스페로이드 계면 배양물을 아가로스에 포매하며, 절편화하고, IHC에 의해 위치화시켰으며(도 1a); 그 후에 일련의 절편을 IMS로 분석하여, 침습 계면에 위치한 단백질을 식별하였다. 분석은 또한, 양성 섬유종(도시되지 않음) 환자로부터의 복수-유래 스페로이드를 포함하여, 시료 사이에서 헤테로타입(heterotypic) 변화를 제어하였다. MALDI IMS 및 후속적인 LC-MALDI-MS/MS는, 스페로이드 / 중피 계면에서, 양성이 아니라 악성 스페로이드를 함유하는 공동-배양물에 독특하게 존재하는 26개의 단백질을 식별하였다. 이들 중에는 이전에 난소암과 관련이 있는 몇몇 단백질이었으며(예를 들어, HSP90, AMH 및 OSM)[Vesci 등 (2014) Int J Oncol 45(4):1421-9; Liu 등 (2013) Clin Cancer Res 19(18):5053-67; Kim 등 (2014) Obstet Gynecol Sci .57(5):343-57; Richards (2013) ISRN Inflammation 2013: 23], 접근법을 확증하고 이들이 침습의 조기 병기 동안 중요한 역할을 할 수 있음을 시사하였다. 분석은 추가로 하기와 같이 한정되었다: (i) 모든 악성 고등급 장액성 난소암(HGSC) 시료에서 식별된 단백질만 포함하고; (ii) 중피 세포 단층에서 또한 식별된 단백질은 배제함. 4가지 단백질(KRT14, HRNR, CDCA8 및 FNDC3B)은 이러한 고(high) 엄격성 접근법에 따라 암 - 중피 계면에서 모든 환자의 HGSC 세포에 독특한 것으로 학인되었다. TMA에 대한 면역염색 및 신선한 냉동 조직에 대한 RT-PCR을 사용하여, 조직학적으로 정상적인 난소 조직과 비교하여 독립적인 종양 조직에서 후보 발현 및 위치화를 확인하였다.
실시예 3
침습적 계면 상의 KRT14는 난소암 세포 침습에 필요하다
HRNR, KRT14, CDCA8 및 FNDC3B의 존재비를 다수의 HGSC 세포주(OVCAR3, OVCAR4 및 CaOV3)(상기 문헌[Domcke 등 (2013)])에서 웨스턴 블롯에 의해 검사하였다. 프로테오믹 프로파일링과 일치하게도, HRNR, KRT14 및 CDCA8은 중피 세포 대조군이 아니라 암세포 용해물에서 검출되었다. FNDC3B는 LP9 중피 세포에서 검출되었고, 추가 분석으로부터 배제되었다. 그 후에, CRISPR를 사용하여 KRT14, CDCA8 및 HRNR을 넉아웃시켰으며(CaOV3 및 OVCAR4 세포주), 이의 특이적인 소실을 시퀀싱 PCR 및 웨스턴 블롯에 의해 클론 집단에서 확인하였다. 세포 증식 및 침습에 미치는 기능적 KRT14, CDCA8 또는 HRNR 소실의 효과를 RTCA에 의해 시험하였다. 비처리된 대조군 또는 비-표적화 대조군과 비교하여, HRNR 또는 CDCA8 결여 세포는 유의하게 감소된 증식을 나타내었으며(도시되지 않음); 대조적으로, KRT14의 소실은 증식에 영향을 미치지 않았고(도 2), 이는 KRT14가 종양 세포 생존력 또는 성장에 필요하지 않았음을 시사한다. CDCA8 및 HRNR 넉아웃 세포 둘 다는 또한, 침습 적격성을 보유하였으며; CDCA8 넉아웃 세포는 비처리된 세포 또는 비-표적화 세포와 유사한 침습 동역학(kinetics)을 나타낸 한편, HRNR 넉아웃 세포는 침습 개시에서 지연(lag)을 나타내었다. 그러나, 기능적 KRT14가 결여된 세포는 침습 능력의 완전한 소실을 나타내었으며(도 2a) 30시간 후에는(또는 7일 이하의 연장된 기간에 걸쳐) 침습이 관찰되지 않았다. 침습 적격의 KRT14-매개 소실은 2D 상처 치유 검정에서 확인되었으며(도 2b), KRT14 넉아웃(KRT14KO) 세포는 48시간 후 상처 단층을 회복하는 데 실패하였다. 그러므로, 추가 연구는 악성 난소암 세포의 침습 능력을 제어하는 주된 유전자로서 KRT14에 초점을 맞추었다.
실시예 4
복막 미세환경 모델
복막 미세환경 모델을 사용하여, KRT14는 침습적 난소암 세포의 "리딩 엣지" 상에서 전이의 초기 단계에서 발현되는 것으로 검출된다. 이들 세포는 "리더 세포"로 정의된다. 이러한 모델에서, 난소암 스페로이드는, CIM-16 RTCA 플레이트의 매트리겔 매트릭스 상에서 확립된 중피 단층 상으로 중첩된다. 중피 단층/매트릭스를 통한 스페로이드 부착 및 침습은 xCELLigence 기기를 사용하여 실시간으로 모니터링되어, 침습 세포 거동의 동적(dynamic) 스냅샷을 제공한다.
양성(난소 섬유종) 또는 악성(HGSC) 질환을 앓고 있는 환자의 스페로이드를 복수액으로부터 단리하고 침습 능력에 대해 평가하였다. 악성 HGSC 세포는 중피 단층을 통해 신속하게 침습하였으며, 모든 시료는 첨가-후 4시간 이내에 활성적인 침습을 실증하였다. 반면, 양성 섬유종 환자로부터 수득된 스페로이드는 중피 단층을 파괴하는 데 실패하였다. 그러므로, 암세포 침습의 개시는 시험관내에서 중피 단층과 접촉 시 신속하게 발생하였으며, 이는 침습에 관여하는 초기 사건의 분석을 위한 기간을 시사한다.
실시예 5
실시간 시험관내 침습 검정
중피 단층을 통한 난소암 세포 침습을 측정하기 위해 실시간 시험관내에서 침습 검정(문헌[Bilandzic and Stenvers (2014) J Vis Exp 87])을 사용하여, KRT14(K14KO)의 유전적 절제는 다수의 난소암 주(CVAR4 및 CaOV3(도 2), 뿐만 아니라 복수액으로부터 회수된 1차 난소암 세포(n=5)의 침습 능력을 완전히 무효화시킨 것으로 실증되었다(데이터는 도시되지 않음). KRT14 발현의 소실은 다른 연구와 일관되게 세포 생존력 및 증식 능력에 어떠한 영향도 미치지 않았다(상기 문헌[Papafoliou 등 (2016)]; 문헌[Rock 등 (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106(31):12771-12775]). KRT14KO 난소암 세포는 또한, 상처 치유 검정에서 손상된 세포 단층을 회복할 수 없었으며, 이는 이동 능력의 소실을 실증한다(도 2b). 또한, 다세포성 스페로이드로서 배양된 KRT14KO 난소암 세포는 중피 단층에 대한 결합력이 감소하고, 상피 난소암(EOC) 침습에 대한 주된 요건인 중피 제거(도시되지 않음)를 개시하는 데 실패한 것으로 관찰되었다(문헌[Iwanicki 등 (2011) Cancer Discov 1(2):144-157]). 동계(syngeneic) 난소암 마우스 모델(문헌[Roby 등 (2000) Carcinogenesis 21(4):585-591])을 사용한 생체내 연구는, 마우스에 점액낭내로 이식된 KRT14KO 난소암 세포가 종양을 형성하는 데 실패하였음을 실증하였고(도 3); KRT14KO 세포가 이식된 마우스는 복부 팽만 또는 다른 증상은 발병하지 않았다.
실시예 6
이동성(migratory) 세포는 증가된 KRT14 발현을 나타낸다
KRT14 mRNA 발현을, 하기를 포함하는 임상 표본으로부터의 이동성 세포에서 측정하였다: (i) 원발성 종양 조직; (ii) 복수-유래 HGSC 세포; 및 (iii) 양성 세포; (iv) 조직학적으로 정상적인 난소; 및 (v) 표적 복막 세포층 LP9 단독(n=3/군). 모든 악성 세포는 검정 시작 시 KRT14를 발현하였으며, 양성 섬유종, 정상적인 난소 또는 LP9 중피 세포에서는 발현이 검출되지 않았다. 세포주와 일관되게, 이동성 세포는 악성 시료(즉, 종양 조직 또는 복수 유래)에서만 검출되었으며; 양성 복수로부터 단리된 세포, 정상적인 대조군 또는 LP9 세포 단독은 침습하는 데 실패하였다. KRT14 발현은, 원발성 종양 시료 내 이동 전 시료와 비교하여 하부 챔버 내로 이동하였던 침습적 세포에서 상당히 농화되었으며, 복수-유래 난소암 세포 집단은 최고 수준의 KRT14 mRNA를 나타내었다. 종합하자면, 데이터는, KRT14가 세포 생존력 또는 증식에 영향을 미치지는 않지만, 이는 구체적으로는 시험관내에서 이동성 암세포 하위세트의 침습 잠재력을 유지하는 데 필요함을 나타내고; 이는 활발하게 이동하는 세포에서는 상당히 농화된다.
실시예 7
KRT14는, 스페로이드 조립 및 중피에의 접착에 영향을 미치는 HGSC 세포의 하위집단으로 한정된다
KRT14 존재비 및 난소암 세포(불멸 세포와 원발성 복수-유래 세포 둘 다)에서의 이의 위치화를 면역염색에 의해 확인하였다. 단층 배양에서, KRT14는 소수의 단리된 세포로 한정되었으며, 한편, 저접착 조건 하에 배양된 스페로이드는 KRT14 면역염색이 외부(outer) 스페로이드 림(rim)에만 배제적으로 국소화된 것으로 나타났다. 항-N-카드헤린 항체는 효과적으로 투과하여 전체 스페로이드를 염색했기 때문에, 내부 KRT14 염색의 부재는 스페로이드로부터의 항체의 폐색(occlusion)으로 인한 것이 아니였다. KRT14KO 및 KRT14 과발현(KRT14OE) 주를 검사함으로써 KRT14 발현이 시험관내에서 스페로이드 형성에 필요한지의 여부를 평가하였다. 야생형 OVCAR4 세포, 및 비-표적화 CRISPR 대조군으로 형질주입된 세포는 저접착 배양에서 12시간 후 스페로이드를 형성하였으며; 대조적으로, KRT14 넉아웃 세포는 12시간 후 대체로 분산된 채로 있었다. 그러나, 연장된 배양(48시간)은 대조군과 비슷한 크기 및 형태의 스페로이드를 형성시켰다. 대조적으로, KRT14OE 주는 치밀하고 압축적인 스피어를 신속하게 형성하였으며, 12시간 배양 기간 후 원래의 스피어 사건으로부터 가시적인 성장을 실증하였다. 비처리된 대조군과 비교하여, KRT14KO 스페로이드는 시험관내에서 중피 단층에 접착하는 능력이 현저히 감소되었다.
실시예 8
KRT14+ 세포는 인바도포디아 형성 및 중피 제거를 유발한다
중피 단층 상으로 접종 시, 야생형 HGSC 스페로이드는 24시간 이내에 성장, 중피 제거 및 광범위한 침착과 이동을 나타내었다. 세포 과발현 K14는 신속하게 분산되었고 중피층을 이동시켰으며; 대조적으로, KRT14KO 세포는 중피 단층을 교란시키는 데 실패하였다. 매트릭스 유형이 침습에 영향을 미쳤는지의 여부를 검사하기 위해, 스페로이드(세포주 세포와 복수-유래 HGSC 세포 둘 다)를 매트리겔 또는 콜라겐-I 매트릭스 내로 포매시키고, 시간 경과에 따른 인바도포디아 성장에 대해 모니터링하였다. KRT14+ 인바도포디아는 콜라겐 I 매트릭스에서 12시간 후에 야생형 스페로이드로부터 출현하였으나, 매트리겔에서 뚜렷해지기 전에 48시간 내지 72시간을 필요로 하였다(세포 유형에 따라). 면역염색은 KRT14+ 세포가 인바도포디아로 특이적으로 위치화되었음을 나타내었고, 비-침습적 스페로이드 코어 세포는 KRT14- 표현형을 유지하였다. 이는 단층 스크래치 검정에서 확인되었으며, 여기서, KRT14+ 세포는 상처 폐쇄 영역에 특이적으로 위치화하였다. 침습 능력의 결여와 일관되게, KRT14KO 세포는 어느 매트릭스에서도 시각적인 인바도포디아를 형성하는 데 실패하였다. 종합하자면, 데이터는, KRT14 발현이 활발하게 침습하는 세포의 특징이고, 이의 소실은 중피를 대체하고 종양 성장 동안 퍼뜨리는(disseminate) 스페로이드의 능력을 크게 지연시킴을 시사한다.
실시예 9
KRT14는 종양 병기와 관련이 있고, 난소암 환자에 대한 무진행 생존율을 부정적으로 예측한다
KRT14 발현의 임상 관련성을 확립하기 위해, 다수의 조직학적 하위유형, 난소암의 등급 및 병기, 뿐만 아니라 정상적인 난소 및 나팔관 절편을 포함하는 조직 마이크로어레이(n=292)를 KRT14 존재비 및 위치에 대해 염색하였다. KRT14 발현은 일반적으로 정상적인 난소(5%, 1/20) 또는 나팔관(0%, 0/8) 조직에서는 검출되지 않았으나, 검사된 모든 난소암 하위유형에 의해 보편적으로 발현되었다. 염색은 종양 상피로 위치화되었으며, 기질 조직에서 KRT14의 증거는 거의 없었다. 특히, KRT14는 100%의 HGSC 조직에서 검출되었고, 정상적인 난소와 비교하여 유의하게 상승되었다(p=0.0362, 터키 사후 검정과 함께 독립 t-검정).
그 후에, KRT14 발현과 환자 예후 사이의 잠재적인 관련성을 15개의 공개적으로 입수 가능한 난소암 데이터세트에서 조사하였다(http://www.cbioportal.org/) 상기 문헌[Lanczky 등 (2016)]. 높은 KRT14 발현은 특히 조기-병기(병기 I-II) 질환을 진단받은 환자에 대해(HR 1.96; 95% CI 1.08-3.56 P < 0.025) 감소된 무진행 생존율(PFS)과 관련이 있었다(HR 1.17; 95% CI 1.03-1.33 P < 0.015). 높은 KRT14 발현은 또한, 백금 및 택솔(taxol) 기초 화학치료법 후 감소된 PFS와 관련이 있었으며(HR 1.27; 95% CI 1.07-1.51 P < 0.006), 최적의 디벌크(debulk) 후 PFS의 음성 예측인자였다(HR 1.24; 95% CI 1.03-1.5 P < 0.026). 이에, KRT14에서 얕은(shallow) 결실이 있는 환자들은 화학치료법에 더욱 민감하였고, 1차 치료법에 대해 향상된 반응을 나타내었다. 그러므로, KRT14 발현은 고등급 장액성 난소암이 있는 환자에 대한 예후를 독립적으로 예측하는 인자이다.
실시예 10
마우스 내로의 이식
KRT14KO 세포가 이식된 마우스에서, 부검 시 검출할 수 있는 종양 침착물 또는 심지어 형광 종양 세포는 없었으며, 이는 종양이 이식하는 데 실패하였을 뿐만 아니라 수술 후 후속적으로 제거되었음을 시사한다(도 3). 무손상 세포의 유세포분석 및 면역세포화학 염색을 사용하여, KRT14의 N 말단이 세포 표면에 노출되는 것이 관찰되었다(도 4). 다른 연구와 일관되게(상기 문헌[Papafotiou 등 (2016)]; 상기 문헌[Rock 등 (2009)]), KRT14+ 세포는 종양 세포 집단의 하위세트만 나타내었다(도 4a). KRT14의 N-말단 또는 C-말단에 대한 다중클론 항체를 사용하여, N-말단에 대한 항체가 시험관내에서 침습을 방지하여, KRT14 유전자 넉아웃의 효과를 모방할 수 있는 것으로 확인되었다(도 4b). 항-C-말단 항체는, KRT14의 C-말단 영역의 잘 확립된 세포내 위치화와 일관되게 침습에 아무런 영향을 미치지 않았다(도 4b). 외부에서 첨가된 전장 재조합 KRT14 단백질은 항체 결합을 위해 경쟁할 수 있으며, 시험관내에서 침습이 회복되었다(도 4b). 그러므로, 침습 능력의 소실은 직접적으로, KRT14의 항체의 결합으로 인한 것이었다. 더욱이, 이러한 효과는 KRT14의 N-말단에의 항체 결합에 의해 매개되고; N-말단은 항체 결합에 접근 가능한 세포의 외부면 상에 노출되었다.
실시예 11
항원성 및 소수성 플롯
항원성 및 소수성 플롯을 사용하여, 인실리코에서 KRT14의 처음 200개 아미노산을 검사하였다(도 5a). 5개의 잠재적으로 항원성인 영역을 예측하였고, 이들 영역을 포괄하는 6개의 펩타이드를 추가 경쟁 검정에 사용하기 위해 합성하였다. 펩타이드 #4 및 #5에 의한 N-말단 항체의 차단은 시험관내에서 난소암 세포의 침습(도 5b) 및 이동(도 5c)을 회복시켰다. 펩타이드 1, 2, 3 및 6은 사용된 다중클론 항체에 의해 인식되었음에도 불구하고 완전한 침습 및/또는 이동 능력을 회복시키는 데 실패하였다. 항체 및 펩타이드 경쟁 검정에 기초하여, KRT14 단백질의 표면-노출 영역을 아미노산 서열 NH2-GFGGGYGGGLGAGLGGGFGGGFAGGDGL(SEQ ID NO:1) 내에서 정의하였다. 이러한 아미노산 서열을 사용하여, 무손상 세포에서 KRT14의 N-말단을 표적화하는 단일클론 항체의 생성을 위해 마우스를 면역화시켰다.
실시예 12
KRT14에 대한 항-혈청
기능적 시험을 사용하여, 명시된 KRT14 에피토프를 함유하는 단백질 단편에 대해 발명자들에 의해 생성된 내부 마우스 항-혈청 AN-17 O20023을, 시험관내에서 암세포 침습이 차단되는 능력에 대해 평가한다.
xCELLigence 실시간 세포 분석(RTCA) DP 6-웰 기기(ACEA Biosciences)를 사용하여 실시간 침습 검정을 수행하였다. 난소암 세포(SKOV3)를, 무혈청 배지(SFM)에서 배양하여 Go 기에서 동기화하고, 매트리겔 매트릭스(SFM 중 1:10; BD Biosciences, San Jose, CA)로 코팅된 CIM-16 웰 플레이트의 상부 챔버에 접종하였다(4x104 세포/웰). 10% v/v FBS를 함유하는 배지를 화학주성제로서 하단 챔버에 첨가하였다. 마우스 AN-17 O20023으로부터의 항-혈청(SFM 중 1:100으로 희석됨), 대조군 혈청 또는 KRT14에 대한 상업적으로 입수 가능한 다중클론 항체(Sigma SAB4501657; SFM 중 1 μg/ml)를 상단 챔버에 첨가하고, 침습을 24시간 동안 15분마다 수행하였다. 검정 완료 시 세포 생존력을 알마 블루(Alamar Blue) 염색에 의해 평가하였다. 모든 검정을 2회로 수행하였다. 항-혈청 AN-17 O20023을, 명시된 KRT14 에피토프를 함유하는 단백질 단편에 대해 발생시켰다.
비처리된 대조군 웰 및 혈청-단독 대조군 웰에서, 침습은 5시간의 접종 이내에 관찰되었다(도 6a). 상업적으로 입수 가능한 다중클론 항-KRT14(Sigma SAB4501657; 명시된 KRT14 에피토프를 인식할 수 있음)로 처리된 세포는 침습의 저해를 보였다. 항-혈청 AN-17 O20023은 정제된 항-KRT14 다중클론 항체와 유사한 효능으로 시험관내 침습을 효과적으로 차단하였으며(도 6a), 이는 표적의 효과적인 인식을 실증한다. 종점에서 비처리 세포 대 대조군 또는 항-혈청-처리 세포 사이의 생존력에 있어서 유의한 차이가 존재하지 않았으며(도 6b), 이는 침습의 결여가 손상된 증식 능력으로 인한 것이 아니었음을 시사한다.
항-혈청 AN-17 O20023은 시험관내에서, 상업적으로 구매된 조제물과 유사한 효능으로 난소암 세포 침습 능력을 효과적으로 차단하였다. 그 효과는 손상된 세포 증식으로 인한 것이 아니었으나, 이전에 관찰된 바와 같이 침습에 특이적이었다. 이러한 항체는 리드(lead) 화합물로서의 진행중인 특성화에 적합하다.
실시예 13
비-난소암 세포에 미치는 효과
항-KRT14 항체를 사용하여, 이들 항체가 다른(비-난소) 고형 종양 유형으로부터 유래된 암세포에 의한 침습을 방지할 수 있는지의 여부를 시험하였다.
시험관내 상처 회복 검정을, AN3CA 자궁내막 암종 주 및 SW620 결장직장 암종 주를 사용하여 수행하였다. 세포를 12-웰 플레이트에서 완전 배지 중에서 컨플루어트하게 성장시킨 다음, 밤새 혈청-고갈시켜 G0에서 동기화하였다. 이튿날 세포 배양 배지를 제거하고, 석션에 부착된 피펫 팁으로 긁어서 세포 단층에 상처를 냈다. PBS로 부드럽게 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 세포를 완전 성장 배지 +/- 상업적인 KRT14 항체(1 μg/ml)에서 단독으로 또는 1 μg/ml 경쟁적 펩타이드와 조합하여 배양하였다. 상처 면적을 0시간 내지 72시간 범위의 규칙적인 간격으로 위상 현미경(Leica) 하에 이미지화하였다. 상처 폐쇄를 분석 LS 리써치 소프트웨어(Olympus)를 사용하여 이미지 시리즈에서 측정하여, 매일 상처 면적을 확인하였다. 성장 조건당 관찰된 적어도 6개의 상처 면적으로 실험을 3회 반복하였으며, 16시간 수집점으로부터의 데이터가 실증되었다.
자궁내막 및 결장직장 암종 세포주 둘 다, 16시간의 배양 후 항-KRT14 항체의 존재 하에 손상된 상처 치유를 나타내었다(도 7). 경쟁적 KRT14 에피토프의 존재 하에, 상처 치유 능력은 비처리된 대조군에서 관찰된 수준까지 회복되었다.
항-KRT14 항체는, 난소 암종 세포에서 관찰된 저해와 유사하게 결장직장 및 자궁내막 암 세포주의 이동 거동을 저해한다. 저해는 경쟁 검정에 의해 입증된 바와 같이 정의된 KRT14 에피토프에 대해 특이적이다. 데이터는, KRT14의 항체-매개 저해가 다수의 고형 종양 유형에서 침습을 저해하는 범암(pan-cancer) 기전으로서 작용할 수 있음을 시사한다.
실시예 14
항체의 교차 종 효과
항-인간 KRT14 항체를 비-인간 난소암 세포에서 침습을 방지하는 능력에 대해 평가하였다.
모든 실험을 뮤린 ID8 난소암 세포주를 사용하여 수행하였다. 실시간 침습 검정(실시예 5에 따라) 및 시험관 상처 회복 검정(실시예 6에 따라)을 기재된 바와 같이 수행하였다.
인간 KRT14 에피토프에 특이적인 항-KRT14 항체는 시험관내에서 마우스 암세포의 이동을 효과적으로 차단하였다(도 8a). 펩타이드 경쟁 검정(실시예 6에 기재된 바와 같음)은 이들 세포에서 이동 능력을 회복시켰으며(도 8a), 이는 KRT14 에피토프에 대한 특이성을 실증한다.
실시간 침습 검정은, 항-KRT14 항체가 시험관내에서, 인간 세포주에서 관찰된 것과 유사한 효능으로 ID8 세포 침습을 차단하였음을 확인시켜 주었다(도 8b).
KRT14의 항원성 에피토프는 다수의 종에 걸쳐 높은 상동성(>80%)을 실증한다. 이에, 인간 에피토프에 대한 항체는 비-인간 단백질에 효과적으로 결합하여, 시험관내에서 세포 이동 및 침습을 저해할 수 있다. 이들 데이터는, 항-KRT14 치료법이 종에 걸쳐 적용 가능할 것임을 시사한다.
실시예 15
mAb AN-17은 시험관내에서 치유-표준 화학치료법과 상승작용한다
이 연구를 수행하여, 이동 및 침습을 손상시키는 것으로 실증되었던(본원 어디에서나 주지된 바와 같음) 세포-표면 항원 KRT14의 단일클론 항체 AN-17(mAb AN-17)에 의한 표적화가 난소 세포를 표준 제1차 화학치료제인 시스플라틴에 민감하게 하는 지 여부를 결정하였다.
실시간 세포 분석(RTCA)을, xCELLigence RTCA SP 96-웰 기기(ACEA Biosciences)를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이(PMID: 31443478; 문헌[Bilandzic 등, Cancers (Basel). 2019; 11(9), E1228]) 수행하였다. 세포주를 무혈청 배지에서 밤새 배양함으로써 G0에서 동기화시켰고, 0.5 Х 103 세포/0.15 ml/웰로 접종하였다. 24시간 후, 시스플라틴 단독(1.25 mg/ml), mAb AN-17 단독(1 ug/ml) 또는 시스플라틴 + mAb AN-17의 조합을 첨가하였다. 임피던스 판독을 실험 기간 동안 15분마다 수행하였다. mAb AN-17은 각각 SEQ ID NO:2 및 4의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 SEQ ID NO:3의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:5의 경쇄 가변 영역을 포함한다(또한 도 21 및 도 22 참조).
15 μg/ml 또는 20 μg/ml에서 세포의 시스플라틴-처리는 완전한 세포 사멸을 초래하였으며, 한편 1.25 μg/ml의 용량은 준-치사였고, 세포는 계속 증식하였다(도 9). 이전에 실증된 바와 같이, mAb AN-17 단독은 세포 생존력 또는 증식에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 그러나, 세포와 mAb AN-17 및 시스플라틴의 공동-배양은 시험된 모든 용량에서 화학치료법 단독과 비교하여 세포 생존력 및 증식을 크게 감소시켰다(도 9). 시스플라틴이 1.25 μg/ml의 준-치사 용량으로 사용되었을 때 가장 뚜렷한 효과가 관찰되었으며; mAb AN-17과의 공동-배양은 약 50시간 후, 12-배 더 높은 시스플라틴 용량 단독과 유사하게, 완전히 세포를 사멸시켰다(도 9). 그러므로, mAb AN-17은 시험관내에서 세포의 민감성을 표준 백금 화학치료법의 적어도 10-배로 증가시키는 작용을 한다.
실시예 16
mAb AN-17은 약 10,000개 항원의 패널에 대해 검출 가능한 교차-반응성을 나타내지 않는다
하기 실험을 수행하여, mAb AN-17이 단백질 항원의 패널에 대해 임의의 교차-반응성을 나타내는지의 여부를 확립하였다.
2벌로 스팟된(spotted) 9,184개의 개별 재조합 인간 단백질을 포함하는 InvitrogenTM ProtoarrayTM 인간 단백질 마이크로어레이 v5.0(ThermoFisher Scientific, Waltham MA)을 사용하여, mAb AN-17 항체 반응성의 프로테오믹 프로파일링을 수행하였다. 모든 절차를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(PMID: 29141850; 문헌[Wilson 등 Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018; 27(2):183-192]). 어레이를, 세척 완충제 중 1:500으로 희석된 mAb AN-17을 사용하여 프로브화하였다. IgG 중쇄 및 경쇄에 대한 형광 검출 항체는, 사용 전에 세척 완충제에서 2 mg/ml까지 희석된 Abcam(예비흡착된 #ab150119 염소 항-마우스 IgG H&L Alexa Fluor® 647)에서 나왔다. 검출 항체 단독과 함께 배양된 단일 어레이를 비-특이적 항체 결합에 대한 대조군으로서 사용하였다.
기재된 바와 같이(PMID: 29141850; 문헌[Wilson 등 Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018; 27(2):183-192]) 635 nm 여기 레이저 및 이중 밴드 통과 Cy3/Cy5 필터를 사용하는 Fuji FLA5100 다중 파장 스캐너를 사용하여 어레이 이미지화를 수행하였다. 이미지를 10 μm 해상도에서 획득하였고, PMT는 1000 V로 설정되었다. 어레이 정렬, 특징 추출 및 데이터 정규화를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(PMID: 29141850; 문헌[Wilson 등 Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018; 27(2):183-192]). 어레이 코디네이트(co-ordinate)를 제조업체가 제공한 다운로드 가능한 .GAL 파일로부터 수득하였다(ThermoFisher Scientific; (http://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/biomarker-discovery/protoarray/resources/lot-specific-information.html).
mAb AN-17 또는 2차 항체 단독과 항원 반응성을 나타내는 개별 어레이 이미지를 도 10에 도시한다. 대조군과 mAb AN-1-처리 어레이 사이에 유의한 차이가 존재하지 않았으며, 이는 mAb AN-17이 시험된 어레이 상에 존재하는 임의의 단백질과 반응하지 않았음을 시사한다.
이들 데이터는, 시험관내에서 표적 항원(KRT14)에 대한 이의 mAb AN-17의 높은 특이성을 실증한다. mAB AN-17은, 몇몇 관련 케라틴 단백질을 포함하여 어레이 상에 존재하는 어떠한 항원과도 반응하지 않았다. 따라서, mAb AN-17은 이의 표적 항원에 대해 높은 친화성을 나타낸다.
실시예 17
mAb AN-17은 KRT14를 웨스턴 블로팅에 의해 검출한다
전장 재조합 KRT14 단백질(Abcam #ab73637)의 1 μg 분취물을 SDS PAGE에 의해 분리하고, 표준 절차(PMID: 23952987)를 사용하여 PVDF 막으로 이전시켰다. 상기 막을 1:1000, 1:5000 및 1:10,000의 희석에서 mAb AN-17로 프로브화하였다. 2차 항체는 염소 항-마우스 HRP 접합체(1:50,000 희석)였으며, KRT14의 검출을 표준 절차에 따fms 화학발광을 사용하여 수행하였다(PMID: 23952987; 문헌[Rainczuk 등, J Proteome Res. 2013; 12(9):4074-88]).
전장 KRT14 단백질은 mAb AN-17을 1차 항체로서 사용하는 웨스턴 블로팅에 의해 성공적으로 검출되었다(도 11). 다중 희석은 강한 신호를 제공하였다.
실시예 18
mAb AN-17은 KRT14+ 리더 세포 및 순환하는 종양 세포를 유세포분석에 의해 식별한다
유세포분석을 표준 프로토콜(PMID: 30602661)에 따라 수행하였으며, 데이터를 BD LSRFortessa X-20(BD Biosciences)을 사용하여 획득하고 FlowJo 소프트웨어 v10.5.0(BD Biosciences)을 사용하여 분석하였다. KRT14+ 세포 집단에 대해 평가된 시료에는 OVCAR3, CAOV4, ID8 마우스 난소암 세포, 임상 표본으로부터 유래된 복수-유래 난소암 세포(#3.1937-07로 지정됨) 및 12-주령 상피 난소 종양이 있는 마우스의 심장 혈액이 포함되었다. 세포주의 경우, 세포주당 1x106개 세포를 mAb AN-17(1:200 희석) 또는 양성 대조군으로서 상업적으로 입수 가능한 항-KRT14 다중클론 항체(Sigma SAB4501657; 1:50 희석)와 함께 비-면역 혈청에서 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 2차 항체, 염소 항-마우스 Alexa647(mAb AN-17) 또는 염소 항-토끼 IgG Alexa 488(상업적인 Ab)을 1:500으로 희석시키고 30분 동안 배양하였다. 혈액 시료의경우, 2x106개 세포를 Alexa Fluor® 488-접합 mAb AN-17 항체와 함께 45분 동안 배양하였다. PBS 세척 후, 세포를 PBS/2%FBS에 재현탁시키고, BD LSRFortessa X-20(BD Biosciences) 유세포분석기를 사용하여 데이터를 획득하였다.
KRT14를 발현하는 세포를 세포주(인간 - OVCAR4, CAOV4; 마우스 - ID8) 및 임상적으로 수득된 난소암 세포(3:19367-03)에서 상업적으로 입수 가능한 다중클론 항체인 Sigma SAB4501657(도 12)과 비교하여 mAb AN-17을 사용한 유사한 검출로 유세포분석에 의해 검출하였다.
세포외 KRT14의 발현은 또한, 순환하는 종양 세포(CTC) 집단을 표시한다. PMID: 30602661(문헌[Wilson 등 Cancers (Basel). 2018; 11(1), E32])에서 이전에 기재된 바와 같이 뮤린 난소암 모델을 사용하여, CTC는 근적외선 형광단 iRFP720을 의무적으로 발현한다. mAb AN-17을 사용하여, 난소암이 있는 마우스의 전혈을 프로브화하였으며, KRT14+ iRFP+ 세포에 대해 유세포분석으로 분석하였다. mAB AN-17은 전혈로부터 iRFP+ 세포를 올바르게 식별할 수 있었으며, 이는 CTC를 식별하고 포착하는(capture) 이용성을 실증한다.
mAb AN-17은 상업적으로 입수 가능한 항-KRT14 다중클론 항체(Sigma SAB4501657)와 비슷한 민감성으로 KRT14+ 세포를 유세포분석에 의해 식별하였다. 더욱이, mAb AN-17은 ID8 iRFP720+ 상피 난소 종양이 있는 마우스로부터 KRT14+ CTC를 유세포분석에 의해 검출하고 단리할 수 있었다. 그러므로, mAb AN-17과 같은 항-KRT14 결합제 CTC의 포착 및 분석을 포함하여 진단 및/또는 예후 시험에 사용될 가능성이 있다. 데이터는 또한, mAb AN-17과 같은 항-KRT14 결합제가 생체내에서 이들 세포를 치료적으로 표적화하는 데 사용될 수 있었음을 나타내었다.
실시예 19
mAb AN-17은 KRT14+ 세포를 면역형광 염색에 의해 검출한다
난소암 세포주 SKOV-3, Ovcar4 및 Cov362.3을 96웰 검정색 플루오르트랙(fluortrac) 이미지화 플레이트 상으로 접종하였다. mAb AN-17을 사용하여 무손상 또는 고정되고(1% 파라포름알데하이드; PFA) 투과된(0.1% Triton X) 세포를 염색하였다. 고정된 세포의 경우, 시료를 10% 우태 혈청(FBS)에서 차단한 다음, 1 μg/ml mAb AN-17로 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 세포를 후속적으로 PBS로 세척하고, Alexa Fluor®-647 염소 항-마우스 2차로 1:2000에서 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 무손상 세포의 경우, 시료를 1% FBS를 함유하는 PBS 중, 1 μg/ml의, Alexa-647에 접합된 mAb AN-17로 37℃에서 2시간 동안 염색하였으며, 배지를 신선한 PBS/1% FBS로 교체하였고, 세포를 즉시 이미지화하였다. 시료를, Cytation 3 다중모드 판독기를 4X 배율에서 사용하여 이미지화하였다.
mAb AN-17에 대한 특이적인 세포내 세포질 위치화를 투과된 난소암 세포주 시료에서 관찰하였다(도 14). 무손상 생존(live) 세포에서, mAb AN-17에 대한 주요한 세포 표면 위치화가 관찰되었다.
이들 데이터는, mAb AN-17이 세포에서 KRT14를 면역형광에 의해 염색하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다. 염색은 생존한 무손상 세포와 고정되고 투과된 세포 둘 다에서 효과적이다.
실시예 20
mAb AN-17은 암 조직 절편에서 KRT14+ 세포를 면역조직화학적 염색에 의해 검출한다
포르말린-고정된, 파라핀-포매된(FFPE) 시료 상에서의 면역조직화학을, 표준 프로토콜(PMID: 31443478; 문헌[Bilandzic 등, Cancers (Basel). 2019; 11(9), E1228])을 사용하여 수행하였다. mAb AN-17의 효능을 농도 범위(2 μg/ml 내지 0.25 μg/ml)에 걸쳐 시험하고, 밤새 배양 후 상업적으로 입수 가능한 항-KRT14 항체(Sigma SAB4501657, 1:100 희석) 및 마우스 IgG 대조군과 비교하였다. 기재된 바와 같이 2차 항체와의 배양 후, 항체 결합 및 위치화를, Vectastain Elite ABC 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 갈색 침전물로서 시각화하였다.
mAb A-17을 사용하여 염색된 조직은 상업적인 항-KRT14 다중클론 항체(Sigma SAB4501657)로의 동일한 위치화를 나타내었으며, 염색은 종양 상피에서 특이적으로 관찰되었다(도 15). 기질 조직에서 관찰된 염색에 대한 증거는 거의 없었으며, 마우스 IgG 대조군에 대해 관찰된 염색은 없었다. 신호 존재비는 상업적으로 입수 가능한 다중클론 항체(Sigma SAB4501657)와 비교하여 덜 확산되었다.
이들 데이터는, mAb AN-17이 절편화된 종양 조직에서 KRT14를 위치화하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 21
mAb AN-17은 생체내에서 검출 가능한 급성 독성을 갖지 않는다
난소 종양의 유도; 뮤린 ID8 난소 종양 세포를 C57BL/6 마우스에서 점액낭내로 이식하였으며, 원발성 종양을 이전에 기재된 바와 같이 약 4주의 기간에 걸쳐 발병하도록 하였다(PMID: 30602661; 문헌[Wilson 등 Cancers (Basel). 2018; 11(1), E32]).
mAb AN-17 독성의 평가; 마우스(n=2/용량/시점)는 단일 용량의 mAb AN-17 또는 이소타입이 일치하는 대조군 IgG 카파 항체(Ultra-LEAF™ 정제된 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군, Biolegend #401411)를 복막내 주사에 의해 받았으며, 그 후에 독성과 관련된 모든 임상 징후에 대해 최대 7일에 걸쳐 모니터링하였다. 0.5, 1.0. 2.5, 5.0 및 10 mg/kg의 용량을 평가하였다. 7일 후, 마우스를 도태시켰고, 독성의 임의의 증거(거시적인 조직 외양, 염증의 존재, 또는 임의의 명백한 병변)에 대해 사후 검사하였다.
모든 마우스(종양 및 비-종양)를 실험 기간에 걸쳐 독성 효과의 증거에 대해(주사 후 초기 반응, 고통의 징후), 그리고 사후 독성의 증거에 대해(상기와 같음) 평가하였다. 독성 효과의 증거는 임의의 시점에서 또는 시험된 임의의 용량에 대해 주지되지 않았다.
실시예 22
mAb AN-17은 종양 조직으로 특이적으로 위치화하고, 생체내에서 건강한 조직에는 유지되지 않는다
mAb AN-17 또는 이소타입이 일치하는 대조군 IgG 카파 항체(Ultra-LEAF™ 정제된 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군, Biolegend #401411)를, ALEXA647 또는 ALEXA750 형광 염료(Thermo Fischer Scientific)로 1:10 비로 제조업체의 지침에 따라 표지하였다. 마우스(n=2/군)는 ALEXA-표지된 mAb AN-17 또는 이소타입 대조군 IgGκ(상기와 같음)를 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 또는 10.0 mg/kg으로 복막내(100 μl) 주사에 의해 받았다. 대조군 마우스는 비히클(PBS) 단독을 받았다. 주사-후 4시간 내지 7일의 시점에서, 마우스를 도태시켰고, 선택된 조직(간, 신장, 비장, 창자, 난소 + 나팔관 / 난소 종양(관련되어 있음), 뇌, 심장, 폐)을 수합하였다. 조직 분포 및 제거율을, IVIS Lumina III 이미지화 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 ALEXA647 또는 ALEXA750 형광에 의해 평가하였다. 명시야(자동-노출) 및 형광 이미지화(ALEXA647 ex640, em670; 또는 ALEXA750 ex740, em790nm). 스펙트럼 불혼합(unmixing) 및 이미지 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(PMID: 30602661; 문헌[Wilson 등, Cancers (Basel). 2018 Dec 31;11(1), E32]). 비히클-치료 동물의 배경 평균 방사상 효율을 각각의 경우 형광 측정으로부터 차감하였고, 생성된 데이터를 비교를 위해 플롯팅하였다.
7일에 걸쳐 건강한 조직(난소 종양이 없는 마우스를 사용함)에서 mAb AN-17의 위치화를, 0.5 mg/kg의 단일 용량의 투여 후 비-표적된 이소타입 대조군 항체와 비교하였다. 각각의 경우, 항체를 형광 표지하여, 사후 검출을 용이하게 하였다. 항체-관련 형광을 창자, 생식 기관, 간, 신장, 비장, 폐 및 심장에서 관찰하였으며; 형광은 뇌에서 검출되지 않았다(도 16). 그러나, mAb AN-17과 이소타입 대조군 IgGκ 항체 사이에 유의한 차이가 없었으며, 이는 검사되는 임의의 건강한 조직에서 mAb AN-17의 특이적인 축적을 실증하지 않았다. 더욱이, 제7일까지, 각각의 항체는 모든 기관으로부터 대체로 제거되었으며(형광 신호의 소실에 의해 판단됨), 이는 mAb AN-17이 장기간 유지되지 않았음을 시사한다(도 16).
저용량에서의 항체 제거율이 제7일까지 완료되는 것으로 나타났기 때문에, 건강한 조직으로부터의 mAb AN-17 제거율을 다중 증가 용량(0.5 mg/kg으로부터 10 mg/kg까지)에서 유사한 방식으로 평가하였다. 심지어 최고 용량(10 mg/kg)에서, mAb AN-17은 7일 후 모든 기관에서 사실상 검출 불가능하였고, 전형적으로 대조군 항체보다 더 낮은 수준으로 존재하였다(도 17). 이들 데이터는, mAb AN-17이 건강한 조직에서 비-선택적 축적 또는 유지를 나타내지 않음을 시사한다.
그 후에, mAb AN-17의 분포를, 원발성 난소 종양이 있는 마우스에서 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 단일 용량을 사용하여 평가하였다. 평가를 7일에 걸쳐 수행하였다. 투여-후 24시간째에, mAb AN-17은 종양 조직으로 강하게 위치화되었다(도 18). 건강한 조직과는 달리, mAb AN-17은 종양 조직에서 지속되었고, 심지어 7일 후 검출 가능한 채로 남아 있었다(도 18). 더 높은 형광 수율이 10 mg/kg 용량을 받은 마우스에서 초기에 관찰되었으나; 주사-후 제3일까지 유사한 수준의 mAb AN-17이 용량과 상관 없이 검출되었고, 이는 종양이 5 mg/kg 용량에서 포화되었을 수 있음을 시사한다. 더욱이, mAb AN-17 검출의 초기 수준은, 종양이 없는 마우스의 생식관에서 검출된 것보다 종양 조직에서 2자릿수배(orders of magnitude) 더 높았다(도 18; 패널 a, b, c 비교).
이들 데이터는, mAb AN-17이 종양 조직에 특이적이고, 투여 후 적어도 1주일 동안 종양 부위에서 지속됨을 나타낸다.
본원에 제시된 데이터는, mAb AN-17이 이의 표적(KRT14)에 대해 높은 특이성, 최소의 표적-외(off-target) 효과, 및 비-표적 조직에서는 낮은 유지율을 가짐을 실증한다. 건강한, 종양이 없는 마우스에서, mAb AN-17은 건강한 기관에서 임의의 특이적인 유지를 나타내지 않았으며, 쉽게 제거되는 것으로 나타났다. 대조적으로, mAb AN-17은, 이것이 적어도 1주일 동안 지속된 난소 종양과 관련되어 특이적으로 검출되었다. 임의의 용량 또는 임의의 시점에서 주지된 독성은 없었으며, 이는, mAb AN-17의 높은 특이성이 주사 시 선호할 만한 안전성 프로파일을 부여함을 시사한다. 더욱이, 최대 내약 용량은 도달되지 않았다. 그러므로, mAb AN-17은 종양 조직에 대해 양호한 안전성 프로파일 및 높은 생체내 특이성을 갖는다.
실시예 23
mAb AN-17 치료는 생체내에서 확립된 난소 종양을 성공적으로 퇴축시킨다
이들 실험의 목적은, mAb AN-17이 동계 마우스 모델에서 확립된 원발성 악성물의 모델에서 종양 진행에 영향을 미치는 데 사용될 수 있는지의 여부를 확립하는 것이었다.
뮤린 ID8 난소 종양 세포를 C57BL/6 마우스의 점액낭내로 이식하였고, 원발성 종양을 이전에 기재된 바와 같이 약 4주의 기간에 걸쳐 발병하도록 하였다(PMID: 30602661). 원발성 종양이 있는 마우스(n=10/군)는 mAb AN-17을 5 mg/kg으로 3주의 기간 동안 1주-2회 복막내 주사에 의해 받았다. 대조군 동물은 동등한 용량의 이소타입이 일치하는 대조군 IgG 카파 항체(대조군 1); 또는 및 동등한 부피의 비히클(PBS) 단독(대조군 2)을 받았다. 3주간의 1주-2회 치료(월요일 및 목요일) 후, 모든 마우스를 도태시켰고, 종양 크기 및 체중에 대해 평가하였다. 2 마리의 추가, 종양이 없는 동물을 비-수술적 대조군으로서 사용하였다.
mAb AN-17의 1주-2회 투여는 단일 용량 실험에 의해 이전에 지시된 바와 같이 동물에 대해 어떠한 관찰 가능한 부작용이 없었다(상기). 3주의 계속된 치료 후, 모든 마우스를 도태시켰고, 종양 크기에 미치는 mAb AN-17 투여의 영향을 평가하였다. 비히클 단독(대조군 2)으로 치료된 마우스에서, 6/10 동물(60%)은 원발성 난소 종양을 가졌으며(도 19); 유사하게는, 이소타입 대조군 항체로 치료된 마우스(대조군 1) 중 6/10 동물(60%) 또한, 원발성 종양을 가졌고, 이는 비-표적 항체가 종양 진행에 어떠한 영향도 갖지 않았음을 시사한다.
mAb AN-17을 받은 마우스를 분석하였을 때, 우측 난소(이식 부위)에서 또는 그 위에서 어떠한 종양도 식별될 수 없었으며 동물의 다른 어떠한 곳에서도 마찬가지였다(도 19). 더욱이, 이들 마우스로부터 적출된 난소는 건강하게 보였으며, 치료되지 않은, 비-수술적 대조군과 관찰 가능한 형태학적 차이가 없었다.
mAb AN-17로 마우스를 치료하면 확립된 원발성 난소 종양이 3주 후 검출 불가능한 수준까지 완전히 퇴축되었다. 치료 기간 동안 주지되는 부작용은 없었으며, 이는 mAb AN-17의 투여가 생체내에서 확립된 고형 종양을 치료하기 위한 안전하고 고도로 효능 있는 치료적 접근법임을 시사한다.
실시예 24
mAb AN-17은 다수의 암세포에서 이동 및 침습을 차단한다
상기 언급된 실험은, 난소, 결장직장 및 자궁내막 암 세포주에서 mAb AN-17에 의한 세포 이동 및 침습의 항체-특이적 저해를 실증하였다. 하기 실험을 수행하여, 다른 암세포 유형의 이동 및 침습에 미치는 mAb AN-17의 효과를 조사하였다.
시험관내 상처 회복 검정을 하기 암세포주에서 수행하였다: BT16 비정형 기형 횡문근양(뇌) 암종, NCI-H1573 폐 선암종, SJ-GBM2 원발성 다형성 교모세포종, AN3CA 자궁내막 암종, SW620 결장직장 암종 및 MDA-MB-468 유방 암종. 세포를 12-웰 플레이트에서 완전 배지 중에서 컨플루언트하게 성장시켰고, 후속적으로 밤새 혈청-고갈시켜 G0에서 동기화하였다. 이튿날 세포 배양 배지를 제거하고, 석션에 부착된 피펫 팁으로 긁어서 세포 단층에 상처를 냈다. 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 부드럽게 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하고, mAb AN-17(1 μg/ml)의 부재 또는 존재 하에 완전 성장 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 상처 면적을 0시간 내지 24시간 동안 매시간마다 이미지화하였다. 상처 폐쇄를 분석 LS 리써치 소프트웨어(Olympus)를 사용하여 이미지 시리즈에서 측정하여, 매일 상처 면적을 결정하였다. 성장 조건당 관찰된 적어도 6개의 상처 면적으로 실험을 3회 반복하였다.
도 23에 도시된 바와 같이, 시험관내 상처 회복 검정을 사용하여 시도 시, 비처리된 세포는 16시간 후 상처로 이동하고 폐쇄시킬 수 있었다. 대조적으로, mAb AN-17로 치료된 모든 세포주는 동일한 조건 하에 상처를 폐쇄시키는 데 실패하였다. 이들 데이터는, 결장직장, 자궁내막 및 다수의 난소암 세포주에서 유사한 효과를 보여주는 이전에 데이터와 일관되게, mAb AN-17이 암세포의 세포 이동 및 침습을 저해함을 실증한다.
이들 데이터는, KRT14의 길항제가 적어도 난소, 자궁내막, 뇌, 폐, 유방 암세포를 포함한 다수의 암세포 유형의 이동 거동을 저해함을 보여준다. 이들 암 유형의 이질적인(disparate) 성질은, KRT14의 길항제, 예컨대 mAb AN-17이 암세포에서 고도로 보존적인 경로를 표적화하고 따라서 다수의 종양 유형의 진단, 예후 및 치료에 적용 가능함을 시사한다.
당업자는, 본원에 기재된 개시내용이 구체적으로 기재된 것 이외의 변화 및 변형을 받을 수 있음을 이해할 것이다. 본 개시내용은 모든 이러한 변화 및 변형을 고려하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용은 또한, 본 명세서에서 개별적으로 또는 종합적으로 지칭되거나 지시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 임의의 2개 이상의 단계 또는 특징 또는 조성물 또는 화합물의 임의의 및 모든 조합을 허용한다.
참고문헌
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
SEQUENCE LISTING <110> Hudson Institute of Medical Research <120> A method of treatment and prophylaxis <130> 35538517 <150> 2019900382 <151> 2019-02-07 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Phe Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Leu Gly Ala Gly Leu Gly Gly 1 5 10 15 Gly Phe Gly Gly Gly Phe Ala Gly Gly Asp Gly Leu 20 25 <210> 2 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc 60 acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg tacactgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaagcac agactataat 180 tcagctctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaaagactac 300 ggctactcct actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Lys Asp Tyr Gly Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca 300 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360 tcc 363 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 115 120 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Ala Arg Lys Asp Tyr Gly Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Lys Val Ser 1 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 15 Met <210> 14 <211> 38 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp 20 25 30 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 35 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 26 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 20 25 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 18 <211> 36 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly 20 25 30 Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 1 5 10 15 Thr Val Ser

Claims (59)

  1. 포유류 대상체의 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 암세포 상에 존재하는(resident) KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 이의 변이체를 표적화하는 제제 또는 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생성을 유도하는 제제의 양(amount)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 암세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암은 부인과(gynecological) 암인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 부인과 암은 난소암 또는 난소암의 병기(stage) 또는 형태인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암은 뇌, 방광, 간, 유방, 폐, 췌장, 장(bowel), 결장, 위장관(gastrointestinal tract), 위, 인후(throat), 자궁내막 및 결장직장 암으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 대상체는 인간인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 KRT14의 세포외 부분은 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체에 의해 정의되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제제는 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체 내의 에피토프의 길항제인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 길항제는 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체 내의 에피토프에 특이적인 항체인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체 또는 이의 탈면역화된(deimmunized) 형태인, 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 제제는 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 포함하는 암세포에 특이적인 면역 반응을 유도하는 백신인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 백신은 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 등가물 또는 변이체에 특이적인 항체를 유도하는 길항제 분자를 포함하는, 방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 제제는 세포독성 분자에 접합된 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 등가물 또는 변이체에 특이적인 항체인, 방법.
  13. 인간 대상체의 난소암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 난소암 세포 상에 존재하는 SEQ ID NO:1에 의해 식별되는 KRT14의 세포외 부분을 표적화하는 항체의 양을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 양은 난소암 세포 침습, 이동 및/또는 전이를 예방하거나 감소시키기에 효과적인, 방법.
  14. 포유류 대상체의 암 치료에서의 약제의 제조에 있어서, 암세포 상에 존재하는 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 이의 변이체를 표적화하는 제제 또는 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체의 길항제의 생성을 유도하는 제제의 용도.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 부인과 암인, 용도.
  16. 제15항에 있어서, 상기 부인과 암은 난소암 또는 난소암의 병기 또는 형태인, 용도.
  17. 제14항에 있어서, 상기 암은 뇌, 방광, 간, 유방, 폐, 췌장, 장, 결장, 위장관, 위, 인후, 자궁내막 및 결장직장 암으로부터 선택되는, 용도.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 대상체는 인간인, 용도.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 KRT14의 세포외 부분은 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체에 의해 정의되는, 용도.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제제는 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체 내의 에피토프의 길항제인, 용도.
  21. 제20항에 있어서, 상기 길항제는 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체 내의 에피토프에 특이적인 항체인, 용도.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체 또는 이의 탈면역화된 형태인, 용도.
  23. 제19항에 있어서, 상기 제제는 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 포함하는 암세포에 특이적인 면역 반응을 유도하는 백신인, 용도.
  24. 제23항에 있어서, 상기 백신은 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 등가물 또는 변이체에 특이적인 항체를 유도하는 길항제 분자를 포함하는, 용도.
  25. 제19항에 있어서, 상기 제제는 세포독성 분자에 접합된 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 등가물 또는 변이체에 특이적인 항체인, 용도.
  26. 포유류 대상체의 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분을 특이적으로 표적화하는 제제를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 제제는 상기 암세포의 세포독성 또는 세포성색전(cytostasis)을 직접적으로 유도하거나, 세포에서 상기 암의 세포독성 또는 세포성색전을 유도하는 포유류 대상체의 신체 내에서 길항제를 유도하는, 약학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 암은 부인과 암인, 약학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 부인과 암은 난소암 또는 난소암의 병기 또는 형태인, 약학적 조성물.
  29. 제26항에 있어서, 상기 암은 뇌, 방광, 간, 유방, 폐, 췌장, 장, 결장, 위장관, 위, 인후, 자궁내막 및 결장직장 암으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 대상체는 인간인, 약학적 조성물.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 KRT14의 세포외 부분은 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체에 의해 정의되는, 약학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제제는 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체 내의 에피토프의 길항제인, 약학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 길항제는 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체 내의 에피토프에 특이적인 항체인, 약학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체 또는 이의 탈면역화된 형태인, 약학적 조성물.
  35. 제31항에 있어서, 상기 제제는 KRT14의 세포외 부분 또는 이의 기능적 상동체 또는 변이체를 포함하는 암세포에 특이적인 면역 반응을 유도하는 백신인, 약학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 백신은 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 등가물 또는 변이체에 특이적인 항체를 유도하는 길항제 분자를 포함하는, 약학적 조성물.
  37. 제31항에 있어서, 상기 제제는 세포독성 분자에 접합된 SEQ ID NO:1 또는 이의 기능적 등가물 또는 변이체에 특이적인 항체인, 약학적 조성물.
  38. 리포터 분자에 접합된, 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분에 특이적인 항체를 포함하는 진단 시약.
  39. 환자의 암을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 환자로부터의 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 시료를, KRT14의 세포외 에피토프에 결합하는 제제와 접촉시켜 이의 수준을 결정하고, 상기 수준을 알고리즘에 적용하여 암에 걸린 환자의 확률 지수를 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 확률 지수에 기초하여 암에 걸린 환자의 위험성을 진단하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  40. 환자의 순환하는(circulating) KRT14-양성 암세포를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 환자로부터의 혈액 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 혈액 시료를, KRT14의 세포외 에피토프에 결합하는 제제와 접촉시켜 상기 시료에서 KRT14-양성 암세포의 존재를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  41. 환자의 암을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1 시점에서 환자로부터의 혈액 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 (a)의 시료를, KRT14의 세포외 에피토프에 결합하는 제제와 접촉시켜 상기 시료에서 KRT14-양성 암세포의 수준을 결정하는 단계;
    (c) 제2 시점에서 환자로부터의 혈액 시료를 제공하는 단계로서, 상기 제1 시점은 상기 제2 시점과 상이한 것인, 단계;
    (d) 상기 (c)의 시료를, KRT14의 세포외 에피토프에 결합하는 제제와 접촉시켜 상기 시료에서 KRT14-양성 암세포의 수준을 결정하는 단계; 및
    (e) 상기 제1 시점과 제2 시점 사이에서 환자에서 KRT14-양성 암세포의 수준의 변화가 있었는지의 여부를 결정하는 단계
    를 포함하며,
    상기 제1 시점과 제2 시점 사이에서 환자에서 KRT14-양성 암세포의 수준의 변화는 환자에서 암의 상태 변화를 나타내는, 방법.
  42. 암, 또는 이의 하위유형 또는 병기에 관하여 대상체의 상태를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 통신 네트워크를 통해 KRT14의 세포외 부분의 존재의 형태로 데이터를 수용하는 단계;
    (b) 대상체 데이터를, 질환 지수값(disease index value)을 제공하는 알고리즘을 통해 처리하는 단계;
    (c) 예정된 값과 비교하여 질환 지수값의 결과에 따라 대상체의 상태를 결정하는 단계; 및
    (d) 대상체의 상태 표시를 통신 네트워크를 통해 사용자에게 전달하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  43. 암세포 상의 KRT14의 세포외 부분에 특이적으로 결합하는 제제 또는 이의 KRT14-결합 단편으로서, 상기 제제는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 상기 VH는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VH CDR1), SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VL CDR1), SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 제제 또는 이의 KRT14-결합 단편.
  44. 제43항에 있어서, 상기 VH는
    (a) SEQ ID NO:12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 프레임워크 영역 1(FR1);
    (b) SEQ ID NO:13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2;
    (c) SEQ ID NO:14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 및
    (d) SEQ ID NO:15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4
    를 포함하고, 상기 VL은
    (e) SEQ ID NO:16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1;
    (f) SEQ ID NO:17과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2;
    (g) SEQ ID NO:18과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 및
    (h) SEQ ID NO:19와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4
    를 포함하는, 제제 또는 이의 KRT14-결합 단편.
  45. 제44항에 있어서,
    (a) 상기 VH는 SEQ ID NO:3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) 상기 VL은 SEQ ID NO:5와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 제제 또는 이의 KRT14-결합 단편.
  46. 제7항 내지 제9항, 제12항 및 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항, 제20항 내지 제22항 및 제25항 중 어느 한 항, 또는 제32항 내지 제34항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 상기 VH는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VH CDR1), SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VL CDR1), SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 방법, 용도 또는 약학적 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 VH는
    (a) SEQ ID NO:12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 프레임워크 영역 1(FR1);
    (b) SEQ ID NO:13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2;
    (c) SEQ ID NO:14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 및
    (d) SEQ ID NO:15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4
    를 포함하고, 상기 VL은
    (e) SEQ ID NO:16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1;
    (f) SEQ ID NO:17과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2;
    (g) SEQ ID NO:18과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 및
    (h) SEQ ID NO:19와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4
    를 포함하는, 방법, 용도 또는 약학적 조성물.
  48. 제47항에 있어서,
    (a) 상기 VH는 SEQ ID NO:3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) 상기 VL은 SEQ ID NO:5와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법, 용도 또는 약학적 조성물.
  49. 제13항 또는 제38항에 있어서, 상기 항체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 상기 VH는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VH CDR1), SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(VL CDR1), SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 방법 또는 진단 시약.
  50. 제49항에 있어서, 상기 VH는
    (a) SEQ ID NO:12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 프레임워크 영역 1(FR1);
    (b) SEQ ID NO:13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2;
    (c) SEQ ID NO:14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 및
    (d) SEQ ID NO:15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4
    를 포함하고, 상기 VL은
    (e) SEQ ID NO:16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1;
    (f) SEQ ID NO:17과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2;
    (g) SEQ ID NO:18과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 및
    (h) SEQ ID NO:19와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4
    를 포함하는, 방법 또는 진단 시약.
  51. 제50항에 있어서,
    (a) 상기 VH는 SEQ ID NO:3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) 상기 VL은 SEQ ID NO:5와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법 또는 진단 시약.
  52. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 부인과 암인, 방법 또는 제제.
  53. 제52항에 있어서, 상기 부인과 암은 난소암 또는 난소암의 병기 또는 형태인, 방법.
  54. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 뇌, 방광, 간, 유방, 폐, 췌장, 장, 결장, 위장관, 위, 인후, 자궁내막 및 결장직장 암으로부터 선택되는, 방법 또는 제제.
  55. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 항암제를 상기 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여하고/거나 상기 대상체를 면역치료법, 방사선 치료법 및/또는 수술적 개입에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 추가 항암제 및/또는 면역치료법, 방사선 치료법 및/또는 수술적 개입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료법과 함께 동시에 또는 순차적으로 투여용으로 제형화되는, 용도.
  57. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 항암제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  58. 제55항, 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 추가 항암제는 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin)(아드리아마이신(adriamycin)), 이다루비신(idarubicin) 및 미톡산트론(mitoxantrone), 백금계 제제, 항대사물질(antimetabolite), 프라이밍된(primed) T-세포 및 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법, 용도 또는 약학적 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 항대사물질은 아자세린, D-사이클로세린, 니코페놀산(nycophenolic acid), 트리메토프림(trimethoprim), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 카페시타빈(capecitabine), 메토트렉세이트(methotrexate), 겜시타빈(gemcitabine), 시타라빈(cytarabine)(ara-C) 및 플루다라빈(fludarabine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법, 용도 또는 약학적 조성물.
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