BR112021015586A2 - Método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero, método para o tratamento de câncer de ovário em um sujeito humano, uso de um agente, composição farmacêutica, reagente de diagnóstico, método para detectar câncer em um paciente, método para detectar células cancerígenas krt14-positivas em circulação em um paciente, método para monitorar um câncer em um paciente, método para determinar a situação de um sujeito em relação a um câncer ou a um subtipo ou estágio do mesmo, agente que se liga especificamente a uma porção extracelular de krt14 em células cancerígenas ou um fragmento de ligação a krt14 do mesmo, agente ou fragmento de ligação a krt14 do mesmo, e, método ou agente de diagnóstico - Google Patents

Método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero, método para o tratamento de câncer de ovário em um sujeito humano, uso de um agente, composição farmacêutica, reagente de diagnóstico, método para detectar câncer em um paciente, método para detectar células cancerígenas krt14-positivas em circulação em um paciente, método para monitorar um câncer em um paciente, método para determinar a situação de um sujeito em relação a um câncer ou a um subtipo ou estágio do mesmo, agente que se liga especificamente a uma porção extracelular de krt14 em células cancerígenas ou um fragmento de ligação a krt14 do mesmo, agente ou fragmento de ligação a krt14 do mesmo, e, método ou agente de diagnóstico Download PDF

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Abstract

método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero, método para o tratamento de câncer de ovário em um sujeito humano, uso de um agente, composição farmacêutica, reagente de diagnóstico, método para detectar câncer em um paciente, método para detectar células cancerígenas krt14-positivas em circulação em um paciente, método para monitorar um câncer em um paciente, método para determinar a situação de um sujeito em relação a um câncer ou a um subtipo ou estágio do mesmo, agente que se liga especificamente a uma porção extracelular de krt14 em células cancerígenas ou um fragmento de ligação a krt14 do mesmo, agente ou fragmento de ligação a krt14 do mesmo, e, método ou agente de diagnóstico. trata-se de métodos, usos e composições para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero, que compreendem a administração ao sujeito de uma quantidade de um agente que tem como alvo uma porção extracelular de krt14 ou seu homólogo funcional ou variante do mesmo residente em células cancerígenas ou um agente que induz a produção de um antagonista da porção extracelular de krt14 ou seu homólogo funcional ou variante em células cancerígenas. a presente revelação também se estende a métodos de monitoramento e/ou diagnóstico de câncer em um sujeito.

Description

MÉTODO PARA O TRATAMENTO OU PROFILAXIA DE CÂNCER EM UM SUJEITO MAMÍFERO, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER DE OVÁRIO EM UM SUJEITO HUMANO, USO DE UM AGENTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, REAGENTE DE DIAGNÓSTICO, MÉTODO PARA DETECTAR CÂNCER EM UM PACIENTE, MÉTODO PARA DETECTAR CÉLULAS CANCERÍGENAS KRT14-POSITIVAS EM CIRCULAÇÃO EM UM PACIENTE, MÉTODO PARA MONITORAR UM CÂNCER EM UM PACIENTE, MÉTODO PARA
DETERMINAR A SITUAÇÃO DE UM SUJEITO EM RELAÇÃO A UM CÂNCER OU A UM SUBTIPO OU ESTÁGIO DO MESMO, AGENTE QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A UMA PORÇÃO EXTRACELULAR DE KRT14 EM CÉLULAS CANCERÍGENAS OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A KRT14 DO MESMO, AGENTE OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A KRT14 DO MESMO, E, MÉTODO OU
AGENTE DE DIAGNÓSTICO CAMPO
[001] A presente invenção refere-se, em geral, à terapia de câncer que inclui o tratamento, prevenção ou retardamento de desenvolvimento ou metástase de câncer e a medicamentos úteis para os mesmos.
ANTECEDENTES
[002] Detalhes bibliográficos das publicações referidas pelo autor neste relatório descritivo são coletados em ordem alfabética no final da descrição.
[003] Referência neste relatório descritivo a qualquer publicação anterior (ou informações derivadas da mesma), ou a qualquer questão que seja conhecida, não é, e não deve ser tomada como um reconhecimento ou admissão ou qualquer forma de sugestão de que a publicação anterior (ou informações derivadas da mesma) ou questões conhecidas fazem parte do conhecimento geral comum no campo de esforço ao qual este relatório descritivo se refere.
[004] O câncer permanece como uma das doenças mais significativas que afetam seres humanos e animais com altas taxas de morbidade e mortalidade. O câncer de ovário, por exemplo, é o nono câncer mais comum diagnosticado em mulheres. De fato, câncer de ovário é o mais letal de todos os cânceres ginecológicos. Recursos significativos foram expandidos no diagnóstico precoce e tratamento de cânceres de ovário. Apesar de aprimoramentos em intervenções cirúrgicas e quimioterapêuticas, as taxas de sobrevivência de câncer de ovário permanecem imediatas em aproximadamente 25% (Vaughan et al. (2011) Nat Rev Cancer 11(10):719-725).
[005] Mais de 75% dos pacientes com câncer de ovário são diagnosticados com doença metastática de estágio tardio na primeira apresentação clínica. O tratamento é amplamente limitado à cirurgia agressiva e quimioterapia. Não obstante, mais de 90% dos pacientes reincidem, frequentemente dentro do primeiro ano após o tratamento. Na vasta maioria desses pacientes, tumores recorrentes exibem quimiorresistência. Esse fenômeno limita opções terapêuticas adicionais e substendem a taxa de mortalidade muito alta para cânceres de ovário.
[006] Tentativas de triagem genética para identificar alvos terapêuticos potenciais foram, apesar do esforço substancial, amplamente sem sucesso. Isso se dá provavelmente devido à natureza altamente heterogênea de tecidos de câncer de ovário.
[007] A queratina-14 (KRT14) é um componente de proteína intracelular do citoesqueleto, tipicamente expresso em uma linhagem primitiva de células progenitoras que residem em nichos mioepiteliais e epiteliais em tecidos adultos saudáveis (Chu et al. (2001) Histopathology 39(1):9-16; Paraskevopoulou et al. (2016) Cell Cycle 15(23):3161-3162). Em tecido tumoral, a KRT14 marca uma população de células especializadas (alternadamente descritas como “células condutoras”, “células-tronco de câncer” ou “células iniciais tumorais”) que controlam a capacidade de depósitos de tumor de invadirem tecidos saudáveis. Células que expressam KRT14 são implicadas de modo mecânico ao controlar invasão de tumor através de uma faixa de tipos de tumor sólido (incluindo de mama, bexiga e pulmonar). Nesses tumores, a presença de células que expressam KRT14 é diretamente correlacionada ao potencial de invasão de tumor e uma redução de sobrevivência livre de doenças e geral (Chu et al. (2001) supra; Cheah et al. (2015) Proc Natl Acad Sci USA 112(15):4725-4730; Volkmer et al. (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109(6):2078-2083; Ho et al. (2012) Nat Rev Urol 9(10):583-594; Cheung et al. (2016) Proc Natl Acad Sci USA 113(7):E854-863; Cheung et al. (2013) Cell 155(7):1639-1651; Papafotiou et al. (2016) Nat Commun 7:11914).
[008] Há uma necessidade urgente de uma abordagem terapêutica que possa aprimorar o prognóstico de paciente e qualidade de vida.
SUMÁRIO
[009] De acordo com a presente invenção, é estabelecido que KRT14 é essencial para invasão celular de câncer de ovário através de uma camada mesotelial in vitro; e para a implantação com sucesso de tumor de ovário in vivo. É também estabelecido no presente documento que KRT14 desempenha uma função na migração e invasão de outros tipos de célula cancerígena, incluindo células cancerígenas colorretais,
endometriais, cerebrais, de mama e pulmonares. A KRT14 não é expressa no tecido saudável, incluindo trato reprodutivo normal, tal como os ovários e trompas de falópio. De modo importante, é determinado que KRT14 tem uma porção extracelular que está presente em uma faixa de cânceres em sujeitos tanto masculinos quanto femininos. O termo “extracelular" deve ser entendido como significando uma porção, segmento ou domínio de KRT14 que é localizado em, expostos a, ou de outro modo, acessível a partir do exterior da célula.
[0010] Consequentemente, é ensinado no presente documento um método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero, incluindo sujeitos humanos ou animais, sendo que o método compreende administrar ao sujeito uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular de KRT14 ou seu residente homólogo ou variante funcional em células cancerígenas ou um agente que induz a produção in vivo de um antagonista da porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo ou variante funcional em células cancerígenas, a quantidade eficaz para impedir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas. Por “administrar” a um sujeito inclui contatar as células cancerígenas. Um “sujeito” pode ser macho ou fêmea.
[0011] Em uma modalidade, o câncer é um câncer ginecológico incluindo, porém, sem limitação, câncer de ovário ou uma forma ou estágio de câncer de ovário. Em uma modalidade, o câncer é endometrial ou câncer colorretal. Em uma modalidade, o câncer é selecionado dentre câncer de cérebro, bexiga, fígado, mama, pulmão, pâncreas, intestino, cólon, trato gastrointestinal, estômago, garganta, endometrial e colorretal.
[0012] Em uma modalidade, o agente é um anticorpo que alveja um epítopo contido dentro de uma proteína que compreende a sequência de peptídeos (em código de letra única): GFGGGYGGGLGAGLGGGFGGGFAGGDGL (SEQ ID NO:1), ou seu homólogo funcional ou um variante que tem pelo menos 80% de similaridade à SEQ ID NO:1 após alinhamento ideal. Outros agentes que atuam como antagonistas ou agentes de alvejamento da SEQ ID NO:1 são também contemplados no presente documento. A SEQ ID NO:1 representa a sequência humana. Homólogos em outras espécies são também contemplados no presente documento como alvos terapêuticos ou de diagnóstico. O “anticorpo” inclui um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal e antissoro que se liga à KRT14 assim como formas recombinantes, fragmentos e derivados que se ligam à porção exógena de KRT14 ou parte da mesma.
[0013] Em uma modalidade revelada no presente documento, o agente compreende um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), em que o VH compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VH CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, uma VH CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e uma VH CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8; e em que o VL compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VL CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9, uma VL CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 e uma VL CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11.
[0014] Em uma modalidade, a VH compreende: (a) uma região de framework de VH 1 (FR1) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12; (b) uma VH FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:13; (c) uma VH FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:14 e (d) uma VH FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:15; e o VL compreende: (e) uma VL FR1 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:16; (f) uma VL FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:17; (g) uma VL FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:18 e (h) uma VL FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:19.
[0015] Em uma modalidade, a VH compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência à SEQ ID NO:3, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência à SEQ ID NO:5.
[0016] Em uma modalidade, o sujeito mamífero é uma fêmea humana ou macho humano. Não obstante, a presente invenção se estende a aplicações veterinárias em mamíferos masculinos ou femininos não humanos.
[0017] Conforme ensinado no presente documento, uma função inovadora para KRT14 é identificada como sendo um regulador precoce crítico de invasão e deposição de câncer de ovário. Células que carecem de uma cópia funcional do gene KRT14 são incompetentes de invasão, e não têm capacidade de estabelecer tumores de ovário in vivo. Alvejar o epítopo identificado por SEQ ID NO:1 com um agente adicionado de modo exógeno que alveja SEQ ID NO:1 anula completamente a capacidade invasiva de células cancerígenas in vitro, simulando os efeitos de perda de KRT14 funcional. De modo similar, induzir uma resposta in vivo tal como uma resposta imune específica a células que transportam SEQ ID NO:1 é também eficaz em reduzir desenvolvimento de câncer.
[0018] Em uma modalidade, o presente relatório descritivo ensina um método para o tratamento de câncer de ovário em um sujeito humano, sendo que o método compreende a administração ao sujeito de uma quantidade de um anticorpo que tem como alvo uma porção extracelular de KRT14 definida pela SEQ ID NO:1 residente em células de câncer de ovário, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a migração e/ou metastização das invasões de células cancerígenas do ovário.
[0019] Muitos outros tipos de tumor sólido (por exemplo, mama, bexiga, pulmão e outros) são propostos para empregar esse mecanismo mediado por KRT14 de invasão, indicando que terapia direcionada anti-KRT14 é amplamente aplicável através de uma faixa de tipos de tumor sólido.
[0020] Medicamentos que alvejam SEQ ID NO:1 ou seu homólogo ou variante funcional para anular assim a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas são possibilitados no presente documento. Em uma modalidade, o medicamento compreende um anticorpo específico para SEQ ID NO:1 ou seu homólogo ou variante funcional. Conforme indicado acima, o anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal ou antissoro que compreende anticorpos que se ligam a KRT14 ou pode ser um anticorpo sintético (por exemplo, recombinante) ou um fragmento de ligação a KRT14 ou derivado de qualquer um dos precedentes. O anticorpo também pode ser um anticorpo derivado de animal de cartilagem ou um fragmento de ligação a KRT14 ou derivado do mesmo. O medicamento, além de ser um anticorpo, pode ser qualquer reagente de afinidade que inclui, porém, sem limitação aptâmeros, monobodies, anticalinas, DARPins e nanobodies e similares.
[0021] A presente invenção se estende à terapia de combinação em que o agente que alveja KRT14 ou o agente que induz um antagonista de KRT14 in vivo é dado com outro agente anticâncer e/ou terapia de radiação e/ou intervenção cirúrgica. Exemplos de agentes adicionais incluem um agente quimioterapêutico tal como um ou mais dentre dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina e mitoxantrona, ou agentes à base de platina ou um antimetabólito. Antimetabólitos são substâncias que interferem com os processos químicos do corpo, tais como criando proteínas, DNA, e outros produtos químicos necessários para crescimento celular e reprodução; em tratamento de câncer, fármacos antimetabólitos que interrompem a produção de DNA, que por sua vez, impede a divisão celular. Exemplos incluem azaserina, D-cicloserina, ácido nicofenólico, trimetoprim, 5-
fluorouracila, capecitabina, metotrexato, gemcitabina, citarabina (ara-C) e fludarabina. Outros reagentes imunes podem ser administrados tais como células T iniciadas e citocinas. A terapia de combinação pode ser fornecida simultânea ou sequencialmente em qualquer ordem e dentro de segundos, minutos, horas, dias ou semanas um do outro.
[0022] A presente revelação também se estende a um agente que se liga especificamente a uma porção extracelular de krt14 em células cancerígenas ou um fragmento de ligação a krt14 do mesmo, sendo que o agente compreende um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), em que o VH compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VH CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, uma VH CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e uma VH CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8; e em que o VL compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VL CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9, uma VL CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 e uma VL CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11.
[0023] Em uma modalidade, a VH compreende: (a) uma região de framework de VH 1 (FR1) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12; (b) uma VH FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:13; (c) uma VH FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:14 e (d) uma VH FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:15; e o VL compreende: (e) uma VL FR1 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:16; (f) uma VL FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:17; (g) uma VL FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:18 e (h) uma VL FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:19.
[0024] Em uma modalidade, a VH compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência à SEQ ID NO:3, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência à SEQ ID NO:5.
[0025] As sequências de aminoácidos são denominadas por um número identificador de sequência (SEQ ID NO). As SEQ ID NOs correspondem numericamente aos identificadores de sequência <400>1 (SEQ ID NO:1), <400>2 (SEQ ID NO:2), etc. Uma listagem de sequências é fornecida após as reivindicações.
[0026] Um sumário do identificador de sequência usado por todo o relatório descritivo em questão é fornecido na Tabela 1. TABELA 1
SUMÁRIO DE IDENTIFICADOR DE SEQUÊNCIA SEQUÊNCIA ID NO: DESCRIÇÃO Sequência de aminoácidos de porção 1 extracelular de KRT14 humano que compreende um epítopo Sequência de ácidos nucleicos que codifica 2 a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal (mAb) AN-17 Sequência de aminoácidos da região variável 3 de cadeia pesada de anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de ácidos nucleicos que codifica 4 a região variável de cadeia leve de anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos da região variável 5 de cadeia leve de anticorpo monoclonal AN- 17 Sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia 6 pesada do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia 7 pesada do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia 8 pesada do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos do CDR1 de cadeia 9 leve do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos do CDR2 de cadeia 10 leve do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos do CDR3 de cadeia 11 leve do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos da FR1 de cadeia 12 pesada do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos da FR2 de cadeia 13 pesada do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos da FR3 de cadeia 14 pesada do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos da FR4 de cadeia 15 pesada do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos do FR1 de cadeia 16 leve do anticorpo monoclonal AN-17
SEQUÊNCIA ID NO: DESCRIÇÃO Sequência de aminoácidos do FR2 de cadeia 17 leve do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos do FR3 de cadeia 18 leve do anticorpo monoclonal AN-17 Sequência de aminoácidos do FR4 de cadeia 19 leve do anticorpo monoclonal AN-17
[0027] Aminoácidos podem ser denominados pelo nome ou por código de letra única ou três letras (Tabela 2). TABELA 2
TRÊS LETRAS OU LETRA ÚNICA DE AMINOÁCIDO Aminoácido Abreviação de três Símbolo de uma letras letra Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido Aspártico Asp D Cisteína Cys C Glutamina Gln Q Ácido Glutâmico Glu E Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina MET M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Tryptofano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Val V Pirrolisina Pyl O Selenocisteína Sec U Qualquer resíduo Xaa X
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0028] Algumas Figuras contêm representações coloridas ou entidades. Fotografias coloridas estão disponíveis da Patentee mediante solicitação ou de um Escritório de Patentes apropriado. Uma taxa pode ser imposta se obtida de um Escritório de Patentes.
[0029] As Figuras 1A a C são representações fotográficas que mostram a identificação de KRT14 na borda dianteira dos depósitos de câncer de ovário invasivo. (A) Esferoides de câncer de ovário foram cultivadas com uso de um modelo de microambiente peritoneal, e invasão através de uma barreira mesotelial monitorada. Criosseções que contêm esferoides que rompem ativamente uma monocamada celular mesotelial LP9 foram (B) analisadas por espectrometria de massa de imageamento MALDI, que identificou KRT14 dentre várias proteínas na interface invasiva. (C) Imunocoloração de dispersão de células de câncer de ovário (OVCAR4) para KRT14, que mostram localização à invadopodia. Uma região ampliada é mostrada (direita superior). A coloração de KRT14 aparece verde contra um fundo negro. Coloração nuclear por DAPI em azul.
[0030] As Figuras 2A e 2B são representações gráficas e fotográficas que mostram a expressão de KRT14 necessária para migração e invasão de células de câncer de ovário in vitro. A expressão de gene KRT14 foi interrompida com uso de tecnologia de CRISPR em linhagens celulares de câncer de ovário OVCAR4 e CaOV3. Experimentos representativos são mostrados. (A) Proliferação e invasão foram medidas com uso de xCELLigence. Perda de expressão de KRT14 não teve efeito na proliferação, mas anulou completamente a invasão através de uma monocamada mesotelial in vitro. (B) Células que carecem de KRT14 falham em reparar feridas de um dia para o outro com uso de um teste de arranhamento in vitro.
[0031] As Figuras 3A a 3C são representações fotográficas e gráficas que mostram a expressão de KRT14 necessária para implantação de tumor com sucesso in vivo. Células de câncer de ovário ID8 de Murina, que tanto expressam (“tipo selvagem”; WT) como carecem de (“KRT14KO”) expressão de KRT14, foram implantadas de modo intrabursal em camundongos C57BL/6 de tipo selvagem. O crescimento tumoral foi monitorado em tempo real com uso de fluorescência in vivo. (A) células ID8 foram enxertadas com sucesso a um single ovário em cada camundongo, e foram detectáveis e localizadas ao sítio de implante. Após 4 semanas, fluorescência foi perdida dos camundongos implantados com células K14KO. (B) A fluorescência aumentou em camundongos que têm células tumorais de tipo selvagem em ~3-4 semanas; nenhum aumento similar em fluorescência foi detectável em camundongos implantados com células KRT14-KO. (C) Camundongos foram abatidos em ~7 semanas e autópsia foi realizada. Camundongos implantadas com células ID8 de tipo selvagem formaram tumores de ovário primários grandes, com metástases ao ovário contralateral, paredes peritoneais, fígado, intestino e diafragma, e exibiram acúmulo significativo de fluido de ascites na cavidade peritoneal. Por contraste, camundongos implantados com células KRT14KO não desenvolveram ascites, e nenhum tumor foi observado. As células tumorais não poderiam ser detectadas em autópsia nesses camundongos.
[0032] As Figuras 4A e 4B são representações gráficas e fotográficas que mostram que a terminação N de KRT14 é exposta na superfície celular, e é accessível a anticorpos adicionados de modo exógeno. (A) A citometria de fluxo foi realizada em contato, células de câncer de ovário não permeabilizadas (identificadas conforme indicado), com uso de anticorpos policlonais contra a região de terminal N de KRT14. Entre 30-50% de células foram positivamente coloradas para superfície celular KRT14. A imunocoloração de células intactas em cultura confirmou a coloração de uma subcultura de células com os anticorpos anti-KRT14. (B) Anticorpos contra qualquer uma dentre a terminação N e a terminação C de KRT14 foram testados para sua capacidade de inibir a invasão por células de câncer de ovário in vitro. Anticorpos anti-terminal C (um termo C) não teve efeito na invasão, enquanto anticorpos anti- terminal N (um termo N) bloquearam completamente a invasão. Adicionada de modo exógeno, a proteína de KRT14 (rK14) recombinante de comprimento total não teve efeito por si só ou em combinação com um anticorpo de termo C. No entanto, rK14 competiu com sucesso com um anticorpo de termo N para restaurar a capacidade invasiva in vitro.
[0033] As Figuras 5A a 5C são representações gráficas e fotográficas que mostram que uma única região antigênica na terminação N de KRT14 é exposta e pode ser alvejada para bloquear a invasão in vitro. (A) Antigenicidade e hidrofobicidade da terminação N de KRT14 foram previstas in silico com uso do portal IEDB publicamente disponível (http://tools.iedb.org/bcell/). Cinco regiões de antigenicidade potencial foram previstas, e seis peptídeos correspondentes foram sintetizados. (B) Ensaios de Competição com uso de peptídeos individuais foram usados para mapear a região relevante de KRT14 reconhecida por anticorpos policlonais. Dois peptídeos, que abrangem aminoácidos 83-110 (sequência humana), restauraram com sucesso a capacidade invasiva em ensaios Xcelligence. (C) Em um experimento de cicatrização de ferida paralelo, os mesmos dois peptídeos (#4 e #5) competiram com sucesso com anti anticorpos KRT14 de terminal N para restaurar a migração celular e efetuar o fechamento de ferida completo por 16 horas.
[0034] As Figuras 6A e B são representações gráficas que mostram que AN-17 antissoro O20023 bloqueia completamente a invasão de célula cancerígena in vitro. (A) Antissoro se elevou contra o epítopo de KRT14 específico inibiu de modo eficaz a invasão, com eficácia comparável a um anticorpo policlonal comercial (Sigma SAB4501657). (B) A inibição de invasão por anti-KRT14 não teve impacto na viabilidade celular.
[0035] A Figura 7 é uma representação fotográfica que mostram que a migração de tipos de células diferentes de câncer de ovário é prejudicada por anticorpo anti-KRT14 in vitro. O anticorpo anti-KRT14 impediu o fechamento de ferida em monocamadas celulares compreendidas por células de carcinoma endometriais ou colorretais. Peptídeos curtos (peptídeos 4 e 5) que simulam o epítopo de KRT14 de interesse poderia competir de modo eficaz para anticorpo que se liga para reestabelecer a migração in vitro.
[0036] As Figuras 8A e B são representações fotográficas e gráficas que mostram a migração de células de câncer de ovário de murina é prejudicada por anticorpo anti- KRT14 in vitro. (A) Anticorpo Anti-KRT14 impediu o fechamento de ferida em monocamadas celulares compreendidas por células de câncer de ovário ID8 de murina. Peptídeos curtos (peptídeos 4 e 5) que simulam o epítopo de KRT14 de interesse poderia competir de modo eficaz para anticorpo que se liga para reestabelecer a migração in vitro. (B) A análise de RTCA confirmou que anticorpo anti-KRT14 humano bloqueou a invasão de células de câncer de ovário de murina in vitro.
[0037] A Figura 9 mostra que o anticorpo anti- KRT14 monoclonal AN-17 (AN-17 de mAb) aumenta a sensibilidade à quimioterapia de platina in vitro. Células de câncer de ovário OVCAR4 foram incubadas com AN-17 de mAb, cisplatina ou uma combinação das duas, e a proliferação celular monitorada por um período de 72 h. As células tratadas com uma combinação de AN-17 de mAb mais a cisplatina mostrou IC50 significativamente inferior em comparação à cisplatina por si só. De modo notável, AN-17 de mAb intensificou significativamente a toxidade de cisplatina usada em doses subletais (n=3/tratamento, significa índices celulares).
[0038] A Figura 10 mostra que AN-17 de mAb não exibe reatividade cruzada com múltiplos antígenos de proteína in vitro. Os arranjos de proteína foram usados para identificar quaisquer proteínas de reação cruzada que podem ser potencialmente reconhecidos por AN-17 de mAb. Nenhuma reatividade cruzada foi evidente, sugerindo alta especificidade de AN-17 de mAb para KRT14.
[0039] A Figura 11 mostra processo de western blot para detecção de KRT14 com uso de AN-17 de mAb. Diluições de anticorpo de 1:1.000 a 1:10.000 proteína de KRT14 detectada com sucesso por processo de western blot.
[0040] A Figura 12 mostra que AN-17 de mAb pode identificar células de KRT14+ em células de câncer de ovário humanas e de murina. OVCAR3, CAOV4, ID8 e as linhagens celulares 3.1937-07 derivadas de paciente foram analisadas em um citômetro de fluxo de BD LSRFortessa X-20 (BD Biosciences) para populações de células KRT14+, com uso de AN-17 de mAb ou um anticorpo policlonal comercialmente disponível para KRT14 (Sigma SAB4501657).
[0041] A Figura 13 mostra detecção de célula tumoral circulatória com AN17 de mAb em camundongos que transportam tumores de ovário epiteliais. Sangue Cardíaco foi tomado de camundongos que transportam tumores de ovário epiteliais de iRFP720+ ID8 de 12 semanas de idade e coloradas com uso de anti-CD45 e AN-17 de mAb. Células tumorais ID8 circulatórias foram identificadas como células de KRT14+ CD45- e confirmadas por situação de iRFP720+. Células ID8 iRFP720+ injetadas no sangue foram usadas como um controle positivo.
[0042] A Figura 14 mostra a detecção de células de KRT14+ por coloração de imunofluorescência. Células cancerígenas foram incubadas com AN-17 de mAb tanto intactas (esquerda) como seguindo a permeabilização (direita), para superfície de rótulo- ou KRT14 intracelular, respectivamente.
[0043] A Figura 15 mostra coloração imuno- histoquímica de tecido tumoral com uso de AN-17 de mAb. A coloração foi restrita a epitélio tumoral, e foi similar a um anticorpo anti-KRT14 policlonal comercialmente disponível (Sigma SAB4501657).
[0044] A Figura 16 mostra captação de tecido não específico de AN-17 de mAb e liberação por um período de 7 dias. Camundongos sem tumores foram injetados com AN-17 de mAb em 0,5 mg/kg (i.p.), e a distribuição de tecido foi analisada ao longo do tempo monitoramento de fluorescência. Comparações foram realizadas contra um anticorpo de controle de isotipo IgG-kappa não alvejada. Não houve retenção não específica de AN-17 de mAb observada, e ambos os anticorpos (AN-17 de mAb e IgG-kappa de controle) foram quase indetectáveis após 7 dias.
Tecidos examinados incluíram órgãos reprodutivos (ovários, trompas de falópio, útero); intestino; fígado; fígado; rins; baço; pulmão; coração; e cérebro (n=2 animais/grupo, meio +/- SD). Medições em cada ponto de tempo são deslocadas contra o eixo geométrico para tornar conjuntos de dados de sobreposição claros.
[0045] A Figura 17 mostra a captação de tecido não específico de AN-17 de mAb e liberação por um período de 7 dias. Camundongos sem tumores foram injetados com AN-17 de mAb em 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 ou 10,0 mg/kg (i.p.), e a distribuição de tecido ao longo do tempo foi analisada por monitoramento de fluorescência. Comparações foram realizadas contra um anticorpo de controle de isotipo IgG-kappa não alvejada. Nenhuma retenção não específica de AN-17 de mAb observada em quaisquer tecidos analisados, com AN-17 de mAb se tornando amplamente indetectáveis após 7 dias. Tecidos examinados incluíram órgãos reprodutivos (ovários, trompas de falópio, útero); intestino; fígado; fígado; rins; baço; pulmão; coração; e cérebro (n=2 animais/grupo, meio +/- SD).
[0046] A Figura 18 mostra que AN-17 de mAb tem alta especificidade para tecido tumoral. Camundongos (n=2/grupo/ponto de tempo) com tumores de ovário primários estabelecidos foram doses administradas tanto de 5 mg/kg como de 10 mg/kg AN-17 de mAb por injeção intraperitoneal. Animais de controle receberam anticorpo de controle compatível com isotipo na mesma dose. Em 1, 3, 5 e 7 dias após a administração, camundongos foram abatidos e a localização de anticorpo analisada por fluorescência (conforme acima). A fluorescência foi expressa como a intensidade fluorescente radiante média por área de tecido de unidade ao longo do tempo. (A) sinal de fluorescência específica de tumor. (B) fluorescência de tecido reprodutivo não tumoral que mostra ausência de sinal específico. (C) imagem de fluorescência de AN-17 de mAb (vermelha) em tumores isolados post-mortem, com tecido reprodutivo sem tumor para comparação (n =2/grupo/ponto de tempo; médio +/-SD).
[0047] A Figura 19 mostra que a administração de AN-17 de mAb causa a regressão direta de massa de tumor estabelecida em camundongos. Camundongos (n=10/grupo) com tumores de ovário primários estabelecidos foram administrados AN-17 de mAb em doses de 5 mg/kg bissemanalmente (Segundas e Terças) por injeção intraperitoneal. Animais de controle receberam tanto anticorpo de controle compatível com isotipo, como veículo de PBS por si só. Após 3 semanas de tratamento continuado, todos os animais foram abatidos e examinados, e massa de tumor medida post-mortem. Sessenta por cento de camundongos que receberam tanto veículo como anticorpo de controle de isotipo teve tumores de ovário primários no abate. Por contraste, nenhum tumor poderia ser identificado em camundongos tratados com AN-17 de mAb (médio +/-SD).
[0048] A Figura 20 mostra (A) as sequências de ácido nucleicos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal AN-17 (de clone AN-17A RG4.E5b.A7.B4) e (B) a % de similaridade entre as sequências de aminoácidos de VH e VL das AN-17 de mAb contra sequências de anticorpo de camundongo de linha germinativa não redisposta (com uso de programa IMGT/V- Quest). N/A = não aplicável; nt=nucleotídeo.
[0049] A Figura 21 mostra as sequências de ácido nucleicos e aminoácidos da VH e VL de AN-17 de mAb.
[0050] A Figura 22 mostra as sequências de aminoácidos de VH (A) e VL (B) de AN-17 de mAb anotadas por texto em negrito e sublinhado para destacar as regiões de framework (FWR) e as regiões de determinação de complementaridade (CDR).
[0051] A Figura 23 mostra que a migração de células de câncer não ovariano (carcinoma rabdoide teratoide (cerebral) atípico BT16, adenocarcinoma pulmonar NCI-H1573, glioblastoma multiforme primário SJ-GBM2, carcinoma endometrial AN3CA, carcinoma colorretal SW620 e linhagens celulares de carcinoma de mama MDA-MB-468) é prejudicada por AN-17 de mAb in vitro.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0052] Por todo este relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outro modo, a palavra “compreender”, ou variações tais como “compreendem” ou “compreende”, serão entendidas para implicar a inclusão de um elemento ou número inteiro declarado ou etapa de método ou grupo de elementos ou números inteiros ou etapas de método, mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou número inteiro ou etapas de método ou grupo de elementos ou números inteiros ou etapas de método.
[0053] Conforme usado no relatório descritivo em questão, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem aspectos adicionais a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, referência a “uma célula cancerígena” inclui uma célula cancerígena única, assim como duas ou mais células cancerígenas; referência a “um epítopo” inclui um epítopo único, assim como dois ou mais epítopos; referência a “a revelação” inclui aspectos únicos e múltiplos ensinados pela revelação; e assim por diante. Aspectos ensinados e possibilitados no presente documento são abrangidos pelo termo “invenção”. Quaisquer variantes e derivados contemplados no presente documento são abrangidos pelas “formas” da invenção. Todos os aspectos da invenção são possibilitados através da largura das reivindicações.
[0054] A presente invenção é direcionada a um protocolo terapêutico para tratar ou prevenir ou de outro modo melhorar o progresso de câncer em um sujeito mamífero. O sujeito pode ser macho ou fêmea. A melhoria de progresso inclui prevenir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas para tratar, impedir ou retardar assim o desenvolvimento do câncer ou reduzir sua capacidade de metastase. Os termos “câncer” e “tumor” são usados no presente documento de modo intercambiável.
[0055] Portanto, é possibilitado no presente documento um método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero. O método que compreende a administração ao sujeito mamífero um agente que: (i) alveja diretamente uma porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas ou seu homólogo ou variante funcional; exemplos de agentes incluem anticorpos, incluindo fragmentos e derivados que alvejam diretamente uma porção extracelular de KRT14 e apropriadamente anticorpos desimunizados ou outras porções químicas ou ligantes de alvejamento; ou (ii) induz um agente endógeno in vivo que alveja uma porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas ou seu homólogo ou variante funcional; exemplos de agentes endógenos incluem, porém, sem limitação, anticorpos, células T e macrófagos.
[0056] Em qualquer caso, o agente ou agente endógeno induz citotoxidade ou citostase de células cancerígenas que transportam a porção extracelular de KRT14 para impedir ou reduzir assim a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas. Por exemplo, em relação a (i), um anticorpo pode se ligar induzindo lise ou senescência de célula mediada por complemento ou mediada por macrófago ou citocina. Alternativamente, um anticorpo ou outro agente de alvejamento pode ser conjugado a uma molécula citotóxica ou usada para iniciar linfócitos. Referência a um “anticorpo” inclui um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, antissoro que compreende anticorpo que se liga a KRT-14 e a formas sintéticas ou recombinantes, fragmentos e derivados que se ligam à porção exógena de KRT14 ou parte da mesma. O medicamento, além de ser um anticorpo, pode ser qualquer reagente de afinidade que inclui, porém, sem limitação aptâmeros, monobodies, anticalinas, DARPins e nanobodies e similares.
[0057] Em uma modalidade, a porção extracelular de KRT14 humano é definida pela sequência de aminoácidos (em código de letra única): NH2-GFGGGYGGGLGAGLGGGFGGGFAGGDGL (SEQ ID NO:1).
[0058] São abrangidos no presente documento homólogos funcionais em mamíferos humanos ou não humanos e ou variantes. Em um exemplo, um homólogo ou variante funcional da SEQ ID NO:1 inclui uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de similaridade à SEQ ID NO:1 após alinhamento ideal. Por “pelo menos 80% de similaridade” inclui pelo menos 80, 81, 82, 82, 83, 84, 85,
86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100% de similaridade ou identidade à SEQ ID NO:1. Tal sequência seria de uma porção extracelular do homólogo ou variante de KRT14.
[0059] Exemplos de homólogos que têm pelo menos cerca de 80% de similaridade à SEQ ID NO:1 são mostrados na Tabela 3.
TABELA 3 Nomes de Entrada Nomes de Identid Gene Organismo Uniprot proteína ade (primários) Queratina, citoesqueleto tipo I 14 Homo sapiens P02533 KRT14 (Citoqueratin 100,00% (Humano) a-14) (CK-14) (Queratina- 14) (K14) Nomascus leucogenys (gibão de bochechas G1RJ14 KRT14 Queratina 14 98,90% brancas do norte) (Hylobates leucogenys) Pan Proteína não H2QCZ7 KRT14 troglodytes 98,50% caracterizada (Chimpanzé) Macaca mulatta F7H312 KRT14 Queratina 14 98,50% (Rhesus macaque)
Chlorocebus sabaeus A0A0D9S2F0 KRT14 Queratina 14 (símio verde) 98,10% (Cercopithecu s sabaeus) Pongo abelii (Orangotango da Sumatra) H2NVQ7 KRT14 Queratina 14 98,10% (Pongo pygmaeus abelii) Papio anubis A0A096P5N3 KRT14 Queratina 14 (Babuíno 98,10% Anúbis) Macaca Citoqueratina mulatta G7NII8 97,20% -14 (macaco Rhesus) Tupaia Queratina, chinensis L9K0I1 citoesqueleto (Musaranho de 96,30% tipo I 14 árvore chinês) Equus F7ATL5 KRT14 Queratina 14 caballus 95,80% (Cavalo) Gorilla gorilla gorilla G3QRG7 KRT14 Queratina 14 95,40% (Gorila da planície do Ocidente) Felis catus (Gato) (Felis M3WGY4 KRT14 Queratina 14 93,70% silvestris catus) Sus scrofa A0A287AEL2 KRT14 Queratina 14 92,50% (Porco) Mesocricetus Queratina, auratus A0A1U7R4L9 Krt14 citoesqueleto 92,30% (Hamster tipo I 14 dourado)
Erinaceus Queratina, europaeus A0A1S3AIS0 LOC103124740 citoesqueleto (Ouriço 92,20% tipo I 14 Europeu do Ocidente) Otolemur garnettii (Galago de Orelha H0X4W1 KRT14 Queratina 14 91,90% Pequena) (grande jágara de Garnett) Dipodomys Queratina, ordii A0A1S3GYN5 Krt14 citoesqueleto 91,60% (Cangurú rato tipo I 14 de Ord) Canis lupus familiaris F1Q0R0 KRT14 Queratina 14 91,60% (Cão) (Canis familiaris) Oryctolagus G1T1Y7 KRT14 Queratina 14 cuniculus 91,50% (Coelho) Queratina, Bos mutus L8HP74 citoesqueleto (iaque 91,50% tipo I 14 selvagem) Ailuropoda melanoleuca G1LFZ4 KRT14 Queratina 14 91,40% (Panda Gigante) Camelus ferus Queratina, (camelo proteína do bactriano S9XAP9 tipo selvagem) 91,40% citoesqueleto (Camelus tipo I 14 bactrianus ferus) Tarsius Queratina, syrichta A0A1U7UN37 KRT14 citoesqueleto 91,20% (tarsio das tipo I 14 Filipinas)
Queratina, Bos taurus F1MC11 KRT14 citoesqueleto 91,10% (Bovino) tipo I 14 Mustela putorius furo (Furão M3YHM3 KRT14 Queratina 14 doméstico 91,00% Europeu) (Mustela furo) Cricetulus griseus Queratina, (Hamster G3I8F9 citoesqueleto Chinês) 89,80% tipo I 14 (Cricetulus barabensis griseus) Queratina, citoesqueleto tipo I 14 Mus musculus Q61781 Krt14 (Citoqueratin 89,00% (Camundongo) a-14) (CK-14) (Queratina- 14) (K14) Loxodonta africana G3T6A4 KRT14 Queratina 14 88,20% (Elefante Africano) Cavia porcellus A0A286XM26 KRT14 Queratina 14 87,80% (Porquinho- da-Índia) Myotis Queratina, brandtii S7PB95 citoesqueleto 87,30% (Morcego de tipo I 14 Brandt) Ovis aries W5Q6L8 KRT14 Queratina 14 86,70% (Ovelha)
Queratina, citoesqueleto tipo I 14 (Citoqueratin Rattus Q6IFV1 Krt14 a-14) (CK-14) norvegicus 86,30% (Queratina- (Rato) 14) (K14) (Queratina Tipo I Ka14) Myotis lucifugus G1PTJ6 KRT14 Queratina 14 (morcego 86,00% pequeno marrom) Heterocephalu Queratina, s glaber G5B0M6 citoesqueleto (rato- 84,80% tipo I 14 toupeira pelado) Macaca mulatta F7A610 KRT14 Queratina 14 84,00% (macaco Rhesus) Fukomys damarensis Queratina, (rato- A0A091DDD7 citoesqueleto toupeira de 82,50% tipo I 14 Damaraland) (Cryptomys damarensis) Sus scrofa A0A287BSX6 KRT14 Queratina 14 82,20% (Porco) Macaca mulatta A0A1D5QHL9 KRT14 Queratina 14 81,40% (macaco Rhesus) Sus scrofa A0A287AK58 KRT14 Queratina 14 81,10% (Porco) Sus scrofa A0A287AXN9 KRT14 Queratina 14 81,00% (Porco)
[0060] O termo “similaridade” conforme usado no presente documento inclui identidade exata entre sequências comparadas no nível de aminoácido. Onde houver não identidade no nível de aminoácido, “similaridade” inclui aminoácidos que são, todavia, relacionados entre si nos níveis estruturais, funcionais, bioquímicos e/ou conformacionais. Em uma modalidade, comparações de aminoácido e sequência são realizadas no nível de identidade em vez de similaridade.
[0061] Termos usados para descrever relações de sequências entre dois ou mais polipeptídeos incluem “sequência de referência”, “janela de comparação”, “similaridade de sequência”, “identidade de sequência”, “porcentagem de similaridade de sequência”, “porcentagem de identidade de sequência”, “substancialmente similar” e “identidade substancial”. Uma “sequência de referência” é de 5 a 20 aminoácidos de comprimento. Uma “janela de comparação” se refere a um segmento conceitual de tipicamente 5-20 resíduos contíguos que é comparado a uma sequência de referência. A janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) de cerca de 20% ou menos conforme comparado à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. Alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzida por implementações computadorizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics Lançamento 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, E.U.A) ou por inspeção e o melhor alinhamento (isto é, resultando na maior homologia de porcentagem através da janela de comparação) geralmente por qualquer um dos vários métodos selecionados. Referência também pode ser feita à família BLAST de programas conforme, por exemplo, revelado por Altschul et al. (1997)
Nucl. Acids. Res. 25:3389. Uma discussão detalhada de análise de sequência pode ser encontrada na Unidade 19.3 de Ausubel et al. (1994-1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.
[0062] Os termos “similaridade de sequência” e “identidade de sequência” conforme usado no presente documento se refere à extensão de que as sequências são idênticas ou funcional ou estruturalmente similares em uma base de aminoácido por aminoácido por uma janela de comparação. Desse modo, uma “porcentagem de identidade de sequência”, por exemplo, é calculada comparando-se duas sequências idealmente alinhadas através de comparação, determinando-se o número de posições nas quais o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências para render o número de posições compatíveis, dividindo o número de posições compatíveis pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho de janela), e multiplicando-se o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência.
[0063] Os termos “variante” e “derivado” se referem, portanto, a uma sequência de aminoácidos que exibe identificação ou similaridade de sequência substancial com uma sequência de referência de aminoácidos (isto é, SEQ ID NO:1 ou subsequência do mesmo). Os termos “variante” e “derivados” também inclui variantes alélicos de ocorrência natural.
[0064] Um “derivado” também inclui um mutante, fragmento, parte, porção ou molécula híbrida em referência à SEQ ID NO:1 ou seu homólogo funcional. Um derivado geralmente, porém, não exclusivamente, transporta uma substituição, adição e/ou deleção de aminoácido único ou múltiplo.
[0065] Um “homólogo” inclui um polipeptídeo análogo que tem pelo menos cerca de 80% de sequência de aminoácidos similar de outra espécie animal ou de um lócus diferente dentro da mesma espécie.
[0066] Um variante também inclui um “análogo” que é geralmente um análogo químico. Análogos químicos da SEQ ID NO:1 contemplados no presente documento incluem, porém, sem limitação, modificações para cadeias laterais, incorporação de aminoácidos não naturais e/ou seus derivados durante síntese de peptídeo, polipeptídeo ou proteína e o uso de reticuladores e outros métodos que impõem restrições conformacionais na molécula proteínácea ou seus análogos.
[0067] Exemplos de modificações de cadeia lateral contempladas pela presente invenção incluem modificações de grupos amino tais como por alquilação redutiva por reação com um aldeído seguido pela redução com NaBH4; amidinação com metilacetimidato; acilação com anidrido acético; carbamilação de grupos amino com cianato; trinitrobenzilação de grupos amino com ácido sulfônico de 2, 4, 6-trinitrobenzeno (TNBS); acilação de grupos amino com anidrido succínico e anidrido tetrahidroftálico; e piridoxilação de lisina com piridoxal-5- fosfato seguido por redução com NaBH4.
[0068] O grupo guanidina de resíduos de arginina pode ser modificado pela formação de produtos de condensação heterocíclica com reagentes tais como 2,3-butanediona, fenilglioxal e glioxal.
[0069] O grupo carboxila pode ser modificado pela ativação de carbodiimida por meio de formação O-acilisourea seguida por derivatização subsequente, por exemplo, a uma amida correspondente.
[0070] Grupos sulfidrila podem ser modificados por métodos tais como carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida; oxidação de ácido perfórmico para ácido cisteico; formação de dissulfetos misturados com outros compostos de tiol; reação com maleimida, anidrido maleico ou outra maleimida substituída; formação de derivados imprevisíveis com uso de 4-cloromercuribenzoato, ácido 4- cloromercuriphenilsulfônico, cloreto de fenilmercúrio, 2- cloromercuri-4-nitrofenol e outros imprevisíveis; carbomilação com cianato em pH alcalino.
[0071] Resíduos de triptofano pode ser modificado, por exemplo, por oxidação com N-bromosuccinimida ou alquilação do anel de indol com bromida de 2-hidroxi-5- nitrobenzil bromida ou haletos de sulfenila. Resíduos de tirosina, por outro lado, podem ser alterados por nitração com tetranitrometano para formar um derivado de 3-nitrotirosina.
[0072] A modificação do anel de imidazol de um resíduo de histidina pode ser concluída pela alquilação com derivados de ácido iodoacético ou N-carbetoxilação com dietilpirocarbonato.
[0073] Reticuladores podem ser usados, por exemplo, para estabilizar conformações 3D, com uso de reticuladores homobifuncionais tais como os imidoésteres bifuncionais que têm grupos espaçadores (CH2)n com n=1 a n=6, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida e reagentes heterobifuncionais que geralmente contêm uma porção amino- reativa, tal como N-hidroxisuccinimida e outra porção química reativa específica de grupo tal como maleimido ou porção química de ditio (SH) ou carbodiimida (COOH). Adicionalmente,
peptídeos podem ser restringidos de modo conformacional por, por exemplo, incorporação de Cα e Nα-metilamino ácidos, introdução de ligações duplas entre Cα e Cβ átomos de aminoácidos e a formação de peptídeos cíclicos ou análogos introduzindo-se ligações covalentes tais como formando uma ligação de amida entre as terminações N e C, entre duas cadeias laterais ou entre uma cadeia lateral e o término N ou C.
[0074] Tais análogos podem ser úteis em vacinas sintéticas ou para gerar anticorpos para uso como agentes de alvejamento. Análogos podem ter atributos tais como meia-vida de soro adequada. Os anticorpos também podem estar em antissoro que compreende anticorpos que se ligam a KRT14.
[0075] É ensinado no presente documento um método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero, sendo que o dito método compreende a administração ao dito sujeito de uma quantidade de um agente que tem como alvo uma porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo funcional ou variante do mesmo residente em células cancerígenas ou um agente que induz produção de um antagonista da porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo funcional ou variante nas células cancerígenas, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização das células cancerígenas.
[0076] É permitido no presente documento o método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero, sendo que o método compreende a administração ao sujeito, uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular definida pela sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80% de similaridade à SEQ ID NO:1 após o alinhamento ideal ou seu homólogo ou variante funcional da mesma residente em células cancerígenas ou um agente que induz produção in vivo de um antagonista da porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo ou variante funcional em células cancerígenas, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[0077] É adicionalmente ensinado no presente documento método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero, sendo que o método compreende a administração ao sujeito, uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular definida pela sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:1 ou um homólogo ou variante funcional da mesma residente em células cancerígenas ou um agente que induz a produção in vivo de um antagonista da porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas ou seu homólogo ou variante funcional em células cancerígenas pela quantidade eficaz para impedir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[0078] É ainda possibilitado um método para o tratamento de câncer de ovário em um sujeito humano, sendo que o método compreende a administração ao sujeito de uma quantidade de um anticorpo que tem como alvo uma porção extracelular de KRT14 definida pela SEQ ID NO:1 residente em células de câncer de ovário, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a migração e/ou metastização das invasões de células cancerígenas do ovário. O medicamento, além de ser um anticorpo, pode ser qualquer reagente de afinidade que inclui, porém, sem limitação aptâmeros, monobodies, anticalinas, DARPins e nanobodies e similares.
[0079] O termo “administrar ao sujeito” inclui contatar a célula cancerígena por qualquer meio para colocar o agente em contato com a porção extracelular de KRT14 na célula cancerígena. O sujeito mamífero pode ser macho ou fêmea e de qualquer idade.
[0080] É identificado no presente documento um epítopo curto da proteína de KRT14 exposta na superfície celular, e é disponível para a interação com agentes adicionados de modo exógeno ou moléculas endógenas especificamente induzidas. Alvejar essa região com uso de um anticorpo ou outro agente de alvejamento que reconhece a sequência exposta pode prevenir completamente a invasão de célula cancerígena in vitro, simulando os efeitos de ablação de gene de KRT14. Esses dados indicam que KRT14 representa um alvo anteriormente não reconhecido e altamente específico em células tumorais para terapia de antagonista direcionada.
[0081] É também observada falha para formar um tumor sólido em camundongos. Células cancerígenas implantadas que carecem de gene de KRT14 funcional se tornam indetectáveis após várias semanas. Isso indica que essas células cancerígenas são removidas do animal, de modo similar, através de, por exemplo, liberação mediada imune. Desse modo, é proposto no presente documento que o uso de uma terapia anti- KRT14 pode promover estabilização de tumor (através de implantação/invasão prejudicada), e regressão de tumor. Terapia anti-KRT14 alvejada tem alto potencial para tratamento de câncer, pelas seguintes razões:
[0082] (i) espera-se que a terapia anti-KRT14 não seja tóxica, visto que KRT14 não é amplamente expresso e um antagonista é selecionado para ser não tóxico às células;
[0083] ii) terapia anti-KRT14 é aplicável a todos os estágios de doenças, para alvejar depósitos tanto primários quanto metastáticos;
[0084] iii) células que expressam KRT14 são especificamente enriquecidos ao longo do tempo e em resposta à quimioterapia; desse modo, a terapia anti-KRT14 seria altamente aplicável a pacientes que desenvolveram doença quimiorresistente recorrente e não têm opções de tratamento convencionais adicionais disponíveis;
[0085] iv) terapia anti-KRT14 pode promover potencialmente a regressão de tumores, adicionalmente a doença existente estabilizante.
[0086] Há também várias aplicações adicionais para terapias anti-KRT14 incluindo:
[0087] i) conjugação a uma “carga” citotóxica para terapia direcionada contra a população de células-tronco de câncer invasivas;
[0088] ii) o uso em terapias CAR-T, projetadas para direcionar células T citotóxicas antitumorais para destruir a população celular iniciada por tumor;
[0089] iii) vacinação terapêutica ou preventiva;
[0090] iv) geração de produção de anticorpo “desumanizado” em aplicações veterinárias;
[0091] v) aplicações teranósticas, por exemplo, para prever resposta terapêutica/quimiorresistência/recorrência de tumor ou progresso.
[0092] O progresso de tumor dependente de KRT14 foi também identificado como um mecanismo-chave envolvidos em vários outros tipos de tumor sólido, e provavelmente representa um mecanismo conservado que é a base de espalhamento de tumor.
Desse modo, a terapia anti-KRT14 tem aplicações além dos cânceres de ovário e pode se provar aplicável ao tratamento de uma ampla faixa de tumor sólido.
Conforme usado no presente documento um “câncer” se refere a um grupo de doenças e distúrbios que são caracterizados por crescimento celular não controlado (por exemplo, formação de tumor) sem qualquer diferenciação daquelas células em células especializadas e diferentes.
Cânceres contemplados para tratamento no presente documento incluem, sem limitação, e adicionalmente a uma afecção ginecológica tais como câncer de ovário, proto- oncogene ABL1, cânceres relacionados à AIDS, neuroma acústico, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenocístico, câncer adrenocortical, metaplasia mieloide agnogênica, alopécia, sarcoma de parte macia alveolar, câncer anal, angiosarcoma, anemia aplástica, astrocitoma, ataxia- telangiectasia, carcinoma de célula basal (Pele), câncer de bexiga, cânceres ósseos, câncer de intestino, glioma de tronco encefálico, tumores cerebrais e de CNS, câncer de mama, tumores de CNS, tumores carcinoides, câncer cervical, tumores cerebrais infantis, câncer infantil, leucemia infantil, sarcoma de tecido macio infantil, condrossarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, cânceres colorretais, linfoma de célula T cutânea, dermatofibrosarcoma-protuberante, tumor de célula redonda pequena desmoplástica, carcinoma ductal, cânceres endócrinos, cânceres endometriais, ependimoma, câncer esofageal, sarcoma de Ewing, câncer de duto de bile extra- hepático, câncer ocular, melanoma, retinoblastoma, câncer de trompa de falópio, anemia de Fanconi, fibrosarcoma, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico, cânceres gastrointestinal,
tumor gastrointestinal carcinoide, cânceres genitourinários, célula germinal, doença gestacional-trofoblástica, glioma, cânceres ginecológicos, malignidades hematológicas, leucemia de células cabeludas, câncer de cabeça e pescoço, câncer hepatocelular, câncer de mama hereditário, histiocitose, doença de Hodgkin, papilomavírus humano, gravidez molar, hipercalcemia, câncer de hipofaringe, melanoma intraocular, câncer de célula de ilhota, sarcoma de Kaposi, câncer renal, histiocitose de célula de Langerhan, câncer laringeal, leiomiosarcoma, leucemia, síndrome Li-Fraumeni, câncer labial, lipossarcoma, câncer de fígado, câncer pulmonar, linfedema, linfoma, linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, câncer de mama masculino, tumor renal rabdoide maligno, meduloblastoma, melanoma, câncer de célula de Merkel, mesotelioma, câncer metastático, câncer bucal, neoplasia endócrina múltipla, micose fungoide, síndromes mielodisplásticas, mieloma, distúrbios mieloproliferativos, câncer nasal, câncer nasofaringeal, nefroblastoma, neuroblastoma, neurofibromatose, síndrome de quebra de Nijmegen, câncer de pele de não melanoma, câncer pulmonar de célula não pequena(NSCLC), cânceres oculares, câncer de esôfago, câncer de cavidade oral, câncer de orofaringe, osteosarcoma, câncer de pâncreas, câncer paranasal, câncer paratireoide, câncer de glândula parótida, câncer peniano, tumores neuroectodérmicos periféricos, câncer de hipófise, policitemia vera, câncer de próstata, cânceres raros e distúrbios associados, carcinoma de célula renal, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, síndrome de Rothmund-Thomson, câncer de glande salivar, sarcoma, schwannoma, síndrome de Sézary, câncer de pele, câncer pulmonar de célula pequena (SCLC), câncer de intestino delgado, sarcoma de tecido macio, tumores de medula espinhal, carcinoma de célula escamosa(pele), câncer de estômago, sarcoma sinovial, câncer testicular, câncer de timo, câncer de tireoide, câncer de célula transicional(bexiga), câncer de célula transicional(renal-pelvis/uretra), câncer trofoblástico, câncer uretral, câncer de sistema urinário, uroplakins, sarcoma uterino, câncer de útero, câncer vaginal, câncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom e tumor de Wilms. Cânceres endometriais e colorretais também podem ser tratados. Esses cânceres podem afetar sujeitos masculinos ou femininos e qualquer um pode ser tratado de acordo com a presente invenção.
[0093] Em uma modalidade, o câncer é um câncer ginecológico. Em uma modalidade, o câncer ginecológico é câncer de ovário ou um estágio ou forma de câncer de ovário. Alternativamente, o câncer é, entre outros, um câncer do fígado, bexiga, pulmão, cólon, trato gastrointestinal, intestino, pâncreas e/ou garganta dentre outro câncer em um sujeito masculino ou feminino. A presente invenção se estende à terapia de combinação em que o agente que alveja KRT14 ou o agente que induz um antagonista de KRT14 in vivo é dado com outro agente anticâncer e/ou terapia de radiação e/ou intervenção cirúrgica. Em uma modalidade, os métodos revelados no presente documento compreendem adicionalmente a administração ao sujeito um agente anticâncer adicional e/ou expor o paciente a imunoterapia, terapia de radiação e/ou intervenção cirúrgica. Exemplos ilustrativos de agentes anticâncer adicionais incluem um agente quimioterapêutico tal como um ou mais dentre dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina e mitoxantrona, ou agentes à base de platina ou um antimetabólito. Antimetabólitos são substâncias que interferem com os processos químicos do corpo, tais como criando proteínas, DNA, e outros produtos químicos necessários para crescimento celular e reprodução; em tratamento de câncer, fármacos antimetabólitos que interrompem a produção de DNA, que por sua vez, impede a divisão celular. Exemplos incluem azaserina, D- cicloserina, ácido nicofenólico, trimetoprim, 5-fluorouracila, capecitabina, metotrexato, gemcitabina, citarabina (ara-C) e fludarabina. Outros reagentes imunes podem ser administrados tais como células T iniciadas e citocinas. A terapia de combinação pode ser fornecida simultânea ou sequencialmente em qualquer ordem e dentro de segundos, minutos, horas, dias ou semanas um do outro. Em uma modalidade, o agente anticâncer adicional é selecionado dentre o grupo que consiste em dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina e mitoxantrona, um agente à base de platina, um antimetabólito, células T iniciadas e citocinas. Em uma modalidade, o um antimetabólito é selecionado dentre o grupo que consiste em azaserina, D-cicloserina, ácido nicofenólico, trimetoprim, 5-fluorouracila, capecitabina, metotrexato, gemcitabina, citarabina (ara-C) e fludarabina.
[0094] Em uma modalidade, o sujeito mamífero é um humano. Para um câncer ginecológico, o sujeito é uma humana feminina. No entanto, para todos os outros cânceres, o sujeito pode ser um humano masculino ou feminino.
[0095] Consequentemente, é ensinado no presente documento um método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito humano, incluindo sujeitos humanos ou animais, sendo que o método compreende administrar ao sujeito uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular de KRT14 ou seu residente homólogo ou variante funcional em células cancerígenas ou um agente que induz a produção in vitro de um antagonista da porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo ou variante funcional em células cancerígenas, a quantidade eficaz para impedir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[0096] É possibilitado no presente documento método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito humano, sendo que o método compreende a administração ao sujeito, uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular definida pela sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:1 ou um homólogo ou variante funcional da mesma residente nas células cancerígenas ou um agente que induz a produção de um antagonista da porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas ou seu homólogo ou variante funcional pelo dito sujeito, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[0097] É adicionalmente no presente documento o método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito humano, sendo que o método compreende a administração ao sujeito uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular definida pela sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80% de similaridade à SEQ ID NO:1 após alinhamento ideal ou seu homólogo ou variante funcional da mesma residente em células cancerígenas ou um agente que induz produção in vivo de um antagonista da porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas ou seu homólogo ou variante funcional, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[0098] Em uma modalidade, o câncer é câncer de ovário e o sujeito é um sujeito feminino humano.
[0099] Consequentemente, é ensinado no presente documento um método para o tratamento ou profilaxia de câncer de ovário em um sujeito feminino humano, sendo que o método compreende administrar ao sujeito uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular de KRT14 ou seu residente homólogo ou variante funcional em células cancerígenas ou um agente que induz a produção in vitro de um antagonista da porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo ou variante funcional em células cancerígenas, a quantidade eficaz para impedir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[00100] É possibilitado no presente documento método para o tratamento ou profilaxia de câncer de ovário em um sujeito feminino humano, sendo que o método compreende a administração ao sujeito uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular definida pela sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:1 ou um homólogo ou variante funcional da mesma residente em células cancerígenas ou um agente que induz produção de um antagonista da porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas ou seu homólogo ou variante funcional pelo dito sujeito, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[00101] É adicionalmente ensinado no presente documento método para o tratamento ou profilaxia de câncer de ovário em um sujeito feminino humano, sendo que o método compreende a administração ao sujeito, uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular definida pela sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80% de similaridade à SEQ ID NO:1 após alinhamento ideal ou seu homólogo ou variante funcional da mesma residente em células cancerígenas ou um agente que induz produção in vivo de um antagonista da porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas ou seu homólogo ou variante funcional, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[00102] A presente invenção também tem aplicação veterinária tal como o tratamento de câncer em animais de estimação (por exemplo, cães e gatos) ou outros animais não humanos tais como animais de fazenda (por exemplo, animais equinos, porcos, ovelha, bovino, cabras, lhamas e alpacas), animais de teste laboratoriais (por exemplo, camundongos, coelhos, porquinhos-da-índia, hamsters) e animais cativos selvagens (por exemplo, o demônio da Tasmânia). Outros animais contemplados para tratamento incluem símios de espécie Gibão, Chimpanzés, macacos Rhesus, símios verdes, Orangotangos, babuínos, musaranhos, gorilas, ouriços, jágaras, ratos- canguru, iaques selvagens, Társios das Filipinas, furões, elefantes e morcegos. Em relação a animais equinos, os mesmos incluem cavalos, cavalos Przewalski, zebras e jumentos. Em relação a cavalos, os mesmos incluem um cavalo puro-sangue, cavalo de sangue-quente, cavalo Quarto de milha e um cavalo Padrão assim como um cavalo equestre e um cavalo de desempenho.
[00103] Consequentemente, é ensinado no presente documento um método para o tratamento ou profilaxia de câncer de ovário em um sujeito feminino humano, sendo que o método compreende administrar ao sujeito uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular de KRT14 ou seu residente homólogo ou variante funcional em células cancerígenas ou um agente que induz a produção in vitro de um antagonista da porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo ou variante funcional em células cancerígenas, a quantidade eficaz para impedir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[00104] É adicionalmente ensinado no presente documento método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero não humano, sendo que o método compreende a administração ao sujeito, uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular definida pela sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80% de similaridade à SEQ ID NO:1 após alinhamento ideal ou seu homólogo ou variante funcional da mesma residente em células cancerígenas ou um agente que induz in vivo produção de um antagonista da porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas ou seu homólogo ou variante funcional pelo dito sujeito, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[00105] É possibilitado no presente documento método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero não humano, sendo que o método compreende a administração ao sujeito, uma quantidade de um agente que alveja uma porção extracelular definida pela sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:1 ou um homólogo ou variante funcional da mesma residente em células cancerígenas ou um agente que induz in vivo produção de um antagonista da porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas ou seu homólogo ou variante funcional em células cancerígenas, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização de células cancerígenas.
[00106] O sujeito mamífero não humano pode ser masculino ou feminino. Em uma modalidade, o agente é um anticorpo. O anticorpo pode ser um anticorpo derivado de humano ou um anticorpo desimunizado ou um anticorpo mamiferizado adequado para um sujeito mamífero particular. Por exemplo, um anticorpo de camundongo pode ser humanizado para uso em humanos. Portanto, o anticorpo pode ser geralmente em uma espécie de mamífero para uso pelo fato de que o mamífero ou pode ser mamiferizado ou desimunizado conforme apropriado. Para evitar dúvidas, o “anticorpo” pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal ou antissoro que compreende anticorpos que se ligam a KRT14 ou variantes que se ligam a KRT14 ou derivados ou fragmentos desses anticorpos ou formas sintéticas ou recombinantes, incluindo fragmentos que se ligam a F’ (ab). O medicamento, além de ser um anticorpo, pode ser qualquer reagente de afinidade que inclui, porém, sem limitação aptâmeros, monobodies, anticalinas, DARPins e nanobodies e similares.
[00107] Portanto, a presente invenção fornece adicionalmente, portanto, a aplicação de técnicas bioquímicas para tornar um anticorpo derivado de um animal substancialmente não imunogênico em outro animal da mesma espécie ou de espécies diferentes. O processo bioquímico é denominado no presente documento como “desimunização”. Referência no presente documento a “desimunização” inclui processos, tais como enxertamento de região determinante complementar (CDR), “remodelamento” em relação a uma região de framework de uma molécula imunointerativa e mutação de região variável (v), todos com objetivo de reduzir a imunogenicidade de uma molécula imunointerativa (por exemplo, anticorpo) em um hospedeiro particular (por exemplo, um sujeito humano). Em uma modalidade, a molécula imunointerativa preferencial é um anticorpo, tal como um anticorpo policlonal ou monoclonal específico para uma célula cancerígena que transporta uma porção extracelular de KRT14. Em uma modalidade, a molécula imunointerativa é um anticorpo monoclonal, derivada de um animal e que exibe imunogenicidade reduzida em outro animal da mesma espécie ou de espécies diferentes tais como, porém, sem limitação, humanos.
[00108] Referência a “substancialmente não imunogênico” inclui imunogenicidade reduzida em comparação a um anticorpo percursor, isto é, um anticorpo antes da exposição aos processos de desimunização. O termo “imunogenicidade” inclui uma capacidade para provocar, induzir ou de outro modo facilitar uma resposta humoral e/ou mediada com célula T em um animal hospedeiro. Critérios imunogênicos convenientes incluem a capacidade para sequências de aminoácidos derivadas de uma região variável (v) de um anticorpo para interagir com terapia de moléculas de classe II MHC que estimulam ou facilitam uma resposta de mediação de célula T incluindo uma resposta humoral auxiliada com célula T.
[00109] Por “anticorpo”, é representada uma proteína da família de imunoglobulina que tem capacidade de combinar, interagir ou, de outro modo, se associar com um antígeno. Um anticorpo é, portanto, uma molécula de ligação a antígeno. Um “anticorpo” é um exemplo de uma molécula imunointerativa e inclui um anticorpo policlonal ou monoclonal ou antissoro. Em uma modalidade, as moléculas imunointerativas da presente invenção são anticorpos monoclonais.
[00110] O termo “antígeno” é usado no presente documento em seu sentido mais amplo para se referir a uma substância que tem capacidade de reagir em uma resposta imune e/ou induzir a mesma. Referência a um “antígeno” inclui um antigênico determinante ou epítopo ou uma célula cancerígena conforme definido por SEQ ID NO:1 ou seu homólogo ou variante funcional.
[00111] Por “molécula de ligação a antígeno”, é representada qualquer molécula que tem afinidade de ligação para um antígeno alvo (isto é, SEQ ID NO:1). Será entendido que que esse termo se estende a imunoglobulinas (por exemplo, anticorpos policlonais e monoclonais), fragmentos de imunoglobulina e frameworks de proteína não derivados de imunoglobulina que exibem atividade de ligação a antígeno. Os termos “anticorpo” e “moléculas de ligação a antígeno” incluem formas desimunizadas dessas moléculas.
[00112] Por “determinante antigênico” ou “epítopo”, é representado que parte da KRT14 que tem um domínio extracelular ao qual uma resposta imune pode ser direcionada.
[00113] Embora anticorpos da presente invenção sejam tipicamente formas desimunizadas de anticorpos monoclonais de murina para uso em humanos, a invenção em questão se estende a anticorpos de quaisquer fontes e desimunizada para uso em qualquer hospedeiro. Exemplos de fontes animais e hospedeiros incluem humanos, primatas, animais de gado (e.g., ovelha, vacas, cavalos, porcos, burros),
animais de teste laboratoriais (por exemplo, camundongos, coelhos, porquinhos-da-índia, hamsters) e animais de estimação (por exemplo, cães, gatos).
[00114] A imunização e produção subsequente de anticorpos monoclonais podem ser realizadas com uso de protocolos padrão por exemplo, conforme descrito, por Köhler e Milstein (Kohler et al. (1975) Nature 256:495-499 e Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6(7):511-519;, Coligan et al. Current Protocols in Immunology, 1991-1997 ou Toyama et al. (1987) Monoclonal Antibody, Experiment Manual, publicado por Kodansha Scientific). Essencialmente, um animal é imunizado com um antígeno (isto é, uma proteína ou proteína análogo que compreende a SEQ ID NO:1 ou seu homólogo ou variante funcional) por métodos padrão para produzir células que produzem anticorpo, particularmente, células somáticas que produzem anticorpo (por exemplo, linfócitos B). Essas células podem ser então removidas do animal imunizado para imortalização. O antígeno pode precisar ser primeiro associado a um carreador.
[00115] Por “carreador”, é representada qualquer substância de pelo molecular tipicamente alto ao qual uma substância não imunogênica ou fracamente imunogênica (por exemplo, um hapteno) é natural ou artificialmente ligado para intensificar sua imunogenicidade.
[00116] A imortalização de células que produzem anticorpo pode ser realizada com uso de métodos, que são conhecidos na técnica. Por exemplo, a imortalização pode ser alcançada pelo método de transformação com uso de Epstein-Barr virus (EBV) [Kozbor et al. (1986) Methods in Enzymology 121:140]. Em uma modalidade preferencial, células que produzem anticorpo são imortalizadas com uso do método de fusão
(descrito em [Coligan et al. (1991-1997) supra]), que é amplamente empregado para a produção de anticorpos monoclonais. Nesse método, células somáticas que produzem anticorpo com o potencial para produzir anticorpos, particularmente, células B, são fundidas com uma linhagem celular de mieloma. Essas células somáticas podem ser derivadas dos gânglios linfáticos, baços e sangue periférico de animais iniciados, tais como animais roedores incluindo camundongos e ratos. Na modalidade exemplificadora dessa invenção, camundongos, células de baço são usadas. No entanto, seria possível usar células de rato, coelho, ovelha ou ovelha, ou células de outra espécie de animal em vez disso.
[00117] Linhagens celulares especializadas foram desenvolvidas a partir de tumores linfocíticos para uso em procedimentos de fusão de produção de hibridoma (Kohler et al. (1976) supra; Kozbor et al. (1986) supra; e Volk et al. (1982) J. Virol. 42(1):220-227).
[00118] Muitas linhagens celulares de mieloma podem ser usadas para a produção de híbridos de célula fundida, incluindo, por exemplo, P3X63-Ag8, P3X63-AG8.653, P3/NS1-Ag4- 1 (NS-1), Sp2/0-Ag14 e S194/5.XXO.Bu.1. As linhagens celulares P3X63-Ag8 e NS-1 foram descritas por Köhler e Milstein (Kohler et al. (1976) supra). Shulman et al. (1978) Nature 276:269- 270, desenvolvida a linha de mieloma Sp2/0-Ag14. A linha S194/5.XXO.Bu.1 foi relatada por Trowbridge (1982) J. Exp. Med. 148(1):220-227.
[00119] Métodos para gerar híbridos de células de baço ou gânglios linfáticos que produzem anticorpo e células de mieloma geralmente envolvem misturar células somáticas com células de mieloma em uma proporção de 10:1 (embora a proporção pode variar de cerca de 20:1 a cerca de 1:1), respectivamente, na presença de um agente ou agentes (químicos, virais ou elétricos) que promove a fusão de membranas celulares. Métodos de fusão foram descritos (Kohler et al. (1975) supra, Kohler et al. (1976) supra, Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-236 e Volk et al. (1982) supra). Os agentes de promoção de fusão usados por aqueles investigadores foram Sendai virus e polietileno glicol (PEG).
[00120] Devido ao fato de que procedimentos de fusão produzem híbridos viáveis em frequência muito baixa (por exemplo, quando baços são usados como uma fonte de células somáticas, somente um híbrido é obtido aproximadamente a cada 1x105 células de baço), é preferencial ter meio de seleção dos híbridos de célula fundida das células não fundidas restantes, particularmente as células de mieloma não fundidas. Um meio de detecção dos hibridomas que produzem anticorpo desejados dentre outros híbridos de célula fundida resultantes é também necessário. Em geral, a seleção de híbridos de célula fundida é acompanhada cultivando-se as células nos meios que suportam o crescimento de hibridomas, mas impedem o crescimento das células de mieloma não fundidas, que normalmente continuariam se dividindo indefinitivamente. As células somáticas usadas na fusão não mantêm viabilidade a longo prazo em cultura in vitro e, portanto, não expõem um problema. No exemplo da presente invenção, células de mieloma que carecem de fosforibosila de hipoxantina transferase (HPRT-negative) foram usadas. A seleção contra essas células é realizada em meio de hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT), um meio no qual os híbridos de célula fundida sobrevivem devido ao genótipo positivo de HPRT das células de baço. O uso de células de mieloma com diferentes deficiências genéticas (sensibilidades de fármaco, etc.) que podem ser selecionadas contra nos meios que suportam o crescimento de híbridos competentes de modo genotípico é também possível.
[00121] Várias semanas são necessárias para cultivar seletivamente os híbridos de célula fundida. No início desse período de tempo, é necessário identificar aqueles híbridos que produzem o anticorpo desejado, de modo que os mesmos possam ser subsequentemente clonados e propagados. Em geral, cerca de 10% dos híbridos obtidos produzem o anticorpo desejado, embora uma faixa de cerca de 1 a cerca de 30% não é incomum. A detecção de híbridos que produzem anticorpos pode ser alcançada por qualquer um dos vários métodos de ensaio padrão, incluindo imunoensaio ligado a enzima e técnicas de radioimunoensaio, por exemplo, conforme descrito em Kennet et al. (Chou et al. Patente nº U.S. 6.056.957).
[00122] Uma vez que os híbridos de célula fundida desejados foram selecionados e clonados em linhagens celulares que produzem anticorpo individuais, cada linhagem celular pode ser propagada em qualquer um dos métodos padrão. Uma suspensão das células de hibridoma pode ser injetada em um animal histocompatível. O animal injetado então desenvolverá tumores que secretam o anticorpo monoclonal específico produzido pelo híbrido de célula fundida. Os fluidos corporais do animal, tais como soro ou fluido de ascites, podem ser canalizados para fornecer anticorpos monoclonais em alta concentração. Alternativamente, as linhagens celulares podem ser propagadas in vitro em recipientes de cultura laboratoriais. O meio de cultura que contém altas concentrações de um único anticorpo monoclonal específico pode ser coletado por decantação,
filtração ou centrifugação, e subsequentemente purificado.
[00123] As linhagens celulares são testadas para sua especificidade para detectar o antígeno de interesse por qualquer meio de imunodetecção adequado. Por exemplo, linhagens celulares podem ser divididas por alíquotas em vários poços e incubados e o sobrenadante de cada poço é analisado por ensaio de imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), técnica de anticorpo fluorescente indireta ou similares. A linhagem (ou linhagens) celular que produz um anticorpo monoclonal com capacidade de reconhecer o antígeno alvo, mas que não reconhece epítopos não alvo são identificados e então diretamente cultivados in vitro ou injetados em um animal histocompatível para formar tumores e para produzir, coletar e purificar os anticorpos necessários.
[00124] Desse modo, a presente invenção fornece em uma primeira etapa, anticorpos monoclonais que especificamente interagem com uma proteína que compreende uma porção extracelular que inclui SEQ ID NO:1 ou um variante da mesma ou um epítopo da mesma.
[00125] O anticorpo monoclonal é então geralmente submetido a meios de desimunização. Tal processo pode tomar quaisquer de várias formas incluindo a preparação de anticorpos quiméricos que têm a mesma especificidade ou especificidade similar que os anticorpos monoclonais preparados de acordo com a presente invenção. Anticorpos quiméricos são anticorpos cujos genes de cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente por manipulação genética, de genes de região variável e constante de imunoglobulina pertencentes a diferentes espécies. Desse modo, de acordo com a presente invenção, uma vez que um hibridoma que produz o anticorpo desejado monoclonal é obtido, técnicas são usadas para produzir anticorpos monoclonais interespecíficos em que a região de ligação de uma espécie é combinada com uma região de não ligação do anticorpo de outras espécies (Liu et al. (1987) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 84:3439-3443). Por exemplo, as CDRs de um anticorpo monoclonal não humano (por exemplo, murina) podem ser enxertadas em um anticorpo humano, “humanizando” assim o anticorpo de murina (Publicação de Patente Europeia Nº 0 239 400, Jones et al. (1986) Nature 321:522-525, Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536 e Richmann et al. (1988) Nature 332:323-327). Nesse caso, o processo de desimunização é específico para humanos.
Mais particularmente, as CDRs podem ser enxertadas em uma região variável de anticorpo humano com ou sem regiões constantes humanas.
O anticorpo não humano que fornece as CDRs é tipicamente denominado como o “doador” e o anticorpo humano que fornece o framework é tipicamente denominado como o “aceitador”. Regiões constantes não precisam estar presente, mas se estiverem, as mesmas precisam ser substancialmente idênticas a regiões constantes de imunoglobulina humana, isto é, pelo menos cerca de 85-90%, preferencialmente, cerca de 95% ou mais idêntica.
Portanto, todas as partes de um anticorpo humanizado, exceto possivelmente as CDRs, são substancialmente idênticas a partes correspondentes de sequências de imunoglobulina humana natural.
Desse modo, um “anticorpo humanizado” é um anticorpo que compreende uma cadeia leve humanizada e uma imunoglobulina de cadeia pesada humanizada.
Um anticorpo doador é dito como “humanizado”, pelo processo de “humanização”, devido ao fato de que se espera que o anticorpo humanizado resultante se ligue ao mesmo antígeno como o anticorpo doador que fornece as CDRs.
Referência no presente documento a “humanizado” inclui referência a um anticorpo desimunizado a um hospedeiro particular, nesse caso, um hospedeiro humano.
[00126] Será entendido que os anticorpos desimunizados podem ter substituições de aminoácidos conservativas adicionais que substancialmente não tem efeito na ligação de antígeno ou outras funções de imunoglobulina.
[00127] Métodos exemplificadores que podem ser empregados para produzir anticorpos desimunizados de acordo com a presente invenção são descritos, por exemplo, em (Richmann et al. (1988) supra, Chou et al. (Patente Nº U.S.
6.056.957), Queen et al. (Patente Nº U.S. 6.180.377), Morgan et al. (Patente Nº U.S. 6.180.377) e Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901).
[00128] Outra forma de anticorpo inclui um “novo antígeno receptor de imunoglobulina” (IgNAR) que é um isotipo de anticorpo encontrado somente em cartilaginosos em animais marinhos (tubarões e arraias), que tem evoluíram por centenas de milhões de anos para serem expressos de modo estável no ambiente de ureia potente do fluxo sanguíneo (Greenberg et al. (1995) Nature 374:168-173; Nuttall et al. (2001) Mol Immunol 38:313-326). A resposta de IgNAR é acionada por antígeno no tubarão, e bibliotecas moleculares tanto imunes quanto virgens de domínios variáveis de IgNAR foram construídos e triados com sucesso para reagentes de ligação específica de antígeno (Greenberg et al. (1995) supra; Nuttall et al. (2001) supra). IgNARs são bivalentes, mas antígeno alvo através de um domínio variável de imunoglobulina único (~14kDa) que exibe dois ciclos de região de determinação de complementaridade (CDR) fixado a números variados de domínios constantes (Nuttall et al. (2003)
Eur J Biochem 270:3543-3554; Roux et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:11804-11809). Em contraste, anticorpos de imunoglobulina tradicional (Ig) anticorpos têm um formato de domínio pesado variável (VH) + leve variável (VL) (~26kDa) e se liga a antígeno através de até seis CDRs (Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Padlan (1994) Mol Immunol 31:169- 217). O pequeno tamanho, e estabilidade termodinâmica de domínios variáveis de IgNAR (VNARs), oferece vantagens distintas sobre anticorpos convencionais. Além disso, o pequeno tamanho VNAR possibilita esse acesso de domínio de anticorpo comum a epítopos antigênicos crípticos através de ciclos de CDR3 incomumente longos e variáveis (Greenberg et al. 1995 supra; Ewert et al. (2002) Biochemistry 41:3628-2636; Nuttall et al. (2004) Proteins 55:187-197; Stanfield et al. (2004) Science 305:1770-1773; Streltsov et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:12444-12449; Streltsov et al (2005) Protein Sci 14:2901-2909). Domínios de IgNAR foram identificados que reconhecem uma variedade de antígenos alvo incluindo: a proteína de membrana apical 1 (AMA-1) de P. falciparum (Nuttall et al, 2004 supra); a Kgp protease de Porphyromonas gingivalis (Nuttall et al. (2002) FEBS Lett 516:80-86); toxina de cólera (Goldman et al, Anal Chem 78:8245- 8255, 2006); a proteína de extensão de membrana mitocondrial de Tom70 (Nuttall et al. (2003) supra), e lisozima (Streltsov et al. (2004) supra).
[00129] As IgNARs ou mais anticorpos convencionais podem ser usadas como agentes terapêuticos por si só ou usados para transportar moléculas citotóxicas às células cancerígenas. As mesmas também podem ser usadas em diagnóstico.
[00130] Reagentes de ligação precisos e sensíveis são o alicerce da indústria terapêutica e diagnóstica baseada em proteína. Dadas as altas taxas de câncer em todo o mundo, há uma necessidade urgente de tais reagentes que alvejam antígenos de câncer para uso em protocolos terapêuticos e diagnósticos. A identificação de uma porção extracelular de KRT14 e a função de KRT14 possibilita o desenvolvimento dessas aplicações terapêuticas e diagnósticas.
[00131] Em outra modalidade, o agente é uma vacina que compreende uma porção de peptídeo que compreende a porção extracelular de KRT14 suficiente para gerar uma resposta imune às células cancerígenas que transportam a porção extracelular de KRT14.
[00132] A vacina pode ser uma vacina de peptídeo ou um compósito ou agente conjugado que compreende a porção extracelular de KRT14 ou um análogo de KRT14 e/ou SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, a vacina compreende uma porção de peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:1 ou um homólogo funcional da mesma ou variante da mesma, incluindo uma sequência de peptídeos que tem pelo menos 80% de similaridade à SEQ ID NO:1 após alinhamento ideal e um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, diluentes ou excipientes. A presente invenção também possibilita uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo à porção extracelular de KRT14.
[00133] O termo “farmaceuticamente aceitável” se refere a formas fisiológica e farmaceuticamente aceitáveis de carreadores, diluentes ou excipientes.
[00134] A presente invenção também inclui composições farmacêuticas e formulações que incluem os compostos antisenso e senso para realizar regulação descendente de expressão de KRT14. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de várias maneiras dependendo da possibilidade de o tratamento local ou sistêmico ser desejado e da área a ser tratada.
A administração pode ser tópica (incluindo entrega vaginal ou retal), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmico e transdérmico), oral ou parenteral.
A administração parenteral inclui injeção ou infusão intravenosa, intraarterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou intracraniana, por exemplo, administração intratecal ou intraventricular.
Composições farmacêuticas e formulações para administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, aspersores, líquidos e pós.
Carreadores farmacêuticos convencionais, bases aquosas, pós ou oleosas, agentes espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis.
As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais conhecidas na indústria farmacêutica.
Tais técnicas incluem a etapa de associar os ingredientes ativos com o carreador (ou carreadores) farmacêutico ou excipiente (ou excipientes). De modo geral, as formulações são preparadas associando-se uniforme e intimamente os ingredientes ativos a carreadores líquidos ou carreadores sólidos divididos precisamente ou, os dois, em seguida, se for necessário, conformar o produto.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um agente anticâncer adicional, cujos exemplos ilustrativos serão conhecidos aos elementos versados na técnica e descritos em qualquer ponto no presente documento. Em uma modalidade, o agente anticâncer adicional é selecionado dentre o grupo que consiste em dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina e mitoxantrona, um agente à base de platina, um antimetabólito, células T iniciadas e citocinas. Em uma modalidade, o um antimetabólito é selecionado dentre o grupo que consiste em azaserina, D-cicloserina, ácido nicofenólico, trimetoprim, 5-fluorouracila, capecitabina, metotrexato, gemcitabina, citarabina (ara-C) e fludarabina.
[00135] Um ensaio rápido, eficiente e sensível é também fornecido para a identificação de câncer, incluindo um câncer ginecológico tal como câncer de ovário. O ensaio possibilita a detecção precoce de câncer e, em particular, câncer de ovário. Não obstante, a presente invenção não é limitada a somente a detecção precoce de câncer de ovário visto que o ensaio pode ser usado em qualquer estágio de um, por exemplo, câncer ginecológico ou seu tratamento ou qualquer complicação que aparece a partir do mesmo.
[00136] Referência a um “câncer” em relação a uma “afecção ginecológica” inclui câncer de ovário assim como um subtipo de câncer de ovário, tal como câncer de ovário mucinoso ou endometrial ou um estágio de câncer de ovário, tal como estágio I, II, III ou IV. Termos tais como “câncer de ovário”, “câncer de ovário epitelial” e uma “malignidade ovariana” podem ser usados de modo intercambiável no presente documento. A presente invenção é útil quando aplicada ao diagnóstico de mulheres sintomáticas, mas pode ser igualmente aplicada ao diagnóstico de mulheres assintomáticas e/ou mulheres com alto risco de desenvolver uma afecção ginecológica. A presente invenção abrange, no entanto, uma ampla faixa de cânceres em sujeitos masculinos e femininos.
[00137] [0128] A presente invenção se estende a um “ligante” ou “agente de ligação” e outros termos similares, se refere a qualquer composto, composição ou molécula com capacidade de especificamente ou substancialmente especificamente (ou seja, com reatividade cruzada limitada) que se ligam a um epítopo extracelular em KRT14. O “agente de ligação” geralmente tem uma especificidade única. Não obstante, agentes de ligação que têm múltiplas especificidades para dois ou mais epítopos são também contemplados no presente documento. Os agentes de ligação (ou ligantes) são tipicamente anticorpos, tais como anticorpos monoclonais, ou derivados ou análogos dos mesmos, mas também incluem, sem limitação: Fragmentos de Fv; fragmentos Fv (scFv) de cadeia única; fragmentos de Fab'; fragmentos de F(ab')2; anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpo; anticorpos camelizados e fragmentos de anticorpo; e versões multivalentes dos precedentes. Reagentes de ligação multivalentes também podem ser usados, conforme apropriado, incluindo, sem limitação: anticorpos monoespecíficos ou biespecíficos; tais como fragmentos de Fv estabilizados com dissulfeto, tandems de scFv [fragmentos de (scFv)2], diabodies, tribodies ou tetrabodies, que são tipicamente ligados de modo covalente ou de outro modo fragmentos de scFv estabilizados (isto é, ziper de leucina ou estabilizados por hélice). “Agentes de ligação” também incluem aptâmeros, conforme são descritos na técnica.
[00138] Outros exemplos não limitadores de fragmentos de ligação adequados de antígeno de anticorpos incluem: (i) fragmentos de Fd; (ii) fragmentos de dAb; e (iii) unidades de reconhecimento mínimo que consistem nos resíduos de aminoácidos que simulam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma CDR isolada, tal como um peptídeo CDR3), ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito. A presente revelação também se estende a outras moléculas manipuladas, tais como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de domínio único, anticorpos de domínio deletado, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados de CDR, anticorpos de um braço, diabodies, triabodies, tetrabodies, minibodies, nanobodies (por exemplo, nanobodies monovalentes, nanobodies bivalentes, etc.), produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs), e domínios de IgNAR variáveis de tubarão.
[00139] Em uma modalidade, o fragmento de anticorpo de ligação a antígeno compreende pelo menos um domínio variável de imunoglobulina. O domínio variável pode compreender uma sequência de aminoácidos de qualquer comprimento ou composição adequados e geralmente compreenderá pelo menos uma CDR que é adjacente a uma ou mais sequências de frameworks ou em quadro com as mesmas. Onde o fragmento de ligação a antígeno compreende um domínio VH e um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados um em relação ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL. Alternativamente, o fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.
[00140] Em algumas modalidades, o fragmento de anticorpo de ligação a antígeno pode compreender pelo menos um domínio variável ligado de modo covalente a pelo menos um domínio constante. Configurações não limitadoras de domínios variáveis e constantes que podem ser encontradas dentro de um fragmento de ligação a antígeno incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH- CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3, (vi) VH- CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2, (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL- CL.
Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplificadoras listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser tanto diretamente ligados entre si ou podem ser ligados por uma dobradiça total ou parcial ou região de ligante.
Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma molécula de polipeptídeo única.
Em algumas modalidades, o fragmento de ligação a antígeno, conforme descrito no presente documento, pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de quaisquer das configurações de domínio variável ou constante listadas acima em associação não covalente entre si e/ou com um ou mais domínios VH ou VL monoméricos (por exemplo, por ligação (ou ligações) de dissulfeto). Uma molécula de ligação multiespecífica a antígeno compreenderá tipicamente pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável tem capacidade de se ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno.
Qualquer formato de molécula de ligação multiespecífica a antígeno, incluindo formatos de molécula de ligação a antígeno biespecíficos, podem ser adaptados para uso no contexto de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente revelação com uso de técnicas de rotina disponíveis na arte.
[00141] O termo “região variável” ou “domínio variável” se refere ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina que é envolvida na ligação ao antígeno alvo. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de uma molécula de imunoglobulina nativa terá geralmente estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de framework conservadas e três regiões hipervariáveis (HVRs). Consultar, e.g., Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação a antígeno.
[00142] Para aplicações terapêuticas, pode ser desejável modificar o agente de ligação para compatibilidade com as espécies alvo; ou seja, a espécie a qual o agente de ligação deve ser administrado. Em uma modalidade, o agente de ligação é um agente de ligação humanizado.
[00143] Em algumas modalidades, as FRs dos agentes de ligação, incluindo os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, conforme descrito no presente documento, podem ser idênticos à FR das sequências de linha germinativa das espécies alvo (isto é, a espécie a qual os agentes de ligação serão administrados). Em algumas modalidades, a FR pode ser natural ou artificialmente modificada. Embora seja geralmente desejável que cada uma das sequências de FRs seja idêntica às sequências de FRs derivadas de uma ou mais moléculas de imunoglobulina das espécies alvo, incluindo para minimizar uma resposta imune que é elevada contra a molécula de ligação mediante administração a um sujeito das espécies alvo, em algumas modalidades, o agente de ligação pode compreender um ou mais resíduos de aminoácidos através de um ou mais de suas sequências de FRs que seriam estranhas em uma posição correspondente em uma ou mais FR das espécies alvo. Preferencialmente, onde o agente de ligação compreender um ou mais resíduos de aminoácidos através de um ou mais de suas sequências de FRs que seriam estranhas em uma posição correspondente nas espécies alvo, o fato de que resíduo de aminoácido "estranho" não (i) causará impacto adverso na especificidade de ligação dos agentes de ligação ao seu antígeno alvo (KRT14), e / ou (ii) causará uma resposta imune a ser elevada contra o agente de ligação quando administrada a um sujeito das espécies alvo.
[00144] Em uma modalidade revelada no presente documento, o agente (que incluem anticorpos que se ligam à porção extracelular de krt14 e fragmentos que se ligam a KRT14 dos mesmos, conforme descrito no presente documento) compreende um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), em que o VH compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VH CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, uma VH CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e uma VH CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8; e em que o VL compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VL CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9, uma VL CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 e uma VL CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11.
[00145] Em uma modalidade, a VH compreende:
[00146] (a) uma região de framework de VH 1 (FR1)
que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12;
[00147] (b) uma VH FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:13;
[00148] (c) uma VH FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:14 e
[00149] (d) uma VH FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:15;
[00150] e o VL compreende:
[00151] (e) uma VL FR1 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:16;
[00152] (f) uma VL FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:17;
[00153] (g) uma VL FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:18 e
[00154] (h) uma VL FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:19.
[00155] Em uma modalidade, a VH compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência à SEQ ID NO:3, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência à SEQ ID NO:5.
[00156] A presente revelação também se estende a um agente que se liga especificamente a uma porção extracelular de krt14 em células cancerígenas ou a um fragmento de ligação a krt14 do mesmo, sendo que o agente compreende um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), em que o VH compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VH CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, uma VH CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e uma VH CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8; e em que o VL compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VL CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9, uma VL CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 e uma VL CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11.
[00157] Em uma modalidade, a VH compreende:
[00158] (a) uma região de framework de VH 1 (FR1) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12;
[00159] (b) uma VH FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:13;
[00160] (c) uma VH FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:14 e
[00161] (d) uma VH FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:15;
[00162] e o VL compreende:
[00163] (e) uma VL FR1 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:16;
[00164] (f) uma VL FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:17;
[00165] (g) uma VL FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:18 e
[00166] (h) uma VL FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:19.
[00167] Em uma modalidade, a VH compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência à SEQ ID NO:3, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência à SEQ ID NO:5.
[00168] Os ligantes e agentes de ligação podem ser usados em ensaios para detectar a presença de células que transportam KRT14. Imunoensaios de ECLIA, ELISA e Luminex LabMAP são exemplos de ensaios adequados para detectar níveis dos biomarcadores. Em um exemplo, um primeiro reagente/anticorpo de ligação é fixado a uma superfície e um segundo reagente/anticorpo de ligação que compreende um grupo detectável se liga ao primeiro anticorpo. Exemplos de grupos detectáveis incluem, por exemplo, e sem limitação: fluorocromos, enzimas, epítopos para ligação a um segundo reagente de ligação (por exemplo, quando o segundo reagente/anticorpo de ligação é um anticorpo de camundongo, que é detectado por um anticorpo anticamundongo rotulado de modo fluorescente), por exemplo, um antígeno ou um membro de um par de ligação, tal como biotina. A superfície pode ser um superfície plana, tal como no caso de um arranjo do tipo grade típico (por exemplo, porém, sem limitação, placas de 96 poços e microarranjos planos) ou uma superfície não plana, assim como com tecnologias de arranjo de microesferas revestidas, em que cada “espécie” de microesfera é rotulada com, por exemplo, um fluorocroma (tal como a tecnologia Luminex descrita nas Patentes nº U.S. 6.599, 331.6, nº U.S. 592.822 e nº U.S.6.268, 222), ou tecnologia de ponto quântico (por exemplo, conforme descrito na Patente nº U.S. 6.306. 610). Tais ensaios também podem ser relacionados como sistemas de gerenciamento de informações laboratoriais (LIMS).
[00169] Conforme usado no presente documento, “imunoensaio” se refere a ensaios imunes, tipicamente, porém, não exclusivamente, ensaios em sanduíche, com capacidade de detectar e quantificar um biomarcador desejado, a saber, a porção extracelular de KRT14.
[00170] Métodos para diagnóstico de uma afecção ginecológica ou outro câncer determinando-se a presença de a porção extracelular de KRT14 e com uso do nível de porção extracelular como dados de segunda base de conhecimento em um algoritmo geralmente com primeira base de conhecimento de quantidades conhecidas de KRT14 em pacientes com uma doença conhecida. São também fornecidos métodos de detecção de câncer de ovário pré-clínico ou outro câncer que compreende determinar a presença e/ou velocidade de KRT14 em uma amostra do sujeito. Por “velocidade” é representada a mudança na concentração de KRT14 em uma amostra do paciente ao longo do tempo.
[00171] Conforme indicado acima, uma afecção ginecológica inclui câncer ou uma compilação do mesmo. O termo “câncer” conforme usado no presente documento inclui todos os cânceres, incluindo, porém, sem limitação, um “câncer ginecológico”. Em uma modalidade, um câncer ginecológico, que inclui, porém, sem limitação, metaplasia tubal, neoplasmas de fronteira serosa ovariana, adenocarcinomas serosos, neoplasmas mucinosos de baixo grau e tumores endometriais. Em uma modalidade específica, o câncer ginecológico é um neoplasma ovariano, que passa por diferenciação epitelial de Mullerian aberrante. Outras afecções ginecológicas contempladas no presente documento incluem distúrbios inflamatórios, tais como endometriose. Conforme indicado acima, a presente invenção se estende a uma ampla faixa de cânceres por sujeitos masculinos e femininos.
[00172] O termo “amostra” conforme usado no presente documento significa qualquer amostra que contém células cancerígenas em que é desejado detectar incluindo, porém, sem limitação, fluidos biológicos (incluindo sangue, plasma, soro, ascites), extratos de tecido, células recém coletadas, e lisatos de células que foram incubados em culturas celulares. Em uma modalidade particular, a amostra é tecido ginecológico, sangue, soro, plasma ou ascites.
[00173] Conforme indicado acima, o “sujeito” pode ser qualquer mamífero, geralmente humano, suspeito de ter ou que tem uma afecção ginecológica ou outro câncer. O sujeito pode ser denominado como um paciente e é um mamífero suspeito de ter ou que tem um câncer ou em risco de desenvolver o mesmo. O termo “afecção” também inclui complicações que parecem a partir do mesmo.
[00174] O termo “amostra de controle” inclui qualquer amostra que pode ser usada para estabelecer uma primeira base de conhecimento de dados de sujeitos com uma situação de doença conhecida.
[00175] O método do sujeito invenção pode ser usado no diagnóstico e estágio de um câncer, tal como um câncer ginecológico que inclui câncer de ovário. A presente invenção também pode ser usada para monitorar o progresso de uma condição e para monitorar a possibilidade de um tratamento particular ser eficaz ou não. Em particular, o método pode ser usado para confirmar a ausência ou melhoria dos sintomas da afecção, tal como acompanhar cirurgia, quimioterapia, imunoterapia, e/ou terapia de radiação. Os métodos podem ser adicionalmente usados para monitorar quimioterapia e reaparecimento de tecido aberrante.
[00176] Conforme indicado acima, anticorpos podem ser usados em quaisquer de vários imunoensaios que se baseiam na interação de ligação entre um determinante antigênico do biomarcador e os anticorpos. Exemplos de tais ensaios são radioimmunoensaio, imunoensaios de enzima (por exemplo, ECLIA, ELISA), imunofluorescência, imunoprecipitação, aglutinação de látex, hemaglutinação e testes histoquímicos. Os anticorpos podem ser usados para detectar e quantificar o nível do biomarcador em uma amostra de modo a determinar sua função no câncer e diagnosticar o câncer.
[00177] Em particular, os anticorpos da presente invenção também podem ser usados em análises imuno- histoquímicas, por exemplo, no nível celular e subcelular, para detectar um biomarcador, para localizar o mesmo às células e tecidos particulares, e às localizações subcelulares específicas, e para quantificar o nível de expressão. O medicamento, além de ser um anticorpo, pode ser qualquer reagente de afinidade que inclui, porém, sem limitação aptâmeros, monobodies, anticalinas, DARPins e nanobodies e similares.
[00178] Técnicas citoquímicas conhecidas na técnica para localizar antígenos com uso de microscopia de luz e elétron podem ser usadas para detectar células que transportam o domínio extracelular de KRT14. Em geral, um anticorpo da presente invenção pode ser rotulado com uma substância detectável e uma proteína de biomarcador pode ser localizada em tecidos e células baseadas mediante a presença da substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem, porém, sem limitação, o seguinte: radioisótopos (e.g., 3H, 14C 35S, 125I, 131I), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanida), rótulos luminescentes, tais como luminol; rótulos enzimáticos (por exemplo, peróxido de rábano, beta-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, acetilcholinesterase), grupos de biotinila (que podem ser detectados por avidina marcada por exemplo, estreptavidina que contêm um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou calorimétricos), epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de ziper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal; etiquetas de epítopo). Em uma modalidade, rótulos são fixados por meio de braços de espaçador de vários comprimentos para reduzir obstáculo estérico potencial. Anticorpos também podem ser acoplados às substâncias densas de elétron, tais como ferritina ou ouro coloidal, que são prontamente visualizados por microscopia de elétron.
[00179] O anticorpo ou amostra pode ser imobilizado em um carreador ou suporte sólido que tem capacidade de imobilizar células, anticorpos, etc. Por exemplo, o carreador ou suporte pode ser nitrocelulose, ou vidro, poliacrilamidas, gabros e magnetite. O material de suporte pode ter qualquer configuração possível incluindo esférica (por exemplo, microesfera), cilíndrica (por exemplo, superfície interior de um tubo de teste ou poço, ou a superfície externa de uma haste), ou achatada (por exemplo, folha, tira de teste) Métodos indiretos também podem ser empregadas nas quais a reação de antígeno-anticorpo primário é amplificada pela introdução de um segundo anticorpo, que tem especificidade para o anticorpo reativo contra proteína de biomarcador. A título de exemplo, se o anticorpo que tem especificidade contra o domínio extracelular de KRT14 é um anticorpo IgG de coelho, o segundo anticorpo pode ser gama- globulina anticoelho de cabra rotulada com uma substância detectável conforme descrito no presente documento.
[00180] Onde um rótulo radioativo for usado como uma substância detectável, o biomarcador de KRT14 pode ser localizado por radioautografia. Os resultados de radioautografia pode ser quantificado determinando-se a densidade de partículas nos radioautógrafos por vários métodos ópticos, ou contando-se os grãos.
[00181] Anticorpos rotulados contra KRT14 podem ser usados em localizar tecido tumoral em pacientes que passam por cirurgia, isto é, no imageamento. Tipicamente para aplicações in vivo, anticorpos são rotulados com rótulos radioativos (por exemplo, iodina-123, iodina-125, iodina-131, gálio-67, tecnécio-99, e índio-111). Preparações de anticorpos rotulados podem ser administradas a um paciente de modo intravenoso em um carreador apropriado em um tempo várias horas a quatro dias antes de o tecido ser imageado. Durante esse período, frações não ligadas são liberadas do paciente e os únicos anticorpos restantes são aqueles associados ao tecido tumoral. A presença do isotipo é detectada com uso de uma câmera gama adequada. O tecido rotulado pode ser correlacionado a marcadores conhecidos no corpo do paciente para apontar a localização do tumor para o cirurgião.
[00182] Consequentemente, em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para detectar câncer em um paciente que compreende:
[00183] (a) fornecer uma amostra do paciente;
[00184] (b) colocar a amostra em contato com um agente que se liga a um epítopo extracelular de KRT14 para determinar os níveis do mesmo e submeter os níveis a um algoritmo para fornecer um índice de probabilidade de o paciente ter um câncer e
[00185] (c) diagnosticar o risco de o paciente ter câncer com base no índice de probabilidade.
[00186] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para detectar as células cancerígenas KRT14- positivas circulatórias em um paciente, sendo que o método compreende:
[00187] (a) fornecer uma amostra de sangue do paciente;
[00188] (b) colocar a amostra de sangue em contato com um agente que se liga a um epítopo extracelular de KRT14 para determinar a presença de células cancerígenas KRT14- positivas na amostra.
[00189] Os métodos descritos no presente documento podem ser realizados utilizando-se kits de diagnóstico pré- empacotados que compreendem os reagentes necessários para executar quaisquer dos métodos da invenção. Por exemplo, os kits podem incluir pelo menos um anticorpo específico a uma porção extracelular de KRT14, que pode ser usado de modo conveniente, por exemplo, em ajustes clínicos, para realizar triagem e diagnosticar pacientes e para realizar triagem e identificar aqueles indivíduos que exibem uma pré-disposição para desenvolver câncer. O kit também inclui instruções detalhadas para realizar os métodos da presente invenção.
[00190] A presente invenção fornece adicionalmente um ensaio de triagem baseado em algoritmo para realizar triagem de amostras dos pacientes. Em geral, dados de entrada são coletados com base em níveis de KRT14 e submetido a um algoritmo para analisar a significância estatística de qualquer elevação ou redução em níveis cujas informações são então dados de saída. Software e hardware de computador para analisar dados de entrada são abrangidos pela presente invenção.
[00191] O ensaio da presente invenção permite a integração em arquitetura de patologia existente ou recém- desenvolvida ou sistemas de plataforma. Por exemplo, a presente invenção contempla um método de permitir que um usuário determine a situação de um sujeito em relação a um câncer, ou a um subtipo ou estágio do mesmo, sendo que o método compreende:
[00192] (a) receber dados na forma de presença da porção extracelular de KRT14 por meio de uma rede de comunicações;
[00193] (b) processar os dados do sujeito por meio de um algoritmo que fornece um valor de índice de doença;
[00194] (c) determinar a situação do sujeito de acordo com os resultados do valor de índice de doença em comparação com valores predeterminados e
[00195] (d) transferir uma indicação da situação do sujeito ao usuário por meio da rede de comunicações.
[00196] Em outra modalidade revelado no presente documento, é fornecido um método de monitoramento de um câncer em um paciente, sendo que o método compreende:
[00197] (a) fornecer uma amostra de sangue de um paciente em um primeiro ponto no tempo;
[00198] (b) colocar a amostra de (a) em contato com um agente que se liga a um epítopo extracelular de KRT14 para determinar o nível de células cancerígenas KRT14- positivas na amostra;
[00199] (c) fornecer uma amostra de sangue de um paciente em um segundo ponto no tempo, em que o primeiro ponto no tempo é diferente do segundo ponto no tempo;
[00200] (d) colocar a amostra em contato de (c) com um agente que se liga a um epítopo extracelular de KRT14 para determinar o nível de células cancerígenas KRT14- positivas na amostra e
[00201] (e) determinar se houve uma mudança no nível de células cancerígenas KRT14-positivas no paciente entre o primeiro e o segundo pontos no tempo;
[00202] em que uma mudança no nível de células cancerígenas KRT14-positivas no paciente entre o primeiro e o segundo pontos no tempo é indicativo de uma mudança na situação do câncer no paciente.
[00203] Tais métodos podem ser adequadamente usados para monitorar mudanças na situação ou estágio de câncer (por exemplo, em resposta à terapia) ou para detectar a recorrência (por exemplo, após recessão de tumor).
[00204] Em uma modalidade, o câncer é um câncer ginecológico. Em uma modalidade, o câncer ginecológico é câncer de ovário ou um estágio ou forma de câncer de ovário. Em outra modalidade, o câncer é selecionado dentre câncer de cérebro, bexiga, fígado, mama, pulmão, pâncreas, intestino, cólon, trato gastrointestinal, estômago, garganta, endometrial e colorretal.
[00205] Referência a um “algoritmo” ou “funções algorítmicas” conforme destacado acima inclui o desempenho de uma função de análise multivariada. Uma faixa de diferentes arquiteturas e plataformas pode ser implementada adicionalmente a aquelas descritas acima. Será verificado que qualquer forma de arquitetura adequada para implementar a presente invenção pode ser usada.
EXEMPLOS
[00206] Aspectos revelados no presente documento são adicionalmente descritas pelos exemplos não limitadores a seguir. Os materiais e métodos a seguir podem ser empregados.
[00207] Cultura Celular. As linhagens celulares OVCAR-4 (NIH-OVCAR4) e CaOV-3 #HTB-75 foram adquiridas da ATCC e NIH. Células OVCAR-4 foram mantidas em meio-1640 da Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Life Technologies, 21870092); células CaOV-3 foram mantidas em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) (Thermo Scientific, #11965118); SKOV3 células (ATCC® #HTB-77™) foram mantidas em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM)/F-12 da Ham (DMEM/F12) (Thermo Scientific, #11965118); COV362.4, Sigma Aldrich (Sigma #07071904) foram mantidas em meio Eagle de alto teor de glicose modificado da Dulbecco (DMEM-HG); BT-16, tumor teratoide/rabdoide atípico (CVCL_M156) e Adenocarcinoma de pulmão NCI-H1573 (NCI-H1573) foram ambos mantidos em Rosswel Park Memorial Institute (RPMI), MDA-MB-468; células de câncer de mama Triplo negativas (CVCL_0419) foram mantidas em DMEM, ANE CA (ATCC HTB-11) em meio EMEM essencial mínimo Eagle e SW 620 células (ATCC CCL- 227) foram mantidas em meio L-15 de Leibovitz. Todos os meios foram suplementados com 10% soro de bezerro fetal (FCS) (Thermo Fisher, #16000044) e 1% Penicilina-Estreptomicina (Thermo Scientific, #15240062). A linhagem celular de OC epitelial de camundongo ID8 (Dr. Kathy Roby, Centro Médico da Universidade do Kansas, Cidade do Kansas, KA, E.U.A) foi desenvolvida em Gibco DMEM (ThermoFisher Scientific) que contêm soro bovino fetal (FBS)a 4% com insulina-transferrina- selenite (ITS) a 1% e penicilina/estreptomicina (Ps) a 1%.. A linhagem celular mesotelial humana LP9 (Coriell Institute Cell Repository #AG07086) foi mantida em meio HamsF12/199 com 10% v/v FCS, penicilina-estreptomicina a 1% v/v, 10ng/ml de EGF e 0,4ug/ml de hidrocortisona. Todas as linhas foram mantidas em 37 °C com 5% v/v CO2 e contagens de viabilidade celular foram conduzidas antes do começo de todos os ensaios com uso do Contador Celular Automatizado FL II Countess (Marca Registrada). Células tumorais não aderentes são obtidas a partir das ascites malignas após o consentimento do paciente com uso de métodos de purificação estabelecidos (Latifi et al. (2012) PLoS ONE 7(10)) e mantidos sob baixas condições adesivas antes da análise por cultura em placas de baixa adesão em meio MCDB:F12 e 10% v/v FCS.
[00208] Interrupção alvejada a CRISPR KRT14 e superexpressão de KRT14. Silenciamento de gene mediado com CRISPR foi realizado como pelo protocolo do laboratório de Zhang (Cong et al. (2013) Science 339(6121):819-23), com uso de 3 cepas de guia por gene. Células foram transfectadas com cepas de guia (1-3), um controle não tratado ou a superexpressão de construto de KRT14 KRT14OE (Origene #RC214907) com uso de Lipofectamine (Marca Registrada) Reagente de Transfecção 2000 (Invitrogen, #11668019) em DMEM como pelo protocolo de fabricações. Após a transfecção e um período de recuperação de 12 horas, células foram subcultivadas em meio seletivo e mantidas sob pressão seletiva pela adição de 1μg/ml de Puromicina (Sigma-Aldrich, #P8833) ou Antibiótico Seletivo (Sulfato G418) Geneticin (Marca Registrada) (Life Technologies Austrália #10131-035). Células foram submetidas a diluição limitada em que o meio de seleção foi substituído a cada dois dias por aproximadamente duas semanas. Colônias individuais foram expandidas e o knockdown do gene alvo medido por análises de Western Blot e verificadas por sequênciamento de Sanger.
[00209] Arranjos de Tecido Humano e imuno- histoquímica. imuno-histoquímica foi realizada em seções de microarranjo de tecido (TMA) adquiridas junto à USBIOMAX (#ov2085, #ov20811) ou geralmente internamente (tumor e trompa de falópio) conforme anteriormente descrito [Bilandzic et al. (2014) Cancer Lett 354(1):107-114; Rainczuk et al. (2013) J Proteome Res; Salamonsen et al. (2013) Fertil Steril 99(4):1086-92] (Dados Suplementares 6 e 7). Para recuperação de antígeno, seções foram incubadas por 10 minutos em 50 mM de glicina (pH 3,5) em 90 °C. Seções foram incubadas de um dia para o outro em 4 °C com anticorpo Rb-KRT14 (1:100, Sigma,
SAB4501657) e AN-17 de mAb (1:500) em 0,1% p/v de BSA/PBS. Etapas subsequentes foram realizadas em temperatura ambiente, com lavagens de PBS entre incubações. Seções foram incubadas com: Conjugado de peroxidase IgG anticoelho cabra (1:1000, Dako, Glostrup, Dinamarca; item de catálogo PO448), Anricorpo IgG Anti-Cabra Coelho Biotinilado (1:1000, Vector Laboratories Nº De Cat.: BA-5000) ou Anticorpo IgG anti-Camundongo de Coelho Biotininilado (1:1000, Vector Laboratories Nº. De Cat.: BA- 9200) por 1 hora, seguido por um kit Vectastain Elite ABC de acordo com as instruções do fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, Califórnia). A ligação de anticorpo foi detectada como um precipitado marrom após o desenvolvimento com 3,3′- diaminobenzidina tetracloridrato, e hematoxilina Harris foi usada como contracoloração. As seções foram montadas sob lamelas de vidro em Depex (BDH Laboratory Supplies, Poole, Reino Unido). Imunocoloração positiva foi analisada em relação a seções paralelas expostas a um controle de isotipo (IgG). Imunocoloração em tumor e tecido de estroma foi analisada com uso de Aperio ImageScope (v 12.3.3) conforme descrito (Rainczuk et al. (2013) supra).
[00210] Análises de Western Blot. SDS-PAGE e processo de western blot foram realizados conforme anteriormente descrito em Bilandzic et al. (2013) Mol Endocrinol, 2013. 27(3):466-79). Blots foram sondados com uso de anticorpos contra KRT14 (1:1000, SAB4501657), AN-17 de mAb e β-actina (1:20,000; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Austrália). Anticorpos secundários conjugados com HRP anticamundongo de cabra, anticoelho e anticabra de burro (1:50,000; Merck Millipore, Kilsyth, Austrália) foram usados Bilandzic et al. (2013) Mol Endocrinol, 2013. 27(3):466-79). Bandas de proteína foram detectadas com uso de substrato de manchamento Clarity Western ECL (Biorad #1705061) e visualizada com uso de um ChemiDoc (Marca Registrada) MP System (Bio-Rad, #1708280).
[00211] Análise Celular em Tempo Real com xCELLigence (RTCA). Análises celulares em tempo real (RTCA) foram conduzidas com uso de um instrumento de 96 poços xCELLigence RTCA SP (ACEA Biosciences). Linhagens celulares foram sincronizadas em fase Go por incubação de um dia para o outro em meios sem soro antes do começo. Para ensaios de proliferação, células foram semeadas em 0,5 × 103 células/0.14 ml/ por poço (conforme destacado no texto experimental), e leituras de impedância realizadas a cada 5 minutos por 8 horas (de modo a monitorar a adesão celular), e subsequentemente a cada 15 minutos por 24 horas (para monitorar proliferação celular). Para ensaios de invasão, a câmara superior de uma placa de CIM-16 poço foi revestida com matriz de Matrigel (1:10 em SFM; BD Biosciences, San Jose, CA). Células foram semeadas na câmara superior (conforme acima), com meios FBS +/- a 10% v/v adicionados à câmara inferior. Todos os ensaios foram realizados em duplicata ou triplicata, com pelo menos três experimentos independentes.
[00212] Modelo microambiental Peritoneal. Para estabelecer um modelo do microambiente peritoneal, poços de placa CIM RTA de duas câmaras foram preparadas revestindo-se a câmara superior com Matrigel (1:10 em SFM; BD Biosciences) e então 7 × 104 células LP9 células/poço foram adicionadas e monitoradas até que uma monocamada confluente fosse formada (Domcke et al. (2013) Nat Commun 4:2126). Esferoides (obtidos a partir de ascites frescos de pacientes; 10 esferas/poço) foram semeados em SFM na câmara superior, e meios a ±10% v/v
FBS adicionados à câmara inferior. Leituras em tempo real foram usadas para determinar o tempo ideal(s) para uso como pontos de coleta para análise de imageamento MALDI, com todas as amostras preparadas em poços em duplicata ou triplicata por experimento. Como um controle adicional, foram também realizados ensaios de invasão de ponto final concorrente em paralelo com uso de câmaras Boyden modificadas. Nesse caso, células LP9 mesoteliais foram rotuladas com uso de Cell Trace (Marca Registrada) CFSE antes da inoculação com esferoides de câncer de ovário. Invasão mesotelial foi analisada de acordo com a retração de células mesoteliais rotuladas com CSFE embaixo dos esferoides, com uso de um Imageador de Múltiplos modos Cytation (Marca Registrada) 3 (BioTek Instruments, Winooski E.U.A).
[00213] Preparação de amostras para MALDI – IMS. Esferoide – interfaces mesoteliais foram cocultivadas em lamelas selecionáveis, e encapsuladas com agar em pontos de tempo determinados correspondendo a pre-, durante- e pós- invasão (conforme medido por ensaio RTCA). Amostras foram seccionadas em 5μm e a interface invasiva foi localizada por coloração de H&E em seções periódicas. Uma vez identificadas, duas seções não coloradas através da interface foram colocadas em um deslizador de óxido de índio-estanho (ITO) para processamento de MALDI (Bruker Daltonik, GmbH).
[00214] MALDI IMS. Peptídeos trípticos na interface mesotelial de esferoide de câncer de ovário foram identificados com uso do fluxo de trabalho de ImageID (Bruker). Tripsina foi aplicada a seções de tecido em série por nebulização com uso de um dispositivo de aspersão ImagePrep (Bruker). Amostras foram digeridas em uma câmara umidificada por 90 minutos, então peptídeos foram extraídos e purificados com uso de um ponta de pipeta de C18. Análise de LC-MALDI foi realizada com uso de um ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF (Bruker) e um sistema Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo) conforme descrito (Rainczuk et al. (2014) Int J Cancer 134(3):530-41). A aquisição de imageamento de MALDI de uma seção em série digerida subsequente foi então realizada com uso de flexImaging
4.1 (Bruker) conforme anteriormente descrito (Rainczuk et al. (2014) supra). LC-MALDI dados e dados de imageamento MALDI foram comparados e filtrados com uso de software ImageID (Bruker), e picos de massa compatíveis entre dados de imageamento e análise de LC-MALDI. Tolerância de massa para compatibilidade de pico foi automaticamente calculada pelo software ImageID.
[00215] Sobreposição de metilcelulose e formação de esfera. Células de câncer de ovário foram desassociadas por tripsinização e ressuspensa em meio de cultura de célula completa (viabilidade mínima de 98% conforme determinado pelo contador de célula countess). 2.500 células por esfera foram sobrepostas em 0,25% p/v por metilcelulose (Sigma Aldrich, Castle Hill, Austrália) em meio livre de soro, e semeadas em um poço único de uma Placa de Cultura de Suspensão com fundo em U da CELLSTAR (Registrada) de 96 poços (Greiner Bio One, Interpath Services PTY, Vic, Austrália). A agregação de esferoide e formação para cada linhagem celular foi observada e imageada em intervalos regulares com uso de um microscópio de luz. Esferas formadas foram coletadas com uso de uma ponta de furo amplo e centrifugação.
[00216] Ensaio de deslocamento mesotelial. A linhagem celular mesotelial humana LP9 foi semeada conforme acima e incubada em 37 °C até que uma monocamada confluente fosse formada. Esferas de câncer de ovário (conforme acima) foram coletadas, e 16 esferas foram semeadas em poços que contêm a monocamada mesotelial confluente. Deslocamento mesotelial e resultado foram imageados em intervalos regulares com uso de microscopia por contraste de fase.
[00217] Ensaio de reparo de ferida In vitro. Células de câncer de ovário (ou outras linhagens celulares cancerígenas - BT16, NCI-H1573, AN3CA, SW620 e MDA-MB-468) foram cultivadas em meio completo à confluência em uma placa de 12 poços, então desprovidas de soro de um dia para o outro para sincronizar em G0. No dia seguinte, o meio de cultura celular foi removido, e monocamadas celulares foram lesionadas por raspagem com uma ponta de pipeta fixada para sucção. Células não aderentes foram removidas por lavagens delicadas com PBS, e o meio de crescimento completo com ou sem AN-17 de mAb (1 µg/ml) ou anticorpo policlonal KRT14 comercial (1 µg/ml) foi substituído. A área de ferida foi imageada sob um microscópio de fase (Leica) em intervalos regulares que variam de 0–72 h. O fechamento de ferida foi medido em séries de imagens com uso de Software de Pesquisa AnalySIS LS (Olympus) para determinar a área da ferida em cada dia. Experimentos foram repetidos em triplicata com pelo menos seis áreas de ferida observadas por condição de crescimento.
[00218] Ensaio de Resultado de Matrigel e Colágeno I: Coloração e Imageamento. Protocolo foi adotado a partir de Nguyen-Ngoc et al. (2012) Proc Natl Acad Sci U S A. 109(39):E2595-604. Brevemente, esferoides de câncer de ovário foram coletados para render uma suspensão de 6 esferas por matriz. Esferas foram incorporadas tanto em Matrigel 3D
(354230; BD Biosciences) como em colágeno I de cauda de rato (354236; BD Biosciences). Culturas foram definidas em 8 poço em deslizadores de vidro de cobertura (94.6190.802, Starstedt) como por (Nguyen-Ngoc et al. (2012) supra. Para esferas de coloração de anticorpo cultivadas tanto em matrigel ou colágeno I foram fixadas com paraformaldeído 4% p/v por 30 minutos, enxaguado duas vezes PBS por 10 minutos, permeabilizado com Triton X-100 a 0,5% v/v em PBS por 20 minutos, e enxaguado duas vezes em PBS por 10 minutos e bloqueado em FBS a 10% v/v em PBS por 2 horas em temperatura ambiente então incubadas com anticorpo primário (1:1000, anticorpo Anti-N Cadherina [5D5] ab98952 AbCam e 1:500, KRT14) de um dia para o outro a 4 °C. No dia seguinte, as amostras foram lavadas três vezes com PBS e incubadas com anticorpos secundários: 1:2000, Alexa 467 de IgG anti-Coelho de Cabra, ab150083 e 1:2000 Alexa 488 de IgG Anti-camundongo de Cabra, ab150117) por 3 horas em temperatura ambiente então enxaguadas três vezes em PBS por 10 min. Amostras foram imageadas com uso de um Imageador de Múltiplos Modos Cytation (Marca Registrada) (BioTek Instruments, Winooski, E.U.A) com software Gen5 Image + ou microscópio Nikon C1 Confocal (Monash Micro Imaging Facility, Monash).
[00219] PCR em tempo real. RNA total foi extraído de tumores de ovário serosos de alto grau primários (n=3) e o ovário normal inteiro (n=3) com uso do sistema Tissue Lyser LT com microesferas de aço inoxidável de 5 mm e o Mini Kit RNeasy (Qiagen). RNA total foi extraído de linhagens celulares de câncer de ovário OVCAR4 e CaOV3, desenvolvidas como monocamadas ou esferoides (KRT14KO e linhagens de tipo selvagem); câncer de ovário derivado de ascites (n=3) ou esferoides de fibroma benigno (n=2); e a camada celular peritoneal alvo LP-9 com uso do Mini Kit Rneasy (Qiagen) como por protocolo de fabricações. Iniciadores de oligonucleotídeo senso e antisenso a KRT14, HNRN, FNDC3B, 18S, CDCA8 foram projetados contra sequências humanas publicadas e verificadas conforme anteriormente descrito (Bilandzic et al. (2009) Mol Endocrinol, 23(4):539- 48). cDNA foi sintetizado com uso de transcriptase reversa Superscript III (Life Technologies, Grand Island, NY). Amostras de PCR em tempo real foram preparadas a um volume final de 10μl com uso da mistura Applied Biosystems ABI SYBR (Scoresby, Victoria, Austrália). PCR em tempo real quantitativo foi concluído conforme anteriormente descrito (Bilandzic et al. (2009) supra) com uso da máquina em tempo real Applied Biosystems ABI 7900 HT Fast com todas as reações realizadas em triplicata. Rendimentos foram convertidos em fentogramas com base na curva padrão para cada produto de PCR, e os níveis de mRNA resultantes foram normalizados ao nível de 18S mRNA por amostra.
[00220] Análises Estatísticas. Análises Estatísticas foram conduzidas com uso de GraphPad Prism (Versão 6; Software GraphPad Inc., San Diego, CA). Para dados derivados de ensaios celulares, meios foram comparados com uso de ANOVA unidirecional ou bidirecional com testes post hoc de Bonferroni, Dunnett, ou Tukey, conforme indicado. Para determinar a possibilidade de a expressão de mRNA ter divergido significativamente entre amostras, um teste Mann-Whitney-U ou teste t não pareado foi realizado. Meios foram considerados significativamente diferentes se p<0,05. Todos os experimentos foram independentemente repetidos pelo menos três vezes.
[00221] Curvas Kaplan-Meier. A ferramenta de plotagem online Kaplan-Meier (http://kmplot.com/ analysis/)
foi usada para gerar curvas de sobrevivência com uso de dados de mRNA de pacientes com câncer de ovário serosos de 15 conjuntos de dados de câncer de ovário público em que os melhores valores de corte foram autosselecionados pela ferramenta de plotagem, e classificação de log, valor p e razão de perigo (e 95% de intervalos de confiabilidade) foram calculados (Lanczky et al. (2016) Breast Cancer Res Treat. 3 (160):439-446).
EXEMPLO 1
ADESÃO E PROLIFERAÇÃO NÃO PREVEEM A CAPACIDADE INVASIVA DE CÉLULAS
[00222] Células de câncer de ovário metastáticos interagem com a monocamada mesotelial que cobre a cavidade peritoneal e órgãos, invadindo e se fixando à matriz subjacente para estabelecer nódulos secundários (Kenny et al. (20017) Int J Cancer 121(7):1463-72; Burleson et al. (2006) J Transl Med 4:6; Sodek et al. (2012) Cancer Metastasis Rev 31(1-2):397- 414). Com uso de células tumorais derivadas de ascites primárias, o deslocamento mesotelial foi analisado com a emergência de filopodia invasiva de esferoides in vitro por um quadro de tempo estendido. No começo do ensaio, esferoides de amostras benignas e malignas foram de tamanho similar e não exibiram diferenças morfológicas aparentes. O resultado de filopodia extensiva e liberação da camada mesotelial subjacente ocorreu dentro de 24 horas para todas as amostras malignas; por contraste, esferoides benignos não exibiram nenhuma evidência visível de resultado ou invasão. A falta de invasão não foi devido à adesão fracassada ou proliferação celular reduzida; de fato, células benignas exibiram aderência comparativamente elevada às placas de cultura não revestidas e revestidas com fibronectina e alcançadas um índice proliferativo maior do que as amostras de células malignas em ensaios de RTCA. Esses dados demonstram que somente células malignas exibiram capacidade invasiva; e que o potencial invasivo não pode ser previsto a partir da capacidade adesiva ou proliferativa de células in vitro.
EXEMPLO 2
PERFILAÇÃO PROTEÔMICA IDENTIFICA PROTEÍNSAS EXCLUSIVAS À INTERFACE DE INVASÃO
[00223] Nenhum estudo anterior examinou proteínas diretamente na interface entre células cancerígenas ativamente invasoras e o mesotélio. Para analisar a abundância e localização de proteína relacionada à invasão, coculturas esferoidais/mesoteliais foram coletadas após a fixação ao mesotélio, mas antes do início da invasão (conforme determinado por ensaio de RTCA). Ensaios de câmara Boyden de ponto final paralelo foram usados para confirmar essa fixação mesotelial, mas nenhuma invasão ocorreu em amostras usadas para análises de MALDI IMS.
[00224] Culturas de interface de esferoide celular foram incorporadas em agarose, seccionadas e localizadas por IHC (Figura 1A); seções em série foram então analisadas por IMS para identificar proteínas localizadas na interface de invasão. Análises também incluíram esferoides derivados de ascites de um paciente com fibroma benigno (não mostrado), para controle para variância heterotípica entre amostras. MALDI IMS e subsequente LC-MALDI-MS/MS identificou 26 proteínas, exclusivamente presentes em coculturas que contêm esferoides malignos, mas não benignos, na interface de esferoide/mesotelial. Dentre esses, várias foram as proteínas anteriormente associadas a câncer de ovário (por exemplo, HSP90, AMH e OSM) [Vesci et al. (2014) Int J Oncol 45(4):1421- 9; Liu et al. (2013) Clin Cancer Res 19(18):5053-67; Kim et al. (2014) Obstet Gynecol Sci.57(5):343-57; Richards (2013) ISRN Inflammation 2013: 23], validando a abordagem e sugerindo que os mesmos podem desempenhar funções importantes durante os estágios precoces de invasão. Análises foram adicionalmente restritos a: (i) incluir somente aquelas proteínas identificadas em cada amostra de câncer de ovário seroso de alto grau (HGSC) maligno; e (ii) excluir proteínas que foram também identificados na monocamada de célula mesotelial. Quatro proteínas (KRT14, HRNR, CDCA8 e FNDC3B) foram identificadas como exclusivas a todas as células de HGSC de paciente no câncer – interface mesotelial seguindo essa abordagem de alta severidade. Imunocoloração em TMAs e RT-PCR em tecido congelado fresco foi também usado para confirmar a expressão candidata e localização em tecido tumoral independente em comparação a tecido ovariano histologicamente normal. EXEMPLO 3 KRT14 NA INTERFACE INVASIVA É NECESSÁRIA PARA
INVASÃO DE CÉLULA DE CÂNCER DE OVÁRIO
[00225] A abundância de HRNR, KRT14, CDCA8 e FNDC3B foi examinada em múltiplas linhagens celulares HGSC (OVCAR3, OVCAR4 e CaOV3) (Domcke et al. (2013) supra) por Western blot. Em acordo com a perfilação proteômica, HRNR, KRT14 e CDCA8 foram detectados em lisados de célula cancerígena, mas não nos controles de células mesoteliais.
FNDC3B foi detectado em células mesoteliais LP9, e foi excluído de análises adicionais.
KRT14, CDCA8 e HRNR foram então submetidos a knockout (linhagens celulares de CaOV3 e OVCAR4) com uso de CRISPR, com sua perda específica confirmada em populações clonais por sequenciamento de PCR e Western blot.
Os efeitos de perda de KRT14, CDCA8 ou HRNR funcional em proliferação celular e invasão foram testadas por RTCA.
Em comparação a controles tanto não tratados como não alvejados, células que carecem de HRNR ou CDCA8 mostraram proliferação significativamente reduzida (não mostrada); por contraste, a perda de KRT14 não afetou a proliferação (Figura 2), sugerindo que a mesma não foi necessária para viabilidade ou crescimento de célula tumoral.
Tanto células com knockout de CDCA8 quanto células com knockout de HRNR também reteve competência de invasão; células com knockout de CDCA8 exibiram cinética de invasão similar a células não tratadas ou não alvejadas, enquanto células com knockout de HRNR exibiram um atraso no início da invasão.
No entanto, células que carecem de KRT14 funcional exibiram uma vida completa de capacidade invasiva (Figura 2A) sem invasão observada após 30h (ou por períodos estendidos de até 7 dias). A perda mediada por KRT14 de competência de invasão foi confirmada em ensaios de cicatrização de ferida em 2D (Figura 2B), em que células com knockout de KRT14 (KRT14KO) falharam em reparar uma monocamada lesionada após 48 horas.
Estudos adicionais se focaram desse modo em KRT14 como um gene- chave que controla a capacidade invasiva de células malignas de câncer de ovário.
EXEMPLO 4 MODELO MICROAMBIENTAL PERITONEAL.
[00226] Com uso de um modelo de microambiente peritoneal, KRT14 é detectado expresso nos estágios mais precoces de metástase na “borda dianteira” de células de câncer de ovário invasivas. Essas células são definidas como “células condutoras”. Nesse modelo, esferoides de câncer de ovário são sobrepostos em uma monocamada mesotelial, estabelecidos em uma matriz de matrigel em uma placa de RTCA de CIM-16. A fixação e invasão de esferoide através da monocamada mesotelial/matriz são monitoradas em tempo real com uso de um instrumento xCELLigence, que fornece uma captura instantânea dinâmica de comportamento de célula invasiva.
[00227] Esferoides de pacientes com doença tanto benigna (fibroma ovariano) como maligna (HGSC) foram isolados de fluido de ascites e analisados para capacidade invasiva. Células de HGSC malignas invadiram rapidamente através da monocamada mesotelial, com todas as amostras demonstrando invasão ativa dentro de 4h após a adição. Por contraste, esferoides obtidos de um paciente com fibroma benigno falharam em romper a monocamada mesotelial. Desse modo, o início de invasão de célula cancerígena ocorreu rapidamente mediante contato com uma monocamada mesotelial in vitro, sugerindo um quadro de tempo para a análise dos eventos precoces envolvidos na invasão. EXEMPLO 5
ENSAIO DE INVASÃO IN VITRO EM TEMPO REAL
[00228] Com uso de um ensaio de invasão in vitro em tempo real (Bilandzic e Stenvers (2014) J Vis Exp 87) para medir invasão celular de câncer de ovário através de uma monocamada mesotelial, foi demonstrado que a ablação genética de KRT14(K14KO) anulou completamente a capacidade invasiva de múltiplas linhagens de câncer de ovário (CVAR4 e CaOV3 (Figura 2), assim como células de câncer de ovário primárias (n=5) recuperadas a partir de fluido de ascites (dados não mostrados). A perda de expressão de KRT14 não teve efeito na viabilidade celular e capacidade proliferativa, consistente com outros estudos (Papafoliou et al. (2016) supra; Rock et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106(31):12771-12775). Células de câncer de ovário KRT14KO também não tiveram capacidade de reparar uma monocamada de célula danificada em ensaios de cicatrização de ferida, demonstrando uma perda de competência de migração (Figura 2B). Foi também observado que células de câncer de ovário KRT14KO, cultivadas como esferoides multicelulares, exibiram ligação reduzida a uma monocamada mesotelial e falharam em iniciar a liberação mesotelial (não mostrada), uma necessidade-chave para invasão de câncer de ovário epitelial (EOC) (Iwanicki et al. (2011) Cancer Discov 1(2):144-157). Estudos In vivo com uso de um modelo de camundongo com câncer de ovário singeneico (Roby et al. (2000) Carcinogenesis 21(4):585-591) demonstrou que células de câncer de ovário KRT14KO implantadas de modo intrabursal em camundongos falharam em estabelecer tumores (Figura 3); e camundongos implantados com KRT14KO células não desenvolveram distensão abdominal ou quaisquer outros sintomas. EXEMPLO 6 CÉLULAS MIGRATÓRIAS EXIBEM EXPRESSÃO DE KRT14
AUMENTADA
[00229] A expressão de mRNA de KRT14 foi medida em células migratórias de espécimes clínicos que incluem: (i) a tecido tumoral primária; (ii) células de HGSC derivadas de ascites; e (iii) células benignas; (iv) ovário histologicamente normal; e (v) a camada celular peritoneal alvo LP9 por si só (n=3 por grupo). Todas as células malignas expressaram KRT14 no começo do ensaio, sem expressão detectada em fibroma benigno, ovário normal ou células mesoteliais LP9. Consistentes com linhagens celulares, as células migratórias foram detectadas somente em amostras malignas (isto é, tecido tumoral ou ascites derivados); células isoladas de ascites benignos, controles normais ou células LP9 por si só falharam em invadir. A expressão de KRT14 foi significativamente enriquecida em células invasivas que migraram para a câmara inferior em comparação às amostras pré-migratórias nas amostras de tumor primário, com a população de células de câncer de ovário derivadas de ascites que exibe os maiores níveis de mRNA de KRT14. Em conjunto, os dados indicam que, embora KRT14 não tenha efeito na viabilidade celular ou proliferação, é especificamente necessário manter o potencial invasivo do subconjunto de células cancerígenas migratórias in vitro; e o mesmo é significativamente enriquecido de células ativamente migratórias. EXEMPLO 7 KRT14 É RESTRITA A UMA SUBPOPULAÇÃO DE CÉLULAS HGSC
QUE INFLUENCIAM A REUNIÃO DE ESFEROIDES E ADESÃO AO MESOTÉLIO
[00230] A abundância de KRT14 foi determinada e sua localização em células de câncer de ovário (derivados de ascites tanto imortalizados quanto primários) por imunocoloração. Na cultura de monocamada, KRT14 foi restrito a algumas células isoladas, embora esferoides cultivados sob condições de baixa adesão tivessem mostrado imunocoloração de KRT14 exclusivamente localizada à rebordo de esferoide externo. A ausência de coloração de KRT14 interna não se deu devido à oclusão de anticorpos do esferoide, visto que um anticorpo anti-N-caderina penetrou de modo eficaz para colorar o esferoide inteiro. Foi analisada a possibilidade de a expressão de KRT14 ter sido necessária para formação de esferoide in vitro examinando-se KRT14KO e a superexpressão de linhagens de KRT14 (KRT14OE). As células OVCAR4 de tipo selvagem, e células transfectadas com controle de CRISPR não alvejado, formaram esferoides após 12 horas em cultura de baixa adesão; por contraste, células com knockout de KRT14 permaneceram amplamente dispersas após 12 horas. No entanto, a incubação estendida (48 horas) resultou na formação de esferoides que eram de um tamanho e morfologia comparáveis ao controle. Em contrapartida, linhagens de KRT14OE rapidamente formaram esferas densas e compactas e demonstraram resultado visível da esfera original evidente seguindo um período de cultura de 12 horas. Em comparação a controles não tratados, esferoides de KRT14KO reduziram significativamente a capacidade de aderir a uma monocamada mesotelial in vitro. EXEMPLO 8 CÉLULAS KRT14+ CAUSAM A FORMAÇÃO DE INVADOPODIA E
LIBERAÇÃO MESOTELIAL
[00231] Quando inoculada em uma monocamada mesotelial, esferoides de HGSC do tipo selvagem exibiram resultado, liberação mesotelial e deposição extensiva e migração dentro de 24 horas. Células que superexpressam K14 rapidamente dispersaram e deslocaram a camada mesotelial; por contraste, células KRT14KO falharam em romper a monocamada mesotelial. Para examinar a possibilidade de invasão afetada por tipo de matriz, esferoides (tanto linhagens celulares quanto células HGSC derivadas de ascites) foram incorporadas em matrizes tanto de Matrigel como de Colágeno-I e monitoradas para resultado de invadopodia ao longo do tempo. Invadopodia de KRT14+ surgiu de esferoides de tipo selvagem após 12 horas em matriz de colágeno I, mas exigiu 48-72 horas (dependente do tipo de célula) antes de se tornar evidente em Matrigel. A imunocoloração mostrou que as células de KRT14+ foram especificamente localizadas na invadopodia, com células de núcleo de esferoide não invasor mantendo um fenótipo de KRT14. Isso foi confirmado em ensaios de arranhamento de monocamada, em que células de KRT14+ foram localizadas especificamente nas áreas de fechamento de ferida. Consistente com sua falta de capacidade invasiva, células de KRT14KO falhou em formar invadopodia visível em qualquer matriz. Em conjunto, os dados sugerem que a expressão de KRT14 é um recurso de células ativamente invasoras, e que sua perda impede significativamente a capacidade de esferoides de deslocar o mesotélio e disseminar durante o resultado de tumor. EXEMPLO 9 KRT14 É ASSOCIADa A ESTÁGIO DE TUMOR E PREVÊ
NEGATIVAMENTE A SOBREVIVÊNCIA LIVRE DE PROGRESSO PARA PACIENTES COM CÂNCER DE OVÁRIO
[00232] Para estabelecer a relevância clínica de expressão de KRT14, microarranjos de tecido (n=292) que compreendem múltiplos subtipos histológicos, graus e estágios de cânceres de ovário, assim como seções de ovário normal e trompa de falópio foram colorados para abundância e localização de KRT14. A expressão de KRT14 foi geralmente não detectada em ovário normal (5%, 1/20) ou tecido de trompa de falópio (0%, 0/8), mas foi universalmente expressa por todos os subtipos de câncer de ovário examinados. A coloração foi localizada ao epitélio de tumor, com pouca evidência de KRT14 em tecido de estroma. Em particular, KRT14 foi detectada em 100% de tecidos de HGSC, e foi significativamente elevada em comparação a ovário normal (p=0.0362, teste t não pareado com Tukeys post Hoc).
[00233] Associações potenciais entre a expressão de KRT14 e prognóstico de paciente foram então questionadas em 15 conjuntos de dados de câncer de ovário publicamente disponíveis (http://www.cbioportal.org/) [Lanczky et al. (2016) supra]. A alta expressão de KRT14 foi associada a sobrevivência livre de progresso reduzida (PFS) (HR 1,17; 95% CI 1,03–1,33 P < 0,015), particularmente para pacientes diagnosticados com doença de estágio precoce (Estágios I-II) (HR 1,96; 95% CI 1,08–3,56 P < 0,025). A alta expressão de KRT14 foi também associada a PFS reduzido após a quimioterapia à base de platina ou taxol (HR 1,27; 95% CI 1,07–1,51 P < 0,006), e foi um previsor negativo de PFS após debulk ideal (HR 1,24; 95% CI 1,03–1,5 P < 0,026). Consequentemente, pacientes com uma deleção superficial de KRT14 foram mais sensíveis à quimioterapia e exibiram resposta aprimorada à terapia primária. Desse modo, a expressão de KRT14 é um previsor independente de prognóstico para pacientes com cânceres de ovário serosos de alto grau. EXEMPLO 10
IMPLANTAÇÃO EM CAMUNDONGOS
[00234] Em camundongos implantados com células KRT14KO, nenhum depósito de tumor, ou mesmo células tumorais fluorescentes, foram detectáveis em autópsia sugerindo que não somente os tumores falharam em implantar, mas foram subsequentemente liberados após a cirurgia (Figura 3). Com uso de citometria de fluxo e coloração imunocitoquímica de células intactas, foi observado que a terminação N de KRT14 é exposta na superfície celular (Figura 4). Consistente com outros estudos (Papafotiou et al. (2016) supra; Rock et al. (2009) supra), células de KRT14+ representou somente uma população de células tumorais (Figura 4A). Com uso de anticorpos policlonais tanto contra terminações N como contra terminações C de KRT14, foi confirmado que anticorpos contra a terminação N poderiam impedir a invasão in vitro, simulando os efeitos de knockout de gene KRT14 (Figura 4B). Anticorpos anti-terminal C não tiveram efeito na invasão, consistente com a localização intracelular estabelecida da região de terminal C de KRT14 (Figura 4B). Proteína KRT14 recombinante de comprimento total adicionada de modo exógeno poderia competir para ligação de anticorpo, e a invasão recorrente in vitro (Figura 4B). Desse modo, a perda de capacidade invasiva se deu diretamente devido à ligação do anticorpo de KRT14. Além disso, esse efeito é mediado por ligação de anticorpo à terminação N de KRT14; e a terminação N foi exposta no lado externo de células, accessível à ligação de anticorpo. EXEMPLO 11
ANTIGENICIDADE E PLOTAGENS DE HIDROFOBICIDADE
[00235] Plotagens de Antigenicidade e hidrofobicidade foram usados para examinar os primeiros 200 aminoácidos de KRT14 in silico (Figura 5A). Cinco regiões potencialmente antigênicas foram previstas, e seis peptídeos abrangentes a essas regiões foram sintetizadas para uso em ensaios de competição adicionais. O bloqueio do anticorpo de terminal N por peptídeos #4 e #5 invasão restaurada (Figura 5B) e migração (Figura 5C) de células de câncer de ovário in vitro. Os peptídeos 1, 2, 3 e 6 falharam em restaurar a capacidade invasiva e/ou migratória completa, apesar do reconhecimento por anticorpos policlonais usados. Com base em ensaios de competição de anticorpo e peptídeo, a região exposta à superfície da proteína de KRT14 foi definida dentro da sequência de amino NH2-GFGGGYGGGLGAGLGGGFGGGFAGGDGL (SEQ ID NO:1). Essa sequência de aminoácidos foi usada para imunizar camundongos, para a produção de anticorpos monoclonais que alvejam a terminação N de KRT14 em células intactas. EXEMPLO 12 ANTISSORO PARA KRT14
[00236] Um teste funcional é usado para analisar antissoro de camundongo interno AN-17 O20023, geralmente pelos inventores contra um fragmento de proteína que contém o epítopo de KRT14 especificado, para que a capacidade para invasão de célula cancerígena seja bloqueada in vitro.
[00237] Ensaios de invasão em tempo real foram conduzidos com uso de um instrumento de 6 poços de DP de análise de célula em tempo real de xCELLigence (RTCA) (ACEA Biosciences). Células de câncer de ovário (SKOV3) foram sincronizadas em fase Go por incubação em mídia sem soro (SFM), e semeadas (4x104 células/poço) na câmara superior de uma placa de CIM-16 poço revestida com matriz de Matrigel (1:10 em SFM; BD Biosciences, San Jose, CA). Meios que contêm 10% v/v FBS foram adicionados à câmara inferior como um quimioatraente. Antissoro de camundongo AN-17 O20023 (diluído 1:100 em SFM), soro de controle ou anticorpo policlonal comercialmente disponível contra KRT14 ((Sigma SAB4501657; 1 μg/ml em SFM) foram adicionados à câmara superior, e medições de invasão tomadas a cada 15 minutos por 24 horas. A viabilidade celular na conclusão do ensaio foi analisada por coloração com Alamar Blue. Todos os ensaios foram realizados em duplicata. AN-17 Antissoro O20023 foram geralmente contra um fragmento de proteína que contém o epítopo de KRT14 especificado.
[00238] Em poços de controle não tratados e somente de soro, invasão foi observada dentro de 5 horas de inoculação (Figura 6A). Células tratadas com anti-KRT14 policlonal comercialmente disponível (Sigma SAB4501657; que pode reconhecer o epítopo de KRT14 especificado) mostrou inibição de invasão. AN-17 Antissoro O20023 bloqueou de modo eficaz a invasão in vitro com eficácia similar ao anticorpo anti-KRT14 policlonal purificado (Figura 6A), demonstrando seu reconhecimento eficaz do alvo. Não houve diferença significativa de viabilidade no ponto final entre células não tratadas vs células de controle ou tratadas com antissoro células (Figura 6B), sugerindo que a falta de invasão não se deu devido à capacidade proliferativa prejudicada.
[00239] AN-17 Antissoro O20023 bloqueou de modo eficaz a capacidade invasiva de célula de câncer de ovário in vitro, com eficácia similar a uma preparação comercialmente adquirida. O efeito não se deu devido à proliferação celular prejudicada, mas foi específico à invasão conforme anteriormente observado. Esse anticorpo é adequado para caracterização em curso como um composto principal. EXEMPLO 13
EFEITOS EM CÉLULAS DE CÂNCER QUE NÃO É DE OVÁRIO
[00240] Anticorpos anti-KRT14 foram usadas para testar a possibilidade de as mesmas poderem impedir a invasão por células cancerígenas derivadas de outros tipos de tumor sólido (não ovário).
[00241] Ensaios de reparo de ferida in vitro foram conduzidos com uso de linhagens de carcinoma endometrial AN3CA e carcinoma colorretal SW620. Células foram desenvolvidas em meio completo para confluência em uma placa de 12 poços, então desprovidas de soro de um dia para o outro para sincronizar em G0. No dia seguinte, o meio de cultura celular foi removido, e monocamadas celulares foram lesionadas por raspagem com uma ponta de pipeta fixada para sucção. Células não aderentes foram removidas por lavagens delicadas com PBS. Células foram incubadas em meio de crescimento completo +/- anticorpo de KRT14 comercial (1µg/ml) por si só ou em combinação com 1µg/ml de peptídeos de competição. A área de ferida foi imageada sob um microscópio de fase (Leica) em intervalos regulares que variam de 0–72 horas. O fechamento de ferida foi medido em séries de imagem com uso de Software de Pesquisa AnalySIS LS (Olympus) para determinar a área da ferida em cada dia. Experimentos foram repetidos em triplicata com pelo menos seis áreas de ferida observadas por condição de crescimento com os dados a partir do ponto de coleta de 16 horas demonstrado.
[00242] Linhagens celulares de carcinoma tanto endometrial quanto colorretal exibiram cicatrização de ferida prejudicada na presença de anticorpo anti-KRT14 após 16 horas de cultura (Figura 7). Na presença do epítopo de KRT14 de competição, a capacidade de cicatrização de ferida foi restaurada ao nível observado em controles não tratados.
[00243] O anticorpo anti-KRT14 inibe o comportamento migratório de linhagens celulares cancerígenas colorretais e endometriais, de modo similar à inibição observada em células de carcinoma de ovário. A inibição é específica para o epítopo de KRT14 definido, conforme evidenciado por ensaio de competição. Os dados sugerem que a inibição mediada por anticorpo de KRT14 pode atuar como um mecanismo anticâncer para inibir a invasão em múltiplos tipos de tumor sólido. EXEMPLO 14
EFEITOS DE ESPÉCIES CRUZADAS DE ANTICORPOS
[00244] Anticorpos humanos anti-KRT14 foram analisados para sua capacidade para impedir a invasão em células de câncer de ovário não humanas.
[00245] Todos os experimentos foram realizados com uso da linhagem celular de câncer de ovário ID8 de murina. Ensaios de invasão em tempo real (como pelo Exemplo 5) e ensaios de reparo de ferida in vitro (como pelo Exemplo 6) foram realizados conforme descrito.
[00246] Anticorpos anti-KRT14 específicos para o epítopo de KRT14 humano bloquearam de modo eficaz a migração de células cancerígenas de camundongo in vitro (Figura 8A). Ensaios de competição de peptídeo (conforme descrito no Exemplo 6) restauraram a capacidade migratória nessas células (Figura 8A), demonstrando especificidade para o epítopo de KRT14.
[00247] O ensaio de invasão em tempo real confirmou que o anticorpo anti-KRT14 bloqueou a invasão de célula ID8 in vitro (Figura 8B), com eficácia similar à observada em linhagens celulares humanas.
[00248] O epítopo antigênico de KRT14 demonstra alta homologia (>80%) através de múltiplas espécies. Consequentemente, anticorpos contra o epítopo humano podem se ligar de modo eficaz à proteína não humana para inibir a migração celular e invasão in vitro. Esses dados sugerem que as terapias anti-KRT14 serão aplicáveis através das espécies.
EXEMPLO 15 AN-17 DE MAB REALIZA SINERGIA COM QUIMIOTERAPIA DE
PADRÃO DE CUIDADOS IN VITRO
[00249] Esse estudo foi realizado para determinar a possibilidade do alvejamento de superfície celular antígeno KRT14 por anticorpo monoclonal AN-17 (AN-17 de mAb), que foi demonstrado como prejudicando a migração e invasão (conforme notado em outro ponto no presente documento) sensibilizaria as células de ovário ao agente quimioterapêutico de primeira linha padrão, cisplatina.
[00250] A análise de célula em tempo real (RTCA) foi conduzida conforme anteriormente descrito (PMID: 31443478; Bilandzic et al., Cancers (Basel). 2019; 11(9), E1228) com uso de um instrumento de 96 poços xCELLigence RTCA SP (ACEA Biosciences). Linhagens celulares foram sincronizadas em G0 por incubação de um dia para o outro em meios sem soro e foram semeadas em 0,5 × 103 células/0,15 ml/ por poço. Após 24 horas, uma combinação tanto de cisplatina por si só (1.25 mg/ml), AN- 17 de mAb por si só (1ug/ml) ou cisplatina mais AN-17 de mAb foi adicionada. Leituras de impedância foram tomadas a cada 15 minutos para a duração experimental. AN-17 de mAb compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:3 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:5, codificada pelas sequências de ácido nucleico da SEQ ID NOs:2 e 4, respectivamente (consultar também as Figuras 21 e 22).
[00251] O tratamento com cisplatina de células a 15 μg/ml ou 20 μg/ml resultou em morte celular completa, enquanto uma dose de 1,25 μg/ml foi subletal e células continuaram a se proliferar (Figura 9). Conforme anteriormente demonstrado, AN-17 de mAb por si só não teve efeito em viabilidade celular ou proliferação. No entanto, a coincubação de células com AN-17 de mAb e cisplatina significativamente reduziu a viabilidade celular e proliferação em comparação à quimioterapia por si só em cada dose testada (Figura 9). O efeito mais profundo foi observado quando a cisplatina foi usada na dose subletal de 1,25 μg/ml; coincubação com AN-17 de mAb resultou em morte celular completa após ~50 h (Figura 9), similar à dose de cisplatina 12 vezes maior por si só. Desse modo, AN-17 de mAb atua para aumentar a sensibilidade de células pelo menos 10 vezes à quimioterapia de platina padrão in vitro. EXEMPLO 16 AN-17 de MAB NÃO EXIBE REATIVIDADE CRUZADA DETECTÁVEL CONTRA UM PAINEL DE ~10000 ANTÍGENOS
[00252] Os experimentos a seguir foram realizados para estabelecer a possibilidade de AN-17 de mAb exibir qualquer reatividade cruzada contra um painel de antígenos de proteína.
[00253] O perfilamento proteômico de reatividade de anticorpo de AN-17 de mAb foi realizado com uso de Microarranjos de Proteína Humano InvitrogenTM ProtoArrayTM v5.0 (ThermoFisher Scientific, Waltham MA), que compreende 9.184 proteínas humanas recombinantes individuais apontadas em duplicata. Todos os procedimentos foram realizados conforme anteriormente descrito (PMID: 29141850; Wilson et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018; 27(2):183-192). Arranjos foram sondados com uso de AN-17 de mAb diluído 1:500 em tampão de lavagem. O anticorpo de detecção fluorescente contra cadeias pesadas e leves de IgG foi de Abcam (#ab150119 IgG Anticamundongo de Cabra H&L Alexa Fluor® 647, pré-absorvido)
diluído para 2 mg/ml em tampão de lavagem antes do uso. Um arranjo único incubado com anticorpo de detecção por si só foi usado como um controle para ligação de anticorpo não específico.
[00254] O imageamento de arranjo foi realizado com uso de um dispositivo de varredura de múltiplos comprimentos de onda Fuji FLA5100 conforme descrito (PMID: 29141850; Wilson et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018; 27(2):183-192), com uso de um laser de excitação de 635nm e filtro de Cy3/Cy5 de passa-faixa dupla. Imagens foram adquiridas em 10 μm de resolução, com PMT definido em 1000V. Alinhamento de arranjo, extração de recurso e normalização de dados foram realizados conforme anteriormente descrito (PMID: 29141850; Wilson et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018; 27(2):183-192). Coordenadas de arranjo foram obtidas a partir dos arquivos .GAL transferíveis por download fornecidos pelo fabricante (ThermoFisher Scientific; (http://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life- science/protein-expression-and-analysis/biomarker- discovery/protoarray/resources/lot-specific- information.html).
[00255] Imagens de arranjo Individuais que mostram a reatividade de antígeno tanto com AN-17 de mAb como com anticorpo secundário por si só são mostrados na Figura 10. Não houve diferenças significativas entre arranjos de controle e tratados com mAb AN-1, sugerindo que AN-17 de mAb não reagiu nenhuma das proteínas presentes nos arranjos testados.
[00256] Esses dados demonstram alta especificidade de AN-17 de mAb para seu antígeno alvo (KRT14) in vitro. AN- 17 de mAB não reagiu com nenhum dos antígenos presentes no arranjo, incluindo várias proteínas de Queratina relacionadas. Portanto, AN-17 de mAb exibe alta afinidade para seu antígeno alvo. EXEMPLO 17 AN-17 DE MAB DETECTA KRT14 POR WESTERN BLOTTING
[00257] Uma alíquota de 1 µg de proteína de KRT14 recombinante de comprimento total (Abcam #ab73637) foi separada por SDS PAGE e transferida para membrana de PVDF com uso de procedimentos padrão (PMID: 23952987). A membrana foi sondada com AN-17 de mAb em diluições de 1:1000, 1:5000 e 1:10,000. O anticorpo secundário foi conjugado de anticamundongo de cabra HRP (diluição de 1:50.000), com detecção de KRT14 com uso de quimiluminescência de acordo com protocolos padrão (PMID: 23952987; Rainczuk et al., J Proteome Res. 2013; 12(9):4074-88).
[00258] A proteína de KRT14 de comprimento total foi detectada com sucesso por processo de western blot com uso de AN-17 de mAb como o anticorpo primário (Figura 11). Múltiplas diluições geraram sinal forte. EXEMPLO 18 AN-17 de MAB IDENTIFICA CÉLULAS CONDUTORAS DE KRT14+
E CÉLULAS TUMORAIS CIRCULATÓRIAS POR CITOMETRIA DE FLUXO
[00259] A citometria de fluxo foi realizada de acordo com protocolos padrão (PMID: 30602661), com dados adquiridos com uso de um LSRFortessa X-20 de BD (BD Biosciences) e analisados com uso de software FlowJo v10.5.0 (BD Biosciences). Amostras analisadas para populações de células de KRT14+ incluíram OVCAR3, CAOV4, células de câncer de ovário de camundongo ID8, células de câncer de ovário derivada com ascites derivadas de uma espécimes clínica
(designada #3.1937-07) e sangue cardíaco de camundongos que têm tumores de ovário epiteliais com 12 semanas de idade. Para linhagens celulares, 1x106 células por linhagem celular foram incubadas tanto com AN-17 de mAb (diluição de 1:200) como com um anticorpo anti-KRT14 policlonal comercialmente disponível (Sigma SAB4501657; diluição de 1:50) como um controle positivo por 45 min em soro não imune em temperatura ambiente. Os anticorpos secundários, anticamundongo de cabra Alexa647 (AN- 17 de mAb) ou anticoelho de cabra IgG Alexa 488 (Ab comercial), foram diluídos 1:500 e incubados por 30 minutos. Para amostras de sangue, 2x106 células foram incubadas com um anticorpo AN- 17 de mAb 488 conjugadas com Alexa Fluor® por 45 minutos. Após as lavagens de PBS, células foram ressuspensas em PBS/2%FBS, dados foram adquiridos com uso de um citômetro de fluxo de BD LSRFortessa X-20 (BD Biosciences).
[00260] Células que expressam KRT14 foram detectadas por citometria de fluxo, com detecção similar com uso de AN-17 de mAb em comparação a um anticorpo policlonal comercialmente disponível, Sigma SAB4501657 (Figura 12), em linhagens celulares (humano - OVCAR4, CAOV4; camundongo – ID8) e células de câncer de ovário clinicamente obtidas (3:19367- 03).
[00261] A expressão de extracelular KRT14 também marca a população de células tumorais circulatórias (CTC). Com uso de um modelo de câncer de ovário de murina conforme anteriormente descrito em PMID: 30602661 (Wilson et al. Cancers (Basel). 2018; 11(1), E32), CTCs expressam obrigatoriamente o fluoróforo de infravermelho próximo iRFP720. AN-17 de mAb foi usado para sondar o sangue inteiro de camundongos com câncer de ovário, e analisados por citometria de fluxo para KRT14+ iRFP+ células. AN-17 de mAB teve capacidade de identificar corretamente células iRFP+ do sangue inteiro, demonstrando sua utilidade para identificar e capturar CTCs.
[00262] AN-17 de mAb identificou células de KRT14+ por citometria de fluxo, com sensibilidade comparável a um anticorpo anti-KRT14 policlonal comercialmente disponível (Sigma SAB4501657). Além disso, AN-17 de mAb teve capacidade de detectar e isolar CTCs de KRT14+ por citometria de fluxo de camundongos que têm tumores de ovário epiteliais de iRFP720+ ID8. Anti-KRT14 agentes de ligação, tais como AN-17 de mAb, desse modo, têm potencial para uso em teste diagnóstico e/ou prognóstico, incluindo a captura e análise de CTCs. Os dados também indicaram que agentes de ligação anti-KRT14, tais como AN-17 de mAb, poderiam ser usados para alvejar de modo terapêutico essas células in vivo. EXEMPLO 19 AN-17 DE MAB DETECTA CÉLULAS DE KRT14+ POR COLORAÇÃO
DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
[00263] As linhagens celulares de câncer de ovário SKOV-3, Ovcar4 e Cov362.3 foram semeadas em placas de imageamento com fluortrac negro de 96 poços. Células intactas ou fixadas (1% de paraformaldeído; PFA) e permeabilizadas (Triton X a 0,1%) foram coloradas com uso de AN-17 de mAb. Para células fixadas, amostras foram bloqueadas em soro bovino fetal (FBS) a 10% e então coloradas com 1 μg/ml AN-17 de mAb para uma hora em temperatura ambiente. Células foram subsequentemente lavadas com PBS e coloradas com o anticamundongo de cabra secundário Alexa Fluor®-647 em 1:2000 por uma hora em temperatura ambiente. Para células intactas, amostras foram coloradas com 1 μg/ml de AN-17 de mAb conjugada para Alexa-647 em PBS que contém FBS a 1% por duas horas a 37 °C, o meio foi substituído com PBS fresco/FBS a 1% e células foram imediatamente imageadas. Amostras foram imageadas com uso do leitor de múltiplos modos Cytation 3 em ampliação de 4X.
[00264] A localização citoplásmica intracelular específica para o AN-17 de mAb foi observada em amostras de linhagem celular de câncer de ovário permeabilizadas (Figura 14). Em células vivas intactas, uma localização de superfície celular predominante para o AN-17 de mAb foi observada.
[00265] Esses dados mostram que AN17 de mAb podem ser usados de modo eficaz para coloração para KRT14 em células por imunofluorescência. A coloração é eficaz tanto em células intactas vivas, quanto em células fixadas e permeabilizadas. EXEMPLO 20 AN-17 de MAB DETECTA CÉLULAS DE KRT14+ POR COLORAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA EM SEÇÕES DE TECIDO DE CÂNCER
[00266] A imuno-histoquímica em amostras incorporadas de parafina (FFPE) fixadas com formalina foi realizada com uso de protocolos padrão (PMID: 31443478; Bilandzic et al., Cancers (Basel). 2019; 11(9), E1228). A eficácia de AN-17 de mAb foi testada através de uma faixa de concentrações (2 μg/ml - 0,25 μg/ml) e comparada a um anticorpo anti-KRT14 comercialmente disponível (Sigma SAB4501657, diluição de 1:100) e um controle de IgG de camundongo após incubação um de um dia para o outro. Após a incubação com anticorpos secundários, conforme descrito, a ligação e localização de anticorpo foram visualizadas como um precipitado marrom com uso de um kit Vectastain Elite ABC de acordo com as instruções do fabricante (Vector Laboratories,
Burlingame, CA, E.U.A).
[00267] O tecido colorado com uso de A-17 de mAb mostrou uma localização idêntica ao anticorpo anti-KRT14 policlonal comercial (Sigma SAB4501657), com coloração observada especificamente no epitélio tumoral (Figura 15). Houve pouca evidência de coloração observada no tecido de estroma, e nenhuma coloração observada para o controle IgG de camundongo. A abundância de sinal foi menos difusa quando comparada ao anticorpo policlonal comercialmente disponível (Sigma SAB4501657).
[00268] Esses dados mostram que AN-17 de mAb pode ser usado de modo eficaz para localizar KRT14 em tecidos de tumor seccionados. EXEMPLO 21 AN-17 de MAB NÃO TEM TOXIDADE AGUDA DETECTÁVEL IN
VIVO
[00269] Indução de tumores de ovário; Células tumorais de ovário de murina ID8 foram implantadas de modo intrabursal em camundongos C57BL/6, e tumores primários permitidos a se desenvolver por um período de ~4 semanas conforme anteriormente descrito (PMID: 30602661; Wilson et al. Cancers (Basel). 2018; 11(1), E32).
[00270] Avaliação de toxidade de AN-17 de mAb; Camundongos (n=2/dose/ponto de tempo) receberam uma dose única tanto de AN-17 de mAb como de um anticorpo de kappa de IgG de controle compatível com isotipo (IgG1 de Camundongo purificado com Ultra-LEAF™, κ Ctrl de isotipo, Biolegend #401411) por injeção intraperitoneal, e foram então monitorados por um período de até 7 dias para quaisquer sinais clínicos associados à toxicidade. Doses de 0,5, 1,0. 2,5, 5,0 e 10 mg/kg foram analisados. Após 7 dias, os camundongos foram abatidos, e examinados post mortem para qualquer evidência de toxidade (aparência de tecido macroscópico, presença de inflamação, ou quaisquer lesões óbvias).
[00271] Todos os camundongos (tumor e não tumor) foram analisados para evidência de efeitos tóxicos (reação inicial após a injeção, sinais de dor) pelo período experimental, e para evidência de toxidade como post mortem (conforme acima). Nenhuma evidência de efeitos tóxicos foi notada em qualquer ponto de tempo, ou para qualquer dose testada. EXEMPLO 22 AN-17 de MAB LOCALIZA ESPECIFICAMENTE A TECIDO
TUMORAL E NÃO É RETIDA EM TECIDO SAUDÁVEL IN VIVO
[00272] AN-17 de mAb ou um anticorpo de kappa de IgG de controle compatível com isotipo (IgG1 de Camundongo Purificado com Ultra-LEAF™, κ Controle de isotipo, Biolegend #401411) foram rotulados tanto com ALEXA647 como com corante fluorescente ALEXA750 (Thermo Fischer Scientific) em uma razão de 1:10, de acordo com as instruções do fabricante. Camundongos (n=2/grupo) receberam tanto AN-17 de mAb rotulado com ALEXA como controle de isotipo IgGĸ (conforme acima) em 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 ou 10,0 mg/kg por injeção intraperitoneal (100µl). Camundongos de controle receberam veículo (PBS) por si só. Nos pontos de tempo de 4 h a 7 dias após a injeção, camundongos foram abatidos e tecidos selecionados (fígado, rins, baço, intestino, ovário + trompa de falópio / tumor de ovário (conforme for relevante), cérebro, coração, pulmão) foram coletados. A distribuição e liberação de tecido foram analisadas por fluorescência de ALEXA647 ou ALEXA750 com uso de um Sistema de Imageamento IVIS Lumina III (Perkin Elmer). Campo de brilho (autoexposição) e imageamento de fluorescência (ALEXA647 ex640, em670; ou ALEXA750 ex740, em790nm). A não mistura espectral e análise de imagem foram realizadas conforme anteriormente descrito (PMID: 30602661; Wilson et al., Cânceres (Basel). 31 de dez de 2018; 11(1), E32). A eficiência radiante média de fundo de animais tratados por veículo foi subtraída de medições de fluorescência em cada caso, e os dados resultantes plotados para comparação.
[00273] A localização de AN-17 de mAb in tecidos saudáveis (com uso de camundongos sem tumores de ovário) por um período de 7 dias foi comparada a um anticorpo de controle de isotipo não alvejado, após a administração de uma dose única de 0,5 mg/kg. Em cada case, anticorpos foram rotulados de modo fluorescente para facilitar a detecção post mortem. A fluorescência associada a anticorpo foi observada no intestino, órgãos reprodutivos, fígado, rins, baço, pulmão e coração; nenhuma fluorescência foi detectada no cérebro (Figura 16). No entanto, não houve diferença significativa entre AN-17 de mAb e anticorpo de IgGĸ de controle de isotipo, não demonstrando nenhum acúmulo específico de AN-17 de mAb em qualquer um dos tecidos saudáveis examinados. Além disso, no dia 7, cada anticorpo fora amplamente liberado de todos os órgãos (conforme julgado pela perda de sinal fluorescente) sugerindo que AN-17 de mAb não foi retido a longo prazo (Figura 16).
[00274] Visto que a liberação de anticorpo na baixa dose pareceu ser complete no dia 7, a liberação de AN-17 de mAb de tecidos saudáveis foi avaliada em múltiplas doses crescentes (de 0,5 mg/kg a 10 mg/kg) de maneira similar. Mesmo na dose mais alta (10 mg/kg), AN-17 de mAb foi virtualmente indetectável em todos os órgãos após 7 dias, e estava tipicamente presente em uma dose menor do que o anticorpo de controle (Figura 17). Esses dados sugerem que AN-17 de mAb não exibe acúmulo não seletivo ou retenção em tecidos saudáveis.
[00275] A distribuição de AN-17 de mAb foi então avaliada em camundongos com tumores primários de ovário, com uso de doses únicas de 5 mg/kg e 10 mg/kg. Avaliação foi realizada por um período de 7 dias. Em 24 horas após a administração, AN-17 de mAb foi fortemente localizada no tecido tumoral (Figura 18). Deferente do tecido saudável, AN-17 de mAb persistiu no tecido tumoral e permaneceu detectável mesmo após 7 dias (Figura 18). Um rendimento de fluorescência maior foi inicialmente observado em camundongos que receberam a dose de 10 mg/kg; no entanto, no dia 3 após a injeção, um nível similar de AN-17 de mAb foi detectado independentemente da dose, sugerindo que tumores podem ter sido saturados na dose de 5 mg/kg. Além disso, níveis iniciais de detecção de AN-17 de mAb foram 2 ordens de magnitude maior em tecido tumoral do que foram detectados no trato reprodutivo de camundongos que não tinham tumores (comparar a Figura 18: painéis A, B, C).
[00276] Esses dados mostram que AN-17 de mAb é específico para tecido tumoral e persiste no sítio de tumor por pelo menos 1 semana após a administração.
[00277] Os dados apresentados no presente documento demonstram que AN-17 de mAb tem alta especificidade para seu alvo (KRT14), efeitos mínimos fora de alvo e baixa retenção em tecidos não alvo. Em camundongos saudáveis que não têm tumor, AN-17 de mAb não exibiu nenhuma retenção específica em órgãos saudáveis e pareceu ser rapidamente liberado. Por contraste, AN-17 de mAb foi especificamente detectado associado a tumores de ovário em que o mesmo persistiu por pelo menos 1 semana. Não houve toxidade notada em nenhuma dose ou qualquer ponto de tempo, sugerindo que a alta especificidade de AN-17 de mAb confere um perfil de segurança favorável quando injetado. Além disso, uma dose tolerada máxima não foi alcançada. AN-17 de mAb tem desse modo perfil de segurança satisfatório e alta especificidade in vivo para tecido tumoral.
EXEMPLO 23 TRATAMENTO DE AN-17 de MAB REGRIDE COM SUCESSO
TUMORES DE OVÁRIO ESTABELECIDOS IN VIVO
[00278] O propósito desses experimentos foi estabelecer a possibilidade de AN-17 de mAb poder ser usado para influenciar progresso de tumor em um modelo de malignidade primária estabelecida em um modelo de camundongo singeneico.
[00279] Células tumorais de ovário de murina ID8 foram implantadas de modo intrabursal em camundongos C57BL/6, e tumores primários permitidos a se desenvolver por um período de ~4 semanas conforme anteriormente descrito (PMID: 30602661). Camundongos com tumores primários (n=10/grupo) receberam AN-17 de mAb em 5 mg/kg por injeção intraperitoneal bissemanalmente, para um período de 3 semanas. Animais de controle receberam uma dose equivalente de anticorpo de kappa de IgG de controle compatível com isotipo (Grupo de Controle 1); ou e volume equivalente de veículo (PBS) por si só (Grupo de Controle 2). Após 3 semanas de tratamento bissemanal (Segunda-feira e quinta-feira), todos os camundongos foram abatidos e analisados para tamanho e peso de tumor. Dois animais adicionais que não têm tumor foram usados como controles não cirúrgicos.
[00280] A administração bissemanal de AN-17 de mAb não teve efeitos adversos observáveis em animais, conforme anteriormente indicado por experimentos de dose única (acima). Após 3 semanas de tratamento continuado, todos os camundongos foram abatidos e a influência de administração de AN-17 de mAb em tamanho de tumor analisado. Em camundongos tratados com veículo por si só (Grupo de Controle 2), 6/10 animais (60%) tiveram tumores primários de ovário (Figura 19); de modo similar, 6/10 animais (60%) de camundongos tratados com anticorpo de controle de isotipo (Grupo de Controle 1) também tiveram tumores primários demonstrando que o anticorpo não alvejado não teve influência no progresso de tumor.
[00281] Quando camundongos que receberam AN-17 de mAb foram analisados, nenhum tumor poderia ser identificado tanto em como sobre o ovário direito (o sítio de implantação), nem em mais lugar algum nos animais (Figura 19). Além disso, ovários extraídos desses camundongos apareceram saudáveis e não tiveram diferença morfológica observável a controles não cirúrgicos não tratados.
[00282] O tratamento de camundongos com AN-17 de mAb resultou na regressão completa de tumores primários de ovário estabelecidos a um nível indetectável após 3 semanas. Não houve efeitos adversos notados durante o tratamento período, sugerindo que a administração de AN-17 de mAb é uma abordagem terapêutica segura e altamente eficaz para tratar tumores sólidos estabelecidos in vivo. EXEMPLO 24 AN-17 de MAB BLOQUEIA A MIGRAÇÃO E INVASÃO EM
MÚLTIPLAS CÉLULAS CANCERÍGENAS
[00283] Os experimentos destacados acima demonstraram inibição específica de anticorpo de migração celular e invasão por AN-17 de mAb em linhagens celulares cancerígenas de ovário, colorretais e endometriais. Os experimentos a seguir foram realizados para investigar o efeito de AN-17 de mAb na migração e invasão de outros tipos de célula cancerígena.
[00284] Ensaios de reparo de ferida in vitro foram conduzidos nas seguintes linhagens celulares cancerígenas: carcinoma rabdoide teratoide (cerebral) atípico BT16, adenocarcinoma pulmonar NCI-H1573, glioblastoma multiforme primário SJ-GBM2, carcinoma endometrial AN3CA, carcinoma colorretal SW620 e carcinoma de mama MDA-MB-468. Células foram desenvolvidas em meio completo para confluência em uma placa de 12 poços, e sequencialmente desprovidas de soro de um dia para o outro para sincronizar em G0. No dia seguinte, o meio de cultura celular foi removido, e as monocamadas celulares foram lesionadas por raspagem com uma ponta de pipeta fixada para sucção. Células não aderentes foram removidas por lavagens delicadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e meio de crescimento completo foi adicionado a cada poço, tanto na ausência como na presença de AN-17 de mAb (em 1µg/ml). A área de ferida foi imageada a cada hora por 0–24 horas. O fechamento de ferida foi medido em séries de imagem com uso de Software de Pesquisa AnalySIS LS (Olympus) para determinar a área da ferida em cada dia. Experimentos foram repetidos em triplicata com pelo menos seis áreas de ferida observadas por condição de crescimento.
[00285] Conforme mostrado na Figura 23, quando desafiado com o uso de um ensaio de reparo de ferida in vitro,
células não tratadas tiveram capacidade de migrar e fechar a ferida após 16 h. Por contraste, todas as linhagens celulares tratadas com AN-17 de mAb falharam em fechar a ferida sob as mesmas condições. Esses dados demonstram que AN-17 de mAb inibe a migração celular e invasão de células cancerígenas, são compatíveis com os dados anteriores que mostram efeitos similares em linhagens celulares de câncer colorretal, endometrial e múltiplos cânceres de ovário.
[00286] Esses dados mostram que antagonistas de KRT14 inibem o comportamento migratório de múltiplos tipos de célula cancerígena, incluindo pelo menos células de câncer de ovário, endometrial, cerebral, pulmonar, de mama. A natureza discrepante desses tipos de câncer sugere que antagonistas de KRT14, tais como AN-17 de mAb, têm como alvo uma via altamente conservada em células cancerígenas e são, portanto, aplicáveis ao diagnóstico, prognóstico e tratamento de múltiplos tipos de tumor.
[00287] Os elementos versados na técnica verificarão que a revelação descrita no presente documento é suscetível a variações e modificações diferentes daquelas especificamente descritas. Deve-se entender que a revelação contempla todas as tais variações e modificações. A revelação também possibilita todas as etapas, recursos, composições e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo, individual ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações de quaisquer duas ou mais das etapas ou recursos ou composições ou compostos.
BIBLIOGRAFIA Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389 Ausubel et al. (1994-1998) In: Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.
Bilandzic et al. (2009) Mol Endocrinol, 23(4):539- 48 Bilandzic et al. (2013) Mol Endocrinol, 2013. 27(3):466-79 Bilandzic et al. (2014) Cancer Lett 354(1):107-114 Bilandzic e Stenvers (2014) J Vis Exp 87 Burleson et al. (2006) J Transl Med 4:6 Cheah et al. (2015) Proc Natl Acad Sci USA 112(15):4725-4730 Cheung et al. (2013) Cell 155(7):1639-1651 Cheung et al. (2016) Proc Natl Acad Sci USA 113(7):E854-863 Chothia et al. (1987) J.
Mol.
Biol. 196:901 Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883 Chu et al. (2001) Histopathology 39(1):9-16 Coligan et al.
Current Protocols in Immunology, 1991-1997 Cong et al. (2013) Science 339(6121):819-23 Domcke et al. (2013) Nat Commun 4:2126 Ewert et al. (2002) Biochemistry 41:3628-2636 Greenberg et al. (1995) Nature 374:168-173 Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-236 Ho et al. (2012) Nat Rev Urol 9(10):583-594 Iwanicki et al. (2011) Cancer Discov 1(2):144-157 Jones et al. (1986) Nature 321:522-525 Kenny et al. (20017) Int J Cancer 121(7):1463-72 Kim et al. (2014) Obstet Gynecol Sci.57(5):343-57 Kohler et al. (1975) Nature 256:495-499 Kohler et al. (1976) Eur.
J.
Immunol. 6(7):511-519
Kozbor et al. (1986) Methods in Enzymology 121:140 Lanczky et al. (2016) Breast Cancer Res Treat. 3 (160):439-446 Latifi et al. (2012) PLoS ONE 7(10) Liu et al. (1987) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 84:3439- 3443 Liu et al. (2013) Clin Cancer Res 19(18):5053-67 Nguyen-Ngoc et al. (2012) Proc Natl Acad Sci U S A. 109(39):E2595-604 Nuttall et al. (2001) Mol Immunol 38:313-326 Nuttall et al. (2002) FEBS Lett 516:80-86 Nuttall et al. (2003) Eur J Biochem 270:3543-3554 Nuttall et al. (2004) Proteins 55:187-197 Padlan (1994) Mol Immunol 31:169-217 Papafotiou et al. (2016) Nat Commun 7:11914 Paraskevopoulou et al. (2016) Cell Cycle 15(23):3161-3162 Rainczuk et al. (2013) J Proteome Res Rainczuk et al. (2014) Int J Cancer 134(3):530-41 Richmann et al. (1988) Nature 332:323-327 Richards (2013) ISRN Inflammation 2013: 23 Roby et al. (2000) Carcinogenesis 21(4):585-591 Rock et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106(31):12771-12775 Roux et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:11804- 11809 Salamonsen et al. (2013) Fertil Steril 99(4):1086- 92 Shulman et al. (1978) Nature 276:269-270 Sodek et al. (2012) Cancer Metastasis Rev 31(1-
2):397-414 Stanfield et al. (2004) Science 305:1770-1773 Streltsov et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:12444-12449 Streltsov et al (2005) Protein Sci 14:2901-2909 Toyama et al. (1987) Monoclonal Antibody, Experiment Manual, publicado por Kodansha Scientific) Trowbridge (1982) J.
Exp.
Med. 148(1):220-227 Vaughan et al. (2011) Nat Rev Cancer 11(10):719-925 Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536 Vesci et al. (2014) Int J Oncol 45(4):1421-9 Volk et al. (1982) J.
Virol. 42(1):220-227 Volkmer et al. (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109(6):2078-2083

Claims (59)

REIVINDICAÇÕES
1. MÉTODO PARA O TRATAMENTO OU PROFILAXIA DE CÂNCER EM UM SUJEITO MAMÍFERO, sendo que o dito método é caracterizado por compreender a administração ao dito sujeito de uma quantidade de um agente que tem como alvo uma porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo funcional ou variante do mesmo residente em células cancerígenas ou um agente que induz produção de um antagonista da porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo funcional ou variante nas células cancerígenas, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a invasão, migração e/ou metastização das células cancerígenas.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo câncer ser um câncer ginecológico.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo câncer ginecológico ser câncer de ovário ou um estágio ou forma de câncer de ovário.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo câncer ser selecionado dentre câncer de cérebro, bexiga, fígado, mama, pulmão, pâncreas, intestino, cólon, trato gastrointestinal, estômago, garganta, endometrial e colorretal.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo sujeito mamífero ser um ser humano.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela porção extracelular de KRT14 ser definida pela SEQ ID NO:1 ou um homólogo funcional ou variante do mesmo.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo agente ser um antagonista de um epítopo na
SEQ ID NO:1 ou seu homólogo funcional ou variante.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo antagonista ser um anticorpo específico para o epítopo na SEQ ID NO:1 ou seu homólogo funcional ou variante.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo monoclonal ou uma forma desimunizada do mesmo.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo agente ser uma vacina que induz uma resposta imune específica para células cancerígenas que compreende a porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo funcional ou variante.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela vacina compreender uma molécula antagonista que induz anticorpos específicos para a SEQ ID NO:1 ou seu equivalente funcional ou variante.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo agente ser um anticorpo específico para a SEQ ID NO:1 ou seu equivalente funcional ou variante conjugado a uma molécula citotóxica.
13. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER DE OVÁRIO EM UM SUJEITO HUMANO, sendo que o dito método é caracterizado por compreender a administração ao dito sujeito de uma quantidade de um anticorpo que tem como alvo uma porção extracelular de KRT14 identificada pela SEQ ID NO:1 residente em células de câncer de ovário, a quantidade eficaz para impedir ou reduzir a migração e/ou metastização da invasão de células cancerígenas do ovário.
14. USO DE UM AGENTE, caracterizado por ter como alvo uma porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo funcional ou variante do mesmo residente em células cancerígenas ou de um agente que induz a produção de um antagonista de uma porção extracelular de KRT14 ou seu equivalente funcional ou variante na fabricação de um medicamento no tratamento de câncer em um sujeito mamífero.
15. USO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo câncer ser um câncer ginecológico.
16. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo câncer ginecológico ser câncer de ovário ou uma fase ou forma de câncer de ovário.
17. USO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo câncer ser selecionado dentre câncer de cérebro, bexiga, fígado, mama, pulmão, pâncreas, intestino, cólon, trato gastrointestinal, estômago, garganta, endometrial e colorretal.
18. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo sujeito mamífero ser um ser humano.
19. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pela porção extracelular de KRT14 ser definida pela SEQ ID NO:14 ou um homólogo funcional ou variante do mesmo.
20. USO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo agente ser um antagonista de um epítopo na SEQ ID NO:1 ou seu homólogo funcional ou variante.
21. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo antagonista ser um anticorpo específico para o epítopo na SEQ ID NO:1 ou seu homólogo funcional ou variante.
22. USO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo monoclonal ou uma forma desimunizada do mesmo.
23. USO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo agente ser uma vacina que induz uma resposta imune específica para células cancerígenas que compreende a porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo funcional ou variante.
24. USO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pela vacina compreender uma molécula antagonista que induz anticorpos específicos para a SEQ ID NO:1 ou seu equivalente funcional ou variante.
25. USO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo agente ser um anticorpo específico para a SEQ ID NO:1 ou seu equivalente funcional ou variante conjugado a uma molécula citotóxica.
26. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um agente que tem como alvo especificamente uma porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas em um sujeito mamífero e em que o dito agente induz diretamente citotoxicidade ou citostase das ditas células cancerígenas ou induz um antagonista no corpo do sujeito mamífero que induz citotoxicidade ou citostase do dito câncer nas células.
27. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo câncer ser um câncer ginecológico.
28. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo câncer ginecológico ser câncer de ovário ou um estágio ou forma de câncer de ovário.
29. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo câncer ser selecionado dentre câncer de cérebro, bexiga, fígado, mama, pulmão, pâncreas, intestino, cólon, trato gastrointestinal, estômago, garganta, endometrial e colorretal.
30. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizada pelo sujeito mamífero ser um ser humano.
31. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, caracterizada pela porção extracelular de KRT14 ser definida pela SEQ ID NO:26 ou um homólogo funcional ou variante do mesmo.
32. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo agente ser um antagonista de um epítopo na SEQ ID NO:1 ou seu homólogo funcional ou variante.
33. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo antagonista ser um anticorpo específico para o epítopo na SEQ ID NO:1 ou seu homólogo funcional ou variante.
34. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo anticorpo ser um anticorpo monoclonal ou uma forma desimunizada do mesmo.
35. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo agente ser uma vacina que induz uma resposta imune específica para células cancerígenas que compreende a porção extracelular de KRT14 ou seu homólogo funcional ou variante.
36. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pela vacina compreender uma molécula antagonista que induz anticorpos específicos para a
SEQ ID NO:1 ou seu equivalente funcional ou variante.
37. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo agente é um anticorpo específico para a SEQ ID NO:1 ou seu equivalente funcional ou variante conjugada a uma molécula citotóxica.
38. REAGENTE DE DIAGNÓSTICO, caracterizado por compreender um anticorpo específico para uma porção extracelular de KRT14 em células cancerígenas conjugadas a uma molécula repórter.
39. MÉTODO PARA DETECTAR CÂNCER EM UM PACIENTE, sendo que o método é caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra do paciente; (b) colocar a amostra em contato com um agente que se liga a um epítopo extracelular de KRT14 para determinar os níveis do mesmo e submeter os níveis a um algoritmo para fornecer um índice de probabilidade de o paciente ter um câncer e (c) diagnosticar o risco de o paciente ter câncer com base no índice de probabilidade.
40. MÉTODO PARA DETECTAR CÉLULAS CANCERÍGENAS KRT14-POSITIVAS EM CIRCULAÇÃO EM UM PACIENTE, sendo que o método é caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra de sangue do paciente; (b) colocar a amostra de sangue em contato com um agente que se liga a um epítopo extracelular de KRT14 para determinar a presença de células cancerígenas KRT14-positivas na amostra.
41. MÉTODO PARA MONITORAR UM CÂNCER EM UM PACIENTE, sendo que o método é caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra de sangue de um paciente em um primeiro ponto no tempo; (b) colocar a amostra de (a) em contato com um agente que se liga a um epítopo extracelular de KRT14 para determinar o nível de células cancerígenas KRT14-positivas na amostra; (c) fornecer uma amostra de sangue de um paciente em um segundo ponto no tempo, em que o primeiro ponto no tempo é diferente do segundo ponto no tempo; (d) colocar a amostra em contato de (c) com um agente que se liga a um epítopo extracelular de KRT14 para determinar o nível de células cancerígenas KRT14-positivas na amostra e (e) determinar se houve uma mudança no nível de células cancerígenas KRT14-positivas no paciente entre o primeiro e o segundo pontos no tempo; em que uma mudança no nível de células cancerígenas KRT14-positivas no paciente entre o primeiro e o segundo pontos no tempo é indicativo de uma mudança na situação do câncer no paciente.
42. MÉTODO PARA DETERMINAR A SITUAÇÃO DE UM SUJEITO EM RELAÇÃO A UM CÂNCER OU A UM SUBTIPO OU ESTÁGIO DO MESMO, sendo que o método é caracterizado por compreender: (a) receber dados na forma de presença da porção extracelular de KRT14 por meio de uma rede de comunicações; (b) processar os dados do sujeito por meio de um algoritmo que fornece um valor de índice de doença; (c) determinar a situação do sujeito de acordo com os resultados do valor de índice de doença em comparação com valores predeterminados e (d) transferir uma indicação da situação do sujeito para um usuário por meio da rede de comunicações.
43. AGENTE QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A UMA PORÇÃO
EXTRACELULAR DE KRT14 EM CÉLULAS CANCERÍGENAS OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A KRT14 DO MESMO, sendo que o agente é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), em que o VH compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VH CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, uma VH CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e uma VH CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8; e em que o VL compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VL CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9, uma VL CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 e uma VL CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11.
44. AGENTE OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A KRT14 DO MESMO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo VH compreender: (a) uma região de framework de VH 1 (FR1) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12; (b) uma VH FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:13; (c) uma VH FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:14 e (d) uma VH FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:15; e o VL compreender:
(e) uma VL FR1 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:16; (f) uma VL FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:17; (g) uma VL FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:18 e (h) uma VL FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:19.
45. AGENTE OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A KRT14 DO MESMO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por: (a) o VH compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 e (b) o VL compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5.
46. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, 12 e 39 a 41, USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22 e 25, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34 e 37, caracterizada pelo agente compreender um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), em que o VH compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VH CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, uma VH CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO:7 e uma VH CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8; e em que o VL compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VL CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9, uma VL CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 e uma VL CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11.
47. MÉTODO, USO ou COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo VH compreender: (a) uma região de framework de VH 1 (FR1) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12; (b) uma VH FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:13; (c) uma VH FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:14 e (d) uma VH FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:15; e o VL compreender: (e) uma VL FR1 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:16; (f) uma VL FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:17; (g) uma VL FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:18 e (h) uma VL FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:19.
48. MÉTODO, USO ou COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada por: (a) o VH compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 e (b) o VL compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5.
49. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, ou REAGENTE DE DIAGNÓSTICO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo anticorpo compreender um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), em que o VH compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VH CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, uma VH CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e uma VH CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8; e em que o VL compreende uma região de determinação de complementaridade 1 (VL CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9, uma VL CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 e uma VL CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11.
50. MÉTODO ou AGENTE DE DIAGNÓSTICO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo VH compreender: (a) uma região de framework de VH 1 (FR1) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12; (b) uma VH FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:13; (c) uma VH FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:14 e (d) uma VH FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:15; e o VL compreender: (e) uma VL FR1 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:16; (f) uma VL FR2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:17; (g) uma VL FR3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:18 e (h) uma VL FR4 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:19.
51. MÉTODO ou AGENTE DE DIAGNÓSTICO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por: (a) o VH compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 e (b) o VL compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO:5.
52. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 42, ou AGENTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizado pelo câncer ser um câncer ginecológico.
53. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo câncer ginecológico ser câncer de ovário ou um estágio ou forma de câncer de ovário.
54. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 42, ou AGENTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizado pelo câncer ser selecionado dentre câncer de cérebro, bexiga, fígado, mama, pulmão, pâncreas, intestino, cólon, trato gastrointestinal, estômago, garganta, endometrial e colorretal.
55. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por compreender adicionalmente administrar ao sujeito, simultânea ou sequencialmente, um agente anticâncer adicional e/ou expor o sujeito a imunoterapia, radioterapia e/ou intervenção cirúrgica.
56. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 25, caracterizado pelo agente ser formulado para administração, simultânea ou sequencialmente, de um agente anticâncer adicional e/ou uma terapia adicional selecionada do grupo que consiste em imunoterapia, radioterapia e/ou intervenção cirúrgica.
57. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 37, caracterizada por compreender adicionalmente um agente anticâncer adicional.
58. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 55, USO,
de acordo com a reivindicação 56, ou COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo agente anticâncer adicional ser selecionado do grupo que consiste em dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina e mitoxantrona, um agente à base de platina, um antimetabólito, células T primadas e uma citocina.
59. MÉTODO, USO OU COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que um antimetabólito é selecionado do grupo que consiste em azasserina, D-ciclosserina, ácido nicofenólico, trimetoprim, 5-fluorouracila, capecitabina, metotrexato, gencitabina, citarabina (ara-C) e fludarabina.
BR112021015586-4A 2019-02-07 2020-02-07 Método para o tratamento ou profilaxia de câncer em um sujeito mamífero, método para o tratamento de câncer de ovário em um sujeito humano, uso de um agente, composição farmacêutica, reagente de diagnóstico, método para detectar câncer em um paciente, método para detectar células cancerígenas krt14-positivas em circulação em um paciente, método para monitorar um câncer em um paciente, método para determinar a situação de um sujeito em relação a um câncer ou a um subtipo ou estágio do mesmo, agente que se liga especificamente a uma porção extracelular de krt14 em células cancerígenas ou um fragmento de ligação a krt14 do mesmo, agente ou fragmento de ligação a krt14 do mesmo, e, método ou agente de diagnóstico BR112021015586A2 (pt)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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