BR112014003501B1

BR112014003501B1 - Anticorpo humanizado que se liga especificamente à integrina alfa-v beta-8, seu uso na redução da sinalização de tgfbeta, composição farmacêutica, bem como método para detectar a presença de uma célula que expressa alfa-v beta-8

Info

Publication number: BR112014003501B1
Application number: BR112014003501-6A
Authority: BR
Inventors: Steven Nishimura; Jianlong Lou; Jody Lynn Baron; James Marks
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 2011-08-17
Filing date: 2012-08-17
Publication date: 2022-02-08
Also published as: CA2846240A1; ES2643397T3; SG2014014237A; RU2014109928A; EP2744823A4; CN103857696A; JP2015501285A; US9492569B2; US20140271478A1; MX2014001850A; BR112014003501A2; WO2013026004A3; AU2012296362B2; JP6093360B2; MX350335B; WO2013026004A2; KR20140054238A; RU2614252C2; AU2012296362A1; KR102010098B1

Abstract

anticorpos que se ligam à integrina alfa-v beta-8, seus usos na redução da sinalização de tgfbeta, composição farmacêutica, bem como método para detectar a presença de uma célula de expressão de alfa-v beta-8. são aqui fornecidos anticorpos com alta afinidade para a subunidade (beta)8 de (alfa)v(beta)8, bem como o uso dos referidos anticorpos na redução da sinalização de tgf(beta). ainda, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende os referidos anticorpos, bem como um método para detectar a presença de uma célula de expressão de (alfa)v(beta)8.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade ao Pedido de PatenteProvisório US No. 61 /524.708, depositado em 17 de agosto de 2011 e Pedido de Patente Provisório No. 61/646.111, depositado em 11 de maio de 2012, cujas divulgações são incorporadas por referência na sua totalidade.

REFERÊNCIA A UMA “LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS”, UMA TABELA, OU UM APÊNDICE DE LISTAGEM DE PROGRAMA DE COMPUTADOR APRESENTADO COMO UM ARQUIVO DE TEXTO ASCII

[0002] A Listagem de Sequência escrita em arquivo 81906-848664_ST25.TXT, criado em 17 de agosto de 2012, 71.601 bytes, formato de máquina IBM-PC, sistema operacional MS-Windows, é por meio desta incorporada por referência.

DECLARAÇÃO AOS DIREITOS ÀS INVENÇÕES CRIADAS SOB PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PATROCINADOS PELO GOVERNO FEDERAL

[0003] Esta invenção foi criada com o apoio do governo sob GrantNo. HL63993, NS-44155, U01 A1075443 emitido pelo National Institutes of Health. O governo possui certos direitos na invenção.

ANTEDEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] O fator-β de crescimento transformante (TGF-β) da citocinamultifuncional afeta as células imunes endoteliais, epiteliais e mesenquimais durante o desenvolvimento e a vida adulta em espécies invertebradas e vertebradas. Nos mamíferos, estas funções são mediadas por três isoformas amplamente expressas, TGF-β1, 2 e 3. Todas as três isoformas interagem com os mesmos receptores de superfície celular (TGFBR2 e ALK5) e sinalizam através das mesmas vias de sinalização intracelulares, que envolvem os efetores de sinalização canônicos (isto é, SMADs) ou não canônicos (isto é, MAPK, JUN, PI3K, PP2A, Rho, PAR6). Na via de sinalização de TGF-β canônica, o sinal é propagado a partir do receptor de TGF-β por meio da fosforilação de SMAD-2/3 citoplasmático, da formação complexa com SMAD-4, da translocação do complexo de SMAD-2/3/4 para o núcleo, e da ligação aos elementos de resposta SMAD localizados nas regiões promotoras de muitos genes envolvidos na resposta fibrogênica. Embora as isoformas de TGF-β possuam pares de sinalização similares, cada uma serve a funções biológicas distintas. As isoformas de TGF-β possuem diferenças nas afinidades de ligação aos receptores de TGF-β, ao mecanismo de ativação, à intensidade ou duração da sinalização, ou distribuição espacial e/ou temporal.

[0005] Os modelos silenciados e de anulação condicional dasisoformas, receptores e mediadores de sinalização de TGF-β, assim como os reagentes de bloqueio de função que direcionam todas as isoformas de TGF-β, possuem papéis essenciais revelados para o TGF- β no desenvolvimento de células T, cardíaco, pulmonar, vascular e do palato. Camundongos deficientes de TGF-β1 morrem no útero, devido aos defeitos na vasculogênese do saco vitelínico, ou sobrevivem até a idade adulta com auto-imunidade de múltiplos órgãos grave. A extinção genética do mediador sinalização de TGF-β Smad2 revela que é essencial na padronização prematura e formação mesodérmica. Os camundongos carentes de Smad3 são viáveis e férteis, mas apresentam malformações dos membros, desregulação imune, colite, carcinoma do cólon, e dilatação alveolar. Nos tecidos adultos, a via de TGF-β está envolvida nas interações celulares imunes, mesenquimais e epiteliais para manter a homeostasia em resposta ao estresse ambiental.

[0006] As vias homeostáticas mediadas por TGF-β são perturbadasem resposta à lesão repetitiva crônica. O TGF-β é uma citocina profibrogênica importante em resposta à lesão, atraso da cicatrização de feridas epiteliais. O TGF-β inibe a proliferação e migração epitelial, promove a apoptose, e expande o compartimento mesenquimal mediante a indução do recrutamento de fibroblastos, contratilidade dos fibroblastos e deposição da matriz extracelular. A transferência intratraqueal do TGF-β1 recombinante adenoviral para o pulmão de roedores aumenta drasticamente o acúmulo de fibroblastos e a expressão de colágeno tipo I e tipo III em torno das vias aéreas e no interstício pulmonar. A neutralização de anticorpos anti-TGF-β pode bloquear a bleomicina ou a fibrose pulmonar induzida por radiação.

[0007] A atividade de TGF-β aumentada pode desempenhar umpapel na doença pulmonar fibrótica, glomerulosclerose, e restenose de vasos cardíacos, principalmente mediada por TGF-β1. A função do TGF-β1 em seres humanos é complexa, como indicado pelos distúrbios hereditários que envolvem o próprio TGF-β ou os seus efetores de sinalização. As mutações que aumentam a atividade da via de TGF-β levam a defeitos no metabolismo ósseo (isto é, a doença de Camurati- Engelmann), no tecido conjuntivo (isto é, a síndrome de Marfan), e no aneurisma da aorta (isto é, a síndrome de Loeys-Dietz). As mutações que levam à diminuição da actividade da via de TGF-β são correlativas com o câncer. O papel do TGF-β como um supressor tumoral no câncer não é constante, no entanto, por causa do TGF-β, também pode intensificar o crescimento de tumores e metástases.

[0008] Apesar das múltiplas funções essenciais do TGF-β, umadose única ou a administração a curto-prazo de um anticorpo de neutralização de TGF-β em mistura é bem tolerada. Nenhum efeito colateral é observado em roedores nas doses que inibem a fibrose de órgão ou crescimento celular de carcinoma e metástase. Este tratamento também inibe eficazmente a fibrose experimental. Os ensaios clínicos de dose única fase I/II que utilizam anticorpos de TGF- β em mistura de neutralização estão adiantados com relação ao carcinoma de células renais metastático, melanoma, glomeruloesclerose segmentar focal e fibrose pulmonar idiopática (Genzyme Corporation, disponível em genzymeclinicalresearch.com). BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] São aqui fornecidas composições de anticorpo que podemser utilizadas para o diagnóstico e tratamento de distúrbios associados com a atividade elevado de TGF-β mediada por αvβ8. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado que especificamente se liga ao αvβ8, em que o anticorpo isolado inibe a libertação do peptídeo de TGF-β ativo maduro, mas significativamente não inibe a adesão do TGF-β latente ao αvβ8 sobre uma célula que expressa αvβ8, e em que o anticorpo isolado se liga às células de expressão de αvβ8 fixas (por exemplo, fixadas com formalina). O anticorpo com estas atividades é referido como 11E8, cujo termo inclui as versões amadurecidas por afinidade, humanizadas, quiméricas e rotuladas dos anticorpos 11Eo, assim como os seus fragmentos de ligação ao αvβ8. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado especificamente se liga ao epítopo sobre β8 que está dentro da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NOs: 48, 49 e 50). Em certas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NOs: 51, 52 e 53). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 10 e as CDRs de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a região variável da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 10 e a região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada e as CDRs de cadeia leve de 11E8Mut28. Em certas modalidades, o anticorpo compreende a sequências de cadeia pesada e a sequência da região variável de cadeia leve de 11E8Mut28. Em certas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada e as CDRs de cadeia leve de 11E8Mut94. Em certas modalidades, o anticorpo compreende a sequência da região variável de cadeia pesada e a sequência da região variável de cadeia leve de 11E8Mut94. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada e as CDRs de cadeia leve de 11E8Mut39. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a sequência da região variável de cadeia pesada e a sequência da região variável de cadeia leve de 11E8Mut39. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado se liga ao epítopo β8 com alta afinidade, por exemplo, com uma maior afinidade do que o anti-anticorpo anti-αvβ8 37E1, com uma afinidade na faixa nanomolar ou picomolar, ou com um Kd de 10-7, 10-8, 10-9 ou inferior. Em certas modalidades, o anticorpo isolado é menor do que 50 kD, menor do que 25 kD, ou um anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-αvβ8 37E1 ou 37E1B5 compete com o anticorpo 11E8 para a ligação ao αvβ8 sobre uma célula que expressa αvβ8. Também é fornecida uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo isolado aqui descrito e um excipiente farmacêutico.

[00010] Ainda se fornece um anticorpo humanizado que especificamente se liga ao αvβ8, em que o anticorpo isolado inibe a liberação do peptídeo TGFβ ativo maduro, mas não inibe significativamente a adesão d TGF-β latente ao αvβ8 sobre uma célula que expressa αvβ8. O anticorpo com essa atividade é referida como h37E1B5 (37E1B5 ou Hu37E1B5 humanizado), cujo termo se refere aos seus fragmentos de ligação ao h37E1B5 e αvβ8 rotulados. Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado se liga especificamente a um epítopo sobre β8 que está dentro da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado se liga ao epítopo β8 com alta afinidade, por exemplo, com uma maior afinidade do que o anticorpo anti-αvβ8 37E1, com uma afinidade na faixa nanomolar ou picomolar, ou com um Kd de 10-7, 10-8, 10-9 ou inferior. Em certas modalidades, o anticorpo isolado é menor do que 50 kD, menor do que 25 kD, ou é um anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv). Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado possui uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 9. Também é fornecida uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo humanizado aqui descrito e um excipiente farmacêutico.

[00011] Também são fornecidas composições de anticorpos quepodem ser utilizadas para o diagnóstico de distúrbios associados com a atividade elevada de TGF-β mediada por αvβ8. Em algumas modalidades, fornece-se um anticorpo isolado que especificamente se liga ao αvβ8, em que o anticorpo não inibe a liberação do peptídeo de TGF-β ativo maduro ou a adesão de TGF-β latente ao αvβ8 sobre uma célula que expressa αvβ8, em que o anticorpo isolado se liga às células ou tecido de expressão de αvβ8 fixas (por exemplo, fixadas com formalina), e em que o anticorpo distingue os níveis de expressão de αvβ8 na célula ou tecido (por exemplo, o anticorpo pode ser utilizado para comparar os níveis de expressão de αvβ8 em células diferentes). Os anticorpos com estas atividades são referidos como 6B9 e 4F1, que inclui as versões amadurecidas por afinidade, humanizadas, quiméricas, e rotuladas dos anticorpos 6B9 e 4F1, assim como os seus fragmentos de ligação ao αvβ8. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado especificamente se liga a um epítopo sobre β8 que está dentro da SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o epítopo inclui S95 de β8 humano, cuja sequência de comprimento total é mostrada na SEQ ID NO: 17. Em certas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as CDR de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 18 e as CDRs de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 19. Em certas modalidades, o anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a região variável da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 18 e a região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 19. Em certas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada e as CDRs de cadeia leve de 6B9Mut1. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a sequência da região variável de cadeia pesada e a sequência da região variável de cadeia leve de 6B9Mut1. Em certas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs da cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 20 e as CDRs de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 21. Em certas modalidades, o anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 21. Em certas modalidades, o anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 20 e a região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado se liga ao epítopo β8 com alta afinidade, por exemplo, com uma afinidade na faixa nanomolar ou picomolar, ou com um Kd de 10-7, 108, 10-9 ou inferior. Em certas modalidades, o anticorpo isolado é menor do que 50 kD, menor do que 25 kD, ou um anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv). Em certas modalidades, o anticorpo anti-αvβ8 6B9 ou 4F1 não competem com relação à ligação com o 37E1, 37E1B5, ou anticorpo 11E8 com relação ao αvβ8 sobre uma célula que expressa αvβ8. Também é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo os anticorpos isolados aqui descritos e um excipiente farmacêutico.

[00012] São aqui fornecidos os métodos de redução da sinalização de TGF-β (redução da atividade de TGF-β, que reduz a liberação do TGF-β ativo maduro) em um indivíduo, compreendendo a administração da composição farmacêutica que compreende o anticorpo 11E8 ou h37E1B5 (como descrito acima) ao indivíduo, reduzindo assim a sinalização de TGF-β no indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo possui pelo menos uma condição (doença, distúrbio) selecionada do grupo consistindo em doença inflamatória do intestino (IBD), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, artrite, fibrose hepática, um distúrbio fibrótico pulmonar, uma doença inflamatória auto-imune do cérebro, esclerose múltipla, uma doença desmielinizante, neuroinflamação, doença do rim, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, glioma e carcinoma da mama; e redução da sinalização de TGF-β resulta em melhora da condição.

[00013] São ainda fornecidos métodos de diagnóstico de um distúrbios associado com αvβ8 em um indivíduo, compreendendo o contato de uma célula do indivíduo com o anticorpo 11E8, 6B9 ou 4F1 como descrito acima, e detecção da ligação do anticorpo isolado com a célula, em que a ligação do anticorpo isolado com a célula indica que o indivíduo possui o distúrbio associado com αvβ8. Em algumas modalidades, o distúrbio associado com αvβ8 é selecionado do grupo consistindo em doença inflamatória do intestino (IBD), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, artrite, fibrose hepática, um distúrbio fibrótico pulmonar, uma doença auto-imune inflamatória do cérebro, esclerose múltipla, uma doença desmielinizante, neuroinflamação, doença do rim, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, glioma e carcinoma da mama. Em certas modalidades (por exemplo, técnicas de diagnóstico in vitro), a célula é fixada. Em certas modalidades, o distúrbio associado com αvβ8 é IBD, e a célula é obtida a partir do intestino (por exemplo, cólon ou intestino) do indivíduo. Em certas modalidades, o distúrbio associado com αvβ8 é a artrite e a célula é uma célula condrócita ou de cartilagem do indivíduo. Em algumas modalidades, o distúrbio associado com αvβ8 é a fibrose hepática, e a célula é uma célula estrelada hepática do indivíduo. Em certas modalidades, o distúrbio associado ao αvβ8 é a asma, COPD, ou fibrose pulmonar, e a célula é obtida a partir das vias aéreas do indivíduo. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a administração de uma composição farmacêutica (compreendendo o anticorpo 11E8, 37E1B5 ou h37E1B5) ao indivíduo.

[00014] São ainda fornecidos os métodos para determinar o nível relativo da expressão de αvβ8 sobre uma célula de teste. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da célula de teste com um anticorpo 6B9, que detecta o anticorpo 6B9 que se liga à célula de teste, e a comparação do nível de anticorpo 6B9 que se liga a este de uma célula de controle, determinando assim o nível relativo de expressão de αvβ8 sobre a célula de ensaio. Em certas modalidades, o método compreende o contato da célula de teste com um anticorpo 4F1, que detecta o anticorpo 4F1 que se liga à célula de teste, e a comparação do nível de anticorpo 4F1 que se liga a este de uma célula de controle, determinando assim o nível relativo de expressão de αvβ8 na célula de teste. Em certas modalidades, a célula de teste é fixada (por exemplo, fixada com formalina). Em algumas modalidades, a célula de controle é fixada. Em algumas modalidades, a célula de controle é uma célula não cancerígena do tipo selvagem. Em certas modalidades, a célula de controlo é uma célula saudável (de um indivíduo que não sofre de um distúrbio relacionado com αvβ8). Em certas modalidades, o nível de expressão é indicativo do número de cópias de β8 genômico na célula, por exemplo, de modo que um nível de expressão relativa mais elevado do que um controle não cancerígeno indica que a célula de teste possui um número de cópia de β8 genômico aumentado. Em algumas modalidades, a célula de teste é em uma amostra biológica de um indivíduo (por exemplo, um fluido ou amostra de tecido in vitro). Em algumas modalidades, a célula de teste é in situ no indivíduo. Em certas modalidades, o método ainda compreende o diagnóstico do indivíduo com um distúrbio associado com αvβ8 (como aqui descrito) quando a expressão de αvβ8 é mais elevada do que o normal na célula de teste. Uma pessoa de habilidade irá compreender que uma célula de controle pode ser de um indivíduo saudável (por exemplo, representativa dos níveis de expressão normais), ou pode ser um controle positivo, por exemplo, conhecido de ter a expressão de αvβ8 elevada, ou de um indivíduo com um distúrbio associado αvβ8.

[00015] É adicionalmente fornecido um anticorpo isolado que especificamente se liga ao αvβ8, em que dito anticorpo não inibe a libertação do peptídeo do TGF-β ativo maduro ou adesão do TGF-β latente ao αvβ8 sobre uma células de expressão de αvβ8. Em certas modalidades, o anticorpo isolado especificamente se liga a um epítopo sobre β8 que está dentro da SEQ ID NO: 1. O anticorpo com estas atividades é referido como 14E5, cujo termo inclui as versões humanizadas, quiméricas e rotuladas amadurecidas por afinidade dos anticorpos 14E5, assim como os seus fragmentos de ligação ao αvβ8. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs da cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 12 e as CDRs de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada e as CDRs de cadeia leve de um anticorpo amadurecido por afinidade selecionado do grupo que consiste de: 14E5Mut11, 14E5Mut42, 14E5Mut54, 14E5Mut68,14E5Mut65, 14E5Mut83 e 14E5Mut95. Em certas modalidades, oanticorpo compreende a região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a região variável da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 12 e a região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o anticorpo compreende a sequência da região variável de cadeia pesada e a sequência da região variável de cadeia leve de um anticorpo amadurecido por afinidade selecionado do grupo que consiste em: 14E5Mut11, 14E5Mut42, 14E5Mut54, 14E5Mut68, 14E5Mut65, 14E5Mut83 e 14E5Mut95. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado se liga ao epítopo β8 com afinidade elevada, por exemplo, com afinidade mais elevada do que o anticorpo anti-αvβ8 37E1, com uma afinidade na faixa nanomolar ou picomolar, ou com um Kd de 10-7, 108, 10-9 ou inferior. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado é menor do que 50 kD, menor do que 25 kD, ou é um anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv). Em algumas modalidades, o anticorpo anti- αvβ8 37E1 ou 37E1B5 compete com o anticorpo 14E5 com relação à ligação ao αvβ8 sobre uma célula que expressa αvβ8.

[00016] Métodos são fornecidos para detectar a presença de uma célula que expressa αvβ8 compreendendo o contato de uma célula com o anticorpo 14E5, e determinar se o anticorpo se liga à célula, em que a ligação do anticorpo à célula indica a presença de uma célula que expressa αvβ8. Em algumas modalidades, o contato é in vivo. Em certas modalidades, o contato é in vitro.

[00017] Tais métodos podem ser utilizados nos métodos de diagnóstico de um distúrbio associado com αvβ8 em um indivíduo, compreendendo o contato de uma célula do indivíduo com o anticorpo 14E5 como descrito acima, e a detecção da ligação do anticorpo isolado à célula, em que a ligação do anticorpo isolado à célula indica que o indivíduo possui o distúrbio associado com αvβ8. Em certas modalidades, o distúrbio associado com αvβ8 é selecionado do grupo consistindo em doença inflamatória do intestino (IBD), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, artrite, fibrose hepática, uma doença fibrótica pulmonar, uma doença auto-imune inflamatória do cérebro, esclerose múltipla, uma doença desmielinizante, neuroinflamação, doença do rim, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, glioma e carcinoma da mama. Em algumas modalidades, distúrbio associado com αvβ8 é IBD, e a célula é obtida do intestino (por exemplo, do cólon ou do intestino) do indivíduo. Em algumas modalidades, o distúrbio associado com αvβ8 é a artrite e a célula é uma célula condrócita ou de cartilagem do indivíduo. Em algumas modalidades, o distúrbio associado com αvβ8 é a fibrose hepática, e a célula é uma célula estrelada hepática do indivíduo. Em algumas modalidades, o distúrbio associado com αvβ8 é a asma, COPD, ou fibrose pulmonar, e a célula é obtida a partir das vias respiratórias do indivíduo. Em certas modalidades, o método ainda compreende a administração de uma composição farmacêutica (compreendendo o anticorpo 11E8, 37E1B5 ou h37E1B5) ao indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00018] A Figura 1 mostra o alinhamento das regiões variáveis de cadeia pesada e leve para os anticorpos 37E1, 37E1B5 e 37E1B5 humanizado. A CDR e as sequências de estrutura são indicadas.

[00019] A Figura 2 mostra a expressão de β8 humano sobre as células estreladas hepáticas em camundongos transgênicos ITGB8. O painel superior mostra o controle de isótipo, enquanto que o painel inferior mostra a expressão de β8, determinada utilizando o anticorpo 14E5.

[00020] A Figura 3 mostra a expressão de β8 sobre os macrófagos alveolares do pulmão, células dendríticas, células de linfonodos do mediastino, células T e B e fornece um resumo dos dados de coloração em outros órgãos. A) Macrófagos do pulmão: autofluorescente +, CD11Chi+, F480+,CD8+, CD11B-, Ly6G-, CD103-, Ly6C +/- , TCR-; B) Células dendríticas do pulmão: autofluorescente -, CD11c Intermed+, F480 (principalmente negativa), CD8+, CD11B+, CD103-/+, Ly6C +/- , TCR-, Ly6G-, GR-1- C) Células T do pulmão- TCR αβ +, CD3+, B220-, Classe II-, CD19-, não auto-fluorescente; D) Células B do pulmão- TCR αβ-, CD3-, B220+, Classe II+, CD19+, não auto-fluorescente; E) células dendríticas MLN: auto-fluorescente -, CD11C intermed +, CD11B+, Classe II MHC hi, F480- , Ly6C +/- , Ly6G- (provavelmente CD8+, CD103+/-, GR-1+/-); F) células B MLN- TCR αβ-, CD3-, B220+, Classe II+, CD19+, não auto-fluorescente; G) Tabela de resumo dos dados de coloração em múltiplos órgãos. A coloração foi executado utilizando o clone de hibridoma 14E5.

[00021] A Figura 4 mostra o efeito da administração de 37E1B5 sobre o tamanho do intestino delgado (inflamação) em camundongos BACtg.

[00022] A Figura 5 mostra uma foto da seção do intestino delgado de camundongos BACtg de controle (sem tratamento) e tratados com 37E1B5.

[00023] A Figura 6 mostra que os anticorpos 4F1 e 6B9 especificamente se ligam e mancham as células 293 fixadas por formalina que expressam β8 (293 B8), mas não as células 293 não transfectadas (293 WT p). Os anticorpos também mancham as seções cerebrais fixadas com formalina de camundongos transgênicos β8 de integrina (ITGB8 BAC).

[00024] Figura 7: Clone de hibridoma 4F1 especificamente mancha os cérebros e pulmões embutidos com parafina fixada com formalina de camundongos transgênicos (Tg) ITGB8 BAC. O cérebro ou pulmões de camundongo ITGB8 BAC Tg ou tipo silvestre (WT) foram fixados durante a noite em formalina tamponada a 10% e submetidos ao processamento de tecidos, incrustação de parafina e corte. A imunocoloração foi executada utilizando o mesmo antígeno de recuperação de calor como acima, e os anticorpos foram detectados utilizando um kit comercial (Dako).

[00025] Figura 8: Clone de hibridoma 6B9 pode detectar a variação de números de cópias, conforme mostrado pela imunocoloração do cérebro de camundongo transgênico (Tg) ITGB8 BAC incrustado de parafina, fixado com formalina. São mostradas três linhagens de camundongos Tg (B, C e D) em comparação com o WT (painel inferior). Os números de cópias são como se segue: 1 cópia (D---linhagem BAC/WT), 2 cópias (B e C---linhagem BAC/WT; D---linhagem BAC/BAC) ou 4 cópias (B e C---linhagem BAC/BAC).

[00026] Figura 9: IgG de coelho monoclonal recombinante derivado dos domínios variáveis de clone 4F1 pode detectar a variação de número de cópias, conforme mostrado pela imunocoloração de pulmão de camundongo transgênico (Tg) ITGB8 BAC incrustado com parafina fixado com formalina. São mostradas três linhagens de camundongos Tg (B, C e D) em comparação com o WT (painel inferior). Os números de cópias são como se segue: 1 cópia (D---linhagem BAC/WT), 2 cópias (B e C---linhagem BAC/WT; D---linhagem BAC/BAC) ou 4 cópias (B e C---linhagem BAC/BAC).

[00027] Figura 10: IgG de coelho monoclonal recombinante derivado dos domínios variáveis de clone 4F1 pode detectar expressão de αvβ8 pela imunocoloração de pulmão fibrótico humano incrustado de parafina fixado com formalina. As setas indicam a coloração de células fusiformes, representando os fibroblastos incluídos no tecido conjuntivo fibroso denso.

[00028] Figuras 11A- B: Sequência variável de cadeia pesada para uma variedade de anticorpos descobertos e subsequentes variantes amadurecidas por afinidade (com “Mut” na designação). Os aminoácidos em negrito e sublinhados indicam alterações das sequências da região variável de cadeia pesada de anticorpo oririginal (“wt”).

[00029] Figuras 12A-B: Sequência variável da cadeia leve de uma variedade de anticorpos descobertos e subsequentes variantes amadurecidas por afinidade (com “Mut” na designação). Os aminoácidos em negrito e sublinhados indicam alterações das sequências da região variável de cadeia leve de anticorpo original (“wt”). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Introdução

[00030] O fator de crescimento transformante β (TGF-β) foi originalmente caracterizado como um oncogene capaz de induzir um fenótipo transformado em células não neoplásicas. Vários membros da família de TGF-β foram desde então caracterizados, com base na presença de domínios de aminoácido semelhantes.

[00031] Algumas isoformas de TGF-β são expressas ubiquamente em mamíferos (TGF-β 1-3), mas são mantidas em uma forma inativa mediante a interação não covalente com um pró-peptídeo, o domínio associado de latência de TGF-β (LAP). Para o TGF-β sinalizar, deve ser liberado do seu complexo inativo por um processo chamado de ativação de TGF-β, O complexo de TGF latente inclui 3 porções: o dímero de TGF-β ativo (maduro), LAP (peptídeo associado à latência) e LTBP (proteína de ligação de TGF-β latente). LAP é um dímero, ligado por uma ligação de dissulfeto, que representa a extremidade N-terminal da proteína precursora de TGF-β. A proteína de TGF-β madura representa a extremidade C-terminal (ao redor de 25 kD) do precursor. A ligação entre o TGF-β e o LAP é clivado proteoliticamente dentro do Golgi, mas o pró-peptídeo de TGF-β permanece ligado ao TGF-β através das interações não covalentes. O complexo de TGF-β e LAP é chamado o pequeno complexo latente (SLC). É a associação de LAP e TGF-β que confere a latência. A ligação de LAP-TGF-β é reversível e as porções purificadas isoladas podem recombinar para formar um SLC inativo. Tanto o SLC quanto o complexo maior são aqui referidos como TGF-β latente, já que ambos são inativos.

[00032] Em geral, as integrinas são as moléculas de adesão e servem de mediador da ligação de células às proteínas de matriz extracelular. A integrina αvβ8 se liga ao LAP do TGF-β e serve de mediador da ativação de TGF-β1 e 3 (Mu et al. (2002) J. Cell Biol. 159:493). A ativação mediada pela integrina αvβ8 do TGF-β é requerida para a ativação in vivo do TGF-β (isto é, a liberação do polipeptídeo de TGF-β maduro), assim o αvβ8 é uma cancela da função de TGF-β. A integrina αvβ8 é expressa no epitélio normal (por exemplo, epitélios das vias aéreas), células mesenquimatosas, e tecidos neuronais. Os resultados aqui apresentados indicam que a ativação mediada pela integrina αvβ8 de TGF-β pode resultar em COPD, fibrose pulmonar, artrite, doença inflamatória do intestino, fibrose hepática e renal, doenças auto-imunes cerebrais inflamatórias e doenças desmielinizantes (por exemplo, MS, mielite transversa, doença de Devic, síndrome de Guillain-Barré), neuroinflamação, doença renal e crescimento do câncer e metástases.

Definições

[00033] A não ser que de outra maneira definidos, os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade prática na técnica. Ver, por exemplo, Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4th ed. 2007); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos podem ser utilizados na prática desta invenção. As seguintes definições são fornecidas para facilitar a compreensão de certos termos frequentemente utilizados neste documento e não se destinam a limitar o escopo da presente divulgação.

[00034] Os termos “anticorpo anti-αvβ8”, “anticorpo específico de αvβ8”, “anticorpo de αvβ8” e “anti-αvβ8” são aqui usados sinonimicamente para referir-se a um anticorpo que especificamente se liga ao αvβ8. Similarmente, um anticorpo anti-αvβ8 (e termos semelhantes) refere-se a um anticorpo que especificamente se liga ao β8. Os anticorpos anti-αvβ8 e os anticorpo anti-β8 aqui descritos se ligam à proteína expressa sobre as células de expressão de αvβ8.

[00035] Uma célula fixa é aquela que foi tratada para inibir o metabolismo das células e preservar a célula para caracterização. A fixação é geralmente praticada na técnica, por exemplo, para observar as características citológicas através da histologia, ou para observar a expressão do marcador da superfície celular mediante a imunocoloração e/ou citometria de fluxo. Uma pessoa de habilidade compreenderá que uma célula pode ser fixada em qualquer uma de várias soluções de fixação conhecidas compreendendo, por exemplo, formalina, formaldeído, paraformaldeído, metanol, acetona, etc. Os tecidos podem ser fixados de uma forma semelhante.

[00036] Um distúrbio associado com αvβ8 é uma condição caracterizada pela presença de expressão de αvβ8, células que expressam um nível aumentado de αvβ8, ou número aumentado de células de expressão de αvβ8 em relação a um controlo normal não doente. Os distúrbios associados com o TGF-β (distúrbios caracterizados por uma atividade de TGF-β maior do que o normal) incluem os distúrbios associados com o αvβ8, quando o αvβ8 está envolvido na ativação de TGF-β em certas circunstâncias, como aqui descrito.

[00037] “Ácido nucleico” refere-se à desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e seus polímeros na forma de filamento único ou duplo, e seus complementos. O termo “polinucleotídeo” refere-se a uma sequência linear de nucleotídeos. O termo “nucleotídeo” tipicamente se refere a uma única unidade de um polinucleotídeo, isto é, um monômero. Os nucleotídeos podem ser ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, ou as suas versões modificadas. Exemplos de polinucleotídeos aqui contemplados incluem o DNA de filamento único e duplo, RNA de filamento único e duplo (incluindo siRNA) e moléculas híbridas tendo misturas de DNA e RNA de filamento único e duplo.

[00038] A palavra “complementar” ou “complementaridade” refere-se à capacidade de um ácido nucleico em um polinucleotídeo de formar um par de bases com outro ácido nucleico em um segundo polinucleotídeo. Por exemplo, a sequência de A-G-T é complementar à sequência de T- C-A. A complementaridade pode ser parcial, em que apenas uma parte dos ácidos nucleicos se iguala de acordo com o pareamento de base, ou se completa, onde todos os ácidos nucleicos se correspondem de acordo com o pareamento de base.

[00039] Uma variedade de métodos das medições específicas de DNA e RNA que utilizam as técnicas de hibridização de ácido nucleico é conhecida por aqueles de habilidade na técnica (ver, Sambrook, id.). Alguns métodos envolvem a separação eletroforética (por exemplo, Southern blot para a detecção de DNA e Northern blot para a detecção de RNA), mas a medição de DNA e RNA também pode ser realizada na ausência de separação por eletroforese (por exemplo, PCR quantitativa, manchas-pontos, ou disposição).

[00040] As palavras “proteína”, “peptídeo” e “polipeptídeo” são utilizadas de modo trocável para significar um polímero de aminoácido ou um conjunto de dois ou mais polímeros de aminoácido de interação ou ligação. Os termos se aplicam aos polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um produto químico artificial mimético de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como aos polímeros de aminoácido de ocorrência natural, aqueles contendo resíduos modificados, e polímero de aminoácido de ocorrência não natural.

[00041] O termo “aminoácido” refere-se aos aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, assim como os análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam de modo semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, assim como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, e O-fosfoserina. Análogos de aminoácido referem-se aos compostos que possuem a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural, por exemplo, um α carbono que está ligado a um hidrogênio, um grupo de carboxila, um grupo de amino, e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfônio de metionina. Tais análogos podem ter grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais de peptídeo modificado, mas retêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Os miméticos de aminoácido referem-se aos compostos químicos que possuem uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de forma semelhante em um aminoácido de ocorrência natural.

[00042] Os aminoácidos podem ser referidos aqui pelos seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides, da mesma maneira, podem ser referidos pelos seus códigos de uma só letra comumente aceitos.

[00043] “Variantes conservativamente modificadas” se aplica nas sequências tanto de aminoácido quanto de ácido nucleico. No que diz respeito às sequências de ácido nucleico particulares, as variantes conservativamente modificadas referem-se aos ácidos nucleicos que codificam as sequências de aminoácido idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácido, para essencialmente idêntica ou associada, por exemplo, sequências naturalmente contíguas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica a maior parte das proteínas. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina for especificada por um códon, o códon pode ser alterado para outro a partir dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são “variações silenciosas”, que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácido nucleico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve as variações silenciosas do ácido nucleico. Uma pessoa de habilidade reconhecerá que em certos contextos cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é normalmente o único códon para metionina, e TGG, que é normalmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, as variações silenciosas de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo estão implícitas em uma sequência descrita em relação ao produto de expressão, mas não em relação às sequências de sonda real.

[00044] Como para as sequências de aminoácido, uma pessoa de habilidade reconhecerá que as substituições individuais, deleções ou adições de um ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou sequência de proteína que altera, adiciona ou elimina um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma “variante conservativamente modificada”, onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são além das variantes polimórficas, homólogos entre espécies e alelos da invenção, e não a excluem. Os seguintes aminoácidos são tipicamente substituições conservadoras entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)).

[00045] Os termos “idêntico” ou “identidade percentual”, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos, ou dois ou mais polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou possuem uma porcentagem específica de nucleotídeos, ou aminoácidos, que são os mesmos (isto é, cerca de 60% de identidade, preferivelmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou identidade superior ao longo de uma região especificada, quando comparada e alinhada com relação à correspondência máxima sobre uma margem de comparação ou região designada) como medido utilizando um BLAST ou algoritmos de comparação da sequência BLAST 2.0 com os parâmetros básicos, ou por alinhamento manual e inspeção visual. Ver, por exemplo, o site da web NCBI em ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Tais sequências são então ditas de ser “substancialmente idênticas”. Esta definição também se refere, ou pode ser aplicada, ao complemento de uma sequência de teste de nucleotídeo. A definição inclui também as sequências que possuem anulações e/ou adições, assim como aquelas que possuem substituições. Como descrito abaixo, os algoritmos podem ser responsáveis por lacunas e semelhantes. Tipicamente, existe identidade ao longo de uma região compreendendo um epítopo de anticorpo, ou uma sequência que é pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou ao longo de uma região que é de 50 a 100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou ao longo de todo o comprimento da sequência de referência.

[00046] O termo “recombinante” quando utilizado com referência, por exemplo, a uma célula ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, o ácido nucleico, a proteína ou o vetor foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativa, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não são observados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outra forma anormalmente expressos, sub-expressos ou não expressos em absoluto.

[00047] O termo “heterólogo” quando usado com referência às partes de um ácido nucleico indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não são observadas na mesma conexão entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de modo recombinante, tendo duas ou mais sequências de genes não relacionados dispostas para produzir um novo ácido nucleico funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte. Similarmente, uma proteína heteróloga indica que a proteína inclui duas ou mais subsequências que não se observam na mesma conexão entre si na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).

[00048] O termo “anticorpo” refere-se a um polipeptídeo que compreende uma região de estrutura de um gene de imunoglobulina, ou seus fragmentos, que especificamente se ligam e reconhecem um antígeno, por exemplo, β8, um marcador da superfície celular particular, ou qualquer alvo desejado. Tipicamente, a “região variável” contém a região de ligação ao antígeno do anticorpo (ou seu equivalente funcional) e é mais crítica na especificidade e afinidade de ligação. Ver Paul, Fundamental Immunology (2003).

[00049] Uma unidade estrutural de imunoglobulina exemplar (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia “leve” (ao redor de 25 kD) e uma “pesada” (ao redor de 50 a 70 kDa). O N-terminal de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) referem-se a estas cadeias leves e pesadas, respectivamente.

[00050] Um “isotipo” é uma classe de anticorpos definida pela região constante de cadeia pesada. Os genes de imunoglobulina incluem os genes da região constante capa, lambda, alfa, gama, delta, epsilo e mu. As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou epsilo, que por sua vez definem as classes de isotipo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

[00051] Os anticorpos podem existir como imunoglobulinas intactas ou como qualquer um de vários fragmentos bem caracterizados que incluem a atividade de ligação ao antígeno específica. Tais fragmentos podem ser produzidos pela digestão com várias peptidases. A pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações de dissulfeto na região da dobradiça para produzir F(ab)’2, um dímero de Fab que por si só é uma cadeia leve unida a VH-CH1 através de uma ligação de dissulfeto. O F(ab)’2 pode ser reduzido sob condições suaves para quebrar a ligação de dissulfeto na região da dobradição, convertendo assim o dímero F(ab)’2 em um monômero de Fab’. O monômero de Fab’ é essencialmente Fab com parte da região da dobradiça (ver Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993). Embora vários fragmentos de anticorpo são definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, uma pessoa de habilidade observará que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo quimicamente ou mediante a utilização da metodologia de DNA recombinante. Assim, o termo anticorpo, como aqui usado, também inclui os fragmentos de anticorpo produzidos pela modificação de anticorpos inteiros, ou aqueles sintetizados de novo utilizando as metodologias de DNA recombinante (por exemplo, Fv de cadeia única) ou aqueles identificados utilizando bibliotecas de apresentação de fagos (ver, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).

[00052] Um “anticorpo monoclonal” refere-se a uma preparação clonal de anticorpos com uma especificidade de ligação única e afinidade para um determinado epítopo em um antígeno. Um “anticorpo policlonal” refere-se à uma preparação de anticorpos que são criados contra um único antígeno, mas com diferentes especificidades e afinidades de ligação.

[00053] Como aqui utilizado, “região V” refere-se a um domínio da região variável do anticorpo que compreende os segmentos da Estrutura 1, CDR1, Estrutura 2, CDR2, Estrutura 3, CDR3, e Estrutura 4. Estes segmentos são incluídos no segmento V como uma consequência do rearranjo dos genes da região V de cadeia pesada e cadeia leve durante a diferenciação de células B.

[00054] Como aqui utilizado, “região determinante da complementaridade (CDR)” refere-se às três regiões hipervariáveis em cada cadeia que interrompem as quatro regiões de “estrutura” estabelecidas pelas regiões variáveis de cadeia leve e pesada. As CDRs são essencialmente responsáveis pela ligação a um epítopo de um antígeno. As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente começando do N- terminal, e também são tipicamente identificadas pela cadeia em que a CDR particular está localizada. Assim, uma VH CDR3 está localizada no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo em que é encontrada, enquanto que uma VL CDR1 é a CDR1 do domínio variável da cadeia leve do anticorpo em que se encontra.

[00055] As sequências das regiões da estrutura de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região da estrutura de um anticorpo, isto é, as regiões da estrutura combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDRs no espaço tridimensional.

[00056] As sequências de aminoácido das CDRs e as regiões da estrutura podem ser determinadas utilizando várias definições bem conhecidos na técnica, por exemplo, Kabat, Chothia, international ImMunoGeneTics database (IMGT), e AbM (ver, por exemplo, Johnson et al., supra; Chothia & Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342, 877-883; Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol 1997, 273(4)). As definições dos sítios de combinação do antígeno também são descritos nos seguintes: Ruiz et al. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); e Lefranc Nucleic Acids Res. Jan 1;29(1):207-9 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996); e Martin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 92689272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol., 203: 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992); e Rees et al, InSternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996).

[00057] Um “anticorpo quimérico” é uma molécula de anticorpo na qual (a) a região constante, ou uma parte desta, é alterada, substituída ou trocada de modo que o local de ligação ao antígeno (região variável, CDR, ou suas partes) esteja ligado a uma região constante de uma classe, função efetora e/ou espécie diferente ou alterada, ou uma molécula totalmente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico (por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, medicamento, etc.); ou (b) a região variável, ou uma parte desta, é alterada, substituída ou trocada com uma região variável tendo uma especificidade ao antígeno diferente ou alterada (por exemplo, CDR e regiões da estrutura de espécies diferentes).

[00058] O anticorpo se liga a um “epítopo” no antígeno. O epítopo é o sítio de interação da ligação do anticorpo específico sobre o antígeno, e podem incluir alguns aminoácidos ou partes de alguns aminoácidos, por exemplo, 5 ou 6, ou mais, por exemplo, 20 ou mais aminoácidos, ou partes daqueles aminoácidos. Em alguns casos, o epítopo inclui porções não proteicas, por exemplo, a partir de um carboidrato, ácido nucleico ou lipídeo. Em alguns casos, o epítopo é um radical tri dimensional. Assim, por exemplo, onde o alvo for uma proteína, o epítopo pode ser compreendido de aminoácidos consecutivos, ou aminoácidos de diferentes partes da proteína que são levadas em proximidade pelo dobramento das proteínas (por exemplo, um epítopo descontínuo). O mesmo é verdadeiro para outros tipos de moléculas alvo que formam estruturas tridimensionais.

[00059] O termo “especificamente se liga” refere-se a uma molécula (por exemplo, o anticorpo ou fragmento de anticorpo) que se liga a um alvo com pelo menos afinidade duas vezes maior do que os compostos não alvo, por exemplo, pelo menos, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior afinidade. Por exemplo, um anticorpo que especificamente se liga ao β8 tipicamente se ligará ao β8 com pelo menos uma afinidade 2 vezes maior do que um alvo não β8 (por exemplo, uma subunidade de integrina diferente, por exemplo, β6).

[00060] O termo “se liga” em relação a um tipo de célula (por exemplo, um anticorpo que se liga às células fibróticas, hepatócitos, condrócitos, etc.), tipicamente indica que um agente se liga a uma maioria das células em uma população pura destas células. Por exemplo, um anticorpo que se liga a um determinado tipo de célula tipicamente se liga a pelo menos 2/3 das células em uma população de células indicadas (por exemplo, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%). Uma pessoa de habilidade reconhecerá que alguma variação irá surgir dependendo do método e/ou do limite da ligação determinante.

[00061] Como aqui utilizado, um primeiro anticorpo, ou uma parte de ligação ao antígeno deste, “compete” para a ligação a um alvo com um segundo anticorpo, ou uma parte de ligação ao antígeno desta, quando a ligação do segundo anticorpo com o alvo é detectavelmente reduzida na presença do primeiro anticorpo em comparação com a ligação do segundo anticorpo na ausência do primeiro anticorpo. A alternativa, onde a ligação do primeiro anticorpo ao alvo também é detectavelmente reduzida na presença do segundo anticorpo, pode, mas não necessita ser o caso. Isto é, um segundo anticorpo pode inibir a ligação de um primeiro anticorpo ao alvo sem que primeiro anticorpo iniba a ligação do segundo anticorpo ao alvo. No entanto, onde cada anticorpo de forma detectável inibe a ligação de outro anticorpo ao seu epítopo ou ligando cognato, quer na mesma, maior ou menor extensão, os anticorpos são ditos de “competir mutuamente” entre si para a ligação dos seus respectivos epítopos. Os anticorpos tanto de competição quanto de competição mútua são incluídos pela presente invenção. O termo anticorpo “competidor” pode ser aplicado ao primeiro ou segundo anticorpo como pode ser determinado por uma pessoa de habilidade na técnica. Em alguns casos, a presença do anticorpo competidor (por exemplo, o primeiro anticorpo) reduz a ligação do segundo anticorpo ao alvo em pelo menos 10%, por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou mais, por exemplo, de modo que a ligação do segundo anticorpo ao alvo seja indetectável na presença do primeiro anticorpo (competidor).

[00062] O termo “diferencialmente expresso” ou “diferencialmente regulado” refere-se de uma forma geral a um biomarcador de proteína ou ácido nucleico que é super-expresso (supra-regulado) ou sub- expresso (infra-regulado) em uma amostra em relação a pelo menos uma outra amostra. No contexto da presente invenção, o termo geralmente se refere à super-expressão de um biomarcador (por exemplo, αvβ8) em uma célula doente em comparação com uma célula normal.

[00063] Por exemplo, os termos “super-expresso” ou “supra- regulado” de modo trocável referem-se a uma proteína ou um ácido nucleico, geralmente um biomarcador, que é transcrito ou transladado em um nível detectavelmente maior do que o nível de controle. O termo inclui a super-expressão devido à transcrição, processamento pós- transcricional, translação, processamento pós-translação, localização celular (por exemplo, organela, citoplasma, núcleo, superfície celular), e RNA e a estabilidade da proteína. A super-expressão pode ser detectada utilizando técnicas convencionais para detectar os biomarcadores, quer mRNA (isto é, por RT-PCR, hibridação) quer proteína (isto é, citometria de fluxo, formação de imagens, ELISA, técnicas imunoistoquímicas). A super-expressão pode ser 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais, em comparação com uma célula normal.

[00064] Os termos “agonista”, “ativador”, “indutor” e termos semelhantes referem-se às moléculas que aumentam a atividade ou a expressão em comparação com um controle. Os agonistas são agentes que, por exemplo, se ligam, estimulam, aumentam, ativam, intensificam a ativação, sensibilizam ou supra-regulam a atividade do alvo. A expressão ou atividade pode ser aumentada 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que aquela em um controle. Em certos casos, a ativação é 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes ou mais em comparação com um controle.

[00065] Os termos “inibidor”, “repressor” ou “antagonista” ou “infra- regulador” de modo trocável se referem a uma substância que resulta em uma expressão ou nível de atividade detectavelmente mais baixa em comparação com um controle. A expressão ou atividade inibida pode ser 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou menor do que aquela de um controle. Em certos casos, a inibição é 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, ou mais em comparação com um controle.

[00066] Uma amostra de “controle” ou valor refere-se a uma amostra que serve como uma referência, geralmente uma referência conhecida, para a comparação à uma amostra de teste. Por exemplo, uma amostra de teste pode ser tomada de uma condição de teste, por exemplo, na presença de um composto de teste, e comparada com as amostras das condições conhecidas, por exemplo, na ausência do composto de teste (controle negativo), ou na presença de um composto conhecido (controle positivo). Um controle também pode representar um valor médio acumulado de vários testes ou resultados. Uma pessoa de habilidade na técnica irá reconhecer que os controles podem ser designados para a avaliação de qualquer número de parâmetros. Por exemplo, um controle pode ser planejado para comparar o benefício terapêutico baseado em dados farmacológicos (por exemplo, meia-vida) ou medidas terapêuticas (por exemplo, comparação de benefício e/ou efeitos colaterais). Os controles podem ser designados para aplicações in vitro. Uma pessoa de habilidade na técnica entenderá que os controles são valiosos em uma determinada situação e será capaz de analisar os dados com base nas comparações com os valores de controlo. Os controles também são valiosos para a determinação da importância dos dados. Por exemplo, se os valores para um determinado parâmetro forem amplamente variantes nos controles, variação nas amostras de teste não será considerada como significativa.

[00067] Um “rótulo” ou uma “porção detectável” é uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, químicos, ou outros físicos. Por exemplo, os rótulos úteis incluem 32P, tinturas fluorescentes, reagentes densos de elétrons, enzimas (por exemplo, como comumente usado em um ELISA), biotina, digoxigenina ou haptenos e proteínas ou outras entidades que possam se tornar detectáveis, por exemplo, através da incorporação de um radiorrótulo em um peptídeo ou anticorpo especificamente reativo com um peptídeo alvo. Qualquer método conhecido na técnica para conjugar um anticorpo ao rótulo pode ser empregado, por exemplo, utilizando os métodos descritos em Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.

[00068] Uma molécula “rotulada” (por exemplo, ácido nucleico, proteína ou anticorpo) é aquela que é ligada, covalentemente, através de um ligante ou uma ligação química, ou de forma não covalente, através das ligações iônicas, de van der Waals, eletrostáticas ou de hidrogênio a um rótulo tal que a presença da molécula possa ser detectada através da detecção da presença do rótulo ligado à molécula.

[00069] O termo “diagnóstico” refere-se a uma probabilidade relativa de que um distúrbio tal como câncer ou uma condição inflamatória está presente no indivíduo. Similarmente, o termo “prognóstico” refere-se a uma probabilidade relativa de que um determinado resultado futuro pode ocorrer no indivíduo. Por exemplo, o prognóstico pode referir-se à probabilidade de que um indivíduo irá desenvolver um distúrbio associado com o TGF-β ou αvβ8, ter recaída, ou a provável gravidade da doença (por exemplo, a gravidade dos sintomas, a taxa de declínio funcional, sobrevivência, etc.). Os termos não se destinam a ser absolutos, como será observado por qualquer um de habilidade na área de diagnósticos médicos.

[00070] A “biópsia” ou “amostra biológica de um paciente” como aqui usado refere-se à uma amostra obtida de um paciente tendo, ou suspeito de ter, um distúrbio associado com TGF-β ou αvβ8. Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma biópsia de tecido, tal como a biópsia de agulha, biópsia com agulha fina, biópsia cirúrgica, etc. A amostra também pode ser uma amostra de sangue ou fração do sangue, por exemplo, fração de glóbulos brancos do sangue, soro ou plasma. A amostra pode compreender uma amostra de tecido que abriga uma lesão ou lesão suspeita, embora a amostra biológica também possa ser derivada de outro local, por exemplo, um local de metástase suspeita, um linfonodo, ou do sangue. Em alguns casos, a amostra biológica também pode ser de uma região adjacente à lesão ou lesão suspeita.

[00071] Uma “amostra biológica” pode ser obtida de um paciente, por exemplo, uma biópsia, de um animal, tal como um modelo animal, ou de células cultivadas, por exemplo, uma linhagem celular ou células removidas de um paciente e cultivadas em cultura para observação. As amostras biológicas incluem tecidos e fluidos corpóreos, por exemplo, sangue, frações de sangue, linfa, saliva, urina, fezes, etc.

[00072] Os termos “terapia”, “tratamento” e “melhora” referem-se a qualquer redução na gravidade dos sintomas. No caso de tratamento de uma condição inflamatória, o tratamento pode referir-se à redução, por exemplo, dos níveis sanguíneos de citocinas inflamatórias, dos níveis sanguíneos de TGF-β maduro ativo, dor, inchaço, recrutamento de células imunes, etc. No caso de tratamento de câncer, o tratamento pode referir-se à redução, por exemplo, do tamanho do tumor, do número de células cancerosas, da taxa de crescimento, da atividade metastática, da morte celular de células não cancerosas, etc. Como aqui utilizado, os termos “tratar” e “prevenir”, não se destinam a ser termos absolutos. Tratamento e prevenção podem se referir a qualquer atraso no início, melhora dos sintomas, melhora na sobrevida do paciente, aumento do tempo de sobrevida ou taxa, etc. Tratamento e prevenção podem ser completos (nenhum sintoma detectável remanescente) ou parciais, de tal modo que os sintomas sejam menos frequentes de grave do que em um paciente sem o tratamento aqui descrito. O efeito do tratamento pode ser comparado a um indivíduo ou grupo de indivíduos que não recebem o tratamento, ou ao mesmo paciente antes de tratamento ou em um momento diferente durante o tratamento. Em alguns aspectos, a gravidade da doença é reduzida em pelo menos 10%, em comparação, por exemplo, com o indivíduo antes da administração ou com um indivíduo de controlo não submetido ao tratamento. Em alguns aspectos a gravidade da doença é reduzida em pelo menos 25%, 50%, 75%, 80% ou 90%, ou em alguns casos, não mais detectável utilizando as técnicas de diagnóstico padrão.

[00073] Os termos “quantidade eficaz”, “dose eficaz”, “quantidade terapeuticamente eficaz”, etc, referem-se àquela quantidade do agente terapêutico suficiente para melhorar um distúrbio, como descrito acima. Por exemplo, para o parâmetro dado, uma quantidade terapeuticamente eficaz irá mostrar um aumento ou diminuição do efeito terapêutico pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, ou pelo menos 100%. A eficácia terapêutica também pode ser expressa como aumento ou diminuição “dobrado”. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ter pelo menos 1,2 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 5 vezes, ou mais efeitos sobre um controle.

[00074] Como aqui utilizado, o termo “farmaceuticamente aceitável” é utilizado como de forma sinônima com fisiologicamente aceitável e farmacologicamente aceitável. Uma composição farmacêutica geralmente compreenderá agentes para tamponamento e conservação na armazenagem, e poderá incluir tampões e portadores para a liberação apropriada, dependendo da via de administração.

[00075] Os termos “dose” e “dosagem” são aqui utilizados de modo trocável. Uma dose refere-se à quantidade de ingrediente ativo dada a um indivíduo em cada administração. Pela presente invenção, a dose pode referir-se à concentração do anticorpo ou porções associadas, por exemplo, a quantidade de agente terapêutico ou dosagem de radiorrótulo. A dose irá variar dependendo de vários fatores, incluindo a frequência de administração, o tamanho e a tolerância do indivíduo; a gravidade da condição; o risco de efeitos colaterais; a via de administração; e a modalidade de formação imagem da porção detectável (se presente). Uma pessoa de habilidade na técnica irá reconhecer que a dosagem pode ser modificada dependendo dos fatores acima ou com base no progresso terapêutico. O termo “forma de dosagem” refere-se ao formato particular do produto farmacêutico, e depende da via de administração. Por exemplo, uma forma de dosagem pode estar em uma forma líquida, por exemplo, uma solução salina para injeção.

[00076] “Sujeito”, “paciente”, “indivíduo” e termos semelhantes são utilizados de modo trocável e referem-se, exceto onde indicado, aos mamíferos tais como os seres humanos e primatas não humanos, assim como coelhos, ratos, camundongos, cabras, porcos, e outras espécies de mamífero. O termo não indica necessariamente que o indivíduo tenha sido diagnosticado com uma doença particular, mas tipicamente se refere a um indivíduo sob supervisão médica. Um paciente pode ser um indivíduo que está buscando tratamento, monitoramento, ajuste ou modificação de um regime terapêutico existente, etc.

[00077] Uma “condição inflamatória” refere-se a qualquer inflamação em um indivíduo, e pode ser transitória (por exemplo, em resposta à exposição a um patógeno ou alergeno) ou crônica. A inflamação é caracterizada por citocinas inflamatórias tais como o IFN-gama, IL-6 e TNF-alfa que recrutam e ativam os macrófagos e outros leucócitos. Em alguns casos, a inflamação pode evoluir para uma condição crônica nociva ou condição auto-imune (por exemplo, MS, lúpus, artrite reumatóide, doença de Crohn). A inflamação pode ser evidente localmente (por exemplo, em um sítio localizado de infecção ou exposição) ou sistemicamente (por exemplo, aterosclerose, hipertensão arterial). Em algumas modalidades, as composições de anticorpos e os métodos aqui descritos podem ser utilizados para tratar as condições inflamatórias.

[00078] Os termos “câncer”, “tumor”, “transformado” e termos semelhantes incluem as células pré-cancerosas, neoplásicas, transformadas e cancerosas, e podem se referir a um tumor sólido, ou um câncer não sólido (ver, por exemplo, Edge et al. AJCC Cancer Staging Manual (7th ed. 2009); Cibas and Ducatman Cytology: Diagnostic principles and clinical correlates (3rd ed. 2009)). O câncer inclui tumores tanto benignos quanto malignos (crescimento anormal). “Transformação” refere-se às alterações fenotípicas espontâneas ou induzidas, por exemplo, imortalização de células, alterações morfológicas, crescimento celular aberrante, inibição reduzida de contato e ancoragem e/ou malignidade (ver, Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)). Embora a transformação possa surgir a partir da infecção com um vírus de transformação e incorporação de novo DNA genômico, ou absorção de DNA exógeno, também pode surgir espontaneamente ou após a exposição a um agente cancerígeno.

[00079] O termo “câncer” pode referir-se aos carcinomas, sarcomas, adenocarcinomas, linfomas, leucemias, cânceres sólidos e linfóides, etc. Exemplos de diferentes tipos de câncer incluem, mas não são limitados a estes, câncer do pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas ou NSCLC), câncer de ovário, câncer de próstata, câncer colorretal, câncer de fígado (isto é, hepatocarcinoma), câncer renal (isto é, carcinoma de células renais), câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de tireóide, câncer pleural, câncer de pâncreas, câncer do útero, câncer do colo do útero, câncer testicular, câncer anal, câncer pancreático, câncer do duto biliar, tumores carcinóides gastrointestinais, câncer de esôfago, câncer da vesícula biliar, cancro do apêndice, câncer do intestino delgado, cance do estômago (gástrico), câncer do sistema nervoso central, câncer de pele, coriocarcinoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de sangue, osteossarcoma, fibrossarcoma, neuroblastoma, glioma, melanoma, linfoma de células B, linfoma não Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfoma de pequenas células, linfoma de grandes células, leucemia monocítica, leucemia mielóide, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielóide aguda (AML), leucemia mielóide crônica (CML) e mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, as composições de anticorpos e os métodos aqui descritos podem ser utilizados para o tratamento de câncer.

Anticorpos específicos para αvβ837E1B5 Humanizado

[00080] O anticorpo monoclonal de camundongo 37E1 (IgG2a) seletivamente bloqueia a interação da integrina αvβ8 humana com o seu ligando, fator-β do crescimento transformante (TGF-β). O anticorpo é distinto na medida em que seletivamente bloqueia a ativação mediada por αvβ8 de TGF-β (liberação do polipeptídeo de TGF-β maduro), mas não impede a ligação de αvβ8 ao TGF-β imobilizado ou secretado. Isto proporciona um elevado grau de seletividade na perturbação da ativação de TGF-β única, nem nas propriedades de adesão celular do αvβ8. Além disso, a inativação sistêmica de TGF-β é indesejável em alguns casos. A atividade específica do anticorpo 37E1 fornece uma ferramenta terapêutica direcionada para a redução dos níveis de TGF- β.

[00081] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 37E1 foram refinadas para produzir um anticorpo com afinidade mais elevada. A Figura 1 mostra as substituições específicas de aminoácido que conferem maior afinidade para o mesmo epítopo sobre β8. O anticorpo melhorado (maior afinidade) foi nomeado 37E1B5. Ele mostra o aumento da afinidade in vitro e eficácia mais forte na inibição da ativação mediada pela integrina αvβ8 de TGF-β nas células cultivadas. A dose terapêutica eficaz do anticorpo 37E1B5 in vitro está na faixa picomolar. Uma versão humanizada de 37E1B5, que retém a ligação de alta afinidade de β8, foi gerada, como mostrado na Figura 1. Tal como acontece com os anticorpos 37E1 e 37E1B5 de origem, o 37E1B5 humanizado bloqueia a ativação mediada por αvβ8 de TGF-β, mas não impede a ligação de αvβ8 ao TGF-β imobilizado ou secretado.

[00082] Consequentemente, são fornecidos anticorpos que possuem CDRs de cadeia pesada 1-3 como observado nas sequências de cadeia pesada variáveis da SEQ ID NOs: 4, 6 e 8. As sequências de CDRs de cadeia pesada 1-3 são RYWMS (SEQ ID NO: 94),EINPDSSTINYTSSLKD (SEQ ID NO: 95) e LITTEDY (SEQ ID NO: 96), respectivamente. São ainda fornecidos anticorpos que possuem CDRs de cadeia leve 1-3 como observado na sequência de cadeia leve variável SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NOs: 7 e 9. As sequências de CDRs de cadeia leve 1-3 da SEQ ID NO: 5 são KASQDINSYL (SEQ ID NO: 97), RANRLVD (SEQ ID NO: 98) e LQYDEFPYT (SEQ ID NO: 99). As sequências da região variável de cadeia leve SEQ ID NOs: 7 e 9 possuem as mesmas sequências de CDR1 e CDR3 como SEQ ID NO: 5, mas diferem na CDR2 (YANRLVD, SEQ ID NO: 100).

[00083] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos que compreendem:

[00084] uma sequência da região variável de cadeia pesada que compreende as SEQ ID NOs: 94, 95 e 96, e uma sequência da região variável de cadeia leve que compreende as SEQ ID NOs: 97, 98 e 99;

[00085] uma sequência da região variável de cadeia pesada que compreende as SEQ ID NOs: 94, 95 e 96, e uma sequência da região variável de cadeia leve que compreende as SEQ ID NOs: 97, 100 e 99; ou

[00086] uma sequência da região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 6 e 8 e uma sequência da região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 7 e 9, em qualquer combinação.

[00087] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma sequência da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 9.

B. 11E8

[00088] O anticorpo 11E8 liga um epítopo semelhante em sobre αvβ8 como 37E1B5, mas também liga as células fixadas (por exemplo, fixadas com formalina). Semelhante ao 37E1B5, 11E8 especificamente se liga ao αvβ8, e inibe a liberação do petídeo TGF-β ativo maduro, sem inibir a adesão de TGF-β e αvβ8 latentes. Visto que o 11E8 pode ligar o αvβ8 sobre as células tanto não fixadas quanto fixadas por formalina, e pode reduzir a liberação de TGF-β maduro, o 11E8 é útil para a detecção (por exemplo, diagnóstico ou monitoração), terapia, e aplicações combinadas de detecção/terapêuticas.

[00089] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve (com as CDRs sublinhadas) para o anticorpo 11E8 são apresentadas abaixo:

[00090] SEQ ID NO: 10 - região variável de cadeia pesada para 11E8 (as CDRs 1-3 estão sublinhadas; SEQ ID NOs: 48-50, respectivamente)

[00091] EVQLQQSGPELMKTGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQ RPGHGLEWIGDILPGSGTTNYNEKFKGRATVTADRSSNTAYMQLSSL TYGDSAVYYCATWGWDTYWDQGTSVTVSS

[00092] SEQ ID NO: 11 - região variável de cadeia leve para o 11E8 (as CDRs 1-3 estão sublinhadas; SEQ ID NOs: 51-53 respectivamente)

[00093] DIVMTQSPSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKP DGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYC QQYSNLPYTFGGGTKLEIKR

[00094] Consequentemente, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 48, 49 e 50, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 51, 52 e 53. Em algumasmodalidades, os anticorpos compreendem a região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 10 e/ou a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11.

[00095] Como mostrado nas Figuras 11A-B e 12A-B, anticorpos amadurecidos por afinidade de 11E8 foram descobertos e designados 11E8Mut28, 11E8Mut94 e 11E839.

[00096] O anticorpo amadurecido por afinidade 11E8Mut28 tinha uma alteração na CDR3 de cadeia pesada (WGWDSY; SEQ ID NO: 54) e uma alteração na CDR3 de cadeia leve (QQFSNLPYT; SEQ ID NO: 55). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem:

[00097] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOs: 48, 49 e 54, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOs: 51, 52 e 53; ou

[00098] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOs: 48, 49 e 50, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOs: 51, 52 e 55; ou

[00099] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOs: 48, 49 e 54, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOs: 51, 52 e 55.

[000100] 11E8Mut28 também teve alterações na FR3 de cadeiapesada

[000101] (KAAITADTSSNTSYLQLSSLTSEDSAVYYCAR; SEQ ID NO: 56) e FR4 de cadeia pesada (WGQGTLVTVSS; SEQ ID NO: 57). Assim, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 56 ou 57 (por exemplo, SEQ ID NO: 32), e opcionalmente uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 23.

[000102] O anticorpo amadurecido por afinidade 11E8Mut94 possui uma alteração nas CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (DILPGSGTTNYNEKFEG, SEQ ID NO: 90 e WGWDSY, SEQ ID NO: 54, respectivamente). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem:

[000103] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 48, 90 e 54, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 51, 52 e 53.

[000104] 11E8Mut94 também possui alterações na FR2 de cadeiapesada (WVKQRPGHGFEWIG, SEQ ID NO: 91), FR3 de cadeia pesada (RAAITADTSSNTSYMQLSSLTSEDSAVYYCAR, SEQ ID NO: 92) e FR4 de cadeia pesada (WGQGTLVTVSS; SEQ ID NO: 57). Assim, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 91, 92 ou 57 (por exemplo, SEQ ID NO: 88), e opcionalmente uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 89. 11E8Mut94 também possui alterações na FR1 de cadeia leve(DIKMTQTPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO: 93). Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 93, por exemplo, SEQ ID NO: 89, e opcionalmente uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 88.

[000105] O anticorpo amadurecido por afinidade 11E8Mut39 possui uma alteração na CDR1 de cadeia pesada (TYWIE; SEQ ID NO: 112), CDR2 de cadeia leve (HTLPGSGTTNYNEKFKG; SEQ ID NO: 113), CDR1 de cadeia leve (STSQDVSSYLN; SEQ ID NO:105) e CDR2 de cadeia leve (YASNLHS;SEQ ID NO:107). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem:

[000106] CDR de cadeia pesada SEQ ID NOs: 112, 113 e 50, e CDR de cadeia leve SEQ ID NOs: 51, 52 e 53;

[000107] CDR de cadeia pesada SEQ ID NOs: 48, 49 e 50, e CDR de cadeia leve SEQ ID NOs: 105, 107 e 53; ou

[000108] CDR de cadeia pesada SEQ ID NOs: 112, 113 e 50, e CDR de cadeia leve SEQ ID NOs: 105, 107 e 53.

[000109] 11E8Mut39 também possui alterações na FR1 de cadeiapesada (QVQLQQSGPELMKTGASVKISCKATGYTFS; SEQ ID NO: 106) FR3 de cadeia pesada(RATITADRPSNTSYMQLSSLTYGDSAVFYCAT; SEQ ID NO: 114), e FR4 de de cadeia pesada (WDHGTSVTVSS; SEQ ID NO:108). 11E8Mut39 possui alterações na FR1 de cadeia leve (DIMMTQTPSSLSASLGDRVTISC; SEQ ID NO: 115) e FR4 de cadeia leve (FGGGTKLEIKA; SEQ ID NO: 111). Assim, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável da cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 106, 114 ou 108 (por exemplo, SEQ ID NO: 102), e opcionalmente uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 104. Em algumas modalidades, os anticorpos possuem uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 115 ou 111 (por exemplo, SEQ ID NO: 104), e opcionalmente uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 102.

C. 14E5

[000110] O anticorpo 14E5 se liga a um epítopo semelhante sobre αvβ8 como 37E1B5. Semelhante ao 37E1B5, 14E8 especificamente se liga ao αvβ8, mas ao contrário de 37E1B5, 14E5 não inibe a liberação do peptídeo de TGF-β ativo maduro, ou adesão do TGF-β latente ao αvβ8. Visto que o 14E5 é específico para o αvβ8, mas não bloqueia a atividade, é útil para a detecção, por exemplo, aplicações de diagnóstico ou monitoramento in vivo.

[000111] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve (com as CDRs sublinhadas) para o anticorpo 14E5 são apresentadas abaixo:

[000112] SEQ ID NO: 12 - região variável de cadeia pesada para 14E5 (CDRs 1-3 são sublinhadas; SEQ ID NOS: 58-60, respectivamente)

[000113] EVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSTYWIEWIKQR PGHGLEWIGHILPGSVITNYNEKFKGKAAITADTSSNTSYMQLSSLTS EDSAVYYCARWGWDSYWGQGTLVTVSS

[000114] SEQ ID NO: 13 - região variável da cadeia leve para 14E5 (as CDRs 1-3 são sublinhadas; SEQ ID NOS: 61-63, respectivamente)

[000115] DIEMTQSPSSLSASLGDRVTISCSTSQDISSSLNWYQQKP DGTVTLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYC QQYSKLPYTFGGGTKLEIKR

[000116] Consequentemente, os anticorpos são fornecidas os quais compreendem CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 58, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 61, 62 e 63. Em algumasmodalidades, os anticorpos compreendem a região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 12 e/ou a região variável de cadeia leve SEQ ID NO: 13.

[000117] Como mostrado nas Figuras 11A-B e 12A-B, sete anticorpos amadurecidos por afinidade de 14E5 foram descobertos, designados 14E5Mut11, 14E5Mut42, 14E5Mut54, 14E5Mut68, 14E5Mut65,14E5Mut83 e 14E5Mut95. Estes anticorpos amadurecidos por afinidade possuem alterações nas sequências de CDR e FR como demonstrado abaixo. Em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem CDRs e FRs de 14E5 e as formas amadurecidas por afinidade de 14E5 em várias combinações.

[000118] 14E5Mut11 possui uma alteração na CDR1 de cadeiapesada (TNWIE, SEQ ID NO: 64), uma alteração na CDR1 de cadeia leve (SASQGISKYLN, SEQ ID NO: 65), uma alteração na CDR2 de cadeia leve (YTSSLHS, SEQ ID NO: 66), e uma alteração na CDR3 de cadeia leve (QQYSNLPYT, SEQ ID NO: 67). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem combinações das CDRs de 14E5 e 14E5Mut11, por exemplo:

[000119] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 64, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 61, 62 e 63; ou

[000120] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 58, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 65, 66 e 67; ou

[000121] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 64, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 65, 66 e 67.

[000122] 14E5Mut11 também possui alterações nas FR1 e FR2 decadeia leve (DILMTQSPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO: 68 e WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO: 69, respectivamente). Assim, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável da cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 68 ou 69 (por exemplo, SEQ ID NO: 24), e opcionalmente uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 33.

[000123] 14E5Mut42 possui uma alteração na CDR1 de cadeia leve(SASQGISNYLN, SEQ ID NO: 70), uma alteração na CDR2 de cadeia leve (YTSSLHS, SEQ ID NO: 66), e uma alteração na CDR3 de cadeia leve (QQYSDLPYT, SEQ ID NO: 71). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem combinações das CDRs de 14E5 e 14E5Mut42, por exemplo:

[000124] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 58, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 70, 66 e 71.

[000125] 14E5Mut42 também possui alterações na FR1 de cadeiapesada (EVPLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFS, SEQ ID NO: 72) FR1 e FR2 de cadeia leve (DIVMTQTPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO: 73 e WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO: 69, respectivamente). Assim, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 72 (por exemplo, SEQ ID NO: 34), opcionalmente com uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 73 ou 69 (por exemplo, SEQ ID NO: 25), e opcionalmente uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 34.

[000126] 14E5Mut54 tem uma alteração na CDR1 de cadeia pesada(TNWIE, SEQ ID NO: 64), uma alteração na CDR1 de cadeia leve (SASQGISNYLN, SEQ ID NO: 70), uma alteração na CDR2 de cadeia leve (YTSSLHS, SEQ ID NO: 66), e uma alteração na CDR3 de cadeia leve (QQYSNLPYT, SEQ ID NO: 67). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem combinações de CDRs de 14E5 e 14E5Mut54, por exemplo:

[000127] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 64, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 61, 62 e 63; ou

[000128] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 58, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 70, 66 e 67; ou

[000129] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 64, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 70, 66 e 67.

[000130] 14E5Mut54 também possui alterações na FR3 de cadeiapesada (KAAITADTSSNTSYMQLTSLTSEDSAVYYCAR, SEQ ID NO: 74) e nas FR1 e FR2 de cadeia leve (DILMTQTPSSLSASLGDRVTIRC, SEQ ID NO:75 e WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO:69, respectivamente). Assim, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 74 (por exemplo, SEQ ID NO: 35), opcionalmente com uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 75 ou 69 (por exemplo, SEQ ID NO: 26), e opcionalmente uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 35.

[000131] 14E5Mut68 possui uma alteração na CDR2 de cadeiapesada (DILPGSGTTNYNEKFKG, SEQ ID NO: 76), uma alteração na CDR1 de cadeia leve (SASQGISNYLN, SEQ ID NO: 70), uma alteração na CDR2 de cadeia leve (YTSSLHS, SEQ ID NO: 66), e uma alteração na CDR3 de cadeia leve (QQYSELPYT, SEQ ID NO: 77). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem combinações das CDRs de 14E5 e 14E5Mut68, por exemplo:

[000132] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 58, 76 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 61, 62 e 63; ou

[000133] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 58, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 70, 66 e 77; ou

[000134] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 58, 76 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 70, 66 e 77.

[000135] 14E5Mut68 também possui alterações na FR3 de cadeiapesada (RATVTADRSSNTSYMQLSSLTSEDSAVYYCAR, SEQ ID NO: 78) e na FR1 e FR2 de cadeia leve (DIKMTQSPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO: 79 e WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO: 69, respectivamente). Assim, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 78 (por exemplo, SEQ ID NO: 36), opcionalmente com uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 79 ou 69 (por exemplo, SEQ ID NO: 27), e opcionalmente uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 36.

[000136] 14E5Mut65 possui uma alteração na CDR1 de cadeiapesada (TNWIE, SEQ ID NO: 64), uma alteração na CDR1 de cadeia leve (SASQGISNYLN, SEQ ID NO: 70), uma alteração na CDR2 de cadeia leve (YTSSLHS, SEQ ID NO: 66), e uma alteração na CDR3 de cadeia leve (QQFSNLPYT, SEQ ID NO: 80). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem combinações de CDRs de 14E5 e 14E5Mut65, por exemplo:

[000137] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 64, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 61, 62 e 63, ou

[000138] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 58, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 70, 66 e 80, ou

[000139] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 64, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 70, 66 e 80.

[000140] 14E5Mut65 também possui alterações nas FR1 e FR3 de cadeia pesada (QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYSFS, SEQ ID NO: 81 e KAAITADTSSNTSYMQLSSLTSDDSAVYYCAR, SEQ ID NO: 82) e nas FR1 e FR2 de cadeia leve (DIKMTQSPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO: 79 e WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO:69, respectivamente). Assim, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 81 ou 82 (por exemplo, SEQ ID NO: 37), opcionalmente com uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 79 ou 69 (por exemplo, SEQ ID NO: 28), e opcionalmente uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 37.

[000141] 14E5Mut83 possui uma alteração na CDR1 de cadeiapesada (THWIE, SEQ ID NO: 83), uma alteração na CDR1 de cadeia leve (SASQGISNYLN, SEQ ID NO: 70), uma alteração na CDR2 de cadeia leve (YTSSLHS, SEQ ID NO: 66), e uma alteração na CDR3 de cadeia leve (QQYSDLPYT, SEQ ID NO: 71). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem combinações de CDRs de 14E5 e 14E5Mut83, por exemplo:

[000142] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 83, 59 e 60, e CDR de cadeia leve SEQ ID NOS: 61, 62 e 63; ou

[000143] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 58, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 70, 66 e 71; ou

[000144] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 83, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 70, 66 e 71.

[000145] 14E5Mut83 também possui alterações na FR1 de cadeiapesada (EVQLQQSGAVLMKPGASVKISCKATGYTFS, SEQ ID NO: 84) e nas FR1 e FR2 de cadeia leve (DILMTQSPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO: 68 e WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO: 69, respectivamente). Assim, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 84 (por exemplo, SEQ ID NO: 38), opcionalmente com uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 68 ou 69 (por exemplo, SEQ ID NO: 29), e opcionalmente uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 38.

[000146] 14E5Mut95 possui uma alteração na CDR1 de cadeia leve(SASQGISNYLN, SEQ ID NO: 70), uma alteração na CDR2 de cadeia leve (YTSSLHS, SEQ ID NO: 66), e uma alteração na CDR3 de cadeia leve (QQYSDLPYT, SEQ ID NO: 71). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem combinações das CDRs de 14E5 e 14E5Mut95, por exemplo:

[000147] CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 58, 59 e 60, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 70, 66 e 71.

[000148] 14E5Mut95 também possui alterações nas FR1 e FR3 decadeia pesada (EVQLQQTGAELMKPGASVKISCKATGYTFS, SEQ ID NO: 85 e KAVITADTSSNTSYMQLSSLTSEDSAVYYCAR, SEQ ID NO: 86) e nas FR1 e FR2 de cadeia leve (DIEMTQSPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO: 87 e WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO: 69, respectivamente). Assim, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 86 (por exemplo, SEQ ID NO: 39), opcionalmente com uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 87 ou 69 (por exemplo, SEQ ID NO: 30), e opcionalmente uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 29.

D. 6B9

[000149] O anticorpo 6B9 se liga a um epítopo sobre β8 que é incluído nos aminoácidos 61-105 de β8 humano (posições de aminoácido em relação à sequência de β8 de comprimento total mostradas na SEQ ID NO: 17), e não interagem significativamente com β8 de murino. Como mostrado nos exemplos, a serina 95 está envolvida no epítopo (diretamente ligada, ou indiretamente envolvida na estrutura do epítopo), já que a substituição de serina com prolina naquela posição essencialmente elimina a ligação. O anticorpo 6B9 não compete pela ligação com 37E1B5, 11E8 ou 14E5. Além disso, o anticorpo 6B9 pode detectar o β8 sobre as células e tecidos fixados por formalina, e níveis de expressão de β8 distintos, por exemplo, sobre as células que expressam diferentes níveis de β8 (ver os Exemplos, e as Figuras 6 e 8. Os níveis de expressão também podem ser indicativos do número de cópias genômicas de β8 na célula e patogênese.

[000150] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve (com as CDRs sublinhadas) para o anticorpo 6B9 são apresentadas abaixo:

[000151] SEQ ID NO: 18 - região variável de cadeia pesada para 6B9 (CDRs 1-3 estão sublinhadas, SEQ ID NOS: 40-42, respectivamente)

[000152] QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTDYLIEWVKQ RPGQGLEWIGVINPETGGTNYNAKFKGKATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAREAGNYIYAMDYWGQ GTSVTVSS

[000153] SEQ ID NO: 19 - região variável de cadeia leve para 6B9 (CDRs 1-3 estão sublinhadas, SEQ ID NOS: 43-45, respectivamente)

[000154] DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASVNIYSYLVWYQQKQ GKSPQLLVHNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYY CQHHHGTPYTFGGGTKLEIKR

[000155] Consequentemente, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem as CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOs: 40, 41 e 42, e as CDRs de cadeia leve SEQ ID NOs: 43, 44 e 45. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem a região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 18 e/ou a região variável de cadeia leve SEQ ID NO: 19.

[000156] Como mostrado nas Figuras 11A-B e 12A-B, um anticorpo amadurecido por afinidade de 6B9, designado 6B9Mut1, foi descoberto. Notavelmente este anticorpo amadurecido por afinidade possui uma alteração na CDR2 de cadeia pesada (VINPETGGTNYNAKFRG; SEQ ID NO: 46). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem as CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 40, 46 e 42, e CDRs de cadeia leve SEQ ID NOS: 43, 44 e 45.

[000157] 6B9Mut1 também possui uma alteração na FR1 de cadeia leve (DIVMTQSPASLSASVGETVTITC; SEQ ID NO: 47). Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 47 (por exemplo, a região variável pode compreender a SEQ ID NO: 23) e opcionalmente uma região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 18.

E. 4F1

[000158] O anticorpo 4F1 também se liga a um epítopo sobre β8 que é incluído nos aminoácidos 61-105 de β8 (posições de aminoácido em relação à sequência de β8 de comprimento total mostrada na SEQ ID NO: 17), e não interage significativamente com o β8 de murino. Como mostrado nos exemplos, a serina 95 está envolvida no epítopo, já que a substituição de serina com prolina naquela posição essencialmente elimina a ligação. O anticorpo 4F1 não compete pela ligação com 37E1B5, 11E8 ou 14E5. Além disso, o anticorpo 4F1 pode detectar o β8 sobre as células e tecidos não fixados ou fixados por formalina, e os níveis de expressão de β8 distintos, por exemplo, sobre as células que expressam diferentes níveis de β8 (Exemplos e Figuras 6, 7, 9 e 10). Os níveis de expressão também podem ser indicativos do número de cópias genômicas de β8 na célula e patogênese.

[000159] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve (com as CDRs sublinhadas) para os anticorpos 4F1 são apresentadas abaixo:

[000160] SEQ ID NO: 20 - região variável de cadeia pesada para o 4F1 (as CDRs 1-3 estão sublinhadas, SEQ ID NOS: 116-118, respectivamente)

[000161] QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQ RPGQGLEWIGVINPGTGGTNYNKKFKVKATLTADKSSSTAYMQLGGL TFDDSAVYFCAREGNARTYYYAMDYWGQGTSVTVSS

[000162] SEQ ID NO: 21 - região variável de cadeia leve para o 4F1 (as CDRs 1-3 estão sublinhadas, SEQ ID NOS: 119-121,respectivamente)

[000163] DIEMTQTPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLVWYQQKQ GKSPQVLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYY CQHHNGTPYTFGGGTKLEIKR

[000164] Consequentemente, os anticorpos são fornecidos os quais compreendem as CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOS: 116, 117 e 118, e as CDRs de cadeia leve SEQ ID NOs: 119, 120 e 121. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem a região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 20 e/ou a região variável de cadeia leve SEQ ID NO: 21.

F. Anticorpos anti-αvβ8

[000165] São aqui fornecidos anticorpos que especificamente se ligam à integrina αvβ8, mas significativamente não se ligam a outras integrinas (por exemplo, αvβ8, αvβ3, etc.). Os presentes anticorpos se ligam a um epítopo específico ou região do epítopo dentro de αvβ8. O epítopo pode ser um epítopo conformacional (não linear) ou não conformacional. Um tal anticorpo pode se ligar ao β8 isoladamente, isto é, o epítopo está localizado β dentro do β8, ou a um epítopo não linear que compreende partes de ambas as subunidades, ou um epítopo que conta com a interação de αv e β8. Os presentes anticorpos incluem os anticorpos específicos αvβ8 descritos acima, assim como as suas versões humanizadas, quiméricas e/ou rotuladas, e os fragmentos de ligação de αvβ8 e/ou as suas variantes.

[000166] Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao β8 e inibe a ativação do TGF-β, por exemplo, em comparação com a ativação de TGF-β na ausência do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo não reduz a adesão de células que expressam o αvβ8 no TGF-β, isto é, o anticorpo não reduz a adesão celular mediada pelo αvβ8 ao TGF-β. Em algumas modalidades, o anticorpo pode reduzir a ligação de αvβ8 solúvel ao TGF-β, em comparação com a ligação de αvβ8 na ausência do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ligar-se a um epítopo sobre β8 que está dentro da SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o epítopo inclui pelo menos um aminoácido selecionado de aminoácidos R79, I85, S95, P100, I108, P109, R128, H140 e F179 de β8 humano. Em algumas modalidades, o epítopo inclui pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoácidos I74, N88, I107, T110, I125, R175 e F180 de β8 humano. Em algumas modalidades, o epítopo inclui pelo menos um aminoácido selecionado de aminoácidos I125, R128, R175, F179 e F180 de β8 humano Em certas modalidades, o anticorpo se liga ao β8 humano, mas não de camundongo.

[000167] O sítio de ligação, isto é, o epítopo, de um anticorpo incitado contra um determinado antígeno pode ser determinado utilizando os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio de competição (por exemplo, um ELISA competitivo) pode ser realizado utilizando um anticorpo com um epítopo conhecido. Se o anticorpo de teste compete para a ligação ao antígeno, então provavelmente compartilha pelo menos parte do mesmo epítopo. O epítopo também pode ser localizado utilizando a troca de domínio ou a mutagênese seletiva do antígeno. Isto é, cada região, ou cada aminoácido, do antígeno pode ser “trocado”, ou substituído com aminoácidos ou porções que são conhecidos de não interagir com o anticorpo de teste. Se a substituição de uma dada região ou aminoácido reduz a ligação do anticorpo de teste no antígeno substituído em comparação com o antígeno não substituído, então esta região ou aminoácido está provavelmente envolvido no epítopo.

[000168] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo 37E1B5 humanizado com uma região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 8, e uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 9. O isótipo do anticorpo pode ser IgG1, IgG2, IgG2a, IgG3 ou IgG4.

[000169] Os anticorpos presentemente descritos podem ser policlonais ou monoclonais. Os soros policlonais tipicamente contêm populações misturadas de anticorpos que especificamente se ligam a vários epítopos ao longo do comprimento de αvβ8. No entanto, soros policlonais podem ser específicos para um segmento particular de αvβ8. Em algumas modalidades, o anticorpo é quimérico, humanizado (ver Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) e WO 90/07861, US 5693762, US 5693761, US 5585089, US 5530101 e Winter, US 5225539), or humano (Lonberg et al., WO 93/12227 (1993); US 5877397, US 5874299, US 5814318, US 5789650, US 5770429, US 5661016, US 5633425, US 5625126, US 5569825, US 5545806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996),Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) EP 1481008, Bleck, Bioprocessing Journal 1 (Sept/Oct. 2005), US 2004132066, US 2005008625, WO 2004072266, WO 2005065348, WO 2005069970 e WO 2006055778. Em algumas modalidades, os anticorpos são humanizados ou as formas quiméricas de 37E1B5, 11E8, ou 14E5. O isótipo humano IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 pode ser usado para os anticorpos humanizados ou quiméricos. Alguns anticorpos especificamente se ligam ao αvβ8 com uma afinidade de ligação maior ou igual a cerca de 107, 108, 109, 1010, 1011 ou 1012 M-1 (por exemplo, com um Kd na faixa micromolar (106), nanomolar (10-9), picomolar (10-12), ou inferior).G. Detecção da atividade de TGF-β e efeito dos anticorpos anti-αvβ8

[000170] Para determinar o efeito de um anticorpo sobre a atividade de TGF-β, vários bioensaios de TGF-β estão disponíveis. Por exemplo, a ativação de TGF-β pode ser testada em um ensaio de co-cultura. As células de teste que expressam αvβ8 são co-cultivadas com células TMLC, isto é, células epiteliais do pulmão de vison estavelmente transfectadas com um fragmento promotor responsivo de TGF-β que conduz o gene luciferase (Abe et al. (1994) Annal Biochem 216:276). As células TMLC são altamente sensíveis ao TGF-β com uma formação muito baixa de ativação de TGF-β. As células TMLC pode assim ser utilizadas na co-cultura com outras linhagens ou frações livres de células para testar com relação à presença de TGF-β ativo usando uma luminescência como uma leitura. Os ensaios podem ser executados na presença ou ausência de anticorpo de bloqueio anti TGF-β (10 μg/ml, 1D11; R&D System), anti-β8 (20 μg/ml, 37E1B5) ou anti-β6 (150 μg/ml, 10D5) como descrito (Abe (1994); Munger (1999).

[000171] Para medir o TGF-β ativo no tecido do tumor, pesos iguais de tecido de tumor podem ser triturados e incubados em DME estéril durante 30 min a 4°C. Os sobrenadantes contendo TGF-β ativo podem ser colhidos após a centrifugação (20 g) a 4°C. Os grânulos podem então ser incubados em DME livre de soro durante 20 min a 80°C para ativar SLC, após o que os sobrenadantes podem ser colhidos. Os sobrenadantes contendo TGF-β ativo ou ativado por calor (latente) são então adicionados nas células TMLC pré-plaqueadas com ou sem 1D11. Para os ensaios de inibidor da protease, inibidores são adicionados no início da co-cultura. A dose máxima de cada inibidor é definida como a concentração mais elevada que não inibe a capacidade das células TMLC em responder ao TGF-β ativo recombinante. Para medir a atividade do TGF-β solúvel a partir das células cultivadas, as células são incubadas em 100 μl de meio completo com ou sem 37E1 ou 10D5 durante 1 h a 37°C com rotação suave. Os sobrenadantes livres de células são colhidas por centrifugação (20 g) durante 5 min a 4°C e depois adicionados nas células TMLC pré-plaqueadas na presença ou ausência de 1D11. Para os ensaios de receptor solúvel, o meio condicionado obtido a partir de culturas de células na noite anterior é utilizado. As unidades de luciferase relativas são definidas como atividade menos a atividade de formação das células repórteres TMLC. IV. Métodos de geração de anticorpos

[000172] Para a preparação e utilização de anticorpos adequados como aqui descrito, por exemplo, anticorpos recombinantes, monoclonais ou policlonais, muitas técnicas conhecidas no ofício podem ser utilizadas (ver, por exemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); e Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)). Os genes que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpo de interesse podem ser clonados a partir de uma célula, por exemplo, os genes que codificam um anticorpo monoclonal podem ser clonados de um hibridoma e utilizados para produzir um anticorpo monoclonal recombinante. Bibliotecas de genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos monoclonais também podem ser produzidas a partir de células do hibridoma ou plasma. Combinações aleatórias dos produtos de gene de cadeia pesada e leve geram um grande grupo de anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (ver, por exemplo, Kuby, Immunology (3rd ed. 1997)). As técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única ou anticorpos recombinantes (Patente U.S. 4.946.778, Patente U.S. No 4.816.567) podem ser adaptadas para produzir anticorpos para os polipeptídeos desta invenção. Da mesma forma, camundongos transgênicos, ou outros organismos tais como outros mamíferos, podem ser usados para expressar anticorpos humanizados ou humanos (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126;5.633.425; 5.661.016, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:81213 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996);Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); e Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)). Alternativamente, a tecnologia de apresentação de fagos pode ser usada para identificar anticorpos e fragmentos Fab heteroméricos que especificamente se ligam aos antígenos selecionados (ver, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)). Os anticorpos também podem ser produzidos biespecíficos, isto é, capazes de reconhecer dois diferentes antígenos (ver, por exemplo, WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); e Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)). Os anticorpos também podem ser heteroconjugados, por exemplo, dois anticorpos covalentemente unidos, ou imunotoxinas (ver, por exemplo, Patente U.S. No 4.676.980, WO 91/00360; WO 92/200373 e EP 03089).

[000173] Os anticorpos podem ser produzidos utilizando qualquer número de sistemas de expressão, incluindo os sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos. Em algumas modalidades, o sistema de expressão é uma expressão de célula de mamífero, tal como um hibridoma, ou um sistema de expressão de células CHO. Muitos desses sistemas são amplamente disponíveis de fornecedores comerciais. Nas modalidades em que um anticorpo compreende uma região tanto VH quanto VL, as regiões VH e VL podem ser expressas utilizando um único vetor, por exemplo, em uma unidade de expressão di-cistrônica, ou sob o controle de diferentes promotores. Em outras modalidades, a região VH e VL pode ser expressa utilizando vetores separados. Uma região VH ou VL, como aqui descrita, pode opcionalmente compreender uma metionina no N-terminal.

[000174] Um anticorpo como aqui descrito também pode ser produzido em vários formatos, incluindo como um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um scFv ou um dAB. Os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por uma variedade de métodos, incluindo a digestão de um anticorpo intacto com uma enzima, tal como pepsina (para gerar fragmentos F(ab’)2) ou papaina (para gerar fragmentos Fab); ou a síntese de novo. Os fragmentos de anticorpos também podem ser sintetizados utilizando a metodologia de DNA recombinante. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-β8 compreende fragmentos F(ab’)2 que especificamente se ligam ao β8. Um anticorpo da invenção também pode incluir uma região constante humana. Ver, por exemplo, Fundamental Immunology (Paul ed., 4d ed. 1999); Bird, et al., Science 242:423 (1988); and Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 (1988).

[000175] Os métodos para a humanização ou primatização de anticorpos não humanos também são conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácido nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são frequentemente referidos como resíduos importados, que são tipicamente retirados de um domínio variável de importação. A humanização pode ser essencialmente executada seguindo o método de Winter e colaboradores (ver, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593596 (1992)), mediante a substituição de CDRs de roedor ou sequências de CDR pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Patente U.S. No 4.816.567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor.

[000176] Em alguns casos, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser conjugado com outra molécula, por exemplo, polietileno glicol (PEGuilação) ou albumina do soro, para fornecer uma meia-vida prolongada in vivo. Exemplos de PEGuilação de fragmentos de anticorpo são fornecidos em Knight et al. Platelets 15:409, 2004 (for abciximab); Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994 (for an anti-CEA antibody); Chapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999; e Humphreys, et al., Protein Eng. Des. 20: 227,2007). O anticorpo ou fragmento de anticorpo também pode ser rotulado, ou conjugado a um agente terapêutico como descrito abaixo.

[000177] A especificidade de ligação de anticorpos pode ser definida em termos das constantes de dissociação comparativas (Kd) do anticorpo para o alvo (por exemplo, β8) em comparação com a constante de dissociação no que diz respeito ao anticorpo e outros materiais no ambiente ou moléculas não relacionadas em geral. Tipicamente, a Kd para o anticorpo em relação ao material não relacionado será pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes ou mais elevado do que a Kd em relação ao alvo.

[000178] A afinidade desejada para um anticorpo, por exemplo, elevada (pM abaixo de nM), média (nM baixo em 100 nM) ou baixa (ao redor de 100 nM ou superior), pode diferir dependendo se ela está sendo utilizada como um diagnóstico ou terapêutico. Por exemplo, um anticorpo com afinidade média pode ser mais bem sucedido na localização do tecido desejado em comparação a um com uma elevada afinidade. Assim, os anticorpos tendo afinidades diferentes podem ser utilizados para aplicações de diagnóstico e terapêuticas.

[000179] Uma porção de direcionamento tipicamente se ligará com um Kd de menos do que cerca de 1000 nM, por exemplo, menos do que 250, 100, 50, 20 ou inferior nM. Em algumas modalidades, o Kd do agente de afinidade é menor do que 15, 10, 5 ou 1 nM. Em certas modalidades, o Kd é de 1 a 100 nM, de 0,1 a 50 nM, de 0,1 a 10 nM, ou de 1 a 20 nM. O valor da constante de dissociação (Kd) pode ser determinado por métodos bem conhecidos, e pode ser computado mesmo para misturas complexas por métodos como divulgados, por exemplo, em Caceci et al., Byte (1984) 9:340-362.

[000180] A afinidade de um anticorpo, ou qualquer agente de direcionamento, por um alvo pode ser determinada de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como revisto em Ernst et al. Determination of Equilibrium Dissociation Constants, Therapeutic Monoclonal Antibodies (Wiley & Sons ed. 2009).

[000181] O ELISA quantitativo e métodos de afinidade com base na disposição semelhantes podem ser utilizado. O ELISA (ensaio de sinalização imunossorvente ligado a enzima) é um método baseado em anticorpos. Em alguns casos, um anticorpo específico para o alvo de interesse é afixado a um substrato, e colocado em contato com uma amostra suspeita de conter o alvo. A superfície é então lavada para remover as substâncias não ligadas. A ligação ao alvo pode ser detectada em uma variedade de meios, por exemplo, utilizando uma segunda etapa com um anticorpo rotulado, a rotulagem direta do alvo, ou a rotulagem do anticorpo primário com um rótulo que é detectável após a ligação ao antígeno. Em alguns casos, o antígeno é afixado ao substrato (por exemplo, utilizando um substrato com alta afinidade com relação às proteínas, ou uma interação estreptavidina-biotina) e detectado utilizando um anticorpo rotulado (ou outra porção de direcionamento). Várias permutações dos métodos originais de ELISA foram desenvolvidas e são conhecidas na técnica (ver Lequin (2005) Clin. Chem. 51:2415-18 para uma revisão).

[000182] O Kd, Kon e Koff também podem ser determinados utilizando a ressonância de plásmon superficial (SPR), por exemplo, como medido pelo uso de um sistema Biacore T100. As técnicas SPR são revistas, por exemplo, em Hahnfeld et al. Determination of Kinetic Data Using SPR Biosensors, Molecular Diagnosis of Infectious Diseases (2004). Em uma experiência típica de SPR, um interagente (alvo ou agente de direcionamento) é imobilizado em uma lâmina revestida de ouro com SPR ativo com uma célula de fluxo, e uma amostra contendo o outro interagente é introduzida para circular em toda a superfície. Quando a luz de uma determinada frequência for irradiada sobre a superfície, as alterações para a refletividade ótica do ouro indicam ligação, e os cinéticos de ligação.

[000183] A afinidade de ligação também pode ser determinada através da ancoragem de um interagente biotinilado a um chip sensor de estreptavidina (SA). O outro interagente é então colocado em contato com o chip e detectado, por exemplo, como descrito em Abdessamad et al. (2002) Nuc. Acids Res. 30:e45.

V. Aplicações e composições farmacêuticas

[000184] Os anticorpos anti-αvβ8 aqui descritos (incluindo os seus fragmentos de ligação ao αvβ8, anticorpos rotulados, imunoconjugados, composições farmacêuticas, etc.) podem ser utilizados para detectar, tratar, melhorar ou prevenir a doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e asma.

[000185] Os anticorpos anti-αvβ8 aqui descritos (incluindo os seus fragmentos de ligação ao αvβ8, anticorpos rotulados, imunoconjugados, composições farmacêuticas, etc.) podem ser utilizados para detectar, tratar, melhorar ou prevenir a doença inflamatória do intestino.

[000186] Os anticorpos anti-αvβ8 aqui descritos (incluindo os seus fragmentos de ligação ao αvβ8, anticorpos rotulados, imunoconjugados, composições farmacêuticas, etc.) podem ser utilizados para detectar, tratar, melhorar ou prevenir uma doença auto-imune inflamatória do cérebro, esclerose múltipla, uma doença desmielinizante (por exemplo, mielite transversa, doença de Devic, síndrome de Guillain-Barré), neuroinflamação, doença renal ou glioma.

[000187] Os anticorpos anti-αvβ8 aqui descritos (incluindo os seus fragmentos de ligação ao αvβ8, anticorpos rotulados, imunoconjugados, composições farmacêuticas, etc.) podem ser utilizados para detectar, tratar, melhorar ou prevenir a artrite.

[000188] Os anticorpos anti-αvβ8 aqui descritos (incluindo os seus fragmentos de ligação ao αvβ8, anticorpos rotulados, imunoconjugados, composições farmacêuticas, etc.) podem ser utilizados para detectar, tratar, melhorar ou prevenir várias doenças fibróticas, tais como a fibrose das vias aéreas, fibrose pulmonar idiopática, pneumonia intersticial não específica, fibrose pulmonar pós-infeciosa, dano alveolar difuso, fibrose pulmonar associada com a doença vascular de colágeno, fibrose pulmonar induzida por medicamentos, silicose, fibrose pulmonar relacionada ao amianto, bronquiolite respiratória, doença intersticial pulmonar de bronquiolite respiratória, fibrose intersticial descamativa, pneumonia criptogênica em organização, pneumonia de hipersensibilidade crônica, fibrose pulmonar ou hepática relacionada com medicamento, fibrose renal e fibrose hepática (por exemplo, induzida por álcool, uso de drogas, esteato-hepatite, infecção viral (por exemplo, hepatite B ou C), coleostasia, etc.).

[000189] Os anticorpos anti-αvβ8 aqui descritos (incluindo os seus fragmentos de ligação ao αvβ8, anticorpos rotulados, imunoconjugados, composições farmacêuticas, etc.) podem ser utilizados para detectar, tratar, melhorar ou prevenir adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma da mama, e crescimento de câncer e metástases.

[000190] Uma pessoa de habilidade observará que a natureza da composição farmacêutica e a via de administração dependerão em parte da condição a ser tratada.

[000191] As formulações adequadas para a administração oral podem consistir de (a) soluções líquidas, tais como uma quantidade eficaz do ácido nucleico acondicionado colocado em suspensão em diluentes, tais como água, salina ou PEG 400; (b) cápsulas, saches oucomprimidos, cada um contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo, como líquidos, sólidos, grânulos ou gelatina; (c) suspensões em um líquido apropriado; e (d) emulsões adequadas. As formas de comprimido podem incluir um ou mais de lactose, sacarose, manitol, sorbitol, fosfatos de cálcio, amido de milho, amido de batata, celulose microcristalina, gelatina, dióxido de silício coloidal, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico, e outros excipientes, corantes, cargas, aglutinantes, diluentes, agentes tamponantes, agentes umectantes, conservantes, agentes flavorizantes, tinturas, agentes desintegrantes e portadores farmaceuticamente compatíveis. Formas de pastilha podem compreender o ingrediente ativo com um sabor, por exemplo, sacarose, assim como pastilhas compreendendo o ingrediente ativo com uma base inerte, tal como gelatina e glicerina ou sacarose e emulsões de acácia, géis e outros mais contendo, além do ingrediente ativo, portadores conhecidos na técnica.

[000192] Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo aqui descrito (ou seu fragmento de ligação ao αvβ8) pode ser administrada isoladamente ou em combinação com outras porções adequadas, pode ser preparada em formulações de aerossol (“nebulizados”) para serem administradas por meio de inalação. As formulações de aerossol podem ser colocadas em propulsores pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio, etc.

[000193] As formulações adequadas para a administração por via retal incluem, por exemplo, supositórios, que consistem do ácido nucleico acondicionado com uma base de supositório. As bases de supositório adequadas incluem triglicerídeos naturais ou sintéticos ou hidrocarbonetos de parafina. Além disso, também é possível utilizar cápsulas retais de gelatina que consistem de uma combinação do composto de escolha com uma base, incluindo, por exemplo, triglicerídeos líquidos, polietileno glicóis e hidrocarbonetos parafínicos.

[000194] As formulações adequadas para a administração parenteral, tal como, por exemplo, por vias intra-articulares (nas articulações), intravenosas, intramusculares, intratumorais, intradérmicas,intraperitoneais e subcutâneas, incluem soluções de injeção estéreis isotônicas aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor destinado, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. Na prática desta invenção, as composições podem ser administradas, por exemplo, através da infusão intravenosa, por via oral, por via tópica, por via intraperitoneal, por via intravesical ou por via intratecal. Os anticorpos são tipicamente administrados através da administração parenteral ou intravenosa. As formulações de compostos podem ser apresentadas em recipientes lacrados de dose única ou de múltiplas doses, tais como ampolas e frascos.

[000195] As soluções e suspensões de injeção podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo anteriormente descrito. Métodos para a preparação de composições parenteralmente administráveis serão conhecidos ou evidentes daqueles versados na técnica e são descritos com mais detalhes em tais publicações como Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980).

[000196] As composições para administração tipicamentecompreendem um anticorpo como aqui descrito (por exemplo, um anticorpo anti-αvβ8 ou seu fragmento de ligação ao αvβ8 ou imunoconjugado) dissolvido em um portador farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um portador aquoso. Uma variedade de portadores aquosos pode ser utilizada, por exemplo, salina tamponada. Estas soluções são estéreis e geralmente isentas de matéria indesejável. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar as condições fisiológicas tais como agentes de ajuste e tamponantes do pH, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. A concentração de agente ativo nestas formulações pode variar amplamente, e será selecionada principalmente com base nos volumes de fluido, viscosidades, peso corporal e outros mais de acordo com o modo particular de administração selecionado e as necessidades do paciente.

[000197] A formulação também pode fornecer compostos ativos adicionais, incluindo agentes quimioterapêuticos, agentes citotóxicos, citocinas, agente inibidor do crescimento, e agente anti-hormonal. Os ingredientes ativos podem ser preparados como preparações de liberação controlada (por exemplo, matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos (por exemplo, poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool vinílico), polilactídeos. Os anticorpos e immunoconjugados também podem ser colocados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através da polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de medicamento coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões.

VI. Composições e aplicações de diagnóstico

[000198] A integrina avb8 é expressa nos fibroblastos, células estreladas, condrócitos, macrófagos ativados e subconjuntos de células T e B. A integrina avb8 é aumentada na expressão nos fibroblastos na COPD e fibrose pulmonar, e pode ser usada como um marcador substituto para a massa aumentada de células de fibroblastos. Assim os anticorpos presentemente divulgados podem ser amplamente aplicáveis às estratégias de formação de bioimagens para detectar os processos fibroinflamatórios. Os anticorpos terapêuticos e de diagnóstico presentemente descritos podem ser aplicados às: doença inflamatória do intestino (IBD), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, artrite, um distúrbio fibroinflamatório hepático, lesão no fígado induzida por álcool, esteatoepatite não alcoólica (NASH), hepatite viral, e cirrose biliar primária (PBC), a rejeição de enxerto após o transplante de fígado, hepatite autoimune, um distúrbio autoimune, lúpus eritematoso, esclerodermia, dermatomiosite, penfigóide bolhoso, pênfigo vulgar, distúrbio fibrótico pulmonar, uma doença autoimune inflamatória cerebral, esclerose múltipla, uma doença desmielinizante, neuroinflamação, doença renal, glomerulonefrite, carcinoma hepatocelular (HCC), adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, glioma, melanoma, carcinoma da próstata, ovário, útero e mama.

[000199] Conforme explicado acima, os anticorpos anti-αvβ8 aqui descritos (incluindo os seus fragmentos de ligação ao αvβ8, variantes amadurecidas por afinidade, e variantes de anticorpo menores do que 50 ou 25 kD ou scFv) podem ser utilizados para o diagnóstico, in vivo ou in vitro (por exemplo, utilizando uma amostra biológica obtida de um indivíduo). O anticorpo é tipicamente conjugado ou de outra maneira associado com um rótulo detectável. A associação pode ser direta, por exemplo, uma ligação covalente, ou indireta, por exemplo, utilizando um agente de ligação secundário, quelante ou ligante.

[000200] Um anticorpo rotulado pode ser fornecido a um indivíduo para determinar a aplicabilidade de uma terapia planejada. Por exemplo, um anticorpo rotulado pode ser utilizado para detectar a densidade da integrina β8 dentro de uma área doente. Para as terapias destinadas a orientar a atividade de TGF-β ou αvβ8 (para reduzir a atividade de TGF- β ou αvβ8), a densidade de β8 é tipicamente elevada em relação ao tecido não doente. Um anticorpo rotulado também pode indicar que a área doente é acessível para terapia. Os pacientes podem assim ser selecionados para a terapia com base nos resultados de formação de imagem. A caracterização anatômica, tal como a determinação dos limites precisos de um câncer, pode ser executada utilizando técnicas de formação de imagem padrão (por exemplo, varredura de CT, MRI, varredura de PET, etc.). Tais métodos in vivo podem ser realizados utilizando qualquer um dos anticorpos presentemente divulgados. Em algumas modalidades, 14E5 rotulado é utilizado, visto que não afeta os níveis de TGF-β.

[000201] Qualquer um dos anticorpos presentemente divulgados também pode ser usado para os métodos de diagnóstico ou monitoramento in vitro, por exemplo, utilizando as células ou tecidos de uma amostra de paciente. Em certas modalidades, o 11E8 rotulado (ou um fragmento de ligação ao αvβ8 ou variante amadurecida por afinidade) é usado, já que ele pode ligar as células fixadas assim como as células não fixadas. Em algumas modalidades, o 6B9 rotulado (ou um fragmento de ligação ao αvβ8 ou variante amadurecida por afinidade) é usado, visto que ele pode ligar as células fixas assim como as células não fixas, e não compete para a ligação de β8 com os anticorpos terapêuticos tais como 11E8, 37E1 ou 37E1B5. Em algumas modalidades, o 4F1 rotulado (ou um fragmento de ligação ao αvβ8 ou variante amadurecida por afinidade) é usado, já que ele pode ligar as células fixas assim como as células não fixas, e não compete para a ligação ao β8 com anticorpos terapêuticos tais como 11E8, 37E1 ou 37E1B5.

[000202] Em algumas modalidades, o anticorpo de diagnóstico é um fragmento variável de cadeia única (scFv). Os anticorpos intactos (por exemplo, IgG) podem ser utilizados para a radioimunoterapia ou liberação direcionada de agentes terapêuticos, porque eles apresentam uma elevada absorção e retenção. Em alguns casos, a persistência na circulação de mAbs intactos pode resultar em formação elevada (Olafsen et al. (2012) Tumour Biol. 33:669-77; Cai et al. (2007) J Nucl Med. 48:304-10). Os scFvs, tipicamente com uma massa molecular de ~ 25 kD, são rapidamente excretados pelos rins, mas são monovalentes e podem ter menor afinidade. As questões de monovalência podem ser superadas com engenharia avançada de anticorpos (como aqui demonstrada), onde as afinidades podem ser melhoradas para a faixa inferior de nM para pM. Tais anticorpos possuem meias-vidas suficientemente curtas para serem úteis como agentes de formação de imagem e possuem as características adequadas de ligação para o tecido alvo (Cortez-Retamozo et al. (2004) Cancer Res. 64:2853-7). Como aqui mostrado, criamos vários derivados de anticorpo de scFV de afinidade muito elevada de 4F1, 6B9 e 14E5 que podem ser convertidos em plataformas de scFV humanizados. Estes anticorpos melhorados não estão na função de bloqueio, e assim podem ser usados em combinação com um agente terapêutico que direciona o β8.

[000203] Um agente de diagnóstico compreendendo um anticorpo aqui descrito pode incluir qualquer agente de diagnóstico conhecido na técnica, como fornecido, por exemplo, nas seguintes referências: Armstrong et al., Diagnostic Imaging, 5th Ed., Blackwell Publishing (2004); Torchilin, V. P., Ed., Targeted Delivery of Imaging Agents, CRC Press (1995); Vallabhajosula, S., Molecular Imaging: Radiopharmaceuticals for PET and SPECT, Springer (2009). Os termos “agente detectável”, “porção detectável”, “rótulo”, “agente de formação de imagem”, e termos semelhantes são utilizados aqui como sinônimos. Um agente de diagnóstico pode ser detectado por uma variedade de meios, incluindo como um agente que fornece e/ou intensifica um sinal detectável. Os sinais detectáveis incluem, mas não são limitados a estes, sinais emissores de raio gama, radioativos, ecogênicos, ópticos, fluorescentes, absorventes, magnéticos ou tomográficos. As técnicas para a formação de imagem do agente de diagnóstico podem incluir, mas não são limitadas a estas, tomografia computadorizada de emissão de fótons isolada (SPECT), formação de imagem por ressonância magnética (MRI), formação de imagem ótica, tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada (CT), formação de imagem por raio-x, formação de imagem por raios gama, e outros mais. A PET é particularmente sensível e quantitativa, e assim valiosa para a caracterização dos processos fibróticos in vivo (Olafsen et al. (2012) Tumour Biol. 33:669-77; Cai et al. (2007) J Nucl Med. 48:304-10). Isto é útil para além de um diagnóstico companheiro e geralmente seria útil para diagnosticar, clinicamente adaptar e acompanhar os pacientes fibróticos durante qualquer regime de tratamento.

[000204] Um radioisótopo pode ser incorporado nos agentes de diagnóstico aqui descritos e pode incluir radionuclídeos que emitem raios gama, pósitrons, partículas beta e alfa, e raios-X. Os radionuclídeos adequados incluem, mas não são limitados a estes, 225Ac, 72As, 211At, 11B, 128Ba, 212Bi, 75Br, 77Br, 14C, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 166Ho, 123I, 124I, 125I, 130I, 131I, 111In, 177Lu, 13N, 15O, 32P, 33P, 212Pb, 103Pd, 186Re, 188Re, 47Sc, 153Sm, 89Sr, 99mTc, 88Y e 90Y. Em certas modalidades, os agentes radioativos podem incluir 111In-DTPA, 99mTc(CO)3-DTPA, 99mTc(CO)3-ENPy2, 62/64/67Cu-TETA, 99mTc(CO)3-IDA, e 99mTc(CO)3triaminas (cíclicos ou lineares). Em outras modalidades, os agentes podem incluir DOTA e seus vários análogos com 111In, 177Lu, 153Sm, 88/90Y, 62/64/67Cu, ou 67/68Ga. Em algumas modalidades, uma nanopartícula pode ser rotulada mediante a incorporação de lipídeos ligados a quelatos, tais como o DTPA-lipídeo, como fornecido nas seguintes referências: Phillips et al., Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology, 1(1): 69-83 (2008); Torchilin, V.P. & Weissig, V., Eds. Liposomes 2nd Ed.: Oxford Univ. Press (2003); Elbayoumi, T.A. & Torchilin, V.P., Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 33:1196-1205 (2006); Mougin-Degraef, M. et al., Int’l J. Pharmaceutics 344:110-117 (2007).

[000205] Em certas modalidades, um agente de diagnóstico pode incluir quelantes que se ligam, por exemplo, os íons de metal, para ser utilizado em uma variedade de técnicas de formação de imagem de diagnóstico. Os quelantes exemplares incluem, mas não são limitados a estes, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido [4-(1,4,8,11- tetraazaciclotetradec-1-il)metil]benzóico (CPTA), ácidocicloexanodiaminatetraacético (CDTA), ácido etilenobis(oxietilenonitrilo) tetraacético (EGTA), ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA), ácido cítrico, ácido hidroxietil etilenodiamina triacético (HEDTA), ácido iminodiacético (IDA), ácido trietileno tetramina hexaacético (TTHA), 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetra(ácido metileno fosfônico) (DOTP), ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacético (TETA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), N1,N1-bis(piridin-2-ilmetil)-etano-1,2-diamina (ENPy2) e seus derivados.

[000206] Em algumas modalidades, o agente de diagnóstico pode estar associado com um ligando de ligação secundária ou a uma enzima (um rótulo de enzima) que irá gerar um produto colorido após o contato com um substrato cromogênico. Exemplos de enzimas adequadas incluem urease, fosfatase alcalina, (rábano-picante) hidrogênio peroxidase e glicose oxidase. Os ligandos de ligação secundária incluem, por exemplo, biotina e avidina ou compostos de estreptavidina conforme conhecidos na técnica.

[000207] Em algumas modalidades, os agentes de diagnóstico podem incluir agentes óticos tais como agentes fluorescentes, agentes fosforescentes, agentes quimioluminescentes e outros mais. Numerosos agentes (por exemplo, tinturas, sondas, rótulos ou indicadores) são conhecidos na técnica e podem ser utilizados na presente invenção. (Ver, por exemplo, Invitrogen, The Handbook—A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Tenth Edition (2005)). Os agentes fluorescentes podem incluir uma variedade de pequenas moléculas orgânicas e/ou inorgânicas ou uma variedade de proteínas fluorescentes e seus derivados. Por exemplo, os agentes fluorescentes podem incluir, mas não são limitados a estes, cianinas, ftalocianinas, porfirinas, indocianinas, rodaminas, fenoxazinas, fenilxantenos, fenotiazinas, fenosselenazinas, fluoresceínas, benzoporfirinas, esquaraínas, dipirrolo pirimidonas, tetracenos, quinolinas, pirazinas, corrinas, crocônios, acridonas, fenantridinas, rodaminas, acridinas, antraquinonas, análogos de calcogenopirílio, clorinas, naftalocianinas, tinturas de metina, tinturas de indolênio, compostos azo, azulenos, azaazulenos, tinturas de trifenil metano, indóis, benzoindóis, indocarbocianinas, benzoindocarbocianinas, e derivados de BODIPY™.

VII. Métodos de tratamento

[000208] Os anticorpos anti-αvβ8 presentemente descritos, e os seus fragmentos de ligação ao αvβ8 ou imunoconjugados podem ser administrados a um indivíduo utilizando métodos conhecidos, tais como a administração intravenosa, por exemplo, como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, pela via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea, intra-articular, intra- sinovial, intratecal, oral, tópica (por exemplo, transdérmica) ou inalação. A administração pode ser local ou sistêmica.

[000209] As composições podem ser administradas para tratamentos terapêuticos ou profiláticos. Nas aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente que sofre de uma doença (por exemplo, IBD, câncer, fibrose (pulmonar ou hepática), COPD, asma, artrite, etc.) em uma “dose terapeuticamente eficaz”. As quantidades eficazes para este uso dependerão do distúrbio a ser tratada, a via de administração, a gravidade da condição, e o estado geral de saúde do paciente. As administrações isoladas ou múltiplas das composições podem ser administradas dependendo da dosagem e frequência como requerido e tolerado pelo paciente. As composições presentemente descritas podem ser administradas a seres humanos e outros animais, em particular mamíferos. Assim os métodos são aplicáveis em aplicações tanto para terapia humana quanto para veterinária. Outras terapias de câncer conhecidas podem ser utilizadas em combinação com os métodos da invenção. Por exemplo, as composições para uso de acordo com a invenção também podem ser utilizadas para direcionar ou sensibilizar uma célula para outros agentes terapêuticos de câncer tais como 5FU, vinblastina, actinomicina D, cisplatina, metotrexato, etc. As composições presentemente descritas também podem ser combinadas com radioterapia ou imunoterapia, assim como agentes terapêuticos atualmente em desenvolvimento.

[000210] As terapias de combinação contemplam a co-administração, utilizando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica isolada, e administração consecutiva em qualquer ordem.

[000211] Para determinar uma dose terapeuticamente eficaz, uma dose baixa de um anticorpo anti-αvβ8 (ou seu fragmento de ligação ao αvβ8 ou imunoconjugado) pode ser inicialmente administrada ao indivíduo, e a dose pode ser aumentada gradualmente até que a condição do indivíduo comece a melhorar. Por exemplo, a dosagem inicial pode ser de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 1 mg/kg por dia. Uma faixa de dose diária de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 500 mg/kg, ou cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 200 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, ou cerca de 10 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, pode ser utilizada em momentos posteriores se a condição do indivíduo não se altera na dose mais baixa. Como mencionado acima, uma pessoa de habilidade irá observar que várias variáveis devem ser consideradas quando se determina uma dose terapeuticamente eficaz. A dose administrada a um paciente deve ser suficiente para efetuar uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo. O tamanho da dose também será determinado pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que acompanham a administração de uma composição particular (ou terapia de combinação) em um paciente particular.

VIII. ExemplosExemplo 1: anticorpo 37E1B5

[000212] As sequências da região V da cadeia pesada e leve de 37E1, 37E1B5, e 37E1B5 humanizado (h37E1B5 ou Hu37E1B5) são mostradas na Figura 1. As regiões de estrutura e CDR são indicadas. O anticorpo 37E1B5 humanizado retém a alta afinidade e atividade de 37E1B5.

[000213] Na cultura in vitro, 37E1 em uma concentração de cerca de 200 μg/ml inibe a liberação do peptídeo de TGF-β ativo maduro. Como explicado acima, 37E1B5 possui uma afinidade muito mais elevada, e é ativo na faixa picomolar. 37E1B5 em 10 μg/m é muito eficaz para a inibição da liberação do peptídeo de TGF-β ativo maduro em cultura in vitro.

B. Exemplo 2: Geração dos anticorpos 11E8 e 14E5

[000214] Os anticorpos 11E8 e 14E5 foram produzidos nas células de hibridoma, que foram criadas pela fusão de células do mieloma SP2/0 com linfócitos de camundongos especificamente imunizados. Os camundongos foram imunizados por injeção subcutânea de uma versão planejada de integrina αvβ8 secretada purificada.C. Exemplo 3: Caracterização do epítopo β8

[000215] Os constructos de integrina β8 quiméricos, que trocaram as sequências de camundongo em ITGB8 humano, foram usados para localizar os epítopos de ligação para os anticorpos 37E1B5, 11E8 e 14E5. O epítopo foi localizado pela ligação do anticorpo, coloração da superfície celular, e detecção por citometria de fluxo. O epítopo é incluído dentro dos aminoácidos 121-180 da integrina β8 humana (em relação à sequência β8 mostrada na SEQ ID NO: 17). Todos os três anticorpos se ligam ao β8 humano, mas não ao β8 de camundongo. Portanto, pelo menos uma das 9 diferenças de aminoácidos não conservativos ou 7 diferenças de aminoácido secundárias (indicadas por + na linha média da sequência) é incluída no epítopo de ligação, ou afetam a estrutura tridimensional do domínio de uma tal maneira como para distinguir a proteína de camundongo da humana. O epítopo cai no que é conhecido como o híbrido Psi e a hélice alfa 1 e região de ligante alfa 1 do domínio Beta-I da subunidade da integrina β8, e é observado na superfície da molécula.

[000216] M itgb8 121

GEVSVQLHPGAEANFMLKVRPLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLN SVGNDLSKKMALY 180

[000217] GEVS+QL PGAEANFMLKV

PLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLS+KMA +

[000218] H ITGB8 121

GEVSIQLRPGAEANFMLKVHPLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLN SVGNDLSRKMAFF 180

[000219] A SEQ ID NO: 1 representa a região da integrina β8 humana que inclui o epítopo 37E1B5 (aminoácidos 121-180). A SEQ ID NO: 2 representa a sequência de murino homóloga, que não é ligada pelo anticorpo 37E1B5. O R na posição 140 da sequência de murino é polimórfico, e também pode ser um H. A sequência de alinhamento é representada pela SEQ ID NO: 3.

[000220] Outros estudos de troca de domínio dentro desta região, que substitui a sequência de murino para a de humano, foram executados para determinar quais aminoácidos são incluídos no epítopo 37E1B5. A substituição de aminoácidos de murino 125-180 da integrina β8 significativamente reduziu a ligação de 37E1B5. Assim, o epítopo sobre a Integrina β8 humana inclui pelo menos um aminoácido selecionado de I125, R128, R175, F179 e F180.

D. Exemplo 4: Caracterização do anticorpo 11E8

[000221] O anticorpo 11E8 imunoprecipita o αvβ8 secretado, e reconhece um epítopo da subunidade β8 que está presente nas células renais embrionárias 293 humanas transfectadas por β8 e células do carcinoma do cólon SW480, mas não as células transfectadas simuladas.

[000222] 11E8 especificamente bloqueia a ativação de TGF-βmediada por αvβ8 nas células SW480 transfectadas por ITGB8. Como o 37E1B5, o 11E8 é um anticorpo de alta afinidade, e possui a atividade de bloqueio em uma concentração muito baixa (40 μg/ml in vitro foi a concentração mais baixa testada). O 11E8 não bloqueia a ativação de TGF-β mediada por outros mecanismos não mediados por β8.

[000223] Além disso, o 11E8 reconhece um epítopo β8 que está prsente nas células fixadas em formalina, tornando-o bem adequado para estudos de localização nos tecidos humanos. O anticorpo 11E8 é ativo in vitro e in vivo, e pode ser utilizado como um agente terapêutico para reduzir a atividade de TGF-β mediada por αvβ8. A capacidade do 11E8 de se ligar às células fixas é útil para acelerar a aprovação regulamentar, e para selecionar um grupo de pacientes (por exemplo, para confirmar a expressão de αvβ8 no tecido de interesse antes de iniciar o tratamento), caracterizar as populações de pacientes (por exemplo, de acordo com a localização da expressão de αvβ8, responde a vários agentes terapêuticos, etc.), e monitorar a progressão da doença (por exemplo, durante um curso de tratamento com o anticorpo 11E8 ou outro agente terapêutico).

[000224] Para melhor definir o epítopo de 11E8, um ensaio de competição foi executado com 37E1B5. A adição de 37E1B5 não rotulado inibiu a ligação do anticorpo 11E8 rotulado que se liga às células SW480 transfectadas por ITGB8 (integrina β8 humana) e células puras de expressão de αvβ8. O resultado indica que os epítopos destes anticorpos significativamente se sobrepõem.

[000225] As sequências da região variável para 11E8 foram obtidas, como mostrado na SEQ ID NOs: 10 e 11. As CDRs 1-3 da cadeia pesada de 11E8 são: SYWIE, DILPGSGTTNYNEKFKG, e WGWDTY, respectivamente. As CDRs 1-3 da cadeia leve de 11E8 são: SASQGISNYLN, YTSSLHS, QQYSNLPYT, respectivamente.

E. Exemplo 5: Caracterização do anticorpo 14E5

[000226] Como divulgado acima, o anticorpo 14E5 reconhece a integrina β8 humana, mas não a de camundongo, e se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 120-180. O anticorpo 14E5 se siga ao αvβ8 nas células de expressão tanto in vitro quanto in vivo, mas não inibe a liberação de TGF-β maduro ativo. O anticorpo 14E5 é útil para aplicações de diagnóstico ou seleção da população de pacientes, uma vez que se liga com alta afinidade e funciona bem nos ensaios FACS.

[000227] Para melhor definir o epítopo do anticorpo 14E5, um ensaio de competição foi executado com 37E1B5. A adição de anticorpo 37E1B5 não rotulado inibiu a ligação do anticorpo 14E5 rotulado que se liga às células SW480 transfectadas por ITGB8 e células puras de expressão de αvβ8. O resultado indica que o epítopo para estes anticorpos é a sobreposição.

[000228] As sequências de região variável para 14E5 foram obtidas, como mostrado na SEQ ID NOs: 12 e 13. As CDRs 1-3 da cadeia pesada 14E5 são: TYWIE, HILPGSVITNYNEKFKG, WGWDSY, respectivamente. As CDRs 1-3 da cadeia leve 14E5 são: STSQDISSSLN, YTSNLHS, QQYSKLPYT, respectivamente.

F. Exemplo 6: O papel da integrina αvβ8 nas vias aéreas

[000229] O TGF-β está envolvido na resposta inflamatória e fibrótica. O IL-1β supra-regula a expressão de β8, que é superexpresso nas vias aéreas de pacientes com COPD. Um modelo de camundongo de remodelagem das vias aéreas mediada por β8 foi projetado para determinar as interações de β8, TGF-β e IL-1β in vivo. Os resultados mostram que a ativação mediada por β8 induzida com IL-1β desempenha um papel crítico na remodelação das vias aéreas.

[000230] O β8 foi anulado em camundongos C57BL/6 utilizando um sistema Cre/LoxP. O IL-1β intratraqueal adenoviral foi utilizado como um modelo para a inflamação em camundongo com idade de 6 a 9 semanas com um alelo de integrina β8 floxed e um alelo silenciado (Floxed/-). IL- 1β humano adenoviral (Ad-hIL-1β) ou adenovírus de controle foi administrado por via intratraqueal, com ou sem o Ad-Cre.

[000231] Os camundongos que expressam a recombinase de fusão Cre-ER(T) sob o controle do promotor de Colágeno Iα2 foram utilizados para mostrar que os fibroblastos desempenham um papel importante na ativação mediada por αvβ8 de TGF-β na fibrose pulmonar induzida por bleomicina, remodelagem das vias aéreas induzida por ovalbumina e remodelagem das vias aéreas induzida por Ad-IL1β. As alterações da morfologia das vias aéreas foram avaliadas por histologia. A expressão de genes de diversas citocinas inflamatórias em múltiplos momentos após a administração de AD-hIL-1β revelou a indução sequencial dos genes que caracterizam uma resposta inflamatória.

[000232] Os resultados dos camundongos silenciados condicionais de β8 mostraram que o β8 é requerido para inflamação e fibrose das vias aéreas transitórias induzidas por IL-1β. A administração de IL-1β humano em camundongos que expressam β8 resultou na ativação mediada por β8 de TGF-β, indução dos genes ccl2 e ccl20 de camundongo (Ligando de Quimiocina CC 2 e 20, que estão envolvidos nas respostas inflamatórias), recrutamento de células dendríticas, e iniciação e perpetuação da resposta imune adaptativa.

[000233] Os dados da integrina β8 condicional torna inoperante a resposta de inflamação e fibrótica reduzida apresentada tanto para Ad- hIL-1β quanto para a ovalbumina, que resultou na proteção da remodelagem das vias aéreas. Assim, o direcionamento de β8 reduz a ativação de TGF-β induzida por IL-1β e induzida por ovalbumina na remodelação das vias aéreas, e lesão pulmonar aguda induzida por bleomicina.

G. Exemplo 7: Anti-integrina β8 reduz a expressão celular

[000234] A produção aumentada de ECM e a contratilidade aumentada de fibroblastos são características de respostas fibróticas observadas no espessamento da parede das vias aéreas e aumento do colágeno tipo I (ColI) e Smooth Muscle Actin (α-SMA). A neutralização de anti-β8 foi utilizada para avaliar a contribuição da ativação de TGF-β mediada por αvβ8 autócrino na resposta pró-fibrótica. O tratamento de fibroblastos das vias aéreas com anticorpos de bloqueio de TGF-β inibiu a expressão de α-SMA e secreção de ColI, indicando que a ativação mediada por αvβ8 de TGF-β influencia o fenótipo de miofibroblasto. A co-cultura de fibroblastos das vias aéreas com células epiteliais brônquicas humanas metaplásicas escamosas levou a um aumento na expressão de fibroblastos das vias aéreas, a qual foi dependente de IL- 1β e fibroblasto β8. O aumento na expressão de ColI pode ser quase completamente inibido através da transfecção de fibroblastos das vias aéreas com o siRNA de β8, indicando que a inibição da ativação mediada por β8 de TGF-β pode reduzir as respostas pró-fibróticas e melhorar as condições fibróticas.H. Exemplo 8: Expressão da integrina β8 em fibroblastos da COPD

[000235] A expressão da integrina β8 foi detectada em fibroblastos dos pulmões de pacientes humanos com COPD utilizando a coloração de tecido e cultura primária, e foi maior do que no tecido sem a COPD. A expressão de integrina β8 também foi significativamente aumentada nos fibroblastos isolados de pacientes com fibrose pulmonar idiopática, em comparação com fibroblastos de pacientes normais. Os fibroblastos da COPD também tiveram a expressão de proteína integrina αvβ8 dependente de IL-1β aumentada, em comparação com os fibroblastos normais do pulmão. Estes dados demonstram que o αvβ8 é tanto um alvo a jusante quanto um mediador patológica da atividade de IL-1β.

[000236] Os anticorpos anti-β8 aqui descritos (por exemplo, 37E1B5, 14E5, 11E8) podem ser utilizados terapeuticamente e/ou paradiagnóstico em doenças onde a integrina β8 é expressa, e o IL-1β e/ou TGF-β desempenham um papel patológico.Exemplo 9: O anticorpo de neutralização da integrina β8 reduz a inflamação induzida das vias aéreas

[000237] O clone BAC humano RP11-431K20 foi utilizado para gerar camundongos transgênicos que expressam a integrina β8 humana. Estes camundongos foram reproduzidos em camundongos com um alelo funcional de camundongo itgb8 para gerar uma geração F1 de camundongos com ITGB8 humano e uma cópia funcional de camundongo itgb8. Estes camundongos foram cruzados para gerar uma geração F2 que resultou em BAC viável ITGB8, isto é, itgb8 -/camundongos com apenas uma cópia humana do gene, demonstrando o resgate da letalidade de itgb8 -/- com ITGB8 humano.

[000238] Estes camundongos foram utilizados para induzir a remodelação das vias aéreas utilizando um modelo de liberação de IL- 1β intratraqueal adenoviral. Neste modelo, a remodelação das vias aéreas robusta com um perfil imunológico semelhante à doença pulmonar obstrutiva crônica humana (COPD) é induzida de forma reprodutiva.

[000239] O anticorpo 37E1B5, em uma dose de 7 mg/kg, significativamente bloqueou a inflamação da via aérea, com uma redução significativa nos neutrófilos na lavagem interna broncoalveolar. Histologicamente, a inflamação e fibrose da parede das vias aéreas foi significativamente diminuída por 37E1B5. Além disso, a supressão específica de fibroblastos de itgb8 pode inibir significativamente a remodelação das vias aéreas induzida por IL-1β adenoviral.

[000240] Os camundongos com anulação específica de fibroblastos de itgb8 também foram usados para estudar a remodelação das vias aéreas alérgicas (inflamação, fibrose e metaplasia da mucosa das vias aéreas induzida por ovalbumina). A remodelação grandemente diminuída nos camundongos itgb8 -/- em comparação com os do tipo silvestre. O modelo alérgico também é dependente tanto de IL-1β quanto de TGF-β. Estes dados mostram que o itgb8 desempenha um papel importante nas respostas imunes inatas e adaptativas mediadas por IL-1β e TGF-β. O IL-1β provoca um aumento da integrina β8 em vários tipos de células, incluindo fibroblastos das vias aéreas e pulmão, e astrócitos, e a expressão de β8 induzida por IL-1β é observada tanto em camundongos quanto em seres humanos.

J. Exemplo 10: Os condrócitos articulares humanos expressam a integrina αvβ8

[000241] A cartilagem articular adulta foi colhida do espaço articular do joelho de um paciente submetido à cirurgia eletiva de um joelho para a osteoartrose crônica. Os condrócitos primários foram cultivados até 70% de confluência e a expressão do receptor de integrina determinada pela coloração celular e citometria de fluxo. Os anticorpos utilizados foram anti-β8 (37E1B5), e anti-β6 (E7P6). A coloração robusta foi detectada com 37E1B5 e nenhuma coloração foi observada com E7P6. Os condrócitos primários foram co-cultivados com células repórteres TMLC TGF-β (Annes et al. (2004) J. Cell Biol. 165:723) em um bioensaio de TGF-β na presença ou ausência de anti-β8 (37E1B5) ou anti-β6. O anti-β8 produziu um bloqueio robusto de ativação de TGF-β enquanto que o anti-β6 não produziu tal efeito.

[000242] Os resultados indicam não apenas que o αvβ8 é expresso nos condrócitos, mas que a expressão resulta na ativação de TGF-β. Assim, a inibição de αvβ8 pode ser utilizada para tratar os distúrbios da cartilagem relacionados com o TGF-β ativado, tais como artrite e fibrose sinovial (ver, por exemplo, Bakker et al. (2001) Osteoarthritis and Cartilage 9:128).

K. Exemplo 11: As células estreladas hepáticas expressam o αvβ8

[000243] As células estreladas hepáticas são as células contráteis que podem produzir colágeno em resposta ao TGF-β ativado, e o tipo de célula parênquima envolvido na fibrose hepática. A fibrose hepática possui vários ativadores, incluindo álcool, medicamentos e anestésicos, da infecção (por exemplo, hepatite B e C), autoimunidade, colestase (excesso de bile) e esteatoepatite não alcoólica.

[000244] A expressão de integrina β8 foi detectada nos camundongos transgênicos descritos acima (IGTB8 humano, mas não igtb8 de camundongo) para determinar se a atividade de TGF-β no fígado pode ser direcionada utilizando um anticorpo específico de β8 aqui descrito.

[000245] A Figura 2 mostra que uma porcentagem significativa de células estreladas hepáticas expressam o β8, conforme determinado utilizando o anticorpo 14E5.

L. Exemplo 12: Anticorpos anti-β8 reduzem a inflamação do intestino delgado

[000246] Os sintomas de doença inflamatória intestinal (IBD) foram observados em camundongos transgênicos descritos acima que expressam IGTB8 humano, mas não igtb8 de camundongo. Os sintomas incluem perda de peso e dilatação e inflamação do intestino delgado, assim como escoliose. A Figura 3 mostra a propagação das células imunes nas tripas destes camundongos. A Figura 3A mostra os parâmetros gerais de propagação, enquanto que as Figuras 3B-3E mostram o padrão de expressão de β8 sobre CD4+, CD8+, células B e células NK, respectivamente. As células NK não expressam β8 em um nível detectável. Células dendríticas dos intestinos dos camundongos IGTB8 também apresentaram expressão de β8.

[000247] Os camundongos IGTB8 foram assim utilizados para determinar o efeito do anticorpo anti-β8 37E1B5 in vivo. Os camundongo transgênicos IGTB8 foram tratados com 3 mg de 37E1B5/kg, administrados IP duas vezes por semana durante 8 semanas. A Figura 4 mostra que o tratamento com o anticorpo 37E1B5 significativamente reduziu o dilatação do intestino delgado associado com a inflamação. A Figura 5 ainda ilustra o efeito do tratamento com anticorpo, comparando um segmento do intestino tomado de um camundongo de controle IGTB8 (sem tratamento) com aquele de um camundongo tratado com anticorpo (B5).

M. Exemplo 13: Anticorpos 4F1 e 6B9 se ligam ao β8 humano nas células e tecidos fixados

[000248] Os clones de hibridoma 4F1 e 6B9 especificamente mancham as células renais embrionárias humanas 293 embutidas com parafina fixada com formalina transfectadas com ITGB8 e cérebros de camundongos transgênicos (Tg) ITGB8 BAC. As células estavelmente transfectadas 293 que expressam integrina αvβ8 humana (293 B8) ou não (293 WT) foram fixadas durante a noite em formalina tamponada a 10%, granuladas, e depois incorporadas em tampões de agarose e submetidas ao processamento de tecido rotineiro, incorporação de parafina, e divisão. As amostras de cérebro de camundongos Tg ITGB8 BAC foram processadas de um modo semelhante. A imunocoloração foi executada utilizando a recuperação térmica do antígeno e os anticorpos foram detectados utilizando um kit comercial (Dako). 6B9 foi utilizado em 25 ug/ml com recuperação térmica do antígeno 102C durante 10 minutos. 4F1 foi utilizado em 50 a 100 ug/ml, com a recuperação térmica do antígeno 95C durante 10 minutos. Os resultados na Figura 6 mostram que os anticorpos são específicos para β8, e podem ligar β8 no tecido fixado.

[000249] Para o clone de hibridoma 4F1, cérebros ou pulmões de camundongos Tg ITGB8 BAC ou tipo silvestre (WT) foram fixados durante a noite em formalina tamponado a 10% e submetidos ao processamento de tecidos, incorporação de parafina e divisão. A imunocoloração foi executada usando a mesma recuperação térmica do antígeno como acima, e os anticorpos foram detectados utilizando um kit comercial. Os resultados são mostrados na Figura 7.

N. Exemplo 14: Os anticorpos 6B9 e 4F1 podem distinguir as células com diferentes números de cópias genômicas de β8

[000250] O clone de hibridoma 6B9 pode se ligar ao β8 no tecido fixado, e detectar a variação do número de cópias. A figura 8 mostra a imunocoloração do cérebro de camundongo transgênico (Tg) ITGB8 BAC incluído em parafina fixada com formalina. Cérebros de camundongos Tg ou WT ITGB8 BAC foram fixados durante a noite com formalina tamponada a 10% e submetidos ao processamento de tecido rotineiro, incorporação de parafina, e divisão. A imunocoloração foi executada como descrito acima. São mostrados três linhagens de camundongos Tg (B, C e D) em relação ao WT, expressando 1 cópia (D---linhagem BAC/WT), 2 cópias (B e C---linhagem BAC/WT; D--- linhagem BAC/BAC) ou 4 cópias (B e C---linhagem BAC/BAC).

[000251] Similarmente, um coelho monoclonal recombinante IgG derivado dos domínios variáveis de 4F1 pode detectar a variação de número de cópias. A Figura 9 mostra os resultados da imunocoloração de pulmão de camundongo transgênico (Tg) ITGB8 BAC incorporado com parafina fixado em formalina. Os pulmões de camundongos Tg ou WT ITGB8 BAC foram fixados durante a noite em formolina tamponada a 10% e submetidos ao processamento de tecido, incorporação de parafina e divisão. A imunocoloração foi executada como descrito acima. São mostradas três linhagens de camundongos Tg (B, C e D) em relação ao WT, expressando 1 cópia (D---linhagem BAC/WT), 2 cópias (B e C---linhagem BAC/WT; D---linhagem BAC/BAC) ou 4 cópias (B e C---linhagem BAC/BAC).

[000252] Os anticorpos 4F1 e 6B9 podem detectar diferenças na expressão entre uma e duas cópias de ITGB8 em tecidos incorporados com parafina fixados por formalina de camundongos BAC ITGB8. Estes anticorpos são assim potencialmente úteis como agentes de diagnóstico para detectar o aumento da expressão de b8, como agentes de diagnóstico de companhia para anticorpos terapêuticos (por exemplo, fragmentos de ligação ao 37E1B5, 11E8 e b8 e suas variantesamadurecidas por afinidade).

O. Exemplo 15: Detecção de β8 no tecido pulmonar patológico humano fixo

[000253] IgG de coelho monoclonal recombinante derivado dos domínios variáveis de clone 4F1 pode detectar a expressão de αvβ8 através da imunocoloração do pulmão fibrótico humano incorporado com parafina fixado em formalina. Os espécimes de pulmão humano foram obtidos a partir do tecido de patologia cirúrgica de um paciente com enfisema e cicatrizes subpleurais. O tecido foi fixado durante a noite em formalina tamponada a 10% e submetido ao processamento de tecido, incorporação de parafina e divisão. A imunocoloração foi executada como descrito acima. Os resultados são mostrados na Figura 10. As setas indicam a coloração de células fusiformes, representando fibroblastos incorporados no tecido conjuntivo fibroso denso.

P. Exemplo 16: Mapeamento do epítopo para os anticorpos 6B9 e 4F1

[000254] Os constructos de integrina β8 quiméricos, que trocaram as sequências de camundongo em ITGB8 humano foram usados para localizar os epítopos de ligação para os anticorpos 6B9 e 4F1. O epítopo foi localizado pela ligação de anticorpo, coloração da superfície celular, e detecção por citometria de fluxo. O epítopo é incluído dentro dos aminoácidos 61-105 de integrina β8 humana. Os anticorpos 6B9 e 4F1 se ligam ao β8 humano, mas não de camundongo. Pelo menos uma das 3 diferenças de aminoácido não conservativas ou 2 diferenças de aminoácido secundárias (indicadas por + na sequência de alinhamento), é incluída no epítopo de ligação, ou afetam a estrutura tridimensional do domínio de uma tal forma que distingue a proteína de camundongo da humana.

[000255] Camundongo 61 LGPECGWCVQEDFVSGGSGSERCDTVSSLISKGCPVDSIEYLSVH 105

[000256] LGPECGWCVQEDF+SGGS SERCD VS+LISKGC VDSIEY SVH

[000257] Humano 61LGPECGWCVQEDFISGGSRSERCDIVSNLISKGCSVDSIEYPSVH 105

[000258] A SEQ ID NO: 14 representa a região da integrina β8 humana que inclui o epítopo (aminoácidos 61-105). A SEQ ID NO: 15 representa a sequência de murino homóloga, que não é ligada pelos anticorpos 4F1 ou 6B9. A sequência de alinhamento é representada pela SEQ ID NO: 16.

[000259] A troca de aminoácido nesta região foi realizada para determinar quais aminoácidos são incluídos no epítopo de β8. A tabela abaixo indica que o resíduo serina na posição 95 da sequência β8 humana está envolvido nos epítopos 6B9 e 4F1.

Q. Exemplo 17: Caracterização de anticorpos 6B9 e 4F1

[000260] As sequências da região variável para 6B9 foram obtidas, como mostrado na SEQ ID NOs: 18 e 19. As CDRs 1-3 da cadeia pesada 6B9 são: DYLIE, VINPETGGTNYNAKFKG e EAGNYIYAMDY, SEQ ID NO: 40-42, respectivamente. As CDRs 1-3 da cadeia leve 6B9 são: RASVNIYSYLV, NAKTLAE e QHHHGTPYT, SEQ ID NOs: 43-45, respectivamente.

[000261] As sequências da região variável para 4F1 foram obtidas, como mostrado na SEQ ID NOs: 20 e 21. As CDRs 1-3 da cadeia pesada 4F1 são: NYLIE, VINPGTGGTNYNKKFKV eEGNARTYYYAMDY, SEQ ID NOs: 116-118, respectivamente. As CDRs 1-3 da cadeia leve 4F1 são: RASENIYSYLV, NAKTLAE eQHHNGTPYT, SEQ ID NOs: 119-121, respectivamente.

R. Exemplo 18: Caracterização de epítopos de anticorpos 37E1B5, 14E5 e 11E8

[000262] Como mostrado acima, a SEQ ID NO: 1 representa a região da integrina β8 humana que inclui o epítopo β8 (aminoácidos 120-180) para os anticorpos 37E1B5, 14E5 e 11E8. A SEQ ID NO: 2 representa a sequência homóloga de murino, que não está significativamente ligada.

[000263] A troca de aminoácido nesta região foi realizada para determinar quais aminoácidos estão incluídos no epítopo β8. A tabela abaixo indica qual dos aminoácidos 175-180 da SEQ ID NO: 1 são incluídos no epítopo para cada anticorpo.

S. Exemplo 19: Determinação da afinidade para os anticorpos Fv de cadeia única

[000264] Determinamos também a afinidade dos anticorpos divulgados, incluindo as versões amadurecidas por afinidade. Tipicamente, a afinidade Kd de um anticorpo de cadeia única é de 10 a 100 vezes maior do que aquela do Ig correspondente (isto é, o anticorpo de cadeia única possui afinidade de 10 a 100 vezes mais baixa do que o Ig correspondente).

[000265] Os exemplos e modalidades aqui descritas são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou alterações na sua compreensão serão sugeridas às pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e escopo deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, sites da web, números de acesso, patentes e pedidos de patente aqui citados são incorporados por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

Claims

1. Anticorpo humanizado que especificamente se liga à integrina αvβ8, caracterizado pelo fato de que inibe a liberação do peptídeo de TGFβ ativo maduro, mas não inibe significativamente a adesão de TGFβ latente à integrina αvβ8 em uma célula que expressa αvβ8; eem que o anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 9.

2. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo scFv.

3. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo está ligado a um marcador detectável.

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo humanizado, como definido na reivindicação 1 ou 2, em um excipiente farmaceuticamente aceitável.

5. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar uma condição selecionada do grupo que consiste em doença inflamatória do intestino (IBD), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, doença fibrótica pulmonar, e em que a redução da sinalização de TGFβ resulta em melhora da condição no indivíduo.

6. Método in vitro de diagnóstico de um distúrbio associado à integrina αvβ8 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:o contato de uma célula do indivíduo com o anticorpo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, e a detecção da ligação do anticorpo isolado à célula,em que o distúrbio associado à integrina αvβ8 é selecionado do grupo consistindo em doença inflamatória intestinal (IBD), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, artrite, fibrose hepática, um distúrbio fibrótico pulmonar, uma doença autoimune inflamatória do cérebro, esclerose múltipla, uma doença desmielinizante, neuroinflamação, doença renal, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, glioma e carcinoma da mama, eem que a ligação do anticorpo isolado na célula indica que o indivíduo possui o distúrbio associado à integrina αvβ8.

7. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as células são fibroblastos, condrócitos ou células estreladas hepáticas.

8. Método in vitro para detectar a presença de uma célula que expressa integrina αvβ8, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de uma célula com o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e determinar se o anticorpo se liga à célula, em que a ligação do anticorpo na célula indica a presença de uma célula que expressa integrina αvβ8.