BR112012020790B1 - Anticorpo isolado anti-integrina alfavbeta8 e composição farmacêutica - Google Patents

Anticorpo isolado anti-integrina alfavbeta8 e composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

anticorpo de neutralização da integrina alfavbeta8. a presente invenção refere-se a antagonistas de (alfa)v(beta)8, anticorpos anti-(alfa)v(beta)8 ou imunoconjugados para reduzir a ativação de tgf(beta) em um indivíduo. ainda fornecidas são composições compreendendo um dos antagonistas de (alfa)v(beta)8, anticorpos anti-(alfa)v(beta)8 ou imunoconjugados, métodos para usar as composições, e questões relacionadas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido de patente reivindica prioridade para o Pedido provisório US 61/305,749 depositado em 18 de fevereiro de 2010, e o Pedido provisório US 61/428,814, depositado em 30 de dezembro de 2010, as revelações destes são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
DECLARAÇÃO SOBRE DIREITOS PARA INVENÇÕES FEITAS SOB PESQUISA E DESENVOLVIMENTO COM PATROCÍNIO FEDERAL
[002] Esta invenção foi feita com o apoio do Governo sob Conces são No. HL63993, NS-44155, U01 AI075443 outorgada pelos National Institutes of Health. O Governo tem certos direitos nesta invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] O fator de transformação do crescimento β de citocina mul tifuncional(TGF-β) representa papéis principais na biologia de células imunes, endoteliais, epiteliais, e mesenquimais durante o desenvolvimento e vida adulta em espécies invertebrada e vertebrada. Em mamíferos, estas funções são mediadas por três isoformas, TGF-β1, 2, e 3, que são, cada, amplamente expressas. Todas as três isoformas interagem com os mesmos receptores da superfície celular (TGFBR2 e ALK5) e sinalizam através das mesmas vias de sinalização intracelulares, que envolvem efetores de sinalização canônicos (isto é , SMADs) ou não-canônicos (isto é, MAPK, JUN, PI3K, PP2A, Rho, PAR6). A via de sinalização canônica de TGF-β, por meio da qual a sinalização de TGF-β é propagada do aparelho do receptor de TGF-β através da fos- forilação de SMAD-2/3 citoplásmico, formação de complexo com SMAD-4, translocação nuclear do complexo de SMAD-2/3/4, e ligação aos elementos de resposta de SMAD localizados nas regiões de pro- motor de muitos genes envolvidos na resposta fibrogênica, tem sido muito intensivamente estudada. Porém, apesar de ter pares de sinalização similares, cada isoforma cumpre funções biológicas individuais, talvez devido às diferenças na afinidade de ligação aos receptores de TGF-β, mecanismo de ativação, intensidade ou duração da sinalização, ou distribuição espacial e/ou temporal.
[004] Modelos geneticamente silenciados (knockout) e de dele- ção condicionais das isoformas de TGF-β, receptores, e mediadores de sinalização, como também reagentes bloqueadores de função visando todas as isoformas de TGF-β, revelaram papéis essenciais para TGF-β no desenvolvimento de células T, cardíaco, pulmonar, vascular, e palatal. Por exemplo, camundongos deficientes em TGF-β1 ou morrem no útero devido a defeitos na vasculogênese do saco vitelínico ou nascem e sobrevivem na vida adulta mas desenvolvem autoimunidade severa de múltiplos órgãos. Deleção genética dos mediadores de sinalização de TGF-β mostraram um papel essencial para Smad2 na padronização prematura e formação mesodérmica, e camundongos desprovidos de Smad3 são viáveis e férteis, mas apresentam malformações dos membros, desregulação imune, colite, carcinomas de cólon, e alargamento alveolar. Em tecidos adultos, acredita-se que a via de TGF-β regule as interações dinâmicas entre as células imunes, me- senquimais, e epiteliais para manter a homeóstase em resposta à tensão ambiental.
[005] As vias homeostáticas normais mediadas por TGF-β são perturbadas em resposta à lesão repetitiva crônica. Em casos de lesão, TGF-β se torna uma citocina profibrogênica principal tardando a cura da ferida epitelial inibindo a proliferação e migração epitelial e promovendo a apoptose e expandindo o compartimento mesenquimal por indução do recrutamento dos fibroblastos, contractilidade dos fi- broblastos, e deposição da matriz extracelular. De fato, transferência intratraqueana do TGF-β1 recombinante adenoviral para o pulmão de roedores aumenta dramaticamente a acumulação de fibroblastos e expressão de colágeno do tipo I e III ao redor das vias aéreas e no interstício pulmonar, e neutralização dos anticorpos anti-TGF-β pode bloquear bleomicina experimental ou fibrose pulmonar induzida por radiação.
[006] Atividade aumentada da via de TGF-β também tem estado implicada em doença pulmonar fibrótica, glomerulosclerose, e restenose dos vasos cardíacos. A maioria das alterações patológicas mediadas por TGF-β parece ser atribuída à isoforma TGF-β1. A complexidade da função de TGF-β1 em seres humanos é elucidada por distúrbios hereditários com intensificação ou deficiência generalizadas ou específica para o tipo de célula ou em TGF-β1 ou seus efetores de sinalização. Mutações que aumentam a atividade da via de TGF-β levam a defeitos no metabolismo ósseo (isto é, doença de Camurati- Engelmann) e em tecido conjuntivo (isto é, síndrome de Marfan), e em aneurismas aórticos (isto é, síndrome de Loeys-Dietz), enquanto que as mutações que levam à atividade diminuída da via de TGF-β correlatam com ocorrência e prognóstico de câncer. O papel de TGF-β como um supressor tumoral em câncer não é direto, porém, porque TGF-β pode também intensificar o crescimento tumoral e metástase, talvez através de seus papéis em supressão imune, invasão celular, transição epitelial-mesenquimal, ou angiogênese.
[007] Apesar das funções essenciais múltiplas do TGF-β, uma dose ou administração única a curto prazo de um anticorpo neutrali- zante de pan-TGF-β é supostamente bem tolerada em doses que inibem a fibrose dos órgãos ou crescimento e metástase de célula de carcinoma experimental, sem efeitos colaterais relatados em camundongos e ratos adultos. Este tratamento mostrou eficácia terapêutica na inibição da fibrose experimental. Por causa destes resultados pro missores, as experimentações clínicas de fase I/II de dose única usando anticorpos neutralizantes de pan-TGF-β foram executadas ou estão em progresso para carcinoma metastático de célula renal, melanoma, glomerulosclerose segmentária focal, e fibrose pulmonar idiopática (Genzyme Corporation, genzymeclinicalresearch.com, último acesso em 27 de agosto de 2009). Visamento cuidadoso da via de TGF-β para minimizar os efeitos sistêmicos é uma meta altamente desejável.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] A presente invenção é direcionada a um método de reduzir a ativação de TGF-β em um indivíduo, por exemplo, um ser humano ou um não-humano, administrando o antagonista de integrina αvβ8 a um indivíduo em necessidade do mesmo, assim reduzindo a ativação de TGF-β no indivíduo. Em algumas modalidades, o antagonista reduz a ativação de TGF-β (por exemplo, recrutamento de uma protease que cliva TGF-β latente assim liberando o peptídeo de TGF-β maduro, ativo) mas não inibe significativamente a adesão de αvβ8 a TGF-β (por exemplo, adesão de αvβ8 expressa em uma superfície da célula a TGF-β latente associado com a matriz celular).
[009] Em algumas modalidades, o antagonista é um anticorpo. Desse modo, a invenção fornece anticorpos isolados que inibem a liberação de peptídeo de TGF-β ativo, maduro (ativação de TGF-β), mas não inibe significativamente a adesão de TGF-β a αvβ8 em uma célula de expressão de αvβ8. Em algumas modalidades, o anticorpo liga especificamente a αvβ8, por exemplo, especificamente a β8. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a um epítopo em β8 que está dentro da SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o epítopo inclui pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoácidos I125, R128, R175, F179, e F180 de β8 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo liga pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoácidos R79, I85, S95, P100, I108, P109, R128, H140, e F179 de β8 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo liga pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoácidos I74, N88, I107, T110, I125, R175, e F180 de β8 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a β8 humana, mas não de camundongo. Em algumas modalidades, o anticorpo reduz ativação de TGF-β mas não inibe significativamente a adesão das células mediadas por αvβ8 a TGF-β.
[010] Em algumas modalidades, o anticorpo compete para liga ção a αvβ8 com um anticorpo tendo uma região variável da cadeia leve compreendendo três CDRs da cadeia leve da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, e SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo três CDRs da cadeia pesada da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região variável da cadeia leve compreendendo três CDRs da cadeia leve da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, e SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo três CDRs da cadeia pesada da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 3 ou 4 e uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1 ou 2. Exemplos específicos do anticorpo da invenção incluem um anticorpo tendo uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 3 e uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1, e um anticorpo tem uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 2.
[011] O anticorpo pode ser de vários isótipos, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG3 ou IgG4. Um anticorpo monoclonal ou policlonal pode ser usado. Em algumas modalidades, o anticorpo é anticorpo humano, humanizado ou quimérico.
[012] A presente invenção ainda fornece um ácido nucleico isola do, um vetor ou vetores, e células hospedeiras adequadas para codifi- car o anticorpo da presente invenção.
[013] A presente invenção ainda diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo da presente invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um diagnóstico, por exemplo, compreendendo um anticorpo marcado. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é terapêutica.
[014] Em algumas modalidades, o anticorpo é usado para detec ção para, por exemplo, determinar a presença de β8 in vivo ou in vitro. Em tais modalidades, o anticorpo é direta ou indiretamente marcado com uma porção detectável. Desse modo, em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de determinar a presença de integrina β8 em uma amostra biológica (in vitro ou in vivo) compreendendo contatar a amostra biológica com um anticorpo marcado de acordo com a invenção e detectar a presença do anticorpo marcado, assim determinando a presença da integrina β8. Em algumas modalidades, o métodoé usado para diagnosticar uma condição selecionada do grupo que consiste em artrite, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, distúrbios fibróticos, uma doença inflamatória autoimune do cérebro, esclerose múltipla, uma doença desmielinizante (por exemplo, mi- elite transversa, doença de Devic, síndrome de Guillain-Barré), neu- roinflamação, doença renal, adenocarcinoma, carcinoma escamoso, glioma, carcinoma de mama, e crescimento e metástase de câncer.
[015] A presente invenção ainda diz respeito a um camundongo transgênico que expressa a integrina β8 humana. Em algumas modalidades, o camundongo transgênico da invenção não expressa integrina β8 de camundongo.
[016] As composições e métodos da invenção podem ser usados para reduzir a ativação de TGF-β em um indivíduo tendo uma ou mais das condições selecionadas do grupo que consiste em artrite, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, distúrbios fibróticos, uma doença inflamatória autoimune do cérebro, esclerose múltipla, uma doença desmielinizante (por exemplo, mielite transversa, doença de Devic, síndrome de Guillain-Barré), neuroinflamação, doença renal, adenocarcinoma, carcinoma escamoso, glioma, carcinoma de mama, e crescimento e metástase de câncer, e em que a redução de TGF-β resulta em melhora da condição. Em algumas modalidades, os distúrbiosfibróticos são fibrose das vias aéreas, fibrose pulmonar idiopática, pneumonia intersticial não-específica, fibrose pulmonar pós-infecciosa, dano alveolar difuso, fibrose pulmonar associada a doenças colágeno- vasculares, fibrose pulmonar induzida por fármacos, silicose, fibrose pulmonar relacionada a amianto, bronquiolite respiratória, doença pulmonar intersticial associada à bronquiolite respiratória, fibrose intersticial descamativa, pneumonia em organização criptogênica, pneumonia de hipersensibilidade crônica, fibrose pulmonar relacionada a fárma- cos, fibrose renal, ou fibrose hepática.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO INTRODUÇÃO
[017] A presente invenção baseia-se, em parte, na constatação de que certos antagonistas anti-αvβ8, anticorpos anti-αvβ8 ou imu- noconjugados seletivamente perturbam a ativação mediada por αvβ8 de TGF-β, mas não a adesão celular de uma célula de expressão de αvβ8 a TGF-β imobilizado. Consequentemente, a presente invenção fornece métodos de reduzir a ativação de TGF-β em um indivíduo administrando o antagonista de αvβ8 (por exemplo, moléculas pequenas, anticorpos anti-αvβ8 ou imunoconjugados) a um indivíduo em necessidade do mesmo, assim reduzindo a ativação de TGF-β no indivíduo. A presente invenção também fornece novos anticorpos tendo uma região variável da cadeia leve compreendendo três CDRs da cadeia leve da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, e SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo três CDRs da cadeia pesada da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
DEFINIÇÕES
[018] O termo "integrina β8"é usado alternadamente com itgb8, ITGB8, β8, e termos similares. ITGB8 é tipicamente usado para referir- se à sequência humana, enquanto itgb8 se refere à sequência de camundongo. A sequência de proteína humana pode ser encontrada no Uniprot número de acesso P26012, enquanto a sequência murina tem número de acesso de Uniprot Q0VBD0.
[019] Um "antagonista" se refere a um agente que inibe a ex pressão de um polipeptídeo ou polinucleotídeo da invenção ou se liga, bloqueia parcial ou totalmente a estimulação, diminui, impede, retarda a ativação, inativa, dessensibiliza, ou infrarregula a atividade de um polipeptídeo ou polinucleotídeo da invenção. Um antagonista pode neutralizar a atividade (por exemplo, impedir a ligação e ativação por um ligante natural) ou ativamente reduzir a atividade.
[020] Os termos "idêntico" ou porcentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências de aminoácidos ou de polipeptí- deos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos (isto é, cerca de 60% de identidade, preferivelmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais alto de identidade em uma região especificada, quando comparada e alinhada para correspondência máxima em uma janela de comparação ou região designada) como medido usando algoritmos de comparação de sequência BLAST ou BLAST 2.0 com os parâmetros predefinidos descritos abaixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual (vide, por exemplo, sítio de rede da NCBI ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ou outros). Tais sequências são depois ditas ser "substancialmente idênticas". A pre- sente invenção fornece, por exemplo, anticorpos que têm sequências de polinucleotídeos ou de polipeptídeos tendo pelo menos 80% de identidade, preferivelmente 85%, 90%, 91%, 92%, 93, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade, a uma sequência de referência, por exemplo, SEQ ID NOs: 1 -10. Esta definição também se refere, ou pode ser aplicada, ao complemento de uma sequência de teste. A definição também inclui sequências tendo deleções e/ou adições, como também aquelas que têm substituições. Como descrito abaixo, os algoritmos preferidos podem responder por intervalos e outros. Preferivelmente, a identidade existe em uma região que é pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleotídeos em comprimento, ou mais preferivelmente em uma região que é 50-100 aminoácidos ou nu- cleotídeos em comprimento.
[021] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequên cia atua como uma sequência de referência à qual as sequências de teste são comparadas. Quando usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são entradas em um computador, as coordenadas da subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. Preferivelmente, parâmetros predefinidos do programa podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência depois calcula a porcentagem de identidades de sequência para as sequências de teste com relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa.
[022] Uma "janela de comparação", como aqui usado, inclui refe rência a um segmento de qualquer um do número de posições contíguas selecionadas do grupo que consiste em 20 a 600, usualmente cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências estarem otimamente alinhadas. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Alinhamento de sequências ótimo para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de ho- mologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa por método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), através de implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Wisconsin Genetics Software, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds. 1995 suplemento)).
[023] Um algoritmo que é adequado para determinar a porcen tagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) e Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 são usados, com os parâmetros descritos aqui, para determinar a porcentagem de identidade de sequência para os ácidos nucleicos e proteínas da invenção. Software para executar as análises de BLAST está publicamentedisponível por meio do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro identificar os pares de sequência de contagem alta (HSPs) identificando as palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que pareiam ou satisfazem alguma contagem de limiar com valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de base de dados. T é referido como o limiar de contagem de palavra vizinha (Altschul et al, supra). Estas repetições iniciais de palavras vizinhas atuam como sementes para iniciar as pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo as mesmas. As repetições de palavra são estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência para até onde a contagem de alinhamento cumulativa puder ser aumentada. As contagens cumulativassão calculadas usando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (contagem de recompensa para um par de resíduos pa- reados; sempre > 0) e N (contagem de penalidade para resíduos não- pareados; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de contagem é usada para calcular a contagem cumulativa. Extensão das repetições de palavra em cada direção é parada quando: a contagem de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a contagem cumulativa vai para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduo de registro negativo; ou o final de qualquer sequência é chegado. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como predefinições um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambos os filamentos. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como predefinições um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de contagem de BLO- SUM62 (vide Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os filamentos.
[024] "Ácido nucleico" se refere aos deoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos na forma de fita simples ou dupla, e seus complementos. O termo abrange ácidos nucleicos contendoanálogos de nucleotídeo conhecidos ou resíduos da cadeia principal modificados ou ligações que são sintéticas, de ocorrência natural e de ocorrência não-natural tendo propriedades de ligação similares que o ácido nucleico de referência e sendo metabolizado de uma maneira similar aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metila, fosfonatos de quiral-metila, ribonucleotídeo de 2-O-metila, peptídeo-ácidos nucléicos (PNAs).
[025] A menos que do contrário indicado, uma sequência de áci do nucleicos particular também implicitamente abrange variantes de modo conservador modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códon degenerado) e sequências complementares, como também a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códon degenerado podem ser alcançadas gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos basais misturados e/ou de deoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al, Mol. Cell Probes 8:91 -98 (1994)). O termo ácido nucleico é usado alternadamente com gene, cDNA, mRNA, oligonucleotídeo, e polinucleotídeo.
[026] Uma sequência de ácido nucleicos particular também impli citamente abrange "variantes splice". Similarmente, uma proteína particular codificada implicitamente por um ácido nucleico abrange qualquerproteína codificada por uma variante splice daquele ácido nuclei- co. "variantes splice", como o nome sugere, são produtos de splicing alternativo de um gene. Após transcrição, uma transcrição de ácido nucleico inicial pode ser submetida a splicing de modo que produtos splice de ácido nucleico diferentes (alternados) codifiquem polipeptí- deos diferentes. Mecanismos para a produção de variantes splicevariam, mas incluem splicing alternado de éxons. Polipeptídeos alternados derivados do mesmo ácido nucleico por transcrição de leitura ininterrupta (read-through) são também abrangidos por esta definição. Quaisquer produtos de uma reação de splicing, incluindo formas re- combinantes dos produtos splice, são incluídos nesta definição. Um exemplo de variantes splice do canal potássio é debatido em Leicher, et al., J. Biol. Chem. 273(52):35095-35101 (1998).
[027] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo"e "proteína" são usa dos alternadamente aqui para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, como também a polímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímero de aminoácido de ocorrência não-natural.
[028] O termo "aminoácido"se refere a aminoácidos de ocorrên cia natural e sintéticos, como também análogos de aminoácido e mi- méticos de aminoácido que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, como também aqueles aminoácidos que são modificados depois, por exemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, e O-fosfosserina. Análogos de aminoácido referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, isto é, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metioni- na, sulfônio de metila de metionina. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais peptídicas mo-dificadas, mas retém a mesma estrutura química básica que um ami- noácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácido referem-se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estruturaquímica geral de um aminoácido, mas que funcionam de uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural.
[029] Aminoácidos podem ser referidos aqui ou por seus símbo- los de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotídeos, igualmente, podem ser referidos por seus códigos de uma letra comumente aceitos.
[030] "Variantes de modo conservador modificadas" aplica-se às sequências de aminoácidos e de ácido nucleicos. Com respeito às sequências de ácido nucleicos particulares, variantes de modo conservador modificadas referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codificar uma sequência de aminoácido, às sequências essencialmente idênticas. Por causa da degeneração do código genético, um número grande de ácidos nucleicos funcionalmenteidênticos codifica qualquer proteína dada. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Desse modo, em cada posição onde uma alanina for especificada por um có- don, o códon pode ser alterado em quaisquer dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações de modo conservador modificadas. Toda sequência de ácido nucleicos aqui que codifica um polipeptídeo também descreve toda possível variação silenciosa do ácido nucleico. Alguém de habilidade reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG que ordinariamente é o único códon para metionina, e TGG que ordinariamenteé o único códon para triptofano) pode ser modificado para render uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita com respeito ao produto de expressão, mas não com respeito às sequências de sonda atuais.
[031] Sobre as sequências de aminoácidos, alguém de habilidade reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais em uma sequência de ácidos nucleicos, peptídeos, polipeptídeos, ou de proteínas que alteram, adicionam ou excluem um aminoácido simples ou uma porcentagem pequena de aminoácidos na sequência codificadaé uma "variante de modo conservador modificada" onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituições conservadoras que fornecemaminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes de modo conservador modificadas são em adição e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies, e alelos da invenção.
[032] Os seguintes oito grupos cada um contém aminoácidos que são substituições conservadoras um pelo o outro: 1) Alanina (A), Glici- na (G); 2) Ácido aspártico(D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (vide, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)).
[033] Uma "marcação"ou uma "porção detectável" é uma com posição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquí-micos,imunoquímicos, físicos químicos, ou outros. Por exemplo, as marcações úteis incluem 32P, tinturas fluorescentes, reagentes densos para elétrons, enzimas (por exemplo, como comumente usadas em uma ELISA), biotina, digoxigenina, ou haptenos e proteínas que podem ser feitas detectáveis, por exemplo, incorporando uma radiomar- cação no peptídeo ou usado para especificamente detectar anticorpos reativos com o peptídeo.
[034] O termo "recombinante" quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucleico, proteína, ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativos, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Desse modo, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não-recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são do contrário expressados anormalmente, infraexpressa- dos ou não expressados.
[035] O termo "heterólogo"quando usado com referência às por ções de um ácido nucleico indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação uma com a outra na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de modo recombinante, tendo duas ou mais sequências gênicas não relacionadas dispostas para fazer um ácido nu- cleico funcional novo, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte. Similarmente, uma proteína hete- róloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação uma com a outra na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).
[036] "Anticorpo" se refere a um polipeptídeo compreendendo uma região estrutural de um gene de imunoglobulina ou seus fragmentos que especificamente liga e reconhece um antígeno. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes capa, lambda, alfa, gama, delta, epsilo, e mu das regiões constantes, como também os genes da miríade das regiões variáveis da imunoglobulina. Cadeias leve são classificadas como capa ou lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsilo que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Tipicamente, a região de ligação de antígeno de um anticorposerá muito crítica em especificidade e afinidade de ligação.
[037] O anticorpo se liga a um epítopo no antígeno. O epítopo é o sítio de interação específico de ligação do anticorpo no antígeno, e pode incluir alguns aminoácidos ou porções de alguns aminoácidos, por exemplo, 5 ou 6, ou mais, por exemplo, 20 ou mais aminoácidos, ou porções daqueles aminoácidos. Em alguns casos, o epítopo inclui componentes de não-proteína, por exemplo, de um carboidrato, ácido nucleico, ou lipídio. Em alguns casos, o epítopo é uma porção tridimensional. Desse modo, por exemplo, onde o alvo for uma proteína, o epítopo pode ser compreendido de aminoácidos sucessivos, ou ami- noácidos de partes diferentes da proteína que são colocadas em proximidade pelo dobramento das proteínas (por exemplo, um epítopo descontínuo). O mesmo é verdade para outros tipos de moléculas alvo que formam estruturas tridimensionais.
[038] Uma unidade estrutural de imunoglobulina exemplar (anti corpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kD) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kD). O término N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) se referem a estas cadeias leve e pesada, respectivamente.
[039] Anticorpos existem, por exemplo, como imunoglobulinas intactas ou como vários fragmentos bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases. Desse modo, por exemplo, a pep- sina digere um anticorpo abaixo das ligações de dissulfeto na região de dobradiça para produzir F(ab)’2, um dímero de Fab que é por si só uma cadeia leve unida a VH-CH1 por uma ligação de dissulfeto. O F(ab)’2 pode ser reduzido sob condições moderadas para quebrar a ligação de dissulfeto na região de dobradiça, assim convertendo o dí- mero de F(ab)’2 no monômero de um Fab. O monômero de Fab’ é essencialmente Fab com parte da região de dobradiça (vide Fundamen- tal Immunology (Paul ed., 3aed. 1993). Embora vários fragmentos de anticorpo fossem definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, alguém de habilidade apreciará que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo ou quimicamente ou usando metodologia de DNA recombinante. Desse modo, o termo anticorpo, como aqui usado, também inclui fragmentos de anticorpo ou produzidos pela modificação de anticorpos inteiros, ou aqueles sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante (por exemplo, Fv de cadeia simples) ou aqueles identificados usando bibliotecas de exibição de fago (vide, por exemplo, McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990)).
[040] Para a preparação de anticorpos adequados da invenção e para o uso de acordo com a invenção, por exemplo, anticorpos recom- binantes, monoclonais, ou policlonais, muitas técnicas conhecidas na técnica podem ser usadas (vide, por exemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al, págs. 77-96 em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); e Goding, Monoclonal Antibodies: Principle and Practice (2a ed. 1986)). Os genes que codificam as cadeias pesada e leve de um anticorpo de interesse podem ser clonados de uma célula, por exemplo, os genes que codificam um anticorpo monoclonal podem ser clonados de um hibridoma e usados para produzir um anticorpo monoclonal recombi- nante. Bibliotecas de genes que codificam cadeias pesada e leve de anticorpos monoclonais podem também seja feitas de hibridoma ou células plasmáticas. Combinações aleatórias dos produtos de gene de cadeia pesada e leve geram um fundo geral grande de anticorpos com especificidade antigênica diferente (vide, por exemplo, Immunology (3a ed. 1997)). Técnicas para a produção de anticorpos de cadeia simples ou anticorpos recombinantes (patente U. S. 4.946.778, patente U. S. 4.816.567) podem ser adaptadas para produzir anticorpos para os po- lipeptídeos desta invenção. Também, camundongos transgênicos, ou outros organismos tais como outros mamíferos, podem ser usados para expressar anticorpos humanizados ou humanos (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, Marks et al, Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); e Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)). Alternativamente, a tecnologia de exibição de fago pode ser usada para identificar os anticorpos e os fragmentos de Fab heteroméricos que especificamente ligam aos antígenos selecionados (vide, por exemplo, McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)). Os anticorpos podem também ser feitos biespecíficos, isto é, capazes de reconhecer dois antígenos diferentes (vide, por exemplo, WO 93/08829, Traunec- ker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991); e Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)). Anticorpos podem também ser hetero- conjugados, por exemplo, dois anticorpos covalentemente unidos, ou imunotoxinas (vide, por exemplo, Patente U. S. 4.676.980, WO 91/00360; WO 92/200373; e EP 03089).
[041] Métodos para primatizar anticorpos humanos ou não- humanos são bem conhecidos na técnica. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo de uma fonte que é não-humana. Estes resíduos de aminoáci- dos não-humanos são frequentemente referidos como resíduos de importação que são tipicamente tirados de um domínio variável de importação. Humanização pode ser essencialmente executada seguindo o método de Winter e colaboradores (vide, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)), substituindo as CDRs de roedor ou sequências de CDR pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (patente U. S. 4.816.567), em que substancialmente menos que um domínio de variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos roedores.
[042] Um "anticorpo quimérico" é uma molécula de anticorpo em que (a) a região constante, ou uma porção da mesma, é alterada, substituída ou trocada de modo que o sítio de ligação de antígeno (região variável) é ligado a uma região constante de uma classe, função efetora e/ou espécie diferente ou alterada, ou uma molécula completamente diferente que confere propriedades novas ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, fármaco, etc.; ou (b) a região variável, ou uma porção da mesma, é alterada, substituída ou trocada com uma região variável tendo uma especificidade de antígeno diferente ou alterada. Os anticorpos preferidos, e para o uso de acordo com a invenção, incluem anticorpos hu-manizados e/ou monoclonais quiméricos.
[043] Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com uma porção "efetora". A porção efetora pode ser qualquer número de moléculas, incluindo porções de marcação tais como marcações radioativas ou marcações fluorescentes, ou pode ser uma porção terapêutica. Em um aspecto, o anticorpo modula a atividade da proteína. Tais porções efetoras incluem, mas não se limitam a, um fármaco antitumoral, uma toxina, um agente radioativo, uma citocina, um segundo anticorpo ou uma enzima. Ainda, a invenção fornece uma modalidade em que o anticorpo da invenção está ligado a uma enzima que converte um pró- medicamento em um agente citotóxico.
[044] O imunoconjugado pode ser usado para visar a porção efe- tora para uma célula αvβ8-positiva, particularmente células que expressam a αvβ8. Tais diferenças podem ser facilmente evidentes ao ver as bandas de géis aproximadamente carregadas de modo similar com as amostras de teste e de controle. Exemplos de agentes citotóxi- cos incluem, mas não se limitam a, ricina, doxorrubicina, daunorrubici- na, taxol, brometo de etídio, mitomicina, etoposide, tenoposide, vincris- tina, vinblastina, colquicina, di-hidróxi antracina diona, actinomicina D, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, e glicocorticóide e outros agentes quimioterapêuticos, como também ra- dioisótopos. Marcadores detectáveis adequados incluem, mas não se limitam a, um radioisótopo, um composto fluorescente, um composto bioluminescente, composto quimioluminescente, um quelante de metal ou uma enzima.
[045] Em algumas modalidades, a invenção fornece anticorpos para αvβ8. Anticorpos anti-αvβ8 podem ser usados sistemicamente para reduzir a ativação de TGF-β em um indivíduo sozinho ou quando conjugado com uma marcação detectável ou porção efetora. Anticorpos anti-αvβ8 conjugados com agentes tóxicos, tais como ricina, como também anticorpos não conjugados podem ser agentes terapêuticos úteis.
[046] Adicionalmente, a proteína recombinante da invenção com preendendo a região de ligação de antígeno de quaisquer dos anticorpos monoclonais da invenção pode ser usada para detectar ou tratar câncer. Em uma tal situação, a região de ligação de antígeno da proteína recombinante é unida a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma segunda proteína endo atividade terapêutica. A segunda proteína pode incluir, mas não se limitada a, uma enzima, linfocina, oncostatina ou toxina. Toxinas adequadas incluem doxorrubicina, dau- norrubicina, taxol, brometo de etídio, mitomicina, etoposide, tenoposi- de, vincristina, vinblastina, colquicina, di-hidróxi antracina diona, acti- nomicina D, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, ricina, abrina, glicocorticóide e radioisótopos.
[047] Uma "marcação"ou uma "porção detectável" é um agente de diagnóstico ou componente detectável por meios espectroscópicos, radiológicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, físicos químicos, ou outros. Marcações exemplares incluem radiomarcações (por exemplo, 111In, 99mTc, 131I, 67Ga) e outros agentes de imageamento aprovados pela FDA. Marcações adicionais incluem 32P, tinturas fluorescentes, reagentes densos para elétrons, enzimas, biotina, digoxige- nina, ou haptenos e proteínas ou outras entidades que possam ser feitasdetectáveis, por exemplo, incorporando uma radiomarcação no agente de visamento. Qualquer método conhecido na técnica para conjugar um ácido nucleico ou nanoveículo com a marcação pode ser empregado, por exemplo, usando os métodos descritos em Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.
[048] Um anticorpo ou agente "marcado" ou "identificado"é um que está ligado, ou covalentemente, através de um ligador ou uma ligação química, ou não-covalentemente, através de ligações iônicas, van der Waals, eletrostáticas, ou de hidrogênio a uma marcação de modo que a presença do anticorpo ou agente pode ser detectada detectando a presença da marcação ligada ao anticorpo ou agente.
[049] Técnicas para conjugar agentes detectáveis e terapêuticos para anticorpos são bem conhecidas (vide, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" em Controlled Drug Delivery (2aEd.), Robin son et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" em Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)).
[050] A frase "especificamente (ou seletivamente) liga" a um anti corpo ou "especificamente (ou seletivamente) imunorreativo com", ao referir-se a uma proteína ou peptídeo, se refere a uma reação de ligação que é determinativa da presença da proteína, frequentemente em uma população heterogênea de proteínas e outras biologias. Desse modo, sob condições de imunoensaio designadas, os anticorpos especificados se ligam a uma proteína particular pelo menos duas vezes a base e mais tipicamente mais que 10 a 100 vezes a base. Ligação específica a um anticorpo sob tais condições requer um anticorpo que seja selecionado por sua especificidade para uma proteína particular. Por exemplo, anticorpos policlonais podem ser selecionados para obter-se apenas aqueles anticorpos policlonais que especificamente sejam imunorreativos com o antígeno selecionado e não com as outras proteínas. Esta seleção pode ser alcançada deduzindo os anticorpos que reagem cruzando com as outras moléculas. Uma variedade de formatos de imunoensaio pode ser usada para especificamente selecionar os anticorpos imunorreativos com uma proteína particular. Por exemplo, imunoensaios de ELISA de fase sólida são habitualmente usados para especificamente selecionar os anticorpos imunorreativos com uma proteína (vide, por exemplo, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) para uma descrição dos formatos e condições de imunoensaio que podem ser usados para determinar a imunorreatividade específica).
[051] Por "dose ou quantidade terapeuticamente efetiva" aqui é significado uma dose que produz efeitos para os quais é administrada. A dose e formulação exatas dependerão do propósito do tratamento, e serão determináveis por alguém versado na técnica usando técnicas conhecidas (vide, por exemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20aEdição, Editor Gennaro, (2003), e Pickar, Dosage Calculations (1999)).
[052] Os termos "sais farmaceuticamente aceitáveis"ou "veículo farmaceuticamente aceitável" são significados a incluir sais dos compostos ativos que são preparados com ácidos ou bases relativamente não tóxicos, dependendo dos substituintes particulares encontrados nos compostos descritos aqui. Quando os compostos da presente invenção contiverem funcionalidades relativamente acídicas, os sais de adição de base podem ser obtidos contatando a forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente da base desejada, ou puro ou em um solvente inerte adequado. Exemplos de sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis incluem sal de sódio, potássio, cálcio, amônio, amino orgânico, ou de magnésio, ou um sal similar. Quando os compostos da presente invenção contiverem funcionalidades relativamente básicas, os sais de adição de ácido podem ser obtidos contatando a forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente do ácido desejado, ou puro ou em um solvente inerte adequado. Exemplos de sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos como ácidos clorídricos, hidrobrômico, nítrico, carbônico, mono-hidrogenocarbônico, fosfórico, mono-hidrogenofosfórico, di-hidrogenofosfórico, sulfúrico, mono-hidrogenossulfúrico, hidriódico, ou fosforosos e outros, como também os sais derivados dos ácidos orgânicos relativamente não tóxicos como acético, propiônico, isobutírico, maleico, malônico, benzoi- co, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, benzenos- sulfônico, p-tolilsulfônico, cítrico, tartárico, metanossulfônico, e outros. Também inclusos são os sais de aminoácidos tais como arginato e outros, e sais de ácidos orgânicos como ácidos glucurônicos ou galac- tunóricos e outros (vide, por exemplo, Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19 (1977)). Certos compostos específicos da presente invenção contêm funcionalidades básicas e acídicas que permitem converter os compostos em sais de adição de base ou de ácido. Outros veículos farmaceuticamente aceitáveis conhecidos àqueles de habilidade na técnica são adequados para a presente invenção.
[053] As formas neutras dos compostos podem ser regeneradas contatando o sal com uma base ou ácido e isolando o composto inicial da maneira convencional. A forma inicial do composto difere das várias formas de sal em certas propriedades físicas, tais como solubilidade em solventes polares, mas do contrário os sais são equivalentes à forma inicial do composto para o propósito da presente invenção.
[054] Além das formas de sal, a presente invenção fornece com postos que são em uma forma de pró-medicamento. Pró- medicamentos dos compostos descritos aqui são aqueles compostos que facilmente sofrem alterações químicas sob condições fisiológicas para fornecer os compostos da presente invenção. Adicionalmente, os pró-medicamentos podem ser convertidos nos compostos da presente invenção através de métodos químicos ou bioquímicos em um ambienteex vivo. Por exemplo, os pró-medicamentos podem ser lentamente convertidos nos compostos da presente invenção quando colocados em um reservatório de emplastro transdérmico com uma enzima ou reagente químico adequado.
[055] Certos compostos da presente invenção podem existir nas formas não-solvatadas como também formas solvatadas, incluindo formas hidratadas. Em geral, as formas solvatadas são equivalentes às formas não-solvatadas e são intencionadas ser abrangidas dentro do escopo da presente invenção. Certos compostos da presente invenção podem existir em múltiplas formas cristalinas ou amorfas. Em geral, todas as formas físicas são equivalentes aos usos contemplados pela presente invenção e são intencionadas que estar dentro do escopo da presente invenção.
[056] Certos compostos da presente invenção possuem átomos de carbono assimétricos (centros ópticos) ou ligações duplas; os racematos, diastereômeros, isômeros geométricos e isômeros individuaissão todos intencionados ser abrangidos dentro do escopo da presente invenção.
[057] Os termos "reduzir", "redutor", ou "redução", quando usa dos no contexto de ativação de TGF mediada por αvβ8 se refere a qualquer alteração negativa ou diminuição detectável na quantidade de um parâmetro refletindo a ativação de TGF-β, comparada a um valor padrão obtido sob as mesmas condições mas na ausência de um agente como descrito aqui (por exemplo, antagonistas anti-αvβ8, anticorpos anti-αvβ8 e imunoconjugados). O nível desta diminuição seguindoexposição a um agente como descrito aqui (por exemplo, antagonistas anti-αvβ8, anticorpos anti-αvβ8 e imunoconjugados) é, em algumas modalidades, pelo menos 10% ou 20%, e mais preferivelmente pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90%, e o mais preferivelmente 100%.
[058] O termo "competir", como aqui usado com respeito a um an ticorpo, significa que um primeiro anticorpo, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compete para ligação com um segundo anticorpo, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, onde a ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato é detectavelmente diminuída na presença do segundo anticorpo comparado à ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa onde a ligação do segundo anticorpo a seu epítopo é também detectavelmente diminuída na presença do primeiro anticorpo, pode, mas não necessariamente, ser o caso. Isto é, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo a seu epítopo sem aquele segundo anticorpo inibindo a ligação do primeiro anticorpo a seu respectivo epítopo. Porém, onde cada anticorpo detectavelmente inibe a ligação do outro anticorpo com seu epítopo ou ligante cognato, quer na mesma proporção, maior ou menor, os anticorpos são ditos "competirem cruzado" entre si para ligação de seu(s) respectivo(s) epítopo(s). Anticorpos competidores e competidores cruzados são abrangidos pela presente invenção. Independente do mecanismo por que tal competição ou competição cruzada ocorra (por exemplo, obstáculo estérico, alteração conformaci- onal, ou ligação a um epítopo comum, ou porção do mesmo, e outros), o artesão versado apreciaria, com base nos ensinamentos fornecidos aqui, que tal competição e/ou competição cruzada são abrangidas e podem ser úteis aos métodos revelados aqui.
[059] Numerosos tipos de ensaios de ligação competitivos são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (vide Stahli et al, Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (vide Kirkland et al, J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); ensaio marcado direto de fase sólida, ensaio em sanduíche marcado direto de fase sólida (vide Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA marcado direto de fase sólida RIA usando marcação de I-125 (vide Morel et al, Molec. Immunol. 25 (1):7-15 (1988)); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (Cheung et al, Virology 176:546-552 (1990)); e RIA marcado direto (Moldenhau- er et al, Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Tipicamente, um tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sóli- da ou células que carregam qualquer um destes, uma imunoglobulina de teste não-marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. Inibição competitiva é medida determinando a quantidade de marcação ligada à superfície sólida ou células na presença da imunoglobuli- na de teste. Usualmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos competidores) incluem anticorpos que ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para obstáculo estérico ocorrer. Usualmente, quando um anticorpo competidor estiver presente em excesso, ele inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50 ou 75%.
ATIVAÇÃO DE TGF-β
[060] O fator transformador de crescimento β (TGF-β) foi caracte rizado originalmente como uma proteína (segregado de uma linhagem celular tumoral) que era capaz de induzir um fenótipo transformado em células não-neoplásticas em cultura. Este efeito foi reversível, como demonstrado pela reversão das células para um fenótipo normal seguindoremoção do TGF-β. Hoje, TGF-β1 a TGF-β5 foram identificados. Estas proteínas compartilham regiões de aminoácido similares.
[061] TGF-βs têm efeitos proliferativos em muitos tipos de células mesenquimais e epiteliais. Sob certas condições, TGF-β demonstra efeitos antiproliferativos em células epiteliais, células endoteliais, ma- crófagos, e linfócitos T e B. Tais efeitos incluem diminuição da secreçãode imunoglobulina e supressão de hematopoiese, miogênese, adi- pogênese, e esteroidogênese ad-renal. Vários membros da família de TGF-β são indutores potentes da diferenciação mesodérmica em embriõesprematuros, em particular, TGF-β e activina A.
[062] TGF-βs, especificamente TGF-β 1, 2, e 3, são citocinas multipotentes que são moduladores importantes do crescimento celular,inflamação, síntese de matriz, do sistema imune, angiogênese, e apoptose (Taipale et al.). Defeitos na função de TGF-β estão associados com vários estados patológicos incluindo imunossupressão, crescimento de células tumorais, fibrose, e doença autoimune (Blobe et al.). Os TGF-βs são os protótipos da superfamília de TGF-β que consiste em mais de 40 membros que controlam os eventos fundamentais no desenvolvimento prematuro, padronização, reparo de tecido e cura de ferida. TGF-β é liberado como parte de um complexo latente em que a citocina não pode interagir com seu receptor.
[063] Para TGF-β sinalizar, deve ser liberado de seu complexo inativo por um processo chamado ativação de TGF-β. O complexo de TGF latente inclui 3 componentes: o dímero de TGF-β ativo (maduro), LAP (peptídeo associado à latência) e LTBP (proteína ligadora de TGF-β latente). LAP é um dímero ligado a diS que representa a extremidade N-terminal da proteína precursora de TGF-β. A proteína de TGF-β madura representa a extremidade C-terminal (cerca de 25kD) do precursor. A ligação entre os TGF-βs e LAP é proteoliticamente clivada dentro do Golgi, mas pró-peptídeo de TGF-β permanece ligado a TGF-β através de interações não-covalentes. O complexo de TGF-β e LAP é chamado o complexo latente pequeno (SLC). É a associação de LAP e TGF que confere latência. Ligação de LAP-TGF-β é reversível e os componentes purificados isolados podem recombinar-se para formar um SLC inativo. O SLC e o complexo maior são referidos aqui como TGF-β latente, uma vez que ambos são inativos.
[064] Uma propriedade incomum de TGF-β é que sua atividade é limitada pela conversão de TGF-β latente para TGF-β ativo (um processo denominado ativação de TGF-β latente). Tecidos contêm quantidades significativas de TGF-β latente e ativação de apenas uma fração pequena deste TGF-β latente gera respostas celulares máximas (Annes et al. (2003) J. Cell Sci. 116:217). Latência é conferida pela interação não-covalente do pró-peptídeo de TGF-β, também chamada a proteína associada à latência (LAP). Ativação ocorre sob clivagem da ligação entre TGF-β maduro e LAP. TGF-β latente é, desse modo, um precursor da proteína do TGF-β maduro, ativo. Uma vez ativo, TGF-β liga e reúne seus receptores do tipo I e do tipo II de seri- na/treonina cinase de afinidade alta e inicia uma cascata de transdu- ção de sinal.
[065] Há a diferença entre os termos "ativação de TGF" e "pro cessamento de TGF-β". Para os TGF-βs, o termo "processamento de TGF-β" se refere à clivagem proteolítica da ligação entre TGF-β e LAP. Sem clivagem, nenhuma atividade de TGF-β pode ser detectada no dímero de TGF-β de precursor sob qualquer condição. Clivagem é uma condição prévia para atividade de TGF-β. O termo "ativação de TGF-β" se refere à liberação do dímero de TGF-β de sua interação com LAP. Portanto, o precursor de TGF-β "processado" tem o potencial de ser ativado, isto é, para liberar TGF-β, enquanto que o TGF-β não processado não pode ser ativado sem inicialmente clivar (processar) a ligação do pró-peptídeo.
[066] Várias moléculas foram descritas como ativadores de TGF-β latentes. O primeiro processo da ativação mediada por células em que vários tipos celulares converteram o LLC, que é produzido constitutivamente pela maioria das células, em TGF ativo por uma reação dependente de protease foi por proteases. Ativação de TGF-β latente requereu a) o ativador de plasminogênio da protease urocinase (uPA), b) ativação do plasminogênio do substrato de uPA (o zimogênio da protease plasmi- na), c) ligação de LAP aos receptores fosfato/IGF-Il da manose-6 de superfície celular (M6P), d) LTBP, e e) TGase, uma vez que os anticorpos e/ou inibidores de cada um destes reagentes bloquearam a ativação de TGF-beta latente. Várias outras proteases, incluindo MMP-2, MMP-9, plasmina, calpaína, quimase, e elastase foram subsequentemente descritas como ativadores de TGF-β latentes (Koli, et al. (2001)).
[067] Um segundo mecanismo para ativação de TGF-β latente envolve a interação da proteína matricelular trombospondina (TSP-1) com TGF-β latente em um complexo multimolecular contendo receptores de TSP-1 como também CD36, e, em alguns casos, plasmina. Ativação de TGF-β latente envolve uma interação direta entre TSP-1 e LAP e inclui a sequência de tripeptídeo RFK encontrada nas repetições de TSP-1 do tipo 1. Acredita-se que o peptídeo interaja com o tetrapeptídeo conservado LSKL no término amino de LAP rompendo a associação não-covalente entre LAP e TGF-β. Um tetra peptídeo KRFK ativará TGF-β latente in vitro e in vivo, enquanto que a adição do peptídeo de LAP (LSKL) em excesso bloqueia a ativação de TGF-β latente. Camundongos de TSP-1 -/- mostram um fenótipo parcial, sobreposto com camundongos de TGF-β1 -/- com respeito à inflamação intensificada. A administração do peptídeo de bloqueio de LSKL em camundongos do tipo selvagem induz patologias do pâncreas e do pulmão similares àquelas observadas em animais de TGF-β -/-, enquanto que a adição do peptídeo de ativação de KRFK para camundongos de TSP-1 -/- revertem o fenótipo para normal. Porém, o fenóti- po do camundongo de TSP-1 -/- não replica o fenótipo total do camundongo de TGF-β1 -/- nem o fenótipo de TSP-1 -/- se assemelha a quaisquer dos fenótipos dos camundongos de TGF-β2 -/- ou TGF-β1 - /-. Estas discrepâncias sugerem novamente que possa haver múltiplos mecanismos e isoforma-específicos para a ativação de TGF-β latente.
[068] TGF-β latente pode ser ativado através de ácido moderado (pH 4,5) que provavelmente desestabiliza a interação entre LAP e TGF-β. Porém, com exceção das situações especializadas, tais como o compartimento extracelular formado por osteoclasto durante a res- sorção óssea, este pH é provavelmente alcançado raramente no am- biente extracelular in vivo. Portanto, o pH é improvável de ser um mecanismo comum para a ativação de TGF-β.
[069] Os pró-peptídeos de TGF-β1 e β3, mas não o pró-peptídeo de TGF-β2, contêm a sequência de reconhecimento da integrina RGD. LAPs de TGF-β1 e TGF-β3 interagem com as células que expressam as integrinas αvβ1 e αvβ5. Embora a ligação do TGF-β latente com estas integrinas não resulte em ativação, ligação do TGF-β latente com αvβ6 resulta na ativação (Munger et al. (1999) Cell 96:319). Ativação de TGF-β1 ou β3 latente através de αvβ6 requer a sequência de RGD como formas mutantes de TGF-β1 ou β3 contendo RGE falhe em ser ativada.
[070] Integrina αvβ8, em combinação com MT1-MMP, ativa TGF- β latente (Mu et al. (2002) J. Cell Biol. 159:493). A integrina αvβ8 é expressa primariamente em epitélios normais (por exemplo, epitélios das vias aéreas), células mesenquimais, e tecidos neuronais. Em que for considerado um único mecanismo, αvβ8, expressa na superfície da célula, interage com TGF-β latente na matriz celular, e recruta MT1- MMP para o complexo, onde a protease cliva o TGF-β latente e libera o peptídeo de TGF-β ativo, maduro.
BIOENSAIO DE TGF-β
[071] Para determinar a ativação de TGF-β em um ensaio de co- cultura, as células de teste que expressam αvβ8 são cocultivadas com as células de TMLC, que são as células epiteliais pulmonares de marta estavelmente transfeccionadas com um fragmento responsivo de TGF- β do promotor do inibidor-1 do ativador de plasminogênio dirigindo o gene da luciferase (Abe et al. (1994) Annal Biochem 216:276). Células de TMLC são altamente responsivas a TGF-β e produzem uma desativação basal muito baixa de TGF-β. Células de TMLC podem ser desse modo usadas na cocultura com outras linhagens celulares ou frações livres de célula para testar para a presença de TGF-β ativo usando lu- minescência como um estágio de leitura. Os ensaios são executados na presença ou ausência de anticorpo de bloqueio de anti-TGF-β (10 μg/mL, 1D11; R&D Systems), anti-β8 (20 μg/mL, 37E1B5) ou anti-β6 (150 μg/mL, 10D5) como descrito (Abe (1994); Munger (1999)).
[072] Para medir o TGF-β ativo em tecido tumoral, pesos iguais de tecido tumoral são picados e incubados em DME estéril por 30 min a 4°C. Os sobrenadantes contendo TGF-β ativo são colhidos após centrifugação (20 g) a 4°C. As pelotas são depois incubadas em DME livre de soro por 20 min a 80°C para ativar SLC após os quais os so- brenadantes foram colhidos. Os sobrenadantes contendo TGF-β ativo ou termoativado (latente) são depois acrescentados às células de TMLC pré-colocadas em placa com ou sem 1D11. Para os ensaios de inibidor da protease, os inibidores são adicionados na iniciação da co- cultura. A dose máxima de cada inibidor é definida como a concentração mais alta que não inibe a habilidade das células de TMLC para responder aos TGF-β ativo recombinante. Para medir atividade de TGF-β solúvel das células cultivadas, as células são incubadas em 100 μl de meio completo com ou sem 37E1 ou 10D5 por 1h a 37°C com rotação suave. Os sobrenadantes livres de célula são colhidos através de centrifugação (20 g) por 5 min a 4°C e depois acrescentadosàs células de TMLC de pré-colocadas em placa na presença ou ausência de 1D11. Para os ensaios de receptor solúvel, o meio condicionado obtido das culturas de células durante a noite é usado. Unidades de luciferase relativas são definidas como atividade menos a atividade basal das células repórter de TLC.
ANTICORPOS DA INVENÇÃO
[073] A presente invenção fornece anticorpos que especificamen te se ligam à integrina αvβ8, mas não se liga significativamente a outras integrinas (por exemplo, αvβ6, αvβ3, etc.). Os anticorpos da invenção podem se ligar a um epítopo específico ou região de epítopo dentro da αvβ8. O epítopo pode ser um epítopo conformacional (não- linear) ou não-conformacional. Um tal anticorpo pode ligar-se sozinho a β8, isto é, o epítopo fica localizado dentro de β8. A ligação do anticorpo da invenção pode requerer uma região de epítopo fora de β8, por exemplo, um epítopo conformacional, ou um que seja dependente de elementos tanto de dentro de αv como de dentro de β8.
[074] Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a β8 e inibe a ativação de TGF, por exemplo, comparada à ativação de TGF-β na ausência do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo não reduz a adesão das células que expressam αvβ8 ao TGF-β, isto é, o anticorponão reduz a adesão das células ao TGF-β. Em algumas modalidades, o anticorpo pode reduzir a ligação de αvβ8 solúvel ao TGF-β, comparado à ligação de αvβ8 na ausência do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ligar-se a um epítopo em β8 que está dentro da SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o epítopo inclui pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoácidos R79, I85, S95, P100, I108, P109, R128, H140, e F179 de β8 humana. Em algumas modalidades, o epítopo inclui pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoácidos I74, N88, I107, T110, I125, R175, e F180 de β8 humana. Em algumas modalidades, o epítopo inclui pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoácidos I125, R128, R175, F179, e F180 de β8 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a β8 humana, mas não de camundongo.
[075] O sítio de ligação, isto é, epítopo, de um anticorpo elevado contra um antígeno dado pode ser determinado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio de competição (por exemplo, um ELISA competitivo) pode ser realizado usando um anticorpo com um epítopo conhecido. Se o anticorpo de teste competir para ligação do antígeno, então ele provavelmente compartilha pelo menos parte do mesmo epítopo. O epítopo pode também ser localizado usando troca de domínio ou mutagênese seletiva do antígeno. Ou seja, cada região, ou cada aminoácido, do antígeno pode ser "trocada", ou substituída com aminoácidos ou componentes que são conhecidos não interagir com o anticorpo de teste. Se a substituição de uma região ou ami- noácido dado reduzir a ligação do anticorpo de teste ao antígeno substituído comparado ao antígeno não-substituído, então aquela região ou aminoácido está provavelmente envolvido no epítopo.
[076] A invenção fornece anticorpos que seletivamente perturbam a ativação mediada por αvβ8 de TGF-β (por exemplo, liberação de TGF-β maduro, ativo a partir de TGF-β latente na superfície de célula) mas, em algumas modalidades, o anticorpo não interfere significativamente com a adesão de αvβ8 (por exemplo, em uma célula de expressão de αvβ8) ao TGF-β latente. Alguns anticorpos são caracterizados por um grau alto de seletividade perturbando apenas a ativação de TGF-β mediada por integrina αvβ8 e não as propriedades da adesão celular, que podem ser indesejáveis inibir. Alguns anticorpos bloqueiam a ativação de TGF-β localmente onde a integrina αvβ8 é expressada.
[077] Um anticorpo exemplar da invenção tem uma região variá vel da cadeia leve compreendendo três CDRs da cadeia leve da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, e SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo três CDRs da cadeia pesada da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10. Anticorpos da presente invenção também incluem um anticorpo que compete para ligar a αvβ8 com um anticorpo tendo uma região variável da cadeia leve compreendendotrês CDRs da cadeia leve da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, e SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia pesada compreendendotrês CDRs da cadeia pesada da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10. O primeiro resíduo para SEQ ID NO: 9 podem ser R ou Y. É contemplado que outras substituições conservadoras de R ou Y também funcionarão. O isótipo do anticorpo pode ser IgG1, IgG2, IgG2a, IgG3 ou IgG4.
[078] Consequentemente, os anticorpos da presente invenção podem ser um anticorpo tendo uma região variável da cadeia leve de qualquer uma da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia pesada de qualquer uma da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção têm uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 3 e uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção têm uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 2. Dois anticorpos exemplares são 37E1 e 37E1B5.
[079] Anticorpos da presente invenção podem ser policlonais ou monoclonais. Soros policlonais tipicamente contêm populações misturadas de anticorpos que especificamente ligam-se a vários epítopos ao longo do comprimento da αvβ8. Porém, soros policlonais podem ser específicos para um segmento particular de αvβ8. Anticorpos exemplares são quiméricos, humanizados (vide Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989) e WO 90/07861, US 5.693.762, US 5.693.761, US 5.585.089, US 5.530.101 e Winter, US 5.225.539), ou humano (Lonberg et al., W093/12227 (1993); US 5.877.397, US 5.874.299, US 5.814.318, US 5.789.650, US 5.770.429, US 5.661.016, US 5.633.425, US 5.625.126, US 5.569.825, US 5.545.806, Nature 148. 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) EP 1481008, Bleck, Bioprocessing Jorunal 1 (set/out. de 2005), US2004132066, US2005008625, WO2004072266, WO2005065348, WO2005069970, e WO2006055778. Em algumas mo-dalidades, os anticorpos são formas humanizadas ou quiméricas de 37E1, ou 37E1B5. Isótipo humano IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 podem ser usados para anticorpos humanizados ou quiméricos. Alguns anticorpos especificamente ligam-se a αvβ8 com uma afinidade de ligação maior ou iguala a cerca de 107, 108, 109, 1010, 1011 ou 1012 M-1.
ANTAGONISTAS DE INTEGRINA αvβ8
[080] É ainda contemplado que vários antagonistas de integrina αvβ8, de ocorrência natural ou sintética, podem ser usados. Tais antagonistas incluem, por exemplo, peptídeos ou moléculas pequenas. Antagonistas podem incluir, por exemplo, agentes farmacêuticos, agentes terapêuticos, agentes ambientais, agrícolas, ou industriais, poluente, cosmecêuticos, fármacos, compostos orgânicos, lipídios, glicocorticói- des, antibióticos, peptídeos, proteínas, açúcares, carboidratos, e moléculasquiméricas. Em algumas modalidades, o antagonista de integrina αvβ8 é um peptídeo, por exemplo, um peptídeo TGF-β1-especifico ou um peptídeo TGF-e3-específico. Exemplos de peptídeos TGF-β- específicos incluem, mas não se limitam a, um peptídeo compreendendo GRRGDLATIH (Mu et al. (2002) Journal of Cell Biology 157:493507), e um peptídeo compreendendo HGRGDLGRLK. Em algumas mo-dalidades, a antagonista reduz a ativação de TGF-β mas não significati-vamente inibe a adesão celular mediada por αvβ8 ao TGF-β.
INDICAÇÕES
[081] É contemplado que os antagonistas anti-αvβ8, anticorpos anti-αvβ8 ou imunoconjugados, composições, e métodos da presente invenção podem ser usados para detectar, tratar, ou impedir doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e asma.
[082] É ainda contemplado que os antagonistas anti-αvβ8, anti corposanti-αvβ8 ou imunoconjugados, composições, e métodos da presente invenção podem ser usados para detectar, tratar, ou impedir uma doença inflamatória autoimune do cérebro, esclerose múltipla, uma doença desmielinizante (por exemplo, mielite transversa, doença de Devic, síndrome de Guillain-Barré), neuroinflamação, doença renal, ou glioma.
[083] É ainda contemplado que os antagonistas anti-αvβ8, anti- corpos anti-αvβ8 ou imunoconjugados, composições, e métodos da presente invenção podem ser usados para detectar, tratar, ou impedir artrite.
[084] É ainda contemplado que os antagonistas anti-αvβ8, anti corpos anti-ccvp8 ou imunoconjugados, composições, e métodos da presente invenção podem ser usados para detectar, tratar, ou impedir vários distúrbios fibróticos, tais como fibrose das vias aéreas, fibrose pulmonar idiopática, pneumonia intersticial não-específica, fibrose pulmonar pós-infecciosa, dano alveolar difuso, fibrose pulmonar associada a doenças colágeno-vasculares, fibrose pulmonar induzida por fármacos, silicose, fibrose pulmonar relacionada a amianto, bronquioli- te respiratória, doença pulmonar intersticial associada à bronquiolite respiratória, fibrose intersticial descamativa, pneumonia em organização criptogênica, pneumonia de hipersensibilidade crônica, fibrose pulmonar relacionada a fármacos, fibrose renal, fibrose hepática.
[085] É ainda contemplado que os antagonistas anti-αvβ8, anti corpos anti-αvβ8 ou imunoconjugados, composições, e métodos da presente invenção podem ser usados para detectar, tratar, ou impedir adenocarcinoma, carcinoma escamoso, carcinoma de mama, e crescimento e metástase de câncer.
COMPOSIÇÕES DE DIAGNÓSTICO
[086] A porção detectável pode ser associada com um anticorpo da invenção, ou direta ou indiretamente, por exemplo, por meio de um quelante ou ligador. Um anticorpo marcado pode ser depois fornecido a um indivíduo para determinar a aplicabilidade de uma terapia intencionada. Por exemplo, um anticorpo marcado pode ser usado para detectar a densidade da integrina β8 dentro da área doente, onde a densidade é tipicamente alta com relação ao tecido não-doente. Um anticorpo marcado pode também indicar que a área doente é acessível para terapia. Pacientes podem ser, desse modo, selecionados para terapia com base nos resultados do imageamento. Caracterização anatômica, tal como determinação dos limites precisos de um câncer, pode ser realizada usando técnicas de imageamento padrões (por exemplo, varredura de CT, MRI, varredura de PET, etc.).
[087] Um agente de diagnóstico compreendendo um anticorpo da presente invenção pode incluir qualquer agente de diagnóstico conhecido na técnica, como fornecido, por exemplo, nas referências a seguir: Armstrong et al, Diagnostic Imaging,5aEd., Blackwell Publishing (2004); Torchilin, V. P., Ed., Targeted Delivery of Imaging Agents, CRC Press (1995); Vallabhajosula, S., Molecular Imaging: Radiopharmaceuticals for PET e SPECT, Springer (2009). Um agente de diagnóstico pode ser detectado por uma variedade de modos, incluindo como um agente que fornece e/ou intensifica um sinal detectável. Sinais detec- táveis incluem, mas não se limitam a, sinais de emissão gama, radioativos,ecogênicos, ópticos, fluorescentes, absorptivos, magnéticos, ou sinais de tomografia. Técnicas para imagear o agente de diagnóstico podem incluir, mas não são limitadas a, tomografia computadorizada de emissão única de fótons (SPECT), imageamento de ressonância magnética (MRI), imageamento óptico, tomografia de emissão de pósi- trons (PET), tomografia computadorizada (CT), imageamento de raio X, imageamento de raio gama, e outros. Os termos "agente detectá- vel", "porção detectável", "marcação", "agente de imageamento", e termos similares são usados sinonimicamente aqui.
[088] Um radioisótopo pode ser incorporado nos agentes de di agnóstico descritos aqui e podem incluir radionuclídeos que emitem raios gama, pósitrons, partículas alfa e beta, e Raios X. Radionuclí- deos adequados incluem, mas não são limitados a, 225Ac, 72As, 211At, 11B, 128Ba, 212Bi, 75Br, 77Br, 14C, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 166Ho, 123I, 124I, 125I, 130I, 131I, 111I, 177Lu, 13N, 15O, 32P, 33P, 212Pb, 103Pd, 186Re, 188Re, 47Sc, 153Sm, 89Sr, 99mTc, 88Y e 90Y. Em certas moda- lidades, os agentes radioativos podem incluir 111In-DTPA, 99mTc(CO)3- DTPA, 99mTc(CO)3-ENPy2, 62/64/67Cu-TETA, 99mTc(CO)3-IDA, e 99mTc(CO)3triaminas (cíclicas ou lineares). Em outras modalidades, os agentes podem incluir DOTA e seus vários análogos com 111In, 177Lu, 153Sm, 88/90Y, 62/64/67Cu, ou 67/68Ga. Em algumas modalidades, uma na- nopartícula pode ser marcada por incorporação de lipídios presos aos quelatos, tal como DTPA-lipídio, como fornecido nas referências a seguir: Phillips et al, Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology, 1(1): 69-83 (2008); Torchilin, V. P. & Weissig, V., Eds. Lipossomes2aEd.: Oxford Univ. Press (2003); Elbayoumi, T. A. & Torchilin, V. P., Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 33: 1196-1205 (2006); Mougin-Degraef, M. et al, Int’l J. Pharmaceutics 344: 110-117 (2007).
[089] Em algumas modalidades, um agente de diagnóstico pode incluir quelantes que ligam, por exemplo, a íons de metal a serem usados para uma variedade de técnicas de imageamento de diagnóstico. Que- lantes exemplares incluem, mas não são limitados a, ácido etilenodiami- natetra-acético (EDTA), ácido [4-(1,4,8,11-tetra-azaciclotetradec-1- il)metil]benzoico (CPTA), ácido ciclo-hexanodiaminatetra-acético (CDTA), ácido etilenobis(oxietilenonitrilo)tetra-acético (EGTA), ácido dietilenotria- minapenta-acético (DTPA), ácido cítrico, ácido hidroxietil etilenodiamina triacético (HEDTA), ácido iminodiacético (IDA), ácido trietileno tetraamina hexa-acético (TTHA), 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10- tetra(ácido metileno fosfônico) (DOTP), ácido 1,4,8,11-tetra- azaciclotetradecano-1,4,8,11-tetra-acético (TETA), ácido 1,4,7,10-tetra- azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA), N1,N1-bis(piridin-2- ilmetil)etano-1,2-diamina (ENPy2) e derivados dos mesmos.
[090] Em algumas modalidades, o agente de diagnóstico pode ser associado com um ligante de ligação secundária ou com uma enzima (um marcador de enzima) que gerará um produto colorido em contato com um substrato cromogênico. Exemplos de enzimas ade- quadas incluem urease, fosfatase alcalina, peroxidase (raiz-forte) de hidrogênio e glicose oxidase. Ligantes de ligação secundária incluem, por exemplo, compostos de biotina e avidina ou de estreptavidina como conhecidos na técnica.
[091] Em algumas modalidades, os agentes de diagnóstico po dem incluir agentes ópticos tais como agentes fluorescentes, agentes fosforescentes, agentes quimioluminescentes, e outros. Numerosos agentes (por exemplo, tinturas, sondas, marcações, ou indicadores) são conhecidos na técnica e podem ser usados na presente invenção (vide, por exemplo, Invitrogen, The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Décima Edição (2005)). Agentes fluorescentes podem incluir uma variedade de moléculas pequenas orgânicas e/ou inorgânicas ou uma variedade de proteínas fluorescentes e seus derivados. Por exemplo, agentes fluorescentes podem incluir, mas não são limitados a, cianinas, ftalocianinas, porfirinas, indo- cianinas, rodaminas, fenoxazinas, fenilxantenos, fenotiazinas, fenosse- lenazinas, fluoresceína, benzoporfirinas, esquaraínas, dipirrolo pirimi- donas, tetracenos, quinolinas, pirazinas, corrinas, crocônios, acrido- nas, fenantridinas, rodaminas, acridinas, antraquinonas, análogos de calcogenopirílio, clorinas, naftalocianinas, tinturas de metina, tinturas de indolênio, compostos de azo, azulenos, aza-azulenos, tinturas de trifenil metano, indóis, benzoindóis, indocarbocianinas, benzoindocar- bocianinas, e derivados de BODIPY™.
MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO E FORMULAÇÃO
[092] Os antagonistas anti-αvβ8, anticorpos anti-αvβ8 ou imu- noconjugados são administrados a um paciente humano de acordo com os métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, como um bolo ou através de infusão contínua durante um certo tempo, por rotas intramusculares, intraperitoneais, intracerobro- espinhais, subcutâneas, intra-articulares, intrassinoviais, intratecais, orais, tópicas (por exemplo, transdérmica), ou de inalação. Administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo é preferida. A administração pode ser local ou sistêmica.
[093] As composições para administração compreenderão um agente comumente como descrito aqui (por exemplo, antagonistas an- ti-αvβ8, anticorpos anti-αvβ8 e imunoconjugados) dissolvido em um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente veículo aquoso. Uma variedade de veículos aquosos pode ser usada, por exemplo, solução salina tamponada e outros. Estas soluções são estéreis e em geral livres de substâncias indesejáveis. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas convencionais de esterilização bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares far- maceuticamente aceitáveis como requerido para aproximar das condições fisiológicas tais como agentes de ajuste de pH e tamponantes, agentes de ajuste de toxicidade e outros, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e outros. A concentração de agente ativo nestas formulações pode variar amplamente, e será selecionada primariamente com base nos volumes fluidos, viscosidades, peso do corpo e outros de acordo com o modo particular de administração selecionado e as necessidades do paciente.
[094] Desse modo, uma composição farmacêutica típica para administração intravenosa variará de acordo com o agente. Métodos atuais para preparar composições parenteralmente administráveis serão conhecidos ou evidentes àqueles versados na técnica e são descritos em mais detalhes em tais publicações como a Remington’s Pharmaceutical Science, 15aed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980).
[095] As composições farmacêuticas podem ser administradas em uma variedade de formas de dosagem de unidade dependendo do método de administração. Por exemplo, as formas de dosagem de unidade adequadas para administração oral incluem, mas não são limitadas a, pó, tabletes, pílulas, cápsulas e pastilhas. É reconhecido que os anticorpos quando administrados oralmente, deveriam ser protegidos da digestão. Isto é tipicamente realizado através de complexa- ção das moléculas com uma composição para as tornar resistentes à hidrólise acídica e enzimática, ou empacotamento das moléculas em um veículo apropriadamente resistente, tal como um lipossoma ou uma barreira de proteção. Meios de proteger os agentes da digestão são bem conhecidos na técnica.
[096] Formulações farmacêuticas, particularmente, dos anticor pos e imunoconjugados e inibidores para o uso com a presente invenção podem ser preparadas misturando um anticorpo tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farma- ceuticamente aceitáveis, opcionais. Tais formulações podem ser formulações ou soluções aquosas liofilizadas. Veículos, excipientes, ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações usadas. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis podem ser acetato, fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico) conservantes, poli- peptídeos de peso molecular baixo; proteínas, tais como albumina sé- rica ou gelatina, ou polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; e aminoácidos, monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes; e tensoati- vos iônicos e não-iônicos (por exemplo, polissorbato); contraíons for-madores de sal tais como sódio; complexos de metal (por exemplo complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos. O anticorpo pode ser formulado em uma concentração dentre 0,5 - 200 mg/mL, ou entre 10-50 mg/mL.
[097] A formulação pode também fornecer compostos ativos adi- cionais, incluindo, agentes quimioterapêuticos, agentes citotóxicos, citocinas, agente inibidor do crescimento, e agente anti-hormonal. Os ingredientes ativos podem também ser preparados como preparações de liberação contínua (por exemplo, matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos (por exemplo, poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool vinílico), polilactí- deos. Os anticorpos e imunoconjugados podem também ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de gelatina de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina,microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroe- mulsões.
[098] As composições podem ser administradas para tratamentos terapêuticos ou profilácticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente que sofre de uma doença (por exemplo, câncer, fibrose, COPD, artrite, etc.) em uma "dose terapeuti- camente efetiva". Quantidades efetivas para este uso dependerão da severidade da doença e do estado geral de saúde do paciente. Administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser administradas dependendo da dosagem e frequência como requerido e tolerado pelo paciente. Um "paciente" ou "sujeito" para o propósito da presente invenção inclui humanos e outros animais, particularmente mamíferos. Desse modo os métodos são aplicáveis à terapia humana e aplicações veterinárias. Na modalidade preferida, o paciente é um mamífero, preferivelmente um primata, e na modalidade mais preferida o paciente é humano. Outras terapias de câncer conhecidas podem ser usadas em combinação com os métodos da invenção. Por exemplo, as composições para o uso de acordo com a invenção podem também ser usadas para visar ou sensibilizar uma célula a outros agentes terapêuticos de câncer tais como 5FU, vinblastina, actinomici- na D, cisplatina, metotrexato, e outros.
[099] As administrações combinadas contemplam coadministra- ção, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica só, e administração sucessiva em qualquer ordem, em que preferivelmentehá um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos simultaneamente exercem suas atividades biológicas.
[0100] Moléculas e compostos identificaram que indireta ou dire tamente modulam a expressão e/ou função de uma αvβ8 podem ser úteis em reduzir a ativação de TGF-β em um indivíduo. Os antagonistas anti-αvβ8, anticorpos anti-αvβ8 ou imunoconjugados podem ser administrados sozinhos ou coadministrados em combinação com quimioterapia convencional, radioterapia ou imunoterapia como também terapêuticas correntemente desenvolvidas.
[0101] Formulações adequadas para administração oral podem consistir em (a) soluções líquidas, tais como uma quantidade efetiva do ácido nucleico empacotado, suspenso em diluentes, tais como água, solução salina ou PEG 400; (b) cápsulas, sachês ou tabletes, cada contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo, como líquidos, sólidos, grânulos ou gelatina; (c) suspensões em um líquido apropriado; e (d) emulsões adequadas. Formas de tablete podem incluir um ou mais de lactose, sacarose, manitol, sorbitol, fosfato de cálcio, amido de milho, amido de batata, celulose microcristalina, gelatina, dióxido de silício coloidal, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico, e outros excipientes, corantes, enchedores, aglutinantes, diluentes, agentes tamponantes, agentes umectantes, conservantes, agentes aromatizantes, tinturas, agentes desintegrantes, e veículos farmaceuticamente compatíveis. Formas de pastilha podem compre-ender o ingrediente ativo em um sabor, por exemplo, sacarose, como também pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte, tal como gelatina e glicerina ou sacarose e emulsões de acácia, géis, e outros contendo, além do ingrediente ativo, veículos conhecidos na técnica.
[0102] O composto de escolha, sozinho ou em combinação com outros componentes adequados, pode ser feito em formulações de aerossol (isto é, eles podem ser "nebulizados") para serem administrados por meio de inalação. As formulações de aerossol podem ser colocadas em propulsores aceitáveis pressurizados, tais como diclorodifluo- rometano, propano, nitrogênio, e outros.
[0103] Formulações adequadas para administração retal incluem, por exemplo, supositórios que consistem no ácido nucleico empacotado com uma base de supositório. Bases de supositório adequadas in-cluemtriglicerídeos naturais ou sintéticos ou hidrocarbonetos de parafina.Além disso, é também possível usar cápsulas retais de gelatina que consistem em uma combinação do composto de escolha com uma base, incluindo, por exemplo, triglicerídeos líquidos, polietileno glicóis, e hidrocarbonetos de parafina.
[0104] Formulações adequadas para administração parenteral, tal como, por exemplo, através de rotas intra-articulares (nas juntas), intra-venosas, intramusculares, intratumorais, intradérmicas, intraperitoneais, e subcutâneas, incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não- aquosas, isotônicas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteri- ostatos, e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente intencionado e suspensões estéreis aquosas e não-aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes es- pessantes, estabilizantes, e conservantes. Na prática desta invenção, as composições podem ser administradas, por exemplo, por infusão intravenosa, oral, tópica, intraperitoneal, intravesical ou intratecalmente. Administração parenteral, administração oral, e administração intrave- nosa são os métodos preferidos de administração. As formulações dos compostos podem ser introduzidas em recipientes vedados de dose única ou de doses múltiplas, tal como ampolas e frascos.
[0105] Soluções e suspensões de injeção podem ser previamente preparadas de pós estéreis, grânulos, e tabletes do tipo descrito. Células transduzidas por ácidos nucleicos para terapia ex vivo podem também ser administradas intravenosa ou parenteralmente como descrito acima.
[0106] A preparação farmacêutica é preferivelmente na forma de dosagem de unidade. Em tal forma, a preparação é subdividida em doses de unidade contendo quantidades apropriadas do componente ativo. A forma de dosagem de unidade pode ser uma preparação empacotada, o pacote contendo quantidades distintas de preparação, tais como tabletes, cápsulas, e pós acondicionados em frascos ou ampolas.Também, a forma de dosagem de unidade pode ser uma cápsula, tablete, sinete, ou pastilha em si, ou pode ser o número apropriado de qualquer um destes na forma empacotada. Se desejado, a composição pode também conter outros agentes terapêuticos compatíveis.
[0107] Preparações farmacêuticas preferidas liberam um ou mais antagonistas anti-αvβ8, anticorpos anti-αvβ8 ou imunoconjugados, op-cionalmente em combinação com um ou mais agentes quimioterapêu- ticos ou agentes imunoterapêuticos, em uma formulação de liberação contínua.
[0108] Em uso terapêutico para o tratamento de câncer, os anta gonistas anti-αvβ8, anticorpos anti-αvβ8 ou imunoconjugados utilizados no método farmacêutico da invenção são administrados na dosagem inicial de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 1000 mg/kg diariamente. Uma faixa de dose diária de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 500 mg/kg, ou cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 200 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, ou cerca de 10 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, pode ser usada. Porém, as dosagens podem ser variadas, dependendo dos requerimentos do paciente, da severidade da condição sendo tratada, e do composto sendo empregado. Por exemplo, dosagens podem ser empiricamente determinadas considerando o tipo e o estágio do câncer diagnosticado em um paciente particular. A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deveria ser suficiente para realizar uma resposta terapêutica benéfica com o passar do tempo no paciente. O tamanho da dose também será determinado pela existência, natureza, e extensão de qualquer efeito colateral adverso que acompanha a administração de um vetor particular, ou tipo de célula transduzida em um paciente particular. A determinação da dosagem apropriada para uma situação particular está dentro da habilidade do médico. Em geral, o tratamento é iniciado com dosagens menores que são menos que a dose ótima do composto. Depois disso, a dosagem é aumentada em incrementos pequenos até o efeito ótimo sob circunstâncias ser alcançado. Para conveniência, a dosagemdiária total pode ser dividida e administrada em porções durante o dia, se desejado.
[0109] As preparações farmacêuticas (por exemplo, antagonistas anti-αvβ8, anticorpos anti-αvβ8 ou imunoconjugados) para o uso de acordo com a invenção são tipicamente liberadas a um mamífero, incluindomamíferos humanos e não-humanos. Os mamíferos não- humanos tratados usando os métodos presentes incluem animais domesticados (isto é, canino, felino, murino, roedores, e lagomorfos) e animais agrícolas (bovino, equino, ovino, porcino).
EXEMPLOS
[0110] Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitar, a invenção reivindicada.
EXEMPLO 1. INVESTIGAÇÃO DO PAPEL DA INTEGRINA AVB8 NA REMODELAGEM DAS VIAS AÉREAS
[0111] Fator transformado de crescimento beta (TGF-β) é uma ci- tocina envolvida na resposta inflamatória e fibrótica. Foi previamente mostrado que IL-1β suprarregula a expressão de β8, e que a expressão de β8 é aumentada nas vias aéreas de pacientes de COPD. Porém, as interações de β8, TGF-β, e IL-1β são precariamente entendidasin vivo, nos levando a desenvolver um modelo de camundongo da remodelagem das vias aéreas mediada por β8. Aqui foi mostrado que a ativação induzida por IL-1β, mediada por β8 representa um papel crítico na remodelagem das vias aéreas.
[0112] O papel de β8 na mediação da remodelagem das vias aé reas foi tratado por deleção de β8 usando um sistema de Cre/LoxP, usando IL-1β intratraqueana adenoviral como um modelo para inflamação. Camundongos de seis a 9 semanas de idade com um alelo floxed (gene flanqueado por sítios loxP) da integrina β8 e um alelo geneticamente silenciado (Floxed/-) em uma base de C57B1/6 foi usado. Ou IL-1β humano adenoviral (Ad-hIL-1β) ou adenovírus de controle foi instilado de forma intratraqueana com ou sem Ad-Cre. Além disso, os camundongos expressando recombinase de fusão Cre-ER(T) sob controle do promotor de Iα2 de colágeno foi usado para mostrar que os fibroblastos representam um papel principal na ativação de TGF-β me-diada por αvβ8 em fibrose pulmonar induzida por bleomicina, remode- lagem das vias aéreas induzida por ovalbumina, e remodelagem das vias aéreas induzida por Ad-hIL-1β. As alterações de morfometria das vias aéreas foram avaliadas usando histologia, e a análise da expressão gênica das várias citocinas inflamatórias em pontos de tempo múltiplosapós administração de Ad-hIL-1β revelou indução sequencial dos genes que caracterizam uma resposta inflamatória.
[0113] No modelo geneticamente silenciado condicional de β8, β8 é requerido para inflamação transiente das vias aéreas induzida por IL- 1β humano e fibrose. Adição de IL-1β humano leva à ativação de TGF- β mediada por β8, indução dos genes de ccl2 e ccl20 de camundongo, recrutamento das células dendríticas e iniciação e perpetuação da resposta imune adaptável.
[0114] Estes dados mostram que a deleção condicional da integri- na β8 resultou em inflamação diminuída e resposta fibrótica a ambos Ad-hIL-1β e ovalbumina, que resultou na proteção da remodelagem das vias aéreas. Foi identificado um papel pivotante para ativação de TGF-β induzida por IL-1β ou induzida por ovalbumina, mediada por β8 na remodelagem das vias aéreas, e para lesão pulmonar aguda induzida por bleomicina.
EXEMPLO 2. ANTICORPO 37E1
[0115] Foi criado um anticorpo monoclonal de camundongo (de nominado clone 37E1, isótipo lgG2a) que seletivamente bloqueia a interação da integrina humana αvβ8 com seu Iigante, fator transformador de crescimento β (TGF-β). TGF-β é de modo ubíquo expresso em três isoformas nos mamíferos (TGF-β 1-3), mas é mantido em uma forma inativa por sua interação não-covalente com seu pró-peptídeo, o domínio de TGF-β associado à latência (LAP). A integrina αvβ8 liga-se ao LAP de TGF-β e medeia a ativação de TGF-β1 e 3. Estudos da linhagem germinal ou deleção genética condicional revelaram que a ativação da integrina de TGF-β é essencial para a ativação in vivo de TGF-β e, desse modo, αvβ8 é um "porteiro" da função de TGF-β. Em particular, a ativação de TGF-β mediada por integrina αvβ8 está provavelmente envolvida na patogênese de COPD, fibrose pulmonar, fibrose renal, doenças inflamatórias autoimunes do cérebro (esclerose múltipla e doenças desmielinizantes), neuroinflamação, doença renal, e crescimento e metástase de câncer. Em geral, as integrinas são moléculas de adesão e medeiam a ligação das células às proteínas de matriz extracelular. Clone 37E1 é distinto em que seletivamente perturba a ativação de TGF-β mediada por αvβ8 e não a ligação de αvβ8 a TGF-β imobilizado ou segregado. Isto fornece um grau alto de seletividade perturbando apenas a ativação mediada por integrina αvβ8 da ativação de TGF-β e não as propriedades de adesão celular que podem ser indesejáveis inibir. Além disso, a inativação global de TGF-β é provável ter efeitos colaterais indesejáveis uma vez que TGF-β é um homeostático epitelial essencial, e efetor imune.
EXEMPLO 3. ANTICORPO 37E1B5
[0116] Foram engenheiradas as regiões variáveis das cadeias pe sada e leve do clone 37E1, e mutagênese aleatória usada e embaralhamento de cadeia no sistema de exibição de levedura para fazer anticorpos de afinidade mais altos. Foram identificadas substituições específicas de aminoácidos que conferem afinidade mais alta pelo mesmo antígeno, e estas mutações foram amplamente classificadas de acordo com a função. Um daqueles mutantes foi nomeado 37E1B5. Mostra afinidade aumentada in vitro e eficácia mais forte na inibição da ativação de TGF-β de integrina em células cultivadas. A dose terapêutica efetiva do anticorpo 37E1B5 in vitro é na faixa picomolar. Para melhor aplicação de diagnóstico e terapêutica, Foram criadas três versões de 37E1B5: IgG1 de camundongo, IgG2a de camundongo, e IgG1 parcialmente humanizado. Todas foram produzidas em células CHO transformadas.
EXEMPLO 4. GERAÇÃO DE CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS DE BAC DE ITGB8
[0117] Foi criado um camundongo transgênico de BAC humaniza do expressando β8 humana e cruzaram-se os mesmos com camundongos ko de β8 para recuperar livrar dos efeitos letais da deleção da integrina murina αvβ8. Este camundongo humanizado será usado para testar a toxicidade e eficácia dos clones de afinidade alta em modelos de doença do pulmão, cérebro, fígado, e rim.
[0118] Clone RP11-431K20 que contém 72315 5’ e 30.683 3’ das respectivas regiões de flanqueamento 5’ e 3’ foi obtido do gene ITGB8 como uma cultura bacteriana "Stab" (Children’s Hospital Oakland Research Instituite, Oakland, CA). Placas (LB com cloranfenicol, 12,5 g/mL) foram riscadas e as colônias selecionadas usando PCR de colônia empregando iniciadores projetados para as extremidades de BAC 5’ e 3’. A sequência foi confirmada nas extremidades 5’ e 3’, na UTR de 5’ no primeiro intron, no 9° éxon no 9° íntron e na 10aregião de éxon/íntron. Uma colônia individual foi crescida e o DNA do plasmí- deo de BAC isolado (Nucleobond). O plasmídeo foi linearizado com PI- Sce (NEB), purificado em uma coluna de NAP5 e submetido à eletroforese de campo de pulso para confirmar a concentração e a integridade do DNA. O DNA foi injetado nos embriões de FVB/N na UCSF Cancer Center Transgenic Facility. De mais de duzentos embriões injetados, 24 filhotes foram obtidos dos quais 4 foram identificados como funda-dores através de PCR de DNA da cauda usando os iniciadores das extremidades de BAC 5’ e 3’.
[0119] Três destas linhagens (B, C e D) forneceram transmissão de linhagem germinal. As linhagens B, C, e D foram cruzadas com camundongos C57B/6 de itgb8 engenheirados para ter um alelo de itgb8 geneticamente silenciado. A geração de F2 foi cruzada para obter camundongos de BAC tg de ITGB8 em uma base itgb8 -/-.
[0120] Estes camundongos (linhagens B, C, e D) não exibem ne nhuma anormalidade fenotípica total em 3 ou 6 meses de idade. Estes resultados demonstram que todos os elementos reguladores requeridos são confinados aos elementos a montante e a jusante contidos BAC RP11-431 K20 para fornecer expressão de tecido apropriada para livrar do fenótipo letal dos camundongos de itgb8 -/-. Estes camundongos também fornecem um sistema experimental para determinar o biomarcador, ainda investigar mecanismos de doença in vivo, doença humana modelo, e testar os efeitos das terapêuticas direcionadas con- tra ativação de TGF-β mediada por αvβ8.
EXEMPLO 5. NEUTRALIZAÇÃO DE ANTI-INTEGRINA B8 REDUZ ColI
[0121] Produção aumentada de ECM e contractilidade aumentada de fibroblastos são conspicuidades das respostas fibróticas vistas no espessamento da parede das vias aéreas, e colágeno do tipo I aumentado Col I) e SMA aumentado (αSMA) são marcadores bioquímicos fundamentais daquela resposta. Para avaliar a contribuição de ativação de TGF-β mediada por αvβ8 autócrina para o fenótipo de fi- broblasto profibrótico foi usado anti-β8 neutralizante. Ativação de TGF- β mediada por αvβ8 autócrina influenciou o fenótipo de miofibroblas- tos, uma vez que o tratamento dos fibroblastos das vias aéreas com anticorpos de bloqueio de β8 inibiu a expressão de aSMA e secreção de Col I. Cocultura dos fibroblastos das vias aéreas com células epite- liais bronquiais humanas metaplásticas escamosas conduziram a um aumento na transcrição de Col I e produção de proteína através dos fibroblastos das vias aéreas. A produção aumentada de colágeno foi dependente de IL-1β e de β8 dos fibroblastos. O aumento na expressão de Col I induzido por cocultura com células epiteliais bronquiais humanas escamosas metaplásticas quase pode ser inibido por completo através do tratamento das coculturas com IL-1RA, ou por trans- fecção dos fibroblastos das vias aéreas com siRNA de β8.
EXEMPLO 6. CARACTERIZAÇÃO DO EPÍTOPO DE 37E1B5
[0122] Os constructos quiméricos da integrina β8, que trocaram as sequências de camundongo em ITGB8 humano foram usados para localizar o epítopo de ligação de 37E1B5. O epítopo foi localizado por ligação ao anticorpo, tingimento da superfície da célula, e detecção através de citometria de fluxo. O epítopo de 37E1B5 é abrangido dentro dos aminoácidos 74-180 da integrina humana β8. 37E1B5 liga-se a β8 humana, mas não à de camundongo. Portanto, pelo menos uma das 9 diferenças de aminoácidos não-conservadores ou 7 diferenças de aminoácidos secundários (indicadas por + na linha mediana da sequência) está incluído no epítopo de ligação. Estes domínios refletem as porções do que é conhecido no campo como Psi, híbrido e a hélice alfa1 do domínio beta-1 da subunidade de integrina β8, e são encontrados na superfície da molécula.
Figure img0001
[0123] SEQ ID NO: 11 representa a região da integrina β8 humana que inclui o epítopo de 37E1B5 (aminoácidos 74 - 180). SEQ ID NO: 12 representa a sequência murina homóloga que não está ligada pelo anticorpo de 37E1B5. O R na posição 140 da sequência murina é po- limórfico, e pode também ser um H.
[0124] Foram executados outros estudos de troca de domínio den tro desta região, substituindo a sequência murina pela humana, para determinar qual(is) aminoácido(s) está(ão) incluído(s) no epítopo de 37E1B5. Foi verificado que substituindo os aminoácidos murinos 125180 da integrina β8 reduziu a ligação de 37E1B5 significativamente. Desse modo, o epítopo na integrina β8 humana inclui pelo menos um aminoácido selecionado de I125, R128, R175, F179, e F180.
EXEMPLO 7: EXPRESSÃO DA INTEGRINA β8 EM FIBROBLASTOS DE COPD
[0125] Foi verificado que a expressão da Integrina β8 é aumentada nos fibroblastos dos pulmões de pacientes de COPD humana, como demonstrado por tingimento de tecido e cultura primária. Além disso, a expressão da Integrina β8 é significativamente aumentada nos fi- broblastos isolados de pacientes com fibrose pulmonar idiopática comparada aos fibroblastos de pacientes normais. Foi também verificado que os fibroblastos de COPD aumentaram a expressão da proteína da integrina αvβ8 dependente de IL-1β comparada aos fibroblastos de pulmão normal. Estes dados demonstram que αvβ8 é tanto um alvo a jusante como um mediador patológico dos efeitos de IL-1β.
[0126] O anticorpo 37E1B5 pode ser usado terapêutica e diagnos ticamente em doenças onde a integrina β8 é expressada, e IL-1β e/ou TGF-β representam um papel patológico.
EXEMPLO 8: ANTICORPO DE NEUTRALIZAÇÃO DA INTEGRINA β8 REDUZ INFLAMAÇÃO INDUZIDA DAS VIAS AÉREAS
[0127] Foram geradas três linhas de camundongos transgênicos de BAC usando o clone de BAC humano RP11-43K20. Estes camundongos foram cruzados com camundongos com um alelo funcional de itgb8 de camundongo para gerar uma geração de F1 de camundongos com ITGB8 humano e uma cópia funcional de itgb8 de camundongo. Estes camundongos foram hibridamente cruzados para gerar uma geração de F2 que resultou em BAC ITGB8 viável, isto é, camundongos de itgb8 -/- com uma cópia humana do gene, demonstrando livramento da letalidade de itgb8 -/-.
[0128] Estes camundongos foram usados para induzir remodela- gem das vias aéreas usando um modelo de liberação de IL-1β adenoviral intratraqueana. Neste modelo de inflamação da parede das vias aéreas induzida por IL-1β adenoviral, remodelagem robusta das vias aéreas com um perfil imunológico similar à doença pulmonar obstrutiva crônica é reprodutivelmente induzida.
[0129] Foi também verificado que o anticorpo de 37E1B5, em uma dose de 7 mg/kg, bloqueou significativamente a inflamação das vias aéreas, com uma redução significativa nos neutrófilos na lavagem broncoalveolar. Histologicamente, a inflamação da parede das vias aéreas e fibrose foram diminuídas significativamente por 37E1B5. Estes dados complementam outros dados que mostram que a deleção fibroblasto-específica de itgb8 pode inibir significativamente a remode- lagem das vias aéreas induzida por IL-1β adenoviral.
[0130] Foi também verificado que a remodelagem das vias aéreas alérgicas (inflamação das vias aéreas induzida por ovalbumina, fibrose e metaplasia mucosa), é grandemente diminuída em camundongos com deleção fibroblasto-específica de itgb8. O modelo alérgico é também dependente tanto de IL-1β como de TGF-β. Estes dados implicam um papel geral para itgb8 na amplificação de ambas as respostas imunes patológicas inatas e adaptáveis onde IL-1β e TGF-β representam um papel. IL-1β causa um aumento na integrina β8 em vários tipos de célula, incluindo fibroblastos da via aérea e pulmão, e astrócitos. Esta expressão da integrina β8 induzida por IL-1β é observada em camundongos e seres humanos.
EXEMPLO 9: CONDRÓCITOS ARTICULARES HUMANOS EXPRESSAM INTEGRINA αvβ8
[0131] Cartilagem articular adulta foi colhida do espaço da junta do joelho de um paciente que sofre reparo eletivo de um joelho para oste- oartrite crônica. Os condrócitos primários foram crescidos para confluênciade 70% e a expressão do receptor de integrina determinado por tingimento celular e citometria de fluxo. Os anticorpos usados foram anti-β8 (37E1B5) e anti-β6 (E7P6). Tingimento robusto foi detectado com 37E1B5 e nenhum tingimento foi visto com E7P6. Condróci- tos primários foram cocultivados com células repórter de TGF-β de TMLC (Annes et al. (2004) J. Cell Biol. 165:723) em um bioensaio de TGF-β na presença ou ausência anti-β8 (37E1B5) ou anti-β6 neutrali- zante. Anti-β8 produziu um bloqueio robusto da ativação de TGF-β en-quanto anti-β6 não produziu tal efeito.
[0132] Os resultados não só indicam que αvβ8 é expressada nos condrócitos, mas que a expressão resulta na ativação de TGF-β. Desse modo, a inibição de αvβ8 pode ser usada para tratar distúrbios de cartilagem relacionados ao TGF-β ativado, tal como artrite e fibrose sinovial (vide, por exemplo, Bakker et al. (2001) Osteoarthritis e Carti- lage 9: 128).
[0133] É entendido que os exemplos e as modalidades descritos aqui são para propósitos ilustrativos apenas e que as várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas às pessoas versadas na técnica e serão incluídas dentro do espírito e esfera deste pedido de patente e escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente citados aqui são por este meio incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

Claims (6)

1. Anticorpo isolado que especificamente se liga a αvβ8, ca-racterizado pelo fato de que possui uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 5, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 8, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 9, em que Xaa em SEQ ID NO: 9 é tirosina e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 10.
2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o anticorpo apresenta uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 2.
3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o isótipo do anticorpo é IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
4. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
5. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o anticorpo é anticorpo humano, humanizado ou quimérico.
6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 1 e um excipi- ente farmaceuticamente aceitável.
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