ES2202336T3 - Anticuerpo monoclonal contra la integrina alfa-v. - Google Patents
Anticuerpo monoclonal contra la integrina alfa-v.Info
- Publication number
- ES2202336T3 ES2202336T3 ES95119233T ES95119233T ES2202336T3 ES 2202336 T3 ES2202336 T3 ES 2202336T3 ES 95119233 T ES95119233 T ES 95119233T ES 95119233 T ES95119233 T ES 95119233T ES 2202336 T3 ES2202336 T3 ES 2202336T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- cells
- antibody
- cell
- monoclonal antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO ANTICUERPO MONOCLONAL, A UNA LINEA CELULAR DE HIBRIDOMAS QUE PRODUCE EL ANTICUERPO, A SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN EL ANTICUERPO Y A SECUENCIAS DE AMINOACIDO. EL ANTICUERPO MONOCLONAL, CUYA CONFORMACION PREFERIDA SE NOMBRA COMO 17E6 TIENE LAS SIGUIENTES PROPIEDADES: - REACCIONA SOLAMENTE CON LA CADENA {AL}V DE LAS INTEGRINAS {AL}V HUMANAS; BLOQUEA LA UNION AL SUBSTRATO DE INTEGRINA DE LA CELULA QUE SOPORTA LA INTEGRINA {AL}V; - EL DISPARO DE LA INTERACCION DE LA MATRIZ DE LAS CELULAS ESTABLECIDAS PROVOCADO POR LAS {AL}V INTEGRINAS; - BLOQUEA EL DESARROLLO DE LOS TUMORES; Y NO MUESTRA ACTIVIDAD CITOTOXICA.
Description
Anticuerpo monoclonal contra la integrina
\alpha-V.
La invención se refiere a un nuevo anticuerpo
monoclonal y a una línea de células de hibridoma que produce dicho
anticuerpo. El anticuerpo monoclonal, del que una realización
preferida se denomina 17E6, tiene las siguientes propiedades:
- reacciona sólo con la cadena \alphaV de
integrinas \alphaV humanas,
- bloquea la unión al substrato de integrina de
la célula que lleva la integrina \alphaV,
- induce la inversión de la interacción de la
matriz celular establecida provocada por integrinas \alphaV,
- bloquea el desarrollo de tumores,
- no muestra actividad citotóxica.
Por lo tanto, un objeto de la invención es un
anticuerpo monoclonal que tenga dichas propiedades.
De esta forma, la invención es un anticuerpo
monoclonal que produce la línea de células de hibridoma que tiene
la designación 272-17E6 y depositada con el número
de acceso DSM ACC2160, así como un anticuerpo monoclonal que tiene
las propiedades presentadas anteriormente y que se puede obtener
por dicha línea de células de hibridoma.
Además, la invención se refiere a secuencias de
ADN y a secuencias de aminoácidos. Las secuencias de ADN se
codifican por el anticuerpo o por partes del mismo. Las secuencias
se proporcionan en las SEC ID Nº 1 y 9 en el protocolo de
secuencias adjunto.
Finalmente, un objeto de la invención es una
composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como se ha
definido anteriormente.
Las integrinas son una superfamilia de receptores
de adhesión de la superficie celular que controlan la unión de las
células con el medio extracelular sólido - tanto a la matriz
extracelular (ECM) como a otras células. La adhesión es de vital
importancia para una célula; proporciona anclaje, indicaciones para
la migración y señales para el crecimiento y la diferenciación. Las
integrinas están implicadas directamente en numerosas afecciones
normales y patológicas y, como tales, son objetivos primarios para
la intervención terapéutica. Las integrinas son proteínas
transmembrana integrales, heterodímeros, cuya especificidad de
unión depende de las posibles combinaciones entre las 14 cadenas
\alpha y las 8 cadenas-\beta. Las integrinas se
clasifican en cuatro familias solapantes, que contienen las cadenas
\beta1, \beta2, \beta3 o \alphav, y una célula particular
puede expresar varias integrinas diferentes de cada subfamilia. En
la última década se ha demostrado que las integrinas son receptores
importantes implicados en la adhesión celular. Se proporcionan
informes concernientes a las integrinas, por ejemplo, por E.
Ruoslahti (J. Clin. Invest. 1991, 87) y R. O. Hynes (Cell, 1992,
69) y, de esta forma, pueden ser un objetivo adecuado para la
intervención terapéutica.
Con la excepción de los eritrocitos, todas las
células humanas expresan una o más integrinas. Sus funciones se
regulan a muchos niveles, pero principalmente, su especificidad de
ligando depende de qué cadena a se asocie con qué cadena \beta en
el heterodímero y del estado de activación de las integrinas
(Hynes, 1992; Diamond y Springer, 1994). También pueden afectar a la
especificidad el medio celular en el que actúan las integrinas
(Chan y Hemler, 1993), y la forma variante de unión de la integrina
que se use (Delwel et al., 1993). Dada esta complejidad, una de las
pocas indicaciones fiables de la especificidad de las integrinas es
perturbar directamente la función de la integrina y analizar las
respuestas celulares que se ven afectadas. La historia de la
investigación de las integrinas ha demostrado que ciertos reactivos
que pueden bloquear específicamente la función de las integrinas son
factores decisivos en el análisis funcional, desde el anticuerpo
CSAT que bloquea la función, que primero definió una integrina de
cadena \beta1 (Neff et al., 1982), hasta los numerosos ejemplos
posteriores vitales (por ejemplo, P1D6, P1B5 (Wayner y Carter,
1987), P4C10 (Carter et al., 1990), AIIB2 (Hall et al., 1990), 3A3
(Turner et al., 1989), G0H3 (Sonnenberg et al., 1987) y LM609
(Cheresh y Spiro, 1987)): el campo depende absolutamente de tales
reactivos.
Ahora se ha observado que las integrinas de la
serie \alphav son una subfamilia principal, con funciones tanto
clásicas como nuevas. Además de como mediadores clásicos en la
unión y extensión celular (Pytela et al., 1985; Cheresh, 1991), las
integrinas \alphav también se han implicado en la locomoción
celular (Seftor et al., 1992), en la internalización de receptores
(Panetti y McKeown Longo, 1993a; Panetti y McKeown Longo, 1993b)
como co-receptores de virus (Wickham et al., 1993),
en el tratamiento de las cascadas de proteasas extracelulares (de
Boer et al., 1993), y como reguladores de la progresión de tumores
(Felding-Habermann et al., 1992). Se han definido
parcialmente las especificidades de las integrinas de las cinco
series \alphav conocidas, \alphav\beta1 (Zhang et al., 1993);
-\beta3 (Pytela et al., 1985; Cheresh et al., 1987), -\beta5
(Cheresh et al., 1989), -\beta6 (Busk et al., 1992) y -\beta8
(Moyle et al., 1991), y parecen reconocer exclusivamente ligandos
que llevan las secuencias RGD-tripéptido
(NH2-arginina-glicina-ácidoaspártico-COOH),
incluyendo las presentes en la vitronectina (\alphav\beta1,
\alphav\beta3, \alphav\beta5), en la fibronectina
(\alphav\beta1, \alphav\beta3, \alphav\beta5,
\alphav\beta6), y en el factor de von Willebrand, en el
fibrinógeno y en la osteopontina (\alphav\beta3) (por ejemplo,
1991; Busk et al., 1992; Zhang et al., 1993, Denhardt y Guo, 1993;
Smith y Cheresh, 1990). En la misma célula pueden
co-expresarse dímeros con especificidades
relacionadas (por ejemplo, \alphav\beta3 y \alphav\beta5 -
para la vitronectina en células M21) (Wayner et al., 1991), pero
pueden controlar funciones independientes. Sin embargo, las
especificidades de ligando solapantes dentro de la propia familia
\alphav y también entre las integrinas de las series \alphav y
\beta1, hacen que la asignación de una función a un receptor
definido dentro de un medio celular particular sea problemática.
Los anticuerpos bloqueantes de la función han sido vitales para
clarificar la función de \alphav\beta3 (Cheresh y Spiro, 1987;
Chuntharapai, et al., 1993) y av\beta5 (Wayner et al., 1991). Sin
embargo, para las demás integrinas \alphav, no se conoce ningún
anticuerpo que especifique el complejo y que perturbe la función.
En particular, se dispone de pocos reactivos que especifiquen la
cadena \alphav del complejo y perturben la función integrina de la
familia entera. Lehmann et al., (1994) describió un anticuerpo
\alphav\betax que no muestra inversión de la interacción de la
matriz celular ni actividad bloqueante del desarrollo de
tumores.
Kim, K.J. (1993) describió varios anticuerpos
monoclonales capaces de inhibir la unión de
\alpha_{v}\beta_{3} al fibrinógeno (substrato preferido) y a
la vitronectina, tanto en ensayos celulares como en ensayos de
receptores aislados. En este caso tampoco se describió un efecto de
inversión de la interacción.
Por lo tanto, existe un interés permanente en la
función de las integrinas de la serie \alphav en el desarrollo de
tumores. El melanoma maligno humano es un cáncer de piel agresivo
cada vez más prevalente. En la progresión del melanoma se han
implicado niveles elevados de las integrinas \alpha2\beta1
(Danen et al., 1993; Etoh et al., 1992), \alpha3\beta1 (Natali
et al., 1993; Yoshinaga et al., 1993), \alpha4\beta1 (Hart et
al., 1991), y \alpha6\beta1 (Hart et al., 1991), pero las
integrinas implicadas de forma más consistente son las de la serie
\alphaV. En particular, tanto la invasión desde el tumor principal
como la metástasis distante se caracterizan histológicamente por un
aumento de la expresión de la integrina \alphav\beta3, "el
receptor de vitronectina". Los tumores no invasivos primarios y
los nevi melanóticos no malignos expresan pocos \alphav\beta3
detectables, un receptor raro en el tejido adulto sano (Brooks, et
al., 1994; Buck et al., 1990; Pignatelli et al., 1992; Lessey et
al., 1992; Korhonen et al., 1991; Nesbitt et al., 1993). La
inmunohistoquímica de tumores en diversas etapas y de metástasis
mostraron un aumento progresivo en \alphaV\beta3 con la etapa de
invasión (Albelda et al., 1990; Si y Hersey, 1994), la selección de
líneas de melanoma revela uniformemente una alta expresión de
integrinas de la serie \alphaV (Sanders, et al., 1992, Gehlsen et
al., 1992; Marshall et al., 1991) y, además, la aparición de
capilares sanguíneos expresa \alphav\beta3 durante la
angiogénesis tumoral (Brooks et al., 1994).
Ciertos estudios in vivo también implican
a la integrina \alphaV\beta3 en el desarrollo del melanoma. En
el sistema del melanoma B16-F10 murino, la
metástasis experimental de pulmón podría suprimirse por altos
niveles de RGD-péptidos (Hardan et al., 1993;
Humphries et al., 1986), potentes bloqueantes de la función de las
integrinas \alphav. Más recientemente,
Felding-Habermann y colaboradores han demostrado
que las integrinas de la serie \alphaV promueven el crecimiento
subcutáneo del melanoma humano M21 en ratones inmunodeficientes. El
sistema M21 es elegante y consta de una serie de células que
expresan diferentes integrinas de la serie \alphaV (Kieffer et
al., 1991; Felding-Habermann et al., 1992; Cheresh
y Spiro, 1987). El parental, M21, expresa \alphaV\beta3 y
\alphaV\beta5 (Wayner et al., 1991): se une a la vitronectina y
crece como un tumor subcutáneo. M21-L, una variante
somática de M21, no tiene \alphaV detectable (Cheresh y Spiro,
1987): no se puede unir a la vitronectina y desarrolla tumores de
crecimiento lento. M21-L4 es un transfectante de
M21-L, que re-expresa de forma
estable una cadena \alphaV de longitud completa: se une a la
vitronectina y crece rápidamente como un tumor subcutáneo
(Felding-Habermann, et al., 1992). De esta forma,
la presencia de integrinas \alphaV en la superficie celular está
directamente correlacionada con el crecimiento subcutáneo de
M21.
Sin embargo, M21 se sometió a presiones de
selección extremas durante el establecimiento de las líneas
variantes M21-L y M21-L4. En esta
invención, se descubrió que la función de la integrina \alphav
sobre la población nativa de M21 puede bloquearse y que puede
encontrarse un efecto sorprendente sobre el comportamiento celular
y sobre el desarrollo de tumores. Pueden sintetizarse fácilmente
antagonistas peptídicos, sin embargo, su uso esta restringido debido
a su baja biodisponibilidad, su corta vida media in vivo y a
su rápida eliminación de los animales (Humphries et al., 1988). Los
anticuerpos singénicos ofrecen una alternativa interesante a los
péptidos. Tienen una larga vida media in vivo (Tao y
Morrison, 1989; Haba et al., 1985) y sus especificidades de unión
pueden demostrarse bien por técnicas convencionales.
Desafortunadamente, aunque existen excelentes anticuerpos
específicos de \alphaV, tales como LM142 (Cheresh y Spiro, 1987),
existen pocos que bloqueen eficazmente las funciones de las
integrinas \alphaV.
La especificidad y la función biológica de los
miembros de la familia \alphav se ha debatido mucho,
principalmente porque todavía no existen reactivos que supriman la
función de la clase entera - no existe un anticuerpo potente que
bloquee \alphav. La revelación de que los receptores de adhesión
clásicos de la familia de las integrinas soportan otras funciones
biológicas menos convencionales ha intensificado la búsqueda de sus
mecanismos de acción moleculares. La búsqueda ha revelado varias
regiones no previstas en las integrinas que indican alostéricamente
su estado de activación o que, cuando están unidas, pueden activar
por sí mismas la función de las integrinas. Por el contrario, los
inhibidores de la función de las integrinas generalmente obstruyen
el sitio activo, siendo el ejemplo clásico
RGD-péptidos que replican el sitio de
reconocimiento de las integrinas de muchos ligandos de integrinas de
la serie \alphav y de \alpha5\beta1.
Esta invención describe tal nuevo anticuerpo
bloqueante de la función dirigido contra la cadena de la integrina
\alphav humana, que se denomina 17E6. Muchos informes han
descrito la naturaleza irreversible de la interacción entre
\alphav\beta3 y su ligando, por ejemplo, la vitronectina. En
ese documento se revela que 17E6 inducirá rápidamente la inversión
de esta denominada interacción irreversible entre las integrinas de
la serie \alphav y sus substratos, sugiriendo aplicaciones
terapéuticas. Esta invención analiza el mecanismo de acción de 17E6
y lo considera un competidor extremadamente deficiente para la
unión del ligando a \alphav\beta3, mientras que la vitronectina
y ciertas sondas de sitio activo basadas en RGD compiten
fuertemente entre sí en el receptor. Y otros anticuerpos compiten
fuertemente por 17E6. De esta forma, 17E6 actúa como un inhibidor
alostérico. El experimento de entrecruzamiento revela que
\alphav\beta3, pero no \alphav\beta1 o \alphav\beta5,
necesita dimerizarse antes de que 17E6 pueda bloquear. Este
descubrimiento revela que 17E6 funciona mediante un nuevo mecanismo
que implica una manipulación de las rutas de transducción de
señales inducidas por integrinas. El anticuerpo de acuerdo con la
invención bloquea el desarrollo de tumores y, además, no tiene
actividad citotóxica.
Los microorganismos, líneas celulares, plásmidos,
fagémidos, promotores, marcadores de resistencia, orígenes de
replicación u otros fragmentos de vectores que se mencionan en esta
solicitud normalmente están disponibles en el mercado o se pueden
adquirir de otra forma. En algunos casos, los materiales
mencionados anteriormente no pueden comprarse directamente. Sin
embargo, en este documento se usan sólo como ejemplos para
demostrar las propiedades o los efectos de los objetos de acuerdo
con la invención, y no son esenciales para satisfacer los requisitos
de la descripción. En general, pueden reemplazarse por otras
herramientas y materiales biológicos adecuados que se pueden obtener
de forma general.
El anticuerpo monoclonal 17E6 es un anticuerpo
que se produce por una línea de células de hibridoma que tiene la
denominación 272-17E6. La línea celular se depositó
con el número de acceso DSM ACC2160 en el Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen, Braunschweig, FRG.
Las técnicas y métodos que son esenciales de
acuerdo con la invención se describen con detalle en la memoria
descriptiva. Otras técnicas que no se describen con detalle
corresponden a métodos convencionales conocidos que son bien
conocidos para un especialista en la técnica, o se describen con
más detalle en las referencias y solicitudes de patente citadas y en
la bibliografía convencional.
Las secuencias de ADN y de aminoácidos también
incluyen secuencias ligeramente variadas o alteradas tales como
mutantes y variantes que pueden obtenerse intencionadamente o de
forma aleatoria por procesos químicos o físicos. Generalmente, se
incluyen todos los mutantes y variantes que muestran las
propiedades y funciones descritas.
En general, el término anticuerpo también incluye
fragmentos de anticuerpo tales como Fab', F(ab')_{2} o Fv
monocatenarios. Estos fragmentos pueden producirse por técnicas
convencionales normales.
| \alphallb\beta3 | integrina |
| av\beta1 | integrina |
| av\beta3 | integrina |
| av\beta5 | integrina |
| av\beta6 | integrina |
| av\beta8 | integrina |
| 10G2 | Mab |
| 14.18 G2a | Mab |
| 14D9.F8 | Mab |
| 14E2 | Mab |
| 17E6 | Mab |
| 20A9 | Mab |
| 23G5 | Mab |
| 3A3 | Mab |
| 9.2.27 | Mab |
| ADCC | citotoxicidad celular dirigida a anticuerpos |
| AECM | citostasis dependiente de células efectoras y anticuerpos |
| AIIB2 | Mab |
| AP3 | Mab |
| ATCC | American Type Culture collection |
| B16F10 | línea celular |
| CP8 | Mab |
| CSAT | Mab |
| cRGDfV | péptido cíclico: Arg-Gly-Asp-DPhe-Val |
| cRGDfK | péptido cíclico: Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys |
| EMM31 | línea celular |
| G0H3 | Mab |
| GRGDSPK | péptido: Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys |
| LM142 | Mab |
| LM609 | Mab |
| M21 | línea celular |
| M21-L | línea celular |
| M21-L-IIb | línea celular |
| M21-L4 | línea celular |
| MAb | anticuerpo monoclonal |
| MTT | biomida de 3-(4-5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazolio |
| NBT-BCIP | Nitro Azul Tetrazolio - Bromocloroindolil Fosfato |
| NP18 | Línea celular |
| OG | octil-glucósido-(detergente) |
| P1D6 | Mab |
| PIH6 | Mab |
| P4C10 | Mab |
| P5H9 | Mab |
| PMSF | Fenil-metil-sufonil-fluoruro |
| RGD | Péptido: NH2-Arginina-Glicina-Ácido aspártico-COOH |
| SDS-PAGE | electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilaniida |
| UCLAP-3 | línea celular |
| WM164 | línea celular |
| WM793 | línea celular |
| V+B2 | línea celular |
Tabla
1
Los anticuerpos se compararon en ELISA y ELISA
celular. En el texto se describen totalmente los reactivos y las
especificidades. + = reacción positiva, - = sin reacción.
Clave: - Anticuerpo Anticuerpos
caracterizados en este estudio (negrita), reactivos convencionales
(cursiva). - Inmunógeno: \alphav\beta3 = integrina
placentaria humana inmovilizada \alphav\beta3. M21 = células
M21 intactas. - Se inmovilizaron \alphav\beta3 y
\alphaIIb\beta3 purificadas en placas de 93
pocillos para ELISA - las líneas celulares M21,
M21-L y M21-L-IIb y
UCLAP3 se desarrollaron y se fijaron sobre las placas y se
ensayaron con respecto a la reactividad del anticuerpo en CELISA. -
Especificidad: (Véase texto) \alphav = cadena \alphav de
integrinas de mamífero. 200 KDa = proteína superficial de 200.000
MW desconocida de células de melanoma. \alphav\beta5 = integrina
\alphav\beta5. \beta1 = cadena de la integrina \beta1.
\beta3 = cadena de la integrina \beta3.
Tabla
2
Los niveles de reactividad relativos al control
(sólo anticuerpo secundario) se clasificaron como sigue:
1-2 (-), 2-4 (+),
4-9 (++), >9 (+++). Por ejemplo, en M21, la
intensidad fluorescente relativa del control fue típicamente de
30-50 unidades, y la de la unión de LM142 fue de
300- 500 unidades, proporcionando una reactividad relativa media de
aproximadamente 10 (400/40).
(*) M21-L se permeabilizó con
etanol al 70% a -20ºC.
(@) M21-L tiene conjuntos
intracelulares de cadena \beta3 de la integrina VNR.
Tabla
3
Se recogieron células M21 y M21-L
con tripsina/EDTA, se incubaron con anticuerpo 17E6 o anticuerpo de
control, se lavaron y se inyectaron en la vena de la cola de
ratones desnudos. Siete semanas después, los animales se
sacrificaron y se examinaron los pulmones con respecto a los focos
de tumores superficiales. El pretratamiento con 17E6 redujo el
número de focos que se desarrollaron. Se desarrollaron números
similares de focos cuando se inyectaron células
M21-L (sin \alphav en la superficie celular).
* = En comparación con el control: no dependiente
de anticuerpo.
Se incubaron células con 10 \mug ml^{-1} de
anticuerpos primarios, se tiñeron con anticuerpos secundarios
marcados con fluorescencia, se tiñeron con un contracolorante de
yoduro de propidio para permitir la entrada de células necróticas,
y se analizaron 10.000 células por muestra. El pico blanco
representa la intensidad de la segunda capa de anticuerpo sola. El
pico negro, la intensidad de los anticuerpos de especificación
primario y secundario conjuntamente. El eje vertical muestra las
células por canal, el eje horizontal muestra el log. de intensidad
fluorescente en ese canal. M21 lleva la integrina \alphav de
superficie, M21-L no tiene. El modelo de tinción
para los anticuerpos del grupo alfa-V corresponde
fielmente a las tinciones de LM142 (específico de \alphav) y LM609
(específico de \alphav\beta3). Especialmente, reaccionan con
M21 pero mínimamente con M21- L. El anticuerpo 9.2.27 reacciona con
un proteoglicano de la superficie. 14E2 y 21H6 reconocen una
proteína superficial de melanoma de 200 KDa no definida de otra
forma. Sus modelos de tinción son discretos de los del grupo
alfa-V. Específicamente, reaccionan de forma similar
tanto con M21 como con M21-L.
El melanoma M21 viable (A) se marcó en la
superficie celular con biotina, se extrajo con detergente y se
inmunoprecipitó y se resolvió en SDS-PAGE al 7,5% no
reductora. Los patrones se procesaron en la calle a y los pesos en
KDa se muestran a la izquierda. La precipitación se realizó con los
anticuerpos de control LM142 (anti-\alphav: calle a) y
LM609 (anti- \alphav\beta3: calle b), y 21H6 (calle c),
10G2 (calle d), 20A9 (calle e), 23G5 (calle f), 17E6 (calle g), 14D9
(calle h) y 14E2 (calle i). LM142 y LM609 precipitan un modelo
similar de proteínas a 10G2, 20A9, 23G5 y 17E6, mientras que 21H6 y
14E2 precipitan una banda a 200 KDa. 14D9 precipita los dos
modelos. Las células de melanoma M21 (B), de melanoma
deficiente en \alphav M21-L (C), y
UCLAP-3 (D) se marcaron en la superficie
celular con biotina, se inmunoprecipitaron como en (A). La
precipitación se realizó con anticuerpos LM142
(anti-\alphav: calle a), LM609 (anti-
\alphav\beta3: calle b) 17E6 (calle c), AP3
(anti-\beta3: calle d) y 20A9 (calle e). Los marcadores de
peso molecular se procesaron en la calle situada a la izquierda de
la calle a, y los pesos en KDa se muestran a la izquierda. Se
indica la posición de las bandas \alphav, \beta1, \beta3 y
\beta5.
Se analizó una serie de líneas de melanoma
(Mels.) y de líneas de células de carcinoma (Cars.) por FACS con
respecto a la reactividad con el Mab 17E6. Las intensidades FACS
fueron como se describe en la tabla 2. Después, se dejó que las
células se unieran a substratos recubiertos con vitronectina (0,5
\mug ml^{-1} de recubrimiento) en presencia de sobrenadantes de
hibridoma de 17E6 (blanco) o 14E2 (relleno). Después
del lavado, las células unidas se contaron como se describe en la
sección de Materiales y Métodos, y los datos se normalizaron para la
unión en la ausencia de anticuerpos. Obsérvese que exceptuando
B16F10 (melanoma murino), todas células eran de origen humano.
Malme 3 es una línea de fibroblastos. Los porcentajes absolutos de
células unidas en ausencia de anticuerpos fueron los siguientes: M21
(70%), WM164 (68%), A375 (75%), EMM31 (67%), WM793 (65%), MalMe3
(67%), B16F10 (70%), UCLA-P3 (76%),
NP-18 (65%), SW1116 (68%), HT29 (65%). Eje
horizontal: unión celular en % del control.
Durante la unión celular a substratos recubiertos
con vitronectina (5 mg ml^{-1}), se coincubaron anticuerpos
monoclonales (Mab) purificados o líquido ascítico de ratón. Líneas
celulares (A, B) M21; (C, D) UCLAP-3;
(E, F) WM-793. Los símbolos representan los
siguientes anticuerpos (especificidades): (\medbullet) = 17E6
(\alphav); (?) = LM609 (\alphav\beta3); (\vardiamondsuit) =
14D9.F8 (\alphav); (\medcirc) = P4C10 (\beta1); (\square) =
P5H9 (\alphav\beta5); (\nabla) = P5H9 + LM609 [comienzo de la
dilución a 10 \mug ml^{-1}]
(\alphav\beta3+\alphav\beta5). Eje Vertical: células unidas
(%). Eje horizontal: lado izquierdo: Mab (\mug/ml), lado derecho:
dilución de líquido ascítico (1/x).
Se estudió el efecto de 17E6 (\alphav,
\medbullet) y de P4C10 (\beta1, \medcirc) sobre la unión
celular a vitronectina (A), laminina (B), o colágeno
de tipo I (C). El 17E6 bloquea la unión celular sólo sobre
superficies recubiertas con VN. El P4C10 sólo bloquea la unión
celular sobre colágeno de tipo I y laminina. Eje horizontal:
dilución de P4C10 (1/x) (eje superior) y Mab (\mug/ml) (eje
inferior); eje vertical: % de células unidas.
Se dejó que el melanoma M21 se uniera durante 24
horas a superficies recubiertas con vitronectina (VN - fila
superior) o fibronectina (FN- fila inferior). Las células se unieron
en un período de 30 minutos y se extendieron bien, proliferando en
24 horas (a, e) cuando se añadió 17E6 al medio de cultivo
(b, f). Después de 30 minutos en vitronectina (b) las
células se redondearon, mientras que en fibronectina (f)
permanecieron extendidas. LM609 (c, g) y 14E2 (d, h),
tuvieron poco efecto sobre cualquiera de los substratos.
Concentraciones de anticuerpo:- (b): 0,1 \mug ml^{-1} (c, d,
f-h): 100 \mug ml^{-1}.
Se incubaron 0,5 x 10^{6} células M21
(A.) o M21-L (B) con tampón
(\medcirc), anticuerpos 17E6 \medbullet o 14E2 (\Delta) y se
inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. Se midieron las
dimensiones de los tumores a lo largo del tiempo y se representó el
volumen. Se muestra un experimento típico. Las barras de error
muestran el s.e.m. de 8 animales por grupo. Eje vertical: volumen
del tumor (mm^{3}), eje horizontal: días después de la
inyección.
Se inyectaron 0,32 x 10^{6}
(\vardiamondsuit,\blacksquare) o 1 x 10^{6}
(\lozenge,\square) células M21 (\vardiamondsuit,?) o M21L
(\blacksquare,\square) en la vena de la cola de ratones
desnudos. En el momento mostrado, se sacrificaron grupos de
animales y los pulmones se examinaron para comprobar la presencia de
nódulos tumorales. Todos los ratones M21 se sacrificaron a los 42
días. En el caso de los ratones M21-L, se
sacrificaron 3-6 ratones en cada punto. La carga
tumoral después de 6 semanas en los ratones M21 fue demasiado
grande como para contabilizarse (\gg250 por pulmón), por lo que se
muestran los parámetros estadísticos T para la hipótesis de que un
grupo M21-L procede de la misma población que el
grupo de control M21 a los 42 días al nivel <0,001 (**) o <
0,02 (*). Cuando los grupos de inyección de alta y baja
concentración tienen el mismo significado, sólo se muestra uno. Las
barras muestran el número medio de tumores para los grupos. Eje
vertical: metástasis/pulmón; eje horizontal: días después de la
inyección.
Se sembraron 5 x 10^{4} células M21 en DMEM/FCS
con vehículo, (\medcirc), o en presencia de 50 \mug ml^{-1}
de anticuerpos 17E6 (\medbullet) o 14E2 (\Delta) y se
contabilizó diariamente el número de células. La cinética y la
densidad de saturación de la proliferación no se ven afectadas por
los anticuerpos. Eje vertical: número de células; eje horizontal:
días.
Se mezclaron células M21 marcadas con timidina
con macrófagos de cerebro microgliales derivados de ratones BALB/c,
se añadieron anticuerpos diluidos en serie y, después de la
incubación, se midió la liberación de timidina. Controles:
(\Delta) células M21 solas; (\vardiamondsuit) M21 + 17E6 (100
nM); (?) M21+14.18 G2a; (?) M21 + microglia. Media \pm s.d. (n=6).
Experimentales: (\medbullet) M21 + microglia + 17E6; (\square)
M21+ microglia + 14.18 G2a. 17E6 no indujo la lisis celular
dependiente de anticuerpo. Media \pm s.d. (n=3). Eje vertical:
citotoxicidad (%); eje horizontal: concentración de anticuerpo
(M).
Se incubaron células M21 con células microgliales
y anticuerpos diluidos en serie, y después se sometieron a pulsos
con[H^{3}]-timidina para medir la síntesis
de ADN. Se midió la incorporación de timidina
([H^{3}]-ti). Los símbolos son los mismos que en
B. Obsérvese la actividad citostática de las células
efectoras solas (?). La observación microscópica del ensayo demostró
que en regiones de células microgliales homogéneas a 14.18 G2a
\geq 10^{10} M, no sobrevivió ninguna célula M21. Eje vertical:
incorporación de [H^{3}]-timidina (cpm x
10^{-3}); eje horizontal: concentración de anticuerpo (M).
Se cultivaron las líneas celulares (A)
M21; (B) M21-L; (C)
M21-L4; y (D) M21-LGpIIb, y
se añadió tampón (\medcirc), o los anticuerpos 17E6
(\medbullet), LM609 (?) o 14E2 (\Delta) a las concentraciones
mostradas. En (B) y (D), se muestra el control
positivo rutinario, taxol (?). Después de 48 horas, las células se
sometieron a pulsos de [H^{3}]-timidina y se midió
la radiactividad incorporada. Los anticuerpos no tuvieron ningún
efecto sobre la síntesis de ADN. El taxol lo suprime completamente.
cf. Fig. 8: 90 \mug ml^{-1} Mab = 600 nM. Eje vertical:
incorporación de [H^{3}]-timidina (cpm x
10^{-3}); eje horizontal: concentración de Mab (\mug/ml).
ELISA de 17E6 y fragmentos en \alphav\beta3
purificado. Se dejó que se unieran 17E6 intacto (\Delta), sus
fragmentos F(ab')_{2} (\medcirc) o F(ab')
(\square), a las concentraciones indicadas, a placas recubiertas
a 1 mg ml^{-1} con \alphav\beta3 y se detectó el anticuerpo
unido. Eje vertical: densidad óptica (OD) a 450 nm; eje horizontal:
anticuerpo (log_{10} \mug/ml).
La unión celular mediada por \alphav\beta1 y
\alphav\beta5, pero no por \alphav\beta3, se bloquea por
17E6 F(ab'). Como se indica, las células se dejaron unir a un
recubrimiento de 5 mg ml^{-1} de vitronectina en presencia de las
concentraciones indicadas de 17E6, o sus fragmentos
F(ab')_{2} o F(ab'). La unión del 100% varió del
\sim 85% (WM164) al -50% (V+B2) de las células totales añadidas.
Eje vertical: % de unión celular máxima; eje horizontal:
concentración de anticuerpos (\mug/ml).
La unión de M21 a vitronectina se bloquea por
medio del entrecruzamiento de 17E6 F(ab'). Durante la unión
de células M21 a vitronectina (como en las Fig. 4, 11), los
fragmentos F(ab') de 17E6 o el anticuerpo AP3 intacto a 0
(\medcirc), 0,1 (\nabla), 1,0 (\square) o 10 \mul
\mul^{-1} (\Delta) se coincubaron con las concentraciones
indicadas de anticuerpo de segunda capa anti-ratón
de entrecruzamiento. El entrecruzamiento mostró afinidades ELISA
idénticas para el F(ab') de 17E6 y AP3, (no
mostrado). Eje vertical: densidad óptica (OD) a 405 nm; eje
horizontal: concentración de anticuerpo de cabra
anti-ratón (\mug/ml).
Los miméticos de sito activo de ligando y la
vitronectina compiten entre sí por la unión a \alphav\beta3 en
ensayos de competición directa. Se coincubaron concentraciones
crecientes de vitronectina (\nabla), o péptidos GRGDSPK
(\medcirc,\medbullet) o cRGDfV (\vardiamondsuit,?) con
vitronectina biotinilada (1 \mug ml^{-1} \equiv 1,5 nM) o un
derivado de cRGDfV biotinilado (cRGDfK-bio: 50 nM)
en placas recubiertas con \alphav\beta3. La biotina unida se
detectó con un anticuerpo anti-biotina. La figura
asume un valor medio de Mr para la vitronectina multimérica
univalente de 0,65 MDa. Eje vertical: % de ligando unido; eje
horizontal: péptido/VN (log [(\muM]).
Se coincubaron concentraciones crecientes de 17E6
(\medbullet), otros anticuerpos anti-\alphav\beta3
(\square,?,\nabla,\Delta) o cRGDfV mimético de ligando
(\vardiamondsuit) con vitronectina biotinilada (1 \mug
ml^{-1}) en placas recubiertas con \alphav\beta3. La biotina
unida se detectó con un anticuerpo anti-biotina
(cf. perfil de saturación en las mismas condiciones de recubrimiento
de \alphav\beta3 para 17E6: Fig. 10.). Eje vertical: % de VN
unida; eje horizontal: [Mab] \mug/ml - [cRGD] \muM.
Los ligandos y los miméticos de sitio activo no
compiten con anticuerpos por la unión a \alphav\beta3 en
ensayos de competición de pre-bloqueo. Se
pre-incubaron concentraciones crecientes de
vitronectina (VN, \medcirc), fibrinógeno (FG, \nabla),
fibronectina, (FN, \square), cRGDfV (66203, ?) o los anticuerpos
indicados (\vardiamondsuit) durante 1 hora en placas recubiertas
con \alphav\beta3 y después se sondaron mediante la adición
(sin lavado) con anticuerpo biotinilado (1 \mug ml^{-1}), como
se muestra. Se detectó la biotina unida. Un valor de unión de
anticuerpo del 100% indica que la unión del anticuerpo en presencia
de las concentraciones de exposición mostradas fue como en el
control sin competidor. Los ligandos no afectan a la unión del
anticuerpo. Eje vertical: % de anticuerpo unido a la sonda; eje
horizontal (lado izquierdo y derecho): concentración de ligando
(\mug/ml).
Los anticuerpos no compiten entre sí por la unión
a \alphav\beta3 en ensayos de competición de
pre-bloqueo. Se pre-incubaron
concentraciones crecientes de los anticuerpos 17E6 (\medbullet),
LM609) (\nabla), AP3 (\square) o 14D9.F8 (\Delta), a las
concentraciones indicadas, durante 1 hora en placas recubiertas con
\alphav\beta3 y después se sondaron mediante adición (sin
lavado) con anticuerpo biotinilado (1 \mug ml^{-1}), como se
muestra en cada panel. Se detectó la biotina unida. Un valor de
unión de anticuerpo del 100% indica que la unión de anticuerpo en
presencia de las concentraciones de exposición mostradas fue como
en el control sin competidor. Los anticuerpos compiten entre sí en
los grupos de competición cruzada. Eje vertical: % de anticuerpo
unido a la sonda; eje horizontal (lado izquierdo y derecho):
concentración de anticuerpo (\mug/ml).
Cadena ligera: cadena pesada VL17E6H (a) y cadena
pesada VH17E6 (b). Se muestran las secuencias completas de
nucleótidos y de aminoácidos deducidas de las regiones variables
(incluyendo la secuencia líder). Las secuencias líder se escriben en
negrita; las secuencias CDR están en cursiva. La cadena pesada
tiene la estructura característica del grupo II B y la cadena
ligera del grupo V kappa, de acuerdo con la clasificación de
Kabat.
Se extrajo ARNm que codifica los dominios Fv de
las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 17E6 a partir de células
de hibridoma 17E6, se transcribió en ADNc y se usó una PCR para
amplificar las regiones variables. Después, éstas se clonaron y se
secuenciaron.
Albelda, S.M., et al. (1990),
Cancer Res. 50, 6757-6764.
Bhattacharya, S. et al. (1995)
J. Biol. Chem. 270: 16781-16787
Brooks, P.C. et al. (1994),
Science 264, 569-571.
Buck, C., et al., (1990), Cell
Differ. Dev. 32, 189-202.
Busk, M. et al. (1992), J. Biol.
Chem. 267, 5790-5796.
Carter, W.G. et al. (1990), J.
Cell Biol. 110, 1387-1404.
Chan, B.M. y Hemler, M.E.
(1993), J. Cell Biol. 120,
537-543.
Charo, I.F. et al. (1990), J.
Cell Biol. 111, 2795-2800.
Cheng, Y.F. et al. (1991), Exp.
Cell Res. 194, 69-77.
Cheresh, D.A. et al. (1987), J.
Cell Biol. 105, 1163-1173.
Cheresh, D.A. et al. (1989),
Cell 57, 59-69.
Cheresh, D.A. (1991), Cancer
Metastasis Rev. 10, 3-10.
Cheresh, D.A. y Harper, J.R.
(1987), J. Biol. Chem. 262, 1434.
Cheresh, D.A. y Spiro, R.C.
(1987), J. Biol. Chem. 262, 17703.
Cherny, R.C. et al., 1993, J.
Biol. Chem. 268, 9725-9729.
Chirgwin, J.M. et al. (1979),
Biochemistry 18, 5294-5299.
Chuntarapai, A. et al. (1993),
Exp. Cell Res. 205, 345-352.
Danen, E.H. et al. (1993), Int.
J. Cancer 54, 315-321.
de Boer, H.C. et al. (1993), J.
Biol. Chem. 268, 1279-1283.
Delwel, G.O. et al. (1993), J.
Biol. Chem. 268, 25865-25875.
Denhardt, D.T. y Guo, X.
(1993), FASEB J. 7, 1475-1482.
Diamond, M.S. y Springer, T.A.
(1994), Current Biology 4, 506
Dougall, WC., 1994, Oncogene.,
9: 2109-23
Etoh, T. et al. (1992), J.
Dermatol. 19, 841-846.
Felding-Habermann, B. et
al. (1992), J. Clin. Invest. 89,
2018-2022.
Fidler, I.J. (1986), Cancer
Metastasis Rev. 5, 29-49.
Fidler, I.J. (1988), Isr. J.
Med. Sci. 24, 456-463.
Furihata, K. et al. (1987), J.
Clin. Invest. 80, 1624-1630.
Gehlsen, K.R. et al. (1992),
Clin. Exp. Metastasis 10, 111-120.
Goodman, S.L. et al (1991),J.
Cell Biol. 113, 931-941.
Gussow, D. y Clackson, T.
(1989), Nucleic. Acids. Res. 17, 4000
Haba, S. et al. (1985), J.
Immunol. 134, 3291-3297.
Hall, D.E. et al (1990), J. Cell
Biol. 110, 2175-2184.
Hardan, I. et al. (1993), Int.
J. Cancer 55, 1023-1028.
Harel, W. et al (1990), Cancer
Res. 50, 6311-6315.
Harlow, E. y Lane, D.
(1988). Antibodies-a laboratory Manual
(Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor
Laboratory).
Hart, I. R. et al. Birch (1991),
Cancer Metastasis Rev. 10, 115-128.
Herlyn, D. et al. (1985), Cell
Immunol. 92, 105-114.
Herlyn, D. et al. (1990), Cancer
Res. 50, 2296-2302.
Humphries, M.J. et al. (1986),
Science 233, 467-470.
Humphries, M.J. et al. (1988),
J. Clin. Invest. 81, 782-790.
Hynes, R.O. (1992), Cell 69,
11-25.
Jones, S.T. y Bendig, M.M.
(1991), Biotechnology 9, 88-89.
Kabat, E.A. et al. (1987), US
dept. health and human services, US gouvemment Printing
offices).
Kazal, L.A. et al. (1963), Proc.
Soc. Exp. Biol. Med. 113, 989-994.
Kieffer, N. et al (1991), J.
Cell Biol. 113, 451-461.
Kim. K.J. (1993) WO 93/20229
Korhonen, M. et al., (1991),
Lab. Invest. 65, 347-356.
Landegren, U. (1984), J.
Immunol. Methods 67, 379-388.
Lehmann, M. et al. (1994).
Cancer Research 54, 2102-2107.
Lessey, B.A. et al (1992), J.
Clin. Invest. 90, 188-195.
Liotta, L.A. et al. (1991), Cell
64, 327-336.
Marshall, J. F. et al (1991),
Int. J. Cancer 49, 924-931.
Melvaer, K.L. y Fystro, D.
(1982), Appl. Environ. Microbiol. 43,
493-494.
Mosmann, T. (1983), Methods
65, 55-63.
Moyle, M. et al. (1991), J.
Biol. Chem. 266, 19650-19658.
Mujoo, K. et al. (1989), Cancer
Res. 49, 2857-2861.
Natali, P.G. et al. (1993), Int.
J. Cancer 54, 68-72.
Neff, N.T. et al (1982), J. Cell
Biol. 95, 654-666.
Nesbitt, S. et al. (1993), J.
Biol. Chem. 268, 16737-16745.
Orlando, R.A. y Cheresh, D.A.
(1991), J. Biol. Chem. 266, 19543
Panetti, T.S. y McKeown Longo, P.J.
(1993a), J. Biol. Chem. 268,
11988-11993.
Panetti, T.S. y McKeown Longo, P.J.
(1993b), J. Biol. Chem. 268,
11492-11495.
Paulsson, M. et al (1987), Eur.
J. Biochem. 166, 11-19.
Pignatelli, M. et al. (1992),
Hum. Pathol. 23, 1159-1166.
Poste, G. et al. (1980), Cancer
Res. 40, 1636-1644.
Preissner, K.T. (1991), Annu.
Rev. Cell Biol. 7,275-310.
Pytela, R. et al. (1985), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, 5766-5770.
Pytela, R. et al. (1986),
Science 231, 1559-1562.
Rodeck, U. et al. (1985), J.
Immunology 134, 1300-1304.
Ruoslahti, E. et al., (1982),
Methods Enzymol. 82 Pt A, 803-831.
Ruoslahti, E., (1991), J. Clin.
Invest. 87.
Sambrook, J. et al. (1989).
Molecular Cloning, a laboratory manual (Cold Spring Harbor: Cold
Spring Harbor Laboratory Press).
Sanders, L.C. et al. (1992),
Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 57,
233-240.
Sanger, F. et al. (1977), Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463
Seftor, R.E. et al. (1992),
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1557
Si, Z. y Hersey, P. (1994),
Pathology. 26, 6-15.
Smith, J.W. et al (1990)., J.
Biol. Chem. 265, 11008-11013.
Smith, J.W. and Cheresh, D.A.
(1988), J. Biol. Chem. 263, 18726
Smith, J.W. and Cheresh, D.A.
(1990), J. Biol. Chem. 265, 2168
Sonnenberg, A. et al (1987), J.
Biol. Chem. 262, 10376-10383.
Sonnenberg, A. et al. (1988).,
Nature (London) 336, 487-489.
Sonnenberg., A. (1993), Curr.
Top. Microbiol. Immunol. 184, 7-35.
Stetler Stevenson, W.G., et al.
(1993), Annu. Rev. Cell Biol. 9, 541
Stockmann, A. et al., 1993,
J-Biol-Chem., 268:
22874-82
Suffer, A. et al. (1991),
Pathobiology 59, 254-258.
Takada, Y. et al. (1987), J.
cell. Biochem. 37, 385-393.
Tao, M.H. y Morrison, S.L.
(1989), J. Immunol. 143,
2595-2601.
Towbin, H. et al. (1979), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.
Turner, D.C. et al. (1989), J.
Neurosci. 9, 3287-3296.
Wayner, E.A. et al. (1991), J.
Cell Biol. 113, 919-929.
Wayner, E.A. y Carter, W.G.
(1987), J. Cell Biol. 105,
1873-1884.
Wickham, T.J. et al. (1993),
Cell 73, 309-319.
Yatohgo, T. et al. (1988), Cell
Struct. Funct. 13, 281-292.
Yoshinaga, I.G. et al. (1993),
Melanoma. Res. 3, 435-441.
Zambruno, G. et al. (1993), J.
Cell Sci. 105, 179-190.
Zhang, Z. et al. (1993), J. Cell
Biol. 122, 235-242.
La selección de anticuerpos por ELISA en
\alphav\beta3 y \alphaIIb\beta3 purificados reveló 5
clones, 17E6, 20A9, 23G5, 14D9.F8 y 10G2, que reaccionaban
específicamente con \alphav\beta3 (tab. 1). Estos Mab se
denominan "el grupo alfa-V". Todos fueron de
isotipo IgG1. En el mismo ensayo ELISA, los anticuerpos
anti-integrina de especificidad conocida contra el
complejo \alphav\beta3 (LM609), las cadenas \alphav (LM142),
el complejo \alphav\beta5 (P5H9), el complejo
\alphaIIb\beta3 (CP8), las cadenas \beta3 (AP3) y las cadenas
\beta1 (P4C10), reaccionaron como se predijo en la bibliografía
(Tab. 1). En un ELISA sobre células fijadas ('CELISA'), con células
que expresaban \alphav\beta3 y \alphav\beta5 (M21),
\alphav\beta5 pero no \alphav\beta3 (UCLAP3), ni
\alphav\beta3 ni \alphav\beta5 (M21-L) y
\alphaIIb\beta3 (M21-L-IIb), el
grupo alfa-V mostró un modelo de reacción
consistente con su reconocimiento de la cadena de integrina
\alphav, y claramente distinto de una reacción con \beta3,
\beta5, \beta1 u otras cadenas \alpha (tab. 1). Los
resultados corroboraron los datos del ensayo ELISA con receptores
purificados. En la selección también se obtuvieron Mab con
especificidades para \beta3, y GpIIb (datos no mostrados),
y éstos reaccionaron de una forma claramente discreta a partir del
grupo alfa-v. 17E6, 14D9.F8, 20A9 y 23G5 se unieron
a \alphav\beta3 con una afinidad aparente similar. Se consiguió
el 50% de la unión a \sim10-20 ng ml^{-1}
(\sim50-100pM - similar a LM609). 10G2 se unió de
forma similar a LM142 con una afinidad aproximadamente 10 veces
inferior). CP8, contra \alphaIIb\beta3 y 14E2 (véase más
adelante), mostró una unión mínima a \alphav\beta3 a
concentraciones de hasta 100 nM.
La capacidad del grupo alfa-V
para reconocer integrinas \alphav nativas se ensayó por FACS
(fig. 1; tab. 2) y por inmunoprecipitación a partir de células
marcadas en la superficie (fig. 2). En el análisis FACS (fig. 1),
la línea que expresa \alphav (M21) reaccionó fuertemente con 17E6,
14D9.F8, 20A9, 23G5 y con los anticuerpos que definen \alphav,
LM142 y LM609, de forma moderada con 10G2, y también con los Mab de
control 14E2 y 21H6 y el Mab 9.2.27. Por el contrario, la variante
deficiente en \alphav (M21-L) reaccionó
débilmente con el grupo alfa-V y con LM142 y LM609,
pero mostró una reactividad a la de M21 con 14E2, 21H6 y 9.2.27.
M21-L tiene un conjunto intracelular de subunidades
\beta3 que se detectaron en FACS sólo cuando las células se
habían permeabilizado (tab. 2). En el análisis FACS de
M21-L4 (células M21-L
retransfectadas con \alphav (Felding-Habermann et
al., 1992)), el grupo alfa-V proporcionó modelos de
reacción como en M21. Los transfectantes del vector de control,
M21-L12 y los transfectantes de GpIIb,
M21-L-IIb (Kieffer et al., 1991), no
mostraron ninguna reacción con el grupo alfa-V
(tab. 1). El adenocarcinoma UCLAP-3 reaccionó con el
grupo alfa-V, con LM142 y P5H9, pero no con LM609.
UCLAP-3 no expresa \beta3 (véase la
introducción). El melanoma WM793 tuvo el mismo modelo de
reacción que M21. En la selección de inmunoprecipitación de células
M21, el grupo alfa-V proporcionó los mismos modelos
de inmunoprecipitación que LM142 (anti-\alphav) y
LM609 (anti \alphav\beta3) (fig. 2a). Se observó una fuerte
banda ancha a \sim92 kDa y una banda más débil a \sim145 kDa,
con bandas débiles adjuntas a 100 kDa, un modelo característico de
las integrinas \alphav\beta3 y \alphav\beta5 marcadas en la
superficie (Wayner et al., 1991). Cuando se comparó con los modelos
de precipitación en M21-L, no precipitó ninguno de
los grupos alfa-V (se muestran los datos de 17E6 y
20A9) y tampoco precipitó LM142 o LM609. (Fig. 2c). Los anticuerpos
específicos de \beta1 proporcionaron modelos de precipitación
similares a partir de las dos líneas celulares. En
M21-L, la precipitación con anticuerpos
anti-\beta3 proporcionó una banda a \sim92 kDa,
debido al marcaje \beta3 intracelular en células permeables
(posiblemente necróticas). UCLAP3 (fig. 2d) no proporcionó ningún
precipitado con LM609, pero precipitó un complejo de \sim95
kDa/145 kDa, por el grupo alfa-V y por LM142 (fig.
2d). En resumen, los análisis ELISA, CELISA, FACS y las
inmunoprecipitaciones de modelos de reacción consistentes dados
sugirieron fuertemente que los Mab del grupo alfa-V
reaccionan con dominios extracelulares presentes en las cadenas de
integrinas \alphav humanas.
Las integrinas \alphav pueden funcionar como
receptores para la vitronectina, por lo que el grupo
alfa-V se seleccionó con respecto a sus posibles
efectos sobre la unión celular a substratos de vitronectina. Después
del análisis de las integrinas por FACS, se ensayaron las células
en ensayos de unión (tab. 2, fig. 3). En FACS, las líneas de
células de melanoma y de carcinoma humano reaccionaron de forma
similar con el grupo alfa-V. Se resume la reacción
con 17E6 (fig. 3). La unión inicial a la vitronectina de células que
reaccionaban en FACS con 17E6 se bloqueó fuertemente por ese
anticuerpo, pero sólo se vio afectada débilmente por el anticuerpo
de control 14E2 (fig. 3). Otros miembros del grupo
alfa-V fueron menos potentes (datos no mostrados).
La unión vigorosa de células murinas B16F10 sobre vitronectina no se
vio afectada por 17E6 y B16F10 no reaccionó con 17E6 en FACS. Como
se había previsto (Cheresh y Harper, 1987), la unión de B16F10 a la
vitronectina fue sensible a concentraciones micromolares de
RGD-péptidos, lo que sugiere la presencia de
\alphav\beta3 funcional en la superficie (SLG y B. Diefenbach).
De esta forma, 17E6 y el grupo alfa-V reaccionaban
con áv humano, pero no con av de ratón.
Se investigó el efecto de 17E6 sobre la unión
celular. 17E6 bloqueó la unión de M21 (85% a la vitronectina con
una IC_{50} (concentración inhibidora del 50%) de 0,1 \mug
ml^{-1} (fig. 4a). Esta invención confirma los estudios previos
(Wayner et al., 1991), demostrando que la unión de M21 se bloqueaba
poco por anticuerpos contra \alphav\beta3 (LM609) o
\alphav\beta5 (P5H9) solos, pero se bloqueaba fuertemente
cuando estos anticuerpos se añadían conjuntamente (fig. 4a, b). Los
anticuerpos anti-integrina \beta1 (P4C10) no
tuvieron ningún efecto sobre la unión de M21 a la vitronectina (fig.
4b). Las líneas UCLAP3 y WM793 se unieron a vitronectina y esta
unión se bloqueó por 17E6, también por los anticuerpos con
especificidad de \alphav\beta5 (P5H9/UCLAP3) o con especificidad
de \alphav\beta3 complementarios (LM609/WM793) (fig.
4c-f). Sobre \alphav\beta5 (UCLAP3), 17E6 tuvo
una IC_{50} de \sim30 ng ml^{-1}. Sobre WM793, fue de
\sim60 ng ml^{-1} y para LM609, la IC_{50} fue de \sim600 ng
ml^{-1}. UCLAP3 expresa \alphav\beta5 pero no
\alphav\beta3 (Wayner et al., 1991), mientras que WM793 expresa
altos niveles de \alphav\beta3 (tab. 1). La especificidad de
bloqueo de 17E6 se confirmó por su falta de efecto sobre la unión
celular a otros substratos de matriz (fig. 5). P4C10
(anti-\beta1) anuló la unión de M21 a laminina y a
colágeno. La adhesión celular a estos dos substratos puede mediarse
por integrinas de la serie \beta1 (Sonnenberg et al., 1988; Takada
et al., 1987).
Considerados conjuntamente con los datos
bioquímicos, estos resultados son coherentes con la teoría de que
17E6 se une a la cadena \alphav de diversos complejos de integrina
y altera su interacción con sus ligandos.
Después se investigó si 17E6 podría afectar a las
interacciones de la matriz celular establecidas. Cuando se añadió
17E6 a bajas concentraciones (\sim0,1 \mug ml^{-1}) a células
M21, indujo un redondeo celular extensivo después de
0,5-1 hora a 37ºC en cultivos de M21 incluso
después de 24 horas de unión (fig. 6). El efecto fue totalmente
reversible y, después de lavar las células, volvieron a su estado
extendido en un período de 48 horas. Por el contrario, los
anticuerpos (LM609) y 14E2 afectaron a la morfología sólo de forma
débil incluso a altas concentraciones (100 \mug ml^{-1}). Los
anticuerpos no tuvieron efectos morfológicos incluso a 100 \mug
ml^{-1} sobre substratos recubiertos con fibronectina (fig. 6).
M21-L4 (y otras células unidas mediante \alphav)
se vio afectado de forma similar por 17E6 sobre superficies de
vitronectina, pero no sobre fibronectina, colágeno o sobre
laminina.
La invención investigó el efecto del anticuerpo
bloqueante de \alphav 17E6 sobre el desarrollo subcutáneo de
tumores M21 en ratones BALB/c nu/nu (fig. 7). En modelos animales,
el desarrollo de tumores M21 en ratones desnudos se ha
correlacionado con la expresión en la superficie celular de
integrinas de la serie \alphav (véase la introducción). Se
co-inyectaron por vía subcutánea células M21 y los
anticuerpos sin endotoxina 17E6 bloquearon consistentemente (4/4
experimentos) el desarrollo subcutáneo de tumores M21 (fig. 7a). No
se han recogido tumores (0/32) en presencia de 17E6, y los animales
siguen sin tener sin tumores después de 6 meses. La recogida de
tumores en los grupos de control fue del 75-90%.
Los anticuerpos no bloqueantes contra la propia cadena \alphav y
los anticuerpos de control contra la superficie de células de
melanoma mostraron efectos variables e inconsistentes sobre el
desarrollo de los tumores. En controles tratados con 14E2, la
recogida de tumores se redujo dependiendo del experimento en un
30-60%, pero los tumores restantes crecieron como
los controles no tratados y, al igual que los controles, estos
animales tuvieron micrometástasis pulmonares que se revelaron cuando
los pulmones se pusieron en cultivos de tejido (no mostrado). Por
el contrario, los animales tratados con 17E6 no tuvieron ni tumores
subcutáneos ni metástasis en pulmones, hígado, riñón, bazo, colon,
estómago, ni en las cavidades corporales torácica o abdominal
cuando se sacrificaron a los 6 meses. La línea M21-L
deficiente en \alphav\beta3 creció más lentamente por vía
subcutánea que M21, y no se vio afectada por 17E6. Los controles de
M21-L tratados con 14E2 tuvieron una recogida de
tumores reducida en comparación con los animales no tratados,
similar a la observada en las células M21 (fig. 7b).
El crecimiento de M21 y M21-L y
el efecto del anticuerpo 17E6 se compararon en un modelo de
"metástasis experimental" por inyección en la vena de la cola.
M21 formó muchas colonias de una manera dependiente de la dosis,
mientras que M21-L formó significativamente menos
colonias, pero formó nódulos pulmonares cuando se inyectó a una
dosificación superior (fig. 7c). En otras palabras, el crecimiento
tumoral en los pulmones también se potenciaba por la presencia de
integrinas \alphav en la superficie celular, y la
pre-incubación de M21 con 17E6 redujo (en un 90%)
el número de colonias tumorales que se formaron. Como aspecto de
interés, el nivel de formación de tumores fue similar al obtenido
por las células M21-L en el mismo experimento. El
anticuerpo no alteró el número de animales en los que crecía el
tumor (tab. 3).
En resumen, la presencia de \alphav en la
superficie celular promovió la formación de tumores M21 en modelos
de metástasis tanto experimentales como subcutáneos, y el anticuerpo
17E6 bloqueante de \alphav y de inversión suprimió vigorosamente
el crecimiento de M21. En un modelo de metástasis experimental con
células M21, el crecimiento vigoroso de M21 y el escaso crecimiento
de M21-L sigue estrechamente el modelo subcutáneo
de crecimiento tumoral y el crecimiento de M21 también se suprimió
por el pretratamiento con 17E6. Estos datos refuerzan la asociación
entre las integrinas \alphav y el desarrollo del melanoma
humano.
Después de observar sus potentes efectos sobre la
unión, la morfología y el desarrollo de tumores, se intentó
encontrar el mecanismo de acción de 17E6. Se ensayó la citotoxicidad
de 17E6 (fig. 8). La cinética del crecimiento celular y las
densidades de saturación finales conseguidas no se vieron muy
influenciadas por la presencia de 17E6 o del anticuerpo de control
(fig. 8a).
Los ratones desnudos son inmunodeficientes. De
las pocas células inmunocompetentes que quedan, los macrófagos son
los que más probabilidad tienen de dirigir una respuesta
citotóxica, mediada por anticuerpos. Para ensayar la posibilidad de
que los anticuerpos dirigieran la citotoxicidad celular (ADCC), se
ensayaron en ADCC macrófagos murinos singénicos para los anticuerpos
contra células M21. Como células efectoras, son mediadores
especialmente potentes de ADCC los macrófagos de cerebro murino
(microglia) (Sutter et al., 1991). El control positivo, Mab 14.18
G2a provocó una lisis casi completa de M21 a <10^{-9} M,
mientras que 17E6 a una concentración de hasta 10^{-7} M no medió
ADCC (fig. 8b).
Para evaluar si 17E6 podría ejercer una actividad
citostática en presencia de células efectoras, se midió la síntesis
de ADN de cocultivos microgliales de M21 en presencia de los
anticuerpos (fig. 8c). A 10^{-10} M, 14.18 G2a provocó una
inhibición \geq90% de la incorporación de
[^{3}H]-timidina.
Una vez ensayados los efectos sobre la
proliferación celular, ADCC y AECM, se examinó si los niveles de
síntesis de ADN en células M21 se veían afectados por los Mab. 17E6,
14E2 y LM609, a una concentración de 0,5 \muM, no tuvieron ningún
efecto sobre la incorporación de timidina (fig. 9). La síntesis de
ADN en células M21-L, M21-L4 y
M21-L-IIb tampoco se vio afectada
por los anticuerpos. M21-L y
M21-L-IIb no reaccionan ni con 17E6
ni con LM609, pero sí reaccionan con 14E2 (fig. 1). También se
ensayaron muchas otras líneas de células de melanoma y se demostró
que sus síntesis de ADN no se veían afectadas de forma evidente por
el grupo alfa-V (no mostrado).
17E6 y 14E2 eran isotipos IgG1, y no afectaron a
la lisis mediada por el complemento en células M21 (no
mostrado). Se puede concluir que los efectos de 17E6 son
específicos para las integrinas \alphav y no son efectos tóxicos
drásticos en otros sistemas celulares.
En muchos sistemas biológicos, la señalización
transmembrana se inicia por la dimerización de receptores. De hecho,
la multimerización de \alphav\beta3 altera los modelos de
fosfotirosinalización en HUVEC (Bhattacharya et al., 1995). Por lo
tanto, se investigó si durante la acción de 17E6 estaba implicada
la agregación de receptores.
17E6 inhibió las integrinas celulares
\alphav\beta3, \alphav\beta5 y \alphav\beta1 (fig. 4).
El 17E6 intacto y sus fragmentos F(ab')_{2} y F(ab')
tuvieron características de unión similares en ELISA sobre
\alphav\beta3 aislado (fig. 10), consiguiéndose una saturación
del 50% a \sim1 ng ml^{-1} (Mab intacto \sim7 pM). Las curvas
de titulación ELISA similares sugirieron una interacción monovalente
entre 17E6 y las placas ELISA. Pero en los ensayos de unión
celular, los fragmentos se comportaron de forma diferente. El
F(ab')_{2} y el 17E6 intacto bloquearon la unión celular
mediada por \alphav\beta1 (células V+B2) y \alphav\beta5
(células UCLA-P3) (IC_{50}\sim0,1 \mug
ml^{-1}: \sim700 pM) y la unión de \alphav\beta3 (células
WM164 y M21) (IC_{50} \sim0,5 \mug ml^{-1}: 3 nM), y el
fragmento F(ab') fue tan activo como los anticuerpos
diméricos sobre \alphav\beta1 y \alphav\beta5 (fig. 11).
Sin embargo, tanto sobre \alphav\beta1 como sobre
\alphav\beta5, el fragmento F(ab') fue al menos
1x10{4} veces más activo que sobre \alphav\beta3, donde sólo
bloqueó el 25+10% a las concentraciones máximas ensayadas (50
\mug ml^{-1}: IC_{50} >> 50 \mug ml^{-1}: >>
400 nM) - a estos niveles, los anticuerpos irrelevantes también
produjeron grados similares de bloqueo (no mostrado),
sugiriendo que este efecto marginal no es específico.
La falta de actividad biológica de un fragmento
de anticuerpo F(ab') que presenta capacidad de unión (como
el F(ab') de 17E6: (fig. 10)) es un indicador clásico de que
la función mediada por el anticuerpo requiere la dimerización. Para
confirmar que el entrecruzamiento efectivamente era necesario para
la acción de 17E6 sobre \alphav\beta3, se entrecruzó el
F(ab') de 17E6 durante el ensayo de unión celular por medio
de la adición de un anticuerpo policlonal
anti-F(ab'). Se observó un efecto clásico de
tipo prozona donde, a concentraciones críticas de anticuerpos tanto
primarios como secundarios, y sólo entonces, se observaba una
fuerte inhibición de la unión celular. La adición de altas
cantidades del anticuerpo de segunda capa solo o del F(ab')
solo no afectó a la adhesión celular. Además, el efecto no fue el
resultado no específico del entrecruzamiento de integrinas
\alphav\beta3: el entrecruzamiento de \alphav\beta3 por el
anticuerpo de unión pero no inhibidor AP3 no tuvo ningún efecto
sobre la unión celular, (fig. 12). Las concentraciones de
F(ab') activo después de la adición del anticuerpo secundario
en los experimentos de entrecruzamiento, coinciden con la IC_{50}
del 17E6 intacto en la unión mediada por \alphav\beta3 (cf. fig.
11).
Conjuntamente, estos datos indican que se
requiere el entrecruzamiento de integrinas \alphav\beta3 para
prevenir la unión de WM164 y M21 a los ligandos afines, mientras que
\alphav\beta5 y \alphav\beta1 no requieren entrecruzamiento
para inactivarse.
Se estudió con detalle la naturaleza inusual de
la función de 17E6 sobre \alphav\beta3 en ensayos de receptores
aislados. El contraste entre los bloqueantes clásicos del sitio
activo y 17E6 es notable. La unión de la vitronectina a
\alphav\beta3 se satura a \sim5 \mug ml^{-1} (\sim10
nM: asumiendo el tamaño multimérico medio de la vitronectina de 10
monómeros) (fig. 13), y por esta unión compiten específicamente
tanto los péptidos miméticos de ligando lineales clásicos (GRGDSPK:
IC_{50} \sim2 \muM) como péptidos cíclicos (cRGDfV:
IC_{50}\sim5 nM). Usando una variante marcada con biotina de
cRGDfV, cRGDfK-biotina, fue posible demostrar
directamente que no sólo los inhibidores competirían por la unión a
la vitronectina, sino que la vitronectina también competiría por la
unión al inhibidor (fig. 13), es decir, el sistema era simétrico.
De hecho, la vitronectina, GRGDSPK y cRGDfV compitieron entre sí y
lo hicieron de forma racional y simétrica, ya que la IC_{50} para
la competición reflejaba la IC_{50} para la inhibición de la
unión de la vitronectina al complejo av\beta3 (fig. 13).
La unión de 17E6 satura a \alphav\beta3 a
0,01-0,1 \mug ml^{-1} (700-70
pM) (cf fig. 10). Sin embargo, el anticuerpo sólo es un inhibidor
débil de la unión del ligando. Incluso a una concentración de
anticuerpo 70 nM, hubo una inhibición inferior al 30(+10%) de la
unión de vitronectina. LM609 se comportó de forma similar, mientras
que los anticuerpos no inhibidores que se unían a \alphav\beta3
(14D9.F8, 20A9 y WAM2-4) fueron ineficaces. El
péptido cíclico mimético de ligando cRGDfV bloqueó eficazmente la
interacción receptor-ligando (IC_{50} \sim10 nM)
(fig. 14), pero no afecta a la unión de 17E6. Tampoco mostró
inhibición ni el 17E6 intacto ni el 17E6 monovalente (no
mostrado).
La competición débil de 17E6 por el ligando en el
ensayo de receptores aislados y la disponibilidad de inhibidores
competitivos fuertes tales como cRGDfV plantearon la cuestión de
cómo estaba afectando 17E6 a la función de \alphav. La actividad
bloqueante de 17E6 y sus fragmentos en ensayos de unión celular
para la integrina \alphav\beta3 requiere entrecruzamiento,
comportamiento no totalmente compatible con una inhibición por
competición. Después se investigó si los ligandos de
\alphav\beta3 interferían directamente con la unión de 17E6.
Los ligandos se pre-unieron al
receptor y se añadieron bajas concentraciones de 17E6 marcado
directamente (fig. 15). La unión de 17E6 no se vio afectada (bloqueo
<10%) por altas concentraciones de vitronectina, fibronectina o
fibrinógeno (todos ligandos nativos de \alphav\beta3 {Cheresh y
Spiro, 1987}), 100 veces superiores a las necesarias para saturar
los sitios de unión específicos en \alphav\beta3. Por el
contrario, el 17E6 pre-unido compite fuertemente por
la unión del 17E6 marcado añadido posteriormente (fig. 15, 16), y
los ligandos nativos de \alphav\beta3 también compiten bien
entre sí (no mostrado). Esto falsea nuestra suposición de
que 17E6 competía con la vitronectina por el sitio activo de
\alphav\beta3. Además, los competidores fuertes del sitio
activo, tales como el péptido cíclico cRGDfV a 200 \muM, tampoco
tienen ningún efecto sobre la unión de 17E6, aunque bloquean la
unión de vitronectina a \alphav\beta3 con una IC_{50} de 2 nM
(fig. 13).
Los datos ELISA (fig. 10) indicaron que las
interacciones 17E6-\alphav\beta3 eran
monovalentes, lo que reduce la posibilidad de que se observara un
artefacto de competición debido a una afinidad de anticuerpo muy
alta combinada con una afinidad de ligando muy baja. Sin embargo,
se marcaron otros anticuerpos con especificidad para \alphav y
\beta3 y se usaron para exponer el ligando
pre-unido (fig. 15), incluyendo los propios
anticuerpos (fig. 16). Los anticuerpos compitieron de forma
satisfactoria entre sí y se incluyeron claramente en grupos de
competición cruzada (fig. 16). El anticuerpo con especificidad por
\beta3 AP3 compitió por su propia unión, pero no afectó a la unión
y no se vio afectado por anticuerpos específicos por el complejo
\alphav\beta3 (LM609) o por la cadena \alphav sola (17E6,
14D9.F8); LM609, 17E6 y 14D9.F8 presentaron una competición cruzada
fuerte. Por el contrario, los ligandos pre-unidos
no afectaron a la unión de 17E6 a \alphav\beta3. Debe concluirse
que 17E6 no funcionó por competición directa por el sitio de unión
al ligando.
Se usó una biblioteca de cebadores diseñada para
la amplificación por PCR de regiones variables de inmunoglobulina
para clonar bibliotecas de ADNc enriquecidas con inmunoglobulina
para las regiones de cadena ligera y pesada del hibridoma 17E6. Los
cebadores de región variable redundantes se terminaron al comienzo
del líder. Los cebadores inversos de región constante se terminaron
30 pb dentro de la región constante. Los cebadores se diseñaron con
sitios de restricción Sal I o Xma I terminales para la clonación.
Se obtuvieron productos de PCR del tamaño esperado
(420-450 pb (Jones y Bendig, 1991)), se clonaron y
se secuenciaron (fig. 17, SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 9). La región
variable de la cadena ligera de inmunoglobina 17E6, VL17E6, tenía
una longitud de 381 pb. La región variable de la cadena pesada,
VH17E6, tenía una longitud de 411 pb. Las secuencias variables de la
cadena pesada eran características de las inmunoglobulinas del
grupo IIb de Kabat y las secuencias de cadena ligera fueron
características del grupo V de Kabat (Kabat et al., 1987). La
estrategia de clonación se muestra esquemáticamente (fig. 18).
La progresión tumoral y la metástasis
clásicamente es una enfermedad donde las células escapan al control
del crecimiento y la adhesión normales e invaden, migran, se unen y
crecen en un sitio inapropiado. Ahora se sabe que las integrinas
controlan muchos acontecimientos de adhesión celular y, a su vez,
la adhesión puede regular mecánicamente acontecimientos entrelazados
incluyendo el crecimiento, la diferenciación, el movimiento celular
y la actividad de redes de proteasa, acontecimientos del desarrollo
que se repiten en la cascada metastática (Liotta et al., 1991,
Stetler Stevenson et al., 1993; Fidler, 1988). En este estudio, se
describen anticuerpos dirigidos contra integrinas humanas de la
serie aV, de los cuales uno, 17E6, perturba la unión celular
inicial, altera las interacciones estables \alphav- ligando e
interfiere en el desarrollo del melanoma humano en un modelo animal
in vivo (Fidler, 1986). En análisis bioquímicos, los
anticuerpos del grupo alfa-V mostraron modelos de
reacción muy relacionados con ML142- un anticuerpo bien definido
para \alphav humano - pero distinto de los modelos de reacción de
anticuerpos específicos para aV\beta3 (LM609), específicos para
aV\beta5 (P5H9) y de otros anticuerpos anti- integrina definidos.
De esta forma, es probable que los anticuerpos del grupo
alfa-V reconozcan la cadena de la integrina aV
humana. La clonación del ADNc de los transcritos de inmunoglobulina
17E6 reveló secuencias únicas y poco ambiguas. Las secuencias
variables de la cadena pesada fueron características de
inmunoglobulinas del grupo IIb de Kabat y las secuencias de la
cadena ligera fueron características del grupo V de Kabat (Kabat et
al., 1987). De esta forma, se define de forma única el
anticuerpo.
\newpage
17E6 perturbó fuertemente interacciones celulares
mediadas por aV. Los anticuerpos que perturban la función han sido
vitales para que comprendamos la función de las integrinas, pero el
campo aV ha carecido de un anticuerpo potente bloqueante específico
de clase. 17E6 bloquea la unión celular mediada por aV con una
IC_{50} de \sim0,3-1 nM (anticuerpo MW 150.000);
por comparación, el bloqueante peptídico, GRGDSPK tiene una
IC_{50} de \sim5 \muM. Las líneas celulares que expresan
principalmente \alphav\beta3 (WM793) o \alphav\beta5
(UCLAP3) se bloquean por 17E6, ya que son células que expresan
principalmente aV\beta1. De esta forma, 17E6 es un inhibidor
general de las integrinas \alphav.
17E6 no sólo previene la interacción inicial de
las integrinas \alphav con sus ligandos, sino que también causa
la inversión de interacciones bien establecidas, provocando una
rápida retracción de células unidas sobre la vitronectina. Las
interacciones de \alphav\beta3 con la vitronectina se han
descrito como "no disociables", procediendo en dos etapas,
estando seguida una interacción bloqueable inicial rápidamente por
una reacción de estabilización (Orlando y Cheresh, 1991). Por el
contrario, 17E6 provocó rápidamente la retracción y la separación
parcial de M21 y muchas otras células (observaciones no
publicadas) de substratos de vitronectina. El redondeo se
invirtió cuando se retiró el anticuerpo. La unión inicial de M21
sobre la vitronectina se bloquea de forma incompleta (\sim90%) por
17E6, pero su efecto de redondeo afecta esencialmente a todas las
células unidas. Pudieron confirmarse estudios previos cuando la
unión inicial de M21 a vitronectina se bloqueó completamente por
mezclas de anticuerpos anti- \alphav\beta3 y
anti-\alphav\beta5, y por RGDS-péptidos,
lo que sugiere que estaban implicados tanto \alphav\beta3 como
\alphav\beta5 (Wayner et al., 1991). Como se demuestra en este
estudio, 17E6 bloquea varios receptores \alphav y puede invertir
interacciones estables mediadas por ellos. La diferencia en
actividad de 17E6 en células M21 unidas y en células M21 que se
unen puede basarse en la diferente función y localización de
\alphav\beta3 y \alphav\beta5 en cada situación. En células
que se unen, ambos tipos de moléculas se distribuyen difusamente,
mientras que en células unidas, \alphav\beta3 se encuentra en
contactos focales y \alphav\beta5 se distribuye difusamente
(Wayner et al., 1991; Zambruno et al., 1993). Además se investigó si
17E6 alteraba selectivamente uno de estos contactos.
El crecimiento de tumores M21 en ratones desnudos
depende fuertemente de las integrinas aV
(Felding-Habermann et al., 1992; Sanders et al.,
1992). Como 17E6 podía modular interacciones estables de
ligando-aV y tenía un efecto a largo plazo, se
examinó su efecto sobre el desarrollo de tumores. Se descubrió que
17E6 bloqueaba el desarrollo de tumores M21 subcutáneos en ratones
desnudos, avalando de esta forma fuertemente los estudios de
Felding-Habermann et al. Además, pudo demostrarse
que \alphav también promovía, y 17E6 inhibía, el desarrollo de M21
como metástasis de pulmón experimentales. De esta forma, esta
invención ha confirmado independientemente el importante estudio
anterior, y lo ha ampliado usando una "terapia" mediada por
anticuerpos singénicos con 17E6. Estos resultados destacan la
importancia de las integrinas aV en el desarrollo de tumores M21, y
eliminan la posibilidad de que los resultados anteriores se
presentasen como artefactos de selección de clonación.
Los efectos de 17E6 in vitro continuaron
durante > 24 horas desde la eliminación. Dado un volumen de
ratón de 20 ml, la concentración de anticuerpo inicial in
vivo fue de \sim 10 nM, un orden de magnitud por encima de la
IC_{50} para invertir las interacciones
célula-ligando en el cultivo. 17E6 es singénico
para los animales tratados, ratones BALB/C nu/nu, y la vida
media de IgG1 murino es de 20-200 horas (Tao y
Morrison, 1989; Haba et al., 1985). De esta forma, en este modelo,
la IC_{50} para invertir la interacción
M21-ligando podría excederse durante al menos 100
horas (5 vidas medias). Es interesante comparar 17E6 con
RGD-péptidos. En el modelo de melanoma murino
B16F10-C57blk6, los péptidos coinyectados
inhibieron el desarrollo de tumores pulmonares
B16-F10 (Humphries et al., 1986; Hardan et al.,
1993). Con las mismas suposiciones que para 17E6, estuvo presente
una concentración \sim100 \muM del RGD-péptido
(Hardan et al., 1993), unos dos órdenes de magnitud por encima de la
dosis requerida para bloquear la unión celular a vitronectina. Sin
embargo, RGDS tiene una vida media en suero de 8 minutos (Humphries
et al., 1988). Como objetivo terapéutico general, sería preferible
generar bloqueantes de larga duración para suprimir el desarrollo
de tumores.
¿Como puede afectar 17E6 al desarrollo de
tumores? Como no reacciona con células murinas, el efecto está en
las células tumorales, y pueden excluirse efectos obvios del
anticuerpo sobre la angiogénesis tumoral (Brooks et al., 1994). Los
únicos efectos de 17E6 que pueden identificarse son a) su unión al
dominio extracelular de integrinas \alphaV, y b) su capacidad para
alterar interacciones celulares mediadas por \alphaV. Puede
asumirse que se han eliminado la mayoría de las fuentes de
destrucción mediada por anticuerpos disponibles para una ratón
desnudo. 17E6 no afectó de forma crónica o aguda al crecimiento ni
a la viabilidad celular de las células M21, no medió la fijación del
complemento, no afectó a la síntesis de ADN, y no medió la
citotoxicidad mediada por macrófagos singénicos. Las células M21
fueron sensibles a ADCC ya que se destruyeron eficazmente por
células microgliales en presencia del Mab 14.18 G2a. Los Mab IgG1
(como 17E6) median eficazmente la ADCC de macrófagos murinos (Herlyn
et al., 1985). El número de sitios \alpha_{v}\beta_{3}
expresados por célula puede estar por debajo del umbral crítico
para que se produzca una ADCC. Ciertos estudios previos han
demostrado que la eficacia de ADCC se correlaciona con la densidad
del antígeno diana (Rodeck et al., 1985). Los macrófagos, a
diferencia de otras células mieloides o efectoras linfocíticas,
expresan las tres clases de receptores Fc\gamma. Los datos
indican que la ADCC no es el mecanismo que explica la inhibición del
crecimiento tumoral observado in vivo con 17E6. El
anticuerpo carecía de endotoxina. No puede excluirse que 17E6 active
la destrucción mediada por células NK, pero si es así, se activa
bastante más débilmente por los anticuerpos de control de isotipo
singénico correspondientes que se usaron.
De esta forma, 17E6 probablemente actúa
deteriorando la función de las integrinas \alphav. Las funciones
que podría bloquear 17E6 y donde podría participar \alphav
incluyen la adhesión celular, la interacción con componentes de la
matriz solubles (Seftor et al., 1992), la modulación de una red de
inhibidor de proteasa/proteasa (Gehlsen et al., 1992, de Boer et
al., 1993, Preissner, 1991), la estimulación del movimiento celular
(Seftor et al., 1993, Gehlsen et al., 1992), o el efecto sobre la
internalización de receptores (Wickham et al., 1993, Panetti y
McKeown Longo, 1993a; Panetti y McKeown Longo, 1993b), pero sigue
siendo un objeto de experimentación adicional cual de ellas está
implicada, si es que está implicada alguna.
El efecto bloqueante de 17E6 sobre
\alphav\beta3, pero no sobre \alphav\beta1 y
\alphav\beta5, requiere la dimerización de la diana. Aunque los
fragmentos del anticuerpo 17E6 monovalentes y divalentes son
igualmente activos en la unión a la integrina \alphav\beta3 en
ELISA, y en el bloqueo de la adhesión celular mediado por
\alphav\beta1 y \alphav\beta5, los fragmentos monovalentes
son esencialmente inactivos contra \alphav\beta3.
Además, cuando se añaden anticuerpos de
entrecruzamiento a los fragmentos monovalentes, recuperan la
capacidad de bloquear la adhesión mediada por \alphav\beta3 y
al hacer esto muestran un efecto de prozona clásico. Sin embargo, el
simple entrecruzamiento de \alphav\beta3 no es suficiente para
bloquear la actividad, porque el entrecruzamiento de AP3 no tiene
ningún efecto sobre la adhesión mediada por \alphav\beta3:
AP3 se une a la cadena \beta3 (cf. fig.
2B:e).
Una transición de una interacción monovalente a
bivalente provoca un rápido aumento en la afinidad de un anticuerpo
por su diana (Lane y Harlow, 1988). La titulación ELISA de 17E6
sobre la integrina \alphav\beta3 aislada no puede demostrar esta
transición y, por lo tanto, indica que en esta configuración tiene
lugar una interacción monovalente con elementos tanto monovalentes
como bivalentes de 17E6. En ensayos de receptores de unión a
ligandos que usan la misma la configuración ELISA, 17E6 es un
reactivo bloqueante sorprendentemente insuficiente en comparación
con miméticos de ligando peptídicos tales como EMD66203: cRGDfV.
Para poner esto en contexto: mientras que cRGDfV consigue
unos 2-3 órdenes de magnitud en actividad
(IC_{50} de \sim1 \muM a -1 nM) en la transferencia del ensayo
de receptores celulares a receptores aislados, 17E6 pierde
al menos tres órdenes de magnitud de actividad aparente (IC_{50}
de \sim100 ng ml^{-1} a >100 \mug ml^{-1}) y se vuelve
esencialmente inactivo.
Esta anomalía y la relevancia de los datos de
entrecruzamiento de anticuerpos celulares se resolvieron por
experimentos de competición. Éstos indicaron que 17E6, a diferencia
de los bloqueantes peptídicos, no interfería directamente con los
sitios de unión a ligandos. En ausencia de pruebas directas, es
normal asumir que un reactivo bloqueante funciona por medio de la
obstrucción estérica del sitio de interacción
ligando-receptor, una visión reforzada en el campo
de las integrinas por miméticos de sitio activos de ligando tales
como péptidos que contienen RGD (Hynes, 1992), y la inactivación
del ligando causada por mutagénesis dirigida de este sitio en la
vitronectina (Chemey et al., 1993). Nuestros datos indican
firmemente que esto no es así para el potente anticuerpo bloqueante
17E6. En resumen: en la integrina \alphav\beta3 a) los
péptidos miméticos de ligando compiten entre sí y por los propios
ligandos, b) los ligandos compiten por los péptidos, c) ni los
péptidos ni los ligandos compiten por la unión de 17E6, d) 17E6 no
compite por la unión del ligando o del mimético de ligando y e) 17E6
compite consigo mismo y con otros anticuerpos de unión a
\alphav.
17E6 es un competidor extremadamente insuficiente
para la unión del ligando a \alphav\beta3, mientras que la
vitronectina y las sondas del sitio activo basadas en RGD compiten
fuertemente entre sí en el receptor. Y otros anticuerpos compiten
fuertemente por 17E6. De esta forma, 17E6 actúa como un inhibidor
alostérico. El experimento de entrecruzamiento revela que
\alphav\beta3, pero no \alphav\beta1 o \alphav\beta5,
necesita dimerizarse antes que pueda bloquearse por 17E6. Este
descubrimiento revela que 17E6 funciona mediante un mecanismo nuevo
que implica una manipulación de las rutas de transducción de
señales inducidas por integrinas, en lugar de mediante el simple
antagonismo de las interacciones
integrina-ligando.
Como los ligandos \alphav\beta3 son
homopolímeros en su forma activa e inactivos como monómeros
(Preissner, KT. 1991; Stockmann, A. et al., 1993), la
multimerización de integrinas por el substrato puede ser esencial
para su función, de hecho, la dimerización de tirosina quinasas
receptoras de la familia de receptores de factores del crecimiento
por ligandos es el acontecimiento clave en el inicio de la
transducción de señales (Dougall, WC. et al., 1994). Es
intuitivamente obvio que la estereoquímica del polímero del
substrato adquiere gran importancia en la orientación de las
integrinas en la membrana y en la orden de la formación de un
complejo de señalización. De hecho, la "lógica" biológica de la
vitronectina multimérica para la adhesión celular puede surgir de
esta restricción.
Los multímeros de vitronectina tienen un tamaño
de 3 a 16 unidades (Stockman, A. et al., 1993) y puede predecirse
que producen series ordenadas de integrinas en la superficie
celular así como la mayor afinidad necesaria por la interacción
multimérica. La duración individual de un interacción de
vitronectina-\alphav\beta3 monomérica es corta,
y la afinidad es baja, mientras que la rotación de la integrina no
unida en el plano de la membrana es rápida, y la afinidad del
anticuerpo y la velocidad de activación son altas. De esta forma,
puede predecirse que anticuerpos divalentes asociados con una
integrina en la superficie celular pueden capturar integrinas
disociadas durante la rotación y atraparlas en un conformación que
no puede unirse al ligando. Esto provoca un debilitamiento
progresivo de la serie molecular de \alphav\beta3 y de los
enlaces de vitronectina y desestabiliza la interacción
célula-vitronectina - como si no se desprendiera un
Velcro molecular. Esto puede explicar la falta de función de 17E6 en
los ensayos de receptores, donde el receptor no puede rotar en la
orientación necesaria para permitir la unión divalente (demostrado
por los datos ELISA), y su eficacia en el ensayo celular, la falta
de necesidad observada para la competición del sitio activo en el
ensayo celular, y la ineficacia del fragmento F(ab') en el
bloqueo de la adhesión celular mediada por \alphav\beta3.
También es implícitamente obvio que, como
\alphav\beta5 y \alphav\beta1 (y \alphav\beta6,
\alphav\beta8 y \alpha5\beta1) comparten un espectro de
ligando solapante con \alphav\beta3, es concebible que regulen
de forma cruzada la función de los demás, de una forma directamente
análoga a la regulación cruzada por
hetero-dimerización de receptores de la familia de
receptores de factores del crecimiento RTK (Dougall, WC et al.,
1994). Por ejemplo, \alphav\beta5, que tiene una afinidad mayor
que \alphav\beta3 por la vitronectina, podría competir por los
sitios de unión a \alphav\beta3 en multímeros individuales de
este substrato - parando los homodímeros de \alphav\beta3
necesarios para generar la señal o sostener la adhesión celular, y
reemplazándolos por heterodímeros de
\alphav\beta5-\alphav\beta3. Las otras
integrinas \alphav pueden funcionar de una forma de regulación
cruzada similar, pero no se dispone de datos que confirmen estas
hipótesis.
En conclusión, se desarrolló una serie de
anticuerpos monoclonales contra la cadena de la integrina \alphaV
humana. Uno de ellos, 17E6, bloquea e invierte los procesos mediados
por \alphaV in vivo. Como aspecto interesante, también
bloquea el desarrollo del melanoma dependiente de \alphaV en
ratones desnudos. Esto sugiere que las integrinas \alphaV pueden
ser candidatos eficaces para la terapia tumoral. Mientras se estaba
preparando este manuscrito, Lehmann et al. (Lehmann et al., 1994)
describieron unos anticuerpos específicos para \alphaV con algunas
propiedades relacionadas con 17E6. Será de interés observar si
éstos también pueden invertir las interacciones mediadas por
\alphaV y alterar el desarrollo del melanoma.
El anticuerpo de acuerdo con la invención puede
administrarse a pacientes humanos para terapia. Por lo tanto, es un
objeto de la invención proporcionar una formulación farmacéutica
que comprenda, como ingrediente activo, al menos un anticuerpo o un
fragmento de anticuerpo como se ha definido anteriormente en las
reivindicaciones, asociado con uno o más vehículos, excipientes o
diluyentes farmacéuticamente aceptables para el mismo.
Típicamente, el anticuerpo de esta invención se
inyectará por vía intravenosa o parenteral. Generalmente, los
intervalos de dosificación para la administración del anticuerpo (o
fragmentos del mismo) son suficientemente grandes como para producir
la supresión del tumor y el efecto de lisis tumoral deseados. La
dosificación dependerá de la edad, el estado, el sexo y el grado de
enfermedad en el paciente y puede variar de 0,1 mg/kg a 200 mg/kg,
preferiblemente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg/dosis en una o más dosis
administradas al día, durante uno o varios días.
Las preparaciones para la administración
parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles
acuosas o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no acuosos
propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como
aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato
de etilo y otros disolventes conocidos en la técnica que son
adecuados para estos fines. Los anticuerpos de esta invención
pueden usarse en una composición que comprende un vehículo
fisiológicamente aceptable. Son ejemplos de tales vehículos
adecuados solución salina, PBS, solución de Ringer, o solución de
Ringer con lactato. En las formulaciones farmacéuticas también
pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como
antibióticos, antioxidantes y agentes quelantes.
El anticuerpo (o un fragmento del mismo) también
puede conjugarse de acuerdo con métodos conocidos con citoquinas
tales como IL-2 para soportar su citotoxicidad.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente
invención son adecuadas para el tratamiento de todos los tipos de
tumores, incluyendo melanomas, gliomas y carcinomas, así como
tumores del sistema circulatorio y tumores sólidos.
Para fines de diagnóstico, el anticuerpo puede
conjugarse, por ejemplo, con un tinte radio-opaco o
puede radiomarcarse. Un método de marcaje preferido es el método de
Iodogen. Preferiblemente, para fines de diagnóstico, el anticuerpo
se administrará como fragmentos scFv. Esto proporciona resultados
superiores, de forma que no es necesario restar los valores de
interferencia.
(Tabla pasa a página
siguiente)
| Células | Recogida de | Número de Focos Tumorales | % | ||
| y tratamiento | tumores | Media\pmSEM | Mediana | (Intervalo) | Control |
| M21 (Control) | 99 | 87 \pm 110 | 30 | (3-378) | 100 |
| M21 + 17E6 | 78 | 8 \pm 7,7 | 5 | (0-21) | 9 |
| M21-L | 56 | 19 \pm 22 | 8,5 | (0-60) | 22* |
Animales: Los ratones para la producción
de anticuerpos (ratones BALB/c hembra; 8 semanas de edad) y para
los modelos de tumores ("ratones desnudos": BALB/c nu/nu
atímicos homocigóticos hembra; 4-5 semanas de edad)
procedían de Criffa (Barcelona, España). Los ratones desnudos se
mantuvieron en una sala estéril en cajas microaisladoras, y
recibieron alimento y agua esterilizada ad libitum. Todas
las manipulaciones se realizaron en una campana de flujo laminar
Proteínas: La fibronectina (Ruoslahti et
al., 1982) y la vitronectina (Yatohgo et al., 1988) se purificaron
a partir de plasma humano recién congelado y el fibrinógeno (Kazal
et al., 1963) a partir de sangre entera. La laminina se purificó a
partir de tumores murinos
Engelbreth-Holm-Swarm (Paulsson et
al., 1987).
Donde no se indica otra cosa, todas las
manipulaciones se realizaron a 20ºC y todos los lavados se
realizaron con PBS sin calcio-magnesio ("PBS":
NaCl 137 mM, KCl 2,8 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM, KH_{2}PO_{4}
1,5 mM, pH 7,4). PBS++ es PBS a la que se le ha añadido MgCl_{2} 1
mM y CaCl_{2} 1 mM. Donde no se indica específicamente, los
agentes químicos (Merck KGaA, Darmstadt) tuvieron la máxima pureza
disponible. Los péptidos cíclicos tales como cRGDfV y cRGDfK se
sintetizaron de acuerdo con técnicas convencionales conocidas (por
ejemplo, FEBS Let. 291, páginas 50-54, 1991). El
péptido lineal GRGDSPK que se usa como compuesto comparativo está
disponible en el mercado (por ejemplo, en Bachem, Suiza).
Líneas de células tumorales y cultivos:
American Type Culture Collection (ATCC) suministró carcinomas
humanos SW1116, HT29 y melanoma humano A375 y las siguientes líneas
celulares humanas fueron una generosa donación de algunos colegas:
melanoma M21, sus variantes M21-L y
M21-L4 (Cheresh y Spiro, 1987),
M21-L-IIb (preparado de acuerdo con
(Kieffer et al., 1991)), y el adenocarcinoma de pulmón humano
UCLA-P3 (Cheresh et al., 1989) (Dr.D.A. Cheresh;
Scripps), melanoma WM793 y WM164 (Dr. M. Herlyn, Wistar) (Herlyn et
al., 1990). NP18, carcinoma pancreático (Dr. G. Cappellà: Hospital
Sant Pau; Barcelona). Melanoma murino B16F10 procedente
originalmente del Dr. I. Fidler (Poste et al., 1980) (Dr. S. Aliño:
Universidad de Valencia). EMM31 se estableció en nuestro grupo a
partir de una muestra de tumor definida por criterios histológicos
convencionales como un melanoma primario (Jäggle et al.,
observaciones no publicadas). Todas las células se
cultivaron a 37ºC en una atmósfera con un 7,5% de CO2 y un 92,5% de
aire en RPMI 1640 al 90%, suero de ternero fetal (FCS) al 10% más
L-glutamina 2 mM, y carecieron consistentemente de
micoplasmas cuando se evaluaron por un ensayo patentado (Mycotect
Kit; Gibco).
Anticuerpos: Las fusiones de anticuerpos
monoclonales (MAb), la selección ELISA, la subclonación y el
mantenimiento de cultivos se realizaron usando tecnologías
convencionales (Harlow y Lane, 1988) a menos que se especifique otra
cosa.
Inmunización: Se produjeron MAb contra la
\alphav\beta3 por inyección intraperitoneal (ip) de
\alphav\beta3 de placenta purificada inmovilizada en Sepharose
(80 \mug de \alphav\beta3 sobre 80 \mul de Sepharose en 200
\mul de PBS) o de células M21 vivas (1x10^{6} células en 0,5 ml
de PBS) cada dos semanas durante doce semanas. Cuatro días después
de la última inyección, se realizó una fusión inducida por PEG
usando Friendly Myeloma (Ventrex) como compañero de fusión. Se
produjeron anticuerpos contra una proteína de superficie asociada
con el melanoma de 200 kDa por medio de la inmunización de células
M21 intactas (1x10^{6} células en 0,5 ml de PBS).
Selección: Se usó ELISA sobre receptores y
sobre células M21 fijadas. Para el ELISA de receptores, se
recubrieron placas ELISA de 96 pocillos (Dynatech) con
\alphav\beta3 purificada (1 \mug/ml en PBS, 16 horas; 4ºC),
se bloquearon (1,5% de leche desnatada en PBS; 1 hora; 4ºC) y se
incubaron con sobrenadantes de hibridoma. Las inmunoglobulinas
unidas se detectaron con Ig anti-ratón conjugada
con fosfatasa alcalina (Dako) usando
p-nitrofenil-fosfato como substrato.
Para el ELISA celular, se fijaron células M21 o
M21-L, M21-LIIb o
UCLAP-3 en placas de cultivo de tejidos de 96
pocillos (4% de paraformaldehído en PBS, 15 minutos, 20ºC) y se
bloquearon (BSA al 3%, PBS; 1 hora; 4ºC) antes de la incubación con
sobrenadantes de hibridoma y de la detección como en el ELISA
receptor. Los híbridos positivos se subclonaron tres veces por
dilución limitante y se adaptaron al medio RPMI. El isotipo de
inmunoglobulina se determinó usando anticuerpos de cadena pesada
específicos de subclase (Zymed) o anticuerpos de cadena ligera
(Promega).
Otros MAb murinos usados en los estudios fueron
una donación de nuestros colegas, LM609 para
\alpha_{v}\beta_{3} y LM142 para \alphav (Cheresh y Spiro,
1987) (Dr. D.A. Cheresh; Scripps), P4C10 para la integrina \beta1
(Carter et al., 1990) (Telios) y P5H9 para el complejo de integrinas
\alphav\beta5 (Wayner et al, 1991) (Dr. E. Wayner, Universidad
de Minnesota), CP8 para el complejo \alphaIIb\beta3 (Dr.
Ruggieri; Scripps), AP3 para la cadena \beta3 (Furihata et al.,
1987) (ATCC), 9.2.27 contra un proteoglicano de superficie celular
de melanoma (Harel et al., 1990) (Dr. R. Reisfeld; Scripps) y 14.18
G2a contra el gangliósido GD2 (Mujoo et al., 1989).
Purificación de Anticuerpos y Ampliación a
Escala: Para la purificación a gran escala, se recogieron
sobrenadantes de anticuerpo a partir de cultivos en fase exponencial
desarrollados en frascos cilíndricos. Los anticuerpos purificados
en proteína A-Sepharose CL-4B
(Pharmacia) se dializaron frente a PBS antes de la filtración
estéril (0,45 \mum) y del almacenamiento a -70ºC (Harlow y Lane,
1988). Los anticuerpos purificados se liberaron de endotoxinas
pasándolos a través de columnas Kurimover-II
(Kurita-Vater, Tokio). Esto redujo los niveles de
endotoxina desde >250 IU de endotoxina mg^{-1} de anticuerpo a
< 0,2 IU mg^{-1} en el ensayo de Limulus (Melvaer y Fystro,
1982). Los fragmentos F(ab')_{2} y F(ab)' de 17E6
(IgG_{1} murina) se prepararon por técnicas convencionales de
escisión con pepsina y separación en columnas de proteína A
(Pharmacia), seguido de escisión por papaína y separación por
exclusión molecular (Harlow y Lane, 1988).
Se purificó \alphav\beta3 a partir de
placenta humana (Smith y Cheresh, 1988). Se trituró placenta a
término y se lavó en \sim2 volúmenes de solución A enfriada con
hielo (digitonina al 0,05% p/v, CaCl_{2} 2 mM, PMSF 2 mM, pH
7,4), y después se filtró. El material retenido se extrajo en
\sim4 volúmenes de tampón B enfriado con hielo
(octil-\beta-D-glucopiranósido
[OG] 100 mM, CaCl_{2} 1 mM, PMSF 2 mM, en PBS) y se centrifugó
(12000 gmax, 45 minutos; 4ºC). El sobrenadante se recircularizó
sobre una columna de anticuerpo LM609 (16 horas; 4ºC). Después de
lavar con tampón C (NP-40 al 0,1% en PBS; \sim10
cv) y tampón D (NP-40 al 0,1%, CaCl_{2} 2 mM,
Na-acetato 10 mM; pH 4,5: \sim10 cv), el material
unido se eluyó con tampón E (tampón D ajustado a pH 3,1). El
eluyente se neutralizó con Tris 3 M (pH 8,8), se dializó contra
tampón C y se concentró \sim10x usando Aquacide II (Calbiochem).
El receptor purificado se almacenó a -70ºC.
a_{IIb}\beta_{3} se preparó a partir de
plaquetas humanas (Pytela, et al., 1986).
Se mezclaron concentrados de plaquetas caducadas
con un volumen de tampón de Tyrodes, se sedimentaron (1200 gmax) y
el sedimento se extrajo (1 hora; 20ºC) con tampón de lisis (OG 50
mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 1 \muM, PMSF 2
mM, NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM; pH 7,4). Después
de la centrifugación (32000 gmax, 30 minutos; 4ºC), el sobrenadante
se recircularizó (16 horas; 4ºC) sobre una columna de Sepharose
CL-4B conjugada con GRGDSPK. La columna se lavó con
tampón de lisis (\sim10 cv) y se eluyó con el GRGDSPK (3 mg
ml^{-1} en tampón de lisis al 90%, DMSO al 10%). El pico se
concentró \sim5 veces, se dializó contra tampón de lisis
modificado (en el que el OG se sustituyó por NP-40
al 0,1%) y se almacenó a -70ºC. Las preparaciones de integrina
fueron tuvieron una pureza del - 95% a juzgar por un ELISA
anti-integrina usando anticuerpos monoclonales
específicos de cadena \alpha y de cadena \beta y por
SDS-PAGE.
Biotinilación de la superficie celular y
extracción: Se recogieron células en crecimiento exponencial
con EDTA, se lavaron y 5x10^{6} células en PBS (1 ml) se marcaron
en la superficie con éster de
biotin-N-hidroxisuccinimida (10
\mug/ml: Sigma) en un rotador de extremo sobre extremo (2 horas;
20ºC), se lavaron, y se lisaron 5x10^{6} células por mililitro
durante 1 hora a 20ºC en tampón de extracción (OG 100 mM,
CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM y PMSF 1 mM en PBS). Después de la
centrifugación (12000 g, 20 minutos), el sobrenadante se usó para la
inmunoprecipitación.
Inmunoprecipitación: Se inmunoprecipitaron
extractos de células biotiniladas con MAb
anti-integrina purificados acoplados a perlas
Affigel-10 (Biorad), o unidos a proteína
G-Sepharose (Pharmacia). Se incubaron 10 mg de MAb
acoplados con equivalentes de células 5E6 de extractos celulares
biotinilados durante una noche a 4ºC. Las perlas lavadas se
hirvieron en tampón de SDS-muestra no reductor, se
centrifugaron y se resolvieron en SDS-PAGE al 7,5%.
Después de la transferencia electroforética a nitrocelulosa (Towbin
et al., 1979), se visualizaron las bandas con conjugado de
fosfatasa alcalina de cabra anti-biotina (Dako)
usando NBT-BCIP (Biorad) como substrato.
Citrometría de Flujo: Se recogieron
células con EDTA, se lavaron, y se incubaron 106 células en
PBS-BSA al 1% con MAb (10 \mug ml^{-1}; 20
minutos, 4ºC). Después del lavado y el marcaje (20 minutos, 4ºC)
con Ig-FITC de cabra anti-ratón
(Becton Dickinson), las células se incubaron con yoduro de propidio
antes del análisis de citometría de flujo (EPICS Profile II,
Coulter). Las células vivas se seleccionaron mediante aberturas
apropiadas en la dispersión lateral y de avance. La fluoresceína se
excitó a 488 nm con un láser de ion argón y se registró la
fluorescencia emitida (525 nm). En algunos experimentos, las
células M21-L se tiñeron después de una breve etapa
de fijación y de permeabilización (etanol al 70%; 5 minutos x
-20ºC).
Citotoxicidad dependiente del complemento
(CDC): Se cultivaron células M21 (10.000) en una placa de 96
pocillos con 50 \mul de medio completo y 20 \mul de anticuerpos.
Se añadió suero de conejo (50 \mul, 1:5; Behring) como fuente de
complemento y se incubó la placa (37ºC; 60 minutos). La lisis se
cuantificó mediante la técnica MTT (Mosmann, 1983). El porcentaje de
lisis se calculó usando pocillos con Tween-20 al 1%
como controles lisados al 100%, y sin anticuerpo como control
lisado al 0%.
Ensayos de proliferación: Para ensayar los
efectos crónicos del anticuerpo, se incubaron 10^{6} células en
presencia de MAb (70 \mug ml^{-1} de PBS; 1 hora; 20ºC) en un
rotador de extremo sobre extremo, se lavaron, y después se
resuspendieron y se cultivaron adicionalmente en medio RPMI. El
crecimiento y la viabilidad se estimaron por exclusión del tinte
azul trípano. La activación se midió mediante el ensayo MTT como se
ha descrito anteriormente, y el número de células se contabilizó
diariamente usando contador de células (Coulter electronics).
Se separaron células de melanoma adherentes
(tripsina al 0,05%/EDTA al 0,02%). Las células lavadas se sembraron
en placas de microensayo de fondo plano de 96 pocillos (1 x
10^{4} células por pocillo) y se cultivaron sin (control) o en
presencia de anticuerpos diluidos en serie en medio RPMI con FCS al
10%. Después de 48 horas, las células se marcaron por pulsos durante
18 horas (18,5 kBeq [^{3}H]-timidina por pocillo)
y se recogieron. La radiactividad incorporada se midió y se expresó
en cuentas por minuto.
Ensayos de citotoxicidad celular dirigida a
anticuerpos (ADCC): La preparación de células microgliales de
ratón BALB/C y las condiciones para la ADCC y la citostasis mediada
por anticuerpo-células efectoras (AECM) fueron
esencialmente como se ha descrito (Sutter et al., 1991). Se
sometieron a pulsos células M21 durante 18 horas con
[^{3}H]-timidina (18kBq por 4x10^{3} células
por pocillo) y se incubaron en placas de 96 pocillos con microglia
de ratón BALB/C (5x10^{4} células por pocillo) en 200 \mul de
DMEM/FCS (10%) en presencia de anticuerpos. Después de 48 horas, se
midió el marcador [^{3}H] retenido en el compartimento nuclear de
células diana. La citotoxicidad dependiente de MAb se calculó
usando la fórmula: [(ccpm experimental-ccpm
espontánea) / (ccpm máxima-ccpm espontánea)] x
100
Citostasis dependiente de células efectoras y
de anticuerpos (AECM): Como en el caso de la ADCC, pero en lugar
de células sometidas a pulsos, se usaron células M21 no marcadas
sometidas a pasos recientemente. Después de 24 horas, los cocultivos
de células efectoras-diana se sometieron a pulsos
de [^{3}H]-timidina (18 kBq por pocillo) durante
24 horas más y se midió el marcador [^{3}H] nuclear
incorporado.
Los Ensayos de unión celular fueron como
se han descrito previamente (Goodman et al., 1991), usando
actividad hexosaminidasa (Landegren, 1984) para detectar las células
unidas. Las diluciones y las suspensiones celulares se realizaron
en tampón de unión (RPMI, BSA al 1%, HEPES 25 mM; pH 7,4). Se
aplicaron proteínas de matriz como un recubrimiento en placas de 96
o 48 pocillos, los pocillos se bloquearon con BSA y se añadieron
MAb diluidos en serie a los pocillos seguido de células
(2,5x10^{4} - 5x10^{4}). Después de 1 hora a 37ºC, se retiraron
por lavado células no adherentes y las células unidas se
contabilizaron frente a un curva patrón establecida en paralelo. La
inhibición de la unión se calculó usando pocillos sin MAb como
referencia. Típicamente, más de 70% de las células añadidas se
habían unido a vitronectina en 1 hora. La unión celular a pocillos
recubiertos con BSA sola fue habitualmente inferior al 5% de las
células unidas específicamente.
Ensayo de entrecruzamiento de superficie:
Como en el ensayo de unión celular, se dejó que las células se
unieran a placas recubiertas con matriz en presencia de 17E6
diluido en serie o de sus fragmentos F(ab')_{2} o
F(ab'), y de cantidades crecientes de F(ab') de cabra
anti-ratón como reactivo de entrecruzamiento. El
lavado y la detección de las células unidas se realizaron como en el
ensayo de unión de células normales.
Ensayo de inversión de la unión: Se
cultivaron células en placas en tampón de unión en pocillos
recubiertos y se bloquearon como en los ensayos de unión celular, y
se incubaron a 37ºC. Después de la expansión (60-75
min), se añadieron MAb diluidos en serie y las células se
devolvieron al incubador. Como alternativa, se dejó que las células
se unieran durante 24 horas antes de la adición de los anticuerpos.
Después de 2-3 horas en presencia de anticuerpos,
los sobrenadantes se retiraron cuidadosamente y se reemplazaron 5
veces con tampón de unión precalentado nuevo - obteniéndose un
factor de dilución final de > 1x10^{5}.
Desarrollo tumoral in vivo : Se
recogieron células tumorales en crecimiento exponencial con EDTA, se
lavaron y se examinaron con respecto a la viabilidad mediante
exclusión con el colorante azul trípano. La viabilidad estuvo
comprendida entre el 96 y el 99%. Para el crecimiento tumoral
primario, se inyectaron células (0,5x10^{6} células en 0,2 ml de
PBS++) por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos. El
crecimiento tumoral se siguió mediante la medición de los diámetros
de los tumores con calibres y el volumen de los tumores se calculó
usando una fórmula aproximada para un elipsoide alargado.
volumen = [(a\cdot
b^{2})/2]
donde a es el eje más largo del tumor y
b es el más corto. Se usó un mínimo de ocho animales por
grupo.
Para la metástasis de pulmón experimental, se
recogieron células (Tripsina al 0,05%/EDTA al 0,02%) y se
inyectaron en la vena de la cola de ratones desnudos (0,5x10^{6}
células en 0,2 ml de PBS++). Siete semanas después, los animales se
sacrificaron, se retiraron los pulmones y se fijaron en una
solución de Bouins, y se contabilizaron los focos de los tumores en
la superficie de los pulmones. Para el tratamiento de anticuerpos,
se incubaron células recogidas y lavadas con MAb sin endotoxina
purificados (70 \mug por 10^{6} células, 0,5 ml de PBS++)
durante 30 minutos a 20ºC en un rotador de extremo sobre extremo
antes de la dilución a 0,5x10^{6} células en 0,2 ml de PBS y de la
inyección. La viabilidad de las células se evaluó mediante
exclusión con colorante azul trípano antes y después de completar el
esquema de inyección, sin encontrar ninguna diferencia
significativa (viabilidad antes de la inyección = viabilidad
después de la inyección \pm 5%). Los datos de inhibición tumoral
se evaluaron usando el ensayo T de Student de 2 colas.
A menos que se indique otra cosa, todas técnicas
de biología molecular se realizaron como se ha descrito previamente
con detalle (Sambrook et al, 1989).
Preparación de ARN y ADNc: Se aisló ARN
total a partir de células 17E6 por extracción con tiocianato de
guanidinio y el ARN se aisló por ultracentrifugación en gradiente
de densidad con cloruro de cesio (Chirgwin et al., 1979). El ADNc de
primera cadena se sintetizó usando un kit comercial (Pharmacia). La
síntesis se realizó en un volumen de 15 \mul con 5 \mug de ARN,
durante 1 hora a 37ºC. El ADNc de primera cadena se usó
directamente para la amplificación por PCR.
Amplificación por PCR: Las regiones
variables de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera
de ratón se amplificaron usando un conjunto de cebadores de PCR
redundantes y semi-degenerados diseñados para
hibridar con secuencias líder de Ig murina (Jones y Bendig, 1991).
Una mezcla de 61 oligonucleótidos sirvió como cebadores 5' para el
dominio variable de la cadena pesada, y una mezcla de 405
oligonucleótidos sirvió como cebadores 5' para el dominio variable
de la cadena kappa. Se diseñaron cebadores 3' para hibridación en
la región constante: se usaron cebadores de ratón específicos de
IgG1 y kappa.
Para la amplificación, con una ADN polimerasa
termoestable, 25 \mul de mezcla de reacción que contenía: 1\mul
del híbrido de ADNc-ARN, 250 nM de la mezcla
apropiada de cebadores 5' y 3', 200 \muM de cada dNTP, MgCl_{2}
1 mM (para la cadena ligera), MgCl_{2} 2 mM (para la cadena
pesada), y 1 U de Taq polimerasa (Cetus), se recubrieron con aceite
mineral y se sometieron a calor empezando a 60ºC hasta la
temperatura de templado de 55ºC. Después de 30 ciclos (1'x55ºC;
1,5'x72ºC; 45 s x 92ºC), una décima parte de la reacción de PCR se
realizó en electroforesis de gel TAE de agarosa al 1% y se tiñó con
bromuro de etidio para visualizar los productos de PCR
resultantes.
Clonación y secuenciación molecular: 1
\mul de cada producto de PCR se unió al vector TA (Invitrogen, San
Diego). Las dos reacciones de unión de ADN, para regiones variables
de cadena pesada y ligera, se utilizaron para transformar por choque
térmico células TG1 de cepa de E. coli competente para crear
dos bibliotecas de ADN, siendo una de una región variable ligera de
Mab de 17E6 y la otra de la región variable pesada del Mab de 17E6.
Se seleccionaron colonias en placas LB con 100 \mug/ml de
carbenicilina y se recogieron para un análisis adicional. Se
detectaron colonias positivas por selección en PCR o usando
digestión plasmídica (Gussow y Clackson, 1989). Se preparó ADN
plasmídico de doble cadena (Wizard preps, Promega Corp.) para la
secuenciación a partir de los transformantes. La secuenciación en
ciclos térmicos usando el método de terminación de cadena de
didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977) se realizó usando Taq
polimerasa. Se usaron cebadores de secuenciación cadena arriba y
cadena abajo complementarios para el vector TA.
Ensayos de competición y unión de ligando de
integrinas: Biotinilación de ligandos. Se diluyeron ligandos en
PBS con tampón de unión concentrado 5 veces (concentraciones
finales: 1 mg ml^{-1} de proteína, NaCl 100 mM, NaHCO_{3} 100
mM, pH 8,2) en un volumen final de 1 ml. Se añadió solución de
N-hidroxisuccinimido biotina recién preparada (100
\mul; 1 mg ml^{-1} en DMSO) con mezcla y la reacción se
continuó durante 2 horas a 20ºC con una rotación de extremo sobre
extremo. Después de una diálisis exhaustiva a (4ºC: PBS, NaN_{3}
al 0,05% ), se evaluó la concentración de proteína y el ligando
biotinilado se almacenó a 4ºC y se usó en un plazo de 21 días. La
síntesis del péptido biotinilado cRGDfK
(cíclico-Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys
= ácido N-biotina-aminohexanoico) se
ha descrito en la técnica anterior o puede obtenerse de acuerdo con
técnicas convencionales.
Ensayos de Competición Directa: Se
basaron, con algunas modificaciones, en métodos anteriores (Smith et
al., 1990). Se diluyó \alphav\beta3 a 1 \mug ml^{-1} en
tampón A (NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1 mM, MnCl_{2}
10 \muM, Tris-HCl 20 mM; pH 7,4) y se aplicaron
100 ml durante una noche a 4ºC a placas de microtitulación de 96
pocillos. La placa se lavo una vez con tampón B (BSA al 3% (p/v),
NaCl 100 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 10 \muM,
Tris-HCl 50 mM; pH 7,4) y se incubó durante 2 horas
a 20ºC en el mismo tampón.
Después de aclarar con tampón C (tampón B con BSA
al 0,1% (p/v)) se añadió ligando biotinilado (concentración final 1
\mug ml^{-1}) y los péptidos o proteínas de ensayo se diluyeron
en serie. Después de la incubación (3 horas, 30ºC), el ligando no
unido se lavó de la placa mediante 3 lavados con tampón C, y la
incubación continuó durante 1 hora con anticuerpo
anti-biotina conjugado con fosfatasa alcalina
(1:10000 en tampón C) (Sigma) seguido de lavado con PBS y detección
del anticuerpo unido con NBT-BCIP (Biorad) como
substrato. Las moléculas ECM y los anticuerpos se biotinilaron de
forma rutinaria y se usaron en dicha configuración de ensayo.
Los ensayos se realizaron rutinariamente por
triplicado o por cuadruplicado, y se repitieron al menos tres veces
para obtener una IC_{50} a partir de un ajuste de curva sigmoidea
no ponderada. Los resultados se normalizaron frente a péptidos de
control externos para permitir la comparación
intra-ensayo. El péptido RGD lineal GRGDSPK y el
péptido cíclico cRGDfV se incluyeron rutinariamente en titulaciones
como patrones externos, así como pocillos de control donde se midió
la unión del ligando biotinilado a pocillos bloqueados pero sin
integrina y del anticuerpo anti-biotina a la
integrina sin ligando: la señal de los pocillos de control fue <
7,5 % de la unión de ligando específica.
Se preincubaron placas de ensayo de competición
de pre-bloqueo recubiertas con el receptor y
bloqueadas como en el ensayo de competición directa con anticuerpos
concentrados dos veces, moléculas de matriz o péptidos competitivos
(50 \mul en tampón C: 1 hora; 30ºC) antes de la adición del
anticuerpo o del ligando de sondeo biotinilado (50 \mul en tampón
C) y de continuar la incubación (3 horas; 30ºC), seguido del lavado
y de la detección de la biotina unida como se ha descrito para el
ensayo de competición directa.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Merck Patent GmbH
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Farnkfurter Str. 250
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Darmstadt
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 64271
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TÉLEFONO: 49-6151-727022
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 49-6151-727191
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpo monoclonal anti integrina alfa-V
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patent in Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 381 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ratón
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: BALB/c
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: 72-17E6
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..129
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "Secuencia líder y FR-1 (líder: 1 a 60; FR-1:61-129)"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 130..162
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia CDR-1"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 163..207
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia FR-2"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 208..228
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia CDR-2"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 229..324
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia FR-3"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 325..351
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia CDR-3"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 352..381
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia FR-4"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Ser Gln Asp Ile SEr ASn Tyr Leu
Ser}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
Leu Leu Ile Phe}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
Gly Thr Asp Tyr Ser}
\sac{Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Gln Glu Asp Ile
Ala Thr Tyr Phe Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Gly Asn Thr Phe Pro Tyr Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met
Arg}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 411 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ratón
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: BALB/c
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: 272-17E6
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..57
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "Secuencia líder"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 58..147
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia FR-1"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 148..162
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia CDR-1"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 163..204
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia FR-2"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 205..255
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia CDR-2"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 256..351
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia FR-3"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 352..378
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia CDR-3"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 379..411
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "secuencia FR-4"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Ile Phe Leu Phe
Ser Val Thr Ala Gly}
\sac{Val His Ser}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
Ala Glu Pro Gly Ala}
\sac{Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
Thr Phe Ser}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Phe Trp Met His}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
Trp Ile Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Glu Cys
Asn Glu Ile Phe Arg}
\sac{Asp}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser
Thr Ala Tyr Met Gln}
\sac{Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
Tyr Tyr Cys Ala Ser}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Leu Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Ser
Ser}
Claims (20)
1. Un anticuerpo monoclonal que comprende las
secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales (FR) y las
regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena
ligera de la SEC ID NO: 1 y de la cadena pesada de la SEC ID NO:
9.
2. Anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1,
que tiene las siguientes propiedades:
- reacciona sólo con la cadena \alphaV de
integrinas \alphaV humanas,
- bloquea la unión al substrato de integrina de
la célula que lleva la integrina \alphaV,
- induce la inversión de la interacción con la
matriz celular establecida provocada por integrinas \alphaV,
- bloquea el desarrollo de tumores,
- no muestra actividad citotóxica.
3. Anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 ó
2, donde el substrato de integrina es vitronectina, fibrinógeno o
fibronectina.
4. Anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones
1-3, donde el tumor del que se bloquea el
crecimiento celular es un melanoma.
5. Fragmento del anticuerpo monoclonal que
comprende las secuencias de aminoácidos de la reivindicación 1 y
que tiene las propiedades descritas en las reivindicaciones
2-4, caracterizado porque dicho fragmento es
bivalente.
6. Una línea de células de hibridoma que tiene la
designación 272-17E6 y depositada con el número de
acceso DSM ACC2160, capaz de producir un anticuerpo monoclonal de
las reivindicaciones 1-4.
7. Anticuerpo monoclonal que puede obtenerse por
la línea de células de hibridoma DSM ACC2160.
8. Secuencia de aminoácidos que comprende la
secuencia proporcionada en la SEC ID NO: 1.
9. Secuencia de aminoácidos que comprende la
secuencia proporcionada en la SEC ID NO: 9.
10. Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la
reivindicación 8 que comienza en la posición 21.
11. Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la
reivindicación 9 que comienza en la posición 20.
12. Secuencia de ADN que comprende la secuencia
de ADN de la SEC ID NO: 1 que codifica para las FR y CDR de la
cadena ligera de la región variable de un anticuerpo monoclonal que
tiene las propiedades que se han definido en la reivindicación
2.
13. Secuencia de ADN que comprende una secuencia
de ADN de la SEC ID NO: 9 que codifica para las FR y CDR de la
cadena pesada de la región variable de un anticuerpo monoclonal que
tiene las propiedades que se han definido en la reivindicación
2.
14. Secuencia de ADN de acuerdo con la
reivindicación 12, que comprende la secuencia líder proporcionada
en la SEC ID NO: 1.
15. Secuencia de ADN de acuerdo con la
reivindicación 13, que comprende la secuencia líder proporcionada
en la SEC ID NO: 9.
16. Composición farmacéutica que comprende un
anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 ó 7, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
17. Método para la fabricación de un anticuerpo
monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-5 a 7, realizando las siguientes etapas:
(i) inmunizar a un ratón con integrina
\alpha_{v}\beta_{3} purificada,
(ii) producir células de hibridoma,
(iii) seleccionar clones cuyos sobrenadantes
muestren resultados positivos y un modelo de reacción consistente
con su reconocimiento de la cadena de integrina \alphav,
(iv) seleccionar clones cuyos sobrenadantes
bloqueen la unión de células que expresan integrinas de cadena
\alphav a proteínas de la matriz,
(v) seleccionar clones cuyos sobrenadantes
bloquee el desarrollo de tumores,
(vi) seleccionar clones cuyos sobrenadantes no
muestren citotoxicidad,
(vii) seleccionar clones cuyos sobrenadantes
induzcan la inversión de la interacción con la matriz celular
mediada por la integrina establecida,
(viii) producir una línea celular específica,
y
(ix) aislar el anticuerpo monoclonal a partir de
dicha línea celular.
18. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ó 7,
para la fabricación de un fármaco dirigido a tumores.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18,
donde el tumor es un melanoma.
20. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ó 7,
para la fabricación de un compuesto de diagnóstico para la
localización y la evaluación del crecimiento de tumores.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94120165 | 1994-12-20 | ||
| EP94120165 | 1994-12-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2202336T3 true ES2202336T3 (es) | 2004-04-01 |
Family
ID=8216547
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95119233T Expired - Lifetime ES2202336T3 (es) | 1994-12-20 | 1995-12-06 | Anticuerpo monoclonal contra la integrina alfa-v. |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5985278A (es) |
| EP (1) | EP0719859B1 (es) |
| JP (1) | JP3898245B2 (es) |
| KR (1) | KR100450368B1 (es) |
| CN (1) | CN1117763C (es) |
| AR (1) | AR001778A1 (es) |
| AT (1) | ATE244306T1 (es) |
| AU (1) | AU710234B2 (es) |
| BR (1) | BR9505980B1 (es) |
| CA (1) | CA2165573C (es) |
| CO (1) | CO4480042A1 (es) |
| CZ (1) | CZ290477B6 (es) |
| DE (1) | DE69531187T2 (es) |
| DK (1) | DK0719859T3 (es) |
| ES (1) | ES2202336T3 (es) |
| FI (1) | FI118536B (es) |
| HU (1) | HU221061B1 (es) |
| NO (1) | NO321186B1 (es) |
| PL (1) | PL182961B1 (es) |
| PT (1) | PT719859E (es) |
| RU (1) | RU2205223C2 (es) |
| SI (1) | SI0719859T1 (es) |
| SK (1) | SK284932B6 (es) |
| TR (1) | TR199501614A2 (es) |
| UA (1) | UA40621C2 (es) |
| ZA (1) | ZA9510806B (es) |
Families Citing this family (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998009651A1 (fr) * | 1996-09-03 | 1998-03-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | COMPLEXES D'ANTICORPS ANTI-INTEGRINE α3 |
| EP0846702B1 (en) * | 1996-12-09 | 2009-03-11 | MERCK PATENT GmbH | Soluble recombinant alphaV beta3 adhesion receptor |
| ATE410179T1 (de) * | 1997-08-08 | 2008-10-15 | Univ California | Behandlung von leberfibrose mit anti-alpha v beta 6 integrin antikörpern |
| EP1049718B1 (en) * | 1998-01-23 | 2006-04-05 | MERCK PATENT GmbH | Use of the antibody 271.14d9.f8 (dsm acc2331) to inhibit in vitro alphavbeta6-integrin attachment to fibronectin |
| US6160099A (en) * | 1998-11-24 | 2000-12-12 | Jonak; Zdenka Ludmila | Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies |
| US6521593B1 (en) * | 1999-02-01 | 2003-02-18 | Childrens Hospital Los Angeles | Methods for inhibiting brain tumor growth |
| US7323552B2 (en) * | 2000-07-31 | 2008-01-29 | The General Hospital Corporation | Variant integrin polypeptides and uses thereof |
| US7153944B2 (en) * | 2000-07-31 | 2006-12-26 | The General Hospital Corporation | High affinity integrin polypeptides and uses thereof |
| US7064180B2 (en) | 2000-07-31 | 2006-06-20 | The General Hospital Corporation | High affinity integrin polypeptides and uses thereof |
| US7163681B2 (en) | 2000-08-07 | 2007-01-16 | Centocor, Inc. | Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses |
| US7288390B2 (en) | 2000-08-07 | 2007-10-30 | Centocor, Inc. | Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses |
| WO2002070007A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Medimmune, Inc. | Methods of preventing or treating inflammatory or autoimmune disorders by administering integrin alphav beta3 antagonists |
| RU2316337C2 (ru) | 2001-04-24 | 2008-02-10 | Мерк Патент Гмбх | КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ, ИСПОЛЬЗУЮЩАЯ АНТИАНГИОГЕННЫЕ СРЕДСТВА И TNF-α |
| JP4351043B2 (ja) * | 2001-07-09 | 2009-10-28 | エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | アミロイド毒性の阻害方法 |
| US7829087B2 (en) * | 2001-07-09 | 2010-11-09 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating cognitive impairment |
| EP1487489A4 (en) * | 2002-03-04 | 2008-10-01 | Medimmune Inc | METHODS FOR PREVENTING OR TREATING DISORDERS BY ADMINISTERING AN INTEGRIN AVB3 ANTAGONIST ASSOCIATED WITH HMG-COA REDUCTASE INHIBITOR OR BISPHOSPHONATE |
| AU2003217930A1 (en) * | 2002-03-04 | 2003-09-22 | Medimmune, Llc | The prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents |
| UA90242C2 (ru) * | 2002-03-13 | 2010-04-26 | Байоджен Айдек Ма Инк. | МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЕТСЯ С αVβ6 |
| AU2003261071C1 (en) | 2002-03-13 | 2008-12-11 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-AlphavBeta6 antibodies |
| CA2481922A1 (en) * | 2002-04-12 | 2003-10-23 | Raven Biotechnologies, Inc. | Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof |
| EP2270049A3 (en) * | 2002-04-12 | 2011-03-09 | Medimmune, Inc. | Recombinant anti-interleukin-9-antibody |
| WO2004066956A2 (en) * | 2003-01-30 | 2004-08-12 | Medimmune, Inc. | Uses of integrin alphavbeta3 antagonists |
| CA2521826C (en) | 2003-04-11 | 2013-08-06 | Jennifer L. Reed | Recombinant il-9 antibodies and uses thereof |
| US7351739B2 (en) * | 2004-04-30 | 2008-04-01 | Wellgen, Inc. | Bioactive compounds and methods of uses thereof |
| WO2006047639A2 (en) | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Medimmune, Inc. | Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens |
| CN102875681A (zh) | 2005-07-08 | 2013-01-16 | 拜奥根Idec马萨诸塞公司 | 抗-αvβ6抗体及其用途 |
| EP1989231B1 (en) | 2006-03-21 | 2015-05-20 | Genentech, Inc. | Combinatorial therapy involving alpha5beta1 antagonists |
| JP2009542810A (ja) | 2006-07-10 | 2009-12-03 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | Ｓｍａｄ４欠損癌の増殖を阻害するための組成物および方法 |
| EP2851064A3 (en) | 2006-07-11 | 2015-08-05 | Roy C. Levitt | Rhinosinusitis prevention and therapy with proinflammatory cytokine inhibitors |
| DK2068889T3 (da) | 2006-08-10 | 2020-02-03 | Roy C Levitt | Anakinra til anvendelse i behandling af bronchiolitis obliterans syndrom |
| WO2008141274A1 (en) * | 2007-05-11 | 2008-11-20 | Centocor, Inc. | Anti-alpha v immunoliposome composition, methods and uses |
| US20090196913A1 (en) * | 2007-05-11 | 2009-08-06 | Ken Shi Kun Huang | Anti-Alpha-V Immunoliposome Composition, Methods, and Uses |
| BRPI0815567B8 (pt) | 2007-07-17 | 2021-05-25 | Merck Patent Gessellschaft Mit Beschraenkter Haftung | anticorpos híbridos anti-alfa v-integrina projetados, proteína de fusão e composição farmacêutica |
| JP2011501656A (ja) * | 2007-09-26 | 2011-01-13 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 新規抗体 |
| JP5680547B2 (ja) | 2008-12-23 | 2015-03-04 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ | 抗血管形成活性を有するインヒビターのためのバイオマーカー |
| MX2011010012A (es) | 2009-03-25 | 2011-12-06 | Genentech Inc | NUEVOS ANTICUERPOS ANTI-A5ß1 Y SUS USOS. |
| CA2780773A1 (en) | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Merck Patent Gmbh | Anti integrin antibodies linked to nanoparticles loaded with chemotherapeutic agents |
| EP4219560A3 (en) * | 2010-02-18 | 2023-08-23 | The Regents of The University of California | Integrin alpha v beta 8 neutralizing antibody |
| WO2012027745A1 (en) * | 2010-08-27 | 2012-03-01 | University Of Miami | Treatment of renal diseases |
| MX352025B (es) | 2011-02-11 | 2017-11-07 | Merck Patent Gmbh | Anticuerpo anti-integrina alfa v para el tratamiento de cancer de prostata. |
| JP2014515753A (ja) | 2011-04-21 | 2014-07-03 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 新規な結合剤−薬物複合体（ａｄｃ）およびそれらの使用 |
| RU2614252C2 (ru) * | 2011-08-17 | 2017-03-24 | Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния | Антитела, которые связывают интегрин альфа-v бета-8 |
| WO2014143739A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof |
| WO2014144466A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof |
| NZ720736A (en) | 2013-12-23 | 2020-08-28 | Bayer Pharma AG | Antibody drug conjugates (adcs) with kinesin spindel protein (ksp) |
| CA2961421C (en) | 2014-09-17 | 2024-01-30 | Merck Patent Gmbh | A method of treating solid cancers and/or metastases thereof, medicaments therefore, and a method of predicting the clinical outcome of treating solid cancers and/or metastases thereof |
| BR112017004729A2 (pt) | 2014-09-17 | 2017-12-05 | Merck Patent Gmbh | processo de tratamento de doenças causadas por metástase óssea, medicamentos para as mesmas e processo de previsão do resultado clínico de tratamento de doenças causadas por metástase óssea |
| EP3310440A1 (de) | 2015-06-22 | 2018-04-25 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) und binder-prodrug-konjugate (apdcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen |
| EP3313523A2 (en) | 2015-06-23 | 2018-05-02 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Targeted conjugates of ksp inhibitors |
| WO2017060322A2 (en) | 2015-10-10 | 2017-04-13 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Ptefb-inhibitor-adc |
| US20190144547A1 (en) | 2015-11-23 | 2019-05-16 | Merck Patent Gmbh | Anti-alpha-v integrin antibody for the treatment of fibrosis and/or fibrotic disorders |
| RU2018136778A (ru) | 2016-03-24 | 2020-04-24 | Байер Фарма Акциенгезельшафт | Пролекарства цитотоксических лекарственных средств, содержащие ферментативно расщепляемые группы |
| WO2017216028A1 (en) | 2016-06-15 | 2017-12-21 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies |
| US20190242908A1 (en) | 2016-09-08 | 2019-08-08 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for diagnosing and treating nephrotic syndrome |
| JP7066714B2 (ja) | 2016-12-21 | 2022-05-13 | バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト | 酵素的に切断可能な基を有する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ） |
| US11433140B2 (en) | 2016-12-21 | 2022-09-06 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Specific antibody drug conjugates (ADCs) having KSP inhibitors |
| CN110312533B (zh) | 2016-12-21 | 2023-11-03 | 拜耳公司 | 具有酶促可裂解的基团的细胞毒性活性剂的前药 |
| KR101961715B1 (ko) | 2018-07-18 | 2019-03-25 | (주) 삼진정밀 | 고효율 수처리장치 |
| WO2020079209A1 (en) | 2018-10-19 | 2020-04-23 | Merck Patent Gmbh | Abituzumab for the treatment of colorectal cancer |
| KR101999620B1 (ko) | 2019-03-26 | 2019-07-12 | 조용진 | 부상슬러지 및 침전슬러지의 동시처리장치 |
| MA55613A (fr) * | 2019-04-08 | 2022-02-16 | Biogen Ma Inc | Anticorps anti-intégrine et leurs utilisations |
| CN117143241B (zh) * | 2023-10-26 | 2024-02-23 | 迈威(上海)生物科技股份有限公司 | 与人整合素蛋白itgav/itgb8特异性结合的单克隆抗体 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0633945B1 (en) * | 1992-04-03 | 1998-12-30 | Genentech, Inc. | ANTIBODIES TO ALPHAvBETA3 INTEGRIN |
| US5753230A (en) * | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
-
1995
- 1995-12-06 ES ES95119233T patent/ES2202336T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-06 AT AT95119233T patent/ATE244306T1/de active
- 1995-12-06 DK DK95119233T patent/DK0719859T3/da active
- 1995-12-06 SI SI9530683T patent/SI0719859T1/xx unknown
- 1995-12-06 PT PT95119233T patent/PT719859E/pt unknown
- 1995-12-06 DE DE69531187T patent/DE69531187T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-06 EP EP95119233A patent/EP0719859B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-13 AU AU40421/95A patent/AU710234B2/en not_active Ceased
- 1995-12-13 CZ CZ19953288A patent/CZ290477B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-12-18 CA CA2165573A patent/CA2165573C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-18 JP JP32887795A patent/JP3898245B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-19 SK SK1592-95A patent/SK284932B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-12-19 CN CN95120901A patent/CN1117763C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-19 NO NO19955167A patent/NO321186B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-12-19 RU RU95121105/13A patent/RU2205223C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-12-19 US US08/574,699 patent/US5985278A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-19 FI FI956112A patent/FI118536B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-12-19 UA UA95125376A patent/UA40621C2/uk unknown
- 1995-12-19 HU HU9503638A patent/HU221061B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-12-19 PL PL95311926A patent/PL182961B1/pl unknown
- 1995-12-19 ZA ZA9510806A patent/ZA9510806B/xx unknown
- 1995-12-20 AR AR33473095A patent/AR001778A1/es active IP Right Grant
- 1995-12-20 BR BRPI9505980-6A patent/BR9505980B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-12-20 CO CO95060553A patent/CO4480042A1/es unknown
- 1995-12-20 KR KR1019950052440A patent/KR100450368B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-12-20 TR TR95/01614A patent/TR199501614A2/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2202336T3 (es) | Anticuerpo monoclonal contra la integrina alfa-v. | |
| US20210095017A1 (en) | Methods for treating vascular leak syndrome and cancer | |
| CN104822705B (zh) | M971嵌合抗原受体 | |
| ES2335643T3 (es) | Metodos de tratamiento de lesion isquemica o hemorragica del sistema nervioso central usando antagonistas anti-integrinas alfa 4. | |
| AU2006284884B2 (en) | Trail receptor 2 polypeptides and antibodies | |
| JP2019503709A (ja) | ヒト化抗ｃｄ７３抗体 | |
| US20070048325A1 (en) | Combination therapies for inhibiting integrin-extracellular matrix interactions | |
| CA2237808A1 (en) | Therapeutic uses of humanized antibodies against alpha-4 integrin | |
| CN106029694A (zh) | 治疗性肽 | |
| CA2597717A1 (en) | Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof | |
| ES2926511T3 (es) | Anticuerpos anti-CLEVER-1 humanizados y utilización de los mismos | |
| EP1049718A1 (en) | Monoclonal antibody anti alphav-integrin and its use to inhibit alphavbeta6-integrin attachment to fibronectin | |
| US9574001B2 (en) | Humanized single-chain antibody against beta 3 integrin for the treatment and prevention of metastasis | |
| ES2345981T3 (es) | Parejas de interaccion de cd55 y la utilizacion de las mismas. | |
| CN103492419B (zh) | 可中和狂犬病病毒的结合分子 | |
| BR112015023429B1 (pt) | Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo,composição farmacêutica e uso do referido anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo |