KR100450368B1

KR100450368B1 - 항-αV-인테그린 모노크로날 항체

Info

Publication number: KR100450368B1
Application number: KR1019950052440A
Authority: KR
Inventors: 미트얀스 프란세스크; 피울라트스 야우메; 로젤 엘리사베트; 아단 야우메; 굿맨 사이몬; 하하 다이안
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 1994-12-20
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 2005-01-31
Also published as: CN1117763C; JP3898245B2; DK0719859T3; NO955167L; DE69531187D1; CA2165573A1; CZ290477B6; FI956112A0; CZ328895A3; DE69531187T2; AR001778A1; HU9503638D0; ZA9510806B; SK284932B6; NO321186B1; HU221061B1; ES2202336T3; BR9505980B1; CA2165573C; UA40621C2

Abstract

본 발명은 신규한 모노크로날 항체, 동 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 항체를 암호화하고 있는 DNA 서열 및 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 따른 모노크로날 항체는 17E6 으로 명명된 것이며;

- 사람의 αV-인테그린의 αV-사슬과만 반응하고;

- 인테그린 기질이 αV-인테그린을 보유하고 있는 세포에 부착하는 것을 차단하고;

- αV-인테그린에 의하여 기 생성된 세포 매트릭스의 상호작용을 가역화하고;

- 종양의 성장을 차단하고;

- 세포독성을 나타내지 않는 성질을 가진다.

Description

항- αV-인테그린 모노크로날 항체

본 발명은 신규한 모노크로날 항체와 동 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 따른 모노크로날 항체는 17E6 으로 명명된 것이며, 이는;

- 사람의 αV-인테그린의 αV-사슬과만 반응하고;

- αV-인테그린을 보유하고 있는 세포가 인테그린의 기질에 결합하는 것을 차단하고;

- αV-인테그린에 의하여 발생한 종래의 세포 매트릭스의 상호작용을 역으로 진행되도록 하며;

- 종양의 성장을 차단하고;

- 세포독성이 없는 등의 특성을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 특성을 갖춘 모노크로날 항체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(272-17E6로 명명; 접수번호 제 DSM ACC2160호로 기탁)와, 동 세포주에 의하여 얻을 수 있는 상기 특성을 갖춘 모노크로날 항체를 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명은 DNA 서열과 아미노산 서열에 관한 것이다. DNA 서열은 상기 항체의 전부 또는 일부를 암호화 하고 있다. 동 서열은 제 17a 도, 17b도 및 별첨 서열 프로토콜에 기재되어 있다.

마지막으로, 본 발명의 목적은 상기 항체를 포함하고 있는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

발명의 배경

인테그린은 세포가 고형의 주변환경, 즉 세포외 매트릭스(ECM) 및 다른 세포에 부착하는 것을 조절하는 세포 표면의 부착성 수용체의 일종인 단백질 군(super-family)이다. 부착 기능은 세포에서 매우 중요한 역할을 한다; 이에 의하여 정박, 전이의 개시, 그리고 성장 및 분화의 신호가 제공된다. 인테그린은 정상 상태 및 질병상태에서 다양한 기능에 직접적으로 관여하므로, 치료적 목적의 저해 과정에서 주요한 표적이 된다. 인테그린은 세포막을 관통하는 막 단백질로서, 이종이량체(heterodimers)이며, 일부가 8β-사슬과 조합되어 있는 14α-사슬에 의하여 결합의 특이성이 나타난다. 인테그린은, β1, β2, β3 또는 αV사슬을 포함하고 있는, 상호 오버랩되는 4개의 아군(subfamily)으로 분류되며, 하나의 세포가 각 아군에서 분화된 다른 몇 가지의 인테그린을 발현할 수 있다. 지난 십년간의 연구 결과 인테그린이 세포 부착에 관여하는 주요한 수용체인 것으로 밝혀졌다. 예컨대, 이. 루오슬라티(J. Clin. Invest., 1991, 87) 및 알. 오. 하이네즈(Cell, 1992, 69)등이 인테그린에 관하여 연구하여 보고한 바 있으며, 이는 치료 목적의 저해 과정에서 적절한 표적이 될 수 있다.

적혈구를 제외한 사람의 모든 세포는 하나 이상의 인테그린을 발현하고 있다. 이의 기능은 다양한 수준에서 조절되지만, 일차적으로 이의 리간드 특이성은 이종이량체 상태에서 어떤 α-사슬이 어떤 β-사슬과 결합하는가에 의하여 그리고, 인테그린의 활성상태(Hynes, 1992; Diamond and Springer, 1994)에 따라 좌우된다. 인테그린이 작용하는 세포의 환경(Chan and Hemler, 1993)과 사용되는 인테그린 슬라이스-변형체의 형태(Delwel et al., 1993)도 특이성에 영향을 미친다. 이러한 복잡성 때문에 인테그린 특이성에 관한 믿을 만한 몇가지 지표 중의 하나는, 인테그린의 기능을 직접적으로 교란하고 그에 의하여 영향을 받는 세포 반응을 분석하는 것이다. 인테그린 연구에서 인테그린의 기능을 특이적으로 차단하는 시약이 기능 분석에 있어 결정적인 역할을 하였으며, 인테그린 β1-사슬을 결정하는 데에 이용되었던 CSAT-항체 차단 기능으로 부터 다른 여러가지 생리학적으로 주요한 예[eg. P1D6, P1B5(Wayner and Carter, 1987), P4C10(Carter et al., 1990), AIIB2(Hall et al., 1990), 3A3(Turner et al., 1989) GOH3(Sonnenberg et al., 1987) 및 LM609(Cheresh and Spiro, 1987)]들이 있다; 이 분야는 전적으로 그러한 시약들에 의존한다.

αV-계열의 인테그린은 종래의 전통적인 기능외에 신규한 기능을 가진 주요 아군인 것으로 보인다. αV-인테그린은 세포 부착 및 확산의 기본적인 기능을 매개할 뿐만 아니라(Pytela et al., 1985; Cheresh, 1991), 세포의 이동(Seftor et al., 1992), 수용체의 함입(Panetti and Mckeown Longo, 1993a; Panetti and Mckeown Longo, 1993b)에 관여하고, 바이러스 공-수용체로서(Wickham et al., 1993), 세포외 프로테아제 증폭반응(cascade) 조절에(de Boer et al., 1993), 그리고 종양 성장의 조절제로서(Felding-Habermann et al., 1992) 여러가지 기능에 관여한다. 공지의 5가지 αV-계열 인테그린, 즉 αVβ1 (Zhang et al., 1993), -β3 (Pytela et al., 1985; Cheresh et al., 1987), -β5 (Cheresh et al., 1989), -β6 (Busk et al., 1992) 및 -β8 (Moyle et al., 1991)의 특이성은 일부 확인되었다. 이들은 RGD-(NH₂-arginine-glycine-aspartic acid-COOH) 트리펩티드 서열을 포함하고 있는 리간드, 예컨대 비트로넥틴( αVβ1, αVβ3, αβ5), 피브로넥틴( αVβ1, αVβ3, αVβ5, αVβ6) 그리고, 본 월레브란드 인자, 피브리노겐 및 오스테오폰틴(αVβ3) (e.g. 1991; Busk et al., 1992; Zhang et al., 1993; Denhardt and Guo, 1993; Smith and Cheresh, 1990) 등을 예외없이 인식하는 것으로 보인다. 상호 관련된 특이성을 가지는 이량체들이 동일한 세포에 함께 발현하여(e.g. M21 세포상에 비트로넥틴을 인식하는 αVβ3 및 αVβ5) (Wayner et al., 1991), 상호 무관한 기능을 조절할 수 있다. 그러나, αV-군내에서, 및 αV-계열 인테그린과 β1-계열 인테그린 간에서 리간드 특이성이 겹쳐 나타나는 것은 일정한 세포 환경에서 하나의 기능을 하나의 수용체에 할당하는 것은 문제의 소지가 있다는 것을 의미한다. 항체를 차단하는 기능은 αVβ3(Cheresh and Spiro, 1987; Chuntharapai et al., 1993) 및 αVβ5(Wayner et al., 1991)의 기능을 구분하는 데에 매우 중요하다. 그러나, 다른 αV-인테그린에 대해서는, 복합체를 특정하고 기능을 저해하는 항체가 밝혀지지 않았다. 특히, 복합체 중 αV-사슬을 특정하고 전체 인테그린 군의 기능을 저해하는 시약은 거의 없다. 레흐만 등(Lehman et al., 1994)은 αVβx 항체를 발견하여 공개한 바 있으나, 이는 세포 매트릭스 상호작용을 반전시키거나 종양성장을 차단하는 활성을 보이지는 않는다.

따라서, 종양의 성장에 있어서 αV-계열 인테그린의 기능은 관심의 대상이 되고 있다. 사람의 악성 흑색종은 발병률이 높아지고 있는 무서운 피부암이다. 흑색종의 발병 과정에서, α2β1 인테그린(Danen et al., 1993; Etoh et al., 1992), α3β1 인테그린(Natali et al., 1993; Yoshinaga et al., 1993), α4β1 인테그린(Hart et al., 1991) 및 α6β1 인테그린(Hart et al., 1991)의 농도가 높아지는 것으로 나타나지만, 가장 일관된 관련성을 보이고 있는 것은 αV-계열의 인테그린이다. 특히, 일차 종양으로부터의 침투 및 원거리 전이시에는 "비트로넥틴 수용체"인 αVβ3 인테그린의 발현률이 높아지는 것이 조직학적 특징이다. 비침투적인 일차 종양이나 비악성의 멜라노 네비(melanotic nevi)의 경우 αVβ3 인테그린이 거의 검출되지 않으며, 동 수용체는 건강한 성인의 조직에서는 거의 존재하지 않는다(Brooks et al., 1994; Buck et al., 1990; Pignatelli et al., 1992; Lessey et al., 1992; Korhonen et al., 1991; Nesbitt et al., 1993). 단계적인 종양 및 전이의 면역조직화학(immunohistochemistry)적 연구에 의하면, 침투단계에 있어서 αVβ3의 점진적인 증가 현상이 나타나며(Albelda et al., 1990; Si and Hersey, 1994), 흑색종 세포주을 스크린해 보면 αV-계열의 인테그린의 발현이 일괄적으로 증가되는 것으로 나타나고(Sanders et al., 1992; Gehlsen et al., 1992; Marshall et al., 1991), 또한 종양의 맥관형성기 동안 자라나고 있는 모세 혈관이 αVβ3를 발현한다(Brooks et al., 1994).

한편, in vivo 실험에서도 흑색종의 성장에 αVβ3 가 관여하는 것으로 나타났다. 쥐의 B16-F10 흑색종 계에서의 실험적 폐 전이(experimental lung metastasis)가 αV-인테그린 기능의 단백질 차단제인 RGD-펩티드(Hardan et al., 1993; Humphries et al., 1986)를 고 농도로 처리하여 억제되었다. 최근, 휄딩-하버만(Felding Habermann)과 그의 동료들은, 면역 결핍 쥐의 피하에서 M21사람 흑색종이 성장하는 것을 αV-계열의 인테그린이 촉진하는 것을 증명하였다. 상기 M21 실험계는 매우 유용하며, 서로 다른 αV-계열의 인테그린을 발현하는 한 무리의 세포로 구성되어 있다(Kieffer et al., 1991; Felding-Habermann et al., 1992; Cheresh and Spiro, 1987). 모체 M21은 αVβ3 및 αVβ5를 발현한다(Wayner et al., 1991); 이것은 비트로넥틴에 부착되어 피하 종양으로 성장한다. M21의 체세포 변형체인 M21-L에서는 αV가 거의 감지되지 않는다(Cheresh and Spiro, 1987): 이는 비트로넥틴과 결합하지 않으며, 서서히 성장하는 종양을 일으킨다. M21-L4는 M21-L의 복제체(transfectant)로서, 전체 αV-사슬을 안정하게 재발현한다; 이는 비트로넥틴에 결합하고 피하 종양으로서 빠르게 성장한다(Felding-Habermann et al., 1992). 따라서, 세포 표면의 αV-인테그린의 존재는 M21의 피하 성장과 정비례 관계에 있다.

그러나, 변형주인 M21-L 및 M21-L4를 성립시키는 과정에서 M21은 매우 까다로운 선별 과정을 거치게 된다. 본 발명에 의하면, 본래의 M21 세포들 상에서의 αV-인테그린의 기능이 차단될 수 있으며, 세포의 거동이나 종양의 성장에 놀랄만한 영향을 미칠수 있다는 것도 발견되었다. 펩타이드성 길항제는 합성이 용이하지만, in vivo에서 이들의 생물학적 이용가능성이 낮고, 반감기가 짧으며 동물의 체내에서 빠르게 배설되므로(Humphries et al., 1988) 이의 사용에는 제약이 따른다. 공통 유전형의 항체는 펩티드를 대신할 매우 흥미있는 대체물이 된다. 이들은 in vivo에서 반감기가 길고(Tao and Morrison, 1989; Haba et al., 1985) 표준화된 기술에 의해서 결합의 특이성이 용이하게 증명된다. LM142와 같이 αV-특이적인 우수한 항체가 있기는 하지만(Cheresh and Spiro, 1987), αV-인테그린의 기능을 효율적으로 차단할 수 있는 것은 거의 없다.

αV-군에 속하는 멤버들의 특이성 및 생물학적 기능에 대해서는 논란이 많은데, 전체 클래스의 기능을 마비시킬 수 있는 시약이 아직 존재하지 않고, αV-차단용의 강력한 항체가 존재하지 않기 때문이다. 전통적인 부착 수용체인 인테그린 군들이 다소 전통적이지 못한 다른 생물학적 기능을 지원한다는 사실이 밝혀져 이의 분자 작용 기전을 찾아내기 위한 연구가 활기를 띠게 되었다. 그 결과 이들의 활성을 알로스테릭한 방법으로 보고하거나 결찰(ligate)시 인테그린 자체의 기능을 활성화 시킬 수 있는 예상치 못했던 인테그린 내의 몇가지 영역을 발견해 내었다. 한편, 인테그린 기능의 저해제는 일반적으로 활성 부위를 폐색하며, 그 전형적인 예로는 다양한 αV-계열과 α5β1 인테그린 리간드의 인테그린 인식부위를 복제하고 있는 RGD-펩티드를 들 수 있다.

본 발명은 사람의 αV-인테그린 사슬에 대한 차단 기능을 나타내는 신규한 항체를 제공하며, 동 항체는 17E6으로 명명된 것이다. 많은 보고에 의하면 αVβ3와 이의 리간드, 예를들면 비트로넥틴 간의 상호작용을 비가역적인 것으로 보고하고 있다. 본 발명에 의하면 상기 17E6이 αV-계열의 인테그린과 이의 기질과의, 소위 비가역적이라고 생각했던 상호작용의 역반응을 일으키는 것으로 나타나, 이의 치료학적으로 응용가능성을 시사하고 있다. 본 발명은 17E6의 작용기전을 분석하여, 동 항체는 리간드가 αVβ3에 결합하는 과정에서 거의 경쟁적 저해제로 작용하지 않지만, 비트로넥틴과 RGD-에 기초한 활성부위 탐침은 수용체에 대하여 상호 강하게 경쟁한다. 다른 항체들은 17E6와 강하게 경쟁한다. 따라서, 17E6는 알로스테릭 저해제로 작용한다. 교차-결합 실험 결과, αVβ1 또는 αVβ5는 그렇지 않지만, αVβ3는 17E6가 저해작용을 나타내기 위하여 사전에 이량체화 되어야 하는 것으로 나타났다. 이는 인테그린에 의하여 유도된 신호 전달 체계를 조절하는 새로운 기전에 의해서 17E6이 기능한다는 것을 보여준다. 본 발명에 따른 항체는 종양의 성장을 차단하고 나아가 독성을 나타내지 않는다.

일반설명, 재료, 도면, 표 및 약어:

본 명세서에 언급되어 있는 미생물, 세포주, 플라스미드, 파제미드(phagemids), 촉진제, 내성마커, 복제 시작위치 또는 다른 벡터 단편들은 상업적으로 또는 그외 일반적으로 용이하게 입수할 수 있는 것들이다. 몇가지 경우 직접 입수할 수 없는 것들도 있다. 그런 것들은 본 명세서에서, 본 발명에 따른 목적물질의 성질 및 효과를 증명하기 위한 예로서만 이용된 것이며, 개시가 필수적인 것은 아니다. 이들은 통상 쉽게 입수 가능한 다른 적당한 도구나 생물학적 물질로 대체 가능하다.

모노크로날 항체인 17E6는, 272-17E6로 명명된 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 항체이다. 이 세포주는 DSM ACC2160호로 기탁되어 있다 (기탁기관: Deutsche Sammlung fr Mikroorganismen, Braunschweig, FRG).

본 발명에서 주요한 기법 및 방법은 본 명세서에 상세히 기재되어 있다. 본 명세서에 상세히 기재되어 있지 않은 기법은 당업자에게 잘 알려진 공지의 표준 방법이거나 인용된 참조 문헌, 특허 출원 및 표준 문헌에 더 상세히 기재되어 있는 것이다.

DNA- 및 아미노산 서열은, 화학적 또는 물리적 처리에 의하여 의도적으로 또는 불규칙하게 변화시켜 얻어지는 돌연변이체 및 변형체와 같은 다소 변형 또는 변화된 서열을 포함한다. 일반적으로, 본 발명에서 기술하고 있는 성질이나 기능을 나타내는 모든 돌연변이체나 변형체가 포함된다.

본 명세서에서 항체는 통상 Fab', F(ab')2 또는 단일 사슬 Fvs와 같은 항체의 단편도 포함하는 것으로 해석한다. 이러한 항체 단편은 일반적인 표준 기법에 의하여 생성될 수 있다.

약어:

αIIbβ3 인테그린

αvβ1 인테그린

αvβ3 인테그린

αvβ5 인테그린

αvβ6 인테그린

αvβ8 인테그린

10G2 Mab

14.18G2a Mab

14D9.F8 Mab

14E2 Mab

17E6 Mab

20A9 Mab

23G5 Mab

3A3 Mab

9.2.27 Mab

ADCC 항체에 의한 세포독성

(antibody directed cellular cytotoxicity)

AECM 항체 및 효능세포 의존적인 세포성 색전

(antibody and effector cell dependent cytostatis)

AIIB2 Mab

AP3 Mab

ATCC 미국 형 배지 콜렉션

(American Type Culture Collection)

B16F10 세포주

CP8 Mab

CSAT Mab

cRGDfV 환상의 펩티드(Arg-Gly-Asp-DPhe-Val)

cRGDfK 환상의 펩티드(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)

EMM31 세포주

GOH3 Mab

GRGDSPK 펩티드(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys)

LM142 Mab

LM609 Mab

M21 세포주

M21-L 세포주

M21-L-IIb 세포주

M21-L4 세포주

MAb 모노크로날 항체

MTT 3-(4-5-디메틸티아졸-2-일)-2-5-디페닐테트라졸리움 브로마이드

NBT-BCIP 니트로 블루 테트라졸리움-브로모클로로인돌릴 포스페이트

NP18 세포주

OG 옥틸-글루코사이드-(계면활성제)

P1D6 Mab

P1H6 Mab

P4C10 Mab

P5H9 Mab

PMSF 페닐-메틸-술포닐-플루오라이드

RGD 펩티드: NH2-아르기닌-글리신-아스파르트산-COOH

SDS-PAGE 소디움-도데실-설페이트 폴리아크릴아마이드겔 전기영동

UCLAP-3 세포주

WM164 세포주

WM793 세포주

V+B2 세포주

표 1

항체들을 ELISA 및 세포 ELISA 방법으로 비교하였다. 시약과 특이성은 본문에서 상세히 기재한다. + = 양성반응, - = 반응 없음.

주요용어- 항체: 본 연구에서 특정된 항체들(bold), 표준 시약(italicized) - 이뮤노젠: αVβ3= 고정된 사람의 태반 인테그린 αVβ3. M21=완전한 M21 세포 - ELISA를 실시하기 위하여 정제된 αVβ3 및 αIlbβ3를 96-웰 플레이트에 고정하였다 - M21, M21-L 및 M21-L-Ilb 그리고 UCLAP3 세포주을 플레이트에서 성장 고정시키고, CELISA상에서 항체의 활성을 시험하였다. -특이성: (본문참조) αV=포유동물 인테그린의 αV-사슬 200 KDa= 흑색종 세포 표면에 존재하는 200,000 MW의 미지단백질. αVβ5=인테그린 αVβ5. β1=인테그린 β1 사슬. β3=인테그린 β3 사슬.

표 2

대조구(이차 항체만 사용)와 반응성을 비교하여 다음과 같이 등급을 매겼다. 1-2(-), 2-4(+), 4-9(++), >9(+++) 예를들어, M21 상에서, 대조군의 상대적인 형광 강도는 통상 30-50 단위이고, LM142 결합의 형광 강도는 300-500 단위정도 이므로 비반응성은 약 10 (400/40) 정도이다.

(*) M21-L은 -20℃에서 70% 에탄올로 처리하여 투과 가능하도록 함.

(@) M21-L 은 VNR 인테그린의 β3 사슬의 세포내 풀(pool)을 보유함.

표 3

트립신/EDTA로 M21 및 M21-L 세포를 수확하여, 17E6 항체 또는 대조군의 항체와 배양한 후, 세척하고 누드 마우스의 꼬리정맥에 주사하였다. 7 주 경과후 시험 동물을 치사시키고, 폐의 종양 병소를 관찰하였다. 17E6를 전처리한 경우, 병소 발생부의 수가 줄었다. M21-L 세포(세포 표면에 αV 결핍)를 주사한 경우 병소 발생 숫자는 이와 거의 비슷하였다.

*=대조군에 대한 비교: 항체 비-의존적

제 1 도

사람의 흑색종 세포 M21 및 M21L의 알파-V 그룹의 항체와 대조군에 대한, 형광 활성된 세포 분류기[Fluorescence Activated Cell Sorter: FACS]를 이용한 분석.

세포를 10 ㎍㎖^-1의 일차 항원과 배양하고, 형광 라벨된 이차 항체로 염색한 후 프로피디움 요오드로 대조 염색하여 괴사 세포를 제거한(gating) 다음, 샘플당 10,000 개의 세포를 분석하였다. 흰색(open) 피크는 2차층 항체의 강도만을 나타내고, 흑색(closed) 피크는 일차 및 이차 항체의 강도를 함께 나타낸다. 종축은 채널 당 세포수이고, 횡축은 해당 채널의 형광 강도의 log 값이다. M21은 표면에 αV-인테그린을 보유하고 있으나, M21-L은 그렇지 않다. 알파-V 그룹의 항체에 대한 염색 패턴은 LM142(αV-특이적) 및 LM609(αVβ3-특이적) 염색과 매우 밀접한 관련성을 보인다. 특히, 이들은 M21과 반응하지만, M21-L과는 거의 반응하지 않는다. 항체9.2.27은 표면의 프로테오글리칸과 반응한다. 14E2 및 21H6은 달리 정의 되어 있지 않은 200KDa 흑색종 표면 단백질을 인식한다. 이들의 염색 패턴은 알파-V 그룹의 염색 패턴과 구별된다. 특히, 이들은 M21 및 M21-L 양자 모두와 유사하게 반응한다.

제 2 도

알파-V 그룹의 항체는 유사한 단백질들을 면역침강 시킨다.

살아있는 M21 흑색종 세포(A)의 표면을 비오틴으로 라벨한 후, 계면활성제로 추출하고, 면역 침강 시킨 후 비환원성 7.5% SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 표준 물질이 a 레인에서 전개되어 있으며, 좌측에 KDa 단위의 무게를 표시하였다. 대조 항체 LM142(항-αV: a 레인), LM609(항-αVβ3: b 레인), 21H6(c 레인), 10G2(d 레인), 20A9(e 레인), 23G5(f 레인), 17E6(g 레인), 14D9(h 레인) 및 14E2(i 레인)로 침강시켰다. LM142 및 LM609는 10G2, 20A9, 23G5 및 17E6에 대한 단백질과 유사한 패턴으로 침강하고, 21H6 및 14E2는 ~200KDa에서 하나의 밴드로 침강한다. 14D9는 양쪽의 패턴으로 침강한다. H21 흑색종 세포(B), M21-L αV-결핍 흑색종 세포(C) 및 UCLAP-3 세포(D)의 표면을 비오틴으로 라벨하여 (A)의 경우와 같이 면역침강시켰다. 항체 LM142(항-αV: a 레인), LM609(항-αVβ3: b 레인), 17E6(c 레인), AP3(항-β3: d 레인) 및 20A9(e 레인)로 침강시켰다. 분자량 마커는 a 레인의 좌측 레인에 전개되어 있고, KDa 단위의 분자량이 좌측에 표시되어 있다. αV, β1, β3, β5 밴드의 위치를 표시하였다.

제 3 도

17E6은 비트로넥틴으로의 초기 세포부착을 방해한다.

일련의 흑색종 세포주(Mels.) 및 암종 세포주(Cars.)이 17E6 Mab에 대하여 반응성을 가지는지 FACS에 의하여 스크린하였다. FACS 강도는 표 2에서와 같이 기재하였다. 이어 세포를 17E6(open) 또는 14E2(solid)로 부터 얻어진 하이브리도마 상청액의 존재하에 비트로넥틴으로 코팅된 기질(0.5 ㎍㎖^-1코팅)에 부착되도록 하였다. 세척 후, 상기 사용물질 및 방법에 기재된 바와 같이 부착된 세포 수를 세었다. 항체가 없는 경우의 부착 정도를 기준으로 하여 얻어진 데이타를 표준화 하였다. B16F10(쥐의 흑색종 세포)를 제외하면 모든 세포는 사람으로 부터 유래된 것이다. 말메 3 (MalMe 3)은 섬유아세포주이다. 항체가 없는 경우 부착된 세포의 절대 %는 M21(70%), WM164(68%), A375(75%), EMM31(67%), WM793(65%), MalMe 3(67%), B16F10(70%), UCLA-P3(76%), NP-18(65%), SW1116(68%), HT 29(65%) 이다. 횡축: 대조군에 대한 % 세포 부착도

제 4 도

17E6는 αVβ3 및 αVβ5 인테그린에 의하여 매개되는 부착 현상을 방해한다.

정제된 모노크로날 항체(Mab) 또는 마우스의 복수(腹水)를 함께 배양하면서 비트로넥틴으로 코팅된 기질(5 ㎍㎖^-1)로 세포가 부착되도록 하였다. 세포주 (A, B) M21, (C, D) UCLAP-3; (E, F) WM-793. 각 기호는 다음 항체(특이성)를 각각 나타낸다: ()=17E6(αV), ()=LM609(αVβ3), (◆)=14D9.F8(αV), ()=P4C10(β1),()=P5H9(αVβ5); (▽)=P5H9+LM609 [10 ㎍㎖^-1으로 부터 희석](αVβ3+ αVβ5) 종축: 부착된 세포(%), 횡축: 좌측: Mab(㎍/㎖), 우측: 복수 희석액(1/x).

제 5 도

17E6은 비트로넥틴으로의 부착을 방해하지만, 다른 매트릭스 구성분에 대한 부착은 방해하지 않는다.

비트로넥틴(A), 라미닌(B) 또는 콜라겐 타입 I (C)으로의 세포 부착에 17E6(αV,) 및 P4C10(β1,)이 미치는 영향을 조사하였다. VN으로 코팅된 세포 표면에 대해서만 17E6이 세포 부착을 저해하였다. P4C10은 라미닌 및 콜라겐 타입 I 으로의 세포부착을 저해하였다. 횡축: P4C10 희석액(1/X) (상부축) 및 Mab (㎍/㎖) (하부축); 종축: 결합된 세포의 %.

제 6 도

17E6은 기 생성된 세포-비트로넥틴의 접촉반응을 가역화한다.

24 시간 동안 비트로넥틴(VN-윗줄) 또는 피브로넥틴(FN-아랫줄)로 코팅된 표면에 M21 흑색종 세포가 부착될 수 있도록 방치하였다. 세포들은 30분 내에 부착하며, 잘 확산되어, 17E6이 배양액에 첨가되는(b, f) 24 시간 까지(a, e) 증식한다. 30 분 후 비트로넥틴(b) 세포는 둥글게 되지만, 피브로넥틴(f)은 확산된 상태로 남아있다. LM609(c, g) 및 14E2(d, h)는 양쪽 기질에 모두 거의 영향을 미치지 않았다. 항체 농도: -(b): 0.1 ㎍㎖^-1. (c, d, f, h): 100 ㎍㎖^-1.

제 7 도

BALB/c 누드 마우스에서 사람 M21 흑색종의 성장은 αV-인테그린에 의하여 조절된다. A,B. 17E6가 M21의 피하 성장에 미치는 영향. 0.5×10⁶의 M21(A.) 또는 M21-L(B)를 완충액(), 17E6() 또는 14E2(△)와 함께 배양한 후, 누드 마우스에 피하 주사하였다. 시간 경과에 따른 종양 면적을 측정하여 그 양을 플롯하였다. 전형적인 실험 (결과가) 나타난다. 오차 막대는 그룹당 8마리의 동물로부터 얻어진 s.e.m을 나타낸다. 종축: 종양부피(㎣), 횡축: 주사후 경과 시일.

C. αV가 M21의 실험적 전이에 미치는 영향

0.32×10⁶(◆,) 또는 1×10⁶(◇,)의 M21(◆, ◇) 또는 M21L(,)세포를 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 일정한 시간에 동물군을 치사시키고, 폐에서 종양혹을 조사하였다. 모든 M21 마우스는 42일 째에 치사시켰다. M21-L 마우스의 경우 각 시간대 별로 치사시켰다. 6주 경과후 M21 마우스에서는 종양이 헤아리기 어려울 정도로 부하되었으므로(각 폐당 250이상), M21-L 그룹이 42일에 <0.001레벨(**) 또는 <0.02(*) 레벨에서 대조 M21 그룹의 수와 같은 것으로부터 얻어졌다는 가설하에서 T-통계값을 나타내었다. hi 및 1o로 주사한 그룹에서 같은 유의성을 나타낼 경우 하나의 값만 나타내었다. 바는 각 그룹의 평균 종양수이다. 종축 : 전이/폐; 횡축: 주사후 시일 경과

제 8 도

17E6는 세포독성이 없다. A. 17E6가 M21 세포의 증식에 미치는 영향

5×10⁴의 M21를 매체를 수반하고 있는 DMEM/FCS, (0), 또는 50㎍㎖^-1의 17E6() 또는 14E2()항체의 존재하에 접종하고, 매일 세포수를 세었다. 증식의 속도 및 포화 밀도는 항체에 의하여 영향받지 않았다. 종축 세포수; 횡축 : 시일

B. 마이크로 글리알 세포에 의한 17E6 의존적 M21 세포 용해(lysis)

티미딘 라벨된 M21 세포를 BABL/c-유래의 마이크로 글리알 뇌 마크로파지와 혼합한 후, 계열 희석한 항체를 첨가하고 배양하여 티미딘 유리도를 측정하였다. 대조군: (△) M21세포; (◆) M21 + 17E6 (100nM), (◇) M21 + 14.18 G2a; () M21 +마이크로글리아 평균±s.d. (n=6) 실험 : () M21 +마이크로글리아 + 17E6; () M21 + 마이크로글리아 + 14.18 G2a, 17E6은 항체의존적인 세포 용해를 일으키지 않았다. 평균±s.d. (n=3). 종축 : 세포독성(%); 횡축: 항체 농도(M).

C. 마이크로글리알 세포에 의한 17E6-의존적인 M21 세포색전증

M21 세포를 마이크로글리알 세포 및 계열 희석된 항체와 배양한 후, [H³]-티미딘 펄스를 가하여 DNA 합성도를 측정하였다. 티미딘의 삽입도 ([H³]-thy]를 측정하였다. B.에서 효과세포만 있는 경우의 세포색전 효과() 참고. 이 검정을 현미경으로 관찰하면 10^-10M 이상의 14.18 G2a가 있는 균질한 마이크로 글리알 세포 영역에서는 M21세포가 전혀 생존하지 못함을 확인할 수 있다. 종축 : [H^3-]- 티미딘 삽입도(cmp×10^-3); 횡축 : 항체 농도(M).

제 9 도

17E6는 M21 세포의 DNA 합성에 영향을 주지 않는다.

세포주(A) M21; (B) M21-L; (C) M21-L4; (D) M21-LGpllb를 배양한 후, 완충액(), 또는 항체 17E6(), LM609() 또는 14E2(△)를 일정 농도로 가하였다. (B) 및 (D)에서는, 일반적인 양성 대조군인 탁솔(◇)을 나타내었다. 48시간 경과후 세포에 [H³]-티미딘 펄스를 가한 후 삽입되어 나타나는 방사능을 측정하였다. 항체는 DNA 합성에 전혀 영향을 주지 않았다. 탁솔은 완전히 억제시켰다. 참고. 제 8도: 90㎍㎖^-1Mab = 600nM 종축 : [H³]-티미딘 삽입도(cpm×10^-3); 횡축 : Mab 농도(㎍/㎖).

제 10 도

정제된 αVβ3에 대한 17E6 및 단편의 ELISA 검정. 일정한 농도의 17E6(△), 이의 F(ab')₂() 단편 또는 F(ab')() 단편이, 1mg㎖^-1의 αVβ3로 코팅된 플레이트에 결합될 수 있도록 방치한 후, 결합된 항체를 검출하였다. 종축 : 450nm에서의 광학밀도(OD); 횡축 : 항체(log₁₀㎍/㎖)

제 11 도

αVβ1 및 αVβ5(αVβ3는 제외)에 의하여 매개되는 세포 부착은 17E6 F(ab')에 의하여 차단된다. 일정한 농도의 17E6, 이의 F(ab')₂단편 및 F(ab') 단편의 존재하에, 세포들이 5mg㎖^-1의 비트로넥틴 코팅에 부착되도록 하였다. 100% 부착도는 첨가한 세포의 ~85%(WM164) 내지 ~50%(V+B2)로 변하였다. 종축 : 최대 세포 부착도(%); 횡축 : 항체 농도(㎍/㎖)

제 12 도

교차 결합 17E6 F(ab')에 의하여 비트로넥틴에 대한 M21의 부착이 차단된다. (제 4도 및 11도에서와 같이) 비트로넥틴에 M21 세포가 결합하는 동안, 17E6F(ab') 단편 또는 완전한 AP3 항체를 0(○),0.1(▽), 1.0(), 또는 10㎍㎕^-1(△) 농도로 가하여 정해진 농도의 교차 결합 항-마우스 이차층 항체와 함께 배양하였다. 교차 결합체는 17E6F(ab')와 AP3에 대하여 동일한 ELISA 친화성을 가진다(표시하지 않음). 종축 : 405nm에서의 광학 밀도(OD); 횡축 염소의 항 마우스 항체의 농도(㎍/㎖).

제 13 도

직접 경쟁 검정 시험에서 리간드 활성부위 모방체와 비트로넥틴은 αVβ3와의 결합시 상호 경쟁한다. αVβ3로 라벨된 플레이트 상에서 비트로넥틴(▽), 또는 펩티드 GRGDSPK(,) 또는 cRGDfV(◆,◇)의 농도를 증가시키면서 비오틴으로 라벨된 비트로넥틴(1㎍㎖^-1≡1.5nM) 또는 비오틴으로 라벨된 cRGDfV 유도체(cRGDfK-bio; 50nM)과 함께 배양하였다. 결합된 비오틴은 항-비오틴 항체로 검출하였다. 도면은 일가의 다량체 비트로넥틴의 평균 Mr을 0.65MDa로 가정하였다. 종축 : 결합된리간드 %: 횡축: 펩티드 /VN (log[(μM)]).

제 14 도

직접 경쟁 검정시험에서, 17E6는 αVβ3와의 결합시 비트로넥틴과 경쟁하지 않는다. αVβ3 코팅된 플레이트상에서 17E6(), 다른 항-αVβ3 항체(, ◇, ▽, △) 또는 cRGOfV 리간드 모방체(◆)의 농도를 증가시켜가며 비오틴으로 라벨된 비트로넥틴(1㎍㎖^-1)과 함께 배양하였다. 항-비오틴 항체로 결합된 비오틴을 검출하였다. (cf: 동일한 αVβ3 코팅 조건하에서 17E6에 대한 포화 곡선: 제 10도). 종축: 결합된 VN%; 횡축: [Mab]㎍㎖-[cRGD]μM.

제 15 도

전 처리에 의하여 차단된 경쟁시험에서 리간드와 활성부위 모방체는 αVβ3에 결합시 항체와 경쟁하지 않는다. 비트로넥틴(VN,), 피브로겐(FG, ▽), 피브로넥틴(FN,), cRGDfV(66203,) 또는 다른 정해진 항체(◆)의 농도를 증가시켜가며 αVβ3-코팅된 플레이트 상에서 1시간 정도 전 배양한 후, (세척 없이) 비오틴으로 라벨된 항체(1㎍㎖^-1)를 첨가하여 조사하였다. 결합된 비오틴을 검출하였다. 100%의 항체 결합도라는 값은, 전기 방해물질이 존재하는 경우의 항체 결합이, 저해제가 없는 경우의 대조군에서의 결합과 같다는 것을 의미한다. 리간드는 항체 결합에 영향을 주지 않는다. 종축: 결합된 탐침 항체의 %; 횡축(좌우측) : 리간드 농도(㎍/㎖).

제 16 도

전처리에 의하여 차단된 경쟁시험에서 αVβ3 결합시 항체들은 상호 경쟁한다. 항체 17E6(), LM609(▽), AP3() 또는 14D9.F8(△)의 농도를 정해진 대로 증가시켜가며 αVβ3-코팅된 플레이트 상에서 1시간동안 전배양한 후, 각 판넬에 나타낸 바와 같이 (세척없이) 비오틴으로 라벨된 항체(1㎍㎖^-1)를 첨가하여 탐침 조사하였다. 결합된 비오틴을 검출하였다. 100%의 항체 결합도는, 전기 방해 물질이 존재하는 경우의 항체 결합이, 저해제가 없는 경우 대조군에서의 결합과 같다는 것을 의미한다. 교차 경쟁 그룹에서 항체들은 상호 경쟁한다. 종축: 결합된 탐침 항체%; 횡축(좌우측): 항체 농도(㎍/㎖).

제 17a,b 도

Mab 17E6 가변(Fv)부의 cDNA 서열

경쇄(light chain) VL 17E6 (a) 및 중쇄(heavy chain) VH 17E6(b). 가변부(variable region)의 완전한 핵산 서열 및 연역한 아미노산 서열(리더 서열 포함)을 나타내었다. 리더 서열은 굵은 문자로 표시; CDR 서열은 이탤릭체로 표시, 카벳분류(Kabat classification)에 의하면, 중쇄는 그룹 ⅡB의 특징적 구조를, 경쇄는 카파(kappa) 그룹 V의 구조를 가진다.

제 18 도 :클로닝 과정의 도해

17E6 항체의 중쇄 및 경쇄의 Fv영역을 암호화하고 있는 mRNA를 17E6 하이브리도마 세포로부터 추출하고, cDNA로 전사하여, PCR에 의하여 가변부를 증폭시켰다. 이를 클로닝하여 서열을 조사하였다.

인테그린의 αV-사슬과 반응하는 알파-V 그룹의 모노크로날 항체

정제된 αVβ3 및 aIIbβ3 상에서의 ELISA 기법에 의하여 항체를 스크린하여, αVβ3와 특이적으로 반응하는 17E6, 20A9, 23G5, 14D9.F8, 10G2의 5개의 클론을 찾아내었다(표 1). 이러한 Mab들을 "알파-V 그룹" 이라 한다. 이들은 모두 IgG1 이소타입이다. 동일한 ELISA 기법에 의하여 검정시, αVβ3 복합체(LM609), αV사슬(LM142), αVβ5 복합체(P5H9), αIIbβ3 복합체(CP8), β3 사슬(AP3) 및 β1 사슬(P4C10)에 대하여 특이성을 가지는 기지의 항-인테그린 항체들은 문헌에서 예측되는 바와 같이 반응하였다(표 1). αVβ3 및 αVβ5(M21) 모두 발현하고 있는 세포, αVβ3 없이 αVβ5만을 발현하고 있는 세포(UCLAP3), αVβ3 및 αVβ5를 모두 발현하지 않는 세포(M21-L), αIIbβ3를 발현하고 있는 세포(M21-L-IIb)들을 고정시켜 실시한 ELISA 검정("CELISA")에서, 알파-V 그룹은 αV-인테그린 사슬을 인식하는 일정한 반응 패턴을 보였고, 이는 β3, β5, β1 또는 다른 α-사슬과의 반응과는 구별된다(표 1). 이 결과는 정제된 수용체를 이용한 ELISA 시험에서 얻어진 데이타를 더욱 뒷받침한다. β3 및 GPIIb에 대하여 특이성을 가지는 Mab도 스크린하여 얻을 수 있으며(데이타 표시 안함), 이들은 알파-V 그룹과는 완전히 구별되는 방식으로 반응한다. 17E6, 14D9.F8, 20A9 및 23G5는 αVβ3 결합에 대하여 유사한 겉보기 친화도를 가진다. 약 10∼20ng ml^-1(~50-100pM-LM609에 유사) 정도의 농도에서 50%가 결합한다. 10G2은 약 10배 낮은 친화도로 LM142에 유사하게 결합한다. CP8은 αⅡbβ3 및 14E2에 대하여 (하기 참조) 100 nM 이하의 농도에서 αVβ3에 대한 최소 결합을 보인다.

알파-V 그룹이 자연의 αV-인테그린을 인식하는 능력을 FACS(제 1도: 표 2) 및 표면 라벨된 세포로부터의 면역침강법(제 2도)에 의하여 시험하였다. FACS 분석에서(제 1도), αV-발현 주(M21)는 17E6, 14D9.F8, 20A9, 23G5, 그리고 αV-결정항체 LM142 및 LM609와 강하게 반응하고, 10G2 및 대조군의 Mabs 14E2, 21H6 그리고 Mab 9.2.27과는 중간 정도로 반응한다. 이와는 대조적으로 αV-결핍 변종(M21-L)은 알파-V그룹 및 LM142, LM609와 약하게 반응하지만, M21과 14E2, 21H6 및 9.2.27과의 반응시와 유사한 반응성을 보인다. M21-L은 세포내에 세포가 투과되었을 때 FACS에 의하여 검출되는 β3 서브유닛의 풀을 보유하고 있다(표 2). M21-L4(αV-로 재복제된 M21-L세포; Felding-Habermann et al., 1992)를 FACS 분석한 결과, 알파-V 그룹이 M21에서와 같은 반응 패턴을 보였다. 대조 백터 복제체 M21-L12와 GpIIb 복제체, M21-L-IIb(Kieffer et al., 1991)는 알파-V 그룹과 반응하지 않았다(표 1). UCLAP-3(adenocarcinoma)는 알파 V그룹, LM142, P5H9과 반응하지만, LM609와는 반응하지 않는다. UCLAP-3는 β3를 발현하고 있지 않다(배경 설명부 참조). 흑색종세포 WH793은 M21과 동일한 반응 패턴을 가진다. M21세포의 면역 침강 스크린에서 알파-V 그룹은 LM142(항-αV) 및 LM609(항 αVβ3)와 같은 면역 침강 패턴을 보인다(제 2a도). 강하고 넓은 밴드가 ~92kDa에서 나타나며, ~100kDa에 희미한 밴드를 동반하여 그보다 희미한 밴드가 ~145kDa에서 나타나고 있어, 표면에 라벨된 αVβ3및 αVβ5의 특징적 패턴이 된다(Wayner et al., 1991). M21-L의 침강 패턴과 비교하여 보면, 알파-V 그룹이 전혀 침강하지 않았으며(17E6 및 20A9을 사용한 경우의 데이타 표시), LM142 또는 LM609의 경우도 마찬가지였다(제 2C 도). β1-특이적인 항체는 양쪽 세포주으로부터 유사한 침강 패턴을 보였다. M21-L에서는 투과된(거의 괴사된) 세포내의 라벨된 β3로 인하여 생기는 항-β3 항체와의 침강이 ~92kDa에서 밴드를 생성한다. UCLAP3(제 2d도)는 LM609와 침강물을 형성하지 않지만 알파-V 그룹 및 LM142에 의하여 형성된 ~95kDa/145kDa의 복합체가 침강한다(제 2d도). 요약하면, ELISA, CELISA, FACS 및 면역학적 침강은 일관된 반응 패턴을 보여, 알파-V 그룹의 Mab들이 사람의 αV-인테그린 사슬의 세포외 영역과 반응함을 강하게 시사하고 있다.

Mab 17E6는 강력한 기능 차단 항체

17E6은 초기에 세포가 αV-리간드에 결합하는 것을 변화시킬 수 있다 : αV-인테그린은 비트로넥틴 수용체로 기능하므로, 비트로넥틴 기질로 세포가 결합하는데 알파 V-그룹이 미치는 영향을 스크린하였다. FACS에 의하여 인테그린을 분석한 후, 세포를 부착검정을 실시하였다(표 2, 제 3도). FACS에서 사람의 흑색종 세포 및 암세포 주은 알파 V-그룹과 유사하게 반응한다. 17E6와의 반응성을 요약하였다(제 3도). FACS에서 17E6의 존재하에 세포의 비트로넥틴 결합은 동 항체에 의하여 강하게 차단되지만, 대조 항체인 14E2에 의해서는 약간만 영향을 받았다(제 3도). 알파 V그룹의 다른 물질들은 활성이 더 적었다(데이타 제시안함). 비트로넥틴에 대한 쥐의 세포 B16F10의 강력한 결합은 17E6에 의하여 영향받지 않으며, FACS에서B16F10은 17E6와 반응하지 않는다. 예상했던 바와 같이(Cheresh and Harper, 1987), 비트로넥틴에 대한 B16F10의 부착 반응은 RGD-펩티드가 마이크로 몰량만 존재하여도 민감하게 영향을 받았으며, 이는 기능적 표면 αVβ3가 존재함을 시사한다(SLG 및 B. Diefenbach). 따라서, 17E6 및 알파-V 그룹은 사람의 αV와는 반응하지만 쥐의 αV와는 반응하지 않는다.

17E6가 세포부착에 미치는 영향을 조사하였다. 17E6은 M21이 비트로넥틴에 결합(∼85%%)하는 것을 차단하며, IC₅₀은 ~0.1㎍㎖^-1이다(제 4a도). 본 발명에 의하여 αVβ3(LM609) 또는 αVβ5(P5H9) 어느 하나에 대한 항체로는 M21의 부착 반응을 거의 차단하지 못하지만, 이를 함께 투입하면 강력하게 차단할 수 있다(제 4a, b도)는 사실을 입증함으로써 과거의 연구결과(Wayner et al., 1991)를 확인하였다. 항-β1 인테그린 항체(P4C10)는 M21이 비트로넥틴에 결합하는데에 영향을 주지 못한다(제 4b도). UCLAP3 및 WM793 주은 비트로넥틴에 결합하고, 이 결합은 17E6에 의하여 차단되며, 또한 상보적인 αVβ5-특이적 항체(P5H9/UCLAP3) 또는 αVβ3-특이적 항체(LM609/WH793)에 의하여도 차단된다(제 4c-f도). αVβ5(UCLAP3)에 대하여 17E6는 ~30ng㎖^-1의 IC₅₀값을 가진다. WM793에 대하여는 ~60ng㎖^-1이고, LM609에서는 ~600ng㎖^-1이다. UCLAP3는 αVβ5를 발현하지만 αVβ3는 발현하지 않고(Wayner et al., 1991), WM793은 αVβ3를 다수 발현한다(표 1). 17E6의 차단 특이성은 다른 매트릭스 기질로의 세포 부착에 영향을 주지 않는 사실에 의하여 증명된다(제 5도). P4C10(항-β1)은 M21이 라미닌 및 콜라겐에 부착하는 것을 완전히 차단한다. 상기 두 기질에 대한 세포 부착은 β1-계열의 인테그린에 의하여 매개된다(Sonnenberg et al., 1988; Takada et al., 1987).

생화학적 결과와 함께 고려해 보면, 이 결과는 17E6가 다양한 인테그린 복합체의 αV사슬과 결합하여 이들의 리간드와의 상호작용을 교란시킨다는 이론과 일치된다.

17E6는 αV-인테그린에 의하여 매개되는 세포 매트릭스 상호작용을 가역화한다:

17E6이 세포 매트릭스 상호작용에 영향을 주는가 여부를 조사하였다.

저농도(~0.1㎍㎖^-1)의 17E6을 M21 세포에 첨가한 경우, 0.5~1h후에 37℃, M21 배지에서 부착 24시간 후에도 세포의 라운딩 현상이 광범위하게 나타났다(제 6도). 이 효과는 완전히 가역적이며, 세척후 48 시간내에 세포는 확산(spread)상태로 복귀한다. 이와는 대조적으로 항체 LM609 및 14E2는 고농도(100㎍㎖^-1)에서도 약간만 형태에 영향을 주었다. 상기 항체는 100㎍㎖^-1에서도 피브로넥틴으로 코팅된 기질에 형태학적인 영향을 주지 않았다(제 6도). M21-L4(및 αV를 통하여 부착되는 다른 세포들)은 비트로넥틴과 관련하여 유사하게 17E6의 영향을 받지만, 피브로넥틴, 콜라겐 또는 라미닌에 대하여는 그렇지 않다.

17E6는 누드 마우스에서 M21 종양 발생을 차단한다: 본 발명에서는 αV 차단 항체인 17E6가 BALB/c nu/nu 마우스에서 M21 피하의 종양발생에 미치는 영향을 조사하였다(제 7도). 동물모델의 경우, 누드 마우스에서의 M21 종양 발생은 세포 표면의 αV-계열 인테그린의 발현과 상관 관계가 있다(배경 설명 참조). M21 세포는 피하로 동시에 주사되며 엔도톡신이 없는 항체이다. 17E6는 일관되게 (4/4 실험) 피하에서의 M21 종양의 발생을 차단하였다(제 7a도). 17E6의 존재하에서는 종양(0/32)이 발생하지 않았으며 6개월이 경과한 후에도 종양의 징후는 없었다. 대조군의 종양 발생은 75~90%이었다. αV-사슬에 대하여 차단 효과가 없는 항체 및 흑색종 세포 표면에 대한 대조 항체는 종양발생에 대하여 불규칙하고 일관되지 못한 효과를 보였다. 14E2를 투여한 대조군에서는 실험에 따라 30-60% 종양의 발생이 줄었지만, 잔존하는 종양은 이를 처리하지 않은 대조군에서와 같이 성장하였고, 이 동물들의 폐를 조직 배양해 보면 대조군에서와 같이 폐에 마이크로-전이부가 존재한다(데이타 제시않음). 이와는 대조적으로, 17E6로 처리한 동물은 6월 경과후에 치사시켜 조사시 피하 종양이나 폐, 간, 신장, 지라, 결장, 위, 흉강, 복강 등에 전이가 일어나지 않았다. αVβ3-결핍주인 M21-L의 경우 M21에 비해 매우 느리게 피하에서 성장하지만 17E6에 의해서는 영향 받지 않았다. 14E2로 처리한 M21-L 대조군은 무처리 동물에 비하여는 발생이 적고 M21 세포의 경우와 유사하였다(제 7b도).

M21 및 M21-L의 성장 그리고 17E6의 영향을, 꼬리정맥 주사모델에 의한 "실험적 전이"에 의하여 비교하였다. M21은 용량 의존적으로 많은 군락을 형성하였지만, M21-L은 유의성있게 적은 정도로 군락을 형성하였고 고용량 주사시 폐에 결절을 형성하였다(제 7c도). 즉, 폐에서의 종양의 성장은 세포표면에 αV-인테그린이존재할 경우 강화되고, 17E6와 M21을 사전 배양할 경우 형성되는 종양 군락의 수는 감소(90%)한다. 특히, 종양 형성 정도는 동일한 실험에서 M21-L 세포가 형성하는 정도와 유사하였다. 항체는 종양이 성장하고 있는 동물의 수에 영향을 주지 않았다(표 3).

요약하면, 세포 표면의 αV의 존재는 피하에서 그리고 실험적 전이 모델에서 M21 종양의 형성을 촉진하며, αV- 차단 및 가역화 항체인 17E6는 M21의 성장을 현저하게 억제한다. M21 세포를 사용한 실험적 전이 모델에서, M21의 왕성한 성장 및 M21-L의 저조한 성장은 피하 종양 성장의 패턴을 따르고, M21의 성장은 17E6 전처리에 의하여 억제된다. 이 데이타는 αV-인테그린과 사람의 흑색종의 발생과의 관련성을 강력하게 확인시켜 준다.

세포독성과 무관한 17E6의 효과: 부착 작용, 형태 및 종양 발생에 대한 강력한 효과를 관찰한 후, 17E6의 작용기전을 규명하려 하였다. 17E6의 세포독성에 대하여 실험하였다(제 8도). 세포성장의 속도 및 최종 포화 밀도는 17E6나 대조 항체의 존재에 크게 영향 받지 않았다(제 8a도).

누드 마우스는 면역 결핍 마우스이다. 남아 있는 극소수의 면역기능 세포 중 마이크로파지가 항체에 의하여 매개되는 세포 독성반응을 일으킬 가능성이 크다. 항체들이 세포의 세포독성을 일으키는지 (ADCC) 조사하기 위하여, 항체에 동일한 유전자형을 가지는 쥐 마크로파지를 이용하여 M21세포에 대하여 ADCC시험하였다. 효능 세포로서 쥐뇌의 마크로파지(마이크로 글리아; microglia)는 ADCC의 강력한매개체이다(Sutter et al., 1991). 양성 대조군인 Mab14,18 G2a는 <10^-9M에서 M21의 거의 완전한 용해를 일으켰으나, 17E6의 경우 10^-7M까지 ADCC 반응을 매개하지 않았다(제 8b도).

효능세포의 존재시 17E6가 세포 증식억제를 일으키는지 평가하기 위해서, 항체 존재하에 M21 마이크로 글리알 공배지의 DNA 합성을 측정하였다(제 8C도). 10^-10M에서 14.18 G2a는 [³H]-티미딘의 삽입을 90%이상 억제하였다.

세포증식에 미치는 영향, ADCC 및 AECM을 조사한 후, Mab들에 의하여 M21에서의 DNA 합성 레벨이 영향을 받는지 시험하였다. 17E6, 14E2 및 LM609는 0.5μM의 농도에서 티미딘 삽입에 영향을 주지 않았다(제 9도). M21-L, M21-L4 및 M21-L-IIb 세포에서의 DNA 합성 역시 항체에 의하여 영향받지 않았다. M21-L 및 M21-L-IIb는 17E6, LM609와는 반응하지 않지만 14E2와는 반응한다(제 1도). 다른 흑색종 세포주에 대하여도 실험을 하였지만, 이들의 DNA합성은 알파V-그룹에 의하여 영향을 받지 않았다(데이타 제시않음).

17E6 및 14E2는 IgG1 이소타입으로, 보체에 의하여 매개되는 M21 세포의 용해에 영향을 주지 않는다(데이타 제시않음). 따라서, 17E6의 효과는 αV-인테그린에 특이적으로 나타나며, 다른 세포계에는 주목할만한 독성효과를 보이지 않는다.

αVβ1 및 αVβ5의 경우와 달리 17E6가 αVβ3에 작용하기 위해서는 수용체의 교차-결합이 필요하다: 생체계에서 막을 통한 신호의 전달시에는 수용체가 이량체화 되는 경우가 많다. αVβ3를 다량체화 할 경우 HUVECs에서 이의 인산티로신화 패턴이 변화된다(Bhattacharya et al., 1995). 따라서, 17E6의 작용에서도 수용체의 집합이 관여하는지 조사하였다.

17E6는 세포 인테그린 αVβ3, αVβ5 및 αVβ1을 저해한다(제 4도). 완전한 17E6 및 이의 F(ab')₂및 F(ab') 단편은, 분리된 αVβ3에 대한 ELISA에서 유사한 결합특성을 가지며, ~1ng㎖^-1(~7pM 완전한 Mab)의 농도에서 50%가 포화된다. 유사한 ELISA 적정 곡선은 17E6와 ELISA 플레이트 사이에 일가의 상호작용이 있음을 시사한다. 그러나, 세포부착 검정에서 단편들은 다른 거동을 보인다. F(ah')₂및 완전한 17E6는 αVβ1(V+B2 세포) 및 αVβ5(UCLA-P3 세포)에 의하여 매개되는 세포부착(IC₅₀~0.1㎍㎖^-1: ~700pM)과 αVβ3 부착(WM164 및 M21세포)(IC₅₀~0.5㎍㎖^-1: ~3nM)을 차단하고, F(ab') 단편은 αVβ1 및 αVβ5에 대하여 이량체 항체와 비슷한 활성을 보인다(제 11도). 그러나, F(ab')단편은 αVβ3의 경우보다 αVβ1 및 αVβ5에 대해서 적어도 1×10⁴배 이상 높은 활성을 보이고, αVβ3의 경우 시험 농도 중 가장 고농도(50 ㎍㎖^-1: IC₅₀>>50㎍㎖^-1: >>400nM)에서 25+10% 만을 차단한다-이 농도에서 관련이 없는 항체도 비슷한 정도의 차단 효과를 보이므로(데이타 제시 않음), 이러한 주변 효과는 특이적 활성이 아님을 시사한다.

[17E6 F(ab'): (제 10도)에서와 같이] F(ab')항체 단편의 생물학적 결합 활성 부족은, 항체에 의하여 매개되는 기능을 나타내기 위하여 이량체화가 필요하다는 것을 보여주는 전통적인 지표이다. 17E6가 αVβ3에 작용하기 위하여 교차 결합이 필요하다는 것을 확인하기 위해서, 세포부착 검정시 폴리클로날 항-F(ab') 항체를 가하여 17E6 F(ab')를 교차-결합시켰다. 일차 및 이차 항체 모두가 일정한 임계농도에 있을 때에만, 강력한 세포부착 억제 효과가 나타나는 전통적인 유사 프로존 효과가 관찰된다. 2차층 항체의 양이 많거나 F(ab')만 많은 경우에는 세포부착에 영향을 주지 않는다. 또한, 상기 효과는 교차-결합된 αVβ3 인테그린에 의하여 비특이적으로 나타나는 것이 아니다. αVβ3를 저해효과가 없는 AP3 항체로 교차-결합시킨 경우 세포부착에는 영향을 주지 않았다(제 12도). 교차-결합실험에서 2차 항체를 가한 후 F(ab')의 활성은, αVβ3-매개 부착에 대한 17E6의 IC₅₀과 일치하였다(cf. 제 11도).

따라서, 상기 데이타는 αVβ3 인테그린의 교차 결합이 WM164 및 M21가 동족 리간드에 결합하는 것을 방해하는데 필요하지만, αVβ5 및 αVβ1의 불활성화에는 필요치 않다는 것을 보여준다.

분리된 수용체 검정에서 17E6는 수용체의 기능을 거의 차단하지 못한다: 분리 수용체 검정을 통하여, αVβ3에 대한 17E6 기능의 특유한 성질을 연구하였다. 전통적인 활성부위 차단제와 17E6의 차이를 조사한다. αVβ3에 대한 비트로넥틴의 결합은 ~5㎍㎖^-1에서 포화되고(~10nM: 평균의 비트로넥틴의 크기를 10 모노머로 가정)(제 13도), 이러한 결합은 전통적인 선형 리간드 유사 펩티드(GRGDSPK: IC₅₀~2μM) 및 환상 펩티드(cRGDfV: IC₅₀~5nM)에 의하여 특이적으로 경쟁 저해된다. cRGDfV의 비오틴 라벨 변형체인, cRGDfK-비오틴을 사용하여, 상기 저해제가 비트로넥틴 결합에서 경쟁할 뿐만 아니라, 비트로넥틴이 상기 저해제의 결합에 대하여도 경쟁한다는 사실(제 13도), 즉 계가 대칭적(symmetrical)이라는 사실을 직접적으로 증명할 수 있다. 실제, 경쟁의 IC₅₀은 αVβ3 복합체에 대한 비트로넥틴의 결합 저해 IC₅₀을 반영하고 있다는 점에서(제 13도) 비트로넥틴, GRGDSPK 및 cRGDfV 각각은 이론적으로("rationally"), 대칭적으로(symmetrical) 상호 경쟁한다.

17E6 결합은 0.01~0.1㎍/㎖(700-70pM)의 농도에서 αVβ3를 포화시킨다(cf. 제 10도). 그러나, 이 항체는 리간드 결합에 대하여 약한 저해제이다- 70nM의 농도에서도 이 항체는 비트로넥틴 결합을 30(+10)% 이하로 저해한다. LM609는 유사한 거동을 보이지만, αVβ3-결합-비저해 항체들(14D9.F8, 20A9 및 WAM2-4)은 효과가 없다. 리간드 모방체인 환상의 펩티드 cRGDfV는 수용체-리간드 상호작용을 효과적으로 차단하지만(IC₅₀~10nM)(제 14도), 17E6 결합에는 영향을 주지 않는다. 완전한 17E6 및 일가의 17E6 모두 영향받지 않았다(데이타 제시않음).

17E6는 포화량의 경합 리간드가 존재할 때 αVβ3와 결합한다:

분리 수용체 검정에서 17E6가 리간드에 대하여 약하게 경쟁하는 점 및 cRGDfV와 같은 강한 경쟁적 저해제의 존재는 17E6가 αV-기능에 어떻게 영향을 주는가에 대한 의문을 제기하였다. αVβ3 인테그린에 대한 세포 부착 검정시험에서 17E6 및 이의 단편이 저해 활성을 나타내기 위하여 교차-결합이 필요하나, 이의 거동은 경쟁적 저해의 경우와 완전히 일치하지는 않는다. 따라서, αVβ3의 리간드가 17E6 결합을 직접적으로 방해하는지 조사하였다.

리간드는 수용체에 미리 결합시킨 후 직접 라벨된 17E6를 저농도로 첨가하였다(제 15도). 17E6의 결합은, αVβ3상에 있는 특이적인 결합부위를 포화시키기 위하여 필요한 양의 100배에 해당되는 과량의 고농도 비트로넥틴, 피브로넥틴 또는 피브로겐(모두 αVβ3의 자연 리간드{Cheresh and Spiro, 1987})에 의하여 거의 영향을 받지 않는다(<10% 차단). 이와는 대조적으로, 사전에 결합된 17E6는 후에 첨가되는 라벨된 17E6의 결합에 강력히 경쟁하며(제 15, 16도), αVβ3의 자연 리간드들도 상호 경쟁한다(데이타 제시않음). 이것은 17E6가 αVβ3 활성부에 대하여 비트로넥틴과 경쟁할 것이라는 당초 추정과 다른 것이다. 또한, 환상의 펩티드 cRGDfV와 같은 강력한 활성부위 경쟁제는 200μM에서 17E6 결합에 전혀 영향을 주지 않는 반면, 비트로넥틴이 αVβ3에 결합하는 것은 차단하였다(IC₅₀=2nM; 제 13도).

ELISA 실험결과는 17E6-αVβ3 간의 상호작용이 일가의 상호작용임을 시사하며(제 10도), 이는 리간드의 낮은 친화도와 결합되어 나타내는 항체의 고친화도에 의하여 인공적 경쟁이 관찰될 가능성을 낮추어 준다. 한편, αV 및 β3에 특이적인 다른 항체들을 라벨로 표시하여, 다른 종류의 사전-결합 리간드(제 15도) 및 동일한 항체(제 16도)에 대한 경합성 측정에 사용하였다. 항체들은 상호 경쟁하였으며, 교차 저해 그룹으로 분류된다(제 16도). β3-특이적인 항체, AP3는 동일 항체의 결합에 대하여 경쟁하지만, αVβ3 복합체에 특이적이거나(LM609) αV-사슬에 대해서만 특이적인(17E6, 14D9.F8) 항체들에 영향을 주거나 동 항체들의 영향을 받지 않는다; LM609, 17E6, 14D9.F8은 상호 강하게 경쟁한다. 이와는 대조적으로, 사전에 결합된 리간드들은 17E6의 αVβ3 결합에 영향을 주지 않는다. 따라서, 17E6는 리간드 결합부위에 경쟁적으로 직접 작용하여 기능을 나타내는 것은 아닌 것으로 결론될 수 있다.

17E6 가변부의 클로닝 및 서열연구:

면역 글로불린 가변부를 PCR 증폭시키기 위하여 설계된 프리머 라이브러리(primer library)를 사용하여, 하이브리도마 17E6의 중쇄 및 경쇄부에 대한 면역 글로불린이 많은 cDNA를 클론하였다. 중복되는 가변부 프리머는 리더부의 시작으로 끝난다. 불변부의 역 프리머는 불변부로 30bp 들어간 부분에서 종료된다. 터미널 Sal I이나 XmaI 제한부위에 의하여 이 프리머들을 클로닝 설계한다. 원하는 크기의 PCR 산물[420-450bp (Jones and Bendig, 1991)]을 얻고, 클론하여 서열을 조사한다(제 17도). 17E6 면역 글로불린의 경쇄 가변부, VL17E6는 381bp의 길이이다. 중쇄 가변부, VH17E6는 411bp의 길이이다. 중쇄 가변부 서열은 카벳 그룹 IIb 면역글로불린의 특징을 가지며, 경쇄 서열은 카벳 그룹 V의 특징을 가진다(Kabat et al., 1987). 클론화 기법을 도해하여 나타내었다(제 18도).

종양의 성장 및 전이는 세포가 정상적인 세포성장 및 부착제어를 벗어나, 비정상적인 부위에 침입, 이주, 부착, 성장하는 전통적인 질환이다. 현재는 인테그린이 세포부착 현상을 제어하는 것으로 알려져 있고, 그 결과 성장, 분화, 세포 이동, 프로테아제 망의 활성, 전이 파급 과정에서 반복되는 성장등 기계적으로 서로 얽혀 있는 현상들을 부착에 의하여 조절할 수 있다(Liotta et al., 1991; Stetler Stevenson et al., 1993; Fidler; 1968). 본 발명에서는 사람의 αV-계열 인테그린에 대한 제어 작용을 가지는 물질을 제공하며, 그중의 하나인 17E6는 초기 세포 부착현상을 교란하여 안정한 αV-리간드 상호작용을 와해시키며, in vivo 동물 모델에서 사람의 흑색종의 성장을 방해한다(Fidler, 1986). 생화학적 분석 결과, αV-계열의 항체는 LM 142(사람의 αV에 대한 잘 알려진 항체)와 밀접하게 관련된 반응 패턴을 보이지만, αVβ3-특이적(LM 609), αVβ5-특이적(P5H9)인 반응 패턴이 상이하고, 다른 항-인테그린 항체들과도 다르다. 따라서, 알파-V 그룹 항체들은 사람의 αV-인테그린 사슬을 인식할 가능성이 높다. 17E6 면역글로불린 전사체의 cDNA 클로닝에 의하여 독특하고 뚜렷한 서열을 얻었다. 중쇄 가변부는 카뱃 그룹 Ⅱb 면역 글로불린의 특징을, 경쇄는 카뱃 그룹 V의 특성을 각각 가진다(Kabat et al., 1987). 따라서, 항체는 독특한 특징을 갖는다.

17E6는 αV-매개의 세포 상호작용을 강력하게 교란한다. 기능을 교란시키는 항체들은 인테그린의 기능을 이해하는데 매우 중요한 역할을 하지만, αV-분야에는 종류별로 특이성을 가지며 강력한 차단기능을 나타내는 항체가 드물다. 17E6는 αV-매개의 세포 부착 반응을 IC₅₀~0.3-1nM(항체 MW 150,000)정도의 활성으로 저해한다; 비교해보면, 펩티드 차단제인 GRGDSPK는 IC₅₀이 ~5nM이다. 주로 αVβ3(WM793) 또는 αVβ5(UCLAP3)를 발현하고 있는 세포주은, 주로 αVβ1을 발현하고 있는 세포에서와 같이 17E6에 의하여 차단된다. 따라서, 17E6는 αV-인테그린에 대한 일반적인 저해제이다.

17E6는 초기 αV-인테그린과 리간드가 상호작용하는 것을 저해할 뿐만 아니라 비트로넥틴에 결합된 세포를 빠르게 이탈시키는 등 이미 완료된 상호작용을 역으로 진행시키기도 한다. 종래 αVβ3와 비트로넥틴간의 상호 결합은, 초기 저해 가능한 상호작용 및 뒤이은 안정화 반응의 두 단계로 진행되는 '해리 불가능'한 상호작용으로 기술되었다(Orlando and Cheresh, 1991). 그러나, 17E6는 M21 및 많은 다른 세포(공개되지 않은 관찰 결과)들이 비트로넥틴 기질로부터 완전히 이탈하거나 부분적으로 탈착되도록 한다. 상기 라운딩 현상(rounding)은 항체를 제거하면 다시 역전된다. M21의 초기 비트로넥틴 결합은 17E6에 의하여 불완전하게(~90%) 차단되지만, 라운딩 현상은 거의 모든 부착 세포에 영향을 준다. M21의 초기 비트로넥틴 부착 반응이 항-αVβ3 및 항-αVβ5 항체의 혼합물에 의하여, 그리고 RGDS-펩티드에 의하여 완전히 차단된다는 종래의 연구 결과를 다시 확인할 수 있으며, 이에는 αVβ3 및 αVβ5가 모두 관여한다(Wayner et al., 1991). 본 연구에 의하면, 17E6는 여러 αV-수용체를 차단하며, 이에 의하여 매개되는 안정한 상호작용을 가역화한다. 부착된 또는 부착과정에 있는 M21 세포에 대한 17E6의 활성이 다르게 나타나는 것은 각 상황에 있어서 αVβ3 및 αVβ5의 기능이나 분포가 다르기 때문일 것이다. 부착과정중에서는 양자가 모두 산만하게 분포하지만, 부착된 세포에서는 αVβ3는 중심적인 접촉부에 분포하고 αVβ5는 산만하게 분포한다(Wayner et al., 1991; Zambruno et al., 1993). 17E6가 이들 접촉 과정중 하나만은 선택적으로 교란시키는지 여부도 조사하였다.

누드 마우스에서 M21 종양의 성장은 αV-인테그린에 크게 의존한다(Felding-Habermann et al., 1992; Sander et al., 1992). 17E6가 안정한 αV-리간드 상호작용을 변화시키고 장기적인 효과를 나타내므로, 동 물질이 종양의 발생에 미치는 영향을 조사하였다. 17E6는 누드 마우스에서 피하의 M21 종양이 발생하는 것을 차단하여, 펠딩-하버만 등의 연구를 강력히 뒷받침하였다. 또한, 실험적 폐 전이시 αV는 M21의 성장을 촉진하고 17E6를 저해한다는 것도 증명되었다. 따라서, 본 발명에 의하여 중요한 종래의 연구결과를 독립적으로 확인하였으며, 17E6를 이용한 공동의 항체-매개 "치료법"에 의하여 동 연구를 확대하였다. 이 결과 M21 종양의 발생에 있어서 αV-인테그린의 중요성을 다시 확인하였으며, 종래의 연구 결과가 클로닝의 인공 선택으로 얻어졌을지도 모른다는 가능성을 없앴다.

In vitro에서 17E6의 효과는, 세척후 24시간 이상 지속되었다. 20㎖의 용량을 마우스에 투여한 경우, in vivo 에서 초기 항체 농도는 ~10nM로, 배지에서 세포-리간드 상호작용 가역화하는 IC₅₀양을 10배 초과하는 농도이다. 17E6는 처리동물인 BALB/c nu/nu에 대한 공통 유전자형이며, 쥐의 IgG1의 반감기는 20-200시간이다(Tao and Morrison, 1989; Haba et al., 1985). 따라서, M21-리간드 상호 작용을 역전시키는 IC₅₀을 초과하는 농도가 이 동물 모델에서 적어도 100시간 이상 지속될 수 있다(반감기 5배). 17E6와 RGD-펩티드를 비교해 볼만하다. B16F10-C57bIk6 쥐의 흑색종 모델에서 공동으로 투여된 펩티드가 B16-F10 폐종양의 발생을 억제하였다(Humphries et al., 1993). 17E6에서와 동일한 가정을 해보면, ~100μM RGD-펩티드가 존재하여(Hardan et al., 1993), 비트로넥틴에 대한 세포 부착을 차단하는데 필요한 용량의 약 100 배 정도가 된다. 그러나, RGDS는 혈청중 반감기가 8분이다(Humphries et al., 1988). 일반적인 치료 목적으로 종양의 성장을 억제시키기 위해서는, 반감기가 긴 차단제를 이용하는 것이 바람직하다.

17E6는 어떠한 기전에 의하여 종양의 성장에 영향을 주는 것일까? 이것이 쥐의 세포와는 반응하지 않으므로, 종양 세포에 효과를 미치는 것이고, 종양의 혈관 생성에 대한 항체의 효과도 분명히 제외된다(Brook et al., 1994). 규명된 17E6의 효과는 a) αV-인테그린의 세포외 영역에 결합하고, b) αV-매개의 세포 상호작용을 교란시키는 기능을 가진다는 것이다. 누드 마우스에서 일어날 수 있는 항체 매개의 사멸 현상도 제외되는 것으로 가정할 수 있다. 17E6는 M21 세포의 성장과 생존에 만성적으로나 급성적으로 영향을 주지 않으며, 보체에 의한 고착 반응을 매개하지 않고, DNA 합성에 영향을 주지 않으며, 동종 유전자형의 마크로파지 매개에 의한 세포독성에 관여하지 않는다. M21 세포는 Mab 14.18 G2a의 존재하에 마이크로 글리알 세포에 의하여 효과적으로 사멸되므로 M21세포는 ADCC에 대하여 민감하다. (17E6와 같이) IgG1 Mab's는 쥐의 마크로파지 ADCC를 효율적으로 매개한다(Herlyn et al., 1985). 세포당 발현되어 있는 αVβ3부의 수가 ADCC가 일어나기에 필요한 임계수치 보다 낮을 수 있다. ADCC의 효과는 표적 항체의 밀도와 관련을 가진다(Rodeck et al., 1985). 마크로파지는 다른 골수성 또는 림프구성 효능 세포와는 달리, 세 종류의 Fcγ 수용체를 모두 발현하고 있다. In vivo에서 17E6를 사용하여 관찰된 종양 성장 저해 기전은 ADCC와 일치되지 않는다. 항체는 엔도톡신이 없다. NK-세포가 매개하는 사멸 반응이 17E6에 의하여 활성화될 수 있다는 가능성을 배제할 수 없으나, 그렇다면 사용된 이소타입에 대응하는 동형의 대조 항체에 의한 것 보다 더 약하게 활성화된다.

따라서, 17E6는 αV-인테그린의 기능을 저해하여 작용을 나타낼 가능성이 크다. 17E6가 차단하는 기능 및 αV가 관여하는 기능으로는 세포부착, 가용성 매트릭스 구성분과의 상호작용(Seftor et al., 1992), 프로테아제/프로테아제 저해제 망의 변화(Gehlsen et al., 1992; de Boer et al., 1993; Preissner, 1991), 세포 이동 촉진(Seftor et al., 1992; Gehlsen et al., 1992) 또는 수용체 함입에 대한 영향(Wickham et al., 1993; Panetti and McKeown Longo, 1993a; Panetti and McKeown Longo, 1993b) 등이 있으나, 어떤 부분이 관여하는지는 이후의 실험에 의하여 확인되어야 할 것이다.

17E6가 αVβ3에 차단 효과를 나타내기 위해서는 표적이 이량체화 되어야 하지만 αVβ1 및 αVβ5는 그러하지 않다. ELISA 실험에서 αVβ3 인테그린과의 결합하는 활성, 그리고 αVβ1- 및 αVβ5- 매개 세포 부착 반응의 차단 활성이, 일가 및 이가의 17E6 항체 단편에서 동일하지만, 일가의 단편은 αVβ3에 대하여 본질적으로 활성이 없다. 또한, 교차-결합 항체를 상기 일가 단편에 첨가하면, αVβ3-매개부착 반응을 차단시키는 활성이 복원되어 나타나며, 그러한 과정에서 전형적인 프로존 효과가 나타난다. 그러나, αVβ3의 단순한 교차-결합만으로는 활성 차단에 부족한데, 교차-결합 AP3가 αVβ3-매개의 부착반응에 영향을 주지 않기때문이다: AP3는 β3사슬과 결합한다(cf: 제 2B도:e).

일가의 상호작용에서 이가의 상호작용으로 변화되면, 표적에 대한 항체의 친화성이 현저히 증가된다{Lane and Harlow, 1988}. 분리된 αVβ3상에서 17E6의 ELISA 적정시에는 그러한 변화가 나타나지 않으므로, 이 실험구성에서는 일가 및 이가의 17E6 성분과 일가의 상호작용이 일어나고 있음을 시사한다. 동일한 ELISA 실험구성을 사용한 리간드-결합 수용체 검정에서, 17E6는 EMD66203; cRGDfV와 같은 펩티드성의 리간드 모방체에 비하여 현저히 낮은 차단제 활성을 보인다. 이를 종합하여 보면 cRGDfV는 세포상에서 분리된 수용체 검정으로 변화시 활성이 100~1000 배 활성이 증가하지만, 17E6는 적어도 외관상 1000 배 활성이 줄어(IC₅₀이 ~100ng㎖^-1에서 >100㎍㎖^-1으로 변화) 거의 활성이 사라진다.

상기와 같은 이례적 결과와 세포항체의 교차-결합 데이타의 상관성에 관한 의문은 경쟁 실험에 의하여 해결된다. 17E6는 펩티드 저해제와 달리 리간드 결합부위를 직접적으로 방해하지 않는다. 직접적인 증거가 없을 경우 저해제가 리간드-수용체 상호작용 부위를 입체적으로 폐쇄함으로서 기능을 나타낸다고 보는 것이 일반적이며, 이러한 견해는 RGD-포함 펩티드와 같은 리간드 활성부-모방체에 의하여(Hynes, 1992) 그리고 비트로넥틴에서 해당부위를 돌연변이시켜 리간드를 불활성화하는 방법에 의하여(Cherney et al., 1993), 인테그린 분야에서 확인되고 있다. 본 발명에서의 데이타에 의하면 강력한 저해 항체인 17E6의 경우는 그렇지 않다는 것을 강력히 시사한다. 요약하면: αVβ3 인테그린에 있어서 a) 리간드 모방펩티드는 상호간에 그리고 리간드와 경쟁하며; b) 리간드는 펩티드에 대하여 경쟁하지만; c) 펩티드나 리간드 모두 17E6 결합에 있어서 경쟁하지 않으며; d) 17E6도 리간드나 리간드 모방 펩티드와 경쟁하지 않고; e) 17E6는 그 자신과 또는 다른 αV-결합 항체와 완전히 경쟁한다.

17E6는 리간드가 αVβ3에 결합하는데 대해서는 경쟁적 저해제로 거의 작용하지 못하지만, 비트로넥틴 및 RGD의 활성부 탐침은 수용체 부위에서 상호 강력히 경쟁한다. 다른 항체는 17E6에 대하여 강력히 경쟁한다. 따라서, 17E6는 알로스테릭 저해제로서 기능한다. 교차-결합 실험결과, αVβ1이나 αVβ5는 그렇지 않지만, 17E6가 αVβ3에 대한 저해 활성을 보이기 위해서는 αVβ3가 먼저 이량체화 되어야 한다. 이 결과는 17E6가 단순히 인테그린-리간드의 상호작용에 대하여 길항하는 것이 아니라 인테그린이 유도하는 신호 전도체계를 정교하게 조작하는 신규한 기전에 의하여 기능을 나타낸다는 것을 보여준다.

αVβ3 리간드는 활성형이 동종의 폴리머이고, 모노머는 활성이 없으므로(Preissner, KT. 1991; Stockmann, A, et al., 1993) 기질에 의한 인테그린의 다량체화는 이들의 기능발현을 위하여 필수적일수 있고, 실제로 리간드에 의하여 성장 인자 수용체 패밀리에 속하는 티로신 키나아제 수용체를 이량체화하는 것은 신호 전도를 일으키는데 핵심적인 단계가 된다(Dougall, WC. et at., 1994). 막중에서 인테그린의 방향성 결정 및 신호전달 복합체 형성에 폴리머 기질의 입체화학이 중요한 역할을 하리라는 것은 분명하다. 이러한 조건으로 인하여, 세포 부착시에는 다량체의 비트로넥틴이어야 한다는 생물학적 "논리"가 생길 수 있다. 비트로넥틴 다량체는 크기가 3 내지 16 유닛으로 되며(Stockmann, A. et al., 1993), 다량체 상호작용에 의해서 세포 표면에서 인테그린이 정렬된 구조와 필요한 강화된 친화성을 가지도록 하는 것으로 보인다. 단량체 비트로넥틴과 αVβ3간의 개별적인 상호작용의 지속시간은 짧고 친화성이 낮은 반면, 막 평면상에서 결찰되지 않은 인테그린은 회전이 빠르고, 항체 친화성 및 속도가 크다. 따라서, 세포표면에서 하나의 인테그린과 결합하고 있는 이가의 항체들이 회전하고 있는 해리된 인테그린을 포획하여 리간드와 결합할 수 없는 구조로 고정시키는 것으로 보인다. 이 결과 점차적으로 αVβ3와 비트로넥틴 연결의 분자-정렬이 약화되고-마치 분자상의 벨크로(Velcro)를 껍질로 싸는 것처럼 세포-비트로넥틴간의 상호 작용을 불안정화한다. 이로써, 수용체가 이가 결합(ELISA 데이타)이 가능한 방향으로 회전할 수 없는 수용체 검정에서 17E6가 기능을 나타내지 못하는 이유가 설명되며, 세포 검정시의 효능에 있어서 활성부위 경쟁의 부재 및 역시 세포 검정 시험에서 F(ab') 단편이 αVβ3-매개의 세포 부착을 저해하지 못하는 이유가 설명 가능하다.

또한, αVβ5 및 αVβ1(그리고 αVβ6, αVβ8 및 α5β1)이 αVβ3와 오버랩되는 리간드 스펙트럼을 공유하므로, 이들이, RTK 성장인자 수용체 패밀리에서 수용체의 이종이량체화에 의하여 교차 제어하는 것(Dougall, WC. et al., 1994)과 유사한 방법으로, 상호 기능을 교차 제어하는 것으로 생각할 수 있다. 예를 들어, αVβ3에 비하여 비트로넥틴에 대한 친화도가 높은 αVβ5는, -신호 발생이나 세포부착 유지에 필요한 αVβ3 동종 이량체의 양을 감소시키고 이를 αVβ5-αVβ3 이종-이량체로 대치하여-, 상기 기질의 개별 다량체에 대하여 αVβ3 결합부와 경쟁할 수 있다. 다른 αV-인테그린도 유사한 교차 제어방식으로 기능을 나타낼 수 있지만 이를 확인할만한 결정적인 데이타는 없다.

결론적으로, 사람의 αV-인테그린 사슬에 길항적으로 작용하는 모노크로날 항체군들이 개발되었다. 그중의 하나인 17E6는 in vivo에서 αV-매개에 의한 반응을 차단하거나 가역화한다. 특히, 17E6는 누드 마우스에서 αV-의존적인 흑색종의 성장을 차단한다. 이는 αV-인테그린들이 종양치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 시사한다.

완성된 것은 아니었으나 레흐만 등(Lehmann et al., 1994)은 αV-특이적인 항체들이 17E6와 관련된 몇가지 성질을 보유한다고 기술한 바 있다. 동 물질이 αV-매개의 상호작용을 가역화하고 흑색종의 생성을 방해하는지 연구해 볼 만하다.

치료 및 진단에의 이용

본 발명에 의한 항체는 환자 치료용으로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적은, 활성성분으로 상기 설명 및 특허 청구범위에 기재된 항체 또는 항체 단편을 적어도 하나 이상 포함하고 또한 약제학적으로 허용 가능한 캐리어, 부형제 또는 희석제를 하나 이상 포함하고 있는 약제학적 제제를 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 항체는 정맥 주사하거나 비경구적으로 투여할 수 있다. 일반적으로, 항체(또는 이의 단편)의 투여 용량은 종양 억제 및 괴사 효과를 나타내기에 충분한 범위로 투여한다. 투여량은 나이, 상태, 성별, 환자의 질환 진척도 등에 따라 달라지며, 일일 또는 수일 투여용량을 0.1mg/kg 내지 200mg/kg, 바람직하게는 0.1mg/kg 내지 100mg/kg으로 하는 것이 바람직하다.

비경구 투여 제제는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유탁액을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르 등이 있으며, 목적에 부합되는 다른 공지의 용매들을 사용할 수도 있다. 본 발명의 항체는 생리학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하여 구성된 조성물에 사용될 수 있다. 적절한 캐리어의 예로는 생리 식염액, PBS, 링거용액, 또는 젖산 링거 용액 등이 있다. 보존제 및 항생제, 항산화제, 킬레이트화제와 같은 다른 첨가제들도 동 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다.

항체(또는 이의 단편)는 공지의 방법에 따라 IL-2등과 같은 시토킨에 접합시켜 이들의 세포독성을 보조할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 제제는 순환기 종양과 고형 종양 뿐만 아니라 흑색종, 신경교종 및 암종등 모든 종류의 종양에 투여될 수 있다.

진단 목적으로 사용시 항체를 예를 들면 방사능 불투과성 염료에 접합시키거나 방사능으로 라벨할 수 있다. 바람직한 라벨 방법은 로도겐(lodogen) 기법이다. 진단 목적으로는 상기 항체의 scFv 단편을 투여하는 것이 바람직하다. 이에 의할 경우 기본적인 반응을 고려한 감산이 불필요하므로 더 우수한 결과를 얻을 수 있다.

표 1. ELISA 및 CELISA에서 Mab들의 반응패턴

표 2. 모노크로날 항체의 반응성 (Flow Cytometry)

표 3 BALB/c nu/nu 마우스의 폐 군락을 이용한 "실험적 전이" 검정시험에서17E6 Mab에 의한 M21 종양 병소 발생 저해도

실 시 예

실시예 1 : 시료

실험 동물 : 항체 생성(암컷 BALB/c; 8주령) 및 종양 모델("누드 마우스" : 암컷 동형 접합체 무흉선 BALB/c nu/nu : 4~5주령)로 사용할 마우스는 스리파(Criffa: Barcelona, Spain)로부터 입수하였다. 누드 마우스는 멸균실의 마이크로-분리장 안에서 사육하였고, 멸균 수 및 사료(ad libitum)을 공급하였다. 모든 조작은 라미나 플로우가 흐르는 후드내에서 하였다.

단백질 : 피브로넥틴(Ruoslahti et al., 1982), 비트로넥틴(Yatohgo et al., 1988)은 동결된 신선한 사람의 플라스마로부터 정제하였고, 피브리노겐(Kazal et al., 1963)은 혈액(whole blood)로부터 정제하였다. 라미닌은 엔겔브레트-홀름-스왐 쥐의 종양(Paulsson et al., 1987)로부터 정제하였다. 달리 특정되지 않을 경우 모든 조작은 20℃에서 하였고, 세척은 칼슘-마그네슘을 포함하지 않은 PBS("PBS" : 137mM NaCl, 2.8mM KCl, 8.1mM Na₂HPO₄, 1.5mM KH₂PO₄; pH 7.4)로 하였다. PBS++는 1mM MgCl₂및 1mM CaCl₂를 첨가한 PBS를 의미한다. 달리 언급이 없는 한 화학물질(Merck KGaA, Darmstadt)은 얻을 수 있는 가장 높은 질의 물질을 사용하였다. cRGDfV 및 cRGDfK와 같은 환상의 펩티드는 종래의 표준 기법에 의하여 합성하였다(예, FEBS Let. 291, p50-54, 1991). 비교를 위하여 사용될 선형의 펩티드 GRGDSPK는 상업적으로 입수할 수 있다(예, Bachem, Switzerland).

종양 세포주 및 배지- 아메리칸 타입 배지 콜렉션(ATCC)에서 SW1116, HT29 사람 암종 및 A375 사람 흑색종을 제공하였고, 다음과 같은 사람의 세포주은 동료들이 제공하였다: M21 흑색종, 이의 변종 M21-L 및 M21-L4(Cheresh and Spiro, 1987), M21-L-IIb(Kiefter et al., 1991의 방법에 따라 제조), UCLA-P3 사람 폐선암(Cheresh et al., 1989)(Dr. D. A. Cheresh; Scripps), WM 793 및 WM 164 멜라노마(Dr. M. Herlyn; Wister)(Herlyn et al., 1990), 췌장 암종 NP18(Dr. G. Cappella; Hospital Sant Pau; Barcelona). B16F10 쥐의 흑색종(당초 Dr. I. Fidler 제공)(Poste et al., 1980) (Dr. S. Alino, Unversity of Valencia). EMM31은 표준 조직학 기준에 따라 일차 흑색종으로 정의된 종양 견본으로부터 본 발명자들이 제조하였다(Jaggle et al., 비공개). 모든 세포는 7.5% CO₂92.5% 공기, 37℃ 배양조건에서, 90% RPMI 1640, 10% 소태아 혈청(FCS) 및 2mM L-글루타민을 사용하여 배양하였고, 독점시험(Proprietary test: Mycotect Kit; Gibco)에 의하여 평가한 결과 마이코 플라즈마는 존재하지 않았다.

항체- 달리 명시되지 않은 경우, 모노크로날 항체(MAb) 융합, ELISA 스크린, 서브클로닝 및 배지의 유지는 표준 기법(Harlow and Lane, 1988)을 사용하여 수행하였다.

실시예 2

면역화 : αVβ3에 대한 MAb는, 정제하여 세파로즈(80㎍ αVβ3를 80㎕ 세파로즈에 사용, 200㎕PBS)에 고정한 태반 αVβ3 또는 살아있는 M21세포(0.5㎖PBS 중 1×10⁶세포)를 2주마다 12주간 복강 투여하여 생산하였다. 최종 주사일로부터 4일 경과후, 프렌들리 마이엘로마(Ventrex)를 함께 사용하여 PEG-에 의하여 융합시켰다. 200KDa 흑색종에 나타나는 표면 단백질에 대한 항체를 완전한 M21 세포(0.5㎖ PBS 중 1×10⁶세포)로 면역화하여 제조하였다.

스크린 : 수용체 및 고정된 M21 세포에 대한 ELISA를 실시하였다. 수용체에 대한 ELISA시, 96-웰의 ELISA 플레이트(Dynatech)를 정제된 αVβ3(1㎍/㎖ in PBS 16시간; 4℃)로 코팅하고 차단한 후(PBS중 1.5% 스킴 밀크: 1시간; 4℃), 하이브리도마 상청액으로 배양하였다. 결합된 면역 글로불린을, p-니트로페닐-포스페이트를 기질로 사용하여 알칼라인-포스파타아제 접합 항-마우스 Ig(DaKo)로 검출하였다. 세포 ELISA의 경우, M21 또는 M21-L, M21-LIIb 또는 UCLAP-3 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트상에 고정시키고(PBS중 4% 파라포름알데히드, 15분, 20℃), 하이브리도마 상청액과 배양 하기전에 차단하고(3% BSA PBS, 1시간, 4℃), 수용체 ELISA 시험에서와 같은 방법으로 검출하였다. 희석을 제한하여 양성의 하이브리드를 3번에 걸쳐 서브클론화 하고 RPMI 배지에 넣었다. 서브클래스-특이적인 중쇄 항체(Zymed) 또는 경쇄항체(Promega)를 이용하여, 면역 글로불린의 이소타입을 결정하였다.

본 발명에 사용된 쥐의 다른 MAbs는 동료들이 제공한 것이다: αVβ3에 대한LM609 및 αV에 대한 LM142(Cheresh and Spiro, 1987)(Dr, D. A. Cheresh; Scripps), β1 인테그린에 대한 P4C10(Carter et al., 1990)(Telios), αVβ5 인테그린 복합체에 대한 P5H9(Wayner et al., 1991) (Dr. E. Wayner University of Minnesota), αⅡbβ3 복합체에 대한 CP8(Dr. Ruggieri, Scripps), β3 사슬에 대한 AP3(Furihata et al., 1987)(ATCC), 흑색종 세포 표면의 프로테오 글리칸에 대한 9.2.27(Harel et al., 1990)(Dr. R. Reisfeld; Scripps) 및 강글리오사이드 GD2에 대한 14.18 G2a(Mujoo et al., 1989).

실시예 3

항체 정제 및 양산: 대량 정제를 위하여 롤러 바틀에서 배양한 항체 상청액을 지수함수 상의 배지로부터 수확하였다. 단백질 A-세파로즈 CL-4B (Pharmacia)상에서 정제한 항체를 PBS에 의하여 투석시킨 후, 멸균 필더(0.45μm)하여 -70℃에서 저장하였다(Harlow and Lane, 1988). 정제된 항체는 큐림오버-II (Kurimover-II)컬럼 상을 통과시켜 엔도톡신을 제거하였다(Kurita-Vater; Tokyo). 이를 리물러스 검정하여 보면, 엔도톡신 함량이 mg 항체당 엔도톡신 >250 IU에서 <0.2 IU mg^-1으로 감소된 것으로 나타난다(Melvaer and Fystro, 1982). 17E6(쥐의 IgG1)의 F(ab')₂및 F(ab') 단편은, 펩신분해, 단백질-A-칼럼(Pharmacia)상에서의 분리, 파파인 분해, 겔 여과에 의한 분리(Harlow and Lane, 1988)등의 표준기법에 의하여 제조하였다.

αVβ3 및 αIIbβ3 인테그린의 정제

사람의 태반으로부터 αVβ3를 정제하였다(Smith and Cheresh, 1988). 이 태반을 얇게 저민후 2배량의 얼음용액 A(0.05% w/v 디기토닌, 2mM CaCl₂, 2mM PMSF, pH 7.4)로 세척하고 여과하였다. 걸러진 물질들을 4배의 얼음 완충액B(PBS중 100mM 옥틸-β-D-글루코파라노사이드[OG], 1mM CaCl₂, 2mM PMSF)로 추출하여 원심분리하였다(12000g max, 45분, 4℃). 상청액을 LM609 항체 컬럼을 통과시키며 재환류 시켰다(16시간: 4℃), 완충액C (PBS 중 0.1% NP-40: ~10cv) 및 완충액 D(0.1% NP-40, 2mM CaCl₂, 10mM Na-아세테이트; pH 4.5: ~10cv)로 세척하고, 결합된 물질을 완충액 E(pH 3.1로 조절한 완충액 D)로 용출시켰다. 용출물을 3M 트리스(pH 8.8)로 중화한 후, 완충액 C로 투석하고, 아쿠아시드II(Calbiochem)로 10배 농축하였다. 정제된 수용체를 -70℃에서 저장하였다.

αⅡbβ3는 사람의 혈소판으로부터 제조하였다(Pytela et al., 1986). 시일이 경과한 혈소판 농축물을 1배량의 티로데 완충액과 혼합한 후 펠렛화(1200g max)하고, 펠렛을 용해 완충액(50mM OG, 1mM MgCl₂, 1mM CaCl₂, 1μM MnCl₂, 2mM PMSF, 150mM NaCl, 50mM Tris-HCl; pH 7.4)으로 추출(1시간: 20℃)하였다. 원심분리(32000g max, 30분: 4℃)후, 상청액을 GRGDSRK-접합된 CL-4B 세파로스 컬럼을 통과시키며 재환류시켰다(16시간; 4℃). 칼럼을 용균 완충액(~10cv)으로 세척한 후, GRGDSPK(90% 용해 완충액 중 30mg ㎖^-1, 10% DMSO)로 용출시켰다. 피크를 5배 농축한 후, 변형된 용해 완충액(OG 대신 0.1% NP-40)을 이용하여 투석한 후, -70℃에서 저장하였다. α- 및 β-쇄 특이적인 모노크로날 항체를 이용한 항 인테그린 ELISA 기법 및 SDS-PAGE 기법에 의하여 평가한 결과, 인테그린 제제는 95% 이상의 순도를 가졌다.

실시예 4

표면 라벨화 및 면역-특성 평가

세포표면 비오틴화 및 추출 - 지수함수적인 성장기의 세포를 EDTA로 수확한 후 세척하고, PBS(1㎖)중 5×10⁶세포를 비오틴 N-히드록시숙신이미도 에스테르(10㎍/㎖: Sigma)를 사용하여 회전기(end-over-end rotator: 2시간: 20℃)상에서 표면 라벨한 후 세척하고, 밀리리터당 5×10⁶세포를 1시간 동안 추출 완충액(PBS중 100mM OG 2mM CaCl₂, 1mM MgCl₂및 1mM PMSF)에서 용해시켰다. 원심분리(12000g, 20분)후 얻어진 상청액을 면역 침강에 사용하였다.

면역침강 : 아피겔-10 비드(Biorad)나 단백질-G 세파로즈(Pharmacia) 결합된 정제 항-인테그린 MAb로 비오틴 라벨된 세포 추출물을 면역 침강시켰다. MAb에 결합된 10mg을 비오틴 라벨된 세포 추출물의 5E6 세포 균등물과 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 비환원 SDS-샘플 완충액에서 세척한 비드를 끓인 후 원심분리하고 7.5% SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 니트로셀룰로오스에 전기 영동 전이 시킨 후(Towbin et al., 1979), 염소의 항-비오틴 알칼라인 포스파타아제 접합물(Dako)에 의하여 NBT-BCIP (Biorad)를 기질로 이용하여 밴드를 가시화하였다.

세포류 측정(Flow Cytometry): EDTA로 세포를 수확하고, 세척한 후 PBS-1%BSA 중 10⁶세포를 MAb(10㎍㎖^-1, 20분, 4℃)와 배양하였다. 세척후 염소의 항-마우스 Ig-FITC(Becton Dickinson)으로 라벨한 후(20분, 4℃), 세포를 프로피디움 요오드화물과 배양한 후 세포류 분석하였다(SPICS Profile Ⅱ, Coulter). 살아있는 세포를 전방 및 측면 분산계 상에서의 적절한 문을 이용하여 선별하였다. 488nm에서 아르곤 이온 레이저로 형광계를 흥분시켜 방출되는 형광(525nm)을 측정하였다. 몇몇 실험에서 M21-L 세포를 간단히 고착 및 투과화 과정(70% 에탄올: 5분, -20℃)을 거쳐 염색하였다.

보체 의존적인 세포독성(CDC): M21 세포(10,000)를 50㎕의 완전한 배지와 20㎕의 항체와 함께 96-웰 플레이트상에 분배하였다. 토끼의 혈청(50㎕, 1:5; Behring)을 보체원으로 첨가하고 플레이트를 배양하였다(37℃: 60분). MTT기법(Mosmann, 1983)에 의하여 용해(lysis)도를 측정하였다. 용해된 %는, 1% 트윈-20을 포함하는 웰을 100% 용해된 대조군으로 하고, 항체가 없는 웰을 0% 용해된 대조군으로 하여 계산하였다.

실시예 5

세포성장, 생존률 및 활성화

증식 검정: 만성적인 항체의 효과를 시험하기 위해서, 회전기(end-over-end rotator)상에서 MAb(70㎍㎖^-1PBS; 1시간; 20℃)의 존재하에 10⁶세포를 배양하고, 세척, 재현탁한 후, RPMI-배지에서 계속 배양하였다. 트립판 블루 염색 배제 기법에 의하여 성장 및 생존률을 평가하였다. 활성화는 상기 MTT 검정법에 의하여 측정하였고, 세포수 측정기(Coulter electronics)를 이용하여 매일 세포수를 세었다.

부착성 흑색종 세포가 탈착되었다(0.05% 트립신/0.02% EDTA). 세척후 세포를 96웰의 평평한 지면을 가진 마이크로테스트 플레이트에 접종하고(웰당 1×10⁴세포), 10% FCS를 포함하는 RPMI 배지상에서, 계열 희석된 항체의 존재 또는 부재(대조군)하에 배양하였다. 48시간 후 18시간 동안 펄스 라벨(웰당 18.5 kBeq [³H]-티미딘)하여 수확하였다. 삽입된 방사능을 측정하여 분당 카운트로 표시하였다.

실시예 6

항체에 의한 세포 독성 검정(ADCC): BALB/C 마이크로 글리알 세포의 준비, ADCC, 항체-효능세포에 의하여 매개되는 세포 색전증(AECM)의 조건은 전술한 바와 같이 하였다(Sutter et al., 1991). M21 세포에 [³H]-티미딘 펄스를 18시간 동안 가하고(웰당 4×10³세포당 18kBq), 항체 존재하에 200㎕의 DMEM/FCS(10%)를 사용하여 96웰-플레이트 상에서 BALB/C 마이크로글리아(웰당 5×10⁴세포)와 배양하였다. 48시간 후 표적 세포의 핵이 보유하고 있는 [³H]-라벨을 측정하였다. MAb 의존적인 세포독성은 다음 식을 이용하여 계산하였다: [(실험적 ccpm-자연적 ccpm)/(최대 ccpm- 자연적 ccpm)] × 100

실시예 7

항체 및 효능세포 의존적인 세포 색전증(AECM): 펄스된 세포 대신에 새롭게통과한 라벨안된 M21세포를 사용하여 ADCC와 같이 실시하였다. 24시간 후에 효능-표적 세포 공동배지에 24시간동안 [³H]-티미딘(웰당 18kBg) 펄스를 가하고 삽입된 핵의 [³H]-라벨을 측정하였다.

세포 부착검정은 헥소스아미니다아제 활성(Landegren, 1984)을 이용하여 전술한 바와 같이 실시하여(Goodman et al., 1991), 부착된 세포를 측정하였다. 희석물 및 세포 현탁액을 부착 완충액(RPMI, 1% BSA, 25mM HEPES: pH 7.4)에 넣었다. 매트릭스 단백질을 96- 및 48-웰 플레이트에 코팅한 후, 웰을 BSA로 차단하고, 계열 희석한 MAbs를 웰에 첨가한 후 이어 세포를 가하였다(2.5×10⁴×10⁴). 37℃에서 1시간 경과 후 비부착세포를 세척해 내고 평행한 표준곡선에 대하여 부착된 세포를 세었다. MAbs가 없는 경우를 기준으로 하여, 부착 저해도를 계산하였다. 일반적으로 첨가된 세포중 70%이상이 1시간 내에 비트로넥틴에 부착한다. BSA만으로 코팅된 웰로의 세포부착은, 특이적으로 부착된 세포의 5% 미만이었다.

표면 교차결합 검정 세포 부착 검정에서와 같이, 계열 희석된 17E6또는 이의 F(ab')₂단편, F(ab')단편의 존재하에 교차 결합제로서 염소-항-마우스-F(ab')의 양을 증가시키면서, 매트릭스로 코팅된 플레이트에 세포가 부착되도록 하였다. 세척 후, 일반적인 세포부착 시험에서와 같이 부착된 세포를 검출하였다.

탈착 검정 : 세포 부착시험에서와 같이 코팅 및 차단된 웰에 부착 완충액에 세포를 첨가한 후, 37℃에서 배양하였다. 확산(60~75분)후 계열 희석한 MAb를 가하고, 세포를 배양기에 다시 넣었다. 다른 한편으로, 항체를 가하기 전에 24시간 동안 세포가 부착하도록 방치하였다. 항체 존재하에 2~3시간 경과 후 조심스럽게 상청액을 제거하고, 사전 가온한 신선한 부착 완충액으로 5회 치환하여 최종 희석 인자가 1×10⁵이상이 되도록 하였다.

In vivo 종양 성장 : EDTA로 지수 함수 성장기에 있는 종양 세포를 수확하여 세척하고, 트립판 블루 염료 배제법에 의하여 생존률을 측정하였다. 생존률은 96-99%이었다. 1차 종양을 성장시키기 위하여, 세포(0.2㎖ PBS++중 0.5×10⁶세포)를 누드 마우스의 측복부에 피하 주사하였다. 칼리퍼스로 종양의 직경을 측정하여 퍼진 타원에 대하여 사용되는 다음식을 이용하여 종양 부피를 측정하였다:

부피 = [(aㆍb²)/2]

(a는 종양의 장축, b는 단축; 한 그룹당 최소 8마리의 동물을 사용)

실험적 폐전이를 위하여, 세포를 수확한 후(0.05% 트립신/0.02% EDTA), 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다(0.2㎖ PBS++중 0.5×10⁶세포). 7주 경과후 동물을 치사시켜 폐를 잘라내어 보우신 용액(Bousin's solution)으로 고정한 후, 폐 표면의 종양 병소를 세었다. 항체 처리를 위하여 수확, 세척한 세포를 엔도톡신이 없는 정제된 MAbs(0.5㎖ PBS++중 10⁶세포당 70㎍)와 함께 회전기(end-over-end rotator)내에서 20℃, 30분 배양하고 0.2㎖ PBS당 0.5×10⁶세포로 희석한 후 주사하였다. 주사 전후에 트립판 블루 염료 배제법을 이용하여 세포 생존률을 평가하였으며, 유의성 있는 차이는 없었다(주사전 생존율 = 주사후 생존율 ±5%). 종양 저해 시험결과는 T-테스트(2-tailed Student T-test)로 평가하였다.

실시예 8

분자생물학적 기법

달리 언급이 없는 한 모든 분자생물학적 기법은 전술한 바와 같다(Sambrook et al., 1989).

RNA 및 cDNA 제조 : 구아니디움 티오시아네이트 추출법을 이용하여 17E6 세포로부터 전체 RNA를 추출하여, 카에슘 클로라이드(caesium chloride) 밀도 구배에 의해 초원심 분리하였다(Chirgwin et at., 1979). 1차-표준 cDNA를 상용 키트(Pharmacia)를 이용하여 합성하였다. 이때 5㎍의 RNA 15㎕을 사용하였으며 37℃에서 1시간 동안 합성하였다. 1차 표준 cDNA는 바로 PCR 증폭에 사용하였다.

PCR 증폭 : 마우스의 경쇄 가변부와 중쇄 가변부를, 쥐의 Ig리더 서열에 하이브리드 되도록 설계된, 반복 및 부분-변형된 PCR 프리머 세트를 사용하여 증폭시켰다(Jones and Bendig, 1991), 61 올리고뉴클레오티드 혼합물은 5' 프리머 또는 중쇄 가변 영역으로 작용하며, 405 올리고뉴플레오티드 혼합물은 카파 사슬 가변 영역의 5' 프리머로 작용한다. 3' 프리머는 불변부에서 어닐(anneal)하도록 설계하였다. 특이적인 IgG1 및 카파 마우스 프리머를 사용하였다.

증폭을 위하여 열안정성 DNA 폴리머라아제와, 1㎕의 cDNA-RNA 하이브리드,250nM의 적절한 5' 및 3' 프리머 혼합물, 200μM의 각 dNTP, 1mM MgCl₂(경쇄용), 2mM MgCl₂(중쇄용) 및 1U의 Taq 폴리머라아제(Cetus)를 포함하고 있는 25㎕의 반응 혼합물을 미네랄 오일과 함께 가한 후, 60℃로 가온하고 어닐링을 위하여 55℃로 유지시켰다. 30회 반복한 후(1'×55℃: 1.5'×72℃: 42s×92℃), PCR 반응물의 1/10을 1% 아가로스 TAE 겔 전기영동하고 에티디움 브로마이드로 염색하여 PCR 산물을 관찰하였다.

분자 클로닝 및 서열확인 : 1㎕의 각 PCR 산물을 TA 벡터에 결찰시켰다(Invitrogen, San Diego). 중쇄 및 경쇄 가변영역을 위한 두 가지의 DNA 결찰반응을 열-쇼크에 의하여 E. coli TG1 종의 세포로 도입하여, 17E6 Mab의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역에 대한 두개의 DNA 라이브러리를 만들었다. LB 플레이트상에서 카베니실린 100㎍/㎖로 군락을 선택하여 분석하였다. 양성군락은 PCR 스크리닝이나 플라스미드 소화법(Gussow and Clakson, 1989)을 이용하여 검출하였다. 변형체로부터 이중사슬의 DNA 플라스미드를 제조하여 서열 분석하였다(Wizard Preps, Promega Corp.), Taq 폴리머라아제를 사용하여, 디데옥시 뉴클레오티드 사슬 종료 방법(Sanger et. al., 1977)을 이용한 열순환 서열 분석을 실시하였다. TA 벡터에 상보적인 상류 및 하류 서열 분석 프리머가 사용되었다.

인테그린 리간드 결합 및 경쟁 검정 : 리간드의 비오틴 라벨: PBS중의 리간드를 최종 부피가 1㎖가 되도록 5배 농축된 결찰 완충액으로 희석하여(최종농도 : Img㎖^-1단백질, 100mM NaCl, 100mM NaHCO₃pH 8.2), 새로 준비한 N-히드록시숙신이미도 비오틴 용액(100㎕, DMSO중 1mg㎖^-1)을 혼합하면서 가하고, 회전시키면서(end-over-end rotation) 20℃에서 2시간동안 반응시켰다. 완전히 투석한 후(4℃: PBS, 0.05% NaN₃), 단백질 농도를 분석하고 비오틴으로 라벨된 리간드를 4℃에서 저장하였으며, 21일 내에 사용하였다. 비오틴으로 라벨된 cRGDfK 펩티드 (환상의-Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys=N-비오틴-아미노헥산산)은 공지이며, 표준기법에 의하여 제조할 수 있다.

직접적 경쟁시험은 공지의 방법(Smith et al., 1990)을 약간 변형시켜 실시하였다. αVβ3를 완충액 A(150mM NaCl, 1mM MgCl₂, 1mM CaCl₂, 10μM MnCl₂, 20mM, Tris-HCl; pH 7.4)에서 1㎍㎖^-1의 농도로 희석한 후, 100㎖를 96-웰의 마이크로 적정 플레이트에 넣어 4℃에서 밤새 방치하였다. 플레이트를 완충액 B(3% BSA(w/v), 100mM NaCl, 1mM MgCl₂, 1mM CaCl₂, 10μM MnCl₂, 50mM Tris-HCl; pH 7.4)로 세척한 후, 동일 완충액을 이용하여 20℃에서 2시간 배양하였다.

완충액 C(0.1%(w/v)의 BSA를 포함하고 있는 완충액 B)로 헹군후, 비오틴 라벨된 리간드(최종농도 1㎍㎖^-1)와 계열 희석된 시험 펩티드 또는 단백질을 가하였다. 배양(3시간, 30℃)후, 완충액 C로 세번 헹구어 비결합된 리간드를 플레이트로부터 세척하고, 항 비오틴-알칼라인 포스파타아제 접합 항체 (완충액 C중 1:10000)(Sigma)와 1시간 배양한 후 PBS로 세척하고, NBT-BCIP(Biorad)를 기질로 사용하여 결합 항체를 검출하였다. ECM 분자 및 항체들은 일반적인 방법으로 비오틴 라벨하여 검정계에 사용하였다.

검정시험은 보통 n=3 또는 4로 실시하였고, 시그모이드 커브(unweighted sigmoid curve fit)로부터 IC₅₀을 찾아내기 위해 적어도 3회 이상 반복하였다. 내부-검정 비교를 위하여, 외부 대조 펩티드를 이용하여 실험결과를 정상화하였다. 직정시에는 선형의 RGD 펩티드 GRGDSPK 및 환상의 펩티드 cRGDfV를 외부 기준 물질 및 대조 물질로 첨가하여, 인테그린 없이 차단된 웰로의 비오틴 라벨 리간드의 결합과 리간드 없는 인테그린에 대한 항비오틴 항체의 결합을 측정하였다: 대조 웰로부터 특이적인 리간드 결합의 시그널은 7.5% 미만이었다.

전차단-경쟁적 시험 : 직접적 경쟁시험에서와 같이 수용체로 코팅하고 차단한 플레이트를 두배 농도의 항체, 매트릭스 분자 또는 경쟁 펩티드(완충액 C 중 50㎕: 1시간: 30℃)와 전 배양한 후, 비오틴으로 라벨된 탐침용 리간드 또는 항체(완충액 C중 50㎕)를 가하고 배양한 후(3시간; 30℃) 세척하고 상기 직접적 경쟁 시험에서와 같은 방법으로 결합 비오틴을 검출하였다.

제 1 도는 사람의 흑색종 세포 M21 및 M21L의 알파-V 그룹의 항체와 대조군에 대한 반응성을, 형광 활성된 세포 분류기[Fluorescence Activated Cell Sorter: FACS]를 이용한 분석하여 얻어진 결과를 나타낸 것이고;

제 2 도는 알파-V 그룹의 항체와 단백질간의 면역침강 패턴을 나타낸 것이고;

제 3 도는 비트로넥틴으로의 초기 세포부착에 대한 17E6의 영향을 나타낸 것이고;

제 4 도는 17E6가 αVβ3 및 αVβ5 인테그린에 의하여 매개되는 부착 반응에 미치는 영향을 나타낸 것이고;

제 5 도는 비트로넥틴과 다른 매트릭스 구성분으로의 부착에 미치는 17E6의 영향을 비교하여 나타낸 것이고;

제 6 도는 17E6가 기 생성된 세포-비트로넥틴의 접촉반응에 미치는 영향을 나타낸 것이고;

제 7 도는 17E6 및 αV-인테그린이 BALB/c 누드 마우스에서 사람 M21 흑색종의 성장에 미치는 영향을 나타낸 것이고;

제 8 도는 17E6의 세포 독성 실험 결과를 나타낸 것이고;

제 9 도는 17E6가 M21 세포의 DNA 합성에 미치는 영향을 나타낸 것이고;

제 10 도는 정제된 αVβ3에 대한 17E6 및 단편의 결합도를 ELISA 검정하여 나타낸 것이고;

제 11 도는 17E6 및 이의 단편이 αVβ1, αVβ3 및 αVβ5에 의하여 매개되는 세포 부착에 미치는 영향을 나타낸 것이고;

제 12 도는 교차 결합 17E6 F(ab')이 비트로넥틴에 대한 M21의 부착에 미치는 영향을 나타낸 것이고;

제 13 도는 αVβ3에 대한 리간드 활성부위 모방체와 비트로넥틴간의 직접결합 경쟁 실험 결과를 나타낸 것이고;

제 14 도는 αVβ3에 대한 비트로넥틴과 17E6 간의 직접결합 경쟁 실험 결과를 나타낸 것이고;

제 15 도는 전 처리에 의하여 차단된 경쟁시험에서 αVβ3에 결합에 대한 리간드 및 활성부위 모방체와 항체 간의 경쟁성 평가의 결과를 나타낸 것이고;

제 16 도는 전 처리에 의하여 차단된 경쟁시험에서 αVβ3에 결합에 대하여 항체들 상호 간의 경쟁성 평가의 결과를 나타낸 것이고;

제 17 a,b도는 Mab 17E6 가변(Fv)부의 cDNA 서열을 나타낸 것이고;

제 18 도는 클로닝 과정을 도해하여 나타낸 것이다.

Claims

SEQ ID NO:1의 경쇄와 SEQ ID NO:9의 중쇄의 FRs와 CDRs의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 모노크로날 항체.
제1항에 있어서,

- 사람의 αV-인테그린의 αV-사슬과만 반응하고;

- 인테그린 기질이 αV-인테그린을 보유하고 있는 세포에 부착하는 것을 차단하고;

- αV-인테그린에 의하여 기 생성된 세포 매트릭스의 상호작용을 가역화하고;

- 종양의 성장을 차단하고;

- 세포독성을 나타내지 않는 특성을 가진 모노크로날 항체.
제 2항에 있어서, 상기 인테그린 기질이 비트로넥틴, 피브리노겐 또는 피브로넥틴임을 특징으로 하는 모노크로날 항체.
제2항에 있어서, 세포 성장이 차단되는 종양이 흑색종인 것을 특징으로 하는 모노크로날 항체.
272-17E6로 명명되어 DSM ACC2160호로 기탁되어 있는, 제 1항 또는 제 2항의 모노크로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주.
하이브리도마 세포주 DSM ACC2160에 의하여 생산될 수 있는 모노크로날 항체.
SEQ ID NO:1의 서열을 포함하고 있는 아미노산 서열.
SEQ ID NO:9의 서열을 포함하고 있는 아미노산 서열.
제 7항에 있어서, 제 21위치로 부터 시작되는 아미노산 서열.
제 8항에 있어서, 제 20위치로 부터 시작되는 아미노산 서열.
제 2항에 정의된 특성을 가진 모노크로날 항체의 경쇄 가변부의 FRs 및 CDRs를 암호화하고 있는 SEQ ID NO:1의 DNA 서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
제 2항에 정의된 특성을 가진 모노크로날 항체의 중쇄 가변부의 FRs 및 CDRs 를 암호화하고 있는 SEQ ID NO:9의 DNA서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
제 11항에 있어서, SEQ ID NO:1의 리더 서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
제 12항에 있어서, SEQ ID NO:9의 리더 서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
(i) 마우스를 정제된 αVβ3 인테그린으로 면역화하는 단계,

(ii) 하이브리도마 세포를 생산하는 단계,

(iii) 그 상등액이 양성 결과와 이들의 αV-인테그린 사슬의 인식과 일치하는 반응 패턴을 나타내는 클론을 선택하는 단계,

(iv) 그 상등액이 매트릭스 단백질에 대한 αV 사슬 인테그린 발현 세포의 발현을 차단하는 클론을 선택하는 단계,

(v) 그 상등액이 종양 성장을 차단하는 클론을 선택하는 단계,

(vi) 그 상등액이 세포독성을 나타내지 않는 클론을 선택하는 단계,

(vii) 그 상등액이 기 생성된 인테그린 매개 세포 매트릭스 상호작용을 가역화하는 클론을 선택하는 단계,

(viii) 특정 세포주를 생산하는 단계,

(ix) 상기 세포주로부터 모노크로날 항체를 분리하는 단계를 수행함으로써, 제1항 또는 제2항에 따른 모노크로날 항체를 제조하는 방법.
종양에 대한 약물의 제조에 사용되는, 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 모노크로날 항체.
제16항에 있어서, 상기 종양이 흑색종인 것을 특징으로 하는 모노크로날 항체.
종양 성장의 진단 위치 및 평가에 사용되는, 제 1항 내지 제 4항 및 제 6항 중 어느 한 항에 따른 모노크로날 항체.