HU221061B1 - Anti-alfaV-integrin monoklonális ellenanyag - Google Patents

Description

A találmány tárgyát egy új monoklonális ellenanyag és az azt termelő hibridóma-sejtvonal képezi. A találmány szerinti ellenanyag - melynek egy előnyös megvalósítása a 17E6 ellenanyag - a következő sajátságokkal bír:

- a humán aV-integrineknek kizárólag az aVláncával reagál,

- meggátolja az integrinszubsztrát aV-integrint hordozó sejtekhez történő kötődését,

- indukálja az aV-integrinek által kiváltott sejtmátrix kölcsönhatások reverzióját,

- gátolja a tumorképződést, és

- nincs citotoxikus aktivitása.

A találmány tárgyát tehát a fenti sajátosságokkal bíró ellenanyag képezi.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy 27217E6 jelű monoklonális ellenanyagot termelő hibridóma-sejtvonal, melyet DSM-ACC2160 deponálási számon helyeztünk letétbe, és a találmány tárgyát képezi az említett hidridóma-sejtvonallal termeltethető fenti sajátosságokkal bíró ellenanyag is.

A találmány tárgyát képezik továbbá DNS-szekvenciák és aminosavszekvenciák. A találmány szerinti DNS-szekvenciák a fenti ellenanyagot vagy annak fragmenseit kódolják. A találmány szerinti szekvenciákat a 17a. és 17b. ábrán ismertetjük, valamint a leíráshoz csatolt szekvencialistában.

A találmány tárgyát képezik végül a fent definiált ellenanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények is.

Az integrinek a sejtfelszíni adhéziós receptorok egy szupercsaládját képezik, melynek tagjai szabályozzák a sejtek szilárd extracelluláris környezethez történő kapcsolódását, mind az extracelluláris mátrixhoz (ECM), mind pedig egyéb sejtekhez történő kapcsolódásukat. Az adhézió a sejtek számára alapvető jelentőségű, a sejtek az adhézión keresztül rögzítődnek a megfelelő helyre, szabályozza a migrációt, és jelet szolgáltat a növekedés és differenciálódás vonatkozásában. Az integrinek közvetlenül szerepet játszanak számos normális és patológiás állapot kialakulásában, és ezért a terápiás beavatkozás elsődleges célpontjai. Az integrinek integrális transzmembránfehérjék, heterodimerek, melyek kötőspecifitása attól függ, hogy a lehetséges körülbelül 14 α-lánc és körülbelül 8 béta-lánc közül melyek kombinálódtak bennük. Az integrineket négy átfedő alcsaládba osztották, melyek βΐ-, β2-, β3- vagy aV-láncokat tartalmaznak, és egy adott sejt egyidejűleg expresszálhat néhány különböző integrint minden egyes alcsaládból. Az utóbbi évtizedben végzett kutatások kimutatták, hogy az integrinek a sejtek adhéziós kölcsönhatásaiban szerepet játszó fontos receptorok, és ezért terápiás beavatkozás alkalmas célpontjai lehetnek. Integrinekkel kapcsolatos összefoglaló munkákat közölt például E. Ruoslahti [J, Clin. Invest: 87, (1991)’ és R. O. Hynes [Cell, 69, (1992)].

Az eritrociták kivételével valamennyi humánsejt expresszál egy vagy több integrint. Az integrinek funkciói számos szinten szabályozottak, döntő fontosságú azonban ligandumspecifitásuk, amely azon múlik, hogy mely α-lánc asszociálódott mely β-lánccal a heterodimerben, és fontos az integrinek aktiváltsági állapota is (Hynes, 1992; Diamond and Springer, 1994). Az integrinek specifitását befolyásolja a celluláris környezet is, amelyben az integrinek működnek (Chan és Hemler, 1993), valamint az integrin alkalmazott „splice-variánsa” is (Delwel és munkatársai: 1993). Az integrinek szerkezetének és működésének fenti komplexitását figyelembe véve az integrinek specifitását oly módon vizsgálhatjuk megbízhatóan, hogy az integrin működését közvetlenül megzavarjuk, és megvizsgáljuk, hogy ez milyen celluláris válaszreakciót befolyásol. Az integrinkutatás története azt mutatja, hogy a funkcionális analízisben nagy szerepük van azoknak a reagenseknek, melyek specifikusan gátolják az integrinek működését. Ilyenek például az integrinműködést gátló CSAT ellenanyag, amely elsőként tette lehetővé egy integrin βΐ-lánc meghatározását (Neff és munkatársai: 1982), és további létfontosságú példákat is megemlíthetünk [P1D6, P1B5 (Wayner és Carter, 1987), P4C10 (Carter munkatársai: 1990), AIIB2 (Hall és munkatársai: 1990), 3A3 (Tumer és munkatársai: 1989), GOH3 (Sonnenbert és munkatársai: 1987), valamint LM609 (Cheresh és Spiro: 1987)]. Az integrinek kutatásának területén az ilyen reagensek nélkülözhetetlenek.

Az aV-integrineket jelenleg egy nagyon fontos alcsaládnak tekintik, melyek rendelkeznek mind klasszikus, mind újonnan felismert funkciókkal. Amellett, hogy klasszikus módon szerepet játszanak a sejtek tapadásában és szétterülésében [Pytela és munkatársai: (1985), Cheresh (1991), az aV-integrinek szerepet játszanak a sejtek helyzetváltoztatásában [Seftor és munkatársai: (1992)], a receptorintemalizációban [Panetti és McKeown Longo: (1993a); Panetti és McKeown Longo (1993b), az aV-integrinek szerepelnek vírus-coreceptorokként is [Wickham és munkatársai: (1993)], szerepet játszanak az extracelluláris proteázkaszkádok szabályozásában [de Boer és munkatársai: (1993)], valamint a tumorfejlődés szabályozásában [Felding-Habermann és munkatársai: (1992)]. Az öt különböző ismert aV-integrin, az ανβΐ- [Zhang és munkatársai: (1993)], a ^3-[Pytela és munkatársai: (1985); Cheresh és munkatársai: (1987)], a β5- [Cheresh és munkatársai: (1989)], a -β6- [Busk és munkatársai: (1992)] és a β8-mtegrin [Moyle és munkatársai: (1991)] specifitását részben feltárták, és úgy tűnik, hogy kizárólag olyan ligandumokat ismernek fel, melyek tartalmazzák az RGD-tripeptidet (NH2-arginin-glicin-aszparaginsav-COOH), ilyen ligandumok például a vitronektin (ανβΐ, ανβ3, α.νβ5), a fibronektin (ανβΐ, «νβ3, ανβ5, ανβ6), és a von Willebrand-faktor, a fibrinogén, és az oszteopontin (α.νβ3; 1991; Busk és munkatársai: (1992); Zhang és munkatársai: (1993); Denhardt és Guo: (1993); Smith és Cheresh: (1990)]. Az egymással összefüggő specifitású dimerek együttesen is expresszálódhatnak egyazon sejtben (például az ανβ3 és a ανβ5, melyek vitronektint kötnek M21-sejtek esetében [Wayner és munkatársai: (1991)], de elképzelhető, hogy az együtt expresszálódott integrinek egymástól független funkciókat szabályoznak. Mivel azonban az aV-család tagjainak specifitása egymással átfedő, és az

HU 221 061 Β1 aV- és βΐ-integrinek is átfedő specifitásúak, komoly nehézségekbe ütközik egy adott celluláris környezetben valamely bizonyos funkciót egyazon receptorhoz kötni. Az aVp3-integrin [Cheres és Spiro: (1987); Chuntharapai és munkatársai: (1993)] és az aVp5-integrin [Wayner és munkatársai: (1991)] esetén a funkció tisztázása szempontjából létfontosságú volt gátló ellenanyagok előállítása. A többi aV-integrinek esetén azonban nem ismeretesek olyan ellenanyagok, melyek azonosítanák a komplexet és megzavarnák funkciójukat. Igen kevés olyan reagens áll rendelkezésre, amely a komplex aV-láncához kötődne, és az egész család integrinfúnkcióját megzavarná. Lehmann és munkatársai (1994) feltárnak egy ανβχ jelű ellenanyagot, amely azonban nem változtatja meg a sejt-mátrix kölcsönhatást, és nincs tumomövekedés-gátló aktivitása.

Az elmondottak értelmében nagy érdeklődés van az aV-integrinek tumomövekedésben játszott szerepének tisztázása vonatkozásában. A humán malignus melanoma egy egyre jobban teijedő agresszív bőrrák. A melanoma kifejlődésével kapcsolatban kimutatták α2β1[Danen és munkatársai: (1993); Etoh és munkatársai: (1992)], α3β1- [Natali és munkatársai: (1993); Yoshinaga és munkatársai: (1993)], α4β1- [Hart és munkatársai: (1991)], valamint a6pi-integrinek [Hart és munkatársai: (1991)] megnövekedett mennyiségben való jelenlétét, de a melanomák kifejlődésében legáltalánosabban az aV-integrinek játszanak szerepet. Közelebbről mind a primer tumor inváziója, mind pedig a távoli metasztázisok hisztológiailag az aV]33-integrin fokozott expressziójával jellemezhető, mely integrint „vitronektin-receptor”-nak is neveznek. A nem invazív primer tumorok és a nem malignus melanotikus anyajegyek csekély mennyiségű, kimutatható aVp3-integrint expresszálnak, ez a receptor egészséges felnőtt szövetekben ritkán fordul elő [Brooks és munkatársai: (1994); Buck és munkatársai: (1990); Pignatelli és munkatársai: (1992); Lessey és munkatársai: (1992); Korhonen és munkatársai: (1991); Nesbitt és munkatársai: (1993)]. Különböző fázisú tumorok és metasztázisok immunhisztokémiai vizsgálatával kimutatták, hogy az invazív fázishoz közeledve egyre több ανβ3 expresszálódik [Albelda és munkatársai: (1990); Si és Hersey (1994)], melanoma-sejtvonalak átvizsgálásával kimutatták, hogy az aV-integrinek nagymértékű expressziója általánosan jellemző [Salders és munkatársai: (1992); Gehlsen és munkatársai: (1992); Marshall és munkatársai: (1991)], és azt is kimutatták, hogy tumor-angiogenezis során a kifejlődő kapilláris vérerek aVp3-integrint expresszálnak [Brooks és munkatársai: 1994).

In vivő kísérletekkel kimutatták az aVp3-integrin szerepét is a melanoma kifejlődésében. Az egéreredetű B16-F10 melanomarendszerben kísérletileg előidézett tüdőmetasztázist szuppresszálni lehetett nagy mennyiségű RGD-peptid hozzáadásával [Hardan és munkatársai: (1993); Humphires és munkatársai: (1986), mely peptidek az aV-integrin funkció hatásos gátlószerei. Legújabban Felding-Habermann és munkatársai kimutatták, hogy az aV-integrinek immundefficiens egerekben hozzájárulnak az M21- humánmelanoma szubkután növekedéséhez. Az M21-rendszer egy elegáns kísérleti rendszer, és számos sejtet tartalmaz, melyek különféle aV-integrineket expresszálnak [Kieffer és munkatársai: (1991); Felding-Habermann és munkatársai: (1992); Cheresh és Spiro (1987)]. A szülői vonal, az M21-sejtek ανβ3- és aVp5-integrineket expresszálnak [Wayner és munkatársai: (1991)], ezek a sejtek vitronektinhez kapcsolódnak és szubkután tumorként növekednek. Az M21-L-sejtek, az M21-sejtek szomatikus variánsai, nem expresszálnak kimutatható mennyiségű aV-integrint [Cheresh és Spiro: (1987)], nem képesek vitronektinhez kötődni, és lassan növekvő tumorokat hoznak létre. Az M21-L4-sejtek az M21-L-sejtek transzfektánsai, stabilan újra expresszálják a teljes hosszúságú aV-láncot, ezek a sejtek kötődnek vitronektinhez, és gyorsan szubkután tumorrá növekednek [Felding-Habermann és munkatársai: (1992)]. Az elmondottakból következik, hogy a sejtfelszíni aV-integrinek jelenléte közvetlenül összefüggésben van az M21sejtek szubkután növekedésével.

Mindazonáltal az M21-sejteket extrém szelekciós nyomásnak tették ki az M21-L-sejtvonal és az M21L4 jelű variáns sejtvonal kifejlesztése során. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során azt találtuk, hogy a natív M21-populáció aV-integrin-funkciója gátolható, és ennek a gátlásnak a sejtek viselkedésére és a tumor növekedésére meglepő hatása van. Az aV-integrinek vonatkozásában peptidantagonisták könnyen szintetizálhatok, mindazáltal ezek felhasználhatósága korlátozott, mivel biológiai hozzáférhetőségük nem megfelelő, in vivő rövid a fél életidejük, és az állatokból hamar kiürülnek [Humphries és munkatársai: (1988)]. A peptidekkel szingenikus ellenanyagok alkalmazása érdekes alternatívát ígér. In vivő hosszabb a fél életidejük [Tao és Morrison: (1989); Haba és munkatársai: (1988) és kötési specifitásuk standard technikák alkalmazásával kimutatható. Bár ismertek kiváló aV-integrin-specifikus ellenanyagok, mint például az LM 142 [Cheresh és Spiro: (1987)] vagy a WO 93/20229 számú nemzetközi közzétételi iratban feltárt monoklonális ellenanyagok, sajnos azonban kevés olyan ellenanyag ismeretes, amely hatékonyan gátolná az aV-integrin-fünkciókat.

Az aV-integrin-család tagjainak specifitása és biológiai funkciója erősen vitatott, elsősorban azért, mert pillanatnyilag nem hozzáférhető olyan reagens, amely az egész osztály működését gátolná, azaz nem áll rendelkezésre hatásos aV-integrin-gátló ellenanyag. Az a felismerés, hogy az integrincsalád klasszikus adhéziós receptorai kifejtenek más kevéssé konvencionális biológiai hatásokat is, fokozta az integrinek molekuláris hatásmechanizmusának kutatási intezitását. A kutatás kimutatta, hogy az integrinekben található néhány előre nem várt szerkezeti régió, mely aloszterikusan jelzi a molekula aktiváltsági állapotát, valamint olyan régiók, melyek kötődés esetén maguk is integrinfunkciót képesek aktiválni. Az integrinműködés inhibitorai ezzel szemben általában az aktív helyet gátolják, az ilyen inhibitorok klasszikus példái az RGH-peptidek, melyek az aV-integrinek és az o^l-integrin számos ligandumának integrinfelismerő helyére hasonlítanak.

HU 221 061 Β1

A találmány tárgyát egy új típusú funkciógátló ellenanyag képezi, mely a humán aV-integrin-láncot ismeri fel, és amely ellenanyag elnevezése 17E6. Sok közlemény beszámol arról, hogy az aVp3-integrin és liganduma - például a vitronektin - között a kölcsönhatás irreverzíbilis természetű. Kimutattuk, hogy a találmány szerinti 17E6 ellenanyag gyorsan előidézi az aV-integrinek és szubsztrátjai közötti úgynevezett „irreverzíbilis” kölcsönhatás reverzióját, amely felismerés arra utal, hogy az ellananyag terápiás felhasználása is lehetséges lesz. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során megvizsgáltuk a 17E6 ellenanyag hatásmechanizmusát, és azt találtuk, hogy az aVp3-integrin-kötő ligandumok rendkívül rossz kompetítora, ezzel szemben a vitronektin és az RGD-alapú aktív helyhez kötődő reagensek erősen versenyeznek egymással a receptorkötő helyéért. Kimutattuk azt is, hogy más ellenanyagok erős kompetícióban állnak a 17E6 ellenanyaggal. Elmondhatjuk tehát, hogy a 17E6 ellenanyag aloszterikus inhibitorként hat. Keresztkötéses kísérletekkel kimutattuk, hogy az aVp3-integrinnek dimerizálódva kell lennie ahhoz, hogy a 17E6 ellenanyag gátlóhatását kifejthesse, ugyanez nem mondható el viszont az ανβ3- vagy aVp5-integrinekről. Ez a felfedezés nyilvánvalóvá teszi, hogy a 17E6 ellenanyag új hatásmechanizmus szerint működik, mely hatásnak részét képezi az integrin indukálta szignáltranszdukciós reakcióút manipulálása. A találmány szerinti ellenanyag gátolja a tumorfejlődést, és nincs citotoxikus aktivitása.

A leírásban említett mikroorganizmusok, sejtvonalak, plazmidok, fágmidok, promoterek, rezisztenciagének, replikációs origók és egyéb vektorfragmensek kereskedelmi forgalomból vagy más módon bárki számára hozzáférhetőek. Bizonyos esetekben a fent említett anyagok nem vásárolhatók meg közvetlenül. Mindazáltal az ilyen anyagokat a leírásban csak példaként említjük, a találmány szerinti megoldás sajátságainak vagy hatásainak szemléltetése céljából, és az ilyen anyagok beszerzése a találmány szerinti megoldás megvalósításához nem döntő fontosságú. Az ilyen anyagok minden esetben helyettesíthetők egyéb alkalmas általánosan hozzáférhető biológiai eszközökkel és anyagokkal.

A 17E6 jelű monoklonális ellenanyag olyan ellenanyag, melyet a 272-17E6 jelű hibridóma-sejtvonal termel. A sejtvonalat DSM-ACC2160 deponálási szám alatt letétbe helyeztük a „Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen” (Braunschweig, Németország) intézetnél.

A találmány szerinti megoldás megvalósítása szempontjából esszenciális módszereket és eljárásokat a leírás további részében részletesen ismertetjük. A részleteiben nem ismertetett módszerek szakember által jól ismert, standard eljárások, vagy pedig részletes leírásuk megtalálható az idézett publikációkban és szabadalmi leírásokban, valamint a szakember számára hozzáférhető szakirodalomban.

A leírásban ismertetett DNS- és aminosavszekvenciák szintén tartalmaznak bizonyos mértékben eltérő vagy megváltoztatott szekvenciákat, például mutánsokat és variánsokat, mely mutánsok és variánsok előállíthatok célzott vagy véletlenszerű mutagenezissel, kémiai vagy fizikai módszerek alkalmazásával. Általánosságban elmondhatjuk, hogy a találmány tárgyát képezi minden olyan mutáns és variáns, amely rendelkezik a találmány tárgyát képező, bemutatott sajátságokkal és funkciókkal.

Az „ellenanyag” kifejezés a leírás vonatkozásában magában foglalja az ellenanyag fragmenseit is, például az Fab’-, F(ab’)₂- és az egyláncú Fv-fragmenseket. Az ilyen ellenanyagffagmensek szakember számára ismert eljárások alkalmazásával előállíthatok.

A leírásban alkalmazott rövidítések jelentése a kö-

vetkező:
allbp3	integrin
ανβΐ	integrin
ανβ3	integrin
ανβ5	integrin
ανβ6	integrin
ανβ8	integrin
10G2	Mab (monoklonális ellenanyag)
14.18G2a	Mab
14D9.F8	Mab
14Ε2	Mab
17Ε6	Mab
20Α9	Mab
23G5	Mab
3Α3	Mab
9.2.27	Mab
ADCC	ellenanyag által közvetített celluláris citotoxicitás
AECM	ellenanyag- és effektorsejtfüggő citosztatikus
AIIB2	Mab
AP3	Mab
ATCC	„American Type Culture Collection”
B16F10	sejtvonal
CP8	Mab
CSAT	Mab
cRGDfV	ciklikus peptid: Arg-Gly-Asp-DPhe-Val
cRGDfK	ciklikus peptid: Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys
EMM31	sejtvonal
G0H3	Mab
GRGDSPK	peptid: Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys
LM142	Mab
LM609	Mab
M2Í	sejtvonal
M21-L	sejtvonal
M21-L-IIb	sejtvonal
M21-L4	sejtvonal
MAb	monoklonális ellenanyag
MTT	3-(4-5-dimetil-tiazol-2-il)-2-5-difenil-tet- razolium-bromid
NBT-BCIP	„Nitro Blue Tetrazolium”-bróm-klór-indolil-foszfát
NP18	sejtvonal
OG	oktil-glükozid (detergens)
P1D6	Mab
P1H6	Mab
P4C10	Mab
P5H9	Mab
PMSF	fenil-metil-szulfonil-fluorid

HU 221 061 Β1

RGD	peptid: NH2-arginin-glicin-aszparaginsav-COOH
SDS-PAGE	nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamidgélelektroforézis
UCLAP-3	sejtvonal
WM164	sejtvonal
WM793	sejtvonal
V+B2	sejtvonal
1. táblázat

Ellenanyagokat hasonlítottunk össze ELISA- és sejtes ELISA-vizsgálattal. Az alkalmazott reagenseket és az ellenanyagok specifitását a későbbiekben részletesen ismertetjük. + =pozitív reakció, - = nincs reakció.

Jelölések magyarázata: ellenanyagok: a vizsgálatban jellemzett ellenanyagok (vastag betűvel szedve), standard reagensek (dőlt betűvel szedve). Immunogén: aVp3=immobilizált humánplacenta-eredetű aVp3-integrin. M21=intakt M21-sejtek. - Tisztított aV(33- és allbp3-integrineket immobilizáltunk 96 mélyületű ELISA-lemezeken, majd a lemezeken M21-, M21-Lés M21-L-IIb-, valamint UCLAP3-sejteket növesztettünk és fixáltunk, majd CELISA-eljárással vizsgáltuk a sejtek ellenanyag-reaktivitását.

- Specifitás: (lásd később, a kísérlet leírásánál) a=emlőseredetű integrinek aV-lánca. 200 kD=a melanomasejtek ismeretlen funkciójú 200 ezer molekulatömegű sejtfelszíni fehérjéje. aVp5=aVp5-integrin. βΐ =β1-integrál-lánc. P3=p3-integrin-lánc.

2. táblázat

A kontrolihoz (csak másodlagos ellenanyag) viszonyított reaktivitás szintjeit a következőképpen osztályoztuk: 1-2(-), 2-4(+), 4-9(++), >9(+ + +). Például M21-sejteken a kontroll fluoreszcens intenzitása tipikusan 30-50 egység volt, LM142-sejtek kötődése esetén ugyanez az intenzitás 300-500 egység körül volt, mely értékekből az átlagos relatív reaktivitás körülbelül 10-nek adódott (400/40).

(*) M21-L-sejteket 70% etanol hozzáadásával -20 °C-on permeabilizáltunk.

(@) M21-L-sejtekben felhalmozott intracelluláris VNR-integrin p3-láncok.

3. táblázat

Az M21- és M21-L-sejteket tripszin/EDTA-oldat alkalmazásával gyűjtöttük be, 17E6 ellenanyaggal és kontrollellenanyaggal inkubáltuk őket, majd a sejteket megmostuk és csupasz egerek farki vénájába injektáltuk. Hét héttel később az állatokat elpusztítottuk és tüdejüket megvizsgáltuk tumoros gócpontok kialakulásának vonatkozásában. A 17E6 ellenanyaggal végzett előkezelés csökkentette a kifejlődő tumoros gócpontok számát. M21-L-sejtek injektálása esetén is hasonló számú tumoros gócpont keletkezett (ezeken a sejteken nem található sejtfelszíni aV-integrin).

*=a kontrolihoz viszonyítva: nem ellenanyagfüggő.

1. ábra

M21- és M21-L jelű humán-melanomasejtekhez kötött a-Vellenanyagok és kontrollellenanyagokfluoreszcencia által aktivált sejtosztályozó berendezéssel (FACS) végrehajtott analízise. A sejteket 10 pg/ml elsődleges ellenanyaggal inkubáltuk, majd fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyaggal festettük őket, a számlálót propidium-jodiddal festettük, hogy a nekrotikus sejtek kapuzását („gating”) lehetővé teszük, és mintánként 10 000 sejtet analizáltunk. A nyitott csúcs a második rétegben lévő ellenanyag intenzitását mutatja önmagában. A zárt csúcs a specifikus elsődleges és másodlagos ellenanyagok együttes intenzitását mutatja. A függőleges tengelyen a sejtek csatornánkénti számát ábrázoltuk, a vízszintes tengelyen pedig az adott csatorna fluoreszcens intenzitásának logaritmusát. Az M21sejtek hordoznak felszíni aV-integrint, az M-21-Lsejtek nem. Az aV-ellenanyagok esetén talált festődésmintázata nagyon hasonló az LM142- (aV-specifikus) és az LM609-festődéshez (aVp3-specifiku). Ezek az ellenanyagok reagálnak M21-sejtekkel, de minimális reakciót mutatnak M21-L-sejtekkel. A 9.2.27 jelű ellenanyag a felszíni proteoglikánnal reagál. A 14E2 és 21H6 jelű ellenanyagok egy más szempontból nem meghatározott 200 kD molekulatömegű melanomasejtfelszíni fehérjét ismernek fel. Ezen ellenanyagok festődési mintázata különbözik az aV-ellenanyagok mintázatától. Ezek az ellenanyagok hasonlóképpen reagálnak mind M21-, mind pedig Μ-21-L-sejtekkel.

2. ábra

Az aV ellenanyagok hasonló fehérjéket képesek kicsapni (immunprecipitáció). Életképes Μ-21-melanomasejteket (A) felszínükön biotinnel jelöltünk, detergenssel extraháltuk őket, majd immunprecipitációnak vetettük alá, és a sejtfehérjéket 7,5%-os nem redukáló gélen SDS-PAGE-eljárásnak vetettük alá. A molekulatömeg-standardokat az a-sávban futtattuk, és a standardok molekulatömegét kD-egységekben baloldalt adjuk meg. Az immunkicsapást az LM142 jelű kontroliellenanyagokkal végeztük (anti-aV: a-sáv), valamint a következő ellenanyagokkal: LM609 (anti-aVp3: bsáv), 21H6 (c-sáv), 10G2 (d-sáv), 20A9 (e-sáv), 23G5 (f-sáv), 17E6 (g-sáv), 14D9 (h-sáv), valamint 14E2 (isáv). Az LM142 és LM609 jelű ellenanyagok hasonló fehérjemintázatot csapnak ki, mint a 10G2,20A9,23G5 és 17E6 jelű ellenanyagok, a 21H6 és 14E2 jelű ellenanyagok azonban egy körülbelül 200 kD molekulatömegű fehérjét csapnak ki. A 14D9 mindkét típusú fehérjéket kicsapja. M21 jelű melanomasejteket (B), M21-L jelű aVdeficiens melanomasejteket (C), valamint UCLAP-3sejteket (D) felszínükön biotinnal megjelöltünk, és immunprecipitációnak vetettük alá őket, az (A) kísérletben leírtakhoz hasonlóan. A kicsapást a következő ellenanyagokkal hajtottuk végre: LM142 (anti-aV: a-sáv), LM609 (anti\\aVp3: b-sáv), 17E6 (c-sáv), AP3 (antiβ3: d-sáv), valamint 20A9 (e-sáv). A molekulatömegmarkereket az a-sávtól balra lévő sávban futtattuk, és a megfelelő molekulatömegeket a bal oldalon tüntettük fel kD-egységekben. Az aV-, βΐ-, β3- és β5-láncoknak megfelelő fehérjecsíkokat megjelöltük.

3. ábra

A 17E6 ellenanyag gátolja a vitronektinhez történő kezdeti sejtkötődést. Melanoma- és karcinóma-sejtvonalakat vizsgáltunk át FACS-eljárással 17E6 ellen5

HU 221 061 Β1 anyaggal való reaktivitás vonatkozásában. Az FACSintenzitásokat a 2. táblázatban adtuk meg. A sejteket ezután tapadni engedtük vitronektinburkolt szubsztrátokhoz (0,5 pg/ml-es oldattal végzett burkolás), 17E6 ellenanyagot termelő hibridóma felülúszók jelenlétében (üres téglalapok), valamint 14E2 ellenanyagot termelő hibridóma felülúszó jelenlétében (tele téglalapok). A mosást követően a tapadt sejteket a kísérletes részben leírtak szerint megszámoltuk, és a kísérleti adatokat az ellenanyagok hiányában kapott tapadási értékekre normalizáltuk. A B16F10-sejtvonal kivételével (egérmelanoma-sejtvonal) valamennyi sejtvonal emberi eredetű volt. A MalMe3-sejtvonal egy fibroblasztsejtvonal. Ellenanyag hiányában a különböző sejtvonalak a következő tapadási értékeket adták abszolút százalékban megadva: M21: 70%, WM164 : 68%, A375: 75%, EMM31: 67%, WM793: 65%, MalMe3: 67%, B16F10: 70%, UCLA-P3: 76%, NP-18: 65%, SW1116: 68%, HT29: 65%. A vízszintes tengelyen a tapadási értékeket a kontroll százalékában adtuk meg.

4. ábra

A 17E6 ellenanyag megzavarja mind az αΡβ3-, mind pedig az aVfi5-integrinek által közvetített tapadást. Vitronektinnel burkolt (5 pg/ml) szubsztrátokon sejttapadást mértünk, oly módon, hogy a sejteket monoklonális ellenanyagokkal (Mab) vagy egéraszticesszel együttesen inkubáltuk. Az ábra különböző részein a következő sejtvonalakra vonatkozó adatokat ábrázoltuk: A, B: M21; C,D: UCLAP-3; E, F: WM-793. Az ábrákon a jelek a következő ellenanyagokat (specifitásokat) jelentik: fekete kör=17E6 (aV); fekete háromszög=LM609 (ανβ3); csúcsán álló teli négyzet=14D9.F8 (aV); üres kör=P4C10 (βΐ); üres négyzet=P5H9 (ανβ5); csúcsán álló üres háromszög=P5H9+LM609 [a hígítás kiinduló koncentrációja: 10 pg/ml] (ανβ3+ανβ5). Függőleges tengely: feltapadt sejtek (%). Vízszintes tengely: bal oldal: Mab (pg/ml), jobb oldal: aszciteszhígítás (1/x).

5. ábra

A 17E6 ellenanyag megzavarja a vitronektinhez történő kötődést, de az egyéb mátrixkomponensekhez történő kötődést nem. Az ábrán látható kísérletben a 17E6 ellenanyag (aV, fekete kör) és a P4C10 ellenanyag (βΐ, üres kör) hatását vizsgáltuk vitronektinhez (A), lamininhoz (B), vagy I. típusú kollagénhez (C) történő tapadásra. A 17E6 ellenanyag kizárólag VN-burkolt felületekhez gátolta a sejtek tapadását. A P4C10 ellenanyag viszont csak az I. típusú kollagénnel és lamininnal burkolt felületekhez gátolta a sejttapadást. Vízszintes tengely: P4C10-hígítás (1/x; felső tengely) és Mab (pg/ml; alsó tengely); függőleges tengely: sejttapadás (%)·

6. ábra

A 17E6 ellenanyag megszünteti a kialakult sejt-vitronektin kapcsolatokat. M21- melanomasejteket 24 órán keresztül tapadni engedtünk vitronektinnel (VN - felső sor) és fibronektinnek (FN - alsó sor) burkolt felületekhez. A sejtek 30 perc alatt feltapadtak a felületre és jól szétterjedtek, majd 24 óra alatt proliferálni kezdtek (a, e). Ekkor a táptalajhoz 17E6 ellenanyagot adtunk (b, f). A vitronektinnel burkolt felszínen (d) 30 perc inkubációt követően a sejtek kör alakúvá váltak, a fibronektinnel burkolt felszínnel (f) azonban szétterjedt állapotban maradtak. Az LM609 ellenanyag (c, g) és a 14E2 ellenanyag (d, h) egyik szubsztráton sem mutatott jelentős hatást. Az alkalmazott ellenanyagkoncentrációk a következők voltak: b: 0,1 pg/ml, c, d, f, h: 100 pg/ml.

7. ábra

Az aV-integrinek modulálják az M21 típusú humánmelanoma kifejlődését BALB/c jelű csupasz egerekben. AB: a 17E6 ellenanyag hatása az M21- melanoma szubkután kifejlődésére. 0,5x10® M21-sejtet (A) vagy M21-L-sejtet (B) pufferrel (üres kör), 17E6 ellenanyaggal (telekor) vagy 14E2 ellenanyaggal (talpán álló üres háromszög) inkubáltunk, majd a sejteket egyidejűleg szubkután csupasz egerekbe injektáltuk. Mértük a kialakult tumor méreteinek időbeli változását, és a grafikonon ábrázoltuk a tumor térfogatát. Az ábrán egy tipikus kísérlet eredményeit láthatjuk. A függőleges hibavonalak a csoportonként nyolc állatot tartalmazó kísérlet eredményeinek szórását jelzik. Függőleges tengely: tumortérfogat (mm³), vízszintes tengely: injektálás után eltelt napok.

C : Az a V-integrinek hatása kísérleti M21- metasztázisra. M21- (csúcsán álló fekete négyzet, csúcsán álló üres négyzet) és M21-L-sejtekből (fekete négyzet, üres négyzet) 0,32 χ 10® (csúcsán álló fekete négyzet, fekete négyzet) vagy 1 χ 10® darabot (csúcsán álló üres négyzet, üres négyzet) csupasz egerek farki vénájába injektáltunk. A jelzett időpontban egy csoport állatot elpusztítottunk és tüdejükben megszámoltuk a kialakult tumoros gócokat. Valamennyi M21- egeret a 42. napon pusztítottunk el. Az M21-L-egerekből 3-6 darabot pusztítottunk el minden egyes időpontban. Az M21egerek tüdejében hat hét elteltével olyan sok tumoros gócpont alakult ki, hogy nem lehetett már megszámolni > >250 tüdőnként), ezért a T-statisztikát abból a hipotézisből kiindulva készítettük el, hogy az M21-L-csoport ugyanabból a populációból való, mint a kontroll M21csoport a 42. napon <0,1 szinten (**) vagy <0,02 szinten (*). Amelyik esetben mind a sok sejttel, mind a kevés sejttel injektált csoportok azonos eredményt adtak, csak az egyik értéket mutatjuk. Az oszlopok a csoportonkénti átlagos tumorszámot mutatják. Függőleges tengely: metasztázis/tüdő; vízszintes tengely: injektálás után eltelt napok.

8. ábra

A 17E6 ellenanyag nem citotoxikus. A: a 17E6 ellenanyag hatása M21-sejtek proliferációjára. 5 x1ο⁴ M21-sejtet oltottunk le DMEM/FCS-hordozókban (üres kör), valamint 50 pg/ml 17E6- (fekete kör) és 14E2 ellenanyag jelenlétében (talpán álló üres háromszög), és a sejteket naponta megszámoltuk. Az ellenanyagok jelenléte nem befolyásolta a proliferáció kinetikáját és a telítési sűrűséget. Függőleges tengely: sejtszám; vízszintes tengely: eltelt napok száma.

B: Az M21 -sejtek 17E6-függő lízise mikrogliális sejtek hatására. Timidinnel jelölt M21-sejteket összekevertünk BALB/c-eredetű agyi mikrogliális makro6

HU 221 061 Β1 fágokkal, a reakcióelegyekhez sorozatban hígított ellenanyagokat adtunk, és inkubációt követően mértük a timidinfelszabadulást. Kontrollok: talpán álló üres háromszög: M21-sejtek önmagukban; csúcsán álló teli négyzet: M21 + 17E6 (100 nm/1); csúcsán álló üres négyzet: M21 + 14,18G2a; talpán álló fekete háromszög: M21 + mikrogliális sejtek. Eredmények: átlag±s. d. (n=6). Kísérleti értékek: fekete kör: M21 + mikrogliális sejtek + 17E6; üres négyzet: M21 + mikrogliális sejtek + 14,18G2a. A 17E6 ellenanyag nem indukált ellenanyagfüggő sejtlízist. Eredmények: átlag±s. d. (n=3). Függőleges tengely: citotoxicitás (%); vízszintes tengely: ellenanyag-koncentráció (mol/1).

C: Mikrogliális sejtek által előidézett 17E6-föggő M21-citosztázis. M21-sejteket inkubáltunk mikrogliális sejtek és sorozatban hígított ellenanyag jelenlétében, majd [H³]-timidinnel pulzusjelöltük, a DNS-szintézis mérése céljából. A timidinbeépülést ([H³]-thy) mértük. Az alkalmazott jelek jelentése megegyezik a B. pontban leírttal. Említésre érdemes az effektorsejtek önmagukban kifejtett citosztatikus aktivitása (talpán álló fekete háromszög). A kísérleti eredmények mikroszkópos kiértékelése során megállapítottuk, hogy a homogénen mikrogliális sejteket tartalmazó régiókban, amennyiben a 14.18G2a koncentrációja > vagy=volt 10-¹⁰ mol/l-rel, egyetlen M21-sejt sem maradt életben. Függőleges tengely: [H³]-timidinbeépülés (cpmx 10³); vízszintes tengely: ellenanyag-koncentráció (mol/1).

9. ábra

A 17E6 ellenanyag nem befolyásolja az M21-sejtek DNS-szintézisét. A következő sejtvonalakat tenyésztettük: A: M21; B: M21-L; C: M21-L4; D: M21LgpIIb, és a jelzett koncentrációkban a sejtekhez puffért (üres kör), 17E6 ellenanyagot (fekete kör), LM609 ellenanyagot (talpán álló fekete háromszög) és 14E2 ellenanyagot (talpán álló fekete háromszög) adtunk. A B és D ábrán feltüntettük a rutinszerűen alkalmazott pozitív kontrollkísérlet (taxol: csúcsán álló üres rombusz) eredményeit is. 48 óra elteltével a sejteket pulzusjelöltük [H³]-timidinnel, és mértük a beépült radioaktivitást. Az ellenanyagok nem hatottak a DNSszintézisre. A taxol ezzel szemben teljes mértékben gátolta azt. 90 pg/ml=600 nmol (csakúgy, mint a 8. ábrán). Függőleges tengely [H³]-timidinbeépülés (cpmxlO³); vízszintes tengely: Mab-koncentráció (pg/ml).

10. ábra

A 17E6 ellenanyag és fragmensei ELlSA-vizsgálata tisztított aV$3-integrinnel burkolt felületen. A jelzett koncentrációkban 17E6 ellenanyagot (talpán álló üres háromszög), F(ab’)₂-fragmensét (üres kör) és F(ab’)₂ffagmensét (üres négyzet) inkubáltunk 1 pg/ml koncentrációban aVp3-integrinnel burkolt ELISA-lemezeken, és az ellenanyag kötődését kimutattuk. Függőleges tengely: optikai denzitás (OD) 450 nm-en mérve; vízszintes tengely: ellenanyag-koncentráció (log₁₀ pg/ml).

11. ábra

A 17E6 ellenanyag F(ab)₂-fragmense gátolja az αΡβ7- és a a.V$5-integrin által közvetített sejttapadást, de nem gátolja az aV$3-integrin által közvetített sejttapadást. A jelzett sejteket tapadni engedjük 5 mg/ml vitronektinnel burkolt felülethez, a jelzett koncentrációjú 16E6 ellenanyag, F(ab’)₂- és F(ab’)-fragmense jelenlétében. A sejtek tapadásának mértéke az összes sejtek százalékában kifejezve körülbelül 85% (VM164) és körülbelül 50% (V+B2) között mozgott. Függőleges tengely: maximális sejttapadás százaléka; vízszintes tengely : ellenanyag-koncentráció (pg/ml).

12. ábra

Az M21-sejtek vitronektinhez történő tapadását gátolja a keresztkötő 17E6-F(abj. M21-sejtek vitronektinhez történő tapadása közben (a 4. és 11. ábra magyarázatában leírtakhoz hasonlóan) 17E6-F(ab’)-fragmenseket és teljes AP3 ellenanyagokat együtt inkubáltunk a jelzett koncentrációjú keresztkötő antiegér második ellenanyaggal a következő koncentrációkban: 0 pg/ml (üres kör), 0,1 pg/ml (csúcsán álló üres háromszög), 1,0 gg/ml (üres négyzet), és 10 pg/ml (talpán álló üres háromszög). A keresztkötő ellenanyag azonos ELISAaffinitást mutatott a 17E6-F(ab’), és az AP3 ellenanyag vonatkozásában (kísérleti adatokat nem közlünk). Függőleges tengely: optikai denzitás (OD) 405 nm-nél mérve; vízszintes tengely: antiegér kecskeellenanyagkoncentráció (pg/ml).

13. ábra

Direkt kompetíciós vizsgálati eljárás során a ligandum-aktívhelymimetikumok és a vitronektin versenyeznek egymással az aV$3-hoz történő kötődésben. αλ/β3mal burkolt tálcákon vitronektin (csúcsán álló üres háromszög), GRGDSPK-peptid (üres kör, fekete kör) és cRGDfV-peptid (csúcsán álló teli négyzet, csúcsán álló üres rombusz) növekvő koncentrációit együtt inkubáltuk biotinilált vitronektinnel (1 pg/ml=l,5 nmol), valamint egy biotinilált cRGDfV-származékkal (cRGDfKbio: 50 nmol/1). A megkötődött biotint antibiotin ellenanyaggal mutattuk ki. Az ábra azzal a feltételezéssel készült, hogy az egy kötőhelyű multimer vitronektin M_rértéke 0,65 MD. Függőleges tengely: kötött ligandum százalékosan megadva; vízszintes tengely: peptid/VN (log[pmol/lj).

14. ábra

Közvetlen kompetíciós vizsgálati eljárásban a 17E6 ellenanyag nem versenyez a vitronektinnel, az a.V$3-hoz való kötődésben. aVp3-mal burkolt tálcákban együtt inkubáltunk biotinilált vitronektint (1 pg/ml) 17E6 ellenanyag (fekete kör), egyéb antiανβ3 ellenanyagok (üres négyzet, csúcsán álló rombusz, csúcsán álló háromszög, talpán álló háromszög, és a cRGDfV-ligandum-mimetikum (csúcsán álló teli négyzet) növekvő koncentrációival. A megkötődött biotint antibiotin ellenanyag alkalmazásával mutattuk ki (a 17E6 ellenanyag telítési profilját a 10. ábrán láthatóval azonos ανβ3-burkolási körülmények között vettük fel). Függőleges tengely: kötött VN-(%); vízszintes tengely: Mab-koncentráció (pg/ml) - cRGD-koncentráció (pmol/l).

75. ábra

Előblokkolásos kompetíciós vizsgálati eljárásokban a ligandumok és az aktívhely-mimetikumok nem versenyeznek az ellenanyagokkal az aV$3-hoz történő kötő7

HU 221 061 Β1 désben. aVp3-burkolt tálcákon egy órán keresztül inkubáltuk vitronektin (VM, üres kör), fíbrinogén (FG, csúcsán álló üres háromszög), fibronektin (FM, üres négyzet), cRGDfV (66203, talpán álló fekete háromszög), és a jelzett ellenanyagok (csúcsán álló fekete négyzet) növekvő koncentrációit, majd a tálcákat biotinnal jelölt ellenanyaggal (1 pg/ml) reagáltattuk (mosás nélkül). A megkötődött biotin jelenlétét kimutattuk. A 100% kötöttellenanyag-érték azt jelzi, hogy a kompetítor jelzett koncentrációja esetén ugyanannyi ellenanyag kötődött, mint a kompetítormentes kontrolikísérletben. A ligandumok nem befolyásolták az ellenanyagkötődést. Függőleges tengely: jelzett ellenanyag kötődése (%); vízszintes tengely (bal és jobb oldal): ligandumkoncentráció (pg/ml).

16. ábra

Előblokkolásos vizsgálati eljárásban az ellenanyagok versenyeznek egymással az aV^3-hoz történő kötődésben. aVp3-burkolt tálcákat előinkubáltunk a következő ellenanyag növekvő koncentrációival: 17E6 (fekete kör), LM609 (csúcsán álló üres háromszög), AP3 (üres négyzet), valamint 14D9.F8 (talpán álló üres háromszög), majd a tálcákat biotinilált ellenanyaggal (1 pg/ml) reagáltattuk (mosást nem végeztünk). A megkötődött biotin jelenlétét kimutattuk. A kötött ellenanyag 100%-os értéke azt jelzi, hogy a kompetítor adott koncentrációjánál ugyanolyan mértékű volt az ellenanyag kötődése, mint kompetítor nélkül. A vizsgált ellenanyagok keresztkompetíciós csoportokban versenyeznek egymással. Függőleges tengely: jelzett ellenanyag kötődése (%); vízszintes tengely (bal és jobb oldal) : ellenanyag-koncentráció (pg/ml).

17A., B. ábra

A 17E6-Mab variábilis régióinak (Fv) cDNS-szekvenciája. Könnyűlánc: VL17E6 (a) és nehézlánc VH17E6 (b). Az ábrán látható a variábilis régiók (a szignálszekvenciát is beleértve) teljes nukleotidszekvenciája és az abból kikövetkeztetett aminosavsorrend. A szignálszekvenciákat vastag betűs szedéssel jelöltük; a CDR-szekvenciákat dőlt betűvel szedtük. A nehézlánc szerkezete a IIB-csoport sajátságait mutatja, a könnyűlánc szerkezete pedig a kappa-V-csoportba sorolható, a Kabat-rendszerezés szerint.

18. ábra

A klónozási eljárás vázlata. A 17E6 ellenanyag nehéz- és könnyűláncainak Fv-doménjeit kódoló mRNS-t 17E6-termelő hibridómasejtekből extraháltuk, átírtuk cDNS-sé, majd a variábilis régiókat kódoló DNS-t PCR-eljárással amplifikáltuk. Az amplifíkált DNS-t azután megklónoztuk és megszekvenáltuk.

A leírásban idézett publikációk jegyzéke:

Albelda, S. M., et al. (1990), Cancer Rés. 50, 6757-6764.

Bhattacharya, S. et al. (1995) J. Bioi. Chem. 270: 16781-16787.

Brooks, P. C. et al. (1994), Science 264, 569-571. Buck, C., et al., (1990), Cell Differ. Dev. 32, 189-202. Busk, M. et al. (1992), J. Bioi. Chem. 267, 5790-5796. Carter, W. G. et al. (1990), J. Cell Bioi. 110, 1387-1404.

Chan, B. M. and Hemler, Μ. E. (1993), J. Cell Bioi. 120, 537-543.

Charo, I. F. et al. (1990), J. Cell Bioi. 111, 2795-2800. Cheng, Y. F. et al. (1991), Exp. Cell Rés. 194, 69-77. Cheresh, D. A. et al. (1987), J. Cell Bioi. 105, 1163-1173.

Cheresh, D. A. et al. (1989), Cell 57, 59-69.

Cheresh, D. A. (1991), Cancer Metastasis Rév. 10, 3-10. Cheresh, D. A. and Harper, J. R. (1987), J. Bioi. Chem. 262, 1434.

Cheresh, D. A. and Spiro, R. C. (1987), J. Bioi. Chem. 262, 17 703.

Cherny, R. C. et al., 1993, J. Bioi. Chem. 268, 9725-9729.

Chirgwin, J. M. et al. (1979), Biochemistry 18, 5294-5299.

Chuntharapai, A. et al. (1993), Exp. Cell Rés. 205, 345-352.

Dánén, E. H. et al. (1993), Int. J. Cancer 54, 315-321. de Boer, H. C. et al. (1993), J. Bioi. Chem. 268, 1279-1283.

Delwel, G. O. et al. (1993), J. Bioi. Chem. 268, 25 865-25 875.

Denhardt, D. T. and Guo, X. (1993), FASEB J. 7, 1475-1482.

Diamond, M. S. and Springer, T. A. (1994), Current Biology 4, 506.

Dougall, WC., 1994, Oncogene, 9: 2109-23.

Etoh, T. et al. (1992), J. Dermatol. 19, 841-846. Felding-Habermann, B. et al. (1992), J. Clin. Invest. 89, 2018-2022.

Fidler, I. J. (1986), Cancer Metastasis Rév. 5, 29-49. Fidler, I. J. (1988), Isr. J. Med. Sci. 24, 456-463. Furihata, K. et al. (1987), J. Clin. Invest. 80, 1624-1630.

Gehlsen, K. R. et al. (1992), Clin. Exp. Metastasis 10, 111-120.

Goodman, S. L. et al. (1991), J. Cell Bioi. 113, 931-941.

Gussow, D. and Clackson, T. (1989), Nucleic. Acids. Rés. 17, 4000.

Haba, S. et al. (1985), J. Immunoi. 134, 3291-3297. Hall, D. E. et al. (1990), J. Cell. Bioi. 110, 2175-2184. Herdan, I. et al. (1993), Int. J. Cancer 55, 1023-1028. Harel, W. et al. (1990), Cancer Rés. 50, 6311-6315. Harlow, E. and Lane, D. (1988). Antibodies - a laboratory Manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory).

Hart, I. R. et al. Birch (1991), Cancer Metastasis Rév. 10, 115-128.

Herlyn, D. et al. (1985), Cell Immunoi. 92, 105-114. Herlyn, D. et al. (1990), Cancer Rés., 50, 2296-2302. Humphries, M. J. et al. (1986), Science 233, 467-470. Humphries, M. J. et al. (1988), J. Clin. Invest. 81, 782-790.

Hynes, R. O. (1992), Cell 69, 11-25.

Jones, S. T. and Bendig, Μ. M. (1991), Biotechnology, 9, 88-89.

Kábát, E. A. et al. (1987), US dept. health and humán Services, US gouvemment Printing offices).

HU 221 061 Β1

Kazal, L. A. et al. (1963), Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 113, 989-994.

Kieffer, N. et al. (1991), J. Cell Bioi. 113, 451-461. Korhonen, M. et al., (1991), Láb. Invest. 65, 347-356. Landegren, U. (1984), J. Immunoi. Methods 67, 379-388.

Lehmann, M. et al. (1994). Cancer Research 54, 2102-2107.

Lessey, B. A. et al. (1992), J. Clin. Invest, 90, 188-195.

Liotta, L. A. et al. (1991), Cell 64, 327-336.

Marshall, J. F. et al. (1991), Int. J. Cancer 49, 924-931.

Melvaer, K. L. and Fystro, D. (1982), Appl. Environ. Microbiol. 43, 493-494.

Mosmann, T. (1983), Methods 65, 55-63.

Moyle, M. et al. (1991), J. Bioi. Chem. 266, 19 650-19 658.

Mujoo, K. et al. (1989), Cancer Rés. 49, 2857-2861. Natali, P. G. et al. (1993), Int. J. Cancer 54, 68-72. Neff, N. T. et al. (1982), J. Cell Bioi. 95, 654-666. Nesbitt, S. et al. (1993), J. Bioi. Chem. 268, 16 737-16 745.

Orlando, R. A. and Cheresh, D. A. (1991), J. Bioi. Chem. 266, 19 543.

Panetti, T. S. and McKeown Longo, P. J. (1993a), J. Bioi. Chem. 268, 11 988-11 993.

Panetti, T. S. and McKeown Longo, P. J. (1993b), J. Bioi. Chem. 268, 11 492-11 495.

Paulsson, M. et al. (1987), Eur. J. Biochem. 166, 11-19.

Pignatelli, M. et al. (1992), Hűm. Pathol. 23, 1159-1166.

Poste, G. et al. (1980), Cancer Rés. 40, 1636-1644. Preissner, K. T. (1991), Annu. Rév. Cell Bioi. 7, 275-310.

Pytela, R. et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5766-5770.

Pytela, R. et al. (1986), Science 231, 1559-1562. Rodeck, U. et al. (1985), J. Immunology 134, 1300-1304.

Ruoslahti, E. et al., (1982), Methods Enzymol. 82 PtA, 803-831.

Ruoslahti, E., (1991), J. Clin. Invest. 87.

Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning, a laboratory Manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Sanders, L. C. et al. (1992), Cold Spring Harb. Symp. Quant. Bioi. 57, 233-240.

Sanger, F. et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463.

Seftor, R. E. et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1557.

Si, Z. and Hersey, P. (1994), Pathology. 26, 6-15. Smith, J. W. et al. (1990), J. Bioi. Chem. 265, 11 008-11013.

Smith, J. W. and Cheresh, D. A. (1988), J. Bioi. Chem. 263, 18 726.

Smith, J. W. and Cheresh, D. A. (1990), J. Bioi. Chem. 265, 2168.

Sonnenberg, A. et al. (1987), J. Bioi. Chem. 262, 10 376-10 383.

Sonnenberg, A. et al. (1988), Natúré (London) 336, 487-489.

Sonnenberg, A. (1993), Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 184, 7-35.

Stetler Stevenson, W. G. et al. (1993), Annu. Rév. Cell Bioi. 9, 541.

Stockmann, A. et al. 1993, J. Bioi. Chem. 268: 22 874-22 882.

Sutter, A. et al. (1991), Pathobiology 59, 254-258. Takada, Y. et al. (1987), J. Cell. Biochem. 37, 385-393.

Tao, Μ. H. and Morrison, S. L. (1989), J. Immunoi. 143, 2595-2601.

Towbin, H. et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.

Tumer, D. C. et al. (1989), J. Neurosci. 9, 3287-3296. Wayner, E. A. et al. (1991), J. Cell Bioi. 113, 919-929. Wayner, E. A. and Carter, W. G. (1987), J. Cell Bioi. 105, 1873-1884.

Wickham, T. J. et al. (1993), Cell 73, 309-319. Yatohgo, T. et al. (1988), Cell Struct. Funct. 13, 281-292.

Az a-V-csoporthoz tartozó monoklonális ellenanyagok reagálnak az a V-integrin-lánccal

Tisztított aVp3-mal és allbp3-mal burkolt felületen végzett ELISA-eljárással azonosítottunk öt ellenanyag-termelő kiónt, melyek specifikusan reagáltak aVp3-mal: 17E6, 20A9, 23G5, 14D9.F8, 10G2 (1. táblázat). Ezeket a monoklonális ellenanyagokat „aV-csoportnak” neveztük el. Valamennyi ellenanyag IgGl-izotípusú volt. Ugyanebben az ELISA-vizsgálati eljárásban az ismert specifitású antiintegrin ellenanyagok az irodalomban leírtak szerint viselkedtek (1. táblázat). A következő specifitású antiintegrin ellenanyagokat vizsgáltuk: aVp3-komplex (LM609), aV-láncok (LM142), ανβ5-komplex (P5H9), allbp3-komplex (CP8), P3-láncok (AP3), valamint βΐ-láncok (P4C10). Rögzített sejtekkel végrehajtott ELISA-eljárással („CELISA”) kimutattuk, hogy az aV-csoporthoz tartozó ellenanyagok egyértelműen az aV-integrin-láncok ismerik fel, és nem kötődnek a β3-, β5-, βΐ- vagy egyéb α-láncokhoz (1. táblázat). A következő integrineket kifejező sejteket alkalmaztuk az eljárásban: ανβ3 és ανβ5 (M21), ανβ5, de ανβ3 nem (UCLAP3), sem ανβ3, sem ανβ5 (M21-L), valamint αΙΠ>β3 (M21-LIlb). Ezek az eredmények alátámasztották a tisztított receptorokkal végzett ELISA-vizsgálatok eredményeit. A fent leírt szűrővizsgálat során izoláltunk olyan ellenanyagokat is, melyek β3- és GpIIb-specifikusak voltak (kísérleti adatokat nem közlünk) és ezek az ellenanyagok világosan elkülöníthető módon reagáltak, mint az aV-csoporthoz tartozó ellenanyagok. A 17E6, 14D9.F8,20A9 és 23G5 jelű ellenanyagok hasonló affinitással kötődtek az ανβ3-1ιοζ. Az 50%-os kötődést körülbelül 10-20 ng/ml koncentrációnál értük el (=50-100 pmol/1, hasonló, mint az LM609 esetén mért érték). A 10G2 ellenanyag az LM142 ellenanyaghoz hasonlóan kötődött, de tízszer kisebb affinitással.

HU 221061 Β1

A CP8 ellenanyag és a 14E2 ellenanyag (lásd alább) egészen 100 nmol/l-es koncentrációig minimális mértékben kötődött sorrendben allbp3-hoz, illetve ανβ3hoz.

Az aV-ellenanyagcsoport aV-integrineket felismerő képességét FACS-eljárással vizsgáltuk (1. ábra; 2. táblázat), valamint felszínükön jelzett sejtek immunkicsapásos vizsgálatával (2. ábra). Az FACS-analízis során (1. ábra) az aV-integrint expresszáló sejtvonal (M21) erősen reagált a következő ellenanyagokkal: 17E6, 14D9.F8, 20A9, 23G5, valamint az LM142 és LM609 jelű aV-integrinekhez kötődő ellenanyagokkal, közepesen erősen reagált a 10G2 ellenanyaggal, és reagált a 14E2 és 21H6 jelű kontrollellenanyagokkal, valamint a 9.2.27 jelű ellenanyaggal. Ezzel szemben az aV-deficiens variáns sejtvonal (M21-L) gyengén reagált az aV-csoporthoz tartozó ellenanyagokkal, valamint az LM142 és az LM609 jelű ellenanyagokkal, de a 14E2-21H6 és 9.2.27 ellenanyagokkal hasonló mértékben reagált, mint az M21-sejtvonallal. Az M21-Lsejtekben intracellulárisan találhatók p3-alegységek, melyeket az FACS-eljárással csak abban az esetben lehetett kimutatni, ha a sejteket permeabilizáltuk (2. táblázat). FACS-eljárással vizsgálva az M21-L4-sejtvonal (M21-L-sejtek, aV-integrin-génnel újra transzfektálva; Felding-Habermann és munkatársai: 1992) az aV-csoport ugyanúgy reagált, mint az M21-sejtekkel. A kizárólag vektorral transzfektált kontrollsejtek, az M21-L12sejtek, valamint a GpIIb-transzfektánsok, az M21-LIlb-sejtek (Kieffer és munkatársai: 1991) nem reagáltak az aV-csoporthoz tartozó ellenanyagokkal (1. táblázat). Az UCLAP3 jelű adenokarcinóma-sejtvonal reagált az aV-csoporttal, az LM142 és P5H9 jelű ellenanyagokkal, de nem reagált az LM609 ellenanyaggal. Az UCLAP3-sejtek nem expresszálnak p3-alegységet (lásd a bevezető részt). A VM793 jelű melanomasejtvonal ugyanolyan reakciómintázatot mutatott, mint az M21-sejtek. M21-sejtek immunprecipitációs szűrővizsgálata során az aV-csoport azonos immunprecipitációs mintázatot adott az LM142 ellenanyaggal (anti-aV), valamint az LM609 ellenanyaggal (anti-aVp3; 2A. ábra). 92 kD molekulatömegnél egy erős széles csíkot kaptunk, valamint egy gyengébb csíkot körülbelül 145 kD molekulatömegnél, és körülbelül 100 kD molekulatömegnél gyenge kisérőcsíkok is megfigyelhetők voltak, ez a mintázat a felszínükön jelölt ανβ3- és aVp5-integrinekre jellemző (Wayner és munkatársai: 1991). M21-L-sejtekkel végzett precipitációs kísérletekben egyetlen aV-csoporthoz tartozó ellenanyag sem képzett csapadékot (a 17E6 és 20A9 ellenanyagra vonatkozó kísérleti adatokat mutatjuk be), és az LM142 és LM609 ellenanyagok sem reagáltak (2C. ábra). A βΐ-specifikus ellenanyagok mindkét fenti sejtvonal esetén hasonló precipitációs mintázatot adtak. M21-Lsejtek esetében az anti^3-ellenanyagokkal végzett kicsapás során egy körülbelül 92 kD molekulatömegű csíkot kaptunk, a permeábilis (lehetséges, hogy nekrotikus) sejtekben található intracelluláris jelzett β3alegységeknek köszönhetően. Az UCLAP3-sejtek (2D. ábra) nem képeztek csapadékot az LM609 ellenanyaggal, de az aV-csoport és az LM142 ellenanyag hatására (2D. ábra) kicsapódott egy körülbelül 95 kD/145 kD molekulatömegű komplex. Összegezve elmondhatjuk, hogy az ELISA-, CELISA-, FACS- és immunprecipitációs vizsgálatok mindegyike egymással konzisztens reakciómintázatot adott, és a kapott eredmények világosan arra utalnak, hogy az aV-csoporthoz tartozó monoklonális ellenanyagok a humán aV-integrin-láncok extracelluláris doménjeivel reagálnak.

A 17E6 ellenanyag erős fimkciógátló ellenanyag

A 17E6 ellenanyag képes módosítani az aV-ligandumokhoz történő kezdeti sejttapadást. Az aV-integrinek vitronektin-receptorként képesek működni, ezért az aV-csoporthoz tartozó ellenanyagokat szűrővizsgálatnak vetettük alá, abból a szempontból, hogy hatással vannak-e a sejtek tapadására vitronektinszubsztrátokhoz. Az FACS-eljárással végrehajtott integrinanalízis után a sejteket tapadásvizsgálati eljárással teszteltük (2. táblázat, 3. ábra). Az FACS-eljárás során a humánmelanoma- és -karcinómasejtek egymáshoz hasonlóan reagáltak az aV-csoporthoz tartozó ellenanyagokkal. A 17E6 ellenanyag reakcióit a 3. ábrán foglaltuk össze. Azon sejtek vitronektinhez történő kezdeti tapadását a 17E6 ellenanyag erősen gátolta, mely sejtek az FACSeljárás során reagáltak a 17E6 ellenanyaggal, a konrollellenanyag (14E2) viszont csak kismértékben befolyásolta a kezdeti tapadást (3. ábra). Az aV-csoport egyét tagjai nem voltak ilyen hatásos blokkolók (kísérleti adatokat nem közlünk). A B16F10 jelű egérsejtek rendkívül erős vitronektinhez történő tapadását a 17E6 ellenanyag nem befolyásolta, és a B16F10-sejtek nem reagáltak a 17E6 ellenanyaggal FACS-eljárásban. Ahogy az várható volt (Cheres és Harper: 1987), a B16F10sejtek vitronektinhez történő tapadása érzékenynek mutatkozott RGD-peptidek mikromólos koncentrációira, amiből arra lehet következtetni, hogy ezen sejtek felszínén funkcionális a\^3-integrin található (SLG és B. Diefenbach). Az ismertetett eredményekből az következik, hogy a 17E6 ellenanyag és az aV-csoporthoz tartozó többi ellenanyagok humán aV-integrinnel reagálnak, egéreredetű aV-integrinekkel viszont nem. A 17E6 ellenanyag sejttapadásra kifejtett hatását tovább vizsgáltuk. A 17E6 ellenanyag blokkolta az M21sejtek vitronektinhez történő tapadását (körülbelül 85%-ban), az IC₅₀-érték körülbelül 0,1 gg/ml-nek adódott (4A. ábra). A találmány szerinti megoldás összhangban van korábbi publikációkkal (Wayner és munkatársai: 1991), abban a tekintetben, hogy az M21sejtek tapadását aVp3-elleni (Lm609) és ανβ5-β11βηί (P5H9) ellenanyagok önmagukban gyengén blokkolták, a gátlás azonban erősnek mutatkozott, amennyiben a fenti ellenanyagokat együttesen alkalmaztuk (4A., 4B. ábra). Az anti^l-integrin ellenanyagok (P4C10) nem befolyásolták az M21-sejtek vitronektinhez történő tapadását (4B. ábra). Az UCLAP3- és VM793-sejtvonalak tapadnak vitronektinhez, és ezt a tapadást a 17E6 ellenanyag gátolja, csakúgy, mint az ανβ5specifikus (P5H9/UCLAP3) és a\^3-specifikus (LM609/VM793) komplementer ellenanyagok (4C., 4F. ábrák). aV35-integrinnel szemben (UCLAP3) a

HU 221 061 Β1

17E6 ellenanyag IC₅₀-értéke körülbelül 30 ng/ml-nek adódott. Ugyanez az érték VM793-sejteken mérve körülbelül 60 ng/ml-nek, LM609-sejteken mérve pedig körülbelül 600 ng/ml-nek adódott. Az UCLAP3-sejtek expresszálnak aVp5-integrint, de nem expresszálnak aVp3-at (Wayner és munkatársai: 1991), a VM793sejtek ugyanakkor nagy mennyiségű aVp3-integrint expresszálnak (1. táblázat). A 17E6 ellenanyag gátlóspecifitását megerősítette az a tény, hogy a 17E6 ellenanyag nem fejt ki hatást sejtek tapadására egyéb mátrixszubsZtrátokhoz (5. ábra). A P4C10 ellenanyag (anti-βΐ) megszüntette M21-sejtek tapadását lamininhez és kollagénhez. A sejtek fenti két szubsztráthoz történő tapadását feltehetőleg βΐ-integrinek közvetítik (Sonnenberg és munkatársai: 1988; Takada és munkatársai: 1987).

A biokémiai kísérleti eredményekkel összevetve a fenti kísérleti eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy a 17E6 ellenanyag különböző integrinkomplexek aV-láncaihoz kötődik, és ily módon gátolja azok ligandumaikkal kialakuló kölcsönhatásait.

A 17E6 ellenanyag indukálja az a.V-integrinek által közvetített, kialakult sejt-mátrix kölcsönhatások megszűnését

A következő lépésben azt vizsgáltuk, hogy a 17E6 ellenanyag meg tudja-e bontani a már kialakult sejt-mátrix kölcsönhatásokat. Amennyiben kis koncentrációkban (körülbelül 0,1 pg/ml) 17E6 ellenanyagot adtunk M21-sejtekhez, az ellenanyag határozott sejtkerekedést idézett elő 0,5-1 órás 37 °C-os inkubálás után, még abban az esetben is, amikor az ellenanyag hozzáadását 24 órás tapadás előzte meg (6. ábra). Az ellenanyag hatása teljesen reverzibilisnek bizonyult, és amennyiben az ellenanyagot a tenyészetből kimostuk, a sejtek 48 órán belül újra szétteqedt alakot vettek fel. Ezzel szemben az LM609 és 14E2 ellenanyagok a feltapadt sejtek morfológiájára még nagy koncentrációban is (100 pg/ml) csak csekély hatással voltak. Az ellenanyagok még 100 pg/ml-es koncentrációban sem fejtettek ki morfológiai hatást fibronektinnel burkolt szubsztrátokon (6. ábra). Az M24-E4-sejtekre (valamint egyéb aV-integrineken keresztül feltapadt sejtekre) a 17E6 ellenanyag hasonló hatást fejtett ki vitronektinnel burkolt felületeken, de fibronektinnel, kollagénnel, vagy lamininnel burkolt felületeken nem.

A 17E6 ellenanyag gátolja az M21-tumor kifejlődését csupasz egerekben

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során megvizsgáltuk az 17E6 jelű aV-blokkoló ellenanyag hatását M21-tumorok szubkután kifejlődésére BALB/c-nu/nu-egerekben (7. ábra). Állatkísérletes modellekben az M21-tumorok kifejlődése csupasz egerekben korrelációt mutat az aV-integrinek sejtfelszíni expressziójának mértékével (lásd a bevezető részt). M21sejteket és endotoxinmentes ellenanyagokat szubkután koinjektáltunk. A 17E6 ellenanyag konzisztens módon (négy kísérletből négyszer) gátolta az M21-tumorok szubkután kifejlődését (7A. ábra). 17E6 ellenanyag jelenlétében nem alakult ki tumor egy esetben sem (0/32) és az állatok hat hónap elteltével is tumormentesek maradtak. A kontrollállatok esetében a tumorkialakulás 75-90%-os volt. Az aV-lánccal reagáló nem blokkoló ellenanyagok, önmagukban, valamint a kontrollellenanyagok, amelyek melanomasejtek felszínével reagáltak, változó és nem konzisztens hatást fejtettek ki a tumor kifejlődésére. A 14E2 ellenanyagokkal kezelt kontrollállatok esetében a különböző kísérletekben a tumorkialakulás 30-60%-kal csökkent, de a megmaradt tumorok ugyanúgy növekedtek, mint a kezeletlen kontrollok esetében, és a kontrollokhoz hasonlóan ezekben az állatokban tüdőszövet-tenyésztés útján pulmonáris mikrometasztázisokat lehetett kimutatni (kísérleti adatokat nem közlünk). Ezzel szemben a 17E6 ellenanyaggal kezelt állatokban sem szubkután tumorok, sem tüdő-, máj-, vese-, lép-, vastagbél-, gyomor-, sem pedig mellüregi vagy hasüregi metasztázisok nem alakultak ki, amit a kísérleti állatok hat hónappal az injektálást követően történt elpusztítása után igazoltunk. Az a\^3-deficiens M21-sejtvonal szubkután lassabban növekedett, mint az M21-sejtvonal, és a 17E6 ellenanyag ebben az esetben nem volt hatással a tumor kifejlődésére. A 14E2 ellenanyaggal kezelt M21-L-sejtekkel injektált kontrollállatokban a kezeletlen állatokhoz képest csökkent mértékű tumorkifejlődés volt tapasztalható, hasonlóképpen az M21-sejtekkel injektált állatokhoz (7B. ábra).

Az M21- és M21-L-sejtek növekedését és a 17E6 ellenanyag sejtnövekedésre kifejtett hatását egy „kísérleti metasztázisos” farki vénába történő injektáláson alapuló állatkísérletes modellrendszerben vizsgáltuk. Az M21sejtek dózisfüggő módon sok kolóniát alakítottak ki, az M21-L-sejtek pedig lényegesen kevesebb kolóniát képeztek, mindazáltal képeztek tüdőgócokat, amennyiben nagyobb dózisban injektáltuk őket (7C. ábra). Ez arra utal, hogy a tüdőben történő tumomövekedést is fokozza sejtfelszíni aV-integrinek jelenléte, és amennyiben az M21-sejteket 17E6 ellenanyaggal előinkubáltuk, a kialakult tumorkolóniák száma csökkent (90%-kal). Érdekes módon a tumorképződés mértéke ebben az esetben hasonló volt az M21-L-sejtek által kiváltott tumomövekedés mértékéhez. Az ellenanyagos kezelés nem változtatta meg azoknak az állatoknak a számát, melyekben tumomövekedés kimutatható volt (3. táblázat).

Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy az aV-integrinek jelenléte a sejt felszínén elősegítette az M21-tumorképződést, mind szubkután mind experimentális metasztázis kísérleti modellekben, és a 17E6 jelű aV-blokkoló és reverzáló ellenanyag jelentősen gátolta az M21tumor-növekedést. Az M21-sejteken alapuló kísérleti metasztázisos modellben az M21-sejtek erőteljes növekedése és az M21-L-sejtek csökkent növekedése hasonlónak mutatkozott, a szubkután modellben tapasztalt tumomövekedéshez, és az M21-tumor-növekedést a 17E6 ellenanyaggal végzett előkezelés szintén gátolta. Ezek a kísérleti adatok megerősítik az aV-integrinek jelenléte és a humánmelanoma-kifejlődés közötti kapcsoltságot.

A 17E6 ellenanyag hatása nem citotoxicitás következménye

Miután felismertük a 17E6 ellenanyag jelentős hatását a sejttapadásra, sejtmorfológiára és tumorkifejlő11

HU 221 061 Β1 désre, megkíséreltük tisztázni a 17E6 ellenanyag hatásmechanizmusát. Megvizsgáltuk a 17E6 ellenanyag citotoxicitását (8. ábra). A sejtnövekedés kinetikáját és az elért telítési sűrűséget a 17E6 vagy a kontrollellenanyag jelenléte nem befolyásolta nagymértékben (8A. ábra). A csupasz egerek immundeficiensek. Az ilyen egerekben megmaradt kisszámú immunkompetens sejtek közül a legvalószínűbb, hogy a makrofágok képesek ellenanyag által kiváltott citotoxikus választ kifejteni. Azt a lehetőséget, hogy az ellenanyagok celluláris citotoxicitást (ADCC) váltanak ki, az ellenanyagokkal szingenikus makrofágok alkalmazásával teszteltük, M21-sejtek ellen kiváltott ADCC-vizsgálattal. Effektorsejtekként az egéreredetű agyi makrofágok (mikroglia) különösen hatékony ADCC-mediátorok (Sutter és munkatársai: 1991). A 14.18G2a jelű monoklonális ellenanyag, melyet pozitív kontrollként alkalmaztunk, kisebb mint 10~⁹ mol/l-es koncentrációban közel teljes mértékben lizálta az M21sejteket, a 17E6 ellenanyag azonban egészen 10 ⁷ mol/1 koncentrációig nem idézett elő ADCC-t (8B. ábra).

Hogy megvizsgáljuk annak lehetőségét, hogy a 17E6 ellenanyagok effektorsejtek jelenlétében citosztatikus aktivitást fejtenek-e ki, M21-sejtekből álló mikrogliális tenyészetek DNS-szintézisének mértékét ellenanyagok jelenlétében határoztuk meg (8C. ábra). A 14.18G2a ellenanyag a [³H]-timidin-beépülést 10-¹⁰ mol/l-es koncentrációban >90%-ban gátolta.

Miután teszteltük az ellenanyagok proliferációra, ADCC-re és AECM-re kifejtett hatását, azt vizsgáltuk meg, hogy az M21-sejtek DNS-szintézisének mértékét befolyásolják-e az előállított monoklonális ellenanyagok. A 17E6,14E2 és LM609 ellenanyagok 0,5 pmol/1 koncentrációban nem fejtettek ki hatást a timidinbeépülésre (9. ábra). M21-L-, M21-L4- és M21-L-IIb-sejtekben az ellenanyagok szintén nem befolyásolták a DNS-szintézist. Sejtek nem reagálnak sem 17E6, sem LM609 ellenanyaggal, reagálnak viszont 14E2 ellenanyaggal (1. ábra). Megvizsgáltunk számos más melanoma-sejtvonalat is, és az aV-csoporthoz tartozó ellenanyagok nem befolyásolták bennük a DNS-szintézist kimutathatóan (kísérleti adatokat nem közlünk).

A 17E6 és 14E2 ellenanyagok IgGl-izotípusúnak bizonyultak és M21-sejtek esetén nem befolyásolták a komplement rendszer által közvetített sejtlízist (kísérleti adatokat nem közlünk). Az eddig bemutatott kísérleti eredményekből az következik, hogy a 17E6 ellenanyag hatásai aV-integrin-specifikusak és az ellenanyag nem fejt ki drasztikus toxikus hatásokat egyéb celluláris rendszerekre.

A 17E6 ellenanyag celluláris a V$3-integrinre csak receptor-keresztkötés útján tudja kifejteni hatását, αΡβ7- és aV$5-integrinek esetében azonban receptorkeresztkötésre nincs szükség

Sok biológiai rendszerben a membránon keresztüli jelközvetítés receptorok demerizációjával kezdődik. Az a\^3-integrinek multimerizációja valóban megváltoztatja a foszfo-tirozinilációs mintázatot HUVECsejtekben (Bhattacharya és munkatársai: 1995). E tény ismeretében megvizsgáltuk, hogy a 17E6 ellenanyag hatásában szerepet játszik-e receptoraggregáció.

A 17E6 ellenanyag gátolja az ανβ3-, α.νβ5- és ανβΐ-integrinek hatását (4. ábra). Izolált a\^3-integrinekkel végzett ELISA-vizsgálatban (10. ábra) a 17E6 ellenanyag és F(-ab’)₂ és F(ab’)-fragmensei hasonló kötési sajátságokat mutattak, az 50%-os telítettséget a fragmensek körülbelül 1 ng/ml koncentrációban érték el (ugyanez a koncentráció a teljes ellenanyag esetében körülbelül 7 pmol/1). Az ELISA-kísérletben kapott titrálási görbék hasonlósága arra utalt, hogy az ELISAtálcák és a 17E6 ellenanyag között monovalens kölcsönhatás alakul ki. Sejttapadási vizsgálatok során azonban a fragmensek eltérően viselkedtek. Az F(ab’)₂-fragmens és a teljes 17E6 ellenanyag gátolta az ανβΐ közvetítette sejttapadást (V+B2-sejtek), az ανβ5 közvetítette sejttapadást (UCLA-P3-sejtek; IC_J0 közelítőleg 0,1 pg/ml=körülbelül 700 pmol/1), valamint az ανβ3 közvetítette tapadást (VM164- és M21-sejtek; IC₅₀ körülbelül 0,5 pg/ml=körülbelül 3 nmol/1), és az F(ab’)-fragmens ανβΐ- és a\^5-integrinen vizsgálva azonos aktivitásúnak mutatkozott, mint a dimer ellenanyag (11. ábra). Mindazáltal az F(ab’)-fragmens legalább 1 χ KH-szer aktívabbnak bizonyult mind ανβΐ-, mind a\^5-integrinen, mind a\^3-integinen, mely utóbbi esetben az ellenanyag csak 25+10%-os gátlást idézett elő a legmagasabb vizsgált koncentrációban is (50 pg/ml:IC₅₀>> 50 pg/ml:>>400 nmol/1). Ilyen koncentrációkban a kontrollellenanyagok is hasonló mértékű gátlást idéztek elő (kísérleti adatokat nem közlünk), ami arra utal, hogy ez a jelentéktelen hatás nem specifikus.

A kötődni képes F(ab’)-ellenanyag fragmens [17E6 F(ab’): 10. ábra] biológiai aktivitásának hiánya egyértelműen arra utal, hogy az ellenanyag által közvetített funkció kialakulásához dimerizáció szükséges. Annak bizonyítására, hogy a 17E6 ellenanyag ανβ3-ϊηtegrinre kifejtett hatásához valóban szükség van keresztkötésre, 17E6 F(ab’)-fragmenseket sejttapadási vizsgálat során keresztkötöttünk, poliklonális anti-F(ab’)ellenanyag hozzáadásával. A kísérlet során klasszikus előzónaszerű hatást észleltünk, mivel a sejttapadás észlelt erős gátlása akkor és csak akkor következett be, ha mind az elsődleges, mind a másodlagos ellenanyag kritikus koncentrációban jelen volt. Sem a második ellenanyag egyedül, sem az F(ab’)-fragmens egyedül nem fejtett ki hatást a sejttapadásra, még nagy koncentrációban sem. Elmondhatjuk továbbá, hogy a tapasztalt hatás nem az a\^3-integrinek keresztkötésének aspecifikus következménye volt: az aVp3-integrinek AP3 jelű kötődő, de nem gátló ellenanyaggal történő keresztkötése a sejttapadásra nem volt hatással (12. ábra). Azok a koncentrációk, melyekben a F(ab’)-fragmens a keresztkötéses kísérletekben a második ellenanyag hozzáadása után aktívnak bizonyult, megegyeznek a teljes 17E6 ellenanyag ανβ3 közvetítette sejttapadás gátlásában hatásos IC₅₀-értékeivel (11. ábra).

A fent ismertetett kísérleti adatok együttesen arra utalnak, hogy szükséges az a\^3-integrinek keresztkötése a VM164- és M21-sejtek rokon ligandumokhoz történő tapadásának megelőzésére, az ανβ5- és α,νβΐ-ίηtegrinek inaktiválásához azonban nincs szükség keresztkötésre.

HU 221 061 Β1

Izolált receptorok alkalmazásán alapuló vizsgálati eljárásban a 17E6 ellenanyag a receptorfunkció gyenge gátlójának bizonyul

A 17E6 ellenanyag aVp3-integrinre kifejtett hatásának szokatlan természetét részleteiben izolált receptorokon alapuló vizsgálati eljárásokkal analizáltuk. A klasszikus aktív helyblokkolók és a 17E6 ellenanyagok viselkedése közötti különbség szembetűnő. A vitronektin aVp3-integrinhez történő kötődése telítési értéket ér el körülbelül 5 pg/ml-es koncentrációnál (körülbelül 10 nmol/1: amennyiben feltételezzük, hogy a vitronektin-multimerek átlagos mérete 10 monomer; 13. ábra), és ez a kötődés specifikus kompetícióban van mind a klasszikus lineáris ligandummimetikus peptidekkel (GRGDSPK: IC₅₀ körülbelül 2 pmol/l), mind pedig a ciklikus peptidekkel (cRGDfV: IC50 körülbelül 5 nmol/1). A cRGDfV egy biotinnal jelölt származékának, a CRGDfk-biotinnak az alkalmazásával lehetségessé vált annak közvetlen kimutatása, hogy nemcsak az inhibitorok kompetálnak a vitronektinhez történő kötődésért, hanem a vitronektin is versenyzett az inhibitorhoz történő kötődésben (13. ábra), azaz a rendszer szimmetrikus. Azt találtuk, hogy a GRGDSPK- és a cRGDfV-peptidek egymással versenyeztek, és ezt „racionálisan” és „szimmetrikusan” tették, abban az értelemben, hogy a kompetíciós IC₅₀-érték tükrözte az aVp3komplex vitronektinhez történő kötődésének inhibíciós IC₅₀-értékét (13. ábra).

A 17E6 ellenanyag aVp3-hoz történő kötődése 0,01-0,1 pg/ml koncentrációnál telítődik (700-70 pmol/1; 10. ábra). Mindazáltal az ellenanyag a ligandumkötődésnek csak gyenge inhibitora. Még 70 nmol/1 ellenanyag-koncentráció esetén is csak 30 (+10)%-os vitronektinhez történő kötődés inhibíciója. Az LM609 ellenanyag hasonlóképpen viselkedett, az aVp3-kötő nem gátló ellenanyagok (14D9.F8,20A9 és WAM2-4) azonban hatástalanok voltak. A ligandummimetikum ciklikus peptid a cRGDfV hatékonyan gátolta a receptor-ligandum kölcsönhatást (IC₅₀ körülbelül 10 nmol/1; 14. ábra), nem volt azonban hatással a 17E6kötődésre. Sem a teljes, sem a monovalens 17E6 ellenanyag nem fejtett ki gátlóhatást (kísérleti adatokat nem közlünk).

Telítési mennyiségű kompetáló ligandum jelenlétében a 17E6 ellenanyag kötődik az αΡβ3-komplexhez

A 17E6 ellenanyag izolált receptoron alapuló vizsgálati eljárásban mutatott gyenge kompetíciója és az erős kompetitív inhibitorok - mint például az cRGDfV - hozzáférhetősége felvetette azt a kérdést, hogy a 17E6 milyen módon befolyásolja az aV-funkciót. A 17E6 ellenanyag és fragmensei sejttapadás-vizsgálati eljárásokban kifejtett gátló hatásához aVp3-integrin vonatkozásában szükség van keresztkötésre, és ez a viselkedés nem teljesen összeegyeztethető a kompetíciós gátlással. Következő lépésben azt vizsgáltuk, hogy az aVp3-integrin ligandumai közvetlenül hatnak-e a 17E6 ellenanyag kötődésére.

A ligandumokat előzetesen a receptorhoz kötöttük, és közvetlenül jelölt 17E6 ellenanyag kis koncentrációt adtunk a reakcióelegyhez (15. ábra). A 17E6 ellenanyag kötődését nem befolyásolta (< mint 10% gátlás) vitronektin, fibronektin vagy fibrinogén nagy koncentrációban történő hozzáadása (ezek az aVp3-integrin természetes ligandumai; Cheres és Spiro: 1987). A természetes ligandumokból 100-szoros fölöslegre van szükség az aV33-integrin specifikus kötőhelyeinek telítéséhez. A fentiekkel ellentétben a receptorhoz előzetesen hozzákötött 17E6 ellenanyag erősen versenyez receptorhoz történő kötődésben a később hozzáadott jelölt 17E6 ellenanyaggal (15., 16. ábra), és az aVp3-integrin természetes ligandumai is jól kompetálnak egymással (kísérleti adatokat nem közlünk). Ez a kísérleti eredmény megcáfolta azt a feltételezésünket, hogy a 17E6 ellenanyag kompetícióban van a vitronektinnel, az aVp3-integrin aktív helyéért. Továbbá, az erős aktívhely-kompetítorok - mint például a cRGDfVciklikus peptid 200 pmol/l-es koncentrációban - nem befolyásolják a 17E6 ellenanyag kötődését, mindazáltal blokkolják a vitronektin aVp3-hoz történő kötődését 2 nmol/l-es IC₅₀-értékkel (13. ábra). A 10. ábrán bemutatott ELISA-adatok arra utalnak, hogy a 17E6aVp3-kölcsönhatások monovalensek, amely csökkenti annak valószínűségét, hogy kompetíciós artefaktummal állunk szemben, a nagyon erős ellenanyag-affinitás és alacsony ligandumaffinitás következtében. Mindazáltal továbbá aV- és p3-specifikus ellenanyagokat jelöltünk meg, és előre kötött ligandumokkal kompetáltattuk őket (15. ábra), magukat az ellenanyagokat is beleértve (16. ábra). Az ellenanyagok sikeresen versenyeztek egymással, és egyértelműen keresztkompetíciós csoportokba lehetett osztani őket (16. ábra). Az AP3 jelű P3-specifikus ellenanyag kompetícióban volt a saját kötődésével, de nem volt hatással sem az aVp3-komplexre specifikus (LM609), sem pedig az aV-láncra specifikus ellenanyagok (17E6, 14D9-F8) kötődésére, és ezek az ellenanyagok sem voltak hatással az AP3 kötődésére. Az LM609, a 17E6 és a 14D9.F8 ellenanyagok egymással erős keresztkompetícióban álltak. Ezzel szemben az előzetesen kötődött ligandumok nem voltak hatással a 17E6 ellenanyag aVp3-komplexhez történő kötődésére. Az ismertetett kísérletekből arra kell következtetnünk, hogy a 17E6 ellenanyag nem a ligandumkötő helyért történő közvetlen kompetíció útján fejti ki hatását.

A 17E6 ellenanyag variábilis régióinak klónozása és szekvenálása

A 17E6 ellenanyagot termelő hibridóma-sejtvonal alkalmazásával a nehéz- és könnyűláncrégiókat tartalmazó immunglobulinokban feldúsított cDNS-könyvtárat állítottunk elő egy immunglobulinok variábilis régióinak PCR-amplifikálásához tervezett láncindító oligonukleotidkönyvtár felhasználásával. A redundáns variábilis régióra specifikus láncindító oligonukleotidok a szignálszekvencia startpontjánál termináltak. A láncindító oligonukleotidokat úgy tervezték, hogy terminális Sáli vagy Xmal restrikciós hasítóhelyeket tartalmaztak a klónozás megkönnyítése céljából. Előállítottuk a kívánt méretű PCR-termékeket (420-450 bázispár; Jones és Bendig: 1991), azokat megklónoztuk és megszekvenáltuk (17. ábra). A 17E6 immunoglobulin

HU 221 061 Β1 könnyűláncának variábilis régiója (jele: VL17E6) 381 bázispár hosszúságú volt. A nehézlánc variábilis régiója (jele: VH17E6) 411 bázispár hosszúságúnak bizonyult. A nehéz láncvariábilis szekvenciái a Ilb jelű Kabat-csoporthoz tartozó immunglobulinok sajátságait mutatták, a könnyűlánc-szekvenciák pedig a V. Kabatcsoportra jellemző sajátságúak voltak (Kábát és munkatársai: 1987). A klónozási stratégia vázlatát a 18. ábrán láthatjuk. A tumorok kifejlődése és a metasztázisok kialakulása tipikusan olyan betegségek, melyek esetén a sejtek fölszabadulnak a normális sejtszaporodási és adhéziós kontrollmechanizmusok hatása alól, és emiatt nem megfelelő helyekre vándorolnak, ott megtapadnak és növekednek. Az integrinekről ma már köztudomású, hogy szerepet játszanak sok sejtadhéziós eseményben, az adhézió pedig olyan mechanisztikusán egymásba fonódó eseményeket szabályoz, mint a növekedés, differenciálódás, sejtmozgás és a proteázhálózatok aktivitása, valamint olyan egyedfejlődési eseményeket, melyek szerepet játszanak a metasztatikus kaszkád kialakulásában (Liotta és munkatársai: 1991; Stetler Stevenson és munkatársai: 1993; Fidler: 1988). A leírásban aV-integrinekkel reagáló ellenanyagokat tárunk fel, melyek egyike a 17E6 ellenanyag meggátolja a kezdeti sejttapadást, megbontja a stabil aV-ligandum kölcsönhatásokat és in vivő állatkísérletes modellben (Fidler: 1986) gátolja a humánmelanoma kifejlődését. A találmány szerinti aV-csoporthoz tartozó ellenanyagok biokémiai analízis során hasonló reakciómintázatot mutattak, mint az LM142 ellenanyag, amely egy jól definiált humán aV-integrinekkel reagáló ellenanyag, a kapott reakciómintázat azonban különbözött az ανβ3specifikus (LM609), az aVp5-specifikus (P5H9), valamint egyéb jól definiált antiintegrin ellenanyagok reakciómintázatától. A fentiek értelmében valószínűsíthető, hogy az aV-csoporthoz tartozó ellenanyagok a humán aV-integrin-láncot ismerik fel. A 17E6 immunglobulin génjének cDNS-klónozása alapján meghatároztuk az ellenanyaggén bizonyos régióinak egyértelmű egyedi jellegű szekvenciáit. A nehézlánc-variábilisrégió szekvenciája a II jelű Kabat-csoporthoz tartozó immunglobulinok szekvenciasajátságait hordozta, a könnyűlánc-szekvenciák pedig az V. Kabat-csoport szekvenciasajátságait (Kábát és munkatársai: 1987). Elmondhatjuk tehát, hogy az előállított monoklonális ellenanyagot egyértelműen definiáltuk.

A 17E6 ellenanyag jelentősen megzavarja az aV-integrinek által közvetített sejtek közötti kölcsönhatásokat. Az integrinek működésének tanulmányozásában nagy szerepe van az olyan ellenanyagoknak, melyek ezt a működést megzavaiják, az aV-integrinek vonatkozásában azonban mindeddig nem állt rendelkezésre hatásos osztályspecifikus blokkoló ellenanyag. A 17E6 ellenanyag gátolja az aV-integrinek által közvetített sejttapadást körülbelül 0,3-1 nmol/l-es IC₅₀-értékkel (az ellenanyag molekulatömege: 150 000 D); összehasonlításképpen megjegyezzük, hogy a GRGDSPK-szekvenciájú gátlópeptid IC₅₀-értéke körülbelül 5 pmol/l. A főleg a\^3-integrint (WM793) és aVp5-integrint (UCLAP3) expresszáló sejtvonalakat a 17E6 ellenanyag blokkolja, csakúgy, mint a főként aVpl-integrineket expresszáló sejtvonalakat. Elmondhatjuk tehát, hogy a 17E6 ellenanyag általános aV-integrininhibitor.

A 17E6 ellenanyag nemcsak megakadályozza az aV-integrinek ligandumaikkal való kölcsönhatásának kialakulását, de képes a már kialakult kölcsönhatásokat megbontani, és kiváltani a vitronektinhez tapadt sejtek gyors leválását. Az aVP3-integrinek vitronektinnel való kölcsönhatását a szakirodalom „disszociálhatatlan” kölcsönhatásként tartja számon, mely kölcsönhatás két lépésben alakul ki: a kezdeti blokkolható kölcsönhatást gyors stabilizációs reakció követi (Orlando és Cheresh: 1991). Ezzel szemben azonban a 17E6 ellenanyag a vitronektinszubsztráthoz tapadt M21- és sok más sejt esetén (nem publikált megfigyelések) gyorsan megbontja a kialakult kölcsönhatásokat és részleges leválást idéz elő. A letapadt sejtek kerekedése visszafordul, amennyiben az ellenanyagot a közegből eltávolítjuk. Az M21-sejtek vitronektinhez történő kezdeti tapadását a 17E6 ellenanyag nem tökéletesen blokkolja (körülbelül 90%), de a sejtkerekítő hatása lényegében valamennyi megtapadt sejtet érinti. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során igazoltuk azokat a korábbi publikációkban közölt állításokat, melyek szerint az M21-sejtek kezdeti vitronektinhez történő tapadását teljesen blokkolni lehetett anti-aVp3- és anti-aVp5ellenanyagok keverékével, valamint RGDS-peptidekkel, ami arra utal, hogy a kölcsönhatásban mind az ανβ3-, mind pedig az aV35-integrinek szerepet játszanak (Wayner és munkatársai: 1991). Amint azt a leírásban feltárjuk, a 17E6 ellenanyag blokkol néhány aV-receptort, és képes megbontani az általuk közvetített, stabilan kialakult kölcsönhatásokat. Annak a jelenségnek a magyarázata, hogy a 17E6 ellenanyag különbözőképpen hat már feltapadt és éppen feltapadó M21-sejtekre, abban a tényben lehet, hogy az említett különböző helyzetekben az aVp3- és aVp5-integrinek funkciója és lokalizációja különböző lehet. A tapadás közben lévő sejtek felszínén mindkét típusú integrin diffúz módon el van oszolva, feltapadt sejtek esetén azonban az ανβ3integrinek a sejtek fokális kölcsönhatásaiban találhatók, az aVp5-integrinek viszont továbbra is egyenletes eloszlást mutatnak (Wayner és munkatársai: 1991; Zambruno és munkatársai: 1993). A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy a 17E6 ellenanyag szelektíven bontjae fel a fenti kölcsönhatások valamelyikét.

Az M21-tumorok növekedése csupasz egerekben erősen függ az aV-integrinek jelenlététől (Felding-Habermann és munkatársai: 1992; Sanders és munkatársai: 1992). Mivel a 17E6 ellenanyag képes stabilan kialakult aV-ligandum-kölcsönhatásokat modulálni, és hosszú távú hatást fejt ki, megvizsgáltuk a tumorkifejlődésre kifejtett hatását is. Azt találtuk, hogy a 17E6 ellenanyag gátolta a szubkután M21-tumorok kifejlődését csupasz egerekben, és ez a felismerés erősen alátámasztja Felding-Habermann és munkatársai publikációt. Ezenfelül azt is kimutattuk, hogy az aV-integrinek elősegítik, a 17E6 ellenanyag pedig gátolja az M21-sejtek kísérleti tüdőmetasztázissá fejlődését. A ta14

HU 221 061 Β1 lálmány szerinti megoldás tehát független módon igazolja a korábbi fontos publikációt, és túl is mutat az abban foglaltakon, mivel a találmány szerinti megoldás lehetőséget ad a 17E6 ellenanyaggal végrehajtott szingenikus ellenanyag által közvetített „terápia” végrehajtására. Ezek az eredmények alátámasztják az aV-integrinek szerepének jelentőségét az M21-tumor kifejlődésében, és cáfolják azt a feltételezést, hogy a korábbi eredmények esetleg klónozási artefaktumok következményei.

A 17E6 ellenanyag hatása in vitro a kimosását követően több mint 24 órán át tartott. Amennyiben a kísérleti egér térfogatát 20 ml-nek tekintjük, a kezdeti ellenanyag-koncentráció in vivő körülbelül 10 nmol/1 volt, ami körülbelül egy nagyságrenddel fölötte van a sejtligandum kölcsönhatások reverziójához szükséges szövettenyészetben tapasztalt IC₅o-értéknek. A 17E6 ellenanyag a kezelt állatokkal szingenikus, BALB/C nu/nu, és az egéreredetű IgGl ellenanyagok fél életideje 20-200 óra (Tao és Morrison: 1989; Haba és munkatársai: 1985). Az alkalmazott modellben tehát az M21ligandum-kölcsönhatások reverziójához szükséges IC₅₀-értéknél legalább 100 órán keresztül (5 fél életidő) nagyobb koncentrációban van jelen az ellenanyag. Érdekes összehasonlítani az 17E6 ellenanyag hatását az RGD-peptidek hatásával. A B16F10-C57blk6-egérmelanoma kísérleti modellben az együttesen injektált peptidek gátolták a B16-F10 pulmonáris tumorok kifejlődését (Humphries és munkatársai: 1986; Hardan és munkatársai: 1993). A 17E6 ellenanyag esetén alkalmazott feltételezésekkel élve körülbelül 100 pmol/l RGD-peptid volt jelen (Hardan és munkatársai: 1993), ami koncentráció körülbelül két nagyságrenddel nagyobb a sejtek vitronektinhez történő tapadását gátló koncentrációnál. Az RGD-peptidek szérum-féléletideje azonban 8 perc (Humphries és munkatársai: 1988). Általában elmondhatjuk, hogy terápiás céllal előnyösebb hosszú fél életidejű blokkolókat előállítani tumorkifejlődés gátlása céljából.

Felvetődik a kérdés, hogy a 17E6 ellenanyag hogyan képes meggátolni a tumor kifejlődését. Mivel az ellenanyag az egéreredetű sejtekkel nem reagál, a hatását közvetlenül a tumorsejteken kell hogy kifejtse, és az ellenanyag tumor-angiogenezisre kifejtett hatásaival nem kell számolnunk (Brooks és munkatársai: 1994). A 17E6 ellenanyag kizárólag a következő két azonosítható hatással rendelkezik: a) kötődik az aV-integrinek extracelluláris doménjéhez, b) képes megzavarni az aV-integrinek által közvetített celluláris kölcsönhatásokat. Feltételezhetjük, hogy az ellenanyag által közvetített sejtpusztító mechanizmusok legtöbb forrása a csupasz egerekből ki van iktatva. A 17E6 ellenanyag sem krónikusan, sem akut módon nem gátolja az M21sejtek növekedését, vagy életképességét, nem idézi elő a komplementrendszer fixálódását, nem gátolja a DNSszintézist, és nem idéz elő szingenikus makrofág közvetítette citotoxicitást. Az M21-sejtek ADCC-vel szemben szenzitívnek bizonyultak, mivel a 14.18G2a ellenanyag jelenlétében mikrogliális sejtek képesek voltak őket hatékonyan elpusztítani. Az IgGl-alosztályba tartozó monoklonális ellenanyagok (mint a 17E6 is) képesek hatékonyan egér-makrofág-ADCC-t kiváltani (Herlyn és munkatársai: 1985). Az aVp3-integrinek sejtenként expresszált száma lehetséges, hogy alatta van az ADCC létrejötte szempontjából szükséges küszöbértéknek. A korábbiakban kimutatták, hogy az ADCC hatékonysága arányos a célponton található antigénsűrűséggel (Rodeck és munkatársai: 1985). A makrofágok az egyéb mieloid és limfocitikus effektorsejtekkel ellentétben az Fcy-receptorok mindhárom osztályát expresszálják. A kísérleti adatok arra utalnak, hogy az in vivő tumomövekedési kísérletekben tapasztalt, 17E6 ellenanyag által kifejtett gátlóhatás mechanizmusa nem az ADCC. Az alkalmazott ellenanyag endotoxinmentes volt. Nem lehet kizárni, hogy a 17E6 ellenanyag aktiválja az NK-sejtek által közvetített sejtpusztító mechanizmust, de ha ez így lenne is, az alkalmazott szingenikus azonos izotípusú kontrollellenanyag ezt a mechanizmust lényegesen kevéssé aktiválják.

Elmondhatjuk tehát, hogy a 17E6 ellenanyag valószínűleg az aV-integrinek működésének megzavarása útján hat. A 17E6 ellenanyag gátolhatja az aV-integrinek bármely funkcióját, mely integrinek szerepet játszanak a sejtek közötti tapadásban, az oldható mátrixkomponensekkel kialakuló kölcsönhatásokban (Seftor és munkatársai) : 1992), a proteáz-proteázinhibor hálózat modulálásában (Gehlsen és munkatársai: 1992; de Boer és munkatársai: 1993; Preissner: 1991), a sejtmozgás stimulálásában (Seftor és munkatársai: 1992; Gehlsen és munkatársai: 1992), és a receptor-intemalizációban (Wickham és munkatársai: 1993; Panetti és McKeown Longo: 1993a; Panetti és McKeown Longo: 1993b), de ahhoz, hogy eldöntsük, ezek közül a funkciók közül melyik gátlódik (ha valóban ez okozza a 17E6 ellenanyag hatását), további kísérleti munka szükséges.

A 17E6 ellenanyag gátlóhatásának kialakulásához ανβ3-integrinek esetén szükség van a célpont dimerizációjára, ανβΐ- és aVp5-integrinek esetén azonban erre nincs szükség. Bár a monovalens és divalens 17E6 ellenanyagfragmensek egyenlő mértékben aktívak aVp3-integrin-kötési ELISA-vizsgálatban, és ανβΐ-, valamint a\^5-integrinek által közvetített sejttapadás gátlásában, a monovalens fragmensek lényegében inaktívak a\^3-integrinekkel szemben. Elmondhatjuk továbbá, hogy amennyiben keresztkötő ellenanyagokat adunk a monovalens fragmensekhez, azok visszanyerik az ανβ3 közvetítette adhéziót gátló képességüket, és viselkedésük klasszikus előzónahatást mutat a kísérletben. Az a\^3-integrinek egyszerű keresztkötése nem elegendő aktivitásuk gátlásához, mivel a keresztkötésre képes AP3 ellenanyag nem hat az ανβ3 közvetítette adhézióra. Az AP3 ellenanyag a β3-1έηο1ιοζ kötődik (2B. ábra).

Amennyiben a monovalens kölcsönhatás átalakul bivalens kölcsönhatássá, az ellenanyag célpontja iránti affinitása ugrásszerűen fokozódik (Lane és Harlow: 1988). Amennyiben a 17E6 ellenanyagot ELISAeljárással, a\033-integrinnel titráljuk, ezt az átalakulást nem lehet kimutatni, ami arra utal, hogy ebben a kísérletben akár monovalens, akár divelans 17E6 származé15

HU 221 061 Β1 kokat alkalmazunk, a kölcsönhatás jellege monovalens lesz. Receptorligandum-kötődési vizsgálati eljárások során, amennyiben azonos ELISA-konfígurációt alkalmazunk, a 17E6 ellenanyag meglepően gyenge gátlóreagens, az EMD66203:cRGDfV-ligandummimetikum peptidszármazékhoz képest. Más szavakkal: amíg a cRGDfV 2-3 nagyságrenddel aktívabban viselkedik izolált receptorokkal végrehajtott vizsgálatokban, mint amikor teljes sejtek alkalmazásával vizsgáljuk (IC₅₀értéke körülbelül 1 pmol-ról körülbelül 1 nmol-ra változik) a 17E6 ellenanyag izolált receptorokon legalább 3 nagyságrenddel kevésbé aktív (IC₅₀-értéke körülbelül 100 ng/ml-ről >100 μ/ml-re változik), ami azt jelenti, hogy lényegében inaktívvá válik.

Ezt a tapasztalt anomáliát és a celluláris ellenanyagkeresztkötési vizsgálatokkal kapott kísérleti adatokat kompetíciós kísérletekben sikerült értelmeznünk. Ezek a kísérletek arra utaltak, hogy a 17E6 ellenanyag a peptideredetű gátlószerekkel szemben nem közvetlenül a ligandumkötő helyekre fejti ki hatását. Közvetlen bizonyíték hiányában általában szokás feltételezni, hogy a gátlóreagensek úgy hatnak, hogy térben blokkolják a ligandum-receptor kölcsönhatás helyét, és ezt a megközelítését az integrinek kutatási területén az RGDtartalmú aktívhelymimetikum-peptidek viselkedése alá is támasztja (Hynes: 1992), és ugyanerre utalnak azok a kísérletek is, melyek során az említett kötőhelynek megfelelő szekvenciarészletét a vitronektinen helyspecifikus mutációval megváltoztatták, minek hatására a ligandum inaktiválódott (Chemey és munkatársai: 1993). Kísérleti adataink egyértelműen arra utalnak, hogy a 17E6 jelű hatékony gátló ellenanyag esetében ez nem így történik. Kísérleti eredményeinket a következőkben foglalhatjuk össze: aVp3-integrin esetén a) a ligandummimetikum-peptidek versenyeznek egymással és magával a ligandumokkal is, b) a ligandumok versenyeznek a peptidekkel, c) sem a peptidek sem a ligandumok nem állnak kompetícióban a 17E6 ellenanyaggal, d) a 17E6 ellenanyag nem versenyez a ligandumokkal és a ligandummimetikum-peptidekkel, e) a 17E6 ellenanyag teljes mértékben kompetícióba vihető saját magával és egyéb aV-kötő ellenanyagokkal.

A 17E6 ellenanyag az aVP3-hoz történő kötődésben a ligandumok rendkívül gyenge kompetítora, a vitronektin és az RGD-alapú aktívhely-próbák viszont erősen versenyeznek egymással a receptorkötődésben. Egyéb ellenanyagok pedig erősen versenyeznek a 17E6 ellenanyaggal. A 17E6 ellenanyag tehát alloszterikus inhibitorként hat. Keresztkötéses kísérletekkel kimutattuk, hogy ahhoz, hogy a 17E6 ellenanyag kifejthesse gátlóhatását, szükség van az aVp3-komplexek dimerizálódására, az aVpi- és aVp5-integrinek esetében azonban ez nincs így. Ez a felismerés arra utal, hogy a 17E6 ellenanyag új mechanizmuson keresztül fejti ki hatását, amelyben szerepet játszik az integrinek által indukált jelátviteli reakcióutak befolyásolása, és az ellenanyag nem egyszerűen az integrin-ligandum kölcsönhatásokat antagonizálja.

Mivel az aVp3-ligandumok aktív formájukban homopolimerek, és monomerként inaktívak (Preissner,

KT.: 1991; Stockmann, A. és munkatársai: 1993) az integrinek multimerizálódása a szubsztrát hatására létfontosságú lehet hatásuk kifejtésében. Ismert, hogy a szignáltranszdukció iniciálásában a növekedési faktor receptorcsaládhoz tartozó receptor tirozinkinázok ligandumok által okozott dimerizációja kulcsfontosságú esemény (Dougall, WC. és munkatársai: 1994). Intuitíven világos, hogy a szubsztrátpolimer sztereokémiája alkalmassá válik arra, hogy a membránban az integrineket orientálja, és ily módon elősegítse a jelkiváltó komplex kialakulását. Annak a ténynek a biológiai magyarázata, hogy a sejtek tapadásához multimer vitronektin jelenléte szükséges, valóban a fenti szükségszerűségből fakadhat. A vitronektin multimerek 3-16 egységet tartalmaznak (Stockmann, A. és munkatársai: 1993), és megjósolható, hogy a sejtfelszínen rendezett integrinláncokat hoznak létre, és a szükséges fokozott affinitás multimer kölcsönhatások révén alakul ki. A monomer vitronektin-aVp3-kölcsönhatás önálló életideje rövid, az affinitása kicsi, ugyanakkor a ligálatlan integrin forgása a membrán síkjában gyors, és az ellenanyag affinitása, valamint kötési sebessége nagy. Az elmondottak alapján feltételezhető, hogy azok a divalens ellenanyagok, melyek a sejtek felszínén egy integrinnel vannak asszociálódva, forgásuk során kapcsolódhatnak disszociált integrinekhez, és ily módon azokat olyan konformációkban tarthatják, mely konformáció ligandumkötésre nem alkalmas. Ez a folyamat az aVp3-vitronektin-kötések molekuláris hálózatát egyre inkább elgyengíti, és ily módon destabilizálja a sejt-vitronektin kölcsönhatást, mintha egy molekuláris hámozógép hámozná le a sejteket a vitronektinszubsztrátról. Ez a feltételezett mechanizmus megmagyarázhatja azt a tényt, hogy a 17E6 ellenanyag receptorkötődési vizsgálati eljárásokban hatástalan, mivel az ilyen eljárások során a receptor nem képes beforogni a kívánt orientációba, ami lehetővé tenné a divalens kölcsönhatás kialakulását (erre az ELISA-kísérletek adatai alapján következtethetünk), és az is érthető, hogy celluláris vizsgálati eljárásokban a 17E6 ellenanyag miért hatásos, az is világossá válik, hogy a celluláris vizsgálati eljárásokban miért nem szükséges, hogy a 17E6 ellenanyag versenyezzék az aktív helyhez történő kötődésért, és az is érthetővé válik, hogy az F(ab’)-fragmens miért nem képes gátolni az aVp3 közvetítette sejttapadást.

Az eddig ismertetett kísérleti adatok alapján az is világos, hogy mivel az aVp5 és az aVpi (valamint az aVp6, aVp8 és aVpl) az aVp3-mal átfedő ligandumspektrumú, feltételezhető, hogy egymás funkcióit kölcsönösen szabályozzák, olyan módon, amely közvetlenül analóg az RTK jelű növekedési faktor receptorcsalád esetén megfigyelt receptor-heterodimerizáció útján történő keresztszabályozással (Dougall, WC. és munkatársai: 1994). Például az aVp5 - mivel vitronektin iránti affinitása nagyobb az aVp3-énál - a szubsztrát különböző multimer molekuláin képes az aVp3kötőhelyekért versenyezni, és ily módon meggátolja a szignál kialakulásához szükséges aVP3-dimerek keletkezését, és ily módon a sejttapadás megmarad, ebben az esetben ciVp3-dimerek helyett ctVp5-, aVp3-heterodi16

HU 221 061 Β1 merek keletkeznek. A többi aV-integrin is feltehetőleg hasonló módon működik keresztszabályozóként, ennek a hipotézisnek alátámasztására azonban nem rendelkezünk megfelelő mennyiségű kísérleti adattal.

Összefoglalásul elmondhatjuk, hogy kifejlesztet- 5 tűnk egy monoklonális ellenanyag családot, melynek tagjai képesek az aV-integrin-láncot felismerni. Ezek közül az egyik, a 17E6 jelű, in vivő gátolja és reverzálja az aV közvetítette folyamatokat. A 17E6 ellenanyag meglepő módon gátolja az aV-fiiggő melanoma kifejlődését csupasz egerekben. Ez az eredmény arra utal, hogy az aV-integrinek a tumorterápia hatékony célpontjai lehetnek. Jelen leírás készítésével egyidejűleg Lehmann és munkatársai (Lehmann és munkatársai: 1994) leírtak egy olyan aV-specifikus ellenanyagot, melynek bizonyos sajátságai hasonlítanak a 17E6 ellenanyag sajátságaihoz. Érdekes volna tudni, hogy vajon ez az ellenanyag is képes reverzálni az aV-integrinek által közvetített kölcsönhatásokat, és gátolni a melanomakifejlődést.

Terápiás és diagnosztikai alkalmazások

A találmány szerinti ellenanyagot beadhatjuk humán pácienseknek terápiás célzattal. A találmány tárgyát képezi tehát egy gyógyászati készítmény, amely hatóanyagként legalább egy fent és az igénypontokban definiált ellenanyagot vagy ellenanyagfragmenst tartalmaz, valamint egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozót, kötőanyagot vagy hígítószert. A találmány szerinti ellenanyagot tipikusan intravénásán vagy parenterálisan injektáljuk. Általánosságban a találmány szerinti ellenanyagot (vagy ffagmensét) olyan dózisban adjuk be, amely elegendően nagy a kívánt tumorszuppresszáló és tumorlizáló hatás kiváltásához. Az alkalmazott dózis függ a páciens korától, egészségi állapotától, nemétől és a betegség előrehaladottságának fokától, és 0,1 mg/kg-200 mg/kg között változhat, előnyösen pedig egy vagy néhány napon keresztül, egy vagy több dózisban 0,1 mg/kg-100 mg/kg ellenanyagot adunk be.

Parenterális alkalmazásra megfelelő készítmények többek között a steril vizes vagy nemvizes oldatok, szuszpenziók és emulziók. Alkalmazható nemvizes oldószerek példáiként megemlíthetjük a propilénglikolt, a polietilénglikolt, a növényi olajokat - például az olívaolajat -, valamint az injektálható szerves észtereket, 10 például az etil-oleátot és egyéb olyan oldószereket, melyek a technika állása szerint parenterális injektálásra alkalmasak. A találmány szerinti ellenanyagokat alkalmazhatjuk fiziológiásán elfogadható hordozót tartalmazó készítmények hatóanyagaként. Ilyen alkalmas 15 hordozók például a sóoldat, a PBS-puffer, a Ringer-féle oldat, valamint a lakták Ringer-oldat. A találmány szerinti gyógyászati készítmények tartalmazhatnak továbbá egyéb adalékanyagokat is, például antibiotikumokat, antioxidánsokat, valamint kelációs ágenseket.

A találmány szerinti ellenanyagot (vagy fragmensét) a citokinek (például IL-2) esetén alkalmazott eljárásokkal konjugálhatjuk is, citotoxikusságuk fokozása céljából.

A találmány szerinti készítmények alkalmasak min25 denféle tumor kezelésére, például melanomák, gliómák és karcinómák kezelésére, csakúgy, mint a keringési rendszerek tumorjainak és a szilárd tumorok kezelésére.

A találmány szerinti ellenanyagokat diagnosztikai 30 célból konjugálhatjuk például radioátlátszatlan festékkel, vagy radioaktívan meg is jelölhetjük azokat. Előnyös jelölési eljárás a radioaktív jóddal történő jelölés. Diagnosztikai célból előnyösen az ellenanyag scFvfragmensét alkalmazzuk. Ezzel az eljárással olyan jó 35 eredményeket kaphatunk, hogy a háttérzaj levonására nincs szükség.

1. táblázat

Monoklonális ellenanyagok reakciómintázata ELISA- és CELISA-vizsgálatokkal meghatározva

Ellenanyag	Inununogén	Izotípus	aVp3	allbp3	M21	M21-L	M21-L-IIb	UCLA-P3	Specifitás
17E6	aVp3	IgGl/κ	+	-	+	-	-	+	aV
20A9	M21	IgGl/κ	+	-	+	-	-	+	aV
23G5	M21	IgGl/κ	+	-	+	-	-	+	aV
14D9.F8	M21	IgGl/κ	+	-	+	-	-	+	aV
10G2	M21	IgGl/κ	4-	-	+	-	-	+	aV
1 14E2	M21	IgGl/κ	-	-	+	+	+	-	200 kD
21H6	M21	IgG2a/K	-	-	+	+	+	-	200 kD
LM609		IgGl/κ	+	-	+	-	-	-	aVp3
LM142		IgGl/κ	+	-	+	-	-	+	aV
P5H9		IgGl/κ	-	-	+	-	-	+	αΫβ5
CP8		IgGl/κ	-	+	-	-	+	-	allbp3
P4C10		IgGl/κ	-	-	+	+	+	+	Pl
AP3		IgGl/κ		+	+	-	+	-	P3

HU 221 061 Β1

2. táblázat

Monoklonális ellenanyagok áramlási citometriával meghatározott reaktivitásának összefoglalása

Ellenanyag	Specifitás	M21	M21-L	M21-L (p)	M21-L-IIb	M21-L4	M21-L12	UCLA-P3	WM793
		ανβ3; aVP5	(β3)°	(P3)°	allbp3;	aVP3 aVp5	(P3)°	aVp5	aVP3; avp5
17E6	aV	+ +	-	-	-	+ +	-	+ + +	+ + +
20A9	aV	+ +	-	-	-	+ +	-	+ + +	+ + +
23G5	aV	+ +	-	-	-	+ +	-	+ + +	+ + +
14D9.F8	aV	4- 4-	-	-	-	+ +	-	+ + +	+ + +
14E2	200 kD	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	-	+ + +
LM609	ανβ3	+ 4-	-	-	-	+	-	-	+ +
LM142	aV	+ + +	-	-	-	+ +	-	+ +	+ + +
P5H9	ανβ5	+	-	-	-	4-	-	+ + +	4-
P4C10	Pl	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +
I AP3	β3	4- 4-	-	-	-	+	+	-	+
CP8	αΙΙΒβ3	-	-	-	4- 4-	-	-	-	-

3. táblázat

M21-tumorgócok kifejlődésének gátlása 17E6 ellenanyaggal, BALB/C nu/nu-egereken végrehajtott tüdőklónozásos „kísérleti metasztázis” vizsgálati eljárással meghatározva

1 Sejtek és kezelés	Tumorkialakulás	Tumorgócok száma	Kontroll (%)
		Átlagérték± szórás	Középső érték	Értéktartomány
M21 (Kontroll)	99	87±110	30	(3-378)	100
M21+17E6	78	8±7,7	5	(0-21)	9
M21-L	56	19±22	8,5	(0-60)	22*

1. példa

Anyagok

Kísérleti állatok: A kísérleti egereket ellenanyagtermelés céljára (nyolchetes BALB/c-egerek) és tumormodellként (csupasz egerek: négy-öt hetes nőstény homozigóta atimikus, BALB/c nu/nu-egerek) a Criffa cégtől szereztük be (Barcelona, Spanyolország). A csupasz egereket steril szobában tartottuk, mikroizolátor kalitkákban, és ad libitum sterilizált táplálékot és vizet kaptak. Az állatokkal minden műveletet steril fülkében végeztünk.

Fehérjék: A fibronektint (Rouslahti és munkatársai: 1982) és a vitronektint (Yatohgo és munkatársai: 1988) friss, fagyasztott humánplazmából izoláltuk, a fíbrinogént pedig (Kazal és munkatársai: 1963) teljes vérből. A laminint Engerbreth-Holm-Swarm-féle egértumorokból izoláltuk (Paulsson és munkatársai: 1987). Minden kísérletet 20 °C-on hajtottunk végre hacsak másként nem jelöltük - és minden mosást kalciummentes PBS-ben végeztünk („PBS”: 137 mmol/1 NaCl, 2,8 mmol/1 KC1, 8,1 mmol/1 Na₂HPO₄, 1,5 mmol/1 KH₂PO₄; pH=7,4). A PBS+ + puffer olyan

PBS-puffer, amely tartalmaz még 1 mmol/1 MgCl₂-t és 1 mmol/1 KCl₂-t is. Amennyiben másképp nem jelöltük, valamennyi alkalmazott vegyszer (Merck KGaA, Darmstadt) az elérhető legnagyobb tisztaságú készítmény volt. A ciklikus peptideket - például cRGDfV és cRGDfK - ismert eljárások alkalmazásával szintetizáltuk meg [például: FEBS Let, 291, 50, (1991)]. Az összehasonlító vegyületként alkalmazott lineáris GRGDSPK-peptid kereskedelmi forgalomban beszerezhető (például: Bachem, Svájc).

Tumoros sejtvonalak és tenyészetek: Az SW11-16 és HT29 jelű humán-karcinómasejtonalakat és az A375 jelű humán-melanomasejtvonalat az „American Type Culture Collection” (ATCC) intézettől szereztük be,a következő sejtvonalakat pedig különböző kollégáktól kaptuk ajándékba: M21 melanoma, valamint variánsai: M21-L és M21-L4 (Cheres és Spiro: 1987), M21-L-IIb (mi állítottuk elő Kieffer és munkatársai: 1991 eljárása szerint), UCLA-P3 humán-tüdőadenokarcinóma (Dr. D. A. Cheresh, Scripps; Cheresh és munkatársai: 1989), WM793és WM164-melanoma (Dr. M. Herlyn, Wistar; Herlyn és munkatársai: 1990), NP18 pankreaszkarcinóma (Dr. G.

HU 221 061 Β1

Ceppella; Hospital Sant Paul, Barcelona), és a B16F10 jelű egér-melanomasejtvonalat eredetileg Dr. 1. Fidlertől szereztük be (Poste és munkatársai: 1980; Dr. S. Alino, University of Valencia). Az EMM31-sejtvonalat saját magunk állítottuk elő egy standard hisztológiai eljárásokkal primer melanomaként azonosított tumormintából (Jágle és munkatársai: nem publikált megfigyelések). Valamennyi sejtet 37 °C-on tenyésztettük, 7,5% CO₂-92,5% levegőatmoszférában, 90% RPMI-1640ben, ami tartalmazott 10% magzati boíjúsavót (FCS) és 2 mmol/1 L-glutamint, és a tenyészetek folyamatosan mikoplazmamentesek voltak, ahogy arról egy alkalmas vizsgálati eljárás segítségével folyamatosan meggyőződtünk („Mycotect” reagenskészlet, Gibco).

Ellenanyagok: Ha máshogy nem jeleztük, a monoklonális ellenanyagok fuzionáltatását, az ELISA-vizsgálatokat, a szubklónozást és a tenyészetek fenntartását a szokásos eljárások szerint végeztük (Harlow és Lane: 1988).

2. példa

Immunizálás: Az aVp3-integrin ellen úgy termeltettünk ellenanyagokat, hogy intraperitoneálisan (ip.) beinjektáltunk tisztítottplacenta-eredetű aVp3-integrint, melyet „Sepharose”-on immobilizáltunk (80 pg ανβ3 80 μΐ „Sepharoson” immobilizálva, 200 pl PBS-pufferben) vagy élő M21-sejteket (1 χ 10⁶ sejt, 0,5 ml PBS-ben), és az injektálásokat 12 héten keresztül minden második héten végeztük. Négy nappal az utolsó injektálást követően PEG-gel indukált fúziót hajtottunk végre, partnerként „Friendly Myeloma”-sejteket alkalmaztunk (Ventrex). Az élő M21-sejtekkel végzett immunizálás útján (1 χ 10⁶ sejt, 0,5 ml PBS-ben) egy 200 kD molekulatömegű melanomaasszociált felszíni fehérjével reagáló ellenanyagokat sikerült előállítanunk.

Szűrővizsgálatok: Receptorokon és rögzített M21sejteken végrehajtott ELISA-vizsgálatokat alkalmaztunk. A receptor-ELISA-vizsálatok során a következőképpen jártunk el: 96 mélyületű ELISA-tálcákat (Dynatech) tisztított aVp3-integrinnel burkoltunk (1 pg/ml, PBS-ben, 16 óra, 4 °C) a tálcákat blokkoltuk (1,5% lefölözött tej PBS-ben, 1 óra, 4 °C), majd a tálcákat hibridóma-felülúszókkal inkubáltuk. A tálcákhoz kötődött immunglobulinokat alkalikus foszfatázzal konjugált antiegér-Ig-ellenanyaggal (Dako) mutattuk ki, szubsztrátként p-nitro-fenil-foszfátot alkalmazva. A celluláris ELISA-eljárások során 96 mélyületű szövettenyésztő tálcákra M21-, M21-L, M21-LIIb vagy UCLAP-3-sejteket fixáltunk (4% paraformaldehid PBS-ben, 15 perc, 20 °C), a tálcákat ezután blokkoltuk (3% BSA, PBS, 1 óra, 4 °C), majd a receptor-ELISA-vizsgálatoknál leírtakhoz hasonlóan a tálcákat hibridóma felülúszókkal inkubáltuk. A pozitív hibrideket háromszor határhígításos módszerrel szubklónoztuk, és RPMI-táptalajba vittük át őket. Az immunglobulinok izotípusát alosztályspecifikus nehézláncot (Zymed) vagy könnyűláncot (Promega) kimutató ellenanyagok alkalmazásával határoztuk meg.

A leírásban említett többi egéreredetű monoklonális ellenanyagot kollégáinktól kaptuk ajándékba: az aVp3-specifikus LM609- és aV-specifikus LM142 ellenanyagot (Dr. D. A. Cheresh, Scripps; Cheresh és Spiro: 1987), a βΐ-specifikus P4C10 ellenanyagot (Carter és munkatársai: 1990; Telios), az a\^5-mtegrinkomplexre specifikus P5H9 ellenanyagot (Dr. E. Wayner, University of Minnesota; Wayner és munkatársai: 1991), a CP8 ellenanyagot, mely alft$3-komplexre specifikus (Dr. Riggieri, Scripps), az AP3 ellenanyagot, mely β3-1όηοΓ3 specifikus (Furihata és munkatársai: 1987; ATCC), 9.2.27 ellenanyagot, amely a melanomasejtek felszíni proteoglikánjára specifikus (D. R. Reisfeld, Scripps; Harel és munkatársai: 1990) és 14.18G2a ellenanyagot, mely a GD2-gangliozidra specifikus (Mujoo és munkatársai: 1989).

3. példa

Ellenanyag-tisztítás és méretnövelés: Nagy mennyiségű ellenanyag-tisztításhoz az ellenanyagot tartalmazó felülúszókat hengeres lombikokban tenyésztett exponenciáis fázisban lévő tenyészetekből nyertük ki. A „protein-A-Sepharose CL-4B” oszlopon (Pharmacia) tisztított ellenanyagokat PBS-sel szemben dializáltuk, majd az ellenanyagokat tartalmazó oldatot sterilre szűrtük (0,45 pm) és -70 °C-on tároltuk (Harlow és Lane: 1988). A tisztított ellenanyagokat „Kurimover-II” oszlopon történő átengedéssel endotoxinmentessé tettük (Kurita-Vater, Tokió). A Limulus-féie vizsgálati eljárás alapján ez a tisztítási lépés az endotoxinkoncentrációt >250 NE endotoxin/mg ellenanyag értékről <0,2 NE/mg értékre csökkentette (Melvaer és Fystro: 1982). A 17E6 ellenanyag (egéreredetű IgGl) F(ab’)₂és F(ab’)-fragmenseit a szokásos eljárással állítottuk elő, ami után papainos hasítás és gélszűréses eljárás következett (Harlow és Lane: 1988).

αΡβ3- és <xllb$3-integrinek tisztítása

Az αVβ3-integrint humánplacentából tisztítottuk (Smith és Cheresh: 1988). A placentaizolátumokat összevagdaltuk és 2 térfogat jéghideg A-oldattal megmostuk (0,05 vegyes% digitonin, 2 mmol/1 CaCl₂, mmol/1 PMSF, pH=7,4), majd a vagdalékot leszűrtük. A fennmaradt anyagot 4 térfogat jéghideg B-pufferrel extraháltuk [100 mmol/1 oktil^-D-glükopiranozid (OG), 1 mmol/1 CaCl₂, 2 mmol/1 PMSF, PBS-pufferben oldva], majd a reakcióelegyet lecentrifúgáltuk (max. 12 000 g, 45 perc, 4 °C). A felülúszót egy olyan oszlopon recirkuláltattuk, melyen LM609 ellenanyag volt immobilizálva (16 óra, 4 °C). Az oszlopot ezután először C-pufferrel (0,1% NP-40, PBS-ben oldva, körülbelül 10 oszloptérfogat), majd D-pufferrel (0,1% NP-40, 2 mmol/1 CaCl₂,10 mmol/1 Na-acetát, pH=4,5, körülbelül 120 oszloptérfogat) mostuk, majd a felkötődött anyagot E-pufferrel (olyan D-puffer, melynek pHja 3,1-re van állítva) eluáltuk. Az eluátumot ezután mol/l-es Tris-pufferrel (pH=8,8) semlegesítettük, majd C-pufferrel szemben dializáltuk, ezután pedig körülbelül 10-szeresére töményítettük „Aquacide II” alkalmazásával (Calbiochem). A tisztított receptort ezután -70 °C-on tároltuk.

Az ain$3-integrint humánvérlemezkékből izoláltuk (Pytela és munkatársai: 1986). Lejárt szavatosságú vér19

HU 221 061 Β1 lemezke-koncentrátumot 1 térfogat „Tyrodes”-pufferrel elegyítettünk, a vérlemezkéket kiülepítettük (max. 1200 g), majd az üledéket lízispufferrel (50 mmol/1 OG, mmol/1 MgCl₂, 1 mmol/1 CaCl₂, 1 pmol/l MnCl₂, mmol/1 PMSF, 150 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 TrisHC1, pH=7,4) extraháltuk (1 óra, 20 °C). A reakcióelegyet ezután lecentrifugáltuk (max. 32 00 g, 30 perc, °C), majd a felülúszót egy GRGDSPK-peptiddel konjugált „CL-4B Sepharose” oszlopon recirkuláltattuk (16 óra, 4 °C). Az oszlopot ezután lízispufferrel mostuk (körülbelül 10 oszloptérfogat), majd GRGDSPK-peptiddel eluáltuk (3 mg/ml, 90%-os lízispufferben, 10% DMSO). Az eluált csúcsot körülbelül 5-szörösére töményítettük, majd módosított lízispufferrel szemben (0,1% ΝΡ-40-et tartalmazott az OG helyett) dializáltuk, majd -70 °C-on tároltuk. Az előállított integrinpreparátumok körülbelül 95%-os tisztaságúak voltak, integrin-ELISAvizsgálattal meghatározva, melyben a- és β-láncra specifikus monoklonális ellenanyagokat alkalmaztunk, valamint SDS-PaGE-eljárással meghatározva.

4. példa

Felszínjelölés és immunjellemzés

Sejtfelszin biotinilálása és extrakció: Exponenciális növekedési fázisban lévő sejteket EDTA jelenlétében begyűjtöttünk, a sejteket megmostuk és 5 χ 1 Őssejtet PBS-pufferben (1 ml) felszínükön megjelöltünk biotinN-hidroxi-szuccinimid-észter (10 pg/ml, Sigma) alkalmazásával, „end-over-end” rotátorban (2 óra, 20 °C). A sejteket ezután megmostuk, és milliliterenként x 10⁶-sejtet lizáltattunk, 1 órán át 20 °C-on, extrakciós pufferben (100 mmol/1, 2 mmol/1 CaCl₂, 1 mmol/1 MgCl₂, 1 mmol/1 PMSF PBS-pufferben). A reakcióelegyet ezután lecentrifugáltuk (12 000 g, 20 perc), a felülúszót pedig immunprecipitációs kísérletekben használtuk fel.

Immunprecipitáció: A biotinált sejtkivonatokat „Affigel-10” gyöngyökhöz (Biorad) vagy „protein-G Speharose”-hoz (Pharmacia) konjugált antiintegrin monoklonális ellenanyagokkal immunprecipitáltuk. 10 mg konjugált monoklonális ellenanyagot inkubáltunk a biotinilált sejtkivonatok 5E6-sejtekvivalenseivel, 1 éjszakán át 4 °C-on. A megmosott gyöngyöket nem redukáló SDS-mintafelvivő pufferben forraltuk, a mintákat ezután lecentrifugáltuk és SDS-PAGEeljárással 7,5%-os gélben elektroforetizáltuk. Az elválasztott fehérjéket elektroforetikusan nitrocellulóz membránra vittük át (Towbin és munkatársai: 1979) és a fehéijecsíkokat kecskében termeltetett alkalikus foszfatázzal konjugált antibiotin ellenanyaggal (Dako) tettük láthatóvá, szubsztrátként NBT-BCIP-t alkalmazva (Biorad).

Áramlási citometria: A sejteket EDTA jelenlétében begyűjtöttük, megmostuk, és 10⁶ sejtet 1% BSA-t tartalmazó PBS-pufferben inkubáltunk a monoklonális ellenanyaggal (10 pg/ml, 20 perc, 4 °C). A sejteket ezután mostuk, majd kecskében termeltetett FITC-cel konjugált antiegér-Ig-vel (Becton Dickinson) jelöltük (20 perc, 4 °C), majd az áramlási citometriás analízist megelőzően a sejteket propidium-jodiddal inkubáltuk (EPICS Profile II, Coulter). Az élő sejteket az oldalraés előreszóródó sejtek közül a megfelelő kapukon keresztül kiválogattuk. A fluoreszcenciát 488 nm hullámhosszon gerjesztettük, argon-ion-lézer alkalmazásával, és a kibocsátott fluoreszcencia értékeit (525 nm) rögzítettük. Bizonyos kísérletekben rövid fixálási és permeabilizálási lépéseket követően (70% etanol, 5 perc, -20 °C) az M21-L-sejteket megfestettük.

Komplementfüggő citotoxicitás (CDC): M21sejteket (10 000) 96 mélyületű lemezbe széleztettünk 50 μΐ teljes táptalajban és a mélyületekhez 20 μΐ ellenanyagot adtunk. Komplementforrásként nyúlszérumot (50 μΐ, 1:5 Behring) adtunk a mélyületekbe, majd a tálcát 37 °C-on 60 percig inkubáltuk. A lízis mértékét MTT-eljárással (Mosmann, 1983) határoztuk meg. A százalékos lízist úgy számítottuk ki, hogy 100%osan lizált kontrollnak a kizárólag 1% Tween-20-at tartalmazó mélyületeket tekintettük, 0%-os líziskontrollként pedig az ellenanyagot nem tartalmazó mélyületeket vettük figyelembe.

5. példa

Sejtnövekedés, életképesség és aktivitás

Proliferációs vizsgálati eljárások: Az ellenanyagok krónikus hatásának vizsgálata céljából 10⁶ sejtet inkubáltunk monoklonális ellenanyagok jelenlétében (70 pg/ml, PBS, 1 óra, 20 °C) „end-over-end” rotátoron. A sejteket ezután mostuk, majd újra felszuszpendáltuk őket, és RPMI-táptalajban tovább tenyésztettük a sejteket. A sejtek növekedésének sebességét és életképességüket „Trypán”-kék festékkizárás alapján becsültük. Az aktiválást a fent ismertetett MTT-eljárással határoztuk meg, és a sejtszámokat naponta meghatároztuk egy sejtszámláló berendezés alkalmazásával (Coulter Electronics).

Megtapadt melanomasejteket leválasztottunk a felületről (0,05% tripszin, 0,02% EDTA). A megmosott sejteket 96 mélyületű sima aljú mikrotesztálcákba szélesztettük (1 χ 10⁴ sejt mélyületenként), majd a sejteket 10% FCS-t tartalmazó RPMI-táptalajban tenyésztettük, amelyhez sorozatban hígított ellenanyagot adtunk, a kontroll nem tartalmazott ellenanyagot. 48 óra elteltével a sejteket pulzusjelöltük 18 órán keresztül (18,5 kBeq [³H]-timidin mélyületenként), majd a sejteket begyűjtöttük. A beépült radioaktivitás mértékét beütésszám/egységekben határoztuk meg.

6. példa

Ellenanyag által kiváltott celluláris citotoxicitási vizsgálati eljárás (ADCC):

A BALB/C jelű mikrogliális sejtek előállítását, az ADCC-eljárást, valamint az ellenanyag-effektorsejt közvetítette citosztáziseljárást (AECM) lényegében a Sutter és munkatársai által leírtak szerint végeztük (Sutter és munkatársai: 1991). Az M21-sejteket 18 órán keresztül pulzusjelöltük [³H]-timidinnel (18 kBq/4xlO³ sejt/mélyület) és a sejteket 96 mélyületű tálcákban BALB/C-mikrogliasejtekkel (5xl0⁴ sejt mélyületenként) inkubáltuk, 200 μΐ DMEM/FCS-ben (10%), ellenanyagok jelenlétében. 48 óra elteltével a célsejtek

HU 221 061 Β1 nukleáris kompartmenjében található [³H]-jel mennyiségét meghatároztuk. A monoklonális ellenanyagok által kiváltott citotoxicitás mértékét az alábbi összefüggés szerint számítottuk: [(kísérleti beütésszám - spontán beütésszám)/maximális beütésszám - spontán beütésszám)] x 100.

7. példa

Ellenanyag és ejfektorsejt által kiváltott citosztázis (AECM): Az eljárást az ADCC-eljáráshoz hasonlóan hajtottuk végre, azzal a különbséggel, hogy pulzusjelölt sejtek helyett frissen passzált jelöletlen M21-sejteket alkalmaztunk. 24 óra elteltével az effektor célsejt kevert tenyészeteket [³]-timidinnel pulzusjelöltük (18 kBq mélyületenként) további 24 órán át, majd a beépült nukleáris [³H]-jel mennyiségét meghatároztuk.

Sejttapadási vizsgálati eljárások: az eljárásokat a szakirodalomban leírtak szerint végeztük (Goodman és munkatársai: 1991), és a feltapadt sejteket hexózamidináz-aktivitásuk alapján mutattuk ki (Landegren: 1984). A hígításokat és a felszuszpendálásokat tapadási pufferben végeztük (RPMI, 1% BSA, 25 mmol/1 HEPES, pH=7,4). A mátrix fehérjékkel 96 vagy 48 mélyületű tálcákat burkoltunk, a mélyületeket ezután USA-val blokkoltuk, majd a mélyületekbe sorozatban hígított monoklonális ellenanyagokat, majd azt követően sejteket adtunk (2,5 χ 104—5 χ 10⁴). A tálcákat 1 órán keresztül 37 °C-on tartottuk, majd a meg nem tapadt sejteket a mélyületekből kimostuk, a feltapadt sejtek mennyiségét pedig párhuzamos kísérletekben egy standard görbe alapján meghatároztuk. A tapadás gátlásának mértékét az olyan mélyületekben mért értékekhez viszonyítva határoztuk meg, melyekbe nem adtunk monoklonális ellenanyagot. Tipikusan a hozzáadott sejtek több mint 70%-a hozzátapadt a vitronektinhez egy óra alatt. A kizárólag BSA-val burkolt mélyületekben a sejtek feltapadásának mértéke a specifikusan feltapadt sejteket tartalmazó mélyületekhez képest kevesebb mint 5%-os volt.

Felszíni keresztkötéses vizsgálati eljárás: Ugyanúgy, mint a sejttapadási vizsgálati eljárások során, a sejteket sorozatban hígított 17E6 ellenanyag vagy annak F(ab’)₂- vagy (F(ab’)-fragmensei jelenlétében engedtük a mátrixszal burkolt tálcák felszínéhez tapadni, keresztkötő reagensként pedig egyre növekvő mennyiségű kecskében termeltetett antiegér-F(ab’) ellenanyagot alkalmaztunk. A sejtek mosását és a feltapadt sejtek mennyiségének meghatározását a sejttapadási vizsgálatoknál leírtak szerint végeztük.

Tapadásreverziós vizsgálati eljárás: A sejteket tapadási pufferben olyan mélyületekbe szélesztettük, melyek a sejttapadási vizsgálati eljárás ismertetésekor leírtak szerint voltak burkolva és blokkolva, majd a tálcákat 37 °C-on állni hagytuk. Miután a sejtek szétterültek (60-75 perc), a mélyületekbe sorozatban hígított monoklonális ellenanyagot adtunk, és a tálcákat visszahelyeztük az inkubátorba. Úgy is végeztünk kísérleteket, hogy az ellenanyagok hozzáadása előtt a sejteket 24 órán keresztül tapadni engedtük. Miután a sejtek 2-3 órán keresztül érintkeztek az ellenanyaggal, a felülúszókat óvatosan eltávolítottuk a mélyületekből, és 5 χ friss, előmelegített tapadási pufferrel mostuk a mélyületeket, amely eljárása nagyobb mint 1 χ 10⁵-szeres hígítási faktort eredményezett.

In vivő tumorkifejlődési vizsgálati eljárás: Exponenciális növekedési fázisban levő tumorsejteket EDTA jelenlétében begyűjtöttünk, a sejteket megmostuk és életképességüket „Trypan”-kék festékkizárásuk alapján határoztuk meg. A sejteket életképessége 96-99%os volt. Elsődleges tumomövekedés céljából a sejteket (0,5 χ 10⁶ sejt, 0,2 ml PBS++-pufferben) szubkután csupasz egerek lágyékába injektáltuk. A tumorok növekedését úgy követtük nyomon, hogy a tumorok átmérőjét mérőkörző segítségével meghatároztuk, és a tumor térfogatát az elnyújtott ellipszoidok térfogatának meghatározására alkalmas alábbi egyszerűsített képlet szerint határoztuk meg: térfogat=(axb2)/2, ahol a tumor leghosszabb tengelyét, b pedig a legrövidebb tengelyét jelenti. Csoportonként legalább 8 kísérleti állatot vizsgáltunk.

Amennyiben kísérleti tüdőmetasztázist kívántunk előidézni, a begyűjtött sejteket (0,05% tripszin, 0,02% EDTA) csupasz egerek farki vénájába injektáltuk (0,5 xlO⁶ sejt, 0,2 ml PBS⁺⁺-pufferben). Az állatokat hét hét elteltével elpusztítottuk, tüdejüket kivettük és „Bouins”-oldatban fixáltuk, majd a tüdő felületén található tumoros gócpontokat megszámoltuk. Ellenanyagos kezelés esetén úgy jártunk el, hogy a begyűjtött és megmosott sejteket tisztított, endotoxinmentes monoklonális ellenanyagokkal inkubáltuk (70 pg/10⁶ sejt, 0,5 ml PBS⁺⁺-ban) 30 percig, 20 °C-on, „end-overend”-rotátoron, majd a sejteket PBS-sel meghígítottuk, úgy, hogy 0,2 ml szuszpenzió 0,5xlO⁶ sejtet tartalmazzon, és ezt követte az injektálás. A sejtek életképességét „Trypan”-kék festékkizárással határoztuk meg az injektálás előtt és után, és a kapott értékek lényeges különbséget nem mutattak (életképesség injektálás előtt=életképesség injektálás után±5%). A tumomövekedés gátlásának mértékét a kétfarkú Student-féle Tteszt alkalmazásával határoztuk meg.

8. példa

Molekuláris biológiai eljárások:

Ha másképp nem jelezzük, valamennyi molekuláris biológiai eljárást a szakirodalomban leírtak szerint hajtottunk végre (Sambrook és munkatársai: 1989).

RNS- és cDNS-előállítás: 17E6-sejtekből össz-RNS-t izoláltunk guanidium-tiocianátos extrakcióval, majd az RNS-t cézium-klorid-sűrűséggradiens ultracentrifugálással tisztítottuk (Chirgwin és munkatársai: 1979). Az első cDNS-szálat kereskedelmi forgalomban beszerezhető reagenskészlet alkalmazásával szintetizáltuk meg (Pharmacia). A szintézist 15 μΐ térfogatban hajtottuk végre, 5 pg RNS jelenlétében, 1 órán keresztül 37 °C-on. Az előállított első cDNS-szálat közvetlenül templátként használtuk fel PCR-amplifikáció során.

PCR-ampliflkáció: Az egér-immunglobulin könnyűlánca és nehézlánca variábilis régióinak amplifikálásához olyan redundáns és szemidegenerált PCR-láncindító oligonukleotid-keveréket alkalmaztunk, melyet

HU 221 061 Β1 úgy terveztek, hogy az egéreredetű immunglobulin szignálszekvenciákat kódoló régiókhoz hibridizálódjanak (Jones és Bendig: 1991). A nehézlánc variábilisdoméngénje amplifikálásához 5’-végi láncindítóként egy 61 oligonukleotidból álló keveréket használtunk, a kappa-lánc variábilis doménje génjének amplifikálásához pedig egy 405 oligonukleotidot tartalmazó keverék szolgált 5’-végi láncindítóként. A 3’-végi láncindítókat úgy tervezték, hogy a konstans régiókkal hibridizálódjanak, specifikus IgGl- és kappa egér láncindító oligonukleotidokat alkalmaztunk.

Az amplifikációt hőstabil DNS-polimeráz alkalmazásával 25 pl térfogatú reakcióelegyekben hajtottuk végre: 1 pl cDNS-RNS-hibrid, 250 nmol/1 5’-végi és 3’-végi láncindító oligonukleotidkeverék, 200 pmol/1 valamennyi dNTP-ből, 1 mmol/1 MgCl₂ (a könnyűlánc génjének amplifikálásához), 2 mmol/1 MgCl₂ (a nehézlánc génjének amplifikálásához), 1 E Taq-polimeráz (Cetus), a reakcióelegyeket ásványi olajjal fölülrétegeztük, és kiindulásul 60 °C-ra melegítettük őket, ami az 55 °C-os hibridizációs hőmérséklethez képest „forró startnak” számít. 30 amplifikációs ciklus végrehajtása után (1 másodperc, 55 °C; 1,5 másodperc 72 °C; 45 másodperc, 92 °C) a PCR-reakciótermék tizedrészét 1%os TAE-agarózgélben elektroforetizáltuk, és a kapott PCR-termékeket etidium-bromidos festéssel tettük láthatóvá.

Molekuláris klónozás és szekvenálás: A PCRtermékek 1 pl-ét Ta-vektorba ligáltuk (Invitrogen, San Diego). A két ligálási reakció termékét - az inszertek a nehéz-, illetve a könnyűlánc variábilis régióinak génjeit tartalmazták - hősokkal kompetens E. coli TGl-sejtekbe transzformáltuk, és ily módon létrehoztunk két DNS-könyvtárat, melyek egyike a 17E6 ellenanyag könnyűlánca variábilis régiójának génjét, másika pedig a 17E6 ellenanyag nehézlánca variábilis régiójának génjét tartalmazta. A kiónokat 100 pg/ml karbenicilint tartalmazó LB-táptalajon szelektáltuk, majd tovább analizáltuk azokat. A pozitív kiónokat PCR-es szűrővizsgálattal vagy plazmidemésztéssel (Gussow és Clackson: 1989) vizsgáltuk. A transzformánsok szekvenálása céljából kettős szálú plazmid-DNS-t izoláltunk („Wizard preps”, Promega Corp.). A Taq-polimeráz alkalmazásával hőciklusos szekvenálást hajtottunk végre a didezoxinukleotidos láncterminációs eljárás szerint (Sanger és munkatársai: 1977). A TA-vektorral komplementer láncindítók alkalmazásával a szekvenálást mindkét láncon elvégeztük.

Integrin-ligandum-kötődési és kompetíciós vizsgálati eljárások

A ligandumok biotinilálása: A PBS-pufferben oldott ligandumokat 5-ször tömény ligációs pufferrel hígítottuk (végkoncentráció: 1 mg/ml fehérje, 100 mmol/1 NaCl, 100 mmol/1 NaHCO₃, pH=8,2) 1 ml végtérfogatban. A reakcióelegyhez ezután frissen készített N-hidroxiszuccinimido-biotin-oldatot (100 pl, 1 mg/ml, DMSO-ban oldva) adtunk keverés közben, és a reakciót 2 órán át 20 °C-on hajtottuk végre, „end-over-end” rotáció alkalmazásával. Alapos dialízist követően (4 °C, PBS, 0,05% NaN₃), meghatároztuk a fehérjekoncentrációt, és a biotinilált ligandumot 4 °C-on tároltuk, majd 21 napon belül felhasználtuk. A biotinilált cRGDfK-peptid (ciklikus Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys=Nbiotin-amino-hexánsav) a technika állása szerint ismert eljárással állítottuk elő.

Közvetlen kompetíciós vizsgálati eljárások: Az eljárásokat kisebb módosításoktól eltekintve a Smith és munkatársai által leírtak szerint hajtottuk végre (Smith és munkatársai: 1990). Az aVp3-integrint 1 pg/ml koncentrációjúra hígítottuk A-pufferrel (150 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 MgCl₂, 1 mmol/1 CaCl₂, 10 pmol/1 MnCl₂, 20 mmol/1 Tris-HCl, pH=7,4) és a 96 mélyületű mikrotitertálcákat a hígított oldat 100 ml-ével kezeltük egy éjszakán át, 4 °C-on. A tálcákat ezután egyszer B-pufferrel mostuk (3 vegyes% BSA, 100 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 MgCl₂, 1 mmol/1 CaCl₂, 10 pmol/1 MnCl₂, 50 mmol/1 Tris-HCl, pH=7,4), majd a tálcákat 2 órán keresztül 20 °C-on B-pufferben tartottuk. A tálcákat ezután C-pufferrel kiöblítettük (0,1 vegyes% BSA-t tartalmazó B-puffer), majd a mélyületekbe biotinilált ligandumot (1 pg/ml végkoncentrációban) és sorozatban hígított tesztpeptideket vagy -fehérjéket adtunk. Inkubációt követően (3 óra, 30 °C) a megkötetlen ligandumot a tálcából C-pufferrel végzett 3 öblítéssel eltávolítottuk, majd a tálcákat további 1 órán át inkubáltuk lúgos foszfatázzal konjugált antibiotin ellenanyaggal (1:10 000, C-pufferben, Sigma). A tálcákat ezután PBS-pufferrel kimostuk, és a megkötözött ellenanyagot NBT-BCIPszubsztráttal (Biorad) kimutattuk. Az ECM-molekulákat és az ellenanyagokat szokásos eljárással biotiniláltuk, és a fenti vizsgálati elrendezésben alkalmaztuk őket.

A vizsgálatokat három vagy négy párhuzamos méréssel végeztük, és legalább háromszor megismételtük őket, majd a kapott eredményekből az IC₅₀-értékeket súlyozatlan szigmoid görbéhez történő illesztéssel határoztuk meg. Az eredményeket belső kontrollpeptidekhez normalizáltuk, ami lehetővé tette az egy vizsgálati eljáráson belül történő összehasonlítást. Külső standardként a GRGDSPK-szekvenciájú lineáris RGDpeptidet és a cRGDfV ciklikus peptidet alkalmaztuk, kontrollként pedig olyan mélyületeket használtunk, melyekben a biotinilált ligandum blokkolt, de integrinmentes mélyületekhez kötődött, és alkalmaztuk olyan kontrollmélyületeket is, melyekben az antibiotin ellenanyag ligandummentes integrinhezkötődött: akontrollmélyületekben mért értékek kisebbek voltak a specifikus ligandumkötődési értékek 7,5%-nál.

Az előgátlásos kompetíciós vizsgálati eljárásokban alkalmazott tálcákat receptorral burkoltuk, és a közvetlen kompetíciós vizsgálati eljárás esetén leírtak szerint blokkoltuk, majd a tálcákat a biotinilált vizsgálandó ligandum vagy ellenanyag (50 pl, C-pufferben) hozzáadása előtt kétszer tömény ellenanyagot, mátrixmolekulákat, vagy kompetitív peptideket tartalmazó oldattal előinkubáltuk (50 pl, C-pufferben, 1 óra, 30 °C), majd az inkubálást tovább folytattuk (3 óra, 30 °C), azután pedig a tálcákat kimostuk és a közvetlen kompetíciós vizsgálati eljárás esetén leírtak szerint meghatároztuk a kötődött biotin mennyiségét.

HU 221 061 Β1

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 381 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS HIPOTETIKUS: nem ANTISZENSZ: nem FRAGMENSTÍPUS: N-terminális.

EREDETI FORRÁS:

ÉLŐLÉNY: egér

TÖRZS: BALB/C KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 72-17E6 SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELŐLÉS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 1...129

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: szignál- és FRl-szekvencia (szignálszekvencia: 1-60; FR-1: 61-129)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 130...162

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: CDR-1-szekvencia SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 163.. .207

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: FR-2-szekvencia

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 208.. .228

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: CDR-2-szekvencia SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 229...324

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: FR-3-szekvencia

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 325...351

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: CDR-3-szekvencia SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 352...381 EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: FR-4-szekvencia AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATG Me t 1

GTG TCC

TCA GCT CAG

TTC Phe

CTT GGT Leu Gly

CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA

Val

Ser

Ser

Alá Gin 5

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Cy s

Phe 15

Gin

GTT

ACC

AGA

TGT

GAT

ATC

CAG

ATG

ACA

CAG

ACT

ACA

TCC

TCC

CTG

TCT

Val

Thr

Arg

Cy s

As p

I le

Gin

Me t

Thr

Gin

Thr

Thr

Ser

Ser

Leu

Ser

20

25

30

GCC

TCT

CTG

GGA

GAC

AGA

GTC

ATC

ATC

AGT

TGC

AGG

GCA

AGT

CAG

GAC

A1 a

Ser

Leu

Gly

As p

Arg

Val

I le

I le

Ser

Cy s

Arg

A1 a

Ser

Gin

Asp

35

40

1

5

144

HU 221 061 Β1

192

ATT

AGC

AAT

TAT

TTA

AGC

TGG

TAT

CAA

CAG

AAG

CCA

GAT

GGA

ACT

GTT

I le

Se r

Asn

Tyr

Leu 10

Ser

Trp 1

Tyr

Gin

Gin

Ly s 5

Pro

Asp

Gly

Thr

Val 10

AAA

CTC

CTG

ATC

TTC

TAC

ACA

TCA

AAA

TTA

CAC

TCA

GGA

GTC

CCA

TCA

Lys

Leu

Leu

I le

Phe 15

Tyr 1

Thr

Se r

Lys

Leu 5

Hi s

Ser

Gly 1

Val

Pro

Ser

AGA

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGA

ACA

GAT

TAT

TCT

CTC

ACC

ATT

AGT

Arg 5

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 10

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr 15

Ser

Leu

Thr

I le

Ser 20

AAC

CTG

GAC

CAA

GAA

GAT

ATT

GCC

ACT

TAC

TTT

TGC

CAA

CAG

GGT

AAT

Asn

Leu

Asp

Gin

Glu 25

Asp

I le

Al a

Thr

Tyr 30

Phe

Cy s

Gin 1

Gin

Gly

Asn

ACG

TTT

CCG

TAC

ACG

TTC

GGA

GGG

GGG

ACA

AAG

GTG

GAA

ATG

AGA

Thr 5

Phe

Pro

Tyr

Thr

Phe 1

Gly

Gly

Gly

Thr 5

Ly s

Val

Glu

Met

Arg 10

240

288

336

381

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 43 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Va 1

Ser

Se r

Al a

Gin

Phe

Leu

Gly

Leu

Leu

Leu

Leu

Cy s

Phe

Gin

1

5

10

15

Val

Thr

Arg

Cy s

Asp

I le

Gin

Me t

Thr

Gin

Thr

Thr

Ser

Ser

Leu

Ser

20

25

30

Al a

Ser

Leu

Gly

Asp

Arg

Va 1

I le

I le

Ser

Cy s

35

40

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 11 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Alá Ser Gin Asp I le Ser Asn Tyr Leu Ser

5 10

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 15 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: protein

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Va1 Lys Leu Leu I le Phe 1 5 10 15

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 7 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: protein

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser

5

HU 221 061 Β1

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 32 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly Va1 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser

5 10 15

Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Gin Glu Asp Ile Alá Thr Tyr Phe Cys

25 30

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 9 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Gin Gly Asn Thr Phe Pro Tyr Thr

5

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 10 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Me t Arg

5 10

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 411 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS HIPOTETIKUS: nem ANTISZENSZ: nem FRAGMENSTÍPUS: N-terminális.

EREDETI FORRÁS:

ÉLŐLÉNY: egér TÖRZS: BALB/C KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 272-17E6 SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 1...57

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: szignálszekvencia SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 58...147

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: FR-1 szekvencia

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 148...162

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: CDR-l-szekvencia SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 163...204

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: FR-2-szekvencia

HU 221 061 Β1

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 205...255

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: CDR-2-szekvencia SAJÁTSÁG:

NÉV/MEG JELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 256...351

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: FR-3-szekvencia SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 352...378

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: CDR-3-szekvencia SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 379...411

EGYÉB INFORMÁCIÓK: funkciók: FR-4-szekvencia A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATG GGA

TGG AGC

TGG Trp 15

GTC TTT ATC TTC

CTG Leu 20

TTT Phe

TCA Ser

GTA Val

ACT Thr

GCA Al a 25

GGT Gly

Me t

Gly

Trp

Ser

Va 1

Phe

I le

Phe

GTC

CAC

TCC

CAG

GTC

CAG

CTT

CAG

CAG

TCT

GGG

GCT

GAA

CTG

GCA

GAG

Val

Hi s

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Gin

Ser

Gly

Al a

Glu

Leu

Al a

Glu

1

5

10

CCT

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

ATG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTT

Pr o

Gly

Al a

Ser

Val

Ly s

Me t

Ser

Cy s

Ly s

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

AGT

AGT

TTC

TGG

ATG

CAC

TGG

GTA

AAA

CAG

AGG

CCT

GGA

CAG

GGT

CTG

Ser

Ser

Phe

Trp

Me t

Hi s

Trp

Val

Ly s

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

30

1

5

1

5

10

GAA

TGG

ATT

GGA

TAC

ATT

AAT

CCT

AGA

TCT

GGT

TAT

ACT

GAG

TGT

AAT

Glu

Trp

I le

Gly

Tyr

I le

Asn

Pro

Arg

Ser

Gly

Tyr

Thr

G1 u

Cy s

Asn

1

5

10

GAG

ATA

TTC

AGG

GAC

AAG

GCC

ACA

ATG

ACT

GCA

GAC

ACC

TCC

TCC

AGC

Glu

I le

Phe

Arg

Asp

Ly s

Al a

Thr

Me t

Thr

Al a

Asp

Thr

Ser

Ser

Ser

15

1

5

10

ACA

GCC

TAC

ATG

CAA

CTG

AGT

GGT

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCA

GTC

Thr

Al a

Tyr

Me t

Gin

Leu

Ser

Gly

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Al a

Val

15

20

25

TAT

TAC

TGT

GCA

AGT

TTT

CTG

GGA

CGA

GGG

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGT

Ty r

Tyr

Cy s

Al a

Se r

Phe

Leu

Gly

Arg

Gly

Al a

Me t

Asp

Tyr

Trp

Gly

30

1

5

1

CAA

GGA

ACC

TCA

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

Gin

Gly

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ser

144

192

240

288

336

384

411

10

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

HU 221 061 Β1

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t Gly Trp Ser Trp Val Phe I le Phe Leu Phe Ser Val Thr Alá Gly 15 10 15

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 30aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Val 1

Gin

Leu

Gin 5

Gin

Ser

Gly

A1 a

Glu 10

Leu

A1 a

Glu

Pro

Gly Alá 15

Ser

Val

Lys

Me t

Ser

Cys

Lys

A1 a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Ser

20

25

30

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 5 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser Phe Trp Me t His 1 5

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 14 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp I le Gly 1 5 10

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Tyr I le Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Glu Cys Asn Glu I le Phe Arg 15 10 15

Asp

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 32 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys 1

A1 a

Thr

Me t

Thr 5

A1 a

Asp

Thr

Ser

Ser 10

Ser

Thr

A1 a

Tyr

Me t 15

Gin

Leu

Ser

Gly

Leu

Thr

Ser

Glu

As p

Ser

A1 a

Val

Tyr

Tyr

Cy s

A1 a

Ser

20

25

30

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 9 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: protein

HU 221 061 Β1

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEIRASA:

Phe Leu Gly Arg Gly Alá Me t Asp Tyr

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 11 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: protein

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Va1 Thr Val Ser Ser

Claims (19)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Monoklonális ellenanyag, amely tartalmazza a 17A. ábrán bemutatott könnyűlánc 21-127. aminosavai közötti és a 17B. ábrán bemutatott nehézlánc 20-137. aminosavai közötti vázrégióknak (FR) és komplementaritást meghatározó régióknak (CDR) ami- 20 nosavszekvenciáit, vagy azok mutánsait vagy variánsait, és amelynek sajátságai a következők:

   - az aV-integrineknek kizárólag az aV-láncával reagál,

   - képes gátolni az aV-integrint hordozó sejtek in- 25 tegrinszubsztráthoz történő tapadását,

   - képes gátolni a tumorkifejlődést,

   - nincs citotoxikus aktivitása, és

   - képes indukálni az aV-integrinek által okozott, kialakult sejt-mátrix kölcsönhatások reverzióját.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, amely integrinszubsztrátként vitronektinhez, fibrinogénhez vagy fibronektinhez történő tapadást képes gátolni.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, amely tumorként melanoma kifejlődését képes gátolni.
4. 4. Ellenanyagffagmens, melynek sajátságai megegyeznek az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag sajátságaival.
5. 5. Hibridóma-sejtvonal, melynek megjelölése 27217E6, DSM ACC2160 deponálási számon letétbe van helyezve, és képes 1-3. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyagot termelni.
6. 6. Monoklonális ellenanyag, melyet a DSM ACC2160 jelű sejtvonal termelt.
7. 7. Izolált polipeptid, amelynek az aminosavsorrendje a 17A. ábrán megadott.
8. 8. Izolált polipeptid, amelynek az aminosavsorrendje a 17B. ábrán megadott.
9. 9. Izolált polipeptid, amelynek az aminosavsorrendje a 17A. ábrán a 21. aminosavtól kezdődően megadott.
10. 10. Izolált polipeptid, amelynek az aminosavsorrendje a 17B. ábrán a 20. aminosavtól kezdődően megadott.
11. 11. Izolált polinukleotid, amely tartalmazza a 17A. ábrán bemutatott DNS-szekvenciát, vagy annak mutánsát vagy variánsát, amely az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag könnyűlánca variábilis régiójának FR- és CDR-szekvenciáit kódolja.
12. 12. Izolált polinukleotid, amely tartalmazza a 17B. ábrán látható DNS-szekvenciát, annak mutánsát vagy variánsát, amely az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag nehézlánca variábilis régiójának FRés CDR-szekvenciát kódolja.
13. 13. A 11. igénypont szerinti izolált polinukleotid, amely tartalmazza a 17A. ábrán megadott szignálszekvenciát.
14. 14. A 12. igénypont szerinti izolált polinukleotid, amely tartalmazza a 17B. ábrán megadott szignálszekvenciát.
15. 15. Gyógyászati készítmény, amely 1-4. vagy 6. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellen30 anyagot és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
16. 16. Eljárás az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy egeret tisztított aVp3-integrinnel im35 munizálunk, ELISA-eljárással kiválasztjuk azokat a kiónokat, melyek a megfelelő tisztított aVp3-receptorhoz kötődni képes ellenanyagot termelnek, és önmagukban ismert eljárások alkalmazásával olyan specifikus sejtvonalat állítunk elő, amely a kiválasztott ellen40 anyagot termeli.
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egeret integrinként vitronektin-receptorral immunizáljuk.
18. 18. Eljárás a 6. igénypont szerinti monoklonális el45 lenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy egeret tisztított vitronektin-receptorral immunizálunk, a tisztított vitronektin-receptorhoz kötődni képes ellenanyagokat termelő kiónokat ELISA-eljárással kiválasztjuk, és önmagában ismert eljárások alkalmazásával 5. igény50 pont szerinti sejtvonalat állítunk elő, amely 6. igénypont szerinti ellenanyagot termel.
19. 19. Az 1-4. vagy 6. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag alkalmazása tumorellenes, előnyösen melanomaellenes készítmény előállításá55 ra, vagy tumomövekedés lokalizálására, és mértékének meghatározására alkalmas diagnosztikai készítmény előállítására.