KR20040083068A

KR20040083068A - 항-혈관형성 단백질과 단백질 단편 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20040083068A
Application number: KR10-2004-7009500A
Authority: KR
Inventors: 라우람 칼루리
Original assignee: 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2004-09-30
Also published as: EP1517724A4; US20030144481A1; WO2003059257A2; US7387779B2; CA2470998A1; US20090054344A1; WO2003059257A8; EP1517724A2; JP2006508015A; AU2002359784A1

Abstract

항-혈관형성 특성을 보유하는 단백질과 이의 단편 및 이들 단백질과 단편을 사용하여 혈관형성을 저해하거나 촉진하는 방법을 개시한다.

Description

항-혈관형성 단백질과 단백질 단편 및 이의 사용 방법{ANTI-ANGIOGENIC PROTEINS AND FRAGMENTS AND METHODS OF USE THEREOF}

기저막은 상피 또는 내피 세포가 생장할 수 있는 지지구조(supporting structure)를 제공할 수 있고 근육 또는 지방을 둘러싸는 특수화된 세포외 매트릭스로 구성된 얇은 층이다(Paulsson, M., 1992, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27:93-127). 기저막은 항상 세포와 연합되어 있으며, 기저막은 기계적인 뒷받침을 제공할뿐만 아니라 분화 및 증식과 같은 세포 거동에도 영향을 주는 것으로 기저막에 대해 조사가 잘 이루어져 있다. 맥관 기저막은 콜라겐, 라미닌, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 피브로넥틴(fibronectin), 엔탁틴(entactin)과 같은 거대 분자로 구성되어 있다(Timpl, R., 1996, Curr. Opin. Cell. Biol. 8:618-24). 기능상으로, 콜라겐은 세포 흡착, 이동, 분화 및 생장을 촉진시키고 (Paulsson, M., 1992, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27:93-127), 이와 같은 기능을 통하여, 기존의 혈관에서 새로운 혈관을 만드는 공정이 되는 혈관형성(angiogenesis)동안에 내피 세포 증식 및 거동에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다(Madri, J.A. et al., 1986, J. Histochem. Cytochem. 34:85-91; Folkman, J., 1972, Ann. Surg. 175.409-16). 혈관형성과정은 내피 세포의 파생(sprouting) 및 이동이 요구되는 과정으로, 내피 세포가 관형 구조로 분화되고, 발생되는 혈관 주변에 기저막 매트릭스가 만들어지는 복잡한 공정이다. 혈관형성과정은 상처 치유 및 자궁내막 리모델링과 같은 정상적인 생리학적 과정에도 중요한 공정이다(Folkman, J. et al., 1995, J Biol. Chem. 267:10931-34). 혈관형성과정은 크기가 어느 정도인(~㎣) 충실성 종양의 전이와 생장에도 필요한 것으로 알려져 있다(Folkman, J., 1972, Ann. Surg. 175:409-16; Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1:27-3 1). 종양을 관주하는 혈액과 몇 가지 생장인자 및 새로운 모세관 상피에 의해 만들어지는 매트릭스에 의한 종양 세포의 파라크린 자극으로 종양의 크기가 확장될 수 있다(Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1:27-3 1). 최근에, 몇 가지 혈관형성 저해물질이 확인되었는데, 예를 들면, 앤지오스타틴(anglostatin)(O'Reilly, M.S. et al., 1994, Cell 79:315-28), 엔도스타틴(endostatin)(O'Reilly, M.S. et al., 1997, Cell I :277-85), 레스틴(restin) (Ranichandran, R. et al., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 255:735-9), 착색 상피-유도 인자(pigment epithelilum-derived factor)(PEDF)등이 있다(Dawson, D.W. et al., 1999, Science 285:245-8).

Ⅳ형 콜라겐은 6가지 별개의 α 사슬(α1부터 α6)로 발현되고(Prockop, D. J. et al., 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:403-34), 삼중 나선으로 어셈블링된다. 또한 콜라겐은 네트워크를 형성하여, 기저막에 있는 다른 분자를 위한 골격을 제공한다. 이와 같은 α 사슬는 N-말단 7S 도메인, 중간 삼중 나선 도메인, C-말단 구형 비-콜라겐성(NC1) 도메인(Timpl, R. et al., 1981, Eur. J Biochem. 120:203-11)과 같이 세 가지 도메인으로 구성된다. 몇 연구에서는 콜라겐 대사 저해물질이 항-혈관형성 특징을 가지고 있으며, 이는 기저막 콜라겐 합성 및 침착이 혈관 형성 및 생존에 중요하다는 생각을 뒷받침해주고 있다(Maragoudakis, M.E. et al., 1994, Kidney Int. 43:147-50; Haralabopoulos, G.C. et al., 1994, Lab. Invest. 71:575-82). 하지만, 기저막 조직 및 혈관형성과정에서 콜라겐의 정확한 역할에 대해서는 아직 잘 알려지지 않고 있다.

인테그린은 중요한 세포 표면 흡착 수용체 패밀리로써, 많은 화합물에 대해 흡착성 분자로 기능을 하고 있다. 인테그린은 세포-세포간 또는 세포-세포외 매트릭스 상호작용에 관련되며, 이들 두 가지 상호작용 모두 세포와 세포외 매트릭스와의 상호작용을 매개하며, 세포에 인테그린이 결합되는 원인이 된다. 인테그린은 두 개의 비-공유 결합된 막통과 당단백질 아단위 즉, α아단위와 β아단위로 구성된 αβ 이형이량체이다. 모든 α 아단위는 서로 공유하고 있는 상동성이 있으며, β 아단위도 마찬가지다. 현재까지 확인된 α 아단위는 16가지이고(α₁부터 α₉, α_D, α_L, α_M, α_V, α_X, α_Ⅱb, α_IELb), 8가지 β아단위(β₁부터 β₈까지)이고, 이들은 22가지 조합을 만들 수 있다(β₁과 α₁~α₉; β₁과 α_V; β₂와 α_D, α_L, α_M, α_X; β₃과 α_V, α_X; β₄와 α₆; β₅와 α_v; β₆과 α_v; β₇과 α_4,α_IELb; β₈과 α_v;). 인테그린 아단위의 일부 mRNA를 또 다른 방법으로 절단(alternative splicing)하여, 이용할 수 있는 인테그린 아단위 풀(pool)을 추가로 증가시킬 수 있다.

세포 표면상 특정 부위에 인테그린 농도가 특정 최저치 이상이 되는 경우에, 일반적으로 인테그린은 이들 리간드에 결합하여, 초점 접촉부를 형성하거나 또는 반-교소체(hemidesmosome)를 만든다. 초점 접촉부 형성과 낮은 결합 친화력이 복합되면, 인테그린 분자 농도에 따라 약하게 또는 강하게 결합하게 된다.

본 발명의 요약

본 발명은 항-혈관형성 단백질 및 생물학적으로 활성을 지닌 이의 단편에 관계한다. 본원에 기술된 단편은 항-혈관형성 단백질이 별개 활성을 가진 부분으로 추가 분할할 수 있는데, 예를 들면, 항-혈관형성 활성 및 항-종양 세포 활성으로 분할되며, 이와 같은 별개 활성은 더 큰 단백질 분자에서만 나타난다는 것을 설명하는 것이다. Ⅳ형 콜라겐의 α3(Ⅳ)NC1 도메인의 경우에, 이들 활성은 굿패스처 에피토프 부분의 외부에 있다.

여기에서 나타낸 바와 같이, 이들 활성 단편은 내피 세포 특히, α_Vβ₃인테그린을 발현하는 내피 세포에 대해 높은 특이성을 가지고, 이들 단편들은 이와 같은 내피 세포에서 단백질 합성을 저해한다. 내피 세포에서 α_Vβ₃인테그린에 활성 단편이 결합되면, 네거티브 신호가 유도되어, 이들 내피 세포에서 단백질 합성이 저해되는 결과를 가진다. 이는 내피 세포뿐만 아니라 모든 형태의 세포에서 단백질 합성에 영향을 주는 라포마이신(rapomycin)에 의한 단백질 합성 저해와는 별개인 것으로 보인다. 이와 같은 특이성을 이용하면 단백질 합성이 필요하지 않는 경우에 단백질 합성을 저해할 수 있을 것이고, 본원에 기술된 단백질 및 펩티드를 면역억제 물질로 이용할 수도 있다.

특히, 본원에 기술된 발명은 종양 생장을 저해하는 능력을 가진 SEQ ID NO:10의 분리 단편과 관련된다. 단편으로는 T7(SEQ ID NO:37), T7-돌연변이체(SEQ ID NO:38), T8(SEQ ID NO:39), T8-3(SEQ ID NO:4O), TP3(SEQ ID NO:41), P2(SEQ ID NO:42)등이 될 수 있다. 이와 같은 단편들은 환원, 알킬화, 또는 산화형태가 될 수도 있다. 이와 같은 단편들은 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 한 개 이상의 시스테인 잔기를 보유할 수도 있다.

본 발명은 SEQ ID NO: 1O으로 된 분리된 단편에 관계하는데, 이 단편에는 1개 내지 5개 아미노산이 치환되었고, 돌연변이된 단편은 종양 생장을 저해시킬 수 있는 능력을 가지고 있다. 이와 같은 단편들은 T7-돌연변이(SEQ ID NO:38), T8 (SEQ ID NO:39), T8-3(SEQ ID NO:40), TP3(SEQ ID NO:41), P2(SEQ ID NO:42) 등이 될 수 있다. 이와 같은 단편들은 환원, 알킬화, 또는 산화형태가 될 수도 있다. 이와 같은 단편들은 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 한 개 이상의 시스테인 잔기를 보유할 수도 있다.

본 발명은 SEQ ID NO: 10의 분리된 단편에 관계하는데, 이 단편은 혈관형성을 저해하는 능력을 가진다. 단편은 T7(SEQ ID NO:37), T7-돌연변이(SEQ ID NO:38), T8 (SEQ ID NO:39), T8-3(SEQ ID NO:40), TP3(SEQ ID NO:41), P2(SEQ ID 3 NO:42) 등이 될 수 있다. 이와 같은 단편들은 환원, 알킬화, 또는 산화형태가 될 수도 있다. 이와 같은 단편들은 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 한 개 이상의시스테인 잔기를 보유할 수도 있다.

본 발명은 SEQ ID NO: 10의 분리된 단편에 관계하는데, 이 단편에는 1개 내지 5개 아미노산이 치환되어 있고, 돌연변이된 단편은 혈관형성을 저해하는 능력을 가진다. 단편은 T7-돌연변이(SEQ ID NO:38), T8(SEQ ID NO:39), T8-3(SEQ ID NOAO), TP3(SEQ ID NO:40), P2(SEQ ID NO:42) 등이 될 수 있다. 이와 같은 단편들은 환원, 알킬화, 또는 산화형태가 될 수도 있다. 이와 같은 단편들은 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 한 개 이상의 시스테인 잔기를 보유할 수도 있다.

본 발명은 SEQ ID NO: 10의 분리된 단편에 관계하는데, 이 단편은 내피 세포에서 단백질 합성을 저해하는 능력을 가진다. 단편은 T7(SEQ ID NO:37), T7-돌연변이(SEQ ID NO:38), T8(SEQ ID NO:39), T8-3(SEQ ID NO:40), TP3(SEQ ID NO:41), P2(SEQ ID NO:42) 등이 될 수 있다. 이와 같은 단편들은 환원, 알킬화, 또는 산화형태가 될 수도 있다. 이와 같은 단편들은 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 한 개 이상의 시스테인 잔기를 보유할 수도 있다. 단백질 합성은 캡(cap)-의존성 합성이 될 수 있다. 세포는 α_vβ₃인테그린을 발현시킬 수 있다.

본 발명은 SEQ ID NO: 10의 분리된 단편에 관계하는데, 이 단편에는 1개 내지 5개 아미노산이 치환되어 있고, 돌연변이된 단편은 내피 세포에서 단백질 합성을 저해하는 능력을 가진다. 단편은 T7-돌연변이(SEQ ID NO:38), T8(SEQ ID NO:39), T8-3(SEQ ID NO:40), TP3(SEQ ID NO:41), P2(SEQ ID NO:42)등이 될 수 있다. 이와 같은 단편들은 환원, 알킬화, 또는 산화형태가 될 수도 있다. 이와 같은단편들은 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 한 개 이상의 시스테인 잔기를 보유할 수도 있다. 단백질 합성은 캡-의존성 합성이 될 수 있다. 세포는 α_vβ₃인테그린을 발현시킬 수 있다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 포유류 조직에서 혈관형성 활성을 저해하는 방법에 관계하는데, 이때 방법은 다음에서 선택된 분리된 단편을 포함하는 조성물을 조직과 접촉시키는 것이다: (a) SEQ ID NO:1O (b) SEQ ID NO: 1O의 아미노산 1 내지 아미노산 124; (c) SEQ ID NO:20; (d) SEQ ID NO:21 ;(e) SEQ ID NO:22; (f) SEQ ID NO:23; (g) SEQ ID NO:25; (h) SEQ ID NO:26; (i) SEQ ID NO:29; 0) SEQ ID NO:30; (k) SEQ ID NO:33; (l) SEQ ID NO:34; (m) SEQ ID NO:37; (n) SEQ ID NO:38; (o) SEQ ID NO:39; (p) SEQ ID NO:40; (q) SEQ ID NO:41; (r) SEQ ID NO:42. 이와 같은 단편들은 환원, 알킬화, 또는 산화형태가 될 수도 있다. 이와 같은 단편들은 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 한 개 이상의 시스테인 잔기를 보유할 수도 있다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 포유류 조직에서 종양 생장을 저해하는 방법에 관계하는데, 이때 방법은 다음에서 선택된 분리된 단편을 포함하는 조성물을 조직과 접촉시키는 것이다: (a) SEQ ID NO: 1O; (b) SEQ ID NO: 1O의 아미노산 1 내지 아미노산 124; (c) SEQ ID NO:20; (d) SEQ ID NO:21; (e) SEQ ID NO:22; (f) SEQ ID NO:23; (g) SEQ ID NO:25; (h) SEQ ID NO:26; (i) SEQ ID NO:29; (j) SEQ ID NO:30; (k) SEQ ID NO:33; (l) SEQ ID NO:34; (m) SEQ ID NO:37; (n) SEQ IDNO:38; (o) SEQ ID NO:39; (p) SEQ ID NO:40; (q) SEQ ID NO:41; (r) SEQ ID NO:42. 이와 같은 단편들은 환원, 알킬화, 또는 산화형태가 될 수도 있다. 이와 같은 단편들은 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 한 개 이상의 시스테인 잔기를 보유할 수도 있다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 한 개 이상의 포유류 세포에서 단백질 합성을 저해하는 방법에 관계하는데, 이때 방법은 다음에서 선택된 분리된 단편을 포함하는 조성물을 세포와 접촉시키는 것이다: (a) SEQ ID NO: 1O; (b) SEQ ID NO: 1O의 아미노산 1 내지 아미노산 124; (c) SEQ ID NO:20; (d) SEQ ID NO:21; (e) SEQ ID NO:22; (f) SEQ ID NO:23; (g) SEQ ID NO:25; (h) SEQ ID NO:26; (i) SEQ ID NO:29; (j) SEQ ID NO:30; (k) SEQ ID NO:33; (l) SEQ ID NO:34; (m) SEQ ID NO:37; (n) SEQ ID NO:38; (o) SEQ ID NO:39; (p) SEQ ID NO:40; (q) SEQ ID NO:41; (r) SEQ ID NO:42. 이와 같은 단편들은 환원, 알킬화, 또는 산화형태가 될 수도 있다. 이와 같은 단편들은 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 한 개 이상의 시스테인 잔기를 보유할 수도 있다. 단백질 합성은 캡(cap)-의존성 합성이 될 수 있다. 세포는 α_vβ₃인테그린을 발현시킬 수 있다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 포유류 한가지 이상의 세포에서 단백질 합성을 저해하고, 포유류 조직에서 종양 생장 또는 혈관형성을 저해하는 방법에 관계하는데, 이때 방법은 다음에서 선택된 분리된 단편을 포함하는 조성물을 한 개 이상의 세포와 접촉시키는 것이다: (a) SEQ ID NO:2,(b)SEQ ID NO:6; (c)SEQ ID NO:10.단백질 합성은 캡-의존성 합성이 될 수 있다. 포유류 세포는 α_vβ₃인테그린을 발현시킬 수 있다.

본 발명은 아래의 분리된 펩티드 화학식을 특징으로 한다.

R¹X¹LFX²NVNX³VX⁴NFR²(SEQ ID NO:45)

이때, R¹은 수소 또는 1 내지 17개 아미노산으로 된 펩티드 사슬;

R²는 수소 또는 1 내지 12개 아미노산으로 된 펩티드 사슬;

X¹, X², X³는 각각 아미노산이며, 이 펩티드는 종양 생장을 저해한다. X¹은 염기성 측쇄를 가지는 아미노산이거나 방향족 측쇄를 가지는 아미노산이 될 수 있다. X¹은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민 또는 아스파라진이 될 수 있다. X¹은 또한 리산 또는 페닐알라닌이 될 수도 있다. X², X³, X⁴는 각각 친수성 측쇄를 가지는 아미노산 또는 염기성 측쇄를 가지는 아미노산이 될 수 있다. X², X³, X⁴는 각각 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 글루타민이 될 수 있다. X², X⁴는 각각 시스테인, 세린, 아스파르트산이 될 수 있고, X³은 시스테인 또는 아스파르트산이 될 수 있다. X¹은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민 또는 아스파라진이 될 수 있고, X², X³,X⁴는 각각 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 글루타민이 될 수 있다. R¹은 한 개 아미노산 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 아미노산으로 된 펩티드 사슬이 될 수 있다. R¹로 대표되는 아미노산 또는 펩티드 사슬은 (a) P, (b) MP, (c) TMP, (d) TTMP(SEQ ID NO:46), (e) FTTMP(SEQ ID NO:47), (f) RFTTMP(SEQ ID NO:48), (g) QRFTTMP (SEQ ID NO:49), (h) LQRFTTMP (SEQ ID NO:50), (i) KQRFTTMP (SEQ ID NO: 51), (j) (a)~(i)중 한가지의 보존성 변이체가 될 수 있다. R²는 한 개 아미노산 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 아미노산으로 된 펩티드 사슬이 될 수 있다. R²로 대표되는 아미노산 또는 펩티드 사슬은 (a) A, (b) AS, (c) ASR, (d) ASRN (SEQ ID NO:52), (e) ASRND (SEQ ID NO:53), (f) ASRNDY (SEQ ID NO:54), (g) ASRNDYS (SEQ ID NO:55), (h) ASRNDYSY (SEQ ID NO:56), (i) ASRNDYSYW (SEQ ID NO:57), (j) ASRNDYSYWL (SEQ ID NO:58), (k) (a)~(i)중 한가지의 보존성 변이체가 될 수 있다. 이와 같은 분리된 펩티드는 환원, 알킬화, 또는 산화형태가 될 수도 있다. 이와 같은 분리된 펩티드를 한가지 이상의 포유류 세포에서 단백질 합성 저해, 종양 세포 생장 저해, 포유류 조직에서 혈관형성 저해 방법에 이용될 수 있는데, 방법은 분리된 펩티드로 구성된 조성물을 조직과 접촉시키는 것이다. 분리된 펩티드는 약학적으로 수용가능한 담체와 복합시킬 수도 있다.

본 발명은 또한 (a) α_vβ₃인테그린에 결합하는 능력; (b) 내피 세포 증식을 저해시키는 능력; (c) 내피 세포 아폽토시스(apoptosis-세포자살)를 야기하는능력중 한가지 이상 특징을 가지는 항-혈관형성 성질을 가지는 α3(Ⅳ)NC1 도메인의 분리된 비-굿패스처 단편에 관계한다. 본원에 기술된, 분리된 비-굿패스처 단편은 RGD-독립적인 기작으로 α_vβ₃인테그린에 결합한다. 이와 같은 Ⅳ형 콜라겐의 α3(Ⅳ)NC1 도메인의 분리된 단편을 설명하며, 여기에서는 "툼스타틴(Tumstatin)"으로 명명한다. 여기에서 정의한 "툼스타틴"은 SEQ ID NO: 10으로 구성된다. 또 다른 분리된 비-굿패스처 단편 즉, "Tum-1"또는 "툼스타틴 N53"(SEQ ID NO:22)은 툼스타틴의 전장(全長)(SEQ ID NO:10)에서 아미노산 잔기 54 내지 244의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 분리된 단편에는 "Tum-2"(SEQ ID NO:23), "Tum-3"(SEQ ID NO:24), "Tum-4"(SEQ ID NO:25), "Tum-5" (SEQ ID NO:26)가 포함되는데, 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)에서 각각 Tum-2는 아미노산 서열 1 내지 132로 구성된 아미노산 서열로 구성되고, Tum-3은 아미노산 서열 133 내지 244로 구성된 아미노산 서열로 구성되고, Tum-4는 아미노산 서열 181 내지 244로 구성된 아미노산 서열로 구성되고, Tum-5는 아미노산 서열 54 내지 132로 구성된 아미노산 서열로 구성된다. 본원에 기술된 펩티드 단편에는 "T1"(SEQ ID NO:27), "T2"(SEQ ID NO:28), "T3"(SEQ ID NO:29), "T4"(SEQ ID NO:30), "T5"(SEQ ID NO:31), "T6"(SEQ ID NO:32), "T7"(SEQ ID NO:37)이 포함되는데, 이들 아미노산 구성은 각각 다음과 같다: T1의 경우 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)에서 아미노산 잔기 1 내지 19; T2의 경우 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)에서 아미노산 잔기 53 내지 72; T3의 경우 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)에서 아미노산 잔기 68 내지 87; T4의 경우 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)에서 아미노산 잔기 83 내지 102; T5의 경우 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)에서 아미노산 잔기 98 내지 116; T6의 경우 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)에서 아미노산 잔기 113 내지 131: T1의 경우 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)에서 아미노산 잔기 73 내지 97(T7)로 구성된다. 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)에서 또 다른 단편을 "툼스타틴-45-132"(SEQ ID NO:33)로 정의하는데, 이는 T1의 경우 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)의 아미노산 잔기 45 내지 132로 구성된다. 툼스타틴의 전장(SEQ ID NO:10)에서 또 다른 단편을 "Tum 125-C-A" (SEQ ID NO:34)로 정의하는데, 툼스타틴-45-132로 구성되는데, 이때 125번 시스테인(툼스타틴의 전장)이 부위-직접 돌연변이에 의해 알라닌으로 돌연변이된 것이다. 알칼리로 환원된 툼스타틴 단편도 설명하고 있는데, 이는 항-혈관형성 활성을 보유한다. 두 가지 다른 단편은 "툼스타틴 333" (SEQ ID NO:20)과 "툼스타틴 334"(SEQ ID NO:21)인데, 툼스타틴의 전장의 아미노산 잔기 1 내지 124(툼스타틴 333)로 구성되거나 아미노산 잔기 125 내지 244로 구성된다. 툼스타틴의 다른 단편으로는 T7-돌연변이(SEQ ID NO:38, 툼스타틴 분자 전장의 77번 위치에 있는 루이신이 메티오닌으로 치환되고, 81번의 발린이 이소루이신으로 치환되고, 83번의 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된 것이다), T8 (SEQ ID NO:39, 툼스타틴 분자 전장의 68번 위치에 있는 루이신이 리신으로 치환된 것이다), T8-3(SEQ ID NO:40, 툼스타틴 분자 전장의 68번 위치에 있는 루이신이 리신으로 치환되고, 79번과 85번에 있는 시스테인이 세인으로 치환된 것이다), TP3(SEQ ID NO:41, 툼스타틴 분자 전장의 76번 위치에 있는 페닐알라닌이 리신으로 치환되고, 83번에 있는 아스파르트산이 시스테인으로 치환된 것이다), P2(SEQ ID NOA2, 툼스타틴 분자 전장의 68번 위치에 있는 루이신이 리신으로 치환되었고, 79번과 85번에 있는 시스테인이 아스파르트산으로 치환된 것이다).

본 발명은 또한 항-종양 세포인 분리된 α3(Ⅳ)NC1 도메인의 비-굿패스처 단편을 특징으로 하는데, 이들 단편은 다음에 기재된 특징 중 적어도 한가지를 보유한다: (a) α_vβ₃인테그린에 결합하는 능력, (b) 내피 세포에 결합하는 능력, (c) 종양 세포 증식을 저해하는 능력 (d) 내피 세포 증식을 억제하는 능력이 없다. 분리된 비-굿패스처 단편은 본원에 기술된 RGD-독립적인 기작에 의해 α_vβ₃인테그린에 결합할 수 있다. 한가지 분리된 비-굿패스처 단편은 툼스타틴 분자 전장(SEQ ID NO: 1O) 아미노산 잔기 185 내지 아미노산 203으로 구성된다. 툼스타틴 분자 전장(SEQ ID NO: 1O)의 또 다른 펩티드 단편은 "T3"으로 명명하고, 이는 툼스타틴 분자 전장(SEQ ID NO: 1O)의 아미노산 잔기 68 내지 87로 구성된다. 툼스타틴 분자 전장(SEQ ID NO: 1O)의 또 다른 펩티드 단편은 "툼스타틴-45-132"로 명명하고, 툼스타틴 분자 전장(SEQ ID NO: 1O)의 아미노산 잔기 45 내지 132로 구성된다. 툼스타틴 분자 전장(SEQ ID NO: 1O)의 또 다른 펩티드 단편은 "Tum 125-C-A"(SEQ ID N0:34)로 명명하고, 툼스타틴-45-132(SEQ ID NO:33) 서열로 구성되는데, 이때, 툼스타틴 분자 전장(SEQ ID NO: 1O)의 125번 위치에 있는 시스테인이 부위-돌연변이에 의해 알라닌으로 변이되었다. 툼스타틴 단편은 알칼린에 의해 환원되어 항-혈관형성 성질을 보유할 수 있다. 툼스타틴 다른 단편으로는 T7-돌연변이, T8, T8-3, TP3, P2등이 포함된다.

본 발명은 또한 항-혈관형성 단백질과 결합에 의한 상호작용을 하여, 항-혈관형성 단백질, 펩티드, 화합물을 평가할 수 있는 표적을 제공하는 수용체, 결합단백질에 관계한다. 이들 수용체 및 아단위는 혈관형성과정, 종양 생장, 전이, 내피 세포 증식 및 이동, 내피 세포 관 형성을 중재한다. 이들 수용체는 또한 세포 아폽토시스(apoptosis)도 매개한다.

특히, 본 발명은 인테그린 아단위 α₁,α₂,α₃,α_v,β₁,β₂에 관계하는데, 이들은 Ⅳ형 콜라겐의 NC1 도메인의 α_{1 사슬}인 아레스텐(Arresten)에 결합하는 것으로 밝혀졌고, 인테그린 아단위 α₁,α₂,β₁은 Ⅳ형 콜라겐의 NC1 도메인의 α_{2 사슬}인 칸스타틴(Constatin)에 결합하는 것으로 밝혀졌고, 인테그린 아단위 α₅,α₆,α_v,β₁,β₃에 관계하는데, 이들은 Ⅳ형 콜라겐의 NC1 도메인의 α_{3 사슬}인 툼스타틴에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 인테그린 결합에 의해 조절되는 내피 세포의 혈관형성 과정 및 증식은 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴을 투여하거나, 상기 언급된 인테그린 아단위에 결합하여 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴의 수용체로 작용할 수 있는 단백질, 펩티드, 화합물을 투여하여 저해시킬 수 있다. 인테그린 결합에 의해 조절되는 내피 세포의 아폽토시스는 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴을 투여하거나, 상기 언급된 인테그린 아단위에 결합하여 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴의 수용체로 작용할 수 있는 단백질, 펩티드, 화합물을 투여하여 저해시킬 수 있다. 이와 같은 화합물은 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴의 항체, 단편 또는 일부분 또는 상기 인테그린 아단위에 결합할 수 있는 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴의 항체, 단편 또는 일부분으로 구성된 펩티드 또는 단백질이 포함된다.

본 발명은 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴 수용체로 작용할 수 있는 인테그린 아단위를 모방하는 단백질, 펩티드 또는 화합물을 투여하여 혈관형성 과정 또는 세포 증식을 강화, 촉진 또는 유도하는 방법에 관계한다. 이와 같은 단백질, 펩티드 또는 화합물에는 이용가능한 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 및 이들의 생물학적 활성(항-혈관형성)단편, 돌연변이체, 유사체, 동족체, 유도체, 다량체(이량체), 융합단백질(본원에서 키메라 단백질)에 상호작용(결합)할 수 있는 선택된 아단위로 구성된 인테그린 단백질이 포함된다. 이와 같은 단백질, 펩티드 또는 화합물에는 Kd₁8.5X10^-11M 및 B max¹이 3X10⁶sites/cell로 아레스텐에 결합할 수 있는 헤파린 설페이트 프로테오글리칸을 포함한다. 여기에서 언급하는 바와 같이, "이용가능한"이란 인테그린 또는 이의 아단위 또는 단편과 접촉하거나 상호작용(결합)할 수 있는 가용성 또는 순환 단백질을 의미한다. 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 및 이들의 생물학적 활성(항-혈관형성)단편, 돌연변이체, 유사체, 동족체, 유도체, 다량체(이량체), 융합단백질(키메라 단백질)에 대한 항체를 투여함으로써 혈관형성 과정 및 세포 증식을 강화시킬 수 있다. 이와 같은 항체들이 상기 분자들에 결합하여 분자가 이들의 각 인테그린 수용체와 상호작용하는 것을 막고, 혈관형성 활성을 저해한다.

본 발명에는 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴, 항-혈관형성 변이체 및 이의 단편과 유사한 방식으로 혈관형성을 저해할 수 있는 항-혈관형성 단백질, 펩티드, 화합물을 확인하는 키트가 포함된다. 이와 같은 키트는 인테그린의 적절한(α₁,α₂,β₃) 아단위 및 하기 실시예에 기술된 검사중 한가지를 실행하는데 필수적인 다른 성분을 포함된다. 이와 같은 키트로 실행할 수 있는 예외적인 검사에는 실시예 12 및 28에 기술된 세포 흡착 검사(Cell Adhesion Assay) 및 하기 실시예 26에 기술된 경쟁 증식 검사(Competition Proliferation Assay)가 포함된다.

본 발명은 포유류 또는 인체 조직에서 혈관형성 과정, 종양 생장, 종양 전이를 저해하는 방법에 관계하는데, 이때 조직에는 Ⅳ형 콜라겐의 NC1 도메인의 한가지 이상 α 사슬(α₁~₆)을 접촉시키고, 한가지 이상의 인테그린 또는 인테그린 아단위에 의해 혈관형성 과정, 종양 생장 또는 종양 전이가 조절된다.

좀더 구체적으로는 본 발명은 조직에서 혈관형성 과정을 저해시키는 방법을 특징으로 하는데, 이때 혈관형성 과정은 한가지 이상의 내피 세포 인테그린(α₁β₁,α₂β₁,α₃β₁,α_vβ₃) 또는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린 아단위(α₁,α₂,α₃,α_vβ₁,β₃)에 의해 매개된다. 이 방법은 아레스텐, 이의 단편, 돌연변이, 유사체, 동족체, 이의 대립형질 변이체를 내피 세포와 접촉하는 것으로 구성된다. 내피 세포 증식, 내피 세포 이동 또는 내피 세포 관 형성중 한가지를 저해하며 혈관형성 과정을 막을 수 있다.

본 발명은 또한 조직에서 종양 생장 또는 전이를 저해시키는 방법을 특징으로 하는데, 이때 종양 생장 또는 전이는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린(α₁β₁,α₂β₁,α₃β₁,α_vβ₃) 또는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린 아단위(α₁,α₂,α₃,α_vβ₁,β₃)에 의해 매개된다. 이 방법은 아레스텐, 이의 단편, 돌연변이, 유사체, 동족체, 이의 대립형질 변이체를 내피 세포와 접촉하는 것으로 구성된다. 내피 세포 증식, 내피 세포 이동 또는 내피 세포 관 형성중 한가지를 저해하며 종양 생장을 막을 수 있다.

또한 본 발명은 조직에서 내피 세포 아폽토시스를 촉진 또는 유도하는 방법을 특징으로 하는데, 이때 내피 세포 아폽토시스는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린(α₁β₁,α₂β₁,α₃β₁,α_vβ₃) 또는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린 아단위(α₁,α₂,α₃,α_vβ₁,β₃)에 의해 매개된다. 이 방법은 아레스텐, 이의 단편, 돌연변이, 유사체, 동족체, 이의 대립형질 변이체를 내피 세포와 접촉하는 것으로 구성된다. 내피 세포 증식, 내피 세포 이동 또는 내피 세포 관 형성중 한가지를 저해하며 아폽토시스를 촉진 또는 유도할 수 있다.

본 발명은 조직에서 혈관형성 과정을 저해하는 방법을 특징으로 하는데, 이때 혈관형성 과정은 한가지 이상의 내피 세포 인테그린(α₁β₁,α₂β₁) 또는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린 아단위(α₁,α₂,β₁)에 의해 매개된다. 이 방법은 칸스타틴, 이의 단편, 돌연변이, 유사체, 동족체, 이의 대립형질 변이체를 내피 세포와접촉하는 것으로 구성된다. 내피 세포 증식, 내피 세포 이동 또는 내피 세포 관 형성중 한가지를 저해하며 혈관형성 과정을 저해할 수 있다.

본 발명은 조직에서 종양 생장 또는 전이를 저해하는 방법을 특징으로 하는데, 이때 종양 생장 또는 전이는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린(α₁β₁,α₂β₁) 또는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린 아단위(α₁,α₂,β₁)에 의해 매개된다. 이 방법은 칸스타틴, 이의 단편, 돌연변이, 유사체, 동족체, 이의 대립형질 변이체를 내피 세포와 접촉하는 것으로 구성된다. 내피 세포 증식, 내피 세포 이동 또는 내피 세포 관 형성중 한가지를 저해하며 종양 생장 또는 전이를 저해할 수 있다.

본 발명은 조직에서 내피 세포 유도된 아폽토시스를 유도 또는 촉진하는 방법을 특징으로 하는데, 이때 내피 세포 아폽토시스는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린(α₁β₁,α₂β₁) 또는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린 아단위(α₁,α₂,β₁)에 의해 매개된다. 이 방법은 칸스타틴, 이의 단편, 돌연변이, 유사체, 동족체, 이의 대립형질 변이체를 내피 세포와 접촉하는 것으로 구성된다. 내피 세포 증식, 내피 세포 이동 또는 내피 세포 관 형성중 한가지를 저해하여 아폽토시스를 유도 또는 촉진할 수 있다.

본 발명은 조직에서 혈관형성 과정을 저해하는 방법을 특징으로 하는데, 이때 혈관형성 과정은 한가지 이상의 내피 세포 인테그린(α₅β₃,α₆β_1,α_vβ₃) 또는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린 아단위(α₅,α₆,α_v,β₁,β₃)에 의해 매개된다. 이방법은 툼스타틴, 이의 단편, 돌연변이, 유사체, 동족체, 이의 대립형질 변이체를 내피 세포와 접촉하는 것으로 구성된다. 내피 세포 증식, 내피 세포 이동 또는 내피 세포 관 형성중 한가지를 저해하며 혈관형성 과정을 저해할 수 있다.

본 발명은 조직에서 종양 생장 또는 전이를 저해하는 방법을 특징으로 하는데, 이때 종양 생장 또는 전이는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린(α₅β₃,α₆β_1,α_vβ₃) 또는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린 아단위(α₅,α₆,α_v,β₁,β₃)에 의해 매개된다. 이 방법은 툼스타틴, 이의 단편, 돌연변이, 유사체, 동족체, 이의 대립형질 변이체를 내피 세포와 접촉하는 것으로 구성된다. 내피 세포 증식, 내피 세포 이동 또는 내피 세포 관 형성중 한가지를 저해하며 종양 생장 또는 전이를 저해할 수 있다.

본 발명은 조직에서 내피 세포 아폽토시스를 유도 또는 촉진시키는 방법을 특징으로 하는데, 이때 아폽토시스는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린(α₅β₃,α₆β_1,α_vβ₃) 또는 한가지 이상의 내피 세포 인테그린 아단위(α₅,α₆,α_v,β₁,β₃)에 의해 매개된다. 이 방법은 툼스타틴, 이의 단편, 돌연변이, 유사체, 동족체, 이의 대립형질 변이체를 내피 세포와 접촉하는 것으로 구성된다. 내피 세포 증식, 내피 세포 이동 또는 내피 세포 관 형성중 한가지를 저해하며 내피 세포 아폽토시스를 유도 또는 촉진할 수 있다.

본 발명은 아래 언급된 것들중 한가지 이상을 조직과 접촉시킴으로써 조직에서 세포 증식 또는 혈관형성 과정을 저해하는 방법을 특징으로 한다;

인테그린의 α_1아단위에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 펩티드;

인테그린의 α_2아단위에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 펩티드;

인테그린의 α_3아단위에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 펩티드;

인테그린의 α_5아단위에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 펩티드;

인테그린의 α_6아단위에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 펩티드;

인테그린의 α_v아단위에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 펩티드;

인테그린의 β_1아단위에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 펩티드;

인테그린의 β_3아단위에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 펩티드. 이 방법을 혈관형성 과정 또는 세포 증식으로 인한 질병을 치료하는데 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 아래에 언급된 것들중 한가지 이상을 조직과 접촉시킴으로써 조직에서 세포 증식 또는 혈관형성 과정을 유도 또는 촉진하는 방법을 특징으로 한다; 인테그린의 α_1아단위; 인테그린의 α_2아단위; 인테그린의 α_3아단위; 인테그린의 α_5아단위; 인테그린의 α_6아단위; 인테그린의 α_v아단위; 인테그린의 β_1아단위; 인테그린의 β_3아단위. 인테그린의 이들 한가지 이상 아단위는 가용성 형태를 하고 있으며, 이들은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 다량체가 될 수도 있다.

본 발명은 척추동물에서 증식성 질환을 저해하는 방법을 특징으로 하고 있는데, 이때 이 질환은 아레스텐에 대한 수용체(α₁β₁인테그린,α₂β₁인테그린_,α₃β₁인테그린,α_vβ₃인테그린) 에 의해 매개되는 혈관형성 과정을 특징으로 하며; 이 방법은 아레스텐 수용체 매개된 혈관형성 과정을 저해하여, 증식성 질환을 방지하는 것이다. 아레스텐 수용체-매개된 혈관형성 과정을 저해하면 종양 생장, 전이를 막을 수 있고 또는 발생된 종양을 퇴행시킬 수도 있다. 아레스텐-매개된 혈관형성 과정을 저해하는 분자 가령 항체(단클론 또는 다클론 항체), 항체 단편 또는 아레스텐 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드를 세포와 접촉시켜 아레스텐 수용체 매개된 혈관형성 과정을 저해시킬 수 있다.

본 발명은 조직에서 혈관형성 과정을 촉진시키는 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법은 아레스텐에 결합하는 한가지 이상의 가용성 수용체로 구성된 조성물을 조직과 접촉시키는 것으로 구성된다.

또 다른 특징으로, 본 발명은 척추동물에서 증식성 질환을 저해하는 방법을 특징으로 하고 있는데, 이때 이 질환은 칸스타틴에 대한 수용체(α₁β₁인테그린,α₂β₁인테그린)에 의해 매개되는 혈관형성 과정을 특징으로 하며; 이 방법은 칸스타틴 수용체 매개된 혈관형성 과정을 저해하여, 증식성 질환을 방지하는 것이다. 칸스타틴 수용체-매개된 혈관형성 과정을 저해하면 종양 생장, 전이를 막을 수 있고 또는 발생된 종양을 퇴행시킬 수도 있다. 칸스타틴-매개된 혈관형성 과정을 저해하는 분자 가령 항체(단클론 또는 다클론 항체), 항체 단편 또는 칸스타틴 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드를 세포와 접촉시켜 칸스타틴 수용체 매개된혈관형성 과정을 저해시킬 수 있다.

본 발명은 조직에서 혈관형성 과정을 촉진시키는 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법은 칸스타틴에 결합하는 한가지 이상의 가용성 수용체로 구성된 조성물을 조직과 접촉시키는 것으로 구성된다.

본 발명은 척추동물에서 증식성 질환을 저해하는 방법을 특징으로 하고 있는데, 이때 이 질환은 툼스타틴에 대한 수용체(α₅β₁인테그린,α₆β₁인테그린_,α_vβ₃인테그린)에 의해 매개되는 혈관형성 과정을 특징으로 하며; 이 방법은 툼스타틴 수용체 매개된 혈관형성 과정을 저해하여, 증식성 질환을 방지하는 것이다. 툼스타틴 수용체-매개된 혈관형성 과정을 저해하면 종양 생장, 전이를 막을 수 있고 또는 발생된 종양을 퇴행시킬 수도 있다. 툼스타틴-매개된 혈관형성 과정을 저해하는 분자 가령 항체(단클론 또는 다클론 항체), 항체 단편 또는 툼스타틴 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드를 세포와 접촉시켜 툼스타틴 수용체 매개된 혈관형성 과정을 저해시킬 수 있다.

본 발명은 조직에서 혈관형성 과정을 촉진시키는 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법은 툼스타틴에 결합하는 한가지 이상의 가용성 수용체로 구성된 조성물을 조직과 접촉시키는 것으로 구성된다.

또 다른 측면에서 본 발명은 조직에서 혈관형성 과정을 저해하는 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법은 조직에 FLEP 수준을 감소시키는 분자를 조직과 접촉시키는 것으로 구성된다.

본 발명은 한가지 이상의 아레스텐 수용체(α₁β₁인테그린,α₂β₁인테그린_,α₃β₁인테그린,α_vβ₃인테그린) 또는 아레스텐 수용체 아단위(인테그린의 α_1아단위; 인테그린의 α_2아단위; 인테그린의 α_3아단위; 인테그린의 α_5아단위; 인테그린의 α_6아단위; 인테그린의 α_v아단위; 인테그린의 β_1아단위; 인테그린의 β_3아단위)에 특이적으로 결합할 수 있는 한가지 이상의 분자(항체, 항체 단편, 펩티드)를 생물학적으로 활성 성분으로 하는 조성물을 특징으로 한다. 이 조성물에는 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체가 포함된다. 혈관형성 과정 활성으로 인한 질환을 저해시키는 방법에 이들 조성물을 이용할 수 있고, 이때 이 방법은 질환자에 조성물을 투여하는 것이다. 혈관형성을 특징으로 하는 질환이 되며, 조성물은 방사능요법, 화학요법 또는 면역요법과 결합하여 환자에 투여될 수 있다.

본 발명은 한가지 이상의 아레스텐 수용체(α₁β₁인테그린,α₂β₁인테그린_,α₃β₁인테그린,α_vβ₃인테그린) 또는 아레스텐 수용체 아단위(인테그린의 α_1아단위; 인테그린의 α_2아단위; 인테그린의 α_3아단위; 인테그린의 α_5아단위; 인테그린의 α_6아단위; 인테그린의 α_v아단위; 인테그린의 β_1아단위; 인테그린의 β_3아단위)에 특이적으로 결합할 수 있는 한가지 이상의 분자(항체, 항체 단편, 펩티드)를 생물학적으로 활성 성분으로 하는 조성물을 특징으로 한다. 이 조성물에는 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체가 포함된다. 혈관형성을 촉진 또는 유도시키는 방법에 이들 조성물을 이용할 수 있고, 이때 이 방법은 질환자에 조성물을 투여하는 것이다. 혈관형성을특징으로 하는 질환이 되며, 조성물은 방사능요법, 화학요법 또는 면역요법과 결합하여 환자에 투여될 수 있다.

본 발명은 한가지 이상의 칸스타틴 수용체(α₁β₁인테그린,α₂β₁인테그린) 또는 칸스타틴 수용체 아단위(인테그린의 α_1아단위; 인테그린의 α_2아단위; 인테그린의 β_1아단위)에 특이적으로 결합할 수 있는 한가지 이상의 분자(항체, 항체 단편, 펩티드)를 생물학적으로 활성 성분으로 하는 조성물을 특징으로 한다. 이 조성물에는 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체가 포함된다. 혈관형성 과정 활성으로 인한 질환을 저해시키는 방법에 이들 조성물을 이용할 수 있고, 이때 이 방법은 질환자에 조성물을 투여하는 것이다. 혈관형성을 특징으로 하는 질환이 되며, 조성물은 방사능요법, 화학요법 또는 면역요법과 결합하여 환자에 투여될 수 있다.

본 발명은 한가지 이상의 칸스타틴 수용체(α₁β₁인테그린,α₂β₁인테그린) 또는 칸스타틴 수용체 아단위(인테그린의 α_1아단위; 인테그린의 α_2아단위; 인테그린의 β_1아단위)에 특이적으로 결합할 수 있는 한가지 이상의 분자(항체, 항체 단편, 펩티드)를 생물학적으로 활성 성분으로 하는 조성물을 특징으로 한다. 이 조성물에는 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체가 포함된다. 혈관형성 과정을 촉진 또는 유도하는 방법에 이들 조성물을 이용할 수 있고, 이때 이 방법은 질환자에 조성물을 투여하는 것이다. 혈관형성을 특징으로 하는 질환이 되며, 조성물은 방사능요법, 화학요법 또는 면역요법과 결합하여 환자에 투여될 수 있다.

본 발명은 한가지 이상의 툼스타틴 수용체(α₅β₁인테그린,α₆β₁인테그린_,α_vβ₃인테그린) 또는 툼스타틴 아단위(인테그린의 α_5아단위; 인테그린의 α_6아단위; 인테그린의 α_v아단위; 인테그린의 β_1아단위; 인테그린의 β_3아단위)에 특이적으로 결합할 수 있는 한가지 이상의 분자(항체, 항체 단편, 펩티드)를 생물학적으로 활성 성분으로 하는 조성물을 특징으로 한다. 이 조성물에는 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체가 포함된다. 혈관형성 과정 활성으로 인한 질환을 저해시키는 방법에 이들 조성물을 이용할 수 있고, 이때 이 방법은 질환자에 조성물을 투여하는 것이다. 혈관형성을 특징으로 하는 질환이 되며, 조성물은 방사능요법, 화학요법 또는 면역요법과 결합하여 환자에 투여될 수 있다.

본 발명은 한가지 이상의 툼스타틴 수용체(α₅β₁인테그린,α₆β₁인테그린_,α_vβ₃인테그린) 또는 툼스타틴 아단위(인테그린의 α_5아단위; 인테그린의 α_6아단위; 인테그린의 α_v아단위; 인테그린의 β_1아단위; 인테그린의 β_3아단위)에 특이적으로 결합할 수 있는 한가지 이상의 분자(항체, 항체 단편, 펩티드)를 생물학적으로 활성 성분으로 하는 조성물을 특징으로 한다. 이 조성물에는 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체가 포함된다. 혈관형성 과정을 촉진 또는 유도시키는 방법에 이들 조성물을 이용할 수 있고, 이때 이 방법은 질환자에 조성물을 투여하는 것이다. 혈관형성을 특징으로 하는 질환이 되며, 조성물은 방사능요법, 화학요법 또는 면역요법과 결합하여 환자에 투여될 수 있다.

또한 본 발명은 세포(암세포)가 아레스텐 활성에 감응성이 있는지를 결정하는 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법은 (a) 세포를 포함하는 시료(포유류 기원)를 제공하고; (b) 시료를 한가지 이상 항체(가령, α₁β₁인테그린,α₂β₁인테그린_,α₃β₁인테그린,α_vβ₃인테그린, 인테그린의 α_1아단위; 인테그린의 α_2아단위; 인테그린의 α_3아단위; 인테그린의 α_5아단위; 인테그린의 α_6아단위; 인테그린의 α_v아단위; 인테그린의 β_1아단위; 인테그린의 β_3아단위)와 시료를 세포에 한가지 이상 항체와 결합할 수 있는 적절한 조건하에서 충분한 시간동안 반응시키고; (c)세포-항체 복합체가 존재하는지를 감지하는 단계로 구성되어, 시료내에 세포-항체 복합체가 존재한다는 것은 아레스텐 작용에 세포가 감응성이 있다는 것을 나타내는 것이다. 포유류는 원하지 않는 혈관형성을 일부 가지는 질환이 있을 수 있다.

또한 본 발명은 세포(암세포)가 칸스타틴 활성에 감응성이 있는지를 결정하는 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법은 (a) 세포를 포함하는 시료(포유류 기원)를 제공하고; (b) 시료를 한가지 이상 항체(가령, α₁β₁인테그린,α₂β₁인테그린_,인테그린의 α_1아단위; 인테그린의 α_2아단위; 인테그린의 β_1아단위)와 시료를 세포에 한가지 이상 항체와 결합할 수 있는 적절한 조건하에서 충분한 시간동안 반응시키고; (c)세포-항체 복합체가 존재하는지를 감지하는 단계로 구성되어, 시료내에 세포-항체 복합체가 존재한다는 것은 칸스타틴 작용에 세포가 감응성이 있다는 것을 나타내는 것이다. 포유류는 원하지 않는 혈관형성을 일부 가지는 질환이 있을 수 있다.

또한 본 발명은 세포(암세포)가 툼스타틴 활성에 감응성이 있는지를 결정하는 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법은 (a) 세포를 포함하는 시료(포유류 기원)를 제공하고; (b) 시료를 한가지 이상 항체(가령, α₅β₁인테그린,α₆β₁인테그린_,α_vβ₃인테그린; 인테그린의 α_5아단위; 인테그린의 α_6아단위; 인테그린의 α_v아단위; 인테그린의 β_1아단위; 인테그린의 β_3아단위)와 시료를 세포에 한가지 이상 항체와 결합할 수 있는 적절한 조건하에서 충분한 시간동안 반응시키고; (c)세포-항체 복합체가 존재하는지를 감지하는 단계로 구성되어, 시료내에 세포-항체 복합체가 존재한다는 것은 툼스타틴 작용에 세포가 감응성이 있다는 것을 나타내는 것이다. 포유류는 원하지 않는 혈관형성을 일부 가지는 질환이 있을 수 있다.

본 발명은 항-혈관형성 성질을 가지는 Ⅳ형 콜라겐의 알파 사슬 NC1 도메인으로 구성된 단백질에 관계한다. 특히, 본 발명은 신규한 단백질 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 및 이들의 생물학적으로 활성(항-혈관형성) 단편, 돌연변이체, 유사체, 동족체, 유도체, 다량체(이량체), 융합 단백질(키메라 단백질)에 관계한다. 이들 단백질은 모두 Ⅳ형 콜라겐 NC1(비-콜라겐성)의 C-말단 단편으로 구성된다. 좀더 구체적으로는 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴은 각각 Ⅳ형 콜라겐의 α₁, α₂, α₃사슬의 NC1 도메인의 C-말단 도메인이다. 특히, 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴은 단량체 단백질이다. 이들 모두는in vivo에서 종양 생장을 억제하고, 내피 관 검사를 포함하는 몇 가지in vitro모델에서 모세관 형성을 저해할 수 있다.

본 발명은 내피 세포에서 내피 세포 아폽토시스를 포함하는 항-혈관형성 과정을 매개하는 아레스텐 수용체로써 인테그린 또는 인테그린 아단위(α₁β₁인테그린,α₁β₂인테그린_,α₂β₁인테그린)를 포함한다. 아레스텐은 매트릭스 메탈로프로테네이즈 2, 3, 9의 기저막-분해 활성을 저해하고, 이와 같은 저해성 활성은 혈관형성 과정의 일체 부분이 된다.

본 발명은 또한 재조합에 의해 만들어진 분리된 아레스텐을 포함하는데, 아레스텐은 Ⅳ형 콜라겐의 α₁사슬의 NC1도메인으로 구성되는데, 이 도메인은 분리된 아레스텐의 항-혈관형성 활성, 분리된 아레스텐의 다량체의 항-혈관형성 단편, 이들 항-혈관형성 단백질을 인코드하는 항-혈관형성 단편 및 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 또한, 분리된 아레스텐, 이의 항-혈관형성 단편 또는 생물학적으로 활성이 있는 이들 모든 단편등도 포함된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유류에서 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는데, 이때 질병은 혈관형성 활성을 가지며, 치료 방법은 포유류에 항-혈관형성 아레스텐 또는 이의 단편으로 구성된 조성물을 투여하는 것이다. 항-혈관형성 아레스텐 및 이의 단편을 이용하여 세포 이동 또는 내피 세포 증식을 방지할 수도 있다. 또한, 분리된 항-혈관형성 아레스텐 및 이의 단편에 대한 항체도 특징으로 한다.

본 발명은 또한 내피 세포에서 칸스타틴에 대한 세포 흡착 수용체로써 인테그린 또는 인테그린 아단위(α₁β₁인테그린,α₁β₂인테그린)을 포함하는데, 이들 내피 세포에서 내피 세포 아폽토시스를 포함하는 항-혈관형성 활성을 중재한다.

본 발명은 또한 재조합에 의해 만들어진 분리된 칸스타틴을 포함하는데, 칸스타틴은 Ⅳ형 콜라겐의 α2 사슬의 NC1도메인으로 구성되는데, 이 도메인은 분리된 칸스타틴의 항-혈관형성 활성, 분리된 칸스타틴의 다량체의 항-혈관형성 단편, 이들 항-혈관형성 단백질을 인코드하는 항-혈관형성 단편 및 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 또한, 분리된 칸스타틴, 이의 항-혈관형성 단편 또는 생물학적으로 활성이 있는 이들 모든 단편등도 포함된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유류에서 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는데, 이때 질병은 혈관형성 활성을 가지며, 치료 방법은 포유류에 항-혈관형성 칸스타틴 또는 이의 단편으로 구성된 조성물을 투여하는 것이다. 항-혈관형성 칸스타틴 및 이의 단편을 이용하여 세포 이동 또는 내피 세포 증식을 방지할 수도 있다. 또한, 분리된 항-혈관형성 칸스타틴 및 이의 단편에 대한 항체도 특징으로 한다.

본 발명은 또한 내피 세포에서 툼스타틴에 대한 세포 흡착 수용체로써 인테그린 또는 인테그린 아단위(α₁β₁인테그린,α₁β₂인테그린)를 포함하는데, 이들 내피 세포에서 내피 세포 아폽토시스를 포함하는 항-혈관형성 활성을 중재한다.

본 발명은 또한 재조합에 의해 만들어진 분리된 툼스타틴을 포함하는데, 칸스타틴은 Ⅳ형 콜라겐의 α3 사슬의 NC1도메인으로 구성되는데, 이 도메인은 분리된 툼스타틴의 항-혈관형성 활성, 분리된 툼스타틴의 다량체의 항-혈관형성 단편, 이들 항-혈관형성 단백질을 인코드하는 항-혈관형성 단편 및 폴리뉴클레오티드로구성된다. 또한, 분리된 툼스타틴, 이의 항-혈관형성 단편 또는 생물학적으로 활성이 있는 이들 모든 단편등도 포함된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유류에서 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는데, 이때 질병은 혈관형성 활성을 가지며, 치료 방법은 포유류에 항-혈관형성 툼스타틴 또는 이의 단편으로 구성된 조성물을 투여하는 것이다. 항-혈관형성 툼스타틴 및 이의 단편을 이용하여 세포 이동 또는 내피 세포 증식을 방지할 수도 있다. 또한, 분리된 항-혈관형성 툼스타틴 및 이의 단편에 대한 항체도 특징으로 한다.

본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health)으로부터 전부 또는 일부를 지원받았다(승인 DK-5171 1, DK-55001). 따라서, 정부는 본 발명의 일부 권한을 소유한다.

도 1A와 1B는 사람의 Ⅳ형 콜라겐의 α1 사슬의 뉴클레오티드(도 I A, SEQ ID NO: 1) 및 아미노산 서열(도 1B, SEQ ID NO:2)을 나타낸 다이어그램이다. pET22b(+)의 전방 프라이머(SEQ ID NO:3)와 역 프라이머(SEQ ID NO:4)의 위치는 이중선으로 표시하고, pPICZαA의 전방 프라이머(SEQ ID NO:15)와 역 프라이머(SEQ ID NO:16)의 위치는 한 줄로 표시하였다.

도 2는 아레스텐 클로닝 벡터pET22b(+)를 나타낸 다이어그램이다. 전방 프라이머(SEQ ID NO:3)와 역 프라이머(SEQ ID NO:4), 아레스텐이 클론된 부위를 보여준다.

도 3A 및 3B는 내피 세포 증식(C-PAE)을 보여주는 지시물질로³H-티미딘 결합(Y-축)에서 아레스텐(도. 3A, 0㎍/㎖~ 10㎍/㎖, x-축)과 엔도스타틴(도 3B, 0 ㎍/㎖ ~ 10㎍/㎖, x-축)의 효과를 보여주는 한 쌍의 선 그래프이다.

도 4A, 4B, 4C, 4D는 내피 세포 증식을 나타내는 지시물질로³H-티미딘 결합(Y-축)에서 아레스텐과 엔도스타틴의 효과를 보여주는 4개 막대 차트이다. 도 4A, 4B, 4C는 차례로 각각 786-0, PC-3, HPEC 세포에서 아레스텐(도. 4A 및 4B, 0㎍/㎖~50㎍/㎖) 및 (도. 4C, 0㎍/㎖~ 10㎍/㎖)의 효과를 보여준다. 도 4D에서는 A-498 세포에서 0.1㎍/㎖~ 10㎍/㎖ 엔도스타틴의 효과를 보여준다.

도 5A, 5B, 5C는 사람의 배꼽 내피 세포(ECV-304)에서 FBS-유도된 화학주성을 통하여 내피 세포 이동시에 아레스텐(도. 5B, 2㎍/㎖) 및 엔도스타틴(도. 5C, 20㎍/㎖)의 효과를 보여주는 광학현미경 사진이다. 도 5A는 처리안된 대조 세포를 보여준다.

도 6은 도 5의 결과를 그래프로 나타낸 막대그래프이다. 도 6에서는 ECV-304 세포에서 아레스텐(2㎍/㎖ 또는 20㎍/㎖) 및 엔도스타틴(2.5㎍/㎖ 또는 20㎍/㎖)의 효과를 보여준다.

도 7은 내피 세포 관 형성에 대한 아레스텐의 효과를 보여주는 선 그래프이다. 관 형성 비율은 y-축에 나타내고, x-축에는 저해물질의 농도를 나타낸다. 처리는 다음과 같다; 처리되지 않은 경우(대조, ◆), BSA(대조, △), 7S 도메인(대조, X), 아레스텐(■).

도 8A 및 8B는 대조와 비교하여(도 8A) 내피 세포 관 형성에서 아레스텐의 효과(0.82㎍/㎖, 도 8B)를 보여주는 한 쌍의 광학현미경 사진이다.

도 9A, 9B, 9C, 9D는in vivo에서 아레스텐 및 엔도스타틴의 효과를 보여주는 4가지 선 그래프이다. 도 9A는 10㎎/㎏ 아레스텐으로 처리된 생쥐(o), BSA-처리된 생쥐(+), 대조 생쥐(●)에서 700㎣ 종양이 증가되는 것을 보여주는 그래프이다. 도 9B는 10㎎/㎏ 아레스텐으로 처리된 생쥐(□), BSA-처리된 생쥐(+)에서 100㎣ 종양이 증가되는 것을 보여주는 그래프이다. 도 9C는 10㎎/㎏ 아레스텐으로 처리된 생쥐(□), 엔도스타틴 처리된 생쥐(▲), 대조 생쥐(●)에서 100㎣ 종양이 증가되는 것을 보여주는 그래프이다. 도 9D는 대조 생쥐(●)에 비하여 아레스텐 처리된 생쥐(□)에서 200㎣ 종양이 증가되는 것을 보여주는 그래프이다.

도 10A 및 10B는 C-PAE 세포(도 10A) 및 PC-3 세포(도 10B)에서 다양하게 처리한 경우에(x-축) OD₄₀₅에서 흡수도(y-축)에 대한 함수로써 카스파제-3(Caspase) 활성의 양을 보여주는 히스토그램을 나타낸다. 각 칼럼은 3중 웰의 +/- 평균표준 편차를 나타낸다.

도 11A 및 11B는 사람 Ⅳ형 콜라겐의 α2 사슬의 뉴클레오티드 서열(도 11A, SEQ ID NO:5)과 아미노산 서열(도11B, SEQ ID NO:6)을 보여주는 다이어그램이다. pET22b(+)의 전방 프라이머(SEQ ID NO:7)와 역 프라이머(SEQ ID NO:8)의 위치는 이중선으로 나타내었고, pPICZαA의 전방 프라이머(SEQ ID NO:17)와 역 프라이머(SEQ ID NO:18)의 위치는 한 줄로 보여준다.

도 12는 칸스타틴 클로닝 벡터pET22b(+)를 나타낸 다이어그램이다. 전방 프라이머(SEQ ID NO:7)와 역 프라이머(SEQ ID NO:8), 아레스텐이 클론된 부위를 나타내고 있다.

도 13A, 13B, 13C, 13D는 내피 세포(C-PAE) 세포(도 13A, 13C), 비-내피 세포(786-0, PC-3, HEK 293 세포)(도 13B, 13D) 증식에서 칸스타틴(x-축)의 농도를 다양하게 하는 경우에 효과를 보여주는 히스토그램이다. 증식을³H-티미딘 병합(도 13A 및 13B) 및 메틸렌 블루 염색(도 13C 및 13D)의 함수로서 측정하였다.

도 14는 VFGF가 없는(VEGF 없이 또는 혈청) 세포 및 VEGF(1% FCS 및 10 ng/㎖ VEGE) 세포의 치료 및 0.01 ㎍/㎖ 칸스타틴(1% FCS, 10 ng/㎖ VEGF 및 0.01 ㎍/㎖ 칸스타틴) 및 1.0 ㎍/㎖ 칸스타틴(1% FCS, 10 ng/㎖ VEGF 및 1 ㎍/㎖ 칸스타틴)의 처리에 대한 필드(y-축) 당 이동된 내피 세포의 수를 보여주는 막대 차트이다.

도 15는 BSA(□), 칸스타틴(■) 및 α5NC1(○)의 다양한 처리하에서 대조군(PBS 처리된 웰) 관 형성(y-축)의 퍼센트로서 내피 관 형성의 양을 보여주는 선형 그래프이다. 수직 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다.

도 16은 시간에 대해(x-축) t=0일 경우(y-축) 존재하는 단백질 비율에 대한 함수로써 FLIP(FLICE-저해 단백질, 또는 FADD-형 인터루킨-1베타-전환 효소-저해 단백질) 곡선이다.

도 17A, 17B, 17C 및 17D는 부분 종양 부피(㎣)(y-축, 도 17C 및 17D) 또는 mm³으로 표현한 종양 부피(y-축, 도 15C 및 15D)에 대해 칸스타틴(■), 엔도스타틴(○) 및 대조군이 PC-3 세포(도 17A 및 17B) 및 786-0 세포(도 17C 및 17D)에 미치는 효과를 묘사하는 선형 그래프로서, 치료일(x-축) 경과에 따라 플랏한다.

도 18A 및 18B는 인간 Ⅳ형 콜라겐의 α3 사슬의 뉴클레오티드(도 18A, SEQID NO:9) 및 아미노산(도 18B, SEQ ID NO:10) 서열을 나타내는 개략도이다. pET22b(+) 정방향(SEQ ID NO:11) 및 역방향(SEQ ID NO:12) 프라이머의 위치를 표시하였다. 또한 "툼스타틴 333" 및 "툼스타틴 334" 단편의 시작과 끝을 표시하였다(*=툼스타틴 333: +=툼스타틴 334).

도 19는 툼스타틴 클로닝 벡터 pET22b(+)를 나타내는 개략도이다. 정방향(SEQ ID NO:11)과 역방향(SEQ ID NO:12) 프라이머 및 툼스타틴이 클로닝되는 부위를 표시하였다.

도 20은 툼스타틴 돌연변이체 툼스타틴 N-53의 α3(Ⅳ)NC1 단량체내에 절단되는 아미노산의 위치를 보여주는 개략도이다. 채워진 원은 이 돌연변이체를 생성시키기 위해 툼스타틴으로부터 결실된 N-말단 53 아미노산 잔기에 상응한다. 짧은 막대로 표시된 이황화 결합은 이들이 α1(Ⅳ)NC1 및 α2(Ⅳ)NC1에 생기는 것과 같이 배열되어 있다.

도 21A, 21B 및 21C는 다양한 농도의 툼스타틴(x-축)을 사용하여 치료했을 때 C-PAE 세포(도 19A), PC-3 세포(도 19B) 및 786-0 세포(도 19C)에 대한³H-티미딘 병합(y-축)을 보여주는 3개가 한 세트인 막대그래프이다. 모든 군은 삼중 시료들을 대표한다.

도 22는 C-PAE 세포에 의해 취입된 염료에서 α_vβ₃의 양을 증가시키면서 복합된 0.1㎍/㎖ 툼스타틴의 효과를 x-축에 나타낸다. Y-축에는 OD₆₅₅에서 흡수도를 보여준다. "0.1%FCS"는 0.1% FCS-처리된(자극받지 않은) 대조, "20% FCS"는 20%FCS-처리된(자극받은) 대조를 나타낸다. 나머지 막대는 α_vβ₃단독 대조를 나타내고, 치료는 α_vβ₃농도를 증가시키면서 툼스타틴 치료를 한 것이다. 각 막대는 3중 웰의 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 실험은 3회 반복하였다. *는 단측 스튜던트 검증에서 P＜0.05를 나타낸다.

도 23A 및 23B는 다양한 처리하에(x-축) C-PAE 세포(도 23A) 및 PC-3세포(도 23B)의 OD₄₀₅에서 흡수도(y-축)에 대한 함수로써 카스파제-3 활성 양을 보여주는 한 쌍의 히스토그램이다. 흡수도를 보여준다. 각 막대는 3중 웰의 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 실험은 3회 반복하였다.

도 24A, 24B, 24C, 24D는 α₁에서 α₆, β₁또는 α_vβ₃인테그린 아단위 존재하에서, Ⅳ형 콜라겐의 대조(도 24B) 또는 툼스타틴(도 24A), 비트로넥틴(24C), 라미닌-1(24A) 피복된 평판에 HUVEC의 결합을 보여주는 4개 히스토그램 세트를 나타낸다. 평판 피복은 각 그래프의 상단에 표시하였는데, 배양을 위해 이용된 항체는 각 그래프 x-축에 보여준다. BSA-피복된 평판은 네거티브 대조로 이용하였다.

도 25는 툼스타틴-피복된 평판에 C-PAE 세포 결합을 보여주는 히스토그램이다. BSA-피복된 평판은 네거티브 대조로 이용하였다.

도 26은 다양한 양의 툼스타틴(●), BSA(대조군, □) 및 7S 도메인(대조군, ○)(x-축)이 내피 관 형성(y-축)에 미치는 영향을 보여주는 선형 그래프이다.

도 27A 및 27B는 치료일(x-축)에 걸쳐 툼스타틴(●) 및 엔도스타틴(○) 대대조군(□)이 종양 부피(mm³, y-축)에 미치는 효과를 보여주는 한 쌍의 선형 그래프이다. 별표로 표시된 데이터 포인트가 중요하며, 단측 스튜던트 t-검증에서 P＜0.05이었다.

도 28은 대조군 생쥐(□) 및 툼스타틴 돌연변이체 N-53을 사용하여 치료된 생쥐(●)에 대해 치료일(x-축)에 걸쳐 종양 부피(y-축)의 증가를 보여주는 그래프이다. 별표로 표시된 데이터 포인트가 중요하며, 단측 스튜던트 t-검증에서 P＜0.05이었다.

도 29는 툼스타틴 및 툼스타틴 N-53의 농도를 증가시켰을 때(x-축) 세포 생존능(OD₅₉₀에 대한 함수, y-축)을 보여주는 그래프이다. 각 점은 삼중 웰의 평균 +/-표준 편차를 나타낸다. 단측 스튜던트 검증 P＜0.05이었다.

도 30은 아레스텐(●), 칸스타틴(○), 12 kDa 아레스텐 단편(■), 8 kDa 아레스텐 단편(□) 및 10 kDa 칸스타틴 단편(▲)의 다양한 농도에 의한 내피 관 형성의 억제(y-축)를 보여주는 선형 그래프이다.

도 31은 툼스타틴 단편 333(●), 툼스타틴 단편 334(○), BSA(대조군, ■), α6(대조군, □) 및 툼스타틴(▲)의 다양한 농도(x-축)에 의한 내피 관 형성의 억제(y-축)를 보여주는 선형 그래프이다.

도 32A, 32B, 32C는 HPE(도 32A), C-PAE(도 32B), WM-164(도 32C) 세포 증식(y-축)에서 툼스타틴 농도를 증가시켰을 때 효과를 보여주는 히스토그램이다.

도 33A 및 33B는 C-PAC 세포(도 33A) 및 WM-164 세포(도 33B)의 상대적 개수(y-축)에서 툼스타틴(◆), Tum-1(□), Tum-2(●), Tum-3(◇), Tum-4(▲)를 증가하는 경우에 효과(x-축)를 보여주는 한 쌍의 그래프이다.

도 35는 5㎍/㎖ Tum-1, Tum-2, Tum-3, Tum-4 또는 80ng/㎖ TNF-α 또는 PBS 완충액(대조)으로 처리된 C-PAE 세포의 OD₄₀₅에서 흡수도(y-축)를 측정하여 카스파제-3 활성을 보여주는 히스토그램이다.

도 36A, 36B, 36C는 세가지 히스토그램이다. 도 36A, 36B, 36C는 대조 IgG, α_vβ₃, α_vβ₅, BSA 존재하에 Tum-1(도 36A), Tum-2(도 36B), Tum-4(도 36C)로 피복된 평판에 C-PAE 세포(y-축)의 결합 비율을 나타낸다.

도 37은 PBS, 툼, Tum-1, Tum-2, Tum-4, BSA(x-축)으로 피복된 평판에 부착된 WM-164 세포에 대한 OD₆₅₅에서 흡수도(y-축)에 의해 메틸렌 블루 착색 수준을 보여주는 히스토그램이다.

도 38A, 38B, 38C, 38D는 항-Tum-4 항체 또는 α_vβ₃단백질로 사전 배양(1:100, 1:200, 1:500 희석)(x-축)된 1.5㎍/㎖ Tum-1(도 38A) 또는 Tum-2(도 38B)로 처리된 C-PAE 세포의 증식(y-축)을 보여주는 또는 툼스타틴(도 38D) 또는 Tum-4(도 38E)로 처리된 WM-164 세포의 증식을 보여주는 5가지 히스토그램이다.

도 39는 x-축에 툼스타틴(●), 엔도스타틴(△), 항-α_vβ₃항체 및 IgG(◆)(대조) 농도와 y-축에 관련 세포 수를 나타낸 그래프이다. 각 점은 3중 웰의 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 실험은 3회 반복하였다. *는 단측 스튜던트 검증에서 P＜0.05를 나타낸다.

도 40은 C-PAE 세포의 관련 세포 수(y-축)에서 칸스타틴(◆), Can-1(■), Can-2(▲)의 농도를 증가시킨 경우에 효과를 나타낸 그래프이다. 각 단백질 농도는 4회 테스트하였다.

도 41은 PBS(대조), 칸스타틴, Can-1, Can-2로 처리를 위해 충전물당 평균 혈관 개수(y-축)를 나타낸 그래프이다.

도 42는 툼스타틴 단백질 서열을 나타낸 것으로, T1, T2, T3, T4, T5, T6위치를 표시하였다. GP-A=first 굿패스처 에피토프. GP-B=second 굿패스처 에피토프.

도 43A, 43B, 43C, 43D는 내피 세포 증식 저해를 보여주는 히스토그램과(도 43A, 43B, 43C) T3 펩티드에 의한 내피 세포 아폽토시스 유도(도 43D)를 보여주는 히스토그램이다. 43A는 10㎍/㎖ 펩티드 T2, T3, T4, T5, T6(x-축)으로 처리한 C-PAE 세포(y-축)의 증식을 나타낸다. 도 43B는 0.1, 1.0, 10㎍/㎖ T3 펩티드로 처리한 C-PAE 세포 증식(y-축)을 나타낸다. 도 43C는 다양한 농도의 α_vβ₃인테그린으로 사전-처리된 T3 펩티드로 처리하는 경우에 C-PAE 세포 생장(y-축)을 나타낸다. 도 43D는 세포를 10㎍/㎖ 펩티드 T2, T3, T4, T5, T6으로 처리한 후에 MTT 검사로 확증하는 경우에, C-PAE 세포의 세포 생존능(y-축)을 나타낸다. 모든 칼럼은 삼중 웰의 평균±SEM을 나타낸다.

도 44A, 44B, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G는 항-인간 인테그린 항체, 생쥐 IgG(대조), 펩티드 T2, T3, T4, T5, T6으로 세포를 처리하는 경우에, C-PAE 세포의 흡착을 보여주는 7가지 히스토그램이다. 도 44A는 BSA(대조) 존재하에, 항체 없이(대조), 생쥐 IgG(대조), α_vβ₃인테그린 항체(x-축) 존재하에, Tum-5 펩티드(10㎍/㎖)로 피복된 평판에 HUVEC 세포 결합(y-축)을 나타낸다. 도 44B는 10㎍/㎖ 재조합 Tum-5 펩티드로 피복된 평판(x-축)에 대해 C-PAE 세포의 흡착(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. 도 44C는 Tum-5로 피복되고, 2.5㎍/㎖ 펩티드 T2, T3, T4, T5, T6처리된 96-웰 평판(x-축) 또는 T3으로 처리된 Tum-4 피복된 평판(x-축)에 C-PAE 세포 결합(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. PBS처리된 것은 대조로 하였다. 도 44D는 다양한 농도의 T3 펩티드(x-축)를 가지는 Tum-5 피복된 평판에 C-PAE 세포 결합 효과(y-축)를 나타낸다. PBS 처리된 것은 대조로 하였다. 도 44E는 PBS(대조), IgG(대조) 또는 α_vβ₃인테그린 항체 존재하에 T2, T3, T4, T5, T6 피복된 평판(x-축) C-PAE 세포 결합(y-축)을 나타낸다. 도 44F는 PBS(대조), IgG(대조) 또는 α_v인테그린 항체, β₁인테그린 항체, β₃인테그린 항체, α_vβ₃인테그린 항체, BSA(대조)(x-축)으로 배양하는 경우에 T3-피복된 평판에서 C-PAE 세포의 결합을 나타낸다. 도 44G는 PBS(대조), IgG(대조) 또는 다양한 T3 펩티드 농도(0.1, 1.0, 10.0㎍/㎖) 또는 다양한 T6 펩티드 농도(0.1, 1.0, 10.0㎍/㎖)(x-축)로 배양하는 경우에 비트로넥틴(2.5㎍/㎖) 피복된 평판에 C-PAE 세포의 결합을 나타낸다. 각 칼럼은 3중 웰의 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. *는 단측 스튜던트 검증에서 P＜0.05를 나타낸다.

도 45는 PBS(대조), α_vβ₃인테그린 항체, β₁인테그린 항체, α₆인테그린 항체, BSA(대조) 존재하에 툼스타틴-N53-피복된 평판(20㎍/㎖)에 HUVEC 세포 흡착을 보여주는 히스토그램이다.

도 46은 운반체(대조, ○) 또는 매일 5㎎/㎏ 툼스타틴-N-53으로 처리된(□) 또는 매일 20㎎/㎏ 툼스타틴-N-53으로 처리된(◇) 종양을 15일 이상(x축) PC3 전립선 종양(PC3 전입선 이종이식편 모델)에서 평균 종양 크기㎣를 타나낸 그래프이다.

도 47은 운반체(대조, ○) 또는 매일 20㎎/㎏ 툼스타틴-N-53으로 처리된(□) 또는 매일 5㎎/㎏ 툼스타틴-N-53으로 처리된(◇) 종양을 22일 이상(x축) 유방암 암종 MDA-MB435에서 평균 종양 크기㎣를 타나낸 그래프이다.

도 48은 PBS(대조), 완충액(대조), 20㎍/㎖ 툼스타틴-N53, 10㎍/㎖ 툼스타틴 N-45-132, 5㎍/㎖ 툼스타틴-45-132(x-축)로 처리하는 경우에 S 단계 C-PAE 세포 존재(y-축)를 나타낸다. 10% FBS 존재하에 세포 사이클 검사를 시행하였다.

도 49는 PBS(대조), α_vβ₃인테그린 항체, β₁인테그린 항체, α₆인테그린 항체, BSA(대조) 존재하에 툼스타틴-N53-피복된 평판(20㎍/㎖)에 HUVEC 세포 흡착(OD₅₉₅, y-축)을 보여주는 히스토그램이다.

도 50A, 50B는 세포 증식에서 툼스타틴-45-132의 효과를 보여주는 2가지 히스토그램을 나타낸다. 도 50A는 0, 0.125, 0.250, 0.500, 1.0, 2.0μM 농도에서 전장 툼스타틴을 발현하는 293세포(흰색 막대) 또는 툼스타틴-45-132를 발현시키는 대장균(검은색 막대)(x-축)으로 처리된 C-PAE 세포와 BrdU 검사(OD₄₀₅, y축)에 측정된 세포 증식을 나타낸다. 도 50B는 0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0㎍/㎖(x-축) 농도에서 툼스타틴-45-132를 발현시키는 피치아(Pichia)로 처리된 C-PAE 세포와 메틸렌 블루 착색(OD₆₅₅, y축)에 의해 측정하는 경우에 세포 증식을 나타낸다.

도 51은 세포 사이클 진행시에 툼스타틴-45-132 및 Tum-5-125-C-A 발현시키는 대장균의 효과를 나타낸 히스토그램이다. 0시(대조), 0, 1, 10, 20㎍㎖ 툼스타틴-45-132(검은색) 또는 Tum-5-125-C-A(흰색)(x-축)에서 S 단계 C-PAE 세포 비율(y-축)을 나타낸다. 실험은 3회 반복하였다.

도 52A, 52B, 52C, 52D는 세포 생존능에서 툼스타틴-45-132 및 Tum-5-125-C-A의 효과를 보여주는 4가지 히스토그램이다. 도 52A는 0, 3, 6, 12, 25, 50㎍/㎖ 툼스타틴-45-132(검은색) 및 툼스타틴-45-132(알킬화되고 환원된)(흰색)(x-축)로 처리된 C-PAE 세포에서 MTT 검사에서 OD₅₆₂에서 측정한 세포 생존능 효과를 보여주는 히스토그램이다. 도 52B는 0, 3, 6, 12, 25, 50㎍/㎖ Tum-5-125-C-A(x-축)로 처리된 C-PAE 세포에서 MTT 검사에서 OD₅₆₂에서 측정한 세포 생존능 효과를 보여주는 히스토그램이다. 도 52C는 0, 3, 6, 12, 25, 50㎍/㎖ Tum-5-132로 처리된 PC-3 세포(x-축)에서 MTT 검사에서 OD₅₆₂에서 측정한 세포 생존능 효과를 보여주는 히스토그램이다. 도 52D는 0, 3, 6, 12, 25, 50㎍/㎖ 툼스타틴-45-132로 처리된 PC-3(x-축)세포에서 MTT 검사에서 OD₅₆₂에서 측정한 세포 생존능 효과를 보여주는 히스토그램이다.

도 53은 대조, 대조 + DEVD-fmk, TNF-α, TNF-α + DEVD-fmk, 툼스타틴-45-132(1㎍/㎖, 10㎍/㎖), 툼스타틴-45-132(10㎍/㎖) + DEVD-fmk의 카스파제-3 활성(OD₄₀₅에서 측정, y-축)을 나타낸 히스토그램이다.

도 54는 운반체(대조, □), 1㎎/㎏ 툼스타틴-45-132(◆), 1㎎/㎏ Tum-5-125(●), 20㎎/㎏ 엔도스타틴(○), 미니-펌프로 투여된 툼스타틴-45-132(1㎎/㎏, △)로 처리하였을 경우에, 0, 5, 10, 15, 20일(x-축)에서 v/v₀(평균 종양 체적/초기 종양 체적)에서 분절 종양 체적(y-축)을 보여주는 선형 그래프이다.

도 55A 및 55B는 툼스타틴의 다양한 펩티드 아단위 존재하에 툼스타틴을 생산하는 293으로 피복된 조직 배양 평판에 결합하는 C-PAE 세포를 보여주는 히스토그램을 나타낸다. PBS 및 BSA는 각각 양성 및 음성 대조로 이용되었다. 도 55A는 10㎍/㎖ 펩티드 T1, T2, T3, T4, T5, T6, Tum-4 존재하에 세포 결합을 나타낸 것이고, 도 55B는 0.1, 2.0, 10.0㎍/㎖ T3 펩티드 존재하에 세포 결합을 나타낸다.

도 56은 0, 1, 10, 20㎍/㎖ T3 펩티드(검은색), T3 접힌 펩티드(흰색)로 처리하는 경우에 C-PAE 세포 증식(0.1% FCS로 처리되고 자극받지 않은 대조 세포의 비율)을 보여주는 히스토그램이다.

도 57은 전장 툼스타틴(검은색), 툼스타틴-45-132(흰색), T7 펩티드(빗금), T3 펩티드(점각)로 처리하는 경우에, C-PAE 세포 증식(0.1% FCS로 처리되고 자극받지 않은 대조 세포의 비율)을 보여주는 히스토그램이다.

도 58A-58H는 다양한 처리하에(x-축)³⁵S-메티오닌 병합(y-축)을 보여주는 8가지 히스토그램을 나타낸다. 각 칼럼은 3중 실험의 평균± SEM으로 구성된다. 도 58A에서 C-PAE 세포는 T3 펩티드(4.5 μM), 툼스타틴-45-132(4.5 μM), 엔도스타틴(4.5 μM), 라파마이신(100 ng/㎖)으로 12시간(검은색) 또는 24시간(빗금)으로 처리하였다. 도 58B는 HUVEC는 T3 펩티드(4.5 μM), 툼스타틴-45-132(4.5 μM), 엔도스타틴(4.5 μM), 라파마이신(100 ng/㎖)으로 24시간 처리하였다. 도 58C에서 C-PAE는 12 또는 24시간 혈청이 없게 하고, 이후 0μM(대조, 검은색), 4.5μM(수평 빗금), 22.7μM(빗금) T3 펩티드의 존재하에 24시간동안 10% FCS를 포함하는 배지에서 배양하였다. 도 58D-H에서, PC-3세포(도 58D), 786-O 세포(도 58E), NIH3T3 세포(도 58F), HRE 세포(도 58G), WM-164 세포(도 58H)는 24시간동안 T3 펩티드(4.5μM), 툼스타틴-45-132(4.5μM), T7 펩티드(도 58D, 58E, 58H), 엔도스타틴(4.5μM), 라파마이신(100ng/㎖)으로 처리하였다.

도 59A 및 59B는 T3 펩티드(4.5 μM), 툼스타틴-45-132(4.5 μM), T7 펩티드(4.5 μM), 엔도스타틴(4.5 μM) 또는 라파마이신(100 ng/㎖) 처리한 후에 루시페라제(LUC-캡-의존성 번역, 검은색 막대) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT; 캡-독립성 번역; 빗금 막대)의 번역에 대한 리포터 활성(y-축)을 보여주는 한 쌍의 히스토그램이다. 대조군에 상대적인 루시페라제와 CAT 활성을 나타낸다. 이들 실험은 3회 반복하고, 대표적인 데이터를 도시한다. 각 칼럼은 3회 실시의 평균± SEM으로 구성된다.

도 6OA-60H는 8가지 히스토그램이다. 도 60A-60D는 야생형(도 60A, 60B)과β₃-인테그린 녹아웃(도 60B, 60D) 한배새끼 생쥐로부터 유래된 내피 세포(MLEC)(도 60A, 60B)와 태아 섬유아세포(MEF)(도 60A와 60C)에서³⁵S-메티오닌 병합에서 전체 단백질 합성(y-축)을 나타내는데, 이들 세포는 툼스타틴-45-132(4.5 μM), T3(4.5 μM), T7(4.5 μM), T7-돌연변이 펩티드(4.5 μM), 엔도스타틴(4.5 μM) 또는 라파마이신(100 ng/㎖)(x-축)으로 처리하였다. 도 60E-6OG는 야생형(도 60E, 60G)과 β₃-인테그린 녹아웃(도 60F, 60H) 한배새끼 생쥐로부터 유래된 내피 세포(MLEC)(도 60F, 60F)와 태아 섬유아세포(MEF)(도 60G와 60H)에서 대조에 대한 비율(y-축)로 루시페라제(Luc; 검은색 막대) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT; 빗금 막대)의 리포터 활성을 나타내는데, 이들 세포는 툼스타틴-45-132(4.5 μM), T3(4.5 μM), T7(4.5 μM), T7-돌연변이 펩티드(4.5 μM), 엔도스타틴(4.5 μM) 또는 라파마이신(100 ng/㎖)(x-축)으로 처리하였다. 이들 실험은 3회 반복하고, 대표적인 데이터를 도시한다. 각 칼럼은 3회 실시의 평균± SEM으로 구성된다.

도 61A-61F는 8가지 히스토그램을 나타낸다. 도 61A에서는 다음과 같은 처리(x-축)하에 pFAK/FAK 상대 밀도의 상대적 밀도(y-축)를 보여준다: 비트로넥틴-피복된 평판에 부착시간 없음과 T3 펩티드 없음("0-"막대), 30분 부착시간과 T3 펩티드 없음("30-"막대), 30분 부착시간과 50 ㎍/㎖ T3 펩티드("30+"막대), 60분 부착시간과 T3 펩티드 없음("60-"막대), 60분 부착시간과 50㎍/㎖ T3 펩티드("60+"막대). 도 61B에서는 다음과 같은 처리(x-축)하에 PI3-카이나제 활성(y-축)을 보여준다: 비트로넥틴-피복된 평판에 부착시간 없음과 T3 펩티드 없음("0-"막대), 30분 부착시간과 T3 펩티드 없음("30-"막대), 30분 부착시간과 50 ㎍/㎖ T3 펩티드("30+"-막대), 60분 부착시간과 T3 펩티드 없음("60-"막대), 60분 부착시간과 50 ㎍/㎖ T3 펩티드("60+"막대). 도 61C에서는 도 61A에서와 동일한 처리(x-축)하에 pFAK/FAK의 상대적인 밀도를 보여준다. 도 61D에서는 다음과 같은 처리(x-축)하에 mTOR-카이나제 활성(y-축)을 보여준다: mTOR 트랜스펙션 없음과 펩티드 처리없음("- -" 막대), mTOR 트랜스펙션과 펩티드 처리없음("+ -" 막대), mTOR 트랜스펙션과 툼스타틴-45-132로 처리("+ Tum-5" 막대), mTOR 트랜스펙션과 T3 펩티드로 처리("+ T3" 막대). 도 61E에서는 다음과 같은 처리(x-축)하에 C-PAE 세포에서 eIF4E-결합된 4E-BP1 밀도(y-축)를 보여준다; FBS 없음, T3, 툼스타틴-45-132, 라파마이신, 엔도스타틴 또는 FBS. 도 61F에서는 CAT 활성에 상대적인 루시페라제 활성 비율을 대조 lacZ cDNA를 포함하는 아데노바이러스 벡터(그림자 막대)로 감염되거나, 구성적 활성 Akt를 포함하는 아데노바이러스 벡터(빗금 막대)로 감염되거나 또는 전혀 감염되지 않은(검은색 막대) C-PAE에 대하여 나타낸다(y-축). 세포는 혈청이 부족하게 하고, pcDNA-LUC-pol-CAT으로 트랜스펙션시키며, 10% FCS를 포함하는 배지하에 T3 펩티드로 처리하였다.

도 62는 대조 운반제(○)로 치료 및 1 ㎎/㎏(□) 또는 2.5 ㎎/㎏(◇) T8 치료(x-축)이후에 여러 일동안 평균 종양 체적(㎣, y축)을 보여주는 그래프이다.

도 63은 대조(○)로 치료 및 매일 1 ㎎/㎏(◇) TP3, 매일 5 ㎎/㎏(X) TP3, 매일 5 ㎎/㎏(□) T8, 2주간 5 ㎎/㎏ T8(+) 치료(x-축)이후에 여러 일동안 평균 종양 체적 비율(V/V₀, y축)을 보여주는 그래프이다.

도 64A 및 64B는 다양한 치료(x-축)를 개시한 이후 여러 일동안 평균 종양 체적 비율(㎣, y축)을 보여주는 그래프이다. 도 64A에서 치료는 다음과 같다: T7의 원액 운반제(○), T7 매일(□), T8의 원액 운반제(◇), T8 매일(X), TP3 매일(+), SP1 매일(△), SP2 매일(●). 도 64B에서 치료는 다음과 같다; T8의 원액 운반제(○), T8 매일(□), T8 2주(◇), T8 2주(X).

도 65A 및 65B는 다음의 다양한 치료(x-축)를 개시한 이후 여러 일동안 누드 쥐(도 65A)에서 MDAMB-435 동소성 사람 유방암 이종이식편 모델(도 65A) 및 PC3 사람 전립선 종양 이종이식편 모델(도 65B)에서 평균 종양 체적(㎣, y축)을 보여주는 그래프이다: 대조 치료(○) 및 T8 펩티드 5 ㎎/㎏(□), SP2 5 ㎎/㎏(◇), T8-3 1 ㎎/㎏(X) 또는 5 ㎎/㎏(+), P2 1㎎/㎏(△) 또는 5 ㎎/㎏(●). 도 65A와 65B는 각각 MDAMB-435와 PC3 이종이식편 모델 결과를 나타낸다.

바람직하지 않은 혈관형성으로 인해 매우 다양한 질병들이 발생한다. 바꾸어 말하면, 어떠한 조건하에서, 특정 시간에 또는 특정 조직에서 모세혈관의 성장 및 확장을 중단시킬 수 있다면 많은 질병과 바람직하지 않은 질환들을 예방 또는 완화시킬 수 있다. 기저막 조직구성은 Ⅳ형 콜라겐 네트워크의 조립에 의존하며 이것은 Ⅳ형 콜라겐의 C-말단의 구형 비교원질(NC1) 도메인을 통해 일어난다고 생각된다(Timpl, R., 1996, Curr Opin Cell Biol 8:618-24; Timpl, R. et al., 1981, Eur.J. Biochem. 120:203-211). Ⅳ형 콜라겐은 6개의 서로 다른 유전자 산물(즉, α1 내지 α6)로 구성되어 있다(Prockop, D. J. et al., 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:403-34). α1 및 α2 동형물들은 인간 기저막에 편재(遍在)되어 있지만(Paulsson, M., 1992, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27:93-127), 나머지 4개의 동형물들은 제한적으로 분포되어 있다(Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8).

기존 혈관으로부터 새로운 모세관의 형성, 즉, 혈관형성은 종양 성장 및 전이의 과정을 위해 필수적이다(Folkman, J. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-4; Folkman, J. 1995, Nat. Med. 1:27-31; Hanahan, D. et al., 1996, Cell 86:353-64). 인간 및 동물 종양들은 초기에는 혈관을 신생시키지 않지만, 수 mm3이상으로 성장한 종양은 혈관을 신생시킬 수 있다(Folkman, J. 1995, Nat. Med. 1:27-31; Hanahan, D, et al., 1996, Cell 86:353-64). 혈관형성 표현형으로의 전환은 혈관형성 자극제의 상향조절 및 혈관형성 억제제의 하향조절을 필요로 한다(Folkman, J. 1995, Nat. Med. 1:27-31). 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 섬유아세포 성장 인자(bFGF)는 종양에서 가장 보편적으로 발현되는 혈관형성 인자들이다. 혈관을 신생시키는 종양은 상기 혈관형성 인자들을 하나 이상 과다발현시켜 종양 성장을 상승적으로 촉진시킬 수 있다. 수용체 길항제를 사용하여 VEGF와 같은 단일 혈관형성 인자를 억제시키는 것은 종양 성장을 정지시키기에 충분하지 않다. 수많은 혈관형성 억제제들이 최근에 동정되고 있으며, IFN-a, 혈소판-인자-4(Maione, T.E. et al., 1990, Science 247:77-9) 및 PEX(참조: Brooks, P.C. et al., 1998,Cell 92:391-400)와 같은 특정 인자들은 종양 세포와 내생적으로 관련되어 있지 않지만, 앤지오스타틴(참조: O'Reilly, M.S. et al., 1994, Cell 79:315-28) 및 엔도스타틴(O'Reilly, M.S. et al., 1997, Cell 88:277-85)은 종양 조직 자체에 의해 생성된 종양 관련 혈관형성 억제제이다. 이런 내생적인 혈관형성 억제제를 사용한 종양 성장 및 전이의 치료는 매우 효과적이고 매력적인 생각이긴 하지만, 항-혈관형성 치료와 관련된 여러 가지 잠재적인 문제점들이 고려되어야만 한다. 만성 항-혈관형성 치료에 의해 유도된 지연된 독성뿐만 아니라 치료 동안 일어나는 손상된 상처 치료 및 재생적인 혈관형성의 가능성을 심각하게 고려해야 한다.

일반적으로, 인테그린은 수용체를 세포의 세포골격(cytoskeleton)에 연결시키는 짧은 C-말단 세포질 도메인을 보유한다. α와 β 아단위 둘 모두 리간드 결합에 관여하고 광범위한 어레이의 잠재적 리간드가 존재한다. 일부 공통 리간드는 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 및 다양한 유형의 콜라겐이다. 이들중 일부(예, 피브로넥틴과 라미닌)는 다중 인테그린에 의해 결합된다. 콜라겐 I은 인테그린 α₁β₁, α₂β₁, α₃β₁에 의해 결합되고, 콜라겐 Ⅳ는 인테그린 α₁β₁과 α₂β₁에 결합되는 것으로 알려져 있다. 내피 세포는 인테그린 α₂β₁, α₆β₁, α_vβ₃, α₆β₄에 의해 결합된다. 사이토킨-활성화된 내피 세포는 α₄β₁과 α_Lβ₂에 의해 결합되고, 혈관 내피는 α_Mβ₂인테그린에 의해 결합된다.

본 발명에서는 항-혈관형성 단백질과 펩티드와 상호작용하는, 예를 들면 이들과 특이적으로 결합하는 세포 표면 수용체, 특히 항-혈관형성 단백질 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴에 결합하는 인테그린과 인테그린 아단위를 개시한다. 이들 인테그린은 신규한 항-혈관형성 단백질, 펩티드, 화합물; 또는 현재 공지된 항-혈관형성 단백질, 펩티드, 화합물의 좀더 강력한 변이체와 단편, 특히 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴의 좀더 강력한 변이체와 단편을 평가할 수 있는 표적을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 Ⅳ형 콜라겐의 NC1 도메인의 α1 사슬인 아레스텐에 결합하는 인테그린 아단위 α₁, α₂, α₃, α_v, β₁, β₃에 관한다. 본 발명은 또한, Ⅳ형 콜라겐의 NC1 도메인의 α2 사슬인 칸스타틴에 결합하는 인테그린 아단위 α₁, α₂, β₁에 관한다. 이에 더하여, 본 발명은 Ⅳ형 콜라겐의 NC1 도메인의 α3 사슬인 툼스타틴에 결합하는 인테그린 아단위 α₅, α₆, α_v, β₁, β₃에 관한다. 다른 인테그린이나 인테그린 아단위 역시 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴에 결합할 수 있는데, 이들은 본원에서 밝힌 방법으로 동정할 수 있다(참조: 실시예 12, 26, 28).

아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴을 투여하거나 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴에 대한 수용체로 기능하는 앞서 기재된 인테그린 아단위에 결합하는 다른 단백질, 펩티드 또는 화합물을 투여함으로써, 내피 세포의 혈관형성과 증식을 저해하거나 내피 세포 아폽토시스를 촉진이나 유도할 수 있다. 이런 단백질, 펩티드, 화합물에는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 항체, 단편 또는 일부; 또는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴에서 앞서 기재된 인테그린 아단위에 특이적으로 결합하는 영역을 포함하는 단백질이나 펩티드가 포함된다. "특이적으로 결합하는"은 특정 결합 단백질에 리간드(예, 항원)의 높은 친화성 결합을 의미한다. 가령, 특정 항원에서 에피토프에 결합하는 항체는 임의의 다른 에피토프, 특히 특정 항원에 결합된 분자로 존재하거나 동일 시료에서 특정 항원으로 존재하는 임의의 다른 에피토프에 동일 항체의 결합보다 강하다. 관심 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 약하긴 하지만 검출가능한 수준(예, 관심 분자에 10% 이하의 결합)으로 다른 분자에 결합할 수 있다. 이런 약한 결합 또는 배경 결합은 예로써 적절한 대조를 이용하면 관심 분자에 특정 항체 결합과 쉽게 구별할 수 있다.

특정 펩티드에 대한 항체는 통상적으로 생산되는데, 일정한 단백질에 대한 항체를 생산하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다(참조: Chapter 11 of Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., 1987, with Supplements through 1999), especially pages 11.4.2-11.11.5 ("Preparation of Monoclonal Antibodies"), 11.12.1-11.13.4("Preparation of Polyclonal Antisera") and most especially pages 11.14.1-11.15.4("Preparation of Antipeptide Antibodies")). 맞춤 항체는 다수의 공급업자, 예를 들면 Berkeley Antibody Co., Richmond, California, USA로부터 구입할 수도 있다. 인테그린과 인테그린 아단위에 대한 항체를 생산하는 방법 역시 널리 알려져 있는데, 이런 항체를 생산하는 방법은 Gallatin, W.M. et al.(U.S. Pat. No. 5,817,515); Kim, K.J. et al.(U.S.Pat. Nos. 5,652,110; 5,652,109; 5,578,704)에서 기술한다.

본원에 기술된 인테그린과 인테그린 아단위는 재조합 방식으로 가용성 형태로 만들 수 있다. 가용성 수용체와 단백질을 생산하는 방법은 당분야에 널리 알려져 있는데, 인테그린과 인테그린 수용체를 가용성 형태로 생산하는 방법은 Briesewitz, R. et al.(1993, J Biol. Chem. 268:2989-96); Kern, A. et al.(1994, J Biol. Chem. 269:22811-6); Gallatin, W.M. et al.(U.S.Pat. Nos. 5,728,533 and 5,831,029); Duong, L.T. et al.(U.S. Pat. No. 5,895,754)에서 기술한다.

또한, 본 발명은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴에 대한 수용체로 기능하는 인테그린 아단위를 모방하는 단백질, 펩티드 또는 화합물을 투여하여 혈관형성 과정과 세포 증식을 강화시키거나 세포 아폽토시스를 저해하는 방법에 관한다. 이런 단백질, 펩티드 또는 화합물에는 이용가능한 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 및 이들의 생물학적 활성(항-혈관형성)단편, 돌연변이체, 유사체, 동족체, 유도체, 다량체(이량체), 융합단백질(키메라 단백질)에 결합하고, 따라서 이들이 개별 인테그린 수용체와 결합하는 것을 예방하고 혈관형성 활성을 저해하는 선택된 아단위로 구성된 인테그린 단백질이 포함된다. 이런 이유로, 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴 또는 이들의 변이체와 단편에 결합하는 이런 단백질, 펩티드 또는 화합물에는 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴 또는 이들의 변이체와 단편에 대한 항체 역시 포함된다. 이런 항체는 이들 분자에 결합하여 이들이 개별 인테그린 수용체와 상호작용하는 것을 예방하고 혈관형성 활성을 저해한다.

본 발명에서 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴 또는 이들의 변이체와 단편은 조직에서 혈관형성, 내피 세포 증식, 내피 세포 이동 또는 내피 세포 관 형성을 저해하거나 조직에서 아폽토시스를 유도나 촉진하는데 단독으로 또는 공동으로 사용될수 있다. 가령, 아레스텐과 칸스타틴이 한 제약학적 조성물에 결합될 수 있고, Tum-4와 T7이 한 조성물에 결합될 수 있다. 아레스텐, 칸스타틴 및/또는 툼스타틴의 조합은 다른 콜라겐 도메인이나 NC1 사슬; 다른 형태의 요법, 예를 들면 방사선요법, 화학요법, 면역요법; 또는 다른 활성 분자, 예를 들면 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 레스틴과 결합될 수 있다. 이들 분자는 항-아폽토시스 단백질, FLIP (FLICE-저해 단백질 또는 FADD-유사 인터루킨-1Beta-전환 효소-저해 단백질)의 수준을 감소시킨다. 이런 이유로, 혈관형성은 FLIP의 수준을 감소시켜, 카스파제 활성화를 유도하고 말단 아폽토시스 신호를 전달하는 분자에 의해 저해된다.

본원에 기술된 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴에 대한 수용체(예, α₁β₁,α₂β₁,α₃β₁,α₅β₁,α₆β₁,α_vβ₃인테그린) 및/또는 이들의 아단위(α₁,α₂,α₃,α₅,α₆,α_V,β₁,β₃)에 대한 수용체는 혈관형성을 저해하는데 촉진하거나 유도하는데 병용될 수 있다. 아레스텐, 칸스타틴 및/또는 툼스타틴에 대한 항체 역시 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴에 대한 수용체와 이들의 수용체 아단위에 대한 항체처럼 단일 치료 섭생에 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴, 이들의 항-혈관형성 변이체와 단편과 유사한 방식으로 혈관형성을 저해하는 항-혈관형성 단백질, 펩티드, 화합물을 확인하는 키트에 관한다. 이런 키트는 인테그린의 적절한(α₁,α₂,β₃) 아단위 및 하기 실시예에 기술된 검사중 한가지를 실행하는데 필요한 다른 성분을 포함된다. 이런 키트로 실행할 수 있는 예외적인 검사에는 실시예 12 및 28에 기술된세포 흡착 검사(Cell Adhesion Assay) 및 하기 실시예 26에 기술된 경쟁 증식 검사(Competition Proliferation Assay)가 포함된다. 가령, 툼스타틴과 유사한 방식으로 작용하는 단백질, 펩티드 또는 화합물을 확인하는 키트는 실시예 28의 세포 부착 분석을 실시하는데 필요한 성분과 시약, 예를 들면 인테그린 아단위 α₆, β₁, α_v, β₃, IgG(대조)에 대한 항체를 포함한다. 상기 키트는 검사 화합물과 대조, 예를 들면 Ⅳ형 콜라겐 또는 라미닌-1로 피복된 96-웰 평판을 선택적으로 포함할 수 있다(또는 평판은 선택적으로 사전-피복될 수 있다). 상기 키트는 이들 세포를 성장시키고 트립신처리하며 재현탁시키고 염색하는 시약을 비롯하여 BSA 또는 다른 차단제 및 부착용 세포(예, HUVEC 세포) 역시 선택적으로 포함할 수 있다.

잠재적 항-혈관형성 화합물이 확인되면, 처음에 화합물을 확인하는데 사용된 동일한 인테그린 아단위와의 경쟁으로 항-혈관형성 활성의 상실을 확인하는데 다른 키트를 이용할 수 있다. 이런 키트는 실시예 26에 기술된 경쟁 증식 분석에 맞게 설계될 수 있다. 상기 키트는 증식 분석에 유용한 세포 및 단백질 형태의 적절한 인테그린 아단위를 포함할 수 있다. 상기 키트는 검사 화합물의 항-증식 활성을 간섭하는 인테그린 아단위 단백질의 효과를 결정하는데 필요하거나 유용한 색소와 다른 시약을 선택적으로 포함할 수도 있다.

본 발명에서는 항-혈관형성 특성을 가진 단백질 및 이들의 단편, 유사체, 유도체, 동족체 및 돌연변이체와 함께 상기 단백질, 유사체, 유도체, 동족체 및 돌연변이체를 사용하여 혈관형성-매개된 증식성 질환을 억제시키는 방법을 기술한다.상기 단백질은 Ⅳ형 콜라겐의 α사슬의 NC1 도메인 또는 상기 도메인의 일부분, 상세하게는, Ⅳ형 콜라겐의 α1, α2 및 α3 사슬의 NC1 도메인의 단량체들을 포함한다. 이들 단백질(특히 단량체 형태로 존재할 때)은 암의 생체내 모델에서 종양 성장을 억제하며, 또한 내피 관 분석을 포함하여 몇 가지 시험관내 모델에서 모세관의 형성을 억제시킨다.

또한 상기 단백질은 NC1 도메인의 연결 부위를 포함한다. α4, α5 및 α6 사슬들이 감소되거나 탐지 불가능한 항-혈관형성 활성을 가짐을 시사하는 증거에 따라, α1, α2 및 α3 사슬이 바람직하다. 일반적으로, 육량체 형태는 활성이 거의 없거나 감소함을 시사하는 증거에 따라, 상기 단백질의 단량체 형태가 바람직하다.

좀더 구체적으로, 본 발명은 "아레스텐"으로 표기되는 단백질을 기술하며, 아레스텐은 약 230 아미노산 길이의 단백질이고, 인간 Ⅳ형 콜라겐의NC1 도메인의 α1 사슬의 N-말단에서의 아미노산들에 상응한다(Hostikka, S.L. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:19488-93).

본원에 개시된 바와 같이, 인간 아레스텐은 pET22b와 같은 세균성 발현 플라스미드를 사용하여 대장균에서 생산될 수 있으며, pET22b는 주변세포질 이동능력이 있어서, 가용성 단백질로 수득될 수 있다. 상기 단백질은 C-말단 6-히스티딘 태그를 가진 29 kDa 융합 단백질로서 발현된다. 추가적인 3 kDa(26 kDa를 지나서)은 폴리링커 및 히스티딘 태그 서열로부터 생긴다. 또한 아레스텐은 pcDNA 3.1 진핵 벡터를 사용하여 293 신장 세포에서 분비된 가용성 단백질로서 생성될 수 있다.이293-생성된 단백질은 정제되지 않거나 결실 태그가 없다.

아레스텐은 빠르면 치료 2시간후에 내피 세포 아폽토시스를 유발하는데, 이런 효과는 내피 세포에 특이적이며 고용량의 아레스텐으로 처리된 종양 세포에서 현저한 세포 사멸이 관찰되지 않는다. 대표적인 CD-31 염색 패턴은 처리된 생쥐 vs. 대조 생쥐의 맥관구조에서 감소를 보였다. 종양 절편은 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen), 피브로넥틴, Ⅳ형 콜라겐으로 염색하였는데, 종양 세포 증식, 또는 종양 세포를 주위하는 Ⅳ형 콜라겐과 피브로넥틴의 내용물과 구조에서 차이가 발견되지 않았다.

대장균-생성된 아레스텐은 0.25 ㎍/㎖의 ED₅₀을 사용하는 용량-의존성 수단으로 bFGF-자극된 내피 세포의 증식을 억제시킨다. 신장 암종 세포(786-0), 전립선 암 세포(PC-3) 또는 인간 전립선 내피 세포(HPEC)의 증식에 대해 어떠한 현저한 효과도 발견되지 않았다. 엔도스타틴은 0.75 ㎍/㎖의 ED₅₀에서 C-PAE 세포의 증식을 아레스텐보다 3배 높게 억제시켰고, A-498 암세포를 억제시키지 않았다.

본 명세서에 기술한 바와 같이, 내피 세포 증식 및 이동의 특이적인 억제는 아레스텐이 세포 표면 단백질 또는 수용체를 통해 기능할 수 있음을 시사한다. 매트릭스 금속단백질분해효소 또는 MMP의 억제는 바티마스타트(batimastat)(BB-94) 및 마리마스타트(marimastat)(BB-2516)와 유사하게 종양 성장 및 전이에서 아레스텐의 직접적인 역할을 시사한다.

최근의 연구에서 α₁β₁과 α₂β₁인테그린은 EHS 육종으로부터 분리된 Ⅳ형콜라겐에 결합하는 것으로 추정되었다(Senger, D.R. et al., 1997, Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:13612-7). 아레스텐은 Ⅳ형 콜라겐의 α1 사슬의 단편이기 때문에, α₁β₁/α₂β₁인테그린을 통한 내피 세포 결합을 매개하는 능력을 평가하였다. 이는 인테그린 α₁과 β₁아단위에 대한 항체를 기능적으로 차단하고 아레스텐 피복된 배양 웰에 HUVEC 세포의 결합을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다(도 1OA). 아레스텐-피복된 평판에 내피 세포 부착은 α₁항체로 60% 저해되었고 β₁인테그린 항체로 70% 저해되었다. 이들 결과는¹²⁵I-표지된 아레스텐을 이용한 결합 분석의 결과와 일치하였다. 아레스텐은 8.5 x 1O^-11의 높은 친화성 Kd₁값 및 4.6 x 10^-8의 낮은 친화성 Kd₂값으로 내피 세포에 결합하였다. 평판을 Ⅳ형 콜라겐으로 피복하면, α₁에 대한 중화 항체에서 30%, β₁항체에서 40%, α_vβ₃항체에서 15%의 경미한 저해가 관찰되었다(도 1OB). 아레스텐-과 콜라겐 IV-피복된 평판간 세포 부착에서 이런 차이는 전체 콜라겐 Ⅳ 분자에서 잠재적인 추가의 인테그린 결합 부위에 기인하는 것으로 생각되는데, 아레스텐은 α₁β₁인테그린에 대한 단일하고 특이적인 결합 부위를 제공한다(참조: 도 1OA와 1OB).

아레스텐의 종양-억제 활성은 인테그린, 특히 α₁β₁에 의해 매개될 수 있다. 기존 문헌(Bloch, W. et al., 1997, J Cell. Biol. 139:265-78)에서 기술된 α₁β₁인테그린에 대한 VEGF 의존성에서 알 수 있듯이, α₁β₁에 아레스텐의 결합은 내피 세포의 VEGF-유도된 증식과 이동을 하향조절한다. 종합하면, 이들 결과는 아레스텐이 혈관 캐스케이드의 서로 다른 단계에서 효과를 발휘한다는 것을 시사한다. α₁과 α₂인테그린 아단위에 대한 항체는 생체내에서 혈관형성을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Senger, D.R. et al., WO 99/16465). 아레스텐은 VEGF 또는 bFGF의 활성을 직접적으로 억제함으로써 기능한다. 쥐에서 아레스텐의 36시간 반감기는 임상에 요구되는 용량이 다른 단백질 저해물질, 예를 들면 엔도스타틴과 앤지오스타틴보다 훨씬 적다는 것을 암시한다(O'Reilly, M.S. et al., 1994, Cell 79:315-28; O'Reilly, M.S., et al., 1997, Cell 88:277-85).

본 발명에서 Ⅳ형 콜라겐의 α2 사슬의 NC1 도메인인 칸스타틴을 내피 세포의 증식과 이동의 억제 및 내피 관 형성의 억제에 의해 확증된 바와 같이, 혈관형성을 억제시키기 위해 사용하였다. 칸스타틴은 비-내피 세포의 증식이나 아폽토시스 없이 내피 세포 증식을 저해하고 이들 세포의 아폽토시스를 유도하였다. 칸스타틴-유도된 아폽토시스는 항-아폽토시스 단백질, FLIP의 하향-조절에 의해 매개된다. CD-31 조직 염색은 처리된 생쥐 vs, 대조 생쥐의 맥관구조에서 감소를 보였다. 또한 칸스타틴에 의한 내피 세포 증식 및 이동의 특이적인 억제는 이의 항-혈관형성 활성을 입증하며 칸스타틴이 세포 표면 단백질/수용체를 통해 기능할 수 있음을 증명한다. 인테그린은 이들의 세포외 매트릭스 결합 능력 및 이동 및 증식과 같은 세포 거동을 조절하는 능력으로 볼 때 잠재적인 후보 분자이다. 특히, α_vβ₃인테그린은 혈관형성 동안 이의 유도 및 이의 무차별적인 결합 능력에 기인하여, 가능한 칸스타틴이다.

본 발명에서는 Ⅳ형 콜라겐의 α3 사슬의 NC1인 툼스타틴(Timpl, R. et al., 1981, Eur. J. Biochem. 120:203-11; Turner, N. et al., 1992, J. Clin. Invest. 89:592-601)을 혈관형성 및 종양 성장의 시험관내 및 생체내 모델을 사용하여 혈관 내피 세포의 증식 및 혈관 형성을 조절하기 위해 사용하였다. 툼스타틴은 종양 혈관형성 과정의 여러 단계에서 효과를 발휘한다. 툼스타틴에 의한 내피 세포의 특이적인 저해는 툼스타틴이 세포 표면 단백질 또는 수용체를 통하여 기능한다는 것을 암시한다. 최근에, 툼스타틴의 C-말단 영역에 상응하는 19개 아미노산 길이의 합성 펩티드가 α_vβ₃인테그린에 결합하는 것으로 보고되었다(Shahan, T.A. et al., 1999, Cancer Res. 59:4584-90). 하기 실시예에 기술된 세포 부착 분석의 결과는 툼스타틴이 내피 세포에서 α_vβ₃과 α₆β₁인테그린에 결합한다는 것을 시사한다. 내피 세포에 결합하는 α_vβ₃인테그린에 대한 결합을 저해하기 위하여 툼스타틴을 α_vβ₃인테그린 단백질과 함께 사전-배양하면, 툼스타틴의 항-증식 효과가 현저하게 감소하였다(도 22). 이는 툼스타틴의 항-증식 효과가 증식성 내피 세포의 세포 표면에서 α_vβ₃인테그린에 결합을 통하여 적어도 부분적으로 매개된다는 것을 암시한다. 혈관형성이 α_vβ₃인테그린에 의해 매개되는 특이적인 내피 세포 부착 현상에 의존하기 때문에(Brooks, P.S. et al., 1994, Cell 79:1157-64; Brooks,P.S. et al., 1994, Science 264:569-71), 툼스타틴은 증식성 내피 세포 및 매트릭스 구성요소, 예를 들면 비트로넥틴과 피브로넥틴의 상호작용을 교란시킴으로써 항-혈관형성을 발휘할 수 있다. 증식성 내피 세포 및 비트로넥틴과 피브로넥틴의 정상적인 상호작용은 중요한 항-아폽토시스 신호로 간주된다(Isik, F.F. et al., 1998, J Cell. Physiol. 175:149-55). 툼스타틴은 성장-자극된 내피 세포에서 아폽토시스를 유도하는데, 이런 효과는 툼스타틴이 하위합류 단층(monolayer)에 첨가될 때, 다시 말하면 세포가 기하급수적으로 성장할 때 가장 현저하다. 툼스타틴은 내피 세포가 활성화되는 종양 맥관구조에 선택적일 수 있다.

"α3(Ⅳ)NC1 도메인"은 포유동물 Ⅳ형 콜라겐의 α3 사슬의 NC1 도메인의 아미노산 서열의 단편이나 일부를 의미한다. 이런 단편의 전형은 SEQ ID NO: 1O의 아미노산 서열이다.

α3(Ⅳ) 사슬의 분포는 GBM과 같은 특정 기저막, 와우각의 몇몇 기저막, 전방 렌즈 캡슐과 같은 눈의 기저막, 데스메 막(Descemet's membrane), 난소와 정소 기저막(Frojdman, K. et al., 1998, Differentiation 83:125-30) 및 폐포 모세관 기저막(Kashtan, C.E., 1998, J. Am. Soc. Nephrol. 9:1736-50)에 제한된다. 그러나 상기 사슬은 신장 맥관막, 피부의 혈관 기저막과 상피 기저막 및 간의 혈관 기저막(Kashtan, C.E., supra)에는 존재하지 않는다. 상처 치료의 과정에서, α3과 α4 사슬을 제외한 Ⅳ형 콜라겐의 α사슬들은 조립되어 새로운 모세관을 형성할 것이며, 그 이유는 이런 두 사슬들이 '기존'의 기저막, 즉 피부 맥관구조의 구성요소가 아니기 때문이다. α3(Ⅳ) 사슬은 정상적인 인간의 피부의 본래의 구성요소가아니기 때문에, 상처의 손상 치료에서 콜라겐 조립 및 혈관형성의 과정은 툼스타틴을 사용하는 치료에 의해 달라지지 않을 것이다.

α3(Ⅳ) 사슬은 인간 신장 혈관 기저막뿐만 아니라 GBM에서도 발현된다(Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8). 이런 '기존' 혈관들은 신장 세포 암종과 같은 일차적인 신장 종양의 진전과 관련되어 있는 것으로 생각된다. 툼스타틴은 다른 α사슬들과 α3(Ⅳ) 사슬의 조립에 의해 매개되는 신생혈관을 붕괴시킴으로써 일차적인 신장 종양의 치료에 효과적일 수 있다. 신장 세포 암종으로 진단된 환자의 수는 1996년도에 미국에서 약 3만명이었고(Mulders, P. et al., 1997, Cancer Res. 57:5189-95), 전이 경우에 대한 예측은 매우 바람직하지 않았다. 방사능 치료 및 화학요법의 진보에도 불구하고, 치료된 환자의 장기간 생존은 아직 현저하게 향상되지 않고 있다(Mulders, P., supra). 신장 세포 암종을 위한 중요한 치료 대안들의 부족은 신규 치료 전략 개발의 중요성을 역설한다. 이런 사실을 고려하면, 고형 종양의 신생혈관을 치료하는 것은 최근 들어 몇몇 동물 모델에서 유망한 결과들이 증명되고 있다(참조: Baillie, C.T. et al., 1995, Br. J. Cancer 72:257-67; Burrows, F.J. et al., 1994, Pharmacol. Ther. 64:155-74; Thorpe, P.E. et al., 1995, Breast Cancer REs. Treat. 36:237-51). 생체내에서 신장 세포 암종 성장을 억제시키는 툼스타틴의 효과는 상기 종양 타입에 대한 효과적인 항-혈관형성 치료로서 상기 분자의 잠재력을 증명한다.

본 발명에서, 툼스타틴은 내피 세포 증식을 특이적으로 억제시키며 시험관내에서 종양 세포주 PC-3 및 786-O의 증식에는 효과가 없다. 툼스타틴은 내피 세포이동을 억제시키지 않았지만, 시험관내에서 내피 관 형성을 현저하게 억제시켰다. 툼스타틴은 매트리겔 충전물 분석에서 생체내 신생혈관을 67% 저해하였고, 6 ㎎/㎏에서 생쥐 이종이식편 모델에서 사람 신장 세포암(786-O)세포와 전립선암(PC-3)의 종양 성장을 억제하였다. 종합적으로, 이런 결과들은 툼스타틴이 혈관형성 과정의 여러 단계들을 억제시킴으로써 새로운 혈관의 형성을 억제시킴을 보여준다.

생체내 연구에서, 툼스타틴은 매트리겔 충전물 검정에서 혈관형성을 억제시키고 생쥐 이종이식 모델에서 PC-3 종양 및 786-O의 성장을 억제시켰다. 툼스타틴이 거대한 종양의 성장을 억제시켰다는 사실은 고무적인 것이며, 특히 임상적 세팅에서의 종양의 치료를 고려할 때 그러하다.

툼스타틴은 폐출혈 및 급속 진행성 사구체신염을 특징으로 하는 자가면역 질환인 굿패스처 증후군에 대한 병원성 에피토프를 가지고 있기 때문에(Butkowski, R.J. et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:7874-77; Saus, J. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13374-80; Kalluri, R. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:24018-24), 툼스타틴의 급성 또는 만성적인 투여는 이런 자가면역 질환을 유발시킬 수 있다. 여러 연자들이 α3(Ⅳ)NC1상의 굿패스처 자가-에피토프의 위치를 확인하거나 예측하기 위하여 시도하였는데, N-말단 부분, 중간 부분, C-말단 부분이 상기 에피토프를 보유하는 것으로 보고되었다(Kalluri, R. et al., 1995, J. Am. Soc. Nephrol. 6:1178-85; Kalluri, R, et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:9062-8; Levy, J.B. et al., 1997, J. Am. Soc. Nephrol. 8:1698-1705; Quinones, S. et al., 1992,J. Biol. Chem. 267: 19780-4; Kefalides, N.A. et al., 1993, Kidney Int. 43:94-100; Netzer, K.O. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:11267-74). 최근에, 재조합 키메라 구조체를 사용함으로써 α3(Ⅳ)NC1의 N-말단에 특이적인 자가-항체의 반응성이 신장의 생존 비율과 상호관련되어 있음이 보고되었다(Hellmark, T. et al., 1999, Kidney Int. 55:936-44). 또한 N-말단 부분의 처음 40 아미노산에 대한 질병 관련 에피토프가 동정되었다. 굿패스처 증후군에 대한 에피토프를 제거시키기 위해 N-말단 53 아미노산 잔기들을 결여시킴으로써 절단된 툼스타틴을 합성하였는데, 상기 분자는 생쥐 이종이식 모델에서 786-O 종양 성장에 대해 억제 효과를 나타낸다. 또한 이 분자는 심각한 굿패스처 증후군 환자로부터의 자가-항체에 결합하지 않았다. 툼스타틴 N-53(이후, "Tum-1") 역시 내피 세포의 생존능을 현저하게 감소시켰다. 놀랍게도, 이런 효과는 전장 분자에서보다 툼스타틴 N-53(Tum-1)에서 높았다. 이런 결과들은 툼스타틴의 항-혈관형성 부위가 N-말단 53 아미노산들이 제거되었을 때에도 보존된다는 것을 시사한다.

Tum-1이외에, Tum-2, Tum-3, Tum-4를 비롯한 다른 툼스타틴 결실 변이체를 만들었다. 이들은 하기 실시예 35에서 기술한다. 전술한 바와 같이 Tum-1은 C-말단 191개 아미노산으로 구성되고 N-말단 53개 아미노산이 부재한다. "툼스타틴 333"은 툼스타틴의 N-말단 아미노산 1 내지 124로 구성된다. Tum-3은 C-말단 112개 아미노산으로 구성된다. Tum-4는 C-말단 64개 아미노산으로 구성되는데, 이는 아미노산 185-203을 포함한다(Han et aL, 1997, J Biol. Chem. 272:20395-401). 전장 툼스타틴의 아미노산 54 내지 132 영역은 Tum-5로 명명하였다. Tum-5의 발현과 용해성을 증가시키기 위하여 "툼스타틴-45-132"이라고 하는 Tum-5의 신장된 형태를만들었다. 툼스타틴-45-132는 N-말단에 9개 아미노산이 신장된 Tum-5로 구성된다. 이에 더하여, 툼스타틴-45-132의 변이체를 만들고 "Tum-5-125-C-A"로 명명하였다. 상기 변이체는 125번(전장 툼스타틴에서) 시스테인이 특정-부위 돌연변이에 의해 알라닌으로 치환된 툼스타틴-45-132 서열로 구성된다. Tum-5로부터 다른 결실 변이체를 만들었는데, 이들은 T1 및 일단의 부분적으로 중복된 펩티드(T2, T3, T4, T5, T6)로 구성되었다.

이들 변이체는 하기 표 1에 예시한다.

표 1. 재조합 툼스타틴 및 툼스타틴의 결실 변이체.

¹Tum-5-125-C-A에서, 전장 툼스타틴 분자의 125번 위치에서 시스테인이 알라닌 잔기로 치환되었다.

²T7-변이체에서, 전장 툼스타틴 분자의 77번 위치에서 루이신 잔기가 메티오닌으로, 81번 위치에서 발린이 이소루이신으로, 83번 위치에서 아스파라긴산이 아스파라긴으로 치환되었다.

³T8에서, 전장 툼스타틴 분자의 68번 위치에서 루이신 잔기가 리신으로 치환되었다.

⁴T8-3에서, 전장 툼스타틴 분자의 76번 위치에서 페닐알라닌 잔기가 리신으로, 83번 위치에서 아스파라긴산이 시스테인으로 치환되었다.

⁵TP3에서, 전장 툼스타틴 분자의 58번 위치에서 루이신 잔기가 리신으로, 79번과 85번 위치에서 시스테인 잔기가 세린으로 치환되었다.

⁶P2에서, 전장 툼스타틴 분자의 68번 위치에서 루이신 잔기가 리신으로, 79번과 85번 위치에서 시스테인 잔기가 아스파라긴으로 치환되었다.

Tum-4가 본원에 도시된 바와 같이 흑색종 세포 증식(WM-164 세포)을 저해하고 α_vβ₃수용체에 결합하긴 하지만, 상기 영역은 툼스타틴의 항-혈관형성 활성을 보이지 않는다. 대조적으로, 툼스타틴의 N-말단 절반을 보유하는 툼스타틴 결실 변이체 Tum-2는 항-혈관형성 특성을 보이긴 하지만 항-종양 세포 활성을 보이지는 않았다. 이런 이유로, 이는 일부 실험 조건하에 이들 두 활성이 분리될 수 있는 것으로 보인다.

도 34A와 35A에 도시한 바와 같이, 전장 툼스타틴과 결실 변이체 Tum-1 모두 동등한 항-혈관형성 활성을 보인다는 사실은 잔기 1-53의 영역이 이런 활성에 필요하지 않다는 것을 입증한다. 전장 툼스타틴에 비하여 상승된 Tum-1의 항-혈관형성 활성은 전장 분자와 비교하여 상기 변이체 단백질의 증가된 활성 분자수/㎍로 설명할 수 있다.

전장 툼스타틴 및 결실 변이체 Tum-1과 Tum-2 모두 항-혈관형성 활성(즉, 내피 세포 증식을 저해하고 이들의 아폽토시스를 유도한다)을 보이는 반면 Tum-3과 Tum-4는 이런 활성을 보이지 않는다는 사실은 툼스타틴의 항-혈관형성 특성이 잔기 54-132의 영역에 주로 위치한다는 것을 암시한다. 이런 활성이 잔기 132를 초과하여 일부 잔기에까지 확대될 수도 있긴 하지만, Tum-3이 항-혈관형성 특성을 보일만큼 충분한 항-혈관형성 영역을 보유하는 않는다는 점은 분명하다.

하지만, Tum-4는 WM-164 흑색종 세포(도 33B)의 성장을 저해한 반면, Tum-1과 Tum-2는 그렇지 않은데, 이는 툼스타틴의 항-종양 세포 활성이 잔기 181-244에 존재한다는 것을 암시한다. Shahan et al.(1999, Cancer Res. 59:4584-90)의 결과를 고려하면, 이런 항-종양 세포 활성은 잔기 185-203에 존재할 가능성이 높다. 항-혈관형성 분야에서 대부분의 연구가 혈액 공급을 제한하여 종양을 저해하는데 집중되고 있다는 점에서, 톰스타틴의 항-혈관형성 활성과 항-종양 세포 활성의 분리는 놀라운 결과이다.

흥미롭게도, 결실 변이체 Tum-1과 Tum-2의 항-혈관형성 활성이 툼스타틴의 항-혈관형성 활성과 동등하기 때문에 잔기 54-132 영역의 항-혈관형성 활성은 전장접힌 툼스타틴 분자에서도 유효하다. 대조적으로, Tum-4는 항-종양 세포 활성을 보이는 반면, Tum-3(Tum-4와 유사하게 잔기 185-203을 포함한다)은 그렇지 않다. 이런 이유로, 영역 185-203의 항-종양 세포 활성은 상기 영역이 전장 접힌 툼스타틴의 일부로 존재하거나 좀더 큰 툼스타틴 단편(예, Tum-3)이내에 존재한다 하더라도 무효하다. 이런 활성은 상기 영역이 분자의 절두(하기 실시예) 또는 대표적 펩티드의 합성(Han et al. 1997, J Biol. Chem. 272:20395-401)에 의해 노출될 때만 실현된다.

전장 툼스타틴의 다른 단편과 변이체 역시 항-혈관형성 활성을 보유한다. 툼스타틴-45-132는 비-내피 세포에 대한 현저한 효과없이 내피 세포의 증식을 특이적으로 저해하고 이들 세포의 아폽토시스를 유도하였다. 툼스타틴-45-132는 모 단백질로부터 64% 절두되긴 했지만 244개 아미노산의 전장 분자에 필적하는 활성을 보유한다. 툼스타틴-45-132의 항-혈관형성 효과는 매트리겔 충전물 분석으로 생체내에서 더욱 확증하였다. 툼스타틴-45-132는 1 ㎍/㎖에서 PC-3 종양을 저해하고 생쥐 이종이식편에서 신생혈관과 미세혈관 밀도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 내피 세포 표면에 비오틴화된 툼스타틴-45-132의 결합은 면역세포화학으로 확증하였다. 면역침전 실험에서, 툼스타틴-45-132는 경쟁 증식 분석에 의한 측정에서 내피 세포의 표면에서 α_vβ₃과 β₁인테그린에 결합하는 것으로 밝혀졌다.

이에 더하여, 알칼리성-환원된 툼스타틴-45-132는 조절되지 않은 툼스타틴-45-132 만큼 효과적인 것으로 밝혀졌다. 알칼리성 환원은 접힌 단백질 분자의 형태 구조를 유지하는데 중요한 역할을 수행하는 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 파괴한다. 조절되지 않은 분자와 비교하여 알칼리성-환원된 툼스타틴-45-132의 감소된 활성 부재는 툼스타틴-45-132의 시스테인 결합-매개된 형태 특성이 항-혈관형성 활성에 반드시 필요하지는 않다는 것을 시사한다. 이런 이유로, "변이체(돌연변이체)"는 환원되거나, 또는 하나이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산으로 치환되거나 완전히 결실된 툼스타틴 분자의 전부 또는 일부를 의미한다.

125번 위치(전장 분자에서)에서 시스테인 알라닌으로 돌연변이된 툼스타틴-45-132의 변이체, Tum-5-125-C-A를 만들었다. 이런 돌연변이는 단백질 발현을 강화시키고, 상기 분자는 툼스타틴-45-132보다 좀더 강하게 종양 성장을 저해한 생쥐 이종이식편 연구에서 종양 성장의 저해를 제외하고 툼스타틴-45-132와 동등한 항-혈과형성 특성을 보유한다.

이들 활성은 합성 펩티드 T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, T7-변이체, T8, T8-3, TP3, P2의 연구에 의해 더욱 정의된다. 합성 펩티드중에서, T3은 생체내 신생혈관을 저해하였다. 다른 한편, 전장 툼스타틴의 20개 N-말단 아미노산을 포함하고, 따라서 RGD 서열을 포함하는 T1 펩티드는 내피 세포 증식을 저해하지 않았다. T3은 증식성 내피 세포의 G₁정지를 유도하는 것으로 밝혀졌는데, T3 펩티드에 노출에 앞서 세포를 a_vβ₃인테그린 단백질과 함께 배양하는 경우에 이런 효과는 감소하였다. T3 펩티드는 2개의 시스테인이 이황화 결합되어 있는 지에 상관없이 내피 세포 증식을 저해하였다. 이는 툼스타틴-45-132와 유사하게 T3 펩티드의 항-혈관형성 활성이 형태 특성에 의존하지 않는다는 것을 입증한다. T3 펩티드의 활성은 몰 기준에서 툼스타틴이나 툼스타틴-45-132보다 2.5배 덜하였다. T4 펩티드는 T3과 중복되는데, T4는 내피 세포의 증식을 저해하지 않지만 이들 세포에서 a_vβ₃인테그린에 약한 결합을 보였다. 이런 이유로, T3 서열은 T4 펩티드의 첫 9개 잔기로 신장시키고, 새로운 펩티드 서열은 "T7"로 명명하였다.

T7 펩티드는 동몰 농도에서 T3보다는 높고 툼스타틴과 툼스타틴-45-132와 유사한 수준의 활성을 보였다. 툼스타틴, 툼스타틴-45-132, T7 펩티드는 1 μM의 ED₅₀으로 항-증식 효과를 보인 반면, T3 펩티드는 2.5 μM의 ED₅₀을 보였다. 이들 결과는 T4 펩티드의 첫 9개 아미노산이 자체로서는 항-혈관형성 활성을 보이지 않지만, α_vβ₃인테그린에 툼스타틴의 결합에 기여하고, 이들 분자간 좀더 효과적인 상호작용을 촉진하고 최대 항-혈관형성 활성을 달성하는데 조력한다는 것을 시사한다.

흥미롭게도, T7 서열의 아미노산 8-29 역시 종양 세포 저해 활성을 보이는 영역인 C-말단의 아미노산 187-207에 일부 상동성(50% 동일성)을 보인다.

다수의 다른 펩티드와 변이체를 합성하고 암의 생체내 동물 모델에서 활성을 검사하였다. 이들 펩티드는 상기 표 1에 기재하고, 툼스타틴 서열과 이들의 정렬은아래에 도시한다. 툼스타틴 서열과 구별되는 아미노산 잔기는 소문자로 표시한다.

툼스타틴 펩티드 T7은 서열에 변화가 없는 전장 툼스타틴의 단편이다. 펩티드 T7-변이체는 T7 서열에 기초하지만, 전장 툼스타틴의 71번, 81번, 83번 위치에서 루이신, 발린, 아스파라긴산이 각각 메티오닌, 이소루이신, 아스파라긴으로 치환된다. 펩티드 T8은 전장 툼스타틴의 68번 위치에서 루이신이 리신으로 치환된다. T8-3은 추가로 2개 치환을 보유하는데, 여기서 전장 툼스타틴의 79번과 85번 위치에서 시스테인 잔기가 세린으로 치환된다. 펩티드 TP3은 전장 툼스타틴의 83번 위치에서 아스파라긴산이 시스테인으로 치환된다. 펩티드 P2는 T8-3과 유사하지만 전장 툼스타틴의 68번 위치에서 루이신이 리신으로, 79번과 85번 위치에서 시스테인이 아스파라긴산으로 치환된다.

생체내 생쥐 종양 모델에서, 펩티드 T8은 독성을 보이지 않았고, MDAMB-435 동소성 사람 유방 종양 이종이식편에서 종양 성장을 저해하였다. 저해는 1 ㎎/㎏에서 28% 이상, 2.5 ㎎/㎏에서 거의 49%이었다. 흥미롭게도, 5 ㎎/㎏의 일일 용량에서 저해는 31%이지만, 동일 용량(5 ㎎/㎏)이 주 2회 투여되면 저해는 41% 이상이었다. 동일한 종양 모델에서 펩티드 TP3은 1 ㎎/㎏ 용량으로 매일 투여되면 30% 이상, 5 ㎎/㎏ 용량으로 매일 투여되면 50% 저해를 보였다. 다른 실험에서, T8과 T8-3은 5 ㎎/㎏ 용량으로 투여되는 경우에 종양 성장을 각각 50.5%와 41.9% 저해하였고, T8-3은 1 ㎎/㎏ 용량에서 무효하였다. 펩티드 P2는 상기 암 모델에서 종양 성장을 1 ㎎/㎏ 용량에서 26.4%, 5 ㎎/㎏ 용량에서 15.9% 저해하였다.

T7, T8, TP3 및 대조 스크램블드 펩티드 SP1과 SP2가 매일 투여되는 PC-3 사람 전립선 종양 이종이식편 모델에서, T8, T7, TP3은 5 ㎎/㎏ 용량에서 PC3 종양 성장을 각각 45%, 66.8%, 53.2% 저해하였다. SP1과 SP2는 성장을 31.7%와 18.7% 저해하였다. T8은 주 1회 5 ㎎/㎏ 용량으로 투여되는 경우에 종양 성장을 39.5% 저해하였지만, 주 2회 투여되면 단지 8.1% 저해하였는데, 이는 MDAMB-435 모델에서 결과와 일치한다. 다른 실험에서, T8과 T8-3 펩티드 둘 모두 5 ㎎/㎏ 용량에서 종양 성장을 35.4% 저해하였는데, 이는 79번과 85번 위치에서 시스테인이 이런 생물학적활성에 요구되는 2차 구조를 제공하지 않는다는 것을 입증한다. PC3 모델 및 MDAMB-435 모델에서 좀더 적은 용량에서 좀더 효과적인 것으로 입증된 P2는 1과 5 ㎎/㎏ 용량에서 종양 성장을 각각 31.6%와 15.9% 저해하였다.

본원에 도시된 바와 같이, 툼스타틴 펩티드-유도된 아폽토시스는 캡-의존성 단백질 번역의 조절에 관여하는 효소인 카스파제-3의 증가와 연관한다(Maeshima, Y. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:23745-50; Maeshirna, Y. et al., 2001, J Biol. Chem. 276:31959-68; Maeshima, Y. et al., 2001, J Biol. Chem. 276:15240-8; Bushell, M. et al., 1999, FEBS Lett. 451: 332-336). 인테그린 β₃-결핍 생쥐로부터 얻은 세포를 이용한 결과(참조: 실시예 52-55)는 단백질 합성에 대한 다양한 툼스타틴 펩티드의 저해 효과가 내피 세포에서 α_vβ₃인테그린을 통하여 매개된다는 것을 보여준다. 툼스타틴 펩티드는 라파마이신과 유사하게, α_vβ₃인테그린과의 상호작용을 통하여 FAK, PI-3 키나아제, AKT, mTOR의 활성화를 저해하고 eIF4E/4E-BP1 복합체의 분리를 예방하여 내피 세포에서 캡-의존성 단백질 번역을 저해한다; 하지만, 이런 효과는 다른 매트릭스-유래된 혈관형성 저해물질인 엔도스타틴에서는 관찰되지 않는다. 이는 캡-의존성 단백질 합성의 세포-특이적 저해를 매개하는데 있어 인테그린의 신규한 역할을 뒷받침한다. 이런 이유로, 툼스타틴 및 관련된 단백질은 캡-의존성 단백질 합성의 α_vβ₃인테그린-의존성 내피 세포-특이적 저해물질이다.

활성이 펩티드와 단백질의 3차 구조 또는 형태에 의존하지 않기 때문에, 제약학적 목적으로 이들 펩티드와 단백질의 가공이 용이하다. 가령, 접힌 T3 펩티드와 접히지 않은 T3 펩티드, 또는 환원되고 알킬화된 툼스타틴-45-132와 환원되지 않고 알킬화되지 않은 툼스타틴-45-132의 활성에서 차이가 없기 때문에 어떤 종류의 단백질 또는 펩티드를 사용하더라도 환자에 부작용이 적으며 일정한 발현계에서 좀더 높은 수준으로 발현되거나 좀더 가용성이다. 이에 더하여, 작은 크기의 활성 서열은 발현, 용해성, 부작용 등의 조직을 위한 측면에 접하는 서열의 부가를 가능하게 한다.

이런 이유로, 본 발명의 단백질과 펩티드는 다양한 제약학적 특징을 개선하거나 변화시키기 위하여 수정될 수 있다, 예를 들면 분자에 바람직한 특성을 부여하거나 원치않는 특성을 제거하기 위하여 전체 펩티드 또는 단백질 서열에 추가의 아미노산 서열을 통합시킬 수 있다. 가령, 짧은 펩티드 서열은 중량 기준에서 효능을 증가시키긴 하지만, 효과 반감기를 감소시킬 수도 있다. 예로써 수정으로 이들 펩티드 또는 단백질의 생물학적 반감기(예, 혈청 반감기)를 증가시키는 것이 바람직하다. 단백질의 반감기를 증가시키는 다양한 방법이 당분야에 널리 알려져 있는데, 여기에는 폴리에틸렌글리콜 부분에 단백질의 공액, 즉 PEG화(참조: U.S. Pat. Nos. 4,179,337; 5,166,322; 5,206,344; Nucci et al., 1991, Adv. DrugDelivery Rev. 4:133-51) 및 덱스트란에 상기 단백질의 공액(Maksimenko, 1986, Bull. Exp. Biol. Med. (Russian) 52:567-9)이 포함된다.

항-혈관형성과 항-종양 세포 활성은 굿패스처 에피토프 영역의 외부에 존재한다. α3(Ⅳ)NC1 도메인의 "비-굿패스처 단편"은 포유동물 Ⅳ형 콜라겐의 α3 사슬의 NC1 도메인의 아미노산 서열의 단편(예, 47개 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드) 또는 일부를 의미하는데, 여기서 상기 단편은 굿패스처 자가-에피토프를 포함하지 않는다. 최근에, 자가-항체는 α3(Ⅳ)NC1의 N-말단에만 반응하는 것으로 보고되었다.

항-혈관형성 및 항-종양 세포 영역은 고전적인 "RGD"(Arg-Gly-Asp) 결합 부우를 보유하지 않기 때문에, 이들 두 영역은 RGD-독립된 기전을 통하여 리간드에 결합한다. 인테그린 또는 인테그린 아단위에 결합하는 단편(예, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드)의 능력이 "RGD-독립"한다고 말하는 것은 상기 단편이 펩티드 서열 "RGD"(Arg-Gly-Asp)를 포함하지 않음에도 불구하고 인테그린 또는 인테그린 아단위에 결합할 수 있음을 의미한다. 단편(예, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드)이 "α_vβ₃인테그린에 결합하는 능력"을 보유한다고 말하는 것은 상기 단편이 이런 인테그린 또는 이의 아단위(즉, α_v및/또는 β₃)에 결합할 수 있거나 이런 인테그린 또는 이의 아단위에 대한 항체로 사전-처리가 상기 인테그린 및/또는 이의 아단위에 상기 단편의 결합을 저해할 수 있음을 의미한다(예로써 하기 실시예 12 또는 28에 제시된 방법에 의한 측정에서).

이들 유사성에 비추어, (1) 항-혈관형성 영역이 내피 세포 증식을 저해하는 반면, 항-종양 세포 영역은 그렇지 않고, (2) 항-혈관형성 영역이 종양 세포를 저해하지 못하는 반면, 항-종양 세포 영역은 이런 세포를 저해한다는 점은 놀라운 결과이다.

단편(예, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드)이 "종양 세포 증식을 저해하지 못하거나"또는"종양 세포 증식을 저해하는 능력이 부재한다고"말하는 것은 상기 단편이 종양 세포(예, 배양된 흑색종 세포, 특히 WM-164 세포)의 증식을 예방하지 못한다는 것을 의미한다. 검사 방법은 하기 실시예, 예를 들면 실시예 36, 37, 38에 제시한다. 유사하게, 단편(예, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드)이 "종양 세포 증식을 저해하는 능력"을 보유한다고 말하는 것은 상기 단편이 종양 세포(예, 배양된 흑색종 세포, 특히 WM-164 세포)의 증식을 예방한다는 것을 의미한다. 이런 능력을검사하는 방법은 하기 실시예, 예를 들면 실시예 36, 37, 38에 제시한다.

단편(예, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드)이 "내피 세포의 증식을 저해하지 못하거나"또는"내피 세포의 증식을 저해하는 능력이 부재한다고"말하는 것은 상기 단편이 내피 세포(예, 배양된 C-PAE 세포)의 증식을 예방하지 못한다는 것을 의미한다. 이런 무능력을 검사하는 방법은 하기 실시예, 예를 들면 실시예 5, 6, 7, 26, 34, 36, 38에 제시한다.

단편(예, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드)이 "내피 세포에 결합하는 능력"을 보유한다고 말하는 것은 상기 단편이 내피 세포(예, C-PAE 세포)에 결합한다는 것을 의미한다. 이런 능력을 검사하는 방법은 하기 실시예, 예를 들면 실시예 26, 28, 37에 제시한다.

항-혈관형성 활성 또는 항-종양 세포 활성에 요구되는 정확한 최소 길이를 더욱 구체화하는데 하기 실시예에 기술된 추가의 결실 변이체를 만드는 방법을 이용하는 것은 어렵지 않다. 원하는 활성을 보이는 최소한의 분자가 원하는 활성에 불필요한 아미노산을 포함하는 좀더 큰 분자보다 중량 기준에서 좀더 강력하기 때문에 이런 노력은 매우 유익하다.

툼스타틴에 의한 내피 세포 증식의 특이적인 억제는 툼스타틴이 세포 표면 단백질/수용체를 통해 기능할 수 있음을 강력히 시사하는 것이다. 또한 혈관형성은 인테그린 a_vβ₃에 의해 매개되는 특이적인 내피 세포 부착 사건에 의존한다(Brooks, P.C. et al., 1994, Cell 79:1157-64). 세포 부착 분석에서 툼스타틴은 a_vβ₃과 a₆β₁인테그린을 통하여 내피 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 툼스타틴의 항-증식 효과는 가용성 a_vβ₃인테그린 단백질에 의해 부분적으로 회복되었다. 툼스타틴은 매트릭스 구성요소와 증식하는 내피 세포의 상호작용을 교란시킴으로써 내피 세포들이 세포자멸(apoptosis)을 개시하도록 이끌 수 있다(Re, F. et al., 1994, J. Cell. Biol. 127:537-46). 매트릭스 금속단백질분해효소들(MMP)은 종양에서 새로운 혈관의 형성을 조절하는 핵심 효소로서 관련되어 있다(참조: Ray, J.M. et al., 1994, Eur. Respir. J. 7:2062-72). 최근에, MMP-2(PEX)의 억제제가 혈관형성을 억제시킴으로써 종양 성장을 억제시킬 수 있음이 증명되었다(Brooks, P.C. et al., Cell 92:391-400). 툼스타틴은 MMP의 활성을 억제시킴으로써 기능할 수 있다.

Petitclerc et al.(2000, J Biol. Chem. 275:8051-61)에서는 α3(Ⅳ)NC1이 α_vβ₃인테그린을 통하여 내피 세포에 결합한다는 것을 입증하긴 했지만 이런 결합이 α3(Ⅳ)NC1 도메인의 N-말단에 존재하는 RGD 서열을 통하여 이루어진다고 추정하였다. 하지만, RGD 서열은 도메인의 일부가 아니고 삼중 나선 영역으로부터 유래되며 Neilson et al.(1993, J Biol. Chem. 268:8402-5)에 의해 기술된 초기 클론에 포함된다. Petitclerc 등은 상기 클론을 이용하여 293 태아 신장 세포에서 α3(Ⅳ)NC1을 재조합 발현시켰다. 특정 부위 돌연변이유발로 상기 서열을 제거하면 α_vβ₃결합 부위가 보존되는데, 이는 RGD-독립성 결합 기전을 시사한다.

Shahan et al.(1999, Cancer Res. 59:4584-90)에서는 잔기 185-203을 α_vβ₃인테그린에 대한 리간드로 확인하고 이런 상호작용이 연관된 항-종양 세포 특성에 중요하다고 추정하였다. 상기 펩티드 도메인은 HT-144 흑색종 세포에서 RGD 인식 부위와 구별되는 β₃인테그린 아단위에 결합하는 것으로 확인되었다(Pasco, S. et al., 2000, J Biol. Chem. 275.32999-3007). 하기 실시예 37과 38에서는 툼스타틴의 54-132 잔기 영역이내에 별도의 RGD-독립성 α_vβ₃(α_vβ₅또는 β₁아님) 인테그린 결합 부위를 보인다. 이런 이차 부위는 종양 세포 증식의 저해에는 필요하지 않지만 항-혈관형성 활성에 요구된다. Tum-2는 내피 세포와 흑색종 세포 모두에 결합하지만 내피 세포의 증식만 저해하고 종양 세포 증식에는 별다른 영향을 주지 않는다. 잔기 185-203을 포함하는 Tum-4는 내피 세포와 흑색종 세포 모두에 결합하지만 흑색종 세포의 증식만 저해한다. 양 인테그린 결합 부위에서, 가용성 α_vβ₃단백질로 경쟁 분석은 항-증식 활성을 반전시키는데 충분하다. 이는 툼스타틴에서 이들 2가지 별개의 RGD-독립성 α_vβ₃결합 부위가 아마도 별개의 α_vβ₃인테그린-매개된 기전을 통하여 2가지 독립된 항-종양 활성을 매개한다는 것을 암시한다. 이런 결과는 α_vβ₃과 α₆β₁인테그린이 툼스타틴에 결합하고 α_vβ₃결합이 RGD-독립한다는 것을 입증한다.

세포 부착 분석에 결실 변이체를 이용하여 인테그린 결합 부위를 탐지하였다. 툼스타틴의 N-말단 부분에, 삼중-나선 비-콜라겐 부분으로부터 유래된 RGD 서열(아미노산 잔기 7-9)이 존재한다. RGD는 α_vβ₃수용체에 대한 결합 부위이다. 하지만, 이런 서열이 부재하는 Tum-1은 α_vβ₃인테그린에 여전히 결합한다. 이런 이유로, 상기 결합 부위는 185-203 영역에서처럼 RGD 독립하였다. α_vβ₃결합 부위에 부분적으로 결합하는 것으로 밝혀진 상기 영역에 대한 항체(예, 항-Tum-4 항체)는 Tum-1이 α_vβ₃수용체에 결합하는 것을 차단하지 않고, Tum-1의 항-증식 효과 역시 영향을 받지 않는다. 게다가, C-말단 α_vβ₃결합 부위(잔기 185-203)를 포함하지 않는 Tum-2(잔기 1-132)는 세포 유착 분석에서 α_vβ₃에 결합하고 내피 세포 증식을 저해하는 것으로 밝혀졌다(실시예 38). 툼스타틴 또는 Tum-2를 α_vβ₃단백질과 함께 배양하여 내피 세포막에 α_vβ₃수용체를 포화시키면, 툼스타틴의 항-증식 효과가 현저하게 감소하였다(43-74%). 툼스타틴에 대한 가용성 α_vβ₃수용체의 친화성이 막-결합된 α_vβ₃과 비교하여 훨씬 약하고 무효하다는 점을 고려하면, 이는 놀라운 결과이다. 이런 결과는 α_vβ₃결합 부위가 아미노산 54-132이내에 위치한다는 것을 입증한다,

툼스타틴의 항-혈관형성 활성이 α_vβ₃에 의해 매개된다는 결과는 VEGF가 내피 세포에서 α_vβ₃의 발현을 상향 조절한다는 생각과 일치한다(Senger et al., 1996, Am. J Pathol. 149:293-305; Suzurne et al., 1998, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39:1028-35). 혈관형성이 α_vβ₃인테그린에 의해 매개되는 특이적인 내피 세포 부착 현상에 의존하기 때문에(Brooks et al., 1994, Science 264:569-71; Brooks et al., 1994, Cell 79:1157-83), 툼스타틴의 항-혈관형성 효과는 매트릭스 구성요소, 예를 들면 중요한 항-아폽토시스 신호로 간주되는 비트로넥틴과 피브로넥틴에 증식성 내피 세포의 상호작용을 파괴함으로써 매개되는 것으로 생각된다.

제 2 RGD-독립성 부위와 185-203 부위는 내피와 흑색종 세포에서 α_vβ₃인테그린에 결합하긴 하지만, 아미노산 수준에서 현저한 상동성을 보이지 않는다. α_vβ₃인테그린이 잔기 185-203에 결합하긴 하지만, 내피 세포 증식의 저해는 관찰되지 않았다.

툼스타틴은 시험관내 및 생체내에서 혈관형성을 억제시킴으로써 종양 진행을 억제시킨다. 또한 환자에게 이런 방법을 적용시키기 위해선, 전신 투여에 의한 툼스타틴의 잠재적 독성 또는 부작용이 고려되어야만 한다. 툼스타틴의 분포가 제한되어 있고 피부 기저막에는 대부분 부재한다는 사실은 툼스타틴 치료에 의한 부작용의 낮음을 가능성이 시사한다. 또한, 신장과 같은 제한된 기관의 혈관 기저막에서의 툼스타틴의 존재는 제한된 기관들에서 증가하는 종양을 표적화하는데 있어서 이의 잠재적인 독특한 장점을 시사한다. 궁극적으로 유전자 이동 접근방법을 활용하여 종양 맥관구조에서 생체내에서 툼스타틴 유전자를 발현시키기 위한 또 다른 방법을 개발하는 것이 바람직하다(Kashihara, N. et al., 1997, Exp. Nephrol. 5:126-31; Maeshima, Y. et al., 1996, J. Am. Soc. Nephrol. 7:2219-29; Maeshima, T. et al., 1998, J. Clin. Invest. 101:2589-97).

α3(Ⅳ) 사슬의 분포는 선택된 기관의 기저막에 제한되어 있으며, 따라서 툼스타틴은 α사슬들의 조립을 억제시킴으로써 이 분자의 가능한 메커니즘을 고려할 때 유해성이 낮을 것으로 생각된다. 또한 α3(Ⅳ) 사슬은 신장의 혈관 기저막에서 관찰되는데(참조: Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8), 이들 혈관은 신장 세포 암종과 같은 일차적인신장 종양의 진행과 관련되어 있다고 생각된다. 이런 이유로, 툼스타틴은 다른 α사슬들과 α3(Ⅳ) 사슬의 조립을 붕괴시킴으로써 상기 종양의 치료에 효과적일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "혈관형성"은 조직 또는 기관내 새로운 혈관의 생성을 의미하며, 내피 세포 증식과 관련되어 있다. 정상적인 생리적 조건하에서, 인간 또는 동물들은 매우 특이적인 제한된 상황에서만 혈관형성을 개시한다. 예를 들어, 혈관형성은 정상적으로 상처 치료, 태아 및 배의 발달, 및 황체, 자궁내막 및 태반의 형성에서 관찰된다. 용어 "내피"는 장막강, 림프관 및 혈관에 정렬하고 있는 평평한 상피 세포의 얇은 층을 의미한다. 이런 이유로, "항-혈관형성 활성"이란 혈관의 성장을 억제시키는 조성물의 능력을 말한다. 혈관의 성장은 일련의 복잡한 사건이며, 개별적인 내피 세포 아래에 있는 기저막의 국소적인 파괴, 이들 세포의 증식, 차후 혈관의 위치로의 세포의 이동, 새로운 혈관막을 형성하기 위한 세포의 재구성, 내피 세포 증식의 정지 및 새로운 혈관벽을 지지하는 혈관주위세포와 다른 세포들의 결합과 관련되어 있다. 이런 이유로, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "항-혈관형성 활성"은 새로운 혈관의 형성이 억제되는 최종 결과를 수반하는 상기 단계들 중 어떤 것 또는 전부의 차단을 포함한다.

항-혈관형성 활성은 내피 억제 활성과 관련될 수 있으며, 이는 일반적으로 혈관형성을 억제시키는, 예컨대, 섬유아세포 성장 인자, 혈관형성 관련 인자 또는 다른 공지된 성장 인자들의 존재하에 배양액중의 소 모세관 내피 세포의 성장 또는 이동을 억제시키는 조성물의 능력을 말한다. "성장 인자"는 세포의 성장, 생식 또는 합성 활성을 자극하는 조성물이다. "혈관형성 관련 인자"는 형관형성을 억제시키거나 촉진시키는 인자이다. 혈관형성 관련 인자의 예에는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 같은 혈관형성 성장 인자가 있으며, 상기 인자는 혈관형성 촉진제이다. 혈관형성 관련 인자의 또 다른 예에는 예컨대, 앤지오스타틴(예컨대, 미국 특허 제 5,801,012호, 미국 특허 제 5,837,682호, 미국 특허 제 5,733,876호, 미국 특허 제 5,776,704, 미국 특허 제 5,639,725호, 미국 특허 제 5,792,845호, WO 96/35774호, WO 95/29242호, WO 96/41194호, WO 97/23500호) 또는 엔도스타틴(예컨대, WO 97/15666호 참조)과 같은 혈관형성 억제 인자가 있다.

"실질적으로 동일한 생물학적 활성" 또는 "실질적으로 동일하거나 우수한 생물학적 활성"이란 조성물이 항-혈관형성 활성을 가지며, 표준 검정에서 결정된 바와 같이, 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴과 유사하게 작용함을 의미한다. "표준 검정"에는 항-혈관형성 활성, 세포 주기 정지 및 세포자멸을 평가하기 위해 분자생물학 분야에서 사용되는 프로토콜들이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이런 검정에는 내피 세포 증식, 내피 세포 이동, 세포 주기 분석 및 내피 세포 관 형성, 예컨대, 세포자멸 세포 형태학 또는 아넥신 V-FITC 검정, 융모요막(CAM) 검정 및 누드 생쥐에서 신장 암 종양 성장의 억제에 의한 세포자멸의 탐지에 대한 검정이포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 검정들은 하기 실시예에 제공되어 있다.

"아레스텐"(또는 "아레스틴")에는 아레스텐 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 아미노산 서열의 대립형질 변형체뿐만 아니라 다른 포유동물로부터의 아레스텐, 및 아레스텐 아미노산 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체가 포함된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "칸스타틴"에는 칸스타틴 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 아미노산 서열의 대립형질 변형체뿐만 아니라 다른 포유동물로부터의 칸스타틴, 및 칸스타틴 아미노산 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체가 포함된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "툼스타틴"에는 툼스타틴 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 아미노산 서열의 대립형질 변형체뿐만 아니라 다른 포유동물로부터의 툼스타틴, 및 툼스타틴 아미노산 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체가 포함된다.

본 발명이 내피 억제 활성(예컨대, 일반적으로 혈관형성을 억제시키는, 예컨대, 섬유아세포 성장 인자, 혈관형성 관련 인자 또는 다른 공지된 성장 인자들의 존재하에 배양액중의 소 모세관 내피 세포의 성장 또는 이동을 억제시키는 조성물의 능력)을 가진 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 어떤 유도체들을 포함시키고자 하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 단백질, 이들 단백질의 유도체 및 이들 단백질의 생물학적으로 활성인 단편들 전체를 포함한다. 상기 단백질들은 아미노산 치환기 또는 아미노산 작용기에 부착된 당 또는 다른 분자들을 가지고 있는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 활성을 가진 단백질들이다.

또한 본 발명은 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴의 단편, 돌연변이체, 동족체 및 유사체를 설명한다. 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 "단편"은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 분자보다 짧은 아미노산 서열로서 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드의 적어도 25개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 또한 이런 분자들은 클로닝의 과정으로부터 유래된 추가적인 아미노산, 예컨대, 완전하거나 부분적인 링커 서열에 상응하는 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에 의해 포함되기 위해서, 상기 추가적인 아미노산 잔기들을 가지거나 가지지 않은 상기 돌연변이체들은 참조 폴리펩티드의 천연 또는 전장 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가져야만 한다.

단백질의 "단편"은 전장 폴리펩티드의 12개 이상 연속 아미노산으로 구성되는 상기 단백질보다 짧은 임의의 서열이다. 대안으로, 이런 단편은 전장 폴리펩티드의 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 연속 아미노산으로 구성되다. 상기 단편은 전장 폴리펩티드의 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75개 연속 아미노산으로 구성된다. 이런 분자는 클로닝 과정에서 유래된 추가의 아미노산, 예를 들면 전체 또는 부분 링커 서열에 상응하는 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

이런 단편은 아래의 화학식에 기초하여, 툼스타틴 서열에 기초한 일반적인 활성 펩티드를 생산할 수 있다. 아미노산 60개 내지 100개의 툼스타틴 서열은 활성 툼스타틴 펩티드와 함께 정렬하여 아래에 제시한다. 서열에서 공통 잔기는 대문자로 표시한다.

이런 이유로, 상기 화학식에 기초한 펩티드를 만들고 본원에서 밝힌 바와 같이 항-혈관형성 특성을 검사할 수 있다. 가령, 아미노산 F 또는 K; LF; C, S 또는 D; NVN; D 또는 C; V; C, S 또는 D; NF의 순서로 배열된 펩티드를 만들 수 있다. 이런 화학식에서 총 36개의 서로 다른 단백질을 만들어지는데, 이들은 본원에서 밝힌 다양한 분석법으로 검사할 수 있다.

다른 단편 역시 만들 수 있다. "툼스타틴 N-53"으로 표기한 하나의 이런 단편은 표준 검정에 의해 결정된 바와 같이 전장 툼스타틴의 활성과 동등한 항-혈관형성 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 툼스타틴 N-53은 N-말단 53 아미노산이 결실된 툼스타틴 분자를 포함한다. 본 명세서에 기술된 다른 돌연변이체 단편들은 본 명세서에 기술된 검정에 의해 제시된 바와 같이, 매우 높은 수준의 항-혈관형성 활성을 가진 것으로 밝혀졌다. 이들 단편 "툼스타틴 333", "툼스타틴 334", "12 kDa 아레스텐 단편", "8 kDa 아레스텐 단편" 및 "10 kDa 칸스타틴 단편"은 각각 75 ng/㎖, 20 ng/㎖, 50 ng/㎖, 50 ng/㎖ 및 80 ng/㎖의 ED₅₀값을 가진다. 대조적으로, 전장 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴은 각각 400 ng/㎖, 400 ng/㎖ 및 550 ng/㎖의 ED₅₀값을 가지는 것으로 밝혀졌다. 툼스타틴 333은 SEQ ID NO:10의 아미노산 2 내지 125를 포함하며, 툼스타틴 334는 SEQ ID NO:10의 아미노산 126 내지 245를 포함한다.

아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 "돌연변이체"는 동등한 참조 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 서열에 어떤 변화를 포함하고 있는 폴리펩티드를 의미한다. 이런 변화들은 자발적으로 또는 인간에 의한 조작에 의해, 화학 에너지(예컨대, X-레이)에 의해, 또는 다른 형태의 화학적 돌연변이유발에 의해, 또는 유전자 조작에 의해, 또는 유전 정보의 메이팅(mating) 또는 다른 형태의 교환의 결과로서 일어날 수 있다. 돌연변이는 예컨대, 염기 변화, 결실, 삽입, 역위, 전좌 또는 중복을 포함한다. 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 돌연변이체 형태는 동등한 참조 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리뉴클레오티드에 비해 증가되거나 감소된 항-혈관형성 활성을 나타낼 수 있으며, 또한 이런 돌연변이들은 클로닝의 과정으로부터 유래된 추가적인 아미노산, 예컨대, 완전하거나 부분적인 링커 서열에 상응하는 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 항-혈관형성 단백질들의 돌연변이체/단편들은 PCR 클로닝에 의해 생성될 수 있다. "툼스타틴 333" 및 "툼스타틴 334"로 표기된 단편들을 이런 방법으로 생성시켰으며, 이들은 하기 실시예 18에 기술되고 도 23 및 도 24에 제시된 바와 같이, 전장 툼스타틴의 활성보다 우수한 항-혈관형성 활성을 가지고 있다. 상기 단편들을 제조하기 위해, 각 프라이머의 세트로 전체 단백질로부터 공지된 하위서열을 증폭시키는 방식으로 공지된 서열로부터 PCR 프라이머들을 디자인하였다. 그 다음, 이 하위서열들을 pET22b 벡터와 같은 적절한 발현 벡터내로 클로닝하고, 발현된 단백질을 하기 검정에 기술된 바와 같이 이의 항-혈관형성 활성에 대해 시험하였다.

또한 본 발명의 항-혈관형성 단백질들의 돌연변이체/단편들은 마리야마, 엠.(Mariyama, M.) 등의 문헌(1992, J. Biol. Chem. 267:1253-8) 및 하기 실시예 24에 기술된 바와 같이, 슈도모나스 엘라스타제 분해에 의해 생성될 수 있다. 이 방법을 사용하여 12 kDa 및 8 kDa 아레스틴 돌연변이체 및 10 kDa 칸스타틴 돌연변이체를 생성시켰고, 상기 3가지 단백질 모두 본래의 전장 단백질들보다 높은 수준의 항-혈관형성 활성을 가지고 있었다.

아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 "유사체"는 아레스텐, 칸스타틴 또는툼스타틴 분자 또는 이들의 단편 또는 대립형질 변형체와 실질적으로 유사한 비천연 분자를 의미하며, 이들은 실질적으로 동일하거나 우수한 생물학적 활성을 가지고 있다. 이 유사체들에 생물학적으로 활성인 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 유도체(예컨대, 상기 정의한 바와 같은 화학적 유도체)뿐만 아니라 이의 단편, 돌연변이체, 동족체 및 대립형질 변형체를 포함시키고자 하며, 이 유도체들은 개질되지 않은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드, 단편, 돌연변이체, 동족체 또는 대립형질 변형체의 효과와 질적으로 동일한 촉진제 또는 길항제 효과를 나타낸다.

아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 "대립형질"은 참조 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 비교하여 천연적으로 발생하는 서열 변화를 포함하는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 "대립형질"은 참조 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴 폴리펩티드를 인코딩하는 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 서열 변화를 포함하는 폴리펩티드를 의미하며, 여기서 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 대립형질은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드의 대립형질 형태를 인코딩하고 있다.

제공된 폴리펩티드는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 단편, 돌연변이체, 유사체 또는 대립형질 변형체이거나, 2가지 이상의 이런 것들, 예컨대, 폴리펩티드는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드의 유사체 및 돌연변이체 둘 모두일 가능성이 있다. 예를 들어, 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 분자의 짧아진 단백질(예컨대, 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 단편)은 실험실에서 생성될 수 있다. 그 다음, 이 단편이 본 기술 분야에 공지된 수단을 통해 돌연변이 된다면, 분자는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 단편 및 돌연변이체 둘 모두로 생성될 수 있다. 또 다른 예에서, 돌연변이체는 생성될 수 있으며, 이것은 나중에 일부 포유류 개체에서 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 대립형질 형태로서 존재하는 것으로 발견되었다. 이런 이유로, 이런 돌연변이체 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 분자는 돌연변이체 및 대립형질 변형체 둘 모두일 것이다. 단편, 돌연변이체, 대립형질 변형체 및 유사체들의 이런 조합을 본 발명에 포함시키고자 한다.

가령, 하기 실시예 18에 기술한 대장균 발현 클로닝 방법에 의해 제조된 툼스타틴은 단량체이다. 또한 대장균 발현 클로닝 방법은 본래의 단백질에는 존재하지 않는 폴리링커 서열 및 히스티딘 태그를 발현된 단백질에 추가시키기 때문에 상기 툼스타틴은 융합 또는 키메라 단백질이다. 또한 실시예 18에 기술한 툼스타틴 단편 "툼스타틴 N-53"은 전장 툼스타틴 단백질의 단편 및 결실 돌연변이체이며, 동일한 대장균 발현 클로닝 방법에 의해 제조될 때는 이것에 추가된 추가적인 서열을 가지며, 따라서 전장 툼스타틴 단백질의 융합 또는 키메라 돌연변이체 단편이기도 하다. 예컨대, 이량체, 삼량체 등으로 서로 결합될 때, 이 툼스타틴 N-53의 아단위은 툼스타틴 단백질의 키메라 돌연변이체 단편의 다량체 융합체를 생성시킬 것이다.

본 발명에 의해 포함되는 것은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 핵산 서열을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드이다. "실질적으로 동일한 서열"은 참조 서열, 예컨대, 또 다른 핵산 또는 폴리펩티드와 적어도 약 70% 서열 동일성, 전형적으로는 참조 서열과 적어도 약 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 가장 바람직하게는 참조 서열과 적어도 약 97% 서열 동일성을 보여주는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다. 서열들에 대해 비교 길이는 일반적으로는 적어도 75 뉴클레오티드 염기 또는 25 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 150 뉴클레오티드 염기 또는 50 아미노산, 가장 바람직하게는 243-264 뉴클레오티드 염기 또는 81-88 아미노산일 것이다. 본 명세서에 사용된 "폴리펩티드"는 아미노산의 분자 사슬을 가리키며 특정한 길이의 생성물을 말하는 것이 아니다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의내에 포함된다. 또한 이 용어에는 예컨대, 당부가, 아세틸화, 인산화 등과 같은 후발현 개질된 폴리펩티드를 포함시키고자 한다.

본 명세서에 사용된 "서열 동일성"은 2개의 중합 분자, 예컨대, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드사이의 아단위 서열 유사성을 말한다. 2개의 분자 모두의 아단위 위치가 동일한 단량체 아단위으로 채워질 때, 예컨대, 2개의 펩티드 각각의 위치가 세린으로 점유되어 있으면, 이들은 이 위치에서 동일한 것이다. 2개의 서열간의 동일성은 일치하거나 동일한 위치의 수의 직접적인 함수이다[예컨대, 2개의 펩티드나 화합물 서열에서 이들 위치의 절반(예컨대, 10 아단위 길이의 중합체에서 5개 위치)이 동일하다면, 2개의 서열은 50% 동일한 것이고 만일 위치들의 90%(예컨대, 10개중 9개가 일치)가 동일하다면, 2개의 서열은 90% 서열 동일성을 공유하는 것이다]. 예로써, 아미노산 서열 R₂R₅R₇R₁₀R₆R₃과 R₉R₈R₁R₁₀R₆R₃은 6개 위치중 3개를 공통적으로 가지며, 따라서 50% 서열 동일성을 공유하는 반면, 서열 R₂R₅R₇R₁₀R₆R₃과 R₈R₁R₁₀R₆R₃은 5개 위치중 3개를 공통적으로 가지며, 따라서 60% 서열 동일성을 공유한다. 2가지 서열간의 동일성은 일치하거나 동일한 위치들의 수의 직접적인 함수이다. 따라서, 참조 서열의 일부가 특정한 펩티드에서 결실된 경우, 이 결실된 부분은 서열 동일성 계산에 포함되지 않는다(예컨대, R₂R₅R₇R₁₀R₆R₃및 R₂R₅R₇R₁₀R₃은 6개 위치중에서 5개를 공통적으로 가지고 있으며, 그 결과 83.3% 서열 동일성을 공유한다).

동일성은 종종 서열 분석 소프트웨어, 예컨대, BLASTN 또는BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 이용가능함)를 사용하여 측정된다. BLASTN(뉴클레오티드 서열을 위한) 2개의 서열을 비교(예컨대, 2개의 서열을 서로 "Blast"하는것("Blast"-ing), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ bl2.html 참조)하기 위한 디폴트 파라미터는 매치 = 1, 미스매치에 대한 페널티 = -2, 오픈 갭 = 5, 익스텐션 갭 = 2에 대한 보상이다. 단백질 서열을 위한 BLASTP를 사용할 때, 디폴트 파라미터는 매치 = 0, 미스매치에 대한 페널티 = 0, 오픈 갭 = 11 및 익스텐션 갭 = 1에 대한 보상이다.

2개의 서열이 "서열 상동성"을 공유할 때, 서열 상동성이란 2개의 서열이 보존적인 치환에 의해서만 서로 차이가 있는 것을 의미한다. 폴리펩티드 서열에 있어서, 이런 보존적인 치환은 주어진 위치에서의 하나의 아미노산으로 동일 부류의 또 다른 아미노산(예컨대, 소수성, 전하, pK 또는 다른 형태적인 특징 또는 화학적인 특성을 공유하는 아미노산)을 치환하는 것(예컨대, 루이신을 발린으로, 리신을 아르기닌으로 치환), 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키는 정도로 폴리펩티드의 형태 또는 접힘을 변화시키지 않는 서열의 위치에서의 하나 이상의 비보존적인 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 구성되어 있다. "보존적인 치환"의 예에는 이소루이신, 발린, 루이신 또는 메티오닌과 같은 하나의 비극성(소수성) 잔기로 또 다른 잔기를 치환하는 것 하나의 극성(친수성) 잔기로 아르기닌과 리신간, 글루타민과 아스파라긴간, 트레오닌과 세린간과 같은 다른 잔기를 치환하는 것 리신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같은 하나의 염기성 잔기로 또 다른 잔기를 치환하는 것 아스파라긴산 또는 글루탐산과 같은 하나의 산성 잔기로 또 다른 잔기를 치환하는 것 또는 비유도체화된 잔기 대신 화학적으로 유도체화된 잔기의 사용이 포함되는데, 단 폴리펩티드가 필수적인 생물학적 활성을 나타내어야 한다. 서열 상동성을 공유하는 2개의 서열을 "서열 동족체"라고 부르기도 한다.

본 발명은 본원에 개시된 단백질과 펩티드의 변이체를 계획한다. 여기서, 변이체는 상기 단백질 또는 펩티드의 활성을 실질적으로 변화시키지 않는다, 다시 말하면 이들 돌연변이는 실제로 "침묵"돌연변이이다. 125번(전장 툼스타틴 분자에서) 잔기에서 시스테인이 알라닌으로 치환된 이런 변이체, Tum-5-12-C-A를 여기에 제시한다. 이런 돌연변이는 상기 잔기에서 이황화 결합이 형성되는 것을 예방하지만 모분자 툼스타틴-45-132의 완전 활성을 여전히 보유한다.

폴리펩티드에 있어서 상동성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어[예컨대, 유전학 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 팩키지(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)]를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 다른 개질에 대한 상동성의 정도를 지정함으로써 유사한 서열을 매치시킨다. 보존적인 치환에는 전형적으로 하기 군내에서의 치환이 포함된다: 글리신, 알라닌 발린, 이소루이신, 루이신 아스파라긴산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민 세린, 트레오닌 리신, 아르기닌 및 페닐알라닌, 티로신.

또한 본 발명은 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴의 화학적 유도체들을 포함한다. "화학적 유도체"는 작용 사이드 기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기들을 가진 대상 폴리펩티드이다. 예를 들어, 이런 유도체화된 잔기들에는 유리 아미노 기들이 유도체화되어 아민 하이드로클로라이드, p-톨루엔 설포닐 기, 카보벤즈옥시 기, t-부틸옥시카보닐 기, 클로로아세틸 기 또는 포르밀 기를 형성하는 분자들이 포함된다. 유리 카르복실 기는 유도체화되어 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 다른 타입의 에스테르 또는 하이드라지드를 형성할 수 있다. 유리 하이드록실 기는 유도체화되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소는 유도체화되어 N-임벤질히스티딘을 형성할 수 있다. 또한 본 발명은 화학적 유도체로서 20개의 표준 아미노산의 천연 발생 아미노산 유도체들을 하나 이상 포함하는 단백질들을 포함한다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린은 프롤린을 치환할 수 있고 5-하이드록시리신은 리신을 치환할 수 있고 3-메틸히스티딘은 히스티딘을 치환할 수 있고 호모세린은 세린을 치환할 수 있고 오르니틴은 리신을 치환할 수 있다.

또한 본 발명은 항-혈관형성 단백질, 이들의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체를 포함하는 융합 단백질 및 키메라 단백질을 포함한다. 융합 단백질 또는 키메라 단백질은 재조합 발현 및 클로닝 과정의 결과로서 생성될 수 있으며, 예컨대, 상기 단백질은 추가적인 아미노산 또는 완전하거나 부분적인 링커 서열(예컨대, 본 발명의 아레스텐)에 상응하는 아미노산 서열을 포함하여 생성될 수 있으며, 대장균에서 생성될 때(하기 실시예 2 참조)에는, 히스티딘 태그를 포함하여, 단백질에 추가된 추가적인 벡터 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질 또는 키메라 단백질"은 본래의 단백질 서열에 상기 타입의 변화를 포함시키고자 한 것이다. 유사한 변화들이 칸스타틴 및 툼스타틴 단백질에 대해 일어날 수 있다(각각 실시예 14 및 23). 융합 단백질 또는 키메라 단백질은 단일 단백질의 다량체, 예컨대, 항-혈관형성 단백질의 반복체로 구성될 수 있거나 융합 단백질 및 키메라 단백질은 수개의 단백질, 예컨대, 수개의 항-혈관형성 단백질로 구성될 수 있다. 융합 단백질 또는 키메라 단백질은 공지된 항-혈관형성 단백질(예컨대, 앤지오스타틴 및 엔도스타틴, 또는 앤지오스타틴과 엔도스타틴의 생물학적으로 활성인 단편들) 둘 이상의 조합, 또는 표적화제와 결합한 항-혈관형성 단백질(예컨대, 상피 성장 인자(EGF) 또는 RGD 펩티드와 엔도스타틴), 또는면역글로불린 분자와 결합한 항-혈관형성 단백질(예컨대, 엔도스타틴과 IgG, 상세하게는 제거된 Fc 부분)을 포함할 수 있다. 또한 융합 단백질 및 키메라 단백질은 항-혈관형성 단백질, 이들의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체, 및 다른 항-혈관형성 단백질, 예컨대, 엔도스타틴, 또는 앤지오스타틴을 포함할 수 있다. 다른 항-혈관형성 단백질들은 레스틴 및 아포미그렌(WO 99/29856); 및 엔도스타틴의 단편들(WO 99/29855)을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에 사용되는 용어 "융합 단백질" 또는 "키메라 단백질"은 예컨대, 화학요법 약제를 운반하기 위한 추가적인 구성요소를 포함할 수 있으며, 여기서 화학요법 약제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 항-혈관형성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결되어 있다. 또한 융합 단백질 또는 키메라 단백질들은 항-혈관형성 단백질의 다량체, 예컨대, 이량체 또는 삼량체를 포함할 수 있다. 이런 융합 단백질 또는 키메라 단백질들은 후번역 개질을 통해 서로 연결될 수 있거나(예컨대, 화학적으로 연결됨), 융합 단백질 전체는 재조합적으로 제조될 수 있다.

또한 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴, 이들의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체를 포함하는 다량체 단백질들을 본 발명에 포함시키고자 한다. "다량체"는 아단위 단백질의 둘 이상의 복사본을 포함하는 단백질을 의미한다. 아단위 단백질은 본 발명의 단백질, 예컨대, 2번 이상 반복되는 아레스텐, 또는 2번 이상 반복되는 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 또는 대립형질 변형체, 예컨대, 툼스타틴 돌연변이체 또는 단편, 예컨대, 툼스타틴 333 중 하나일 수 있다. 또한 이런 다량체는 융합 단백질 또는 키메라 단백질일 수 있다. 예컨대, 반복된 툼스타틴 돌연변이체는 단일 복사본으로 존재할 수 있는 폴리링커 서열 및/또는 항-혈관형성 펩티드 하나 이상과 결합하거나, 일렬로 반복되어 있을 수도 있다(예컨대, 단백질은 전체 단백질내에 둘 이상의 다량체를 포함할 수 있다).

또한 본 발명은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴을 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드(들)뿐만 아니라 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포 하나 이상을 포함하는 조성물, 및 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴, 및 이들의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체를 제조하는 방법을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "벡터"는 핵산의 조각이 삽입되거나 클로닝될 수 있는 담체를 의미하며, 상기 담체는 숙주 세포내로 핵산의 조각을 이동시키는 기능을 한다. 또한 이런 벡터는 이동된 핵산 조각을 복제 및/또는 발현시킬 수 있다. 벡터의 예에는 예컨대, 플라스미드, 박테리오파지 또는 포유류, 식물 또는 곤충 바이러스, 또는 리간드-핵산 공액체, 리포좀 또는 지질-핵산 복합체와 같은 비바이러스성 벡터로부터 유도된 핵산 분자들이 포함된다. 이동된 핵산 분자는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어 이동된 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 형성하는 것이 바람직하다. 핵산의 이런 이동을 일반적으로 "형질전환"이라 부르며, 형질전환이란 삽입을 위해 사용되는 방법에 상관없이 숙주 세포내로 외인성 폴리뉴클레오티드를 삽입시키는 것을 말한다. 예를 들어, 직접적인 흡수(uptake), 형질도입 또는 f-메이팅(mating)이 포함된다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비통합된 벡터, 예컨대, 플라스미드로서 유지되거나 숙주 지놈(genome)내로 통합될 수도 있다. "작동가능하게 연결된"은 기술된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하도록 이들을 허용하는 관계에 있는 상황을 말하며, 예컨대, 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 상기 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 양립할 수 있는 조건하에서 달성될 수 있는 방식으로 연결되어 있다. "코팅 서열"은 mRNA로 전사되어 적절한 조절 서열의 제어하에(예컨대, 작동가능하게 연결된) 위치될 때 폴리펩티드로 번역되는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단에 번역 시작 코돈 및 3'-말단에 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 이런 경계는 천연적으로 발생되거나 당분야의 공지된 방법에 의해 폴리뉴클레오티드 서열이 도입되거나 추가될 수 있다. 코딩 서열에는 mRNA, cDNA 및 재조합 폴리뉴클레오티드 서열이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

상기 클로닝된 폴리펩티드가 클로닝되는 벡터는 원핵생물체에서 기능한다는 이유 때문에 선택되거나, 진핵생물체에서 기능한다는 이유 때문에 선택될 수도 있다. 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및 상기 폴리뉴클레오티드로부터의 이들 단백질의 발현 둘 모두를 가능하도록 해주는 벡터의 2가지 예는 pET22b와 pET28(a) 벡터(Novagen, Madison, Wisconsin, USA) 및 개질된 pPICZαA 벡터(InVitrogen, San Diego, California, USA)이고, 이들은 각각 세균 및 효모에서 상기 단백질의 발현을 가능하도록 해준다(예컨대, WO 99/29878과 U.S.S.N. 09/589,483).

일단 폴리뉴클레오티드가 적합한 벡터내로 클로닝되면, 이것은 적절한 숙주 세포내로 형질전환될 수 있다. "숙주 세포"는 벡터에 의해 이동되는 핵산의 수용세포로서 사용되거나 사용될 수 있는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 원핵생물 또는진핵생물, 포유류, 식물 또는 곤충일 수 있으며, 단세포로서 존재하거나 집합체, 예컨대, 배양물로서 또는 조직배양물로, 또는 조직이나 생물체로 존재할 수 있다. 또한 숙주 세포는 다세포 생물, 예컨대, 포유동물의 정상 조직 또는 질병 조직으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 숙주 세포에는 핵산과 함께 형질전환된 본래의 세포뿐만 아니라 이런 세포의 자손으로서 여전히 상기 핵산을 가지고 있는 세포가 포함된다.

한가지 구체예에서, 항-혈관형성 단백질을 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 링커를 추가적으로 포함한다. 이런 링커는 당분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 예컨대 상기 링커는 추가적인 아미노산 하나 이상을 인코딩하는 추가적인 코돈 하나 이상을 포함할 수 있다. 전형적으로 상기 링커에는 1 내지 20 또는 30개 아미노산이 포함된다. 폴리뉴클레오티드 링커는 번역되는데, 폴리뉴클레오티드가 항-혈관형성 단백질을 인코딩하고 있기 때문에, 항-혈관형성 단백질의 아미노 또는 카르복실 말단에 추가적인 아미노산 잔기를 하나 이상 가진 항-혈관형성 단백질로 발현된다. 중요하게는, 상기 추가적인 아미노산 또는 아미노산들은 항-혈관형성 단백질의 활성을 손상시키기 않는다.

벡터내로 선택된 폴리뉴클레오티드를 삽입시킨 후에, 벡터를 적절한 원핵세포 균주내로 형질전환시키고 생물학적으로 활성인 항-혈관형성 단백질을 생성시키기 위해 이 균주를 적합한 배양 조건하에서 배양시킴으로써(예컨대, 유지시킴), 생물학적으로 활성인 항-혈관형성 단백질, 또는 이들의 돌연변이체, 유도체, 단편 또는 융합 단백질을 생성시켰다. 한가지 구체예에서, 본 발명은 벡터 pET22b,pET17/b 또는 pET28a내로 항-혈관형성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 클로닝한 다음 세균내로 형질전환시키는 것을 포함한다. 그러면 세균 숙주 균주는 혈관형성 단백질을 발현시킨다. 전형적으로 항-혈관형성 단백질은 배양액의 리터당 약 10-20 ㎎ 이상의 양으로 생성된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 진핵세포 벡터에는 개질된 효모 벡터가 포함된다. 한가지 방법은 다중 클로닝 부위를 포함하고 있는 pPICzα플라스미드를 사용하는 것이다. 다중 클로닝 부위는 상기 다중 클로닝 부위내에 삽입되어 있는 His.tag 모티프를 가지고 있다. 추가적으로 상기 벡터는 개질되어 NdeI 부위 또는 다른 적합한 제한 부위들이 추가될 수 있다. 이 부위들은 당분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 이 구체예에 의해 생성된 항-혈관형성 단백질들에는 하나 이상의 히스티딘, 전형적으로는 약 5-20개 히스티딘을 포함하는 히스티딘 태그 모티프(His.tag)가 포함된다. 상기 태그는 단백질의 항-혈관형성 특성을 방해하지 말아야 한다.

가령, 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴을 생성하는 한가지 방법은 각각 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:9의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키고, 이를 발현 벡터, 예컨대, pET22b, pET28(a), pPICZαA 또는 일부 다른 발현 벡터내로 클로닝하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 상기 벡터를 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 숙주 세포내로 형질전환시키고, 상기 단백질을 발현시키기에 적절한 배양 조건하에서 상기 형질전환시킨 숙주 세포를 배양시킨 다음, 배양물로부터 상기 단백질을 추출 및 정제하는 것이다. 일반적 항-혈관형성 단백질, 및 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴을 생성시키기 위한 모범적인 방법들은 하기 실시예에 제공되어 있다. 또한 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 단백질은 유전자이식 동물의 생성물, 예컨대, 유전자이식 소, 염소, 양 또는 돼지의 유액의 구성요소 또는 유전자이식 식물의 생성물(예컨대, 옥수수에서 전분 분자와 결합되거나 연결된)로서 발현될 수 있다. 이들 방법은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:10 단백질의 일부를 생산하기 위하여 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:9의 하위서열에 이용할 수 있다. 이들 방법은 예로써 단편 툼스타틴-333, 툼스타틴-334, 툼스타틴-N53, Tum-2, Tum-3, Tum-4, 툼스타틴-45-132 및 펩티드 T1, T2, T3, T4, T5, T6를 생산하는데 이용하였다.

또한 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴은 통상적으로 공지된 화학적 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. 합성 방법에 의해 본 발명의 단백질들을 제조하기 위한 방법들은 당분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 합성적으로 제조된 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 단백질 서열들은 예컨대, 재조합적으로 생성된 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴과 1차, 2차 또는 3차 구조적 및/또는 형태적 특징을 공유함으로써 생물학적 활성을 포함하여, 이들과 함께 공통적인 생물학적 특성을 가질 수 있다. 따라서, 합성적으로 제조된 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 단백질 서열들은 예컨대, 치료 화합물의 스크리닝 및 항체의 발달을 위한 면역학적 방법에서 재조합적으로 생성되어 정제된 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 단백질 대신 생물학적으로 활성이거나 면역학적인 대체물로서 사용될 수 있다.

아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴 단백질들은 표준 검정에서 결정되고 하기실시예에 제공되는 바와 같이 혈관형성을 억제시키기에 유용하다. 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴은 다른 세포 타입, 예컨대, 비-내피 세포의 성장을 억제시키지 않는다.

아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 분리된 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 클로닝할 수 있다. 본 명세서에서 언급하는 "분리된" 핵산 폴리펩티드는 이들을 수득할 수 있게 한 생물학적 공급원의 물질(예컨대, 핵산의 혼합물 또는 세포에 존재하는 물질)을 사실상 함유하지 않는(예를 들면, 이런 물질로부터 분리된) 핵산 또는 폴리펩티드로서, 이들은 추가로 처리될 수 있다. "분리된" 핵산 또는 폴리펩티드에는 필수적으로 순수한 핵산 또는 폴리펩티드, 화학적 합성, 화학적 또는 생물학적 방법의 조합에 의해 생성된 핵산 또는 폴리펩티드 및 분리된 재조합적으로 생성된 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하여, 본 명세서에 기술하는 방법, 유사한 방법 또는 다른 적절한 방법에 의해 수득된 핵산 또는 폴리펩티드가 포함된다. 이런 이유로, 분리된 폴리펩티드는 정상적으로 결합되어 있는 다른 단백질, 탄수화물, 지질 및 다른 세포 구성요소를 비교적 함유하지 않는 것을 의미한다. 핵산이 유래된 생물체의 천연적으로 존재하는 지놈에서는 핵산이 양쪽 핵산과 직접 접촉(즉, 공유적으로 결합)하고 있지만 분리된 핵산은 양쪽 핵산과 직접 접촉하고 있지 않다. 이런 이유로, 상기 용어에는, 예컨대, 벡터내에 통합된 핵산(예컨대, 자가 복제하는 바이러스 또는 플라스미드) 또는 화학적 수단이나 제한효소 처리에 의해 생성된 핵산 단편과 같은 다른 핵산들과 독립적으로 분리된 분자로서 존재하는 핵산이 포함된다.

또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 단백질들은 다른 항-혈관형성 단백질들을 분리시키기 위한 프로브를 디자인하기 위해 사용될 수 있다. 우수한 방법들이 자콥(Jacobs) 등이 기술한 미국 특허 제 5,837,490호에 제공한다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 디자인은 다음의 파라미터를 따르는 것이 바람직하다: (a) 불명확 염기("N")를 가지고 있더라도 최소한으로 가지는 서열의 영역으로 디자인해야 하고, (b) (A 또는 T 각각에 대해 2℃, G 또는 C 각각에 대해 4℃로 가정할 때) Tm이 약 80℃가 되도록 디자인해야 한다.

올리고뉴클레오티드를 표지시키기 위해 보편적으로 사용되는 기술을 사용하여 상기 올리고뉴클레오티드를 g-³²P-ATP(특이적 활성 6000 Ci/mmole) 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 표지시키는 것이 바람직하다. 또한 다른 표지 기술들이 사용될 수 있다. 겔 여과 크로마토그래피 또는 다른 확립된 방법들에 의해 비-병합된 표지를 제거시키는 것이 바람직하다. 프로브내로 병합된 방사능의 양은 섬광 계수기로 측정함으로써 정량되어야 한다. 바람직하게는, 수득된 프로브의 비활성은 약 4 x 10⁶dpm/pmole이 되어야 한다. 전장 클론의 혼합물을 포함하는 세균 배양물을 녹이고 이 보존배양물 100 ㎕를 사용하여 ㎖당 100 ㎍으로 암피실린을 함유하는 멸균 L-액체배지 25 ㎖가 담겨있는 멸균 배양 플라스크에 접종하는 것이 바람직하다. 이 배양물을 37℃에서 포화되도록 성장시키는 것이 바람직하며, 포화된 배양물을 새로운 L-액체배지에 희석시키는 것이 바람직하다. 이들 희석액의 분량을 도말시켜 150 mm 페트리 접시(petri dish)중의 ㎖당 100 ㎍의 암피실린을 함유하는L-액체배지 및 1.5% 아가(agar)를 함유하는 고형 세균 배지상에 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰을 때 약 5000개의 명확하게 분리된 콜로니를 생성시키는 희석도 및 부피를 결정하였다. 또한 명확하게 분리된 콜로니를 생성시키는 다른 공지된 방법들이 사용될 수 있다.

이후, 표준 콜로니 혼성화 방법을 사용하여 콜로니를 니트로셀룰로오스 필터로 이동시키고 이들을 용해, 변성 및 베이킹(baking)시켜야 한다. 예를 들어, 높은 엄밀도 조건은 적어도 65℃에서 1x SSC 또는 42℃에서 1x SSC 및 50% 포름아미드를 사용하는 조건이다. 중간 엄밀도 조건은 적어도 65℃에서 4x SSC 또는 42℃에서 4x SSC 및 50% 포름아미드를 사용하는 조건이다. 낮은 엄밀도 조건은 적어도 50℃에서 4x SSC 또는 40℃에서 6x SSC 및 50% 포름아미드를 사용하는 조건이다.

이후, 필터는 0.5% SDS, 효모 RNA 100 ㎍/㎖ 및 10 mM EDTA(150 mm 필터당 약 10 ㎖)를 함유하는 6배 SSC(20x 저장시약은 173.3 g NaCl/ℓ, 88.2 g Na 시트레이트/ℓ이고, NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정)에 부드럽게 교반하면서 65℃에서 1시간 동안 배양시키는 것이 바람직하다. 그 다음 상기 프로브를 바람직하게는 1 x 106 dpm/㎖이상의 농도로 혼성화 혼합물에 첨가한다. 이후, 부드러운 교반하에 65℃에서 하룻밤동안 배양시키는 것이 바람직하다. 그 다음, 교반시키지 않으면서 실온에서 2x SSC/0.5% SDS 500 ㎖중에서 세척하는 것이 바람직하며, 후속으로 부드러운 교반하에 실온에서 15분 동안 2x SSC/0.1% SDS 500 ㎖중에서 세척하는 것이 바람직하다. 65℃에서 30분 내지 1시간 동안 0.1x SSC/0.5% SDS를 사용하는 세척은 선택사항이다. 이후, 필터는 건조시키고 충분한 시간 동안 자동방사선사진법을 수행하여 X-레이 필름상에 포지티브를 가시화시킨다. 또한 다른 공지된 혼성화 방법들이 사용될 수 있다. 그 다음, 포지티브 콜로니를 취하여, 배양액에서 성장시키고, 표준 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리시킨다. 이후, 클론을 제한 분석법, 혼성화 분석법 또는 DNA 서열분석법에 의해 확인할 수 있다.

높은 엄밀도 조건에서는 (1) 65℃에서 0.3 - 0.1x SSC, 0.1 % SDS; 또는 (2) 65℃에서 1 mM Na₂EDTA, 40 mM NaHP0₄(pH 7.2), 1% SDS의 높은 엄밀도 세정액으로 (1) 65℃에서 1x SSC(10x SSC = 3 M NaCl, 0.3 M Na₃-시트레이트x2H₂0(88 g/ℓ), 1 M HCl로 pH 7.0), 1% SDS(소디움 도데실 설페이트), 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (2) 42℃에서 1x SSC, 50% 포름아마이드, 1% SDS, 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (3) 65℃에서 1% 소 혈청 알부민(분획물 V), 1 mM Na₂xEDTA, 0.5 M NaHP0₄(pH 7.2)(1 M NaHP04 = 134 g Na₂HP0₄x7H₂0, 4 ㎖ 85% H₃PO₄/ℓ), 7% SDS, 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (4) 42℃에서 50% 포름아마이드, 5x SSC, 0.02 M Tris-HCl(pH 7.6), 1x Denhardt 용액(100x = 10 g Ficoll 400, 10 g 폴리비닐피롤리돈, 10 g 소 혈청 알부민(분획물 V), 물 500 ㎖), 10% 덱스트란 설페이트, 1% SDS, 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (5) 65℃에서 5x SSC, 5x Denhardt 용액, 1% SDS, 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; 또는 (6) 42℃에서 5x SSC, 5x Denhardt 용액, 50% 포름아마이드, 1% SDS, 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA에서 혼성화를 이용할 수 있다. 상기 조건은 50개 염기쌍 이상의 DNA-DNA 하이브리드에 이용된다. 하이브리드가 18개 염기쌍 미만인 것으로 생각되면 혼성화와 세척 온도는 하이브리드의 계산된 Tm보다 5-10℃ 낮아야하고, 여기서 Tm(℃)은 (2 x A와 T 염기의 개수) + (4 x G와 C 염기의 개수)이다. 하이브리드가 18 내지 49개 염기쌍인 것으로 생각되면 Tm(℃)은 (81.5℃ + 16.6(log₁₀M) + 0.41(% G + C) - 0.61(% 포름아마이드) - 500/L)이고, 여기서 "M"은 일가 양이온(예, Na⁺)의 몰농도이고, "L"은 하이브리드 염기쌍의 길이이다.

중간 엄밀도 조건에서는 (1) 65℃에서 1x SSC, 0.1 % SDS의 중간 엄밀도 세정액으로 (1) 65℃에서 4x SSC(10x SSC = 3 M NaCl, 0.3 M Na₃-시트레이트x2H₂0(88 g/ℓ), 1 M HCl로 pH 7.0), 1% SDS(소디움 도데실 설페이트), 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (2) 42℃에서 4x SSC, 50% 포름아마이드, 1% SDS, 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (3) 65℃에서 1% 소 혈청 알부민(분획물 V), 1 mM Na₂xEDTA, 0.5 M NaHP0₄(pH 7.2)(1 M NaHP04 = 134 g Na₂HP0₄x7H₂0, 4 ㎖ 85% H₃PO₄/ℓ), 7% SDS, 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (4) 42℃에서 50% 포름아마이드, 5x SSC, 0.02 M Tris-HCl(pH 7.6), 1x Denhardt 용액(100x = 10 g Ficoll 400, 10 g 폴리비닐피롤리돈, 10 g 소 혈청 알부민(분획물 V), 물 500 ㎖), 10% 덱스트란 설페이트, 1% SDS, 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (5) 65℃에서 5x SSC, 5x Denhardt 용액, 1% SDS, 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; 또는 (6) 42℃에서 5x SSC, 5x Denhardt 용액, 50% 포름아마이드, 1% SDS, 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA에서 혼성화를 이용할 수 있다. 상기 조건은 50개 염기쌍 이상의 DNA-DNA 하이브리드에 이용된다. 하이브리드가 18개 염기쌍 미만인 것으로 생각되면 혼성화와세척 온도는 하이브리드의 계산된 Tm보다 5-10℃ 낮아야하고, 여기서 Tm(℃)은 (2 x A와 T 염기의 개수) + (4 x G와 C 염기의 개수)이다. 하이브리드가 18 내지 49개 염기쌍인 것으로 생각되면 Tm(℃)은 (81.5℃ + 16.6(log₁₀M) + 0.41(% G + C) - 0.61(% 포름아마이드) - 500/L)이고, 여기서 "M"은 일가 양이온(예, Na⁺)의 몰농도이고, "L"은 하이브리드 염기쌍의 길이이다.

낮은 엄밀도 조건에서는 (1) 50℃에서 2x SSC, 0.1 % SDS; 또는 (2) 0.5% 소 혈청 알부민(분획물 V), 1 mM Na₂EDTA, 40 mM NaHP0₄(pH 7.2), 5% SDS의 낮은 엄밀도 세정액으로 (1) 50℃에서 4x SSC(10x SSC = 3 M NaCl, 0.3 M Na₃-시트레이트x2H₂0(88 g/ℓ), 1 M HCl로 pH 7.0), 1% SDS(소디움 도데실 설페이트), 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (2) 40℃에서 6x SSC, 50% 포름아마이드, 1% SDS, 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (3) 50℃에서 1% 소 혈청 알부민(분획물 V), 1 mM Na₂xEDTA, 0.5 M NaHP0₄(pH 7.2)(1 M NaHP04 = 134 g Na₂HP0₄x7H₂0, 4 ㎖ 85% H₃PO₄/ℓ), 7% SDS, 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (4) 40℃에서 50% 포름아마이드, 5x SSC, 0.02 M Tris-HCl(pH 7.6), 1x Denhardt 용액(100x = 10 g Ficoll 400, 10 g 폴리비닐피롤리돈, 10 g 소 혈청 알부민(분획물 V), 물 500 ㎖), 10% 덱스트란 설페이트, 1% SDS, 0.1 - 2 ㎎/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; (5) 50℃에서 5x SSC, 5x Denhardt 용액, 1% SDS, 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA; 또는 (6) 40℃에서 5x SSC, 5x Denhardt 용액, 50% 포름아마이드, 1% SDS, 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA에서 혼성화를 이용할 수 있다. 상기 조건은 50개 염기쌍 이상의 DNA-DNA 하이브리드에 이용된다. 하이브리드가 18개 염기쌍 미만인 것으로 생각되면 혼성화와 세척 온도는 하이브리드의 계산된 Tm보다 5-10℃ 낮아야하고, 여기서 Tm(℃)은 (2 x A와 T 염기의 개수) + (4 x G와 C 염기의 개수)이다. 하이브리드가 18 내지 49개 염기쌍인 것으로 생각되면 Tm(℃)은 (81.5℃ + 16.6(log₁₀M) + 0.41(% G + C) - 0.61(% 포름아마이드) - 500/L)이고, 여기서 "M"은 일가 양이온(예, Na⁺)의 몰농도이고, "L"은 하이브리드 염기쌍의 길이이다.

본 발명은 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴 또는 이들의 생물학적으로 활성인 단편, 유사체, 동족체, 유도체 또는 돌연변이체를 사용하여 포유동물 조직에서 혈관형성을 억제시키는 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 항-혈관형성 단백질 하나 이상, 이들의 생물학적으로 활성인 단편 하나 이상, 항-혈관형성 활성을 가진 단편들의 조합 또는 촉진제 및 길항제의 효과량을 사용하여 혈관형성-매개된 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 항-혈관형성 단백질의 효과량은 질병 또는 질환을 초래하는 혈관형성을 억제시키기에 충분한 양이며, 따라서 상기 질병 또는 질환을 완전하게 또는 부분적으로 완화시킨다. 혈관형성-매개된 질병의 완화는 질병의 징후의 완화, 예컨대, 종양의 크기의 감소 또는 억제된 종양 성장을 관찰함으로써 결정될 수 있다. 또한 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "효과량"은 환자에게 유의한 장점, 즉, 관련된 의학적 질환의 치료, 치유, 예방 또는 향상, 또는 상기 질환의 치료, 치유, 예방 또는 향상의 비율의 증가를 나타내기에 충분한 조성물 또는 방법의각 활성 성분의 전체량을 의미한다. 조합에 적용할 때, 상기 용어는 연속적으로 또는 동시에 투여여부에 상관없이, 치료적 효과를 유발하는 활성 성분의 합한 양을 말한다. 혈관형성-매개된 질병에는 암, 고형 종양, 혈액-발생 종양(예컨대, 백혈병), 종양 전이, 양성 종양(예컨대, 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종), 류마티즘성 관절염, 건선, 안구 혈관형성 질환(예컨대, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 황반변성, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 후수정체 섬유증식, 홍색증), 오슬러-웨버 증후군, 심근 혈관형성, 플라크 혈관신생, 모세혈관 확장증, 혈우병 관절증, 혈관섬유증 및 외상 과립화가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 항-혈관형성 단백질들은 내피 세포들을 과잉 또는 비정상적으로 자극시키는 질환을 치료하기에 유용하다. 이런 질환들에는 장 부착증, 크론병, 동맥경화증, 경피증 및 비후성 반응(즉, 켈로이드)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 항-혈관형성 단백질들은 배(胚) 착상을 위해 필요한 혈관신생을 방지시킴으로써 출산 제어제로서 사용될 수 있다. 항-혈관형성 단백질은 캣 스크래치 질환[로켈레 미날리아 퀸토사(Rochele minalia quintosa)] 및 궤양[헬리코박터 파일로리(Heliobacter pylori)]와 같은 병리학적인 결과로서 혈관형성을 가지는 질환들을 치료하기에 유용하다. 또한 항-혈관형성 단백질들은 예컨대, 지방 조직에서 모세관 형성을 억제시켜, 모세관의 확장을 방지시킴으로써 투석 이식 혈관 통로 협착증 및 비만을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 또한 항-혈관형성 단백질은 국부적인(예컨대, 전이되지 않은) 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. "암"은 신형성 성장, 과형성 또는 증식성 성장 또는 비정상적인 세포 발생의 병리학적 상태를 의미하며 백혈병에서나타나는 바와 같은 고형 종양, 비고형 종양 및 어떤 비정상적인 세포 증식이 포함된다. 또한 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "암"은 혈관형성-의존성 암 및 종양, 즉, 이들의 성장(부피 및/또는 질량에서의 확장)을 위해 혈액과 함께 이들을 공급하는 혈관의 수 및 밀도에서의 증가를 필요로 하는 종양을 의미한다. "퇴화"란 당분야의 숙련자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 결정되는 것과 같이 종양 질량 및 크기의 감소를 말한다.

대안으로, 혈관형성의 증가가 바람직한 곳, 예컨대, 상처 치료, 또는 경색후 심장 조직, 항-혈관형성 단백질에 대한 항체 또는 항혈청은 국부적인, 본래의 항-혈관형성 단백질 및 과정을 방해함으로써, 새로운 혈관의 형성을 증가시켜 조직의 퇴화를 억제시키는데 사용될 수 있다.

항-혈관형성 단백질들은 질환의 치료를 위해 다른 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양은 통상적으로 항-혈관형성 단백질과 함께 외과수술, 방사능, 화학요법 또는 면역요법을 사용하여 치료한 다음 항-혈관형성 단백질을 환자에게 투여하여 미소전이의 휴면기를 연장시키고 남아있는 일차 종양의 성장을 안정화시켜 억제시킬 수 있다. 또한 항-혈관형성 단백질, 또는 이들의 단편, 항혈청, 수용체 촉진제 또는 수용체 길항제, 또는 이들의 조합들은 다른 항-혈관형성 화합물, 또는 단백질, 단편, 항혈청, 다른 항-혈관형성 단백질(예컨대, 앤지오스타틴, 엔도스타틴)의 수용체 촉진제, 수용체 길항제와 결합될 수 있다. 추가적으로, 항-혈관형성 단백질 또는 이들의 단편, 항혈청, 수용체 촉진제, 수용체 길항제 또는 이들의 조합들은 제약학적으로 수용가능한 부형제 및 생분해성 중합체와 같은임의로 지속방출되는 매트릭스와 결합하여 치료적 조성물을 형성한다. 또한 본 발명의 조성물들은 엔도스타틴 또는 앤지오스타틴과 같은 다른 항-혈관형성 단백질 또는 화학적 화합물 및 이들의 돌연변이체, 단편 및 유사체를 함유할 수 있다. 상기 조성물들은 상기 단백질의 활성을 향상시키거나 부각시키는 또는 화학요법적이거나 방사능적인 약제와 같이 치료에 사용하는 다른 약제들을 추가로 함유할 수 있다. 이런 추가적인 인자 및/또는 약제는 상기 조성물에 포함됨으로써 본 발명의 단백질과 함께 상승효과를 생성시키거나 부작용을 최소화시킬 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 조성물의 투여는 예컨대, 화학요법 또는 방사능 치료 요양법과 함께 투여되는 다른 치료법과 병행할 수 있다.

본 발명은 조직을 본 발명의 단백질을 함유하는 조성물과 접촉시킴으로써 포유동물 조직에서 혈관형성을 억제시키기 위한 방법을 포함한다. "접촉"은 국소적인 적용뿐만 아니라 조직 또는 조직의 세포내로 상기 조성물을 도입시키는 운반 모드를 의미한다.

또한 본 발명은 시한적인 방출 또는 지속적인 방출 운반 시스템의 용도를 포함한다. 상기 시스템은 외과수술이 곤란하거나 불가능한 상황, 예컨대, 환자가 연령 또는 병의 경과로 인해 쇠약해진 상황 또는 위험성-장점 분석 결과 치료보다 조절이 필요하다고 판단되는 상황에 매우 바람직하다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 지속방출되는 매트릭스는 보편적으로 중합체인 물질로 구성된 매트릭스이고, 이것은 효소적 또는 산/염기 가수분해에 의해 또는 용해에 의해 분해될 수 있다. 일단 체내로 삽입되면, 매트릭스는 효소 및 체액에 의해 작용받게 된다. 지속방출된 매트릭스는 리포좀, 폴리락티드 (폴리락트산), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 공(co-)글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체), 폴리산무수물(polyanhydrides), 폴리(오르쏘)에스테르, 폴리단백질, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 페닐알라닌, 티로신, 이소루이신과 같은 아미노산, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘과 같은 생물호환성 물질로부터 선택되는 것이 바람직하다. 바람직한 생분해성 매트릭스는 폴리락티드, 폴리글리콜리드 또는 폴리락티드-글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체)중 하나의 매트릭스이다.

본 발명의 혈관형성 조절 조성물은 고형물, 액체 또는 에어로졸일 수 있으며 어떤 공지된 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 고형 조성물의 예에는 환약, 크림 및 주입가능한 제형 단위가 포함된다. 환약은 경구적으로 투여될 수 있으며, 치료 크림은 국소적으로 투여될 수 있다. 주입가능한 제형 단위는 국부적으로, 예컨대 종양 위치에 투여되거나 혈관형성-조절 조성물의 전신 방출을 위해, 예컨대 피하 주입될 수 있다. 액체 조성물의 예에는 피하, 정맥내, 동맥내 주사를 위해 적합된 제형 및 국소적 및 안구내 투여를 위한 제형이 포함된다. 에어로졸 제형에는 폐에 투여하기 위한 흡입용 제형이 포함된다.

상기 기술한 항-혈관형성 활성을 가진 단백질 및 단백질 단편들은 당분야의 당업자에게 공지되어 있는 제형 방법을 사용하는 제약학적으로 수용가능한 제형중에 분리되어 실질적으로 정제된 단백질 및 단백질 단편으로서 제공될 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물들은 국소적, 경피적, 복강내, 두개내(頭蓋內), 대뇌실내, 대뇌내, 질내, 자궁내, 경구, 직장 또는 비경구(예컨대, 정맥내, 척수내, 피하 또는 근육내) 경로를 통해 투여될 수 있다. 추가적으로, 항-혈관형성 단백질들은 생분해성 중합체내에 병합되어 상기 화합물의 지속된 방출을 가능하도록 해줄 수 있으며, 상기 중합체는 약제 운반이 바람직한 위치의 부근, 예컨대, 종양의 위치에 주입되거나 주입되어 항-혈관형성 단백질을 전신으로 서서히 방출시킨다. 또한 삼투압 미니펌프를 사용하여 직접 전이성 성장을 하는 위치내에 또는 상기 종양에 공급되는 혈관내와 같은 관심있는 위치에 캐뉼러를 통해 고농도의 항-혈관형성 단백질의 운반을 제어할 수 있다. 생분해성 중합체 및 이들의 용도는 예컨대, 브렘(Brem) 등의 문헌(1991, J. Neurosurg. 74:441-446)에서 상세하게 기술한다.

본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 조성물들은 예컨대, 단위 용량의 주사에 의해서와 같이, 정맥내적으로 투여될 수 있다. 본 명세서의 치료적 조성물에 대한 참조로 사용될 때 용어 "단위 용량"은 피검자를 위한 단위 투여량으로서 적절한 단위를 물리적으로 분리시킨 것을 말하며, 각 단위는 요구되는 희석액, 즉, 담체 또는 운반제과 관련하여 바람직한 치료 효과를 생성시키도록 계산된 활성 물질의 미리결정된 양을 함유하고 있다.

본 발명의 조성물의 투여 모드에는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 동맥내 주사 및 주입이 포함된다. 비경구 주사를 위한 약제학적 조성물에는 제약학적으로 수용가능한 멸균 수용액 또는 멸균 비수성용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼뿐만 아니라 사용하기 바로 전에 주사가능한 멸균수 또는 분산액내로 재구성되기 위한 멸균 분말이 포함된다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석액, 용매 또는 운반제의 예에는 물, 에탄올, 폴리오이스(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카복시메틸셀룰로오스 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브 오일) 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르가 포함된다. 적당한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분무의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 또한 상기 조성물들은 방부제, 습윤제, 유화제 및 분무제와 같은 애주번트를 포함할 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등과 같은 여러 항생제 및 항진균제를 함유시킴으로써 보장될 수 있다. 또한 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 함유시키는 것이 바람직하다. 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 약제를 함유시킴으로써 가능하다. 주사가능한 데포(depot) 형태는 폴리락티드-폴리글리코리드, 폴리(오르쏘에스테르) 및 폴리(무수물)과 같은 생분해성 중합체내에 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성시킴으로써 제조된다. 중합체에 대한 약물의 비 및 사용된 특정 중합체의 성질에 따라, 약물 방출의 비가 제어될 수 있다. 또한 저장소 데포 제형들은 신체 조직과 적합성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼안에 약물을 넣음으로써 제조될 수 있다. 주사가능한 제형은 예컨대, 세균-잔류 필터를 통한 여과에 의해 또는 사용하기 바로 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능한 매질중에 용해되거나 분무될 수 있는 멸균 고형 조성물의 형태로 멸균제를 병합시킴으로써 멸균될 수 있다.

본 발명의 치료 조성물들은 상기 조성물내의 구성성분들의 제약학적으로 수용가능한 염, 예컨대 무기 또는 유기산으로부터 유도될 수 있는 염을 포함할 수 있다. "제약학적으로 수용가능한 염"은 정상적인 의학적 판단의 범위내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합하고 합리적인 장점/위험성 비와 균형을 이루는 염을 의미한다. 제약학적으로 수용가능한 염은 당분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등의 문헌[참조 : J. Pharmaceutical Sciences (1997) 66:1 et seq.]에는 제약학적으로 수용가능한 염을 상세하게 기술한다. 제약학적으로 수용가능한 염에는 예컨대, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성되는 산 부가염(폴리펩티드의 유리 아미노기와 함께 형성된)이 포함된다. 또한 유리 카르복실기와 함께 형성된 염은 예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 상기 염들은 본 발명의 화합물의 최종 분리 및 정제 동안 동일계내에서 또는 따로 유리 염기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가염에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시메탄설포네이트(이세티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트,니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙신에이트, 타르테이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, p-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 또한 염기성 질소-함유 기들은 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드와 같은 저급 알킬 할로겐화물 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 설페이트와 같은 디알킬 설페이트 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드와 같은 장쇄 할로겐화물 벤질 및 페네틸 브로마이드와 같은 아릴알킬 할로겐화물 등의 약제들로 4급화할 수 있다. 이렇게 하여 수용성, 유용성 또는 분산성 생성물이 수득된다. 제약학적으로 수용가능한 산 부가염을 형성시키기 위해 사용될 수 있는 산의 예에는 염산, 브롬산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산이 포함된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 조성물, 담체, 희석액 및 시약을 말할 때 용어 "제약학적으로 수용가능한", "생리학적으로 허용되는" 및 이들의 문법적인 변형은 번갈아 사용되며 메스꺼움, 현기증, 구토 등과 같은 바람직하지 못한 생리학적 효과를 최소화시키면서 포유류에게 투여할 수 있는 상기 물질들을 나타낸다. 용해되거나 분산되어 있는 활성 성분을 함유하는 약리학적 조성물의 제법은 당분야에서 널리 이해되고 있으며 제형을 근거로 하여 한정될 필요가 없다. 전형적으로 상기 조성물들은 용액 또는 현탁액과 같은 주사제로서 제조되지만, 사용하기 전에 용액 또는 현탁액에 적합한 액체중의 고형물 형태로 제조될 수도 있다. 또한 제조물을 에멀젼화시킬 수도 있다.

활성 성분은 본 명세서에 기술하고 있는 치료 방법에 사용하기에 적절한 양으로 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 혼화성인 부형제와 함께 혼합될 수 있다. 예를 들어, 적절한 부형제는 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올 등 및 이들의 조합을 함유한다. 추가적으로, 원하는 경우, 상기 조성물은 활성 성분의 효과를 향상시키는 습윤제 또는 유화제와 같은 보조 물질, pH 완충제 등을 소량 함유할 수 있다.

또한 본 발명의 항-혈관형성 단백질들은 프로드러그(prodrug)를 함유하는 조성물중에 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로드러그"는 생체내에서 빠르게 형질전환되어 예컨대, 혈액중에서 효소적 가수분해에 의해 모(母)화합물을 생성시키는 화합물을 말한다. 완전한 해설은 기존 문헌(참조: T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the ACS Symposium Series 및 Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Permagon Press, 1987)에서 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "제약학적으로 수용가능한 프로드러그"는 (1) 정상적인 의학적 판단의 범위이내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 동물 조직과의 접촉에 사용하기에 적합하고 적합한 위험성에 대한 장점 비와 균형을 이루고 이들의 의도된 용도를 위해 효과적인 본 발명의 화합물의 프로드러그 및 (2) 가능한 경우, 상기 모화합물의 양쪽성 이온 형태를 말한다.

본 발명의 항-혈관형성 단백질의 투여량은 치료되고 있는 질병의 상태나 상황, 인간 또는 동물의 체중 및 상태와 같은 다른 임상적 인자 및 화합물의 투여 경로에 의존할 것이다. 인간 또는 동물을 치료하기 위해, 체중 ㎏당 약 10 ㎎ 내지 약 20 ㎎의 단백질을 투여할 수 있다. 치료법들과 병행하여, 예컨대, 본 발명의 단백질들과 방사능치료, 화학요법 또는 면역요법과 함께, 예컨대, 체중 ㎏당 0.1 ㎎ 내지 약 0.2 ㎎으로 투여량을 줄일 수 있다. 특정 동물 또는 인간에서 항-혈관형성 단백질들의 반감기에 따라, 항혈관 단백질을 일주일에 한번씩 하루 당 수차례 투여할 수 있다. 본 발명이 인간과 수의학적 용도 모두를 위해 적용됨이 이해되어야 한다. 본 발명의 방법은 일제히 또는 연장된 기간에 걸쳐, 단독뿐만 아니라 다중 투여를 고려하였다. 추가적으로, 항-혈관형성 단백질들은 다른 형태의 치료법, 예컨대, 화학요법, 방사능치료 또는 면역요법과 함께 투여될 수 있다.

항-혈관형성 단백질 제형에는 경구, 직장, 눈(유리체내 또는 전방내를 포함하여), 코, 국소적(협측(頰側) 및 설하를 포함하여), 자궁내, 질 또는 비경구(피하, 복강내, 근육내, 정맥내, 두개내, 기관내 및 경막외) 투여하기에 적합한 제형이 있다. 항-혈관형성 단백질 제형은 편리하게는 단위 용량 형태로 제공될 수 있으며 통상적인 약제학적 기술에 의해 제조될 수 있다. 이런 기술들에는 활성 성분 및 약제학적 담체 또는 부형제를 조합시키는 단계가 포함된다. 일반적으로, 제형은 활성 성분과 액체 담체 또는 세밀하게 나누어진 고형 담체 또는 둘 모두를 균일하고 직접적으로 조합시킨 다음, 필요한 경우, 생성물을 성형시킴으로써 제조된다.

비경구 투여를 위해 적합한 제형에는 제형이 의도된 피검자의 혈액과 등장이되도록 하는 항산화제, 완충액, 세균 발육 저지제 및 용매를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액 및 현탁제 및 증점제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함된다. 제형은 단위 용량 또는 다중 용량 용기, 예컨대, 밀봉 앰플 및 유리병으로 제공될 수 있으며, 사용하기 바로 전에 멸균 액체 담체, 예컨대, 주사용 물의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 앞서 기술한 유형의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 단백질의 효과량이 경구적으로 투여될 때, 본 발명의 항-혈관형성 단백질들은 정제, 캡슐, 분말, 용액 또는 엘렉시르의 형태일 것이다. 정제 형태로 투여될 때, 본 발명의 약제학적 조성물은 젤라틴 또는 애주번트와 같은 고형 담체를 추가로 함유할 수 있다. 정제, 캡슐 및 분말은 본 발명의 단백질을 약 5 내지 95%, 바람직하게는 25 내지 90% 함유한다. 액체 형태로 투여될 때, 물, 석유, 땅콩 기름, 미네랄 오일, 콩기름 또는 참기름과 같은 동물 또는 식물에서 유래한 오일 및 합성 오일과 같은 액체 담체가 첨가될 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 액체 형태는 생리학적 염수, 덱스트로스 또는 다른 당용액, 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜을 추가로 함유할 수 있다. 액체 형태로 투여될 때, 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질을 약 0.5 내지 90 중량%, 바람직하게는 약 1 내지 50 중량% 함유한다.

본 발명의 단백질의 효과량이 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여될 때, 본 발명의 단백질은 발열물질이 제외된, 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. pH, 등장성, 안정성 등에 대해 적당한 상기 비경구적으로 허용되는 단백질 용액의 제조는 당분야에 공지되어 있다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사를 위해 바람직한 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질에 추가적으로 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사, 락테이트 링커 주사와 같은 등장 운반제 또는 당분야에 공지되어 있는 다른 운반제를 함유해야 한다. 또한 본 발명의 약제학적 조성물은 안정제, 방부제, 완충액, 산화방지제 또는 당분야의 숙련자에게 공지되어 있는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물중의 본 발명의 단백질의 양은 치료중인 질환의 특성 및 심한 정도 및 환자가 받은 이전 치료의 특성에 따를 것이다. 궁극적으로, 주치의는 각 개별 환자를 치료하기 위한 본 발명의 단백질의 양을 결정할 것이다. 처음에, 주치의는 소량의 본 발명의 단백질을 투여하고 환자의 반응을 관찰할 것이다. 환자가 최적의 치료 효과를 나타낼 때까지 본 발명의 단백질의 더 많은 양을 투여할 수 있으며 이 시점에서는 투여량을 추가로 증가시키지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물을 사용하는 정맥내 치료 기간은 치료중인 질환의 심한 정도 및 각 개별 환자의 상태 및 잠재적인 특이체질에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 단백질의 각각의 적용의 지속기간은 연속적인 정맥내 투여의 12 내지 24시간의 범위일 것이다. 궁극적으로 주치의는 본 발명의 약제학적 조성물을 사용하는 정맥내 치료의 적절한 지속기간을 결정할 것이다.

바람직한 단위 용량 제형은 투여된 성분의 일일 용량 또는 유닛, 일일 하위용량 또는 이들의 적절한 분할량을 함유한다. 상기에 상세히 언급하는 상기 성분에추가적으로, 본 발명의 제형은 본 제형의 타입을 가진 당분야의 통상적인 다른 약제를 함유할 수 있다. 임의로, 세포독성제가 병합되거나 아니면 항-혈관형성 단백질들 또는 이들의 생물학적으로 기능적인 단백질 단편과 결합되어 환자에게 이중 치료를 제공할 수 있다.

또한 치료 조성물은 현재 수의학적 적용에 유용하다. 특히 인간뿐만 아니라 가축 및 순혈종 말은 본 발명의 단백질을 사용하는 이런 치료를 위한 바람직한 환자이다.

리신과 같은 세포독성제는 항-혈관형성 단백질 및 이들의 단편에 결합함으로써 항-혈관형성 단백질을 결합시키는 세포를 파괴시키기 위한 도구를 제공할 수 있다. 이 세포들은 미소전이 및 일차 종양을 포함하는 많은 위치에서 발견될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 세포독성제에 결합된 단백질은 목적하는 위치로의 운반을 최대화시키기 위해 설계된 방법으로 주입된다. 예를 들어, 리신-결합된 고친화도 단편들은 캐뉼러를 통해 표적 부위를 제공하는 혈관내로 또는 직접적으로 표적내로 운반된다. 또한 상기 약제는 주입 캐뉼러에 연결된 삼투압 펌프를 통해 제어된 방법으로 운반된다. 항-혈관형성 단백질에 대한 길항제의 결합은 혈관형성 자극제와 함께 동시 적용됨으로써 조직의 혈관신생을 증가시킬 수 있다. 이런 치료 체제는 전이성 암을 파괴시키는 효과적인 수단을 제공한다.

추가적인 치료 방법에는 세포독성제에 결합된 항-혈관형성 단백질, 이들의 단편, 유사체, 항혈청 또는 수용체 촉진제 및 길항제가 포함된다. 항-혈관형성 단백질들의 원천은 인간 또는 동물일 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 항-혈관형성단백질은 화학 반응에 의해 또는 발현 시스템과 관련된 재조합 기술에 의해 합성적으로 생성될 수 있다. 또한 항-혈관형성 단백질들은 항-혈관형성 활성을 가진 단백질을 생성시키기 위해 분리된 Ⅳ형 콜라겐을 효소적으로 절단시킴으로써 생성될 수 있다. 또한 항-혈관형성 단백질은 항-혈관형성 단백질에 대해 Ⅳ형 콜라겐을 절단하는 내생적인 효소의 작용을 모방하는 화합물에 의해 생성될 수도 있다. 또한 항-혈관형성 단백질의 생성은 절단 효소의 활성에 영향을 미치는 화합물에 의해 개질될 수도 있다.

또한 본 발명은 유전자 치료법을 포함하며, 여기서 항-혈관형성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 돌연변이체, 단편 또는 융합단백질은 환자에게 도입되어 조절하게 된다. 유전자 산물 단백질을 발현시키기 위해 세포에 DNA를 이동 또는 운반시키는 다양한 방법들, 아니면 유전자 치료법으로써 언급된 방법은 기존 문헌[참조 : Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang (1992) Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356]에서 기술한다. 유전자 치료법은 생체외 또는 생체내 치료에 사용하기 위해 체세포 또는 생식세포내로 DNA 서열을 병합시키는 것을 포함한다. 유전자 치료법은 유전자들을 대체시키고, 정상적이거나 비정상적인 유전자 기능을 증가시키고, 감염성 질환 및 다른 병리에 대항하도록 하는 기능을 한다.

유전자 치료법을 사용하여 이런 의학적 문제를 치료하기 위한 전략에는 결함 유전자를 동정한 다음 기능적인 유전자를 첨가시켜 결함 유전자의 기능을 대체시키거나 약하게 기능하는 유전자를 증대시키는 것과 같은 치료 전략 또는 생성 단백질을 위한 유전자의 첨가가 질환을 치료하거나 조직 또는 기관이 치료 체제를 더욱 잘 받아들이도록 하는 예방 전략이 포함된다. 예방 전략의 예로써, 항-혈관형성 단백질을 하나 이상 인코딩하는 유전자를 환자내에 위치시킴으로써 혈관형성의 발생을 방지시키거나 종양 세포를 방사능에 더욱 민감하도록 만드는 유전자를 삽입시킨 다음 상기 종양을 조사시켜 종양 세포의 사멸을 증가시킨다.

항-혈관형성 단백질의 DNA 또는 조절 서열의 이식을 위한 많은 프로토콜들이 본 발명에서 계획되어 있다. 또한 항-혈관형성 단백질의 생성을 증가시키는 항-혈관형성 단백질과 특이적으로 관련되어 정상적으로 발견된 프로모터 서열 이외의 프로모터 서열 또는 다른 서열들의 트랜스펙션이 유전자 치료법의 방법으로서 계획되어 있다. 이런 기술의 예는 세포내에서 에리스로포이에틴을 가동시키는 "유전자 스위치"를 삽입시키기 위해 상동성 재조합기술을 사용한 기술(Transkaryotic Therapies, Inc., of Cambridge, Mass.)에서 발견된다(Genetic Engineering News, Apr. 15, 1994 참조). 상기 "유전자 스위치"는 정상적으로 상기 단백질(또는 수용체)을 발현시키지 않는 세포내에서 항-혈관형성 단백질(또는 이들의 수용체)를 활성화시키기 위해 사용될 수 있다.

유전자 치료를 위한 유전자 이식 방법은 3가지 폭넓은 범주로 구분된다: 물리적(예컨대, 일렉트로포레이션, 직접적인 유전자 이식법 및 입자 충격법), 화학적(예컨대, 지질계 담체 또는 다른 비바이러스성 벡터) 및 생물학적(예컨대, 바이러스-유도된 벡터 및 수용체 흡수). 예를 들어, DNA로 코팅된 리포좀을 포함하는 비바이러스성 벡터가 사용될 수 있다. 상기 리포좀/DNA 복합체는 환자에게 정맥내로직접 주사될 수 있다. 리포좀/DNA 복합체는 간에 집중되고 여기서 DNA를 마크로파지 및 쿠퍼세포로 운반시킨다. 추가적으로, 벡터 또는 상기 유전자의 "나신(naked)" DNA는 치료적 DNA의 표적화된 운반을 위해 바람직한 기관, 조직 또는 종양내로 직접 주사될 수 있다.

또한 유전자 치료 방법론은 운반 부위에 의해 설명될 수 있다. 유전자를 운반하는 기초적인 방법에는 생체외 유전자 이식법, 생체내 유전자 이식법 및 시험관내 유전자 이식법이 포함된다. 생체외 유전자 이식법에서는 세포를 환자로부터 취해서 세포 배양액중에 성장시킨다. 상기 DNA를 세포내로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포를 수적으로 부풀린 다음 환자에게 재주입시킨다. 시험관내 유전자 이식법에서 형질전환된 세포는 특정 환자로부터의 특정한 세포가 아니라, 조직 배양 세포와 같은 배양액중에 성장중인 세포이다. 이런 "실험실 세포"를 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포를 선별하고 부풀려서 환자에게 주입시키거나 다른 용도로 사용한다.

생체내 유전자 이식법은 세포가 환자내에 존재할 때 환자의 세포내로 DNA를 도입시키는 것과 관련이 있다. 방법은 비감염성 바이러스를 사용하는 바이러스 매개된 유전자 이식을 사용하여 환자에게 상기 유전자를 운반시키거나 나신 DNA를 환자의 부위내로 주사함을 포함하며 상기 DNA는 유전자 생성 단백질이 발현되는 세포의 백분율에 의해 취해진다. 추가적으로, "유전자 총(gene gun)"의 사용과 같은 본 명세서에서 기술하는 다른 방법들을 사용하여 항-혈관형성 단백질의 생성을 제어하는 DNA 또는 조절 서열들을 시험관내에서 삽입시킬 수 있다.

유전자 치료의 화학적 방법은 지질을 기재로 하는 화합물(반드시 리포좀은 아님)과 관련되어 있어서 세포막을 통과하여 DNA를 이동시킬 수 있다. 음전하를 띠는 DNA에 결합하는 지질을 기재로 하는 양이온들인 리포펙틴(lipofectin) 또는 사이토펙틴(cytofectin)은 세포막을 통과하여 DNA를 세포의 내부에 제공할 수 있는 복합체를 만든다. 또 다른 화학적 방법은 수용체를 기재로 하는 엔도사이토시스를 이용하며, 이것은 특이적인 리간드를 세포 표면 수용체에 결합시키는 것 및 상기 리간드를 둘러싸서 세포막을 통과하여 이동시키는 것과 관련되어 있다. 상기 리간드는 상기 DNA에 결합하여 전체 복합체를 세포내로 이동시킨다. 상기 리간드 유전자 복합체는 혈류내로 주사된 다음 상기 수용체를 가진 표적 세포는 상기 리간드에 특이적으로 결합하여 상기 리간드-DNA 복합체를 세포내로 이동시킬 것이다.

많은 유전자 치료 방법론들이 세포내로 유전자들을 삽입시키기 위해 바이러스 벡터를 사용한다. 예를 들어, 개질된 레트로바이러스 벡터들은 종양이 침윤중인 림프구, 간세포, 상피세포, 근세포 또는 다른 체세포내 및 이들의 주변으로 유전자들을 도입시키기 위한 생체외 방법에 사용되고 있다. 그 다음, 상기 개질된 세포들은 환자에게 도입되어 삽입된 DNA로부터 유전 산물을 제공하게 된다.

또한 바이러스 벡터들은 생체내 프로토콜을 사용하여 세포내로 유전자를 삽입시키기 위해 사용되고 있다. 외래 유전자의 조직 특이적인 발현을 위해, 조직 특이적이라고 공지되어 있는 시스-액팅(cis-acting) 조절 요소를 사용할 수 있다. 또한, 이것은 생체내 특정 해부학적 부위로 DNA 또는 바이러스 벡터의 동일계내 운반을 사용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 생체내에서의 혈관으로의 유전자 이동은 동맥벽의 선택된 부위에 시험관내에서 형질도입된 내피 세포를 이식함으로써 달성되었다. 바이러스는 상기 유전자 산물을 발현시키는 주위 세포들을 감염시킨다. 바이러스 벡터는 예컨대, 카테터를 통해 생체내 부위로 직접적으로 운반됨으로써 특정 지역만 바이러스에 의해 감염되도록 하여 장기간 부위 특이적인 유전자 발현을 제공할 수 있다. 또한 레트로바이러스 벡터를 사용하는 생체내 유전자 이식은 개질된 바이러스를 혈관내에 주입하여 기관에 이르도록 함으로써 포유류 조직 및 간조직에서 증명되었다.

유전자 치료 프로토콜을 위해 사용되고 있는 바이러스 벡터들에는 레트로바이러스, 폴리오바이러스 또는 신드비스바이러스와 같은 다른 RNA 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, SV 40, 백시니아 및 다른 DNA 바이러스들이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 복제 결함 뮤린 레트로바이러스 벡터는 가장 널리 사용되는 유전자 이식 벡터이다. 뮤린 백혈병 레트로바이러스는 핵 코어 단백질 및 중합효소(pol)와 복합체를 이루고 있는 단일 가닥 RNA로 구성되어 있으며, 단백질 코어(gag)에 의해 싸여있고 숙주 범위를 결정짓는 당단백질 외피(env)에 의해 둘러싸여있다. 레트로바이러스의 지놈 구조에는 5' 및 3' 긴 말단 반복서열(LTR)에 의해 둘러싸인 gag, pol 및 env가 포함된다. 레트로바이러스 벡터 시스템은 5' 및 3' LTR 및 패키징 신호를 포함하는 최소한의 벡터가 벡터 패키징, 감염 및 트랜스 방식으로 패키징 세포주에 공급되는 바이러스 구조단백질을 제공하는 표적 세포내로 통합시키기에 충분하다는 사실을 이용한다. 유전자 이식을 위한 레트로바이러스 벡터의 근본적인 장점에는 대부분의 세포 타입에서의 효율적인 감염 및 유전자 발현, 표적 세포 염색체 DNA내로의 정교한 단일 복사본 벡터의 통합 및 레트로바이러스 지놈의 조작의 용이성이 포함된다.

아데노바이러스는 코어 단백질과 복합체를 이룬 선형의 이중 가닥 DNA 및 이를 둘러싸고 있는 캡시드 단백질로 구성되어 있다. 분자 바이러스학의 발달로 말미암아 상기 생물체의 생물학을 이용하여 생체내에서 새로운 유전자 서열을 표적 세포내로 형질도입시킬 수 있는 벡터를 제조할 수 있게 되었다. 아데노바이러스를 기본으로 하는 벡터들은 유전자 생성 단백질을 높은 수준으로 발현시킬 것이다. 아데노바이러스 벡터들은 바이러스의 역가는 낮지만 감염성의 효율이 높다. 또한 상기 바이러스는 무세포 비리온으로서 충분히 감염성이기 때문에 생산자 세포주의 주입이 필요치 않다. 아데노바이러스 벡터의 또 다른 잠재적인 장점은 생체내에서 이형 유전자를 장기간 발현시킬 수 있다는 점이다.

DNA를 운반시키는 기계적인 방법에는 리포좀과 같은 푸소제닉(fusogenic) 지질 운반제 또는 막 융합을 위한 다른 운반제, 리포펙틴과 같은 DNA 병합 양이온 지질의 지질 입자, DNA의 폴리리신-매개된 이식, 생식세포 또는 체세포내로의 DNA의 미세주사와 같은 DNA의 직접적인 주사법, "유전자 총"에 사용되는 금 입자와 같은 DNA 코딩된 입자의 압축공기를 사용한 운반법 및 인산칼슘 트랜스펙션과 같은 무기 화학적 접근법이 포함된다. 입자-매개된 유전자 이식 방법은 식물 조직을 형질전환시키는 데에 최초로 사용되었다. 입자 충격 장치 또는 "유전자 총"에 있어서, 동력을 생성시켜 표적 기관, 조직 또는 세포를 관통할 수 있는 고속으로 DNA-코팅된 고밀도 입자(금 또는 텅스텐과 같은)를 가속시켰다. 입자 충격법은 세포, 조직 또는기관내로 DNA를 도입시키기 위해 시험관 시스템에서, 또는 생체외 또는 생체내 기술과 함께 사용될 수 있다. 또 다른 방법인 리간드-매개된 유전자 치료법은 특이적인 리간드와 DNA가 복합체를 형성하여 특이적인 세포 또는 조직과 DNA가 직접 리간드-DNA 공액체를 형성하는 것과 관련되어 있다.

근육세포내로의 플라스미드 DNA의 주사는 트랜스펙션되어 마커 유전자의 발현을 지속시키는 세포의 백분율을 증가시킴이 밝혀졌다. 플라스미드의 DNA는 세포의 지놈내에 통합되거나 되지 않을 수 있다. 트랜스펙션된 DNA의 비통합은 세포 지놈 또는 미토콘드리아 지놈내의 돌연변이적인 삽입, 결실 또는 변화의 우려없이 연장된 기간 동안 말기에 분화된 비증식성 조직에서의 유전자 생성 단백질의 발현 및 트랜스펙션을 가능하도록 해줄 것이다. 반드시 영구적인 것은 아니지만, 특정 세포내로 치료 유전자의 장기간 이식은 유전자 질환 또는 예방 용도를 위한 치료를 지공할 수 있다. 상기 DNA는 주기적으로 재접종됨으로써 수용세포의 지놈에서 발생하는 돌연변이 없이 유전자 산물의 수준을 유지시킬 수 있다. 외인성 DNA의 비통합은 하나의 세포내의 여러 가지 다른 외인성 DNA 구조체와 여러 유전자 산물들을 발현시키는 구조체 모두가 공존하도록 해줄 수 있다.

유전자 이식을 위한 일렉트로포레이션은 전류를 사용하여 세포 또는 조직이 일렉트로포레이션-매개된 유전자 이식에 적합하도록 만든다. DNA 분자들을 세포내로 관통시킬 수 있는 방법으로 막의 투과성을 증가시키기 위해 주어진 장의 세기를 사용하는 짧은 전기적 충격이 사용된다. 이 기술은 세포, 조직 또는 기관내로 DNA를 도입시키기 위해 시험관 시스템에서, 또는 생체외 또는 생체내 기술과 함께 사용될 수 있다.

생체내에서 담체 매개된 유전자 이동법은 외래 DNA를 세포내로 트랜스펙션시키기 위해 사용될 수 있다. 담체-DNA 복합체를 통상적으로 체액 또는 혈액내로 도입시킨 다음 체내의 표적 기관 또는 조직에 대해 부위 특이적으로 처리할 수 있다. 폴리리신, 리포펙틴 또는 사이토펙틴과 같은 리포좀 및 폴리양이온 둘 모두를 사용할 수 있다. 리포좀은 세포 특이적 또는 기관 특이적이 되도록 개발될 수 있어서 리포좀에 의해 운반된 외래 DNA는 표적 세포에 의해 취해질 것이다. 특정 세포상의 특이적인 수용체에 대해 표적화된 면역리포좀의 주사는 상기 수용체를 지닌 세포내로 DNA를 삽입시티는 편리한 방법으로서 사용될 수 있다. 사용되고 있는 또 다른 담체 시스템은 생체내 유전자 이식을 위해 간세포에 DNA를 운반시키기 위한 아시알로당단백질/폴리리신 공액체 시스템이다.

또한 트랜스펙션된 DNA는 다른 유형의 담체와 복합체를 이룬 다음 상기 DNA는 수용세포로 운반됨으로써 세포질 또는 핵질에 존재할 수 있다. DNA는 특별히 유전조작된 운반제 복합체에서 담체 핵 단백질과 커플링되어 핵내로 직접 운반될 수 있다.

항-혈관형성 단백질의 유전자 조절은 항-혈관형성 단백질중 하나를 인코딩하는 유전자, 상기 유전자와 관련된 제어 영역, 또는 전사 또는 번역의 속도를 변화시키기 위한 이의 상응하는 RNA 전사체에 결합하는 화합물을 투여함으로써 수행될 수 있다. 또한, 항-혈관형성 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 사용하여 트랜스펙션시킨 세포들은 상기 단백질들의 생체내 공급원을 제공하기 위해 환자에게 투여될수 있다. 예를 들어, 세포를 항-혈관형성 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 트랜스펙션시킬 수 있다. 트랜스펙션된 세포들은 환자의 정상 조직, 환자의 질병 조직으로부터 유도된 세포 또는 비환자 세포일 수 있다.

가령, 환자로부터 제거된 종양 세포들은 본 발명의 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터를 사용하여 트랜스펙션되어, 환자에게 재도입될 수 있다. 트랜스펙션된 종양 세포는 환자의 체내에서 종양의 성장을 억제시키는 수준의 단백질을 생성한다. 환자들은 인간 또는 인간 이외의 동물일 수 있다. 또한 세포들은 벡터를 사용하지 않거나 일렉트로포레이션, 이오노포레이션 또는 "유전자 총"을 통한 방법과 같은 당분야에 공지된 물리적 또는 화학적 방법에 의해 트랜스펙션될 수 있다. 또한, 상기 DNA는 담체의 도움없이, 환자내로 직접 주사될 수도 있다. 상세하게는, 상기 DNA는 피부, 근육 또는 혈액내로 주사될 수 있다.

환자 체내로 항혈관혈성 단백질을 트랜스펙션시키기 위한 유전자 치료 프로토콜은 세포의 지놈내로, 미니염색체내로 항-혈관형성 단백질 DNA를 통합시켜 수행하거나 세포의 세포질 또는 핵질내의 분리된 복제 또는 비복제 DNA 구조체로서 할 수 있다. 항-혈관형성 단백질의 발현은 장기간 동안 계속될 수 있거나 주기적으로 재접종되어 세포, 조직 또는 기관 또는 결정된 혈액 수준에서 바람직한 수준의 단백질(들)을 유지시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 항체 및 항혈청을 포함하며, 이것들은 새로운 항-혈관형성 단백질을 시험하기 위해 사용될 수 있으며, 항-혈관형성 활성 또는 이들의 결여와 관련되거나 이에 의해 특징화되는 질병이나 질환의 진단, 예후(豫後) 또는 치료에사용될 수도 있다. 또한 상기 항체 및 항혈청은 바람직한 부위, 예컨대, 경색후 심장 조직에서의 혈관형성을 상향조절하기 위해 사용될 수 있고, 본 발명의 단백질에 대한 항체 또는 항혈청은 국부화된 본래의 항-혈관형성 단백질 및 과정을 방해하고, 새로운 혈관의 형성을 증가시켜 심장조직의 퇴화를 억제시키기 위해 사용될 수 있다.

상기 항체 및 항혈청은 제약학적으로 수용가능한 조성물과 결합하여 진단적, 예후적 또는 치료적 조성물을 형성할 수 있다. 용어 "항체" 또는 "항체 분자"는 면역글로불린 분자 및/또는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 항체 결합 부위 또는 파라토프를 함유하는 분자의 군집을 말한다.

항-혈관형성 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 수동적 항체 치료법은 생식, 발생 및 상처 치유 및 조직 치료와 같은 혈관형성 의존성 과정을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 항-혈관형성 단백질의 항체의 Fab 영역에 직접적인 항혈청을 투여하여 상기 단백질에 결합하는 단백질에 대한 내인성 항혈청의 능력을 방해할 수 있다.

또한 본 발명의 항-혈관형성 단백질들은 억제제(들) 및 수용체(들)에 대해 특이적인 항체들을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 항체들은 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 항-혈관형성 단백질 또는 이들의 수용체에 특이적으로 결합하는 항체들은 체액 또는 조직에서 항-혈관형성 단백질 또는 이들의 수용체를 검출하고 정량하기 위해 당분야의 숙련자에게 널리 공지된 진단 방법 및 키트에 사용될 수 있다. 상기 시험으로부터의 결과들은 암 및 다른 혈관형성 매개된 질환들의 발생 또는 재발을 진단하거나 예측하기 위해 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 항-혈관형성 단백질, 상기 단백질에 대한 항체 및 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환의 진단 또는 예후에서 상기 단백질 및/또는 이들의 항체를 함유하는 조성물의 용도를 포함한다. 본 명세서에 사용하는 바와 같이, 용어 "예후 방법"은 상기 질환, 상세하게는, 혈관형성 의존성 질환을 가진 것으로 진단된 인간 또는 동물의 질환의 진행에 대한 예측을 가능하도록 해주는 방법을 의미한다. 본 명세서에 사용하는 바와 같은 용어 "진단 방법"은 인간 또는 동물에서 혈관형성 의존성 질환의 존재 및 타입의 결정을 가능하도록 해주는 방법을 의미한다.

상기 항-혈관형성 단백질들은 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체를 검출하고 정량하기 위한 진단 방법 및 키트에 사용될 수 있다. 상기 키트는 동일계내에서 일차 종양에 의해 분비된 항-혈관형성 단백질의 존재하에 미소전이의 분포를 나타내는 항-혈관형성 단백질에 대한 순환하는 항체들을 검출할 수 있도록 해줄 것이다. 상기 순환하는 항-단백질 항체를 가진 환자들은 다중 종양 및 암이 발생할 가능성이 높을 것 같으며, 치료 또는 완화기간 후에 암이 재발할 수 있는 가능성이 높을 것 같다. 상기 항-단백질 항체의 Fab 단편들을 항원으로서 사용하여 항-단백질 항체를 중화시키기 위해 사용될 수 있는 항-단백질 Fab 단편 항혈청을 생성시킬 수 있다. 이런 방법은 항-단백질 항체에 의해 순환하는 단백질의 제거를 감소시킴으로써 항-혈관형성 단백질들의 순환 수준을 효과적으로 상승시킬 것이다.

또한 본 발명은 항-혈관형성 단백질에 대해 특이적인 수용체의 분리를 포함한다. 조직에 결합하는 높은 친화도를 가진 단백질 단편들은 친화도 칼럼상에서 항-혈관형성 단백질들의 수용체를 분리시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 수용체(들)의 분리 및 정제는 항-혈관형성 단백질의 작용의 메커니즘을 밝혀내기 위한 근본적인 단계이다. 수용체의 분리 및 촉진제 및 길항제의 동정은 생물학적 활성을 위한 최종 경로인 상기 수용체의 활성을 조절하기 위한 약물의 개발을 촉진시킬 것이다. 수용체의 분리는 뉴클레오티드 프로브의 제조를 가능하게 함으로써 동일계 및 용액 혼성화 기술을 사용하여 상기 수용체의 위치 및 합성을 모니터링할 수 있도록 한다. 추가로, 상기 수용체에 대한 유전자를 분리시켜, 발현 벡터내에 통합시키고 환자 종양세포와 같은 세포내에 트랜스펙션시켜 항-혈관형성 단백질에 결합하는 세포 타입, 조직 또는 종양의 능력을 증가시키고 국부적인 혈관형성을 억제시킬 수 있다.

항-혈관형성 단백질들은 배양된 종양 세포로부터의 항-혈관형성 단백질에 대한 수용체(들)의 분리를 위한 친화도 칼럼을 개발하기 위해 사용된다. 상기 수용체의 분리 및 정제에 이어서 아미노산 서열분석을 수행한다. 이런 정보를 사용하여 상기 수용체를 코딩하는 유전자 또는 유전자들을 동정하고 분리시킬 수 있다. 다음으로, 클로닝된 핵산 서열을 상기 수용체를 발현시킬 수 있는 벡터내로 삽입시키기 위해 개발한다. 이런 방법들은 당분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 종양 세포내로의 상기 수용체를 코딩하는 핵산 서열(들)의 트랜스펙션 및 트랜스펙션된 종양 세포에 의한 상기 수용체의 발현은 내인성 또는 외인성 항-혈관형성 단백질에 대한 상기 세포들의 반응성을 향상시킴으로써 전이성 성장의 속도를 감소시킨다.

본 발명의 혈관형성 억제 단백질들은 표준 미량화학적 설비에서 합성할 수있고 순도는 HPLC 및 질량 분광 광도법을 사용하여 검사할 수 있다. 단백질 합성의 방법, HPLC 정제 및 질량 분광 광도법은 당분야의 숙련자에게 보편적으로 공지되어 있다. 또한 항-혈관형성 단백질 및 이들의 수용체 단백질들은 재조합 대장균 또는 효모 발현 시스템에서 생성되어 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제된다.

온전한 항-혈관형성 단백질의 다른 단백질 단편들은 특이적인 항혈청의 개발을 위한 항원, 항-혈관형성 단백질의 결합 부위에 활성인 촉진제 및 길항제, 항-혈관형성 단백질에 결합하는 세포의 표적화된 사멸을 위한 세포독성제에 연결되어 있거나 상기 세포독성제와 함께 사용되는 단백질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 여러 가지 적용에 사용하기 위해 합성될 수 있다.

항-혈관형성 단백질의 합성 단백질 단편들은 다양한 용도를 가지고 있다. 높은 특이성 및 결합성을 가진 항-혈관형성 단백질의 수용체(들)에 결합하는 단백질을 방사능표지시키고 자동방사능사진 및 막결합 기술을 사용하여 결합 부위의 가시화 및 정량을 위해 사용한다. 이런 응용법은 중요한 진단적 및 연구 도구를 제공한다. 상기 수용체(들)의 결합 특성에 대한 지식은 상기 수용체(들)에 연결된 형질도입 메커니즘의 연구를 촉진시켰다.

항-혈관형성 단백질 및 상기 수용체로부터 유도된 단백질은 표준 방법을 사용하여 다른 분자와 커플링될 수 있다. 항-혈관형성 단백질의 아미노 및 카르복실 말단 둘 모두는 티로신 및 리신 잔기를 포함하고 있고 많은 기술들, 예컨대, 통상적인 기술(티로신 잔기-클로르아민 T, 요오도겐, 락토페록시다제 리신 잔기-볼튼-헌터 시약)을 사용하는 방사능표지법을 사용하여 동위원소 및 비동위원소로 표지된다. 이런 커플링 기술은 당분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 또한, 티로신 또는 리신을 상기 잔기들을 가지지 않은 단편들에 첨가함으로써 상기 단백질상에 방사능 아미노 및 하이드록실 기의 표지를 촉진시킨다. 커플링 기술은 아미노, 설프하이드랄, 카르복실, 아미드, 페놀 및 이미다졸을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 아미노산상에 이용가능한 기능기들을 근거로 하여 선택된다. 이런 커플링을 달성하기 위해 사용된 여러 시약들에는 그 중에서도 글루타르알데히드, 디아조화된 벤지딘, 카보디이미드 및 p-벤조퀴논이 포함된다.

항-혈관형성 단백질은 동위원소, 효소, 담체 단백질, 세포독성제, 형광성 분자, 화학발광제, 생물발광제 및 여러 적용을 위한 다른 화합물과 화학적으로 커플링된다. 커플링 반응의 효율은 특정 반응에 적합한 다른 기술들을 사용하여 결정된다. 예를 들어,¹²⁵I를 사용한 본 발명의 단백질의 방사능표지는 고특이적 활성의 클로르아민 T 및 Na¹²⁵I를 사용하여 수행된다. 상기 반응은 나트륨 메타바이설피트를 사용하여 종결되며 이 혼합물은 일회용 칼럼상에서 탈염화된다. 표지된 단백질은 칼럼으로부터 용리되고 분획이 수집된다. 분취액은 각 분획으로부터 제거되며 방사능은 감마 계수기중에서 측정된다. 이 방법에서, 반응하지 않은 Na¹²⁵I는 표지된 단백질로부터 분리된다. 가장 높은 특이적인 방사능을 가진 단백질 분핵을 항-혈관형성 단백질의 항혈청에 결합하는 능력의 분석과 같은 차후 사용을 위해 보관한다.

추가적으로, 반감기가 짧은 동위원소를 사용하는 항-혈관형성 단백질의 표지는 양전자 방출 단층 촬영법 또는 다른 현대 방사능사진 기술을 사용하여 생체내에서 수용체 결합 부위를 가시화시킴으로써 상기 단백질의 결합 부위를 사용하여 종양의 위치를 결정할 수 있다.

상기 합성된 단백질의 범위내에서 아미노산들의 전신적인 치환은 수용체(들)에 대한 결합을 향상시키거나 감소시키는 항-혈관형성 단백질들의 수용체(들)에 대한 높은 친화도 단백질 촉진제 및 길항제를 생성시킨다. 상기 촉진제들을 사용하여 미소전이의 성장을 억제시킴으로써 암의 확산을 제한시킨다. 항-혈관형성 단백질에 대한 길항제는 불충분한 혈관신생의 상황에 적용됨으로써 항-혈관형성 단백질의 억제 효과를 방해하여 혈관형성을 촉진시킨다. 예를 들어, 이런 치료는 당뇨병에서의 상처 치유를 촉진시키는 치료적 효과를 가질 수 있다.

본 발명은 하기 실시예들에 의해 추가로 예증되며, 실시예들은 이에 의하여 범위를 한정시키는 방식으로 해석됨을 의미하는 것이 아니다. 대조적으로, 본 발명의 의지는 여러 다른 구체예, 수정 및 이에 의한 균등물을 가질 수 있으며, 본 명세서의 설명을 읽은 후에는, 본 발명의 사상 및/또는 덧붙인 청구항의 범위로부터 벗어남이 없이 당분야의 숙련자 자신들에게 제안될 수 있음이 명백하게 이해되어야 한다.

실시예 1: 고유 아레스텐의 분리.

아레스텐은 사람 태반과 양막 조직으로부터 ㎎ 단위의 수량으로 생산될 수 있다. 아레스텐 및 유사한 단백질을 분리하는 프로토콜은 다른 연자에 의해 보고되었다(Langeveld, J.P. et al., 1988, J Biol. Chem. 263:10481-8; Saus, J. et al., 1988, J Biol. Chem. 263.13374-80; Gunwar, S. et al., 1990, J Biol. Chem. 265:5466-9; Gunwar S. et al., 1991, J Biol. Chem. 266:15318-24; Kahsai, T.Z. et al., 1997, J Biol. Chem. 272:17023-32). 아레스텐의 재조합 형태의 생산은 Neilson et al.(1993, J Biol. Chem. 268.8402-6)에서 기술한다. 상기 단백질은 293 신장 세포에서 발현될 수도 있다(예로써 Holienester, E. et al., 1998, EMBO J 17:1656-64에 기술된 방법으로). 아레스텐은 Pihlajaniemi, T. et al.(1985, J Biol. Chem. 260:7681-7)의 방법에 따라 분리될 수도 있다.

Ⅳ형 콜라겐의 α1 사슬의 NC1 도메인의 뉴클레오티드(SEQ ID NO: 1)와 아미노산(SEQ ID NO: 2) 서열은 도 1에 도시하는데, 이들은 GenBank 수탁 번호 M11315에 해당한다(Brinker, J.M. et al., 1994). 일반적으로, 아레스텐은 Ⅳ형 콜라겐의 α1 사슬의 NC1 도메인 및 선택적으로 접합 영역을 포함하는데, 상기 영역은 NC1 도메인 바로 직전의 12개 아미노산이다.

고유 아레스텐은 박테리아 콜라게나제, 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, HPLC, 친화성 크로마토그래피를 이용하여 사람 태반으로부터 분리하였다(Gunwar, S. et al., 1991, J Biol. Chem. 266:15318-24; Weber, S. et al., 1984, Eur. J Biochem. 139.401-10). 사람 태반으로부터 분리된 IV 콜라겐 단량체는 C-18 소수성 칼럼(Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA)을 이용하여 HPLC-정제하였다. 구성 단백질은 아세토니트릴 구배(32% - 39%)로 분리하였다. 주요 피크는 가시적이고 작은 이중 피크이었다. SDS-PAGE 분석에서, 제 1 피크에서는 2개의 밴드가 확인되었지만 제 2 피크에서는 탐지가능한 단백질이 발견되지 않았다. 면역블랏팅에서도 제 2 피크에서는 면역탐지가능한 단백질이 발견되지 않았으며. 주요 피크는 아레스텐로 동정되었다.

실시예 2: 대장균( E. Coli )에서 아레스텐의 재조합 생산.

아레스텐을 인코드하는 서열은 정방향 프라이머 5'-CGG GAT CCT TCT GTT GAT CAC GGC TTC-3'(SEQ ID NO: 3) 및 역방향 프라이머 5'-CCC AAG CTT TGT TCT TCT CAT ACA GAC-3'(SEQ ID NO: 4)을 이용하여 α1 NC1(Ⅳ)/pDS 벡터(Neilson, E.G. et aL, 1993, J. Biol. Chem. 268:8402-5)로부터 PCR 증폭하였다. 결과의 cDNA 단편은 BamHI과 HindⅢ으로 절단하고 사전절단된 pET22b(+)(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 결찰시켰다. 상기 구조체는 도 2에 도시한다. 이런 결찰은 아레스텐을 pelB 리더 서열의 하류에 인-프레임(in-frame)하게 위치시켜 가용성 단백질의 주변세포질 정위(periplasmic localization)와 발현을 가능하게 하였다. 아미노산 MDIGINSD(SEQ ID NO: 13)을 인코드하는 추가의 벡터 서열을 상기 단백질에 부가하였다. 상기 서열의 3' 말단은 폴리히스티딘 태그 서열에 인-프레임하게 결찰시켰다. 상기 cDNA의 3' 말단과 his-태그 사이의 추가의 벡터 서열은 아미노산 KLAAALE(SEQ ID NO: 14)를 인코드하였다. 양성 클론은 양 가닥에서 서열분석하였다.

아레스텐을 인코드하는 플라스미드 구조체는 발현을 위하여 대장균(E. coli) HMS 174(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 형질전환시키고, 이후 BL21(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 형질전환시켰다. 하룻밤 박테리아 배양액을 사용하여 LB 배지의 500 ㎖ 배양액에 접종하였다. 상기 배양액은 세포가 0.6의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 대략 4시간동안 성장시켰다. 이후, 1-2 mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 2시간 유도후, 세포는 5000 x g에서 원심분리하여 수확하고 6M 구아니딘, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)에서 재현탁하여 용해시켰다. 재현탁된 세포는 짧게 초음파처리하고, 30분동안 12,000 x g에서 원심분리하였다. 상층액 분획물은 5 ㎖ Ni-NTA 아가로즈 칼럼(Qiagen, Hilden, Germany)에 분당 2 ㎖ 속도로 4 내지 6회 통과시켰다. 특이적으로 결합되지 않은 단백질은 8M 요소, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)에서 10 mM과 25 mM 이미다졸로 세척하여 제거하였다. 아레스텐 단백질은 8M 요소, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)에서 증가하는 농도(50 mM, 125 mM, 250 mM)의 이미다졸로 칼럼으로부터 용리시켰다. 용리된 단백질은 4℃에서 PBS에 2회 투석하였다. 전체 단백질중 일부가 투석동안 침전되었다. 투석된 단백질은 수집하고 대략 3500 x g에서 원심분리하며 펠렛과 상층액 분획물로 분리하였다. 각 분획물에서 단백질 농도는 BCA 분석법(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) 및 정량적 SDS-PAGE 분석법으로 측정하였다. 펠렛에서 전체 단백질의 분획물은 대략 22%이었고, 나머지 78%는 가용성 단백질로 회수되었다. 단백질의 전체 수확량은 대략 10 ㎎/ℓ이었다.

대장균(E. coli)-발현된 단백질은 주로 가용성 단백질로 분리되는데, SDS-PAGE에서 29 kDa의 단량체 밴드가 확인되었다. 다른 3 kDa는 폴리링커와 히스티딘태그 서열에 기인하고 아레스텐과 6-히스티딘 태그 항체에 의해 면역탐지되었다.

실시예 3: 293 태아 신장 세포에서 아레스텐의 발현.

α1(Ⅳ)NC1을 포함하는 pDS 플라스미드를 이용하여, 리더 신호 서열이 pcDNA 3.1 진핵 발현 벡터(Invitrogen, San Diego, California, USA)에 인-프레임하게 부가되도록 하는 방식으로 아레스텐을 증폭하였다. 전장 α1(Ⅳ) 사슬의 5' 말단으로부터 유래된 리더 서열은 NC1 도메인의 5'에 클론하여 배양 배지로 단백질이 분비되도록 하였다. 아레스텐-포함 재조합 벡터는 측면에서 접하는 프라이머를 이용하여 서열분석하였다. 오류-없는 cDNA 클론은 더욱 정제하고, 단백질 발현을 확증하기 위한 시험관내 번역 연구에 사용하였다. 아레스텐-포함 플라스미드와 대조 플라스미드는 염화칼슘 방법으로 293 세포를 트랜스펙션시키는데 사용하였다. 트랜스펙션된 클론은 제네티신(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) 항생제 처리로 선별하였다. 세포는 세포 사멸이 보이지 않을 때까지 상기 항생제의 존재하에 3주동안 계대배양하였다. 클론은 T-225 플라스크로 확대하고 합류 수준까지 성장시켰다. 이후, 상층액을 수집하고 Amicon 농축장치(Amicon. Inc., Beverly, Massachusettes, USA)를 이용하여 농축하였다. 농축된 상층액은 SDS-PAGE, 면역블랏팅, ELISA로 아레스텐 발현을 분석하였다. 상층액에서 강한 결합이 ELISA에 의해 탐지되었다. SDS-PAGE 분석에서 대략 30 kDa의 단일 주요 밴드가 확인되었다. 아레스텐-포함 상층액은 아레스텐-특이적 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피를 실시하였다(Gunwar, S. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15318:24). 주요 피크가 확인되었는데, 이는 아레스텐 항체와 면역반응하는대략 30 kDa의 단량체를 내포하였다. 배양액 ℓ당 대략 1-2 ㎎의 재조합 아레스텐이 생산되었다.

실시예 4: 아레스텐은 내피 세포 증식을 저해한다.

C-PAE 세포는 10% 소 태아 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM에서 합류 수준까지 성장시키고 48시간동안 접촉을 금지하였다. 대조 세포는 786-0(신장암) 세포, PC-3 세포, HPEC 세포, A-498(신장암) 세포이었다. 세포는 37℃에서 5분동안 트립신처리(trypsinization)(Life Technologies/Gibeo BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)로 수확하였다. 1% FCS를 함유하는 DMEM에서 12,500 세포의 현탁액은 10 ㎍/㎖ 피브로넥틴으로 피복된 24-웰 평판의 각 웰에 첨가하였다. 세포는 37℃, 5% C0₂, 95% 습도에서 24시간동안 배양하였다. 배지는 제거하고 0.5% FCS와 3 ng/㎖ bFGF(R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)를 함유하는 DMEM으로 교체하였다. 자극받지 않은 대조에는 bFGF를 첨가하지 않았다. 세포는 0.01 내지 50 ㎍/㎖ 농도의 아레스텐 또는 엔도스타틴으로 처리하였다. 모든 웰에는 처리 시점에서 1 μCurie의³H-티민딘이 첨가되었다. 24시간후, 배지는 제거하고, 웰은 PBS로 세척하였다. 세포는 1N NaOH로 추출하고 4 ㎖ ScintiVerse Ⅱ(Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) 용액을 담은 신틸레이션 바이알에 첨가하였다. 티미딘 병합은 신틸레이션 계수기를 이용하여 측정하였다. 결과는 도 3A와 3B에 도시하는데, 이들은 다양한 함량의 아레스텐(도 3A)과 엔도스타틴(3 B)으로 처리된 C-PAE 세포로의³H-티미딘 병합을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 아레스텐은 엔도스타틴처럼 C-PAE에서 티미딘 병합을 저해하는 것으로 나타났다. 아레스텐과 엔도스타틴으로 처리된 대조 세포의 반응은 도 4A, 4B, 4C, 4D에 도시하는데, 아레스텐은 786-0 세포(도 4A), PC-3 세포(도 4B) 또는 HPEC 세포(도 4C)에 별다른 영향을 주지 않았다. 엔도스타틴은 A-498 세포(도 4D)에 별다른 영향을 주지 않았다. 도 3과 4에서 모든 군은 삼중 시료를 대표한다.

실시예 5: 아레스텐은 내피 세포에서 아폽토시스를 유도한다.

1O% FBS로 보충된 DMEM에서 6-웰 조직 배양 평판의 각 웰에 5만개의 C-PAE 세포를 12시간동안 첨가하였다. 새로운 배지 및 5 ㎍/㎖ 아레스텐 또는 40 ng/㎖ TNF-α(양성 대조)를 2, 4, 6시간 시점에 첨가하였다. 대조 웰에는 동동 부피의 PBS를 첨가하였다. 분리된 세포와 부착된 세포는 함께 모으고 1500 rpm에서 원심분리하였다. 세포는 접합 완충액(Clontech, Palo Alto, California, USA)으로 세척하고, 아폽토시스의 지표인 포스파티딜세린(PS) 외부화(externalization)는 제조업자의 지시에 따라 FITC-표지된 아넥신 V(Clontech, Palo Alto, California, USA)로 표지(labeling)하여 측정하였다. 아넥신-FITC 표지된 세포는 FACStar Plus 유세포분석기(Becton-Dickinson, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 계산하였다. 각 처리에서, 10,000개의 세포가 계산되고 저장되었다. 이후, 이들 데이터는 표준 Cell Quest 소프트웨어(Becton-Dickinson, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 분석하였다. 대조와 비교하여, 아넥신-V-염색된(아폽토시스) 세포의 비율은 2시에 대략 27%로 증가하였고, 양성 대조인 TNFα에서 4시와 6시에 대략 20%이었다. 아레스텐-처리된 세포에서, 아폽토시스 세포의 비율은 2시에 대략 18%, 4시와 6시에 대략 23%이었다. 실험동안 내피 세포 형태 변화 역시 관찰되는 반면, 대조 세포는 별다른 변화를 보이지 않고, 아레스텐-처리되고 비-부착된 세포는 아폽토시스를 시사하는 세포 형태에서 변화를 보였다.

실시예 6: 아레스텐은 내피 세포 이동을 저해한다.

FBS-유도된 화학주성에 대한 아레스텐과 엔도스타틴의 저해 효과는 Boyden 챔버 분석법(Neuro-Probe, Inc., Cabin John, Maryland, USA)을 이용하여 사람 배꼽 내피 세포(ECV-304 세포, ATCC 1998-CRL, ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, USA))에서 조사하였다. ECV-304 세포는 10% FBS와 5 ng/㎖ DiIC18(3) 살아있는 형광 색소(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA)를 함유하는 M199 배지에서 하룻밤동안 성장시켰다. 트립신처리, 세척, 0.5% FBS를 함유하는 M199에서 희석한 이후, 60,000개의 세포는 아레스텐 또는 엔도스타틴(2-40 ㎍/㎖)의 존부하에 상부 챔버 웰에 접종하였다. 2% FBS를 함유하는 M199 배지는 화학주성인자로 하부 챔버에 위치시켰다. 이들 세포-포함 구획은 8 ㎛ 구멍 크기의 폴리카보네이트 필터(Poretics Corp., Livermore, California, USA)로 화학주성인자로부터 분리시켰다. 상기 챔버는 37℃, 5% C0₂, 95% 습도에서 4.5시간동안 배양하였다. 이동하지 않은 세포를 버리고 상부 웰을 PBS로 세척한 이후, 필터는 플라스틱 칼로 긁어모으고 PBS에 녹인 4% 포름알데하이드에 고정시키며 유리 슬라이드에 위치시켰다. 형광 광확대 시역(high power field)을 이용하여, 여러 독립된 균일한 영상은 영상 처리소프트웨어 PMIS(Roper Scientific/Photometrics, Tucson, Arizona, USA)로 작동되는 디지털 SenSyS^TM카메라로 기록하였다. 대표적인 사진은 도 5A, 5B, 5C에 도시하는데, 이들은 2 ㎍/㎖ 아레스텐이 20 ㎍/㎖ 엔도스타틴만큼 효과적임을 보여준다. 세포는 OPTIMAS 6.0 소프트웨어(Media Cybernetics, Rochester, NY)를 이용하여 계산하고, 결과는 도 6에 도시하는데, 이는 현미경사진에서 관찰된 결과를 그래프 형태로 보여준다.

실시예 7: 아레스텐은 내피 관 형성을 저해한다.

내피 관 형성의 저해를 측정하기 위하여, 320 ㎕ 매트리겔(Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)을 24-웰 평판의 각 웰에 첨가하고 중합되도록 하였다(Grant, D.S. et aL, 1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63). 항생제 없는 EGM-2 배지(Clonetics Corporation, San Diego, California, USA)에서 25,000개 생쥐 대동맥 내피 세포(MAE)의 현탁액은 매트리겔로 피복된 각 웰에 계대배양하였다. 이들 세포는 증가하는 농도의 아레스텐, BSA, 무균 PBS 또는 7S 도메인으로 처리하였다. 모든 분석은 삼중으로 실시하였다. 세포는 37℃에서 24-48시간동안 배양하고 CK2 Olympus 현미경(3.3 대안렌즈, 1OX 대물렌즈)으로 세밀히 검사하였다. 이후, 세포는 400 DK 피복된 TMAX 필름(Kodak)을 이용하여 사진을 촬영하였다. 세포는 diff-quik 정착액(Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA)으로 염색하고 다시 한번 사진을 촬영하였다. 10개 시역(視域)을 세밀히 검사하여 관을 계산하고 평균하였다. 결과는 도 7에 도시하는데, 이는 아레스텐(■)이 대조(무균 PBS, ◆; BSA, △; 7S 도메인, -X-)와 비교하여 관 형성을 저해한다는 것을 보여준다. 잘-형성된 대표적인 관은 도 8A에서 관찰할 수 있는데, 이는 7S 도메인으로 처리된 세포를 보여준다(1OOx 확대). 다른 한편, 도 8B는 0.8 ㎍/㎖ 아레스텐으로 처리된 MAE 세포에서 불량한 관 형성을 보여준다(1OOx 확대).

매트리겔 분석은 또한, C57/BL6 생쥐에서 생체내 실시하였다. 매트리겔은 4℃에서 하룻밤동안 해동시켰다. 이후, 2OU/㎖ 헤파린(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA), 150 ng/㎖ bFGF(R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) 및 1 ㎍/㎖ 아레스텐 또는 10 ㎍/㎖ 엔도스타틴과 혼합하였다. 매트리겔 혼합물은 21 g 바늘을 이용하여 피하 주사하였다. 대조군은 혈관형성 저해물질이 없는 동일한 혼합물을 섭취하였다. 14 일후, 생쥐는 죽이고 매트리겔 충전물을 떼어냈다. 매트리겔 충전물은 PBS에 녹인 4% 파라포름알데하이드에 실온에서 4시간동안 고정시키고, 이후 24시간동안 PBS에 전환시켰다. 상기 충전물은 파라핀에 포매하고 절단하며 H&E 염색하였다. 절편을 광 현미경으로 검사하여 10개 광확대 시역으로부터 혈관의 개수를 계산하고 평균하였다.

매트리겔을 증가하는 농도의 아레스텐과 함께 또는 이런 아레스텐 없이, bFGF의 존재하에 위치시키는 경우에, 1 ㎍/㎖ 아레스텐과 10 ㎍/㎖ 엔도스타틴에서 혈관 개수의 50% 감소가 관찰되었다. 이들 결과는 아레스텐이 혈관형성 과정에서 다양한 단계를 저해함으로써 새로운 혈관 형성에 영향을 준다는 것을 보여준다. 또한, 이들 결과는 생체내에서 새로운 혈관 형성의 저해에서 1 ㎍/㎖ 아레스텐이10 ㎍/㎖ 엔도스타틴만큼 효과적이라는 것을 보여준다.

실시예 8: 아레스텐은 생체내에서 종양 전이를 저해한다.

C57/BL6 생쥐는 백만개의 MC38/MUCI를 정맥내 주사하였다(Gong, J. et al., 1997, Nat. Med. 3:5 5 8-6 1). 26일동안 매 이틀마다, 5마리 대조 생쥐에 10 mM 무균 PBS를 주사하였고, 6마리의 실험 생쥐는 4 ㎎/㎖ 아레스텐을 섭취하였다. 26일간 치료한 이후, 각 생쥐에서 폐종양 소결절을 계산하고 두 군에서 평균하였다. 각 군에서 2건의 폐사 사례가 보고되었다. 아레스텐은 일차 소결절의 평균 개수를 대조 생쥐에서 300에서 200으로 현저하게 감소시켰다.

실시예 9: 아레스텐은 생체내에서 종양 성장을 저해한다.

2백만개의 786-0 세포는 7- 내지 9-주령 생쥐 무흉선 누드 생쥐에 피하 주사하였다. 6마리로 구성된 첫 번째 생쥐군에서, 종양은 대략 700 ㎣까지 성장시켰다. 6마리로 구성된 두 번째 생쥐군에서, 종양은 100 ㎣까지 성장시켰다. 무균 PBS에 녹인 아레스텐은 700 ㎣의 종양을 보유하는 생쥐의 경우에 20 ㎎/㎏ 농도로, 100 ㎣ 종양을 보유하는 생쥐의 경우에 10 ㎎/㎏ 농도로 10일동안 매일 I.P. 주사하였다. 대조 생쥐는 BSA 또는 PBS 운반제를 섭취하였다. 결과는 도 9A와 9B에 도시한다. 도 9A는 10 ㎎/㎏ 아레스텐-치료된 생쥐(▣), BSA-치료된 생쥐(+), 대조 생쥐(●)에서 700 ㎣로부터 종양 체적의 증가를 보여주는 평면도이다. 아레스텐-치료된 생쥐에서 종양은 700에서 500 ㎣으로 축소되는 반면, BSA-치료된 생쥐와 대조 생쥐에서 종양은 10일동안 대략 1200 ㎣으로 증가하였다. 도 9B는 아레스텐(▣)이 100 ㎣의 종양을 보유한 생쥐에서 종양을 대략 80 ㎣로 축소시키는 반면,BSA-치료된 생쥐(+)에서는 종양 크기가 10일동안 거의 500 ㎣로 증가한다는 것을 보여준다.

대략 5백만개의 PC-3 세포(사람 전립선 선암종 세포)를 수확하고 7- 내지 9-주령 수컷 무흉선 누드 생쥐에 피하 주사하였다. 종양은 10일동안 성장시키고, 이후 Vernier 캘리퍼스로 측정하였다. 종양 체적은 표준 공식(너비²x 길이 x 0.52)에 따라 산정하였다(O'Reilly, M.S. et al., 1997, Cell 88:277-85; O'Reilly, M.S. et al., 1994, Cell 79:315-28). 동물은 5-6 마리의 생쥐군으로 분할하였다. 실험군에는 아레스텐(1O ㎎/㎏/day) 또는 엔도스타틴(10 ㎎/㎏/day)을 매일 I.P. 주사하였다. 대조군은 매일 PBS를 섭취하였다. 결과는 도 9C에 도시하는데, 이는 아레스텐(▣)이 엔도스타틴(▲) 또는 대조(●)보다 좀더 효과적으로 종양 성장을 저해한다는 것을 보여준다. 아레스텐 용량을 4 ㎎/㎏/day로 하여 상기 실험을 반복하였다. 결과는 도 9D에 도시한다(아레스텐, ▣; 대조, ●). 8일후 치료를 중단하였는데(화살표), 추가적인 아레스텐 치료없이 12일 이상동안 현저한 저해가 지속되었다. 치료없이 12일이 경과한 이후, 종양이 아레스텐의 저해 효과로부터 벗어나기 시작하였다.

실시예 10: 아레스텐의 면역조직화학.

종양 연구를 실시한 생쥐는 10-20일간 치료후 죽였다. 종양은 절제하고 4% 파라포름알데하이드에 고정시켰다. 조직은 파라핀 포매하고 3 ㎛로 절단하며 유리 슬라이드에 올려놓았다. 절편은 파라핀을 제거하고 재수화시키며 37℃에서 5분동안 300 ㎎/㎖ 프로테아제 XXIV(SIGMA Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)로 처리하였다. 분해는 100% 에탄올로 중단시키고, 절편은 대기 건조시키고 10% 토끼 혈청으로 차단하였다. 이후, 슬라이드는 1:50 희석된 쥐 항-생쥐 CD-31 단클론 항체(PharMingen, San Diego, California, USA)와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하고, 후속으로 1:50 희석된 토끼 항-쥐 면역글로불린(DAKO) 및 쥐 APAAP(DAKO)와 함께 37℃에서 30분동안 2회 연속 배양하였다. 발색 반응은 새로운 푹신(fuchsin)으로 실시하고, 절편은 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색(counterstain)하였다. CD-31 염색 패턴은 처리된 생쥐 vs. 대조 생쥐의 맥관 구조에서 감소를 보였다.

PCNA 염색을 위하여, 조직 절편은 1:200 희석된 항-PCNA 항체(Signet Laboratories, Dedham, Massachusetts, USA)와 함께 실온에서 60분동안 배양하였다. USA 양고추냉이 과산화효소 시스템(Signet Laboratories, Dedham, Massachusetts, USA)을 이용하여 제조업자의 권고에 따라 탐지를 실시하였다. 슬라이드는 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 피브로넥틴과 Ⅳ형 콜라겐에 대한 염색은 1:500으로 희석된 다클론 항-피브로넥틴(SIGMA Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) 및 1:100으로 희석된 항-Ⅳ형 콜라겐(ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, California, USA)을 이용하여 실시하였다. Vectastain Elite ABC 키트(Vector Laboratories. Inc., Burlingame, California, USA)는 제조업자의 권고에 따라 탐지에 이용하였다. 세포외 매트릭스의 PCNA, 피브로넥틴, Ⅳ형 콜라겐 염색은 종양 세포 증식에서 또는 종양 세포를 주변하는 Ⅳ형 콜라겐과 피브로넥틴의 내용이나 구조에서 차이를 보이지 않았다.

실시예 11: 아레스텐의 순환 반감기.

사람 태반으로부터 분리된 고유 아레스텐은 2OOg 크기로 쥐에 정맥내 주사하였다. 각 쥐는 5 ㎎의 사람 아레스텐을 섭취하였다. 혈청은 상이한 시점에서 항-아레스텐 항체를 이용한 직접 ELISA로 순환 아레스텐의 존재를 분석하였다. 대조로서 혈청 알부민을 각 시점에서 평가하여 동일한 함량의 혈청이 분석에 사용되도록 담보하였다. 아레스텐은 대략 36시간의 반감기로 혈청에서 순환하는 것으로 밝혀졌다.

쥐의 다른 군에는 200 ㎍의 사람 human 아레스텐을 I.P. 및/또는 피하 주사하고 폐, 신장, 간, 췌장, 비장, 뇌, 고환, 난소 등에서 병인의 증세를 평가하였다. 직접 ELISA를 실시하였는데, 아레스텐 항체가 이들 쥐의 혈청에서 탐지되었고 일부 내인성 IgG 침착이 신장 사구체 기저막에서 관찰되었다(Kalluri, R. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6201-5). 신장에서 이런 항체 침착은 염증 증세 또는 신장 기능의 악화를 동반하지 않았다. 이들 실험은 아레스텐이 비-병원성임을 암시한다.

실시예 12: 세포 부착에 대한 아레스텐의 효과.

6-웰 평판은 37℃에서 하룻밤동안 10 ㎍/㎖ 농도의 사람 아레스텐 또는 사람 Ⅳ 콜라겐(Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)으로 피복하였다. 나머지 단백질 결합 부위는 37℃에서 2시간동안, PBS에 녹인 10% BSA(SIGMA Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)로 차단하였다. HUVEC 세포는 EGM-2 MV 배지(Clonetics Corporation, San Diego, California, USA)에서 하위합류수준(70-80%)으로 성장시켰다. 세포는 부드럽게 트립신처리하고 혈청-없는 배지(5 x 10⁴세포/㎖)에 재현탁시켰다. 이후, 세포는 1O ㎍/㎖ 항체와 혼합하고 부드럽게 교반하면서 실온에서 15분동안 배양하였다. 그 다음, 100 ㎕ 세포 현탁액은 각 웰에 첨가하고, 평판은 37℃, 5% C0₂에서 45분동안 배양하였다. 부착되지 않은 세포는 혈청-없는 배지로 세척하여 제거하고, 부착된 세포는 계산하였다. 대조 생쥐 IgG 및 사람 β₁인테그린 아단위(클론 P4CIO)에 대한 생쥐 단클론 항체는 Life Technologies(Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)로부터 구입하였다. 단클론 항체 α₁인테그린 아단위와 α_vβ₃(각각, 클론 CD49a와 LM609)은 CHEMICON International (Temecula, California, USA)로부터 구입하였다.

결과는 도 1OA와 1OB에 도시하는데, 이들은 피복된 평판에서 부착된 HUVEC 세포의 비율(y-축)을 보여주는 히스토그램인데, 여기서 세포는 생쥐 IgG(c, 대조); α₁이나 β₁인테그린 아단위에 대한 항체; 또는 α_vβ₃인테그린에 대한 항체와 혼합된다. 도 1OA와 1OB는 각각 아레스텐-피복된 평판과 Ⅳ형 콜라겐-피복된 평판에서 부착된 세포의 비율을 보여준다. 아레스텐-피복된 평판에서는 α₁아단위에 대한 세포 부착에서 60% 및 β₁아단위에 대한 세포 부착에서 70% 저해가 관찰된 반면(도 1OA), Ⅳ형 콜라겐-피복된 평판(도 1OB)은 α₁에서 30%, β₁에서 40%, α_vβ₃중화항체에서 15%의 좀더 완화된 저해를 보였다.

실시예 13: 아레스텐에 의한 세포간질 금속단백질효소의 결합과 저해.

MMP-2, MMP-9 및 이들 효소에 대한 항체는 Oncogene, Inc로부터 구입하였다. 사람 태반으로 분리된 고유 아레스텐을 이용하여 직접 ELISA를 실시하였다(Kalluri, R. et al., 1994, Proe. Natl. Acad. Sci. USA 91:6201-5). MMP-2와 MMP-9 둘 모두 아레스텐에 특이적으로 결합하였다. 이들은 7S 도메인에 결합하지 않았다. 이런 결합은 각각 TIMP-2와 TIMP-1 결합에 무관하다.

기저막을 분해시키는 아레스텐 능력을 평가하기 위하여, 매트리겔은 부드럽게 교반하면서 37℃에서 6시간동안 MMP-2 및 MMP-9와 함께 배양하였다. 상층액은 SDS-PAGE로 분석하고 Ⅳ형 콜라겐의 α2 사슬에 대한 항체로 면역블랏하였다. 분해 분석의 시작 시점에서, 아레스텐을 증가하는 농도로 첨가하고 MMP-2 활성의 저해를 관찰하였다. NC1 도메인은 SDS-PAGE 겔에서 26 kDa의 단량체와 56 kDa의 이량체로 확인되었고, Ⅳ형 콜라겐 항체를 이용한 웨스턴 블랏에 의해 가시화될 수 있었다. 증가하는 농도의 아레스텐은 MMP-2에 의한 기저막의 분해를 저해하였는데, 이는 아레스텐이 MMP-2에 결합하여 MMP-2에 의한 기저막 콜라겐의 분해를 예방할 수 있다는 것을 보여준다. MMP-9에서 유사한 결과가 수득되었다.

실시예 14. 대장균( E. coli )에서 칸스타틴의 재조합 생산.

사람 칸스타틴은 pET22b, 박테리아 발현 플라스미드를 이용하여 C-말단 6개-히스티딘 태그를 보유하는 융합 단백질로 대장균(E. coli)에서 생산하였다.

Ⅳ형 콜라겐의 α2 NC1 도메인의 뉴클레오티드(SEQ ID NO: 5)와 아미노산(SEQ ID NO: 6) 서열은 각각 도 11A와 11B에 도시한다. 칸스타틴을 인코드하는 서열은 정방향 프라이머 5'-CGG GAT CCT GTC AGC ATC GGC TAC CTC-3'(SEQ ID NO: 7) 및 역방향 프라이머 5'-CCC AAG CTT CAG GTT CTT CAT GCA CAC-3'(SEQ ID NO: 8)을 이용하여 α2 NC1(Ⅳ)/pDS 벡터(Neilson, E.G. et aL, 1993, J. Biol. Chem. 268:8402-5)로부터 PCR 증폭하였다. 결과의 cDNA 단편은 BamHI과 HindⅢ으로 절단하고 사전절단된 pET22b(+)(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 결찰시켰다. 상기 구조체는 도 12에 도시한다. 이런 결찰은 칸스타틴을 pelB 리더 서열의 하류에 인-프레임(in-frame)하게 위치시켜 가용성 단백질의 주변세포질 정위(periplasmic localization)와 발현을 가능하게 하였다. 아미노산 MDIGINSD(SEQ ID NO: 13)을 인코드하는 추가의 벡터 서열을 상기 단백질에 부가하였다. 상기 서열의 3' 말단은 폴리히스티딘 태그 서열에 인-프레임하게 결찰시켰다. 상기 cDNA의 3' 말단과 his-태그 사이의 추가의 벡터 서열은 아미노산 KLAAALE(SEQ ID NO: 14)를 인코드하였다. 양성 클론은 양 가닥에서 서열분석하였다.

칸스타틴을 인코드하는 플라스미드 구조체는 발현을 위하여 대장균(E. coli) HMS 174(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 형질전환시키고, 이후 BL21(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 형질전환시켰다. 하룻밤 박테리아 배양액을 사용하여 LB 배지의 500 ㎖ 배양액에 접종하였다. 상기 배양액은 세포가 0.6의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 대략 4시간동안 성장시켰다. 이후, 0.5 mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 2시간 유도후, 세포는 5000 x g에서 원심분리하여 수확하고 6M 구아니딘, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)에서 재현탁하여 용해시켰다. 재현탁된 세포는 짧게 초음파처리하고, 30분동안 12,000 x g에서 원심분리하였다. 상층액 분획물은 5 ㎖ Ni-NTA 아가로즈 칼럼(Qiagen, Hilden, Germany)에 분당 2 ㎖ 속도로 4 내지 6회 통과시켰다. 특이적으로 결합되지 않은 단백질은 8M 요소, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)에서 15 ㎖의 10 mM, 25 mM, 50 mM 이미다졸로 세척하여 제거하였다. 칸스타틴 단백질은 8M 요소, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)에서 2가지 농도(125 mM과 250 mM)의 이미다졸로 칼럼으로부터 용리시켰다. 용리된 단백질은 4℃에서 PBS에 2회 투석하였다. 전체 단백질중 일부가 투석동안 침전되었다. 투석된 단백질은 수집하고 대략 3500 x g에서 원심분리하며 펠렛과 상층액 분획물로 분리하였다. 각 분획물에서 단백질 농도는 BCA 분석법(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) 및 정량적 SDS-PAGE 분석법으로 측정하였다. SDS-PAGE 분석에서 대략 26-32 kDa, 일반적으로 27 kDa의 단량체 밴드가 확인되었는데, 여기서 3 kDa는 폴리링커와 히스티딘 태그 서열에 기인하였다. 칸스타틴을 포함하는 용리액은 후속 분석을 위하여 합치고 PBS에 투석하였다. SDS-PAGE와 웨스턴 블랏팅으로 분석된 칸스타틴 단백질은 폴리-히스티딘 태그 항체에 의해 탐지되었다. 칸스타틴 항체는 박테리아-발현된 재조합 칸스타틴 단백질 역시 탐지하였다.

대장균(E. coli)-발현된 단백질은 주로 가용성 단백질로 분리되었다. 펠렛에서 전체 단백질의 분획물은 대략 40%이었고, 나머지 60%는 가용성 단백질로 회수되었다. 단백질의 전체 수확량은 대략 15 ㎎/ℓ이었다.

실시예 15: 293 태아 신장 세포에서 칸스타틴의 발현.

사람 칸스타틴은 pcDNA 3.1 진핵 벡터를 이용하여 293 태아 신장 세포에서 분비된 가용성 단백질로 생산하고, 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다(정제 또는 탐지 태그 없이).

α2(Ⅳ)NC1을 포함하는 pDS 플라스미드(Neilson, E.G. et aL, 1993, J. Biol. Chem. 268:8402-5)를 이용하여, 리더 신호 서열이 pcDNA 3.1 진핵 발현 벡터(Invitrogen, San Diego, California, USA)에 인-프레임하게 부가되도록 하는 방식으로 칸스타틴을 PCR 증폭하였다. 전장 α2(Ⅳ) 사슬의 5' 말단으로부터 유래된 리더 서열은 NC1 도메인의 5'에 클론하여 배양 배지로 단백질이 분비되도록 하였다. 칸스타틴-포함 재조합 벡터는 측면에서 접하는 프라이머를 이용하여 서열분석하였다. 오류-없는 cDNA 클론은 더욱 정제하고, 단백질 발현을 확증하기 위한 시험관내 번역 연구에 사용하였다. 칸스타틴-포함 플라스미드와 대조 플라스미드는 염화칼슘 방법으로 293 세포를 트랜스펙션시키는데 사용하였다. 트랜스펙션된 클론은 제네티신(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) 항생제 처리로 선별하였다. 세포는 세포 사멸이 보이지 않을 때까지 상기 항생제의 존재하에 3주동안 계대배양하였다. 클론은 T-225 플라스크로 확대하고 합류 수준까지 성장시켰다. 이후, 상층액을 수집하고 Amicon 농축장치(Amicon. Inc., Beverly, Massachusettes, USA)를 이용하여 농축하였다. 농축된 상층액은 SDS-PAGE, 면역블랏팅, ELISA로 칸스타틴 발현을 분석하였다. 상층액에서 강한 결합이 ELISA에 의해 탐지되었다. 칸스타틴-포함 상층액은 칸스타틴-특이적 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피를 실시하였다(Gunwar, S. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15318:24). 주요 피크가 확인되었는데, 이는 칸스타틴 항체(항-α2 NC1 항체, 1:200 희석)와 면역반응하는 대략 24 kDa의 순수한 단량체를 내포하였다.

실시예 16: 칸스타틴은 내피 세포 증식을 저해한다.

송아지 대동맥 내피(C-PAE) 세포는 10% 소 태아 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM에서 합류 수준까지 성장시키고 48시간동안 접촉을 금지하였다. 세포는 37℃에서 5분동안 트립신처리(trypsinization)(Life Technologies/Gibeo BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)로 수확하였다. 0.5% FCS를 함유하는 DMEM에서 12,500 세포의 현탁액은 10 ㎍/㎖ 피브로넥틴으로 피복된 24-웰 평판의 각 웰에 첨가하였다. 세포는 37℃, 5% C0₂, 95% 습도에서 24시간동안 배양하였다. 배지는 제거하고 0.5% FCS(자극받지 않은 세포) 또는 10% FCS(자극되고 처리된 세포)로 교체하였다. 786-O, PC-3, HEK 293 세포는 대조로 이용되었는데, 이들 역시 합류 수준까지 성장시키고 트립신처리하며 동일한 방식으로 도말하였다. 세포는 0.025 내지 40 ㎎/㎖ 농도의 칸스타틴 또는 엔도스타틴으로 삼중으로 처리하였다. 티미딘 병합 실험에서, 모든 웰에는 처리 시점에서 1 μCurie의³H-티민딘이 첨가되었다. 24시간후, 배지는 제거하고, 웰은 PBS로 3회 세척하였다. 세포는 1N NaOH로 추출하고 4 ㎖ ScintiVerse Ⅱ(Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) 용액을 담은 신틸레이션 바이알에 첨가하였다. 티미딘 병합은 신틸레이션 계수기를 이용하여 측정하였다.

결과는 도 13A와 13B에 도시한다. 도 13A는 C-PAE 세포의 증식에 대한 가변 함량의 칸스타틴 효과를 보여주는 히스토그램이다. 분당 계수에서 티미딘 병합은 y-축에 제시한다. x-축에서 "0.5%"는 0.5% FCS(자극받지 않은) 대조이고, "10%"는 10% FCS(자극된) 대조이다. 증가하는 농도의 칸스타틴으로 처리는 티미딘 병합을 지속적으로 감소시켰다. 도 13B는 786-O(반점 막대), PC-3(교차-빗금 막대), HEK 293 세포(백색 막대)에서 티미딘 병합에 대한 증가하는 함량의 칸스타틴 효과를 보여주는 히스토그램이다. 분당 계수에서 티미딘 병합은 y-축에 제시하고, x-축은 3가지 세포주 각각에 대하여 0.5% FCS(자극받지 않은)와 10% FCS(자극된) 대조를 보여주고, 계속하여 증가하는 농도의 칸스타틴을 보여준다. 모든 군은 삼중 시료를 대표하고, 막대는 분당 평균 계수 ± 표준오차를 나타낸다.

메틸렌 블루 염색 검사를 또한 실시하였다. 3,100개의 세포는 각 웰에 첨가하고 전술한 바와 같이 처리하며, 이후 Oliver et al.(Oliver, M.H. et al., 1989, J Cell. Science 92:513-8)의 방법을 이용하여 세포를 계산하였다. 모든 웰은 100 ㎖의 1X PBS로 세척하고, 세포는 중성-완충액(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)에 녹인 100 ㎖의 1O% 포르말린을 실온에서 30분동안 첨가하여 고정시켰다. 포르말린 제거후, 세포는 0.01M 붕산염 완충액(pH 8.5)에 녹인 1% 메틸렌 블루 용액(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)으로 실온에서 30분동안 염색하였다. 염색 용액의 제거후, 웰은 100 ㎖의 0.01M 붕산염 완충액(pH 8.5)으로 5회 세척하였다. 메틸렌 블루는 100 ㎖의 0.1N HCl/에탄올(1:1 혼합물)로 실온에서 1시간동안 세포로부터 추출하였다. 메틸렌 블루 염색의 양은 655 nm 파장에서 광 흡수도를 이용하여 마이크로평판 판독기(BioRad, Hercules, California, USA)로 측정하였다.

결과는 도 13C와 13D에 도시한다. 도 13C는 C-PAE 세포에 의한 염료 흡수에 대한 증가하는 함량의 칸스타틴 효과를 보여주는 히스토그램이다. OD₆₆₅에서 흡수도는 y-축에 제시한다. "0.1%"는 0.1% FCS-처리된(자극받지 않은) 대조이고, "10%"는 10% FCS-처리된(자극된) 대조이다. 나머지 막대는 증가하는 농도의 칸스타틴으로 처리를 나타낸다. C-PAE 세포에서 염료 흡수는 대략 0.625 - 1.25 ㎍/㎖의 칸스타틴 처리 수준에서 자극받지 않은 세포에서 관찰되는 수준으로 하락하였다. 도 13D는 비-내피 세포 HEK 293 세포(백색 막대)와 PC-3(교차-빗금 막대)에 대한 가변 농도의 칸스타틴 효과를 보여주는 히스토그램이다. OD₆₆₅에서 흡수도는 y-축에 제시한다. "0.1%"는 0.1% FCS-처리된(자극받지 않은) 대조이고, "10%"는 10% FCS-처리된(자극된) 대조이다. 막대는 655 nm에서 상대적 흡수도의 평균 ± 표준오차를 나타낸다.

10% 혈청-자극된 내피 세포의 용량-의존성 저해는 대략 0.5 ㎍/㎖의 ED₅₀값으로 탐지되었다(도 13A와 13C). 최대 40 ㎎/㎖의 칸스타틴 용량에서 신장암 세포(786-0), 전립선암 세포(PC-3) 또는 사람 태아 신장 세포(HEK293)에 대한 현저한 효과는 관찰되지 않았다(도 13B와 13D). 이런 내피 세포 특이성은 칸스타틴이 특히 효과적인 항-혈관형성제임을 시사한다.

실시예 17: 칸스타틴은 내피 세포 이동을 저해한다.

혈관형성의 과정에서, 내피 세포는 증식하고 이동한다. 이런 이유로, 내피 세포 이동에 대한 칸스타틴의 효과를 평가하였다. FBS-유도된 화학주성에 대한 칸스타틴과 엔도스타틴의 저해 효과는 Boyden 챔버 분석법(Neuro-Probe, Inc., Cabin John, Maryland, USA)을 이용하여 사람 배꼽 내피 세포(HUVEC)에서 조사하였다. HUVEC 세포는 10% FBS와 5 ng/㎖ DiIC18(3) 살아있는 형광 색소(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA)를 함유하는 M199 배지(Life Technologies/ Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland, USA)에서 하룻밤동안 성장시켰다. 트립신처리, 세척, 0.5% FBS를 함유하는 M199에서 희석한 이후, 60,000개의 세포를 칸스타틴(0.01 또는 1.00 ㎎/㎖)의 존부하에 상부 챔버 웰에 접종하였다. 2% FBS를 함유하는 M199 배지는 화학주성인자로 하부 챔버에 위치시켰다. 이들 세포-포함 구획은 8 ㎛ 구멍 크기의 폴리카보네이트 필터(Poretics Corp., Livermore, California, USA)로 화학주성인자로부터 분리시켰다. 상기 챔버는 37℃, 5% C0₂, 95% 습도에서 4.5시간동안 배양하였다. 이동하지 않은 세포를 버리고 상부 웰을 PBS로 세척한 이후, 필터는 플라스틱 칼로 긁어모으고 PBS에 녹인 4% 포름알데하이드에 고정시키며 유리 슬라이드에 위치시켰다. 형광 광확대 시역(high power field)을 이용하여, 여러 독립된 균일한 영상은 영상 처리 소프트웨어 PMIS(Roper Scientific/Photometrics, Tucson, Arizona, USA)로 작동되는 디지털 SenSyS^TM카메라로 기록하였다. 세포는 OPTIMAS 6.0 소프트웨어(Media Cybernetics, Rochester, NY)를 이용하여 계산하였다.

결과는 도 14에 도시하는데, 이는 VEGF 없음(무(無)-VEGF 또는 혈청)과 VEGF(1% FCS와 10 ng/㎖ VEGF) 세포의 처리 및 0.01 칸스타틴(1% FCS, 10 ng/㎖ VEGF, 0.01 ㎍/㎖ 칸스타틴)과 1.0 ㎍/㎖ 칸스타틴(1% FCS, 10 ng/㎖ VEGF, 1 ㎍/㎖ 칸스타틴)의 처리에 대한 시역(視域)당 이동된 내피 세포의 개수를 보여주는 막대 차트이다.

칸스타틴은 1O ng/㎖에서 HUVEC의 이동을 현저하게 저해하였다. 내피 세포의 증식과 이동 모두를 저해하는 칸스타틴의 능력은 칸스타틴이 혈관형성의 과정에서 한가지이상의 단계에서 기능한다는 것을 암시한다. 대안으로, 칸스타틴은 증식과 이동 모두에 영향을 줄 수 있는 자극된 내피 세포에 대한 아폽토시스 신호로 기능할 수도 있다. 아폽토시스 유도는 다른 항-혈관형성 분자인 앤지오스타틴(angiostatin)에서 보고되었다(O'Reilly, M.S. et al., 1994, Cell 79:315-28; Lucas, R. et al., 1998, Blood 92:4730-41).

실시예 18: 칸스타틴 내피 관 형성을 저해한다.

칸스타틴의 항-혈관형성 능력의 첫 번째 검사로, 육종 종양으로부터 유래된 생쥐 기저막 단백질의 고형 겔인 매트리겔에서 내피 세포에 의한 관 형성을 교란시키는 능력을 평가하였다. 생쥐 대동맥 내피 세포는 매트리겔에서 배양하는 경우에, 빠르게 정렬되고 공동(空洞)의 관-유사 구조를 형성한다(Grant, D.S. et aL, 1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63).

매트리겔(Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)은 24-웰 평판의 각 웰에 첨가하고 중합되도록 하였다(Grant, D.S. et aL,1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63). 항생제 없는 EGM-2 배지(Clonetics Corporation, San Diego, California, USA)에서 25,000개 생쥐 대동맥 내피 세포(MAE)의 현탁액은 매트리겔로 피복된 각 웰에 계대배양하였다. 이들 세포는 증가하는 농도의 칸스타틴, BSA, 무균 PBS 또는 α5-NC1 도메인으로 처리하였다. 모든 분석은 삼중으로 실시하였다. 세포는 37℃에서 24-48시간동안 배양하고 CK2 Olympus 현미경(3.3 대안렌즈, 1OX 대물렌즈)으로 세밀히 검사하였다. 이후, 세포는 400 DK 피복된 TMAX 필름(Kodak)을 이용하여 사진을 촬영하였다. 세포는 diff-quik 정착액(Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA)으로 염색하고 다시 한번 사진을 촬영하였다(Grant, D.S. et aL, 1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63). 10개 시역(視域)을 세밀히 검사하여 관을 계산하고 평균하였다.

결과는 도 15에 도시하는데, 이는 BSA(▣), 칸스타틴(■), α5NC1(○)의 가변 처리하에 대조(PBS-처리된 웰) 관 형성(y-축)의 비율로 관 형성의 정도를 보여주는 그래프이다. 수직 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다. 이런 결과는 칸스타틴이 대조와 비교하여 내피 관 형성을 현저하게 감소시킨다는 것을 보여준다.

293 세포에서 생산된 칸스타틴은 용량 의존성 방식으로 내피 관 형성을 선택적으로 저해하였는데, 1 ㎎ 칸스타틴 단백질의 첨가에서 관 형성의 거의 완전한 저해가 관찰되었다(도 15). 대조 단백질, 소 혈청 알부민(BSA) 및 Ⅳ형 콜라겐 α5 사슬의 NC1 도메인은 내피 관 형성에 별다른 영향을 주지 않았는데, 이는 상기 분석에서 칸스타틴의 저해 효과가 칸스타틴에 특이적이고 첨가된 단백질 내용물에 기인하지 않는다는 것을 입증한다.

실시예 19: ERK 활성화에 대한 칸스타틴의 효과.

칸스타틴의 항-증식 활성과 항-이동 활성을 좀더 명확하게 이해하기 위하여, 20% 소 태아 혈청과 내피 유사분열원에 의해 유도된 ERK(세포외 신호-조절된 키나아제) 활성화에 대한 칸스타틴의 효과를 평가하였다. HUVEC 세포는 20% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 100 ㎍/㎖ 헤파린, 50 ㎍/㎖ 내피 유사분열원(Biomedical Technologies, Inc., Cambridge, Massachusetts, USA)으로 보충된 McCoy 배지에서 하룻밤동안 배양하였다. 다음날, 세포는 세척하고 저혈청 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신, 100 ㎍/㎖ 헤파린, 5% FBS로 보충된 McCoy 배지)에서 4시간동안 성장시켰다. 4시간후, 배지는 20 ㎍/㎖ 칸스타틴을 함유하거나 함유하지 않은 새로운 저혈청 배지로 교체하였다. 1시간후, 혈청 농도를 20%로 조정하고, 50 ㎍/㎖의 최종 농도로 내피 유사분열원을 첨가하였다. 0, 5, 10, 25, 40분에, 세포는 PBS로 세척하고 수용 용해 혼합물(Promega, Madison, Wisconsin, USA) + 레우펩틴(leupeptin), PMSF, NaF, Na₃VO₄, 0-글리세로포스페이트, 소디움 피로포스페이트로 용해시켰다. 용해질은 단백질 농도를 정량하고 12% SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 항-포스포-ERK 항체(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA)를 이용하여 혈청-처리된 HUVEC 및 혈청 + 칸스타틴-처리된 HUVEC에서 포스포-ERK의 웨스턴 블랏을 실시하였다. HUVEC에서 ERK 인산화는 성장 인자 자극후 5분이내에 분명하였다. 20 ㎍/㎖ 칸스타틴으로 처리는 ERK의 조기 활성화를 변화시키지 않았다. ERK 인산화에서 감소는 만기 시점에서 관찰되었는데, 이런 프로필은 여러유사분열원에서 관찰되는 반응과 일치한다(Gupta, K. et al., 1999, Exp. Cell. Res. 247:495-504; Pedram, A. et al., 1998, J Biol. Chem. 273:26722-8). 이들 관찰 결과는 칸스타틴이 VEGF 또는 bFGF 수용체에 의해 활성화되는 인접 현상(proximal event)을 저해함으로써 기능하지 않음을 시사한다.

실시예 20: 칸스타틴은 내피 세포에서 아폽토시스를 유도한다.

아넥신 V-FITC 표지. 칸스타틴의 잠재적 작용 양식으로 아폽토시스를 확립하기 위하여, 아넥신 V-FITC를 사용하여 외부화된 포스파티딜세린(PS)을 표지하고 아폽토시스 세포를 평가하였다. 1O% FBS 보충된 DMEM(BioWhittaker, Walkersville, 105 Maryland, USA)에서 6-웰 조직 배양 평판의 각 웰에 0.5 x 10⁶C-PAE 세포, PC-3, 786-0, HEK 293 세포를 첨가하였다. 다음날, 40 ng/㎖ TNF-α(양성 대조) 또는 15 ㎍/㎖ 칸스타틴과 함께 새로운 배지를 모든 웰에 첨가하였다. 대조 세포에는 동등 부피의 PBS를 첨가하였다. 24시간 처리이후, 이탈된 세포를 포함하는 배지는 수집하고 부착된 세포는 트립신처리하고 이탈된 세포와 합치며 3,000 x g에서 원심분리하였다. 이후, 세포는 세척하고 포스파티딜-세린 외부화(조기 아폽토시스 지표)는 제조업자의 지시에 따라 FITC-표지된 아넥신 V(Clontech, Palo Alto, California, USA)로 표지(labeling)하여 측정하였다. 아넥신-FITC 표지된 세포는 FACStar Plus 유세포분석기(Becton-Dickinson, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 계산하였다. 각 처리에서, 15,000개의 세포가 계산되고 리스트모드(listmode)에 저장되었다. 이후, 이들 데이터는 표준 Cell Quest 소프트웨어(Becton-Dickinson, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 분석하였다.

칸스타틴이 내피 세포의 아폽토시스를 특이적으로 유도하긴 하지만 PC-3, 786-0 또는 HEK 293 세포주에 대한 현저한 효과는 관찰되지 않는 것으로 밝혀졌다.

FLIP 단백질 수준. HUVEC 세포는 ERK 분석에서처럼 처리하고 0, 1, 3, 6, 24시에 수확하였다. 혈청-처리된 HUVEC 세포 및 혈청 + 칸스타틴-처리된 HUVEC 세포에서 FLIP 단백질 수준은 항-FLIP 항체(Sata, M. et al., 1998, J Biol. Chem. 273:33103-6)를 이용하여 정량화시키고 빈쿨린(vinculin) 수준을 이용하여 단백질 적하에 대하여 표준화시키며 0시 시점에서 비율로 플랏하였다.

결과는 도 16에 도시하는데, 이는 시간(x-축) 흐름에 따라 t=O(y-축)에 존재하는 단백질의 비율로 표시되는 빈쿨린의 수준 함수로서 FLIP 단백질 수준의 그래프이다. FLIP 단백질 수준은 칸스타틴으로 처리하고 1시간후 감소하고, 이런 감소는 혈청 자극후 24시간까지 지속되는데, 이는 칸스타틴의 아폽토시스 작용이 Fas 활성화된 아폽토시스 저해물질, FLIP에 의해 매개됨을 시사한다. 내피 세포가 Fas와 FasL 모두를 구성적으로 발현하기 때문에(Sata, M. et al., supra), FLIP에서 이런 감소는 카스파제 활성화를 유인하고 최종 아폽토시스 신호를 전달한다.

실시예 21: 칸스타틴은 생체내에서 종양 성장을 저해한다.

사람 전립선 선암종 세포(PC-3 세포)는 배양액으로부터 수확하고, 무균 PBS에서 2백만개의 세포는 7- 내지 9-주령 수컷 SCID 생쥐에 피하 주사하였다. 종양은 대략 4주동안 성장시키고, 이후 4마리 생쥐로 구성된 군으로 분할하였다. 실험군은 0.1 ㎖ 총부피의 PBS에 녹인 10 ㎎/㎏ 투여량의 칸스타틴을 매일 I.P. 주사하였다. 대조군은 매일 동등 부피의 PBS를 섭취하였다. 치료 시작 시점(0일)에서, 종양 체적은 대조 생쥐에서 88 ㎣ 내지 135 ㎣이고, 칸스타틴-처리된 군에서 108 ㎣ 내지 149 ㎣이었다. 각 군은 5 마리의 생쥐로 구성되었다. 정해진 일자에서 계산된 종양 체적은 치료 0일에 체적으로 분할하여 부분적 종양 체적(V/V₀)을 산출하였다. 결과는 도 17A에 도시하는데, 이는 치료일(x-축)에 따라 플랏된 부분적 종양 체적(y-축) ± 표준 편차를 설명하는 그래프이다. 칸스타틴-처리된(■) 종양은 대조(□)와 비교하여 크기가 약간 증가하였다.

두 번째 PC-3 실험에서, PC-3 세포는 배양액으로부터 수확하고, 3백만개의 세포는 6- 내지 7-주령 무흉선 누드 생쥐에 주사하고, 종양은 대략 2주동안 피하에서 성장시키고, 이후 이들 동물은 4마리 생쥐로 구성된 군으로 분할하였다. 실험군(4마리 생쥐)은 0.2 ㎖ 총부피의 PBS에 녹인 3 ㎎/㎏ 투여량의 칸스타틴 또는 동일 부피의 PBS에서 8 ㎎/㎏ 투여량의 엔도스타틴을 매일 I.P. 주사하였다. 대조군(4마리 생쥐)은 매일 동등 부피의 PBS를 섭취하였다. 종양 길이와 너비는 Vernier 캘리퍼스를 이용하여 측정하고, 종양 체적은 종양 체적은 표준 공식(너비²x 길이 x 0.52)에 따라 산정하였다. 종양 체적은 26 ㎣ 내지 73 ㎣이고, 정해진 일자에서 계산된 종양 체적은 치료 0일에 체적으로 분할하여 전술한 바와 같이 부분적 종양 체적(V/V₀)을 산출하였다. 결과는 도 17B에 도시하는데, 이는 치료일(x-축)에 따라 플랏된 부분적 종양 체적(y-축) ± 표준 편차를 설명하는 그래프이다. 대조(□)와 비교하여, 칸스타틴-처리된(■) 종양은 크기가 약간 증가하였는데, 이런 결과는 엔도스타틴(□)에서 얻은 결과에 필적한다.

신장 세포 암세포 모델에서, 2백만개의 786-O 세포는 7- 내지 9-주령 수컷 무흉선 누드 생쥐에 피하 주사하였다. 종양은 대략 100 ㎣ 또는 대략 700 ㎣으로 성장하도록 하였다. 각 군은 6마리 생쥐로 구성되었다. 무균 PBS에 녹인 칸스타틴은 10일동안 10 ㎎/㎏ 농도로 매일 I.P. 주사하였다. 대조군은 동일 부피의 PBS를 섭취하였다. 결과는 도 17C(100 ㎣ 종양) 및 15D(700 ㎣ 종양)에 도시한다. 양 군에서, 칸스타틴-처리된(■) 종양은 대조(□)와 비교하여 실질적으로 축소되었다.

대장균(E. coli)에서 생산된 칸스타틴은 위약-처리된 생쥐와 비교하여 소형(100 ㎣, 도 17C)과 대형(700 ㎣, 도 17D) 신장 세포암(786-0) 종양의 성장을 각각 4배와 3배 저해하였다. 중증 복합 면역결핍(SCID) 생쥐에서 확립된 사람 전립선(PC-3)에서, 10 ㎎/㎏ 칸스타틴은 부분적 종양 체적을 부형제만 주사된 생쥐의 55%(1.8배 감소)로 억제하였다. 무흉선(nu/nu) 생쥐에서, 처리된 종양은 위약-처리된 생쥐보다 2.4-배 적었다. 종양 크기에서 감소는 CD-31-양성 맥관구조의 감소와 일치한다(실시예 29 참조). 무흉선 생쥐에서, 좀더 적은 용량의 칸스타틴과 엔도스타틴이 사용되었는데, 3 ㎎/㎏ 칸스타틴이 8 ㎎/㎏ 엔도스타틴과 동일한 억제 효과를 보였고, 5 ㎎/㎏ 용량의 엔도스타틴은 종양 성장을 억제할 수 없었다. 모든 생체내 연구에서, 생쥐는 쇠약 증상없이 건강하게 보였고 치료동안 폐사한 생쥐는 없었다.

실시예 22: 칸스타틴-처리된 생쥐에서 CD31 면역조직화학.

생체내에서 종양의 감소된 크기는 이들 종양에서 혈관의 형성에 대한 억제 효과를 암시하였다. 이종이식 종양 연구의 종결 시점에서, 생쥐는 죽이고 종양을 절제하였다. 종양 혈관을 탐지하기 위하여, 항-CD31 항체 알칼리성 포스파타제-공액된 면역세포조직화학을 파라핀-포매된 종양 절편에서 실시하였다. 제거된 종양은 스카펠(scapel)로 대략 3-4 ㎜ 두께의 여러 조각으로 절개하고, 24시간동안 4% 파라포름알데하이드에 고정시켰다. 이후, 조직은 탈수와 파라핀 포매에 앞서 24시간동안 PBS에 전환시켰다. 파라핀에 포매한 이후, 3 ㎛ 절편으로 절단하고 유리 슬라이드에 올려놓았다. 절편은 파라핀을 제거하고 재수화시키며 37℃에서 5분동안 300 ㎎/㎖ 프로테아제 XXIV(SIGMA Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)로 처리하였다. 분해는 100% 에탄올로 중단시켰다. 절편은 대기 건조시키고 재수화시키며 10% 토끼 혈청으로 차단하였다. 이후, 슬라이드는 1:50 희석된 쥐 항-생쥐 CD-31 단클론 항체(PharMingen, San Diego, California, USA)와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하고, 후속으로 1:50 희석된 토끼 항-쥐 면역글로불린(DAKO) 및 쥐 APAAP(DAKO)와 함께 37℃에서 30분동안 2회 연속 배양하였다. 발색 반응은 새로운 푹신(fuchsin)으로 실시하였다. 절편은 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색(counterstain)하였다.

칸스타틴-처리된 종양에서 종양 크기 감소는 CD31-양성 맥관구조의 감소와 일치하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 23: 대장균( E. coli )에서 툼스타틴과 툼스타틴의 재조합 생산.

Ⅳ형 콜라겐의 α3 NC1 도메인의 뉴클레오티드(SEQ ID NO: 9)와 아미노산(SEQ ID NO: 10) 서열은 각각 도 18A와 18B에 도시한다. 툼스타틴을 인코드하는 서열은 정방향 프라이머 5'-CGG GAT CCG GGT TTG AAA GGA AAA CGT-3'(SEQ ID NO: 11) 및 역방향 프라이머 5'-CCC AAG CTT TCA GTG TCT TTT CTT CAT-3'(SEQ ID NO: 12)을 이용하여 α3 NC1(Ⅳ)/pDS 벡터(Neilson, E.G. et aL, 1993, J. Biol. Chem. 268:8402-5; GenBank Accession Nos. M92993(Quinones, S. et al., 1994), M81379(Turner, N. et al., 1994), X80031(Leionin, A.K., and Mariyama, M. et al., 1998)))로부터 PCR 증폭하였다. 결과의 cDNA 단편은 BamHI과 HindⅢ으로 절단하고 사전절단된 pET22b(+)(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 결찰시켰다. 상기 구조체는 도 19에 도시한다. 이런 결찰은 툼스타틴을 pelB 리더 서열의 하류에 인-프레임(in-frame)하게 위치시켜 가용성 단백질의 주변세포질 정위(periplasmic localization)와 발현을 가능하게 하였다. 아미노산 MDIGINSD(SEQ ID NO: 13)을 인코드하는 추가의 벡터 서열을 상기 단백질에 부가하였다. 상기 서열의 3' 말단은 폴리히스티딘 태그 서열에 인-프레임하게 결찰시켰다. 상기 cDNA의 3' 말단과 his-태그 사이의 추가의 벡터 서열은 아미노산 KLAAALE(SEQ ID NO: 14)를 인코드하였다. 양성 클론은 양 가닥에서 서열분석하였다. 툼스타틴을 인코드하는 플라스미드 구조체는 발현을 위하여 대장균(E. coli) HMS 174(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 형질전환시키고, 이후 BL21(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 형질전환시켰다. 하룻밤 박테리아 배양액을 사용하여 LB 배지(Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA)의 500 ㎖ 배양액에 접종하였다. 상기 배양액은 세포가 0.6의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 대략 4시간동안 성장시켰다. 이후, 1 mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 2시간 유도후, 세포는 5000 x g에서 원심분리하여 수확하고 6M 구아니딘, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)에서 재현탁하여 용해시켰다. 재현탁된 세포는 짧게 초음파처리하고, 30분동안 12,000 x g에서 원심분리하였다. 상층액 분획물은 5 ㎖ Ni-NTA 아가로즈 칼럼(Qiagen, Hilden, Germany)에 분당 2 ㎖ 속도로 4 내지 6회 통과시켰다. 특이적으로 결합되지 않은 단백질은 8M 요소, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)에서 10 mM과 25 mM 이미다졸로 세척하여 제거하였다. 툼스타틴 단백질은 8M 요소, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)에서 증가하는 농도(50 mM, 125 mM, 250 mM)의 이미다졸로 칼럼으로부터 용리시켰다. 용리된 단백질은 4℃에서 PBS에 2회 투석하였다. 전체 단백질중 일부가 투석동안 침전되었다. 투석된 단백질은 수집하고 대략 3500 x g에서 원심분리하며 불용성(펠렛)과 가용성(상층액) 분획물로 분리하였다.

대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴은 주로 가용성 단백질로 분리되었는데, SDS-PAGE 분석에서 31 kDa의 단량체 밴드가 확인되었다. 다른 3 kDa는 폴리링커와 히스티딘 태그 서열에 기인하였다. 상기 밴드를 포함하는 용리된 분획물은 아래의 실험에 사용하였다. 각 분획물에서 단백질 농도는 BCA 분석법(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) 및 정량적 SDS-PAGE 분석법으로 측정하였다. 환원 조건하에, 대략 60 kDa로 관찰된 밴드는 비-환원된 조건에서 31 kDa의 단일 밴드로분리되는 툼스타틴의 이량체를 나타낸다. 단백질의 전체 수확량은 대략 5 ㎎/ℓ이었다.

53개 N-말단 아미노산이 부재하는 재조합 절두된 툼스타틴(툼스타틴-N53)은 다른 변이체에서 밝힌 바와 같이 대장균(E. coli)에서 생산하고 정제하였다(Kalluri, R. et al., 1996, J Biol. Chem. 271:9062-8). 상기 변이체는 도 20에서 도시하는데, 이는 α3(Ⅳ)NC1 단량체내에서 절두된 아미노산의 위치를 보여주는 혼성 다이어그램이다. 채워진 원은 '툼스타틴-N53'을 발생시키기 위하여 툼스타틴으로부터 결실된 N-말단 53개 아미노산 잔기에 상응한다(Kalluri, R. et al., 1996, J Biol. Chem. 271:9062-8). 짧은 막대로 표시된 이황화 결합은 α1(Ⅳ)NC1과 α2(Ⅳ)NC1에서처럼 정렬된다(Siebold, B. et al., 1988, Eur. J Biochem. 176:617-24). 명료하게 하기 위하여, 2가지의 가능한 이황화 배열중 한가지만 표시한다.

사람 α3(Ⅳ)NC1에 대한 토끼 항체는 기존 문헌에 기술된 바와 같이 준비하였다(Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8). 단클론 쥐 항-생쥐 CD31(혈소판 내피 세포 부착 막, PECAM-1) 항체는 PharMingen(San Diego, California, USA)으로부터 구입하였다. FITC-공액된 염소 항-쥐 IgG 항체, FITC-공액된 염소 항-토끼 IgG 항체 및 양고추냉이 과산화효소와 공액된 염소 항-토끼 IgG 항체는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, Missouri, USA)로부터 구입하였다.

이렇게 얻은 농축된 상층액은 기존 문헌에 기술된 바와 같이 SDS-PAGE와 면역블랏팅(immunoblotting)으로 툼스타틴 발현을 분석하였다(Kalluri, R. et al.,1996, J Biol. Chem. 271:9062-8). 1차원 SDS-PAGE는 12% 분리 겔(resolving gel)과 불연속 완충액 시스템으로 실시하였다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 막으로 이전하고 실온에서 30분동안 2% BSA로 차단하였다. 나머지 결합 부위를 차단한 이후, 막은 세척액으로 완전하게 세척하고 1% BSA를 함유하는 PBS에서 1:1000 희석된 일차 항체와 함께 배양하였다. 배양은 교반기에서 실온에 하룻밤동안 실시하였다. 이후, 블랏은 세척액으로 완전하게 세척하고, 양고추냉이 과산화효소에 공액된 이차 항체와 함께 교반기에서 실온에 3시간동안 배양하였다. 블랏은 다시 한번 완전하게 세척하고 기질(diaminobenzidine in 0.05 M phosphate buffer containing 0.01% cobalt chloride and nickel ammonium)을 첨가하며 실온에서 10분동안 배양하였다. 이후, 기질 용액을 부어넣고, 과산화수소를 함유하는 기질 완충액을 첨가하였다. 밴드의 발생이후, 증류수로 반응을 중단시키고 블랏을 건조시켰다. 31 kDa의 단일 밴드가 관찰되었다.

실시예 24: 293 태아 신장 세포에서 툼스타틴의 발현.

사람 툼스타틴은 pcDNA 3.1 진핵 벡터를 이용하여 293 태아 신장 세포에서 분비된 가용성 단백질로 생산하였다. 상기 재조합 단백질(정제 또는 탐지 태그 없이)은 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리하고, 순수한 단량체 형태는 SDS-PAGE와 면역블랏 분석법으로 주요 피크에서 탐지하였다.

α3(Ⅳ)NC1을 포함하는 pDS 플라스미드(Neilson, E.G. et aL, 1993, J. Biol. Chem. 268:8402-5)를 이용하여, 리더 신호 서열이 pcDNA 3.1 진핵 발현 벡터(Invitrogen, San Diego, California, USA)에 인-프레임하게 부가되도록 하는 방식으로 툼스타틴을 PCR 증폭하였다. 전장 α3(Ⅳ) 사슬의 5' 말단으로부터 유래된 리더 서열은 NC1 도메인의 5'에 클론하여 배양 배지로 단백질이 분비되도록 하였다. 툼스타틴-포함 재조합 벡터는 측면에서 접하는 프라이머를 이용하여 서열분석하였다. 오류-없는 cDNA 클론은 더욱 정제하고, 단백질 발현을 확증하기 위한 시험관내 번역 연구에 사용하였다. 툼스타틴-포함 플라스미드와 대조 플라스미드는 염화칼슘 방법으로 293 세포를 트랜스펙션시키는데 사용하였다(Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, pps. 16 16.40). 트랜스펙션된 클론은 제네티신(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) 항생제 처리로 선별하였다. 세포는 세포 사멸이 보이지 않을 때까지 상기 항생제의 존재하에 3주동안 계대배양하였다. 클론은 T-225 플라스크로 확대하고 합류 수준까지 성장시켰다. 이후, 상층액을 수집하고 Amicon 농축장치(Amicon. Inc., Beverly, Massachusettes, USA)를 이용하여 농축하였다. 농축된 상층액은 SDS-PAGE, 면역블랏팅, ELISA로 툼스타틴 발현을 분석하였다. 상층액에서 강한 결합이 ELISA에 의해 탐지되었다.

툼스타틴-포함 상층액은 친화성 크로마토그래피를 실시하고 항-툼스타틴과 항-6-히스티딘 태그 항체로 면역탐지하였다(Gunwar, S. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15318:24). 주요 피크가 확인되었는데, 이는 툼스타틴 항체와 면역반응하는 대략 31 kDa의 단량체를 내포하였다.

실시예 25: 툼스타틴은 내피 세포 증식을 저해한다.

C-PAE 세포에 대한 툼스타틴의 항-증식 효과는 대장균(E. coli) 생산된 가용성 단백질을 이용한³H-티미딘 병합으로 조사하였다.

세포주와 배양. 786-0(신장 세포암 세포주), PC-3(사람 전립선 선암종 세포주), C-PAE(소 폐동맥 내피 세포주), HPE(사람 일차 전립선 내피 세포), HUVEC(사람 배꼽 정맥 내피 세포), MAE(생쥐 대동맥 내피 세포주)는 모두 American Type Culture Collection으로부터 입수하였다.

786-0과 C-PAE 세포주는 10% 소 태아 혈청(FCS), 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM(Life Technologies/Gibco BRL, 1 5 Gaithersburg, Maryland, USA)에, HPE 세포는 소 뇌하수체 추출물과 재조합 사람 EGF(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)로 보충된 각화세포-SFM에, HUVEC와 MAE 세포는 EGM-2(Clonetics Corporation, San Diego, California, USA)에 유지시켰다.

증식 분석. C-PAE 세포는 10% 소 태아 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM에서 합류 수준까지 성장시키고 48시간동안 접촉을 금지하였다. C-PAE 세포는 2차 계대배양과 4차 계대배양 사이에 사용하였다. 786-0과 PC-3 세포는 본 실험에서 비-내피 대조로 이용되었다. 세포는 37℃에서 5분동안 트립신처리(trypsinization)(Life Technologies/Gibeo BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)로 수확하였다. 1% FCS를 함유하는 DMEM에서 12,500 세포의 현탁액은 10 ㎍/㎖ 피브로넥틴으로 피복된 24-웰 평판의 각 웰에 첨가하였다. 세포는 37℃, 5% C0₂, 95% 습도에서 24시간동안 배양하였다. 배지는 제거하고 20% FCS를 함유하는 DMEM으로 교체하였다. 자극받지 않은 대조는 0.1% FCS와 함께 배양하였다. 세포는 0.01 내지 10 ㎎/㎖ 농도의 툼스타틴으로 처리하였다. 모든 웰에는 처리 시작후 12시에 1 mCurie의³H-티민딘이 첨가되었다. 24시간후, 배지는 제거하고, 웰은 PBS로 3회 세척하였다. 세포는 1N NaOH로 추출하고 4 ㎖ ScintiVerse Ⅱ(Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) 용액을 담은 신틸레이션 바이알에 첨가하였다. 티미딘 병합은 신틸레이션 계수기를 이용하여 측정하였다.

메틸렌-블루 염색 방법에서, 7000개 세포는 96-웰 평판의 각 웰에 도말하고 앞서 밝힌 바와 같이 처리하였다. 이후, Oliver et al.(Oliver, M.H. et al., 1989, J Cell. Science 92:513-8)의 방법을 이용하여 세포를 계산하였다. 48시간 처리후, 모든 웰은 100 ㎕ PBS로 세척하고, 세포는 중성-완충액(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)에 녹인 100 ㎖의 1O% 포르말린으로 고정시켰다. 이후, 세포는 0.01M 붕산염 완충액(pH 8.5)에 녹인 1% 메틸렌 블루 용액(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)으로 염색하였다. 웰은 0.01M 붕산염 완충액으로 세척하고, 메틸렌 블루는 0.1N HCl/에탄올(1:1 혼합물)로부터 추출하고, 흡수도는 655 nm 파장에서 마이크로평판 판독기(BioRad, Hercules, California, USA)로 측정하였다. 5 ㎍/㎖ 최종 농도의 Polymyxin B(Sigma)는 사용하여 내독소를 불활성화시켰다(Liu, S. et al., 1997, Clin. Biochem. 30:455-63).

결과는 도 21A, 21B, 21C에 도시하는데, 이들은 다양한 농도의 툼스타틴(x-축)으로 처리된 C-PAE 세포(도 21A), PC-3(도 21B), 786-O 세포(도 21C)에 대한³H-티미딘 병합(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. 모든 군은 삼중 시료를 대표한다. 툼스타틴은 대략 0.01 ㎎/㎖의 ED₅₀으로 용량-의존성 방식으로 FCS 자극된³H-티미딘 병합을 20% 저해하였다(도 21A). 이에 더하여, 최대 20 ㎎/㎖ 용량의 툼스타틴에서 전립선 암세포(PC-3) 또는 신장암 세포(786-0)에 대한 현저한 항-증식효과는 관찰되지 않았다(도 21B와 21C). 툼스타틴-처리된 군(0.1-10 ㎎/㎖)과 대조군에서³H-티미딘 병합의 평균값간의 차이는 유의하였다(P<0.05). PC-3 세포 또는 786-O 세포를 툼스타틴으로 처리하는 경우에, 저해 효과는 관찰되지 않았다(도 21B, 21C). 각 칼럼은 삼중 웰의 평균 ± SE를 나타낸다. 실험은 3회 반복하였다. 별표로 표시된 막대는 단측 스튜던트 t-검증(one tailed Student's t test)에서 유의하다(P<0.05).

실시예 26: 경쟁 증식 분석.

C-PAE 세포는 내피 세포 증식 분석을 위하여 전술한 바와 같이 96-웰 평판에 도말하였다. 0.1 ㎍/㎖ 최종 농도의 툼스타틴은 가변 농도(0, 0.008, 0.08, 0.8, 1.6, 2.4 ㎍/㎖)의 사람 α_vβ₃단백질(CHEMICON International, Temecula, California, USA)과 함께 실온에서 30분동안 배양하였다. 상기 혼합물은 웰에 첨가하고 48시간동안 배양하였다. 이후, 내피 세포 증식 분석에서 앞서 밝힌 바와 같이 메틸렌 블루 염색법을 이용하여 증식 분석을 실시하였다.

결과는 도 22에 도시하는데, 이는 C-PAE 세포에 의한 염료 흡수에 대한 증가하는 함량의 α_vβ₃과 결합된 0.1 ㎍/㎖ 툼스타틴 효과를 보여주는 히스토그램이다. OD₆₆₅에서 흡수도는 y-축에 제시한다. "0.1% FCS"는 0.1% FCS-처리된(자극받지 않은) 대조이고, "20% FCS"는 20% FCS-처리된(자극된) 대조이다. 나머지 막대는 α_vβ₃단독(대조) 및 툼스타틴과 증가하는 농도의 α_vβ₃으로 처리를 나타낸다. 각 막대는 삼중 웰의 평균 ± 표준오차를 나타낸다. 실험은 3회 반복하였다. 별표는 단측 스튜던트 t-검증(one tailed Student's t test)에서 P<0.05를 표시한다.

전술한 바와 같이, 툼스타틴은 용량-의존성 방식으로 세포 증식을 정상적으로 저해한다. 하지만, α_vβ₃인테그린이 첨가되면 툼스타틴의 항-증식 효과가 α_vβ₃단백질의 농도 증가와 함께 용량-의존성 방식으로 반전되었는데, 이는 α_vβ₃인테그린 단백질이 내피 세포 증식을 저해하는데 이용가능한 툼스타틴을 효과적으로 "포화"시킨다는 것을 시사한다. 2.4 ㎍/㎖(3배 몰 과다)의 α_vβ₃은 툼스타틴-유도된 항-증식 효과를 43.1% 반전시켰다. α_vβ₃단독으로 처리는 내피 세포 증식을 저해하지 못하였다.

실시예 27: 툼스타틴은 내피 세포에서 아폽토시스를 유도한다.

아넥신 V-FITC 분석. 아폽토시스의 초기 단계에서, 혈장 막의 내부 표면으로부터 외부로 막 인지질 PS의 전자가 관찰된다(van Engeland, M. et al., 1998, Cytomeuy 31:1-9; Zhang, G. et al., 1997, Biotechniques 23:525-3 1; Koopman,G. et al. 1994, Blood 84:1415-20). 외부화된 PS는 PS에 자연적으로 높은 결합 친화성을 보유하는 아넥신 V의 FITC 공액체로 염색하여 탐지할 수 있다(van Engeland, supra). 이런 이유로, 아넥신 V-FITC 표지를 이용하여 툼스타틴으로 처리직후에 내피 세포의 아폽토시스를 평가하였다.

C-PAE 세포(0.5 x 10⁶)는 1O% FBS 보충된 DMEM에서 6-웰 평판에 접종하였다. 다음날, 80 ng/㎖ TNF-α(양성 대조) 또는 0.02 내지 20 ㎍/㎖ 툼스타틴과 함께, 10%FCS를 함유하는 새로운 배지를 첨가하였다. 대조 세포에는 동등 부피의 PBS를 첨가하였다. 18시간 처리이후, 이탈된 세포를 포함하는 배지는 수집하고 부착된 세포는 트립신처리하고 이탈된 세포와 함께 3,000 x g에서 원심분리하였다. 이후, 세포는 PBS에서 세척하고 결합 완충액(10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂)에 재현탁시켰다. 아넥신 V-FITC(Clontech, Palo Alto, California, USA)는 150 ng/㎖의 최종 농도로 첨가하고, 세포는 암실에서 10분동안 배양하였다. 세포는 다시 한번 PBS에서 세척하고 결합 완충액에 재현탁시켰다. 아넥신-FITC 표지된 세포는 FACStar Plus 유세포분석기(Becton-Dickinson, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 계산하였다. 각 처리에서, 15,000개의 세포가 계산되고 리스트모드(listmode)에 저장되었다. 이후, 이들 데이터는 표준 Cell Quest 소프트웨어(Becton-Dickinson, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 분석하였다.

20 ㎍/㎖ 툼스타틴은 18시간후 아넥신 형광 피크의 분명한 전환을 보였다.형광 강도에서 이런 전환은 20 ㎍/㎖ 툼스타틴 및 양성 대조 TNF-α(80 ng/㎖)에서 유사하였다. 2 ㎍/㎖ 툼스타틴 역시 아넥신 형광 강도에서 완화된 전환을 보였지만, 0.2 ㎍/㎖ 미만의 농도는 아넥신 V 실증성(positivity)을 입증하지 못하였다. 피크 강도의 이런 전환은 비-내피 세포(PC-3)를 이용하는 경우에 관찰되지 않았다.

툼스타틴은 또한, 상 대조 현미경(phase contrast microscopy)에 의해 모니터되는 바와 같이 C-PAE 세포의 세포 형태를 변화시켰다. 피브로넥틴-피복된 평판에서 1O% FCS의 존재하에 20 ㎍/㎖ 툼스타틴으로 세포를 24시간동안 처리한 이후, 아폽토시스 세포의 전형적인 형태 특징, 막 기포화, 세포질 위축, 크로마틴 응집이 관찰되었다. 대조 웰에서 세포는 원래 형태를 보였다.

카스파제-3 분석. 카스파제-3(CPP32)은 아폽토시스의 초기 단계에서 활성화되는 세포내 프로테아제이고, 구조와 DNA 복구 단백질을 분해시켜 세포 파괴를 개시한다(Casciola-Rosen, L. et al., 1996, J Exp. Med. 183:1957-64; Salvesen, G.S. et al., 1997, Cell 115 :443-6). 카스파제-3의 프로테아제 활성은 표지된 기질(DEVD-pNA)로부터 절단된 형광단(p-니트로아닐리드)을 탐지하여 분광 광도법으로 측정하였다.

C-PAE 세포 또는 PC-3 세포(0.5 x 10⁶/웰)는 10% FCS로 보충된 DMEM에 녹인 피브로넥틴(10 ㎍/㎖)으로 사전피복된 6-웰 평판에 도말하고 하룻밤동안 배양하였다. 다음날, 배지는 2% FCS를 함유하는 DMEM으로 교체하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 이후, 세포는 2% FCS로 보충되고 TNF-α(80 ng/㎖, 양성 대조) 또는툼스타틴(10 ㎍/㎖)를 함유하는 DMEM에 녹인 bFGF(3 ng/㎖)로 자극하였다. 대조 세포에는 PBS 완충액을 첨가하였다. 24시간후, 상층액은 수집하고 부착된 세포는 트립신처리하고 상층액 세포와 합쳤다. 세포는 계산하고 세포 용해 완충액(Clontech, Palo Alto, California, USA)에 4 x 10⁷세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 이런 프로토콜의 나머지 부분은 제조업자(Clontech, Palo Alto, California, USA)의 지시에 따랐다. 카스파제-3의 특이적 저해물질인 DEVD-fink (Asp-Glu-Val-Asp-플루오르메틸 케톤)을 사용하여 이런 분석의 특이성을 확증하였다. 흡수도는 405 nm에서 마이크로평판 판독기(BioRad, Hercules, California, USA)로 측정하였다. 분석은 각 세포형에 대하여 3회 반복하였다.

결과는 도 23A와 23B에 도시하는데, 이들은 다양한 처리(x-축)하에 C-PAE 세포(도 23A)와 PC-2 세포(도 23B)에 대한 OD₄₀₅에서 흡수도(y-축)의 함수로 카스파제-3 활성의 정도를 보여주는 한 쌍의 히스토그램이다. 각 칼럼은 삼중 웰에서 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.

2O ㎍/㎖ 툼스타틴으로 처리된 C-PAE 세포는 카스파제-3 활성에서 1.6배 증가를 보인 반면, 양성 대조 TNF-α는 대조와 비교하여 필적하는(1.7배) 증가를 제공하였다. 카스파제-3의 특이적 저해물질, DEVD-fmk는 프로테아제 활성을 기준선으로 감소시키는데, 이는 측정된 활성에서 증가가 카스파제-3에 특이적임을 시사한다. 비-내피 PC-3 세포에서, 대조와 툼스타틴-처리된 세포간에 카스파제-3 활성의 차이는 존재하지 않았다.

실시예 28: 세포 부착 분석.

인테그린 아단위 α1-α6, β1, α_vβ₃인테그린 차단 항체의 존재하에 HUVEC의 툼스타틴-피복된 평판에 부착을 조사하였다. 이런 분석은 Senger et al.(Senger, D.R. et al., 1997, Proc. Natl. Acad Sci. USA 94:13612-7)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 96-웰 평판은 10 ㎍/㎖의 사람 툼스타틴, 생쥐 라미닌-1 또는 사람 Ⅳ형 콜라겐(Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)으로 37℃에서 하룻밤동안 피복하였다. 이후, 0.5 ㎍/㎖비트로넥틴(Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)을 사용하여 평판을 피복하였다. 나머지 단백질 결합 부위는 PBS에 녹인 100 ㎎/㎖ BSA(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)로 2시간동안 차단하였다. HUVEC 세포는 EGM-2 MV 배지에서 하위합류 수준(70-80%)으로 성장시키고 부드럽게 트립신처리하며 혈청-없는 배지(1.5 x 10⁵세포/㎖)에 재현탁시켰다. 이후, 세포는 1O ㎍/㎖ 생쥐 IgG₁(대조)(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland, USA) 또는 항체(사람 β₁인테그린에 대한 생쥐 단클론 항체(클론 P4C1O)(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland, USA); 사람 인테그린 α₁내지 α₆(CHEMICON International, Temecula, California, USA); α_vβ₃인테그린(클론 LM609)(CHEMICON International)과 혼합하고 부드럽게 교반하면서 실온에서 15분동안 배양하였다. 그 다음, 100 ㎕ 세포 현탁액은 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 45분동안 배양하였다. 부착되지 않은 세포는 세척하고, 부착된 세포는 메틸렌 블루로 염색한 이후 계산하였다. C-PAE 세포는 상기 절차에 따라 별도의 실험에 이용하였다.

결과는 도 24A 내지 24D 및 도 25에 도시한다. 도 24A, 24B, 24C, 24D는 인테그린 아단위 α₆, β₁또는 α_vβ₃인테그린 차단 항체의 존재하에 툼스타틴(도 24A), 또는 Ⅳ형 콜라겐(도 24B), 비트로넥틴(도 24C) 또는 라미닌-1(도 24D)로 피복된 평판에 HUVEC 세포의 결합을 보여주는 4가지 히스토그램이다. 도 25는 툼스타틴-피복된 평판에 C-PAE 세포의 결합을 보여주는 히스토그램이다. 평판 피복은 각 그래프의 상부에 표시하고, 배양에 사용된 항체는 각 그래프의 x-축에 표시한다. BSA-피복된 평판은 음성 대조로 이용하였다.

툼스타틴-피복된 평판에 HUVEC 세포 부착은 IgG-피복된 대조 평판과 비교하여 항-α₆, 항-β₁또는 항-αβ₃항체에 의해 현저하게 차단되었다. 세포 부착은 항-β₁과 항-α_vβ₃항체를 함께 사용하면 더욱 저해되었다. α_vβ₃항체는 세포 부착을 80% 저해하였고, α₆또는 β₁항체는 대조 IgG 처리와 비교하여 54% 차단되었다. α₅항체는 약간의 저해(20%)를 보였지만, 아단위 α1 내지 α4에 대한 항체는 세포 부착을 차단하지 않았다. α_vβ₃항체와 β₁항체를 함께 사용하면, 세포 결합은 91% 차단되었다.

툼스타틴-피복된 평판에서 HUVEC 세포 대신에 C-PAE 세포를 사용하여도 동등한 저해가 관찰되었다. Ⅳ형 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌-1은 대조로 이용하였다. α₁β₁과 α₂β₁인테그린은 콜라겐에 결합한다(Elices, M.J. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:9906-10; Ignatius, M.J. et al., 1990, J Cell. Biol. 11 1:709-20). Ⅳ형 콜라겐-피복된 평판에 세포 결합은 대조 IgG와 함께 배양된 세포와 비교하여 α₁(20%), α₂(27%), β₁(53%)에 대한 항체에 의해 부분적으로 저해되었다. α_vβ₃인테그린은 비트로넥틴에 대한 수용체이다(Hynes, R.O. et al., 1992, Cell 69:11-25). 비트로넥틴-피복된 평판에 세포 결합은 α_vβ₃항체에 의해 61% 저해되었다. α₅β₁과 α₆β₁인테그린은 라미닌에 결합한다(Wayner, E.A. et al., 1988, J Cell. Biol. 107:1881-91; Sonnenberg, A. et al., 1988, Nature 336:487-9). 항-α₅또는 항-α₆항체는 라미닌-1 피복된 평판에 내피 세포의 결합을 각각 50%와 89% 저해하였다. 툼스타틴-피복된 평판에 세포 부착(도 25)은 IgG-처리된 대조와 비교하여 항-β₁또는 항-α_vβ₃항체에 의해 현저하게 저해되었다. 항-β₁또는 항-α_vβ₃항체를 함께 사용하면, 세포 부착은 더욱 저해되었다.

실시예 29: 툼스타틴은 내피 관 형성을 저해한다.

매트리겔(Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)은 24-웰 평판의 각 웰에 첨가하고 중합되도록 하였다(Grant, D.S. et aL, 1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63). 항생제 없는 EGM-2 배지(Clonetics Corporation, San Diego, California, USA)에서 25,000개 MAE 세포의 현탁액은 매트리겔로 피복된 각 웰에 계대배양하였다. 이들 세포는 증가하는 농도의 툼스타틴, BSA 또는 7S 도메인으로 처리하였다. 대조 세포는 무균 PBS와 함께 배양하였다. 모든 분석은 삼중으로 실시하였다. 세포는 37℃에서 24-48시간동안 배양하고 CK2 Olympus 현미경(3.3 대안렌즈, 1OX 대물렌즈)으로 세밀히 검사하였다. 이후, 세포는 400 DK 피복된 TMAX 필름(Kodak)을 이용하여 사진을 촬영하였다. 세포는 diff-quik 정착액(Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA)으로 염색하고 다시 한번 사진을 촬영하였다(Grant, D.S. et aL, 1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63). 10개 시역(視域)을 세밀히 검사하고, 관의 개수는 실험 프로토콜을 알지 못하는 2명의 연구자가 계산하고 평균하였다.

결과는 도 26에 도시한다. 생쥐 대동맥 내피 세포는 매트리겔에서 배양하는 경우에, 빠르게 정렬되고 공동(空洞)의 관-유사 구조를 형성한다(Grant, D.S. et aL, 1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63). 293 세포에서 생산된 툼스타틴은 BSA 대조와 비교하여 용량 의존성 방식으로 MAE 세포에서 내피 관 형성을 현저하게 저해하였다(도 26). 1 ㎎/㎖ 단백질로 처리이후 관 형성의 비율은 BSA 98.0 ± 4.0 및 툼스타틴 14.0 ± 4.0이었다. 대장균(E. coli) 생산된 툼스타틴을 사용하여도 유사한 결과가 수득되었다. Ⅳ형 콜라겐의 7S 도메인(N-말단 비-콜라겐 도메인)은 내피 관 형성에 별다른 영향을 주지 않았다. 툼스타틴으로 최대 저해는 800-1000 ng/㎖로 달성되었다. 툼스타틴-처리된 군(●, 0.1-10 ㎎/㎖) 및 대조(BSA(▣), 7S 도메인(○))의 평균 비율 수치간 차이가 현저하였다(P<0.05). 각 지점은 삼중 웰에서 평균 ± SE를 나타낸다. 실험은 3회 반복하였다. 별표로 표시된 데이터 포인트는 단측 스튜던트 검증에서 P<0.05로 현저하였다. 잘-형성된 관이 7S 도메인 처리에서 관찰되었다. 0.8 ㎎/㎖로 처리된 MAE 세포는 감소된 관 형성을 보였다.

새로운 모세혈관의 형성에 대한 툼스타틴의 생체내 효과를 평가하기 위하여, 매트리겔 충전물 분석을 실시하였다(Passaniti, A. et al., 1992, Lab. Invest. 67:519-29). 5- 내지 6-주령 수컷 C57/BL6 생쥐(Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA)를 얻었다. 매트리겔(Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)은 4℃에서 하룻밤동안 해동하였다. C57/BL6 생쥐로 주사에 앞서, 이는 20 U/㎖ 헤파린(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA), 150 ng/㎖ bFGF(R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), 1 ㎎/㎖ 툼스타틴과 혼합하였다. 대조군은 혈관형성 저해물질을 섭취하지 않았다. 매트리겔 혼합물은 21 게이지 바늘을 이용하여 피하 주사하였다. 14일후, 생쥐는 죽이고 매트리겔 충전물을 제거하였다. 매트리겔 충전물은 실온에서 4시간동안 4% 파라-포름알데하이드(PBS에 녹임)에서 4시간동안 고정시키고, 이후 24시간동안 PBS로 전환시켰다. 충전물은 파라핀에 포매시키고 절단하며 H&E 염색하였다. 절편은 광 현미경으로 검사하고, 10개 광확대 시역으로부터 혈관의 개수는 계산하고 평균하였다. 모든 절편은 연구 프로토콜을 알지 못하는 병리학자가 코드화하고 관찰하였다.

매트리겔을 대장균(E. coli) 생산된 툼스타틴과 함께 또는 이런 툼스타틴 없이, bFGF 또는 헤파린의 존재하에 위치시키는 경우에, 1 ㎍/㎖ 툼스타틴에서 혈관개수의 67% 감소가 관찰되었다. 광확대 시역당 혈관의 개수는 툼스타틴 2.25 ± 1.32 및 대조 7.50 ± 2.17이었다. 각 칼럼은 군당 5-6마리의 평균 ± SE를 나타낸다. 툼스타틴(1 ㎎/㎖)은 PBS로 처리된 대조와 비교하여 생체내 신생혈관(neo-vascularization)을 현저하게 저해하였다. 툼스타틴-처리된 동물과 대조 동물의 평균 비율 수치간 차이가 현저하였다(P<0.05). 툼스타틴 처리는 꼬리 스튜던트 검증에서 P<0.05로 현저하였다.

실시예 30: 툼스타틴과 툼스타틴 변이체는 생체내에서 종양 성장을 저해한다.

5백만개의 PC-3 세포를 수확하고 7- 내지 9-주령 수컷 무흉선 누드 생쥐의 등에 피하 주사하였다. 종양은 Vernier 캘리퍼스로 측정하고, 종양 체적은 표준 공식(너비²x 길이 x 0.52)에 따라 산정하였다. 종양은 대략 100 ㎣까지 성장시키고, 동물은 5-6 마리의 생쥐군으로 분할하였다. 개별 실험군에 무균 PBS에 녹인 툼스타틴 또는 생쥐 엔도스타틴(20 ㎎/㎏/day)을 10일동안 매일 복강내 주사하였다. 대조군은 운반제(BSA 또는 PBS)를 주사하였다. 종양 체적은 10일동안 매 2-3일마다 산정하였다. 결과는 도 27A에 도시하는데, 이는 PBS 대조(▣), 20 ㎎/㎏ 툼스타틴(●), 20 ㎎/㎏ 엔도스타틴(○)의 치료일(x-축)에서 종양 체적(㎣)(y-축)을 보여주는 그래프이다. 대장균(E. coli)에서 생산된 툼스타틴은 PC-3 사람 전립선 종양의 성장을 현저하게 저해하였다(도 27A). 20 ㎎/㎏ 툼스타틴은 20 ㎎/㎏ 엔도스타틴과 유사하게 종양 성장을 저해하였다. 종양 성장에 대한 현저한 저해효과는 10일(대조 202.8 ± 50.0 ㎣, 툼스타틴 82.9 ± 2.52 ㎣, 엔도스타틴 68.9 ± 16.7 ㎣)에 관찰되었다. 툼스타틴 또는 엔도스타틴의 매일 복강내 주사는 대조와 비교하여 사람 전립선 선암종 세포(PC-3)의 종양 성장을 저해하였다. 이런 실험은 종양 체적이 100 ㎣ 미만일 때 시작하였다.

생쥐에서 다른 확립된 일차 종양에 대한 툼스타틴 효과를 또한 조사하였다. 2백만개의 786-O 신장 세포암 세포를 7- 내지 9-주령 수컷 무흉선 누드 생쥐의 등에 피하 주사하였다. 종양은 대략 600 내지 700 ㎣까지 성장시키고, 동물은 6 마리의 생쥐군으로 분할하였다. 무균 PBS에 녹인 툼스타틴(6 ㎎/㎏)을 10일동안 매일 복강내 주사하였다. 대조군은 BSA를 주사하였다. 결과는 도 27B에 도시하는데, 이는 PBS 대조(▣)와 6 ㎎/㎏ 툼스타틴(●)의 치료일(x-축)에서 종양 체적(㎣)(y-축)을 보여주는 그래프이다. 대장균(E. coli)-생산된 6 ㎎/㎏ 툼스타틴은 BSA 대조와 비교하여 786-O 사람 신장 세포암의 종양 성장을 저해하였다(도 27B). 종양 성장에 대한 현저한 저해 효과는 10일(대조 1096 ± 179.7 ㎣, 툼스타틴 619 ± 120.7 ㎣)에 관찰되었다. 툼스타틴의 매일 복강내 주사는 대조와 비교하여 사람 신장 세포암(786-O)의 종양 성장을 저해하였다. 이런 실험은 종양 체적이 600-600 ㎣일 때 시작하였다. 각 지점은 군당 5-6마리의 평균 ± SE를 나타낸다. 별표로 표시된 데이터 포인트는 단측 스튜던트 t-검증에서 P<0.05로 유의하였다.

Ⅳ형 콜라겐의 α3 사슬의 NC1 도메인(α3(Ⅳ)NC1)의 일부분은 굿패스처 증후군(Goodpasture syndrome)의 병원성 에피토프이다(Butkowski, R.J. et al., 1987, J Biol. Chem. 262.7874-7; Saus, J. et al., 1988, J Biol. Chem.263:13374-80; Kalluri, R. et al., 1991, J Biol. Chem. 266:24018-24). 굿패스처 증후군은 폐출혈 및 급속히 진행하는 사구체신염(glomerulonephritis)으로 특성화되는 자가면역질환이다(Wilson, C. & F. Dixon, 1986, The Kidney, W.B. Sanders Co., Philadelphia, Pennsylvania, USA, pps. 800-89; Hudson, 1 5 B.G. et al., 1993, J Biol. Chem. 268:16033-6). 이들 증상은 α3(Ⅳ)NC1에 대한 자가-항체의 결합을 통하여 사구(glomerular)와 폐포(alveolar) 기저막의 파괴에 의해 유발된다(Wilson, 1986, supra; Hudson, 1993, supra). 여러 연자들이 α3(Ⅳ)에서 굿패스처 자가-항원의 위치를 확인하거나 예측하려 시도하였는데(Kalluri, R. et al., 1995, J Am. Soc. Nephrol. 6:1178-85; Kalluri, R. et al., 1996, J Biol. Chem. 271:9062-8; Levy, J.B. et al., 1997, J Am. Soc. Nephrol. 8:1698-1705; Kefalides, N.A. et al. , 1993, Kidney Int. 43:94-100; Quinones, S. et al., 1992, J Biol. Chem. 267:19780-4 (erratum in J Biol. Chem. 269:17358); Netzer, K.O. et al., 1999, J Biol. Chem. 274:11267-74), N-말단, C-말단, 중간-영역에서 잔기가 에피토프 위치인 것으로 보고되었다. 최근에, 가장 유력한 질환-관련된 병원성 에피토프가 N-말단 영역의 첫 40개 아미노산에 동정되었고(Hellmark, T. et al., 1999, Kidney Int. 55:936-44) N-말단 40개 아미노산에 더욱 한정되었다. 절두된 툼스타틴은 병원성 굿패스처 자가-에피토프에 상응하는 N-말단 53개 아미노산이 부재된 툼스타틴-N53으로 명명하였다. 상기 변이 단백질은 아래의 실험에 사용하였다.

2백만개의 786-O 신장 세포암 세포를 7- 내지 9-주령 수컷 무흉선 누드 생쥐의 등에 피하 주사하였다. 종양은 대략 100 내지 150 ㎣까지 성장시켰다. 생쥐는 5 마리 군으로 분할하고, 53 N-말단 아미노산이 부재하는 20 ㎎/㎏의 대장균(E. coli)-생산된 절두된 툼스타틴(Kalluri, R. et al,. 1996, J Biol. Chem. 271:9062-8)을 10일동안 매일 복강내 주사하였다. 대조 생쥐는 PBS를 주사하였다. 결과는 도 28에 도시하는데, 이는 대조 생쥐(▣)와 툼스타틴 변이체로 치료된 생쥐(●)의 치료일(x-축)에서 종양 체적(㎣)(y-축)을 보여주는 그래프이다. 대장균(E. coli)-생산된 6 ㎎/㎏ 툼스타틴-N53은 대조와 비교하여 4일에서 10일까지 786-O 사람 신장 종양의 성장을 저해하였다(도 28). 각 지점은 군당 5-6마리의 평균 ± SE를 나타낸다. 별표로 표시된 데이터 포인트는 단측 스튜던트 t-검증에서 P<0.05로 유의하였다.

실시예 31: α3(Ⅳ)NC1과 CD31의 면역조직화학적 염색.

7-주령 수컷 C57/BL6 생쥐로부터 얻은 신장과 피부 조직은 면역형광 검경에 의한 평가를 위하여 처리하였다. 조직 시료는 액체 질소에 동결하고 4 ㎜ 두께 절편을 사용하였다. 조직은 기존 문헌에 기술된 간접 면역형광 기술로 처리하였다(Kalluri, R. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271.9062-8). 동결된 절편은 일차 항체, 다클론 항-CD31 항체(1:100 희석) 또는 다클론 항-α3(Ⅳ)NC1 항체(1:50 희석); 후속으로 이차 항체, FITC-공액된 항-쥐 IgG 항체 또는 FITC-공액된 항-사람 IgG 항체로 염색하였다. 면역형광은 Olympus 형광 현미경(Tokyo, Japan)하에 조사하였다. 음성 대조는 일차 항체를 무관한 면역전 혈청으로 대체하여 실시하였다.

생쥐 신장에서, α3(Ⅳ)NC1의 발현은 GBM과 혈관 기저막에서 관찰되었다.CD31, PECAM-1의 발현은 사구 내피와 혈관 내피에서 관찰되었다. 생쥐 피부에서, α3(Ⅳ)NC1은 표피 기저막과 혈관 기저막에서 부재하였다. CD31의 발현은 피부의 혈관 내피에서 관찰되었다. CD31 발현은 사구체의 내피에서 관찰되었고 생쥐 신장 α3(Ⅳ)NC1 발현에서 소형 혈관은 사구 기저막과 사구외(extraglomerular) 혈관 기저막에서 관찰되었다. CD31의 발현은 생쥐 피부에서 피부 소혈관의 내피에서 관찰되었다. α3(Ⅳ)NC1 발현은 표피 기저막에 부재하였고 피부 소혈관의 기저막에서 거의 관찰되지 않았다. 이들 결과는 툼스타틴의 한정된 분포의 전형이다.

실시예 32: 툼스타틴 N-53은 내피 세포에서 아폽토시스를 유발한다.

툼스타틴 N-53의 친-아폽토시스 활성은 C-PAE 세포에서 조사하였다. 세포 생존능은 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라솔륨 브로마이드) 분석법으로 평가하였다(Sugiyama, H. et al., 1998, Kidney Int. 54:1188-96). 이런 분석법은 활성 미토콘드리아에서 테트라솔륨 고리를 제거하는 생존 세포의 능력에 기초한 세포 생존의 비색 정량 분석이다. C-PAE 세포(7,000 세포/웰)는 DMEM을 함유하는 10% FCS에서 96-웰 평판에 도말하였다. 다음날, TNF-α(양성 대조, 80 ng/㎖) 또는 가변 농도의 툼스타틴이나 툼스타틴 N-53을 웰에 첨가하고 24시간동안 배양하였다. 이후, 10 ㎕/웰의 비율로 MTT 용액(5 ㎎/㎖; CHEMICON International, Temecula, California, USA)을 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 산-이소프로판올을 첨가하고 완전하게 혼합하였다. 흡수도는 590 nm에서 마이크로평판 판독기(Bio-Rad, Hercules, California, USA)로 측정하였다.

결과는 도 29에 도시하는데, 이는 증가하는 농도의 툼스타틴과 툼스타틴 N-53(x-축)에서 세포 생존능(OD₅₉₀의 함수, y-축)을 보여주는 그래프이다. 각 지점은 삼중 웰에서 평균 ± SE를 나타낸다. 별표로 표시된 데이터 포인트는 단측 스튜던트 t-검증에서 P<0.05로 유의하였다.

툼스타틴 N-53은 용량-의존성 방식으로 세포 생존능을 감소시킨다. 5 ㎍/㎖에서 툼스타틴 N-53은 대조와 비교하여 세포 생존능을 49.4% 감소시켰는데, 이런 효과는 양성 대조로 이용된 80 ng/㎖ TNF-α에 필적하였다. 다른 실험에서, 전장 툼스타틴은 5 ㎍/㎖ 툼스타틴 N-53에서 49.4%와 비교하여, 5 ㎍/㎖에서 22.5%와 1O ㎍/㎖에서 세포 생존능을 60% 저해하였다. 놀랍게도, 5 ㎍/㎖ 또는 1 ㎍/㎖ 툼스타틴 N-53은 내피 세포에서 전장 툼스타틴보다 높은 아폽토시스를 유도하였다.

실시예 33: 항-혈관형성 단백질의 변이체와 단편.

아레스텐과 칸스타틴의 단편과 변이체는 또한, Mariyama et al. (1992, J Biol. Chem. 267:1253-8)의 슈도모나스(Pseudomonas) 엘라스타제 절단으로 만들었다. 절단물은 겔 여과 HPLC로 분리하고, 생성 단편은 SDS-PAGE로 분석하고 앞서 기술된 내피 관 분석에서 평가하였다. 이들 단편에는 아레스텐의 12 kDa 단편, 아레스텐의 8 kDa 단편, 칸스타틴의 10 kDa 단편이 포함되었다. 이에 더하여, 툼스타틴의 2가지 단편('333'과 '334')은 PCR 클로닝으로 발생시켰다.

앞서 기술된 바와 같이 실시되고 도 30에 도시된 내피 관 분석은 2가지 아레스텐 단편(12 kDa(■)과 8 kDa(□)) 및 칸스타틴 단편(19 kDa(▲))은 아레스텐(●) 또는 칸스타틴(○)보다 내피 관 형성을 좀더 현저하게 저해함을 보여준다. 도31에서는 툼스타틴 단편, "333"(●)과 "334"(○)가 툼스타틴(▲) 및 대조로 기능하는 BSA(■)과 α6 사슬(○)보다 효과적이라는 것을 보여준다.

실시예 34: 내피와 WM-164 세포의 증식에 대한 툼스타틴의 효과.

내피 세포 증식은 실시예 25에서 밝힌 바와 같이³H-티미딘 병합 또는 메틸렌 블루 염색으로 실시하였다. C-PAE 세포(계대배양 2-4)는 합류 수준까지 성장시키고 48시간동안 접촉을 금지하였다. 786-0, PC-3, WM-164 세포는 비-내피 대조로 이용하고 상기 실시예 25에서 밝힌 바와 같이 배양하였다. HPE(사람 일차 전립선 내피 세포)는 소 뇌하수체와 재조합 사람 EGF(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)로 보충된 각화세포-SFM에 배양하였다. 흑색종 세포주 WM-16은 Wistar Institute(Philadelphia, Pennsylvania, USA)의 Dr. Meenhard Herlyn으로부터 입수하고, Herlyn et al. (1990, Adv. Cancer Res. 54:213 -34)에 의해 기술된 바와 같이 78% MCDB-153 배지, 10% L-15 배지, 10% 트립토스 포스페이트 액체배지, 2% FBS, 50 units/㎖ 인슐린에 배양하였다.

C-PAE, PC-3, 786-O 세포에서³H-티미딘 병합의 결과는 도 21A-C에 도시한다. HPE, C-PAE, WM-164 세포의 메틸렌 블루 염색은 도 32A, 32B, 32C에 도시하는데, 이들은 HPE(도 32A), C-PAE(도 32B), WM-164(도 32C)의 증식(y-축)에 대한 증가하는 농도의 툼스타틴의 효과(x-축)를 보여주는 히스토그램이다. 이런 결과는 툼스타틴이 용량-의존성 방식으로 C-PAE 세포의 FCS-자극된 증식을 저해한다는 것을 입증한다. 툼스타틴-처리된 세포(0.1-10 ㎎/㎖)와 대조 세포에서³H-티미딘 병합의 평균값간의 차이는 유의하였다(P<0.05). PC-3(도 21B), 786-O(도 21C), HPE(도 32A), WM-164 세포(도 32C)는 툼스타틴에 의한 저해 효과를 보이지 않았다. 폴리믹신 B(5 ㎍/㎖)를 첨가하여 내독소를 활성화시키는 경우에, 툼스타틴 저해 효과는 변하지 않았다(도 32B).

흥미롭게도, α3(Ⅳ)NC1 도메인의 아미노산 185-203에 의한 이들 세포의 저해가 보고되긴 했지만(Han et al., 1997, J Biol. Chem. 272:20395-401), 전장 툼스타틴은 WM-164 세포의 증식에 별다른 영향을 주지 않았다. 이는 영역 185-203이 전장 접힌 툼스타틴의 일부로 존재하는 경우에 항-종양 세포 활성이 유효하지 않다는 것을 암시한다.

실시예 35: 툼스타틴 변이체 Tum-1, Tum-2, Tum-3, Tum-4의 재조합 생산.

α3(Ⅳ)NC1 도메인은 시험관내에서 흑색종 및 다른 내피 종양 세포주에 결합하여 이들의 증식을 저해하는 것으로 밝혀졌다(Han et al., 1997, J Biol. Chem. 272.20395-401). Han et al.은 흑색종 세포에 대한 결합 부위를 α3(Ⅳ)NC1 도메인의 아미노산 185-203으로 확인하였다. 이런 부위에 대한 단클론과 다클론 항체는 흑색종 세포 부착 및 증식 저해를 차단할 수 있었다(Han et al., supra). Han et al.은 또한, 아미노산 189-191에 위치한 특이적 서열 "SNS"가 흑색종 세포 부착 및 증식 저해에 필요하다는 것을 발견하였다(Han et al., supra). 이들 연구에서, 185-203 α3(Ⅳ)NC1 합성 펩티드는 내피 세포를 비롯한 다른 세포형에서는 검사하지 않았다. 이에 더하여, Han et al.은 분리된 사람 α3(Ⅳ)NC1 도메인을 사용하지 않았다.

4개의 재조합 결실 변이체는 실시예 23 및 Kalluri, R. et al., 1996 J Biol. Chem. 271:9062-8에서 밝힌 바와 같이 생산하고 정제하였다. 툼스타틴 N53으로 알려져 있는 Tum-1은 SEQ ID NO: 10의 C-말단 191개 아미노산으로 구성되고 N-말단 53개 아미노산이 부재한다. Tum-1은 상기 실시예 23에서도 기술한다. 툼스타틴 333은 툼스타틴의 N-말단 아미노산 2 내지 125(SEQ ID NO: 1O)로 구성된다. Tum-3은 C-말단 112개 아미노산으로 구성된다. Tum-4는 아미노산 185-203을 포함하는 C-말단 64개 아미노산이다(Han et al., supra). 이들 결실 변이체는 상기 실시예 23에서 밝힌 바와 같이 pET22b 또는 pET28a(+) 발현계(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)를 이용하여 대장균(E. coli)에서 발현시켰다. 이들 변이체는 상기 표1에 예시한다.

실시예 36: 내피와 WM-164 세포 증식과 아폽토시스에 대한 툼스타틴 변이체의 효과.

내피 세포(C-PAE 세포)와 WM-164 흑색종 세포의 증식은 실시예 25와 34에 기술된 바와 같이 메틸렌 블루 염색으로 분석하였다. 결과는 도 33A와 33B에 도시하는데, 이들은 C-PAE 세포(도 33A)와 WM-164 세포(도 33B)의 상대적 개수(y-축)에 대한 증가하는 농도의 툼스타틴, Tum-1, Tum-2, Tum-3, Tum-4의 효과(x-축)를 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 도 33A에서는 툼스타틴, Tum-1, Tum-2가 용량-의존성 방식으로 C-PAE 세포 증식을 저해한다는 것을 보여준다.

도 33B에서는 흑색종 세포주, WM-164가 Tum-1 또는 Tum-2에 의해 영향 받지 않음을 보여준다. 하지만, Tum-4는 이들 세포주에 항-증식 활성을 보였다. 하기표 2에 도시된 바와 같이, 15 ㎍/㎖ 툼스타틴은 C-PAE 세포의 증식을 78.5% 저해하였다. Tum-1과 Tum-2는 C-PAE 세포를 각각 65.6%와 73.3% 저해하였다. 대조적으로, Tum-3과 Tum-4는 C-PAE 세포를 저해하지 않았다. Tum-4만 WM-164 흑색종 세포를 저해하였다. 50 ㎍/㎖ Tum-4는 이들 세포를 46.1% 저해했지만, C-PAE 세포를 저해하지는 않았다.

표 2. 재조합 툼스타틴과 툼스타틴의 결실 변이체.

재조합 툼스타틴 및 결실 변이체는 pET22b 또는 pET28a(+) 발현계(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)를 이용하여 대장균(E. coli)에서 발현시켰다. 웰당 7,000개 세포를 96-웰 평판에 도말하고, 15 ㎍/㎖(C-PAE 세포) 또는 50 ㎍/㎖(WM-164 세포)의 재조합 단백질의 존부하에 20% FCS(C-PAE 세포) 또는 3% FCS (WM-164 세포)로 자극하였다. 상대적 세포 개수는 전술한 바와 같이 메틸렌 블루 염색으로측정하였다. 데이터는 삼중 웰에서 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. N.D. = 측정되지 않음. * = 단백질 없음과 비교하여 P<0.05.

MTT 분석법을 이용하여 툼스타틴, Tum-1, Tum-2, Tumm-3, Tum-4로 처리이후 C-PAE 내피 세포와 WM164 흑색종 세포에서 세포 생존능을 평가하였다. 결과는 도 34A와 34B에 도시하는데, 이들은 C-PAE 세포(도 34A)와 WM-164 세포(도 34B)의 세포 생존능(y-축)에 대한 증가하는 농도의 툼스타틴, Tum-1, Tum-2, Tum-3, Tum-4의 효과(x-축)를 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 각 지점은 삼중 웰에서 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 도 34A에서는 Tum-1이 용량-의존성 방식으로 세포 생존능을 감소시킨다는 것을 보여준다. 1과 5 ㎍/㎖의 용량에서, Tum-1은 세포 생존을 감소시키는데 있어 툼스타틴보다 훨씬 효과적이었다. Tum-4는 WM-164 흑색종 세포의 생존능을 감소시킨 유일한 결실 변이체이었다(도 34B).

상기 실시예 27에서 밝힌 바와 같이 카스파제-3 활성을 측정하여 아폽토시스를 또한 평가하였다. 결과는 도 35에 도시하는데, 이는 5 ㎍/㎖ Tum-1, Tum-2, Tum-3 또는 Tum-4; 또는 80 ng/㎖ TNF-α 또는 PBS 완충액(대조)으로 처리된 C-PAE 세포(x-축)의 OD₄₀₅에서 흡수도의 크기로 카스파제-3 활성(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. Tum-1과 Tum-2는 C-PAE 세포에서 카스파제-3의 활성을 증가시킨 반면, Tum-3과 Tum-4는 그렇지 않았다.

실시예 37: 내피 세포에서 α _v β ₃ 인테그린에 툼스타틴 변이체의 결합.

툼스타틴 결실 변이체로 피복된 평판에 C-PAE 세포의 부착을 측정하기 위하여, 전술한 바와 같이 세포 부착을 실시하였다(참조: 실시예 28). Tum-4에 대한 토끼 항체는 기존 문헌에 기술된 바와 같이 준비하였다(Kalluri et al., 1997, J Clin. Invest. 99:2470-8). 양고추냉이 과산화효소로 공액된 염소 항-토기 IgG 항체는 Sigma Chemical Company(St. Louis, Missouri, USA)로부터 구입하였다. 결과는 도 36A, 36B, 36C에 도시하는데, 이들은 대조 IgG, α_vβ₃, α_vβ₅, BSA의 존재하에 Tum-1(도 36A), Tum-2(도 36.), Tum-4(도 36C)로 피복된 평판에 C-PAE 세포의 결합 비율(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. Tum-1(도 36A)로 피복된 평판은 항-Tum-4 항체(1:200 희석)로 처리하여 α_vβ₅결합 부위를 비롯하여 기존 문헌에 기술된 α_vβ₃결합 부위를 차단하였다(Shahan et al., 1999, Cancer Res. 59:4584-90).

α_vβ₃항체는 Tum-1, Tum-2 또는 Tum-4에 C-PAE 세포의 부착을 각각 55.9%, 69.8, 62.6% 저해하였다. Tum-1, Tum-2 또는 Tum-4로 피복된 평판에 C-PAE 세포의 결합은 α_vβ₅항체에 의해 저해되지 않았다. 항-Tum-4 항체(아미노산 209-244에 결합한다)를 첨가하는 경우에도, α_vβ₃항체는 Tum-1에 C-PAE 세포의 부착을 여전히 저해하였다(도 36A).

툼스타틴, Tum-1, Tum-2, Tum-4는 도 37에 도시된 바와 같이 WM-164 세포에도 결합하는데, 도 37은 PBS, 툼스타틴, Tum-1, Tum-2, Tum-4 또는 BSA로 피복된 평면에 부착된 WM-164 세포(x-축)에서 OD₆₅₅에서 흡수도에 의한 메틸렌 블루 염색의 수준(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. 툼스타틴 및 3가지 결실 변이체는 평판에WM-164 흑색종 세포의 부착을 강화시켰다.

실시예 38: 툼스타틴 결실 변이체의 활성 반전.

Tum-1의 내피 세포 증식 저해가 항-Tum-4 항체에 의해 무력화될 수 있는 지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 26에서 밝힌 바와 같이 경쟁 증식 분석을 실시하였다. Tum-1은 α_vβ₃인테그린 결합 부위를 부분적으로 차단할 목적으로 항-Tum-4 항체와 함께 사전-배양하였다. 이후, 내피 세포 증식 분석에 사용하였다..

결과는 도 38A와 38B에 도시하는데, 이들은 항-Tum-4 항체(1:100, 1:200, 1:500 희석)(x-축)와 함께 사전 배양된 1.5 ㎍/㎖ Tum-1(도 38A) 또는 Tum-2(도 38B)로 처리된 C-PAE 세포의 증식(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. 각 칼럼은 삼중 웰에서 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 실험은 3회 반복하였다. 별표는 단측 스튜던트 t-검증에서 P<0.05를 표시한다.

Tum-1은 항-Tum-4 항체 또는 대조 토끼 IgG와 함께 사전-배양되는 경우에도 항-증식 효과에 변화가 없었다(도 38A). 유사하게, Tum-2의 항-증식 효과는 항-Tum-4 항체 또는 대조 토끼 IgG의 사전-배양에 의해 영향 받지 않았다(도 38B).

이후, 인테그린 α_vβ₃에서 툼스타틴과 Tum-2의 항-증식 효과를 반전시키는 능력을 조사하였다. 툼스타틴과 Tum-2는 30분동안 α_vβ₃단백질과 함께 배양하고, 96-well 평판에 도말되고 성장 배지에서 하룻밤동안 배양된 C-PAE 세포에 첨가하였다. 48시간 배양후, 메틸렌 블루 염색으로 세포 개수를 측정하였다. 도 22에 도시되고 실시예 26에 기술된 바와 같이, 툼스타틴의 항-증식 효과는 증가하는 용량의 α_vβ₃가용성 단백질에 의해 용량-의존적으로 반전되었고, 2.4 ㎍/㎖(툼스타틴과 비교하여 3배 몰 과다)에서 α_vβ₃은 툼스타틴의 항-증식 효과를 현저하게 회복시켰다(43.1%). α_vβ₃단백질 단독으로 처리는 내피 세포 증식을 저해하지 않았다. 도 38에 도시된 바와 같이, Tum-2의 항-증식 효과는 증가하는 용량의 α_vβ₃가용성 단백질에 의해 용량-의존적으로 반전되었고, Tum-2의 항-증식 효과는 2 ㎍/㎖ α_vβ₃단백질에 의해 현저하게 회복되었다(74.1%).

이후, α_vβ₃은 흑색종 세포에 대한 Tum-4의 항-증식 효과를 무력화시키는 능력을 조사하였다. 툼스타틴과 Tum-4는 α_vβ₃인테그린 단백질과 함께 실온에서 30분동안 사전-배양하고, 이후 96-웰 평판에서 성장된 WM-164 세포에 첨가하였다. 48시간 배양후, 세포 개수 증가는 메틸렌 블루 염색으로 측정하였다. 결과는 도 38D와 38E에 도시한다. 툼스타틴은 WM-164 세포에 별다른 영향을 주지 않았다. Tum-4의 항-증식 효과는 증가하는 용량의 α_vβ₃가용성 단백질에 의해 용량-의존적으로 반전되었고, 2 ㎍/㎖에서 α_vβ₃단백질은 툼스타틴-4-유도된 항-증식 효과를 76.7% 회복시켰다. α_vβ₃단백질 단독으로 처리는 흑색종 세포 증식을 저해하지 않았다.

툼스타틴의 증식 효과는 엔도스타틴 및 항-α_vβ₃항체의 증식 효과와 비교하였다. 동몰량의 툼스타틴과 항-α_vβ₃인테그린 항체를 C-PAE 세포에 첨가하였다. 결과는 도 39에 도시하는데, 이는 x-축에 툼스타틴, 엔도스타틴, 항-α_vβ₃항체, IgG(대조) vs. y-축에서 상대적 세포 개수를 보여주는 그래프이다. 각 지점은 삼중 웰에서 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 실험은 3회 반복하였다. 별표는 단측 스튜던트 t-검증에서 P<0.05를 표시한다. 증가하는 함량의 항-α_vβ₃항체는 내피 세포 증식을 저해하지 않은 반면, 툼스타틴과 엔도스타틴은 내피 세포 증식의 용량-의존성 저해를 보였다.

실시예 39: 칸스타틴의 결실 변이체.

칸스타틴의 결실 변이체는 실시예 23과 35에서 밝힌 바와 같이 작제하였다. Can-1은 of 전장 칸스타틴(SEQ ID NO: 6)의 N-말단 114개 아미노산으로 구성되고, Can-2는 C-말단 113개 아미노산으로 구성된다. 이들 2가지 변이체는 발현을 위하여 각각 pET22b와 pET28a에 클론하고 BL21 세포(Novagen, Madison, Wisconsin, 129 USA)에 옮겼다. 이들 단백질은 발현 클론으로부터 용이하게 생산하고, 벡터에 통합된 폴리히스티딘 태그를 이용하여 Ni-TA 칼럼에서 정제하였다. 단백질은 증가하는 농도의 이미다졸로 칼럼으로부터 용리시키고, 이후 PBS에 투석하였다. 투석동안 용액으로부터 이탈한 단백질은 불용성으로 간주하고, 용액에 남아있는 단백질은 가용성 분획물로 간주하였다. 가용성 분획물은 농축하고 멸균 여과하며 -20℃에 보관하였다. 불용성 단백질은 PBS에 재현탁시키고 -20℃에 보관하였다.

증식 분석을 위하여, 칸스타틴, Can-1, Can-2 가용성 단백질(O.1 - 20.0 ㎍/㎖)을 증식성 C-PAE 세포의 성장 배지에 첨가하고, 이는 5 ng/㎖ bFGF와 3 ng/㎖ VEGF 이외에, DMEM에 녹인 10% FBS로 자극하였다. 결과는 도 40에 도시하는데, 이는 C-PAE 상대적 세포 개수(y-축)에 대한 증가하는 농도의 칸스타틴(◆), Can-1(■), Can-2(▲)의 효과(x-축)를 보여주는 그래프이다. 각 단백질의 농도는 사중으로 조사하였다. 소 혈청 알부민(BSA)은 대조 처리로 이용하였다. Polymyxin B는 내독소 간섭의 대조로 이용하였는데, 배지에 polymyxin B의 첨가 여부에 따른 분석간 차이는 발견되지 않았다. 세포는 48시간동안 증식시키고, 이후 고정시키고 염색하며, 밀도는 Bio-Rad 평판 판독기(Bio-Rad, Hercules, California, USA)로 판독하였다. 칸스타틴과 Can-1은 둘 모두 세포 개수 비율에서 용량-의존성 감소를 유도하였고, 5 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 세포 개수를 80% 감소시켰다. Can-2는 1O ㎍/㎖ 이상의 농도에서 세포 개체 비율의 약간 감소를 보였고, 최대 농도(20 ㎍/㎖)에서 Can-2는 증식을 33% 저해하였다.

아폽토시스는 ApoAlert 키트(CLONTECH, Palo Alto, California, USA)를 이용하여 아넥신 V-FITC 분석법으로 측정하였다. 프로피듐 요오드(Propidium iodide)를 사용하여 아폽토시스 이외의 방법으로 사멸한 세포의 핵을 염색하였다. 칸스타틴, Can-1, Can-2 모두 1 ㎍/㎖ 초과의 농도에서 내피 세포의 아폽토시스를 유도하였다. 1 ㎍/㎖ 미만의 농도에서 Can-1은 아폽토시스를 가장 강력하게 유도하였다.

항-혈관형성 활성은 매트리겔 충전물 분석으로 측정하였는데, 여기서 2 ㎍/㎖이나 20 ㎍/㎖ 불용성 단백질, 50 ng/㎖ VEGF, 20 U/㎖ 헤파린을 함유하는 0.5 ㎖ 매트리겔은 C57/BL6 생쥐의 양 옆구리에 동시 주사하였다. 충전물은 생쥐에14일동안 유지시키고, 이후 생쥐는 죽이고 충전물은 절제하고 고정시켰다. 충전물은 포매하고 절단하며 H&E 염색하였다. 시료는 어둡게 하고 혈관을 정량하였다. 2가지 농도의 단백질 사이에 혈관 개수에서 차이가 발견되지 않았기 때문에, 6개 계수를 평균하고 플랏하였다.

결과는 도 41에 도시하는데, 이는 PBS(대조), 칸스타틴, Can-1, Can-2로 처리에서 충전물마다 혈관의 평균 개수(y-축)를 보여주는 히스토그램이다. 칸스타틴 또는 Can-1로 처리된 충전물은 PBS 또는 Can으로 처리된 충전물과 비교하여 현저하게 적은 혈관을 보였다.

실시예 40: 툼스타틴의 합성 단편의 활성.

툼스타틴의 펩티드 단편: 툼스타틴의 아미노산 54-132 영역은 Tum-5로 명명하였다. 펩티드 T1, T2, T3, T4, T5, T6이 합성되었다. T2, T3, T4, T5, T6은 부분적으로 중복하고, Tum-5내에 위치한다. 툼스타틴에서 이들 펩티드의 위치는 도 42 및 표 3에 도시한다.

표 3. 툼스타틴 결실 변이체.

항-증식 활성: 내피 세포(C-PAE 세포)에서 펩티드 T2, T3, T4, T5, T6의 항-증식 활성을 조사하였다. 결과는 도 43A에 도시하는데, 이는 10 ㎍/㎖ T2, T3, T4, T5, T6(x-축)에 의한 내피 세포 증식(y-축)의 저해를 보여주는 히스토그램이다. 대조는 자극받지 않은 세포와 20% FCS로 자극된 세포이다. 펩티드 T3은 내피 세포의 증식을 유의하게(P<0.05) 저해하는 것으로 밝혀졌는데, 이런 저해는 도 도 43B에 도시된 바와 같이 용량-의존하였다. 도 43B는 0.1, 1.0, 10.0 ㎍/㎖의 펩티드 T3(x-축)으로 처리에서 C-PAE 세포 증식의 저해(y-축)를 보여주는 히스토그램이다. 이런 저해는 다른 펩티드에서 관찰되지 않았고, C-PAE 세포가 WM-164 세포로 대체되는 경우에 관찰되지 않았다.

인테그린 a_vβ₃은 펩티드 T3의 항-증식 효과를 반전시키는 능력을 조사하였다. T3 펩티드는 0, 0.001, 0.01, 0.1, 0.5 또는 1.0 ㎍/㎖ a_vβ₃인테그린 단백질(CHEMICON International, Temecula, California, USA)과 함께 실온에서 30분동안 배양하고, 이후 성장 배지에서 96-웰 평판에서 성장된 C-PAE 세포에 20 ㎍/㎖ 최종 농도로 첨가하였다. 추가로 48시간동안 배양한 이후, 메틸렌 블루 분석으로 세포 개수를 측정하였다. 결과는 도 43C에 도시하는데, 이는 가변 농도의 a_vβ₃인테그린과 함께 사전 배양된 T3 펩티드(x-축)로 처리에서 C-PAE 세포의 성장(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. 펩티드 T3의 항-증식 효과는 a_vβ₃인테그린 단백질과의 사전-배양에 의해 현저하게 감소하였다. a_vβ₃인테그린 자체는 증식을 저해하지 않았다(대조).

내피 세포 증식에 대한 T3 펩티드의 기전을 더욱 면밀히 평가하기 위하여, 세포 주기 진행에 대한 T3 펩티드의 효과를 분석하였다. 성장이 중지되고 접촉이 금지된 세포(0시)에서 4.1%의 세포가 S 단계이었다. 이들 세포를 24시간동안 bFGF로 자극하면, S 단계 세포의 비율이 22.1%로 5.4배 증가하였다. 최대 50 ㎍/㎖ 용량의 T3 펩티드로 처리는 S 단계 세포의 비율을 13.8%로 감소시켰다. 대조적으로, T1 또는 T6 펩티드 처리는 T1과 T6 처리에서 S 단계 세포가 각각 22.3%와 21.2%로, S 단계 세포에 현저한 감소를 보이지 않았다. 이는 1OO ㎍/㎖의 최대 용량에도 해당된다. 하지만, T3 펩티드의 이런 효과는 용량-의존하는데, S 단계 세포 비율은 1O ㎍/㎖에서 21.4%, 25 ㎍/㎖에서 20.5%이었다. GO/G1 단계 세포의 비율은 0시에 88.3%; bFGF 대조에서 53.4%; T1, T6, T3 펩티드 처리에서 각각 57.6%, 57.6%71.0%이었다. GO/G1 단계 세포의 비율은 bFGF 대조군에서 가장 낮았고, T3 처리에서 상승하는데, 이는 T3으로 내피 세포의 처리가 증식성 내피 세포의 G1 정지를 유도한다는 것을 시사한다.

아폽토시스 활성: 펩티드 T2, T3, T4, T5, T6(10 ㎍/㎖ 농도)은 상기 실시예 32와 36에서 밝힌 바와 같이 MTT 분석법을 이용하여 C-PAE 세포의 생존능 효과를 조사하였다. 결과는 도 43D에 도시하는데, 이는 OD₅₉₅에서 측정된 세포 생존능(y-축) 및 합성 펩티드로 처리(x-축)를 보여주는 히스토그램이다. 펩티드 T3은 Tum-5로부터 유래된 다른 펩티드와 비교하여 세포 생존능을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. TNF-α(100 ng/㎖)는 내피 세포 아폽토시스를 유도하는데 있어 양성 대조로 이용하였다.

세포 부착 활성: 내피 세포를 이용한 세포 부착은 전술한 바와 같이 실시하였다. HUVEC 또는 C-PAE 세포는 사전-피복된 96-웰 평판에 도말된 단클론 항-사람 인테그린 항체, 대조 생쥐 IgG(1O ㎍/㎖) 또는 합성 펩티드와 함께 배양하고, 평판에 부착하는 세포 개수는 OD₆₅₅에서 메틸렌 블루 염색의 깊이로 측정하였다. 도 44A에서는 BSA(대조), 합체 없음(대조), 생쥐 IgG(대조), a_vβ₃인테그린 항체의 존재하에 Tum-5 펩티드(10 ㎍/㎖)로 피복된 평판에 HUVEC 세포의 결합을 보여준다. 세포 부착은 항-a_vβ₃인테그린 항체에 의해 현저하게 저해되었다. 대조 생쥐 IgG는 세포 부착의 저해를 보이지 않았다. 도 44B는 10 ㎍/㎖ 재조합 Tum-5 펩티드로 피복된 96-웰 평판에 C-PAE 세포의 결합을 보여준다. 이들 평판에 C-PAE 세포의부착은 RGD 펩티드와 함께 배양에 의해 저해되지 않는데, 이는 Tum-5에 이들 내피 세포의 결합은 RGD-독립한다. CNGRC 펩티드는 대조로 사용하였다.

이후, Tum-5-피복된 평판에 C-PAE 세포의 부착에 대한 합성 펩티드 T2, T3, T4, T5, T6의 효과를 조사하였다. 결과는 도 44C에 도시하는데, 이는 Tum-5로 피복되고 펩티드 2.5 ㎍/㎖ T2, T3, T4, T5 또는 T6으로 처리된 96-웰 평판(x-축), 또는 Tum-4 피복되고 T3 처리된 평판에 C-PAE 세포(y-축)의 결합을 보여주는 히스토그램이다. Tum-5-피복된 평판에 세포 부착은 T3 펩티드에 의해 현저하게 저해되었는데, 이는 내피 세포와 Tum-5의 상호작용이 T3에 원인한다는 것을 시사한다. 다른 합성 펩티드는 이런 효과를 보이지 않았고, T3은 Tum-4 펩티드로 피복된 평판에 내피 세포의 부착을 저해하지 못하였다. 도 44D에서는 가변 농도의 T3 펩티드의 Tum-5-피복된 평판(x-축)에 C-PAE 세포의 결합에 대한 효과(y-축)를 보여준다. PBS 처리는 대조로 이용하였다. T3 펩티드는 Tum-5-피복된 평판에 내피 세포의 부착을 용량-의존성 방식으로 저해하는 것으로 밝혀졌다.

펩티드-피복된 평판에 내피 세포의 부착은 도 44E에 도시된 바와 같이 T3 펩티드에 대한 a_vβ₃인테그린에 의해서만 저해되었는데, 이는 내피 세포와 펩티드 T3의 상호작용이 a_vβ₃인테그린에 의해 매개된다는 것을 시사한다. 도 44F에서는 T3 펩티드-피복된 평판에 C-PAE 세포의 부착이 항-β₃인테그린 항체와의 사전-배양에 의해 저해된다는 것을 보여준다. 하지만, 항-a_v또는 β₁인테그린 항체는 T3-피복된 평판에 세포 부착을 저해하지 않았는데, 이는 β₁인테그린이 내피 세포에 T3의 결합 및 T3-매개된 항-혈관형성 활성 모두에서 중요한 역할을 수행하지 못한다는 것을 암시한다. β₁인테그린 결합 부위는 다른 비-항-혈관형성 펩티드에 존재할 수도 있다.

도 44G에서는 2.5 ㎍/㎖ 비트로넥틴으로 피복된 평판에 C-PAE 세포의 결합이 T3 펩티드와의 배양으로 저해되지 않는다는 것을 보여주는데, 이는 T3이 비트로넥틴 결합에 이용되지 않는 a_vβ₃인테그린에서 별개의 도메인에 결합한다는 것을 시사한다. 게다가, 상기 세포는 T6 펩티드와 함께 배양하여도 부착이 저해되지 않았다.

실시예 41: 툼스타틴 결실 변이체의 활성.

툼스타틴의 결실 변이체는 박테리아 발현계에 클론하고 발현시키며 니켈 크로마토그래피로 정제하고, 이후 시험관내 항-혈관혈성 활성 및 관련된 활성을 분석하였다. 단백질 제제로부터 오염 내독소의 제거를 담보하기 위하여 특히 노력하였다. 전장-툼스타틴, 툼스타틴-N53 및 2가지 다른 결실 변이체(Tum-2C와 Tum-KE)를 제조하고 검사하였다. 결실 변이체는 내피 세포 증식, 세포 주기 진행, 아폽토시스, 내피 관 형성을 조사하였다. 이에 더하여, 이들 분자의 내피 세포 특이성을 확인하기 위하여 비-내피 세포에 대한 활성 툼스타틴 단편의 효과를 분석하였다. 이들 활성은 표 4에 요약한다.

표 4. 추가의 툼스타틴 결실 변이체의 활성.

"구조체"칼럼에서 1-12는 전장 툼스타틴내에서 아미노산 번호 34, 67, 79, 85, 122, 125, 144, 178, 190, 196, 236, 239에 위치하는 12개 시스테인 잔기를 의미한다.

이황화 결합 쌍은 시스테인 1과 6; 시스테인 2와 5; 시스테인 3과 4; 시스테인 7과 12; 시스테인 8과 11; 시스테인 9와 1O에서 발생한다.

G1: 세포 주기 정지 분석.

Apo: 아넥신 V-FITC 분석.

Tube: 내피 관 형성 분석.

EU: BioWhitaker 시약으로 측정된 내독소 수준.

툼스타틴-N53은 이들 분석에서 가장 활발한 것으로 밝혀졌다. 시험관내에서 툼스타틴-N53은 내피 세포 아폽토시스를 유도하고, 10% 소 태아 혈청(FBS)의 존재하에 내피 세포에서 세포 주기 진행을 저해하였다. IC₅₀은 양 활성에서 대략 5 ㎍/㎖인 반면, 엔도스타틴은 이들 동일 분석에서 20 ㎍/㎖를 초과하는 농도에서 활성을 보이지 않았다.

툼스타틴-N53은 부착 분석에도 사용하였다. 툼스타틴-N53(1O ㎍/㎖)은 96-웰 평판에 피복되는 경우에 사람 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC) 부착을 뒷받침하였다. a_vβ₃인테그린과 β₁인테그린에 대한 항체는 도 45에 도시된 바와 같이 HUVEC과 함께 사전-배양되는 경우에 이런 부착을 저해한 반면, a₆에 대한 항체는 그렇지 않았다. 이런 이유로, 툼스타틴-N53은 a_vβ₃인테그린과 β₁인테그린을 통하여 항-혈관형성 효과를 발휘하게 된다. 이는 상기 실시예 28에서 밝힌 바와 같이, 전장 툼스타틴에서 관찰되는 결과와 일치한다.

툼스타틴-N53은 신생혈관(neovascularization)에 대한 매트리겔 충전물 분석에서도 혈관형성을 저해한다. 툼스타틴-N53은 PC3 전립선 이종이식편 모델 및 MDA-MB435 유방암 동소성(orthotopic) 모델 모두에서 실질적인 항-종양 활성을 또한 보인다. 툼스타틴-N53(5 ㎎ 또는 20 ㎎/㎏)은 매일 2회 투여하였다. 이들 마지막 2가지 분석의 결과는 도 46과 47에 도시한다. 도 46은 15일동안 운반제(대조, ○), 5 ㎎/㎏/day 툼스타틴-N53(□) 또는 20 ㎎/㎏/day 툼스타틴-N53(◇)으로처리된 PC3 전립선 종양(x-축)에서 평균 종양 체적(㎣)(y-축)을 보여주는 그래프이다. 도 47은 22일동안 운반제(대조, ○), 20 ㎎/㎏/day 툼스타틴-N53(□) 또는 5 ㎎/㎏/day 툼스타틴-N53(◇)으로 처리된 MDA-MB435 유방암 종양(x-축)에서 평균 종양 체적(㎣)(y-축)을 보여주는 그래프이다. 5와 20 20 ㎎/㎏/day의 용량이 동등한 항-종양 활성을 보였기 때문에, 좀더 적은 용량을 사용하면서 여전히 현저한 항-종양 활성을 달성할 수 있다.

두 번째 굿패스처 에피토프, GPB가 툼스타틴-N53 이내의 영역(전장 툼스타틴의 아미노산 140-153)에서 위치가 최근에 확인되었다. 이런 이유로, 상기 영역을 제거한 추가의 결실 변이체를 만들었다. 전장 툼스타틴의 아미노산 45 내지 132로 구성되는 상기 변이체 툼스타틴-45-132는 잔기 54-132의 항-혈관형성 도메인 이외에 N-말단 9개 아미노산을 포함한다. 툼스타틴-45-132는 높은 수준의 발현을 보이고, 툼스타틴-N53에서보다 적은 용량으로 세포 주기 진행을 저해한다. 이런 결과는 도 48에 도시하는데, 이는 PBS(대조), 완충액(대조), 20 ㎍/㎖ 툼스타틴-N53, 10 ㎍/㎖ 툼스타틴-45-132, 5 ㎍/㎖ 툼스타틴-45-132(x-축)로 처리되는 경우에 S 단계 C-PAE 세포의 비율(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. 툼스타틴-45-132는 HUVEC 세포 부착을 또한 뒷받침하고, a_vβ₃과 β₁인테그린에 대한 항체에 의해 저해된다. 이런 결과는 도 49에 도시하는데, 이는 PBS(대조), a_vβ₃인테그린 항체, β₁인테그린 항체, a₆인테그린 항체, BSA(대조)의 존재하에 툼스타틴-45-132-피복된(20 ㎍/㎖) 평판에 HUVEC 세포의 부착(OD₅₉₅, y-축)을 보여주는 히스토그램이다.이런 이유로, 툼스타틴의 항-혈관형성 활성은 아미노산 45 내지 132의 영역내에 존재할 가능성이 높다. 이들 단편의 다른 결실 변이체, 예를 들면 6개 시스테인 잔기(전장 툼스타틴에서)가 결실된 툼스타틴-45-132의 단편 역시 이들 방법에 따라 만들 수 있다.

실시예 42. 툼스타틴-45-132와 Tum-5-125-C-A의 발현과 정제.

전장 툼스타틴의 아미노산 45-132로 구성되는 툼스타틴-45-132는 발현 플라스미드 pET28a를 이용하여, C-말단 6개-히스티딘 태그를 보유하는 융합 단백질로 대장균(E. coli)에서 발현시켰다. 대장균(E. coli)-발현된 단백질은 재접힘(refolding)과 SDS-PAGE 분석이후, 주로 12 kDa 가용성 단백질로 분리되었다. 툼스타틴-45-132는 항-폴리히스티딘 태그 항체에 의해 면역탐지되었다. 단백질 발현의 효율과 가용성을 증가시키기 위하여 Tum-5에 추가의 9개 아미노산(전장 툼스타틴 잔기 45-54)을 부가하였다. 낮은(50 EU/㎎) 내독소 수준을 보유하는 가용성 단백질만 후속 실험에 사용하였다.

재조합 툼스타틴-45-132 역시 전술한 바와 같이 효소 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 발현시켰다. 벡터 pPlCZαA를 이용하여, 툼스타틴-45-132를 서브클론하고 상기 단백질이 C-말단 6개-히스티딘 태그에 융합되도록 하였다.

Tum-5-125-C-A(SEQ ID NO: 34)는 툼스타틴-45-132의 분비를 강화하기 위하여 시스테인에서 알라닌으로 잔기 125(전장 툼스타틴에서)의 특정 부위 돌연변이유발로 만들었다. 이는 대장균(E. coli)에서 발현되고, 항-폴리히스티딘 태그 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅에서 동일한 분자량 크기로 탐지되었다.

굿패스처 증후군은 폐출혈 및/또는 급속히 진행하는 사구체신염(glomerulonephritis)으로 특성화되는 자가면역질환으로, α3(Ⅳ)NC1에 대한 자가-항체 활성과 연관된 면역 손상을 통하여 사구와 폐포 기저막의 파괴에 의해 발생한다. 최근에, 가장 유력한 질환-관련된 병원성 에피토프가 N-말단 영역에서 동정되었고(Kalluri, R. et al., 1996, J Biol. Chem. 271:9062-8; Hellmark, T. et al., 1999, Kidney Int. 55:938-44), 이후 N-말단 40개 아미노산내에서 더욱 한정되었다(Hellmark, T. et al., 1999, J Biol. Chem 274:25862-8; Netzer, K.O. et al., 1999, J Biol. Chem. 274:11267-74). N-말단 툼스타틴-45-132는 굿패스처 자가-에피토프를 벗어나는 툼스타틴의 45-132 잔기로 구성된다. 툼스타틴-45-132가 굿패스처 자가-항체에 의해 탐지되지 않는다는 것을 더욱 확증하기 위하여, 굿패스처 환자로부터 얻은 항혈청을 웨스턴 블랏팅에 사용하였다. 상기 항혈청은 높은 민감성으로 293 세포-발현된 전장 툼스타틴을 탐지하긴 했지만 대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴-45-132와 피치아(Pichia)-발현된 Tum-5-125-C-A를 탐지하지는 못하였다. 이는 툼스타틴-45-132와 Tum-5-125-C-A가 굿패스처 자가-에피토프를 보유하지 않고, 따라서 사람에 투여직후에 이런 자가면역 질환을 유발할 가능성이 없다는 것을 입증한다.

실시예 43. 툼스타틴-45-132와 Tum-5-125-C-A의 활성.

툼스타틴-45-132는 내피 세포의 증식, 세포 주기(G1/S) 정지, 세포 생존능에 대한 효과를 조사하였다.

C-PAE 세포에 대한 툼스타틴-45-132의 항-증식 효과는 BrdU 병합 분석으로조사하였다. 이런 분석에는 티미딘 유사체로 [³H]티미딘 대신에 브로모디옥시우리딘(BrdU)이 사용된다. BrdU는 활발하게 증식하는 세포에서 새로이 합성된 DNA에 병합된다. 이후, 세포로 병합된 BrdU는 면역화학적으로 탐지할 수 있다. 상기 분석은 약간 변화된 제조업자의 지시에 따라 BrdU 증식 분석 키트(CalbioChem, San Diego, California, USA)를 이용하여 실시하였다. C-PAE 세포는 10% FCS를 함유하는 DMEM에서 96-웰 평판에 접종하였다. 다음날, 배지는 대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴-45-132 또는 293 세포에 발현된 전장 툼스타틴의 존부하에 2F FCS를 하유하는 DMEM으로 교체하였다. 이후, 평판은 46시간동안 배양하고, 세포는 10 nM BrdU로 2시간동안 펄스하였다. 그 다음, 세포와 DNA는 웰에 고정시키고 항-BrdU 일차와 이차 항체와 반응시키며 제공된 키트로 비색 정량 반응을 발생시켰다. 이후, 평판은 OD₄₅₀에서 평판 판독기(Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, USA)에서 판독하였다.

세포 주기에 대한 툼스타틴-45-132와 Tum-5-125-C-A의 효과는 상기 실시예 4에서와 유사하게 분석하였다. 간단히 말하면, C-PAE 세포는 48시간동안 접촉 저해로 성장을 정지시켰다. 이후, 웰당 10⁵세포를 수확하고, 5% FCS에 녹인 피브로넥틴 및 재조합 툼스타틴-45-132 또는 Tum-5-125-C-A로 피복된 12-웰 평판에 도말하였다. 21시간후, 세포는 수확하고 70% 차가운 에탄올에 고정시켰다. 고정된 세포는 2% FCS와 0.1 % Tween-20을 함유하는 PBS에서 30분동안 실온에서 재수화시키고 원심분리하며 0.5 ㎖의 동일 완충액에 재현탁하였다. RNase(5 ㎍/㎖) 절단은 37℃에서 1시간동안 실시하고, 이후 프로피듐 요오드(propidium iodide)(5 ㎍/㎖)로 염색을 실시하였다. 그 다음, 세포는 EPICS XL-MCL 유세포분석기(Beckman-Coulter Instruments, Fullerton, California, USA)를 이용하여 계산하였다.

세포 생존능은 전술한 바와 같이 MTT 분석으로 측정하였다.

일부 실험에서, 전장 툼스타틴과 툼스타틴-45-132는 환원시키고 알킬화시켰다. 간단히 말하면, 6M 구아니딘-HCl과 10 mM Tris-HCl(pH 7.5)에서 2.5 ㎎/㎖의 툼스타틴이나 툼스타틴-45-132는 10 mM DTT에서 50℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 반응 혼합물은 실온이 되게 하고 25 mM의 최종 농도로 요오드아세트아마이드를 첨가하였다. 용액은 실온에서 1시간동안 배양하고 5 mM HCl(5시간에서 2회 교체)과 1 mM HCl에 투석하였다. 최종 산물에서 유리 티올기의 부재는 Ellman 시약을 이용하여 확증하였다. 환원되지 않은 툼스타틴-45-132는 단량체, 이량체 및 다른 올리고머로 존재할 수 있지만, 환원되고 알킬화된 툼스타틴-45-132는 12 kDa 분자량의 단량체 단백질에 상응하는 단일 밴드로서 이동한다.

도 50-52에 도시된 바와 같이, 툼스타틴-45-132는 내피 세포의 증식을 특이적으로 저해하고(도 50A와 50B), 세포 주기 정지를 유도하며(도 51), 세포 생존능을 감소시킨다(도 52A, 52B, 52C, 52D).

도 50A는 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 또는 2.0 μM 농도의 대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴-45-132(검은색 막대) 또는 293 세포-발현된 전장 툼스타틴(흰색 막대)으로 처리된 C-PAE 세포(x-축)에서, BrdU 분석으로 OD₄₅₀에서 측정된 세포 증식(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. 툼스타틴-45-132와 전장 툼스타틴은 용량-의존성 방식으로 C-PAE 세포에 BrdU의 병합을 감소시켰다. 도 50B는 0, 0.1, 1.0, 5.0 또는 10.0 ㎍/㎖ 농도의 피치아(pichia)-발현된 툼스타틴-45-132로 처리된 C-PAE 세포(x-축)에서, 메틸렌 블루 염색으로 OD₆₅₅에서 측정된 세포 증식(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. 자극받지 않은 C-PAE 세포는 대조로 이용하였다. 툼스타틴-45-132는 20% FCS로 자극된 C-PAE 세포를 용량-의존성 방식으로 저해하였고, ED₅₀은 5 ㎍/㎖이었다. 대조(O ㎍/㎖)와 툼스타틴-45-132(5와 10 ㎍/㎖) 처리간 차이는 유의하였다(단측 스튜던트 t-검증에서 P<0.05). 대조 사람 흑색종 세포(WM-164 세포)를 이용하는 경우에, 툼스타틴-45-132의 항-증식 효과는 관찰되지 않았다.

도 51은 증식하는 내피 세포의 G1 정지를 보여주는 히스토그램이다. 성장-정지되고 접촉-저해된 세포에서, 0시에서 5.8%의 세포가 S 단계이었다. 세포를 5% FCS로 21시간동안 자극하는 경우에, S 단계 세포의 비율이 21.5%로 3.7배 증가하였다. 툼스타틴-45-132 처리는 S 단계 세포의 비율을 6.0%로 감소시켰다. 이런 효과는 S 단계 세포의 비율이 1 ㎍/㎖ 툼스타틴-45-132에서 19.3%, 10 ㎍/㎖ 툼스타틴-45-132에서 11.3%로 용량-의존하였다. 다른 실험에서, GO/G1 단계 세포의 비율은 5% FCS-처리된 대조군에서 가장 낮았고 툼스타틴-45-132 처리로 상승하였다. 이들 결과는 툼스타틴-45-132 처리가 증식성 내피 세포에서 세포 주기 정지를 유도한다는 것을 입증한다. Tum-5-125-C-A 처리는 툼스타틴-45-132 처리와 동등한 결과를 보였다.

도 52A, 52B, 52C, 52D는 세포 생존능에 대한 툼스타틴-45-132와Tum-5-125-C-A의 효과를 보여주는 히스토그램이다. 도 52A에서는 0, 3, 6, 12, 25, 50 ㎍/㎖ 툼스타틴-45-132(검은색 막대) 및 환원되고 알킬화된 툼스타틴-45-132(흰색 막대)로 처리된 C-PAE 세포(x-축)에서, MTT 분석으로 OD₅₆₂에서 측정된 세포 생존능(y-축)을 보여준다. 툼스타틴-45-132는 12 ㎍/㎖의 ED₅₀으로 용량-의존성 방식으로 세포 생존능을 현저하게 감소시켰다. 환원되고 알킬화된 툼스타틴과 툼스타틴-45-132는 C-PAE 세포의 세포 생존능을 감소시키는데 있어 처리되지 않은 툼스타틴과 툼스타틴-45-132와 유사한 효과를 보였다. 이런 이유로, 툼스타틴과 툼스타틴-45-132의 항-혈관형성 효과는 시스테인 잔기사이의 이황화 결합으로부터 파생된 형태(conformation)에 의존하지 않는다.

Tum-5-125-C-A는 도 52B에 도시된 바와 같이 세포 생존능에서 툼스타틴-45-132와 유사한 효과를 보였다. 도 52B에서는 0, 3, 6, 12, 25, 50 ㎍/㎖ Tum-5-125-C-A로 처리된 C-PAE 세포(x-축)에서, MTT 분석으로 OD₅₆₂에서 측정된 세포 생존능(y-축)을 보여준다.

C-PAE 세포의 세포 생존능에 대한 툼스타틴-45-132와 Tum-5-125-C-A의 효과는 도 52C와 52D에 도시된 바와 같이 대조 PC-3과 DU-145 세포에서 관찰되지 않았다. 도 52C에서는 0, 3, 6, 12, 25, 50 ㎍/㎖ Tum-45-132로 처리된 PC-3 세포(x-축)에서, MTT 분석으로 OD₅₆₂에서 측정된 세포 생존능(y-축)을 보여준다. 도 52D에서는 0, 3, 6, 12, 25, 50 ㎍/㎖ Tum-45-132로 처리된 DU-145 세포(x-축)에서, MTT 분석으로 OD₅₆₂에서 측정된 세포 생존능(y-축)을 보여준다.

실시예 44. 내피 세포에 대한 툼스타틴-45-132의 효과.

툼스타틴-45-132는 아래의 분석에서 내피 세포 아폽토시스를 유도하고 내피 관 형성을 저해하는 것으로 입증되었다.

툼스타틴-45-132는 아넥신 V-FITC 분석에서 내피 세포 아폽토시스를 유도하는 것으로 입증되었다. 상기 분석은 C-PAE 세포를 툼스타틴-45-132로 18시간동안 처리하여 전술한 바와 같이 실시하였다. 대조 세포는 PBS로 처리하였다. 5 ㎍/㎖ 툼스타틴-45-132는 대조 TNF-α와 비교하여 형광 강도 피크의 명확한 변화를 유도하였다.

카스파제-3 활성 역시 전술한 바와 같이 분석하였다. 카스파제-3의 특이적 저해물질인 DEVD-fmk는 툼스타틴-45-132의 특이성을 보여주는 내부 대조로 이용하였다. TNF-α(80 ng/㎖)는 양성 대조로 이용하였다. 실험은 3회 반복하였다.

결과는 도 53에 도시하는데, 이는 대조, 대조 + DEVD-fmk, TNF-α, TNF-α + DEVD-fmk, 툼스타틴-45-132(1 ㎍/㎖와 10 ㎍/㎖), 툼스타틴-45-132(10 ㎍/㎖) + DEVD-fmk(x-축)의 카스파제-3 활성(OD₄₀₅에서 측정, y-축)을 보여주는 히스토그램이다. 10 ㎍/㎖의 대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴-45-132로 C-PAE 세포를 처리하면 카스파제-3 활성에서 4.5배 증가가 관찰되었다. 양성 대조 TNF-α 역시 4배 증가를 유도하였다. 카스파제-3의 특이적 저해물질, DEVD-fmk는 기저 수준의 프로테아제 활성을 감소시켰는데, 이는 측정된 활성에서 증가가 카스파제-3에 특이적임을 시사한다. 툼스타틴-45-132로 PC-3 세포를 처리하는 경우에는 이런 증가된 활성이 관찰되지 않았다.

툼스타틴-45-132는 매트리겔 분석에서 내피 관 형성 역시 저해하는 것으로 입증되었다. 매트리겔 분석은 상기 실시예에서 밝힌 바와 같이 실시하였다. 간단히 말하면, HUVEC는 5 ㎍/㎖ 대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴-45-132의 존부하에 배양된 매트리겔-피복된 평판에서 관을 형성하도록 하였다. BSA-처리된 세포와 효모-발현된 사람 엔도스타틴(5와 20 ㎍/㎖)은 대조로 이용하였다. 툼스타틴-45-132는 대조와 비교하여 용량-의존성 방식으로 내피 관 형성을 현저하게 저해하였다. 처리이후 평균 분관 형성은 BSA 처리에서 22.7 ± 3.1, 툼스타틴-45-132 처리에서 2.1 ± 2.0인 반면, 5 ㎍/㎖와 20 ㎍/㎖ 엔도스타틴은 각각 평균 19.4 ± 3.0과 7.5 ± 6.0을 유도하였다. 5 ㎍/㎖ 툼스타틴-45-132는 대조와 비교하여 내피 관 형성을 현저하게 감소시켰다. 사람 엔도스타틴은 20 ㎍/㎖에서도 5 ㎍/㎖ 툼스타틴-45-132보다 적은 저해 효과를 보였다.

실시예 45. 툼스타틴-45-132의 결합 활성.

세포 부착 분석은 실시하였는데, 여기서 툼스타틴-45-132는 내피 세포에서 a_vβ₃과 β₁인테그린에 결합하고 이런 결합은"RGD"펩티드 서열과 무관한 것으로 밝혀졌다.

세포 부착 분석은 전술한 바와 같이 실시하였다. 간단히 말하면, 96-웰 평판은 10 ㎍/㎖ 툼스타틴-45-132 또는 0.5-2.5 ㎍/㎖ 비트로넥틴(Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)으로 하룻밤동안 피복하였다. 평판은 BSA로 차단하고, HUVEC 또는 C-PAE 세포는 10 ㎍/㎖ 항체, 합성 펩티드(합성 펩티드 CDCRGDCFC(SEQ ID NO: 35) 또는 합성 대조 펩티드 CNGRC(SEQ ID NO: 36)과 함께 15분동안 배양하였다. 세포는 평판에 첨가하고 37℃에서 45분동안 배양하였다. 이후, 평판은 세척하고, 부착된 세포 개수는 메틸렌 블루 염색으로 측정하였다.

대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴-45-132로 피복된 평판에 HUVEC 세포의 부착은 a_vβ₃과 β₁인테그린에 대한 항체에 의해 현저하게 저해되었다. a_vβ₃인테그린 항체와 β₁인테그린 항체는 대조로 이용되는 생쥐 IgG와 비교하여 세포 부착을 각각 47.1%와 47.5% 저해하였다. C-PAE 세포는 동등한 저해를 보였다.

5 ㎍/㎖ 합성 펩티드 CDCRGDCFC는 비트로넥틴-피복된 평판에 내피 세포의 부착을 저해하였다. 대조 펩티드 CNGRC는 이런 저해를 보이지 않았다. 하지만, 1.0 또는 10.0 ㎍/㎖ CDCRGDCFC 펩티드와 함께 세포를 배양하는 경우에, 대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴-45-132로 피복된 평판에 C-PAE 세포의 부착은 저해되지 않았는데, 이는 툼스타틴-45-132가 내피 세포에서 이전에 알려진 RGD 결합 부위와는 상이한 a_vβ₃인테그린 수용체상의 부위에 결합한다는 것을 암시한다(Arap, W. et al., 1998, Science 279:377-80). CNGRC 대조 펩티드 역시 툼스타틴-45-132 피복된 평판에 대한 세포 부착을 저해하지 못하였다.

가용성 a_vβ₃인테그린 단백질은 툼스타틴-45-132의 항-증식 효과를 반전시켰다. 이는 상기 실시예 26에서 밝힌 경쟁 증식 분석으로 입증되었다. 비트로넥틴-피복된 평판은 a_vβ₃가용성 단백질과 함께 배양하고, 이후 세포 부착 분석을 실시하였다. 1과 2 ㎍/㎖ 가용성 a_vβ₃단백질은 피복된 평판에서 C-PAE 세포의 부착을 현저하게 저해하였다. 이후, 대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴-45-132는 a_vβ₃인테그린 단백질과 함께 30분동안 배양하고, 20% FCS와 함께 C-PAE 세포에 첨가하였다. 48시간후, 메틸렌 블루 염색으로 세포 증식을 측정하였다. 툼스타틴-45-132의 항-증식 효과는 증가하는 농도의 a_vβ₃가용성 단백질에 의해 용량-의존적으로 반전되었다. 1 ㎍/㎖에서 a_vβ₃단백질은 툼스타틴-45-132-유도된 항-증식 효과를 65.9% 반전시켰다. 툼스타틴-45-132없이 a_vβ₃단백질 단독으로 처리는 내피 세포 증식을 저해하지 않았는데, 이는 툼스타틴-45-132의 항-혈관형성 활성이 내피 세포의 표면에서 a_vβ₃인테그린에 대한 결합으로 매개된다는 것을 더욱 시사한다.

내피 세포의 표면에 툼스타틴-45-132의 결합을 더욱 입증하기 위하여, 비오틴화된 툼스타틴-45-132를 세포 표면 표지에 이용하였다. 재조합 대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴-45-132는 Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)을 이용하여 비오틴화시켰다. 10% DMSO와 5% D-만니톨을 함유하는 완충액에서 툼스타틴-45-132는 12M 과량의 Sulfo-NHS-LC-Biotin과 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 비오틴화된 툼스타틴-45-132는 배양 과정동안 용액으로부터 침전되었다. 침전물은 증류수로 2회 세척하고 DMSO에 재현탁시키며, 이후 증류수와 1:1로 혼합하여 대략 4 ㎎/㎖의 최종 농도를 달성하였다. 비오틴화된 툼스타틴-45-132는 4℃에 보관하였다.

세포 표면 표지를 위하여, 하위합류 HUVEC 세포는 약한 트립신처리로 EDTA를 이용하여 플라스크로부터 제거하고 2% BSA를 함유하는 DMEM으로 2회 세척하였다. 이후, 세포는 DMEM/BSA에 재현탁시키고, 비오틴-표지된 툼스타틴-45-132 또는 툼스타틴-45-132없이 실행된 모의 비오틴 반응의 산물과 함께 4℃에서 1시간동안 배양하였다. 그 다음, 세포는 DMEM/BSA로 2회 세척하고, 스트렙타비딘-FITC("Neutravidin-FITC", Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)과 함께 4℃에서 30분동안 배양하였다. 이후, 시료는 Nikon Eclipse E600 형광 현미경에서 면밀히 관찰하고 유세포분석기로 분석하였다.

툼스타틴-45-132와 간접적으로 결합한 FITC는 현탁액에서 HUVEC 세포의 표면에서 탐지되었고, 형광은 부착후 세포 표면에서 좀더 작은 반점 패턴으로 광범위하게 분포하였다. 비오틴화된 툼스타틴-45-132 대신에 유리 비오틴과 함께 세포를 배양하면, 세포 표면에서 현저한 형광은 탐지되지 않았다. FITC-양성, 다시 말하면 툼스타틴-45-132-결합된 세포의 개수는 증가하는 농도의 비오틴화된 툼스타틴-45-132와 용량-의존적으로 증가하였는데, 이는 툼스타틴-45-132이 내피 세포의 표면에 결합한다는 것을 입증한다.

실시예 46. 혈관형성과 종양 성장에 대한 툼스타틴-45-132의 효과.

새로운 모세혈관의 형성에 대한 툼스타틴-45-132의 생체내 효과를 평가하기위하여, 매트리겔 충전물 분석을 실시하였다. 처리 6일후, 새로 형성된 혈관의 개수는 PBS-처리된 대조와 비교하여 5 ㎍/㎖ 대장균(E. coli)-발현된 툼스타틴-45-132로 처리직후에 91% 감소하였다. 전장 툼스타틴의 N-말단 53개 아미노산이 결핍된 Tum-1 역시 검사하였는데, 이는 신생혈관을 95% 감소시켰다. 혈관의 평균(3-4개 매트리겔 충전물에서) 개수는 Tum-1-처리된 충전물에서 0.47 ± 0.16, 툼스타틴-45-132-처리된 충전물에서 0.80 ± 0.16, PBS-처리된 대조에서 8.81 ± 0.35이었다.

툼스타틴-45-132는 종양 성장을 억제하는 능력을 또한 조사하였다. 5-6주령의 대략 25g 수컷 무흉선 누드 NCRNU 생쥐는 배축 피하조직(dorsal subcutis)에 대략 2 x 10⁶PC-3(전립선암 암종)을 이식하였다. 종양은 Vernier 캘리퍼스로 측정하고, 종양 체적은 표준 공식(너비²x 길이 x 0.52)에 따라 산정하였다. 종양은 대략 50 ㎣까지 성장시키고, 동물은 6 마리의 생쥐군으로 페어-매칭(pair matching)하였다. 단백질 또는 운반제(PBS, 대조)의 최초 분량은 페어 매칭 당일에 제공하였다. 무균 PBS에 녹인 1 내지 20 ㎎/㎏/day 용량의 툼스타틴-45-132, Tum-5-125-C-A 또는 사람 엔도스타틴을 20일동안 매일 복강내 b.i.d. 주사하였다. 대조 동물에는 PBS를 주사하였다. 한 처리군에는 외과적으로 이식된 Alzet 미니-펌프를 이용하여 툼스타틴-45-132의 연속 피하 전달을 실시하였다.

생쥐는 주 2회 칭량하고, 종양은 1일부터 측정하였다. 산정된 평균 종양 체적을 계산하고, 21일에 생쥐는 칭량하고 죽이며, 이들의 종양은 절제하고 광 현미경으로 검사하며 CD31 면역염색하였다. 평균 치료된 종양 중량은 평균 대조 종양 중량으로 나누고 1로부터 감하며 각 군에서 종양 성장 저해를 부여하는 비율로 표시하였다.

결과는 도 54A에 도시하는데, 이는 운반제(대조, ▣), 1 ㎎/㎏ 툼스타틴-45-132(◆), 1 ㎎/㎏ Tum-5-125-C-A(●), 20 ㎎/㎏ 엔도스타틴(○), 미니-펌프 투여된 1 ㎎/㎏ 툼스타틴-45-132(△)의 0, 5, 10, 15, 20일간 치료(x-축)에서 V/Vo(평균 종양 체적/최초 종양 체적)의 측면에서 부분 종양 체적(y-축)을 보여주는 그래프이다. 체중 변화로 판단할 때, 이런 단백질 치료로부터 독성은 관찰되지 않았다. 툼스타틴-45-132와 Tum-5-125-C-A 둘 모두 PC-3 세포의 성장을 현저하게 저해하였다. 운반제-주사된 대조군과 비교하여, 사람 툼스타틴-45-132는 1 ㎎/㎏에서 종양 성장을 74.1%(p = 0.02) 저해하였고, Tum-5-125-C-A는 종양 성장을 92.0%(p = 0.001) 저해하였다. Alzet 미니-펌프를 통한 툼스타틴-45-132(24시간동안 1 ㎎/㎏)의 연속 전달 역시 70.1%(p = 0.03)의 현저한 종양 성장 저해를 보였다. 20 ㎎/㎏(b.i.d., 거환 주사) 용량으로 전달된 엔도스타틴은 운반제-처리된 대조군과 비교하여 현저한 종양 성장 저해를 보이지 않았다.

CD31 면역염색을 이용하여, 표준 스트렙타비딘-비오틴-페록시다제 탐지 시스템(Vectastain ABC Elite Kit, Vector Labs, Burlingame, California, USA) 및 쥐 항-생쥐 VD31 단클론 항체(PharMingen, San Diego, California, USA)로 PC-3 종양 이종이식편의 동결된 조직 절편에서 종양내 미세혈관 밀도(MVD)를 측정하였다. 내인성 과산화효소 활성은 1% H₂0₂/메탄올로 30분동안 차단하고, 슬라이드는 프로테이나아제 K와 함께 실온에서 30분동안 배양하여 항원성 회복(antigen retrieval)을 실시하였다. 항-생쥐 CD31 항체는 0.1% TWEEN-20을 함유하는 PBS에서 1:20 희석하고, 절편을 5% 정상 염소 혈청/PBS + 0.1% TWEEN-20으로 차단한 이후 2시간동안 배양하였다. 정상 쥐 IgG는 음성 대조로 이용하였다. Vectastain ABC Elite 시약 키트를 이용하여 면역과산화효소 염색을 실시하였다. 절편은 메틸 그린으로 대조염색하였다. MVD는 낮은 배율(power magnification)에서 종양을 주사하고, 이후 구별된 최대 개수의 미세혈관을 보유하는 종양 주위에서 세 영역을 확인하고 40x 시역에서 개별 미세혈관을 계산하여 평가하였다. 평균 미세혈관 밀도는 처리군간에 비교하고 스튜던트 t-검증을 이용하여 분석하였다.

툼스타틴-45-132 복강내 주사는 운반제-주사된 대조군과 비교하여 PC-3 이종이식편에서 미세혈관 밀도를 현저하게 저해하였다. 낮은 배율(40x) 시역당 CD31 양성 혈관의 개수는 툼스타틴-45-132 처리에서 6.33 ± 0.54, vs. 대조에서 9.44 ± 1.05이었다(p = 0.047). Tum-5-125-C-A 또는 미니-펌프 투여된 툼스타틴-45-132로 처리된 군은 평균 혈관 밀도의 유사한 감소를 보였다.

실시예 47. 툼스타틴과 툼스타틴-45-132는 T3 펩티드 서열을 통하여 내피 세포에 결합한다.

293 사람 태아 신장 세포에서 생산된 툼스타틴은 조직 배양 평판을 피복하는데 사용하였다. 10 ㎍/㎖ T1, T2, T3, T4, T5, T6 또는 Tum-4의 존재하에 툼스타틴-피복된 평판에 C-PAE 세포의 부착. 결과는 도55A와 55B에 도시하는데, 이들은 툼스타틴의 다양한 펩티드 아단위의 존재하에 293-생산된 툼스타틴으로 피복된 조직 배양 평판에 C-PAE 결합을 보여주는 한 쌍의 히스토그램이다. PBS와 BSA는 각각 양성과 음성 대조로 이용하였다. 도 55A에서는 1O ㎍/㎖ 펩티드 T1, T2, T3, T4, T5, T6, Tum-4의 존재하에 세포 결합을 보여준다. T3 펩티드는 툼스타틴-피복된 평판에 세포 부착을 46.4% 저해하는 것으로 밝혀졌다. 도 55B에서는 0,1, 2.0 또는 10.0 ㎍/㎖ T3 펩티드의 존재하에 세포 결합을 보여준다. 세포 부착의 저해는 용량-의존하였다. 다른 펩티드는 세포 부착을 저해하지 않았다.

이들 결과는 실시예 40(도 44C와 44D)의 결과와 함께, 내피 세포가 전장 툼스타틴의 툼스타틴-45-132 도메인내에서 T3 서열에 특이적으로 결합하고, 이들 분자들의 항-혈관형성 특성이 이런 결합에 원인함을 입증한다. 툼스타틴과 툼스타틴-45-132는 다른 내피 세포 결합 부위를 보유하고, 이들 부위는 T3 펩티드에 의한 내피 세포 결합의 완전 저해의 부재를 설명하는데, 그 이유는 T3이 a_vβ₃인테그린 결합을 통해서만 결합을 저해하기 때문이다(참조: 실시예 40, 도 44E와 44F).

실시예 48. T3 펩티드는 카스파제-3의 활성을 증가시킨다.

T3 펩티드로 처리된 세포에서 카스파제-3의 프로테아제 활성은 표지된 기질(DEVD-pNA)로부터 절단된 형광단(p-니트로아닐리드)의 탐지에 의한 분광 광도법으로 측정하였다. 음성 대조와 비교하여, 50 ㎍/㎖ T3 펩티드로 처리된 C-PAE 세포는 카스파제-3 활성에서 3.6배 증가를 보였고 양성 대조 TNF-α(80 ng/㎖)는 동등한(4.5배) 증가를 보였다. 10 ㎎/㎖ T3 펩티드는 카스파제-3 활성을 1.6배 증가시켰는데, 이는 용량-의존성 효과를 암시한다. 카스파제-3의 특이적 저해물질, DEVD-fmk는 프로테아제 활성을 기준선으로 감소시켰는데, 이는 측정된 활성에서 증가가 카스파제-3에 특이적임을 시사한다. PC-3 비-내피 세포에서, 대조 처리와 T3 펩티드-처리된 세포간에 카스파제-3 활성에서 차이는 나타나지 않았다.

실시예 49. T3 접힌 펩티드의 합성과 활성 및 S-S 가교 형성.

T3 펩티드는 2개의 시스테인 잔기를 보유한다. T3 펩티드의 2개의 시스테인간 S-S 가교 형성은 아래와 같이 산화(oxidation)로 실시하였다. T3 펩티드는 1O ㎖의 50% 아세토니트릴과 1O mM 중탄산암모늄 완충액(pH 7.3)에 0.25 ㎎/㎖ 농도로 용해시켰다. 1O mM 중탄산암모늄 완충액(pH 7.3)에 용해된 30 ㎕의 산화제 2 ㎎/㎖ 적혈염(potassium ferricyanide)의 분량을 5분 간격으로 실온에서 5회 첨가하고 각 첨가후에 짧게 교반하며, 이후 실온에서 2시간동안 배양하였다. 최종 산물에서 유리 티올기의 부재는 Ellman 시약(DTNB, dithionitrobenzoic acid)을 이용하여 확증하였고, 펩티드 이량체와 고등 올리고머의 부재는 SDS-PAGE(16.5%)와 은 염색으로 확증하였다. HPLC는 T3 펩티드의 최종 정제에 이용하였다. T3 펩티드는 아세토니트릴(CH₃CN) 구배(30분동안 20-60% 완충액 B)를 이용하여 C-18 300A Jupiter 칼럼(Phenomenex, Torrance, California, USA)에 가하였다. 완충액 A는 O.1% 트리플루오르아세트산이고, 완충액 B는 아세토니트릴에 녹인 O.1% 트리플루오르아세트산이었다. 순수한 단량체 피크가 각 시료에서 서로 다른 용리 시점에 관찰되었는데,이는 상기 펩티드의 소수성에서 차이를 암시한다. T3-접힌 펩티드의 피크 분획물은 수집하고 SDS-PAGE와 은 염색으로 확증하였다.

결과는 도 56에 도시하는데, 0, 1, 10, 20㎍/㎖ T3 펩티드(검은색), T3 접힌 펩티드(흰색)로 처리하는 경우에 C-PAE 세포 증식(0.1% FCS로 처리되고 자극받지 않은 대조 세포의 비율)을 보여주는 히스토그램이다. T3-접히지 않은 펩티드의 항-증식 효과는 T3-접힌 펩티드의 항-증식 효과와 차이가 없었는데, 이는 툼스타틴과 툼스타틴-45-132에서처럼, 이황화 결합과 이차 구조가 T3 활성에 요구되지 않는다는 것을 시사한다.

실시예 50. 툼스타틴과 결실 변이체의 항-혈관형성 활성의 비교.

내피 세포 증식 분석을 이용하여 툼스타틴 및 일부 결실 변이체의 활성을 비교하였다. 재조합 툼스타틴(28 kDa), 툼스타틴-45-132(12 kDa), T3 펩티드는 동몰 농도로 메틸렌 블루 증식 분석에 사용하였다. 1 μM, 2.5 μM, 5 μM 농도에서, 툼스타틴, 툼스타틴-45-132, T3 펩티드는 항-증식 활성을 보였다. 하지만, T3 펩티드(접힘에 상관없음, 실시예 49)는 동몰 농도에서 툼스타틴 및 툼스타틴-45-132와 비교하여 활성이 2.5배 덜하였다.

이차 구조는 T3 펩티드의 좀더 낮은 활성을 설명하지 못하는데, 아마도 이런 활성을 위하여 추가의 서열이 요구되는 것으로 생각된다. T2 펩티드는 툼스타틴에 a_vβ₃인테그린 결합을 저해하지 않고 내피 세포 증식 역시 저해하지 않았는데, 이런 영역은 T3 펩티드의 활성을 강화시키는데 중요하지 않은 것으로 생각된다. 대조적으로, T4 펩티드 서열은 내피 세포 증식에 저해 활성을 나타내지 않지만 a_vβ₃인테그린에 약한 결합을 보였다. 이런 이유로, T4 펩티드로부터 9개의 아미노산이 추가로 확장된 새로운 펩티드가 만들어졌다. 이들 9개 잔기는 T5 펩티드에 포함되지 않았다. 이런 새로운 펩티드(TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWL; SEQ ID NO: 37)는 "T7"로 명명되었고, C-PAE 세포의 증식에 대한 효과를 조사하였다.

결과는 도 57에 도시하는데, 이는 전장 툼스타틴(검은색), 툼스타틴-45-132(흰색), T7 펩티드(교차 빗금), T3 펩티드(점각)로 처리하는 경우에, C-PAE 세포 증식(0.1% FCS로 처리되고 자극받지 않은 대조 세포의 비율)을 보여주는 히스토그램이다. 도 57의 각 칼럼은 삼중 웰에서 평균 ± SEM을 나타낸다. 툼스타틴은 5 μM 농도에서 검사하지 않았다.

T7 펩티드는 동몰 농도에서 툼스타틴 및 툼스타틴-45-132와 유사한 활성 수준을 보였다. 툼스타틴, 툼스타틴-45-132, T7 펩티드는 1 μM의 ED₅₀에서 항-증식 효과를 보인 반면, T3 펩티드는 2.5 μM의 ED₅₀을 보유하였다. 이들 결과는 T4 펩티드의 첫 9개 아미노산이 항-혈관형성 효과를 보이지는 하지만 a_vβ₃인테그린에 대한 툼스타틴의 광학적 결합에 중요하고 이들 분자간 좀더 나은 상호작용을 제공하며 최대 항-혈관형성 활성을 달성하는데 조력한다는 것을 시사한다.

실시예 51. 합성 펩티드의 생체내 항-혈관형성 활성.

새로운 모세혈관의 형성에 대한 T3의 생체내 효과를 평가하기 위하여, 툼스타틴-N53(5 ㎍/㎖), T1과 T3 펩티드(1O ㎍/㎖)로 매트리겔 충전물 분석을 실시하였다. 4-7개 광확대 시역에서 혈관 개수를 계산하고 평균하였다. 처리이후 광확대 시역당 혈관의 평균 개수는 툼스타틴-N53에서 0.47 ± 0.16, T1 펩티드에서 7.41 ± 0.54, T3 펩티드에서 0.33 ± 0.16이었다. 대조 처리는 시역당 평균 8.81 ± 0.35 혈관을 유도하였다. 툼스타틴-N53과 T3은 처리되지 않은 대조와 비교하여 신생혈관을 각각 95%와 96% 저해한 반면, T1 펩티드는 혈관 개수에서 현저한 감소를 유도하지 않았다.

실시예 52: 툼스타틴 펩티드는 내피 세포에서 전체 단백질 합성을 저해한다.

단백질 합성의 조절은 세포 증식 및 예정된 세포 사멸 또는 아폽토시스에 중요하다(McBratney, S. et al., 1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5:961-5; Brown, E.J. et al., 1996, Cell 86:517-520; Tan, S.L. et al., 1999, J Interferon Cytokine. Res. 19:543-54; Gingras, A.C. et al., 2001, Genes Dev. 15:807-826). 기저막-유래된 α3 Ⅳ형 콜라겐 펩티드 단편인 툼스타틴은 항-혈관형성 활성을 갖는 내피 세포-특이적 친-아폽토시스 작용제로 밝혀졌다(Maeshima, Y. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:21340-8; Maeshima, Y. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:23745-50; Maeshima, Y. et al., 2001, J Biol. Chem. 276.15240-8; Maeshima, Y. et al., 2001, J Biol. Chem. 276:31959-68). 툼스타틴-유도된 아폽토시스는 캡-의존성 단ㅂ개질 번역의 조절에 관여하는 효소인 카스파제-3의 증가와 연관한다(Maeshima, Y. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:23745-50; Maeshima, Y. et al., 2001, J Biol. Chem. 276:15240-8; Maeshima, Y. et al., 2001, J Biol. Chem. 276:31959-68; Bushell, M. et al.. 1999, FEBS Lett. 451: 332-336).

이런 이유로, 다양한 내피 세포에서 단백질 합성을 저해하는 툼스타틴의 잠재적 능력을 조사하였다. 툼스타틴 및 이의 활성 소단편(툼스타틴-45-132), T3, T7 펩티드를 사용하였다. 툼스타틴의 아미노산 45-132는 전술한 바와 같이 대장균(E. coli)에서 툼스타틴-45-132로 발현되었다(Maeshima, Y. et al., 2001, J Biol. Chem. 276.15240-8). 사람 엔도스타틴은 기존 문헌에 기술된 바와 같이 생산하였다(Dhanabal, et al., 1999, Cancer Res. 59:189-97). 낮은 내독소 수준(50 EU㎎ 미만)을 보이는 가용성 단백질만 사용하였다. 각각 툼스타틴의 68-87과 73-97 잔기로 구성되는 T3 펩티드와 T7 펩티드 및 T7-변이체 펩티드(TMPFMFCNINNVCNFASRNDYSYWL; SEQ ID NO: 38)는 기존 문헌에 기술된 바와 같이 합성하였다(Maeshima, Y. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:21340-8; Maeshima, Y. et al., 2001, J Biol. Chem. 276:31959-68).

일치 사람 신장 내피 세포(HRE)는 Clonetics(San Diego, California, USA)로부터 구입하였고 REGM(Clonetics Corporation, San Diego, California, USA)에 유지시켰다. 다른 세포주는 전술한 바와 같이 입수하고 유지시켰다. 세포는 24시간동안 혈청-기아시키고(0.5% FCS) T3 펩티드, 툼스타틴-45-132, 엔도스타틴 또는 라파마이신의 존재하에 12-24시간동안 10% FCS로 자극하였다. 메티오닌-없음 배지에서 1시간동안 사전-배양한 이후, 세포는³⁵S-메티오닌으로 1시간동안 표지하고 트리클로로아세트산으로 방사능의 병합을 분석하였다(Sudhakar, A. et al., 2000, Biochem. 39:12929-38; Maeshima, Y. et al., 1996, J Amer. Soc. Nephrol.7:2219-29). 본 연구의 병렬 비교에서 유의한 차이를 확인하기 위하여 단측 스튜던트 t-검증과 함께 ANOVA를 실시하였다. P<0.05 수준으로 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과는 도 58A-58H에 도시하는데, 이들은 다양한 처리하에(x-축)³⁵S-메티오닌 병합(y-축)을 보여주는 히스토그램이다. 실험은 3회 반복하고 대표적인 데이터를 도시한다. 각 칼럼은 3중 실험의 평균± SEM으로 구성된다. 도 58A에서 C-PAE 세포는 T3 펩티드(4.5μM), 툼스타틴-45-132(4.5μM), 엔도스타틴(4.5μM), 라파마이신(100ng/㎖)으로 12시간(검은색) 또는 24시간(빗금)동안 처리하였다. HUVEC 역시 T3 펩티드(4.5μM), 툼스타틴-45-132(4.5μM), 엔도스타틴(4.5μM), 라파마이신(100ng/㎖)으로 24시간 처리하였다(도 58). 도 58C에서 C-PAE는 12 또는 24시간 혈청-기아시키고, 이후 0μM(대조, 검은색), 4.5μM(수평 빗금), 22.7μM(빗금) T3 펩티드의 존재하에 10% FCS를 포함하는 배지에서 24시간동안 배양하였다. 도 58D-H에서, PC-3세포(도 58D), 786-O 세포(도 58E), NIH3T3 세포(도 58F), HRE 세포(도 58G), WM-164 세포(도 58H)는 24시간동안 T3 펩티드(4.5μM), 툼스타틴-45-132(4.5μM), T7 펩티드(도 58D, 58E, 58H), 엔도스타틴(4.5μM), 라파마이신(100ng/㎖)으로 처리하였다.

동몰 농도(4.5 μM)에서 모든 툼스타틴 펩티드는³⁵S-메티오닌 병합 측정에서, 소와 사람 내피 세포의 24시간 자극이후 단백질 합성을 25-30% 저해한다(도 58A와 58B). 용량 반응 연구에서, 툼스타틴 펩티드 T3은 22.7 μM에서 대략 45%의최대 저해를 달성하였다(도 58C). 이들 모든 실험에서, 양성 대조인 라파마이신( pan-특이적 mTOR/단백질 합성 저해물질)(Beretta, L. et al. 1996, EMBO J 15:658-64)은 단백질 합성을 저해한 반면, 다른 매트릭스-유래된 내피 세포-특이적 친-아폽토시스 작용제인 엔도스타틴(O'Reilly, M.S. et al., 1997, Cell 88:277-85; Bergers, G. et al., 1999, Science 284:808-12; Dhanabal, M. et al., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 258:345-352)는 단백질 합성을 저해하지 않았다(도 58A와 58B). 툼스타틴 펩티드는 비-내피 세포, 예를 들면 PC-3 전립선 암종 세포, 786-0 신장암 세포, NIH-3T3 섬유아세포, 일차 사람 신장 내피 세포(HRE) 또는 WM-164 사람 흑색종 세포에서 단백질 합성을 저해하지 않았다(도 58D-58H). 대조적으로, 라파마이신은 검사된 모든 세포에서 단백질 합성을 저해한다(도 58A, 58B, 58D-58H).

실시예 53: 툼스타틴 펩티드는 내피 세포에서 캡-의존성 단백질 번역을 저해한다.

툼스타틴에 의한 단백질 합성의 저해를 캡-의존성으로 확립하기 위하여, 내피 세포는 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절하에 이중시스트론(dicistronic) mRNA를 발현하고 폴리오바이러스의 비번역 영역으로부터 유래된 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 보유하는 플라스미드(pcDNA3-LUC/pol/CAT)(Beretta, L. et al. 1996, EMBO J 15:658-64; Kumar, V. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:10779-87)로 트랜스펙션시켰다. 상기 플라스미드는 루시페라제(LUC)의 번역이 캡-의존하고 클로람페니콜의 아세틸트랜스퍼라제(CAT)의 번역은 캡-독립하도록 작제된다(Beretta, L. et al. 1996. EMBO J 15:658-64; Kumar, V. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:10779-87). 간단히 말하면, 세포는 24시간동안 혈청-기아시키고 Lipofectamine Plus(Life Technologies, Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) (Maeshima, Y. et al., 1998, J Clin. Invest. 101:2589-97)을 이용하여 1.5 ㎍ pcDNA3-LUC-pol-CAT(Kumar, V. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:10779-87)으로 일시 트랜스펙션시켰다. 3시간후, 세포는 T3 펩티드(4.5 μM), 툼스타틴-45-132 (4.5 μM), T7 펩티드(4.5 μM), 엔도스타틴(4.5 μM) 또는 라파마이신(100 ng/㎖)의 부재(대조)와 존재하에 10% FCS에서 21시간동안 처리하였다. 세포 용해질을 준비하고 Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega, Madison, Wisconsin, USA)을 이용하여 루시페라제 활성을 분석하였다. CAT 활성은¹⁴C-클로람페니콜과 함께 CAT Enzyme Assay System(Promega, Madison, Wisconsin, USA)을 이용하여 측정하였다. 액체 신틸레이션 계산 방법을 이용하여 n-부티릴 클로람페니콜의 수준을 측정하였다.

결과는 도 59A와 59B에 도시하는데, 이는 T3 펩티드(4.5 μM), 툼스타틴-45-132(4.5 μM), T7 펩티드(4.5 μM), 엔도스타틴(4.5 μM) 또는 라파마이신(100 ng/㎖) 처리한 후에 루시페라제(LUC-캡-의존성 번역, 검은색 막대) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT; 캡-독립성 번역; 빗금 막대)의 번역에 대한 리포터 활성(y-축)을 보여주는 한 쌍의 히스토그램이다. 대조군에 상대적인 루시페라제와 CAT 활성을 나타낸다. 이들 실험은 3회 반복하고, 대표적인 데이터를 도시한다. 각 칼럼은 3회 실시의 평균± SEM으로 구성된다.

툼스타틴 펩티드는 소 내피 세포에서 LUC에 의한 캡-의존성 번역을 37-39% 저해하였는데, 이는 라파마이신에 필적하다(도 59A). 엔도스타틴은 캡-의존성 번역에 영향을 주지 않았다(도 59B). 앞서 관찰한 바와 같이, 툼스타틴 펩티드는 비-내피 세포에서 캡-의존성 번역을 저해하지 않지만, 라파마이신은 이를 저해하였다(도 59B). 캡-독립성 번역(CAT 활성)은 툼스타틴 펩티드에 의해 변화되지 않았다.

라파마이신은 내피 세포에서 캡-독립성 번역을 유도했는데(도 59A), 이는 라파마이신이 IRES(폴리오바이러스)를 보유하는 mRNA의 번역을 자극한다는 기존의 연구 보고서와 일치한다(Beretta, L. et al. 1996, EMBO J 15:65 8-64; Gingras, A.C. et al., 2001, Genes Dev. 15:807-826). 흥미롭게도, 캡-독립성 번역은 NIH3T3 세포에서 라파마이신에 의해 감소되었는데, 이는 기존의 보고와 일치한다(Beretta, L. et al. 1996, EMBO J 15:658-64). 다른 실험에서, 처리된 내피 세포와 처리되지 않은 내피 세포에서 RNA 수준은 노던 분석에 의한 평가에서 변하지 않았는데, 이는 RNA 수준이 아닌 단백질 번역에 툼스타틴 펩티드의 특이적 효과를 암시한다.

실시예 54: 캡-의존성 번역과 단백질 합성에 대한 툼스타틴 펩티드의 내피 세포 특이적 저해 효과는 a _v β ₃ 인테그린에 의해 매개된다.

기존 연구에서는 툼스타틴에 의한 내피 세포의 아폽토시스가 내피 세포에서 a_vβ₃인테그린에 대한 이의 결합에 의존한다고 제안한다(Maeshima, Y. et al.,2000, J Biol. Chem. 275.21340-8; Maeshima, Y. et al., 2001, J Biol. Chem. 276:15240-8; Maeshima, Y. et al., 2001, J Biol. Chem. 276:31959-68). 이런 이유로, 캡-의존성과 캡-독립성 번역에 대한 툼스타틴 펩티드의 효과를 평가하기 위하여 a_vβ₃인테그린의 발현이 결핍된 12주령 수컷(즉, β₃인테그린-결핍 생쥐) 및 이들의 야생형 대응물의 폐로부터 내피 세포를 분리하였다(Hodivala-Dilke, K.M. et al., 1999, J Clin. Invest. 103.229-38). 간단히 말하면, ICAM-2 발현하는 MLEC는 자성 비드(Dynabeads M-450, Dynal, Oslo, Norway)에 공액된 쥐 항-생쥐 ICAM-2(#01800D, PharMingen, San Diego, California, USA)를 이용하여 풍부하게 하였다. MLEC는 40% Ham's F-12, 40% DME-저 글루코오스, 헤파린으로 보충된 20% FBS, 내피 유사분열원(Biomedical Technologies, Inc., Cambridge, Massachusetts, USA), 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신에 유지시켰다. 야생형과 β₃인테그린-결핍 생쥐 태아 섬유아세포를 준비하였다(Hodivala-Dilke, K.M. et al., 1999, J Clin. Invest. 103:229-38). MEF는 10% FBS를 함유하는 DMEM에 유지시켰다. MLEC는 형태 관찰 및 내피-특이적 마커에 대한 면역형광 염색으로 균질성을 특성화시켰다. 계대배양 3과 계대배양 6의 세포를 이들 실험에 사용하였다.

결과는 도 6OA-60H에 도시하는데, 이들은 8가지 히스토그램이다. 도 60A-60D는 야생형(도 60A, 60B)과 β₃-인테그린 녹아웃(도 60B, 60D) 한배새끼 생쥐로부터 유래된 내피 세포(MLEC)(도 60A, 60B)와 태아 섬유아세포(MEF)(도 60A와 60C)에서³⁵S-메티오닌 병합에서 전체 단백질 합성(y-축)을 나타내는데, 이들 세포는 툼스타틴-45-132(4.5 μM), T3(4.5 μM), T7(4.5 μM), T7-돌연변이 펩티드(4.5 μM), 엔도스타틴(4.5 μM) 또는 라파마이신(100 ng/㎖)(x-축)으로 처리하였다. 도 60E-6OG는 야생형(도 60E, 60G)과 β₃-인테그린 녹아웃(도 60F, 60H) 한배새끼 생쥐로부터 유래된 내피 세포(MLEC)(도 60F, 60F)와 태아 섬유아세포(MEF)(도 60G와 60H)에서 대조에 대한 비율(y-축)로 루시페라제(Luc; 검은색 막대) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT; 빗금 막대)의 리포터 활성을 나타내는데, 이들 세포는 툼스타틴-45-132(4.5 μM), T3(4.5 μM), T7(4.5 μM), T7-돌연변이 펩티드(4.5 μM), 엔도스타틴(4.5 μM) 또는 라파마이신(100 ng/㎖)으로 처리하였다(x-축). 이들 실험은 3회 반복하고, 대표적인 데이터를 도시한다. 각 칼럼은 3회 실시의 평균± SEM으로 구성된다.

야생형과 β₃-인테그린 결핍 MLEC 둘 모두 세포 접합과 접촉 지점에서 내피 세포 특이적 마커, VE-Cadherin의 발현에 양성이었다. 또한, 양 세포주는 diI-Ac-LDL을 흡수할 수 있었다. 툼스타틴은 대조 세포(β₃+/+ 세포)에서 단백질 합성을 저해했지만, a_vβ₃인테그린의 발현이 결핍된 생쥐 내피 세포(β₃-/-)에서 캡-의존성 단백질 합성에는 별다른 영향을 주지 않았다(도 60A와 60B, 60E와 60F). 라파마이신은 대조와 a_vβ₃인테그린-결핍 생쥐 내피 세포 모두에서 캡-의존성 단백질 합성을 저해한 반면, 유사한 실험 조건하에 엔도스타틴은 이런 특성을 보이지 않았다(도 60A와 60B, 60E와 60F). a_vβ₃인테그린을 발현하는 내피 세포에 대한 툼스타틴의 특이성을 확립하기 위하여, a_vβ₃인테그린(Hodivala-Dilke, K.M. et al., 1999, J Clin. Invest. 103:229-38)을 발현하는 생쥐 태아 섬유아세포 역시 단백질 합성 실험에 사용하였다. 툼스타틴 펩티드는 a_vβ₃인테그린 발현과 무관하게 이들 세포에서 단백질 합성을 저해하지 못한 반면, 라파마이신은 이들 세포에서 단백질 합성과 캡-의존성 번역을 저해하였다(도 60C, 60D, 6OG, 60H).

실시예 55: 툼스타틴 펩티드는 4E-BP1의 감소된 인산화를 유도하는 PI3-k-Akt-mTOR 신호전달을 하향-조절한다.

단백질 합성의 저해에 관여하는 신호전달 경로에 대한 툼스타틴의 역할을 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 내피 세포를 비롯한 서로 다른 세포형에서, 인테그린에 리간드 결합은 병소 부착 키나아제(FAK)의 인산화를 유도하고 다양한 신호전달 분자의 활성화를 결과한다(Vuori, K., 1998, J Membr. Biol. 165:191-9; Ruoslahti, E., 1999, Adv. Cancer Res. 76:1-20). 인산화된 FAK는 포스파티딜이노시톨 3'-키나아제(PI3-키나아제)와 Akt(PI3-키나아제의 하류)와 상호작용하고 이를 활성화시켜 세포 생존을 결과하는 것으로 알려져 있다(Chen, H.C. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10148-52; Vuori, K., 1998, J Membr. Biol. 165:191-9). 기존의 한 연구 보고서에서 내피 세포에서 PI3-K의 저해가 단백질 합성의 저해를 유도한다는 것을 입증하였다[Vinals, F. et al., 1999, J Biol. Chem. 274.26776-82).

C-PAE는 30시간 혈청-기아시키고 트립신처리하였다. 현탁액에서 세포는 T3펩티드(50 ㎍/㎖)와 함께 15분동안 배양하고, 이후 혈청-없는 조건하에 비트로넥틴-사전피복된 접시에 30-60분동안 부착되도록 하였다. 전체 세포 추출물을 준비하고, 항-인산화된 FAK(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA; goat IgG)와 항-인산화된 FAK(Tyr397; Biosource International, Camarillo, California, USA; rabbit IgG) 항체로 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏팅(Kalluri, R. et al., 1996, J Biol. Chem. 271:90628; Maeshinia, Y. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:23745-50; Sudhakar, A. et al., 1999, Biochem. 38.15398-405; Kalluri, R. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:12719-24)을 실시하였다. WM-164 흑색종 세포를 이용하여 동일한 실험을 또한 실시하였다.

결과는 도 61A에 도시하는데, 이는 다음과 같은 처리(x-축)하에 pFAK/FAK 상대 밀도의 상대적 밀도(y-축)를 보여주는 히스토그램이다: 비트로넥틴-피복된 평판에 부착시간 없음과 T3 펩티드 없음("0-"막대), 30분 부착시간과 T3 펩티드 없음("30-"막대), 30분 부착시간과 50 ㎍/㎖ T3 펩티드("30+"막대), 60분 부착시간과 T3 펩티드 없음("60-"막대), 60분 부착시간과 50㎍/㎖ T3 펩티드("60+"막대).

PI3-키나아제 활성은 포스파티딜이노시톨(PI)의 시험관내 인산화로 측정하였다(Ueki, K. et al., 2000, J Clin. Invest. 105:1437-45). C-PAE는 30시간동안 혈청-기아시키고(0.5% FCS) 트립신처리하며 T3 펩티드(50 ㎍/㎖)와 함께 15분동안 사전-배양하였다. 이후, 세포는 비트로넥틴-피복된 접시에 30-60분동안 부착되도록 하고, 세포 용해질은 항-포스포티로신 항체(Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York, USA)로 면역침전시켰다. 연속 세척한 이후, 면역침전물은 0.1㎎/㎖ PI(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, Alabama, USA)를 함유하는 50 ㎕ PI3K 반응 시약(20 mM Tris-HC1, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.5 mM EGTA)에 재현탁시켰다. PI3-키나아제 반응은 5 μCi의 γ-³²P-ATP를 함유하는 5 ㎕의 200 μM ATP를 첨가하여 개시하였다. 25℃에서 20분후, 반응은 종결시키고, 시료는 원심분리하고, 유기상은 제거하고 클로로포름-메탄올-28% 수산화암모늄-물(43:38:5:7)에서 발색하는 Silicagel 60 평판에 반점을 찍었다. 인산화된 지질은 방사선 자동 사진법으로 가시화시켰다.

결과는 61B에 도시하는데, 이는 다음과 같은 처리(x-축)하에 PI3-카이나제 활성(y-축)을 보여주는 히스토그램이다: 비트로넥틴-피복된 평판에 부착시간 없음과 T3 펩티드 없음("0-"막대), 30분 부착시간과 T3 펩티드 없음("30-"막대), 30분 부착시간과 50 ㎍/㎖ T3 펩티드("30+"-막대), 60분 부착시간과 T3 펩티드 없음("60-"막대), 60분 부착시간과 50 ㎍/㎖ T3 펩티드("60+"막대).

이후, 도 61에서처럼, C-PAE와 WM-164 세포를 이용하여 항-Akt와 항-인산화된 Akt 항체(Ser473; New England BioLabs, Beverly, Massachusetts, USA; rabbit IgG)로 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 결과는 도 61C에 도시하는데, 이는 도 61A에서와 동일한 처리(x-축)하에 pFAK/FAK의 상대적인 밀도를 보여주는 히스토그램이다.

기준 문헌에 보고된 바와 같이 mTOR 키나아제 분석을 실시하였다(Kumar, V. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:10779-87). C-PAEs 또는 WM-164는 혈청-기아시키고 Lipofectamine Plus(Life Technologies, Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)를 이용하여 HA-mTOR cDNA(Kumar, V. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:10779-87)로 일시 트랜스펙션시키며 T3 펩티드(50 ㎍/㎖) 또는 툼스타틴-45-132로 24시간동안 처리하였다. 세포 용해질(150 ㎍)은 항-HA 항체(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA)로 면역침전시켰다. 비드는 30 μM 차가운 ATP를 함유하는 키나아제 완충액(25 mM Tris, 25 mM KCl, 2.5 mM 아세트산마그네슘)에서 1O μCi의 γ-³²P-ATP의 존재하에 재조합 GST-4E-BP1 융합 단백질(Kumar, V. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:10779-87)과 함께 30℃에서 20분동안 배양하였다. 반응은 종결시키고, 시료는 SDS-PAGE를 실시하고 방사전 자동 사진법으로 분석하였다.

결과는 도 61D에 도시하는데, 이는 다음과 같은 처리(x-축)하에 mTOR-카이나제 활성(y-축)을 보여주는 히스토그램이다: mTOR 트랜스펙션 없음과 펩티드 처리없음("- -" 막대), mTOR 트랜스펙션과 펩티드 처리없음("+ -" 막대), mTOR 트랜스펙션과 툼스타틴-45-132로 처리("+ Tum-5" 막대), mTOR 트랜스펙션과 T3 펩티드로 처리("+ T3" 막대).

혈청 기아이후, C-PAE 또는 WM-164는 10% FCS의 존재하에 T3 펩티드, 툼스타틴 132, 라파마이신 또는 엔도스타틴으로 24시간동안 처리하였다. 세포 용해질을 준비하고 30 ㎕의 7-메틸-GTP-세파로스(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey, USA) 50% 슬러리를 첨가하고 25℃에서 30분동안 배양하였다. 수지를 2회세척(세척 완충액: 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 7 mM β-멀캡토에탄올, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4)한 이후, 결합된 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고, 결합된 eIF4E와 4E-BP1은 면역블랏팅으로 탐지하였다(Kumar, V. et al., 2000, J Biol. Chem. 275:1077987).

결과는 도 61E에 도시하는데, 이는 다음과 같은 처리(x-축)하에 C-PAE 세포에서 eIF4E-결합된 4E-BP1 밀도(y-축)의 히스토그램이다; FBS 없음, T3, 툼스타틴-45-132, 라파마이신, 엔도스타틴 또는 FBS.

PI3-키나아제와 Akt의 활성화에 대한 툼스타틴 펩티드의 효과를 조사하기 위하여, 구성적 활성 Akt(CAAkt, 야생형 Akt의 N-말단에 융합된 Gag 단백질)의 cDNA를 작제하였다(Burgering, B.M. et al., 1995, Nature 376:599-602). 상기 재조합 아데노바이러스는 기존 문헌에 기술된 바와 같이 모 바이러스 게놈과 발현 코스미드 카셋트 또는 셔틀 벡터 사이의 상동성 재조합으로 작제하였다(Ueki, K. et al., 2000, J Clin. Invest. 105.1437-45). 상기 아데노바이러스는 1x1O⁸플라크-형성 units/㎖의 농도로 적용하고, lacZ 유전자를 보유하는 동일한 모 게놈의 아데노바이러스는 대조로 이용하였다. 재조합 아데노바이러스로 24시간동안 C-PAE를 감염시킨 이후, 세포는 24시간동안 혈청-기아시키고 pcDNA-LUC-pol-CAT로 트랜스펙션시켰다. 1O% FCS를 함유하는 배지의 존재하에 세포를 T3 펩티드로 21시간동안 처리한 이후, 세포 용해질을 수득하고 루시페라제 분석과 CAT 분석을 실시하였다.

CAT 활성에 상대적인 루시페라제 활성 비율은 도 61F에 도시하는데, 이는대조 lacZ cDNA를 포함하는 아데노바이러스 벡터(그림자 막대)로 감염되거나, 구성적 활성 Akt를 포함하는 아데노바이러스 벡터(빗금 막대)로 감염되거나 또는 전혀 감염되지 않은(검은색 막대) C-PAE에서 CAT 활성에 상대적인 루시페라제 활성 비율의 히스토그램이다(y-축). 세포는 혈청-기아시키고 pcDNA-LUC-pol-CAT으로 트랜스펙션시키며 10% FCS를 포함하는 배지하에 T3 펩티드로 처리하였다.

툼스타틴 펩티드는 비트로넥틴에 부착으로 유도된 내피 세포에서 FAK의 인산화를 저해한다(도 61A). PI3-키나아제와 Akt의 활성화 역시 툼스타틴 펩티드 처리에 의해 저해되었다(도 61B와 61C). Akt 하류에서 (FRAP/mTOR)로 알려져 있는 라파마이신/FKBP-표적 1(RAFT 1)은 진핵 개시 인자 4E(eIF4E)-결합 단백질(4EBP1)을 직접 인산화시킨다(Brunn, G.J. et al., 1997, Science 277:99-101; Gingras, A.C. et al., 1998, Genes Dev. 12:502-13). 인산화되지 않은 4E-BP1은 eIF4E와 상호작용하고 캡-의존성 번역을 저해한다(Pause, A. et al., 1994, Nature 371:762-7).

성장 인자 또는 혈청으로 세포의 자극은 4E-BP1의 인산화를 유도하고 eIF4E로부터 이의 분리를 결과하여 번역 저해를 완화시킨다(Pause, A. et al., 1994, Nature 371:762-7; Gingas, A.C. et al., 1998, Genes Dev. 12:502-13). 툼스타틴 펩티드는 mTOR 키나아제 활성을 활성화시키고, 따라서 4E-BP1의 인산화를 저해한다(도 61D). 4E-BP1 인산화의 저해는 eIF-4E에 4E-BP1 결합을 강화시켜(도 61E) 캡-의존성 번역의 저해를 유도한다. a_vβ₃인테그린을 발현하는 비-내피 WM-164 흑색종 세포를 이들 실험에 사용하면, 툼스타틴 펩티드에 의한 저해 효과는 관찰되지않았다(도 61A와 61C-61E). 내피 세포에서 캡-의존성 번역을 저해하는데 있어 이런 경로의 중요성을 확증하기 위하여, 구성적 활성 Akt는 재조합 아데노바이러스를 이용하여 내피 세포에서 과다발현시켰다. 툼스타틴 펩티드에 의한 캡-의존성 번역의 저해는 구성적 활성 Akt의 과다발현에 의해 극복되었다(도 61F).

이들 데이터는 a_vβ₃인테그린-인테그린-FAK-PI3-KAkt-mTOR 신호전달의 네거티브 조절을 통한 내피 세포의 단백질 합성의 저해에 툼스타틴 펩티드의 관여를 더욱 뒷받침한다. 툼스타틴/a_vβ₃인테그린-유도된 네거티브 신호는 이들 2가지 경로간 크로스-토크(cross-talk)를 통하여, 성장 인자(혈관 내피 성장 인자(VEGF) 등) 개시된 세포 생존 신호를 상쇄시킬 수 있다.

툼스타틴 펩티드에 의한 단백질 합성의 조절에서 MAP-키나아제 경로의 역할 역시 조사하였다. 비트로넥틴 부착 또는 VEGF로 자극직후에 세포외 조절된 키나아제(ERK)1/2의 인산화는 C-PAE에서 툼스타틴 펩티드에 의해 변화되지 않았다. 종합적하면, 이들 결과는 캡-의존성 단백질 합성의 내피 세포 특이적 저해물질로서 툼스타틴 펩티드가 a_vβ₃인테그린을 포함하는 "쌍 방향성(outside-in)"신호전달을 통하여 작용하고, 기존 문헌에 보고된 툼스타틴의 항-혈관형성 활성이 캡-의존성 단백질 번역의 a_vβ₃인테그린-매개된 저해를 통하여 작용할 수 있음을 확립한다.

실시예 56: MDAMB-435 종양 이종이식편 모델에서 T8 합성 펩티드의 활성.

누드 생쥐에서 MDAMB-435 사람 유방 동소성 이종이식편 모델에 대한 합성 펩티드 T8의 활성을 조사하였다.

T8(KQRFTTMPFLFCNVNDVCNFASRNDYS; SEQ ID NO: 39)을 합성하고 HPLC(<20 EU/㎎)을 통하여 90% 초과 순도로 정제하였다. 상기 펩티드는 주사에 앞서 2X 완충액 1:1(v:v)의 5O mM 글리신, 5 mM 아르기닌, 9% D-만니톨(pH 8.0)로 중화시켰다.

대략 20 g의 5-6주령 암컷 누드 NCRNU 생쥐는 액와하 유방 지방 비후(subaxillary mammary fat pad)에 2 x 10⁶MDAMB-435 세포를 이식하였다. 종양이 100 ㎣일 때, 동물은 치료군과 대조군으로 페어-매칭(pair-matching)하였다. 각 군은 7마리의 종양 생쥐로 구성되었고, 이들 각각은 귀표하고 전체 실험 과정동안 개별적으로 관리하였다. T8 펩티드 또는 운반제 대조의 초기량은 페어-매칭 당일(Day 0)에 제공하고 동물 체중 ㎏당 1 ㎎과 2.5 ㎎으로 복강내(i.p.) 주사하였다. 생쥐는 주 2회 칭량하고, 종양은 Day 1일부터 시작하여 주 2회 캘리퍼스로 측정하였다. 이들 종양 치수는 널리 알려진 공식 V=W²x L/2로 종양 체적으로 전환시키고, 평균 종양 체적은 시간에 따라 플랏하였다. 생쥐는 치료 종결 시점에서 마취시켰다. 종결 직후에, 생쥐는 칭량하고 죽이며 종양을 절제하였다. 군당 평균 종양 중량을 산정하고, 값(평균 치료된 종양 중량/평균 대조 종양 중량 x 100)을 100%로부터 감하여 각 군에 대한 종양 성장 저해(TGI)를 부여하였다.

종양 체적이 100 ㎣에 도달하면 치료를 개시하였다. 모든 군은 26일동안 bid, i.p. 주사를 투여하였다. 결과는 아래의 표 5에 도시한다.

표 5: 100 ㎣의 이미 존재하는 MDAMB-435 종양 이종이식편에 대한 T8 펩티드의 생체내 효과 요약.

연속적인 중량 변화에 의한 판단에서 임의의 군에서 독성이 관찰되지 않음

**P<0.01

결과는 도 62에 도시하는데, 이는 대조 운반제(○)로 치료 및 1 ㎎/㎏(□) 또는 2.5 ㎎/㎏(◇) T8 치료(x-축)이후에 여러 일동안 평균 종양 체적(㎣, y축)을 보여주는 그래프이다. 연속적인 중량 변화에 의한 판단에서 임의의 군에서 독성은 관찰되지 않았다. 26일간 치료후의 결과는 27-mer 펩티드 T8이 2.5 ㎎/㎏ 용량으로 매일 투여되는 경우에 종양 성장을 47.91% 저해한다는 것을 보여준다(p<0.001). 1.0 ㎎/㎏으로 매일 2회 투여된 T8은 종양 성장을 현저하게 저해하지 않았다. 결론적으로, 툼스타틴 서열로부터 유래된 소형 합성 펩티드인 T8은 MDAMB-435 동소성 사람 유방 종양 이종이식편 모델에서 종양 성장을 저해하는데 효과적이다.

실시예 57: MDAMB-435 종양 이종이식편 모델에 대항하는 T8과 TP3 합성 펩티드의 활성.

Tum5 합성 펩티드 T8과 TP3의 항종양 활성은 누드 생쥐에서 MDAMB-435 사람유방 동소성 이종이식편 모델에 대하여 실시하였다. T8의 용량 스케줄 역시 변화시켰다.

고유 툼스타틴 서열의 변이체인 합성 펩티드 T8과 TP3(KLFCNVNCVCNFASRNDYS; SEQ ID NO: 41)을 합성하고 HPLC(<20 EU/㎎)을 통하여 90% 초과 순도로 정제하였다. 상기 펩티드는 주사에 앞서 2X 완충액 1:1(v:v)의 5O mM 글리신, 5 mM 아르기닌, 10 mM Na-아세테이트, 9% D-만니톨(pH 8.2)로 중화시켰다.

대략 20 g의 5-6주령 암컷 누드 NCRNU 생쥐는 액와하 유방 지방 비후(subaxillary mammary fat pad)에 2 x 10⁶MDAMB-435 세포를 이식하였다. 종양이 100 ㎣일 때, 동물은 치료군과 대조군으로 페어-매칭(pair-matching)하였다. 각 군은 6-7마리의 종양 생쥐로 구성되었고, 이들 각각은 귀표하고 전체 실험 과정동안 개별적으로 관리하였다. T8이나 TP3 펩티드 또는 운반제 대조의 초기량은 페어-매칭 당일(Day 0)에 제공하고 지정된 용량으로 복강내(i.p.) 주사를 투여하였다. 생쥐는 주 2회 칭량하고, 종양은 Day 1일부터 시작하여 주 2회 캘리퍼스로 측정하였다. 이들 종양 치수는 널리 알려진 공식 V=W²x L/2로 종양 체적으로 전환시키고, 평균 종양 체적과 체척 비율(V/V₀)은 시간에 따라 플랏하였다. 생쥐는 치료 종결 시점에서 마취시켰다. 종결 직후에, 생쥐는 칭량하고 죽이며 종양을 절제하였다. 군당 평균 종양 중량을 산정하고, 평균값(평균 치료된 종양 비율/평균 대조 종양 비율 x 100)을 100%로부터 감하여 각 군에 대한 종양 성장 저해(TGI)를 부여하였다.

종양 체적이 80 ㎣에 도달하면 치료를 개시하였다. 주 2회 치료를 받은 하나의 T8-치료군을 제외하고 모든 군은 매일 i.p. 주사를 투여하였다. 결과는 아래의 표 6에 도시한다.

표 6: 100 ㎣의 이미 존재하는 MDAMB-435 종양 이종이식편에 대한 T8과 TP3 펩티드의 생체내 효과 요약.

결과는 도 63에 도시하는데, 이는 대조(○)로 치료 및 매일 1 ㎎/㎏(◇) TP3, 매일 5 ㎎/㎏(X) TP3, 매일 5 ㎎/㎏(□) T8, 2주간 5 ㎎/㎏ T8(+) 치료(x-축)이후에 여러 일동안 평균 종양 체적 비율(V/V₀, y축)을 보여주는 그래프이다.

중량 변화에 의한 판단에서 임의의 군에서 독성은 관찰되지 않았다. 4주간 치료후의 결과는 27-mer 펩티드 T8이 5 ㎎/㎏ 용량으로 매일 또는 주 2회 투여되는 경우에 종양 성장을 각각 31.0%(p = 0.07)과 41.4% (p = 0.02) 저해한다는 것을 보여준다. 이에 더하여, 18-mer 절두된 펩티드 TP3은 종양 성장을 1 ㎎/㎏ 용량에서30.6% (p = 0.14), 5 ㎎/㎏ 용량에서 50.0%(p<0.01) 저해하였다. 이런 이유로, 툼스타틴 서열로부터 유래된 소형 합성 펩티드는 MDAMB-435 동소성 사람 유방 종양 이종이식편 모델에서 종양 성장을 저해하는데 효과적이다.

실시예 58: PC3 종양 이종이식편 모델에서 T7, T8, TP3, SP1, SP2 합성 펩티드의 활성.

합성 펩티드 T7, T8, TP3, SP1, SP2의 항종양 활성은 누드 생쥐에서 PC3 사람 전립선 종양 이종이식편 모델에 대하여 평가하였다.

펩티드 T7, T8, TP3 및 대조 스크램블드 대조 펩티드 SP1 (ANMSRNVFFDCTSFPVCQKFLNDTRNY; SEQ ID NO: 43)과 SP2 (TFNCVKNYQRLDFTSRFVMDSCANFPN; SEQ ID NO: 44)를 합성하고 HPLC(<20 EU/㎎)을 통하여 90% 초과 순도로 정제하였다. 이들 펩티드는 주사에 앞서 2X 완충액 1:1(v:v)의 5O mM 글리신, 5 mM 아르기닌, 10 mM Na-아세테이트, 9% D-만니톨(pH 8.2)로 중화시켰다. 펩티드 T7과 T8은 서로 다른 원액 운반제(T7의 경우 25% DMSO/PBS; T8의 경우 2 mM HCl)에 보관하여, 이들 원액 운반제 자체가 대조군에 포함될 수 있도록 하였다.

대략 25 g의 5-6주령 수컷 누드 NCRNU 생쥐는 배축 피하조직(dorsal subcutis)에 2 x 10⁶PC3 세포를 이식하였다. 종양이 60 ㎣일 때, 동물은 치료군과 대조군으로 페어-매칭(pair-matching)하였다. 각 군은 6-7마리의 종양 생쥐로 구성되었고, 이들 각각은 귀표하고 전체 실험 과정동안 개별적으로 관리하였다. 펩티드 또는 운반제 대조의 초기량은 페어-매칭 당일(Day 0)에 제공하고 지정된 용량으로 복강내(i.p.) 주사를 투여하였다. 생쥐는 주 1회 칭량하고, 종양은 주 1회 캘리퍼스로 측정하였다. 이들 종양 치수는 널리 알려진 공식 V=W²x L/2로 종양 체적으로 전환시키고, 평균 종양 체적은 시간에 따라 플랏하였다. 생쥐는 치료 종결 시점에서 마취시켰다. 종결 직후에, 생쥐는 칭량하고 죽이며 종양을 절제하였다. 군당 평균 종양 중량을 산정하고, 값(평균 치료된 종양 체적이나 체적 비율/평균 대조 종양 체적이나 체적비율 x 100)을 100%로부터 감하여 각 군에 대한 종양 성장 저해(TGI)를 부여하였다.

각각 주 2회와 주 1회 치료되는 두개의 T8-치료군을 제외하고 모든 군은 매일 i.p. 주사를 투여하였다. 결과는 아래의 표 7에 도시한다.

표 7: 60 ㎣의 이미 존재하는 PC3 종양 이종이식편에 대한 T7, T8, TP3, SP1, SP2 펩티드의 생체내 효과 요약.

결과는 도 64A 및 64B에 도시하는데, 이는 다양한 치료(x-축)를 개시한 이후 여러 일동안 평균 종양 체적 비율(㎣, y축)을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 도 64A에서 치료는 다음과 같다: T7의 원액 운반제(○), T7 매일(□), T8의 원액 운반제(◇), T8 매일(X), TP3 매일(+), SP1 매일(△), SP2 매일(●). 도 64B에서 치료는 다음과 같다; T8의 원액 운반제(○), T8 매일(□), T8 2주(◇), T8 2주(X).

중량 변화에 의한 판단에서 임의의 군에서 독성은 관찰되지 않았다. 매일 i,p, 투여된 펩티드로 3주간 치료후의 결과는 27-mer 펩티드 T8이 5 ㎎/㎏ 용량에서 종양 성장을 45% 저해한다는 것을 보여준다. 동일 용량에서 T7은 종양 성장을 66.8% 저해하였고, 동일 용량에서 TP3은 종양 성장을 53.2% 저해하였다. 모든 사례에서, 종양 성장 저해는 스튜던트 t-검증에서 별로 유의하지 않았다. 스크램블드 대조 펩티드 SP1과 SP2는 유의한 수준으로 간주되지 않는 각각 31.7%와 18.7% 종양 성장을 저해하였다.

용량 스케줄에서 차이를 또한 조사하였다. 5.0 ㎎/㎏ 용량으로 주 1-2회 투여된 T8은 종양 성장을 현저하게 저해하지 않았다(각각 8.1%와 39.5%). 이런 이유로, 펩티드 TP3은 PC3 사람 전립선 종양 이종이식편 모델에서 T7 및 T8과 유사한 종양 성장 저해 활성을 보이는 것으로 생각된다.

실시예 59: MDAMB-435 종양 이종이식편과 PC3 종양 이종이식편 모델에서 T8, T8-3, P2, SP2 합성 펩티드의 활성.

합성 펩티드 T8, T8-3, P2, SP2의 항종양 활성은 누드 생쥐에서 MDAMB-435 사람 유방 종양 이종이식편 모델 및 PC3 사람 전립선 종양 이종이식편 모델에 대하여 평가하였다.

펩티드 T8; T8과 동일한 서열을 보유하지만 세린이 시스테인으로 치환된 T8-3(KQRFTTMPFLFSNVNDVSNFASRNDYS; SEQ ID NO: 40); 아스파라긴산이 시스테인으로 치환된 P2(KQRFTTMPFLFDNVNDVDNFASRNDYS; SEQ ID NO: 42)를 합성하였다. 스크램블드대조 펩티드인 SP2를 또한 합성하였다. 이들 펩티드는 HPLC(<20 EU/㎎)을 통하여 90% 초과 순도로 정제하였다. 이들 펩티드는 주사에 앞서 2X 완충액 1:1(v:v)의 5O mM 글리신, 5 mM 아르기닌, 10 mM Na-아세테이트, 9% D-만니톨(pH 8.2)로 중화시켰다.

MDAMB-435 모델을 포함하는 검사를 위하여, 대략 20 g의 5-6주령 암컷 누드 NCRNU 생쥐는 액와하 유방 지방 비후에 2 x 10⁶MDAMB-435 세포를 이식하였다. PC3 모델을 포함하는 검사를 위하여, 대략 25 g의 5-6주령 수컷 누드 NCRNU 생쥐는 배축 피하조직에 2 x 10⁶PC3 세포를 이식하였다. 종양이 100 ㎣(MDAMB-435 모델의 경우) 또는 60 ㎣(PC3 모델의 경우)일 때, 동물은 치료군과 대조군으로 페어-매칭(pair-matching)하였다.

각 군은 6-7마리의 종양 생쥐로 구성되었고, 이들 각각은 귀표하고 전체 실험 과정동안 개별적으로 관리하였다. 펩티드 또는 운반제 대조의 초기량은 페어-매칭 당일(Day 0)에 제공하고 지정된 용량으로 복강내(i.p.) 주사를 매일 투여하였다. 생쥐는 주 1회 칭량하고, 종양은 Day 0부터 시작하여 주 1회 캘리퍼스로 측정하였다. 이들 종양 치수는 널리 알려진 공식 V=W²x L/2로 종양 체적으로 전환시키고, 평균 종양 체적은 시간에 따라 플랏하였다. 생쥐는 치료 종결 시점에서 마취시켰다. 종결 직후에, 생쥐는 칭량하고 죽이며 종양을 절제하였다. 군당 평균 종양 중량을 산정하고, 값(평균 치료된 종양 체적/평균 대조 종양 체적 x 100)을 100%로부터 감하여 각 군에 대한 종양 성장 저해(TGI)를 부여하였다.

MDAMB-435와 PC3 모델은 각각 하기 표 8과 9에 도시한다.

표 8: 100 ㎣의 이미 존재하는 MDAMB-435 종양 이종이식편에 대한 T8, T8-3, P2, SP2 펩티드의 생체내 효과 요약.

표 9: 60 ㎣의 이미 존재하는 PC3 종양 이종이식편에 대한 T8, T8-3, P2, SP2 펩티드의 생체내 효과 요약.

*P<0.05

결과는 도 65A 및 65B에 도시하는데, 이는 다음의 다양한 치료(x-축)를 개시한 이후 여러 일동안 누드 쥐(도 65A)에서 MDAMB-435 동소성 사람 유방암 이종이식편 모델(도 65A) 및 PC3 사람 전립선 종양 이종이식편 모델(도 65B)에서 평균 종양 체적(㎣, y축)을 보여주는 한 쌍의 그래프이다: 대조 치료(○) 및 T8 펩티드 5 ㎎/㎏(□), SP2 5 ㎎/㎏(◇), T8-3 1 ㎎/㎏(X) 또는 5 ㎎/㎏(+), P2 1㎎/㎏(△) 또는 5 ㎎/㎏(●). 도 65A와 65B는 각각 MDAMB-435와 PC3 이종이식편 모델 결과를 나타낸다. 중량 변화에 의한 판단에서 임의의 군에서 독성은 관찰되지 않았다.

누드 생쥐의 MDAMB-435 동소성 사람 유방 종양 이종이식편 모델에서 매일 i,p, 투여된 펩티드로 3주간 치료후의 결과는 27-mer 펩티드 T8이 5 ㎎/㎏ 용량에서 종양 성장을 50.5%(p = 0.002) 저해한다는 것을 보여준다. 이에 더하여, T8-3 펩티드는 1 ㎎/㎏ 용량에서 무효하긴 하지만, 5 ㎎/㎏ 용량에서 종양 성장을 41.9%(p = 0.008) 저해하였다. P2 펩티드는 1 ㎎/㎏ 용량에서 종양 성장의 26.4% 저해를 보이긴 하지만(유의하지 않음, p = 0.55), 5 ㎎/㎏ 용량에서 현저한 저해는 관찰되지 않았다. 또한, 스크램블드 대조 펩티드 SP2는 5 ㎎/㎏ 용량에서 종양 성장 저해를 보이지 않았다. 결론적으로, 세린-치환된 T8 변이체 T8-3은 MDAMB-435 동소성 사람 유방 종양 이종이식편 모델에서 T8과 유사한 종양 성장 저해 활성을 보유한다.

누드 생쥐의 PC3 사람 전립선 종양 이종이식편 모델에서 매일 i,p, 투여된 펩티드로 3주간 치료후의 결과는 27-mer 펩티드 T8이 5 ㎎/㎏ 용량에서 종양 성장을 35.4%(p = 0.036) 저해한다는 것을 보여준다. 이에 더하여, T8-3 펩티드는 5 ㎎/㎏ 용량에서 종양 성장을 35.4% 저해하였는데, 이런 저해는 유의하지 않았다(p = 0.065). P2 펩티드 역시 종양 성장 저해를 보였는데, 좀더 적은 용량에서 좀더 유효하였다: 1 ㎎/㎏에서 TGI = 31.6%, p = 0.54, vs. 5 ㎎/㎏에서 TG1 = 15.9%, p = 0. 또한, 스크램블드 대조 펩티드 SP2는 5 ㎎/㎏ 용량에서 종양 성장 저해를 보이지 않았다. 결론적으로, 세린-치환된 T8 변이체 T8-3 및 아스파라긴산-치환된 T8 변이체 P2는 PC3 사람 전립선 종양 이종이식편 모델에서 종양 성장 저해 활성을 보인다. 비록 유의하지는 않지만, T8-3은 효능의 측면에서 T8에 근접하는 것으로생각된다.

모든 참고문헌, 특허, 특허 출원은 여기에 참조로 한다. 본 발명을 바람직한 구체예를 참고하여 설명하긴 했지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 포섭되는 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 다양한 개변이 실시될 수 있음은 당업자에게 자명하다.

SEQUENCE LISTING <110> Raghuram Kalluri <120> ANTI-ANGIOGENIC PROTEINS AND FRAGMENTS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 2312/2088C <140> PCT/US02/40938 <141> 2002-12-20 <150> 10/032,221 <151> 2001-12-21 <160> 58 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(687) <400> 1 tct gtt gat cac ggc ttc ctt gtg acc agg cat agt caa aca ata gat 48 Ser Val Asp His Gly Phe Leu Val Thr Arg His Ser Gln Thr Ile Asp 1 5 10 15 gac cca cag tgt cct tct ggg acc aaa att ctt tac cac ggg tac tct 96 Asp Pro Gln Cys Pro Ser Gly Thr Lys Ile Leu Tyr His Gly Tyr Ser 20 25 30 ttg ctc tac gtg caa ggc aat gaa cgg gcc cat gga cag gac ttg ggc 144 Leu Leu Tyr Val Gln Gly Asn Glu Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly 35 40 45 acg gcc ggc agc tgc ctg cgc aag ttc agc aca atg ccc ttc ctg ttc 192 Thr Ala Gly Ser Cys Leu Arg Lys Phe Ser Thr Met Pro Phe Leu Phe 50 55 60 tgc aat att aac aac gtg tgc aac ttt gca tca cga aat gac tac tcg 240 Cys Asn Ile Asn Asn Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser 65 70 75 80 tac tgg ctg tcc acc cct gag ccc atg ccc atg tca atg gca ccc atc 288 Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Pro Met Pro Met Ser Met Ala Pro Ile 85 90 95 acg ggg gaa aac ata aga cca ttt att agt agg tgt gct gtg tgt gag 336 Thr Gly Glu Asn Ile Arg Pro Phe Ile Ser Arg Cys Ala Val Cys Glu 100 105 110 gcg cct gcc atg gtg atg gcc gtg cac agc cag acc att cag atc cca 384 Ala Pro Ala Met Val Met Ala Val His Ser Gln Thr Ile Gln Ile Pro 115 120 125 ccg tgc ccc agc ggg tgg tcc tcg ctg tgg atc ggc tac tct ttt gtg 432 Pro Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Phe Val 130 135 140 atg cac acc agc gct ggt gca gaa ggc tct ggc caa gcc ctg gcg tcc 480 Met His Thr Ser Ala Gly Ala Glu Gly Ser Gly Gln Ala Leu Ala Ser 145 150 155 160 ccc ggc tcc tgc ctg gag gag ttt aga agt gcg cca ttc atc gag tgt 528 Pro Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ser Ala Pro Phe Ile Glu Cys 165 170 175 cac ggc cgt ggg acc tgc aat tac tac gca aac gct tac agc ttt tgg 576 His Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ala Asn Ala Tyr Ser Phe Trp 180 185 190 ctc gcc acc ata gag agg agc gag atg ttc aag aag cct acg ccg tcc 624 Leu Ala Thr Ile Glu Arg Ser Glu Met Phe Lys Lys Pro Thr Pro Ser 195 200 205 acc ttg aag gca ggg gag ctg cgc acg cac gtc agc cgc tgc caa gtc 672 Thr Leu Lys Ala Gly Glu Leu Arg Thr His Val Ser Arg Cys Gln Val 210 215 220 tgt atg aga aga aca taa 690 Cys Met Arg Arg Thr 225 <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Val Asp His Gly Phe Leu Val Thr Arg His Ser Gln Thr Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Gln Cys Pro Ser Gly Thr Lys Ile Leu Tyr His Gly Tyr Ser 20 25 30 Leu Leu Tyr Val Gln Gly Asn Glu Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly 35 40 45 Thr Ala Gly Ser Cys Leu Arg Lys Phe Ser Thr Met Pro Phe Leu Phe 50 55 60 Cys Asn Ile Asn Asn Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser 65 70 75 80 Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Pro Met Pro Met Ser Met Ala Pro Ile 85 90 95 Thr Gly Glu Asn Ile Arg Pro Phe Ile Ser Arg Cys Ala Val Cys Glu 100 105 110 Ala Pro Ala Met Val Met Ala Val His Ser Gln Thr Ile Gln Ile Pro 115 120 125 Pro Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Phe Val 130 135 140 Met His Thr Ser Ala Gly Ala Glu Gly Ser Gly Gln Ala Leu Ala Ser 145 150 155 160 Pro Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ser Ala Pro Phe Ile Glu Cys 165 170 175 His Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ala Asn Ala Tyr Ser Phe Trp 180 185 190 Leu Ala Thr Ile Glu Arg Ser Glu Met Phe Lys Lys Pro Thr Pro Ser 195 200 205 Thr Leu Lys Ala Gly Glu Leu Arg Thr His Val Ser Arg Cys Gln Val 210 215 220 Cys Met Arg Arg Thr 225 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+) forward oligonucleotide primer for Arresten <400> 3 cgggatcctt ctgttgatca cggcttc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+) reverse oligonuceotide primer for Arresten <400> 4 cccaagcttt gttcttctca tacagac 27 <210> 5 <211> 684 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(681) <400> 5 gtc agc atc ggc tac ctc ctg gtg aag cac agc cag acg gac cag gag 48 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Ile Ala Val His Ser Gln Asp Val Ser Ile Pro His Cys Pro 115 120 125 gct ggg tgg cgg agt ttg tgg atc gga tat tcc ttc ctc atg cac acg 432 Ala Gly Trp Arg Ser Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Phe Leu Met His Thr 130 135 140 gcg gcg gga gac gaa ggc ggt ggc caa tca ctg gtg tca ccg ggc agc 480 Ala Ala Gly Asp Glu Gly Gly Gly Gln Ser Leu Val Ser Pro Gly Ser 145 150 155 160 tgt cta gag gac ttc cgc gcc aca cca ttc atc gaa tgc aat gga ggc 528 Cys Leu Glu Asp Phe Arg Ala Thr Pro Phe Ile Glu Cys Asn Gly Gly 165 170 175 cgc ggc acc tgc cac tac tac gcc aac aag tac agc ttc tgg ctg acc 576 Arg Gly Thr Cys His Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Ser Phe Trp Leu Thr 180 185 190 acc att ccc gag cag agc ttc cag ggc tcg ccc tcc gcc gac acg ctc 624 Thr Ile Pro Glu Gln Ser Phe Gln Gly Ser Pro Ser Ala Asp Thr Leu 195 200 205 aag gcc ggc ctc atc cgc aca cac atc agc cgc tgc cag gtg tgc atg 672 Lys Ala Gly Leu Ile Arg Thr His Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys Met 210 215 220 aag aac ctg tga 684 Lys Asn Leu 225 <210> 6 <211> 227 <212> PRT 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205 Lys Ala Gly Leu Ile Arg Thr His Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys Met 210 215 220 Lys Asn Leu 225 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+) forward oligonucleotide primer for Canstatin <400> 7 cgggatcctg tcagcatcgg ctacctc 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+) reverse oligonucleotide primer for Canstatin <400> 8 cccaagcttc aggttcttca tgcacac 27 <210> 9 <211> 738 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(735) <400> 9 cca ggt ttg aaa gga aaa cgt gga gac agt gga tca cct gca acc tgg 48 Pro Gly Leu Lys Gly Lys Arg Gly Asp Ser Gly Ser Pro Ala Thr Trp 1 5 10 15 aca acg aga ggc ttt gtc ttc acc cga cac agt caa acc aca gca att 96 Thr Thr Arg Gly Phe Val Phe Thr Arg His Ser Gln Thr Thr Ala Ile 20 25 30 cct tca tgt cca gag ggg aca gtg cca ctc tac agt ggg ttt tct ttt 144 Pro Ser Cys Pro Glu Gly Thr Val Pro Leu Tyr Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 ctt ttt gta caa gga aat caa cga gcc cac gga caa gac ctt gga act 192 Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr 50 55 60 ctt ggc agc tgc ctg cag cga ttt acc aca atg cca ttc tta ttc tgc 240 Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys 65 70 75 80 aat gtc aat gat gta tgt aat ttt gca tct cga aat gat tat tca tac 288 Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr 85 90 95 tgg ctg tca aca cca gct ctg atg cca atg aac atg gct ccc att act 336 Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met Ala Pro Ile Thr 100 105 110 ggc aga gcc ctt gag cct tat ata agc aga tgc act gtt tgt gaa ggt 384 Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr Val Cys Glu Gly 115 120 125 cct gcg atc gcc ata gcc gtt cac agc caa acc act gac att cct cca 432 Pro Ala Ile Ala Ile Ala Val His Ser Gln Thr Thr Asp Ile Pro Pro 130 135 140 tgt cct cac ggc tgg att tct ctc tgg aaa gga ttt tca ttc atc atg 480 Cys Pro His Gly Trp Ile Ser Leu Trp Lys Gly Phe Ser Phe Ile Met 145 150 155 160 ttc aca agt gca ggt tct gag ggc acc ggg caa gca ctg gcc tcc cct 528 Phe Thr Ser Ala Gly Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ser Pro 165 170 175 ggc tcc tgc ctg gaa gaa ttc cga gcc agc cca ttt cta gaa tgt cat 576 Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ala Ser Pro Phe Leu Glu Cys His 180 185 190 gga aga gga acg tgc aac tac tat tca aat tcc tac agt ttc tgg ctg 624 Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu 195 200 205 gct tca tta aac cca gaa aga atg ttc aga aag cct att cca tca act 672 Ala Ser Leu Asn Pro Glu Arg Met Phe Arg Lys Pro Ile Pro Ser Thr 210 215 220 gtg aaa gct ggg gaa tta gaa aaa ata ata agt cgc tgt cag gtg tgc 720 Val Lys Ala Gly Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys 225 230 235 240 atg aag aaa aga cac tga 738 Met Lys Lys Arg His 245 <210> 10 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Pro Gly Leu Lys Gly Lys Arg Gly Asp Ser Gly Ser Pro Ala Thr Trp 1 5 10 15 Thr Thr Arg Gly Phe Val Phe Thr Arg His Ser Gln Thr Thr Ala Ile 20 25 30 Pro Ser Cys Pro Glu Gly Thr Val Pro Leu Tyr Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr 50 55 60 Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys 65 70 75 80 Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr 85 90 95 Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met Ala Pro Ile Thr 100 105 110 Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr Val Cys Glu Gly 115 120 125 Pro Ala Ile Ala Ile Ala Val His Ser Gln Thr Thr Asp Ile Pro Pro 130 135 140 Cys Pro His Gly Trp Ile Ser Leu Trp Lys Gly Phe Ser Phe Ile Met 145 150 155 160 Phe Thr Ser Ala Gly Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ser Pro 165 170 175 Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ala Ser Pro Phe Leu Glu Cys His 180 185 190 Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Pro Glu Arg Met Phe Arg Lys Pro Ile Pro Ser Thr 210 215 220 Val Lys Ala Gly Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys 225 230 235 240 Met Lys Lys Arg His 245 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+) forward oligonucleotide primer for Tumstatin <400> 11 cgggatccgg gtttgaaagg aaaacgt 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+) reverse oligonucleotide primer for Tumstatin <400> 12 cccaagcttt cagtgtcttt tcttcat 27 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Additional vector sequence added to protein <400> 13 Met Asp Ile Gly Ile Asn Ser Asp 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Additional vector sequence added to protein <400> 14 Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu 1 5 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPICZaA forward oligonucleotide primer for Arresten <400> 15 ttcggaattc tctgttgatc acggcttc 28 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPICZaA reverse oligonucleotide primer for Arresten <400> 16 tgctctagag gtgttcttct catacagact tggca 35 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPICZaA forward oligonucleotide primer for Canstatin <400> 17 ttcggaattc gtcagcatcg gctacctcct g 31 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPICZaA reverse oligonucleotide primer for Canstatin <400> 18 ggggtacccc caggttcttc atgcacacct gg 32 <210> 19 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumstatin (amino acids 1-244) <400> 19 Pro Gly Leu Lys Gly Lys Arg Gly Asp Ser Gly Ser Pro Ala Thr Trp 1 5 10 15 Thr Thr Arg Gly Phe Val Phe Thr Arg His Ser Gln Thr Thr Ala Ile 20 25 30 Pro Ser Cys Pro Glu Gly Thr Val Pro Leu Tyr Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr 50 55 60 Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys 65 70 75 80 Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr 85 90 95 Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met Ala Pro Ile Thr 100 105 110 Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr Val Cys Glu Gly 115 120 125 Pro Ala Ile Ala Ile Ala Val His Ser Gln Thr Thr Asp Ile Pro Pro 130 135 140 Cys Pro His Gly Trp Ile Ser Leu Trp Lys Gly Phe Ser Phe Ile Met 145 150 155 160 Phe Thr Ser Ala Gly Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ser Pro 165 170 175 Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ala Ser Pro Phe Leu Glu Cys His 180 185 190 Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Pro Glu Arg Met Phe Arg Lys Pro Ile Pro Ser Thr 210 215 220 Val Lys Ala Gly Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys 225 230 235 240 Met Lys Lys Arg <210> 20 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumstatin 333 (amino acids 2-125 of SEQ ID NO:10) <400> 20 Gly Leu Lys Gly Lys Arg Gly Asp Ser Gly Ser Pro Ala Thr Trp Thr 1 5 10 15 Thr Arg Gly Phe Val Phe Thr Arg His Ser Gln Thr Thr Ala Ile Pro 20 25 30 Ser Cys Pro Glu Gly Thr Val Pro Leu Tyr Ser Gly Phe Ser Phe Leu 35 40 45 Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr Leu 50 55 60 Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn 65 70 75 80 Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp 85 90 95 Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met Ala Pro Ile Thr Gly 100 105 110 Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr Val 115 120 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumstatin 334 (amino acids 126-244 of SEQ ID NO:10) <400> 21 Cys Glu Gly Pro Ala Ile Ala Ile Ala Val His Ser Gln Thr Thr Asp 1 5 10 15 Ile Pro Pro Cys Pro His Gly Trp Ile Ser Leu Trp Lys Gly Phe Ser 20 25 30 Phe Ile Met Phe Thr Ser Ala Gly Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Leu 35 40 45 Ala Ser Pro Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ala Ser Pro Phe Leu 50 55 60 Glu Cys His Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser 65 70 75 80 Phe Trp Leu Ala Ser Leu Asn Pro Glu Arg Met Phe Arg Lys Pro Ile 85 90 95 Pro Ser Thr Val Lys Ala Gly Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Arg Cys 100 105 110 Gln Val Cys Met Lys Lys Arg 115 <210> 22 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tum-1 (Tumstatin N53) (amino acids 54-244 of SEQ ID NO:10) <400> 22 Asn Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu 1 5 10 15 Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val 20 25 30 Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro 35 40 45 Ala Leu Met Pro Met Asn Met Ala Pro Ile Thr Gly Arg Ala Leu Glu 50 55 60 Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr Val Cys Glu Gly Pro Ala Ile Ala Ile 65 70 75 80 Ala Val His Ser Gln Thr Thr Asp Ile Pro Pro Cys Pro His Gly Trp 85 90 95 Ile Ser Leu Trp Lys Gly Phe Ser Phe Ile Met Phe Thr Ser Ala Gly 100 105 110 Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Cys Leu Glu 115 120 125 Glu Phe Arg Ala Ser Pro Phe Leu Glu Cys His Gly Arg Gly Thr Cys 130 135 140 Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu Ala Ser Leu Asn Pro 145 150 155 160 Glu Arg Met Phe Arg Lys Pro Ile Pro Ser Thr Val Lys Ala Gly Glu 165 170 175 Leu Glu Lys Ile Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys Met Lys Lys Arg 180 185 190 <210> 23 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tum-2 (amino acids 1-132 of SEQ ID NO:10) <400> 23 Pro Gly Leu Lys Gly Lys Arg Gly Asp Ser Gly Ser Pro Ala Thr Trp 1 5 10 15 Thr Thr Arg Gly Phe Val Phe Thr Arg His Ser Gln Thr Thr Ala Ile 20 25 30 Pro Ser Cys Pro Glu Gly Thr Val Pro Leu Tyr Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr 50 55 60 Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys 65 70 75 80 Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr 85 90 95 Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met Ala Pro Ile Thr 100 105 110 Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr Val Cys Glu Gly 115 120 125 Pro Ala Ile Ala 130 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tum-3 (amino acids 133-244 of SEQ ID NO:10) <400> 24 Ile Ala Val His Ser Gln Thr Thr Asp Ile Pro Pro Cys Pro His Gly 1 5 10 15 Trp Ile Ser Leu Trp Lys Gly Phe Ser Phe Ile Met Phe Thr Ser Ala 20 25 30 Gly Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Cys Leu 35 40 45 Glu Glu Phe Arg Ala Ser Pro Phe Leu Glu Cys His Gly Arg Gly Thr 50 55 60 Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu Ala Ser Leu Asn 65 70 75 80 Pro Glu Arg Met Phe Arg Lys Pro Ile Pro Ser Thr Val Lys Ala Gly 85 90 95 Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys Met Lys Lys Arg 100 105 110 <210> 25 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tum-4 (amino acids 181-244 of SEQ ID NO:10) <400> 25 Glu Glu Phe Arg Ala Ser Pro Phe Leu Glu Cys His Gly Arg Gly Thr 1 5 10 15 Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu Ala Ser Leu Asn 20 25 30 Pro Glu Arg Met Phe Arg Lys Pro Ile Pro Ser Thr Val Lys Ala Gly 35 40 45 Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys Met Lys Lys Arg 50 55 60 <210> 26 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tum-5 (amino acids 54-132 of SEQ ID NO:10) <400> 26 Asn Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu 1 5 10 15 Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val 20 25 30 Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro 35 40 45 Ala Leu Met Pro Met Asn Met Ala Pro Ile Thr Gly Arg Ala Leu Glu 50 55 60 Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr Val Cys Glu Gly Pro Ala Ile Ala 65 70 75 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1 (amino acids 1-20 of SEQ ID NO:10) <400> 27 Pro Gly Leu Lys Gly Lys Arg Gly Asp Ser Gly Ser Pro Ala Thr Trp 1 5 10 15 Thr Thr Arg Gly 20 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2 (amino acids 54-73 of SEQ ID NO:10) <400> 28 Asn Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu 1 5 10 15 Gln Arg Phe Thr 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 (amino acids 69-88 of SEQ ID NO:10) <400> 29 Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Val Cys Asn Phe 20 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T4 (amino acids 84-103 of SEQ ID NO:10) <400> 30 Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser 1 5 10 15 Thr Pro Ala Leu 20 <210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T5 (amino acids 99-117 of SEQ ID NO:10) <400> 31 Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met Ala Pro Ile Thr Gly Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T6 (amino acids 114-132 of SEQ ID NO:10) <400> 32 Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr Val Cys Glu Gly Pro 1 5 10 15 Ala Ile Ala <210> 33 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumstatin-45-132 (amino acids 45-132 of SEQ ID NO:10) <400> 33 Gly Phe Ser Phe Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln 1 5 10 15 Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro 20 25 30 Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn 35 40 45 Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met 50 55 60 Ala Pro Ile Thr Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr 65 70 75 80 Val Cys Glu Gly Pro Ala Ile Ala 85 <210> 34 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumstatin-5-126-C-A (amino acids 45-132 of SEQ ID NO:10; alanine has been substituted for the cysteine residue at position 126 of the full-length Tumstatin molecule) <400> 34 Gly Phe Ser Phe Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln 1 5 10 15 Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro 20 25 30 Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn 35 40 45 Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met 50 55 60 Ala Pro Ile Thr Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr 65 70 75 80 Val Ala Glu Gly Pro Ala Ile Ala 85 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic blocking peptide <400> 35 Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic blocking peptide <400> 36 Cys Asn Gly Arg Cys 1 5 <210> 37 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 (amino acids 74-98 of SEQ ID NO:10) <400> 37 Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala 1 5 10 15 Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu 20 25 <210> 38 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-mutant <400> 38 Thr Met Pro Phe Met Phe Cys Asn Ile Asn Asn Val Cys Asn Phe Ala 1 5 10 15 Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu 20 25 <210> 39 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T8 (amino acids 69-95 of SEQ ID NO:10; lysine has been substituted for the leucine residue at position 69 of the full-length Tumstatin molecule) <400> 39 Lys Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser 20 25 <210> 40 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T8-3 <400> 40 Lys Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Ser Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Val Ser Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser 20 25 <210> 41 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TP3 <400> 41 Lys Leu Phe Cys Asn Val Asn Cys Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn 1 5 10 15 Asp Tyr Ser <210> 42 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 <400> 42 Lys Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Asp Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Val Asp Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser 20 25 <210> 43 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Scrambled peptide SP1 <400> 43 Ala Asn Met Ser Arg Asn Val Phe Phe Asp Cys Thr Ser Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Gln Lys Phe Leu Asn Asp Thr Arg Asn Tyr 20 25 <210> 44 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Scrambled peptide SP2 <400> 44 Thr Phe Asn Cys Val Lys Asn Tyr Gln Arg Leu Asp Phe Thr Ser Arg 1 5 10 15 Phe Val Met Asp Ser Cys Ala Asn Phe Pro Asn 20 25 <210> 45 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <223> X at position 1 to 17 is any amino acid <223> X at position 2 is F or K <223> X at position 5 is C, S or D <223> X at position 9 is D or C <223> X at position 11 is C, S or D <223> X at position 14 is any amino acid <400> 45 1 5 10 15 Xaa Xaa Leu Phe Xaa Asn Val Asn Xaa Val Xaa Asn Phe Xaa 20 25 30 35 40 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 46 Thr Thr Met Pro 1 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 47 Phe Thr Thr Met Pro 1 5 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 48 Arg Phe Thr Thr Met Pro 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 49 Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 50 Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 51 Lys Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro 1 5 <210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 52 Ala Ser Arg Asn 1 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 53 Ala Ser Arg Asn Asp 1 5 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 54 Ala Ser Arg Asn Asp Tyr 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 55 Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 56 Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 57 Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Asp Tyr Trp 1 5 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic peptide <400> 58 Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu 1 5 10 Page 1

Claims

아래 화학식의 분리된 펩티드:

R¹X¹LFX²NVNX³VX⁴NFR²(SEQ ID NO: 45),

여기서, R¹은 수소 또는 1 내지 17개 아미노산의 펩티드 사슬이고, R²는 수소 또는 1 내지 12개 아미노산의 펩티드 사슬이고, X¹, X², X³은 개별적으로 아미노산이고, 상기 펩티드는 종양 성장을 저해한다.
제 1 항에 있어서, X¹은 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산 또는 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 2 항에 있어서, X¹은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민 또는 아스파라긴인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 2 항에 있어서, X¹은 리신 또는 페닐알라닌인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 1 항에 있어서, X², X³, X⁴는 독립적으로 친수성 측쇄를 보유하는 아미노산 또는 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 5 항에 있어서, X², X³, X⁴는 독립적으로 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴산 또는 글루타민인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 6 항에 있어서, X²와 X⁴는 독립적으로 시스테인, 세린 또는 아스파라긴산이고, X³은 시스테인 또는 아스파라긴산인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 1 항에 있어서, X¹은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민 또는 아스파라긴이고, X², X³, X⁴는 독립적으로 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴산 또는 글루타민인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 1 항에 있어서, R¹은 하나의 아미노산, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 잔기의 펩티드 사슬인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 9 항에 있어서, R¹로 대표되는 아미노산 또는 펩티드 사슬은 아래에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:

(a) P;

(b) MP;

(c) TMP;

(d) TTMP (SEQ ID NO: 46);

(e) FTTMP (SEQ ID NO: 47);

(f) RFTTMP (SEQ ID NO: 48);

(g) QRFTTMP (SEQ ID NO: 49);

(h) LQRFTTMP (SEQ ID NO: 50);

(i) KQRFTTMP (SEQ ID NO: 51);

(j) (a)-(i)중 한가지의 보존적 변이체.
제 1 항에 있어서, R²는 하나의 아미노산, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 아미노산 잔기의 펩티드 사슬인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 11 항에 있어서, R²로 대표되는 아미노산 또는 펩티드 사슬은 아래에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:

(a) A;

(b) AS;

(c) ASR;

(d) ASRN (SEQ ID NO: 52);

(e) ASRND (SEQ ID NO: 53);

(f) ASRNDY (SEQ ID NO: 54);

(g) ASRNDYS (SEQ IUD NO: 55);

(h) ASRNDYSY (SEQ ID NO: 56);

(i) ASRNDYSYW (SEQ ID NO: 57);

(j) ASRNDYSYWL (SEQ ID NO: 58);

(k) (a)-(j)중 한가지의 보존적 변이체.
제 1 항에 있어서, 환원된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 1 항에 있어서, 알킬화된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 1 항에 있어서, 산화된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
아래 화학식의 분리된 펩티드:

R¹X¹LFX²NVNX³VX⁴NFR²(SEQ ID NO: 45),

여기서, R¹은 수소 또는 1 내지 17개 아미노산의 펩티드 사슬이고, R²는 수소 또는 1 내지 12개 아미노산의 펩티드 사슬이고, X¹, X², X³은 개별적으로 아미노산이고, 상기 펩티드는 포유동물 조직에서 혈관혈성 활성을 저해한다.
제 16 항에 있어서, X¹은 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산 또는 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 17 항에 있어서, X¹은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민 또는 아스파라긴인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 18 항에 있어서, X¹은 리신 또는 페닐알라닌인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 16 항에 있어서, X², X³, X⁴는 독립적으로 친수성 측쇄를 보유하는 아미노산 또는 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 20 항에 있어서, X², X³, X⁴는 독립적으로 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴산 또는 글루타민인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 21 항에 있어서, X²와 X⁴는 독립적으로 시스테인, 세린 또는 아스파라긴산이고, X³은 시스테인 또는 아스파라긴산인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 16 항에 있어서, X¹은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민 또는 아스파라긴이고, X², X³, X⁴는 독립적으로 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴산 또는 글루타민인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 16 항에 있어서, R¹은 하나의 아미노산, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 잔기의 펩티드 사슬인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 24 항에 있어서, R¹로 대표되는 아미노산 또는 펩티드 사슬은 아래에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:

(a) P;

(b) MP;

(c) TMP;

(d) TTMP (SEQ ID NO: 46);

(e) FTTMP (SEQ ID NO: 47);

(f) RFTTMP (SEQ ID NO: 48);

(g) QRFTTMP (SEQ ID NO: 49);

(h) LQRFTTMP (SEQ ID NO: 50);

(i) KQRFTTMP (SEQ ID NO: 51);

(j) (a)-(i)중 한가지의 보존적 변이체.
제 16 항에 있어서, R²는 하나의 아미노산, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 아미노산 잔기의 펩티드 사슬인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 26 항에 있어서, R²로 대표되는 아미노산 또는 펩티드 사슬은 아래에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:

(a) A;

(b) AS;

(c) ASR;

(d) ASRN (SEQ ID NO: 52);

(e) ASRND (SEQ ID NO: 53);

(f) ASRNDY (SEQ ID NO: 54);

(g) ASRNDYS (SEQ IUD NO: 55);

(h) ASRNDYSY (SEQ ID NO: 56);

(i) ASRNDYSYW (SEQ ID NO: 57);

(j) ASRNDYSYWL (SEQ ID NO: 58);

(k) (a)-(j)중 한가지의 보존적 변이체.
제 16 항에 있어서, 환원된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 16 항에 있어서, 알킬화된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 16 항에 있어서, 산화된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
아래 화학식의 분리된 펩티드:

R¹X¹LFX²NVNX³VX⁴NFR²(SEQ ID NO: 45),

여기서, R¹은 수소 또는 1 내지 17개 아미노산의 펩티드 사슬이고, R²는 수소 또는 1 내지 12개 아미노산의 펩티드 사슬이고, X¹, X², X³은 개별적으로 아미노산이고, 상기 펩티드는 내피 세포에서 단백질 합성을 저해한다.
제 31 항에 있어서, X¹은 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산 또는 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 32 항에 있어서, X¹은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민 또는 아스파라긴인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 33 항에 있어서, X¹은 리신 또는 페닐알라닌인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 31 항에 있어서, X², X³, X⁴는 독립적으로 친수성 측쇄를 보유하는 아미노산 또는 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 35 항에 있어서, X², X³, X⁴는 독립적으로 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴산 또는 글루타민인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 36 항에 있어서, X²와 X⁴는 독립적으로 시스테인, 세린 또는 아스파라긴산이고, X³은 시스테인 또는 아스파라긴산인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 31 항에 있어서, X¹은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민 또는 아스파라긴이고, X², X³, X⁴는 독립적으로 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴산 또는 글루타민인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 31 항에 있어서, R¹은 하나의 아미노산, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 잔기의 펩티드 사슬인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 39 항에 있어서, R¹로 대표되는 아미노산 또는 펩티드 사슬은 아래에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:

(a) P;

(b) MP;

(c) TMP;

(d) TTMP (SEQ ID NO: 46);

(e) FTTMP (SEQ ID NO: 47);

(f) RFTTMP (SEQ ID NO: 48);

(g) QRFTTMP (SEQ ID NO: 49);

(h) LQRFTTMP (SEQ ID NO: 50);

(i) KQRFTTMP (SEQ ID NO: 51);

(j) (a)-(i)중 한가지의 보존적 변이체.
제 31 항에 있어서, R²는 하나의 아미노산, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 아미노산 잔기의 펩티드 사슬인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 41 항에 있어서, R²로 대표되는 아미노산 또는 펩티드 사슬은 아래에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드:

(a) A;

(b) AS;

(c) ASR;

(d) ASRN (SEQ ID NO: 52);

(e) ASRND (SEQ ID NO: 53);

(f) ASRNDY (SEQ ID NO: 54);

(g) ASRNDYS (SEQ IUD NO: 55);

(h) ASRNDYSY (SEQ ID NO: 56);

(i) ASRNDYSYW (SEQ ID NO: 57);

(j) ASRNDYSYWL (SEQ ID NO: 58);

(k) (a)-(j)중 한가지의 보존적 변이체.
제 31 항에 있어서, 환원된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 31 항에 있어서, 알킬화된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 31 항에 있어서, 산화된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
포유동물 조직에서 종양 성장을 저해하는 방법에 있어서, 제 1 항의 분리된 펩티드를 함유하는 조성물과 상기 조직을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
포유동물 조직에서 혈관형성 활성을 저해하는 방법에 있어서, 제 16 항의 분리된 펩티드를 함유하는 조성물과 상기 조직을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
하나이상의 포유동물 세포에서 단백질 합성을 저해하는 방법에 있어서, 제 31 항의 분리된 펩티드를 함유하는 조성물과 상기 하나이상의 세포를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 제약학적으로 수용가능한 담체와 결합되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 16 항에 있어서, 제약학적으로 수용가능한 담체와 결합되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제 31 항에 있어서, 제약학적으로 수용가능한 담체와 결합되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
종양 성장을 저해하는 능력을 보유하는 SEQ ID NO: 10의 분리된 단편.
제 52 항에 있어서, SEQ ID NO: 37인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 52 항에 있어서, 환원된 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 52 항에 있어서, 알킬화된 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 52 항에 있어서, 산화된 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
1개 내지 5개의 아미노산이 치환된 SEQ ID NO: 1O의 분리되고 돌연변이 단편에 있어서, 종양 성장을 저해하는 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 57 항에 있어서, 환원된 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 57 항에 있어서, 알킬화된 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 57 항에 있어서, 산화된 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 57 항에 있어서, SEQ ID NO: 38인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 57 항에 있어서, SEQ ID NO: 39인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 57 항에 있어서, SEQ ED NO: 40인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 57 항에 있어서, SEQ ED NO: 41인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 57 항에 있어서, SEQ ED NO: 42인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
혈관형성을 저해하는 능력을 보유하는 SEQ ID NO: 10의 분리된 단편.
제 66 항에 있어서, SEQ ID NO: 37인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 66 항에 있어서, 환원된 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 66 항에 있어서, 알킬화된 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 66 항에 있어서, 산화된 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
1개 내지 5개의 아미노산이 치환된 SEQ ID NO: 1O의 분리되고 돌연변이 단편에 있어서, 혈관형성 활성을 저해하는 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 71 항에 있어서, 환원된 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 71 항에 있어서, 알킬화된 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 71 항에 있어서, 산화된 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 71 항에 있어서, SEQ ID NO: 38인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 71 항에 있어서, SEQ ID NO: 39인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 71 항에 있어서, SEQ ED NO: 40인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 71 항에 있어서, SEQ ED NO: 41인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 71 항에 있어서, SEQ ED NO: 42인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
혈관형성을 저해하는 능력을 보유하는 SEQ ID NO: 10의 분리된 단편.
제 80 항에 있어서, SEQ ID NO: 37인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 80 항에 있어서, 환원된 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 80 항에 있어서, 알킬화된 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 80 항에 있어서, 산화된 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
1개 내지 5개의 아미노산이 치환된 SEQ ID NO: 1O의 분리되고 돌연변이 단편에 있어서, 혈관형성 활성을 저해하는 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 85 항에 있어서, 환원된 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 85 항에 있어서, 알킬화된 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 85 항에 있어서, 산화된 것을 특징으로 하는 분리된 돌연변이 단편.
제 85 항에 있어서, SEQ ID NO: 38인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 85 항에 있어서, SEQ ID NO: 39인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 85 항에 있어서, SEQ ED NO: 40인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 85 항에 있어서, SEQ ED NO: 41인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 85 항에 있어서, SEQ ED NO: 42인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
포유동물 조직에서 종양 성장을 저해하는 방법에 있어서, 아래에서 선택되는 분리된 단편을 함유하는 조성물과 상기 조직을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) SEQ ID NO: 1O;

(b) SEQ ID NO: 1O의 1-124 아미노산;

(c) SEQ ID NO: 20;

(d) SEQ ID NO: 21;

(e) SEQ ID NO: 22;

(f) SEQ ID NO: 23;

(g) SEQ ID NO: 25;

(h) SEQ ID NO: 26;

(i) SEQ ID NO: 29;

(j) SEQ ID NO: 30;

(k) SEQ ID NO: 33;

(l) SEQ ID NO: 34;

(m) SEQ ID NO: 37;

(n) SEQ ID NO: 38;

(o) SEQ 1D NO: 39;

(p) SEQ ID NO: 40;

(q) SEQ ID NO: 41;

(r) SEQ ID NO: 42.
제 94 항에 있어서, 단편은 환원되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 94 항에 있어서, 단편은 알킬화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 94 항에 있어서, 단편은 산화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 94 항에 있어서, 하나이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
포유동물 조직에서 혈관형성 활성을 저해하는 방법에 있어서, 아래에서 선택되는 분리된 단편을 함유하는 조성물과 상기 조직을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) SEQ ID NO: 1O;

(b) SEQ ID NO: 1O의 1-124 아미노산;

(c) SEQ ID NO: 20;

(d) SEQ ID NO: 21;

(e) SEQ ID NO: 22;

(f) SEQ ID NO: 23;

(g) SEQ ID NO: 25;

(h) SEQ ID NO: 26;

(i) SEQ ID NO: 29;

(j) SEQ ID NO: 30;

(k) SEQ ID NO: 33;

(l) SEQ ID NO: 34;

(m) SEQ ID NO: 37;

(n) SEQ ID NO: 38;

(o) SEQ 1D NO: 39;

(p) SEQ ID NO: 40;

(q) SEQ ID NO: 41;

(r) SEQ ID NO: 42.
하나이상의 포유동물 세포에서 단백질 합성을 저해하는 방법에 있어서, 아래에서 선택되는 분리된 단편을 함유하는 조성물과 상기 하나이상의 세포를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) SEQ ID NO: 1O;

(b) SEQ ID NO: 1O의 1-124 아미노산;

(c) SEQ ID NO: 20;

(d) SEQ ID NO: 21;

(e) SEQ ID NO: 22;

(f) SEQ ID NO: 23;

(g) SEQ ID NO: 25;

(h) SEQ ID NO: 26;

(i) SEQ ID NO: 29;

(j) SEQ ID NO: 30;

(k) SEQ ID NO: 33;

(l) SEQ ID NO: 34;

(m) SEQ ID NO: 37;

(n) SEQ ID NO: 38;

(o) SEQ 1D NO: 39;

(p) SEQ ID NO: 40;

(q) SEQ ID NO: 41;

(r) SEQ ID NO: 42.
하나이상의 포유동물 세포에서 단백질 합성을 저해하는 방법에 있어서, 아래에서 선택되는 분리된 단편을 함유하는 조성물과 상기 하나이상의 세포를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) SEQ ID NO: 2;

(b) SEQ ID NO: 6;

(c) SEQ ID NO: 10.
제 80 항에 있어서, 단백질 합성은 캡(cap)-의존성 단백질 합성인 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 100 항에 있어서, 단백질 합성은 캡(cap)-의존성 단백질 합성인 것을 특징으로 하는 방법.
제 101 항에 있어서, 단백질 합성은 캡(cap)-의존성 단백질 합성인 것을 특징으로 하는 방법.
제 80 항에 있어서, 내피 세포는 α_vβ₃인테그린을 발현하는 것을 특징으로 하는 분리된 단편.
제 100 항에 있어서, 내피 세포는 α_vβ₃인테그린을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 101 항에 있어서, 내피 세포는 α_vβ₃인테그린을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.