CN1420926A - 抗生血管蛋白和片段及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有抗生血管功能的蛋白质及其片段，和使用这些蛋白质和片段抑制或促进血管生成的用途。

Description

抗生血管蛋白和片段及其应用方法
相关申请
本发明是2000年7月21日申请的U.S.S.N.09/625 191、2000年4月4日申请的U.S.S.N.09/543 371、2000年1月7日申请的U.S.S.N.09/479 118的部分连续申请。U.S.S.N.09/625 191又是U.S.S.N.09/543371的部分连续申请，其中U.S.S.N.09/479 118是1999年6月17日申请的U.S.S.N.09/335 224的部分连续申请，其又要求了1998年6月17日申请的美国临时申请60/089 689和1999年3月25日申请的美国临时申请60/126 175的优先权。所有这些申请的全部内容在这里引作参考。政府支持
本发明全部或部分受到美国卫生部(National Institutes of Health)DK-51711和DK55001项目的支持。国家在本发明中享有一定权利。
背景技术
基膜是特定胞外基质的薄层，其提供了上皮细胞和内皮细胞在其上生长的支持结构，从而包围肌肉或脂肪(Paulsson，M.，1992，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.27：93-127)。基质总是和细胞相关，并且文献也大量报道过，基质不仅提供了机械支持而且还影响细胞行为，例如分化和增殖。血管基质由胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、纤粘连蛋白和巢蛋白这样的大分子组成(Timpl，R 996，Curr.Opin.Cell.Biol.8：618-24)。从功能上说，胶原促进细胞粘着、迁移、分化和生长(Paulsson，M.，1992，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.27：93-127)，并且通过这些功能推测在内皮细胞增殖和血管生成期间起着重要的作用，血管生成期是从已有的血管生成新血管的过程(Madri，J.A.等，1986，J.Histoclzem.Cytochem.34：85-91；Folkman，J.，1972，Ann.Surg.175：409-16)。
血管生成是一个复杂的过程，需要内皮细胞萌发、迁移和增殖，以及它们分化成管样结构并且产生包围发育的血管的基膜基质。另外，血管生成是一个对于正常生理作用(例如伤口修复和子宫内膜改造)来说是决定性的过程(Folkman，J.等，1995，J；Biol.Chem.771.267：10931-34)。现在文献大量报道超过数立方毫米大小的实体肿瘤的转移和生长需要血管生成(Folkman，J.，1972，Ann.Surg.175：409-16；Folkman，J.，1995，Nat.Med.：27-31)。肿瘤质的扩展不仅在于血液充满肿瘤，而且还在于新内皮毛细血管产生的几种生长因子和基质蛋白对肿瘤细胞的分泌刺激(Folkman，J.，1995，Nat.Med.1：27-31)。最近，鉴定出了很多种血管生成抑制剂，称为制管张素(O′Reilly，M.S.等，1994，Cell 79：315-28)、内静素(内静素)(O′Reilly，M.S.等，1997，Cell88：277-85)、抑制素(restin)(Ramchandran，R.等，1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.255：735-9)和色素上皮组织衍生因子(PEDF)(Dawson，D.W.等，1999，Science 285：245-8)。
IV型胶原表达为六种截然不同的α-链：α1至α6(Prockop，D.J.等，1995，Annu.Rev.Biochem.64：403-34)，并且装配成三链螺旋。其进一步形成给基膜中的其它大分子提供支架的网络。这些α-链由三个结构域组成：N-末端7S结构域、中间三链螺旋结构域和C-末端球形非胶原(NC1)结构域(Timpl，R.等，1981，Eur.J.Biochem.120：203-211)。几项研究表明胶原代谢的抑制剂具有抗血管生成功能，支持基膜胶原合成和贮存对血管生成和存活很重要的观点(Maragoudakis，M..等，1994，Kidney Int.43：147-50；Haralabopoulos，G.C.等，1994，Lab.Invest.71：575-82)。但是，仍然没有完全明白基膜组织和血管生成中胶原的准确作用。
整联蛋白是重要的细胞表面粘着受体家族，其作为很多化合物的粘着分子而发挥功能。它们涉及细胞-细胞或者细胞-胞外基质相互作用，并且两者都介导细胞与胞外基质的相互作用，从而引起细胞与其结合。整联蛋白是αβ异二聚体，由两个非共价结合的跨膜糖蛋白亚基组成——α亚基和β亚基。所有的α亚基都表现出彼此之间有同源性，所有的β亚基也是如此。现在鉴定了16种α亚基(α1至α9、αD、αL、αM、αV、αX、αIIb和αIELb)和8种β亚基(β1至β8)，它们形成22种不同的组合(β1和α1至α9；β1和αV；β2和αD、αL、αM和αX；β3和αV和αX；β4和α6；β5和αV；β6和αV；β7和α4和αIELb；β8和αV)。通过一些整联蛋白亚基mRNA的交替剪接可以进一步扩大可获得的整联蛋白亚基库。
当细胞表面上某一个特定点的整联蛋白浓度高于某一最小阈值时，整联蛋白通常就会与它们的配体结合，形成病灶或者半桥粒。低结合亲和性和病灶形成的组合使得整联蛋白依据其分子浓度或弱或强地结合。
发明内容
本发明涉及抗血管生成蛋白质和它们的生物活性片段。这里描述的片段证明抗血管生成蛋白质可以再分为具有不连续活性的区域，例如抗血管生成和抗肿瘤细胞活性，这些不连续活性只有在更大蛋白质分子细分时才显现。在IV型胶原的α3(IV)NC1结构域情况下，这些活性区域也处于古德帕斯彻(Goodpasture)表位之外。
特别地，本发明涉及抗血管生成的分离的α3(IV)NC1结构域的非古德帕斯彻片段，其具有下面特征中的一项或多项：(a)结合αVβ3整联蛋白的能力；(b)抑制内皮细胞增殖的能力；和(c)引起内皮细胞程序性死亡的能力。这种分离的非古德帕斯彻片段通过这里描述的不依赖于RGD的机理结合αvβ3整联蛋白。这里描述这样一种分离的IV型胶原的α3(IV)NC1结构域片段，并且指定为塔牡斯达丁(Tumstatin)。这里使用的术语“塔牡斯达丁”包括SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：19。另外，另一种分离的非古德帕斯彻片段，这里指定为Tum-1或者塔牡斯达丁N53(SEQ ID NO：22)，由全长塔牡斯达丁(SEQ ID NO：10)的氨基酸残基54至244的氨基酸序列组成。这里公开的其它分离的片段包括Tum-2(SEQ ID NO：23)、Tum-3(SEQID NO：24)、Tum-4(SEQ ID NO：25)和Tum-5(SEQ ID NO：26)，它们分别由全长塔牡斯达丁(SEQ ID NO：10)的残基1至132(Tum-2)、残基133至244(Tum-3)、残基181至244(Tum-4)和残基54至132(Tum-5)的氨基酸序列组成。这里也公开了肽片段，包括T1(SEQID NO：27)、T2(SEQ ID NO：28)、T3(SEQ ID NO：29)、T4(SEQID NO：30)、T5(SEQ ID NO：31)和T6(SEQ ID NO：32)，它们分别由全长塔牡斯达丁(SEQ ID NO：10)的残基1至20(T1)、54至73(T2)、69至88(T3)、84至103(T4)、99至117(T5)和114至132(T6)的氨基酸残基组成。还有另一种全长塔牡斯达丁的肽片段是这里指定的塔牡斯达丁-45-132(SEQ ID NO：33)，由全长塔牡斯达丁(SEQ ID NO：10)的氨基酸残基45至132组成。全长塔牡斯达丁的另一种片段指定为Tum-5-126-C-A(SEQ ID NO：34)，由塔牡斯达丁-45-132组成，其中(全长塔牡斯达丁)126位的半胱氨酸定点诱变为丙氨酸。
被还原(例如碱还原)的塔牡斯达丁的片段这里也描述为具有抗血管生成功能。两种其它片段是“塔牡斯达丁333”(SEQ ID NO：20)和“塔牡斯达丁334”(SEQ ID NO：21)，由塔牡斯达丁全长(SEQ IDNO：10)的残基2至125(塔牡斯达丁333)和残基2至245组成。
本发明的特征还在于抗肿瘤细胞，分离的α3(IV)NC1结构域的非古德帕斯彻片段，其具有下面特征的一项或多项：(a)结合αvβ3整联蛋白的能力；(b)结合内皮细胞的能力；(c)抑制肿瘤细胞增殖的能力，和(d)不能抑制内皮细胞的增殖。分离的非古德帕斯彻片段通过不依赖于RGD的机理能够结合αvβ3整联蛋白，这一点如这里所述。一种分离的非古德帕斯彻片段包括全长塔牡斯达丁(SEQ ID NO：10)的氨基酸残基185至203的氨基酸序列。全长塔牡斯达丁的另一种肽片段这里指定为T3，由全长塔牡斯达丁(SEQ IDNO：10)的氨基酸残基69至88组成。还有全长塔牡斯达丁的另一种肽片段这里指定为塔牡斯达丁-45-132，由全长塔牡斯达丁(SEQIDNO：10)的氨基酸残基45至132组成。全长塔牡斯达丁的另一种片段这里指定为Tum-5-126-C-A(SEQ ID NO：34)，由塔牡斯达丁-45-132组成(SEQ ID NO：33)，其中(全长塔牡斯达丁)126位的半胱氨酸定点诱变为丙氨酸。被还原(例如碱还原)的塔牡斯达丁的片段这里也描述为具有抗血管生成功能。
本发明还涉及受体、结合蛋白，例如与抗血管生成蛋白和肽相互作用(例如结合)的蛋白质，从而提供评价抗血管生成蛋白、肽和化合物的靶物。这些受体和它们的亚基介导血管生成、肿瘤生长和转移、内皮细胞增殖和迁移、内皮细胞管生成。这些受体也介导细胞程序性死亡。
特别地，本发明涉及整联蛋白亚基α1、α2、α3、αV、β1和β3，已经发现它们结合安瑞斯丁(安瑞斯丁)(安瑞斯丁是IV型胶原的NC1结构域的α1链、整联蛋白亚基α1、α2和β1)，已经发现它们结合卡斯达丁(Canstatin)(卡斯达丁是IV型胶原的NC1结构域的α2链、整联蛋白亚基α5、α6、αV、β1和β3)，已经发现它们结合塔牡斯达丁(Tumstatin)(塔牡斯达丁是IV型胶原的NC1结构域的α3链)。整联蛋白结合介导的血管生成和内皮细胞增殖可以通过施用安瑞斯丁、卡斯达丁或者塔牡斯达丁，或者施用作为安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁的受体而与上述整联蛋白亚基结合的其他蛋白质、肽或化合物而抑制。整联蛋白结合介导的内皮细胞程序性死亡也可以通过施用安瑞斯丁、卡斯达丁或者塔牡斯达丁、或者施用作为安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁的受体而与上述整联蛋白亚基结合的其他蛋白质、肽或化合物而抑制。这样的化合物可以包括安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的抗体、片段或者部分，或者包括与上述整联蛋白亚基结合的安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的这些区域的蛋白质或肽。
本发明还涉及通过施用模拟整联蛋白亚基作为安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的受体的蛋白质、肽或化合物而增强、促进或者诱导血管生成和细胞增殖的方法。这样的蛋白质、肽或化合物包括由选择的亚基组成的用来与可获得的安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁相互作用(例如结合)的整联蛋白、生物活性(例如抗血管生成)片段、突变体、类似物、同系物及其衍生物，还有其多聚体(例如二聚体)和融合蛋白(这里也称为嵌合蛋白)。这样的蛋白质、肽或化合物也包括硫酸乙酰肝素蛋白多糖，其每个细胞结合安瑞斯丁的Kd1值是8.5×10-11M并且其Bmax1是3×106位点。如这里所指的，“可获得的”指能够与整联蛋白或者其亚基或片段接触或者相互作用(例如结合)的可溶的或者循环的蛋白质。通过施用抗安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁、或其生物活性(例如抗血管生成)片段、突变体、类似物、同系物及其衍生物、多聚体(例如二聚体)和融合蛋白的抗体也可以增强血管生成和细胞增殖。这样的抗体结合这些分子，从而防止它们与它们各自的整联蛋白受体相互作用并且抑制血管生成活性。
本发明还包括用于鉴定以类似于安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁及其抗血管生成变体和片段的方式来抑制血管生成的蛋白质、肽和化合物的试剂盒。这样的试剂盒包括合适的整联蛋白的亚基(例如α1、α2、β3等)和进行下面的实施例中描述的测试之一所需要的这样的其它成分。使用试剂盒进行的特别测试包括下面的实施例12和28中描述的细胞粘着测试和下面的实施例26中描述的竞争增殖测试。
本发明还涉及抑制组织(例如哺乳动物或人组织)中血管生成、肿瘤生长或者肿瘤转移的方法，其中组织接触IV型胶原的NC1结构域的一个或多个α链(例如α1至α6)，并且其中血管生成、肿瘤生长或者肿瘤转移是一种或多种整联蛋白或者整联蛋白亚基介导的。
更具体地说，本发明特征在于抑制组织中血管生成的方法，其中血管生成是由一种或多种内皮细胞整联蛋白(例如α1β1，α2β1，α3β1，αVβ3)或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基(例如α1，α2，α3，αV，β1，β3)介导的。该方法包括内皮细胞接触安瑞斯丁或者其片段、突变体、同系物、类似物或者等位变体。通过抑制下面的一项或多项能够抑制血管生成：内皮细胞增殖、内皮细胞迁移或者内皮细胞管生成。
本发明特征还在于抑制组织中肿瘤生长或转移的方法，其中肿瘤生长或转移是由一种或多种内皮细胞整联蛋白(例如α1β1、α2β1、α3β1、αVβ3)或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基(例如α1、α2、α3、αV、β1、β3)介导的。该方法包括内皮细胞接触安瑞斯丁或者其片段、突变体、同系物、类似物或者等位变体。通过抑制下面的一项或多项能够抑制肿瘤生长：内皮细胞增殖、内皮细胞迁移或者内皮细胞管生成。
另外，本发明特征在于促进或诱导组织中内皮细胞程序性死亡的方法，其中内皮细胞程序性死亡是由一种或多种内皮细胞整联蛋白(例如α1β1、α2β1、α3β1、αVβ3)或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基(例如α1、α2、α3、αV、β1、β3)介导的。该方法包括内皮细胞接触安瑞斯丁或者其片段、突变体、同系物、类似物或者等位变体。通过抑制下面的一项或多项能够促进或诱导程序性细胞死亡：内皮细胞增殖、内皮细胞迁移或者内皮细胞管生成。
本发明特征在于抑制组织中血管生成的方法，其中血管生成是由一种或多种内皮细胞整联蛋白(例如α1β1、α2β1)或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基(例如α1、α2、β1)介导的。该方法包括内皮细胞接触卡斯达丁或者其片段、突变体、同系物、类似物或者等位变体。通过抑制下面的一项或多项能够抑制血管生成：内皮细胞增殖、内皮细胞迁移或者内皮细胞管生成。
本发明特征还在于抑制组织中肿瘤生长或转移的方法，其中肿瘤生长或转移是由一种或多种内皮细胞整联蛋白(例如α1β1、α2β1)或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基(例如α1、α2、β1)介导的。该方法包括内皮细胞接触卡斯达丁或者其片段、突变体、同系物、类似物或者等位变体。通过抑制下面的一项或多项能够抑制肿瘤生长：内皮细胞增殖、内皮细胞迁移或者内皮细胞管生成。
另外，本发明特征在于促进或诱导组织中内皮细胞程序性死亡的方法，其中内皮细胞程序性死亡是由一种或多种内皮细胞整联蛋白(例如α1β1、α2β1)或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基(例如α1、α2、β1)介导的。该方法包括内皮细胞接触卡斯达丁或者其片段、突变体、同系物、类似物或者等位变体。通过抑制下面的一项或多项能够促进或诱导程序性细胞死亡：内皮细胞增殖、内皮细胞迁移或者内皮细胞管生成。
本发明特征在于抑制组织中血管生成的方法，其中血管生成是由一种或多种内皮细胞整联蛋白(例如α5β3、α6β1、αVβ3)或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基(例如α5、α6、αV、β1、β3)介导的。该方法包括内皮细胞接触塔牡斯达丁或者其片段、突变体、同系物、类似物或者等位变体。通过抑制下面的一项或多项能够抑制血管生成：内皮细胞增殖、内皮细胞迁移或者内皮细胞管生成。
本发明特征还在于抑制组织中肿瘤生长或转移的方法，其中肿瘤生长或转移是由一种或多种内皮细胞整联蛋白(例如α5β3、α6β1，αVβ3)或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基(例如α5、α6、αV、β1、β3)介导的。该方法包括内皮细胞接触塔牡斯达丁或者其片段、突变体、同系物、类似物或者等位变体。通过抑制下面的一项或多项能够抑制肿瘤生长：内皮细胞增殖、内皮细胞迁移或者内皮细胞管生成。
另外，本发明特征在于促进或诱导组织中内皮细胞程序性死亡的方法，其中内皮细胞程序性死亡是由一种或多种内皮细胞整联蛋白(例如α5β3、α6β1、αVβ3)或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基(例如α5、α6、αV、β1、β3)介导的。该方法包括内皮细胞接触塔牡斯达丁或者其片段、突变体、同系物、类似物或者等位变体。通过抑制下面的一项或多项能够促进或诱导程序性细胞死亡：内皮细胞增殖、内皮细胞迁移或者内皮细胞管生成。
本发明进一步特征在于抑制组织中血管生成或细胞增殖的方法，包括以下面的一种或多种方式与组织接触：与整联蛋白的α1亚基特异性结合的抗体或肽、与整联蛋白的α2亚基特异性结合的抗体或肽、与整联蛋白的α3亚基特异性结合的抗体或肽、与整联蛋白的α5亚基特异性结合的抗体或肽、与整联蛋白的α6亚基特异性结合的抗体或肽、与整联蛋白的αV亚基特异性结合的抗体或肽、与整联蛋白的β1亚基特异性结合的抗体或肽、或者与整联蛋白的β3亚基特异性结合的抗体或肽。该方法可以用来治疗特征在于血管生成或细胞增殖的疾病。
另外，本发明特征在于促进或者诱导组织中血管生成或细胞增殖的方法，包括组织接触下面的一种或多种：整联蛋白的α1亚基、整联蛋白的α2亚基、整联蛋白的α3亚基、整联蛋白的α5亚基、整联蛋白的α6亚基、整联蛋白的αV亚基、整联蛋白的β1亚基、或者整联蛋白的β3亚基。整联蛋白的亚基的一种或多种可以是可溶形式，它们也可以是单体、二聚体、三聚体、四聚体或者多聚体。
本发明特征还在于抑制脊椎动物增殖疾病的方法，其中所述疾病特征在于安瑞斯丁的受体(例如α1β1整联蛋白、α2β1整联蛋白、α3β1整联蛋白、αVβ3整联蛋白)介导的血管生成；该方法包括抑制安瑞斯丁受体介导的血管生成，从而抑制增殖疾病。安瑞斯丁受体介导的血管生成的抑制能够导致肿瘤生长和转移的抑制或者已发生肿瘤的退化。通过增殖细胞接触抑制安瑞斯丁受体介导的血管生成的分子能够实现对安瑞斯丁受体介导的血管生成的抑制作用，所述分子是例如特异性结合安瑞斯丁受体的抗体(例如多克隆抗体或单克隆抗体)、抗体片段或者肽。
另外，本发明特征在于促进组织中血管生成的方法，包括与组织接触含有能够结合安瑞斯丁的一种或多种可溶性受体的组合物。
另一方面，本发明特征在于抑制脊椎动物增殖疾病的方法，其中所述疾病特征在于卡斯达丁的受体(例如α1β1整联蛋白、α2β1整联蛋白)介导的血管生成；该方法包括抑制卡斯达丁受体介导的血管生成，从而抑制增殖疾病。卡斯达丁受体介导的血管生成的抑制能够导致肿瘤生长和转移的抑制或者已发生肿瘤的退化。通过增殖细胞接触抑制卡斯达丁受体介导的血管生成的分子能够实现对卡斯达丁受体介导的血管生成的抑制作用，所述分子是例如特异性结合卡斯达丁受体的抗体(例如多克隆抗体或单克隆抗体)、抗体片段或者肽。
另外，本发明特征在于促进组织中血管生成的方法，包括所述组织接触含有能够结合卡斯达丁的一种或多种可溶性受体的组合物。
另一方面，本发明特征在于抑制脊椎动物增殖疾病的方法，其中所述疾病特征在于塔牡斯达丁的受体(例如α5β1整联蛋白、α6β1整联蛋白、αVβ3整联蛋白)介导的血管生成；该方法包括抑制塔牡斯达丁受体介导的血管生成，从而抑制增殖疾病。塔牡斯达丁受体介导的血管生成的抑制能够导致肿瘤生长和转移的抑制或者已发生肿瘤的退化。通过增殖细胞接触抑制塔牡斯达丁受体介导的血管生成的分子能够实现对塔牡斯达丁受体介导的血管生成的抑制作用，所述分子是例如特异性结合塔牡斯达丁受体的抗体(例如多克隆抗体或单克隆抗体)、抗体片段或者肽。
另外，本发明特征在于促进组织中血管生成的方法，包括所述组织接触含有能够结合塔牡斯达丁的一种或多种可溶性受体的组合物。
另一方面，本发明特征在于抑制组织中血管生成的方法，包括与组织接触降低组织中FLIP水平的分子。
本发明特征还在于含有作为生物活性成分的一种或多种特异性结合一种或多种安瑞斯丁受体或者安瑞斯丁受体亚基(例如α1β1整联蛋白、α2β1整联蛋白、α3β1整联蛋白、αVβ3整联蛋白、α1整联蛋白亚基、α2整联蛋白亚基、α3整联蛋白亚基、αV整联蛋白亚基、β1整联蛋白亚基、β3整联蛋白亚基)的分子(例如抗体、抗体片段、肽)的组合物。该组合物可以任选地含有药学可接受载体。所述组合物可以用于抑制特征在于血管生成的疾病的方法中，其中所述方法包括对患者施用所述组合物。所述疾病可以以血管生成活性为特征，并且所述组合物可以与放射治疗、化学治疗或免疫治疗结合对患者施用。
另一方面，本发明特征在于含有作为生物活性成分的一种或多种安瑞斯丁受体或者安瑞斯丁受体亚基(例如α1β1整联蛋白、α2β1整联蛋白、α3β1整联蛋白、αVβ3整联蛋白、α1整联蛋白亚基、α2整联蛋白亚基、α3整联蛋白亚基、αV整联蛋白亚基、β1整联蛋白亚基、β3整联蛋白亚基)的组合物。该组合物可以任选地含有药学可接受载体。所述组合物可以用于促进或诱导血管生成的方法，其中所述方法包括对患者施用所述组合物。所述疾病可以以血管生成活性为特征，并且所述组合物可以与放射治疗、化学治疗或免疫治疗结合对患者施用。
本发明特征还在于含有作为生物活性成分的一种或多种特异性结合一种或多种卡斯达丁受体或者卡斯达丁受体亚基(例如α1β1整联蛋白、α2β1整联蛋白、α1整联蛋白亚基、α2整联蛋白亚基、β1整联蛋白亚基)的分子(例如抗体、抗体片段、肽)的组合物。该组合物可以任选地含有药学可接受载体。所述组合物可以用于抑制特征在于血管生成活性的疾病的方法中，其中所述方法包括对患者施用所述组合物。所述疾病可以以血管生成活性为特征，并且所述组合物可以与放射治疗、化学治疗或免疫治疗结合对患者施用。
另一方面，本发明特征在于含有作为生物活性成分的一种或多种卡斯达丁受体或者卡斯达丁受体亚基(例如α1β1整联蛋白、α2β1整联蛋白、α1整联蛋白亚基、α2整联蛋白亚基、β1整联蛋白亚基)的组合物。该组合物可以任选地含有药学可接受载体。所述组合物可以用于促进或诱导血管生成的方法，其中所述方法包括对患者施用所述组合物。所述疾病可以以血管生成为特征，并且所述组合物可以与放射治疗、化学治疗或免疫治疗结合对患者施用。
本发明特征还在于含有作为生物活性成分的一种或多种特异性结合一种或多种塔牡斯达丁受体或者塔牡斯达丁受体亚基(例如α5β1整联蛋白、α6β1整联蛋白、αVβ3整联蛋白、α5整联蛋白亚基、α6整联蛋白亚基、αV整联蛋白亚基、β1整联蛋白亚基、β3整联蛋白亚基)的分子(例如抗体、抗体片段、肽)的组合物。该组合物可以任选地含有药学可接受载体。所述组合物可以用于抑制特征在于血管生成活性的疾病的方法中，其中所述方法包括对患者施用所述组合物。所述疾病可以以血管生成活性为特征，并且所述组合物可以与放射治疗、化学治疗或免疫治疗结合对患者施用。
另一方面，本发明特征在于含有作为生物活性成分的一种或多种塔牡斯达丁受体或者塔牡斯达丁受体亚基(例如α5β1整联蛋白、α6β1整联蛋白、αVβ3整联蛋白、α5整联蛋白亚基、α6整联蛋白亚基、αV整联蛋白亚基、β1整联蛋白亚基、β3整联蛋白亚基)的组合物。该组合物可以任选地含有药学可接受载体。所述组合物可以用于促进或诱导血管生成的方法，其中所述方法包括对患者施用所述组合物。所述疾病可以以血管生成活性为特征，并且所述组合物可以与放射治疗、化学治疗或免疫治疗结合对患者施用。
另一方面，本发明特征在于一种测定细胞(例如癌细胞)是否易受安瑞斯丁活性的影响的方法，包括下面的步骤：(a)提供含有该细胞的样品(例如来自哺乳动物)，(b)使样品与一种或多种抗体(例如α1β1整联蛋白、α2β1整联蛋白、α3β1整联蛋白、αVβ3整联蛋白、α1整联蛋白亚基、α2整联蛋白亚基、α3整联蛋白亚基、αV整联蛋白亚基、β1整联蛋白亚基、β3整联蛋白亚基抗体)反应足够时间并且处于适合这一种或多种抗体与细胞结合的条件下；如果细胞对安瑞斯丁的作用敏感，则可形成细胞-抗体复合物；然后是(c)检测细胞-抗体复合物的存在；这样样品中细胞-抗体复合物的存在是细胞易受安瑞斯丁活性影响的指征。所述哺乳动物可以患有至少部分特征在于不期望的血管生成的疾病。
另一方面，本发明特征在于一种测定细胞(例如癌细胞)是否易受卡斯达丁活性的影响的方法，包括下面的步骤：(a)提供含有该细胞的样品(例如来自哺乳动物)，(b)使样品与一种或多种抗体(例如抗α1β1整联蛋白、α2β1整联蛋白、α1整联蛋白亚基、α2整联蛋白亚基、β1整联蛋白亚基抗体)反应足够时间并且处于适合这一种或多种抗体与细胞结合的条件下；如果细胞对卡斯达丁的作用敏感则在哪里形成细胞-抗体复合物；然后是(c)检测细胞-抗体复合物的存在；这样样品中细胞-抗体复合物的存在是细胞易受卡斯达丁活性的影响的指征。所述哺乳动物可以患有至少部分特征在于不期望的血管生成的疾病。
另一方面，本发明特征在于一种测定细胞(例如癌细胞)是否易受塔牡斯达丁活性的影响的方法，包括下面的步骤：(a)提供含有该细胞的样品(例如来自哺乳动物)，(b)使样品与一种或多种抗体(例如抗α5β1整联蛋白、α6β1整联蛋白、αVβ3整联蛋白、α1整联蛋白亚基、α5整联蛋白亚基、α6整联蛋白亚基、αV整联蛋白亚基、β1整联蛋白亚基、β3整联蛋白亚基抗体)反应足够时间并且处于适合这一种或多种抗体与细胞结合的条件下；如果细胞对塔牡斯达丁的作用敏感，则可形成细胞-抗体复合物；然后是(c)检测细胞-抗体复合物的存在；这样样品中细胞-抗体复合物的存在是细胞易受塔牡斯达丁活性的影响的指征。所述哺乳动物可以患有至少部分特征在于不期望的血管生成的疾病。
本发明还涉及具有抗血管生成功能的包括IV型胶原的α链的NC1结构域的蛋白质。特别地，本发明涉及新的蛋白质安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁，并且涉及生物活性(例如抗血管生成)片段、其突变体、类似物、同系物和衍生物、以及多聚体(例如二聚体)和融合蛋白(这里也称作嵌合蛋白)。这些蛋白质全部包括IV型胶原的NC1(非胶原性1)结构域的C-末端片段。更具体地，安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁各自分别是IV型胶原的α1链、α2链和α3链的NC1结构域的C-末端片段。特别地，安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁是单体蛋白质。这三种蛋白质都体内抑制肿瘤生长，并且在几种体外模型中(包括内皮管测试)也抑制毛细管的形成。
本发明包括在这些细胞中作为内皮细胞中安瑞斯丁的受体，介导抗血管生成活性，包括内皮细胞程序性死亡的整联蛋白或整联蛋白亚基(例如α1β1，α1β2，α2β1整联蛋白)。安瑞斯丁也特异性结合和抑制基质金属蛋白酶2、3和9的基膜降解活性；这样的降解活性是血管生成的整体部分。
本发明还包括分离的和重组产生的安瑞斯丁，其包括具有抗血管生成活性的IV型胶原α1链的NC1结构域、分离的安瑞斯丁的抗血管生成片段、分离的安瑞斯丁的多聚体和抗血管生成片段和编码这些抗血管生成蛋白质的多核苷酸。也包括含有分离的安瑞斯丁、其抗血管生成片段或者这两者作为生物活性成分的组合物。在另一个实施方案中，本发明特征在于治疗例如哺乳动物癌癌症的增殖性疾病的方法，其中所述疾病特征在于生血管活性，所述方法包括对哺乳动物施用含有抗血管生成安瑞斯丁或者其片段的组合物。抗血管生成的安瑞斯丁及其片段也可以用来防止细胞迁移或内皮细胞增殖。另一个特征是分离的抗血管生成的安瑞斯丁及其片段的抗体。
本发明还包括在这些细胞中作为内皮细胞中卡斯达丁的受体，介导抗血管生成活性，包括内皮细胞程序性死亡的整联蛋白或整联蛋白亚基(例如α1β1和α1β2整联蛋白)。
本发明还包括分离的和重组产生的卡斯达丁，其包括具有抗血管生成活性的IV型胶原α2链的NC1结构域、分离的卡斯达丁的抗血管生成片段、分离的卡斯达丁的多聚体和抗血管生成片段和编码这些抗血管生成蛋白质的多核苷酸。也包括含有分离的卡斯达丁、其抗血管生成片段、或者这两者作为生物活性成分的组合物。在另一个实施方案中，本发明特征在于治疗例如哺乳动物癌癌症的增殖性疾病的方法，其中所述疾病特征在于生血管活性，所述方法包括对哺乳动物施用含有抗血管生成卡斯达丁或者其片段的组合物。抗血管生成卡斯达丁及其片段也可以用来防止细胞迁移或内皮细胞增殖。另一个特征是分离的抗血管生成的卡斯达丁及其片段的抗体。
本发明还包括在这些细胞中作为内皮细胞中塔牡斯达丁的受体，介导抗血管生成活性，包括内皮细胞程序性死亡的整联蛋白或整联蛋白亚基(例如α5β1，α6β1和αVβ3整联蛋白)。
本发明还包括分离的和重组产生的塔牡斯达丁，其包括具有抗血管生成活性的IV型胶原α3链的NC1结构域、分离的塔牡斯达丁的抗血管生成片段、分离的塔牡斯达丁的多聚体和抗血管生成片段和编码这些抗血管生成蛋白质的多核苷酸。也包括含有分离的塔牡斯达丁、其抗血管生成片段或者这两者作为生物活性成分的组合物。在另一个实施方案中，本发明特征在于治疗例如哺乳动物癌症的增殖性疾病的方法，其中所述疾病特征在于生血管活性，所述方法包括对哺乳动物施用含有抗血管生成的塔牡斯达丁或者其片段的组合物。抗血管生成的塔牡斯达丁及其片段也可以用来防止细胞迁移或内皮细胞增殖。另一个特征是分离的抗血管生成的塔牡斯达丁及其片段的抗体。
附图说明
图1A和1B是描述人IV型胶原的α1链的核苷酸(图1A，SEQ IDNO：1)和氨基酸(图1B，SEQ ID NO：2)序列的图。双下划线指明pET22b(+)正向(SEQ ID.NO：3)和反向(SEQ ID NO：4)引物的位置，单下划线指明pPICZαA正向(SEQ ID NO：15)和反向(SEQID NO：16)引物的位置。
图2是描述安瑞斯丁克隆载体pET22b(+)的示意图。指明其中克隆安瑞斯丁的正向(SEQ ID NO：3)和反向(SEQ ID NO：4)引物和位点。
图3A和3B是说明安瑞斯丁(图3A，0μg/ml至10μg/ml，x-轴)和内静素(图3B，0μg/ml至10μg/ml，x-轴)对3H-胸苷掺入(y-轴)作为内皮细胞(C-PAE)增殖的指示剂的作用的一对线形图。
图4A、4B、4C和4D一组四个条形图，说明安瑞斯丁和内静素对3H-胸苷掺入(y-轴)作为内皮细胞增殖的指示剂的作用。图4A、4B和4C说明安瑞斯丁(0μg/ml-50μg/ml(图4A和4B)和0μg/ml-10μg/ml(Fig.4C))分别对786-O，PC-3，HPEC细胞的作用。图4D说明0.1-10μg/ml内静素对A-498细胞的作用。
图5A、5B和5C是一组四个显微照片，说明安瑞斯丁(2μg/ml，图5B)和内静素(20μg/ml，图5C)通过FBS诱导的趋化性对人脐带内皮细胞(ECV-304)迁移的作用。图5A说明没有处理的细胞。
图6是说明图5的结果的条形图。图6说明安瑞斯丁(2μg/ml或20μg/ml)和内静素(2.5μg/ml和20μg/ml)对ECV-304内皮细胞迁移的作用。
图7是说明安瑞斯丁对内皮管生成的作用的线形图。y-轴表示管生成百分比，x-表示抑制剂浓度。处理是：没有(对照，◆)，BSA(对照，△)，7S结构域(对照，×)和安瑞斯丁(■)。
图8A和8B是一对显微照片，说明安瑞斯丁(0.8μg/ml，图8B)相对于对照物(Fig.8A)对内皮管生成的作用。
图9A、9B、9C和9D是四个线形图，说明体内安瑞斯丁和内静素对肿瘤生长的作用。图9A是说明对于10mg/kg安瑞斯丁-处理(□)，BSA-处理(+)，和对照小鼠(●)，肿瘤体积从700mm3增加的图。图9B说明对于10mg/kg安瑞斯丁-处理(□)和BSA-处理(+)肿瘤，肿瘤体积从100mm3增加的图。图9C说明对于对于10mg/kg安瑞斯丁-处理(□)，内静素-处理(▲)，和对照小鼠(●)，肿瘤体积从大约100mm3增加的图。图9D说明安瑞斯丁-处理(□)对对照物(●)，从200mm3肿瘤增加的图。图10A和10B是一对直方图，说明各种处理下(x-轴)作为C-PAE细胞(图10A)和PC-3细胞(图10B)在OD405下的吸光度(y-轴)的函数的Caspase-3活性的量。每一个柱形代表三个孔的平均值+/-标准误差。图11A和11B是描述人IV型胶原的α2链的核苷酸(图11A，SEQ ID NO：5)和氨基酸(图11B，SEQID NO：6)序列的图。双下划线指明pET22b(+)正向(SEQ ID NO：7)和反向(SEQ ID NO：8)引物的位置，单下划线指明pPICZαA正向(SEQ ID NO：17)和反向(SEQ ID NO：18)引物的位置。
图12是描述卡斯达丁克隆载体pET22b(+)的示意图。指明其中克隆了卡斯达丁的正向(SEQ ID NO：7)和反向(SEQ ID NO：8)引物和位点。
图13A，13B，13C和13D是直方图，说明各种浓度的卡斯达丁(x-轴)对内皮细胞(C-PAE)的增殖的作用(图13A和13C)和对非-内皮细胞(786-O，PC-3和HEK 293)的作用(图13B和13D)。以3H-胸苷掺入(图13A和13B)和亚甲基蓝染色(图13C和13D)的函数测定增殖。
图14是条形图，说明对于没有VEGF(没有VEGF或者血清)，和有VEGF(1％FCS和10ng/ml VEGF)细胞的处理，和对于0.01卡斯达丁(1％FCS和10ng/ml VEGF和0.01μg/ml卡斯达丁)和1.0μg/ml卡斯达丁(1％FCS和10ng/ml VEGF和1μg/ml卡斯达丁)的处理每个条框区(y-轴)迁移的内皮细胞的数目。
图15是说明BSA(□)，卡斯达丁(■)，和α5NC1(○)的不同处理下以对照(PBS-处理孔)管形成(y-轴)的量的线形图。垂直棒形图代表平均值的标准误差。
图16是作为t＝0(y-轴)时存在的蛋白质的百分比的粘着斑蛋白的水平对时间(x-轴)的函数的FLIP(FLICE-抑制蛋白，或者FADD-样白血病介素-1β-转化酶-抑制蛋白)水平的图。
图17A，17B，17C和17D是描述卡斯达丁(■)，内静素(○)和对照(□)对PC-3细胞(图17A和17B)和786-O细胞(图17C和17D)对分数肿瘤体积(y-轴，图17A和17B)或者肿瘤体积立方毫米(y-轴，图17C和17D)的作用，对处理的天数作图(x-轴)的条形图。
图18A和18B是描述人IV型胶原的α3链的核苷酸(图18A，SEQ ID NO：9)和氨基酸(图18B，SEQ ID NO：10)序列的图。双下划线指明pET22b(+)正向(SEQ ID.NO：11)和反向(SEQ ID NO：12)引物的位置。也指出了”塔牡斯达丁333”(SEQ ID NO：20)和”塔牡斯达丁334”(SEQ ID NO：21)片段的起点和终点(“*”＝塔牡斯达丁333；”+”＝塔牡斯达丁334)。
图19是描述塔牡斯达丁克隆载体pET22b(+)的示意图。指明其中克隆塔牡斯达丁的正向(SEQ ID NO：11)和反向(SEQ ID NO：12)引物和位点。
图20是说明塔牡斯达丁突变体Tumsatin N-53(Tum-1)中α3(IV)NC1单体中截短的氨基酸的位置的示意图。实心圆圈相应于从塔牡斯达丁缺失N-末端53个氨基酸残基产生该突变体。短线标出的二硫键和它们在α1(IV)NC1和α2(IV)NC1中一样排列。
图21A、21B和21C是三个直方图，说明当用各种浓度的塔牡斯达丁(x-轴)处理时3H-胸苷对C-PAE细胞(图21A)、PC-3细胞(图21B)和786-O细胞(图21C)的掺入(y-轴)。所以的组代表三次重复的样品。
图22是说明x轴与递增量的αVβ3结合的0.1μg/ml Tumstatatin对C-PAE细胞摄入颜料的影响的直方图。y-轴给出的是OD655的吸光度。“0.1％FCS”代表0.1％FCS处理过(没有刺激的)对照物，而“20％FCS”是20％FCS处理过(刺激的)对照物。剩余的条框代表单独的αVβ3对照物和用塔牡斯达丁加递增浓度的αVβ3处理的情况。每个条框代表三个孔的平均值+/-标准误差。该实验重复三次。星号表明t-试验P＜0.05。
图23A和23B是一对直方图，说明作为各种处理下(x-轴)C-PAE细胞(图23A)和PC-3细胞(图23B)OD405吸光度(y-轴)的函数的Caspase-3活性的量。每个条框柱代表三个孔的平均值+/-标准误差。
图24A、24B、24C和24D是四个直方图，说明在整联蛋白亚基α1至α6、β1或者αVβ3整联蛋白阻断抗体存在下，HUVEC细胞对用塔牡斯达丁(图24A)、或者IV型胶原对照物(图24B)、玻连蛋白(图24C)或者层粘连蛋白-1(图24A)包被的平板的结合。在每个表的上方列出了平板包被物，每个表的x-轴是用于温育的抗体。BSA-包被的平板用作负对照。
图25是说明C-PAE细胞与塔牡斯达丁-包被的平板的结合的直方图。BSA-包被的平板用作负对照。
图26是说明各种量(x-轴)的塔牡斯达丁(●)，BSA(对照，□)和7S结构域(对照，O)对内皮管形成的作用(y-轴)的线形图。
图27A和27B是一对线形图，说明塔牡斯达丁(●)和内静素(○)相对对照物(□)随着处理天数(x-轴)对肿瘤体积的作用(mm3，y-轴)。用星号标记的点是显著的，t-实验测定P＜0.05。
图28是说明肿瘤体积随着对照小鼠(□)和用塔牡斯达丁变体N-53处理的小鼠(●)处理的天数(x-轴)而增加(y-轴)的图。用星号标记的点是显著的，t-实验测定P＜0.05。
图29是说明递增浓度的塔牡斯达丁和Numstatin N-53下(x-轴)细胞生存能力(作为OD590的函数，y-轴)的图。每个点代表三个孔的平均值+/-标准误差。星号代表t-实验测定P＜0.05。
图30是线形图，说明各种浓度的安瑞斯丁(●)、卡斯达丁(○)、12kDa安瑞斯丁片段(■)、8kDa安瑞斯丁片段(□)和10kDa卡斯达丁片段(▲)(x-轴)对内皮管形成的抑制作用(y-轴)。
图31是线形图，说明各种浓度的塔牡斯达丁片段333(●)、塔牡斯达丁片段334(○)、BSA(对照，■)、α6(对照，□)和塔牡斯达丁(▲)(x-轴)对内皮管形成的抑制作用(y-轴)。
图32A、32B和32C是三个直方图，说明递增浓度的塔牡斯达丁(x-轴)对HPE(图32A)、C-PAE(图32B)和WM-164(图32C)细胞的增殖的作用(y-轴)。
图33A和33B是一对说明递增浓度的塔牡斯达丁(◆)、Tum-1(□)、Tum-2(●)、Tum-3(◇)和Tum-4(▲)(x-轴)对C-PAE细胞(图33A)和WM-164细胞(图33B)相对数目的影响(y-轴)的图。
图34A和34B是一对说明递增浓度的塔牡斯达丁(◆)、Tum-1(□)、Tum-2(●)、Tum-3(◇)和Tum-4(▲)(x-轴)对C-PAE细胞(图34A)和WM-164细胞(图34B)细胞生存能力的影响(y-轴)的图。每个点代表三个孔的平均值+/-标准误差。
图35说明用5μg/ml的Tum-1、Tum-2、Tum-3、Tum-4，或80ng/mlTNF-α或PBS缓冲液(对照)处理的C-PAE细胞(x-轴)在OD405的吸光度(y-轴)所显示出的Caspase-3活性的直方图。
图36A、36B和36C是三个直方图。图36A、36B和36C说明在对照物IgG、αVβ3、αVβ5和BSA存在下C-PAE细胞与包被有Tum-1(图36A)、Tum-2(图36B)和Tum-4(图36C)的平板的结合百分率(y-轴)。
图37是说明与包被有PBS、塔牡斯达丁、Turn-1、Tum-2、Tum-4或BSA(x-轴)的平板粘着的WM-164细胞OD655吸光度(y-轴)表示的亚甲基蓝染色的水平的直方图。
图38A、38B、38C、38D和38E是五个直方图，说明预先与Tum-4抗体(1∶100、1∶200、1∶500稀释度)(x-轴)温育的用1.5μg/ml的Tum-1(图38A)或Tum-2(图38B)、或αVβ3蛋白质(图38C)处理的C-PAE细胞(y-轴)，或者用塔牡斯达丁(图38D)或Tum-4(图38E)处理的WM-164细胞的增殖。
图39是说明x-轴上塔牡斯达丁(●)、内静素(△)、αVβ3抗体(□)和IgG(◆)(对照)的浓度对y-轴上相对细胞数目的图。每个点代表三个孔平均值+/-标准误差。每项实验重复三次。星号代表t-实验测定P＜0.05。
图40是说明递增浓度的卡斯达丁(◆)、Can-1(■)和Can-2(▲)(x-轴)对C-PAE细胞相对细胞数(y-轴)的作用。每一种蛋白质的每种浓度试验重复四次。
图41是说明使用PBS(对照)、卡斯达丁、Can-1和Can-2处理的每一栓形成的血管的平均数(y-轴)的直方图。
图42是塔牡斯达丁蛋白质序列的图示，指明了T1、T2、T3、T4、T5和T6肽的位置。GP-A＝第一古德帕斯彻表位。GP-B＝第二古德帕斯彻表位。
图43A、43B、43C和43D是四个直方图，说明T3肽对内皮细胞增殖的抑制(图43A、43B和43C)和对内皮细胞程序性死亡的诱导(图43D)。图43A说明用10μg/ml的肽T2、T3、T4、T5或T6(x-轴)处理的C-PAE细胞的增殖(y-轴)。图43B说明用0.1、1.0或10μg/ml的T3肽处理C-PAE细胞的增殖(y-轴)。图43C说明当用与各种浓度的αVβ3整联蛋白(x-轴)预先温育的T3肽处理时C-PAE细胞的细胞生长(y-轴)。图43D说明MTT实验测定的用10μg/ml肽T2、T3、T4、T5或T6处理之后的C-PAE细胞的存活能力(y-轴)。所有的柱值代表三个孔的平均值+/-SEM。
图44A、44B、44C、44D、44E、44F和44G是7个直方图，说明当用整联蛋白抗体、小鼠IgG(对照)、或者肽T2、T3、T4、T5或T6处理时C-PAE细胞的附着。图44A说明在BSA(对照)、没有抗体(对照)、小鼠IgG(对照)和αVβ3整联蛋白抗体(x-轴)下，HUVEC细胞怎样结合Tum-5肽(10μg/ml)包被的平板(y-轴)。图44B是说明C-PAE细胞(y-轴)与用10μg/ml重组Tum-5肽(x-轴)包被的96-孔平板的附着的直方图。图44C是说明C-PAE细胞(y-轴)结合包被Tum-5并用2.5μg/ml肽T2、T3、T4、T5或T6处理的96-孔平板(x-轴)，或者结合用T3处理的Tum-4包被的平板的直方图。PBS处理作为对照。图44D说明不同浓度的T3肽(x-轴)对C-PAE细胞(y-轴)与Tum-5-包被的平板的结合的作用。PBS处理作为对照。图44E说明在PBS(对照)、IgG(对照)或者αVβ3整联蛋白抗体存在下C-PAE细胞(y-轴)与T2、T3、T4、T5或T6-包被的平板(x-轴)的结合。图44F说明当与PBS(对照)、IgG(对照)或者αV整联蛋白抗体、β1整联蛋白抗体、β3整联蛋白抗体、αVβ5整联蛋白抗体或者BSA(对照)(x-轴)温育时，C-PAE细胞(y-轴)与T3-包被的平板的结合。图44G说明当与PBS(对照)、BSA(对照)或者不同浓度(0.1、1.0、10.0μg/ml)的T3肽或者不同浓度(0.1、1.0、10.0μg/ml)的T6肽(x-轴)温育时，C-PAE细胞(y-轴)与玻连蛋白(2.5μg/ml)包被的平板的结合。每一个柱子代表三个孔的平均值+/-SEM。实验重复三次。星号表示t-实验测定P＜0.05。
图45是直方图，说明在PBS(对照)、αVβ3整联蛋白抗体、β1整联蛋白抗体、α6整联蛋白抗体或者BSA(对照)存在下，HUVEC细胞与塔牡斯达丁-N53包被(20μg/ml)的平板的附着。
图46是说明用赋形剂(对照，○◇)、每日每千克5毫克的塔牡斯达丁-N53(□)或者每日每千克20毫克的塔牡斯达丁-N53(◇)处理的PC3前列腺肿瘤(PC3前列腺异种移植模型)经15天(x-轴)以mm3表示的平均肿瘤体积(y-轴)的图。
图47是说明用赋形剂(对照，○)、每日每千克20毫克的塔牡斯达丁-N53(□)或者每日每千克5毫克的塔牡斯达丁-N53(◇)处理的MDA-MB435乳腺癌肿瘤经22天(x-轴)以mm3表示的平均肿瘤体积(y-轴)的图。
图48是直方图，说明当用PBS(对照)、缓冲液(对照)、20μg/ml的塔牡斯达丁-N53、10μg/ml的塔牡斯达丁-45-132和5μg/ml的塔牡斯达丁-45-132(x-轴)处理时S-期C-PAE细胞百分比(y-轴)。在10％FBS存在下进行细胞周期测定。
图49是直方图，说明在PBS(对照)、αVβ3整联蛋白抗体、β1整联蛋白抗体、α6整联蛋白抗体或者BSA(对照)存在下HUVEC细胞与塔牡斯达丁-45-132-包被(20μg/ml)的平板的附着(y-轴)。
图50A和50B是两个直方图，说明塔牡斯达丁-45-132对细胞增殖的作用。图50A说明用0、0.125、0.250、0.500、1.0或2.0μM的浓度(x-轴)的大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132(黑色条框)或者293细胞表达的全长塔牡斯达丁(白色条框)处理的C-PAE细胞的BrdU实验测定的细胞增殖(OD450下，y-轴)。图50B说明用0、0.1、1.0、5.0和10.0μg/ml浓度(x-轴)的Pichia表达的塔牡斯达丁-45-132处理C-PAE的亚甲基蓝染色(OD655)测定的细胞增殖。没有刺激的C-PAE细胞作为对照物。
图51是说明大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132和Tum-5-126-C-A对细胞周期影响的直方图。说明0时刻(对照)和用0、1、10和20μg/ml(x-轴)的塔牡斯达丁-45-132(黑色条框)或者Tum-5-126-C-A(白色条框)处理之后S-期C-PAE细胞百分比(y-轴)。实验重复三次。
图52A、52B、52C和52D是四个直方图，说明塔牡斯达丁-45-132和Tum-5-126-C-A对细胞存活能力的影响。图52A说明MTT实验中用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-轴)塔牡斯达丁-45-132(黑色条框)和烷基化并且还原的塔牡斯达丁-45-132(白色条框)处理的C-PAE细胞在OD562下测定的细胞生存能力(y-轴)。图52B说明MTT实验中用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-轴)Tum-5-126-C-A处理的C-PAE细胞在OD562下测定的细胞生存能力(y-轴)。图52C说明MTT实验中用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-轴)塔牡斯达丁-45-132处理的PC-3细胞在OD562下测定的细胞生存能力(y-轴)。图52D说明MTT实验中用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-轴)塔牡斯达丁-45-132处理的DU-145细胞在OD562下测定的细胞生存能力(y-轴)。
图53是直方图，说明了对照、对照+DEVD-fmk、TNF-α、TNF-α+DEVD-fmk、塔牡斯达丁-45-132(1μg/ml和10μg/ml)、塔牡斯达丁-45-132(10μg/ml)+DEVD-fmk条件(x-轴)下的caspase-3活性(OD405下测定的，y-轴)。
图54是线形图，说明在用赋形剂(对照，□)、1mg/kg塔牡斯达丁-45-132(◆)、1mg/kgTum-5-126-C-A(●)、20mg/kg内静素(○)和微量泵控制的塔牡斯达丁-45-132(1mg/kg，△)处理第0、5、10、15和20天(x-轴)时以V/Vo(平均肿瘤体积/最初肿瘤体积)表示的分数肿瘤体积(y-轴)。
具体实施方式
很多种疾病都是不期望的血管生成的结果。换句话说，如果有可能终止某些症状下或者特定组织中毛细血管的生长和扩张，则可以预防或减轻很多疾病和不期望的症状。基膜组织依赖IV型胶原网络的形成，推测通过IV型胶原的C-末端球形非胶原(NC1)结构域而发生(Timpl，R.，1996，Curr.Opin.Cell.Biol.8：618-24；Timpl，R.等，1981，Eur.J.Biochem.120：203-211)。IV型胶原由6种不同的基因产物组成，即α1至α6(Prockop，D.J.等，1995，Annu.Rev.Biochenz.64：403-34)。α1和α2异构体普遍存在于人基膜中(Paulsson，M.，1992，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.27：93-127)，而其它四种异构体表现出有限分布(Kalluri，R.等，1997，J Clin.Invest.99：2470-8)。
从已经存在的血管形成新的毛细管、血管生成，是肿瘤生长和转移过程必需的(Folkman，J.等，1992，J.Biol.Chem.267：10931-4；Foll man，J.1995，Nat.Med.1：27-31；Hanahan，D.等，1996，Cell86：353-64)。人和动物肿瘤开始时不血管化，但是，肿瘤生长大于数mm3时，就必须血管化(Folkman，J.1995，Nat.Med.1：27-31；Hanahan，D.等，1996，Cell 86：353-64)。向血管生成表型的转变需要血管生成刺激剂的正调节和血管生成抑制剂的负调节(Folkman，J.1995，Nat.Med.1：27-31)。血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞因子(bFGF)是肿瘤中最常表达的生血管因子。血管化的肿瘤可以过量表达一种或多种生血管因子，它们可以协同促进肿瘤生长。受体拮抗剂对单一生血管因子例如VEGF的抑制不足以阻止肿瘤生长。最近鉴定了很多血管生成抑制剂，并且一些因子例如IFN-α，血小板因子-4(Maione，T.E.等，1990，Science 247：77-9)和PEX(Brooks，P.C.等，1998，Cell 92：391-400)不与肿瘤细胞相关，而制管张素(O′Reilly，M.S.等，1994，Cell 79：315-28)和内静素(O′Reilly，M.S.等，1997，Cell 88：27785)是肿瘤组织本身产生的与肿瘤相关的血管生成抑制剂。
尽管用这些内源血管生成抑制剂治疗肿瘤生长和转移非常有效并且是一个有吸引力的想法，但是必须考虑一些潜在的与抗血管生成治疗相关的问题。要认真考虑长期抗血管生成治疗诱导的推迟的毒性，以及损害的伤口愈合的可能性或者治疗期间发生的复发性血管生成。
整联蛋白一般具有短的C-末端细胞质结构域，以连接受体和细胞支架，和用于结合配体的长N-末端胞外结构域。配体结合中涉及这两个α和β亚基，并且存在很多组潜在的配体。一些常见的配体包括纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白和各种类型的胶原。其中的一些(例如纤连蛋白和层粘连蛋白)被多种整联蛋白结合。已知胶原I被整联蛋白α1β1、α2β1和α3β1结合，而胶原IV被整联蛋白α1β1和α2β1结合。上皮细胞被整联蛋白α2β1、α6β1、αVβ3和α6β4结合。细胞因子激活的内皮细胞被α4β1和αLβ2结合，而血管内皮被αMβ2整联蛋白结合。
在本发明中，公开了与抗血管生成蛋白质和肽相互作用(例如特异性结合)的细胞表面受体，特别是结合抗血管生成蛋白质安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁的整联蛋白和整联蛋白亚基。这些整联蛋白为评价新的抗血管生成蛋白质、肽和化合物或者目前已知的抗血管生成蛋白质肽和化合物的更有效的变体和片段，特别是安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁的更有效的变体和片段提供了靶物。具体地说，本发明涉及整联蛋白亚基α1、α2、α3、αV、β1和β3，发现它们结合安瑞斯丁、它是IV型胶原NC1结构域的α1链。本发明还涉及整联蛋白亚基α1、α2和β1，发现它们结合卡斯达丁，它是IV型胶原NC1结构域的α2链。另外，本发明还涉及整联蛋白亚基α5、α6、αV、β1和β3，发现它们结合塔牡斯达丁，它是IV型胶原NC1结构域的α3链。其它整联蛋白和整联蛋白亚基也可以结合安瑞斯丁，卡斯达丁或塔牡斯达丁，并且这些可以利用这里描述的方法鉴定(参见，例如，下面的实施例12、26和28)。
通过施用安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁，或者施用作为安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁的受体结合上述整联蛋白亚基的另一种蛋白质、肽或者化合物，可以抑制内皮细胞的血管生成和增殖，或者促进或诱导内皮细胞的程序性死亡。这样的蛋白质、肽和化合物包括安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的抗体、片段或部分，或者包括特异性结合上述整联蛋白亚基的安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的那些区的蛋白质或肽。所谓“特异性结合”指具有配体(例如抗原)与特异性结合蛋白(例如抗体或受体)结合的高亲合力和/或高亲和性。例如，抗体与该特异性抗原上的表位结合强于相同抗原与任何其它表位的结合，特别是那些在相同样品中或者与相同样品相关的分子中作为感兴趣的特异性抗原存在的那些。
特异性结合感兴趣的分子的抗体能以非常弱的但是仍然可检测的水平结合其它分子(证明与感兴趣的分子结合10％或者更少)。例如通过利用合适的对照物，容易从与感兴趣的分子特异性抗体结合辨别这样弱的结合，或者背景结合。
一般制备特定肽的抗体，制备给定肽的抗体的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Ausubel，F.M.等(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，1987，至1999年的增补本)第11章，特别是11.4.2-11.11.5页(“Preparation of MonoclonalAntibodies”)，11.12.1-11.13.4页(“Preparation of Polyclonal Antisera”)并且最特别是11.14.1-11.15.4页(“Preparation of AntipeptideAntibodies”))。定制的抗体也可以购自多个供应商，例如购自BerkeleyAntibody Co.，Richmond，California，USA。制备整联蛋白和整联蛋白亚基的抗体的方法也是公知的，并且制备这样的抗体的方法曾由Gallatin，W.M.等(美国专利No.5,817,515)，和Kim，K.J.等(美国专利Nos.5,652,110；5,652,109；5,578,704)描述，它们在这里全文引作参考。
可以重组制备这里描述的可溶形式的整联蛋白和整联蛋白亚基。制备可溶性受体和蛋白质的方法是本领域公知的，并且制备可溶形式的整联蛋白和整联蛋白受体的方法由Briesewitz，R.等(1993，J.Biol.Chem.268：2989-2996)和Kem，A.等(1994，J.Biol.Chem.269：22811-22816)描述；并且也由Gallatin，W.M.等(美国专利Nos.5,728,533和5,831,029)和Duong，L.T.等(美国专利No.5,895,754)描述，它们在这里全文引作参考。
本发明还涉及通过施用模拟作为安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的受体的整联蛋白亚基的蛋白质、肽或者化合物来增强血管生成和细胞增殖，或者抑制细胞程序性死亡的方法。这样的蛋白质、肽或者化合物包括选择的亚基组成的整联蛋白，它能结合可获得的安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁、和其生物活性(例如抗生血管)片段、突变体、类似物、同系物及其衍生物、以及其多聚体(例如二聚体)和融合蛋白(这里也称作嵌合蛋白)，从而防止它们与它们各自的整联蛋白受体相互作用并且抑制生血管活性的。结合安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁、或者其变体和片段的蛋白质、肽或化合物还包括安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁、或者抗其变体或片段的抗体。这样的抗体结合这些分子，从而防止它们与它们各自的整联蛋白受体相互作用并且抑制血管生成活性。
在本发明中，安瑞斯丁、卡斯达丁和/或塔牡斯达丁、或者它们的片段或突变体可以单独使用或者结合使用来抑制组织中血管生成、内皮细胞增殖、内皮细胞迁移、或者内皮细胞官形成、或者诱导或促进组织中程序性细胞死亡。安瑞斯丁、卡斯达丁和/或塔牡斯达丁的结合可以进一步结合其它胶原结构域或者NC1链，或者其它形式的治疗，例如放射疗法、化学治疗、免疫治疗。这些分子降低抗程序性细胞死亡蛋白质FLIP(FLICE-抑制蛋白或FADD-样白细胞介素-1β转换酶抑制蛋白)的水平。因此降低FLIP水平的分子抑制血管生成，从而引发caspase活性并且传送终止程序性细胞死亡信号。
这里描述的安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁的受体(例如α1β1、α2β1、α3β1、α5β1、α6β1和αVβ3整联蛋白)和/或它们的亚基(例如α1、α2、α3、α5、α6、αV、β1、β3)可以结合使用来促进或诱导血管生成。安瑞斯丁、卡斯达丁和/或塔牡斯达丁的抗体也可以结合成一个治疗方案，安瑞斯丁、卡斯达丁和/或塔牡斯达丁的受体和它们的受体亚基的抗体也可以这样。
本发明还包括鉴定以类似于安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁和其抗生血管变体和片段的方式抑制血管生成的抗生血管的蛋白质、肽和化合物的试剂盒。这样的试剂盒包括整联蛋白的合适亚基(例如α1、α2、β3等)，和进行下面的实施例中描述的测试之一所必须的这样的其它成分。使用这样的试剂盒进行的特别的测试包括下面实施例12和28描述的细胞粘着测试，和下面实施例26描述的竞争增殖测试。例如，鉴定行为方式类似于塔牡斯达丁的蛋白质、肽或化合物的试剂盒包括进行实施例28的细胞粘着测试所必需的那些成分和试剂，例如整联蛋白亚基α6、αV、β1、β3和IgG(作为对照物)的抗体。该试剂盒可以任选地包括要用实验化合物和对照物例如IV型胶原或者层粘连蛋白-1包被的96-孔平板(或者可选地预先包被的平板)。所述试剂盒可以任选地包括BSA或者其它封闭剂，和吸附用的细胞(例如HUVEC细胞)，以及用于生长、胰蛋白酶消化、再悬浮和细胞染色的试剂。
一旦鉴定出一种潜在的抗生血管化合物，可以使用另一种试剂盒通过与用来鉴定第一位置中的化合物的相同的整联蛋白亚基竞争来证实抗生血管活性的降低。在下面的实施例26中描述了进行竞争增殖测试的这样的试剂盒的模型。所述试剂盒包括增殖测试(下面的实施例中描述的)中使用的细胞和蛋白质形式的合适的整联蛋白亚基。所述试剂盒也可选地包括测定整联蛋白亚基干扰实验化合物的抗增殖活性的作用所必需的染料和其它试剂。
在本发明中，描述了具有抗生血管性质的蛋白质、其片段、类似物、衍生物、同系物和突变体、以及这些蛋白质、类似物、衍生物、同系物和突变体抑制血管生成介导的增殖性疾病的使用方法。所述蛋白质包括IV型胶原的α链的NC1结构域，或者该结构域的部分，尤其是包括IV型胶原的α1、α2、和α3链的NC1结构域的单体。这些蛋白质，特别是当单体形式时，在癌症体内模型中阻止肿瘤生长，并且在几个体外模型包括内皮管测试中也抑制毛细管形成。
这些蛋白质也包括NC1结构域的连接区。α1、α2或α3链是优选的，因为证据表明α4、α5或α6链具有降低的或者检测不到的抗生血管活性。一般情况下，蛋白质的单体形式是优选的，因为证据表明六聚体形式也具有极小的或者降低的活性。
更特别地，本发明描述了一种称为安瑞斯丁的蛋白质，它是相应于人IV型胶原的NC1结构域的α1链的N-末端处的氨基酸的大约230个氨基酸长的蛋白质(Hostikka，S.L.等，1988，J.Biol.Chem.263：19488-93)。
如这里所公开的，使用能周质运送的细菌表达质粒(例如pET22b)可以在大肠杆菌中生产人安瑞斯丁，这样得到可溶性蛋白质。蛋白质表达为C-末端带有6-组氨酸标记的29kDa融合蛋白。附加的3kDa(超出26kDa)来自多接头和组氨酸标记序列。使用pcDNA 3.1真核载体在293肾细胞中也产生分泌性的可溶蛋白质安瑞斯丁。这种293-产生的蛋白质没有纯化或检测标记。
安瑞斯丁处理之后2小时的时候就引起内皮细胞程序性死亡，并且该作用对于内皮细胞是特异性，因为的用高剂量安瑞斯丁处理的肿瘤细胞中没有发现显著的细胞凋亡。有代表性的CD-31染色图案表明，相对于对照小鼠处理过的脉管系统有所减少。将肿瘤切片染色用于PCNA(增殖细胞核抗原)、纤连蛋白和IV型胶原，并且证明IV型胶原和肿瘤细胞周围纤连蛋白之间的肿瘤细胞增殖、内含物或者体系结构没有差异。
大肠杆菌生产的安瑞斯丁以剂量依赖方式抑制bFGF刺激的内皮细胞的增殖，ED50是0.25μg/ml。对于肾癌细胞(786-O)、前列腺癌细胞(PC-3)，或者人前列腺上皮细胞(HPEC)的增殖没有发现显著作用。内静素在ED50是0.75μg/ml时抑制C-PAE细胞增殖，比安瑞斯丁高三倍，并且不抑制A-498癌细胞。
如上所述，内皮细胞增殖和迁移的特异性抑制表明安瑞斯丁通过细胞表面蛋白质或受体而发挥功能。基质金属蛋白酶或者MMP的抑制提示安瑞斯丁在肿瘤生长和转移中的直接作用，类似于batimastat(BB-94)和marimastat(BB-2516)。
最近的研究推测α1β1和α1β1和α2β1整联蛋白结合从EHS肉瘤肿瘤分离的IV型胶原(Senger，D.R.等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：13612-13617)。因为安瑞斯丁是IV型胶原α1链的片段，对它的评价是通过其介导的α1β1/α2β1整联蛋白的内皮细胞结合能力。研究证明其功能上阻断整联蛋白α1和β1亚基抗体，并且明显减少HUVEC细胞与安瑞斯丁包被的培养孔的结合(图10A)。α1抗体抑制内皮细胞对安瑞斯丁包被的平板的附着60％，并且使用β1整联蛋白抗体抑制70％。这些结果与使用125I标记的安瑞斯丁的结合测试的结果相吻合。安瑞斯丁结合内皮细胞，其高亲和性的Kd1值是8.5×10-11，低亲和性的Kd2值是4.6×10-8。当用IV型胶原包被平板时，使用α1中和抗体发现适度抑制30％，用β1抗体抑制40％，用αvβ3抗体抑制15％(图10B)。安瑞斯丁和IV型胶原包被的平板之间的细胞附着差异可能是由于整个IV胶原分子上潜在的另外的整联蛋白结合位点，而安瑞斯丁为α1β1整联蛋白提供了单一的并且特异性的结合位点  (参见图10A和10B)。
整联蛋白，特别是α1β1，可以介导安瑞斯丁的肿瘤抑制活性。安瑞斯丁与α1β1的结合可以负调节VEGF-诱导的内皮细胞的增殖和迁移，正如其它人先前证明的VEGF对α1整联蛋白的依赖性(Bloch，W.等，1997，J.Cell.Biol.139：265-278)。总而言之，这些结果表明安瑞斯丁可以在血管生成级联中的不同阶段发挥其作用。已经证明抗α1和α2整联蛋白亚基的抗体能够体内抑制血管生成(Senger，D.R.等.，WO 99/16465)。安瑞斯丁可以通过直接抑制VEGF和/或bFGF的活性而发挥功能。大鼠安瑞斯丁的半衰期是36小时提示临床应用要求的剂量可以比其它蛋白质抑制剂例如内静素和angiostatin小得多(O′Reilly，M.S.等，1994，Cell 79：315-328；O′Reilly，M.S.，等，1997，Cell 88：277-285)。
在本发明中，根据通过抑制内皮细胞的增殖和迁移的测试，或者通过抑制内皮管形成的测试，可以使用IV型胶原的α2链的NC1结构域卡斯达丁抑制血管生成。卡斯达丁抑制内皮细胞增殖并且诱导这些细胞的程序性细胞死亡，而不抑制非内皮细胞的增殖或程序性细胞死亡。抗程序性细胞死亡蛋白质FLIP的负调节介导卡斯达丁诱导的程序性细胞死亡。CD-31组织学染色证明，处理过的小鼠脉管系统必对照有所减少。卡斯达丁对内皮细胞增殖和迁移的特异性抑制也证明其抗生血管活性，并且其可以通过细胞表面蛋白质/受体而发挥功能。Integrins是潜在的候选分子，依据是它们的胞外基质结合能力和介导迁移和增殖等细胞行为的能力。特别地，αVβ3整联蛋白是一种可能的卡斯达丁受体，由于其在血管生成期间的诱导作用，和它混杂的结合能力。
在本发明中，利用血管生成和肿瘤生长的体外和体内模型，使用IV型胶原的α3链的NC1结构域塔牡斯达丁(Timpl，R.等，1981，Eur.J.Biochem.120：203-11；Turner，N.等，1992，J.Clin.Invest.89：592-601)调节血管内皮细胞的增殖和血管的形成。塔牡斯达丁在肿瘤血管生成过程中的不同阶段发挥其作用。塔牡斯达丁对内皮细胞的特异性抑制作用明显提示它通过细胞表面蛋白或受体而发挥功能。最近有人报道相应于塔牡斯达丁的C-末端部分的19个氨基酸长的合成肽结合αVβ3整联蛋白(Shahan，T.A.等，1999，Cancer Res.59：4584-4590)。下面实施例描述的细胞粘着测试的结果表明塔牡斯达丁结合内皮细胞表面上的αVβ3和α6β1整联蛋白。当为了抑制其与αVβ3整联蛋白结合进而结合内皮细胞，使塔牡斯达丁与αVβ3整联蛋白预温育时，塔牡斯达丁的抗增殖作用显著降低(图22)。这表明塔牡斯达丁的抗增殖作用至少是部分地通过与增殖的内皮细胞的细胞表面上αVβ3整联蛋白结合而介导。因为血管生成依赖于αVβ3整联蛋白介导的特异性内皮细胞的粘着作用(Brooks，P.S.等，1994，Cell 79：1157-1164；Brooks，P.S.等，1994，Science 264：569-571)，塔牡斯达丁可以通过破坏增殖的内皮细胞与基质成分(例如玻连蛋白和纤连蛋白)的相互作用而影响抗血管生成。内皮细胞与玻连蛋白和纤连蛋白的正常的相互作用被认为是重要的抗程序性细胞死亡信号(Isik，F.F.等，1998，J.Cell.Physio.175：149-155)。塔牡斯达丁诱导生长刺激的内皮细胞的程序性细胞死亡，并且当塔牡斯达丁加给亚汇合的单层，即当细胞指数生长时，该作用最显著。塔牡斯达丁对于其中内皮细胞被激活的肿瘤脉管系统可以是选择性的。
所谓”α3(IV)NC1结构域”的片段指哺乳动物IV型胶原的α3链的NC1结构域的氨基酸序列的片段或部分。这样的片段的一个例子是SEQ ID NO：10的氨基酸序列的片段。
α3(IV)链(塔牡斯达丁)的分布局限于某些基膜，例如GBM、耳蜗的几种基膜、眼睛基膜例如前晶状体被膜，Descemet′s膜、卵巢和睾丸基膜(Frojdman，K.等，1998，Differentiation 83：125-30)和牙槽毛细管基膜(Kashtan，C.E.，1998，J.Am.Noc.Nephrol.9：1736-50)。但是，肾小球膜、血管基膜、皮肤表皮基膜和肝的血管基膜中不存在该链(Kashtan，C.E.，上文)。在伤口愈合过程中，除α3和α4链之外的IV型胶原的α链将装配形成新的毛细管，因为那两种链不是已经存在的即真皮脉管系统的基膜的成分。因为α3(IV)链不是正常人皮肤中原始成分，使用塔牡斯达丁处理可能不改变损伤伤口愈合中胶原组装和血管生成的过程。
α3(IV)链在人肾血管基膜以及GBM中表达(Kalluri，R.等，1997，J.Clin.Invest.99：2470-8)。推测这些“预先存在的”血管在原发肾肿瘤例如肾细胞癌的过程中涉及。塔牡斯达丁通过破坏由α3(IV)链与其它α链装配介导的新血管化而对于原发性肾癌的治疗是有效的。1996年美国诊断出患有肾细胞癌的患者数目大约三万人(Mulders，P.等，1997，Cancer Res.57：5189-95)，对转移病例的预测非常不利。尽管放射治疗和化学治疗有所发展，但是接受治疗的患者的长期存活率还没有显著提高(Mulders，P.等，上文)。由于肾细胞癌没有效果显著的治疗选择，因而强调开发新的治疗策略的重要性。考虑到该事实，针对实体肿瘤新血管化最近在几种动物模型中证实前途有望的结果(Baillie，C.T.等，1995，Br.J.Can cer 72：257-67；Burrows，F.J.等，1994，Pharmacol.Ther.64：155-74；Thorpe，P.E.等，1995，Breast CancerRes.Treat.36：237-51)。塔牡斯达丁体内抑制肾细胞癌生长的作用证实该分子作为该种肿瘤类型的有效抗生血管治疗是有效的。
在本发明中，塔牡斯达丁以剂量依赖方式体外特异性抑制牛肺动脉细胞的血清刺激的增殖，并且体外对肿瘤细胞系PC-3和786-O的增殖没有作用。尽管塔牡斯达丁不抑制内皮细胞迁移，但是它体外显著抑制小鼠主动脉内皮细胞的管形成，并且也诱导内皮细胞程序性死亡。在Matrigel栓测试中，塔牡斯达丁体内抑制新血管化67％，并且在6mg/kg下，在小鼠异种移植模型中抑制人肾细胞癌细胞(786-O)和前列腺癌细胞(PC-3)的肿瘤生长。总而言之，这些结果表明塔牡斯达丁通过抑制生血管过程中各种步骤而抑制新血管形成。
在体内研究中，在Matrigel栓测试中，塔牡斯达丁抑制血管生成并且在小鼠异种移植模型中抑制PC-3肿瘤和786-O肿瘤的生长。塔牡斯达丁抑制大肿瘤的生长的事实是令人鼓舞的，特别是考虑到临床标准对肿瘤的治疗。
因为塔牡斯达丁具有古德帕斯彻综合症的病原表位(Butkowski，R.J.等，1987，J.Biol.Chem.262：7874-7；Saus，J.等，1988，J.Biol.Chem.263：13374-80；Kalluri，R.等，1991，J Biol.Chem.266：24018-24)，它是一种特征在于肺出血和/或快速发病的肾小球性肾炎的自身免疫疾病，因此急性或慢性施用塔牡斯达丁有可能诱发这种自身免疫疾病。有几个研究小组试图作图或者预测出古德帕斯彻综合症自身表位在α3(IV)NC1上的位置，曾报道过N-末端部分，中间部分，和C-末端部分携带表位(Kalluri，R.等，1995，J.Am.Soc.Nephrol.6：1178-85；(Kalluri，R.等，1996，J.Biol.Chem.271：9062-8；Levy，J.B.等，1997，J.Am.Soc.Nephrol.8：1698-1705；Quinones，S.等，1992，J.Biol.Chem 267：19780-4；Kefalides，N.A.等，1993，KidneyInt.43：94-100；Netzer，K.O.等，1999，J.Biol.Chem.274：11267-74)。最近有人报道该自身抗体的反应性只是针对α3(IV)NC1的N-末端，并且与肾存活率有关。使用重组嵌合构建体完成了该项实验(Hellmark，T.等，1999，Kidney Int.55：936-44)。N-末端部分前40个氨基酸鉴定为与疾病相关的病原表位。因此为了去除古德帕斯彻综合症病原表位，合成了缺失N-末端53个氨基酸残基的截短的塔牡斯达丁，该分子在小鼠异种移植模型中表现出对786-O肿瘤生长的抑制作用。另外，该分子不结合来自古德帕斯彻综合症严重患者的自身抗体。塔牡斯达丁N-53(这里也称作“Tum-1”)也有效降低内皮细胞的存活力。令人惊奇的是，塔牡斯达丁N-53(Tum-1)的该作用比全长分子高。这些结果证明即使去除N-末端53个氨基酸，塔牡斯达丁的抗生血管区是保守的。
除了Tum-1之外，也制备了其它塔牡斯达丁缺失突变体，包括Tum-2，Tum-3和Tum-4。这些在下面的实施例35中描述。如上所述，Tum-1包括C-末端191个氨基酸，并且缺失N-末端53个氨基酸。”塔牡斯达丁333”包括塔牡斯达丁的N-末端氨基酸2-125。Tum-3包括C-末端112个氨基酸。Tum-4包括C-末端64个氨基酸，其包括氨基酸185-203(Han等，1997，J.Biol.Chem.272：20395-401)。全长塔牡斯达丁的氨基酸54-132区指定为Tum-5。构建Tum-5的一种延长的变型指定为“塔牡斯达丁-45-132”，以提高Tum-5的表达和溶解性。塔牡斯达丁-45-132由Tum-5和延长的N-末端另外9个氨基酸组成。另外，构建塔牡斯达丁-45-132的突变体指定为“Tum-5-126-C-A”。该突变体由塔牡斯达丁-45-132的序列组成，其中(全长塔牡斯达丁)的126位的半胱氨酸定点诱变为丙氨酸。由Tum-5制备其它缺失突变体，其包括T1和一组部分重叠的肽(T2、T3、T4、T5和T6)。
下面的表1中详细给出了这些突变体。
表1.重组塔牡斯达丁和塔牡斯达丁的缺失突变体
蛋白     残基  大小  SEQIDNO：
塔牡斯达丁(全长) 1    245  245  10
塔牡斯达丁 1    244  244  19
塔牡斯达丁333 2    125  124  20
  塔牡斯达丁334            126     244   119   21
  Tum-1(塔牡斯达丁N53)      54             244   191   22
  Tum-2    1           132   132   23
  Tum-3                 133    244    112   24
  Tum-4                   181  244    64   25
  Tum-5      54        132    79   26
  T1 120    20   27
  T2      54 73    20   28
  T3        69 88    20   29
  T4         84 103    20   30
  T5          99  117    19   31
  T6             114    132    19   32
  塔牡斯达丁-45-132       45           132    88   33
  Tum-5-126-C-A       45      A *    132    88   34
*Tum-5-126-C-A中的“A”指(全长塔牡斯达丁分子)126位的半胱氨酸残基定点诱变为丙氨酸。
尽管如这里所示，Tum-4抑制黑素瘤细胞增殖(WM-164细胞)，并且结合αVβ3受体，但是该区域可能不负责塔牡斯达丁的抗生血管活性。相反，塔牡斯达丁缺失突变体Tum-2，它包含塔牡斯达丁d N-末端一半，表现出了抗生血管功能，但是没有抗肿瘤细胞活性。因此，看来在某些实验条件下，这两种活性可以分开。
如图34A和35A所示，全长塔牡斯达丁和缺失突变体Tum-1两者表现出相同的抗生血管活性的事实表明，残基1-53区域对于该活性不是必需的。Tum-1与全长塔牡斯达丁相比提高的抗生血管活性可以合理解释为每微克突变体蛋白质活性分子数增加，这一点与较大全长分子相反。
全长塔牡斯达丁和缺失突变体Tum-1和Tum-2都表现出抗生血管活性(即抑制内皮细胞增殖并且引起它们的程序性细胞死亡)，而Tum-3和Tum-4则不如此的事实提示塔牡斯达丁的抗生血管性质主要位于残基54-132的区域。该活性也可以延伸到残基132之外的一些残基，但是有一点是清楚的，即Tum-3不包含足够的抗生血管区域来表现抗生血管功能。
但是，Tum-4抑制WM-164黑素瘤细胞的生长(如图33B所示)，而Tum-1和Tum-2则不如此，这表明塔牡斯达丁的抗肿瘤细胞活性不在残基181-244之中。考虑到Shahan等(1999，Cancer Res.59：4584-4590)的结果，更可能的是该抗肿瘤细胞活性位于残基185-203之中。塔牡斯达丁的抗生血管活性和抗肿瘤细胞活性是分开的，这一点是令人惊奇的，因为抗血管生成领域中的大多数研究表明可以通过限制血液供应来抑制肿瘤。
令人感兴趣的是，因为缺失突变体Tum-1和Tum-2的抗生血管活性与塔牡斯达丁的抗生血管活性相等，当它包含在全长折叠的塔牡斯达丁分子中时，残基54-132区域的抗生血管活性也是有效的，这一点是清楚的。相反，Tum-4具有抗肿瘤活性，而Tum-3(它与Tum-4一样含有残基185-203)则没有。因此，当185-203区域作为全长折叠的塔牡斯达丁的部分存在时，即使在较大塔牡斯达丁片段之内(例如Tum-3之内)，该区域也没有抗肿瘤细胞活性。根据Han等(1997，J.Biol.Chem.272：20395-20401)所做的，只有通过截短该分子(如下面的实施例所述)或者通过合成有代表性的肽而暴露该区域时才实现该活性。
全长塔牡斯达丁的其它片段和突变体也具有抗生血管活性。塔牡斯达丁-45-132特异性抑制内皮细胞的增殖并且引起内皮细胞程序性死亡，而对非内皮细胞没有显著作用。即使从母体蛋白质截断64％，它也具有和244个氨基酸的全长分子一样的活性。应用Matrigel栓体内测试进一步证明塔牡斯达丁-45-132的抗生血管作用。研究发现1μg/ml的塔牡斯达丁-45-132抑制PC-3肿瘤，并且在小鼠异种移植模型中降低新血管化作用和微血管密度。通过免疫细胞化学证实生物素化塔牡斯达丁-45-132结合到内皮细胞表面上。根据竞争增殖测试确定的，免疫沉淀实验表明塔牡斯达丁-45-132结合内皮细胞表面上的αVβ3和β1整联蛋白。
另外，发现碱性还原的塔牡斯达丁-45-132和没有还原的塔牡斯达丁-45-132一样有效。碱性还原破坏半胱氨酸之间的二硫键，该二硫键起着保持折叠蛋白分子的构象的作用。相对于没有还原的分子，碱性还原的塔牡斯达丁-45-132没有降低活性，这表明半胱氨酸键介导的塔牡斯达丁-45-132的构象特征对于其抗生血管活性不是必需的。术语”突变体”，因此也可以指被还原的，或者其中一个或多个半胱氨酸残基突变为其他氨基酸或者完全缺失的塔牡斯达丁分子的全部或部分。
构建塔牡斯达丁-45-132的突变体，Tum-5-126-C-A，其中(全长分子)残基126处的半胱氨酸突变为丙氨酸。该突变表现出增强的蛋白质表达，并且该分子具有和塔牡斯达丁-45-132相当的抗生血管功能，而在小鼠异种移植研究中抑制肿瘤生长，其中该突变体实际上抑制肿瘤生长，其程度比塔牡斯达丁-45-132强得多。
抗生血管和抗肿瘤细胞活性都位于古德帕斯彻综合症表位区之外。所谓α3(IV)NC1结构域的“非古德帕斯彻综合症片段”指哺乳动物IV型胶原的α3链的NC1结构域的氨基酸序列(例如蛋白质、肽或多肽的)片段或部分，其中所述片段不包括古德帕斯彻综合症自身表位。最近有人报道所述自身抗体只与α3(IV)NC1的N-末端反应。
抗生血管和抗肿瘤细胞区都不含有常规的“RGD”(Arg-Gly-Asp)结合位点，因此两个区通过不依赖RGD的机理结合它们的配体。所说的(例如蛋白质、肽或多肽的)片段结合整联蛋白或整联蛋白亚基的能力是“不依赖于RGD的”，指该片段能够结合整联蛋白或者整联蛋白亚基，尽管该片段不包含肽序列RGD(Arg-Gly-Asp)。虽然都不含有RGD序列，抗生血管和抗肿瘤细胞区两者都仍然结合αVβ3整联蛋白，并且两者都结合内皮细胞。
所说的(例如蛋白质、肽或多肽的)片段具有“结合αVβ3整联蛋白的能力”，指所述片段能结合该整联蛋白或者其亚基(即αV和/或β3)或者用抗该整联蛋白或者其亚基的抗体预处理导致该片段与该整联蛋白和/或其亚基的结合被抑制(例如，如下面实施例12或28提供的方法证明的)。
从这些相似性来看，令人惊奇的是：(1)抗生血管区抑制内皮细胞增殖，而抗肿瘤细胞区则不然，和(2)抗生血管区不抑制肿瘤细胞，而抗肿瘤细胞区则抑制这些细胞。
所说的(例如蛋白质，肽或多肽的)片段“不能抑制肿瘤细胞增殖”或者它“没有抑制肿瘤细胞增殖的能力”，指所述片段不阻止肿瘤细胞的增殖(例如培养的黑素瘤细胞，例如WM-164细胞)。下面的实施例(例如实施例36、37和38)中给出了试验方法。同样，所说的(例如蛋白质、肽或多肽的)片段“具有抑制肿瘤细胞增殖的能力”指所述片段阻止肿瘤细胞的增殖(例如培养的黑素瘤细胞，例如WM-164细胞)。下面的实施例(例如实施例36、37和38)中给出了测验该能力的方法。
所说的(例如蛋白质、肽或多肽的)片段“不能抑制内皮细胞增殖”或者它“没有抑制内皮细胞增殖的能力”，指所述片段不阻止内皮细胞的增殖(例如培养的C-PAE细胞)。下面的实施例(例如实施例5、6、7、26、34、36、38和其它)中给出了测验该能力的方法。
所说的(例如蛋白质、肽或多肽的)片段具有“结合内皮细胞的能力”指所述片段结合内皮细胞(例如C-PAE细胞)。下面的实施例(例如实施例26、28、37)中给出了测验该能力的方法。
对于一个人来说，为了进一步描绘抗生血管活性或抗肿瘤细胞活性所需要的精确的最短长度，利用下面实施例中描述的方法制备另外的缺失突变体即不困难也不麻烦。这样的努力是非常有益的，因为仍然表现出期望的活性的尽可能小的分子比同样活性但含有非必需氨基酸的较大分子以重量为基础更有效。
塔牡斯达丁特异性地抑制内皮细胞增殖提示其可能通过细胞表面蛋白质/受体发挥功能。血管生成也取决于整联蛋白αVβ3介导的特异性内皮细胞粘着作用(Brooks，P.C.等，1994，Cell 79：1157-64)。细胞附着测试表明塔牡斯达丁通过αVβ3和α6β1整联蛋白结合内皮细胞。可溶性αVβ3整联蛋白部分恢复塔牡斯达丁的抗增殖作用。塔牡斯达丁可以破坏增殖的内皮细胞与基质成分的相互作用，从而驱使内皮细胞进行程序性细胞死亡(Re，F.等，1994，.Cell.Biol.127：537-46)。基质金属蛋白酶(MMP′s)作为关键酶调节肿瘤中新血管的形成(Ray，J.M.等，1994，Eur.Respir.J.7：2062-72)。最近，研究证明MMP-2的抑制剂(PEX)能够通过抑制血管生成能够抑制肿瘤生长(Brooks，P.C.等，Cell 92：391-400)。塔牡斯达丁可以通过抑制MMPs的活性而发挥功能。
Petitclerc等(2000，J.Biol.Chem.275：8051-61)证明α3(IV)NC1通过αVβ3整联蛋白结合内皮细胞，但是推测该结合是通过α3(IV)NC1结构域的N-末端中存在的RGD序列。但是，该RGD序列不是NC1结构域的部分，而是由三股螺旋区衍生，并且包括在Neilson等(1993，J.Biol.Chem.268：8402-5)描述的原始克隆中，Petitclerc等使用该克隆在293胚胎肾细胞中重组表达α3(IV)NC1。当利用定点诱变去除该序列时，保留了αVβ3结合位点，说明这是不依赖RGD的结合机理。
Shahan等(1999，Cancer Res.59：4584-4590)鉴定残基185-203是αVβ3整联蛋白的配体，并且推测这种相互作用对于相关的抗肿瘤细胞功能是重要的。下面的实施例37和38说明其他不同的塔牡斯达丁的54-132残基区域的不依赖于RGD的αVβ3(不是αVβ5或β1)整联蛋白结合位点。该第二位点对于抑制肿瘤细胞增殖不是必需的，但是对于抗生血管活性是需要的。Tum-2结合内皮细胞和黑素瘤细胞，但是只抑制内皮细胞的增殖，并且对肿瘤细胞增殖没有作用。Tum-4含有残基185-203，结合内皮细胞和黑素瘤细胞，但是只抑制黑素瘤细胞的增殖。对于两个整联蛋白结合位点，使用可溶性αVβ3蛋白质的竞争测试足以逆转抗增殖活性。这提示塔牡斯达丁上这两种不同的不依赖于RGD的αVβ3结合位点介导两个分开的抗肿瘤活性，可能是通过不同的αVβ3整联蛋白介导的机理。这里描述的结果证明αVβ3和α6β1整联蛋白结合塔牡斯达丁，并且αVβ3结合是不依赖RGD的。
在细胞粘着测试中使用缺失突变体来检测整联蛋白结合位点。在塔牡斯达丁的N-末端部分中，有从三股螺旋非胶原部分衍生的RGD序列(氨基酸残基7-9)。RGD是αVβ3受体的结合位点。但是，缺失该序列的Tum-1仍然结合αVβ3整联蛋白。因此该结合位点是RGD独立的，如对185-203区所示。该区的抗体(例如抗-Tum-4抗体)，其已被证明部分地结合αVβ3结合位点，不阻止Tum-1结合αVβ3受体，并且Tum-1的抗增殖作用也不受影响。此外，Tum-2(残基1-132)，其不包含C-末端αVβ3结合位点(残基185-203)，如实施例38所示，在细胞粘着测试中结合αVβ3并且抑制内皮细胞增殖。当塔牡斯达丁或Tum-2与αVβ3蛋白质温育来饱和内皮细胞膜上的αVβ3受体时，塔牡斯达丁的抗增殖作用显著降低(43-74％)。这是出人意料的，考虑到塔牡斯达丁的可溶性αVβ3受体的亲和性相对于膜键合的αVβ3要弱得多而且不足够。这里描述的结果证明αVβ3结合位点可能位于氨基酸54-132之内。
αVβ3介导的塔牡斯达丁的抗生血管活性与VEGF正调节内皮细胞上αVβ3的表达的想法相吻合(Senger等，1996，Am.J.Pathol.149：293-305；Suzume等，1998，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.39：1028-1035)。因为血管生成取决于αVβ3整联蛋白介导的特异性内皮细胞粘着作用(Brooks等，1994，Science 264：569-571；Brooks等，1994，Cell 79：1157-1183)，通过破坏增殖的内皮细胞与基质成分(例如玻连蛋白和纤连蛋白)之间的相互作用可以介导塔牡斯达丁的抗生血管作用，所述的这种相互作用被认为是重要的抗程序性细胞死亡信号(36)。
第二个不依赖于RGD的位点在氨基酸水平上与185-203位点没有明显同源性，但是两者都结合内皮细胞和黑素瘤细胞上的αVβ3整联蛋白，没有发现内皮细胞增殖的抑制。
塔牡斯达丁可体内和体外抑制血管生成，导致肿瘤进程的抑制。为了对患者应用该策略，也必须考虑全身施用可能的毒性或副作用。
塔牡斯达丁分布有限并且在真皮基膜中几乎不存在的实事提示塔牡斯达丁治疗带来副作用的可能性极小。
而且，有限器官(例如肾脏)的血管基膜中塔牡斯达丁的存在提示其在有限器官定向肿瘤中潜在的独特优点。最后，期望研发应用基因转移方法(Kashihara，N.等，1997，Exp.Nephrol.5：126-31；Maeshima，Y等，1996，J.Am.Soc.Nephrol.7：2219-29；Maeshima，T.等，1998，J.Clin.Invest.101：2589-97)在肿瘤血管中体内表达塔牡斯达丁基因的可替代的策略。
α3(IV)链的分布局限于选择的器官的基膜，因此考虑到该分子可能通过抑制α3链组装的机理，塔牡斯达丁可能较小有害。此外，在肾脏血管基膜中发现α3(IV)链(Kalluri，R.等，1997，J.Clin.Invest.99：2470-8)，并且想必这些血管在原发性肾肿瘤(例如肾细胞癌)的发展中涉及。因此，塔牡斯达丁通过破坏α3(IV)链和其它α链的组装在这样的肿瘤的治疗中是有效的。
如这里使用的，术语“血管生成”指组织或器官中新血管的产生，并且涉及内皮细胞增殖。在正常生理条件下，只有在非常特定有限情况下人或动物才经历血管生成。例如，一般在伤口愈合、胎儿和胚胎发育、luteum体、子宫内膜和胎盘的形成中才观察有血管生成。术语“内皮”指构成浆液腔、淋巴管和血管的平上皮细胞的薄层。因此“抗生血管活性”指一种成分抑制血管生长的能力。血管生长是一系列复杂作用，并且包括位于各内皮细胞之下的基膜的局部击穿、那些细胞的增殖、细胞迁移到未来血管的位置、细胞的再组织化形成新血管膜、内皮细胞增殖停止、以及掺入外膜细胞和支持新血管壁的其它细胞。因此这里使用的“抗生血管活性”包括这些阶段的任何或所有阶段的中断，结果是新血管的形成被抑制。
抗生血管活性可以包括内皮抑制活性，这是指一种成分一般性地抑制血管生成的能力，例如，在成纤维细胞生长因子、血管生成相关因子或者其它已知生长因子的存在下抑制培养基中牛毛细管内皮细胞的生长或迁移。“生长因子”是一种刺激细胞的生长、再生或合成活性的成分。“血管生成相关因子”是抑制或促进血管生成的因子。血管生成相关因子的一个例子是血管生成生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，它是一种血管生成促进剂。血管生成相关因子的另一个例子是血管生成抑制因子，例如制管张素(参见例如美国专利No.5,801,012，美国专利No.5 837 682，美国专利No.5 733876，美国专利No.5 776 704，美国专利No.5 639 725，美国专利No.5792 845，WO 96/35774，WO 95/29242，WO 96/41194，WO 97/23500)或者内静素(参见例如，WO97/15666)。
“基本上相同的生物活性”或者“基本上相同或优势的生物活性”是指一种成分具有抗生血管活性，并且根据标准测试其行为类似于安瑞斯丁，卡斯达丁和塔牡斯达丁，“标准测试”包括但不限于分子生物领域用来评价抗生血管活性、细胞周期停止和程序性细胞死亡的那些方法。这样的测试包括但不限于内皮细胞增殖、内皮细胞迁移、细胞周期分析和内皮细胞管形成的测试、程序性细胞死亡检测(例如通过程序性死亡细胞的形态学或者膜联蛋白V-FITC测试尿囊绒膜(CAM)、裸鼠中肾癌肿瘤生长的抑制。下面的实施例中提供了这样的测试。
“Arresten”这里也称作“Arrestin”，意指包括安瑞斯丁序列的氨基酸序列的片段、突变体、同系物、类似物和等位变体，以及来自其它哺乳动物的安瑞斯丁和安瑞斯丁氨基酸序列的片段、突变体、同系物、类似物和等位变体。
这里使用的“卡斯达丁”，意指包括卡斯达丁序列的氨基酸序列的片段、突变体、同系物、类似物和等位变体，以及来自其它哺乳动物的卡斯达丁和卡斯达丁氨基酸序列的片段、突变体、同系物、类似物和等位变体。
这里使用的“塔牡斯达丁”，意指包括塔牡斯达丁序列的氨基酸序列的片段、突变体、同系物、类似物和等位变体，以及来自其它哺乳动物的塔牡斯达丁和塔牡斯达丁氨基酸序列的片段、突变体、同系物、类似物和等位变体。
要明白本发明涉及包括具有内皮抑制活性(例如，一种成分一般性地抑制血管生成的能力，以及在成纤维细胞生长因子、血管生成相关因子或者其它已知生长因子的存在下抑制培养基中牛毛细管内皮细胞的生长或迁移的能力)的安瑞斯丁，卡斯达丁或塔牡斯达丁的所有的衍生物。本发明包括全安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁蛋白质、这些蛋白质的衍生物和这些蛋白质的生物活性片段。这包括具有安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁活性并且具有氨基酸取代或者具有与氨基酸功能基团连接的糖基或者其它分子的蛋白质。
本发明还描述了安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁的片段、突变体、类似物和类似物。安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的“片段”是比安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁分子短的至少包括安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁肽的25个连续的氨基酸的任何氨基酸序列。这样的分子可以包括也可以不包括从克隆过程中衍生的另外的氨基酸，例如相应于全长或部分连接序列的氨基酸残基或氨基酸序列。本发明包括这些变体，无论有还是没有另外的氨基酸残基，必须具有和天然或者全长参照多肽分子基本上相同的生物活性。
根据标准实验测定的，一个具有和全长塔牡斯达丁相同的抗生血管活性的片段被指定为“塔牡斯达丁N-53”。塔牡斯达丁N-53包括其中缺失N-末端53个氨基酸的塔牡斯达丁分子。研究发现这里描述的其它突变体片段具有非常高的抗生血管活性水平，如这里描述的测试所证明的。“塔牡斯达丁333”、“塔牡斯达丁334”、“12kDa安瑞斯丁片段”、“8kDa安瑞斯丁片段”和“10kDa卡斯达丁片段”具有的ED50值分别是75ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、50ng/ml和80ng/ml。相反，全长安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁具有的ED50值分别是400ng/ml、400ng/ml和550ng/ml。塔牡斯达丁333包括SEQ ID NO：10的氨基酸2至125，而塔牡斯达丁334包括SEQ ID NO：10的氨基酸126-245。
安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的“突变体”是指相对于等参考物安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁肽的氨基酸序列的氨基酸序列中有任意变化的多肽。这样的变化可以自发产生或者通过人为操作，通过化学能量(例如，X-射线)，或者通过其它形式的化学诱变，或者通过遗传工程而产生，或是配对或者遗传信息变化的其它形式的结果。突变包括例如碱基变化、缺失、插入、反转、易位或者重叠。安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的突变形式可以表现出相对于等参照物安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁肽的提高的或降低的抗生血管活性，并且这样的突变体可以包括也可以不包括从克隆过程中衍生的另外的氨基酸，例如，相应于全长或部分连接序列的氨基酸残基或氨基酸序列。
通过PCR克隆可以产生本发明的抗生血管蛋白的突变体/片段。用这种方法产生指定为“塔牡斯达丁333”和“塔牡斯达丁334”的片段，并且具有比全长塔牡斯达丁优越的抗生血管活性，如下面的实施例23所述，并且如图30和31所示。要制备这样的片段，以这样一种方式从已知序列设计PCR引物，使得每一组引物都从蛋白质整体扩增已知的亚序列。然后将这些亚序列克隆到合适的表达载体中，例如pET22b载体，并且如下面测试中所述对所表达的蛋白质测定其抗生血管活性。
通过假单孢杆菌弹性蛋白酶消化也可以产生本发明的抗生血管蛋白的突变体/片段，如Mariyama，M.等(1992，J.Biol.Chem.267：1253-8)，和下面的实施例33所述。使用该方法来制备12kDa和8kDa安瑞斯丁突变体和10kDa卡斯达丁突变体，所有这三种都具有比原来全长蛋白质更高的抗生血管活性。
安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的“类似物”指与全安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁分子或者其片段或等位变体基本上相似，并且基本上具有相同的或优越的生物活性的非天然分子。这样的类似物指包括具有生物活性的安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的衍生物(例如如上定义的化学衍生物)、及其片段、突变体、类似物和等位变体，这些衍生物具有与没有修饰的安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁肽、片段、突变体、类似物或等位变体功能相似的激动剂或拮抗剂作用。
安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的“等位变体”指包含相对于安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁肽的参照天然多肽序列发生改变的多肽序列。编码安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁多肽的多核苷酸的“等位基因”指包含相对于编码安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁参照多肽多核苷酸序列序列变体的多核苷酸，其中编码安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁多肽的多核苷酸的等位基因编码安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁多肽的等位形式。
给定的多肽可以是安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的片段、突变体、类似物或等位变体，也可以是它们中的两种或多种，例如，一种多肽可以是安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁多肽的类似物和突变体。例如，实验室可以制备安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁分子的截短的分子(例如安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的片段)。如果通过本领域公知的方法诱变这个片段，则可产生安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的片段和突变体的分子。在另一个实施例中，可以制备一种突变体，后来发现它是以一些哺乳动物个体中的安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的等位形式存在。这样一种突变体安瑞斯丁，卡斯达丁或塔牡斯达丁分子因此是突变体和等位变体。本发明包括片段、突变体、等位变体和类似物的这样的组合。
例如，下面实施例23中描述的大肠杆菌表达克隆方法制备的塔牡斯达丁是一种单体。它也是一种融合蛋白或嵌合蛋白，因为大肠杆菌表达克隆方法给表达的蛋白质加上天然蛋白质中不存在的多接头和组氨酸标记。在实施例23中描述的塔牡斯达丁片段“塔牡斯达丁N-53”是全长塔牡斯达丁蛋白质的片段和缺失突变体，并且当使用大肠杆菌表达克隆的方法制备时，也对其加上另外的序列，因此它是全长塔牡斯达丁蛋白质的融合或嵌合突变体片段。当一起结合到例如二聚体、三聚体等中时，该塔牡斯达丁N-53亚基将产生塔牡斯达丁蛋白质的嵌合突变体片段的多聚体融合体。
本发明包括具有和安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，或者和编码安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的多核苷酸基本上相同的核酸序列的多核苷酸。“基本上相同的序列”指和参照序列具有至少约70％序列同一性的核酸或多肽，例如另一种核酸或多肽，一般与参照序列具有至少大约80％序列同一性，优选至少大约90％序列同一性，更优选至少大约95％同一性，并且最优选与参照序列具有至少大约97％序列同一性。序列比较的长度一般是至少75个核苷酸碱基或者25个氨基酸，更优选至少150核苷酸碱基或者50个氨基酸，并且最优选243-264个核苷酸碱基或者81-88个氨基酸。这里使用的“多肽”指氨基酸分子链而不是指产物的具体长度。因此，多肽定义包括肽、寡肽和蛋白质。该术语也包括进行了糖基化、乙酰化、磷酸化等表达后修饰的多肽。
这里使用的“序列同一性”指两个聚合体分子之间亚基序列相似性，例如两个多核苷酸或者多肽之间。当相同的单体亚基占据两个分子中同一个亚基位置时，例如，如果丝氨酸占据两个肽中每一个肽的一个位置的话，则它们在这个位置处是相同的。两个序列之间的同一性是匹配数目或相同位置数目的直接函数，例如，如果两个肽或化合物序列中一半位置(例如长度是10个亚基的聚合物中5个位置)是相同的，则这两个序列是50％相同的；如果位置的90％，例如，10个中9个匹配，则这两个序列具有90％序列同一性。举例来说，氨基酸序列R2R5R7R10R6R3和R9R8R1R10R6R36个位置中三个是相同的，因此具有50％序列同一性，而序列R2R5R7R10R6R3和R8R1R10R6R35个位置中3个是相同的，因此具有60％序列同一性。两个序列之间的同一性是匹配数目或相同位置数目的直接函数。因此，如果一个特定肽中缺失参照序列的一部分，则为了计算序列同一性的目的而不计该缺失的部分，例如，R2R5R7R10R6R3和R2R5R7R10R36个位置中5个是相同的，因此具有83.3％序列同一性。
经常利用序列分析软件来测定同一性，例如BLASTN或者BLASTP(下载网址是http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。通过BLASTN(对于核苷酸序列)比较两个序列的默认参数(例如，“Blast”-ing两个序列彼此之间，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html)是：配对＝1，错配＝-2，开放缺口＝5，延伸缺口＝2。当对于蛋白质序列使用BLASTP时，默认参数是：配对＝0，错配＝0，开放缺口＝11，延伸缺口＝1。
当两个序列具有“序列同源性”时，意思是两个序列彼此之间不同之处只是在于保守取代。对于多肽序列，这样的保守取代包括在序列的给定位置的一个氨基酸被取代为相同类型的另外一个氨基酸(例如具有相同的疏水性、电荷、pK或者其它构象或者化学性质特性的氨基酸，例如颉氨酸取代亮氨酸、精氨酸取代赖氨酸)，或者通过不将多肽的构象或折叠改变至破坏该多肽的生物活性的程度的序列的一些位置处一处或多处非保守型氨基酸取代、缺失或插入。“保守取代”的例子包括一个非极性(疏水性)残基例如异亮氨酸、颉氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸被取代为另一个氨基酸；一个极性(亲水性)残基被取代为另一个氨基酸，例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、苏氨酸和丝氨酸之间；一个碱性残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)被取代为另一个氨基酸；或者一个酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)被取代为另一个氨基酸；或者使用化学衍生的残基置换非衍生残基；条件是所述多肽表现出必不可少的生物活性。具有序列同源性的两个序列可以称为“序列同系物”。
本发明包括这里描述的蛋白质和肽的突变体，其中所述突变体基本上不改变蛋白质或肽的活性，也就是说突变是有效“沉默”突变。这里给出一种这样的突变体，Tum-5-126-C-A，其中(全长塔牡斯达丁分子的)126位残基半胱氨酸从半胱氨酸突变为丙氨酸。这种突变防止在该残基处形成二硫键，但是Tum-5-126-C-A仍保持其母体分子塔牡斯达丁-45-132的全部活性。
一般使用序列分析软件来测定多肽的同源性(例如，SequenceAnalysis Software Package of the Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin Bioteclmology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)。蛋白质分析软件通过对各种取代，缺失和其它修饰对比同源性程度来匹配相似序列。保守型取代一般包括下面组中的取代：甘氨酸、丙氨酸，颉氨酸、异亮氨酸、亮氨酸，天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺，丝氨酸、苏氨酸，赖氨酸、精氨酸，和苯丙氨酸、酪氨酸。
本发明还包括安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁的化学衍生物。“化学衍生物”指通过功能侧基的反应而具有一个或多个化学衍生残基的多肽。这样衍生的残基包括，例如，其中自由氨基被衍生化生成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄酯基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子，自由羧基可以被衍生化生成盐、甲酯和乙酯或者其它类型的酯或者酰肼，自由羟基可以被衍生化生成O-酰基或O-烷基衍生物，组氨酸的咪唑氮原子可以被衍生化生成N-im苄基组氨酸(N-imbenzylhistidine)。作为化学衍生物也包括那些肽，其包含一个或多个20个标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物。例如：4-羟基脯氨酸可以被取代为脯氨酸；3-甲基组氨酸可以被取代为组氨酸；高丝氨酸可以被取代为丝氨酸；和鸟氨酸可以被取代为赖氨酸。
本发明还包括包含抗生血管蛋白质、它们的片段、突变体、同系物、类似物和等位变体(例如塔牡斯达丁和卡斯达丁、或者T1和T4)的融合蛋白和嵌合蛋白。作为重组表达和克隆方法的结果可以制备融合蛋白或嵌合蛋白，例如，当在大肠杆菌中生产时，可以制备包括另外的氨基酸或相应于全长或部分连接序列(例如本发明的安瑞斯丁的氨基酸序列)的蛋白质(参见实施例2，下文)，包括给蛋白质添加另外的载体序列，包括组氨酸标记。如这里使用的，术语“融合或嵌合蛋白”意指包括该类型变化为原来的蛋白质序列。对卡斯达丁和塔牡斯达丁蛋白质也进行了类似改变(分别见实施例14和23)。融合或嵌合蛋白可以由单一蛋白质的多聚体(例如抗生血管蛋白质的重复单元)组成，融合和嵌合蛋白也可以由几种蛋白质例如几种抗生血管蛋白质制成。融合或嵌合蛋白可以包括两种或多种已知抗生血管蛋白质的结合(例如，制管张素和内静素，或者制管张素和内静素的生物活性片段)，或者与定向试剂结合的抗生血管蛋白质(例如，内静素与表皮生长因子(EGF)或RGD肽)，或者与免疫球蛋白分子结合的抗生血管蛋白质(例如，内静素和IgG，特别是与Fc部分去除的IgG)。融合和嵌合蛋白也可以包括抗生血管蛋白质、它们的片段、突变体、同系物、类似物、等位变体以及其它抗生血管蛋白质，例如，内静素或者angiostatin。其它抗生血管蛋白质可以包括restin和apomigren；(WO 99/29856，其中内容在这里引作参考)和内静素的片段(WO99/29855，其中内容在这里引作参考)。这里使用的术语“融合蛋白”或者“嵌合蛋白”也可以包括另外的成分，例如用于送递化学治疗物质，其中编码该化学治疗物质的多核苷酸与编码抗生血管蛋白的多核苷酸连接。融合或嵌合蛋白也可以包括抗生血管蛋白的多聚体，例如二聚体或三聚体。这样的融合或嵌合蛋白可以通过翻译后修饰连接在一起(例如化学连接)，或者可以通过重组制备全融合蛋白。
本发明也包括包含安瑞斯丁、卡斯达丁、塔牡斯达丁、它们的片段、突变体、同系物、类似物和等位变体的多聚体蛋白质。“多聚体”指包括亚基蛋白质的一个或多个拷贝的蛋白质。所述亚基蛋白质可以是本发明蛋白质的一种，例如，安瑞斯丁重复两次或多次、或者片段、突变体、同系物、类似物或者等位变体，例如塔牡斯达丁突变体或片段，例如塔牡斯达丁333，重复两次或多次。这样一种多聚体可以是融合或嵌合蛋白，例如重复的塔牡斯达丁突变体可以与多接头序列和/或一种或多种抗生血管肽结合，其可以以单一拷贝存在，也可以串连重复，例如，一种蛋白质可以在总蛋白质中包括两个或多个多聚体。
本发明还包括含有一种或多种分离的编码安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的多核苷酸的组合物，以及包含这样一种多核苷酸的载体和宿主细胞，和制备安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁、它们的片段、突变体、同系物、类似物和等位变体的方法。这里使用的术语“载体”指其中可以插入或克隆核酸片段的载体，其将核酸片段的功能转移到宿主细胞中。这样一种载体也可以实现转移的核酸片段的复制和/或表达。载体的例子包括从例如质粒、噬菌体或者哺乳动物、植物或昆虫病毒衍生的核酸分子，或者非病毒载体例如配体一核酸偶联物、脂质体或者脂质-核酸复合体。要转移的核酸分子通过可操作地连接于表达控制序列，形成能表达所转移的核酸的表达载体。这样的核酸转移一般称为“转化”，并且指在宿主细胞中插入外源多核苷酸，与插入所用方法无关。例如，包括直接吸收、转导或者F介导。所述异源多核苷酸可以保持为没有整合的载体(例如质粒)，也可以整合到宿主基因组中。“操作连接”指其中描述的成分是允许它们以它们想要的方式发挥功能的关系的情况，例如，一个控制序列“操作连接”于编码序列是以这样一种方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“编码序列”是当置于合适的调节序列的控制下(例如操作连接于合适的调节序列)时转录成mRNA并且翻译成多肽的多核苷酸序列。通过5′-末端翻译起始密码子和3′-末端翻译终止密码子确定编码序列的边界。这样的边界可以是天然存在的，或者通过本领域公知的方法导入或者加给多核苷酸序列。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA和重组多核苷酸序列。
可以选择其中克隆多核苷酸的载体，因为其在原核生物中发挥功能，或者，可以选择它在真核生物中有功能。能克隆编码安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁蛋白质的多核苷酸并且能从所述多核苷酸表达那些蛋白质的载体的两个例子是pET22b和pET28(a)载体(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)和修饰的pPICZαA载体(InVitrogen，San Diego，California，USA)，它们分别可以在细菌和酵母中表达所述蛋白质。参见例如，WO 99/29878，其全文引作参考。
一旦多核苷酸克隆到合适的载体中，其可以转化到合适的宿主细胞中。“宿主细胞”指已经或者能够被用来接受使用载体转移的核酸的细胞。
宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞、哺乳动物、植物、或者昆虫细胞，并且可以作为单细胞存在，或者作为聚集体存在，例如，作为培养物，或者在组织培养物中，或者在组织或器官中。宿主细胞也可以来自多细胞生物体，例如哺乳动物的正常或疾病组织。如这里使用的宿主细胞，意在不仅包括用核酸转化的原初细胞，而且也包括仍然包含该核酸的这样的细胞的后代。
在一个实施方案中，分离的编码抗生血管蛋白质的多核苷酸另外还包括编码多肽的多核苷酸接头。这样的接头对于本领域技术人员是公知的，例如所述接头可以包括至少一个其他的编码至少一个其他氨基酸的密码子。典型地，接头包括1至约20或者30个氨基酸。多核苷酸接头象编码抗生血管蛋白质的多核苷酸一样被翻译，会导致表达的抗生血管蛋白的氨基末端或羧基末端携带至少一个附加的氨基酸残基。重要的是，所述附加的氨基酸(或者多个氨基酸)，不危害所述抗生血管蛋白的活性。
将选择的多核苷酸插入载体之后，载体转化到合适的原核菌株中并且在适合产生生物活性抗生血管蛋白的合适的培养条件下培养(例如保持)菌株，从而产生生物活性抗生血管蛋白，或者其突变体、衍生物、片段或者融合蛋白。在一个实施方案中，本发明包括将编码抗生血管蛋白的多核苷酸克隆到载体pET22b、pET17b或pET28a中，然后将其转化到细菌中。所述细菌宿主菌株然后表达所述抗生血管蛋白。一般情况下，每升培养液可以生产约10-20毫克或更多的抗生血管蛋白。
在本发明另一个实施方案中，真核载体包括修饰的酵母载体。一个方法是使用其中包含多个克隆位点的pPICzα质粒。多克隆位点已经插入一个His标记基元。另外，可以修饰载体加入一个NdeI位点，或者其它合适的限制性位点。这样的位点是本领域技术人员公知的。该实施方案产生的抗生血管蛋白包括一个或多个组氨酸，一般是大约5-20个组氨酸的组氨酸标记基元(His.tag)。该标记必须不干扰所述蛋白质的抗生血管性质。
例如，产生安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的一个方法是分别扩增SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9的多核苷酸，并且将其克隆到表达载体中(例如pET22b、pET28(a)、pPICZαA，或者一些其它表达载体)，将包含该多核苷酸的载体转化到能表达该多核苷酸编码的多肽的宿主细胞中，在适合表达该蛋白质的培养条件下培养转化的宿主细胞，然后从培养物中提取并纯化所述蛋白质。产生一般的抗生血管蛋白特别是安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁的实例方法在下面的实施例中提供。
安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁蛋白质也可以表达为转基因动物的产品，例如作为转基因牛、山羊、绵羊或猪的奶的成分，或者作为转基因植物的产品，例如，与谷物中淀粉分子结合或连接。这些方法也可以用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9的亚序列使用，产生SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10的蛋白质的一部分。使用这些方法可以制备片段塔牡斯达丁-333、塔牡斯达丁-334、塔牡斯达丁-N53、Tum-2、Tum-3、Tum-4、塔牡斯达丁-45-132和肽T1、T2、T3、T4、T5和T6。
也可以通过已知的常规化学合成方法制备安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁。通过合成手段构建本发明蛋白质的方法是本领域技术人员公知的。合成构建的安瑞斯丁，卡斯达丁或者塔牡斯达丁蛋白质序列，由于和重组产生的安瑞斯丁，卡斯达丁或塔牡斯达丁具有共同的一级、二级或三级结构和/或构象特征，所以可以具有相同的生物学性质，包括生物活性。因此，在筛选治疗用化合物中和在开发抗体的免疫学方法中，合成构建的安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁蛋白质序列可以用作生物活性或免疫学替代物，例如替代重组产生的纯化的安瑞斯丁、卡斯达丁或者塔牡斯达丁蛋白质。
如标准实验测定的，安瑞斯丁、卡斯达丁和塔牡斯达丁蛋白质用于抑制血管生成，并且在下面的实施例中提供。安瑞斯丁、卡斯达丁或者塔牡斯达丁不抑制其它类型细胞(例如非内皮细胞)的生长。
可以在分离的DNA或cDNA文库之外克隆编码安瑞斯丁、卡斯达丁或者塔牡斯达丁的多核苷酸。核酸和多肽，这里称为是“分离的”，指核酸或多肽基本上不含有(即独立于)它们的来源物(例如存在于核酸的混合物中或者细胞)中的物质，其可以进行进一步处理。“分离的”核酸或多肽包括通过这里描述的方法、类似方法、或者其它合适的方法获得的核酸或多肽，包括基本上纯的核酸或多肽、通过化学合成核酸或多肽、通过化学和生物方法结合产生的核酸或多肽和重组产生的分离的核酸或多肽。因此，分离的多肽相对来说没有正常情况下与其相关的其它蛋白质、碳水化合物、脂质和其它细胞成分。分离的核酸不与衍生该核酸的生物体的天然存在的基因组中邻接的两个核酸邻接(即共价连接)。因此，该术语包括例如插入到载体(例如自主复制病毒或质粒)中的核酸，或者作为独立于其它核酸(例如化学方法或者限制性内切酶处理产生的核酸片段)的分开的分子存在的核酸。
本发明的多核苷酸和蛋白质也可以用来设计分离其它抗生血管蛋白的探针。特别的方法描述于Jacobs等的美国专利No.5,837,490，其内容在这里全文引作参考。寡核苷酸探针的设计应当参照下面的这些参数：(a)如果有的话，应该设计到具有最少不确定碱基(“N′s”)的序列区域，和(b)应该设计到具有大约80℃的Tm(假设对于每一个A或T是2℃，对于每一个G或C是4℃)。
应用标记寡核苷酸的一般使用技术优选地用g-32p-ATP(比活性6000Ci/mmole)和T4多核苷酸激酶标记寡核苷酸。也可以利用其它标记技术。没有掺入的标记应该优选通过凝胶过滤层析或者其它成熟方法去除，插入到探针中的放射量应该通过在闪烁计数器中定量测定。优选地，得到的探针的比活性应该是大约4×106dpm/pmole。含有全长克隆库的细菌培养液应该融化，并且使用100微升原种接种含有25毫升无菌L-液体培养基的无菌培养烧瓶，所述液体培养基含有100微克/毫升的氨苄青霉素。培养物应该优选在37℃下生长至饱和，并且所述饱和培养物应该优选在新鲜L-液体培养基中稀释。这些稀释物的等份应该优选制成平板，以确定当在37℃下培养过夜时，在150mm培养皿(装有100微克/毫升的氨苄青霉素和1.5％琼脂的L-培养基的固体细菌培养基)上得到大约5000个清楚的并且分离很好的菌落的稀释度和体积。也可以利用已知的并且菌落分离很好的其它方法。
然后应用标准菌落杂交方法将菌落转移给硝基纤维素过滤器并且溶胞、变性和烘干。高度严谨的条件是至少象下面这样严格的那些条件，例如，65℃下1×SSC，或者42℃下1×SSC和50％甲酰胺。中等严谨性条件是至少象下面这样严格的那些条件：65℃下4×SSC，或者42℃下4×SSC和50％甲酰胺。低严谨性条件是至少象下面这样严格的那些条件：50℃下4×SSC，或者40℃下6×SSC和50％甲酰胺。
然后在温和搅动下，在含有0.5％SDS、100μg/ml的酵母RNA和10mM EDTA(大约10mL/150mm过滤器)的6×SSC(20×原种是175.3g NaCl/升、88.2g柠檬酸钠/升，用氢氧化钠调节到pH7.0)中65℃将过滤器温育1小时，优选地，然后把探针加入浓度大于或等于1×106dpm/mL的杂交混合物。然后该过滤器在65℃温和搅动下优选温育过夜。然后优选地，该过滤器用500mL的2×SSC/0.5％SDS在室温下无搅动洗涤，优选地接着用500mL的2×SSC/0.1％SDS在室温下温和摇动下洗涤15分钟。第三次洗涤可选用0.1×SSC/0.5％SDS在65℃下洗涤30分钟至1小时。然后优选地干燥过滤器并且放射自显影足够时间，来观察X-射线膜上的正克隆。也可以利用其它已知的杂交方法。然后收集正克隆，在培养基中培养，利用标准方法分离质粒DNA。然后通过限制性分析、杂交分析或者DNA测序来确认这些克隆。
杂交的严谨条件指允许第一核酸序列与第二核酸序列杂交的温度和缓冲液成分条件，其中这些条件决定彼此杂交的那些序列之间的同一性程度。因此，“高严谨性条件”是其中只有彼此非常类似的核酸序列将杂交的那些条件。如果它们在中等严谨性条件下杂交，则序列可能具有较小相似性。在低严谨性条件下杂交，两个要杂交的序列仍然需要较小相似性。通过将杂交条件从没有杂交发生的严谨性水平变为第一次发现杂交的水平，可以确定给定序列将与大多数与之类似的那些序列杂交的条件。决定特定杂交的严谨性的精确条件不仅包括离子强度、温度和去稳定剂(例如甲酰胺)的浓度，而且还包括这样的因素：例如核酸序列的长度、它们的碱基成分、两个序列之间错配碱基对的百分比和其它不一样序列中序列的亚型(例如重复单元的小片段)的出现率。洗涤是这样的步骤，其中设置条件，以确定彼此杂交序列之间相似性的最小程度。一般情况下，从只有同源杂交发生的最低温度，两个序列之间1％的错配会导致任何选择的SSC浓度融解温度(Tm)降低1℃。一般情况下，SSC浓度加倍会导致Tm升高大约17℃。利用这些指标，根据寻找的错配的水平凭经验可以确定洗涤温度。Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F.M.等，编著，John Wiley & Sons，Inc.，1995，增刊更新)第2.10.1至2.10.16页，和6.3.1至6.3.6页解释了杂交和洗涤条件。
高严谨性条件可以利用下面任一项的条件杂交：(1)1×SSC(10×SSC＝3M NaCl，0.3M柠檬酸三钠.2H2O(88g/升)，用1M HCl调节pH至7.0)，1％SDS(十二烷基硫酸钠)，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，65℃，(2)1×SSC，50％甲酰胺，1％SDS，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，42℃，(3)1％牛血清白蛋白(级分V)，1mM Na2-EDTA，0.5M NaHPO4(pH7.2)(1M NaHPO4＝134g Na2HPO4.7H2O，4ml85％H3PO4/升)，7％SDS，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，65℃，(4)50％甲酰胺，5×SSC，0.02M Tris-HCl(pH7.6)，1×Denhardt′s溶液(100×＝10g Ficoll 400，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白(级分V)，水达500ml)，10％硫酸葡聚糖，1％SDS，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，42℃，(5)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，1％SDS，100微克/毫升变性鲑精DNA，65℃，或者(6)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，50％甲酰胺，1％SDS，100微克/毫升变性鲑精DNA，42℃，高严谨性洗涤是下面任一项：(1)0.3-0.1×SSC，0.1％SDS，65℃，或者(2)1mM Na2EDTA，40mM NaHPO4(pH7.2)，1％SDS，65℃。上述条件要用于50个碱基对或更长的DNA-DNA杂合体。其中相信杂合体长度少于18个碱基对，则杂交和洗涤温度应该比计算的该杂合体的Tm低5-10℃，其中以℃表示的Tm＝(2×A和T碱基数)+(4×G和C碱基数)。对于据信长度大约18至大约49个碱基对的杂合体，以℃表示的Tm＝(81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-500/L)，其中“M”是一价阳离子(例如Na+)的克分子浓度，“L”是杂合体碱基对长度。
中等严谨性条件可以利用下面任一项的条件杂交：(1)4×SSC，(10×SSC＝3M NaCl，0.3M柠檬酸三钠·2H2O(88g/升)，用1M HCl调节pH至7.0)，1％SDS(十二烷基硫酸钠)，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，65℃，(2)4×SSC，50％甲酰胺，1％SDS，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，42℃，(3)1％牛血清白蛋白(级分V)，1mM Na2-EDTA，0.5MNaHPO4(pH7.2)(1M NaHPO4＝134g Na2HPO4·7H2O，4ml 85％H3PO4/升)，7％SDS，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，65℃，(4)50％甲酰胺，5×SSC，0.02M Tris-HCI(pH7.6)，1×Denhardt′s溶液(100×＝10gFicoll 400，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白(级分V)，水至500ml)，10％硫酸葡聚糖，1％SDS，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，42℃，(5)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，1％SDS，100微克/毫升变性鲑精DNA，65℃，或者(6)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，50％甲酰胺，1％SDS，100微克/毫升变性鲑精DNA，42℃，中等严谨性洗涤是1×SSC，0.1％SDS，65℃。上述条件要用于50个碱基对或更长的DNA-DNA杂合体。其中相信杂合体长度少于18个碱基对，则杂交和洗涤温度应该比计算的该杂合体的Tm低5-10℃，其中以℃表示的Tm＝(2×A和T碱基数)+(4×G和C碱基数)。对于据信长度大约18至大约49个碱基对的杂合体，以℃表示的Tm＝(81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-500/L)，其中”M”是一价阳离子(例如Na+)的克分子浓度，并且”L”是杂合体碱基对长度。
低严谨性条件可以利用下面任一项的条件杂交：(1)4×SSC，(10×SSC＝3M NaCl，0.3M柠檬酸三钠·2H2O(88g/升)，用1MHCl调节pH至7.0)，1％SDS(十二烷基硫酸钠)，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，50℃，(2)6×SSC，50％甲酰胺，1％SDS，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，40℃，(3)1％牛血清白蛋白(级分V)，1mM Na2-EDTA，0.5M NaHPO4(pH7.2)(1M NaHPO4＝134g Na2HPO4·7H2O，4ml85％H3PO4/升)，7％SDS，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，50℃，(4)50％甲酰胺，5×SSC，0.02M Tris-HCl(pH7.6)，1×Denhardt′s溶液(100×＝10gFicoll 400，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白(级分V)，水至500ml)，10％硫酸葡聚糖，1％SDS，0.1-2mg/ml变性鲑精DNA，40℃，(5)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，1％SDS，100微克/毫升变性鲑精DNA，50℃，或者(6)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，50％甲酰胺，1％SDS，100微克/毫升变性鲑精DNA，40℃，低严谨性洗涤是下面任一项：(1)2×SSC，0.1％SDS，50℃，或者(2)0.5％牛血清白蛋白(级分V)，1mM Na2EDTA，40mM NaHPO4(pH7.2)，1％SDS。上述条件要用于50个碱基对或更长的DNA-DNA杂合体。其中相信杂合体长度少于18个碱基对，则杂交和洗涤温度应该比计算的该杂合体的Tm低5-10℃，其中以℃表示的Tm＝(2×A和T碱基数)+(4×G和C碱基数)。对于据信长度大约18至大约49个碱基对的杂合体，以℃表示的Tm＝(81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-500/L)，其中“M”是一价阳离子(例如Na+)的克分子浓度，并且“L”是杂合体碱基对长度。
本发明包括使用安瑞斯丁、卡斯达丁、塔牡斯达丁或者它们的生物活性片段、类似物、同系物、衍生物或者突变体抑制哺乳动物组织中血管生成的方法。特别地，本发明包括用有效量的一种或多种抗生血管蛋白、或者其一种或多种生物活性片段、或者具有抗生血管活性的片段的组合、或者激动剂和拮抗剂治疗血管生成介导的疾病的方法。抗生血管蛋白有效量是足以抑制导致疾病或症状的血管生成从而完全或部分减轻疾病或症状的量。通过观察疾病症状的减轻可以确定血管生成介导的疾病的减轻，例如肿瘤大小的减小或者阻止肿瘤生长。如这里使用的，术语“有效量”也指足以表现出意味深长的患者利益，即相关医学症状的治疗、愈合、预防或减轻、或者这样的症状的治疗、愈合、预防或减轻的速度加快的组合物或方法的各活性成分的总量。当结合施用时，该术语指不管组合、依次或者同时施用都产生治疗作用的活性成分的组合量。血管生成介导的疾病包括但不限于癌症、实体肿瘤、生于血液的肿瘤(例如白血病)、肿瘤转移、良性肿瘤(例如血管瘤、听觉神经瘤、神经纤维瘤、器官纤维变性、沙眼和生脓性风湿性肉芽肿)、类风湿性关节炎、牛皮癣、眼科血管生成疾病(例如糖尿病性视网膜病、早熟视网膜病、斑点变性、角膜移植排异、新血管青光眼、晶状体后纤维组织形成、纤维组织形成)、Osler-Webber综合症、心肌血管生成、血小板新血管化、毛细管扩张、血友病关节、血管纤维瘤、和伤口肉芽。抗生血管蛋白用于治疗内皮细胞过多或异常刺激疾病。这些疾病包括但不限于肠粘连、局限性回肠炎、动脉粥样硬化、硬皮病、和肥大伤疤(例如瘢痕瘤)。抗生血管蛋白通过阻止胚胎植入所需要的血管化可以用作控制生育药物。抗生血管蛋白用于治疗作为病理结果的疾病例如猫抓伤(Rocheleminalia quintosa)和溃疡(Heliobacter pylori)。抗生血管蛋白，例如通过抑制脂肪组织中毛细管形成，从而防止其扩展，也可以用来防止透析移植物血管发病狭窄，和肥胖症。抗生血管蛋白也可以用来治疗局部(例如没有转移的)疾病。“癌症”指肿瘤生长、增生或者增殖性生长或者细胞异常发育病理状态，并且包括实体肿瘤、非实体肿瘤和任何异常细胞增殖，例如白血病所见到的。如这里使用的，“癌症”也指血管生成依赖性癌症和肿瘤，即它们的生长要求血管数量和密度增加以供给它们血液的肿瘤。“消退”指使用本领域技术人员公知的方法确定的肿瘤质的减少和大小的减小。
或者，在期望血管生成增加的情况下，例如伤口愈合，或者在梗塞后的心脏组织中，可以使用抗生血管蛋白的抗体或抗血清来阻断局部的天然抗生血管蛋白和进程，从而增加新血管形成，这样抑制组织的萎缩。
抗生血管蛋白可以与其它组合物和用于治疗疾病的方法结合使用。例如，可以结合抗生血管蛋白、常规使用手术、放射疗法、化学疗法或免疫疗法治疗肿瘤，然后可以接着对患者施用抗生血管蛋白，达到停止微量转移并且稳定和抑制任何残留的原发性肿瘤的生长的程度。所述抗生血管蛋白、或者其片段、抗血清、受体激动剂或者受体拮抗剂、或者其组合，也可以与其它抗生血管化合物、或者蛋白质、其它抗生血管蛋白(例如制管张素、内静素)的片段、抗血清、受体激动剂、受体拮抗剂结合。另外，也可以与药学可接受的赋形剂和可选的缓释基质(例如生物可降解聚合物)组合形成治疗组合物。
本发明的组合物也可以含有其它抗生血管蛋白或者化合物，例如内静素或制管张素和其突变体、片段和类似物。所述组合物可以进一步含有提高蛋白质活性或者维护其在治疗中的活性或应用的其它物质，例如化学治疗物质或放射性物质。所述组合物中也可以包括这样的其他因子和/或物质，与本发明的蛋白质产生协同作用或者减小副作用。另外，施用本发明的组合物可以并行地与其它治疗一起进行，例如与化学治疗或发射治疗方案结合施用。
本发明包括通过使组织接触含有本发明蛋白质的组合物来抑制哺乳动物(例如人)组织中血管生成的方法。所谓“接触”是指不只是局部施用，而且还有将组合物输入组织或者输入组织的细胞的那些送递方法。
本发明也包括应用随时间缓释或者持续释放送递系统。这样的送递系统在难以手术或者不可能手术的情况下特别需要，例如由于年龄或者疾病病程本身而衰弱的患者，或者风险-利益分析表明控制超过治疗的情况。
这里使用的持续释放基质通常是由聚合物等可通过酶或酸/碱水解或者通过溶解而降解的材料制成的。一旦插入到体内，酶和体液就对基质作用。持续释放基质期望选自生物相容性物质，例如脂质体、聚交酯(聚乙酸)、聚乙醇酸交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯共聚乙醇酸交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚(原)酯、聚蛋白质、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯丙稀、聚乙烯吡咯烷酮和硅氧烷。
优选的生物可降解基质是聚交酯、聚乙醇酸交酯或者聚交酯共聚乙醇酸交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)之一基质。
本发明血管生成调节组合物可以是固体、液体或者气溶胶，并且可以通过任何已知的给药途经施用。固体组合物的例子包括药丸、乳膏和可埋植剂量单位。药丸可以口服给药，治疗性乳膏可以局部施用。可埋植剂量单位可以局部施用，例如在肿瘤位点；或者其可以埋植用于血管生成调节组合物的全身释放，例如皮下埋植。液体组合物的例子包括适合皮下、静脉内、动脉内注射的制剂和局部和眼内给药的制剂。气溶胶制剂的例子包括用于对肺给药的吸入制剂。
应用本领域技术人员公知的配制方法和药学可接受制剂、蛋白质和蛋白质片段可以获得上述基本上纯的具有抗生血管活性的蛋白质和蛋白质片段。这些制剂可以通过标准途经施用。一般情况下，组合物可以通过局部、经皮、腹膜内、颅内、脑室内、大脑内、阴道内、子宫内、口服、直肠或者肠胃外(例如静脉内、脊柱内、皮下或者肌内)途经施用。另外，可以将抗生血管蛋白掺入到生物可降解聚合物中使化合物持续释放，在期望送递药物之处附近植入所述聚合物，例如，在肿瘤位点或者植入，使得抗生血管蛋白全身性缓慢释放。也可以使用渗透小型泵提供高浓度抗生血管蛋白的控制送递，通过套管达到感兴趣的部位，例如直接到转移的肿瘤中或者到供给肿瘤的管中。例如Brem等(1991，J.Neurosurg74：441-446)详细描述了可生物降解聚合物和它们的应用，该文献在这里全文引作参考。
例如，含有本发明多肽的组合物可以通过单位剂量注射静脉内施用。参照本发明治疗组合物使用的术语“单位剂量”实际上指对接受者适合的单位剂量的不连续单位，每一个单位含有计算产生与要求的稀释度相关的期望的治疗作用的预定量活性物质，即载体和赋形剂。
本发明的组合物的施用方式包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和动脉内注射和输液。用于肠胃外注射的药物组合物包括药学可接受无菌水溶液或不含水的溶液、分散剂、悬浮剂或者乳状液以及用于在使用之前再勾兑成无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末剂。合适的含水和不含水的载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的例子包括水、乙醇、polyois(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇和类似物)、羧甲基纤维素和其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯例如油酸乙酯。例如，通过利用卵磷脂等包衣材，通过在分散剂情况下保持要求的颗粒度，通过利用表面活性剂，都可以保持适当的流动性。这些组合物也可以含有佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过包括各种抗细菌和抗真菌物质例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等可以保证防止微生物的作用。也可以期望含有等张剂例如糖、氯化钠等。通过含有象一硬脂酸铝和明胶这样的延迟吸收的物质可以实现可注射药物形式的长时间吸收。通过在可生物降解聚合物例如聚交酯聚乙醇酸交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中将药物制成微胶囊基质可制备成注射贮存形式。根据药物和聚合物的比例和使用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速度。通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或者微乳状液中也可以制备贮存式可注射制剂。例如通过截留细菌的过滤器过滤或者在使用之前掺入在无菌水或者其它无菌可注射介质中能溶解或分散的无菌固体组合物形式的灭菌剂，可以将可注射制剂灭菌。
本发明的治疗组合物可以含有所述成分的药学可接受盐，例如，所述盐可以从无机酸或有机酸衍生。所谓“药学可接受盐”指经可靠医学鉴定范围内的适用于与人和低级动物的组织接触而没有过度毒性、过敏反应等并且有合理的利润/风险比的那些盐。药学可接受盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge，等详细描述了药学可接受盐，见J.Pharmaceutical Sciences(1977)66：1 et seq.，其在这里引作参考。药学可接受盐包括与无机酸(例如盐酸、磷酸)或者与有机酸(例如乙酸、酒石酸、苯乙醇酸)形成的酸性盐(与多肽的自由氨基形成的)。与自由羧基形成的盐可以衍生自无机碱(例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)和有机碱(例如异丙基胺、三甲基胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因)等。可以在本发明的化合物的最后分离和纯化过程中就地制备盐或者分开地通过使自由碱官能团与合适的有机酸反应来制备盐。代表性的酸性盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、heptonoate、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基甲磺酸盐(羟乙磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、pamoate、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫代氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷基酸盐。使用下面的试剂可以将含氮碱基季铵盐化，例如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、硫酸二烷基酯(例如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯)、长链卤化物(例如十烷基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物)；芳基烷基卤化物(象苄基和苯乙基溴化物)和其它。从而获得水或者油可溶性或可分散产物。可以用来生成药学可接受酸性盐的酸的例子包括无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸)和有机酸(例如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸)。
这里使用的术语“药学可接受的”、“生理耐受的”及其语法变换形式是指组合物、载体、稀释剂和试剂，它们可互换使用并且代表能够以最小的不期望的生理作用例如恶心、头晕和胃不适等对哺乳动物施用。含有溶解于其中或者悬浮于其中的活性成分的药物组合物的制备是本领域公知的并且不局限于配制。典型地，这样的组合物制备成注射液或者液体溶液或悬浮液，但是也可以在使用之前在液体中制备成适用于溶液或悬浮液的固体形式。制剂也可以是被乳化的。
活性成分可以以适合这里描述的治疗方法的量与药学可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂包括例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等和它们的混合物。另外，如果需要，所述组合物可以含有少量辅助物质(例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等增强活性成分效力的物质)。
本发明的抗生血管蛋白也可以包括在含有前体药物的组合物中。如这里使用的，术语“前体药物”指能在体内快速转化得到母体的化合物，例如通过在血液中酶解。T.Higuchi和V.Stella在Prodrugs asNovel Delivery Systems(Vol.14，the ACS Symposium Series)和Bioreversible Carriers in Drug Design(Edward B.Roche编著，AmericanPharmaceutical Association and Permagon Press，1987)中提供了充分的讨论，这两篇文献在这里引作参考。如这里使用的，术语“药学可接受前体药物”指(1)经可靠医学鉴定范围内的适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、过敏反应等并且有合理的利润/风险比并且对于它们的应用有效的那些本发明化合物的前体药物和(2)可能情况下母体化合物的两性离子形式。
本发明的抗生血管蛋白的剂量取决于疾病状态和要治疗的症状和其它临床因素，例如人或动物的体重和施用化合物的途经。对于治疗人或动物，可以施用大约10mg/kg体重至大约20mg/kg体重的蛋白质。在组合治疗中，例如与放射疗法、化学疗法或免疫疗法结合的本发明的蛋白质，有可能将剂量减小到例如大约0.1mg/kg体重至大约0.2mg/kg体重。根据抗生血管蛋白在具体动物或人体内的半衰期，可以每天几次至一周一次施用抗生血管蛋白。要明白本发明具有人用和兽用的用途。本发明的方法包括一次给药和多次给药、同时或者经延长的时间。另外，抗生血管蛋白可以与其它形式的治疗结合施用，例如放射疗法、化学疗法或免疫疗法。
抗生血管蛋白制剂包括适合口服、直肠、眼部(包括玻璃体内或眼房内)、鼻、局部(包括口腔和舌下)、子宫内、阴道或者肠胃外(包括皮下、腹膜内、肌内、静脉内、真皮内、颅内、气管内和硬膜外)施用的那些。生血管蛋白制剂可以方便地以单位剂量形式存在并且可以通过常规制药技术制备。这样的技术包括将活性成分和药物载体和赋形剂混合的步骤。一般情况下，通过均匀密切地混合活性成分和液体载体或者研细地固体载体或者两者来制备这些剂型。如果需要，然后将产品成型。
适合肠胃外施用的制剂包括含水和不含水无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、制菌剂和使得制剂与接受者的血液等张的溶质；含水和不含水无菌悬浮液，其可以含有悬浮剂和增稠剂。制剂可以装在一剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以保存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用之前只需要加入无菌液体，例如注射用水。可以从前面描述类型的无菌粉末剂，颗粒剂和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
当口服施用有效量的本发明的蛋白质时，本发明的抗生血管蛋白可以是片剂、胶囊、粉末剂、溶液或酏剂形式。当以片剂形式施用时，本发明的药物组合物可以另外含有固体载体例如明胶或佐剂。片剂、胶囊和粉末剂含有大约5-95％的本发明蛋白质，优选大约25-90％的本发明蛋白质。当以液体形式施用时，可以加入液体载体例如水、石油、动物来源或植物来源的油，例如花生油、矿物油、豆油、或芝麻油或者合成油。药物组合物的液体形式可以进一步含有生理盐水、葡萄糖或者其它糖溶液或者二醇类，例如乙二醇、丙二醇或者聚乙二醇。当以液体形式施用时，药物组合物含有大约0.5-90％重量的本发明蛋白质，优选大约1-50％重量的本发明蛋白质。
当通过静脉内、皮或皮下注射施用有效量的本发明的蛋白质时，本发明的蛋白质是没有热原并且肠胃外可接受的水溶液形式。关于pH、等张性、稳定性等，本领域技术人员能够制备这样的肠胃外可接受的蛋白质溶液。用于静脉内、皮或皮下注射的优选的药物组合物除了本发明的蛋白质之外，应该含有等张赋形剂，例如氯化钠注射液、Ringer′s注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸化Ringer′s注射液或者本领域公知的其它赋形剂。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂，或者本领域技术人员公知的其它添加剂。
本发明的药物组合物中含有的本发明的蛋白质的量取决于要治疗的症状的性质和严重程度，并且取决于治疗之前患者的状况。最后，主治医生决定对各患者治疗所用的本发明的蛋白质的量。开始时，主治医生将给予低剂量的本发明的蛋白质并且观察患者反应。可以给予较大剂量的本发明的蛋白质，直到对患者获得最佳治疗效果，在这一点上不再增加剂量。
使用本发明的药物组合物静脉内治疗的时间将随着要治疗的疾病的严重程度和各患者的症状和潜在的特应性反应而不同。每一次施用本发明的蛋白质的时间是连续静脉内给药12-24小时范围内。最后主治医生决定使用本发明的药物组合物静脉内治疗的合适的时间。
优选的单位剂量制剂是含有日剂量或单位、日亚剂量、或者其合适的施用成分的片段。应该明白除了特别提到的所述成分之外，本发明的制剂可以含有就研究的制剂类型来说本领域常规的其它试剂。可选地，细胞毒性试剂可以和抗生血管蛋白或者其生物功能蛋白质片段混合或组合，对患者提供双重治疗。
目前所述治疗组合物对于兽用也是有价值的。除人之外，特别是驯养动物和良种马，是用本发明的蛋白质进行这样的治疗的预计的患者。
细胞毒性试剂例如蓖麻毒蛋白，可以与抗生血管蛋白和它的片段连接，从而为破坏结合抗生血管蛋白的细胞提供工具。可以在很多部位发现这些细胞，包括但不限于微转移病灶和原发肿瘤。与细胞毒性试剂连接的蛋白质可以以最大送递量的方式对预计部位灌注。例如，蓖麻毒蛋白连接的高亲和性片段通过套管送递到血管中供给靶位或者直接供给靶物。这样的药物也可以通过与输液套管连接的渗透泵耦合灌注的方式送递。可以和血管生成的刺激剂一起施用抗生血管蛋白的拮抗剂的组合，提高组织的血管化。这种治疗方案提供了有效的破坏转移肿瘤的方法。
另外的治疗方法包括施用与细胞毒性试剂连接的抗生血管蛋白、其片段、类似物、抗血清、或者受体激动剂和拮抗剂。要明白所述抗生血管蛋白可以是人源或动物源的。通过化学反应或者通过与表达系统结合的重组技术也可以合成制备所述抗生血管蛋白。通过将分离的IV型胶原酶酶解产生具有抗生血管活性的蛋白质，也可以制备抗生血管蛋白。通过模拟将IV型胶原裂解为抗生血管蛋白的内源酶的作用的化合物也可以制备抗生血管蛋白。通过化合物影响裂解酶的活性也可以调节抗生血管蛋白的制备。
本发明还包括基因治疗方法，其中将编码抗生血管蛋白、整联蛋白、整联蛋白亚基或者其突变体、片段、或者融合蛋白的多核苷酸导入患者并且在患者体内调节。Gene Transfer into Mammalian SomaticCells in vivo，N.Yang(1992)Crit.Rev.Biotechn.12(4)：335-356中公开了向细胞转移或送递表达基因产物蛋白质的DNA的各种方法，也称为基因治疗，该文献在此引作参考。基因治疗包括将DNA序列插入离体或体内治疗中使用的体细胞或胚系细胞。基因治疗功能在于置换基因、增加正常或异常基因功能和对抗感染疾病和其它疾病。
用基因疗法治疗这些医学难题的策略包括这样的治疗策略，例如鉴定缺陷基因，然后加入功能基因替代缺陷基因功能或者稍微增加基因功能；或者预防策略，例如加入基因产生治疗所述症状的蛋白质或者产生更易接受治疗方案的组织或器官。作为预防策略的一个例子，可以置换患者中例如编码一种或多种抗生血管蛋白的基因，这样防止血管生成；或者插入使得肿瘤细胞更容易接受放射的基因，然后对肿瘤放射将提高引起肿瘤细胞的杀死率。
本发明想到很多转移抗生血管蛋白的DNA或调节序列的方法。除了常见的与抗生血管蛋白特异性相联的启动子序列或者其他提高抗生血管蛋白的产率，序列之外的启动子序列的转染也认为是基因治疗的方法。Transkaryotic Therapies，Inc.，ofCambridge，Mass中找到该技术的一个例子，利用同源重组插入启动细胞中红细胞生成素基因的“基因开关”。参见Genetic Engineering News，Apr.15，1994。这样的“基因开关”能被用来激活表达那些蛋白质(或受体)的细胞中的抗生血管蛋白(或者它们的受体)。
用于基因治疗的基因转移方法广义上分为三类：物理方法(例如电穿孔、直接基因转移和颗粒轰击)、化学方法(例如脂质基载体或者其它非病毒载体)和生物方法(例如病毒衍生的载体和受体摄取)。例如，可以使用非病毒载体，它包括DNA包被的脂质体，可以直接对患者静脉内注射这样的脂质体/DNA复合体。相信脂质体/DNA复合体在肝脏浓缩，在那里它们给噬菌体和Kupfer细胞送递DNA。这些细胞存活期长，因此长期提供送递的DNA的表达。另外，基因的载体或者“裸”DNA可以直接注射给目标器官、组织或肿瘤，用于定向送递治疗DNA。
通过送递位点也描述了基因治疗方法。送递基因的基本方式包括离体基因转移、体内基因转移和体外基因转移。在离体基因转移中，取来自患者的细胞并且在培养基中培养。将DNA转染到该细胞中，转染的细胞数目扩增，然后再移植给该患者。在体外基因转移中，转化的细胞是培养基中生长的细胞，例如组织培养细胞，而不是来自特定患者的特定细胞。这些“实验细胞”被转染，选择转染的细胞并且扩增，用于对患者移植或者其它用途。
体内基因转移涉及细胞在患者体内的时候将DNA导入细胞。方法包括使用病毒介导的基因转移，使用非感染病毒来向患者体内送递基因或者对患者的某一位置注射裸DNA，一定百分比的细胞吸收基因并在其中表达基因产物。另外，可以使用这里描述的其它方法，例如使用“基因枪”，用于体外插入DNA或者控制抗生血管蛋白产生的调控序列。
基因治疗的化学方法涉及脂质基化合物，不一定是脂质体，来转移DNA穿过细胞膜。脂质转染试剂或细胞转染剂，与带负电荷的DNA结合的脂质基正电荷，构成能够跨越细胞膜的复合体并且将DNA提供给细胞内部。另一种化学方法使用基于受体的胞吞作用，其涉及特异配体与细胞表面受体结合和将其包被并运送过细胞膜。所述配体结合该DNA并且这个复合体被运送给细胞。将配体基因复合体注射到血液中，然后具有该受体的靶细胞将特异性结合该配体并且将该配体-DNA复合体运送到细胞中。
很多基因治疗方法使用病毒载体来将基因插入到细胞中，例如离体方法中使用改变的逆转录病毒载体将基因导入外周和肿瘤渗透淋巴细胞、肝细胞、表皮细胞、肌细胞或者其它体细胞。然后将这些改变的细胞导入患者，提供来自插入的DNA的基因产物。
也通过体内方法使用病毒载体将基因插入细胞。对于指导外源基因的组织特异性表达，可以使用已知是组织特异性的顺式作用调控元件或启动子。或者，这可以使用体内对特异的解剖学构造原位送递DNA或表达载体来实现。例如，通过体外将转导的内皮细胞植入到动脉壁上选择的位点实现体内基因向血管的转移。病毒转染也表达基因产物的周围的细胞。例如通过导管直接将病毒载体送递到体内位点，这样只含有病毒要感染的区域，并且提供长期的位点特异性基因表达。通过将改变的病毒注射到与器官连接的血管中，使用逆转录病毒的体内基因转移在哺乳动物组织和肝组织中也已经证明。
已经用于基因治疗方案的病毒载体包括但不限于逆转录病毒，其它RNA病毒例如骨髓灰质炎病毒或者新培斯病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、SV 40、牛痘和其它DNA病毒。复制缺陷鼠逆转录病毒载体是最广泛使用的基因转移载体。鼠白血病逆转录病毒由与核核心蛋白和聚合酶(pol)酶复合的单链RNA组成，由蛋白质核心(gag)包被并且由确定宿主范围的糖蛋白膜(env)包围。逆转录病毒基因组结构包括5′和3′长末端重复单元(LTR)连接的gag、pol和env基因。逆转录病毒载体系统利用这样的事实，即包含5′和3′LTRs和包装信号的最小载体的足以使载体包装、感染并且整合到靶细胞中，条件是在包装细胞系中反式供给病毒结构蛋白质。用于基因转移的逆转录病毒载体的重要优点是：包括在大多数细胞类型中充分感染并且进行基因表达，严谨的单一拷贝载体整合到靶细胞染色体DNA中，以及容易操作逆转录病毒基因组。
腺病毒由与核心蛋白复合并且由衣壳蛋白包围的线性双链DNA组成。分子病毒学的发展有能力开发这些生物体的生物学，产生能体内将新的基因序列转导到靶细胞中的载体。腺病毒基载体将以高水平表达基因产物蛋白。腺病毒载体具有高转染效率，即使伴随低病毒效价也是如此。另外，病毒具有全感染性，不区分细胞，所以不需要注射生产者细胞系。腺病毒载体另一个潜在的优点是能够在实现体内长期表达异源基因。
DNA送递的物理方法包括融合脂小泡(例如脂质体)和用于膜融合的其它小泡，DNA插入阳离子脂质的脂质颗粒例如脂质转染剂，多赖氨酸介导的DNA转移，DNA的直接注射，例如将DNA微注射到胚细胞或体细胞中，充气送递DNA-包被颗粒，例如”基因枪”中使用的金颗粒，和无机化学方法例如磷酸钙转染。首先在转化植物组织中使用颗粒介导的基因转移方法。使用颗粒轰击装置，或者“基因枪”，产生一种运动力，推动DNA包被的高密度颗粒(例如金或钨)有高速度，使其穿过靶器官、组织或细胞。在体外系统中可以使用颗粒轰击，或者使用离体或体内技术，将DNA导入细胞、组织或器官。另一种方法是配体介导的基因治疗，涉及DNA与特异性配体复合，形成配体-DNA偶联物，将DNA导入特异细胞或组织。
已经发现将质粒DNA注射到肌细胞中产生高百分比的转染率，并且持续表达标记基因的细胞。质粒的DNA可以或者可以不整合到细胞的基因组中。转染的DNA没有整合将使得基因产物蛋白质在最后分化的没有增殖的组织中转染和表达延长的时间而不用担心细胞或线粒体基因组中突变性插入、缺失或者改变。长期但是不必须永久性的治疗性基因转移到特异细胞中，可以对遗传病提供治疗或者提供预防性应用。周期性反复注射DNA，保持基因产物水平，接受者细胞的基因组不发生突变。异源DNA没有整合使得细胞内存在几种不同的异源DNA构建体，所有的构建体表达不同的基因产物。
用于基因转移的电穿孔利用电流产生电穿孔易接受的基因转移的细胞或组织。使用给定场强的短暂的电脉冲来以这样的方式提高膜的透过性使得DNA分子能够透过膜并进入细胞。可以在体外系统中使用该技术，或者使用离体或体内技术，将DNA导入细胞、组织或器官。
可以应用体内载体介导的基因转移将外来DNA转染到细胞中。方便地将载体-DNA复合体导入体液或者血液，然后点特异性进入体内的靶器官或组织。可以使用脂质体和聚阳离子，例如聚赖氨酸、脂质转染剂或者细胞转染剂。可以研发这样的脂质体，它是细胞特异性的或器官特异性的，因此可通过靶细胞吸收脂质体携带外来DNA。定向某些细胞上的特异受体的免疫脂质体注射可以用作将DNA插入携带该受体的细胞的常规方法。使用过的另一种载体系统是用于体内基因转移的将DNA传递给肝细胞的脱唾液酸糖蛋白/聚赖氨酸偶联物系统。
转染的DNA也可以与其它类型的载体复合以便将该DNA载到受体细胞中，然后留在胞质或核质中。DNA可以与基因工程得到的小泡复合体中的载体核蛋白质偶联并且直接载进细胞核。
抗生血管蛋白基因调节可以通过施用结合编码抗生血管蛋白的基因、或者与该基因相关的控制区域、或者其相应的RNA转录区的化合物来改变转录或翻译的速度。另外，可以对患者施用用编码抗生血管蛋白的DNA序列转染的细胞，提供那些蛋白质的体内来源。例如，可以用包含编码抗生血管蛋白的核苷酸序列的载体转染细胞。转染的细胞可以是来自患者正常组织、患者病理组织的细胞或者可以是不是患者的细胞。
例如，用能够表达本发明的蛋白质的载体转染从患者取出的肿瘤细胞，再给患者导入。转染的肿瘤细胞在患者体内产生抑制肿瘤生长水平的蛋白质。患者可以是人或者非人动物。细胞也可以不用载体，或者用本领域公知的物理方法或化学方法转染，例如电穿孔、离子穿孔或者通过“基因枪”。另外，可以直接对患者注射DNA，不借助载体。特别地，可以将DNA注射到皮肤、肌肉或血液中。
将抗生血管蛋白转染到患者体内的基因治疗方案可以通过抗生血管蛋白DNA整合到细胞的基因组中，到小染色体中或者作为细胞胞质或核质中分开复制或非复制DNA构建体。抗生血管蛋白的表达可以持续一段长时间或者可以周期性反复注射，保持细胞、组织或器官中期望的蛋白质水平或者确定的血液水平。
另外，本发明包括抗体和抗血清，其可以用来测试新的抗生血管蛋白，并且也可以在特征在于或与生血管活性相关或者缺少生血管活性的疾病和症状的诊断、预后或治疗中使用。这样的抗体和抗血清也可以在期望的情况下用来正调节血管生成，例如，在梗塞后心脏组织中，抗本发明蛋白质的抗体或抗血清可以用来阻断局部的天然抗生血管蛋白和过程，并且增加新血管的生成，并且抑制心脏组织的萎缩。
这样的抗体和抗血清可以与药学可接受成分和载体结合形成诊断、预后或治疗组合物。术语“抗体”或“抗体分子”指免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗体结合位点或抗原互补位的分子。
使用特异性结合抗生血管蛋白的抗体的被动抗体疗法可以用来调节生依赖于血管生成的过程，例如再生、发育和伤口愈合和组织修复。另外，可以施用抗生血管蛋白的Fab区的抗血清阻断该蛋白的同源抗血清结合该蛋白质的能力。
也可以使用本发明的抗生血管蛋白产生对抑制剂和受体特异性的抗体。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以在本领域技术人员公知用来检测或定量测定体液或组织中抗生血管蛋白或者它们的受体的诊断方法和试剂盒中使用特异性结合抗生血管蛋白或者它们的受体的这些抗体。这些测定的结果可以用来诊断或预测癌症和其它血管生成介导的疾病的发生或复发。
本发明还包括抗生血管蛋白、那些蛋白质的抗体和含有那些蛋白质和/或它们的抗体的组合物在诊断或预后特征在于生血管活性的疾病中的用途。这里使用的术语“预后方法”指能预测确诊患有疾病特别是血管生成依赖性疾病的人或动物疾病的相关进程的方法。这里使用的术语“诊断方法”指能确定人或动物血管生成依赖性疾病的存在或类型的方法。
在检测和定量测定能结合蛋白质的抗体的诊断方法和试剂盒中可以使用抗生血管蛋白。这些试剂盒将允许检测循环的抗生血管蛋白的抗体，它指示原位原发肿瘤分泌的抗生血管蛋白存在下微转移的扩散。具有这样的循环的抗蛋白质抗体的患者更可能发生多个肿瘤和癌症，并且更可能治疗或缓和一段时间之后复发癌症。这些抗蛋白质抗体的Fab片段也可以用作产生蛋白Fab片段抗血清的抗原，所述抗血清可以用来中和蛋白抗体。这样一种方法将通过蛋白抗体还原循环蛋白质的去除，从而有效提高抗生血管蛋白的循环水平。
本发明还包括对抗生血管蛋白特异性的受体的分离。具有与组织结合的高亲和性的蛋白质片段可以用来在亲和柱上分离抗生血管蛋白的受体。受体的分离和纯化步骤是说明抗生血管蛋白作用机理的基本步骤。受体的分离和激动剂和拮抗剂的鉴定将有利于研发调节受体活性和发挥生物活性途经的药物。利用原位和溶液杂交技术，受体的分离使构建探测受体位置和合成的核苷酸探针成为可能。此外，可以分离受体的基因，插入到表达载体中并且转染到细胞中，例如患者肿瘤细胞，以提高细胞类型、组织或肿瘤结合抗生血管蛋白和抑制局部血管生成的能力。
可以使用抗生血管蛋白研发用于从培养的肿瘤细胞分离抗生血管蛋白的受体的亲和柱。分离和纯化受体之后进行氨基酸测序。利用该信息可以鉴定和分离编码该受体的基因。接着，研发用于插入到能表达受体的载体中的克隆的核酸序列。这些技术是本领域技术人员公知的。编码受体的核酸序列转染到肿瘤细胞中，并且由转染的肿瘤细胞表达受体，提高了这些细胞对内源或外源抗生血管蛋白的响应能力，从而降低转移生长速度。
可以在标准的微量化学设备中合成本发明的血管生成抑制蛋白质并且通过HPLC和质谱检测纯度。蛋白质合成方法，HPLC纯化和质谱是本领域技术人员公知的。已在重组大肠杆菌或酵母表达系统中产生抗生血管蛋白和它们的受体，并且用柱层析纯化。
可以合成完整抗生血管蛋白的不同的蛋白质片段，用于几种应用，包括但不限于如下：作为研发特异性抗血清的抗原，作为在抗生血管蛋白结合位点处有活性的激动剂和拮抗剂，作为与定向杀死结合抗生血管蛋白的细胞的细胞毒性试剂连接或者结合使用的蛋白质。
抗生血管蛋白的合成的蛋白质片段具有各种各样的用途。以高特异性和亲合力结合抗生血管蛋白的受体的蛋白质被放射标记并且利用放射自显影和膜结合技术用于观察和定量测定结合位点。该应用提供了重要的诊断和研究工具。受体结合性质的知识有利于研究与受体连接的转导机理。
抗生血管蛋白和从它们衍生的蛋白质可以用标准方法与其它分子偶联。抗生血管蛋白的氨基和羧基末端都包含酪氨酸和赖氨酸残基，并且用很多技术进行同位素和非同位素标记，例如使用常规技术进行放射性标记(酪氨酸残基-氯胺T，iodogen，乳过氧化物酶；赖氨酸残基-Bolton-Hunter试剂)。这些偶联技术是本领域技术人员公知的。或者，给不具有这些残基的片段加上酪氨酸或赖氨酸以有利于标记蛋白质上反应性氨基和羟基基团。根据对氨基酸可获得的官能团选择偶联技术，包括但不限于氨基、硫氢基、羧基、酰胺、苯酚和咪唑。使用各种试剂进行这些偶联，其中包括戊二醛、重氮化联苯胺、碳二亚胺和对苯醌。
抗生血管蛋白化学偶联于同位素、酶、载体蛋白质、细胞毒性试剂、荧光分子、化学发色团、生物发光物和其它化合物，用于各种各样的应用。可利用适合具体反应的不同的技术确定偶联反应效率。例如，利用高特异性活性的氯胺T和Na125I完成对本发明蛋白质的放射性标记。用偏亚硫酸氢钠终止反应并且在可自由使用的柱子上将混合物脱盐。从柱子上洗脱标记的蛋白质并且收集级分。从各级分中取小份并且在γ计数器上测定放射性。用这种方法，可从标记的蛋白质分离没有反应的Na125I。将具有最高特异性放射性的蛋白质级分贮存用于下面的应用，例如分析结合抗生血管蛋白的抗血清的能力。
另外，利用短寿命同位素标记抗生血管蛋白，可以实现正电子发射X线体层照像术，体内观察受体结合位点或者用其它现代放射照像技术确定含有蛋白质结合位点的肿瘤的位置。
系统地取代这些合成的蛋白质中的氨基酸可以得到增强或者减弱受体结合作用的抗生血管蛋白受体的高亲和性蛋白质激动剂和拮抗剂。这样的激动剂被用来抑制微转移生长，从而限制癌症扩散。在不适当血管化情况下使用抗生血管蛋白的拮抗剂来阻断抗生血管蛋白的抑制作用并且促进血管生成。例如，该项处理可以具有促进糖尿病患者伤口愈合的治疗作用。
通过下面的实施例进一步详细说明本发明，这些实施例不是要解释为以任何方式限制本发明的范围。相反，要清楚地明白可以有各种其它实施方案、改进、及其等效方案，在阅读这里的说明之后，可以提示本领域技术人员，而不脱离本发明的精神和/或后面的权利要求书的范围。
实施例
实施例1：天然安瑞斯丁的分离
从人胎盘和羊膜组织可以获得毫克量的安瑞斯丁。有人描述过安瑞斯丁和类似蛋白质的分离方法(例如，Langeveld，J.P.等，1988，J：Biol.Chem.263：10481-10488；Saus，J.等，1988，J：Biol.Chem.263：13374-13380；Gunwar，S，等，1990，J.Biol.Chem.265：5466-5469；Gunwar S.等，1991，J Biol.Chem.266：15318-15324；Kahsai，T.Z.等，1997，J.Biol.Chem.272：17023-17032)。安瑞斯丁的重组体形式的制备由Neilson等(1993，J Biol.Chem.268：8402-8406)描述。也可以在293肾细胞中表达该蛋白质(例如，通过Hohenester，E.等，1998，EMBO J 17：1656-1664描述的方法)。也可以根据Pihlajaniemi，T.等(1985，J.Biol.Chem.260：7681-7687)的方法分离安瑞斯丁。
IV型胶原的NC1结构域的α1链的核苷酸(SEQ ID NO：1)和氨基酸(SEQ ID NO：2)序列在图1中给出，并且相应于GenBankAccession No.M11315(Brinker，J.M.等，1994)。安瑞斯丁一般包括IV型胶原的α1链的NC1结构域及其可能的连接区，连接区是指NC1前面的含有12个氨基酸的结构域。
使用细菌胶原酶、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、HPLC和亲和层析(Gunwar，S.等，1991，J.Biol.Chem.266：15318-24；Weber，S.等，1984，Eur.J.Biochem.139：401-10)从人胎盘分离天然安瑞斯丁。使用C-18疏水柱(Pharmacia，Piscataway，New Jersey，USA)将IV型胶原单体通过HPLC纯化。使用乙腈梯度(32％-39％)洗脱组成蛋白，可见到一个主峰和一个小的双重峰。SDS-PAGE分析表明第一个峰中有两个带，并且在第二个峰中没有检测到蛋白质。免疫印迹也没有在第二个峰中发现可检测到的蛋白质，并且主峰鉴定是安瑞斯丁。
实施例2：在大肠杆菌中重组生产安瑞斯丁
从α1 NC1(IV)/pDS载体(Neilson，E.G.等，1993，J.Bio.Chem.268：8402-5)通过PCR扩增编码安瑞斯丁的序列，要使用正向引物5′-CGG GAT CCT TCT GTT GAT CAC GGC TTC-3′(SEQ ID NO：3)和反向引物5′-CCC AAG CTT TGT TCT TCT CAT ACA GAC3′(SEQID NO：4)。得到的cDNA片段用BamHI和HindIII酶切并且连接到预先酶切的pET22b(+)(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中。图2给出了该构建体。该构建体位于带有pelB前导序列的符合读框的安瑞斯丁下游和可读框中，以位于胞质并且可溶蛋白表达。另一个载体序列加给蛋白质编码氨基酸MDIGINSD(SEQ ID NO：13)。该序列的3′端符合读框地连接多组氨酸标记序列。另一个载体序列位于cDNA的3′端和组氨酸标记编码的氨基酸KLAAALE(SEQ ID NO：14)之间。对阳性克隆双链测序。
首先将编码安瑞斯丁的质粒构建体转化到大肠杆菌HMS174(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中，然后转化到BL21(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中进行表达。使用过夜细菌培养物接种500ml LB培养基。该培养物生长大约4小时，直到细胞密度达到OD600时0.6。然后通过加入IPTG至终浓度为1-2mM来诱导蛋白质表达。诱导2小时之后，以5000×g离心收集细胞并且再次悬浮于6M胍，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液中溶菌。对再悬浮的细胞进行短时间声波处理，并且以12,000×g离心30分钟。以每分钟2毫升的速度使上清液级分通过5ml Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen，Hilden，德国)4-6次。用含有10mM和25mM咪唑以及8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液洗涤，去除没有特异性结合的蛋白质。用含有8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)以及递增浓度的咪唑(50mM、125mM and250mM)的溶液从柱中洗脱出安瑞斯丁蛋白质。洗脱出的蛋白质用4℃的PBS透析两次。在透析过程中，总蛋白质中的一小部分沉淀下来。收集透析的蛋白质并且以大约3500×g离心分离为沉淀和上清液级分。通过BCA分析(Pierce Chemical Co.，Rocldbrd，Illinois，USA)和定量SDS-PAGE来分析测定各级分中的蛋白质浓度。沉淀中的总蛋白质级分大约是22％，回收的其余78％是可溶性蛋白质。蛋白质总收率是大约10mg/l。
大肠杆菌表达的蛋白质主要分离为可溶性蛋白质，并且SDS-PAGE表明有29kDa单体泳带。另外的3kDa来自多连接体和组氨酸标记序列可以通过安瑞斯丁和6-组氨酸标记的抗体进行免疫检测。
实施例3：293胚胎肾细胞中安瑞斯丁的表达
使用包含α1(IV)NC1的pDS质粒以扩增安瑞斯丁，要求使得前导信号序列符合读框地加到pcDNA 3.1真核表达载体(InVitlogen，San Diego，Califomia，USA)中。前导序列从全长α1(IV)链5′端克隆5′到NC1结构域使蛋白质分泌到培养基中。用侧翼引物对包含安瑞斯丁的重组载体测序。进一步纯化无差错cDNA克隆并且用于体外翻译研究来证实蛋白质表达。应用氯化钙方法使用包含安瑞斯丁的质粒和对照质粒转染293细胞。通过遗传霉素抗生素处理(LifeTechnologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)来筛选转染的克隆。在抗生素存在下细胞生长3星期直到显然不再有细胞凋亡。然后在T-225烧瓶中扩增克隆展平并且生长直到汇合。然后收集上清液并且使用amicon浓缩器(Amicon，Inc.，Beverly，
Massachusetts，USA)浓缩。通过SDS-PAGE，免疫印迹分析和ELISA对浓缩的上清液分析安瑞斯丁表达。通过ELISA检测上清液中的较强结合。SDS-PAGE分析表明主泳带是大约30kDa。使用安瑞斯丁-特异性抗体对包含安瑞斯丁的上清液进行亲和层析(Gunwar，S.等，1991，J.Biol.Chem.266：15318-24)。鉴定主峰含有大约30kDa的单体，其与安瑞斯丁抗体发生免疫反应。每升培养液产生1-2mg重组安瑞斯丁。
实施例4：安瑞斯丁抑制内皮细胞增殖
C-PAE细胞在含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM中生长至汇合并且保持接触抑制48小时。对照细胞是786-O(肾癌)细胞，PC-3细胞、HPEC细胞和A-498(肾癌)细胞。37℃下利用胰蛋白酶作用(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)5分钟收获细胞。向包被有10μg/ml纤连蛋白的24-孔平板的每一个孔中加入含有12500个细胞和1％FCS的DMEM的悬浮液。在37℃、5％CO2和95％湿度下将细胞温育24小时。去除培养基并且用含有0.5％FCS和3ng/ml bFGF(R & D Systems，Minneapolis，Minnesota，USA)的DMEM替换。没有刺激的对照物不接受bFGF。用0.01～50μg/ml浓度范围的安瑞斯丁或内静素处理细胞。在处理时所有的细胞接受1μCurie的3H-胸苷。24小时之后，去除培养基并且用PBS洗涤孔三次。用1N NaOH抽提细胞并且加给含有4ml ScintiVerse II(FisherScientific，Pittsburgh，Pennsylvania，USA)溶液的闪烁瓶。使用闪烁计数器测定胸苷插入。图3A和3B给出结果，图3A和3B是一对说明3H-胸苷掺入不同量的安瑞斯丁(图3A)或内静素(图3B)处理的C-PAE细胞的图。安瑞斯丁表现出和内静素一样抑制C-PAE中的胸苷掺入。图4A、4B、4C和4D也给出了用安瑞斯丁和内静素处理的对照细胞的行为，安瑞斯丁对786-O细胞(图4A)、PC-3细胞(图4B)或HPEC细胞(图4C)有较小作用。内静素对A-498细胞(图4D)没有作用。图3和4中所有的组代表三次重复的样品。
实施例5：安瑞斯丁诱导内皮细胞程序性死亡
向6-孔组织培养平板的每一个孔加入5万C-PAE细胞，在补加有10％FBS的DMEM中培养12小时。在2、4和6小时的时间点，在加入新鲜培养基时一起加入5μg/ml安瑞斯丁或者40ng/ml TNFα(正对照)。对照孔接受等体积的PBS。分离的细胞和粘连的细胞集中在一起并且以1500rpm离心。
用结合缓冲液(Clontech，Palo Alto，California，USA)冲洗细胞，并且根据厂商说明用FITC-标记的膜联蛋白V(Clontech，Palo Alto，California，USA)进行标记来测定作为程序性细胞死亡指征的磷脂酰基-丝氨酸(PS)的外表化作用。使用FACStar Plus流式细胞仪(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)计数膜联蛋白-FITC标记的细胞。对于每一次处理，计数10000个细胞并且贮存。然后使用标准CellQuest软件(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)分析该数据。相对于对照物来说，2小时时膜联蛋白-V-染色(程序性细胞死亡)细胞百分比增加至大约27％，而正对照TNFα在4和6小时时接近20％。对于安瑞斯丁-处理的细胞，程序性细胞死亡细胞的百分比在2小时时是大约18％，在4和6小时时是大约23％。在实验期间也发现内皮细胞形态的变化，而对照细胞没有明显变化，而安瑞斯丁-处理的和非粘连细胞指示程序性细胞死亡的细胞形态表现出变化。
实施例6：安瑞斯丁抑制内皮细胞迁移
应用Boyden室测试(Neuro-Probe，Inc.，Cabin John，Maryland，USA)，对人脐带内皮细胞(ECV-304细胞，ATCC 1998-CRL，ATCC(美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110-2209，USA))测试安瑞斯丁和内静素对FBS-诱导的趋化性的抑制作用。ECV-304细胞在含有10％FBS和5ng/ml DilC18(3)活体荧光染料(Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon，USA)的M199培养基中培养过夜。受胰蛋白酶作用之后，在含有0.5％FBS的M199中洗涤并稀释细胞，在有或没有安瑞斯丁或内静素(2-40μg/ml)的情况下在上室孔中接种60,000个细胞。将含有2％FBS的M199培养基放置于下室中作为chemotactant。用8微米孔径的聚碳酸酯过滤器(Poretics Corp.，Livermore，California，USA)将含有细胞的隔室和chemotactant分开。在37℃、5％CO2和95％湿度下温育4.5小时。弃去没有迁移的细胞并且用PBS冲洗上面的细胞之后，用塑料片刮过滤器，固定在4％甲醛PBS溶液中，并且置于载玻片上。利用高强度荧光场，通过数字SenSysTM相机记录几个独立的同质图象，所述数字相机用成像处理软件PMIS(Roper Scientific/Photometrics，Tucson，Arizona，USA)操作。
图5A、5B和5C给出几个有代表性的照片，说明2μg/ml的安瑞斯丁和20μg/ml的内静素一样有效。使用OPTIMAS 6.0软件(MediaCybernetics，Rochester，NY)计数细胞，结果如图6所示，这是显微照片看到的图形形式结果。
实施例7：安瑞斯丁抑制内皮管形成
为了测定内皮管形成的抑制作用，320微升的Matrigel(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)加到24-孔平板的每一个孔中并且使之聚合(Grant，D.S.等，1994，Pathol.Res.Pract.190：854-63)。25000个小鼠主动脉内皮细胞(MAE)在没有抗生素的EGM-2培养基(Clonetics Corporation，San Diego，California，USA)中的悬浮液注入Matrigel包被的每一个孔中。用递增浓度的安瑞斯丁、BSA、无菌PBS或者7S结构域处理细胞。所有的测试都重复进行三次。细胞在37℃下温育24-48小时并且使用CIZ2Olympus显微镜(3.3目镜，10X物镜)观察。然后使用400 DK套装TMAX胶片对细胞照像(Kodak)。用diff-quik定影剂(SigmaChemical Company，St.Louis，Missouri，USA)对细胞染色并且再次照像。观察10个场，计数管数并且取平均值。图7给出结果，表明安瑞斯丁(X)相对对照物(无菌PBS，+，BSA，A；7S结构域，-X-)来说抑制管形成。图8A中可以观察到具有代表性的形成得很好的管，该图显示用7S结构域处理过的细胞(放大100×倍)。另一方面，图8B，显示用0.8μg/ml安瑞斯丁处理的MAE细胞管形成不好或者不形成(放大100×倍)。
也对C57/BL6小鼠进行体内matrigel测试。Matrigel在4℃下解冻过夜。其然后与20U/ml的肝素(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，USA)、150ng/ml的bFGF(R & D Systems，Minneapolis，Minnesota，USA)和1μg/ml的安瑞斯丁或者10μg/ml的内静素混合。使用21g针头皮下注射这种matrigel混合物。
对照组接受相同的混合物，但是没有生血管抑制剂。14天之后，杀死小鼠并且取出matrigel栓。将matrigel栓固定在4％多聚甲醛的PBS溶液中在室温下固定4小时，然后转换到PBS中24小时。将所述栓包埋在石蜡中，切片，并且H&E染色。用光学显微镜检查切片并且从10个高强度场计数血管数并且取平均值。
在有或没有递增浓度的安瑞斯丁下，当在bFGF存在下放置Matrigel时，在1μg/ml的安瑞斯丁或者10μg/ml的内静素情况下观察到血管数减少50％。这些结果表明安瑞斯丁通过抑制生血管过程的各个步骤而影响新血管的形成。结果还表明1μg/ml的安瑞斯丁和10μg/ml的内静素在体内抑制新血管形成上同样有效。
实施例8：安瑞斯丁体内抑制肿瘤转移
对C57/BL6小鼠静脉内注射1百万MC38/MUC1(Gong，J.等，1997，Nat.Med.3：558-61)。26天中每隔一天，对5只对照小鼠注射10mM的无菌PBS，同时6只实验小鼠接受4mg/ml的安瑞斯丁。处理26天之后，对每只小鼠计数肺肿瘤结数，并且取两组的平均值。每组记录有两例死亡。安瑞斯丁显著地将原发肿瘤结平均数从对照小鼠的300减少到200。
实施例9：安瑞斯丁体内抑制肿瘤生长
对7至9周龄雄性无胸腺裸鼠皮下注射二百万786-O细胞。在第一组6只小鼠中，让肿瘤生长至大约700mm3。在第二组6只小鼠中，让肿瘤生长至大约100mm3。对有700mm3肿瘤的小鼠以20mg/kg的浓度，对有100mm3肿瘤的小鼠以10mg/kg的浓度，每天I.P.注射安瑞斯丁无菌PBS溶液，注射10天。对照小鼠接受BSA或PBS赋形剂。图9A和9B给出了结果。图9A是说明10mg/kg安瑞斯丁-处理的(□)、BSA处理的(+)和对照小鼠(●)肿瘤体积从700mm3增加的图。安瑞斯丁处理的小鼠的肿瘤从700mm3减小至500mm3，而BSA处理的和对照小鼠的肿瘤在10天内生长至大约1200mm3。图9B说明对于携带100mm3肿瘤的小鼠，安瑞斯丁(□)也导致肿瘤收缩至大约80mm3，而BSA-处理的肿瘤(+)10天内增大至接近500mm3。
收集大约5千万PC-3细胞(人前列腺癌细胞)并且皮下注射给7-至9周龄雄性无胸腺裸鼠。让肿瘤生长10天，然后用游标卡尺测量。
利用标准公式计算肿瘤体积(宽2×长×0.52(O′Reilly，M.S.等，1997，Cell 88：277-85；O′Reilly，M.S.等，1994，Cell 79：31528)。将动物分为5-6只小鼠的组。实验组每日I.P.注射安瑞斯丁(10mg/kg/天)或者内静素(10mg/kg/天)。对照组每天接受PBS。结果见图9C，说明安瑞斯丁(□)抑制肿瘤生长而且比内静素(▲)或者对照(●)更好。重复实验，但是使用安瑞斯丁剂量是4mg/kg/天。结果在图9D中给出(安瑞斯丁，□；对照，●)。8天之后停止处理(二箭头)，但是没有另外的安瑞斯丁处理也有显著的抑制作用持续12多天。
不加处理12天之后，肿瘤开始不受安瑞斯丁抑制影响。
实施例10：安瑞斯丁的免疫组织化学
处理10-20天之后杀死用于肿瘤研究的小鼠。
将肿瘤切除并且固定在4％多聚甲醛中。组织包埋在石蜡中并且切成3μm切片并且固定在载玻片上。将切片去石蜡，37℃下用300mg/ml蛋白酶XXIV(SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)再水合和处理5分钟。用100％乙醇终止消化并且在空气中风干切片并且用10％兔血清封闭。然后将玻片在4℃下与大鼠抗小鼠CD-31单克隆抗体(PharMingen，San Diego，California，USA)的1∶50稀释液一起温育过夜，接着37℃下连续两次在兔抗大鼠免疫球蛋白(DAKO)和大鼠APAAP(DAKO)的1∶50稀释液中温育30-分钟。用新洋红进行颜色反应，并且用苏木紫对切片对比染色。CD-31染色图案说明处理小鼠对对照小鼠的脉管系统有所减少。
对于PCNA染色，组织切片在室温下与PCNA的抗体(SignetLaboratories，Dedham，Massachusetts，USA)的1∶200的稀释液温育60分钟。使用USA Horeseradish过氧化物酶系统(SignetLaboratories，Dedham，Massachusetts，USA)根据厂商说明进行检测。用苏木紫对玻片对比染色。使用1∶500稀释度的多克隆抗-纤连蛋白(SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)和1∶100稀释度的抗-IV型胶原(ICN Phannaceuticals，Costa Mesa，California，USA)实施对纤连蛋白和IV型胶原的染色。使用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratories.Inc.，Burlingame，California，USA)根据厂商说明进行检测。PCNA、纤连蛋白和IV型胶原胞外基质染色说明IV型胶原和纤连蛋白的肿瘤细胞增殖或者肿瘤细胞周围内含物或者体系结构没有差异。
实施例11：安瑞斯丁的循环半衰期
对200g大小的大鼠静脉内注射从人胎盘分离的天然安瑞斯丁。每只大鼠接受5mg人安瑞斯丁。通过使用安瑞斯丁的抗体，在不同的时间点通过直接ELISA对血清分析循环安瑞斯丁的存在。作为对照，在各时间点也对血清白蛋白进行评价来保证对于分析使用相同量的血清。发现安瑞斯丁在血清中循环的半衰期是大约36小时。
对另一组大鼠I.P.和/或皮下注射200μg的人安瑞斯丁，并且评价肺、肾、肝、胰、脾、脑、睾丸、卵巢等中的疾病发病症状。进行直接ELISA并且测定这些大鼠血清中的安瑞斯丁抗体，并且在肾小球基膜上注意到一些内源IgG沉积，这一点以前就观察到过(Kalluri，R.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6201-5)。肾中抗体沉积不伴随任何炎症或者肾功能衰退。这些实验提示安瑞斯丁是不致病的。
实施例12：安瑞斯丁对细胞粘着的作用
37℃下用10μg/ml浓度的人安瑞斯丁或者人IV型胶原(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)包被96-孔平板过夜。37℃下用10％ BSA(SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)PBS溶液将剩余的蛋白质结合位点封闭2小时。HUVEC细胞在EGM-2 MV培养基(Clonetics Corporation，SanDiego，California，USA)中生长至亚汇合(70-80％)。细胞温和地受胰蛋白酶作用并且重新悬浮于无血清培养基中(5×104细胞/毫升)。然后将细胞与10μg/ml的抗体混合并且温育15分钟，并且在室温下温和搅拌。然后将100微升的细胞悬浮液加给每一个孔，并且在37℃和5％CO2下将平板温育45分钟。通过用无血清培养基洗涤去除没有粘着的细胞并且计数粘着的细胞。对照小鼠IgG和抗人β1整联蛋白亚基小鼠单克隆抗体亚基(克隆P4C10)购自Life Technologies(Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)。单克隆抗体α1整联蛋白亚基和αVβ3(分别是克隆CD49a和LM609)购自CHEMICONInternational(Temecula，California，USA)。
结果在图10A和10B中给出，图10A和10B是一对直方图，说明细胞与小鼠IgG(c，对照)、或者α1或β1整联蛋白亚基的抗体、或者αVβ3整联蛋白抗体混合包被的平板上附着HUVEC细胞的百分比(y-轴)。图10A和10B分别说明安瑞斯丁包被的或者IV型胶原包被的平板上附着细胞的百分比。对于安瑞斯丁包被的平板，对于α1亚基发现细胞粘着被抑制60％，对于β1亚基被抑制70％(图10A)，而IV型胶原包被的平板(图10B)显示更轻的抑制作用，对于α1是30％，对于β1是40％，对于αVβ3中和抗体是15％。
实施例13：安瑞斯丁对基质金属蛋白酶的结合和抑制
MMP-2、MMP-9和抗这些酶的抗体购自Oncogene，Inc.。使用如前所述(Kalluri，R.et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6201-5)的从人胎盘分离的天然安瑞斯丁进行直接ELISA。MMP-2和MMP-9都特异性结合安瑞斯丁。它们不结合7S结构域。该结合分别独立于TIMP-2和TIMP-1结合。
为了评价安瑞斯丁降解基膜的能力，37℃温和搅拌下Matrigel与MMP-2和MMP-9温育6小时。通过SDS-PAGE分析上清液，并且用抗IV型胶原α2链抗体免疫印迹。降解测试开始时，以递增浓度加入安瑞斯丁，并且观察MMP-2活性的抑制。在SDS-PAGE凝胶中确定的NC1结构域是26kDa的单体和56kDa的二聚体，并且使用IV型胶原抗体通过蛋白质印迹可以观测。递增浓度的安瑞斯丁抑制MMP-2对基膜的降解，说明安瑞斯丁能够结合MMP-2并且防止它降解基膜胶原。对于MMP-9观察到类似结果。
实施例14.卡斯达丁在大肠杆菌中的重组生产
使用pET22b细菌表达质粒，人卡斯达丁在大肠杆菌中作为功能蛋白质产生，该蛋白质携带C-末端6-组氨酸标记。
图11A和11B分别给出了IV型胶原α2NC1结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。从α2NC1(IV)/pDS载体(Neilson，E.G.等，1993，J.Bio.Chem.268：8402-5；GenBank Accession No.M24766(Killen，P.D.et al.，1994))通过PCR扩增编码卡斯达丁的序列，使用正向引物5′-CGG GAT CCT GTCAGC ATC GGC TAC CTC-3′(SEQ ID NO：7)和反向引物5′-CCC AAGCTT CAG GTT CTT CAT GCA CAC-3′(SEQ ID NO：8)。得到的cDNA片段用BamHI和HindIII消化并且连接到预先消化的pET22b(+)(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中。图12给出了该构建体。该构建体位于带有pelB前导序列的符合读框的卡斯达丁下游和可读框中，使位于胞质并且使可溶蛋白表达。另一个载体序列加给蛋白质编码氨基酸MDIGINSD(SEQ ID NO：13)。该序列的3′端符合读框地连接多组氨酸标记序列。另一个载体序列位于cDNA的3′端和组氨酸标记编码的氨基酸KLAAALE(SEQ ID NO：14)之间。对阳性克隆双链测序。
首先将编码卡斯达丁的质粒构建体转化到大肠杆菌HMS174(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中，然后转化到BL21(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中进行表达。使用过夜细菌培养物接种500ml LB培养基。该培养物生长大约4小时直到细胞密度达到OD600值为0.6。然后通过加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导蛋白质表达。诱导2小时之后，以5000×g离心收集细胞并且再次悬浮于6M胍、0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液中溶菌。对再悬浮的细胞进行短时间声波处理，并且以12000×g离心30分钟。以每分钟2毫升的速度使上清液级分通过5ml Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen，Hilden，德国)4-6次。用15ml含有8M脲、0.1MNaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)的10mM或25mM或50mM咪唑的溶液洗涤，去除没有特异性结合的蛋白质。用两种浓度且含有8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)的咪唑溶液(125mM和250mM)从柱中洗脱出卡斯达丁蛋白质。洗脱出的蛋白质用4℃的PBS透析两次。在透析过程中总蛋白质中的一部分沉淀下来。收集透析的蛋白质并且以大约3500×g离心分离为沉淀和上清液级分。通过BCA(Pierce Chemical Co.，Rocldbrd，Illinois，USA)和定量SDS-PAGE分析测定各级分中的蛋白质浓度。SDS-PAGE表明有大约26-32kDa单体泳带，最可能是27kDa，其中3kDa来自多连接体和组氨酸标记序列。合并含有卡斯达丁的洗脱液并且用PBS透析用于下面的分析。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析卡斯达丁蛋白质，并且通过多组氨酸标记抗体进行检测。也用卡斯达丁抗体检测细菌表达的重组卡斯达丁蛋白质。
大肠杆菌表达的蛋白质优先作为可溶性蛋白质分离出。沉淀中总的蛋白质级分是大约40％，回收的剩余60％是可溶性蛋白质。蛋白质的总产率是大约15毫克/升。
实施例15：293胚胎肾细胞中卡斯达丁的表达
使用pcDNA3.1真核载体在293胚胎肾细胞中也生产出作为分泌的可溶性蛋白质的人卡斯达丁，并且使用亲和层析分离(没有任何纯化或检测标记)。
使用包含α2(IV)NC1的pDS质粒(Neilson，E.G.等，1993，J；Biol.Chem.268：8402-5)以这样的方式PCR扩增卡斯达丁，使得前导信号序列符合读框地加到pcDNA3.1真核表达载体(In Vitlogen，San Diego，California，USA)中。前导序列从全长α2(IV)链5′端克隆5′到NC1结构域使蛋白质分泌到培养基中。用侧翼引物对包含卡斯达丁的重组载体测序。进一步纯化无差错cDNA克隆并且用于体外翻译研究来证实蛋白质表达。应用氯化钙方法(Kingston，R.E.，1996，”Calcium Phosphate Transfection，”pp.9.1.4-9.1.7，in：CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.，等，编著，Wiley和Sons，Inc.，纽约，纽约，USA)使用包含卡斯达丁的质粒和对照质粒转染293细胞。通过遗传霉素抗生素处理(Life Technologies/GibcoBRL，Gaithersburg，Maryland，USA)筛选转染的克隆。在抗生素存在下细胞生长3星期直到不再有细胞凋亡。然后在T-225烧瓶中扩增克隆并且生长到汇合。然后收集上清液并且使用amicon浓缩器(Amicon，Inc.，Beverly，Massachusetts，USA)浓缩。通过SDS-PAGE，免疫印迹分析和ELISA对浓缩的上清液分析卡斯达丁表达。使用卡斯达丁特异性抗体对含有卡斯达丁的上清液进行亲和层析(Gunwar，S.等，1991，J.Biol.Chem.266：15318-24)。鉴定主峰含有大约24kDa的纯单体，其与卡斯达丁抗体(抗-α2NC1抗体，1∶200稀释度)发生免疫反应。
实施例16：卡斯达丁抑制内皮细胞增殖
牛主动脉内皮(C-PAE)细胞在含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM中生长至汇合并且保持接触抑制48小时。37℃下利用胰蛋白酶作用(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)5分钟收获细胞。向包被有10μg/ml纤连蛋白的24-孔平板的每一个孔中加入含有12500个细胞和0.5％ FCS的DMEM悬浮液。在37℃、5％CO2和95％湿度下将细胞温育24小时。去除培养基并且用含有0.5％FCS(没有刺激)或者10％FCS(刺激和处理的细胞)的DMEM代替。786-0、PC-3和HEK293细胞作为对照并且也生长至汇合，受胰蛋白酶作用并且以同样的方法制成平板。用0.025～40μg/ml浓度范围的卡斯达丁或内静素处理细胞，重复三次。在胸苷掺入实验中，在处理时所有的细胞接受1mCurie的3H-胸苷。24小时之后，去除培养基并且用PBS洗涤孔三次。用1N NaOH抽提细胞的放射性并且加给含有4ml ScintiVerse II(Fisher Scientific，Pittsburgh，Pennsylvania，USA)溶液的闪烁瓶。使用闪烁计数器测定胸苷插入。
图13A和13B给出结果，图13A是说明不同量的卡斯达丁对C-PAE细胞增殖的作用的直方图。y-轴是每分钟胸苷掺入量。x-轴上”0.5％”是0.5％FCS(没有刺激)对照，”10％”是10％FCS(刺激)对照。递增浓度的卡斯达丁处理能稳定减少胸苷掺入。图13B是说明递增量的卡斯达丁对非内皮细胞786-O(斑点条框)、PC-3(斜杠条框)和HEK293(白色条框)中胸苷掺入作用的直方图。y-轴是每分钟胸苷掺入量，x-轴表示，对于三个细胞系中的每一个，0.5％FCS(没有刺激)、10％FCS(刺激)对照都用递增浓度的卡斯达丁。所有的组代表三次重复的样品，并且条框代表每分钟的平均量±平均值的标准误差。
也进行亚甲基蓝染色。向各孔中加入3100个细胞并且如上所述处理，然后应用Oliver等(Oliver，M.H.等，1989，J Cell.Science 92：513-8)的方法计数。所有的孔用100ml的1X PBS洗涤一次并且通过加入100ml的10％福尔马林中性缓冲盐水溶液(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，Missouri，USA)在室温下将细胞固定30分钟。去除福尔马林之后，室温下用1％亚甲基蓝溶液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)对细胞染色30分钟。去除染色溶液之后，用100ml的0.01M硼酸盐缓冲液(pH8.5)将孔洗涤5次。室温下用100ml的0.1N HCl/乙醇(1∶1混合物)从细胞萃取亚甲基蓝1小时。在微量滴定板(BioRad，Hercules，California，USA)上使用655nm波长吸光度测定亚甲基蓝染色量。
图13C和13D给出结果。图13C是说明递增量的卡斯达丁对C-PAE细胞摄取染料的作用的直方图。y-轴是OD655的吸光度。”0.1％”代表0.1％FCS处理(没有刺激)对照，”10％”是10％FCS处理(刺激的)对照。剩下的条框代表使用递增浓度的卡斯达丁处理。在C-PAE细胞中，染料摄取降至未刺激细胞中可见到的卡斯达丁处理水平0.625-1.25μg/ml。图13D是说明不同浓度的卡斯达丁对非内皮细胞HEK293(白色条框)和PC-3(斜杠条框)的作用的直方图。y-轴是OD655的吸光度。”0.1％”代表0.1％FCS处理(没有刺激)对照，：“10％”是10％FCS处理(刺激的)对照。条框代表655nm处相对吸光度单位的平均值±每个处理浓度8个孔的标准误差。
用大约0.5μg/ml的ED50值检测10％血清刺激内皮细胞的剂量-依赖性抑制作用(图13A和13C)。在最大40mg/ml卡斯达丁剂量下，对肾癌细胞(786-O)、前列腺癌细胞(PC-3)或者人胚胎肾细胞或者(HEK293)的增殖没有发现明显作用(图13B和13D)。这种内皮细胞特异性表明卡斯达丁可能是特别有效的抗血管生成物质。
实施例17：卡斯达丁抑制内皮细胞迁移
在血管生成过程中，内皮细胞不仅增殖而且迁移。因此，评价了卡斯达丁对内皮细胞迁移的作用。应用Boyden室测试(Neuro-Probe，Inc.，Cabin John，Maryland，USA)，利用人脐带内皮细胞(HUVECs)测试卡斯达丁和内静素对FBS-诱导的趋化性的抑制作用。HUVECs细胞在含有10％FBS和5ng/mlDiIC18(3)活体荧光染料(MolecularProbes，Inc.，Eugene，Oregon，USA)的M199培养基中培养过夜。受胰蛋白酶作用之后，在含有0.5％FBS的M199中洗涤并稀释细胞，在有或没有卡斯达丁(0.01或1.00mg/ml)时在上室孔中接种60000个细胞。将含有2％FBS的M199培养基放置于下室中作为chemotactant。用8微米孔径的聚碳酸酯过滤器(Poretics Corp.，Livermore，California，USA)将含有细胞的隔室和chemotactant分开。在37℃、5％CO2和95％湿度下温育4.5小时。弃去没有迁移的细胞并且用PBS冲洗上面的细胞之后，用塑料片刮过滤器，固定在4％甲醛PBS溶液中，并且置于载玻片上。利用高强度荧光场，通过数字SenSysTM相机记录几个独立的同质图象，所述数字相机用成像处理软件PMIS(Roper Scientific/Photometrics，Tucson，Arizona，USA)操作。使用OPTIMAS6.0软件(Media Cybernetics，Rochester，NY)计数细胞(Klemke，R.L.等，1994，J.Cell.Biol.127：859-66)。
图14给出结果，图14是条形图，说明对于没有VEGF(没有VEGF或者血清)，和有VEGF(1％FCS和10ng/ml VEGF)细胞的处理，和对于0.01卡斯达丁(1％FCS和10ng/ml VEGF和0.01μg/ml卡斯达丁)和1.0μg/ml卡斯达丁(1％FCS和10ng/ml VEGF和1μg/mi卡斯达丁)的处理每个条框区(y-轴)迁移的内皮细胞的数目。
卡斯达丁抑制HUVECs的迁移，10ng/ml时观察到明显作用。卡斯达丁抑制内皮细胞的增殖和迁移的能力提示其在血管生成过程中以一步以上的步骤工作。或者，卡斯达丁可以作为既能影响增殖又能影响迁移的刺激的内皮细胞的程序性细胞死亡信号而起作用。对于另一种抗生血管分子制管张素报道过程序性细胞死亡诱导作用(O′Reilly，M.S.等，1994，Cell 79：315-28；Lucas，R.等，1998，Blood 92：4730-41)。
实施例18：卡斯达丁抑制内皮管形成
作为卡斯达丁抗生血管能力的第一个试验，评价其在Matrigel中的内皮细胞破坏管形成的能力，其中所述Matrigel是从肉瘤肿瘤衍生的小鼠基膜蛋白质的固体凝胶。当在Matrigel上培养小鼠主动脉内皮细胞时，它们很快地排列并且形成空管样结构(Grant，D.S.等，1994，Pathol.Res.Pract.190：854-63)。
将Matrigel(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)(320微升)加到24-孔平板的每一个孔中并且使聚合(Grant，D.S.等，1994，上文)。25,000个小鼠主动脉内皮细胞(MAE)在没有抗生素的EGM-2培养基(Clonetics Corporation，San Diego，California，USA)中的悬浮液注入Matrigel包被的每一个孔中。用递增浓度的卡斯达丁、BSA、无菌PBS或者α5-NC1结构域处理细胞。所有的测试都重复进行三次。细胞在37℃下温育24-48小时并且使用CK2 Olympus显微镜(3.3目镜，10X物镜)观察。然后使用400 DK套装TMAX胶片(Kodak)对细胞照像。用diff-quik定影剂(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)对细胞染色并且再次照像(Grant，D.S.等，1994，Pathol.Res.Pract.190：854-63)。观察10个场，计数管数并且取平均值。
图15给出结果，就是说明BSA(□)、卡斯达丁(■)和α5NC1(○)不同处理下作为对照(PBS-处理孔)管形成百分比(y-轴)的管形成量的图。垂直线代表平均值的标准误差。结果表明卡斯达丁相对对照物来说大大减少内皮管形成。
293细胞中产生的卡斯达丁以依赖于剂量的方式选择性抑制内皮管形成，加入1mg的卡斯达丁可见到几乎完全抑制管形成(图15)。不管是对照蛋白质，还是牛血清白蛋白(BSA)，还是IV型胶原α5链NC1结构域，对内皮管形成都没有作用，证明该项实验中卡斯达丁抑制作用对卡斯达丁是特异性的，并且不是由于加入的蛋白质含量。这些结果表明卡斯达丁是一种抗生血管物质。
实施例19：卡斯达丁对ERK激活的作用
为了进一步理解卡斯达丁抗增殖和抗迁移活性中涉及的分子机理，评价了卡斯达丁对20％胎牛血清和内皮促细胞分裂剂诱导的ERK(胞外信号-调节激酶)激活的作用。在补充有20％FBS、1％青霉素/链霉素、100μg/ml肝素和50μg/ml内皮促细胞分裂剂(Biomedical Technologies，Inc.，Cambridge，Massachusetts，USA)的McCoy′s培养基中将HUVEC细胞培养过夜。第二天，洗涤细胞并且在低血清培养基(补充有1％青霉素/链霉素、100μg/ml肝素和5％FBS的McCoy′s培养基)中培养4小时。4小时之后，用有或没有20μg/ml卡斯达丁的新鲜低血清培养基置换培养基。1小时之后，将血清浓度调节到20％并且加入促内皮细胞分裂剂至最终浓度是50μg/ml。在0、5、10、25和40分钟，细胞用PBS洗涤并且用被动溶胞混合物(Promega，Madison，Wisconsin，USA)加亮抑酶肽、PMSF、NaF、Na3VO4、β-甘油磷酸酯和焦磷酸钠溶胞。对溶胞产物定量测定蛋白质浓度并且在12％SDS-PAGE凝胶上分离。使用磷酸ERK的抗体(New England Biolabs，Beverly，Massachusetts，USA)对血清处理的和血清+卡斯达丁处理的HUVECs进行磷酸-ERK蛋白质印迹。生长因子刺激5分钟之内证实HUVECs中的ERK磷酸化作用。20μg/ml的卡斯达丁处理不影响ERK的早期激活。在较后的时间点发现ERK磷酸化作用降低，是与几种促细胞分裂剂观察到的响应相吻合的曲线(Gupta，K.等，1999，Exp.Cell.Res.247：495-504；Pedram，A.等，1998，J.Biol.Chem.273：26722-26728)。这些观察表明卡斯达丁不主要通过抑制由VEGF或bFGF受体激活地近中心作用而工作。
实施例20：卡斯达丁诱导内皮细胞程序性死亡
膜联蛋白V-FITC标记.为了确定程序性细胞死亡作为卡斯达丁作用的潜在模式，使用膜联蛋白V-FITC标记外部磷脂酰丝氨酸(PS)来评价程序性细胞死亡细胞。向6-孔组织平板的每一个孔加入0.5×106的C-PAE细胞、PC-3、786-O和HEK293细胞，在补加有10％FBS的DMEM(BioWhittaker，Walkersville，Maryland，USA)中培养过夜。向各孔中加入新鲜培养基和40ng/ml TNF-α(正对照)或者15μg/ml卡斯达丁。对照孔接受等体积的PBS。处理24小时之后，收集含有分离的细胞的培养基并且将粘着细胞胰蛋白酶作用，并且与分离的细胞混合，以3000×g离心。然后冲洗细胞，根据厂商说明用FITC-标记的膜联蛋白V(Clontech，Palo Alto，California，USA)进行标记来测定磷脂酰基-丝氨酸外表化作用(早期程序性细胞死亡指征)。使用FACStar Plus流式细胞仪(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)计数膜联蛋白-FITC标记的细胞。对于每一次处理，计数15000个细胞并且排列贮存。然后使用标准Cell Quest软件(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)分析该数据。
发现卡斯达丁特异性诱导内皮细胞程序性死亡，而对PC-3、786-O或HEK 293细胞系没有观察到显著作用。
FLIP蛋白质水平.和上文对于ERK测试一样处理HUVEC细胞，并且在0、1、3、6和24时收集。使用FLIP的抗体(Sata，M.等，1998，J.Biol Chem.273：33103-33106)定量测定血清处理的HUVEC细胞和血清+卡斯达丁处理的HUVEC细胞中FLIP蛋白质水平并且使用粘着斑蛋白水平对蛋白质负载规格化，并且以0小时时间点的百分比作图。
图16给出结果，图16是作为t＝0(y-轴)时存在的蛋白质百分比的粘着斑蛋白水平随着时间(x-轴)的函数的FLIP蛋白质水平的图。用卡斯达丁处理之后1小时FLIP蛋白质水平有所降低，持续至血清刺激后24小时，表明卡斯达丁的程序性细胞死亡作用可能由Fas激活的程序性细胞死亡抑制剂FLIP介导的。因为内皮细胞组成型表达Fas和FasL(Sata，M.等，上文)，可能的是FLIP降低触发caspase激活并且传送终端程序性细胞死亡信号。
实施例21：卡斯达丁体内抑制肿瘤生长
从培养物收集人前列腺癌细胞(PC-3细胞)对7至9周龄雄性SCID小鼠皮下注射二百万细胞的无菌PBS悬浮液。肿瘤生长大约4星期之后，将小鼠分为四只一组。对实验组每天I.P.注射总体积0.1毫升PBS的10mg/kg剂量的卡斯达丁。对照组每天接受等体积的PBS。处理开始时(第0天)，对照小鼠肿瘤范围是88mm3至135mm3体积，卡斯达丁处理小鼠肿瘤范围是108mm3至149mm3体积。每组包括5只小鼠。在指定天数计算的肿瘤体积除以处理第0天的体积，得到分数肿瘤体积(V/V0)。图17A给出了结果，图17A是说明对处理天数(x-轴)作图的分数肿瘤体积(y-轴)±标准误差的图。卡斯达丁-处理的(■)的肿瘤相对对照组(□)大小只有少量增加。
在第二个PC-3实验中，从培养物收集PC-3细胞并且皮下注射给6至7周龄雄性无胸腺裸鼠，将动物分为4只小鼠的组之后让肿瘤皮下生长大约2星期。对实验组(4只小鼠)每天I.P.注射总体积0.2毫升PBS中3mg/kg剂量的卡斯达丁或者相同PBS体积中8mg/kg剂量的内静素。对照组(4只小鼠)每天接受等体积的PBS。用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，并且利用标准公式计算肿瘤体积：宽2×长×0.52。肿瘤体积范围是26mm3至73mm3，并且在指定天数计算的肿瘤体积除以处理第0天的体积，得到分数肿瘤体积(V/V0)，如上所述。图17B给出了结果，图17B是说明对处理天数(x-轴)作图的分数肿瘤体积(y-轴)±标准误差的图。相对于对照组(□)，卡斯达丁-处理的(■)的肿瘤大小只有少量增加，并且这些结果顺利地与用内静素(○)实现的那些相比较。
对于肾细胞癌细胞模型，7至9周龄雄性无胸腺裸鼠皮下注射2百万786-O细胞。让肿瘤生长至大约100mm3或者大约700mm3。每组包括6只小鼠。每天以10mg/kg浓度I.P.注射无菌PBS中的卡斯达丁。对照组接受等体积的PBS。结果见图17C(100mm3肿瘤)和15D(700mm3肿瘤)。在两个组中，卡斯达丁-处理(■)肿瘤实际上相对于对照组(□)收缩。
与安慰剂处理的小鼠相比，大肠杆菌中产生的卡斯达丁分别抑制小(100mm3，图17C)和大(700mm3，图17D)肾细胞癌(786-O)肿瘤的生长4-倍和3-倍。对于结合严重免疫缺陷(SCID)小鼠的确诊的人前列腺(PC-3)肿瘤，10mg/kg的卡斯达丁占仅注射赋形剂小鼠的55％分数肿瘤体积(比其小1.8-倍)。在无胸腺(nu/nu)小鼠中，处理的肿瘤比安慰剂处理的小鼠的小2.4倍。肿瘤大小的减小与CD-31-正脉管系统中的降低相吻合(参见下文实施例29)。在无胸腺小鼠中，使用低剂量的卡斯达丁和内静素，3mg/kg的卡斯达丁和8mg/kg的内静素一样具有相同的抑制作用，5mg/kg剂量的内静素不能抑制肿瘤生长。在所有的体内研究中，小鼠表现健康，没有消瘦现象，并且在处理期间没有一只小鼠死亡。
实施例22：卡斯达丁处理小鼠的CD31免疫组织化学
体内肿瘤的减小提示对这些肿瘤中血管形成的抑制作用。在异种移植肿瘤研究最后杀死小鼠并且将肿瘤切除。为了测定肿瘤血管，对石蜡包埋的肿瘤切片进行CD31抗体碱性磷酸酶-偶联的免疫组织化学反应。将切除的肿瘤切成几个大约3-4mm厚的片，然后固定在4％多聚甲醛中24小时。在脱水和石蜡包埋之前使组织接触PBS24小时。在石蜡中包埋之后，切下3mm组织切片并且固定。将切片去石蜡，37℃下用300mg/ml蛋白酶XXIV(SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)再水合和预处理5分钟。用100％乙醇终止消化并且在空气中风干切片，用10％兔血清再水合和封闭。然后将玻片在4℃下与大鼠抗小鼠CD-31单克隆抗体(PharMingen，San Diego，California，USA)的1∶50稀释液一起温育过夜，接着37℃下连续两次在兔抗大鼠免疫球蛋白(DAKO)和大鼠APAAP(DAKO)的1∶50稀释液中各温育30分钟。用新洋红进行颜色反应，并且用苏木紫对切片对比染色。
发现卡斯达丁处理的肿瘤中肿瘤的减小与CD31正脉管系统减少相吻合。
实施例23：塔牡斯达丁和塔牡斯达丁突变体在大肠杆菌中的重组生产
图18A和18B分别给出了IV型胶原NC1结构域的α3链的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)和氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。从α3 NC1(IV)/pDS载体(Neilson，E.G.等，1993，J.Bio.Chem.268：8402-5；GenBank Accession No.M92993(Quinones，S.等，1994)，M81379.(Turner，N.等，1994)，和X80031(Leionin，A.K.，和Mariyama，M.等，1998))通过PCR扩增编码塔牡斯达丁的序列，使用正向引物5′-CGG GAT CCA GGT TTG AAA GGA AAA CGT-3′(SEQ IDNO：11)和反向引物5′-CCC AAG CTT TCA GTG TCT TTT CTT CAT3′(SEQ ID NO：12)。得到的cDNA片段用BamHI和HindIII消化并且连接到预先消化的pET22b(+)(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中。图19给出了该构建体。该连接位于带有pelB前导序列的符合读框的塔牡斯达丁下游和可读框中，以位于胞质并且使可溶蛋白表达。另一个载体序列加给蛋白质编码氨基酸MDIGINSD(SEQ IDNO：13)。该序列的3′端符合读框地连接多组氨酸标记序列。另一个载体序列位于cDNA的3′端和组氨酸标记编码的氨基酸KLAAALE(SEQ ID NO：14)之间。对阳性克隆双链测序。首先将编码塔牡斯达丁的质粒构建体转化到大肠杆菌HMS174(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中，然后转化到BL21(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中进行表达。使用过夜细菌培养物接种500ml LB培养基(FisherScientific，Pittsburgh，Pennsylvania，USA)。该培养物生长大约4小时直到细胞密度达到OD600为0.6。然后通过加入IPTG至终浓度为1mM诱导蛋白质表达。诱导2小时之后，以5000×g离心收集细胞并且再次悬浮于含有6M胍、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液中溶菌。对再悬浮的细胞进行短时间声波处理，并且以12000×g离心30分钟。以每分钟2毫升的速度使上清液级分通过5mlNi-NTA琼脂糖柱(Qiagen，Hilden，德国)4-6次。用含有8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)和10mM或25mM咪唑的溶液洗涤，去除没有特异性结合的蛋白质。用递增浓度并含有8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)的咪唑(50mM、125mM和250mM)从柱中洗脱出塔牡斯达丁蛋白质。洗脱出的蛋白质用4℃的PBS透析两次。在透析过程中总蛋白质中的一部分沉淀下来。收集透析的蛋白质并且以大约3500×g离心分离为不溶的(沉淀)和可溶的(上清液)级分。
大肠杆菌表达的塔牡斯达丁优先作为可溶性蛋白质分离出，并且SDS-PAGE分析表明有31kDa单体泳带。另外的3kDa来自多连接体和组氨酸标记序列。在下面的实验中使用含有该泳带的洗脱的级分。通过BCA测定(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，USA)和定量SDS-PAGE分析，使用扫描测光密度术测定各级分的蛋白质浓度。在还原条件下，观察到的大约60kDa的带代表确定为31kDa单带的非还原条件下塔牡斯达丁的二聚体。蛋白质的总产率大约是每升5毫克。
大肠杆菌中产生重组截短的缺少53个N末端氨基酸的塔牡斯达丁(塔牡斯达丁-N53)，并且根据先前对于另一种突变体的描述(Kallun，R.等，1996，J Biol.Chem.271：9062-8)进行纯化。该突变体如图20所示，它是一个组成图，说明α3(IV)NC1单体中截短的氨基酸的位置。实心圆圈相应于从塔牡斯达丁缺失N-末端53个氨基酸残基，产生′塔牡斯达丁-N53′(Kalluri，R.等，1996，J Biol.Chem.271：9062-8)。短线标出的二硫键和它们在α1(IV)NC1和α2(IV)NC1中一样排列(Siebold，B.等，1988，Eur.J.Biochem.176：617-24)。为清楚起见，只标出两个可能的二硫键构型中的一个。
按前述方法，制备抗人α3(IV)NC1的兔抗体(Kalluri，R.等，1997，J.Clin.Invest.99：2470-8)。单克隆大鼠抗小鼠CD31(血小板内皮细胞粘着分子，PECAM-1)抗体购自PharMingen(San Diego，California，USA)。FITC偶联的山羊抗大鼠IgG抗体、FITC偶联的山羊抗兔IgG抗体和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG抗体均购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Missouri，USA)。
通过SDS-PAGE和如上所述对于塔牡斯达丁表达的免疫印迹分析(Kalluri，R.等，1996，J.Biol.Chem.271：9062-8)分析上面获得的浓上清液。使用12％解析凝胶和不连续缓冲系统进行一维SDS-PAGE。将分离的蛋白质移至硝基纤维素膜并且在室温下用2％BSA封闭30分钟。封闭剩余的结合位点之后，用洗涤缓冲液充分洗涤膜并且以在含有1％BSA的PBS中1∶1000的稀释度与一抗温育。在摇床上室温下温育过夜。然后用洗涤缓冲液充分洗涤印迹并且与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下在摇床上温育3小时。然后充分洗涤印迹并且加入底物(含有0.01％氯化钴和镍铵的0.05M磷酸缓冲液中的二氨基联苯胺)并且在室温下温育10分钟。然后倒出底物溶液，并且加入含有过氧化氢的底物缓冲液。
出现带之后，用蒸馏水终止反应，并且干燥印迹。看到31kDa的单一带。
实施例24：293胚胎肾细胞中塔牡斯达丁的表达
使用pcDNA3.1真核载体在293胚胎肾细胞中也生产出作为分泌的可溶性蛋白质的人塔牡斯达丁。使用亲和层析分离(没有任何纯化或检测标记)该重组蛋白质，然后通过SDS-PAGE和免疫印迹分析在主峰中检测出纯单体形式。
使用包含α3(IV)NC1的pDS质粒(Neilson，E.G.等，1993，J；Biol.Chem.268：8402-5)以这样的方式PCR扩增塔牡斯达丁，使得前导信号序列符合读框地加到pcDNA 3.1真核表达载体(In Vitlogen，San Diego，California，USA)中。前导序列从全长α3(IV)链5′端克隆5′到NC1结构域使蛋白质分泌到培养基中。用侧翼引物对包含塔牡斯达丁的重组载体双链测序。进一步纯化无差错cDNA克隆并且用于体外翻译研究来证实蛋白质表达。应用氯化钙方法(Sambrook，J.et al.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA，pps.16.32-16.40)使用包含塔牡斯达丁的质粒和对照质粒转染293细胞。通过遗传霉素抗生素处理(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)筛选转染的克隆。在抗生素存在下细胞生长3星期直到不再有细胞凋亡。然后在T-225烧瓶中扩增克隆并且生长到汇合。然后收集上清液并且使用amicon浓缩器(Amicon，Inc.，Beverly，Massachusetts，USA)浓缩。通过SDS-PAGE、免疫印迹分析和ELISA对浓缩的上清液分析塔牡斯达丁表达。通过ELISA检测上清液中的强结合。
使含有塔牡斯达丁的上清液进行亲和层析，并且用抗-塔牡斯达丁和抗-6-组氨酸标记抗体(Gunwar，S.等，1991，J.Biol.Chem.266：15318-24)进行免疫检测。鉴定主峰含有大约31kDa单体，其与塔牡斯达丁抗体发生免疫反应。
实施例25：塔牡斯达丁抑制内皮细胞增殖
通过使用大肠杆菌生产的可溶性蛋白质进行3H-胸苷掺入实验来测定塔牡斯达丁对C-PAE细胞的抗-增殖作用。
细胞系和培养。从美国典型培养物收集保藏中心获得786-O(肾清细胞癌细胞系)、PC-3(人前列腺癌细胞系)、C-PAE(牛肺动脉内皮细胞系)、HPE(人初期前列腺内皮细胞)、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)、MAE(小鼠主动脉内皮细胞系)。786-O和C-PAE细胞系在含有10％胎牛血清(FCS)、100单位/毫升的青霉素、100mg/ml的链霉素和10％胎牛血清(FCS)的DMEM(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)中保持，HPE细胞在补充有牛脑垂体提取物和重组人EGF(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)的角质细胞-SFM中保持，而HUVEC和MAE细胞在EGM-2(Clonetics Corporation，San Diego，California，USA)中保持。
增殖测试。C-PAE细胞在含有10％FCS的DMEM中生长至汇合并且保持接触抑制48小时。使用第二代和第四代之间的C-PAE细胞。在该实验中786-O和PC-3细胞用作非内皮对照物。37℃下利用胰蛋白酶作用(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)5分钟收获细胞。向包被有10μg/ml纤连蛋白的24-孔平板的每一个孔中加入含有12500个细胞和0.1％FCS的DMEM的悬浮液。在37℃、5％CO2和95％湿度下将细胞温育24小时。去除培养基并且用含有20％FCS的DMEM代替。没有刺激的对照细胞与0.1％FCS温育。用0.01～10mg/ml浓度范围的各种浓度的塔牡斯达丁处理细胞。在开始处理之后，所有的孔接受1mCurie的3H-胸苷。24小时之后，去除培养基并且用PBS洗涤孔三次。用1N NaOH抽提细胞并且加到含有4ml ScintiVerse II(Fisher Scientific，Pittsburgh，Pennsylvania，USA)溶液的闪烁瓶。使用闪烁计数器测定胸苷插入。
在亚甲基蓝染色方法中，向96孔平板中的各孔中加入7000个细胞并且如上所述处理。然后应用Oliver等(Oliver，M.H.等，1989，J Cell.Science 92：513-8)的方法对细胞计数。处理48小时之后，所有的孔用100微升的PBS洗涤一次并且通过加入10％福尔马林中性缓冲盐水溶液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)将细胞固定。用含有1％亚甲基蓝溶液(Sigma)的0.01M硼酸盐缓冲液(pH8.5)对细胞染色。用0.01M硼酸盐缓冲液将孔洗涤，并且用0.1NHCl/乙醇从细胞萃取亚甲基蓝，在微量滴定板(BioRad，Hercules，California，USA)上使用655nm波长测定吸光度。使用终浓度是5微克/毫升的多粘菌素B(Sigma)来灭活内毒素(Liu，S.等，1997，Clin.Biochem.30：455-63)。
图21A、21B和21C给出结果，它们说明当用不同量的塔牡斯达丁(x-轴)处理时，C-PAE细胞(图21A)、PC-3细胞(图21B)和786-O细胞(图21C)的3H-胸苷掺入(y-轴)的直方图。所有的组代表三次重复的样品。塔牡斯达丁以剂量依赖方式显著抑制20％FCS刺激的3H-胸苷掺入，ED50大约是0.01mg/ml(图21A)。而且，即使在至多20mg/ml的塔牡斯达丁剂量下，对前列腺癌细胞(PC-3)或者肾癌细胞(786-O)没有发现显著的抗增殖作用(图21B和21C)。3H-胸苷掺入平均值在塔牡斯达丁处理的(0.1-10mg/ml)和对照物中之间的差异是显著的(P＜0.05)。当使用塔牡斯达丁处理PC-3细胞或者786-O细胞时，没有发现抑制作用(图21B，21C)。每一条框代表平均值±三个孔的SE。该项实验重复三次。星号标记的条框是统计学意义的，t-试验测得P＜0.05。
实施例26：竞争增殖测试
如上所述用C-PAE细胞制成96-孔板用于内皮细胞增殖测试。终浓度是0.1μg/ml的塔牡斯达丁与不同浓度(0、0.008、0.08、0.8、1.6和2.4μg/ml)的人αVβ3蛋白质(CHEMICON International，Temecula，California，USA)在室温下温育30分钟。然后将该混合物加到孔中，并且温育48小时。然后利用上文内皮细胞增殖测试所述的亚甲基蓝染色方法进行增殖测试。
结果如图22所示，图22是说明x-轴上与递增量的αVβ3结合的0.1μg/ml的塔牡斯达丁对C-PAE细胞摄入染料的影响的直方图。y-轴是OD655吸光度。“0.1％FCS”代表0.1％FCS处理的(没有刺激)对照物，“20％FCS”是20％FCS处理的(刺激的)对照物。其余条框代表单独αVβ3的对照，和使用塔牡斯达丁加递增浓度的αVβ3的处理。每一条框代表三个孔的平均值±平均标准误差。该项实验重复三次。星号标记指示t-试验测得P＜0.05。
如上所述，塔牡斯达丁一般以剂量依赖方式抑制细胞增殖。但是加入αVβ3整联蛋白时，塔牡斯达丁的抗增殖作用以剂量依赖方式与αVβ3蛋白的递增浓度呈反比，表明αVβ3整联蛋白有效地“饱和了”抑制内皮细胞增殖的塔牡斯达丁。2.4μg/ml的αVβ3(3倍摩尔过量)显著逆转塔牡斯达丁诱导的抗增殖作用达43.1％。单独用αVβ3处理没有抑制内皮细胞增殖。
实施例27：塔牡斯达丁诱导内皮细胞程序性死亡
膜联蛋白V-FITC测试。在程序性细胞死亡早期，发现膜磷脂PS从质膜内表面易位到外部(van Engeland，M.等，1998，Cytometry31：1-9；zhang，G.等，1997，Biotechniques 23：525-531；Koopman，G.等1994，Blood 84：1415-1420)。通过使用本质对PS有高结合亲和性的膜联蛋白V的FITC偶联物进行染色可以检测外部化PS(vanEngeland，上文)。因此可以使用膜联蛋白V-FITC标记来评价用塔牡斯达丁处理时内皮细胞的程序性细胞死亡细胞。
将C-PAE细胞(0.5×106/孔)接种到补加装有10％FBS的DMEM的6孔平板上。第二天，加入含有10％FCS的新鲜培养基和80ng/ml的TNFα(正对照)或者0.02-20μg/ml的塔牡斯达丁。对照细胞接受等体积的PBS。处理18小时之后，收集含有漂浮细胞的培养基，并且用胰蛋白酶处理粘着细胞，与漂浮细胞一起以3000×g离心。然后用PBS冲洗细胞，再次悬浮于结合缓冲液(10mM HEPES/NaOH，pH7.4，140mM NaCl，2.5mMCaCl2)。加入膜联蛋白V-FITC(Clontech，Palo Alto，California，USA)至最终浓度150ng/ml，将细胞避光下温育10分钟。再次用PBS洗涤细胞并且再次悬浮于结合缓冲液。使用FAC Star Plus流式细胞仪(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)计数膜联蛋白-FITC标记的细胞。对于每一次处理，计数15000个细胞并且排列贮存。然后使用Cell Quest软件(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)分析该数据。
18小时之后20μg/ml的塔牡斯达丁表现出膜联蛋白荧光峰的显著位移。对于20μg/ml的塔牡斯达丁和正对照TNF-α(80ng/ml)来说，荧光强度位移是相似的。2μg/ml的塔牡斯达丁也表现出膜联蛋白荧光强度中等位移，但是浓度低于0.2μg/ml证明没有任何膜联蛋白V确定性。当使用非内皮细胞(PC-3)时没有发现峰强度位移。
根据相对比显微镜的监测，塔牡斯达丁也改变了C-PAE细胞的细胞形态。在纤连蛋白包被的平板上，在10％FCS存在时用20μg/ml的塔牡斯达丁处理细胞24小时之后，可以观察到程序性细胞死亡、膜泡、胞质收缩和染色质缩合的典型的形态特征。在对照孔中，细胞表现出完整的形态学。
Caspase-3测试。Caspase-3(CPP32)是程序性细胞死亡早期激活的胞内蛋白酶，通过降解结构蛋白和DNA修复蛋白而引发细胞破碎(Casciola-Rosen，L.等，1996，J Exp.Med.183：1957-1964；Salvesen，G.S.等，1997，Cell 91：443-446)。可以通过检测从标记的底物(DEVD-pNA)裂解的发色团(对硝基苯胺)来用分光光度法测定Caspase-3的蛋白酶活性。
C-PAE细胞或者PC-3细胞(0.5×106/孔)接入10％FCS的DMEM中，并在预先包被有纤连蛋白(10μg/ml)的6孔平板培养温育过夜。第二天，用含有2％FCS的DMEM置换培养基后，在37℃下温育过夜。然后用含有2％FCS和TNFα(80ng/ml，正对照)或者塔牡斯达丁(10μg/ml)的DMEM溶液中的bFGF(3ng/ml)刺激细胞，温育24小时。对照物接受PBS缓冲液。24小时之后，收集上清液细胞并且用胰蛋白酶处理粘着细胞，与上清液细胞合并。计数细胞并且以4×107细胞/毫升的浓度再次悬浮于细胞溶解缓冲液(Clontech，PaloAlto，California，USA)中。接下来的方案根据厂商说明(Clontech，PaloAlto，California，USA)。使用Caspase-3的一种特异性抑制剂DEVD-fmk(Asp-Glu-Val-Asp-氟甲基酮)来证实测试的特异性。在微量滴定平板读数器(Bio-Rad，Hercules，California，USA)上在405nm下测定吸光度。对于每种细胞类型测定重复三次。
图23A和23B给出了结果，图23A和23B是一对直方图，说明不同各种处理下(x-轴)，C-PAE细胞(图23A)和PC-3细胞(图23B)的Caspase-3活性对OD405吸光度(y-轴)的函数。每个条框柱代表三个孔的平均值+/-标准误差。
用20μg/ml的塔牡斯达丁处理的C-PAE细胞表现出Caspase-3活性提高1.6倍，而正对照TNF-α与对照物相比表现出可比较的(1.7倍)提高。Caspase-3的具体的指示剂DEVD-fmk将蛋白酶活性降低至基线，表明测定的活性的提高对于Caspase-3是特异性的。在非内皮PC-3细胞中，对照和塔牡斯达丁处理的细胞之间的Caspase-3活性没有差异。
实施例28：细胞粘着测试
在整联蛋白亚基α1至α6、β1和αVβ3整联蛋白封闭抗体存在下，观察了HUVECs对塔牡斯达丁包被平板的附着。对Senger等的方法(Senger，D.R.等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USS 94：13612-13617)稍作改进后进行该项测试。用人塔牡斯达丁、小鼠层粘连蛋白-1或者人IV型胶原(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)以10μg/ml的浓度对96-孔板包被后在37℃下过夜。然后使用玻连蛋白(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)以0.5μg/ml的浓度包被平板。用含有100mg/ml的BSA的PBS(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)将剩余的蛋白质结合位点封闭2小时。使HUVEC细胞在EGM-2培养基中生长至亚汇合(70-80％)，温和地用胰蛋白酶处理并且再次悬浮于无血清培养基(1.5×105细胞/ml)。细胞与10μg/ml的小鼠IgG1(对照)(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersberg，Maryland，USA)或者抗体(抗人β1整联蛋白的小鼠单克隆抗体(克隆P4C10)(LifeTechnologies/Gibco BRL，Gaithersberg，Maryland，USA)、人整联蛋白α1至α6的单克隆抗体(CHEMICON International，Temecula，California，USA)和αVβ3整联蛋白(克隆LM609)(CHEMICONInternafional))混合，然后并且室温温和搅动下温育15分钟。然后将100微升细胞悬浮液加给每个孔，并且在37℃下温育45分钟。通过洗涤去除没有附着的细胞，用亚甲基蓝染色之后计数附着细胞数目。根据上述方法，在其它实验中使用C-PAE细胞。
图24A至24D和图25给出了结果，图24A、24B、24C和24D是一组四个直方图，说明在整联蛋白亚基α1至α6、β1或者αVβ3整联蛋白阻断抗体存在下HUVEC细胞对用塔牡斯达丁(图24A)、IV型胶原对照物(图24B)、玻连蛋白(图24C)或者层粘连蛋白-1(图24D)包被的平板的结合。图25是说明C-PAE细胞与塔牡斯达丁-包被平板结合的直方图。在每个表的上方列出了平板包被物，每个表的x-轴是用于温育的抗体。BSA-包被的平板用作负对照。
与IgG-包被的对照平板相比，α6、β1或者αVβ3的抗体显著封闭与塔牡斯达丁包被平板附着的HUVEC细胞。当一起使用β1和αVβ3的抗体时细胞附着被进一步抑制。与对照IgG处理相比，αVβ3抗体抑制细胞附着80％，而α6或β1抗体封闭54％。尽管α5表现出较小的抑制作用(20％)，亚基α1至α4的抗体则不阻断细胞附着。当一起使用αVβ3抗体和β1抗体时，细胞结合被阻断91％。
在塔牡斯达丁包被的平板上使用C-PAE细胞代替HUVEC细胞也发现可比较的抑制作用。用IV型胶原包被平板，玻连蛋白和层粘连蛋白-1也作为对照物。α1β1和α2β1整联蛋白结合胶原(Elices，M.J.等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：9906-9910 Ignatius，M.J.等，1990，J.Cell.Biol.111：709-720)。与对照组IgG温育的细胞相比，α1(20％)、α2(27％)和β1(53％)的抗体部分抑制细胞结合到IV型胶原包被平板上。αVβ3整联蛋白是玻连蛋白的受体(Hynes，R.O.等，1992，Cell 69：11-25)。αVβ3的抗体抑制61％细胞结合到玻连蛋白包被平板上。α5β1和α6β1整联蛋白结合层粘连蛋白(Wayner，E.A.等，1988，J.Cell.Biol.107：1881-1891；Sonnenberg，A.等，1988，Nature 336：487-489)。α5或α6的抗体分别阻断50％和89％的内皮细胞结合到层粘连蛋白-1包被平板上。与IgG处理对照物相比较，β1或αVβ3的抗体显著抑制细胞附着到塔牡斯达丁包被板上(图25)。当一起使用β1和αVβ3的抗体时，细胞附着被进一步抑制。
实施例29：塔牡斯达丁抑制内皮管形成
将Matrigel(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)(320微升)加到24-孔平板的每一个孔中并且使聚合(Grant，D.S.等，1994，上文)。25000个MAE细胞在没有抗生素的EGM-2培养基(Clonetics Corporation，San Diego，California，USA)中的悬浮液注入到Matrigel(Grant，D.S.等，1994，Pathol.Res.Pract.190：854-63)包被的每一个孔中。用递增浓度的塔牡斯达丁、BSA、无菌PBS或者7S结构域处理细胞。对照细胞与无菌PBS温育。所有的测试都重复进行三次。细胞在37℃下温育24-48小时并且使用CK2 Olympus显微镜(3.3目镜，10X物镜)观察。然后使用400 DK套装TMAX胶片(Kodak)对细胞照像。用diff-quik定影剂(SigmaChemical Company，St.Louis，Missouri，USA)对细胞染色并且再次照像(Grant，D.S.等，1994，Pathol.Res.Pract.190：854-63)。观察数个场，由两名不知道实验方案的研究人员计数管数并且取平均值。
图26给出结果。当在小鼠基质膜蛋白固体凝胶Matrigel上培养小鼠主动脉内皮细胞时，它们快速排列并且形成空管样结构(Haralabopoulos，G.C.等，1994，Lab.Invest.71：575-82)。293细胞产生的塔牡斯达丁与BSA对照物(图26)相比较，以剂量依赖方式显著抑制MAE细胞中内皮管形成。用1mg/ml的蛋白质处理之后，管形成百分比是BSA98.0±4.0和塔牡斯达丁14.0±4.0。使用大肠杆菌产生的塔牡斯达丁也获得了相似结果。IV型胶原的7S结构域(N末端非胶原结构域)对内皮管形成没有作用。浓度在800-1000ng/ml之间的塔牡斯达丁获得最大抑制。塔牡斯达丁处理(●，0.1-10mg/ml)和对照物(BSA(□)，7S结构域(○))的平均百分比值之间的差异是显著的(P＜0.05)。每一点代表三个孔的平均值±SE。该项实验重复三次。星号标记的数据点是显著的，t-试验测得P＜0.05。在7S结构域处理中发现形成完好的管。用0.8mg/ml的塔牡斯达丁处理的MAE细胞表现出减少的管形成。
为了评价体内塔牡斯达丁对新毛细管形成的作用，进行Matrigel栓测试(Passaniti，A.等，1992，Lab.Invest.67：519-29)。获得5至6周龄雄性C57/BL6小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine，USA)。Matrigel(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)在4℃下解冻过夜。然后与20U/ml的肝素(PierceChemical Co.，Rockford，Illinois，USA)、150ng/ml的bFGF(R&DSystems，Minneapolis，Minnesota，USA)和1mg/ml的塔牡斯达丁混合，然后注射给C57/BL6小鼠。对照组不接受生血管抑制剂。使用21规格针头皮下注射这种matrigel混合物。14天之后，杀死小鼠并且取出matrigel栓。将matrigel栓固定在4％多聚甲醛(PBS溶液)中，在室温下固定4小时，然后转换到PBS中24小时。将所述栓包埋在石蜡中、切片，并且H&E染色。用光学显微镜检查切片并且从10个高强度场计数血管数并且取平均值。对所有的切片编号并且由不知道研究方案的病理学家观察。
在有或没有大肠杆菌产生的塔牡斯达丁下，当在bFGF和肝素存在下放置Matrigel时，用1mg/ml的塔牡斯达丁处理发现血管数减少67％。每个高强度场的血管数是：塔牡斯达丁2.25±1.32，对照物7.50±2.17。每一个条框代表每组5-6只小鼠的平均值±SE。与用PBS处理的对照物相比，塔牡斯达丁(1mg/ml)体内显著抑制新血管化作用。塔牡斯达丁处理动物和对照动物的平均百分比值之间的差异是显著的(P＜0.05)。塔牡斯达丁处理是显著的，t-试验测得P＜0.05。
实施例30：塔牡斯达丁和塔牡斯达丁突变体体内抑制肿瘤生长
收集大约5百万PC-3细胞并且皮下注射给7至9周龄雄性无胸腺裸鼠。用游标卡尺测量肿瘤，并且利用标准公式宽2×长×0.52计算肿瘤体积。让肿瘤生长至大约100mm3，然后将动物分为5或6只小鼠的组。对各实验组，每日腹膜内注射无菌PBS中的塔牡斯达丁或者小鼠内静素(20mg/kg/天)，注射10天。对照组接受赋形剂注射(BSA或PBS)。在10天中每2或3天计算肿瘤体积。结果见图27A，图27A是说明分别用PBS对照(□)、20mg/kg塔牡斯达丁(●)和20mg/kg内静素(○)处理时，肿瘤体积(mm3)(y-轴)对处理天数(x-轴)的图。大肠杆菌产生的塔牡斯达丁显著抑制PC-3人前列腺肿瘤的生长(图27A)。20mg/Kg的塔牡斯达丁与20mg/kg的内静素类似，抑制肿瘤生长(图27A)。在第10天观察到对肿瘤生长的显著抑制作用(对照202.8±50.0mm3，塔牡斯达丁82.9±25.2mm3，内静素68.9±16.7mm3)。与对照物相比，每天腹膜内注射塔牡斯达丁或内静素抑制人前列腺癌细胞(PC-3)肿瘤的生长。当肿瘤体积小于100mm3时开始该项实验。
也研究了塔牡斯达丁对小鼠已经确诊的另一种原发肿瘤的作用。对7至9周龄雄性无胸腺裸鼠背部皮下注射二百万786-O细胞。让肿瘤生长至大约600-700mm3，并且将动物分为6只一组。每天腹膜内注射塔牡斯达丁(6mg/kg)无菌PBS溶液，注射10天。对照小鼠接受BSA注射。结果见图27B，图27B是说明PBS对照(□)和6mg/kg塔牡斯达丁(●)处理时]肿瘤体积(mm3)(y-轴)对处理天数(x-轴)的图。与BSA相比较，6mg/kg的大肠杆菌产生的塔牡斯达丁抑制786-O人肾细胞癌肿瘤的生长(图27B)。在第10天观察到对肿瘤生长的显著抑制作用(对照1096±179.7mm3，塔牡斯达丁619±120.7mm3)。与对照物相比，每天腹膜内注射塔牡斯达丁抑制人肾细胞癌(786-O)肿瘤的生长。当肿瘤体积是600-700mm3时开始该项实验。每一个点代表每组5-6只小鼠的平均值±SE。星号标记的数据点是显著的，t-试验测得P＜0.05。
IV型胶原的α3链的NC1结构域的一部分(α3(IV)NC1)是古德帕斯彻综合症德病原表位(Butkowski，R.J.等，1987，J.Biol.Chem.262：7874-7；Saus，J.等，1988，J.Biol.Chem.263：13374-80；Kalluri，R.等，1991，J Biol.Chem.266：24018-24)。古德帕斯彻综合症是一种特征在于肺出血和/或快速发病的肾小球性肾炎的自身免疫疾病(Wilson，C.& F.Dixon，1986，The Kidney，W.B.Sanders Co.，Philadelphia，Pennsylvania，USA，pps.800-89；Hudson，B.G.等，1993，J.Biol.Chem.268：16033-6)。这些症状是由通过抗α3(IV)NC1自身抗体的结合而破坏血管小球和肺泡基膜引起的(Wilson，1986，上文；Hudson，1993，上文)。几个研究组试图作图或预测古德帕斯彻综合症自身抗原在α3(IV)上的位置(Kalluri，R.等，1995，J.Am.Soc.Nephrol.6：1178-85；Kalluri，R.等，1996，J.Biol.Chem.271：9062-8；Levy，J.B.等，1997，J.Am.Soc.Nephrol.8：1698-1705；Kefalides，N.A.等，1993，Kidney Int.43：94-100；Quinones，S.等，1992，J：Biol.Chem.267：19780-4(erratum in J.Biol.Chem.269：17358)；Netzer，K.O.等，1999，J.Biol.Chem.274：11267-74)，据报道，N-末端、C-末端和中间部分的残基是表位位置。最近，N端头40个氨基酸中鉴定了最有可能的与疾病相关的病原表位(Hellmark，T.等，1999，Kidney Int.55：936-44)，并且进一步证实是N-末端40个氨基酸。设计了相应于古德帕斯彻综合症病原自身表位的缺失N-末端53个氨基酸的截短的塔牡斯达丁(塔牡斯达丁N53)。在下面的实验中使用该突变体蛋白质。
对7至9周龄雄性无胸腺裸鼠背部皮下注射二百万786-O肾细胞癌细胞。让肿瘤生长至大约100-150mm3大小。将小鼠分为5只一组，并且每天腹膜内注射20mg/kg的大肠杆菌表达的缺失53个N末端氨基酸的截短的塔牡斯达丁(Kalluri，R.等，1996，J Biol.Chem.271：9062-8)，注射10天。对照小鼠接受PBS注射。结果见图28，图28是说明对照小鼠(□)和用塔牡斯达丁突变体N53处理的小鼠(●)肿瘤体积的增加(y-轴)对处理天数(x-轴)的图。与对照物相比较，从第4天至第10天，6mg/kg的大肠杆菌产生的塔牡斯达丁-N53抑制786-O人肾癌肿瘤的生长(第10天；塔牡斯达丁-N53 110.0±29.0mm3，对照345.0±24.0mm3)(图28)。每一个点代表每组5-6只小鼠的平均值±SE。星号标记的数据点是显著的，t-试验测得P＜0.05。
实施例31：对α3(IV)NC1和CD31的免疫组织化学染色
处理从7周龄雄性C57/BL6小鼠获得的肾组织和皮组织用于免疫荧光显微镜检查评估。组织样品在液氮中冷冻，并且使用4mm厚的切片。通过如前所述的间接免疫荧光技术处理组织(Kalluri，R.等，1996，J；Biol.Chem.271：9062-8)。用一抗、多克隆CD31抗体(1∶100稀释度)或者多克隆α3(IV)NC1抗体(1∶50稀释度)，接着用二抗、FITC-偶联的大鼠IgG抗体或者FITC-偶联的人IgG抗体对冷冻的切片染色。Olympus荧光显微镜(Tokyo，Japan)下检查免疫荧光。通过用无关的预先免疫血清替换一抗进行负对照。
在小鼠肾中，在GBM和血管基膜中发现α3(IV)NC1的表达。在血管小球内皮和血管内皮中发现CD31、PECAM-1的表达。在小鼠皮肤中，表皮基膜和血管基膜中不存在α3(IV)NC1。皮肤血管内皮中发现CD31的表达。在小鼠肾中的肾小球和小管的内皮中发现CD31表达。在血管小球基膜和血管小球外血管基膜中发现α3(IV)NC1表达。在小鼠皮肤的真皮血管的内皮中发现CD31的表达。在表皮基膜中不存在α3(IV)NC1表达，并且在皮肤小管的基膜中几乎没有发现α3(IV)NC1表达。这些结果是塔牡斯达丁有限分布的一个例子。
实施例32：塔牡斯达丁N-53引起内皮细胞中程序性死亡
检查了C-PAE细胞中塔牡斯达丁N-53的前程序性细胞死亡活性。通过MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基tetrasolium溴化物)分析(Sugiyama，H.等，1998，KidneyInt.54：1188-1196)评价细胞生存力。该项分析是以活细胞裂解活性线粒体中tetrasolium环的能力为基础对细胞存活的定量比色法分析。C-PAE细胞(7000个细胞/孔)在96孔板上在含有10％FCS的DMEM中培养。第二天，对孔中加入TNF-α(正对照，80ng/ml)或者不同浓度的塔牡斯达丁或者塔牡斯达丁N-53，并且温育24小时。然后以10微升/孔的比例向孔中加入MTT溶液(5mg/ml；CHEMICON International，Temecula，California，USA)，并且在37℃下温育4小时。
加入酸-异丙醇并且充分混合。在微量滴定平板读数器(Bio-Rad，Hercules，California，USA)上在590nm处测定吸光度。
图29给出结果，图29是说明递增浓度的塔牡斯达丁和NumstatinN-53(x-轴)条件下细胞存活力(作为OD590的函数，y-轴)的图。每一个点代表三个孔的平均值+/-三个孔的平均标准误差。信号指示t-试验测得P＜0.05。
塔牡斯达丁N-53以剂量依赖方式降低细胞存活力。与对照物相比，5μg/ml的塔牡斯达丁N-53降低细胞存活力49.4％，该效果可以与用作正对照的80ng/ml TNF-α相比较。在其它实验中，与5μg/ml塔牡斯达丁N-53下49.4％相比，全长塔牡斯达丁在5μg/ml下只将细胞存活力降低22.5％并且在10μg/ml下降低60％。出人意料地，即使与全长塔牡斯达丁相比，5μg/ml或1μg/ml的塔牡斯达丁N-53诱导更多的内皮细胞程序性死亡
实施例33：抗生血管蛋白的突变体和片段
根据Mariyama等假单胞菌弹性蛋白酶消化方法(1992，J.Biol.Chem.267：1253-8)也制备了安瑞斯丁和卡斯达丁的突变体和片段。通过凝胶过滤HPLC分离消化物和通过SDS-PAGE分析得到的片段，然后用如上所述的方法进行内皮管分析评价。这些片段包括安瑞斯丁的12kDa片段、安瑞斯丁的8kDa片段和卡斯达丁的10kDa片段。另外，通过PCR克隆产生了两个塔牡斯达丁片段(′333′和′334′)。
如图30所示，如上所述进行内皮管分析，两个安瑞斯丁片段(12kDa(■)和8kDa(□))和卡斯达丁片段(19kDa(▲))抑制内皮管形成，其程度甚至大于安瑞斯丁(●)或卡斯达丁(○)。图31表明塔牡斯达丁片段”333”(●)和”334”(○)与塔牡斯达丁(▲)相似，BSA(■)和α6链(□)作为对照。
实施例34：塔牡斯达丁对内皮细胞和WM-164细胞增殖的影响
如上文实施例25中所述，通过3H-胸苷掺入或者亚甲基蓝染色进行内皮细胞增殖。C-PAE细胞(传代2-4代)生长至汇合并且保持接触抑制48小时。786-O、PC-3和WM-164细胞用作非内皮对照物，并且如上文实施例25中所述培养。HPE(人初期前列腺上皮细胞)在补充有牛脑垂体和重组人EGF(Life Technologies/GibcoBRL，Gaithersburg，Maryland，USA)的角质细胞-SFM中培养。黑色素细胞系WM-164从Wistar Institute(Philadelphia，Pennsylvania，USA)MeenhardHerlyn博士处获得，并且根据Herlyn等(1990，Adv.CancerRes.54：213-234)所述，在78％MCDB-153培养基、10％L-15培养基、10％胰蛋白朊磷酸液体培养基、2％FBS和50单位/毫升胰岛素中培养。
C-PAE、PC-3和786-O细胞中3H-胸苷掺入的结果如图21A-C所示，并且在上文实施例25中有所描述。HPE、C-PAE和WM-164细胞的亚甲基蓝染色如图32A、32B和32C所示，它们是一组三个直方图，说明递增浓度的塔牡斯达丁(x-轴)对HPE(图32A)、CPAE(图32B)和WM-164(图32C)细胞的增殖(y-轴)的作用。结果表明塔牡斯达丁以剂量依赖方式抑制FCS刺激的C-PAE细胞的增殖(图21A)。塔牡斯达丁-处理的(0.1-10μg/ml)和对照细胞中3H-胸苷掺入平均值之间的差异是显著的(P＜0.05)。塔牡斯达丁对PC3(图21B)、786-O(图21C)、HPE(图32A)和WM-164细胞(图32C)没有抑制作用。当加入多粘菌素B(5μg/ml)激活内毒素时，塔牡斯达丁的抑制作用不改变(图32B)。
令人感兴趣的是，全长塔牡斯达丁对WM164细胞的增殖没有作用，尽管有人报道过(Han等，1997，J.Biol.Chem.272：20395-20401)α3(IV)NC1结构域的氨基酸185-203抑制这些细胞。这表明当作为全长折叠塔牡斯达丁的一部分存在时，185-203区域没有抗肿瘤细胞活性。
实施例35：塔牡斯达丁突变体Tum-1、Tum-2、Tum-3和Tum-4的重组制备
已经证明α3(IV)NC1结构域体外结合并且抑制黑素瘤以及其它上皮肿瘤细胞系的增殖(Han等，1997，J.biol.Chem.272：20395-20401)。Han等将黑素瘤细胞的结合位点定位为α3(IV)NC1结构域的氨基酸185-203。在该位点产生的单克隆抗体和多克隆抗体能够阻断黑素瘤细胞附着并且抑制增殖(Han等，上文)。Han等也发现位于氨基酸189-191中的具体序列”SNS”对于黑素瘤细胞附着和增殖的抑制是必需的(Han等，上文)。在这些研究中，对其它细胞类型没有测试185-203α3(IV)NC1合成肽，包括内皮细胞。另外，Han等没有使用分离的人α3(IV)NC1结构域。
根据上文实施例23中和(Kalluri，R.等，1996 J.Biol Chem.271：9062-8)中所述制备并纯化四种重组缺失突变体。Tum-1也称为塔牡斯达丁N53，由SEQ IDNO：10的C-末端191个氨基酸组成，并且缺失N-末端53个氨基酸。上面实施例23中也描述了Tum-1。塔牡斯达丁333由塔牡斯达丁(SEQ ID NO：10)的N-末端氨基酸2至125组成。Tum-3由C-末端112个氨基酸组成。Tum-4是C-末端64个氨基酸，包括氨基酸185-203(Han等，上文)。如上文实施例23所述，使用pET22b或pET28a(+)表达体系(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)在大肠杆菌中表达这些缺失突变体。这些突变体在上面的表1中详细说明。
实施例36：塔牡斯达丁突变体对内皮细胞和WM-164细胞的增殖和程序性死亡的影响
如上实施例25和34所述，通过亚甲基蓝染色评价内皮细胞(C-PAE细胞)和WM-164黑素瘤细胞的增殖。图33A和33B给出了结果，图33A和33B是一对说明递增浓度的塔牡斯达丁、Tum-1、Tum-2、Tum-3和Tum-4(x-轴)对C-PAE细胞(图33A)和WM-164细胞(图33B)的相对数目(y-轴)的影响的图。图33A说明塔牡斯达丁、Tum-1和Tum-2以剂量依赖方式抑制C-PAE细胞增殖。图33B说明黑素瘤细胞系WM-164不受Tum-1或Tum-2的影响。但是Tum-4在该细胞系中不具有抗增殖活性。如下面表2所示，15μg/ml的塔牡斯达丁抑制C-PAE细胞增殖78.5％。Tum-1和Tum-2分别抑制C-PAE细胞65.6％和73.3％。相反，Tum-3和Tum-4不抑制C-PAE细胞。只有Tum-4抑制WM-164黑素瘤细胞。50μg/ml的Tum-4抑制这些细胞46.1％，但是不抑制C-PAE细胞。表2.重组塔牡斯达丁和塔牡斯达丁的缺失突变体
  蛋白     残基  大小         相对细胞数目(％)
  C-PAE  WM-164
  无   100.0±3.2  100.0±2.9
  塔牡斯达丁(全长) 1            244  244   20.5±3.4*  100.7±2.7
  Tum-1(塔牡斯达丁N53)    54         244  191   34.3±3.5*  96.8±3.5
  Tum-2 1    132  132   26.7±3.9*  94.2±3.7
  Tum-3         133   244  112   94.9±3.1  N.D.
  Tum-4           181 244  64   95.7±3.6  52.4±3.4*
如下文实施例X所述，使用pET22b或pET28a(+)表达体系(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)在大肠杆菌中表达这些重组塔牡斯达丁和缺失突变体。每孔7000个细胞制成96孔板，并且在存在或者不存在15μg/ml(对于C-PAE细胞)或者50μg/ml(对于WM-164细胞)重组蛋白质下，用20％FCS(C-PAE细胞)或3％FCS(WM-164细胞)刺激。通过如上所述的亚甲基蓝染色测定相对细胞数目。数据代表三个孔的平均值±平均值的标准误差。N.D.＝没有测定。*＝与没有蛋白质(“没有”)相比较P＜0.05。
应用MTT实验来评价塔牡斯达丁、Tum-1、Tum-2、Tum-3和Tum-4处理之后C-PAE内皮细胞和WM-164黑素瘤细胞的存活力。图34A和34B给出了结果，图34A和34B是一对说明递增浓度的塔牡斯达丁、Tum-1、Tum-2、Tum-3和Tum-4(x-轴)对C-PAE细胞(图34A)和WM-164细胞(图34B)细胞生存能力的影响(y-轴)的图。每个点代表三个孔的平均值+/-平均值的标准误差。图34A说明Tum-1以剂量依赖方式降低细胞存活力。在1μg/ml和5μg/ml的剂量下，Tum-1比塔牡斯达丁在降低细胞存活力方面明显更有效。Tum-4是唯一的降低WM-164黑素瘤细胞(图34B)的存活力的缺失突变体。
如上文实施例27所述，通过测定Caspase-3活性评价程序性细胞死亡。图35给出这些结果。图35是说明用5μg/ml Tum-1、Tum-2、Tum-3或Tum-4、或80 ng/ml TNF-α或PBS缓冲液(对照)处理的C-PAE细胞(x-轴)后，在以OD405吸光度值为量度(y-axis)的Caspase-3活性的直方图。Tum-1和Tum-2提高了C-PAE细胞中Caspase-3的活性，而Tum-3和Tum-4则不能。
实施例37：塔牡斯达丁突变体与内皮细胞上αVβ3整联蛋白的结合
为了测定C-PAE细胞与包被有塔牡斯达丁缺失突变体的平板的结合，如上所述(参见例如实施例28)进行细胞附着测试。如先前所述制备Tum-4兔抗体(Kalluri等，1997，J Clin.Invest.99：2470-2478)。与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-兔IgG抗体购自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Missouri，USA)。结果如36A、36B和36C所示，它们是一组三个直方图，说明在对照物IgG、αVβ3、αVβ5和BSA存在下，C-PAE细胞与包被有Tum-1(图36A)、Tum-2(图36B)和Tum-4(图36C)的平板的结合百分率(y-轴)。也用Tum-4抗体(1∶200稀释度)处理Tum-1包被的平板(图36A)来封闭先前报道的(Shahan等，1999，Cancer Res.59：4584-4590)αVβ3结合位点和αVβ5结合位点。
αVβ3抗体分别抑制C-PAE细胞对Turn-1、Tum-2或Tum-4的附着55.9％、69.8％和62.6％。αVβ5抗体不抑制C-PAE细胞与包被有Tum-1、Tum-2或Tum-4的平板的结合。即使当加入Tum-4抗体(其结合氨基酸209-244)时，αVβ3抗体仍然抑制C-PAE细胞与Tum-1的附着(图36A)。
如图37所示，塔牡斯达丁、Tum-1、Tum-2和Tum-4也结合WM-164细胞，图37是说明与包被有PBS、塔牡斯达丁、Turn-1、Tum-2、Tum-4或BSA(x-轴)的平板粘着的WM-164细胞以OD655吸光度(y-轴)表示的亚甲基蓝染色水平的直方图。塔牡斯达丁和所有三种缺失突变体增强WM-164黑素瘤细胞对平板的附着。
实施例38：塔牡斯达丁缺失突变体的活性的逆转
为了测定Tum-4抗体是否使Tum-1对内皮细胞增殖的抑制作用无效，如上文实施例26所述进行竞争增殖测试。Tum-1与Tum-4抗体预先温育，目的在于至少部分地封闭αVβ3整联蛋白结合位点。然后在内皮细胞增殖试验中使用它。
结果如图38A和38B所示，它们是说明预先与Tum-4抗体(1∶100，1∶200，1∶500稀释度)(x-轴)温育的用1.5μg/mlTum-1(图38A)或Tum-2(图38B)处理的C-PAE细胞(y-轴)的增殖的直方图。每一条框代表三个孔的平均值±平均值的标准误差。实验重复三次。星号表明t-试验测得P＜0.05。
即使当预先与Tum-4抗体或者对照兔IgG温育，Tum-1的抗增殖作用也不改变(图38A)。类似地，与Tum-4抗体或者对照兔IgG预先温育也不影响Tum-2的抗增殖作用(图38B)。
然后对整联蛋白αVβ3研究其逆转塔牡斯达丁和Tum-2的抗增殖作用的能力。塔牡斯达丁和Tum-2与αVβ3蛋白质温育30分钟，然后加给在96-孔平板中培养并与生长培养基温育过夜的C-PAE细胞。温育48小时之后，通过亚甲基蓝染色测定细胞数目。如图22所示并且如实施例26所述，递增剂量的αVβ3可溶性蛋白质以剂量依赖方式逆转塔牡斯达丁的抗增殖作用，并且在2.4μg/ml(相对于塔牡斯达丁3倍摩尔过量)下，αVβ3明显恢复塔牡斯达丁的抗增殖作用(43.1％)。单独用αVβ3蛋白质处理不抑制内皮细胞增殖。如图38C所示，递增剂量的αVβ3可溶性蛋白质以剂量依赖方式逆转Tum-2的抗增殖作用，并且使用2μg/mlαVβ3蛋白质，可使Tum-2的抗增殖作用明显恢复74.1％。
然后对αVβ3测试其取消Tum-4对黑素瘤细胞的抗增殖作用的能力。塔牡斯达丁和Tum-4在室温下与αVβ3整联蛋白预先温育30分钟，然后加给96-孔平板中生长的WM-164细胞。温育48小时之后，通过亚甲基蓝染色测定细胞数目的增加。结果见图38D和38E。塔牡斯达丁对WM-164细胞没有作用。递增剂量的αVβ3可溶性蛋白质以剂量依赖方式逆转Tum-4的抗增殖作用，并且使用2μg/mlαVβ3蛋白质，可使Tum-4诱导的抗增殖作用明显恢复76.7％。单独使用αVβ3蛋白质处理不抑制黑素瘤细胞增殖。
将塔牡斯达丁的增殖作用与内静素和αVβ3抗体相比较。对C-PAE细胞加给等摩尔量的塔牡斯达丁和αVβ3整联蛋白抗体。图39给出结果，图39是说明x-轴上塔牡斯达丁，内静素，αVβ3抗体和IgG(对照)的浓度对y-轴上相对细胞数目的影响的图。每个点代表三个孔平均值+/-标准误差。每项实验重复三次。星号代表t-实验测定P＜0.05。递增量的抗-αVβ3抗体不抑制内皮细胞增殖，而塔牡斯达丁和内静素则表现出对内皮细胞增殖的剂量依赖性抑制作用。
实施例39：卡斯达丁的缺失突变体
如上实施例23和35所述构建卡斯达丁的缺失突变体。Can-1由全长卡斯达丁(SEQ ID NO：6)的N-末端114氨基酸组成，Can-2由C-末端113个氨基酸组成。将这两个突变体分别克隆到pET22b和pET28a中，并且穿梭到BL21细胞(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中表达蛋白质。蛋白质容易从表达克隆中产生，并且用Ni-TA柱子纯化，使用插入到载体中的多组氨酸标记。用递增浓度的咪唑从柱子上将蛋白质洗脱，然后用PBS透析。透析过程中析出的所有的蛋白质是不溶性的，仍然留在溶液中的称为可溶性级分。浓缩可溶性级分，无菌过滤，并且在-20℃下储存。不溶性蛋白质重新悬浮于PBS并且在-20℃下储存。
在增殖测试中，卡斯达丁、Can-1和Can-2可溶蛋白(0.1-20.0μg/ml)加给增殖的C-PAE细胞的生长培养基，用含有10％FBS，5ng/ml bFGF和3ng/mlVEGF的DMEM刺激。结果在图40中给出，图40是说明递增浓度的卡斯达丁(◆)、Can-1(■)和Can-2(▲)(x-轴)对C-PAE细胞相对细胞数(y-轴)的影响的图。每一种蛋白质的每一浓度试验重复四次。牛血清白蛋白(BSA)用作对照处理。多粘菌素B用来控制内毒素干扰，并且发现有或没有向培养基加入多粘菌素B进行的测试之间没有差异。使细胞增殖48小时，然后固定、染色，并且用Bio-Rad平板读数器(Bio-Rad，Hercules，California，USA)读出密度。卡斯达丁和Can-1都引起细胞数目百分比的剂量依赖性减少，在5μg/ml和更高浓度下两者都将细胞数减少80％。Can-2表现出在高于10μg/ml浓度下细胞数目百分比稍微降低，并且在最高浓度下(20μg/ml)，Can-2抑制增殖33％。
使用ApoAlert试剂盒(CLONTECH，Palo Alto，California，USA)通过膜联蛋白V-FITC测试测定程序性细胞死亡。使用碘化丙锭对通过程序性细胞死亡之外的途经死亡的细胞核染色。卡斯达丁、Can-1和Can-2在高于1μg/ml的浓度下都诱导内皮细胞的程序性细胞死亡。在小于1μg/ml的浓度下，Can-1在诱导程序性细胞死亡方面最有效。
通过体内Matrigel栓测试测定抗生血管活性，其中对C57/BL6小鼠两腹侧皮下注射含有2μg/ml或20μg/ml不溶性蛋白质、50ng/mlVEGF和20U/ml肝素的0.5ml的Matrigel。栓在小鼠体内停留14天，然后杀死小鼠并且切除栓并且固定。将栓包埋、切片并且H&E染色。对样品进行盲测并且定量测定血管。两个浓度的蛋白质之间没有发现血管数目的差别，对所有6个数值取平均值并且作图。
图41给出结果，图41是说明使用PBS(对照)、卡斯达丁、Can-1和Can-2治疗时的每一栓的血管平均数(y-轴)的直方图。用卡斯达丁或Can-1处理的栓与用PBS或Can-2处理的栓相比表现出少得多的血管。
实施例40：塔牡斯达丁的合成片段的活性
塔牡斯达丁的肽片段：塔牡斯达丁的氨基酸54-132区指定为Tum-5。合成了肽T1、T2、T3、T4、T5和T6。T2、T3、T4、T5和T6部分重叠，并且位于Tum-5中。下面的图42和表3中给出这些肽在塔牡斯达丁中的位置。表3.塔牡斯达丁缺失突变体
 多肽  氨基酸长度  在塔牡斯达丁中的位置  序列
 T1  20  1-20  PGLKGKRGDSGSPATWTTRG
 T2  20  54-73  NQRAHGQDLGTLGSCLQRFT
 T3  20  69-88  LQRFTTMPFLFCNVNDVCNF
 T4  20  84-103  DVCNFASRNDYSYWLSTPAL
 T5  19  99-117  STPALMPMNMAPITGRALE
 T6  19  114-132  RALEPYISRCTVCEGPAIA
抗增殖活性：检查肽T2、T3、T4、T5和T6对内皮细胞(C-PAE细胞)的抗增殖活性。图43A给出结果，图43A是说明10μg/ml肽T2、T3、T4、T5或T6(x-轴)处理对内皮细胞的增殖(y-轴)的抑制作用的直方图。对照物是没有刺激的细胞和用20％FCS刺激的细胞。发现肽T3显著抑制内皮细胞的增殖(p＜0.05)，并且抑制作用是剂量依赖性的，如图43B所示，图43B是说明用0.1、1.0或10μg/ml肽T3处理C-PAE细胞的增殖的抑制作用(y-轴)的直方图。对整联蛋白αVβ3研究其逆转肽T3的抗增殖作用的能力。T3肽与0、0.001、0.01、0.1、0.5或1.0mlαVβ3整联蛋白(CHEMICON International，Temecula，California，USA)在室温下温育30分钟，然后以20μg/ml的终浓度加给已经在96孔板的生长培养基中生长的C-PAE细胞。附加温育48小时之后，通过亚甲基蓝染色测定细胞数。图43C给出了结果，图43C是说明用与各种浓度的αVβ3整联蛋白(x-轴)预先温育的T3肽处理时C-PAE细胞的生长(y-轴)的直方图。与αVβ3整联蛋白预先温育明显降低肽T3的抗增殖作用。αVβ3整联蛋白本身不抑制增殖(对照)。
程序性细胞死亡活性：如上文实施例32和36所述利用MTT实验测试肽T2、T3、T4、T5和T6(10μg/ml浓度)对C-PAE细胞存活力的影响。图43D给出结果，图4D是说明OD595(y-轴)测定的用合成肽(x-轴)处理的细胞的存活力的直方图。发现肽T3相对从Tum-5衍生的其它肽来说显著降低细胞的存活力。使用TNF-α(100ng/ml)作为诱导内皮细胞程序性死亡的正对照。
细胞附着活性。如上所述使用内皮细胞进行细胞附着性测试。HUVEC或C-PAE细胞与单克隆人整联蛋白抗体、对照小鼠IgG(10μg/ml)、或者合成肽在预先包被的96-孔平板上培养，然后利用亚甲基蓝染色在OD655下测定附着平板的细胞数。图44A说明在BSA(对照)、没有抗体(对照)、小鼠IgG(对照)和αVβ3整联蛋白抗体存在下，HUVEC细胞结合Tum-5肽(10μg/ml)包被的平板的情况。αVβ3整联蛋白抗体显著抑制细胞附着。对照小鼠IgG不抑制细胞附着。图44B是说明C-PAE细胞与用10μg/ml重组Tum-5肽包被的96-孔平板的附着情况的直方图。与RGD肽温育不抑制C-PAE细胞与这些平板的附着，说明这些内皮细胞与Tum-5的结合是RGD依赖性的。CNGRC用作对照。
然后测定合成肽T2、T3、T4、T5和T6对C-PAE细胞与Tum-5包被平板的附着的影响。图44C中给出结果，图44C是说明C-PAE细胞(y-轴)与包被Tum-5的96-孔平板并用2.5μg/ml的肽T2、T3、T4、T5或T6处理(x-轴)和Tum-4包被的平板并用用T3处理相合的直方图。PBS处理作为对照。T3肽显著抑制细胞对Tum-5包被的平板的附着，说明T3负责内皮细胞与Tum-5的相互作用，而其它合成肽没有表现出该作用，而T3没有抑制内皮细胞对Tum-4肽包被的平板的附着。图44D是一个直方图，说明不同浓度的T3肽(x-轴)对C-PAE细胞(y-轴)结合Tum-5-包被的平板的影响。PBS处理作为对照。发现T3肽以剂量依赖方式抑制内皮细胞对Tum-5包被平板的附着。
如图44E所示，对于T3肽，只有αVβ3整联蛋白抑制内皮细胞对肽-包被的平板的附着，表明αVβ3整联蛋白介导内皮细胞与肽T3的相互作用。图44F说明与β3整联蛋白抗体预温育抑制C-PAE细胞与T3肽包被的平板的附着。但是αV或者β1整联蛋白抗体不抑制细胞与T3包被平板的附着。图44G说明与T3肽温育不抑制C-PAE细胞与玻连蛋白(2.5μg/ml)包被的平板的结合，这表明T3结合在不与αVβ3整联蛋白上玻连蛋白结合的结构域。细胞与T6肽的温育也不抑制附着。
实施例41：塔牡斯达丁的缺失突变体的活性
将塔牡斯达丁的缺失片段克隆到细菌表达载体中并表达，利用镍层析纯化，然后分析体外抗生血管活性和相关的活性。特殊努力地保证从蛋白质制剂中去除污染内毒素。制备全长塔牡斯达丁、塔牡斯达丁-N53和两种其他的缺失突变体(Tum-2C和Tum-KE)并且试验。对这些缺失突变体测定内皮细胞增殖、细胞周期进程、程序性细胞死亡和内皮管形成。也分析活性塔牡斯达丁片段对非内皮细胞的影响来证明这些分子的内皮细胞特异性。下面表4中总结了这些活性。表4.另外的塔牡斯达丁缺失突变体的活性
    构成  MW(kDa)   pI   G1   Apo  管  细胞实验   EU/mg
塔牡斯达丁(全长) 1        12  27   8.5  10μg  10μg  有活性  C-PAE   200
塔牡斯达丁N53    2      12  21.3   8.1  5μg  5μg  有活性  C-PAE   33
Tum-2C      7    12  14   8.5  无活性  无活性  C-PAE   ＜25
Tum-KE        9  12  18   9.4  无活性  无活性  无活性  C-PAE   4.5
塔牡斯达丁-45-132    2    6   12   8.8   ＜5μg   有活性   有活性   C-PAE  ＜14
“构成”栏中的1-12指全长塔牡斯达丁中位于氨基酸位点35、68、80、86、123、126、145、179、191、197、237、240的12个半胱氨酸残基。
二硫键存在于：半胱氨酸1和6、半胱氨酸2和5、半胱氨酸3和4、半胱氨酸7和12、半胱氨酸8和11、以及半胱氨酸9和10。
G1：细胞周期停止测试
Apo：膜联蛋白V-FITC测试
管：内皮管形成测试
EU：BioWhitaker试剂测定的内毒素水平。
在这些实验中发现塔牡斯达丁-N53最有活性。在体外，塔牡斯达丁-N53诱导内皮细胞程序性死亡，并且在10％胎牛血清(FBS)的存在下抑制内皮细胞细胞周期进程。两种活性的IC50是大约5μg/ml，而在超过20μg/ml的浓度下，在这些相同的测试中，内静素没有表现出活性。
在细胞附着测试中也使用了塔牡斯达丁-N53。当在96孔平板上包被时，塔牡斯达丁-N53(10μg/ml)支持人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘着。当与HUVECs预温育时，αVβ3整联蛋白抗体和β1整联蛋白抗体抑制该粘着，如图45所示，而α6抗体则不这样。塔牡斯达丁-N53因此可以通过αVβ3整联蛋白和β1整联蛋白实现其抗生血管作用。这与用全长塔牡斯达丁见到的结果相吻合，如上文实施例28所述。
塔牡斯达丁-N53在对于新血管形成的Matrigel栓测试中也抑制血管生成。塔牡斯达丁-N53在PC3前列腺异种移植模型和MDA-MB435乳腺癌常位模型中也表现出实质性的抗肿瘤活性。每天施用两次塔牡斯达丁-N53(每千克5mg/kg或20mg/kg)。后两项测试的结果在图46和47中给出。图46说明了用赋形剂(对照，○)、每日每千克5毫克的塔牡斯达丁-N53(□)或者每日每千克20毫克的塔牡斯达丁-N53(◇)处理的肿瘤经15天(x-轴)PC3前列腺肿瘤以mm3表示的平均肿瘤体积(y-轴)。图47说明了用赋形剂(对照，○)、每日每千克20毫克的塔牡斯达丁-N53(□)或者每日每千克5毫克的塔牡斯达丁-N53(◇)处理的肿瘤经22天(x-轴)MDA-MB435乳腺癌肿瘤以mm3表示的平均肿瘤体积(y-轴)。因为每日每千克5毫克和20毫克的剂量表现出可比较的抗肿瘤活性，使用低剂量时仍然可以实现显著的抗肿瘤活性。
最近有人作图将第二古德帕斯彻综合症德表位GPB定位于塔牡斯达丁-N53内的区域(在全长塔牡斯达丁的氨基酸140-153中)。
因此去除该区来制备另外的缺失突变体。突变体塔牡斯达丁-45-132(全长塔牡斯达丁的氨基酸45至132)表现出高水平表达，并且以低于塔牡斯达丁-N53的剂量抑制细胞周期进程。如图48所示，图48是直方图，说明当用PBS(对照)、缓冲液(对照)、20μg/ml塔牡斯达丁-N53、10μg/ml塔牡斯达丁-45-132和5μg/ml塔牡斯达丁-45-132(x-轴)处理时S-期的C-PAE细胞百分比(y-轴)。塔牡斯达丁-45-132也支持HUVEC细胞附着，并且受αVβ3抗体和β1抗体的抑制。如图49所示，图49是直方图，说明在PBS(对照)、αVβ3整联蛋白抗体、β1整联蛋白抗体、α6整联蛋白抗体和BSA(对照)存在下HUVEC细胞(y-轴)与塔牡斯达丁-45-132包被(20μg/ml)的平板的附着(x-轴)。因此塔牡斯达丁的抗生血管活性同样在氨基酸45-132的区域内。这些片段的其它缺失突变体也可以根据这些方法制备，例如，缺失其中(全长塔牡斯达丁)的第6个半胱氨酸的片段。
实施例42.塔牡斯达丁-45-132和Tum-5-126-C-A的表达和纯化
塔牡斯达丁-45-132由全长塔牡斯达丁的氨基酸45-132组成，使用表达质粒在大肠杆菌中表达为带有C-末端6-组氨酸标记的融合蛋白。重折叠和SDS-PAGE分析之后，大肠杆菌表达的蛋白质主要分离为12kDa可溶性蛋白质。通过多组氨酸标记抗体免疫方法可以检测塔牡斯达丁-45-132。在Tum-5上加上另外9个氨基酸(全长塔牡斯达丁残基45-54)来提高蛋白质表达率和溶解性。在其它实验中只使用具有低水平(小于50EU/mg)内毒素的可溶性蛋白质。
如上所述也在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达重组塔牡斯达丁-45-132。使用载体pPICZαA亚克隆塔牡斯达丁-45-132使得该蛋白质与C末端6-组氨酸标记融合。
通过在全长塔牡斯达丁的残基126处将半胱氨酸定点诱变为丙氨酸来制备Tum-5-125-C-A(SEQ ID NO：34)，以提高塔牡斯达丁-45-132的分泌。其在大肠杆菌中表达并且利用蛋白质印迹使用多组氨酸标记抗体在相同分子量大小处检测出。
古德帕斯彻综合症是一种特征在于肺出血和/或快速发病的肾小球性肾炎的自身免疫疾病，它是由与α3(IV)NC1的自身抗体相关的免疫损伤破坏血管小球和肺泡基膜引起的。最近在N末端部分鉴定出了最可能的与疾病相关的病原表位(Kalluri，R.等，1996，J：Biol.Chem.271：9062-8；Hellmark，T.等，1999，Kidney Int.55：938-44)，并且进一步证实是在N末端40个氨基酸内(Hellmark，T.等，1999，J.Biol.Chem 274：25862-8；Netzer，K.O.等，1999，J.Biol.Chem.274：11267-74)。N-末端塔牡斯达丁-45-132由塔牡斯达丁的残基45-132组成，其位于古德帕斯彻综合症自身表位之外。为了进一步证明古德帕斯彻综合症自身抗体不检测塔牡斯达丁-45-132，将来自古德帕斯彻综合症患者的抗血清用于蛋白质印迹。这种抗血清检测293细胞表达的具有高灵敏性的全长塔牡斯达丁，但是不能检测大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132和毕赤酵母表达的Tum-5-126-C-A。这表明塔牡斯达丁-45-132和Tum-5-126-C-A不包含古德帕斯彻综合症自身表位，并且排除了当施用时这些重组蛋白质会诱导这种自身免疫疾病可能性。
实施例43.塔牡斯达丁-45-132和Tum-5-126-C-A的活性
对塔牡斯达丁-45-132检查了其对内皮细胞增殖、细胞周期(GI/S)停止和细胞存活力的影响。
通过BrdU掺入实验检查塔牡斯达丁-45-132对C-PAE细胞的抗增殖作用。该项测试使用溴代脱氧尿苷(BrdU)代替[3H]胸苷作为胸苷类似物。BrdU掺入到活跃增殖的细胞的新合成DNA链中。然后免疫化学检测掺入到细胞中的BrdU。使用BrdU增殖实验试剂盒(CalbioChem，San Diego，California，USA)根据厂商说明(有一些改动)进行该项测试，C-PAE细胞接种到含有10％FCS的DMEM中的96-孔平板上。第二天，用有或没有大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132或者293细胞中表达的全长塔牡斯达丁的含有2％FCS的DMEM置换培养基。然后将平板温育46小时，用10nM BrdU对细胞脉冲处理2小时。然后将细胞和DNA固定到孔中，与抗-BrdU的一抗和二抗反应，然后用试剂盒提供的比色反应显色。然后在平板读数器(Molecular Dynamics，Sunnyvale，California，USA上在OD450处读取平板数据。
与上文实施例4类似，评价了塔牡斯达丁-45-132和Tum-5-126-C-A对细胞周期的作用。简要地说，接触抑制48小时后的C-PAE细胞生长停止。然后收获细胞，每孔105个细胞，并且在用含有纤连蛋白的5％FCS和重组塔牡斯达丁-45-132或者Tum-5-126-C-A包被的12-孔板上平板培养。21小时之后，收集细胞并且固定在70％冰冷乙醇中。室温下在含有2％FCS和0.1％Tween-20的PBS中将固定的细胞再水合化30分钟，离心并且再悬浮于0.5ml的相同的缓冲液中。在37℃下使用RNA酶(5μg/ml)消化1小时，接着用碘化丙锭染色(5μg/ml)。然后使用EPICS XL-MCL流式细胞仪(Beckman-CoulterInstruments，Fullerton，California，USA)计数细胞。
如上所述，通过MTT实验测定细胞存活力。
如图50-52所示，塔牡斯达丁-45-132特异性抑制内皮细胞的增殖(图50A和50B)、诱导细胞周期停止(图51)，并且降低细胞存活力(图52A、52B、52C和52D)。
图50A是说明用0、0.125、0.250、0.500、1.0或2.0μM浓度(x-轴)的大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132(黑色条框)、或者293细胞表达的全长塔牡斯达丁(白色条框)处理的C-PAE细胞的BrdUOD450测试下(y-轴)测定的细胞增殖的直方图。图50B是说明用0、0.1、1.0、5.0和10.0μg/ml浓度(x-轴)的毕赤酵母表达的塔牡斯达丁-45-132处理的C-PAE细胞的亚甲基蓝染色OD655测定的细胞增殖(y-轴)的直方图。没有刺激的C-PAE细胞作为对照物。塔牡斯达丁-45-132以剂量依赖方式抑制用20％FCS刺激过的C-PAE细胞，并且ED50是5μg/ml。对照(0μg/ml)和用塔牡斯达丁-45-132(5和10μg/ml)处理之间的差异是显著的(t-试验测得P＜0.05)。当使用对照人黑素瘤细胞(WM-164细胞)时，没有发现塔牡斯达丁-45-132的抗增殖作用。
图51是说明增殖的内皮细胞的G1期停止的直方图。在生长停止、接触抑制的细胞中，5.8％的细胞在0小时时处于S期。当用5％FCS处理细胞21小时时，S期细胞的百分比增加3.7倍，达到21.5％。使用塔牡斯达丁-45-132处理将S期细胞百分比降低至6.0％。该作用是剂量依赖性的，S期细胞百分比在1μg/ml塔牡斯达丁-45-132时是19.3％，在10μg/ml塔牡斯达丁-45-132时是11.3％。在另一个实施方案中，G0/G1期细胞百分比在5％FCS处理对照组中最低，用塔牡斯达丁-45-132处理则升高。这些结果表明用塔牡斯达丁-45-132处理引起增殖的内皮细胞细胞周期停止。用Tum-5-126-C-A处理表现出的结果与用塔牡斯达丁-45-132处理相同。
图52A、52B、52C和52D是一组四个直方图，说明塔牡斯达丁-45-132和Tum-5-126-C-A对细胞存活能力的影响。图52A说明MTT实验中对用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-轴)塔牡斯达丁-45-132(黑色条框)和烷基化并且还原的塔牡斯达丁-45-132(白色条框)处理的C-PAE细胞在OD562(y-轴)下测定的细胞生存能力。塔牡斯达丁-45-132以剂量依赖方式显著降低细胞存活力，ED50是12μg/ml。还原并且烷基化的塔牡斯达丁-45-132在降低C-PAE细胞的细胞存活力方面表现出与没有处理的塔牡斯达丁-45-132相似的作用。因此塔牡斯达丁-45-132抗生血管作用不取决于其从半胱氨酸残基之间的二硫键衍生的构象。
Tum-5-126-C-A在细胞存活力方面表现出的作用与塔牡斯达丁-45-132的类似，如图52B所示。图52B说明MTT实验中对用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-轴)Tum-5-126-C-A处理的C-PAE细胞在OD562(y-轴)下测定的细胞生存能力。
塔牡斯达丁-45-132和Tum-5-126-C-A对C-PAE细胞的细胞存活力的作用在对照PC-3和DU-145细胞中没有见到，如图52C和52D所示。图52C说明MTT实验中对用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-轴)塔牡斯达丁-45-132处理的PC-3细胞在OD562(y-轴)下测定的细胞生存能力。图52D说明MTT实验中对用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-轴)塔牡斯达丁-45-132处理的DU-145细胞在OD562(y-轴)下测定的细胞生存能力。因此塔牡斯达丁-45-132的活性对内皮细胞是特异性的。
实施例44.塔牡斯达丁-45-132对内皮细胞的作用
发现塔牡斯达丁-45-132诱导内皮细胞程序性死亡并且抑制内皮管形成，如下面的测试所证明的。
如膜联蛋白V-FITC测试所证实的，发现塔牡斯达丁-45-132诱导内皮细胞程序性死亡。如上所述通过用塔牡斯达丁-45-132处理C-PAE细胞18小时进行该项测试。对照细胞接受PBS。5μg/ml塔牡斯达丁-45-132与对照物TNF-α相比诱导荧光强度峰的显著位移。
也如上所述测定了Caspase-3活性。DEVD-fmk，一种特异性caspase-3抑制剂，被用作内部对照物来说明塔牡斯达丁-45-132的特异性。TNF-α(80ng/ml)用作正对照。实验重复三次。
图53给出了结果，图53是说明(x-轴)对照、对照+DEVD-fmk、TNFα、TNF-α+DEVD-fmk、塔牡斯达丁-45-132(1μg/ml和10μg/ml)和塔牡斯达丁-45-132(10μg/ml)+DEVD-fmk的caspase-3活性(OD405下测定的，y-轴)的直方图。通过用10μg/ml大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132处理C-PAE细胞，发现caspase-3活性提高4.5倍。正对照TNF-α也产生4.5倍的提高。caspase-3的特异性抑制剂DEVD-fink能降低该蛋白酶活性基础水平，表明测得的活性的提高对于caspase-3是特异性的。用塔牡斯达丁-45-132处理PC-3细胞没有发现该提高的活性。
如Matrigel测试证实的，也发现塔牡斯达丁-45-132抑制内皮管形成。如上文实施例所述进行Matrigel测试。简要地说，使HWECS在与或者没有与5μg/ml大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132温育的Matrigel包被平板上形成管。BSA处理的细胞和酵母表达的人内静素(5和20μg/ml)用作对照物。相对对照物来说，塔牡斯达丁-45-132以剂量依赖方式显著抑制内皮管形成。处理之后平均支化管形成百分比对于BSA处理是22.7±3.1，对于塔牡斯达丁-45-132处理是2.1±2.0，而5μg/ml和20μg/ml内静素分别产生19.4±3.0和7.5±6.0平均值。与对照物相比较，5μg/ml的塔牡斯达丁-45-132显著降低内皮管形成。人内静素甚至在20μg/ml下也表现出比5μg/ml塔牡斯达丁-45-132小的抑制作用。
实施例45.塔牡斯达丁-45-132的结合活性
进行细胞附着测试，其证明塔牡斯达丁-45-132结合内皮细胞上的αVβ3和β1整联蛋白，并且该结合不依赖RGD肽序列。
如上所述进行细胞附着测试。简要地说，用10μg/ml塔牡斯达丁-45-132或者0.5-2.5μg/ml玻连蛋白(Collaborative BiomedicalProducts，Bedford，Massachusetts，USA)将96-孔平板包被过夜。用BSA封闭平板，并且HUVEC或者C-PAE细胞与10μg/ml的抗体或者合成肽(合成肽CDCRGDCFC(SEQ ID NO：35)或者合成对照肽CNGRC(SEQ ID NO：36)温育15分钟。将细胞加给平板并且在37℃下温育45分钟。然后洗涤平板，并且通过亚甲基蓝染色测定附着细胞数目。
αVβ3和β1整联蛋白的抗体显著抑制用大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132包被的平板上HUVEC细胞的附着。相对用作对照物的小鼠IgG来说，αVβ3整联蛋白抗体和β1整联蛋白抗体分别抑制细胞附着47.1％和47.5％。C-PAE细胞表现出可比较的抑制作用。
合成肽CDCRGDCFC在5μg/ml下抑制内皮细胞附着到玻连蛋白包被的平板上。对照肽CNGRC没有表现出这样的抑制作用。但是，当细胞与1.0和10.0μg/ml CDCRGDCFC肽温育时，C-PAE细胞对大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132包被的平板的附着没有被抑制，表明塔牡斯达丁-45-132结合在内皮细胞上αVβ3整联蛋白受体上不同的位点，一个不同于先前描述的(Arap，W.等，1998，Science 279：377-80)RGD结合位点的位点。CNGRC对照肽也不抑制细胞对塔牡斯达丁-45-132包被平板的附着。
可溶性αVβ3整联蛋白逆转塔牡斯达丁-45-132的抗增殖作用。这可通过上文实施例26中描述的竞争增殖测试证明。玻连蛋白包被的平板与αVβ3可溶性蛋白质温育，然后进行细胞附着测试。可溶性αVβ3蛋白质在1μg/ml和2μg/ml下显著抑制C-PAE细胞附着到包被的平板上。然后大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132与αVβ3整联蛋白温育30分钟，然后和20％FCS一起加给C-PAE细胞。48小时之后，通过亚甲基蓝染色测定细胞增殖。递增浓度的αVβ3可溶性蛋白质以剂量依赖方式逆转塔牡斯达丁-45-132的抗增殖作用。在1μg/ml下，αVβ3蛋白质显著逆转塔牡斯达丁-45-132诱导的抗增殖作用65.9％。用αVβ3蛋白质本身处理，没有塔牡斯达丁-45-132，则不抑制内皮细胞增殖，进一步表明与内皮细胞表面上αVβ3整联蛋白结合介导塔牡斯达丁-45-132抗生血管活性。
为了进一步证明塔牡斯达丁-45-132与内皮细胞的表面结合，将生物素化的塔牡斯达丁-45-132用于细胞表面标记。使用Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，USA)将重组大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132生物素化。塔牡斯达丁-45-132，在含有10％DMSO和5％D-甘露糖醇的缓冲液中，在4℃下与12M过量的Sulfo-NHS-LC-Biotin温育过夜。在温育过程中从溶液中沉淀出生物素化的塔牡斯达丁-45-132。沉淀物用蒸馏水洗涤两次，重新悬浮于DMSO，然后以1∶1与蒸馏水混合，得到大约4mg/ml的终浓度。4℃下贮存生物素化的塔牡斯达丁-45-132。
对于细胞表面标记，使用受轻微胰蛋白酶作用的EDTA从烧瓶中去除亚汇合的HUVEC细胞，然后用含有2％BSA的DMEM洗涤两次。然后将细胞再次悬浮于DMEM/BSA，并且在4℃下和生物素标记的塔牡斯达丁-45-132或者没有塔牡斯达丁-45-132的条件下进行的模拟生物素反应的产物一起温育1小时。然后用DMEM/BSA将细胞洗涤两次，然后在4℃下与链霉抗生物素-FITC(“Neutravidin-FITC”，Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，USA)温育30分钟。然后在Nikon Eclipse E600荧光显微镜下观察样品并且用流式细胞仪分析。
在悬浮液中，在HWEC细胞的表面检测到与塔牡斯达丁-45-132间接结合的FITC，附着之后荧光以较小的点状图案广泛分布在细胞表面上。当细胞与代替生物素化塔牡斯达丁-45-132的自由生物素温育时，在细胞表面上没有检测到明显荧光。FITC阳性即塔牡斯达丁-45-132结合的细胞数，随着递增浓度的生物素化塔牡斯达丁-45-132以剂量依赖方式增加，表明塔牡斯达丁-45-132结合在内皮细胞的表面。
实施例46.塔牡斯达丁-45-132对血管生成和肿瘤生长的影响
为了评价体内塔牡斯达丁-45-132对新毛细管形成的作用，进行了Matrigel栓测试。处理6天之后，相对于PBS处理的对照物来说，用5μg/ml大肠杆菌表达的塔牡斯达丁-45-132处理时，生成的新血管数目减少91％。也对缺失全长塔牡斯达丁的N-末端53个氨基酸的Tum-1进行了测试，并且减少新血管化作用95％。血管的平均数(超过3-4Matrigel栓)，对于Tum-1处理的栓是0.47±0.16，对于塔牡斯达丁-45-132处理的栓是0.80±0.16，并且对于PBS处理的对照物是8.81±0.35。
也对塔牡斯达丁-45-132测试了其抑制肿瘤生长的能力。对5-6周龄并且大约25g的雄性无胸腺裸鼠NCRNU小鼠的背部皮下组织植入大约2×106PC-3(前列腺癌)细胞。用游标卡尺测量肿瘤并且用标准公式(宽2×宽×0.52)计算肿瘤体积。让肿瘤生长至大约50mm3，然后将动物配对分成6只小鼠的组。在配对的这一天(第一天)给予初始剂量的蛋白质或赋形剂(PBS，对照)。每天以1～20mg/kg范围的剂量腹膜内注射含有塔牡斯达丁-45-132、Tum-5-126-C-A或者人内静素的b.i.d.无菌PBS，注射20天。对照动物接受PBS赋形剂注射。在一个处理中，使用手术包埋的Alzet小泵实施塔牡斯达丁-45-132的连续皮下送药。每周两次对小鼠称重，并且从第一天开始测量肿瘤。计算估计的平均肿瘤体积，在第21天对小鼠称重，杀死小鼠，切除它们的肿瘤，然后用光学显微镜和CD31免疫染色检查。从1中减去处理过的平均肿瘤重量除以对照组的平均肿瘤重量，并且以百分比表示，得到它对每一个组的肿瘤生长的抑制作用。
图54给出了结果，图54是线形图，说明在用赋形剂(对照，□)、1mg/kg的塔牡斯达丁-45-132(◆)、1mg/kgTum-5-126-C-A(●)、20mg/kg内静素(○)和微量泵控制的塔牡斯达丁-45-132(1mg/kg，△)处理第0、5、10、15和20天(x-轴)时以V/Vo(平均肿瘤体积/最初肿瘤体积)表示的分数肿瘤体积(y-轴)。根据体重变化判断，蛋白质处理没有观察到毒性。塔牡斯达丁-45-132和Tum-5-126-C-A都显著抑制PC-3细胞的生长。与注射赋形剂的对照组相比，1mg/kg的人塔牡斯达丁-45-132具有74.1％(p＝0.02)的肿瘤生长抑制作用，而Tum-5-126-C-A具有92.0％(p＝0.001)的肿瘤生长抑制作用。通过Alzet小型泵连续送递塔牡斯达丁-45-132(1mg/kg，经24小时)也证明70.1％(p＝0.03)的显著的肿瘤生长抑制作用。与注射赋形剂的对照组相比，以20mg/kg的剂量(b.i.d.，大丸剂注射)送递内静素没有发现显著的肿瘤生长抑制作用。
应用CD31免疫染色来测定PC-3肿瘤异种移植冷冻组织切片中肿瘤内的微血管密度(MVD)，应用标准链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶检测系统(Vectastain ABC Elite Kit，Vector Labs，Burlingame，California，USA)，使用大鼠抗-小鼠VD31单克隆抗体(PharMingen，San Diego，California，USA)。使用1％H2O2/甲醇将内源过氧化物酶活性封闭30分钟，然后通过与蛋白酶K在室温下温育30分钟对玻片进行抗原检索。以1∶20在含有0.1％TWEEN-20的PBS中稀释小鼠CD31的抗体，并且在用5％正常山羊血清/PBS+0.1％TWEEN-20封闭切片之后温育2小时。正常大鼠IgG用作负对照。使用VectastainABC Elite试剂盒进行免疫过氧化物酶染色。用甲基绿对切片计数染色。通过以较低放大率扫描肿瘤来评价MVD，然后在肿瘤周围鉴定含有最大数目离散的微血管的三个区域，然后在40×场上计数各微血管。处理组之间比较平均微血管密度并且利用t试验进行分析。
与注射赋形剂的对照组相比，塔牡斯达丁-45-132腹膜内注射显著抑制PC-3异种移植中微血管密度。每个低强度(40×)场CD31-阳性血管数目是，对于塔牡斯达丁-45-132处理是6.33±0.54，对于对照组是9.44±1.05(p＝0.047)。用Tum-5-126-C-A处理的组或者微量泵控制的塔牡斯达丁-45-132表现出平均血管密度相似的降低。
所有的参考文献、专利文献和专利申请在这里全文引作参考。本发明参照优选的实施方案进行了具体说明和描述，本领域技术人员明白不脱离后面附加的权利要求书的精神和范围可以进行形式和详细方面的各种变化。

Claims (41)

1.安瑞斯丁(Arresten)、卡斯达丁(Canstatin)或者塔牡斯达丁(Tumstatin)、或者其片段、突变体、同系物、类似物或等位变体在制备用于治疗涉及抑制组织中血管生成的疾病的药物中的用途，其中所述血管生成由一种或多种内皮细胞整联蛋白或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基介导。
2.根据权利要求1的用途，其中所述疾病是肿瘤生长。
3.安瑞斯丁、卡斯达丁或者塔牡斯达丁、或者其片段、突变体、同系物、类似物或等位变体在制备通过促进或诱导组织中内皮细胞编程性细胞死亡来治疗疾病的药物中的用途，其中所述内皮细胞编程性细胞死亡由一种或多种内皮细胞整联蛋白或者一种或多种内皮细胞整联蛋白亚基介导。
4.根据权利要求1或2的用途，其中通过抑制下面的一项或几项来抑制血管生成：内皮细胞增殖、内皮细胞迁移或者内皮细胞管生成。
5.根据权利要求1-4任一项的用途，其中所述一种或多种整联蛋白选自α1β1、α2β1、α3β1和αVβ3，并且所述一种或多种整联蛋白亚基选自α1、α2、α3、αV、β1和β3。
6.下面的物质在制备用于抑制组织中血管生成或细胞增殖的药物中的用途：
(a)特异性结合整联蛋白α1亚基的抗体或肽；
(b)特异性结合整联蛋白α2亚基的抗体或肽；
(c)特异性结合整联蛋白α3亚基的抗体或肽；
(d)特异性结合整联蛋白α5亚基的抗体或肽；
(e)特异性结合整联蛋白α6亚基的抗体或肽；
(f)特异性结合整联蛋白αV亚基的抗体或肽；
(g)特异性结合整联蛋白β1亚基的抗体或肽；或者
(h)特异性结合整联蛋白β3亚基的抗体或肽。
7.根据权利要求6的用途，其中所述药物用于治疗特征在于血管生成或细胞增殖的疾病。
8.下述物质在制备用于促进或诱导组织中血管生成或细胞增殖的药物中的用途：
(a)整联蛋白α1亚基；
(b)整联蛋白α2亚基；
(c)整联蛋白α3亚基；
(d)整联蛋白α5亚基；
(e)整联蛋白α6亚基；
(f)整联蛋白αV亚基；
(g)整联蛋白β1亚基；或者
(h)整联蛋白β3亚基。
9.根据权利要求8的用途，其中所述一种或多种整联蛋白亚基是可溶的。
10.根据权利要求8或权利要求9的用途，其中所述一种或多种整联蛋白亚基是单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体。
11.受体介导的血管生成的抑制剂在制备用于治疗脊椎动物增殖性疾病的药物中的用途，其中所述疾病特征在于安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的受体介导的血管生成，并且其中所述被抑制的受体是安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁受体。
12.根据权利要求11的用途，其中所述安瑞斯丁受体选自α1β1、α2β1、α3β1和αVβ3整联蛋白。
13.根据权利要求11的用途，其中所述卡斯达丁受体选自α1β1或α2β1。
14.根据权利要求11的用途，其中所述塔牡斯达丁受体选自α5β1、α6β1和αVβ3整联蛋白。
15.根据权利要求11的用途，其中所述药物用于抑制肿瘤生长。
16.根据权利要求11的用途，其中所述药物用于已确诊肿瘤的消退。
17.根据权利要求11-16任一项的用途，其中抑制安瑞斯丁受体介导的血管生成、卡斯达丁受体介导的血管生成、或者塔牡斯达丁受体介导的血管生成的分子被用来制备药物。
18.根据权利要求17的用途，其中与安瑞斯丁受体、卡斯达丁受体或塔牡斯达丁受体特异性结合的抗体、抗体片段或肽被用来制备药物。
19.根据权利要求18的用途，其中所述抗体是多克隆或单克隆抗体。
20.在促进组织中血管生成的药物存在下结合安瑞斯丁、卡斯达丁或塔牡斯达丁的一种或多种可溶性受体的用途。
21.根据权利要求20的用途，包括所述组织接触一种降低组织中FLIP水平的分子。
22.具有选自下面特征的一项或两项的α3(IV)NC1结构域的非古德帕斯彻片段：
(a)结合αVβ3整联蛋白的能力；
(b)抑制内皮细胞增殖的能力；和
(c)引起内皮细胞编程性细胞死亡的能力。
23.具有选自下面特征的一项或多项的α3(IV)NC1结构域的非古德帕斯彻片段：
(a)结合αVβ3整联蛋白的能力；
(b)结合内皮细胞的能力；
(c)抑制肿瘤细胞增殖的能力；和
(d)不抑制内皮细胞增殖的能力。
24.根据权利要求22或23的片段，其中所述结合αVβ3整联蛋白的能力是不依赖于RGD的。
25.根据权利要求24的片段，进一步包括不抑制肿瘤细胞增殖的能力。
26.权利要求22-25任一项的片段在制备用于治疗涉及血管生成的疾病的药物中的用途。
27.权利要求22-25任一项的片段在制备用于治疗涉及肿瘤生长的疾病的药物中的用途。
28.含有权利要求22-25任一项的片段的药物组合物。
29.根据权利要求22或23的片段，其中所述片段具有SEQIDNO：10的氨基酸残基54至氨基酸124的氨基酸序列。
30.根据权利要求24的片段，具有SEQIDNO：10的氨基酸残基185至氨基酸203的氨基酸序列。
31.根据权利要求22或23的片段，其中所述片段包括氨基酸序列：PGL KGK RGD SGS PAT WTT RGF VFT RHS QTT AIP SCP EGTVPL YSG FSF LFV QGN QRA HGQ DLG TLG SCL QRF TTM PFLFCN VND VCN FAS RND YSY WLS TPA LMP MNM API TGR ALEPYI SRC TVC EGP AIA(SEQIDNO：23)。
32.根据权利要求22或23的片段，其中所述片段包括氨基酸序列：G FSF LFV QGN QRA HGQ DLG TLG SCL QRF TTM PFL FCN VNDVCN FAS RND YSY WLS TPA LMP MNM API TGR ALE PYI SRCTVC EGP AIA(SEQIDNO：33)。
33.根据权利要求22或23的片段，其中所述片段包括氨基酸序列LQRFTTMPFLFCNVNDVCNF(SEQIDNO：29)。
34.权利要求29-33任一项的片段用于药物的用途。
35.权利要求29-33任一项的片段在制备用于治疗涉及血管生成的疾病的药物中的用途。
36.权利要求29-33任一项的片段在制备用于治疗涉及肿瘤生长的疾病的药物中的用途。
37.含有权利要求29-33任一项的片段的药物组合物。
38.根据权利要求29-33任一项的片段，其中一个或多个半胱氨酸残基被碱性还原。
39.根据权利要求29-33任一项的片段，其中一个或多个半胱氨酸残基被诱变为其他氨基酸。
40.根据权利要求39的片段，其中一个或多个半胱氨酸残基被诱变为丙氨酸。
41.根据权利要求22或23或40的片段，其中所述片段包括氨基酸序列：G FSF LFV QGN QRA HGQ DLG TLG SCL QRF TTM PFL FCN VNDVCN FAS RND YSY WLS TPA LMP MNM API TGR ALE PYI SRCTVA EGP AIA(SEQIDNO：34)。
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