CN101053561A - 用于抑制αvβ5介导的血管生成的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于抑制α_vβ₅介导的血管生成的方法和组合物。本发明描述了使用玻连蛋白α_vβ₅拮抗剂抑制组织中血管生成的方法。α_vβ₅介导的血管生成与暴露于细胞因子相关，所述细胞因子包括血管内皮生长因子、转化生长因子－α和表皮生长因子。特别优选在血管内皮眼新血管(neovascular)疾病中、肿瘤生长中和炎症中使用含α_vβ₅拮抗剂的治疗组合物抑制α_vβ₅介导的血管生成。

Description

用于抑制αvβ5介导的血管生成的方法和组合物

本申请是申请日为1996年8月13日的中国专利申请96197429.X“用于抑制α_vβ₅介导的血管生成的方法和组合物”的分案申请。

政府支持

本发明是政府资助的，合同号为CA 45726和CA 50286，与国立卫生研究院，国立癌症研究院(The National Institutes of Health，NationalCancer Institute)签订。政府具有本发明的一些权利。

技术领域

本发明总体来讲涉及医药领域，具体而言涉及使用玻连蛋白受体α_vβ₅拮抗剂来抑制α_vβ₅-介导的血管生成的方法和组合物。

背景技术

整联蛋白是一类细胞受体，已知与胞外基质蛋白结合，由此介导细胞-细胞和细胞-胞外基质的相互作用，即通常所谓的细胞粘着事件。虽然文献中描述了许多整联蛋白及其各自的配体，但许多整联蛋白的生物功能仍是不清楚的。整联蛋白受体由一簇具有共同结构特征的蛋白质组成，为α和β亚基形成的非共价结合的异源二聚糖蛋白复合物。

玻连蛋白受体，以其优先与玻连蛋白结合的本质特征而命名，目前已知指三种不同的整联蛋白，即α_vβ₁、α_vβ₃和α_vβ₅。Horton，国际实验病理符杂志(Int.J.Exp.Pathol.)，71：741-759(1990)。α_vβ₁与纤连蛋白和玻连蛋白结合。α_vβ₃与多种配体结合，所述配体包括血纤维蛋白、血纤维蛋白原、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、玻连蛋白、von Willebrand因子、骨桥蛋白(osteospontin)和骨涎蛋白I。α_vβ₅与玻连蛋白结合。目前仍在研究这三种整联蛋白在组织中细胞的许多相互作用中所起的特定的细胞粘着作用。但是有一点是清楚的，即存在着具有不同生物功能的不同的整联蛋白，并且还存在着具有相同生物特性的不同的整联蛋白和亚基。

许多整联蛋白的配体中一个重要的识别位点是Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列。在上述已鉴别出的玻连蛋白受体整联蛋白的所有配体中均发现了RGD。可以用含有RGD序列的为肽(“肽”)模拟RGD识别位点，已知这种RGD肽是整联蛋白功能抑制剂。但是，重要的是应注意到依赖于RGD肽的序列和结构，可改变抑制作用的特异性，以靶向于特定的整联蛋白。

论及RGD识别位点，参见Pierschbacher等， 自然(Nature)，309：30-33(1984)和Pierschbacher等， 美国国家科学院院刊( Proc. Natl.Acad.Sci.USA)，81：5985-5988(1984)。改变整联蛋白特异性的各种RGD多肽还被描述于Grant等， 细胞( cell)，58：933-943(1989)、Cheresh等， 细胞( Cell)，58：945-953(1989)、Aumailley等，FEBS Letts.，291：50-54(1991)和Pfaff等， 生物化学杂志( J.Biol.Chem.)，269：20233-20238(1994)以及美国专利No.4,517,686、4,578,079、4,589,881、4,614,517、4,661,111、4,792,525、4,683,291、4,879,237、4,988,621、5,041,380和5,061,693。

血管生成，也指新血管形成，是一种组织血管形成的过程，包括新生血管的生长向组织中的。此过程由内皮细胞和平滑肌细胞的浸润作用介导。认为该过程以下述三种方式之一进行：1)从预先存在的血管中可分枝生长出(Sprout)血管；2)从前体细胞中可从头产生血管再生(血管发生)；或者3)已存在的小血管直径增大。Blood等， 生 物化学与生物物理学报( Bioch.Biophys.Acta)，1032：89-118(1990)。已知血管内皮细胞至少含有5种RGD-依赖性整联蛋白，包括玻连蛋白受体(α_vβ₃或α_vβ₅)、胶原蛋白I型和IV型受体(α₁β₁)、层粘连蛋白受体(α₂β₁)、纤连蛋白/层粘连蛋白/胶原蛋白受体(α₃β₁)和纤连蛋白受体(α₅β₁)。Davis等，细胞生物化学杂志( J.Cell. Biochem.)，51：206-218(1993)。已知平滑肌细胞至少含有6种RGD依赖性整联蛋白，包括α₅β₁、α_vβ₃和α_vβ₅。

血管生成在新生儿生长中是一个重要过程，但其在伤口愈合和多种临床主要疾病的发病机理中也非常重要，所述疾病包括组织炎症、关节炎、牛皮癣、癌症、糖尿病性视网膜病、黄斑退变和其它新血管性眼病。这些与血管生成有关的临床实例称为血管生成性疾病。Folkman等， 科学( Science)，235：442-447(1987)。虽然在伤口愈合和黄体生长循环中发生血管生成，但在成人或成熟组织中通常没有血管生成。例如参见Moses等， 科学(Science)248：1408-1410(1990)。

使用对各种整联蛋白α或β亚基具有免疫特异性的单克隆抗体体外抑制细胞粘着会涉及包括微血管内皮细胞在内的各种细胞类型的细胞粘着中的玻连蛋白受体α_vβ₃。Davis等， 细胞生物学杂志( J.Cell. Biol.)，51：206-218(1993)。此外，Nicosia等在 美国病理学 杂志( Am.J.Pathol.)，138：829-833(1991)中还描述了使用RGD肽GRGDS体外抑制培养于胶原蛋白胶中大鼠主动脉的“微血管”形成。

但是，在胶原蛋白胶中“微血管”形成的体外抑制作用不是抑制组织中血管生成的模型，因为没有表明微血管结构与新生毛细血管相同或胶原蛋白胶培养物中微血管形成与实体组织中新血管生长相同，所述组织如关节炎组织、肿瘤组织或疾病组织，其中需要抑制血管生成。

最近确证了α_vβ₃在血管生成中的作用。参见Brooks等 科学( Science)，264：569-571(1994)。表明整联蛋白被表达于人伤口肉芽组织的血管中而在正常皮肤中不被表达。针对α_vβ₃受体的单克隆抗体抑制由生长因子(细胞因子)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及黑素瘤片段诱导的血管生成。然而拮抗剂仅抑制新血管，而不抑制预先存在的血管。并且，含RGD的特定的线性肽和环肽也表明能抑制新血管形成。

已有人提出血管生成的抑制将是一种用于限制肿瘤生长的有用疗法。已提出通过下述方法抑制血管生成：(1)抑制“生成血管的分子”如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的释放，(2)如使用抗-bFGF抗体中和生成血管的分子，(3)抑制内皮细胞对生成血管刺激物的答应。后一种方法已受到关注，且Folkman等人在 癌生物学( Cancer Biology)，3：89-96(1992)中描述了几种内皮细胞应答抑制剂，包括胶原蛋白酶抑制剂、基底膜更新抑制剂、收缩血管的(angiostatic)类固醇、真菌衍生的血管生成抑制剂、血小板因子4、血小板反应蛋白、关节炎药物如D-青霉胺和硫代苹果酸金盐、维生素D₃类似物、α-干扰素以及可用于抑制血管生成的类似物。提出的其它血管生成抑制剂参见Blood等生物化学与生物物理学报( Bioch. Biophys.Acta.)，1032：89-118(1990)、Moses等 科学( Science)，248：1408-1410(1990)、Ingber等Lab.Invest.，59：44-51(1988)和美国专利Nos.5,092,885、5,112,946、5,192,744、和5,202,352。

但是，直到本发明为止没有人指出或明确整联蛋白α_vβ₅在血管生成中的作用，而且上面参考文献中所描述的任何一种血管生成抑制剂均没有被靶向于抑制α_vβ₅。再者，除本发明之外，没有参考文献涉及新血管形成中的α_vβ₅，特别是由生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-α(TGF-α)和表皮生长因子(EGF)诱导的新血管形成。

虽然控制血管生成中涉及的生长因子的数目是有限的，但对于静止状态向新血管状态转化存在着不同水平的控制过程。参见D′Amore，实验眼科学和视觉科学(Investigative ophthal.Visual Sci.)，35：3974-3979(1994)。当血管生成中包括的一些生长因子被调节在合成水平时，其它生长因子由活化状态调节。在受损伤或局部缺血后静止血管经历新血管形成，产生这些细胞过程。

尤其是VEGF被认为是初期肿瘤和局部缺血眼病中血管生成的主要介质。参见Folkman，天然医药( Nature Medicine)，1：27-31(1995)中的综述。VEGF是一种46千道尔顿(kDa)的同源二聚体，为内皮细胞特异性的血管生成性(Ferrara等， 内分泌学综述( Endocrin.Rev.)，13：18-32(1992))和血管渗透性因子(Senger等， 癌研究( Cancer Res.)，46：5629-5632(1986))，与具有酪氨酸激酶活性的高亲和性膜结合受体相结合(Jakeman等，临床研究杂志( J.Clin.Invest.)，89：244-253(1992))。

最近受体酪氨酸激酶的活化被表明能促进整联蛋白依赖性细胞在胞外基质蛋白上迁移。具体来讲，Klemke等在 细胞生物学杂志( J. Cell.Biol.)，127：859-866(1994)中提及了促进细胞移动中的EGF受体(EGFR)酪氨酸激酶，但没有提及用α_vβ₅整联蛋白使FG人胰腺癌细胞粘附于玻连蛋白上。作者给出了直接证据，即，EGFR与EGF配体的结合活化了酪氨酸激酶对EFGR的活化作用，最终激活了蛋白激酶C(PKC)-依赖性途径，导致诱发玻连蛋白底物的α_vβ₅-依赖性细胞的迁移，通常细胞在该底物上是不能迁移的。由此，Klemke等人的发现为细胞迁移中细胞因子特别是EGF的存在与整联蛋白活性之间的相关性提供了证据。已表明在小鸡绒毛尿囊膜模型系统中PKC活化与血管生成的调节作用有关。参见Tsopanoglou等， 血管研究杂志(J.Vasc.Res.)，30：202-208(1993)。该文作者鉴别出PKC特异的活化剂和抑制剂，它们在模型系统中分别刺激和抑制血管生成。

然而，上述的Klemke等人和Tsopanoglou等人都没有描述各种情况和疾病状态中在促进血管生成时细胞因子的作用和α_vβ₅整联蛋白的表达和/或活化，以及使用α_vβ₅特异性拮抗剂对疾病状态的抑制。

最近的实验证据表明，在眼病猴模型系统中由视网膜静脉闭塞诱发的视网膜缺血导致眼房中VEGF的快速上升。这种上升与Miller等人在 美国病理学杂志(Am.J.Path.)，145：574-584(1994)中所描述的观察到的虹膜新血管形成是一致的。在增殖性视网膜病的小鼠模型系统中给出另一证据，其中诱发缺氧，在相对缺氧的6-12小时内VEGF信使RNA显示出上升状态，保持高水平直至发生新血管形成。当新血管衰退时，VEGF的表达也下降，正如Pierce等人在 美国 国家科学院院刊( Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，92：905-909(1995)中所述。

因此，局部缺血性动物模型中所显示的最新数据将VEGF的诱导与局部缺血后新血管形成情况关联起来。在包含新血管形成的其它情况和疾病中也涉及VEGF及其它生长因子，Folkman在 天然医药(Nature Medicine)，1：27-31(1995)中作出了综述。

Folkman等人的文章中还总结了用于控制不需要的血管生成的最新临床手段。临床试验中的病人接受血管生成抑制剂治疗，所述抑制剂包括血小板因子4、烟曲霉素衍生物、羧氨三唑等等。但是，没有文献或现有治疗方法将α_vβ₅的表达与血管生成特别是VEGF诱导的血管生成相互关联起来。因此，本发明之前，没有人描述过或使用过以α_vβ₅拮抗剂来控制经受血管生成组织中血管生成的治疗方案，所述血管生成与α_vβ₅的存在和活化是相关的。

因此，除了这里所报道的这些有关α_vβ₃和生长因子与血管生成的关系的研究外，申请人们没有意识到其它任何证据，即使用α_vβ₅介导的细胞粘着抑制剂能够抑制组织中血管生成。具体而言，以前从未证明过组织中血管生成需要α_vβ₅或者α_vβ₅抑制剂能抑制组织中血管生成，尤其是在眼新血管性疾病中。

发明内容

本发明证明了在需α_vβ₃的组织血管生成途径之外，还存在着一条单独的新的α_vβ₅-依赖性途径。因此，本发明描述了能抑制血管生成的α_vβ₅抑制剂。本发明还描述了促进血管生成中α_vβ₅介导的活性与生长因子受体酪氨酸激酶和蛋白激酶C(PKC)对生长因子(细胞因子)的活化有关。以此方式起作用的生长因子(细胞因子)包括血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)等等。

由此本发明描述了抑制组织中血管生成的方法，包括对该组织给药一种组合物，该组合物含血管生成抑制量的α_vβ₅拮抗剂。

受治疗组织可以是需要抑制血管生成的任何组织，如发生新血管形成的疾病组织。例如这些组织包括经受新血管形成的眼组织、炎症组织，实体瘤、转移瘤、经受再狭窄的组织和类似组织。在优选的实施方案中，与α_vβ₅表达相关的新血管形成是暴露于生长因子、VEGF、TGF-α和EGF的结果。

具体优选的治疗方法是在产生血管生成的疾病组织例如眼中直接抑制VEGF诱导的血管形成，所述疾病包括糖尿病性视网膜病(也称为增殖性糖尿病视网膜病)、与年龄相关的黄斑退变性、假性眼组织胞浆菌病、早熟视网膜病、镰状细胞视网膜病和新血管青光眼。在其它优选实施方案中，治疗方法是直接抑制发生于角膜新血管疾病中的血管生成，所述疾病状况包括角膜移植术、疱疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状胬肉、与使用隐形眼镜有关的新血管角膜翳等等。

本方法中使用的α_vβ₅拮抗剂能够与α_vβ₅结合，并能竞争性抑制α_vβ₅结合天然玻连蛋白配体的能力。优选此拮抗剂对α_vβ₅比对其它整联蛋白具有特异性。在一具体优选实例中，α_vβ₅拮抗剂抑制玻连蛋白或其它含RGD配体与α_vβ₅的结合，但基本上不抑制玻连蛋白与α_vβ₃或α_IIbβ₃的结合。优选的α_vβ₅拮抗剂可以是一种线性或环化肽、一种单克隆抗体或其功能片段，或是一种模拟α_vβ₅配体的有机分子，也称之为有机模拟物，所有这些拮抗剂与α_vβ₅均具有特异性相互作用。

本发明α_vβ₅拮抗剂的给药方式包括眼内、静脉内、透皮、滑膜腔内、肌内或口服给药。在其它优选实施方案中，给药方式与控制肿瘤发生和癌转移的化学疗法协调一致。

附图说明

附图构成了本说明书的一部分：

图1A-1D说明了由α_v整联蛋白抗体拮抗剂对细胞因子诱导的家兔角膜血管生成的抑制作用。实施例4中描述了通过bFGF或VEGF处理来诱导血管生成及用α_v整联蛋白抗体拮抗剂P1F6(α_vβ₅)和LM609(α_vβ₅)进行处理的效果。OD和OS分别为实验家兔的右眼和左眼。大箭头表示水肿的角膜血管生成，小箭头指明正常结膜缘血管。图1A和1B示出用bFGF诱导血管生成，图1C和1D示出用VEGF诱导。图1A和1C中的家兔角膜示出用P1F6处理的效果，图1B和1D示出用LM609处理的效果。

图2A和2B为组方图，分别示出用FGF或VEGF诱导再以P1F6或LM609单抗处理后新血管平均面积，以mm²+/-标准误差表示(n＝8，两组系列中每一系列中只数)。实施例4中讨论了实施结果。

图3A-3F以图示说明了抗整联蛋白抗体处理小鸡CAM标本的效果。结果描述于实施例6A中。用bFGF或VEGF诱导血管生成，随后静脉内给药磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照，或者用图1说明中所述的P1F6或LM609单克隆抗体处理。以bFGF处理的CAM示于图3A、3C和3E中，以VEGF处理的CAM示于图3B、3D和3F中。接受静脉注射PBS的对照CAM示于图3A和3B中。用P1F6抗体处理CAM的情况示于图3C和3D中，用LM609抗体处理CAM的情况示于图3E和3F中。

图4A和4B以组方图形式提供了图3A-3F中所示结果的数量值。在Y轴示出相对于对照或抗体处理的血管生成指数。图4A和4B分别显示出bFGF和VEGF诱导的血管生成。结果讨论见于实施例4中。

图5A-5F以图示说明了合成肽处理实施例6所述的小鸡CAM标本的结果。用bFGF或VEGF诱导血管生成，随后静脉内给药磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照，或用合成环肽RGDfV(SEQ ID NO4)或RADfV(SEQ ID NO5)处理。以bFGF处理的CAM示于图5A、5C和5E，以VEGF处理的CAM示于图5B、5D和5F。接受静脉内注射PBS的对照CAM示于图5A和5B。用RDGfV处理CAM示于图5C和5D，用RADfV处理CAM示于图5E和5F。

图6A和6B以组方图形式提供了图5A-5F所示结果的数量值。在Y-轴示出相对于对照或抗体处理的血管生成指数。图6A和6B分别表示bFGF-和VEFG诱导的血管生成。结果于实施例6中讨论。

图7A-7E表明针对分别由细胞因子、bFGF、TNF-α、VEGF和TGF-α诱导的CAM血管生成用抗整联蛋白单克隆抗体和calphostin C产生的效果。也评估了PMA。分析和结果描述于实施例6中。结果绘成组方图形式，Y轴表示血管生成指数，X轴表示各种对照或抑制剂。图7A-7E分别表明由bFGF、TNF-α、VEGF、TGF-α和PMA诱导的血管生成。

图8表明在按实施例5C和6D所述进行的小鸡胚胎CAM测定中抗体处理CS1黑素瘤生长的效果组方图。Y轴示出肿瘤重量，以毫克(mg)表示，X轴示出各种处理情况。CSAT是对整联蛋白β1亚基特异的对照抗体。LM609和P1F6已在前面描述。

图9是对照物和标记的肽189(SEQ ID NO9)的α_vβ₅肽拮抗剂相比对黑素瘤生长产生的效果组方图，测量黑素瘤体积为mm³，示于Y-轴。分析和结果描述于实施例8。

图10说明了实施例10A-G中所述化合物7的合成。

图11说明了实施例10A-C、H-I中所述化合物9的合成。

图12说明了实施例10J中所述化合物10的合成。

图13说明了实施例10K-L和10M-N中分别描述的化合物12和化合物14的合成。

图14示出化合物15、化合物16、化合物17和化合物18的化学结构。所述化合物的具体合成过程描述于实施例10O-R中。

具体实施方式

A.定义

氨基酸残基：由多肽在肽键处的化学消化(水解)形成氨基酸。这里所述的氨基酸残基优选为“L”异构体型式。但是，只要多肽仍保持所需的功能性质，可以用“D”异构体型式的残基取代任何一种L-氨基酸残基。NH₂指存在于多肽氨基末端的游离氨基。COOH指存在于多肽羧基末端的游离羧基。为与标准多肽命名(描述于 生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，243：3552-59(1969)并在37CFR§1.822(b)(2)中被采纳)一致，氨基酸残基缩写形式示于下面对应表中：

                  对应表

符号		氨基酸
			单字母	三字母
YGFMASILTVPKHQEZWRDNBCX	TyrGlyPheMetAlaSerIleLeuThrValProLysHisGlnGluGlxTrpArgAspAsnAsxCysXaa				酪氨酸甘氨酸苯丙氨酸蛋氨酸丙氨酸丝氨酸异亮氨酸亮氨酸苏氨酸缬氨酸脯氨酸赖氨酸组氨酸谷氨酰胺谷氨酸Glu和/或Gln色氨酸精氨酸天冬氨酸天冬酰胺Asn和/或Asp半胱氨酸未知或其它

此外下述符号含义如下：

BOC                         叔丁氧羰基

DCCI                        二环己基碳化二亚胺

DMF                         二甲基甲酰胺

OMe                         甲氧基

应注意，此处用结构式表示所有的氨基酸残基序列，式子左右方向为氨基末端至羧基末端的常规方向。并且，应注意在氨基酸残基序列的开始或末端的短线表示一个肽键，与一个或多个氨基酸残基的序列相连。

多肽：氨基酸残基的一个线性序列，氨基酸残基通过相邻氨基酸残基的α氨基和羧基间的肽键彼此连结起来。

肽：不高于50个氨基酸残基按多肽中方式彼此相连形成的线性序列。

环肽：环肽由相应线性肽衍生，其中不存在游离N或C-端，相应线性肽的N-端与此相应线性肽的C-端羧酸形成酰胺键。

蛋白质：多于50个氨基酸残基按多肽中方式彼此连结形成的线性序列。

合成肽：化学方法生产的由肽键连结在一起的氨基酸残基链，没有天然产生的蛋白质或其片段。

B.总的思路

本发明总的来讲涉及一种发现，即血管生成由特定的玻连蛋白受体α_vβ₅介导，抑制α_vβ₅功能能抑制血管生成。

由于血管生成在多种疾病过程中的作用，该发现很重要的。通过抑制血管生成，人们可以干预疾病、改善症状，且某些情况下治愈疾病。

当新血管的生长是疾病相关的病理原因或对病理有影响时，抑制血管生成将会减少疾病的有害效果。疾病的例子包括类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、炎症、再狭窄等等。当需要生长新血管以支持有害组织生长时，血管生成的抑制将会减少对组织供血，由此有助于减少基于供血需求的组织大小。例子有，在应答局部缺血中新血管的生长，导致生长因子诱发的血管生成，肿瘤的生长，其中新血管形成是一种连续性需求，由此肿瘤会生长超过几毫米厚，并形成实体瘤转移。

本发明方法局部有效，因为此疗法对血管生成是高度选择性的，对其它生物学过程则没有。正如实施例中所示，仅有新血管生长含有大量α_vβ₅，因此该疗法对成熟血管没有副作用。

单独使用α_vβ₅的抑制作用会有效抑制血管生成，这一发现为开发具有潜在高度特异性的且由此具有较低毒性的治疗组合物创造了条件。虽然本发明揭示了能抑制一种或多种整联蛋白的以肽为基础的试剂的用途，但人们可以设计出更能选择性抑制α_vβ₅的其它试剂。因此，某些以肽为基础试剂对那些不是由α_vβ₅介导的其它生物学过程没有抑制副作用。

例如，正如本说明书所示，要制备对与α_vβ₅而非α_vβ₁、α_vβ₃或α_IIbβ₃的免疫反应具有高度选择性的单克隆抗体是可能的，这与选择性抑制α_vβ₅功能类似。此外，能设计出选择抑制α_vβ₅的含RGD的肽，下文对此进一步做出描述。

本发明的发现之前，人们不知道通过使用拮抗α_vβ₅生物功能的试剂能够在体内抑制血管生成及依赖于血管生成的任何过程。

C.抑制血管生成的方法

本发明提供了抑制组织中血管生成的方法，并由此抑制组织中依赖血管生成的事件的方法。一般来讲，该方法包括对组织给药一种组合物，所述组合物包含一种血管生成抑制量α_vβ₅拮抗剂。

在实施本发明方法中使用的靶组织被定义为含α_vβ₅的组织，其特征在于存在可检测出的α_vβ₅整联蛋白受体。换句话说，含α_vβ₅的组织被定义为在细胞膜中存在α_vβ₅受体复合物。这类组织包括上皮衍生细胞和间质衍生细胞。可以使用多种方法确定该受体的存在，所述方法包括受体与抗α_vβ₅整联蛋白受体抗体的免疫反应性，其中通过显微镜检查法、免疫沉淀法、配体结合分析的竞争性及类似技术来检测组织中免疫反应。用于检测组织中α_vβ₅存在的优选抗体描述于下文及实施例1中。例如，实施例2中描述了通过免疫荧光显微镜检术检测α_vβ₅在肾、皮肤和眼组织中的分布。

在本发明方法的上下文中，含α_vβ₅的组织也表示具有血管生成现象的组织。如前所述，血管生成包括涉及组织新血管形成的各种过程，包括“生长出新血管(Sprout)”、血管发生或血管增大，所有这些血管生成过程均由α_vβ₅介导并依赖于α_vβ₅的表达。除外伤愈合、黄体形成和胚胎发生外，大多数血管生成过程被认为与疾病过程有关，因此本发明治疗方法的使用对疾病具有选择性且没有有害的副作用。

存在着许多种其中血管生成起重要作用的疾病，称之为血管生成性疾病，它包括炎症如免疫和非免疫炎症，慢性关节风湿病和牛皮癣、与不合适或不正常血管侵染相关的疾病如再狭窄、动脉粥样硬化斑毛细血管增殖和骨质疏松症、癌症相关疾病如实体瘤、实体瘤转移瘤、血管纤维瘤、晶状体后纤维组织形成、血管瘤、卡波济肉瘤及需要新血管形成支持肿瘤生长的此类癌症，但不限于此。

以新血管形成为特征的眼病是特别优选的治疗靶。眼新血管形成是大多数眼病中所视察到的最常见的病理变化，可导致严重的视力丧失。从预存在的脉络膜、视网膜或副缘血管(paralimbal)生长新血管可引起水肿，出血或纤维血管膜形成，导致眼睛正常组织构造关系的破坏并伴随正常视觉功能的丧失。

以血管生成为特征的眼病包括角膜新血管疾病，有角膜移植、疱疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状胬肉、与使用隐形眼镜有关的新血管角膜翳等等。其它眼病还包括糖尿病性视网膜病(DR)、与年龄有关的黄斑退变(ARMD)、假性眼组织胞浆菌病(POHS)、早熟视网膜病(ROP)和新血管青光眼等等。尽管对这些疾病中血管生成的抑制不一定能治愈病根，但它能显著减轻与血管生成有关的视觉疾病。

例如，患糖尿病超过25年的300000病人中90％多少有些DR，这是一种视网膜病，特征为损耗和/或增殖血管。事实上这些病人中30％具有后一种症状，可用本发明治疗方法改善。对于ARDM，25％的超过65岁的人，约630000人多少患有该病，设想到2030年，将会有超过63000000的人患ARDM。因此，能抑制α_vβ₅相关的血管生成的本发明治疗组合物和方法，具有重大的医学价值。

因此，抑制发病组织中血管生成的方法改善疾病症状，并能根据疾病情况有助于治愈疾病。在一实施方案中，本发明设法抑制组织中血管生成本身。通过多种方法可以评估组织中血管生成的程度以及由本发明方法达到的抑制程度，这些方法描述于实施例中，通过免疫组织化学检测α_vβ₅-免疫阳性的新生血管结构和未成熟血管结构。

正如这里所描述的，各种组织或由有机组织构成的器官均能支持疾病状态中的血管生成，这些组织包括皮肤、肌肉、肠、结缔组织、关节、骨等类似组织，借助血管生成性刺激物血管能侵入这些组织中。

具体而言，本发明方法及α_vβ₅拮抗剂组合物在抑制由生长因子也称细胞因子诱导的血管生成中具有治疗用途。在生理条件下，血管生成受高度调节，且正如Brooks等在 科学( Science)，264：569-5761(1994)中已公开的，已证明血管生成被特定的血管生成性分子如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)活化。还描述了血管生成的负调节剂。因此血管生成由局部刺激剂和抑制剂之间复杂的平衡来调节。参见，D′Amore， 实验眼科和视觉科学( Investigative Ophthal.Visual Sci.)，35：3974-3979(1994)。

当紧密控制正常静止毛细血管的血管生成性刺激剂和抑制剂间的生理平衡被打破时，如产生某些疾病状态时，毛细血管内皮细胞便被诱发增殖、迁移并最终分化，形成新血管。

血管生成特征在于是一个级联过程，具有一系列早期过程，随后是一系列晚期过程，正如Leibovich在细胞因子在肿瘤血管生成过程中的作用(Role of Cytokihes in the Process of Tumor Angiogenesis)一文中所做的综述，该文在Aggarwal和Puri编的人细胞因子：在疾病及治疗中的作用(“Human Cytokines：Their Role in Disease andTherapy”)书中第35章，Blackwell Science，Ine(1995)。通过来自血管外源和血管生成性生长因子和细胞因子的递送启动早期过程。然后该早期过程进入目标微血管，破坏胞间连接、诱导内皮细胞活化作用抗原和蛋白水解表型的表达并引发定向方式的内皮细胞迁移。后期过程特征在于生长因子和细胞因子基因在生长的毛细血管芽细胞内进行自分泌表达和旁分泌表达，所述细胞包括内皮细胞，外膜细胞和平滑肌细胞。这些细胞反过来调节细胞与胞外基质的相互作用，导致从已存在的成熟血管中形成新功能毛细血管袢。

正如此处和背景技术中所述，文献中的报道描述了在人和实验动物中生长因子的出现与增殖性新血管眼病中发生血管生成之间的联系，其中包括那些随肿瘤块增大与α_vβ₅表达增多有关的生长因子，即VEGF、TGF-α和EGF。

因此，在多种其它生长因子中VEGF、EGF、TGF-α被认为是以刺激细胞生长这一性质为特征的生长因子。生长因子是由一种细胞分泌的蛋白质，作用于分泌细胞或另一种细胞。它们能起作用依赖于生长因子受体的存在，这些受体通常是跨膜蛋白。生长因子如VEGF通常也被称为细胞因子，被定义为由一种细胞分泌的多肽激素，影响相同细胞(自分泌)或另一种细胞(旁分泌)的生长和代谢。术语细胞因子不限于由免疫系统细胞产生的分子和同一系统的生物答修饰因子。因此，术语细胞因子是一个宽范畴，其中一个基于生物应答型的子范畴是刺激性生长因子或增强因子，如VEGF、bFGF、EGF、TGF-α等等。参见Aggarwal等人的综述：细胞因子和细胞因子的常见和不常见性质：综述(Common and Uncommon Features of Cytokines andCytokine Receptors：An Overview)，该文在Aggarwal和Puri编的“人细胞因子：在疾病和治疗中的作用”(Human Cytokines：Their Role inDisease and Therapy)第1章中，Blackwell Science Inc.(1995)出版。

本发明中，α_vβ₅特异性拮抗剂而非抗VEGF抗体这种生长因子拮抗剂被计划用于抑制组织中血管生成。在优选实施方案中，此处所述的α_vβ₅拮抗剂被用于抑制生长因子诱导的血管生成，其中α_vβ₅整联蛋白受体的表达被诱导。本说明书中优选的生长因子包括VEGF、EGF、TGF-α等等。

正如背景技术中所讨论的，已知生长因子EGF和VEGF均与用作酪氨酸激酶的其细胞受体结合。进一步证明了EGF受体的活化与蛋白激酶C的活化有关，其中蛋白激酶C活化导致α_vβ₅活化，使得特定细胞在玻连蛋白底物上迁移。因此，在细胞因子或生长因子中的暴露与整联蛋白表达或活化中的协调应答之间的作用机理是一个复杂的生物学过程。正如本发明所示(参见实施例6A)，使用细胞因子VEGF处理家兔眼模型或小鸡绒毛尿囊模型中的组织，导致依赖于蛋白激酶C活化的α_vβ₅-强化的血管生成。

在一具体优选实施方案中，本发明计划使用α_vβ₅拮抗剂来抑制已由VEGF诱导出血管生成的任何组织中的血管生成。例如，已证明在各种动物模型系统中视网膜缺血造成Muller细胞分泌的VEGF的向上调节，由此VEGF的产生诱导眼内组织的新血管形成，参见Miller等美国病理学杂志( Am.J.Path.)，145：574-584(1994)和Pierce等 美国国家科学院院刊( Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)92：905-909(1995)。

因此，本发明中要治疗的组织是患有上述糖尿病性视网膜病、黄斑退变、新血管青光眼或类似疾病的病人的视网膜组织，并且要抑制的血管生成是视网膜组织血管生成，其中有视网膜组织的新血管形成。这类组织的例子在上文和实施例中描述，包括眼新血管形成疾病患者的角膜组织。用于详估本发明α_vβ₅拮抗剂对视网膜血管生成的治疗效果的一例模型系统是实施例9中所述的视网膜新血管形成的小鼠模型。

在另一有关实施方案中，要治疗的组织是发炎的组织，要抑制的血管生成是发炎组织血管生成，其中有发炎组织的新血管形成。这类情况中，本方法计划抑制关节炎组织如患慢性类风湿性关节炎病人中的血管生成、抑制免疫或非免疫发炎组织和牛皮癣等组织中的血管生成。

细胞因子白介素1和肿瘤坏死因子α被认为与类风湿性关节炎有关，基于内皮细胞上粘连分子表达的诱导和酶的释放它们在关节破坏中具有直接作用。参见Arend等， 关节炎和风湿( Arthritis & Rheumatism)，38：151-160(1995)。已有人提出了治疗方案，使用细胞因子特异性抑制剂阻断这两种细胞因子，并靶向于疾病中表达的细胞粘连分子。参见Haskard等 细胞粘附通讯( Cell Adhesion Comm.)，2：235-238(1994)。

因此，通过将疗法针对α_vβ₅粘着分子的参与来抑制关节炎中血管生成是发明的另一优选实施方案，正如本发明前文所述。

在另一有关实施方案中，要治疗的组织是患有实体瘤、转移瘤、皮肤癌、乳腺癌、血管瘤或血管纤维瘤等这类癌症的病人的肿瘤组织，要抑制的血管生成是肿瘤组织血管生成，其中有肿瘤组织的新血管形成。可由本发明方法治疗的典型实体瘤组织包括肺、胰、乳腺、结肠、喉、卵巢等类似组织。

存在于人实体瘤中复杂的细胞因子网的作用是Leek等人在白细胞生物学(J.Leukocyte Biol.)，56：423-435(1994)中的综述主题，该文章在此引作参考文献。

多种细胞因子，包括VEGF、酸性和碱性FGF(bFGF)、TGF-α和-β、EGF、TNF-α、血小板衍生的内皮细胞生长因子、血管生成素、干扰素α和γ、白介素1、白介素6和8等等，被认为影响恶性组织和细胞系中血管生成的各种细胞机制。例如，除了其在各种肿瘤中的定位，VEGF最近还被证明与乳腺癌中的血管生成有关，正如Brown等人在 人类病理学( Human Path.)26：86-91(1995)中所述。

通过使用抗细胞因子抗体筛选肿瘤组织样品可鉴别出分泌各种细胞因子并在其中作为应答诱导局部血管生成的肿瘤，特别是本发明中具有细胞因子VEGF、TGF-α和EGF及产生的α_vβ₅介导的血管生成的肿瘤。这些方法是本领域普通技术人员所熟悉的，无论是用于培养的还是用于活检的肿瘤组织样品。从Oncogene Science(Uniondale，NY)或Upstate Biotech Incorporated(Lake Placid，NY)可购买到抗上述细胞因子的抗体。用这些方法筛选所选的肿瘤组织，允许人们对本发明α_vβ₅拮抗剂的潜在的血管生成抑制活性进行评估。

实施例中描述了肿瘤组织血管生成及其抑制的例子。

抑制肿瘤组织血管生成也是本发明的另一优选的实施方案，因为在肿瘤生长中新血管形成起重要作用。在没有新血管形成的肿瘤组织中，肿瘤组织得不到所需营养，生长减慢，停止再生长，退化并最终坏死，导致肿瘤死亡。

换句话说，根据本方法通过抑制肿瘤血管生成，本发明提供了抑制肿瘤新血管形成的方法。类似地，通过实施血管生成抑制法，本发明提供了抑制肿瘤生长的方法。

这些方法对抑制转移瘤的形成也特别有效，因为(1)它们的形成要求初始肿瘤的血管形成，从而转移癌细胞可移出初始肿瘤，(2)它们在第二位点的确立需要新血管形成以支持转移瘤的生长。在有关的实施方案中，本发明将其它疗法如直接抑制实体瘤和控制转移瘤确立的常规化学疗法与本方法结合使用。通常在化学治疗中或治疗后给药血管生成抑制剂，虽然有时优选在化学疗法之后抑制血管生成，其中肿瘤组织将通过诱导血管生成对毒素攻击作出应答，以对肿瘤组织提供血液和营养使其恢复。此外，作为抑制转移瘤的预防措施将实体瘤除去的情况中，优选在手术后实施血管生成抑制法。

既然本方法用于抑制肿瘤新血管形成，它们也可用于抑制肿瘤组织生长、抑制转移瘤的形成和使已形成肿瘤退化。对于后一种情况，在本发明使用的家兔眼分析模型中评估肿瘤块的减小，或使用嵌合小鼠：人模型的模型系统，其中具有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠的皮肤以人新生包皮取代，如Yan等人在 临床研究杂志( J.Clin.Invest.)，91：986-996(1993)中所述，该文内容在此引作参考。后一模型是使用本发明方法研究血管生成及其抑制的另一个活体模型。实施例5C和5D中示出使用家兔肿瘤模型和本发明α_vβ₅拮抗剂的实验结果，实施例8中描述了在SCID小鼠模型中抑制血管生成的结果。

再狭窄是一种平滑肌细胞(SMC)迁移并在经腔冠状血管成形术处增殖的过程，阻碍血管成形术的成功。在再狭窄中SMC的迁移和增殖可被认为是一种血管生成过程，被本发明方法抑制。因此，根据本方法通过在血管成形术后的病人中抑制血管生成，本发明还抑制了再狭窄。通常在血管成形术后给药α_vβ₅拮抗剂用于抑制再狭窄，给药约2天至约28天，且常常为术后前14天左右。

虽然本发明原理表明其对包括在术语“患者”中的所有哺乳动物是有效的，但在本发明许多实施方案中治疗的患者应是人。本文中，认为哺乳动物包括任意哺乳动物种类，特别是农业和饲养业中的哺乳动物种类，其中使用本发明方法对其进行治疗。

抑制组织中血管生成的本方法以及由此用来治疗血管生成相关疾病的方法，包括用一种组合物接触发生血管生成或快要发生血管生成的组织，所述组合物含治疗有效量的能抑制α_vβ₅与其天然受体结合的α_vβ₅拮抗剂。因此，本方法包括对病人给药治疗有效量的生理上可耐受的组合物，该组合物含一种本发明的α_vβ₅拮抗剂。

α_vβ₅拮抗剂的给药剂量范围如下文所述依赖于拮抗剂的型式及其效力，并且用量足够产生所需效果，血管生成及由血管生成介导的疾病症状均被减轻。剂量不应太大以致产生副作用，如粘滞性过高综合征、肺水肿、充血性心脏衰竭等等。通常，剂量随年龄、身体条件、性别和病人患病程度而不同，可由本领域技术人员确定。在任何一种并发症的情况中该剂量也可由医生个人调节。

α_vβ₅拮抗剂是一种通过抑制受体与其配体即玻连蛋白的结合活性来阻断或抑制α_vβ₅生理或药理活性的分子。优选的α_vβ₅拮抗剂可以是单克隆抗体、肽或模拟α_vβ₅配体的有机分子。

治疗有效量是α_vβ₅拮抗剂用量足以对被治疗组织中的血管生成产生可测出的抑制作用，即血管生成抑制量。通过这里所述的免疫组织化学或本领域技术人员所知的其它方法可原位测量血管生成的抑制。

既然α_vβ₅拮抗剂可以是α_vβ₅配体有机模拟物、含RGD的肽、抗α_vβ₅单克隆抗体或其片段或α_vβ₅受体模拟物的形式，应理解效力和“治疗有效”量的表达是可以变化的。但正如这些分析鉴定方法所示，本领域技术人员能容易评估本发明候选α_vβ₅拮抗剂的效力。

正如此处所述，通过各种方法包括在CAM分析中、在活体家兔眼分析中血管生成的抑制及通过测定天然配体与α_vβ₅结合的抑制及类似分析等，可以测定α_vβ₅拮抗剂的效力。

一个优选的α_vβ₅拮抗剂在其浓度小于0.5微摩尔浓度(μM)，优选小于0.1μM，更优选小于0.05μM时能基本抑制溶液中天然配体如玻连蛋白与α_vβ₅的结合。“基本”意思指在α_vβ₅拮抗剂存在时由于抑制作用观察到与玻连蛋白的结合至少减少了50％，这里在50％抑制作用时称为IC₅₀值。

更优选的α_vβ₅拮抗剂对α_vβ₅比对其它整联蛋白具有选择性。因此，优选的α_vβ₅拮抗剂基本抑制玻连蛋白与α_vβ₅的结合，而基本不抑制玻连蛋白与另一种整联蛋白如α_vβ₁、α_vβ₃或α_IIbβ₃的结合。具体优选的α_vβ₅拮抗剂，在抑制玻连蛋白与α_vβ₅结合时呈现的IC₅₀活性比在抑制玻连蛋白与另一整联蛋白结合时的IC₅₀活性低10倍至100倍。实施例中描述了在抑制玻连蛋白与整联蛋白结合时测定IC₅₀活性的分析方法。

本发明单克隆抗体形式的α_vβ₅拮抗剂的治疗有效量通常是当以一种生理上可耐受的组合物给药时该量足以达到血清浓度0.01μg/ml至约100μg/ml，优选约1μg/ml至约5μg/ml，通常约5μg/ml。换句话说，每天一剂或多剂给药，剂量可以从约0.1mg/kg至约300mg/kg、优选约0.2mg/kg至约200mg/kg、最优选约0.5mg/kg至约20mg/kg变化，给药一天或几天。

当拮抗剂为单克隆抗体的片段形式时，可根据片段大小相对于完整抗体大小容易调节用量。优选血浆摩尔浓度为约2μM至约5μM，并优选约100μM至1mM的抗体拮抗剂。

本发明多肽形式或其它相似大小的小分子α_vβ₅配体模拟物形式的α_vβ₅拮抗剂，其治疗有效量通常是：当以一种生理上可耐受的组合物给药时，多肽量足以达到血浆浓度约0.1μg/ml至约200μg/ml，优选1μg/ml至约150μg/ml。每摩尔质量约为500g的多肽，优选血浆摩尔浓度约为2μM至约5mM，优选约100μM至1mM的多肽拮抗剂。换句话说，每天一剂或多剂给药时，每公斤体重剂量可以从约0.1mg/kg至约300mg/kg，优选0.2mg/kg至约200mg/kg变化，给药一天或多天。

本发明单克隆抗体、多肽或有机模拟物可通过注射或一段时间内逐渐输注进行肠胃外给药。虽然一般通过全身给药且更常见的是通过静脉内给药治疗组合物可以进入要治疗的组织，但是，当靶向组织可能含有靶分子时应考虑其它组织和递送方式。因此，本发明的单克隆抗体、多肽或有机模拟物可以被眼内、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、透皮给药，也可用蠕动方式进行递送。

例如通过注射单位剂量，通常静脉内给药含α_vβ₅拮抗剂的本发明治疗组合物。术语“单位剂量”当用于本发明治疗组合物时，指物理上分开的单元，适于给患者的单元药剂，每个单元含预定量的活性物质，为产生所需治疗效果计算出这一数值，与所需稀释剂即载体或赋形剂配伍。

在如实施例所示的优选实施方案中，以单一剂量静脉内给药α_vβ₅拮抗剂。

以适合剂型的方式和治疗有效量给药组合物。给药量和给药时间依赖要治疗的患者、患者身体系统利用活性成分的能力和所需程度的治疗效果。给药所需的活性成分的精确量依赖实施者的判断且每个人各有特点。但是，此处公开了全身施用的合适的剂量范围，且此范围依赖给药途径。合适的给药方案也是可变的，但是其特征都是初次给药后间隔1小时或几小时通过随后的注射或其它方式给药重复剂量。或者，考虑连续静脉内输注，足以保持血中浓度在活体内治疗规定的范围内。

D.治疗组合物

本发明设计了用于实施此处所述治疗方法治疗组合物。本发明治疗组合物包含生理上可耐受的载体及这里所述的α_vβ₅拮抗剂，拮抗剂溶解或分散于载体中作为活性成分。在优选实施方案中，当对哺乳动物或人患者给药α_vβ₅拮抗剂治疗组合物用于治疗目的时，它是非免疫原性的。

此处所用术语“药学上可接受的”“生理上可耐受的”及其各种词性形式，当其指组合物、载体、稀释剂和试剂时，可交换使用，表示能将这些物质给药或用于哺乳动物，不会产生不需要的生理效应，如恶心、眩晕、胃不适等等。

根据配方，含有活性成分的药物组合物的制备是本领域熟知的，不必受限制，其中活性成分是溶解或分散于组合物中的。通常将这种组合物制备成可注射的形式如液体溶液或悬浮液，但是也可制成适于变成溶液或悬浮液的固体形式，使用前溶于液体。制剂也可以是乳化的。

可将活性成分与药学上可接受的、与活性成分相容的且用量适于此处所述疗法的赋形剂混合。例如，合适的赋形剂有水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其结合物。此外，如果需要的话，组合物可含有微量助剂如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等，其增强活性成分的有效性。

本发明治疗组合物可包括其成分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸如盐酸、磷酸或与有机酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成酸加成盐(由多肽游离氨基形成)。由游离羧基形成的盐也可以从无机碱如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物及从有碱如异丙胺、三甲基胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等衍生。

当用于环肽α_vβ₅拮抗剂的制备时，具体优选的是盐酸盐。

生理上可耐受的载体是本领域熟知的。液体载体的例子有无菌水溶液，除活性成分和水之外它不含任何物质，或含一种缓冲液如生理pH值的磷酸钠，含生理盐水或含这两种物质如磷酸盐缓冲盐水。并且，水溶液载体可以含多于一种的缓冲盐，及氯化钠、氯化钾、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶质。

液体组合物还可以含有除水之外的液体相。这种附加的液体相例子有甘油、植物油如棉子油和水油乳浊液。

治疗组合物含有血管生成抑制量的本发明α_vβ₅拮抗剂，通常被配制成单位重量的总治疗组合物含至少0.1重量百分比的拮抗剂。重量百分比是抑制剂重量与组合物总重的比率。因此，0.1重量百分比是每100g总组合物中有0.1g的抑制剂。

E.整联蛋白α_vβ₅拮抗剂

本方法中使用α_vβ₅拮抗剂抑制组织中血管生成，此拮抗剂可以是多种形式的，包括化合物，其与α_vβ₅相互作用从而阻碍α_vβ₅与天然α_vβ₅配体间的功能相互作用。拮抗剂的例子包括：α_vβ₅的类似物或模拟物，其由α_vβ₅的配体位点上结合衍生而来；α_vβ₅天然配体的模拟物，其模拟α_vβ₅配体结合相互作用中涉及的结构区域；多肽，具有与α_vβ₅特异的天然配体的功能结合区域相应的序列，特别是与α_vβ₅天然配体中包含RGD的区域相应的序列；以及与α_vβ₅或天然配体进行免疫反应的抗体，所有这些物质均表现出此处所定义的拮抗剂活性。

1.多肽

在一实施方案中，本发明设计使用多肽形式的α_vβ₅拮抗剂。α_vβ₅多肽(肽)拮抗剂可以具有α_vβ₅天然配体的序列特征，或α_vβ₅本身在α_vβ₅-配体相互作用中涉及的区域序列特征，此多肽具有此处所述的α_vβ₅拮抗剂活性。优选的α_vβ₅肽拮抗剂含有RGD三肽，且与天然配体含RGD区域序列一致。

优选的含RGD多肽序列与α_vβ₅天然配体如玻连蛋白的含RGD区的氨基酸残基序列一致，其中玻连蛋白的序列是熟知的。

正如前所述，一个具体优选的α_vβ₅肽拮抗剂，在α_vβ₅和其它整联蛋白相比时，优先抑制α_vβ₅与其天然配体结合。至少特别优选这些α_vβ₅特异性肽，因为对α_vβ₅的特异性减少副反应如抑制其它整联蛋白的发生。在典型的结合抑制分析如实施例中所述的ELISA分析中能很快鉴别出优选的对α_vβ₅具有特异性的α_vβ₅肽拮抗剂。

在一实施方案中，本发明的多肽包含不多于100个氨基酸残基，优选不多于60个残基，更优选不多于30个残基。肽可以是线性的或环状的，尽管特别优选肽是环状的。实施例中描述了优选的肽。

应理解，主题多肽不必与α_vβ₅天然配体的氨基酸残基序列等同，只要该多肽包含拮抗α_vβ₅配体与α_vβ₅结合所必需的序列并能在这里描述的分析中用作α_vβ₅拮抗剂即可。

主题多肽包括此处示出其氨基酸序列的多肽的任何类似物、片段或化学衍生物，只要此多肽是α_vβ₅拮抗剂。因此，可以对现存多肽进行各种改变、取代、插入和缺失，这些变化提供了某些使用中的优点。从这方面看，本发明α_vβ₅多肽拮抗剂与所列举的肽序列是相应的，而非等同，其中进行了一处或多处改变且在这里所述的一种或多种分析中保持用作α_vβ₅拮抗剂的功能。

因此，多肽可以是各种形式的肽衍生物，包括酰胺、与蛋白的结合物、环肽、聚合肽、类似物、片段、化学修饰的肽等此类衍生物。

术语“类似物”包括任何多肽，它的氨基酸残基序列与此处具体示出的序列基本相同，其中一个或多个残基被功能相似的残基保守性替换，表现出此处所述的α_vβ₅拮抗剂活性。保守性替换的例子包括：用一个非极性(疏水)残基如Ile、Val、Leu或Met替换另一个非极性残基，用一个极性(亲水)残基替换另一个极性残基如Arg和Lys之间、Gln和Asn之间、Gly和Ser之间的替换，用一个碱性残基如Lys、Arg或His替换另一个碱性残基，或用一个酸性残基如Asp或Glu替换另一个酸性残基。

术语“保守性替换”也包括用化学衍生的残基替换非衍生的残基，条件是该多肽具有必需的抑制活性。

“化学衍生物”指一个多肽，具有一个或多个通过侧链官能团的反应化学衍生的残基。例如这类衍生分子包括那些游离氨基被衍生形成胺盐酸盐的分子、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基。游离羧基可被衍生，形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯或酰肼。自由羟基可被衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可被衍生形成N-咪唑-苄基组氨酸(N-im-benzylhistidine)。化学衍生物也包括含一个或多个20个标准氨基酸的一个或多个天然衍生物的那些肽。例如：可用4-羟基脯氨酸替换Pro；用5-羟基赖氨酸替换Lys；用3-甲基组氨酸替换组氨酸；用高丝氨酸替换丝氨酸；用乌氨酸替换赖氨酸。本发明多肽也包括相对于这里所示序列的多肽增加和/或缺失了一个或多个残基的任何多肽，只要保持必需的活性即可。

术语“片段”指氨基酸残基序列比此处所示多肽氨基酸残基序列短的任何多肽。

当本发明多肽的序列与α_vβ₅天然配体的序列不等同时，通常由于已进行了一个或多个保守性或非保守性替换，所以常替换不多于30％的氨基酸残基，优选不多于10％的氨基酸残基。为提供一个“接头”使本发明多肽通过此接头被方便地固定于标记上或固体基质或载体上，在多肽的每个末端也可加入另外的残基。

下面描述了可用于多肽的标记、固体基质和载体。

通常氨基酸残基接头至少是一个残基，可以是40个或更多残基，更常见的是1至10个残基，但它不形成α_vβ₅配体表位。用于连接的常用氨基酸残基是酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等。此外，除非特别指出，主题多肽与α_vβ₅配体的天然序列可以通过氨基末端酰化作用如乙酰化或巯基乙酸酰胺化作用，羧基末端酰胺化作用如使用氨、甲胺酰胺化等末端修饰作用对序列进行修饰而不同。正如人们所熟知的，末端修饰能用于减少对蛋白酶消化的敏感性，从而延长多肽在溶液中特别是可存在蛋白酶的生物学流体中的半衰期。在这方面，多肽环化作用也是有用的末端修饰，并且也因为环化作用形成的稳定结构及这里所述环肽显示的生物活性，特别优选多肽环化作用。

本发明多肽均可被用于形成药学上可接受的盐。能与本发明肽形成盐的合适的酸包括无机盐，如三氟乙酸(TFA)、盐酸(HCl)、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸等。优选HCl盐。

能与本发明肽形成盐的合适的碱包括无机碱：如氢氧化物、氢氧化铵、氢氧化钾等；有机碱如单-、双-和三-烷基和芳基胺(如三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺等)以及可任选被取代的乙醇胺(如乙醇胺、二乙醇胺等)。

本发明肽这里也称主题多肽，可由多肽领域技术人员已知的任何方法合成，包括重组DNA技术。鉴于纯度、抗原特异性、无副产物、易于生产等原因，优选合成化学方法，如固相merrifield型合成法。对这些多种可用方法的极好总结可参见Steward等人的“ 固相肽合成”(“ Solid Phase Peptide Synthesis”)，W.H.Freeman Co.，San Francisco，1969；Bodanszky等人的(“肽合成”)“ Peptide Synthesis”，JohnWiley & Sons，第2版，1976；J.Meienhofer的“ 激素蛋白和肽”(“ Hormonal Proteins and Peptides”)，第2卷，第46页，AcademicPress(New York)，1993；Merrifield， 酶学进展( Adv. Enzymol)，32：221-96，1969；Fields等人 国际肽和蛋白质研 究(Int.J.Peptide Protein Res.)，35：161-214，1990；有关固相肽合成的美国专利No.4,244,946和有关经典溶液合成的Schroder等人的“ 肽( The Peptides)”，第1卷，Academic Press(New York)，1965，这些文献在此均引为参考。可用于这类合成中的合适的保护基描述于上述文献中及J.F.W.McOmie的“ 有机化学中的保护基( Protective Groups in Organic Chemistry)”，Plenum Press，NewYork，1973，该文献在此引为参考。

总的来说，所设计的固相合成方法包括在增长的肽链上按顺序加上一个或多个氨基酸残基或被适当保护的氨基酸残基。通常，第一位氨基酸残基的氨基或羧基被一个合适的可选择脱除的保护基保护。对含活性侧链基团的氨基酸如Lys使用不同的可选择脱除的保护基。

利用固相合成作为示例，被保护的或衍生的氨基酸通过其未保护的羧基或氨基与惰性固相载体连接。然后选择脱除氨基或羧基的保护基，掺入互补基(氨基或羧基)被适当保护的序列中下一个氨基酸，在适于形成酰胺键的条件下，将其与已连接在固相载体上的残基反应。然后从这个新加入的氨基酸残基上除去氨基或羧基保护基，再加入下一个氨基酸，如此重复进行下去。在所有所需氨基酸被连接成合适的序列后，按顺序或同时将所有残余的末端或侧链保护基(和固相载体)除去，产生最终的线性多肽。

可以将上述制备的线性多肽产物反应形成其相应的环肽。一例环化肽的方法描述于Zimmer等人的 肽类( Peptides)1992，第393-394页，ESCOM Science Publishers，B.V.，1993。通常，将叔丁氧羰基保护的肽甲酯溶解于甲醇中，加入氢氧化钠溶液，混合物于20℃(20C)反应；水解除去甲酯保护基。蒸发溶剂后，用乙酸乙酯从酸化的水溶液中萃取叔丁氧羰基保护的肽。然后在弱酸性条件下在二_烷共溶剂中除去叔丁氧羰基保护基。通过在1-羟基苯并三唑和N-甲基吗啉存在下，在二氯甲烷和二甲基甲酰胺的混合物中将线性肽的稀释溶液与二环己基碳化二亚胺反应，从而将所得到的具有游离氨基和羧基末端的脱保护肽转化为其相应的环肽。然后用色谱纯化所得环肽。

具体优选的环肽合成法描述于Gurrath等人的 欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)210：911-921(1992)和实施例中。本方法在主要表现α_vβ₅相关血管生成的组织中使用的具体优选肽描述于实施例中，并包括SEQ ID Nos 4、6、7、8和9所示的多肽。

2.单克隆抗体

在一实施方案中，本发明描述了单克隆抗体形式的α_vβ₅拮抗剂，它们与α_vβ₅进行免疫反应并抑制α_vβ₅与此处所述的其天然配体结合。本发明还描述了生产抗体的细胞系、生产细胞系的方法和生产单克隆抗体的方法。

本发明的单克隆抗体包含(1)与分离的α_vβ₅免疫反应且(2)抑制玻连蛋白与α_vβ₅结合的抗体分子。优选的单克隆抗体优先与α_vβ₅结合，包括具有mAb P1F6和mAb P5H9免疫反应特征的单克隆抗体，其被描述于实施例中。

各种词性形式的术语“抗体或抗体分子”在这里用作一个集合名词，指免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白分子中免疫活性部分的群体，即包含抗体结合位点或抗原互补位的分子。

“抗体结合位点”是抗体分子中包含与抗原特异性结合的重链、轻链可变区及高变区的结构部分。

本发明中使用的抗体例子是完整的免疫球蛋白分子、基本完整的免疫球蛋白分子和含抗原互补位的免疫球蛋白分子部分，包括本领域已知的那些部分如Fab、Fab′、F(ab′)₂和F(v)，也称之为抗体片段。

在另一优选实施方案中，本发明设计使用一种截短的免疫球蛋白分子，它包含来自本发明单克隆抗体的Fab片段。Fab片段缺乏Fc受体，是可溶的，使用可溶性Fab片段形式具有血清半衰期方面的治疗优点和诊断优点。可溶性Fab片段的制备通常是免疫学领域已知的，可由多种方法实施。

例如，用熟知方法，对基本完整的抗体通过分别使用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白水解反应制备抗体的Fab和F(ab′)₂部分(片段)。例如参见Theofilopolous和Dixon的美国专利No.4342566。Fab′抗体部分也是熟知的，并由F(ab′)₂部分制备，即制备出F(ab′)₂部分后，如使用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键，并随后用试剂如碘乙酰胺使所得的蛋白硫醇烷基化。优选含完整免疫球蛋白分子的抗体并如此处所述使用该抗体。

各种词性形式的术语“单克隆抗体”指仅包含一种能与一个特定表位进行免疫反应的抗体结合位点的抗体分子群。因此，单克隆抗体通常对与其进行免疫反应的任何表位呈现出单一结合亲和性。因此单克隆抗体可以包含一种具有多个抗体结合位点的抗体分子，其中每个位点对不同表位是免疫特异性的，如双特异的单克隆抗体。

单克隆抗体通常由仅分泌(产生)一种抗体分子的单一细胞克隆即杂交瘤产生的抗体组成。通过使产生抗体的细胞与骨髓瘤或其它自身永生细胞系融合形成杂交瘤细胞。这种抗体的制备首先由Kohler和Milstein描述于 Nature，256：495-497(1975)中，该文献在此引作参考。其它方法描述于Zola， 单克隆抗体：方法手册( Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)，CRS Press，Inc.(1987)中。然后可对如此制备的杂交瘤上清液筛选抗体分子的存在，所述抗体分子与α_vβ₅进行免疫反应并抑制α_vβ₅与天然配体结合。

简单地说，为形成产生单克隆抗体组合物的杂交瘤，将骨髓瘤或其它自身永生细胞系与用α_vβ₅源超免疫的哺乳动物脾淋巴细胞融合。

优选用于制备杂交瘤的骨髓瘤细胞系与淋巴细胞来自同一物种。通常129 GlX⁺品系小鼠是优选的哺乳动物。用于本发明的合适的小鼠骨髓瘤包括次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷敏感的(HAT)细胞系P3X63-Ag8.653和Sp2/0-Ag14，可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，保藏号分别为CRL1580和CRL1581。

通常使用聚乙二醇(PEG)1500将脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过它们对HAT的敏感性筛选融合的杂种细胞。使用酶联免疫吸附分析(ELISA)鉴别产生本发明单克隆抗体的杂交瘤，实施例中描述了ELISA的改变。

也可通过使含有一种营养培养基的单克隆杂交瘤培养物初始化来制备本发明单克隆抗体，培养基中含分泌合适特异性抗体分子的杂交瘤。培养物在一定条件下保持，且保持时间足以使杂交瘤向培养基中分泌抗体分子。然后收集这种含抗体的培养基。可再用熟知方法进一步分离抗体分子。

这些组合物制备所用的材料是本领域熟知的，且可购买到，包括合成的培养基、近亲繁殖的小鼠等等。一例合成的培养基是Dulbecco极限必需培养基(DMEM；Dulbecco等， 病毒学( Virol.)，8：396，1959)，补充有4.5mg/l葡萄糖、20mM葡萄糖胺和20％胎牛血清。一例近亲繁殖小鼠品系是Balb/c。

生产单克隆抗体、杂交瘤细胞或杂交瘤细胞培养物的其它方法也是熟知的。例如参见Sastry等人在 美国国家科学院院刊( Proc.Natl. Acad.Sci.，USA)，86：5728-5732(1989)和Huse等人在 科学( Science)，246：1275-1281(1989)中描述的从所有免疫组成成分(immunological repertoire)中分离单克隆抗体的方法。

本发明还设计了产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞和包含杂交瘤细胞的培养物。特别优选的是分泌单克隆抗体mAb P1F6和mAbP5H9的杂交瘤细胞系，其制备描述于实施例中。

在一实施方案中，本发明设计了具有mAb P1F6或mAb P5H9免疫反应特性的单克隆抗体。

无需过多实验，也可以确定一种单克隆抗体与本发明单克隆抗体是否具有相同(即等同)的特异性(免疫反应特性)，通过确定前者是否阻碍后者与预先选择的靶分子相结合。如果被测试的单克隆抗体与本发明单克隆抗体相竞争，正如在测定与固相中存在靶分子相结合的标准竞争性分析中本发明单克隆抗体的结合减少所表明，那么这两种单克隆抗体与相同的或紧密相关的表位结合。

确定一种单克隆抗体是否具有本发明单克隆抗体的特异性的另一种办法是：将本发明单克隆抗体和通常与之反应的靶分子一起预温育，然后加入被测试的单克隆抗体，确定此被测单克隆抗体结合靶分子的能力是否被抑制。如果该被测单克隆抗体被抑制，那么十之八九它具有本发明单克隆抗体相同的或功能等同的表位特异性。

确定一种单克隆抗体是否具有本发明单克隆抗体的特异性的另一种方法是确定所研究抗体的CDR区氨基酸残基序列。在其CDR区具有相同或功能等同的氨基酸残基序列的抗体分子具有相同的结合特异性。多肽测序方法在本领域是熟知的。

抗体的免疫特异性、其靶分子结合容量和抗体对表位呈现的伴随亲和性均由抗体与之进行免疫反应的表位限定。表位特异性至少部分由免疫球蛋白抗体的重链可变区氨基酸残基序列限定、部分由轻链可变区氨基酸残基序列限定。

使用术语“具有…的结合特异性”表示等同的单克隆抗体呈现相同的或相似的免疫反应(结合)特性，竞争结合预先选择的靶分子。

人源化单克隆抗体比鼠单克隆抗体具有特别的优点，特别是它们能被用于治疗人的疾病。具体来讲，人抗体不会象“外源”抗原被从循环中迅速清除。此外，人抗体不以外源抗原和外源抗体的相同方式活化免疫系统。通常制备“人源化”抗体的方法是本领域熟知的，可容易应用于本发明抗体。

因此，在一实施方案中，本发明设计了一种单克隆抗体，通过移植术使抗体人源化以导入人免疫系统成分，基本上不干扰抗体结合抗原的能力。

3.α_vβ₅特异的模拟物

本发明证明α_vβ₅拮抗剂通常可用于本发明中，这些拮抗剂可包括能阻碍α_vβ₅功能的多肽、抗体和其它分子，被称为“模拟物”。特别优选那些特异性阻碍α_vβ₅功能而不阻碍其它整联蛋白功能的拮抗剂。

在本文中，认为多种试剂可适用于本方法，只要这些试剂具有必需的生物活性。这些试剂从种属上讲被称为模拟物，因为它们具有模拟α_vβ₅配体的能力，通过受体上配体结合区域参与受体和配体功能相互作用，由此阻碍(即抑制)正常功能。在另一个实施方案中，α_vβ₅拮抗剂可以是受体模拟物而非配体。

除了抗体或配体衍生的肽，模拟物是任何具有上述性质的分子。它可以是肽的合成类似物、形状象上述结合区域口袋样的化合物或其它分子。本发明优选的模拟物是有机分子因而称为有机模拟物。特别优选的有机模拟分子通过模拟α_vβ₅配体而用作α_vβ₅拮抗剂，为化合物7、9、10、12、14、15、16、17和18，描述于实施例10中。

可以用任何一种本领域已知的用于药物设计的结构分析法进行α_vβ₅模拟物的设计，这些方法包括分子模型设计、二维核磁共振(-2D NMR)分析、X-射线晶体衍射、肽的随机筛选、肽类似物或其它化学聚合物文库等药物设计方法学。

本说明书示出了许多结构证据，表明α_vβ₅拮抗剂可以是小的多肽、单克隆抗体或有机分子，它们是具有选择性抑制α_vβ₅这一共同功能性质的非常不同的化学结构，从这点来看用于本方法的主题α_vβ₅拮抗剂的结构不必如此限制，但包括这里所定义的任何一种α_vβ₅模拟物。

F.鉴别α_vβ₅拮抗剂的方法

本发明还描述了用于鉴别按本方法使用的候选α_vβ₅拮抗剂的分析方法。在这些分析方法中，评价候选物分子在抑制α_vβ₅结合天然配体中的效能，并进一步评价它们在抑制组织血管生成中的效能。

第一种分析法是测定小鸡绒毛尿囊膜(CAM)中的血管生成，称为CAM分析。别人已详细描述过CAM分析，并进一步使用该方法测定肿瘤组织的血管生成和新血管形成。参见Ausprunk等， 美国病理学 杂志( Am.J.pathol.)，79：597-618(1975)和Ossonski等，癌症研究( Cancer Res.)，40：2300-2309(1980)。

CAM分析是一种熟知的活体血管生成分析模型，因为发生的是整个组织的新血管形成。真正的小鸡胚胎血管在CAM中或CAM上生成的组织中生长。

正如此处所示，CAM分析从新血管生长的数量和程度上说明对新血管形成的抑制作用。并且，容易监测移植至CAM上的任何组织如肿瘤组织的生长。最后，由于在该分析系统中具有毒性的内部控制，所以该分析特别有用。将小鸡胚胎暴露给任意测试试剂。这样，胚胎的健康是毒性的指征。

测定血管生成的第二种分析法是活体家兔眼模型，称为家兔眼分析。别人已详细描述过家兔眼分析，并进一步使用该方法测定血管生成性抑制剂如酞胺哌啶酮存在条件下血管生成和新血管形成。参见D′Amato等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：4082-4085(1994)。

家兔眼分析是一种熟知的活体血管生成分析模型，因为从角膜缘生长至角膜的家兔血管例证的新血管形成过程容易透过家兔眼的自然透光角膜被造影。此外，能随时间方便地监测新血管形成的刺激或抑制的程度或数量或新血管形成的衰退。

最后，将家兔暴露于任意测试试剂，这样家兔的健康是测试试剂的毒性指征。

第三种分析法测定天然配体玻连蛋白与α_vβ₅直接结合的抑制作用，优选的实施方案详细描述于实施例中。该分析法通常在固相中通过ELISA法测定天然配体如玻连蛋白与分离的α_vβ₅结合的抑制程度，此抑制作用由α_vβ₅特异的抑制作用介导。

因此，该分析法能用于鉴别对α_vβ₅具有特异性而不抑制天然配体结合其它整联蛋白的化合物。使用平价ELISA分析进行此特异性分析，其中在分离开的分析室中，同时筛选α_vβ₅和其它整联蛋白分别与天然配体结合的能力和抑制这种整联蛋白分别结合预选配体的能力的候选化合物。优选的筛选分析方式描述于实施例中。

实施例

有关本发明的下述实施例是说明本发明，当然不应认为它们具体限制本发明。并且，本发明的由本领域技术人员可预知的这类改变，现在已知的或今后开发的，均被认为落入后面权利要求所要求的本发明范围内。

1.α_vβ₅特异的单克隆抗体的制备

使用标准杂交瘤方法通过将A549肺癌细胞免疫入RBF/DnJ小鼠制备单克隆抗体P1F6和P5H9，如Wayner等人在 细胞生物学杂志( J. Cell Biol.)113：919-929(1991)中所述，该文在此引作参考。从免疫小鼠中分离出脾，并与Ns-1/FOX-NY骨髓瘤细胞融合。如Wayner等人所述，通过特异性抑制UCLA-P3粘着于玻连蛋白涂膜表面，筛选出产生针对癌细胞玻连蛋白受体的抗体的杂交瘤，并通过胸腺细胞饲养层的有限稀释克隆杂交瘤。

已表明P1F6和P5H9单克隆抗体均与α_vβ₅复合物进行特异性免疫反应，不与α_v亚基、β₅亚基或其它整联蛋白进行免疫反应。P1F6单克隆抗体可从Gibco BRL(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)购买，P5H9单克隆抗体可从the Fred Hutchinson Cancer ResearchInstitute，Seattle，WA的E-Wayner博士处得到。

通过相似方法得到用于本发明的其它α_vβ₅单克隆抗体并表示出这些抗体特征，如此处所述。此外，用不纯的或纯化形式的α_vβ₅受体对小鼠进行免疫接种，通过融合分离自小鼠的脾生产α_vβ₅单克隆抗体。α_vβ₅的纯化是整联蛋白生物领域普通技术人员熟知的过程，已由Smith等人在 生物化学杂志( J.Biol Chem.)，265：11008-11013(1990)中描述，该文内容在此引为参考。一旦被纯化，分离的受体被制备成免疫原用于免疫小鼠，如E2部分中所述，且基本按Kohler和Milstein在 自然( Nature)，256：495-497(1975)中所述方法制备，该文内容在此引作参考。筛选所得杂交瘤克隆与免疫原的反应性，然后表示出杂交瘤克隆特征，如下述实施例中所述。

2.抗α_vβ₅单克隆抗体的特异性的表征和在作α_vβ₅表达的组织分布图谱中的应用

A.对玻连蛋白的特异性

Wayner等人在 细胞生物学杂志( J.Cell Biol.)，113：919-929(1991)中表明实施例1中制备的P5H9单克隆抗体阻止UCLA-P3癌细胞附着于玻连蛋白而不影响细胞附着于胶原蛋白或纤连蛋白。还表明了同样细胞仅含有α_vβ₅玻连蛋白受体，没有α_vβ₅特异性，免疫沉淀非还原状态α链(160kD)和β链(95kD)组成的异源二聚体。由P5H9检测的α_vβ₅受体也表明介导M21黑素癌细胞和H2981癌细胞对玻连蛋白的粘着。P1F6单克隆抗体具有同样的免疫反应性分布图。

B.用抗整联蛋白受体抗体进行的免疫荧光

在伤口愈合中，血管基底膜表达一些粘着蛋白，包括VonWillebrand团子、纤连蛋白和血纤维蛋白。另外，粘着受体整联蛋白家族的一些成员在培养的平滑肌和内皮细胞表面被表达。参见Cheresh，美国国家科学院院刊( Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，84：6471(1987)；Janat等人 细胞生理学杂志( J.Cell.Physiol.)，151：588(1992)；和Cheng等人， 细胞生理学杂志( J.Cell Physiol.)，139：275(1989)。

除了整联蛋白β₅亚基的结构和功能，由其它抗β₅单克隆抗体绘制的该亚基组织分布已描述于Pasqualini等人的 细胞科学杂志( J.Cell Sci.)，105：101-111(1993)，该文内容在此引为参考。

上述β₅亚基特异的单克隆抗体，与实施例1中所述相似，由使用来自小鼠的脾细胞制备的杂交瘤分泌，小鼠已用A549人肺癌细胞系免疫接种。然后，该单克隆抗体用于描绘β₅亚基在正常人胸腺、皮肤和肾中的组织分布。在低温箱切片机上从冷冻组织块切下4μm厚切片，用于随后的与β₅整联蛋白特异的抗体进行的链霉素和素-生物素免疫过氧化物酶染色，按Pasqualini等人的参考文献中所述方法进行。

胸腺切片的染色显示了β₅在血管、哈索尔小体、皮质和髓质基质细胞和基底膜中的分布。皮肤切片显示了β₅在表皮基底层和一些皮肤血管壁上的分布，肾切片显示了肾小球区、近肾小球器官、近曲小管和集合小管的染色。因此，对不同细胞类型，β₅的分布是不均匀的，包括且更重要的是在毛细血管内皮细胞上，该细胞的染色与培养的脐静脉内皮细胞的染色是一致的。

C.用抗整联蛋白受体抗体进行眼病患者的人视网膜组织的免疫荧光

在大多数导致严重视力丧失的眼病中眼新血管形成是观察到的最常见的病理变化。从先存在的脉络膜、视网膜或副缘血管中生长新血管可导致水肿、出血或纤维血管形成，造成眼睛正常解剖学关系的破坏并伴随正常视功能的丧失。

在生理条件下，血管生成是高度被调节的，并已表明由特定的血管原细胞因子如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)活化。正如Brooks等在 科学( Science)，264：569-571(1994)中所述，抗α_vβ₃单克隆抗体表明在模型系统包括下述CAM模型中阻断bFGF和TNF-α诱导的血管生成。正如实施例4-6所述，抗α_vβ₅单克隆抗体阻断一个单独的血管生成途径，特别是由血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-α(TGF-α)和表皮生长因子(EGF)诱导的血管生成。

因此，正如本发明文中所述，血管生成的两条途径受不同的整联蛋白α_vβ₃和α_vβ₅限定。为研究这些整联蛋白在人眼病中的表达和作用，从患增殖性糖尿病视网膜病(PDR)的病人玻璃体切割术整个获得视网膜上新血管膜和视网膜下新血管膜。这些病人已被临床跟踪，通过临床检查和基底荧光素血管造影术证明患活性增殖性新血管病，在此基础上筛选病人用于组织学评价。得到的组织立即在Tissue Tek低温保藏箱中冷冻并切片。

当使用免疫荧光法检查这些病人组织时，对于整联蛋白α_vβ₅血管是阳性的，正如由与小鼠单克隆抗体LM609的免疫反应性表明的结果。整联蛋白的分布表明限于血管并与血管标记Von Willebrand因子的染色一致，正如用家兔抗体对该因子的绘图。用若丹明结合的抗小鼠免疫球蛋白或荧光素结合的抗兔免疫球蛋白显现出免疫反应性位点，这两种免疫球蛋白的使用能同时定位整联蛋白的位置和血管特异性抗体。

从正常眼中或没有活性增殖血管的萎缩膜病人得到的标本，通过用免疫荧光，对整联蛋白α_vβ₃是阴性的。

同时，用实施例1制备的抗α_vβ₅单克隆抗体P1F6以免疫组织化学法分析相同组织α_vβ₅的存在和分布。染色表明α_vβ₅存在于与VonWillebrand因子共定位的血管上。但是，用P1F6抗体无血管组织也呈现出有限的荧光，表明α_vβ₅的广泛分布。这与α_vβ₃限于血管中存在不同。

当使用各自的抗体LM609和P1F6在α_vβ₃和α_vβ₅之间比较膜免疫荧光染色时，血管壁上的染色图实际上是一样的，表明α_vβ₃和α_vβ₅均呈现在新血管眼病如糖尿病视网膜病中存在的新增殖人血管的表面。

因此，此处所述结果表明，α_vβ₅整联蛋白受体被选择性表达于发生血管生成的特定组织类型中，正如在患活性增殖性新血管疾病病人新血管膜所见。由此，正如下面实施例4-6所述，这些组织与暴露于特定生长因子的组织一起为本发明治疗方法提供了理想的靶子。

3.合成肽的制备

使用标准固相合成法合成本发明方法中使用的环多肽，例如，如Merrifield在 酶学进展( Adv.Enzymol.)，32：221-296(1969)中和Fields，G.B.和Noble，R.L.在 国际肽和蛋白质研究杂志( Int.J. Peptide Protein Res.)，35：161-214(1990)中所述。

首先将2克(g)BOC-Agr-Gly-Asp-D-Phe-Val-OMe(SEQ ID NO1)溶解于60毫克(ml)甲醇中，向其中加入1.5ml2N氢氧化钠溶液形成一种混合物。然后在20度C(20C)搅拌混合物3小时。蒸发后，将残余物取出放于水中并用稀HCl酸化至pH3，用乙酸乙酯萃取。萃取液由Na₂SO₄脱水，再次蒸发，将所得BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH(SEQ ID NO2)与20ml 2NHCl在二_烷中于20C搅拌2小时。蒸发得到的混合物获得H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH(SEQ ID NO3)，随后将其溶解于1800ml二氯甲烷和200ml二甲基甲酰胺(DMF)的混合物中，冷却至0C。然后搅拌下顺序加入0.5g二环己基碳化二亚胺(DCCI)、0.3g 1-羟基苯并三唑和0.23ml N-甲基吗啉。

在0C将所得混合物再搅拌24小时，然后在20C再搅拌48小时。浓缩此溶液并用混合床离子交换剂处理以脱盐。过滤除去所得树脂后，蒸发澄清的溶液，用色谱法纯化残余物，得到环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(用单字母也表示为c-RGDfV)(SEQ IDNO4)。肽中小写字母表示D型氨基酸，不是大写字母表示的L型。

如上所述制备对照环肽环(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)(用单字母也表示为RADfV)(SEQ ID NO5)。前面己说明环肽c-RADfV(SEQ ID NO5)抑制血纤维蛋白原与整联蛋白α_vβ₃的结合，不抑制血纤维蛋白原与整联蛋白α_IIbβ₃或α₅β₁的结合(Pfatf.等，生物化学杂志( J.Biol.Chem.)，269：20233-20238，1994)。

用类似方法制备特异抑制天然配体与α_vβ₅结合的其它肽，特异性和活性范围测试如下述实施例中所述。包括下面用类似方法获得的肽：环(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(SEQ ID NO6)和环(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)(SEQ ID NO7)。氨基酸残基序列为Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe(SEQ ID NO8)和环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-MeVal)(SEQ ID NO9)的肽也由合成法制备。在SEQ ID NO9中，MeVal中前缀“Me”表示第6位的Val是甲基化的Val。

4.用α_vβ₅拮抗剂抑制生长因子诱导的血管生成，通过活体家兔眼模型分析进行测定

在天然透光结构例如眼角膜中可观察抗α_vβ₅拮抗剂对生长因子诱导的血管生成的效应。新血管从供血富足的角膜缘生长至正常条件下没有血管的角膜中心。血管生成刺激剂如VEGF和TGF-α当施用于角膜时，诱导新血管从角膜缘的生长。血管生成抑制剂当施用于角膜时抑制新血管从角膜缘生长。因此，角膜经历血管生成，通过内皮细胞从角膜缘侵入容易看到的坚韧的充满胶原蛋白的角膜组织。由此，家兔眼模型分析提供了一个活体模型，用于在将化合物直接植入眼角膜后，直接观察血管生成的刺激和抑制。

A.活体家兔眼模型分析

1)生长因子诱导的血管生成

在活体家兔眼模型分析中用生长因子诱导血管生成，并描述如下。

a.含生长因子和单克隆抗体的海昌丸(hydron pellets)的制备

根据D′Amato等在 美国国家科学院院刊( Proc.Natl.Acad.Sci.)，91：4082-4085(1994)中所述制备含生长因子和单克隆抗体(mAbs)的海昌聚合物丸。单个小丸含750ng的生长因子(也称细胞因子)，特别是与sucralfate(carafet，Marion Merrell DowCorporation，Cincinnati，OH)结合的bFGF或VEGF，sucralfate用来稳定细胞因子并确保它们缓慢释放于周围组织中。此外，制备含40μg mAb P1F6(抗α_vβ₅)或对照抗体LM609(抗α_vβ₃)的PBS的海昌丸。

根据熟知方法，利用蛋白-A Sepharose CL-4B亲和柱层析，从腹水中纯化所有测试mAbs。然后洗脱的免疫球蛋白对PBS透析并用Detoxi-胶(Pierce Chemicals，Rockford，IL)处理以除去内毒素。已表明内毒素是一种有效的血管生成性和炎症刺激剂。因此，用生色性鲎阿未巴梓细胞裂解物测定(Chromogenic Limulus AmebocyteLysate Assay)(Bio Whittaker，Walkersville，MD)测试单克隆抗体中内毒素的存在，只有那些没有测出内毒素的mAbs被用于家兔眼模型分析中。

小丸被浇铸入特制的特氟隆栓，这些栓上有2.5mm芯钻入其表面。在每个栓内放入约12μl的浇铸物，并在一个消毒罩内聚合一昼夜。然后用紫外线照射对小丸消毒。

使用一组8只动物进行配对眼实验，其中每只动物接受一个包含预选细胞因子和预选抗体或对照免疫球蛋白的海昌植入物。具体来说，对每只家兔，一只角膜被手术植入一粒包含bFGF或VEGF和mAbP1F6的海昌丸，另一只角膜用bFGF或VEGF与MAb LM609一起处理。各个小丸被植入家兔角膜中间基质手术形成的“口袋”中。在无菌条件下进行手术，使用一个装备有分光镜的Wild型M691手术显微镜，其中分光镜上安装着照相机，通过照相记录各个角膜。用69 Beaver刀片在角膜基质中切一个3mm切口至角膜厚度的一半，产生一个3mm×5mm的“口袋”。用虹膜药刀从外周解剖出基质；并植入小丸，其周边距角膜缘2mm。

在接下来的12天中，细胞因子和mAbs从植入的小丸扩散入周围组织中，由此影响自角膜缘的血管生成。

左眼和右眼角膜分别称为OS和OD。然后观察角膜12天。在手术后第10天拍照，这时新血管形成最大。

上述用细胞因子/mAb混合物进行处理的有代表性的照片结果示于图1A-1D。平行的mAb抑制细胞因子诱导的血管生成的定量数值示于图2A和2B中。在图1A和1D中，角膜分别暴露于bFGF/P1F6和VEGF/LM609组合物中，伴有水肿的细胞因子诱导的血管生成是明显的，正如大箭头所示。因此，α_vβ₅抗体P1F6在抑制bFGF诱导的血管生成中是无效的。与此类似，α_vβ₃抗体LM609在抑制VEGF诱导的血管生成中是无效的。

作为对比，当在家兔模型中使用细胞因子/mAb组合物bFGF/LM609和VEGF/P1F6时，细胞因子诱导的血管生成被抗体抑制，分别如图1B和1C所示。这些图中，小箭头示出的正常结膜缘血管，表明整联蛋白抗体在抑制一类细胞因子诱导的血管生成中的效力。

特异的mAb整联蛋白免疫反应性对上述细胞因子诱导的血管生成的效应也被定量，如图2A和2B所示。血管生成由bFGF或VEGF刺激，分别如图2A和2B所示。使用配备Nikon相机的Wild手术显微镜，每天对处理眼睛拍照。相片记录于Kodak Ektachrome 64T底片上，通过Model GS 670图象密度计获得数值后，图象被转化用于计算机辅助定量，使用Biorad′s Nolecular Analyst 1.1软件。组方图示出暴露于mAbsP1F6或LM609后新血管平均面积+/-标准偏差(n＝8，两组中每组只数)。

正如图2A所示，与P1F6处理的同一动物另一只配对眼睛相比，LM609使bFGF诱导的血管生成减少了86％(p＜0.005，配对t-试验)。当VEGF被用于刺激血管生成时如图2B所示，观察到相反效果，LM609处理的眼睛对VEGF诱导的血管生成具有最小效应，与之相比，P1F6使新血管形成的平均面积减少了60％(p＜0.03，配对t-试验)。

值得注意的是，通过暴露给特定的抗体，只有细胞因子诱导的新血管受影响，而每种mAb都不影响预先存在的缘周血管，表明观察到的效果限于新形成的角膜血管。

使用实施例3中制备的合成肽进行类似分析，如下所述，用于抑制细胞因子诱导的与α_vβ₅表达特异相关的血管生成。

这些结果表明由特定细胞因子诱导的血管生成仅受一种抗整联蛋白抗体的影响，特别是α_vβ₅整联蛋白受体在VEGF诱导的血管生成中起作用，为确证这些结果，用细胞因子和整联蛋白抗体的组合物评价另一个新血管模型小鸡绒毛尿囊膜(CAM)，如下一实施例所述。

5.在小鸡绒毛尿囊膜(CAM)标本中的血管生成

A.来处理的CAM的特征

1)CAM的制备

正常胚胎血管生成导致成熟血管形成后，在小鸡绒毛尿囊膜(CAM)上可诱导血管生成。已表明在应答特定的细胞因子或肿瘤片段中血管生成被诱导，正如Leibovich等人在 自然( Nature)，329：630(1987)和Ausprunk等人在 美国病理学杂志( Am.J.Pathol.)，79：597(1975)中所述。从鸡胚中制备CAMs，用于随后血管生成的诱导和用本发明α_vβ₅拮抗剂对其抑制，正如下面及实施例6中所述。

从McIntyre Poultry(Lakeside，CA)获得10日龄鸡胚，于37℃60％湿度下孵育。用一个小的工艺钻(Dremel，Division ofEmerson Electric Co.，Racine，WI)直接在鸡蛋壳一端气囊上扎一个小孔。在鸡蛋大头一端再钻一个孔，避开预先通过对光检查鸡蛋确定的胚胎血管。在初始孔施加负压，从壳膜上拉出CAM(绒毛尿囊膜)并在CAM上产生一个人造气囊。用小型砂轮(Dremel)在悬垂的CAM的蛋壳上开一个1.0厘米(cm)×1.0cm方形窗口。这个小窗口允许直接通入下面的CAM。

然后在胚胎形成10天使用所得CAM标本，其中血管生成已衰退。在本发明中使用此标本，用于应答细胞因子处理时诱导恢复的血管生成。

2.CAM的组织学

为在显微镜下分析鸡胚CAMs的结构，在低温箱切片机上从冷冻块切下6微米(μm)厚切片，用于免疫荧光分析。

未处理的10日龄CAM的特征是无血管区。因为到胚胎形成阶段时CAM系统中的血管生成在减退，所以此系统可用于本发明中由各种细胞因子刺激新血管产生，从存在的血管邻近区进入目前无任何血管的CAM区。

正如CAM模型和下述实施例中所示，当血管在正常胚胎形成中或由细胞因子诱导生长新的血管时，血管表达α_vβ₃和α_vβ₅。

B.生长因子诱导的血管生成

已表明血管生成由细胞因子或生长因子诱导，正如实施例4A家兔眼模型中所述。这里描述的实验中，实施例4中所述的家兔角膜标本中的血管生成相似地由生长因子诱导，其中生成因子被局部施用于CAM血管上，如此处所述。

诱导血管生成过程如下：将一个5毫米(mm)×5mm Watman滤纸片(Watman Filter Paper No.1)用含预选浓度预选细胞因子的Hanks平衡盐溶液(HBSS，GIBCO，Grand Island，NY)或HBSS饱和，其中预选浓度即影响血管生成测试浓度，将此滤纸片放置在10天鸡胚的无血管CAM上，随后用胶带封闭窗口。72小时后用照相显微镜监测血管生成。CAMs被速冻，然后6μm低温箱切片以丙酮固定，用10μg/ml选择的抗整联蛋白抗体包括那些实施1所述的针对α_vβ₅的抗体通过免疫荧光使切片染色，如实施例2B和2C所述。

先前由Brooks等人在 科学( Science)264：569-571(1994)中进行的研究已表明在bFGF和TNF-α处理的标本中血管是明显可见的，但在未处理的CAM中没有血管。bFGF诱导血管生成后表达增强。在未处理的CAM中所看到的整联蛋白β₁的表达没有改变，而在刺激的血管上也可很快测出β₁。

这些公开的发现表明，在人和鸡中参与血管生成的血管显示出增强的α_vβ₃的表达。与这一点一致的是，α_vβ₃在培养的内皮细胞上的表达在体外由各种细胞因子诱导，正如Janat等人在 细胞生物学杂志( J. Cell Physiol.)，151：588(1992)；Enenstein等人在 实验细胞研 究( Exp.Cell Res.)，203：499(1992)和Swerlick等人在 实验皮 肤病学杂志( J.Invest.Derm.)，99：715(1993)中所述。

本发明中，确定了一条单独的细胞因子介导的刺激血管生成的途径，其中血管生成依赖于一种不同的粘着整联蛋白受体α_vβ₅的表达和活化。正如本文所述，CAM暴露于细胞因子VEGF、TGF-α和EGF的效果相关于α_vβ₅的表达、血管生成及用α_vβ₅拮抗剂对血管生成的抑制被描述于实施例6中。

C.肿瘤诱导的血管生成

为研究α_vβ₅在肿瘤诱导的血管生成中的作用，在CAM分析中使用各种α_vβ₅阴性的人黑素瘤和癌碎片，这些碎片预先从17日鸡胚的CAM中生长并分离，如Brooks等人在 细胞生物学杂志( J.Cell Biol.)，122：1351(1993)中所述，如此处所述。

在CAM分析系统中将肿瘤碎片直接放置在CAM上，诱导血管生成。鸡胚CAM的制备与上面描述方法相同。用下述细胞系悬浮液中生成的α_vβ₅阴性的肿瘤碎片50毫克(mg)至55mg，代替滤纸片放置在CAM起初的无血管区上。

细胞系rabdomyosarcoma、骨髓样(HL-60或KG-1)和淋巴梓(T细胞-Jurkat、HPB/ALL、PEER；和各种B细胞系)如Pasqualini等人在 细胞科学杂志( J.Cell Sci.)，105：101-111(1993)中所述，被用来在鸡胚CAMs上生长人实体瘤。首先将各种细胞系在总体积30μl的无菌HBSS中的单一细胞悬浮液施用于CAMs。用胶带封闭窗口，孵育胚胎7天，使人肿瘤病灶生长。在第7天末，即17天的胚胎，将肿瘤从CAMs上切除，剪掉周围的CAM组织。肿瘤被切成50mg至55mg的肿瘤碎片，用于血管生成。如实施例5A中所述这些肿瘤碎片被放置在一组新的10天鸡胚CAMs上无血管区中。

然后，在局部或静脉内应用或未应用α_vβ₅诱导的细胞因子(VEGF、TGF-α或EGF)的鸡胚CAMs上活体生长的肿瘤被mAbsP1F6或P5H9染色用于分析α_vβ₅的表达，如前所述。

随后根据实施例6C和6D所述处理这些CAM肿瘤标本，用于测定抗体和肽对肿瘤诱导的血管生成的效应。

在一实施方案中，从旧金山加利福尼亚大学Caroline Damsky博士处得到的仓鼠黑素瘤细胞CS-1被用于上述CAM分析中，形成黑素瘤约50mgCS-1肿瘤碎片转移至新的10天鸡胚CAM上后，各个标本接受静脉内注射100μg或300μg的P1F6抗体、LM609抗体或对照CSAT(抗β₁)抗体。另一对照样是没有处理的标本。结果讨论于下面实施例6D中。

6.CAM分析中所测定的血管生成的抑制

A.通过静脉内应用抑制剂抑制生长因子诱导的血管生成

静脉内注射入CAM标本的单克隆抗体对生长因子诱导的血管生成产生的效应被评价用作本发明活体模型系统。

活化的新血管形成后，一旦血管停止生长，那么通过免疫荧光分析α_vβ₅的表达使减少至测不出的水平。在经历血管生成的血管中α_vβ₅表达的这种调节与成熟血管中缺乏表达相反，它使本发明能控制和抑制下述CAM血管生成分析系统中所示的血管生成。

用于静脉注射的鸡胚CAMs标本基本如上所述。

首先通过应用生长因子饱和的滤纸片在10日龄鸡胚上诱导血管生成。具体而言，在第一步分析中，通过暴露于浓度为150ng/ml的bFGF或VEGF诱导血管生成。

为应用生长因子，在对光检查步骤中，进出突出的血管并在蛋壳上作出标记示出其位置。在壳上钻孔，垂悬下CAMs，然后将生长因子饱和的滤纸分别放在CAMs上，如上所述。用无菌胶带封闭窗口，胚胎放于恒温箱中。

24小时后，直接在先选出的突出血管正上方蛋壳的侧面上仔细开另一个小窗口。小心去除鸡蛋外壳留下完整的胚胎膜。用一小滴矿物油(Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT)使壳膜呈透明，使得血管易于观察。然后，将磷酸盐缓冲盐水(PBS)、PBS中75μg纯化的无菌抗整联蛋白抗体或75μg合成肽(环肽RGDfV，SEQ ID NO4和对照环肽RADfV，SEQ ID NO5)被注射入生长因子诱导的CAMs上明显可见的血管中。用胶带封闭窗口，孵育胚胎直至72小时。

在一立体显微镜拍照滤纸片和有代表性的周围CAM组织(图3A-3F和图5A-5F)，确定每种条件12个CAMs的平均血管生成指数+/-标准偏差(图4A-4B和图6A-6B)。通过分析每张纸片区域内血管分支的数目和程度，以双盲方式评分每个胚胎的血管生成。分数从1(低)至4(高)，通过从总数中减去背景1确定血管生成指数。

整联蛋白抗体介导的对CAM模型中生长因子诱导的血管生成的抑制作用的特异性镜面反映了上述家兔角膜模型中观察到的结果。分别如图3A和3B所示，bFGF和VEGF均在对照的PBS处理的CAM中引起血管生成。但是，用α_vβ₅特异抗体P1F6处理导致VEGF诱导的血管生成的抑制，如图3D所示，而在bFGF诱导的血管生成中未检测出抑制作用，如图3C所示。相反，α_vβ₃特异抗体LM609抑制bFGF诱导的血管生成(图3E)而对VEGF诱导的CAM中的血管生成没有什么作用(图3F)。

这些结果还分别示于棒图4A和4B，分别对于bFGF和VEGF处理的CAMs，将血管生成指数对暴露于LM609或P1F6作图，没有暴露于抗体的作为对照。因此，由整联蛋白特异抗体对生长因子诱导的血管生成的抑制作用依赖于生长因子的种类。

暴露于含RGD肽的情况支持上面的结果。在PBS存在下，如图5A和5B所示，暴露于bFGF和VEGF导致对照CAM中血管生成。相反，针对α_vβ₃和α_vβ₅的环肽拮抗剂RGDfV(SEQ ID NO4)使bFGF或VEGF诱导的血管形成消除。环肽RADfV(SEQ ID NO5)不影响bFGF-或VEGF处理的CAM标本中的血管生成。结果还示于图6A和6B中，其中示出bFGF和VEGF刺激的CAMs的血管生成指数，表明暴露于试验肽和对照肽情况。因此，这些发现与家兔角膜中测定结果一起说明了bFGF和VEGF诱导的血管生成依赖于不同的但同源α_v特异整联蛋白，但是用环肽RGDfV可抑制这两种整联蛋白。

用根据实施例3所述制备的合成肽进行另外类似分析，以限定对α_vβ₅而非α_vβ₃相关血管生成有特异性的肽。还用按实施例10所述制备的有机分子进行分析。

通过将生长因子血管生成诱导作用分析延伸至肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子-α(TGF-α)或佛波酯、4-β-佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)，使整联蛋白抗体抑制生长因子诱导的血管生成的特异性进一步确证并强化。

上述生长因子(细胞因子)包括bFGF和VEGF，在浓度为1.0μg/ml时分别施用于如前所述的10日龄CAM模型。PMA使用浓度为20ng/ml。

生长因子处理后24小时后，通过如上所述的单一静脉内剂量或下一实施例所述的局部给药分别对CAM模型提供抗体LM609和P1F6或蛋白激酶C(PKC)抑制剂、Calphostin C。在接下来连续3天时间静脉内注射时，抗体使用浓度为每只胚胎75μg，Calphostin C剂量为100nM。

在第13天时，切下滤纸片和相关CAM组织，并用立体显微镜分析血管生成。通过分析滤纸片区内血管数量和分支程度，以双盲形式评分血管生成。分数范围从低(1)至高(4)。通过从所有数据中减去背景分数1确定血管生成指数。每种条件下用5-6只胚胎重复实验2-4次。

分别如图7A和7B所示，抗α_vβ₃抗体LM609阻断应答bFGF和TNF-α的血管生成，而抗α_vβ₅抗体P1F6没有什么抑制剂效果。相反，分别如图7C-7E所示，P1F6在抑制VEGF、TGF-α或PMA诱导的血管生成中是有效的，而LM609没有这种效果。

PNA一种有效的血管生成诱导剂，能活化蛋白激酶C(PKC)，一族胞内丝氨酸苏氨酸激酶。因此，我们还检测了Calphostin C一种PKC抑制剂对小鸡CAM上血管生成的效果。Calphostin C阻断PMA(图7E)和VEGF、TGF-α(分别示于图7C和7D)诱导的血管生成，而对bFGF或TNF-α介导的血管生成(分别示于图7A和7B)具有最小效果。

这些结果一起表明存在两条单独的不同的血管生成途径，其中一条途径依赖于α_vβ₃介导的信号，与PKC远远无关，正如先前Brooks等在 科学( Science)，264：569-571(1994)中所述，另一条途径由α_vβ₅介导的转导信号强化，关键依赖PKC活化作用。

除上述实验外，为确定P1F6和LM609 mAbs在静脉内注射LM609的CAM组织中的定位，室温下用HBSS中2.5％BSA封闭固定切片1小时，随后用1∶250山羊抗小鼠若丹明标记的二级抗体(Tago)染色。然后用Zeiss免疫荧光化合物显微镜分析切片。

B.通过局部施用抑制剂抑制生长因子诱导的血管生成

为确定α_vβ₅是否在血管生成中起活化作用，上述用生长因子饱和的滤纸片被放置于CAMs上以诱导血管生成，随后施用P1F6或LM609。

然后用总体积25μl的无菌HBSS在0、24和48小时处理滤纸片，其中于50ml HBSS中含25mg mAb。在72小时，收集CAMs，放置于陪替氏培养皿中并用1ml PBS洗涤1次。然后在Olympus立体显微镜下由两名观察者以双盲形式分析滤纸底部和CAM组织。当CAMs呈现出纸片正下方CAM的血管浸润减少＞50％时，认为血管生成抑制明显。每种条件用6至7个胚胎，每个抗体重复4次实验。

为检测整联蛋白抗体对预先存在的由正常血管发育的邻近无血管区的成熟血管的效果，将mAbs饱和的滤纸片放于CAMs的血管形成区，CAMs来自10天胚胎，没有接受细胞因子表面施用。

还用本发明合成肽进行了CAM分析，以确定环肽和线性肽对生长因子诱导的血管生成的效应。将如前所述制备的8μg肽分别放入总体积25μl的无菌HBSS中。立即将此肽溶液施用于CAM标本，24小时和48小时再次施用。在72小时，切除滤纸及周围CAM组织，如上所述进行观察。

用实施例10所述制备的有机分子进行类似分析。

C.通过局部施用抑制肿瘤诱导的血管生成

1)用单克隆抗体处理

在上述血管生成分析中评估了抗α_vβ₅抗体和肽拮抗剂的效应，除此之外，还研究α_vβ₅在肿瘤诱导的血管生成中的作用。作为诱导物，使用预先生长并分离自17日鸡胚的CAM中的α_vβ₅阴性的人组织。如实施例5C所述制备碎片。

如上所述，将mAbs分别局部施用于肿瘤碎片，浓度为25μl HBSS中25μg，然后用胶带封闭窗口。以同样方式在24小时和48小时再次加入mAbs。在72小时，如上所述分析肿瘤和周围CAM组织。

如实施例5C所述，通过向10日龄鸡胚的CAMs上移植人细胞系使肿瘤开始生长，所述细胞素不表达整联蛋白α_vβ₅。

为定量mAbs对肿瘤诱导的血管生成的效果，由两名观察者以双盲形式计数立体显微镜下进入CAM焦平面内肿瘤的血管。

如上所述，将实施例3制备的合成肽和实施例10制备的有机分子以类似方法表面施用于肿瘤诱导的血管生成性CAM分析系统。以类似方法评估肽和有机分子对血管生存力的影响效应。

D.通过静脉内施用抑制肿瘤诱导的血管生成

1)用单克隆抗体处理

还通过静脉注射施用单克隆抗体对上面制备的肿瘤诱导的血管进行处理。将CS-1黑素瘤按实施例5C所述方法放置在CAMs上，窗口用胶带封闭，24小时后，100至300μg纯化的mAbs静脉内接种入鸡胚血管一次，如上所述。然后使鸡胚孵育7天。按前述方法观察血管生成程度。这个时期之后，切除肿瘤并分析重量，以确定暴露于抗体对肿瘤生长或抑制的效应。

用300μgα_vβ₅特异抗体P1F6处理CS-1肿瘤的结果示于图8。与未处理的到CSAT处理的肿瘤相比，肿瘤重量显著减至少于50mg。α_vβ₃特异抗体LM609也抑制肿瘤生长，但比用P1F6的效果差。用100μgP1F6处理肿瘤获得了可比结果。因此，P1F6在抑制CAM标本上肿瘤模型中α_vβ₅介导的血管生成时是有效的，导致肿瘤细胞量减少。

2)用合成肽或有机分子处理

还评估了肽或有机分子对CAM分析系统中肿瘤诱导的血管形成的效应。如上所述使用肿瘤-CAM标本，除了将分别按实施例3和10所述制备的合成肽和有机分子各自静脉内注射入可见血管，代替静脉内注射mAb。

7.通过配体-受体结合分析检测鉴别α_vβ₅特异的拮抗剂

通过测定它们在纯化的配体-受体结合分析中拮抗α_vβ₅、α_vβ₃和α_IIbβ₃受体结合活性的能力，筛选分别由实施例1和3制备的α_vβ₅免疫反应抗体和合成肽。用于这些结合测定的方法描述于Barbas等 美国国 家科学院院刊( Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，90：10003-10007(1993)，Smith等 生物化学杂志( J.Biol.Chem.)，265：11008-11013(1990)和Pfaff等 生物化学杂志( J.Biol.Chem.)，269：20233-20238(1994)，其内容在此引作参考。

描述了在配体-受体结合分析中鉴别拮抗剂的方法，其中受体被固定化于固相载体，配体和拮抗剂是可溶的。也描述了配体-受体结合分析，其中配体被固定化于固相载体，受体和拮抗剂是可溶的。

简单来说，所选择的纯化的整联蛋白被分别固定在Titertek微量滴定孔中，覆膜浓度为每孔50纳克(ng)。用于配体-受体结合分析中的受体的纯化是本领域熟知技术，由本领域普通技术人员熟知方法很易获得。在4℃孵育18小时后，用10毫克/毫升(mg/ml)中血清白蛋白(BSA)的Tris缓冲盐水封闭板上非特异结合位点。研究抑制作用时，测试所选择抗体或肽的各种浓度阻断¹²⁵I-玻连蛋白或其它标记配体与整联蛋白受体α_vβ₅、α_vβ₃、α_vβ₁和α_IIbβ₃结合的能力。

虽然这些配体表现出对一个特定整联蛋白的最佳结合，玻连蛋白对α_vβ₅和α_vβ₃、血纤维蛋白原对α_IIbβ₃，但使用抗体或肽以阻断玻连蛋白与每个受体结合的结合抑制作用研究能准确测定半最大抑制受体与配体结合所需的肽的微摩尔(μM)量。使用放射性标记的配体浓度1nM，分别用未标记的合成肽进行竞争结合。温育3小时后，洗涤除去游离配体，由γ计数检测结合配体。

由此，此处所述的配体-受体分析被用于筛选对特定整联蛋白受体特别是α_vβ₅具有选择性特异性的环状或线性合成肽以及单克隆抗体和有机分子，它们均在实施本发明中用作玻连蛋白受体(α_vβ₅)拮抗剂。

8.使用α_vβ₅拮抗体使活体肿瘤组织生长衰退，通过嵌合小鼠：人分析测定

通过用人新生包皮替换SCID小鼠的一块皮肤产生一种活体嵌合小鼠：人模型。基本按Yan等人在 临床研究杂志( J.Clin.Invest.)，91：986-996(1993)中所述制备活体嵌合小鼠：人模型。简单来说，通过手术从SCID小鼠(6-8周龄)除去一块2cm²的皮肤，并以人包皮替换。使小鼠麻醉，刮去位于侧腹区每边5cm²区的毛。通过除去全层皮直至筋膜以下制备出两个2cm²的圆形移植床。将来自人新生包皮的同样大小的全层人皮肤移植片放在伤口床上并缝合就位。用Band-Aid包覆移植片，与皮肤缝合。再用纱布带包覆伤口。

皮肤移植完成后，用黑素瘤细胞接种人包皮。M21L人黑素瘤细胞系被用于在SCID小鼠人皮肤移植片上形成人实体肿瘤。2×10⁶M21L单一细胞悬浮液被真皮内注射入人皮肤移植片。然后观察小鼠2至4周，使人肿瘤生长至可测量水平。

可测的肿瘤长成后，用250μg序列为SEQ ID NO9(含RGD环肽Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-甲基化Val)的肽(体积100μl)或对照肽环Arg-βAla-Asp-D-Phe-Val腹膜内注射小鼠，每周3次，共3周。之后，切除肿瘤并分析其重量和组织学。

结果示于图9，其中肿瘤体积以mm³示于Y轴，相对于X轴为肽处理法。序列为SEQ ID NO9的测试肽，在图中被标为肽189，使肿瘤体积显著减小至约25mm³，相比于对照肽(标记为肽601)肿瘤体积大于300mm³。

因此，通过静脉内施用α_vβ₅拮抗剂肽189阻断α_vβ₅受体，导致此模型系统中黑素瘤的衰退，与如前所述的CAM和家兔眼模型系统中的方式相同。

上面SCID/人嵌合模型也用于评估本发明其它α_vβ₅拮抗剂的效力，即抗体和有机分子，后者由实施例10所述制备。

9.用于α_vβ₅介导的视网膜血管生成的小鼠模型的制备和用α_vβ₅拮抗剂对血管生成的抑制

基于实施例2C中观察的α_vβ₃和α_vβ₅在视网膜新血管组织中的表达，使用新的小鼠模型研究系统给药两种整联蛋白的环肽拮抗剂对视网膜血管生成的效应。新生小鼠在出生后前两周中生长视网膜血管，这期间浅表视网膜脉管系统形成一个丰富的、高度分支的血管网络，它起源于视神经头并向周围辐射以覆盖视网膜表面，方式类似于在其它哺乳动物和人中所观察到的(Jiang等在 Glia，15：1-10(1995))。

对于该模型，用环肽RGDfV(SEQ ID NO4)(也称为肽203)或对照肽RADfV(SEQ ID NO5)每天两次皮下注射新生小鼠，从0天开始共4天。在出生后第5天，眼球被移去并室温固定于4.0％多聚甲醛(PFA)中。

为定量小鼠视网膜血管生成，测量单一血管从视神经头至最远端的距离，其中在一个12小时钟的6个等分扇区的每一扇区内选择血管。计算平均距离，用从整个视网膜得到的近似数平均。为测量视网膜血管的总体积，整个样品在2.0μm可视区部分扫描并计数存储。然后使用Bio-Rad′s Lasersharp软件的“seed”功能进行限阈并计算每一部分的立方象素(cubic pixels)。存储入宏，以加和出全部部分的体积，确定出全部血管结构的数值。

根据在图片二维体系直接测定血管生长，系统给药肽拮抗剂203抑制视网膜血管发生，与对照肽相比，抑制了44％(N＝9，p＜.0000001，配对t-试验)。在未处理的新生小鼠和接受肽203的5日龄小鼠间没有发现统计学差异，因此该肽有效抑制血管发生。此外，在未处理间5日龄小鼠和接受对照肽的同龄小鼠间没有发现统计学差异。因此在RGDfV处理的新生小鼠中视网膜血管发生的抑制作用与未处理的对照小鼠相比有效率为100％。

使用一个考虑血管生长三维性质的定量分析，与对照动物相比发现肽203处理的动物中视网膜血管体积减少了78％。203处理的动物在出生后第5天血管平均体积为3.6×10⁶μm³，对照处理动物为15.7×10⁶μm³。在未处理的新生小鼠中视网膜血管占的体积与5日龄203处理的动物之间难以区别。

以上获得的结果表明这些拮抗剂特异地抑制新血管形成，对已形成血管没有影响。这些结果表明视网膜新血管疾病的病理不同于视网膜下新血管疾病的病理，α_vβ₅拮抗剂在治疗相关于血管生成的使眼失明疾病中是有效的。

用实施例10制备的有机模拟物α_vβ₅拮抗剂进行类似分析。

10.α_vβ₅拮抗剂有机分子的制备

下面描述了有机α_vβ₅拮抗剂化合物7、9、10、12、14、15、16、17和18的合成，并且还示于附图中。所得的有机分子称为本发明有机模拟物，然后用于抑制α_vβ₅介导的血管生成。

对于下述每种合成，在Perkin-Elmer 241分光光度计上测量旋光性，在Beckmann DU-70分光计上记录紫外和可见光谱。在BrukerAMX-400和AMX-500分光计上在400和500MHz记录¹H和¹³CNMR谱。在VG ZAB-ZSE质谱仪上在快速原子轰击(FAB)条件下记录高分辨质谱(HRMS)。用70-230目硅胶进行柱色谱。在Merck Art.5744(0.5mm)上进行制备型TLC。在Thomas Hoover装置上测定熔点。

A.化合物1：t-Boc-L-酪氨酸苄基酯，于图10所示

化合物1

25℃时向0.10M(M)N-(叔-丁氧羰基)-L-酪氨酸(t-Boc-L-Tyr)(1.0当量，Aldrich)的二氯甲烷溶液中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(1.5当量)，并搅拌1小时。接着，加入1.5当量苄醇，并于25℃再搅拌混合物12小时。然后反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释并用水洗涤两次(2X)、用盐水洗1次(1X)，在硫酸镁上干燥。真空除去溶剂，然后粗产物用硅胶色谱纯化。也可以从Sigma购买化合物1，t-Boc-L-酪氨酸苄酯。

B.化合物2：(S)-3-(4-(4-溴丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸苄酯，示于图10步骤i

化合物2

将t-Boc-L-酪氨酸苄酯(2g，5.38mmol；如上合成)、1，4-二溴丁烷(1.9ml，16.2mmol，Aldrich)、碳酸钾(5g)和18-冠(醚)-6(0.1g，Aldrich)的混合物于80℃加热12小时。冷却后，滤去沉淀，真空中蒸发反应混合物至干燥。然后利用100％己烷通过结晶纯化粗产物，得2.0g(92％)的化合物2。

C.化合物3：(S)-3-(4-(4-叠氮基丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸苄酯，示于图10步骤ii

化合物3

将化合物2(2.5g，4.9mmol)与叠氮化钠(1.6g，25mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(20ml)中25℃搅拌12小时。然后蒸发除去溶剂，残余物用水(约10ml)处理并用乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，通过硫酸镁干燥，蒸发，得到2.0g(90％)化合物3，为无色浆液(FAB-MS：469(M+H⁺))。

D.化合物4：(S)-3-(4-(4-叠氮基丁基氧基)苯基-2-氨基-丙酸苄酯，示于图10步骤iii

化合物4

将化合物3(2.0g(4.4mmol))溶解于三氟乙酸(TFA；2ml)中，室温下搅拌3小时。真空中蒸发得到1.6g(定量的)化合物4，为无色浆液，被用于下一步骤无需进一步纯化。FAB-MS：369(M⁺N⁺)。

E.化合物5：(S)-3-(4-(4-叠氮基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸苄酯，示于图10步骤iv

化合物5

将化合物4(1.6g；4.3mmol)、丁烷磺酰氯(0.84ml；6.6mm0l)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中室温下搅拌12小时。然后蒸发反应混合物，残余物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。蒸发至干燥后，粗产物用快速色谱(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化，得到1.4g(67％)化合物5，为无定形固体。

F.化合物6：(S)-3-(4-(4-氨基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于图10步骤v

化合物6

将化合物5(1.3g(2.6mmol))溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)中，在100mg Pd(炭上10％)存在下25℃在氢气(1个大气压；Parr Shaker仪)中氢化。3小时后，滤出催化剂，蒸发溶剂得到化合物6，为油状残余物。冷冻干燥脱水后，得到1.0g(定量的)化合物6，为白色粉末。FAB-MS：373(M⁺H⁺)。

G化合物7：(S)-3-( 4-(4-胍基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于图10步骤vi

化合物7

将化合物6(200mg，0.5mmol)、3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸盐(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和乙三胺(0.15ml，1.0mmol)在二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中于60℃加热12小时。冷却后，真空中蒸发掉溶剂，残余物用HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)纯化，得50mg(25％)化合物7，冷冻干燥后为无定形白色粉末。FAB-MS：415(M⁺H⁺)，m.p.：70℃。

H.化合物8：(S)-3-(4-(4-氨基丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸，示于图11步骤iii

化合物8

将化合物3(0.5g，1.07mmol)溶解于10ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.1ml三氟乙酸(TFA)中，在30mg Pd(炭上10％)存在下25℃在氢气(1个大气压，Parr Shaker仪)中氢化。3小时后，滤去催化剂，蒸发掉溶剂，得化合物8为油状残余物。冷冻干燥脱水后，得到370mg(定量的)化合物8，为白色粉末。FAB-MS：353(M⁺H⁺)。

I.化合物9：(S)-3-( 4-(4-胍基丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸，示于图11步骤iv

化合物9

将化合物8(200mg，0.5mmol)、3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸盐(DPFN)(170mg，0.8mmol，Aldrich ChemicalCompany)和乙三胺(0.15ml，1.0mmol)在二甲基甲酰胺(DMF，5ml)中60℃加热12小时。冷却后，真空蒸发掉溶剂，残余物用HPLC(Lichrocart RP-18 ，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)纯化，得160mg(90％)化合物9，冷冻干燥后为白色无定形粉末。FAB-MS：395(M⁺H⁺)。

J.化合物10：(R)-3-(4-(4-胍基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于图12步骤i-vi

化合物10

用与合成化合物7相同的反应顺序制备D-酪氨酸类似物10，得到205mg白色无定形物质FAB-MS：415(M⁺H⁺)，正如下面使用中间体化合物100-600形成化合物10：

1)化合物100：t-Boc-D-酪氨酸苄酯，示于图12

化合物100

25℃时向0.10M的N-(叔丁氧羰基)-D-酪氨酸(t-Boc-L-Tyr)(1.0当量；Aldrich)的二氯甲烷溶液中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(1.5当量)并搅拌1小时。接着，加入1.5当量苄醇，于25℃再搅拌混合物12小时。然后反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，用水洗涤2X，用盐水洗涤1X，在硫酸镁上干燥。真空除去溶剂，然后用硅胶柱色谱纯化粗产物。

2)化合物200：(R)-3-(4-(4-溴丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸苄酯，示于图12步骤i

化合物200

将t-Boc-D-酪氨酸苄酯(2g，5.38mmol，如上合成)、1，4-二溴丁烷(1.9ml，16.2mmol，Aldrich)、碳酸钾(5g)和18-冠醚-6(0.1g；Aldrich)的混合物在80℃加热12小时。冷却后，滤去沉淀，真空中蒸发反应混合物至干燥。然后利用100％己烷通过结晶纯化粗产物，得到2.5g(92％)化合物200。

3)化合物300：(R)-3-(4-(4-叠氮基丁基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基-丙酸苄酯，示于图12步骤ii

化合物300

化合物200(2.5g，4.9mmol)与叠氮化钠(1.6g，25mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(20ml)中于25℃搅拌12小时。然后蒸发掉溶剂，残余物用水(约10ml)处理，用乙酸乙酯萃取2次。合并有机层，用硫酸镁干燥，并蒸发得到2.0g(90％)化合物300，为无色浆液(FAB-MS：469(M⁺H⁺))。

4)化合物400：(R)-3-(4-(4-叠氮基丁基氧基)苯基-2-氨基-丙酸苄酯，示于图12步骤iii

化合物400

将化合物300(2.0g(4.4mmol))溶解于三氟乙酸(TFA，2ml)中，于室温下搅拌3小时。真空蒸发得到1.6g(定量的)化合物400，为无色浆液，其被用于下一步骤，无需纯化。FAB-MS：369(M⁺H⁺)。

5)化合物500：(R)-3-(4-(4-叠氮基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸苄酯，示于图12步骤iv

化合物500

将化合物400(1.6g，4.3mmol)、丁烷磺酰氯(0.84ml，6.6mmol)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中室温下搅拌12小时。然后蒸发反应混合物，残余物溶于乙酸乙酯，用稀HCl、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。蒸发至干燥后，通过快速色谱(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化粗产物，得到1.4g(67％)化合物500，为无定形固体。

6)化合物600：(R)-3-(4-(4-氨基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于图12步骤v

化合物600

将化合物500(1.3g(2.6mmol))溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)中，并在100mg Pd(炭上10％)存在下于25℃在氢气(1个大气压，Parr Shaker仪)中氢化。3小时后，滤去催化剂，蒸发掉溶剂，得到化合物600，为油状残余物。冷冻干燥脱水后，得到1.0g(定量的)化合物600，为白色粉末。FAB-MS：373(M⁺H⁺)。

7)化合物10：(R)-3-(4-(4-胍基丁基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于图12步骤vi

将化合物600(200mg，0.5mmol)、3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸盐(DPFN)(170mg，0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml，1.0mmol)在二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中于60℃加热12小时。冷却后，真空中蒸发掉溶剂，通过HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)纯化残余物，得到50mg(25％)化合物10，冷冻干燥后为白色无定形粉末。FAB-MS：415(M⁺H⁺)，m.p.：70℃

K.化合物11：(S)-3-(4-(4-叠氮基丁基氧基)苯基-2-(10-樟脑磺酰氨基)-丙酸苄酯，示于图13

化合物11

将化合物4(1.0g，2.7mmol)、10-樟脑磺酰氯(6.6mmol，Aldrich Chemical Company)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温下搅拌12小时。然后蒸发反应混合物，残余物溶于乙酸乙酯，用稀HCl、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。蒸发至干燥后，通过快速色谱(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化粗产物，得1.4g(67％)化合物11，为无定形固体。

L.化合物12：(S)-3-(4-(4-胍基丁基氧基)苯基-2-(10-樟脑磺酰氨基)-丙酸，示于图13步骤i-ii

化合物12

按下述条件将化合物11氢化并脒基化后得化合物12：

步骤i：将化合物11(1.3g(2.6mmol))溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)中，在100mg Pd(炭上10％)存在下于25℃在氢气(1个大气压，Parr Shaker仪)中氢化。3小时后，滤去催化剂，蒸发溶剂得中间体胺，为油状残余物，冷冻干燥脱水后，得1.0g(定量)中间体胺，为白色粉末，继续以下操作：

步骤ii：将上述中间体胺化合物(200mg，0.5mmol)、3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸盐(DPFN)(170mg，0.8mmol；AldrichChemical Company)和三乙胺(0.15ml，1.0mmol)在二甲基甲酰胺(DMF，5ml)中于60℃加热12小时。冷却后，真空蒸发溶剂，残余物由HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)纯化，得50mg(25％)化合物12，冷冻干燥后为白色无定形粉末。FAB-MS：509.6(M⁺H⁺)。

M.化合物13：(S)-3-(4-(5-溴戊基氧基)苯基-2-N-叔丁氧羰基丙酸苄酯，

化合物13

将t-Boc-L-酪氨酸苄酯(4.5g，12.1mmol；如上合成的化合物1)、1，5-二溴戊烷(5ml，36.7mmol；Aldrich)、碳酸钾(10g)和18-冠醚-6(0.25g；Aldrich)的混合物于80℃加热12小时。冷却后，滤去沉淀，真空中蒸发反应混合物至干燥。然后利用100％己烷通过结晶纯化粗产物，得到5.35g(85％)化合物13。

N.化合物14：(S)-3-(4-(5-胍基戊基氧基)苯基-2-丁基磺酰氨基-丙酸，示于图13步骤i-v

化合物14

进行5步反应，顺序为溴-叠氮交换、Boc-脱除、用丁烷磺酰氯进行磺酰化、氢化和用DPFN脒基化，与上述使用中间体化合物1-6形成7的步骤相同，或与上述使用化合物100-600形成化合物10的步骤相同。得到化合物14为白色粉末FAB-MS：429(M⁺H⁺)。

O.化合物15：3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，二盐酸盐示于图14

1)用于化合物15的原料2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯的合成

化合物15

通过(D或L)，N-(叔丁氧羰基)-L(D)-酪氨酸(t-BOC-L(D)-Tyr)(1.0当量；Sigma)在0.10M甲醇和1％稀盐酸中的酯化作用得到原料2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯。反应混合物于25℃搅拌12小时，然后通过碳酸钾中和，用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X，用盐水洗涤1X，在硫酸镁上干燥。真空下除去溶剂，之后用硅胶柱色谱纯化粗产物，得到2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯。

2)用于化合物15的原料3-P-N-BOC-脒基-苯基-5-甲烷磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮的合成：3步法如下：

将对-氨基-苄腈(1.0当量；Aldrich)在二氯甲烷(0.10M)中与2，3-环氧丙醇(1.0当量，Aldrich)一起于25℃搅拌12小时。接着，真空除去溶剂，粗4-(2，3-二羟丙氨基)苄腈进行下一步骤如下：

将25℃二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2，3-二羟丙氨基)苄腈(10当量；如上所述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(1.1当量，Aldrich)一起于110℃搅拌6小时。接着，用乙酸乙酯(0.10M)稀释反应混合物，并用水洗涤2X，用盐水洗涤1X，在硫酸钾上干燥。然后真空中除去溶剂，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得到3-(4-氰苯基)-5-羟甲基-2-_唑烷，进行下一步骤，如下：

将3-(4-氰苯基)-5-羟甲基-2-_唑烷(1.0当量；如上所述)在二氯甲烷(0.10M)中与1.1当量的硫化氢、1.1当量的碘代甲烷和1.1当量的乙酸铵一起搅拌。将反应混合物搅拌6小时，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X，盐水洗涤1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得到脒，进行下一步骤，如下：

上述合成的1.0当量脒由二氯甲烷(0.10M)中的1.1当量BOC-ON(2-(BOC-氧亚氨基)-2-苯乙腈，Aldrich)于25℃保护，搅拌6小时。然后反应混合物用乙酸乙酯(0.1M)稀释)，并用水洗涤2X，盐水洗涤1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物在0.1M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。于0℃搅拌反应混合物6小时，然后用水(5当量)骤冷，用乙酸乙酯(0.1M)稀释，并用水洗涤2X，盐水洗涤1X，在硫酸镁上干燥。然后真空中除去溶剂，粗产物由硅胶柱色谱纯化，得到3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮。

3)将中间体2-N-BOC-氨基-3-(4-羟苯基)-丙酸酯与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧-甲基-2-_唑烷酮偶联，形成保护形式的化合物15：3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧羰基-2N-BOC-氨基-乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮

将1.9g 2-N-BOC-氨基-3-(4-羟苯基)丙酸酯(如上所述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)的混合物于室温下搅拌30分钟。搅拌后，加入10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8g 3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮(如上所述)，于室温下再搅拌15分钟。然后用乙酸乙酯(0.1M)稀释反应混合物，并用水洗2X，盐水洗1X，于硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得到被保护形式的化合物15：3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧羰基-2N-BOC-氨基-乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮，继续进行下一步骤。

4)保护形式的化合物15脱保护，形成化合物15：3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮二盐酸盐，图14

在室温下用4ml 2N NaOH处理保护形式的化合物15：3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧羰基-2N-BOC-氨基-乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮(1.0当量；合成如上所述)4小时。然后在0℃-25℃向混合物中滴加40ml 2N HCl的二_烷溶液3小时。反应混合物用碳酸氢钠(5当量)骤冷，再用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得化合物15：3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮二盐酸盐；m.p.165℃(d)。

P.化合物16：3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧)甲基-2-_唑烷酮，示于图14

1)用于化合物16的原料2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯的合成

化合物16

通过((D或L)酪氨酸)(1.0当量，Sigma)在0.1M甲醇和1％稀盐酸中的酯化作用获得原料2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯。反应混和物于25℃搅拌12小时然后用碳酸钾中和，并用乙酸乙酯(0.10M)稀释，用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物继续进行如下反应：

将上述化合物(4.3mmol)、丁烷磺酰氯(6.6mmol)和三乙胺(1.5当量)的混合物于室温下在二氯甲烷(20ml)中搅拌12小时。然后，蒸发该反应混合物，残余物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。蒸发至干燥后，粗产物用快速色谱(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化，得到标题化合物。

2)用于化合物16的原料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧-甲基-2-_唑烷酮的合成：3步法如下：

将对-氨基-苄腈(1.0当量，Aldrich)在二氯甲烷(0.10M)中与2，3-环氧丙醇(1.0当量，Aldrich)一起于25℃搅拌12小时。接着，真空除去溶剂，粗4-(2，3-二羟丙氨基)苄腈继续进行如下步骤：

将25℃二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2，3-二羟丙氨基)苄腈(1.0当量，如上所述)与碳酸二乙酯(1.1当量，Aldrich)和叔丁酸钾(1.1当量，Aldrich)一起于110℃搅拌6小时。接着，反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，用水洗涤2X，盐水洗涤1X，在硫酸镁上干燥。然后真空中除去溶剂，粗产物用硅胶色谱柱纯化，得到3-(4-氰丙基)-5-羟甲基-2-_唑烷酮，继续进行如下步骤：

将3-(4-氰苯基)-5-羟甲基-2-_唑烷酮(1.0当量；如上所述)在二氯甲烷(0.10M)中25℃与1.1当量硫化氢、1.1当量碘代甲烷和1.1当量乙酸铵一起搅拌。搅拌反应混合物6小时，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得到脒，继续进行如下步骤：

将上述合成的1.0当量脒用二氯甲烷(0.10M)中1.1当量的BOC-ON(2-(BOC-氧亚氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)保护，25℃搅拌6小时。接着，反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。然后真空中除去溶剂，粗产物在0.1M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。于0℃搅拌反应混合物6小时，然后用水(5当量)骤冷，用乙酸乙酯(0.10M)稀释)，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物用硅胶色谱纯化，得3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮。

3)使中间体2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧-甲基-2-_唑烷酮偶联形成保护形式的化合物16：3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮

将1.9g 2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯(如上所述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)的混合物于室温下搅拌30分钟。搅拌后，加入10ml二甲基甲酰胺中的1.8g 3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮(如上所述)，并于室温下再搅拌15分钟。然后反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得到保护形式的化合物16：3-(4-BOC-脒苯基)-5-(4-(2-甲氧羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)-苯氧基甲基-2-_唑烷酮，继续进行下一步骤。

4)保护形式的化合物16脱保护，形成化合物16：3-(4-脒苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，图14

用4ml 2N NaOH在室温下处理保护形式的化合物16，3-(4-BOC-脒苯基)-5-(4-(2-甲氧-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮(1.0当量，合成如上)4小时。然后在0℃-25℃向混合物中滴加40ml 2N HCl的二_烷溶液3小时。反应混合物用碳酸氢钠(5当量)淬火，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空除去溶剂，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得化合物16：3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮；m.p.236-237℃。

Q.化合物17：3-(4-脒苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，示于图14中

1)用于化合物17的原料2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯的合成：

化合物17

通过在0.10M甲醇和1％稀盐酸中((D或L)酪氨酸)(1.0当量；Sigma)的酯化作用得到原料2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯。反应混合物于25℃搅拌12小时，用碳酸钾中和，并用乙酸乙酯稀释(0.10M)，用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空除去溶剂，粗产物进行如下步骤：

将上述化合物(4.3mmol)、丙磺酰氯(6.6mmol，Aldrich)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中室温下搅拌12小时。然后蒸发反应混合物，残余物溶于乙酸乙酯，用稀HCl、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。蒸发至干燥后，粗产物通过快速色谱(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化，得标题化合物。

2)用于化合物17的原料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮的合成：3步法如下：

将对-氨基-苄腈(1.0当量，Aldrich)在二氯甲烷中(0.10M)与2，3-环氧丙醇(1.0当量；Aldrich)一起于25℃搅拌12小时。然后真空除去溶剂，粗4-(2，3-二羟丙氨基)苄腈继续进行如下步骤：

将25℃二甲基甲酰胺中(0.10M)的4-(2，3-二羟丙氨基)苄腈(1.0当量，如上所述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(1.1当量，Aldrich)一起于110℃搅拌6小时。接着，用乙酸乙酯稀释反应混合物，用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。然后真空中除去溶剂，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得3-(4-氰苯基)-5-羟甲基-2-_唑烷酮，进行如下步骤：

3-(4-氰苯基)-5-羟甲基-2-_唑烷酮(1.0当量，如上所述)在25℃二氯甲烷中(0.10M)与1.1当量硫化氢、1.1当量碘代乙烷和1.1当量乙酸铵一起搅拌。搅拌反应混合物6小时，然后用乙酸乙酯稀释(0.10M)，水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。然后真空中除去溶剂，粗产物用硅胶柱色谱纯化，得到脒，继续如下步骤：

将上面合成的1.1当量脒用二氯甲烷中(0.10M)1.1当量BOC-ON(2-(BOC-氧亚胺基)-2-苯乙腈；Aldrich)保护，并搅拌6小时。接着，反应混合物用乙酸乙酯稀释(0.10M)，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物在0.10M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。0℃时搅拌反应混合物6小时，然后用水(5当量)骤冷，用乙酸乙酯稀释(0.10M)，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。然后真空除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮。

3)将中间体2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酮酯与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮偶联，形成保护形式的化合物17：3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)-苯氧甲基-2-_唑烷酮

室温下，将1.9mg 2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯(如上所述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)的混合物一起搅拌30分钟。搅拌后，加入溶在10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8g 3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮(如上所述)，于室温下再搅拌15分钟。然后用乙酸乙酯稀释(0.10M)反应混合物；并用水洗涤2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得到保护形式的化合物17，3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)苯氧甲基-2-_唑烷酮，继续下一步骤。

4)保护形式的化合物17脱保护，形成化合物17：3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，图14

室温下用4m 2N NaOH处理保护形式的化合物17：3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧甲基-2-_唑烷酮(1.0当量；如上合成)4小时。然后0℃至25℃向混合物中滴加40ml 2N HCl的二_烷溶液。然后反应混合物用碳酸氢钠(5当量)骤冷，用乙酸乙酯稀释(0.10M)，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。然后真空中除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得化合物17：3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮；m.p.200℃(d)。

R.化合物18：3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，示于图14

1)用于化合物18的原料2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯的合成：

化合物18

通过在0.10M甲醇和1％稀盐酸中((D或L)酪氨酸)(1.0当量；Sigma)的酯化作用获得原料2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯。于25℃搅拌反应混合物12小时，然后用碳酸钾中和，用乙酸乙酯稀释(0.10M)，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物继续如下步骤：

室温下将上述化合物(4.3mmol)、乙基磺酰氯(6.6mmol，Aldrich)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中搅拌12小时。然后蒸发反应混合物，残余物溶于乙酸乙酯，用稀HCl、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。蒸发至干燥后，粗产物通过快速色谱(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化，得到标题化合物。

2)用于化合物18的原料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮；3步法如下：

25℃时将对-硝基-苄腈(1.0当量；Aldrich)二氯甲烷(0.10M)溶液与2，3-环氧丙醇(1.0当量，Aldrich)一起搅拌12小时。接着，真空中除去溶剂，粗4-(2，3-二羟基丙氨基)苄腈继续进行如下步骤：

将25℃二甲基甲酰胺中(0.10M)的4-(2，3-二羟基丙氨基)苄腈(1.0当量，如上所述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(1.1当量，Aldrich)于110℃一起搅拌6小时。接着，用乙酸乙酯稀释反应混合物(0.10M)，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。然后真空中除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得到3-(4-氰苯基)-5-羟甲基-2-_唑烷酮，继续如下步骤：

将25℃二氯甲烷中(0.10M)的3-(4-氰苯基)-5-羟甲基-2-_唑烷酮(1.0当量，如上所述)与1.1当量硫化氢、1.1当量碘代甲烷和1.1当量乙酸铵一起搅拌。搅拌反应混合物6小时，然后用乙酸乙酯稀释(0.10M)，水洗2X，盐水洗1X，并在硫酸镁上干燥。然后真空中除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得到脒，继续进行如下步骤：

将上述合成的1.0当量脒用25℃二氯甲烷中(0.10M)1.1当量的BOC-ON(2-(BOC-氧亚氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)保护，并搅拌6小时。接着，用乙酸乙酯(0.10M)稀释反应混合物，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物在0.10M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。0℃时搅拌反应混合物6小时，然后用水(5当量)骤冷，用乙酸乙酯稀释(0.10M)，水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧-甲基-2-_唑烷酮。

3)使中间体2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮偶联，形成保护形式的化合物18：3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)-苯氧甲基-2-_唑烷酮

室温下将1.9g 2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸酯(如上所述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)的混合物搅拌30分钟。搅拌后，加入10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8g 3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-_唑烷酮(如上所述)，再于室温下搅拌15分钟。然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释反应混合物，用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得保护形式的化合物18：3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)-苯氧基甲基-2-_唑烷酮，继续进行下一步。

4)保护形式的化合物18脱保护，形成化合物18：3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮，图14

室温下用4ml 2N NaOH处理保护形式的化合物18：3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧-羰基-2-N-乙磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-_唑烷酮(1.0当量，如上所述合成)4小时。然后在0℃至25℃向混合物中滴加40ml 2N HCl的二_烷溶液3小时。反应混合物用碳酸氢钠(5当量)骤冷，用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗2X，盐水洗1X，在硫酸镁上干燥。真空中除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得化合物18：3-(4-脒基苯基)-5-(4-2-羧基-2-N-乙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-_唑烷酮；m.p.212℃(d)。

上述说明书足以使本领域技术人员实施本发明。事实上，除此处所示及所述内容之外对本发明的各种改动对本领域技术人员而言，根据前面说明书是显而易见的，并且落入后附权利要求的范围内。

                          序列表

(1)总体信息：

(i)申请人：THE SCRIPPS RESERCH INSTITUTE

(ii)发明名称：用于抑制α_vβ₅介导的血管生成的方法和组合物

(iii)序列数：9

(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25

(v)当前申请数据：

(A)申请号：PCT/US96/

(B)申请日：1996年8月13日

(C)分类：

(vi)优先权申请数据：

(A)申请号：US 08/514,799

(B)申请日：1995年8月14日

(2)SEQ ID NO：1信息：

(i)序列特征：

(A)长度：5氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝BOC

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝D-Phe

/注＝“D-Phe中前缀“D”表示第4位的苯丙氨酸是D-氨基酸”

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝OMe

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Arg Gly Asp Phe Val

1               5

(2)SEQ ID NO：2信息：

(i)序列特征：

(A)长度：5氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝BOC

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝D-Phe

/注＝“D-Phe中前缀“D”表示第4位的苯丙氨酸是D-氨基酸”

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝OH

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Arg Gly Asp Phe Val

1               5

(2)SEQ ID NO：3信息：

(i)序列特征：

(A)长度：5氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝H

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝D-Phe

/注＝“D-Phe中前缀“D”表示第4位苯丙氨酸为D-氨基酸”

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝OH

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Arg Gly Asp Phe Val

1               5

(2)SEQ ID NO：4信息：

(i)序列特征：

(A)长度：5氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：环

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝cyclo

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝D-Phe

/注＝“D-Phe中前缀“D”表示第4位苯丙氨酸是D-氨基酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Arg Gly Asp Phe Val

1               5

(2)SEQ ID NO：5信息：

(i)序列特征：

(A)长度：5氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：环

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝环

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝D-Phe

/注＝“D-Phe中前缀“D”表示第4位苯丙氨酸是D-氨基酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Arg Ala Asp Phe Val

1               5

(2)SEQ ID NO：6信息：

(i)序列特征：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：环

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝环

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：2

(D)其它信息：/标记＝D-Arg

/注＝“D-Arg中前缀“D”表示第2位精氨酸是D-氨基酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

Gly Arg Gly Asp Phe Val

1               5

(2)SEQ ID NO：7信息：

(i)序列特征：

(A)长度：5氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝环

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝D-Val

/注＝“D-Val中前缀“D”表示第5位的缬氨酸是D-氨基酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

Arg Gly Asp Phe Val

1               5

(2)SEQ ID NO：8信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe

1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：9信息：

(i)序列特征：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝D-Phe

/注＝“D-Phe中前缀“D”表示第4位的苯丙氨酸是D-氨基酸”

(ix)特点：

(A)名称/键：肽

(B)位置：6

(D)其它信息：/标记＝MeVal

/注＝“MeVal中的前缀“Me”表示第6位的缬氨酸是甲基化缬氨酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

Arg Gly Asp Phe Asn Val

1               5

Claims (6)

1.α_vβ₅拮抗剂在制备用于抑制含α_vβ₅的组织中α_vβ₅介导的血管生成的药物中的用途，其中所述α_vβ₅拮抗剂是有机模拟物。

2.权利要求1的α_vβ₅拮抗剂的用途，其中所述有机模拟物由下面结构表示：

3.权利要求1的α_vβ₅拮抗剂的用途，其中所述有机模拟物由下面结构表示：

4.权利要求1的α_vβ₅拮抗剂的用途，其中所述有机模拟物由下面结构表示：

5.权利要求1的α_vβ₅拮抗剂的用途，其中所述有机模拟物由下面结构表示：

6.权利要求1的α_vβ₅拮抗剂的用途，其中所述有机模拟物由下面结构表示：

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