KR19990036426A - αＶβ５ 매개 혈관형성의 억제를 위해 유용한 방법 및 조성물 - Google Patents

αＶβ５ 매개 혈관형성의 억제를 위해 유용한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비트로넥틴 αVβ5길항제를 사용한 조직내 혈관형성을 억제하는 방법을 기술하고 있다. αVβ5-매개 혈관형성은 혈관 내피 성장 인자, 변형 성장 인자-α 및 표피 성장 인자를 포함한 사이토킨으로의 노출과 연관되어 있다. αVβ5길항제를 포함한 치료학적 조성물을 사용한 αVβ5-매개 혈관형성의 억제는 특히 혈관 내피 안구 신생 혈관 질환, 종양 증식 및 염증 질환에서 바람직하다.

Description

αＶβ５ 매개 혈관형성의 억제를 위해 유용한 방법 및 조성물
정부 지원
본 발명은 보건 국가 암 연구기관에 의해 계약 번호 CA45726 및 CA50286하에 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
인테그린은 세포외 매트릭스 단백질에 결합하는 것으로 공지된 세포성 수용체 부류이고 따라서 일반적으로 세포 접착 이벤트(event)로서 언급되는 세포-세포 및 세포-세포외 매트릭스 작용을 매개한다. 하지만 많은 인테그린 및 이들 각각의 리간드가 문헌에 기술되어 있다 할지라도 많은 인테그린의 생물학적 기능은 밝혀지지 않았다. 인테그린 수용체는 α 및 β 서브유니트로 형성된 비공유 이종 이량체성 당단백질 복합체의 구조적 특성을 공유하는 일군의 단백질을 구성한다.
비트로넥틴에 우선적으로 결합하는 이의 고유 특성에 따라 명명된 비트로넥틴 수용체는 αvβ1, αvβ3, αvβ5로 명명된 3개의 상이한 인테그린을 언급하는 것으로 공지되어 있다[참조: Horton, Int. J. Exp. Pathol., 71:741-759(1990)]. αvβ1은 피브로넥틴 및 비트로넥틴에 결합한다. αvβ3은 피브린, 피브리노겐, 라미닌, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴, 본 빌레브란트 인자, 오스테오스폰틴 및 골 시알로단백질 I를 포함하는 다양한 리간드와 결합한다. αvβ5는 비트로넥틴에 결합한다. 특이적인 세포 접착에 관여하는 3개의 인테그린의 많은 세포 작용에 있어서의 역할은 아직 연구중에 있다. 하지만 공유된 생물학적 특이성을 갖는 상이한 인테그린 및 서브유니트 뿐만아니라 상이한 생물학적 기능을 갖는 상이한 인테그린이 존재하다는 것은 명백하다.
많은 인테그린에 대한 리간드내의 하나의 중요한 인식 부위는 아르기닌-글라이신-아스파르트산(RGD) 트리펩티드 서열이다. RGD는 비트로넥틴 수용체 인테그린에 대해 상기 확인된 리간드 모두에서 발견된다. 상기 RGD 인식 부위는 RGD 서열을 포함하는 폴리펩티드(펩티드)에 의해 모방될 수 있고 상기 RGD 펩티드는 인테그린 기능의 공지된 억제제이다. 하지만 RGD 펩티드의 서열 및 구조에 따라 표적 특이적인 인테그린에 대한 억제 특이성이 변환될 수 있다는 것을 주지하는 것은 중요하다.
RGD 인식 부위에 대한 논의를 위해 문헌[Pierschbacher et al., Nature, 309:30-33(1984), and Pierschbacher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5985-5988(1984)]을 참조한다. 다양한 인테그린 특이성을 갖는 다양한 RGD 폴리펩티드는 또한 문헌[참조: Grant et al., Cell, 58:933-943(1989), Cheresh, et al., Cell, 58:945-953(1989), Aumailley et al., FEBS Letts., 291:50-54(1991), and Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238(1994), and in United States Patent Nos. 4,517,686, 4,578,079, 4,589,881, 4,614,517, 4,661,111, 4,792,525, 4,683,291, 4,879,237, 4,988,621, 5,041,380 and 5,061,693]에 기술되어 있다.
혈관신생으로 언급되기도 하는 혈관형성은 신생 혈관의 조직으로의 성장을 포함하는 조직 혈관형성의 과정이다. 상기 과정은 내피 세포 및 평활근 세포의 침투에 의해 매개된다. 상기 과정은 3가지 방식중 하나로 진행되는 것으로 사료된다: 1) 혈관이 기존의 혈관으로부터 생겨날 수 있다; 2) 혈관의 신생이 전구세포로부터 생겨날 수 있다(맥관형성); 또는 3) 기존의 작은 혈관의 직경이 방대해질 수 있다[참조: Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118(1990)]. 혈관 내피 세포는 비트로넥틴 수용체(αvβ3또는 αvβ5), 콜라겐 I형 및 IV형 수용체(α1β1), 라미닌 수용체(α2β1), 피브로넥틴/라미닌/콜라겐 수용체(α3β1) 및 피브로넥틴 수용체(α3β1)를 포함한 5개이상의 RGD-의존 인테그린을 포함하는 것으로 공지되어 있다[참조: Davis et al., J. Cell. Biochem., 51:206-218(1993)]. 평활근 세포는 α5β1, αvβ3, 및 αvβ5을 포함한 6개이상의 RGD-의존 인테그린을 포함하는 것으로 공지되어 있다.
혈관형성은 신생아 성장에 중요한 과정이지만 또한 상처 치료 및 조직 염증, 관절염, 건선, 암, 당뇨 망막증, 황반의 퇴화 및 또 다른 신생 혈관의 안질환을 포함하는 임상적으로 중요한 다양한 질환의 병인론에 중요하다. 혈관형성과 연관된 이들 임상적인 실체는 혈관형성 질환으로서 언급된다[참조: Folkman et al., Science, 235:442-447(1987)]. 혈관형성이 상처 치료 및 황체 성장 주기에서 발생한다 할지라도 혈관형성은 일반적으로 성인 또는 성숙한 조직에서는 부재이다[참조: Moses et al., Science, 248:1408-1410(1990)].
다양한 인테그린 α 또는 β 서브유니트에 면역특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 시험관내 세포 접착 억제는 미세혈관 내피 세포를 포함한 다양한 세포 유형의 세포 접착에 있어서 비트로넥틴 수용체 αvβ3와 연루되어 있다[참조: Davis et al., J. Cell. Biol. 51:206-218(1993)]. 추가로 문헌[참조: Nicosia et al., Am. J. Pathol., 138:829-833(1991)]은 콜라겐 겔에서 배양된 래트 대동맥에서 미세혈관의 시험관내 형성을 억제하기 위한 RGD 펩티드, GRGDS의 사용을 기술하고 있다.
하지만 콜라겐 겔 배양에서 시험관내 미세혈관의 형성 억제는 미세혈관 구조가 신생 모세 혈관과 동일하거나 콜라겐 겔 배양에서 미세혈관의 형성은 신생 혈관의 완전한 조직(예: 관절 조직, 종양 조직 또는 혈관형성 억제가 필요한 질환 조직)으로의 성장과 동일한 것으로 나타나지 않기 때문에 조직에서의 혈관형성 억제를 위한 모델이 아니다.
혈관형성에 있어서의 αvβ3의 역할은 최근에 밝혀졌다[참조: Brooks, et al. Science, 264:569-571(1994)]. 인테그린은 사람 상처 과립 조직에서 혈관상에 나타나지만 정상 피부에서는 나타나지 않는 것으로 보여진다. αvβ3수용체에 대한 모노클로날 항체는 흑색종 단편 뿐만아니라 성장 인자(사이토킨), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)에 의해 유도된 혈관형성을 억제한다. 하지만 신생 혈관형성만이 억제되고 기존의 혈관은 억제되지 않는다. 게다가 특이적인 선형 및 사이클릭 RGD-함유 펩티드는 또한 혈관 신생을 억제하는 것으로 나타났다.
혈관형성의 억제는 종양 성장을 억제하기 위해 유용한 치료법일 수 있다고 제안되어 왔다. 혈관형성의 억제는 하기와 같이 제안되었다: (1) bFGF(염기성 섬유아세포 성장 인자)와 같은 맥관형성 분자의 방출 억제, (2) 항bFGF 항체를 사용한 혈관형성 분자의 중화 및 (3) 맥관형성 자극에 대한 내피 세포 반응의 억제. 상기 후자 방법이 주목을 받아왔으며 문헌[참조: Folkman et al., Cancer Biology, 3:89-96(1992)]은 콜라겐아제 억제인자, 기저막 회전 억제인자, 지혈성 스테로이드, 진균 유래 혈관형성 억제인자, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘, D-페니실라민 및 골드 티오말레이트와 같은 관절염 약제, 비타민 D3동족체, 알파-인터페론 및 혈관형성을 억제하는데 사용될 수 있는것 등을 포함한 내피 세포 반응 억제인자를 기술하고 있다. 혈관형성에 대해 추가로 제안된 억제인자는 하기의 문헌을 참조할 수 있다:
Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118(1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410(1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51(1988) and United States Patent Nos. 5,092,885, 5,112,946, 5,192,744 and 5,202,352.
하지만 혈관형성에 있어서 인테그린αvβ5의 역할은 본 발명에 이르기까지 제안되거나 확인되지 않았으며 αvβ5의 억제를 목적으로하는 이전의 참조문헌에 기술한 혈관형성 억제인자의 역할도 마찬가지이다. 더욱이 본 발명이외의 어떠한 참조문헌도 혈관신생 특히 성장 인자, 즉 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α) 및 표피 성장 인자(EGF)에 의해 유도된 혈관신생에 있어서의 αvβ5인테그린의 역할을 밝히지 못하였다. 혈관형성에 관여하는 수많은 성장인자가 제한되어 있다 할지라도 휴지기 상태에서 혈관신생 상태로 전환하기위한 또 다른 단계의 조절 과정이 존재한다[참조: D'Amore, Investigative Ophthal. Visual Sci., 35:3974-3979(1994)]. 혈관형성에 관여하는 몇몇 성장 인자는 합성 단계에서 조절되는 반면에 또 다른 인자는 활성화 상태에 의해 조절된다. 이들 세포성 반응들은 휴지기 혈관이 상처 또는 허혈에 따른 혈관신생에 따라 일어난다.
특히 VEGF는 제1차 종양 및 허혈성 안구 질환에 있어서 혈관형성의 주요 매개인자로서 사료된다[참조: Folkman, Nature Medicine, 1:27-31(1995)]. VEGF는 내피 세포 특이적인 혈관형성 인자[참조: Ferrara et al., Endocrin. Rev., 13:18-32(1992)] 및 타이로신 키나제 활성을 갖는 고친화성 막결합 수용체[참조: Jakeman et al., J. Clin. Invest., 89:244-253(1992)]와 결합하는 혈관 침투성 인자[참조: Senger et al., Cancer Res., 46:5629-5632(1986)]인 46킬로달톤(kDa)의 동종 이량체이다.
수용체 타이로신 키나제의 활성화는 최근에 세포외 매트릭스 단백질상에 인테그린-의존 세포 이동을 촉진시키는 것으로 나타났다. 특히 문헌[참조: Klemke et al., J. Cell Biol., 127:859-866(1994)]은 αvβ5인테그린을 사용한 비트로넥틴상의 FG 사람 췌장 암 세포의 접착이 아닌 세포 이동을 촉진시키는데에 EGF 수용체(EGFR) 타이로신 키나제를 관련시켰다. 연구가들은 EGF 리간드와 EGFR의 결합이 EGFR의 타이로신 키나제 활성을 활성화시켜 결과적으로 단백질 키나제 C(PKC)-의존 경로를 자극하여 세포가 정상적으로 이동할 수 없는 비트로넥틴 기질의 αvβ5-의존 세포 이동을 유도할 수 있다는 직접적인 증거를 제공한다. 따라서 클렘크 등의 발견은 세포이동에 있어서 인테그린 활성을 갖는 사이토킨, 특히 EGF의 존재에 대한 관련 증거를 제공한다. PKC의 활성은 병아리 융모요막 모델 시스템에서 혈관형성의 조절에 관여하는 것으로 나타났다[참조: Tsopanoglou et al., J. Vasc. Res., 30:202-208(1993)]. 연구가들은 모델 시스템에서 각각 혈관형성을 자극하고 억제하는데 특이적인 PKC의 활성화인자 및 억제인자를 확인하였다.
하지만 상기 논의된 클렘크 및 초파노글로우등은 사이토킨의 역할 및 다양한 증상 및 질환에서 혈관형성을 촉진시키는 αvβ5인테그린의 발현 및/또는 활성화 및 αvβ5-특이적인 길항제에 의한 이의 억제를 기술하고 있지 않다.
최근 실험적인 증거는 안구 질환의 몽키 모델 시스템에서 망막 정맥 폐색에 의해 유도된 망막 허혈이 안구의 안방내 VEGF의 급격한 증가를 초래하는 것으로 나타났다. 상기 증가는 문헌[참조: Miller et al., Am. J. Path., 145:574-584(1994)]에 기술된 바와 같이 관찰된 홍채 혈관신생과 부합한다. 저산소증이 유발되는 증식성 망막증의 마우스 모델 시스템에서의 추가 정보는 VEGF 메신저 RNA가 6 내지 12시간이내에 상대적으로 저산소증이 증가되어 혈관신생이 발생할 때까지 증가된 채로 남아있는 것으로 나타났다. 신생 혈관이 감소함에 따라서 문헌[참조: Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:905-909(1995)]에 기술된 바와 같이 VEGF 발현이 발생한다.
따라서, 허혈성 동물 모델에서 입증된 바와 같은 최근 정보는 허혈에 따른 혈관 신생과 VEGF의 유도를 연관시켰다. 또 다른 성장 인자 뿐만아니라 VEGF는 또한 문헌[참조: Folkman, Nature Medicine, 1:27-31(1995)]에 기술된 바와 같이 혈관신생을 포함한 또 다른 증상 및 질환과 연관되어 있다.
포크만 등의 문헌은 또한 목적하지 않는 혈관 신생을 억제하는데 사용되는 현재 임상적인 방법을 요약하고 있다. 임상적인 실험에서 환자는 혈소판 인자 4, 푸마길린-유도체, 카복시-아미노-트리아졸 등을 포함한 혈관형성 억제인자로 치료학적 치료를 받았다. 하지만 어떠한 참조문헌 또는 현재의 치료학적 참조문헌도 αvβ5의 발현을 혈관신생, 특히 VEGF에 유도된 것과 연관시키지 못하였다. 따라서 본 발명에 선행하여 어떠한 누구도 αvβ5의 존재와 활성과 연관된 혈관신생을 겪는 조직에서의 혈관 신생을 억제하기 위해 αvβ5길항제를 사용한 치료학적 섭생을 기술하거나 사용하지 못하였다.
따라서 αvβ5및 성장 인자와 혈관신생과의 관계에 대해 본원에서 보고된 연구이외에 다른 연구가는 혈관신생이 αvβ5-매개 세포 접착의 억제인자를 사용한 조직에서 억제될 수 있다는 어떠한 다른 입증에 대해 알지못한다. 특히 αvβ5기능이 조직내 혈관 신생을 위해 요구된다거나 αvβ5길항제가 조직내 특히 안구 혈관 신생 질환내 혈관 신생을 억제할 수 있다는 것을 결코 입증된바 없다.
본 발명의 간단한 설명
본 발명은 조직내 αvβ5-요구성 혈관신생 경로에 추가로 분리된 신규 αvβ5-의존 경로가 또한 존재한다는 것을 입증한다. 따라서 본 발명은 혈관신생을 억제할 수 있는 αvβ5억제인자를 기술하고 있다. 추가로 본 발명은 혈관 신생을 촉진하는 αvβ5-매개 활성이 성장 인자 수용체 타이로신 키나제 및 단백질 키나제 C(PKC)의 성장인자(사이토킨)활성화와 연관되어 있다는 것을 기술하고 있다. 상기 방식으로 작용하는 성장 인자(사이토킨)는 혈관 내피 인자(VEGF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 표피 성장 인자(EGF) 등을 포함한다.
따라서 본 발명은 혈관 신생 억제량의 αvβ5길항제를 포함하는 조성물을 조직에 투여하는 것을 포함하여 조직내 혈관신생을 억제하기 위한 방법을 기술하고 있다.
치료될 조직은 혈관 신생이 일어나는 질환 조직과 같은 혈관 신생의 억제가 요구되는 어떠한 조직도 될 수 있다. 조직의 예로는 혈관 신생을 겪는 안구 조직, 자극된 조직, 충실성 종양, 메타스타제, 재발협착증을 앓는 조직 및 기타 조직을 포함한다. 바람직한 양태에서, αvβ5의 발현과 연관된 혈관 신생은 성장 인자 즉 VEGF, TGF-α 및 EGF에 노출된 결과이다.
당뇨 망막증(또한 증식성 당뇨 망막증이라고도 함), 연령과 관련된 황반 퇴화, 추정된 안구 히스토플라스모증, 미성숙 망막증, 겸상세포 망막증 및 혈관 신생 녹내장을 포함한 질환에서 혈관 신생이 명백한 안구와 같은 조직내 VEGF-유도 혈관형성을 억제하는 치료학적 방법이 특히 바람직하다. 추가의 바람직한 양태에서 치료학적 방법은 각막 이식, 포진성 각막염, 매독성 각막염, 익상편, 콘택트렌즈 사용과 관련된 혈관신생 판누스 등을 포함한 각막 혈관 신생 질환에서 일어나는 혈관신생을 억제하는 것이다.
본 발명의 방법에 사용하는 αvβ5길항제는 αvβ5와 결합하여 경쟁적으로 중성 비트로넥틴 리간드에 결합하여 αvβ5의 활성을 억제시킬 수 있다. 바람직하게 길항제는 다른 인테그린중에서 αvβ5에 대해 특이성을 나타낸다. 특히 바람직한 양태에서, αvβ5길항제는 비트로넥틴 또는 또 다른 RGD-함유 리간드와 αvβ5의 결합을 억제하지만 비트로넥틴과 αvβ3또는 αIIbβ3의 결합을 상당히 억제하지 않는다. 바람직한 αvβ5길항제는 선형 또는 사이클릭 폴리펩티드, 모노클로날 항체 또는 이의 작용성 단편 또는 유기 유사체로서 언급되기도 하는 αvβ5리간드와 유사한 유기분자일 수 있고 이모두는 특이적으로 αvβ5와 작용한다.
본 발명의 αvβ5길항제의 투여는 안구내, 정맥내, 경피적, 활액낭내, 근육내 및 경구 투여를 포함한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 종양형성 및 암전이를 억제하기 위한 화학치료섭생과 연관된 투여가 있다.
본 발명은 일반적으로 의학 분야에 관한 것이고 특히 비트로넥틴 수용체 αvβ5의 길항체를 사용한 조직의 αvβ5매개 혈관형성을 억제하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
상기 기술한 것의 일부를 차지하는 도면에서:
도 1A 내지 1D는 αv인테그린 항체 길항제에 의한 사이토킨 유도 래빗 각막 혈관형성의 억제를 설명한다. bFGF 또는 VEGF중 하나로 치료하는 혈관형성의 유도 및 αv인테그린 항체 길항제, P1F6(αvβ5) 및 LM609(αvβ3)와 함께 이의 치료 효과가 실시예 4에 기술되어 있다. OD 및 OS는 각각 실험용 래빗의 오른쪽 및 왼쪽눈이다. 큰 화살표는 수종과 함께 각막 혈관형성을 나타내는 반면에 작은 화살표는 정상적인 결막 윤부 용기를 지적한다. 도 1A 및 1B는 bFGF로 혈관형성의 유도를 보여주는 반면에 도 1C 및 1D는 VEGF로 유도하는 것을 보여준다. 도 1A 및 1C는 래빗 각막을 P1F6으로 치료하는 것을 나타낸 반면에 도 1B 및 1D는 LM609로 치료하는 것을 보여준다.
도 2A 및 2B는 각각 bFGF 또는 VEGF로 유도함에 이어서 P1F6 또는 LM609로 mAb로 치료한후의 +/- 표준오차(각각의 2개 시리즈에 대한 n은 8이다)내의 평균 혈관 신생 면적(mm2)을 나타내는 히스토그램이다. 결과는 실시예 4에서 논의된다.
도 3A 내지 3F는 사진으로 병아리 CAM 표본상의 항인테그린 항체 치료의 효과를 설명한다. 상기 결과는 실시예 6A에 기술한다. 혈관형성은 bFGF 또는 VEGF중 하나에 이어서 대조구로서 인산 완충 식염수(PBS)의 정맥내 투여에 의해 유도되거나 도 1에 대한 범례에서 기술된 P1F6 또는 LM609 모노클로날 항체로 유도된다. bFGF로 치료되는 CAMs는 도 3A, 3C 및 3E에 나타낸 반면에 VEGF로 치료되는 CAMs은 도 3B, 3D 및 3F에 나타낸다. PBS의 정맥내 주사를 받은 대조구 CAMs는 도 3A 및 3B에 나타낸다. P1F6 항체는 도 3C 및 3D에 나타낸 CAMs를 치료하는데 사용되는 반면에 LM109 항체는 도 3E 및 3F에서 CAMs를 치료하는데 사용된다.
도 4A 및 4B는 히스토그램 포맷으로 도 3A 내지 3F에서 나타낸 결과의 측정량을 제공한다. 혈관형성 지수를 대조구 또는 항체 처리에 대한 Y축상에 기입한다. 도 4A 및 4B는 각각 bFGF- 및 VEGF 유도 혈관형성을 보여준다. 결과는 실시예 4에서 논의된다.
도 5A 내지 5F는 실시예 6에서 기술된 바와 같이 병아리 CAM 표본상에 대한 합성 펩티드 처리 효과를 사진으로 설명한다. 혈관형성은 bFGF 또는 VEGF중 하나에 이어서 대조구로서 인산 완충 식염수(PBS)에 의해 유도되거나 합성 사이클릭 펩티드 RGDfV(서열 4) 또는 RADfV(서열 5)로 유도된다. bFGF로 치료된 CAMs는 도 5A, 5C 및 5E에 나타낸 반면에 VEGF로 치료된 CAMs는 도 5B, 5D 및 5F에 나타낸다. PBS의 정맥내 주사를 받은 대조구 CAMs는 도 5A 및 5B에 나타낸다. RDGfV 펩티드는 도 5C 및 5D에 나타낸 CAMs를 치료하는데 사용되는 반면에 RADfV 펩티드는 도 5E 및 5F의 CAMs를 치료하는데 사용된다.
도 6A 및 6B는 히스토그램 포맷으로 도 5A 내지 5F에 나타낸 결과의 측정량을 제공한다. 혈관형성 지수를 대조구 또는 항체 처리에 대한 Y축상에 기입한다. 도 6A 및 6B는 각각 bFGF 및 VEGF 유도된 혈관형성을 나타낸다. 상기 결과는 실시예 6에서 논의된다.
도 7A 내지 7E는 분리된 사이토킨, bFGF, TNF-α, VEGF 및 TGF-α에 의해 유도된 CAM 혈관형성에 대한 항인테그린 모노클로날 항체의 효과를 보여준다. 또한 PMA를 평가한다. 분석 및 결과는 실시예 6에서 기술한다. 상기 결과는 혈관 신생 지수가 Y축상에 그래프화되고 다양한 조절 또는 억제인자가 X축상에 나타낸 히스토그램 포맷내에 기입된다. 도 7A 내지 7E는 각각 bFGF, TNF-α, VEGF, TGF-α 및 PMA로 유도된 혈관형성을 보여준다.
도 8은 실시예 5C 및 6D에서 기술된 바와 같이 수행되고 분석된 병아리 태아 CAM내 CS1 흑색종 종양 성장에 대한 항체 치료 효과를 나타내는 히스토그램이다. 종양의 무게(mg)는 X축상에 표시한 다양한 처리에 대한 Y축상에 기입한다. CSAT는 인테그린 β1 서브유니트에 대해 특이적인 대조구 항체이다. LM609 및 P1F6은 이전에 기술되어 있다.
도 9는 Y축상에 기입된 종양 부피(mm3)로 측정된 바와 같은 흑색종 종양 성장에 대해 대조구대 αvβ5펩티드 길항제, 표지화된 펩티드 189(서열 9) 효과의 히스토그램이다. 분석 및 결과는 실시예 8에 기술되어 있다.
도 10은 실시예 10A 내지 10G에 기술된 바와 같은 화합물 7의 합성을 설명한다.
도 11은 실시예 10A 내지 10C; 10H 내지 10I에서 기술된 바와 같은 화합물 9의 합성을 설명한다.
도 12는 실시예 10J에서 기술된 바와 같은 화합물 10의 합성을 설명한다.
실시예 13은 실시예 10K 내지 10L 및 10M 내지 10N에 각각 기술된 바와 같은 화합물 12 및 화합물 14의 합성을 설명한다.
도 14는 화합물 15, 화합물 16, 화합물 17 및 화합물 18의 화학 구조를 보여준다. 상기 화합물의 상세한 합성은 실시예 100-R에 기술되어 있다.
A. 정의
아미노산 잔기: 아미노산은 펩티드 연결로 되어 있는 폴리펩티드의 화학분해(가수분해)에 의해 형성된다. 본원에서 기술된 아미노산 잔기는 바람직하게 "L" 이성체 형태이다. 하지만 "D" 이성체 형태의 잔기는 목적하는 기능적인 성질이 폴리펩티드에 의해 보유되는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 치환될 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 자유 아미노 그룹을 언급한다. COOH는 폴리펩티드의 카복시 말단에 존재하는 자유 카복시 그룹을 언급한다. 표준 폴리펩티드 명명법{문헌[J. Biol. Chem., 243:3552-59(1969)]에 기술되어 있고 37 CFR ξ1.822(b)(2)에 채택됨}에 따라 아미노산 잔기에 대한 약칭이 하기의 상응표에 보여진다.
기 호 아 미 노 산
1문자 3문자
Y Tyr 타이로신
G Gly 글라이신
F Phe 페닐알라닌
M Met 메티오닌
A Ala 알라닌
S Ser 세린
I Ile 이소류신
L Leu 류신
T Thr 트레오닌
V Val 발린
P Pro 프롤린
K Lys 라이신
H His 히스티딘
Q Gln 글루타민
E Glu 글루탐산
Z Glx Glu 및/또는 Gln
W Trp 트립토판
R Arg 아르기닌
D Asp 아스파르트산
N Asn 아스파라긴
B Asx Asn 및/또는 Asp
C Cys 시스테인
X Xaa 미확인
추가로 하기의 기호는 하기의 의미를 갖는다
BOC 3급-부틸옥시카보닐
DCCI 디사이클로헥실카보디이미드
DMF 디메틸포름아미드
OMe 메톡시
HOBt 1-하이드록시벤조트리아졸
모든 아미노산 잔기 서열은 본원에서 왼쪽 및 오른쪽 배향이 아미노 말단에서 카복시 말단인 통상적인 방향으로 화학식에 의해 나타낸다는 것을 주지해야한다. 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 말단까지의 점선은 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 서열에 결합된 펩티드를 지적한다.
폴리펩티드: 연속적인 아미노산 잔기의 알파-아미노 그룹 및 카복시 그룹간의 펩티드 결합에 의해 서로가 연결된 일련의 아미노산 잔기
펩티드: 폴리펩티드와 마찬가지로 서로가 연결된 일련의 약 50개 이하의 아미노산 잔기
사이클릭 펩티드: 상응하는 선형 펩티드로부터 유래된 사이클릭 펩티드 및 상응하는 선형 펩티드의 N-말단이 상기 상응하는 선형 펩티드의 C-말단 카복실산과 아미드 결합을 형성하여 자유 N-말단 또는 C-말단이 존재하지 않는 펩티드를 언급한다.
단백질: 폴리펩티드에서와 같이 서로가 연결된 일련의 50개 이상의 아미노산 잔기
합성 펩티드: 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 이의 천연적으로 존재하는 단백질 및 단편이 없는 화학적으로 제조된 아미노산 잔기의 쇄.
B. 일반적인 고찰
본 발명은 일반적으로 혈관형성이 특이적인 비트로넥틴 수용체 αvβ5에 의해 매개되고 αvβ5기능 억제가 혈관형성을 억제한다는 발견에 관한 것이다.
상기 발견은 혈관형성이 다양한 질환의 진행에 있어서 중요한 역할을 하기 때문에 중요하다. 혈관형성을 억제함으로써 질환을 예방하고 증상을 개선시킬수 있으며 어떠한 경우에 질환을 치료할 수 있다.
신생 혈관의 성장이 원인이되고 기여하는 질환과 연관된 병리학에 있어서 혈관형성의 억제는 질환의 해로운 효과를 저하시킬 수 있다. 이러한 예는 류마티스 관절염, 당뇨 망막증, 염증 질환, 재발협착증 등을 포함한다. 상처받은 조직의 성장을 위해 신생 혈관 성장이 요구되는 조직에서 혈관형성의 억제는 조직으로의 혈액 공급을 감소시킴으로써 혈액 공급 요구량을 기초로하는 조직질량 감소의 원인이 될 수 있다. 이러한 예는 허혈에 따른 신생 혈관의 성장, 성장 인자 유도 혈관형성, 종양의 두께가 몇 미리미터를 초과하고 충실성 종양 전이를 위해 신생 혈관형성이 계속적으로 요구되는 종양의 성장을 포함한다.
본 발명의 방법은 상기 치료가 어떠한 다른 생물학적 과정이 아닌 혈관형성에 대해서 고도로 특이적이기 때문에 부분적으로 효과적이다. 실시예에서 기술한 바와 같이 단지 신생 혈관 성장만이 상당한 αvβ5을 포함하고 따라서 치료학적 방법은 성숙한 혈관에 역효과를 나타내지 않는다.
단독의 αvβ5의 억제가 효과적으로 혈관형성을 억제한다는 발견으로 잠재적으로 고특이성을 가지며 따라서 낮은 독성을 갖는 치료학적 조성물을 개발할 수 있다. 본 발명이 하나이상의 인테그린을 억제할수 있는 능력을 가진 펩티드 기본 제제의 용도를 기술하고 있다 할지라도 보다 선택적으로 αvβ5를 억제하는 또 다른 제제를 디자인할 수 있다. 따라서, 특정 펩티드 기본 제제는 αvβ5에 의해 매개되는 과정이외의 다른 생물학적 과정을 억제하는 부작용을 나타내지 않는다.
예를들어, 본원 교시에서 나타낸바와 같이 αvβ5기능억제를 위해 유사하게 선택적인 αvβ1, αvβ3, 또는 αIIbβ3가 아닌 αvβ5과의 면역반응에 대해 고도로 선택적인 모노클로날 항체를 제조하는 것이 가능하다. 추가로, RGD 함유 펩티드는 본원에서 추가로 기술된 바와 같이 선택적으로 αvβ5를 억제할 수 있도록 디자인될 수 있다.
본 발명의 발견 이전에 혈관형성 및 혈관형성에 의존하는 임의의 과정은 αvβ5의 생물학적 기능을 길항하는 제제를 사용하여 생체내에서 억제될 수 있다.
C. 혈관형성 억제 방법
본 발명은 조직내 혈관형성을 억제함으로써 혈관형성에 의존하는 조직내 반응을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 일반적으로 상기 방법은 혈관형성 억제량의 αvβ5길항제를 포함하는 조성물을 조직에 투여함을 포함한다.
본 발명의 방법을 실행하는데 사용되는 표적 조직은 αvβ5인테그린 수용체가 감지될 수 있을 만큼 존재하는 것을 특징으로하는 αvβ5함유 조직으로서 정의된다. 다른 말로 αvβ5함유 조직은 세포막내 αvβ5수용체 복합체의 존재에 의해 정의된다. 상기 조직은 상피 및 간엽적으로 유래된 세포를 포함한다. 수용체의 존재는 수용체와 항αvβ5인테그린 수용체 항체와의 면역 반응성을 포함하는 다수의 방법에 의해 결정될 수 있는데 이때 면역반응은 현미경, 면역 침전법, 리간드 결합 경쟁 분석 및 기타 기술에 의해 감지된다. 조직내 αvβ5의 존재를 감지하는데 사용하기 위한 바람직한 항체는 하기 실시예 1에 기술되어 있다. 예를들어, 면역형광성 현미경에 의한 신장, 피부 및 안구 조직내 αvβ5의 분포가 실시예 2에 기술되어 있다.
본 발명의 방법에서, αvβ5-함유 조직은 또한 혈관형성의 증후를 갖는 조직으로서 특징화된다. 앞서 기술한 바와 같이 혈관형성은 스프라우팅(sprouting) 혈관형성 또는 혈관 비대와 같은 조직의 신생 혈관형성을 포함한 다양한 과정을 포함하는데 이때 혈관형성 방법 모두는 αvβ5의 발현에 따라 매개된다. 외상 상처 치료, 몸통 루테움 형성 및 배형성을 제외하고는 대다수의 혈관형성 과정이 질환 진행과 연관되어 있고 따라서 본 치료학적 방법의 용도는 질환에 대해 선택적이고 해로운 부작용을 나타내지 않는 것으로 사료된다.
혈관형성이 중요하다고 사료되는 다양한 질환 즉 혈관형성 질환은 염증 질환(예: 면역 및 비면역 염증, 만성 관절 류마티즘, 및 건선), 비적절하고 부적합한 혈관의 침투와 연관된 질환(예: 재발협착증, 죽상동맥경화 플라크 및 골다공증내 모세혈관 번식), 암 관련 질환(예: 충실성 종양, 충실성 종양 전이, 맥관섬유증, 후수정체섬유증식증, 혈관종, 카포시육종 및 종양 증식을 지지하는 신생 혈관형성을 요구하는 암)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
신생 혈관형성에 의해 특징화되는 안구 질환은 특히 치료를 위한 바람직한 표적을 제공한다. 안구 신생 혈관형성은 시력을 상실하게되는 다양한 안구 질환에서 관찰되는 가장 일반적인 병리학적 변화이다. 기존의 맥락막, 망막 또는 윤부 근접 혈관으로부터 신생 혈관의 성장은 부종, 출혈 또는 섬유혈관 막 형성을 초래하여 안구의 정상적인 해부학적 관계의 파괴 및 이에 수반하는 정상적인 시각 기능의 상실을 일으킨다.
혈관형성에 의해 특징화되는 안구 질환은 각막 이식, 포진성 각막염, 매독성 각막염, 익상편, 콘택트렌즈 사용과 관계된 신생 혈관 판누스 및 기타 등을 포함하는 각막 신생혈관 질환을 포함한다. 또한 추가의 안구 질환은 당뇨 망막증(DR), 연령과 관계된 황반 퇴화(ARMD), 추정된 안구 히스토플라스모증(POHS), 미성숙한 망막증(ROP) 및 신생혈관 녹내장등을 포함한다. 이들 질환에서 혈관형성의 억제가 반드시 질환을 치료하는 것은 아니지만 질환과 연관된 시각 이환율을 상당히 감소시킨다.
예를들어 25년 이상동안 당뇨를 앓은 300,000환자중에 90%가 혈관이 누출되거나 번식함으로써 특징화되는 망막 질환인 몇몇 형태의 DR를 갖는다. 이들 환자중에 30%는 사실 본 발명의 치료학적 방법으로 개선될 수 있는 후자 조건을 갖는다. ARDM에 대해 65,000, 대략 630,000이상의 인구중에 25%가 2030년까지는 6천3백만 이상의 환자가 ARDM일 것이라는 예상과 함께 몇몇 형태의 질환을 앓게 될 것이다. 결과로서 αvβ5연관된 혈관형성을 억제할 수 있는 능력을 가진 본 발명의 치료학적 조성물 및 방법이 의학적으로 큰 가치를 갖는다.
따라서, 병든 조직내 혈관형성을 억제하는 방법은 질환의 증상을 개선시킬 수 있고 질환에 따라 질환의 치료에 기여할 수 있다. 하나의 양태에서 본 발명은 본질적으로 조직내 혈관형성의 억제를 예측한다. 조직내 혈관형성 정도 및 이에 따른 본 발명의 방법에 의해 성취되는 억제 정도는 다양한 방법, 예를들어 αvβ5-면역양성의 온전하고 미성숙한 혈관 구조를 면역조직화학을 사용하여 검출하기위한 실시예에 기술된 방법으로 평가될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이 다양한 조직 또는 유기적인 조직으로 구성된 기관은 피부, 근육, 장, 연결 조직, 관절, 골 및 혈관이 혈관형성 자극에 따라 침투할 수 있는 기타 조직을 포함하여 질환 증상에서 혈관형성을 지지할 수 있다.
특히, 본 발명의 방법 및 αvβ5길항제 조성물은 사이토킨으로 언급되는 성장인자에 의해 유도되는 혈관형성을 억제하는데 치료학적으로 유용하다. 생리적 조건하에서, 혈관형성은 고도로 조절되고 이전에 공개된 문헌[참조: Brooks et al., Science, 264:569-5761(1994)]은 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 같은 특이적인 혈관형성 분자에 의해 활성화되는 것으로 나타났다. 혈관형성의 음성 조절인자가 또한 기술되어 있다. 따라서 혈관형성은 국소적 자극인자 및 억제인자간의 복잡한 균형에 의해 조절된다[문헌참조: D'Amore, Investigative Ophthal. Visual Sci., 35:3974-3979(1994)].
몇몇 질환에서 발생하는 바와 같이 정상적으로 휴지기의 모세 혈관을 조절하는 혈관형성 자극인자 및 억제인자의 생리적 균형이 파괴되는 경우 모세혈관 내피 세포가 유도되어 증식하고 이동하며 궁극적으로 분화하여 신생 혈관을 형성한다.
혈관형성은 문헌[참조: Leibovich, "Role of Cytokines in the Process of Tumor Angiogenesis", in "Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapy", eds. Aggarwal and Puri, Chapter 35, Blackwell Science, Inc(1995)]에서 논의된 바와 같이 일련의 초기 반응에 이어서 일련의 후기 반응을 갖는 계단식 반응으로서 특징화된다. 초기 반응은 혈관외부 공급원에서 전달된 혈관형성 성장인자 및 사이토킨의 전달에 앞서 수행된다. 따라서 초기 반응은 세포간 연결체의 붕괴, 내피 세포 활성화 항원의 발현 유도 및 단백질 분해성 표현형 및 일정한 방향으로 내피 세포의 이동 개시와 함께 표적 미세혈관형성으로 진행한다. 후기 반응은 진행되는 모세혈관아(capillary bud)의 세포, 내피 세포, 혈관주위세포 및 평활근 세포내 성장 인자 및 사이토킨 유전자들의 오토크라인 및 파라크라인 발현과 함께 특징화된다. 이어서 이들 세포는 세포외 매트릭스와 함께 세포의 작용을 조절하여 기존의 성숙한 혈관으로부터 새로운 기능의 모세혈관 루프의 형성을 초래한다.
본원 및 발명의 배경에서 논의된 바와 같이 문헌의 보고서는 사람 및 실험동물 모두에서 종양괴의 확장과 함께 증식성 신생혈관 안구 질환의 혈관형성이 개시되어 αvβ5발현의 증가와 연관된 성장 인자 즉, VEGF, TGF-α 및 EGF를 포함하는 출현된 성장인자간의 상호작용을 기술하고 있다.
따라서 많은 다른 것중에서 VEGF, EGF 및 TGF-α는 세포 증식을 자극시키는 이의 성질에 의해 특징화되는 성장인자로서 사료된다. 성장 인자는 분비 세포 또는 다른 세포에 작용하는 하나의 세포에 의해 분비되는 단백질이다. 작용할 수 있는 이의 능력은 일반적으로 전이막 단백질인 성장 인자 수용체 존재 여부에 달려있다. VEGF와 같은 성장 인자는 또한 일반적으로 폴리펩티드 호르몬으로서 정의되고 동일한 세포(오토크라인) 또는 상이한 세포(파라크라인)중 하나의 증식 및 대사에 영향을 미칠수 있으며 한 세포에 의해 분비되는 사이토킨으로서 언급된다. 용어 사이토킨은 면역 시스템의 세포 및 동일 시스템의 생물학적 반응 변형제(modifier)에 의해 생산되는 분자에 제한되지 않는다. 따라서 용어 사이토킨은 광범위하게 분류되는데 생물학적 반응을 기초로한 이의 아분류는 자극 성장 인자 또는 인핸서(VEGF, bFGF, EGF, TGF-α)등이다[참조문헌: Aggarwal et al., "Common and Uncommon Features of Cytokines and Cytokine Receptors: An Overview", in "Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapy". eds. Aggarwal and Puri, Chapter 1, Blackwell Science, Inc. (1995)]
본 발명에서 항VEGF 항체와 같은 성장 인자 길항제가 아닌 αvβ5-특이적인 길항제는 조직내 혈관형성을 억제하는데 사용하기위해 고려된다. 바람직한 양태에서, 본원에 기술된 αvβ5길항제는 αvβ5인테그린 수용체의 발현이 유도되는 성장 인자-유도 혈관형성을 억제시키는데 유용하다. 상기에서 바람직한 성장 인자는 VEGF, EGF, TGF-α 등을 포함한다.
본 발명의 배경에서 논의된 바와 같이 성장 인자 EGF 및 VEGF 모두는 타이로신 키나제로서 작용하는 이의 세포 수용체에 결합하는 것으로 공지되어 있다. EGF 수용체의 활성화는 추가로 단백질 키나제 C의 활성화와 연관된 것으로 나타나고 이는 αvβ5를 활성화시켜 비트로넥틴 기질상에 특이적인 세포가 이동하게 한다. 따라서, 사이토킨 또는 성장인자에대한 노출과 인테그린 발현 또는 활성화에 있어서 연계 반응간의 작용 메커니즘은 복잡한 생물학적 과정이다. 본 발명에서 나타낸 바와 같이(실시예 6A 참조), 래빗 안구 모델 또는 병아리 융모요막 모델중 하나에서 사이토킨 VEGF를 사용한 조직 치료는 단백질 키나제 C의 활성화에 의존하는 αvβ5-강화된 혈관형성을 일으킨다.
특히 바람직한 양태에서, 본 발명은 혈관형성이 VEGF에서 유도되는 임의의 조직내 혈관형성을 억제시키는 αvβ5길항제의 용도를 고려한다. 예를들어, 다양한 동물 모델 시스템에서 망막의 허혈은 뮬러(Muller) 세포에서 분비되는 VEGF가 상향 조절되어 이의 생산이 결과적으로 안구내 조직의 신행 혈관형성을 유도하는 것으로 나타났다[참조: Miller et al., Am. J. Path., 145:574-584(1994) and Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:905-909(1995)].
따라서, 본 발명에서 치료될 조직은 당뇨 망막증, 황반 퇴화, 신생 혈관 녹내장 또는 상기 논의된 기타 질환을 앓는 환자의 망막 조직이고 억제될 혈관형성은 망막 조직의 신생 혈관형성인 망막 조직 혈관형성이다. 각막 조직을 포함한 안구 신생 혈관형성 증상 또는 질환을 앓는 환자의 조직의 예는 본원 및 실시예에 기술되어 있다. 망막 혈관형성을 치료하기 위한 본 발명의 αvβ5길항제의 효과를 평가하기 위한 모델 시스템의 예는 실시예 9에서 기술한 바와 같은 망막 신생 혈관형성의 뮤린 모델이다.
또 다른 연관된 양태에서, 치료될 조직은 자극된 조직이고 억제될 혈관형성은 자극된 조직의 신생 혈관형성인 자극된 조직 혈관형성이다. 상기 부류에서 상기 방법은 만성 관절 류마티즘을 앓는 환자의 관절 조직, 면역 또는 비면역 자극 조직, 및 건선 조직에서의 혈관형성의 억제를 고려한다.
사이토킨, 인터류킨 1 및 종양 괴사 인자-α는 내피 세포상에 접착 분자 발현의 유도 및 효소 방출을 기초로한 관절 파괴에 있어서 이의 직접적인 역할을 함으로써 류마티스 관절염과 연관되어 있는 것으로 사료된다[참조: Arend et al., Arthritis ＆ Rheumatism, 38:151-160(1995)]. 치료 섭생은 상기 증후에서 발현되는 표적 세포 접착 분자 뿐만아니라 사이토킨 특이적인 억제인자와 함께 사이토킨 모두를 차단하는 것으로 제안되었다[참조: Haskard et al., Cell Adhesion Comm., 2:235-238(1994)]
따라서, αvβ5접착 분자가 관여하는 증상에 상기 치료법을 수행하여 관절 질환에서의 혈관형성 억제는 본 발명에 선행된 발명의 또 다른 바람직한 양태이다.
추가의 관계된 양태에서 치료될 조직은 충실성 종양, 전이조직, 피부암, 유방암, 혈관종 또는 맥관섬유종 및 기타암을 앓는 환자의 종양 조직이고 억제될 혈관형성은 종양 조직의 신행 혈관형성인 종양 조직 혈관형성이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 전형적인 충실성 종양 조직은 폐, 췌장, 유방, 결장, 후두, 난소 및 기타 조직을 포함한다.
사람 충실성 종양에 존재하는 복잡한 사이토킨 네트워크의 역할은 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Leek et al., J. Leukocyte Biol., 56:423-435(1994)]에서 논의된 문제이다. VEGF, 산성 및 염기성 FGF(bFGF), TGF-α 및 -β, EGF, TNF-α, 혈소판 유래 내피 세포 증식 인자, 앤지오제닌, 인터페론 α 및 γ, 인터류킨 1, 6 및 8 및 기타를 포함한 다수의 사이토킨은 악성 조직 및 세포주내에서 다양한 혈관형성 세포 기작에 영향을 주는 것으로 사료된다. 예를들어 다양한 종류의 위치화와 더불어 VEGF는 최근에 문헌[참조: Brown et al. Human Path., 26:86-91(1995)]에 기술된 바와 같은 유방암의 혈관형성과 연계되어 있는 것으로 나타났다.
다양한 사이토킨 특히 본 발명에서 사이토킨 VEGF, TGF-α, 및 EGF을 분비하고 이에 응답하여 국소적인 혈관형성을 유도하는 종양 및 이로인한 αvβ5-매개 혈관형성은 항사이토킨 항체와 함께 종양 조직 샘플을 검색하여 동정될 수 있다. 상기 기술한 항사이토킨 항체는 제조회사[Oncogene Sciences(Uniondale, NY) or Upstate Biotech Incoporated(Lake Placid, NY)]로부터 시판되고 있다. 이들 수단에 의해 선택된 종양 조직의 검색은 본 발명의 αvβ5길항제에 의한 혈관형성 억제 활성의 잠재력을 평가할 수 있게한다.
종양 조직 혈관형성 및 이의 억제의 예는 실시예에 기술되어 있다.
종양 조직 혈관형성의 억제는 종양 증식에서 신생 혈관형성에서 중요한 역할을 하기 때문에 여전히 본 발명의 또 다른 바람직한 양태이다. 종양 조직의 신생 혈관혈성의 부재하에 종양 조직은 요구되는 영양물을 수득하지 못하고 증식이 느리고 추가의 증식이 정지되어 퇴화하게 되고 결과적으로 괴사하여 종양이 사멸하게 된다.
즉 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 종양 혈관형성을 억제함으로써 종양 신생 혈관을 억제하는 방법을 제공한다. 유사하게 본 발명은 혈관형성 억제 방법을 수행함으로써 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또한 상기 방법은 특히 전이의 형성에 대해 효과적인데 이러한 이유는 (1) 전이암 세포가 제1차 종양으로부터 분출할 수 있도록 제1차 종양의 혈관형성을 요구하고 (2) 제2차 부위내 이의 확립은 전이암의 성장을 지지하기 위해 혈관형성을 요구한다. 연관된 양태에서, 본 발명은 충실성 종양 및 전이의 확립을 억제하기 위한 통상적인 화학치료법과 같은 또 다른 치료법과 연계된 방법의 수행을 고려한다. 종양 조직으로 혈액 및 영양물을 공급함으로써 회복하기 위한 혈관형성의 유도에 의해 종양 조직이 독성 침입에 응답하게될 시기에 화학치료 섭생후에 혈관형성을 억제하는 것이 바람직하지만 혈관형성 억제인자의 투여는 통상 화학 치료섭생동안에 또는 후에 수행된다.
본 발명의 방법이 종양 신생 혈관형성의 억제에 적용되는 한 상기 방법은 또한 종양 조직 증식의 억제, 종양 전이 형성의 억제 및 확정된 종양의 퇴화에 적용될 수 있다. 후자를 위해 종양괴의 감소가 본 발명의 용도로서 기술된 래빗 안구 분석 모델 또는 심하게 조합된 면역 결핍(SCID)을 갖는 마우스의 피부를 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Yan et al., J. Clin. Invest., 91:986-996(1993)]에 기술된 바와 같은 사람 신생아 포피로 대체한 키메릭 마우스:사람 모델의 모델 시스템에서 평가된다. 후자 모델은 본 발명의 방법을 사용하여 혈관형성 및 이의 억제를 조사하기 위한 추가의 생체 모델을 제공한다. 래빗 종양 모델 및 본 발명의 αvβ5길항제를 사용한 결과의 예는 실시예 5C 및 6D에서 제공되는 반면에 SCID 마우스 모델에서 혈관형성의 억제에 대한 결과는 실시예 8에 기술되어 있다.
재발협착증은 혈관성형술을 방해하는 경피성 관내 혈관성혈술의 위치에서 평활근 세포(SMC) 이동 및 증식과정이다. 재발협착증동안에 SMC의 이동 및 증식은 본 발명의 방법에 의해 억제되는 혈관형성의 과정으로서 사료될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 혈관성형술 절차를 밟은 환자에서 본 발명의 방법에 따라 혈관성형술을 억제시킴에 의한 재발협착증의 억제를 고려한다. 재발협착증의 억제를 위해 αvβ5길항제는 전형적으로 약 2 내지 28일동안 혈관성형술 과정후에 투여되고 절차후 처음 약 14일동안이 보다 전형적인 것이다.
본 발명의 원리가 용어 환자에 포함될 수 있는 모든 포유동물 각각에 대해 효과적인 것으로 사료된다 할지라도 이의 많은 양태중에서 본 발명에서 치료된 환자는 바람직하게 사람 환자이다. 상기에서 포유동물은 질환의 치료가 본 발명의 방법에 대해 요구되는 몇몇 포유동물종 특히 농업 및 가정용 포유동물종을 포함하는 것으로 사료된다.
조직내 혈관형성을 억제하고 따라서 혈관형성과 관계된 질환을 치료하기 위한 방법을 수행하기 위한 본 발명의 방법은 혈관형성이 일어나거나 일어날 위험성이 있는 조직을 고유 리간드에 결합하여 αvβ5를 억제할 수 있는 αvβ5길항제의 치료학적 유효량을 함유하는 조성물에 접촉시킴을 포함한다. 따라서, 상기 방법은 본 발명의 αvβ5길항제를 포함하는 치료학적 유효량의 생리적으로 허용될 수 있는 조성물을 환자에게 투여함을 포함한다.
추가로 본원에 기술된 바와 같이 αvβ5길항제의 투여량 범위는 길항제의 형태 및 이의 효능에 좌우되고 혈관형성 및 혈관형성에 의해 매개되는 질환증상이 개선되는 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 양이다. 투여량은 역효과 예를들어 과점도 증후, 울혈성 심부전증등과 같은 부작용을 나타낼 만큼 많아서는 안된다. 일반적으로 투여량은 연령, 증상, 성별 및 환자의 질환 정도에 따라 다양하고 당해 분야의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 또한 투여량은 몇몇 합병증의 경우에 담당 의사에 의해 조정될 수 있다.
αvβ5길항제는 수용체와 이의 리간드 즉 비트로넥틴의 결합 활성을 억제함으로써 αvβ5의 생리적 또는 약리적 활성을 차단하거나 억제하는 분자이다. 바람직한 αvβ5길항제는 모노클로날 항체, 펩티드 또는 αvβ5리간드를 모방한 유기 기초 분자중 하나일 수 있다.
치료학적 유효량은 치료될 조직내 혈관형성의 측정할만한 억제를 나타내는데 충분한 αvβ5길항제의 양, 예를들어 혈관형성 억제량이다. 혈관형성의 억제는 본원에서 기술된 바와 같이 면역조직화학 또는 당해 기술분야에 공지된 또 다른 방법에 의해 동일계에서 측정될 수 있다.
지금까지 αvβ5길항제는 αvβ5리간드 유기 유사체, RGD 함유 펩티드, 항αvβ5모노클로날 항체 또는 이의 단편 또는 αvβ5수용체의 유사체의 형태를 취해왔기 때문에 효능 및 "치료학적 유효량"의 표현은 광법위할 수 있는 것으로 평가된다. 그러나 본 발명의 분석 방법에 의해 나타낸바와 같이 당해 분야의 기술자는 본 발명의 추천된 αvβ5길항제의 효능을 용이하게 평가할 수 있다.
αvβ5길항제의 효능은 본원에서 기술한 바와 같이 CAM 분석, 생체 래빗 안구 분석에서 혈관형성의 억제를 포함한 다양한 방법 및 αvβ5에 대한 고유 리간드의 결합 억제 측정 및 기타 분석법에 의해 측정될 수 있다.
바람직한 αvβ5길항제는 0.5uM 이하, 바람직하게는 0.1uM 이하 및 보다 바람직하게는 0.05uM 이하의 길항제 농도 용액에서 비트로넥틴과 같은 고유 리간드의 αvβ5에 대한 결합을 상당히 억제하는 능력을 갖는다. "상당히"란 의미는 비트로넥틴 결합에 있어서 50% 이상 감소하고 50%억제는 본원에서 IC50으로서 언급된다.
보다 바람직한 αvβ5길항제는 다른 인테그린중에서 αvβ5에 대해 특이성을 나타낸다. 따라서 바람직한 αvβ5길항제는 αvβ5에 대한 비트로넥틴 결합을 상당히 억제하지만 다른 인테그린 예를들어 αvβ1, αvβ3또는 αIIbβ3에 대한 비트로넥틴 결합을 억제한다. 특히 바람직한 것은 다른 인테그린에 대한 비트로넥틴의 결합을 억제하는 IC50활성과 비교하여 αvβ5에 대한 비트로넥틴 결합을 억제하는데 10배 내지 100배 미만의 IC50활성을 나타내는 αvβ5길항제이다. 인테그린에 대한 비트로넥틴의 결합을 억제하는데 IC50활성을 측정하기 위한 분석의 예는 실시예에 기술되어 있다.
모노클로날 항체의 형태에서 본 발명의 αvβ5길항제의 치료학적 유효량은 전형적으로 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여되는 경우 약 0.01㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖, 바람직하게는 약 1㎍/㎖ 내지 약 5㎍/㎖, 및 통상적으로 약 5㎍/㎖의 혈장 농도를 성취하는데 충분한 양이다. 이와는 달리 투여량은 하루 또는 수일동안 하루 1회이상 투여로 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 300 ㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.2㎎/㎏ 내지 200㎎/㎏, 가장 바람직하게는 0.5㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏까지 광범위할 수 있다.
길항제가 모노클로날 항체의 단편 형태인 경우 상기 양은 전체 항체의 질량과 상대적인 단편의 질량을 기준으로 조정될 수 있다. 바람직한 혈장 몰 농도는 약 2uM 내지 약 5mM이고 바람직하게는 약 100uM 내지 1mM 항체 길항제이다.
폴리펩티드 형태 또는 또 다른 유사 크기의 작은 분자 αvβ5유사체 형태로 본 발명의 αvβ5길항제의 치료학적 유효량은 전형적으로 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여되는 경우 약 0.1㎍/㎖ 내지 200㎍/㎖, 바람직하게는 약 1㎍/㎖ 내지 약 150㎍/㎖ 혈장 농도를 성취하는데 충분한 양이다. 몰당 약 500㎎의 질량을 갖는 폴리펩티드를 기준으로하여 바람직한 혈장 농도는 약 2uM 내지 약 5mM이고 바람직하게는 약 100uM 내지 1mM 폴리펩티드 길항제이다. 이와는 달리 체중당 투여량은 하루 또는 수일동안 하루 1회이상 투여로 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 300 ㎎/㎏, 및 바람직하게는 약 0.2㎎/㎏ 내지 약 200㎎/㎏까지 광범위할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체, 폴리펩티드 또는 유기 유사체를 비경구적으로 주사 또는 시간경과에 따른 점진적인 주입으로 투여될 수 있다. 치료될 조직이 전형적으로 전신 투여에 의해 체내에서 접근될 수 있다 할지라도 대부분은 치료학적 조성물의 정맥내 투여로 치료되며 표적화된 조직이 표적 분자를 포함할 가능성이 있는 경우 또 다른 조직 및 전달 수단이 고려된다. 따라서 본 발명의 모노클로날 항체, 폴리펩티드 도는 유기 유사체는 안내, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하내, 공동내, 경피적으로 투여될 수 있고 또한 연동 수단으로 전달될 수 있다.
본 발명의 αvβ5길항제를 포함하는 치료학적 조성물은 간편하게 단위 투여량을 주사함으로써 정맥내로 투여될 수 있다. 용어 단위 투여량이 본 발명의 치료학적 조성물을 언급하여 사용되는 경우 환자를 위해 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위체를 언급하고 각각의 단위체는 요구되는 희석제 예를들어 담체 또는 비히클과 연계하여 목적하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 포함한다.
실시예에서 나타낸바와 같이 하나의 바람직한 양태에서 αvβ5길항제는 1회 투여량으로 정맥내 투여된다.
상기 조성물은 투여 제형 및 치료학적으로 유효량과 양립할 수 있는 방식으로 투여된다. 투여될 양과 투여 시간은 치료될 환자, 활성 성분을 사요할 수 있는 환자의 시스템의 능력, 및 목적하는 치료학적 효과의 정도에 좌우된다. 투여하는데 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 전문의의 판단에 좌우되고 각각의 환자에 따라 다르다. 그러나 전신 투여를 위해 적합한 범위는 본원에 기술되어 있고 투여 경로에 좌우된다. 투여를 위한 적합한 섭생은 또한 다양하지만 최초 투여에 따른 1시간이상의 간격으로 주사 또는 투여함으로써 특징화된다. 또한 생체 치료법을 위해 특정화된 범위의 혈액농도를 유지하기에 충분한 연속적인 정맥 주입이 고려된다.
D. 치료학적 조성물
본 발명은 본원에 기술된 치료학적 방법을 수행하기에 유용한 치료학적 조성물을 고려한다. 본 발명의 치료학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 αvβ5길항제와 함께 활성 성분으로서 용핵되거나 분산된 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직한 양태에서, 치료학적 αvβ5길항제 조성물은 치료목적을 위해 포유동물 또는 사람 환자에게 투여되는 경우 면역원성이 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "약제학적으로 허용되는", "생리학적으로 허용되는" 및 이의 어법적으로 다른 용어는 조성물, 담체, 희석제 및 제제를 언급하는 것으로서 상호 번갈아가면서 사용되고 물질이 메스꺼움, 졸음, 위경련등과 같은 목적하지 않는 생리학적 효과 없이 포유동물에게 투여될 수 있다는 것을 나타낸다.
용해되거나 분산된 활성 성분을 포함하는 약리학적 조성물의 제조는 당해 기술 분야에서 널리 공지되어 있고 제형화를 제한할 필요는 없다. 전형적으로 상기 조성물은 수성 용제 또는 현탁제중 하나로서 주사용으로 제조되지만 사용전에 수용액중에 용제 또는 현탁제에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다.
활성 성분은 약제학적으로 허용되고 활성성분과 양립할수 있는 부형제와 함께 본원에서 기술한 치료학적 방법에 사용하기에 적합한 양으로 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는 예를들어, 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 배합물이다. 추가로 경우에 따라 상기 조성물은 소량의 보조물질 예를들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 및 활성 성분의 효능을 증진시킬 수 있는 제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 치료학적 조성물은 성분들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 무기산 예를들어 염산 또는 인산 또는 유기산 예를들어 아세트산, 타르타르산, 만델산등과 함께 형성되는 산 부가염(폴리펩티드의 자유 아미노 그룹과 함께 형성됨)을 포함한다. 자유 카복실 그룹과 형성된 염은 또한 무기염 예를들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철 및 유기염 예를들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인등으로부터 유래될 수 있다.
특히 바람직한 것은 사이클릭 폴리펩티드 αvβ5길항제의 제조에 사용되는 경우 HCl염이다.
생리학적으로 허용되는 담체는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 수성 담체의 예는 활성 성분 및 물이외에 어떠한 물질을 포함하지 않거나 생리적 pH값에서 인산 나트륨, 생리 식염수 또는 이모두를 포함하는 인산 완충 식염수와 같은 완충액을 포함한다. 추가로 액상 담체는 하나 이상의 완충염뿐만아니라 염화 나트륨 및 염화 칼륨 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜 및 또 다른 용질을 포함할 수 있다.
수성 조성물은 또한 물이 배제되거나 포함된 액체상을 포함할 수 있다. 상기 추가 액체상의 예는 글리세린, 식물성 기름 예를들어 목화씨 기름 및 수유 유제이다.
치료학적 조성물은 본 발명의 혈관형성 억제량의 αvβ5길항제를 포함하는데 전형적으로 총 치료학적 조성물의 중량당 0.1중량%이상의 길항제를 포함하도록 제형화된다. 중량%는 총 조성물에 대한 억제제의 중량비이다. 따라서 예를들어 0.1중량%는 100g의 총 조성물당 0.1g의 억제제이다.
E. 인테그린 αvβ5의 길항제
αvβ5길항제는 본 발명에서 조직내 혈관형성을 억제하는데 사용되고 중화 αvβ5리간드와 기능적 작용이 방해되는 방식으로 αvβ5와 반응하는 화합물을 포함하는 다양한 형태를 취할 수 있다. 길항제의 예는 동족체 또는 αvβ5상에 리간드 결합 부위로부터 유래된 αvβ5의 유사체, αvβ5-리간드 결합 반응에 관여하는 구조 영역을 모방한 αvβ5의 중화 리간드 유사체, αvβ5에 특이적인 중화 리간드의 기능적 결합 도메인에 상응하는 서열을 갖는 폴리펩티드, 특히 αvβ5의 중화 리간드의 RGD를 포함하는 도메인에 상응하는 폴리펩티드 및 αvβ5또는 중화 리간드와 면역반응하는 항체를 포함하는데 이모두는 본원에서 정의한 길항제 활성을 나타낸다.
1. 폴리펩티드
하나의 양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 형태의 αvβ5길항제를 고려한다. 폴리펩티드(펩티드) αvβ5길항제는 αvβ5-리간드 작용에 관여하는 영역에서 αvβ5의 중화 리간드 또는 αvβ5그자체중 하나의 서열 특징을 가질수 있고 본원에서 기술한 바와 같은 αvβ5길항제 활성을 나타낸다. 바람직한 αvβ5길항제 펩티드는 RGD 트리펩티드를 포함하고 서열에 있어서 RGD 함유 영역내의 중화 리간드에 상응한다.
바람직한 RGD-함유 폴리펩티드는 αvβ5예를들어 비트로넥틴과 같은 중화 리간드의 RGD 함유 영역의 아미노산 잔기 서열에 상응하는 서열을 가지며 이에 대한 서열은 널리 공지되어 있다.
특히 바람직한 αvβ5길항제 펩티드는 앞서 기술한 바와 같이 또 다른 인테그린과 비교할 경우 우선적으로 중화 리간드에 대한 αvβ5결합을 억제한다. 이들 αvβ5-특이적인 펩티드는 적어도 αvβ5에 대한 특이성이 또 다른 인테그린을 억제와 같은 바람직하지 못한 역효과의 발생을 감소시키기 때문에 특히 바람직하다. αvβ5에 대한 특이성을 갖는 바람직한 αvβ5길항제 펩티드의 확인은 실시예에서 기술한 ELISA 분석과 같은 전형적인 결합 억제 분석에서 용이하게 확인될 수 있다.
하나의 양태에서 본 발명의 폴리펩티드는 100개 이하의 아미노산 잔기, 바람직하게 60개 이하의 잔기, 보다 바람직하게는 30개 이하의 잔기를 포함한다. 펩티드는 선형 또는 사이클릭일 수 있고 특히 바람직한 펩티드는 사이클릭이다. 바람직한 펩티드는 실시예에 기술되어 있다.
대상 폴리펩티드는 αvβ5에 대한 αvβ5리간드의 결합을 길항하는데 필요한 서열을 포함하고 본원에서 기술한 것과 같은 분석에서 αvβ5길항제로서 작용할 수 있는 한 αvβ5중화 리간드의 아미노산 잔기 서열과 동일할 필요는 없다고 사료되어야만한다.
대상 폴리펩티드는 폴리펩티드의 몇몇 동족체, 단편 또는 화학 유도체를 포함하는데 이의 아미노산 잔기 서열은 폴리펩티드가 αvβ5길항제인 경우 본원에서 보여진다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드는 다양한 변화, 예를들어 대체, 삽입 및 결실을 통해 변화할 수 있으며 이의 변화는 이의 용도에 있어서 잇점을 제공한다. 이러한 관점에서 본 발명의 αvβ5길항제 폴리펩티드는 하나이상의 변화가 수행되고 본원에서 정의한 하나이상의 분석에서 αvβ5길항제로서 작용하는 기능을 보유한 인용된 펩티드의 서열과 동일하기보다는 이에 상응한다.
따라서 폴리펩티드는 아미드, 단백질과의 복합체, 폐환된 펩티드, 중합화된 펩티드, 동족체, 단편, 화학적으로 변형된 펩티드 및 기타 유도를 포함하는 다양한 형태의 펩티드 유도체일 수 있다.
용어 "동족체"는 하나이상의 잔기가 보존적으로 기능적으로 유사한 잔기로 대체되고 본원에 기술한 바와 같은 αvβ5길항제 활성을 나타내는 서열과 상당히 동일한 아미노산 잔기서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 보존적인 대체의 예는 아르기닌과 라이신사이, 글루타민 및 아스파라긴 사이, 글라이신 및 세린 사이의 잔기를 비극성(소수성)잔기, 예를들어 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌으로 대체하거나 하나의 극성(친수성)잔기로 대체하거나 하나의 염기성 잔기 예를들어 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘을 대체하거나 하나의 산성 잔기 예를들어 아스파르트산 또는 글루탐산으로 대체함을 포함한다.
문장 "보존적인 대체"는 또한 비유도된 잔기를 대신하여 폴리펩티드가 요구되는 억제 활성을 나타내도록 제공된 화학적으로 유도된 잔기의 사용을 포함한다.
"화학적 유도체"는 작용성 측면 그룹과 반응시켜 화학적으로 유도화된 하나이상의 잔기를 갖는 대상 폴리펩티드를 언급한다. 상기 유도화된 분자는 예를들어 자유 아미노 그룹이 유도화되어 아민 염화수소, p-톨루엔 설포닐 그룹, 카보벤조시 그룹, 3급 부틸옥시카보닐 그룹, 클로로아세틸 그룹 또는 포밀 그룹을 형성하는 분자들을 포함한다. 자유 카복시 그룹은 유도화되어 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 또 다른 유형의 에스테르 또는 히드라지드를 형성할 수 있다. 자유 하이드록시 그룹은 유도화되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 히즈티딘의 이미다졸 질소는 유도화되어 N-임벤질히스티딘을 형성할 수 있다. 20개의 표준 아미노산중에 천연적으로 존재하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드가 화학적 유도체로서 포함된다. 예를들어, 4-하이드록시프롤린은 프롤린으로 대체될 수 있고 5-하이드록시라이신은 라이신으로 대체될 수 있으며 3-메틸히스티딘은 히스티딘으로 대체될 수 있고 호모세린은 세린으로 대체될 수 있으며 오르니틴은 라이신으로 대체될 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 요구되는 활성이 유지되는한 하나이상의 삽입 및/또는 결실 또는 서열을 본원에 나타낸 폴리펩티드 서열과 상대적인 잔기를 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "단편"은 아미노산 잔기 서열을 본원에 나타낸 폴리펩티드의 아미노산 잔기서열보다 단축된 아미노산 잔기 서열을 갖는 대상 폴리펩티드를 언급한다.
본 발명의 폴리펩티드는 αvβ5천연 리간드의 서열과 동일하지 않은 서열을 갖는 경우 전형적으로 보존적이거나 비보존적인 치환이 수행될 수 있기 때문에 통상적으로 아미노산 잔기의 30%이하 및 바람직하게는 10%이하가 대체된다. 본 발명의 폴리펩티드가 간편하게 라벨 또는 고체 매트릭스 또는 담체에 고정될 수 있도록하는 링커를 제공할 목적으로 폴리펩티드의 말단중 하나에 추가의 잔기가 첨가될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있는 라벨, 고체 매트릭스 및 담체는 하기에 기술된다.
아미노산 잔기 링커는 통상 하나이상의 잔기이고 40개이상의 잔기, 흔히 1 내지 10개의 잔기일 수 있지만 αvβ5리간드 에피토프를 형성하지 않는다. 연결을 위해 사용되는 전형적인 아미노산 잔기는 타이로신, 시스테인, 라이신, 글루탐산 및 아스파르트산등이다. 추가로 대상 폴리펩티드는 달리 언급하지 않는한 αvβ5리간드의 천연 서열과 상이할 수 있는데 이는 이의 서열이 말단-NH2아실화(예: 아세틸화), 티오글리콜산 아미드화, 암모니아, 메틸아민과 함께 말단-카복시아미드화 및 기타 말단 변형에 의해 변화될 수 있다. 말단 변형은 널리 공지된 바와 같이 프로틴아제 분해에 대한 민감성을 감소키고 용액 특히 프로테아제가 존재할 수 있는 생물학적 유체중의 폴리펩티드의 반감기를 연장시키는데 유용하다. 이러한 관점에서 폴리펩티드 폐환은 또한 유용한 말단 변형이고 또한 특히 폐환에 의해 형성된 안정한 구조 및 본원에서 기술한 바와 같이 상기 사이클릭 펩티드에 대해 관찰된 생물학적 활성 관점에서 바람직하다.
본 발명의 펩티드는 약제학적으로 허용되는 염은 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드와 염을 형성할 수 있는 적합한 산은 무기산(예: 트리플루오로아세트산(TFA), 염산(HCl), 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산) 및 인산 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 안트라닐산, 시남산, 나프탈렌 설폰산, 설파닐산 등을 포함한다. HCl염이 특히 바람직하다.
본 발명의 펩티드와 함께 염을 형성할 수 있는 적합한 염기는 무기염기(예: 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨 및 기타및 유기염기[예: 모노-, 디- 및 트리-알킬 및 아릴 아민[예: 트리에틸아민, 디이소프로필 아민, 메틸 아민, 디메틸 아민등 및 임의로 치환된 에탄올아민(예: 에탄올아민, 디에탄올아민 등)]을 포함한다.
또한 대상 폴리펩티드로서 본원에서 언급되는 본 발명의 펩티드는 재조합 DNA 기술을 포함하여 당해 폴리펩티드의 기술분야의 기술자에게 공지된 기술중 어떠한 것에 의해서도 합성될 수 있다. 합성 화학 기술(예: 고체상 메리필드형 합성)은 순도, 항원 특이성, 부산물의 부재, 생산의 용이성 등의 이유 때문에 바람직하다. 유용하고 우수한 많은 기술에 대한 개요는 본원에 참조문으로서 인용된 하기의 문헌에 기술되어 있다:
Steward et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky, et al., "Peptide Synthesis", John Wiley ＆ Sons, Second Edition, 1976; J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2. p. 46, Academic Press(New York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-96, 1969; and United States Patent No. 4,244,946 for solid phase peptide synthesis, and Schroder et al., "The Peptides", Vol. 1, Academic Press(New York), 1965 for classical solution synthesis.
상기 합성에 유용한 적합한 보호 그룹은 상기 문헌과 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973]에 기술되어 있다.
일반적으로 고려된 고상(Solid-phase) 합성 방법은 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 적합하게 보호된 아미노산 잔기를 합성되는 펩티드쇄에 연속적으로 첨가하는 것이다. 정상적으로 첫 번째 아미노산 잔기의 아미노 또는 카복시 그룹중 하나는 적합하고 선택적으로 제거될 수 있는 보호그룹에 의해 보호된다. 선택적으로 제거할 수 있는 다른 보호 그룹은 라이신과 같은 반응성 측쇄 그룹을 포함하는 아미노산을 위해 사용된다.
예로서 고상 합성을 사용하는 경우, 보호되거나 유도된 아미노산이 이의 비보호된 카복시 또는 아미노 그룹을 통해 불활성 고체 지지체에 부착된다. 아미노 또는 카복시 그룹의 보호 그룹은 선택적으로 제거되고 적합하게 보호된 상보적인 그룹(아미노 또는 카복실)을 갖는 서열중에 다음 아미노산을 혼합하고 이미 고체 지지체에 부착된 잔기와 아미드 결합을 형성하기에 적합한 조건하에서 반응시킨다. 아미노 또는 카복실 그룹의 보호 그룹은 새롭게 첨가된 아미노산 잔기로부터 제거되고 다음 아미노산(적합하게 보호됨)을 이어서 첨가한다. 모든 목적하는 아미노산이 적당한 서열로 연결된 후에 몇몇 잔여 말단 및 그룹을 보호하는 측쇄 그룹( 및 고체 지지체)을 연속적으로 또는 동시에 제거하여 최종적인 선형 폴리펩티드를 수득한다.
예를들어 상기 기술한 바와 같이 제조된 선형 폴리펩티드는 이의 상응하는 사이클릭 펩티드를 형성하도록 반응될 수 있다. 펩티드를 폐환시키는 방법의 예는 문헌[참조: Zimmer et al., Peptides 1992, pp. 393-394, ESCOM Science Publishers, B. V., 1993]에 기술되어 있다. 전형적으로 3급부톡시카보닐 보호된 펩티드 메틸 에스테르는 메탄올중에 용해시키고 수산화나트륨 용액을 첨가하고 혼합물을 20℃에서 가수분해시켜 메틸 에스테르 보호 그룹을 제거한다. 용매를 증발시킨후에 3급 부톡시카보닐 보호 펩티드를 산성화된 액상 용매중에서 에틸 아세테이트를 사용하여 추출한다. 이어서 3급 부톡시카보닐 보호 그룹을 디옥산 조용매중에 약한 산성 조건하에서 제거한다. 수득된 자유 아미노 및 카복시 말단을 갖는 비보호된 선형 펩티드는 디클로로메탄 및 디메틸포름아미드의 혼합물중의 선형 펩티드의 희석액과 1-하이드록시벤조트리아졸 및 N-메틸모르폴린의 존재하에 디사이클로헥실카보디이미드와 반응시킴으로써 이에 상응하는 사이클릭 펩티드로 전환된다. 수득한 사이클릭 펩티드는 이어서 크로마토그래피에 의해 정제된다.
특히 바람직한 사이클릭 펩티드 합성 방법은 문헌[참조: Gurrath et al., Eur. J. Biochem., 210:911-921(1992)] 및 실시예에 기술되어 있다. 주로 αvβ5-연합된 혈관형성을 보여주는 조직내에서 본 발명의 방법을 사용하기에 특히 바람직한 펩티드는 실시예에 기술되어 있고 서열 번호 4, 6, 7, 8 및 9에 나타낸 폴리펩티드를 포함한다.
2. 모노클로날 항체
하나의 양태에서 본 발명은 αvβ5와 면역반응시키고 본원에 기술된 바와 같이 이의 천연 리간드와 αvβ5의 결합을 억제하는 모노클로날 항체의 형태로 αvβ5길항제를 기술하고 있다. 또한 본 발명은 항체를 생산하는 세포주, 세포주를 제조하는 방법 및 모노클로날 항체를 제조하는 방법을 기술하고 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 1) 분리된 αvβ5와 면역반응하고 2)비트로넥틴과 αvβ5의 결합을 억제하는 항체 분자를 포함한다. 우선적으로 αvβ5에 결합하는 바람직한 모노클로날 항체는 실시예에서 기술된 mAb P1F6 및 mAb P5H9의 면역반응 특징을 갖는 모노클로날 항체를 포함한다.
다양한 어법 형태로 용어 "항체 또는 항체 분자"는 면역글로불린 분자 및/또는 면역글로불린 분자의 면역적으로 활성인 부분, 예를들어 항체 결합 부위 또는 파라토프를 포함하는 분자를 언급하는 집합 명사로서 본원에서 사용된다.
"항체 결합 부위"는 특이적으로 항원에 결합하는 중쇄 및 경쇄 다변성 및 과다변성 영역으로 구성된 항체 분자의 구조적 부위이다.
본 발명에 사용하기 위한 항체의 예는 완전한 면역글로불린 분자, 상당히 완전한 면역글로불린 분자 및 당해 기술분야에 Fab, Fab', F(ab') 및 F(v)로서 공지되어 있고 또한 항체 단편으로서 언급되는 부위를 포함하여 파라토프를 포함하는 면역글로불린 분자의 부위이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체로부터 유래된 Fab 단편을 포함하여 절단된 면역글로불린 분자를 고려한다. Fc 수용체가 없는 Fab 단편은 가용성이고 혈청 반감기에서 치료학적 잇점 및 가용성 Fab 단편을 사용하는 방식에서 진단 잇점을 제공한다. 가용성 Fab 단편의 제조는 일반적으로 면역학적 기술분야에 공지되어 있고 다양한 방법에 의해 성취될 수 있다.
예를들어, 항체의 Fab 및 F(ab')2부위(단편)는 널리 공지된 방법에 의해 상당히 완전한 항체상에 각각 파파인 및 펩신을 반응시켜 단백질분해에 의해 제조된다[참조: U.S. Patent No. 4,342,566 to Theofilopolous and Dixon]. Fab' 항체 부위는 또한 널리 공지되어 있고 2개의 경쇄 부분을 연결하는 이황화결합을 머캅토에탄올로 환원시킴에 이어서 수득한 단백질 머캅탄을 요오드아세트아미드와 같은 시약을 사용하여 알킬화하여 F(ab')2부분으로부터 제조된다. 완전한 면역글로불린 분자를 포함하는 항체가 바람직하고 본원에서 실례로서 사용된다.
이의 다양한 어법 형태로서 문장 "모노클로날 항체"는 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항체 결합 부위의 유일한 한 종류를 포함하는 항체 분자의 총체를 언급한다. 따라서 모노클로날 항체는 전형적으로 면역반응하는 임의의 에피토프에 대해 단일 결합 친화성을 보여준다. 따라서 모노클로날 항체는 복수의 항체 결합 부위를 갖고 각각 상이한 에피토프 예를들어 2중 특이적 모노클로날 항체를 갖는 항체 분자를 포함한다.
모노클로날 항체는 전형적으로 단지 한 종류의 항체 분자를 분비(생산)하는 하이브리도마라고 불리우는 단일 세포의 클론에 의해 생산된 항체로 구성된다. 하이브리도마 세포는 항체 생산 세포 및 골수종 또는 또 다른 자가 영구적인 세포주를 융합시킴으로써 형성된다. 상기 항체의 제조는 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497(1975)]에 최초로 기술되어있다. 추가의 방법은 문헌[참조: Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.(1987)]에 기술되어 있다. 따라서 상기와 같이 제조된 하이브리도마는 αvβ5와 면역반응할 수 있는 항체 분자의 존재 여부 및 천연 리간드와 αvβ5의 결합 억제에 대해 검색된다.
간략하게, 모노클로날 항체 조합물이 생성되는 하이브리도마를 형성하기 위해 골수종 또는 또 다른 자가 영구적인 세포주는 αvβ5공급원으로 과면역화된 포유동물의 췌장으로부터 수득된 임파구와 융합된다.
하이브리도마를 제조하기 위해 사용되는 골수종 세포주는 임파구와 동일한 종으로부터 유래된 것이 바람직하다. 전형적으로 균주 129 GlX+의 마우스는 바람직한 포유동물이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 마우스 골수종은 각각 수탁번호 CRL 1580 및 CRL 1581로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 구입할 수 있는 하이포산틴-아미노프테린-티미딘-민감성(HAT) 세포주 P3X63-Ag8.653 및 Sp2/o-Ag14를 포함한다.
전형적으로 비장세포는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)1500을 사용한 골수종 세포와 융합된다. 융합된 하이브리드는 HAT에 대한 민감성에 의해 선택된다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 확인되고 이의 다양성은 실시예에 기술되어 있다.
또한 본 발명의 모노클로날 항체는 적절한 특이성을 지닌 항체 분자를 분비하는 하이브리도마를 포함하는 영양 배지로 구성된 모노클로날 하이브리도마의 배양을 개시함으로써 생산된다. 상기 배양은 하이브리도마가 배지로 항체 분자를 분비하기에 충분한 조건 및 기간동안 유지된다. 이어서 항체 함유 배지는 수거된다. 이어서 항체 분자는 널리 공지된 기술에 의해 분리될 수 있다.
이들 조성물의 제조에 유용한 배지는 당해 기술분야 및 상업적으로 널리 공지되어 있고 합성 배양 배지, 근친 교배 마우스 등을 포함한다. 합성 배지의 예는 4.5gm/l 글루코즈, 20mM 글루타민 및 20% 태아 소 혈청이 보충된 듈베코 최소 필수 배지(DMEM; Dulbecco et al., Virol., 8:396, 1959)이다. 근친 교배 마우스종의 예는 Balb/c이다.
모노클론 항체, 하이브리도마 세포 또는 하이브리도마 세포 배양물을 제조하는 방법은 또한 널리 공지되어 있다. 예를들어 면역학적 페퍼토리(repertoire)로 부터 모노클로날 항체를 분리하는 방법은 문헌[참조: Sastry, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:5728-5732(1989) and Huse et al., Science, 246:1275-1281(1989)]에 기술되어 있다.
또한 본 발명에 의해 고려되는 것은 하이브리도마 세포 및 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 포함하는 배양이다. 특히 바람직한 것은 모노클로날 항체 mAb, P1F6 및 mAb P5H9을 분비하는 하이브리도마 세포주이고 이의 제조는 실시예에 기술되어 있다.
본 발명은 하나의 양태에서 mAb, P1F6 또는 mAb P5H9의 면역 특성을 갖는 모노클로날 항체를 고려한다.
또한 불필요한 실험없이 모노클로날 항체가 본 발명의 모노클로날 항체와 동일한(등가물) 특이성(면역반응 특징)을 갖는 경우 전자가 후자의 미리 선택된 표적 분자와의 결합을 방해하는지를 밝힘으로써 단일항체의 동일성 여부를 결정하는 것이 가능하다. 고상에 존재하는 본 발명의 모노클로날 항체의 표적분자로의 결합에 대한 표준 경쟁 분석에서 결합력의 감소에 의해 나타난 바와 같이 시험된 모노클로날 항체가 본 발명의 모노클로날 항체와 경쟁하는 경우 2개의 모노클로날 항체가 동일하거나 밀접하게 연관된 에피토프에 결합한다는 것을 짐작할 수 있다.
모노클로날 항체가 본 발명의 모노클로날 항체의 특이성을 갖는지를 결정하는 또 다른 방법은 정상적으로 반응성인 표적분자와 본 발명의 모노클로날 항체를 예비반응 시킴에 이어서 시험될 모노클로날 항체가 표적분자에 대한 결합능이 억제되는 지를 결정하기 위해 시험될 모노클로날 항체를 첨가한다. 시험될 모노클로날 항체가 억제되는 경우 모든 가능성에 있어서 이는 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하거나 기능적으로 등가물인 에피토프성 특이성을 갖는다.
모노클로날 항체가 본 발명의 모노클로날 항체의 특이성을 갖는지의 여부를 결정하기 위한 추가의 방법은 의문시되는 항체의 CDR 영역내 아미노산 잔기 서열이 동일한 결합 특이성을 갖는다. 이들의 CDR 영역내 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산 잔기 서열을 갖는 항체 분자는 동일한 결합 특이성을 갖는다. 폴리펩티드를 서열화하는 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다.
항체의 면역 특이성, 항체가 에피토프에 대해 나타내는 이의 표적 분자 결합 능력 및 이에 수반되는 친화성은 항체가 면역반응하는 에피토프에 의해 한정된다. 에피토프 특이성은 면역글로불린 항체의 중쇄 다변성 영역의 아미노산 잔기 서열의 적어도 일부분 및 경쇄 다변성 영역 아미노산 잔기 서열의 일부분에 한정된다.
"결합 특이성을 갖는" 용어의 사용은 동등한 모노클로날 항체가 동일하거나 유사한 면역반응(결합)특징을 나타내고 미리선택된 표적 분자에 결합하기 위해 경쟁한다는 것을 지적한다.
사람화된 모노클로날 항체는 뮤린 모노클로날 항체보다 특별한 잇점을 제공하고 특히 이들은 사람에게 치료학적으로 사용될 수 있다. 특히, 사람 항체는 외부 항원처럼 신속하게 혈액 순환계로부터 제거되지 않는다. 사람화된 항체를 제조하는 방법은 일반적으로 당해 기술 분야에 공지되어 있고 본 발명의 항체에 용이하게 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하나의 양태에서 항체의 항원에 대한 결합능을 상당히 방해하지 않으면서 사람 면역 시스템의 성분을 도입하기위해 이식시켜 사람화된 본 발명의 모노클로날 항체를 고려한다.
3. αvβ5-특이성 유사체
본 발명은 일반적으로 αvβ5길항제가 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 입증하고 이의 길항제는 αvβ5기능을 방해하는 능력을 갖는 폴리펩티드, 항체 및 유사체로 명명된 또 다른 분자를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 것은 αvβ5기능을 특이적으로 방해하는 길항제이고 다른 인테그린의 기능을 방해하지 않는다.
상기 문헌에서 다양한 시약이 요구되는 생물학적 활성을 갖고 있는한 본 발명의 방법에 사용하기에 적합할 수 있다고 평가된다. 이들 시약은 수용체내 리간드 결합 도메인을 차단시킴으로써 수용체 및 리간드의 작용 반응에 관여하는 αvβ5리간드를 모방할 수 있고 이로써 정상적인 기능을 방해(억제)할 수 있기 때문에 유사체로서 언급된다. 또 다른 양태에서, αvβ5길항제는 이의 리간드보다는 차라리 수용체와 유사할 수 있다.
유사체는 상기 기술된 성질을 나타내는 항체 또는 리간드 유래 펩티드와는 다른 임의의 분자이다. 이는 상기 기술된 결합 도메인의 결합 포켓과 같은 형태인 화합물, 즉 펩티드의 합성 동족체 또는 또 다른 분자일 수 있다. 바람직한 본 발명의 유사체는 유기물 기초 분자이고 따라서 유기 유사체로서 언급된다. 특히 αvβ5리간드와 유사한 αvβ5길항제로서 작용하는 바람직한 유기 유사체 분자는 실시예 10에서 기술된 화합물 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 및 18이다.
αvβ5유사체의 디자인은 분자 모델링, 2차원 핵자기공명(2-D NMR) 분석, X선 결정학, 펩티드, 펩티드 동족체 또는 또 다른 화학 중합체 라이브러리 및 약제 디자인 방법을 포함하여당해 기술분야에 공지된 약제 디자인에 대한 임의의 다양한 구조 분석 방법에 의해 수행될 수 있다.
αvβ5길항제가 작은 폴리펩티드일 수 있다는 것을 보여주는 본 발명에 제공된 광범위한 구조적 증거의 관점에서, 선택적으로 αvβ5의 작용 성질을 공유한 다양하게 상이한 화학구조이고 본 발명의 방법에 유용한 대상 αvβ5길항제의 구조인 모노클로날 항체 또는 유기분자가 제한될 필요는 없지만 본원에서 정의된 바와 같이 임의의 αvβ5유사체를 포함한다.
F. αvβ5의 길항제를 동정하는 방법
또한 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 사용하도록 추천된 αvβ5길항제를 동정하기 위한 분석 방법을 기술하고 있다. 이들 분석 방법에서, 추천된 분자는 αvβ5의 천연 리간드로의 αvβ5결합을 억제하는 효능에 대해 평가되고 추가로 조직내서 혈관형성을 억제하는 이의 효능에 대해 평가된다.
제1 분석은 병아리 융모요막 막(CAM)내 혈관형성을 측정하고 CAM 분석으로서 언급된다. CAM 분석은 상세히 기술되어 있고 추가로 종양 조직의 혈관형성 및 신생 혈관형성 모두를 측정하는데 사용되오고 있다[참조: Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597-618(1975) and Ossonki et al., Cancer Res., 40:2300-2309(1980)].
CAM 분석은 전체 조직의 신생 혈관형성이 일어나기 때문에 생체내 혈관형성을 위한 널리 인지된 분석 모델이다. 실질적인 병아리 태아 혈관이 CAM 또는 CAM상에 성장한 조직으로 증식한다.
본원에서 입증된 바와 같이 CAM 분석은 신생 혈관 증식의 양과 정도 모두를 기초로하여 신생 혈관형성의 억제를 설명한다. 추가로 CAM에 이식된 임의의 조직(예: 종양 조직)의 성장을 조사하는 것이 용이하다. 최종적으로 상기 분석은 특히 분석 시스템내 독성에 대한 내부 대조구 때문에 특히 유용하다. 병아리 태아를 임의의 테스트 시약에 노출시킨다. 상기한 바와 같이 태아의 건강은 독성을 지적한다.
혈관형성을 측정하는 제2 분석은 생체내 안구 모델이고 래빗 안구 분석으로서 언급된다. 래빗 안구 분석은 상세히 기술되어 있고 추가로 탈리도미드와 같은 혈관형성 억제인자의 존재하에 혈관형성 및 신생 혈관형성을 측정하는데 사용된다[참조: D'Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:4082-4085(1994)]
래빗 안구 분석은 각막의 가장자리로부터 각막으로 증식하는 래빗 혈관에 의해 예시된 신생 혈관형성 과정이 천연적으로 안구의 투명한 각막을 통해 용이하게 가시화되기 때문에 생체내 혈관형성을 위해 널리 인지된 분석 모델이다. 추가로 신생 혈관형성의 자극 또는 억제, 또는 신생 혈관형성의 퇴화 정도와 양 모두가 시간경과에 따라 용이하게 조사될 수 있다.
최종적으로 래빗은 임의의 테스트 시약에 노출되고 래빗의 건강이 테스트 시약의 독성을 나타낸다.
제3분석은 천연 리간드, 비트로넥틴의 αvβ5로의 직접 결합의 억제를 측정하고 바람직한 양태는 실시예에서 상세히 기술되어 있다. 전형적으로 상기 분석은 고상에서 ELISA에 의해 비트로넥틴과 같은 천연 리간드와 분리된 αvβ5로의 결합 억제 정도를 측정하고 이의 억제는 αvβ5-특이적인 억제에 의해 매개된다.
따라서 상기 분석은 또한 αvβ5에 대한 특이성을 나타내는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있고 천연 리간드와 또 다른 인테그린의 결합을 억제하지 않는다. 특이성 분석은 αvβ5및 또 다른 인테그린 모두가 이들 각각의 천연 리간드에 대한 결합능력과 미리 선택된 리간드와 결합하는 이들 각각의 결합 능력을 억제하는데 추천된 화합물에 대해 분리된 분석 챔버에서 동시에 검색된다. 바람직한 검색 분석 포맷은 실시예에 기술되어 있다.
본 발명에 관한 하기의 실시예는 실례이고 특히 본 발명을 제한하려는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 더욱이 현재 공지되어 있고 후에 개발될 당해 기술분야의 취지내에 포함될 수 있는 본 발명의 변화는 이후에 청구될 본 발명의 범위내에 속하는 것으로서 사료된다.
1. αvβ5-특이적인 모노클로날 항체의 제조
모노클로날 항체 P1F6 및 P5H9은 표준 하이브리도마 방법을 사용하여 본 원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Wayner et al., J. Cell Biol., 113:919-929(1991)]에 기술된 바와 같이 A549 폐 암종 세포와 함께 RBF/DnJ 마우스로 면역화함에 의해 제조된다. 비장은 면역화된 마우스로부터 제거되고 Ns-1/FOX-NY 골수종 세포와 융합된다. 암종 세포 비트로넥틴 수용체에 특이적인 항체를 제조하는 하이브리도마는 와이너 등에 의해 기술된 바와 같이 비트로넥틴 코팅된 표면에 UCLA-P3 부착의 특이적인 억제에 의해 검색되고 흉선세포 공급 층상의 희석을 제한함에 의해 클론된다.
P1F6 및 P5H9 모노클로날 항체 모두는 αvβ5복합체와 특이적으로 면역반응하고 αv서브유니트, β5서브유니트, 또는 다른 인테그린과는 면역 반응 하지 않는 것으로 나타났다. P1F6 모노클로날 항체는 제조회사(Gibco BRL, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)로부터 시판되고 있고 P5H9 모노클로날은 연구소(Dr. E. Wayner at the Fred Hutchinson Cancer Research Institute, Seattle, WA)에서 구입할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 αvβ5모노클로날 항체는 본원에 기술한 바와 같이 유사하게 유래되고 특징화된다. 뿐만아니라 αvβ5모노클로날 항체는 불순하거나 정제된 형태중 하나인 αvβ5수용체로 면역화된 마우스로부터 분리된 췌장을 융합함으로써 제조된다. αvβ5의 정제는 인테그린 생물학 기술분야에 통상적인 기술자에게 공지된 방법이고 또한 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Smith et al., J. Biol. Chem., 265:11008-11013]에 기술되어 있다. 일단 정제되고 분리된 수용체는 섹션 E2에서 기술된 바와 같이 마우스를 면역화하기 위한 면역원으로서 제조되고 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497(1975)]에 기술된 바와 같이 제조된다. 수득한 하이브리도마 클론은 면역원에 대한 반응성에 대해 검색되고 이어서 하기의 실시예에 기술된 바와 같이 특징화된다.
2. 항-αvβ5모노클로날 항체 특이성의 특징화 및 αvβ5발현의 조직 분포 맵핑을 위한 용도
A. 비트로넥틴에 대한 특이성
실시예 1에서 제조된 P5H9 모노클로날 항체는 UCLA-P3 육종 세포와 비트로넥틴의 부착을 차단시키지만 콜라겐 또는 피브로넥틴에 대한 접착에는 영향을 미치지 않는다[문헌참조: Wayner et al., J. Cell. Biol., 113:919-929(1991)]. 동일한 세포는 또한 단지αvβ5비트로넥틴 수용체를 포함하지만 αvβ3특이성을 갖는 비트로넥틴 수용체는 포함하지 않아 비환원 조건과 함께 α쇄(160KD) 및 β쇄(95KD)로 구성된 이종이량체를 면역 침전시킨다. P5H9에 의해 검출된 αvβ5수용체는 M21 흑색종 세포 및 H2981 암종 세포의 비트로넥틴으로의 부착을 매개하는 것으로 나타났다. P1F6 모노클로날 항체는 동일한 면역반응성 양상을 갖는다.
B. 항인테그린 수용체 항체와 함께 면역형광
상처 치료동안에 혈관의 기저막은 본 빌레브란트 인자, 피브로넥틴, 및 피브린을 포함하여 여러개의 접착 단백질을 발현한다. 추가로 인테그린류의 접착 수용체의 여러 구성원은 배양된 평활근 및 내피세포의 표면상에 발현된다[참조: Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:6471(1987); Janat et al., J. Cell Physiol., 151:588(1992); and Cheng et al., J. Cell Physiol., 139:275(1989)].
인테그린 β5서브유니트의 구조 및 기능 뿐만아니라 다른 항β5모노클로날 항체와 함께 맵핑함에 의한 서브유니트의 조직 분포는 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Pasqualini et al., J. Sci., 105:101-111(1993)]에 기술되어 있다.
실시예 1에서 기술한 것과 유사한 상기 기술한 β5서브유니트 특이성 모노클로날 항체는 A549 사람 폐 암종 세포주와 면역화된 마우스의 비세포를 사용하여 제조된 하이브리도마로부터 분비된다. 하이브리도마는 하이브리도마 배양 상등액을 사용하여 A549 세포의 양성 표면 염색 및 표면 라벨된 A549 추출물로부터 αvβ5복합체의 면역침전에 의해 선택된다. 따라서 모노클로날 항체는 정상 사람 흉선, 피부 및 신장내 β5서브유니트의 조직 분포를 맵핑하는데 사용된다. 4 마이크론 두께의 절편을 항냉기 마이크로톰상에서 동결된 차단체로부터 절단함에 이어서 문헌[참조: Pasqualini et al. reference]에 기술된 수행된 β5인테그린에 특이적인 항체를 사용하여 스트렙트아비딘-비오틴 면역퍼옥시다제 염색한다.
흉선 절편의 염색은 혈관, 핫살 혈구, 피질 및 수질 지질 세포 및 기저막상의 β5의 분포를 보여준다. 피부 절편은 표피의 기저층상 및 몇몇 피부 혈관상에 β5를 나타내고 신장 절편은 사구체 영역, 사구체 부근의 기관, 인접 굴곡된 소관 및 수거 소관의 염색을 나타낸다. 따라서 β5의 분포는 더욱 특히 모세 내피 세포를 포함한 상이한 세포 유형에 대해 이종성이고 이의 염색은 배양된 배꼽의 정맥 내피 세포의 염색과 일관성이 있다.
C. 항인테그린 수용체 항체를 사용한 안구질환을 앓는 환자의 사람 망막 조직의 면역형광
안구 신생 혈관 질환은 재난적인 시력상실을 초래하는 상당히 다양한 안구 질환에서 관찰되는 가장 공통적인 병리학적 변화이다. 기존의 맥락막, 망막 또는 윤부 근접 혈관으로부터 신생 혈관의 성장은 부종, 출혈 또는 섬유혈관 막 형성을 초래하여 안구의 정상적인 해부학적 관계의 파괴 및 이에 수반하는 정상적인 시각 기능의 상실을 일으킨다.
생리적 조건하에서, 혈관형성은 고도로 조절되고 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)와 같은 특이적인 혈관형성 사이토킨에 의해 활성화되는 것으로 나타났다. 문헌[참조: Brooks et al., Science, 264:569-571(1994)]에서 기술된 바와 같이 αvβ5에 대한 모노클로날 항체는 하기 기술된 CAM 모델을 포함하는 모델 시스템에서 bFGF- 및 TNF-α-유도 혈관형성 모두를 차단시키는 것으로 나타났다. 실시예 4 내지 6에 기술된 바와 같이 αvβ5에 대한 모노클로날 항체는 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α) 및 표피 성장 인자(EGF)에 의해 특이적으로 유도된 혈관형성의 분리된 경로를 차단시킨다.
따라서, 본 발명의 배경에서 기술된 바와 같이 혈관형성의 2개의 경로는 구분되는 인테그린, αvβ3및αvβ5에 의해 한정된다. 사람 안구 질환중에 이들 인테그린의 발현 및 역할을 조사하기 위해 망막상부 신생혈관 막 및 망막하부 신생 혈관 막을 증식성 당뇨 망막증(PDR)을 앓는 환자의 유리체절제술에서 수득한다. 이들 환자는 임상적인 절차를 밟고 임상적인 실험 및 기저부 플루오레세인 혈관조영술에 의해 입증된 활성 증식 신생 혈관형성 질환을 기초로 병력 평가를 위해 선택된다. 수득된 조직은 즉시 조직 테크(Tek) 냉각 보존기내에서 동결되고 절편화된다.
이들 환자의 조직이 면역형광에 의해 조사되는 경우 혈관은 마우스 모노클로날 항체 LM609와의 면역반응에 의해 지적된 바와 같이 인테그린 αvβ3에 대해 양성이다. 인테그린의 분포는 혈관에 제한되고 인자에 대한 래빗 항체로 맵핑된 바와 같이 혈관의 마커인 본 빌레브란트 인자의 염색과 부합하는 것으로 나타났다. 면역반응의 부위는 로다민-결합 항마우스 면역글로불린 또는 플루오레신 결합 항래빗 면역글로불린중 하나로 가시화되고 이 2개를 사용하여 인테그린 위치 및 혈관 특이적인 항체의 위치를 알수 있다.
정상적인 안구 또는 활성적으로 증식하는 혈관이 부재인 위축성 막을 가진 환자로부터 수득된 제제는 인테그린 αvβ5에 대해 면역형광적으로 음성이다.
병행하여 동일한 조직이 면역조직화학적으로 실시예 1에서 제조된 항αvβ5모노클로날 항체, P1F6을 사용한 αvβ5의 존재 및 분포에 대해 분석된다. 상기 염색은 αvβ5가 본 빌레브란트 인자의 분포위치와 상응하게 혈관상에 존재한다. 그러나 또한 비혈관 조직은 광범위한 αvβ5의 분포를 나타내는 P1F6 항체와 제한된 형광성을 나타낸다. 이것은 혈관에 제한된 αvβ3의 존재와는 반대이다.
막의 면역형광성 염색이 각각의 항체 LM609 및 P1F6를 사용하여 αvβ3및 αvβ5간에 비교되는 경우에 혈관 벽상의 염색 패턴이 실질적으로 동일하여 αvβ3및αvβ5모두가 신생 혈관 안구 질환(예: 당뇨 망막증)에 존재하는 신생 증식 사람 혈관의 표면상에 나타난다.
따라서 본원에 기술한 결과는 αvβ5인테그린 수용체가 활성 증식 신생 혈관 질환을 갖는 환자의 신생 혈관 막에서 보여지는 바와 같이 혈관형성이 일어나는 특정 조직 유형에서 선택적으로 발현되는 것을 보여준다. 하기 실시예 4 내지 6에서 기술한 특정 성장 인자에 노출된 이들 조직은 따라서 본 발명의 치료학적 양태를 위해 이상적인 표적물을 제공한다.
3. 합성 펩티드의 제조
본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 사이클릭 폴리펩티드는 예를들어 문헌[참조: Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-296(1969) and Fields, G.B. and Noble, R.L., Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214(1990)]에 기술된 바와 같은 표준 고상 합성 기술을 사용하여 합성된다.
2g의 BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OMe(서열 1)을 처음에 60ml의 메탄올중에 용해시키고 여기에 1.5ml, 2N 수산화나트륨 용액을 첨가하여 혼합물을 형성한다. 혼합물을 3시간동안 20℃에서 교반시킨다. 증발시킨후 잔사를 물에 용해시키고 묽은 HCl로 pH 3으로 산성화시키고 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출물을 Na2SO4로 건조시키고 다시 증발시켜 수득한 BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH(서열 2)를 2시간동안 20℃에서 디옥산중에서 20ml, 2N HCl과 함께 교반시킨다. 수득한 혼합물을 증발시켜 H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH(서열 3)를 수득함에 이어서 디클로로메탄 1800ml 및 디메틸포름아미드(DMF) 200ml의 혼합물중에 용해시킨 다음 0℃로 냉각시킨다. 이후에 디사이클로헥실카보디이미드(DCCI) 0.5g, 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 0.3g 및 N-메틸모르폴린 0.23ml을 교반과 함께 연속적으로 첨가한다.
수득한 혼합물을 0℃에서 24시간동안 교반시킴에 이어서 20℃에서 48시간동안 교반시킨다. 용액을 농축하고 혼합된 베드 이온 교반기로 처리하여 염을 제거한다. 수득한 수지를 여과하여 제거한후에 세정용액을 증발시키고 잔사를 크로마토그래피로 정제하여 사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)( 또한 c-RGDfV와 같이 1문자코드로 열거됨)(서열 4)를 수득한다. 펩티드내 소문자는 D형의 아미노산을 나타내고 대문자는 L형을 나타낸다.
대조구 사이클릭 펩티드인 사이클로(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)(또한 RADfV와 같이 1문자 코드로 열거됨)(서열 5)는 상기 기술한 바와 같이 제조한다. 사이클릭 펩티드 c-RADfV(서열 5)는 피브리노겐과 인테그린 αvβ3의 결합을 억제하지만 피브리노겐과 인테그린 αIIbβ3또는 α5β1의 결합을 억제하지 않는 것으로 나타난다[참조: Pfaff, et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238, 1994].
특이적으로 천연 리간드와 αvβ5의 결합을 억제하는 또 다른 펩티드를 하기 실시예에서 기술된 바와 같이 특이성 및 활성의 범위에 테스트된 바와 같이 유사하게 제조한다. 이들은 유사하게 수득된 하기의 펩티드를 포함한다: 사이클로(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(서열 6) 및 사이클로(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val(서열 7). 아미노산 잔기 서열 Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe(서열 8) 및 사이클로(Arg-Gly-Asp--D-Phe-Asn-MeVal)(서열 9)는 또한 합성적으로 제조된다. 서열 9에서 MeVal의 접두어 "Me"는 6번 위치의 발린이 메틸화된 발린이라는 것을 의미한다.
4. 생체내 래빗의 눈의 모델 분석에 의해 측정된 αvβ5길항제를 사용한 성장 인자-유도 혈관형성의 억제
성장 인자-유도 혈관형성에 대한 항-αvβ5길항제의 효과를 눈의 각막에 의해 예시된 천연 투명 구조물에서 관찰할 수 있다. 새로운 혈관은 혈액 공급이 풍부한 각막의 림으로부터 통상적으로 혈관을 갖지 않는 각막의 중심으로 성장한다. 혈관형성의 자극제, 예를 들면, VEGF 및 TGF-α는 각막에 적용되는 경우, 각막의 림으로부터 새로운 혈관의 성장을 유도한다. 각막에 적용되는 혈관형성의 길항제는 각막의 림으로부터 새로운 혈관의 성장을 억제한다. 따라서, 각막은 각막의 림으로부터 내피 세포의 침입을 통해 용이하게 보이는 강성 콜라겐-충전된 각막 조직으로 혈관형성을 유도한다. 따라서, 래빗의 눈의 모델 분석은 눈의 각막으로의 화합물의 이식을 통해 혈관형성의 자극 및 억제의 직접적인 관찰을 위한 생체내 모델을 제공한다.
A. 생체내 래빗의 눈의 모델 분석
1) 성장 인자에 의해 유도된 혈관형성
혈관형성은 성장 인자를 사용한 생체내 래빗의 눈의 모델 분석으로 유도되고, 다음에 기술되어 있다.
a. 성장 인자 및 모노클로날 항체 함유 하이드론 펠렛의 제조
성장 인자 및 모노클로날 항체(mAb) 함유 하이드론 중합체 펠렛을 문헌[참조: D'Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:4082-4085(1994)]에 기술된 바와 같이 제조한다. 개개의 펠렛은 사이토킨을 안정화시키고 주변 조직으로의 서방출을 보장하기 위한 성장 인자(또한 사이토킨이라 함), 특히 수크랄페이트(sucralfate: carafate, Carafet, Marion Merrell Dow Corporation, Cincinnati, OH)에 결합된 bFGF 또는 VEGF 750ng을 함유한다. 또한, PBS 중의 mAb P1F6(항-αvβ5) 또는 대조 항체 LM609(항-αvβ3) 40μg을 함유하는 하이드론 펠렛을 제조한다.
시험되는 모든 mAb를 널리 공지된 방법에 따라 단백질-A 세파로즈 CL-4B 친화성 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 복수증 유체로부터 정제한다. 용출된 면역 글로불린을 PBS에 대하여 투석하고, 데톡시(Detoxi)-겔(Pierce Chemicals, Rockford, IL)로 처리하여 내독소를 제거한다. 내독소는 강력한 혈관형성 및 염증성 자극제인 것으로 보인다. 따라서, 모노클로날 항체를 색소생성 리물러스 변형세포 분해물 분석(Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay, BioWhittater, Walkersville, MD)을 사용하여 내독소의 존재에 대해 시험하고, 검출 가능한 내독소를 함유하지 않는 경우의 mAb 만을 래빗의 눈의 모델 분석에 사용한다.
펠렛을 표면으로 구멍이 뚫린 2.5mm의 코어를 갖는 특별히 제조된 테플론 페그로 주조시킨다. 주조 물질 약 12μl을 각각의 페그에 놓고 밤새 멸균 후드에서 중합시킨다. 펠렛을 자외선 조사에 의해 멸균시킨다.
각각의 동물이 예정된 항체 또는 대조 면역 글로불린과 함께 예정된 사이토킨을 함유하는 하이드론 이식체를 갖는 일련의 8마리의 동물을 한쌍의 눈 실험에 사용한다. 특히, 각각의 래빗에서, 하나의 각막은 mAb P1F6과 함께 bFGF 또는 VEGF를 함유하는 하이드론 펠렛으로 외과 이식시키고, 다른 각막은 MAb LM609와 함께 bFGF 또는 VEGF로 처리한다. 개개의 펠렛을 래빗의 각막의 중앙 기질에서 형성된 외과적 생성 "포켓"에 이식한다. 외과적 방법은 개개의 각막을 사진 기록하기 위한 카메라를 갖는 빔스플리터가 장착된 Wild 모델 M691 작동 현미경을 사용하여 멸균 기술하에 수행한다. 3mm x 5mm "포켓"을 69 Besver 블레이드를 사용하여 각막 두께의 반으로 3mm 절개하여 각막 기질에 생성시킨다. 기질을 이리스 주걱을 사용하여 말초 절개하고, 펠렛을 주변으로부터 2mm 여유를 두고 이식한다.
이후 12일 동안, 사이토킨 및 mAb는 이식된 펠렛으로부터 주변 조직으로 확산되어 각막의 림으로부터 혈관형성을 유도한다.
좌우 각막을 각각 OS 및 OD라 한다. 각막을 12일 동안 관찰한다. 신혈관 신생이 최대인 수술후 10일째에 사진을 취한다.
사이토킨/mAb 혼합물로의 상기 처리의 각각의 사진 결과는 도 1A 내지 1D에 나타내었다. 사이토킨-유도 혈관형성의 mAb 억제의 평행 정량 평가는 도 2A 및 2B에 나타내었다. 각막이 각각 bFGF/P1F6 및 VEGF/LM609 배합물에 노출된 도 1A 및 1D에서, 부종을 갖는 사이토킨-유도 혈관형성은 대화살로 나타낸 바와 같이 우세하다. 따라서, αvβ5항체, P1F6은 bFGF-유도 혈관형성을 억제하는데 효과적이지 않다. 유사하게, αvβ3항체, LM609는 VEGF-유도 혈관형성을 억제하는제 효과적이지 않다.
대조적으로, bFGF/LM609 및 VEGF/P1F6의 사이토킨/mAb 배합물을 래빗 모델에 사용하는 경우, 사이토킨-유도 혈관형성은 도 1B 및 1C에 나타낸 바와 같이 항체에 의해 억제된다. 이들 도면에서, 소화살로 나타낸 정상의 결막부 혈관은 사이토킨-유도 혈관형성의 한 유형을 억제하는데 있어서 인터그린 항체의 유용성을 나타내는 것으로 보인다.
상기 사이토킨-유도 혈관형성에 대한 특이 mAb 인터그린 면역 반응성의 효과를 또한 도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이 정량화한다. 혈관형성은 각각 도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이 bFGF 또는 VEGF로 자극한다. 처리된 눈을 매일 니콘 카메라가 장착된 Wild 작동 현미경을 통해 사진을 찍는다. 사진을 Kodak Ektachrome 64T 슬라이드 필름상에 기록하고, 상을 모델 GS670 상 농도계를 통한 습득후 Bioraf's Molecular Analyst 1.1 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터-보조 정량화에 대하여 상을 변환시킨다. 막대 그래프는 mAbs P1F6 또는 LM609에 노출시킨후 평균 신혈관 영역 +/- 표준 오차(2개의 일련의 각각에 대하여 n=2)를 나타낸다.
도 2A에 나타낸 바와 같이, LM609는 P1F6으로의 동일한 동물의 한쌍의 처리와 비교하는 경우, bFGF-유도 혈관형성을 86%(p<0.05, 한쌍의 t-시험)로 저하시킨다. 도 2B에 나타낸 바와 같이 VEGF를 사용하여 혈관형성을 자극하는 경우, 반대 효과가 관찰되는 반면, VEGF-유도 혈관형성에 대한 최소 효과를 갖는 LM609-처리 눈과 비교하는 경우 P1F6은 신혈관 생성의 평균 영역을 60%(p<0.03, 한쌍의 t-시험)로 저하시킨다.
유의하게는, 새로운 사이토킨-유도 혈관은 특정 mAb에 대한 노출에 의해 효과적인데 반해, 선재하는 가장자리 혈관은 관찰되는 효과가 각막의 새롭게 형성되는 혈관으로 제한되는 것을 나타내는 mAb에 의해 영향받지 않는다.
유사한 분석을 실시예 3 및 αvβ5발현과 특히 상관 관계가 있는 사이토킨-유도 혈관형성을 억제하는데 사용하기 위한 하기 기술된 바와 같이 제조된 합성 펩타이드를 사용하여 수행한다.
특정 사이토킨에 의해 유도된 혈관형성이 항-인터그린 항체의 한 유형에 의해서만 효과적이다는 것, 특히 αvβ5인터그린 수용체가 VEGF-유도 혈관형성에 역할을 한다는 것을 나타내는 이들 결과를 확인하기 위해, 병아리 융모 요막(CAM: chick chorioallantoic membrancd)의 또 다른 신혈관 모델을 다음 실시예에 나타낸 바와 같이 사이토킨 및 인터그린 항체의 배합물을 사용하여 평가한다.
5. 병아리 융모 요막(CAM) 제제의 혈관형성
A. 미처리 CAM의 특징
1) CAM의 제조
혈관형성을 정상의 배아 혈관형성이 숙성 혈관의 형성을 초래한 후 병아리 융모 요막(CAM)에 대하여 유도할 수 있다. 혈관형성은 문헌[참조: Am. J. Pathol., 79:597(1975)]에 기술된 바와 같이 특이 사이토킨 또는 종양 단편에 대한 반응을 유도하는 것으로 보인다. CAM은 본 발명의 αvβ5길항제를 사용하여 하기 및 실시예 6에 기술되어 있는 바와 같이 혈관형성의 후속의 유도 및 이의 억제에 대하여 병아리 배아로부터 제조한다.
10일된 병아리 배아를 McIntyre Poultry(Lakeside, CA)으로부터 수득하고, 37℃에서 60% 습도하에 항온처리한다. 소형 크라프트 드릴(Dremel, Division of Emerson Electric Co., Racine, WI)을 사용하여 기낭 위의 에그의 끝의 쉘을 통해 소형 구멍을 낸다. 두 번째 구멍은 이미 에그를 캔들링하여 측정한 배아 혈관이 전혀 없는 영역에서 에그의 광범위한 측면에 구멍을 낸다. 음압을 원래 구멍에 적용시켜 CAM(융모 요막)에서 쉘막으로부터 뽑아내고 CAM에 걸펴 불량한 기낭을 생성시킨다. 1.0cm x 1.0cm으 사각형 윈도우를 소형 모델 그라인딩 휠(Dremel)을 사용하여 강하 CAM 상의 쉘을 통해 절단한다.
생성된 CAM 제제를 혈관형성이 잠잠해진 배아 형성의 10일째에 사용한다. 제제를 사이토킨 처리에 대한 반응에서 재생 혈관형성을 유도하기 위한 본 발명에 사용한다.
2) CAM의 조직학
병아리 배아 CAM의 현미경 구조를 분석하기 위해, 6μm 의 단편을 면역 형광 분석용 저온 유지 장치 마이크로톰상에서 동결 블록으로부터 절단한다.
전형적인 미처리 10일된 CAM은 혈관이 없는 영역이다. CAM 시스템에서 혈관형성은 이러한 배아 형성의 단계에 의해 잠잠해지므로, 시스템은 인접한 영역으로부터 통상 혈관이 없는 CAM의 영역으로 존재하는 혈관으로부터 새로운 맥관 구조의 생성을 각종 사이토킨으로 자극하기 위한 본 발명에 유용하다.
CAM 모델 및 하기 실시예에서 나타낸 바와 같이, 혈관은 정상의 배아 형성에서 새로운 성장을 유도하거나 사이토킨에 의해 유도되며, 혈관은 αvβ3및 αvβ5을 발현한다.
B. 성장 인자에 의해 유도된 혈관형성
혈관형성은 래빗의 눈 모델에서 실시예 4A에 기술된 바와 같이 사이토킨 또는 성장 인자에 의해 유도되는 것으로 보인다. 본원에 기술된 실험에서, 실시예 4에 기술된 래빗 각막 제제에서의 혈관형성은 유사하게는 본원에 기술된 바와 같이 CAM 혈관상에 통상 적용된 성장 인자에 의해 유도된다.
혈관형성은 혈관이 없는 영역에서 10일된 병아리 배아의 CAM상에 Hanks Balanced Salt Solution(HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) 또는 예정된 농도, 즉 혈관형성을 시험하기 위한 농도에서 예정된 사이토킨을 함유하는 HBSS로 포화된 5mm x 5mm Whatman 필터 디스크(Whatman 필터 페이퍼 제1번)을 놓고 유도시키고 윈도우를 테이프로 밀봉한다. 혈관형성을 72시간 후 광현미경으로 모니터링한다. CAM을 급동결시키고, 6μm 저온 유지 장치 부분을 아세톤으로 고정시킨 다음 실시예 1에 기술된 바와 같이 αvβ5에 대한항체를 포함하는 선택된 항-인테그린 항체 10μg/ml로 실시예 2B 및 2C에 기술된 바와 같이 면역 형광에 의해 염색시킨다.
문헌[참조: Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994)]에 의한 연구는 혈관이 bFGF 및 TNF-α 처리된 제제 모두에서 용이하게 보이지만, 미처리 CAM에서는 나타나지 않다는 것을 보인다. 또한, 저자는 αvβ3발현이 bFGF-유도 혈관형성에 따라 증가됨을 보인다. 인테그린 β1의 발현은 미처리 CAM에서 나타낸 것으로부터 변화지 않으며, β1은 또한 자극된 혈관상에서 용이하게 검출가능하다.
이들 공개된 발견은 사람 및 병아리 모두에서 혈관형성에 수반된 혈관이 αvβ3의 발현을 증진시킴을 가리킨다. 이와 함께, 배양된 내피 세포 상의 αvβ3의 발현은 문헌[참조: Janat et al., J. Cell Physiol., 151:588 (1992); Enenstein et al., Exp. Cell Pes., 203:499(1992) and Swerlick et al., J. Invest. Derm., 99:715(1993)]에 기술된 바와 같이 시험관 내에서 각종 사이토킨에 의해 유도된다.
본 발명에서, 상이한 접착 인테그린 수용체 αvβ5의 발현 및 활성화에 의존적인 혈관형성을 자극하기 위한 개개의 사이토킨-중대 경로를 이제 측정한다. αvβ5의 발현과 관련한 사이토킨 VEGF, TGF-α 및 EGF, 혈관형성 및 αvβ5길항제를 사용한 이의 억제에 대한 본원에 기술된 CAM의 노출 효과는 실시예 6에 기술되어 있다.
C. 종양에 의해 유도된 혈관형성
종양-유도 혈관형성에서 αvβ5의 역할을 조사하기 위해, 가종 αvβ5-음성 사람 흑색종 및 암종 단편을 문헌[참조: Brooks et al., J. Cell Biol., 122:1351 (1993)]에 기술되고 본원에 기술된 17일된 병아리 배아의 CAM으로부터 이미 성장시키고 분리시킨 CAM 분석에 사용한다.
혈관형성은 CAM 분석 시스템에서 CAM상에서의 종양 단편의 직접적인 병치에 의해 유도된다. 병아리 배아 CAM의 제조는 상기 기술된 방법과 동일하다. 필터 페이퍼 디스크 대신에 하기 기술되는 세포주 현탁액의 성장으로부터의 하나의 αvβ5-음성 종양의 중량 단편 50 내지 55mg을 최초 혈관이 없는 영역에서 CAM에 놓는다. 문헌[참조: Pasqualini et al., J. Cell Sci., 105:101-111 (1993)]에 기술된 바와 같이 세포주, rabdomyosarcoma 척수(HL-60 또는 KG-1) 및 임파(T-세포, Jurkat, HPB/ALL, PEER 및 각종 B 세포주)를 사용하여 병아리 배아의 CAM 상에서 고형 사람 종양을 성장시킨다. 각종 세포주의 단일 세포 현탁액을 우선 멸균 HBSS의 30μl의 총 용적 중의 CAM에 적용시킨다. 윈도우를 테이프로 밀봉시키고, 배아를 7일 동안 항온처리하여 사람 종양 병변을 성장시킨다. 7일째에, 17일된 배아인 종양을 CAM으로부터 절제하고 주변 CAM 조직을 트리밍한다. 종양을 혈관형성에 사용하기 위해 종양 단편 50 내지 55mg으로 잘라낸다. 종양 단편을 혈관이 없는 영역에서 실시예 5A에 기술된 바와 같이 새로운 세트의 10일된 병아리 배아 CAM상에 놓는다.
αvβ5-유도 사이토킨(VEGF, TGF-α 또는 EGF)의 국소 또는 정맥내 적용하거나 적용하지 않은 병아리 배아 CAM 상에서 생체내 종양 성장을 이미 기술한 바와 같이 mAb, P1F6 또는 P5H9로의 αvβ5발현에 대하여 염색한다.
이들 CAM 종양 제제는 종양-유도 혈관형성 상에서 항체 및 펩타이드의 효과를 측정하기 위해 실시예 6C 및 6D에 기술한 바와 같이 처리한다.
한 양태에서, 햄스터 흑색종 세포,CS-1(Dr. Caroline Damsky, University of California, San Francisco)를 흑색종 종양의 형성을 위해 상기 기술한 바와 같이 CAM 분석에 사용한다. 약 50mg의 CS-1 종양 단편을 새로운 10일된 병아리 배아 CAM에 전이시키고, 각각의 제제에 100μg 또는 300μg의 P1F6 항체, LM609 항체 또는 대조CSAT(항-β1) 항체를 정맥내 주사한다. 추가의 대조 그룹은 처리하지 않은 제제를 포함한다. 결과는 실시예 6D에서 논의된다.
6. CAM 분석에서 측정된 혈관형성의 억제
A.억제제의 정맥내 적용에 의한 성장 인자-유도 혈관형성의 억제
CAM 제제를 정맥내 주사한 모노클로날 항체를 사용한 성장 인자-유도 혈관형성의 효과를 본 발명의 생체내 모델 시스템으로서 사용하기 위해 평가한다.
활성 혈관 신생에 따라, 혈관 전개가 중단되면, αvβ5의 발현은 면역 형광 분석에 의해 검출 불가능한 수준으로 감소한다. 완숙 혈관의 발현 결여와 대조적으로 혈관형성에 따른 혈관의 αvβ5발현 조절은 CAM 혈관형성 분석 시스템에서 모형화된 바와 같이 혈관형성을 조절하고 억제하기 위한 본 발명의 독특한 능력을 제공한다.
정맥 주사용 병아리 배아의 제제는 본질적으로 상기 기술한 바와 같다.
혈관형성을 성장 인자-포화 필터 디스크를 적용시켜 10일된 병아리 배아 상에 유도한다. 특히, 제1 분석에서, 혈관형성을 각각 150ng/ml의 농도에서 bFGF 또는 VEGF에 노출시켜 유도한다.
성장 인자의 적용에서, 캔들링 방법 동안, 돌출 혈관을 선택하고 달걀 껍질 상에 표시하여 이의 위치를 나타낸다. 쉘에 구멍을 내고, CAM을 적하하고 성장 인자-포화 필터 페이퍼를 상기 기술한 바와 같이 각각 CAM상에 놓는다. 윈도우를 멸균 테이프로 밀봉하고 배아를 항온처리기에 넣는다.
24시간후 제2의 소형 윈도우를 이미 선택한 돌출 혈관 바로 위의 달걀 껍질의 측면 상에 조심스럽게 절단한다. 외부 달걀 껍질을 조심스럽게 제거하여 본래의 배아막을 남긴다. 껍질 막을 무기 오일(Perkin-Elmer Corp, Norwalk, CT) 소적을 사용하여 투명하게 하여 혈관이 용이하게 가시화시킨다. 인산염 완충 염수(PBS), 정제 염수 항-인테그린 항체 75μg 또는 합성 펩타이드(사이클릭 펩타이드 RGDfV, 서열 4 및 대조 사이클릭 펩타이드 RADfV, 서열 5) 75μg을 성장 인자-유도 CAM 상에 명백한 혈관에 주사한다. 윈도우를 테이프로 밀봉하고 배아를 72시간 까지 항온처리한다.
필터 디스크 및 대표적인 주변 CAM 조직을 입체 현미경으로 사진을 찍고(도 3A 내지 3F 및 도 5A 내지 5F) 평균 맥관 지수 +/- 표준 오차를 조건당 12 CAM에 대하여 측정한다(도 4A-4B 및 도 6A-6B). 혈관형성을 각각의 배아에 대하여 각각의 디스크의 영역 내에서 혈관의 가지수 및 정도를 분석하여 이중 맹검 방법으로 스코어링한다. 스코어를 1(저) 내지 4(고)의 범위로 하여 혈관형성 지수를 모든 데이터로부터 바탕 1을 감하여 측정한다.
CAM 모델에서 성장 인자-유도 혈관형성의 인테그린 항체-중재 억제의 특이성은 상기 기술한 래빗의 각막 모델에서 나타낸 것을 반영한다. 각각 도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, bFGF 및 VEGF는 대조 PBS-처리 CAM에서 혈관형성을 야기시킨다. 그러나, αvβ5-특이 항체, P1F6을 처리하는 경우 도 3D에 나타낸 바와 같이 VEGF-유도 혈관형성을 억제하는 반면, 도 3C에 나타낸 바와 같이 bFGF-유도 혈관형성에서는 억제가 검출되지 않는다. 대조적으로, LM609 αvβ3-특이 항체는 bFGF-유도 혈관형성을 억제하지만(도 3E), VEGF-유도 CAM에서는 혈관형성에 약간의 효과를 갖는다(도 3F).
이들 결과는 또한 혈관형성 지수가 대조로서 항체 노출 부재하와 함께 LM609 또는 P1F6로의 노출에 대하여 플로팅된 bFGF- 및 VEGF-처리 CAM에 대하여 각각 도 4A 및 도 4B의 막대 그래프에 나타내었다. 따라서, 인테그린-특이 항체에 의한 성장-인자 유도 혈관형성의 억제는 성장 인자의 유형에 의존적이다.
RGD-함유 펩타이드에 대한 노출은 상기 결과를 지지한다. 도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이 PBS의 존재하에서, bFGF 및 VEGF에 대한 노출은 대조 CAM에서 혈관형성을 초래한다. 대조적으로, αvβ3및 αvβ5에 대한 사이클릭 펩타이드 길항제 RGDfV(서열 4)은 bFGF 또는 VEGF에 의해 유도된 혈관형성을 파괴한다. 사이클릭 펩타이드 PADfV(서열 5)는 bFGF- 또는 VEGF-처리 CAM 제제에서 혈관형성에 효과적이지 않다. 이러한 결과는 또한 bFGF- 및 VEGF-자극 CAM의 혈관형성 지수가 시험 및 대조 펩타이드에 대한 노출을 나타내는 그래프화된 도 6A 및 6B에 나타내었다. 따라서, 래빗 각막에서의 결과와 함께 이들 발견은 bFGF- 및 VEGF-유도 혈관형성이 사이클릭 펩타이드 PGDfV로 억제할 수 있는 독특하나 균질한 αv-특이 인테그린에 의존적이라는 것을 나타낸다.
추가의 유사한 분석을 실시예 3에서 기술한 바와 같이 제조한 합성 펩타이드를 사용하여 수행하여 αvβ5이나αvβ3가 아닌 관련 혈관형성에 대하여 특이성을 나타내는 펩타이드를 한정한다. 분석은 또한 실시예 10에서 기술한 바와 같이 제조된 유기 분자를 사용하여 수행한다.
성장 인자-유도 혈관형성의 인테그린 항체-억제의 특이성을 추가로 종양 회사 인자-α(TNF-α), 변형 성장 인자-α(TGF-α) 또는 포르볼 에스테르, 4-β-포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)를 포함시키기 위해 성장 인자 혈관형성 유도 분석기를 연장시켜 확인하고 강화시킨다.
bFGF 및 VEGF를 포함하는 상기 성장 인자(사이토킨)을 상기 기술한 10일된 CAM 모델에 1.0μg/ml의 농도에서 각각 적용한다. PMA를 20ng/ml의 농도에서 사용한다.
성장 인자 처리 24시간 후 항체, LM609 및 P1F6 또는 단백질 키나제 C(PKC) 억제제, 칼포스틴 C를 상기 기술한 단독 혈관내 투여량 또는 다음 실시예에서 기술되는 국소 투여에 의해 CAM에 각각 제공한다. 이후 연속 3일 동안에 걸쳐 혈관내 주사에 있어서 항체를 배아당 75μg의 농도로 사용하고 칼포스틴 C를 100nM의 투여량으로 사용한다.
13일째에, 필터 디스크 및 연합된 CAM 조직을 절개하고 입체 현미경으로 혈관형성에 대해 분석한다. 혈관형성을 디스크의 영역 내에서 혈관의 분지수 및 정도를 분석하여 이중 맹검 방법으로 스코어링한다. 스코어는 저(1) 내지 고(4)의 범위 내이다. 혈관형성 지수는 모든 데이터로부터 바탕 1을 감하여 측정한다. 실험을 조건당 5-6 배아를 사용하여 2 내지 4회 반복한다.
도 7A 및 7B에 각각 나타낸 바와 같이, 항-αvβ3항체, LM609는 bFGF 및 TNF-α 에 대한 반응시 혈관형성을 차단하는 반면, 항-αvβ5항체, P1F6은 약간의 억제 효과를 갖는다. 대조적으로, 도 7C 내지 7E에 나타낸 바와 같이, P1F6은 VEGF, TGF-α 또는 PMA에 의해 유도된 혈관형성을 억제하는데 효과적이나, LM609는 그러하지 못하다.
PMA, 혈관형성의 강력한 유도제는 세린 트레오닌 키나제의 세포내 계열인 단백질 키나제 C(PKC)를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 또한 병아리 CAM 상에서 혈관형성에 대한 칼포스틴 C, PKC 억제제의 효과를 시험하였다. 칼포스틴 C는 PMA(도 7E) 뿐만 아니라 VEGF 및 TGF-α(각각 도 7C 및 7D에 나타냄)에 의해 유도된 혈관형성을 차단하는 반면, bFGF- 또는 TNF-α 중재 혈관형성(각각 도 7A 및 7B에 나타냄)에 대한 최소의 효과를 갖는다.
또한, 이들 결과는 2개의 각각의 독특한 혈관형성 경로의 존재를 나타내는데, 하나는 문헌[참조:Brooka et al., Science, 264:569-571 (1994)]에 이미 기술한 바와 같이 PKC 에 크게 독립적인 αvβ3-중재 시그날에 의존적이고 제2 경로는 PKC 활성화에 결정적으로 의존적인 αvβ5-중재 전환 시그날에 의해 영향 받는다.
상기 실험 이외에, LM609로 정맥내 접종된 CAM 조직에서 P1F6 및 LM609 mAb의 국소하를 측정하기 위해 고정 부분을 1시간 동안 실온에서 HBSS 중의 2.5% BSA로 차단시키고 염소 항-마우스 로드아민 표지 제2 항체(Tago)의 1:250 희석액으로 염색시킨다. 부분을 Zeiss 면역 형광 화합물 현미경을 사용하여 분석한다.
B. 억제제의 국소 적용에 의한 성장 인자-유도 혈관형성의 억제
αVβ5가 혈관형성에서 실질적인 역할을 하는지를 결정하기위해, 상기 기술된 성장 인자들을 흡착시킨 필터 디스크들을 CAM상에 놓고 PIF6 또는 LM609중 어느 하나를 적용하여 혈관형성을 유발시킨다.
그 후, 디스크에 전체 부피 25㎕의 멸균된 HBSS중 mAb 25㎎을 함유하는 HBSS 50㎖을 0, 24, 및 48시간동안 처리한다. 72시간 후, CAM을 회수하여 35㎜ 페트리 디쉬안에 놓고 PBS 1㎖로 한 번 세척한다. 필터 바닥면과 CAM 조직을 올림푸스 입체 현미경하에서 2명의 관찰자가 이중 맹검법으로 분석한다. 혈관형성 억제는 디스크 바로 아래에서 CAM의 ＞50%의 혈관 침투 감소를 보일 때 의미있는 것으로 간주된다. 실험은 조건당 6 내지 7개의 배 (embryo)를 사용해서 항체당 4번 반복한다.
혈관이 존재하지 않은 지역에 인접한 정상적인 혈관 발생으로 부터 나온 기존의 성숙한 혈관에 대한 인테그린 항체의 효과를 시험하기 위해, mAb를 흡착시킨 필터 디스크들을 사이토킨의 국부적 적용을 받지 않는 10일된 배의 혈관형성 지역에 놓는다.
또한 본 발명의 합성 펩티드를 사용하여 CAM 분석을 수행하여 성장 인자에 의해 유도된 혈관형성에 대한 환형 및 선형 펩티드의 효과를 측정한다. 전술된 것과 같이 제조된, 펩티드 8㎍을 전체 부피25㎕의 멸균된 HBSS에 각각 넣는다. 펩티드 용액을 CAM 제제에 즉시 적용하고 24 시간 및 48시간동안 처리한다. 72시간 후, 필터 및 주변 CAM 조직을 절단하여 상기와 같이 관찰한다.
유사한 분석들을 실시예 10에서 기술된 것과 같이 제조된 유기 분자들을 사용해 실시한다.
C. 국부 적용에 의한 종양 유발성 혈관형성의 억제
1) 모노클로날 항체의 처리
항-αVβ5 항체 및 펩티드 길항제의 효과를 측정하는 상기 혈관형성 분석에 추가로, 또한 종양 유발성 혈관형성에 있어 αVβ5의 역할을 조사한다. 유도체로서, 17일된 병아리 배의 CAM으로 부터 미리 키워 분리시킨 αVβ5-음성 사람 조직을 사용한다. 그런 단편들은 실시예 5C에서 기술된 것과 같이 제조된다.
상기 기술된 것과 같이, mAb를 HBSS 25㎕중 25㎍ 농도로 종양 단편에 각각 국부적으로 적용하고 그 윈도우을 테이프로 밀봉한다. mAb를 24시간 및 48시간에 다시 부가한다. 72시간 후, 종양 및 주변 CAM 조직을 상기와 같이 분석한다. 실시예 5C에서 기술한 것과 같이, 최초 종양은 인테그린 αvβ5를 발현하지 않는 사람 세포주를 10일된 병아리 배의 CAM에 이식함으로써 유도된다.
종양 유발성 혈관형성에 대한 mAb의 효과를 정량하기 위해, CAM의 초점면내의 종양으로 향한 혈관을 입체 현미경하에서 2명의 관찰자가 이중 맹검법으로 합산한다.
실시예 3에서 제조된 합성 펩티드 및 실시예 10에서 제조된 유기 분자들을 상기 기술된 것과 같은 종양 유발성 혈관형성 CAM 분석에 마찬가지로 국부적으로 적용한다. 혈관의 생존능에 대한 펩티드 및 유기 분자의 효과를 마찬가지로 측정한다.
D. 정맥내 주사를 통한 종양 유발성 혈관형성의 억제
1) 모노클로날 항체의 처리
상기 제조된 종양 유발성 혈관에 정맥내 주사를 통해 또한 mAb를 처리한다. CS-1 흑색종을 실시예 5C에서 기술된 것과 같이 CAM상에 놓고 윈도우을 테이프로 봉한 뒤 24시간 후, 정제된 mAb 100 내지 300㎍을 상기 기술된 것과 같이 병아리 배 혈관에 한 번 정맥내 주사한다. 이후 병아리 배를 7일간 배양한다. 혈관형성의 정도를 상기 기술된 것과 같이 관찰한다. 이시기 이후, 종양을 절제하여 중량을 측정하여 종양 성장 또는 억제에 대한 항체 처리의 효과를 측정한다.
CS-1 종양에 대한 αvβ5 특이적인 항체 P1F6 300㎍의 처리 결과는 표 8에 나타낸다. 종양 중량은 미처리 종양 이나 CSAT-처리된 종양에 비해 50㎎ 미만까지 극적으로 감소한다. αvβ3 특이적인 항체, LM609 또한 종양 성장을 억제하나, P1F6보다 덜 효과적이다. 비교 결과는 P1F6 100㎍을 처리한 종양을 사용하여 수득한다. 따라서, P1F6는 종양 세포 덩어리의 감소를 초래하는 CAM 제조에 있어 종양 모델에서 αvβ5 매개 혈관형성을 억제하는데 효과적이다.
2) 합성 펩티드 또는 유기 분자의 처리
CAM 분석 시스템에서 종양 유발성 혈관에 대한 펩티드 또는 유기 분자의 효과를 또한 분석한다. 종양-CAM 제조물은 mAb를 정맥내 주사하는 대신, 실시예 3 및 실시예 10에서 각각 기술된 것과 같이 제조된 합성 펩티드 및 유기 분자를 가시 (visible) 혈관에 정맥내 주사하는 것을 제외하고는 상기와 같이 사용된다.
7. 리간드-수용체 결합 분석에 의해 검출되는 αvβ5-특이적인 길항제의 동정
실시예 1 및 3에서 각각 제조된 αvβ5-면역 반응 항체 및 합성 펩티드를 정제된 리간드-수용체 결합 분석에서 αvβ5, αvβ3, 및 αIIbβ3 수용체의 결합 활성을 저해하는 능력을 측정하여 스크리닝한다. 이런 결합 연구를 수행하는 방법은 문헌[Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 10003-10007 (1993), Smith et al., J. Biol. cHEM., 265:11008-11013 (1990) and Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238]에 기술되어 있으며, 그 내용은 본원에서 참조로 인용된다.
리간드-수용체 결합 분석에서 길항제를 동정하는 한 방법에서 수용체는 고형 지지체에 고정시키고 리간드 및 길항제는 가용성이다. 또 다른 한 리간드-수용체 결합 분석에서는 리간드를 고형 지지체에 고정시키고 수용체 및 길항제는 가용성이다.
간단히, 선택된 정제된 인테그린을 각각 타이터텍 (Titertek) 미세적정 웰에 웰당 50 나노그램 (ng)의 코팅 농도로 고정시킨다. 리간드-수용체 결합 분석에 사용되는 수용체의 정제는 본 기술 분야에서 널리 공지되어 있고 본 기술 분야의 통상적인 숙련자에게 친숙한 방법들을 통해 쉽게 수득할 수 있다. 4℃에서 18시간 배양한 후, 플레이트상의 비특이적인 결합 위치는 트리스 완충 식염수중 소 혈청 알부민 (BSA) 10㎎/㎖로 차단한다. 억제 연구에 있어서, 다양한 농도의 선택된 항체 또는 펩티드를 사용해 인테그린 수용체 αvβ5, αvβ3, αvβ1 및 αIIbβ3에 125I-비트로텍틴 또는 다른 표지시킨 리간드가 결합하는 것을 차단하는 능력을 시험한다.
이런 리간드는 αvβ5 및 αvβ3에 대하여 비트로넥틴, 및 αIIbβ3에 대하여 피브리노겐과 같이 특정 인테그린에 대해 최상의 결합을 나타내지만, 어느 하나의 수용체에 대한 비트로넥틴의 결합을 차단하기 위해 항체 또는 펩티드를 사용하는 결합 억제 연구는 수용체의 리간드와의 결합을 최대의 반으로 억제하는데 필요한 펩티드의 정확한 양을 uM 단위로 결정하는 것을 가능하게 한다. 방사성 표지된 리간드를 1nM의 농도로 사용하고 결합은 각각 비표지된 합성 펩티드와 함께 시도된다. 3시간의 배양후, 유리 리간드르 세척하여 제거하고 결합된 리간드를 감마 카운팅으로 검출한다.
이와 같이, 본 원에서 기술되는 리간드-수용체 분석을 사용하여 본 발명을 실시하는데 있어 비트로넥틴 수용체 (αvβ5) 길항제로 사용되는 것과 같이, 특정 인테그린 수용체, 특히 αvβ5에 대해 선택적인 특이성을 보이는 모노클로날 항체 및 유기 분자와 함께 환형 또는 선형 합성 펩티드를 스크리닝한다.
8. 키메릭 마우스:사람 분석에 의해 측정된 바와 같이 αvβ5 길항제를 사용한 종양 조직 성장의 생체 퇴화
생체 퇴화 키메릭 마우스:사람 모델을 SCID 마우스의 피부 일부분을 사람 신생아 포피로 대체하여 제조한다. 생체 키메릭 마우스:사람 모델을 필수적으로 문헌[참조: Yan, et al., J. Clin. Invest., 91:986-996(1993)]에 기술된 바와 같이 제조한다. 간략하게, 피부의 2cm2 평방 면적을 SCID 마우스(6 내지 8주)로부터 수술 제거하고 사람 포피로 데체한다. 마우스를 마취시키고 외측 복부 각 측면상의 5cm2 면적의 털을 깎아 제거한다. 2개의 2cm2 원형 이식편 베드를 근막 아래의 피부를 완전히 제거하여 제조한다. 사람 신생아 포피로부터 유래된 동일크기의 완전한 사람 피부 이식편을 좌상 베드상에 놓고 그위치에서 봉합한다. 이식편을 피부로 봉합된 밴드에이드(Band Aid)로 덮는다. 미세공 의류 테이프를 또한 좌상을 보호하는데 사용한다.
피부 이식편이 완료된 후에 사람 포피를 흑색종 세포로 접종한다. M21L 사람 흑색종 세포주를 사용하여 SCID 마우스의 사람 피부 이식편상에 고형 사람 종양을 형성시킨다. 2 x 106 M21L의 단일세포 현탁액을 사람 피부 이식편 피내로 주사한다. 측정할만한 사람 종양이 성장하는 2 내지 4주동안 마우스를 관찰한다.
측정할만한 종양이 완료된 후에 서열 9(환형 RGD-함유 펩티드 Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-메틸화된 Val)를 갖는 펩티드 또는 대조구 펩티드, 사이클로 Arg-βAla-Asp-D-Phe-Val중 하나의 250㎍을 3주에 걸쳐 주당 3회 마우스의 복강내로 주사한다. 이시간의 말기에 종양을 절개하고 중량 및 조직학에 대해 분석한다.
결과는 종양 용적(mm3)이 X축상의 펩티드 처리에 대한 Y축상에 기입한다. 펩티드 189로서 도면에 표시된 서열 9의 테스트 펩티드가 종양 용적이 300mm3을 초과하는 대조구 펩티드(펩티드 601로서 표시)와 비교하여 종양 용적이 약 25mm3으로 감소된다.
따라서, αvβ5 길항제 펩티드 189의 정맥내 투여에 의한 αvβ5 수용체의 차단은 이전에 기술된 CAM 및 래빗 안구 모델 시스템과 동일한 방식으로 상기 모델 시스템에서 흑색종 종양을 퇴화시킨다.
상기 SCID/사람 키메릭 모델을 또한 본 발명의 다른 αvβ5 길항제 즉 항체 및 유기 분자의 효과를 평가하는데 사용하고 유기분자의 제조는 실시예 10에 기술되어 있다.
9. αvβ5 매개 망막 혈관형성 및 αvβ5 길항제를 사용한 이의 억제에 대한 뮤린 마우스 모델의 제조
망막 신생혈관 조직내 αvβ3 및 αvβ5 발현에 대한 실시예 2C에서의 관찰을 근거로하여 신규 마우스 모델을 사용하여 망막 혈관형성에 2개의 인테그린의 전신적으로 투여된 환형 펩티드 길항제의 효과를 연구한다. 신생 마우스는 피상적인 망막 맥관 구조가 시각 신경 상부에서 발원하고 또 다른 포유동물 및 사람에서 관찰된 것과 유사한 방식으로 망막 표면을 덮을 정도로 원형으로 사출하는 풍부하고 고도로 분기된 망상 혈관을 형성하는 시점인 생후 첫 2주동안 망막 혈관을 형성한다[참조: Jiang et al., Glia, 15:1-10(1995)].
상기 모델을 위해 신생 마우스에 환형 펩티드 RGDfV(서열 4)(또한 펩티드 203으로서 언급됨) 또는 대조구 펩티드 RADfV(서열 5)를 0일 부터 개시한 4일동안 하루 2회 정맥내내 주사한다. 생후 5일째에 글로브를 제거하고 실온에서 4.0% 하라포름알데히드(PFA)에 고정시킨다.
마우스 망막 혈관형성을 정량하기 위해 24시간경에 시각 신경 상부에서 6개의 동일한 부분에서 선택된 단일 혈관의 가장 원거리까지의 거리를 측정한다. 평균 거리를 계산하고 전체 동산아로부터 수득한 유사한 정보와 함께 평균화한다. 망막 혈관의 전체 용적을 측정하기 위해 전체 표본을 2.0㎛ 시각 부위에 스캐닝하고 디지탈로 저장한다. 바이오-래드 레이져샤프 소프트웨어의 시드(seed) 기능을 사용하여 각부위내 정육면체 픽셀을 역치화하고 계수한다. 모든 부위의 용적을 합계하고 모든 혈관 구조에 대한 값을 결정하기 위해 마크로(macro)를 기록한다.
2차원적인 혈관 성장을 사진으로부터 직접 측정하여 전신적으로 투여된 펩티드 길항제 203은 대조구 펩티드와 비교하여 44%(N=9, p<.0000001, 쌍 t-테스트)의 망막 맥관형성을 억제한다. 처리되지 않은 신생 마우스 및 펩티드 203을 투여받은 5일된 마우스간에 어떠한 통계학적 차이가 나타나지 않고 따라서 펩티드가 효과적으로 맥관형성을 억제한다. 추가로 처리되지 않은 5일된 마우스와 대조구 펩티드를 투여받은 동일한 나이의 마우스간에 어떠한 통계학적 차이가 나타나지 않는다. 따라서 처리되지 않은 대상물과 비교하는 경우 RGDfV-처리된 신생 마우스내 망막 맥관형성의 억제는 효과적으로 100%이다.
3차원적인 혈관 성장을 통한 보다 많은 정량적 분석을 사용하여 대조구와 비교하여 펩티드 203-처리된 동물내 망막 혈관 용적의 78%가 감소하는 것으로 나타난다. 생후 5일된 203-처리된 동물의 혈관 평균 용적은 3.6 x 106 ㎛3이고 대조구 처리된 동물에서는 15.7 x 106 ㎛3이다. 처리되지 않은 신생 마우스내 망막 혈관이 차지하는 용적은 5일된 203 처리된 동물과 구분할 수 없다.
상기 수득한 결과는 길항제가 특이적으로 완전히 형성된 혈관상에 어떠한 효과를 나타내지 않으면서 신생 혈관형성을 차단한다는 것을 보여준다. 상기 결과는 망막 신생 혈관 질환이 망막하부 신생 혈관 질환에서 보여지는 것으부터 구별되고 αvβ5의 길항제가 혈관형성과 연관된 블라인딩(blinding) 안구 질환을 앓는 환자를 치료하는데 효과적이라는 것을 지적한다.
실시예 10에서 기술한 바와 같이 제조된 유기 유사체 αvβ5 길항제를 사용하여 유사하게 수행된다.
10. 유기분자 αvβ5 길항제의 제조
유기 αvβ5 길항제 화합물 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 및 18의 합성은 하기에 기술되어 있고 또한 도면에 나타낸다. 본 발명의 유기 유사체로서 언급되는 수득한 유기분자는 따라서 αvβ5 매개 혈관형성을 억제하기 위한 방법에서 사용된다.
하기에 기술된 각각의 합성을 위해 시각적 전환이 퍼킨-엘머 241 분광광도계 UV상에서 측정되고 가시 스펙트럼이 베크만 DU-70 분광기상에 기록된다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 400 및 500 MHz에서 브루커 AMX-400 및 AMX-500 분광계상에 기록된다. 고해상 질량 스펙트럼(HRMS)은 고속 원자 충격(FAB) 조건하에서 VG ZAB-ZSE 질량 분광계상에 기록된다. 70 내지 230 메쉬의 실리카 겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피를 수행한다. 예비 TLC를 머크 아트 5744(0.5mm)상에서 수행한다. 융점은 토마스 후버 장치상에서 구한다.
A. 화합물 1: 도 10에 예시된 t-Boc-L-티로신 벤질 에스테르
0.10M(M) 메틸렌 클로라이드 중의 N-(3급-부톡시카보닐)-L-티로신(t-Boc-L-티로신)(1.0당량; Aldrich)의 용액에 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(1.5당량)을 25℃에서 가하고 1시간 동안 교반한다. 벤질 알콜 1.5당량을 가하고 혼합물을12시간 동안 25℃에서 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.01M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제한다. 화합물 1, t-Boc-L-티로신 벤질 에스테르는 Sigma로부터 구입할 수 있다.
B. 화합물 2: 도10의 단계 i에 예시된 (S)-3-(4-(4-브로모부틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산 벤질 에스테르
t-Boc-L-티로신 벤질 에스테르(2g, 5.38mmol, 상기 기술한 바와 같이 합성), 1,4-디브로모부탄(1.9ml, 16.2mmol, Aldrich), 탄산칼륨(5g) 및 18-크라운-6(0.1g, Aldich)의 혼합물을 12시간 동안 80℃에서 가열한다. 냉각시킨후 침전물을 여과하고 반응 혼합물을 진공하에 증발 건조시킨다. 조 생성물을 100% 헥산을 사용하여 결정화에 의해 정제하여 화합물 2를 2.5g(92%) 수득한다.
C. 화합물 3: 도10의 단계 ii에 예시된 (S)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-N-3급-부톡시카보닐-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 2(2.5g, 4.9mmol)을 디메틸포름아미드(DMF)(20ml) 중의 나트륨 아지드(1.6g, 25mmol)와 25℃에서 12시간 동안 교반한다. 용매를 증발시키고 잔사를 물(약 10ml)로 처리하고 에틸 아세테이트로 추출한다. 유기 층을 합하고 황산마그네슘으로 건조시키고 증발시켜 무색 시럽으로서 화합물 3을 2.0g(90%) 수득한다.
FAB-MS: 469(M+H+)
D. 화합물 4: 도10의 단계 iii에 예시된 (S)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-아미노-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 3(2.0g, 4.4mmol)을 트리플루오로아세트산(TFA, 2ml)에 용해시키고 3시간 동안 실온에서 교반한다. 진공하에 증발시켜 무색 시럽으로서 화합물 4를 1.6g(정량) 수득하고, 이를 다음 단계에서 추가의 정제 없이 사용한다.
FAB-MS: 369(M+H+)
E. 화합물 5: 도 10의 단계 iv에 예시된 (S)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 4(1.6g, 4.3mmol), 부탄 설폰산 클로라이드(0.84ml, 6.6mmol) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 교반한다. 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 증발 건조시키고 조 생성물을 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)에 의해 정제하여 무정형 고체로서 화합물 5를 1.4g(67%) 수득한다.
F. 화합물 6: 도10의 단계 v에 예시된 (S)-3-(4-(4-아미노부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
화합물 5(1.3g, 2.6mmol)을 에틸 아세테이트/메탄올/물 5/3/1 20ml 및 트리플루오로아세트산(TFA) 0.2ml에 용해시키고 수소(1atm, Parr Shaker 기기)하에 25℃에서 100mg의 팔라듐(목탄상의 10%)의 존재하에 수소화시킨다. 3시간 후 촉매를 여과하고 용매를 증발시켜 오일 잔사로서 화합물 6을 수득한다. 물로부터 동결건조시켜 화합물 6을 백색 분말로서 1.0g(정량) 수득한다.
FAB-MS: 373(M+H+)
G. 화합물 7: 도10의 단계 vi에 예시된 (S)-3-(4-(4-구아니디노부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
디메틸포름아미드(DMF, 5ml) 중의 화합물 6(200mg, 0.5mmol), 3,5-디메틸피라졸-1-카복스아미딘 니트레이트(DPFN)(170mg, 0.8mmol, Aldrich Chemical Company) 및 트리에틸아민(0.15ml, 1.0mmol)을 12시간 동안 60℃에서 가열한다. 냉각시키고 용매를 진공하에 증발시키고 잔사를 HPLC(Lichrocart RP-18, 구배 아세토니트릴/물 + 0.3% TFA 99:1 내지 1:99)에 의해 정제하고 동결 건조후 백색 무정형 분말로서 화합물 7을 50mg(25%) 수득한다.
FAB-MS: 415(M+H+)
융점: 70℃
H. 화합물 8: 도10의 단계 iii에 예시된 (S)-3-(4-(4-아미노부틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산
화합물 3(0.5g, 1.07mmol)을 에틸 아세테이트/메탄올/물 5/3/1 10ml 및 트리플루오로아세트산(TFA) 0.1ml에 용해시키고 수소(1atm, Parr Shaker 기기)하에 25℃에서 30mg의 팔라듐(목탄상의 10%)의 존재하에 수소화시킨다. 3시간 후 촉매를 여과하고 용매를 증발시켜 오일 잔사로서 화합물 8을 수득한다. 물로부터 동결건조시켜 화합물 8을 백색 분말로서 370mg(정량) 수득한다.
FAB-MS: 353(M+H+)
I. 화합물 9: 도11의 단계 iv에 예시된 (S)-3-(4-(4-구아니디노부틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산
디메틸포름아미드(DMF, 5ml) 중의 화합물 8(200mg, 0.5mmol), 3,5-디메틸피라졸-1-카복스아미딘 니트레이트(DPFN)(170mg, 0.8mmol, Aldrich Chemical Company) 및 트리에틸아민(0.15ml, 1.0mmol)을 12시간 동안 60℃에서 가열한다. 냉각시키고 용매를 진공하에 증발시키고 잔사를 HPLC(Lichrocart RP-18, 구배 아세토니트릴/물 + 0.3% TFA 99:1 내지 1:99)에 의해 정제하고 동결 건조후 백색 무정형 분말로서 화합물 9을 160mg(90%) 수득한다.
FAB-MS: 395(M+H+)
J. 화합물 10: 도12의 단계 i-vi에 예시된 (R)-3-(4-(4-구아니디노부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
화합물 7을 합성하는 반응 순서와 동일하게 하여 D-티로신 동족체 10을 백색 무정형 물질로서 205mg(FAB-MS: 415(M+H+)) 수득한 다음 중간체 화합물 100 내지 600을 사용하여 화합물 10을 수득한다.
1) 화합물 100: 도12에 예시된 t-Boc-D-티로신 벤질 에스테르
0.10M 메틸렌 클로라이드 중의 N-(3급-부톡시카보닐)-D-티로신(t-Boc-L-티로신)(1.0당량; Aldrich)의 용액에 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(1.5당량)을 25℃에서 가하고 1시간 동안 교반한다. 벤질 알콜 1.5당량을 가하고 혼합물을12시간 동안 25℃에서 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 정제한다.
2) 화합물 200: 도12의 단계 i에 예시된 (R)-3-(4-(4-브로모부틸옥시)페닐-2-N-3급-부틸옥시카보닐-프로피온산 벤질 에스테르
t-Boc-D-티로신 벤질 에스테르(2g, 5.38mmol, 상기 기술한 바와 같이 합성), 1,4-디브로모부탄(1.9ml, 16.2mmol, Aldrich), 탄산칼륨(5g) 및 18-크라운-6(0.1g, Aldich)의 혼합물을 12시간 동안 80℃에서 가열한다. 냉각시킨후 침전물을 여과하고 반응 혼합물을 진공하에 증발 건조시킨다. 조 생성물을 100% 헥산을 사용하여 결정화에 의해 정제하여 화합물 200를 2.5g(92%) 수득한다.
3) 화합물 300: 도12의 단계 ii에 예시된 (R)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-N-3급-부톡시카보닐-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 200(2.5g, 4.9mmol)을 디메틸포름아미드(DMF)(20ml) 중의 나트륨 아지드(1.6g, 25mmol)와 25℃에서 12시간 동안 교반한다. 용매를 증발시키고 잔사를 물(약 10ml)로 처리하고 에틸 아세테이트로 2회 추출한다. 유기 층을 합하고 황산마그네슘으로 건조시키고 증발시켜 무색 시럽으로서 화합물 300을 2.0g(90%) 수득한다.
FAB-MS: 469(M+H+)
4) 화합물 400: 도12의 단계 iii에 예시된 (R)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-아미노-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 300(2.0g, 4.4mmol)을 트리플루오로아세트산(TFA, 2ml)에 용해시키고 3시간 동안 실온에서 교반한다. 진공하에 증발시켜 무색 시럽으로서 화합물 400를 1.6g(정량) 수득하고, 이를 다음 단계에서 추가의 정제 없이 사용한다.
FAB-MS: 369(M+H+)
5) 화합물 500: 도 12의 단계 iv에 예시된 (R)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 400(1.6g, 4.3mmol), 부탄 설폰산 클로라이드(0.84ml, 6.6mmol) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 교반한다. 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 증발 건조시키고 조 생성물을 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)에 의해 정제하여 무정형 고체로서 화합물 500를 1.4g(67%) 수득한다.
6) 화합물 600: 도12의 단계 v에 예시된 (R)-3-(4-(4-아미노부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
화합물 500(1.3g, 2.6mmol)을 에틸 아세테이트/메탄올/물 5/3/1 20ml 및 트리플루오로아세트산(TFA) 0.2ml에 용해시키고 수소(1atm, Parr Shaker 기기)하에 25℃에서 100mg의 팔라듐(목탄상의 10%)의 존재하에 수소화시킨다. 3시간 후 촉매를 여과하고 용매를 증발시켜 오일 잔사로서 화합물 600을 수득한다. 물로부터 동결건조시켜 화합물 600을 백색 분말로서 1.0g(정량) 수득한다.
FAB-MS: 373(M+H+)
7) 화합물 10: 도12의 단계 vi에 예시된 (R)-3-(4-(4-구아니디노부틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
디메틸포름아미드(DMF, 5ml) 중의 화합물 600(200mg, 0.5mmol), 3,5-디메틸피라졸-1-카복스아미딘 니트레이트(DPFN)(170mg, 0.8mmol, Aldrich Chemical Company) 및 트리에틸아민(0.15ml, 1.0mmol)을 12시간 동안 60℃에서 가열한다. 냉각시키고 용매를 진공하에 증발시키고 잔사를 HPLC(Lichrocart RP-18, 구배 아세토니트릴/물 + 0.3% TFA 99:1 내지 1:99)에 의해 정제하고 동결 건조후 백색 무정형 분말로서 화합물 10을 50mg(25%) 수득한다.
FAB-MS: 415(M+H+)
융점: 70℃
K. 화합물 11: 도13에 예시된 (S)-3-(4-(4-아지도부틸옥시)페닐-2-(10-캄포르설폰아미도)-프로피온산 벤질 에스테르
화합물 4(1.0g, 2.7mmol), 캄포르설폰산 클로라이드(6.6mmol, Aldrich Chemical Company) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 교반한다. 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 증발 건조시키고 조 생성물을 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)에 의해 정제하여 무정형 고체로서 화합물 11를 1.4g(67%) 수득한다.
L. 화합물 12: 도13의 단계 i-ii에 예시된 (S)-3-(4-(4-구아니디노부틸옥시)페닐-2-(10-캄포르설폰아미도)-프로피온산
화합물 12를 다음의 조건에 따라 화합물 11을 수소화시키고 구아닐화시켜 수득한다:
단계 i: 화합물 11(1.3g, 2.6mmol)을 에틸 아세테이트/메탄올/물 5/3/1 20ml 및 트리플루오로아세트산(TFA) 0.2ml에 용해시키고 수소(1atm, Parr Shaker 기기)하에 25℃에서 100mg의 팔라듐(목탄상의 10%)의 존재하에 수소화시킨다. 3시간 후 촉매를 여과하고 용매를 증발시켜 오일 잔사로서 중간체 아민을 수득한다. 물로부터 동결건조시켜 중간체 아민을 백색 분말로서 1.0g(정량) 수득하고, 이를 다음과 같이 수행한다.
단계 ii: 디메틸포름아미드(DMF, 5ml) 중의 상기 형성된 중간체 아민 화합물(200mg, 0.5mmol), 3,5-디메틸피라졸-1-카복스아미딘 니트레이트(DPFN)(170mg, 0.8mmol, Aldrich Chemical Company) 및 트리에틸아민(0.15ml, 1.0mmol)을 12시간 동안 60℃에서 가열한다. 냉각시키고 용매를 진공하에 증발시키고 잔사를 HPLC(Lichrocart RP-18, 구배 아세토니트릴/물 + 0.3% TFA 99:1 내지 1:99)에 의해 정제하고 동결 건조후 백색 무정형 분말로서 화합물 12을 50mg(25%) 수득한다.
FAB-MS: 509.6(M+H+)
M. 화합물 13: 도13에 예시된 (S)-3-(4-(5-브로모펜틸옥시)페닐-2-N-3급-부톡시카보닐옥시-프로피온산 벤질 에스테르
t-Boc-L-티로신 벤질 에스테르(4.5g, 12.1mmol, 상기 기술한 바와 같이 합성된 화합물 1), 1,5-디브로모펜탄(5ml, 36.7mmol, Aldrich), 탄산칼륨(10g) 및 18-크라운-6(0.25g, Aldich)의 혼합물을 12시간 동안 80℃에서 가열한다. 냉각시킨후 침전물을 여과하고 반응 혼합물을 진공하에 증발 건조시킨다. 조 생성물을 100% 헥산을 사용하여 결정화에 의해 정제하여 화합물 13를 5.35g(85%) 수득한다.
N. 화합물 14: 도13의 단계 i-v에 예시된 (S)-3-(4-(5-구아니디노펜틸옥시)페닐-2-부틸설폰아미도-프로피온산
중간체 화합물 1 내지 6을 사용하여 브롬-아지드-교환, Boc-분해, 부탄 설폰산 클로라이드를 사용한 설포닐화, 수소화 및 DPFN을 사용한 구아닐화의 5단계 반응을 상기 방법과 동일하게 수행하여 화합물 7을 수득하거나, 화합물 100 내지 600을 사용하여 상기 기술한 바와 같이 수행하여 화합물 10을 수득한다. 화합물 14을 백색 분말로서 수득한다.
FAB-MS: 429(M+H+)
O. 화합물 15: 도 14에 나타낸 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-아미노-에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논 디하이드로클로라이드
1) 화합물 15에 대한 출발 물질 2-N-BOC-아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 합성
출발 물질 2-N-BOC-아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트를 0.10M 메탄올 및 묽은 1% HCl 중의 (D 또는 L) N-(3급-부톡시카보닐)-L(D)-티로신(t-Boc-L(D)-티로신)(1.0당량, Sigma)의 에스테르화를 통해 수득한다. 반응 혼합물을 12시간 동안 25℃에서 교반하고 탄산칼륨으로 중화시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 2-N-BOC-아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트를 수득한다.
2) 화합물 15에 대한 출발 물질 2-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논의 합성: 3-단계는 다음과 같이 수행
메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 p-아미노-벤조니트릴(1.0당량, Aldrich)을 2,3-에폭시프로판올(1.0당량, Aldrich)과 12시간 동안 25℃에서 교반한다. 용매를 진공하에 제거하고 조 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조니트릴을 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
25℃의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조니트릴(1.0당량, 상기 기술함)을 디에틸 카보네이트(1.1당량, Aldrich) 및 칼륨 3급-부틸레이트(1.1당량, Aldrich)과 110℃에서 6시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘을 수득하고 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
25℃의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘(1.0당량, 상기 기술함)을 황화수소 1.1당량, 메틸 요오다이드 1.1당량 및 암모늄 아세테이트 1.1당량과 교반한다. 반응 혼합물을 6시간 동안 교반하고 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 아미딘을 수득하고 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
상기 기술한 바와 같이 합성한 아미딘 1.0당량을 25℃에서 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 BOC-ON (2-(BOC-옥시이미노)-2-페닐아세토니트릴, Aldrich) 1.1당량으로 보호시키고 6시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 0.10M 메틸렌 클로라이드 및 메탄설포닐 클로라이드 1.1당량으로 에스테르화한다. 반응 혼합물을 0℃에서 6시간 동안 교반하고 물(5당량)으로 급냉시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 수득한다.
3) 중간체 2-N-BOC-아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 사용한 커플링에 의한 화합물 15의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2N-BOC-아미노에틸)페녹실메틸-2-옥사졸리디논의 제조
2-N-BOC-아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트(상기 기술함) 1.9g, 디메틸포름아미드(DMF) 20ml 및 NaH(1.0당량)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한다. 교반한 후 디메틸포름아미드(DMF) 10ml 중의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논(상기 기술함) 1.8g을 가하고 실온에서 15분 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 15의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2N-BOC-아미노에틸)페녹실메틸-2-옥사졸리디논을 수득하고 이를 다음 단계에서 수행한다.
4) 화합물 15의 보호 형태의 탈보호에 의한 화합물 15, 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-아미노-에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논 디하이드로클로라이드의 제조, 도 14
화합물 15의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2N-BOC-아미노에틸)페녹실메틸-2-옥사졸리디논(1.0당량, 상기 기술한 바와 같이 합성)을 2N NaOH 4ml로 4시간 동안 실온에서 처리한다. 혼합물을 디옥산 중의 2N HCl용액 40ml로 0 내지 25℃에서 3시간 동안 적가 처리한다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨(5당량)으로 급냉시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 15, 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-아미노-에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논 디하이드로클로라이드을 수득한다.
융점: 165℃(분해)
P. 화합물 16: 도 14에 나타낸 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-부틸설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논
1) 화합물 16에 대한 출발 물질 2-N-부틸설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 합성
출발 물질 2-N-부틸설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트를 0.10M 메탄올 및 묽은 1% HCl 중의 ((D 또는 L) 티로신)(1.0당량, Sigma)의 에스테르화를 통해 수득한다. 반응 혼합물을 12시간 동안 25℃에서 교반하고 탄산칼륨으로 중화시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 다음과 같이 수행한다.
상기 화합물(4.3mmol), 부탄 설폰산 클로라이드(6.6mmol) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 12시간 동안 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 증발시키고, 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨, 물로 세척한다. 증발 건조시키고 조 생성물을 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)로 정제하여 표제 화합물을 수득한다.
2) 화합물 16에 대한 출발 물질 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논의 합성: 3-단계는 다음과 같이 수행
메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 p-아미노-벤조니트릴(1.0당량, Aldrich)을 2,3-에폭시프로판올(1.0당량, Aldrich)과 12시간 동안 25℃에서 교반한다. 용매를 진공하에 제거하고 조 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조니트릴을 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
25℃의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조니트릴(1.0당량, 상기 기술함)을 디에틸 카보네이트(1.1당량, Aldrich) 및 칼륨 3급-부틸레이트(1.1당량, Aldrich)과 110℃에서 6시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘을 수득하고 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
25℃의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘(1.0당량, 상기 기술함)을 황화수소 1.1당량, 메틸 요오다이드 1.1당량 및 암모늄 아세테이트 1.1당량과 교반한다. 반응 혼합물을 6시간 동안 교반하고 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 아미딘을 수득하고 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
상기 기술한 바와 같이 합성한 아미딘 1.0당량을 25℃에서 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 BOC-ON (2-(BOC-옥시이미노)-2-페닐아세토니트릴, Aldrich) 1.1당량으로 보호시키고 6시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 0.10M 메틸렌 클로라이드 및 메탄설포닐 클로라이드 1.1당량으로 에스테르화한다. 반응 혼합물을 0℃에서 6시간 동안 교반하고 물(5당량)으로 급냉시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 수득한다.
3) 중간체 2-N-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 사용한 커플링에 의한 화합물 16의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-부틸설포닐아미노에틸)페녹실메틸-2-옥사졸리디논의 제조
2-N-부틸설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트(상기 기술함) 1.9g, 디메틸포름아미드(DMF) 20ml 및 NaH(1.0당량)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한다. 교반한 후 디메틸포름아미드(DMF) 10ml 중의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논(상기 기술함) 1.8g을 가하고 실온에서 15분 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 16의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-부틸설포닐아미노에틸)-페녹실메틸-2-옥사졸리디논을 수득하고 이를 다음 단계에서 수행한다.
4) 화합물 16의 보호 형태의 탈보호에 의한 화합물 16, 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-부틸설포닐아미노-에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논의 제조, 도 14
화합물 16의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-부틸설포닐아미노에틸)페녹실메틸-2-옥사졸리디논(1.0당량, 상기 기술한 바와 같이 합성)을 2N NaOH 4ml로 4시간 동안 실온에서 처리한다. 혼합물을 디옥산 중의 2N HCl용액 40ml로 0 내지 25℃에서 3시간 동안 적가 처리한다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨(5당량)으로 급냉시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 16, 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-부틸설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논을 수득한다.
융점: 236 내지 237℃(분해)
Q. 화합물 17: 도 14에 나타낸 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-프로필-설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논
1) 화합물 17에 대한 출발 물질 2-N-프로필-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 합성
출발 물질 2-N-프로필-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트를 0.10M 메탄올 및 묽은 1% HCl 중의 ((D 또는 L) 티로신)(1.0당량, Sigma)의 에스테르화를 통해 수득한다. 반응 혼합물을 12시간 동안 25℃에서 교반하고 탄산칼륨으로 중화시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 다음과 같이 수행한다:
상기 화합물(4.3mmol), 프로필 설폰산 클로라이드(6.6mmol, Aldrich) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 12시간 동안 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 증발 건조시키고 조 생성물을 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)로 정제하여 표제 화합물을 수득한다.
2) 화합물 17에 대한 출발 물질 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논의 합성: 3-단계는 다음과 같이 수행
메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 p-아미노-벤조니트릴(1.0당량, Aldrich)을 2,3-에폭시프로판올(1.0당량, Aldrich)과 12시간 동안 25℃에서 교반한다. 용매를 진공하에 제거하고 조 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조니트릴을 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
25℃의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조니트릴(1.0당량, 상기 기술함)을 디에틸 카보네이트(1.1당량, Aldrich) 및 칼륨 3급-부틸레이트(1.1당량, Aldrich)과 110℃에서 6시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘을 수득하고 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
25℃의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘(1.0당량, 상기 기술함)을 황화수소 1.1당량, 메틸 요오다이드 1.1당량 및 암모늄 아세테이트 1.1당량과 교반한다. 반응 혼합물을 6시간 동안 교반하고 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 아미딘을 수득하고 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
상기 기술한 바와 같이 합성한 아미딘 1.0당량을 25℃에서 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 BOC-ON (2-(BOC-옥시이미노)-2-페닐아세토니트릴, Aldrich) 1.1당량으로 보호시키고 6시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 0.10M 메틸렌 클로라이드 및 메탄설포닐 클로라이드 1.1당량으로 에스테르화한다. 반응 혼합물을 0℃에서 6시간 동안 교반하고 물(5당량)으로 급냉시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 수득한다.
3) 중간체 2-N-프로필-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 사용한 커플링에 의한 화합물 17의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-프로필-설포닐아미노에틸)-페녹실메틸-2-옥사졸리디논의 제조
2-N-프로필-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트(상기 기술함) 1.9g, 디메틸포름아미드(DMF) 20ml 및 NaH(1.0당량)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한다. 교반한 후 디메틸포름아미드(DMF) 10ml 중의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논(상기 기술함) 1.8g을 가하고 실온에서 15분 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 17의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-프로필-설포닐아미노에틸)-페녹실메틸-2-옥사졸리디논을 수득하고 이를 다음 단계에서 수행한다.
4) 화합물 17의 보호 형태의 탈보호에 의한 화합물 17, 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-프로필설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논의 제조, 도 14
화합물 17의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-프로필설포닐아미노에틸)페녹실메틸-2-옥사졸리디논(1.0당량, 상기 기술한 바와 같이 합성)을 2N NaOH 4ml로 4시간 동안 실온에서 처리한다. 혼합물을 디옥산 중의 2N HCl용액 40ml로 0 내지 25℃에서 3시간 동안 적가 처리한다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨(5당량)으로 급냉시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 17, 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-프로필설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논을 수득한다.
융점: 200℃(분해)
R. 화합물 18: 도 14에 나타낸 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-에틸-설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논
1) 화합물 18에 대한 출발 물질 2-N-에틸-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 합성
출발 물질 2-N-에틸-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트를 0.10M 메탄올 및 묽은 1% HCl 중의 ((D 또는 L) 티로신)(1.0당량, Sigma)의 에스테르화를 통해 수득한다. 반응 혼합물을 12시간 동안 25℃에서 교반하고 탄산칼륨으로 중화시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 다음과 같이 수행한다:
상기 화합물(4.3mmol), 에틸 설폰산 클로라이드(6.6mmol, Aldrich) 및 트리에틸 아민(1.5당량)의 혼합물을 메틸렌 클로라이드(20ml)에서 12시간 동안 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 증발시키고 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 묽은 HCl, 수성 중탄산나트륨 및 물로 세척한다. 증발 건조시키고 조 생성물을 섬광 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔/에틸 아세테이트 15:1)로 정제하여 표제 화합물을 수득한다.
2) 화합물 18에 대한 출발 물질 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논의 합성: 3-단계는 다음과 같이 수행
메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 p-아미노-벤조니트릴(1.0당량, Aldrich)을 2,3-에폭시프로판올(1.0당량, Aldrich)과 12시간 동안 25℃에서 교반한다. 용매를 진공하에 제거하고 조 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조니트릴을 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
25℃의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 4-(2,3-디하이드록시프로필아미노)벤조니트릴(1.0당량, 상기 기술함)을 디에틸 카보네이트(1.1당량, Aldrich) 및 칼륨 3급-부틸레이트(1.1당량, Aldrich)과 110℃에서 6시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘을 수득하고 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
25℃의 디메틸포름아미드(0.10M) 중의 3-(4-시아노페닐)-5-하이드록시메틸-2-옥사졸리딘(1.0당량, 상기 기술함)을 황화수소 1.1당량, 메틸 요오다이드 1.1당량 및 암모늄 아세테이트 1.1당량과 교반한다. 반응 혼합물을 6시간 동안 교반하고 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 아미딘을 수득하고 다음과 같이 다음 단계에서 수행한다:
상기 기술한 바와 같이 합성한 아미딘 1.0당량을 25℃에서 메틸렌 클로라이드(0.10M) 중의 BOC-ON (2-(BOC-옥시이미노)-2-페닐아세토니트릴, Aldrich) 1.1당량으로 보호시키고 6시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)으로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 0.10M 메틸렌 클로라이드 및 메탄설포닐 클로라이드 1.1당량으로 에스테르화한다. 반응 혼합물을 0℃에서 6시간 동안 교반하고 물(5당량)으로 급냉시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 수득한다.
3) 중간체 2-N-에틸-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논을 사용한 커플링에 의한 화합물 18의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-에틸-설포닐아미노에틸)-페녹실메틸-2-옥사졸리디논의 제조
2-N-에틸-설포닐아미노-3-(4-하이드록시-페닐)프로피오네이트(상기 기술함) 1.9g, 디메틸포름아미드(DMF) 20ml 및 NaH(1.0당량)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한다. 교반한 후 디메틸포름아미드(DMF) 10ml 중의 3-p-N-BOC-아미디노-페닐-5-메탄설포닐옥시-메틸-2-옥사졸리디논(상기 기술함) 1.8g을 가하고 실온에서 15분 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 18의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-에틸-설포닐아미노에틸)-페녹실메틸-2-옥사졸리디논을 수득하고 이를 다음 단계에서 수행한다.
4) 화합물 18의 보호 형태의 탈보호에 의한 화합물 18, 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-에틸설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논의 제조, 도 14
화합물 18의 보호 형태, 3-(4-BOC-아미디노페닐)-5-(4-(2-메톡시-카보닐-2-N-에틸설포닐아미노에틸)페녹실메틸-2-옥사졸리디논(1.0당량, 상기 기술한 바와 같이 합성)을 2N NaOH 4ml로 4시간 동안 실온에서 처리한다. 혼합물을 디옥산 중의 2N HCl용액 40ml로 0 내지 25℃에서 3시간 동안 적가 처리한다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨(5당량)으로 급냉시키고 에틸 아세테이트(0.10M)로 희석하고 물로 2회, 염수로 1회 세척하고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 18, 3-(4-아미디노페닐)-5-(4-(2-카복시-2-N-에틸설포닐아미노에틸)페녹시)메틸-2-옥사졸리디논드을 수득한다.
융점: 212℃(분해)
본 명세서는 당해 분야의 숙련가가 본 발명을 실시하기에 충분한 것으로 여겨진다. 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 각종 변형이 첨부된 청구의 범위 내에서 상기 기술로부터 당해 분야의 숙련가에게는 자명한 일일 것이다.
서열 목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인: 스크립스 리서치 인스티튜트
(ii) 발명의 명칭 : 알파 V 베타5-매개 혈관형성 억제에 유용한 방법 및 조성물
(iii) 서열의 수: 9
(iv) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 타입: 플로피 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 운용 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트 웨어: 패이턴트인 릴리스 #1.0, 버젼 #1.25
(v) 본 출원 데이터:
(A) 출원 번호: PCT/US96/
(B) 출원일: 1996년 8월 13일
(C) 분류:
(vi) 선행 출원 데이터:
(A) 출원 번호: US 08/514,799
(B) 출원일: 1995년 8월 14일
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 1
(C) 기타 정보: /라벨=BOC
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /라벨= D-Phe
/주지= D-Phe에서 "접두사 D"는 4번 위치의 페닐알라닌이 D형-아미노산임을 나타낸다.
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 5
(D) 기타 정보: /라벨=OMe
(xi) 서열 기술:
Arg Gly Asp Phe Val
1 5
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 1
(C) 기타 정보: /라벨=BOC
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /라벨= D-Phe
/주지= D-Phe에서 "접두사 D"는 4번 위치의 페닐알라닌이 D형-아미노산임을 나타낸다.
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 5
(D) 기타 정보: /라벨=OH
(xi) 서열 기술:
Arg Gly Asp Phe Val
1 5
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 1
(C) 기타 정보: /라벨=H
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /라벨= D-Phe
/주지= D-Phe에서 "접두사 D"는 4번 위치의 페닐알라닌이 D형-아미노산임을 나타낸다.
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 5
(D) 기타 정보: /라벨=OH
(xi) 서열 기술:
Arg Gly Asp Phe Val
1 5
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D) 위상: 사이클릭
(ii) 분자 형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 1
(C) 기타 정보: /라벨=사이클로
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /라벨= D-Phe
/주지= D-Phe에서 "접두사 D"는 4번 위치의 페닐알라닌이 D형-아미노산임을 나타낸다.
(xi) 서열 기술:
Arg Gly Asp Phe Val
1 5
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D) 위상: 사이클릭
(ii) 분자 형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 1
(C) 기타 정보: /라벨=사이클로
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /라벨= D-Phe
/주지= D-Phe에서 "접두사 D"는 4번 위치의 페닐알라닌이 D형-아미노산임을 나타낸다.
(xi) 서열 기술:
Arg Ala Asp Phe Val
1 5
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 6 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D) 위상: 사이클릭
(ii) 분자 형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 1
(C) 기타 정보: /라벨=사이클로
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 2
(D) 기타 정보: /라벨= D-Arg
/주지= D-Arg에서 "접두사 D"는 2번 위치의 아르기닌이 D형-아미노산임을 나타낸다.
(xi) 서열 기술:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
1 5
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D) 위상: 사이클릭
(ii) 분자 형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 1
(C) 기타 정보: /라벨=사이클로
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 5
(D) 기타 정보: /라벨= D-Val
/주지= D-Val에서 "접두사 D"는 5번 위치의 발린이 D형-아미노산임을 나타낸다.
(xi) 서열 기술:
Arg Gly Asp Phe Val
1 5
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열 기술:
Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe
1 5 10 15
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 6 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /라벨= D-Phe
/주지= D-Phe에서 "접두사 D"는 4번 위치의 페닐알라닌이 D형-아미노산임을 나타낸다.
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 위치: 6
(D) 기타 정보: /라벨=MeVal
/주지= MeVal에서 "접두사 Me"는 6번 위치의 발린이 메틸화된 발린임을 나타낸다.
(xi) 서열 기술:
Arg Gly Asp Phe Asn Val
1 5

Claims (30)

  1. 혈관형성 억제량의 αvβ5길항제를 포함하는 조성물을 조직에 투여함을 포함하는, αvβ5-함유 조직내 혈관형성을 억제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, αvβ5길항제가 αvβ5에 대해 면역 특이적이지만 αvβ1, αvβ3또는 αIIbβ3에 대해서는 면역 특이적이지 않은 모노클로날 항체인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 모노클로날 항체가 P1F6으로 명명된 모노클로날 항체의 면역반응 특징을 갖는 방법.
  4. 제1항에 있어서, αvβ5길항제가 RGD-함유 폴리펩티드인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 폴리펩티드가 사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(서열 4), 사이클로(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(서열 6), 사이클로(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)(서열 7),
    Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe(서열 8) 및 사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-MeVal)(서열 9) 및 이의 염으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 염이 하이드로클로라이드인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 조직이 염증 발생된 상태이고 혈관형성이 염증이 발생한 조직의 혈관형성인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 조직이 관절염 조직인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 관절염 조직이 류마티스 관절염을 앓는 포유동물에 존재하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 혈관형성이 당뇨 망막증, 연령과 관계된 황반 퇴화, 추정된 안구 히스토플라스마증, 미성숙 망막증 및 신생 혈관 녹내장으로 이루어진 안구 질환의 그룹중에서 선택되는 안구 질환을 앓는 환자에 존재하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 혈관형성이 각막 이식, 포진성 각막염, 매독성 각막염, 콘택트렌즈 사용과 연관된 익상편 및 신생 혈관 판누스로 이루어진 질환의 그룹에서 선택된 각막 신생 혈관 질환을 앓는 환자에 존재하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 조직이 혈관종인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 조직이 충실성 종양이거나 충실성 전이 종양이고 혈관형성이 종양 혈관형성인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 혈관형성이 사이토킨에 의해 유도된 방법.
  15. 제14항에 있어서, 사이토킨이 혈관 내피 성장 인자, 변형 성장 인자-α 및 표피 성장 인자로 이루어진 그룹중에서 선택된 방법.
  16. 제15항에 있어서, 사이토킨이 혈관 내피 성장 인자이고 혈관형성이 망막 혈관형성, 각막 혈관형성, 종양 혈관형성 및 염증 조직 혈관형성으로 이루어진 그룹중에서 선택된 방법.
  17. 제1항에 있어서, 혈관형성 억제량이 약 2uM 내지 5mM인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 안구내, 정맥내, 경피, 비강내, 근육내 또는 경구적으로 투여되는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 화학치료법과 연관되어 투여되는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 정맥내로 1회 투여하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, αvβ5길항제가 유기성 유사체인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 유기성 유사체가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    화학식 7
  23. 제21항에 있어서, 유기성 유사체가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    화학식 9
  24. 제21항에 있어서, 유기성 유사체가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    화학식 10
  25. 제21항에 있어서, 유기성 유사체가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    화학식 12
  26. 제21항에 있어서, 유기성 유사체가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    화학식 14
  27. 제21항에 있어서, 유기성 유사체가 하기 화학식의 화합물인 방법.
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