DE69635417T2 - VERFAHREN UND MITTEL ZUR HEMMUNG DER DURCH ALPHA v BETA 5 VERMITTELTEN ANGIOGENESE - Google Patents

VERFAHREN UND MITTEL ZUR HEMMUNG DER DURCH ALPHA v BETA 5 VERMITTELTEN ANGIOGENESE Download PDF

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Description

  • Fachgebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Fachgebiet der Medizin und insbesondere Verfahren und Zusammensetzungen zum Hemmen einer αvβ5-vermittelten Angiogenese von Geweben unter Verwendung von Antagonisten des Vitronectin-Rezeptors αvβ5.
  • Stand der Technik
  • Integrine sind eine Klasse von zellulären Rezeptoren, von denen bekannt ist, dass sie extrazelluläre Matrixproteine binden und deshalb Wechselwirkungen zwischen den Zellen sowie zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix vermitteln, die allgemein als Zellahäsionsereignisse bezeichnet werden. Obwohl jedoch zahlreiche integrine und ihre entsprechenden Liganden in der Literatur beschrieben sind, ist die biologische Funktion vieler Integrinmoleküle noch unklar. Die Integrin-Rezeptoren stellen eine Familie von Proteinen mit gemeinsamen Strukturmerkmalen von nicht-kovalenten heterodimeren Glykoprotein-Komplexen dar, die aus α- und β-Untereinheiten bestehen.
  • Der Vitronectin-Rezeptor ist nach seiner ursprünglichen Eigenschaft, bevorzugt an Vitronectin zu binden, benannt, inzwischen weiß man, dass er sich auf drei verschiedene Integrine bezieht, die mit αvβ1, αvβ3 und αvβ5 bezeichnet sind. Horton, Int. J. Exp. Pathol. 71: 741–759, 1990. αvβ1 bindet Fibronectin und Vitronectin. αvβ3 bindet eine große Vielzahl von Liganden, umfassend Fibrin, Fibrinogen, Laminin, Thrombospondin, Vitronectin, von-Willebrand-Faktor, Osteospontin und Knochen-Sialoprotein I. αvβ5 bindet Vitronectin. Die spezifischen Rollen in der Zelladhäsion, die diese drei Integrine in zahlreichen zellulären Wechselwirkungen in Geweben spielen, werden noch untersucht. Es ist jedoch klar, dass es verschiedene Integrine mit unterschiedlichen biologischen Funktionen gibt und dass es außerdem verschiedene Integrine und Untereinheiten gibt, die gemeinsame biologische Spezifitäten aufweisen.
  • Eine wichtige Erkennungsstelle in einem Liganden für zahlreiche Integrine ist die Tripeptidsequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD). RGD liegt in allen Liganden vor, die vorstehend für die Vitronectin-Rezeptor-Integrine identifiziert wurden. Diese RGD-Erkennungsstelle kann durch Polypeptide („Peptide") nachgeahmt werden, welche die RGD-Sequenz enthalten, und solche RGD-Peptide sind bekannte Inhibitoren der Integrin-Funktion. Jedoch ist es wichtig zu beachten, dass, abhängig von der Sequenz und Struktur des RGD-Peptids, die Spezifität der Hemmung verändert sein kann, so dass spezifische Integrine das Ziel der Hemmung sind.
  • Diskussionen der RGD-Erkennungsstelle finden sich in: Pierschbacher et al., Nature 309: 30–33, 1984; und Pierschbacher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5985–5988, 1984. Verschiedene RGD-Polypeptide mit variierenden Integrin-Spezifitäten wurden auch von Grant et al., Cell 58: 933–943, 1989; Cheresh et al., Cell 58: 945–953, 1989; Aumailley et al., FEBS Letts. 291: 50–54, 1991; und Pfaff et al., J. Biol. Chem. 269: 20233–20238, 1994; und in den US Patenten Nr. 4 517 686, 4 578 079, 4 589 881, 4 614 517, 4 661 111, 4 792 525, 4 683 291, 4 879 237, 4 988 621, 5 041 380 und 5 061 693 beschrieben.
  • EP-A-0578083 offenbart die Verwendung von cyclischen RGD-enthaltenden Polypeptiden zum Hemmen der Adhäsion.
  • Die Angiogenese, die auch als Neovaskularisation bezeichnet wird, ist ein Gewebe-Vaskularisationsprozess, bei dem sich neu entwickelnde Blutgefäße in ein Gewebe hinein wachsen. Der Prozess wird durch die Infiltration von Endothelzellen und glatten Muskelzellen vermittelt. Man nimmt an, dass der Prozess in einer von drei möglichen Arten abläuft: 1) Die Gefäße können aus bereits existierenden Gefäßen aussprossen; 2) die Gefäße können sich aus Vorläuferzellen de novo entwickeln (Gefäßbildung); oder 3) existierende kleine Gefäße können sich im Durchmesser vergrößern. Blood et al., Biochem. Biophys. Acta 1032: 89–118, 1990. Es ist bekannt, dass Gefäßendothelzellen mindestens fünf RGD-abhängige Integrine enthalten, umfassend den Vitronectin-Rezeptor (αvβ3 oder αvβ5), den Collagen-Typ-I- und -IV-Rezeptor (α1β1), den Laminin-Rezeptor (α2β1), den Fibronectin/Laminin/Collagen-Rezeptor (α3β1) und den Fibronectin-Rezeptor (α5β1). Davis et al., J. Cell. Biochem. 51: 206–218, 1993. Es ist bekannt, dass die glatte Muskelzelle mindestens sechs RGD-abhängige Integrine enthält, umfassend α5β1, αvβ3 und αvβ5.
  • Die Angiogenese ist ein wichtiger Prozess beim Neugeborenenwachstum, sie ist jedoch auch bei der Wundheilung und in der Pathogenese einer großen Vielzahl von klinisch bedeutenden Krankheiten wichtig, umfassend Gewebeentzündung, Arthritis, Psoriasis, Krebs, diabetische Retinopathie, Makuladegeneration und andere neovaskuläre Augenkrankheiten. Diese klinischen Zustände, die mit einer Angiogenese assoziiert sind, werden als angiogene Krankheiten bezeichnet. Folkman et al., Science 235: 442–447, 1987. Die Angiogenese kommt in erwachsenen oder reifen Geweben im Allgemeinen nicht vor, wobei sie jedoch bei der Wundheilung und im Corpus-Iuteum-Wachstumszyklus auftritt. Vgl. z.B. Moses et al., Science 248: 1408–1410, 1990.
  • Durch Hemmen der Zelladhäsion in vitro unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern, die für verschiedene Integrin-α- oder β-Untereinheiten spezifisch sind, wurde der Vitronectin-Rezeptor αvβ3 mit der Zelladhäsion der verschiedensten Zelltypen, umfassend Mikrogefäßendothelzellen, in Verbindung gebracht. Davis et al., J. Cell Biol. 51: 206–218, 1993. Außerdem beschrieben Nicosia et al., Am. J. Pathol. 138: 829–833, 1991, die Verwendung des RGD-Peptids GRGDS zum Hemmen der in vitro-Bildung von „Mikrogefäßen" aus einer in Collagen-Gel gezüchteten Rattenaorta.
  • Jedoch ist die Hemmung der Bildung von „Mikrogefäßen" in vitro in Collagen-Gel-Kulturen kein Modell für die Hemmung der Angiogenese in einem Gewebe, da nicht gezeigt wurde, dass Mikrogefäße die gleichen Strukturen aufweisen wie Kapillarsprossen oder dass die Bildung des Mikrogefäßes in der Collagen-Gel-Kultur genauso abläuft wie das neovaskuläre Wachstum in ein intaktes Gewebe hinein, z.B. arthritisches Gewebe, Tumorgewebe oder erkranktes Gewebe, in welchem es wünschenswert ist, die Angiogenese zu hemmen.
  • WO 95/14714 und WO 95/25543 beschreiben die Verwendung von RGD-enthaltenden Polypeptiden zum Hemmen einer αvβ3-vermittelten Angiogenese.
  • Die Rolle von αvβ3 in der Angiogenese wurde kürzlich bestätigt. Vgl. Brooks et al., Science 264: 569–571, 1994. Es wurde gezeigt, dass das Integrin auf Blutgefäßen in Wund-Granulationsgewebe des Menschen exprimiert wird, nicht jedoch in der normalen Haut. Monoclonale Antikörper gegen den αvβ3-Rezeptor hemmten die Angiogenese, die durch die Wachstumsfaktoren (Cytokine), den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und den Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), sowie durch Melanomfragmente induziert wurde. Jedoch hemmten die Antagonisten nur neue und nicht bereits existierende Gefäße. Außerdem wurde gezeigt, dass spezifische lineare und cyclische RGD-enthaltende Peptide die Neovaskularisation hemmten.
  • Es wurde vorgeschlagen, dass das Hemmen der Angiogenese eine geeignete Therapie darstellen könnte, um das Tumorwachstum einzuschränken. Es wurde vorgeschlagen, dass die Angiogenese gehemmt werden kann, indem (1) die Freisetzung von „angiogenen Molekülen", z.B. bFGF (basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor), gehemmt wird, (2) angiogene Moleküle neutralisiert werden, z.B. durch Verwendung von Anti-bFGF-Antikörpern, und (3) die Endothelzellen-Antwort auf angiogene Stimuli gehemmt wird. Diese letztere Strategie ist auf Interesse gestoßen, und Folkman et al., Cancer Biology 3: 89–96, 1992, haben mehrere Inhibitoren der Endothelzellen-Antwort beschrieben, umfassend Collagenase-Inhibitor, Inhibitoren des Basalmembran-Turnovers, angiostatische Steroide, von Pilzen stammende Inhibitoren der Angiogenese, Thrombozytenfaktor-4, Thrombospondin, Arthritis-Arzneistoffe, z.B. D-Penicillamin und Goldthiomalat, Vitamin-D3-Analoga, Alpha-Interferon und dergleichen, die möglicherweise zum Hemmen der Angiogenese verwendet werden können. Weitere vorge schlagene Inhibitoren der Angiogenese finden sich in Blood et al., Biochem. Biophys. Acta 1032: 89–118, 1990; Moses et al., Science 248: 1408–1410, 1990; Ingber et al., Lab. Invest. 59: 44–51, 1988; und die US Patente Nr. 5 092 885, 5 112 946, 5 192 744 und 5 202 352.
  • Jedoch wurde die Rolle des Integrins αvβ5 in der Angiogenese weder vermutet noch bewiesen, bevor die vorliegende Erfindung gemacht wurde, außerdem wurde keiner der in den vorstehenden Referenzen beschriebenen Inhibitoren der Angiogenese mit der Hemmung von αvβ5 in Zusammenhang gebracht. Weiterhin haben keine Referenzen, außer der vorliegenden Erfindung, das αvβ5-Integrin mit der Neovaskularisation in Verbindung gebracht, insbesondere mit derjenigen, die durch die Wachstumsfaktoren, Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), transformierender Wachstumsfaktor-α (TGF-α) und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), induziert wird.
  • Obwohl die Zahl der Wachstumsfaktoren, die an der Kontrolle der Angiogenese beteiligt sind, begrenzt ist, gibt es verschiedene Ebenen für die Kontrolle des Prozesses, der einen ruhenden Zustand in einen neovaskulären Zustand überführt. Vgl. D'Amore, Investigative Ophthal. Visual Sci. 35: 3974–3979, 1994. Während einige an der Angiogenese beteiligte Wachstumsfaktoren auf der Syntheseebene reguliert werden, werden andere durch den Aktivierungszustand reguliert. Diese zellulären Ereignisse finden statt, wenn in einem ruhenden Gefäß nach einer Verletzung oder Ischämie eine Neovaskularisation abläuft.
  • Insbesondere VEGF wird bei einem primären Tumor und bei ischämischen Augenkrankheiten für einen Hauptmediator der Angiogenese gehalten. Eine Übersicht findet sich in: Folkman, Nature Medicine 1: 27–31, 1995. VEGF ist ein 46 Kilodalton (kDa) Homodimer, das einen Endothelzellen-spezifischen angiogenen (Ferrara et al., Endocrin. Rev. 13: 18–32, 1992) und gefäßpermeablen Faktor darstellt (Senger et al., Cancer Res. 46: 5629–5632, 1986), der an membrangebundene Hochaffinitäts-Rezeptoren mit Tyrosinkinase-Aktivität bindet (Jakeman et al., J. Clin. Invest. 89: 244–253, 1992).
  • Kürzlich wurde gezeigt, dass die Aktivierung von Rezeptor-Tyrosinkinasen die Integrin-abhängige Migration von Zellen auf extrazellulären Matrixproteinen fördert. Insbesondere Klemke et al., J. Cell Biol. 127: 859–866, 1994, haben die EGF-Rezeptor-(EGFR-)Tyrosinkinase mit der Förderung der Zellmobilität in Zusammenhang gebracht, nicht jedoch mit der Adhäsion von menschlichen FG-Pankreaskarzinomzellen an Vitronectin anhand des Integrins αvβ5. Die Autoren präsentieren direkte Beweise, dass das Besetzen von EGFR durch den EGF-Liganden die Tyrosinkinase-Aktivität des EGFR aktiviert, wodurch schließlich ein von der Proteinkinase C (PKC) abhängiger Stoffwechselweg stimuliert wird, der zur Induktion der αvβ5-abhängigen Migration der Zellen auf einem Vitronectrin-Substrat führt, auf dem die Zellen normalerweise nicht wandern kön nen. Somit geben die Ergebnisse von Klemke et al. Hinweise darauf, dass das Vorliegen von Cytokinen, insbesondere EGF, mit der Integrin-Aktivität bei der Zellmigration in Zusammenhang steht. Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung von PKC im Modellsystem der Hühner-Chorioallantoismembran an der Regulation der Angiogenese beteiligt ist. Vgl. Tsopanoglou et al., J. Vasc. Res. 30: 202–208, 1993. Die Autoren identifizierten spezifische Aktivatoren und Inhibitoren von PKC, welche die Angiogenese in dem Modellsystem stimulierten bzw. hemmten.
  • Jedoch beschreiben weder Klemke et al. noch Tsopanoglou et al., vorstehend angegeben, die Rolle von Cytokinen und der Expression und/oder Aktivierung des Integrins αvβ5 bei der Förderung der Angiogenese bei verschiedenen Leiden und Krankheitszuständen sowie die Hemmung davon mit αvβ5-spezifischen Antagonisten.
  • Kürzlich haben experimentelle Ergebnisse in einem Modellsystem für Augenkrankheiten bei Affen gezeigt, dass eine durch den Verschluss der Netzhautvene induzierte Netzhautischämie zu einem raschen Anstieg von VEGF in den Augenkammern führte. Dieser Anstieg trat gleichzeitig mit der Neovaskularisation der Iris auf, die wie von Miller et al., Am. J. Path. 145: 574–584, 1994, beschrieben festgestellt wurde. Weitere Ergebnisse in einem Maus-Modellsystem der proliferativen Retinopathie, in dem eine Hypoxie induziert wird, zeigten, dass die VEGF-messenger-RNA innerhalb von 6 bis 12 Stunden einer relativen Hypoxie ansteigt und so lange erhöht bleibt, bis sich die Neovaskularisation entwickelt. Sobald die neuen Blutgefäße zurückgingen, nahm auch die VEGF-Expression ab, wie von Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 905–909, 1995, beschrieben.
  • Somit haben die kürzlichen Ergebnisse, wie in Tiermodellen der Ischämie gezeigt, die Induktion von VEGF mit der einer Ischämie, auf die eine Neovaskularsation folgt, in Zusammenhang gebracht. VEGF und andere Wachstumsfaktoren wurden auch mit anderen Leiden und Krankheitszuständen in Verbindung gebracht, bei denen eine Neovaskularisation eine Rolle spielt, wie in dem Übersichtsartikel von Folkman, Nature Medicine 1: 27–31, 1995, gezeigt wird.
  • In dem Referenzartikel von Folkman et al. sind auch die derzeitigen klinischen Ansätze zusammengestellt, die verwendet werden, um eine unerwünschte Angiogenese einzuschränken. Patienten haben in klinischen Studien therapeutische Behandlungen mit angiogenen Inhibitor erhaltenen, umfassend Thrombozytenfaktor-4, ein Fumagillin-Derivat, Carboxyaminotriazol und dergleichen. Jedoch bringen keine Referenzen oder derzeitige therapeutische Referenzen die Expression von αvβ5 mit einer Angiogenese in Zusammenhang, insbesondere mit derjenigen, die durch VEGF induziert wird. Somit hat bisher, bevor die vorliegenden Erfindung erfunden wurde, kein Autor ein therapeutisches Schema mit αvβ5-Antagonisten weder beschrieben noch verwendet, um die An giogenese in einem Gewebe zu kontrollieren, in dem eine Angiogenese stattfindet, die mit dem Vorliegen und der Aktivierung von αvβ5 in Zusammenhang steht.
  • Deshalb kennen die Anmelder, abgesehen von den hier beschriebenen Studien über αvβ3 und den Zusammenhang mit Wachstumsfaktoren und Angiogenese, keine weiteren Hinweise darauf, dass die Angiogenese in einem Gewebe unter Verwendung von Inhibitoren der αvβ5-vermittelten Zelladhäsion gehemmt werden könnte. Insbesondere wurde vorher noch nicht gezeigt, dass die Funktion von αvβ5 für die Angiogenese in einem Gewebe erforderlich ist oder dass αvβ5-Antagonisten die Angiogenese in einem Gewebe, insbesondere bei neovaskulären Augenkrankheiten, hemmen können.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung zeigt, dass zusätzlich zu einem αvβ3-abhängigen Angiogenese-Stoffwechselweg in Geweben noch ein getrennter αvβ5-abhängiger Stoffwechselweg vorliegt. So beschreibt die Erfindung Inhibitoren von αvβ5, welche die Angiogenese hemmen können. Weiterhin beschreibt die Erfindung, dass die αvβ5-vermittelte Aktivität zum Fördern der Angiogenese mit der Wachstumsfaktor-(Cytokin-)Aktivierung von Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosinkinasen und Proteinkinase C (PKC) in Zusammenhang steht. Die Wachstumsfaktoren (Cytokine), die auf diese Wiese arbeiten, umfassen den Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), den transformierenden Wachstumsfaktor-α (TGF-α), den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und dergleichen.
  • Die Erfindung ist in Anspruch 1 definiert.
  • Ein αvβ5-Antagonist zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren ist in der Lage, an αvβ5 zu binden und die Fähigkeit von αvβ5, an den natürlichen Vitronectin-Liganden zu binden, kompetitiv zu hemmen. Vorzugsweise zeigt der Antagonist eine stärkere Spezifität für αvβ5 als für andere Integrine. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hemmt der αvβ5-Antagonist die Bindung von Vitronectin oder anderen RGD-enthaltenden Liganden an αvβ5, er hemmt jedoch im Wesentlichen nicht die Bindung von Vitronectin an αvβ3 oder αIIbβ3. Der αvβ5-Antagonist ist ein RGD-enthaltendes Polypeptid.
  • Die Verabreichung der αvβ5-Antagonisten der vorliegenden Erfindung umfasst die intraokulare Verabreichung.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • In den Zeichnungen, die einen Teil der vorliegenden Beschreibung darstellen, wird Folgendes beschrieben:
  • Die 1A bis 1D erläutern die Hemmung einer Cytokin-induzierten Angiogenese der Augenhornhaut des Kaninchens durch αv-Integrin-Antikörper-Antagonisten. Die Induktion der Angiogenese durch Behandlung entweder mit bFGF oder mit VEGF und die Effekte einer Behandlung davon mit einem αv-Integrin-Antikörper-Antagonisten, P1F6 (αvβ5) und LM609 (αvβ3), werden in Beispiel 4 beschrieben. OD und OS sind das rechte bzw. das linke Auge eines Versuchskaninchens. Die großen Pfeile zeigen auf eine Angiogenese der Hornhaut mit Ödem, während die kleinen Pfeile auf normale Gefäße des Bindehautrings deuten. Die 1A und 1B zeigen die Induktion der Angiogenese mit bFGF, während die 1C und 1D die Induktion mit VEGF zeigen. In den 1A und 1C ist die Behandlung mit P1F6 dargestellt, während in den 1B und 1D die Behandlung mit LM609 zu sehen ist.
  • Die 2A und 2B sind Histogramme, die den durchschnittlichen Bereich mit Neovaskularisation in mm2 ± Standardfehler (n = 8 für jede von zwei Serien) nach der Induktion entweder mit bFGF oder mit VEGF zeigen, gefolgt von einer mAb-Behandlung entweder mit P1F6 oder mit LM609. Die Ergebnisse werden in Beispiel 4 besprochen.
  • Die 3A bis 3F erläutern anhand von Fotos die Effekte einer Anti-Integrin-Antikörperbehandlung an dem Hühner-CAM-Präparat. Die Ergebnisse werden in Beispiel 6A besprochen. Die Angiogenese wird entweder mit bFGF oder mit VEGF induziert, gefolgt von einer intravenösen Verabreichung von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Kontrolle oder der monoclonalen Antikörper P1F6 oder LM609, wie in der Legende von 1 beschrieben. Die mit bFGF behandelten CAMs sind in den 3A, 3C und 3E dargestellt, während die mit VEGF behandelten CAMs in den 3B, 3D und 3F dargestellt sind. Kontroll-CAMs, die intravenöse Injektionen von PBS erhalten, sind in den 3A und 3B angegeben. Der Antikörper P1F6 wurde verwendet, um die in den 3C und 3D dargestellten CAMs zu behandeln, während der Antikörper LM609 verwendet wurde, um die CAMs der 3E und 3F zu behandeln.
  • Die 4A und 4B zeigen in Histogramm-Format die quantitative Bestimmung der in den 3A bis 3F dargestellten Ergebnisse. Der Angiogenese-Index ist auf der y-Achse gegen die Kontrolle oder die Antikörper-Behandlung aufgetragen. Die 4A und 4B zeigen die bFGF- bzw. die VEGF-induzierte Angiogenese. Die Ergebnisse werden in Beispiel 4 besprochen.
  • Die 5A bis 5F erläutern anhand von Fotos die Effekte der Behandlung mit dem synthetischen Peptid an dem Hühner-CAM-Präparat wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Angiogenese wird entweder mit bFGF oder mit VEGF induziert, worauf eine intravenöse Verabreichung von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Kontrolle oder der synthetischen cyclischen Peptide RGDfV (SEQ ID NO: 4) oder RADfV (SEQ ID NO: 5) folgt. Die mit bFGF behandelten CAMs sind in den 5A, 5C und 5E dargestellt, während die mit VEGF behandelten CAMs in den 5B, 5D und 5F angegeben sind. Die Kontroll-CAMs, die intravenöse Injektionen von PBS erhalten haben, sind in den 5A und 5B dargestellt. Das Peptid RGDfV wurde zum Behandeln der CAMs verwendet, die in den 5C und 5D angegeben sind, während das Peptid RADfV verwendet wurde, um die CAMs in den 5E und 5F zu behandeln.
  • Die 6A und 6B zeigen in Histogramm-Format die quantitative Bestimmung der in den 5A bis 5F dargestellten Ergebnisse. Der Angiogenese-Index ist auf der y-Achse gegen die Kontrolle oder die Antikörper-Behandlung aufgetragen. Die 6A und 6B zeigen die bFGF- bzw. die VEGF-induzierte Angiogenese. Die Ergebnisse werden in Beispiel 6 besprochen.
  • Die 7A bis 7E zeigen die Effekte der gegen Integrin gerichteten monoclonalen Antikörper und von Calphostin C auf die CAM-Angiogenese, induziert durch die jeweiligen Cytokine, bFGF, TNF-α, VEGF und TGF-α. Außerdem wurde PMA getestet. Die Tests und Ergebnisse werden in Beispiel 6 beschrieben. Die Ergebnisse sind im Histogramm-Format angegeben, wobei der Angiogenese-Index auf der y-Achse und die Kontrolle oder die verschiedenen Inhibitoren auf der x-Achse aufgetragen sind. Die 7A bis 7E zeigen die mit bFGF, TNF-α, VEGF, TGF-α bzw. PMA induzierte Angiogenese.
  • 8 stellt ein Histogramm dar, das die Effekte einer Antikörperbehandlung auf das CS1-Melanom-Tumorwachstum im Hühnerembryo-CAM zeigt, wobei der Test wie in den Beispielen 5C und 6D beschrieben durchgeführt wurde. Das Gewicht der Tumoren in Milligramm (mg) ist auf der y-Achse gegen die verschiedenen, auf der x-Achse angegebenen Behandlungen aufgetragen. CSAT ist ein Kontroll-Antikörper, der für die β1-Untereinheit von Integrin spezifisch ist. LM609 und P1F6 wurden früher beschrieben.
  • 9 stellt ein Histogramm der Effekte der Kontrolle gegenüber einem αvβ5-Peptid-Antagonisten, dem markierten Peptid 189 (SEQ ID NO: 9), auf das Melanom-Tumorwachstum dar, gemessen durch das Tumorvolumen in mm3, das auf der y-Achse aufgetragen ist. Der Test und die Ergebnisse sind in Beispiel 8 beschrieben.
  • 10 erläutert die Synthese der Verbindung 7 wie in Beispiel 10A bis G beschrieben.
  • 11 erläutert die Synthese der Verbindung 9 wie in Beispiel 10A bis C, H bis 1, beschrieben.
  • 12 erläutert die Synthese von Verbindung 10, wie in Beispiel 10J beschrieben.
  • 13 erläutert die Synthese von Verbindung 12 und Verbindung 14 wie in Beispiel 10K bis L bzw. 10M bis N beschrieben.
  • 14 zeigt die chemischen Strukturen der Verbindung 15, Verbindung 16, Verbindung 17 und Verbindung 18. Die ausführlichen Syntheseverfahren dieser Verbindungen sind in Beispiel 10O bis R beschrieben.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • A. Definitionen
  • Aminosäurerest: Eine Aminosäure, die bei der chemischen Spaltung (Hydrolyse) eines Polypeptids an seinen Peptidbindungen freigesetzt wird. Die hier beschriebenen Aminosäurereste liegen vorzugsweise in Form von „L"-Isomeren vor. Jedoch können Reste in Form von „D"-Isomeren für einen beliebigen L-Aminosäurerest substituiert werden, so lange das Polypeptid die gewünschte funktionelle Eigenschaft beibehält. NH2 bezieht sich auf die freie Aminogruppe, die am Aminoterminus eines Polypeptids vorliegt. COOH bezieht sich auf die freie Carboxygruppe, die am Carboxyterminus eines Polypeptids vorliegt. In Übereinstimmung mit der herkömmlichen Polypeptidnomenklatur (beschrieben in J. Biol. Chem. 243: 3552–3559, 1969; und übernommen bei 37 CFR § 1.822 (b) (2)) sind die Abkürzungen für die Aminosäurereste in der folgenden Vergleichstabelle angegeben.
  • Vergleichstabelle
    Figure 00090001
  • Figure 00100001
  • Außerdem haben die folgenden Bezeichnungen die nachstehende Bedeutung:
    BOC tert. Butyloxycarbonyl
    DCCI Dicyclohexylcarbodiimid
    DMF Dimethylformamid
    OMe Methoxy
    HOBt 1-Hydroxybenzotriazol
  • Es sollte beachtet werden, dass alle Aminosäuresequenzen hier durch Formeln dargestellt sind, deren Links-Rechts-Ausrichtung in herkömmlicher Weise vom Aminoende zum Carboxyende dargestellt ist. Außerdem sollte beachtet werden, dass ein Gedankenstrich am Anfang oder am Ende einer Aminosäuresequenz eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz von einem oder mehreren Aminosäureresten angibt.
  • Polypeptid: Eine lineare Reihe von Aminosäureresten, die untereinander durch Peptidbindungen zwischen der Alpha-Aminogruppe und der Carboxygruppe von aufeinander folgenden Aminosäureresten verbunden sind.
  • Peptid: Eine lineare Reihe von nicht mehr als etwa 50 Aminosäureresten, die untereinander wie bei einem Polypeptid verbunden sind.
  • Cyclisches Peptid: Ein ringförmiges Peptid, das von einem entsprechenden linearen Peptid stammt und sich auf ein Peptid bezieht, in dem keine freien N- oder C-Enden vorliegen, wobei der entsprechende N-Terminus des linearen Peptids mit dem C-terminalen Carboxylat des entsprechenden linearen Peptids eine Amidbindung bildet.
  • Protein: Eine lineare Reihe von mehr als 50 Aminosäureresten, die untereinander wie in einem Polypeptid verbunden sind.
  • Synthetisches Peptid: Eine chemisch erzeugte Kette von Aminosäureresten, die untereinander durch Peptidbindungen verbunden sind, die frei ist von natürlich vorkommenden Proteinen und Fragmenten davon.
  • B. Allgemeine Angaben
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Entdeckung, dass die Angiogenese durch den spezifischen Vitronectin-Rezeptor αvβ5 vermittelt wird und dass die Hemmung der αvβ5-Funktion die Angiogenese hemmt.
  • Diese Entdeckung ist wichtig, da die Angiogenese in zahlreichen Krankheitsprozessen eine Rolle spielt. Durch Hemmen der Angiogenese kann man in den Krankheitsverlauf eingreifen, die Symptome bessern und in einigen Fällen die Krankheit heilen.
  • Wenn das Wachstum neuer Blutgefäße die Ursache für den mit einer Krankheit zusammenhängenden pathologischen Befund ist oder dazu beiträgt, wird eine Hemmung der Angiogenese die schädlichen Effekte der Krankheit abschwächen. Beispiele umfassen rheumatoide Arthritis, diabetische Retinopathie, Entzündungskrankheiten, Restenose und dergleichen. Wenn das Wachstum neuer Blutgefäße erforderlich ist, um das Wachstum eines schädlichen Gewebes zu unterstützen, wird eine Hemmung der Angiogenese die Blutversorgung des Gewebes reduzieren und dadurch zur Reduktion der Gewebemasse beitragen, für die eine Blutversorgung erforderlich ist. Beispiele umfassen das Wachstum neuer Blutgefäße als Antwort auf Ischämie, wodurch es zu einer Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese kommt, und das Wachstum von Tumoren, wobei die Neovaskularisation kontinuierlich erforderlich ist, um den Tumor auf eine Größe von mehr als einigen wenigen mm im Durchmesser wachsen zu lassen und solide Tumormetastasen entstehen zu lassen.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind deshalb wirksam, da die Therapie für die Angiogenese sehr selektiv ist und nicht auf andere biologische Prozesse wirkt. Wie in den Beispielen angegeben, ist nur beim Wachstum neuer Gefäße wesentliches αvβ5 enthalten, so dass die therapeutischen Verfahren reife Gefäße nicht negativ beeinflussen.
  • Die Entdeckung, dass die Hemmung von αvβ5 alleine wirksam die Angiogenese hemmt, macht es möglich, neue therapeutische Zusammensetzungen mit einer möglicherweise hohen Spezifität und deshalb einer relativ niedrigen Toxizität zu entwickeln. Obwohl die Erfindung die Verwendung von Peptid-basierenden Reagenzien offenbart, welche die Fähigkeit besitzen, ein oder mehrere Integrine zu hemmen, kann man auch andere Reagenzien entwerfen, die αvβ5 selektiver hemmen. Deshalb haben bestimmte Peptid-basierende Reagenzien nicht die Nebenwirkung, dass sie noch andere biologische Prozesse als diejenigen hemmen, die durch αvβ5 vermittelt werden.
  • Z.B. können RGD-enthaltende Peptide so entworfen werden, dass sie für die Hemmung von αvβ5 selektiv sind, wie hier noch weiter beschrieben wird.
  • Bevor die Entdeckungen der vorliegenden Erfindung gemacht wurden, war nicht bekannt, dass die Angiogenese und ein beliebiger Angiogenese-abhängiger Prozess in vivo durch die Verwendung von Reagenzien gehemmt werden kann, welche die biologische Funktion von αvβ5 antagonisieren.
  • C. Verfahren zum Hemmen der Angiogenese
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Hemmen der Angiogenese in einem Gewebe und dadurch Hemmereignisse in dem Gewebe bereit, das von der Angiogenese abhängig ist. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren das Verabreichen einer Zusammensetzung, die eine Angiogenese-hemmende Menge eines αvβ5-Antagonisten umfasst, an das Gewebe.
  • Das zum Durchführen der Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Zielgewebe ist als αvβ5-enthaltendes Hornhautgewebe definiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der αvβ5-Integrin-Rezeptor nachweisbar vorliegt. Mit anderen Worten ist ein αvβ5-enthaltendes Gewebe durch das Vorliegen des αvβ5-Rezeptorkomplexes in den Zellmembranen definiert. Solche Gewebe umfassen vom Epithel und vom Mesenchym stammende Zellen. Das Vorliegen des Rezeptors kann durch eine Reihe von Verfahren bestimmt werden, umfassend Immunreaktivität des Rezeptors mit einem gegen den αvβ5-Integrin-Rezeptor gerichteten Antikörper, wobei die Immunreaktion in Geweben nachgewiesen wird durch Mikroskopie, durch Immunfällung, durch Kompetition in Ligandenbindungstests und ähnliche Verfahren. Bevorzugte Antikörper, die verwendet werden können, um das Vorliegen von αvβ5 in einem Gewebe nachzuweisen, werden nachstehend und in Beispiel 1 beschrieben. Z.B. wird die Verteilung von αvβ5 in Niere, Haut oder Augengeweben durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie wie in Beispiel 2 beschrieben nachgewiesen.
  • Im Zusammenhang mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein αvβ5-enthaltendes Gewebe außerdem als ein Gewebe gekennzeichnet, das Anzeichen von Angiogenese aufweist. Wie früher beschrieben umfasst die Angiogenese eine Vielzahl von Prozessen, einschließlich Neovaskularisation eines Gewebes, umfassend „Aussprossen", Gefäßbildung oder Vergrößern von Gefäßen, wobei alle diese Angiogeneseprozesse durch die Expression von αvβ5 vermittelt werden und davon abhängig sind. Man nimmt an, dass die meisten Angiogeneseprozesse, mit Ausnahme des Heilens traumatischer Wunden, der Corpus-Iuteum-Bildung und der Embryogenese, mit Krankheitsprozessen assoziiert sind und deshalb die Verwendung der vorliegenden therapeutischen Verfahren für die Krankheit selektiv ist und keine ungünstigen Nebenwirkungen aufweist.
  • Es gibt eine Vielzahl von Krankheiten, bei denen die Angiogenese vermutlich eine wichtige Rolle spielt, diese werden als angiogene Krankheiten bezeichnet, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf entzündliche Störungen, z.B. eine immunologische und nicht-immunologische Entzündung, einen chronischen Gelenkrheumatismus und Psoriasis, Störungen, die mit einer ungeeigneten oder ungünstigen Invasion von Gefäßen assoziiert sind, z.B. Restenose, Kapillarproliferation in atherosklerotischen Plaques und Osteoporose, sowie mit Krebs zusammenhängende Störungen, z.B. solide Tumoren, solide Tumormetastasen, Angiofibrome, retrolentale Fibroplasie, Hämangiome, Kaposi-Sarkom und ähnliche Krebserkrankungen, bei denen eine Neovaskularisation erforderlich ist, um das Tumorwachstum zu unterstützen.
  • Augenkrankheiten, die durch Neovaskularisation gekennzeichnet sind, stellen ein besonders bevorzugtes Ziel für die Therapie dar. Die Neovaskularisation des Auges ist die häufigste pathologische Veränderung, die bei den meisten Augenkrankheiten fest gestellt wird, die zu einem katastrophalen Sehverlust führen. Das Wachstum neuer Blutgefäße aus den bereits existierenden Choroidea-, Retina- oder Paralimbus-Gefäßen kann zu einem Ödem, zur Blutung oder zu einer fibrovaskulären Membranbildung führen, wodurch die normalen anatomischen Zusammenhänge des Auges zerstört werden und es gleichzeitig zu einem Verlust der normalen Sehfunktion kommt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft spezifisch bestimmte neovaskuläre Störungen der Augenhornhaut, nämlich Hornhauttransplantation, Herpes-Keratitis, Lues-Keratitis, Pterygium und neovaskulären Pannus, assoziiert mit dem Tragen von Kontaktlinsen.
  • Somit bessern Verfahren, welche die Angiogenese in einem erkrankten Gewebe hemmen, die Symptome der Krankheit und können, abhängig von der Krankheit, zur Heilung der Krankheit beitragen. Das Ausmaß der Angiogenese in einem Gewebe und somit das Ausmaß der Hemmung, die durch das vorliegende Verfahren erreicht wird, kann durch verschiedene Verfahren bestimmt werden, wie sie in den Beispielen beschrieben werden, mit denen αvβ5-immunpositive naszierende und unreife Gefäßstrukturen durch Immunhistochemie nachgewiesen werden.
  • Insbesondere sind die Verfahren und αvβ5-Antagonist-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung therapeutisch nützlich, um die Angiogenese zu hemmen, die durch Wachstumsfaktoren, die auch als Cytokine bezeichnet werden, induziert wurde. Unter physiologischen Bedingungen ist die Angiogenese stark reguliert, außerdem wurde gezeigt, wie früher von Brooks et al., Science 264: 569–5761, 1994, veröffentlicht, dass sie durch spezifische angiogene Moleküle, z.B. den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), aktiviert wird. Weiterhin wurden negative Regulatoren der Angiogenese beschrieben. Die Angiogenese wird somit durch ein kompliziertes Gleichgewicht zwischen lokalen Stimulatoren und Inhibitoren reguliert. Vgl. D'Amore, Investigative Ophthal. Visual Sci. 35: 3974–3979, 1994.
  • Wenn das physiologische Gleichgewicht von angiogenen Stimulatoren und Inhibitoren, welche die normalerweise ruhenden Kapillargefäßen eng kontrollieren, gestört ist, wie das bei bestimmten Krankheitszuständen der Fall ist, werden Kapillarendothelzellen induziert zu proliferieren, zu wandern und sich schließlich zu differenzieren, so dass sie neue Blutgefäße bilden.
  • Die Angiogenese ist als eine Kaskade von Ereignissen gekennzeichnet, wobei es eine Reihe von frühen Ereignissen gibt, auf die eine Reihe von späten Ereignissen folgt, wie in der Übersichtsarbeit von Leibovich, „Role of Cytokines in the Process of Tumor Angiogenesis", in: „Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapy", Hrsg. Aggarwal und Puri, Kapitel 35, Blackwell Science, Inc., (1995), beschrieben. Bevor die frühen Ereignisse ablaufen, werden die angiogenen Wachstumsfaktoren und Cytokine aus einer extravaskulären Quelle freigesetzt. Danach laufen die frühen Ereignisse in der Mikrogefäßanordnung ab, wobei die interzellulären Verbindungen zerstört werden, die Expression von Endothelzellen-Aktivierungs-Antigenen und ein proteolytischer Phänotyp induziert wird und die Migration von Endothelzellen in einer bestimmten Richtung in Gang gesetzt wird. Die späten Ereignisse sind durch autokrine und parakrine Expression von Wachstumsfaktor- und Cytokin-Genen innerhalb der Zellen, Endothelzellen, Perizyten und glatten Muskelzellen, der sich entwickelnden Kapillarknospe gekennzeichnet. Diese Zellen wiederum modulieren die Wechselwirkungen der Zellen mit der extrazellulären Matrix, dies führt dazu, dass neue funktionelle Kapillarschleifen aus den vorliegenden reifen Gefäßen gebildet werden.
  • Wie hier und im Stand der Technik besprochen, beschreiben Veröffentlichungen in der Literatur einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Wachstumsfaktoren, umfassend diejenigen, die mit einem Anstieg der αvβ5-Expression assoziiert sind, nämlich VEGF, TGF-α und EGF, und der Expansion einer Tumormasse sowie dem Auftreten der Angiogenese bei proliferativen neovaskulären Augenkrankheiten, sowohl bei Menschen als auch bei Versuchstieren.
  • Somit werden VEGF, EGF, TGF-α u.a. als Wachstumsfaktoren angesehen, die durch ihre Eigenschaften, das Zellwachstum zu stimulieren, gekennzeichnet sind. Wachstumsfaktoren sind Proteine, die durch eine bestimmte Zelle ausgeschieden werden und die auf die ausscheidende Zelle oder auf eine andere Zelle wirken. Ihre Fähigkeit zu wirken ist unabhängig vom Vorliegen von Wachstumsfaktor-Rezeptoren, die üblicherweise Transmembran-Proteine sind. Wachstumsfaktoren, z.B. VEGF, werden allgemein auch als Cytokine bezeichnet, die als Polypeptidhormone definiert sind, die durch eine Zelle ausgeschieden werden, wobei sie das Wachstum und den Metabolismus entweder der gleichen Zelle (autokrin) oder einer anderen Zelle (parakrin) beeinflussen. Der Begriff Cytokin ist nicht auf Moleküle, die durch Zellen des Immunsystems produziert werden, und auf die Modifikatoren der biologischen Antwort des gleichen Systems beschränkt. Somit umfasst der Begriff Cytokin ein breites Spektrum, von dem eine Unterkategorie, die auf dem Typ der biologischen Antwort beruht, stimulatorische Wachstumsfaktoren oder Enhancer darstellt, z.B. VEGF, bFGF, EGF, TGF-α und dergleichen. Eine Übersicht findet sich in: Aggarwal et al., „Common and uncommon Features of Cytokines and Cytokine Receptors: An Overview", in: „Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapy", Hrsg. Aggarwal und Puri, Kapitel 1, Blackwell Science, Inc., (1995).
  • In der vorliegenden Erfindung werden αvβ5-spezifische Antagonisten, und nicht Wachstumsfaktor-Antagonisten wie Antikörper gegen VEGF, zum Hemmen der Angiogenese in einem Gewebe eingesetzt. In bevorzugten Ausführungsformen sind die hier beschriebenen αvβ5-Antagonisten geeignet, die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese zu hemmen, bei der die Expression des αvβ5-Integrin-Rezeptors induziert wird.
  • Bevorzugte Wachstumsfaktoren umfassen in diesem Zusammenhang VEGF, EGF, TGF-α und dergleichen.
  • Wie im Stand der Technik besprochen, sind die Wachstumsfaktoren EGF und VEGF beide dafür bekannt, dass sie an ihre zellulären Rezeptoren binden, die als Tyrosinkinasen wirken. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Aktivierung des EGF-Rezeptors mit der Aktivierung der Proteinkinase C in Zusammenhang steht, die zur Aktivierung von αvβ5 führt, wodurch die Migration von spezifischen Zellen auf einem Vitronectin-Substrat ermöglicht wird. Somit ist der Wirkmechanismus zwischen der Exposition gegenüber Cytokinen oder Wachstumsfaktoren und der koordinierten Antwort in der Integrin-Expression oder Aktivierung ein komplexer biologischer Prozess. Wie in der vorliegenden Erfindung gezeigt wird (vgl. Beispiel 6A), führt die Behandlung von Geweben entweder im Kaninchenaugen-Modell oder im Hühner-Chorioallantoismembran-Modell mit dem Cytokin VEGF zu der αvβ5-bewirkten Angiogenese, die von der Aktivierung der Proteinkinase C abhängig ist.
  • Ein Beispiel eines Modellsystems zum Bestimmen der Effekte eines αvβ5-Antagonisten der vorliegenden Erfindung ist das Mausmodell der Netzhaut-Neovaskularisation, wie es in Beispiel 9 beschrieben wird.
  • Ein chimäres Maus/Mensch-Modell, in dem Haut einer Maus, die an einem schweren kombinierten Immundefekt (SCID) leidet, durch menschliche Neugeborenen-Vorhaut ersetzt wird, wird von Yan et al., J. Clin. Invest. 91: 986–996, 1993, beschrieben. Das letztere Modell stellt ein weiteres in vivo-Modell dar, mit dem die Angiogenese und die Hemmung davon durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung untersucht werden können. Beispiele von Ergebnissen mit einem Kaninchentumor-Modell und einem αvβ5-Antagonisten der vorliegenden Erfindung sind in den Beispielen 5C und 6D beschrieben, während Ergebnisse der Hemmung der Angiogenese in dem SCID-Mausmodell in Beispiel 8 beschrieben sind.
  • Der Patient, der in der vorliegenden Erfindung in ihren zahlreichen Ausführungsformen behandelt wird, ist wünschenswerterweise ein menschlicher Patient, wobei es jedoch so zu verstehen ist, dass die Grundsätze der Erfindung zeigen, dass die Erfindung bei allen Säugern wirksam ist, die in dem Begriff „Patient" eingeschlossen sein sollen. In diesem Zusammenhang ist ein Säuger so zu verstehen, dass er eine beliebige Säugerart umfasst, insbesondere eine Säugerart von landwirtschaftliche Nutztieren und von Haustieren, bei der eine Behandlung von Krankheiten nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung gewünscht wird.
  • Das vorliegende Verfahren zum Hemmen der Angiogenese in einem Gewebe und somit auch zum Durchführen der Verfahren zum Behandeln von mit Angiogenese zusammenhängenden Krankheiten, umfasst das Inkontaktbringen eines Gewebes, in dem die Angiogenese stattfindet, oder bei dem die Gefahr besteht, dass sie stattfindet, mit einer Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines αvβ5-Antagonisten umfasst, der in der Lage ist, die Bindung von αvβ5 an seinen natürlichen Liganden zu hemmen. Somit umfasst das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer physiologisch verträglichen Zusammensetzung, die einen αvβ5-Antagonisten der Erfindung enthält, an einen Patienten.
  • Die Dosisbereiche zum Verabreichen des αvβ5-Antagonisten hängen von der Form des Antagonisten und von seiner Wirksamkeit ab, wie hier noch weiter beschrieben wird, wobei es sich um Mengen handelt, die groß genug sind, um die gewünschte Wirkung zu erzeugen, bei der die Angiogenese und die Krankheitssymptome, die durch die Angiogenese vermittelt werden, gebessert werden. Die Dosis sollte nicht so groß sein, dass unerwünschte Nebenwirkungen ausgelöst werden, wie Hyperviskositätssyndrome, Lungenödem, kongestive Herzinsuffizienz und dergleichen. Im Allgemeinen wird die Dosis mit dem Alter, dem Gesundheitszustand, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Krankheit bei dem Patienten variieren und kann durch einen Fachmann bestimmt werden. Außerdem kann die Dosis im Fall einer Komplikation durch den jeweiligen Arzt angepasst werden.
  • Ein αvβ5-Antagonist ist ein Molekül, das die physiologische oder pharmakologische Aktivität von αvβ5 blockiert oder hemmt, indem es die Bindungsaktivität des Rezeptors an seinen Liganden, nämlich Vitronectin, hemmt. Die αvβ5-Antagonisten der Erfindung sind RGD-enthaltende Polypeptide.
  • Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine Menge eines αvβ5-Antagonisten, die ausreichend ist, um eine messbare Hemmung der Angiogenese in dem behandelten Gewebe zu erzeugen, d.h. eine Angiogenese-hemmende Menge. Die Hemmung der Angiogenese kann in situ durch Immunhistochemie wie hier beschrieben oder durch andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gemessen werden.
  • Soweit ein αvβ5-Antagonist in Form eines RGD-enthaltenden Peptids vorliegt, muss man beachten, dass die Wirksamkeit und damit eine Expression einer „therapeutisch wirksamen" Menge variieren kann. Wie jedoch durch die vorliegenden Testverfahren gezeigt wird, kann der Fachmann einfach die Wirksamkeit eines möglichen Kandidaten für einen αvβ5-Antagonisten der vorliegenden Erfindung ermitteln.
  • Die Wirksamkeit eines αvβ5-Antagonisten kann durch die verschiedensten Verfahren gemessen werden, umfassend die Hemmung der Angiogenese im CAM-Test und im in vivo-Kaninchenaugen-Test, außerdem kann die Hemmung der Bindung eines natürlichen Liganden an αvβ5 gemessen werden, diese Tests sind alle hier beschrieben, weiterhin können ähnliche Tests eingesetzt werden.
  • Ein bevorzugter αvβ5-Antagonist besitzt die Fähigkeit, die Bindung eines natürlichen Liganden, z.B. von Vitronectin, an αvβ5 in Lösung bei Antagonisten-Konzentrationen von weniger als 0,5 Mikromol (μM), vorzugsweise weniger als 0,1 μM, und am stärksten bevorzugt weniger als 0,05 μM, wesentlich zu hemmen. Mit „wesentlich" ist gemeint, dass durch die Hemmung in Gegenwart des αvβ5-Antagonisten mindestens eine Reduktion von 50% in der Bindung von Vitronectin festgestellt wird, wobei der Wert bei einer Hemmung von 50% hier als ein IC50-Wert bezeichnet wird.
  • Ein stärker bevorzugter αvβ5-Antagonist zeigt eine Selektivität für αvβ5 gegenüber anderen Integrinen. So hemmt ein bevorzugter αvβ5-Antagonist die Vitronectin-Bindung an αvβ5 wesentlich, während er jedoch die Bindung von Vitronectin an ein anderes Integrin, z.B. αvβ1, αvβ3 oder αIIbβ3, nicht wesentlich hemmt. Besonders bevorzugt ist ein αvβ5-Antagonist, der eine 10-mal bis 100-mal niedrigere IC50-Aktivität beim Hemmen der Bindung von Vitronectin an αvβ5 im Vergleich zur IC50-Aktivität beim Hemmen der Bindung von Vitronectin an ein anderes Integrin aufweist. Beispiele für Tests zum Messen der IC50-Aktivität beim Hemmen der Bindung von Vitronectin an ein Integrin sind in den Beispielen beschrieben.
  • Eine therapeutisch wirksame Menge eines αvβ5-Antagonisten ist typischerweise eine Menge eine Polypeptids, die, wenn sie in einer physiologisch verträglichen Zusammensetzung verabreicht ist, ausreichend ist, um eine Plasmakonzentration von 0,1 Mikrogramm (μg) pro Milliliter (ml) bis 200 μg/ml, vorzugsweise von 1 μg/ml bis 150 μg/ml, zu erreichen. Wenn man es auf ein Polypeptid mit einer Masse von etwa 500 g pro Mol bezieht, liegt die bevorzugte Plasmakonzentration in Molarität bei 2 Mikromol (μM) bis 5 Millimol (mM), und vorzugsweise bei 100 μM bis 1 mM des Polypeptid-Antagonisten. Anders gesagt kann die Dosis pro Körpergewicht von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 300 mg/kg, und vorzugsweise von 0,2 mg/kg bis 200 mg/kg in einer oder mehreren Dosis-Verabreichungen täglich, für einen oder mehrere Tage, variieren.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können parenteral durch Injektion oder durch allmähliche Infusion über eine bestimmte Zeit erfolgen. Obwohl das zu behandelnde Gewebe typischerweise im Körper durch eine systemische Verabreichung zugänglich und deshalb meist durch die intravenöse Verabreichung von therapeutischen Zusammensetzungen behandelt wird, sind auch andere Gewebe und Verabreichungsverfahren gemeint, bei denen eine Wahrscheinlichkeit besteht, dass das als Ziel dienende Gewebe das Zielmolekül enthält. So können Polypeptide der vorliegenden Erfindung intraokular, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakavitär, transdermal und außerdem durch peristaltische Vorrichtungen verabreicht werden.
  • Die therapeutischen Zusammensetzungen, die einen αvβ5-Antagonisten der vorliegenden Erfindung enthalten, werden üblicherweise intravenös verabreicht, z.B. durch Injektion einer Einheitsdosis. Der Begriff „Einheitsdosis" bezieht sich, wenn er in Bezug auf eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, auf physikalisch getrennte Einheiten, die als Einheitsdosis für ein Individuum geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorher bestimmte Menge eines aktiven Materials, die so berechnet wurde, dass sie die gewünschte therapeutische Wirkung erzielt, zusammen mit dem gewünschten Verdünnungsmittel, d.h. einem Träger oder Vehikel, enthält.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, die in den Beispielen angegeben ist, wird der αvβ5-Antagonist in einer Einzeldosis intravenös verabreicht.
  • Die Zusammensetzungen werden in einer Weise, die mit der Dosisformulierung kompatibel ist, und in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die zu verabreichende Menge und der zeitliche Ablauf hängt von dem zu behandelnden Individuum, der Fähigkeit des Systems des Individuums, den Wirkstoff zu nutzen, und dem Ausmaß der gewünschten therapeutischen Wirkung ab. Genaue Mengen des Wirkstoffs, die verabreicht werden müssen, hängen von der Beurteilung des behandelnden Arztes ab und sind für das jeweilige Individuum typisch. Trotzdem werden hier geeignete Dosisbereiche für die systemische Anwendung angegeben, die von der Verabreichungsroute abhängen. Auch geeignete Verabreichungsschemata sind variabel, wobei die Verabreichung jedoch typischerweise durch eine erste Verabreichung erfolgt, auf die wiederholte Dosen im Abstand von einer oder mehreren Stunden durch eine anschließende Injektion oder andere Verabreichung folgen. Andererseits kann es sich auch um eine kontinuierliche intravenöse Infusion handeln, die ausreichend ist, um Konzentrationen im Blut in den Bereichen aufrecht zu halten, die für in vivo-Therapien angegeben sind.
  • D. Therapeutische Zusammensetzungen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Zusammensetzungen, die zum Durchführen der hier beschriebenen therapeutischen Verfahren eingesetzt werden können. Therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten einen physiologisch verträglichen Träger zusammen mit einem hier beschriebenen αvβ5-Antagonisten, der darin als Wirkstoff gelöst oder dispergiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die therapeutische αvβ5-Antagonist-Zusammensetzung nicht immunogen, wenn sie an einen Säuger oder an einen menschlichen Patienten für therapeutische Zwecke verabreicht wird.
  • Die hier verwendeten Begriffe „pharmazeutisch verträglich", „physiologisch verträglich" und andere grammatikalische Formen davon, die sich auf Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien beziehen, werden austauschbar verwendet und sagen aus, dass die Stoffe an oder in einen Säuger verabreicht werden können, ohne dass unerwünschte physiologische Effekte, wie Übelkeit, Schwindel, Magenverstimmung und dergleichen, auftreten.
  • Das Herstellen einer pharmakologischen Zusammensetzung, die darin gelöste oder dispergierte Wirkstoffe enthält, ist dem Fachmann bekannt und braucht nicht bezüglich der Formulierung eingeschränkt werden. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als Injektionspräparate, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, zubereitet, sie können jedoch auch als feste Formen hergestellt werden, die vor der Verwendung in einer Flüssigkeit gelöst oder suspendiert werden können. Das Präparat kann auch emulgiert sein.
  • Der Wirkstoff kann mit Excipienten gemischt werden, die mit dem Wirkstoff pharmazeutisch verträglich und kompatibel sind und die in Mengen vorliegen, die für die Verwendung in den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren geeignet sind. Geeignete Excipienten sind z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen sowie Kombinationen davon. Außerdem kann die Zusammensetzung gewünschtenfalls kleinere Mengen von Hilfsstoffen, z.B. Feuchthaltemittel oder Emulgatoren, pH-puffernde Mittel und dergleichen, enthalten, welche die Wirksamkeit des Wirkstoffs steigern.
  • Die therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann pharmazeutisch verträgliche Salze der Komponenten enthalten. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Polypeptids), die mit anorganischen Säuren, z.B. Salzsäure oder Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, z.B. Essigsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen, gebildet werden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppe gebildet werden, können auch von anorganischen Basen, z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-hydroxid, und organischen Basen, z.B. Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen, stammen.
  • Besonders bevorzugt ist das HCl-Salz, wenn es im Präparat von cyclischen Polypeptid-αvβ5-Antagonisten verwendet wird.
  • Physiologisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt. Beispiele von flüssigen Träger sind sterile wässrige Lösungen, die zusätzlich zu den Wirkstoffen und Wasser keine weiteren Stoffe enthalten oder einen Puffer, z.B. Natriumphosphat bei einem physiologischen pH-Wert, physiologische Kochsalzlösung oder beide, z.B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, enthalten. Weiterhin können wässrige Träger mehr als ein Puffersalz und außerdem Salze, z.B. Natrium- und Kaliumchlorid, Dextrose, Polyethylenglykol und andere gelöste Stoffe, enthalten.
  • Flüssige Zusammensetzungen können auch zusätzlich zu Wasser oder unter Ausschluss von Wasser flüssige Phasen enthalten. Beispiele von solchen weiteren flüssigen Phasen sind Glycerin, pflanzliche Öle, z.B. Baumwollsamenöl, und Wasser-Öl-Emulsionen.
  • Eine therapeutische Zusammensetzung enthält eine Angiogenese-hemmende Menge eines αvβ5-Antagonisten der vorliegenden Erfindung, wobei sie typischerweise so formuliert ist, dass sie eine Menge von mindestens 0,1 Gew.-% des Antagonisten pro Gewicht der gesamten therapeutischen Zusammensetzung enthält. Ein Gew.-% ist das Verhältnis, bezogen auf Gewicht, eines Inhibitors zur gesamten Zusammensetzung.
  • Somit ist z.B. 0,1 Gew.-% 0,1 g des Inhibitors pro 100 g der gesamten Zusammensetzung.
  • E. Antagonisten des Integrins αvβ5
  • In den vorliegenden Verfahren werden αvβ5-Antagonisten zum Hemmen der Angiogenese in Geweben eingesetzt, wobei sie in den verschiedensten Formen vorliegen können, welche Verbindungen umfassen, die mit αvβ5 in einer Weise interagieren, dass funktionelle Wechselwirkungen mit den natürlichen αvβ5-Liganden gestört werden.
  • 1. Polypeptide
  • Die Erfindung betrifft αvβ5-Antagonisten in Form von RGD-enthaltenden Polypeptiden. Ein Polypeptid-(Peptid-)αvβ5-Antagonist kann die Sequenzmerkmale entweder des natürlichen Liganden von αvβ5 oder von αvβ5 selbst an der Region aufweisen, die an der αvβ5-Ligand-Wechselwirkung beteiligt ist, und besitzt eine wie hier beschriebene αvβ5-Antagonist-Aktivität. Ein bevorzugtes αvβ5-Antagonist-Peptid entspricht in der Sequenz in der RGD-enthaltenden Region dem natürlichen Liganden.
  • Bevorzugte RGD-enthaltende Polypeptide besitzen eine Sequenz, die der Aminosäuresequenz der RGD-enthaltenden Region eines natürlichen Liganden von αvβ5 entspricht, z.B. von Vitronectin, für das die Sequenz bekannt ist.
  • Ein besonders bevorzugtes αvβ5-Antagonist-Peptid hemmt vorzugsweise die αvβ5-Bindung an seinen (seine) natürlichen Liganden, wenn man es mit anderen Integrinen vergleicht, wie früher beschrieben wurde. Diese αvβ5-spezifischen Peptide sind mindestens deshalb besonders bevorzugt, da die Spezifität für αvβ5 die Inzidenz von unerwünschten Nebenwirkungen, z.B. die Hemmung anderer Integrine, reduziert. Bevorzugte αvβ5-Antagonist-Peptide, die eine Selektivität für αvβ5 besitzen, können in einem typischen Bindungs-Hemmtest, z.B. in dem in den Beispielen beschriebenen ELISA-Test, einfach identifiziert werden.
  • In einer Ausführungsform umfasst ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung nicht mehr als etwa 100 Aminosäurereste, vorzugsweise nicht mehr als etwa 60 Reste, stärker bevorzugt nicht mehr als etwa 30 Reste. Die Peptide können linear oder cyclisch sein, wobei jedoch cyclische Peptide besonders bevorzugt sind. Bevorzugte Peptide werden in den Beispielen beschrieben.
  • Es ist so zu verstehen, dass ein vorliegendes Polypeptid nicht mit der Aminosäuresequenz eines natürlichen Liganden von αvβ5 identisch sein muss, so lange es eine Sequenz umfasst, die zum Antagonisieren der Bindung eines αvβ5-Liganden an αvβ5 erforderlich ist, und es in der Lage ist, in einem der Tests, wie sie hier beschrieben werden, als ein αvβ5-Antagonist zu wirken.
  • Ein vorliegendes Polypeptid umfasst ein beliebiges Analogon, Fragment oder chemisches Derivat eines Polypeptids, dessen Aminosäuresequenz hier dargestellt ist, so lange das Polypeptid ein αvβ5-Antagonist ist. Deshalb können an einem vorliegen den Polypeptid verschiedene Änderungen, Substitutionen, Insertionen und Deletionen durchgeführt werden, wobei solche Änderungen bestimmte Vorteile für seine Verwendung bereitstellen. In dieser Hinsicht entspricht ein αvβ5-Antagonist-Polypeptid der vorliegenden Erfindung der Sequenz eines angeführten Peptids und ist hiermit nicht unbedingt identisch, wobei eine oder mehrere Änderungen durchgeführt werden und es die Fähigkeit beibehält, in einem oder mehreren der hier definierten Tests als ein αvβ5-Antagonist zu wirken.
  • Somit kann ein Polypeptid in einer beliebigen von einer Vielzahl von Formen von Peptidderivaten vorliegen, diese umfassen Amide, Konjugate mit Proteinen, cyclisierte Peptide, polymerisierte Peptide, Analoga, Fragmente, chemisch modifizierte Peptide und dergleichen Derivate.
  • Der Begriff „Analogon" umfasst ein beliebiges Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die im Wesentlichen mit einer Sequenz identisch ist, die hier spezifisch dargestellt ist, in der ein oder mehrere Reste mit einem funktionell ähnlichen Rest konservativ substituiert wurden, und das die αvβ5-Antagonist-Aktivität wie hier beschrieben aufweist. Beispiele von konservativen Substitutionen umfassen die Substitution eines nicht-polaren (hydrophoben) Rests, z.B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, für eine anderen, die Substitution eines polaren (hydrophilen) Rests für einen anderen, z.B. zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutamin und Asparagin, zwischen Glycin und Serin, die Substitution eines basischen Rests, z.B. Lysin, Arginin oder Histidin, für einen anderen, oder die Substitution eines sauren Rests, z.B. Asparaginsäure oder Glutaminsäure, für einen anderen.
  • Der Begriff „konservative Substitution" umfasst auch die Verwendung eines chemisch derivatisierten Rests anstelle eines nicht-derivatisierten Rests, mit der Maßgabe, dass ein solches Polypeptid die entsprechende Hemmaktivität aufweist.
  • Ein „chemisches Derivat" bezieht sich auf ein vorliegendes Polypeptid, bei dem ein oder mehrere Reste durch die Reaktion einer funktionellen Seitengruppe derivatisiert ist oder sind. Solche derivatisierten Moleküle umfassen z.B. diejenigen Moleküle, in denen freie Aminogruppen derivatisiert wurden, so dass Amin-Hydrochloride, p-Toluolsulfonylgruppen, Carbobenzoxygruppen, t-Butyloxycarbonylgruppen, Chloracetylgruppen oder Formylgruppen gebildet werden. Freie Carboxylgruppen können derivatisiert werden, so dass Salze, Methyl- und Ethylester oder andere Arten von Estern oder Hydraziden entstehen. Freie Hydroxylgruppen können derivatisiert werden, so dass O-Acyl- oder O-Alkylderivate entstehen. Das Imidazol-Stickstoffatom von Histidin kann derivatisiert werden, so dass N-im-Benzylhistidin gebildet wird. Außerdem sind in den chemischen Derivaten diejenigen Peptide enthalten, die ein oder mehrere natürlich vorkommende Aminosäurederivate der 20 Standard-Aminosäuren umfassen. Z.B. kann 4-Hydroxyprolin für Prolin substituiert sein; 5-Hydroxylysin kann für Lysin substituiert sein; 3-Methylhistidin kann für Histidin substituiert sein; Homoserin kann für Serin substituiert sein; und Ornithin kann für Lysin substituiert sein. Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen auch ein beliebiges Polypeptid, das im Vergleich zur Sequenz eines Polypeptids, dessen Sequenz hier dargestellt ist, eine oder mehrere Additionen und/oder Deletionen von Resten aufweist, so lange die erforderliche Aktivität bestehen bleibt.
  • Der Begriff „Fragment" bezieht sich auf ein beliebiges vorliegendes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die kürzer ist als die eines Polypeptids, dessen Aminosäuresequenz hier dargestellt ist.
  • Wenn ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Sequenz besitzt, die nicht mit der Sequenz eines natürlichen Liganden von αvβ5 identisch ist, beruht dies typischerweise darauf, dass eine oder mehrere konservative oder nicht-konservative Substitutionen durchgeführt wurden, wobei üblicherweise nicht mehr als etwa 30%, bezogen auf die Anzahl, und vorzugsweise nicht mehr als 10%, bezogen auf die Anzahl, der Aminosäuren substituiert sind. Außerdem können noch weitere Reste an jedem Terminus eines Polypeptids zu dem Zweck angefügt werden, dass ein „Linke" bereitgestellt wird, durch den die Polypeptide der vorliegenden Erfindung an einer Markierung, einer festen Matrix oder einem Träger herkömmlich fixiert werden können.
  • Markierungen, feste Matrizen und Träger, die zusammen mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind hier nachstehend beschrieben.
  • Aminosäure-Linker bestehen üblicherweise aus mindestens einem Rest und können 40 oder mehr Reste, häufiger 1 bis 10 Reste, umfassen, sie bilden jedoch keine αvβ5-Ligand-Epitope. Typische Aminosäurereste, die zum Koppeln verwendet werden, sind Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutamin- und Asparaginsäure oder dergleichen. Außerdem kann ein vorliegendes Polypeptid, sofern nichts Anderes angegeben ist, sich von der natürlichen Sequenz eines αvβ5-Liganden durch die Sequenz unterscheiden, die durch eine terminale NH2-Acylierung, z.B. Acetylierung, oder Thioglykolsäure-Amidierung durch terminale Carboxyl-Amidierung, z.B. mit Ammoniak, Methylamin, und dergleichen terminate Modifikationen modifiziert ist. Wie bekannt ist, eignen sich terminale Modifikationen dafür, die Empfindlichkeit gegenüber einer Proteinase-Spaltung zu reduzieren, und dienen somit dazu, die Halbwertszeit der Polypeptide in Lösungen, insbesondere in biologischen Flüssigkeiten, in denen möglicherweise Proteasen vorliegen, zu verlängern. In dieser Hinsicht ist auch eine Polypeptid-Cyclisierung eine geeignete terminale Modifikation und ist besonders bevorzugt, auch aufgrund der stabilen Strukturen, die durch eine Cyclisierung gebildet werden, und hinsichtlich der biologischen Aktivitäten, die für solche cyclische Peptide wie hier beschrieben festgestellt werden.
  • Ein beliebiges Peptid der vorliegenden Erfindung kann in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes eingesetzt werden. Geeignete Säuren, die in der Lage sind, mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung Salze zu bilden, umfassen anorganische Säuren, z.B. Trifluoressigsäure (TFA), Salzsäure (HCl), Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphoressigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxasäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure oder dergleichen. Ein HCl-Salz ist besonders bevorzugt.
  • Geeignete Basen, die mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung Salze bilden können, umfassen anorganische Basen, z.B. Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid und dergleichen; und organische Basen, z.B. Mono-, Di- und Trialkyl- und Arylamine (z.B. Triethylamin, Diisopropylamin, Methylamin, Dimethylamin und dergleichen) und gegebenenfalls substituierte Ethanolamine (z.B. Ethanolamin, Diethanolamin und dergleichen).
  • Ein Peptid der vorliegenden Erfindung, das hier auch als ein vorliegendes Polypeptid bezeichnet wird, kann durch eines der Verfahren synthetisiert werden, die dem Fachmann der Polypeptid-Chemie bekannt sind, umfassend DNA-Rekombinations-Techniken. Chemische Syntheseverfahren, z.B. eine Festphasen-Synthese vom Merrifield-Typ, sind aufgrund der Reinheit, der Antigenspezifität, des Fehlens von unerwünschten Nebenprodukten, der einfachen Herstellung und dergleichen bevorzugt. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der zahlreichen verfügbaren Verfahren findet sich in Steward et al., „Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky et al., „Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, 2. Aufl., 1976; J. Meienhofer, „Hormonal Proteins and Peptides," Bd. 2, S. 46, Academic Press (New York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol. 32: 221–296, 1969; Fields et al., Int. J. Peptide Protein Res. 35: 161–214, 1990; und US Patent Nr. 4 244 946 für die Festphasen-Peptidsynthese, und Schroder et al., „The Peptides", Bd. 1, Academic Press (New York), 1965, für die klassische Synthese in Lösung, die jeweils hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Geeignete Schutzgruppen, die in einer solchen Synthese verwendet werden können, sind in den vorstehenden Texten und in J. F. W. McOmie, „Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973, beschrieben.
  • Im Allgemeinen umfassen die angesprochenen Festphasen-Syntheseverfahren das aufeinander folgende Anhängen von einer oder mehreren Aminosäureresten oder auf geeignete Weise geschützten Aminosäureresten an eine wachsende Peptidkette. Normalerweise wird entweder die Amino- oder die Carboxylgruppe des ersten Aminosäurerestes durch eine geeignete, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt. Eine andere, selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für Aminosäuren verwendet, die eine reaktive Seitengruppe enthalten, wie z.B. Lysin.
  • Wenn man eine Festphasen-Synthese als Beispiel nimmt, wird die geschützte oder derivatisierte Aminosäure über ihre ungeschützte Carboxyl- oder Aminogruppe an einen inerten festen Träger gebunden. Dann wird die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe selektiv entfernt und die nächste Aminosäure in der Sequenz, bei der die komplementäre (Amino- oder Carboxyl-)gruppe auf geeignete Weise geschützt ist, wird dazu gemischt und unter Bedingungen umgesetzt, unter denen sich die Amidbindung mit dem bereits an dem festen Träger gebundenen Rest bilden kann. Danach wird die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe von diesem neu angefügten Aminosäurerest entfernt, und sodann wird die nächste Aminosäure (die auf geeignete Weise geschützt ist) angefügt, usw.. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen Folge gebunden wurden, werden alle restlichen terminalen und Seitengruppen-Schutzgruppen (und der feste Träger) nacheinander oder gleichzeitig entfernt, wodurch das endgültige lineare Polypeptid erhalten wird.
  • Die resultierenden linearen Polypeptide, die z.B. wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, können umgesetzt werden, so dass ihre entsprechenden cyclischen Peptide gebildet werden. Ein Beispiel eines Verfahrens zur Cyclisierung von Peptiden wird von Zimmer et al., Peptides, 1992, S. 393–394, ESCOM Science Publishers, B. V., 1993, beschrieben. Typischerweise wird ein tert.-Butoxycarbonyl-geschützter Peptid-Methylester in Methanol gelöst, mit Natriumhydroxidlösung versetzt und das Gemisch bei 20°C (20C) umgesetzt, wodurch die Methylester-Schutzgruppe hydrolytisch entfernt wird. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wird das tert.-Butoxycarbonyl-geschützte Peptid mit Essigsäureethylester aus dem angesäuerten wässrigen Lösemittel extrahiert. Danach wird die tert.-Butoxycarbonyl-Schutzgruppe unter mild-sauren Bedingungen in Dioxan-Co-Lösemittel entfernt. Das auf diese Weise erhaltene ungeschützte lineare Peptid mit freien Amino- und Carboxyenden wird zu seinem entsprechenden cyclischen Peptid umgewandelt, indem eine verdünnte Lösung des linearen Peptids in einem Gemisch aus Dichlormethan und Dimethylformamid mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol und N-Methylmorpholin umgesetzt wird. Anschließend wird das resultierende cyclische Peptid durch Chromatographie gereinigt.
  • Ein besonders bevorzugtes Syntheseverfahren für cyclische Peptide ist von Gurrath et al., Eur. J. Biochem. 210: 911–921, 1992, beschrieben und in den Beispielen dargestellt. Besonders bevorzugte Peptide zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren in Geweben, die hauptsächlich eine αvβ5-assoziierte Angiogenese aufweisen, sind in den Beispielen beschrieben und umfassen die in SEQ ID NOs: 4, 6, 7, 8 und 9 dargestellten Polypeptide.
  • F. Verfahren zum Identifizieren von Antagonisten von αvβ5
  • Die Erfindung beschreibt auch Testverfahren zum Identifizieren von möglichen Kandidaten für αvβ5-Antagonisten zur Verwendung gemäß den vorliegenden Verfahren.
  • In diesen Testverfahren werden die möglichen Molekül-Kandidaten auf ihre Wirksamkeit getestet, die αvβ5-Bindung an natürliche Liganden zu hemmen, und außerdem werden sie auf ihre Wirksamkeit getestet, die Angiogenese in einem Gewebe zu hemmen.
  • Der erste Test misst die Angiogenese in einer Hühner-Chorioallantoismembran (CAM) und wird als der CAM-Test bezeichnet. Der CAM-Test wurde von anderen Autoren ausführlich beschrieben und weiterhin eingesetzt, um sowohl die Angiogenese als auch die Neovaskularisation von Tumorgeweben zu messen. Vgl. Ausprunk et al., Am. J. Pathol. 79: 597–618, 1975; und Ossonski et al., Cancer Res. 40: 2300–2309, 1980.
  • Der CAM-Test ist ein eingeführtes Testmodell für die in vivo-Angiogenese, da eine Neovaskularisation des vollständigen Gewebes auftritt. Die aktuellen Blutgefäße des Hühnerembryos wachsen in die CAM oder in das auf der CAM gezüchtete Gewebe.
  • Wie hier gezeigt wird, erläutert der CAM-Test die Hemmung der Neovaskularisation aufgrund von sowohl der Menge als auch dem Ausmaß des neuen Gefäßwachstums. Weiterhin ist es einfach, das Wachstum eines beliebigen Gewebes zu überwachen, das auf die CAM transplantiert wurde, z.B. eines Tumorgewebes. Schließlich ist der Test besonders gut geeignet, da es in dem Testsystem eine innere Kontrolle auf Toxizität gibt. Der Hühnerembryo wird mit dem jeweiligen Testreagens in Kontakt gebracht. Hierbei dient die Gesundheit des Embryos als eine Anzeige für die Toxizität.
  • Der zweite Test, der die Angiogenese misst, ist das in vivo-Kaninchenaugen-Modell und wird als der Kaninchenaugen-Test bezeichnet. Der Kaninchenaugen-Test wurde ausführlich von anderen Autoren beschrieben und weiterhin eingesetzt, um sowohl die Angiogenese als auch die Neovaskularisation in Gegenwart von angiogenen Inhibitoren, z.B. Thalidomid, zu messen. Vgl. D'Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4082–4085, 1994.
  • Der Kaninchenaugen-Test ist ein eingeführtes Testmodell für die in vivo-Angiogenese, da der Neovaskularisationsprozess, für den die Kaninchen-Blutgefäße als Beispiel dienen, die vom Rand der Hornhaut in die Hornhaut hinein wachsen, einfach durch die von Natur aus transparente Hornhaut des Auges sichtbar gemacht wird. Außerdem können sowohl das Ausmaß als auch die Stärke der Stimulation oder Hemmung der Neovaskularisation oder der Regression der Neovaskularisation einfach über der Zeit überwacht werden.
  • Schließlich wird das Kaninchen mit dem jeweiligen Testreagens in Kontakt gebracht, so dass der Gesundheitszustand des Kaninchens als eine Anzeige für die Toxizität des Testreagens dient.
  • Der dritte Test misst die Hemmung einer direkten Bindung des natürlichen Liganden, Vitronectin, an αvβ5, wobei eine bevorzugte Ausführungsform ausführlich in den Beispielen beschrieben wird. Der Test misst typischerweise das Ausmaß der Hemmung der Bindung eines natürlichen Liganden, z.B. von Vitronectin, an isoliertes αvβ5 in der festen Phase durch einen ELISA, wobei diese Hemmung durch eine αvβ5-spezifische Hemmung vermittelt wird.
  • Somit kann der Test auch zum Identifizieren von Verbindungen eingesetzt werden, die eine Spezifität für αvβ5 zeigen und natürliche Liganden nicht daran hemmen, andere Integrine zu binden. Der Spezifitätstest wird durchgeführt, indem parallele ELISA-Test laufen gelassen werden, in denen sowohl αvβ5 als auch andere Integrine gleichzeitig in getrennten Testkammern auf ihre entsprechenden Fähigkeiten, an einen natürlichen Liganden zu binden, und auf die als Kandidat verwendete Verbindung, die entsprechenden Fähigkeiten der Integrine zum Binden eines vorher gewählten Liganden zu hemmen, gescreent werden. Bevorzugte Screening-Testformate werden in den Beispielen beschrieben.
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele, die sich auf die vorliegende Erfindung beziehen, dienen der Erläuterung und sollen selbstverständlich die Erfindung in keiner Weise einschränken. Außerdem sollen Variationen der Erfindung, die jetzt bekannt sind oder später entwickelt werden und die im Zuständigkeitsbereich eines Fachmanns liegen würden, im Umfang der vorliegenden Erfindung wie nachstehend beansprucht enthalten sein.
  • 1. Herstellen von αvβ5-spezifischen monoclonalen Antikörpern
  • Die monoclonalen Antikörper P1F6 und P5H9 wurden anhand von herkömmlichen Hybridomverfahren hergestellt, indem RBF/DnJ-Mäuse mit A549-Lungenkarzinomzellen wie von Wayner et al., J. Cell Biol. 113: 919–929, 1991, beschrieben immunisiert wurden, wobei die Beschreibung davon hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Milzen wurden aus den immunisierten Mäusen entnommen und mit Ns-1/FOX-NY-Myelomzellen fusioniert. Hybridome, die Antikörper produzieren, die gegen die Vitronectin-Rezeptoren der Krebszellen gerichtet sind, wurden anhand der spezifischen Hemmung der Adhäsion von UCLA-P3 an Vitronectin-beschichtete Oberflächen wie von Wayner et al. beschrieben gescreent und durch Grenzwert-Verdünnung auf Thymozyten-Feeder-Schichten cloniert.
  • Sowohl für die monoclonalen Antikörper P1F6 als auch für P5H9 wurde gezeigt, dass sie spezifisch mit dem αvβ5-Komplex immunreagieren und nicht mit der αv-Untereinheit, mit der β5-Untereinheit oder mit anderen Integrinen. Der monoclonale Antikörper P1F6 ist im Handel von Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) erhältlich, und der monoclonale Antikörper P5H9 kann von Dr. E. Wayner am Fred Hutchinson Cancer Research Institute, Seattle, WA, zur Verfügung gestellt werden.
  • Andere monoclonale αvβ5-Antikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden genauso wie hier beschrieben hergestellt und charakterisiert. Außerdem werden monoclonale αvβ5-Antikörper durch Fusionieren von Milzen hergestellt, die aus Mäusen isoliert wurden, welche mit dem αvβ5-Rezeptor entweder in nicht-gereinigter oder in gereinigter Form immunisiert wurden. Die Reinigung des αvβ5 ist ein Verfahren, das dem Fachmann der Integrin-Biologie bekannt ist, und wurde auch von Smith et al., J. Biol. Chem. 265: 11008–11013, 1990, beschrieben, wobei diese Beschreibung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Sobald der isolierte Rezeptor gereinigt ist, wird er als Immunogen zum Immunisieren von Mäusen zubereitet, wie in Abschnitt E2 beschrieben und im Wesentlichen wie von Köhler und Milstein, Nature 256: 495–497, 1975, beschrieben, wobei diese Beschreibung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die resultierenden Hybridomclone werden auf Reaktivität mit dem Immunogen gescreent und anschließend wie in den folgenden Beispielen beschrieben charakterisiert.
  • 2. Charakterisieren der Spezifität der gegen αvβ5 gerichteten monoclonalen Antikörper und Verwendung zum Kartieren der Gewebeverteilung der αvβ5-Expression
  • A. Spezifität für Vitronectin
  • Von Wayner et al., J. Cell Biol. 113: 919–929, 1991, wurde gezeigt, dass der in Beispiel 1 hergestellte monoclonale Antikörper P5H9 die Anlagerung von UCLA-P3-Krebszellen an Vitronectin blockiert, während er die Anlagerung der Zellen an Collagen oder Fibronectin nicht beeinträchtigt. Weiterhin wurde gezeigt, dass die gleichen Zellen nur den αvβ5-Vitronectin-Rezeptor und keinen mit αvβ3-Spezifität enthalten, wobei eine Immunfällung eines Heterodimers, das aus einer α-Kette (160 kD) und einer β-Kette (95 kD) bestand, unter nicht-reduzierenden Bedingungen erfolgte. Außerdem wurde gezeigt, dass der durch P5H9 nachgewiesene αvβ5-Rezeptor die Adhäsion der Melanomzellen M21 und der Krebszellen H2981 an Vitronectin vermittelt. Der monoclonale Antikörper P1F6 hat das gleiche Immunreaktivitätsprofil.
  • B. Immunfluoreszenz mit Anti-Integrin-Rezeptor-Antikörpern
  • Während der Wundheilung exprimieren die Basalmembranen von Blutgefäßen verschiedene adhäsive Proteine, umfassend den von-Willebrand-Faktor, Fibronectin und Fibrin. Außerdem werden mehrere Mitglieder der Integrinfamilie von Adhäsionsrezeptoren auf der Oberfläche von gezüchteten glatten Muskel- und Endothelzellen exprimiert. Vgl. Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6471, 1987; Janat et al., J. Cell Physiol. 151: 588, 1992; und Cheng et al., J. Cell Physiol. 139: 275, 1989.
  • Zusätzlich zur Struktur und Funktion der Integrin-β5-Untereinheit wurde auch die Gewebeverteilung der Untereinheit von Pasqualini et al., J. Cell Sci. 105: 101–111, 1993, beschrieben, indem sie diese mit anderen monoclonalen Anti-β5-Antikörpern kartierten, wobei diese Beschreibung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • Die vorstehend beschriebenen β5-Untereinheit-spezifischen monoclonalen Antikörper wurden, genauso wie die in Beispiel 1 beschriebenen, aus Hybridomen sekretiert, die unter Verwendung von Splenozyten aus einer Maus hergestellt wurden, die mit der menschlichen Lungenkrebs-Zelllinie A549 immunisiert worden war. Die Hybridome wurden durch positive Oberflächenfärbung von A549-Zellen mit dem Überstand der Hybridomkultur und durch Immunfällung von αvβ5-Komplexen aus Oberflächen-markierten A549-Extrakten selektiert. Danach wurden die monoclonalen Antikörper zum Kartieren der Gewebeverteilung der β5-Untereinheit in einem normalen menschlichen Thymus-, Haut- und Nierengewebe eingesetzt. Aus den gefrorenen Gewebeblöcken wurden auf einem Kryostat-Mikrotom vier μm dicke Schnitte geschnitten, diese wurden anschließend einer Streptavidin-Biotin-Immunperoxidase-Färbung mit Antikörpern unterworfen, die für die β5-Integrine spezifisch waren, wie in der Referenz von Pasqualini et al. beschrieben.
  • Die Färbung von Thymusschnitten zeigte die Verteilung von β5 auf Blutgefäßen, Hassall-Körperchen, Rinden- und Mark-Stromazellen und Basalmembranen. Die Hautschnitte zeigten β5 auf der Basalmembran der Epidermis und auf einigen Blutgefäßwänden der Haut, die Nierenschnitte schließlich zeigten eine Färbung von Glomerulum-Regionen, des juxtaglomulären Apparats, von proximalen Tubuluskonvulaten und von Sammeltubuli. Somit ist die Verteilung von β5 bei verschiedenen Zelltypen heterogen, umfassend und noch wichtiger auf Kapillarendothelzellen, deren Färbung mit der Färbung von gezüchteten Nabelvenen-Endothelzellen übereinstimmte.
  • C. Immunfluoreszenz von menschlichem Netzhautgewebe aus Patienten mit einer Augenkrankheit mit Anti-Integrin-Rezeptor-Antikörpern
  • Die Neovaskularisation des Auges ist die häufigste pathologische Veränderung, die bei den meisten Augenkrankheiten festgestellt wird, die zu einem katastrophalen Sehverlust führen. Das Wachstum neuer Blutgefäße aus den bereits existierenden Choroidea-, Retina- oder Paralimbus-Gefäßen kann zu einem Ödem, zur Blutung oder zu einer fibrovaskulären Membranbildung führen, wodurch die normalen anatomischen Zusammenhänge des Auges unterbrochen werden und es gleichzeitig zu einem Verlust der normalen Sehfunktion kommt.
  • Unter physiologischen Bedingungen ist die Angiogenese stark reguliert, wobei gezeigt wurde, dass sie durch spezifische angiogene Cytokine, z.B. den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), aktiviert wird. Wie von Brooks et al., Science 264: 569–571, 1994, beschrieben wurde gezeigt, dass monoclonale Antikörper gegen αvβ3 sowohl die bFGF- als auch die TNF-α-induzierte Angiogenese in Modellsystemen, umfassend das CAM-Modell wie nachstehend beschrieben, blockieren. Wie in den Beispielen 4 bis 6 dargestellt blockieren monoclonale Antikörper gegen αvβ5 einen getrennten Stoffwechselweg der Angiogenese, insbesondere von derjenigen Angiogenese, die durch den Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), den transformierenden Wachstumsfaktor-α (TGF-α) und den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) induziert wird.
  • Wie also im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung hier beschrieben wird, sind zwei Stoffwechselwege der Angiogenese durch die unterschiedlichen Integrine αvβ3 und αvβ5 definiert. Um die Expression und die Rolle dieser Integrine bei Augenkrankheiten des Menschen zu untersuchen, wurden epiretinale neovaskuläre Membranen und subretinale neovaskuläre Membranen bei einer Glaskörperexstirpation von Patienten mit proliferativer diabetischer Retinopathie (PDR) en bloc erhalten. Der Krankheitsverlauf war bei diesen Patienten klinisch verfolgt worden, und sie wurden für die histologische Untersuchung aufgrund des Vorliegens einer aktiven proliferativen neovaskulären Krankheit ausgewählt, die durch klinische Untersuchung und Fluorescein-Angiographie des Fundus dokumentiert worden war. Das erhaltene Gewebe wurde sofort in dem Kältekonservierungsmittel „Tissue Tek" eingefroren, sodann wurden hieraus Schnittpräparate hergestellt.
  • Wenn die Gewebe dieser Patienten durch Immunfluoreszenz untersucht wurden, waren die Blutgefäße für das Integrin αvβ3 positiv, wie durch Immunreaktivität mit dem monoclonalen Antikörper LM609 der Maus gezeigt wurde. Die Verteilung des Integrins schien auf Blutgefäße beschränkt zu sein und stimmte mit der Färbung auf einen Marker der Blutgefäße, den von-Willebrand-Faktor, überein, wie durch Kartieren mit einem Kaninchen-Antikörper gegen diesen Faktor gezeigt wurde. Die Stellen der Immunreaktivität wurden entweder mit einem Rhodamin-konjugierten Anti-Maus-Immunglobulin oder mit einem Fluorescein-konjugierten Anti-Kaninchen-Immunglobulin sichtbar gemacht, wobei die Verwendung dieser beiden Immunglobuline die gemeinsame Lokalisation der Lage des Integrins und der Blutgefäß-spezifischen Antikörper möglich machte.
  • Proben, die aus normalen Augen oder von Patienten mit atrophischen Membranen, die frei von aktiv proliferierenden Blutgefäßen waren, erhalten wurden, waren bei der Immunfluoreszenz für das Integrin αvβ3 negativ.
  • Gleichzeitig wurden die gleichen Gewebe immunhistochemisch mit dem in Beispiel 1 hergestellten, gegen αvβ5 gerichteten monoclonalen Antikörper P1F6 auf das Vorliegen und die Verteilung von αvβ5 untersucht. Die Färbung zeigte, dass αvβ5 auf Blutgefäßen vorlag, dies fiel mit der Verteilung des von-Willebrand-Faktors zusammen. Jedoch zeigte das nicht-vaskuläre Gewebe auch eine begrenzte Fluoreszenz mit dem Antikörper P1F6, dies weist auf eine breitere Verteilung von αvβ5 hin. Dies stand im Gegensatz zu dem Vorliegen von αvβ3, das auf Blutgefäße beschränkt war.
  • Wenn man einen Vergleich anstellte zwischen den Immunfluoreszenz-Färbungen von Membranen auf αvβ3 und auf αvβ5 mit den Antikörpern LM609 bzw. P1F6, waren die Färbemuster auf der Blutgefäßwand im Wesentlichen identisch, dies zeigt, dass sowohl αvβ3 als auch αvβ5 auf der Oberfläche von neu-proliferierenden menschlichen Blutgefäßen präsentiert werden, die bei neovaskulären Augenkrankheiten, z.B. der diabetischen Retinopathie, vorliegen.
  • Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen somit, dass der αvβ5-Integrin-Rezeptor selektiv in spezifischen Gewebetypen exprimiert wird, in denen eine Angiogenese stattfindet, wie dies bei neovaskulären Membranen von Patienten zu sehen ist, die an einer aktiven proliferativen neovaskulären Krankheit leiden. Deshalb stellen diese Gewebe, zusammen mit denjenigen Geweben, die bestimmten Wachstumsfaktoren ausgesetzt sind, wie in den nachstehenden Beispielen 4 bis 6 beschrieben, ideale Ziele für therapeutische Aspekte der vorliegenden Erfindung dar.
  • 3. Herstellen von synthetischen Peptiden
  • Die cyclischen Polypeptide, die zum Durchführen der Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wurden anhand von herkömmlichen Festphasen-Syntheseverfahren synthetisiert, wie z.B. von Merrifield, Adv. Enzymol. 32: 221–296, 1969; und Fields, G. B., und Noble, R. L., Int. J. Peptide Protein Res. 35: 161–214, 1990, beschrieben.
  • Zwei Gramm (g) von BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OMe (SEQ ID NO: 1) wurden zuerst in 60 Milliliter (ml) Methanol gelöst, das mit 1,5 ml 2 N Natriumhydroxidlösung versetzt wurde, so dass ein Gemisch entstand. Danach wurde das Gemisch drei Stunden bei 20 Grad C (20°C) gerührt. Nach Eindampfen wurde der Rest in Wasser aufgenommen und mit verdünnter HCl auf pH 3 angesäuert und sodann mit Essigsäureethylester extrahiert. Der Extrakt wurde über Na2SO4 getrocknet, wieder eingedampft und das resultierende BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH (SEQ ID NO: 2) zwei Stunden bei 20°C mit 20 ml 2 N HCl in Dioxan gerührt. Das resultierende Gemisch wurde eingedampft, wodurch H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH (SEQ ID NO: 3) erhalten wurde, das anschließend in einem Gemisch aus 1800 ml Dichlormethan und 200 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst und anschließend auf 0°C abgekühlt wurde. Danach wurden 0,5 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI), 0,3 g 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 0,23 ml N-Methylmorpholin nacheinander unter Rühren zugegeben.
  • Das resultierende Gemisch wurde weitere 24 Stunden bei 0°C und danach bei 20°C noch weitere 48 Stunden gerührt. Die Lösung wurde eingeengt und mit einem Mischbett-Ionenaustauscher behandelt, um Salze zu entfernen. Nachdem das resultierende Harz abfiltriert worden war, wurde die geklärte Lösung eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie gereinigt, wodurch Cyclo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) gewonnen wurde (das im Ein-Buchstaben-Code auch als c-RGDfV angegeben ist) (SEQ ID NO: 4). Die klein geschriebenen Buchstaben im Peptid geben die D-Form der Aminosäure an, und die L-Form ist durch Großbuchstaben bezeichnet.
  • Das cyclische Kontrollpeptid, Cyclo-(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (das im Ein-Buchstaben-Code auch als RADfV bezeichnet ist) (SEQ ID NO: 5) wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt. Vorher war gezeigt worden, dass das cyclische Peptid c-RADfV (SEQ ID NO: 5) die Bindung von Fibrinogen an das Integrin αvβ3 hemmt, und dass es nicht die Bindung von Fibrinogen an die Integrine αIIbβ3 oder α5β1 hemmt (Pfaff et al., J. Biol. Chem. 269: 20233–20238, 1994).
  • Andere Peptide, die spezifische Inhibitoren der Bindung von natürlichen Liganden an αvβ5 sind, werden genauso hergestellt und auf Spezifität und Wirkbereich getestet, wie in den folgenden Beispielen beschrieben. Diese umfassen die folgenden Peptide, die analog erhalten wurden: Cyclo-(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO: 6) und Cyclo-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID NO: 7). Auch das Peptid mit der Aminosäuresequenz Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe (SEQ ID NO: 8) wurde synthetisch hergestellt.
  • 4. Hemmung der Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese mit αvβ5-Antagonisten, gemessen durch den in vivo-Kaninchenaugenmodell-Test
  • Die Wirkung von Anti-αvβ5-Antagonisten auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese kann in den von Natur aus transparenten Strukturen z.B. der Hornhaut des Auges beobachtet werden. Neue Blutgefäße wachsen vom Rand der Hornhaut, der stark durchblutet ist, zur Mitte der Hornhaut hin, die normalerweise keine Blutgefäße aufweist. Wenn Stimulatoren der Angiogenese, z.B. VEGF und TGF-α, auf die Hornhaut aufgetragen werden, induzieren sie das Wachstum neuer Blutgefäße vom Rand der Hornhaut aus. Wenn Antagonisten der Angiogenese auf die Hornhaut aufgetragen werden, hemmen sie das Wachstum neuer Blutgefäße vom Rand der Hornhaut aus. So erfolgt die Angiogenese in der Hornhaut, indem Endothelzellen vom Rand der Hornhaut aus in das feste Kollagen-gepackte Hornhautgewebe eindringen, dies ist leicht zu sehen. Deshalb stellt der Kaninchenaugenmodell-Test ein in vivo-Modell bereit, mit dem eine Stimulation oder Hemmung der Angiogenese nach Implantieren von Verbindungen direkt in die Hornhaut des Auges direkt festgestellt werden kann.
  • A. in vivo-Kaninchenaugenmodell-Test
  • 1) Angiogenese, die durch Wachstumsfaktoren induziert wird
  • Die Angiogenese wurde im in vivo-Kaninchenauenmodell-Test mit Wachstumsfaktoren induziert und wird im Folgenden beschrieben.
  • a) Herstellen von Hydron-Pellets, die einen Wachstumsfaktor und monoclonale Antikörper enthalten
  • Hydron-Polymer-Pellets, die einen Wachstumsfaktor und monoclonale Antikörper (mAbs) enthalten, wurden wie von D'Amato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 4082–4085, 1994, beschrieben hergestellt. Die einzelnen Pellets enthielten 750 ng des Wachstumsfaktors (auch als Cytokin bezeichnet), insbesondere entweder bFGF oder VEGF, gebunden an Sucralfat (Carafate) (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation, Cincinnati, OH), um die Cytokine zu stabilisieren und sicherzustellen, dass sie langsam in das umgebende Gewebe freigesetzt werden. Außerdem wurden Hydron-Pellets her gestellt, die entweder 40 μg des mAb P1F6 (Anti-αvβ5) oder des Kontroll-Antikörpers LM609 (Anti-αvβ3) in PBS enthielten.
  • Alle mAbs, die getestet werden, wurden aus Aszitesflüssigkeit unter Verwendung einer Protein-A Sepharose CL-4B Affinitäts-Säulen-Chromatographie gemäß bekannten Verfahren gereinigt. Danach wurde das eluierte Immunglobulin gegen PBS dialysiert und mit Detoxi-Gel (Pierce Chemicals, Rockford, IL) behandelt, um Endotoxin zu entfernen. Es wurde gezeigt, dass Endotoxin ein starkes angiogenes und entzündungsförderndes Stimulans ist. Deshalb wurden monoclonale Antikörper mit dem chromogenen Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test (BioWhittaker, Walkersville, MD) auf das Vorliegen von Endotoxin getestet, und nur diejenigen mAbs ohne nachweisbares Endotoxin wurden im Kaninchenaugenmodell-Test verwendet.
  • Die Pellets wurden anhand von speziell hergestellten Teflonstiften gegossen, in deren Oberflächen ein Bohrkern von 2,5 mm gebohrt worden war. In jeden Stift wurden etwa 12 μl Vergussmaterial gegossen und über Nacht unter einer sterilen Haube polymerisiert. Danach wurden die Pellets durch UV-Bestrahlung sterilisiert.
  • Eine Gruppe von acht Tieren wurde für gepaarte Augenexperimente verwendet, wobei jedes Tier ein Hydron-Implantat erhielt, das ein vorher gewähltes Cytokin zusammen mit einem vorher gewählten Antikörper oder einem Kontroll-Immunoglobin enthielt. Insbesondere wurde bei jedem Kaninchen in die eine Hornhaut ein Hydron-Pellet chirurgisch implantiert, das entweder bFGF oder VEGF in Kombination mit dem mAb P1F6 enthielt, und die andere Hornhaut wurde entweder mit bFGF oder mit VEGF in Kombination mit dem mAb LM609 behandelt. Die einzelnen Pellets wurden in chirurgisch hergestellte „Taschen" implantiert, die im mittleren Stroma der Hornhaut der Kaninchen angelegt wurden. Das operative Vorgehen erfolgte unter sterilen Bedingungen unter Verwendung eines Wild-Operationsmikroskops, Modell M691, das mit einem Strahlenteiler ausgestattet war, hieran war eine Kamera montiert, so dass die einzelnen Hornhäute fotografisch aufgezeichnet werden konnten. Im Hornhaut-Stroma wurde eine „Tasche" von 3 mm mal 5 mm hergestellt, indem mit einer 69-Beaver-Klinge ein 3-mm-Einschnitt bis zur Hälfte der Hornhautdicke angebracht wurde. Das Stroma wurde anhand eines Irisspatels peripher durchtrennt und das Pellet so implantiert, dass sein äußerer Rand einen Abstand von 2 mm zum Hornhautrand hatte.
  • Während der folgenden 12 Tage diffundierten die Cytokine und mAbs aus den implantierten Pellets in das umgebende Gewebe, wodurch die Angiogenese vom Rand der Hornhaut aus bewirkt wurde.
  • Die linken und rechten Hornhäute sind als OS bzw. OD bezeichnet. Danach wurden die Hornhäute zwölf Tage beobachtet. Am postoperativen Tag zehn wurden Fotos aufgenommen, dies ist der Zeitpunkt, an dem eine maximale Neovaskularisation vorliegt.
  • Die repräsentativen fotografischen Ergebnisse der vorstehenden Behandlungen mit Cytokin/mAb-Gemischen sind in den 1A bis 1D dargestellt. Die parallele quantitative Bestimmung der mAb-Hemmung der Cytokin-induzierten Angiogenese ist in den 2A und 2B dargestellt. In den 1A und 1D, in denen die Hornhäute mit den bFGF/P1F6- bzw. VEGF/LM609-Kombinationen in Kontakt gebracht worden waren, herrscht eine Cytokin-induzierte Angiogenese mit Ödem vor, die durch die großen Pfeile bezeichnet ist. Somit bewirkte der αvβ5-Antikörper P1F6 keine Hemmung der bFGF-induzierten Angiogenese. Genauso führte der αvβ3-Antikörper LM609 zu keiner Hemmung der VEGF-induzierten Angiogenese.
  • Im Gegensatz dazu wurde die Cytokin-induzierte Angiogenese durch die Antikörper gehemmt, wenn im Kaninchenmodell die Cytokin-mAb-Kombinationen von bFGF/LM609 und VEGF/P1F6 verwendet wurden, wie in den 1B bzw. 1C dargestellt ist. In diesen Figuren sind normale Gefäße des Bindehautrings zu sehen, die durch die kleinen Pfeile bezeichnet sind, dies zeigt die Wirksamkeit der Integrin-Antikörper beim Hemmen eines bestimmten Typs der Cytokin-induzierten Angiogenese.
  • Die Effekte einer spezifischen mAb-Integrin-Immunreaktivität auf die vorstehende Cytokin-induzierte Angiogenese werden außerdem quantitativ bestimmt, wie in den 2A und 2B dargestellt. Die Angiogenese wurde entweder mit bFGF oder mit VEGF stimuliert, wie in den 2A bzw. 2B dargestellt. Die behandelten Augen wurden täglich durch ein mit einer Nikon-Kamera ausgestattetes Wild-Operationsmikroskop fotografiert. Die Fotos wurden auf einem Kodak Ektachrom 64T Diafilm aufgezeichnet und die Bilder nach Erfassung durch ein abbildendes Densitometer Modell GS670 unter Verwendung der Molecular Analyst 1.1-Software von Biorad für eine Computer-gestütze quantitative Bestimmung umgewandelt. Die Histogramme zeigen den durchschnittlichen Bereich mit Neovaskularisation ± Standardfehler (n = 8 für jede von zwei Gruppen) nach Exposition gegenüber den Abs P1F6 oder LM609.
  • Wie in 2A dargestellt, reduzierte LM609 die bFGF-induzierte Angiogenese im Vergleich zur Behandlung des gepaarten Auges beim gleichen Tier mit P1F6 um 86% (p < 0,005, gepaarter t-Test). Wenn VEGF verwendet wurde, um die Angiogenese zu stimulieren, wie in 2B dargestellt, wurde die umgekehrte Wirkung festgestellt, wobei P1F6 den durchschnittlichen Bereich der Neovaskularisation im Vergleich zu dem LM609-behandelten Auge, bei dem eine minimale Wirkung auf die VEGF-induzierte Angiogenese vorlag, um 60% reduzierte (p < 0,03, gepaarter t-Test).
  • Es war signifikant, dass die Wirkung der Exposition gegenüber einem bestimmten mAb nur bei den neu Cytokin-induzierten Blutgefäßen erfolgte, während die im Randbereich („Perilimbus") bereits vorliegenden Gefäße durch die beiden mAbs nicht beeinflusst wurden, dies legt nahe, dass die festgestellten Effekte auf die sich neu bildenden Blutgefäße der Hornhaut beschränkt sind.
  • Ähnliche Tests werden mit den synthetischen Peptiden durchgeführt, die in Beispiel 3 hergestellt und wie nachstehend beschrieben zum Hemmen der Cytokin-induzierten Angiogenese verwendet wurden, die spezifisch mit der Expression von αvβ5 in Zusammenhang steht.
  • Um diese Ergebnisse zu bestätigen, die zeigen, dass die durch ein bestimmtes Cytokin induzierte Angiogenese nur durch einen Typ von Anti-Integrin-Antikörper beeinflusst wird, insbesondere dass der αvβ5-Integrin-Rezeptor bei der VEGF-induzierten Angiogenese eine Rolle spielt, wurde ein weiteres Neovasularisations-Modell der Hühner-Chorioallantoismembran (CAM) mit den Kombinationen von Cytokinen und Integrin-Antikörpern wie im nächsten Beispiel dargestellt getestet.
  • 5. Angiogenese im Hühner-Chorioallantoismembran-(CAM-)Präparat
  • A. Charakterisieren der unbehandelten CAM
  • 1) Herstellen der CAM
  • Die Angiogenese kann auf der Hühner-Chorioallantoismembran (CAM) induziert werden, nachdem die normale embryonale Angiogenese zur Bildung von reifen Blutgefäßen geführt hat. Es wurde gezeigt, dass die Angiogenese als Antwort auf spezifische Cytokine oder Tumorfragmente induziert wird, wie von Leibovich et al., Nature 329: 630, 1987; und Ausprunk et al., Am. J. Pathol. 79: 597, 1975, beschrieben. Die CAMs wurden aus Hühnerembryos hergestellt, sodann wurde hieran die Angiogenese induziert und diese wie nachstehend und in Beispiel 6 beschrieben mit den αvβ5-Antagonisten der vorliegenden Erfindung gehemmt.
  • Zehn Tage alte Hühnerembryos wurden von McIntyre Poultry (Lakeside, CA) bezogen und bei 37°C und bei 60% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Ein kleines Loch wurde am Ende des Eis direkt über dem Luftsack in der Schale gebohrt, wobei ein kleiner Handwerks- Bohrer verwendet wurde (Dremel, Division of Emerson Electric Co., Racine, WI). Ein zweites Loch wurde an der Breitseite des Eis in einem Bereich gebohrt, in dem keine embryonalen Blutgefäße vorlagen, dies wurde vorher durch Durchleuchten des Eis bestimmt. An das ursprüngliche Loch wurde ein negativer Druck angelegt, der dazu führte, dass die CAM (Chorioallantoismembran) von der Schalenmembran weggezogen wurde und ein falscher Luftsack über der CAM entstand. Sodann wurde ein Fenster von 1,0 Zentimeter (cm) × 1,0 cm im Quadrat über der weggezogenen CAM aus der Schale ausgeschnitten, indem eine kleine Schleifscheibe (Dremel) verwendet wurde. Das kleine Fenster machte einen direkten Zugang zu der darunter liegenden CAM möglich.
  • Anschließend wurde das resultierende CAM-Präparat nach zehn Tagen Embryogenese verwendet, zu diesem Zeitpunkt ist die Angiogenese bereits zurückgegangen. Das Präparat wurde auf diese Weise in der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei eine neuerliche Angiogenese als Antwort auf eine Cytokin-Behandlung induziert wurde.
  • 2) Histologie der CAM
  • Um die mikroskopische Struktur der Hühnerembryo-CAMs zu analysieren, wurden 6 μm dicke Schnitte für die Immunfluoreszenz-Analyse auf einem Kryostat-Mikrotom aus den gefrorenen Blöcken geschnitten.
  • Für eine unbehandelte, zehn Tage alte CAM ist ein Bereich typisch, der keine Blutgefäße aufweist. Da die Angiogenese im CAM-System in diesem Stadium der Embryogenese zurückgeht, kann das System in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um das Entstehen neuer Gefäße aus den vorliegenden Gefäßen der benachbarten Bereiche in die Bereiche der CAM hinein, in denen zu diesem Zeitpunkt keinerlei Blutgefäße vorliegen, mit verschiedenen Cytokinen zu stimulieren.
  • Wie im CAM-Modell und in den folgenden Beispielen gezeigt wird, exprimieren die Blutgefäße, während sie in der normalen Embryogenese oder durch Cytokine induziert ein neues Wachstum durchlaufen, αvβ3 und αvβ5.
  • B. Angiogenese, die durch Wachstumsfaktoren induziert wird
  • Es wurde gezeigt, dass die Angiogenese durch Cytokine oder Wachstumsfaktoren induziert wird, wie im Kaninchenaugenmodell in Beispiel 4A beschrieben. In den hier beschriebenen Experimenten wurde die Angiogenese genauso wie im Kaninchen-Hornhautpräparat von Beispiel 4 durch die Wachstumsfaktoren induziert, die auf die CAM-Blutgefäße wie hier beschrieben topisch aufgetragen wurden.
  • Die Angiogenese wurde induziert, indem ein 5 Millimeter (mm) × 5 mm großes Whatman-Filterscheibchen (Whatman Filter Papier Nr. 1), gesättigt mit bilanzierter Salzlösung nach Hank („Hanks Balanced Salt Solution", HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) oder HBSS, die vorher ausgewählte Cytokine in einer vorher ausgewählten Konzentration enthielt, d.h. um die Wirkung hiervon auf die Angiogenese zu testen, auf die CAM eines zehn Tage alten Hühnerembryos in einen Bereich, in dem sich keine Blutgefäße befanden, gelegt wurde und die Fenster später mit einem Klebeband dicht verschlossen wurden. Die Angiogenese wurde durch Foto-Mikroskopie nach 72 Stunden überwacht. Die CAMs wurden schnell eingefroren und anschließend 6 μm Kryostat-Schnitte mit Aceton fixiert und durch Immunfluoreszenz wie in Beispiel 2B und 2C beschrieben mit 10 μg/ml von ausgewählten Anti-Integrin-Antikörpern, umfassend diejenigen, die gegen αvβ5 gerichtet sind, wie in Beispiel 1 beschrieben gefärbt.
  • Frühere Studien von Brooks et al., Science 264: 569–571, 1994, haben gezeigt, dass Blutgefäße sowohl in den mit bFGF als auch in den mit TNF-α behandelten Präparaten sogleich sichtbar werden, dass sie jedoch in der unbehandelten CAM nicht vorliegen. Außerdem haben die Autoren gezeigt, dass die Expression von αvβ3 nach der bFGF-induzierten Angiogenese erhöht war. Während sich die Expression von Integrin-β1 im Vergleich zu einer unbehandelten CAM nicht änderte, war β1 auf stimulierten Blutgefäßen auch sogleich nachweisbar.
  • Diese veröffentlichten Ergebnisse zeigten, dass sowohl beim Menschen als auch beim Huhn die an der Angiogenese beteiligten Blutgefäße eine gesteigerte Expression von αvβ3 zeigten. Hiermit stimmt überein, dass die Expression von αvβ3 auf gezüchteten Endothelzellen durch verschiedene Cytokine in vitro induziert wurde, wie von Janat et al., J. Cell Physiol. 151: 588, 1992; Enenstein et al., Exp. Cell Res. 203: 499, 1992; und Swerlick et al., J. Invest. Derm. 99: 715, 1993, beschrieben.
  • In der vorliegenden Erfindung wurde nun ein getrennter Cytokin-vermittelter Stoffwechselweg zum Stimulieren der Angiogenese bestimmt, der von der Expression und Aktivierung eines anderen adhäsiven Integrin-Rezeptors, αvβ5, abhängig ist. In Beispiel 6 wird die Wirkung beschrieben, die eine Exposition einer CAM wie hier beschrieben gegenüber den Cytokinen VEGF, TGF-α und EGF auf die Expression von αvβ5, auf die Angiogenese und auf deren Hemmung mit αvβ5-Antagonisten hat.
  • C. Angiogenese, die durch Tumoren induziert wird
  • Um die Rolle von αvβ5 in der Tumor-induzierten Angiogenese zu untersuchen, werden verschiedene αvβ5-negative menschliche Melanom- und Karzinomfragmente im CAM-Test eingesetzt, die vorher gezüchtet und aus der CAM eines 17 Tage alten Hühnerembryos isoliert werden, wie von Brooks et al., J. Cell Biol. 122: 1351, 1993, und hier beschrieben.
  • Die Angiogenese wird im CAM-Testsystem durch direktes Auflegen eines Tumorfragments auf die CAM induziert. Die Hühnerembryo-CAM wird entsprechend dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt. Anstelle eines Filterpapierscheibchens wird ein Fragment mit einem Gewicht von 50 Milligramm (mg) bis 55 mg eines bestimmten αvβ5-negativen Tumors, der durch Züchten von Zelllinien-Suspensionen wie nachstehend beschrieben erzeugt wurde, in einem Bereich auf die CAM aufgelegt, der ursprünglich keine Blutgefäße aufweist.
  • Die Zelllinien, Rabdomyosarkom-, myeloische (HL-60 oder KG-1) und Lymphoid-(T-Zellen – Jurkat, HPB/ALL, PEER; und verschiedene B-Zelllinien), wie von Pasqualini et al., J. Cell Sci. 105: 101–111, 1993, beschrieben, werden verwendet, um die soliden menschlichen Tumoren auf den CAMs der Hühnerembryos zu züchten. Zuerst wird eine Einzelzellsuspension der verschiedenen Zelllinien auf die CAMs in einem Gesamtvolumen von 30 μl steriler HBSS aufgetragen. Die Fenster werden mit Klebeband dicht verschlossen und die Embryos sieben Tage inkubiert, um das Wachstum menschlicher Tumorläsionen zuzulassen. Am Ende der sieben Tage, der Embryo ist jetzt 17 Tage alt, werden die Tumoren aus den CAMs ausgeschnitten und von dem umgebenden CAM-Gewebe gereinigt. Für die Verwendung in der Angiogenese werden die Tumoren in Tumorfragmente zu 50 mg bis 55 mg geschnitten. Die Tumorfragmente werden auf einen neuen Satz von zehn Tage alten Hühnerembryo-CAMs wie in Beispiel 5A be schrieben in einem Bereich aufgelegt, in dem normalerweise keine Blutgefäße vorliegen.
  • Danach werden die Tumoren, die auf den Hühnerembryo-CAMs mit und ohne topische oder intravenöse Verabreichung von αvβ5-induzierenden Cytokinen (VEGF, TGF-α oder EGF) in vivo gewachsen sind, mit den mAbs P1F6 oder P5H9 wie vorher beschrieben auf eine αvβ5-Expression angefärbt.
  • Diese CAM-Tumorpräparate werden anschließend wie in den Beispielen 6C und 6D beschrieben behandelt, um die Effekte von Antikörpern und Peptiden auf die Tumor-induzierte Angiogenese zu messen.
  • In einer Ausführungsform wurden in dem vorstehend beschriebenen CAM-Test für die Bildung von Melanomtumoren die Hamster-Melanomzellen CS-1 verwendet, die von Dr. Caroline Damsky von der University of California, San Francisco, bereitgestellt worden waren. Nach dem Transfer eines CS-1-Tumorfragments von etwa 50 mg auf eine neue zehn Tage alte Hühnerembryo-CAM erhielten getrennte Präparate intravenöse Injektionen entweder mit 100 μg oder mit 300 μg des Antikörpers P1F6, des Antikörpers LM609 oder des Kontrollantikörpers CSAT (Anti-β1). Eine weitere Kontrolle umfasste ein Präparat, das gar nicht behandelt wurde. Die Ergebnisse werden im nachstehenden Beispiel 6D besprochen.
  • 6. Hemmung der Angiogenese, die im CAM-Test gemessen wurde
  • A. Hemmung der Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese durch intravenöse Verabreichung von Inhibitoren
  • Die Wirkung von monoclonalen Antikörpern, die intravenös in das CAM-Präparat injiziert wurden, auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese wurde zur Verwendung als ein in vivo-Modellsystem der vorliegenden Erfindung untersucht.
  • Nach der aktiven Neovaskularisation, sobald die Gefäße aufgehört haben sich zu entwickeln, nimmt die Expression von αvβ5 auf ein Niveau ab, das durch Immunfluoreszenzanalyse nicht mehr nachweisbar ist. Diese Regulation der Expression von αvβ5 in Blutgefäßen, bei denen eine Angiogenese stattfindet, im Gegensatz zum Fehlen der Expression in reifen Gefäßen, bietet für die vorliegende Erfindung die einmalige Möglichkeit, die Angiogenese zu kontrollieren und zu hemmen, wie nachstehend in dem als Modell verwendeten CAM-Angiogenese-Testsystem gezeigt wird.
  • Die Hühnerembryo-CAMs für die intravenösen Injektionen wurden im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben hergestellt.
  • Zuerst wurde die Angiogenese an zehn Tage alten Hühnerembryos durch Auflegen von Wachstumsfaktor-gesättigten Filterscheibchen induziert. Insbesondere in den ersten Tests wurde die Angiogenese durch Exposition gegenüber bFGF oder VEGF, jeweils bei einer Konzentration von 150 ng/ml, induziert.
  • Für die Anwendung von Wachstumsfaktoren wurden während der Durchleuchtungsprozeduren wichtige Blutgefäße ausgewählt und ihre Positionen an der Eischale markiert. Die Löcher wurden in die Schale gebohrt, die CAMs wurden heruntergedrückt und die mit Wachstumsfaktor gesättigten Filterpapiere sodann getrennt auf die CAMs gelegt wie vorstehend beschrieben. Die Fenster wurden mit sterilem Klebeband dicht verschlossen und die Embryos wieder in den Inkubator gelegt.
  • 24 Stunden später wurde in zweites kleines Fenster vorsichtig seitlich an der Eischale direkt über den vorher ausgewählten wichtigen Blutgefäßen eingeschnitten. Die äußere Eihülle wurde sorgfältig entfernt, so dass die embryonalen Membranen intakt blieben. Die Hüllmembran wurde mit einem kleinen Tropfen Mineralöl (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) durchsichtig gemacht, so dass die Blutgefäße leichter sichtbar gemacht werden konnten. Danach wurden Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 75 μg gereinigte sterile Anti-Integrin-Antikörper oder 75 μg synthetische Peptide (das cyclische Peptid RGDfV, SEQ ID NO: 4, und zur Kontrolle das cyclische Peptid RADfV, SEQ ID NO: 5) in PBS in Blutgefäße injiziert, die auf den Wachstumsfaktor-induzierten CAMs sichtbar waren. Die Fenster wurden mit Klebeband dicht verschlossen und die Embryos bis 72 Stunden inkubiert.
  • Die Filterscheibchen und die entsprechenden umgebenden CAM-Gewebe wurden in einem Stereomikroskop fotografiert (3A bis 3F und 5A bis 5F) und der durchschnittliche Angiogenese-Index ± Standardfehler für zwölf CAMs pro Bedingung bestimmt (4A, 4B und 6A, 6B). Die Angiogenese wurde für jeden Embryo doppelblind bewertet, indem die Zahl und das Ausmaß der Verzweigungen von Blutgefäßen innerhalb des Bereichs jedes Scheibchens analysiert wurden. Die Bewertungsziffern lagen im Bereich von 1 (niedrig) bis 4 (hoch), und der Angiogenese-Index wurde bestimmt, indem ein Hintergrundwert von 1 von allen Werten abgezogen wurde.
  • Die Spezifität einer durch Integrin-Antikörper vermittelten Hemmung der Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese spiegelte im CAM-Modell die Ergebnisse wider, die im vorstehend beschriebenen Kaninchenhornhautmodell erhalten wurden. Wie in den 3A und 3B gezeigt wird, lösten sowohl bFGF als auch VEGF in den PBS-behandelten Kontroll-CAMs eine Angiogenese aus. Jedoch führte die Behandlung mit dem αvβ5-spezifischen Antikörper P1F6 zur Hemmung der VEGF-induzierten Angiogenese, wie in 3D dargestellt, während keine Hemmung auf die bFGF-induzierte Angiogenese nachgewiesen wurde, wie in 3C zu sehen ist. Im Gegensatz dazu hemmte der αvβ3-spezifische Antikörper LM609 die bFGF-induzierte Angiogenese (3E), hatte jedoch kaum eine Wirkung auf die Angiogenese in der VEGF-induzierten CAM (3F).
  • Außerdem sind diese Ergebnisse in den Säulendiagrammen der 4A und 4B für bFGF- bzw. VEGF-behandelte CAMs dargestellt, in denen der Angiogenese- Index gegen die LM609- oder P1F6-Exposition und außerdem gegen keine Antikörper-Exposition als Kontrolle aufgetragen ist. Die Hemmung der Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese durch Integrin-spezifische Antikörper ist also vom Typ des Wachstumsfaktors abhängig.
  • Die Exposition gegenüber RGD-enthaltenden Peptiden bestätigt die vorstehenden Ergebnisse. In Gegenwart von PBS führte die Exposition gegenüber sowohl bFGF als auch VEGF in der Kontroll-CAM zur Angiogenese, wie in den 5A und 5B zu sehen ist. Im Gegensatz dazu hob der gegen sowohl αvβ3 als auch αvβ5 gerichtete cyclische Peptid-Antagonist RGDfV (SEQ ID NO: 4) die entweder durch bFGF oder durch VEGF induzierte Angiogenese auf. Das cyclische Peptid RADfV (SEQ ID NO: 5) wirkte in den bFGF- oder VEGF-behandelten CAM-Präparaten nicht auf die Angiogenese. Die Ergebnisse sind auch in den 6A und 6B dargestellt, in denen der Angiogenese-Index von bFGF- und VEGF-stimulierten CAMs grafisch dargestellt ist, wobei die Exposition gegenüber Test- und Kontrollpeptiden gezeigt wird. Diese Ergebnisse zeigen also zusammen mit den in Kaninchenhornhaut erhaltenen Werten, dass die bFGF- und die VEGF-induzierte Angiogenese von unterschiedlichen, aber homologen αv-spezifischen Integrinen abhängig sind, die jedoch beide mit dem cyclischen Peptid RGDfV gehemmt werden können.
  • Weitere ähnliche Tests wurden mit synthetischen Peptiden durchgeführt, die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurden, um Peptide zu definieren, die eine Spezifität für eine mit αvβ5 und nicht mit αvβ3 zusammenhängende Angiogenese aufweisen. Außerdem werden die Tests mit den organischen Molekülen durchgeführt, die wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt wurden.
  • Die Spezifität einer Integrin-Antikörper-Hemmung der Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese wurde weiterhin bestätigt und bekräftigt, indem die Analysen der Induktion der Angiogenese durch Wachstumsfaktoren so erweitert wurden, dass sie den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), transformierenden Wachstumsfaktor-α (TGF-α) oder den Phorbolester 4-β-Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) enthielten.
  • Die vorstehenden Wachstumsfaktoren (Cytokine), umfassend bFGF und VEGF, wurden getrennt in einer Konzentration von 1,0 μg/ml an ein zehn Tage altes CAM-Modell wie früher beschrieben verabreicht. PMA wurde bei einer Konzentration von 20 ng/ml eingesetzt.
  • 24 Stunden nach der Wachstumsfaktor-Behandlung wurden die Antikörper LM609 und P1F6 oder der Proteinkinase-C-(PKC-)Inhibitor Calphostin C getrennt zu dem CAM-Modell zugegeben, entweder durch eine einzelne intravaskuläre Dosis wie vorstehend beschrieben oder durch eine topische Verabreichung wie nachstehend im nächsten Beispiel beschrieben. Für intravaskuläre Injektionen innerhalb des Zeitraums der folgenden drei Tage wurden die Antikörper in einer Konzentration von 75 μg pro Embryo und das Calphostin C in einer Dosis von 100 nM verwendet.
  • Am Tag 13 wurden die Filterscheibchen und das assoziierte CAM-Gewebe ausgeschnitten und mit einem Stereomikroskop auf Angiogenese analysiert. Die Angiogenese wurde doppelblind bewertet, indem die Zahl und das Ausmaß der Verzweigung der Blutgefäße innerhalb des Bereichs der Scheibchen analysiert wurden. Die Bewertungsziffern lagen im Bereich von 1 (niedrig) bis 4 (hoch). Der Angiogenese-Index wurde bestimmt, indem ein Hintergrundwert von 1 von allen Werten abgezogen wurde. Die Experimente wurden zwei- bis viermal mit fünf bis sechs Embryos pro Bedingung wiederholt.
  • Wie in den 7A und 7B gezeigt wird, blockierte der gegen αvβ3 gerichtete Antikörper LM609 die als Antwort auf bFGF und TNF-α entstehende Angiogenese, während der gegen αvβ5 gerichtete Antikörper P1F6 kaum eine Hemmwirkung hatte. Wie im Gegensatz dazu in den 7C bis 7E gezeigt wird, hemmte P1F6 wirksam die durch VEGF, TGF-α oder PMA induzierte Angiogenese, während LM609 dies nicht tat.
  • PMA, ein kräftiger Induktor der Angiogenese, ist in der Lage, die Proteinkinase C (PKC), eine intrazelluläre Familie von Serin-Threonin-Kinasen, zu aktivieren. Deshalb untersuchten wir auch die Effekte von Calphostin C, einem PKC-Inhibitor, auf die Angiogenese an der Hühner-CAM. Calphostin C blockierte die durch PMA (7E) und außerdem die durch VEGF und TGF-α induzierte Angiogenese (in 7C bzw. 7D dargestellt), während es minimale Effekte auf die durch bFGF oder TNF-α vermittelte Angiogenese hatte (in 7A bzw. 7B dargestellt).
  • Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass zwei getrennte unterschiedliche Angiogenese-Stoffwechselwege vorliegen, wobei der eine von einem αvβ3-vermittelten Signal abhängig ist, das größtenteils von PKC unabhängig ist, wie früher von Brooks et al., Science 264: 569–571, 1994, beschrieben, und wobei der zweite Stoffwechselweg durch ein αvβ5-vermitteltes Transduktionssignal bewirkt wird, das von der PKC-Aktivierung kritisch abhängig ist.
  • Zusätzlich zu den vorstehenden Experimenten wurde die Lage der mAbs P1F6 und LM609 in CAM-Geweben bestimmt, die intravenös mit LM609 behandelt worden waren, hierzu werden die fixierten Schnitte mit 2,5% BSA in HBSS eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert, worauf eine Färbung mit einer 1:250-Verdünnung eines sekundären, Rhodamin-markierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpers (Tago) folgt. Anschließend werden die Schnitte mit einem Zeiss-Mikroskop für immunfluoreszierende Verbindungen untersucht.
  • B. Hemmung der Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese durch topische Verabreichung von Inhibitoren
  • Um die Frage zu klären, ob αvβ5 eine aktive Rolle in der Angiogenese spielt, werden die mit den vorstehend beschriebenen Wachstumsfaktoren gesättigten Filterscheibchen auf CAMs gelegt, um die Angiogenese zu induzieren, anschließend wird P1F6 oder LM609 aufgetragen.
  • Danach werden die Scheibchen nach 0, 24 und 48 Stunden mit 50 ml HBSS, enthaltend 25 mg des mAb, in einem Gesamtvolumen von 25 μl steriler HBSS versetzt. Nach 72 Stunden werden die CAMs geerntet, in eine 35-mm-Petrischale überführt und einmal mit 1 ml PBS gewaschen. Anschließend wird die Unterseite von Filterpapier und CAM-Gewebe unter einem Olympus-Stereomikroskop durch zwei Personen in doppelblinder Weise untersucht. Die Hemmung der Angiogenese wird als signifikant angesehen, wenn die CAMs eine Reduktion von > 50% der Infiltration von Blutgefäßen der CAM direkt unter dem Scheibchen aufweisen. Die Experimente werden viermal pro Antikörper mit sechs bis sieben Embryos pro Bedingung wiederholt.
  • Um die Effekte der Integrin-Antikörper auf bereits existierende reife Blutgefäße zu untersuchen, die aus der normalen Gefäßentwicklung in der Nähe der Bereiche stammen, in denen keine Gefäße vorliegen, werden mit mAbs gesättigte Filterscheibchen auf vaskularisierte Regionen von CAMs von zehn Tage alten Embryos aufgelegt, bei denen keine Cytokine topisch verabreicht werden.
  • Außerdem werden CAM-Tests mit den synthetischen Peptiden der vorliegenden Erfindung durchgeführt, um die Wirkung von cyclischen und linearisierten Peptiden auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese zu bestimmen. 8 μg der Peptide, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, werden getrennt in einem Gesamtvolumen von 25 μl steriler HBSS angewendet. Die Peptidlösung wird sofort und dann erneut nach 24 und 48 Stunden auf das CAM-Präparat aufgetragen. Nach 72 Stunden werden das Filterpapier und das umgebende CAM-Gewebe ausgeschnitten und wie vorstehend beschrieben begutachtet.
  • Ähnliche Tests werden mit den organischen Molekülen durchgeführt, die wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt wurden.
  • C. Hemmung der Tumor-induzierten Angiogenese durch topische Verabreichung
  • 1) Behandlung mit monoclonalen Antikörpern
  • Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Angiogenese-Tests, in denen die Effekte eines Anti-αvβ5-Antikörpers und von Peptid-Antagonisten untersucht wurden, wird auch noch die Rolle von αvβ5 in der Tumor-induzierten Angiogenese erforscht. Als Induktor werden αvβ5-negative menschliche Gewebe verwendet, die vorher gezüchtet und aus der CAM eines 17 Tage alten Hühnerembryos isoliert wurden. Die Fragmente werden wie in Beispiel 5C beschrieben hergestellt.
  • Wie vorstehend beschrieben werden die mAbs getrennt topisch auf die Tumorfragmente in einer Konzentration von 25 μg in 25 μl HBSS aufgetragen und anschließend die Fenster mit Klebeband verschlossen. Die mAbs werden erneut nach 24 Stunden und 48 Stunden in gleicher Weise zugegeben. Nach 72 Stunden werden die Tumoren und die umgebenden CAM-Gewebe wie vorstehend beschrieben analysiert.
  • Wie in Beispiel 5C beschrieben werden die Tumoren ursprünglich hergestellt, indem menschliche Zelllinien, die das Integrin αvβ5 nicht exprimieren, auf die CAMs von zehn Tage alten Embryos transplantiert werden.
  • Die Wirkung der mAbs auf die Tumor-induzierte Angiogenese wird quantitativ bestimmt, indem die Blutgefäße, die in den Tumor innerhalb der Fokusebene der CAM eindringen, unter einem Stereomikroskop durch zwei Personen in doppelblinder Weise gezählt werden.
  • Die in Beispiel 3 hergestellten synthetischen Peptide und die in Beispiel 10 hergestellten organischen Moleküle werden genauso an das CAM-Testsystem der Tumor-induzierten Angiogenese topisch verabreicht wie vorstehend beschrieben. Die Wirkung der Peptide und der organischen Moleküle auf die Lebensfähigkeit der Gefäße wird genauso festgestellt.
  • D. Hemmung der Tumor-induzierten Angiogenese durch intravenöse Verabreichung
  • 1) Behandlung mit monoclonalen Antikörpern
  • Die vorstehend hergestellten Tumor-induzierten Blutgefäße wurden auch mit mAbs behandelt, die durch intravenöse Injektion verabreicht wurden. CS-1-Melanom-Tumoren wurden auf die CAMs wie in Beispiel 5C beschrieben aufgelegt und die Fenster mit Klebeband dicht verschlossen, sodann wurden 24 Stunden später 100 bis 300 μg der gereinigten mAbs einmal intravenös an die Blutgefäße des Hühnerembryos wie früher beschrieben verabreicht. Danach wurden die Hühnerembryos sieben Tage inkubiert. Anschließend wurde das Ausmaß der Angiogenese wie vorstehend beschrieben festgestellt. Nach dieser Zeitspanne wurden die Tumoren ausgeschnitten und gewogen, um die Wirkung der Antikörper-Exposition auf Wachstum oder Suppression des Tumors zu bestimmen.
  • Die Ergebnisse der Behandlung von CS-1-Tumoren mit 300 μg des αvβ5-spezifischen Antikörpers P1F6 sind in 8 dargestellt. Das Gewicht des Tumors war dramatisch auf weniger als 50 mg reduziert, wenn man es mit unbehandelten und CSAT-behandelten Tumoren verglich. Der αvβ3-spezifische Antikörper LM609 hemmte auch das Tumorwachstum, jedoch war er weniger wirksam als P1F6. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit Tumoren erhalten, die mit 100 μg P1F6 behandelt wurden. So mit hemmte P1F6 wirksam die αvβ5-vermittelte Angiogenese in einem Tumormodell auf einem CAM-Präparat, wodurch die Tumorzellmasse reduziert wurde.
  • 2) Behandlung mit synthetischen Peptiden
  • Außerdem werden die Effekte von Peptidmolekülen auf die Tumor-induzierte Gefäßbildung im CAM-Testsystem ermittelt. Das Tumor-CAM-Präparat wird wie vorstehend beschrieben verwendet, mit der Ausnahme, dass anstelle der intravenösen Injektion eines mAb die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellten Peptide getrennt intravenös in sichtbare Blutgefäße injiziert werden.
  • 7. Identifizieren von αvβ5-spezifischen Antagonisten, nachgewiesen durch einen Ligand-Rezeptor-Bindungstest
  • Die αvβ5-immunreaktiven Antikörper und synthetischen Peptide, die in Beispiel 1 bzw. 3 hergestellt wurden, werden gescreent, indem ihre Fähigkeit zum Antagonisieren der αvβ5-, αvβ3- und αIIbβ3-Rezeptor-Bindungsaktivität in gereinigten Ligand-Rezeptor-Bindungstests gemessen wird. Das Verfahren für diese Bindungstests wurde von Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10003–10007, 1993; Smith et al., J. Biol. Chem. 265: 11008–11013, 1990; und Pfaff et al., J. Biol. Chem. 269: 20233–20238, 1994, beschrieben.
  • Ein Verfahren zum Identifizieren von Antagonisten in einem Ligand-Rezeptor-Bindungstest wird beschrieben, bei dem der Rezeptor an einen festen Träger immobilisiert ist und der Ligand und der Antagonist löslich sind. Außerdem wird ein Ligand-Rezeptor-Bindungstest beschrieben, bei dem der Ligand an einen festen Träger immobilisiert ist und der Rezeptor und die Antagonisten löslich sind.
  • Kurz gesagt werden ausgewählte gereinigte Integrine getrennt in Titertek-Mikrotiter-Vertiefungen bei einer Beschichtungskonzentration von 50 Nanogramm (ng) pro Vertiefung immobilisiert. Die Reinigung der Rezeptoren, die in Ligand-Rezeptor-Bindungstests verwendet werden, ist nach dem Stand der Technik bekannt und kann anhand von Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann geläufig sind. Nach 18 Stunden Inkubieren bei 4°C werden unspezifische Bindungsstellen auf der Platte mit 10 Milligramm/Milliliter (mg/ml) Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung blockiert. In Hemmstudien werden verschiedene Konzentrationen von ausgewählten Antikörpern oder Peptiden auf die Fähigkeit getestet, die Bindung von 125I-Vitronectin oder anderen markierten Liganden an die Integrin-Rezeptoren αvβ5, αvβ3, αvβ1 und αIIbβ3 zu blockieren.
  • Obwohl diese Liganden eine optimale Bindung für ein bestimmtes Integrin zeigen, Vitronectin für αvβ5 und αvβ3 und Fibrinogen für αIIbβ3, erlaubt es die Hemmung von Bindungsstudien unter Verwendung von Antikörpern oder Peptiden zum Blockieren der Bindung von Vitronectin an einen der Rezeptoren, die Menge des Peptids, das erforderlich ist, um die Bindung des Rezeptors an den Liganden halb-maximal zu hem men, in Mikromol (μMol) genau zu bestimmen. Radiomarkierte Liganden werden in Konzentrationen von 1 nM eingesetzt, außerdem wird die Bindung getrennt mit nicht-markierten synthetischen Peptiden provoziert. Nach einer dreistündigen Inkubation wird der freie Ligand durch Waschen entfernt und der gebunden Ligand durch Gammazählung nachgewiesen.
  • Auf diese Weise wird der hier beschriebene Ligand-Rezeptor-Test verwendet, um ringförmige oder linearisierte synthetische Peptide zusammen mit monoclonalen Antikörpern und organischen Molekülen zu screenen, die eine selektive Spezifität für einen bestimmten Integrin-Rezeptor, insbesondere αvβ5, aufweisen, wie sie beim Durchführen der vorliegenden Erfindung als Vitronectin-Rezeptor-(αvβ5-)Antagonisten eingesetzt werden.
  • 8. In vivo-Regression des Wachstums von Tumorgewebe mit αvβ5- Antagonisten, gemessen durch einen chimären Maus/Mensch-Test
  • Ein chimäres in vivo-Maus/Mensch-Modell wurde hergestellt, indem ein Teil der Haut einer SCID-Maus durch eine menschliche Neugeborenen-Vorhaut ersetzt wurde. Das chimäre in vivo-Maus/Mensch-Modell wurde im Wesentlichen wie in Yan et al., J. Clin. Invest. 91: 986–996, 1993, beschrieben hergestellt. Kurz gesagt wurde ein quadratischer Bereich von 2 cm2 Haut aus der SCID-Maus (6 bis 8 Wochen alt) chirurgisch entfernt und durch eine menschliche Vorhaut ersetzt. Die Maus wurde anästhesiert und das Fell in einem 5-cm2-Bereich auf jeder Seite der seitlichen Bauchregion abrasiert. Zwei runde Transplantatbetten von 2 cm2 wurden präpariert, indem die Haut in der ganzen Dicke bis zur Fascia entfernt wurde. Dann wurden menschliche Hauttransplantate in vollständiger Dicke der gleichen Größe, die von einer menschlichen Neugeborenen-Vorhaut stammten, auf die Wundbetten aufgelegt und an Ort und Stelle vernäht. Das Transplantat wurde mit Band-Aid abgedeckt, das mit der Haut vernäht wurde. Außerdem wurde die Wunde mit einem mikroporösen Gewebeklebeband abgedeckt.
  • Nachdem das Hauttransplantat etabliert war, wurde die menschliche Vorhaut mit Melanomzellen infiziert. Die menschliche Melanomzelllinie M21L wurde verwendet, um auf den menschlichen Hauttransplantaten auf den SCID-Mäusen solide menschliche Tumoren zu bilden. Eine Einzelzellsuspension mit 2 × 106 M21L wurde intradermal in das menschliche Hauttransplantat injiziert. Danach wurden die Mäuse zwei bis vier Wochen beobachtet, ob bei ihnen messbare menschliche Tumoren wuchsen.
  • Nachdem sich ein messbarer Tumor gebildet hatte, wurden entweder 250 μg des Peptids (in einem Volumen von 100 μl) mit der SEQ ID NO: 9 (cyclisches RGD-enthaltendes Peptid, Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-methyliertes-Val) oder eines Kontrollpeptids, Cyclo-Arg-βAla-Asp-D-Phe-Val, dreimal pro Woche, drei Wochen lang, intraperitoneal in die Maus injiziert. Am Ende dieses Zeitraums wurde der Tumor ausgeschnitten und auf Gewicht und Histologie analysiert.
  • Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt, wobei das Tumorvolumen in mm3 auf der y-Achse gegen die Peptidbehandungen auf der x-Achse aufgetragen ist. Das Testpeptid mit der SEQ ID NO: 9, das in der Figur als Peptid 189 angegeben ist, reduziert das Tumorvolumen auf etwa 25 mm3 im Vergleich zum Kontrollpeptid signifikant (das als Peptid 601 angegeben ist), bei dem das Tumorvolumen mehr als 300 mm3 betrug.
  • Somit führte die Blockierung des αvβ5-Rezeptors durch die intravenöse Verabreichung des αvβ5-Antagonisten Peptid 189 in diesem Testsystem in gleicher Weise wie in den CAM- und Kaninchenaugen-Modellsystemen wie früher beschrieben zu einer Regression eines Melanomtumors.
  • Das vorstehende chimäre SCID/Mensch-Modell wird auch verwendet, um die Wirksamkeit anderer αvβ5-Antagonisten der vorliegenden Erfindung zu bestimmen, nämlich von Antikörpern und organischen Molekülen, wobei die letzeren wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt werden.
  • 9. Herstellen eines murinen Maus-Modells für die αvβ5-vermittelte Angiogenese der Netzhaut und deren Hemmung mit αvβ5-Antagonisten
  • Aufgrund der in Beispiel 2C gemachten Beobachtung, dass αvβ3 und αvβ5 in neovaskulärem Netzhautgewebe exprimiert werden, wurde ein neues Mausmodell verwendet, um die Effekte von systemisch verabreichten cyclischen Peptid-Antagonisten der beiden Integrine auf die Angiogenese der Netzhaut zu untersuchen. In neugeborenen Mäusen entwickeln sich während der ersten zwei Wochen nach der Geburt Gefäße in der Netzhaut, während dieser Zeitspanne bildet die oberflächliche Netzhaut-Gefäßstruktur ein reiches, stark verzweigtes Netzwerk von Gefäßen, die ihren Ursprung am Sehnerv-Kopf haben und sich peripher ringförmig ausbreiten, so dass sie die Netzhautoberfläche bedecken, wobei dies in einer Weise erfolgt, wie es auch bei anderen Säugern und Menschen festgestellt wurde (Jiang et al., Glia 15: 1–10, 1995).
  • Für das Modell wurde in neugeborene Mäuse zweimal täglich, für vier Tage, beginnend am Tag 0, das cyclische Peptid RGDfV (SEQ ID NO: 4) (auch als Peptid 203 bezeichnet) oder das Kontrollpeptid RADfV (SEQ ID NO: 5) subkutan injiziert. Am Tag fünf nach der Geburt wurden die Augäpfel entfernt und in 4,0% Paraformaldehyd (PFA) bei Raumtemperatur fixiert.
  • Um die Angiogenese in der Netzhaut der Maus quantitativ zu bestimmen, wurde der Abstand vom Sehnerv-Kopf bis zum am weitesten entfernt liegenden Punkt eines einzelnen Gefäßes in jedem von sechs gleichen Sektoren in Form eines Zwölf-Stunden-Ziffemblatts gemessen. Der durchschnittliche Abstand wurde berechnet und anhand der entsprechenden, aus einem ganzen Wurf erhaltenen Daten als Mittelwert errechnet. Das Gesamtvolumen der Blutgefäße der Netzhaut wurde gemessen, indem die gesamte Probe in 2,0-μm-optischen Abschnitten gescannt und digital gespeichert wurde. Danach wurde die „Seed"-Funktion der Lasersharp-Software von Bio-Rad verwendet, um in jedem Abschnitt den Schwellenwert zu bestimmen und kubische Pixel zu zählen. Ein Makro wurde geschrieben, mit dem das Volumen aller Schnitte summiert und der Wert für alle Gefäßstrukturen bestimmt wurde.
  • Wenn man das Gefäßwachstum anhand von Fotos in zwei Dimensionen maß, zeigte sich, dass der systemisch verabreichte Peptid-Antagonist 203 die Gefäßbildung in der Netzhaut im Vergleich zum Kontrollpeptid um 44% hemmte (n = 9, p < 0,0000001, gepaarter t-Test). Zwischen den unbehandelten neugeborenen Mäusen und den fünf Tage alten Mäusen, die das Peptid 203 erhielten, war kein statistischer Unterschied zu sehen, somit hemmt das Peptid wirksam die Gefäßbildung. Außerdem war kein statistischer Unterschied zwischen den unbehandelten fünf Tage alten Mäusen und den gleichaltrigen Mäusen, die das Kontrollpeptid erhielten, zu sehen. Somit ist die Hemmung der Gefäßbildung in der Netzhaut bei RGDfV-behandelten neugeborenen Mäusen im Vergleich zu den unbehandelten Pendants zu 100% wirksam.
  • Wenn man eine quantitativere Analyse verwendete, bei der die dreidimensionale Natur des Gefäßwachstums berücksichtigt wurde, war bei den mit Peptid 203 behandelten Tieren im Vergleich zu den Kontrollen eine Reduktion des Gefäßvolumens der Netzhaut von 78% zu sehen. Das durchschnittliche Volumen der Gefäße am Tag fünf nach der Geburt betrug bei den 203-behandelten Tieren 3,6 × 106 μm3 und bei den Kontroll-behandelten Tieren 15,7 × 106 μm3. Das Volumen, das die Netzhaut-Blutgefäße in unbehandelten neugeborenen Mäusen aufwiesen, war von dem von fünf Tage alten 203-behandelten Tieren nicht zu unterscheiden.
  • Die vorstehend erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Antagonisten spezifisch die Bildung neuer Blutgefäße blockierten und keine Wirkung auf etablierte Gefäße hatten. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass sich der pathologische Befund der retinalen neovaskulären Krankheit von demjenigen unterscheidet, der bei der subretinalen neovaskulären Krankheit zu sehen ist, und dass Patienten mit einer zum Erblinden führenden Augenkrankheit, die mit einer Angiogenese assoziiert ist, mit Antagonisten von αvβ5 wirksam behandelt werden können.
  • Die vorstehende Beschreibung wird als ausreichend angesehen, um einen Fachmann in die Lage zu versetzen, die Erfindung durchzuführen. Dabei werden zusätzlich zu den hier dargestellten und beschriebenen Modifikationen der Erfindung für den Fachmann noch weitere Modifikationen aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich sein, wobei diese im Umfang der durch die beigefügten Patentansprüche definierten Erfindung enthalten sind.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001

Claims (5)

  1. Verwendung eines αvβ5-Antagonisten zum Herstellen eines Medikaments zum Hemmen einer αvβ5-vermittelten Angiogenese in einem αvβ5-enthaltenden Gewebe, wobei die Angiogenese bei einem Patienten vorliegt, der an einer neovaskulären Störung der Hornhaut des Auges leidet, die aus der Gruppe von Störungen ausgewählt ist, die aus Hornhauttransplantation, Herpes-Keratitis, Lues-Keratitis, Pterygium und neovaskulärem Pannus, assoziiert mit dem Tragen von Kontaktlinsen, besteht, und wobei der αvβ5-Antagonist ein RGD-enthaltendes Polypeptid ist.
  2. Verwendung eines αvβ5-Antagonisten nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cyclo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO: 4), Cyclo-(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO: 6), Cyclo-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID NO: 7), Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe (SEQ ID NO: 8) und einem Salz davon besteht.
  3. Verwendung eines αvβ5-Antagonisten nach Anspruch 2, wobei das Salz ein Hydrochlorid ist.
  4. Verwendung eines αvβ5-Antagonisten nach Anspruch 1, wobei der αvβ5-Antagonist in einer die Angiogenese hemmenden Menge von 2 μM bis 5 mM vorliegt.
  5. Verwendung eines αvβ5-Antagonisten nach Anspruch 1, wobei das Medikament für die intraokulare Verabreichung vorgesehen ist.
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