JPH11511171A - α▲下Ｖ▼β▲下５▼仲介血管形成の阻止に有効な方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ビトロネクチンα_vβ₅拮抗体を用いて組織における血管形成を阻止する方法を述べるものである。α_vβ₅仲介血管形成は、血管内皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−α及び表皮増殖因子を含むサイトカインへの曝露と相関する。α_vβ₅拮抗体を含む治療組成物を用いるα_vβ₅仲介血管形成の阻止は、眼血管内皮細胞血管新生疾患、腫瘍増殖及び炎症症状において特に好適である。

Description

【発明の詳細な説明】 α_vβ₅仲介血管形成の阻止に有効な方法及び組成物政府援助 本発明は、国立予防衛生研究所の国立癌研究所による契約第CA45726号及び同 第CA50286号に基づく政府援助によって行われた。政府は、本発明の権利を所有 する。技術的分野 本発明は、一般的には、医薬品の分野に関し、詳細には、ビトロネクチンレセ プターα_vβ₅の拮抗体を用いて組織のα_vβ₅仲介血管形成を阻止する方法及び組 成物に関する。背景 インテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質を結合し、通常は細胞接着現 象と言われる細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリックス相互作用を仲介すること が既知の細胞レセプターの一種である。しかしながら、多くのインテグリンとそ の各リガンドが文献に記載されているが、インテグリンの多くの生物学的機能は 依然としてわかりにくいままである。インテグリンレセプターは、α及びβサブ ユニットからなるヘテロ二量体非共有結合糖タンパク質の構造上の特徴を共有し たタンパク質ファミリーを構成している。 ビトロネクチンに優先的に結合することの最初の特性に対して名付けられたビ トロネクチンレセプターは、現在、α_vβ₁、α_vβ₃及びα_vβ₅と称される３種類 の異なるインテグリンを示すことが既知である。Horton，Int ．J．Exp．Pathol. ， 71:741-759(1990)。α_vβ₁は、フィブロネクチン及びビトロネクチンと結合す る。α_vβ₃は、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、トロンボスポンジン 、ビトロネクチン、フォンビルブラント因子、オステオスポンチン及び骨シアロ プロテインＩを含む種々のリガンドと結合する。α_vβ₅は、ビトロネクチンと結 合する。組織内の多くの細胞相互作用においてそれらの３種類のインテグリンが 果たす特定の細胞接着の役割はなお研究中である。しかしながら、 生物学的機能が異なる種々のインテグリン及び生物学的特異性を共有する種々の インテグリンとサブユニットがあることは明らかである。 多くのインテグリンに対するリガンドの重要な認識部位は、アルギニン−グリ シン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）トリペプチド配列である。ＲＧＤは、ビトロネ クチンレセプターインテグリンに対して上記で同定したリガンドの全てに見られ る。そのＲＧＤ認識部位は、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド(“ペプチド”)によ ってよく似ており、そのようなＲＧＤペプチドはインテグリン機能の既知のイン ヒビターである。しかしながら、ＲＧＤペプチドの配列及び構造によって阻害の 特異性が変えられ特定のインテグリンを標的にすることがわかることは重要であ る。 ＲＧＤ認識部位の論理についてはPierschbacherら，Nature，309:30-33(1984) 及びPierschbacherら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，81:5985-5988(1984)を参 照されたい。種々のインテグリン特異性を有するＲＧＤポリペプチドは、Grant ら，Cell，58:933-943(1989)，Chereshら，Cell，58:945-953(1989)，Aumailley ら，FEBS Letts. ，291:50-54(1991)及びPfaffら，J ．Biol．Chem.，269:20233-2 0238(1994)並びに米国特許第4,517,686号、同第4,578,079号、同第4,589,881号 、同第4,614,517号、同第4,661,111号、同第4,792,525号、同第4,683,291号、同 第4,879,237号、同第4,988,621号、同第5,041,380号及び同第5,061,693号に記載 されている。 血管新生とも言われる血管形成は、新たに発生する血管の組織への増殖を含む 組織血管新生の過程である。その過程は、内皮細胞及び平滑筋細胞の浸潤によっ て仲介される。その過程は、次の３方法のいずれかで進行すると思われる。１） 血管が以前から存在する血管から発芽する；２）血管の新規発生が前駆細胞から 生じる(血管形成);又は３）存在する小血管の直径が増大する。Bloodら，Bioch ．Biophys．Acta ，1032:89-118(1990)。血管内皮細胞は、ビトロネクチンレセプ ター(α_vβ₃又はα_vβ₅)、コラーゲンＩ及びＩＶ型レセプター(α_vβ₁)、ラミニ ンレセプター(α₂β₁)、フィブロネクチン／ラミニン／コラーゲンレセプター( α₃β₁)及びフィブロネクチンレセプター(α₅β₁)を含む少なくとも５種類のＲ ＧＤ依存性インテグリンを含むことが既知である。Davisら，J ．Cell．Biochem. ，51:206-218(1993)。平滑筋は、α₅β₁、α_vβ₃及び α_vβ₅を含む少なくとも６種類のＲＧＤ依存性インテグリンを含むことが既知で ある。 血管形成は、新生児期の発生では重要な過程であるが、創傷治癒並びに組織炎 症、関節炎、乾癬、がん、糖尿病性網膜症、黄斑変性症及び他の血管新生眼疾患 を含む種々の臨床上重要な疾患の発病でも重要である。血管形成と関連があるこ れらの臨床上の疾病は、血管形成疾患と言われる。Folkmanら，Science ，235:44 2-447（1987）。血管形成は、通常は成人又は成熟組織に存在しないが、創傷治 癒及び黄体成長周期には存在する。例えば、Mosesら，Science ，248:1408-1410 （1990）を参照されたい。 種々のインテグリンα又はβサブユニットに免疫特異的なモノクローナル抗体 を用いる試験管内細胞接着の阻止は、ビトロネクチンレセプターα_vβ₃が微小血 管内皮細胞を含む様々な種類の細胞の細胞接着に関係があることを示している。 Davisら，J ．Cell．Biol.，51:206-218（1993）。更に、Nicosiaら，Am ．J．Pat hol.， 138:829-833(1991)には、コラーゲンゲルで培養したラット大動脈から“ 微小血管”の試験管内形成を阻止するためにＲＧＤペプチド、ＧＲＧＤＳの使用 が記載された。 しかしながら、コラーゲンゲル培養内の試験管内“微小血管”形成の阻止は、 微小血管構造が毛細血管の発芽と同じであること或いはコラーゲンゲル培養内の 微小血管の形成が関節炎組織、腫瘍組織又は血管形成阻止が望ましい疾患組織の ような無傷組織への新生血管の発生と同じものであることが証明されないので組 織における血管形成阻止のモデルではない。 最近、血管形成におけるα_vβ₃の役割が確認された。Brooksら，Science ，264 :569-571(1994)を参照されたい。インテグリンは、ヒト創傷肉芽組織の血管に発 現されるが正常な皮膚には発現されないことがわかった。α_vβ₃レセプターに対 するモノクローナル抗体は、増殖因子（サイトカイン）、塩基性線維芽細胞増殖 因子（ｂＦＧＦ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）並びにメラノーマフラグ メントによって誘導される血管形成を阻止した。しかしながら、拮抗体は新しい 血管のみ阻止し、以前から存在している血管を阻止しなかった。更に、特定の線 状及び環状ＲＧＤ含有ペプチドが血管新生を阻止することもわかった。 血管形成の阻止が腫瘍の発生を制限するのに有効な治療法であることが提案さ れた。血管形成の阻止は、（１）ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）のよう な“血管形成分子”の放出阻害、（２）抗ｂＦＧＦ抗体の使用等による血管形成 分子の中和、及び（３）血管形成刺激に対する内皮細胞応答の阻害によって提案 された。後者の戦略が注目され、Folkmanら，Cancer Biology，3:89-96(1992)に は血管形成を阻止するために用いられるコラゲナーゼインヒビター、基底膜代謝 回転インヒビター、止血ステロイド、真菌由来血管形成インヒビター、血小板因 子４、トロンボスポンジン、Ｄ−ペニシラミン及びチオマリン酸金のような関節 炎薬剤、ビタミンＤ₃類縁体、α−インターフェロン等を含む数種の内皮細胞応 答インヒビターが記載された。更に提案された血管形成インヒビターについては Bloodら，Bioch ．Biophys．Acta.，1032:89-118(1990)，Mosesら，Science ，248 :1408-1410(1990)，Ingberら，Lab ．Invest.，59:44-51（1988）並びに米国特許 第5,092,885号、同第5,112,946号、同第5,192,744号及び同第5,202,352号を参照 されたい。 しかしながら、血管形成におけるインテグリンα_vβ₅の役割は、本発明まで示 唆も同定もされてなく、α_vβ₅阻害を標的にした前述の参考文献に血管形成イン ヒビターが記載されたものもない。更に、本発明以外の文献は、血管新生、特に 、増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子− α（ＴＧＦ−α）及び表皮増殖因子（ＥＧＦ）によって誘導した血管新生におけ るα_vβ₅インテグリンに関係していない。 血管形成の調節に関与する増殖因子の数は限定されるが、異なるレベルの調節 の過程が静止状態から血管新生状態への転換に存在する。D'Amore，Investigati ve Ophthal ．Visual Sci. ，35:3974-3979（1994）を参照されたい。血管形成に 関与する増殖因子は合成レベルで調節されるものもあれば、活性化状態によって 調節されるものもある。静止血管は損傷又は虚血後に血管新生を受けるのでそれ らの細胞現象が起こる。 ＶＥＧＦは、特に、原発性腫瘍及び虚血性眼疾患において主要な血管形成伝達 物質であると考えられる。概説についてはFolkman，Nature Medicine ，1:27-31( 1995)を参照されたい。ＶＥＧＦは、チロシンキナーゼ活性を有する高親和性膜 結合レセプターに結合する内皮細胞特異的血管形成因子(Ferraraら，Endocrin ． Rev. ，13:18-32(1992))及び血管透過性因子（Sengerら，Cancer Res. ，46:5629- 5632(1986)）である４６キロダルトン（ｋＤａ）のホモ二量体である(Jakemanら ，J ．Clin．Invest.，89:244-253(1992))。 最近、レセプターチロシンキナーゼの活性化により細胞外マトリックスタンパ ク質のインテグリン依存性細胞遊走が促進されることがわかった。特に、Klemke ら，J ．Cell Biol.，127:859-866（1994）には、細胞運動を促進するのにＥＧＦ レセプター（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼに関係があるとされたが、α_vβ₅イン テグリンを用いるビトロネクチンのＦＧヒト膵臓がん腫細胞の接着には関係がな いとされた。著者らは、ＥＧＦリガンドによるＥＧＦＲの占有によりＥＧＦＲの チロシンキナーゼ活性化が活性化され、最後にはタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ ）依存性経路を刺激し、細胞が本来遊走することが不可能なビトロネクチン基質 のα_vβ₅依存性細胞遊走の誘導をもたらすことを直接証明している。従って、Kl emkeらの知見は、細胞遊走においてインテグリン活性を有するサイトカイン、特 にＥＧＦの存在が関係することを証明している。ＰＫＣの活性化により、ニワト リ絨毛尿膜モデル系において血管形成調節に関与することがわかった。Tsopanog louら，J ．Vasc．Res.，30:202-208(1993)を参照されたい。著者らは、ＰＫＣの 特定の活性化因子及びインヒビターを同定し、そのモデル系において血管形成を 各々刺激及び阻止した。 しかしながら、上述されたKlemkeらにもTsopanoglouらにも種々の症状及び病 態において血管形成を促進するにあたってのサイトカインの役割及びα_vβ₅イン テグリンの発現及び／又は活性化及びα_vβ₅特異的拮抗体によるその阻止が記載 されていない。 最近の実験的証明から、眼疾患のサルモデル系においてレチナール静脈閉塞に よって誘導されたレチナール虚血により眼房のＶＥＧＦが急速に上昇したことが わかった。その上昇は、Millerら，Am ．J．Path.，145:574-584(1994)に記載さ れるように虹彩の血管新生と同時に起こった。更に、酸素圧低下を生じる増殖性 網膜症のマウスモデル系におけるデータのＶＥＧＦメッセンジャーＲＮＡは、相 対的酸素圧低下の６〜１２時間以内に増え、血管新生が生じるまで上昇したまま であることがわかった。新しい血管が減少するにつれて、Pierceら，Proc ．Natl ．Acad．Sci.，USA， 92:905-909(1995)に記載されるようにＶＥＧＦ発現も減少 した。 従って、虚血の動物モデルで証明された最近のデータから、ＶＥＧＦの誘導と 虚血の誘導後の血管新生との相関が示された。ＶＥＧＦ及び他の増殖因子は、ま た、Folkman，Nature Medicine ，1:27-31（1995）に概説されるように血管新生 を含む他の症状及び病態に関係している。 Folkmanらの文献には、望ましくない血管形成を制御するために用いられる現 在の臨床方法が総括されている。臨床試験の患者に血小板因子４、フマギリン誘 導体、カルボキシアミノトリアゾール等を含む血管形成インヒビターによる治療 法を行っている。しかしながら、文献又は現在の治療上の文献には、α_vβ₅の発 現が血管形成、特にＶＥＧＦによって誘導した血管形成と相関するものはない。 従って、本発明の以前にはα_vβ₅の存在と活性化と相関した血管形成を受ける組 織において血管形成を制御するためにα_vβ₅拮抗体による治療法を記載又は使用 したものはない。 従って、出願人は、α_vβ₃及び血管形成に対する増殖因子との関係についてこ こに報告した研究以外に組織においてα_vβ₅仲介細胞接着のインヒビターを用い て血管形成が阻止された証明を知らない。特に、α_vβ₅機能が組織において血管 形成に必要であること又はα_vβ₅拮抗体が組織、特に眼血管新生疾患において血 管形成を阻止することができることを以前に証明したものはない。発明の簡単な説明 本発明は、組織においてα_vβ₃要求性血管形成経路のほかに新規なα_vβ₅依存 性経路が別個に存在することを証明するものである。従って、本発明は、血管形 成を阻止することができるα_vβ₅インヒビターを述べるものである。本発明は、 更に、血管形成を促進するのにα_vβ₅仲介活性が増殖因子レセプターチロシンキ ナーゼ及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の増殖因子（サイトカイン）活性化 と相関することを述べるものである。この方法で機能する増殖因子（サイトカイ ン）としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子 −α（ＴＧＦ−α）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）等が挙げられる。 従って、本発明は、組織において血管形成を阻止する方法であって、α_vβ₅拮 抗体の血管形成阻止量を含む組成物を該組織に投与することを特徴とする方法を 述べるものである。 治療されるべき組織は、血管新生が起こっている疾患組織のような血管形成の 阻止が望ましい組織とすることができる。具体的な組織としては、血管新生を受 ける眼組織、炎症組織、充実性腫瘍、転移腫瘍、再狭窄を受ける組織及び類似組 織が挙げられる。好適実施態様においては、α_vβ₅の発現と関連した血管新生は 、増殖因子、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＥＧＦに曝露した結果である。 糖尿病性網膜症（糖尿病性増殖性網膜症とも言われる）、老人性黄斑変性症、 推定眼ヒストプラズマ症、早産網膜症、鎌状赤血球網膜症及び血管新生緑内障を 含む疾患において血管形成が顕著な眼のような組織においてＶＥＧＦ誘導血管新 生を阻止する方法に関する治療法が特に好ましい。好適実施態様においては、更 に、治療法は角膜移植、ヘルペス性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状片、コンタクト レンズ装用に伴う血管新生パンヌス等を含む角膜血管新生障害に起こる血管形成 を阻止する方法に関する。 本方法に使用するためのα_vβ₅拮抗体は、α_vβ₅に結合しかつビトロネクチン 天然リガンドに結合するα_vβ₅の能力を競合的に阻害することができる。好まし くは、拮抗体は他のインテグリンよりα_vβ₅に特異性を示す。特に好適実施態様 においては、α_vβ₅拮抗体はビトロネクチン又は他のＲＧＤ含有リガンドのα_v β₅への結合を阻害するが、ビトロネクチンのα_vβ₃又はα_IIbβ₃への結合を実 質的に阻害しない。好ましいα_vβ₅拮抗体は、線状又は環化ポリペプチド、モノ クローナル抗体又はその機能性断片、又は全てα_vβ₅と特異的に相互作用する有 機擬似体とも呼ばれるα_vβ₅リガンドの擬似体である有機分子とすることができ る。 本発明のα_vβ₅拮抗体の投与としては、眼内、静脈内、経皮、滑液嚢内、筋肉 内及び経口投与が挙げられる。他の好適実施態様においては、投与と腫瘍発生及 びがん転移を制御する化学療法とが併用される。図面の簡単な説明 図面は、本開示の一部をなすものである。 図１Ａ〜図１Ｄは、α_vインテグリン抗体拮抗体によるサイトカイン誘導ウサ ギ角膜血管形成の阻止を示す写真である。ｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦで処理するこ とによる血管形成の誘導及びα_vインテグリン抗体拮抗体、Ｐ１Ｆ６（α_vβ₅） 及びＬＭ６０９（α_vβ₃）による治療効果は実施例４に記載されている。ＯＤ及 びＯＳは、実験用ウサギの各々右目及び左目である。大きな矢印は浮腫を伴う角 膜血管形成を示し、小さな矢印は正常な結膜の縁血管を示す。図１Ａ及び図１Ｂ はｂＦＧＦによる血管形成の誘導を示す写真であり、図１Ｃ及び図１ＤはＶＥＧ Ｆによる血管形成の誘導を示す写真である。図１Ａ及び図１Ｃのウサギ角膜はＰ １Ｆ６による治療を示す写真であり、図１Ｂ及び図１ＤはＬＭ６０９による治療 を示す写真である。 図２Ａ及び図２Ｂは、各々ｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦによる誘導に続いてＰ１Ｆ ６或いはＬＭ６０９によるｍＡｂ処理した後の平均新生血管面積mm²+/-標準誤差 （２組の各々についてｎ＝８）を示すヒストグラムである。結果は実施例４に記 載されている。 図３Ａ〜図３Ｆは、ニワトリＣＡＭ標品に対する抗インテグリン抗体処理の作 用を示す写真である。結果は実施例６Ａに記載されている。血管形成をｂＦＧＦ 或いはＶＥＧＦで誘導し、続いて対照として又は図１の説明に記載されたＰ１Ｆ ６又はＬＭ６０９モノクローナル抗体と共にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を静 脈内投与する。ｂＦＧＦで処理したＣＡＭを図３Ａ、図３Ｃ及び図３Ｅに示し、 ＶＥＧＦで処理したＣＡＭを図３Ｂ、図３Ｄ及び図３Ｆを示す。ＰＢＳを静脈内 に注射する対照ＣＡＭを図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ｃ及び図３Ｄに示される ＣＡＭを治療するためにＰ１Ｆ６抗体を用い、図３Ｅ及び図３Ｆに示されるＣＡ Ｍを治療するためにＬＭ６０９抗体を用いた。 図４Ａ及び図４Ｂは、図３Ａ〜図３Ｆに示された結果の定量を示すヒストグラ ムである。血管形成指数をＹ軸上に対照又は抗体処理に対してプロットする。図 ４及び図４Ｂは、各々ｂＦＧＦ誘導及びＶＥＧＦ誘導血管形成を示す図である。 結果は実施例４に示されている。 図５Ａ〜図５Ｆは、実施例６に記載されたニワトリＣＡＭ標品に対する合成ペ プチド処理の効果を示す写真である。血管形成をｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦにより 誘導し、続いて対照として又は合成環状ペプチドＲＧＤｆＶ（配列番号４）又は ＲＡＤｆＶ（配列番号５）と共にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を静脈内投与す る。ｂＦＧＦで処理したＣＡＭを図５Ａ、図５Ｃ及び図５Ｅに示し、ＶＥＧＦで 処理したＣＡＭを図５Ｂ、図５Ｄ及び図５Ｆに示す。ＰＢＳを静脈内に注射する 対照ＣＡＭを図５Ａ及び図５Ｂに示す。図５Ｃ及び図５Ｄに示されるＣＡＭを治 療するためにＲＤＧｆＶペプチドを用い、図５Ｅ及び図５Ｆに示されるＣＡＭを 治療するためにＲＡＤｆＶペプチドを用いた。 図６Ａ及び図６Ｂは、図５Ａ〜図５Ｆに示された結果の定量を示すヒストグラ ムである。血管形成指数をＹ軸上に対照又は抗体処理に対してプロットする。図 ６及び図６Ｂは、各々ｂＦＧＦ誘導及びＶＥＧＦ誘導血管形成を示す図である。 結果は実施例６に示されている。 図７Ａ〜図７Ｅは、別個のサイトカイン、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ及 びＴＧＦ−αで誘導したＣＡＭ血管形成に対する抗インテグリンモノクローナル 抗体及びカルホスチンＣの作用を示すヒストグラムである。ＰＭＡも評価した。 分析及び結果は実施例６に記載されている。結果をヒストグラムでプロットし、 血管形成指数をＹ軸上に示し、種々の対照又はインヒビターをＸ軸上に示す。図 ７Ａ〜図７Ｅは、各々ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＰＭＡ で誘導した血管形成を示すヒストグラムである。 図８は、実施例５Ｃ及び図６Ｄに記載されるように分析を行ったニワトリ胚Ｃ ＡＭにおけるＣＳ１メラノーマ腫瘍発生に対する抗体処理の作用を示すヒストグ ラムである。Ｘ軸上に示された種々の処理に対して腫瘍重量ミリグラム(mg)をＹ 軸上にプロットする。ＣＳＡＴは、インテグリンβ１サブユニットに特異的な対 照抗体である。ＬＭ６０９及びＰ１Ｆ６は以前に記載されている。 図９は、Ｙ軸上にプロットした腫瘍容積mm³で測定されるメラノーマ腫瘍発生 に対してα_vβ₅ペプチド拮抗体、標識ペプチド１８９（配列番号９）の効果を対 照と対比して示すヒストグラムである。分析及び結果は実施例８に記載されてい る。 図１０は、実施例１０Ａ〜Ｇに記載される化合物７の合成を示すスキームであ る。 図１１は、実施例１０Ａ〜Ｃ；Ｈ〜Ｉに記載される化合物９の合成を示すスキ ームである。 図１２は、実施例１０Ｊに記載される化合物１０の合成を示すスキームである 。 図１３は、実施例１０Ｋ〜Ｌ及び１０Ｍ〜Ｎに各々記載される化合物１２及び 化合物１４の合成を示すスキームである。 図１４は、化合物１５、化合物１６、化合物１７及び化合物１８を示す化学構 造である。前記化合物の詳細な合成は、実施例１０Ｏ〜Ｒに記載されている。発明の詳細な説明 Ａ．定義 アミノ酸残基:ポリペプチドのペプチド結合における化学消化（加水分解）に よって生成されたアミノ酸。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、“Ｌ”異性 体であることが好ましい。しかしながら、所望の機能性がポリペプチドによって 保持される限りＬ−アミノ酸残基を“Ｄ”異性体の残基に置き換えることができ る。ＮＨ₂は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。 ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味 する。標準ポリペプチド命名法（J ．Biol．Chem.，243:3552-59(1969)に記載さ れ、37 CFR§1.822(b)(2))で採用された）に従うに当たり、アミノ酸残基の略号 を下記の対応表に示す。 更に、次の略号は下記の意味をする。 全てのアミノ酸残基配列は、本明細書において左右の向きがアミノ末端からカ ルボキシ末端への慣用的方向にある式で表されことは留意されるべきである。更 に、アミノ酸残基配列の始め又は終わりのダッシュは、１個以上のアミノ酸残基 の配列へのペプチド結合を意味することは留意されるべきである。 ポリペプチド: 隣接アミノ酸残基のα−アミノ基とカルボキシ基間のペプチド 結合によって相互に結合した線状のアミノ酸残基。 ペプチド: ポリペプチドのように一方をもう一方に結合した約５０個を超えな い線状のアミノ酸残基。 環状ペプチド: 対応する線状ペプチドに由来しかつ遊離Ｎ末端又はＣ末端が存 在せず該対応する線状ペプチドのＮ末端が前記対応する線状ペプチドのＣ末端カ ルボン酸へのアミド結合をなす環状ペプチド。 タンパク質: ポリペプチドのように一方をもう一方に結合した５０個より多い 線状のアミノ酸残基。 合成ペプチド: 天然に存在するタンパク質及びその断片を含まないペプチド結 合で共に結合した化学的に生成したアミノ酸残基鎖。 Ｂ．概要 本発明は、一般的には、血管形成が特定のビトロネクチンレセプターα_vβ₅に よって仲介されかつα_vβ₅機能阻害が血管形成を阻止するという発見に関する。 本発見は、血管形成が種々の疾患過程に役割を果たしていることから重要である 。血管形成を阻止することにより、疾患に介在し、症状を改善し、ある場合には 疾患を治癒することができる。 新しい血管の発生が疾患と関係がある病状の原因であるか又はその原因となる 場合、血管形成の阻止はその疾患の有害な作用を減少させる。例としては、リウ マチ様関節炎、糖尿病性網膜症、炎症疾患、再狭窄症等が挙げられる。新しい血 管の発生が有害組織の成長を支持するために必要である場合、血管形成の阻止は 組織への血液供給を減少させ、血液供給の要求に基づいて組織量の減少に寄与す る。例としては、増殖因子誘導血管形成をきたす虚血に応答した新しい血管の発 生、腫瘍の厚さが数mmを超えて発生するために血管新生が継続的に要求される場 合の腫瘍の発生及び充実性腫瘍転移を確立する場合の腫瘍の発生が挙げられる。 本発明の方法は、治療法が血管形成に非常に選択的であり他の生物学的過程に は選択的でないことから部分的に効果的である。実施例に示されるように、新し い血管の発生は実質的にα_vβ₅のみ含有し、治療法は成熟血管に悪影響を及ぼさ ない。 α_vβ₅のみの阻害が血管形成を効果的に阻止する発見は、潜在的特異性が高く 相対的に毒性の低い治療組成物の開発を可能にする。本発明は１種以上のインテ グリンを阻害する能力を有するペプチド系試薬の使用を開示するが、α_vβ₅をよ り選択的に阻害する他の試薬を設計することができる。従って、ある種のペプチ ド系試薬はα_vβ₅によって仲介されるもの以外の他の生物学的過程を阻害すると いう副作用がない。 例えば、本発明の教示によって示されるように、α_vβ₅機能阻害に同様に選択 的であるα_vβ₅との免疫反応に非常に選択的でありかつα_vβ₁、α_vβ₃又はα_{II b} β₃に選択的でないモノクローナル抗体を調製することが可能である。更に、Ｒ ＧＤ含有ペプチドも本明細書に記載されるようにα_vβ₅の阻害に選択的であるよ うに設計される。 本発明の発見以前には血管形成及び血管形成に依存する過程がα_vβ₅の生物学 的機能を拮抗する試薬の使用により生体内で阻害されることは知られていなかっ た。 Ｃ．血管形成の阻止方法 本発明は、組織において血管形成を阻止し、血管形成に関係する組織における 現象を阻止する方法を提供する。一般的には、本方法は、α_vβ₅拮抗体の血管形 成阻止量を含む組成物を該組織に投与することを特徴とする。 本発明の方法を実施するのに用いられる標的組織は、α_vβ₅インテグリンレセ プターの検出可能な存在を特徴とするα_vβ₅含有組織として定義される。言い換 えると、α_vβ₅含有組織は細胞膜内のα_vβ₅レセプター複合体の存在によって定 義される。かかる組織としては、上皮及び間葉由来細胞が含まれる。レセプター の存在は、免疫反応が顕微鏡、免疫沈降、リガンド結合分析での競合及び類似手 法によって組織に検出されるレセプターと抗α_vβ₅インテグリンレセプター抗体 との免疫反応性を含む多数の手段によって求められる。組織においてα_vβ₅の存 在を検出するのに使用するために好ましい抗体は、下記及び実施例１に記載され る。例えば、免疫蛍光顕微鏡による腎、皮膚及び眼組織におけるα_vβ₅の分布は 実施例２に記載される。 本発明の方法の関係においては、α_vβ₅含有組織は血管形成の徴候をもつもの としても特徴づけられる。上記の血管形成としては、全ての血管形成過程がα_v β₅によって仲介されかつα_vβ₅の発現に依存する“発芽”、脈管形成又は血管 腫脹を含む組織の血管新生に関係する種々の過程が含まれる。外傷治癒、黄体形 成及び胚形成を除いて血管形成過程の大部分は疾患過程と関連があり、本治療法 の使用はその疾患に選択的でありかつ有害な副作用がないと考えられる。 血管形成疾患と呼ばれる血管形成が重要であると考えられる種々の疾患として は、免疫及び非免疫炎症、慢性関節リウマチ及び乾癬のような炎症疾患、再狭窄 症、アテローム性動脈硬化巣の毛細血管増殖及び骨粗鬆症のような血管の不適切 な又は時機を失った侵入と関連がある疾患、及び充実性腫瘍、充実性腫瘍転移、 線維性血管腫、水晶体後線維増殖、血管腫、カポジ肉腫及び腫瘍成長を支持する 血管新生を必要とする類似のがんのようながん関連疾患が挙げられる。 血管新生を特徴とする眼疾患は、特に好ましい治療標的である。眼の血管新生 は、視覚の破滅的喪失をきたす莫大な数の眼疾患に見られる最も共通の病変であ る。以前から存在する絨毛、網膜又は傍縁血管からの新しい血管の発生は、浮腫 、出血又は線維脈管膜形成を招き眼の正常な解剖学上の関係の破壊及び付随する 正常な視覚機能喪失をきたす。 血管形成を特徴とする眼疾患としては、角膜移植、ヘルペス性角膜炎、梅毒性 角膜炎、翼状片、コンタクトレンズ装用に伴う血管新生パンヌス等が挙げられる 。 更に、眼疾患としては、糖尿病性網膜炎（ＤＲ）、老人性黄斑変性症（ＡＲＭＤ ）、推定眼ヒストプラズマ症（ＰＯＨＳ）、早産網膜症（ＲＯＰ）及び血管新生 緑内障等が挙げられる。これらの疾患における血管形成の阻止は必ずしも基礎に ある疾患を治癒しないが、それらに伴う視力罹病率を著しく減少させる。 例えば、２５年を超える間糖尿病に罹っている３００,０００人の９０％が逸 脱血管及び／又は増殖血管を特徴とする網膜疾患であるＤＲに罹っている。これ らの患者の３０％は、実際に、本発明の治療法で改善される後者の症状に罹って いる。ＡＲＤＭについては、６５歳を超える人口の２５％、約６３０,０００人 がその疾患に罹っており、２０３０年までに６３００,０００人を超える人がＡ ＲＤＭに罹るであろう。結果として、本発明の治療組成物及び方法によりα_vβ₅ 関連血管形成を阻止する能力をもつことは治療的価値が大きい。 従って、疾患組織において血管形成を阻止する方法は、疾患の症状を改善する と共に疾患によっては疾患の治癒に寄与する。実施態様においては、本発明は組 織における血管形成阻止それ自体を企図する。組織における血管形成の程度及び 本方法によって達成される阻止の程度は、免疫組織化学によりα_vβ₅が正の新生 及び未熟血管構造を検出する実施例に記載されるような種々の方法で評価される 。 本明細書に記載される種々の組織又は有機組織から構成された器官は、血管が 血管形成刺激時に侵入することができる皮膚、筋肉、臓器、結合組織、関節、骨 及び類似の組織を含む病態の血管形成を支持することができる。 特に、本発明の方法及びα_vβ₅拮抗体組成物は、サイトカインとも呼ばれる増 殖因子によって誘導された血管形成を阻止するのに治療的に有効である。生理的 条件下で血管形成は高度に調節され、Brooksら，Science ，264:569-5761(1994) に以前に発表されたように塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような特定 の血管形成分子によって活性化されることがわかった。負の血管形成調節剤も記 載されている。従って、血管形成は、局所刺激物質とインヒビター間の複雑なバ ランスによって調節される。D'Amore，Investigative Ophthal ．Visual Sci.，3 5:3974-3979（1994）参照。 正常な静止毛細血管をしっかりと調節する血管形成刺激物質とインヒビター間 の生理的バランスが妨げられる場合、ある種の病態が生じるにつれて毛細血管の 内皮細胞が増殖、遊走及び最後には分化するように誘導されて新しい血管を形成 する。 血管形成は、Leibovich，“Role of Cytokines in the Process of Tumor Ang iogenesis”，“Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapy”，eds ．Aggarwal & Puri，Chap．35，Blackwell Science，Inc.（1995）に概説される ように初発現象に続いて後発現象を有する現象カスケードとして確認される。初 発現象の前に、血管外供給源から供給された血管形成増殖因子及びサイトカイン が供給される。次に、初発現象が標的微小血管系において細胞間結合の破壊、内 皮細胞活性化抗原及びタンパク質分解表現型の発現の誘導、及び方向性での内皮 細胞遊走の開始により進行する。後発現象は、発生する毛細血管蕾の細胞、内皮 細胞、周囲細胞及び平滑筋細胞内の増殖因子及びサイトカイン遺伝子の自己分泌 及びパラ分泌発現で確認される。それらの細胞は、細胞と細胞外マトリックスと の相互作用をモジュレートし、存在する成熟血管から新しい機能性毛細血管ルー プが形成される。 本明細書及び背景で述べた文献には、ヒト及び実験動物の双方においてα_vβ₅ 発現亢進と関連があるもの、即ち、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＥＧＦ、腫瘍量の 増大と関連があるもの及び増殖性血管新生眼疾患の血管形成開始におけるものを 含む増殖因子の出現の間での関連が記載されている。 従って、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αが、特に、細胞増殖を促進するという 特性を特徴とする増殖因子と考えられる。増殖因子は、ある細胞によって分泌さ れ、その分泌細胞又は別の細胞に作用するタンパク質である。作用能は、通常は 貫膜タンパク質である増殖因子レセプターの存在に依存する。ＶＥＧＦのような 増殖因子は、一般的にはサイトカインと言われ、同じ細胞（自己分泌）或いは別 の細胞（パラ分泌）の成長及び代謝に影響を及ぼす、細胞によって分泌されるポ リペプチドホルモンとして定義される。サイトカインという用語は、免疫系の細 胞によって生じる分子及び同じ系の生体応答調節剤に限定されない。従って、サ イトカインは広い範疇の用語であり、生体応答の種類に基づく下位範疇がＶＥＧ Ｆ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α等の刺激増殖因子又はエンハンサーである。 概説としては、Aggarwalら，“Common and Uncommon Features of Cytokines an d Cytokine Receptors: An Overview”，“Human Cytokines: Their Role in Di sease and Therapy”，eds．Aggarwal & Puri，Chapter 1，Blackwell Science ，Inc.（1995）を参照されたい。 本発明においては、組織において血管形成を阻止するのに使用するためにα_v β₅に特異的な拮抗体、及びＶＥＧＦに対する抗体のようなα_vβ₅に特異的でな い増殖因子拮抗体が企図される。好適実施態様においては、本明細書に記載され るα_vβ₅拮抗体は、α_vβ₅インテグリンレセプターの発現が誘導される増殖因子 誘導血管形成を阻止するのに有効である。この関係において好ましい増殖因子と しては、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α等が挙げられる。 背景で述べた増殖因子ＥＧＦ及びＶＥＧＦは、共にチロシンキナーゼとして作 用する細胞レセプターに結合することが既知である。ＥＧＦレセプターの活性化 は、α_vβ₅の活性化をもたらしてビトロネクチン基質上の特定な細胞の遊走を可 能にするプロテインキナーゼＣの活性化と相関することがわかった。従って、サ イトカイン又は増殖因子に対する曝露とインテグリン発現又は活性化における協 調応答間の作用機構は、複雑な生物学的過程である。本発明に示されるように（ 実施例６Ａ参照）、ウサギ眼モデル或いはニワトリ絨毛尿膜モデルにおける組織 をサイトカインＶＥＧＦで処理するとプロテインキナーゼＣの活性化に依存する α_vβ₅増強血管形成が得られる。 特に好適な実施態様においては、本発明は、血管形成がＶＥＧＦによって誘導 された組織において血管形成を阻止するためのα_vβ₅拮抗体の使用を企図する。 例えば、種々の動物モデル系における網膜の虚血により、ミュラー細胞から分泌 されるＶＥＧＦのアップレギュレーションを生じ、結果としてその生産が眼内の 組織の血管新生を誘導することがわかった。Millerら，Am ．J．Path.，145:574- 584(1994)及びPierceら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA，92:905-909(1995)を参 照されたい。 従って、本発明においては、治療されるべき組織は糖尿病性網膜炎、黄斑変性 症、血管新生緑内障又は上述の類似疾患に罹った患者の網膜組織であり、阻止さ れるべき血管形成は網膜組織の血管新生がある網膜組織血管形成である。眼血管 新生症状又は疾患をもつ患者からの角膜を含む具体的な組織は、上記及び実施例 に記載される。網膜血管形成を治療する本発明のα_vβ₅拮抗体の効果を評価する 具体的なモデル系は、実施例９に記載される網膜血管新生のマウスモデルである 。 他の関連実施態様においては、治療されるべき組織は炎症を起こした組織であ り、阻止されるべき血管形成は炎症を起こした組織の血管新生がある炎症を起こ した組織の血管形成である。その種類においては、本方法は慢性関節リウマチに 罹った患者、免疫又は非免疫炎症組織、乾癬組織等のような関節炎組織における 血管形成阻止を企図する。 サイトカインのインターロイキン１及び腫瘍壊死因子−αは、内皮細胞上での 接着分子発現の誘導及び酵素放出に基づく関節破壊に直接役割があるリウマチ様 関節炎と関連があると考えられる。Arendら，Arthritis & Rheumatism，38:151- 160（1995）を参照されたい。双方のサイトカインをサイトカイン特異的インヒ ビターで阻害しかつ症状において発現する細胞接着分子を標的にする治療法が提 案された。Haskardら，Cell Adhesion Comm. ，2:235-238（1994）を参照された い。 従って、本発明以前のようにα_vβ₅接着分子の関係の治療に取組みかつ指示す ることによる関節炎症状における血管形成の阻止は、本発明の他の好適実施例で ある。 他の関連実施態様においては、治療されるべき組織は充実性腫瘍、転移、皮膚 がん、乳がん、血管腫又は線維性血管腫及び類似のがんに罹った患者の腫瘍組織 であり、阻止されるべき血管形成は腫瘍組織の血管新生がある腫瘍組織血管形成 である。本方法により治療可能な典型的な充実性腫瘍組織としては、肺、膵臓、 乳房、結腸、喉頭、卵巣及び類似組織が挙げられる。 ヒト充実性腫瘍に存在する複雑なサイトカイン網目の役割は、Leekら，J ．Leu kocyte Biol.， 56:423-435(1994)の概説の主題であり、この文献の開示は本願明 細書に含まれるものとする。ＶＥＧＦ、酸性及び塩基性ＦＧＦ(ｂＦＧＦ)、ＴＧ Ｆ−α及び−β、ＥＧＦ、ＴＮＦ−α、血小板由来内皮細胞増殖因子、アンギオ ゲニン、インターフェロンα及びγ、インターロイキン１、６及び８等を含 む多数のサイトカインは、悪性腫瘍組織及び細胞系における血管形成の種々の細 胞機構に影響すると考えられる。例えば、ＶＥＧＦは、様々な種類の腫瘍の局在 性のほかにBrownら，Human Path.，26:86-91(1995)に記載されるように乳がんに おける血管形成に関連しでいることが最近わかった。 種々のサイトカインを分泌しかつサイトカインＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＥＧ Ｆとの応答における、詳しくは本発明における局在化血管形成及び得られたα_v β₅介在血管形成を誘導する腫瘍は、腫瘍組織試料を抗サイトカイン抗体で選別 することにより同定可能である。かかる方法は、培養した或いは生検した腫瘍組 織試料について当業者に良く知られている。上記サイトカインに対する抗体は、 Oncogene Sciences(ニューヨーク州ユニオンデイル)又はUpstate Biotech Incor porated(ニューヨーク州レークプラシッド)から市販されている。選定腫瘍組織 のこれらの手段による選別は、本発明のα_vβ₅拮抗体による血管形成阻害活性の 可能性を評価することを可能にする。 具体的な腫瘍組織の血管形成、及びその阻止は実施例に記載されている。 腫瘍組織血管形成の阻止は、血管新生が腫瘍発生に重要な役割を果たすことか ら本発明の他の好適実施例である。腫瘍組織の血管新生が存在しないときの腫瘍 組織は、必要とする栄養が得られず、増殖が遅く、追加の増殖が止まり、退行し 、最後には壊死になって腫瘍の消滅がもたらされる。 言い換えると、本発明は、本方法に従って腫瘍の血管形成を阻止することによ り腫瘍の血管新生を阻止する方法を提供する。同様に、本発明は、血管形成阻止 方法を行うことにより腫瘍発生を阻止する方法を提供する。 本方法は、また、（１）転移形成には原発性腫瘍の血管新生が必要であるので 転移性がん細胞は該原発性腫瘍を出ることができること及び（２）続発性部位の 確立には転移の増殖を支持する血管新生がひつようであることから転移の形成に 対しても特に効果的である。関連実施態様においては、本発明は、充実性腫瘍及 び転移の確立の調節に対する慣用の化学療法のような他の治療法と併用した方法 を企図する。血管形成インヒビターの投与は、典型的には化学療法中又は化学療 法後に行われるが、血液補給及び栄養素を腫瘍組織に供給することにより回復す るように血管形成を誘導することにより腫瘍組織が毒性に対して応答する度の化 学療法後に血管形成を阻止することが好ましい。更に、充実性腫瘍が転移に対す る予防として切除された手術後に血管形成阻止方法を施すことが好ましい。 本発明が腫瘍血管新生の阻止に用いられる限り、本方法は腫瘍組織発生の阻止 、腫瘍転移形成の阻止、及び確立した腫瘍の退行に適用することができる。後者 については、腫瘍量の減少は本発明に使用するために記載されたウサギ眼分析モ デルにおいて又はYanら，J ．Clin．Invest.，91:986-996（1993）に記載される ように重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）をもつマウスの皮膚がヒト新生児包皮 と置き換えられるキメラマウス：ヒトモデルのモデル系を用いて評価され、その 文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。後者のモデルは、本発明の方法 による血管形成及びその阻止を調べる生体内モデルである。本発明のウサギ腫瘍 モデルとα_vβ₅拮抗体による具体的な結果は実施例５Ｃと６Ｄに示され、ＳＣＩ Ｄマウスモデルにおける血管形成の阻止の結果は実施例８に記載される。 再狭窄症は、血管形成術の成功を妨害する経皮貫径冠状血管形成術の部位にお ける平滑筋細胞（ＳＭＣ）遊走及び増殖の過程である。再狭窄中ＳＭＣの遊走及 び増殖は、本方法によって阻止される血管形成過程とみなされる。従って、本発 明は、血管形成術後の患者において本発明の方法に従って血管形成を阻止するこ とにより再狭窄症の阻止を企図する。再狭窄症の阻止については、α_vβ₅拮抗体 が典型的には血管形成術後の約２〜約２８日間、更に典型的には手術後の最初の 約１４日間投与される。 多くの実施態様において本発明で治療される患者はヒト患者が望ましいが、本 発明の原理は本発明が“患者”という語に含まれるものである全ての哺乳動物に ついて有効であることを意味することは理解されるべきである。この関係におい て、哺乳動物は、疾患、特に畜産又は家畜哺乳動物種の治療が本発明の方法につ いて探究される哺乳動物種を含むことが理解される。 組織において血管形成を阻止し、血管形成関連疾患の治療方法を行う本方法は 、血管形成が起こっている組織又は血管形成が起こる危険がある組織を、天然リ ガンドに結合するα_vβ₅を阻害することができるα_vβ₅拮抗体の治療的に有効な 量を含む組成物と接触させることを特徴とする。従って、本方法は、本発明のα_v β₅拮抗体を含む生理的に許容しうる組成物の治療的に有効な量を患者に投 与することを特徴とする。 α_vβ₅拮抗体投与の用量範囲は拮抗体の形態及びその効力に左右され、血管形 成及び血管形成によって仲介される疾患症状が改善される所望効果を生じるのに 十分な量である。用量は、過粘稠度症候群、肺水腫、鬱血性心不全等の副作用を 生じるほどの量であってはならない。用量は、一般的には、年齢、症状、性別及 び患者の疾患の程度で変動し、当業者によって決定される。用量は、また、合併 症の現象においては個々の医師によって調整される。 α_vβ₅拮抗体は、リガンド、即ち、ビトロネクチンに対するレセプターの結合 活性を阻害することにより生理的又は薬理的活性を遮断又は阻止する分子である 。好ましいα_vβ₅拮抗体は、モノクローナル抗体、ペプチド或いはα_vβ₅リガン ドの擬似体である有機分子とすることができる。 治療的に有効な量は、治療される組織において測定可能な血管形成阻止を生じ るのに十分なα_vβ₅拮抗体の量、即ち、血管形成阻止量である。血管形成の阻止 は、本明細書に記載される免疫組織化学又は当業者に既知の他の方法によってそ の場で測定される。 α_vβ₅拮抗体がα_vβ₅リガンド有機擬似体、ＲＧＤ含有ペプチド、抗α_vβ₅モ ノクローナル抗体、もしくはその断片、又はα_vβ₅レセプター擬似体の形態をと ることができる限り、効力、及び“治療的に有効な”量の発現が変動し得ること は理解されるべきである。しかしながら、本分析法に示されるように、当業者は 本発明の候補α_vβ₅拮抗体の効力を容易に評価することができる。 α_vβ₅拮抗体の効力は、ＣＡＭ分析、生体内ウサギ眼分析、及び本明細書に全 て記載されるα_vβ₅に対する天然リガンドの結合阻害を測定することによる血管 形成の阻止を含む種々の手段、及び類似の分析によって測定される。 好ましいα_vβ₅拮抗体は、0.5マイクロモル(μM)未満、好ましくは0.1μM未満 、更に好ましくは0.05μM未満の拮抗体濃度の溶液中でビトロネクチンのような 天然リガンドのα_vβ₅への結合を実質的に阻害する能力を有する。“実質的に” は、ビトロネクチン結合の少なくとも５０％の減少がα_vβ₅拮抗体の存在下の阻 害によって認められることを意味し、本明細書においては５０％阻害はＩＣ₅₀値 と言われる。 更に好ましいα_vβ₅拮抗体は他のインテグリンよりα_vβ₅に選択性を示す。従 って、好ましいα_vβ₅拮抗体は、α_vβ₅に対するビトロネクチン結合を実質的に 阻害するが、α_vβ_1、α_vβ₃及びα_IIbβ₅のような他のインテグリンに対するビ トロネクチン結合を実質的に阻害しない。α_vβ₅に対するビトロネクチン結合を 阻害するときのＩＣ₅₀活性が他のインテグリンに対するビトロネクチン結合を阻 害するときのＩＣ₅₀活性に比べて１０倍〜１００倍低いα_vβ₅拮抗体が特に好ま しい。インテグリンに対するビトロネクチン結合を阻害するときのＩＣ₅₀活性を 測定する具体的な分析は実施例に記載される。 本発明のα_vβ₅拮抗体のモノクローナル抗体としての治療的に有効な量は、典 型的には、生理的に許容しうる組成物で投与した場合に約０.０１〜約１００マ イクログラム(μg)／ミリリットル(ml)、好ましくは約１〜約５μg/ml、通常は 約５μg/mlの血漿濃度を得るのに十分であるような量である。言い換えると、用 量は、約０.１〜約３００mg/kg、好ましくは約０.２〜約２００mg/kg、最も好ま しくは約０.５〜約２０mg/kgに１日１回以上の投与で1〜７日間に変動させるこ とができる。 拮抗体がモノクローナル抗体の断片の形である場合の量は、全抗体の質量に相 対する断片の質量に基づいて容易に調整される。好ましい血漿モル濃度は、約２ マイクロモル(μM)〜約５ミリモル(mM)、好ましくは約１００μM〜１mMの抗体拮 抗体である。 本発明のα_vβ₅拮抗体のポリペプチド又は他の類似の大きさの小分子α_vβ₅リ ガンド擬似体としての治療的に有効な量は、典型的には、生理的に許容しうる組 成物で投与した場合に約０.１〜約２００マイクログラム(μg)／ミリリットル(m l)、好ましくは約１〜約１５０μg/mlの血漿濃度を得るのに十分であるようなポ リペプチドの量である。約５００g/モルの量を有するポリペプチドに対して、好 ましい血漿モル濃度は、約２マイクロモル(μM)〜約５ミリモル(mM)、好ましく は約１００μM〜１mMのポリペプチド拮抗体である。言い換えると、用量／体重 は、約０.１〜約３００mg/kg、好ましくは約０.２〜約２００mg/kgに1日１回以 上の投与で1〜７日間に変動させることができる。 本発明のモノクローナル抗体、ポリペプチド又は有機擬似体は、注射又は時間 をかけて徐々に注入することにより非経口的に投与される。治療されるべき組織 は、典型的には全身系投与によって体内で接触し、たいていは治療組成物の静脈 内投与によって治療されるが、標的にした組織が標的分子を含む可能性がある他 の組織及び送達手段も企図される。従って、本発明のモノクローナル抗体、ポリ ペプチド又は有機擬似体は眼内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、洞内、経皮投 与され、蠕動手段によっても送達される。 本発明のα_vβ₅拮抗体を含む治療組成物は、静脈内に、例えば、単位用量を注 射することにより慣用的に投与される。本発明の治療組成物に対して用いられる 場合の“単位用量”という用語は、患者に対する単位用量として適切な物理的に 分離している単位を意味し、各単位は必要とされる希釈剤、即ち、担体又は伝達 体と会合して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有 する。 実施例に示された好適実施態様においては、α_vβ₅拮抗体は１回の用量で静脈 内投与される。 組成物は、投薬処方と適合する方法及び治療的に有効な量で投与される。投与 されるべき量及び投与のタイミングは、治療されるべき患者、有効成分を用いる 患者の全身の能力及び所望される治療効果の程度に左右される。投与に必要とさ れる有効成分の正確な量は、開業医の判断に左右され、各個体に特有である。し かしながら、全身系適用に適した用量範囲は、本明細書に開示され、投与経路に 左右される。投与に適した用法は可変であるが、典型的には、最初の投与に続い て１時間以上の間隔で注射又は他の投与によって繰り返される。また、生体内治 療法に指定される範囲で血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が企図さ れる。 Ｄ．治療組成物 本発明は、本明細書に記載される治療法を実施するのに有効な治療組成物を企 図する。本発明の治療組成物は、有効成分としてその中に溶解又は分散されたα_v β₅拮抗体と共に生理的に許容しうる担体を含有する。好適実施態様においては 、α_vβ₅拮抗体治療組成物は治療のために哺乳動物又はヒト患者に投与される場 合に免疫原性ではない。 本明細書に用いられる組成物、担体、希釈剤及び試薬を意味する“薬学的に許 容しうる”、“生理的に許容しうる”及びその文法上変化した用語は、同じ意味 に用いられ、はきけ、めまい、胃の不調等の望ましくない生理作用を生じること なく哺乳動物に投与することができることを示す。 有効成分が溶解又は分散されたものを含む薬理的組成物の調製は、当該技術に おいて十分に理解されており処方に対して制限されることを必要としない。典型 的には、かかる組成物は溶液或いは懸濁液のような注射用剤として調製されるが 、使用前に液体としての溶液又は懸濁に適した固体剤形も調製される。調製を乳 化することもできる。 有効成分を、薬学的に許容しうる及び有効成分と適合する賦形剤と本明細書に 記載される治療法に使用するのに適した量で混合することができる。適切な賦形 剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等及び その組合わせである。更に所望により、本組成物は有効成分の有効性を高める湿 潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の少量の補助物質を含有することができる。 本発明の治療組成物は、その中の成分の薬学的に許容しうる塩を包含すること ができる。薬学的に許容しうる塩としては、塩酸又はリン酸のような無機酸、又 は酢酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸と形成される酸付加塩（ポリペプチドの 遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩は 水酸化ナトリウム、アンモニウム、カルシウム又は鉄のような無機塩基、及びイ ソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジ ン、プロカイン等の有機塩基から誘導される。 環状ポリペプチドα_vβ₅拮抗体の調製に用いられる場合、ＨＣｌ塩が特に好ま しい。 生理的に許容しうる担体は当該技術において周知である。液体担体の具体例は 有効成分と水のほかに物質を含まないか又は生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、 生理的食塩水又はその双方、例えば、リン酸塩緩衝食塩水を含む滅菌水溶液であ る。更に、水性担体は１種以上の緩衝塩、及び塩化ナトリウム及びカリウム、デ キストロース、ポリエチレングリコール及び他の溶質のような塩を含有すること ができる。 液体組成物は、また、水に加えて及び水を加えずに液相を含有することもでき る。かかる液相の具体例は、グリセリン、綿実油のような植物油、及び水／油型 エマルジョンである。 治療組成物は、典型的には全治療組成物の重量に対して少なくとも０.１重量 ％の量の拮抗体を含有するように処方された本発明のα_vβ₅拮抗体の血管形成阻 止量を含有する。重量％は、全組成物に対するインヒビターの重量比である。従 って、０.１重量％は、全組成物１００ｇに対して０.１gのインヒビターである 。 Ｅ．インテグリンα_vβ₅の拮抗体 α_vβ₅拮抗体は、組織において血管形成を阻止する本方法に用いられ、天然α_v β₅リガンドとの機能上の相互作用が妨害されるような方法でα_vβ₅と相互作用 する化合物を含むさまざまな形態をとることができる。具体的な拮抗体としては 、α_vβ₅上のリガンド結合部位に由来するα_vβ₅の類縁体又は擬似体、α_vβ₅リ ガンド結合相互作用に関係する構造領域に似ている天然α_vβ₅リガンドの擬似体 、特にα_vβ₅の天然リガンドのＲＧＤ含有ドメインに対応するα_vβ₅に特異的な 天然リガンドの機能上の結合ドメインに対応する配列をもつポリペプチド、及び 全てが本明細書に定義される拮抗体活性を示すα_vβ₅或いは天然リガンドと免疫 反応する抗体が含まれる。 １．ポリペプチド 実施態様においては、本発明は、ポリペプチドとしてのα_vβ₅拮抗体を企図す る。ポリペプチド（ペプチド）α_vβ₅拮抗体は、α_vβ₅リガンド相互作用に関係 する領域において天然α_vβ₅リガンド或いはα_vβ₅自体の配列特徴をもちかつ本 明細書に記載されるα_vβ₅拮抗体活性を示すものである。好ましいα_vβ₅拮抗体 ペプチドは、ＲＧＤトリペプチドを含み、配列がＲＧＤ含有領域において天然リ ガンドに対応する。 好ましいＲＧＤ含有ポリペプチドは、配列が周知であるビトロネクチンのよう な天然α_vβ₅リガンドのＲＧＤ含有領域のアミノ酸残基配列に対応する配列をも っている。 特に好ましいα_vβ₅拮抗体ペプチドは、上述のように他のインテグリンに比べ た場合に天然リガンドに対するα_vβ₅結合を優先的に阻止する。これらの α_vβ₅特異的ペプチドは、少なくともα_vβ₅に対する特異性が他のインテグリン の阻害のような望ましくない副作用の頻度を減少させることから特に好ましい。 α_vβ₅に対する選択性をもつ好ましいα_vβ₅拮抗体ペプチドの同定は、実施例に 記載されるＥＬＩＳＡ分析のような典型的な結合分析阻害で容易に確認される。 実施態様においては、本発明のポリペプチドは、約１００個を超えないアミノ 酸残基、好ましくは約６０個を超えない残基、更に好ましくは約３０個を超えな い残基を含む。ペプチドは線状又は環状とすることができるが、特に好ましいペ プチドは環状である。実施例に好ましいペプチドが記載される。 α_vβ₅リガンドのα_vβ₅への結合を拮抗するのに必要な配列を含みかつ本明細 書に記載されるような分析でα_vβ₅拮抗体として機能することができる限り、本 ポリペプチドは天然α_vβ₅リガンドのアミノ酸残基配列と同一であることを必要 としないことは理解されるべきである。 本ポリペプチドとしては、ポリペプチドがα_vβ₅拮抗体である限りアミノ酸残 基配列が本明細書に示されるポリペプチドの類縁体、断片又は化学誘導体が含ま れる。従って、本ペプチドは、さまざまな変化、置換、挿入及び欠失を受けるこ とができ、かかる変化は使用においてある種の利点を与える。この点で、本発明 のα_vβ₅拮抗体ポリペプチドは、１以上の変化が行われる場合に示されるペプチ ドの配列と同一であるよりもそれに対応し、本明細書に定義される分析の１以上 においてα_vβ₅拮抗体として機能する能力を保持している。 従って、ポリペプチドは、アミド、タンパク質との複合体、環化ペプチド、重 合ペプチド、類縁体、断片、化学修飾ペプチド及び類似の誘導体が含まれる種々 の形態のペプチド誘導体のいずれであってもよい。 “類縁体”という用語は、１種以上の残基が機能的に類似の残基で同類置換さ れかつ本明細書に記載されるα_vβ₅拮抗体活性を示す本明細書に詳細に示される 配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列をもつポリペプチドが含まれる。同類置 換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような非極 性（疎水性）残基の他の基に対する置換、アルギニンとリシン、グルタミンとア スパラギン、グリシンとセリン間のような極性（親水性）残基の他の基に対す る置換、又はアスパラギン酸又はグルタミン酸のような酸性残基の他の基に対す る置換が含まれる。 “同類置換”という用語は、ポリペプチドが必要な阻害活性を示すならば非誘 導化残基の代わりに化学誘導化残基の使用が含まれる。 “化学誘導体”は、側鎖官能基の反応によって化学的に誘導された１個以上の 残基をもつ本ポリペプチドを意味する。かかる誘導化分子としては、例えば、遊 離アミノ基が誘導化されてアミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベン ゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形 成する分子が含まれる。遊離カルボキシル基は誘導化されて塩、メチル及びエチ ルエステル又は他の種類のエステル又はヒドラジンを形成することができる。遊 離ヒドロキシ基は、誘導化されてＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成する ことができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導化されてＮ−インベンジ ルヒスチジンを形成することができる。化学誘導体としては、２０個の標準アミ ノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を１個以上含むペプチドが含まれる。例え ば、プロリンが４−ヒドロキシプロリンに置換され、リシンが５−ヒドロキシリ シンに置換され、ヒスチジンが３−メチルヒスチジンに置換され、セリンがホモ セリンに置換され、リシンがオルニチンに置換される。本発明のポリペプチドは 、また、必要な活性が維持される限り、１個以上の付加及び／又は欠失又は配列 が本明細書に示されるポリペプチドの配列に相対する残基をもつポリペプチドが 含まれる。 “断片”という用語は、アミノ酸残基配列が本明細書に示されるポリペプチド より短いアミノ酸残基配列をもつ本ポリペプチドを意味する。 本発明のポリペプチドが天然α_vβ₅リガンドの配列と同一でない配列をもつ場 合には、典型的には１個以上の同類又は非同類置換が行われたことから１００個 中通常は約３０個を超えない数、好ましくは１０個を超えない数が置換される。 追加の残基は、本発明のポリペプチドを標識又は固体マトリックスに便利にくっ つける“リンカー”を与えるためにポリペプチドの末端或いは担体に付加される 。 本発明のポリペプチドと用いられる標識、固体マトリックス及び担体は、下記 に記載される。 アミノ酸残基リンカーは、通常は少なくとも１個の残基であり、４０個以上の 残基、たいていは１〜１０個の残基であってもよいが、α_vβ₅リガンドエピトー プを形成しない。連鎖に用いられる典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システ イン、リシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸等である。更に、本ポリペプチ ドは、特にことわらない限り、末端ＮＨ₂アシル化、例えば、アセチル化、又は チオグリコール酸アミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンによる末端カル ボキシアミド化、及び類似の末端修飾によって修飾される配列によりα_vβ₅リガ ンドの天然配列と異なる。周知のように末端修飾は、プロテイナーゼ消化による 感受性を減少させかつ溶液、特にプロテアーゼが存在する生物学的液体中のポリ ペプチドの半減期を長くするように働くのに有効である。この点で、ポリペプチ ドの環化は、有効な末端修飾であり、環化によって形成された安定な構造である ことから及び本明細書に記載される環状ペプチドに認められる生物活性の観点か ら特に好ましい。 本発明のペプチドは、薬学的に許容しうる塩の形で用いられる。本発明のペプ チドと塩を形成することができる適切な酸としては、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ) 、塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸 、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸 、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、ナフタレンス ルホン酸、スルファニル酸等のような無機酸が挙げられる。ＨＣｌ塩が特に好ま しい。 本発明のペプチドと塩を形成することができる適切な塩基としては、水酸化ナ トリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基、及びモノ、ジ及 びトリアルキル及びアリールアミン（トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン 、メチルアミン、ジメチルアミン等）及び置換されていてもよいエタノールアミ ン（エタノールアミン、ジエタノールアミン等）のような有機塩基が挙げられる 。 本明細書において本ポリペプチドと呼ばれる本発明のペプチドは、組換えＤＮ Ａ技術を含むポリペプチド技術における当業者に既知の手法によって合成される 。固相メリフィールド合成法のような合成化学法は、純度、抗原特異性、望まし くない副産物がない、製造が容易等の理由のために好ましい。用いうる多くの手 法 のきわめて良好な概要は、固相ペプチド合成についてはStewardら，“Solid Pha se Peptide Synthesis”，W.H.Freeman Co.,サンフランシスコ，1969; Bodanszk yら，“Peptide Synthesis”，John Wiley & Sons，Sec．Edit.，1976; J．Meie nhofer，“Hormonal Proteins and Peptides”，Vol．2，p．46，Academic Pres s(ニューヨーク)，1983；Merrifield，Adv ．Enzymol.，32:221-96，1969; Field sら，Int ．J．Peptide Protein Res.，35:161-214，1990; 米国特許第4,244,946 号、古典的溶液合成についてはSchroderら，“The Peptides"，Vol.1，Academic Press(ニューヨーク)，1965に見出され、その各々の記載は本願明細書に含まれ るものとする。かかる合成に使用できる適切な保護基は、上記の本文及びJ.F.W ．McOmie，“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press,ニュ ーヨーク，1973に記載されており、それらの記載は本願明細書に含まれるものと する。 一般的には、企図された固相合成法は、１個以上のアミノ酸残基又は適当に保 護されたアミノ酸残基を成長するペプチド鎖に連続付加することを含む。通常は 、最初のアミノ酸残基のアミノ基或いはカルボキシル基が選択的に除去可能な適 切な保護基によって保護される。リシンのような反応性側鎖基を含むアミノ酸に 選択的に除去可能な種々の保護基が用いられる。 具体例として固相合成を用いると、保護又は誘導化アミノ酸を非保護カルボキ シル基又はアミノ基を介して不活性固体支持体に結合する。次に、アミノ基又は カルボキシル基の保護基を選択的に除去し、固体支持体に既に結合した残基とア ミド結合を形成するのに適した条件下で適当に保護された相補（アミノ又はカル ボキシル）基をもつ配列の次のアミノ酸を混合及び反応させる。次に、アミノ基 又はカルボキシル基の保護基を新たに付加したアミノ酸残基から除去し、次のア ミノ酸（適当に保護された）を付加する等々。所望のアミノ酸が全て適切な配列 に結合した後、残っている末端基及び側鎖基の保護基（及び固体支持体）は連続 して又は同時に除去して最終の線状ポリペプチドを生成する。 上記のように調製された線状ポリペプチドを反応させて対応する環状ペプチド を形成することができる。ペプチドを環化する具体的な方法は、Zimmerら，Pept ides 1992 ， pp．393-394，ESCOM Science Publishers，B.V.，1993に記載さ れている。典型的には、t-ブトキシカルボニル保護ペプチドメチルエステルをメ タノールに溶解し、水酸化ナトリウム溶液を加え、混合液を２０℃（２０Ｃ）に 反応させてメチルエステル保護基を加水分解的に除去する。溶媒を蒸発させた後 、t-ブトキシカルボニル保護ペプチドを酢酸エチルで酸性にした水性溶媒から抽 出する。次に、ジオキサン共溶媒中緩和な酸性条件下でt-ブトキシカルボニル保 護基を除去する。そのようにして得られた遊離アミノ末端及びカルボキシ末端を 有する非保護線状ペプチドを、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＮ−メチ ルモルホリンの存在下にジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合液中線 状ペプチドの希釈溶液とジシクロヘキシルカルボジイミドとを反応させることに より対応する環状ペプチドに変換する。得られた環状ペプチドをクロマトグラフ ィーで精製する。 特に好ましい環状ペプチド合成法は、Gurrathら，Eur ．J．Biochem.，210:911 -921(1992)及び実施例に記載されている。α_vβ₅結合血管形成を主に示す組織に おいて本方法で使用するのに特に好ましいペプチドは、実施例に記載されており 、配列番号４、６、７、８及び９に示されるポリペプチドが含まれる。 ２．モノクローナル抗体 実施態様においては、本発明は、α_vβ₅と免疫反応しかつ本明細書に記載され る天然リガンドへのα_vβ₅結合を阻害するモノクローナル抗体としてのα_vβ₅拮 抗体を述べるものである。本発明は、また、抗体を産生する細胞系、該細胞系の 生産方法及び該モノクローナル抗体の生産方法を述べるものである。 本発明のモノクローナル抗体は、１）単離したα_vβ₅と免疫反応する及び２） α_vβ₅へのビトロネクチン結合を阻害する抗体分子を含んでいる。α_vβ₅へ優先 的に結合する好ましいモノクローナル抗体としては、実施例に記載されるmAb P1 F6及びmAb P5H9の免疫反応特性を有するモノクローナル抗体が含まれる。 文法上さまざまに変形した“抗体又は抗体分子”という用語は、免疫グロブリ ン分子及び／又は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗体結合 部位又はパラトープを含む分子の集団を意味する集合名詞として本明細書に用い られる。 “抗体結合部位”は、抗原を特異的に結合する重鎖及び軽鎖可変及び超可変領 域から構成される抗体分子の構造部分である。 本発明に使用する具体的な抗体は、無傷免疫グロブリン分子、実質的に無傷の 免疫グロブリン分子及びＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ(ａｂ′)₂及びＦ（ｖ）として当 該技術において既知の部分を含み抗体断片とも言われる、パラトープを含む免疫 グロブリン分子の一部である。 他の好適実施態様においては、本発明は、本発明のモノクローナル抗体に由来 するＦａｂフラグメントを含む切断型免疫グロブリン分子を企図する。Ｆｃレセ プターのないＦａｂフラグメントは可溶性であり、血清半減期において治療上有 利であり、可溶性Ｆａｂフラグメントを使用する方法において診断上有利である 。可溶性Ｆａｂフラグメントの調製は、一般的には免疫学的技術において既知で あり、さまざまな方法によって達成される。 例えば、実質的に無傷の抗体に対してパパイン及びペプシンを周知の方法で各 々タンパク質分解反応させることによりＦａｂ及びＦ(ａｂ′)₂部分（フラグメ ント）が調製される。例えば、Theofilopolous & Dixonの米国特許第4,342,566 号を参照されたい。Ｆａｂ′抗体部分も周知であり、Ｆ(ａｂ′)₂部分から生産 され、次に、メルカプトエタノールとのような２つの重鎖部分を結合するジスル フィド結合の還元に続いて得られたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミ ドのような試薬でアルキル化する。無傷免疫グロブリン分子を含む抗体が好まし く、本明細書に示されるように用いられる。 文法上さまざまに変形した“モノクローナル抗体”という用語は、具体的なエ ピトープと免疫反応することができる唯一の種類の抗体結合部位を含む抗体分子 の集団を意味する。即ち、モノクローナル抗体は、典型的には、免疫反応するエ ピトープに単結合親和性を示す。従って、モノクローナル抗体は、各々が異なる エピトープに免疫特異的な複数の抗体結合部位をもつ抗体分子を含むことができ る、例えば、二重特異性モノクローナル抗体。 モノクローナル抗体は、典型的には、唯一の種類の抗体分子を分泌する（産生 する）ハイブリドーマと呼ばれる単細胞のクローンによって産生された抗体から 構成される。抗体産生細胞とミエローマ又は他の自己永続細胞系を融合すること によりハイブリドーマ細胞が形成される。かかる抗体の調製は、Kohler & Milstein，Nature，256:495-497(1975)に最初に記載され、その論文の記載は本 願明細書に含まれるものとする。更に、Zola，Monoclonal Antibodies: AManual of Techniques ，CRC Press，Inc．(1987)に方法が記載されている。そのように 調製されたハイブリドーマ上清についてα_vβ₅と免疫反応する抗体分子の存在及 び天然リガンドへのα_vβ₅結合の阻害を選別する。 概要としては、モノクローナル抗体組成物を生産するハイブリドーマを形成す るために、ミエローマ又は他の自己永続細胞系をα_vβ₅源で超免疫した哺乳動物 の脾臓から得られたリンパ球と融合する。 ハイブリドーマを調製するために用いられるミエローマ細胞系はリンパ球と同 じ種由来であることが好ましい。典型的には、129 GlX⁺株のマウスが好ましい哺 乳動物である。本発明に使用するのに適切なマウスミエローマとしては、アメリ カン・タイプ・カルチュア・コレクション、メリーランド州ロックビルからCRL 1580及びCRL 1581の呼称で各々入手できるヒポキサンチン−アミノプテリン−チ ミジン感受性（ＨＡＴ）細胞系P3X63-Ag8.653及びSp2/O-Ag14gaが含まれる。 脾細胞は、典型的には、ミエローマ細胞とポリエチレングリコール（ＰＥＧ） 1500を用いて融合させる。融合ハイブリッドは、ＨＡＴに対する感受性によって 選択される。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、その変 法が実施例に記載される酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて同定 される。 本発明のモノクローナル抗体は、また、適切な特異性を有する抗体分子を分泌 するハイブリドーマを含有する栄養培養液を含むモノクローナルハイブリドーマ 培養を開始することにより生産される。培養は、ハイブリドーマが抗体分子を培 養液に分泌するのに十分な条件及び時間で維持される。次に、抗体含有培養液が 集められる。次に、抗体分子が周知の手法で単離される。 これらの組成物の調製に有用な培養液は、当該技術及び市販双方において周知 であり、合成培養液、近交系マウス等が挙げられる。具体的な合成培養液は、４ .５g/lグルコース、２０mMグルタミン及び２０％ウシ胎児血清で補足したダルベ ッコの最少必須培地(DMEM; Dulbeccoら，Virol.，8:396，1959)である。具体的 な近交系マウス株はＢａｌｂ／ｃである。 モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞又はハイブリドーマ細胞培養物の他 の生産方法も周知である。例えば、Sastryら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA，8 6:5728-5732（1989）及びHuseら，Science ，246:1275-1281（1989）に記載され た免疫学的レパートリーからモノクローナル抗体を単離する方法を参照されたい 。 ハイブリドーマ細胞及び本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー マ細胞を含む培養物も企図される。モノクローナル抗体mAb P1F6及びmAb P5H9を 分泌するハイブリドーマ細胞系が特に好ましく、その調製は実施例に記載されて いる。 実施態様においては、本発明は、mAb P1F6及びmAb P5H9の免疫反応特性を有す るモノクローナル抗体を企図する。 モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ（即ち、等価な）特 異性（免疫反応特性）をもつ場合には前者が予め選ばれた標的分子に結合しない ように後者を妨げるかを確認することにより過度に実験せずに求めることが可能 である。固相に存在する場合に標的分子に結合する標準競合分析において本発明 のモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、試験されるモ ノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合する場合にはその２つの モノクローナル抗体は同じか又は密接に関連したエピトープに結合すると思われ る。 モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかを求め る他の方法は、本発明のモノクローナル抗体と通常は反応性の標的分子とプレイ ンキュベートし、次に、試験されるモノクローナル抗体を加えて試験されるモノ クローナル抗体の標的分子を結合する能力が阻止されるかを求めるものである。 試験されるモノクローナル抗体が多分阻害される場合には、本発明のモノクロー ナル抗体と同じか又は機能的に等価なエピトープ特異性を有する。 モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかを求め る他の方法は、問題の抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸残基配列を求めるものである 。ＣＤＲ領域において同一の又は機能的に等価なアミノ酸残基配列をもつ抗体分 子は、同じ結合特異性を有する。ポリペプチドの配列方法は当該技術において周 知である。 抗体の免疫特異性、その標的分子結合能及び抗体がエピトープに対して示す付 随する親和性は、抗体が免疫反応するエピトープによって定義される。エピトー プ特異性は、抗体の免疫グロブリンの重鎖可変領域アミノ酸残基配列によって少 なくとも部分的に及び軽鎖可変領域アミノ酸残基配列によって部分的に定義され る。 “結合特異性を有する”という用語の使用は、等価なモノクローナル抗体が同 じか又は類似の免疫反応（結合）特性を示しかつ予め選ばれた標的分子への結合 に競合することを意味する。 人間化モノクローナル抗体は、特にヒトにおいて治療的に用いられる限りマウ スモノクローナル抗体より特に有利である。詳細には、ヒト抗体は“異種”抗原 ほど速やかに循環から清浄化されない。更に、ヒト抗体は異種抗原及び異種抗体 と同じ方法で免疫系を活性化しない。“人間化”抗体の調製方法は、一般的には 、当該技術において周知であり、本発明の抗体に容易に適用される。 従って、実施態様においては、本発明は、抗原を結合する抗体能力を実質的に 妨害せずに移植してヒト免疫系の成分を導入することにより人間化される本発明 のモノクローナル抗体を企図する。 ３．α_vβ₅特異的擬似体 本発明は、α_vβ₅機能を妨害する能力をもつポリペプチド、抗体及び“擬似体 ”と称する他の分子が含まれるたいていのα_vβ₅拮抗体が本発明に用いられるこ とを証明する。α_vβ₅機能を特に妨害しかつ他のインテグリン機能を妨害しない 拮抗体が特に好ましい。 この関係においては、さまざまな試薬が必要な生物活性を有する限り本方法で 使用するのに適切であることが理解される。これらの試薬は、レセプター内のリ ガンド結合ドメインを遮断して正常な機能を妨害（即ち、阻止）することにより レセプターとリガンドの機能上の相互作用に関係するα_vβ₅リガンドに“似せる ”能力を有するので擬似体と包括的に言われる。代替的実施態様においては、α_v β₅拮抗体がリガンドではなくむしろレセプターの擬似体である。 擬似体は、抗体又はリガンド由来ペプチド以外の上記の性質を示す分子である 。ペプチドの合成類縁体、上記の結合ドメインの結合ポケットのように形成され る 化合物、又は他の分子とすることができる。本発明の好ましい擬似体は、有機系 分子であり、有機擬似体と呼ばれる。α_vβ₅リガンドに対する擬似体であること によりα_vβ₅拮抗体として機能する特に好ましい有機擬似体分子は、実施例１０ に記載される化合物７、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７及び１８であ る。 α_vβ₅擬似体の設計は、分子モデリング、二次元核磁気共鳴(2-D NMR)分析、 ｘ線結晶学、ペプチドのランダムスクリーニング、ペプチド類縁体又は他の化学 ポリマーライブラリー、及び類似の薬剤設計方法を含む当該技術において既知の 薬剤設計についての種々の構造分析解析法で行われる。 α_vβ₅拮抗体がα_vβ₅の選択阻害の機能特性を共有する種々の異なる化学構造 である小ポリペプチド、モノクローナル抗体又は有機分子であることを示す本発 明の明細書に示された広範囲の構造上の証明の観点から、本方法に有効な本α_v β₅拮抗体の構造は限定されることを必要としないが本明細書に定義されるα_vβ₅ 擬似体が含まれる。 Ｆ．α_vβ₅拮抗体の同定方法 本発明は、また、本方法に従って使用するための候補α_vβ₅拮抗体を同定する 分析法を述べるものである。これらの分析法においては、候補分子について天然 リガンドへのα_vβ₅結合を阻害する点での効力を評価し、組織において血管形成 を阻止する点での効力を評価する。 第１の分析は、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）における血管形成を測定し、ＣＡ Ｍ分析と呼ばれる。ＣＡＭ分析は、他のものに詳述されており、血管形成及び腫 瘍組織の血管新生の双方を測定するために用いられてきた。Ausprunkら，Am ．J ．Pathol.， 79:597-618(1975)及びOssonskiら，Cancer Res. ，40:2300-2309(198 0)を参照されたい。 ＣＡＭ分析は、全組織の血管新生が起こっていることから生体内血管形成の十 分に認められた分析モデルである。実際のニワトリ胚血管は、ＣＡＭ内又はＣＡ Ｍ上で発育した組織内へ増殖している。 本明細書に示されるＣＡＭ分析は、新しい血管増殖の量及び程度の双方に対し て血管新生の阻害を示す。更に、腫瘍組織のようなＣＡＭに移植した組織の発育 をモニターすることが容易である。更に、該分析は、分析系において毒性の内部 制御があることから特に有用である。ニワトリ胚を試験試薬に曝露する。それだ けで、胚の健康状態が毒性を示す。 血管形成を測定する第２の分析は、生体内ウサギ眼モデルであり、ウサギ眼分 析と呼ばれる。ウサギ眼分析は、他のものに詳述されており、タリドマイドのよ うな血管形成インヒビターの存在下に血管形成及び血管新生の双方を測定するた めに用いられてきた。D'Amatoら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA，91:4082-4085 (1994)を参照されたい。 ウサギ眼分析は、角膜縁から角膜内へ発生するウサギ血管によって例示される 血管新生過程が眼の通常は透明な角膜を介して簡単に可視化されるので生体内血 管形成の十分に認められた分析モデルである。更に、血管新生の促進もしくは阻 止又は血管新生の退行の経時の程度及び量の双方が簡単にモニターされる。 更に、ウサギを試験試薬に曝露し、それだけでウサギの健康状態が試験試薬の 毒性を示す。 第３の分析は、天然リガンド、ビトロネクチンのα_vβ₅への直接結合の阻害を 測定し、好適実施態様が実施例に詳述される。該分析は、典型的には、阻止がα_v β₅特異的阻害によって仲介される固相におけるビトロネクチンのような天然リ ガンドの単離α_vβ₅への結合阻害の程度をＥＬＩＳＡで測定するものである。 従って、該分析は、α_vβ₅に対する特異的を示しかつ天然リガンドが他のイン テグリンを結合することから阻害しない化合物を同定するために用いられる。特 異性分析は、α_vβ₅及び他のインテグリンの双方について天然リガンドを結合す る各々の能力及び予め選ばれたリガンドを結合するインテグリンの各々の能力を 阻害する候補化合物を別個の分析室内で同時に選別するＥＬＩＳＡ分析を平行し て実験することにより行われる。実施例 下記の実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、本発明を個々に限定 するものとして解釈されるものでないことは当然のことである。更に、当業者の 範囲内である現在既知の又は後に開発される本発明の変更は、後に請求の範囲に 記載される本発明の範囲内に包含されるものである。 １．α_vβ₅特異的モノクローナル抗体の調製 Waynerら，J ．Cell Biol.，113:919-929(1991)に記載されるようにＡ５４９肺 がん腫細胞をＲＢＦ／ＤｎＪマウスに免疫することにより標準ハイブリドーマ法 を用いてモノクローナル抗体、Ｐ１Ｆ６及びＰ５Ｈ９を生産した。この文献の記 載は本願明細書に含まれるものとする。脾臓を免疫マウスから切除し、Ｎｓ−１ ／ＦＯＸ−ＮＹミエローマ細胞と融合する。がん腫細胞ビトロネクチンレセプタ ーに対するハイブリドーマ産生抗体を、Waynerらに記載されるビトロネクチン被 覆表面へのＵＣＬＡ−Ｐ３接着の特異的阻害により選別し、胸腺細胞支持細胞上 で限界希釈することによりクローン化した。 Ｐ１Ｆ６及びＰ５Ｈ９の両モノクローナル抗体は、α_vβ₅複合体と特異的に免 疫反応し、α_vサブユニット、β₅サブユニット又は他のインテグリンと免疫反応 しないことがわかった。Ｐ１Ｆ６モノクローナル抗体は、Gibco BRL(Life Techn ologies，Inc.，メリーランド州ゲイザースバーグ)から市販されており、Ｐ５Ｈ ９モノクローナル抗体はFred Hutchinson Cancer Research Institute，ワシン トン州シアトルのDr．E．Waynerから入手したものである。 本発明に使用するための他のα_vβ₅モノクローナル抗体を、ここに記載される ように同様に誘導及び確認する。更に、α_vβ₅モノクローナル抗体を、不純な或 いは精製した形態のα_vβ₅で免疫するマウスから単離した脾臓を融合することに より生産する。α_vβ₅の精製は、インテグリンバイオロジーの当業者に周知の手 順であり、Smithら，J ．Biol．Chem.，265:11008-11013(1990)に記載されており 、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。精製されると、単離した レセプターを、Ｅ２項及び実質的にKohler & Milstein，Nature，256:495-497(1 975)に記載されるように調製されるマウスを免疫する免疫原として調製する。得 られたハイブリドーマクローンについて免疫原との反応性を選別し、次に、下記 の実施例に記載されるように確認する。 ２．抗α_vβ₅モノクローナル抗体の特異性の確認及びα_vβ₅発現の組織分布のマ ッピングでの使用 Ａ．ビトロネクチンに対する特異性 実施例１で調製されたＰ５Ｈ９モノクローナル抗体は、ＵＣＬＡ−Ｐ３がん腫 細胞のビトロネクチンへの結合を阻止しコラーゲン又はフィブロネクチンへの細 胞結合に影響しないことがWaynerら，J ．Cell Biol.，113:919-929（1991）によ ってわかった。その細胞は、α_vβ₅ビトロネクチンレセプターのみ含み、α_vβ₃ 特異性を有するものを含まず、非還元条件でα鎖（１６０ｋＤ）及びβ鎖（９５ ｋＤ）からなるヘテロ二量体を免疫沈降することもわかった。Ｐ５Ｈ９で検出さ れたα_vβ₅レセプターは、Ｍ２１メラノーマ細胞及びＨ２９８１がん腫細胞のビ トロネクチンへの接着を仲介することもわかった。Ｐ１Ｆ６モノクローナル抗体 は、同じ免疫反応性プロファイルを有する。 Ｂ．抗インテグリンレセプター抗体による免疫蛍光 創傷治癒中、血管の基底膜はフォンビルブラント因子、フィブロネクチン及び フィブリンを含む数種の接着性タンパク質を発現する。更に、接着性レセプター のインテグリンファミリーの一部は培養した平滑筋及び内皮細胞の表面上で発現 する。Cheresh，Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA，84:6471(1987); Janatら，J ．C ell Physiol.， 151:588(1992); Chengら，J ．Cell Physiol.，139:275（1989） を参照されたい。 インテグリンβ₅サブユニットの構造及び機能のほかに、他の抗β₅モノクロー ナル抗体でマッピングすることによるサブユニットの組織分布は、Pasqualiniら ，J ．Cell Sci.，105:101-111(1993)に記載されており、この明細書の記載は本 願明細書に含まれるものとする。 実施例１に記載されたものと同様の上記のβ₅サブユニット特異的モノクロー ナル抗体を、Ａ５４９ヒト肺がん腫細胞系で免疫したマウスからの脾細胞を用い て調製されるハイブリドーマから分泌した。ハイブリドーマの培養上清によるＡ ５４９細胞のポジティブ表面染色及び表面標識Ａ５４９抽出液からのα_vβ₅複合 体の免疫沈降によってハイブリドーマを選択した。次に、モノクローナル抗体を 用いて正常ヒト胸腺、皮膚及び腎におけるβ₅サブユニットの組織分布をマッピ ングした。Pasqualiniらの文献に記載されるように行われるβ₅インテグリンに 特異的な抗体による後続のストレプトアビジン−ビオチンイムノペルオキシダー ゼ染色のためにクリオスタットミクロトームで凍結組織ブロックから４μ厚切 片を切り取った。 胸腺切片の染色から、血管、ハッサル小体、皮質及び髄質の間質細胞、及び基 底膜にβ₅の分布が示された。皮膚切片から、表皮の基底層及び血管皮膚壁にβ₅ が示され、腎切片から、糸球体部、旁糸球体装置、近位曲尿細管及び集合管の染 色が示された。従って、β₅の分布は、毛細内皮細胞を含む異なる種類の細胞、 更に重要なことにはその細胞上の異なる種類の細胞に対して不均一であり、その 染色は培養した臍帯静脈内皮細胞の染色と一致した。 Ｃ．抗インテグリンレセプター抗体による眼疾患に罹った患者からのヒト網膜組 織の免疫蛍光 眼の血管新生は、視力の破滅的消失を生じる多数の眼疾患に認められる最も共 通の病変である。以前から存在する脈絡膜、網膜又は縁周囲血管から新しい血管 の発生は、浮腫、出血又は線維血管膜形成を招き、眼の正常な解剖学的関係の破 壊を生じ、付随して正常な視覚機能の消失を生じる。 生理的条件下、血管形成は高度に調節され、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦ ＧＦ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のような特定の血管形成サイトカイン によって活性化されることがわかった。Brooksら，Science ，264:569-571（1994 ）に記載されるように、α_vβ₅に対するモノクローナル抗体は下記のＣＡＭモデ ルを含むモデル系においてｂＦＧＦ及びＴＮＦ−α誘導血管形成の双方を阻止す ることがわかった。実施例４〜６に記載されるように、α_vβ₅に対するモノクロ ーナル抗体は、特に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖 因子−α（ＴＧＦ−α）及び表皮増殖因子（ＥＧＦ）によって誘導した別個の血 管形成経路を阻止する。 従って、本発明の関係において本明細書に記載される２経路の血管形成は異な るインテグリン、α_vβ₃及びα_vβ₅によって定義される。ヒト眼疾患におけるこ れらのインテグリンの発現及び役割を調べるために、糖尿病性増殖性網膜症（Ｐ ＤＲ）をもつ患者から硝子体切除術で新生血管網膜上膜及び新生血管網膜下膜の 一塊を得た。これらの患者について臨床的に追跡し、臨床試験及び蛍光眼底血管 造影法によって証明される活性な増殖性血管新生疾患をもつことに基づく組織学 的評価を選択した。得られた組織をティッシュテック凍結保存剤中で直接凍 結し、切片にした。 これらの患者からの組織を免疫蛍光で試験した場合、血管はマウスモノクロー ナル抗体ＬＭ６０９との免疫反応性によって示されるようにインテグリンα_vβ₃ に陽性であった。インテグリンの分布は、血管に制限されるように見られ、因子 に対するウサギ抗体でマッピングした血管のマーカー、フォンビルブラント因子 の染色と一致した。免疫反応性の部位をローダミン結合抗マウス免疫グロブリン 或いはフルオレセイン結合抗ウサギ免疫グロブリンで可視化し、その双方の使用 はインテグリンの場所と血管特異抗体の同時局在を可能にした。 正常な眼又は血管を活発に増殖しない萎縮性膜をもつ患者から得られた試料は 、免疫蛍光でインテグリンα_vβ₃に陰性であった。 同時に、同じ組織について実施例１で調製された抗α_vβ₅モノクローナル抗体 、Ｐ１Ｆ６によるα_vβ₅の存在と分布を免疫組織化学的に分析した。α_vβ₅がフ ォンビルブラント因子の分布で同時局在した血管に存在することが染色からわか った。しかしながら、非血管組織はＰ１Ｆ６による蛍光が制限され、α_vβ₅の広 い分布を示した。これは、血管に制限されるα_vβ₃の存在と対照的であった。 α_vβ₃とα_vβ₅間で各々の抗体ＬＭ６０９とＰ１Ｆ６による膜の免疫蛍光染色 を比較した場合、血管壁に対する染色パターンはほとんど同じであり、α_vβ₃と α_vβ₅は共に糖尿病性網膜症のような血管新生眼疾患に存在する新たに増殖する ヒト血管の表面上に表されることが示された。 ここに記載された結果から、活発な増殖性血管新生疾患をもつ患者からの新生 血管膜に見られるようにα_vβ₅インテグリンレセプターは血管形成が起こってい る特定の種類の組織で選択的に発現することがわかる。従って、実施例４〜６に 記載される具体的な増殖因子に曝露された組織と共にこれらの組織は、本発明の 治療態様の理想的な標的である。 ３．合成ペプチドの調製 本発明の方法を実施するのに用いられる環状ポリペプチドを、例えば、Merrif ield，Adv ．Enzymol.，32:221-296(1969)及びFields，G.B．& Noble，R．L.，In t ．J．Peptide Protein Res. ，35:161-214（1990）に記載される標準固相 合成法を用いて合成した。 ２グラム（ｇ）のBOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OMe(配列番号１)をまず６０ミ リリットル(ml)のメタノールに溶解し、これに１.５mlの２N水酸化ナトリウム溶 液を加えて混合液を生成した。次に、その混合液を２０℃（２０Ｃ）で３時間攪 拌した。蒸発後、残留物を水に溶解し、ｐＨ３に希ＨＣｌで酸性にし、酢酸エチ ルで抽出した。抽出液をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、蒸発し、得られたBOC-Arg-Gly-As p-D-Phe-Val-OH（配列番号２）をジオキサン中２０mlの２N ＨＣｌと２０Ｃで２ 時間攪拌した。得られた混合液を蒸発してH-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH（配列番 号３）を得、引き続き１８００mlのジクロロメタンと２００mlのジメチルホルム アミド（ＤＭＦ）の混合液に溶解し、続いて０Ｃに冷却した。その後、０.５ｇ のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）、０.３ｇの１−ヒドロキシベ ンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び０.２３mlのＮ−メチルモルホリンを連続し て攪拌しながら加えた。 得られた混合液を０Ｃで更に２４時間、次に２０Ｃで更に４８時間攪拌した。 その溶液を濃縮し、混合床イオン交換体で処理して塩を除去した。得られた樹脂 をろ過で除去した後、清澄化溶液を蒸発し、残留物をクロマトグラフィーで精製 してシクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(一文字略号でｃ−ＲＧＤｆＶとも示される )（配列番号４）を回収した。ペプチド中の小さい枠の文字は、大文字で示され るアミノ酸のＤ体を示し、Ｌ体を示さない。 環状制御ペプチド、シクロ(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)(ＲＡＤｆＶとして一文字 略号でも示される)(配列番号５)を上記のように調製した。環状ペプチドｃ−Ｒ ＡＤｆＶ（配列番号５）はフィブリノーゲンのインテグリンα_vβ₃への結合を阻 害しフィブリノーゲンのインテグリンα_IIbβ₃又はα₅β₁への結合を阻害しない ことが以前に示されている(Pfaffら，J ．Biol．Chem.，269:20233-20238，1994) 。 天然リガンドのα_vβ₅への結合に特異的に阻害する他のペプチドは、下記の実 施例に記載されるように特異性及び活性範囲を試験するように同様に調製される 。これらは、同じように得られた次のペプチドが含まれる：シクロ(Gly-D-Arg-G ly-Asp-Phe-Val)(配列番号６)及びシクロ(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)(配列番号 ７)。アミノ酸残基配列Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp -Val-Phe(配列番号８)及びシクロ(Arg-Gly-Asp--D-Phe-Asn-MeVal)(配列番号９) を有するペプチドも合成される。配列番号９においては、MeValの先頭部分“Me ”は、６位のバリンがメチル化バリンであることを意味する。 ４．生体内ウサギ眼モデル分析によって測定されるα_vβ₅拮抗体による増殖因子 誘導血管形成の阻止 増殖因子誘導血管形成に対する抗α_vβ₅拮抗体の作用は、眼の角膜によって例 示される天然の透明構造で観察される。新しい血管は角膜縁から増殖し、本来は 血管がない角膜の中心に血液が豊富に供給される。角膜に適用されるＶＥＧＦ及 びＴＧＦ−αのような血管形成刺激物質は、角膜縁から新しい血管の増殖を誘導 する。角膜に適用される血管形成拮抗体は、角膜縁からの新しい血管の増殖を阻 止する。従って、角膜は、角膜縁から見えやすい堅いコラーゲン充填角膜組織へ 内皮細胞の侵入によって血管形成を受ける。従って、ウサギ眼モデル分析は、化 合物を眼の角膜へ直接接種した後の血管形成の促進及び阻止を直接観察するため の生体内モデルとなる。 Ａ．生体内ウサギ眼モデル分析 １）増殖因子によって誘導した血管形成 下記のように生体内ウサギ眼モデル分析において増殖因子による血管形成を誘 導した。 ａ．増殖因子及びモノクローナル抗体を含むハイドロンペレットの調製 増殖因子及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含むハイドロンポリマーペレッ トをD'Amatoら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，91:4082-4085（1994）に記載される ように調製した。個々のペレットは、スクラルフェート（カラフェート）(Caraf et，Marion Merrell Dow Corporation，オハイオ州シンシナテイ)に結合した７ ５０ngの増殖因子（サイトカインとも言われる）、特にｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦ を含有しサイトカンを安定化すると共に周囲組織への緩慢な放出を行わせた。更 に、ＰＢＳ中４０μgのmAb P1F6(抗α_vβ₅)又は制御抗体、LM609(抗α_vβ₃)を含 有するハイドロンペレットを調製した。 試験ｍＡｂは全て周知の方法に従いプロテインＡセファロースCL-4Bアフィニ ティーカラムクロマトグラフィーを用いて腹水から精製した。次に、溶離した免 疫グロブリンをＰＢＳに対して透析し、デトキシゲル(Detoxi-gel)(Pierce Chem icals,イリノイ州ロックフォード)で処理して内毒素を除去した。内毒素は、有 効な血管形成性及び炎症性刺激物質であることがわかっている。従って、モノク ローナル抗体について色素原カブトガニアメーバ様細胞溶解物分析(BioWhittake r,メリーランド州ウォーカースビル）で内毒素の存在を試験し、検出可能な内毒 素のないｍＡｂのみをウサギ眼モデル分析に用いた。 ペレットを、表面に２.５mmコアがあいた特別に調製したテフロンペグに注入 した。約１２μlの注型材料を各ペグに入れ、滅菌フードで一晩重合した。次に 、ペレットを紫外線照射により滅菌した。 ８匹の一連の動物を両眼実験に用い、各動物に予め選ばれた抗体と共に予め選 ばれたサイトカイン又は対照免疫グロブリンを含むハイドロンを移植した。詳し くは、各ウサギについては一方の角膜をmAb P1F6と共にｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦ を含むハイドロンペレットを外科的に移植し、もう一方の角膜をMAb LM609と共 にｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦで処理した。個々のペレットを、ウサギの角膜支質中 央に形成された外科的につくった“ポケット”に移植した。外科操作は、個々の 角膜を写真で記録するカメラを取り付けたビームスプリッタを備えたワイルドモ デルM691手術顕微鏡を用いて滅菌法のもとで行った。３×５mmの“ポケット”を 、69ビーバーブレードで角膜の厚さの１／２の３mmまで切開することにより角膜 支質につくった。基質を虹彩用へらを用いて末梢的に解剖し、ペレットを辺縁か ら２mmの末梢縁に移植した。 次の１２日間にサイトカインとｍＡｂは、移植したペレットから周囲の組織へ 拡散して角膜縁から血管形成を引き起こした。 左右角膜は、各々ＯＳとＯＤと呼ばれる。次に、角膜を１２日間観察した。手 術の１０日後に写真を取りそのときの血管新生が最大である。 上記のサイトカイン／ｍＡｂ混合物による処理の代表的な写真結果を図１Ａ〜 図１Ｄに示す。サイトカイン誘導血管形成の対応する量のｍＡｂ阻止を図２Ａ及 び図２Ｂに示す。角膜をｂＦＧＦ／Ｐ１Ｆ６及びＶＥＧＦ／ＬＭ６０９の組合わ せに各々曝露した図１Ａ及び図１Ｄにおいては、大きな矢印で示されるように浮 腫によるサイトカイン誘導血管形成が著しい。従って、α_vβ₅抗体、Ｐ１Ｆ６は ｂＦＧＦ誘導血管形成を阻止するのに有効でなかった。同様に、α_vβ₃抗体、Ｌ Ｍ６０９はＶＥＧＦ誘導血管形成を阻止するのに有効でなかった。 対照的に、ｂＦＧＦ／ＬＭ６０９及びＶＥＧＦ／Ｐ１Ｆ６のサイトカイン／ｍ Ａｂ組合わせをウサギモデルに用いた場合、図１Ｂ及び図１Ｃに各々示されるよ うに抗体でサイトカイン誘導血管形成が阻止された。これらの図においては、小 さな矢印で示された正常な結膜辺縁血管が示され、ある種のサイトカイン誘導血 管形成を阻止するのにインテグリン抗体の有効性を意味する。 上記のサイトカイン誘導血管形成に対する特定のｍＡｂインテグリン免疫反応 性の作用は、図２Ａ及び図２Ｂに示されるように定量される。血管形成は、図２ Ａ及び図２Ｂに示されるように各々ｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦで促進された。処理 した眼の写真をニコンカメラを外に備えたワイルド手術用顕微鏡で毎日取った。 写真をコダックエクタクロム64Tスライドフィルムに記録し、モデルGS670画像デ ンシトメータで得られた後のバイオラドモレキュラーアナリスト１.１ソフトウ ェアを用いるコンピュータ定量化のために画像を変換した。ヒストグラムは、mA b P1F6又はLM609曝露後の平均新生血管面積＋／−標準誤差（２系の各々につい てｎ＝８）を示す。 図２Ａに示されるように、ＬＭ６０９は、同じ動物の両眼をＰ１Ｆ６で処理し たものと比べた場合に８６％（ｐ＜０.００５、両眼のｔ検定）だけｂＦＧＦ誘 導血管形成を減少させた。図２Ｂに示されるようにＶＥＧＦを用いて血管形成を 促進した場合、反対の作用が見られ、Ｐ１Ｆ６はＶＥＧＦ誘導血管形成に対する 作用が最小のＬＭ６０９処理眼に比べて６０％（ｐ＜０.０３、両眼のｔ検定） だけ血管新生の平均面積を減少させた。 新しいサイトカイン誘導血管のみ個々のｍＡｂへの曝露で作用し以前から存在 する縁周囲血管は両ｍＡｂに影響されず、実験効果は角膜の新たに形成する血管 に限定されることは意味のあることである。 α_vβ₅発現と特に相関するサイトカイン誘導血管形成を阻害するのに使用する ための実施例３で調製された及び下記のように調製される合成ペプチドを用いて 同様の分析を行う。 個々のサイトカインによって誘導された血管形成がある種の抗インテグリン抗 体によってのみ影響されることを示す結果、特にα_vβ₅インテグリンレセプター がＶＥＧＦ誘導血管形成に役割を果たすことを示す結果を確認するために、ニワ トリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）の他の血管新生モデルを次の実施例に示されるサイトカ インとインテグリン抗体の組合わせを用いて評価した。 ５．ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）標品での血管形成 Ａ．未処理ＣＡＭの確認 １）ＣＡＭの調製 血管形成は、正常胚血管形成が成熟血管の形成をもたらした後にニワトリ絨毛 尿膜（ＣＡＭ）に誘導される。血管形成は、Leibovichら，Nature，329:630(198 7)及びAusprunkら，Am ．J．Pathol.，79:597（1975）に記載されるように特定の サイトカイン又は腫瘍断片に応答して誘導されることがわかった。ニワトリ胚か ら後続の血管形成誘導及び本発明のα_vβ₅拮抗体による下記の実施例６に記載さ れるその阻止のためのＣＡＭを調製した。 マッキンタイア家禽（カリフォルニア州レイクサイド）から卵生１０日のニワ トリ胚を入手し、３７Ｃ、湿度６０％でインキュベートした。小さなクラフトド リル(Dremel，Division of Emerson Electric Co.,ウイスコンシン州ラシーヌ) を用いて肺胞のすぐ上の卵の端に殻から小さな穴をあけた。二番目の穴は、卵を 光に透かして見ることにより前に求めた胚血管のない領域の卵の幅広い方にドリ ルであけた。最初の穴に負圧をかけることによりＣＡＭ（絨毛尿膜）が得られ、 殻膜から離れＣＡＭ上に偽肺胞を生じるた。小型のといし(Dremel)を使用して下 がったＣＡＭの上に殻から１.０センチメートル(cm)×１.０cm平方の窓を開けた 。小窓から、下にあるＣＡＭに直接近づくことができる。 次に、血管形成が止まった胚形成の１０日目に得られたＣＡＭ標品を用いた。 従って、サイトカイン処理に応答して新しい血管形成を誘導する本発明に標品を 用いた。 ２）ＣＡＭの組織学 ニワトリ胚ＣＡＭの顕微鏡的構造を分析するために、凍結塊から免疫蛍光分析 用クリオスタットミクロトームで６ミクロン(μm)厚切片を切り取った。 典型的な卵生１０日の未処理ＣＡＭは血管がない領域である。ＣＡＭ系の血管 形成がこの段階の胚形成によって止まっているので、該系は本発明において隣接 領域からの既存の血管から現在血管のないＣＡＭの領域への新しい血管系の生産 を種々のサイトカインで促進するのに有用である。 下記の実施例においてＣＡＭモデルに示されるように、血管が正常な胚形成に おいて新たに増殖している間又はサイトカンによって誘導されている間、血管は α_vβ₃及びα_vβ₅を発現している。 Ｂ．増殖因子により誘導された血管形成 血管形成は、ウサギ眼モデルにおいてサイトカン又は実施例４Ａに記載される 増殖因子によって誘導されることがわかった。ここに記載される実験においては 、実施例４に記載されるウサギ角膜標品での血管形成をここに記載されるＣＡＭ 血管に局所適用される増殖因子によって同様に誘導した。 血管形成は、ハンクス液(HBSS，GIBCO，ニューヨーク州グランドアイランド) 又は予め選ばれたサイトカインを予め選ばれた濃度で含有するＨＢＳＳで飽和し た５×５ミリメートル(mm)ワットマンフィルターディスク（ワットマンろ紙No. １）、即ち、血管形成に対する作用を試験するためのものを血管のない領域の卵 生１０日のニワトリ胚のＣＡＭに入れることにより誘導し、後に、窓をテープで 閉じた。７２時間後に光学顕微鏡で血管形成をモニターした。ＣＡＭを急速冷凍 し、次に、６μmのクリオスタット切片をアセトンで固定し、実施例１に記載さ れるα_vβ₅に対するものを含む１０μg/mlの選定抗インテグリン抗体で実施例２ Ｂ及び２Ｃに記載されたように免疫蛍光法で染色した。 Brooksら，Science ，264:569-571（1994）による以前の研究には、血管がｂＦ ＧＦ及びＴＮＦ−αの両処理標品には容易に明らかであるが未処理ＣＡＭには存 在しないことが示されている。著者らは、α_vβ₃発現がｂＦＧＦ誘導血管形成後 に増強されることも示している。インテグリンβ₁の発現は未処理ＣＡＭに見ら れるものから変化しなかったが、β₁は刺激した血管では容易に検出可能であっ た。 これらの発表された知見から、ヒト及びニワトリ双方において血管形成に関係 する血管はα_vβ₃の発現を増強することが示された。これと一致してJanatら，J.Cell Physiol. ，151:588(1992); Enensteinら，Exp.Cell Res.,203:499(1992) 及びSwerlickら，J ．Invest．Derm.，99:715（1993）に記載されるように、培養 内皮細胞の発現は試験管内で種々のサイトカインによって誘導された。 本発明においては、種々の接着性インテグリンレセプターα_vβ₅の発現及び活 性化に依存する血管形成を促進する別個のサイトカイン仲介経路が求められた。 α_vβ₅の発現、α_vβ₅拮抗体による血管形成及びその阻止に関してここに記載さ れるＣＡＭをサイトカインＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＥＧＦに曝露することの影 響を実施例６に記載する。 Ｃ．腫瘍によって誘導された血管形成 腫瘍誘導血管形成におけるα_vβ₅の役割を調べるために、Brooksら，J ．Cell Biol. ，122:1351（1993）及びここに記載される卵生１７日のニワトリ胚のＣＡ Ｍから以前に増殖及び単離した種々のα_vβ₅陰性ヒトミエローマ及びがん腫断片 をＣＡＭ分析に用いる。 ＣＡＭ上の腫瘍断片を直接並置することによりＣＡＭ分析系において血管形成 を誘導する。ニワトリ胚ＣＡＭの調製は、上記の手順と同じである。ろ紙ディス クの代わりに下記の細胞系浮遊液の増殖から得られるα_vβ₅陰性腫瘍の５０〜５ ５ミリグラム(mg)重量断片を最初は血管のない領域のＣＡＭに置く。 Pasqualiniら，J ．Cell Sci.，105:101-111(1993)に記載される細胞系、ラブ ドミオサルコーマ、ミエロイド（ＨＬ−６０又はＫＧ−１）及びリンホイド（Ｔ 細胞-Jurkat，HPB/ALL，PEER; 及び種々のＢ細胞系）を用いてニワトリ胚のＣＡ Ｍ上でヒト充実性腫瘍を増殖する。種々の細胞系の単細胞浮遊液をまず全量３０ μlの滅菌ＨＢＳＳ中のＣＡＭに加える。窓をテープで閉じ、ヒト腫瘍病変を増 殖させるために胚を７日間インキュベートする。７日間の終わりの卵生１７日の 胚にＣＡＭから腫瘍を切除し、ＣＡＭの周囲組織を切り取る。腫瘍を血管形成に 使用するために５０〜５５mgの腫瘍断片に薄く切る。血管のない領域の実施例５ Ａに記載される新しい卵生１０日のニワトリ胚ＣＡＭセット上に腫瘍断片を置く 。 次に、α_vβ₅誘導サイトカイン（ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α又はＥＧＦ）の局所適 用又は静脈内適用した及びしないニワトリ胚ＣＡＭ上で生体内増殖した腫瘍を上 記のようにｍＡｂ、Ｐ１Ｆ６又はＰ５Ｈ９によるα_vβ₅発現に対して染色す る。 引き続いて、腫瘍誘導血管形成に対する抗体及びペプチドの作用を測定する実 施例６Ｃ及び６Ｄに記載されるようにこれらのＣＡＭ腫瘍標品を処理する。 １実施態様においては、サンフランシスコのカリフォルニア大学のDr．Caroli ne Damskyから入手したハムスターメラノーマ細胞、ＣＳ−１をメラノーマ腫瘍 の形成のために上記ＣＡＭ分析で使用した。ほぼ５０mgのＣＳ−１腫瘍断片を新 しい卵生１０日のニワトリ胚ＣＡＭ上に移した後、標品に１００μg又は３００ μgのＰ１Ｆ６抗体、ＬＭ６０９抗体或いは対照ＣＳＡＴ（抗β１）抗体を別個 に静脈内注入した。対照は、更に、処理していない標品も含まれた。結果を下記 の実施例６Ｄに示す。 ６．ＣＡＭ分析において測定される血管形成の阻止 Ａ．インヒビターの静脈内適用による増殖因子誘導血管形成の阻止 ＣＡＭ標品に静脈内注入したモノクローナル抗体による増殖因子誘導血管形成 に対する作用を、本発明の生体内モデル系として使用するために評価した。 活発な血管新生後に血管の発生が停止すると、αｖβ₅発現が免疫蛍光分析に よる検出可能なレベルまで減少する。成熟血管において発現がないことと対照的 に血管形成を受ける血管におけるα_vβ₅発現のこの制御は、ＣＡＭ血管形成分析 系のモデルである下記に示される血管形成を制御及び阻止する本発明のユニーク な能力を与える。 静脈内注入用ニワトリ胚ＣＡＭの調製は実質的に上記の通りとした。 卵生１０日のニワトリ胚について増殖因子飽和フィルターディスクを適用する ことにより血管形成を誘導した。詳しくは、最初の分析においてｂＦＧＦ或いは ＶＥＧＦに各々１５０ng/mlの濃度で曝露することにより血管形成を誘導した。 光に透かして見る方法で増殖因子を適用する場合、目立つ血管を選び卵殼に印 を付けて位置を示した。殻にドリルで穴を開け、ＣＡＭを下げ、次に、増殖因子 飽和ろ紙を上記のＣＡＭ上に別個に置いた。窓を滅菌テープで閉じ、インキュベ ーター内で胚を置き換えた。 ２４時間後に、前に選んだ目立つ血管のすぐ上の卵殻の側面に第２の小窓を注 意深く切断した。外側の卵殻を無傷の胚膜を残して注意深く除去した。小滴の鉱 油(Perkin-Elmer Corp，コネチカット州ノルウォーク)で殻膜を透明にし、血管 が容易に可視化されるようにした。次に、ＰＢＳ中リン酸塩緩衝食塩水(ＰＢＳ) 、７５μgの精製滅菌抗インテグリン抗体又は７５μgの合成ペプチド（環状ペプ チドＲＧＤｆＶ、配列番号４及び対照環状ペプチドＲＡＤｆＶ、配列番号５）を 増殖因子誘導ＣＡＭ上の明らかな血管に注入した。窓をテープで閉じ、胚を７２ 時間までインキュベートした。 フィルターディスク及び代表的なＣＡＭ周囲組織を立体顕微鏡（図３Ａ〜図３ Ｆ及び図５Ａ〜図５Ｆ）で写真をとり、１条件に対して１２個のＣＡＭについて 平均血管形成指数＋／−標準誤差を求めた（図４Ａ〜図４Ｂ及び図６Ａ〜図６Ｂ ）。血管形成について各ディスクの領域内の血管の分枝の数及び程度を分析する ことにより二重盲検法で各胚を評点した。評点は１（低）〜４（高）の範囲であ り、血管形成指数は全てのデータからバックグラウンドの１を引くことにより求 めた。 ＣＡＭモデルにおける増殖因子誘導血管形成のインテグリン抗体仲介阻止の特 異性は、上記のウサギ角膜モデルに見られたものを反映した。図３Ａ及び図３Ｂ に各々示されるように、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦは共に対照ＰＢＳ処理ＣＡＭにお いて血管形成を引き起こした。しかしながら、α_vβ₅特異抗体で処理すると図３ Ｄに示されるようにＶＥＧＦ誘導血管形成の阻止がもたらされ、図３Ｃに見られ るようにｂＦＧＦ誘導血管形成に対しては阻止が検出されなかった。対照的に、 ＬＭ６０９α_vβ₃特異抗体はｂＦＧＦ誘導血管形成を阻止した（図３Ｅ）が、Ｖ ＥＧＦ誘導ＣＡＭにおいては血管形成に対してほとんど効果がなかった（図３Ｆ ）。 これらの結果は、対照として抗体なし曝露と共にＬＭ６０９或いはＰ１Ｆ６へ の曝露に対して血管形成指数がプロットされるｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ処理ＣＡＭ 双方について各々の図４Ａ及び図４Ｂの棒グラフにも示されている。従って、イ ンテグリン特異抗体による増殖因子誘導血管形成の阻止は、増殖因子の種類に左 右される。 ＲＧＤ含有ペプチドに対する曝露は上記の結果を支持する。図５Ａ及び図５Ｂ に示されるようにＰＢＳの存在下のｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ双方に対する曝露によ り対照ＣＡＭにおいて血管形成がもたらされた。対照的に、α_vβ₃及びα_v β₅双方に対する環状ペプチド拮抗体ＲＧＤｆＶ（配列番号４）はｂＦＧＦ或い はＶＥＧＦによって誘導された血管形成を消滅させた。環状ペプチドＲＡＤｆＶ （配列番号５）はｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦ処理ＣＡＭ標品において血管形成に影 響しなかった。結果は、試験と対照のペプチドへの曝露を示すｂＦＧＦ及びＶＥ ＧＦ促進ＣＡＭの血管形成指数のグラフである図６Ａ及び図６Ｂに示されている 。従って、ウサギ角膜でのものと共にこれらの知見は、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ誘 導血管形成は異なるが類似のα_v特異インテグリンに依存し環状ペプチドＲＧＤ ｆＶにより阻止可能であることを意味する。 同様の分析は、更に、α_vβ₅関連血管形成に対する特異性を示しα_vβ₃関連血 管形成に特異性を示さないペプチドを定義するために実施例３に記載されたよう に合成ペプチドを用いて行われる。分析は実施例１０に記載されるように調製さ れた有機分子を用いても行われる。 増殖因子誘導血管形成のインテグリン抗体阻止の特異性を、腫瘍壊死因子−α （ＴＮＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）又はホルボ ールエステル、４−β−ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ ＰＭＡ）を含む増殖因子血管形成誘導分析を拡大することにより確認及び強化し た。 ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦを含む上記の増殖因子（サイトカイン）を上記の卵生１ ０ＢＣＡＭモデルに１.０μg/mlの濃度で別個に加えた。ＰＭＡは２０ng/mlの濃 度で用いた。 増殖因子処理後の２４時間後に、抗体、ＬＭ６０９及びＰ１Ｆ６又はプロテイ ンキナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビター、カルホスチンＣを上記のように１回の脈 管内投与で或いは下記の実施例に記載される局所投与でＣＡＭモデルに別個に与 えた。引き続き３日間にわたる脈管内注射については、抗体を１胚あたり７５μ gの濃度で用い、カルホスチンＣを１００nMの用量で用いた。 １３日目に、フィルターディスクとＣＡＭ結合組織を分け、立体顕微鏡で血管 形成を分析した。ディスクの領域内の血管の分枝の数及び程度を分析することに より血管形成を二重盲検法で評点した。評点は低（１）〜高（４）の範囲とした 。血管形成指数は、全てのデータからバックグラウンド評点の１を引くことによ り 求めた。１条件に対して５〜６個の胚を用いて実験を２〜４回繰り返した。 図７Ａ及び図７Ｂに各々示されるように、抗α_vβ₃抗体ＬＭ６０９はｂＦＧＦ 及びＴＮＦ−αに応答した血管形成を阻止するが抗α_vβ₅抗体Ｐ１Ｆ６はほとん ど阻止作用がなかった。対照的に、図７Ｃ〜図７Ｅに各々示されるように、Ｐ１ Ｆ６はＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α又はＰＭＡによって誘導された血管形成を阻止する のに有効であるがＬＭ６０９は阻止しなかった。 ＰＭＡ、血管形成の強力な誘導物質はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、セリ ントレオニンキナーゼの細胞内ファミリーを活性化することができる。従って、 ニワトリＣＡＭ上の血管形成に対するカルホスチンＣ、ＰＫＣインヒビターの作 用を試験した。カルホスチンＣは、ＰＭＡ（図７Ｅ）並びにＶＥＧＦ及びＴＧＦ −α（各々図７Ｃ及び図７Ｄに示される）によって誘導された血管形成を阻止し ｂＦＧＦ又はＴＮＦ−α仲介血管形成に対する効果は最小であった（各々図７Ａ 及び図７Ｂに示される）。 更に、これらの結果は２つの異なる別個の血管形成経路の存在を示し、第１の 経路はBrooksら，Science ，264:569-571（1994）に記載されたようにＰＫＣと主 として依存しないα_vβ₃仲介シグナルに依存し、第２経路はＰＫＣ活性化に決定 的に依存するα_vβ₅仲介導入シグナルによって増強される。 上記の実験のほかに、ＬＭ６０９を静脈内接種したＣＡＭ組織においてＰ１Ｆ ６及びＬＭ６０９ｍＡｂの局在を求めるために、固定切片をＨＢＳＳ中２.５％ ＢＳＡで室温において１時間阻止し、続いてヤギ抗マウスローダミン標識二次抗 体(Tago)の１：２５０希釈液で染色した。次に、切片をツェイス免疫蛍光複式顕 微鏡で分析する。 Ｂ．インヒビターの局所適用による増殖因子誘導血管形成の阻止 α_vβ₅が血管形成において活発な役割を果たすかを求めるために、上記の増殖 因子で飽和したフィルターディスクをＣＡＭ上に置き、血管形成を誘導した後に Ｐ１Ｆ６或いはＬＭ６０９を適用する。 次に、ディスクを全量２５μlの滅菌ＨＢＳＳ中２５mgのｍＡｂを含有する５ ０mlのＨＢＳＳで０、２４及び４８時間において処理する。７２時間にＣＡＭを 取り出し、３５mmのペトリ皿に入れ、１mlのＰＢＳで１回洗浄する。ろ紙の底 面及びＣＡＭ組織を二重盲検法で２人の観察者によりオリンパス立体顕微鏡下で 分析する。血管形成阻止は、ＣＡＭがディスクのすぐ下のＣＡＭの血管浸潤が＞ ５０％減少を示す場合に顕著であるとみなされる。実験は、１条件に対して６〜 ７個の胚を用いて１抗体あたり４回繰り返す。 血管のない領域に隣接した正常な血管発生からの以前から存在する成熟血管に 対するインテグリン抗体の作用を調べるために、ｍＡｂで飽和したフィルターデ ィスクはサイトカインを局所適用していない卵生１０日の胚からのＣＡＭの血管 新生領域に置かれる。 ＣＡＭ分析は、また、増殖因子誘導血管形成に対する環状及び線状ペプチドの 作用を求めるために本発明の合成ペプチドを用いて行われる。上記のように調製 した８μgのペプチドを全量２５μlの滅菌ＨＢＳＳ中に別個に存在させる。ペプ チド溶液を直ちに及び２４時間及び４８時間においてＣＡＭ標品に適用する。７ ２時間においてろ紙とＣＡＭ周囲組織を分け、上記のように調べた。 同様の分析は、実施例１０に記載されるように調製した有機分子を用いて行わ れる。 Ｃ．腫瘍誘導血管形成の局所適用による阻止 １）モノクローナル抗体による処理 抗α_vβ₅抗体及びペプチド拮抗体の作用を評価した上記の血管形成分析のほか に、腫瘍誘導血管形成におけるα_vβ₅の役割を調べる。誘導物質として、卵生１ ７日のニワトリ胚のＣＡＭから以前に増殖及び単離したα_vβ₅陰性ヒト組織を用 いる。断片を実施例５Ｃに記載されたように調製する。 上記のように、ｍＡｂを２５μlのＨＢＳＳ中２５μgの濃度で腫瘍断片に別個 に局所適用し、窓をテープで閉じる。２４時間及び４８時間に同じ方法でｍＡｂ を加える。７２時間に腫瘍及びＣＡＭ周囲組織を上記のように分析する。 実施例５Ｃに記載されたように、インテグリンα_vβ₅を発現しないヒト細胞系 を卵生１０日のニワトリ胚のＣＡＭに移植することにより最初に腫瘍を誘導する 。 腫瘍誘導血管形成に対するｍＡｂの作用を定量するために、ＣＡＭの病巣面内 の腫瘍に入る血管を二重盲検方法で２人の観察者により立体顕微鏡下で計数する 。 実施例３で調製した合成ペプチド及び実施例１０で調製した有機分子を、上記 と同様に腫瘍誘導血管形成ＣＡＭ分析系に局所適用する。血管の生育性に対する ペプチド及び有機分子の作用を同様に評価する。 Ｄ．腫瘍誘導血管形成の静脈内適用による阻止 １）モノクローナル抗体による処理 上で調製した腫瘍誘導血管を、静注で投与したｍＡｂで処理した。ＣＳ−１メ ラノーマ腫瘍を実施例５Ｃに記載されたようにＣＡＭ上に置き、窓をテープで閉 じ、２４時間後に１００〜３００μgの精製ｍＡｂを上記のニワトリ胚血管の静 脈内に１回接種した。次に、ニワトリ胚を７日間インキュベートした。次に、血 管形成の程度を上記のように観察した。この後、腫瘍を切除し、その重量で分析 して腫瘍増殖又は抑制に対する抗体曝露の影響を求めた。 ＣＳ−１腫瘍の３００μgのα_vβ₅特異抗体Ｐ１Ｆ６による処理結果を図８に 示す。腫瘍重量は、ＣＳＡＴ処理腫瘍に対する未処理に比べて５０mg未満まで劇 的に減少した。しかしながら、α_vβ₃特異抗体ＬＭ６０９もＰ１Ｆ６より効果が 小さいが腫瘍増殖を阻止した。１００μgのＰ１Ｆ６で処理された腫瘍で匹敵す る結果が得られた。従って、Ｐ１Ｆ６はＣＡＭ標品による腫瘍モデルにおいてα_v β₅仲介血管形成を阻止するのに効果的であり、腫瘍細胞量の減少をもたらした 。 ２）合成ペプチド又は有機分子による処理 ＣＡＭ分析系において腫瘍誘導血管系に対するペプチド又は有機分子の影響を 評価する。ｍＡｂの静注の代わりに実施例３及び１０に各々記載されるように調 製した合成ペプチド及び有機分子鎖を可視血管に別個に静注する。 ７．リガンド−レセプター結合分析によって検出されるα_vβ₅特異拮抗体の同定 実施例１及び３で各々調製したα_vβ₅免疫反応性抗体及び合成ペプチドを、精 製リガンド−レセプター結合分析においてα_vβ₅、α_vβ₃及びα_IIbβ₃レセプタ ー結合活性を拮抗する能力を測定することにより選別する。これらの結合実験の 方法は、Barbasら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA，90:10003-10007(1993)，Smi thら，J ．Biol．Chem.，265:11008-11013(1990)及びPfaffら，J ． Biol ．Chem.， 269:20233-20238（1994）に記載されており、これらの文献の記載 は本願明細書に含まれるものとする。 レセプターを固体支持体に固定化しかつリガンド及び拮抗体が可溶性であるリ ガンド−レセプター結合分析において拮抗体を同定する方法を記載する。リガン ドを固体支持体に固定化しかつレセプター及び拮抗体が可溶性であるリガンド− レセプター結合分析を記載する。 概要としては、選定した精製インテグリンをタイターテックマイクロタイター ウェルに１ウェルあたり５０ナノグラム(ng)の被覆濃度で別個に固定化する。リ ガンド−レセプター結合分析に用いられるレセプターの精製は、当該技術に周知 であり、当業者に良く知られた方法で容易に入手しうる。４Ｃで１８時間インキ ュベートした後、プレート上の非特異的結合部位をトリス緩衝食塩水中１０ミリ グラム／ミリリットル(mg/ml)のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で阻止する。阻 止実験については、種々の濃度の選定抗体又はペプチドについて¹²⁵I−ビトロネ クチン又は他の標識リガンドのインテグリンレセプター、α_vβ₅、α_vβ₃、α_v β₁及びα_IIbβ₃への結合を阻止する能力を試験する。 これらのリガンドは具体的なインテグリンに最適な結合、α_vβ₅及びα_vβ₃に ビトロネクチン及びα_IIbβ₃にフィブリノーゲンを示すがビトロネクチンの両レ セプターへの結合を阻止する抗体或いはペプチドを用いる結合実験の阻害は、レ セプターのリガンドへの結合を最大の１／２阻害するのに必要なペプチドのマイ クロモル(μM)の量の正確な定量を可能にする。放射能標識リガンドを１nMの濃 度で用い、結合は非標識合成ペプチドを別個に投与する。３時間インキュベート した後、洗浄で遊離リガンドを除去し、結合リガンドをγ計数で検出する。 従って、ここに記載されるリガンド−レセプター分析を用いて本発明を実施す るのにビトロネクチンレセプター(α_vβ₅)拮抗体として用いられる、具体的なイ ンテグリンレセプター、詳しくはα_vβ₅に選択特異性を示すモノクローナル抗体 及び有機分子と共に環状又は線状合成ペプチドの双方を選別する。 ８．キメラマウス：ヒト分析で測定されるα_vβ₅拮抗体による腫瘍組織増殖の生 体内退縮 ＳＣＩＤマウスからの皮膚の一部をヒト新生児包皮に置き換えることにより生 体内キメラマウス：ヒトモデルをつくった。生体内キメラマウス：ヒトモデルを 実質的にYanら，J ．Clin．Invest.，91:986-996（1993）に記載されるように調 製した。概要としては、２cm²の正方形の皮膚面をＳＣＩＤマウス（６〜８週齢 ）から外科的に切除し、ヒト包皮に置き換えた。マウスに麻酔をかけ、腹部側方 部の各側の５cm²領域を剃髪した。皮膚の下の筋膜まで十分な厚さを除去するこ とにより２cm²の２枚の円形移植片床を調製した。ヒト新生児包皮に由来する同 じサイズの十分な厚さのヒト皮膚移植片を創傷床に入れ、適所を縫合した。移植 片にバンドエイドを被覆し、皮膚を縫合した。創傷を被覆するためにミクロポア 布テープも用いた。 皮膚移植片を確立した後、ヒト包皮にメラノーマ細胞を接種した。Ｍ２１Ｌヒ トメラノーマ細胞系を用いてＳＣＩＤマウスのヒト皮膚移植片にヒト充実性腫瘍 を形成した。２×１０⁶Ｍ２１Ｌの単細胞浮遊液をヒト皮膚移植片へ皮内注射し た。次に、測定可能なヒト腫瘍が増殖する２〜４週間マウスを観察した。 測定可能な腫瘍を確立した後、配列番号９(環状ＲＧＤ含有ペプチドArg-Gly-A sp-D-Phe-Asn-メチル化Val)を有する２５０μgのペプチド（１００μl容量）或 いは対照ペプチド、シクロArg-βAla-Asp-D-Phe-Valを１週間に３回３週間かけ てマウスに腹腔内注射した。この期間の終わりに、腫瘍を切除し重量及び組織学 で分析した。 Ｘ軸のペプチド処理に対してＹ軸に腫瘍容積mm³がプロットされる図９に結果 を示す。ペプチド１８９として図面に表示した配列番号９を有する試験ペプチド は、腫瘍容積が３００mm³より大きい対照ペプチド（ペプチド６０１として表示 した）に比べて約２５mm³まで腫瘍容積を顕著に減少させた。 従って、α_vβ₅拮抗体ペプチド１８９の静脈内適用によりα_vβ₅レセプターを 阻止すると上記のＣＡＭ及びウサギ眼モデル系と同じ方法で本モデル系において もメラノーマ腫瘍の退縮がもたらされた。 本発明の他のα_vβ₅拮抗体、即ち、抗体及び実施例１０に記載されるように 調製される有機分子の有効性を評価するために、上記のＳＣＩＤ／ヒトキメラモ デルを用いる。 ９．α_vβ₅仲介網膜血管形成及びα_vβ₅拮抗体によるその阻止のマウスモデルの 調製 網膜血管新生組織でのα_vβ₃及びα_vβ₅発現の実施例２Ｃの観察に基づき、新 規なマウスモデルを用いて網膜血管形成に対する両インテグリンの全身系に投与 し環状ペプチド拮抗体の作用を実験した。新生仔マウスは、生後最初の２週間で 網膜血管を発生し、表在性網膜血管系が視神経頭から始まり末梢に放射状に伸び る血管の多くの高度に分枝した網目を形成して他の哺乳動物及びヒトに観察され るのと同じ方法で網膜表面を被覆する(Jiangら，Glia，15:1-10(1995)。 モデルについては、新生仔マウスに環状ペプチドＲＧＤｆＶ(配列番号４)(ペ プチド２０３とも呼ばれる)又は対照ペプチドＲＡＤｆＶ（配列番号５）を０日 から開始して４日間毎日２回皮下注射した。生後５日に眼球を取り出し、室温で ４.０％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に固定した。 マウス網膜血管形成を定量するために、視神経頭から時計の１２時間を６等分 した扇形の各々に選ばれた１本の血管の最も末梢にある点までの距離を測定した 。平均距離を計算し、全同腹仔から得られた同様のデータと平均した。網膜血管 の全量を測定するために、全試料を２.０μmの光学的切片で走査しデジタル方式 で記憶させた。次に、バイオラドレーザシャープソフトウェアの“シード”機能 を用いて各切片の容積画素の閾値及び計数を出した。マクロを書き込み全切片の 容量を合計し全血管構造の値を求めた。 写真から２次元で血管増殖を直接測定することによって、全身系に投与したペ プチド拮抗体２０３は対照ペプチドに相対する網膜の血管形成を４４％だけ阻止 した（Ｎ＝９、ｐ＜０.００００００１、両眼のｔ検定）。未処理の新生仔マウ スとペプチド２０３を投与している生後５日のマウス間に統計的差異は見られず 、該ペプチドは血管形成を効果的に阻止した。更に、未処理の生後５日のマウス と対照ペプチドを投与している同齢のマウス期に統計的差異は見られなかった。 従って、未処理の対照マウスと比較した場合にＲＧＤｆＶ処理新生仔マウスの網 膜血管形成の阻止は、実際上１００％である。 ３次元の血管増殖を用いる更に定量的な分析を用いると、対照と比べてペプチ ド２０３処理マウスにおいて網膜血管容積の７８％減少が見られた。２０３処理 マウスにおいて生後５日の血管の平均容積は３.６×１０⁶μm³であり、対照処理 マウスにおいては１５.７×１０⁶μm³であった。未処理新生児マウスにおいて網 膜血管が占める容積は生後５日の２０３処理マウスと区別できない。 上で得られた結果から拮抗体が確立した血管に作用せずに新しい血管形成を特 異的に阻止することがわかった。結果は、網膜血管新生疾患の病変が網膜下血管 新生疾患に見られるものと異なりかつα_vβ₅拮抗体が血管形成と関連がある失明 する眼疾患をもつ患者を治療するのに効果的であることを示している。 同様の分析は、実施例１０に記載されるように調製した有機擬似体のα_vβ₅拮 抗体を用いて行われる。 １０．有機分子α_vβ₅拮抗体の調製 α_vβ₅拮抗体有機化合物７、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７及び１ ８の合成を、下記及び簡単な説明の付いた図面に示す。次に、本発明の有機模擬 体と呼ばれる得られた有機分子をα_vβ₅仲介血管形成を阻止する方法に用いる。 下記の合成の各々について、パーキン・エルマー241分光光度計UVで旋光を測 定し、ベックマンDU-70分光計で可視スペクトルを記録した。ブルッカーAMX-400 及びAMX-500光度計で４００MHz及び５００MHzの¹Ｈ及び¹³Ｃ NMRスペクトルを記 録した。高速原子衝撃(FAB)条件下、VG ZAB-ZSE質量光度計で高分解能質量スペ クトル(HRMS)を記録した。カラムクロマトグラフィーを７０〜２３０メッシュの シリカゲルを用いて行った。メルクArt.5744(０.５mm)で分取ＴＬＣを行った。 融点をトーマスフーバー装置で測定した。 Ａ．化合物１：図１０に示されるｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル ０.１M(M)塩化メチレン中Ｎ−（tert−ブトシキカルボニル）−Ｌ−チロシン( ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン)(１.０当量；Aldrich)の溶液にジシクロヘキシルカ ルボジイミド(ＤＣＣ)(１.５当量)を２５℃で加え、１時間攪拌した。次に、１. ５当量のベンジルアルコールを加え、混合液を２５℃で更に１２時間攪拌した。 次に、反応混合液を酢酸エチル（０.１０M)で希釈し、水で２回（２×）、食塩 水で１回（１×）洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で 除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。化合物１ 、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステルはシグマ社から購入することもで きる。 Ｂ．化合物２：図１０工程ｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−ブロモブチル オキシ）フェニル−２−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸ベンジ ルエステル ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル（２ｇ、５.３８ミリモル；上記 のように合成した）、１,４−ジブロモブタン(１.９ml、１６.２ミリモル；Aldr ich)、炭酸カリウム（５ｇ）及び１８−クラウン−６(０.１ｇ；Aldrich)の混合 液を８０℃で１２時間加熱した。冷却後、沈殿をろ別し、反応混合液を減圧下で 蒸発乾固した。次に、粗生成物を１００％ヘキサンを用いて結晶化することによ り精製して２.５ｇ（９２％）の化合物２を得た。 Ｃ．化合物３：図１０工程ｉｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−アジドブチ ルオキシ）フェニル−２−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸ベン ジルエステル 化合物２（２.５ｇ、４.９ミリモル）をアジ化ナトリウム（１.６ｇ、２５ミ リモル）とジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)(２０ｍｌ)中２５℃で１２時間攪拌し た。次に、溶媒を蒸発し、残留物を水（約１０ml）で処理し、酢酸エチルで２回 抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発して２.０ｇ（90 ％）の化合物３を無色のシロップとして得た（FAB-MS: 469（M+H⁺）。 Ｄ．化合物４：図１０工程ｉｉｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−アジドブ チルオキシ）フェニル−２−アミノプロピオン酸ベンジルエステル 化合物３(２.０ｇ(４.４ミリモル))をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；２ml）に溶 解し、室温で３時間攪拌した。減圧下で蒸発して１.６ｇ（定量的）の化合物４ を無色のシロップとして得、精製せずに次の工程に用いた。FAB-MS: 369(M+H⁺) 。 Ｅ．化合物５：図１０工程ｉｖに示される（Ｓ）−３−（４−（４−アジドブチ ルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸ベンジルエステル 化合物４（１.６ｇ；４.３ミリモル）、ブタンスルホン酸塩化物（０.８４ml ； ６.６ミリモル）及びトリエチルアミン（１.５当量）の混合液を塩化メチレン（ ２０ml）中室温で１２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物を酢酸 エチルに溶解し、希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸発乾固 した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢 酸エチル１５：１）で精製して１.４ｇ（６７％）の化合物５を無定形固形物と して得た。 Ｆ．化合物６：図１０工程ｖに示される（Ｓ）−３−（４−（４−アミノブチル オキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸 化合物５（１.３ｇ（２.６ミリモル）を、２０mlの酢酸エチル／メタノール／ 水５／３／１及び０.２mlのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、１００mgの パラジウム（１０％／木炭）の存在下に２５℃で水素（１気圧；パーシェーカー 装置）によって水素添加した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発して化合物 ６を油状残留物として得た。水から凍結乾燥した後、１.０ｇ（定量的）の化合 物６を白色粉末として得た。FAB-MS: 373（M+H⁺）。 Ｇ．化合物７：図１０工程ｖｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−グアニジノ ブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；５ml）中化合物６(２００mg；０.５ミリモル )、３.５−ジメチルピラゾル−１−カルボキサミジン硝酸塩(ＤＰＦＮ)(１７０m g；０.８ミリモル；Aldrich Chemical Co.)及びトリエチルアミン（０.１５ml、 １.０ ミリモル）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残留 物をＨＰＬＣ（Lichrocart RP-18、勾配アセトニトリル／水＋０.３％ＴＦＡ９ ９：１〜１：９９）で精製して凍結乾燥後に５０mg（２５％）の化合物７を白色 無定形粉末として得た。FAB-MS: 415（M+H⁺）、m.p.：70℃。 Ｈ．化合物８：図１１工程ｉｉｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−アミノブ チルオキシ）フェニル−２−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸 化合物３（０.５ｇ（１.０７ミリモル）を、１０mlの酢酸エチル／メタノール ／水５／３／１及び０.１mlのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、３０mgの パラジウム（１０％／木炭）の存在下に２５℃で水素（１気圧；パーシェーカー 装置）によって水素添加した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発して化合物 ８を油状残留物として得た。水から凍結乾燥した後、３７０mg（定量的）の化合 物８を白色粉末として得た。FAB-MS: 353（M+H⁺）。 Ｉ．化合物９：図１１工程ｉｖに示される（Ｓ）−３−（４−（４−グアニジノ ブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；５ml）中化合物８(２００mg；０.５ミリモル )、３.５−ジメチルピラゾル−１−カルボキサミジン硝酸塩(ＤＰＦＮ)(１７０m g；０.８ミリモル；Aldrich Chemical Co.)及びトリエチルアミン（０.１５ml、 １.０ ミリモル）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残留 物をＨＰＬＣ（Lichrocart RP-18、勾配アセトニトリル／水＋０.３％ＴＦＡ９ ９：１〜１：９９）で精製して凍結乾燥後に１６０mg（９０％）の化合物９を白 色無定形粉末として得た。FAB-MS: 395（M+H⁺）。 Ｊ．化合物１０：図１２工程ｉ〜ｖｉに示される（Ｒ）−３−（４−（４−グア ニジノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸 化合物７を合成する反応順序を用いてＤ−チロシン類縁体１０を同様に調製し 、化合物１０を生成する中間化合物１００〜６００を用いて次の通り２０５mgを 白色無定形物質FAB-MS: 415（M+H⁺）として得た。 １）化合物１００：図１２に示されるｔ−Ｂｏｃ−Ｄ−チロシンベンジルエステ ル ０.１M塩化メチレン中Ｎ−（tert−ブトシキカルボニル）−Ｄ−チロシン(ｔ −Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン)(１.０当量；Aldrich)の溶液にジシクロヘキシルカル ボジイミド(ＤＣＣ)(１.５当量)を２５℃で加え、１時間攪拌した。次に、１.５ 当量のベンジルアルコールを加え、混合液を２５℃で更に１２時間攪拌した。次 に、反応混合液を酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２回、食塩水で１回洗浄 し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシ リカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。 ２）化合物２００：図１２工程ｉに示される（Ｒ）−３−（４−（４−ブロモブ チルオキシ）フェニル−２−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸ベ ンジルエステル ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル（２ｇ、５.３８ミリモル；上記の ように合成した）、１,４−ジブロモブタン(１.９ml、１６.２ミリモル；Aldric h)、炭酸カリウム（５ｇ）及び１８−クラウン−６(０.１ｇ；Aldrich)の混合液 を８０℃で1２時間加熱した。冷却後、沈殿をろ別し、反応混合液を減圧下で蒸 発乾固した。次に、粗生成物を１００％ヘキサンを用いて結晶化することにより 精製して２.５ｇ（９２％）の化合物２００を得た。 ３）化合物３００：図１２工程ｉｉに示される（Ｒ）−３−（４−（４−アジド ブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸 ベンジルエステル 化合物２００（２.５ｇ、４.９ミリモル）をアジ化ナトリウム（１.６ｇ、２ ５ミリモル）とジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)(２０ml)中２５℃で１２時間攪拌 した。次に、溶媒を蒸発し、残留物を水（約１０ml）で処理し、酢酸エチルで２ 回抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発して２.０ｇ（ ９０％）の化合物３００を無色のシロップとして得た（FAB-MS: 469（M+H⁺）。 ４）化合物４００：図１２工程ｉｉｉに示される（Ｒ）−３−（４−（４−アジ ドブチルオキシ）フェニル−２−アミノプロピオン酸ベンジルエステル 化合物３００(２.０ｇ(４.４ミリモル))をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；２ml） に溶解し、室温で３時間攪拌した。減圧下で蒸発して１.６ｇ（定量的）の化合 物４００を無色のシロップとして得、精製せずに次の工程に用いた。FAB-MS: 36 9(M+H⁺)。 ５）化合物５００：図１２工程ｉｖに示される（Ｒ）−３−（４−（４−アジド ブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸ベンジルエス テル 化合物４００（１.６ｇ；４.３ミリモル）、ブタンスルホン酸塩化物（０.８ ４ml；６.６ミリモル）及びトリエチルアミン（１.５当量）の混合液を塩化メチ レン（２０ml）中室温で１２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物 を酢酸エチルに溶解し、希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸 発乾固した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエ ン／酢酸エチル１５：１）で精製して１.４ｇ（６７％）の化合物５００を無定 形固形物として得た。 ６）化合物６００：図１２工程ｖに示される（Ｒ）−３−（４−（４−アミノブ チルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸 化合物５００（１.３ｇ（２.６ミリモル）を、２０mlの酢酸エチル／メタノー ル／水５／３／１及び０.２mlのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、１００m gのパラジウム（１０％／木炭）の存在下に２５℃で水素（１気圧；パーシェー カー装置）によって水素添加した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発して化 合物６００を油状残留物として得た。水から凍結乾燥した後、１.０ｇ（定量的 ）の化合物６を白色粉末として得た。FAB-MS: 373（M+H⁺）。 ７）化合物１０：図１２工程ｖｉに示される（Ｒ）−３−（４−（４−グアニジ ノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；５ml）中化合物６００（２００mg；０.５ミ リモル）、３.５−ジメチルピラゾル−１−カルボキサミジン硝酸塩(ＤＰＦＮ)( １７０mg；０.８ミリモル；Aldrich Chemical Co.)及びトリエチルアミン(０.１ ５ml、１.０ミリモル）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で 蒸発し、残留物をＨＰＬＣ（Lichrocart RP-18、勾配アセトニトリル／水＋０. ３％ＴＦＡ９９：１〜１：９９）で精製して凍結乾燥後に５０mg（２５％）の化 合物１０を白色無定形粉末として得た。FAB-MS: 415（M+H⁺）、m.p.：70℃。 Ｋ．化合物１１：図１３に示される（Ｓ）−３−（４−（４−アジドブチルオキ シ）フェニル−２−（１０−カンファスルホンアミド）プロピオン酸ベンジルエ ステル 化合物４（１.０ｇ；２.７ミリモル）、１０−カンファスルホン酸塩化物（６ .６ ミリモル；Aldrich Chemical Co.）及びトリエチルアミン（１.５当量）の混合 液を塩化メチレン（２０ml）中室温で１２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸 発し、残留物を酢酸エチルに溶解し、希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で 洗浄した。蒸発乾固した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ ゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１）で精製して１.４ｇ（６７％）の化合物 １１を無定形固形物として得た。 Ｌ．化合物１２：図１３ｉ〜ｉｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−グアニジ ノブチルオキシ）フェニル−２−（１０−カンファスルホンアミド）プロピオン 酸 下記の条件に従い化合物１１を水素添加及びグアニル化した後に化合物１２を 得た。 工程ｉ：化合物１１（１.３ｇ（２.６ミリモル）を、２０mlの酢酸エチル／メ タノール／水５／３／１及び０.２mlのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、 １００mgのパラジウム（１０％／木炭）の存在下に２５℃で水素（１気圧；パー シェーカー装置）によって水素添加した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発 して中間体アミンを油状残留物として得た。水から凍結乾燥した後、１.０ｇ（ 定量的）の中間体アミンを白色粉末として得、次のように続けた。 工程ｉｉ：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；５ml）中上で生成した中間体アミ ン化合物（２００mg；０.５ミリモル）、３.５−ジメチルピラゾル−１−カルボ キサミジン硝酸塩(ＤＰＦＮ)(１７０mg；０.８ミリモル；Aldrich Chemical Co. )及びトリエチルアミン（０.１５ml、１.０ミリモル）を６０℃で１２時間加熱 した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残留物をＨＰＬＣ（Lichrocart RP-18、 勾配アセトニトリル／水＋０.３％ＴＦＡ９９：１〜１：９９）で精製して凍結 乾燥後に５０mg（２５％）の化合物１２を白色無定形粉末として得た。FAB-MS: 509.6（M +H⁺）。 Ｍ．化合物１３：図１３に示される（Ｓ）−３−（４−（５−ブロモペンチルオ キシ）フェニル−２−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸ベンジル エステル ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル（４.５ｇ、１２.１ミリモル；上 記のように合成した化合物１）、１,５−ジブロモペンタン(５ml、３６.７ミリ モル；Aldrich)、炭酸カリウム（１０ｇ）及び１８−クラウン−６(０.2５ｇ；A ldrich)の混合液を８０℃で１２時間加熱した。冷却後、沈殿をろ別し、反応混 合液を減圧下で蒸発乾固した。次に、粗生成物を１００％ヘキサンを用いて結晶 化することにより精製して５.３５ｇ（８５％）の化合物１３を得た。 Ｎ．化合物１４：図１３工程ｉ〜ｖに示される（Ｓ）−３−（４−（５−グアニ ジノペンチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸 臭素−アジ化合物交換、Ｂｏｃ開裂、ブタンスルホン酸塩化物によるスルホン 化、水素添加及びＤＰＦＮによるグアニル化の５工程反応順序を中間化合物１〜 ６を用いて上記の操作と同様に行って化合物７を生成するか又は化合物１００〜 ６００を用いて上記のように化合物１０を生成した。化合物１４を白色粉末とし て得た。FAB-MS: 429（M+H⁺）。 Ｏ．化合物１５：図１４に示される３−（４−アミジノフェニル）−（５−（４ −（２−カルボキシ−２−アミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリ ジノン、二塩酸塩 １）化合物１５の出発物質２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシフェ ニル（プロピオネート）の合成 ０.１０Mメタノール及び１％希ＨＣｌ中で（Ｄ又はＬ）、Ｎ−（tert−ブトキ シカルボニル）−Ｌ（Ｄ）−チロシン(ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ（Ｄ）−チロシン)(１.０ 当量；Sigma)のエステル化により出発物質２−Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ−３−（４− ヒドロキシフェニル）プロピオネートを得た。反応混合液を２５℃で１２時間攪 拌し、炭酸カリウムで中和し、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、食塩 水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、 次に、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して２−Ｎ−ＢＯ Ｃ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを得た。 ２）化合物１５の出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタン スルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンの合成：３工程の手順は次の通 りである 塩化メチレン(０.１０M)中ｐ−アミノベンゾニトリル(１.０当量；Aldrich)を ２,３−エポキシプロパノール(１.０当量；Aldrich)と２５℃で１２時間攪拌し た。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗４−（２,３−ジヒドロキシプロピルアミ ノ）ベンゾニトリルを下記の通り次の工程へ続けた。 ２５℃においてジメチルホルムアミド(０.１０M)中４−（２,３−ジヒドロキ シプロピルアミノ）ベンゾニトリルを、炭酸ジエチル(１.１当量；Aldrich)及び tert−ブチル酸カリウム(１.１当量；Aldrich)と１１０℃で６時間攪拌した。次 に、反応混合液を酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄 し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシ リカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−（４−シアノフェニル）−５ −ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジンを得、下記の通り次の工程へ続けた。 ２５℃において塩化メチレン(０.１０M)中３−（４−シアノフェニル）−５− ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１.０当量；上記）を１.１当量の硫化 水素、１.１当量のヨウ化メチル及び１.１当量の酢酸アンモニウムと攪拌した。 反応混合液を６時間攪拌し、次に、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、 食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去 し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してアミジンを得、下記の 通り次の工程へ続けた。 上記のように合成した１.０当量のアミジンを、２５℃において塩化メチレン( ０.１０M)中１.１当量のＢＯＣ−ＯＮ（２−ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェ ニルアセトニトリル；Aldrich)で保護し、６時間攪拌した。次に、反応混合液を 酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシ ウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を０.１０M塩化メチレ ン及び１.１当量の塩化メタンスルホニル中でエステル化した。反応混合液を０ ℃で６時間攪拌し、水（５当量）で急冷し、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水 で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧 下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−ｐ −Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オ キサゾリジノンを得た。 ３）中間体２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオ ネートを３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシ メチル−２−オキサゾリジノンでカップリングして保護形態の化合物１５、３− （４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２ Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを生 成する １.９ｇの２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピ オ ネート（上記）、２０mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ（１.０ 当量）の混合液を室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１０mlのジメチルホルムア ミド（ＤＭＦ）中１.８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタ ンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノン（上記）を加え、室温で１５ 分間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、 食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去 し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して保護形態の化合 物１５、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカ ルボニル−２Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル）フェニルオキシメチル−２−オキサゾ リジノンを得、次の工程へ続けた。 ４）保護形態の化合物１５を脱保護して化合物１５：３−（４−アミジノフェニ ル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−アミノエチル）フェノキシ）メチル− ２−オキサゾリジノン、二塩酸塩、図１４を生成する 保護形態の化合物１５、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４− （２−メトキシカルボニル−２Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル）フェニオキシルメチ ル−２−オキサゾリジノン（１.０当量；上記のように合成）を４mlの２NＮａＯ Ｈで室温において４時間処理した。次に、ジオキサン中４０mlの２NＨＣｌ溶液 を滴下して０〜２５℃で３時間混合した。次に、反応混合液を重炭酸ナトリウム （５当量）で急冷し、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、食塩水で１× 洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物 をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物１５：３−（４−アミ ジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−アミノエチル）フェノキシ ）メチル−２−オキサゾリジノン、二塩酸塩；m.p．165℃(d)を得た。 Ｐ．化合物１６：図１４に示される３−（４−アミジノフェニル）−（５−（４ −（２−カルボキシ−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メ チル−２−オキサゾリジノン １）化合物１６の出発物質２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロ キシフェニル（プロピオネート）の合成 ０.１０Mメタノール及び１％希ＨＣｌ中で((Ｄ又はＬ)チロシン)(１.０当量； Sigma)をエステル化することにより出発物質２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ− ３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを得た。反応混合液を２５℃で １２時間攪拌し、炭酸カリウムで中和し、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で ２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下 で除去し、粗生成物を次のように続けた。 上記化合物（４.３ミリモル）、ブタンスルホン酸塩化物（６.６ミリモル）及 びトリエチルアミン（１.５当量）の混合液を塩化メチレン（２０ml）中室温で １２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物を酢酸エチルに溶解し、 希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸発乾固した後、粗生成物 をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１ ）で精製して標記化合物を得た。 ２）化合物１６の出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタン スルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンの合成：３工程の手順は次の通 りである 塩化メチレン(０.１０M)中ｐ−アミノベンゾニトリル(１.０当量；Aldrich)を ２,３−エポキシプロパノール(１.０当量；Aldrich)と２５℃で１２時間攪拌し た。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗４−（２,３−ジヒドロキシプロピルアミ ノ）ベンゾニトリルを下記のように次の工程へ続けた。 ２５℃においてジメチルホルムアミド(０.１０M)中４−（２,３−ジヒドロキ シプロピルアミノ）ベンゾニトリルを、炭酸ジエチル(１.１当量；Aldrich)及び tert−ブチル酸カリウム(１.１当量；Aldrich)と１１０℃で６時間攪拌した。次 に、反応混合液を酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄 し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシ リカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−（４−シアノフェニル）−５ −ヒドロキシメチル-２−オキサゾリジンを得、下記の通り次の工程へ続けた。 ２５℃において塩化メチレン(０.１０M)中３−（４−シアノフェニル）−５− ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１.０当量；上記）を１.１当量の硫化 水素、１.１当量のヨウ化メチル及び１.１当量の酢酸アンモニウムと攪拌した。 反応混合液を６時間攪拌し、次に、酢酸エチル（０.１０M)で希釈し、水で２× 、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除 去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してアミジンを得、下記 の通り次の工程へ続けた。 上記のように合成した１.０当量のアミジンを、２５℃において塩化メチレン( ０.１０M)中１.１当量のＢＯＣ−ＯＮ（２−ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェ ニルアセトニトリル；Aldrich)で保護し、６時間攪拌した。次に、反応混合液を 酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシ ウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を０.１０M塩化メチレ ン及び１.１当量の塩化メタンスルホニル中でエステル化した。反応混合液を０ ℃で６時間攪拌し、水（５当量）で急冷し、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水 で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧 下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−ｐ −Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オ キサゾリジノンを得た。 ３）中間体２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル） プロピオネートを３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニ ルオキシメチル−２−オキサゾリジノンでカップリングして保護形態の化合物１ ６、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボ ニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オ キサゾリジノンを生成する １.９ｇの２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル ）プロピオネート（上記）、２０mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａ Ｈ （１.０当量）の混合液を室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１０mlのジメチル ホルムアミド（ＤＭＦ）中１.８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル− ５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノン（上記）を加え、室 温で１５分間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水 で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧 下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して保護形 態の化合物１６、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メ トキシカルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメ チル−２−オキサゾリジノンを得、次の工程へ続けた。 ４）保護形態の化合物１６を脱保護して化合物１６：３−（４−アミジノフェニ ル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル） フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン、図１４を生成する 保護形態の化合物１６、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４− （２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオ キシルメチル−２−オキサゾリジノン（１.０当量；上記のように合成）を４ml の２N ＮａＯＨで室温において４時間処理した。次に、ジオキサン中４０mlの２ N ＨＣｌ溶液を滴下して０〜２５℃で３時間混合した。次に、反応混合液を重炭 酸ナトリウム（５当量）で急冷し、酢酸エチル(０.１０M)で急冷し、水で２×、 食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去 し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物１６：３ −（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−ブチルス ルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン；m.p．236 -237℃を得た。 Ｑ．化合物１７：図１４に示される３−（４−アミジノフェニル）−（５−（４ −（２−カルボキシ−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェノキシ） メチル−２−オキサゾリジノン １）化合物１７の出発物質２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノ−３−（４−ヒド ロキシフェニル（プロピオネート）の合成 ０.１０Mメタノール及び１％希ＨＣｌ中で((Ｄ又はＬ)チロシン)(１.０当量； Sigma)をエステル化することにより出発物質２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノ −３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを得た。反応混合液を２５℃ で１２時間攪拌し、炭酸カリウムで中和し、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水 で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧 下で除去し、粗生成物を次のように続けた。 上記化合物（４.３ミリモル）、プロピルスルホン酸塩化物(６.６ミリモル；A ldrich)及びトリエチルアミン（１.５当量）の混合液を塩化メチレン（２０ml） 中室温で１２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物を酢酸エチルに 溶解し、希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸発乾固した後、 粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル １５：１）で精製して標記化合物を得た。 ２）化合物１７の出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタン スルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンの合成：３工程の手順は次の通 りである 塩化メチレン(０.１０M)中ｐ−アミノベンゾニトリル(１.０当量；Aldrich)を ２,３−エポキシプロパノール(１.０当量；Aldrich)と２５℃で１２時間攪拌し た。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗４−（２,３−ジヒドロキシプロピルアミ ノ）ベンゾニトリルを下記のように次の工程へ続けた。 ２５℃においてジメチルホルムアミド(０.１０M)中４−（２,３−ジヒドロキ シプロピルアミノ）ベンゾニトリル（１.０当量；上記）を、炭酸ジエチル(１. １当量；Aldrich)及びtert−ブチル酸カリウム(１.１当量；Aldrich)と１１０℃ で６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２ ×、 食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去 し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−（４−シア ノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジンを得、下記の通り次 の工程へ続けた。 ２５℃において塩化メチレン(０.１０M)中３−（４−シアノフェニル）−５− ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１.０当量；上記）を１.１当量の硫化 水素、１.１当量のヨウ化メチル及び１.１当量の酢酸アンモニウムと攪拌した。 反応混合液を６時間攪拌し、次に、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、 食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去 し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してアミジンを得、下記の 通り次の工程へ続けた。 上記のように合成した１.０当量のアミジンを、塩化メチレン(０.１０M)中１. １当量のＢＯＣ−ＯＮ（２−ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニト リル；Aldrich)で保護し、６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル(０. １０M)で希釈し、水で２×、食塩水で１洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。 次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を０.１０M塩化メチレン及び１.１当量 の塩化メタンスルホニル中でエステル化した。反応混合液を０℃で６時間攪拌し 、水（５当量）で急冷し、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、食塩水で １×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生 成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−ア ミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンを 得た。 ３）中間体２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル ）プロピオネートを３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホ ニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンでカップリングして保護形態の化合物 １７、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカル ボニル−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２ −オキサゾリジノンを生成する １.９ｇの２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニ ル） プロピオネート（上記）、２０mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ （１.０当量）の混合液を室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１０mlのジメチル ホルムアミド（ＤＭＦ）中１.８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル− ５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノン（上記）を加え、室 温で１５分間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水 で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧 下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して保護形 態の化合物１７、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メ トキシカルボニル−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェニルオキシ メチル−２−オキサゾリジノンを得、次の工程へ続けた。 ４）保護形態の化合物１７を脱保護して化合物１７：３−（４−アミジノフェニ ル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル ）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン、図１４を生成する 保護形態の化合物１７、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４− （２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェニ オキシルメチル−２−オキサゾリジノン（１.０当量；上記のように合成）を４m lの２N ＮａＯＨで室温において４時間処理した。次に、ジオキサン中４０mlの ２N ＨＣｌ溶液を滴下して０〜２５℃で３時間混合した。次に、反応混合液を重 炭酸ナトリウム（５当量）で急冷し、酢酸エチル(０.１０M)で急冷し、水で２× 、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、減圧下で溶媒を除 去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物１７： ３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−プロピ ルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン；m.p ．200℃(d)を得た。 Ｒ．化合物１８：図１４に示される３−（４−アミジノフェニル）−（５−（４ −（２−カルボキシ−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メ チル−２−オキサゾリジノン １）化合物１８の出発物質２−Ｎ−エチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロ キシフェニル（プロピオネート）の合成 ０.１０Mメタノール及び１％希ＨＣｌ中で((Ｄ又はＬ)チロシン)(１.０当量； Sigma)をエステル化することにより出発物質２−Ｎ−エチルスルホニルアミノ− ３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを得た。反応混合液を２５℃で １２時間攪拌し、炭酸カリウムで中和し、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で ２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下 で除去し、粗生成物を次のように続けた。 上記化合物（４.３ミリモル）、エチルスルホン酸塩化物(６.６ミリモル；Ald rich)及びトリエチルアミン（１.５当量）の混合液を塩化メチレン中室温で１２ 時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物を酢酸エチルに溶解し、希Ｈ Ｃｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸発乾固した後、粗生成物をフ ラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１）で 精製して標記化合物を得た。 ２）化合物１８の出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタン スルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンの合成：３工程の手順は次の通 りである 塩化メチレン(０.１０M)中ｐ−アミノベンゾニトリル(１.０当量；Aldrich)を ２,３−エポキシプロパノール(１.０当量；Aldrich)と２５℃で１２時間攪拌し た。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗４−（２,３−ジヒドロキシプロピルアミ ノ）ベンゾニトリルを下記のように次の工程へ続けた。 ２５℃においてジメチルホルムアミド(０.１０M)中４−（２,３−ジヒドロキ シプロピルアミノ）ベンゾニトリル（１.０当量；上記）を、炭酸ジエチル(１. １当量；Aldrich)及びtert−ブチル酸カリウム(１.１当量；Aldrich)と１１０℃ で６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２ ×、 食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去 し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−（４−シア ノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジンを得、下記の通り次 の工程へ続けた。 ２５℃において塩化メチレン(０.１０M)中３−（４−シアノフェニル）−５− ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１.０当量；上記）を１.１当量の硫化 水素、１.１当量のヨウ化メチル及び１.１当量の酢酸アンモニウムと攪拌した。 反応混合液を６時間攪拌し、次に、酢酸エチル（０.１０M)で希釈し、水で２× 、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除 去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してアミジンを得、下記 の通り次の工程へ続けた。 上記のように合成した１.０当量のアミジンを、塩化メチレン(０.１０M)中１. １当量のＢＯＣ−ＯＮ（２−ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニト リル；Aldrich)で保護し、６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル(０. １０M)で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した 。次に、減圧下で溶媒を除去し、粗生成物を０.１０M塩化メチレン及び１.１当 量の塩化メタンスルホニル中でエステル化した。反応混合液を０℃で６時間攪拌 し、水（５当量）で急冷し、酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水で２×、食塩水 で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗 生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ− アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノン を得た。 ３）中間体２−Ｎ−エチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル） プロピオネートを３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニ ルオキシメチル−２−オキサゾリジノンでカップリングして保護形態の化合物１ ８、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メキシカルボニ ル−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキ サゾリジノンを生成する １.９ｇの２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル ） プロピオネート（上記）、２０mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ （１.０当量）の混合液を室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１０mlのジメチル ホルムアミド（ＤＭＦ）中１.８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル− ５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノン（上記）を加え、室 温で１５分間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル(０.１０M)で希釈し、水 で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧 下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して保護形 態の化合物１８、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メ トキシカルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメ チル−２−オキサゾリジノンを得、次の工程へ続けた。 ４）保護形態の化合物１８を脱保護して化合物１８：３−（４−アミジノフェニ ル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル） フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン、図１４を生成する 保護形態の化合物１８、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４− （２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェニオ キシルメチル−２−オキサゾリジノン（１.０当量；上記のように合成）を４ml の２N ＮａＯＨで室温において４時間処理した。次に、ジオキサン中４０mlの２ N ＨＣｌ溶液を滴下して０〜２５℃で３時間混合した。次に、反応混合液を重炭 酸ナトリウム（５当量）で急冷し、酢酸エチル(０.１０M)で急冷し、水で２×、 食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去 し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物１８：３ −（４−アミジノフェニル）−５−（4−（２−カルボキシ−２−Ｎ−エチルス ルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン；m.p．212 ℃(d)を得た。 上記明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。実際 に、本明細書に図示及び記述されたものの他に本発明の様々な変更が上記説明か ら当業者に明らかであり、下記の請求の範囲に包含される。

【手続補正書】 【提出日】１９９８年７月１６日 【補正内容】 請求の範囲 １．α_vβ₅拮抗体の血管形成阻止量を含む、α_vβ₅含有組織において血管形成を 阻止する医薬組成物。 ２．前記α_vβ₅拮抗体が、α_vβ₅に免疫特異的であるが、α_vβ₁、α_vβ₃又はα_IIb β₃に免疫特異的でないモノクローナル抗体である請求項１記載の医薬組成物 。 ３．前記モノクローナル抗体が、Ｐ１Ｆ６と称するモノクローナル抗体の免疫反 応特性を有する請求項２記載の医薬組成物。 ４．前記α_vβ₅拮抗体がＲＧＤ含有ポリペプチドである請求項１記載の医薬組成 物。 ５．前記ポリペプチドが、シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(配列番号４)、シク ロ(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(配列番号６)、シクロ(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (配列番号７)、Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Ph e(配列番号８)及びシクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-MeVal)(配列番号９)並びにそ の塩からなる群より選ばれる請求項４記載の医薬組成物。 ６．前記塩が塩酸塩である請求項５記載の医薬組成物。 ７．前記組織が炎症組織であり、前記血管形成が炎症組織血管形成である請求項 １記載の医薬組成物。 ８．前記組織が関節炎である請求項７記載の医薬組成物。 ９．前記関節炎組織が、リウマチ様関節炎に罹った哺乳動物に存在する請求項８ 記載の医薬組成物。 10．前記血管形成が、糖尿病性網膜症、老人性黄斑変性症、推定眼ヒストプラズ マ症、未熟児網膜症及び血管新生緑内障からなる眼疾患群より選ばれた眼疾患を もつ患者に存在する請求項１記載の医薬組成物。 11．前記血管形成が、角膜移植、ヘルペス性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状片及び コンタクトレンズ装用に伴う血管新生パンヌスからなる障害群より選ばれた角膜 血管新生障害をもつ患者に存在する請求項１記載の医薬組成物。 12．前記組織が血管腫である請求項１記載の医薬組成物。 13．前記組織が充実性腫瘍又は充実性腫瘍転移であり、前記血管形成が腫瘍血管 形成である請求項１記載の医薬組成物。 14．前記血管形成がサイトカインによって誘導される請求項１記載の医薬組成物 。 15．前記サイトカインが、血管内皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因 子−α及び表皮増殖因子からなる群より選ばれる請求項14記載の医薬組成物。 16．前記サイトカインが血管内皮細胞増殖因子であり、前記血管形成が網膜血管 形成、角膜血管形成、腫瘍血管形成及び炎症組織血管形成からなる群より選ばれ る請求項15記載の医薬組成物。 17．前記血管形成阻止量が約２μＭ〜５ｍＭである請求項１記載の医薬組成物。 18．前記α_vβ₅拮抗体が有機擬似体である請求項１記載の医薬組成物。 19．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項18記載の医薬組成物。 20．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項18記載の医薬組成物。 21．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項18記載の医薬組成物。 22．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項18記載の医薬組成物。 23．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項18記載の医薬組成物。 24．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項18記載の医薬組成物。 25．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項18記載の医薬組成物。 26．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項18記載の医薬組成物。 27．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項18記載の医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５Ｂ 31/195 ６０３ 31/195 ６０３ 31/42 31/42 45/00 45/00 // Ｃ０７Ｄ 263/24 Ｃ０７Ｄ 263/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 チェリッシュ ディヴィッド エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92007 カーディフ シー ヴィレッジ サークル 2108 (72)発明者 フリードランダー マーティン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92014 デルマー ザポ ストリート 1720

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．α_vβ₅含有組織において血管形成を阻止する方法であって、α_vβ₅拮抗体の 血管形成阻止量を含む組成物を前記組織に投与することを特徴とする方法。 ２．前記α_vβ₅拮抗体が、α_vβ₅に免疫特異的であるがα_vβ₁、α_vβ₃又はα_{II b} β₃に免疫特異的でないモノクローナル抗体である請求項１記載の方法。 ３．前記モノクローナル抗体が、Ｐ１Ｆ６と称するモノクローナル抗体の免疫反 応特性を有する請求項２記載の方法。 ４．前記α_vβ₅拮抗体がＲＧＤ含有ポリペプチドである請求項１記載の方法。 ５．前記ポリペプチドが、シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(配列番号４)、シク ロ(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(配列番号６)、シクロ(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (配列番号７)、Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Ph e(配列番号８)及びシクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-MeVal(配列番号９)及びその 塩からなる群より選ばれる請求項４記載の方法。 ６．前記塩が塩酸塩である請求項５記載の方法。 ７．前記組織が炎症組織であり、前記血管形成が炎症組織血管形成である請求項 １記載の方法。 ８．前記組織が関節炎である請求項７記載の方法。 ９．前記関節炎組織が、リウマチ様関節炎に罹った哺乳動物に存在する請求項８ 記載の方法。 10．前記血管形成が、糖尿病性網膜症、老人性黄斑変性症、推定眼ヒストプラズ マ症、未熟児網膜症及び血管新生緑内障からなる眼疾患群より選ばれた眼疾患を もつ患者に存在する請求項１記載の方法。 11．前記血管形成が、角膜移植、ヘルペス性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状片及び コンタクトレンズ装用に伴う血管新生パンヌスからなる障害群より選ばれた角膜 血管新生障害をもつ患者に存在する請求項１記載の方法。 12．前記組織が血管腫である請求項１記載の方法。 13．前記組織が充実性腫瘍又は充実性腫瘍転移であり、前記血管形成が腫瘍血管 形成である請求項１記載の方法。 14．前記血管形成がサイトカインによって誘導される請求項１記載の方法。 15．前記サイトカインが、血管内皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因 子−α及び表皮増殖因子からなる群より選ばれる請求項１４記載の方法。 16．前記サイトカインが血管内皮細胞増殖因子であり、前記血管形成が網膜血管 形成、角膜血管形成、腫瘍血管形成及び炎症組織血管形成からなる群より選ばれ る請求項１５記載の方法。 17．前記血管形成阻止量が約２μM〜５mMである請求項１記載の方法。 18．前記投与が眼内、静脈内、経皮、滑液嚢内、筋肉内又は経口投与を含む請求 項１記載の方法。 19．前記投与が化学療法と共に行われる請求項１記載の方法。 20．前記投与が１回の静脈内投与を含む請求項１記載の方法。 21．前記α_vβ₅拮抗体が有機擬似体である請求項１記載の方法。 22．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項21記載の方法。 23．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項21記載の方法。 24．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項21記載の方法。 25．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項21記載の方法。 26．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項21記載の方法。 27．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項21記載の方法。 28．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項21記載の方法。 29．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項21記載の方法。 30．前記有機擬似体が下記構造によって表される請求項21記載の方法。