NO319264B1 - Anvendelse av en spesifikk alfavbeta5-antagonist ved fremstilling av et medikament for inhibering av alfavbeta5-formidlet angiogenese i et alfavbeta5-inneholdende vev. - Google Patents

Anvendelse av en spesifikk alfavbeta5-antagonist ved fremstilling av et medikament for inhibering av alfavbeta5-formidlet angiogenese i et alfavbeta5-inneholdende vev. Download PDF

Info

Publication number
NO319264B1
NO319264B1 NO19980622A NO980622A NO319264B1 NO 319264 B1 NO319264 B1 NO 319264B1 NO 19980622 A NO19980622 A NO 19980622A NO 980622 A NO980622 A NO 980622A NO 319264 B1 NO319264 B1 NO 319264B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
angiogenesis
tissue
antagonist
avp5
beta
Prior art date
Application number
NO19980622A
Other languages
English (en)
Other versions
NO980622L (no
NO980622D0 (no
Inventor
Peter Brooks
David A Cheresh
Martin Friedlander
Original Assignee
Scripps Research Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Research Inst filed Critical Scripps Research Inst
Publication of NO980622D0 publication Critical patent/NO980622D0/no
Publication of NO980622L publication Critical patent/NO980622L/no
Publication of NO319264B1 publication Critical patent/NO319264B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/02—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C311/03—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C311/06—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to acyclic carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A61K31/421—1,3-Oxazoles, e.g. pemoline, trimethadione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/04—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
    • C07C279/08—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being further substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/10—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of a saturated carbon skeleton containing rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings
    • C07D263/08—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D263/16—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D263/18—Oxygen atoms
    • C07D263/20—Oxygen atoms attached in position 2
    • C07D263/24—Oxygen atoms attached in position 2 with hydrocarbon radicals, substituted by oxygen atoms, attached to other ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2602/00—Systems containing two condensed rings
    • C07C2602/36—Systems containing two condensed rings the rings having more than two atoms in common
    • C07C2602/42—Systems containing two condensed rings the rings having more than two atoms in common the bicyclo ring system containing seven carbon atoms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Teknisk område
Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av en spesifikk avp5-antagonist ved fremstilling av et medikament for inhibering av avP5-formidlet angiogenese i et ccvps-inneholdende vev.
Bakgrunn
Integriner er en klasse av cellulære reseptorer som
er kjent for å binde ekstracellulære matriksproteiner og derfor formidler celle-celle- og celle-ekstracellulærmatriks-interaksjoner, generelt referert til som celleadhesjons-prosesser. Selv om mange integriner og deres respektive ligander er beskrevet i litteraturen, forblir imidlertid den biologiske funksjon av mange av integrinene vanskelig å defi-nere. Integrinreseptorene utgjør en familie av proteiner med de samme strukturelle karakteristiske egenskaper som ikke-kovalente, heterodimere glykoproteinkomplekser dannet av a- og p-subenheter.
Vitronektinreseptoren, „som er gitt denne betegnelse etter sin opprinnelige egenskap med preferensiell binding til vitronektin, er nå kjent for å referere til tre forskjellige integriner, betegnet avpi, avp\} og avJ35; Horton, Int. J. Exp. Pathol., 71:741-759 (1990). avPi binder fibronektin og vitronektin. avp3 binder mange forskjellige ligander, inkludert fibrin, fibrinogen, laminin, trombospondin, vitronektin, von Willebrands faktor, osteospontin og bensialoprotein I. avp5 binder vitronektin. De spesifikke celleadhesjonsroller som disse tre integriner spiller ved de mange cellulære inter-aksjoner i vev, blir fremdeles utforsket. Det er imidlertid klart at det eksisterer forskjellige integriner med forskjellige biologiske funksjoner, så vel som forskjellige integriner og subenheter med de samme biologiske spesifisiteter.
Ett viktig gjenkjennelsessete for mange integriner i
en ligand er arginin-glysin-asparaginsyre(RGD)-tripeptid-sekvensen. RGD finnes i alle de ovenfor identifiserte ligander for vitronektinreseptorintegrinene. Dette RGD-gjenkjennelsessetet kan etterlignes ved hjelp av polypeptider ("peptider")
som inneholder RGD-sekvensen, og slike RGD-peptider er kjente
inhibitorer av integrinfunksjon. Det er imidlertid viktig å merke seg at, avhengig av sekvensen og strukturen til RGD-peptidet, spesifisiteten av inhiberingen kan endres for å målrette spesifikke integriner.
For diskusjoner om RGD-gjenkjennelsessetet, se Pierschbacher et al., Nature, 309:30-33 (1984); og Pierschbacher et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:5985-5988
(1984). Forskjellige RGD-polypeptider med varierende integrin-spesifisitet er også beskrevet av Grant et al., Cell, 58:933-943 (1989); Cheresh et al., Cell, 58:945-953 (1989); Aumailley et al., FEBS Letts., 291:50-54 (1991); og Pfaff et al., J. Biol. Chem., 259:20233-20238 (1994); og i US patentskrifter nr. 4 517 686, 4 578 079, 4 589 881, 4 614 517, 4 661 111, 4 792 525, 4 683 291, 4 879 237, 4 988 621, 5 041 380 og 5 061 693. Angiogenese, også referert til som neovaskularisering, er en prosess med vevsvaskularisering som involverer vekst av nye utviklende blodkar inn i et vev. Prosessen formidles ved infiltrering av endotelceller og glatte muskelceller. Prosessen antas å foregå på enhver av de tre måter: 1) blodkarene kan vokse frem fra tidligere eksisterende blodkar; 2) nyutvikling av blodkar kan oppstå fra forløperceller (vaskulogenese); eller 3) eksisterende små blodkar kan utvides i diameter; Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118
(1990) . Vaskulaere endotelceller er kjent for å inneholde minst fem RGD-avhengige integriner, inkludert vitronektinreseptoren (avP3 eller avp5) , kollagenreseptor type I og IV (aipi) , lamininreseptoren (a2Pi) , fibronektin-/laminin-/kollagenresep-toren (CI3P1) og fibronektinreseptoren (a5Pi) ,- Davis et al., J. Cell. Biochem., 51:206-218 (1993). Glatte muskelceller er kjent for å inneholde minst seks RGD-avhengige integriner, inkludert a5Pi, av£3 og av<p>5.
Angiogenese er en viktig prosess i neonatal vekst, men er også viktig i sårheling og i patogenesen av mange forskjellige klinisk viktige sykdommer, inkludert vevsinflamma-sjon, artritt, psoriasis, cancer, diabetisk retinopati, makular degenerering og andre neovaskulære øyesykdommer. Disse kliniske entiteter forbundet med angiogenese refereres til som angiogene sykdommer; Folkman et al., Science, 235:442-447
(1987). Angiogenese er vanligvis fraværende i voksne eller modne vev, selv om den forekommer ved sårheling og i vekst-syklusen for corpus luteum; se f.eks. Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990).
Inhibering av celleadhesjon in vi tro ved anvendelse av monoklonale antistoffer som er immunspesifikke for forskjellige integrin-a- eller -{3-subenheter, har implisert vitronektinreseptoren avp3 i celleadhesjon av forskjellige celletyper, inkludert mikrovaskulære endotelceller; Davis et al., J. Cell. Biol., 51:206-218 (1993). Nicosia et al., Am. J. Pathol., 138:829-833 (1991), har dessuten beskrevet anvendelse av RGD-peptidet GRGDS for å inhibere dannelsen in vitro av "mikroblodkar" fra rotteaorta dyrket i kollagengel.
Inhiberingen av dannelse av "mikroblodkar" in vitro i kollagengelkulturer er imidlertid ikke en modell for inhibering av angiogenese i et vev, siden det ikke er vist at mikro-blodkarstrukturene er de samme som kapillærutskudd, eller at dannelsen av mikroblodkar i kollagengelkultur er den samme som neovaskulær vekst inn i et intakt vev, slik som artritisk vev, tumorvev eller sykt vev hvor inhibering av angiogenese er ønskelig.
Rollen til avp3 i angiogenese er nylig bekreftet, se Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994). Integrinet ble vist å bli uttrykt på blodkar i humant sårgranuleringsvev, men ikke i normal hud. Monoklonale antistoffer mot avfJ3-reseptoren inhiberte angiogenese indusert av vekstfaktorene (cytokiner) basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) og tumornekrosefaktor-a (TNF-a), så vel som av melanomfragmenter. Antagonistene inhiberte imidlertid kun nye og ikke forhåndseksisterende blodkar. Spesifikke lineære og sykliske RGD-inneholdende peptider ble dessuten vist å inhibere neovaskularisering.
Det er blitt foreslått at inhibering av angiogenese ville være en anvendelig terapi for begrensning av tumorvekst. Inhibering av angiogenese er blitt foreslått ved (1) inhibering av frigivelse av "angiogene molekyler", som bFGF (basisk fibroblastvekstfaktor), (2) nøytralisering av angiogene molekyler, slik som ved anvendelse av anti-bFGF-antistoffer, og (3) inhibering av endotelcellerespons mot angiogene stimuli. Denne sistnevnte strategi har fått oppmerksom-het, og Folkman et al., Cancer Biology, 3:89-96 (1992), har beskrevet flere endotelcelleresponsinhibitorer, inkludert kollagenaseinhibitor, basismembranomsetningsinhibitorer, angiostatiske steroider, soppavledete angiogeneseinhibitorer, blodplatefaktor 4, trombospondin, artrittlegemidler, slik som D-penicillamin og gulltiomalat, vitamin D3-analoger, a-inter-feron og lignende, som kan anvendes for å inhibere angiogenese. For ytterligere foreslåtte inhibitorer av angiogenesen, se Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118
(1990); Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990); Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988); og US patentskrifter nr. 5 092 885, 5 112 946, 5 192 744 og 5 202 352.
Rollen til integrinet avps ved angiogenese er imidlertid verken blitt antydet eller identifisert før foreliggende oppfinnelsen, og noen av inhibitorene av angiogenese beskrevet i de foregående referanser er heller ikke blitt mål-rettet til inhibering av avp5. Ingen referanser, foruten foreliggende oppfinnelse, har dessuten implisert avps-integrinet i neovaskularisering, spesielt den som induseres av vekstfaktorene, vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), transformasjonsvekstfaktor-a (TGF-a) og epidermal vekstfaktor (EGF).
Selv om antallet vekstfaktorer involvert i kontroll av angiogenese er begrenset, eksisterer det forskjellige nivåer av kontroll av prosessen for omdannelse av en hvilende tilstand til en neovaskulær tilstand, se D'Amore, Investi - gative Ophthal. Visual Sei., 35:3974-3979 (1994). Selv om noen vekstfaktorer involvert i angiogenese reguleres på syntese-nivåer, reguleres andre av aktiveringstUstanden. Disse cellulære prosesser forekommer når et hvilende blodkar gjennomgår neovaskularisering etter skade eller iskemi.
Spesielt VEGF antas å være en hovedformidler av angiogenese i en primær tumor og ved iskemiske okularsykdom-mer. For en oversikt, se Folkman, Nature Medicine, 1:27-31
(1995). VEGF er en 46 kg dalton (kDa) homodimer som er en endotelial, cellespesifikk, angiogen (Ferrara et al., Endocrin. Rev., 13:18-32 (1992)) og vasopermeabel faktor
(Senger et al., Cancer Res., 46:5629-5632 (1986)) som bindes til høyaffinitetsmembranbundne reseptorer med tyrosinkinase-aktivitet (Jakeman et al., J. Clin. Invest., 89:244-253
(1992)).
Aktivering av reseptortyrosinkinaser er nylig vist å fremme integrinavhengig cellemigrasjon på ekstracellulære matriksproteiner. Klemke et al., J. Cell. Biol., 127:859-866
(1994) har spesielt implisert EGF-reseptor(EGFR)-tyrosin-kinasen i aktivering av cellemotilitet, men ikke adhesjon av
FG-humane pankreaskarsinomceller til vitronektin ved anvendelse av av{35 - integrinet. Forfatterne tilveiebringer direkte bevis for at okkupasjon av EGFR med EGF-liganden aktiverer tyrosink-inaseaktiveringen av EGFR, som til sist stimulerer en proteinkinase C(PKC)-avhengig reaksjonsvei og fører til induksjon av avp5-avhengig cellemigrasjon av et vitronektinsubstrat som cellene vanligvis ikke er i stand til å migrere på. Funnene til Klemke et al. tilveiebringer således bevis for å korrelere tilstedeværelsen av cytokiner, spesielt EGF, med integrinak- . tivitet i cellemigrasjon. Aktivering av PKC er blitt vist å være involvert i reguleringen av angiogenese i korioallan-toinmembranmodellsystemet fra kylling, se Tsopanoglou et al., J. Vase. Res., 30:202-208 (1993). Forfatterne identifiserte spesifikke aktivatorer og inhibitorer av PKC som henholdsvis stimulerte og inhiberte angiogenese i modellsystemet.
Verken Klemke et al. eller Tsopanoglou et al. diskutert ovenfor beskriver imidlertid rollen til cytokiner og ekspresjon og/eller aktivering av avps-integrinet ved å fremme angiogenese under forskjellige forhold og sykdomstilstander, og inhibering av disse med avp5-spesifikke antagonister.
Nylig eksperimentelt bevis har vist i et apemodell-system for øyesykdom at retinal iskemi indusert av retinal veneokklusjon, resulterte i en hurtig økning av VEGF i de vannholdige kamre i øyet. Denne økning inntraff samtidig med irisneovaskulariseringen som ble observert, som beskrevet av Miller et al., Am. J. Path., 145:574-584 (1994). Ytterligere data i et musemodellsystem for proliferativ retinopati hvori hypoksi blir indusert, viste at VEGF-budbringer-RNA økte innen 6-12 timer med relativ hypoksi, og forble forhøyet inntil neo-kar avtok, avtok også VEGF-ekspresjonen, som beskrevet av Pierce et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 92:905-909 (1995).
De nylige data, som demonstrert i dyremodeller for iskemi, har således korrelert med induksjonen av VEGF med induksjonen av iskemi, etterfulgt av neovaskularisering. VEGF, så vel som andre vekstfaktorer, er også blitt implisert i andre forhold og sykdomstilstander som involverer neovaskularisering, som beskrevet av Folkman, Nature Medicine, 1:27-31
(1995) .
Referansen Folkman et al. oppsummerer også de verserende kliniske metoder anvendt for å kontrollere uønsket angiogenese. Pasienter under kliniske forsøk har mottatt terapeutiske behandlinger med angiogeneseinhibitorer, inkludert blodplatefaktor 4, et fumagillinderivat, karboksyaminotriazol og lignende. Ingen referanser eller aktuelle terapeutiske referanser korrelerer imidlertid ekspresjonen av avfis med angiogenese, spesielt den som induseres av VEGF. Forut for foreliggende oppfinnelse har således ingen verken beskrevet eller anvendt et terapeutisk regime med civps-antagonister for å kontrollere angiogenese i et vev som gjennomgår angiogenese som henger sammen med tilstedeværelse og aktivering av avPs.
EP 578083 gjør kjent syklopeptider med RGD-motivet som er typisk for integriner. Det beskrives at sykliske RGD-inneholdende peptider er anvendbare for å understøtte angiogenese, hvilket er motsatt av anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse.
WO 9514714 beskriver peptider som bindes til avps-inneholdende integriner. Peptidene binder både til ctvp3 og Ovps-Publikasjonen omfatter imidlertid ikke anvendelse av en av<p>s-antagonist ved fremstillingen av et medikament for inhibering av angiogenese i et ctvPs-inneholdende vev.
M. Lehmann et al., Cancer Research, bind 54, 1994,
s. 2102-2107, omfatter antistoffer mot Ov og I. Hardan et al., Int. J. Cancer, bind. 55, 1993, s. 1023-1028, foreslår anvendelse av RGD-peptidetterligninger. Ingen av publika-sjonene beskriver inhibering av angiogenese med noen type integrininhibitor.
Foruten undersøkelsene rapportert heri vedrørende
Foruten undersøkelsene rapportert heri vedrørende dv^3 og slektskapet med vekstfaktorer mot angiogenese er derfor de foreliggende patentsøkere uvitende om noen annen demon-strasjon av at angiogenese kunne inhiberes i et vev ved anvendelse av inhibitorer av avPs-formidlet celleadhesjon. Spesielt er det aldri tidligere demonstrert at avp5-funksjon fordres for angiogenese i et vev, eller at avp5-antagonister kan inhibere angiogenese i et vev, spesielt ved okulare, neovaskulære sykdommer.
Kort beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av en spesifikk avps-antagonist ved fremstilling av et medikament for inhibering av avps-formidlet angiogenese i et avp5-inneholdende vev, hvori den spesifikke avp5-antago-nisten er et RGD-inneholdende polypeptid.
Foreliggende oppfinnelse viser at i tillegg til en angiogenesereaksjonsvei som fordrer avP3, eksisterer det også en separat ny av£J5-avhengig reaksjonsvei. Foreliggende oppfinnelse beskriver således inhibitorer av avPs som kan inhibere angiogenese. Oppfinnelsen beskriver dessuten at avp5-formidlet aktivitet ved fremmelse av angiogenese er forbundet med vekstfaktor (cytokin)aktivering av vekstfaktorreseptor, tyrosinkinaser og proteinkinase C (PKC). Vekstfaktorene (cytokiner) som virker på denne måten, inkluderer vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), transformasjonsvekstfaktor-a (TGF-a), epidermal vekstfaktor (EGF) og lignende.
Oppfinnelsen beskriver derfor fremgangsmåter for inhibering av angiogenese i et vev, omfattende at det til vevet administreres et preparat som omfatter en angiogenese-inhiberende mengde av en av£s-antagonist.
Vevet som skal behandles, kan være ethvert vev hvori inhibering av angiogenese er ønskelig, slik som sykdomsrammet vev hvor neovaskularisering forekommer. Eksempler på vev inkluderer okulart vev som gjennomgår neovaskularisering, betent vev, faste tumorer, metastaser, vev som gjennomgår restenose og lignende vev. I foretrukne utførelsesformer er neovaskul ari ser ingen forbundet med av{33 resultatet av innvirk-
ning av vekstfaktorene VEGF, TGF-a og EGF.
Spesielt foretrukket er terapeutiske metoder rettet på inhibering av VEGF-indusert vaskularisering i vev, slik som øyet, hvor angiogenese er utpreget ved sykdommer som inkluderer diabetisk retinopati (også betegnet proliferativ diabetisk retinopati), aldersrelatert makular degenerering, antatt okular histoplasmose, retinopati ved for tidlig fødsel, sigdcelleretinopati og neovaskulært glaukom. I ytterligere foretrukne utførelsesformer er de terapeutiske fremgangsmåter rettet på inhibering av angiogenese som forekommer ved hornhinne -neovaskulære sykdommer som inkluderer hornhinnetrans-plantasjon, herpetisk keratitt, luetisk keratitt, pterygium, neovaskulær pannus forbundet med anvendelse av kontaktlinser og lignende.
En avp5-antagonist for anvendelse i de foreliggende fremgangsmåter er i stand til å bindes til avps og kompetitivt inhibere evnen hos avPs til å bindes til den naturlige vitro-nektinligand. Antagonisten utviser fortrinnsvis spesifisitet for avp5 i forhold til andre integriner. I en spesielt foretrukket utførelsesform inhiberer av{Js-antagonisten binding av vitronektin eller andre RGD-inneholdende ligander til av$ 5t men inhiberer ikke vesentlig binding av vitronektin til avP3 eller o-ubpV En foretrukket o. vp3~antagonist kan være et lineært eller syklisert polypeptid, et monoklonalt antistoff eller et funksjonelt fragment derav, eller et organisk molekyl som er en etterligning av en avp5-ligand som også refereres til som en organisk etterligning, hvilke alle spesifikt reagerer med avp5.
Administrering av avp5-antagonistene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer intraokular, intravenøs, trans-dermal, intrasynovial, intramuskulær og oral administrering. I andre foretrukne utførelsesformer koordineres administreringen med et kjemoterapeutisk regime for å kontrollere tumordannelse og cancermetastase.
Kort beskrivelse av figurene
Figurene 1A-1D illustrerer inhibering av cytokinindusert korneal angiogenese hos kanin ved hjelp av av-integrin-antistoffantagonister. Induksjon av angiogenese ved behandling med enten bFGF eller VEGF og virkninger av behandling med av-integrinantistof f antagonistene P1F6 (avPs) og LM609 (avp3) er beskrevet i eksempel 4. OD og OS er henholdsvis de høyre og venstre øyne hos en eksperimentkanin. Store piler indikerer korneal angiogenese med ødem, mens små piler peker på normale konjunktivale limbalblodkar. Figurene IA og IB viser induksjon av angiogenese med bFGF, mens figurene 1C og ID viser denne induksjon med VEGF. Kaninhornhinner i figurene IA og 1C viser behandling med P1F6, mens figurene IB og ID viser behandling med LM609.
Figurene 2A og 2D er histogrammer som viser det gjennomsnittlige neovaskulære areal i mm<2> +/- standardfeilen
(n = 8 for hver av to serier) etter induksjon med henholdsvis bFGF eller VEGF, etterfulgt av mAb-behandling med enten P1F6 eller LM609. Resultatene er diskutert i eksempel 4.
Figurene 3A-3F illustrerer fotografisk virkningene av antiintegrin-antistoffbehandling på CAM-preparatet fra kylling. Resultatene er beskrevet i eksempel 6A. Angiogenese induseres enten med bFGF eller VEGF, etterfulgt av intravenøs administrering av fosfatbufret saltløsning (PBS) som en kontroll, eller med P1F6- eller LM609-monoklonale antistoffer beskrevet i forklaringen til figur l. CAM behandlet med bFGF
er vist i figurene 3A, 3C og 3E, mens CAM behandlet med VEGF
er vist i figurene 3B, 3D og 3F. Kontroll-CAM behandlet med intravenøse injeksjoner av PBS er vist i figurene 3A og 3B. PlF6-antistoffet ble anvendt for å behandle CAM vist i
figurene 3C og 3D, mens LM609-antistoffet ble anvendt for å behandle CAM i figurene 3E og 3F.
Figurene 4A og 4B er histogrammer som viser kvantifisering av resultatene vist i figurene 3A-3F. Angiogeneseindeksen er plottet på Y-aksen mot kontroll- eller antistoffbehandling. Figurene 4A og 4B viser henholdsvis bFGF- og VEGF-indusert angiogenese. Resultatene er diskutert i eksempel 4. Figurene 5A-5F illustrerer fotografisk virkningene av syntetisk peptidbehandling på CAM-preparatet fra kylling, som beskrevet i eksempel 6. Angiogenese induseres enten med bFGF eller VEGF, etterfulgt av intravenøs administrering av fosfatbufret saltløsning (PBS) som en kontroll, eller med de syntetiske sykliske peptider RGDfV (SEKV.ID. NR. 4) eller RADfV (SEKV.ID. NR. 5). CAM behandlet med bFGF er vist i figurene 5A, 5C og 5E, mens CAM behandlet med VEGF er vist i figurene 5B, 5D og 5F. Kontroll-CAM behandlet med intravenøse injeksjoner av PBS er vist i figurene 5A og 5B. RDGfV-peptidet ble anvendt for å behandle CAM vist i figurene 5C og 5D, mens RADfV-peptidet ble anvendt for å behandle CAM i figurene 5E og 5F. Figurene 6A og 6B er histogrammer som viser kvanti-fiseringen av resultater vist i figurene 5A-5F. Angiogeneseindeksen er plottet på Y-aksen mot kontroll- eller antistoffbehandling. Figurene 6A og 6B viser henholdsvis bFGF- og VEGF-indusert angiogenese. Resultatene er diskutert i eksempel 6. Figurene 7A-7E viser virkningene av antiintegrin-monoklonale antistoffer og kalfostin C på CAM-angiogenese indusert av de enkelte cytokiner bFGF, TNF-a, VEGF og TGF-a. PMA ble også evaluert. Analysene og resultatene er beskrevet i eksempel 6. Resultatene er plottet i histogramformat, der angiogeneseindeksen er plottet på Y-aksen, og de forskjellige kontroller eller inhibitorer er vist på X-aksen. Figurene 7A-7E viser henholdsvis angiogenese indusert med bFGF, TNF-a, VEGF, TGF-a og PMA. Figur 8 er et histogram som viser virkningene av antistoffbehandling på CSl-melanomtumorvekst i kyllingembryo-CAM analysert som beskrevet i eksemplene 5C og 6D. Vekten av tumorene i milligram (mg) er plottet på Y-aksen mot de forskjellige behandlinger indikert på X-aksen. CSAT er et kontrollantistoff som er spesifikt for integrin-Pi-subenheten. LM609 og P1F6 er beskrevet tidligere. Figur 9 er et histogram som viser effektene av en kontroll i forhold til en avfJs-peptidantagonist, merket peptid 189 (SEKV.ID. NR. 9) på melanomtumorvekst, som målt ved tumor-volum i mm<3> plottet på Y-aksen. Analysen og resultatene er beskrevet i eksempel 8. Figur 10 illustrerer syntesen av forbindelse 7, som beskrevet i eksemplene 10A-G. Figur 11 illustrerer syntesen av forbindelse 9, som beskrevet i eksemplene 10A-C; H-I. Figur 12 illustrerer syntesen av forbindelse 10, som beskrevet i eksempel 10J. Figur 13 illustrerer syntesen av forbindelse 12 og forbindelse 14, som beskrevet i henholdsvis eksempel 10K-L og 10M-N. Figur 14 viser de kjemiske strukturer av forbindelse 15, forbindelse 16, forbindelse 17 og forbindelse 18. Den detaljerte syntese av disse forbindelser er beskrevet i eksempel 10O-R.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
A. Definisjoner
Aminosyrerest: en aminosyre dannet ved kjemisk spalting (hydrolyse) av et polypeptid ved peptidbindingene. Aminosyrerestene beskrevet heri, foreligger fortrinnsvis i "L"-isomerformen. Rester i "D"-isomerformen kan imidlertid erstatte enhver L-aminosyrerest, så lenge som polypeptidets ønskede funksjonelle egenskap bibeholdes. NH2 refererer til den frie aminogruppe til stede på aminoterminalen av et polypeptid. COOH refererer til den frie karboksygruppe til stede på karboksyterminalen av et polypeptid. I overensstemmelse med standard polypeptidnomenklatur (beskrevet i J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), og innført ved 37 CFR § 1.822 (b) (2)), er forkortelser for aminosyrerester vist i den følgende korre-spondansetabell:
De følgende forkortelser har dessuten betydningene:
Boe tert.-butyloksykarbonyl
DCCI disykloheksylkarbodiimid
DMF dimetylformamid
OMe metoksy
HOBt 1-hydroksybenzotriazol
Det bør anføres at alle aminosyrerestsekvenser er representert heri ved formler hvis venstre og høyre orienter-ing har den konvensjonelle retning fra aminoterminal til karboksyterminal. Det skal videre anføres at en tankestrek ved begynnelsen eller slutten av en aminosyrerestsekvens indikerer en peptidbinding til en ytterligere sekvens av én eller flere aminosyrerester.
Polypeptid: en lineær serie av aminosyrerester forbundet med hverandre ved peptidbindinger mellom a-aminogruppen og karboksygruppen på tilstøtende aminosyrerester.
Peptid: en lineær serie av ikke flere enn ca.
50 aminosyrerester forbundet med hverandre som i et polypeptid.
Syklisk peptid: et sirkulært peptid avledet fra et tilsvarende lineært peptid, og som refererer til et peptid hvor det ikke foreligger noen frie N- eller C-terminaler, idet det tilsvarende lineære peptids N-terminal danner en amid-binding med det C-terminale karboksylat i det tilsvarende lineære peptid.
Protein: en lineær serie med flere enn 50 aminosyrerester forbundet med hverandre som i et polypeptid.
Syntetisk peptid: en kjemisk produsert kjede av aminosyrerester bundet sammen med peptidbindinger, og hvor naturlig forekommende proteiner og fragmenter derav er fraværende .
B. Generelle betraktninger
Foreliggende oppfinnelse angår generelt oppdagelsen at angiogenese formidles av den spesifikke vitronektinreseptor avp5, og at inhibering av avp$-funksjon inhiberer angiogenese.
Denne oppdagelse er veldig viktig på grunn av den rolle som angiogenese spiller i mange forskjellige sykdomsprosesser. Ved å inhibere angiogenese kan sykdommen påvirkes, symptomene kan lindres, og i noen tilfeller kan sykdommen hel-bredes .
Når vekst av nye blodkar er årsaken til eller bidrar til patologien forbundet med en sykdom, vil inhibering av angiogenese redusere de skadelige virkninger av sykdommen. Eksempler inkluderer reumatoid artritt, diabetisk retinopati, inflammatoriske sykdommer, restenose og lignende. Når veksten av nye blodkar fordres for å understøtte vekst av et skadelig vev, vil inhibering av angiogenese redusere blodtilførselen til vevet og derved bidra til å redusere vevsmassen, basert på blodtilførselskrav. Eksempler inkluderer vekst av nye blodkar som respons på iskemi, hvilket fører til vekstfaktorindusert angiogenese, vekst av tumorer hvor neovaskularisering er et kontinuerlig krav for at tumoren skal vokse til en tykkelse på mer enn noen få millimeter, og for etablering av faste tumormetastaser.
Fremgangsmåtene er effektive, delvis fordi terapien er høyselektiv for angiogenese og ikke noen andre biologiske prosesser. Som vist i eksemplene, inneholder kun nye blodkarutvekster vesentlige mengder av{Js, og derfor gir de
Oppdagelsen at inhibering av avfS3 alene effektivt vil inhibere angiogenese, tillater utvikling av terapeutiske preparater med potensielt høy spesifisitet, og derfor for-holdsvis lav toksisitet. Selv om foreliggende oppfinnelse beskriver anvendelse av peptidbaserte reagenser som har evne til å inhibere ett eller flere integriner, kan det utformes andre reagenser som mer selektivt inhiberer avpV Visse peptidbaserte reagenser har derfor ikke bivirkningene med å inhibere andre biologiske prosesser foruten prosessene formidlet av avPs«
Som vist ved læren ifølge foreliggende oppfinnelse, er det f.eks. mulig å fremstille monoklonale antistoffer som er ytterst selektive for immunreaksjon med avJ35, og ikke med avJPi, av<p>3 eller aubf33r som likeledes er selektive for inhibering av avp5-funksjon. RGD-inneholdende peptider kan dessuten utformes til å bli selektive for inhibering av avPs, som beskrevet nærmere heri.
Før oppdagelsene ifølge foreliggende oppfinnelse var det ikke kjent at angiogenese og noen av prosessene som er avhenger av angiogenese, kunne inhiberes in vivo ved anvendelse av reagenser som antagoniserer den biologiske funksjon av avp5.
C. Fremgangsmåter for inhibering av angiogenese
Målvevet anvendt ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse defineres som avp5-inneholdende vev, som er kjennetegnet ved den påvisbare tilstedeværelse av avp5-integrinreseptor. Et avp5-inneholdende vev defineres med andre ord ved tilstedeværelsen av avps-reseptorkomplekset i cellemembranene. Slike vev inkluderer celler avledet fra epitel og mesenchym. Tilstedeværelsen av reseptoren kan bestemmes på mange forskjellige måter, inkludert immunreaktivitet av reseptoren med et anti-civfis-integrinreseptorantistoff, hvori immunreaksjonen påvises i vev ved hjelp av mikroskopi, immunutfelling, ved konkurranse i ligandbindingsanalyser og lignende teknikker. Foretrukne antistoffer for anvendelse ved påvisning av tilstedeværelse av avps i et vev er beskrevet nedenfor og i eksempel 1. Fordelingen av avp5 i nyrer, hud og okularvev ved hjelp av immunfluorescensmikroskopi er f.eks. beskrevet i
eksempel 2.
I sammenheng med. foreliggende oppfinnelse er et avp5-inneholdende vev også kjennetegnet som et vev som viser tegn på angiogenese. Som beskrevet tidligere, inkluderer angiogenese mange forskjellige prosesser som involverer neovaskularisering av et vev, inkludert "spiring", vaskulogenese eller blodkarforstørrelse, hvilke alle angiogeneseprosesser formidles og er avhengige av ekspresjon av av$ 5. Med unntak av traumatisk sårheling, dannelse av corpus luteum og embryogenese antas det at majoriteten av angiogeneseprosesser er forbundet med sykdomsprosesser, og anvendelse av de foreliggende terapeutiske metoder er derfor selektive for sykdommen og har ingen skadelige bivirkninger.
Det foreligger mange forskjellige sykdommer hvori angiogenese antas å være viktig, referert til som angiogene sykdommer, inkludert, men ikke begrenset til, inflammatoriske forstyrrelser som immun og ikke-immun inflammasjon, kronisk artikulær reumatisme og psoriasis, forstyrrelser forbundet med uheldig eller ubeleilig inntrengning av blodårer, slik som restenose, kapillærproliferasjon i arteriosklerotiske plakk og osteoporose, og cancerassosierte sykdommer, slik som faste tumorer, faste tumormetastaser, angiofibromer, retrolental fibroplasi, hemangiomer, Kaposi-sarkom og lignende cancere som fordrer neovaskularisering for å understøtte tumorvekst.
Øyesykdommer kjennetegnet ved neovaskularisering representerer et spesielt foretrukket mål for terapi. Okular neovaskularisering er den mest vanlige patologiske endring observert i det overveldende flertall av øyesykdommer som resulterer i katastrofalt tap av syn. Veksten av nye blodkar fra de forhåndseksisterende koroidale, retinale eller paralimbale blodkar kan føre til ødem, blødning eller fibrovaskulær membrandannelse og resultere i ødeleggelse av de normale anatomiske forhold i øyet og ledsagende tap av normal syns-funksjon.
Øyesykdommer som er kjennetegnet ved angiogenese, inkluderer korneale, neovaskulære sykdommer som inkluderer korneal transplantasjon, herpetisk keratitt, luetisk keratitt, pterygium, neovaskulær pannus forbundet med anvendelse av
kontaktlinser og lignende. Ytterligere øyesykdommer inkluderer også diabetisk retinopati (DR), aldersrelatert makular degenerering (ARMD), antatt okular histoplasmose (POHS), retinopati ved for tidlig fødsel (ROP) og neovaskulært glaukom og lignende. Selv om inhibering av angiogenese i disse sykdommer ikke nødvendigvis ville helbrede den underliggende sykdom, ville det betydelig redusere den visuelle sykelighet forbundet med sykdommene. 90 % av de 300 000 personer som har hatt diabetes i mer enn 25 år, vil f.eks. ha en eller annen form for DR som er en retinasykdom, kjennetegnet ved lekkende og/eller prolifererende blodkar. 30 % av disse pasienter vil i realiteten ha den sistnevnte tilstand som kan lindres. For ARDM vil 25 % av populasjonen over 65 år, ca. 630 000, ha en eller annen form for sykdommen og med en forventning at i år 203 0 vil over 6,3 millioner individer ha ARDM.
Fremgangsmåter som inhiberer angiogenese i et sykdomsrammet vev, reduserer således symptomene på sykdommen og, avhengig av sykdommen, kan bidra til å helbrede sykdommen. I én utførelsesform angår oppfinnelsen inhibering av angiogenese per se i et vev. Graden av angiogenese i et vev, og derfor graden av inhibering oppnådd ved hjelp av de foreliggende fremgangsmåter, kan evalueres på mange forskjellige måter, slik som beskrevet i eksemplene, for påvisning av o-vps-immun-positive, tilblivende og umodne blodårestrukturer ved hjelp av immunhistokj emi.
Som beskrevet heri, kan ethvert av mange forskjellige vev eller organer som består av organiserte vev, understøtte angiogenese ved sykdomstilstander, inkludert hud, muskel, tarm, bindevev, ledd, ben og lignende vev som blodkar kan trenge inn i ved angiogene stimuleringer.
Under fysiologiske betingelser er angiogenese sterkt regulert og, som tidligere publisert av Brooks et al., Science, 264:569-5761 (1994), er vist å bli aktivert av spesifikke angiogene molekyler, slik som basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF). Negative regulatorer av angiogenese er også beskrevet. Angiogenese blir således regulert ved en intrikat balanse mellom lokale stimulatorer og inhibitorer, se
D'Amore, Investigative Ophthal. Visual Sei., 35:3974-3979
(1994) .
Når den fysiologiske balanse mellom angiogene stimulatorer og inhibitorer som strengt kontrollerer de vanligvis hvilende kapillærblodkar blir forstyrret, hvilket forekommer ved visse sykdomstilstander, induseres kapillære endotelceller til å proliferere, vandre og til sist differensiere for å danne nye blodkar.
Angiogenese er kjennetegnet som en kaskade av begivenheter med et sett av tidlige begivenheter, etterfulgt av et sett av sene begivenheter, som beskrevet av Leibovich, "Role of Cytokines in the Process of Tumor Angiogenesis", i "Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapy", red. Aggarwal og Puri, kapittel 35, Blackwell Science, Inc. (1995). De tidlige begivenheter forutgås av utlevering av angiogene vekstfaktorer og cytokiner avlevert fra en ekstravaskulær kilde. De tidlige begivenheter fortsetter deretter i mikro-blodkarene som mål med ødeleggelse av intercellulære forbindelser, induksjon av ekspresjon av endotelcelleaktiverings-antigener og en proteolytisk fenotype, og initiering av endo-telcellemigrasjon på en retningsstyrt måte. De sene begivenheter er kjennetegnet ved autokrin og parakrin ekspresjon av vekstfaktor og cytokingener i cellene, endotelceller, peri-cytter og glatte muskelceller i den utviklende kapi1lærknopp. Disse celler modulerer i sin tur interaksjonene mellom cellene og den ekstracellulære matriks, hvilket resulterer i dannelse av nye funksjonelle kapillærløkker fra eksisterende modne blodkar.
Som diskutert heri og i kapitlet Bakgrunn, beskriver rapporter i litteraturen en forbindelse mellom tilsynekomsten av vekstfaktorer, inkludert dem som er forbundet med en økning av o-vpVekspresjon, nemlig VEGF, TGF-a og EGF, med utvidelse av en tumormasse og inntreden av angiogenese ved proliferative neovaskulære øyesykdommer, både hos mennesker og forsøksdyr.
VEGF, EGF, TGF-a, blant mange andre, betraktes således som vekstfaktorer som er kjennetegnet ved sine egenskaper for stimulering av cellevekst. Vekstfaktorer er proteiner som utskilles av én celle som virker på den utskil-lende celle eller en annen celle. Deres virkningsevne er avhengig av tilstedeværelsen av vekstfaktorreseptorer som vanligvis er transmembranproteiner. Vekstfaktorer, slik som VEGF, refereres også generelt til som cytokiner som defineres som polypeptidhormoner, utskilt av én celle, som påvirker vekst og metabolisme av enten den samme celle (autokrin) eller en annen celle (parakrin). Betegnelsen cytokin er ikke begrenset til molekyler produsert av celler i immunsystemet og de biologiske responsmodifiserende molekyler i det samme system. Betegnelsen cytokin er således en bred kategori fra hvilken én underkategori basert på typen av biologisk respons er stimu-latoriske vekstfaktorer eller enhancere, slik som VEGF, bFGF, EGF, TGF-a og lignende. For en oversikt, se Aggarwal et al., "Common and Uncommon Features of Cytokines and Cytokine Recep-tors: An Overview", i "Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapy", red. Aggarwal og Puri, kapittel 1, Blackwell Science, Inc. (1995).
Ved foreliggende oppfinnelse betraktes avJ35-spesifikke antagonister, og ikke vekstfaktorantagonister, slik som antistoffer mot VEGF, for anvendelse ved inhibering av angiogenese i et vev. I foretrukne utførelses former er avPs-antagonistene beskrevet heri anvendelige for inhibering av vekstfaktorindusert angiogenese, hvori ekspresjon av avp5-integrin-reseptoren induseres. Foretrukne vekstfaktorer i denne sammenheng inkluderer VEGF, EGF, TGF-a og lignende.
Som diskutert i kapitlet Bakgrunn, er vekstfaktorene EGF og VEGF begge kjent for å bindes til deres cellulære reseptorer som virker som tyrosinkinaser. Aktivering av EGF-reseptoren er dessuten vist å ha sammenheng med aktivering av proteinkinase C, som resulterer i aktivering av avJ3s for å tillate vandring av spesifikke celler på et vitronektinsubstrat. Virkningsmekanismen mellom utsettelse for cytokiner eller vekstfaktorer og den koordinerte respons ved integrin-ekspresjon eller aktivering er således en kompleks biologisk prosess. Som vist ved foreliggende oppfinnelse (se eksempel 6A), fører behandling av vev i enten kaninøyemodellen eller kyllingkorioallantoinmodellen med cytokinet VEGF til den avPs-potensierte angiogenese som er avhengig av aktivering av
proteinkinase C.
I en spesielt foretrukket utførelsesform er det beskrevet anvendelse av avPs-antagonister for inhibering av angiogenese i ethvert vev hvori angiogenese er blitt innført ved hjelp av VEGF. Iskemi i retina i forskjellige dyremodell-systemer er f.eks. vist å resultere i oppregulering av VEGF som utskilles fra Muller-celler, der produksjonen av VEGF følgelig induserer neovaskularisering av vev i øyet, se Miller et al., Am. J. Path., 145:574-584 (1994), og Pierce et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 92:905-909 (1995).
Ved foreliggende oppfinnelse er således et vev som skal behandles, et retinavev fra en pasient med diabetisk retinopati, makular degenerering, neovaskulært glaukom eller lignende sykdommer, som diskutert ovenfor, og angiogenesen som skal inhiberes, er retinavevsangiogenese hvor det foregår neovaskularisering av retinavev. Eksempler på vev, inkludert kornealvev, fra pasienter med okulare neovaskulariserings-tilstander eller sykdommer er beskrevet ovenfor og i eksemplene. Et eksempel på et modellsystem for bestemmelse av effektene av en avp5-antagonist ifølge foreliggende oppfinnelse for behandling av retinaangiogenese er musemodellen for retina-neovaskularisering, som beskrevet i eksempel 9.
I en annen beslektet utførelsesform er et vev som skal behandles, et inflammert vev, og angiogenesen som skal inhiberes, er inflammert vevsangiogenese hvor det foregår neovaskularisering av inflammert vev. I denne klasse omfatter fremgangsmåten inhibering av angiogenese i artritisk vev, slik som hos en pasient med kronisk artikulær reumatisme, i immun-eller ikke-immuninflammert vev, i psoriatisk vev og lignende.
Cytokinene, interleukin 1 og tumornekrosefaktor-a, antas å være forbundet med reumatoid artritt på grunn av deres direkte rolle ved leddestruksjoner basert på induksjon av adhesjonsmolekylekspresjon på endotelceller og på enzym-frigivelse, se Arend et al., Arthritis & Rheumatism, 38:151-160 (1995). Terapeutiske regimer er blitt foreslått både for blokkering av cytokinene med cytokinspesifikke inhibitorer så vel som målcelleadhesjonsmolekyler som uttrykkes ved til-standen, se Haskard et al., Cell Adhesion Comm., 2:235-238
(1994) .
Inhibering av angiogenese ved artritiske tilstander ved å rette og dirigere terapien mot involvering av avfi5-adhesjonsmolekylet, er således en annen foretrukket ut-førelses form av oppfinnelsen.
I en ytterligere beslektet utførelsesform er et vev som skal behandles, et tumorvev fra en pasient med en fast tumor, metastaser, en hudcancer, en brystcancer, et hemangiom eller angiofibrom og en lignende cancer, og angiogenesen som skal inhiberes, er tumorvevsangiogenese hvor det foregår neovaskularisering av et tumorvev. Typiske faste tumorvev som kan behandles ved hjelp av de foreliggende fremgangsmåter, inkluderer lungevev, pankreasvev, brystvev, tykktarmsvev, laryngialvev, ovarievev og lignende vev.
Rollen til det komplekse cytokinnettverk som eksisterer i faste humane tumorer, er emnet for en oversikt av Leek et al., J. Leukocyte Biol., 56:423-435 (1994), som er inkorporert heri ved referanse. Et antall cytokiner inkludert VEGF, sur så vel som basisk FGF (bFGF), TGF-a og -p, EGF, TNF-a, blodplateavledet endotelcellevekstfaktor, angiogenin, interferoner a og y, interleukiner 1, 6 og 8 og lignende, antas å påvirke forskjellige cellemekanismer ved angiogenese i maligne vev og cellelinjer. I tillegg til dens lokalisering i forskjellige typer tumorer er f.eks. VEGF nylig vist å være bundet til angiogenese i brystkarsinom, som beskrevet av Brown et al., Human Path., 26:86-91 (1995).
Tumorer som utskiller forskjellige cytokiner og derved induserer lokalisert angiogenese som respons ved foreliggende oppfinnelse, spesielt med cytokinene VEGF, TGF-a og EGF og den resulterende avPs-formidlede angiogenese, kan identifiseres ved å screene tumorvevsprøver med anticytokin-antistoffer. Slike metoder er kjente for en vanlig fagperson for enten dyrkede tumorvevsprøver eller biopsiprøver av tumorvev. Antistoffer mot de ovenfor beskrevne cytokiner er kommersielt tilgjengelige fra Oncogene Sciences (Uniondale, NY) eller Upstate Biotech Incorporated (Lake Placid, NY). Screeningen av utvalgte tumorvev ved hjelp av disse metoder tillater derved bestemmelse av potensialet for angiogenese-inhibitorisk aktivitet ved hjelp av dvfis-antagonistene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Eksempler på tumorvevsangiogenese og inhibering derav er beskrevet i eksemplene.
Inhibering av tumorvevsangiogenese er fremdeles en annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen på grunn av den viktige rolle som neovaskularisering spiller ved tumorvekst. I fravær av neovaskularisering av tumorvev får ikke tumorvevet de nødvendige næringsstoffer, veksten blir lang-sommere, ytterligere vekst stanser, går tilbake, og vevet blir til sist nekrotisk, hvilket fører til at tumoren dør.
Fremgangsmåtene er også spesielt effektive mot dannelse av metastaser, fordi (1) deres dannelse fordrer vaskularisering av en primær tumor, slik at de metastatiske cancerceller kan komme ut fra den primære tumor, og (2) deres etablering i et sekundært sete som fordrer neovaskularisering for å understøtte vekst av metastasene.
Administreringen av angiogeneseinhibitor utføres typisk under eller etter kjemoterapi, selv om det er foretrukket å inhibere angiogenese etter et regime med kjemoterapi på tidspunkter hvor tumorvevet vil reagere på det toksiske angrep ved å indusere angiogenese for å restituere seg ved tilveiebringelse av en blodtilførsel og næringsmidler til tumorvevet. Det er dessuten foretrukket å administrere angiogeneseinhiberingsfremgangsmåtene etter kirurgi, hvor de faste tumorer er blitt fjernet som en profylakse mot metastaser.
Så lenge som de foreliggende fremgangsmåter kan anvendes for å inhibere tumorneovaskularisering, kan fremgangsmåtene også anvendes for inhibering av tumorvevsvekst, for inhibering av tumormetastasedannelse og for regresjon av etablerte tumorer. Med hensyn til det sistnevnte blir minskingen av en tumormasse evaluert i kaninøyeanalyse-modellen, som beskrevet for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse, eller med et modellsystem av en kimær mus:human modell hvori huden fra en mus som har alvorlig kombinert immunsvikt (SCID), erstattes med human neonatal forhud, som beskrevet av Yan et al., J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993), som er inkorporert heri ved referanse. Den sistnevnte modell representerer en ytterligere in vivo-modell for å undersøke angiogenese og inhibering av denne ved hjelp av fremgangsmåtene. Eksempler på resultater med kanintumormodellen og en civfSs-antagonist ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i eksemplene 5C og 6D, mens resultater for inhibering av angiogenese i SCTD-musemodellen er beskrevet i eksempel 8.
Restenose er en prosess med migrasjon og prolifera-sjon av glatte muskelceller (SMC) på stedet for perkutan, transluminal koronarangioplasti, som hindrer det vellykkede resultat av angioplasti. For inhibering av restenose blir avPs~ antagonisten typisk administrert etter angioplastiprosedyren i fra ca. 2 til 28 dager, og mer typisk i ca. de første 14 dager etter prosedyren.
Pasienten som behandles ifølge de mange utførelses-former av foreliggende oppfinnelse, er fortrinnsvis en human-pasient, selv om det er underforstått at prinsippene ved oppfinnelsen indikerer at oppfinnelsen er effektiv med hensyn til alle pattedyr som er tilsiktet.inkludert i betegnelsen "pasient". I denne sammenheng er et pattedyr underforstått å inkludere enhver pattedyrart, spesielt landbruksdyr og husdyr, hvor behandling av sykdommer søkes med hensyn til fremgangsmåtene .
Doseområdene for administrering av avfS5-antagonisten avhenger av antagonistens form og potens, som beskrevet ytterligere heri, og er mengder som er store nok til å produsere den ønskede effekt, hvor angiogenese og sykdomssymptomene formidlet av angiogenese forbedres. Dosen bør ikke være så stor at den forårsaker uønskede bivirkninger, slik som hypervisko-sitetssyndromer, lungeødem, kongestiv hjertesvikt og lignende. Dosen vil generelt variere med alder, tilstand, kjønn og syk-domsgrad hos pasienten, og kan bestemmes av en fagperson. Dosen kan også justeres av den individuelle lege i tilfelle av kompiikasj oner.
En avJ35-antagonist er et molekyl som blokkerer eller inhiberer den fysiologiske eller farmakologiske aktivitet av avJ3s ved å inhibere bindingsaktiviteten av reseptoren til dens ligand, nemlig vitronektin. Foretrukne avp5-antagonister kan enten være et monoklonalt antistoff, et peptid eller et organisk basert molekyl som er en etterligning av en avPs-1igand.
En terapeutisk effektiv mengde er en mengde av avPs-antagonist tilstrekkelig til å produsere en målbar inhibering av angiogenese i vevet som behandles, dvs. en angiogenese-inhiberende mengde. Inhibering av angiogenese kan måles in situ ved hjelp av immunhistokjemi, som beskrevet heri, eller ved hjelp av enhver annen metode kjent for fagfolk.
Så lenge som en avPs-antagonist kan innta formen av en organisk etterligning av en avps-ligand, et RGD-inneholdende peptid, et anti-avfJs-monoklonalt antistoff eller fragmenter derav, eller en avPs-reseptoretterligning, er det underforstått at potensen, og derfor en ekspresjon av en "terapeutisk effektiv" mengde, kan variere. Som vist ved hjelp av de foreliggende analysemetoder, kan imidlertid en fagperson lett vurdere potensen av en kandidat-avps-antagonist ifølge foreliggende oppfinnelse.
Potensen av en avPs-antagonist kan måles på mange forskjellige måter, inkludert inhibering av angiogenese i CAM-analysen, i in vivo-kaninøyeanalysen og ved å måle inhibering av binding av naturlig ligand til av£J5, alle som beskrevet heri, og lignende analyser.
En foretrukket avPs-antagonist har evnen til i betydelig grad å inhibere binding av en naturlig ligand, slik som vitronektin, til avfJ5 i løsning ved antagonistkonsentra-sjoner på mindre enn 0,5 mikromolar (uM) , fortrinnsvis mindre enn 0,1 uM, mer foretrukket mindre enn 0,05 uM. Med "vesentlig" er det ment at en minst 50 % reduksjon av binding av vitronektin observeres ved inhibering i nærvær av avPs-antagonisten, og 50 % inhibering er referert til heri som en IC50-verdi.
En mer foretrukket avp5-antagonist oppviser selektivitet for dvps fremfor andre integriner. En foretrukket av$ 5-antagonist inhiberer således vesentlig vitronektinbinding til avp5, men inhiberer ikke vesentlig binding av vitronektin til et annet integrin, slik som avPi, avP3 eller auBpV Spesielt foretrukket er en avps-antagonist som oppviser 10-100 ganger lavere IC50-aktivitet for inhibering av vitronektinbinding til dvPs/ sammenlignet med IC50- aktivi teten for inhibering av vitronektinbinding til et annet integrin. Eksempler på analyser for måling av ICSo-aktivitet for inhibering av vitronektinbinding til et integrin er beskrevet i eksemplene.
En terapeutisk effektiv mengde av en avps-antagonist ifølge foreliggende oppfinnelse i form av et monoklonalt antistoff er typisk en mengde som, når den administreres i et fysiologisk tolererbart preparat, er tilstrekkelig til å oppnå en plasmakonsentrasjon fra ca. 0,01 mikrogram (ug) pr. milliliter (ml) til ca. 100 ug/ml, fortrinnsvis fra ca. 1 ug/ml til ca. 5 ug/ml, og vanligvis ca. 5 ug/ml. Sagt på en annen måte kan doseringen variere fra ca. 0,1 mg/kg til ca. 300 mg/kg, fortrinnsvis fra ca. 0,2 mg/kg til ca. 200 mg/kg, mest foretrukket fra ca. 0,5 mg/kg til ca. 20 mg/kg, i én eller flere doseadministreringer daglig, i én eller flere dager.
Når antagonisten foreligger i form av et fragment av et monoklonalt antistoff, kan mengden lett justeres, basert på massen av fragmentet i forhold til massen av hele antistoffet. En foretrukket plasmakonsentrasjon i molaritet er fra ca. 2 mikromolar (uM) til ca. 5 millimolar (mM), fortrinnsvis fra ca. 100 uM til 1 mM antistoffantagonist.
En terapeutisk effektiv mengde av en avPs-antagonist ifølge oppfinnelsen i form av et polypeptid, eller et annet O-vPs-ligandet ter lignende lite molekyl med lignende størrelse, er typisk en mengde polypeptid, slik at når den administreres i et fysiologisk tolererbart preparat, er tilstrekkelig til å oppnå en plasmakonsentrasjon fra ca. 0,1 mikrogram (ug) pr. milliliter (ml) til ca. 200 ug/ml, fortrinnsvis fra ca. 1 ug/ml til ca. 150 ug/ml. Basert på et polypeptid med en masse på ca. 500 g pr. mol er den foretrukne plasmakonsentrasjon i molaritet fra ca. 2 mikromolar (uM) til ca. 5 millimolar (mM), fortrinnsvis fra ca. 100 uM til 1 mM polypeptid-antagonist. Sagt på en annen måte kan doseringen pr. kropps-vekt variere fra ca. 0,1 mg/kg til ca. 300 mg/kg, fortrinnsvis fra ca. 0,2 mg/kg til ca. 200 mg/kg, i én eller flere doseadministreringer daglig i én eller flere dager.
De monoklonale antistoffer, polypeptider eller organiske etterligninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres parenteralt ved injeksjon eller ved gradvis infusjon over tid'. Selv om vevet som skal behandles typisk kan innføres i kroppen ved hjelp av systemisk administrering, og derfor oftest behandles ved intravenøs administrering av terapeutiske preparater, kan det tenkes andre vev og utleverings-metoder hvor det er sannsynlig at det målrettede vev inneholder målmolekylet. Monoklonale antistoffer, polypeptider eller organiske etterligninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan således administreres intraokulart, intravenøst, intraperitonealt, intramuskulært, subkutant, intrakavitalt, trans-dermalt, og kan også utleveres ved hjelp av peristaltiske metoder.
De terapeutiske preparater som inneholder en avp5-antagonist ifølge foreliggende oppfinnelse, blir konvensjonelt administrert intravenøst, slik som f.eks. ved injeksjon av en enhetsdose. Betegnelsen "enhetsdose" anvendt som referanse til et terapeutisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse, refererer til fysisk atskilte enheter som er egnet som enhetsdose for individet, idet hver enhet inneholder en forutbestemt mengde aktivt materiale beregnet til å produsere den ønskede terapeutiske effekt i forbindelse med det nødvendige for-tynningsmiddel, dvs. bærer eller vehikkel.
I én foretrukket utførelsesform, som vist i eksemplene, administreres avPs-antagonisten intravenøst i en enkelt dose.
Preparatene administreres på en måte som er forenlig med doseformuleringen, og i en terapeutisk effektiv mengde. Mengden som skal administreres og tidsbestemmelsen for administrering avhenger av individet som skal behandles, kapasiteten av individets system til å utnytte den aktive bestanddel og graden av den ønskede terapeutiske effekt. Nøyaktige mengder aktiv bestanddel som skal administreres, avhenger av den praktiserende leges skjønn og er spesiell for hvert individ. Egnede doseringsområder for systemisk administrering er imidlertid beskrevet heri og avhenger av administreringsmåten. Egnede regimer for administrering er også variable, men kan typisk beskrives som en innledende administrering, etterfulgt av gjentatte doser, med én eller flere timers mellomrom, av en etterfølgende injeksjon eller en annen administrering. Alter-nativt kan det anvendes kontinuerlig intravenøs infusjon som er tilstrekkelig til å opprettholde konsentrasjoner i blodet i de områder som er spesifisert for in vivo-terapier.
D. Terapeutiske preparater
Som anvendt heri, anvendes betegnelsene "farmasøytisk akseptabel", "fysiologisk tolererbar" og grammatikalske varia-sjoner derav, når de refererer til preparater, bærere, for-tynningsmidler og reagenser, om hverandre og angir at materialene er i stand til å administreres til eller på et pattedyr uten produksjon av uønskede fysiologiske effekter, slik som kvalme, svimmelhet, magebesvær og lignende.
Fremstillingen av et farmasøytisk preparat som inneholder aktive bestanddeler oppløst eller dispergert deri, er meget kjent i teknikken og behøver ikke begrenses basert på formulering. Slike preparater fremstilles typisk som injiser-: bare, enten som flytende løsninger eller suspensjoner, men faste former egnet for oppløsning eller suspensjon i en væske før anvendelse kan også prepareres. Preparatet kan også emul-geres .
Den aktive bestanddel kan blandes med eksipienser som er farmasøytisk akseptable og forenlige med den aktive bestanddel, og' i mengder som er egnet for anvendelse i de terapeutiske metoder beskrevet heri. Egnede eksipienser er f.eks. vann, saltvann, dekstrose, glyserol, etanol eller lignende, og kombinasjoner derav. Preparatet kan dessuten, hvis ønsket, inneholde mindre mengder hjelpestoffer, slik som fuktemidler eller emulgeringsmidler, pH-bufringsmidler og lignende, som øker effektiviteten av den aktive bestanddel.
Det terapeutiske preparat kan inkludere farmasøytisk akseptable salter av komponentene deri. Farmasøytisk akseptable salter inkluderer syreaddisjonssaltene (dannet med de frie aminogrupper i polypeptidet) som dannes med uorganiske syrer, slik som f.eks. saltsyre eller fosforsyrer, eller slike organiske syrer som eddiksyre, vinsyre, mandelsyre og lignende. Salter dannet med de frie karboksylgrupper kan også avledes fra uorganiske baser, slik som f.eks. natrium-, kalium-, ammonium-, kalsium- eller jern(III)-hydroksider, og slike organiske baser som isopropylamin, trimetylamin, 2-etylaminoetanol, histidin, prokain og lignende.
Spesielt foretrukket er HCl-saltet når det anvendes ved fremstilling av sykliske polypeptid-avf}s-antagonister.
Fysiologisk tolererbare bærere er velkjent i teknikken. Eksempler på flytende bærere er sterile, vandige løsninger som ikke inneholder noen materialer i tillegg til de aktive bestanddeler og vann, eller som inneholder en buffer som natriumfosfat ved fysiologisk pH-verdi, fysiologisk saltvann eller begge, slik som fosfatbufret saltvann. Vandige bærere kan dessuten inneholde flere enn ett buffersalt, så vel som salter som natrium- og kaliumklorider, dekstrose, polyetylenglykol og andre oppløste materialer.
Flytende preparater kan også inneholde væskefaser i tillegg til og for å utelukke vann. Eksempler på slike ytterligere væskefaser er glyserol, vegetabilske oljer som bomulls-frøolje, og vann-oljeemulsjoner..- ■
Et terapeutisk preparat inneholder en angiogenese-inhiberende mengde av en avps-antagonist ifølge foreliggende oppfinnelse, typisk formulert for å inneholder en mengde på minst 0,1 vekt% antagonist pr. vekt av det totale terapeutiske preparat. En vektprosent er et vektforhold mellom inhibitor og totalt preparat. 0,1 vekt% er således f.eks. 0,1 g inhibitor pr. 100 g totalt preparat.
E. Antagonister av integrin- ciyPs
av{35-antagonister anvendes for inhibering av angiogenese i vev, og kan innta mange forskjellige former som inkluderer forbindelser som reagerer med av{3s på en måte slik at funksjonelle inter-
aksjoner med de naturlige o-vps-ligander forstyrres. Eksempler på antagonister inkluderer analoger eller etterligninger av avPs avledet fra ligandbindingssetet på avps, etterlignere av en naturlig avps som etterligner det strukturelle området involvert i avps-ligandbindingsinteraksjoner, polypeptider med en sekvens som tilsvarer et funksjonelt bindingsdomene i den
naturlige ligand som er spesifikk for avPs, spesielt som tilsvarer det RGD-inneholdende domenet i en naturlig ligand av civPsi og antistoffer som immunreagerer med enten avps eller den naturlige ligand, hvilke alle oppviser antagonistaktivitet som definert heri.
1. Polypeptider
I én utførelsesform omfatter oppfinnelsen avPs-antagonister i form av polypeptider. En polypeptid(peptid)-avp5~antagonist kan ha sekvenskarakteristika som enten den naturlige ligand av avPs eller selve avJ3s i området involvert i civps-ligandinteraksjon, og oppviser avps-antagonistaktivitet som beskrevet heri. Et foretrukket o-v<P>s-antagonistpeptid inneholder RGD-tripeptidet og tilsvarer i sekvens den naturlige ligand i det RGD-inneholdende området.
Foretrukne RGD-inneholdende polypeptider har en sekvens som tilsvarer aminosyrerestsekvensen i det RGD-inneholdende området i en naturlig ligand av avPs, slik som vitronektin, hvis sekvens er velkjent.
Et spesielt foretrukket avp5-antagonistpeptid inhiberer fortrinnsvis avp5-binding til dets naturlige ligand(er) sammenlignet med andre integriner, som beskrevet tidligere. Disse avPs-spesifikke peptider er spesielt foretrukket, i det minste fordi spesifisiteten for avP5 reduserer forekomsten av uønskede bivirkninger, slik som inhibering av andre integriner. Identifikasjonen av foretrukne avP3-anta-gonistpeptider med selektivitet for avPs kan lett identifiseres i en typisk analyse for inhibering av binding, slik som ELI SA - analysen beskrevet i eksemplene.
I én utførelsesform omfatter et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse ikke flere enn ca. 100 aminosyrerester, fortrinnsvis ikke flere enn ca. 60 rester, mer foretrukket ikke flere enn ca. 30 rester. Peptider kan være lineære eller sykliske, selv om spesielt foretrukne peptider er sykliske. Foretrukne peptider er beskrevet i eksemplene.
Det er underforstått at et aktuelt polypeptid ikke behøver å være identisk med aminosyrerestsekvensen av en avPs-naturlig ligand, så lenge som det inkluderes en sekvens som er nødvendig for å antagonisere bindingen av en avPs-ligand til avPs, og som er i stand til å funksjonere som en avPs-antagonist i en analyse, som beskrevet heri.
Et aktuelt polypeptid inkluderer enhver analog, ethvert fragment eller kjemisk derivat av et polypeptid hvis aminosyrerestsekvens er vist heri, så lenge som polypeptidet er en avp5-antagonist. Et slikt polypeptid kan derfor utsettes for forskjellige endringer, substitusjoner, innføyelser og delesjoner, når slike endringer gir visse fordeler ved anvendelse. I den henseende tilsvarer et avps-antagonistpolypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, istedenfor å være identisk med, sekvensen til et anført peptid hvor én eller flere endringer er utført, og det bibeholder evnen til å funksjonere som en avfJ5-antagonist i én eller flere av analysene, som definert heri.
Et polypeptid kan således foreligge i enhver av mange forskjellige former for peptidderivater som inkluderer amider, konjugater med proteiner, sykliserte peptider, polymeriserte peptider, analoger, fragmenter, kjemisk modifiserte peptider og lignende derivater.
Betegnelsen "analog" inkluderer ethvert polypeptid som har en aminosyrerestsekvens som er vesentlig identisk med en sekvens spesifikt vist heri, hvori én eller flere rester er konservativt erstattet med en funksjonelt lignende rest, og som utviser avps-antagonistaktiviteten som beskrevet heri. Eksempler på konservative substitusjoner inkluderer substi-tusjonen av én ikke-polar (hydrofob) rest, slik som isoleucin, valin, leucin eller metionin, med en annen, substitusjon av én polar (hydrofil) rest med en annen, slik som mellom arginin og lysin, mellom glutamin og asparagin, mellom glysin og serin, substitusjon av én basisk rest, slik som lysin, arginin eller histidin, med en annen, eller substitusjon av én sur rest, slik som asparaginsyre eller glutaminsyre, med en annen.
Betegnelsen "konservativ substitusjon" inkluderer også anvendelse av en kjemisk derivatisert rest istedenfor en ikke-derivatisert rest, forutsatt at et slikt polypeptid fremviser den nødvendige inhiberingsaktivitet.
"Kjemisk derivat" refererer til et polypeptid hvor én
eller flere rester er kjemisk derivatisert ved reaksjon av en funksjonell sidegruppe. Slike derivatiserte molekyler inkluderer f.eks. de molekyler hvor frie aminogrupper er blitt derivatisert for å danne aminhydroklorider, p-toluensulfonyl-grupper, karbobenzoksygrupper, t-butyloksykarbonylgrupper, kloracetylgrupper eller formylgrupper. Frie karboksylgrupper kan derivatiseres for å danne salter, metyl- og etylestere eller andre typer av estere eller hydrazider. Frie hydroksyl-grupper kan derivatiseres for å danne O-acyl- eller O-alkyl-derivater. Imidazolnitrogenet på histidin kan derivatiseres for å danne N-im-benzylhistidin. Også inkludert som kjemiske derivater er de peptider som inneholder ett eller flere naturlig forekommende aminosyrederivater av de 20 standard aminosyrer. 4-hydroksyprolin kan f,eks. erstatte prolin; 5-hydroks-ylysin kan f.eks. erstatte lysin; 3-metylhistidin kan erstatte histidin; homoserin kan erstatte serin; og ornitin kan erstatte lysin. Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer også ethvert polypeptid med én eller flere addi-sjoner og/eller delesjoner eller rester i forhold til sekvensen til et polypeptid, hvis sekvens er vist heri, så lenge som den nødvendige aktivitet er opprettholdt.
Betegnelsen "fragment" refererer til ethvert polypeptid med en aminosyrerestsekvens som er kortere enn sekvensen av et polypeptid hvis aminosyrerestsekvens er vist heri.
Når et polypeptid har en sekvens som ikke er identisk med sekvensen til en naturlig av$ s-ligand, er dette typisk fordi det er utført én eller flere konservative eller ikke-konservative substitusjoner, vanligvis er ikke mer enn ca. 3 0 %, og fortrinnsvis ikke mer enn 10 %, av antallet aminosyrerester substituert. Ytterligere rester kan også tilføyes ved ende av et polypeptid for formålene å tilveie-bringe en "linker" ved hvilken polypeptidene ifølge oppfinnelsen på egnet måte kan festes til en markør eller en fast matriks, eller en bærer.
Markører, faste matrikser og bærere som kan anvendes med polypeptidene, er beskrevet nedenfor.
Aminosyrerestlinkere er vanligvis minst én rest og kan være 40 eller flere rester, mer ofte 1-10 rester, men danner ikke av{Js-ligandepitoper. Typiske aminosyrerester anvendt for linking er tyrosin, cystein, lysin, glutaminsyre og asparaginsyre eller lignende. Et polypeptid kan dessuten, dersom ikke annet er angitt, være forskjellig fra den naturlige sekvens til en avp5-ligand ved at sekvensen er modifisert ved terminal NH2-acylering, f.eks. acetylering, eller tioglykol-syreamidering, ved terminal karboksylamidering, f.eks. med ammoniakk, metylamin og lignende terminale modifikasjoner. Terminale modifikasjoner anvendes, hvilket er velkjent, for å redusere mottakeligheten for proteinasespalting, og tjener derfor til å forlenge halveringstiden av polypeptidene i løsninger, spesielt biologiske fluider hvor proteaser kan være til stede. I denne henseende er polypeptidsyklisering også en anvendelig terminal modifikasjon, og er også spesielt foretrukket på grunn av de stabile strukturer som dannes ved syklisering, og i betraktning av de biologiske aktiviteter observert for slike sykliske peptider, som beskrevet heri.
Ethvert peptid kan anvendes i form av et farmasøytisk akseptabelt salt. Egnede syrer som er i stand til å danne salter med peptidene ifølge oppfinnelsen, inkluderer uorganiske syrer som trifluoreddiksyre (TFA), saltsyre (HCl), hydrogenbromid, perklorsyre, salpetersyre, tiocyansyre, svovelsyre, fosforeddiksyre, propionsyre, glykolsyre, melke-syre, pyrodruesyre, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, antranilsyre, kanelsyre, naftalensulfonsyre, sulfanilsyre eller lignende. HCl-salt er spesielt foretrukket.
Egnede baser som kan danne salter med peptidene, inkluderer uorganiske baser som natriumhydroksid, ammonium-hydroksid, kaliumhydroksid og lignende; og organiske baser som mono-, di- og trialkyl- og arylaminer (f.eks. trietylamin, diisopropylamin, metylamin, dimetylamin og lignende), og eventuelt substituerte etanolaminer {f.eks. etanolamin, dietanolamin og lignende).
Et peptid, også referert til som et aktuelt polypeptid, kan syntetiseres ved hjelp av enhver av teknikkene som er kjent for fagfolk i polypeptidteknikken, inkludert rekom-binant DNA-teknikker. Syntetiske kjemiteknikker, slik som en fastfase-Merrifield-typesyntese er foretrukket på grunn av renhet, antigenspesifisitet, mangel på uønskede biprodukter, produksjonsletthet og lignende. En utmerket oppsummering av de mange tilgjengelige teknikker kan finnes i Steward et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky et al., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, 2. utgave, 1976; J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", vol. 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-96, 1969; Fields et al., Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214, 1990; og US patentskrift nr. 4 244 946 for fastfasepeptidsyntese, og Schroder et al., "The Peptides", vol. 1, Academic Press (New York), 1965, for klassisk oppløsningssyntese, hvilke alle er inkorporert heri ved referanse. Egnede beskyttelsesgrupper anvendelige ved slike synteser er beskrevet i de ovennevnte tekster og i J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973, som er inkorporert heri ved referanse.
De aktuelle fastfasesyntesemetoder omfatter generelt sekvensiell addisjon av én eller, flere aminosyrerester eller egnet beskyttede aminosyrerester til en voksende peptidkjede. Vanligvis er enten aminogruppen eller karboksylgruppen på den første aminosyrerest beskyttet ved hjelp av en egnet beskyttelsesgruppe.som kan fjernes selektivt. En forskjellig, selektivt fjernbar beskyttelsesgruppe anvendes for aminosyrer som inneholder reaktive sidegrupper, slik som lysin.
Ved anvendelse av en fastfasesyntese som eksempel blir den beskyttede eller derivatiserte aminosyre bundet til et inert, fast støttemateriale gjennom sin ubeskyttede karbok-sylgruppe eller aminogruppe. Beskyttelsesgruppen på amino-eller karboksylgruppen fjernes deretter selektivt, og den neste aminosyre i sekvensen som har den komplementære (amino-eller karboksyl)gruppe egnet beskyttet, blandes og reageres under betingelser som er egnet for dannelse av amidbindingen med resten som allerede er bundet til det faste støtte-materialet. Beskyttelsesgruppen på amino- eller karboksylgruppen fjernes deretter fra denne nytilsatte aminosyrerest, og den neste aminosyre (egnet beskyttet) tilføyes deretter, osv. Etter at alle de ønskede aminosyrer er blitt bundet i riktig rekkefølge, fjernes alle resterende terminal- og side-beskyttende grupper (og faste støttematerialer) sekvensielt eller samtidig, for å danne det ferdige lineære polypeptid.
De resulterende lineære polypeptider, fremstilt f.eks. som beskrevet ovenfor, kan omsettes for å danne de tilsvarende sykliske peptider. Et eksempel på en metode for syklisering av peptider er beskrevet av Zimmer et al., Peptides, 1992, s. 393-394, ESCOM Science Publishers, B.V., 1993. Tert.-butoksykarbonylbeskyttet peptidmetylester oppløses typisk i metanol, natriumhydroksidløsning tilsettes, og blandingen omsettes ved 20 °C for å fjerne metylesterbeskyt-telsesgruppen hydrolytisk. Etter fordamping av løsningsmidlet blir det tert.-butoksykarbonylbeskyttede peptid ekstrahert med etylacetat fra et surgjort, vandig løsningsmiddel. Tert.-butoksykarbonylbeskyttelsesgruppen fjernes deretter under mildt sure betingelser i dioksan som koløsningsmiddel. Det således oppnådde ubeskyttede lineære peptid med frie amino- og karboksyterminaler omdannes til det tilsvarende sykliske peptid ved å omsette en fortynnet løsning av det lineære peptid, i en blanding av diklormetan og dimetylformamid, med disykloheksylkarbodiimid i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol og N-metylmorfolin. Det resulterende sykliske peptid renses deretter ved kromatografi.
En spesielt foretrukket syntesemetode for syklisk peptid er beskrevet av Gurrath et al., Eur. J. Biochem., 210:911-921 (1992), og beskrevet i eksemplene. Spesielt foretrukne peptider for anvendelse i de foreliggende metoder i vev som primært oppviser avps-assosiert angiogenese, er beskrevet i eksemplene og inkluderer polypeptidene som er vist i SEKV.ID. NR. 4, 6, 7, 8 og 9.
2. Monoklonale antistoffer
Foreliggende oppfinnelse beskriver i én utførelses-form avPs-antagonister i form av monoklonale antistoffer som immunreagerer med avf3s og inhiberer avPs-binding til dets naturlige ligand, som beskrevet heri. Oppfinnelsen beskriver også cellelinjer som produserer antistoffene, fremgangsmåter for fremstilling av cellelinjene og fremgangsmåter for frem-
stilling av de monoklonale antistoffer.
Et monoklonalt antistoff omfatter antistoffmolekyler som 1) immunreagerer med isolert av$ s, og 2) inhiberer vitronektinbinding til avPs. Foretrukne monoklonale antistoffer som fortrinnsvis bindes til avPs, inkluderer et monoklonalt antistoff som har de samme immunreaksjonskarakteristika som mAb P1F6 og mAb P5H9, som er beskrevet i eksemplene.
Betegnelsen "antistoff eller antistoffmolekyl" i de forskjellige grammatikalske former anvendes heri som en
kollektiv betegnelse som refererer til en populasjon av immunglobulinmolekyler og/eller immunologisk aktive deler av immunglobulinmolekyler, dvs. molekyler som inneholder et antistoffkombinasjonssete eller en paratop.
Et "antistoffkombinasjonssete" er den strukturelle del av et antistoffmolekyl som består av tungkjedete og lett-kjedete variable og hypervariable områder som spesifikt binder antigen.
Eksempler på antistoffer for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse er intakte immunglobulinmolekyler, vesentlig intakte immunglobulinmolekyler og de deler av et immunglobu-linmolekyl som inneholder paratopen, inkludert de deler kjent i teknikken som Fab, Fab', F(ab')2 og F(v), og også referert til som antistoffragmenter.
Fab-fragmentet, som mangler Fc-reseptoren, er opp-løselig og gir terapeutiske fordeler uttrykt ved halveringstid i serum, og diagnostiske fordeler uttrykt ved måter for å anvende det oppløselige Fab-fragment. Fremstillingen av et oppløselig Fab-fragment er vanligvis kjent i immunologiteknik-ken og kan oppnås ved hjelp av mange forskjellige metoder.
Fab- og F (ab1)2-deler (fragmenter) av antistoffer fremstilles f.eks. ved proteolytisk reaksjon av henholdsvis papain og pepsin, med vesentlig intakte antistoffer ved hjelp av velkjente metoder, se f.eks. US patentskrift nr. 4 342 566, av Theofilopolous og Dixon. Fab'-antistoffdeler er også velkjente og produseres fra F (ab') 2-deler, etterfulgt av reduksjon av disulfidbindingene som sammenknytter de to tungkjedete
deler, slik som med merkaptoetanol, og etterfulgt av alky-lering av det resulterende proteinmerkaptan med et reagens,
slik som jodacetamid. Et antistoff inneholdende intakte immunglobulinmolekyler er foretrukket og anvendes som illustrerende heri.
Betegnelsen "monoklonalt antistoff" i dens forskjellige grammatikalske former refererer til en populasjon av antistoffmolekyler som kun inneholder én type antistoffkombinasjonssete som er i stand til å immunreagere med en spesiell epitop. Et monoklonalt antistoff fremviser således typisk en enkelt bindingsaffinitet for enhver epitop som det immunreagerer med. Et monoklonalt antistoff kan derfor inneholde et antistoffmolekyl med et stort antall antistoffkombinasjons-seter, hvor hvert sete er immunspesifikt for en forskjellig epitop, f.eks. et bispesifikt monoklonalt antistoff.
Et monoklonalt antistoff er typisk sammensatt av antistoffer produsert av kloner fra en enkelt celle betegnet en hybridom, som kun utskiller (produserer) én type antistoffmolekyl. Hybridomcellen dannes ved fusjon av en antistoff-produserende celle og et myelom eller en annen selvbevarende cellelinje. Fremstillingen av slike antistoffer ble først beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 56:495-497 (1975), som er inkorporert heri ved referanse. Ytterligere metoder er beskrevet av Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technigues, CRC Press, Inc. (1987). De således preparerte hybridomsupernatanter kan deretter screenes for tilstedeværelse av antistoffmolekyler som immunreagerer med avps, og for inhibering av avps-binding til naturlige ligander.
For å danne hybridomet fra hvilken det monoklonale antistoffpreparat produseres, blir kort beskrevet et myelom eller en annen selvbevarende cellelinje fusjonert med lymfo-cytter erholdt fra milten hos et pattedyr som er hyperimmuni-sert med en kilde for avp5.
Det er foretrukket at den anvendte myelomcellelinjen for å fremstille en hybridom er fra den samme art som lymfo-cyttene. En mus av stammen 12 9-G1X+ er typisk det foretrukne pattedyr. Egnede musemyelomer for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse inkluderer de hypoksantin-aminopterin-tymidin-sensitive (HAT) cellelinjer P3X63-Ag8.653 og Sp2/0-Agl4, som er tilgjengelige fra American Type Culture Collection, Rock-ville, MD, under henholdsvis under betegnelse CRL 1580 og CRL 1581.
Splenocytter blir typisk fusjonert med myelomcelle-linjer ved anvendelse av polyetylenglykol (PEG) 1500. Fusjo-nerte hybrider utvelges ved hjelp av deres sensitivitet overfor HAT. Hybridomer som produserer et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, identifiseres ved anvendelse av enzymbundet immunsorbentanalyse (ELISA), og en variasjon av denne er beskrevet i eksemplene.
Et monoklonalt antistoff kan også produseres ved å initiere en monoklonal hybridomkultur, som omfatter et næringsmedium som inneholder en hybridom som utskiller antistoffmolekyler med den egnede spesifisitet. Kulturen opprettholdes under betingelser og i et tidsrom som er tilstrekkelig til at hybridomet utskiller antistoffmolekylene i mediet. Det antistoffinneholdende medium oppsamles deretter. Antistoffmolekylene kan deretter isoleres ved hjelp av velkjente teknikker.
Medier anvendelige for fremstilling av disse preparater er både velkjente i teknikken og kommersielt tilgjengelige, og inkluderer syntetiske kulturmedier, innavlede mus og lignende. Et eksempel på et syntetisk medium er Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396, 1959), supplert med 4,5 g/l glukose, 20 mM glutamin og 20 % kalvefosterserum. Et eksempel på en innavlet musestamme er Balb/c.
Andre metoder for fremstilling av et monoklonalt antistoff, en hybridomcelle eller en hybridomcellekultur er også velkjente, se f.eks. metoden for isolering av monoklonale antistoffer fra et immunologisk repertoar, som beskrevet av Sastry et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:5728-5732
(1989); og Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989).
Det er også mulig å bestemme, uten unødvendig eks-perimentering, hvorvidt et monoklonalt antistoff har den samme (dvs. ekvivalente) spesifisitet (immunreaksjonskarakteristika) som et monoklonalt antistoff ved å undersøke hvorvidt det førstnevnte forhindrer at det sistnevnte bindes til et forhåndsutvalgt målmolekyl. Dersom det monoklonale antistoff som testes konkurrerer med det monoklonale antistoff, som vist ved en reduksjon av binding av det monoklonale antistoff i standard kompetitive analyser for binding til målmolekylet når det er til stede i den faste fase, er det sannsynlig at de to monoklonale antistoffer bindes til den samme, eller en nært beslektet, epitop.
En ytterligere måte for å bestemme hvorvidt et monoklonalt antistoff har den samme spesifisitet som et monoklonalt antistoff, er å preinkubere det monoklonale antistoff med det målmolekyl som det vanligvis er reaktivt med, og deretter tilsette det monoklonale antistoff under test for å bestemme dette monoklonale antistoff inhiberes med hensyn til dets evne til å binde målmolekylet. Dersom det monoklonale antistoff som testes blir inhibert, har det med all sannsyn-lighet den samme, eller funksjonelt ekvivalente, epitope spesifisitet som det monoklonale antistoff.
En ytterligere for å bestemme hvorvidt et monoklonalt antistoff har den samme spesifisitet som et monoklonalt antistoff, er å bestemme aminosyrerestsekvensen til CDR-områdene av de aktuelle antistoffer. Antistoffmolekyler med identiske eller funksjonelt ekvivalente aminosyrerestsekvenser i CDR-områdene har den samme bindingsspesifisitet. Metoder for sekvensering av polypeptider er velkjente i teknikken.
Immunspesifisiteten av et antistoff, dets målmolekyl-bindingskapasitet og den ledsagende affinitet som antistoffet oppviser for epitopen, er definert av epitopen som antistoffet immunreagerer med. Epitopspesifisiteten er i det minste delvis definert ved aminosyrerestsekvensen i det variable området i den tunge kjede i immunglobulinet, antistoffet og delvis av aminosyrerestsekvensen i lettkjedens variable område.
Anvendelse av betegnelsen "med samme bindingsspesifisitet som" indikerer at ekvivalente monoklonale antistoffer oppviser de samme eller lignende immunreaksjons(bindings)-karakteristika og konkurrerer med hensyn til binding til et forhåndsutvalgt målmolekyl.
Humaniserte, monoklonale antistoffer gir spesielle fordeler i forhold til musemonoklonale antistoffer, spesielt så lenge de kan anvendes terapeutisk i mennesker. Spesielt blir humane antistoffer ikke fjernet fra sirkulasjonen så hurtig som "fremmede" antigener. Humane antistoffer aktiverer dessuten ikke immunsystemet på samme måte som fremmede antigener og fremmede antistoffer. Fremgangsmåter for fremstilling av "humaniserte" antistoffer er generelt velkjente i teknikken og kan lett anvendes på antistoffene.
3 . Qv{ 35- spesif ikke etterligninger
Foreliggende oppfinnelse demonstrerer at avPs-antagonister kan anvendes generelt ved oppfinnelsen, og antagonistene kan inkludere polypeptider, antistoffer og andre molekyler, betegnet "etterligninger", som har evnen til å forstyrre avPs-funksjon. Spesielt foretrukket er antagonister som spesifikt forstyrrer avPs-funksjon, og som ikke forstyrrer funksjonen til andre integriner.
I denne sammenheng er det underforstått at mange forskjellige reagenser kan være egnet for anvendelse i de foreliggende fremgangsmåter, så lenge disse reagenser besitter den nødvendige biologiske aktivitet. Disse reagenser refereres generisk til som etterligninger fordi de har evnen til å "etterligne" en avp5-ligand involvert i den funksjonelle inter-aksjon mellom reseptoren og liganden ved å blokkere ligand-bindingsdomenet i reseptoren, og derved forstyrre (dvs. inhiberer) normal funksjon. I en alternativ utførelsesform kan en avp5-antagonist være en etterligning av reseptoren istedenfor dens ligand.
En etterligning er ethvert molekyl, foruten et antistoff eller et ligandavledet peptid, som oppviser de ovenfor beskrevne egenskaper. Den kan være en syntetisk analog av et peptid, en forbindelse som er utformet som bindingsfordyp-ningen i det ovenfor beskrevne bindingsdomenet, eller et annet molekyl. Foretrukne etterligninger er organisk baserte molekyler og refereres således til som organiske etterligninger. Spesielt foretrukne organiske etterligninger som funksjonerer som avp5-antagonister ved å være en etterligning av en ligand av av£Js, er forbindelser 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 og 18, som beskrevet i eksempel 10.
Utformingen av en avPs-etterligning kan utføres ved hjelp av enhver av mange forskjellige strukturelle analysemetoder for legemiddelutforming kjent i teknikken, inkludert molekylær modellering, todimensjonal nukleær, magnetisk resonans(2-D-NMR)-analyse, røntgenkrystallografi, vilkårlig screening av peptid-, peptidanalog- eller andre kjemiske poly-merbiblioteker, og lignende legemiddelutformingsmetodikker.
I betraktning av det brede strukturelle bevis presen-tert i foreliggende beskrivelse, som viser at en OvP5-antagonist kan være et lite polypeptid, et monoklonalt antistoff eller et organisk molekyl, hvilke er mangfoldig forskjellige kjemiske strukturer som deler den funksjonelle egenskap ved selektiv inhibering av avp*5, behøver strukturen av en aktuell o-vPs-antagonist som er anvendelig ved de foreliggende fremgangsmåter, ikke være så begrenset, men inkluderer enhver avPs-etterligning, som definert heri.
F. Fremgangsmåter for identifikasjon av antagonister av Qyfts
Foreliggende oppfinnelse beskriver også analysemetoder for identifikasjon av avp5-antagonistkandidater for anvendelse i overensstemmelse med de foreliggende fremgangsmåter. I disse analysefremgangsmåter evalueres kandidatmole-kyler for deres potens inhibering av avPs-binding til naturlige ligander, og de evalueres videre for deres potens for inhibering av angiogenese i et vev.
Den første analysen måler angiogenese i kyllingkorioallantoinmembranen (CAM) og refereres til som CAM-analysen. CAM-analysen er beskrevet i detalj av andre, og er dessuten anvendt for å måle både angiogenese og neovaskularisering av tumorvev, se Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597-618
(1975), og Ossonski et al., Cancer Res., 40:2300-2309 (1980).
CAM-analysen er en anerkjent analysemodell for in vivo-angiogenese fordi neovaskularisering av helt vev foregår. Kyllingembryoblodkar vokser inn i CAM eller inn i vevet dyrket på CAM.
Som vist heri, illustrerer CAM-analysen inhibering av neovaskularisering basert på både mengden og graden av ny blodkarvekst. Det er dessuten lett å kontrollere veksten av ethvert vev transplantert på CAM, slik som et tumorvev. Som siste punkt er analysen spesielt anvendelig fordi det foreligger en intern kontroll med hensyn til toksisitet i analysesystemet. Kyllingembryoet utsettes for ethvert testreagens. Som sådant er embryoets helse en indikasjon på toksisitet.
Den andre analysen som måler angiogenese, er in vivo-kaninøyemodellen, og refereres til som kaninøyeanalysen. Kaninøyeanalysen er beskrevet i detalj av andre, og den er videre anvendt for å måle både angiogenese og neovaskularisering i nærvær av angiogeneseinhibitorer, slik som thali-domid, se D'Amato et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 91:4082-4085
(1994) .
Kaninøyeanalysen er en anerkjent analysemodell for in vivo-angiogenese fordi neovaskulariseringsprosessen, eksemplifisert ved vekst av kaninblodkar fra randen av hornhinnen og inn i hornhinnen, lett kan ses gjennom den naturlig gjennomsiktige hornhinne i øyet. Både graden og omfanget av stimulering eller inhibering av neovaskularisering eller regresjon av neovaskularisering kan dessuten lett overvåkes over tid.
Kaninen utsettes til sist for ethvert testreagens, og som sådan er kaninens helse en indikasjon på testreagensets toksisitet.
Den tredje analysen måler inhibering av direkte binding av den naturlige ligand, vitronektin, til avp5l og en foretrukket utførelsesform er beskrevet i detalj i eksemplene. Analysen måler typisk graden av inhibering av binding av en naturlig ligand, slik som vitronektin, til isolert avp5 i den faste fase ved hjelp av ELISA, og denne inhibering formidles ved hjelp av en dvps-spesifikk inhibering.
Analysen kan således anvendes for å identifisere forbindelser som oppviser spesifisitet for av$ s, og som ikke inhiberer naturlige ligander fra å binde andre integriner. Spesifisitetsanalysen utføres ved hjelp av parallelle ELISA-analyser, hvor både avp5 og andre integriner screenes samtidig i separate analysekamre for deres respektive evner til å binde en naturlig ligand, og for kandidatforbindeIsens evne til å inhibere de respektive integriners evne til å binde en forhåndsutvalgt ligand. Foretrukne screeningsanalyseformater er beskrevet i eksemplene.
Eksempler
1. Fremstilling av gvp5- spesifikke monoklonale antistoffer
De monoklonale antistoffer P1F6 og P5H9 ble produsert ved anvendelse av standard hybridommetoder ved immunisering i RBF/DnJ-mus med A549-lungekarsinomceller( som beskrevet av Wayner et al., J. Cell. Biol., 113:919-929 (1991), som er inkorporert heri ved referanse. Miltene ble fjernet fra de immuniserte mus og fusjonert med Ns-l/FOX-NY-myelomceller. Hybridomer som produserer antistoffer rettet mot karsinom-cellevitronektinreseptorer, ble screenet ved hjelp av den spesifikke inhibering av UCLA-P3-adhesjon til vitronektin-belagte overflater, som beskrevet av Wayner et al., og klonet ved begrensende fortynning på thymocyttilfarselslag.
Både de P1F6- og P5H9-monoklonale antistoffer er blitt vist å spesifikt immunreagere med avPs-kompiekset, og ikke reagere med av-subenhet, £5-subenhet eller med andre integriner. P1F6-monoklonalt antistoff er kommersielt tilgjengelig fra Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithers-burg, MD), og P5H9-monoklonalen er tilgjengelig fra dr.
E. Wayner ved Fred Hutchinson Cancer Research Institute, Seattle, WA.
Andre avps-monoklonalé antistoffer for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse er avledet på samme måte og karakterisert som beskrevet heri. avp5-monoklonale antistoffer produseres dessuten ved å fusjonere milter isolert fra mus som mottar immuni se ringer med OvPs-re sept oren i enten en uren eller renset form. Rensing av avp5 er en prosedyre som er velkjent for en fagperson på området integrinbiologi, og er også beskrevet av Smith, J. Biol. Chem., 265:11008-11013 (1990), som er inkorporert heri ved referanse. Når den er renset, prepareres den isolerte reseptor som et immunogen for immunisering av mus, som beskrevet i kapittel E2, og preparert vesentlig som beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 256:495-497 (1975), som er inkorporert heri ved referanse. De resulterende hybridomkloner screenes for reaktivitet med immunogenet og karakteriseres deretter som beskrevet i de etterfølgende eksempler.
2 . Karakterisering av spesifisiteten av ant i- Qvp5- monoklonale antistoffer og anvendelse ved kartlegging av vevs fordel ingen av ctvPs- ekspresjon
A. Spesifisitet for vitronektin
Det P5H9-monoklonale antistoff fremstilt i eksempel 1 ble vist av Wayner et al., J. Cell. Biol., 113:919-929 (1991), å blokkere binding av UCLA-P3-karsinomceller til vitronektin uten å påvirke cellebinding til kollagen eller fibronektin. De samme celler ble også vist å inneholde kun avPs-vitronektinreseptoren og ikke en reseptor med avf}3-spesifisitet, og immunutfelte en heterodimer bestående av en a-kjede (160 kD) og en p"-kjede (95 kD) under ikke-reduserende betingelser. a. v$ 5-reseptoren påvist ved hjelp av P5H9 ble også vist å formidle adhesjon av M21-melanomceller og H2981-karsinomceller til vitronektin. Det P1F6-monoklonale antistoff har den samme immun-reaktivitetsprofil.
B. Immunfluorescens med antiintegrinreseptor-antistoffer
Under sårheling uttrykker basismembranene i blodkar flere adhesive proteiner, inkludert von Willebrands faktor, fibronektin og fibrin. Flere medlemmer av integrinfamilien av adhesjonsreseptorer blir dessuten uttrykt på overflaten av dyrkede glatte muskelceller og endotelceller, se Cheresh, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:6471 (1987); Janat et al., J. Cell. Physiol., 151:588 (1992); og Cheng et al., J. Cell. Physiol., 139:275 (1989).
I tillegg til strukturen og funksjonen av integrin-p5-subenheten er vevsfordelingen av subenheten ved hjelp av kartlegging med andre anti-p5-monoklonale antistoffer beskrevet av Pasqualini et al., J. Cell. Sei-, 105:101-111 (1993), som er inkorporert heri ved referanse.
De ps-subenhetsspesifikke monoklonale antistoffer beskrevet ovenfor, likeledes som dem beskrevet i eksempel 1, ble utskilt fra hybridomer som ble fremstilt ved anvendelse av splenocytter fra en mus som mottok immuniseringer med den A549-humane lungekarsinomcellelinje. Hybridomene ble utvalgt ved positiv overflatefarging av A549-celler med hybridom-kul tur supernat anten og ved immunut f elling av avPs-komplekser fra overflatemerkede A549-ekstrakter. De monoklonale antistoffer ble deretter anvendt for å kartlegge vevsfordelingen av p5-subenheten i normal human thymus, hud og nyre. Snitt med tykkelse på 4 mikron ble utskåret fra de frosne vevsblokker på en kryostatmikrotom for etterfølgende streptavidin-biotion-immunperoksidasefarging med antistoffer spesifikke for ps-integrinene, utført som beskrevet i den refererte publikasjon av Pasqualini et al.
Farging av thymussnitt viste fordelingen av p5 på blodkar, HasBals korpuskler, kortikale og medullare stroma-celler og basismembraner. Hudsnitt viste J35 på basislaget av epidermis og på noen dermale blodkarvegger, og nyresnitt viste farging av glomerulære områder, juxtaglomerulærapparaturen, proksimale sammensnodde tubuli og oppsamlingstubuli. Fordelingen av p5 er således heterogen overfor forskjellige celletyper, inkludert og, mer viktig, på kapillære endotelceller, og fargingen av disse var overensstemmende med farging av dyrkede umbilikalveneendotelceller.
C. Immunfluorescens av humant retinavev fra pasienter med okularsykdom med antiintegrinresep-torantistoffer
Okular neovaskularisering er den mest vanlige patologiske endring observert i de langt fleste øyesykdommer som fører til katastrofalt tap av syn. Veksten av nye blodkar fra de forhåndseksisterende koroidale, retinale eller paralimbale blodkar kan føre til ødem, blødning eller fibrovaskulær membrandannelse som resulterer i ødeleggelse av de normale anatomiske forhold i øyet og ledsagende tap av normal syns-funksjon.
Under fysiologiske betingelser blir angiogenese sterkt regulert og er vist å bli aktivert av spesifikke angiogene cytokiner, slik som basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) og tumornekrosefaktor-a (TNF-a). Som beskrevet av Brooks et al-. Science, 264:569-571 (1994), er monoklonale antistoffer mot av03 vist å bli blokkert av både bFGF- og TNF-a-indusert angiogenese i modellsystemer inkludert CAM-modellen beskrevet nedenfor. Som beskrevet i eksemplene 4-6, blokkerer monoklonale antistoffer mot avPs en separat angiogenesereaksjonsvei, spesielt den som induseres av vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), transformasjonsvekstfaktor-a (TGF-a) og epidermal vekstfaktor (EGF).
Som beskrevet heri i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, er to angiogenesereaksjonsveier definert av dis-tinkte integriner avJ33 og avps. For å undersøke ekspresjonen av og rollen til disse integriner ved human okularsykdom ble epi-retinale, neovaskulære membraner og subretinale, neovaskulære membraner erholdt, samlet ved vitrektomi fra pasienter med proliferativ, diabetisk retinopati (PDR). Disse pasienter var blitt fulgt klinisk og ble utvalgt for histologisk evaluering på basis av at de hadde aktiv proliferativ, neovaskulær sykdom som var dokumentert ved klinisk undersøkelse og fundus-fluor-esceinangiografi. Det erholdte vev ble øyeblikkelig nedfrosset i "Tissue Tek" kryokonserveringsmiddel og oppdelt i snitt.
Når vevene fra disse pasienter ble undersøkt ved immunfluorescens, var blodkarene positive for integrinet avp3, som indikert ved immunreaktivitet med musemonoklonalt antistoff LM609. Fordelingen av integrinet synes å være begrenset til blodkar og falt sammen med farging for en markør av blodkar, von Willebrands faktor, som kartlagt med et kaninanti-stoff mot faktoren. Setene for immunreaktivitet ble visuali-sert med enten rhodaminkonjugert antimuseimmunglobulin eller fluoresceinkonjugert antikanin-immunglobulin, der anvendelse av begge disse tillot samtidig lokalisering av integrinbelig-genheten og blodkarspesifikke antistoffer.
Prøver fra normale øyne eller fra pasienter med atrofiske membraner uten innhold av aktivt prolifererende blodkar var negative for integrinet avps ved immunfluorescens.
Parallelt med dette ble de samme vev analysert immun-histokjemisk for tilstedeværelse og fordeling av avp5 med det anti-avp5-monoklonale antistoff, P1F6, fremstilt i eksempel 1. Fargingen avslørte at avPs var til stede på blodkar som hadde samme beliggenhet som fordelingen av von Willebrands faktor. Det ikke-vaskulære vev utviste også imidlertid begrenset fluorescens med P1F6-antistoffet, hvilket indikerte en bredere fordeling av avps. Dette stod i motsetning til tilstedeværelsen av avP3, som var begrenset til blodkar.
Når immunfluorescensfarging av membraner ble sammenlignet mellom avP3 og avps med de respektive antistoffer LM609 og P1F6, var fargingsmønsteret på blodkarveggen praktisk talt identisk, hvilket indikerer at både avp>2 og avp"5 blir fremvist på overflaten av nylig prolifererende humane blodkar til stede ved neovaskulære øyesykdommer, slik som diabetisk retinopati.
Resultatene beskrevet heri viser således at avPs-integrinreseptoren blir selektivt uttrykt i spesifikke vevs-typer som angiogenese forekommer i, slik som dem observert med neovaskulære membraner fra pasienter med aktiv proliferativ, neovaskulær sykdom. Disse vev, sammen med vevene som utsettes for spesielle vekstfaktorer som beskrevet nedenfor i eksemplene 4-6, tilveiebringer derfor ideelle mål for terapeutiske aspekter av foreliggende oppfinnelse.
3. Fremstilling av syntetiske peptider
De sykliske polypeptider anvendt ved utøvelse av fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse ble syntetisert ved anvendelse av standard fastfasesynteseteknikker, slik som f.eks. beskrevet av Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-296
(1969), og Fields, G.B. og Noble, R.L., Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214 (1990).
2 gram (g) BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ome (SEKV.ID. NR. 1) ble først oppløst i 60 milliliter (ml) metanol og ble deretter tilsatt 1,5 ml 2 N natriumhydroksidløsning for å danne en blanding. Blandingen ble deretter omrørt i 3 timer ved 20 °C. Etter inndamping ble resten oppløst i vann og surgjort til pH 3 med fortynnet HCl og ekstrahert med etylacetat. Ekstraktet ble tørket over Na2S04, inndampet på nytt, og det resulterende BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH (SEKV.ID. NR. 2) ble omrørt ved 2 0 °C i 2 timer med 20 ml 2 N HCl i dioksan. Den resulterende blanding ble inndampet for å oppnå H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH (SEKV.ID. NR. 3), sora deretter ble oppløst i en blanding av 1800 ml diklormetan og 200 ml dimetylformamid (DMF), etterfulgt av avkjøling til 0 °C. 0,5 g disykloheksylkarbodiimid (DCCI), 0,3 g 1-hydroksybenzotriazol (HOBt) og 0,23 ml N-metylmorfolin ble deretter tilsatt sekvensielt under omrøring.
Den resulterende blanding ble omrørt i ytterligere 24 timer ved 0 °C og deretter ved 20 °C i ytterligere 48 timer. Oppløsningen ble konsentrert og behandlet med en blandet ionebytter for å fjerne salter. Etter at det resulterende resin var fjernet ved filtrering, ble den klarede løsning inndampet, og resten ble renset ved kromatografi, hvilket resulterte i isolering av syklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (også oppført med enkeltbokstavkode som c-RGDfV) (SEKV.ID. NR. 4). De små bokstavene i peptidet indikerer D-formen av aminosyren og ikke L-formen, som indikert med store bokstaver.
Det sykliske kontrollpeptid syklo(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (også oppført med enkeltbokstavkode som RADfV) (SEKV.ID. NR. 5) ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det sykliske peptid c-RADfV) (SEKV.ID. NR. 5) er tidligere blitt vist å inhibere binding av fibrinogen til integrinet avp3i og ikke inhibere binding av fibrinogen til integrinene O-uhf^ eller cisfSi (Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238, 1994).
Andre peptider som er spesifikt inhibitoriske for bindingen av naturlige ligander til av|3s, fremstilles på samme måte og testes for spesifisitet og aktivitetsområde, som beskrevet i de følgende eksempler. Disse inkluderer de følgende peptider, som ble fremstilt på analog måte: syklo(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEKV.ID. NR. 6) og syklo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEKV.ID. NR. 7). Peptidene med aminosyrerestsekvensen Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe (SEKV.ID. NR. 8) og syklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-MeVal)
(SEKV.ID. NR. 9) ble også fremstilt syntetisk. I SEKV.ID.
NR. 9 angir prefikset "Me" i MeVal at valinet i posisjon 6 er metylert valin.
4 . Inhibering av vekstfaktorindusert angiogenese med Qvp5- antagonister, som målt ved in vivo - kaninøye-modellanalyse
Virkningen av anti-avps-antagonister på vekstfaktorindusert angiogenese kan observeres i naturlig gjennomsiktige strukturer, som eksemplifisert ved øyets hornhinne. Nye blodkar vokser fra randen av hornhinnen, som har rik blodtilfør-sel, mot senteret av hornhinnen, som vanligvis ikke inneholder blodkar. Stimulatorer av angiogenese, slik som VEGF og TGF-a, induserer, når de appliseres på hornhinnen, veksten av nye blodkar fra randen av hornhinnen. Antagonister av angiogenese applisert på hornhinnen inhiberer veksten av nye blodkar fra randen av hornhinnen. Hornhinnen gjennomgår således en angiogenese gjennom en invasjon av endotelceller fra randen av hornhinnen og inn i det seige, kollagenpakkede hornhinnevev, hvilket er lett synlig. Kaninøyemodellanalysen tilveiebringer derfor en in vivo-modell for direkte observasjon av stimulering og inhibering av angiogenese etter implantasjon av forbindelser direkte i øyets hornhinne.
A. In yjvo- kaninøyemodellanalyse
1) Angiogenese indusert med hjelp av vekstfaktorer
Angiogenese ble indusert i in vi vo-kaninøyemodell-analysen ved hjelp av vekstfaktorer, og er beskrevet i det etterfølgende.
a. Fremstilling av hydronpelleter inneholdende vekstfaktor og monoklonale antistoffer Hydronpolymerpelleter inneholdende vekstfaktor og monoklonale antistoffer ble preparert som beskrevet av D'Amato et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 91:4082-4085 (1994). De individuelle pelleter inneholdt 750 ng av vekstfaktoren (også referert til som cytokin), nærmere bestemt enten bFGF eller VEGF, bundet til sukralfat (carafat) (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation, Cincinnati, OH) for å stabilisere cytokinene og sikre deres langsomme frigivelse inn i det omliggende vev. Det ble dessuten fremstilt hydronpelleter som inneholdt enten 40 ug av det monoklonale antistoff P1F6 (anti-avps) eller kontrollantistoffet LM609 (anti-avp3) i PBS.
Alle de testede monoklonale antistoffer ble renset fra asciteBvæske ved anvendelse av protein-A-Sepharose CL-4B-affinitetskolonnekromatografi i overensstemmelse med velkjente metoder. Det eluerte immunglobulin ble deretter dialysert mot PBS og behandlet med Detoxi-gel (Pierce Chemicals, Rockford, IL) for å fjerne endotoksin. Endotoksin er vist å være et potent angiogent og inflammatorisk stimulerende middel. Monoklonale antistoffer ble derfor testet for tilstedeværelse av endotoksin ved hjelp av den kromogene limulusamøbocyttanalyse {BioWhittaker, Walkersville, MD), og kun de monoklonale antistoffer uten påvisbart endotoksin ble anvendt i kaninøye-modellanalysen.
Pelletene ble støpt i spesielt preparerte teflon-plugger som hadde en 2,5 mm kj erne boret inn i deres overflater.
Cirka 12 ul støpemateriale ble plassert i hver plugg og polymerisert over natten i et sterilt avtrekksskap. Pelletene ble deretter sterilisert ved hjelp av ultrafiolett bestråling.
En serie på 8 dyr ble anvendt for eksperimenter for øyepar hvor 2 dyr mottok et Hydron-implantat inneholdende et forhåndsutvalgt cytokin med et forhåndsutvalgt antistoff eller et kontrollimmunglobulin. For hver kanin ble nærmere bestemt én hornhinne kirurgisk implantert med en Hydron-pellet inneholdende enten bFGF eller VEGF i forbindelse med monoklonalt antistoff P1F6, og den andre hornhinnen ble behandlet med enten bFGF eller VEGF i forbindelse med monoklonalt antistoff LM609. Individuelle pelleter ble implantert i kirurgisk formede "lommer" dannet i det midtre stroma i hornhinnen hos kaniner. Den kirurgiske prosedyre ble utført under en steril teknikk ved anvendelse av et Wild modell M691-operasjonsmikroskop utstyrt med en strålesplitter på hvilken det ble montert kamera for fotografisk registrering av individuelle hornhinner. En "lomme" med størrelse 3 mm x 5 mm ble utformet i hornhinnestroma ved å gjøre et snitt på 3 mm til halvparten av hornhinnetykkelsen med et 69 Beaver-blad. Stroma ble dissekert perifert ved anvendelse av en irisspatel, og pelleten ble implantert med sin perifere kant 2 mm fra limbus.
I løpet av de påfølgende 12 dager diffunderte cytokinene og de monoklonale antistoffer fra de implanterte pelleter inn i det omliggende vev, og bevirket derved angiogenese fra randen av hornhinnen.
De venstre og høyre hornhinner refereres til som henholdsvis OS og OD. Hornhinnene ble deretter observert i 12 dager. Fotografier ble tatt på postoperativ dag 10, som er det tidspunkt hvor neovaskularisering er maksimal.
Representative fotografiske resultater fra de ovennevnte behandlinger med blandinger av cytokin og monoklonalt antistoff er vist i figurene 1A-1D. Den parallelle kvantifisering av monoklonalt antistoff-inhibering av cytokinindusert angiogenese er vist i figurene 2A og 2B. I figurene IA og ID, hvori hornhinner henholdsvis ble utsatt for kombinasjonene bFGF/PlF6 og VEGF/LM609, er cytokinindusert angiogenese med ødem fremtredende, som indikert ved de store pilene. avps-antistoffet, P1F6, ga derfor ingen effektiv inhibering av bFGF-indusert angiogenese. avP3-antistoffet LM609 ga likeledes ingen effektiv inhibering av VEGF-indusert angiogenese.
I motsetning til dette, når kombinasjonene av cytokin og monoklonalt antistoff bFGF/LM609 og VEGF/P1F6 ble anvendt i kaninmodellen, ble den cytokininduserte angiogenese inhibert av antistoffene, som vist i henholdsvis figur IB og 1C. I disse figurer er normale konjunktivale limbalblodkar angitt ved de små pilene, og indikerer effektivitet av integrinanti-stoffene ved inhibering av én type cytokinindusert angiogenese .
Virkningene av spesifikt monoklonalt antistoff-integrin-immunreaktivitet overfor den ovenfor angitte cytokininduserte angiogenese er også kvantifisert, som vist i figurene 2A og 2B. Angiogenese ble stimulert med enten bFGF eller VEGF, som henholdsvis vist i figur 2A og 2B. De behandlede øyne ble fotografert daglig gjennom et Wild-operasjonsmikroskop utstyrt med et Nikon-kamera. Fotografier ble registrert på Kodak Ektachrome 64T diapositiv film, og avbildninger ble omdannet for dataassistert kvantifisering ved anvendelse av Biorad's Molecular Analyst 1.1 software etter tilegnelse gjennom et modell GS670-avbildningsdensitometer. Histogrammer illustrerer det gjennomsnittlige neovaskulære området +/- standardfeilen (n = 8 for hver av to serier) etter utsettelse for det monoklonale antistoff P1F6 eller LM609.
Som vist i figur 2A, reduserte LM609 bFGF-indusert angiogenese med 86 % (p < 0,005, paret t-test) sammenlignet med behandling av øyeparet hos det samme dyr med P1F6. Når VEGF ble anvendt for å stimulere angiogenese, som vist i figur 2B, ble den motsatte effekt observert idet P1F6 reduserte det gjennomsnittlige areal for neovaskularisering med 60 %
(p < 0,003, paret t-test) sammenlignet med det LM609-behandlede øyet, som hadde en minimal effekt på VEGF-indusert angiogenese .
Det er viktig å legge merke til at kun de nylig cytokininduserte blodkar ble påvirket ved utsettelse for et spesielt monoklonalt antistoff, mens de forhåndseksisterende perilimbale blodkar var upåvirket av alle monoklonale antistoffer, hvilket antyder at de observerte effekter er begrenset til nylig dannede blodkar i hornhinnen.
Lignende analyser er utført med syntetiske peptider fremstilt i eksempel 3, og som beskrevet nedenfor, for anvendelse av inhibering av cytokinindusert angiogenese som har spesifikk sammenheng med avps-ekspresjon.
For å bekrefte disse resultater, som indikerer at angiogenese indusert av et spesielt cytokin kun ble bevirket av én type antiintegrin-antistoff, spesielt at avf}s-integrin-reseptoren spiller en rolle ved VEGF-indusert angiogenese, ble en annen neovaskulær modell av kyllingkorioallantoinmembranen (CAM) evaluert med kombinasjonene av cytokiner og integrinantistoffer, som vist i det neste eksempel.
5. Angiogenese i preparatet av kyllingkorioallantoinmembranen ( CAM)
A. Karakterisering av den ubehandlede CAM
1) Preparering av CAM
Angiogenese kan induseres på kyllingkorioallantoinmembranen (CAM) etter at normal embryonisk angiogenese har resultert i dannelse av modne blodkar. Angiogenese er vist å bli indusert som respons på spesifikke cytokiner eller tumorfragmenter, som beskrevet av Leibovich et al.. Nature, 329:630
(1987), og Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597 (1975). CAM ble preparert fra kyllingembryoer for etterfølgende induksjon og inhibering av angiogenese, som beskrevet nedenfor og i eksempel 6, med avps-antagonistene ifølge foreliggende oppfinnelse . 10 dager gamle kyllingembryoer ble anskaffet fra Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) og inkubert ved 37 °C under 60 % fuktighet. Et lite hull ble laget i skallet ved enden av egget direkte over luftsekken ved anvendelse av et lite drill-bor (Dremel, Division of Emerson Electric Co., Racine, WI). Et andre hull ble boret i eggets bredside i et område uten innhold av embryoniske blodkar, hvilket var bestemt tidligere ved gjennomlysning av egget. Negativt trykk ble påført på det opprinnelige hul, hvilket resulterte i at CAM (korioallantoin-membranen) ble trukket bort fra skallmembranen og dannet en falsk luftsekk over CAM. Et på 1,0 cm x 1,0 cm kvadratisk åpning ble utskåret fra skallet over den innsunkne CAM ved anvendelse av en liten modellslipeskive (Dremel). Den lille åpningen tillot direkte tilgang til den underliggende CAM. Det resulterende CAM-preparat ble deretter anvendt 10 dagers embryogenese, når angiogenesen har stilnet av. Preparatet ble således anvendt ved foreliggende oppfinnelse for indusering av fornyet angiogenese som respons på cytokin-behandling.
2) Histologi av CAM
For å analysere den mikroskopiske struktur av kyllingembryo-CAM ble 6 mikron (um) tykke seksjoner skåret fra de nedfrosne blokker på en kryostatmikrotom for immunfluorescensanalyse.
Typisk for en ubehandlet 10 dager gammel CAM er et område uten innhold av blodkar. Fordi angiogenese i CAM-systemet har stilnet av på dette stadium av embryogenese, er systemet anvendelig ved foreliggende oppfinnelse for stimulering med forskjellige cytokiner av produksjonen av ny vaskulatur fra eksisterende blodkar fra nærliggende områder og inn
i områder av CAM som mangler blodkar.
Som vist i CAM-modellen og i de etterfølgende eksempler, uttrykker blodkarene avp3 og av$$ mens blodkarene gjennomgår ny vekst ved normal embryogenese eller indusert av cytokiner.
B. Angiogenese indusert av vekstfaktorer
Angiogenese er vist å bli indusert av cytokiner eller vekstfaktorer, som beskrevet i eksempel 4A i kaninøyemodellen. I eksperimentene beskrevet heri, ble angiogenese i kaninhorn-hinnepreparatet beskrevet i eksempel 4 indusert på lignende måte ved hjelp av vekstfaktorer som ble topisk applisert på CAM-blodkarene, som beskrevet heri.
Angiogenese ble indusert ved å plassere en 5 mm x
5 mm Whatman-filterskive (Whatman-filterpapir nr. 1) mettet med Hanks balanserte saltløsning (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) eller HBSS inneholdende forhåndsutvalgte cytokiner i en forhåndsutvalgt konsentrasjon, dvs. en konsentrasjon for å teste effekten på angiogenesen, på CAM fra et 10 dager gammelt kyllingembryo i et område uten innhold av blodkar, og åpningene ble senere forseglet med tape. Angiogenese ble kontrollert ved hjelp av fotomikroskopi etter 72 timer. CAM ble hurtig nedfrosset, deretter ble 6 um kryostatsnitt fiksert med aceton og farget ved immunfluorescens, som beskrevet i eksemplene 2B og 2C, med 10 ug/ml utvalgte antiintegrin-antistof f er, inkludert antistoffene rettet mot avp5, som beskrevet i eksempel 1.
Tidligere undersøkelser av Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994) har vist at blodkar er klart synlige i både de bFGF- og TNF-a-behandlede preparater, men de er ikke til stede i den ubehandlede CAM. Forfatterne har også vist at avP3-ekspresjon ble forhøyet etter bFGF-indusert angiogenese. Selv om ekspresjonen av integrin Pi ikke endret seg fra den observerte i en ubehandlet CAM, var p2 også klart synlig på stimulerte blodkar.
Disse publiserte funn indikerte at hos både menneske og kylling viser blodkar involvert i angiogenese forhøyet ekspresjon av avp3. I overensstemmelse med dette ble ekspresjon av avp"3 på dyrkede endotelceller indusert ved hjelp av forskjellige cytokiner in vitro, .som beskrevet av Janat et al., J. Cell. Physiol., 151:588 (1992); Enenstein et al., Exp. Cell Res., 203:499 (1992), og Swerlick et al., J. Invest. Derm., 99:715 (1993).
Ved foreliggende oppfinnelse er det nå bestemt en separat cytokinformidlet reaksjonsvei for simulering av angiogenese som er avhengig av ekspresjon og aktivering av en forskjellig adhesiv integrinreseptor, avpV Effekten av at en CAM, som beskrevet heri, utsettes for cytokinene VEGF, TGF-a og EGF i forbindelse med ekspresjon av avPs, angiogenese og inhibering av angiogenese med avPs-antagonister, er beskrevet i eksempel 6.
C. Angiogenese indusert av tumorer
For å undersøke rollen til cxvps ved tumor indusert angiogenese anvendes det i CAM-analysen forskjellige avf}5-negative humane melanom- og karsinomfragmenter som tidligere er dyrket og isolert fra CAM fra,. 17 dager gamle kyllingembryoer, som beskrevet av Brooks et al., J. Cell Biol., 122:1351 (1993), og som beskrevet heri.
Angiogenese induseres i CAM-analysesystemet ved direkte plassering av et tumorfragment på CAM. Preparering av kyllingembryo-CAM er identisk med prosedyren beskrevet ovenfor. Istedenfor en filterpapirskive plasseres et fragment med en vekt på 50-55 mg av en avPs-negativ tumor som resulterer fra vekst av cellelinjesuspénsjonene beskrevet nedenfor på
CAM i et område som opprinnelig ikke inneholder blodkar.
Cellelinjene, rhabdomyosarkom, myeloid (HL-60 eller KG-1), og lymfoid (T-celler - Jurkat, HPB/ALL, PEER; og forskjellige B-cellelinjer), som beskrevet av Pasqualini et al., J. Cell. Sei., 105:101-111 (1993), anvendes for å dyrke de faste humane tumorer på CAM fra kyllingembryoer. En enkelt cellesuspensjon fra de forskjellige cellelinjer appliseres først på CAM i et totalt volum på 30 ul sterilt HBSS. Åpningene forsegles med tape, og embryoene inkuberes i 7 dager for å tillate vekst av humane tumorlesjoner. Etter 7 dager, nå et 17 dager gammelt embryo, utskjæres tumorene fra CAM og trimmes for å fjerne omgivende CAM-vev. Tumorene kuttes i 50-55 mg tumorfragmenter for anvendelse i angiogenese. Tumorfragmentene plasseres på et nytt sett av 10 dager gamle kyllingembryo-CAM, som beskrevet i eksempel 5A, i et område uten innhold av blodkar.
Tumorer dyrket in vivo på kyllingembryo-CAM, med og uten topisk eller intravenøs applisering av avps-induserende cytokiner (VEGF, TGF-a eller EGF) farges deretter for avp5-ekspresjon med monoklonalt antistoff P1F6 eller P5H9, som beskrevet tidligere.
Disse CAM-tumorpreparater behandles deretter som beskrevet i eksemplene 6C og 6D for måling av effektene av antistoffer og peptider på tumorindusert angiogenese.
I én utførelsesform ble hamstermelanomceller, CS-1, anskaffet fra dr. Caroline Damsky ved Universitet i Cali-fornia, San Francisco, anvendt i CAM-analysen som beskrevet ovenfor, for dannelse av melanomtumorer. Etter overføringen av et ca. 50 mg CS-1-tumorfragment på en ny 10 dager gammel kyllingembryo-CAM mottok atskilte preparater en intravenøs injeksjon av enten 100 ug eller 300 ug PlF6-antistoff, LM609-antistoff eller kontroll-CSAT(anti- pl)-antistoff. En ytterligere kontroll inkluderte et preparat som ikke hadde mottatt noen behandling. Resultatene er diskutert nedenfor i eksempel 6D.
6. Inhibering av angiogenese som målt ved CAM- analysen
A. Inhibering av vekstfaktorindusert angiogenese ved
intravenøs applisering av inhibitorer
Effekten på vekstfaktorindusert angiogenese med monoklonale antistoffer som var injisert intravenøst i CAM-preparatet, ble evaluert for anvendelse som et in vivo-modellsystem ifølge foreliggende oppfinnelse.
Etter aktiv neovaskularisering, når blodkarene hadde stanset å utvikle seg, reduseres ekspresjonen av avPs til nivåer som ikke kan påvises ved immunfluorescensanalyse. Denne regulering av avPs~ekspresjon i blodkar som gjennomgår angiogenese, i motsetning til mangelen på ekspresjon i modne blodkar, tilveiebringer ved foreliggende oppfinnelse en unik evne til å kontrollere og inhibere angiogenese, som vist nedenfor, utformet i CAM-angiogeneseanalysesystemet.
Prepareringen av kyllingembryo-CAM for intravenøse injeksjoner var vesentlig som beskrevet ovenfor.
Angiogenese ble først indusert på 10 dager gamle kyllingembryoer ved applisering av vekstfaktormettede filterskiver. Spesielt i de første analyser ble angiogenese indusert ved utsettelse for enten bFGF eller VEGF, begge i en konsentrasjon på 150 ng/ml.
For applisering av vekstfaktorer ble under gjennom-lysningsprosedyrene fremtredende blodkar utvalgt, og merker ble satt på eggeskallet for å angi deres posisjoner. Hullene ble boret i skallet, CAM ble tilbaketrukket, og vekstfaktor-mettet filterpapir ble deretter separat plassert på CAM, som beskrevet ovenfor. Åpningene ble forseglet med steril tape, og embryoene ble satt tilbake i inkubatoren. 24 timer senere ble en andre liten åpning forsiktig utskåret på den laterale side av eggeskallet direkte over fremtredende blodkar som var utvalgt på forhånd. Det ytre eggeskall ble forsiktig fjernet og etterlot de embryoniske membraner intakte. Skallmembranen ble gjort gjennomsiktig med en liten dråpe mineralolje (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT), hvilket tillot at blodkarene lett kunne visualiseres. Fosfatbufret saltløsning (PBS), 75 ug rensede, sterile antiintegrin-antistoffer eller 75 ug syntetiske peptider (syklisk peptid RGDfV, SEKV.ID. NR. 4, og det sykliske kontrollpeptid RADfV, SEKV.ID. NR. 5) i PBS ble injisert i blodkar som var synlige på de vekstfaktorinduserte CAM. Åpningene ble forseglet med tape, og embryoene ble inkubert i 72 timer.
Filterskivene og representative omgivende CAM-vev ble fotografert i et stereomikroskop (figurene 3A-3F og figurene
5A-5F), og den gjennomsnittlige angiogene indeks +/- standardfeilen ble bestemt for 12 CAM pr. tilstand (figurene 4A-4B og figurene 6A-6B). Angiogenese ble poengvurdert for hvert embryo på en dobbelt blindprøve-måte ved å analysere antallet og graden av forgrening av blodkar innen området for hver skive. Poengvurderingene varierte fra 1 (lav) til 4 (høy), og angio-
geneseindeksen ble bestemt ved å subtrahere en bakgrunn på 1 fra alle data.
Spesifisitet av integrin-antistofformidlet inhibering av vekstfaktorindusert angiogenese i CAM-modellen avspeilet den observerte i kaninhornhinnemodellen beskrevet ovenfor. Som henholdsvis vist i figur 3A og 3B, forårsaket både bFGF og VEGF angiogenese i den kontroll-PBS-behandlede CAM. Behandling med det avp5-spesifikke antistoff, P1F6, resulterte imidlertid i inhibering av VEGF-indusert angiogenese, som vist i figur 3D, mens ingen inhibering ble påvist på bFGF-indusert angiogenese, som vist i figur 3C. I motsetning til dette inhiberte det LM609-avp3-spesifikke antistoff bFGF-indusert angiogenese (figur 3E), men hadde liten effekt på angiogenese i den VEGF-induserte CAM (figur 3F).
Disse resultater er også vist i stolpediagrammene i henholdsvis figur 4A og 4B for både bFGF- og VEGF-behandlede CAM, hvori angiogeneseindeksen er plottet mot utsettelse for enten LM609 eller P1F6 sammen med ingen antistoffbehandling som en kontroll. Inhibering av vekstfaktorindusert angiogenese ved hjelp av integrinspesifikke antistoffer er således avhengig av typen vekstfaktor.
Utsettelse for RGD-inneholdende peptider understøtter de ovenfor angitte resultater. I nærvær av PBS, som vist i figurene 5A og 5B, resulterte utsettelse for både bFGF og VEGF i angiogenese i kontroll-CAM. I motsetning til dette opphevet den sykliske peptidantagonist RGDfV (SEKV.ID. NR. 4), rettet på både avp3 og avJ3s/ angiogenese indusert av enten bFGF eller VEGF. Det sykliske peptid RADfV (SEKV.ID. NR. 5) forårsaket ikke angiogenese i verken de bFGF- eller VEGF-behandlede CAM-preparater. Resultatene er også vist i figurene 6A og 6B, hvor angiogeneseindeksen for bFGF- og VEGF-stimulerte CAM er opp-ført grafisk og viser utsettelse for test- og kontroll-peptider. Disse resultater, sammen med resultatene for kanin-hornhinnene, indikerer således at bFGF- og VEGF-indusert angiogenese avhenger av forskjellige, men homologe, av-spesifikke integriner som imidlertid begge kan inhiberes av det sykliske peptid RGDfV.
Ytterligere lignende analyser er utført med syntetiske peptider fremstilt som beskrevet i eksempel 3 for å defi-nere peptider som oppviser spesifisitet overfor avps- og ikke overfor avp3-korrelert angiogenese. Analyser er også utført med de organiske molekyler fremstilt som beskrevet i eksempel 10.
Spesifisiteten av integrinantistoffinhibering av vekstfaktorindusert angiogenese ble ytterligere bekreftet og bestyrket ved å utvide analysene av vekstfaktorangiogenese-induksjon til å inkludere tumornekrosefaktor-a (TNF-a), transformerende vekstfaktor-a (TGF-a) eller forbolesteren 4-fJ-forbol-12-myristat-13-acetat (PMA).
De ovennevnte vekstfaktorer (cytokiner), inkludert bFGF og VEGF, ble separat anvendt i en konsentrasjon på
1,0 ug/ml på den 10 dager gamle CAM-modell, som beskrevet tidligere. PMA ble anvendt i en konsentrasjon på 20 ng/ml. 24 timer etter vekstfaktorbehandling ble antistoffene LM609 og P1F6 eller proteinkinase C(PKC)-inhibitoren kalfostin C separat anvendt på CAM-modellen, enten ved hjelp av en enkelt intravaskulær dose, som beskrevet ovenfor, eller ved . topisk administrering, som beskrevet i det neste eksempel. For intravaskulære injeksjoner i den etterfølgende periode på 3 dager ble antistoffene anvendt i en konsentrasjon på 75 ug pr. embryo, og kalfostin C ble anvendt i en dose på 100 nM.
På dag 13 ble filterskiver og assosiert CAM-vev dissekert og analysert for angiogenese med et stereomikroskop. Angiogenese ble poengvurdert på en dobbelt blindprøve-måte ved å analysere antallet og graden av forgrening av blodkarene i arealene på skivene. Poengvurderingene varierte fra lav (1) til høy (4). Angiogeneseindeksen ble bestemt ved å subtrahere et bakgrunnspoengtall på 1 fra alle data. Eksperimenter ble gjentatt 2-4 ganger med 5-6 embryoer pr. tilstand.
Som vist i henholdsvis figur 7A og 7B blokkerte anti-avp3-antistoffet LM609 angiogenese som respons på bFGF og TNF-a, mens anti-avPs-antistof f et P1F6 hadde liten inhibitorisk effekt. I motsetning til dette, som vist i figurene 7C-7E, inhiberte P1F6 effektivt angiogenese indusert av VEGF, TGF-a, eller PMA, mens LM609 ikke gav noen inhibering.
PMA, en potent induserer av angiogenese, er i stand til å aktivere proteinkinase C (PKC), en intracellulær familie av serin-treoninkinaser. Virkningene av kalfostin C, en PKC-inhibitor, på angiogenese på kylling-CAM ble derfor også undersøkt. Kalfostin C blokkerte angiogenese indusert av PMA (figur 7E), så vel som VEGF og TGF-a (henholdsvis vist i figur 7C og 7D), mens den har minimale effekter på bFGF- eller TNF-a-formidlet angiogenese (henholdsvis vist i figur 7A og 7B).
Disse resultater indikerer sammen eksistensen av to separat forskjellige angiogenesereaksjonsveier der én er avhengig av et avp3-formidlet signal som i høy grad er uavhengig av PKC, som tidligere beskrevet av Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994), og en andre reaksjonsvei som potenseres av et avPs-formidlet transduksjonssignal som kritisk avhenger av PKC-aktivering.
I tillegg til de ovenfor beskrevne eksperimenter, for å bestemme lokaliseringen av P1F6- og LM609-monoklonale antistoffer i CAM-vev som var inokulert intravenøst med LM609, blir de fikserte snitt blokkert med 2,5 % BSA i HBSS i 1 time ved romtemperatur, etterfulgt av farging med en l:250-fortynning av geite-antimuse-rhodaminmerket sekundært antistoff (Tago). Snittene analyseres deretter med et Zeiss-immunfluor-escensmikroskop.
B. Inhibering av vekstfaktorindusert angiogenese ved
topisk applisering av inhibitorer
For å bestemme hvorvidt avPs spiller en aktiv rolle i angiogenese plasseres filterskiver mettet med vekstfaktorer beskrevet ovenfor CAM for å indusere angiogenese, etterfulgt av applisering av enten P1F6 eller LM609.
Skivene behandles deretter med 50 ml HBSS inneholdende 25 mg monoklonalt antistoff i et totalt volum på 25 ul sterilt HBSS ved 0, 24 og 48 timer. Etter 72 timer innhøstes CAM og plasseres i en 35 mm petriskål og vaskes én gang med 1 ml PBS. Bunnsiden av filterpapiret og CAM-vevet analyseres deretter under et Olympus-stereomikroskop av to observatører på en dobbelt blindprøve-måte. Angiogeneseinhibering betraktes som signifikant når CAM oppviser > 50 % reduksjon av blodkar-infiltrering av CAM direkte under skiven. Eksperimenter gjen-tas fire ganger pr. antistoff med 6-7 embryoer pr. tilstand.
For å undersøke virkningene av integrinantistoffer på forhåndseksisterende, modne blodkar etter normal blodkarutvik-ling nær områdene uten blodkar plasseres filterskiver mettet med monoklonale antistoffer på vaskulariserte områder av CAM fra 10 dager embryoer som ikke mottar topisk applisering av cytokin.
CAM-analyser utføres også med de syntetiske peptider ifølge foreliggende oppfinnelse for å bestemme effekten av sykliske og lineariserte peptider på vekstfaktorindusert angiogenese. 8 ug peptider, fremstilt som beskrevet ovenfor, plasseres separat i et totalt volum på 25 ul sterilt HBSS. Peptidløsningen appliseres på CAM-preparatet umiddelbart og deretter på nytt etter 24 og 48 timer. Etter 72 timer disse-keres filterpapiret og det omgivende CAM-vev og betraktes som beskrevet ovenfor.
Lignende analyser utføres med de organiske molekyler fremstilt som beskrevet i eksempel 10.
C. Inhibering av tumorindusert angiogenese ved
topisk applisering
l) Behandling med monoklonale antistoffer
I tillegg til angiogeneseanalysene beskrevet ovenfor, hvor effekten av anti-avPs-antistoff og peptidantagonister ble evaluert, undersøkes også rollen til avp5 ved tumorindusert angiogenese. Ved induseringen benyttes av£s-negative humane vev som tidligere er dyrket og isolert fra CAM fra et 17 dager gammelt kyllingembryo. Fragmentene prepareres som beskrevet i eksempel 5C.
Som beskrevet ovenfor, appliseres monoklonale antistoffer topisk hver for seg på tumorfragmentene i en konsentrasjon på 25 ug i 25 ul HBSS, og åpningene forsegles deretter med tape. De monoklonale antistoffer tilsettes på nytt på samme måte etter 24 og 48 timer. Etter 72 timer analyseres tumorene og omgivende CAM-vev, som beskrevet ovenfor.
Som beskrevet i eksempel 5C, frembringes tumorer inn-ledningsvis ved å transplantere humane cellelinjer som ikke uttrykker integrin-avPs, på CAM fra 10 dager gamle kyllingembryoer .
For å kvantifisere effekten av de monoklonale antistoffer på den tumorinduserte angiogenese telles blodkar som kommer inn i tumoren innen det fokale plan i CAM under et stereomikroskop av to observatører på en dobbelt blindprøve-måte.
De syntetiske peptider fremstilt i eksempel 3 og de organiske molekyler fremstilt i eksempel 10 blir på samme måte anvendt topisk i det tumorinduserte angiogene CAM-analyse-system, som beskrevet ovenfor. Effekten av peptidene og de organiske molekyler på blodkarenes levedyktighet blir likeledes bestemt.
D. Inhibering av tumorindusert angiogenese ved
intravenøs applisering
1) Behandling med monoklonale antistoffer
Tumorinduserte blodkar fremstilt ovenfor ble også behandlet med monoklonale antistoffer applisert ved intravenøs injeksjon. CS-l-melanomtumorer ble plassert på CAM, som beskrevet i eksempel 5C, åpningene ble forseglet med tape, og 24 timer senere ble 100-300 ug rensede monoklonale antistoffer inokulert én gang intravenøst i kyllingembryoblodkar, som beskrevet tidligere. Kyllingembryoene ble deretter inkubert i 7 dager. Graden av angiogenese ble deretter observert, som beskrevet ovenfor. Etter denne tidsperiode ble tumorene utskåret og analysert ved veiing for å bestemme effekten av antistoffinnvirkning på tumorvekst eller -undertrykkelse.
Resultatene fra behandling av CS-l-tumorer med 300 ug dvfls-spesifikt antistoff P1F6 er vist i figur 8, Tumorvekten ble dramatisk redusert til mindre enn 50 mg, sammenlignet med ubehandlede CSAT-behandlede tumorer. Det avp3-spesifikke antistoff LM609 inhiberte også tumorvekst, men mindre effektivt enn P1F6. Sammenlignbare resultater ble oppnådd med tumorer som ble behandlet med 100 ug P1F6. P1F6 gav derfor effektiv inhibering av avp5-formidlet angiogenese i en tumormodell på et CAM-preparat som resulterte i en minsking av tumorcellemasse.
2) Behandling med syntetiske peptider eller
organiske molekyler
Effektene av peptider eller organiske molekyler på tumorindusert vaskulatur er også bestemt i CAM-analysesystemet. Tumor-CAM-preparatet anvendes som beskrevet ovenfor, med unntak av at istedenfor intravenøs injeksjon av et monoklonalt antistoff blir syntetiske peptider og organiske molekyler fremstilt som beskrevet i henholdsvis eksempel 3 og 10, separat injisert intravenøst i synlige blodkar.
7. Identifikasjon av Q- vPs- spesifikke antagonister påvist ved hjelp av en ligandreseptorbindingsanalyse
De avp5-immunreaktive antistoffer og syntetiske peptider, fremstilt i henholdsvis eksempel 1 og 3, screenes ved å måle deres evne til å antagonisere avps-, avfo- og o-hbPs-reseptorbindingsaktivitet i bindingsanalyser med renset ligand og reseptor. Fremgangsmåten for disse bindingsunder-
søkelser er beskrevet av Barbas et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:10003-10007 (1993); Smith et al., J. Biol. Chem., 265:11008-11013 (1990); og Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994), som er inkorporert heri ved referanse.
Det beskrives en fremgangsmåte for identifikasjon av antagonister i en ligandreseptorbindingsanalyse hvori reseptoren immobiliseres på et fast støttemateriale og liganden og antagonisten er oppløselige. Det beskrives også en ligandreseptorbindingsanalyse hvori liganden immobiliseres på et fast støttemateriale og reseptoren og antagonistene er opp-løselige .
Kort beskrevet blir utvalgte rensede integriner separat immobilisert i Titertek-mikrotiterbrønner ved en beleg-gingskonsentrasjon på 50 ng pr. brønn. Rensingen av resep-torene anvendt i ligandreseptorbindingsanalysene er velkjente i teknikken og oppnås lett ved hjelp av velkjente fremgangsmåte for fagfolk. Etter inkubasjon i 18 timer ved 4 °C blir uspesifikke bindingsseter på platen blokkert med 10 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) i Tris-bufret saltløsning. For inhiberingsundersøkelser testes forskjellige konsentrasjoner av utvalgte antistoffer eller peptider for evnen til å blokkere bindingen av 12<5>1-vitronektin eller andre merkede ligander til integrinreseptorene civps, o. vp3, avpi og O-ubJ^-
Selv om disse ligander oppviser optimal binding av et spesielt integrin, vitronektin av avfJ5 og avp3l og fibrinogen av o.iiBfJ3, tillater inhibering i bindingsundersøkelser ved anvendelse av enten antistoffer eller peptider for å blokkere bindingen av vitronektin til enhver reseptor, nøyaktig bestemmelse av den mengde i mikromol (uM) av peptid som er nødvendig for å inhibere halvmaksimalt bindingen av reseptor til ligand. Radiomerkede ligander anvendes i konsentrasjoner på 1 nM, og bindingen utfordres separat med umerkede, syntetiske peptider. Etter inkubasjon i 3 timer fjernes fri ligand ved vasking, og bundet ligand påvises ved gammatelling.
Ligandreseptoranalysen beskrevet heri anvendes således for å screene for både sirkulære og lineariserte, syntetiske peptider sammen med monoklonale antistoffer og organiske molekyler som oppviser selektiv spesifisitet for en spesiell integrinreseptor, spesielt avp5, som anvendes som vitronektinreseptor (avPs) antagonister ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse.
8 . In vi vo- regresjon av tumorvevsvekst med gvJ35- antagonister, som målt ved hjelp av kimær mus:menneske-analyse
En in vivo kimær mus:menneskemode11 ble dannet ved å erstatte en del av huden fra en SCID-mus med human neonatal forhud. Den in vivo kimære mus:menneskemodell ble preparert vesentlig som beskrevet av Yan et al., J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993). Kort beskrevet ble et kvadratisk område på 2 cm<2> hud fjernet kirurgisk fra en SCID-mus (6-8 uker gammel) og erstattet med en human forhud. Musen ble bedøvd, og håret ble barbert bort fra et 5 cm<2> område på hver side av det laterale bukområdet. To sirkulære transplantasjonsområder på 2 cm<2> ble preparert ved å fjerne hele tykkelsen av huden ned til fascia. Humane hudtransplantater avledet fra human neonatal forhud med full tykkelse og samme størrelse ble plassert på sårområdene og sydd på plass. Transplantatene ble dekket med et plaster som ble sydd fast til huden. Micropore stoff-
tape ble også applisert for å dekke såret.
Etter at hudtransplantatet var etablert ble den humane forhud inokulert med melanomceller. M21-L-humanmelanom-cellelinjen ble anvendt for å danne de faste humane tumorer på de humane hudtransplantater på SCID-musene. En enkeltcelle-suspensjon av 2 x IO<6> M21-L ble injisert intradermalt i det humane hudtransplantat. Musene ble deretter observert i 2-
4 uker for å tillate vekst av målbare humane tumorer.
Etter at en målbar tumor var etablert, ble enten
250 ug av peptidet (i et volum på 100 ul) med SEKV.ID. NR. 9 (syklisk RGD-inneholdende peptid, Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-metylert Val) eller et kontrollpeptid, syklo-Arg-pAla-Asp-D-Phe-Val, injisert intraperitonealt i musen 3 ganger pr. uke i 3 uker. Ved slutten av denne tid ble tumoren utskåret og analysert ved hjelp av vekt og histologi.
Resultatene er vist i figur 9, hvor tumorvolumet i mm<3> er plottet på Y-aksen mot peptidbehandlingene på X-aksen. Testpeptidet med SEKV.ID. NR. 9, merket i figuren som peptid 189, reduserte vesentlig tumorvolumet til ca. 25 mm3, sammenlignet med kontrollpeptid (merket som peptid 601), hvor tumorvolumet var større enn 300 mm<3>.
Blokkeringen av avp5-reseptoren ved intravenøs applisering av avJ3s-antagonistpeptid 189 resulterte således i en regresjon av en melanomtumor i dette modellsystem på samme måten som CAM- og kaninøyemode11systemene, som beskrevet tidligere.
Den ovenfor beskrevne SCID/humane kimære modell anvendes også for å vurdere effektiviteten av andre avps-antagonister ifølge foreliggende oppfinnelse, nemlig antistoffer og organiske molekyler, der de sistnevnte fremstilles som beskrevet i eksempel 10.
9. Fremstilling av en musemodell for g^- formidlet retinal angiogenese og inhiberin<g> av denne med avP5~ antaqonister
Basert på observasjonen i eksempel 2C av ctvp3- og avP5-ekspresjon i retinalt, neovaskulært vev, ble en ny musemodell anvendt for å undersøke virkningene av systemisk administrerte antagonister av syklisk peptid i begge integriner på retinal angiogenese. Nyfødte mus utvikler retinal-blodårer under de første 2 uker etter fødselen, hvor den retinale overflatevaskulatur danner et rikt, ytterst forgrenet nettverk av blodårer som begynner ved det optiske nervehodet og stråler ut perifert for å dekke retinaoverflaten på en måte lignende den observert hos andre pattedyr og mennesker (Jiang et al., Glia, 15:1-10 (1995).
For modellen ble nyfødte mus injisert subkutant to ganger pr. dag i 4 dager med start fra dag 0 med det sykliske peptid RGDfV (SEKV.ID. NR. 4) (også referert til som peptid 203) eller kontrollpeptidet RADfV (SEKV.ID. NR. 5). På den 5. dag etter fødselen ble øyeepler fjernet og fiksert i 4,0 % i paraformaldehyd (PFA) ved romtemperatur.
For å kvantifisere retinal angiogenese hos mus ble distansen fra det optiske nervehodet til det mest distale punkt på ett enkelt blodkar utvalgt i hver av seks like
sektorer rundt en 12 timers klokke, målt. Den gjennomsnittlige i distanse ble beregnet, og gjennomsnitt ble beregnet med lignende data oppnådd fra et helt kull. For å måle det totale volum av retinale blodkar ble hele prøven skannet i 2,0 fm optiske snitt og lagret digitalt. "Seed"-funksjonen i Bio-Rads
Lasersharp-software ble deretter anvendt for å beregne
> terskelverdien og telle kubiske "PIXELS" i hvert snitt. En makro ble skrevet for å summere volumet av alle snitt og bestemme verdien for alle vaskulære strukturer.
Med den direkte måling av blodkarvekst i to dimen-sjoner fra fotografier inhiberte systemisk administrert 5 peptidantagonist 203 retinal vaskulogenese, i forhold til kontrollpeptid, med 44 % (N = 9, p < 0,0000001, paret t-test). Ingen statistisk forskjell ble observert mellom ubehandlede nyfødte mus og 5 dager gamle mus som mottok peptid 203, og peptidet inhiberer således effektivt vaskulogenese. Ingen statistisk forskjell ble dessuten observert mellom ubehandlede 5 dager gamle mus og musene med samme alder som mottok kontrollpeptid. Inhibering av retinal vaskulogenese i RGDfV-behandlede nyfødte mus er således effektivt 100 %, sammenlignet med ubehandlede motparter.
Ved anvendelse av en mer kvantitativ analyse ved benyttelse av blodårevekstens tredimensjonale natur ble det observert en 78 % reduksjon av det retinale vaskulære volum hos dyrene behandlet med peptid 203, sammenlignet med kontrol-lene. Gjennomsnittsvolumet av blodkar på dag 5 etter fødselen hos 203-behandlede dyr var 3,6 x IO<6>^m<3>, og hos kontroll-behandlede dyr 15,7 x IO<6> fim3. Volumet okkupert av retinale blodkar hos ubehandlede nyfødte muB kunne ikke skjelnes fra de 5 dager gamle 203-behandlede dyr.
Resultatene oppnådd ovenfor, viste at antagonistene spesifikt blokkerte dannelse av nye blodkar uten effekt på etablerte blodkar. Resultatene indikerer at patologien for retinal, neovaskulær sykdom er forskjellig fra den observerte hos subretinal, neovaskulær sykdom, og at antagonister av avP5 er effektive for behandling av pasienter med blindhetssykdom assosiert med angiogenese.
Lignende analyser er utført med de organiske avp5-antagonistetterligninger fremstilt som beskrevet i eksempel 10.
10. Fremstillin<g> av organiske aTB5- antaaonistmolekyler
Syntesen av organiske ctvp5-antagonistforbindelser 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 og 18 er beskrevet nedenfor og er også vist i de oppførte figurer. De resulterende organiske molekyler, referert til som organiske etterligninger ifølge foreliggende oppfinnelse, anvendes deretter i fremgangsmåtene for inhibering av avp5-formidlet angiogenese.
For hver av syntesene beskrevet nedenfor ble optiske rotasjoner målt på Perkin-Elmer-spektrofotometer, UV- og synlige spektra ble registrert på Beckmann DU-70-spektrometer. <X>H- og <13>C-NMR-spektra ble registrert ved 400 og 500 MHz på Bruker AMX-400- og AMX-500-spektrometer. HøyoppløsningBmasse-spektra (HRMS) ble registrert på et VG ZAB-ZSE-massespektro-meter under hurtig atombombardement(FAB)-betingelser. Kolonne-kromatografi ble utført med kiselgel på 70-230 mesh. Prepara-tiv TLC ble utført på Merck, art. 5744 {0,5 mm). Smeltepunkter ble målt på et Thomas Hoover-apparat.
A. Forbindelse 1: t- BOC- L- tyrosinbenzylester som
illustrert i figur 10
Til en oppløsning av N-(tert.-butoksykarbony1)-L-tyrosin(t-BOC-L-tyrosin) (1,0 ekv.; Aldrich) i 0,10 M (M) metylenklorid ble det tilsatt disykloheksylkarbodiimid (DCC) (1,5 ekv.) ved 25 °C, og blandingen ble omrørt i 1 time. Deretter ble 1,5 ekv. benzylalkohol tilsatt, og blandingen ble omrørt i ytterligere 12 timer ved 25 °C. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket to ganger (2 x) med vann, én gang (1 x) med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi. Forbindelse 1, t-BOC-L-tyrosinbenzylester, er også kommersielt tilgjengelig fra Sigma. B. Forbindelse 2: ( S)- 3-( 4- f4- brombutyloksy) fenvl- 2-N- tert.- butyloksykarbonvlpropionsyrebenzylester som illustrert i figur 10. trinn i
En blanding av t-BOC-L-tyrosinbenzylester (2 g, 5,38 mmol; syntetisert som beskrevet ovenfor), 1,4-dibrombutan (1,9 ml, 16,2 mmol; Aldrich), kaliumkarbonat (5 g) og 18-krone-6 (0,1 g; Aldrich) ble oppvarmet ved 80 °C i 12 timer. Etter avkjøling ble bunnfallet filtrert fra, og reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet i vakuum. Råproduktet ble deretter renset ved krystallisering ved anvendelse av 100 % heksan for å gi 2,5 g (92 %) av forbindelse 2.
C. Forbindelse 3: ( S )- 3 -( 4- f4- azidobutyloksy) fenyl-2- N- tert.- butyloksykarbonylpropionsyrebenzylester som illustrert i figur 10. trinn ii
Forbindelse 2 (2,5 g, 4,9 mmol) ble omrørt med natriumazid (1,6 g, 25 mmol) i dimetylformamid (DMF) (20 ml) ved 25 °C i 12 timer. Løsningsmidlet ble deretter avdampet, og resten ble behandlet med vann (ca. 10 ml) og ekstrahert to ganger med etylacetat. De organiske lag ble kombinert, tørket via magnesiumsulfat og avdampet for å gi 2,0 g (90 %) av forbindelse 3 som en fargeløs sirup. FAB-MS: 469 (M + H<+>).
D. Forbindelse 4: lS )- 3 -( 4- f4- azidobutyloksy) fenyl-2- aminopropionsvrebenzvlester som illustrert i figur 10. trinn iii
Forbindelse 3 (2,0 g (4,4 mmol)) ble oppløst i trifluoreddiksyre (TFA; 2 ml) og omrørt i 3 timer ved romtemperatur. Inndamping i vakuum gav 1,6 g (kvantitativt) av forbindelse 4 som en fargeløs sirup, som ble anvendt uten ytterligere rensing i det neBte trinn. FAB-MS: 369 {M + H<+>).
E. Forbindelse 5: ( S)- 3-( 4-( 4- azidobutvloksv) fenvl-2- buty1su1fonamidopropionsyrebenzylester som illustrert i figur 10. trinn iv
En blanding av forbindelse 4 (1,6 g, 4,3 mmol), butansulfonsyreklorid (0,84 ml, 6,6 mmol) og trietylamin (1,5 ekv.) ble omrørt i metylenklorid (20 ml) i 12 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet, og resten ble oppløst i etylacetat, vasket med fortynnet HCl, vandig natriumbikarbonat og vann. Etter inndamping til tørrhet ble råproduktet renset ved flashkromatografi (kiselgel, toluen/etylacetat, 15:1) for å gi 1,4 g (67 %) av forbindelse 5 som et amorft, fast materiale.
F. Forbindelse 6: ( S)- 3-( 4-( 4- aminobutyloksy) fenyl-2- butylsulfonamidopropionByre som illustrert i figur 10. trinn v
Forbindelse 5 (1,3 g (2,6 mmol)) ble oppløst i 20 ml etylacetat/metanol/vann, 5/3/1, og 0,2 ml trifluoreddiksyre
(TFA) og hydrogenert under hydrogen (1 atmosfære; Parr-risteapparat) ved 25 °C i nærvær av 100 mg palladium (10 % på aktivt karbon). Etter 3 timer ble katalysatoren filtrert fra,
og løsningsmidlet ble avdampet for å gi forbindelse 6 som en ; oljeaktig rest. Etter lyofilisering fra vann ble det oppnådd 1,0 g (kvantitativt) av forbindelse 6 som et hvitt pulver.
FAB-MS: 373 (M + H<+>).
G. Forbindelse 7: ( S)- 3-( 4- f4- guanidinobutyloksy)-) fenyl- 2- butylsulfonamidopropionsyre som illustrert i figur 10. trinn vi
Forbindelse 6 (200 mg, 0,5 mmol), 3,5-dimetylpyrazol-1-karboksamidinnitrat (DPFN) (170 mg, 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) og trietylamin (0,15 ml, 1,0 mmol) i dimetylformamid (DMF; 5 ml) ble oppvarmet ved 60 °C i 12 timer. Etter avkjøling ble løsningsmidlet avdampet i vakuum, og resten ble renset ved HPLC (Lichrocart RP-18, gradient: acetonitril/vann + 0,3 % TFA, 99:1 til 1:99) for å gi 50 mg (25 %) av forbindelse 7 som et hvitt, amorft pulver etter lyofilisering. FAB-MS: 415 (M + H<+>), smp. 70 °C.
H. Forbindelse 8: ( S)- 3-( 4- f4- aminobutvloksv) fenyl-2- N- tert.- butvloksvkarbonylpropionsvre som illustrert i figur 11, trinn iii
Forbindelse 3 (0,5 g, 1,07 mmol) ble oppløst i 10 ml etylacetat/metanol/vann, 5/3/1, og 0,1 ml trifluoreddiksyre (TFA) og hydrogenert under hydrogen (1 atmosfære; Parr-risteapparat) ved 25 °C i nærvær av 30 mg palladium (10 % på aktivt karbon). Etter 3 timer ble katalysatoren filtrert fra, og løsningsmidlet ble avdampet for å gi forbindelse 8 som en oljeaktig rest. Etter lyofilisering fra vann ble det erholdt 370 mg (kvantitativt) av forbindelse 8 som et hvitt pulver. FAB-MS: 353 (M + H+) .
I. Forbindelse 9: fS)- 3— <4- f4- auanidinobutyloksy>-fenvl- 2- N- tert.- butyloksykarbonylpropionsvre som illustrert i figur 11. trinn iv
Forbindelse 8 (200 mg, 0,5 mmol), 3,5-dimetylpyrazol-1-karboksamidinnitrat (DPFN) (170 mg, 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) og trietylamin (0,15 ml, 1,0 mmol) i dimetylformamid (DMF; 5 ml) ble oppvarmet ved 60 °C i 12 timer. Etter avkjøling ble løsningsmidlet avdampet i vakuum, og resten ble renset ved HPLC (Lichrocart RP-18, gradient: acetonitril/vann + 0,3 % TFA, 99:1 til 1:99) for å gi 160 mg (90 %) av forbindelse 9 som et hvitt, amorft pulver etter lyofilisering. FAB-MS: 395 (M + H+) . J. Forbindelse 10: f R)- 3- f 4-( 4- quanidinobutvlokBy)-fenvl- 2- butylsulfonamidopropionsvre som illustrert i figur 12. trinnene i- iv
En reaksjonssekvens identisk med sekvensen for syntese av forbindelse 7 ble anvendt for å fremstille D-tyrosinanalogen 10, som ble erholdt i en mengde på 205 mg som et hvitt, amorft materiale, FAB-MS: 415 (M + H<+>), ved anvendelse av de intermediære forbindelser 100-600 for å danne forbindelse 10.
1) Forbindelse 100: t- BOC- D- tyrosinbenzylester som illustrert i figur 12
Til en oppløsning av N-(tert.-butoksykarbonyl)-D-tyrosin(t-BOC-L-tyrosin) (1,0 ekv.; Aldrich) i 0,10 M metylenklorid ble det tilsatt disykloheksylkarbodiimid (DCC)
(1,5 ekv.) ved 25 °C, og blandingen ble omrørt i 1 time.
1,5 ekv. benzylalkohol ble deretter tilsatt, og blandingen ble omrørt i ytterligere 12 timer ved 25 °C. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltløsning og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble deretter renset ved kiselgelkolonnekromatografi.
2) Forbindelse 200: ( R)- 3- f4- f4- brombutyloksy) fenvl-2- N- tert.- butvloksykarbonylpropionsyrebenzylester som illustrert i figur 12, trinn i
En blanding av t-BOC-D-tyrosinbenzylester (2 g,
5,38 mmol; syntetisert som beskrevet ovenfor), 1,4-dibrombutan (1,9 ml, 16,2 mmol; Aldrich), kaliumkarbonat (5 g) og 18-krone-6 (0,1 g; Aldrich) ble oppvarmet ved 80 °C i 12 timer. Etter avkjøling ble bunnfallet filtrert fra, og reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet i vakuum. Råproduktet ble deretter renset ved krystallisering ved anvendelse av 100 % heksan for å gi 2,5 g (92 %) av forbindelse 200.
3) Forbindelse 300: fR)- 3-( 4-( 4- azidobutyloksy)-fenvl- 2- N- tert.- butvloksvkarbonvlpropionsyre-benzylester som illustrert i figur 12, trinn ii
Forbindelse 200 (2,5 g, 4,9 mmol) ble omrørt med natriumazid (1,6 g, 25 mmol) i dimetylformamid (DMF) (20 ml) ved 25 °C i 12 timer. Løsningsmidlet ble deretter avdampet, og resten ble behandlet med vann (ca. 10 ml) og ekstrahert to ganger med etylacetat. De organiske lag ble kombinert, tørket via magnesiumsulfat og avdampet for å gi 2,0 g (90 %) av forbindelse 300 som en fargeløs sirup, FAB-MS: 469 (M + H<+>).
4) Forbindelse 400: ( R)- 3-( 4- f4- azidobutyloksy)-fenyl- 2- aminopropionsvrebenzvlester som illustrert i figur 12, trinn iii
Forbindelse 300 (2,0 g (4,4 mmol)) ble oppløst i trifluoreddiksyre (TFA; 2 ml) og omrørt i 3 timer ved romtemperatur. Inndamping i vakuum gav 1,6 g (kvantitativt) av forbindelse 400 som en fargeløs sirup, som ble anvendt uten ytterligere rensing i det neste trinn. FAB-MS: 369 (M + H<+>).
5) Forbindelse 500: fR)- 3-( 4-( 4- azidobutyloksy)-fenvl- 2- butvlsulfonamidopropionsyrebenzylester' som illustrert i figur 12. trinn iv
En blanding av forbindelse 400 (1,6 g, 4,3 mmol), butansulfonsyreklorid (0,84 ml, 6,6 mmol) og trietylamin (1,5 ekv.) ble omrørt i metylenklorid (20 ml) i 12 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet, og resten ble oppløst i etylacetat, vasket med fortynnet HCl, vandig natriumbikarbonat og vann. Etter inndamping til tørrhet ble råproduktet renset ved flashkromatografi (kiselgel, toluen/etylacetat, 15:1) for å gi 1,4 g (67 %) av forbindelse 500 som et amorft, fast materiale.
6) Forbindelse 600: ( R)- 3- f4- f4- aminobutyloksy)-fenvl- 2- butvlsulfonamidopropionsyre som illustrert i figur 12. trinn v
Forbindelse 500 (1,3 g (2,6 mmol)) ble oppløst i
20 ml etylacetat/metanol/vann, 5/3/1, og 0,2 ml trifluoreddiksyre (TFA) og hydrogenert under hydrogen (1 atmosfære; Parr-risteapparat) ved 25 °C i nærvær av 100 mg palladium (10 % på aktivt karbon). Etter 3 timer ble katalysatoren filtrert fra, og løsningsmidlet ble avdampet for å gi forbindelse 600 som en oljeaktig rest. Etter lyofilisering fra vann ble 1,0 g (kvantitativt) av forbindelse 600 erholdt som et hvitt pulver. FAB-MS: 373 (M + H<+>). 7) Forbindelse 10: <R)- 3-( 4- f4- guanidinobutvloksv)-fenyl- 2- butvlsulfonamidopropionsvre som illustrert i figur 12. trinn vi
Forbindelse 600 (200 mg, 0,5 mmol), 3,5-dimetyl-pyrazol-l-karboksamidinnitrat (DPFN) (170 mg, 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) og trietylamin (0,15 ml, 1,0 mmol) i dimetylformamid (DMF; 5 ml) ble oppvarmet ved 60 °C i 12 timer. Etter avkjøling ble løsningsmidlet avdampet i vakuum, og resten ble renset ved HPLC (Lichrocart RP-18, gradient: acetonitril/vann + 0,3 % TFA, 99:1 til 1:99) for å gi 50 mg (25 %) av forbindelse 10 som et hvitt, amorft pulver etter lyofilisering. FAB-MS: 415 (M + H<+>), smp. 70 °C.
K. Forbindelse 11: ( S)- 3-( 4-( 4- azidobutyloksy) fenvl-2- ( 10- kamf ersulf onanvido ^ propionsYrebenzylester som illustrert i figur 13
En blanding av forbindelse 4 (1,0 g, 2,7 mmol), 10-kamfersulfonsyreklorid (6,6 mmol; Aldrich Chemical Company) og trietylamin (1,5 ekv.) ble omrørt i metylenklorid (20 ml) i 12 timer ved romtemperatur. Re aksjonsblandingen ble deretter inndampet, og resten ble oppløst i etylacetat, vasket med fortynnet HCl, vandig natriumbikarbonat og vann. Etter inndamping til tørrhet ble råproduktet renset ved flashkromatografi (kiselgel, toluen/etylacetat, 15:1) for å gi 1,4 g (67 %) av forbindelse 11 som et amorft, fast materiale. L. Forbindelse 12: ( S)- 3-( 4-( 4- quanidinobutyloksy)-fenyl- 2-( 10- kamfersulfonamido) propionsvre som illustrert i figur 13, trinnene i- ii
Forbindelse 12 ble fremstilt etter hydrogenering og guanylering av forbindelse 11 i overensstemmelse med de følgende betingelser: Trinn i: Forbindelse 11 (1,3 g (2,6 mmol)) ble opp-løst i 20 ml etylacetat/metanol/vann, 5/ 3/ 1, og 0,2 ml trifluoreddiksyre (TFA) og hydrogenert under hydrogen (1 atmosfære; Parr-risteapparat) ved 25 °C i nærvær av 100 mg palladium (10 % på aktivt karbon). Etter 3 timer ble katalysatoren filtrert fra, og løsningsmidlet ble avdampet for å gi det intermediære amin som en oljeaktig rest. Etter lyofilisering fra vann ble det erholdt 1,0 g (kvantitativt) av det intermediære amin som et hvitt pulver, som ble viderebehandlet som følger: Trinn ii: Den ovenfor dannede intermediære amin-forbindelse (200 mg, 0,5 mmol), 3,5-dimetylpyrazol-l-karboks-amidinnitrat (DPFN) (170 mg, 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) og trietylamin (0,15 ml, 1,0 mmol) i dimetylformamid (DMF; 5 ml) ble oppvarmet ved 60 °C i 12 timer. Etter av-kjøling ble løsningsmidlet avdampet i vakuum, og resten ble renset ved HPLC (Lichrocart RP-18, gradient: acetonitril/vann + 0,3 % TFA, 99:1 til 1:99) for å gi 50 mg (25 %) av forbindelse 12 som et hvitt, amorft pulver etter lyofilisering. FAB-MS: 509,6 (M + H+) . M. Forbindelse 13: ( S)- 3- f4- f5- brompentvloksy) fenvl-2- N- tert.- butvloksykarbonylpropionsvrebenzvlester som illustrert i figur 13
En blanding av t-BOC-L-tyrosinbenzylester (4,5 g, 12,1 mmol; forbindelse 1, syntetisert som beskrevet ovenfor), 1,5-dibrompentan (5 ml, 36,7 mmol; Aldrich), kaliumkarbonat (10 g) og 18-krone-6 (0,25 g; Aldrich) ble oppvarmet ved 80 °C i 12 timer. Etter avkjøling ble bunnfallet filtrert fra, og reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet i vakuum. Råproduktet ble deretter renset ved krystallisering ved anven-deise av 100 % heksan for å gi 5,35 g (85 %) av forbindelse 13.
N. Forbindelse 14: fS)- 3-( 4- f5- ouanidinopentyloksy)-fenyl- 2- butylsulfonamidopropionsvre som illustrert i figur 13. trinnene i- v
Reaksjonssekvensen på fem trinn med brom-azidutbyt-ting, BOC-spalting, sulfonylering med butansulfonsyreklorid, hydrogenering og guanylering med DPFN ble utført identisk med prosedyrene beskrevet ovenfor ved anvendelse av de intermediære forbindelser 1—6 for å danne forbindelse 7, eller prosedyrene ved anvendelse av forbindelser 100-600 for å danne forbindelse 10, som beskrevet ovenfor. Forbindelse 14 ble erholdt som et hvitt pulver. FAB-MS: 429 (M + H<+>).
O. Forbindelse 15: 3- f4- amidinofenyl)- 5- f4-( 2-karboksv- 2- aminoetvl) fenoksv^ metvl- 2- oksazolidinon- dihvdroklorid som vist i figur 14
1) Syntese av startmaterialet 2- N- BOC- amino- 3- f4-hydroksyfenyppropionat for forbindelse 15
Startmaterialet 2-N-BOC-amino-3-(4-hydroksyfenyl)-propionat ble erholdt via forestring av (D eller L), N-(tert.-butoksykarbonyl)-L(D)-tyrosin (t-BOC-L(D)-tyrosin) (1,0 ekv.; Sigma) i 0,10 M metanol og fortynnet 1 % HCl. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 25 °C i 12 timer og deretter nøytralisert via kaliumkarbonat, fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde 2-N-BOC-amino-3-(4-hydroksyfenyl)-
propionat.
2) Syntese av startmaterialet 3- p- N- BOC- amidino-fenyl- 5- metansulfonvloksvmetYl- 2- oksazolidinon for forbindelse 15: 3- trinnsprosedvre som følger p-aminobenzonitril (1,0 ekv.; Aldrich) i metylen-
klorid (0,10 M) ble omrørt med 2,3-epoksypropanol (1,0 ekv.; Aldrich) i 12 timer ved 25 °C. Løsningsmidlet ble deretter
fjernet i vakuum, og råproduktet 4-(2,3-dihydroksypropyl-amino)benzonitril ble overført til neste trinn som følger: 4-(2,3-dihydroksypropylamino)benzonitril (1,0 ekv.;
som beskrevet ovenfor) i dimetylformamid (0,10 M) ved 25 °C
ble omrørt med dietylkarbonat (1,1 ekv.; Aldrich) og kalium-tert.-butylat (1,1 ekv.; Aldrich) ved 110 °C i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat
(0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket
over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde 3-(4-cyanofenyl)-5-hydroksymetyl-2-oksa-zolidin, som ble overført til neste trinn som følger:
3-(4-cyanofenyl)-5-hydroksymetyl-2-oksazolidin
(1,0 ekv.; som beskrevet ovenfor) i metylenklorid (0,10 M) ved
25 °C ble omrørt med 1,1 ekv. hydrogensulfid, 1,1 ekv. metyl-jodid og 1,1 ekv. ammoniumacetat. Reaksjonsblandingen ble om-
rørt i 6 timer og deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M)
og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum,
og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde amidinet, som ble overført til neste trinn som følger:
1,0 ekv. av amidinet, syntetisert som beskrevet ovenfor, ble beskyttet med 1,1 ekv. BOC-ON (2-(BOC-oksyimino)-2-fenylacetonitril; Aldrich) i metylenklorid (0,10 M) ved 25 °C og omrørt i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble forestret i 0,10 M metylenklorid og 1,1 ekv. metansulfonylklorid. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0 °C i 6 timer, reaksjonen ble deretter stanset med vann (5 ekv.) og deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-metansulfonyloksymetyl-2-oksazolidinon. 3) Kopling av mellom<p>rodukt 2-N-BOC-amino-3-(4-hydroksyfenyl) propionat med 3- p- N- BOC- amidino-fenyl- 5- metansulfonyloksymetyl- 2- oksa20lidinon for å danne beskyttet form av forbindelse 15, 3-( 4- BOC- amidinofenyl\~ 5 -( 4-( 2- metoksykarbonyl- 2- N-BOC- aminoetvl) fenoksylmetvl- 2- oksazolidinon En blanding av 1,9 g 2-N-BOC-amino-3-(4-hydroksy-fenyl)propionat (som beskrevet ovenfor), 20 ml dimetylformamid (DMF) og NaH (1,0 ekv.) ble omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. Etter omrøring ble 1,8 g 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-metansulfonyloksymetyl^2-oksazolidinon (som beskrevet ovenfor) i 10 ml dimetylformamid (DMF) tilsatt, og blandingen ble omrørt på nytt i 15 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde beskyttet form av forbindelse 15, 3-(4-BOC-amidino-fenyl)-5-(4-(2-metoksykarbonyl-2-N-BOC-aminoetyl)fenoksyl-metyl-2-oksazolidinon, som ble overført til neste trinn. 4) Avbeskyttelse av beskyttet form av forbindelse 15 for å danne forbindelse 15: 3- f4- amidinofenvl)- 5-( 4-( 2- karboksv- 2- aminoetvl) fenoksy) metyl- 2- oksazolidinon- dihydroklorid. figur 14 Den beskyttede form av forbindelse 15, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2-metoksykarbonyl-2-N-BOC-aminoetyl)-fenoksylmetyl-2-oksazolidinon (1,0 ekv.; syntetisert som beskrevet ovenfor) ble behandlet med 4 ml 2 N NaOH i 4 timer ved romtemperatur. Blandingen ble deretter tilsatt dråpevis 40 ml 2 N HCl-oppløsning i dioksan ved 0 °C til 25 °C i 3 timer. Reaksjonen ble deretter stanset med natriumbikarbonat (5 ekv.), og reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde forbindelse 15: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboksy-2-aminoetyl)fenoksy)metyl-2-oksazolidinon-dihydroklorid, smp. 165 °C (d). P. Forbindelse 16: 3-( 4- amidinofenvl)- 5-( 4-( 2-karboksv- 2- N- butvlsulfonylaminoetyl) fenoksy)-metyl- 2- oksazolidinon som vist i figur 14 1) Syntese av startmaterialet 2- N- butylsulfonyl-amino- 3- f4- hvdroksyfenvl^ propionat for for bindelse 16
Startmaterialet 2-N-butylsulfonylamino-3-(4-hydroksy-fenyl)propionat ble erholdt via forestring av ((D eller L) tyrosin) (1,0 ekv.; Sigma) i 0,10 M metanol og fortynnet 1 % HCl. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 25 °C i 12 timer og deretter nøytralisert med kaliumkarbonat og deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble viderebehandlet som følger: En blanding av den ovennevnte forbindelse (4,3 mmol), butansulfonsyreklorid (6,6 mmol) og trietylamin (1,5 ekv.) ble omrørt i metylenklorid (20 ml) i 12 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet, og resten ble opp-løst i etylacetat, vasket med fortynnet HCl, vandig natriumbikarbonat og vann. Etter inndamping til tørrhet ble råproduktet renBet ved flashkromatografi (kiselgel, toluen/etylacetat, 15:1) for å gi tittelforbindelsen. 2) Syntese av startmaterialet 3- p- N- BOC- amidino-fenyl- 5- metansulfonvloksymetvl- 2- oksazolidinon for forbindelse 16: 3- trinnsprosedyre som følger p-aminobenzonitril (1,0 ekv.; Aldrich) i metylenklorid (0,10 M) ble omrørt med 2,3-epoksypropanol (1,0 ekv.; Aldrich) i 12 timer ved 25 °C. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet 4-(2,3-dihydroksypropyl-amino)benzonitril ble overført til neste trinn som følger: 4-(2,3-dihydroksypropylamino)benzonitril (1,0 ekv.; som beskrevet ovenfor) i dimetylformamid (0,10 M) ved 25 °C ble omrørt med dietylkarbonat (1,1 ekv.; Aldrich) og kalium-tert.-butylat (1,1 ekv.; Aldrich) ved 110 °C i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde 3-(4-cyanofenyl)-5-hydroksymetyl-2-oksa-zolidin og overført til neste trinn som følger:
3-(4-cyanofenyl)-5-hydroksymetyl-2-oksazolidin
(1,0 ekv.; som beskrevet ovenfor) i metylenklorid (0,10 M) ved 25 °C ble omrørt med 1,1 ekv. hydrogensulfid, 1,1 ekv. metyl-jodid og 1,1 ekv. ammoniumacetat. Reaksjonsblandingen ble om-rørt i 6 timer og deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for
å erholde amidinet, som ble overført til neste trinn som følger: 1,0 ekv. av amidinet, syntetisert som beskrevet ovenfor, ble beskyttet med 1,1 ekv. BOC-ON (2-(BOC-oksyimino)-2-fenylacetonitril; Aldrich) i metylenklorid (0,10 M) ved 25 °C og omrørt i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble forestret i 0,10 M metylenklorid og 1,1 ekv. metansulfonylklorid. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0 °C i 6 timer, reaksjonen ble deretter stanset med vann (5 ekv.) og deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-metansulfonyloksymetyl-2-oksazolidinon.
3) Ko<p>lin<g> av mellomprodukt 2- N- butylsulfonylamino-3- f4- hydroksyfenyl) propionat med 3- p- N- BOC-amidinof envl- 5- metansulfonyloksymetyl- 2- oksazolidinon for å danne beskyttet form av forbindelse 16. 3- 1 4- BOC- amidinofenvl)- 5-( 4-( 2- metoksykarbo-nvl- 2- N- butylsulfonvlaminoetyl) fenoksylmetyl- 2-oksazolidinon
En blanding av 1,9 g 2-N-butylsulfonylamino-3-(4-hydroksyfenyl)propionat (som beskrevet ovenfor), 20 ml dimetylformamid (DMF) og NaH (1,0 ekv.) ble omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. Etter omrøring ble 1,8 g 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5-metansulfonyloksymetyl-2-oksazolidinon (som beskrevet ovenfor) i 10 ml dimetylformamid (DMF) tilsatt, og blandingen ble omrørt på nytt i 15 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde beskyttet form av forbindelse 16, 3-(4-BOC-amidino-fenyl)-5-(4-(2-metoksykarbonyl-2-N-butylsulfonylaminoetyl)-fenoksylmetyl-2-oksazolidinon, som ble overført til neste
trinn.
4) Avbeskvttelse av beskyttet form av forbindelse 16 for å danne forbindelse 16: 3-( 4- amidinofenvl)- 5-( 4- f 2- karboksy- 2- N- butvlsulfonylaminoetyl)-fenoksv) metyl- 2- oksazolidinon. figur 14
Den beskyttede form av forbindelse 16, 3-(4-BOC-amidinofenyl )-5-(4-(2-metoksykarbonyl-2-N-butylsulf onylamino-etyl) f enoksylmetyl-2-oksazolidinon (1,0 ekv.; syntetisert som beskrevet ovenfor) ble behandlet med 4 ml 2 N NaOH i 4 timer ved romtemperatur. Blandingen ble deretter tilsatt dråpevis 40 ml 2 N HCl-oppløsning i dioksan ved 0 °C til 25 °C i
3 timer. Reaksjonen ble deretter stanset med natriumbikarbonat (5 ekv.), og reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselge1-kolonnekromatografi for å erholde forbindelse 16: 3-(4-amidinof enyl) -5-( 4- (2-karboksy-2-N-butylsulfonylaminoetyl) - fenoksy)mety1-2-oksazolidinon, smp. 236-237 °C. Q. Forbindelse 17: 3-( 4- amidinofenyl)- 5- f4- f2-karboksv- 2- N- propvlsulfonylaminoetyl) fenoksy)-metyl- 2- oksazolidinon som vist i figur 14 1) Syntese av startmaterialet 2- N- propvlsulfonyl-amino- 3-( 4- hydroksyfenyl) propionat for forbindelse 17
Startmaterialet 2-N-propylsulfonylamino-3-(4-hydroksyfenyl)propionat ble erholdt via forestring av ((D eller L) tyrosin) (1,0 ekv.; Sigma) i 0,10 M metanol og fortynnet 1 % HCl. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 25 °C i 12 timer og deretter nøytralisert med kaliumkarbonat, fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble viderebehandlet som følger: En blanding av den ovennevnte forbindelse (4,3 mmol), propylsulfonsyreklorid (6,6 mmol; Aldrich) og trietylamin (1,5 ekv.) ble omrørt i metylenklorid (20 ml) i 12 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet, og resten ble oppløst i etylacetat, vasket med fortynnet HCl, vandig natriumbikarbonat og vann. Etter inndamping til tørrhet ble råproduktet renset ved flashkromatografi (kiselgel, toluen/etylacetat, 15:1) for å gi tittelforbindelsen. 2) Syntese av startmaterialet 3- p- N- BOC- amidino-fenyl- 5- metanBulfonyloksymetvl- 2- oksazolidinon for forbindelse 17: 3- trinnsprosedvre som følger p-aminobenzonitril (1,0 ekv.; Aldrich) i metylenklorid (0,10 M) ble omrørt med 2,3-epoksypropanol (1,0 ekv.; Aldrich) i 12 timer ved 25 °C. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet 4-(2,3-dihydroksypropyl-amino)benzonitril ble overført til neste trinn som følger: 4-(2,3-dihydroksypropylamino)benzonitril (1,0 ekv.; som beskrevet ovenfor) i dimetylformamid (0,10 M) ved 25 °C ble omrørt med dietylkarbonat (1,1 ekv.; Aldrich) og kalium-tert.-butylat (1,1 ekv..; Aldrich) ved 110 °C i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde 3-(4-cyanofenyl)-5-hydroksymetyl-2-oksa-zolidin og overført til neste trinn som følger:
3-(4-cyanofenyl)-5-hydroksymetyl-2-oksazolidin
(1,0 ekv.; som beskrevet ovenfor) i metylenklorid (0,10 M) ved 25 °C ble omrørt med 1,1 ekv. hydrogensulfid, 1,1 ekv. metyl-jodid og 1,1 ekv. ammoniumacetat. Reaksjonsblandingen ble om-rørt i 6 timer og deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over
magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde amidinet, som ble overført til neste trinn som følger: 1,0 ekv. av amidinet, syntetisert som beskrevet ovenfor, ble beskyttet med 1,1 ekv. BOC-ON {2-(BOC-oksyimino)-2-fenylacetonitril; Aldrich) i metylenklorid (0,10 M) ved 25 °C og omrørt i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble forestret i 0,10 M metylenklorid og 1,1 ekv. metansulfonylklorid. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0 °C i 6 timer, reaksjonen ble deretter stanset med vann (5 ekv.) og deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-metansulfonyloksymetyl-2-oksazolidinon.
3) Kopling av mellom<p>rodukt 2- N- propvlsulfonvlamino-3-( 4- hydroksyfenvl) propionat med 3-p-N-BOC-amidinof eny 1-5 -met ansul f onvloksvmetvl-2 - oksazolidinon for å danne beskyttet form av forbindelse 17. 3 -( 4- BOC- amidinofenyl)- 5-( 4-( 2-metoksykarbonyl- 2- N- propylsulfonylaminoetyl)-fenoksylmetvl- 2- oksazolidinon
En blanding av 1,9 g 2-N-propylsulfonylamino-3-(4-hydroksyfeny1)propionat (som beskrevet ovenfor), 20 ml dimetylformamid (DMF) og NaH (1,0 ekv.) ble omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. Etter omrøring ble 1,8 g 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5-metansulfonyloksymetyl-2-oksazolidinon (som beskrevet ovenfor) i 10 ml dimetylformamid (DMF) tilsatt, og blandingen ble omrørt på nytt i 15 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde beskyttet form av forbindelse 17, 3-(4-BOC-amidino-fenyl)-5-<4-(2-metoksykarbonyl-2-N-propylsulfonylaminoetyl)-fenoksylmetyl-2-oksazolidinon, som ble overført til neste trinn.
4) Avbeskvttelse av beskyttet form av forbindelse 17 for å danne forbindelse 17: 3-( 4- amidinofenvl)- 5-1 4- f 2- karboksy- 2- N- propylsulfonylaminoetyl)-fenoksy) metyl- 2- oksazolidinon, figur 14
Den beskyttede form av forbindelse 17, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2-metoksykarbonyl-2-N-propylsulfonylamino-etyl) fenoksylmetyl-2-oksazolidinon (1,0 ekv.; syntetisert som beskrevet ovenfor) ble behandlet med 4 ml 2 N NaOH i 4 timer ved romtemperatur. Blandingen ble deretter tilsatt dråpevis 40 ml 2 N HCl-oppløsning i dioksan ved 0 °C til 25 °C i
3 timer. Reaksjonen ble deretter stanset med natriumbikarbonat (5 ekv.), og reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde forbindelse 17: 3-{4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboksy-2-N-propylsulfonylaminoetyl)-fenoksy)metyl-2-oksazolidinon, smp. 200 °C (d). R. Forbindelse 18: 3- <4- amidinofenyl)- 5-( 4-( 2-karboksy- 2- N- etyls ulfonylaminoetyl) fenoksy) mety1-2- oksazolidinon som vist i figur 14 1) Syntese av startmaterialet 2- N- etylsulfonvlamino-3- ( 4- hvdroksyfenyl) propionat for forbindelse 18
Startmaterialet 2-N-etylsulfonylamino-3-(4-hydroksy-fenyl)propionat ble erholdt via forestring av ((D eller L) tyrosin) (1,0 ekv.; Sigma) i 0,10 M metanol og fortynnet 1 % HCl. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 25 °C i 12 timer og deretter nøytralisert med kaliumkarbonat, fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble viderebehandlet som følger: En blanding av den ovennevnte forbindelse (4,3 mmol), etylsulfonsyreklorid (6,6 mmol; Aldrich) og trietylamin (1,5 ekv.) ble omrørt i metylenklorid (20 ml) i 12 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet, og resten ble oppløst i etylacetat, vasket med fortynnet HCl, vandig natriumbikarbonat og vann. Etter inndamping til tørrhet ble råproduktet renset ved flashkromatografi (kiselgel, toluen/etylacetat, 15:1) for å gi tittelforbindelsen. 2) Syntese av startmaterialet 3- p- N- BOC- amidino-fenyl- 5- metansulfonyloksymetyl- 2- oksazolidinon for forbindelse 18: 3- trinnsprosedvre som følger p-aminobenzonitril (1,0 ekv.; Aldrich) i metylenklorid (0,10 M) ble omrørt med 2,3-epoksypropanol (1,0 ekv.; Aldrich) i 12 timer ved 25 °C. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet 4-(2,3-dihydroksypropyl-amino)benzonitril ble overført til neste trinn som følger: 4-(2,3-dihydroksypropylamino)benzonitril (1,0 ekv.; som beskrevet ovenfor) i dimetylformamid (0,10 M) ved 25 °C ble omrørt med dietylkarbonat (1,1 ekv.; Aldrich) og kalium-tert.-butylat (1,1 ekv.; Aldrich) ved 110 °C i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde 3-(4-cyanofenyl)-5-hydroksymetyl-2-oksa-zolidin og overført til neste trinn som følger:
3-(4-cyanofenyl)-5-hydroksymetyl-2-oksazolidin
(1,0 ekv.; som beskrevet ovenfor) i metylenklorid (0,10 M) ved 25 °C ble omrørt med 1,1 ekv. hydrogensulfid, 1,1 ekv. metyl-jodid og 1,1 ekv. ammoniumacetat. Reaksjonsblandingen ble om-rørt i 6 timer og deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M)
og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde amidinet, Bom ble overført til neste trinn som følger: 1,0 ekv. av amidinet, syntetisert som beskrevet ovenfor, ble beskyttet med 1,1 ekv. BOC-ON (2-(BOC-oksyimino)-2-fenylacetonitril; Aldrich) i metylenklorid (0,10 M) ved 25 °C og omrørt i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble forestret i 0,10 M metylenklorid og 1,1 ekv. metansulfonylklorid. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0 °C i 6 timer, reaksjonen ble deretter stanset med vann (5 ekv.) og deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-metansulfonyloksymetyl-2-oksazolidinon.
3) Kopling av mellomprodukt 2- N- etylsulfonylamino- 3-( 4- hydroksyfenyl) propionat med 3- p- N- BOC- amidino-fenyl- 5- metansulfonylokBymetyl- 2- oksazolidinon for å danne beskyttet form av forbindelse 18, 3-( 4- BOC- amidinofenyl)- 5- l 4-( 2- metoksvkarbonvl- 2- N-etvlsulfonYlaminoety1\ fenoksylmety1- 2- oksazolidinon
En blanding av 1,9 g 2-N-etylsulfonylamino-3-(4-hydroksyfeny1)propionat (som beskrevet ovenfor), 20 ml dimetylformamid (DMF) og NaH (1,0 ekv.) ble omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. Etter omrøring ble 1,8 g 3-p-N-BOC-amidino-fenyl-5-metansulfonyloksymetyl-2-oksazolidinon (som beskrevet ovenfor) i 10 ml dimetylformamid (DMF) tilsatt, og blandingen ble omrørt på nytt i 15 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde beskyttet form av forbindelse 18, 3-(4-BOC-amidino-fenyl)-5-(4-(2-metoksykarbonyl-2-N-etylsulfonylaminoetyl)-fenoksylmetyl-2-oksazolidinon, som ble overført til neste trinn.
4) Avbeskvttelse av beskyttet form av forbindelse 18 for å danne forbindelse 18: 3- f4- amidinofenyl)- 5-( 4-( 2- karboksv- 2- N- etYlsulfonylaminoetyl)-fenoksv^ metvl- 2- oksazolidinon, figur 14
Den beskyttede form av forbindelse 18, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2-metoksykarbonyl-2-N-etylBulfonylamino-etyl) fenoksylmetyl-2-oksazolidinon (1,0 ekv.; syntetisert som beskrevet ovenfor) ble behandlet med 4 ml 2 N NaOH i 4 timer ved romtemperatur. Blandingen ble deretter tilsatt dråpevis 40 ml 2 N HCl-oppløsning i dioksan ved 0 °C til 25 °C i
3 timer. Reaksjonen ble deretter stanset med natriumbikarbonat (5 ekv.), og reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (0,10 M) og vasket 2 x med vann, 1 x med saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og råproduktet ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi for å erholde forbindelse 18: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboksy-2-N-etylsulfonylaminoetyl)-fenoksy)metyl-2-oksazolidinon, smp. 212 °C (d). s

Claims (18)

1. Anvendelse av en spesifikk avps-antagonist ved fremstilling av et medikament for inhibering av ocvp5-f ormidlet angiogenese i et avp5-inneholdende vev, hvori den spesifikke avP5-antago-nisten er et RGD-inneholdende polypeptid.
2. Anvendelse av en ccvP5-antagonist ifølge krav 1, hvori polypeptidet er utvalgt fra gruppen bestående av syklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEKV.ID. NR. 4), syklo(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEKV.ID. NR. 6), syklo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEKV.ID. NR. 7), Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe (SEKV.ID. NR. 8) og syklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-MeVal) (SEKV.ID. NR. 9), og et salt derav.
3. Anvendelse av en ocvp5-antagonist ifølge krav 2, hvori saltet er hydroklorid.
4. Anvendelse av en avP5-antagonist ifølge krav 1, hvori vevet er inflammert og antagonisten er inflammert vevsangiogenese.
5. Anvendelse av en avp5-antagonist ifølge krav 4, hvori vevet er artrittisk.
6. Anvendelse av en ccvps-antagonist ifølge krav 5, hvori det artrittiske vev er til stede i et pattedyr med reumatoid artritt.
7. Anvendelse av en <xvp5-antagonist ifølge krav 1, hvori angiogenesen er til stede hos en pasient med en øyesykdom som er utvalgt fra gruppen av øyesykdommer bestående av diabetisk retinopati, aldersrelatert, makular degenerering, antatt okular histoplasmose, retinopati ved for tidlig fødsel og neovaskulært glaukom.
8. Anvendelse av en avps-antagonist ifølge krav 1, hvor angiogenesen er til stede hos en pasient med en korneal neovaskulær forstyrrelse utvalgt fra gruppen av forstyrrelser bestående av korneal transplantasjon, herpetisk keratitt, luetisk keratitt, pterygium og neovaskulær pannus forbundet med anvendelse av kontaktlinser.
9. Anvendelse av en ccvp5-antagonist ifølge krav 1, hvori vevet er et hemangiom.
10. Anvendelse av en av|35-antagonist ifølge krav 1, hvori vevet er en fast tumor eller en fast tumormetastase og angiogenesen er tumorangiogenese.
11. Anvendelse av en ctvp5-antagonist ifølge krav 10, hvori den nevnte' tumor gjennomgår regresjon.
12. Anvendelse av en <xvp5-antagonist ifølge krav 1, hvori angiogenesen er indusert av et cytokin.
13. Anvendelse av en ctvpS-antagonist ifølge krav 12, hvori nevnte cytokin er utvalgt fra gruppen bestående av vaskulær, endotelial vekstfaktor, transformerende vekstfaktoren og epidermal vekstfaktor.
14. Anvendelse av en avp5-antagonist ifølge krav 12, hvori cytokinet er vaskulær, endotelial vekstfaktor og nevnte angiogenese er utvalgt fra gruppen bestående av retinal angiogenese, korneal angiogenese, tumorangiogenese og angiogenese i inflammert vev.
15. Anvendelse av en avp5-antagonist ifølge krav 1, hvori nevnte avp5-antagonist er til stede i en angiogeneseinhiber-ende mengde fra 2 pM til 5 mM.
16. Anvendelse av en avp5-antagonist ifølge krav 1, hvori nevnte medikament er ment for intraokular, intravenøs, trans-dermal, intrasynovial, intramuskulær eller oral administrering .
17. Anvendelse av en avP5-antagonist ifølge krav 1, hvori medikamentet er ment for administrering i forbindelse med kjemoterapi.
18. Anvendelse av en avps-antagonist ifølge krav 1, hvori medikamentet er ment for intravenøs administrering av en enkelt dose.
NO19980622A 1995-08-14 1998-02-13 Anvendelse av en spesifikk alfavbeta5-antagonist ved fremstilling av et medikament for inhibering av alfavbeta5-formidlet angiogenese i et alfavbeta5-inneholdende vev. NO319264B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51479995A 1995-08-14 1995-08-14
PCT/US1996/013194 WO1997006791A1 (en) 1995-08-14 1996-08-13 METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR INHIBITION OF αvβ5 MEDIATED ANGIOGENESIS

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO980622D0 NO980622D0 (no) 1998-02-13
NO980622L NO980622L (no) 1998-04-07
NO319264B1 true NO319264B1 (no) 2005-07-11

Family

ID=24048748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19980622A NO319264B1 (no) 1995-08-14 1998-02-13 Anvendelse av en spesifikk alfavbeta5-antagonist ved fremstilling av et medikament for inhibering av alfavbeta5-formidlet angiogenese i et alfavbeta5-inneholdende vev.

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0844874B1 (no)
JP (2) JP4903921B2 (no)
KR (1) KR100516322B1 (no)
CN (2) CN101053561A (no)
AT (1) ATE308981T1 (no)
AU (1) AU726793B2 (no)
CA (2) CA2754102C (no)
CZ (1) CZ40998A3 (no)
DE (1) DE69635417T2 (no)
DK (1) DK0844874T3 (no)
ES (1) ES2250996T3 (no)
HU (1) HUP9802675A3 (no)
MX (1) MX9801228A (no)
NO (1) NO319264B1 (no)
RU (1) RU2214268C2 (no)
SK (1) SK18898A3 (no)
UA (1) UA84665C2 (no)
WO (1) WO1997006791A1 (no)
ZA (1) ZA966886B (no)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ380098A3 (cs) * 1996-05-31 1999-05-12 The Scripps Research Institute Způsoby, výrobky, farmaceutické látky a alfa v beta5 antagonisté, vhodní pro inhibici angiogeneze řízené alfa v beta5
AU5596298A (en) * 1996-12-09 1998-07-03 Cor Therapeutics, Inc. Integrin antagonists
US6245809B1 (en) 1996-12-09 2001-06-12 Cor Therapeutics Inc. Integrin antagonists
US6228985B1 (en) 1998-05-21 2001-05-08 Schering Corporation Derivatives of aminobenzoic and aminobiphenylcarboxylic acids useful as anti-cancer agents
GB9812019D0 (en) * 1998-06-05 1998-07-29 Zeneca Ltd Chemical compounds
CA2333332A1 (en) 1998-06-05 1999-12-16 Astrazeneca Ab Oxazolidinone derivatives, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US6759047B1 (en) 1998-06-17 2004-07-06 Beth Israel Deaconess Hospital Corp. Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof
US7387779B2 (en) 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US6962974B1 (en) 1998-06-17 2005-11-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US6235877B1 (en) 1999-08-04 2001-05-22 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Peptido-mimetic compounds containing RGD sequence useful as integrin inhibitors
US6160099A (en) 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies
US6344484B1 (en) 1999-02-12 2002-02-05 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Tyrosine alkoxyguanidines as integrin inhibitors
EP1028114A1 (en) 1999-02-13 2000-08-16 Aventis Pharma Deutschland GmbH Novel guanidine derivatives as inhibitors of cell adhesion
US6429214B1 (en) 1999-07-21 2002-08-06 Wyeth Bicyclic antagonists selective for the αvβ3 integrin
CZ20011872A3 (cs) 1999-09-29 2002-03-13 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Isonipekotamidy pro léčbu onemocnění zprostředkovaných integriny
GB9928568D0 (en) 1999-12-03 2000-02-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
JP5043271B2 (ja) 2000-04-12 2012-10-10 ジーイー・ヘルスケア・アクスイェ・セルスカプ ペプチドベースの化合物
GB0009803D0 (en) 2000-04-25 2000-06-07 Astrazeneca Ab Chemical compounds
US6486174B2 (en) 2000-08-07 2002-11-26 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid alkoxyguanidines as integrin antagonists
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
NO20004795D0 (no) 2000-09-26 2000-09-26 Nycomed Imaging As Peptidbaserte forbindelser
JP4615826B2 (ja) 2001-01-29 2011-01-19 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 置換インドールおよびインテグリンアンタゴニストとしてのそれらの使用
EP1389205B1 (en) 2001-04-09 2005-12-21 Ortho-McNeil Pharmaceutical Research Inc. Quinazoline and quinazoline-like compounds for the treatment of integrin-mediated disorders
US6872730B2 (en) 2001-04-27 2005-03-29 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Substituted benzofurans and benzothiophenes, methods of making and methods of use as integrin antagonists
IL159310A0 (en) 2001-07-10 2004-06-01 Amersham Health As Peptide-based compounds
CN1536998A (zh) * 2001-08-01 2004-10-13 Ĭ��ר�����޹�˾ 用于治疗眼病的整联蛋白抑制剂
WO2005053683A1 (en) 2003-11-26 2005-06-16 Duke University A method of preventing or treating glaucoma
AU2012216372B2 (en) * 2004-04-02 2015-01-22 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alphaVbeta5 integrin
ES2671522T3 (es) * 2004-04-02 2018-06-06 The Regents Of The University Of California Métodos y composiciones para tratar y prevenir una enfermedad asociada con la integrina alfa V beta 5
JP2012513589A (ja) 2008-12-23 2012-06-14 ジーイー・ヘルスケア・リミテッド 骨髄イメージング剤としての９９ｍＴｃ−ペプチド系化合物の応用
WO2013132485A1 (en) 2012-03-05 2013-09-12 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Polymers having therapeutically active agents conjugated thereto, processes of preparing same and uses thereof
KR101597327B1 (ko) * 2014-04-24 2016-02-24 동아에스티 주식회사 옥사졸리딘계 화합물 및 이를 포함하는 선택적 안드로겐 수용체 효능제
WO2017145164A1 (en) 2016-02-24 2017-08-31 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Polymeric conjugates and uses thereof
RU2646125C1 (ru) * 2016-09-20 2018-03-01 Константин Николаевич Руссков Способ профилактики рецидива птеригиума
RU2653814C1 (ru) * 2017-06-01 2018-05-14 Федеральное государственное автономное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ профилактики рецидивов птеригиума после хирургического лечения

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5135919A (en) * 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US5235919A (en) * 1991-07-01 1993-08-17 Robuck Norman F Picnic table and flying insect control apparatus
UA43823C2 (uk) * 1992-07-06 2002-01-15 Мерк Патент Геселлшафт Міт Бесшренктер Хафтунг ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ІНГІБУВАННЯ ІНТЕГРИН <font face="Symbol">a</font><sub>V</sub><font face="Symbol">b</font><sub>3</sub>-ОПОСЕРЕДКОВАНОЇ КЛІТИННОЇ АДГЕЗІЇ КЛІТИН ССАВЦІВ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ТА ПРОФІЛАКТИКИ ЗАХВОРЮВАННЯ, АСОЦІЙОВАНОГО З ПОРУШЕННЯМ АДГЕЗІЇ КЛІТИН, СПОСІБ БЛОКУВАННЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ ФІБРИНОГЕНОМ ІНТЕГРИНУ, КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ЗАГОЄННЯ РАН
US5981478A (en) * 1993-11-24 1999-11-09 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5753230A (en) * 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
SK163598A3 (en) * 1996-05-31 1999-06-11 Scripps Research Inst Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis

Also Published As

Publication number Publication date
UA84665C2 (ru) 2008-11-25
ATE308981T1 (de) 2005-11-15
NO980622L (no) 1998-04-07
WO1997006791A1 (en) 1997-02-27
CN1313146C (zh) 2007-05-02
EP0844874A4 (en) 2001-02-14
NO980622D0 (no) 1998-02-13
RU2214268C2 (ru) 2003-10-20
CA2227265A1 (en) 1997-02-27
ES2250996T3 (es) 2006-04-16
JP4903921B2 (ja) 2012-03-28
CA2754102C (en) 2012-12-18
JP4544639B2 (ja) 2010-09-15
KR19990036426A (ko) 1999-05-25
EP0844874B1 (en) 2005-11-09
CA2754102A1 (en) 1997-02-27
SK18898A3 (en) 1998-07-08
DE69635417T2 (de) 2006-07-13
CA2227265C (en) 2012-01-03
CZ40998A3 (cs) 1998-09-16
MX9801228A (es) 1998-05-31
JP2007262073A (ja) 2007-10-11
CN101053561A (zh) 2007-10-17
CN1198667A (zh) 1998-11-11
DK0844874T3 (da) 2006-01-16
HUP9802675A3 (en) 2000-09-28
HUP9802675A2 (hu) 1999-03-29
AU726793B2 (en) 2000-11-23
AU6846696A (en) 1997-03-12
JPH11511171A (ja) 1999-09-28
KR100516322B1 (ko) 2005-12-26
DE69635417D1 (de) 2005-12-15
ZA966886B (en) 1997-04-24
EP0844874A1 (en) 1998-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2754102C (en) Monoclonal antibodies and compositions comprising such useful for inhibition of .alpha.v.beta.5 mediated angiogenesis
RU2195312C2 (ru) СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ αvβ5-ОПОСРЕДОВАННОГО АНГИОГЕНЕЗА
WO1997006791A9 (en) METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR INHIBITION OF αvβ5 MEDIATED ANGIOGENESIS
US5766591A (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
WO1997045447A9 (en) METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR INHIBITION OF αvβ5 MEDIATED ANGIOGENESIS
CA2256543C (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US20060165703A1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of alpha v beta 5 mediated angiogenesis
US20030176334A1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
MXPA98009944A (en) Methods and useful compositions for medium angiogenesis inhibition by alfavbe
MXPA98009945A (en) Useful methods and compositions for angiogene inhibition