CN1237075C - 用作层粘连蛋白/巢蛋白相互作用抑制剂的低分子量肽衍生物 - Google Patents

用作层粘连蛋白/巢蛋白相互作用抑制剂的低分子量肽衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是能起层粘连蛋白与巢蛋白之间相互作用(层粘连蛋白/巢蛋白相互作用)抑制剂作用的低分子量肽衍生物，其制备方法，由其制备的药物组合物，以及所述肽衍生物在制备药物和鉴定层粘连蛋白/巢蛋白相互作用抑制剂中的应用。

Description

用作层粘连蛋白/巢蛋白相互作用 抑制剂的低分子量肽衍生物
本发明的目的是能起层粘连蛋白与巢蛋白之间相互作用(层粘连蛋白/巢蛋白相互作用)抑制剂作用的低分子量肽衍生物，其制备方法，由其制备的药物组合物，以及所述肽衍生物在制备药物和鉴定层粘连蛋白/巢蛋白相互作用抑制剂中的应用。
层粘连蛋白(一种800kDa糖蛋白)与巢蛋白(一种160kDa糖蛋白)之间的相互作用被认为是基底膜合成与稳定中的决定性生物分子机制(Mayer，U.和Timpl，R.(1994)：分子外基质装配和结构(Extracellular Matrix Assembly and Structure)(P.D.Yurchenco，D.Birk and R.P.Mecham，Ed.)S.389-416，Academic Press，Orlando，FL)。巢蛋白与基底膜的所有主要成分例如含有γ1的层粘连蛋白同种型(关于命名参见：Burgeson，R.E.；Chiquet，M.；Deutzmann，R.；Ekblom，P.；Engel，J.；Kleinmann，H.；Martin，G.R.；Meneguzzi，G.；Paulsson M.；Sanes，J.；Timpl，R.；Tryggvasson，K.；Yamada，Y.；Yurchenco，P.D.(1994)Matrix Biology 14；209-211)、胶原IV、基底膜聚糖和fibulin、以及它们各自的相关结构形成三元复合物的能力意谓着其承担着联系、空间组织和稳定独立的宏观结构的功能(Fox，J.W.；Mayer，U.；Nischt，R.；Aumailley，M.；Reinhardt，D.；Wiedemann，H.；Mann，K.；Timpl，R.；Krieg，T.；Engel，J.；和Chu，M.-L.(1991)EMBO J.10，3137-3146)。
基底膜是高度特化的细胞外结构，其在控制细胞和组织功能、组织体系结构、组织相互作用、细胞生长、细胞转化、细胞迁移以及组织特异性基因表达中行使重要功能(Adams，J.C.和Watt，F.M.(1993)Development 117，1183-1198)。用多克隆抗层粘连蛋白抗体进行的实验已清楚地证明了层粘连蛋白/巢蛋白相互作用在功能性基底膜合成中的至关重要作用。所述抗体是通过用层粘连蛋白P1或重组制得的层粘连蛋白的巢蛋白结合结构域(γ1 III 3-5)给兔子免疫接种而获得的。通过使用层粘连蛋白P1或层粘连蛋白γ1 III 3-5基质的亲和色谱浓缩的抗体在抑制测定中显示层粘连蛋白/巢蛋白相互作用的完全抑制。然而，这是基于抗体空间阻断巢蛋白接近层粘连蛋白，所述抗体的结合区域位于层粘连蛋白的巢蛋白结合序列附近(Mayer，U.；Nischt，R.；Pschl，E.；Mann，K.；Fukuda，K.；Gerl，M.；Yamada，Y.；Timpl，R.(1993)EMBO J.12；1879-1885)。
在胚胎器官培养物中，所述抗体既抑制肾小管的发育、肺泡的形成，又抑制胚胎唾液腺的形态形成。这三个模型是依赖新基底膜无阻合成的代表性个体发育模型(Ekblom，P.；Ekblom，M.；Fecker，L.；Klein，G.；Zhang，H.-Y.；Kadoya，Y.；Chu，M.-L.；Mayer，U.；Timpl，R.(1994)Development 120；2003-2014)。
直接抗层粘连蛋白γ1链序列区域(与巢蛋白结合所必需的)的抗体也能够抑制层粘连蛋白/巢蛋白相互作用。然而，与上述抗层粘连蛋白抗体不同，该抑制是竞争性的，这是因为它们直接与巢蛋白竞争层粘连蛋白上的结合位点(WO 98/31709)。
IgM亚类的单克隆抗体(抗层粘连蛋白P1 A6/2/4-DSM ACC2327；参见WO 98/31709)在体外抑制粘连蛋白/巢蛋白相互作用，IC50为30nM。象上述多克隆抗层粘连蛋白抗体一样，其在器官培养物中阻止了胚胎唾液腺的形态形成。这强调了粘连蛋白/巢蛋白相互作用的特异性、LE-4组件的重要性、以及层粘连蛋白γ1 III 4结构域中鉴定出的序列区域在该相互作用中的重要性。
已经对层粘连蛋白的巢蛋白结合结构域进行了清楚的鉴定，并且在其位置、序列及其空间结构方面作了特征描绘(X-射线晶体结构和NMR结构)(Gerl，M.；Mann，K.；Aumailley，M.；Timpl，R.(1991)Eur.J.Biochem.202；167-174.Mayer，U.；Nischt，R.；Pschl，E.；Mann，K.；Fukuda，K.；Gerl，M.；Yamada，Y.；Timpl，R.(1993)EMBO J.12；1879-1885.Baumgartner，R.；Czisch，M.；Mayer，U.；Pschl，E.；Huber，R.；Timpl，R.；Holak，T.A.(1996)J.Mol.Biol.257；658-668.Stetefeld，J.；Mayer，U.；Timpl，R.；Huber，R.(1996)J.Mol.Biol.257；644-657)。其位于结构域γ1 III 4中层粘连蛋白γ1链短臂的″LE组件″(层粘连蛋白型表皮生长因子样)内。″LE组件″是具有类似于EGF的复杂折叠模式的50-60氨基酸结构基元，其具有4个二硫键连接(Bairoch，A.；(1995)细胞外结构域命名(Nomenclature ofextracellular domains).The SWISS-PROT Protein sequencedata bank.release 310.Engel，J.(1989)FEBS Letters 251；1-7)。
已经用得自小鼠EHS肿瘤的层粘连蛋白P1、得自人胎盘的层粘连蛋白2和层粘连蛋白4、以及得自果蝇的层粘连蛋白测定了巢蛋白对互补层粘连蛋白结构域的高亲和力。该种属重叠结合特异性的原因是，对于所研究的种属，在γ1 III4结构域中存在非常高的序列同源性。当考虑整个结构域时，在人和小鼠之间存在97％同源性，在小鼠和果蝇之间存在61％同源性，在小鼠和Caenorhabditis elegans之间存在51％同源性(Pikkarinen，T.；Kallunki，T.；Tryggvasson，K.(1987)J.Biol.Chem.263；6751-6758.Chi，H.-C.；Hui，C.-F.(1989)J.Biol.Chem.264；1543-1550.Wilson，R.等人.(1994)Nature 368：32-38.Pschl，E.；Mayer，U.；Stetefeld，J.；Baumgartner，R.；Holak，T.A.；Huber，R.；Timpl，R.(1996)EMBO J.15：5154-5159)。
除了对结合在完整三维结构上的巢蛋白的依赖性以外，还鉴定了位于结构域γ1 III4的S-S稳定环a和c中的明确序列区域。已鉴定出了5个必需氨基酸，其中4个位于环a的7氨基酸部分中，另一个是在环c中的酪氨酸侧链(Mann，K.；Deutzmann，R.；Timpl，R.(1988)Eur.J.Biochem.178；71-80)。
J.W.Fox和R.Timpl(US 5,493,008)公开了可衍生自γ1 III 4结构域的适当区域、并且在特异性结合测定中完全抑制层粘连蛋白/巢蛋白结合的合成肽。
据信，对巢蛋白的层粘连蛋白结合位点的高亲和力结合需要与实际结合序列邻近的环(环c)中的酪氨酸或组氨酸的相互作用。据假定该芳族相互作用是下述抑制作用和结果的先决条件：即基于层粘连蛋白γ1 III 3-5的3D结构IC50＜500nM的抑制作用，和在US专利5,493,008中描述的结构/功能关系结果。然而，对于环c是否与巢蛋白直接相互作用，或者其是否有助于稳定NIDPNAV序列区域的适当空间结构的疑问仍然不清楚(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.Baumgartner，R.；Czisch，M.；Mayer，U.；Pschl，E.；Huber，R.；Timpl，R.；Holak，T.A.(1996)J.Mol.Biol.257；658-668.Stetefeld，J.；Mayer，U.；Timpl，R.；Huber，R.(1996)J.Mol.Biol.257；644-657)。
层粘连蛋白/巢蛋白相互作用受强构象成分的影响(Mayer，U.；Nischt，R.；Pschl，E.；Mann，K.；Fukuda，K.；Gerl，M.；Yamada，Y.；Timpl，R.(1993)EMBO J.12；1879-1885.Mann，K.；Deutzmann，R.；Timpl，R.(1988)Eur.J.Biochem.178；71-80)。可衍生自层粘连蛋白的巢蛋白结合位点的合成肽不能形成如在LE组件中存在的二硫键合模式，但是它们在抑制测定中显示出比完整层粘连蛋白P1或层粘连蛋白γ1 III 3-5弱约400-10,000倍的活性(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.J.W.Fox和R.Timpl；US5,493,008)。这种活性降低是不寻常的，因为已知肽在水溶液中可呈现无数种不同构象，并且发现只有一定百分比的肽呈生物活性构象。迄今为止所描述的最有活性的肽(IC50为22nM)具有约2700Da的分子量(＝LE组件的约50％)。其包含完整的S-S环，据假定该环稳定必需的NIDPNAV序列区域的结构(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.J.W.Fox and R.Timpl；US 5,493,008)。
序列NIDPNAV(Asn-Ile-Asp-Pro-Asn-Ala-Val)的化学式如下所示：
Figure C0080450100171
层粘连蛋白/巢蛋白相互作用抑制剂适于制备用于治疗与基底膜的增加或不良合成有关的疾病的药物。
这样的疾病是例如伴有基底膜增厚(尤其是在肾、眼睛、血管系统中)的所有类型的糖尿病晚期并发症，特征是窦状隙中持续基底膜合成的肝脏纤维变性、尤其是酒精中毒性肝脏纤维变性和由其引起的毛细管化，其中可观察到基底膜或基底膜成分合成增加的所有纤维组织形成(慢性或医原性)(肾、肺、皮肤)，特征是脂质代谢的调控受限制的动脉粥样硬化，这可能特别是由于经由部分毛细管化的肝脏窦状隙引起的脂蛋白受损渗入引起的(可在动脉粥样硬化中观察到的该血管系统病变还可能部分由于血管基底膜的组成和结构发生改变所致)，其中血管生成导致临床图像变质的疾病，例如其中肿瘤生长需要新血管生成的癌症，糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维组织形成、具有强炎性成分的疾病(例如类风湿性关节炎、骨关节炎、结节性脉管炎)、血管瘤、牛皮癣、以及其它疾病。
然而，象在US 5,493,008中描述的，肽作为药物的应用非常有限，因为它们具有构象柔性、对蛋白酶不稳定、并且生物利用度和药效学特性不佳(Milner-White，E.J.(1989)Trends Pharmacol.Sci.10；70-74.Verber，D.F.；Freidinger，R.M.；(1985)Trends Neurosci.8；392-396.Hruby，V.J.(1994)in：Peptides，Proc.Thirteenth American Peptide Symposium；(Hodges，R.S.；Smith，J.A.；Ed.)S.3-17；ESCOM：Leiden，Netherlands)。
因此，本申请的目的是发现低分子量肽衍生物，它们能特异性地与巢蛋白的层粘连蛋白结合位点相互作用，并以低浓度竞争性地抑制层粘连蛋白与巢蛋白的结合。
因此，本发明的目的是式I化合物：
其中
R1是其中一个下式所示基团
Figure C0080450100182
或 或
Figure C0080450100184
或
或
Figure C0080450100186
或
Figure C0080450100187
或 或
Figure C0080450100189
其中
R4表示-A、-NH2、-NHR、-NR2、A2、-NHR1、
或 或
且R5表示-(CH2)lCOOA、-(CH2)lCONH2、-(CH2)lNH2或-(CH2)l-SO3H、
或
Figure C0080450100195
且X是其中一个下式所示基团
或 或
Figure C0080450100198
或
或
Figure C00804501001910
或
Figure C00804501001911
或
或
Figure C00804501001913
其中Y表示O、S、-N(A)-CO-或-(CH2)r-，
D表示(CH2)r、O、S、NH、NR、(CH2)r-O、(CH2)r-S、(CH2)r-NH或(CH2)rNR，且
R2表示-A、-E-OH、-E-COOH或-E-CONH2，
其中E表示直链或支链C1-C10-烷基链，该烷基链未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-环烷基取代，或者E表示C5-C10-环烷基，该环烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-环烷基取代，
且R3是其中一个下式所示基团
或
或
其中R6表示-H、-COOH、-CONH2、-CONHR、-CONR2、-CH2OH或
Figure C0080450100204
或
或
其中R7表示直链或支链C1-C10-烷基，该烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-环烷基取代，或者R7表示C5-C10-环烷基，该环烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-环烷基取代，
且R表示直链或支链C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-链炔基、C5-C10-环烷基、Het或Ar，所述基团可任选被一个或多个卤素、C1-C6-烷氧基、直链或支链C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-链炔基、C5-C10-环烷基或-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O- C1-C6-烷基-Ar、Het或Ar取代，
其中
Het表示单环或二环5元-10元芳族或非芳族环，该环包含1或2个相同或不同的选自氮、氧和硫的杂原子作为所述环的成员，并且未取代或者被一个或多个羟基或羧基取代，
Ar表示单环或二环5元-10元芳环，该环未取代或者被一个或多个羟基或羧基取代，
Z表示(CH2)m、O、S、NH、NR、N-C(O)-R或NSO2R，
A表示H或C1-C4-烷基，
l、m和r是0-3的整数，
n和k是1-2的整数，
p是0-1的整数，
q是1-3的整数，
其中所述化合物是所有其立体异构体和所有比例的立体异构体混合物，并包括它们的所有生理可耐受盐。
生理可耐受盐是例如无机酸和有机酸的盐，例如盐酸、硫酸、乙酸、柠檬酸、或对甲苯磺酸的盐，或无机碱和有机碱的盐，例如NH4OH、NaOH、KOH、Ca(OH)2、Mg(OH)2、二乙醇胺或乙二胺的盐，或氨基酸的盐，例如精氨酸、赖氨酸、赖氨酰赖氨酸或谷氨酸的盐。
本发明的一个优选实施方案是其中n为1的式I化合物。
进一步优选的实施方案是这样的式I化合物，其中基团X中的R表示Het或Ar，所述Het或Ar可任选被-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O-C1-C6-烷基-Ar、Het或Ar取代。基团X中的R更优选为Het。例如，Het表示
彧
Figure C0080450100222
或
或
Figure C0080450100224
或
Figure C0080450100225
本发明优选的实施方案还是这样的式I化合物，其中基团X中的R表示Ar，所述Ar可任选被-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Ar或Ar取代。基团X中的R优选表示Ar。
例如Ar表示
或
Figure C0080450100232
或
或
Figure C0080450100234
优选的实施方案还是这样的式I化合物，其中基团X中的R表示
Figure C0080450100235
或
Figure C0080450100236
在式I化合物中，X优选为下式所示基团：
Figure C0080450100241
Y优选为-(CH2)r，其中r优选为0或1，且k优选为1或2。
本发明进一步优选的实施方案是这样的式I化合物，其中基团X是下式所示基团
Figure C0080450100242
其中D优选为-(CH2)r-，其中r优选为0或1。
还优选的本发明实施方案是这样的式I化合物，其中R是下式所示基团
Figure C0080450100243
其中Z优选表示(CH2)m，且m是0或1。R5优选表示-(CH2)l-COOA，其中A优选表示H，或者R5表示-(CH2)l-COONH2，其中l是0。R4优选表示-NH2或-A，其中A优选表示H，或者R4优选表示-NHR1，其中-NHR1优选表示
Figure C0080450100244
且其中-NHR1的R5优选表示
且l优选为0，或者-NHR1的R5优选表示
且l优选为0，或者-NHR1的R5优选表示(CH2)l-NH2，且l优选为0。
进一步优选的本发明实施方案是这样的式I化合物，其中R1是下式所示基团
Figure C0080450100253
其中Z优选表示-(CH2)m-，且m优选为1，R4优选表示-NH2，且R5优选表示-(CH2)l-COOA，其中l优选为0，且其中A优选表示H。
进一步优选的本发明实施方案是这样的式I化合物，其中R1是下式所示基团
Figure C0080450100254
其中R5优选表示-(CH2)l-COOA，其中l优选为0，且其中A优选表示H。
进一步优选的本发明实施方案是这样的式I化合物，其中R2表示A，且A优选表示-CH3，或者其中R2表示-E-COOH，优选为-CH2-COOH，或者其中R2表示-E-OH，优选为-CH2-OH。
进一步优选的本发明实施方案是这样的式I化合物，其中R3是下式所示基团
其中k优选为2。
进一步优选的本发明实施方案是这样的式I化合物，其中R3是下式所示基团
Figure C0080450100262
进一步优选的本发明实施方案是这样的式I化合物，其中R3是下式所示基团
其中R7优选为支链C1-C10-烷基，优选为-CH(CH3)2、-C(CH3)3、-CH(CH3)CH2-CH3或-CH2-CH(CH3)2，且其中R6优选表示-H、-COOH、-CONH2、-CH2OH、-CON(CH3)2，或者R更优选表示
Figure C0080450100264
其中q优选为2。
进一步优选的本发明实施方案是这样的式I化合物，其中R3是下式所示基团表示
Figure C0080450100271
其中R7优选-CH(CH(CH3)2)2或-CH2C(CH3)3。
本发明化合物是非天然(即不是天然生成的)、低分子量肽衍生物，其能在nM浓度范围内抑制层粘连蛋白/巢蛋白相互作用。令人惊奇的是，已经发现，这些低分子量结构能以高亲和力结合到巢蛋白的层粘连蛋白结合位点上，同时不需要与实际结合序列邻近的环(环c)中的酪氨酸或组氨酸相互作用。
更令人惊奇的是，在本发明中描述的分子量为550-800Da的低分子量肽衍生物表现出与下述迄今为止所描述的最有活性的肽(IC50为22nM)相同数量级的抑制作用：具有约2700Da的分子量(＝LE组件的约50％)，包含完整的S-S环，据假定该环稳定必需NIDPNAV序列区域的结构(J.W.Fox and R.Timpl；US 5,493,008)。
根据巢蛋白结合位点的结构/功能关系和公开的三维结构，通过在树脂载体上特定合成肽衍生物实现了本发明目的。用于肽合成的构件随合适标准而变，以保证非天然构件的广泛结构多样性和集成。使用合适的灵敏筛选测定来测定和比较从树脂载体上分离下来的所得肽衍生物的抑制活性。
本发明化合物可用于制备用于治疗与基底膜的增加或不良合成有关的疾病的药物。
因此，本发明肽衍生物和/或其生理可耐受盐的可能治疗应用领域是：
1.伴有基底膜增厚(尤其是在肾、眼睛、血管系统中)的所有类型的糖尿病晚期并发症。
2.特征是窦状隙中持续基底膜合成的肝脏纤维变性，尤其是酒精中毒性肝脏纤维变性，和由其引起的毛细管化。
3.其中可观察到基底膜或基底膜成分合成增加的所有纤维组织形成(慢性或医原性)(肾、肺、皮肤)。
4.特征是脂质代谢的调控受限制的动脉粥样硬化，这可能特别是由于经由部分毛细管化的肝脏窦状隙引起的脂蛋白受损渗入引起的。可在动脉粥样硬化中观察到的该血管系统病变还可能部分由于血管基底膜的组成和结构发生改变所致。
5.其中血管生成导致临床图像变质的疾病，例如其中肿瘤生长需要新血管生成的癌症、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维组织形成、具有强炎性成分的疾病(例如类风湿性关节炎、骨关节炎、结节性脉管炎)、血管瘤、牛皮癣、以及其它疾病。
因此，本发明化合物和/或其生理可耐受盐适于用作药物。所以本发明的进一步目的是含有至少一种本发明肽衍生物和/或其生理可耐受盐的药物组合物。
可依据本发明将式I化合物和/或其生理可耐受盐可作为治疗或预防药物施用给动物优选哺乳动物，特别是人。它们可以以自身的形式给药，在彼此混合物中给药，或者以经肠或非胃肠道给药用药物制剂的形式给药，所述制剂包含有效剂量的至少一种式I化合物和/或其生理可耐受盐以及衍生物作为活性成分和常规可药用无毒赋形剂和/或添加剂。
药物可系统或局部施用。药物可以以例如丸剂、片剂、膜包衣片剂、糖包衣片剂、粒剂、硬和软明胶胶囊剂、粉剂、溶液、糖浆剂、乳剂、悬浮剂或其它药物剂型的形式给药。然而，给药还可以经阴道或直肠进行，例如以栓剂的形式阴道或直肠给药，或者以例如注射液或输液、微胶囊或贮药柱的形式非胃肠道给药或植入给药，或者以例如软膏剂、溶液或酊剂的形式局部给药或经皮给药，或者以其它途径给药，例如以鼻用喷雾剂或气雾剂混合物的形式给药，或作为可吸入干粉制剂给药。如果溶液是非胃肠道给药的，它们可通过例如静脉内、肌内、皮下、关节内、滑膜内或其它方式例如吸入湿气雾剂或干粉制剂给药。
本发明药物制剂可按照其自身已知的方法制备，除了式I化合物和/或其生理可耐受盐和衍生物以外，还可以使用药物惰性无机和/或有机赋形剂。为了制备丸剂、片剂、糖包衣片剂和硬明胶胶囊，可使用例如乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石粉、硬脂酸或其盐等。软明胶胶囊剂和栓剂的赋形剂有例如脂肪、蜡、半固体和液体多元醇、聚乙二醇，天然或硬化油等。为了制备溶液例如注射液、或乳剂或糖浆剂，合适的赋形剂是例如水、醇、甘油、二醇、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖、植物油等。对于微胶囊、植入物或贮药柱，合适的赋形剂是例如乙醇酸与乳酸的共聚物。药物赋形剂通常含有大约0.5-90％的式I化合物和/或其生理可耐受盐和衍生物。
除了活性化合物和赋形剂以外，本发明药物制剂还可以含有辅料或添加剂，例如填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、甜料、着色剂、矫味剂或香料、增稠剂、稀释剂、缓冲物质、溶剂或助溶剂、获得贮药效果的装置、改变渗透压的盐、包衣剂或抗氧化剂。本发明药物制剂还可以含有两种或两种以上的式I化合物和/或其生理可耐受盐和衍生物。此外，除了至少一种式I化合物和/或其生理可耐受盐和衍生物以外，本发明药物制剂还可以含有其它治疗或预防活性物质。本发明药物制剂通常每剂含有0.2-500mg、优选1-100mg式I化合物和/或其生理可耐受盐和衍生物。
如果式I化合物或含有它们的药物制剂是作为气雾剂例如鼻用气雾剂给药，或通过湿气雾剂或干粉吸入给药，可分别使用喷雾器、雾化器、泵式喷洒器、吸入装置、计量吸入器或干粉吸入器给药。用于将式I化合物作为气雾剂给药的药物剂型可通过本领域技术人员众所周知的方法制备。对于其制备，例如在使用常规添加剂例如苯甲醇或其它合适防腐剂、提高生物利用度的吸收增强剂、助溶剂、分散剂等、和如果适当的话常规推进剂例如氯氟烃和/或氟烃的式I化合物在水、水-醇混合物或适当盐水溶液中的溶液或分散液是合适的，而式I化合物和/或其生理可耐受盐的干粉制剂可通过将式I化合物和/或其生理可耐受盐与合适水溶性添加剂例如糖或糖衍生物和氨基酸的水溶液冷冻干燥或优选喷雾干燥而制得。
当使用式I化合物时，剂量可在宽的限度内变化，并且如医师所知道的那样，通常在每一个体病例中对于具体病症使用特定剂量。剂量取决于所治疗疾病的性质和严重程度、所用的化合物、或者所治疗或预防的是急性还是慢性疾病、或者除了式I化合物以外是否还施用其它活性化合物。通常，对于口服给药，为了获得有效结果，在成人中约0.01-100mg/kg、优选0.1-10mg/kg、特别是0.3 to 2mg/kg(每kg体重)的日剂量是适当的。对于静脉内给药，日剂量为约0.01-50mg/kg、优选0.01-10mg/kg体重。特别是当使用较大剂量时，日剂量可分多次，例如2、3或4次施用。如果适当的话，根据个体特性，可能需要超出所指出日剂量范围的上限和下限。
此外，本发明式I化合物及其盐可用作制备可由式I化合物制得的其它化合物、特别是其它药物活性化合物的中间体，例如，所述其它化合物可通过例如将官能团酯化、还原、氧化或其它转化，修改或引入基团或功能基，由式I化合物制得。
因此，一方面，本发明肽衍生物可直接用作治疗剂，但是它们也可形成适于用作治疗与基底膜的增加或不良合成有关的疾病的治疗剂的相关结构的基础。
本发明的另一目的是鉴定抑制层粘连蛋白与巢蛋白相互作用的化合物的方法，其中使用本发明化合物作为竞争性抑制剂。该方法还包括以可药用形式鉴定的化合物的制剂。
本发明的目的还是，提供制备包含经鉴定能抑制层粘连蛋白与巢蛋白相互作用的化合物的药物组合物的方法，其中使用本发明化合物作为竞争性抑制剂，并将所鉴定的化合物和/或其生理可耐受盐与可药用载体混合。
本发明的目的还是提供制备本发明式I化合物的方法。
本发明式I化合物
Figure C0080450100311
是通过将式II化合物
与III化合物进行片段缩合而制得的
Figure C0080450100313
其中变量R1、X、n、R2和R3具有上述含义，并且可通过肽化学中的已知常用保护基将式II和III化合物在如上所定义的官能团上保护(参见例如Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie，vol.15/1和15/2，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974)。合适的缩合方法是本领域众所周知的(Houben-Weyl，Methoden der OrganischenChemie，vol.15/1和15/2，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974)。合适的缩合剂或偶合剂有例如羰基二咪唑、碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺、或O-((氰基(乙氧基羰基)亚甲基)氨基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TOTU)或焦磷酸酐(PPA)。该缩合反应可在标准条件下进行。在肽缩合期间，通常用易于在不同于偶合条件的条件下除去的保护基将不打算参与偶合反应的氨基保护。这同样适用于不打算参与偶合反应的羧基，优选在偶合反应期间将羧基作为C1-C6-烷基酯、苄基酯或叔丁基酯保护。对于仍然以氨基前体例如硝基或氰基形式存在的氨基，无需将该氨基保护。缩合反应后，通过水合步骤形成氨基。缩合步骤后，通过已知的合适方法除去保护基，例如苄氧基羰基和苄基可通过在苄基酯中水合来除去；叔丁基酯的保护基一般是在酸性条件下除去；9-芴基甲氧基羰基残基是通过仲胺除去。
本发明式I化合物的制备还可以通过各成分例如天然、非天然氨基酸及其衍生物在固相上的分步加成来进行，这样各成分可以以多种不同顺序加上。
为了制备式I化合物，还有利的是，不通过片段缩合将式I和II化合物直接偶合，而是偶合它们各自适当的前体，以获得可通过例如衍生化转化成式I化合物的中间体。
不是直接，而是通过其各自前体将官能团引入到分子中，以获得可易于在缩合反应后通过将前体基团转化成各自的官能团来制得终产物的中间体的上述方法也可用于制备式I化合物分子的不同部分，例如式I化合物的R1-或R1-X-侧链。
实施例
缩写具有下述含义：
试剂和溶剂
AcOH         乙酸
aq           含水
BSA          牛血清白蛋白
DCC          N，N’-二环己基碳二亚胺
DCM          二氯甲烷
DIPEA        N，N-二异丙基乙胺
DMAP         4-二甲基氨基吡啶
DMF          N，N-二甲基甲酰胺
DMSO         二甲亚砜
Et2O         乙醚
EtOAc                醋酸乙酯(乙酸乙酯)
EtOH                 乙醇
Fmoc-OSucc           Fmoc-O-琥珀酰亚胺
HOBT                 1-羟基苯并三唑
KHMDS                六甲基二硅氮烷基钾
n-Buli               正丁基锂
MeOH                 甲醇
MTBE                 甲基叔丁基醚
TEA                  三乙胺
TFA                  三氟乙酸
THF                  四氢呋喃
TMEDA                甲基乙二胺
TMSCI                三甲基甲硅烷基氯
TOTU                 O-((氰基(乙氧基羰基)亚甲基)氨基)-N，N，N’，N’-
                     四甲基脲四氟硼酸盐
TrisN3              三甲硅烷基叠氮化物
化学基团：
Me                   甲基            CH3-
Et                   乙基            CH3-CH2-
nPr                  正丙基          CH3CH2CH2-
iPr                  异丙基          (CH3)2CH-
nBu                  正丁基          CH3CH2CH2CH2-
iBu                  异丁基          (CH3)2CHCH2-
tBu                  叔丁基          (CH3)3C-
Ph                   苯基            C6H5-
Fmoc                 9-芴基甲氧基羰基
Z                    苄氧基羰基      C6H5-CH2-O-CO-
BOC                  叔丁氧基羰基    (CH3)3C-O-CO-
1.筛选层粘连蛋白/巢蛋白相互作用抑制剂的库
设计库来找到更小的、效力更强的、且代谢更稳定的与现有技术已知的庚肽NIDPNAV有关的肽(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.Pschl，E.；Mayer，U.；Stetefeld，J.；Baumgartner，R.；Holak，T.A.；Huber，R.；Timpl，R.(1996)EMBO J.15：5154-5159.Baumgartner，R.；Czisch，M.；Mayer，U.；Pschl，E.；Huber，R.；Timpl，R.；Holak，T.A.(1996)J.Mol.Biol.257；658-668)。将库作为三个子库来合成和筛选；五聚物、六聚物和七聚物。下面描述五聚物子库的筛选策略。该方法代表了筛选其它两个子库所用的方法，只是在第一个步骤中，以约50个珠子/孔筛选六聚物，以约100个珠子/孔筛选七聚物。
1.1筛选五聚物库
该五聚物库含有2,160种不同化合物。
1)将约8,800个珠子悬浮在0.1％HCl中，并以大约14个珠子/孔分配到7个滤底96孔微量滴定板内。
2)将珠子用200μl去离子水洗涤2次，然后加入50μl 500mMHEPES，pH 7.0。当pH增加至7.0时，在该库中使用的接头释放1等分试样的化合物，过夜进行该分裂步骤。
3)将平板堆积在U-底滤板的顶部并离心。从珠子上释放下来的化合物的混合物收集在底部板上，而相应的珠子保留在最初的滤板中。
4)每孔中向珠子加入25μl DMSO以将剩余化合物从珠子上洗下来，并将平板再次离心以将溶液中的化合物与珠子分离开。所得贮备液大概在333mM HEPES，33％DMSO中含有27μM化合物。
5)将化合物贮备液与巢蛋白一起预培养(10μl化合物贮备液/90μl巢蛋白溶液)，进行在附加方案中描述的测定，获得2.7μM化合物的最终筛选浓度。
6)在其中可重复抑制≥62％的25个测定孔中，将得自最初滤板的相应珠子悬浮在0.05％HCl，0.1％吐温20中，并以1个珠子/孔吸移到5个新的滤板中。向每个板中加入两个在相同接头上有母化合物的对照珠子以用作对照。
7)将珠子用200μl去离子水洗涤2次，然后向每个孔中加入25μl50mM NaOH。当pH从7.0增加至10.0或更高时，在该库中使用的接头释放第二份等摩尔等分试样的化合物，该分裂步骤进行3小时。
8)将平板堆积在U-底滤板的顶部并离心。从珠子上释放下来的化合物的混合物收集在底部板上，而相应的珠子保留在最初的滤板中。
9)将珠子用20μl加入50mM HCl的50mM HEPES(最初pH 7.0)洗涤，将该溶液离心到下层板中，并与第一次的释放物合并。
10)将珠子用25μl DMSO进行第3次洗涤，其中是将DMSO与珠子平衡10分钟，然后离心。
11)如步骤#5所述，以1/10的体积测定所得释放物。
12)抑制作用与对照珠子(约50％抑制)一样好或者更好的溶液认为是hit。收集到了23个hit珠子，其它2个潜在的hit孔可通过在单个孔中添加的弱抑制剂来解释。
13)将Hit溶液进行质谱分析，以测定分子量。
14)将相应的各hit珠子进行Edman降解以测定肽序列。
15)分析合并的MS和Edman数据以鉴定hit化合物结构。
其结构和回收频率如下所示。G-Hopa＝甘氨酸羟基丙基酰胺，剩余接头
频率                                             IC50，μM
6      D    Nal2      N      D    V    G-Hopa    0.43
4      D    Nal2      N      A    V    G-Hopa    0.37
4      D    Nal2      N      D    I    G-Hopa    0.64
4      D    Nal2      N      S    V    G-Hopa    0.49
3      D    Nal2      N      S    I    G-Hopa    0.81
2      D    Nal2      N      A    I    G-Hopa    0.47
图例文字：
Nal2＝L-3-(2-萘基)丙氨酰基：
Figure C0080450100361
G-Hopa＝甘氨酸-3-羟基丙基酰胺：
D＝Asp(天冬氨酰基)，P＝Pro(脯氨酰基)，N＝Asn(天冬酰胺酰基)，A＝Ala(丙氨酰基)，V＝Val(缬氨酰基)，S＝Ser(丝氨酰基)，I＝Ile(异亮氨酰基).
1.2方法：制备肽库
使用标准固相肽Fmoc化学(Stewart，J.M.，and Young，J.D.(1984)Solid Phase Peptide Synthesis.Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.；Atherton，E.，and Sheppard，R.C.(1989)Solid Phase Peptide Synthesis.IRL Press Oxford)，通过分裂/混合合成方法合成肽库(Lam，K.S.，Salmon，S.E.，Hersh，E.M.，Hruby，V.J.，Kazmierski，W.M.，and Knapp，R.J.(1991)Nature 354，82；Furka，A.，Sebestyen，F.，Asgedom，M.，andDibo，G.(1991)Int.J.Pept.Protein Res.37，487)。在每一偶合循环中，将每个树脂珠子仅暴露于一种活化的氨基酸。因此，在库合成完成时，每个树脂珠子仅表达一个肽实体。因为不能单独测定所有化合物，我们通过差别可分裂接头在每个树脂珠子上以一式两份构建相同结构，fig.1(Kocis，P.，Krchnak，V.，和Lebl，M.(1993)Tetr.Lett.34，7251；Lebl，M.，Krchnak，V.，Salmon，S.E.，和Lam，K.S.(1994)A Companion to Methods inEnzymolog 6，381)。然后可用不同分裂机制在顺序步骤中将肽从树脂珠子上释放下来。在pH 7-9的缓冲液中将第一部分肽作为羟基丙基酰胺释放下来。使用更高pH将第二部分肽释放下来(合成方案1)。
在肽库中，使用聚乙二醇接枝的聚苯乙烯珠子或TentaGelSNH2。实际上，在含水条件下与肽合成和筛选相容的所有树脂珠子都是适用的。
用一个固定位置(L-天冬酰胺)制备五聚物、六聚物、和七聚物库。在C-末端上的甘氨酸羟基丙基酰胺是接头的一部分。
H-X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH(2,160个肽)
H-X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH(25,920个肽)
H-X6X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH(311,040个肽)
X1：在第一个随机化中使用的N-Fmoc-L-氨基酸(9)：缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、β(2-萘基)丙氨酸、2-氮杂环丁烷甲酸、脯氨酸、环己基甘氨酸、苯基甘氨酸。
X2：在第二个随机化中使用的N-Fmoc-L-氨基酸(4)：丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸。
X3＝X5＝X6：在第三、五和六个随机化中使用的N-Fmoc-L-氨基酸(12)：2-哌啶酸、β(2-萘基)丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、2-氮杂环丁烷甲酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、3，5-二碘酪氨酸、瓜氨酸、精氨酸。
X4：在第四个随机化中使用的N-Fmoc-L-氨基酸(5)：天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基己二酸、O-硫酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸。
将树脂(PEG-PS.HCl，Millipore，20g，装载0.58mmol/g，平均粒径220μm)在N，N-二甲基甲酰胺中膨胀2小时，然后用10％N，N-二异丙基乙胺在二氯甲烷中的溶液中和。用二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂。用1，3-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑(各3eq)将接头(Fig.1，3eq)在N，N-二甲基甲酰胺中于室温偶合12小时。通过溴酚蓝方法监测反应(Krchnak，V.，Vagner，J.，Safar，P.，和Lebl，M.(1988)Collec.Czech.Cem.Commun.53，2542)。通过茚三酮测试确定偶合完全(Kaiser，E.，Colescott，R.L.，Bossinger，C.D.，和Cook，P.I.(1969)Anal.Biochem.34，595)。用N，N-二甲基甲酰胺洗涤后，用50％哌啶在N，N-二甲基甲酰胺中的溶液处理15分钟来除去Fmoc保护基。然后用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，通过UV光谱测定法(302nm)定量测定所释放的富烯-哌啶加成物的量。在整个库合成中，以该方法测定的稳定水平的树脂装载(mmol/g)用作一个质量控制标准。
将树脂分成9个等份。然后将9份Fmoc-保护的氨基酸(X1)独立地加到各树脂等分试样中，并通过所述方法偶合2小时。然后将树脂汇集在在底部装配有玻璃料的圆柱形玻璃容器中。通入干燥氮气以将树脂混合。如上所述除去Fmoc保护基。
将树脂分成4个等份。然后将4份Fmoc-保护的氨基酸(X2)独立地加到各树脂等分试样中，并用相同偶合方法进行偶合。除去Fmoc保护基，并测定树脂装载。在下一循环中，通过所述方法偶合L-天冬酰胺。然后将树脂分成等分试样以进行另一偶合循环。所有随机化步骤完成后，除去Fmoc，用三氟乙酸(82.5％)、茴香醚(5％)、水(5％)、茴香硫醚(5％)、乙二硫醇(2.5％)的混合物经由2.5小时裂解掉侧链保护基。然后用三氟乙酸、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤树脂。将所得库在4℃干燥贮存。
为了检查库的质量，随机选择几个珠子，通过Edman降解和质谱技术定序。
Figure C0080450100391
合成方案1
1.3结果(还参见附图2-12)
Figure C0080450100421
Figure C0080450100441
Figure C0080450100461
Figure C0080450100471
Figure C0080450100481
2.大规模合成
2.1合成N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸(A8)
概述：分10步制备N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸(A8)：
2.1.1反式-3-(2’-萘基)-丙烯酸乙酯(A1)
向2-萘甲醛(7.8g，50mmol)在50mL乙醇内的溶液中加入(乙氧羰基亚甲基)三苯基正膦(18.3g，52.5mmol)。观察到有轻微放热。有沉淀形成，同时将该混合物搅拌过夜。将该反应混合物用Et2O(500mL)稀释，并用1M H3PO4(2×100mL)、饱和NaHCO3(1×100 mL)、水(100mL)、和盐水(100mL)洗涤。将有机部分干燥(MgSO4)，并减压浓缩。将残余物过SiO2塞，用9∶1己烷∶EtOAc洗脱。真空浓缩后，以接近定量的收率收集到了产物，为85∶15的几何异构体混合物(反式占优势，nmr)。将产物从己烷/EtOAc(己烷占大部分)中重结晶，收集到了4.5g所需产物，为97∶3的异构体混合物(nmr)。将母液浓缩，并如前所述重结晶，又收集到了2.9g(总共7.4g，33mmol，收率65％)。NMR(CDCl3)δ7.93(s，1H)；7.88-7.83(c，4H)；7.67(dd，1H，J＝1.6，8.6Hz)；7.53-7.50(c，2H)；6.55(d，1H，J＝16.0Hz)；4.30(q，2H，J＝7.1Hz)；1.42(t，3H，J＝7.1Hz).
2.1.2反式-3-(2’-萘基)-丙烯酸(A2)
向酯A1(4.24g，18.8mmol)在THF(75mL)内的溶液中加入在水(19mL)中的LiOH.H2O(2.36g，56.3mmol)。将开始时呈多相的该混合物剧烈搅拌过夜，该混合物变均匀。用浓盐酸将该反应混合物酸化(pH约为2)，形成了沉淀。将该多相混合物转移到分液漏斗中，并用EtOAc(3×150mL)萃取。将合并的萃取液干燥(MgSO4)，并真空浓缩，收集到了该羧酸，为白色固体(3.66g，收率98％)。NMR(CDCl3)δ7.97(d，1H，J＝15.7Hz)；7.90(d，1H，J＝15.3Hz)；7.90-7.83(c，3H)；7.70(dd，1H，J＝1.6，8.6Hz)；7.57-7.50(c，2H)；6.58(d，1H，J＝16.0Hz)。
2.1.3反式-(4S)-3-(3’-(2″-萘基)-丙烯酰基)-4-苯基-2-噁唑烷酮(A3)
将羧酸A2(3.66g，18.5mmol)和三乙胺(1.87g，2.56mL，18.5mmol)在无水THF(74mL)中的溶液冷却至-78℃。用2分钟加入新戊酰氯(2.35g，2.40mL，19.4mmol)，期间形成了白色沉淀。10分钟后，将烧瓶置于0℃浴中放置10分钟，然后将烧瓶再冷却至-78℃，并保持1.5h小时。在一个单独烧瓶中，将衍生自L-苯基甘氨醇的噁唑烷酮(3.31g，20.3mmol)在无水THF(74mL)中的溶液冷却至-78℃。加入n-BuLi溶液(1.6M的己烷溶液，11.6mL，18.5mmol)，并继续搅拌约1小时，从该THF/溶液中沉淀出了金属化的噁唑烷酮。通过插管将该混合酸酐加到金属化的噁唑烷酮中，并将该反应混合物置于0℃浴中。1小时后，移去该浴，将该混合物温热至室温并保持过夜。用50mL饱和NH4Cl中止该反应。将THF减压除去，转移到分液漏斗中，然后用CH2Cl2(3×75mL)萃取。将合并的有机部分用1MNaOH(2×50mL)洗涤，干燥(MgSO4)并浓缩。将残余物从EtOAc/己烷中重结晶，收集到了白色固体(3.87g，11.2mmol，收率61％)。NMR(CDCl3)δ8.05(d，1H，J＝15.7Hz)；7.94(d，1H，J＝15.4Hz)；7.87-7.81(c，3H)；7.76(dd，1H，J＝1.5，8.6Hz)；7.53-7.47(c，2H)；7.41-7.34(c，5H)；5.58(dd，1H，J＝8.7，3.9Hz)；4.76(t，1H，J＝8.7Hz)；4.33(dd，1H，J＝8.8，3.9Hz)。
2.1.4(3’R4S)-3-(3’-(2″-萘基)-4’-戊烯酰基)-4-苯基-2-噁唑烷酮(A4)
在-78℃，向CuI(3.96g，20.9mmol)和TMEDA(2.66g，3.46mL，22.9mmol)在无水THF(92mL)内的溶液中加入溴化乙烯基镁(1.0M的THF溶液，20.9mL，20.9mmol)。将该混合物搅拌15分钟。在一个单独的烧瓶中，将三甲基甲硅烷基氯(5.69g，6.64mL，52.2mmol)加到不饱和酰亚胺A3(3.87g，11.3mmol)在无水THF(42mL)内的溶液中。由于该酰亚胺的不溶性，移去含有铜酸盐试剂的该烧瓶的隔片，一次性加入酰亚胺浆液，并用少量THF迅速洗涤。将水浴温度升至-30℃，并继续搅拌1小时。将该反应混合物倒入250mL 3∶2的饱和NH4Cl∶浓NH4OH混合物中。分离各层，用EtOAc(3×200mL)萃取水层。将合并的有机部分依次用饱和NH4Cl(1×100mL)和水(1×100mL)洗涤。将有机部分(MgSO4)干燥并减压浓缩。将残余物过二氧化硅塞以进行纯化，用4∶1的己烷∶EtOAc洗脱。将洗脱液真空浓缩，收集到了白色固体(3.64g，9.81mmol，收率87％).NMR(CDCl3)δ7.87-7.82(c，3H)；7.72(s，1H)；7.54-7.27(c，8H)；6.11(ddd，1H，J＝6.7，10.4，17.0Hz)；5.34(dd，1H，J＝8.6，3.5Hz)；5.10(d，1H，J＝8.2Hz)；5.08(d，1H，J＝17.2Hz)；4.56(t，1H，J＝8.8Hz)；4.26(dd，1H，J＝8.8，3.5Hz)；4.16(ddd，1H，J＝8.1，7.0，6.9Hz)；3.68(dd，1H，J＝8.4，16.5Hz)；3.50(dd，1H，J＝6.5，16.5Hz)。
2.1.5(2’S3’R4S)-3-(2’-叠氮基-3’-(2″-萘基)-4’-戊烯酰基)-4-苯基-2-噁唑烷酮(A5)
在-78℃，将六甲基二硅氮烷基钾(0.5M的甲苯溶液，25.5mL，12.8mmol)一次性加到无水THF(34mL)中。通过插管加入酰亚胺A4(3.64g，9.81mmol)在THF(34mL)中的浆液，并用THF(2×11mL)洗涤以转移完全。30分钟后，将三甲硅烷基叠氮化物(4.40g，14.2mmol)溶于THF(34mL)中，冷却至-78℃，并通过插管加入。30分钟后，加入AcOH(1.41g，1.34mL，23.4mmol)以中止反应。将该混合物在室温搅拌过夜。将该混合物在CH2Cl2(300mL)和稀盐水(150mL)之间分配。分离各层，并用CH2Cl2(3×150mL)萃取水相。将合并的有机部分干燥(MgSO4)，并减压浓缩。通过快速柱色谱法纯化残余物，回收到了产物(3.41g，8.28mmol，收率84％)。NMR(CDCl3)δ7.85-7.82(c，3H)；7.72(s，1H)；7.53-7.47(c，2H)；7.42(dd，1H，J＝1.7，8.5Hz)；7.37-7.31(c，3H)；
7.18-7.15(c，2H)；6.28(ddd，1H，J＝8.2，10.2，17.1Hz)；5.63(d，1H，J＝10.2Hz)；5.37(d，1H，J＝17.0Hz)；5.34(d，1H，J＝10.2Hz)；4.83(dd，1H，J＝3.0，8.3Hz)；4.14(t，1H，J＝7.2Hz)；4.07(dd，1H，J＝9.3，17.9Hz)；3.94(dd，1H，J＝3.0，5.8Hz)；3.68(t，1H，J＝8.6Hz)。
2.1.6(2S3R)-2-叠氮基-3-(2’-萘基)-4-戊烯酸甲酯(A6)
向酰亚胺A5(3.41g，8.28mmol)在THF(62mL)内的溶液中加入水(21mL)、35％H2O2(2.7mL)、和LiOH.H2O(695mg，16.6mmol)。2小时后，加入Na2SO3(4.17g，33.1mmol)在水(41mL)中的溶液。将该混合物搅拌15分钟，减压除去THF。用HCl酸化该水溶液，并用EtOAc(2×150mL)萃取。将合并的萃取液干燥(MgSO4)，并减压浓缩。将残余物过二氧化硅塞柱，并用1∶1的己烷∶EtOAc洗脱，浓缩后，收集到了白色固体，推测其是羧酸与手性副产物的混合物。从己烷/EtOAc中重结晶，获得了手性副产物，为针状结晶。将母液浓缩，并进行酯化步骤。将含有羧酸粗产物的残余物溶于无水MeOH(46mL)中，并冷却至0℃。加入亚硫酰氯(1.18g，725μL，9.94mmol)，10分钟后，将该混合物加热回流2小时。向该混合物中加入水(1.0mL)，搅拌10分钟，将烧瓶的内容物减压浓缩。把残余物在EtOAc(150mL)和盐水(100mL)之间分配。分离各层，将有机部分干燥(MgSO4)，并减压浓缩。通过快速柱色谱法(19∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物，收集到了该甲酯(1.54g，5.48mmol，收率66％)。NMR(CDCl3)δ7.84-7.80(c，3H)；7.71(s，1H)；7.50-7.46(c，2H)；7.39(dd，1H，J＝1.8，8.5Hz)；6.23(ddd，1H，J＝8.3，10.9，17.6Hz)；5.30(d，1H，J＝9.9Hz)；5.28(d，1H，J＝17.7Hz)；4.22(d，1H，J＝7.5Hz)；4.06(t，1H，J＝7.9Hz)。
2.1.7反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸甲酯(A7)
将硼烷-二甲硫醚络合物(2.0M的THF溶液，6.57mL，13.1mmol)用无水THF(26mL)稀释，并冷却至0℃。通过注射器小心地加入环己烯(2.16g，2.66mL，26.3mmol)。30分钟后已形成了白色沉淀，继续搅拌3小时。将烧瓶中的内容物真空浓缩。将该反应物在CH2Cl2(36mL)中形成浆液，并冷却至0℃。将乙烯基叠氮化物A6(1.23g，4.38mmol)溶于CH2Cl2(9mL)中，并通过插管加入。该反应混合物变成淡黄色，明显有气体释放出来。将该混合物温热至室温并保持过夜。加入MeOH(26mL)，并再搅拌15分钟。将该混合物减压浓缩。把残余物置于Et2O(25mL)中，并用0.1M HCl(5×25mL)萃取。用饱和碳酸氢钠将水萃取液碱化，并用CH2Cl2(3×100mL)萃取。将有机萃取液干燥(MgSO4)，并真空浓缩，收集到了含有一些衍生自二环己基硼烷的污染物的环化产物(974mg，3.82mmol，粗产物收率87％)。NMR(CDCl3)δ7.84-7.78(c，3H)；7.71(s，1H)；7.49-7.41(c，3H)；3.91(d，1H，J＝6.9Hz)；3.69(s，3H)；3.63(m，1H)，3.48(dd，1H，J＝8.2，15.4Hz)；3.27(d，1H，J＝7.8Hz)；3.25(d，1H，J＝7.8Hz)；2.33(m，1H)，2.09(m，1H)。
2.1.8N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸(A8)
将510mg(2mmol)甲酯(A7)在12ml 6N HCl中于100℃加热10小时。将该反应溶液减压浓缩，把固体残余物悬浮在15ml丙酮中。用2N碳酸钠溶液将该悬浮液调节至pH 9-10。然后缓慢地加入742mg(2.2mmol)Fmoc-O-琥珀酰亚胺。然后将pH调节至9-10，并将该混合物在室温搅拌4小时，然后在室温放置过夜。用浓盐酸将pH调节至2，将该混合物与乙酸乙酯混合。抽滤出560mg沉淀产物。用乙酸乙酯将水相萃取3次，然后与二氯甲烷混合。又以沉淀形式获得了185mg产物。产量：745mg(80.4％)。NMR(d6-DMSO)δ7.95-7.80(c，6H)；7.68(d，1H，J＝7.3Hz)；7.60(d，1H，J＝7.4Hz)；
7.50-7.34(c，6H)；7.25(m，1H)，4.39-4.15(c，4H)；3.70-3.48(c，3H)；2.29(m，1H)；2.14(m，1H)。
2.2N-琥珀酰基-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-丙氨酰基-L-缬氨酰胺(34)
Figure C0080450100541
2.2.1N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-缬氨酰胺(B1)
将463.5mg(1mmol)N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸(A8)、338mg H-Asn-Ala-Val-NH2盐酸盐(依据常规肽化学方法制备的)和135mg HOBT溶于20ml DMF中。在0℃，加入0.13ml N-乙基吗啉和220mg DCC。将该混合物在0℃搅拌1小时，然后在室温搅拌3小时，之后在室温放置过夜。抽滤出沉淀，将溶液在高度真空下浓缩。将残余物在戊醇和碳酸氢钠溶液之间分配。用KHSO4溶液和H2O/NaCl溶液洗涤戊醇相。抽滤出沉淀，并用乙醚充分研制。获得了473mg产物。将戊醇相用Na2SO4干燥并浓缩。用乙醚将残余物研制2次。又获得了另外257mg产物。产量：730mg(97.7％)。
2.2.2反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-缬氨酰胺(B2).
将248mg(0.332mmol)N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-缬氨酰胺B1置于5ml DMF中。加入0.35ml(3.32mmol)二乙胺，将该混合物在室温搅拌15分钟。将该混合物经由澄清层抽滤，并在高度真空下浓缩。将该固体残余物用乙醚研制，并抽滤产量：141mg(81％)。
2.2.3琥珀酸甲酯叔丁酯(B3).
在氩气氛下，将13.2g(100mmol)琥珀酸一甲酯悬浮在500ml二氯甲烷中。用30分钟滴加12.9ml(150mmol)草酰氯，然后将该混合物在室温搅拌6小时。大约3.5小时后，获得了澄清的溶液。然后滴加300ml叔丁醇。之后将该混合物在室温放置21小时，并将该澄清溶液浓缩。把残余物溶于乙酸乙酯中，并用H2O、NaHCO3溶液和H2O洗涤。用硫酸钠将该溶液干燥，并浓缩。
产量：21.6g(油状粗产物)。
2.2.4琥珀酸一叔丁酯(B4)
将9.4g(50mmol)琥珀酸甲酯叔丁酯(B3)溶于115ml 1，4-二氧杂环己烷中。然后加入110ml 0.5N NaOH。将该混合物在室温放置，产物沉淀出来。将该混合物在室温放置一个周末，之后浓缩。用乙醚萃取该水溶液。将水相冷却至0℃，并用冷的2N H2SO4酸化至pH4。然后用乙醚将该混合物萃取5次。合并有机相，用水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。产量：5.62g油状物(64.5％)。
2.2.5N-叔丁基琥珀酰基-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-缬氨酰胺(B5)
将262mg(0.5mmol)反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-缬氨酰胺(B2)、87.1mg(0.5mmol)琥珀酸一叔丁酯(B4)和67.5mg HOBt溶于5ml DMF。在0℃，加入110mg DCC，将该混合物在0℃搅拌1小时，然后在室温搅拌2小时，并在室温放置过夜。抽滤出沉淀，将滤液在高度真空下浓缩。用碳酸氢钠溶液研制残余物，抽滤，用水洗涤，并在干燥器中干燥。
产量：169mg(49.6％)。
2.2.6N-琥珀酰基-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-缬氨酰胺(34)
将316mg N-叔丁基琥珀酰基-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-缬氨酰胺(B5)溶于2ml 90％浓度的三氟乙酸中，并在室温放置1小时。然后将该混合物经由澄清层过滤，并浓缩。用乙醚研制残余物，并抽滤。获得了159mg粗产物。为了纯化，将该粗产物经由SephadexLH20进行色谱处理，用丁醇/冰醋酸/水混合物洗脱。
产量：27.5mg(9.5％)。
m/z：625.298949(M+H)+(高分辨率质谱)。
化合物34的NMR数据：
Figure C0080450100561
化合物34在DMSO中于300K的化学位移：
  见上式   1H   13C
  反式   顺式   反式   顺式
  But-1   -   -   173.88   173.92
  But-2   2.54/2.46   2.61/2.20   28.64   28.37
  But-3   2.70/2.54   2.56/2.39   28.80   28.80
  But-4   -   -   170.67   170.22
  Pro-α   4.39   4.68   66.18   65.46
  Pro-C’   -   -   171.03   170.94
  Pro-β   3.55   3.68   47.42   49.45
  Pro-γ   2.40/2.16   2.33/1.94   32.02   30.41
  Pro-δ   3.81/3.72   3.59/3.53   46.12   45.40
  Nap-1   -   -   138.79   139.55
  Nap-2   7.76   7.78   125.14   124.79
  Nap-2a   -   -   132.97   132.97
  Nap-3   7.87   7.87   127.66   127.66
  Nap-4   7.49   7.49   126.03   126.03
  Nap-5   7.48   7.48   125.63   125.63
  Nap-6   7.88   7.88   127.33   127.33
  Nap-6a   -   -   131.98   131.98
  Nap-7   7.87   7.89   127.97   127.97
  Nap-8   7.45   7.46   125.96   125.96
  Asn-NH   8.31   8.50   -   -
  Asn-α   4.44   4.64   50.13   49.79
  Asn-C’   -   -   170.58   170.29
  Asn-β   2.64/2.46   2.57/2.45   36.96   36.25
  Asn-γ-C’   -   -   171.73   171.44
  Asn-δ-NH2   7.41/6.93   7.33/6.93   -   -
  Ala-NH   7.74   8.02   -   -
  Ala-α   4.19   4.27   48.71   48.46
  Ala-C’   -   -   171.84   171.78
  Ala-β   1.22   1.19   17.49   18.04
  Val-NH   7.48   7.70   -   -
  Val-α   4.04   4.08   57.69   57.57
  Val-C’   -   -   172.77   172.73
  Val-β   1.97   1.97   30.08   30.29
  Val-γ   0.82   0.86   19.24   19.27
  Val-γ‘   0.82   0.84   17.89   17.97
  Val-NH2   7.15/6.99   7.27/7.00   -   -
2.3N-琥珀酰基-L-(2-萘基)丙氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基甘氨酸-3-羟基丙基酰胺(24)
Figure C0080450100581
2.3.1苄氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇)酰胺(C1)
将627g(30mmol)Gly-OH、2.45ml 3-氨基-1-丙醇、4.05gHOBt溶于60ml DMF中。在0℃，加入6.6g DCC。将该混合物在0℃搅拌1小时，在室温搅拌3小时，并在室温放置过夜。抽滤出沉淀，将滤液在高度真空下浓缩。把残余物在乙酸乙酯和NaHCO3溶液之间分配。然后将有机相用NaHCO3溶液和H2O/NaCl洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。用乙醚研制残余物。
产量：7.05g(88.2％)。
2.3.2苄氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C2)
将7g(26.28mmol)苄氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇)酰胺(C1)溶于60二氧杂环己烷中。在低温下(液态CO2)，缓慢地加入6ml H2SO4。然后加入60ml缩合的异丁烯。将该混合物在高压反应釜中于室温和大约20巴的氮气压力下振摇3天。然后将该混合物与乙醚混合，并用2NNa2CO3溶液萃取3次。用乙醚洗涤该水溶液。合并有机相，用水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。
产量：7.98g(94.2％)。
2.3.3甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺盐酸盐(C3)
将7.98g(24.75mmol)苄氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C2)溶于80ml MeOH中，与Pd/碳混合，并使用HCl甲醇溶液和H2在自动滴定仪上氢化。然后抽滤出催化剂，并将滤液浓缩。将残余物在高度真空下干燥。
产量：4.7g(84.5％).
2.3.4苄氧基羰基-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C4)
将5.13g(20.43mmol)苄氧基羰基-Val-OH、4.59g(20.43mmol)甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺盐酸盐(C3)和2.75g HOBt溶于60ml DMF中。在0℃，加入2.65ml N-乙基吗啉和4.5g DCC。将该混合物在0℃搅拌1小时，然后在室温搅拌2小时。将该混合物在室温放置过夜，然后在高度真空下浓缩。将该残余物在冰醋酸和碳酸氢钠溶液之间分配。然后将冰醋酸相用NaHCO3溶液、KHSO4溶液和H2O/NaCl洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。用乙醚乙醚研制固体残余物，并抽滤。
产量：7.32g(85％).
2.3.5L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺盐酸盐(C5)
将7.29g(17.3mmol)苄氧基羰基-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C4)溶于90ml MeOH中，与Pd/碳混合，并用HCl甲醇溶液在自动滴定仪上氢化。然后抽滤出催化剂，并将滤液浓缩。将残余物(无定形)在高度真空下干燥，用乙醚研制，并抽滤。
产量：5.22g(93.2％).
2.3.6苄氧基羰基-L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C6)
将5.46g(18.5mmol)Z-Ser(But)OH、6g(18.5mmol)L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺盐酸盐(C5)和2.5g HOBt溶于60ml DMF中。在0℃，加入2.4ml N-乙基吗啉和4.07g DCC。将该混合物在0℃搅拌1小时，然后在室温搅拌3小时。将该混合物在室温放置过夜，然后在高度真空下浓缩。将该固体残余物在冰醋酸和碳酸氢钠溶液之间分配。然后将冰醋酸相用NaHCO3溶液、KHSO4溶液和H2O/NaCl洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。用乙醚研制固体残余物，并抽滤。
产量9.74g(93.2％)。
2.3.7L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺盐酸盐(C7)
将9.74g(17.25mmol)苄氧基羰基-L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C6)溶于大约100ml MeOH中，与Pd/碳混合，并用HCl甲醇溶液在自动滴定仪上氢化。然后抽滤出催化剂，并将滤液浓缩。将残余物(无定形)在高度真空下干燥，用乙醚研制，并抽滤。
产量：8.02g(99.6％).
2.3.8苄氧基羰基-L-天冬酰胺-L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C8)
将4.53g(17mmol)Z-Asn-OH、7.94g L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺盐酸盐(C7)和2.3g HOBt溶于60ml DMF中。在0℃，加入2.21ml N-乙基吗啉和3.74g DCC。将该混合物在0℃搅拌1小时，在室温搅拌3小时，然后在高度真空下浓缩。将该固体残余物在戊醇和碳酸氢钠溶液之间分配。然后将戊醇相用NaHCO3溶液、KHSO4溶液和H2O/NaCl洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。用乙醚研制残余物，冷却并抽滤。将产物在干燥器中用P2O5干燥。
产量：10.8g(93.6％).
2.3.9L-天冬酰胺-L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺盐酸盐(C9)
将10.8g(15.9mmol)苄氧基羰基-L-天冬酰胺-L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C8)溶于大约160ml温热的MeOH中，与Pd/碳混合，并用HCl甲醇溶液在自动滴定仪上氢化。然后抽滤出催化剂，并将滤液浓缩。将无定形残余物在高度真空下干燥，用乙醚研制，冷却并抽滤。
产量：8.96g(97％).
2.3.10苄氧基羰基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C10)
将5.24g(15mmol)苄氧基羰基-2-Nal-OH、8.72g(15mmol)L-天冬酰胺-L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺盐酸盐(C9)和2.04g HOBt溶于60ml DMF中。在0℃，加入1.95ml N-乙基吗啉和3.3g DCC。将该混合物在0℃搅拌1小时，在室温搅拌3小时。然后将该混合物在室温放置过夜，用DMF稀释并轻微加热。然后抽滤出沉淀，并将滤液在高度真空下浓缩。用NaHCO3溶液研制残余物，抽滤，然后用KHSO4溶液研制，抽滤，用水研制，抽滤，并用水洗涤，在干燥器中用P2O5干燥。
产量：13.25g(＞99％)。
2.3.11L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺盐酸盐(C11)
将8.85g(10.1mmol)苄氧基羰基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C10)部分溶于270ml MeOH中，与Pd/碳混合，并用HCl甲醇溶液在自动滴定仪上氢化。用DMF将该悬浮液稀释。大约6小时后，将该混合物浓缩至其最初体积的一半。所有物质都溶解了。将该混合物在室温放置过夜。然后抽滤出催化剂，将滤液用相同量的MeOH稀释，与新催化剂(Pd/碳)混合，并在自动滴定仪上进一步氢化。7小时后，将该混合物在室温放置过夜。然后将该混合物再氢化4小时，抽滤出催化剂，并将滤液浓缩。将残余物(无定形)在高度真空下干燥，然后用乙醚研制，并抽滤。
产量：7.56g(96.2％)。
2.3.12N-叔丁基琥珀酰基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-丝氨酸-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇)酰胺(C12)
将523mg(3mmol)L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-丝氨酸(叔丁酯)-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺盐酸盐(C11)、2.33g琥珀酸一叔丁酯(B4)和405mg HOBt溶于20ml DMF中。在0℃，加入0.39ml N-乙基吗啉和660mg DCC。将该混合物在0℃搅拌1小时，在室温搅拌2小时，然后在室温放置过夜。将该混合物在高度真空下浓缩，用NaHCO3溶液研制固体残余物，抽滤。然后用KHSO4溶液研制产物，抽滤，用水洗涤，在干燥器中用P2O5干燥。
产量：3.04g(粗产物).
2.3.13N-琥珀酰基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-丝氨酸-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇)酰胺(24)
将3g(粗产物)N-叔丁基琥珀酰基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-丝氨酸-L-缬氨酸-甘氨酸-(3-丙醇)酰胺(C12)溶于30ml 90％浓度的三氟乙酸中，并在室温放置1小时。然后将该混合物浓缩，用乙醚研制残余物，并抽滤。获得了2.6g粗产物。为了纯化，将250mg粗产物溶于温热的冰醋酸中，并经由Sephadex LH20进行色谱处理，用丁醇/冰醋酸/水混合物洗脱。
产量：103mg
m/z：730.341246(M+H)+(高图形分辨率质谱).
化合物24的NMR数据：
Figure C0080450100631
  见上式   1H   13C
  But-1   -   173.71
  But-2   2.29   28.99
  But-3   2.32/2.26   29.91
  But-4   -   171.15
  Nap-NH   8.19   -
  Nap-α   4.60   53.92
  Nap-C’   -   171.20
  Nap-β   3.19/2.91   37.56
  Nap-1   -   135.62
  Nap-2   7.42   127.85
  Nap-3   7.80   127.30
  Nap-3a   -   131.75
  Nap-4   7.85   127.38
  Nap-5   7.44   125.31
  Nap-6   7.47   125.83
  Nap-7   7.82   127.38
  Nap-7a   -   132.91
  Nap-8   7.73   127.38
  Asn-NH   8.35   -
  Asn-α   4.60   49.73
  Asn-C’   -   170.92
  Asn-β   2.60/2.49   37.03
  Asn-γ-C’   -   171.73
  Asn-δ-NH2   7.44/6.99   -
  Ser-NH   7.89   -
  Ser-α   4.33   55.15
  Ser-C’   -   170.13
  Ser-β   3.66/3.56   61.52
  Ser-OH   4.93   -
  Val-NH   7.82   -
  Val-α   4.10   58.37
  Val-C’   -   171.02
  Val-β   2.04   29.91
  Val-γ   0.86   19.17
  Val-γ‘   0.86   18.11
  Gly-NH   8.06   -
  Gly-α   3.65   41.97
  Gly-C’   -   168.45
  Xxx-NH   7.63   -
  Xxx-2’   3.10   35.78
  Xxx-3’   1.54   32.24
  Xxx-4’   3.40   58.33
  Xxx-4’-OH   4.40   -
3.抑制层粘连蛋白/巢蛋白相互作用和生物活性
除非另有说明，否则所用的化学品购自Merck(Darmstadt)，Sigma(Munich)或Riedel de Haen(Seelze)。
从人胎盘中分离层粘连蛋白P1、从转染的HEK-293细胞中分离人巢蛋白、和从HEK-293细胞中分离小鼠层层粘连蛋白γ1 III 3-5描述在WO 98/31709中。
实施例3.1抑制测定-用所发现的肽衍生物抑制层粘连蛋白/巢蛋白结合
3.1.1.HTS筛选测定(高灵敏性测定变型)：
时间-解析荧光测定
包被试管
在室温将微量滴定板(例如FluoroNunc)用75μl 0.1μg/ml层粘连蛋白P1溶液(在0.159g Na2CO3，0.293g NaHCO3，0.02g NaN3/升，pH 9.2中)包被1小时。然后将该溶液倒出，通过与0.5％BSA(在7.9g NaCl，1.2g Na2HPO4，0.31g KCl，0.23g of NaH2PO4，0.04％吐温20/升，pH 7.2中)在室温培养0.5小时来阻断游离的结合位点。阻断反应完成后，倾出溶液，用250μl洗涤缓冲液(PBS/0.04％吐温)洗涤一次。
顺序抑制
与包被平行进行的是，将85-100μl 0.25nM巢蛋白溶液(重组制得的人巢蛋白)与抑制剂或标准物在单独的反应容器中预培养(在7.9g NaCl，1.2g Na2HPO4，0.31g KCl，0.23g NaH2PO4，0.04％吐温20/升，0.5％BSA，pH 7.2中于室温预培养1小时)。
将75μl预培养物(巢蛋白+抑制剂或标准物)转移到微量滴定板的包被孔中，并在室温培养1小时。然后用PBS/0.04％吐温洗涤2次。通过在室温与75μl特异性抗体制备物(由用人巢蛋白免疫接种的小鸡的蛋黄制得的)培养1小时来检测结合的巢蛋白。使用在PBS/0.04％吐温中进行了1∶500稀释的IgY片段。用PBS/0.04％吐温洗涤后，通过加入抗-小鸡IgY-生物素(75μl 1∶2500稀释液；Promega，Madison，WI 53711，608-274-4330)来检测巢蛋白与特异结合抗体的复合物。培养1小时，用PBS/0.04％吐温洗涤2次，然后与链霉抗生物素蛋白-铕培养(Wallac；在室温培养1小时)，用PBS/0.04％吐温洗涤2次。加入100μl增强溶液(Wallac)并振摇5分钟后，可用铕方案在Victor多标记计数器中测定荧光信号。发现了在该溶液中与抑制剂结合的巢蛋白的量和不具有所加入的抑制剂的巢蛋白的量之间的关系。
3.1.2.3-天平衡测定
在该测定变型中评价所选抑制剂的抑制活性。该测定描述在US5,493,008中。
下表比较了所选物质的IC50值与HTS筛选测定的结果。很明显，该3-天测定给出了稍低的测定值，并且如预计的那样，该测定比筛选测定的灵敏度高。然而，从该比较中可明显看出，可用我们开发的筛选测定可靠地鉴定具有抑制活性的结构。
表2：层粘连蛋白/巢蛋白结合的特异性抑制剂的特征：在不同测定变型中的IC50值(μM)
  结构  HTS测定   3-天平衡测定
  NIDPNAV  3.9   1.2
  DPNAV  7.7   5.0
  化合物24  0.36   0.09
  化合物31  0.19   0.085
实施例3.2(假设)
测试肽衍生物的生物活性
可使用在文献中详细描述的几种模型来测定肽衍生物的生物活性。
其中的代表性模型如下所述：
在胚胎肾培养物中的细管形成
Grobstein，C.；(1956)Exp.Cell Res.10：424-440.
Ekblom，P.等人.(1994)Development 120：2003-2014
在胚胎肺中的分支形态
Ekblom，P.等人.(1994)Development 120：2003-2014
在胚胎唾液腺中的分支形态
Grobstein，C.(1953)J.Exp.Zool.124：383-413
Kadoya，Y.等人.(1997)Development 124：683-691
器官型皮肤培养物中的基底膜装配
Smola，H.；Stark，H.-J.；Thiektter，G.；Mirancea，N.；Krieg，T.；Fusenig，N.E.(1998)Exp.Cell Res.239：399-410
得自分裂细胞的hydra重新构成
Yang，Y.G.；Mayura，K.；Spainhour，C.B.；Edwards Jr.，J.F.；Phillips，T.D.(1993)Toxicology 85：179-198
在提高的葡萄糖浓度下培养后hydra中基底膜的增厚。
Zhang，X.；Huff，J.K.；Hudson，B.G.；Sarras Jr.；M.P.(1990)Diabetologia 33：704-707
R.K.等人.在Nature Medicine(1997)Vol.3，No.中的综述性文章里对所有定量血管生成测定作了总结，例如：
通过植入得自自发血管内皮瘤的细胞来在小鼠中诱导血管瘤
O’Reilly，M.S.；Brem，M.S.；Folkman，J.(1995)J.Pediatr.Surg.30：2；325-329
在不含血清的大鼠主动脉培养物中微血管的生长
Nicosia，R.F.；Ottinetti，A.(1990)Lab.Invest Vol.63，No.1，115-122
包埋到纤维蛋白凝胶中后在微载体上形成内皮细胞的毛细管
Nehls，V.；Drenckhahn，D.(1995)Microvascular Research 50：311-322.

Claims (68)

1.式I化合物：
其中
R1是其中一个下式所示基团
Figure C008045010002C2
 或   或   或
Figure C008045010002C5
 或   或 
或 
Figure C008045010002C8
 或 
其中
R4表示-A、-NH2、-NHR、-NR2、A2、
Figure C008045010002C10
或
Figure C008045010002C11
或
Figure C008045010002C12
且R5表示-(CH2)lCOOA、-(CH2)lCONH2、-(CH2)lNH2或-(CH2)l-SO3H、
Figure C008045010003C1
或
Figure C008045010003C2
且X是其中一个下式所示基团
Figure C008045010003C3
 或   或 
Figure C008045010003C5
 或
Figure C008045010003C6
 或   或 
Figure C008045010003C8
 或
Figure C008045010003C9
 或 
Figure C008045010003C10
其中Y表示O、S、-N(A)-CO-或-(CH2)r-，
D表示(CH2)r、O、S、NH、NR、(CH2)r-O、(CH2)r-S、(CH2)r-NH或(CH2)rNR，且
R2表示-A、-E-OH、-E-COOH或-E-CONH2，
其中E表示直链或支链C1-C10-烷基链，该烷基链未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-环烷基取代，
或者E表示C5-C10-环烷基，该环烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-环烷基取代，
且R3是其中一个下式所示基团
Figure C008045010004C1
 或 
Figure C008045010004C2
或
其中R6表示
Figure C008045010004C4
其中R7表示直链或支链C1-C10-烷基，该烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-环烷基取代，
或者R7表示C5-C10-环烷基，该环烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-环烷基取代，
且R表示C5-C10-环烷基、Het或Ar，所述基团可任选被-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O-C1-C6-烷基-Ar、Het或
Ar取代，
其中
Het表示单环或二环5元-10元芳族或非芳族环，该环包含1或2个相同或不同的选自氮、氧和硫的杂原子作为所述环的成员，并且未取代或者被一个或多个羟基或羧基取代，
Ar表示单环或二环5元-10元芳环，该环未取代或者被一个或多个羟基或羧基取代，
Z表示(CH2)m、O、S、NH、NR、N-C(O)-R或NSO2R，
A表示H或C1-C4-烷基，
l、m和r是0-3的整数，
n和k是1-2的整数，
p是0-1的整数，
q是1-3的整数，
其中所述化合物是所有其立体异构体和所有比例的立体异构体混合物，并包括它们的生理可耐受盐。
2.权利要求1的式I化合物，其中n是1。
3.权利要求1的式I化合物，其中基团X中的R表示Het。
4.权利要求3的式I化合物，其中Het表示
5.权利要求3的式I化合物，其中Het表示
Figure C008045010005C2
6.权利要求3的式I化合物，其中Het表示
Figure C008045010006C1
7.权利要求3的式I化合物，其中Het表示
Figure C008045010006C2
8.权利要求3的式I化合物，其中Het表示
Figure C008045010006C3
9.权利要求1或2的式I化合物，其中基团X中的R表示Ar，所述Ar可任选被-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Ar或Ar取代。
10.权利要求9的式I化合物，其中基团X中的R表示Ar。
11.权利要求10的式I化合物，其中Ar表示
Figure C008045010006C4
12.权利要求10的式I化合物，其中Ar表示
Figure C008045010007C1
13.权利要求10的式I化合物，其中Ar表示
Figure C008045010007C2
14.权利要求10的式I化合物，其中Ar表示
15.权利要求9的式I化合物，其中基团X中的R表示
Figure C008045010007C4
16.权利要求9的式I化合物，其中基团X中的R表示
17.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中X是下式所示基团
Figure C008045010008C1
18.权利要求17的式I化合物，其中Y表示-(CH2)r-。
19.权利要求18的式I化合物，其中r是1。
20.权利要求18的式I化合物，其中r是0。
21.权利要求17的化合物，其中k是2。
22.权利要求17的化合物，其中k是1。
23.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中X是下式所示基团
24.权利要求23的式I化合物，其中D表示-(CH2)r-。
25.权利要求23的式I化合物，其中r是0。
26.权利要求23的式I化合物，其中r是1。
27.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中R1是下式所示基团
28.权利要求27的式I化合物，其中Z表示(CH2)m。
29.权利要求28的式I化合物，其中m是0。
30.权利要求28的式I化合物，其中m是1。
31.权利要求27的式I化合物，其中R5表示-(CH2)l-COOA。
32.权利要求31的式I化合物，其中A表示H。
33.权利要求27的式I化合物，其中R5表示-(CH2)l-COONH2。
34.权利要求31的式I化合物，其中l是0。
35.权利要求27的式I化合物，其中R4表示-NH2。
36.权利要求27的式I化合物，其中R4表示-A。
37.权利要求36的式I化合物，其中A表示H。
38.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中R1是下式所示基团
Figure C008045010009C2
39.权利要求38的式I化合物，其中Z表示-(CH2)m-。
40.权利要求39的式I化合物，其中m是1。
41.权利要求38的式I化合物，其中R4表示-NH2。
42.权利要求38的式I化合物，其中R5表示-(CH2)l-COOA。
43.权利要求42的化合物，其中l是0。
44.权利要求42的化合物，其中A表示H。
46.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中R1是下式所示基团
Figure C008045010010C1
47.权利要求46的式I化合物，其中R5表示-(CH2)l-COOA。
48.权利要求47的式I化合物，其中l是0，且A表示H。
49.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中R2表示A。
50.权利要求49的式I化合物，其中R2表示-CH3。
51.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中R2表示-E-COOH。
52.权利要求51的式I化合物，其中R2表示-CH2-COOH。
53.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中R2表示-E-OH。
54.权利要求53的式I化合物，其中R2表示-CH2-OH。
55.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中R3是下式所示基团
56.权利要求55的式I化合物，其中k是2。
57.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中R3表示
Figure C008045010011C2
58.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中R3是下式所示基团
59.权利要求58的式I化合物，其中R7是支链C1-C10-烷基。
60.权利要求59的式I化合物，其中R7表示-CH(CH3)2。
61.权利要求59的式I化合物，其中R7表示-C(CH3)3。
62.权利要求59的式I化合物，其中R7表示-CH(CH3)CH2-CH3。
63.权利要求59的式I化合物，其中R7表示-CH2-CH(CH3)2。
64.权利要求62的式I化合物，其中q是2。
65.权利要求1-16中一项或多项的式I化合物，其中R3是下式所示基团
66.权利要求58的式I化合物，其中R7表示-CH(CH(CH3)2)2。
67.权利要求58的式I化合物，其中R7表示-CH2C(CH3)3。
68.药物组合物，其中含有至少一种如一项或多项前述权利要求所述的化合物和/或其生理可耐受盐。
69.权利要求1-67中一项或多项的化合物和/或其生理可耐受盐在生产药剂中的用途。
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