CZ300736B6 - Deriváty peptidu o nízké molární hmotnosti a jejich použití jako inhibitory interakce lamininu/nidogenu - Google Patents

Abstract

Deriváty peptidu o nízké molární hmotnosti, které jsou schopné pusobit jako inhibitory interakce mezi lamininem a nidogenem (interakce laminin/nidogen), zpusob jejich prípravy, farmaceutická kompozice, která je z nich pripravená a jejich použití pro prípravu léciv a pro identifikaci inhibitoru interakce laminin/nidogen.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká derivátů peptidů o nízké molární hmotnosti, které mohou působit jako inhibitory interakce mezi tamininem a nidogenem (interakce laminin/nidogen), způsobu jejich přípravy, farmaceutických kompozic, které je obsahují a jejich použití pro přípravu léčiv a pro identifikaci inhibitorů interakce laminin/nidogen.

Dosavadní stav techniky

Asociace lamin inu (800 kDa glykoproteinu) a nidogenu (160 kDa glykoproteinu) se považuje za rozhodující biomolekulámí mechanismus při syntéze a stabilizaci základu membrán (Mayer, U. a Timpl, R. (1994): Extracellular Matrix Assembly and Structure (P.D. Yurchenco, D. Birk a R.P. Mecham, Ed.) S. 389-416, Academie Press, Orlando, FL). Schopnost nidogenu tvořit is temámí komplexy se všemi hlavními složkami základu membrány, jako jsou například isoformy lamininu obsahující γΐ (nomenklatura viz.: Burgeson, R.E.; Chiquet, M.; Deutzmann, R.;

Ekblom, P.; Engel, J.; Kleinmann, H.; Martin, G. R.; Meneguzzi, G.; Paulsson M.; Sanes, J.; Timpl, R.; Tryggvasson, K.; Yamada, Y.; Yurchenco, P.D. (1994) Matrix Biology 14; 209-211), kolagen IV, perlecan a fibulin, a asociované struktury každého z nich znamená, že se předpoklá20 dá, že funguje jako můstek, ktetý navzájem spojuje, prostorově organizuje a stabilizuje nezávislé makrostruktury (Fox, J.W.;Mayer, U.; Nischt, R.; Aumailley, M.; Reinhardt, D,; Wiedemann, H.; Mann, K.; Timpl, R.; Krieg, T.; Engel, I; a Chu, M.L. (1991) EMBO J. 10,3137-3146).

Základy membrán jsou vysoce specializované extracelulámí struktury, kterým se připisuje důležitá úloha pri kontrole funkcí buněk a tkání, výstavbě tkání, tkáňových interakcí, buněčném růstu, transformacích buněk, migraci buněk a při tkáňově specifické expresi genů (Adams, J.C. a Watt, F.M. (1993) Development 117, 1 183—1 198), Pokusy s polyklonainímí protilátkami protilamininu poskytly jasný důkaz o klíčové funkcí interakce laminin/nidogen při syntéze funkčního základu membrány. Popsané protilátky byly získány imunizací králíků lamininem Pl nebo rekombinantně připravenou doménou lamininu vážící nidogen (yl 111 3-5). Protilátky koncentrované afinitní chromatografií na matricích lamininu Pl nebo mamininuyl Ul 3-5 vykazují pri inhibičním testu úplnou inhibiei asociace laminin/nidogen. Tento jev je však založen na sférické blokádě přístupu nidogenu k lamininu protilátkami, jejichž vazebné oblasti jsou umístěny blízko sekvencí lamininu vážících nidogen (Mayer, U.; Nischt, R.; PGschl, E.; Mann, K.; Fukuda, K,; Gerl, M.; Yamada, Y.; Timpl, R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885).

V embryonálních orgánových kulturách inhibují popsané protilátky jak vývoj ledvinných kanálků, vznik plicních sklípků, tak morfogenezi embryonální slinné žlázy. Tyto tři modely reprezentují programy ontogeneze, které závisí na nerušené syntéze nových základů membrán (Ekblom, P.; Ekblom, M.; Fecker, L.; Klein, G.; Zhang, H.Y.; Kadoya, Y.; Chu, M-L.; Mayer, U.; Timpl, R. (1994) Development 120; 2003-2014).

Protilátky směřující proti oblasti sekvence řetězce mamininuyl, která je zásadní pro vazbu nidogenu, jsou také schopny inhibovat asociaci laminin/nidogen. Inhibice je však kompetitivní, narozdíl od protilátek protilamininu popsaných výše, protože soutěží přímo s nidogenem o vazebné místo na lamininu (WO 98/31709).

Monoklonální protilátka podtridy IgM (antilaminin Pl A6/2/4 DSM ACC2327; viz. WO 98/31709) inhibuje interakci laminin/nidogen in vitro pri IC₅₀30nM. Jako polyklonální přípravek protilátky protilamininu popsaný výše, působí preventivně proti morfogenezi embryonické slinné žlázy v kultuře orgánu. Tato skutečnost podtrhuje specifičnost interakce laminin/nidogen a důležitost LE-4 modulu a identifikované oblasti sekvence v doméně lamininu yl III4 při této interakci.

Nidogenová vazebná doména lamininu byla jednoznačně identifikována a charakterizována ve smyslu jejího umístění, sekvence a její prostorové struktury (rentgenová krystalová struktura a NMR struktura) (Gerl, M.; Mann, K.; Aumaiiley, M.; Timpl, R. (1991) Eur. J. Bíochem. 202;

167-174. Mayer, U.; Nischt, R.; Póschl, E.; Mann, K.; Fukuda, K.; Gerl, M.; Yamada,Y.;

Timpl, R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885. Baumgartner, R.; Czisch, M.; Mayer, U.; Pfischl, E.; Huber, R.; Timpl, R.; Holak, T.A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668. Stetefeld, J.; Mayer, U.; Timpl, R.; Huber, R. (1996) J. Mol. Biol. 257; 644-657). Je umístěna v “LE modulu“ (lamininový typ podobný epidermálnímu růstovému faktoru) krátkého ramene řetězce yl lamininu, io v doméně yl III 4 „LE moduly“ jsou strukturními motivy 50 az 60 aminokyselin, které mají komplexní poskládanou strukturu, analogickou jako EGF, se 4 disulfidovými můstky (Baíroch, A.; (1995) Nomenclature of extracellular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank. release 310. Engel, J. (1989) FEBS Letters 251; 1 -7).

Vysoce afinitní vazba nidogenu ke komplementární doméně lamininu byla zjištěna u lamininu Pl z EHS nádoru myší, u mamininu2 a mamininu4 z lidské placenty a lamininu zoctomilky. Důvodem této druhově se překrývající vazebné specifičnosti je mimořádně rozsáhlá shoda sekvence přítomné v doméně yl III 4 u zkoumaných druhů. Je to 97% mezi člověkem a mouchou, 61 % mezi myší a octomilkou a, překvapivě, 51 % mezi mouchou a Caenorhabditis elegans, pokud se bere v úvahu celá doména (Pikkarinen, T.; Kallunki, T.; Tryggvasson, K. (1987) J. Biol. Chem. 263; 6 751-6 758. Chi, H.-C.; Hui,C.-F. (1989) J. Biol. Chem. 264; l 543-1 550. Wilson, R. a kol. (1994) Nátuře 368: 32-38. Póschl, E.; Mayer, U.; Stetefeld, J.; Baumgartner, R.; Holak, T.A; Huber, R.; Timpl, R. (1996) EMBO J. 15: 5 154-5 159).

Kromě závislosti vazby nidogenu na neporušené třírozměrné struktuře byly identifikovány jednoznačné oblasti sekvence v S-S stabilizovaných smyčkách a a c domény yl III 4. Bylo identifikováno pět esenciálních aminokyselin, kdy čtyři jsou umístěny uvnitř oblasti 7 aminokyselin ve smyčce a a tyrosinový postranní řetězec ve smyčce c (Mann, K.; Deutzmann, R.; Timpl, R. (1988) Eur. J. Biochem. 178; 71-80).

Syntetické peptidy, které mohou být odvozeny od příslušných oblastí domény yl III 4 a jsou schopny inhibovat úplně vazbu laminin/nidogen při testech vazebné specifičnosti jsou popsány v J.W. Fox a R. Timpf (US 5 493 008).

O vysoce afinitní vazbě nidogenu k vazebnému místu lamininu se předpokládá, že vyžaduje interakci s tyrosinem nebo histidinem ze smyčky (smyčky c) sousedící s konkrétní vazebnou sekvencí. O této aromatické interakci se předpokládá, že je předpokladem k inhibici v rozsahu IC50 < 500 nM na základě 3D struktury lamininu yl III 3-5, a je výsledkem vzájemného vztahu struktura/funkce popsaného v US patentu 5 493 008. Nejasná však zůstává odpověď na otázku, zda smyčka c interaguje přímo s nidogenem nebo zda napomáhá stabilizaci vhodné prostorové struktury oblasti sekvence NIDPNAV (Póschl, E.; Fox, J.W.;Block, D.; Mayer, U.; Timpl, R, (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. Baumgartner, R.; Czisch, M.; Mayer, U.; Póschl, E.; Huber, R.; Timpl, R.; Holak, T.A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668. Stetefeld, J.; Mayer, U.; Timpl, R.; Huber, R. (1996) J. Mol. Biol. 257; 644-657).

Interakce laminin/nidogen je ovlivněna silnou konformační složkou (Mayer, U.; Nischt, R.; Póschl, E.; Mann,K.; Fukuda, K.; Gerl,M.; Yamada,Y.; Timpl, R. (1993) EMBOJ. 12; 18791885. Mann, K.; Deutzmann, R.; Timpl, R. (1988) Eur. J. Biochem. 178; 71-80). Syntetické peptidy, které mohou být odvozeny od vazebného místa lamininu k nidogenu, nejsou schopny tvořit matrici s disulfidovými můstky, která je přítomná v LE modulech, ale vykazují aktivitu při testu inhibice, která je asi 400 až lOOOOkrát slabší, než je aktivita neporušeného mamininuPl nebo lamininu yl III 4 (Póschl, E.; Fox, J.W.; Block, D.; Mayer, U.; Timpl, R, (1994) EMBOJ. 13; 3741-3747. J.W. Fox a R. Timpl; US 5 493 008). Toto snížení aktivity není neobvyklé, protože je známo, že peptidy mohou mít mnoho různých konformací ve vodném roztoku a že pouze určité procento peptidů se vyskytuje v biologicky aktivní konformaci. Většina dodnes popsaných aktivních peptidů (IC₅o 22 nM) má molární hmotnost asi 2700 Da (asi 50 % LE modulu). Obsahuje neporušenou S-S smyčku, která pravděpodobně stabilizuje strukturu esenciální oblasti sekvence NIDPNAV (POschl, E.; Fox, J.W.; Block, D.; Mayer, U.; Timpl, R, (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. J.W. Fox a R. Timpli US 5 493 008).

Chemický vzorec sekvence NIDPNAV (Asn-Ile-Asp-Pro-Asn-Ala-Val) je následující:

Inhibitory interakce laminin/nidogen mohou být vhodné pro přípravu léčiv pro léčbu onemocio není, která souvisí se zvýšenou nebo nežádoucí syntézou základů membrán.

Mezi tato onemocnění patří například pozdní komplikace diabetů, které jsou doprovázeny houstnutím základu membrán (zejména ledvin, oka, cévního systému), hepatická fibróza, zejména alkoholická hepatická fibróza, vyznačující se syntézou kontinuálního základu membrány v kapilárách a související kapilarizací, všechny fibrózy (chronická nebo iatrogenní), při kterých se může pozorovat zvýšená syntéza základu membrány nebo složek základu membrány (ledviny, plíce, kůže), atheroskleróza vyznačující se omezením regulace metabolismu tuků, které může být způsobeno mimo jiné zhoršenou filtrací lipoproteinů přes částečně kapilarizované kapiláry jater (patologické změny cévního systému, které se mohou pozorovat při atheroskleróze, se mohou také částečně přisuzovat modifikacím složení a struktury základů membrán v cévách), onemocnění, při kterých angiogeneze přispívá ke zhoršení klinického obrazu, například rakoviny, při kterých je neovaskularizace potřebná pro růst nádoru, diabetická retinopatie, retrolentální fibroplasie, poruchy se silnou zánětlivou složkou (například revmatoidní arthritida, osteoarthritida, vaskulitida), hemangiomy, psoriasa a mnoho dalších.

Použití peptidů, jakojsou ty, popsané v US patentu 5 493 008 jako léčiv je však do značné míry omezeno z důvodu jejich konformační flexibility, jejich nestability k proteázám a jejich špatné biologické využitelnosti a farmakodynamiky (Milner-White, E.J. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10; 70-74. Verber, D.F.; Freidinger, R.M.; (1985) Trends Neurosci. 8; 392-396. Hrubý, V.J.

(1994): Peptides, Proč. Thirteenth American Peptide Symposium; (Hodges, R.S.; Smith, J.A.;

Ed.) S. 3-17; ESCOM: Leiden, Netheriands).

Cílem podle předkládaného vynálezu bylo najít deriváty o nízké molární hmotnosti, které by byly schopné specificky interagovat s lamininovým vazebným místem nidogenu a inhibovat kompeti35 tivně asociaci mezi lamíninem a nidogenem při nízké koncentraci.

Podstata vynálezu

Proto je předmětem podle předkládaného vynálezu sloučenina obecného vzorce 1

Ί kde R] je skupina vybraná z následujících vzorců:

kde R4 je skupina -A, aminoskupina, skupina -NHR, skupina -NR₂, skupina (A)₂,

a R_s je skupina-(CH2)iCOOA, skupina-(CH₂)iCONH2, skupina-(CH₂)iNH₂ nebo skupina (CH₂),SO₃H,

nebo

kde

Y je skupina O, skupina S, skupina -N(A)-CO- nebo skupina (CH₂)_r,

-4CZ 300736 B6

D je skupina (CH₂)_n skupina O, skupina S, skupina NH, skupina NR, skupina (CH₂)_r-O, skupina (CH2)_r-S, skupina (CH₂)_r-NH nebo (CH₂)_rNR a

R₂ je skupina -A, skupina -E-OH, skupina -E-COOH nebo skupina - E-CONH₂, kde E je lineární nebo rozvětvená alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, která je nesubstituovaná nebo substituovaná skupinou -A, skupinou (CH₂)_m-OH, skupinou -(CH₂)_m-COOH, skupinou -(CH₂ VC(O)N(A)₂, a kde R₇ je lineární nebo rozvětvená alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, která je nesubstituovaná nebo substituovaná skupinou -A, skupinou -(CH₂)_m~OH, skupinou -(CH₂)_m-COOH, skupinou 4CH₂)„,-<(O)N(A)₂, a R je cykloalkylové skupina obsahující 5 až 10 atomů uhlíku, skupina Het nebo skupina Ar, které jsou popřípadě substituované skupinou alkyl-Het obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou alkyl-Ar obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou -O-alkylHet obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou -O-alkyl-Ar obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou Het nebo skupinou Ar, kde

Het je monocyklická nebo bicyklická, pětičlenná až desetičlenná aromatická nebo nearomatická kruhová skupina obsahující 1 nebo 2 stejné nebo různé heteroatomy jako členy kruhu, vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom dusíku, atom kyslíku a atom síry, která je nesubstituovaná nebo substituovaná jednou nebo více hydroxylovými skupinami nebo karboxylovými skupinami a kde

Ar je monocyklický nebo bicyklický pětičlenný až desetičlenný aromatický kruh, který je nesubstituovaný nebo substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami nebo karboxy30 lovými skupinami a

Z je skupina (CH₂)_m, skupina O, skupina S, skupina NH, skupina NR, skupina N-C(O)-R nebo skupina NSO₂R,

A je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a

1, m a r jsou celá čísla 0 až 3, n a k jsou celá čísla 1 až 2, p je celé číslo 0 až 1 a q je celé číslo 1 až 3, ve všech stereoizomemích formách ajejich směsi ve všech poměrech včetně všech fyziologicky přijatelných solí.

Fyziologicky přijatelnými solemi jsou například soli anorganických a organických kyselin, například kyseliny chlorovodíkové, kyseliny sírové, kyseliny octové, kyseliny citrónové nebo kyseliny p-toluensulfonové nebo soli anorganických nebo organických bází, jako je hydroxid amonný, hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý, hydroxid hořečnatý, diethanolamin nebo ethylendiamin, nebo soli aminokyseliny, jako je arginin, lysin, Iysyl-lysin nebo kyselina glutamová.

Jedním výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je sloučenina vzorce I, kde n je 1.

Dalším výhodným provedením je sloučenina vzorce I, kde R ve skupině X je skupina Het nebo skupina Ar, které jsou popřípadě substituované skupinou alkyl-Het obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou -alkyl-Ar obsahující v alkylové částí 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou -O-alkyl-Het obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou -O-alkyl-Ar obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou Het nebo skupinou Ar. Výhodněji je R ve skupině X skupina Het. Het je například nebo nebo nebo nebo

Výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je také sloučenina vzorce I, kde R ve skupině X je skupina Ar, která je popřípadě substituovaná skupinou alkyl-Ar obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou -O-alkyl-Ar obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku nebo skupinou Ar, S výhodou je R ve skupině X skupina Ar.

Ar je například nebo

nebo nebo

Výhodným provedením je také sloučenina vzorce I, kde R ve skupině X je

nebo

Ve sloučenině vzorce I je X s výhodou skupina následujícího obecného vzorce

S výhodou je Y skupina-JCFT)» kde rje s výhodou 0 nebo 1 a kje s výhodou 1 nebo 2.

Dalším výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je sloučenina vzorce 1, kde X je 15 skupina následuj ícího vzorce

kde Dje s výhodou skupina -(CH₂)_r-, kde rje 0 nebo 1.

-7CZ 300736 B6

Výhodným provedením podle předkládaného vynálezu jsou také sloučeniny vzorce I, kde R| je skupina následujícího vzorce

kde Z je s výhodou skupina (CH2)m a m je 0 nebo 1. S výhodou R5 Je skupina-(CH₂)iCOOA, 5 kde A je s výhodou atom vodíku nebo Rj je skupina-(CH2)jCOONH2, kde 1 je 0. S výhodou R4 je aminoskupina nebo skupina -A, kde A je s výhodou atom vodíku nebo s výhodou R4 je skupina NHRi, kde -NHR_t je s výhodou

a kde R₅ ze skupiny -NHRi je s výhodou skupina /-(CHK. Λ

K NH. H a 1 je s výhodou 0 nebo R₅ ze skupiny -NHRj je s výhodou skupina O

Λ.

N 'NH₂ a 1 je s výhodou 0 nebo R5 ze skupiny -NHRj je s výhodou skupina (CH₂)rNH₂ a 1 je s výhodou 0.

Dalším výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je sloučenina A vzorce I, kde Ri je skupina následujícího vzorce

O

R4 Rs kde Z je s výhodou skupina -(CH₂)_m- a m je s výhodou 1 a kde R4 je s výhodou aminoskupina a 20 R₅ je s výhodou skupina-(CH₂)iCOOA, kde 1 je s výhodou 0 a kde A je s výhodou atom vodíku.

Dalším výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je sloučenina A vzorce I, kde Rt je skupina následujícího vzorce

R₅

- 8 CZ 300736 B6 kde R_s je s výhodou skupina -(CH₂)iCOOA, kde 1 je s výhodou 0 a A je s výhodou atom vodíku.

Dalším výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je sloučenina vzorce I, kde R₂ je A a A je s výhodou methylová skupina nebo kde R₂ je skupina -E-COOH, s výhodou skupina

-CH₂COOH nebo kde R₂ je skupina -E-OH, s výhodou ^CH₂OH.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou nepřírodní (t.j. nevyskytují se v přírodě) deriváty peptidů o nízké molární hmotnosti, které jsou schopné inhibovat interakci laminin/nidogen v rozsahu nM koncentrací. Nalezené nízkomolekulární struktury jsou překvapivě schopné vysoio koafinitní vazby k lamininovému vazebnému místu nidogenu aniž by byla nutná interakce s tyrosinem nebo histidinem smyčky (smyčky c) sousedícím s příslušnou vazebnou sekvencí.

Ještě překvapivější je, že deriváty peptidů o nízké molární hmotnosti (molární hmotnost 550 až

800 Da) popsané podle předkládaného vynálezu vykazují inhibiei stejného řádu, jako většina is dodnes popsaných aktivních peptidů (IC₅o 22 nM), které mají molární hmotnost asi 2700 Da (asi % LE modulu) a obsahují celou S-S smyčku, která pravděpodobně stabilizuje strukturu esenciální oblasti sekvence NIDPNAV (J. W. Fox a R. Timpl; US 5 496 008).

Cíle vynálezu bylo dosaženo pomocí specifické syntézy derivátů peptidů na pryskyřičném nosiči 20 na základě vztahů mezi strukturou a funkcí a publikované třírozměrné struktury vazebného místa nidogenu. Stavební bloky pro syntézu peptidů se budou měnit podle vhodného kritéria tak, aby se zajistila pestrá strukturní různorodost a integrace nepřírodních stavebních bloků. Pro testování a porovnání inhibiční aktivity získaných derivátů peptidů po jejich odštěpení z nosné pryskyřice se používá vhodně citlivý sereeningový test,

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se mohou použít pro přípravu léčiv pro léčbu onemocnění, které souvisí se zvýšenou nebo nežádoucí syntézou základů membrán.

Možnými oblastmi terapeutického využití derivátů peptidů podle vynálezu a/nebo jejich fyziolo30 gicky přijatelných solí jsou proto:

1. Všechny typy pozdních komplikací diabetů, které jsou doprovázeny zahuštěním základů membrán (zejména ledvin, oka, cévního systému).

2. Hepatická fibróza, zejména alkoholická hepatická fibróza, vyznačující se syntézou kontinuálního základu membrány v kapilárách a kapilarizace tímto způsobená.

3. Všechny fibrózy (chronická nebo iatrogenní), při kterých lze pozorovat zvýšenou syntézu základu membrány nebo složek základu membrány (ledviny, plíce, pokožka).

4. Atheroskleróza vyznačující se omezením regulace metabolismu tuků, které může být způsobeno mimo jiné zhoršenou filtrací lipoproteinů přes částečně kapilarizované kapiláry jater. Patologické změny cévního systému, které se mohou pozorovat při atheroskleróze, se mohou také částečně přisuzovat modifikacím složení a struktury základů membrán v cévách.

5. Onemocnění, při kterých angiogeneze přispívá ke zhoršení klinického obrazu, například rakoviny, při kterých je neovaskularizace potřebná pro růst nádoru, diabetická retinopatie, retrolentální fibroplasie, poruchy se silnou zánětlivou složkou (například revmatoidní arthritida, osteoarthritida, vaskulitida), hemangiomy, psoriasa a mnoho dalších,

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu a/nebo jejich fyziologicky přijatelné soli jsou tedy vhodné pro použití jako léčiva. Dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je tedy farmaceutická kompozice obsahující nejméně jednu sloučeninu podle předkládaného vynálezu a/nebo její fyziologicky přijatelné soli.

Sloučeniny obecného vzorceI ajejich fyziologicky přijatelné soli a deriváty se mohou podávat podle vynálezu živočichům, s výhodou savcům a zejména člověku, jako léčiva pro léčbu nebo profylaxi. Mohou se podávat jako takové, ve směsi navzájem nebo ve formě farmaceutických přípravků, které umožňují enterální nebo parenterální podávání a které jako aktivní složku obsahují účinnou dávku nejméně jedné sloučeniny vzorce 1 a/nebo její fyziologicky přijatelné soli a derivátu společně s běžnými farmaceuticky nezávadnými excipienty a/nebo přísadami.

Léčiva se mohou podávat systémově nebo lokálně. Mohou se podávat například ve formě pilulek, tablet, tablet potažených filmem, tablet potažených cukrem, granulí, tvrdých a měkkých želatino10 vých tobolek, prášků, roztoků, sirupů, emulzí, suspenzí nebo v jiných farmaceutických formách. Podávání se však může také provádět vaginálně nebo rektálně, například ve formě čípků nebo parenterálně nebo implantací, například ve formě injekčních roztoků nebo infúzních roztoků, míkrokapsulí nebo tyčinek, nebo místně nebo perkutánně, například ve formě mastí, roztoků nebo tinktur nebo jiným způsobem, například ve formě nosního spreje nebo aerosolové směsi nebo jako práškové přípravky pro inhalování. Pokud se roztoky podávají parenterálně, mohou se podávat například nitrožilně, mezisvalově, subkutánně, intraartikulámě, intrasynoviálně nebo jiným způsobem, například inhalováním vlhkého aerosolu nebo suchých práškových přípravků.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu se připraví způsoby, které jsou odbor20 níkům v této oblasti známé, za použití farmaceuticky inertních anorganických a/nebo organických přísad a sloučenin(y) vzorce I a/nebo jejich fyziologicky přijatelných solí a derivátů. Pro přípravu pilulek, tablet, tablet potažených cukrem a tvrdých želatinovýeh tobolek je možné použít například laktózu, kukuřičný škrob nebo jeho deriváty, mastek, kyselinu stearovou nebo její soli atak dále. Mezi přísady pro měkké želatinové tobolky a čípky patří například tuky, vosky, polotuhé a kapalné polyoly, polyethylenglykoly, přírodní a ztužené oleje a tak dále. Vhodnými přísadami pro přípravu roztoků, například injekčních roztoků nebo emulzí nebo sirupů jsou například voda, alkoholy, glyeerol, dioly, polyoly, sacharóza, invertní cukr, glukóza, rostlinné oleje a tak dále. Vhodnými přísadami pro mikrokapsule, implantáty nebo tyčinky jsou například kopolymery glykolové kyseliny a kyseliny mléčné. Farmaceutické přípravky normálně obsahují asi 0,5 až 90 % hmotnostních sloučeniny vzorce I a/nebo jejích fyziologicky přijatelných solí nebo derivátů.

Kromě aktivních sloučenin a excipientu mohou farmaceutické přípravky dále obsahovat přísady nebo aditiva, jako jsou například plniva, rozvolňovadla, pojivá, lubrikanty, zvlhčující činidla, stabilizátory, emulgátory, konzervační látky, sladidla, barviva, příchutě nebo aromatizující látky, zahušťovadla, ředidla, pufrovací látky, rozpouštědla nebo solubilizéry, prostředky pro dosažení ukládacího efektu, soli pro úpravu osmotického tlaku, potahovací Činidla nebo antioxidanty. Mohou také obsahovat dvě nebo více sloučenin obecného vzorce l a/nebo jejich fyziologicky přijatelných solí a derivátů. Dále mohou také obsahovat jednu nebo více dalších terapeuticky nebo proťylakticky aktivních látek vedle nejméně jedné sloučeniny vzorce I a/nebo její fyziologicky přijatelné soli a derivátu. Farmaceutické přípravky normálně obsahují 0,2 až 500 mg, s výhodou 1 až 100 mg, aktivní sloučeniny vzorce I a/nebo její fyziologicky přijatelné soli a derivátu na dávku.

Pokud se sloučeniny vzorce I nebo farmaceutické přípravky, které je obsahují, podávají ve formě aerosolů, například jako nasální aerosoly nebo jako vlhké aerosoly nebo prášky pro inhalování za sucha, mohou se podávat například za použití zařízení pro přípravu spreje, atomizéru, atomizéru s pumpou, inhalacního zařízení, dávkovač ího inhaléru nebo inhaléru na suchý prášek. Farmaceutické formy pro podávání sloučenin vzorce I ve formě aerosolu se mohou připravit způsobem, který je odborníkům v této oblasti známý. Pro jejich přípravu jsou vhodné například roztoky nebo disperze sloučenin vzorce I ve vodě, vodně alkoholové směsi nebo roztoky v šalinu obsahující běžné přísady, například benzy lalkohol nebo jiné vhodné konzervační látky, látky podporující absorpci pro zvýšení biologické využitelnosti, solubilizéry, dispergaění činidla a další látky a, pokud je to vhodné, běžné hnací látky, například chlorfluorované uhlovodíky a/nebo fluorované uhlovodíky, zatímco suché práškové prostředky sloučenin vzorce I a/nebo jejich fyziologicky

A přijatelných solí se mohou získat sušením za zmrazení nebo s výhodou sušením rozstřikováním vodných roztoků sloučenin vzorce I a/nebo jejich fyziologicky přijatelných solí a vhodných přísad rozpustných ve vodě Jako jsou cukry nebo deriváty cukrů a aminokyseliny.

Dávka se při použití sloučenin vzorce I může měnit v širokém rozmezí a běžně se upraví podle konkrétního onemocnění v každém individuálním případě, podle úsudku lékaře. Závisí například na povaze a závažnosti onemocnění, které se má léčit, na použité sloučenině nebo na tom, zda se provádí léčba nebo profylaxe akutního nebo chronického stavu nebo zda se kromě sloučenin vzorce í podávají další aktivní sloučeniny. Obecně se u dospělého člověka dosáhne účinku io v případě orálního podávání při denní dávce asi 0,01 až 100 mg/kg, s výhodou 0,1 až 10 mg/kg, zejména 0,3 až 2 mg/kg (v každém případě na kg tělesné hmotnosti). V případě nitrožilního podávání se denní dávka obecně pohybuje mezi 0,01 až 50 mg/kg, s výhodou 0,01 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Zvláště, když se podává relativně velké množství, může se denní dávka rozdělit do několika, například 2, 3 nebo 4 částí. Pokud je to vhodné, může být na základě individuální povahy podávaná denní dávka vyšší nebo nižší, než dávky uvedené výše.

Dále se mohou sloučeniny vzorce I ajejich soli podle předkládaného vynálezu použít jako meziprodukty pro přípravu jiných sloučenin, zejména jiných farmaceuticky aktivních sloučenin, které lze získat ze sloučenin vzorce I, například prostřednictvím modifikace nebo zavedení zbytků nebo funkčních skupin, například pomocí esterifíkace, redukce, oxidace nebo jiných konverzí funkčních skupin.

Takto získané deriváty peptidu podle předkládaného vynálezu se mohou na jednu stranu použít přímo jako léčebná činidla, ale mohou také tvořit základ pro podobné struktury, které jsou také vhodné jako terapeutická činidla pro léčbu onemocnění příbuzných zvýšené nebo nežádoucí syntéze základu membrán.

Dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je způsob identifikace sloučeniny, která inhibuje interakci lamininu a nidogenu, kdy se použije sloučenina podle předkládaného vynálezu

3ů jako kompetitivní inhibitor. Tento způsob může dále zahrnovat formulaci sloučeniny identifikované ve farmaceuticky přijatelné formě.

Předmětem podle předkládaného vynálezu je také poskytnout způsob přípravy farmaceutické kompozice zahrnující identifikaci sloučeniny, která inhibuje interakci lamininu a nidogenu, kde se sloučenina podle předkládaného vynálezu použije jako kompetitivní inhibitor a dále smísení identifikované sloučeniny a/nebo jejích fyziologicky přijatelných solí s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Předmětem podle předkládaného vynálezu je také poskytnout způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I podle předkládaného vynálezu.

Sloučenina vzorce I

podle předkládaného vynálezu se připraví kondenzací fragmentu sloučeniny vzorce II R_ls OH (II) se sloučeninou vzorce III

kde proměnné R_b X, n, R₂ mají významy uvedené výše a kde sloučeniny vzorce II a III mohou být chráněny na funkčních skupinách definovaných výše běžnými chránícími skupinami, které jsou známé v chemii peptidů (viz. například Houben-Weil, Methoden der Organischen Chemie, díl 15/1 a 15/2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Vhodné způsoby kondenzace jsou odborníkům v této oblasti známé (Houben-Weil, Methoden der Organischen Chemie, díl 15/1 a 15/2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Vhodnými kondenzačními činidly jsou například karbony 1-diimidazoly, karbodiimidy, jako je di-cyklohexyl-karbodiimid nebo di-isopropylio karbodiimid, nebo O-((kyano(ethoxykarbonyl)methylen)amino)-N.N,N',N'-tetramethyluroníumtetrafluoroborát (TOTU) nebo anhydrid dífosforečné kyseliny (PPA). Kondenzace se provádí za standardních podmínek. Pravidlem je, zeje nutné během kondenzace peptidů chránit aminoskupiny, které se nemají účastnit kondenzační reakce, pomocí chránících skupin, které lze snadno odstranit za podmínek, které jsou jiné, než podmínky, za kterých probíhá kondenzační reakce. Totéž platí pro karboxylové skupiny, které se neúčastní kondenzační reakce a které se s výhodou chrání během kondenzační reakce jako alkylestery obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, benzy lestery nebo terc-butyl estery. Chránění aminoskupin není nutné v případě, že jsou aminoskupiny ještě přítomny ve formě prekurzorů aminoskupin, například ve formě nitro nebo kyanoskupin. Aminoskupiny se potom získají hydrataci následující po kondenzační reakci.

Po kondenzačním kroku se chránící skupiny odstraní pomocí známých postupů, například benzyloxy-karbonylová skupina a benzylová skupina se mohou odstranit hydrataci v benzylesterechi chránící skupiny terc-butylového typu se obecně odštěpí za kyselých podmínek; 9-fluorenylmethyloxykarbonylová skupina se odstraní pomocí sekundárního aminu.

Příprava sloučeniny vzorce I podle předkládaného vynálezu se může také provádět postupnou adicí příslušných složek, například přírodních, nepřírodních aminokyselin a jejich derivátů, na pevné fázi, kdy se složky mohou přidat v různých sekvencích.

Pro přípravu sloučenin vzorce I může být také výhodné nekondenzovat přímo sloučeniny vzorce I a II kondenzací fragmentů, ale kondenzovat příslušné vhodné prekurzory za získání meziproduktu, který se může převést na sloučeninu vzorce I například derivatizací.

Výše popsaný způsob zavádění funkčních skupin nepřímo, ale pomocí příslušných prekurzorů zaváděných do molekuly za získání meziproduktů, ze kterých se mohou snadno získat koncové produkty pomocí transformace skupin prekurzorů na příslušné funkční skupiny po kondenzační reakci, se může také použít pro různé části molekuly sloučeniny vzorce I, například pro postranní řetězec slouěeniny vzorce I, Rj- nebo R₍-X.

Příklady provedení vynálezu

Zkratky mají následující významy:

Činidla a rozpouštědla:

Ach kyselina octová

Aq vodný

BSA hovězí sérový albumin

DCC Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid

	DCM	dichlormethan
	DIPEA	N,N-diisopropylethyIamin
	DMAP	4-dimethylaminopyridin
	DMF	N,N-dimethylformamid
5	DMSO	Dimethylsulfoxid
	Et2O	Diethylether
	EtOAe	Ethylethanoát (ethylester kyseliny octové)
	EtOH	ethanol
	Fmoc-OSucc	Fmoc-O-sukci n im id
10	HOBT	l -hydroxy benzotriazol
	KHMDS	hexamethyldisilazid draselný
	n-Buli	n-butyllithium
	MeOH	methanol
	MTBE	methylterc-butylester
15	TEA	triethylamin
	TFA	kyselina trifluoroctová
	THF	tetrahydrofuran
	TMEDA	tetramethylethylendiamin
	TMSC1	trimethylsilylchlorid
20	TOTU	0-((kyano(ethoxykarbony l)methy len)amino)-N,N,N' ,N'-

tetramethyluroniumtetrafluoroborát

	TRISn3	trisilylazid
	Chemické skupiny:
25	Me	methyl	ch3-
	Et	ethyl	CH3-CH2
	NPr	n-propyl	CH3CH2CH2-
	IPr	isopropyl	(CH3)2CH-
	NBu	n-butyl	ch3ch2ch2ch2-
30	IBu	isobutyl	(CH3)2ČHCH2-
	TBu	terc-butyl	(CH3)3c-
	Ph	fenyl	C6H5-
	Fmoc	9-fluorenylmethoxykarbonyI
	Z	benzyloxykarbonyl	C6H5-CH2-0-C0-
35	BOC	terc-butyloxykarbonyl	(CH3)3C-O-CO-

I. Screening knihovny inhibitorů interakce laminin/nidogen

Knihovna byla navržena za účelem nalezení menších, účinnějších a metabolicky stabilnějších 40 peptidů podobných již známému heptapeptidu NIDPNAV (PĎschl, E.; Fox, J.W.; Block, D.;

Mayer, U.; Timpl, R, (1994) EMBOJ. 13; 3741-3747. PĎschl, E.; Mayer, U.; Stetefeld, J.; Baumgartner, R.; Holak, T.A.; Huber, R.; Timpl,R. (1996) EMBOJ. 15; 5154-5159. Baumgartner, R.; Czisch, M.; Mayer, U.; Poschl, E.; Huber, R.; Timpl, R.; Holak, T.A. (1996)

J. Mol. Biol. 257; 658-668). Knihovna se syntetizovala a screenovala ve formě tří podknihoven; 45 pentamer, hexamer a heptamer. Následuje popis strategie sereeningu pro podknihovnu pentameru. Způsob je reprezentativním příkladem způsobů používaných pro další dvě podknihovny, kromě toho, že hexamery se sereenují v prvním kroku při asi 50 perličkách na jamku a heptamery se sereenují asi při 100 perličkách na jamku.

1.1 Screening knihovny pentameru

Knihovna pentameru obsahuje 2160 různých sloučenin.

. π.

I) Asi 8 800 jednotlivých perliček se suspenduje v 0,1% kyselině chlorovodíkové a rozdělí se do sedmi 96jamkových mikrotitračních destiček s filtračním dnem při asi čtrnácti perličkách na jamku.

2) Perličky se promyjí dvakrát 200 μΐ deion izované vody, potom se přidá 50 μΐ 500 nM

HEPES, pH 7,0. Můstek použitý v knihovně uvolní jeden alikvot sloučeniny, když se zvýší pH na 7,0 a tento štěpící krok se nechá probíhat přes noc.

3) Destičky se umístí na vrchol filtračních desek ve tvaru U a odstředí se. Směsi sloučenin io uvolněné z perliček se shromáždí na dně desky, zatímco příslušné perličky zůstanou v původní filtrační destičce.

4) K perličkám se přidá 25 μΐ DMSO na jamku, aby se vymyla zbývající volná sloučenina z perliček a destičky se znovu odstředí za oddělení sloučenin v roztoku od perliček. Získaný zásobní roztok byl přibližně 27 μΜ na sloučeninu v 333 mM HEPES, 33 % DMSO.

5) Zásobní roztoky sloučenin se pře inkubují s nidogenem (10 μΙ zásobního roztoku sloučeniny ku 90 μΐ roztoku nidogenu) a test se provádí tak, jak je popsáno v přiloženém postupu za získání konečné screeningové koncentrace 2,7 μΜ na sloučeninu.

6) V 25 testovacích jamkách, ve který se dosáhlo reprodukovatelné inhibice > 62 %, se odpovídající perličky z původních filtračních destiček suspendují v 0,05% kyselině chlorovodíkové, 0,1% Tween 20 a pipetují se do pěti nových filtračních destiček při 1 perličce na jamku. Jako kontrola se do každé destičky přidají dvě kontrolní perličky s mateřskou sloučeninou na stejném můstku.

7) Perličky se promyjí dvakrát 200 μΐ deionizované vody, potom se do každé jamky přidá 25 μΙ 50 mM hydroxidu sodného. Můstek použitý v knihovně uvolní druhý ekvimolámí alikvot sloučeniny, když se pH zvýší ze 7,0 na 10,0 nebo více. Tento štěpící krok se nechá probíhat 3 hodiny.

8) Destičky se umístí na vrchol filtrační desky s dnem ve tvaru U a odstředí se. Sloučeniny uvolněné z perliček se soustředí na dně desky, zatímco odpovídající perličky zůstanou v původních filtračních destičkách.

9) Perličky se promyjí 20 μΐ 50mM HEPES (původně pH 7,0) s přídavkem 50mM HCI a roztok se odstředí do dolní desky a spojí se s první uvolněnou částí.

10) Perličky se promyjí potřetí 25 μΐ dimethylsulfoxidu, přičemž se nechá ekvilibrovat s perličkami 10 minut a potom se odstředí.

II) Získaná uvolněná směs se testuje v 1/10 objemu stejně, jako v kroku číslo 5.

12) Roztoky, které inhibují stejně nebo lépe, než kontrolní perličky (asi 50% inhibice) se považují za úspěšné. Získá se 23 úspěšných perliček, další dvě jamky jsou potenciálně úspěšné, což lze prokázat přidáním slabých inhibitorů do jednotlivých jamek.

13) Úspěšné roztoky se podrobí hmotové spektroskopii a určí se tak molární hmotnost,

14) Odpovídající jednotlivé úspěšné perličky se potom podrobí Edmanově odbourávání a určí se tak peptidová sekvence.

15) Kombinace údajů získaných pomocí hmotové spektroskopie a Edmanova odbourávání se analyzují a tak se identifikuje struktura úspěšné sloučeniny.

Struktury a frekvence jejich získání jsou uvedeny níže. G-Hopa = glycinhydroxypropylamid, zbytek můstku.

Frekvence							IC50, pm
6	4	NaI2	N	D	V	G-Hopa	0,43
4	D	NaI2	N	A	V	G-Hopa	0,37
4	D	NaI2	N	D	I	G-Hopa	0,64
4	D	NaI2	N	S	v	G-Hopa	0,49
3	D	NaI2	N	S	I	G-Hopa	0,81
2	D	NaI2	N	A	I	G-Hopa	0,47

Legenda:

NaI2 = L-3-(2-naftyl)alanyl;

G-Hopa = glycin-3-hydroxypropylamid:

D = Asp (aspartyl), P = Pro (prolyl), N = Asn (asparagínyl), A = Ala (alanyl), V - Val (valínyl), S = Ser (seryl), I - Ile (isoleucyl).

1.2 Postupy: Příprava peptidové knihovny

Peptidové knihovny se syntetizují pomocí syntetického přístupu štěpení/mísení (Lam, K. S., Salmon, S. E., Hersh, Ε. M., Hrubý, V. I, Kazmierski, W. M., a Knapp, R. J. (1991) Nátuře 354, 82; Furka, A., Sebestyen, F., Asgedom, M., a Dibo, G. (1991) Int. J. Pept. Protein Res. 37, 487) za použití standardní Fmoc peptidové chemie na pevné fázi (Stewart, J. M,, a Young, J. D. (1984)

Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., Rockford, IL.; Atherton, E., a Sheppard, R.C. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis. IRL Press Oxford). Každá perlička pryskyřice se vystaví pouze jedné aktivované aminokyselině v každém kondenzačním cyklu. Proto po ukončení syntézy knihovny každá perlička pryskyřice vykazuje pouze jednu peptidovou entitu. Protože není možné testovat všechny sloučeniny odděleně, byla vystavěna stejná struktura na každé perličce pryskyřice ve dvou kopiích pomocí různě štěpitelných můstků, obr. 1 (Kocis, P., Krchňák, V., a Lebl, M. (1993) Tetr. Lett. 34, 7 251; Lebl, M., Krchňák, V., Salmon, S.E., a Lam, K. S. (1994) A Companion to Methods in Enzyrooíog 6, 381). Uvolnění peptidů z perliček pryskyřice se může provádět v postupných krocích za použití různých mechanismů štěpení. Uvolnění první části peptidů jako hydroxypropylamidu se provádí v pufru při pH 7 až 9.

Uvolnění druhé části peptidů se dosáhne za použití vyššího pH (Schéma 1).

Použijí se peptidové knihovny, polyethylenglykolem roubované polystyrénové perličky nebo TentaGel®S NH2. Vhodné jsou ve skutečnosti jakékoli perličky pryskyřice, které jsou kompatibilní se syntézou peptidů a screeningem ve vodných podmínkách.

Penta- hexa- a heptamemí knihovna se připraví s jednou fixovanou polohou (L-asparagin). Glycinhydroxypropylamid na C konci je částí můstku:

H-X₄X₃-Asn-X₂X,-Gly-NH (CH₂)₃OH (2 160 peptidů)

H-X₅X₄X₃-Asn-X₂X,-Gly-NH (CH₂)₃OH (25 920 peptidů)

H-X₆X₅X₄X₃-Asn-X₂X,-Gly-NH (CH₂)₃OH (311 040 peptidů)

Xj: N-Fmoc-L-aminokyseliny (9) použité při prvním randomizaci: valin, isoleucin, threonin, fenylalanin, (3-(2-naftyl)alanin, 2-azetidin karboxy lová kyselina, prolin, cyklohexylglycin, fenylglycin.

io

X₂: N-Fmoc-L-amino kyseliny (4) použité při druhé randomizaci: alanin, glycin, serin, kyselina asparagová.

X₃~X₅=X₆: N-Fmoc-L-aminokyseliny (12) použité při třetí, páté a šesté randomizaci: pipeko15 lová kyselina, (3-(2-naftyl)alanin, glutamová kyselina, lysin, 2-azetidinekarboxylová kyselina, threonin, prolin, asparagin, isoleucin, 3,5-dijodotyrosin, citrullin, arginin.

X₄: N-Fmoc-L-aminokyseliny (5) použité při čtvrté randomizaci: kyselina asparagová, kyselina glutamová, 2-aminoadipová kyselina, O-sulfát tyrosinu, γ-karboxyglutamová kyselina.

Pryskyřice (PEG-PS.HC1, Millipore®, 20 g, navážka 0,58 mmol/g, průměrná velikost částic 220 Nm) se bobtnají v N,N-dimethylformamidu 2 hodiny a potom se neutralizují 10%N,N-diisopropylethylaminem v dichlormethanu. Pryskyřice se promyje dichlormethanem a N,N-dimethylformámidem. Můstek (Obr. 1, 3 ekv.) se kondenzuje za použití 1,3-diisopropylkarbodi25 imidu a 1-hydroxybenzotriazolu (každý 3 ekv.) v N,N-dimethyIformamidu 12 hodin při teplotě místnosti. Reakce se monitoruje pomocí způsobu za použití brom fenolové modři (Krchňák, V., Vágner, J., Safar, P,, a Lebl, M. (1988) Collec. Czech. Chem. Commun., 53, 2542). Dokončení kondenzace se potom určí pomocí ninhydrinového testu (Kaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, C.D., a Cook, P.L (1969) Anal. Biochem. 34, 595). Po promytí Ν,Ν-dimethylform30 amidem, se chránící skupina Fmoc odštěpuje 50% piperidinem v Ν,Ν-dimethylformamidu po dobu 15 minut. Pryskyřice se potom promyje Ν,Ν-dimethyl formám idem a množství uvolněného fulven-piperidlnového aduktu se určí pomocí UV spektrometrie (302 nm). Stabilní hladina navážky pryskyřice (mmol/g) určená při tomto způsobu během syntézy knihovny slouží jako jedno z měřítek kontroly kvality.

Pryskyřice se rozdělí do g stejných dílů. Potom se odděleně ke každému alikvotu pryskyřic přidá devět Fmoc-chráněných aminokyselin (XI) a kondenzuje se popsaným postupem 2 hodiny. Pryskyřice se potom spojí ve válcovité skleněné nádobě opatřené na dně fritou. Směsí se za účelem promíchávání pryskyřice probublává suchý dusík. Chránící skupiny Fmoc se odstraní podle postupu popsaného výše.

Pryskyřice se rozdělí do čtyř stejných dílů. Čtyři Fmoc-chráněné aminokyseliny (X2) se potom přidají odděleně ke každému alikvotu pryskyřice a kondenzují se podle stejného postupu. Odstraní se chránící skupiny Fmoc a určí se navážka pryskyřice. V dalším cyklu se podle popsa45 ného postupu kondenzuje L-asparagin. Pryskyřice se potom rozdělí do alikvotů pro další cyklus kondenzace. Když se provedou všechny randomizační kroky, odstraní se chránící skupiny Fmoc a směsí 82,5 % kyseliny trifluoroctové, 5 % anisolu, 5 % vody, 5 % thioanisolu, 2,5 % ethandithiolu se během 2,5 hodiny odštěpí chránící skupiny z postranního řetězce.

Pro ověření kvality knihovny se několik náhodně vybraných perliček podrobí sekvenčnímu Edmanovu odbourávání a technikám hmotové spektrometrie.

Schéma 1

Peptid o

\^{0 0<}V^ o⁰ o .

,₀Va^v_y* Peptid^B^^A^ 0

HK ^,0 (píysfc.

I

HN. ^0

OH

T ^N^V^V O ⁺oaJLa_oHO ^Χ^γ^Ρβρ“’

O _ n

1.3 Výsledky (viz. také obr. 2 až 12)

č.		MH	Čist	ICsoftiM]	Struktura
1	Kontrola	855	>95%	3.9	• 0 O H-AjfttteAsQ^iu^sn^VaU^ttíCHibOH
	1-Α3ρ9Γ39ίηγ14.-ί5θΙθΐκγ1-1-35ρ3Λ)(1-1-ρΓ0ΐν14-38ρβΓ^ηγΗ.-9ΐβηγ(’ί·ν3ΐνΙ-9ΐ/6ΐη·34ιγ(ίΓ0ΧγρΓ0ργΙβίΤΐϊ(1
2	Kontrola	628	>95%	7.7	9 Λ) u O 1 h 0 h UU I 1 / Π β Π f Π 0 u 0 0 O 0 ’ H4U(>Fm4ÍsnAto-VaUSH)H(CH,]yOH
	υ-Α8ρβΓί/1-^ρΓο1γΗ--35ρ3Γ39ίπγΙ^-3ΐ3πγί^-ν3ΐγί^Ιγο4π-3^ν^Γθχγρ<τ>ργΐ3ΓηκΙ
3		772	>95%	0,51	o p
	L-Aspartyt-L-3-(2-nafty1)a)anyl-L-asparaginyl-L-a5partyl-t-valyl-glycín-34iydraxypropylamíd
4		744	>95%	0,38	o /”' β 0H o 0 0 H-AaD-NaKZVAan-Ser-VeWjfy-NHfChhhOH
	1-Α5ρ3ΓίγΚ-3-(2-η8βγΙ)3ΐ8ηγΙ-υΒ8ρ8Τ3ς1ηγ(-ί-3βΓγΗ.-ν3ΐγ4ΰΙ/ο1ηι-’ 3-hydroxypropylamid
5		728	>95%	0,75	μ,ΛλΞβ JL hJL. Ύ íp Η-Μί^Ν3Κ2)-Α5(νΛί8-νβμθ^-ΝΗ{(Η}ιΟΗ
	L-Asparíyl-L-3-(2-naftyl)alanyi-L-3sparaginyH.-alanyl-L-valyl-glyclii-3-hyclroxypropy1amkl

6		786	>95%	1,38	a rM O V 0 ® 5 o Γ HAtHbKZHtoAvMrWHi]^
	11-Α5ρ3τ1γΙ-υ-3-{2-η3ΐτγ1)3ΐ8ηγΙ-1-35ρβΓβ9ίηγυ_-3»ρ3ΓΐγΙ-υνΈ»Ιγ1“9(χοΰν3-Ηγ0ΓθχγρτΌργΙζ»τηκ1
7		758	>95%	0,6	« /y « 4 W1 o ® Λ*· β e 1
	L^AspartylL-^ZTiaftyOaíanyW-asparagirylU^seíy^-tóoteucyl^ydn^ydroxypfopy^
8		742	>95%	0,7	~γ* ° yj ’ f-L
	L-AspaftytL*3424iaftyl)atanylE^ar^y14.^yU.4saleúcy(-gt/cin-34iydroxypropylarnl(l
9		?*>o t A.V	*»Α£0Λ w*z zu	O oc V,4,V	“ť 0 <f*· 0 ' ' H^jp4M1Man-A^V#<3I^NH<CHibOH
	L-Aspartyll-3-(l4iaftyl)alanyl<-asparaginyk.-aIanyK-\raM-9tyafi-3-hydro)cypropy(afTiid
10		717	>95%	8,57	Qr H^TipAVbAtkVeMmCHihOH
	L-Aspartyt-L-tryptofaryR_-asparaginyi-L-alanyl-L-vafy1-gtycin-3-hydroxypropy1amid
11		678	>95%	3,38	„'AyAVAV'— V 4 )-«, e ’ HWIwJtaAb-Via^HlCHjbOH |

.IQ.

12		694	>95%	3,79	OH ·*Ά a^yfriíFr·11 Μβ^^· 0 Υ Ο Ο I ° HA(p-Tn^s«^Va(WH(CHi)íOH
	ΙΑ5ρ3ΓΐγΙ-1-ίγτο8γΙ-υ-35ρ3Γ39ίηγΐ4_-3ΐ3ην1-ί-ν3}γΙ-9ΐγαη~3-Κ/όΓθχγρΓοργΐ3ττύ<1
13		734	>95%	7,03	HA2^{3^erao<^M3n^Vatx>41H(CHI)/)H
	υ-Α5ρ3Γίγ(-1-3-<3-0βηζο10ίβη>ί)3ΐαηνΚ-38ρ3Γ39ίηνΜ_-3ί9ηγ1-ί-ν3)γ1-9ΐγοίη-^γ0ΓθχγρΓθργί3Γπ10
14		754	>95%	0,94	·*/ ΑΛΤ \.a 0 Υ ° Ο ϊ 0 H-AíiMMHMtfcnyl» Aan^VakGíy-NHfCHjbOH
	1-Αβρ3ΐ1γΚΙ-3-{4-όΐίβηγ!)αΐ3ηχΜ-35ρ3Γβ9ίηγ1-Ι-ΑΐάηγΜ-ν3ΐνΙ-9ΐγο1η-3-ϊΊγ<1ΤοχγρΓορνΐ3σιίά
15		754	>95%	26,3	μ,^^?ΖΛΊ|\'Ι1ΎΛ|1'ΊΤΒ---“ V 0 >», 0 0 H-Asp-Alap.S-diíenyHs^AIa-Val-G^-NHíCHzJaOH
	1-Α5ρ3Ηγί4.-(3.3-0ϊίθηγί)^3η^ί95ρ3Γ35^γΙ-Ε-3ΐβηχ1-υ-ν3ίν^γ€^-3-4ιγϋΤ0Χγρτυρνΐ3Γηί€ΐ
16		720	50-75%	4,26	9^\\AÁkXaa^«^» L»5p ϊχ’! ϊ l·* H-Asp4»rot3SÍ-fenyf] -Asn-Ser-VakGly-NH(CtíibOH
	L“Asparty1-L-(3SHeny1ProíyH--a3para9inyl-L-seŤyi-L-vaJyl-glycín-3-hydroxypropy!amid
17		720	50-75%	2,27	Ο 9 ο o tt 1 v- ‘ O ° α O 0

					HAsp^MPRJWl Aw^VatólrWHjJíOH
	L-Aspartyk-(3R)-fehytpn)lyl<-a^^
18		695	50-75%	25	( H / Q i (jion n°V ° o **·
19		744	75-05%	25	β O ,0H o Η, Μ γΛ H λγ » Μ Χγ 3 >Λ Jj a 0 H J ° >»ζ ° -^ 0 H^iiH3iWWsn^V^^*VOCl30H
	L-AspartirfO-SJZ-nafWalanyK-aeparaoÍn^-se^
20		vno ♦ w	50-75%	QO K νχ,,ν	*» J H ů Ý H ů A H 0 5 c> ·*» H4kip4W*3n^A/aM>»HCH2PQH
	LAspartyi<4wmofenylabnyK‘asparagtnyR-w^
21		686	75-85%	0,34	W OH HAaHfelt2MaftWiMÍl^NH2
	L-Aspartyt-L-3-<2-naftyí)alanyl-L-a3paraginyí-L-seryW_-valyf-glycin-arrtd
22		629	75-95%	0,18

. 11 .

					H4sp-M2Msn-S«-VS-NH2
	L-AapartyH-3-(2‘naftyl)alanyH_-asparag»riyl-L-seryl-L-V3[in-amid
23		777	50-75%	1,49		OH on
					|FlalyW^I(2).Asi>SeřVaWly-NH(CHi)3OH
	Ftaloyí-L-3-(2-naftyl)alanyl-L-asparaginyK-sery1-L-valyi-g1ycin-3-hydroxypropy1amíd
24	viz. př. 2.3	729	>95%	0,39		o / o f 0
					Su&Na<2>Asft5«r-1rtW3W*W(CH2)3OH
	Sukdny!-L-3-(2-naftyl)alanyl-L-asparaginyH-sery1-L-valyl-glycin-3-hydroxypropytar™d
25		744	75-95%	0,23
					H-pAsp^at(2>AsMer-VaM3ty->IH(CHi)iOH
	L-P-Aspartyt-L-3-(2-naňyl)alany1-L-asparagirylT-ssryl-L-Yalyl-glycjn^hydroxyprapy(aíTiid
26		743	75-95%	0,45		OH o o í o Z o • V-. · ♦
					GltrtaryPtel(2Msn-Ser-Vfltóly-NH(CH213OH
	Θ1υί3ΓγΚί-3-(2-π3ίΙν1)3Ϊ3ηγ]-ί-35ρ3Γ39ίηγ1-1-5βΓγΙ-1-ν3ΐγ1-9ΐγοΙη-3-ίιγάΓθχγρΓοργΐ3πικ!
27		901	>95%	0,44	M/JyO Γ\ 0

					H-CUip4<a<2>Asn^VakG^tt^
	LCilrirtyf^-aspartyl<342-nafty1)alanyf-L-3spar3gJnyt<-serYW_-vaíyt^lYdn-3-tTydroxypropy1amid
28		900	75-95%	045	7 8 r
	L-Arginy«aspartyK.’3^2^afty1)alan^-t-asparaginvl-L-5eryW.’Valy1’glydn-3-hydroxypropy(amid
29		872	>95%	044	H<y»^»Hta<2M«n^er-VaJX3)^NH(CHi^
	L<ysytL-asp^<-3424iafty1)^ylL’aspara9ÍryW.-sefyt-L-vaíyi-gíydn-3-hydTOxypropytamid
30		713	>95%	045	„ _ 1 i 1 i 1 _ i _ „ γ'Ί'ϊ^νϊχτγ — SooMN2>M»N>WaHW|CH2)3QH
	8υ^απγΙ<-3^2κΐ3ίΙγ1)3ΐ3πγΙ’1-3δρ3Γβ9ίΓ^ν^8ηνΙΑ-ν3ΐ/1^οΙη·3-ΚγΛτ)χγρπ)ρχΐ3πιί(1
31	viz. př. 3.1	598	>95%	OJ 9	SuoNiWWaftAb-VaUW
	3ϋωη/Κ^(2^3Λγθ3ΐ3η^1^5ρ8Γβ$ΐη/Κί'8ΐ8π/Η.-ν3ΐΙπ-8ΐηί(1
	SukcinyH-3-{2-naftylíalanyl-L-asparaginyH.-alanyl-l,-2-terc.butyl-glycln-amid

33		584	>95%	0,72 s	0 0 ucJÍaKZMafrGWrf-MŽ
34	viz. př. 2.2	624	>95%	0,027	{P SlífrPro((3RJ-2-fiaíly)) ^Asn-AItVakNHj
	δυΙ(σηγ1-1-{3Ρ)'(2-ίΐ3ΛγΙ)ρίο^-1-35ρ»·89ίπ0-1-3ΐ3ηγΜ.’ν35η-3πιίό
35		654	>95%	5,02	0°Ó 0 Z u 0 u O 0 0 )-mh” °
	Síikanyl-L-O-benzyl-tyTosyl-L-asparaginyt-L-afanyl-L-vaHn-amW
36		624	>95%	2,83	O \ H η Ϊ M Ů 0 0 S-.H, 0 S uoAta{3-(4-bÍfonyt) ] Asn-Ala-Val-NHi
	Sukcínyl-t^^^Wíefi^aíanyl-i-asparaginyt-L-alanyK-vatin-amic}
37		599	>95%	0,83	S«?M2>AsrvAh-V«H
	Sukányf-L-S-ÍŽ-naftyfJalanytUasparaginyH-alanyH-valIn

38		585	>95%	0,26	O °γ— /Hi, 0 Suc4taK2U»Mte.Vakt
	Sukdnyl^-3-(2-Naftyí)alany|^-asparagbyH.-alanhy^L·valnol
39		597	>95%	1,5	0^------<f” NH, SteWMsMI»NHCH(lPňZ
	Sukdnyl-L'3-{2-Naftyl)alanyt<-asparaginylT^^in-2,4-(imethyipentylamkj
40		569	>95%	1,16	----- ^Ίγ'^'Ά0 ° VMH, ® Sbo4í<2W»4Mí^CH2C(C^
	Sukcinyl-L-3-(2-naflyf)aianyl<-a6paraginyl-L'alanln>neopentytamid
41		595	>95%	8,17	θ’ ” -τ—-1 ϊ^τ115 Ar <5 C 0 0 ^4” KM, Sue4W(2bMnHAIa4,W™Kby^^
	5ϋΚάη^ί-3-(2-Ν3Λ^)3!3η^-33ρ«99ηχ|.ί.8(βηίη-3Γ3^βΰ)γΙρΙρβτΜ(η^βΓηΙίΙ
42		626	75-95%	0,24	Ύ— Su>fMÍŽMm4l»WH3B
	SukdnyH.-3-(24iaftyt)alar^-asparagínytÁ-alanyt-L-valirwftnefhylamkl

43		611	>95%	0,026	Swřfto ((3R>2-wty 1 -Asn-Aia-VaW
	Sukcíny1-L-(3R)-(2-riaftyi)prolyl-L-asparaginy1-L-aianyl-(2S}-amino-3-methyí-1 -butanol

2. Syntézy ve velkém měřítku

2.1 Syntéza N-Fmoc-trans-3-(2 -naftyI)—L—prolinu (A8)

Shrnutí: N-Fmoc-trans-3-{2'-naftyl)-L-prolin (A8) se připraví v 10 krocích:

ρκ orj-inn p*

EtOH ^^CH° P^PCHCOaEt

A1:R = Et,65% ^CO/t 1) UOH. aq THF (A2: R = H, S8%) 2) a) (CH^COCl, TEA, THF

1) LiOH, H₂O₂, aq. THF^

2) MeOH, SOCk

1) CH₂CHMgBr, Cul, TMEOA TMSCt THF ÍA4; X * H, 87%).

2) a) KHMDS, PhCH_3t THF

b) TrisN,

c) AcOH ^b> Li X '0

Ph

Ph

A5: X = N₃, 84%

1)6NHCl, var

2) Fmoc-o-suítc, aq aceton Na₂CO₃

OMe

48%

A8

CO₂Me

87%

A7

Fmoc io 2.1.1 Ethy ltran s3—(2 '-nafty lý-propenoát (A 1)

K míchajícímu se roztoku 7,8 g (50 mmol) 2-naftaldehydu v 50 ml ethanolu se přidá 18,3 g (52,5 mmol) (karbethoxymethylen)trifenylfosforanu. Reakce je mírně exotermní. Během míchání směsi přes noc vznikne sraženina. Reakění směs se zředí 500 ml diethyletheru a promyje se dvakrát 100 ml 1M kyseliny fosforečné, jednou 100 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, 100 ml vody a 100 ml solanky. Organická fáze se suší nad síranem hořečnatým a odpaří se za sníženého tlaku. Zbytek se filtruje přes sloupec silikagelu za eluce směsí hexanu a ethy 1acetátu 9:1. Po odpaření ve vakuu se získá téměř kvantitativní výtěžek produktu ve formě směsi geometrických izomerů 85:15 (podle NMR převažuje trans-izomer). Látka se rekrystalizuje ze směsi hexanu a ethylaeetátu (přebytek hexanu) za získání 4,5 g požadovaného produktu jako směsi izomerů 97:2 (podle NMR). Matečné louhy se odpaří a rekrystalizují se za získání dalších 2,9 g produktu (celkem 7,4 g, 33 mmol, výtěžek 65 %). NMR (deuterochloroform) δ 7,93 (s, IH); 7,88-7,83 (c, 4 H); 7,67 (dd, IH, J= 1,6, 8,6 Hz); 7,53-7,50 (c, 2H); 6,55 (d, IH, J = 16,0 Hz); 4,30 (kv, 2 H, J = 7,1 Hz); 1,42 (t, 3H, J = 7,1 Hz).

io

2.1.2 trans-3-(2 -naftyl)-propenová kyselina (A2)

K roztoku 4,24 g (18,8 mmol) esteru Al (4,24 g, 18,8 mmol) v 75 ml tetrahydrofuranu se přidá 2,36 g (56,3 mmol) hydrátu hydroxidu lithného v 19 ml vody. Původně heterogenní směs se energicky míchá přes noc a změní se na homogenní. Reakční směs se okyselí koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (pH asi 2) a vyloučí se sraženina. Heterogenní směs se převede do dělící nálevky a extrahuje se třikrát 150 ml ethylaeetátu. Spojené organické extrakty se suší nad síranem hořečnatým a odpaří se ve vakuu a získá se 3,66 g (výtěžek 98 %) karboxylové kyseliny ve formě bílé, pevné látky. NMR (deuterochloroform) δ 7,97 (d, IH, J= 15,7 Hz); 7,90 (d, IH,

J = 15,3 Hz); 7,90-7,83 (c, 3 H); 7,70 (dd, IH, J = 1,6, 8,6 Hz); 7,57-7,50 (c, 2 H); 6,58 (d, IH, J = 16,0 Hz).

2.1.3 trans-(4S)-3-{3^ř-(2 -Naftyl)-propenoyl)-4-fenyl-2~oxazolidinon (A3)

Roztok 3,66 g (18,5 mmol) karboxylové kyseliny A2 a 1,87 g (2,56 ml, 18,5 mmol triethylaminu v 74 ml bezvodého tetrahydrofuranu se ochladí na -78 °C. Během 2 minut se přidá 2,35 g (2,40 ml, 19,4 mmol) pivaloylchloridu, přičemž vzniká bílá sraženina. Po 10 minutách se baňka umístí na 10 minut do lázně o teplotě 0 °C, potom se ochladí zpět na 1,5 hodiny na -78 °C. V jiné baňce se 3,31 g (20,3 mmol) oxazolidionu odvozeného od L-fenylglycinolu v 74 ml bezvodého tetrahydrofuranu ochladí na -78 °C. Přidá se 11,6 ml 1,6M (18,5 mmol) roztoku n—butyllithia v hexanu a míchání pokračuje asi 1 hodinu, přičemž se z roztoku tetrahydrofuranu a hexanu sráží metalovaný oxazolidinon. K metalovanému oxazolidínonu se přidá pomocí kanyly směsný anhydrid a reakční směs se umístí do lázně o teplotě 0 °C. Po jedné hodině se lázeň odstraní a směs se přes noc ohřeje na teplotu místnosti, Reakce se ukončí přidáním 50 mí nasyceného roztoku chloridu amonného. Tetrahydrofuran se odpaří za sníženého tlaku a po převedení do dělící nálevky se směs extrahuje třikrát 75 ml dichlormethanu. Spojené organické frakce se promyjí dvakrát 50 ml IM roztoku hydroxidu sodného, suší se nad síranem hořečnatým a odpaří se. Zbytek se rekrystalizuje ze směsi ethylaeetátu a hexanu a získá se 3,87 g (11,2 mmol, výtěžek 61 %) bílé, pevné látky. NMR (deuterochloroform) δ 8,05 (d, IH, J= 15,7 Hz); 7,94 (d, IH,

J = 15,4 Hz); 7,87-7,81 (c, 3H); 7,76 (dd, IH, J = 1,5, 8,6 Hz); 7,53-7,47 (c, 2H); 7,41-7,34 (c, 5H); 5,58 (dd, IH, J = 8,7, 3,9 Hz); 4,76 (t, IH, J = 8,7 Hz); 4,33 (dd, IH, J = 8,8, 3,9 Hz).

2.1.4 (3 R,4S)-3-(3 '42' -Naftyl)-4'-pentenoyl)-4-fenyl-2-oxazolidinon (A4)

K roztoku 3,96 g (20,9 mmol) jodidu měďného a 2,66 g (3,46 ml, 22,9 mmol) TMEDA v 92 ml bezvodého tetrahydrofuranu se při -78 °C přidá 20,9 ml (20,9 mmol) l,0M roztoku vinylmagnesiumbromidu v tetrahydrofuranu. Směs se míchá 15 minut. V jiné baňce se 5,69 g (6,64 ml, 52,2 mmol) trimethylsily leh loridu přidá k roztoku 3,87 g (11,3 mmol) nenasyceného imidu A3 ve 42 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Vzhledem k nerozpustnosti imidu se septum baňky obsahující kuprátové činidlo odstraní a najednou se přidá suspendovaný imid a rychle se promyje malým množstvím tetrahydrofuranu. Teplota lázně se zvýší na -30 °C a míchání pokračuje 1 hodinu. Reakční směs se nalije do 250 ml směsi nasyceného roztoku chloridu amonného a koncentrovaného hydroxidu amonného 3:2. Vrstvy se oddělí a vodná fáze se extrahuje třikrát 200 ml ethylaeetátu. Spojené organické frakce se postupně promyjí jednou 100 ml nasyceného roztoku chloridu amonného a jednou 100 ml vody. Organická fáze se suší nad síranem hořeěna_ ΊΊ _ tým a odpaří se za sníženého tlaku. Zbytek se čistí filtrací pres sloupec silikagelu za eluce směsí hexanu a ethylacetátu 4:1. Eluent se odpaří ve vakuu a získá se 3,64 g (9,81 mmol, výtěžek 87 %) bílé, pevné látky. NMR (deuterochloroform) δ 7,87-7,82 (c, 3H); 7,72 (s, IH); 7,54-7,27 (c, 8H);

6,11 (ddd, IH, J “ 6,7, 10,4, 17,0 Hz); 5,34 (dd, IH, J = 8,6, 3,5 Hz); 5,10 (d, IH, J=8,2Hz); 5,08 (d, IH, 17,2 Hz); 4,56 (t, IH, J = 8,8 Hz); 4,26 (dd, IH, J = 8,8, 3,5 Hz); 4,16 (ddd, IH,

J = 8,1, 7,0, 6,9 Hz); 3,68 (dd, IH, J = 8,4, 16,5 Hz); 3,50 (dd, 1H, J = 6,5, 16,5 Hz).

2.1.5 (2'S,3'R,4S)-3-(2'-Azido-3'-(2''-naftyí)-4-pentenoyl)-4-fenyl-2-oxazolidinon (A5) io 25,5 ml (12,8 mmol) 0,5M hexamethyldisilazidu draselného se najednou přidá při -78 °C k 34 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Pomocí kanyly se přidá 3,64 g (9,81 mmol) imidu A4 suspendovaného v 34 ml tetrahydrofuranu, přičemž se kanyla propláchne dvakrát 11 ml tetrahydrofuranu. Po 30 minutách se pomocí kanyly přidá 4,40 g (14,2 mmol) trisylazidu rozpuštěného v 34 ml tetrahydrofuranu ochlazeného na -78 °C. Po 30 minutách se reakční směs rozloží přidáním 1,41 g (1,34 ml, 23,4 mmol) kyseliny octové. Směs se míchá při teplotě místnosti pres noc. Směs se extrahuje mezi 300 ml dichlormethanu a 150 ml zředěné solanky. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje třikrát 150 ml dichlormethanu. Spojené organické vrstvy se suší nad síranem hořečnatým a odpaří se za sníženého tlaku. Zbytek se čistí pomocí velmi rychlé ehromatografíe a získá se 3,41 g (8,28 mmol, výtěžek 84 %) produktu. NMR (deuterochloroform) δ 7,85-7,82 (c, 3H);

7,72 (s, IH); 7,53-7,47 (c, 2H); 7,42 (dd, IH, J = 1,7, 8,5 Hz); 7,37-7,31 (c, 3H); 7,18-7,15 (c,

2H); 6,28 (ddd, IH, J = 8,2, 10,2, 17,1 Hz); 5,63 (d, IH, J = 10,2 Hz); 5,37 (d, IH, J = 17,0 Hz); 5,34 (d, IH, J = 10,2 Hz); 4,83 (dd, IH, J = 3,0, 8,3 Hz); 4,14 (t, IH, J = 7,2 Hz); 4, 07 (dd, IH, J = 9,3, 17,9 Hz); 3,94 (dd, 1H, J = 3,0, 5,8 Hz); 3,68 (t, 1H, J = 8,6 Hz).

2.1,6 MethyH2S,3R)-2-Azido-3-(2'-naftyl)-4-pentenoát (A6)

K roztoku 3,41 g (8,28 mmol) imidu A5 v 62 ml tetrahydrofuranu se přidá 21 ml vody, 2,7 ml 35% peroxidu vodíku a 695 mg (16,6 mmol) hydrátu hydroxidu lithného. Po 2 hodinách se přidá roztok 4,17 g (33,1 mmol) siřiČitanu sodného ve formě roztoku v 41 ml vody. Směs se míchá

15 minut a tetrahydrofuran se odstraní za sníženého tlaku. Vodný roztok se okyselí kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje se dvakrát 150 ml ethylacetátu. Spojené extrakty se suší nad síranem hořečnatým a odpaří se za sníženého tlaku. Zbytek se filtruje přes sloupec silikagelu za eluce směsí hexanu a ethylacetátu 1:1 a po odpaření se získá bílá, pevná látka, o které se předpokládá, že je směsí karboxylové kyseliny a chirální přísady. Po rekrystalizací ze směsi hexanu a ethylacetátu se získá chirální přísada ve formě jehel. Matečné louhy se odpaří a provede se esterifikace. Zbytek obsahující surovou karboxylovou kyselinu se rozpustí v 46 ml bezvodého methanolu a ochladí se na 0 °C. Přidá se 1,18 g (725 μϊ, 9,94 mmol) thionylchloridu a po 10 minutách se směs 2 hodiny zahřívá k varu. Ke směsi se přidá 1,0 ml vody, míchá se 10 minut a obsah baňky se odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se extrahuje mezi 150 ml ethylacetátu a

100 ml solanky. Vrstvy se oddělí a organická fáze se suší nad síranem hořečnatým a odpaří se za sníženého tlaku. Zbytek se čistí pomocí velmi rychlé ehromatografíe za eluce směsí hexanu a ethylacetátu 19:1 a získá se 1,54 g, 5,48 mmol, výtěžek 66%) methylesteru. NMR (deuteronchloroform) δ 7,84-7,80 (c, 3H); 7,71 (s, IH); 7,50-7,46 (c, 2H); 7,39 (dd, IH, J = 1,8, 8,5 Hz); 6,23 (ddd, IH, J = 8,3, 10,9, 17,6 Hz); 5,30 (d, IH, J = 9,9 Hz); 5,28 (d, IH, J = 17,7 Hz); 4,22 (d, 1H, J = 7,5 Hz); 4,06 (t, 1H, J - 7,9 Hz).

2.1.7 methylester trans-342-naftylj-L-prolinu (A7)

6,57 ml (13,1 mmol) komplexu boranu a methylsulfidu se zředí 26 ml bezvodého tetrahydro50 furanu a ochladí se na 0 °C. Pomocí kanyly se opatrně přidá 2,16 g (2,66 ml, 26,3 mmol) cyklohexenu. Po 30 minutách vznikne bílá sraženina. Míchání pokračuje 3 hodiny. Obsah baňky se odpaří ve vakuu. Činidlo se suspenduje v 36 ml dichlormethanu a ochladí se na 0 °C. Pomocí kanyly se přidá 1,23 g (4,38 mmol) vinylazidu A6 rozpuštěného v 9 ml dichlormethanu. Reakční směs lehce zežloutne a zjevně se uvolňuje plyn. Směs se ohřeje pres noc na teplotu místnosti.

Přidá se 26 ml methanolu a směs se míchá dalších 15 minut. Směs se odpaří za sníženého tlaku.

Zbytek se převede do 25 ml diethyletheru a extrahuje se pětkrát 25 ml 0.1M roztoku kyseliny chlorovodíkové. pH vodných extraktů se upraví na bazické pomocí nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahují se třikrát 100 ml dichlormethanu. Organické extrakty se suší nad síranem hořečnatým a odpaří se ve vakuu a získá se 974 g (3,82 mmol, výtěžek 87 % surové látky) cyklizovaného produktu společně s trochou kontaminantů odvozených od dicyklohexylboranu. NMR (deutrochloroform) δ 7,84-7,78 (c, 3H); 7,71 (s, 1H); 7,49-7,41 (c, 3H); 3,91 (d, IH, J = 6,9Hz); 3,69 (s, 3H); 3,63 (m, IH); 3,48 (dd, IH, J = 8,2, 15,4 Hz); 3,27 (d, IH, J = 7,8 Hz); 3,25 (d, IH, J = 7,8 Hz); 2,33 (m, IH), 2,09 (m, IH).

io 2.1.8 N-Fmoc-trans-3~(2'-naftyl)-L-prolin (A8)

510 mg (2 mmol) methylesteru (A7) v 12 ml 6N kyseliny chlorovodíkové se 10 hodin zahřívá na 100 °C pod zpětným chladičem. Reakční roztok se odpaří za sníženého tlaku a pevný zbytek se suspenduje v 15 ml acetonu. pH suspenze se upraví na 9 až 10 pomocí 2N roztoku uhličitanu is sodného. Pomalu se přidá 742 mg (2,2 mmol) Fmoc-O-sukcinimidu. Potom se pH upraví na 9 až a směs se míchá 4 hodiny při teplotě místnosti a potom se nechá stát při teplotě místnosti přes noc. Potom se pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové upraví pH na 2 a směs se smísí s ethylacetátem. Vodná vrstva se třikrát extrahuje ethylacetátem a potom se smísí sdichlormethanem. Získá se dalších 185 mg produktu ve formě sraženiny. Výtěžek: 745 mg (80,4%),

NMR (perdeuterodimethylsulfoxid) δ 7,95-7,80 (c, 6H); 7,68 (d, IH, J = 7,3Hz); 7,60 (d, IH,

J = 7,4 Hz); 7,50-7,34 (c, 6H); 7,25 (m, IH); 4,39-4,15 (c, 4H); 3,70-3,48 (c, 3H); 2,29 (m, 1H);

2,14 (m, IH).

2.2 N-Sukcinyl-trans-3-(2 -naftyl)-L-prolyl-L-asparaginyl-L-alaninyI-L-valinamid (34)

2.2.1 N-Fmoc-trans-3-(2 -naftyl)-L-prolin-L-asparagÍn-L-alanin-L-valinamid (Bl)

463,5 mg (1 mmol) N-Fmoc-trans-3-(2'-naftyl)-L-prolinu (A8), 338 mg hydroehloridu H-Asn-Ala-Val-NH₂ (připraveného podle postupu, který se běžně používá v chemii peptidů) a 135 mg HOBT se rozpustí v 20 ml dimethylformamidu. při 0 ^ĎC se přidá 0,13 ml N-ethylmorfolínu a 220 mg DCC. Směs se míchá 1 hodinu při 0 °C a potom 3 hodiny při teplotě místnosti a potom se nechá stát přes noc při teplotě místnosti. Sraženina se odfiltruje za sání a roztok se odpaří za vysokého vakua. Zbytek se extrahuje mezi pentanol a roztok hydrogenuhličitanu sodného. Pentanolová fáze se promyje roztokem hydrogensíranu draselného a roztokem chloridu sodného ve vodě. Sraženina se odfiltruje za sání a trituruje se diethy letherem. Získá se 473 mg produktu. Pentanolová fáze se suší pomocí síranu sodného a odpaří se. Zbytek se trituruje diethyletherem. Získá se 257 mg produktu. Výtěžek je 730 mg (97,7 %).

2.2.2 trans-3-(2'-Naftyl}-L-pΓolin-L-asparagin-L·-alanin-L-valmamid (B2).

248 mg (0,332 mmol) N-Fmoc-trans-3-(2'-naftyl)-L-prolin-L-asparagin-L-alanin~L-valinamidu Bl se převede do 5 ml dimethylformamidu, přidá se 0,35 ml (3,32 mmol) diethylaminu a

směs se míchá 15 minut při teplotě místnosti. Směs se filtruje za sání přes Čisticí vrstvu a odpaří se za vysokého vakua. Pevný zbytek se trituruje diethyletherem a filtruje se za sání. Výtěžek je 141 mg (81 %).

2.2.3 Methyl-terc-butylsukcinát (B3)

V argonové atmosféře se 13,2 g (100 mmol) monomethylsukcinátu suspenduje v 500 ml methylenchloridu. Během 30 minut se přikape 12,9 ml (150 mmol) oxalylchloridu a směs se potom míchá 6 hodin při teplotě místnosti. Asi po 3,5 hodinách se získá čirý roztok. Potom se io přikape 300 ml terc-butanolu. Směs se nechá stát 21 hodin při teplotě místnosti a čirý roztok se odpaří. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu a promyje se vodou, hydrogenuhličítanem sodným a vodou. Roztok se suší nad síranem sodným a odpaří se. Výtěžek 21,6 g (surový, olejovitý produkt).

2.2.4 Mono-terc-butylsukcinát (B4)

9,4 g (50 mmol) methy 1-terc-butyl sukcinátu (B3) se rozpustí v 115 ml 1,4-dioxanu. Potom se přidá 110 ml 0,5N hydroxidu sodného. Směs se nechá stát při teplotě místnosti a produkt se vysráží. Směs se nechá stát při teplotě místnosti přes víkend a potom se odpaří. Vodný roztok se extrahuje pomocí diethyletheru. Vodná fáze se ochladí na 0 ^PC a okyselí se na pH 4 pomocí 2N roztoku kyseliny sírové. Směs se potom extrahuje pětkrát diethyletherem. Organické fáze se spojí, promyjí se vodou, suší se nad síranem sodným a odpaří se. Výtěžek je 5,62 g oleje (64,5%).

2.2.5 N-terc-Butyl-sukcinyl-trans-3-(2 '-naftyl)-L-proIin-L-asparagin-L-aIanin-L-val í namid (B5)

262 mg (0,5 mmol) trans-3-(2'-naftyl)-L-prolÍn-L-asparagin-L-alanin-I-valin-amidu (B2),

87,1 mg (0,5 mmol) mono-terc-butylsukcinátu (B4) a 67,5 mg HOBt se rozpustí v 5 ml dimethylformamidu. Při 0 °C se přidá 110 mg DCC a směs se míchá í hodinu při 0 °C a potom 2 hodiny při teplotě místnosti a nechá se stát přes noc při teplotě místnosti. Sraženina se odfiltruje za sání a filtrát se odpaří za vysokého vakua. Zbytek se trituruje roztokem hydrogenuhličitanu sodného, filtruje se za sání, promyje se vodou a suší se v exsikátoru. Výtěžek 169 mg (49,6 %).

2.2.6 N-Sukcinyl-trans-3-(2 '-nafty lj-L-prolin-L-asparagin-L-alanin-L-valin-amid (34)

316 mg N-terc-butyl-sukcinyl-trans~3~{2'-naftyl)-L-prolin-L-asparagin-L-alanin-L-valÍn“ amid (B5) se rozpustí v 2 ml 90% kyseliny trifluoroetové a nechá se stát 1 hodinu. Směs se potom filtruje přes čisticí vrstvu a odpaří se. Zbytek se trituruje diethyletherem a filtruje se za sání. Získá se 159 mg surového produktu. Pro čištění se použije chromatografie produktu přes

Sephadex® LH20 za použití směsi butanol/ledová kyselina octová/voda. Výtěžek je 27,5 mg (9,5 %).

m/z: 625,298949 (M+H)⁺ (hmotové spektrum s vysokým rozlišením).

NMR údaje pro sloučeninu 34:

Chemické posuny sloučeniny 34 v dimethylsulfoxidu při 300 K.

Viz. vzorec výše	Ή	”c
	trans	cis	trans	cis
But-1	-	-	173,88	173,92
But-2	2,54/2,46	2,61/2,20	2^.64	28,37
But-3	2,70/2,54	2.5672,39	28,80	28,80
But-4	-	-	170,67	170,22
Pro-a	4,39	4,68	66,18	65,46
Pro-C’	-	-	171,03	170,94
Pro-β	3,55	3,68	47,42	49,45
Pro-γ	2,40/2,16	2,33/1,94	32,02	30,41
Pro-6	3,81/3,72	3,59/3,53	46,12	45,40
Nap-1		-	138,79	139,55
Nap-2	7,76	7,78	125,14	124,79
Nap-2a	-	-	132,97	132,97
Nap-3	7.87	7,87	127,66	127,66
Nap-4	7,49	7,49	126,03	126,03
Nap-5	7,48	7,48	125,63	125,63
ki«_ &	7,68	7,88	127,33	127,33
Nap-6a	-	-	131,98	131,98
Nap-7	7,87	7,89	127,97	127,97
Nap-8	7,45	7,46	125,96	125,96
Asn-NH	8,31	8,50	-	-
Asn-a	4,44	4,64	50,13	49,79
Asn-C’		-	170,58	170,29
Asn-β	2,64/2,46	2,57/2,45	36,96	36,25
Asn-y-C'	-	-	171,73	171,44
Asn-5-NH2	7,41/6,93	7,33/6,93
Ala-NH	22Í	8,02	-	-

_ 31 _

Ala-a	4,19	4,27	48,71	48,46
Ala-C'	-		171,84	171,78
Ala-p	1,22	1,19	17,49	18,04
Val-NH	7,48	_	-	-
Val-a	4,04	4,08	57,69	57,57
Val-C	-	-	172,77	172,73
Val-p	1,97	1,97	30,08	30,29
Val-γ	0,82	0,86	19,24	19,27
Val-γ'	0,82	0,84	17,89	17,97
Val-NH2	7,15/6,99	7,27/7,00	-	-

2.3 N-Sukcínyl-L-(2-naftyl)alaninyl-L-asparaginyl-L-serinyl-L-valinyl-glycin-3-hydroxypropylamid (24)

2.3.1 Benzyloxykarbonyl-glycin-(3-propanol)amid (Cl)

627 g (30 mmol) Gly-OH, 2,45 ml 3-amino-l-propanolu a 4,05 g HOBt se rozpustí v 60 ml io dimethylformamidu. Při 0 °C se přidá 6,6 g DCC. Směs se míchá 1 hodinu při 0 °C a 3 hodiny při teplotě místnosti a nechá se stát při teplotě místnosti přes noc. Sraženina se odfiltruje za sání a filtrát se odpaří za vysokého vakua. Zbytek se extrahuje mezi ethylacetát a roztok hydrogenuhličitanu sodného. Organická fáze se potom promyje roztokem hydrogenuhličitanu sodného a chloridem sodným ve vodě, suší se nad síranem horečnatým a odpaří se. Zbytek se trituruje diethyletherem. Výtěžek je 7,05 g (88,2 %).

2.3.2 Benzy loxykarbony l-glycin-(3-propanol-terc-butylester)amid (C2) g (26,28 mmol) benzy loxykarbony l-glycin-{3-propanol)amidu (Cl) se rozpustí v 60 ml dioxa20 nu. Při nízké teplotě (kapalný CO₂) se pomalu přidá 6 ml kyseliny sírové. Potom se přidá 60 ml kondenzovaného isobutylenu. Směs se třepe v autoklávu při teplotě místnosti a při tlaku dusíku

MPa 3 dny. Ke směsi se potom přidá diethylether a extrahuje se třikrát 2N roztokem uhličitanu sodného. Vodný roztok se promyje diethyletherem. Organické fáze se spojí, promyjí vodou, suší se nad síranem sodným a odpaří. Výtěžek je 7,98 g (94,2 %).

2.3.3 Hydrochlorid glycin-(3-propanol“terc-butylester)amidu (C3)

7,98 g (24,75 mmol) benzyloxykarbonyl-glycin-(3-propanol-terc-butylester)amtdu (C2) se rozpustí v 80 ml methanolu, přidá se palladium na uhlí a hydrogenuje se v autotitrátoru za použití methanolického chlorovodíku a vodíku. Katalyzátor se potom odfiltruje za sání a filtrát se odpaří. Zbytek se suší ve vakuu. Výtěžek je 4,7 g (84,5 %).

2.3.4 BenzyloxykarbonyI-L-valin-glycin-(3-propanol-terc-butylester)amid (C4) io 5,13 g (20,43 mmol) benzyloxykarbonyl-Val-OH, 4,59 g (20,43 mmol) hydroehloridu glycin— (3-propanol-terc-butylester)amidu (C3) a 2,75 g HOBt se rozpustí v 60 ml dimethylformamidu. při 0 °C se přidá 2,65 ml N-ethylmorfolinu a 4,5 g DCC. Směs se míchá 1 hodinu při 0 °C a potom 2 hodiny při teplotě místnosti. Směs se nechá stát při teplotě místnosti přes noc a potom se odpaří ve vysokém vakuu. Fáze obsahující ledovou kyselinu octovou se potom promyje roztokem iš hydrogenuhličitanu sodného, roztokem hydrogensíranu draselného a chloridem sodným ve vodě, suší se nad síranem sodným a odpaří se. Pevný zbytek se trituruje diethyletherem a odfiltruje se za sání. Výtěžek je 7,32 g (85 %).

2.3.5 hydrochlorid L-valin-glycin-(3-propanol-terc-butylester)amidu (C5)

7,29 g (17,3 mmol) benzyloxykarbonyl-L-valin-glycin-(3-propaiiol-terc-butyIester)amidu (C4) se rozpustí v 90 ml methanolu, přidá se palladium na uhlí a hydrogenuje se v autotrituratoru za použití methanolického chlorovodíku. Katalyzátor se potom odfiltruje za sání a filtrát se odpaří. Zbytek (amorfní) se potom suší ve vysokém vakuu, trituruje se diethyletherem a filtruje se za sání. Výtěžek je 5,22 g (93,2 %).

2.3.6 Benzyloxykarbonyl-L~serin-(terc-butylester)-L-valin-glycin-(3-propanol“terc-butylester)amid (Có)

5,46 g (i 8,5 mmol) Ž-Ser(But)OH, 6 g (18,5 mmol) hydroehloridu L-valin-glycin-(3-propanolterc-butylester)amidu (C5) a 2,5 g HOBt se rozpustí v 60 ml dimethylformamidu. Při 0 °C se přidá 2,4 ml N-ethylmorfolinu a 4,07 g DCC. Směs se míchá 1 hodinu při 0 °C a 3 hodiny při teplotě místnosti. Směs se nechá stát při teplotě místnosti pres noc a potom se odpaří za vysokého vakua. Pevný zbytek se extrahuje mezi ledovou kyselinu octovou a roztok hydrogenuhličitanu sodného. Fáze obsahující ledovou kyselinu octovou se promyje roztokem hydrogenuhličitanu sodného, roztokem hydrogensíranu sodného a chloridem sodným ve vodě, suší se pomocí síranu sodného a odpaří se. Zbytek se trituruje diethyletherem a filtruje se za sání. Výtěžek je 9,74 g (93,2 %).

2.3.7 Hydrochlorid L-serin(terc-butylester)-L-valin-~glycin-(3-propanol-terc-butylester)amidu (C7)

9,74 g (17,25 mmol) benzy loxy karbony I-L-serin(terc-butylester)-L-val in-glyc in(3-propanolterc-butylester)amidu (C6) se rozpustí asi v 100 ml methanolu, přidá se palladium na uhlí a hydrogenuje se v autotitrátoru za použití methanolického chlorovodíku. Katalyzátor se potom odfiltruje za sání a filtrát se odpaří. Zbytek (amorfní) se suší za vysokého vakua a potom se trituruje diethyletherem a filtruje se za sání. Výtěžek je 8,02 g (99,6 %).

2.3.8 Benzy loxy karbony l-L-asparagin-L-serin(terc-buty lester)-L-valin-glycin-(3-propanol50 terc-butylester)amid (C8)

4,53 g (17 mmol) Z-Asn-OH, 7,94 g hydroehloridu L-serin(terc-butylester)-L-valin-glycin(3propanoRerc-butylester)amidu (C7) a 2,3 g HOBt se rozpustí v 60 ml dimethylformamidu. při 0 °C se přidá 2,21 ml N-ethylmorfolinu a 3,74 g DCC. Směs se míchá 1 hodinu při 0 °C a

3 hodiny pří teplotě místnosti a potom se odpaří ve vakuu. Zbytek se extrahuje mezi pentanol

a roztok hydrogenuhličitanu sodného. Pentanolová fáze se promyje roztokem hydrogenuhličitanu sodného, roztokem hydrogensíranu draselného a chloridem sodným ve vodě, suší se nad síranem sodným a filtruje se za sání a filtrát se odpaří ve vysokém vakuu. Zbytek se trituruje diethy 1etherem, ochladí se a filtruje se za sání. Produkt se suší v exsikátoru nad oxidem fosforečným.

Výtěžek je 10,8 g (93,6 %).

2.3.9 Hydrochloríd L-asparagin-L-serin(terc-butylester)-L-valin-glycin-(3-propanol-tercbutylester)amidu (C9) ίο 10,8 g (15,9 mmol) benzyloxykarbonyl-L-asparagin-L-serin(terc-butylester)-L-valín-gÍycin(3-propanol-tcrc-buty lester )amidu (C8) se rozpustí asi v 160 ml horkého methanolu, přidá se palladium na uhlí a směs se hydrogenuje v autotitrátoru za použití methanol ického chlorovodíku. Katalyzátor se potom odfiltruje za sání a filtrát se odpaří. Amorfní zbytek se suší ve vysokém vakuu, trituruje se diethyletherem, ochladí se a filtruje za sání. Výtěžek je 8,96 g (97 %).

2.3.10 Benzyloxykarbonyl-L-2-naftylalanin-L-asparagin-L-serin(terc-butylester)-L-vaIinglycin-(3-propanol-terc-butylester)amid (CIO)

5,24 g (15 mmol) benzyloxykarbonyl-2-Nal-OH, 8,72 g (15 mmol) hydrochloridu L-asparagin20 L-serin(terc-butylester)-L-valin-glycin-(3-propanoÍ-terc-butylester)amidu (C9) a 2,04 g HOBt se rozpustí v 60 ml dimethylformarnidu. při 0 °C se přidá 1,95 ml N-ethylmorfolinu a 3,3 g DCC. Směs se míchá 1 hodinu při 0 °C a 3 hodiny při teplotě místnosti. Směs se potom nechá stát při teplotě místnosti přes noc, zředí se dimethylformamidem a mírně se zahřeje. Sraženina se potom filtruje za sání a filtrát se odpaří za vysokého vakua. Zbytek se trituruje roztokem hydro25 genuhličitanu sodného a filtruje se za sání a potom se trituruje roztokem hydrogensíranu draselného, filtruje se za sání, trituruje se vodou, filtruje se za sání a promyje se vodou a suší se v exsikátoru nad oxidem fosforečným. Výtěžek je 13,25 g (více, než 99 %).

2.3.11 Hydrochloríd L-2-naftylalanin-L-asparagin-L-serin(terc-butylester)-L-valinglycÍn-(330 propanoRerc-butylester)amidu (Cli)

8,85 g (10,1 mmol) benzyloxykarbonyl-L-2-naftylalanin-L-asparagin-L-serin(terc-butyl· ester)-L-vaIin-glycin-(3-propanol-terc-butyIester)amidu (CIO) se částečně rozpustí v 270 ml methanolu, přidá se palladium na uhlí a směs se hydrogenuje v autotitrátoru za použití methano35 1 ického chlorovodíku. Suspenze se zředí dimethylformamidem. Asi po 6 hodinách se směs odpaří na polovinu původního objemu. Všechny látky se rozpustí. Směs se nechá stát při teplotě místnosti přes noc. Katalyzátor se potom filtruje za sání a filtrát se zředí stejným množstvím methanolu, přidá se nový katalyzátor (palladium na uhlí) a hydrogenace v autotitrátoru pokračuje. Po 7 hodinách se směs nechá stát při teplotě místnosti přes noc. Směs se potom hydrogenuje další

4 hodiny, katalyzátor se odfiltruje za sání a filtrát se odpaří. Zbytek (amorfní) se suší za vysokého vakua a potom se trituruje diethyletherem a filtruje se za sání. Výtěžek je 7,56 g (96,2 %).

2.3.12 N-terc-buty l-sukcinyl-L-2-nafty lalanin-L-asparagin-L-serin-L-valin-glycin-(3propanol)amid (Cl 2)

523 mg (3 mmol) hydrochloridu L-2-naftylaIan i n-L-asparagin-L-ser in( terc-buty lester)-Lvalin-g!ycin-(3-propanol-terc-butylester)amidu(Cil), 2,33 g mono-terc-butylsukcinátu(B4) a 405 mg HOBt se rozpustí v 20 ml dimethylformarnidu. Při 0 °C se přidá 0,39 ml N-ethylmorfolinu a 660 mg DCC. Směs se míchá 1 hodinu při 0 °C, 2 hodiny při teplotě místnosti a potom se nechá stát při teplotě místnosti přes noc. Směs se odpaří ve vysokém vakuu a pevný zbytek se trituruje hydrogenuhličitanem sodným a filtruje se za sání. Produkt se potom trituruje roztokem hydrogensíranu draselného a filtruje se za sání, promyje se vodou a potom se suší v exsikátoru nad oxidem fosforečným. Výtěžek je 3,04 g (surový produkt).

CZ 300736 Bó

2.3.13 N-Sukcinyl-L-2-naftylalanin-L-asparagin-L-serin-L-valin-glycin-(3-propanol)amid (24) g (surový produkt) N-terc-butyl-sukcinyl-L-2-naftylalanin-L-asparagin-L-senn-L-valin5 glycin-{3-propanol)amidu (C12) se rozpustí v 30 ml 90% roztoku kyseliny trifluoroctové a nechá se stát 1 hodinu při teplotě místnosti. Směs se potom odpaří a zbytek se trituruje diethyletherem a filtruje se za sání. Získá se 2,6 g surového produktu, Za účelem čištění se

250 ml surového produktu rozpustí v horké ledové kyselině octové a chromatograficky se čistí na Sephadexu LH20 za eluce směsí butanol/ledová kyselina octová/voda. Výtěžek je 103 mg.

io m/z: 730,341246 (M+H)⁺ (hmotové spektrum s vysokým rozlišením).

Chemické posuny sloučeniny 24 v dimethylsulfoxidu při 300 K:

Viz. vzorec výše	Ή	’3C
But-1		173,71
But-2	2,29	28,99
But-3	2,32/2,26	29,91
But-4	-	171,15
Nap-NH	8,19	*
Nap-a	4,60	53,92
Nap-C’	*	171,20
Nap-β	3,19/2,91	37,56
Nap-1	-	135,32
Nap-2	7,42	127,85
Nap-3	7,80	127,30
Nap-3a		131,75
Nap-4	7,85	127,38
Nap-5	7,44	125,31
Nap-6	7,47	125,83

. Tí _

Nap-7	7,82	127,38
Nap-7a	-	132,91
Nap-8	7,73	127,38
Asn-NH	8,35	-
Asn-a	4,60	49,73
Asn-C’	-	170,92
Asn-β	2,60/2,49	37,03
Asn-y-C’	-	171,73
Asn-5-NH2	7,44/6,99	-
Ser-NH	7,89	-
Ser-a	4,33	55,15
Ser-C	-	170,13
Ser-β	3,66/3,56	61,52
Ser-OH	4,93	-
Val-NH	7,82	-
Val-a	4,10	58,37
Va!-C’	-	171,02
Val-β	2,04	29,91
Val-γ	0,86	19,17
Va4y‘	0,86	18,11
Gly-NH	8,06	-
Gly-a	3,65	41,97
Gly-C’	-	168.45
Xxx-NH	7,63	-
Xxx-2'	3,10	35,78
Xxx-3'	1.54	32,24
Xxx-4‘	3,40	58,33
Xxx-4'-0H	4,40	-

3. Inhibiee interakce laminin/nidogen a biologická aktivita

Pokud není výslovně uvedeno jinak, použité chemikálie byly získány od společnosti Merck (Darmstadt), Sigma (Munich) nebo Riedel de Haen (Seelze).

Izolace lamininu Pl z lidské placenty, lidského nidogenu z transfekovaných HEK-293 buněk a myšího laminu γΐ III 3-5 z HEK-293 buněk je popsána v Mezinárodní patentové přihlášce io WO 98/31709.

Příklad 3.1

Test inhibice—inhibice vazby laminin/nidogen nalezenými deriváty peptidů

3.1.1. HTS screening test (vysoce citlivá varianta testu)

Časově rozlišený fluorescenční test

Potahování testových destiček

Mikrotitrační destičky (například FluorNunc®) se potahují 75 μΐ 0,1 pg/ml roztoku lamininu Pl (v 0,159 g uhličitanu sodného, 0,293 g hydrogenuhličitanu sodného, 0,02 g NaN₃/litr, pH9,2) is 1 hodinu při teplotě místnosti. Roztok se potom odstraní a volná vazebná místa se blokují inkubací s 0,5 % BSA (v 7,9 g chloridu sodného, 1,2 g hydrogenfosforečnanu sodného, 0,31 g chloridu draselného, 0,23 g dihydrogenfosforečnanu sodného, 0,04 % Tween 20/litr, pH 7,2) po dobu půl hodiny při teplotě místnosti. Po ukončení blokovací reakce následuje slití roztoku a promytí jednou 250 μΙ promývactho pufru (PBS/0,04% Tween).

Postupná inhibice

Paralelně s potahováním se v jiné reakční nádobě provádí preinkubace 85 až 100 μΐ 0,25 nM roztoku nidogenu (rekombinantně připraveného lidského nidogenu) s inhibitorem nebo standardem (1 hodina při teplotě místnosti v 7,9 g chloridu sodného, 1,2 g hydrogenfosforečnanu sodného, 0,31 g chloridu draselného, 0,23 g dihydrogenfosforečnanu sodného, 0,04% Tween 20/litr, 0,5% BSA, pH 7,2).

μΐ preinkubační směsi (nidogen + inhibitor nebo standard) se převede do potažených jamek mikrotitrační destičky a inkubuje se 1 hodinu při teplotě místnosti. Potom následuje promytí dvakrát směsí PBS/0,04% Tween. Detekce vázaného nidogenu se provádí inkubací (při teplotě místnosti) 1 hodinu se 75 μΐ přípravku specifické protilátky připraveného ze žloutku vajíčka slepice imunizovanéfie lidským nidogenem. Frakce IgY se použije ve zředění 1:500 v PBS/0,04% Tween. Komplex nidogenu a specificky vázané protilátky se po promytí dvakrát směsí

PBS/0,04% Tween, detekuje přidáním anti-kuře IgY-biotinu (75 μΐ zředěno 1:2 500; Promega,

Madison, WI 53711, 608-274-4330). Za tímto účelem se provede jednohodinová inkubace a dvojí promytí PBS/0,04% Tween, po které následuje inkubace s streptavidin-europium (Wallac; 1 hodina při teplotě místnosti) a promytí PBS/0,04% Tween. Nakonec je možné po přidání 100 μΐ podpůrného roztoku (Wallac) a 5 minutách protřepání, změřit fluorescenční signál pomocí zařízení Victor za použití europiového postupu. Zjistí se vztah mezi množstvím vázaného nidogenu v roztoku s inhibitorem a množstvím nidogenu bez přídavku inhibitoru.

3.1.2. Třídenní test rovnováhy

U vybraných inhibitorů se testovala inhibiční aktivita na této variantě testu. Test je popsaný v US patentu US 5 493 008.

Následující tabulka porovnává hodnoty IC₅o vybraných látek s výsledky HTS screening testů. Jak se očekávalo, je zřejmé, že třídenní test poskytuje trochu nižší naměřené hodnoty, je citlivější, než screening test. Ze srovnání je také zřejmé, že inhibiční struktury se mohou identifikovat spolehlivě pomocí námi vyvinutého screening testu.

TJ

Tabulka 2: Charakterizace specifických inhibitorů asociace laminin/nidogen: hodnoty [C50 při různých variantách testu

Struktura	HTS test	Třídenní test rovnováhy
NIDPNAV	3,9	1,2
DPNÁV	7,7	5,0
Sloučenina 24	0,36	0,09
Sloučenina 31	0,19	0,085

Příklad 3.2 (hypotetický)

Testování biologické aktivity derivátů peptidů

Pro testování biologické aktivity derivátů peptidů se může použít několik modelů, které jsou podrobněji popsány v literatuře.

Některé příklady takových testů jsou uvedené níže:

Vznik tubulů v kulturách embrionických ledvin.

Grobstein, C.; (1956) Exp. Cell Res. 10: 424^440.

Ekblom, P. a kol. (1994) Development 120: 2 003-2 014 Větvení morfologie v embryonických plicích.

Ekblom, P. a kol. (1994) Development 120: 2 003-2 014

Větvení morfologie v embryonických sliímých žlázách.

Grobstein, C. (1953) J. Exp. Zool. 124: 383-413

Kadoya, Y. a kol. (1997) Development 124: 683-691

Test základu membrány v organotypické kultuře kůže.

Smola, H.; Stark, H.-J,; Thíekótter, G.; Mirancea, N.; Krieg, T.; Fusenig, N.E. (1998) Exp. Cell Res. 239:399-410

Rekonstituce hydra z rozpadlých buněk.

Yang, Y.G.; Mayura, K.; Spainhour, C.B.; Edwards Jr., J.F.; Phillips, T.D. (1993) Toxíkology 85:

179-198

Zahuštění základu membrán v hydra po kultivaci při zvýšené koncentraci glukózy.

Zhang, X.; Huff, J.K.; Hudson, B.G.; Sarras Jr.; M.P. (1990) Diabetologia 33: 704 707

Všechny typy kvantitativních testů angiogeneze jsou shrnuty v souhrnném článku od Jain, R.K. a kol., Nátuře Medicine (1997) díl. 3, č. 11, například:

Induction of Haemangiomes in míče by implantation of cells from spontaneous hemangioendotheliomes.

O'Reilly, M.S.; Brém, M.S.; Folkman, J. (1995) J. Pediatr. Surg. 30:2; 325-329

Growth of micro-vessels in a serum-free eulture of rat aorta.

Nicosia, R.F.; Ottinetti, A. (1990) Lab. Invest díl 63, č. 1, 115-122

Formation of capillaries of endothelic cells on micro-camers after imbedding into a fíbrin gel. Nehls, V.; Drenckhahn, D. (1995) Microvascular Research 50: 311-322.

- 38 .

kde

Claims (3)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   Rt je skupina vybraná z následujících vzorců:

   kde

   R4 je skupina -A, aminoskupina, skupina -NHR, skupina -NR₂, skupina (A)_2t a R₅ je skupina-(CH2)|COOA, skupma-(CH₂)iCONH2, skupina -(CH₂)|NH₂ nebo skupina -(CH₂),SO₃H, nebo

   NH a X je skupina vybraná z jednoho z následujících vzorců

   Y je skupina O, skupina S, skupina -N(A}-C0- nebo skupina-(CH2)rD je skupina (CH₂)_r, skupina O, skupina S, skupina NH, skupina NR, skupina (CH₂)_r-O, skupina (CH₂)-S, skupina (CH₂)_r-NH nebo skupina (CH₂)_rNR a

   R₂ je skupina -A, skupina -E-OH, skupina -E-COOH nebo skupina -E-CONH₂, kde E je lineární nebo rozvětvená alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, která je nesubstituované nebo substituovaná skupinou -A, skupinou -(Cfyjm-OH, skupinou -(CH₂)_mCOOH, skupinou 4CH₂)_m-C(O)N(A)₂, a kde R₇ je lineární nebo rozvětvená alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, která je nesubstituované nebo substituovaná skupinou -A, skupinou -(CH₂)_m-OH, skupinou 4CH₂)_m-COOH, skupinou -CCH₂)_m-C(O)N(A)2, a R je cykloalkylová skupina obsahující 5 až 10 atomů uhlíku, skupina Het nebo skupina Ar, 20 které jsou popřípadě substituované skupinou -alkyl-Het obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou -alkyl-Ar obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou

   -Ο-alkyl-Het obsahující v alkylové části l až 6 atomů uhlíku, skupinou -O-alkyl-Ar obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou Het nebo skupinou Ar, kde

   Het je monocyklická nebo bicyklická, pětičlenná až desetičlenná aromatická nebo nearomatická kruhová skupina obsahující 1 nebo 2 stejné nebo různé heteroatomy jako členy kruhu, vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom dusíku, atom kyslíku a atom síty, která je nesubstituovaná nebo substituovanájednou nebo více hydroxylovými skupinami nebo karboxylovými skupinami a kde

   Ar je monocyklíeký nebo bicyklický pčtičlenný až desetičlenný aromatický kruh, kteiý je nesubstituovaný nebo substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami nebo karboxylovými skupinami a

   Z je skupina (CH₂)_m, skupina O, skupina S, skupina NH, skupina NR, skupina N-C(O)-R nebo skupina NSO₂R,

   A je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a

   1. m a r jsou celá čísla 0 až 3, n a k jsou celá čísla 1 až 2, p je celé číslo 0 až 1 a q je celé číslo 1 až 3, ve všech stereoizomemích formách ajejich směsi ve všech poměrech, včetně všech fyziologicky io přijatelných solí.
2. 2. Sloučenina vzorce I podle nároku 1, kde n je 1.
3. 3. Sloučenina vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kde R ve skupině Xje skupina Het

   Sloučenina vzorce I podle nároku 3, kde Het je skupina

   5.

   Sloučenina vzorce Ϊ podle nároku 3, kde Het je skupina

   Sloučenina vzorce I podle nároku 3, kde Het je skupina

   7.

   Sloučenina vzorce I podle nároku 3, kde Het je skupina

   8.

   Sloučenina vzorce I podle nároku 3, kde Het je skupina _ Λ 1 _

   9. Sloučenina vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kde R ve skupině X je skupina Ar, která je popřípadě substituovaná skupinou -alkvl-Ar obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, skupinou -O-alkyl-Ar obsahující v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, nebo skupinou Ar.

   10. Sloučenina vzorce I podle nároku 9, kde R ve skupině X je skupina Ar.

   11. Sloučenina vzorce I podle nároku 10, kde Ar je skupina

   12. Sloučenina vzorce I podle nároku 10, kde Ar je skupina

   13. Sloučenina vzorce I podle nároku 10, kde Ar je skupina

   14. Sloučenina vzorce I podle nároku 10, kde Arje skupina is 15. Sloučenina vzorce I podle nároku 9, kde R ve skupině X je skupina

   16. Sloučenina vzorce I podle nároku 9, kde R ve skupině X je skupina

   17. Sloučenina vzorce I podle jednoho nebo více nároků 1 až 16, kde X je skupina následujícího 20 vzorce

   -42CZ 300736 B6

   18. Sloučenina vzorce I podle nároku 17, kde Y je skupina -(CH₂)_r-.

   19. Sloučenina vzorce I podle nároku 18, kde r je 1.

   20. Sloučenina vzorce I podle nároku 18, kde r je 0.

   21. Sloučenina vzorce I podle nároků 17 až 20, kde k je 2, io 22. Sloučenina vzorce I podle nároků 17 až 20, kde kje 1.

   23. Sloučenina vzorce I podle jednoho nebo více nároků 1 až 16, kde X je skupina následujícího vzorce

   24. Sloučenina vzorce I podle nároku 23, kde D je skupina-(CH₂)_r-.

   25. Sloučenina vzorce ! podle nároku 23, kde r je 0.

   26. Sloučenina vzorce I podle nároku 23, kde r je 1.

   27. Sloučenina vzorce í podle jednoho nebo více nároků 1 až 26, kde Rj je skupina následujícího vzorce

   28. Sloučenina vzorce I podle nároku 27, kde R₅ je skupina -(CH₂)r-COOA.

   29. Sloučenina vzorce I podle nároku 28, kde 1 je 0 a A je atom vodíku.

   30. Sloučenina vzorce I podle jednoho nebo více nároků 1 až 28, kde R₂ je skupina A.

   31. Sloučenina vzorce I podle nároku 30, kde R₂ je methylová skupina.

   32. Sloučenina vzorce I podle jednoho nebo více nároků 1 až 28, kde R₂ je skupina -E-COOH.

   33. Sloučenina vzorce í podle nároku 32, kde R₂ je skupina -CH₂-COOH.

   34. Sloučenina vzorce I podle jednoho nebo více nároků 1 až 28, kde R₂ je skupina E-OH.

   /11

   35. Sloučenina vzorce I podle nároku 34, kde R₂ je skupina -CH2-OH.

   36. Sloučenina vzorce I podle nároku 1, kde R₇ je rozvětvená alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku.

   37. Sloučenina vzorce I podle nároku 1, kde R₇ je skupina -CH(CH₃)₂.

   38. Sloučenina vzorce I podle nároku 1, kde R₇ je skupina -C(CH₃)₃.

   io 39. Sloučenina vzorce I podle nároku 1, kde R₇ je skupina -CH(CH₃)CH2-CH₃.

   40. Sloučenina vzorce I podle nároku 1, kde R₇ je skupina -CH₂-CH(CH₃)₂.

   41. Sloučenina vzorce I podle jednoho nebo více nároků 36 až 40, kde q je 2.

   42. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jednu sloučeninu podle jednoho nebo více předchozích nároků a/nebo její fyziologicky přijatelné soli.

   43. Sloučenina podle jednoho nebo více nároků 1 až 41 a/nebo její fyziologicky přijatelné soli 20 pro použití jako léčivo.

   44. Použití sloučeniny podle jednoho nebo více nároků 1 až 41 a/nebo jejích fyziologicky přijatelných solí pro přípravu léčiva pro léčení onemocnění, které souvisí se zvýšenou nebo nežádoucí syntézou základu membrán.

   45. Použití podle nároku 44, kde onemocněním jsou pozdní komplikace diabetů mel litu.

   46. Použití podle nároku 44, kde onemocněním je fibróza doprovázená zvýšenou syntézou základů membrán nebo jejich složek.

   47. Použití podle nároku 46, kde onemocněním je fibróza jater,

   48. Použití podle nároku 44, kde onemocněním je atheroskleróza.

   49. Použití podle nároku 44, kde onemocněním je rakovina.

   50. Použití podle nároku 44, kde onemocněním je diabetická retinopatie.

   51. Použití podle nároku 44, kde onemocněním je fibroplasia retrolentalis.

   52. Použití podle nároku 44, kde onemocnění souvisí se silnou zánětlivou složkou.

   53. Použití podle nároku 52, kde onemocněním je revmatoidní arthritida.

   54. Použití podle nároku 52, kde onemocněním je osteoarthritida.

   55. Použití podle nároku 52, kde onemocněním je vaskulitida.

   56. Použití podle nároku 44, kde onemocnění souvisí se hemangiomy,

   57. Použití podle nároku 44, kde onemocněním je psoriáza.

   výkresů _ /1^