WO2005082394A1 - インスリン受容体のリン酸化阻害剤 - Google Patents

インスリン受容体のリン酸化阻害剤 Download PDF

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WO2005082394A1
WO2005082394A1 PCT/JP2005/003559 JP2005003559W WO2005082394A1 WO 2005082394 A1 WO2005082394 A1 WO 2005082394A1 JP 2005003559 W JP2005003559 W JP 2005003559W WO 2005082394 A1 WO2005082394 A1 WO 2005082394A1
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lys
insulin receptor
peptide
seq
phosphorylation
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Application number
PCT/JP2005/003559
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshihiro Kuroda
Munetaka Hirose
Original Assignee
Amato Pharmaceutical Products, Ltd.
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Publication date
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • Insulin receptor phosphorylation inhibitors Insulin receptor phosphorylation inhibitors
  • the present invention relates to an insulin receptor phosphorylation inhibitor or a dephosphorylation of phosphorylated insulin receptor containing a peptide having an insulin receptor phosphorylation inhibitory activity or a phosphorylated insulin receptor dephosphorylation promoting activity.
  • Agent for example, an insulin receptor phosphorylation inhibitor or a dephosphorylation of phosphorylated insulin receptor containing a peptide having an insulin receptor phosphorylation inhibitory activity or a phosphorylated insulin receptor dephosphorylation promoting activity.
  • the insulin receptor is an a 2 j32 hetetetrameric glycoprotein with protein tyrosine kinase activity. Binding of insulin to the ⁇ -subunit activates tyrosine-specific phosphotransferase activity, which results in autophosphorylation of specific tyrosine residues in the ⁇ -subunit cytoplasmic domain.
  • the regions of autophosphorylation that are primarily responsible for the activation of phosphorylation of the substrate are located on the activation loop of the substrate at the tyrosine at position 115, the tyrosine at position 116, and the tyrosine at position 116 Consists of three tyrosine residues of tyrosine (CHERQUI, G.
  • Figure 1 shows the amino acid sequence of the activation loop.
  • 2 shows the comparison with the amino acid sequence of the III_IV linker of rat brain type IIA sodium channel.
  • the amino acid sequence between the 147-aspartic acid and the 146-lysine of the III-IV linker is the 1-aspartic acid of the insulin receptor activation loop.
  • lysines at positions 116 and 115 In the human skeletal muscle (hSkMl) sodium channel, phenylalanine at position 148 and glutamine at position 486 are replaced by leucine and lysine, respectively. Since lysine and arginine are both basic amino acids, the lysine residue matches the arginine at position 115 of the insulin receptor.
  • KI FMK acetyl-KI FMK-amide
  • EAHOLTZ G. et al., (1999) J. Gen. Physiol.
  • Insulin receptors phosphorylate their own tyrosine residues (autophosphorylation) in vivo, triggered by the binding of insulin, and at the same time phosphorylate tyrosine residues of various proteins that serve as substrates, thereby It is responsible for information transmission within.
  • the enzyme phosphatase controls signal transduction by dephosphorylating these phosphorylated tyrosine residues.
  • the present invention identifies a peptide having an insulin receptor phosphorylation inhibitory activity or a phosphorylated insulin receptor dephosphorylation promoting activity, and uses the peptide to inhibit the insulin receptor phosphorylation inhibitor or phosphorylation.
  • An object of the present invention was to provide a dephosphorylation promoter of an oxidized insulin receptor.
  • the present inventors have investigated in vitro the phosphorylation of insulin receptor] 3 subunits using various oligopeptides in vitro.
  • Lys-lie-Phe-Met-Lys SEQ ID NO: 1
  • Lys-Ile-Tyr-Glu-Lys SEQ ID NO: 2
  • Lys-lie-Gin-Met-Lys SEQ ID NO: 3
  • Asp -The amino acid sequence represented by lie-Tyr-Glu-Thr SEQ ID NO: 4
  • the peptide has an activity of inhibiting the phosphorylation of the insulin receptor or the activity of promoting the dephosphorylation of the phosphorylated insulin receptor.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • a phosphorylation inhibitor or a phosphorylated insulin receptor of an insulin receptor comprising a peptide of any of the following (a) or (b) or a pharmacologically acceptable salt thereof: Is provided.
  • (b) has an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, or added to the amino acid sequence described in (a) above, and inhibits phosphorylation of insulin receptor.
  • a peptide having an activity or a dephosphorylation promoting activity is a peptide having an activity or a dephosphorylation promoting activity.
  • an insulin receptor phosphorylation inhibitor that inhibits the phosphorylation of insulin receptor tyrosine by insulin is provided.
  • phosphorylation of an insulin receptor is characterized by using any one of the following peptides (a) or (b) or a pharmacologically acceptable salt thereof: Methods for inhibiting or promoting dephosphorylation of phosphorylated insulin receptor are provided.
  • Lys-lie-Phe-Met-Lys SEQ ID NO: 1
  • Lys-lie-Tyr-Glu-Lys SEQ ID NO: 2
  • Lys-lie-Gin-Met-Lys SEQ ID NO: 3
  • Asp- a peptide having an amino acid sequence represented by lie-Tyr-Glu-Thr SEQ ID NO: 4
  • (b) has an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, or added to the amino acid sequence described in (a) above, and inhibits phosphorylation of insulin receptor.
  • a peptide having an activity or a dephosphorylation promoting activity is described in (a) above.
  • Figure 1 shows the rat brain type IIA sodium channel III-IV linker (K1480-M1501)
  • 2 shows the amino acid sequence of the activation loop (G1149-L1170) of the human insulin receptor.
  • F1438 and Q1486 are replaced by Leu and Lys OiSkMl respectively by K1308).
  • Arrows indicate the similarity of the amino acids in the activation loops of the III-IV linker and the insulin receptor.
  • FIG. 2 shows in vitro phosphorylation of purified insulin receptor in the presence or absence of peptides (LPFFD, KIQMK, DIYET, KIFMK, KIYEK).
  • the purified insulin receptor was incubated with (or without) 100 nM insulin in buffer and with (or without) the peptide at 37 ° C for 10 minutes.
  • the four results for each peptide shown in the upper panel show a typical immunoblot.
  • Figure 3 shows the effect of synthetic peptides at different time points on insulin-stimulated tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in vitro.
  • Purified insulin receptor was incubated at 37 ° C for 0, 10, 20 or 30 minutes in a buffer containing 100 nM insulin. Each peptide was added to the sample for 20 or 30 minutes incubation 11 minutes after insulin stimulation.
  • the results shown in the upper panel show a typical immunoblot.
  • N 4 for each lane Best mode for carrying out the invention
  • the peptides used in the present invention are Lys-Ile-Phe-Met-Lvs (SEQ ID NO: 1), Amino acid represented by Lys-Ile-Tyr-Glu-Lys (SEQ ID NO: 2), Lys-lie-Gin-Met-Lys (SEQ ID NO: 3) or Asp-Ile-Tyr-Glu-Thr (SEQ ID NO: 4) It is a peptide having a sequence.
  • the peptide used in the present invention can be used as an insulin receptor phosphorylation inhibitor or a phosphorylated insulin receptor dephosphorylation accelerator. It is particularly preferred to use Lys-lie-Phe-Met-Lys (SEQ ID NO: 1) and Lys-Ile-Tyr-Glu-Lys (SEQ ID NO: 2) as phosphorylation inhibitors of the insulin receptor.
  • the peptide having the amino acid sequence represented by Lys-lie-Tyr-Glu-Lys (SEQ ID NO: 2) and Asp-lie-Tyr-Glu-Thr (SEQ ID NO: 4) can be dephosphorylated from phosphorylated insulin receptor. It can be used as a phosphorylation accelerator.
  • the peptide used in the present invention may have one or more amino acid sequences in the amino acid sequence as long as it has the activity of inhibiting the phosphorylation of the insulin receptor or the activity of promoting the dephosphorylation of the phosphorylated insulin receptor.
  • Amino acids may be substituted, deleted, inserted, or added.
  • the number of substitutions, deletions, insertions Z or amino acids added is not particularly limited, but is generally 1 to 5, preferably 1 to 4, and more preferably 1 to 4.
  • the number is particularly preferably 1 or 2.
  • conservative substitution is preferable, and specifically, substitution with an amino acid in parentheses below is mentioned.
  • the peptide used in the present invention may be modified.
  • modification refers to a modification of the structure of the amino acid itself constituting the peptide, a cross-linking between adjacent or non-adjacent amino acid residues in the peptide, a modification of a peptide bond, a modification of a peptide basic skeleton, a side chain function.
  • Specific examples of the modification include, for example, introduction of a functional group such as alkylation, esterification, halogenation, or amination, conversion of a functional group by oxidation, reduction, addition, or elimination, and sugar compound (monosaccharide, disaccharide).
  • Sugars, oligosaccharides, or polysaccharides) or lipid compounds, Phosphorylation or biotinylation can be mentioned, but is not limited to these.
  • a peptide or a modified peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added has an inhibitory activity on insulin receptor phosphorylation or Whether the phosphorylated insulin receptor has the activity of promoting dephosphorylation can be determined by the test method described in detail and specifically in the Examples of the present specification, or by appropriately modifying or modifying the above test method. It can be easily confirmed by those skilled in the art.
  • the salt of the peptide used in the present invention may be any pharmacologically acceptable acid addition salt or salt addition salt.
  • the acid (inorganic acid and organic acid) addition salts include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid or nitric acid, or acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, and maleic acid
  • salts with organic acids such as succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid, aspartic acid or glutamic acid.
  • Bases inorganic bases and organic bases
  • addition salts include salts with inorganic bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide or magnesium hydroxide, or caffeine, piperidine, trimethyla. Salts with organic bases such as min, triethylamine, pyridine or lysine are mentioned.
  • Salts can be prepared using a suitable acid such as hydrochloric acid, or a suitable base such as sodium hydroxide.
  • a suitable acid such as hydrochloric acid
  • a suitable base such as sodium hydroxide.
  • it can be prepared by treating with water or a liquid containing an inert water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol or dioxane using a standard protocol.
  • the processing temperature is usually
  • the temperature is 0 to 10 ° C., preferably room temperature.
  • the peptide or its salt used in the present invention can be synthesized by a conventional method of synthesizing the peptide.
  • a conventional method of synthesizing the peptide For example, an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, a carboimidazole method, an acid-reduction method and the like can be mentioned.
  • an azide method an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, a carboimidazole method, an acid-reduction method and the like can be mentioned.
  • solid-phase synthesis or liquid-phase synthesis is used.
  • the desired peptide or its salt is synthesized by condensing an amino acid capable of constituting the peptide or its salt with the remaining portion and, if the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • the peptide or its salt can be purified by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like.
  • the peptide or its salt usually has a carboxyl
  • R in the ester includes an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, an aryl group having 6 to 12 carbon atoms, and an aralkyl group having 7 to 12 carbon atoms.
  • the peptides or salts thereof used in the present invention include those in which the N-terminal amino group is protected with a protecting group, and those having a sugar chain bonded thereto, such as complex peptides.
  • a gene encoding the amino acid sequence of the peptide is used to recompose in a host such as a microbial cell, a plant cell, or an animal cell by a genetic engineering technique. Production method as protein (peptide).
  • an oligonucleotide encoding a desired amino acid sequence is synthesized by a conventional method, assembled by a PCR method or the like, and then introduced into an appropriate expression vector.
  • an appropriate host cell is transformed with the expression vector.
  • peptides are produced in a culture solution or host cells.
  • nucleotide sequence encoding FLAG peptide human immunoglobulin constant region is added to peptide coding nucleotide sequence to facilitate isolation and purification of the produced peptide or to increase stability Then, this may be expressed.
  • any expression system eukaryotic cell, eg, animal cell, eg, established mammalian cell line, fungal cell, and yeast cell, and prokaryotic cell, eg, bacterial cell, eg, E. coli cell, etc.
  • the peptides used in the present invention are expressed in mammalian cells, such as COS cells, CH0 cells.
  • conventional promoters useful for expression in mammalian cells can be used. For example, it kills mosquitoes 3 ⁇ 4 possible to use human cytomegalovirus early promoter (human cytomega ⁇ ovirus immediate early promoter).
  • promoters for gene expression in mammalian cells include viral promoters and human polypeptides such as retroviruses, polioviruses, adenoviruses, and simian virus 40 (SV40).
  • a mammalian cell-derived promoter such as elongation factor-la (HEF-1 ⁇ ) may be used.
  • the peptide can be purified according to a conventional method.For example, it can be purified using a method used for normal protein or peptide purification, such as gel filtration, reverse-phase ⁇ PLC, and ion-exchange power lamb purification. .
  • the peptide used in the present invention has an insulin receptor phosphorylation inhibitory activity or a phosphorylated insulin receptor dephosphorylation promoting activity, and can be administered to mammals such as humans. It is effective for treating or preventing cancer and the like.
  • the peptide used in the present invention can be used as it is or in the form of being contained in various solid carriers, liquid carriers, emulsifying dispersants and the like usually used in the field of pharmaceutical production.
  • its formulation can be appropriately selected according to the purpose of use and the intended use. Examples thereof include tablets, pills, It can be used in the form of powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories, injections (solutions, suspensions, etc.).
  • Carriers used for tablet formation include excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbide, kaolin, crystalline cellulose, and cayic acid, and water or alcohols.
  • Starch, gelatin, power Binders such as sodium propyloxymethylcellulose (CMC-Na), methylcellulose (MC), hydroxypropylcellulose (HPC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone, dried starch, agar powder, laminaran powder, Sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose, etc., disintegrants, sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil sugar disintegration controlling agents, Adsorbents such as quaternary ammonium base, lauryl sulfate night, and colloidal
  • the liquid preparation, emulsion and suspension are preferably sterilized and isotonic with blood and blood.
  • water, ethyl alcohol are used as diluents.
  • Suspending agents such as cellulose, sodium alginate, aluminum monostearate, etc., tonicity agents such as sodium chloride, dextrose, glycerin, etc., preservatives such as paraoxybenzoates, benzyl alcohol, chlorobutanol, etc.
  • tonicity agents such as sodium chloride, dextrose, glycerin, etc.
  • preservatives such as paraoxybenzoates, benzyl alcohol, chlorobutanol, etc.
  • Auxiliaries, buffers, soothing agents and the like can also be used in combination.
  • composition of each of the above forms may further contain, if necessary, commonly used coloring agents, flavors, flavors, sweeteners, etc., and may contain other active pharmaceutical ingredients. I do not care.
  • the peptide When the peptide is used as a pharmaceutical composition, the peptide is generally used in a proportion of 0.001 to 90% by weight, preferably 0.001 to 80% by weight. I do.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals including humans. Administration route May be administered orally or parenterally.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention should be appropriately adjusted according to conditions such as the age, sex, body weight, symptoms, and administration route of the patient. Per day g from 1, OO Omg
  • the above dose may be administered once a day or divided into several times a day.
  • the administration period and the administration interval are not particularly limited, and the administration may be carried out every day or every several days.
  • Anti-phosphotyrosine antibody (4G10) was obtained from Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Insulin receptor, insulin and ATP from rat liver purified by affinity chromatography of wheat germ agglutinin were purchased from Sigma Chemical Co. (St Louise, MO, USA).
  • the peptide was automatically synthesized by a solid phase method using the Fmoc method on an Applied Biosystems 433A peptide synthesizer, and the N-terminus was acetylated (indicated by Ac—) and the C-terminus was amidated (indicated by NH 2 ). After cleavage with TFA, the peptide was eluted with a gradient of 90% solvent A / 10% solvent B to 60% solvent AZ 40% solvent B (where solvent A was a 0.1% aqueous trifluoroacetic acid solution and solvent B was 0% (1% TFA in acetonitrile) for 30 min on a reverse phase C18 HP LC column. Peptides were measured by ion spray mass spectrum analysis on a Perkin-Elmer SCIEX API III mass spectrometer.
  • Purified insulin receptor (l ⁇ ug protein) is combined with ⁇ ⁇ ⁇ insulin at 37 ° C for 10 minutes, 50 ⁇ l of incubation buffer (50 mM HEPES, pH 7.4, 125 mM NaCl, lmM EDTA, lOmM Phosphorylation in MgCl 2> 5 mM MnCl 2 , 5 mM dithiothreitol, lmM phenylmethylsulfonyl fluoride, and 0.2 mM ATP).
  • Peptides (LPFFD, KIQMK, DIYET, KIFMK, and KIYEK; 0.04, 0.4 or 4 mM, respectively) were also added prior to incubation. After incubation, a sample for SDS-PAGE was prepared by adding Laemmli sample buffer and boiling for 5 minutes, and Western blot analysis was performed using an anti-phosphotyrosine antibody.
  • Purified insulin receptor (1 ⁇ g protein) was incubated at 37 ° C. in incubation buffer for 0, 10, 20, or 30 minutes. Insulin (100 nM) was added to all samples at 0 minutes. The reaction was stopped by adding Laemmli sample buffer 0 or 10 minutes after insulin stimulation into the sample designed for 0 or 10 minutes incubation.
  • the maximum level of tyrosine phosphorylation of the insulin receptor reached 10 minutes after insulin stimulation and was maintained for at least 30 minutes in the incubation buffer. Therefore, the insulin-stimulated response of the insulin receptor after 100 minutes was considered to be 100%.
  • the maximum level of tyrosine phosphorylation was reduced when mash was added 11 minutes after stimulation (Fig. 3).
  • KIQMK and KIFMK were less effective at reducing tyrosine phosphorylation levels.
  • the two peptides, KIYEK and DIYET almost completely restored the increased insulin receptor phosphorylation when observed after 10 minutes.
  • LPFFD did not affect insulin-stimulated autophosphorylation.
  • KIYEK and DIYET containing the IYE sequence present on the activation loop of the insulin receptor have a dephosphorylating effect on the autophosphorylated insulin receptor.
  • KIFMK which contains the IFM sequence in the III-IV linker of the sodium channel, effectively suppresses autophosphorylation, but dephosphorylates the autophosphorylated insulin receptor. Is weak. The difference in dephosphorylation between KIYEK and KIFMK may be due to the molecular mechanism of dephosphorylation. Since DIYET was also able to dephosphorylate phosphorylated residues, the IYE (Ile-Tyr-Glu) sequence is considered to be important for dephosphorylation. Industrial applicability
  • a phosphorylation inhibitor of an insulin receptor containing a peptide having an insulin receptor phosphorylation inhibitory activity or a phosphorylated insulin receptor dephosphorylation promoting activity or dephosphorylation of a phosphorylated insulin receptor is provided.
  • Agent can be provided.
  • the phosphorylation inhibitor of the insulin receptor or the dephosphorylation promoter of the phosphorylated insulin receptor of the present invention is useful as a medicine and an experimental reagent.

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Abstract

　本発明の目的は、インスリン受容体のリン酸化阻害活性又はリン酸化インスリン受容体の脱リン酸化促進活性を有するペプチドを同定し、該ペプチドを利用したインスリン受容体のリン酸化阻害剤又はリン酸化インスリン受容体の脱リン酸化促進剤を提供することである。本発明によれば、下記の（ａ）又は（ｂ）の何れかのペプチド又はその薬理学的に許容される塩を含む、インスリン受容体のリン酸化阻害剤又はリン酸化インスリン受容体の脱リン酸化促進剤が提供される。（ａ）Lys-Ile-Phe-Met-Lys（配列番号１）、Lys-Ile-Tyr-Glu-Lys（配列番号２）、Lys-Ile-Gln-Met-Lys（配列番号３）又はAsp-Ile-Tyr-Glu-Thr（配列番号４）で表されるアミノ酸配列を有するペプチド；又は、（ｂ）上記（ａ）に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／又は付加されているアミノ酸配列を有し、インスリン受容体のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化促進活性を有するペプチド。

Description

明細書
インスリン受容体のリン酸化阻害剤 技術分野
本発明は、 インスリン受容体のリン酸化阻害活性又はリン酸化ィンスリン受容 体の脱リン酸化促進活性を有するぺプチドを含むィンスリン受容体のリン酸化阻 害剤又はリン酸化ィンスリン受容体の脱リン酸化促進剤に関する。 背景技術
インスリン受容体は、 タンパク質チロシンキナーゼ活性を有する a 2 j3 2へテ 口 4量体糖タンパク質である。 αサブユニットにインスリンが結合すると、 チロ シン特異的ホスホトランスフェラーゼ活性が活性化され、 これにより、 βサブュ ニットの細胞質ドメイン中の特異的チロシン残基が自己リン酸化される。 基質の リン酸化の活性化の主な原因となる自己リン酸化の領域は、 サブュニットの活 性化ループ上の 1 1 5 8番目のチロシン、 1 1 6 2番目のチロシン及び 1 1 6 3 番目のチロシンの 3個のチロシン残基から構成される （CHERQUI, G. et al. , (1990) J. Biol. Chem. , 265, 21254-21261、 MURAKAMI, M. S. & ROSEN, 0. M. (1991) J. Biol. Chem. , 266, 22653-22660、 及び ZHANG, B. et al. , (1991) J. Biol. Chem. , 266, 990-996) 0 図 1に、 活性化ループのアミノ酸配列と、 ラット脳の I I A型 ナトリゥムチャンネルの I I I _ I Vリンカーのアミノ酸配列との比較を示す。 意外なことに、 I I I一 I Vリンカ一の 1 4 8 7番目のァスパラギン酸と 1 4 9 6番目のリジンの間のァミノ酸配列は、 インスリン受容体活性化ループの 1 1 5 6番目のァスパラギン酸と 1 1 6 5番目のリジンの間の配列と類似している。 ヒ ト骨格筋 （h S k M l ) ナトリウムチャンネルでは、 1 4 8 3番目のフエニルァ ラニンと 1 4 8 6番目のグルタミンが各々ロイシンとリジンに置換されている。 リジン及ぴアルギニンは共に塩基性ァミノ酸なので、 リジン残基はィンスリン受 容体の 1 1 5 5番目のアルギニンと合致する。 合成ペプチドである K I FMK (ァセチルー K I FMK—アミド） は、 欠損し た不活性化ゲートを有する変異体ナトリゥムチャンネルに対する急速な不活性化 を回復 させる こ と が知 られてい る （ EAH0LTZ，G. et al. , (1994) Neuron, 12， 1041— 1048 )。 EAHOLTZ, G. et al. , (1999) J. Gen. Physiol. 113， 279-293には、 N末端及び C末端のリジン残基並びに正確な lie— Phe— Met配列 が急速な不活性化を回復するのに重要な決定因子であることが示されている。 K I FMKは I I I— I Vリンカ一の 1 4 8 7番目のァスパラギン酸と 1 4 9 6番 目のリジンの間に結合すると考えられている（KUYODA, Y. et al. , (1999) Biophys. J. , 77， 1363-1373) o これらの知見から、 K I FMKはインスリン受容体活性化 ループの 1 1 5 6番目のァスパラギン酸と 1 1 6 5番目のリジンの間に結合する ことが推察される。 し力 しながら、 アミノ酸配列 K I FMKから成るペプチドが インスリンシグナル伝達に及ぼす影響については不明であった。 発明の開示
インスリン受容体は、 生体内においてインスリンの結合を引き金として自身の チロシン残基をリン酸化する （自己リン酸化） と同時に、 基質となる種々の蛋白 質のチロシン残基をリン酸化することによって、 細胞内の情報伝達を担う。 酵素 ホスファターゼは、 これらのリン酸化されたチロシン残基を脱リン酸化すること により情報伝達をコントロールしている。 本発明は、 インスリン受容体のリン酸 化阻害活性又はリン酸化ィンスリン受容体の脱リン酸化促進活性を有するぺプチ ドを同定し、 該ぺプチドを利用したィンスリン受容体のリン酸化阻害剤又はリン 酸化ィンスリン受容体の脱リン酸化促進剤を提供することを解決すべき課題とし た。
本発明者らは、 各種オリゴペプチドを用いて、 インスリン受容体] 3サブュニッ トのチ口シンリン酸化をインビトロで調べた。 その結果、 Lys- lie- Phe- Met- Lys (配列番号 1 )、 Lys-Ile-Tyr-Glu-Lys (配列番号 2 )、 Lys- lie- Gin- Met- Lys (配 列番号 3 ) 又は Asp- lie- Tyr - Glu- Thr (配列番号 4 ) で表されるアミノ酸配列を 有するぺプチドが、 インスリン受容体のリン酸化阻害活性又はリン酸化ィンスリ ン受容体の脱リン酸化促進活性を有することを見出した。 本発明はこれらの知見 に基づいて完成したものである。
即ち、 本発明によれば、 下記の （a ) 又は （b ) の何れかのペプチド又はその 薬理学的に許容される塩を含む、 インスリン受容体のリン酸化阻害剤又はリン酸 化ィンスリン受容体の脱リン酸化促進剤が提供される。
( a ) Lys-Ile-Phe-Met-Lys (配列番号 1 )、 Lys- lie- Tyr- Glu- Lys (配列番号 2 )、 Lys-Ile- Gin- Met- Lys (配列番号 3 ) 又は Asp- lie- Tyr- Glu- Thr (配列番号 4 ) で表されるアミノ酸配列を有するペプチド；又は、
( b )上記（ a )に記載のァミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ酸が置換、 欠失、 挿入おょぴ Z又は付加されているアミノ酸配列を有し、 インスリン受容体 のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化促進活性を有するぺプチド。
好ましくは、 インスリンによるインスリン受容体のチロシンのリン酸化を阻害 するインスリン受容体のリン酸化阻害剤が提供される。
本発明の別の側面によれば、 下記の （a ) 又は （b ) の何れかのペプチド又は その薬理学的に許容される塩を用いることを特徴とする、 インスリン受容体のリ ン酸化を阻害する方法又はリン酸化インスリン受容体の脱リン酸化を促進する方 法が提供される。
( a ) Lys- lie- Phe- Met- Lys (配列番号 1 )、 Lys- lie- Tyr- Glu- Lys (配列番号 2 )、 Lys- lie- Gin- Met- Lys (配列番号 3 ) 又は Asp- lie- Tyr- Glu- Thr (配列番号 4 ) で表されるアミノ酸配列を有するペプチド；又は、
( b )上記（ a )に記載のァミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ酸が置換、 欠失、 挿入おょぴ Z又は付加されているアミノ酸配列を有し、 インスリン受容体 のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化促進活性を有するぺプチド。 図面の簡単な説明
図 1は、ラット脳 IIA型ナトリゥムチャンネルの III- IVリンカー（K1480- M1501)、 並びにヒ トインスリン受容体の活性化ループ （G1149-L1170) のアミノ酸配列を 示す。 ヒト骨格筋 （hSkMl) ナトリウムチャンネルでは、 F1438及び Q1486がそれ ぞれ Leu及ぴ Lys OiSkMlでは K1308)に置換されている。 III- IVリンカー及ぴィ ンスリン受容体の活性化ループのァミノ酸の類似性を矢印で示す。
図 2は、 ペプチド （LPFFD、 KIQMK、 DIYET、 KIFMK、 KIYEK) の存在下又は非存 在下における精製ィンスリン受容体のインビトロリン酸化を示す。 精製ィンスリ ン受容体は緩衝液中で 1 0 0 nMのインスリンと共に（又はなしで）、かつ上記ぺ プチドと共に （又はなしで）、 3 7 °Cで 1 0分間インキュベートした。上段のパネ ルに示した各ぺプチドの 4個の結果は、 典型的なィムノブロットを示す。
氺 P < 0 . 0 5
氺氺 P < 0 . 0 1
(ペプチドなしでのインスリン刺激したチロシンリン酸化に対して）
各レーンにつき n = 4
図 3は、 インスリン受容体のインビトロでインスリンで刺激されたチロシンリ ン酸化に対する合成べプチドの異なる時点での効果を示す。 精製ィンスリン受容 体は、 1 0 0 n Mのインスリンを含む緩衝液中で 3 7 °Cで 0、 1 0、 2 0又は 3 0分間インキュベートした。 各ペプチドは、 2 0又は 3 0分間のインキュベーシ ョンの試料中にィンスリン刺激の 1 1分後に添カ卩した。 上段のパネルに示した結 果は、 典型的なィムノブロットを示す。
氺氺 P < 0 . 0 1
( 1 0分間のインキュベーション時におけるインスリンで刺激されたチ口シンリ ン酸化に対して）
各レーンにつき n = 4 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について具体的に説明する。
本発明で用いるぺプチドは、 Lys-Ile-Phe-Met- Lvs (配列番号 1 )、 Lys-Ile-Tyr-Glu-Lys (配列番号 2 )、 Lys- lie- Gin- Met- Lys (配列番号 3 ) 又は Asp-Ile-Tyr-Glu-Thr (配列番号 4 ) で表されるァミノ酸配列を有するペプチド である。
本発明で用いるぺプチドは、 インスリン受容体のリン酸化阻害剤又はリン酸化 インスリン受容体の脱リン酸化促進剤として使用することができる。 特に好まし くは、 Lys- lie- Phe- Met- Lys (配列番号 1 ) 及び Lys-Ile- Tyr- Glu- Lys (配列番 号 2 ) をインスリン受容体のリン酸化阻害剤として使用することができ、 Lys- lie- Tyr- Glu- Lys (配列番号 2 ) 及ぴ Asp- lie- Tyr- Glu- Thr (配列番号 4 ) で表されるアミノ酸配列を有するぺプチドをリン酸化ィンスリン受容体の脱リン 酸化促進剤として使用することができる。
本発明で用いるぺプチドは、 インスリン受容体のリン酸ィ匕阻害活性又はリン酸 化インスリン受容体の脱リン酸化促進活性を有することができる限り、 上記アミ ノ酸配列中に 1又は複数個のァミノ酸が置換、 欠失、 挿入おょぴ Z又は付加され ていてもよい。 置換、 欠失、 挿入おょぴ Zまたは付加されるアミノ酸の個数は特 に限定されないが、 一般的には 1〜 5個であり、 好ましくは 1〜4個であり、 さ らに好ましくは 1〜3個であり、 特に好ましくは 1又は 2個である。 なお、 アミ ノ酸置換の例としては、 保存的置換が好ましく、 具体的には以下の括弧内のアミ ノ酸による置換が挙げられる。 （グリシン、ァラニン） （パリン、 イソロイシン、 ロイシン） （ァスパラギン酸、 グルタミン酸） （ァスパラギン、 グルタミン） （セリ ン、 トレオニン） （リジン、 アルギニン） （フエ二ルァラニン、 チロシン）。
本発明で用いるペプチドは修飾されていてもよい。 ここで修飾とは、 ペプチド を構成するアミノ酸自体の構造の修飾、 ペプチド中の隣接する、 または隣接しな いアミノ酸残基間での架橋、 ペプチド結合の修飾、 ペプチド基本骨格の修飾、 側 鎖官能基の導入、 環状化、 スぺーサー （s p a c e r ) の導入等が挙げられる。 修飾の具体例としては、 例えば、 アルキル化、 エステル化、 ハロゲン化、 又はァ ミノ化などの官能基導入、 酸化、 還元、 付加、 又は脱離などによる官能基変換、 糖化合物 （単糖、 二糖、 オリゴ糖、 若しくは多糖） 又は脂質化合物などの導入、 リン酸化、 あるいはビォチン化などを挙げることができるが、 これらに限定され ることはない。
上記したようなァミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ酸が置換、 欠失、 挿入及びノ又は付加したァミノ酸配列を有するぺプチド、 又は修飾べプチドが、 インスリン受容体のリン酸化阻害活性又はリン酸化ィンスリン受容体の脱リン酸 化促進活性を有するかどうかは、 本明細書の実施例に詳細かつ具体的に記載した 試験方法によって、 又は上記試験方法に適宜の改変や修飾を加えることにより、 当業者が容易に確認可能である。
本発明で用いるペプチドの塩としては、 薬理学上許容される酸付加塩おょぴ塩 基付加塩であればいずれであってもよい。 酸 （無機酸および有機酸） 付加塩とし ては、 例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸又は硝酸などの無機酸との塩、 あるいは酢酸、 ギ酸、プロピオン酸、 フマル酸、マレイン酸、 コハク酸、酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、 トルエンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 ァスパラギン酸又はグルタミン酸などの有機酸との塩が挙 げられる。 塩基 （無機塩基および有機塩基） 付加塩としては、 例えば、 水酸化ナ トリウム、 水酸化力リウム、 水酸化アンモニゥム又は水酸化マグネシウムなどの 無機塩基との塩、 あるいはカフェイン、 ピぺリジン、 トリメチルァミン、 トリエ チルァミン、 ピリジン又はリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
塩は、 塩酸などの適切な酸、 あるいは水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用 いて調製することができる。 例えば、 水中、 又はメタノール、 エタノール若しく はジォキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、 標準的なプロト コルを用いて処理することにより調製することができる。 なお、 '処理温度は通常
0〜1 0 o °cであるが、 室温が好ましい。
本発明で用いるぺプチド又はその塩の化学合成を行う場合は、 ぺプチドの合成 の常法手段によって合成できる。 例えば、 アジド法、 酸クロライド法、 酸無水物 法、 混合酸無水物法、 DCC法、 活性エステル法、 カルボイミダゾール法、 酸ィ匕還 元法等が挙げられる。 また、 その合成は、 固相合成法及び液相合成法のいずれを も適用することができる。 すなわち、 ペプチド又はその塩を構成し得るアミノ酸 と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離すること により目的とするペプチド又はその塩が合成される。 縮合方法や保護基の脱離と しては、 公知のいずれの手法を用いてもよい [例えば Bodanszky, M and M. A. Ondetti, Pept i deSynthe sis, Interscience Publishers, New York (1966)、 Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)、 泉 屋信夫他， ペプチド合成の基礎と実験， 丸善 (1975)等を参照]。 - 反応後は、 通常の精製法、 例えば溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラフィー、 液体ク口マトグラフィー、 再結晶などを組み合わせてぺプチド又はその塩を精製 することができる。 また、 ペプチド又はその塩は、 C末端が通常カルボキシル
(-C00H) 基又はカルボキシレート（- C00— )であるが、 C末端がアミド（- C0NH2)又は エステル (-C00R)であってもよい。 ここで、 エステルにおける Rとしては、 炭素数 1〜12のアルキル基、 炭素数 3〜10のシクロアルキル基、 炭素 6〜12のァリール 基、 炭素数 7〜12のァラルキル基などが挙げられる。 さらに、 本発明で用いるぺ プチド又はその塩には、 N末端のァミノ基が保護基で保護されているもの、 ある いは糖鎖が結合した糖ぺプチドなどの複合ぺプチド等も含まれる。
本発明で用いるぺプチドの別の製造方法としては、 当該べプチドのァミノ酸配 列をコードする遺伝子を利用して、 遺伝子工学的手法により微生物細胞、 植物細 胞、 動物細胞などの宿主において組み換えタンパク質 （ペプチド） として生産す る方法が挙げられる。
例えば、 所望のァミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを常法により合 成し、 PCR法等によりアセンブリした後、これを適当な発現ベクターに導入する。 次いで、 発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換する。 得られた形質転換細胞 を適当な条件で培養することにより、 培養液中あるいは宿主細胞中にぺプチドが 産生される。 産生されるペプチドの単離、 精製を容易にし、 あるいは安定性を増 大させるためにぺプチドをコ一ドする塩基配列に、 FLAGぺプチドゃヒト免疫グロ ブリン定常領域をコードする塩基配列を付加して、 これを発現させてもよい。 本 発明で用いるペプチドの製造のために任意の発現系、真核細胞例えば、動物細胞、 例えば樹立された哺乳類細胞系、 真菌細胞、 および酵母細胞、 並びに原核細胞例 えば、 細菌細胞例えば、 大腸菌細胞等を使用することができる。 好ましくは、 本 発明で用いるペプチドは哺乳類細胞、 例えば、 COS細胞、 CH0細胞中で発現され る。 これらの場合、 哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用 いることができる。例えば、 ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター（human cytomega丄 ovirus immediate early promoter) を使用することカ¾ きる。 その他 に本発明のために使用することができる哺乳類細胞における遺伝子発現のプ口モ 一ターとしてはレトロウイルス、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 シミア ンウィルス 40 (SV40) などのウィルスプロモーターゃヒ トポリペプチドェロンゲ ーシヨンファクタ- l a (HEF-1 α ) などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用 いればよい。
ペプチドは通常の方法に従い精製することができ、 例えば、 ゲル濾過、 逆相 Η P L C、 ィオン交換力ラム精製など通常のタンパク質又はべプチド精製に用いら れる手段を用いて精製することが可能である。
本発明で用いるペプチドは、 インスリン受容体のリン酸化阻害活性、 又はリン 酸化インスリン受容体の脱リン酸化促進活性を有し、 ヒトをはじめとする哺乳動 物に投与することができ、 例えば、 各種の癌等の治療又は予防に有効である。 本発明で用いるぺプチドは、 そのままで又は医薬製造分野で通常使用される各 種の固体担体、液体担体、乳化分散剤等に含有させた形で使用することができる。 具体的には、 本発明で用いるペプチドを医薬組成物形態で使用する場合には、 そ の製剤形態は、 使用目的や使用対象に応じて適宜選択することができ、 例えば、 錠剤、 丸剤、 散剤、液剤、 懸濁剤、 乳剤、顆粒剤、 カプセル剤、 坐剤、 注射剤 （液 剤、 懸濁剤等） 等の形態で用いることができる。
また、 錠剤形成に際して使用する担体としては、 例えば乳糖、 白糖、 塩化ナト リウム、 ブドウ糖、 尿素、 デンプン、 炭化カルシウム、 カオリン、 結晶セルロー ス、 ケィ酸等の賦形剤、 水又はアルコール類を含ませたデンプン、 ゼラチン、 力 ルポキシメチルセルロースナトリウム （CMC- Na) 、 メチルセルロース （MC) 、 ヒ ドロキシプロピルセルロース （HPC) 、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース (HPMC)、 リン酸カルシウム、ポリビニルピロリ ドン等の結合剤、乾燥デンプン、 寒天末、 ラミナラン末、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸カルシウム、 ポリオキシェチ レンソルビタン脂肪酸エステル類、 ラウリル硫酸ナトリウム、 ステアリン酸モノ グリセリ ド、 デンプン、 乳糖等の崩壊剤、 白糖、 ステアリン、 カカオバター、 水 素添加油糖の崩壌制御剤、 第 4級アンモ-ゥム塩基、 ラウリル硫酸ナイト、 コロ イド状ケィ酸等の吸着剤、 精製タルク、 ステアリン酸塩、 ホウ酸末、 ポリエチレ ングリコール等の滑沢剤等を使用することができる。 さらに錠剤は必要に応じて 通常の剤皮を； ¾した錠剤、 例えば糖皮錠、 ゼラチン被包錠、 腸溶皮膜フィルムコ 一ティング錠又は二重錠、 多層錠とすることができる。
またペプチドを注射剤として調製する場合には、 液剤、 乳剤及び懸濁剤は殺菌 され、 かっ血液と等張であることが好ましく、 これらの形態に成形するに際して は、 希釈剤として水、 エチルアルコール、 プロピレングリコール、 エトキシ化ィ ソステアリルアルコール、 ポリオキシ化イソステアリルアルコール、 ポリオキシ エチレンソルビタン脂肪酸ェステル類等を使用することができ、 また必要に応じ て亜硫酸水素ナトリウム、 ピロ亜硫酸ナトリゥム等の安定剤、 カルボキシメチル セルロース、 アルギン酸ナトリウム、 モノステアリン酸アルミニウム等の懸濁化 剤、 塩化ナトリウム、 ブドウ糖、 グリセリン等の等張化剤、 パラォキシ安息香酸 エステル類、 ベンジルアルコール、 クロロブタノール等の保存剤のほか、 溶液捕 助剤、 緩衝剤、 無痛化剤等を配合して使用することもできる。
上記各形態の医薬組成物の中には、 さらに必要に応じて慣用されている着色剤、 香料、 風味剤、 甘味剤等を配合することができ、 また他の医薬品有効成分を含有 させても構わない。
ぺプチドを医薬糸且成物として用いる場合、 該ぺプチドを一般的には 0 . 0 0 1 〜9 0重量％、好ましくは 0 . 0 0 1〜8 0重量％の割合で包含させて使用する。 本発明の医薬組成物はヒトを含む哺乳動物に投与することができる。 投与経路 は経口投与でも非経口投与でもよい。本発明の医薬組成物の投与量は患者の年齢、 性別、 体重、 症状、 及ぴ投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきである が、 一般的には、 有効成分量として成人一日あたり
Figure imgf000011_0001
gから 1， O O Omg
j
/k g程度の範囲であり、 好ましくは 10 μ g/k gから 10 Omg/k g程度の 範囲である。 上記投与量は一日一回投与しても一日に数回に分けて投与してもよ い。 また投与期間及ぴ投与間隔も特に限定されず、 毎日投与してもよいしあるい は数日間隔で投与してもよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されるものではない。 実施例
(A) 方法
(1) 材料
抗ホスホチロシン抗体 (4G10) は Upstate Biotechnology社 (Lake Placid, NY, USA) から入手した。 小麦胚凝集素のァフィ二ティクロマトグラフィーにより精 製したラット肝臓由来のインスリン受容体、 インスリン及び ATP は、 Sigma Chemical Co. (St Louise, MO, USA) から購入した。
(2) ペプチドの合成及び精製
ペプチドは、 Applied Biosystems 433Aペプチド合成機で F m o c法により固 相法で自動合成し、 N末端はァセチル化し （Ac—で示す）、 C末端はアミ ド化し た （NH2で示す)。 TFAで切断後、 ペプチドは、 90%溶剤 A/10%溶剤 B から 60 %溶剤 AZ 40 %溶剤 Bの勾配 （ここで、 溶剤 Aは 0. 1 %トリフルォ 口酢酸水溶液であり、 溶剤 Bは 0. 1%TFAのァセトニトリル溶液である） を 用いて 30分間、逆相 C18HP LCカラムで精製した。ぺプチドは、 Perkin- Elmer SCIEX API III質量スぺクトロメーターでイオンスプレー質量スぺクトル分析に より測定した。
KIFMK, Ac- KIFMK- NH2: m/z calcd 706.42 (monoisotope) , 706.95(av. ) found 707.0 (MH+)；
KIYEK, Ac— KIYEK— NH2: m/z calcd 720.42 (monoisotope) , 720.87 (av.) found 721.0 (MH+)；
KIQMK, Ac-KIQMK-NH2: m/z calcd 687.41 (monoisotope), 687.91(av. ) found 688.0 (MH+)；
DIYET, Ac - DIYET- NH2: m/z calcd 680.30 (monoisotope), 680.71(av. ) found 680.5 (MH+)；
LPFFD, Ac-LPFFD-NH2: m/z calcd 678.34 (monoisotope), 678.79 (av. ) found 680.0 (MH+);
( 3 ) ぺプチドの存在下でのィンスリン受容体のインビトロリン酸化
精製したインスリン受容体 （l ^u gタンパク質） を、 Ι Ο ΟηΜのインスリン と一緒に 37°Cで 10分間、 50 μ 1のインキュベーション緩衝液 (50mM HEPES, pH7.4, 125mM NaCl, lmM EDTA, lOmM MgCl2> 5mM MnCl2, 5mMジチオスレィ トー ル、 lmMフエ二ルメチルスルホニルフルオリ ド、 及ぴ 0.2mMの ATP) 中において リン酸化した。 ペプチド （LPFFD、 KIQMK, DIYET, KIFMK、 及び KIYEK；それぞれ 0.04、 0.4または 4mM) もインキュベーション前に添加した。 インキュベーショ ン後、 Laemmli試料緩衝液を追加し、 5分間煮沸することによって、 SDS- PAGE用 の試料を調製し、 抗ホスホチロシン抗体を用いてウェスタンブロット分析を行つ た。
(4) インスリン受容体のリン酸ィヒチロシン残基に及ぼすぺプチドの影響につい てのインビトロ解析
精製したインスリン受容体 （タンパク質 1 x g) をインキュベーション緩衝液 中で 37°Cで 0、 10、 20又は 30分間インキュベートした。 インスリン （1 00 nM) を全試料に 0分の時点で添加した。 0又は 10分のインキュベーショ ン用に計画した試料中に、 インスリン刺激の 0または 10分後に Laemmli試料緩 衝液を添加することによって、 反応を停止させた。
20分間又は 30分間のインキュベーション用の試料には、 4 mMの合成ぺプ チド （LPFFD、 KIQMK, DIYET、 KIFMK、 KIYEK) をインスリン刺激の 1 1分後に添 加し、 Lae脑 li試料緩衝液をィンスリン刺激の 2 0分後又は 3 0分後に添加し、 反応を停止した。 全ての試料を 5分間煮沸し、 抗ホスホチロシン抗体を用いてゥ エスタンブロット分析を行った。
( 5 ) 統計分析
データは SPSS (SPSS社、 Chicago, IL， USA) を用いて Turkey post hoc分析 により分散の一方向分析により解析した。 統計的有意差は、 pく 0 . 0 5レベル で確立した。 全ての値は平均土 SDで示す。
(B ) 結果
( 1 ) インビト口における各種べプチドによるインスリン受容体のインスリン刺 激チ口シンリン酸化の阻害
1 0分間ぺプチドなしでのィンスリン受容体のィンスリンに刺激された応答を コント口ールとし、これを 1 0 0 %とした。 KIFMKおよぴ KIYEKは共に 4 mMで、 インスリン受容体のィンスリンで刺激された自己リン酸化の完全な抑制を誘導し た （図 2 )。 0 . 4 mMの KIFMKおよび KIYEKは自己リン酸化の有意な抑制を示 したが、 同濃度の KIQMKおよび DIYETはいずれも自己リン酸ィ匕の抑制を誘導しな かった （図 2 )。 しかしながら、 4 mMの KIQMKおよび DIYETはリン酸化の有意 な抑制を示した。 コント口ールぺプチド LPFFDは、 インスリンで刺激された自己 リン酸化に影響しなかった。 これらの結果は、 KIFMKおよび KIYEKは、 KIQMK又 は DIYETの場合より 1 0倍低い濃度で、 インスリン受容体のィンスリンで刺激さ れた自己リン酸化を抑制することを示している。
( 2 ) インビトロにおける各種べプチドによるィンスリン受容体のチロシン残基 の脱リン酸化
インスリン受容体のチロシンリン酸化の最大レベルはインスリン刺激の 1 0分 後に到達し、 そのレベルはィンキュベーション緩衝液中で少なくとも 3 0分間維 持された。 従って、 1 0分後におけるインスリン受容体のインスリンで刺激され た応答を 1 0 0 %とみなした。 KIYEK ( 4 mM) 又は DIYET ( 4 mM) をインスリ ン刺激の 1 1分後に添カ卩した場合、最大レベルのチロシンリン酸化は低下した（図 3 )。 対照的に、 KIQMKおよび KIFMKは、 チロシンのリン酸化レベルを低下させる 効果が低かった。 KIYEK及ぴ DIYETの 2種のペプチドは、 1 0分後に観察した際、 インスリン受容体のリン酸化の増大をほぼ完全に元の状態まで戻した。予想通り、 LPFFD は、 インスリンで刺激した自己リン酸化に影響しなかつた。 これらの結果 は、 インスリン受容体の活性化ループ上に存在する IYE配列を含有する KIYEK及 び DIYET (図 1 ) は、 自己リン酸化したィンスリン受容体に対する脱リン酸化作 用を有することを示す。 一方、 ナトリゥムチャンネルの I I I一 I Vリンカ一中 の IFM配列を含有する KIFMK (図 1 ) は、 自己リン酸化を効率的に抑制するが、 自己リン酸化したインスリン受容体を脱リン酸化する作用は弱い。 KIYEK及び KIFMK における脱リン酸化作用の相違は、 脱リン酸化の分子機構に起因する可能 性がある。 DIYETもリン酸化残基を脱リン酸化できたので、 IYE (Ile-Tyr-Glu) 配列が脱リン酸化に重要であると考えられる。 産業上の利用可能性
本発明により、 インスリン受容体のリン酸化阻害活性又はリン酸化ィンスリン 受容体の脱リン酸化促進活性を有するぺプチドを含むィンスリン受容体のリン酸 化阻害剤又はリン酸化ィンスリン受容体の脱リン酸化促進剤を提供することが可 能になった。 本発明の薬剤を用いることにより癌などの疾患の治療剤を提供する ことが可能になる。
本発明のィンスリン受容体のリン酸化阻害剤又はリン酸化ィンスリン受容体の 脱リン酸化促進剤は、 医薬並びに実験試薬として有用である。

Claims

請求の範囲
1 . 下記の （a ) 又は （b ) の何れかのペプチド又はその薬理学的に許容さ れる塩を含む、 インスリン受容体のリン酸化阻害剤又はリン酸化ィンスリン受容 体の脱リン酸化促進剤。
( a ) Lys-Ile-Phe-Met-Lys (配列番号 1 )、 Lys - lie - Tyr- Glu - Lys (配列番号 2 )、 Lys-Ile-Gln-Met-Lys (配列番号 3 ) 又は Asp- lie- Tyr- Glu- Thr (配列番号 4 ) で表されるアミノ酸配列を有するペプチド；又は、
( b )上記（ a )に記載のァミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ酸が置換、 欠失、 挿入おょぴ Z又は付加されているアミノ酸配列を有し、 インスリン受容体 のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化促進活性を有するぺプチド。
2 . インスリンによるインスリン受容体のチロシンのリン酸化を阻害する、 請求項 1に記載のィンスリン受容体のリン酸化阻害剤。
3 . 下記の （a ) 又は （b ) の何れかのペプチド又はその薬理学的に許容さ れる塩を用いることを特徴とする、 インスリン受容体のリン酸化を阻害する方法 又はリン酸化ィンスリン受容体の脱リン酸化を促進する方法。
( a ) Lys- lie- Phe- Met- Lys (配列番号 1 )、 Lys- lie- Tyr- Glu- Lys (配列番号 2 )、 Lys- lie- Gin- Met- Lys (配列番号 3 ) 又は Asp- lie- Tyr- Glu- Thr (配列番号 4 ) で表されるアミノ酸配列を有するペプチド；又は、
( b )上記（ a )に記載のァミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ酸が置換、 欠失、 挿入および Z又は付加されているアミノ酸配列を有し、 インスリン受容体 のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化促進活性を有するぺプチド。
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