JP2001520508A

JP2001520508A - インスリン抵抗性の治療

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Publication number: JP2001520508A
Application number: JP50193597A
Authority: JP
Inventors: オレフスキー，ジェロールド，エム．; ピレイ，タヒール，エス・
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティーオブカリフォルニア
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2001-10-30
Also published as: WO1996040894A1; AU6264796A; US6511811B1; EP0832204A1; NO975718L; NO975718D0; US20030211540A1; CA2223891A1; EP0832204A4; AU720920B2

Abstract

(57)【要約】インスリン受容体のアミノ酸残基Ser₁₂₇₀のプロテインキナーゼＣ媒介リン酸化を阻害することによりインスリン抵抗を治療するための方法および組成物が提供される。プロテインキナーゼＣによるセリンリン酸化の阻害に適した候補化合物を試験する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】インスリン抵抗性の治療連邦の資金援助を受けた研究である旨の記載本発明の少なくとも一部は、米国立衛生研究所（NIH）から助成（助成番号N IH DK 33649）を受けるというかたちで、連邦政府の資金援助のもとになされたものである。政府は、本発明に対してある程度の権利を有する可能性がある。発明の背景発明の分野本発明は、インスリン抵抗性の治療に用いる方法ならびに組成物に関するものである。関連技術の説明インスリン抵抗性は、インスリン非依存性糖尿病(NIDDM)、肥満、高血圧、心血管系疾患など、いくつかの疾病状態に伴って生じる。こうした状態うち、最もよく調べられているのはNIDDMである。NIDDMは、インスリン依存性糖尿病(IDD M、Ｉ型糖尿病、あるいは若年型糖尿病と称されることもある)と区別するために、成人型糖尿病あるいは、ＩＩ型糖尿病と称されることもあり、通常、中年の肥満者で発症し、糖尿病診断症例の８０％ないし９０％をしめる。NIDDMは、インスリン抵抗性ばかりでなく、正常あるいは高めのインスリンレベル、高血糖、超低密度リポタンパク質(VLDL)レベルの上昇、筋肉によるグルコース摂取量の低下も伴う。NIDDMの場合、極端なストレス（たとえば、敗血症性ショックあるいは心筋梗塞）にさらされた場合以外、IDDMに特徴的なケトアシドーシスは見られない。NIDDMの患者は、神経、目、腎臓、冠状動脈の疾患をはじめとして、IDDMと同様の合併症の多くを発症する傾向がある。現在も蓄積されつつある科学的事実からは、NIDDMが２つの素因、すなわち１）先天的な遺伝性の素因(Rifkinら，Diabetes Mellitus:Theory and Practice ，New York，Eisevier，1990所収，Rotterら，pp．378-413)と、２）後天的素因 (Moller編Insulin Resistance and Clinical Disorders．England，John Wile & Sons，Ltd.，1993所収，Seelyら，pp．187-252、Efendicら編，New Concepts i n the Pathogenesis of NIDDM．New York，Plenum Publishing Corp.，1993所収，Olefsky、DeGrootら編、DeGroot Text Book of Endocrinology第３版，Ph iladelphia，W.B．Saunders and Co.，1994所収，Olefsky)の組み合わせによって生じるということがわかる。NIDDMの遺伝性の素因は、この疾患の第一段階、すなわち「前糖尿病」状態と称される段階の原因となっている。前糖尿病状態は、高インスリン血症ならびに「一次」インスリン抵抗性が特徴的である。前糖尿病状態のインスリン応答性は、正常耐糖能(NGT)、あるいは少なくとも耐糖能障害(IGT)は十分維持しうるものである。膵臓のβ細胞のインスリン産生能は、時間の経過とともに低下してくるので、この補償メカニズムに各種の問題が生じてくる。こうしたインスリン分泌量の低下が、もとから存在していた遺伝的バックグラウンドとあいまって、高血糖、すなわち「二次」インスリン抵抗性が上昇し、最終的には糖尿病性NIDDM状態となる。前糖尿病状態のNIDDMの場合に比べて糖尿病性NIDDMでインスリン抵抗性が上昇していることからは、何かさらに別の非先天的な要因によって、前糖尿病状態にみられる遺伝性のインスリン抵抗性誘導素因に加えて、インスリン抵抗性の二次素因が生じていることが示唆される。このさらなる要因が高血糖である(Yki -Jarvinen，1990，Diabetologia，33:579-585、Yki-Jarvinen，1992，Endocrine Rev.，13:415-431)。高血糖によってインスリン抵抗性が誘導される際の詳細なメカニズムはわかっていない。しかし、いくつかの観察結果から示唆されるのは、インスリン抵抗性は、少なくとも部分的には、正常なインスリン受容体の機能が損なわれることによって生じているということである。第一に、高血糖のNIDDM状態の結果として、インスリン刺激性の各種作用、たとえば、インスリン受容体の自己リン酸化、インスリン受容体によって媒介される各種のキナーゼ活性（チロシンキナーゼ活性を含む）、インスリン刺激性ホスファチジルイノシトールキナーゼ活性、インスリン刺激性ＤＮＡ合成が低減する(Freidenbergら，1987，J．Clin．Invest. ，79:240-250、Caroら，1986，J．Clin．Invest.，78:249-258、Comiら，1987， J．Clin．Invest.，79:453-462、Caroら，1987，J．Clin．Invest.，79:1330-13 37)。このように、受容体がインスリンと結合しうるにもかかわらず、正常なインスリン媒介性伝達シグナルが伝わらないのである。インスリン受容体のキナーゼ活性の低下は、患者の高血糖のレベルとの相関が指摘されている(Nolanら，19 94 ，J．C1in．Endocrinol．Metab.，78:471-477、Brillonら，1989，Diabetes，38 :397-403、Maegawaら，1991，Diabetes，40:815-819)。第二に、セリンおよび／またはトレオニン残基のリン酸化を生じるプロテインキナーゼＣ(PKC)が、in vitroでのインスリン受容体の不活性化と関連づけられている。高血糖条件下で細胞をインキュベートすると、転位ならびにPKCの活性化が生じる(Mullerら，1991，Diabetes，40:1440-1448、Mosthafら，1993，Ex p．Clin．Endocrinol.，101(Supple 2):150-151)。ホルボールエステルでPKCによるセリンリン酸化活性を誘導すると、インスリン受容体のキナーゼ活性が低下する(Takayamaら,1988，J．Biol．Chem.，263:3440-3447)。高血糖によって誘導されたインスリン受容体のキナーゼ活性の阻害は、広範囲の非特異的なPKC阻害物質、たとえばスタウロスポリン、H7、ポリミキシンBとともに細胞をインキュベートすることによって抑制される(Mosthafら、上掲)。 PKCによって媒介されるリン酸化の具体的な部位はわかっていない。高血糖誘導性のインスリン抵抗性についてもっといろいろなことがわかってくれば、具体的な治療法を設計、開発するうえで大いに役立つはずである。発明の開示本発明は、高血糖の結果として、インスリン受容体の特定のセリン残基(Ser₁₂₇₀ )が、プロテインキナーゼＣ(PKC)によって異常なかたちでリン酸化されるという発見に基づくものである。インスリン受容体のSer₁₂₇₀がリン酸化されても、インスリンの結合に有意な影響が及ぶことはないものの、Ser₁₂₇₀がリン酸化されると、インスリン受容体の自己リン酸化ならびにチロシンキナーゼ活性が抑制され、インスリン刺激性の細胞内シグナル伝達が抑制される。セリンがリン酸化されたインスリン受容体は、インスリンの結合に対して応答不能であるので、インスリン抵抗性が生じることとなる。本発明は、包括的には、組成物、その識別方法、ならびにプロテインキナーゼＣ(PKC)によるインスリン受容体のSer₁₂₇₀残基のリン酸化を抑制するにあたってのその使用に関するものである。本発明の一観点は、プロテインキナーゼＣ(PKC)によって媒介されたインスリン受容体のSer₁₂₇₀のリン酸化を抑制する活性を有するプロテインキナーゼＣの拮抗物質に関するものである。本発明は、候補となる化合物を、PKC拮抗物質としての活性について調べる方法にも関するものである。この方法では、候補化合物を、i)プロテインキナーゼＣ、ならびにii)プロテインキナーゼＣの基質と接触させる。好適な基質は、インスリン受容体由来のポリペプチドで、Ser₁₂₇₀をはさむアミノ酸配列を含むものである。PKC拮抗物質としての活性を有する化合物は、候補化合物の存在下でのポリペプチド基質のリン酸化のレベル検出することによって識別することができる。これと関連した観点として、本発明は、アミノ酸配列DDLHPSFPEVS(配列番号１)を有するポリペプチドをコードする精製ポリヌクレオチド（ただし、このポリヌクレオチドは、天然のインスリン受容体をコードするものではない）、ならびにこのポリヌクレオチドを含むベクターおよび形質転換宿主細胞にも関するものである。本発明は、さらに、本発明のPKC拮抗物質ならびに製剤上許容される担体から構成される治療用組成物にも関するものである。本発明の治療用組成物は、PKC拮抗物質を含む治療用組成物を、PKCによって媒介された患者のインスリン受容体のセリンリン酸化を抑制するのに十分な量投与することによって、患者のインスリン抵抗性を治療する方法で使用することができる。本発明は、さらに、セリンリン酸化抵抗性のヒトインスリン受容体をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのポリヌクレオチドを含むベクターおよび形質転換宿主細胞にも関するものである。セリンリン酸化抵抗性ヒトインスリン受容体をコードするポリヌクレオチドは、インスリン抵抗性の患者の治療方法において、セリンリン酸化抵抗性ヒトインスリン受容体をコードするヌクレオチド配列と、このヌクレオチド配列に機能可能なかたちで結合された真核生物のプロモーター配列とを含む構築物を用いて、患者の細胞を遺伝的に形質転換することによって使用することができる。本発明の一つの利点は、本発明のPKC拮抗物質は、インスリン受容体発現細胞に送達するだけで、患者のインスリン感受性を復元しうることである。患者のインスリン感受性を復元するうえでは、PKCによって媒介されるインスリン受容体のセリンリン酸化を完全に抑制する必要はないし、すべてのインスリン受容体発現細胞でインスリン受容体の応答性を復元する必要もない。本発明のいまひとつの利点は、PKCによるセリンリン酸化のポリペプチド基質（すなわち、Ser₁₂₇₀を含むインスリン受容体ポリペプチド）が、PKCによって媒介されるインスリン受容体のセリンリン酸化を抑制することを介してインスリン抵抗性を治療する薬剤を設計するにあたっての合理的な基礎となることである。本発明のさらに別の利点は、PKCによって媒介されたSer₁₂₇₀のリン酸化を抑制しうるか否かか、PKCによるセリンリン酸化を抑制する活性を有する候補化合物を識別するにあたっての迅速なスクリーニングアッセーの基礎となることである。本発明の他の特徴や利点は、本発明の公的実施態様についての以下の記載、ならびに特許請求の範囲から明らかなはずである。図面の簡単な説明図１は、インスリン受容体の概念図である。図２Ａ−Ｃは、ヒトインスリン受容体の細胞質ドメインのアミノ酸配列ならびにＤＮＡ配列を示す。図３は、ヒトインスリン受容体の細胞内ドメインのアミノ酸配列（配列番号５）、ならびにこの配列で使用したアミノ酸残基の番号を示す。図４は、インスリンで刺激した細胞において、グルコース濃度の上昇が、インスリン受容体の自己リン酸化（βサブユニット）、ならびにインスリン受容体によって媒介されたインスリン受容体基質１(IRS-1)のチロシンリン酸化に及ぼす作用を示すオートラジオグラフである。図５は、正常濃度のグルコース(5mM)あるいは高濃度のグルコース(25mM)の存在下で、最大濃度以下の濃度のインスリンによる細胞の刺激が、インスリン受容体の自己リン酸化（βサブユニット）、ならびにインスリン受容体によって媒介されたインスリン受容体基質１(IRS-1)のチロシンリン酸化に及ぼす作用を示すオートラジオグラフである。図６は、非刺激細胞あるいはIGF-1で刺激した細胞において、正常濃度のグルコース(5mM)あるいは高濃度のグルコース(25mM)が、インスリン受容体の自己リン酸化（βサブユニット）、ならびにインスリン受容体によって媒介されたインスリン受容体基質１(IRS-1)のチロシンリン酸化に及ぼす作用を示すオートラジオグラフである。図７は、先端の４３アミノ酸が欠落しているインスリン受容体(DCT)を発現する細胞において、インスリンによる刺激、ならびにグルコース濃度の上昇が、インスリン受容体の自己リン酸化（βサブユニット）、ならびにインスリン受容体によって媒介されたインスリン受容体基質１(IRS-1)のチロシンリン酸化に及ぼす作用を示すオートラジオグラフを集めたものである。図８は、高濃度のグルコース単独(A)、ホルボールエステル（Ｂ）、あるいは高濃度のグルコースおよびインスリン(C)と接触させた細胞から得たインスリン受容体の二次元トリプシンホスホペプチド分析のオートラジオグラフである。図９は、正常濃度のグルコース(5mM)、高濃度のグルコース(25mM)、あるいは高濃度のグルコース(25mM)およびPKC拮抗物質であるビスインドールマレイミドの存在下で、インスリンによる刺激が、インスリン刺激性のホスファチジルイノシトールキナーゼの活性に及ぼす作用を示すオートラジオグラフである。図１０は、ペプチド１９−３１の存在下あるいは不在化で、インスリンによる刺激およびグルコース濃度の上昇が、ＤＮＡの合成に及ぼす作用を示すグラフである。図１１は、正常濃度のグルコース(5mM)あるいは高濃度のグルコース(25mM) の条件下で、非刺激(基底)細胞あるいはインスリン刺激細胞において、PKC阻害ペプチド19-31がＤＮＡの合成に及ぼす作用を示すグラフである。図１２は、正常濃度のグルコース(5mM)あるいは高濃度のグルコース(25mM) の条件下で、非刺激細胞あるいはインスリンによる刺激を与えた細胞において、 MAPキナーゼキナーゼ(MEK)阻害物質がインスリン受容体の自己リン酸化、ならびにIRS-1のリン酸化に及ぼす作用を示すオートラジオグラフである。図１３は、正常濃度のグルコース（５ｍＭ）あるいは高濃度のグルコース（２５ｍＭ）の条件下で、非刺激細胞（Ｎ）あるいはインスリンによる刺激を与えた細胞（Ｉｎｓ）において、ペプチドSer-1035(配列番号５)あるいはペプチド Ser-1270(配列番号１)のマイクロインジェクションが、ＤＮＡの合成に及ぼす作用を示すグラフである。発明の詳細な説明本発明は、高血糖（すなわち、グルコースが体液中に蓄積される代謝状態）が、プロテインキナーゼＣ(PKC)によるインスリン受容体の特定のセリン残基(Se r₁₂₇₀)の異常なリン酸化の原因となっていることを見いだしたことに基づくものである。インスリン受容体のSer₁₂₇₀がリン酸化されても、インスリンのインスリン受容体への結合に有意な影響が及ぶことはないものの、Ser₁₂₇₀のリン酸化は、インスリン受容体の自己リン酸化ならびにチロシンキナーゼ活性を阻害する。インスリン受容体のキナーゼ活性は、インスリン刺激性細胞内シグナルの伝達に際して必須なので、セリンがリン酸化されたインスリン受容体は、インスリンの結合に対して応答不能となる。したがって、インスリン受容体のセリンがPKC によってリン酸化されると、インスリン抵抗性が生じることとなり、こうしたインスリン抵抗性が、糖尿病性のNIDDMの患者に見られるような高血糖に伴う状態である。インスリン受容体は、２つのモノマータンパク質から構成されるホモ二量体タンパク質で、それぞれのモノマータンパク質は、αサブユニットとβサブユニットとから構成されている。図１は、インスリンのごく大ざっぱな概念図で、細胞外ドメイン、貫膜ドメイン、細胞質ドメインの相対的な位置、また、インスリン受容体の自己リン酸化部位ならびに受容体中のDDLHPSFPEVS(配列番号１)配列を示してある。インスリン受容体の詳細な三次元構造はわかっていない。ヒトインスリン受容体の細胞質ドメインのアミノ酸配列ならびにＤＮＡ配列を図２Ａ− Ｃに示す。 ”Ser₁₂₇₀”は、DDLHPSFPEVS(配列番号１)で定義される配列のセリン残基で、配列中、Ser₁₂₇₀残基には下線を付して示してある。ここでの残基の番号は、図３に示すヒトインスリン受容体の細胞内の細胞質ドメインのアミノ酸配列の番号のつけ方にしたがったものである。「プロテインキナーゼＣ」すなわち「PKC」は、各種タンパク質でセリンならびにトレオニン残基のリン酸化を促進する酵素である。PKCは、実際には、少なくとも８種の別々のPKCのアイソフォームを包括するものであり、この個々のアイソフォームは、細胞の種類に応じて各種の組み合わせをとる。たとえば、ラット１繊維芽細胞は、有意な量のPKCα、β、δ、zを含有している。ンスリン濃度も正常ないし高レベルであることを特徴とする代謝不全状態を意味する。高血糖をin vitroでモデル化する際には、インスリン受容体発現細胞を、高濃度(20mM to 25mM)のグルコースならびに正常ないし準最大濃度のインスリン中でインキュベートする。プロテインキナーゼＣ(PKC)拮抗物質プロテインキナーゼＣ(PKC)拮抗物質は、PKCによって媒介されるインスリン受容体のSer₁₂₇₀残基のリン酸化、特に、高血糖によって誘導されたPKC媒介性のセリンリン酸化を抑制する活性を有する化合物である。「PKCによって媒介されるインスリン受容体のSer₁₂₇₀残基のリン酸化を抑制する活性」とは、PKC拮抗物質が、PKCによって媒介されるインスリン受容体のセリンリン酸化を部分的あるいは完全に抑制して、高血糖条件下でのインスリンの結合に対するインスリン受容体の応答性を保持することを意味する。「インスリンの結合に対するインスリン受容体の応答性」とは、インスリンがインスリン受容体に結合した場合に通常見られる生物学的活性の少なくとも一つを、インスリン受容体がインスリンの結合に対して示すことによって応答することを意味する。インスリンの結合によって刺激される生物学的活性としては、たとえば、インスリン受容体の自己リン酸化、インスリン受容体媒介性のチロシンキナーゼおよびホスファチジルイノシトールキナーゼ活性、ならびにインスリン刺激性のＤＮＡ合成がある。本発明のPKC拮抗物質は、PKCによって媒介されるインスリン受容体のSer₁₂₇ ₀ 残基のリン酸化を各種のメカニズムで抑制することができる。たとえば、PKC拮抗物質は、PKCによって媒介されるSer₁₂₇₀残基のリン酸化を、PKCとの相互作用によって（たとえば、PKCの触媒部位との可逆的あるいはほぼ不可逆的な結合を介してPKCに結合することによって）抑制することもできるし、また、PKCによって媒介されるSer₁₂₇₀残基のリン酸化を、インスリン受容体との相互作用によって抑制することもできる。たとえば、PKC拮抗物質は、PKCによるSer₁₂₇₀残基の認識あるいは近接をマスクするようなかたちで、インスリン受容体のペプチドモチーフと結合することができる。「インスリン受容体のペプチドモチーフ」とは、インスリン受容体のうちの、（PKCあるいはPKC拮抗物質のような）他の分子による相互作用の対象となるアミノ酸配列のことを意味する。PKCによるインスリン受容体のSer₁₂₇₀残基の認識は、PKC拮抗物質によってマスクすることが可能で、具体的には、Ser₁₂₇₀を含むペプチドモチーフにPKC拮抗物質を結合させて、PK CのSer₁₂₇₀への近接を直接阻んだり、PKCのSer₁₂₇₀への近接が立体構造上阻まれるようなかたちでPKC拮抗物質をインスリン受容体に結合させたり、あるいは、P KCによって認識されるペプチドモチーフの三次元構造（すなわちコンホメーション）に変化が生じるようなかたちでPKC拮抗物質をインスリン受容体と結合させて、Ser₁₂₇₀のリン酸化が促進されるようなPKCとインスリン受容体との相互作用を阻んだりすることができる。Ser₁₂₇₀ペプチドモチーフのコンホメーションを変えるようなかたちでPKC拮抗物質をインスリン受容体に結合させる場合、PKC拮抗物質は、インスリン受容体の任意の部分（たとえば、インスリン受容体を構成するホモ二量体のいずれかのタンパク質、そして／または、インスリン受容体単量体のαおよび／またはβサブユニット）に対して結合させることができる。特定の理論に拘束されるものではないものの、インスリン受容体と相互に作用する PKC拮抗物質は、βサブユニット、特に、βサブユニット中に存在するDDLHPSFPE VS(配列番号１)モチーフと相互に作用する傾向が強い。 PKC拮抗物質は、ペプチド様(peptidemimic)化合物とするが好ましい。ペプチド様化合物は、特定の選ばれたペプチドの三次元構造（すなわち「構造モチーフ」）を基本とした三次元構造を有する合成化合物である。ペプチド様化合物は、ペプチドであってもなくてもよいが、ペプチドが示すのと同様の、あるいはさらに強い生物学的活性を（たとえば、そのペプチドが本来結合する触媒部位に結合することによって）示すという点で、ペプチドに「類似(mimic)」している。本発明のペプチド様化合物は、そのペプチド様化合物のもととなったペプチドのPKC拮抗物質としての活性と実質的に同等、あるいはそれ以上のPKC拮抗物質としての活性を有するのが好ましい。本発明のペプチド様PKC拮抗物質として好適なのは、アミノ酸配列DDLHPSFPEVS(配列番号１)から誘導したもので、このペプチド様化合物は、このペプチド様化合物のもととなったペプチドのPKC拮抗物質としての活性と実質的に同等、あるいはそれ以上のPKC拮抗物質としての活性を有している。ペプチド様化合物は、治療上の用途に応じて各種の有利な特徴を有するものとすることができ、たとえば、細胞透過性が改善されていても、各化合物の標的分子との結合親和性および／または結合活性が増大していても、生物学的半減期が伸びていても、経口投与性が改善されていてもよい。PKC拮抗物質としての活性を有するペプチド様化合物を設計するにあたっては、当業界で周知のコンピューターモデリングの手法を利用することもできる。ペプチド様化合物のさらなる設計ならびに製造方法は、当業界で周知である。本発明のPKC拮抗物質の例としては、さらに、インスリン受容体のアミノ酸配列DDLHPSFPEVS(配列番号１)あるいは実質的に同一の配列を有する各種ペプチドが挙げられる。ここで、「実質的に同一の配列」とは、配列DDLHPSFPEVS(配列番号１)に対して少なくとも５０％、好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％のホモロジーを有するアミノ酸配列のことである。アミノ酸配列DDLHPSFPEVS(配列番号１)は、ヒトインスリン受容体（配列番号５）のアミノ酸残基1265-1275由来のものであるが、PKC拮抗物質は、Ser₁₂₇₀残基（あるいは類似物質）が含まれているのであれば、もっと長くても、あるいは短くてもかまわない。一般に、PKC拮抗物質がペプチドである場合には、ペプチドは、天然のインスリン受容体配列の一部から構成されている。ここで、「天然のインスリン受容体配列」とは、野生型インスリン受容体配列の全体を含む核酸配列、あるいはこの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を意味するものである。たとえば、インスリン受容体が、ヒトインスリン受容体である場合には、天然の核酸配列とは、天然に生じるヒトインスリン受容体のアミノ酸配列全体をコードするものである。特に重要なのは、天然のヒトインスリン受容体のSer₁₂₇₀ 残基ならびにSer₁₂₇₀をはさむアミノ酸残基を含むペプチドである（配列番号４）。配列DDLHPSFPEVS(配列番号１)と実質的に同一であるアミノ酸配列は、PKCによるセリンリン酸化活性を抑制する際に、配列DDLHPSFPEVS(配列番号１)と実質的に同一、あるいはそれ以上の活性（たとえば、DDLHPSFPEVS(配列番号１)が有する活性の２５％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％−１００％あるいはそれ以上）を示すことが好ましい。 DDLHPSFPEVS(配列番号１)と実質的に類似したペプチドの例としては、アミノ酸の置換（たとえば保存的置換）、欠失、アミノ酸類似物質（すなわち、合成アミノ酸の各種変異体）、あるいはもっと別の修飾、たとえば化学的修飾（たとえば、メチル化、ハロゲン化等）を有するものの、PKCによって媒介されるインスリン受容体のセリンリン酸化を抑制する能力を保持しているものが挙げられる。保存的置換としては、次の群、すなわちグリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；ならびにフェニルアラニン、チロシン内部の置換が典型的である。また、PKC拮抗物質としての活性を有するペプチドは、Ｄ−アミノ酸による置換を含んでいてもよい。特に重要なのは、天然のインスリン受容体のPKC結合親和性および／または結合活性（すなわち、ペプチドがP KCと結合する力、たとえば、PKCとの結合が可逆性か非可逆性かといった性質）と比べてペプチドのPKC結合親和性および／または結合活性が増大するようなペプチドの修飾である。「ペプチド」とは、一般に、D-および／またはL-アミノ酸の鎖を意味し、翻訳後修飾あるいは化学修飾（たとえば、グリコシル化、リン酸化、メチル化、ハロゲン化）を有していてもよい。「ペプチド」は、そのもととなったポリペプチドより相当数少ない数のアミノ酸を含むものである。PKC拮抗物質としての活性を有する本発明のペプチドは、通常、約２−１００のアミノ酸残基、好ましくは、約３−５０のアミノ酸残基、さらに好ましくは、約３−２５のアミノ酸残基、さらに好ましくは、約５−２０個のアミノ酸残基、通常、約５−１５のアミノ酸残基を含み、一般に、Ser₁₂₇₀残基あるいはその誘導体を含む約１１のアミノ酸残基を含んでいる。PKC拮抗物質としての活性を有する本発明のペプチドは、DDL HPSFPEVS(配列番号１)を含むことが好ましい。プロテインキナーゼ（PKC）拮抗物質の識別本発明のPKC拮抗物質は、PKCによって媒介されたインスリン受容体のSer₁₂₇ ₀ 残基のリン酸化を、特に高血糖環境で抑制する能力によって識別される。 PKC拮抗物質は、たとえば、以下の能力、すなわち、１）in vitroの高血糖モデル中で、PKCによって媒介されたインスリン受容体のセリンリン酸化を抑制する能力、２）精製PKCを使用した無細胞アッセーで、PKCによって媒介されたPK C基質（たとえば、DDLHPSFPEVS(配列番号１)を含むインスリン受容体あるいは他の基質）のセリンリン酸化を抑制する能力、あるいは3)in vitroの無細胞アッセーで、競合的なかたちでPKCに結合する能力によって識別することができる。PKC 拮抗物質となる化合物のこうした識別方法の例を、以下に詳細に説明する。Ｉ．全細胞を用いた、PKCによるセリンリン酸化抑制活性を調べるアッセー PKC拮抗物質となる化合物は、in vitroの高血糖状態をモデル化しているようなin vitroのアッセーで、インスリン受容体発現細胞を使用して識別することができる。PKC拮抗物質のアッセーで使用する哺乳動物細胞は、機能的インスリン受容体（すなわち、このインスリン受容体は、正常なインスリン受容体で見られるようなインスリン刺激性の活性を示す）を発現、あるいは過剰発現する任意の哺乳動物細胞とすることができる。 PKC拮抗物質の候補化合物の活性は、この候補化合物を哺乳動物細胞の細胞質に導入することによって調べる。候補化合物が哺乳動物細胞の細胞膜をたやすく透過しうる場合には、高グルコース環境に細胞を暴露する前、あるいは暴露中に、候補化合物を哺乳動物細胞の入った培養液に、インスリンとともに、あるいはインスリンなしで加えることができる。細胞を高濃度のグルコースならびにインシュリンと接触させる過程は、in vitroのこう血糖状態をin vitroでモデル化した過程である。調べる化合物が哺乳動物細胞の細胞膜をたやすく透過しえない場合は、この哺乳動物細胞を候補化合物とともにインキュベートする前に、たとえば、非致死量の洗剤のような孔形成性化合物での処理によって、哺乳動物細胞をわずかに透過性としておくことができる。あるいは、候補化合物の方の膜透過性を増大させておくこともできる。たとえば、候補化合物をリポソームに封入して、化合物の細胞までの送達と、細胞の細胞質内への導入の双方を促進することができる。膜強化製剤の調製方法は当業界で周知である。(たとえば、Martinら，1982，J．Bi ol．Chem．257:286-288、Szokaら，1980，Ann．Rev．Biophys．Bioeng．9，467- 508，(1980)、Ostro，M.J．編，Liposomes From Biophysics to Therapeutics， Marcel Dekker，Inc.，New York，1987を参照されたい)。候補化合物は、当業界で周知の方法を用いて、マイクロインジェクションで細胞の細胞質に直接導入することもできる。機能的インスリン受容体を発現する哺乳動物細胞は、正常濃度のグルコース（たとえば、約５mMのグルコース）、あるいは高濃度のグルコース（たとえば、 20mM-25mMのグルコースの存在下）の環境で、インスリンを加えて、あるいは加えずにインキュベートする。PKC拮抗物質となる化合物は、PKCによって媒介されたセリンリン酸化活性の変化を検出することによって識別する。細胞中でのPKC によって媒介されたセリンリン酸化活性は、数多くの方法でモニターすることができ、たとえば、a)PKCによって媒介されたインスリン受容体のセリンリン酸化を直接検出したり、b)インスリン受容体の自己リン酸化活性を検出したり、c)インスリン受容体によって媒介されるチロシンキナーゼ活性を検出したり、d)インスリン刺激性のホスファチジルイノシトールキナーゼ活性を検出したり、あるいはe)インスリン刺激性のＤＮＡ合成を調べたりすることによってモニターが可能である。Ａ）インスリン受容体のセリンリン酸化を直接検出する方法 PKCによって媒介されたインスリン受容体のセリンリン酸化については、細胞を、アッセーの全期間にわたって、放射性核種、たとえば³²Pとともにインキュベートすることによって直接調べることができる。放射性核種がリン酸化によってインスリン受容体に取り込まれたかどうか、また、インスリン受容体のどのアミノ酸が具体的にリン酸化されたのかについては、ホスホアミノ酸分析ならびにSDS-PAGE分析によって調べることができる。これらの方法は、すでに公表されている（Andersonら，1991，J．Biol，Chem.，266:21760-21764、Sasaokaら，19 94，J，Biol．Chem.，269:13689-13694）。本発明のPKC拮抗物質の存在下では、高グルコース条件下でのインスリン受容体のセリンリン酸化は、PKC拮抗物質不使用の対照サンプルと比べて低減しているはずである。Ｂ）インスリン受容体の自己リン酸化活性を検出する方法高グルコース濃度が、インスリン受容体の自己リン酸化に及ぼす作用、ならびに候補化合物がこうした作用を抑制する能力については、細胞をアッセーの全期間にわたって³²Pとともにインキュベートすることによって調べることができる。放射性核種が自己リン酸化によってインスリン受容体に取り込まれたかどうかについては、上述したように、ホスホアミノ酸分析ならびにSDS-PAGE分析によって調べることができる。本発明のPKC拮抗物質の存在下では、高グルコース条件下でのインスリン受容体の自己リン酸化は、PKC拮抗物質不使用の対照サンプルと比べて増大しているはずである。Ｃ）インスリン受容体によって媒介されるチロシンキナーゼ活性を検出する方法インスリン受容体のチロシンキナーゼ活性については、こうしたリン酸化活性によって生じた基質のリン酸化を検出することによって調べることができる。たとえば、インスリンが機能的インスリン受容体に結合すると、タンパク質IRS- 1（インスリン受容体基質−１）は、インスリン受容体によってチロシンリン酸化される。したがって、チロシンリン酸化されたIRS-1のレベルは、インスリン受容体のチロシンキナーゼ活性ならびに正常な機能と相関を有するものである。 IRS-1のチロシンリン酸化については、細胞をアッセーの全期間にわたって³ ² Pとともにインキュベートすることによってモニターすることができる。この放射性核種がIRS-１に取り込まれたかどうかについては、上述したように、ホスホアミノ酸分析ならびにSDS-PAGE分析によって、あるいは、当業界で周知の方法にしたがって、抗ホスホチロシン抗体を使用することによって検出することができる。本発明のPKC拮抗物質の存在下では、高血糖条件下でのIRS-1のリン酸化は、PKC拮抗物質不使用の対照サンプルと比べて増大しているはずである。Ｄ）インスリン刺激性のホスファチジルイノシトール(PI-3)キナーゼ活性を検出する方法インスリンで細胞を刺激すると、ホスファチジルイノシトール(PI-3)キナーゼ活性も刺激される。PI-3キナーゼ活性は、当業界で周知の方法にしたがって薄層クロマトグラフィーで分析することによって検出することができる。PKC拮抗物質の存在下では、高血糖条件下でのP1-3キナーゼ活性は、PKC拮抗物質不使用の対照サンプルと比べて高いはずである。Ｅ）インスリン刺激性のＤＮＡ合成を検出する方法インスリンによるインスリン受容体経由の細胞への刺激は、インスリン受容体の自己リン酸化やIRS-1のチロシンリン酸化だけでなく、ＤＮＡ合成の増大も生じる。したがって、高血糖によって誘導されたインスリン媒介性のシグナル伝達、すなわちインスリン受容体の機能の抑制については、インスリンの存在下ならびに不在下でＤＮＡ合成の相対的レベルを測定することによって調べることができる。このアッセーでは、哺乳動物細胞を、正常濃度(たとえば5mM)のグルコースあるいは高濃度のグルコース(20mM-25mM)を含む培養液で、候補化合物を加えて、あるいは加えずにインキュベートする。次に、細胞を最大濃度以下かつ有効濃度のインスリン(すなわち10ng/ml)で刺激し、ＤＮＡ合成用の分子プローブ、たとえばブロモデオキシウリジン(BrDU)の取り込みを染色によって調べる。正常な場合、約１０％の細胞がBrDUを取り込む。正常レベルのグルコースの存在下でインスリンが存在すると、約８０％の細胞がBrDUで染色され、約5-10ng /mlのインスリンでは、最大作用の約半分のレベルとなる。25mMのグルコースと1 0ng/mlのインスリンが存在すると、BrDUの取り込みは、約５０％低減する。たとえば、10ng/mlのインスリンの存在下、生理学的なグルコース条件（５mM）で、B rDUについて６０％の細胞が陽性であった場合、10ng/mlのインスリン、高血糖(2 5mM)レベルのグルコースの存在下では、BrDU陽性細胞の率は約２５％まで低減するはずである。候補化合物がPKC拮抗物質としての活性を有している場合、10ng/mlのインスリンの存在下、高血糖条件下でのBrDU陽性細胞の率は、PKC拮抗物質である化合物の不在下でのBrDU取り込みレベルに対して増大する。表１は、上述のin vitroのアッセーの間に、PKC拮抗物質が、インスリン刺激全細胞に、正常濃度あるいは高濃度のグルコース条件下で及ぼした作用をまとめたものである。ＩＩ．ＰＫＣ拮抗物質の無細胞アッセー PKCによって媒介されるインスリン受容体のセリンリン酸化を、市販の精製PKC 、ならびにPKCによるセリンリン酸化に際しての基質を使用して、無細胞アッセーで調べた。「PKCの基質」は、PKCによって媒介されるセリンリン酸化の基質となる任意の基質とすることができ、好ましくは、ポリペプチド、さらに好ましくは、インスリン受容体のアミノ酸配列DDLHPSFPEVS(配列番号１)を有するポリペプチドとすることができる。PKCの基質として好適なのは、精製インスリン受容体、好ましくはヒトインスリン受容体、あるいはアミノ酸配列DDLHPSFPEVS(配列番号１)を含むその断片である。基質がペプチドあるいはポリペプチドである場合には、PKCによって媒介されるセリンリン酸化は、上述のように、ホスホアミノ分析、および／またはSDS-PAGE分析によって検出することができる。候補化合物がPKC拮抗物質としての活性を有している場合には、その候補化合物の存在下では、基質のセリンリン酸化が、その候補化合物が不在である場合の基質のセリンリン酸化レベルと比べて低減する。ＩＩＩ．競合的なPKC結合アッセー PKC拮抗物質であるような化合物については、PKCによるセリンリン酸化のポリペプチド基質、あるいはすでにPKC拮抗物質であることが識別されている物質の濃度を増大させながら、この化合物が精製PKCに結合する能力を調べることによって識別することができる。PKCのポリペプチド基質、ならびにPKC拮抗物質としての活性を有する本発明のペプチドは、アミノ酸配列DDLHPSFPEVS(配列番号１ )、あるいはそのPKC結合性断片を含むのが好ましい。競合的結合アッセーは、各種の免疫診断用検定法で使用される競合的結合アッセーと同様の方法で実施する。たとえば、PKCのポリペプチド基質を、蛍光色素(たとえば蛍光色素)あるいは放射標識を付すなど化て、検出可能なかたちで標識する。この検出可能標識PKCポリペプチド基質の既知量を、精製PKCならびに候補化合物と混ぜる。次に、ポリペプチド基質−PKC複合体を単離し、この複合体についての検出可能標識量を測定する。候補化合物の存在下で検出可能標識レベルが低減しているようであれば、この候補化合物は、PKC拮抗物質としての活性を有している。各種の免疫診断用検定法で使用される競合的結合アッセーの場合と同様、ここに記載した競合的PKC結合アッセーについても、当業者であれば、各種の方法で実施しうることが容易にわかるはずである。たとえば、このアッセーは、溶液中で実施することも、固体支持体（たとえば、PKCを表面に結合させたマイクロタイターウェル）を使用して実施することも可能である。NIDDM の動物モデル本発明のPKC拮抗物質のin vivoでの効力は、NIDDMの動物モデルを使用することによって容易に調べることができる。NIDDMのこうした動物モデルは、ヒトのNIDDMのモデルとして当業界で周知であり、受け入れられている。たとえば、ヒトのNIDDMのインスリン抵抗性は、正常ラットで、このラットにグルコースと低用量のソマトスタチンの輸液を８時間にわたって投与して高血糖(約250mg/dl)とすることによってシミュレートすることができる。その結果、ラットは有意にインスリン抵抗性となり、このことはグルコースクランプ法で測定することができる。このように、ラットモデルで外的に誘導したインスリン抵抗性は、比較的短い時間枠で発現させることができ、PKC拮抗物質の候補化合物のinvivoでの効果を調べるうえで有用な高血糖動物モデルとなる。ＰＫＣアンタゴニストの源および／または合成ＰＫＣアンタゴニストは、当技術分野で公知の種々の技術を使用して産生および／または単離できる。例えば、ＰＫＣアンタゴニストは、天然源（例えば、植物または微生物）から単離し、化学合成を使用して生成させ、または化学化合物のライブラリー（例えば、化学収集物および／またはMerckなどから市販されている結合ライブラリー）から同定することができる。ＰＫＣアンタゴニストがペプチドの場合、該ペプチドは、化学合成または組換えＤＮＡ技術（例えば、本発明のペプチドをコードするＤＮＡの原核性または真核性宿主細胞での発現）によって産生することができる。ペプチドなどの化学化合物の合成法は、精製および単離法と同様に、当技術分野で周知である（例えば、ペプチドの精製に対しては、Deutscher編、1990，”Guide to Protein Purification"（タンパク質精製の指針）、Academic Press，Inc.，SanDiego，CAを参照。）。ＰＫＣセレンリン酸化基質またはＰＫＣアンタゴニストとして使用するためのペプチドの化学合成ＰＫＣアンタゴニスト化合物ならびに本明細書に記載するアミノ酸配列に基づくポリペプチド基質およびそれらの変形は、当技術分野で周知の化学合成法を使用して合成できる（例えば、Peptide Synthesis Protocols（ペプチド合成プロトコール）(Methods in Molecular Biology，35)，PenningtonおよびDunn編、19 94，Humana Press，Totowa，New Jersey;Sold Phase Peptide Synthesis（固相ペプチド合成），第２版、Stewart編，1984，PierceChemical Company，Rockfor d，IL. Peptides:Design，Synthesis and Biological Activity（ペプチド：設計、合成および生物学的活性），BasavaおよびAnantharamaiah編、1994，Birkha user，Boston，MA;Jones，1994，The Chemical Synthesis of Peptides （ペプチドの化学合成），Clarendon Press，Oxford，Eng1andを参照）。例えば、ＰＫＣアンタゴニスト化合物は、Clark-Lewisら、P.N.A.S.，USA，90:3574-3577(199 3)およびC1ark-Lewisら、Biochemistry，30:3128-3135（1991）に記載のｔ−ブチルオキシ−カルボニルおよびベンジル保護法を使用した標準的固相法によって合成できる。フッ化水素で脱保護した後、タンパク質は空気酸化によってフォールディングされ、逆相ＨＰＬＣによって精製される。純度は、逆相ＨＰＬＣおよび等電点電気泳動によって測定する。アミノ酸の混入は合成中にモニターし、最終組成物は、アミノ酸分析によって決定する。タンパク質の正確な共有構造は、イオンスプレー質量分析を使用して確認できる(SCIEX APIII)。合成後、ＰＫＣアンタゴニスト活性を有するペプチドは、例えば、当技術分野で公知の方法に従って、Ｎ−末端アミノ酸およびＣ−末端アミノ酸のα炭素間にさらに炭素−炭素結合を形成することにより、環化することができる（例えば、 Mergler，1994，Meth．Mol．Biol.，90:287-301;Katesら、1995，Tetrahedron L ett.，34:1549-1552;Cavelier-Frontinら、1993，J．Mol．Struc.，286:125-130 ;Bradyら、1979，J．Org．Chem.，44(18):3101;McMurrayら、1994，Peptide Res .，7:195を参照）。ＰＫＣ−媒介セリンリン酸化基質またはＰＫＣアンタゴニストとして使用するためのペプチドまたはポリペプチドを合成するための組換えＤＮＡ技術ＰＫＣ−媒介セリンリン酸化基質または本発明のＰＫＣアンタゴニストとして使用するためのペプチドまたはポリペプチドは、当技術分野で周知の通常の分子クローン化および発現技術を使用して産生できる。ペプチドおよび／またはポリペプチドの組換え産生における第一工程として、関与するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離し、クローニングベクターに挿入する。「精製ポリヌクレオチド」とは、本発明のポリヌクレオチドの誘導源である生物の天然ゲノムにおいて、そのペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸または該ペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸と天然に結合した他のエピソームもしくは染色体ＤＮＡにフランキングした核酸配列を含まない核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味する。すなわち、その用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミドもしくはウイルス、または原核性もしくは真核性のゲノムＤＮＡに組み込まれる、あるいは他の配列とは無関係に別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により産生されるｃＤＮＡまたはそのゲノムもしくはｃＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡを含む。また、別のペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含める。関与する配列をコードするＤＮＡ断片の同定、クローン化および発現のための方法は手順が慣例化しており、当技術分野で周知である（例えば、Sambrookら、 1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NYを参照）。例えば、インスリン受容体ペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば米国特許No．4,80 0,159（Mullisら）に記載されている、合成オリゴヌクレオチドプライマーの標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用して、インスリン受容体をコードするＤＮＡから単離できる。本発明で使用するためのペプチドまたはポリペプチドの作製に使用されるＤＮＡは、インスリン受容体をコードするどんなＤＮＡであってもよいが、ヒトインスリン受容体をコードするＤＮＡが好ましい。特に、ヒトインスリン受容体の細胞質ドメインをコードするＤＮＡが好ましい。ヒトインスリン受容体の二つのサブタイプのいずれも、細胞質ドメインを構成する、同一またはほぼ同一のβ−サブユニットを有するので、本発明で使用できる（図２Ａ〜Ｃおよび３）。ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子は同定され、クローン化されている（Chen，1985，Nature，313:756-761）。インスリン受容体をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅は、インスリン受容体残基Ser₁₂₇₀およびSer₁₂₇₀残基にフランキングしているアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが作製されるように設計できる。ＰＣＲ増幅法で使用するためのプライマーの配列は、例えばヒトインスリン受容体のＤＮＡ配列に基づいて設計できる（配列番号４）。ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがプロモーターに機能を発揮するように結合されるように、ベクターに挿入する。哺乳類、酵母および細菌細胞の安定した形質転換に適する多数のベクターが、各所から幅広く提供されている（例えば、the American Type Culture Coll ection，Rockville，MD）。適する宿主細胞および安定に形質転換された宿主細胞系を構築するための方法は周知である（例えば，Pouwelsら、1985，Cloning V ectors:A Laboratory Manual;Ausubelら、1989，Current Protocols in Molecul ar Biology，John Wiley & Sons，New York;およびSambrookら、前出）。宿主細胞の選択、形質転換法および発現ビヒクルの選択は、選択した宿主系に依存する。「プロモーター」は、機能を発揮するように結合する、転写を行うのに十分な最小の配列である。プロモーターは、プロモーターに依存する遺伝子発現を制御可能にして、細胞型特異的、組織特異的または外部のシグナルもしくは物質によって誘導可能するのに十分であるプロモーター要素（例えば、エンハンサー）を含む。該要素は、天然遺伝子の５’または３’領域に位置することができる。「機能を発揮するように結合した」とは、関与するＤＮＡ（例えば、関与するペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ）および調節配列が、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）がその調節配列に結合すると関与するＤＮＡの遺伝子発現が可能になるように結合し、従って、組換えタンパク質またはＲＮＡ分子の産生を容易にすることを意味する。ＰＫＣ基質またはＰＫＣアンタゴニストをコードするＤＮＡを含むベクターは、公知の技術を使用して構築され、当技術分野で周知の形質転換技術を使用して原核細胞、酵母または真核細胞に導入される。「形質転換」は、新規ＤＮＡ（すなわち、細胞にとって外来のＤＮＡ）を組み込むことによって細胞に誘導される永久の遺伝子変化を意味する。細胞が哺乳類細胞の場合、永久の遺伝子変化は、一般に、細胞のゲノムへのＤＮＡの導入によって達成される。「形質転換細胞」とは、組換えＤＮＡ法によって、本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがその中に（またはその先祖に）導入されている細胞を意味する。宿主細胞において外来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の発現を得るための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Bormalら、1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，84:2150-2154; Sambrookら、前出；それらは各々、関与するＤＮＡの発現に対する方法および組成物に関して、参考として本明細書に組み入れる。）。ＰＫＣセリンリン酸化基質として作用し得るポリペプチド、およびＰＫＣアンタゴニスト活性を有するペプチドは、当技術分野で周知の発現クローン化法によっても単離できる（例えば、Sambrookら、前出を参照）。例えば、ＤＮＡ発現ライブラリー、すなわち、原核性プロモーターに機能を発揮するように結合した種々のｃＤＮＡ断片を含むクローンの集まり、で形質転換した細胞。ＰＫＣセリンリン酸化のためのポリペプチド基質の発現は、精製したＰＫＣの存在下で放射性核種を混入し、次いでホスホアミノ酸および／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行うことにより検出できる。ＰＫＣアンタゴニスト活性を有するペプチドの発現は、培養上清および／または細胞溶解物を、精製したＰＫＣまたは公知のＰＫＣアンタゴニストを結合するその一部を使用してアッセイすることにより検出できる。発現ライブラリーのペプチドがＰＫＣまたはＰＫＣの一部に結合する場合、そのペプチドは、インスリン受容体のＰＫＣ−媒介セリンリン酸化の潜在的阻害活性に対して選択する。ペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法を使用して決定できる（例えば、Sambrookら、前出を参照）。配列を確認した後、得られたプラスミドクローンは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡの発現に対する所望の宿主の形質転換に使用する。組換えペプチドおよびポリペプチド（例えば、本明細書に記載のいずれかの発現系によって産生）の発現は、ウェスタンブロット、組換え細胞抽出物の免疫沈殿分析、組換え細胞抽出物におけるタンパク質のＰＫＣ−媒介セリンリン酸化もしくは組換え細胞抽出物のＰＫＣアンタゴニスト活性の分析などの免疫学的手法によってアッセイできる。ＰＫＣアンタゴニスト活性を有するペプチドの修飾本発明のＰＫＣアンタゴニストがペプチドの場合、ＰＫＣアンタゴニストは、ＰＫＣ結合アフィニティーおよび／またはアビディティー、治療効力、生物学的半減期、膜透過性、標的特異性、薬物相溶性、薬物動力学、生物学的利用能およびＰＫＣアンタゴニストの治療効力を高める他の特性などの、該ＰＫＣアンタゴニストに望ましいいくつかの特性を高めるように修飾できる。化学的修飾を使用して、望ましい薬物動力学および生物学的利用能特性を示すペプチド模倣物を合成することができる。抗−ＰＫＣアンタゴニスト抗体の産生ＰＫＣアンタゴニスト、特にＰＫＣアンタゴニストであるペプチド、に特異的に結合するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体は、当技術分野で周知である、慣例の方法に従って作製することができる（例えば、HarlowおよびLane，1988，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab oratory Press，Cold Spring Harbor，NY;Schrierら、1980，Hybridoma Techniq ues，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NYを参照）。抗−ＰＫＣアンタゴニスト抗体は、ＰＫＣアンタゴニストの精製および／または特異的ＰＫＣアンタゴニストの活性を測定するためのアッセイ（例えば、in v itroアッセイにおけるＰＫＣアンタゴニストの抗体結合および阻害による）において使用できる。薬物組成物本発明のＰＫＣアンタゴニスト化合物は、薬物組成物にすることができる。「薬物組成物」とは、診断または治療法において使用するための患者への投与に適する組成物を意味する。一般に、本発明の薬物組成物は、ＰＫＣアンタゴニストび製剤上許容される担体を含む。「製剤上許容される担体」とは、ＰＫＣアンタゴニストを標的細胞に運ぶためのビビクルを意味し、該ビヒクルは細胞生存力と相溶性である。本発明のＰＫＣアンタゴニストの投与での使用に適する製剤上許容される担体は、当業者に周知である。製剤上許容される担体の選択は、投与されるＰＫＣアンタゴニスト、投与法および治療される状態などの種々の因子に依存する。本発明のＰＫＣアンタゴニストとともに使用するのに適した製剤上許容される担体としては、それらに限定されないが、0.01〜0.1M、好ましくは0.05Mのコハク酸緩衝液または0.8%の食塩水が挙げられる。さらに、そのような製剤上許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁物およびエマルジョンであってもよい。さらに、製剤上許容される担体としては、洗剤、リン脂質、脂肪酸または他の液体担体が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）および注入可能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が挙げられ、食塩水および緩衝媒体を含める。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム水溶液、リンゲル溶液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲルまたは不揮発性油が挙げられる。本発明のＰＫＣアンタゴニストとともに使用するための製剤上許容される担体としては、脂質担体が挙げられる。脂質担体は、滅菌溶液またはゲルの形態であってもよく、洗剤または洗剤含有生物学的界面活性剤であってもよい。非イオン洗剤の例としては、ポリソルベート80（TWEEN80またはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとしても知られる）が挙げられる。イオン性洗剤の例としては、それに限定されないが、臭化アルキルトリメチルアンモニウムが挙げられる。製剤上許容される担体が脂質担体の場合、その脂質担体はリポソームであってもよい。リポソームは、その親水性内部にＰＫＣアンタゴニストなどの所望の物質を含み得るリン脂質膜結合小胞である。治療用リポソームを調製するための適切な脂質および他の物質ならびに方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ma rtin，F.J.およびPapahadjopoulos，D.，J．Biol．Chem．257:286-288(1982);Sz oka，F.およびPapahadjopou1os，D.，Ann．Rev．Biophys．Bioeng．9．467-508 ，(1980);ならびにOstro，M.J.編、Liposomes From Biophysics to Therapeutic s，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987参照）。静脈内用ビビクルとしては、流体および栄養補充液、リンゲルのデキストロースをベースとするもなどの電界質補充液などが挙げられる。また、保存剤、他の製剤上活性な化合物および他の添加物、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなどを存在させてもよい。ＰＫＣアンタゴニストの投与本発明のＰＫＣアンタゴニストを使用した治療が可能な患者としては、糖尿病前症および糖尿病の状態を含む、ＮＩＤＤＭのいずれかの段階にある患者が挙げられる。糖尿病前症ＮＩＤＤＭ患者のＰＫＣアンタゴニストによる治療は、長期にわたる高血糖および付随するＰＫＣ−媒介インスリン受容体セレンリン酸化の誘導から生じる二次的なインスリン抵抗性の開始を防ぐのに役立つと考えられる。「インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）」は、インスリン抵抗性、正常〜高められたレベルのインスリン、高血糖、高められたレベルの極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および糖の筋吸収の低下を特徴とする糖代謝異常の遺伝病を意味する。「インスリン抵抗性」は、患者が、正常〜高レベルのインスリンにもかかわらず、高い血糖値を有することを意味する。本発明の発見によれば、インスリン抵抗性は、インスリン受容体のSer₁₂₇₀のリン酸化によって媒介される。本発明の治療法は、治療量のＰＫＣアンタゴニストを糖尿病前症または糖尿病ＮＩＤＤＭ患者に投与することを含む。「治療的に有効な量」は、プロテインキナーゼＣによるインスリン受容体のセレンリン酸化を減少させて、患者の少なくとも部分的なインスリン応答性を回復し、血糖値の高血糖値以下（すなわち、空腹時の血糖値（ＰＧ）が約140mg/dl以下、および／または75gの経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）後が200mg/dl未満である）への調節を容易にするのに有効な組成物の量を意味する。好ましくは、ＰＫＣアンタゴニストの治療的投与により、患者の血糖値の、糖耐性の低下と同等の血糖値（すなわち、約140mg/dlのＰＧ〜75g のＯＧＴＴの２時間後の200mg/dl）、より好ましくは正常な糖耐性と同等の血糖値（すなわち、空腹時のＰＧが約140mg/dl未満であり、および／または75gの経口糖負荷の２時間後の血糖値が約140mg/dl未満である。）への調節を容易にする。本発明の治療組成物に関して使用する場合の「単位用量」は、患者に対する１回分の用量として適する、物理的に分離した単位を意味し、各単位は、必要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと結合して所望の治療効果を生じるように計算された、予め決まった量の活性物質を含む。投与法および投与するＰＫＣアンタゴニストの量は、治療すべき病気および患者の種々の変量（サイズ、体重、年齢、病気の程度および治療に対する応答性など）により広範囲に変わる。適切な投与法および用量を決める方法は、一般に、担当医師がケースごとに決める。そのような決定は、当業者に周知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版、Gennaro編、Mack Publish ing Company，Easton，PA，1990参照）。投与に適する特定の用量は、当業者であれば上記した因子に従って容易に決定される（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,前出、を参照）。さらに、ヒトにおける適切な用量の概算は、in vitroで測定したＰＫＣ阻害活性レベルおよび／または動物モデルでのインスリン抵抗性の低下に有効なＰＫＣアンタゴニストの量の測定値から外挿して得ることができる。ＰＫＣアンタゴニストの投与法ＰＫＣアンタゴニストの投与法としては、例えば、経口、静脈内注入、リポソームデリバリー、動脈内デリバリーおよび筋肉内デリバリーが挙げられる。各投与法に対して、ＰＫＣアンタゴニストは、当業者によって決定される、その投与法に適切な製剤上許容される担体において製剤化される。好ましくは、ＰＫＣアンタゴニストは、インスリン受容体を発現する細胞を標的とするように投与する。筋肉（特に骨格筋）、脂肪および肝細胞などの古典的なインスリン標的細胞が、ＰＫＣアンタゴニストのデリバリーに適する標的細胞である。ＰＫＣアンタゴニストはまた、放出が制御された製剤の形で投与することもできる。ＰＫＣアンタゴニストの放出制御性薬物投与は、徐放および長期放出における目的と同様の、薬物のデリバリー時間の延長を意味するだけでなく、薬物放出動力学の予測可能性および再現性も含む。デリバリー系ＰＫＣアンタゴニストの投与および細胞内デリバリーに適する種々のデリバリー系が当技術分野で周知である。例えば、ＰＫＣアンタゴニストは、分散デリバリー系を使用して投与できる。本発明に従って使用できる分散系は、その小胞内にＰＫＣアンタゴニストを含む合成膜小胞である。「合成膜小胞」とは、通常はリポソームとして知られる、１個以上の同心室を有する構造を意味する。リン脂質を水性媒体に分散させると、リン脂質は膨潤して水和し、自然に、脂質二重層を分離する水性媒体の層を有する、多層板状の同心二重層小胞を形成する。そのような系は、通常は、多層板状リポソームまたは多層板状小胞（ＭＬＶ）と言い、約100nm〜約4μmの範囲の直径を有する。ＭＬＶを超音波処理すると、直径が約20nm〜約50nmの範囲にある小さい単層板状小胞（ＳＵＶ）が形成され、ＳＵＶのコアには水性溶液が含まれる。合成膜小胞の組成物は、通常は、リン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質の組み合わせであり、通常は、ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質や他の脂質も用いる事が出来る。（Szokaら、1980，Annual Reviews of Biophysics and Bioenginee ring，9:467;Deamerら、Liposomes，Marcel Dekker，New York，1983，27;Hope ら、1986，Chem．Phys．Lipids，40:89）本発明によれば、ＰＫＣアンタゴニストを含む治療組成物は、経口投与することもできる。経口用組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態にすることができる。デリバリー方式（直ちに、徐々に、または制御された放出）および投薬形態の設計（固体、分散体または液体）に関係なく、経口投与法により全身に運ぶための薬物組成物は、胃腸（ＧＩ）生理学の固有の特徴の中で開発しなければならない。本発明方法で使用される組成物のデリバリーに対する一つの系の例は、薬物を含む浸透コアを、生物相溶性ポリマー、例えば酢酸セルロースから作った半透過膜内にカプセル化することにより作った、浸透圧制御式胃腸デリバリー系である。直径が制御されるデリバリーオリフィスを、レーザービームを使用して、薬物の溶質の放出を制御し、薬物通過中の胃腸デリバリー系の構造的完全性を維持できるコーティング膜に開ける。半透過膜の外部表面も、半透過膜による胃腸流体の浸透を調節し、胃腸管のより低い部位への薬物のデリバリーを目的とするために、生物侵食可能なポリマー、例えば腸コーティングの層で被覆することができる。さらに、デリバリー系のコーティング膜は、水の流入速度を調節し、そうして薬物のデリバリー速度をプログラムするために、透過性の異なる２個以上の半透過膜のラミネート、または半透過膜とミクロポーラス膜とのラミネート（英国特許No．1,556,149）で構成することもできる。膜透過が制御される胃腸デリバリー系も本発明方法において有用である。ミクロポーラス膜透過が制御される装置は、まず、水溶性薬物の結晶（または粒子）を適切な薬物賦形剤と組み合わせて圧縮してコア錠剤とし、次いで、その錠剤に非ＧＩ侵食性ポリマー、例えば、塩化ビニルと酢酸ビニルとのコポリマーの層でコーティングすることにより作る。ポリマーコーティングは、錠剤が胃腸流体と接触すると多孔性を生じる少量の水溶性孔形成無機物質、例えばラウリル硫酸マグネシウムを含む。あるいは、コア錠剤は、高配合量の可塑剤（例えば、フタル酸ジオクチル）を含む非ＧＩ侵食性熱可塑性ポリマー（例えば、ポリ塩化ビニル）の層でコーティングしてもよい。当技術分野で周知の別の系は、胃液抵抗性で腸を標的とする放出制御式胃腸デリバリー装置である。この装置は、胃液に対して不安定な薬物を制御された速度で腸の領域でのみ放出するように設計された装置であり、コア錠剤の薬物を、腸液に不溶なポリマー（例えばエチルセルロース）と腸液に可溶なポリマー（例えば、メチルセルロース（または、フタル酸ヒドロキシメチルセルロース））との組み合わせでコーティングすることにより作る。ゲル拡散制御式胃腸デリバリー系は、ゲル形成ポリマーから作る。それは、まず、治療用量の異性体を水溶性カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の層に分散させ、薬物充填ＣＭＣ層を架橋カルボキシメチルセルロース（水不溶性であるが、水に膨潤可能である）の層の間にサンドイッチした後、これらの層を圧縮して多層板状装置を形成することにより作ることができる。ｐＨ制御式胃腸デリバリー系は、まず、酸性（または塩基性）薬物を１種以上の緩衝剤、例えば、クエン酸の第一、第二もしくは第三塩と混合し、適切な薬物賦形剤とともに顆粒化して小さい顆粒を形成した後、その顆粒を胃腸液透過性フィルム形成ポリマー、例えばセルロース誘導体でコーティングすることにより作る。他のＧＩデリバリー系、例えばイオン交換制御式胃腸デリバリー系および水圧制御式胃腸デリバリー系などは、当業者には公知である。上記以外の成分は、それらが生理学的に許容され、上皮細胞およびその機能に有害でない限り、治療組成物に添加することができる。そのような添加物は、上記した酵素阻害剤もしくは刺激剤、または分解酵素の上皮透過効率に悪影響を与えたり、組成物の安定性を低下させるものであるべきでない。本発明の組成物に添加できる成分の例としては、安定剤、保存剤、緩衝剤、界面活性剤、乳化剤、風味剤、芳香剤などが挙げられる。治療組成物の投与の期間および回数は、血糖値の大きさ（従って、インスリン抵抗性の大きさ）、患者の耐性、患者の応答性および当技術分野で十分認識されている他の因子などの種々の因子に応じて広く変化し得る。典型的用量は、１日〜数日の期間にわたって、１単位用量〜連続接触用量まで可能である。すなわち、接触は、種々の処方に従うことができる。処方例としては、時間を置いて投与される１回以上の短時間単位用量ならびに５分〜数時間または数日もの長い時間にわたって連続投与される用量が挙げられる。用量ＰＫＣアンタゴニストの用量は、本明細書に記載する指針に基づいて決定される（例えば、in vitroでのＰＫＣセリンリン酸化阻害に有効なＰＫＣアンタゴニストの量および／または本明細書に記載の高血糖誘導性インスリン抵抗性の動物モデルでのインスリン感度の増加に有効であると測定された用量）。この指針を慣例の実験と組み合わせて、個々の患者および治療する特定の細胞に必要な用量を最適化する。投与に適する、治療的に有効な特定の量は、当業者であれば容易に決定される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版、Genna ro編、Mack Publishing Company，Easton，PA，1990参照）。基礎となる治療は、ＰＫＣによって媒介されるセリンリン酸化を低下させ、正常な糖耐性（ＮＧＴ）または少なくとも低下した糖耐性（ＩＧＴ）状態の維持を可能にするインスリン応答受容体群を患者に提供することである。in vitroでは、有効な用量範囲は、インスリン受容体のＰＫＣ媒介セリンリン酸化の阻害の実証によって決定される。これは、全身の水（体重ｘ0.7）に等しい体積分布と仮定して、所望の薬物濃度の達成に必要な用量(mg)を計算することにより、動物またはヒトのモデルに外挿する。ＬＤ₅₀に対する情報が利用できる場合、これにより、用量の上限が決定される。ＬＤ₅₀で示される上限の10倍以下の用量を投与するが好ましい。投与されるＰＫＣアンタゴニストの有効なレベルは、ＮＩＤＤＭに対する種々の指標から推定できる。好ましくは、ＰＫＣアンタゴニスト処方の効力を、ＮＩＤＤＭ患者の血糖レベルをモニターすることにより評価する。血糖のモニターは慣例化しており、医師または患者自身によって容易に行うことができる。ＰＫＣアンタゴニストの投与による血糖レベルの低下は、治療に対して患者が応答したことを示す。セリンリン酸化抵抗性インスリン受容体本発明はまた、遺伝子治療法によってセリンリン酸化抵抗性インスリン受容体をコードするポリヌクレオチドを患者に発現させることよる、患者のインスリン抵抗性の治療法にも関する。本明細書で使用する「セリンリン酸化抵抗性インスリン受容体」または「組換えインスリン受容体」は、ＰＫＣ−媒介セリンリン酸化による正常なインスリン受容体生物活性の阻害を受けにくいインスリン受容体を意味する。すなわち、高血糖条件下では、セリンリン酸化抵抗性インスリン受容体がインスリンに結合し、セリンリン酸化を受けやすい天然のインスリン受容体によって示されるよりも高められたレベルでインスリン刺激性インスリン受容体活性を示す。セリンリン酸化抵抗性インスリン受容体としては、正常なインスリン受容体機能、特に高血糖条件下で正常なインスリン受容体機能を保持する限り、天然のインスリン受容体にアミノ酸の置換、付加、欠失、および／または挿入を含むその誘導体ならびに野生型タンパク質に対して切断されたインスリン受容体誘導体が挙げられる。好ましくは、本発明の組換えインスリン受容体は、Ser₁₂₇₀残基の周りのインスリン受容体ペプチドモチーフがＰＫＣによってもはや認識されず、従って、Se r₁₂₇₀残基のＰＫＣ媒介セリンリン酸化を防ぐように、インスリン受容体の細胞質ドメイン（例えば、βサブユニット）にアミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。好ましくは、アミノ酸の置換、挿入または欠失が、正常な糖または高血糖の条件下で、インスリン刺激性インスリン受容体生物活性（例えば、インスリン受容体自己リン酸化、インスリン受容体−媒介チロシンキナーゼ活性、インスリン −刺激性ＰＩ−３キナーゼ活性およびインスリン−刺激ＤＮＡ合成）に実質的な影響を及ぼさない。好ましくは、組換えインスリン受容体は、残基位置1270のセリンに対するアミノ酸置換を含む。残基位置1270での置換に適するアミノ酸としては、天然に存在するどのアミノ酸も挙げられ、好ましくは、セリンのものと同様の長さの側鎖を有し、および／またはインスリン受容体の三次元立体配置（特に、インスリン受容体細胞質ドメインの立体配置）に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸である。Ser₁₂₇₀での置換に対しては、アラニンが好ましいアミノ酸である。すなわち、本発明の組換えインスリン受容体は、Ser₁₂₇₀をコードするヌクレオチドに対してアラニンをコードするコドン（例えば、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ）が置換されていることを除いて、天然のヒトインスリン受容体と同じヌクレオチド配列を有する（ヒトインスリン受容体細胞質ドメインのヌクレオチド配列に対しては、図２Ａ−Ｃを参照）。インスリン受容体をコードするポリヌクレオチドは、本発明のセリンリン酸化抵抗性インスリン受容体の生成に使用できる。好ましくは、そのポリヌクレオチドが、ヒトインスリン受容体をコードするＤＮＡまたはそれと実質的に同一のＤＮＡ分子である。「実質的に同一」は、参照アミノ酸または核酸配列に対して少なくとも50%、好ましくは85%、より好ましくは90%、最も好ましくは95%の相同性を示すアミノ酸または核酸配列を意味する。アミノ酸配列の場合、比較する配列の長さは一般に、少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸、より好ましくは少なくとも25アミノ酸、最も好ましくは35アミノ酸である。核酸の場合、比較する配列の長さは一般に、少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、最も好ましくは110ヌクレオチドである。配列の同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定する（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group，University of Wiscons i n Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705）。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、置換および他の修飾に対して相同性の度合いを割り当てることにより、類似の配列を適合させる。本発明の組換えインスリン受容体は、当技術分野で周知の組換え核酸技術を使用して作製することができる（例えば、Sambrookら、前出、を参照）。例えば、 Ser₁₂₇₀に対するアミノ酸置換を有する組換えインスリン受容体は、当技術分野で周知の部位特異的突然変異技術を使用して作製できる。遺伝子治療での使用に適する、セリンリン酸化抵抗性インスリン受容体および該受容体をコードするポリヌクレオチドは、上記したin vitroアッセイを使用して試験できる。例えば、セリンリン酸化抵抗性インスリン受容体をコードするポリヌクレオチドは、哺乳類の細胞で発現させることができ、そのインスリン受容体の機能は、正常な糖および高血糖の条件下、in vitroアッセイで試験できる。ＰＫＣ−媒介セリンリン酸化による阻害を受けにくい組換えインスリン受容体は、本発明の遺伝子治療法での使用に適する。好ましくは、組換えインスリン受容体が、高血糖条件下で、天然のインスリン受容体（例えば、セリンリン酸化を受けやすいインスリン受容体）の生物学的活性に対して実質的に高められたインスリン刺激性生物学的活性を示す。リン酸化耐性インシュリン受容体の発現のための構築インサートのＤＮＡに作動可能に連結する真核性プロモーターを有するいかなる核酸構築体をも、セリンリン酸化耐性インシュリン受容体発現のための標的細胞の形質転換に用いることができる。“構築体”は、本発明のポリヌクレオチドを有する組換え産生核酸分子である。本発明に従って用いることができるＤＮＡ配列（又は対応するＲＮＡ配列）を有する構築体は、関心のあるＤＮＡ又はＲＮＡ配列を有するいかなる真核性発現ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）、であってもよい。構築体を調製するための核酸の操作方法は当該技術分野において公知である（例えば、前掲のSambrookらを参照のこと）。様々な構築体（例えば、ウイルス構築体、細菌構築体、又は真核性および原核性宿主において複製可能な構築体）を本発明に従って用いることができる。好ましくは、構築体は真核性および原核性宿主の両者において複製可能である。真核性および原核性宿主において複製可能な多くの構築体が当該技術分野において公知であり、商業的に利用可能である。一般には、本発明に従って用いられる構築体は、細菌性複製起点及び関心のあるＤＮＡに作動可能に連結する真核性プロモーターを含んでなる。好ましくは、この構築体は、標的細胞、好ましくは骨格筋細胞内で本発明の組換えインシュリン受容体の発現を容易にするプロモーターを有する。好ましくは、このプロモーターは強力な真核性プロモーターである。例示的な真核性プロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及びアデノウイルスに由来するプロモーターが含まれる。より具体的には、例示的なプロモーターには、ヒトＣＭＶの最初期遺伝子に由来するプロモーター（Boshart et al.，Cell41:521-530，1985 ）及びＲＳＶの末端反復配列（ＬＴＲ）に由来するプロモーター（Gorman et al .，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:6777-6781，1982）が含まれる。これらの２つのプロモーターのうち、ＣＭＶプロモーターがＲＳＶプロモーターよりも発現レベルが高いために好ましい。その構築体を含み、及び／又は発現する細胞の選択を補助するマーカー（例えば、（アンピシリン耐性遺伝子のような）抗生物質耐性遺伝子又はβ−ガラクトシダーゼ）、細菌細胞においてその構築体を安定に複製するための複製起点（好ましくは、高コピー数複製起点）、核局在化シグナル、又はそのＤＮＡ構築体、それらによりコードされるタンパク質、もしくはそれらの両者の産生を容易にする他の要素のような他の構成要素。（例えば、骨格筋細胞における）真核性発現のため、この構築体は、本発明の組換えインシュリン受容体をコードするＤＮＡに作動可能に連結し、続いてポリアデニル化配列に作動可能に連結する真核性プロモーターを最小限有する。ポリアデニル化シグナル配列は、当該技術分野において公知の様々なポリアデニル化シグナル配列のあらゆるものから選択することができる。好ましくは、このポリアデニル化シグナル配列はＳＶ40初期ポリアデニル化配列である。この構築体は l以上のイントロンを含んでいてもよく、これは関心のあるＤＮＡの発現レベルを、特にその関心のあるＤＮＡがｃＤＮＡである（すなわち、天然の配列のイントロンを含まない）場合に高める。当該技術分野において公知の様々なイントロンのいかなるものをも用いることができる。例えば、イントロンは、本発明のセリンリン酸化耐性インシュリン受容体をコードするＤＮＡに対して5'の位置でその構築体に挿人されたヒトβ−グロビンイントロンであってもよい。本発明の組換えインシュリン受容体をコードするＤＮＡを有する構築体は、標的細胞のゲノムに部位特異的に組込まれるように設計することもできる。例えば、関心のあるＤＮＡ及びそれが作動可能に連結するプロモーターがサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｔｙ3の位置特異的組込みマーカーに隣接するように構築体を作製することができる。この部位特異的組込みのための構築体は、組込みマーカーを認識する位置特異的エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡをさらに含む。このような構築体はＴｙ3レトロトランスポゾンと様々な動物レトロウイルスとの相同性を利用する。このＴｙ3レトロトランスポゾンは、多くの異なるｔＲＮＡ遺伝子の5'隣接領域への関心のあるＤＮＡの挿入を容易にし、それにより産生される組換え細胞に悪影響を及ぼすことなく関心のあるＤＮＡのより効率的な組込みを生じる。このような部位特異的構築体を調製するための方法及び成分はUSPN5,292,662に記述されており、これはこのような部位特異的挿入ベクターの構築及び使用に関して参照することによりここに組込まれる。セリンリン酸化耐性インシュリン受容体の発現のためのベクター形質転換のための“ベクター”には、セリンリン酸化耐性インシュリン受容体をコードするポリヌクレオチドでの標的細胞（例えば、骨格筋細胞）の形質転換を容易にするあらゆる生物学的もしくは化学的化合物が含まれる。例示的な生物学的ベクターには、特別に弱毒化され、及び／又は複製能力に乏しいウイルスが含まれる。例示的な化学的ベクターには、裸のポリヌクレオチド構築体、ウイルス、プラスミド、リポソーム処方、及びポリ−Ｌ−リジンもしくはＤＥＡＣ−デキストランのようなポリカチオン性物質と複合化したポリヌクレオチド構築体が含まれるがこれらに限定されるものではない。本発明の生物学的および化学的ベクターを処方する方法は当該技術分野において公知である。例えば、本発明の組換えインシュリン受容体をコードするポリヌクレオチドを有するＤＮＡ−又はＲＮＡ−リポソーム複合処方は遺伝物質（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を結合する脂質を含んでなり、これによりその遺伝物質を細胞内に搬送することを可能にする疎水性コートが付与されていてもよい。本発明に従って用いることが可能なリポソームには、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＣＵＤＭＥＤＡ（Ｎ−（５−コレストラム−３−β−オール３−ウレタニル）−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン）が含まれる。本発明のポリヌクレオチドをリポソームを用いて導入する場合、まずin vitroで、形質転換しようとする特定の型の細胞についてＤＮＡ：脂質比の最適値及びＤＮＡ及び脂質の絶対濃度を細胞の死と形質転換効率との関数として決定することが好ましい。その後、これらの値をin vivo形質転換において使用し、あるいはin vivo形質転換において用いるために外挿することが可能である。これらの値のin vitro測定は、当該技術分野において公知の技術を用いて容易に行うことができる。ベクター処方は、界面活性剤、ゼラチン、カプセル、又は分解に対して保護するための他の搬送ビヒクル、及び／又はターゲッティングリガンドもしくは特定の細胞型へのベクターの狙い撃ち及び／又はその細胞型の形質転換を増強する他の化合物をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明の組換えインシュリン受容体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの化学処方を、宿主細胞の生物学的特性を変更するため、その宿主細胞への搬送を容易にする担体分子（例えば、抗体又は受容体リガンド）に結合させることが可能である。“化学処方”は、タンパク質又は脂質又はそれらの誘導体のような担体分子への核酸化合物の結合を可能にするような核酸の修飾を意味する。例示的なタンパク質担体分子には、標的細胞の細胞又は受容体リガンドに特異的な抗体又は受容体リガンド、すなわち標的細胞に結合する受容体と相互作用することが可能な分子が含まれる。公知の技術を用いてベクターを調製し、機能的なセリンリン酸化耐性インシュリン受容体のin vivo発現が可能な形質転換細胞を得る。この形質転換細胞は標的細胞をＲＮＡ又はＤＮＡ含有処方と接触させることにより得られ、この接触により標的細胞へのＲＮＡ又はＤＮＡの移動及び取込み、並びに、好ましくは、真核標的細胞のゲノムへのＤＮＡの作動的挿人が可能となる。“作動的挿入”は、関心のあるＤＮＡが標的細胞のゲノムに導人され、その導入されたＤＮＡの転写及び翻訳を指向するＤＮＡ配列に隣接して位置する（すなわち、本発明の組換えインシュリン受容体の産生を容易にする）ことを意味する。ベクターがウイルスベクターである場合、そのウイルスベクターは一般に、そのウイルスの複製能力を不足させ、かつ本発明による組換えインシュリン受容体を発現するように遺伝的に変更されている天然のウイルスに由来するウイルス粒子を含んでなる。ひとたびそのウイルスがその遺伝物質を細胞に搬送すると、感染性ウイルスをさらに産生することはないものの外来性組換え遺伝子を細胞、好ましくはその細胞のゲノムに導入する。多くのウイルスベクターが当該技術分野において公知であり、これには、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクチニア及びポリオウイルスベクターが含まれる。適切なウイルスベクターの選択は様々な因子に依存し、これには標的細胞型の増殖の相対速度、標的とする特定の細胞型、及び当該技術分野における通常の技術を有する者によって認識される他の因子が含まれる。例えば、標的細胞がゆっくりと複製し、及び／又は末期的に分化した細胞である場合、レトロウイルスはあまり好ましくなく（レトロウイルスが複製中の細胞を必要とするため）、アデノウイルスがより好ましい（このウイルスがゆっくりと複製し、及び／又は末期的に分化した細胞に効率的に感染するため）。複製能力に乏しいウイルスをウイルスベクターとして用いる場合、途中でのウイルスの複製に必須の失われた構成要素を供与するウイルス構築体を組換え細胞系に導入することにより、ＤＮＡ又は関心のあるＤＮＡに対応するＲＮＡのいずれかを有する感染性ウイルス粒子を産生することが可能である。好ましくは、この組換えウイルスベクターでの組換え細胞系の形質転換は、例えば組換え細胞系のウイルス配列の導入ウイルスベクターへの相同組換えにより、複製−コンピテントウィルスを産生しないものである。関心のあるＤＮＡを有する複製能力に乏しいウイルス粒子の作製方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Rosenfeld et al.，Science 252:431-434 ，1991及びRosenfeld et al.，Cell68:143-155，1992（アデノウイルス）；USPN 5,139,941（アデノ随伴ウイルス）；USPN 4,861,719（レトロウイルス）；並びにUSPN 5,356,806（ワクチニアウイルス）に記述されている。宿主中で外来性ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を発現させる技術は当該技術分野において公知である（例えば、Kormal et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:2150 -2154，1987；Sambrookら、前掲（これらの各々は関心のあるＤＮＡの真核性発現のための方法及び組成に関して参照することによりここに組込まれる）を参照のこと）。セリンリン酸化耐性インシュリン受容体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターの投与患者の標的細胞、例えば、患者の骨格筋細胞のゲノムへの本発明のセリンリン酸化耐性インシュリン受容体をコードするポリヌクレオチドの導入は、当該技術分野において公知の様々な遺伝子治療法によって達成することができる。一般には、遺伝子治療（すなわち、患者の細胞への関心のあるＤＮＡの導入及び関心のあるタンパク質を産生するためのそこでの発現）はex vivo又はin vivo遺伝子治療法によってなされる。in vivo遺伝子治療においては、標的細胞の形質転換はポリヌクレオチドを患者に直接投与することにより行うことができる。ex vivo 遺伝子治療においては、ポリヌクレオチドを、in vitro培養物中の細胞、好ましくは患者に由来する細胞又は患者から単離された他の細胞培養物の形質転換に用いる。続いて、これらの形質転換細胞を患者に移植する。in vivo及びex vivo遺伝子治療の方法は当該技術分野において公知である（例えば、ex vivo遺伝子治療法についてはUSPN5,399,346を参照のこと）。 in vivo形質転換法は、通常、ＤＮＡを標的細胞に導入する生物学的手段（例えば、関心のあるＤＮＡを有するウイルス）又はＤＮＡ標的細胞に導入するための機械的手段（例えば、細胞へのＤＮＡの直接注入、リポソーム融合、“遺伝子銃”を用いる含気注入（例えば、Fynan et al.，1993，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA90:11478-11482を参照のこと））を用いる。一般には、標的細胞のin vivo 形質転換に用いられる生物学的手段はウイルス、特には標的細胞に感染し、少なくとも関心のあるＤＮＡを標的細胞のゲノムに組込むことが可能であるものの、複製することができないウイルスである。このようなウイルスを複製能力に乏しいウイルス又は複製能力に乏しいウイルスベクターと呼ぶ。その代わりに、本発明のポリヌクレオチドを有するウイルスを複製させ、又はある程度にまで複製させるものの、重大な症状又は罹患を感染宿主に引き起こさないようにしてもよい（すなわち、このウイルスは非病原性であるか、もしくは僅かな疾患症状しか引き起こさない）。in vivo形質転換及び遺伝子治療において有用な例示的なウイルスベクターは当該技術分野において公知であるか、あるいは当該技術分野における技術及び知識が与えられれば容易に構築することができる（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクチニアウイルス、及びポリオウイルスの非複製変異体／変種）。生物学的手段を用いるin vivo遺伝子移入は、ＤＮＡを有するウイルスを、例えば注入により、患者に直接投与することにより達成することができる。標的細胞の感染、十分な数の標的細胞の形質転換及びセリンリン酸化耐性インシュリン受容体の発現に有効なＤＮＡの量及び／又は感染性ウイルス粒子の数は、in vit roでの形質転換の効率、in vitroで達成されるタンパク質発現のレベル、及び形質転換に対する標的細胞の感受性のような因子に基づいて容易に決定することができる。例えば、本発明のセリンリン酸化耐性インシュリン受容体をコードするＤＮＡを、例えば精製ＤＮＡ、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）、ＤＮＡ−もしくはＲＮＡ−リポソーム複合体、又は標的宿主細胞への搬送を容易にする担体分子に結合するＤＮＡもしくはＲＮＡ含有化学処方として被験体に搬送することができる。本発明のセリンリン酸化耐性インシュリン受容体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子は被検体に局所的もしくは全身的のいずれかで投与することが可能であり、この被検体はヒトであっても非ヒト動物（例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ）であってもよい。例えば、標的細胞が骨格筋細胞である場合、ＤＮＡの投与は骨格筋組織内又はその近傍への局所注射によって達成することができる。全身性投与は、本発明のセリンリン酸化耐性インシュリン受容体をコードするＤＮＡを有するウイルスベクターを筋肉内注射することにより達成することができる。遺伝子治療がex vivo法でなされる場合には、in vitro培養物（例えば、患者組織生検に由来する細胞）を本発明の組換えインシュリン受容体をコードするポリヌクレオチドで形質転換する。形質転換は当該技術分野において公知の様々な方法のいかなるものによっても達成することが可能であり、これには組換え受容体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを有するウイルスベクターでのリポフェクション及び感染が含まれる。 1以上の選択可能なマーカーを本発明のポリヌクレオチドと共に細胞に移人する場合、in vitro培養物中の関心のあるＤＮＡを有する細胞を同定し、そのマーカー（１種もしくは複数）について選択することにより濃縮することができる。典型的には、マーカーはテトラサイクリン、ハイグロマイシン、ネオマイシン等の抗生物質に対する耐性を付与する。他のマーカーにはチミジンキナーゼ等が含まれ得る。形質転換した標的細胞の関心のあるＤＮＡを発現する能力は、当該技術分野において公知の様々な方法によって評価することができる。例えば、検出可能に標識した抗体を細胞表面上のインシュリン受容体に結合させることにより、細胞表面上にセリンリン酸化耐性インシュリン受容体を発現するこれらの細胞の能力を調べることができる。その代わりに、ノーザンブロットによりそのＤＮＡの選択された配列、好ましくは本発明のセリンリン酸化耐性インシュリン受容体に特有の配列から誘導されるＤＮＡプローブとハイブリダイズするｍＲＮＡを検出することにより、本発明のポリヌクレオチドの発現を調べることが可能である。当該技術分野において公知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドを正確に発現する細胞をさらに同定し、in vitro培養物中で発現させることができる。 in vitroで形質転換細胞を増大させた後、それらの細胞を患者に、好ましくは元来それらの細胞を誘導してきた組織に、当該技術分野において公知の方法により移植する。好ましくは、これらの細胞は血管新生の盛んな領域に、被検体に残る手術の痕を最小限に留める様式で移植する。形質転換細胞の移植片の移植は、例えば、移植片拒絶の古典的な徴候、すなわち、移植部位での炎症及び／又は剥脱、及び発熱を調べることによって監視する。一般には、組換えインシュリン受容体をコードするポリヌクレオチドの量又は本発明のポリヌクレオチドを用いてin vitroで形質転換された細胞の数は、（例えば、in vivo遺伝子治療における）形質転換に対する標的細胞の感受性、被検体の大きさ及び重量、（例えば、ex vivo遺伝子治療における）移植細胞の生存の成功並びに所望の発現レベルを含む多くの因子によって大きく変化する。例えば、ヒトの骨格筋に注射されるＤＮＡの量は、一般には約1μg−1,000mg、好ましくは約100μg−500mg、より好ましくは約500μg−100mg、最も好ましくは約50 mgである。一般に、ヒトの遺伝子治療のためのＤＮＡの量は動物モデルでの遺伝子治療に有効なＤＮＡの量から外挿することができる。例えば、ヒトにおける遺伝子治療のためのＤＮＡの量はラットでの遺伝子治療において有効なＤＮＡの量のおおよそ100倍である。一般には、搬送される組換えインシュリン受容体をコードするポリヌクレオチドの量又は患者に移植される形質転換細胞の数は患者のインシュリン感受性を回復するのに十分な量又は数である。患者のインシュリン感受性の回復は、患者の全ての細胞でのセリンリン酸化耐性インシュリン受容体の発現を必要とはせず、全ての（組織グルコース代謝が最大である）骨格筋細胞においてすら必要とはしない。用途本発明の組成物及び方法は、インシュリン受容体のSer₁₂₇₀のＰＫＣ介在リン酸化、又は患者の細胞におけるセリンリン酸化耐性インシュリン受容体の発現により、患者におけるインシュリン耐性の減弱及び／又はインシュリン感受性の回復に有用である。本発明のin vitro法は、候補化合物をインシュリン受容体の残基Ser₁₂₇₀のＰＫＣ介在リン酸化の阻害において活性なものについてスクリーニングするのに有用である。このようなin vitroスクリーニングは、潜在的に有用な化合物の迅速な同定及び無効の化合物のさらなる研究からの排除において商業的に有用である。本発明のＰＫＣアンタゴニストの他の用途は、医学的及び生化学的研究用途におけるＰＫＣ阻害剤としてのものである。例えば、本発明のＰＫＣアンタゴニストは、in vitro又はin vivoのいずれかで観察された現象にＰＫＣが介在するのかどうかを決定するための分子プローブとして用いることができる。広域ベースのＰＫＣ阻害活性を有する幾つかの化合物（例えば、Ｈ7、スタウロスポリン（s taurosporin）、ポリミキシンＢ（polymyxin B））は市販されており、成功した、重要で実現可能な研究ツールである。以下の例は説明を目的とするものであるが本発明を限定するものではない。これらは用いることができる典型的なものではあるが、当該技術分野における通常の技術を有するものに公知の他の手順を代わりに用いることも可能である。実施例実施例１：材料及び方法細胞培養物及び材料野性型ヒトインシュリン受容体（ＨＩＲｃＢ）又はβ−サブユニット（ΔＣＴ）の末端43アミノ酸を欠く変異インシュリン受容体のいずれかが安定に形質移入され、かつ過剰発現しているラット1線維芽細胞を、500nMメトトレキセートを含有するＤＭＥ／Ｆ12中で、従前記述される通りに培養した（McClain et al.，1 983，J．Biol．Chem.，263(18):8904-8911;Maegawa et al.，1988，J．Biol．Ch em.，263(18):8912-8917；McClain et al.，1987，J．Biol．Chem.，262(30):14 663-14671）。ブタインシュリンはライリー（Lilly）から購入した。強化化学発光検出試薬はアマシャム社（Amersham Corp.）から得た。免疫ブロットＨＩＲｃＢ又はΔＣＴ細胞を35mm6−ウェル皿で培養し、亜集密で実験に用いた。実験操作の約16−24時間前に血清含有培地を除去し、1mMグルコースを含む血清非含有ＤＭＥＭ（シグマ（Sigma））と置き換えた。その後、適切な量のグルコースを指示された期間添加し、細胞を様々なリガンドで刺激した。培地を急速に吸引することによりインキュベーションを停止した後、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含む100μlのトリトンＸ−100溶解バッファを添加した。1 0分間のインキュベーションの後、10,000×gで遠心することにより可溶化液を清透化し、5％メルカプトエタノールを含有するラエムリ（Laemmli）サンプルバッファをサンプルに添加した。これらのサンプルを100℃で5分間煮沸し、7.5％Ｔ／3％Ｃトリシン−ＳＤＳＰＡＧＥゲルにロードした。電気泳動の後、バイオーラッド（Bio-Rad）ＳＤトランスブロットを用いてタンパク質を0.45μmニトロセルロースに移した。このメンブランをトリス緩衝生理食塩水（0.1％ツィーン２０を含む50mMトリス、150mMＮａＣｌ、ｐＨ7.4）（バッファＡ）中の3％ＢＳＡ中で1時間ブロックした。これらのブロックしたメンブランを、0.1％ＢＳＡ及び0.1％ツィーン20を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中でアフィニティ精製ウサギ抗−ホスホチロシン抗体（0.5−1μg／ml）を用いて12時間プローブ処理し、ＴＢＳ、0.1％ツィーン20、1mM ＥＤＴＡ（それぞれ4×100ml／10分）（バッファＢ）で洗浄した後、抗−ウサギペルオキシダーゼ結合体（アマシャム 1／1000）を用いて1時間プローブ処理した。その後、これらのメンブランをバッファＢでさらに洗浄した。結合した抗−ホスホチロシン抗体を、抗−ウサギペルオキシダーゼ及びECL試薬を製造者の指示に従って用い、かつ予めフラッシュしたコダック（Kodak）Ｘ −ＯｍａｔＡＲフィルムでのオートルミノグラフィを用いて検出した。このオートルミノグラフィ上のバンド強度を、スキャンアナリシス（Scananalysis）ソフトウェア（エルスビュー・バイオソフト（Elseview Biosoft））を用いるヒューレットーパッカード（Hewlett-Packard）スキャンジェットII（Scan Jet II）での濃度測定により定量化した。プロテインキナーゼＣ阻害剤ペプチドの微量注入ＨＩＲｃＢ又はΔＣＴ細胞を酸洗浄ガラスカバーグラス上で培養して亜集密まで成長させた後、1mMグルコースを含む血清非含有ＤＭＥ中で飢餓状態にした。ペプチドを5mM ＮａＰＯ₄及び100mMＫＣｌ、ｐＨ7.4を含有する微量注入バッファに溶解した。細胞をＰＫＣ阻害剤ペプチドと共にガラスキャピラリ針を用いて微量注入した。この溶液約10フェムトリットルを各細胞に導入した。この注入には1×10⁶個分子のＩｇＧを微量注入のマーカーとして含めた。微量注入の2時間後、細胞をＢｒＤＵ及び様々な濃度の成長因子と共に37℃で1 6時間インキュベートした。これらの細胞を酸アルコール（90％エタノール、5％酢酸）を用いて22℃で20分間固定した後、マウスモノクローナル抗−ＢｒＤＵ抗体と共に22℃で1時間インキュベートした。その後、微量注入したＩｇＧを検出するためにこれらの細胞をローダミン標識ロバ抗−マウスＩｇＧ抗体及びフルオロセインイソチオシアネート標識ロバ抗−ウサギＩｇＧ抗体と共に22℃で1時間インキュベートし、微量注入した細胞を同定した。カバーグラスをマウントした後、アキシオホト（Axiophot）蛍光顕微鏡（ゼイス（Zeiss））を用いて細胞の分析及び写真撮影を行った。カバーグラス当り250−300個の細胞が微量注入されていた。注入された細胞の免疫蛍光染色により、約75％の細胞がうまく微量注入されていたことが示された。細胞透過性ＰＫＣ阻害剤ビスインドリルマレイミド（ＧＦ109203Ｘ；カルバイオケム・バイオケミカルズ（Calbiochem Biochemicals）、サンディエゴ、ＣＡ）を用いる実験を、最初にこのＰＫＣ阻害剤を1mMの貯蔵濃度でＤＭＳＯに溶解することにより行った。ＨＩＲｃＢ又はΔＣＴ細胞をカバーグラス上で成長させ、上述の通り血清飢餓状態にした。その後、これらの細胞を高グルコース（25mM ）中で最終濃度1μmのビスインドリルマレイミドと共に18時間インキュベートした。この期間中に、細胞をインシュリンで刺激し、次いでＢｒＤＵを添加した。ＢｒＤＵの取込みを、上述の通りマウス抗−ＢｒＤＵ抗体及びをローダミンに結合した抗−マウス抗体を用いて可視化した。二次元ホスホペプチドマッピングＨＩＲｃＢ細胞を16時間血清飢餓状態にした後、2mCi／ml ³²Ｐ−オルソリン酸塩を含有するリン酸塩非含有ＤＭＥＭ中で3時間インキュベートした。次に、これらの細胞を支持される通りに高グルコース（25mM）又はインシュリンで刺激した。これらの細胞を溶解し、抗−ホスホチロシン抗体83−14を説朋される通りに用いてインシュリン受容体を免疫沈澱させた。洗浄した免疫沈澱をＳＤＳ電気泳動で分析した。標識β−サブユニットをオートラジオグラフィーで可視化し、ゲルから切り出して電気溶出によって回収した。 in vitroリン酸化に従う³²Ｐ−標識ＩＲ及びＩＲＳ−1を含有するポリアクリルアミドゲル断片を20mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.0、2mM ＥＤＴＡ、0.1％ＳＤＳ、及び0.1％2−メルカプトエタノールに4時間電気溶出した。溶離したタンパク質を4容量のアセトンを用いて−80℃で60分間沈殿させた後、室温で10分間、10, 000gで遠心した。このペレットを乾燥させ、100μlの100mM Ｎ−エチルモルホリンアセテート（ＮＭＡ）、ｐＨ8.2中10μgのＴＰＣＫ処理トリプシン（ワーシントン・ダイアグノスティック・システムズ（Worthington Diagnostic Systems）、フリーホールド、NH）を37℃で24時間用いて消化した。10μgのＴＰＣＫ処理トリプシンをさらに添加し、消化を12時間継続した。これらのペプチドを、少なくとも3回、凍結乾燥し、水で戻し、再度凍結乾燥した。その後、この³²Ｐ−標識トリプシンペプチドを5μlの電気泳動バッファに再懸濁させ、薄層セルロースプレート上にのせた。ハンター（Hunter）薄層電気泳動システム（C.B.S.サイエンティフィック（C.B.S.Scientific）、デルマール、CA）を用いて1：3.5：40.5 ギ酸／酢酸／水、ｐＨ1.9中で高電圧電気泳動を行った。プレートを75：15：50 ：60ｎ−ブタノール／酢酸／ピリジン／水中で二次元の上行薄層クロマトグラフィーにかけ、乾燥させた後、予めフラッシュしたＸ−ＯｍａｔＡＲフィルムを用いて−80℃でオートラジオグラフィーにかけた。PI −3キナーゼ分析インシュリン刺激ホスファチジルイノシトール（PI−3）キナーゼ活性についての検定を、抗−ホスホチロシン免疫沈澱を用いて説明される通りに行った（Sa dd et al.，1994，Mol．Endocrinol.,8(5):545-557）。ＨＩＲｃ細胞を、上述のように高グルコースに晒してインシュリンで刺激した。その後、細胞を溶解し、チロシンーリン酸化タンパク質をＰＹ20（トランスダクション・ラブズ（Transd uction Labs）、レキシントン、KY）を用いて一晩沈殿させた。この溶解物に100 μlの抗−マウスアガロースを1時間添加した。遠心によってアガロースを沈殿させ、以下のバッファで3回洗浄した：i）50mMトリス；150mM ＮａＣｌ；1％ＮＰ40／Ｎａ₃ＰＯ₄：ii)100mMトリス、ｐＨ7.5／500mM ＬｉＣｌ₂／100μm Ｎａ₃ ＰＯ₄：及びiii）10mMトリス、ｐＨ7.5／100mM ＮａＣｌ／1mM ＥＤＴＡ／100μ m Ｎａ₃ＰＯ₄。その後、大豆リン脂質（シグマ・ケミカル社、セントルイス、MO ）及び³²Ｐ−ＡＴＰを用いて結合した免疫沈澱を検定した。これらのリン酸化脂質をクロロホルム：メタノール（1：1）で抽出した後、クロロホルム：ＭＥＯＨ：ＮＨ₄ＯＨ：Ｈ₂Ｏ（60：47：11.3：2）を用いてシリカゲル60プレート（EMサイエンス（EM Science））で上行クロマトグラフィー処理することにより分離した。標識リン脂質をオートラジオグラフィーで可視化し、切り出されたスポットをシンチレーションカウントすることにより定量化した。実施例２：ＩＲＳ−1及びインシュリン受容体のインシュリン刺激チロシンリン酸化の減弱化細胞を5−25mMの範囲で濃度が増加するグルコースに晒すことにより、チロシン自己リン酸化及びＩＲＳ−1チロシンリン酸化が漸次減少した（図４）。ＩＲＳ−1に対する効果が優勢であり、インシュリン受容体自己リン酸化に対する対する効果はより少ない程度であるものと思われた。また、この効果は、インシュリン刺激の用量−応答曲線のシフトにより、最大インシュリン濃度以下でも明らかであった（図５）。実施例３：インシュリン受容体に対する高血糖誘発リン酸化の特異性高グルコースがインシュリン受容体の機能を特異的に減弱させるかどうかを決定するため、インシュリン様成長因子−1（ＩＧＦ−１）刺激ＩＧＦ−1受容体及びＩＲＳ−1リン酸化に対する高グルコースの効果をＨＩＲｃ細胞において調べた。ＨＩＲｃ細胞はＩＧＦ−1受容体の内在レベルが高い。β−サブユニットリン酸化及びＩＲＳ−1リン酸化の刺激は高グルコース及びＩＧＦ−1に晒すことによっては影響を受けなかった（図６）。実施例４：インシュリン受容体の末端43アミノ酸は高血糖誘発リン酸化の基質残基を含まない。変異インシュリン受容体ΔＣＴを形質移入したラット線維芽細胞を用いて、高グルコース介在インシュリン受容体阻害を容易にするインシュリン受容体の構造的特徴を調べた（図７）。変異ΔＣＴ受容体はインシュリン受容体の末端43アミノ酸（図３のアミノ酸1311−1355）を欠いている。この末端43アミノ酸には、ＰＫＣ活性化ホルボールエステルＰＭＡでのＰＭＡ刺激に応答してリン酸化される残基Thr₁₃₄₈及びSer₁₃₂₇が含まれる。ΔＣＴ発現細胞を濃度が増加するグルコースに晒すことにより、ＩＲＳ−1リン酸化に加えて、インシュリン受容体β−サブユニット自己リン酸化の用量依存性の減少が生じる（図７）。ΔＣＴ細胞におけるインシュリン受容体β−サブユニット自己リン酸化及びＩＲＳ−1リン酸化の高血糖誘発減弱は、これらの効果に末端43アミノ酸が介在せず、具体的にはTh r₁₃₄₈及び／又はSer₁₃₂₇のリン酸化が介在しないことを示した。実施例５：高血糖誘発リン酸化にはＰＫＣが介在する高血糖症はインシュリン受容体のキナーゼ活性の減少及びプロテインキナーゼＣの活性化を生じるが、グルコースの増加の効果はプロテインキナーゼＣに依存する機構によって進行する可能性がある。この問題に取り組むため、ＰＭＡ、又は高グルコース及びインシュリンに晒した細胞に由来するインシュリン受容体の二次元トリプシンホスホペプチド分析を行った（図８）。ホルボールエステル刺激はインシュリン受容体のリン酸化を1.5倍に増大した（図８）。二次元トリプシンホスホペプチドマッピングによるリン酸化パターンの分析は、グルコース刺激セリン／トレオニンリン酸化のパターンがＰＭＡによって誘発されるものに類似はするが同一ではないことを明らかにした。高グルコースは、1つの主要ペプチド及び2つの副次的ペプチドを含む3つの異なるペプチドのリン酸化を刺激した。対照的に、ＰＭＡは4つの異なるペプチドのリン酸化を刺激し、そのうちの3つは高グルコース条件下で観察されるものに類似する移動度で移動した。実施例６：インシュリン受容体ホスファチジルイノシトール（ＰＩ−３）に対する高グルコースの効果ホルボールエステルに応答してのプロテインキナーゼＣの活性化はインシュリン刺激ＰＩ−3キナーゼの活性を阻害することが知られている。ＰＩ−3キナーゼの活性を、グルコースとの予備インキュベーションの前後に、インシュリン刺激細胞の抗−ホスホチロシン免疫沈澱において調べた。25mMグルコースに1時間晒した細胞においては、インシュリン刺激ＰＩ−3キナーゼ活性は80％減少した（図９）。プロテインキナーゼＣの高度に特異的な阻害剤との細胞のインキュベーションは高グルコースのこの効果を妨げた。実施例７：インシュリン刺激有糸分裂誘発に対する高グルコースの効果インシュリン誘発ＤＮＡ合成に対する高グルコースの効果を、まず細胞を高グルコースに1時間、次いでインシュリン及びＢｒＤＵにさらに18時間晒すことにより調べた。高グルコースは、ＢｒＤＵの取込みによる測定で、インシュリン刺激細胞におけるＤＮＡ合成を30％減少させた（図１０）。細胞とＰＫＣ阻害剤ビスインドリルマレイミドとの共存インキュベーション（データは示さず）、又はＰＫＣ阻害剤Arg−Phe−Ala−Arg−Lys−Gly−Ala−Leu−Arg−Gln−Lys−Asn− Val（ペプチド19−31）（アップステート・バイオテクノロジー社（Upstate Bio technology Inc.）、レイクプラシッド、ニューヨーク州）の微量注入はＤＮＡ合成の阻害を部分的に逆転させた。実施例８：高血糖誘発インシュリン受容体リン酸化にはＭＡＰキナーゼが介在する無傷の細胞をＰＭＡで刺激することにより、精製プロテインキナーゼＣに晒された精製インシュリン受容体におけるリン酸化された部位に加えて、その場でのインシュリン受容体のリン酸化が生じた。これは、無傷の細胞においてキナーゼがさらに活性化されたことを示唆する。プロテインキナーゼＣの活性化はＲａｆキナーゼ→ＭＡＰキナーゼ→カスケードを生じる。ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ1及びＥＲＫ2）は、インシュリン受容体及び／又はＩＲＳ−1を負のフィードバックでリン酸化する可能性のあるセリン／トレオニンキナーゼである。このＭＡＰ→ キナーゼ介在セリン／トレオニンリン酸化はインシュリン刺激チロシンリン酸化を減弱し得る。ＭＡＰキナーゼカスケードの役割を、正常及び高グルコース濃度において細胞をＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）の特異的阻害剤に晒すことにより調べた。ＥＲＫ2の活性化はＳＤＳゲル電気泳動での移動度の変化によって確認した。ＭＥＫ阻害剤の添加はインシュリン受容体及びＩＲＳ−1リン酸化の減衰を逆転させなかった（図１２）。これらのデータは、ＥＲＫの活性化によってはインシュリン受容体又はＩＲＳ−1チロシンリン酸化の減衰が生じないことを示す。実施例９：インシュリン受容体に由来するペプチドの微量注入ＨＩＲｃＢ細胞を正常（5mM）又は高（25mM）グルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地中のガラスカバーグラス上で亜集密になるまで成長させ、血清飢餓状態にすることにより24時間静止状態にした。当該技術分野において公知の方法で合成した配列KTVNESASLRE（配列番号５）（セリン−1035）及びDDLHPSFPEVS（配列番号１）（セリン−1270）を含む合成環状ペプチドをヒトインシュリン受容体から誘導した。このペプチドを5mM ＮａＰＯ₄及び100mMＫＣｌ、ｐＨ7.2を含有する微量注入バッファに最終濃度l0mMまで溶解した。全ての微量注入試薬には、非注入細胞の同定を可能にするためウサギＩｇＧ（5mg／ml）を含めた。自動微量注入システムを用いて10⁵ ＩｇＧの導入を生じる約100ヘクトパスカルの典型的な針圧でサンプルを細胞原形質に微量注入した。微量注入のおよそ1時間後、100ng／mlインシュリン及び100mM ＢｒＤＵを添加することにより細胞を刺激した。細胞を37℃でさらに16時間インキュベートした後固定し、モノクローナル抗−ＢｒＤＵ抗体を用いて染色した。注入した細胞をフルオロセインイソチオシアネート結合ロバ抗−ウサギＩｇＧで同定した。核のＢｒＤＵの取込みをテトラメチルローダミンイソチオシアネート結合ロバ抗−マウスＩｇＧで検出した。細胞を蛍光顕微鏡で分析した。各カバーグラス上で約30 0個の細胞に微量注入し、約90％がうまく微量注入されたことが免疫蛍光染色により示された。 Ser−1035又はSer−1270ペプチドのいずれかを微量注入することにより、正常グルコース条件下でのインシュリン刺激細胞におけるＤＮＡ合成は僅かに増加し、高グルコース条件下でのインシュリン刺激ＤＮＡ合成は大きく増加した（図１３）。各々の場合において、Ser−1270ペプチド注入細胞におけるＤＮＡ合成の増加がSer−1035ペプチド注入細胞におけるものを上回った。これらのデータは、Ser−1270ペプチドに類似する配列を有するペプチドが高血糖条件によって誘発されるＰＫＣ介在インシュリン受容体リン酸化を阻害することを示す。前掲の本発明の説明は解説及び説明のための例である。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことが可能であることは理解されるべきである。したがって、以下の請求の範囲はそのような変更の全てを包含するものと解釈されることが意図されている。上に言及される全ての刊行物は、細胞系、ベクター、方法論及びここに説明される発明に関連して用いられる可能性のある前記刊行物に説明される他の技術を説明及び開示するため、（各々が参照することにより個別に組込まれた場合と同様の効果を伴って）参照することによりここに組込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 7/06 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/99 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 5/10 1/68 Ａ 9/99 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/48 5/00 Ａ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】１．インスリン受容体のセリン残基１２７０のプロテインキナーゼＣ媒介リン酸化の阻害活性により特性付けられるプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。２．アンタゴニストは、天然のヒトインスリン受容体ではないという条件で、プロテインキナーゼＣ基質の三次元構造モチーフを含み、この基質がヒトインスリン受容体のセリン残基１２７０を含むアミノ酸配列のペプチドモチーフを含むものである、請求項１に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。３．アンタゴニストの活性が自己リン酸化活性、チロシンキナーゼ活性、ホスファチジルイノシトールキナーゼ活性およびインスリン刺激ＤＮＡ合成よりなる群から選択されるインスリンにより刺激されたインスリン受容体活性を維持する、請求項１に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。４．前記活性がアンタゴニストとプロテインキナーゼＣとの相互作用により媒介される、請求項１に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト５．アンタゴニストの相互作用がプロテインキナーゼＣを不活性化する、請求項４に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。６．アンタゴニストの相互作用がプロテインキナーゼＣの触媒結合部位で起こる、請求項４に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。７．阻害活性がアンタゴニストとインスリン受容体との相互作用により媒介される、請求項１に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。８．インスリン受容体との相互作用がインスリン受容体のペプチドモチーフへの結合である、請求項７に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。９．ペプチドモチーフがインスリン受容体のセリン残基１２７０を含む、請求項８に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。 10．アンタゴニストがペプチドミメティック化合物である、請求項１に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。 11．アンタゴニストがペプチドである、請求項１に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。 12．ペプチドがアミノ酸配列DDLHPSFPEVS（配列番号１）を有する、請求項11に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト。 13．天然のインスリン受容体をコードするものではないという条件で、アミノ酸配列DDLHPSFPEVS（配列番号１）を有するポリペプチドをコードする、精製されたポリヌクレオチド。 14．アミノ酸配列DDLHPSFPEVS（配列番号１）をコードする、請求項13に記載の精製されたポリヌクレオチド。 15．配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項14に記載の精製されたポリヌクレオチド。 16．請求項13に記載のポリヌクレオチドを含有する構築物。 17．請求項16に記載の構築物を含有する形質転換宿主細胞。 18．原核細胞である、請求項17に記載の宿主細胞。 19．真核細胞である、請求項17に記載の宿主細胞。 20．プロテインキナーゼＣアンタゴニスト活性に関して候補化合物を試験する方法であって、候補化合物を、プロテインキナーゼＣおよびプロテインキナーゼＣの基質と接触させ、ここで、該基質はインスリン受容体のセリン残基１２７０を含むインスリン受容体のアミノ酸配列を有するものであり、そして該基質のリン酸化レベルを検出する、ことを含んでなる方法。 21．検出が放射性核種の取込みによる、請求項20に記載の方法。 22．基質のリン酸化レベルが自己リン酸化活性、チロシンキナーゼ活性、ホスファチジルイノシトールキナーゼ活性およびインスリン刺激ＤＮＡ合成よりなる群から選択されるインスリン受容体機能のレベルを検出することにより検出される、請求項20に記載の方法。 23．候補化合物がペプチドミメティック化合物である、請求項20に記載の方法。 24．候補化合物がペプチドである、請求項20に記載の方法。 25．前記接触を無細胞系で行う、請求項20に記載の方法。 26．基質がアミノ酸配列DDLHPSFPEVS（配列番号１）を含むポリペプチドである、請求項20に記載の方法。 27．基質がインスリン受容体である、請求項26に記載の方法。 28．インスリン受容体が哺乳動物細胞において発現される、請求項27に記載の方法。 29．前記接触をマイクロインジェクションにより行う、請求項28に記載の方法。 30．請求項20に記載の方法により同定されたＰＫＣアンタゴニスト。 31．1)請求項１に記載のプロテインキナーゼＣアンタゴニスト、および 2)生理学的に許容される担体、を含んでなる治療用組成物。 32．インスリン抵抗性の患者に、該患者のインスリン受容体のプロテインキナーゼＣリン酸化を阻害するのに有効な量の請求項31に記載の治療用組成物を投与することを含んでなる、インスリン抵抗性の治療方法。 33．インスリン抵抗性の患者がインスリン非依存型糖尿病に罹りやすい、請求項 32に記載の方法。 34．インスリン抵抗性の患者がインスリン非依存型糖尿病を有する、請求項32に記載の方法。 35．セリンリン酸化抵抗性のヒトインスリン受容体をコードする、精製されたポリヌクレオチド。 36．セリンリン酸化抵抗性のインスリン受容体が、天然のヒトインスリン受容体のアミノ酸配列と比べて、１２７０の残基位置にアミノ酸置換を含む、請求項 35に記載のポリヌクレオチド。 37．セリンリン酸化抵抗性のインスリン受容体が１２７０の残基位置にアラニンを含む、請求項35に記載のポリヌクレオチド。 38．請求項35に記載のポリヌクレオチドを含有する構築物。 39．請求項35に記載のポリヌクレオチドを含有する形質転換宿主細胞。 40．インスリン抵抗性の患者を治療する方法であって、患者の細胞を、請求項35 に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに機能的に連結された真核細胞プロモーター配列とを含有する構築物を用いて遺伝的に形質転換することを含んでなる方法。 41．細胞が骨格筋細胞である、請求項40に記載の方法。