PL178000B1 - Sposźb wykrywania obecnoşci antagonistźw glukagonu - Google Patents

Sposźb wykrywania obecnoşci antagonistźw glukagonu

Info

Publication number
PL178000B1
PL178000B1 PL93328856A PL32885693A PL178000B1 PL 178000 B1 PL178000 B1 PL 178000B1 PL 93328856 A PL93328856 A PL 93328856A PL 32885693 A PL32885693 A PL 32885693A PL 178000 B1 PL178000 B1 PL 178000B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
glucagon
sequence
amino acid
cells
dna
Prior art date
Application number
PL93328856A
Other languages
English (en)
Inventor
Wayne R. Kindsvogel
Laura J. Jelinek
Paul O. Sheppard
Francis J. Grant
Joseph L. Kuijper
Donald C. Foster
Si Lok
Patrick J. O'hara
Original Assignee
Zymogenetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymogenetics Inc filed Critical Zymogenetics Inc
Priority claimed from PCT/US1993/008174 external-priority patent/WO1994005789A1/en
Publication of PL178000B1 publication Critical patent/PL178000B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/605—Glucagons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności antagonistów glukagonu.
Glukagonjest hormonem peptydowym zbudowanym z 29 aminokwasów, produkowanym przez komórki alfa wysepek trzustkowych. Glukagon odpowiedzialny jest za utrzymywanie normalnego poziomu glukozy u wielu zwierząt, w tym u człowieka, przez działanie jako hormon działający odwrotnie niż insulina. W szczególności, podczas gdy insulina znana jest ze swego działania gwałtownie zmniejszającego poziom glukozy we krwi, glukagon równoważy to działanie, przyczyniając się do podniesienia poziomów glukozy we krwi.
Współdziałanie glukagonu i insulinyjest bardzo ważne dla utrzymania poziomów glukozy w organizmie. Uważa się, że zakłócenie równowagi glukagonu lub insuliny odgrywa rolę w kilku chorobach, j ak cukrzyca czy cukrzycowa kwasica ketonowa. Zgodnie z tą teorią, stan hiperglikemii w cukrzycy może być spowodowany nie tylko słab^utyli^<y^glukozy (spowodowanąobniżeniem insuliny), ale także nadprodukcją glukozy spowodowaną podwyższonym stężeniem glukagonu (patrz: Unger, „Diabetes and alpha celi”, Diabetes 25: 136-151,1976; Unger i Orci, „The essential role of glucagon in the pathogenesis of diabetes mellitus”, Lancet 1:14-16,1975).
178 000
Ważnym czynnikiem w badaniu glukagonu i jego roli w chorobach, takich jak cukrzyca, jest receptor glukagonu, który po związaniu się z glukagonem przekazuje sygnał do komórki, w ten sposób wyzwalając glikogenolizę (hydrolizę glikogenu) i glukoneogenezę (syntezę glukozy).
Uważa się obecnie, że w efekcie działania glukagonu pośredniczy po części podwyższenie poziomów wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP). W szczególności związanie się glukagonu zjego receptorem komórkowym aktywuje cyklazę adenylową do produkcji cAMP, i w ten sposób podnosi poziom wewnątrzkomórkowego c/AMP Wzrost wewnątrzkomórkowego cAMP, jak się uważa, powoduje glikogenolizę i glukoneogenezę, a w konsekwencji wzrost produkcji glukozy przez wątrobę (patrz, Unson i in., ,,Biological Activities of des-His1Glu9] Glucagon Amide, a Glucagon Antagonist”, Peptides 10: 111 71-1777, 1989).
Sugeruje się, jednakże, obecność dodatkowych szlaków metabolicznych, stymulujących glikogenolizę i glukoneogenezę. W szczególności, istniej ą doniesienia, że glukagon wiąże się z receptorem w błonie komórkowej hepatocyta sprzężonym przez białko G z fosfolipazą C. Na skutek stymulacji białko to powoduje rozkład 4,5-bifosforanu fosfatydyloinozytolu do wtórnego przekaźnika jakim jest trifosforan inozytolu i 1,2-diacy loglicerol (patrz. Wakelam i in., Activation of two signal-transduction systems in hepatocytes by glucagon”, Nature 323:68-71, 1986; Unson i in., Peptides 10:1171-1177,1989; Pittneri Fain, Biochem. J. 277:371-378,1991). Pobudzenie metabolizmu fosfolipidu inozytolu przez glukagon może być dodatkowym szlakiem metabolicznym, na którym glukagon pobudza glikogenolizę i glukoneogenezę.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania antagonistów glukagonu z wykorzystaniem rekombinowanego receptora glukagonu.
Figura 1 przedstawia strukturę reprezentatywnego receptora glukagonu. Symbole użyte: EATD (N-końcowa domena zewnątrzkomórkowa), otoczona linią kropkowaną, CM (błona komórkowa); ED (domena efektorowa), otoczona linią przerywaną; 1ID, pierwsza pętla wewnątrzkomórkowa; 2ID, druga pętla wewnątrzkomórkowa; 3ID, trzecia pętla wewnątrzkomórkowa; C-ID, C-końcowa domena wewnątrzkomórkowa; 1ELD, pierwsza pętla zewnątrzkomórkowa; 2ELD, druga pętla zewnątrzkomórkowa; 3ELD, trzecia pętla zewnątrzkomórkowa; TMD1, pierwsza domena śródbłonowa; TMD2, druga domena śródbłonowa; TMD3, trzecia domena śródbłonowa; TMD4, czwarta domena śródbłonowa; TMD5, piąta domena śródbłonowa; TMD6, szósta domena śródbłonowa; TMD7, siódma domena śródbłonowa.
Figura 2 przedstawia graficznie hydrofobowość szczurzego receptora glukagonu.
Figura 3 przedstawia graficznie wiązanie 125I-glukagonu z receptorem glukagonu.
Figura 4 jest analizą Scatcharda prawdopodobnego Kd dla receptorów glukagonu.
Figura 5 jest sekwencją aminokwasową szczurzego receptora glukagonu z zakreślonymi domenami śródbłonowymi.
Zgłoszony równolegle wynalazek (P 307 746) dostarcza wyizolowanych cząsteczek DNA, kodujących receptory glukagonu. W swej natywnej konfiguracji, receptory glukagonu, jak się uważa, występujajako białka związane z błoną, składające się z zewnątrzkomórkowej domeny N-końcowej, jak również z kilku mniejszych wewnętrznych i zewnętrznych domen (patrz, Figura 1). W kontekście niniejszego wynalazku, „receptor glukagonu” odnosi się do takiego białka i podobnych pochodnych. Pochodne obejmują warianty alleliczne i warianty poddane inżynierii genetycznej, zawierające konserwatywne podstawienia aminokwasowe i/lub mniej istotne addycje, substytucje czy delecje aminokwasów. Receptory glukagonu według powołanego wynalazku są zdolne do wiązania glukagonu i przekazywania sygnału dostarczonego przez glukagon komórce. Korzystnie, receptory glukagonu są zdolne do wiązania glukagonu z Kd 100nm lub mniej, jeszcze korzystniej 50nm lub mniej, i najkorzystniej 33nm lub mniej. Reprezentatywne testy, które mogą być użyte w celu określenia wiązania glukagonu przez receptor glukagonu opisane są szczegółowo w przykładach 3 i 6.
Przekazywanie sygnału zwykle zachodzi gdy szlak odpowiedzi aktywowany jest zewnętrznym bodźcem, zwykle choć nie zawsze, bezpośrednio sprzężonym z receptorem związanym z błoną. Szlak odpowiedzi zwykle wywołuje odpowiedzi komórkowe, takjak wydzielenie·' macierzy
178 000 zewnątrzkomórkowej przez zdolne do odpowiedzi linie komórkowe, wydzielenie hormonu, chemotaksję, różnicowanie czy zapoczątkowanie lub zahamowanie podziału komórek. W znaczeniu tu użytym związek receptorów ze szlakiem odpowiedzi odnosi się do bezpośredniej aktywacji szlaku odpowiedzi lub przekazania sygnału przez wtórny przekaźnik,jak np. białko G, aktywujący szlak odpowiedzi komórkowej.
Receptory glukagonu mogą używać wielu komórkowych szlaków odpowiedzi, w celu przekazywania do komórki sygnału związania się glukagonu, w tym np. szlaku cyklazy adenylowej i szlakuwapnia wewnątrzkomórkowego. Testy badające aktywność cyklazy adenylowej dobrze znane są specjalistom, i obejmują np. opisany przez Lin i in. (Biochemistry, 14 1559-1563,1975).
Aktywność biologiczną receptora glukagonu można mierzyć sposobem opartym na stężeniu wapnia wewnątrzkomórkowego (patrz, Grynkiewicz i in., J. Biol. Chem. 260: 3440-3450,
1985), jak również przez użycie systemu reporterowego lucyferazy, który opisano szczegółowo poniżej. Dodatkowo, odpowiedzi biologiczne zachodzące przez szlak trifosforanu inozytolu mogąbyć określane przez pomiar metabolizmu trifosforanu inozytolu, jak to opisano w publikacji Subersa i Nathansona (J. Mol. Cell. Cardiol., 20: 131-140, 1988) czy Pittnera i Fain'a (Biochem. J. 277:371-378, 1991). Należy zauważyć, że nie wszystkie szlaki odpowiedzi muszą występować by receptor glukagonu przekazał sygnał do komórki. Przykładowo, niektóre odpowiedzi komórkowe, jak np. zwiększenie poziomów wapnia wewnątrzkomórkowego, mogą być wywołane przez związanie glukagonu zjego receptorem pod nieobecność sygnału cAMP czy fosforanu inozytolu.
Izolacja klonów cDNA receptora glukagonu
Cząsteczki genomowego lub cDNA kodujące receptory glukagonu mogą być uzyskane z bibliotek, które przygotowane zostały z komórek i tkanek zgodnie z procedurami jak ta opisana poniżej i w przykładach. Komórki i tkanki, które mogąbyć użyte w ramach niniejszego wynalazku, mogą być uzyskane od różnych ssaków na przykład: ludzi, makaków, bydła, świń, koni, psów, szczurów czy myszy. Najlepszymi -komórkami i tkankami, które mogąbyć użyte są: tkanka tłuszczowa, nerka, trzustka, serce i wątroba. Szczurzy receptor glukagonu może być wyizolowany i klonowany z wykorzystaniem procedur opisanych poniżej. Pokrótce, wyizolowano poli(A)+ RNA ze szczurów szczepu Sprague Dawley, i użytojako matrycy do syntezy cDNA, jak to opisano przez Houamed i in. (Science 252:1318-1321, 1991), w celu wytworzenia cDNA o pełnej długości. Stworzono bibliotekę, zawierającą około 1 x 106 klonów, w plazmidzie ekspresyjnym ssaków, drogą klonowania kierowanego cDNA dłuższego niż 800 bp. DNA plazmidowe, przygotowane przez pulowanie z 5000 klonów każde, transfekowano do komórki COS-7, które wybierano i hodowano na szkiełkach mikroskopowych. Transfekowane komórki badano 72 godziny później przez wiązanie 125I-glukagonu i radiografię w emulsji (McMachan i in., EMBOJ. 10:2821 -2832,1991). Pule pozytywne rozdzielane były dopóki nie wyizolowano pojedynczego klonu. Plazmid uzyskany z pojedynczego klonu, oznaczony pLJ4, - zawierający wstawkę o długości około 2.0 kb, która kodowała białko składające się z 485 aminokwasów o przewidywanej masie cząsteczkowej rzędu 54962 Da (patrz, Identyfikator Sekw. Nr: 15).
Do izolowania i klonowania ludzkiego receptora glukagonu można wykorzystać różnorodne techniki włącznie np. z użyciem Reakcji Łańcuchowej Polimerazy („PCR”) w celu amplifikacji sekwencji kodujących receptor glukagonu (przykład 4), które mogąbyć użyte do identyfikacji bibliotek zawierających sekwencje kodujące ludzki receptor glukagonu, i następnie klonowaniem receptora (przykład 5). Szczególnie korzystne strategie klonowania ludzkiego receptora glukagonu zamieszczono poniżej w przykładach 4 i 5. Alternatywnie, można przygotować bibliotekę ekspresyjną zawierającą ludzkie cDNA, z odpowiednich źródeł RNA, jak to opisano w przykładzie 1 i przeglądać, jak to opisano w przykładzie 3, poszukując klonów, w których zachodzi ekspresja do funkcjonowania ludzkiego receptora glukagonu.
Wytwarzanie rekombinowanych receptorów glukagonu
Rekombinowane receptory glukagonu mogą być wytwarzane w komórkach gospodarzy zawierających konstrukt DNA składający się z pierwszego segmentu DNA kodującego receptor glukagonu operacyjnie związanego z dodatkowymi segmentami DNA koniecznymi do ekspresji
178 000 pierwszego segmentu DNA. Definicja „receptory glukagonu” obejmuje równieżjego pochodne, które są zasadniczno podobne. Ponadto, receptory glukagonu mogą być kodowane przez sekwencje DNA, które są zasadniczo podobne do ujawnionych tu sekwencji DNA. W znaczeniu tu użytym, sekwencja DNAjest uznana za „zasadniczo podobną”, gdy: (a) sekwencj a DNA uzyskana jest z regionu kodującego natywnego genu receptora glukagonu (włącznie, przykładowo, z wariantami allelicznymi sekwencji ujawnionej poniżej); (b) sekwencja DNA jest zdolna do hybrydyzacji z sekwencjami DNA według wynalazku w warunkach wysokiej i niskiej swoistości (patrz, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd 2., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989); lub (c) sekwencja DNA jest /.degenerowana, jako wynik kodu genetycznego, w stosunku do sekwencji DNA zdefiniowanej w (a) lub (b).
Mutacje w sekwencjach nukleotydowych skonstruowanych w celu ekspresji wariantów receptorów glukagonu, powinny zachowywać ramkę odczytu sekwencji kodującej. Ponadto, mutacje korzystnie nie powinny tworzyć regionów komplementarnych, które mogłyby hybrydyzować tworząc struktury drugorzędowe mRNA, jak pętle czy „spinki do włosów”, które mogłyby zakłócać translację mRNA dla receptora. Jakkolwiek, miejsce mutacji może być określone, nie jest konieczne by natura tych mutacji per se była określona. Przykładowo, w celu wyboru optymalnej charakterystyki mutanów w danym miej scu, można przeprowadzić losową mutagenezę określonego kodonu, i badać aktywność biologicznąpowstałych mutantów receptora.
Mutacje mogą być wprowadzone w poszczególne loci przez syntetyzowanie oligonukleotydów zawierających sekwencję zmutowaną, otoczoną miejscami restrykcyjnymi, umożliwiającymi ligację do fragmentów natywnej sekwencji. W następstwie ligacji, powstała zrekonstruowana sekwencja koduje pochodną z żądaną inercją, substytucją lub delecją aminokwasów..
Alternatywnie, można użyć kierowanej miejscowo specyficznej mutagenezy, w celu uzyskania zmienionego genu posiadaj ącego kodon zmieniony przez, w zależności od potrzeby, substytucję, delecję lub insercję. Przykładowe metody wprowadzające wspomniane zmiany zamieszczone są w następujących publikacjach: Walder i in. (Gene, 42: 133, 1986); Bauer i in., (Gene, 37:73,1985); Craik (Bio Techniques, January 1985,12-19); Smith i in., (Genetic Engineering; Principles and Methods Plenum Press, 1981); Sambrook i in., (j. w.).
Pierwszorzędowa struktura aminokwasowa receptora glukagonu może być również zmieniana przez tworzenie konwalencyjnych lub agregacyjnych koniugatów z innymi ugrupowaniami chemicznymi, takimi jak grupy glikozylowe, lipidy, fosforany, grupy acetylowe lub z innymi białkami i polipeptydami. W kolejnym wykonaniu, receptory glukagonu mogą być poddane fuzji z innymi peptydami, co ułatwia oczyszczanie czy identyfikację receptorów glukagonu. Przykładowo, receptor glukagonu może być wytworzony jako białko fuzyjne z sekwencjąpolipeptydowąFLAG (patrz, U. S., Patent USA nr 4,851,341; patrz również Hopp i in., Bio/Technology 6: 1204, 1988). Sekwencja polipeptydowa FLAG jest wysoce antygenowa i dostarcza epitopu do wiązania ze specyficznym przeciwciałem monoklonalnym, co umożliwia szybkie oczyszczanie rekombinowanego białka. Sekwencja ta jest również specyficznie cięta wołową enterokinazą śluzówko wą w miejscu następującym po parze Asp-Lys.
W zależności od potrzeby, mogąbyć wytworzone liczne konstrukty DNA zawierające całą bądź część sekwencji nukleotydowej natywnego receptora glukagonu i jego wariantów, jak omówiono powyżej. W kontekście niniejszego wynalazku, konstrukt DNA odnosi się do cząsteczki DNA lub klonu takiej cząsteczki (jedno-lub dwuniciowej), która została zmieniona przez interwencję człowieka tak, że zawiera segmenty DNA połączone lub uporządkowane w sposób, wjaki w całości nie występuje w naturze. Konstrukt DNA składa się z pierwszego segmentu DNA kodującego receptor glukagonu, operacyjnie związanego z dodatkowymi segmentami DNA koniecznymi do ekspresji pierwszego segmentu DNA. Dodatkowe segmenty obejmują promotor i terminatory transkrypcji i mogąjeszcze obejmować wzmacniacze i inne elementy.
Konstrukty DNA, znane również jako wektory ekspresyjne, mogą również zawierać segmenty DNA niezbędne do ukierunkowania sekrecji interesującego polipeptydu. Takie segmenty DNA mogą zawierać przynajmniej jedną sygnałową sekwencję wydzielniczą. Do korzystnych sekwencji sygnałowych należą: sekwencja sygnałowa glukagonu (sekwencja pre-pro), sekwencja
178 000 sygnałowa czynnika alfa (sekwencja pre-pro; Kurjan i Herskowitz, Cell 30:933-943, 1982; Kurjan i in., U. S. PatentNo. 4,546,082; Brake, EP 116,201); sekwencja sygnałowa PH05 (Beck i in., WO 86/00637); sekwencja sygnałowa BAR1 (McKay i in., U. S. Patent No. 4,613,572; McKay W087/002670); sekwencja sygnałowa SUC2(Carlson i m., Mol Cell Biol, 3:439-447,1983); sekwencja sygnałowa α-1-antytrypsyny (Kurachi i in., Proc NatlAcad Sci USA, 78: 6826-6830, 1981), sekwencja sygnałowa inhibitora a-2 plazminy (Tone i in., J. Biochem.(Tokyo) 102: 1033-1042, 1987), sekwencja sygnałowa tkankowego aktywatora plazminogenu (Pennica i in., Nature 301:214-221,1983), sekwencja sygnałowa PhoAE. coli(Yuan i in., J Biol. Chem, 265: 13528-13552,1990) lub jakakolwiek bakteryjna sekwencja sygnałowa opisana przykładowo w publikacji Olivera (Ann. Rev. Microbiol. 39: 615-649. 1985). Alternatywnie, wydzielnicza sekwencja sygnałowa może być zsyntetyzowana zgodnie z zasadami określonymi, przykładowo, przezvonHeinje (Eur. J. Biochem. 133:17-21,1983; J. Mol. Biol. 184:99-1.05,1985;Nuc. Acids Res. 14: 4683-4690, 1986).
Wydziel nicze sekwencje sygnałowe mogą być użyte pojedynczo lub w kombinacji. Przykładowo pierwsza wydzielnicza sekwencja sygnałowa może być użyta w kombinacji z sekwencjąkodującą trzecią domenę Barriera (opisanąw patencie USANr 5,037,243 i umieszczoną tu w całości jako odnośnik). Sekwencja kodująca trzecią domenę Barriera może być ustawiona we właściwej ramce odczytu na końcu 3' interesującej sekwencji DNA lub na końcu 5' segmentu DNA, oraz we właściwej ramce odczytu zarówno z wydzielniczą sekwencją sygnałową i interesującym segmentem DNA.
By umożliwić ekspresję, cząsteczka DNA kodująca receptor glukagonu, wprowadzanajest do odpowiedniego konstruktu DNA, który zkolei użytyjest do transformacji bądź transfekcji komórek gospodarza nadających się do ekspresji. Komórka-gospodarz do użycia w wykonaniu niniejszego wynalazku obejmuje komórki ssacze, ptasie, roślinne, owadzie, bakterii i grzybów. Korzystne komórki eukariotyczne obejmują hodowane linie komórek ssaków (np. linie komórkowe gryzoni lub ludzkie) komórki grzybów, włącznie z gatunkami drożdży (np. Saccharomyces spp. a zwłaszcza S. cerevisiae, Schizosaccharomyces spp. czy Kluyveromyces spp.) lub pleśni (np. Aspergillus spp. Neurospora spp.). Szczepy Schizosaccharomyces cerevisiae są szczególnie użyteczne. Sposoby wytwarzania białek rekombinowanych, z wykorzystaniem różnych komórek prokariotycznych i eukariotycznych, są znane specjalistom (patrz, „Gene Expression Technology”, Methods in Enzymology,, vol. 185, Goeddel (ed.) Academic Press, San Diego, Calif., 1990;patrz również:, „Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology”, Methods in Enzymology’, Gutrie i Fink (eds.) Academic Press, San Diego, Calif., 1991). Generalnie, komórka gospodarz wybrana jest na podstawie jej zdolności do produkowania interesującego białka w dużych ilościach czy zdolności do przeprowadzenia przynajmniej kilku etapów obróbki niezbędnej do aktywności biologicznej białka. W ten sposób zminimalizowanajest liczba sekwencji klonowanego DNA, które muszą być transfekowane do komórki-gospodarza, a maksymalizowany jest całkowity uzysk biologicznie aktywnego białka.
Odpowiednie wektory dla drożdży, do użycia w niniejszym wynalazku, obejmują: YRp7 (Struhl i in., Proc Natl A.cad Sci USA, 76: 1035-1039, 1978), YEp 13 (Broach i in., Gene 8: 121-133,1979), wektory POT (Kawasaki i in., U. S. Patent No. 4,931,373, zamieszczony tu jako odnośnik), pJDB249 i pJDB219 (Beggs, Nature 275:104-108,1987) i ich pochodne. Wektory te powinny zawierać odpowiedni marker umożliwiający selekcję, który może być jednym z wielu genów o fenotypie dominującym, dla których istniejąodpowiednie metody selekcji rekombinantów. Najkorzystniejsze markery umożliwiające selekcję należą do wspomagających wzrost komórki gospodarza, dostarczając oporności na antybiotyki lub umożliwiające komórce użytkowanie specyficznych źródeł węgla, i obejmują LEU2 (Broach i in., ibid), URA3 (Botstein i in., Gene 8:17,1979), HIS3 (Struhl i in., ibid) czy POT1 (Kawasaki i in., ibid). Innym odpowiednim markerem jest gen CAT, odpowiadający za oporność komórek drożdży na chloramfenikol.
Korzystne promotory do użycia w drożdżach obejmująpromotory genów glikolitycznych drożdży (Hitzeman i in., J Biol. Chem. 255:12073-12080,1980; Alber i Kawasaki, J. Mol.Appl. Genet. 1: 419-434,1982; Kawasaki, U. S. Patent No. 4,599,311) łub geny dehydrogenazy alko178 000 holowej (Young i in., Genetic Engneering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender i in. (eds.),str 355, Plenum, New York, 1982; Ammerer, Meth Enzymol. 101:192-201,1983). Wtym względzie szczególnie korzystny jest promotor TPI1 (Kawasaki, Patent USA nr 4,599,311,
1986) i promotor ADH2-4 (Rwsel i in., Nature 304:652-654; Irani i Kiigore, zgłoszenie patentowe USA nr 07/784,653, zamieszczony tu jako odnośnik). Jednostki ekspresji mogą również zawierać terminator transkrypcji. Korzystnym terminatorem transkrypcji jest terminator TPI1 (Alber i Kawasaki, ibid).
Receptory glukagonu mogą być także wytwarzane w wyniku ekspresji w pleśniach, przykładowo w szczepach Aspergillus (McKnight i in., Patent USA nr 4,935, 349, zamieszczony tujako odnośnik). Przykłady odpowiednich promotorów obejmująm. in. uzyskane z genów glikolitycznych Aspergillus nidulans, jak np. promotor ADH3 (McKnigt i in., EMBO J. 4: 2093-2099, 1995) i promotor tpiA. Przykładem odpowiedniego terminatora jest terminator ADH3 (McKnight i im, ibid, 1985). Jednostki ekspresji, w których stosuje się takie składniki, są sklonowane do wektorów zdolnych do integracji z chromosomalnym DNA Aspergillus©.
Techniki transformowania grzybów znane sąw literaturze, i zostały opisane przykładowo, przez Beggs (ibid), Hinnen i in., (Proc Natl Acad Sci USA 75: 1929-1933, 1978), Yelton i in., (Proc Natl AcadSci USA 81:1740-1747,1984) i Russel (Nature 301:167-169,1983). Genotyp komórek gospodarzy powinien zawierać defekt genetyczny uzupełniany przez marker obecny w wektorze ekspresyjnym. Wybór konkretnego gospodarza i markera znajduje się w zakresie wiedzy specjalisty. W celu polepszenia produkcji białka heterologicznego w drożdżach, przykładowo, korzystnie szczep gospodarza posiada mutację taką, jak np. mutacja pep4 (Jones, Genetics 85: 23-33·, 1977), która powoduje zmniejszoną aktywność preolityczna.
Oprócz komórek grzybów mogą być użyte komórki ssaków. Korzystne do zastosowania komórki obejmują linie komórkowe COS-1 (ATCCNr CRL1650) COS-7 (ATCC nr CRL 1651), BHK (ATCC Nr CRL 1632) i 293 (ATCC Nr CRL 1573; Graham i in., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977). Korzy stnąliniąBHKjest linia BHK 570 (zdeponowana w American Type Culture Collection pod numerem CRL 10314). Dodatkowo, możliwejest użycie szeregu innych linii komórkowych ssaków włącznie z komórkami szczura Hepl (ATCC Nr CRL 1600), Hepll (ATCC Nr CRL 1548), TCMK (ATCC Nr CCL 139), ludzkiego płuca (ATCC Nr CCL 75.1), ludzkiego wątrobiaka (ATCC Nr HTB052), Hep G2 (ATCC Nr HB 8065), mysiej wątroby (ATCC Nr CCL 29.1), NCTC1469 (ATCCNrCCL 9.1), SP2/0-Ag14 (ATCCNr 1581),HIT-T15(ATCCNrCRL 1777) i RINm 5AHT2B (Orskov 1 Nlelson, FEBS 229(1): 175-178, 1988).
Wektory ekspresyjne ssaków, do użycia w przedstawionym sposobie zawierają promotor zdolny do kierowania transkrypcją klonowanego genu lub cDNA. Korzystne promotory obejmują promotory wirusowe i komórkowe. Wirusowe promotory obejmują: bezpośredni wczesny promotor cytomegalowirusa (Boshart i in., Cell 41:521 -530,1985) i promotor SV40 (Subramani im,Mol. Cell. Biol. 1854-864,1981). Komórkowe promotory obejmująmysipromotor metalotioneiny 1 (Palmiter i in., Patent USA Nr 4,579,821), mysi promotor Vk (Bergman i in., Proc Natl Acad Sci USA 81: 7041-7045, 1983; Grant i in., NucAcidsRes 15:5496, 1987) i mysi promotor VH (Loh i in., Cell 33: 85-93, 1983). Szczególnie korzystnymjest główny późny promotor Adenowirusa 2 (Kaufman i Sharp, Mol. Cell. Biol. 2:1304-13199,192). Wektory te mogą zawierać zestaw miejsc do składania RNA położonych poniżej promotora i powyżej sekwencji DNA kodującej interesujący peptyd czy białko. Korzystne miejsca składania RNA mogą być uzyskane z adenowirusów i/lub genów immunoglobulin. W wektorze ekspresyjnym umiejscowiony jest również sygnał poliadenylacji, poniżej sekwencji kodującej. Odpowiednie sygnały poliadenylacji obejmują wczesny i późny sygnał poliadenylacji z SV40 (Kaufman i Sharp, ibid), sygnał poliadenylacji z regionu E1B Adenowirusa 5 i terminatora ludzkiego genu hormonu wzrostu (DeNoto i m.,Nuc Acids Res 9: 3719-3730,1981). Wektor ekspresyjny może zawierać wirusową niekodującąsekwencję liderowąjjaknp. trzyczęściowy lider adenowirusa 2, połoźonapomiędzy promotorem i miejscami składania RNA. Korzystne wektory mogą zawierać sekwencje wzmacniaczy, jak np. wzmacniacz SV40 imysi wzmacniacz μ(Gillies, Cell 33:717-728,1883). Wektory
178 000 ekspresyjne mogązawierać również sekwencje kodujące adenowirusowe VA RNA. Odpowiednie wektory mogą być uzyskane komercjalnie (np. Stratagene, La Jolla, CA).
Klonowane sekwencje DNA mogą być wprowadzone do hodowanych komórek ssaków przez, przykładowo, transfekcję z użyciem fosforanu wapnia (Wigier i in., Cell 14: 725, 1978; Corsaro i Pearson, Somatic Celi Genetics 7: 609,1981; Graham i Van der Eb, Yirology 52: 456, 1973), elektroporację (Neumann i in., EMBO J 1: 841-845, 1982) czy transfekcję z użyciem DEAE-dekstranu (Ausubel i in., (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), które są zamieszczone tu jako odnośniki. W celu identyfikacji komórek, które na stałe zintegrowały klonowane DNA, wprowadza się wraz z interesującym genem lub cDNA marker umożliwiający selekcję. Korzystny marker do użycia w hodowanych komórkach ssaków obejmuje geny odpowiedzialne za oporność na lekijak neomycyna, higromycyna i metotreksat. Marker umożliwiający selekcję, powinien być markerem zdolnym do amplifikacji. Korzystnym markerem zdolnym do amplifikacji jest gen DHFR i gen oporności na neomycynę. Markery umożliwiające selekcję opisane zostały przez Thilly (Mammalian Cell Technology,, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, zamieszczone tujako odnośnik). Wybór odpowiedniego markera leży w zakresie wiedzy specjalisty.
Markery umożliwiające selekcję mogą być wprowadzane do komórki w osobnym wektorze w tym samym czasie co sekwencje receptora glukagonu, lub mogą być wprowadzane na tym samym wektorze. W przypadku użycia tego samego wektora marker i sekwencja receptora glukagonu mogą znajdować się pod kontrolą różnych promotorów lub tego samego promotora, powodując powstanie transkryptu dicistronowego. Konstrukcje tego typu znane są specjalistom (przykładowo, Levinson i Simonsen, Patent USA Nr 4,713,339). Może być korzystne dodanie do mieszaniny wprowadzanej do komórki, dodatkowego DNA znanego jako „DNA nośnikowe”.
Transferowanym komórkom ssaków należy umożliwić wzrost przez pewien okres, zwykle 1-2 dni, w celu rozpoczęcia ekspresji interesujących sekwencji DNA. Selekcja pod kątem leku dokonywana jest w celu umożliwienia dalszego wzrostu komórkom ekspresjonującym marker w sposób stały. W przypadku komórek transfekowanych markerem umożliwiającym selekcję zdolnym do amplifikacji, można zwiększać stężenie leku etapowo, wcelu selekcji zwiększonej liczby kopii klonowanej sekwencji, a zatem zwiększonego poziomu ekspresji. Komórki ekspresjonujące wprowadzone sekwencje są wybierane i badane na produkcję interesującego białka w pożądanej formie czy na pożądanym poziomie. Komórki, które spełniają te kryteria mogą być dalej klonowane i rozhodowywane do produkcji.
Korzystnymi prokariotycznymi gospodarzami do użycia w przedstawionym sposobie są szczepy Escherichia coli, jednakże Bacillus czy inne rodzaje są równie użyteczne. Techniki transformowania tych gospodarzy i ekspresjonowania obcych sklonowanych sekwencji DNA, są dobrze znane specjalistom (patrz, np. Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory M.anual, Cold Spimg Harbor Laboratory, 1982, załączony tu jako odnośnik); czy Sambrook i in.j.w.). Wektory używane do ekspresji klonowanych sekwencji DNA w gospodarzach bakteryjnych zwykle zawierają marker umożliwiający selekcję, jak np. geny oporności na antybiotyki, i promotory działające w komórce gospodarza. Odpowiednie promotory obejmująsystemy promotora trp (Nicholas i Yanofsky, Meth. Enzymol. 101: 155-1161,1983),lac(Casadabani in., J Bacteriol. 143:1980)i faga X(Queen, J. Mol.Appl. Genet. 2:1-10,1983). Plazmidy użyteczne do transformowania bakterii obejmująpBR322 (Bolivar i in., Gene 2:95-113,1977), plazmidy pUC (Messing, Meth. Enzymol. 101:20-78,1983; Vieira i Messing, Gene 19:259-268,1982),pCQV2 (Queen, ibid) oraz ich pochodne. Plazmidy mogą zawierać zarówno sekwencje bakteryjne jak i wirusowe.
Na podstawie danych tu wskazówek, promotory, terminatory i sposoby na wprowadzenie wektorów ekspresyjnych kodujących receptory glukagonu do komórki roślinnych, ptasich i owadów stają się oczywiste dla specjalisty. Użycie bakulowirusów, przykładowo, jako wektorów do ekspresji heterologicznych sekwencji DNA w komórkach owadów opisane zostało przez Atkinson i in. (Pestic. Sci. 28: 215-224, 1990). Dodatkowo, użycie Agrobacterium rhizogenes
178 000 jako wektora do ekspresji genów w komórkach roślinnych opisane zostało przez Sinkar i in. (J. Biosc. (Bangalore) 11: 47-58, 1987).
Komórki-gospodarze, zawierające konstrukt DNA, określony powyżej, są hodowane w celu ekspresji segmentu DNA kodującego receptor glukagonu. Komórki hodowane są zgodnie z metodami standardowymi w pożywkach hodowlanych zawierających substancje odżywcze potrzebne do wzrostu wybranych komórek. Liczne odpowiednie pożywki znane są specjalistom i zawierajązwykle: źródło węgla, źródło azotu, niezbędne aminokwasy, witaminy i sole mineralne, jak również inne składniki np.·. czynniki wzrostowe czy surowicę, co może być niezbędne dla niektórych komórek. Pożywka powinna zwykle selekcjonować komórki zawierające konstrukt DNA, przez przykładowo selekcję pod kątem leku lub braku niezbędnej substancji, co jest zapewniane przez marker umożliwiający selekcję, znajdujący się na konstrukcie DNA lub kotransfekowany wraz z konstruktem DNA.
Odpowiednie warunki hodowli komórek drożdży obejmują hodowlę w pożywce o zdefiniowanym składzie, zawierającej źródło azotu, które może być źródłem nieaminokwasowym lub wyciągiem z drożdży, sole nieorganiczne, witaminy i niezbędne aminokwasy w temperaturze pomiędzy 4°C a 37°C, a zwłaszcza w temperaturze 30°C. pH pożywki, najkorzystniej, utrzymywane jest w granicach pomiędzy 2 a 8, a zwłaszcza w okolicy pH 5-6. Sposoby utrzymywania stałego pH obeemujabuforowanie i stałąkontrolę pH. Korzystnym czynnikiem do kontrolowania pH jest wodorotlenek sodu. Korzystnymi czynnikami buforującymi są kwas bursztynowy i BisTris (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Z powodu dążności drożdży do hiperglikozylacji białek heterologicznych korzystne jest by ekspresjonować receptor glukagonu, w komórkach drożdży’ posiadających defekt genu niezbędnego do glikozylacji asparaginy. Komórkite rosną najchętniej w pożywce zawierającej stabilizator osmotyczny. Korzystnym stabilizatorem osmotycznymjest sorbitol dodany do pożywki w stężeniu pomiędzy 0.1 M a 1.5 M, zaś najkorzystniej w stężeniu między 0.5 a 1.0 M. Hodowane komórki ssaków zwykle hodowane są w dostępnych w handlu pożywkach zwierających surowicę lub bezsurowiczych. Wybór pożywki i warunków odpowiednich dla poszczególnej linii komórkowej leży w zakresie wiedzy specjalisty.
Receptory glukagonu mogą być również ekspresjonowane w niebędących człowiekiem zwierzętach transgenicznych, a zwłaszcza transgenicznych zwierzętach ciepłokrwistych. Sposoby tworzenia zwierząt transgenicznych obejmuj ących myszy, szczury, króliki, owce i świnie znane są specjalistom i zamieszczone są, przykładowo, w Hammer i in. (Nature, 315: 680-683, 1985), Palmiter i in. (Science, 222: 809-814, 1983), Brister i in. (Proc Natl Acad Sci USA 82: 4438-4442), Palmiter i Brister (Cell 41: 343-345,1985) i Patent USA nr 4,736,866, zamieszczonym tu jako odnośnik. Pokrótce, jednostkę ekspresyjną, zawierającą sekwencję DNA, która ma ulec ekspresji, wraz z odpowiednio położonymi sekwencjami kontrolującymi ekspresję, wprowadza się do przedjądrzy zapłodnionych komórekjajowych. Zwykle wprowadzenia DNA dokonuje się przez mikroiniekcję. Integrację wstrzykniętego DNA bada się przez analizę DNA z fragmentów tkanki, zwykle przez próbkę pobrarnąz ogona. Jest zwykle korzystne wprowadzenie DNA do linii komórek macierzystych zwierzęcia tak by przeniósł się on na jego potomstwo.
W najkorzystniejszym wykonaniu zwierzę transgeniczne, j' ak mysz tworzy się przez wprowadzenie mutacji niszczącej sekwencję receptora glukagonu (patrz, Mansour i in., „Disruption of the protooncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy fo targeting mutations to non-selectable genes”, Nature 336:348-352,1988). Zwierzęta takie mogą być używane jako model do badania roli receptora glukagonu w metabolizmie.
Peptydy receptora glukagonu
Przez peptydy receptora glukagonu rozumie się peptydy zawierające części receptora glukagonu lub jego pochodnych opisanych powyżej, nie zawierających domen śródbłonowych, i które są długości przynajmniej 10 aminokwasów. Pokrótce, struktura receptora glukagonu jak również domniemanych domen śródbłonowych, może być przewidziana z pierwotnego produktu translacji przy użyciu, przykładowo, funkcji wykresu hydrofobowości oprogramowania jak P/C Gene czy Intelligenetics Suite (Intelligenetisc, Mt. View, CA), lub zgodnie z metodami opisanymi przez Kyte i Doolitle (J. Mol. Biol. 157:105-132,1982). Wykres hydrofobowości szczu10
178 000 rzego receptora glukagonu przedstawiono graficznie na figurze 2. Abstrahując od graficznego przedstawienia, w oparciu o tę analizę hydrofobowości, uważa się, że receptory glukagonu posiadają ogólną strukturę pokazanąna figurze 1. W szczególności, uważa się, że receptory te zawierają zewnątrzkomórkową domenę N-końcową, trzy zewnątrzkomórkowe pętle i cztery wewnątrzkomórkowe, wszystkie oddzielone od siebie domenami śródbłonowymi.
Izolowany peptyd receptor glukagonu obejmujący zewnątrzkomórkową domenę N-końcowąreceptora glukagonu jest przedmiotem równoległego zgłoszenia nr P 307 746. W korzystnym wykonaniu, dostarczonyjest izolowany peptyd receptora glukagonu obejmujący sekwencję aminokwiasowąIdentyfikatora Sekw. Nr: 15 od glutaminy, aminokwasu 28, do tyrozyny, aminokwasu nr 142. Dostarczone sąrównież inne izolowane peptydy receptora glukagonu które mogą być wybrane spośród domen pętli zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych receptora glukagonu. (patrz, figury 1 i 5). W jednym z wykonań, peptydy receptora glukagonu wybrane są spośród grupy składającej się z UD (Identyfikator Sekw. Nr: 15, od lizyny, nr 169, do histydyny, nr 178), 1ELD (Identyfikator Sekw. Nr: 15, od tyrozyny, nr 203, do izoleucyny, nr 231), 2ID (Identyfikator Sekw. Nr: 15 od fenyloalaniny, nr 259, do seryny, nr 266), 2ELD (Identyfikator Sekw. Nr: 15, od waliny, nr 293, do izoleucyny, nr 307), 3ID (Identyfikator Sekw. Nr: 15 od leucyny, nr 334, do lizyny, nr 345), i 3ELD (Identyfikator Sekw. Nr: 15 kwasu asparaginowego, nr 371, do seryny nr 380).
Peptydy receptora glukagonu mogąbyć wytworzone z użyciem technik rekombinacji jak to opisano powyżej, lub metodami syntetycznymi oraz mogąbyć oczyszczane jak to opisano poniżej.
Oczyszczanie peptydów receptora glukagonu
Izolowane peptydy receptora glukagonu mogąbyć wytworzone, obok innych metod, przez hodowlę odpowiednich układów gospodarz/-wektor, w celu wytworzenia rekombinowanych produktów translacji według wynalazku. Nadsącza z tych linii komórkowych mogąbyć poddane różnym procedurom oczyszczania w celu izolacji peptydów receptora glukagonu. Przykładowo, nadsącz może być najpierw zagęszczony przy użyciu dostępnych w handlu filtrów do zagęszczania białek, jak np. jednostki do ultrafiltracji Amicon czy Millipore. W następstwie zagęszczenia, koncentrat może być nałożony na odpowiednie podłoże do oczyszczania, przykładowo glukagon lub przeciwciało przeciwko receptorowi glukagonu, związane z odpowiednim podłożem. Alternatywnie, można użyć żywic anionowych lub kationowych w celu oczyszczenia receptora lub peptydu. Na koniec, można użyć jednego lub więcej etapów wysokosprawnej chromatografii cieczowej (RP-HPLC) by dalej oczyścić peptydy receptora glukagonu.
Peptyd receptora glukagonu jest uważany za „wyizolowany” lub oczyszczony, jeżeli w wyniku analizy na żelu SDS-poliakryloamidowym, a następnie barwienia błękitem Coomasie, widoczny jest wyłącznie jeden pojedynczy prążek.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wykrywania antagonistów glukagonu. W kontekście niniejszego wynalazku, pod pojęciem antagonisty rozumie się cząsteczkę zdolną do wiązania z receptorem, która jednak nie pobudza lub zmniejsza pobudzenie szlaku odpowiedzi w komórce. W szczególności, antagoniści glukagonu wykrywani są przez swoją zdolność do wiązania się z receptorem glukagonu, w ten sposób zmniejszania pobudzenia szlaku odpowiedzi w komórce.
Sposób wykrywania obecności antagonistów receptora glukagonu według wynalazku obejmuje następujące etapy: (a) ekspozycję związku w obecności agonistów glukagonu na rekombinowany receptor glukagonu związany ze szlakiem odpowiedzi w warunkach i w czasie wystarczającym do związania się związku z receptorem i wywołania odpowiedzi przez ten szlak: i (b) badanie zmniejszenia pobudzenia szlaku odpowiedzi wynikające ze związania się związku z receptorem glukagonu, względem pobudzenia szlaku odpowiedzi przez samego agonistę glukagonu i stąd stwierdzenie obecności antagonisty glukagonu.
W kontekście niniej szego wynalazku agoniści glukagonu obejmują cząsteczki (włącznie z samym glukagonem) zdolne do związania się z receptorem glukagonu i pobudzające szlak odpowiedzi w komórce.
178 000
Z użyciem tych sposobów można badać różnorodne związki. Reprezentatywne przykłady obejmująprzeciwciała blokuj ące opisane powyżej, peptydy receptora glukagonu i analogi glukagonu (obejmujące zarówno ligandy peptydowe jak i nie peptydowe).Przykładowo, patent USA nr 07/741,931 dostarcza sposobów produkcji znacznej liczby analogów glukagonu przy użyciu spulowanych sekwencji DNA kodujących te analogi. Pule te kodujące analogi glukagonu mogą być wytworzone przez mutagenezę wysycającą sekwencji DNA kodującej glukagon (n.p. Little Gene 88: 113-115; Hembers i in., Gene 88: 143-151, 1989), przez ukierunkowaną na segment mutagenezę (n.p. Shortle i in., Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 5375-5379,1980) przez forsowane błędne wbudowywanie nukleotydów (n._p. Liao i Wise Gene 88:107-111,1990) lub przez użycie losowo mutagenizowanych oligonukleotydów (Hutchinson i in., Proc Natl Acad Sci USA 83: 710-714,1986). Pojedyncze transformanty ekspresjonujące analogi glukagonu mogąbyć klonowane jak to opisano powyżej lub pulowane.
Związki eksponowane są na rekombinowany receptor glukagonu w obecności agonistów glukagonu w warunkach i w czasie wystarczającym do związania się związku z receptorem i wywołania odpowiedzi przez ten szlak. Warunki i czas odpowiedni do związania się antagonisty glukagonu z receptorem mogą zmieniać się w zależności od źródła receptora, ale warunki odpowiednie do związania zwykle obejmują: temperaturę pomiędzy 4°C i 55°C w roztworze buforu pomiędzy 0 i 2 M NaCl, korzystnie pomiędzy 0 i 0,9 MNaCl, a szczególnie korzystnie wroztworze 0,1 M NaCl, przy pH w zakresie 5-9, korzystnie 6,8-8. Czas odpowiedni do związania i wywołania odpowiedzi zwykle jest w zakresie 5-15 minut od ekspozycji.
Gdy związek eksponuje się na rekombinowany receptor glukagonu w obecności agonisty glukagonu, w warunkach · i w czasie wystarczającym do związania się związku z receptorem, można wykryć zmniejszenie pobudzenia szlaku odpowiedzi jeżeli związek współzawodniczy z agonistami glukagonu o rekombinowany receptor glukagonu. Szlak odpowiedzi może być szlakiem odpowiedzi związanej z błonącyklazy adenylowej, zaś etap wykrywania obejmuje pomiar zmniejszenia cAMP przez szlak związanej z błoną cyklazy adenylowej, w stosunku do produkcji cyklicznego AMP w obecności samego glukagonu. Korzystnie zmniejszenie pobudzenia szlaku odpowiedzijest równe lub większe od zmniejszenia, związanego z des-His1 -glukagonem. Testy aktywności cyklazy adenylowej mogąbyć wykonane, przykładowo, z użyciem sposobu opisanego przez Lin i in. (Biochem. 14:1559-15613,1975), i opisanego w przykładach. Metody te mierzą poziom pobudzenia cAMP w stosunku do natywnego glukagonu, i obejmują zwykle ekspozycję preparatu komórek, które ekspresjonująaktywny biologicznie rekombinowany receptor glukagonu, na mieszaninę glukagonu i badanego związku w obecności znakowanego radioaktywnie ATP.
Alternatywnie, produkcję cAMP można mierzyć przy użyciu sposobów znanych specjalistom, obejmujących, przykładowo, metody opisane przez Salomon i in. (Anal. Biochem 58: 541-548,1976) czy Krishna i in. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 163:379,1986) lub korzystnie przy użyciu dostępnych w handlu zestawów, takich jak Scintillation Proximity Assay Kit f-my Amersham Corporation. Scintillation Proximity Assay Kit mierzy produkcję cAMP przez współzawodnictwo jodowanego cAMP z przeciwciałem anty-cAMP. Szczególnie korzystne receptory glukagonu mają w tym teście aktywność biologiczną ED50 (Dawka Efektywna wywołująca 50% odpowiedzi) mniejsząniż 1 nM, korzystniej ED50 mniejsząniż 0.7 nM, zaś najkorzystniej mniejsząniż 0.25 nM.
Szlak odpowiedzi może też obejmować system reporterowy lucyferazy. Pokrótce, lucyferazajest enzymem katalizującym wydzielenie fotonu przez lucyferynę, i w ten sposób może być wykrywana po ekspresji w obecności lucyferyny (Alam i Cook, Anal. Biochem. 188, 245-254, 1990). Szczególnie korzystnie konstrukt DNA obejmuje element odpowiedzi na cAMP, takijak np. element odpowiedzi proenkefaliny na cAMP, połączony operacyjnie z cDNA lucyferazy. Konstrukt DNA, zawierający cDNA lucyferazy transfekowany jest w sposób stabilny do komórki-gospodarza. Komórka tajest wtedy transfekowana drugim konstruktem DNA zawierającym pierwszy segment DNA kodujący receptor glukagonu powiązany operacyjnie z dodatkowymi segmentami DNA potrzebnymi do ekspresji receptora. Po związaniu agonisty receptora glukagonu, podwyższony poziom cAMP powoduje ekspresję lucyferazy. Lucyferaza pod12
178 000 dana jest działaniu lucyferyny, zaś fotony uwolnione podczas utleniania lucyferyny przez łucyferazę są mierzone.
W innym wykonaniu aktywacja szlaku odpowiedzi powoduj e wzrost stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia. Mogą być wykonywane różne testy w celu określenia stężenia wolnego wapnia wewnątrzkomórkowego, obejmujące, przykładowo, metodę z użyciem fluorochromu QuinZ opisaną przez Charest i in. (J. Biol. Chem. 259: 8769-8773, 1983) czy metodę opartą na ekworynie, białku emitującym światło, opisaną przez Nakajima-Shimada (Proc Natl AcadSci USA 88: 6878-6882,1991). Szczególnie korzystnąmetodąjest metoda fotoobrazowania wapnia wewnątrzkomórkowego, opisana szczegółowo w przykładzie 6. Pokrótce, wjednym z wykonań, komórki transformowane są plazmidem ekspresjonującym receptor glukagonu i hodowane przez trzy dni w normalnych warunkach hodowli. Pożywka jest usuwana i zastąpiona roztworem zawierającym 10 pM fura-2AM (patrz, Grynkiewicz i in., J. Biol. Chem. 260: 3440-3450,1985). Komórki inkubowane sąprzez 30 minut w ciemności po czym odpłukiwane i ponownie inkubowane przez 30 do 120 minut. Fotoobrazowanie może być wykonane przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Diaphot wyposażonego w lampę rtęciową. Komórki mogąbyć wpierw oglądane przez 60 minut w celu ustalenia poziomu zerowego, a następnie stymuluje się je buforem zawierającym glukagon. Obrazy zwykle są rejestrowane przez przynajmniej trzy minuty po pobudzeniu. Do obróbki i pomiaru obrazów można wykorzystać oprogramowanie jak Inovision (Research Triangle Park, N. C.).
Antagonistów glukagonu, których obecność stwierdzono w opisany powyżej sposób według wynalazku można oczyszczać przez chromatografię jonowymienną lub podział ową jak to opisali, przykładowo Coy i in. (Peptide Strukturę and Function, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, str. 369-372, 1983) lub chromatografię z odwróconymi fazami (Andreu i Merrifield,Eur. J. Biochem. 164:585-590,1987) lub przez HPLC (np. Kofodiin. Int. J. Peptide Protein Res. 32:436-440,1988). Dodatkowe oczyszczenie może być uzyskane przez zwykłe oczyszczanie chemiczne, takie jak chromatografia cieczowa, wirowanie na gradiencie i elektroforeza na żelu między innymi. Sposoby oczyszczania białek sąznane w technice (patrz ogólnie, Scopes R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982 i mogąbyć zastosowane do oczyszczania opisanych tu rekombinowanych antagonistów glukagonu. Alternatywnie, antagonistów glukagonu można syntetyzować metodąna podłożu stałym opisanąprzez Barany i Merrifielda (w The Peptides, vol 2A, Gross i Meienhofer, (wyd.), Academic Press,. NY, str. 1-284,1979) lub z użyciem automatycznego syntezatora peptydów.
Korzystnie sąrekombinowani antagoniści glukagonu zasadniczo w stanie czystym, o homogenności przynajmniej 50%, korzystnie o homogenności około 70-80%, zaś najkorzystniej, zwłaszcza do zastosowań farmaceutycznych, o homogenności 95%-99% lub więcej. Po oczyszczeniu lub doprowadzeniu do homogenności antagonistów glukagonu można zastosować do celów leczniczych. Ogólnie, antagonistów można podawać paranteralnie lub we wlewie. Zwykle, antagoniści występują w postaci wolnych zasad lubjako sole kwasów. Odpowiednie sole powinny być dopuszczalne farmaceutycznie. Reprezentatywne przykłady obejmują sole metali, sole metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych, takie jak sole potasu i sodu. Inne dopuszczalne farmaceutycznie sole obejmująsole kwasu cytrynowego, bursztynowego, mlekowego, solnego i bromowodorowego. Kompozycje parenteralne mogąbyć przygotowane w roztworach wodnych izotonicznych o pH w zakresie 5,6 - 7,4. Odpowiednie roztwory izotoniczne mogązawierać chlorek sodu, dekstrozę, kwas bomy, winian sodu i roztwory glikolu propylenowego. Dawki terapeutyczne antagonistów mogąbyć podawane równocześnie z insulinąbądź w tej samej kompozycji, bądź w osobnych kompozycjach.
Poniższe przykłady przedstawione sąw celu zilustrowania wynalazku a niej ego ograniczenia.
Przykład 1. Synteza cDNA i wykonanie bibliotek cDNA
A, Synteza cDNA wątroby szczura
Pobrano wątroby od ważących 30 g samic szczura szczepu Sprague-Dawley (Simonsen Labs. Giłroy, CA) i bezwłocznie umieszczono w ciekłym azocie. Wyizolowano całkowite RNA z tkanki wątroby przy użyciu izotiocyjanianu guanidyny (Chirwig i in., Biochemistry 18:52-94,
178 000
1979) i wirowania na gradiencie CsCl. Poli(A)+ RNA wyizolowano przy użyciu chromatografii z użyciem oligo 0(T) celulozy (Aviv i Leder, Proc NatlAcad Sci USA 69: 1408-1412, 1972).
cDNA wytworzono na matrycy dwukrotnie oczyszczanego poli d(T) poli(A)+ RNA wątroby. Dziesięć mikrolitrów roztworu zawierającego 10 pg poli (A)+ RNA wątroby zmieszano z 2 pl 20 pmol/pl startera pierwszej nici ZC3747 (Identyfikator Sekw. Nr: 7) i 4 pl wody poddanej działaniu pirowęglanu dietylu. Mieszaninę podgrzano w 65°C przez 4 minuty i schłodzono na lodzie.
Syntezę pierwszej nici cDNA rozpoczęto przez dodanie 8 pl 5 x bufora SUPERSCRIPT (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md), 4 pl 100 mM ditiotreitolu i 2.0 pl roztworu dezoksytrifosforanów zawierającego 10 mM każdego z dATP, dGTP, dTTP oraz 5-metylo-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, N. J.) do mieszaniny RNA-starter. Mieszaninę inkubowano w 42°C przez 3 min. Po inkubacji, dodano 6,0 pl 200U/pl odwrotnej transkryptazy SUPERSCRIPT (GIBCO BRL). Wydajność syntezy pierwszej nici badano w równoległej reakcji przez dodanie 10 pC i 321P - adCTP do próbek poi 0 p1 mieznynizyjnaZzyjnej w e^uu znakowania rrouktóó w e-akcji. Mieszaniny reakcyjne do syntezy pierwszej zici ilzaubowano w temperaturze 45°C przez 45 miaut, a następnie w temperaturze 50°C przez 15 miaut. Reakcje przerywano przez dodanie wody do objętości końcowej 100 pl, po czym poddano dwukrotnej ekstrakcji mieszaniną fenol/chloroform (1:1) i jedzej ekstrakcji mieszaniną chloroform/alkohol izoamylowy (24:1). Nie wbudowane nualeotydy usunięto przez dwukrotną precypitację cDNA w obecności 6 pg glikogenu, 2.5 M octanu amonu i 2.5 objętości etanolu. Niewyznakowaze cDNA zawieszono w 50 pl wody i użyto do syntezy drugiej nici. Długość pierwszej aici cDNA określano przez zawieszenie znakowanego cDNA w 20 pl wody i określenie wielkości cDNA przez elektroforezę aa żelu agarozowym.
Syntezę drugiej aici przeprowadzono za hybrydzie DNA-RNA pochodzącej z syntezy pierwszej aici w warunkach umożliwiających pierwszej aici zapoczątkowanie syntezy drugiej nici przez tworzenie „spinek” DNA. Przygotowana została mieszanina reakcyjna zawierająca 20,0 pl 5x bufora polimerazy I (100 mM Tris, pH 7,4,500 mM KC1,25 mM MgCh, 50 mM (NH4)2SO4), 4,0 p P 00 mM Piiionebobu 1,0 pp ro^dwom pa wieraiaczgol0 piM każdego z tTifoofonaiów dezoksyzukleotydów, 3,0 pl β-NAD, 15,0 pl 3U/pl ligazy DNA E. Coli (NBL Ezzymez Ltd., Cramlizgton, Northumbria, Ezglazd), 5,0 pl 10 U/pl pdlimeinzy I DNA E. coli (GIBCO BRL) i 50,0 pl nieznakowazej pierwszej aici DNA. Równoległe reakcje, w których próbki po 10 plsynezzydrugiej aici znakowane przez dodatek 10 miCi 32^-^, używano do mozitorownyin wydajności reakcji syyrezz drugiej nici. Mieszazizy reakcyjne i^ubowazo w temperaturze pokojowej przez 4 minuty, a następnie dodawano 1,5 pl 2U/pl 'RNazy H (GIBCO BRL) do każdej z mieszanin. Reakcje iyarbowano w temperaturze 15°C przez 2 godzinz, a następnie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Reakcje przerywano przez dodanie 4 pl 500 mM EDTA, a następnie poddawazo ekstrakcji mieszaninami fenol/chloroform i chloroform/alkohol izoamzlowz, jak to opisano powyżej . DNA z każdej z reakcji precypitdwazo w obecności etanolu i 2,5 M octanu amonu. DNA z ziezzakownyjj reakcji zawieszono w 50 pl wody. Znakowane DNA zawieszono i poddano elektroforezie jak to opisano powyżej.
Jedzoziciowe DNA w „spinkach” przecięto używając zrklenzy z fasoli muzg. Mieszazizy reakcyjne zawierały 10 pl 10x Buforu Nrklenzz Fasoli Mung (Stratageze Ploziyg Systems, La Jolla, Calif.), 4 p2 000 rMididoij·eito uią 34 μΙ woZ^ 50 pd dragiej mcżcDNA 2 2 prozc jeńzzzin a 1:10 yualenzz Fasoli Mung (Promega Corp., Madison, Wis.) w Buforze 0o dOzzIeńcznzia MB f-my Stratageze (Stratageze Clozizg Systems). Reakcję i^cubowazo w 37°C przez 15 miaut, po czym pr-zerzwazo przez dodanie 20 pl Tris-HCl, pH 8.0, a następnie poddawano ekstrakcji mieszaziyami fenol/chloroform i chloroform/alkohol izoamylowy, jak to opisano powyżej. Po ekstrakcji, DNA prezzpItowayd w etanolu i znwIeszoyd w wodzie.
W zawieszonym DNA tworzono „tępe końce” przy użyciu polimerazz T4 DNA. cDNA rozpuszczone w objętości 192 pl wody, mieszano z 50 pl 5x bufora polimerazz T4 DNA (250 mM Tris-HCl, pH 8,0,250 mM KC1,25 mM MgCĘ), 3 lP UP mM dtttorjeitoju3 3 po znWwrru zawieraj ącego 10 mM każdego z tnfosforazów djzoasyyualeotzdów i 2 pl 6,7 U/pl polimerazy
178 000
T4 DNA (Pharmacia LKB Biotecłmology Inc.). Po inkubacji w 15°C przez 30 minut, reakcję przerywano przez dodanie 2 pl 500 mM EDTA, a następnie poddawano serii ekstrakcji mieszaninami fenol/chloroform i chloroform/alkohol izoamylowy,jak to opisano powyżej. DNA precypitowano etanolem i rozpuszczono w 30 pl wody. W oparciu o wbudowywanie 32P-dCTP, określono uzysk cDNA na 4 pg z 10 fig wyjściowego mRNA.
B. Przygotowanie biblioteki cDNA szczurzej wątroby
W celu ułatwienia klonowania cDNA do wektora ekspresyjnego ssaków, do cDNA przygotowanego, jak to opisano powyżej, dodano łączników EcoRI (Invitrogen, San Diego, Calif.). Porcj e po 10 pl cDNA i 800 pmoli łącznika (12 pl) mieszano z 4,0 pil 10x bufora ligazy (Stratagene Cloning Systems), 4,0 pl 10 mM ATP, 6,0 pl wody i 16 jednostkami ligazy T4 DNA (4,0 p i Stratagene Cloning Systems). Reakcję inkubowano przez szesnaście godzin w gradiencie temperatur od 4°C do 15°C. Reakcję przerwano przez dodanie 185 pl wody, 25 plbuforuIEEATT 2 (GIBCO BRL), a następnie inkubowano przez 30 do 60 minut w temperaturze 65°C. Po inkubacji mieszaninę reakcyjną, poddawano ekstrakcji mieszaninami fenol/chloroform i chloroform/alkohol izoamylowy i precypitowano etanolem, jak to opisano powyżej. Po odwirowaniu peletkę DNA przemyto 70% etanolem i wysuszono na powietrzu. Peletkę zawieszono w 18 pl wody.
W celu ułatwienia kierowanego wprowadzania cDNA do wektora ekspresyjnego ssaków, cDNA trawiono Xhol, co spowodowało powstanie cDNA o „lepkich” końcach: 5' EcoRI i 3' Xhol. Miejsce restrykcyjne Xhol na końcu 3' cDNA zostało wprowadzone przez starter ZC3747 (Identyfikator Sekw. Nr: 7). Trawienie restrykcyjne przerwano serią ekstrakcji mieszaninami fenol/chloroform i chloroform/alkohol izoamylowy. cDNA precypitowano etanolem, a wytworzoną peletkę przemyto 70% etanolem i wysuszono na powietrzu. Peletkę zawieszono w 1x buforze (10 mM bufor fosforanowy, pH 8,8, 5% glicerol, 0,125% błękit bromofenolowy).
Zawieszony cDNA podgrzano do 65°C przez 10 minut, schłodzono na lodzie i poddano elektroforezie na 0,9% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Seaplaque GTG Low Melt Agarose, FMC Corp., Rockland, Me.) z użyciem „drabinki” BRL lkb (GIBCO BRL) i 100 bp (Pharmacia LKB Biotechnołogy Inc.)jako standardu wielkości. Zanieczyszczające łączniki i fragmenty produłktów ubocznych o wielkości poniżej 800 bp wycięto z żelu. Elektrody zostały odwrócone i cDNA poddawano elektroforezie dopóki nie zostało zagęszczone w pobliżu początku ścieżki. Fragment żelu zawierający zatężony DNA wycięto, umieszczono w probówce i określono w przybliżeniu jego objętość. Dodano TE w ilości równej połowie objętości fragmentu żelu i stopiono agarozę przez podgrzanie do 65°C przez 15 minut. Po doprowadzeniu temperatury próbki do 42°C dodano około 5 jednostek β-Aarazzy ((New England Biolabs, Beverly, Msss.). Próbkę inkubowano przez 90 minut w celu strawienia agarozy. Po inkubacji, dodano 0.1 objętości próbki 3 M octanu sodowego, i in.kubowaEo mieszaninę przez 15 minut na lodzie. Po inkubacji, próbkę wirowano przy 14000xg przez 15 minut w temperaturze 4°C w celu usunięcia niestrawionej agarozy. cDNA w nadsączu precypitowano etanolem. Peletkę cDNA przemyto 70% etanolem, wysuszono na powietrzu i zawieszono w 10 p wody.
\VylworzoEZ'' cDNA klonowano do wektora E. coli pZCEP, pochodnej pCDNAl (Ineitrogen), w której początek replikacji M13 i marker umożliwiający selekcję SopF zastąpiono kasetą beta laktamazy z pUC 18. Plazmid pZCEP, linearyzowaiio przez trawienie EcoRI i Xhol i poddawano ligacji z cDNA EcoRI-XhoI. Wytworzone plazmidy wprowadzano metodąelektroporacji do komórek E. coli szczepu DH 10B ELECTROMAX (GiBcO BRL).
C. Synteza cDNA ludzkich komórek wysepek
Wysepki z ludzkich trzustek pobrano od dawców przeszczepów, dla których nie udało się znaleźć biorcy. Po perfuzji in situ zimnym roztworem UW (DuPont, Boston, Mass.), każdą^-zustkę starannie wycinano, kaniulowano przewód trzustkowy i wstrzykiwano, w sposób ciągły, roztwór 4 mg/ml kolagenazy (Type V, Sigma, St. Louis, MO.), początkowo w temperaturze 4°C, a następnie 39°C. Gruczoł rozdrobniono zaś uwolnione fragmenty przemywano przez odwirowanie, przepuszczano przez igły o zmniejszającej się średnicy i oczyszczano przez wirowanie na nieciągłym gradiencie Ficollu (Wamock, Diabetes 35 (supl. 1): 136-139,1989). Materiał zbierany z górnej interfazy pulowano i liczono po oznaczeniu czystości wysepek przez barwienie ditia178 000 zonem.Wysepki użyte do tworzenia biblioteki były bardziej niż w 65% czyste, zaś użyte do analizy metodą Northern biot bardziej niż w 40%. Średnia średnica wysepki wynosiła 175 pm. Dodatkowo, izolowane wysepki wykazywały pierwsząi drugą fazę funkcji wydzielania insuliny po perfuzji bądź wysokim stężeniem glukozy, bądź izobutylo-metyloksantyną (IBMX).
Poli(A)+ RNA izolowano przy użyciu zestawu do izolacji mRNA FASTTRACK (Invitrogen), zgodnie z instrukcją producenta. Pokrótce, 30000 oczyszczonych wysepek poddano lizie w buforze do lizy, homogenizowano przy użyciu igieł o zmniejszającej się średnicy, i trawiono w obecności proteinazy K i RN asin, a następnie poli(A)+ RNA oczyszczano przez chromatografię z użyciem oligo d(T) celulozy. Stężenie i czystość wymywanych frakcji określano na podstawie gęstości optycznej OD260/280·
Około 2,5 pg poli(A)+ RNA z ludzkich wysepek użyto do wykonania biblioteki przy użyciu systemu tworzenia bibliotek cDNA LIBRARIAN RII (Invitrogen) i komórek E. coli DH10B ELECTROMAX (GIBCO BRL), zgodnie z instrukcjami producentów. Pokrótce, około 2.5 pg poli (A)+ RNA wyizolowanego z ludzkich wysepek poddano konwersji do dwuniciowego cDNA, a następnie dodano niepalindromicznego łącznika BstXI (Invitrogen). cDNA frakcjonowano ze względu na wielkość, a nieprzereagowany łącznik usunięto przez elektroforezę na żelu agarozowym i elektroelucję. Wybrano komplementarne nici DNA o wielkości powyżej 600 bp.
Przykład 2. Izolacja cDNA szczurzego receptora glukagonu przez amplifikację reakcj ą łańcuchową polimerazy cDNA szczurzej wątroby użyto jako matrycy do' amplifikacji sekwencji receptora glukagonu, przy użyciu zdegenerowanych oligonukleotydów (ZC4715 i ZC4701; Identyfikatory Sekw. Nr: 9 i 8), odpowiadających regionom wysokiego zakonserwowania spośród członków rodziny genu sekretyny. Nastawiono 50 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 5 ng matrycy cDNA (przykład 1A); 100 pmoli każdego z oligonukleotydów ZC4715 (Identyfikator Sekw. Nr: 9) i ZC4701 (identyfikator Sekw. Nr: 8); 0,25 mM każdego z trifosforanów dezoksynukleotydów (Cetus, Emeryville, CA); 1x bufora 10x Promega (Promega Corp.) i 12,5 jednostek polimerazy Taq (Promega). · Przeprowadzono 40 cykli PCR (jedna minuta w 95°C; jedna minuta w . 42°C i dwie minuty w 72°C) a następnie inkubowano przez 7 minut w 72°C.
Przez elektroforezę wyizolowano produkt PCR wielkości 650 bp i poddano ligacji z pCR 1000 (Stratagene Cloning Systems). Powstałego plazmidu użyto do transformowania komórek XL-1 E. coli. Wyizolowano DNA plazmidowy z wybranego transformanta, oznaczono go G13/pCR1000 i sekwencjonowano (Identyfikator Sekw. Nr: 14). Analiza sekwencji klonu wykazała, że wstawka koduje polipeptyd pokrewny receptorowi sekretyny.
Przykład 3. Klonowanie cDNA pełnej długości szczurzego receptora glukagonu cDNA pełnej szczurzego receptora glukagonu uzyskano przez przeglądanie biblioteki opisanej' w przykładzie 1B wteście wiązania glukagonu. Bibliotekę wysiano by uzyskać milion nieżależnych klonów. Stransformowane kolonie z każdej płytki zeskrobywano do LB-Amp (Sambrook i in.j'.w.). Komórki odpłukano przez odwirowanie zaś pożywkę usunięto. Peletki komórek zawieszono w 4 ml LB-Amp, 150/o glicerolu, po czym przechowywano cztery jednomililitrowe porcje w -80°C. Pierwszą z partii w glicerolu miareczkowano i wysiano 100 pul po 5000 'kolonii na płytkę. Po wzroście kolonii, każdą płytkę zeskrobywano do 10 ml LB-Amp. Porcje komórek z każdej puli pobrano w celu przygotowania DNA plazmidowego. Pozostałe mieszaniny komórek doprowadzono do objętości końcowej 15% glicerolem, · porcjowano i zamrażano w -80°C. DNA plazmidowe przygotowano z każdej z pul komórek, i trawiono RNazą (Boeringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)' zgodnie z instrukcją producenta. Reakcję RNazy przerywano przez ekstrakcję mieszaniną· fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (24:24:1), po czym DNA precypitowano etanolem.
DNA plazmidowe z każdej z pul transfekowano do komórek COS-7 (ATCC CRL 1651), i badano transfektanty na obecność receptorów glukagonu w teście wiązania 125I-glukagonu. Pokrótce, dzień przed transfekcją wysiewano około 2x105komórek do sterylnychjednokomorowych płytek (Nunc AS, Roskilde, Denmark) pokrytych 10 pq/ml ludzkiej fibronektyny (tabela 1.) przez 3 0 minut w temperaturze pokoj owej i odpłukanych roztworem fizj ologicznym soli z bufo16
178 000 rem fosforanowym (PBS, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Dwa mikrogramy DNA plazmidowego z każdej z pul użyto do transfekcji komórek w jednokomorowych płytkach przy użyciu metody opisanej przezMcMahan i in., (EMBOJ, 10:2821-2832,1991: zmieszczonej tujako odnośnik). Po transfekcji, komórki hodowano przez 72 godziny w 37°C w 5% CO2.
Tabela 1
Fibronektyna Ludzka
4g sproszkowana ludzka fibronektyna osocza liofilizowana (Alpha Therapeutics Corp., Los Angeles, Calif.)
50 ml 1 mM NaPO4, pH 7,4 (mieszanina jedno- i dwu Na), 300 mM NaCl
Liofilizowany proszek rozpuszczono w roztworze buforu. Dodano siarczanu amonu do stężenia 25%, i pozostawiono roztwór do precypitacji przez noc w temperaturze 4°C. Fibronektynę zebrano przez odwirowanie w wirówce Bench Top (Beckman Instruments, Inc., Irvine, Califf.) przez piętnaście minut przy 1000 rpm. Supematant usunięto zaś peletkę rozpuszczono w 10 ml roztworu buforu NaPO4 (powyżej.).
Fibronektynę w objętości końcowej 16,9 ml dializowano przez noc do 11 roztworu buforu NaPO4 (opisanego powyżej). Dializowany materiał rozcieńczono trzykrotnie 1 mM NaPO4, pH 7,4, w celu uzyskania roztworu 1 mM NaPO4, pH 7,4,100 mM NaCl. Fibronektynę rozcieńczono dwukrotnie wodądestylowaną. Nierozpuszczony percypitat usunięto przy pomocy pręta szklanego.
Fibronektynę poddano FPLC przez 50 ml kolumnę DEAE FF Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, N. J.), zrównoważonątrzema objętościami 18 mM Tris, pH 8,1, 50 mM NaCl. Po przemyciu kolumny 18 mM Tris, pH 8,1,50 mM NaCl, dopóki nie uzyskano próbki zerowej, fibronektynę eluowano gradientem soli do 18 mM Tris, pH 8,1,300 mM NaCl. Frakcje zbierano, próbki frakcji poddawano elektroforezie na żelu poliakrylamidowym i analizowano przez barwienie Błękitem Coomasie i analizę Western blot. Frakcje szczytowe pulowano i dializowano w stosunku do 10 mM CAPS (kwas 3-(cykloheksy amino)-1 propanosulfonowy, Sigma), pH 11,0,10 mM CaCl2,150 mM NaCl. Roztwórprzechowywano w temperaturze -80°C.
W celu wytworzenia transfektantów do testu wiązania ^I- glukagonu, pożywkę aspirowano znad komórek, i płukano je trzykrotnie zimnym (4°C) PBS. Po ostatnim przemyciu, komórki pokrywano Medium do Testu Wiązania zawierającym 0,5 nM ^I-glukagon (Amersham receptor grade, aktywność właściwa 2000 Ci/mmol; Amersham). Komórki kołysano w temperaturze 30°C przez jedną godzinę. Medium aspirowano znad komórek, dodawano zimnego (4°C) Medium do Testu Wiązania bez glukagonu, po czym inkubowano komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Medium aspirowano znad komórek i przepłukiwano je trzykrotnie zimnym (4°C) PBS. Po ostatnim płukaniu, komórki utrwalono 1 ml 2,5% glutaraldehydem w PBS w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Glutaraldehyd usuwano i przepłukiwano komórki trzykrotnie PBS. Szkiełka suszono na powietrzu przez godzinę w temperaturze pokojowej, zanurzano w ciekłej emulsji fotograficznej (Eastman Kodak Co., Rochester, N. Y.) zgodnie z zaleceniami producenta, i suszono w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej 30 minut. Szkiełka umieszczano w zaciemnionym pudełku na 72 godziny w temperaturze 4°C. Komórki zdolne do wiązania glukagonu wykrywano przy powiększeniu 2,5X w ciemnym polu widzenia. W jednej z pul, # 57, stwierdzono obecność komórek zdolnych do wiązania glukagonu.
178 000
Tabela 2
Medium do Testu Wiązania
RPMI 1640 (Sigma) zawierający 20 pq/ml bacytracyny (Sigma) 25 mM bufor HEPES, pH 7,4 1% roztworu penicylina/streptomycyna (Sigma) 2 mM glutamina 50 U/ml aprotyniny (Sigma) 1% albuminy surowicy wołowej, frakcja V (Sigma)
1M wodorowęglan sodu
8,4 g stałego NaCO2 'Wodorowęglan sodu wlano do 100 ml naczynia miarowego, i dodano 80 cm3 wody destylowanej. Roztwór mieszano do pełnego rozpuszczenia. Dodano wody destylowanej do 100 ml. Roztwór ponownie mieszano i przechowywano w 4°C w zamykanym naczyniu.
Medium:
Do 1 litra destylowanej wody dodawano jeden mililitr IM wodorowęglanu sodu. Przygotowano cztery litry z użyciem roztworu chłodzonego przez noc, lub przygotowanego z zimnej wody destylowanej.
69% roztwór sacharozy g sacharozy
Sacharozę rozpuszczono w 31 ml wody destylowanej przez podgrzanie. Stężenie badano używając refraktometru. W zależności od potrzeby dodawano bądź sacharozy, bądź wody destylowanej doprowadzając stężenie do 69% ± 0,5%.
42.3% roztwór sacharozy g sacharozy
Sacharozę rozpuszczono w 57 ml wody destylowanej przez podgrzanie. Stężenie mierzono przy użyciu refraktometru. W zależności od potrzeby dodawano 69% roztworu sacharozy lub wody, doprowadzając stężenie do 42,3 ± 1%.
BuforX2 do testu wiązania
100 mM HEPES, pH 7,3
300 mM NaCl nM EDTA
2% albumina surowicy wołowej
1.6 mg/ml bacytracyny
Bufor do obrazowania
140 mM NaCl
DmMHEPES
5.6 mM glukoza mM KC1 mM MgSO4 mM CaCl2
Roztwór Fura-2 AM mg fura-2 AM (Molecular Probes) ml DMSO ml Buforu dd obraa,owania
178 000
Pięćdziesiąt miligramów fura-2 AM rozpuszczono w 50 ml DMSO. Po rozpuszczeniu, roztwór zmieszano z 5 ml Buforu do Obrazowania.
Porcję DNA plazmidowego z puli #57 poddano amplifikacji PCR z użyciem oligonukleotydów ZC4701 i ZC4715 (Identyfikatory Sekw. Nr: 8 i 9). Przygotowano 50 μ! mieszaniny reakcyjnej, zawierającej pomiędzy 200 ng a 400 ng DNA plazmidowego z puli # 57; 100 pmoli każdego z oligonukleotydów ZC4701 i ZC4715 (Identyfikatory Sekw. Nr: 8 i 9); 50 mM KC1; 10mMTris-HCllpH9,0(w20°C); l,5mMMgCl2 0.01%żelatyny; 0,1 % TritonX-100; 0,2 mM każdego z trifosforanówdezoksynukleotydów (Pharmacia LKB Biotechnology Inc) i 1 Jednostki polimerazy Taq (Promega). Wykonano 30 cykli reakcji PCR (dwie minuty w 95°C, dwie minuty w 45°C i dwie minuty w 72°C) zakończonych 7-minutową inkubacją, w 72°C. Mieszaninę reakcyjną przechowywano w 4°C. Analiza produktu PCR przez elektroforezę na żelu, wykazała obecność prążka wielkości 700 bp, który był prawie tej samej wielkości co produkt opisany w przykładzie 2.
Próbkę glicerolowąpuli #57 miareczkowano i wysiano z niej 20 płytek po 500 kolonii każda. Kolonie pulowano i wykonywano próbki glicerolowe . i plazmidowe DNA, takjak to opisano powyżej. dNa plazmidowe transfekowano do komórek COS-7 i badano transfektanty w teście wiązania glukagonu, jak to opisano powyżej. Wjednej z pul, # 57-18 stwierdzono obecność komórki zdolnych do wiązania glukagonu.
Próbkę DNA plazmidowego puli # 57-18 poddano amplifikacji PCR z użyciem oligonukleotydów ZC4701 i ZC4715 (Identyfikatory Sekw. Nr: 8 i 9) jak to opisano powyżej. Analiza produktu PCR przez elektroforezą na żelu wykazała obecność prążka wielkości 700 bp, potwierdzającego obecność sekwencji DNA recpetora glukagonu.
Próbkę glicerolowąpuli # 57-18 miareczkowano i wysiano 6 płytek po 50 kolonii i 47 płytek po 20 kolonii. Kolonie pulowano i wykonywano próbki glicerolowe i plazmidowe DNA, jak to opisano powyżej. Porcje z każdej z pul transfekowano do komórek COS-7, a transektanty badano w teście wiązania glukagonu, jak to opisano powyżej. Dodatkowo, porcję plazmidowego DNA z każdej z pul poddano amplifikacji z użyciem oligonukleotydów ZC4701i ZC4715 (Identyfikatory Sekw. Nr: 8 i 9), jak to opisano powyżej. Wykryto cztery pule (#57-18-16, # 57-18-18, # 57-18-36 i # 57-18-48) zawierające komórki zdolne do wiązania glukagonu, w których wykryć można było amplifikacją PCR potwierdzający prążek 700 bp.
W celu wyizolowania cDNA wysiano na każdą z dwóch 150 mm płytek po 2500 kolonii puli # 57-18. Odciski filtrów wykonano według metody opisanej · przez Hanahan i Meselson (Gene 10:63,1980) i Sambrook i in., (ibid.), zamieszczone tujako odnośniki. Sondę hybrydyzacyjną uzyskano przez amplifikację PCR DNA plazmidowego z puli # 57-18, przy użyciu oligonuklotydów i metod opisanych powyżej. Produkt PCR oczyszczono z żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia i startowano z użyciem zestawu MEGAPRIME (Amersham, Arlington Heights, III), zgodnie z zaleceniami producenta. Filtry hybrydyzowano w roztworze zawierającym 6XSSC, 5Xroztwór Denhardta, 5% SDS, 200 /mlDDAAspermyłososiadoadanego łyni.kacji i fragment PCR znakowany 32P o aktywności właściwej 2x105 cpm/ml. Filtry hybrydyzywano przez noc w 65°C. Nadmiar znacznika usunięto przez trzy płukania 2XSSC, 1% sDs w temperaturze 65°C. Film eksponowano na filtry przez cztery godziny w temperaturze -80°C. Zidentyfikowano i sekwencjonowano klony pozytywne, zawierające plazmid pLJ4. Plazmid pLJ4 zdeponowany jest w American Type Culture Colkction (12301 Parklawn Dr., Rockville, mD 20852) jak transformant E. coli, pod numerem 69056 21 sierpnia 1992. Analiza miejsc restrykcyjnych i analiza sekwencji wykazała, że pLJ4 zawiera wstawkę długości około 2 kb, koduj ącąbiałko o długości 485 aminokwasów o przewidywanej masie cząsteczkowej 54962 Da. Sekwencja kwasu nukleinowego i sekwencja aminykwasowa przedstawiona jest w Identyfikatorach Sekw. Nr: 14 i 15. Analiza hydropatii przy użyciu metody Kyte i Doolltlls(J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982; zamieszczone tu jako odnośnik) wykazała osiem przedziałów aminokwasów hydrofobowych odpowiadających sekwencji sygnałowej końca N i siedmiu domenom środbłonowym (figura 2). Dodatkowo, analiza przewidzianej sekwencji aminokwasowej, wyka178 000 zała obecność czterech potencjalnych miejsc N-glikozylacji, położonych w rozległych sekwencjach hydrofitowych i obecność sześciu cystein w tym samym regionie.
Przykład 4. Izolacja cDNA ludzkiego receptora glukagonu przez amplifikację reakcją łańcuchową polimerazy cDNA ludzkich wysepek (przykład 1C) użyto jako matrycy do amplifikacji sekwencji ludzkiego receptora glukagonu, przy użyciu zdegenerowanych oligonukleotydów ZC4715 i ZC4701 (Identyfikatory Sekw. Nr: 9 i 8). Nastawiono 50 pl mieszaniny reakcyjnej zawieraj ącej 5 ng cDNA matrycowego (przykład 1C), 100 pmoli każdego z oligonuklotydów ZC4715 (Identyfikator Sekw. Nr: 9) i ZC4701 (Identyfikator Sekw. Nr: 8); 0,25 mM każdego z trifosforanów dezoksynukleotydów. (Cetus Emeryvnle, Calif.,); IX buforu 10X Promega (Promega). Wykonano 40 cykli reakcji PCR (jedna minuta w 95°C, jedna minuta w 45°C i dwie minuty w 72°C) zakończonych inkubacją przez 7 minut w 72°C.
Metodą elektroforezy na żelu wyizolowano produkt PCR o długości około 750 bp. Jedna dziesiąta izolowanego produktu PCR użyta została jako matryca dla dodatkowej reakcji PCR z użyciem oligonukleotydów ZC4758 i ZC 4778 (Identyfikatory Sekw. Nr: 10 i 11), które zaprojektowano tak, by wprowadzały miejsce restrykcyjne BamHI na końcu 3' i miejsce restrykcyjne EcoRI na końcu 5' produkt PCR, co miało służyć klonowaniu. Nastawiono 50 pl mieszaniny reakcyjnej jak to opisano powyżej. Wykonano 40 cykli reakcji PCR (jedna minuta w95°C, jedna minuta w 50°C ipół minuty w72°C) zakończonych 7 minutową inkubacją w 72°C.
W celu badania transformantów na obecność sekwencji ludzkiego receptora glukagonu, wstawkę obecną w każdym z transformantów amplifikowano z użyciem oligonukleotydów ZC447 i ZC967 (Identyfikatory Sekw. Nr: 1 i 2), które zaprojektowano jako uniwersalne startery sekwencjonujące plazmid pUC i komplementarne do sekwencji pUC--otaczających wstawkę produktu PCR. Czterdzieści osiem transformantów wprowadzono do 25 μ! mieszaniny reakcyjnej zawierającej 20 pmoli każdego z oligonukleotydów; 0,125 mM każdego z trifosforanów oligonukleotydów (Cetus, Emeryville, Calif.,); IX bufora 10X Promega (Promega) i 1,25 jednostki polimerazy Tag (Promega). Wykonano 30 cyklireakcji PCR (jedna minuta w 95°C, jedna minuta w 45°C i pół minuty w 72°C) zakończonych 7 minutową inkubacją w 72°C. .
Produkty PCR badane były następnie hybrydyzacją Southerna (Southern, J. Mel. Biol. 98: 503,1975; i Sambrook i in., ibid., które zamieszczono tu jako odnośniki) przy użyciu fragmentu pLJ4 EcoRI^hol wielkości 1,9 kb, znakowanego losowymi starterami, używając zestawu MEGAPRIME (Amersham) jako sondy. Jeden z klonów, G30, hybrydyzował z sondą cDNA szczura pełnej długości. Sekwencja nukleotydowa G30 pokazana jest w Identyfikatorze Sekw. Nr: 16.
Przykład 5. Klonowanie cDNA pełnej długości ludzkiego glukagonu
W celu z identyfikowania biblioteki zawierającej sekwencje kodujące ludzki receptor glukagonu, badano serię bibliotek przy użyciu PCR z udziałem starterów óligónukłeótydówych ZC5433 i ZC5432 (Identyfikatory Sekw. Nr: 13 i 12), zaprojektowanych tak by obejmowały sekwencję z klonu G30, opisanego powyżej. Badano nabyte i wykonane biblioteki ludzkiego genomowego i cDNA z ludzkiej wątroby, komórki wysepek, mózgu i łożyska (tabela 3). Nastawiono oddzielne 50 pi reakcje z użyciem DNA z różnych bibliotek w objętościach wyszczególnionych w tabeli 4,20pmoli/pl każdego zZC5433 i ZC5432 (Identyfikatory Sekw. 13 i 12), 0,25 mM każdego z trójosforanów deóksynukleotyaów, 5 pl, 10X bufora Tag I (Promega), 15 mM MgCl2,19,5 pl wody destylowanej i 0,5 pl 5 U/pl polimerazy Tag I (Promega). Dodatkowo nastawiono reakcje zawierające pLJ4 jako kontrola pozytywna i bez DNA jako kontrola negatywna.
178 000
Tabela 3 Źródła bibliotek i DNA
Biblioteka/DNA Źródło
ludzkie cDNA wątroba, NIH R. QSIH, Bethesda, Md.)
ludzkie genomowe # 946203 Stratagene
ludzkie genomowe # 944201 Stratagene
ludzkie cDNA komórek wysepek Przykład 1C
Xgt11 HEPG2 Przygotowane jak opisano przez Hagen i in.,
ludzkie cDNA pierw, nić mózg (U. S. Patent 4,784,950, zamieszczone tu w całości jako odnośnik) Clontech
ludzkie cDNA pierw, nić łożysko Clontech
ludzkie cDNA pierw, nić wątroba Clontech
Tabela 4 Objętości
Biblioteka/DNA Objętość (rozcieńczona wodą do 15 pl)
ludzkie cDNA wątroba, NIH ludzkie genomowe # 946203 ludzkie genomowe # 944201 ludzkie cDNA komórek wysepek ggt11 HEPG2 ludzkie cDNA pierw, nić mózg ludzkie cDNA pierw, nić łożysko ludzkie cDNA pierw, nić wątroba 1 pl z roztworu 400 ng/pl 15 fal rowwoni faga 15 pl roztworu faga 1 pl roztworu 12 pg/ pl rozc: 1:3 15 pl roztworu faga 1 pl 10 roztworu ng/pl 1 pl rowwuou 1 Onglpl 1 ul roztworu 10 ng/pl
Wykonano 30 cykli reakcji PCR (jedna minuta w 94°C, jedna minuta w 50°C i pół minuty w 72°C) zakończone 10 minutową inkubacją w 72°C. Następnie analizowano produkt PCR elektroforezą na żelu agarozowym. Wyłącznie biblioteka z wątroby ludzkiej, pochodząca z NIH umożliwiła uzyskanie prążka wielkości 320-410 bp, podobnie jak to obserwowano z pLJ4 jako kontrolą pozytywną.
Biblioteki z ludzkiej wątroby, sklonowanej do plazmidupcD2 (Chen i Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752,1987) uzyskanej od Dr Rogera Bertolloti (National Institutes of Health, Bethesda, Md.) użyto w celu uzyskania klonu cDNA pełnej długości, kodującego ludzki receptor glukagonu. Wysiano bibliotekę w celu uzyskania miliona indywidualnych klonów. Kolonie transformowane z każdej z płytek zdrapywano do 10 ml LB-Amp (Sambrook i in. ibid). Komórki odpłukano przez odwirowanie zaś pożywkę usunięto. Peletkę komórek zawieszono w 4 ml LB-Amp, 15% glicerolu i podzielono na cztery jedno mililitrowe porcje, które przechowywano w -80°C. .Jednąz próbek glicerolowych zmiareczkowano i wysiano jako 100 pul 5000 kolonii każda. Po wzroście kolonii każda płytka była zeskrobywana do 10 ml LB-Amp. Pobrano porcje komórek z każdej z pul w celu wykonania DNA plazmidowego. Pozostałe mieszaniny komórek doprowadzono do objętości końcowej 15% glicerolem, porcjowano i zmrożono w -80°C. DNA plazmidowe przygotowano z każdej z pul komórek, i trawiono DNA RNazą (Boeringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) zgodnie z instrukcją producenta. Reakcję RNazy przerywano przez ekstrakcję mieszamnąfenbl/chlrroOorm/alkohol izamylowy (24:24:1), po czym DNA precypitowano etanolem.
Porcje rozpuszczonego DNA plazmidowego z każdej z pul połączono w grupy po 10 (tzn. 1-10.11-20,21-30, 31-40 itd.). DNA plazmidowe rozcieńczono 1:20 i l pl DNA z każdej z pul użyto do wykonania mieszaniny reakcyjnej do PCR, identycznej z mieszaniną opisaną powyżej.
178 000
Mieszaninę reakcyjna^poddano amplifikacj i w warunkach opisanych powyżej. Analiza produktu PCR przez elektroforezę na żelu agorozowym wykazała, że pula 31 -40 zawiera prążek wielkości 320-410 o wielkości identycznej z kontrolą pozytywną.
DNA plazmidowe przygotowane z oryginalnych pul od 31 do 40 rozcieńczono 1:20 i użyto 1 pl z każdej z pul do wykonania mieszaniny reakcyjnej identycznej z opisanąpowyżej. Amplifikacja PCR mieszanin reakcyjnych wykonana została w warunkach opisanych powyżej. Analiza produktu PCR przez elektroforezę na żelu agarozowym wykazała, że pula # 40 daje prążek o wielkości około 310-420 bp.
Stężenie DNA plazmidowego oceniono, w przybliżeniu, przez elektroforezę 1 (ύ rozcieńczenia 1:10 puli # 40 na żelu agarozowym, na 70 ng/μΐ. Siedemdziesiąt nanogramów DNA plazmidowego puli #40 wprowadzono przez elektroporajję do komórek E. coli szczepu DH1 OB przy 2.3 kV, 400Ω. 25 μΕ po czym zawieszono je w 1ml SOC (Sambrook i in., ibid.). Przygotowano trzy rozcieńczenia komórek, rzędu 10'2,10- i 104. Sto mikrolitrów każdego z rozcieńczeń posiano na cztery płytki. Liczba kolonii wynosiła około 10000 kolonii na płytkę dla czterech płytek zawierających komórki z rozcieńczenia 10'2 i około 1000 kolonii na płytkę dla czterech płytek zawierających komórki z rozcieńczenia 10^. Przygotowano odciski filtrów w powtórzeniach z każdej z czterech płytek W^jednej 10'2,oznaczonyjhjakopule# 1 do #5. Jeden z filtrów z każdego powtórzenia położono na pożywce stałej i pozwolono koloniom utworzyć się. Kolonie zdrapano i użyto do wykonania DNA plazmidowego do amplifikacj i PCR. Dodatkowo, zdrapano trzy pozostałe płytki 10*2 i przygotowano z nich DNA plazmidowe.
Pozostałe filtry przepłukiwano wstępnie 3XSSC z dodatkiem 0.5% SDS w temperaturze 65°C z wytrząsaniem przez 12 godzin w celu usunięcia osadu bakterii. Filtry prehybrydyzowano w buforze Ullricha (Ullrich,EMBOJ. 3:361-364,1984) z dodatkiem 50% formamidu, 1% SDS przez noc w temperaturze 37°C. DNA klonu G30, znakowane zestawem MEGAPRIME Amershama(Amersham) zgodnie z instrukcją producenta, gotowane i dodano do roztworu hybrydyzacyjnego (bufor Ullricha+5- % formamid) w stężeniu końcowym 6X105 cpm/ml. Filtry inkubowano przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem. Po inkubacji przez noc, roztwór sondy usuwano, zaś filtry były przemywane przez pięć minut w temperaturze 65°C w 2XSSC + 0.1 % SDS. W następstwie pierwszego przemycia, filtry były przemywane w tym samym roztworze przez piętnaście minut w temperaturze 65°C, a następnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Ostatnia kąpiel powtórzona jeszcze została dwukrotnie. Filtry eksponowano na film przez noc w temperaturze pokojowej. Pojedyncza kolonia na płytce # 2, która odpowiadała puli # 2, była pozytywna po hybrydyzacji z G30. Kolonię tę pobrano i rozproszono w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Przygotowano DNA plazmidowe z kilku pojedynczych kolonii, a następnie poddano je analizie sekwencji DNA. Jeden z klonów, 40-2-2, poddano dalszej analizie sekwencji i zdeponowano w American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852) jako transformant E. coli pod numerem 69055 21 sierpnia 1992. Częściowa sekwencja DNA klonu 40-2-2 i przewidywana sekwencja aminokwasowa przedstawionajestjako Identyfikator Sekw. Nr: 17 i 18.
W celu potwierdzenia obecności sekwencji receptora glukagonu na filtrach hybiydyzacyjnych, przeprowadzono amplifikację PCR z użyciem każdego z preparatów DNA (plazmidowe DNA wykonane z każdego z powtórzonych filtrów i DNA plazmidowe wykonane z każdej z trzech płytek 10-). Pulowane DNA plazmidowe rozcieńczono 1:20 woda i 1 pl każdego z dNa użyto jako matrycy do nastawienia reakcji PCR i przeprowadzeniajak to opisano powyżej. Elektroforeza na żelu agarozowym produktu PCR wykazała, że pula # 2 i trzy spośród czterech pul po 10000 zawierają wytworzony przez PCR prążek pomiędzy 310 a 420 bp. Obecność prążka wytworzonego przez PCR w puli # 2, która odpowiadała płytce # 2, potwierdziło obecność sekwencji DNA receptora glukagonu.
F Strategia klonowania sekwencji 5' ludzkiego receptora glukagonu
Analiza części sekwencji cDNA klonu 40-2-2 i sekwencji cDNA pełnej długości szczurzego receptora glukagonu wykazała, że klonowi 40-2-2 brakuje sekwencji końca N, odpowiadającego około 25 aminokwasom. Sekwencję cDNA końca 5' ludzkiego receptora glukagonu
178 000 uzyskano przy użyciu adaptacji metody opisanej przezFrohmaa i in. (Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002, 1988). Pokrótce, zaprojektowano, .starter olinonuklvotynowz o sekwencji hzdrzdzó zującej z sekwenccjąw pobliżu końca 5' sekwencji kodującej klonu 40-2-2. Starter hybrydyzowaeo ze znakowaną©! matrycąz pierwszej nici cDNA ludzkiej wątroby po czym wydłużono starter w kierunku 5' przy użyciu polimerazy Taq I. Drugi starter poli d(C) „przyklejono” do matrycy cDNA znakowanej G, by umożliwić amplifikację reakcją łańcuchową polimerazy, a następnie klonowanie, sekwencjonowaaie i złożenie z regionem kodującym obecnym w klonie 40-2-2.
Przygotowano trzy matryce cDNA. Pivrwszząmaΐrycąbzła dostępna w handlu pierwsza nić cDNA ludzkiej wątroby. Drugą i trzecią matrycę cDNA przygotowano przez syntetyzowanie pierwszej nici cDNA z dostępnych w handlu mRNA ludzkiej wątroby (Cloatech) przy użyciu oligoEukleotydu zawierającego sekwencję specyficzną dla ludzkiego receptora glukagonu bądź przy użyciu tradycyjnego startera oligo d(T).
Drugąmatrycę cDNA przygotowano przez syntezę z mRNA ludzkiej wątroby, przy użyciu oligonukleotydu ZC5433 (identyfikator Sekw. Nr: 13), który jest specyficzny dla sekwencji kodującej ludzki receptor glukagonu. Mieszaninę reakcyjną zawierającą 2 pl 1 pg/p mRNA ludzkiej wątroby, 8 pl 20 pmol/pl ZC5433 (identyfikator Sekw. Nr: 13 ) i 0,5 1 10mM Tris,pH7.4, 0.1 mM EDTA inkubowano przez 7 minut w temperaturze 68°C, a następnie dwie minuty aa lodzie. Po inkubacji do mieszaniny reakcyjnej dodano 4 pl 5X buforu SUPERSCRIPT (GiBCO-dRL), 1 pl 0.2I miCi/μ! a^-P-dCTP i 5 p oewrotvjjtaankrzyplzyy SUPERCCRIPT. Reakcję inkubowano przez godzinę w temperaturze 45°C. Reakcję przerwano przez dodatek 80 pl TE. RNA hznrolizowaa.o przez dodanie 1 pl 0.5% EDTA i 1 pl KOH. Reakcję hznrΌlizz inkubowano w temperaturze 65°C przez 5 minut. Po inkubacji, próbkę rozcieńczono do 1 ml z użyciem 50 mM KOH, 0.1 mM EDTA i przepuszczono przez zagęszczacz CENTRICON 100 (Amicon, Daneers, Mass.). Kolumnę przemywano 1ml 50 mM KOH, 0.1 mM EDTA. Stężone cDNA było zbierane i zobojętniane połową objętości 100 mM HC1. Zobojętnionąpróbkę cDNA precypitowano etanolem, po czym rozpuszczono w 26 pl wody destylowanej.
'Trzecia matrycę cDNA przygotowano przez syntezę z mRNA ludzkiej wątroby przy użyciu nabytego startera oligo d(T). Przygotowano mieszaninę reakcyjną zawieraaącą2 pg 1 pn/μl mRNA ludzkiej wątroby, 1 p 1 pg/pl oligo d(T)18 (New EEglaad Biolabs, Beverly, Mass) i 5p 10 mM TRIS, pH 7.4,0.1 mM EDTA. Syntezę cDNA przeprowadzono w warunkach wyszczególnionych dla syntezy opisanej powyżej.
Pierwszą nić cDNA znakowano G. Nastawiono probówki zawierające 4 pl pierwszej nici cDNA ludzkiej wątroby (QUICK CLONE; Cloatech, Palo Alto, Califf.), 4 pl pierwszej nici cDNA ze startera ZC5433 (Identyfikator Sekw. Nr: 13), lub 4 pl pierwszej aici cDNA ze startera oligo d(T). Do każdej mieszaniny reakcyjnej dodano 22 pl wody, 8 pl buforu 5X (Promega), 4 pl 10 mM -GtP i 2 pl 15 U/pl traasferazy terminalnej, po czym iakubowaao reakcje przez 30 minut w temperaturze 37°C, a następnie przez 10 minut w temperaturze 65°C. Reakcje rozcieńczono do 90 pl przy użyciu 10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA i precypitowano etanolem.
Synteza drugiej aici wszystkich znakowanych G cDNA przeprowadzona została identycznie. Każde z cDNA rozpuszczono najpierw w 50 pl wody destylowanej. Do każdego z cDNA dodano 100 pmoliZC4814 (identyfikator Sekw. Nr: 20) w5 pl. cDNA sklejono ze starterem przez podgrzanie mieszania do 68°C przez pięć miaut, a następnie dwuminutową, inkubację aa lodzie. Po sklejeniu cDNA ze starterem, do każdej z mieszania dodano 20 pl buforu polimerazy I X5 (przykład 1), 1 pl 100 mM ditiotreitolu, 2 pl roztworu zawierającego 10 mM każdego z -NTP, 2 pl 0.5 miCi/pl α32I-dCPP, 1 ul 3 U/p ligazy DNA E. coli (New E^l^d Biolabs), 5 ul 7 U/p Polimerazy I DNA E. coli (Amersham). Reakcje inkubowano przez pięć minut w temperaturze 22°C, a następnie dodano po 1.5 ul 2U/p RNazy H (GIBCO-BKL), po czym dalej inkubowano w temperaturze 16°C przez dwie godziny. Reakcję przerywano przez dodanie 200 pl 10mMTris(pH 8.0), 1 mM EDTA, aaastępnie 150 pl wysycoaego wodąfenolui 150 ul chloroformu. Mieszaninę mieszano energicznie i odwirowano przez trzy minuty w 22°C w celu rozdzielenia faz. Fazę wodną pobrano i ponownie ekstrahowano fenolem i chloroformem jak to opisano powyżej. Po drugiej ekstrakcji mieszaniną feaol-chloroform, warstwę wodną ekstrahowano chloroformem.
178 000 cDNA w fazie wodnej precypitowano przez dodanie 5 ug glikogenu z mięśni, 100 pl 8 M octanu amonu i 300 ul izopropanolu w celu wybiórczej precypitacji dużych cząstek kwasu nukleinowego i pozostawieniu nie wbudowanych oligonukleotydowych starterów w nadsączu. cDNA żwirowano, zaś peletkę przemywano 70% etanolem, a następnie wysuszono na· powietrzu. Peletkę rozpuszczono w 15 ul wody redestylowanej.
Dwuniciowe cDNA amplifikowano w pięciu równoległych reakcj ach z użyciem starterów oligonukleotydowych homologicznych do końca 5' ZC4814 (Identyfikator Sekw. Nr: 20) i zawierających miejsca restrykcyjne w celu polepszenia klonowania, i startera oligonukleotydowego specyficznego dla skrajnego końca 5' sekwencji kodującej obecnej w klonie 40-2-2. Każda z mieszanin reakcyjnych zawierała 5 ul 10X bufora Taq 1,3 ul, 25 mM MgC12.5 pl roztworu zawierającego 2.5 mM każdego z dNTP, 1 pl dwuniciowego cDNA i 0.5 pl polimerazy Taq I (Promega). Dodano wody destylowanej do objętości końcowej 50 ul. Reakcję denaturowano przez pięć minut w temperaturze 98°C przed dodaniem 1 pl każdego z 10 pmol/pl ZC5624 (Identyfikator Sekw. Nr: 21) i 20 pmoli/ul ZC4812 (Identyfikator Sekw. Nr: 19). Każdąz próbek pokryto 70 ul oleju mineralnego, trzymanego w temperaturze 90°C. Reakcje amplifikowano trzydziestoma cyklami (95°C przez 60 sekund, 57°C przez 40 sekund i 72°C przez 60 sekund), a następnie inkubowano przez 7 minut w temperaturze 72°C.
Każdy z produktów PCR poddano elektroforezie na żelu agarozowym, zaś amplifikowany fragment wycinano i wklonowywano do pCR1000 przy użyciu zestawu TA cloning kit (Invitrogen). Trzy klony z każdej z ligacji wybrano i badano na obecność wstawki przy użyciu starterów oligonukleotydowych ZC5624 (Identyfikator Sekw. Nr: 21) iZC4812 (Identyfikator Sekw. Nr: 19) w niezależnych mieszaninach reakcyjnych PCR z których każda zawierała próbkę z klonuj ako źródło matrycy DNA. Reakcje PCR przeprowadzono jak to opisano powyżej, z wyjątkiem tego, że przeprowadzano wyłącznie 30 cykli reakcji. Pojedyncze klony posiadające wstawkę z oryginalnych reakcji PCR poddano analizie sekwencji DNA. Spośród dwóch klonów, które jak wykazano, zawierały wolną od błędów sekwencję kodującąkoniec 5' ludzkiego receptora glukagonu, wybrano jeden w celu dostarczenia sekwencji kodującej koniec 5' ludzkiego receptora glukagonu. Klon 9A trawiono EcoRI i KpnI w celu uzyskania fragmentu, wielkości 551 bp, zawierającego sekwencję kodującą koniec 5' ludzkiego receptora glukagonu. Sekwencję kodującą koniec 3' receptora glukagonu uzyskano jako fragment Kpnl-BamHI, wielkości 561 bp, z klonu 40-2-2. Fragment EcoRI-KpnI i fragment Kpnl-BamHI, wielkości 561 bp, ligowano w obecności EcoRI i BamHI, w celu zapobieżenia konkatameryzacji. Produkt ligacji, fragment wielkości 1112 bp, oczyszczono na żelu i nazwano 9A1. Dla wygody fragment 9A1 ligowano do trawionego EcoRI-BamHI plazmidu pUC 18. Mieszaninę ligacyjną transformowano komórki E. coli szczepu DH10b, zaś wybrane klony badano na obecność wstawki. Jeden z klonów posiadał wstawkę.
Sekwencję kodującą receptor glukagonu wprowadzono do wektora ekspresyjnego ssaków przy użyciu plazmidu p9A11 i klonu 40-2-2 w celu uzyskania kompletnej sekwencji kodującej receptor glukagonu. Plazmid p9A11 trawiono Pvull i BamHI w celu wyizolowania fragmentu wielkości 967 bp. Klon 40-2-2 trawiono BamHI i Sacl w celu izolacji fragmentu wielkości 828 bp, zawierającego koniec 3' sekwencji kodującej ludzkiego receptora glukagonu. Wektor ekspresyjny ssaków pHZ1 linearyzowano przez trawienie EcoRI i wypełniano końce polimerazą DNA T4. Linearyzowany wektor o „tępych końcach” trawiono Sacl. Fragmenty Pvull-BamHI, wielkości 967 bp i BamHI-Sacl, wielkości 828 bp, ligowano z trawionym Sacl wektorem pHZl.
Plazmid pHZl jest wektorem ekspresyjnym, który może być użyty do ekspresji białka w komórkach ssaków lub systemie translacyjnym, opartym na oocytach żaby, z mRNA poddanym transkrypcji in vitro. Jednostka ekspresyjna pHZl składa się z promotora mysiej metalotioneiny-1, promotora bakteriofaga T7, otoczonego przez liczne miejsca klonowania, zawierające unikalne miejsca restrykcyjne do wprowadzania sekwencji kodujących, terminator ludzkiego hormonu wzrostu i terminator bakteriofaga T7. Dodatkowo, pHZl zawiera początek replikacji
E. coli; gen bakteryjnej beta laktamazy; jednostkę ekspresyjną markera umożliwiającego sele24
178 000 kcj ę zawieraj ^^ląp^moter i początek SV 40, gen oporności na neomycynę i terminator transkrypcji SV40.
PlazmidpHZl zawierający łekwencjęcDNAreceptora glukagonu w poprawnej orientacji w stosunku do promotora, oznaczono jako pLJ6'. Wstawka i jej połączenia z wektorem zostały zsskwencjynowans w celu potwierdzenia obecności poprawnej sekwencji. Plazmid pLJ6' zdeponowano w American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rock^He, MD 20852) pod numerem 69183 15 stycznia 1993. Sekwencję DNA i przewidywaną sekwencję aminokwasow-ą cDNA receptora glukagonu obecną w pLJ6' pokazano odpowiednio w Identyfikatorach Sekw Nr: 24 i 25.
Przykład 6. Klonowanie cDNA receptora glukagonu z ludzkich komórek wysepek.
Dodatkowo do klonowania receptora glukagonu z komórek wątroby ludzkiej, uzyskano cDNA receptora glukagonu z biblioteki ludzkich komórek wysepek. Porcję biblioteki cDNA ludzkich komórek wysepek (przykład 1C) poddano amplifikacji PCR przy użyciu oligonukleotydu ZC5763 (Identyfikator Sekw. Nr: 22), który jest oligynukleotydsm antysensownym zawierającym miejsce Xhol otoczone przez sekwencje z nie ulegające translacji końca 3' cDNA ludzkiego receptora glukagonu. Obecność miejsc restrykcyjnych w starterach yligynukleytydowych wspomaga ukierunkowane klonowanie powstałego produktu PCR do odpowiedniego wektora plazmidowego. Nastawiono mieszaninę reakcyjną PCR zawierającą4 ul biblioteki cDNA komórek wysepek (przykład 1C), 8 pl X10 bufora PCR Promega (Promega), 20 pmoli ZC5763 (Identyfikator Sekw. Nr: 22), 20 pmoli ZC5849 (Identyfikator Sekw. Nr: 23), 1 pl roztworu zawierającego 20 mM każdego z deoksyrybynuklsotydów i 46.5 ul wody. Mieszaninę podgrzano do 95°C przez trzy minuty, następnie zmniejszono temperaturę do 80°C przez trzy minuty. Mieszaninę utrzymywano w temperaturze 80°C do czasu użycia. W celu rozpoczęcia reakcji dodano 20 pl mieszaniny enzymu zawierającej 2 μΐ 10X buforu PCR Promega (Promega), 2 ul 5U/ul polimerazy Taq I (Cetus) i 16 ul wody. Reakcję pokryto 50 ul oleju mineralnego (Sigma) i poddano trzydziestu cyklom (95°C przez minutę, 55°C przez minutę i 72°C przez dwie minuty i piętnaście sekund, która to inkubacja w 72°C wydłużana była o trzy sekundy co każdy cykl), a następnie inkμbywany przez dziesięć minut w 72°C. Po końcowej inkubacji w 72°C reakcja utrzymywana była w 4°C. Analiza przez elektroforezę na żelu agarozowym 10 ul porcji produktu PCR wykazała obecność fragmentu około 1.8 do 1.9 kb. W oparciu o cDNA ludzkiego receptora glukagonu obecnego wpLJ6'; oczekiwano fragmentu długości 1846 bp.
Reakcję PCR poddano ekstrakcji chloroformem; a następnie dwóm ekstrakcjom mieszaniną fenol:chlyrofyrm i końcowej ekstrakcji chloroformem. Po końcowej ekstrakcji dodano 5 ul 4 ug/ul nośnika glikogenowego (Byshringsr Mannheim Corporation) i mieszaninę poddano precypitacji w obecności octanu amonu i etanolu. DNA zebrano przez odwirowanie a peletkę przemyto etanolem 70%. Peletkę DNA rozpuszczono w wodzie i trawiono Xhol i EcoRI. DNA oczyszczano na żelu i wkuwano do plazmidu pBLUESCRIPT SK+ (Stratagene Cloning Systems) linearyzywanegy przez Xhol i EcoRI, Mieszaninę ligacyjną transformowano komórki E. coli szczepu DH1 OB (GIBCO-BRL). DNA plazmidowe przygotowano z wybranych transformantów, i poddano je trawieniu enzymami restrykcyjnymi i analizie metodą Southern biot. Klony porównywano ze wstawkącDNA ludzkiego receptora glukagonu ybscnąwpLJ6'. Napodstawie diagnostycznego trawienia enzymami restrykcyjnymi, wybrane klony poddano analizie sekwencji. Wykazała ona, że jeden z klonów pSLIGR-1, zawiera sekwencję kodującą receptora glukagonu. Region kodujący pSLIGR-1 zawierał trzy zmiany nukleotydowe w porównaniu z cDNA wątroby obecnym w pLJ6'. Jedna ze zmian była cichą mutacją, pozostałe dwie spowodowały zmiany w aminokwasach jak to pokazano w tabeli 5. Analiza zmian wskazuje, że mogą być one rezultatem odmian polimorficznych reprezentujących warianty alleliczne.
178 000
Tabela 5
Numer Aminokwasu Aminokwas według sekwencji cDNA Wątroby Aminokwas według sekwencji cDNA Komórek Wysepek
184 Phe Leu
265 Ser Gly
Przykład 7. Klonowanie genu ludzkiego receptora glukagonu
W celu uzyskania klonu genomowego ludzkiego receptora glukagonu, przeglądano dwie biblioteki przy użyciu cDNA ludzkiego receptora glukagonujako sondy. Przeglądano amplifikowaną ludzkąbibliotekę genomowąłożyska mężczyzny rasy kaukaskiej lambdaFIX II i amplikowaną ludzką bibliotekę genomową płuca lambdaFIX (obie pochodzące ze Stratagene Cloning Systems, numery katalogowe 946203 i 944201) w poszukiwaniu genu ludzkiego receptora glukagonu.
Ampłifkowanąłudzkąbibliótekę genomowąpNca miareczkowano i wysiano około 4x 104 jednostek tworzących kolonie (pfu) z komórkami E. coli szczepu LE392 (Stratagene Cloning Systems) na każdej z trzydziestu płytek średnicy 150 mm. Wysiano dodatkowo dziesięć płytek po 6x 104komórek E. coli szczepu LE392. Płytki poddano inkubacji przez noc w 3 7°C wybrano trzydzieści płytek do przeglądania.
Wykonano filtry w powtórzeniach dla każdej z trzydziestu płytek. Każdy z filtrów wykonano przez przykrycie płytki błoną nylonową HYBOND (Amersham) zgodnie z zaleceniami producenta. Filtry zdejmowano z płytki zaś komórki poddawano lizie w 1.5 M NaCl i 0.5 M NaOH przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Filtry zobojętniano przez pięć minut w 1M Tris-HCl (pH 7.5), 1.5 M NaCl i utrwalano za pomocą 1200 miJ energii Uv w urządzeniu STRATALINKER (Stratagene Cloning Systems). Po utrwaleniu filtry przemywano trzykrotnie w 0.25XSSC, 0.25% SDS, 1 mM EDTA w temperaturze 65°C. Po przemyciu filtry rozdzielono na sześć partii po 10 filtrów i prehybrydyzowano w roztworze do prehybrydyzacji (5XSSC, 5X roztwór Denhardta, 0.2% SDS, 1 mM EDTA) filtrowanym przez filtr o średnicy porów 0.45 pm po czym dodawano bezpośrednio przed użycieml 00 pg/ml zdenaturowanego gorącym DNA spermy łososia. Filtry prehybrydyzowano przez noc w temperaturze 65°C.
cDNA ludzkiego receptora glukagonu z klonu p40-2-2 znakowano starterami o losowej sekwencji zestawu MEGAPRIME (Amersham) przy użyciu protokołu producenta. Roztwór do - prehybrydyzacji z każdej z partii filtrów był usunięty i zastąpiony przez świeży roztwór do prehybrydyzacji z dodatkiem 28.5X106 cpmsondy. Filtry hybrydyzowano w 65°C przez dwadzieścia godzin. Po hybrydyzacji roztwór hybrydyzacyjny i był usuwany, filtry płukano czterolub pięciokrotnie w roztworze do płukania zawierającym 0.25XSSC, 0.2% SDS, 1 mM EDTA w temperaturze pokojowej. Po płukaniu filtry przemywano w ośmiu kolejnych kąpielach w 65°C a następnie końcowym płukaniem w temperaturze 70°C. Po kąpieli w 7 0°C filmy poddawano autoradiografii na filmie (XAR-5; Eastman Kodak Co., Rochester, NY) przez cztery dni w -70°C z użyciem ekranu intensyfikującego.
Badania autoradiogramów wykazało obecność czterech regionów hybrydyzacji z sondą znakowaną radioaktywnie. Pobrano fragment agaru z każdego z czterech regionów, do oczyszczenia. Każdy z fragmentów agaru moczono przez noc w 1 ml SM (Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. NY 1982; zamieszczone tujako odnośnik), 1% chloroformu. Po inkubacji przez noc, faga z każdego z fragmentów agaru rozcieńczono 1: 1000 SM. porcj e po 5,25 i 50 ul wysiano z komórkami E. coli szczepu LE392. Płytki inkubowano po czym przygotowano pojedyncze odciski z płytek wysianych przy użyciu 5 i 25 ul. Filtry wykonano, prehybrydyzowano i hybrydyzowano jak to opisano powyżej. Filtry eksponowano na film autoradiografi czny.
Badanie autoradiogramów wykazało regiony znakowane pozytywnie pochodzące z każdego z czterech klonów. Dziesięć fragmentów agaru pobrano z regionów wyznakowanych pozytywnie reprezentujących co najmniej dwa obszary pozytywne dla każdego z oryginalnych klonów.
178 000
Fragmenty agaru traktowano jak to opisano powyżej. F aga z każdego z fragmentów agaru rozzIeńczoyd 1:15555 w SM. Porcje 2.5 ul i 10 ul posiano z komórkami E. coli szczepu LE392. Płytki iyaróownyo po czym przygotowano pojedyncze odciski z każdej z płytek posiadających odpowiednio izolowane kolonie. Filtry przygotowano i prehzbrydzzownyd jak to opisano powyżej. AutdradIogrnmz z filtrów wykazaty obecność obszarów eksponowanych odpowiadających pojedynczym koloniom. Pobrano dwanaście pozztzwyych kolonii iepdezeyrujączch co najmniej jeden klon z każdego z czterech oryginalnych pozytywów. Jedna kolonia z każdej płytki poddana została dalszej azalizie.
Fragmenty agaru z klonów faga 2-2-1,3-1-1 i 14-2-1 i 11-2-1 badano jak to opisano powyżej . Fag został iozcieńczdyz 1:100 w SM i posiany za hodowlę komórek E. coli szczepu LE392. DwuzizIdwe DNA przygotowano tak jak to opisano w Gdossójrged ((Nuc. Acids. Res. 15:6737, 1987; zamieszczone tu jako o0yośnIai). Dwuniciowe DNA trawiono Xbai w celu uwolnienia wstawki gezomowej. Elektroforeza za żelu agniozowym wykazała, że klozy 2-2-1 i 11-2-1 zawierały wstawkę Xbal wielkości ok. 1.9 kb, kloz 14-2-1 zawierał wstawkę 15 kb, zaś 3-3-1 zawierał wstawkę wielkości 13 kb. Analiza metodą Southern biot, klonów tiawIoyzzh Xbal i Xbal-BnmHI wykazała, że cDNA ludzkiego receptora glukagozu pokazana jest za figurze 6.
Tabela 6
Numer Nowego Klonu Oryginalny Numer Klonu Hybrydyzacja z fragmentem Xbal Hybrydyzacja z fragmentem XóalzBamHI
klon 1 2-2-1 ~9kb 4.2 kb, 1.9 kb
kloz 6 11-2-1 ~ 9 kb 4.2 kb, 1.9 kb
kloz 2 142-1 ~ 15 kb 4.2 kb, 1.9 kb
klon 5 3-3-1 ~ 13 kb 1.6 kb
Klony 11-2-1 i 14-2-1 poddano dalszej azalizie. Kloz 2-2-1 wydawał się być identyczny z klonem 11-2-1 stąd zaniechano jego dalszej analizy. Dla wygody nazwy klonów zmieniono tak jak to opisano w tabeli 6. Dwuziciowe DNA przygotowano z każdej z kolonii faga 0o wklonowazia do wektora plazmidowego według metody opisanej przez Maziatis. DNA trawiono Xbal, dzzzszzznyo za żelu i wkldyowywnyo do plazmidu pBLUESCRIPT SK (Stratageze Clozizg Systems) liyjnrzzownzego trawieniem Xóal i poddanego działamu fosfatazy alanlizznjj cielęcej w celu zapobieżenia recyrkulacji. Mieszazizy ligazzjye wprowadzano przez elekrropddnzję 0o komórek DH 1 OB ELECTROMAX (GIBCO-BRL) w urządzeniu GENEPULSER (Bio-rad Laboratories; Richmond; CA) przy 400 ohm, 25 mifaradów i 2.3 kV. Przygotowano DNA plazmidowe z wybranych traasfdrmnntów. Klozz zawierające genomo-wą wstawkę z klonów 6 i 2 nazwano pSLHGR6 i pSHLGR2. Klozy pSLHGR6 i pSHLGR2 poddano seawenzjonowaniu. Analiza i porównanie sekwencji z regionem kodującym ludzkiego receptora glukagozu wykazało obecność 12 egzozów obejmujących region kodujący. Analiza chromosomów, pizepidwa0zoza za idzmnznzh chromosomów metafnzalyzzh opisana przez Dumam im Mol. Cell. Biol. 8: 1863-1867,1988; zamieszczona tu jako ddndśyik) przy użyciu biotynowazej sondy gjyrrezjptora glu^ozu i sondzie specyficznej dla rejonu zjntdomerowjgo chromosomu 17. Deyatrdację chromosomów, hybrydyzację i wzarzwnyIj pojedynczego koloru przeprowadzono jak to opisano przez Pinkel i iz., (Proc NatlAcad SCI, 83:2934-2938,1986, zamieszczona tujako odnośnik) i modyfikacje Kievits i iz. (Cytogenet. Cell. Genet. 53:134-136,1990, zamieszczona tu jako odnośnik), z wyjątkiem tego, że hybrydyzację pdzepddwndzoyd w 65% (obj/obj) mieszaninie fdrmnmId./siadzzay dekstdayr/2XSSC i płukanie po hybrydyzacji 65% mieszaziza formamid/2XSSP w temperaturze 42°C po czym płukano w 0.1XSSC w temperaturze 55°C jak to opisano przez Palmiter i iz., (Proc NatlAcadSci USA, 89: 6333-6337,1992, zamieszczona tu jako d0yośyik). Potwierdzono trayslokncję w położeniu q25 przez barwienie DAPI niektórych z idzmnzówmjtafazałnyzhjak to opisazo przezTestA i w.,(Cytogenet Cell Genet. 60:247-249,1992;
178 000 zamieszczone tu jako odnośnik). Barwienie DAPI spowodowało powstanie wzoru przypominającego prążki Q.
Amplifikowana biblioteka ludzkiego łożyska (Stratagene) przeszukiwana była, bezskutecznie, w poszukiwaniu genu ludzkiego receptora glukagonu przy użyciu metody opisanej powyżej. Bibliotekę miareczkowano i wysiano około 5Χ104 pfu z komórkami E. coli szczepu LE392 (Stratagene Clming Systems) na każdej z trzydziestu płytek średnicy 150 mm. Wysiano dodatkowo jedenaście płytek po 105 pfu i komórki E. coli szczepu LE392. Płytki poddano inkubacji przez noc w 37°C wybrano trzydzieści osiem płytek do przeglądania.
Wykonano odciski na filtrach nylonowych, płukano j e i prehybrydyrowaoo jak to opisano powyżej. Fragment cDNA receptora glukagonu ludzkich komórek wysepek G30 (przykład 4) znakowano starterami o losowej sekwencji zestawu MEGAPRIME (Amersham) przy użyciu protokołu producenta. Roztwór do prehybrydyrncji z każdej z partii filtrów był usunięty i zastąpiony przez świeży roztwór do prehybrydyzacji z dodatkiem 1.1Χ106 cpm sondy. Filtry hybrydyrowaor w 65°C przez noc. Po hybrydyzacji roztwór hybrydyrncyjny był usuwany, filtry płukano cztero- lub pięciokrotnie w roztworze do płukania zawierającym 0.25XSSC, 0.2%SDS, 1 mM EDTA w temperaturze pokojowej. Po płukaniu filtry przemywano w ośmiu kolejnych kąpielach w 65°C a następnie końcowym płukaniem w temperaturze 70°C. Po kąpieli w 70°C filmy poddawano autorndiofaaOii na filmie (XAR-5; Eastman Kodak Co.) przez cztery dni w -70°C z użyciem ekranu intensyfikującego.
Badanie autoradiogramów nie wykazało przekonywujących sygnałów pozytywnych; jednakże, wybrano siedem obszarów o słabym znakowaniu do dalszej analizy. Klony poddawano ponownemu przeglądaniu, jak to opisano powyżej, ale ponownie wykonane nutrradibframy nie wykazały znakowania w ogóle. Nie poszukiwano więc tych klonów.
Przykład 8. Ekspresja cDNA receptora glukagonu w komórkach ssaków
A. Ekspresja szczurzego receptora glukagonu w komórkach BHK570
Plazmid pLJ4 kotraosfekowaoo z plazmidem pLJl do komórek BHK570 (zdeponowanych w American Type Cell Collection pod numerem 10314) przy użyciu metody fosforanu wapnia opisanej przez Graham i Van der Eb (Wrology 52:456, 1973; zamieszczone tu jako odnośnik). Plazmid pLJ otrzymano zplazmidup416 zawierającego ori Adenowirusa 5, wzmacniacz SV40, główny późny promotor Adenowirusa 2, potrójny lider Adenowirusa 5, miejsca składania, 3' i 5', cDNA DhfR', sygnał poliadenylacji SV40 i sekwencje wektorapML-1 (Lusky i ^^ιο, Nature 293: 79-81, 1981). Jednostkę ekspresyjną EcoRI-Xbal DHFR z plazmidu p416 ligowano do pUC18 linearyzowanego przez trawienie EcoRI i Xbal, w celu stworzenia pLJl. Trnns0ekowaoe komórki hodowano w pożywce (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) zawierającego 10% surowicy płodowej cielęcej, mieszankę antybiotyków 1XPSN (GIBCO-BRL 600-5640), i 2.0 mM L-Glutaminę). Po kilku dniach w nie selekcjonującej pożywce, pożywkę zastępowano pożywką selekcjonującą (pożywka zawierająca 250 mM metotreksat (MTX)). Komórki rozdzielano i rozcieńczano 1:20 i 1:50 w pożywce selekcjonującej w płytkach 10 cm. Po 7-10 dniach selekcji w 250 mM MTX, pobierano kolonie przy pomocy cylindrów do klonowania, do płytek 24-stfdrieokrwych. Powstałe klony badano na zdolność wiązania glu^gom jak to opisano powyżej (przykład 3). Wiązanie glukagonu przeprowadzano również ze wszystkimi komórkami przez posianie 2X105 komórek każdego z klonów do studzienki płytki 24-studzieokowej. Płytki inkubowano przez 72 godziny w 37°C i 5% CO2. Wiązanie glukagonu przeprowadzano w sposób opisany w przykładzie 3, z wyjątkiem tego, że po ostatnim płukaniu wPBS, komórki usuwano ze studzienki przez trypsynizację do probówek. Probówki zliczane były w liczniku gamma. Komórki posiadające najwyższą liczbę zliczeń, a stąd zdolne do związania największej ilości glukagonf. wybierano do dalszych badań. Wybrane transformanty badano również na odpowiedź cAMP zależną od glukagonu jak to opisano w przykładzie 8D i odpowiedź wapnia wewnątrzkomórkowego zależną od flfkagoou jak to opisano w przykładzie 8E. Test wiązania glukagonu przeprowadzano również na preparatach błon komórkowych z tanos0ektnotów opisanych powyżej.
178 000
B. Wiązanie glukagonu przez preparat błon
Błony z transfekowanych pLJ4 komórek BHK porównywano z preparatami błon szczurzej wątroby pod kątem ich zdolności wiązania 125I-giukagonu. Błony przygotowano jak to opisano przez Rodbell i in., (J. Biol. Chem. 246:1861-1871,1971, zamieszczone tujako odnośnik). Dwie partie błon z wątroby przygotowano z ok. 80 g wątrób pobranych od 12 do 16 zdekapitowanych młodych samic szczura. Wątroby szybko pobrano i umieszczono w chłodzonym lodem naczyniu. Wątroby podzielono nadziesięciogramowe porcje. Porcje były rozdrabniane nożyczkami, w trakcie czego usuwano tkankę łączną. Porcje były homogenizowane osobno w bomogenizatorze Dounce. Do każdej rozdrabnianej w homogenizatorze porcji dodano 25 ml Medium (tabela 2), i każdą z porcji homogenizowano na lodzie ośmioma silnymi ruchami tłuczka homogenizatora. Po homogenizacji, homogenaty zbierano w 450 ml zimnego Medium (tabela 2). Spulowane homogenaty mieszano przez trzy minuty i filtrowano przez dwie warstwy sukna a następnie przez cztery warstwy sukna. Homogenaty odwirowano przez 30 minut przy 1500Xg w temperaturze 4°C. Nadsącze usunięto a peletki pulowano do czystego homogenizatora Dounce. Peletki zawieszono trzema delikatnymi ruchami tłuczka. Zawieszone peletki strącano w naczyniu miarowym o poj. 250 ml, zawierającym 62 ml 69% Roztworu Cukrozy (tabela 2). Dodawano wody destylowanej do objętości końcowej 110 ml, mieszano energicznie i trzymano w chłodzie. Stężenie roztworu dostrajano do 44% +/- 0.1% przy użyciu 69% cukrozy lub wody, co mierzono refraktometrem (Bausch & Lomb, Rochester, N.Y.). Zawiesinę z cukrozą rozdzielano po równo probówek do ultrawirowania 25X89 mm. Każdą z zawiesi ostrożnie pokrywano 20 ml 42.3% Roztworu Cukrozy (tabela 2), i wirowano zawiesiny przez 150 minut przy 24000 rpm w rotorze SW28 (Sorvall, DuPont Company, Wilmington, Del.) w temperaturze 4°C.
Po odwirowaniu, pływający materiał z każdej probówki usuwano przez aspirację do 10 ml strzykawki przez igłę 18G. Materiał z każdej z probówek był pulowany i zawieszany w ok. 10 ml Medium (tabela 2) przez wciąganie i wypychanie mieszaniny przez igłę do probówki wirowniczej. Probówkę napełniono Medium (tabela 2) i wirowano przez 15 minut przy 15000 rpm w wirniku SS-34 (Sorvall). Nadsącz ostrożnie zbierano i usuwano. Peletkę zawieszono w Medium (tabela 2) i rozcieńczono 1:1000 wodądestylowaną. Odczytywano absorbancję wiem kuwetach w celu określenia zawartości białka. Stężenie białka określano przy użyciu wzoru:
^224nm x krotność- rozcieńczenia= mg - białka 1 ml
6.45
Preparat błon porcjowano, zamrażano w kąpieli suchy lód/metanol, i przechowywano w-80°C.
Błony były przygotowywane z transfekowanych komórek BHK rosnących zlewnie w 150 mm płytce w pożywce selekcjonującej. Dwie płytki transfektantów rosnących zlewnie przepłukiwano dwukrotnie zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS; sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), po czym dodawano do każdej płytki 10 ml PBS zawierającego 1 mM PMSF. Komórki z każdej płytki były zdrapywane do roztworu PBS, i przenoszone do świeżych probówek. Każda z płytek przemywana była 5 ml PBS zawierającego 1 mM PMSF po czym płyn po płukaniu dodawany był do odpowiednich komórek. Komórki odwirowano przy 2000 rpm na wirówce stołowej w temperaturze 4°C. Nadsącza usuwano a komórki zawieszano w 30 ml 5 mM Hepes, 1 mM PMSF, pH 7.5. Komórki inkubowano na lodzie przez 15 minut a następnie odwirowane przy 47800Xg w temperaturze 4°C. Każdąpeletkę zawieszano w roztworze PBS zawierającym 1 M PMSF, porcjowano i mrożono w -80°C.
Badanie współzawodnictwa z użyciem testu wiązania glukagonu przeprowadzano na preparatach błon wątroby szczurzej i komórek BHK transformowanych. Pokrótce, nastawiono probówki reakcyjne zawierające 20 pi glukagonu z od 10'11 M do 10'6 M rozcieńczonego w 10 mM HOAc lub 20 pl BSA. Do każdej z probówek dodano 100 pl Buforu do wiązania, 20 pl 125I-glukagonu (Amersham); 20 pl 1 mM NaHCO3; 20 pl 10 mMHOAc, 0.5% BSA (Novo Nordisk N/A, Bagsvaerd, Denmark) i 40 pl wody destylowanej. Reakcję wiązania zapoczątkowano przez do178 000 danie 20 pl preparatu błon do każdej z probówek. Reakcję inkubowano przez 30 minut w 30°C. Błony zbierano przez odwirowanie w mikrowirówce na wysokich obrotach przez 10 minut w temperaturze 4°C. Nadsącza z każdej z próbek aspirowano, i zliczano impulsy peletki. Współzawodnictwo z nieznakowanym glukagonem dało prawie identyczne krzywe sigmoidalne wiązania glukagonu (figura 3). Według analizy Scatcharda (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660-672,1949; zamieszczona tujako odnośniki), Kd wynosiła 50 nM dla klonowanego receptora i 49 nM dla szczurzych błon z wątroby (figura 4).
Specyficzność receptora kodowanego przez pLJ4 badano przez zdolność do współzawodniczenia o wiązanie pokrewnych hormonów peptydowych z 125I-glukagonem. Do preparatów błon komórek transfekowanych pLJ4 dodawano mikromnlarne ilości glukagonu i pokrewnych peptydów (tabela 7), wraz z 125I-glukagonem w teście wiązania opisanym powyżej. Wyłącznie natywny glukagon i antagonista, amid des-His^Glu^-glukagonu były zdolne współzawodniczyć z 125I-glukagonem o wiązanie z błoną.
Tabela 7
1 pM ludzki glukagon (Sigma)
1 pM 1 9 amid des-His [Glu ] glukagonu (syntetyzowany na syntezatorze peptydów 431 A Applied Biosystems przy użyciu żywicy RINK AMIDE MBHA (Bachem Bioscience Inc., Philadelphia, Penn.))
200 nM ludzki peptyd podobny do glukagonu (GLP) (Sigma)
20 pM świński jelitowy peptyd wazoaktywny (VIP) (Sigma)
1 pM kalcytonina łososiowa (Sigma)
1 pM świńska sekretyna (Sigma)
1 pM wołowy hormon przytarczyc (PTH) (Sigma)
C. Ekspresja szczurzego receptora glukagonu w komórkach COS-7
Zdolność komórek COS-7 transfekowanych pLJ4 do bycia pobudzanym przez glukagon do zwiększenia poziomów cAMP, badana była przy użyciu zestawu Amersham SPA (Amersham) jak to opisano poniżej (przykład 8D). Test pokazał, że stymulowane glukagonem transfektanty pLJ4 akumukyą około pięć razy więcej cAMP w porównaniu z kontrolnymi komórkami COS-7 transfekowanymi samym wektorem. Pokrewne peptydy jak sekretyna, VIP, PTH, GLP i kalcytonina dodane były do transfektantów w stężeniach od 100 nM do 1000 nM i badane na ich zdolność do indukowania podwyższonych poziomów cAMP. Wyniki testu pokazały, że żaden z pokrewnych peptydów nie jest zdolny do znaczącego podniesienia poziomów cAMP.
D. Badania z użyciem lucyferazy i cyklazy adenylowej na całych komcórkach cDNA szczurzego receptora glukagonu ekspresjonowano w linii komórkowej BHK570, stabilnie transfekowanej ZK6, jednostce ekspresyjnej zawierającej promotor zawierający co najmniej element odpowiedzi na cAMP, DNA lucyferazy i terminator hGH. Ta linia komórkowa pozwala mierzyć aktywność lucyferazy, aktywność cyklazy adenylowej i stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w odpowiedzi na związanie glukagonu z jego receptorem.
Element odpowiedzi na cAMP proenkefaliny (CRE) w plazmidzie ZK6 uzyskano z Zem233. Zem233 uzyskano z plazmidów Zem67 iZeml06. Plazmid Zeml06 skonstruowano z prekursora Zem93. W celu skonstruowania Zem93, fragment Kpnl-BamHI zawierający promoter MT-1 wyizolowano z MThGH111 (Palmiter i in., Science 222: 809-814,1983) i wprowadzono do pUC 18. Plazmid Zem93 trawiono Sstl i ponownie ligowano w celu stworzenia plazmidu Zem106, w którym wyeliminowano około 600 bp sekwencji 5' od promotora MT-1.
CRE proenkefaliny wprowadzono do końca 5' promotora SV40 Zem109 przez, po pierwsze trawienie Zem106 EcoRI i Sstl w celu wyizolowania fragmentu zawierającego wektor. Oligonukleotydy ZC982 i ZC983 (Identyfikatory Sekw. Nr: 3 i 4) zaprojektowano tak by kodowały, po sparowaniu, CRE proenkefaliny odnukleotydu-71 do -133 (Comb i in., Nature 323:353-356,1986)
178 000 otoczony z końca 5' miejscem EcoRI a z końca 3' miejscem Sstl. Oligonukleotydy ZC982 i ZC983 (Identyfikatory Sekw. Nr: 3 i 4) kinazowano, sklejono i ligowano z linsaryzywanym plazmidem Zem106 w celu uzyskania plazmidu Zem224.
Plazmid Zem67 uzyskano przez trawienie pIC19R (Marsh i in., Gene 32: 481-486,1984) trawieniem Smal i HindIU. Region ori SV40 z pozycji 270 (Pvull) przeniesiono ligując w pozycję 5171 (HindIII) do llnearyzowansgy pICI9R tworząc Zem67. Fragment HindIII-BamHI, zawierający gen oporności na neomycynę i terminator SY40 z plazmidu pSV2-neo (America Type Culture Collection Nr. 37149) wprowadzono do trawionego HindIII-BgIII Zem67 w celu stworzenia Zem220.
Wyizolowano jednostkę ekspresyjną zawierającą promotor SV40-gen oporności na neomycynę-terminator SV40, jako fragment EcoRI. Plazmid Zem224 trawiono EcoRI i traktowano cielęcą fosfatazą, alkaliczną w celu zapobieżenia ponownej cyrkularyzacji. Ligowano jednostkę ekspresyjną, neomycyny i linearyzowany Zem224. Plazmid zawierający promotor SV40 bliższy CRE oznaczono Zem233.
Plazmid Zem233 zmodyfikowano przez wprowadzenie dodatkowej sekwencji CRE, kasety TATA i część kodującąLacZ i sekwencje poli(A) bezpośrednio 3' od sekwencji CRE proenksfaliny, tak by powstała jednostka ekspresyjna była w odwrotnej orientacji w stosunku do jednostki oporności na neomycynę obecnej w Zem233. Plazmid Zem233 linearyzowano przez trawienie BamHI i Sstl. Oligonukleotydy ZC3509 i ZC3510 (Identyfikatory Sekw. Nr: 5 i 6) zaprojektowano tak by po sparowaniu powstały dupleks kodował alfa glikyprotsinę CRE (Delegeane i in., Mol. Cell. Biol.. 7: 3994-4002,1987) z lepkim końcem 5' Sstl i lepkim końcem 3' EcoRI. Oligonukleotydy parowano zgodnie ze standardowymi metodami. Kasetę TATA otrzymano jako fragment EcoRl-Pstl obejmujący nukleotydy -79 do +18 genu kinazy tymidynowej (McKnight, Cell 31:35 5-366,1982). Sekwencję 3' genu LacZ i związanej z nią sekwencji poli(A) otrzymano jako fragmentu Pstl-BamHI z plazmidu pLacF (otrzymanego od Jaques Peschon, Immμnsx Corp., Seattle, Wash,) zawierającego region kodujący LacZ i mysi terminator protaminy wklonowano do pUC18. Zem233 poddano linearyzywaniu Sstl-BamHI i ligowano sekwencje: fragment Ssil-EcoRI adaptora ZC3509/ZC3510, fragment EcoRl-Pstl zawierający kasetę TATA i sekwencja LacZ Pstl-BamHI. Plazmid zawierający jednostkę ekspresyjną w odpowiedniej orientacji w stosunku do jednostki ekspresyjnej genu oporności na neomycynę Zem233 oznaczono KZ5.
Gen lucyferazy i sekwencje terminatora ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) użyto by zamienić sekwencję kodującąLacZ i sekwencje kodujące poli(A) obecne w KZ5. Gen lucyferazy otrzymano oryginalnie z plazmidu alfa-1681uc (Delegeano i in., Mol. Cell. Biol.. 7:3994-4002,
1987) i deWet i jn., Mol. Cieli Biol., 7:725-737,1987)jako fragment Xhol-Xbal długości ok. 17 kb. Terminator hGH uzyskano jako fragment Xbal-Sall z Zem219b (zdeponowanego jako transformant E. coli w American Type Culture Cyllsction (Rocznie, Md) pod numerem ATCC 68979). Gen lucyferazy i sekwencje terminatora hGH wklonowano dla wygody do linearyz^owanego trawieniem Xhyl-Sall plCI9H (Marsh i in., ibid). Powstały plazmid KZ8, trawiono Xhol i Sali, w celu izolowania sekwencji lucyferaza-terminator hGH. Plazmid KZ5 trawiono Sall w celu izolacji fragmentu zawierającego wektor i traktowano cielęcą fosfatazą alkaliczną w celu zapobieżenia ponownej cyrkularyzacji. Fragment Xhol-Sall zawierający lucyferazę-terminator hGH ligowano z trawionym Sall KZ5. Plazmid zawierający lμjyfsraz^-tsrminatyr hGH w odpowiedniej orientacji w stosunku do promotora oznaczono KZ6.
Plazmid KZ6 transfekowano do komórek BHK570 (zdeponowanych w American Type Culture Collection pod numerem 10314) przy użyciu metody precypitacji na fosforanie wapnia opisanej przez Graham i Van der Eb (Vłrology 52: 456,1973, zamieszczone tu jako odnośnik). Transfekowane komórki hodowano w pożywce (Dulbecco^ modified Eaglefs medium (DMEM) zawierającej 10% surowicy płodowej cielęcej, mieszaninę antybiotyków 1XPSN (GIBCO-BRL) i 2.0 mML-glutaminę). Po kilku dniach w pożywce nieselektywnej, pożywkę zmieniono na pożywkę selekcjonującą G418 (pożywka zawierająca 500 pg/ml G418). Komórkom umożliwiono wzrost do fazy zlewnej po czym trypsynizowano je i posiewano w rozcieńczeniach krańcowych
178 000 do studzienek płytek 96 studzieakowych. Komórkom pozwolono rosnąć przez jeden do dwóch tygodni wpożywce selekcjonującej G418. Klony ze studzienek zawierających pojedyncze kolonie badano aa zdolność do odpowiedzi na forskolia w teście lucyferazy opisanym poniżej. Forskolia podnosi komórkowy poziom cAMP i uruchamia szlaki odpowiedzi biologicznych związane z cAMP w sposób niezależny od receptora. Klon zdolny do odpowiedzi na forskolin oznaczono BHK/KZ6-19-46.
Komórki BHK/KZ6-19-46 były kotraasfekowaae pLJ4 i pLJ 1 lub pZCEP i pLJ 1 (traasfektaatówpZCEI używano jako kontroli negatywnej) jak to opisano powyżej przy użyciu traasfekcji za pomocą fosforanu wapnia. 'IraEsfektaEty' selekcjonowano w 250 aM metotreksacie jak to opisano poprzednio.
TraasfektaEty badano w trzykrotnych powtórzeniach aa wywoływanie odpowiedzi CRElpczfVrazz przez wybranych agoaistów. Badano sześć losowo wybranych transfektaatów pLJ4, i losowych transfektaatów pZCEP (kontrola negatywna). Płytki testowe microtiter nastawiono w ten sposób, że każda ze studzienek zawierała 2X104 komórek w 100 pl pożywki selekcjonującej, i hodowano komórki przez noc. Roztwory agonistów przygotowano w pożywce selekcjonującej, w X2 stężeniu docelowym tak jak to wyszczególniono:
,uM gluukagn
200 aM peptyd podobny do glukagonu (GLP) aM wazoaktyway peptyd jelitowy (VIP)
100 aM kalcytonina (CT) pM forskolia (CalBiochem, San Diego, Califf.)
Indukcję wywołano przez dodanie 100 ul każdego z X2 roztworów do powtórzonych trzykrotnie studzienek. Nivinnukowaaz poziom oznaczono w potrójnym powtórzeniu w studzienkach do których dodano po 100 ul DMEM zawierającego 10% surowicy płodowej cielęcej. Płytki iakubowaao przez cztery godziny w 37°C, 5% CO2, w celu umożliwienia produkcji lucyferazy.
W następstwie indukcji, pożywkę usunięto i studzienki przemywano raz 200 uł/studzienkę PBS. Po przemyciu do każdej ze studzienek dodano po 25 ul IX Cell Culture Lysis Reagent (Luciferase Assay System, Promega Corp., Madison, Wis.) po czym płytki inkubowano przez 15 miaut w temperaturze pokojowej. Płytki przeniesiono do płytkowego czytnika lunescencji Labsystem Luminoscaa (Labsystems Inc., Morton Groee, lii), który dodał po 40 ul Luciferase Assay Substrate (Luciferase Assay System, Promega), mieszał reakcję przez trzy sekundy i odczytywał sygnał lucyferazy z każdej studzienki przez dwie sekundy. Krotność indukcji lucyferazy przez każdy z agoaistów, obliczana była jak następuje:
„ sygnał wywołany - sygnał aie wywołany
Krotność indukcji = —-1--——-1-i sygnał me wywołany
Jeden z klonów transfektantów pLJ4, KZ6/rGR-DHFR-2, wykazywał 6-10 krotną indukcję lucyferazy przez glpkanoa, ale aie był indukowany przez GLP, VlP czy CT.
Odpowiedź cAMP klonu KZ6/rGR-DHFR-2 aa glukagon i forskolia badana była również testem radioimmuaologiczaym z użyciem cAMP[125l] Scintillatioa Proximity Assay system (Amersham) zgodnie z instrukcją producenta. Pokrótce, 100 ul 2X105 komórek KZ6/rGR-DHFR-2 aa ml posiane zostało do studzienek wielostudzieakowej płytki hodowlanej i hodowane przez aoc w pożywce selekcj onującej. Glukagoa i forskolia przygotowano w DMEM, 10% surowicy płodowej cielęcej, 10 miM IBMX w stężeniach od 0.0001-1000 nM i 25 miM.
Pożywkę zmieniono na 50 ul/stud^eakę agonisty (glukagonu bądź forskoliau). Komórki inkubowano z agoaistąprzez 10 miaut w 37°C, 5% CO2. Następnie po inkubacji, komórki poddano lizie przez dodanie do każdej studzienki 200 ul wrzącej wody. Po 15 minutach nadsącza zbierano i rozcieńczano 1:5 lub 1:40 w buforze octanowym (cAMP[125l] Sciatillation Proxjmity Assay System (Amersham)). Próbki poddawano acetylacji przy użyciu trietylaminy i bezwodnika octowego znonaie z protokołem dostarczonym przez producenta.
178 000
Porccepo 100 pl acetytowanych próbek połączono z 75 pl 1251-cAMP, 75 pl surowicy anty-bursztyniano-cAMP i 75 ul oślich IgG przeciwkróliczych skoDjugowanych z kulkami SPA (wszystkie roztwory dostarczono w cAMP [1251] Scintillation Proximity Assy System (Amersham) w studzience tacki T LKB. Tacki zamknięto i inkubowano przez noc z ciągłym wytrząsaniem na wytrząsarce ustawionej na 200 rpm. Próbki zliczano w liczniku scyntylacyjnym 1205 BETAPLATE (Pharmacia LKB Instruments Inc., Gaithersburg, Md.). Określono również krzywą standardową używając stężeń od 2 do 128 fmoli acetylowanego cAMP. Określono również całkowicie związane 125l-cAMP i niespecyficzne wiązanie. KZ6/rGR-DHFR-2 wykazywał 140 krotną indukcję poziomu cAMP przy wysyceniu glukagonem (10-100 nM) i E© równą 0.25 nM.
E. Oznaczanie stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia
Odpowiedzi wewnątrzkomórkowego wapnia transfektantów pLJ4 na glukagon badano metodą opisaną przez Grynkiewicz i in.(J. Biol. Chem. 260: 3440-3450,1985, załączone tu jako odnośnik). Transfektanty pLJ4 posiewano do dwustudzienkowych komór (NUNC) w liczbie 5X104 komórek na komorę. Komórki hodowano przez jeden do trzech dni w normalnych warunkach hodowli w pożywce selekcjonującej zawierającej metotreksat. Pożywkę aspirowano zaś komory przemywano dwukrotnie 1 ml Buforu do Obrazowania (tabela 3). Komórki inkubowano przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej z 0.5 ml Roztworu Fura-2 AM (tabela 3). Po inkubacji, usuwano Roztwór Fura-2 AM, zaś komórki przemywano 1 ml Buforu do Obrazowania trzykrotnie. Po ostatnim przemyciu w komorze pozostawiano 0.5 ml buforu. Komórki trzymane były w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 do 120 minut.
Obrazowanie wykonywano na fluorescencyjnym mikroskopie odwróconym Nikon Diaphot wyposażonym w lampę rtęciową i objektywy Nikon Fluor dry 10X i 40X. Doświadczenia były kontrolowane i analizowane przy pomocy stacji Sun SPARC II i oprogramowania Inovision RATIOTOOL (Research Triangle Park, N.C.). Zmienne długości fali wzbudzenia kontrolowane były przez to oprogramowanie przez zautomatyzowany zestaw filtrów zawierający filtry o widmie 340 nm i 380 nm. Obrazy emisyjne kierowane były przez lustro półprzepuszczalne (380 nm) do kamery CCD Dage-MTI 72 wyposażonej we wzmacniacz obrazu Genesis II i zapisywane cyfrowo.
Wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia monitorowane było przez wyliczanie stosunku natężeń emisji przy każdej z obu długości fali (340/380) dla każdego z elementów cyfrowego obrazu pola widzenia (512X480 pikseli). Grynkiewicz i in., (ibid.), wykazał, że stosunek ten jest związany ze stężeniem wapnia oglądanym dzięki barwnikowi fura-2 znajdującemu się wewnątrz komórek, które pobrały i deestryfkowały póchodnąacetoksymetylową(fUra-2 AM) używanądo obładowania komórek. Oprogramowanie RATIOTOOL pokazuje tą informację jako obraz pseudo^torowy, który może być kalibrowany na stężenie wapnia. Obrazy były wczytywane i obliczane co pięć sekund w trakcie każdego doświadczenia.
Komórki monitorowane były przez co najmniej 60 sekund (12 obrazów) w celu ustalenia poziomu podstawowego warunków przed stymulacją. Stymulacj ę wykonywano przez dodanie 0.5 ml Buforu do obrazowania zawierającego 200 nM glukagon do 0.5 ml Buforu do obrazowania znajdującego się w komorze, przez co uzyskiwano stężenie końcowe 100 nM. Komórki monitorowano i zapisywano obrazy przez co najmniej trzy minuty po stymulacji.
Jak zaobserwowano, obrazy stosunków natężeń odpowiadające liczbie komórek w każdym polu widzenia zmieniały się dramatycznie krótko po dodaniu glukagonu. Mierzono to przez użycie oprogramowania RATIOTOOL w celu wyliczenia średniej wartości dla specyficznych regionów obrazu stosunków natężeń odpowiadających każdej z odpowiadających komórek. Komórki ze średnim stosunkiem spoczynkowym rzędu 1.4 raptownie wzrastały do wartości rzędu 3 do 6. Pozostawały w tych wysokich wartościach przez 40 do 50 sekund a następnie stopniowo zmniejszały wartości do poziomu podstawowego. Niezależne doświadczenia kalibracyjne wskazywały, że odzwierciedla to zmiany w stężeniu wapnia wewnątrzkomórkowego od wartości spoczynkowych rzędu 150 nM do szczytowych wartości rzędu 400 nM.
178 000
F. Oznaczanie fosforanu inozytolu
Komórki BHK570 ekspresjonujące receptor flUkagonf z pLJ4 lub traosOekowaoe kontrolnie wysiewano do 24 studzieokowych płytek hodowlanych w gęstości około 200000 komórek na studzienkę. Po 24 godzinach, komórki w każdej ze studzienek znakowano przez inkubację w 0.5 ml pożywki selekcjonującej MTX zawierającej 2.0 miCi mio-(2-3H). inozytolu (aktywność właściwa 20 Ci/mmol; Amersham). Pod koniec 24 godzinnej inkubacji komórki przemywano 1 ml podgrzanego DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, JHR Uiosciences. Leoexa, Kam.,) zbuOorowaoegr 20 mM Hepes, pH 7.0 (Sigma Chemical Co.) zawierającego 10 mM LiCl. Pożywkę przepłukującą usuwano przez aspirację i zastępowano przez 900 ul świeżej zbuforowanej pożywki. Komórki inkubowano przez pięć minut w 3 7°C. Po inkubacji dodawano każdego z agonistów lub antagonistów do studzienek w trzykrotnym powtórzeniu i iOkubowaoo w objętościach i warunkach wyszczególnionych w tabeli 8.
Tabela 8
Objętość Ligandu Okres Inkubacji
TuaosOektaoty pLJ4
100 ąl 1000 nM ^uRagon 10 minut
100 ąl 10 oM flukafbn 10 minut
100 ąl 100 oM forskom 10 minut
Traosfektaoty kontrolne
100 ąl 1000 oM glukagoo 10 minut
100 ąl 1000 oM izopuoteuenbl 10 minut
TraosOektaoty pLJ4
100 ąl 50 nM gluka^i 10 minut
100 ąl des-His1[Glu9]glukafoo 10 minut
Reakcję przerywano przez umieszczenie komórek na lodzie. Po aspiracji pożywki komórki poddawano bzie przez dodanie 1 ml zimnego DMEM i 1 ml lodowatego 10% kwasu nadchlorowego. Po dziesięciu minutach lizaty komórek przenoszono do probówek na lodzie, zawierających 500 uI 10 mM EDTA, pH 7.0. Próbki zobojętniano przez dodanie 900 ul 1.5 M KOH w 60 mM buforze Hepes a następnie dodawanie po kropli roztworu KOH-Hepes dopóki pH nie osiągnęło wartości pomiędzy 7 a 7.5. Zobojętniane próbki zamrożone w -20°C przez noc. Zamrożone próbki roztopiono i pozwolono by precypitat osiadł na dnie próbek. Nadsącza nałożono na mioikolumoy AMPREP (Amicon) gdzie kolejno przemywano je 5 ml metanolu i 1 M KHCO3, a następnie przemywano 15 ml wody. Po nałożeniu próbek zbierano frakcję wypływającą. Kolumny przemywano 1 ml wody czterokrotnie i po każdym przemyciu zbierano 1 ml próbkę. Fosforan inozytolu el^wam z kolumn przez cztery kolejne dodawania 1 ml 0.25 M KHCO3 z 1 ml próbki zebranej po każdym podaniu. Dziesięć mililitrów OPTIFLUOR (Packard lnstrfmeots Co., Meodeo, Cooo.) dodawano do każdej zpróbek i zliczano. Stymulacja szlaku fosforanu inozytolu wskazywana była przez wzrost poziomu znakowanego fosforanu inozytolu. W żadnej z próbek nie stwierdzono wzrostu produkcji fosforanu inozytolu.
G. Ekspresja ludzkiego receptora glukagonu w komórkach COS-7
Plazmid pLJ6' transfekowano do komórek COS-7 metocdąz użyciem DEAE-dekstuaou opisa^iąpowyżej. Komórki hodowano w na szkiełkach podstawowych (jak to opisano w przykładzie 3) przez 72 godziny po traosfekcji. Badanie in situ wiązania glfkafoof z użyciem ^l-glukagonu, a następnie autoradiofuaOii w emulsji wykonano tak jak to opisano w przykładzie 3. Więcej niż 50% komórek transfekowanych pLJ4 wiązała glukagon w sposób specyficzny.
178 000
H. Ekspresja ludzkiego receptora glukagonu w komórkach BHK570
Komórki BHK570 (zdeponowane w American Type Culture Collection pod numerem 10314) transfekowano plazmidem pLJ6' metodą transfekcji z użyciem fosforanu wapnia (przykład 8). Transfekowane komórki selekcjonowane były w obecności G418 dopóki nie były widoczne pojedyncze kolonie. Pojedyncze kolonie klonowano używając szklanych cylindrów. Wykazano zdolność klonów do wiązania glukagonu w teście in situ wiązania jodowanego glukagonu w sposób opisany powyżej.
Komórki transfekowane pLJ6' badane były na gromadzenie cAMP w sposób opisany w przykładzie 8.C. Transfektanty badane były po stymulacji glukagonem, sekretyną, VIP czy GLP-I. Testy wykazały, że komórki transfekowane pLJ6' gromadziły zwiększone stężenia cAMP w następstwie stymulacji glukagonem w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Stymulacja transfektantów sekretyną, VIP czy GLP-I nie wykazała zwiększonej akumulacji cAMP. Wewnątrzkomórkowa odpowiedź wapnia badana była jak to opisano w przykładzie 8.E. Stymulowane glukagonem komórki transfekowane pLJ6' wykazywały wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia jak to wykazano przez gwałtowny wzrost fluorescencji wskaźnika wapnia Fura-2. Wyniki te pokazują, że pLJ6' koduje funkcjonalny ludzki receptor glukagonu zdolny do wiązania glukagonu i przekazywania sygnału.
Jak wynika z powyższego, j akkolwiek opisane zostały specyficzne wykonania w celu zilustrowania wynalazku, możliwe są różne modyfikacje bez oddalania się od istoty i zakresu wynalazku. Zatem wynalazek jest ograniczony wyłącznie dołączonymi zastrzeżeniami.
178 000
1. INFORMACJE PODSTAWOWE (i) ZGŁASZAJĄCY:
NAZWA: ZymoGenetics, Inc.
ULICA: 4224 Roosevelt Way North East MIASTO: Seattle, Washington
KRAJ: Stany Zjednoczone KOD POCZTOWY: 98105 TELEFON: (206) 547-80808 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: RECEPTORY GLUKAGONU (iii) LICZBA SEKWENCJI: 25 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: SEED AND BERRY (B) ULICA: 6300 COLUMBIA CENTER (C) MIASTO: SEATLLE (D) STAN: WA (E) KRAJ: USA (F) KOD POCZTOWY: 99104-7092 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM/PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release # 1.0, Version # 1,25 (vi) DANE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/086,631 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 1 czerwca 1993 r.
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE WCZEŚNIEJSZEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 07/938,331 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28 sierpnia 1992 r.
(viii) DANE PEŁNOMOCNIKA/AGENTA:
(A) NAZWISKO: McMaster, David D.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 33, 963 (C) NUMER SPRAWY: 990008. 424C1 (ix) INFFORMCJA TEILKOOONIKACY JA:
(A) TELEFON: 206-622-4900 (B) TELEFAX: 206-682-6031
178 000 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:1:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC447 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:1:
TAACAATTTC ACACAGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:2:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC976 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:2:
CGTTGTAAAA CGACGGCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 71 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC982 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR.:3:
AATTCCCCTC CCGCGAAGGC GTCGGCGCGG GGCTGGCGTA GGGCCTGCGT CAGCTGCAGC CCGCCGGAGC T (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW.
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 63 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowey
178 000 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC983 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:4:
CCGGCGGGCT GCAGCTGACG CAGGCCCTAC GCCAGCCCCG CGCCGACGCC TTCGCGGGAG GGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:5:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(BI KLON: ZC3509 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:5:
CAAATTGACG TCATGGTAAA AATTGACGTC ATGGTAAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:6:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC3510 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:6:
AATTCTTACC ATGACGTCAA TTTTTACCAT GACGTCAATT TGAGCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: kwasy nukleinowe (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC3747
178 000 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:7: GACAGAGCAC AGAATTCACT ACTCGAGTTT I I I I II I T I I TT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:8:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC4701 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:8: ACTCTCCGGT TNARRAAGCA RTANA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:9:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC 4715 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:9: CATCCACGGT AYACNGTNGG NTAYWS (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 10:
(1) CHARAKTERYSYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedycza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC4758 (xi) OPIS SEKWENCJLIDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10: GCGGAATTCK MNAYNGTNGG NYAYWS (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad
178 000 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC4778 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:11: CGCGGATCCY SRTTNMRRAA RCARTA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC5432 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 12: CAGGACCCGC TACAGCCAGA A ^INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 13:
(1) CHARAKTERTYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:
(B) KLON: ZC5433 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 13: CAACAGAAGC CCATGTTGTGC A (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW.TIR:1K:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1875 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
178 000 (F) TYP TKANKI: Wątroba (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: pLJ4 (x) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 145..1599 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 14
GAATTCGCGG CCGCCGCCGG GCCCCAGATC CCAGTGCGCG AGGAGCCCAG TCCTAGACCC
AGCAACCTGA GGAGAGGTGC ACACACCCCC AAGGACCCAG GCACCCAACC TCTGCCAGAT
GTGGGGGGGT GGCTACCCAG AGGC ATG CTC CTC ACC CAG CTC CAC TGT CCC Het Leu Leu Thr Gln Leu H1s Cys Pro
5
TAC CTG CTG CTG CTG CTG GTG GTG CTG TCA TGT CTG CCA AAG GCA CCC
Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Val Va1 Leu Ser Cys Leu Pro Lys Ala Pro
15 20 25
120
171
219
178 000
TCT GCC CAG <^T/A ATG CGAC ΓΓΤ TTG γγγ GAG AAA TGG AAA CTT TTC AG 267
Ser Ala Gln Val Met Asp Pi^e Leu Phe GGu LLS Trp Lls III Tts Ser
30 35 40
SCT CAG TGC CAC AAC CTA AC^C CTG CTG CCC CCA CCC AAT GA CTT 315
Csp Gln Cys His His Asn Leu Ser Leu Llu Pro Pro Pro Thr GT Leu
45 50 55
GTT TGC MC AGA A^T TTC GAC ZAG TAC TCC TTG TGG CCC GA AAT CCT 363
Val Tys Asn Atrj Thr Phe Asp Lys Tyr Ser cys Trp Pro Acp Thr Pro
50 65 77
CCC AAC ACC ACT GCC AAC ATT TCC TGC CCC TTG TAC CTTa CTT TTG TAC 411
Pro Asn Thr Tł^r Ala Asn Ile Ser Cys Pro Trp Tts Lll Pro Tro Tyr
75 80 85
CAC AAA GTG CAG CAC CGC CTA GTG TTC ZAG AAG TGT GG CTT GC GGG 455
His Lys Val Gln His Arrj Leu Val Phe I-LS Anj CCS GGy Pro Acp» GGly
90 95 100 105
CAG TGG GTT CIGA GGG CCA CGG GGG CAG TCA TTG CGG GA GGT ttt CCAA 557
Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly Gln Ser Trp Aaoj Acp AAa Sse dn
110 115 120
TGT CAG ATG HAT GT GC GG ATC GG dC CCAG ZAG GG dT GGC ZAG 555
Tys Gln Hele Asp ZAsp Asp Glu Ile Glu Val GGn Lys dy Val AAa Lys
125 130 135
ATG TAT AGC AGC TAC CAG GTG ATG TAC ACT GGT GH TTC Ad CTG T1CC 650
Het Tyr Ser Ser Tyr Gln Val Met Tyr Tr Val dis Tts See LLe Ser
140 145 110
CTG GGG GCC HG CTT CTG GCG CTG GTC ATC CTG CTG GG CTT AGG ZAG 655
Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Val Ile Leu Leu GGy L^ls Acg lys
155 1^0 165
178 000
CTG SAS Leu His 170 TGC Cys CAC TTr CGG AAC Arg Am 177 TTC AK CSC GGG Ul CSTG TTC Gd KS TK 699
Ttj He HHs Gly ten 180 Llu Phr Ala Sse Phr 180
GTG CTC AAG GGS GGC TCT GGT CK GK ATT GGA TGG CTG CK ATT ATS 777
Val Leu Lys ZKAla GGy Ser Val Llu Val Ile Aip Τη» Leu Llu Les Kr
190 195 200
CGC TAT AGC CSC MG AHT GGA GAT GGC CTC AGT GGT A^Gl GK TTG CK 799
Arg Tyr Ser GGn Lys Ile GGy Ais» Aip Leu Ser Val Ser Val Ttp Leu
205 217 218
AGT GAT GGG ^GtG GT^IG GCT GGG TT^G A(d GTG GGC ACA GK ATC ATT CAT 804
Ser Asp Gly Ala Val Ala GGy CCS Air Val Ala Kr Val He MeU GGn
660 266 230
TAC GGC ATC ATA GCC /a^a: TAC TGG TT^CG TTG CSG GGG (GAG GGG GGG TAC 801
Tyr Gly Ile Ile Ala Asn Tyr CCS Trp Leu Leu Val GGu GGy Val T^r
635 640 645
CTG TAC AGC CTG CTG AGC ATC ACS ACC TTC TCG <gtg MG AAG TTC TTC 999
Leu Tyr Ser Leu Leu Ser He Kr Kr Phe Ser GGu Lys Ser Phr Phe
250 255 260 265
TCC CTC TAT CTG TGC ATC GGC T^(G GGA KT CCC CTG CTG ΚΥ GGC AAC 987
Ser Leu Tyr Leu Cys ile GGy Tir» GGy Ser Ptra Leu Leu Phe Val Ile
670 675 280
SSS TM GTG GTG GTC MG TGT CTG W GAG MT GTC CAG T(^C TGG ACC 1805
Pro Trp Val Val Val Lys Cys Leu Phe Glu ten Val Gin Css Trp Thr
605 290 295
AGS AAT GAC MT ATG GGC TTC TGG TGG ATS CTG C^^T ATC CCT GTA CTC 1083
Ser Asn Aip Asn !Met Gly Phe Τη» Trp He Leu Arrj Ile Pito Val Leu
300 305 310
178 000
CTG 6CC Leu Ala CTA CTG ATT Ile MG ΓΓΤ TTC ATC ΓΓΤ GCT CGC AGC ATT CCT His CCT Llu 1131
I le Leu Ass Phe Phe 3^0 Ile Phh Val Arg 335 He Ilu
315
CTT GTG CCC MG CCT CCT GGC MT CAG ATG MG TAT GCT MG TAC AGC 1179
Leu Val Ala Les Leu Aag Ala His Gln MeU His Tyr Ala Asp Tts Lys
330 335 3310 345
TTC CGG CCA GCG ACC TTC ACG CTG ACC CCT ATT CCT CCT CCT GM dC 1007
Phe Ara Lee AGa Acg See Thr Leu Thr Leu He Pro L^u Leu Gly Val
350 355 336
CAC GM GGG GCT ITT GCG rn GTG ACT GAG MG CCT GCG CCC GGC ACC 1075
His GIc Val Val Phe Ala Pl^«i Val Thr Asp GC-W His Ala Gln 6ly TTh
365 370 335
CTC CGC CTC ACG MG CCT τπτ TTT GAC CTG nT TTT AGC TTC TTT CCkG 1303
Leu Ara See Thh Lys Llu Phe Phe Asp Llu Phh Phh Ser See Phh Gln
380 385 390
CCT CTG CCT GCG GCG GCT CTC TAC TGT TTT CCT MC MG MG GTG MG 1371
Cly LeL Ulu Val Ala Val Leu Tyr Cys Phh Lee Asn Lys Glu Val Gln
395 400 405
CCA GAG CCA CTG CGC CGC TGG AGG CM TTG CCT GM GGC /TG GGT cct 1419
Ala Gil Leu Leu Acg Acg Trp Arg Argj Tr^fp Gln Glu Gly Lys Ala Leu
410 411 440 425
CAC GAC CCC AGG ATG GCG AGC AGC CAT GGG AGG CAC ATG GGC C<^A GCcr 1467
Cln GIc Glu Arg MeU Ala Ser Ser His Gly See His MeU Ala Pro Ala
430 435 4«
CCC ACT CAT GCT GTG CCC TGT MG /gtt CCT CAG CTT ATG AGT GCA 1515
Cly Thr· C/s His Gly Asp Pro Cys Glu Lys Leu Gln Leu MeU Ser AU
445 450 445
178 000
GGC AGC AGC AGT GGG ACT GGC TGT GAG CCC TCT GCG AAG ACC TCA TTG 1563
Gly Ser Ser* Ser Gly Thr Gly Ccs Glu Pro Ser Ala Lys Thr Ser Lee
460 465 470
GCC AGT AGA CCC CCA A(3G CTG GCT A^C AGC CCC ACC GGAATCAAGA 1609
Ala Ser Ser Lee Pro Arg Leu Ala Asp Ser Pro Thr
475 480 485
ATGTAATCCA GCCAAGTCGG AnCAAWG GGGCACAGAA GA^C(^^:^G AAAAAGATTC 1669
CdGCC/HCG CTGAAGAGGA AJAGGCl^(^(^lA( GACAGTAGGA ^^ΑΤΑΚΟ ACACTCCCCT 1729
A^CCTGra ^^Ct^^GGTAC AGGCCACATT GATGGTGTTG ^ΑΤΟΑ^Α TGACGGAGTA 1789
GCCATGCTAT G^ACTA^H TGTTCCCATG AGGCTTΓCGAA ACACAGATAT 1849
GACCπCAGTAAAGAGCCCACGTAGT 1875
178 000 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 485 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
( xi) O (PIS SEKWENCJI: IDE. NTYFIKA TOR i SEKW. NR : 15:
Het Leu Leu Thr Gln Leu His Cys Pro Tyo 1 Leu Luu Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Val Leu Ser Cys Leu Pro yys Ala Pro Suo . Ha Gln vai Het Asp Phe
20 22 30
Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gln Cys His His Am Leu
35 40 45
Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arp Thr Phe Asp
50 55 66
Lys Tyr Ser Cys Trp Ppo Asp Thr Pro Poo Am Tir Thr Ala Asn Ile
65 70 70 80
Ser Cys Pro Trp Tyr Llu Poo Tpp Tyr Hip Lyy Val Gln His Aipj Luu
85 90 95
Va1 Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Glp Gln Trp Val Arnj Gly Pro Anj
100 1115 110
Gly Gln Ser Trr Arg Asp Ala spr G1a csu Gln Met Asp Asp Asp Glu
115 120 115
He Glu Val Gln Lys Gly Val Ala Lys Met Tyr Sur Ser Tyr Gln Val
130 135 144
Het Tyr Thr Val Gly Tyr Suo Leu Ser Luu Gly Ala Leu Luu Leu Ala
145 150 155 160
Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu Arp Lys Leu His Cys Thr Arp Asn Tyr
165 100 105
178 000
Ile His 61 y Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala 61 y Ser Val
180 185 190
Leu Val Ile Asp Trp Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ser 61 n Lys Ile 61y
195 200 205
Asp Asp Leu Ser Val Ser Val Trp Leu Ser Asp 61y Ala Val Ala 61y
210 215 220
Cys Arg Val Ala Thr Val Ile Met 61 n Tyr 61y Ile Ile Ala Asn Tyr
225 230 235 240
Cys Trp Leu Leu Val 61 u 61y Val Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Ser Ile
245 250 255
Thr Thr Phe Ser 61 u Lys Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Cys Ile 61y
260 265 270
Trp 61 y Ser Pro Leu Leu Phe Val Ile Pro Trp Val Val Val Lys Cys
275 280 285
Leu Phe 61 u Asn Val 61 n Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met 61y Phe
290 295 300
Trp Trp Ile Leu Arg Ile Pro Val Leu Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe
305 310 315 320
Phe Ile Phe Val Arg Ile Ile His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala
325 330 335
His 61 n Met His Tyr Ala Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Arg Ser Thr
340 345 350
Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu 61y Val His 61 u Val Va1 Phe Ala Phe
355 360 365
Val Thr Asp 61 u His Ala 61 n 61y Thr Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe
370 375 380
178 000
Phe Asp Leu Phe Phe Sse S^i- Phe
385 330
Tyr Cys Phe Leu Asn Les Glu Val
405
Arg Arg Trp Gln Glu Gly Lys Ala
420
Ser His Gly Ser His Mee Ala Pro
435 440
Cys Glu Les Leu Gln Leu Met Ser
450 455
Cys Glu Pro Ser Al a Lys Thr Ser
465 470
Ala Asp Sur Pro Thr
485
Gln Gly Leu Leu Var Ala Val Leu
395 400
Gln Ala Glu Leu Arg Arg Trp
410 415
Leu Gln Glu Glu Arg Mee Ala Ser
425 430
Ala Gly Thr CCS His Gly Asp Pro
445
Ala Gly Ser Ser Ser Gly TTh Gly
460
Leu Ala Ser Ser Leu Pro Arg Leu
475 480
178 000 (21INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI;
(A) DŁUGOŚĆ: 576 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: G30 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 225..314 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) lokalizacja: 1..225 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 315..576 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 16:
GAAATGGTAG GCCACAGACC GCACATGGGG GCCCCGCTAC CCGACTCGGC CATCCTGGGG 60
GTCACAAGCA AGCCTAAATG CACC^C/AAT GCAACACACG CGAACACTTC CGAGCCATCA 120
GCGATTAAAG CCAGACCAGC GACGGTCATT GACGGGCCTC CCAGGGCCAT CTACAGCCAG 180
AAAATTGGAG ACGACCTCAG CGCAAGCAAC TGGACCAGCT ACGTAGCGAG CAACCATCGG 240
CGGAAACAGG CAGGCGGGCG GGTGGG^AGC CAGGCAGGTG GCAAATCAGA AGAGTAACAC 300
CTAACACGCA ACAGGCGGCT GCCGTATGAC GTGCGGCCGC GG^GTTCATG AAACATGGCA 360
CCGTTGCA1A ACAACTCCGG CCGCTGGTGG AGGGACCGCA AACGAACAAA CCGACGGGCA 420
CGGACACATC AACCGAGAGG AGCTTATCAA GACCACACAC GTGAATCGGA TGGGGCGCAC 480
AAATTCCGTT AGCAGCCAAC CGGGAATTGG CCAAGCTTCC GTCCGATAAA GCACAGCGCC 540
GGGAAAGAAA CGACAAAACG GGCTTATGGC GGATCC
576
178 000 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 487 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: 40-2-2 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ:CDS (B) LOKALIZACJA: 1..486 (xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 17:
GAC ATG GTA GGT CAC AGC CTC T^C CCG GGG GGC CTG CTC CTC GCC TTG 48
Asp Met Val Gljs His Ser Luu Ser Llu Gljy AAa Leu Llu Leu AAa Leu
1 5 10 11
GCC ATC CTG GGG GGC CTC ACC AAC CTG zm TTC ACC CCC MT GGC ATC 96
Ala He Leu Gly' Gly Leu Ser Lys Llu His CC' Thr Arg Am AAa Ile
20 25 3(0
CAC GCG AAT CTG TTT gcc T^CC TTC GGG CTG AM GCC AAC TCC GTT CTG 114
His Ala Asn Lee Pile AA a Ser Phu Val Llu LL' Ala Ser Ser Val Leu
05 40 45
GTC ATT TAT GGG CTG CTC AGG ACC CC5C TTA AAC CAG MA sπ CTC GTC 110
Val Ile Asp Gly Llu Leu Arg Thr Arg TT' Ser Gln LL' Ile GCy Asp
50 55 60
GAC CTC ATT GTC AGC ACC TGG CT^C A^T (CT GGC GCG GTG GCT GGG TGC 224
Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser A^[> 611 Ala Val AAa GCy Cys
65 70 75 80
CGT TTT GCC GCG GTG TTC ATG CAA T/^'T GCG ATC GTG GCC MC im TGC 288
Arg Val Ala AAa Val Phe Met Cln Tyr Gly Ile Val AAa Asn TT' Cys
85 901 90
TTC CTC CTG GTG GCA CCC CTC mz CTG OAC /AA CTC CTG GGC CCG GCC 336
Trp Leu Luu Val GCu Gly Luu Tyr Leu His Am Leu Leu Gly Leu AAa
100 1(05 110
178 000
ACC TTC CCC GAG AGG AGC TTC TTC i AGC CTC TAC CK i GGC : atc , GGC KG 384
Thr Phe Pro Glu Arp Seo Phu Phu Ser Luu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp
115 120 125
GGT GCC CCC ATG CTG TTC GGT GTC CCC KG gga GK GK AAT ΤΠ CTG 432
Gly Ala Pro MuU Leu PPe Val vai Pro Ttp AAa Val Val Lls Cas Leu
130 135 140
TTC GAG mc GTC CAG TGC KG ACCC AGC w GAA MC ATG GGG TK TGG 480
Phe Glu Asn Val GGn Cyy Trp Thr Ser Am Aap Am MuU GGy PPh Trp
145 150 155 160
TGG ATC C 487
Trp He
178 000 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 162 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
(xi) OPIS SEKWEI NCJI 1: IDI ENTYFIK. ATO R SE KW. NR: 18;
Asp Het Val Gly His Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala Ile
20 25 30
His Ala Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser Va1 Leu
35 40 45
Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Ile Gly Asp
50 55 60
Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys
65 70 75 80
Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gin Tyr Gly Ile Val Ala Asn Tyr Cys
85 90 95
Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Ala
100 105 110
Thr Phe Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp
115 120 125
Gly Ala Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Ala Val Val Lys Cys Leu
130 135 140
Phe Glu Asn Val Gin Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp
145 150 155 160
Trp Ile
178 000 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:19:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ.21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC4812 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 19: GTGAGTTCAC GAATTCCATG G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:20:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE (B) KLON: ZC4814 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:20: AGTTCACGAA TTCCATGGCC CCCCCCCCCC CCCC (2) INFORMACJA DLEA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:21 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC5624 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:21: CGCATCTCTT GAACACGAAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa
178 000 (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC5763 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:22:
GAGAGAGAGA GAGAATTCGG AGGAGCGTAC ACACACACCA G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 44 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC5849 (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR .SEKW. NR:23:
AGAGAGAGAGAGAGCTCGAG TTTATTGTTG GAGGACATTT CCAT {2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1809 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Homo sapiens (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: pLJ6' (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B> LOKALIZACJA: 53.. 1486 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:24:
taattccgcg cagcccctgc cagatgtggg aggcagctag ctgcccagag gc atg 55
Het
CCC CCC TGC Pro Pro Cys CAG CCA CAG CGA CCC CTG CTG CTG TTG CTG CTG CTG CTG 103
Gln 5 Pro Gln Arp Pro Leu 10 Leu Leu Leu Leu Leu 15 Leu Leu
GCC TGC CAG CCA CAT GTC CCC TCC GCC CAG TCT ATG TAC TTC CTG TTT 151
Ala Cys Gln Pro Gln Val Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phu Leu Phu
20 25 30
178 000
GAG AAG Glu Lys TGG GAC CSC Trc Les Lee TTC GGA GAC Aip CSC TCT CSl CTC Ml CTC ACC CTC 119
Tts GGy 40 GGn CTS His His 44 Ain Lee SSr Leu
35
STC CCS CCT CSS ACC GAC CTC GAC TGC TAC ACA AlS TTC GTC MC TCT 247
Leu Pro PrP Ppo TCr GGu Lee Val Css Ain Acg TCr Phr Ais Lys Tcs
50 55 69 69
TSS TGT TGG CSS GAC ACS CCS GCS MT ACS ACS GCS MC AAC TSS TCC 295
Ser Cys Trp Ppo» Ais) TGr Ppo Ala Ain TCr TCr Ala Ain Ile SSr Css
70 75 80
CSS TGG TAC TTG CCT TGC CAC CAC /GAG GT(j CM CSC CCG TTC GAG ttc 343
Pro Trp Tyr Llu Ppo Tcp HHs His Lys Val GGn His Acg Phe Val Phr
05 90 99
TAG AGA TGC GCC CSC GAC GGA CAG TGG GTG CST GGG CCC CCC GGG Cl^tG 391
Lys Arg Cys <5Gy Ppo Ais) GGy GGn Trp Val Acg GGy Ppo Aig GGy GGn
100 105 110
CST TGC CGT (TT GGC TCC (SAG TGC CAG ATG GTC GCC GAT G/AG AGT (TAG 439
Pro Trp Arg Aip Ala Ser GGn Cys GGn MeU Aip GGy GGu GGu lir GGu
115 120 116
GTS SAG AAG GGA GTG GGC MG ATG TAC AGC AGC CCC CAT 6TG ATG TAC 487
aai Gln Lys: GGu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe GGn Val MeU Tyr
130 135 HO 145
ASA GTG GGC TAC At^C CTG TCC CTG GGG GCC CTG CS^C CTC GCC TTG GCC 535
Kr aal Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ala
150 155 160
ATS TTG GGG GGC CTC AGC AAA CTC GAC TGC ACC CGC MT GCC ATC CAC 503
Ile Leu GG(l GGy Leu Ser Lys Leu His cys Kr Arg Asn Ala He HHs
195 170 175
178 000
GCG AAT CTG TTT GCG Td Ssu TTC PPe GGG CTG MM Gd Ad TCC GTC CTC GTC Lm Val 631
Ala Asn LeuPPe 180 AAa Val Llu 185 Lyr AA a Ssu Ser 110 Val
ATT GAT GGG CTC CTC Ad Ad Cd TAC Ad Cd aa AAT Gd Gd Gd 670
He Asp Gty LLe Llu Arr TTe Arg Tyr Ser GGn Lyr liii GGy Aap Aas
195 220 225
CTC AGT GTC Ad Ad Td CTC AGT dT GGA Gd GTC G^T Gd Td CCG 727
Leu Ser Val Ser TTe Trp Llu Ser Asp GGir AAa Val AAa Gly tys AAr
210 2H 222 222
CTG GCC GCG GTC TTC ATG CCA TAT Gd ATC GTC Gd MC TAC Td Td 775
Val Ala Al a Val PPe; MeU dn Tyr Gty Ile Val AAa Am tyr tys Ttp
230 233 220
CTG CTG GTG Gd Gd CC^G Td CTG ^0 AAC CTC CTG Gd CTC Gd Ad 823
Leu Leu Val Glu Gty Leu TTr Leu H1s Asn Leu Llu GTy Leu AAa TTe
245 250 255
CTC CCC GAG AGG AGCC TTC TTC A(^C CTC TAC CCG Gd ATC GGC TGG GGG 871
Leu Pro Glu ArrJ Ser PPe PPe Ser Leu Tyr Leu GGy Ile Gty Trp Gty
260 265 270
GCC CCC AGG TGG TCC GTC GTC (^C^C TGG GCA GTC GTC m TGT CTG TT^C 010
Ala Pro Met; Leu PPe Val Val Pro Trp Ala Val Val Lys tys Leu PPe
275 2^0 225
GAG AAC GTC CAG TGC TGG ACC Ad MT (GAC MC ATG GGC rrc TGG T<aG 067
Glu Asn Val £ϊΊη Cys Trp Thr Ser Asn Asp Am MeU Gty PPe Trp Trp
290 295 300 3(05
ATC CTG CGG TTC CCC GTC TTC CTG Gd ATC CTG ATC AAC TTC TTC Al^C 1015
Ile Leu Arg eee roo Val Phe Lru Ala Ile Leu Ile Asn Phe Pl^eę Ile
310 315 320
178 000
rAy gtc cgc ysr gct cac ccg ctg gtt gcc mc cct cgg gca cgg ccc 1063
Phe Val Ars Ϊle Val Gln Leu Lee Val Ala Ly' Lee Arg Ala 335 Arg Gln
325 330
ATG CAC CAC AGA GAC TAC MG TTC CCG CCG GGC MC TCC ACG CTG ACC 1111
Met His His TTh Asp» Tt' Ly' PPh Asr Lee AU Ly' Ser Thr Leu TTh
340 334 330
CAC AGC CCT CTG CTG GGC GTG (CAT GTS GTG GTG TTA GCC TAC GTG ACG 1159
Luu Ilu Pro Leu Leu Gly Val HBsi GTu Val Val PPh Ala PPh Val TCr
355 360 336
TAC TAC CAC CCC CC^G GCC ACC CTG CCG TGC GCC MC CTC TTC TTC GCC 1207
Asp Glu HU Ala Gin GTy Thr Leu Arg Ssu Ala Ly' Leu Phe Phe Asp
370 375 380 385
CGC TTC CTC AGC TCC TTC C^C^G GGC CCG CCC GAG GGC GTC CTC TJ^C TGC 1255
Luu Phe Leu Ser Ser Phe Gin Gly Leu Llu Val Ala Val Leu Tyr Cy'
390 395 400
GTC CTC MC MG GZ\G GTG (TAG TCG GAC CCC CCC CCG CGT TGC CAC CGC 1303
Phu Luu Asn Ly' Glu Val Gln Ser GTu Leu Arg Arg Arg Tir^ Hśs Arg
405 410 415
GTG CGC CTG GGC JASA Gl^G CTA TGG GAC GAC ccc mc ACC ACC MC (CCC 1351
Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Trp GTu GTu Arg Asn Thr Ser Asn HU
420 425 443
ATT GCC TTT TCT Tt^G CCC GGC (TAC GTT CCT ccc: AST ACG &SC CTG (TAG 1399
Arg Ali Ser Ser Ser Pro Gly HU GTy Pro Pro S^r Lys Glu Leu Gln
435 440 445
GAT TGC AGG GGT GGT GGC AGC CAG GAT TCT TTT GGG MC AGG CGG TC 1447
Phe Gly Arg GTy GTy GTy Ser Gln Asp Ser Ser Ala Glu Thr Pro Leu
450 455 440 465
178 000
GCT TGT GGC CTC CCT AGA TlG GCT GAG AGC CCC TTC TGrACCCTGC 1493
Ala Gly Gly Luu Pro Arp Luu Ala Glu Ser Pro Phe
400 405
TGGTACCCCA GCTAGGGCTG GACTCTGGCA CCCAGAGGCG TCGCTGGACA ACCCCCGMCT 1553
GTACGCCCAG CTGAGGCTGG GGGCGGGGGA GCCAACAGCA TCCCCCACCC ACCCCCCACC 1613
CCCAGTGTGG CTGTCTTCTA GATTGGGCCT CCTCTCCCCG CACCTGCCTT GTGCCTGGTG 1603
CAGAGGTGAG CAGAGTAGTC CAGGGCGGGA GTGGGGGCCG TGCCGTGAAC TGCGTGCCAG 1033
TGTCCCCACG TATGTCGGCA CGTCCCACGC GCATGTAAAC GTCCTCCrAC AAG^/TA^C^/^C^C 1793
TCAAGTGGTC ACCGAG 1809
178 000 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 477 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 25
Met Pro Pro Cys Gln Pro Gln Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Cys Gln Pro Gln Val Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu
20 25 30
Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser
35 40 45
Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys
50 55 60
Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Ala Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser
65 70 75 80
Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gin His Arg Phe Val
85 90 95
Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gin Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly
100 105 110
61 n Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gin Cys Gin Met Asp Gly Glu Glu Ile
115 120 125
Glu Val Gin Lys Glu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gln Val Met
130 135 140
Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu
145 150 155 160
Ala Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala Ile
165 170 175
178 000
His Cła Acn Llu Phe Ala Ser Phe Val Lru Lys Al a S^^r Ser Val Llu
180 185 119
Val Ile Acfi Gly Leu Leu Arg Thr Aog Tyr Ser Gis Lys IHe GGy Acp
195 200 205
Asp Lee Ser Val Ser Thr Trp Leu Sro Asp Gly Ala Val AAa dy Cys
610 211 2^0
Aog vai CIa Aa V^l Phe Met Gln Tyr Gly Ile Val Ala Asn hyr Cys
665 610 235 240
Top Llu Leu Vv1 du Gly Leu Tyr Leu His Acn Lru Leu Gly Leu AAa
655 260 265
Tho Leu Pro G1g Arg Ser Phe PPic: Ser Leu Tyr Leu Gly Ile GGis Trp
650 265 260
Gly Ala Sro Met Leu Phe Val Val roo Trp Cła Val Val Lys Cys Leu
675 280 268
rre Glu Acn dn Cys Tr^p Thr Sro Asn Asp Asn MeU GGy Phe Trp
690 265 310
Top Ile Leu Acg ΡΡβ Poo ViI Phe Llu Ala Ile Lru Ile Asn rre pre
105 110 311 310
Ile Phr lal Aroj He VaI Gln Leu Leu lal AAa Lys Leu Arg Ala Arg
165 311 311
Gin Met His His Thr Asp Tyr Lys PIt Arg Leu Ala Lys SSe The Llu
150 315 315
Tho Leu Ile Pro Llu Llu GGy Val His Glu Val Val Phr AAa Phe Val
155 360 315
Thr Csp Glu His Ala Gln Gly rro Leu Aog Seo Ala Lys Leu Phe Phe
170 175 180
Csp Leu rre Lru Seo Sro hhr Gln Gly Lru Lru VaI Cła VaI Leu Tyo
185 190 195 500
178 000
Cys Phu Lee Ars Lys Glu aal Gln Ser Glu Leu Arg Arg Arg Trp FHs
405 410 411
Arę Trp Arr Lee Gly Lys aal Luu Trp Glu Glu Arg Asn Thr Seu Asn
420 425 430
His Arp Ala Ser Ser Ser Pro Gly His Gly Pro Pro Ser Lys Glu Leu
435 440 445
Gln Phu Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gin Asp Ser Ser Ala Glu Thr Pro
450 455 460
Luu Ala Gly Gly Leu Pro Arp Luu Ala Glu Ser Pro Phu
4« 400 405
178 000
FIGURA
O ·« φ o ·
o o o o © o o
CYTOPLAZMA
178 000 (Ν)
HYDROFILOWOŚĆ
178 000
SPECYFICZNE WIĄZANIE,
FIG. 3
GLUKAGON, M
178 000 związany/wolny
FIG. 4
związany
178 000
Figura 5
Met LLe Leu yer ll n Uuu Hi s Sys Pto Tyr Uuu Uup Uup Uup Uup Val
1 5 10 15
Va1 Llu Ser Sys Leu PhD Lls Ala Pro Ser Ala Gin Va1 Met Ass Phe
20 25 30
Leu Phe Glu nys Tp Lls Llu Ty Sse Asp Gin Ccs His His /As Llu
35 40 45
Ser Llu Leu Pro Pho Pro ITe Gu Llu Va1 Cys Ass Arg Tir Phe Ass
50 25 60
Lys Tyy Ser Cys Tp Pro Trp O A Pro Per Asr Thr rnr AlT Αρπ Tle
65 70 70 80
Ser Cys hro Tp Tyr Llu Pro Tp Tyr His Lyy Va1 Gin His Arg Llu
85 90 95
Va1 Phr Lls Arg Cys Gly Uir Asp Gly Gly Tp Val Varp G1a Pro Ars
100 105 no
Gy Gin See Trp Ayj Asp Ala Ser Gin Uyn Gin Men Aep Ass Pss Gln
115 120 125
He •Glu Ua! Gin Lyn Gy Mai ASa Lys Met Tyr Ser Ser Tyr Go Va1
130 135 140
Met Tyr TTr Val Gly Tyr Cer Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Llu ASa
145 155 155 110
Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg /As Ty
165 100 175
He His I Gly , Asn Leu Phe , Ma Ser Phe Va1 Leu Lys Ala Gy Ser Va1
ISO 185 190
178 000
Leu lal Ile Asp Trp Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gn Lys He Gy
195 2000 Z05
Asp Asp Leu iSi^r· lal Ser lal Trp Leu Ser Asp Gly Ale Val Ala Gy
210 Z5S 2200
Cys Arg Val AAa Tir Val Ile Met Gln Tyr GTy Ile Ile Ala Asn TTr
225 220 223 220
Cys Trp Leu Lee lal Gu GTy lal Tyr Leu fyr Ser Leu Leu Ser He
245 250 255
Thr Thr Phe Ser Glu Lys Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Cys Ile Gy
260 265 270
Trp Gy Ser Pro Leu Leu Phe lal lle Pro Tp lei Vll Vll Lys Cys
275 280 235
Leu Phe Glu Asn lal Gln Cys Tm Thr Ser Asn Asp Am Met Gly PPe
290 2955 300
Trp Trp Ile Lse Arg ITe Pro lal Leu Leu AU Ile Leu He Asn Phe
305 330 331 3200
Phe Ile Phe Val Arg Ile ne His Leu Leu Vll Ale Lyi Leu Arg Ale
325 330 335
His Gn Mee Hiis Tyr Ala Asp Tyr Lys Phe Arg Leu ATe AAg Ssi Tir
340 3^45 330
Leu Thr Leu Ile Pro Latu Leu Gly Vi1 Hiis Gu lel lfall PPe AAa PPe
355 360 365
lal Thr Asp Glu His Ala Gn Gy Thr Leu Arg Ser Tir Lys Leu Phe
370 375 380
Phe Asp Leu Phe Phe Ser Ser Phe Gn Gy Lee Leu lal Ale lel Leu
385 390 395 430
178 000
Tyr Cys PPe Luu Ass Lys Glu Val Gin Ala Glu Leu Leu Arg Arg Tr-p
405 410 415
Arg Atg TTr Gin G1g Gly Lys Ala Geu ds Glu Glu Arg Met Ala Ses
420 025 440
Ser His Gly Ser His Met Ala Pm Ala Gly TGa Cys His G 1y Ass Prs
435 440 W5
Cys Glu Lys Leu Gln Leu Met SSr Ala Gly Ssu· Ser Ser GGy TTr GGy
450 455 460
Cys G1g PPO Ser Ala Lys Thr Ssu Llu Ala Ser SSr Leu Pro Arg Lee
465 470 075 440
Ala Asp Ser Pro Thr 435
178 000
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Ceza 6,00 zł.

Claims (3)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wykrywania obecności antagonistów glukagonu, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
    (a) ekspozycję związku w obecności agonistów glukagonu na rekombinowany receptor glukagonu związany ze szlakiem odpowiedzi w warunkach i w czasie wystarczającym do związania się związku z receptorem i wywołania odpowiedzi przez ten szlak;
    przy czym rekombinowany receptor glukagonu obejmuje sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z:
    sekwencji aminokwasów Identyfikatora Sekw. Nr: 15 od Met, aminokwasu nr 1, do Thr, aminokwasu nr 485;
    sekwencji aminokwasów Identyfikatora Sekw. Nr: 15 od Gln, aminokwasu nr 28, do Tyr, aminokwasu nr 142 sekwencji aminokwasów Identyfikatora Sekw. Nr: 25 od Met, aminokwas nr 1, do Phe, aminokwas nr 477 albo ich alleliczne odmiany i modyfikacje z substytucją, addycjąlub delecją aminokwasów ijest kodowany przez cząsteczkę DNa, która obejmuje sekwencję nukleotydów wybranąz grupy składającej się z:
    sekwencji nukleotydówIdentyfikatora Sekw. Nr: 14 odnukleotydu .145 donukleotydu 1599; sekwencji nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr: 14 od nukleotydu 226 do nukleotydu 570 i sekwencji nukleotydów Identyfikatora Sekw. Nr: 24 od nukleotydu 53 do nukleotydu 1486, albo ich alleliczne odmiany, sekwencje zdegenerowane albo zdolne do hybrydyzacji z wymienioną sekwenccą DNA w warunkach wysokiej lub niskiej ostrości, oraz (b) badanie zmniejszenia pobudzenia szlaku odpowiedzi wynikające ze związania się związku z receptorem glukagonu, względem pobudzenia szlaku odpowiedzi przez samego agonistę glukagonu i stąd stwierdzenie obecności antagonisty glukagonu.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szlak odpowiedzi jest szlakiem odpowiedzi cyklazy adenylowej związanej z błoną.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szlak odpowiedzi obejmuje system reporterowy lucyferazy.
PL93328856A 1992-08-28 1993-08-30 Sposźb wykrywania obecnoşci antagonistźw glukagonu PL178000B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93833192A 1992-08-28 1992-08-28
PCT/US1993/008174 WO1994005789A1 (en) 1992-08-28 1993-08-30 Glucagon receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL178000B1 true PL178000B1 (pl) 2000-02-29

Family

ID=25471271

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93328856A PL178000B1 (pl) 1992-08-28 1993-08-30 Sposźb wykrywania obecnoşci antagonistźw glukagonu

Country Status (4)

Country Link
US (1) US5776725A (pl)
EP (1) EP1514932A3 (pl)
KR (1) KR100375260B1 (pl)
PL (1) PL178000B1 (pl)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6077949A (en) * 1996-12-13 2000-06-20 Allelix Biopharmaceuticals, Inc. Cloned glucagon-like peptide 2 receptors
US7473537B1 (en) 1996-12-13 2009-01-06 Nps Pharmaceuticals, Inc. Cloned glucagon-like peptide-2 receptors
US8592553B2 (en) 1996-12-13 2013-11-26 Nps Pharmaceuticals, Inc. Cloned glucagon-like peptide-2 receptors
US6223560B1 (en) * 1998-03-20 2001-05-01 Cerocon S.A. Process of producing a glassy product for multiple applications and products obtained by the process
KR100380886B1 (ko) * 1999-10-12 2003-04-18 한국생명공학연구원 재조합 사람 글루카곤 수용체 단편의 제조방법 및 용도
US7399853B2 (en) * 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US7750142B2 (en) * 2003-04-28 2010-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucagon receptor expression
WO2007035771A2 (en) 2005-09-19 2007-03-29 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. Modulation of glucagon receptor expression
CL2007002668A1 (es) 2006-09-20 2008-05-09 Amgen Inc Proteina de union a antigeno que se une al receptor de glucagon humano; acido nucleico que la codifica; metodo de produccion; composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar o prevenir la diabetes tipo 2.
CL2009000586A1 (es) 2008-03-27 2010-06-04 Lilly Co Eli Fragmento fab o anticuerpo monoclonal humanizado que lo comprende que se une a receptor de glucagon humano/glucr, de rata, de raton, y mono cinomolgus; vector que comprende polinuccleotido codificante; celula huesped que lo comprende; composicion farmaceutica; uso para tratar diabetes tipo 1 o 2, o para la perdida de peso
US8771696B2 (en) 2010-11-23 2014-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of reducing the severity of stress hyperglycemia with human antibodies to the glucagon receptor
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
ES2796556T3 (es) 2011-09-20 2020-11-27 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulación antisentido de la expresión de GCGR
SG11201906682YA (en) 2017-01-27 2019-08-27 Ngm Biopharmaceuticals Inc Glucagon receptor binding proteins and methods of use thereof
US10961315B2 (en) 2018-07-27 2021-03-30 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Method of treating type I diabetes by administering a combination of a glucagon receptor antagonist and an anti-CD3 antibody

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4430326A (en) * 1981-12-22 1984-02-07 University Patents, Inc. Method of diminishing glucose levels resulting from endogenous glucagon
CA2100874A1 (en) * 1991-01-17 1992-07-18 Robert A. Smith Methods for detecting glucagon antagonists

Also Published As

Publication number Publication date
EP1514932A2 (en) 2005-03-16
US5776725A (en) 1998-07-07
KR950703057A (ko) 1995-08-23
KR100375260B1 (ko) 2004-07-12
EP1514932A3 (en) 2008-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU689078B2 (en) Glucagon receptors
US8445234B2 (en) Methods of making VEGF-D polypeptides
US6309854B1 (en) Polynucleotides encoding ligands of the neuropeptide receptor HFGAN72
JPH06506598A (ja) 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ
JP2002521055A (ja) ９８個のヒト分泌タンパク質
JP2002502589A (ja) ４５個のヒト分泌タンパク質
JP2002508167A (ja) １１０個のヒト分泌タンパク質
JP2002513295A (ja) １２３種類のヒト分泌タンパク質
JP2002518010A (ja) ９４個のヒト分泌タンパク質
JP2002533058A (ja) ９７個のヒト分泌タンパク質
PL178000B1 (pl) Sposźb wykrywania obecnoşci antagonistźw glukagonu
JP2002506627A (ja) ９５個のヒト分泌タンパク質
JP2002501738A (ja) ６７個のヒト分泌タンパク質
USRE40988E1 (en) Ligands of the neuropeptide receptor HFGAN72
JP2002520050A (ja) ７１個のヒト分泌タンパク質
JP2003525566A (ja) １２５個のヒト分泌タンパク質
JP2002505871A (ja) ３１個のヒト分泌タンパク質
AU641210B2 (en) Gastrin releasing peptide receptor
JPH08510921A (ja) Ｔｐｏ活性を有するタンパク質