JPH08510921A

JPH08510921A - Ｔｐｏ活性を有するタンパク質

Info

Publication number: JPH08510921A
Application number: JP7521122A
Authority: JP
Inventors: 洋宮崎; 尚志加藤; 欽也大上; 明彦岩松; 弘典赤堀; 良太黒木; 敏之清水; 隆則武藤
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-02-14
Publication date: 1996-11-19
Anticipated expiration: 2015-01-11
Also published as: AU1671895A; JP2996729B2; BR9505781A; PL311885A1; HK1003896A1; PL179884B1; CN1076356C; CN1163933A; CN1153780C; KR100272867B1; EP0695355A1; CA2160591A1; AU702669B2; HUT75656A; CN1131438A; FI954889A0; CN1118571C; CN1163934A; RO118299B1; HU9503187D0

Abstract

(57)【要約】この発明は、血小板産生を特異的に刺激または増強する生物活性を有しかつ配列番号６のアミノ酸配列１〜332を有するトロンボポエチン（ＴＰＯ）又はその誘導体、ＴＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、ＴＰＯポリペプチドの製造方法、ＴＰＯポリペプチドと特異的に免疫反応性のある抗体、ＴＰＯポリペプチドを含有する医薬組成物、血小板減少症のような血小板障害の治療にＴＰＯポリペプチドを使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ＴＰＯ活性を有するタンパク質この出願は、1995年１月31日出願の係属中の米国特許出願（出願番号不明）の一部継続出願であり、該米国特許出願は、1994年12月22日出願の係属中の米国特許出願第08／361,811号の一部継続出願であり、この後者の米国特許出願は、199 4年10月11日出願の係属中の米国特許出願第08／320,300号の一部継続出願であり、この後者の米国特許出願は、1994年７月20日出願の係属中の米国特許出願第08 ／278,083号の一部継続出願であり、この後者の米国特許出願は、1994年４月１日に出願され現在放棄されている米国特許出願第08／221,020号の一部継続出願であり、この後者の米国特許出願は、1994年３月14日に出願され現在放棄されている米国特許出願第08／212,164号の一部継続出願である。［発明の分野］本発明は巨核球前駆細胞の増殖および分化を促進するか、又は生体内で特異的に血小板の産生を刺激、または増強する活性を有する新規タンパク質、そのようなタンパク質をコードするDNA、およびそのようなタンパク質の製造方法、更にそのようなタンパク質の用途に関する。［発明の背景］巨核球は主に骨髄中で観察される、多核で細胞質が豊富な大型の細胞であり、血小板を産生する。巨核球の源は骨髄中の多能性造血系幹細胞である。多能性幹細胞がある程度分化して、巨核球系だけに方向付けられた巨核球前駆細胞となり、さらに増殖・分化して巨核球となる。巨核球はさらに核の倍数性の増加（poly ploidization）、細胞質の成熟（cytoplasmic maturation）を遂げて、最終的に無核の細胞質断片である血小板を血液循環へ放出する。１個の成熟した巨核球から平均して2000〜4000個の血小板が生成される。血小板形成機構は多くの点で依然として不明であるが、巨核球は骨髄中の静脈洞内皮表面に一般に局在し、血小板の断片化を起こす類洞部内に広くゆきわたる細胞質過程を生じさせると考えられている。血小板の産生機序については不明な点が多いが、巨核球は骨髄の静脈洞の内皮下に局在しており、その細胞質が、内皮を貫通して、静脈洞内壁にひも状の突起を出し、血小板を放出すると考えられている。このような巨核球造血、および血小板産生に関して、特異的な産生調節機構の存在が示唆されてきた。健常人や正常な動物では、有効な血小板数が維持されているが、例えば、正常な動物へ抗血小板抗体を投与すると、短時間で急激に血小板だけが減少し、その後増加し始め、さらに一過性に正常値を越えるが、最終的には再び正常値に戻ることが知られている。また、臨床においても、赤血球数や白血球数が正常であるにもかかわらず、血小板数の低下（血小板減少症）や血小板増加症に陥ることが分かっている。血小板の最も重要な機能は、止血機構における止血栓の形成である。血小板減少により、止血機構が正常に作働しなくなると、出血傾向を示す。巨核球形成や血小板形成に関して、特定の調節機構の存在が示唆されてきた。血小板は、健常人や正常動物では有効数に維持されているが、正常動物に抗血小板抗体を投与すると、血小板数だけが短時間に急激に減少し、その後、増加に転じ、一般的に正常レベルを超えるが最終的に正常値に戻ることが知られている。また、臨床分野において、血小板数の減少（血小板減少症）又は血小板数の増加（血小板増加症）が赤血球数や白血球数が正常であるときでさえ起こることも知られている。しかし、今日まで、（例えば赤血球形成に関与するエリスロポエチンの場合のように）血小板産生に関与する特異的調節因子の単離及び同定の成功例は報告されていない。血小板の最も重要な機能は、止血機構における止血栓の形成である。止血機構の正常な機能が血小板減少症のために損われるときには、出血傾向が起こる。癌の放射線療法や化学療法では、骨髄抑制による血小板減少症は致命的な合併症であり、そのような癌患者には出血傾向を防ぐための血小板輸血が施される。また、血小板輸血は骨髄移植を受けた患者や再生不良性貧血の患者にも施される。そのような血小板輸血のための血小板は、健常な血液提供者の血液から血小板フェレーシスによって調製されるが、輸血用血小板は貯蔵寿命が短く、細菌感染による汚染の可能性がある。また患者をヒト免疫不全ウィルス（HIV）または各種の肝炎ウィルスの様な危険なウィルスにさらしたり、患者に輸血血小板表面の組織適合性抗原（HLA）に対する抗体を誘導したり、あるいは輸血用血小板に混入するリンパ球により移植片対宿主病（GVHD）を引き起こしたりする危険性がある。従って、血小板減少症患者で、内在性の血小板産生を刺激し、同時に血小板輸血依存を減らすことができれば、極めて有益である。また、癌の放射線療法や化学療法を受けている患者で、血小板減少を是正または防止することができれば、それらの治療を一層安全にし、治療の集中度を高めることが可能となり、さらに一層の制癌効果が期待できるであろう。そのような理由から、巨核球および血小板の産生調節に関与する特異的な調節因子の分離、同定のための数多くの研究が熱心に行なわれてきた。試験管内の研究によれば、巨核球系細胞の形成に関与する調節因子は次の二つに大別されると考えられている（例えば、Williamsら、J．Cell．Physiol．、110巻、101-104頁、（1982）参照）。巨核球コロニー刺激因子（Meg-CSF）はCFU-MKの増殖・分化を促進する調節因子であり、半固形の培養液中で巨核球からなる集塊（コロニー）の形成を誘導する活性を有する。もう一つの調節因子は、巨核球増幅因子（Me g-Pot）、巨核球刺激因子、血小板生成刺激因子などと呼ばれ、主に未成熟又は成熟巨核球に働き、分化・成熟を促進させる。ある場合には、Meg-CSF活性と一緒に検出される。また、実験的に血小板減少症にした動物の血小板減少期の血清や血漿を別の正常動物に注入すると、血小板が増加することから、生体内で血小板増加作用を有する体液性因子の存在が考えられており、スロンボポエチン（thrombop oietin：ＴＰＯ）と呼ばれている。近年遺伝子がクローニングされたサイトカインのいくつかについて、試験管内での巨核球系細胞への作用および血小板増加作用が調べられている。ヒトIL-3はヒト巨核球コロニーの形成を刺激し（Brunoら、Exp．Hematol．、16巻、371-377 頁、（1988））、少なくともサルでは血小板数の増加をもたらす（Donahueら、S cience、241巻、1820-頁、（1988））。しかし、IL-3はすべての造血細胞の増殖、分化に影響を及ぼす因子であり、巨核球造血、および血小板産生の特異的調節因子とは区別することができる。ヒトIL-6はMeg-CSF活性は示さないが、未熟な巨核球に作用して成熟巨核球への分化を促進する（Williamsら、Exp．Hematol．、18巻、69頁、（1990））。霊長目動物において、IL-6のin vivo投与は血小板産生を誘起し、骨髄巨核球の成熟を促進し、および核の倍数性を増加させるが、体重の減少や急性期蛋白質の誘導などの副作用も認められている（Asanoら、Blo od、75巻、1602-1605頁、（1990）； Stahlら、Blood、78巻、1467-1475頁、（1991））。ヒトIL-11もMeg-CSF活性は示さず、Meg-Pot活性を発揮し、マウスを用いて血小板増加作用が報告されている（Nebenら、Blood、81巻、901-908頁、（1993））。また、ヒトLIFは霊長目動物において、有意に血小板数を増加させるが（Mayerら、Blood、81巻、3226-323 3頁、（1993））、試験管内での巨核球への作用は微弱である（Bursteinら、J． Cell．Physiol．、153巻、305-312頁、（1992））。これらのサイトカインには血小板増加因子としての臨床応用の可能性が期待されているが、巨核球系だけに特異的に作用するものではなく、また、副作用も認められる。従って、臨床においては、より副作用が少ない、巨核球‐血小板系に特異的な血小板増加因子が待望されている。古くから血小板減少症のヒトや動物の血清、血漿、尿あるいはある種のヒト培養細胞株の上清中に、Meg-CSF、Meg-Pot、あるいはＴＰＯ活性の存在が報告されているが、このような因子が単独で、あるいは複数存在して活性が発揮されるのか、また既知因子との異同など、ほとんど未解明のままである。 Hoffmanらは、再生不良性貧血や無巨核球性血小板減少性紫斑病の患者の血清の中に、有意にヒト巨核球コロニー形成を増加させるMeg-CSF 活性を見いだし（Hoffmanら、N．Eng．J．Med．、305巻、533-538頁、（1981））、Mazurらはさらに、再生不良性貧血患者の血清中のこのMeg-CSF活性はIL-3あるいはGM-CSFとは異なることを示した（Mazurら、Blood、76巻、290-297頁、（1 990））。類似のMeg-CSF活性は、集中的に細胞毒性化学療法を施した癌患者や骨髄移植を施した患者の血清中にも検出されている（Mazurら、Exp．Hematol．、1 2巻、624-628頁、（1984）；de AlarconとSchmieder、Prog．Clin．Bio．Res．、215巻、335-340頁、（1986））。Hoffmanらは、骨髄巨核球低形成の血小板減少症患者の血漿から、見かけの分子量46000を有するMeg-CSFを精製したと報告したが（Hoffmanら、J．Clin．Invest．、75巻、1174-1182頁、（1985））、その後の研究で精製標品の純度がアミノ酸配列を決定するには不十分であることが判明している（Hoffman、Blood、74巻、1196-1212頁、（1989））。血小板減少症患者由来の血漿、あるいは特発性血小板減少性紫斑病（ITP）患者の尿から、マウスでの⁷⁵Se-セレノメチオニン（⁷⁵Se-selenomethionine）の新生血小板への取り込みを促進させるＴＰＯ様活性が部分精製され、血漿由来の活性については見かけの分子量40000を有することが示されている（Grossiら、Hematologica、72巻、291-295頁、（1987）；Vannucchiら、 Leukemia、２巻、236-240頁、（1988））。再生不良性貧血や重症のITP患者の尿中にも、Meg-CSF活性やＴＰＯ様活性が検出されている（Kawakitaら、Br．J．Haematol.、48巻、609-615頁、（1981）；K awakitaら、Blood、61巻、556-560頁、（1983））。さらに、Kawakitaらは、再生不良性貧血患者の尿抽出物に含まれるMeg-CSF活性は、解離条件下のゲル濾過で見かけの分子量45000を有することを報告している（Kawakitaら、Br．J．Haem atol.、62巻、715-722頁、（1986））。Erikson-Millerらも、同様の尿試料からのMeg-CSFの精製を報告しているが、その構造は明らかにされていない（Erikson -Millerら、“Blood Cell Growth Factors：their present and future use in hematology and oncology”ed．by Murphy、AlphaMed Press、Dayton、Ohio、20 4-220頁、（1992））。Turnerらは、骨髄移植を施行された患者の尿からMeg-CSF 活性を有する巨核球刺激因子（MSF）を精製し、その遺伝子をクローニングした（Turnerら、Blood、78巻、1106頁 279a、（1991）（absir.、suppl．1））。このMSFは、分子量28000から35000を有する。この因子が、これまで血小板減少症患者の血清や血漿中に検出されてきたMeg-CSFと同じ因子か否か、また生体内において血小板増加作用を有するか否かは不明である。また、ヒト胎児腎臓由来細胞株（HEK細胞）の培養上清から分子量32000のＴＰＯ様活性が精製され、その生物学的及び生化学的性状が調べられているが、いまだにその構造は明らかにされていない（McDonaldら、J．Lab．Clin．Med.、106 巻、162-174頁、（1985）；McDonald、Int．J．Cell Cloning、７巻、139-155頁、（1989））。一方で、別の研究者により、このHEK細胞のならし培養液中に存在する、試験管内での巨核球の成熟を促進する主要な活性は、既知サイトカイン、即ち、IL-6とEPOに依るという報告もある（Withyら、J．Cell．Physiol．、15 巻、3362-372頁、（1992））。動物由来の因子について、Evattらは、抗血小板血清を注入したウサギの血小板減少期の血漿中にウサギおよびマウスにおいて⁷⁵Se-セレノメチオニンの新生血小板への取り込みを促進させるＴＰＯ様活性を報告している（Evattら、J．La b．Clin． Med.、83巻、364-371頁、（1974））。その他にも1960年代から1970年代にかけて類似の報告がいくつも見られる（例えば、Odellら、Proc．Soc．Biol．Med．、108巻、428-431頁、（1961）；EvattとLevin、J．Clin．Invest.、48巻、1615 -1626頁、（1969）；Harker、Am．J．Physiol．、218巻、1376-1380頁、（1970 ）；ShreinerとLevin、J．Clin．Invest.、49巻、1709-1713頁、（1970）；Peni ngton、Br．Med．J．、１巻、606-608頁、（1070））。Evattら、およびHillとL evinは、血小板減少期のウサギの血漿から、ＴＰＯ様活性を部分精製し（Evatt ら、Blood、54巻、377-388頁、（1979）；HillとLevin、Exp．Hematol．、14巻、752-759頁、（1986））、その後さらに、試験管内において巨核球の分化、成熟を促進させる活性、即ちMeg-Pot活性を指標にしてこの因子の精製を進め、ゲル濾過上で見かけの分子量40000〜46000を有することを明らかにした（Kellerら、Exp．Hematol．、16巻、262-267頁、（1988）；Hillら、Exp．Hematol．、20 巻、354-360頁、（1992））。抗血小板血清投与で誘導した重症の急性血小板減少症のウサギの血漿中にはIL-6活性が検出されないことから、このＴＰＯ様活性はIL-6とは異なる分子によって担われていることが示されている（Hillら、Blood、80巻、346-351頁、（1992））。 TayrienとRosenbergも、血小板減少症ウサギの血漿、あるいはHEK細胞の培養上清から、巨核球系のラット培養細胞株において血小板第４因子の産生を刺激する見かけの分子量15000を有する因子を精製したが、その構造は明らかにされていない（TayrienとRosenberg、J．Biol．Chem.、262巻、3262-3268頁、（1987））。また、Nakeffは、抗血小板抗体投与により血小板減少にしたマウスの血清中に Meg-CSF活性を見いだしている（Nakeff、“Experimental Hematology Today”ed ．by Baum and Ledney、Springer-Verlag、NY、111-123頁、（1977））。一方、血小板減少にしたウサギの血清中には、巨核球の成熟を促進したり（Kellerら、 Exp．Hematol．、16巻、262-267頁、（1988）；Hillら、Exp．Hematol．、17巻、903-907頁、（1989））、巨核球の血小板への形態変化（LevenとYee、Blood、 69巻、1046-1052頁、（1987））を刺激する活性は検出されているが、Meg-CSF活性は認められていない。。 Miuraらは、亜致死線量の放射線を全身照射したラットの血小板減少期の血漿中にMeg-CSF活性を検出し（Miuraら、Blood、63巻、1060-1066 頁、（1984））、この活性が血小板輸血によって変化しないことから、生体内でのMeg-CSF活性の誘導には、血小板の減少ではなく、巨核球の減少が必要であるとしている（Miuraら、Exp．Hematol．、16巻、139-144頁、（1988））。Mazur とSouthは、亜致死性放射線照射したイヌの血清中にMeg-CSF活性を検出し、ゲル濾過上で見かけの分子量175000を有することを報告している（MazurとSouth、Ex p．Hematol．、13巻、1164-1172頁、（1985））。その他に、血清、血漿、あるいは尿に由来する因子が、Stranevaら（Stranevaら、Exp．Hematol.、15巻、657 -663頁、（1987））などによっても報告されている。このように、血小板減少症のヒトや動物の生体試料の中に、巨核球造血、および血小板生成を促進する因子の存在が確認されているにもかかわらず、現在までにそのような因子の単離、生化学的ならびに生物学的な同定、および特性決定は、天然の供給源、例えば血液や尿の中にそのような因子が極端に微量でしか存在しないために成功していない。［発明の概要］そこで、本発明の目的は、巨核球前駆細胞の増殖および分化を促進するか、および／又は生体内で特異的に血小板の産生を刺激、または増強する活性（以下、「ＴＰＯ活性」と称する）を有するＴＰＯタンパク質を天然の供給源から単離・同定し、更にはそのＴＰＯタンパク質をコードする遺伝子を単離すること、組換えDNA技術を用いて、該タンパク質を均質に大量生産する方法を提供することにある。それが可能となれば、現在採用されている血小板輸血にとって代わるか、頻度を減らすことができ、あるいは血小板障害の治療および診断にも使うことができる。したがって、本発明は、（ｉ）ＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする精製、単離されたＤＮＡ配列に係わり、該ＤＮＡ配列は下記の群から選択される。（a）配列番号（SEQ ID NO）194、195及び196に示されるＤＮＡ配列、又はその相補鎖；（b）厳格な条件下で（a）に定義のＤＮＡ配列又はその断片とハイブリッド形成するＤＮＡ配列；及び（c）遺伝コードの縮重がなければ（a）、（b）に定義のＤＮＡ配列とハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列。本発明は、また、（ii）ＴＰＯ活性を有するタンパク質の製造方法に係わり、該方法は、適切な栄養条件下、該タンパク質の発現を可能にするように前記ＤＮＡ配列で形質転換又はトランスフェクトした原核又は真核宿主細胞を増殖し、前記ＤＮＡ配列の発現により得られた目的のタンパク質産物を単離する工程を包含する。本発明はさらに、（iii）原核又は真核宿主細胞内での前記ＤＮＡ配列の発現により得られたタンパク質産物に係わる。本発明はさらにまた、ＴＰＯ活性を有する前記タンパク質を有効量で含有する医薬組成物、並びに血小板障害特に血小板減少症をもつ患者に前記タンパク質を投与することからなる血小板障害特に血小板減少症を治療するための方法に係わる。［図面の簡単な説明］図１は、ＸＲＰ由来のPhenyl Sepharose 6 FF/LS F2のSephacryl S-200HRゲル濾過クロマトグラフィーを示す。図２は、ＸＲＰの低分子量ＴＰＯサンプル（Sephacryl S-200HR F3）由来のYM C-pack CN-AP TPO活性フラクションのCapcell Pak C1逆相クロマトグラフイーを示す。図３は、ＸＲＰの低分子量ＴＰＯサンプル由来のCapcell Pak C1 TPO活性フラクション（FA）のSDS-PAGE分析を示す。図４は、SDS-PAGEにより単離されたラットＴＰＯのＣ18逆相ＨＰＬＣ上のペプチドマップを示す。ペプチド断片は３種のプロテアーゼによる系統的加水分解によって得られた。図５は、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系におけるＸＲＰ由来のＴＰＯ活性を示す。図６は、発現ベクターｐＥＦ18Ｓの構築を示す。図７は、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系における、ｐＥＦ18Ｓ−Ａ２αが導入されたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活性を示す。図８は、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系におけるｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４が導入されたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活性を示す。図９は、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系におけるｐＨＴ１−２３１が導入されたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活性を示す。図１０ａは、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系におけるｐＨＴＦ１が導入されたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活性を示す。図１０ｂは、Ｍ−０７ｅアッセイ系におけるｐＨＴＦ１が導入されたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活性を示す。図１１は、ファージクローンλＨＧＴ１の制限酵素地図、並びにｐＨＧＴ１及びｐＥＦＨＧＴＥの構築を示す。（図中、Ｅ：EcoRＩ、Ｈ：HindIII、Ｓ：Sal Ｉを示す。）図１２ａは、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系におけるｐＥＦＨＧＴＥが導入されたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示す。図１２ｂは、Ｍ−０７ｅアッセイ系におけるｐＥＦＨＧＴＥが導入されたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示す。図１３ａは、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系における、ｐＨＴ１−２１１＃１、ｐＨＴ１−１９１＃１、又はｐＨＴ１−１７１＃２が導入されたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示す。図１３ｂは、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系におけるｐＨＴ１−１６３＃２が導入されたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示す。図１４は、Ｍ−０７ｅアッセイ系におけるｐＨＴ１−２１１＃１、ｐＨＴ１−１９１＃１、ｐＨＴ１−１７１＃２、又はｐＨＴ１−１６３＃２が導入されたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示す。図１５は、ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１を導入・発現させたＣＨＯ細胞の培養上清からのヒトＴＰＯ精製における、逆相クロマトグラフィー（Vydac C4カラム）のクロマトグラム。図１６は、ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１を導入・発現させたＣＨＯ細胞の培養上清から精製されたヒトＴＰＯのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離を示す写真。図１７は、ｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）を導入・発現させた大腸菌からのヒトＴＰＯの精製における、逆相クロマトグラフィーのクロマトグラム。図１８は、ｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）を導入・発現させた大腸菌から分離・精製された変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離を示す写真。図１９は、ヒトＴＰＯ発現プラスミドpDEF２０２-hTPO１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られた培養上清を出発材料にしたhTPO１６３の精製におけるSuperdex 75 pgカラムでのhTPO１６３の溶出パターンを示す。蛋白質は２２０ｎｍで測定した。図２０は、ヒトＴＰＯ発現プラスミドpDEF２０２-hTPO１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られた培養上清を出発材料にしたhTPO１６３の精製において、Superdex 75pgカラムで得られたhTPO１６３標品のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。ゲル上の各hTPO１６３は銀染色された。図２１は、発現ベクターｐＳＭＴ２０１の構造を示す。図２２は、Ｍ−０７ｅアッセイにおけるβGL-TPO、Ｎ３／ＴＰＯ、０９／ＴＰＯを導入・発現させたＣＯＳ７培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。図２３は、Ｍ−０７ｅアッセイにおけるヒトＴＰＯ挿入・欠失誘導体を導入・発現させたＣＯＳ７細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。図２４は、ヒトＴＰＯをマウスに静脈内投与、または皮下投与した場合の血小板数の上昇推移を示す。図２５は、ヒトＴＰＯをマウスに皮下投与した場合の用量に依存した血小板数の上昇推移を示す。図２６は、マウスに5-FUを投与して血小板減少症を誘起した後にヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の上昇推移を示す。図２７は、マウスに塩酸ニムスチンを投与して血小板減少症を誘起した後にヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の上昇推移を示す。図２８は、マウスにＢＭＴ（骨髄移植）を施行した後にヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の上昇推移を示す。図２９は、Ｘ線照射して血小板減少症を誘起した後のマウスにヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示す。図３０は、トランケーテッド（truncated）ＴＰＯ（配列番号６中のアミノ酸1 -163）を投与した場合の血小板数の用量依然的上昇推移を示す。図３１は、塩酸ニムスチンを投与して血小板減少症を誘起した後にトランケーテッド（truncated）ＴＰＯ（配列番号６中のアミノ酸1-163）を投与した場合の血小板数の上昇推移を示すグラフ。図３２は、ヒト巨核球培養系に加えるＭｐl−Ｘの濃度を高めると、巨核球の発生を増々ブロックすることを示す。図３３は、大腸菌で発現されたヒトＴＰＯ誘導体（［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｌｇ¹³³］ＴＰＯ（1-163）、［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ｐｒｏ¹⁴⁸］ＴＰＯ（1-163）及び［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹¹⁵］ＴＰＯ（1-163））のＭ−０７ｅアッセイにおけるＴＰＯ活性を示す。図３４は、大腸菌で発現されたヒトＴＰＯ誘導体（［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｌｇ¹²⁹］ＴＰＯ（1−163）、［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹⁴³］ＴＰＯ（1-163）、［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹ ，Ｖａｌ³，Ｌｅｕ⁸²］ＴＰＯ（1-163）、［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ｌｅｕ¹⁴⁶］ＴＰＯ（1-163）及び［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ⁵⁹］ＴＰＯ（1-163））のＭ−０７ｅアッセイにおけるＴＰＯ活性を示す。［発明の詳細な説明］本発明は、血小板産生を特異的に刺激又は増大させる生物活性を有しかつ配列番号６のアミノ酸配列１〜332を含むトロンボポエチン（ＴＰＯ）ポリペプチド又はその誘導体を提供する。ポリペプチドの例として、配列番号６のアミノ酸配列１〜163、配列番号６のアミノ酸配列１〜232、配列番号６のアミノ酸配列１〜 151、配列番号２、４及び６の成熟アミノ酸配列からなるポリペプチド類、並びに１〜６個のアミノ末端アミノ酸が欠損したポリペプチド類が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドの例として、［Ｔｈｒ³³，Ｔｈｒ³³³，Ｓｅｒ³³⁴，Ｉｌｅ³³⁵，Ｇｌｙ³³⁶，Ｔｙｒ³³⁷，Ｐｒｏ³ ³⁸ ，Ｔｙｒ³³⁹，Ａｓｐ³⁴⁰，Ｖａｌ³⁴¹，Ｐｒｏ³⁴²，Ａｓｐ³⁴³，Ｔｙｒ³⁴⁴，Ａｌａ³⁴⁵，Ｇｌｙ³⁴⁶，Ｖａｌ³⁴⁷，Ｈｉｓ³⁴⁸，Ｈｉｓ³⁴⁹，Ｈｉｓ³⁵⁰，Ｈｉｓ³⁵ ¹ ，Ｈｉｓ³⁵²，Ｈｉｓ³⁵³］ＴＰＯ，［Ａｓｎ²⁵，Ｌｙｓ²³¹，Ｔｈｒ³³³，Ｓｅｒ³³⁴，Ｉｌｅ³³⁵，Ｇｌｙ³³⁶，Ｔｙｒ³³⁷，Ｐｒｏ³³⁸，Ｔｙｒ³³⁹，Ａｓｐ³⁴⁰ ，Ｖａｌ³⁴¹，Ｐｒｏ³⁴²，Ａｓｐ³⁴³，Ｔｙｒ³⁴⁴，Ａｌａ³⁴⁵，Ｇｌｙ³⁴⁶，Ｖａｌ³⁴⁷，Ｈｉｓ³⁴⁸，Ｈｉｓ³⁴⁹，Ｈｉｓ³⁵⁰，Ｈｉｓ³⁵¹，Ｈｉｓ³⁵²，Ｈｉｓ³⁵³ ］ＴＰＯ，［Ａｓｎ²⁵］ＴＰＯ及び［Ｔｈｒ³³］ＴＰＯが挙げられる。本発明の他のポリペプチドとしては、［ΔＨｉｓ³³］ＴＰＯ（1-163），［ΔＡｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163），［ΔＧｌｙ¹¹⁶］ＴＰＯ（1-163），［Ｈｉｓ³³，Ｔｈｒ³³′ ，Ｐｒｏ³⁴］ＴＰＯ（1-163），［Ｈｉｓ³³，Ａｌａ³³′，Ｐｒｏ³⁴］ＴＰＯ（1 - 163），［Ｈｉｓ³³，Ｇｌｙ³³′，Ｐｒｏ³⁴，Ｓｅｒ³⁸］ＴＰＯ（1-163），［Ｇｌｙ¹¹⁶，Ａｓｎ¹¹⁶′，Ａｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163），［Ｇｌｙ¹¹⁶，Ａｌａ¹¹⁶ ′，Ａｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163），［Ｇｌｙ¹¹⁶，Ｇｌｙ¹¹⁶′，Ａｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163），［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹²⁹］ＴＰＯ（1-163），［Ａｌａ¹ ，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹³³］ＴＰＯ（1-163），［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹⁴³］ＴＰＯ（1-163），［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ｌｅｕ⁸²］ＴＰＯ（1-163），［Ａｌａ¹ ，Ｖａｌ³，Ｌｅｕ¹⁴⁶］ＴＰＯ（1-163），［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ｐｒｏ¹⁴⁸］ＴＰＯ（1-163），［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ⁵⁹］ＴＰＯ（1-163），及び［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹¹⁵］ＴＰＯ（1-163）のＴＰＯポリペプチド誘導体が挙げられる。本発明のＴＰＯポリペプチドにはさらに、ポリマー好ましくはポリエチレングリコールに共有結合されたものも包含される。さらに、本発明のＴＰＯポリペプチドには、アミノ酸［Ｍｅｔ^-2−Ｌｙｓ^-1］、［Ｍｅｔ^-1］又は［Ｇｌｙ^-1］をさらに含有してもよい。本発明によって提供されるＤＮＡとしては、ＴＰＯポリペプチド又は上記誘導体をコードするものが挙げられ、適切にはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡとして提供される。本発明はまた、上記ＴＰＯポリペプチドの製造方法を提供し、この方法は、本発明のＤＮＡによりコードされるポリペプチドを適切な宿主中で発現させ、該ＴＰＯポリペプチドを単離する工程を包含する。発現されるＴＰＯポリペプチドがＭｅｔ^-2−Ｌｙｓ^-1ポリペプチドである場合には、前記方法はさらに、前記単離ＴＰＯポリペプチドからＭｅｔ^-2−Ｌｙｓ^-1を切断する工程を含んでもよい。本発明はさらに、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ポリペプチドのようなＴＰＯポリペプチドの製造方法を提供する。アミノ末端ＧＳＴポリペプチド、トロンビン認識ペプチド及びＴＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡを適切な宿主中に導入し、融合ポリペプチドを単離し、そのＧＳＴ部分をトロンビン処理により除去する。これによって、［Ｇｌｙ^-1］ＴＰＯポリペプチド構造が得られる。本発明はさらにまた、血小板産生を特異的に刺激又は増大する生物活性をもつポリペプチドを原核又は真核宿主細胞で発現可能なように、本発明のＤＮＡ配列で形質転換又はトランスフェクトされた前記宿主細胞を提供する。本発明の医薬組成物は、有効量のＴＰＯポリペプチド又はその誘導体と医薬的に許容可能な担体と組合わせて含有するものであり、血小板障害、特に、例えば化学療法、放射線療法又は骨髄移植によって誘発される血小板減少症の治療に有効に使用される。対応の治療法も本発明に含まれる。最後に、本発明はまた、ＴＰＯポリペプチド又はその上記誘導体と特異的に免疫学的に反応する抗体を提供する。この抗体は本発明のＴＰＯポリペプチドの単離や定量のための方法に有用である。本発明によれば、ＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする新規DNA配列（以下、「本発明のDNA配列」と言う）が提供される。本発明のDNA配列としては、後記配列表配列番号２、４又は６に示されたアミノ酸配列をコードするDNA配列が挙げられる。本発明のDNA配列には、ＴＰＯ活性を保持する限りにおいて配列番号２、４又は６に示される前記アミノ酸配列の一部が改変（置換、欠失、挿入、または付加）されている変異体をコードするDNA配列が含まれる。すなわち、ＴＰＯ誘導体をコードするDNA配列もまた本発明に包含される。別の言い方をすれば、本発明のDNA配列としては、アミノ酸配列が実質的に配列番号２、４又は６に示されたアミノ酸配列であるタンパク質分子をコードする DNA配列が含まれる。ここで言う、「実質的に配列番号２、４又は６に示されたアミノ酸配列」とは、配列番号２、４又は６に示されたアミノ酸配列」に加えて、ＴＰＯ活性を保持する限りにおいて、配列番号２、４又は６に示されたアミノ酸配列の一部に置換、欠失、挿入又は付加などの改変があるアミノ酸配列を含むことを意味する。さらに、本発明のDNA配列は、ＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードするDNA 配列から本質的になる。なお、ここで言う「アミノ酸配列をコードするDNA配列」には、ヌクレオチド配列における縮重をもつすべてのDNA配列を包含する。更に、本発明のDNA配列は、以下（ａ）〜（ｃ）の配列を包含する。（ａ）配列番号７、194、195及び196に示されたDNA配列またはそれらの相補鎖、（ｂ）（ａ）のDNA配列またはその断片と厳格な条件下でハイブリッド形成するD NA配列、（ｃ）遺伝コードの縮重がなければ（ａ）、（ｂ）のDNA配列とハイブリッド形成しうるDNA配列。また、別の言い方をすれば、本発明のDNA配列は以下の（ａ）、（ｂ）のいずれかに示された配列も包含する。（ａ）大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２α（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４５６５）に組込まれているＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列、大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＴ１− ２３１（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４５６４）に組込まれているＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列、大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＴＦ１（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−4617）に組込まれているＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列、大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＧＴ１（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−4616）に組み込まれているＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列、（ｂ）ＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列であって、（ａ）のDNA配列またはその断片と（厳格な条件下で）ハイブリッド形成するDNA配列。ここで“厳格な”ハイブリダイゼーション条件という表現は、縮重配列の、および／または単一配列のオリゴヌクレオチドプライマー（プローブ）を用いることにより行う、本発明においてＤＮＡのＰＣＲ増幅をとりあげた一連の実施例において使用されるものである。例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）の第１１章および第１４章、あるいは、Ａｕｓｕｂｅｌら編“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９３）のユニット２．１０を参照のこと。本発明のＤＮＡとしては、配列番号６に示されたアミノ酸配列のうち、１位から１６３位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、かつＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列も含まれる。このようなDNAは、制限酵素による切断部位の供与、および／または、発現を容易にするような発現ベクター構築のための開始部、終止部または中間部へのDNA配列の付加的供与を含むことができる。また、非哺乳類宿主を使用する場合には、それにおける発現に好ましいコドン（優先コドン）を組み込んでも良い。本発明のDNA配列の例としては、ヒトをはじめとする哺乳動物細胞などからmRN Aを調製した後、既知の方法で作製されたcDNAライブラリーから、既知の方法によってスクリーニングすることによって得られたcDNAがある。この場合のmRNAの供給源としては、ラット肝臓細胞由来の細胞株McA-RH8994細胞、HTC細胞、H4-II -E細胞、ラット肝臓、腎臓、脳、小腸、ヒト肝臓等が挙げられる。また、本発明のDNA配列の他の例としては、ヒトをはじめとする哺乳動物細胞から既知の方法で作製されたゲノムライブラリーから既知の方法でスクリーニングされたゲノムDNA配列であってもよい。この場合のゲノムDNAの供給源としては、ヒト、ラット、マウス等の染色体ＤＮＡが挙げられる。また、このようにして得られた、ＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする cDNAを周知の部位特異的突然変異法を用いて修飾することによって、一部のアミノ酸配列が改変されたもの、即ちＴＰＯ誘導体をコードするDNAを得ることができる。また、本明細書中で開示されたＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列又はDNA配列に基づいて、その一部のアミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAは、化学合成することによっても容易に得ることができる。本発明のDNA配列は、種々の遺伝子組換え技術によってＴＰＯ活性を有するタンパク質を大量生産するために有用な物質である。更に、本発明のDNA配列は、ＴＰＯの関連タンパク質をコードする遺伝子、並びに他の哺乳動物のＴＰＯのcDNA、およびゲノムDNAを単離する場合に標識化プローブとして用いるのに適した物質である。また、ヒトおよび他の哺乳類種における遺伝子療法において有用である。本発明のDNAは、大量のＴＰＯ生産のための真核宿主として用いることができるトランスジェニック哺乳類種の開発に有用である（Palmiterら、Science、222、809-814、（1983））。また、本発明によれば、上記ＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードするDNA を組み込んだベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養し、産生されたＴＰＯ活性を有するタンパク質を分離・精製することを特徴とするＴＰＯ活性を有するタンパク質の製造方法が提供される。この場合の宿主細胞としては、原核生物（例えば大腸菌）、真核生物（例えば酵母、昆虫、あるいは哺乳動物）細胞等を用いることができる。哺乳動物細胞の例としては、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovar y）細胞、Ｃ-127細胞、ＢＨＫ（Baby Hamster Kidney）細胞、等があげられる。酵母の例としては、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）やメタノール資化性酵母（Pichia pastoris）等があげられる。昆虫細胞の例としては、蚕培養細胞等があげられる。これらの宿主細胞を形質転換させるために用いられるベクターには、大腸菌用としてpKC30（Shimatake H．and M．Rosenberg、Nature、292、128-132、1981）、pTrc99A（Amann E.ら、Gene6、69、301-315、1988）等があげられる。哺乳動物細胞用としてはpSV2-neo（Southern and Berg；J．Mol．Appl．Genet.、1、32 7-341、1982）、pCAGGS（Niwaら； Gene、108、193-200、1991）、あるいはpcDL-SR α296（Takebeら；Mol．Cell． Biol．、8、466-472、1988）等がある。酵母用としてはpG-1（Schena M．and Ya mamoto K.R.；Science、241、965-967、1988）等がある。蚕細胞用としては、組み換えウイルス作製用トランスファーベクターpAc373（Luckowら、Bio/Technolo gy、6、47-55、1988）等がある。これらのベクターは必要に応じて複製起点、選択マーカー、プロモーターを含み、さらに真核細胞用のベクターには、必要に応じてＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等が付加される。複製起点として、哺乳動物細胞用ベクターには、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のもの等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしては、ColE1、R 因子、F因子由来のもの等を用いることができる。酵母用としては２μmDNA、ARS1由来のもの等を用いることができる。遺伝子発現用プロモーターとして哺乳動物細胞用ベクターには、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、SV40由来のもの等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしてはバクテリオファージλ由来のものや、trp、lpp、lac、tacプロモーター等を用いることができる。パン酵母用としてはADH、PHO5、GPD、PGK、MAF αプロモーター、メタノール資化性酵母についてはAOX1プロモーター等を用いることができる。蚕細胞用ベクターとしては核多角体病ウイルス由来のもの等を用いることができる。選択マーカーとして、哺乳動物細胞用ベクターには、ネオマイシン（neo）耐性遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる。酵母用としてはLeu2、Trp1、Ura3遺伝子等を用いることができる。以上の様な宿主−ベクター系を用いてＴＰＯ活性を有するタンパク質を得るためには、上記ベクターの適当な部位に本発明の遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡ体により、宿主細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体を培養し、さらに細胞内あるいは培養液もしくはろ液から該ポリペプチドを分離・精製すればよい。これらに用いられる手段・方法は公知のものを組み合わせて行なうことができる。目的の遺伝子を発現させる場合に、その発現産物のＮ末端を均一化するために、本来のシグナル配列を改変したり、他のタンパク質のシグナル配列を用いてもよい。また、Ｎ末端およびその近傍のアミノ酸残基を改変（置換、あるいは付加）することによっても、Ｎ末端を均一化することが可能である。例えば、宿主細胞として大腸菌を用いて発現させる場合にメチオニン残基に加え、リジン残基を加えるなどしてもよい。本発明のＴＰＯ活性を有する新規タンパク質（以下、「本発明のタンパク質」と言う）としては、配列番号２、４又は６に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質がある。また、本発明にはＴＰＯ活性を保持する限り、その一部のアミノ酸配列が改変（置換、欠失、挿入、または付加）されたもの、即ちＴＰＯ誘導体も含まれる。別の言い方をすれば、本発明のタンパク質としては、アミノ酸配列が実質的に配列番号２、４又は６に示されたアミノ酸配列であるようなタンパク質が含まれる。ここで言う、「実質的に配列番号２、４又は６に示されたアミノ酸配列」とは、配列番号、４又は６に示されたアミノ酸配列に加えて、ＴＰＯ活性を保持する限りにおいて、配列番号、４又は６に示されたアミノ酸配列の一部に置換、欠失、挿入または付加などがあるアミノ酸配列を含むものである。本発明のタンパク質としては、配列番号６に示されたアミノ酸配列の７位から１５１位のアミノ酸配列を含み、かつＴＰＯ活性を有するタンパク質も含まれる。本発明のタンパク質には、配列番号６に示されるアミノ酸配列の１位から 16 3位のアミノ酸配列を含み、かつＴＰＯ活性を有するタンパク質も含まれる。本発明のＴＰＯ誘導体の他の例としては、例えば、アミノ酸の改変（置換、欠失、挿入または付加）を行うことによって安定性や体内での持続性の向上を図ったもの、糖鎖の付加する１つ以上の潜在的部位を欠失または付加して変化させたもの、１つ以上のシステイン残基を欠失させるか、またはシステインを他のアミノ酸残基（例えば、アラニンまたはセリン残基）で置換したものなどが挙げられる。好ましくは、本発明のタンパク質は、cDNA分子、ゲノムDNA分子、または化学合成により得られるDNA断片を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞から分離・精製して得られたものであることを特徴とする。宿主として、細菌（例えば、大腸菌）を用いて菌体内発現を行う場合には、ＴＰＯ活性を有するタンパク質のＮ末端側に開始メチオニン残基の付加されたタンパク質が得られるが、このようなタンパク質も本発明に含まれる。また、用いる宿主によっては、産生されるＴＰＯ活性を有するタンパク質はグリコシル化されている場合もあるし、あるいはグリコシル化されていない場合もあるがいずれも、本発明のタンパク質に含まれる。また、本発明のタンパク質としては、天然の供給源（例えば、ＴＰＯ活性を含むならし培地、またはヒト尿、血清、血漿）から精製および単離されたＴＰＯ活性を有する天然のタンパク質も含まれる。また、本発明によれば、そのような天然の供給源からＴＰＯを精製する方法を包含する。そのような精製法としては、一般にタンパク質の精製に用いる工程（イオン交換クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、トリアジン色素吸着クロマトグラフィー、疎水相互クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、硫酸化ゲルクロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、金属キレーティングクロマトグラフィー、分取電気泳動法、および等電点電気泳動法など）の一つ以上を組み合わせた方法がある。また、後述の実施例から推定しうるＴＰＯの物理化学的な性質を利用して組み合わせることのできる方法も本発明に含まれる。さらには、ＴＰＯを認識することのできる抗体を用いた抗体アフィニティクロマトグラフィーをも用いることができる。また、ＴＰＯはＭｐｌのリガンドであることが判明したことから（de Sauvageら、Nature 3 69巻533-538頁（1994）、Bartleyら、Cell 77巻1117-1124頁（1994）、Kaushans kyら、Nature 369巻565-568頁（1994））、Ｍｐｌを樹脂にカップリングさせることでアフィニティーゲルカラムを調製し、これを利用することによってもＴＰＯを精製することができる。より具体的には、Ｍｐｌの細胞外領域（Ｍｐｌ−Ｘ）をＣＨＯ細胞を宿主として用いた遺伝子組換え法により生産・調製し、樹脂にカップリングさせて調製されたＭｐｌ−Ｘカラムが挙げられる（前述のBartley ら（1994））。本明細書で記載されるように、本発明のＴＰＯポリペプチドはさらに、Ｍｐｌレセプター、特にその細胞外（可溶性）ドメインに特異的に結合する能力によって特徴付けられる。本発明は更に、ＴＰＯ遺伝子のヒトcDNAまたはゲノムDNA配列の蛋白質コード鎖と相補的なDNA部分によってコードされるタンパク質、即ちTramontanoら（Nuc l．Acids Res.、12、5049-5059（1984））が記載したような“相補的逆方向蛋白質”を含む。本発明には、固体組織および血液または尿のような液体試料中のＴＰＯまたはその受容体保有細胞の検出および定量に有用な試薬を提供するために、検出可能なマーカー物質で標識（例えば¹²⁵Ｉで放射能標識するか、またはビオチニル化する）された本発明のタンパク質も含まれる。ビオチニル化された本発明のタンパク質は、自己骨髄移植において骨髄から巨核芽球性細胞を除去するために固定化ストレプトアビジンと結合する場合に有用である。更には、自己または同種異系骨髄移植の場合に自己または同種異系巨核球系細胞を濃縮するために固定化ストレプトアビジンと結合する場合に有用である。リシン、ジフテリア毒素のような毒素とＴＰＯとの毒素結合体、および放射性同位元素は、抗癌療法に対して、または骨髄移植のコンディショニング養生法として有用である。また、本発明は、検出可能マーカー（例えば放射能標識、またはビオチンのような非同位元素標識）で標識される場合や、染色体地図におけるヒトＴＰＯ遺伝子位置および／または任意の関連遺伝子ファミリーの位置を突き止めるためのハイブリダイゼーション法に用いるのに有用な核酸物質も提供する。それらは、DN AレベルでヒトＴＰＯ遺伝子障害を確認するためにも有用であって、隣接遺伝子およびそれらの障害を確認するための遺伝子マーカーとしても用いられる。さらに、本発明には、有用で好適な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体とともに治療上有効量の本発明のタンパク質を含有する医薬組成物も含まれる。本明細書中で用いる“治療上有効量”という用語は、指定の条件および投与法に対して治療効果を提供する量を示す。このような組成物は、液体であるか、あるいは凍結乾燥またはさもなくば乾燥された剤形であって、種々のpH、およびイオン強度から成る緩衝剤（例えばトリス‐塩酸、酢酸塩、燐酸塩）より選択した希釈剤、表面に吸着しないようにするためのアルブミンまたはゼラチンのような添加剤、界面活性剤（例えばTween 20、Tween 80、Pl uronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、賦形剤または等張化剤（例えばラクトース、マンニトール）を配合した製剤が含まれる。また、蛋白質に対するポリエチレングリコールのような重合体との共有結合、金属イオンとの錯体化、あるいはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのような重合化合物の粒状製剤中またはその表面上への、あるいはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層または多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト中への当該物質の取り込みを包含する。このような組成物は、ＴＰＯの物理的状態、溶解性、安定性、in vivo放出速度、in vivoクリアランスに影響を及ぼすと思われるので、組成物の選択は、ＴＰＯ活性を有する蛋白質の物理的および化学的特性による。さらに、重合体（例えばポロキサマーまたはポロキサミン）と、組織特異的受容体、配位子または抗原に対する抗体に結合するか、あるいは組織特異的受容体の配位子に結合するＴＰＯとで被覆される粒状組成物も本発明に包含される。本発明の組成物の別の剤形としては、非経口、経肺、経鼻、および経口を含めた種々の投与経路のため、粒状形態、保護被膜、プロテアーゼ阻害剤、または吸収促進剤を配合する。本発明のタンパク質を含有する医薬組成物は、（ＴＰＯタンパク質として）通常０．０５μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重を、病状、性別及び投与経路等に応じて、一日数回程度投与することができる。本発明のタンパク質を含有する医薬組成物は、活性成分として後述のＭ−０７ｅアッセイにおける相対活性量通常25,000〜500,000,000/kg体重を、病状、性別及び投与経路等に応じて、一日一回〜数回、１週間に１〜７日間程度投与することができる。本発明者らは、ヒトＴＰＯのＣ末端部位に関して、配列番号６に示されるアミノ酸配列中Ｃ末端から１５２位までのアミノ酸残基が欠損する場合でさえＴＰＯ活性が保持されること、またそのＮ末端部位に関して、該アミノ酸配列中Ｎ末端から６位までのアミノ酸残基が欠損する場合でさえＴＰＯ活性が保持されることを確認している。したがって、配列番号６の７〜１５１アミノ酸配列を含みかつ他の部分に改変（置換、欠失、挿入又は付加）を有するＴＰＯ活性含有タンパク質もまた、本発明の有効成分として好適に使用しうる。より好適なＴＰＯ誘導体は配列番号６の１〜１６３アミノ酸配列をもつものである。更に本発明は、本発明のタンパク質に加えてEPO、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL- 1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-13、LIF、SCFのような因子の１つ以上を付加的造血因子として含有する組成物を包含する。本発明のタンパク質は、単独あるいは他の付加的造血因子との組み合わせても、多数の血小板減少症の治療に有用である。他の付加的造血因子としては、EPO 、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、 IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、LIF、SCFを挙げることができる。血小板障害、例えば、血小板産生障害や血小板の寿命短縮（血小板破壊の亢進、あるいは血小板消費の亢進）による血小板減少を特徴とし、本発明のタンパク質で治療可能な多数の疾患が存在する。例えば、先天性のファンコニ貧血、化学療法や放射線療法に伴う再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、または骨髄移植のような骨髄形成不全による血小板減少症などが挙げられ、このような患者の血小板の回復を促進するために用いることができる。また、ＴＰＯ産生異常による血小板減少症にも有用である。血小板や巨核球の寿命短縮による血小板減少症としては例えば、特発性血小板減少性紫斑病、再生不良性貧血、後天性免疫不全症候群（AIDS）、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少症などがあり、このような患者の血小板回復促進にも有用である。更に、外科手術前にＴＰＯを投与して自分の血小板を増加させ、その血小板を自分の手術時に輸血用血小板として用いる（自己血小板輸血）への用途としても有用である。さらに本発明のタンパク質の別の用途は、例えば他の化学薬品または医薬品、または治療的措置による一過性の血小板の欠損または損傷によってもたらされた障害の処置である。ＴＰＯは、そのような患者で新しい“無傷の”血小板の放出を促進するのに用いることができる。本発明はさらにＴＰＯに特異的に結合する抗体、およびそれを得るための抗原を提供する。本発明のタンパク質または抗原決定基を有する該タンパク質の部分断片が抗原として使い得る。そのような抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の双方、および既知の方法によって作製したキメラ抗体、即ち“組換え”抗体などを含む。抗ＴＰＯ抗体を調製するためには、ヒトＴＰＯ自体を抗原として使用するか、又はヒトＴＰＯの部分ペプチドを抗原として使用することができる。そのようなペプチド抗原に対する抗体を利用する場合、エピトープは該抗原領域を特定することによって規定することができる。一方、抗原タンパク質（ＴＰＯ）自体に対する抗体を利用する場合、抗原領域は該抗原のエピトープを分析することによって明らかにすることができる。このような場合、明らかにされたエピトープを有するこれらの抗体の各々を用いて、付加糖鎖の種類、ペプチド鎖の長さ等のような性質の異なる種種のＴＰＯ類を分画、検出、定量及び精製することができる。このように選択されたアミノ酸配列を有するＴＰＯペプチドを合成し、適当な担体蛋白質（例えば、アルブミン、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などと共有結合して免疫反応性抗原を調製するか、あるいはTam（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85 ，5409-5413，1988）の方法によるＭｕｌｔｉｐｌｅＡｎｔｉｇｅｎＰｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）型のペプチドを合成しこれを抗原として、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ハムスター、ウマ、モルモットなど一般に抗体を作らせるために利用される哺乳動物、鳥類などにアジュバンドなどとともに投与する。これらの動物より抗血清、細胞を回収し、ポリクローナル抗体を得ることができる。ペプチドを抗原とした場合では、抗原領域を特定することによって、エピトープは限定することができる。この場合、分子量の異なる様々なＴＰＯ分子の領域を免疫学的手法により選別、同定することができる。一例を挙げれば、ペプチド部分の欠損領域などを選別、同定することができる。さらには抗体を発現している細胞から抗体遺伝子、またはその一部の遺伝子をクローニングすることにより、遺伝子工学的に発現させた抗体分子を得ることもできる。種々の抗原決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を一般に含有するポリクローナル抗体に対比して、モノクローナル抗体は抗原上の単一抗原決定基に対する抗体である。ＴＰＯに対する特異抗体は、抗原‐抗体反応を用いる診断および分析的アッセイ法の選択性および特異性を改良したり、ＴＰＯを分離・精製するのに有用である。さらに、それらは、血清からＴＰＯを中和または除去するのに用いられる。モノクローナル抗体はまた、たとえば全血の血清中のＴＰＯの検出及び定量に有用である。本発明の抗ヒトＴＰＯ抗体は、ヒトＴＰＯの精製・単離のためのアフィニティークロマトグラフィー法におけるリガンドとして用いることが可能である。このアフィニティークロマトグラフィーにおいて有用な抗体の固定化は各種酵素の固定化方法に準じて行うことができ、例えばＣＮＢｒ活性化セファロース−４Ｂ（ Pharmacia Fine Chemicals社製）などの担体を使用する方法が利用できる。この固定化抗ヒトＴＰＯ抗体を用いて実際にヒトＴＰＯを精製するためには、これをカラムに充填後、これにヒトＴＰＯを含む溶液を通塔する。この操作で大量のヒトＴＰＯがカラム中の担体に吸着される。溶媒として、例えば、グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５）、塩化ナトリウム溶液、プロピオン酸、ジオキサン、エチレングリコール、カオトロピック塩、塩酸グアニジンまたは尿素などで溶出することにより、吸着したヒトＴＰＯが高純度で溶出する。本発明の抗体は、免疫化学的定量アッセイ、特に固相サンドイッチ法が採用される酵素免疫アッセイによってヒトＴＰＯを定量するために使用可能である。モノクローナル抗体の利点は、他の任意の免疫グロブリン分子を含有しない培地中でハイブリドーマ細胞によって産生されうる点に存する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞の培養上清又はハイブリドーマ細胞の腹腔内投与によって誘導されるマウス腹水から調製される。KohlerとMilstein（Eur．J．Immuno l．6:511-519，1976）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術を広く用いて、多数の特異抗原に対するモノクローナル抗体を高レベルで保有するハイブリドーマ細胞系を作製することができる。こうして得られた抗体含有材料（抗血清等）から目的の抗体を精製により単離するために、一般にタンパク質の精製に用いる１つ以上の工程（プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、Ａｖｉｄゲルクロマトグラフィー、抗イムノグロブリン固定化ゲルクロマトグラフィーなどのアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、色素吸着クロマトグラフィー、疎水相互クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、フルオロアパタイトクロマトグラフィー、金属キレーティングクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、分取電気泳動法、および等電点電気泳動法など）の一つ以上を組み合わせた方法がある。また、これらの方法以外にも、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトＴＰＯタンパク質そのものか、あるいは抗原となった領域を含む、あるいはその一部の領域を含むペプチド、即ち目的抗体を認識可能な分子を化学的に結合させたゲル担体あるいは膜を調製し、抗体を含む材料をこれに添加することにより、目的の抗体を吸着させ、これを適当な条件にて溶離、回収する方法、即ち抗原アフィニティ精製を利用することもできる。本発明はまた、ＴＰＯポリペプチドをコードする内因性ＤＮＡ配列を用いて大量のポリペプチド生成物の製造を可能にする。たとえば、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏ相同組換え手法を用いて宿主細胞を形質転換してポリペプチドの発現もしくは増強発現用に供することができる。好適な宿主細胞にはヒト細胞（例えば、肝臓、骨髄等）が含まれるが、結果的にＴＰＯポリペプチド発現が達成又は増強されるように、細胞ゲノム内の標的領域に相同なフランキング配列を用いて前記細胞中にプロモーター又はエンハンサー配列が挿入される。例えば、Ｕ．Ｓ．ＬｅｔｔｅｒｓＰａｔｅｎｔ５，２７２，０７１、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１４０９２、ＷＯ９１／０６６６６及びＷＯ９１／０９９５５を参照のこと。本発明はまた、上記ＴＰＯポリペプチドの製法を提供するが、この方法は、適切な宿主中で本発明のＤＮＡによってコードされるポリペプチドを発現する工程と前記ＴＰＯポリペプチドを単離する工程を包含する。発現されたＴＰＯポリペプチドがＭｅｔ^-2−Ｌｙｓ^-1ポリペプチドである場合、該方法はさらに前記単離ＴＰＯポリペプチドからＭｅｔ^-2−Ｌｙｓ^-1を切断する工程を含んでもよい。本発明はさらにまた、［Ｇｌｙ^-1］構造をもつＴＰＯポリペプチドの製法を提供するが、この方法は、適切な宿主細胞中に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コーディング配列とＴＰＯポリペプチドコーディング配列がトロンビン認識ポリペプチドコーディング配列を介して分断されている、ＴＰＯポリペプチドコーディング配列の５′にＧＳＴポリペプチドコーディング配列を結合して含むＤＮＡを導入する工程、ＧＳＴ−ＴＰＯ発現産物を単離する工程、及びトロンビンで発現ポリペプチドを処理してＧＳＴアミノ酸配列を除去する工程を包含する。これによって得られるＴＰＯポリペプチドは［Ｇｌｙ^-1］構造を有する。以下、本発明を更に詳細に説明する。（Ａ）ラットＴＰＯの精製、ラット精製ＴＰＯの部分アミノ酸配列の分析及びラット精製ＴＰＯの生物学的特性の分析本発明者らは、まずラットCFU-MKの増殖・分化促進活性を有するタンパク質（ラットＴＰＯ）の精製を試みた。本精製では、種々の天然の供給源の選択、更には、クロマトグラフィー担体の選択、分離手段の選択など、精製の組立について数々の試行錯誤を繰り返した。その結果、本発明者らは、Ｘ線、あるいはγ線照射により誘導した血小板減少症ラットの血漿より、後述の〈参考例〉に記載したラットCFU-MKアッセイに基づくＴＰＯ活性を指標として、ＴＰＯ活性を有するタンパク質を精製し、その部分アミノ酸配列を決定した〈実施例１〜２〉。また、その血漿由来ラットＴＰＯの生物学的特性について試験した〈実施例３〉。なお、精製から、精製されたラットＴＰＯの部分アミノ酸配列の決定までの概要は以下の通りである。（ｉ）Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板減少症ラット約1100匹分の血漿を集め、Sephadex G-25クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー（Q-Sepharose FF）、更にレクチンクロマトグラフィー（WGA-Agarose）のステップまで進め、WGA-Agarose吸着ＴＰＯ活性画分を得た。（ii）次に、このWGA-Agarose吸着ＴＰＯ活性画分を色素吸着アフィニティークロマトグラフィー（TSK AF-BLUE 650MH）、疎水相互作用クロマトグラフィー（Phenyl Sepharose 6 FF/LS）、ゲル濾過クロマトグラフィー（Sephacryl S- 200 HR）までの処理を実施した。このSephacryl S-200 HRにおいては、ＴＰＯ活性は４つのピーク（分子量の大きいものから、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４）に分かれたので、ＴＰＯ活性画分Ｆ２とＦ３とをそれぞれ濃縮し、高分子ＴＰＯ標品Ｆ２、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３として、それぞれ個別に次の精製ステップに進めた。（iii）低分子ＴＰＯ標品Ｆ３を分取逆相クロマトグラフィー（YMC-Pack PR OTEIN-RP）、逆相クロマトグラフィー（YMC-Pack CN-AP）、更に逆相クロマトグラフィー（Capcell Pack C1）で分離した。得られたＴＰＯ活性画分を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、電気泳動ゲルからＴＰＯ活性の抽出を行ったところ、非還元下で見かけ上分子量約17000〜19000のバンドにＴＰＯ活性が存在することが確認できた。（iv）そこで、全てのＴＰＯ活性画分を非還元下でＳＤＳゲル電気泳動にかけ、PVDF膜に転写した。次いで、PVDF膜上タンパク質の系統的な限定酵素分解によるペプチド断片化を実施し、ラットＴＰＯタンパク質の部分アミノ酸配列を決定することができた。２つのペプチド断片のアミノ酸配列情報を基にラットＴＰＯの遺伝子クローニングを実施した。（ｖ）一方、Sephacryl S-200 HRからの高分子ＴＰＯ標品Ｆ２についても、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３と同様に精製を進め、最終ステップの逆相クロマトグラフィー（Capcell Pack C1）で得られたＴＰＯ活性画分をＳＤＳゲル電気泳動にかけ、ＴＰＯ活性の抽出を行った。活性を調べてみると、Ｆ３由来のＴＰＯと同じく、非還元下で見かけ上分子量約17000〜22000のバンドにＴＰＯ活性が存在することが確認できた。（Ｂ）ラットＴＰＯ産生細胞の特定化、mRNAの調製及びラットcDNAライブラリーの構築精製したラットＴＰＯは血漿由来であるため、cDNAクローニングのためには、 mRNAの供給源となる臓器あるいは細胞を選抜する必要があった。そこでラット血漿由来ＴＰＯの生化学的性質と生物学的性質に基づいて、種々の臓器、あるいは細胞の培養上清中のＴＰＯ活性をスクリーニングした。その結果、ラット肝臓細胞由来の細胞株であるMcA-RH8994細胞、HTC細胞、H4-II-E細胞の培養上清中、並びにラットの初代肝臓細胞の培養上清中にもラット血漿由来ＴＰＯとほぼ同等のＴＰＯ活性を見いだした〈実施例４〉。一方、発現ベクターｐＥＦ１８Ｓを、２種類の発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ並びにｐＥＦＢＯＳを組み合わせて構築した〈実施例５〉。このベクターの構築によりインサートの組み込みに使用できる多種類のクローニング部位を持つ、発現効率の高いベクターを用いてｃＤＮＡをクローニングすることが容易となった。 cDNAライブラリーの構築には上記の発現ベクターの他にｐＵＣ系やｐＢＲ系のプラスミドベクター、λ系のファージベクター等が主に使用される。本発明者らは、McA-RH8994細胞を培養し、グアニジンチオシアナート溶液を加えてホモジナイズ後、CsCl密度勾配遠心法により全RNAを得た〈実施例６〉。 RNAの調製は熱フェノール法や酸性グアニジンフェノールクロロホルム法等でも行なうことが出来る。この全RNAからオリゴdT固定化ラテックス粒子によりポリ (A)⁺RNAを精製した後、制限酵素NotI切断配列を付加したオリゴdTをプライマーとして逆転写酵素により１本鎖cDNAを合成し、RNase H およびE.coli DNAポリメラーゼＩを用いて、２本鎖cDNAを得た。得られた２本鎖のcDNAにEcoRIリンカーを付加し、これを実施例５で構築したcDNA発現ベクターｐＥＦ１８ＳをNotIとEcoRIで切断したものとつなぎ合わせて、コンピテントな大腸菌DH5株を形質転換させ、cDNAライブラリーを構築した〈実施例７〉。（Ｃ）ＰＣＲ法によるラットＴＰＯcDNA断片の取得（クローニング）ラット血漿より精製したラットＴＰＯの部分アミノ酸配列をもとに、その配列をコードすると考えられるDNA配列を予測し、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）に使用する縮重プライマーを合成した。使用するプライマーは、本発明で用いたプライマー以外の位置のアミノ酸配列に基づくものであってもよい。また、イノシンを使わず縮重度の高いプライマーを用いることも出来る。更に、ラットにおいて使用頻度の高いコドンを使用して縮重度を減らしたプライマーを設計することも出来る（WadaらNucleic Acids Res．、18、2367〜2411、1990 参照）。先に作製したcDNAライブラリー全体よりプラスミドDNAを抽出し、このDNAを鋳型としてＰＣＲを実施したところ約３３０ｂｐのバンドが検出され、ヌクレオチド基配列を決定したところ、ラットＴＰＯの遺伝子の一部をコードするDNA断片（Ａ１断片）であることが分かった〈実施例８〉。（Ｄ）ＰＣＲ法によるラットＴＰＯcDNAのスクリーニング、ラットＴＰＯcDNAのシークエンス及びＴＰＯ活性の確認先に構築したcDNAライブラリーを約１万クローンずつのプールに分け、それらのうち１００プールからプラスミドDNAを抽出した。これらDNAを鋳型とし、Ａ１断片のヌクレオチド配列をもとに新たに合成したプライマーを使用してＰＣＲを行なったところ、１００プール中３プールに特異的と考えられるバンドが検出された。そこで、これらのうち１プールを選び、このプールをさらに約９００クローンずつのサブプールに分け、それらのうち１００プールについて同様のＰＣＲを行なったところ、３サブプールでバンドが検出された。これらのうち１プールを選択し、更に、４０クローンずつのサブプールに分け、最終的には１クローンづつ同様のＰＣＲによる選別を行なった結果、ラットＴＰＯ遺伝子ｃＤＮＡ断片を担持したプラスミドｐＥＦ１８Ｓ‐Ａ２ αを持つクローンの単離に成功した〈実施例９〜１０〉。このｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定したところ、ラット血漿中より精製し部分的に決定したアミノ酸配列をコードしていることが明らかとなり、ラットＴＰＯ遺伝子であると考えられた〈実施例１０〉。上記のようにして得られたクローンよりプラスミドDNAを精製し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションしたところ、その培養上清中にＴＰＯ活性を検出することができた。この結果、得られたｐＥＦ１８Ｓ‐Ａ２αはラットＴＰＯをコードしているcDNAを担持していることが確認できた〈実施例１１〉。（Ｅ）ラット各種組織でのＴＰＯmRNAの検出ラット体内におけるＴＰＯmRNAの発現組織をＰＣＲによって解析し、脳、肝臓、小腸、並びに腎臓において特異的な発現を検出した〈実施例１２〉。（Ｆ）ヒトcDNAライブラリーの構築実施例４および１２の結果より、ヒトＴＰＯｃＤＮＡクローニングのための出発組織として肝臓を選択した。そこで、市販の正常ヒト肝臓由来のmRNAより、cD NAライブラリーを構築した。ベクターにはラットのライブラリーと同様にｐＥＦ１８Ｓを用い、ラットの場合と同じ操作でcDNAを合成し制限酵素NotIとEcoRI部位を利用した方向性を持ったライブラリーとした。大腸菌株ＤＨ５に導入し作製したライブラリーのクローンの数は約１２０万個であった〈実施例１３〉。（Ｇ）ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯcDNA断片の取得（クローニング）ｐＥＦ１８Ｓ‐Ａ２αに担持されたラットＴＰＯをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列をもとに、数種類のＰＣＲ用プライマーを合成した。市販の正常ヒト肝臓由来のmRNAよりcDNAを合成し、これらのプライマーを用いてＰＣＲを実施したところ、６２０ｂｐ前後のバンドが観察された。ヌクレオチド配列を決定したところ、ラットＴＰＯと約８６％の相同性を有するDNA断片であることが明らかとなり、ヒトＴＰＯをコードする遺伝子の一部であると考えられた〈実施例１４〉。（Ｈ）ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯcDNAのスクリーニング、ヒトＴＰＯcDNAのシークエンス及びＴＰＯ活性の確認先に調製したヒトcDNAライブラリーを増幅し、約１０万クローンずつのプールに分割し、９０個のプールからプラスミドを抽出した。これらのDNAを鋳型とし、実施例１４で得られたヒトＴＰＯ断片のヌクレオチド配列を基に新たに合成したプライマーを用いてＰＣＲを行なったところ、３個のプールでバンドが観察された。これらより１個のプールを選択し、５０００個のクローンを１プールとするサブプールに分け、それらのうちの９０プールよりプラスミドDNAを精製した。これらを鋳型として同様のＰＣＲを実施したところ、５個のサブプールでバンドが検出された。そこで、これらより１プールを選び２５０個のクローンを１プールとするサブプールに更に分割し、それらのうちの９０プールよりプラスミドDNAを精製し再度ＰＣＲによる検出を行なったところ、３個のプールでバンドが観察された。そこで、このうち１プールを選び、３０個のクローンを１プールとするサブプールに分割し、それらのうちの９０プールからプラスミドDNAを精製しＰＣＲを実施した結果、３個のプールでバンドが観察された。これらのうち１プールより９０個のコロニーを拾い、プラスミドDNAを調製し、ＰＣＲを実施することで最終的にクローンＨＬ３４を得た〈実施例１５〉。このクローンが持っプラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列を決定したところ、ラットＴＰＯのヌクレオチド配列と約８４％程度の相同性を持つｃＤＮＡを担持していることが明らかとなった〈実施例１６〉。このクローンのプラスミドDNAを精製し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションしたところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検出され、このクローンが持つプラスミドＤＮＡはヒトＴＰＯをコードする遺伝子ｃＤＮＡ断片を担持していることが確認された〈実施例１７〉。しかしながら、このｃＤＮＡ断片は終止コドンが無く、また、ポリＡ尾部様配列を３’端に持っており、これはクローニングの際の人工産物であると考えられた。そこで、ポリＡ尾部様配列直前までのアミノ酸をコードする発現ベクターを構築し、ＣＯＳ１細胞での発現を行なったところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検出された〈実施例１８〉。完全長ｃＤＮＡの構造を解析するためにＰＣＲを利用しヒトＴＰＯ３’末端側のＤＮＡ断片を得た。この断片のヌクレオチド配列を決定したところ、実施例１５で得たクローンＨＬ３４のｃＤＮＡとオーバーラップすることがわかり、オープンリーディングフレームも延び全体で３５３個のアミノ酸からなる蛋白質をコードすることが予想された。すなわちヒトＴＰＯタンパク質は２１個のシグナル配列を含む３５３個のアミノ酸からなることが示唆された〈実施例１９〉。ヒトＴＰＯのcDNAクローニングは、上記のようなクローニング法以外にも、ｐＵＣ系やｐＢＲ系のプラスミドベクター、λ系のファージベクター等を使用して構築したライブラリーを利用し、ラットＴＰＯcDNA断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼイションあるいはプラークハイブリダイゼイションによっても行なうことができる。縮重プローブの設計にあたっては、縮重の度合いを減少させるためにイノシンを使うこともできる。ＴＰＯ活性を特異的に、また感度良く検出できるアッセイ法が利用できる場合には、本発明で用いた様な発現ライブラリーを使用した発現クローニングも行なうことができる。しかしながら、実施例１５で記載するように正常ヒト肝臓においてはヒトＴＰＯをコードするＲＮＡの含量は著しく低いと考えられるため（この実施例から算出される含量は３００万個に１個の割合であった）、合成したオリゴヌクレオチドプローブやラットやヒトＴＰＯのcDNA断片をプローブとして用いるハイブリダイゼイションによるスクリーニング方法では、処理するクローンやプラークの数が膨大なものになり、また、ハイブリダイゼイションの感度や特異性がＰＣＲ法に及ばないため困難を極めることが予想される。実際に本発明者らも実施例１３において作製した正常ヒト肝臓cDNAライブラリー２００万クローンについて、ラットＴＰＯcDNA断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼイションを実施したが、ヒトＴＰＯcDNAクローンを得ることは出来なかった。（Ｉ）ヒト正常肝臓由来ＴＰＯcDNAライブラリーの再構築実施例１５で得られたクローンＨＬ３４は不完全なｃＤＮＡを含むクローンであると考えられたため、完全長のヒトＴＰＯ cDNAを得る目的で、市販の正常ヒト肝臓由来のポリ(A)⁺ＲＮＡを用いてヒトＴＰＯcDNAライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ１）を構築し直した。大腸菌株ＤＨ５に導入し作製したライブラリーのクローンの数は約１００万個であった。〈実施例２０〉（Ｊ）ヒトＴＰＯcDNAのスクリーニング、ヒトＴＰＯcDNAのシークエンス及び発現、並びにＴＰＯ活性の確認実施例１４で得られた部分長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列（配列番号３）、および実施例１９において推定された完全長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１９６）をもとに、ＰＣＲ用プライマーを合成した。実施例２０で構築したcDNAライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ１）を３つのプール（＃１〜３）に分割し、それぞれのプールよりプラスミドＤＮＡを調製し、これらのＤＮＡを鋳型として合成したプライマーを用いてＰＣＲを実施した。＃３のプール由来のＤＮＡを用いた場合に予想される大きさのＤＮＡが増幅されたため、＃３のプールを15000個づつのサブプールに分割し、先の合成プライマーでＰＣＲを実施したところ、９０プール中６プールで予想される大きさのＤＮＡが増幅された。これらより１個のプールを選択し、１０００個のクローンを１プールとするサブプールに分け、プラスミドＤＮＡを調製しＰＣＲを行ったが、ＤＮＡの増幅は観察されなかった。これは、求めるクローンの増殖が他のクローンより遅いためにプラスミドＤＮＡの回収率が悪くなったことが原因と考えられた。そこで、＃３のプールに戻り、ＬＢプレート１枚あたり4100個のコロニーとなるようにクローンをまき、１００枚のプレート、並びにそれぞれのレプリカプレートを作製した。プレートのコロニーから抽出したＤＮＡについて先と同様にＰＣＲを行ったところ、１００プール中１プールでバンドの増幅が観察された。このプールのプレートより２枚のレプリカフィルターを作製し、放射標識プローブ（プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のEcoRＩ／BamHＩ断片）を用いたコロニーハイブリダイゼーションを行った。その結果、陽性シグナルが１個観察されたため、元のプレートよりコロニーを拾い、ＬＢプレートにまき直して得られたコロニー５０個よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣＲを実施することにより、最終的にクローンｐＨＴＦ１を得た。〈実施例２１〉このようにＤＮＡクローンのスクリーニングにおいては、ハイブリダイゼイション、ＰＣＲ、発現クローニング等が主に用いられるが、これらを適宜組み合わせてスクリーニングの効率、感度を上昇させる、あるいは、労力を低減させることができる。ここで得られたクローンｐＨＴＦ１のヌクレオチド配列を決定したところ、オープンリーディングフレームが存在し、このオープンリーディングフレームにコードされると考えられるタンパク質のアミノ酸配列は、ヒトＴＰＯの推定アミノ酸配列（配列番号６）と完全に一致した。ヌクレオチド配列は推定されたもの（配列番号１９６）とは３箇所で異なっていたが、アミノ酸の変換は起こさなかった。これによりヒトＴＰＯタンパク質は２１残基のシグナル配列を含む３５３個のアミノ酸からなることが確認できた。上記のようにして得られたクローンｐＨＴＦ１よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションしたところ、その培養上清中にＴＰＯ活性を検出することができた。〈実施例２３〉（Ｋ）プラークハイブリダイゼーションによるヒトＴＰＯ染色体DNAのスクリーニング、ヒトＴＰＯ染色体DNAのシークエンス及び発現、並びにＴＰＯ活性の確認東北大学遺伝子実験施設山本徳男教授より頂いたヒトゲノミックライブラリーより、NZYMプレート１枚あたり３万個となるようにファージをまき、１８枚のプレート、並びにそれぞれのプレートから２枚のレプリカフィルターを作製した。クローンｐＨＴＦ１に含まれるヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片（配列番号７の塩基配列番号178-1025）をＰＣＲで増幅後精製し、³²Ｐ標識したものをプローブとして用いて、プラークハイブリダイゼーションを行った。その結果、１３個の陽性シグナルが検出されたため、それぞれ元のプレートよりプラークを拾い、NZYMプレート１枚あたり1000プラークとなるようにまき直して、それぞれのプレートから作製した２枚のレプリカフィルターについて前記と同様の条件下で再度プラークハイブリダイゼーションを実施した。その結果、１３組すべてのフィルターで陽性シグナルが検出されたため、プラークを単離し、ファージＤＮＡを調製し、１３クローンそれぞれについてヒトＴＰＯｃＤＮＡのコーディング領域を含んでいるかどうかをＰＣＲによりチェックした。１３クローン中５クローンは、ｃＤＮＡから予想されるコーディング領域を全て含んでいると考えられたため、１クローン（λＨＧＴ１）を選択し、Southern blot解析（用いたプローブは先と同じ）を行った。制限酵素HindIIIで消化した場合に約１０ｋｂｐの単一バンドが観察されたので、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡを制限酵素HindIIIで消化後アガロースゲルで泳動し、１０ｋｂｐのバンドを切り出して精製し、クローニングベクターｐＵＣ１３にサブクローニングし、最終的にクローンｐＨＧＴ１を得た。〈実施例２４〉このクローンのヌクレオチド配列を決定したところ、担持されている染色体ＤＮＡは、実施例１９において推定されたヒトＴＰＯタンパク質のコーディング領域をすべて含み、その領域に関してはヌクレオチド配列はその推定されたヌクレオチド配列と完全に一致した（配列番号１９６）。また、エクソンに相当する領域は４つのイントロンで分断されており、実施例２１で取得したクローンｐＨＴＦ１に担持されている完全長のヒトＴＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列とは異なることが判明した（配列番号７）。最終的に選択された５クローンのうち残りの４クローンについてもヌクレオチド配列の決定を行ったところ、２箇所はクローンｐＨＧＴ１と一致し、残りの２クローンがｐＨＧＴ１と一致するがクローンｐＨＴＦ１で観察されるように３′ 非コーディング領域内に異なる１個のヌクレオチドを有していた〈実施例２５〉上記のようにして得られたプラスミドクローンｐＨＧＴ１のEcoRＩ断片を発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにつなぎ、ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＥＦＨＧＴＥを調製し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションしたところ、その培養上清中にＴＰＯ活性を検出することができた。〈実施例２６〉（Ｌ）ヒトＴＰＯ欠失誘導体の作製、ＣＯＳ１細胞での発現及びＴＰＯ活性確認実施例１８並びに２２の結果よりヒトＴＰＯタンパク質はそのカルボキシ末端側の除去後でさえも生物活性を示すことが明らかになった。そこでヒトＴＰＯタンパク質の活性発現に必要な領域を解析する目的で欠失誘導体実験を実施した。実施例１８で得たクローンｐＨＴ１−２３１のプラスミドＤＮＡを鋳型とし、合成したプライマーでＰＣＲを行うことにより一連の発現プラスミドを調製した。ヒトＴＰＯタンパク質のＣ末端側を欠失させた発現プラスミド、即ち、アミノ酸１−２１１位、１−１９１位、１−１７１位、および１−１６３位をコードする欠失誘導体のプラスミドＤＮＡを得た。得られたそれぞれのプラスミドＤＮＡをＣＯＳ１細胞へトランスフェクションしたところ、いずれの培養上清中においてもＴＰＯ活性が検出された。〈実施例２７〉ＴＰＯ活性を担う領域をさらに詳細に検討するために、Ｃ末側より１５１番目のアミノ酸まで順次欠失させた誘導体並びに、Ｎ末側６、７、１２番目のアミノ酸まで欠失させた誘導体を作製し、ＣＯＳ１細胞で発現させ活性を検出したところ、Ｎ末側では７番目のアミノ酸まで欠失させた場合に、Ｃ末側では１５１番目のアミノ酸まで欠失させた場合に活性が検出できなくなった。〈実施例２８、２９〉このように得られたｃＤＮＡをもとに誘導体（欠失、置換、挿入、付加等）を作製することにより、本来のタンパク質の活性を担う改変型タンパク質を得ることができる。この場合に用いる手法としては、ＰＣＲ法、部位特異的突然変異誘発法、化学合成法等がある。（Ｍ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣＨＯ細胞での発現及びＴＰＯの精製配列番号６に示されるヒトＴＰＯの推定アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを動物細胞中で発現可能な発現プラスミド、ｐＨＴＰ１を構築した。〈実施例３０〉このｐＨＴＰ１中のＴＰＯｃＤＮＡ領域を用い、ＣＨＯ細胞発現用ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１を構築した。〈実施例３１〉このベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションし選択を行った結果、染色体中にヒトＴＰＯを保有する発現ベクターが組み込まれた形質転換細胞が得られた。〈実施例３２〉実施例３２において、ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥＦ２０２‐ｈＴＰＯ‐ Ｐ１をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られたヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株（CHO28-30細胞、２５nM MTX耐性）を大量培養した〈実施例５５〉。その培養上清１００ＬからヒトＴＰＯを精製した。〈実施例５６〉また、別法により実施例５５で得られた培養上清からＴＰＯを精製した。〈実施例５７〉（Ｎ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＸ６３．６．５．３．細胞での発現及び活性確認実施例３０で調製されたプラスミド、ｐＢＬＴＥＮのＴＰＯｃＤＮＡ領域を用い、Ｘ６３．６．５．３細胞用発現ベクター、ＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１を構築した。〈実施例３３〉このベクターをＸ６３．６．５．３細胞にトランスフェクションしたところ、染色体中にヒトＴＰＯをコードする発現ベクターを組み込んだ、形質転換細胞が得られた。この細胞を培養したところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。〈実施例３４〉（Ｏ）ヒトＴＰＯのＣＯＳ１細胞での大量発現並びにその精製、分子量測定及び生物学的特性実施例３０で調製された発現ベクター、ｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションし発現させた培養上清を大量（合計約４０１）に調製した。〈実施例３５〉実施例３５の方法で調製された発現ベクター、ｐＨＴＰ１由来ＴＰＯを含むＣＯＳ１細胞無血清培養上清約７１から、ＴＰＯの精製を行った。疎水相互作用クロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、ＷＧＡカラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーの各段階を経て、高活性のＴＰＯを得ることができた。〈実施例３６〉このようにＣＯＳ１細胞培養上清より部分精製されたＴＰＯについて、分子量測定、および生物学的特性の分析を行った。〈実施例３７、３８〉（Ｐ）ヒトＴＰＯの大腸菌における発現グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼとヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１７４位）の融合タンパク質（「ＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）」）の大腸菌発現用ベクター、ｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（1-174）を構築した。この際のヒトＴＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列の一部（５’側およそ半分の領域）は大腸菌優先コドンに変換した。〈実施例３９〉ＧＳＴ−ＴＰ０（1-174）を大腸菌で発現させ、菌体を破砕後、沈殿画分に含まれるＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）の可溶化を行った。次に、ＴＰＯの巻き戻し（リフォールディング）条件の検討、精製条件の検討（グルタチオンアフィニティーカラム、陽イオン交換カラム等）、トロンビン消化によるＧＳＴ蛋白質領域の切断などの段階を組み合わせた結果、設計通りのＴＰＯのアミノ酸配列を含む蛋白質が部分精製できた。この蛋白質はラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にてＴＰＯ活性を有することが確認できた。〈実施例４０、４１〉また、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３位）の１位のＳｅｒ残基をＡｌａ残基に、かつ３位のＡｌａ残基をＶａｌ残基に変換し、さらに−１位にＬｙｓ残基、 −２位にＭｅｔ残基を付加した変異型ヒトＴＰＯタンパク質（「ｈ６Ｔ（1-163 ）」と称す）の大腸菌発現用ベクター、ｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（1- 163）を構築した。このベクターが担持するヒトＴＰＯｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸（1-163）のヌクレオチド配列は全て大腸菌での優先コドンに変換した。〈実施例４２〉ｈ６Ｔ（1-163）を大腸菌で発現させ、菌体を破砕後、沈殿画分に含まれるｈ６Ｔ（1-163）の可溶化を検討、リフォールディング条件の検討を実施した結果、設計通りのＴＰＯのアミノ酸配列を含むタンパク質が部分精製できた。このタンパク質はラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にてＴＰＯ活性を有することが確認できた。〈実施例４３、４４〉さらに、ヒトＴＰＯタンパク質（アミノ酸１−１６３）の−１位にＬｙｓ残基、−２位にＭｅｔ残基を付加した変異型ヒトＴＰＯタンパク質（「ｈＭＫＴ（1- 163）」と称す）の大腸菌発現用ベクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（1-163）を構築した。ｈＭＫＴ（1-163）を実施例４３と同様に大腸菌で発現させ、得られた発現タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＰＶＤＦ膜に転写し、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行った結果、設計通りのアミノ酸配列を含むことが確認できた。〈実施例５２〉また、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−３３２位）の−１位にＬｙｓ残基、−２位にＭｅｔ残基を付加した変異型ヒトＴＰＯタンパク質（「ｈＭＫＴ（1-332）」と称す）の大腸菌発現用ベクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（1-332）を構築した。ｈＭＫＴ（1-332）を実施例４２と同様に大腸菌で発現させ、後述の実施例４５で作製した抗ヒトＴＰＯペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティングにより発現を確認した。〈実施例６６〉（Ｑ）抗ＴＰＯペプチド抗体の作製及び抗ＴＰＯペプチド抗体カラムの調製実施例１０にて判明されているラットＴＰＯのアミノ酸配列のうち、３箇所の部分領域に相当するペプチドを合成し、ウサギポリクローナル抗ＴＰＯペプチド抗体を作製した。これらの抗体がラット及びヒトＴＰＯを認識することを確認した。また、配列番号６（もしくは配列番号７）に示されるヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、６箇所の部分領域に相当するペプチドを合成し、ウサギポリクロナール抗ＴＰＯペプチド抗体を作製した。これらの抗体がヒトＴＰＯを認識することを確認した。〈実施例４５〉ＴＰＯに対して結合親和性を持つような分子、即ち、抗ＴＰＯ抗体、ＴＰＯ受容体などをカラム担体に結合させ、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによりＴＰＯを精製する方法が考えられる。そこでまず実施例４５で得られた抗ＴＰＯペプチド抗体をゲル担体に結合させた抗ＴＰＯ抗体カラムを調製した。〈実施例４６〉（Ｒ）ＣＯＳ１細胞で発現させたヒトＴＰＯの抗ＴＰＯペプチド抗体カラムを用いた精製並びにその分子量及び生物学的特性発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションした培養上清を材料として部分精製ＴＰＯを得て、これを抗ＴＰＯ抗体カラムにかけた。吸着画分にＴＰＯ活性を有することが確認できたので、これをさらに逆相カラムクロマトグラフィーにかけ精製し、その分子量と生物学的活性を調べた。〈実施例４７〉（Ｓ）ＣＯＳ１細胞で発現させたヒトＴＰＯの部分精製標品の活性確認実施例３６で精製されたＴＰＯ活性画分、すなわち、発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた培養上清由来で、Capcell Pak C1 300Aカラムの段階まで精製されたＴＰＯサンプルの生物学的活性を調べた結果、生体内において血小板増加作用を有することがわかった。〈実施例４８〉また、発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた、培養上清３３Ｌを出発材料にし、陽イオン交換カラムで得られた粗精製ＴＰＯ画分の生物学的活性を調べた結果、生体内において血小板増加作用を有することがわかった。〈実施例４９〉（Ｔ）ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＨＯ細胞での発現及び活性確認ＣＨＯ細胞でのヒトＴＰＯ染色体発現ベクター、ｐＤＥＦ２０２−ｇｈＴＰＯを構築した。〈実施例５０〉このベクターをＣＨＯ細胞に導入したところ、染色体中にヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡを担持する発現ベクターが組み込まれた形質転換細胞が得られた。この細胞を培養したところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。〈実施例５１〉（Ｕ）大腸菌で発現させた変異型ヒトＴＰＯの部分精製及び活性確認大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯヌクレオチド配列をコードするクローンpCFM53 6/h6T(1-163)由来変異型ヒトＴＰＯについて、塩酸グアニジンとグルタチオンを用いたリフォールディング操作を行い、ここで得たｈ６Ｔ（1-163）が、生体内において血小板増加作用を有することを確認した。〈実施例５３〉大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンpCFM536/h6T(1- 163)由来変異型ヒトＴＰＯについて、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウムと硫酸銅を用いたリフォールディング操作を行い、さらに陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製したｈ６Ｔ（1-163）が、生体内において血小板増加作用を有することを確認した。〈実施例５４〉また、更に別法を用いて、変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（1-163）のリフォールディング及び精製を行った。〈実施例６０、６１〉（Ｖ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡの昆虫細胞での発現及びＴＰＯ活性確認ヒトＴＰＯの昆虫細胞での発現用組換えウィルスを作製し〈実施例５８〉、昆虫細胞Ｓｆ２１で発現させ、培養上清中の活性を確認した。〈実施例５９〉（Ｗ）ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３位）のＣＨＯ細胞での発現及び精製配列番号６に示したヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、１−１６３位のアミノ酸配列を有するヒトＴＰＯタンパク質（「hTPO１６３」と称す）のＣＨＯ細胞発現用ベクターpDEF２０２-hTPO１６３を構築した。発現ベクターp DEF２０２-hTPO１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られたhTPO１６３産生ＣＨＯ細胞株を大量培養し、その培養上清からhTPO１６３を精製した。〈実施例６２〜６５〉（Ｘ）ヒトＴＰＯ誘導体の作成ヒトＴＰＯの２５位のＡｒｇ残基がＡｓｎ残基に、２３１位のＧｌｕ残基がＬｙｓ残基にそれぞれ置換された誘導体（「Ｎ３／ＴＰＯ」と称す）、および３３位のＨｉｓ残基がＴｈｒ残基に置換された誘導体（「Ｏ９／ＴＰＯ」と称す）をコードするプラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。各誘導体をコードするプラスミドをＣＯＳ７細胞中にトランスフェクトした後、培養した。培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。〈実施例６７〉ｈ６Ｔ（1-163）のアミノ酸の１つを他のアミノ酸で置換した誘導体を、大腸菌の発現系を用いて調製し、各誘導体についてＴＰＯ活性を見出した。〈実施例９４〉（Ｙ）ヒトＴＰＯの挿入又は欠失誘導体の調製 hTPO１６３にアミノ酸を挿入した誘導体またはhTPO１６３のアミノ酸の一部を欠失させた誘導体をコードするプラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。〈実施例６８〉なお、本発明において用いたＴＰＯ活性の測定方法（in vitroアッセイ系）を〈参考例〉として以下に説明する。（ｚ）抗ヒトＴＰＯ抗体の調製と精製ヒトＴＰＯのペプチド断片を用いてポリクローナル抗体を調製し〈実施例６９〉、次いでウェスターンブロット分析〈実施例７０〉及び抗ＴＰＯ抗体アフィニティカラムの作製〈実施例７１〉に使用した。（AA）ヒトＴＰＯのｉｎｖｉｖｏ活性精製ヒトＴＰＯを血小板減少症を誘導されたマウスに投与し、コントロール群に対して血小板数の変化をモニターした。〈実施例７２〉〜〈実施例７９〉血小板減少症の治療に有用な医薬組成物も記載される。〈実施例８０〉〜〈実施例８９〉（BB）ＭＬＰ受容体結合作用に基づくＴＰＯ活性Ｍｐｌ受容体との特異的結合相互作用に基づいてＴＰＯ活性を定義するアッセイ法が提供される。〈実施例９０〉〜〈実施例９３〉参考例Ａ．ラット巨核球前駆細胞アッセイ（ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ）系（液体培養系）巨核球は、エネルギー依存性に細胞外のセロトニン（serotonin）を取り込んで、濃染顆粒に蓄積する（Fedorko、Lab．Invest.、36巻、310-320頁、（1977））。この現象は、少なくともCFU-MKと認識可能な巨核球の間に位置する小型で単核のアセチルコリン陽性細胞においてすでに認められ（BrickerとZuckerman、Ex p．Hematol．、12巻、672-675頁、（1984））、その後、巨核球サイズの増大に応じてセロトニンの取り込み量が増加する（SchickとWeinstein、J．Lab．Clin ．Med.、98巻、607-615頁、（1981））。しかも、骨髄細胞の中では巨核球系細胞だけに特異的である（SchickとWeinstein、J．Lab．Clin．Med.、98巻、607-6 15頁、（1981））ことが知られている。本アッセイ系は、高度に濃縮されたラットCFU-MK（GpIIb/IIIa⁺ CFU-MK画分；後述）を被検検体の存在下に培養し、ＣＦＵ−ＭＫから成長した巨核球への¹⁴C-セロトニン（¹⁴C-5-hydroxy tryptamine creatinine sulphate；¹⁴ C-5HT））の取り込みを測定法する。本アッセイ系の利点は、用いる細胞に含まれるCFU-MKの割合が極めて高く（後述の「アッセイ方法」参照）、これに反して混入するＴＰＯの標的細胞以外の細胞が少ないので、混入細胞による間接的影響（例えば、本因子以外の何らかの物質が混入細胞に作用してMeg-CSF活性を誘導させたり、混入細胞が本因子と協同作用する何らかの因子を産生したりするなど）を軽減することができ、また、１つのウエルの中で培養する全細胞数が少なくてすむために、比較的長い期間良好な培養環境を維持することができることにある。さらに、培養期間中に活性標品によってCFU-MKから生成した数多くのサイズの大きい成熟巨核球を位相差顕微鏡下に観察することができ、活性の有無や程度を定性的に判定できることも利点である。この定性判定の結果は¹⁴C-セロトニンの取り込みによる定量結果と良く対応している。従って、定性判定を併用することにより、定量結果の信頼性を高めることができる。アッセイ方法まず、アッセイに用いる高度に濃縮されたラットCFU-MK（「GpIIb/IIIa⁺CFU-M K画分」）を既に報告している方法（Miyazakiら、Exp.Hematol.、20巻、855〜86 1頁、（1992年））を若干改良した方法に従って調製した。その概略は次のとおりである。 Wistar系ラット（♂、8〜12週齢）の大腿骨、および脛骨を摘出し、常法に従い、骨髄細胞浮遊液を調製する。骨髄細胞浮遊液の調製には、LevineとFedorko が報告した巨核球分離用媒体（LevineとFedorko、Blood、50巻、713-725頁、（1 977））を若干改良した媒体（13.6mMクエン酸三ナトリウム、11.1mMグルコース、１mMアデノシン、１mMテオフィリン、10mM HEPES（pH 7.25）、0.5%ウシ血清アルブミン（以下、BSAと略す）（Path-O-Cyte 4；生化学工業）、およびCa²⁺と Mg²⁺を含まないHanks平衡塩類溶液からなる溶液：以下、HATCH溶液と略す）を用いる。骨髄細胞浮遊液を、Percoll原液（Pharmacia社製）をHATCH溶液で希釈して調製したPercoll不連続密度勾配溶液（密度；1.050g/ml／1.063g/ml／1.082g/ ml）の上に重層し、20℃にて、400×gで20分間遠心する。遠心後、密度1.063g/m l と1.082g/mlの界面に集まった細胞を回収する。細胞を洗滌後、10%ウシ胎仔血清（以下FCSと略す）を含むIscove改変Dulbecco培養液（以下IMDM培養液と略す）で浮遊させ、直径100mmの組織培養用プラスティックディッシュに入れて、５%炭酸ガス培養器中にて37℃で１時間培養する。培養後、非付着性細胞画分を回収し、再び直径100mmのプラスティックディッシュに入れ、さらに37℃で１時間培養した後、非付着性細胞画分を集める。回収した細胞をHATCH溶液に再浮遊させ、予めマウスモノクローナル抗ラット血小板GpIIb/IIIa抗体であるP55抗体（Miyaz akiら、Thromb．Res.、59巻、941-953頁、（1990））を吸着させておいた細菌検査用100mmペトリディッシュ（Falcon1005；Becton-Dickinson社製）に入れ、室温で１時間静置する。その後、非吸着細胞をHATCH溶液で十分に洗滌、除去した後、固相化P55抗体に吸着した細胞をピペッティングにてはがし、回収する。通常、ラット１匹から３〜４×10⁵個の細胞が得られる。得られた細胞画分にはラットCFU-MKが高度に濃縮されており（以下、「GpIIb/IIIa⁺CFU-MK画分」と言う）、後述するコロニーアッセイ系における飽和濃度のラットIL-3存在下の検定により通常５〜10%程度のCFU-MKが含まれることが分かっている。なお、上記P55抗体を産生するハイブリドーマ（ｐ55細胞）は、１９９４年２月１４日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４５６３として寄託されている。次に、得られたGpIIb/IIIa⁺CFU-MK画分を10%FCSを含むIMDM培養液で再浮遊させ、組織培養用96ウエル平底プレートへ１ウエル当たり10⁴個の細胞が入るように分配し、さらにIMDM培養液に対して十分に透析した標準品（後に詳述する）や、被検検体を加え、最終培養液量を200μｌ／ウエルにする。プレートを炭酸ガス培養器に入れ、37℃で４日間培養する。４日目の培養終了３時間前に１ウエル当たり0.1μCi（3.7KBq）の¹⁴C-セロトニンを添加し、引き続き37℃で培養する。培養終了後、プレートを1000rpmにて、３分間遠心し、上清を吸引除去する。続いて、0.05%EDTAを含むPBSを１ウエル当たり200μｌ加えて遠心し、上清を吸引除去し、細胞を洗滌する。この洗滌操作をもう一度繰り返す。得られた細胞ペレットへ２%Triton X-100を１ウエル当たり200μｌ加え、プレートをプレートミキサーで５〜10分程度振蕩し、細胞を十分に溶解する。得られた細胞溶解液のうちの150μｌを市販のカップ状の固体シンチレーター（Ready Cap；Beckman社製）の中へ移し、一晩50℃の乾燥器中に静置して、乾固させる。翌日、Ready Capをガラスバイアルに入れ、液体シンチレーションカウンターにて¹⁴Cの放射活性を測定する。なお、上述の細胞溶解液中のアセチルコリンエステラーゼ活性をIshibashiとB ursteinの方法（IshibashiとBurstein、Blood、67巻、1512-1514頁、（1986））に従って測定しても、¹⁴C-セロトニンの取り込みによる定量結果と極めて類似した結果が得られる。標準品まず、標準品の作製に用いる血小板減少症ラット血漿を以下の方法で調製した。７〜８週齢のWistar系正常ラット（♂）へ、前述したP55抗体を１回の投与量を0.5mgとして、約24時間間隔で２回、静脈注射し、２回目の投与の約24時間後の血小板減少期にエーテル麻酔下に開腹し、予め抗凝固剤として１mlの3.8%（v/ v）クエン酸三ナトリウム溶液を吸い上げておいた10ml用注射筒を用いて腹大動脈から採血した。血液をプラスティック製の遠心チューブに移し、1200×gで、1 0分間遠心し、血漿画分を回収した。この血漿画分を再度1200×gで、10分間遠心し、遠心後、細胞や血小板などからなるペレットを吸い上げないように十分に気をつけながら血漿画分を回収し、プールした（以下、このようにして得られた血漿を「ＴＲＰ」と言う）。続いて、ＴＲＰから実施例１に記載する方法に従って調製したCa処理ＴＲＰ（標準品 C）、WGA-Agaroseカラム活性画分（標準品W）、あるいはPhenyl Sepharose 6 FF /LSカラム活性画分（標準品P）を、十分量のIMDM培養液に対して徹底的に透析し、活性検定用の標準品とした。なお、実施例１に示したラットＴＰＯ精製過程においては、初期は標準品Cを用いたが、途中から標準品W、さらにその後は標準品Pを用いた。恣意的に標準品 Cの活性を１と定義し、それを基に標準品Wおよび標準品Pの相対活性を求めた。被検検体の相対活性の求め方は、標準品と被検検体との用量反応曲線を描き、被検検体の活性が標準品Cの活性のｎ倍であったとき、その検体の相対活性をｎとした。Ｂ．コロニーアッセイ系骨髄細胞を半固型の培養液中で被検検体の存在下に培養し、CFU-MKが増殖・分化して形成される巨核球コロニーの数を算定することによりMeg-CSF活性を測定するアッセイ法である。アッセイ法（ａ）ラット非分離骨髄細胞などを用いる場合ラット非分離骨髄細胞、前記Ａ．のGpIIb/IIIa⁺CFU-MKの分離・濃縮操作の各段階で得られる細胞、あるいはGpIIb/IIIa⁺CFU-MK画分、10%FCS、２mMグルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、50μM 2-メルカプトエタノール、0.3%の寒天（ AGAR NOBLE、DIFCO社製）を含む最終液量１mlのIMDM培養液を直径35mmの組織培養用プラスチックディッシュに入れて室温で固化させた後、炭酸ガス培養器中にて37℃で培養する。通常、１つのディッシュ当たりのまき込み細胞数を、非分離骨髄細胞、Percoll遠心分離段階およびプラスティックディッシュ付着性細胞除去段階の細胞、およびGpIIb/IIIa⁺CFU-MK画分で、それぞれ、２〜４×10⁵、２〜５×10⁴、0.5〜２×10³個とする。６〜７日目に寒天ゲルをディッシュから取り出してスライドガラス（76mm×52mm）に受け、孔径50μmのナイロンメッシュ、続いて濾紙をのせて水分を吸収し、それらを除いてから室温で十分に乾燥させる。50℃のホットプレート上で５分間熱固定した後、Jacksonの方法（Jackson、Bl ood、42巻、413-421頁、（1973））に従って調製したアセチルコリンエステラーゼ染色液に２〜４時間浸し、巨核球が十分に染色されているのを確認してから取りだして水洗し、乾燥後 Harrisヘマトキシリン液にて30秒間、後染色を施し、水洗、風乾させる。アセチルコリンエステラーゼ陽性の巨核球３個以上から成る集塊を一つのコロニーとして巨核球コロニー数を算定する。（ｂ）マウスの非分離骨髄細胞を用いる場合１つのディッシュ当たりのまき込み細胞数を２〜４×10⁵個として、上記（ａ）と同様の方法で行なうことができる。（ｃ）ヒト骨髄細胞やヒト臍帯血細胞を用いる場合ヒト骨髄細胞やヒト臍帯血細胞をそのまま用いることもできるが、以下のようにそれらから濃縮したCFU-MK画分を用いることができる。まず骨髄液、あるいは臍帯血をLymphoprep（第一化学社製）上に重層し、遠心後、界面に集まった白血球画分を回収する。この細胞画分から、ビオチン化したヒトの細胞表面抗原（CD2、CD11c、およびCD19）に対するビオチン化したモノクローナル抗体が結合する細胞を、アビジンを結合させた磁気ビーズを用いて除去する。この磁気ビーズ法で除去できる細胞は、主にB 細胞、T細胞、マクロファージ、および一部の顆粒球である。残った細胞を、FIT C標識された抗CD34抗体、およびPE標識された抗HLA-DR抗体で染色し、続いてセルソーター（例えば、ELITE；COULTER社製）を用いて、CD34陽性、かつHLA-DR陽性の細胞画分を回収する。この画分にCFU-MKが濃縮されている（CD34⁺DR⁺CFU-MK 画分と略す）。ヒトのコロニーアッセイは、上記のラットの骨髄細胞を用いたコロニーアッセイとほぼ同様の方法で行なうが、１つのプラスティックディッシュ当たりのCD34⁺DR⁺CFU-MK画分のまき込み数を３〜５×10³個とし、10%FCSの代わりに12.5%ヒトAB血漿と12.5%FCSの混合物を用いる。また、巨核球コロニーを形成させるまでの培養期間は12日間から14日間である。ヒト巨核球の検出には、巨核球の表面抗原であるヒトGpIIb/IIIaに対するマウスモノクローナル抗体を用いたアルカリフォスファターゼ‐抗アルカリフオスファターゼ抗体法で巨核球を免疫染色し（例えば、Teramuraら、Exp．Hematol．16巻、843-848頁、（1988））、３個以上の巨核球からなるコロニーを巨核球コロニーとして算定する。Ｃ．ヒト巨核芽球性細胞株を用いたアッセイ系（Ｍ−０７ｅアッセイ）ヒト巨核芽球性細胞株であるM-07e細胞は、GM-CSF、IL-3、SCF、IL-2などに応答して増殖する細胞株であることが知られているが（Avanziら、J．Cell．Physi ol．、145巻、458-464頁、（1990）、Kissら、Leukemia、７巻、）、ＴＰＯにも応答することが判明し、ラットCFU-MKアッセイ系の代替アッセイ法として使うことができる。アッセイ法 GM-CSF存在下に継代培養されたM-07e細胞を回収し、十分に洗滌後、10%FCSを含むIMDM培養液に再浮遊させる。組織培養用96ウエル平底プレートへ１ウエル当たりの細胞数が10⁴個になるようにM-07e細胞を入れ、さらに標準品、および被検検体を加えて、最終液量を200μl/ウエルにする。プレートを５%炭酸ガス培養器に入れ、37℃で、３日間培養する。３日目の培養終了４時間前に１μCi（37 KBq ）／ウエルの³H-thymidineを添加し、培養終了後、セルハーベスターで細胞をガラス繊維フィルター上に集め、³Ｈの放射活性を液体シンチレーションカウンター（例えば、ベータプレート；Pharmacia社製）にて測定する。Ｄ．マウスプロＢ細胞株を用いたアッセイ系（Ba/F3アッセイ）マウスプロＢ細胞株Ba/F3細胞は、IL-3やIL-4などに応答して増殖する細胞株であることが知られている（Palaciosら、Cell、４１巻、７２７−７３４頁）。その亜株であるBF-TE22細胞はIL-3やIL-4ばかりでなくＴＰＯに応答し、細胞増殖する事が判明し、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイやヒト巨核芽球性細胞株を用いたアッセイ（Ｍ−０７ｅアッセイ）の代替アッセイ法として用いることができる。このアッセイ系の概要は以下の通りである。まず、１ng/mlのマウスIL-3存在下に継代培養しているBF-TE22細胞を回収し、イスコフ改変DME培地（IMDM；GIBC O社）で３回洗浄したのちに、１０％FCSを含むIMDM培地に再懸濁させる。次に、組織培養用９６ウエル平底プレートに１ウエルあたり細胞数が１×１０⁴個になるように細胞を接種し、さらにＴＰＯ標準品あるいは被検検体を加えて、最終液量を２００ml／ウエルとなるようにし、プレートを５％炭酸ガス培養器中で２〜３日間培養する。２または３日目の培養終了４時間前に１μCi（３７KBq）／ウエルの³H-チミジンを添加し、さらに培養を継続する。培養終了後、セルハーベスターを用いて細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、細胞に取り込まれた³Hの放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定する。本アッセイ系ではＴＰＯ活性を含まない被検検体では、細胞はほぼ死滅し³H-チミジンをほとんど取り込まないのに対し、ＴＰＯ活性を含む被検検体では、細胞はＴＰＯ濃度依存的に活発な増殖を示し³H-チミジンの取り込みが認められる。また、本アッセイは、Ｍ−０７ｅアッセイやＣＦＵ−ＭＫアッセイとパラレルな結果を示す。以下、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。〈実施例１−１〉抗血小板抗体投与による血小板減少症ラットの血漿からのラットＴＰＯ精製抗血小板抗体投与による血小板減少症ラットの血漿の調製前述の〈参考例〉Ａ．ラット巨核球前駆細胞（CFU-MK）アッセイ系に記載の方法でラット約１０００匹分のＴＲＰを調製し、精製の供給源とした。ＴＲＰからのラットＴＰＯの精製当初、ＴＲＰ中のＴＰＯ含有量は多くとも３００万分の１程度であろうとの推定に基づき、ラット約1000匹分のＴＲＰを材料に精製を進めた結果、１pmole弱のラットＴＰＯの部分精製標品を得た。次にこの標品の部分アミノ酸配列の分析を試行し、３種の部分アミノ酸配列の結果を得た。これらは肝臓でつくられるセリンプロテアーゼインヒビター（ＳＰＩ）のアミノ酸配列と一致しているか、類似したものであった。従って、ＴＰＯがセリンプロテアーゼインヒビターと類似した構造をもつものであるという可能性、及びＴＰＯ以外の混入タンパク質由来の配列である可能性のいずれについても否定はできなかった。これらの不確定な配列をもとにラットｃＤＮＡライブラリーからのＴＰＯ遺伝子クローニングを実施したが、結局、候補遺伝子を得ることはできなかった。これは、分析した標品の純度と量に不足があったためと考え、あらためて鋭意研究を重ねることとなった。アミノ酸配列分析のために必要な最終精製標品を得るため、次の〈実施例１−２〉に述べる精製を行った。尚、特筆すべきことは、本〈実施例１−２〉による結果より、ＴＲＰあるいはＸＲＰ（後述）に存在するＴＰＯ量は、驚くべきことに全血漿蛋白質の１億分の１から１０億分の１と推定され、これを精製することが通常は極めて困難であるほど、微量の含有量であることが判明した。実施例１−２Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板減少症ラットの血漿からのラットＴＰＯの精製Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板減少症ラットの血漿の調製亜致死線量（６〜７Gy）のＸ線、あるいはγ線を７〜８週齢のWistar系正常ラット（♂）へ全身照射し、血小板減少期の14日目に採血し、前述のＴＲＰと同様の操作で血漿画分を調製した（以下、この血漿を「ＸＲＰ」と言う。）。ここでは、合計してラット約1100匹分のXRP（約８Ｌ）を精製の供給源とした。ＸＲＰからのラットＴＰＯの精製ラット約1100匹分の血漿の総蛋白質量は493000mgにも達するため、一度に処理することができなかった。そこで、以下に述べる精製ステップのうち、（１）〜（４）では約100匹ずつ11のロットに分けて実施した。次いで（５）〜（７）では６つのバッチに分けて実施した。（８）以降は約1100匹分から粗精製されたものをまとめて実施した。このうち、あるひとつのロット（ＸＷ９）、バッチ（ＸＢ６）における精製例を代表として説明のために挙げ、併せて精製の各ステップについて述べる。尚、精製の全ステップに於いて、ＴＰＯ活性は前述の〈参考例〉に記載したラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系を用いて測定した。逆相クロマトグラフィー及び界面活性剤の存在下でのSuperdex 75pgゲルろ過を室温で実施した以外は、特に記載しない限り４℃で精製を行った。また、蛋白質の定量は、クーマジー色素結合法（PIERCE社製試薬、カタログ番号23236Ｘ）、または、ビシンコニン酸法（PIERCE社製試薬、カタログ番号23225）を用いて実施した。精製の概要を、表１に示した。（１）ラット血漿の場合カルシウム処理・遠心処理・蛋白質分解酵素阻害剤処理ロット番号ＸＷ９の場合 −80℃で保存した約１００匹分のＸＲＰ（742ml，蛋白濃度54.8mg/ml，総蛋白質量40686mg）を解凍し、ポリプロピレン製遠心チューブ（ナルゲン社製）に移した。これに各々最終濃度100mMになるように塩化カルシウム粉末を加え、４℃ で一晩静置した。次に8000RPMで60分遠心後、上清を回収した。ＴＰＯ活性を含むこの上清（742ml，蛋白濃度54.9mg/ml，総蛋白質量40740mg）に、最終濃度１m Mの蛋白質分解酵素阻害剤であるp-APMSF（p-アミノジフェニルメタンスルホニルフルオリド塩酸塩、和光純薬工業、カタログ番号010-10393）を加え、次に述べるSephadex G-25カラムによるバッファー交換のステップへ進めた。このようにして、約１００匹分ごとにひとつのロットにまとめ、塩化カルシウム・p-APMSF処理し、合計１１ロット、約１１００匹分のＸＲＰ（総体積８１８４ml）総蛋白質量４９３００７mg）の処理を繰り返し、それぞれSephadex G-25 カラムへ進めた。（２）Sephadex G-25〈バッファー交換〉ロット番号ＸＷ９の場合（１）で得られた塩化カルシウム処理後の上清（742ml，蛋白濃度54.9mg/ml、総蛋白質量40740mg）を、20mM Tris-HCl，pH 8で予め平衡化してあったSephadex G-25Mカラム（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-0033-03；直径 11.3cm、ベッド高47cm）に流速40〜70ml/minで添加し、蛋白質が溶出してくるまでの1300mlを捨てた。次に、紫外吸収が立ち上がってきた時点から、電気伝導度が500μS/cmに達するまでを集め、20mM Tris-HCl pH 8溶液に置換されたＴＰＯ活性を含む蛋白質画分（1377ml，蛋白濃度27.56mg/ml）を回収した。ＴＰＯ活性画分の総蛋白質量は、37882mg、このステップでの蛋白収量は、93%であった。また、ＴＰＯの相対活性は、2.3であった。このようにして、全ロットについてそれぞれSephadex G-25カラムを実施した結果、合計すると、総体積２１１１７ｍｌ、総蛋白質量４８０３０６ｍｇ、平均相対活性１．８、相対活性量８６４６００のSephadex G-25のＴＰＯ活性画分を得た。（３）Q-Sepharose FF〈強陰イオン交換クロマトグラフィー〉ロット番号ＸＷ９の場合（２）で得られたSephadex G-25MのＴＰＯ活性画分（1375ml，蛋白濃度27.5mg /ml、総蛋白質量37841mg、相対活性2.3）を流速40ml/minで、Q-Sepharose FF（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-0510-01；直径５cm、ベッド高 27cm）に添加し、20mM Tris-HCl，pH 8で素通り画分Ｆ１（3949ml，蛋白濃度0.9 8mg/ml，総蛋白質量3870mg，相対活性0）を溶出した。次に、175mM NaClを含む20mM Tris-HCl，pH 8緩衝液に換えて、ＴＰＯ活性画分Ｆ２（4375ml，蛋白濃度5.36mg/ml）を溶出した。最後に、1000mM NaClを含む20mM Tris-HCl pH 8緩衝液で、Ｆ３（1221ml，蛋白濃度3.9mg/ml，総蛋白質量4783mg，相対活性3.8）を溶出した。ＴＰＯ活性画分Ｆ２の総蛋白質量は、23440mg、このステップでのＦ２の蛋白収量は、61.9%であった。また、ＴＰＯの相対活性は、6.8に上昇した。このようにして、Sephadex G-25のＴＰＯ活性画分の全ロットをQ-Sepharose F Fにかけた結果、合計すると総体積３５８４２ｍｌ、総蛋白質量３１４３８４ｍｇ、平均相対活性８．６、総活性量２７０４０００のQ-Sepharose FFのＴＰＯ活性画分Ｆ２を得た。（４）小麦胚芽アグルチニン（WGA）-Agarose〈レクチンアフィニティークロマトグラフィー〉ロット番号ＸＷ９の場合（３）で得られたQ-Sepharose FFのＴＰＯ活性画分Ｆ２を３回に分けて、WGA- Agarose（ホーネン社製、カタログ番号800273；直径５cm、ベッド高22.5cm）に流速5ml/minで添加し、ダルベッコ氏リン酸等張緩衝液（DPBS）で素通る画分Ｆ１（9336ml，蛋白濃度2.30mg/ml，総蛋白質量21407mg，相対活性6.9）を得た。次に、0.2M N-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc、ナカライ社製、カタログ番号005-20）、150mM NaCl、0.02%アジ化ナトリウムを含む20mM Na Phosphate，pH 7.2緩衝液により溶出されたプールを、限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウルトラセット分子量8000カット）で濃縮し、WGA-Agarose吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（2993ml，蛋白濃度0.376mg/ml）を得た。このＴＰＯ活性画分Ｆ２の総蛋白質量は、1125mg、このステップでのＦ２の蛋白収量は、4.8%であった。また、ＴＰＯの相対活性は、101に上昇した。ここで得られたＦ２は-80℃で保存した。このようにして、Q-Sepharose FFのＴＰＯ活性画分Ｆ２の全ロットについて、繰り返しWGA-Agaroseにかけた結果、総体積３３０９４ｍｌ、総蛋白質量１５０３０ｍｇ、平均相対活性１３２、総活性量１９８７０００のWGA-AgaroseのＴＰＯ活性画分Ｆ２を得た。（５）TSK-gel AF-BLUE 650 MH〈色素吸着アフィニティークロマトグラフィー〉バッチ番号ＸＢ６の場合（４）で得られた、合計２１５匹分のＸＲＰから出発したロットＸＷ８のWGA- Agarose吸着ＴＰＯ活性画分とロットＸＷ９のWGA-Agarose吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２をバッチＸＢ６としてまとめた（5974ml，蛋白濃度0.388mg/ml、総蛋白質量23 19mg、相対活性150）。この体積5974mlに対し、0.85molesのNaCl（296.76ｇ）を加え、最終濃度0.822 M NaCl，6132mlの溶液とした後、1M NaCl，20mM Na Phosphate，pH7.2で予め平衡化してあったTSK-gel AF-BLUE 650 MHカラム（トーソー社製、カタログ番号08705；直径５cm、ベッド高23cm）に、流速7ml/miｎで添加した。添加終了後、流速10ml/minにて、20mM Na Phosphate，1M NaCl，pH7.2で溶出される素通り（約8470ml）を集め、これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウルトラセット分子量8000カット）で濃縮し、素通り画分Ｆ１（543ml ，蛋白濃度2.05mg/ml，総蛋白質量1112mg，相対活性31）を得た。次に、溶出液を２M NaSCNにかえ、溶出されたTSK-gel AF-BLUE 650MH吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（1427ml，蛋白濃度0.447mg/ml）を得た。このＴＰＯ活性画分Ｆ２の総蛋白質量は638mg、このステップでのＦ２の蛋白収量は27.5%であった。また、ＴＰＯの相対活性は、1500に上昇した。このようにして、WGA-Agarose吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２の全バッチについて、各々TSK AF-BLUE 650MHにかけた結果、総体積１０６５５ｍｌ、総蛋白質量４２３６ｍｇ、平均相対活性９０５、総活性量３８３４０００のTSK-gel AF-BLUE 65 0MHのＴＰＯ活性画分Ｆ２を得た。（６）Phenyl Sepharose 6 FF/LS〈疎水相互作用クロマトグラフイー〉（５）で得られたTSK-gel AF-BLUE 650 MHのＴＰＯ活性画分Ｆ２（1424ml，蛋白濃度0.447mg/ml、総蛋白質量638mg、相対活性1500）の体積1424mlに対し、1.5 molesのAmmonium Sulfate（282.2ｇ）の粉末を加え、最終濃度1.35M Ammonium S ulfate，1581mlの溶液とした。これを1.5M Ammonium Sulfate，50mM Na Phosphate，pH7.2で予め平衡化してあったPhenyl Sepharose 6 FF（Low Sub）カラム（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-0965-05；直径５cm、ベッド高10cm）に、流速7ml/minにて添加し、添加終了後、溶出液を0.8M Ammonium Sulfate，36mM Na Phosphateにかえ、流速10ml/minにて溶出される画分（約3160ml）までを集め、これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウルトラセット分子量8000カット）で濃縮し、Ｆ１（485ml，蛋白濃度0.194mg/ml，総蛋白質量94.2mg，相対活性0）を得た。次に、溶出液を20mM Na Phosphate，pH7.2にかえ、溶出されたＴＰＯ活性画分Ｆ２（約3500ml）を得た。これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウルトラセット分子量8000 カット）で濃縮し、一旦サンプリングした。この段階のＴＰＯ活性画分Ｆ２（22 0ml）の蛋白濃度は1.45mg/ml，総蛋白質量319mg、このステップでのＦ２の蛋白収量は、50.0%であった。また、ＴＰＯの相対活性は、1230であった。このようにして、TSK-gel AF-BLUE 650MHのＴＰＯ活性画分Ｆ２の全バッチについて、繰り返しPhenyl Sepharose FF/LSにかけた結果、総体積１９６６ｍｌ、総蛋白質量２７６２ｍｇ、平均相対活性８４７、総活性量２３３９０００のPhen yl Sepharose FF/LSのＴＰＯ活性画分Ｆ２を得た。（７）Sephacryl S-200 HR〈ゲル濾過クロマトグラフィー〉バッチ番号ＸＢ６の場合（例えば図１）（６）で得られたPhenyl Sepharose 6 FF/LSのＴＰＯ活性画分Ｆ２（217ml，蛋白濃度1.45mg/ml、総蛋白質量315mg、相対活性1230）に、144.8mlの５M NaCl 溶液を加えて362mlの２M NaClとした後、さらに限外濾過ユニット（アミコン社製；YM３膜、直径７６ｍｍ）で約５０ｍｌまで濃縮した。これに８M尿素を等量体積（５０ｍｌ）加え、最終濃度１MNaCｌ、４M尿素の溶液約１００ｍｌにした。さらに約８０ｍｌまで濃縮し、最終的に８８．７８ｍｌのサンプルにし、 Sephacryl S-200 HRカラム（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-0 584-01；直径7.5cm、ベッド高100cm）に、注入した。その後３ｍｌ／ｍｉｎの流速にてDPBSで展開し、ボイド体積（１２００ｍｌ）以降４５ｍｌずつ６０本のポリプロピレン製チューブに集めた。この溶出パターンを図１に示した。２本ごとにアッセイにかけ、残りは１１００匹分の全てのSe phacryl S-200 HRのプロセスを終えるまで、-８５℃にて凍結保存した。アッセイの結果よりＸＢ６では以下のようにフラクションをまとめた（図１）。（Ｆ１）チューブ番号１〜１５（ボイド体積付近の分子量９４０００以上の画分）（Ｆ２）チューブ番号１６〜２６（分子量９４０００〜３３０００）（Ｆ３）チューブ番号２７〜４４（分子量３３０００〜３０００）（Ｆ４）チューブ番号４５〜５５（分子量３０００以下）このようにして、Phenyl Sepharose 6 FF/LSで得たＴＰＯ活性画分Ｆ２の全バッチについて、各々Sephacryl S-200 HRにかけ、それぞれのフラクションについてアッセイを行ない、-８５℃にて凍結保存をした。すべてのバッチについてSephacryl S-200 HR終了後、次の逆相クロマトグラフィー（YMC- Pack PROTEIN-RP）を実施する直前に解凍をし、限外濾過ユニット（アミコン社製；YM３膜、直径７６ｍｍ）で濃縮し、下記の２つの標品を得た。以下、このSe phacryl S-200 HRのＴＰＯ活性画分Ｆ２の濃縮標品を「高分子ＴＰＯ標品Ｆ２」、Sephacryl S-200 HRのＴＰＯ活性画分Ｆ３の濃縮標品を「低分子ＴＰＯ標品Ｆ３」と言う。ここで述べる高分子ＴＰＯ標品Ｆ２、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３とは便宜上、ゲル濾過クロマトグラフィーで溶出位置の異なった画分をまとめたものを称するのであって、必ずしも真の分子量を表現したものではない。 Sephacryl S-200HRにおけるＴＰＯ活性画分以降、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３と高分子ＴＰＯ標品Ｆ２とをそれぞれ次の精製ステップに進めた。以下（８）〜（１１）に低分子ＴＰＯ標品Ｆ３の精製の各ステップについて述べる。（８）YMC-Pack PROTEIN-RP〈逆相クロマトグラフィー〉（７）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３（総蛋白質量50.3mg，蛋白濃度0.184m g/ml，相対活性20000，総活性量1007000、総体積274ml）に展開溶媒Ａ（0.025％トリフルオロ酢酸（TFA））および展開溶媒Ｂ（0.025％TFAを含む1-プロパノール）を加え、最終体積508.63ml、最終プロパノール濃度約 20％、TFA濃度0.012％、蛋白濃度0.0989mg/mlに調製した。ここで不溶物の発生があったので、これを遠心し、上清のみを254.3ml（25.2mg）ずつ２回に分けて、予め30％Ｂで平衡化してあったYMC-Pack PROTEIN-RP（ＹＭＣ社、カタログ番号A-PRRP-33-03-15；直径３cm、ベッド高7.5cm）カラムに流速2ml/minで添加した。沈殿物は５mMのCHAPS（3-［（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］- 1-プロパンスルフオナート；同仁化学研究所製、カタログ番号75621-03-3）を含む20mM酢酸ナトリウム、pH5.5を20ml加えて可溶化し、合わせてカラムに送り込んだ。サンプルを添加した後、約50mlの溶媒（展開溶媒Ａ：展開溶媒Ｂ＝３：１）を通液し、まず素通り画分を集めた。次に展開プログラム（120分の30％Ｂ〜45％Ｂの直線濃度勾配）を開始して、10mlずつ合計36本のフラクションをポリプロピレン製チューブに集め取った。これを繰り返して同じチューブに集めたため、最終的に20mlずつ、合計36本フラクションとなった。素通り画分はそのまま限外濾過ユニット（アミコン社製；YM３膜、直径７６ｍｍ）で20mlまで濃縮した。素通り画分及びチューブ番号１〜36の各20mlのフラクションより0.1ml取り、20μｌの５%BSAを添加後遠心エバポレーションで乾固し、最終的に0.25mlのIMDMアッセイ培養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号17〜27（プロパノール濃度で36.0〜43.0％の範囲）にＴＰＯの活性があり、これを低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のYMC-Pack PRO TEIN-RPのＴＰＯ活性画分Ｆ２とした。次のYMC-Pack CN-APに進める直前まで-85 ℃で保存した。低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のYMC-Pack PROTEIN-RPのＴＰＯ活性画分Ｆ２総体積２２０ｍｌ蛋白濃度０．０１３０ｍｇ／ｍｌ総蛋白質量２．８５ｍｇ相対活性１３００００総活性量３７１０００（９）YMC-Pack CN-AP〈逆相クロマトグラフィー〉（８）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のYMC-Pack PROTEIN-RPのＴＰＯ活性画分Ｆ２のうち214.9ml（総蛋白質量2.79mg，蛋白濃度0.0130mg/ml，相対活性130000，総活性量36300）に、50％グリセロールを0.6ml加え、1.8mlまで濃縮した。最終的に体積５mlで、プロパノール濃度は20%以下、グリセロールは約６% であった。これを５回（各回の注入蛋白質量0.555mg，体積１ml）に分けて実施した。毎回ごとに、展開溶媒Ａに0.1％TFA、展開溶媒Ｂに0.05％TFAを含む1-プロパノールを用い、15％Ｂで平衡化したYMC-Pack CN-AP（ＹＭＣ社製、カタログ番号AP-5 13；直径６mm、ベッド高250mm）カラムに、流速0.6ml/minで注入した。注入終了後、15％Ｂから25％Ｂにプロパノール濃度を上げ、さらに25％Ｂから50％Ｂまで 65分の直線濃度勾配で展開した。最後の回に、蛋白を含まない同じ組成の溶液１ mlを注入、展開し、カラム内に残存するＴＰＯ活性の回収を行った。合計６回分同じポリプロピレン製チューブに集めたため、各フラクションは、7.2mlずつ44 本となった。このうち30μｌ（２４０分の１フラクション）を取り20μｌの５%BSAを加え、遠心エバポレーションで乾固し、最終的に0.24mlのIMDMアッセイ培養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号28〜33 （プロパノール濃度で37.0〜42.0％の範囲）に強いＴＰＯの活性があったため、これを低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来YMC-Pack CN-APのメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとした。低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のYMC-Pack CN-APのＴＰＯ活性画分ＦＡ総体積４３．２０ｍｌ蛋白濃度０．００８６３ｍｇ／ｍｌ総蛋白質量０．３７３ｍｇ相対活性８０００００総活性量２９８４００（１０）Capcell Pak C1 300A〈最終の逆相クロマトグラフィー〉（９）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＴＰＯ活性画分ＦＡ43.20mlのうち43.12ml（総蛋白質量0.372mg，蛋白濃度0.00863mg/ml，相対活性800000，相対活性量297600）に、0.2mlの50％グリセロールを加え、0.1mlのグリセロール溶液となるまで濃縮した。これに展開溶媒Ａ（0.1％TFA）：展開溶媒Ｂ（0.05％TFAを含む1-プロパノール）＝85.15（15%B）の溶液2mlを加えて、最終的に、体積2.1ml、プロパノール濃度が約14%、グリセロールが約4.8%、蛋白濃度0.177mg/mlのサンプルに調製した。これを15％Ｂで平衡化したCapcell Pak C1 300A（資生堂製、カタログ番号C1 TY PE：SG300A；直径4.6mm、ベッド高250mm）カラムに注入し、27％Ｂから38％Ｂまで65分の直線濃度勾配で流速0.4ml/minで展開し、ポリプロピレン製チューブ72 本に0.6mlずつ集めた。各フラクションから、３μｌ（２００分の１フラクション）を取り20μｌの５ %BSAを加え、最終的に225μｌのIMDMアッセイ培養液に置換し、オリジナル体積から75倍希釈したものをアッセイにかけた。各フラクションから、電気泳動のために１μｌ（６００分の１フラクション）を取り、遠心エバポレーションし、還元剤を含まないＳＤＳゲル電気泳動サンプルバッファーを10μｌ加え、95℃で５分処理した。これを15-25%ＳＤＳ−ポリアクリルアミドプレキャストゲル（第一化学薬品社製）を用いてＳＤＳゲル電気泳動し、2D‐銀染色試薬・「第一」銀染色キット（第一化学薬品社製、カタログ番号167997、以下「銀染色キット」と言う）で染色した。分子量マーカーには「第一」・III低分子量マーカー（第一化学薬品社製、カタログ番号181061、以下「D PCIII」と言う）を用いた。以上の分析の結果、チューブ番号35〜43（プロパノール濃度で30.0〜32.5％の範囲）に明らかにＴＰＯの活性があった。このうちチューブ番号36〜42（プロパノール濃度で30.5〜32.0％の範囲）をメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとした。以上の結果を図２に示した。蛋白質量をクロマトグラムから推定し、アッセィの結果と合わせて評価すると、総蛋白質量39.6μｇ，蛋白濃度9.4μg/ml，相対活性4890000，相対活性量1936 00となった。ＴＰＯ活性画分チューブ番号36〜42のＳＤＳゲル電気泳動像を調べてみると、活性の強さと、染色された濃さが相関するバンドが存在することが明らかとなった。しかもこのバンドの分子量は、見かけ上、即ち還元状態での標準分子量蛋白に対し、17000〜19000の位置にあり、ＴＰＯの候補となる有力なバンドであることがわかった。（１１）電気泳動ゲルからのＴＰＯ活性の抽出〈15％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動〉ＴＰＯ活性画分ＦＡの分析例（１０）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＴＰＯ活性画分ＦＡ4200μｌ（総蛋白質量39.6μｇ，蛋白濃度9.4μg/ ml，相対活性4890000，総活性量193600）の内、５．５μｌ（７６４分の１フラクション）を活性抽出のため、２．５μｌ（１６８０分の１フラクション）を銀染色のためにそれぞれサンプルチューブに取り、遠心エバポレーションし、還元剤不含のＳＤＳゲル電気泳動サンプルバッファー10μｌを加え、３７℃１時間処理後、室温で１８時間放置することによりＳＤＳ化した。分子量マーカーには、プレステインド・ローレンジマーカー（Bio-Rad社161-0 305）、及びDPCIIIマーカーを用いた。これらのサンプルを常法（Laemmli、Natu re、227巻、680-685頁、（1970））に従って、マイクロスラブゲルを用いた１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を４℃にて実施した。泳動終了後、直ちに銀染色に付す部分をナイフで切断し固定液に入れ、銀染色キットを用いて銀染色した。一方、活性を切り出すべき部分を、分子量の全域に渡って、ナイフを用いて幅１．５〜２．５mmの３４本のゲルにスライスし、小林の方法（小林幹彦、生化学、第５９巻、第９号（１９８７））を改良した方法でゲルの破砕を行った。微細な断片に破砕されたゲルに各々0.3mlの抽出バッファー（20mM Tris-HCl，pH8，500mM NaCl，0.05%BSA）を加え、４℃で６時間振とうし、抽出を行った。次に最終濃度20mMの500mMリン酸カリウム、pH6.8を加え、４℃で１時間振とうし、沈殿したＳＤＳを除くためウルトラフリーC3GV 0.22μmフィルター付濾過ユニット（ミリポア社製、型番UFC3 OGV 0S）に移し、1000xg（4000RPM）で１５分間遠心し、濾液を回収した。これをウルトラフリーC3-LGC分子量10000カット限外濾過ユニット（ミリポア社製、型番UFC3 LGC 00）に移し3000xg（7000RPM）で遠心した。濃縮液が約50μｌに達した時点で、300μｌの20mM Na Phosphate，pH 7.2のバッファーを加え、再び限外濾過を行った。これを２回繰り返し、残存するＳＤＳを除去した。さらにアッセイ培養液に対し同様な操作を繰り返し、最終的に300μｌに調製した。これを滅菌し、ＴＰＯ活性を測定した。このような実験の結果、銀染色で明瞭に検出できた蛋白質は、DPCIIIマーカーに対し、見かけ上の分子量約17000〜19000、14000、11000の３種であった。 Capcell Pak C1カラムのＴＰＯ活性画分の電気泳動で、前記ステップ（10）の実験において活性の強さと、染色されたバンドの濃さが相関する見かけ上の分子量が約17000〜19000のバンドが観察できたが、本ステップ（11）の実験においてもＴＰＯ活性が検出された見かけ上の分子量は約17000〜19000であった。（図３参照）以上の結果、ＴＰＯ活性を示す蛋白質は、最終的に電気泳動ゲル上で確認可能なまでにCapcell Pak C1 300Aカラムの活性画分中に精製されたと確認できた。このサンプルを１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（非還元下）して銀染色されたバンドの濃さから、全ＴＰＯ活性画分中の見かけ上の分子量約1700 0〜19000のＴＰＯ候補蛋白質の量は、約1.7μgであった。以下（１２）〜（１５）に高分子ＴＰＯ標品Ｆ２の精製の各ステップについて述べる。（１２）YMC-Pack PROTEIN-RP〈逆相クロマトグラフィー〉（７）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２（総蛋白質量257mg，蛋白濃度0.894mg /ml，相対活性7840，総活性量2015000、総体積287ml）に展開溶媒Ａ（0.025％TF A）およびサンプルの３分の１容の95.8mlの展開溶媒Ｂ（0.025％TFAを含む1-プロパノール）を加え、最終体積383ml、最終プロパノール濃度約 25％、TFA濃度0.006％、蛋白濃度0.671mg/mlとした。ここで不溶物の発生があったので、遠心後の上清のみを62.3ml（42.8mg）ずつ６回に分けて、予め30％Ｂで平衡化してあったYMC-Pack PROTEIN-RP（ＹＭＣ社製、カタログ番号A-PRRP-33-0 3-15；直径３cm、ベッド高7.5cm）カラムに流速２ml/minで注入した。沈殿物は５mMのCHAPSを含む20mM酢酸ナトリウム、pH5.5を10ml加えて可溶化できたので、合わせてカラムに送り込んだ。それぞれサンプルを注入した後、約50mlの溶媒（展開溶媒Ａ：展開溶媒Ｂ＝３：１）を通液し、素通り画分を集めた後、展開プログラム（120分の30％Ｂから4 5％Ｂの直線濃度勾配）を開始し、15mlずつ合計24本のフラクションをポリプロピレン製チューブに集め取った。１回目から６回目まで同じ様に繰り返し、最終的に90mlずつのフラクションが24本となった。素通り画分とチューブ番号１はそのまま限外濾過ユニット（アミコン社製；YM３膜、直径７６ｍｍ）で90mlまで濃縮した。素通りを含むチューブ番号１から24までのフラクションより0.3ml取り、10μ ｌの５%BSAを添加後遠心エバポレーションで乾固し、最終的に0.3mlのIMDMアッセイ培養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号10〜15（プロパノール濃度で34.0〜39.5％の範囲）にＴＰＯの活性があり、これを高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のYMC-Pack PROTEIN-RPのＴＰＯ活性画分Ｆ２とした。次のYMC-P ack CN-APに進める直前まで、-85℃で保存した。高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のYMC-Pack PROTEIN-RPのＴＰＯ活性画分Ｆ２総体積５４０ｍｌ蛋白濃度０．０２１ｍｇ／ｍｌ総蛋白質量１１．４ｍｇ相対活性２２７０００総活性量２５８８０００（１３）Superdex 75 pg〈CHAPS存在下でのゲル濾過クロマトグラフィー〉（１２）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のYMC-Pack PROTEIN-RPのＴＰＯ活性画分Ｆ２のうち、538.2ml（総蛋白質量11.3mg，蛋白濃度0.021mg/ml，相対活性227000，総活性量2565000）に50％グリセロールを0.6ml添加後、遠心エバポレーション濃縮した。次に、6mlの20mM CHAPSを加えた。さらに、18mlの20mM CHAPSを加え攪拌し、４℃に移し、４１時間後に最初のサンプルをHiLoad 26/60 Superdex 75 pg（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-1070-01；直径2.6cm、ベッド高60cm）カラムに注入し、流速１ml/minで、５mMCHAPSを含むDPBSで展開した。一回に４ml（蛋白濃度0.466mg/ml，蛋白質量1 .86mg）のサンプルをカラムに注入した。６回目に分けてカラムで展開し、全てのYMC-Pack PROTEIN-RPのＴＰＯ活性画分をSuperdex 75 pgカラムで分取した。フラクションは５mlずつ６回分、即ち合計30mlのフラクションが45本となった。それぞれのフラクションより0.1ml取り、10μｌの５%BSAを添加後、遠心エバポレーションで乾固し、最終的に0.25mlのIMDMアッセイ培養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号13〜31（分子量で78000〜3000の範囲）にＴＰＯの活性があったため、これを高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のSuperdex 75 pgのＴＰＯ活性画分Ｆ２とした。高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のSuperdex 75 pgのＴＰＯ活性画分Ｆ２総体積５４０ｍｌ蛋白濃度０．００２１６ｍｇ／ｍｌ総蛋白質量１．１７ｍｇ相対活性１７５００００総活性量２０４１０００（１４）YMC-Pack CN-AP〈逆相クロマトグラフィー〉（１３）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のSuperdex 75 pgのＴＰＯ活性画分Ｆ２（分子量78000〜3000）540mlのうち、513.2ml（総蛋白質量1.11mg，蛋白濃度0.00216mg/ml，相対活性1750000，相対活性量1943000）に１０分の１容の展開液Ｂ（0.05％TFAを含む1-プロパノール）を加えた後、展開溶媒Ａ（0.1％TF A）と展開液Ｂを用いて15％Ｂで平衡化したYMC-Pack CN-AP（ＹＭＣ社製、カタログ番号AP-513；直径6mm、ベッド高250mm）カラムに、流速0.6ml/minで注入した。注入終了後、15％Ｂから25％Ｂにプロパノール濃度を上げ、さらに25％Ｂから50％Ｂまでの65分の直線濃度勾配で展開した。 YMC-Pack CN-APカラムに進めるにあたり、全インプットサンプルの２０分の１をまずパイロット的に進め、活性が良好に回収できることを確認できた。そこで、残りの２０分の１９を２回に分けて分取した。つまり合計３回の展開をおこなった。計３回分で分取された各フラクションを同じポリプロピレン製チューブ44本に集めたので、合計3.6m lずつとなった。このうち５μｌ（７２０分の１フラクション）を取り、最終的に0.25mlのIM DMアッセイ培養液に置換した。アッセイの結果、チューブ番号24〜30（プロパノール濃度で36.0〜42.0％の範囲）に極めて強いＴＰＯの活性があったため、これを高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のYMC-Pack CN-APのメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとした。高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のSuperdex 75 pgのＴＰＯ活性画分ＦＡ総体積２５．２０ｍｌ蛋白濃度０．０２４６ｍｇ／ｍｌ総蛋白質量０．６２０ｍｇ相対活性７０００００総活性量４３４０００（１５）Capcell Pak C1 300A〈最終の逆相クロマトグラフィー〉（１４）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のYMC-Pack C N-APのＴＰＯ活性画分ＦＡ25.20mlのうち、24.66ml（総蛋白質量0.606mg，蛋白濃度0.0246mg/ml，相対活性700000，総活性量424000）に、0.4mlの50％グリセロールを加え、遠心エバポレーションで濃縮した。最終的に、プロパノール濃度は数%、グリセロールは10%、蛋白濃度0.303mg/ml の２mlのサンプルとなった。展開溶媒Ａ（0.1％TFA）、展開溶媒Ｂ（0,05％TFA を含む1-プロパノール）を用いて、15％Ｂで平衡化したCapcell Pak C1 300A（資生堂カタログ番号C1 TYPE：SG300A；直径4.6mm、ベッド高250mm）カラムに注入し、27％Ｂから38％Ｂまで65分の直線濃度勾配で流速0.4ml/minで展開し、ポリプロピレン製チューブ72本に0.6mlずつ集めた。各フラクションから、0.75μｌ（８００分の１フラクション）を取り、20μｌの５%BSAを加え、最終的に225μｌのIMDMアッセイ培養液に置換し、オリジナル体積から300倍希釈したものをアッセイにかけた。各フラクションから、電気泳動のために２μｌ（３００分の１フラクション）を取り、遠心エバポレーションし、10μｌの還元剤を含まないＳＤＳ電気泳動サンプルバッファーを加え、 95℃で５分処理した。これを15〜25%ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドプレキャストゲル（第一化学薬品製）を用いてＳＤＳゲル電気泳動し、銀染色キットで染色した。分子量マーカーにはDPCIIIマーカーを用いた。以上の分析の結果、チューブ番号33〜39（プロパノール濃度で29.5〜31.5％の範囲）に明らかにＴＰＯの活性があった。このうち、チューブ番号34〜39（プロパノール濃度で30.0〜31.5％の範囲）をメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとした。メインのＴＰＯ活性画分のＳＤＳゲル電気泳動像を調べてみると、（10）に述べた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３から出発したものと同じく見かけ上17000〜22000の分子量範囲に、活性の強さと、染色された濃さが相関するバンドが存在することが明らかとなった。〈実施例２〉ラット精製ＴＰＯの部分アミノ酸配列の分析岩松の方法（岩松ら、新基礎生化学実験法、第４巻、33〜84頁（丸善刊）；岩松明彦、生化学、第63巻、第２号、139-143頁、（1991）；Akihiro Iwamastu、E lectorophoresis、第13巻、142-147頁、（1992））により、実施例１の（１０）で得られたCapcell Pak C1 300AカラムのＴＰＯ画分ＦＡ中のラットＴＰＯ候補タンパク質のアミノ酸配列の分析を行った。即ち、サンプルをＳＤＳゲル電気泳動し、電気的にポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜上の蛋白質を還元Ｓ‐アルキル化した後、系統的、段階的に３種のプロテアーゼでin situ限定酵素分解し、ペプチドフラグメント化し、これを逆相クロマトグラフィーで分離精製し、得られたペプチドを高感度アミノ酸配列決定法により分析した。以下にその詳細を述べる。低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のCapcell Pak C1 300AのＴＰＯ画分ＦＡのＴＰＯ候補蛋白質の分析例（１）Capcell Pak C1 300AカラムのＴＰＯ画分ＦＡ（チューブ番号36〜42）の濃縮実施例１の（１０）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来の、Capcell Pak C1 300AカラムのＴＰＯ活性画分ＦＡ（チューブ番号36〜42）4200μｌ（総蛋白質量39.6μg，蛋白濃度9.4μg/ml，相対活性4890000，相活性量193600）のうち、4 151μｌ（全フラクションの98.8%）をアミノ酸配列のための分析に進めた。クロマトグラムから推定される蛋白質量は39.1μgであるが、このうちＳＤＳゲル電気泳動で銀染色された見かけ上の分子量約17000〜19000のＴＰＯ候補蛋白質の量は、約1.6μgであった。このサンプルにグリセロールを添加し、遠心エバポレーションで濃縮し、５μ ｌのグリセロール溶液とした。これに還元剤を含まないＳＤＳ電気泳動サンプルバッファー、及びｐＨを調整するために1M Tris-HCl，pH8を加え、最終的に、20 0mM Tris-HCl，pH8.0，50mM Tris-HCl，pH6.8，1.1%ＳＤＳ，２mM EDTA，0.02%B PB，30%グリセロールを含む約２５μｌのサンプルにした。このサンプルを過度に加熱することなく十分にＳＤＳ化するために、まず室温に１４時間置き、次に６０℃で５分処理した。（２）電気泳動常法に従って、マイクロスラブゲル（４．０％アクリルアミド濃縮ゲル、１５％アクリルアミド分離ゲル）を調製し、ＳＤＳゲル電気泳動を室温下で１２．５ｍＡ、次いで１７．５ｍＡの一定電流にて２時間かけて実施した。分子量マーカーには、プレステインド・ローレンジマーカー（Bio-Rad社161-305）、及びDPCI IIマーカーを用いた。泳動終了後直ちＰＶＤＦ膜に転写した（次項）。また、分析に付したサンプルの一部を、非還元のまま、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元化し、１５〜２５％ポリアクリルアミドプレキャストゲル（第一化学薬品社製；マルチゲル15/25、カタログ番号211072）で電気泳動した。これを銀染色キットを用いて銀染色したところ、ＴＰＯと期待されたバンドは、還元下において分子量約19000であり、Capcell Pak C1 300AカラムでのＴＰＯ活性画分中のＴＰＯ候補蛋白質の純度が、数％程度であることが確認できた。また非還元・還元それぞれの移動度が異なるため、分子内部に少なくとも一つ以上のＳ ‐Ｓ結合を持つことが示唆された。（３）ＰＶＤＦ膜へのエレクトロブロット法による転写・バンドの検出セミドライ転写装置（マリソル社製、ウエットフォー転写装置モデルＫＳ‐84 60）を用いて、常法に従い、１６０ｍＡ（１１〜１７Ｖ）の一定電流で１時間かけてＰＶＤＦ膜（アプライドバイオシステムズ社製ProBlott、カタログ番号4009 94）に転写を行った。陽極液に、0.3M Tris，20%メタノール，pH10.4、転写膜液に、25mM Tris，20%メタノール，pH10.4、陰極液に、25mM Tris，40mMアミノカプロン酸，20%メタノール， pH10.4を用いた。転写された膜をポンソーＳ染色液（１００ｍｌ中０．１ｇのポンソーＳと１ｍｌの酢酸を含む）で染色したところ、複数のバンドが染色され、この中にＴＰＯと期待された分子量約19000のバンドを確認することができた。これを切り出し、ペプチドの断片化に進めた。（次項）（４）ペプチドフラグメント化とペプチドマッピング・アミノ酸配列分析ＰＶＤＦ膜上に転写・還元Ｓ‐アルキル化されたＴＰＯ候補蛋白質の断片化を系統的に行うために、次の三つのプロテアーゼにより、段階的に限定的酵素分解を行った。一次消化リシルエンドペプチダーゼ（Achromobacter lyticusm497-1、和光純薬工業製、カタログ番号129-02541）二次消化エンドプロテイナーゼAsp-N（ベーリンガー・マンハイム社製、カタログ番号1054 589）三次消化トリプシン-TPCK（Worthington Biochemical社製、カタログ番号3740 ）各々の酵素消化で得られたペプチド断片を回収し、展開溶媒Ａに0.05%TFA、展開溶媒Ｂに0.02%TFAを含むイソプロパノール：アセトニトリル＝７：３の混液を用いて、Wakosil-II 5C18 C18逆相カラム（和光純薬工業製；直径2.0mm、長さ150mm）で、カラム温度３０℃、流速0.25 ml/分、１％Ｂから５０％Ｂを３０分の直線濃度勾配にて展開することによりマッピング（図４）し、得られたペプチドフラグメントを回収した。それぞれのペプチドフラグメントを気相アミノ酸シークエンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ− ２）にてエドマン分解後、順次回収されたＮ末端のＰＴＨアミノ酸を、アイソクラティック溶出法によるＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーにて同定を行った。この結果を次にまとめた。以上の配列のうち、（）付きで示したものは、系統的酵素消化から演繹推定しうるアミノ酸残基である。（５）得られたアミノ酸配列の類似性分析〈ホモロジーサーチ〉得られたアミノ酸配列が、すでに報告されている既知の蛋白質に含まれているかどうか、あるいは、類似配列をもつ蛋白質があるかどうかについて、配列解析ソフトウェアであるマックベクター（Kodak International Biotechnologies，Inc．）を用いて分析した。既知蛋白質あるいは既知遺伝子の情報は、Entrez Release 6データベース（米国 National Center for Biotechnology Information，National Library of Medic ine，National Institutes of Health、1993年８月１５日発行）を利用した。これに含まれる各種データベースは以下の通りである。 Entrez Release 6データベース NCBI-GenBank，August 15，1993（Release 78.0） EMBL，July15，1993（Release 35.0 plus updates） DDBJ，July 15，1993 SWISS-PROT，April，1993（Release 25.0） PIR，June 30，1993（Release 37.0） PDB，April，1993 PRF，May，1993 dbEST，July 15，1993（Release 1.10） U．S．and Europian Patents この結果、ＡＰ１２の配列（Ｋ）ＤＳＦＬＡＤＶＫは、ラットのCorticostero id-binding globulin（ＣＢＧ）precursor ［PIRデータベース登録番号 A40066；Smith and Hammond；“Rat corticostero id-binding globulin：primary structure and messenger ribonucleic acid le vels in the liver under different physiological conditions．”Mol．Endoc rinol.，(1989)，3，420-426，］の内部配列ＫＤＳＦＬＡＤＶＫと完全一致した。さらによく調べてみると、ＡＰ３の配列（Ｋ）ＸＹＹＥＳＺ（（ＸはＡ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｑのどれか）、（ＺはＥまたはＫ））と類似性の高いＫＱＹＹＥＳＥ（配列番号１９３）という配列が、ラットＣＢＧのアミノ酸配列に含まれていることが判明した。これらのＡＰ１２、ＡＰ３に相当する配列はラットＣＢＧでは連続しており、ＫＤＳＦＬＡＤＶＫＱＹＹＥＳＥ（配列番号１９０）という内部アミノ酸配列に相当する。しかしながら、ＡＰ１２、ＡＰ３以外のフラグメントのアミノ酸配列に関しては、類似性を考慮すべき既知の蛋白質や遺伝子は見つからなかった。〈実施例３〉血小板減少症ラット血漿由来ＴＰＯの生物学的特性分析（1）ラットCFU-MKアッセイ系（液体培養系）において代表例として、血小板減少症ラット血漿からのＴＰＯ部分精製標品（実施例１ −２の（８）に記載したYMC Pack Protein-RPカラムＴＰＯ活性画分Ｆ２）を用いた場合の用量反応曲線を図５に示した。培養を経時的に顕微鏡下で観察したところ、日を追って巨核球の分化、成熟の進行、即ち細胞サイズの増大が認められ、おそらく、細胞の増加も起こっていることと思われた。特に顕著な変化として、培養最終日の４日目に数多くの巨核球による突起形成が認められた（培養３日目ではほとんど認められない）。この突起形成は、cytoplasmic process format ion（LevenとYee、Blood、69巻、1046-1052頁、(1987)）、あるいは、proplatel et process formation（Toppら、Blood7、76巻、912-924頁、(1990)）などと呼ばれ、巨核球からさらに分化の進んだ血小板の前駆構造体であり、現在までのところin vitroで観察できる巨核球分化の最終形態と考えられている。ＴＰＯ標品単独でこのような形態変化が高い頻度で認められたことから、本因子は単独でCF U-MKの増殖・分化を促進し、成熟巨核球を生成させ、さらに最終的に血小板産生まで進行させる可能性が考えられる。（2）コロニーアッセイ系において血小板減少症ラット血漿からのＴＰＯ部分精製標品について、ラットの非分離骨髄細胞、分離・濃縮各段階の細胞、あるいはGpIIb/IIIa⁺ CFU-MK画分を用いたコロニーアッセイ系で検定したところ、ラット血漿由来のＴＰＯは、巨核球コロニーを形成させた。ＴＰＯによって形成される巨核球コロニーと他の既知サイトカイン、即ち、ラットIL-3、マウスGM-CSF、あるいはヒトEPOによって形成される巨核球コロニーを比較すると、ＴＰＯによって形成される巨核球コロニーには、個々のコロニーを構成する巨核球数は少ないが、各々の巨核球のサイズが大きい、即ち成熟度が進んでいるという特徴がある。さらに、他の細胞系統のコロニーはほとんど形成されず、ＴＰＯが示すMeg-CSF活性は巨核球特異的な活性と考えられる。これらのことから、ＴＰＯは、本コロニーアッセイ系においてMeg-CS F活性を発揮する他の既知サイトカイン、即ち、ラットIL-3、マウスGM-CSF、あるいはヒトEPOとは、生物学的特性を異にし、ユニークなMeg-CSF活性を発揮することが明白となった。ヒト骨髄細胞、あるいはヒト臍帯血細胞由来のCD34⁺DR⁺細胞画分に対しても血小板減少症ラット血漿からのＴＰＯ部分精製標品はMeg-CSF活性を示し、有意な数のヒト巨核球コロニーを形成させた。このことは本因子に種特異性のないことを示している。〈実施例４〉ラットＴＰＯ産生細胞の特定化（1）ラットＴＰＯ産生臓器の探索まず、ラットＴＰＯの部分アミノ酸配列に基づくラットＴＰＯ遺伝子のクローニング、あるいは発現クローニングのためのmRNA供給源を確保する目的で、ラットＴＰＯ産生臓器の探索、特定化を行った。当初、P55抗体投与により血小板減少症にしたラットから経時的に骨髄、肺、肝臓、脾臓を摘出し、その細胞（肺、肝臓の場合は臓器切片）の培養上清を採取し、ラットCFU-MKアッセイ系にて上清中の活性を評価したが、明確な結果は得られなかった。続いて、ラットにおける肝臓とＴＰＯ産生との関連性を示唆する報告（Siemensmaら、J．Lab．Clin．Med .、86巻、817-833頁、(1975)）を考慮して、P55抗体投与により血小板減少症にしたラットの肝臓からコラゲナーゼかん流法にて調製した肝細胞を培養し、その上清からWGA-Agaroseカラムに吸着した画分をVydac phenyl逆相カラムに展開したところ、ラットCFU-MKアッセイ系にてラット血漿由来ＴＰＯ活性と同じ位置に極めて類似した活性が認められた。正常ラット肝細胞の培養上清からも弱いながらも活性が認められた。これらの結果から、肝臓がＴＰＯ産生臓器の１つである可能性が強く示唆された。（2）ラットＴＰＯ産生細胞株のスクリーニング上記の結果を基に、ラットＴＰＯ産生細胞株のスクリーニングを行った。まず、20種類のラット肝臓由来細胞株をそれぞれの継代培養用の培養液中でほぼコンフルエントになるまで培養した後、培養液に含まれる血清を５%FCSに統一したそれぞれの培養液で置換して、さらに３日間培養を継続し、それぞれの培養上清を採取した。その上清を（1）に記した方法で部分精製して、ＴＰＯ産生の有無を調べたところ、３種類のラット肝実質細胞由来細胞株、即ち、McA-RH8994細胞（ ATCC寄託番号CRL1602、Beckerら、“Oncodevelopmental Gene Expression”ed． by Fishman and Sell、Academic Press、NY、259-270頁、（1976）、大日本製薬より購入）、H4-II-E細胞（ATCC寄託番号CRL1548、Pitotら、Nat．Cancer Inst．Monogr．、13巻、229-245頁、（1 964）、大日本製薬より購入）、およびHTC細胞（Thompsonら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA、56巻、296-303頁、（1966）、大日本製薬より購入）から明らかにＴＰＯ活性の産生が確認された。（3） McA-RH8994細胞、H4-II-E細胞、およびHTC細胞が産生するＴＰＯ活性の詳細な分析これらの３種類のラット細胞株から分泌されるＴＰＯ活性と平行して精製を進めていたラット血漿由来のＴＰＯ活性を、生化学的性質と生物学的性質の両面からさらに詳細に比較検討した。 McA-RH8994細胞を10%FCSを含むalpha-MEM（-）培養液に浮遊させて、底面積17 5cm²の組織培養用培養プラスティックフラスコに１×10⁶個／フラスコになるように入れ、５%炭酸ガス培養器中にて37℃で３日間培養した後、５%FCSを含むIMD M培養液に置き換え、さらに３日間培養し、上清を回収した。H4-II-E細胞を10%F CSを含むDulbecco改変Eagle培養液（グルコース4.5g/l含有）（以下、DMEM培養液）に浮遊させて、底面積175cm²の組織培養用プラスティックフラスコに５×10⁵ 個／フラスコになるように入れ、５%炭酸ガス培養器中にて37℃で３日間培養した後、５%FCSを含むIMDM培養液に置き換え、さらに３日間培養し、上清を回収した。また、HTC細胞を５%FCSを含むDMEM培養液に浮遊させて、底面積175cm²の組織培養用プラスティックフラスコに2.5×10⁵個／フラスコになるように入れ、５%炭酸ガス培養器中にて37℃で３日間培養した後、５%FCSを含むIMDM培養液に置き換え、さらに３日間培養し、上清を回収した。このようにして得た３種類の細胞株の培養上清それぞれ２リットルから、実施例１−２に記載したＸＲＰからのＴＰＯの精製法に従って、細胞株由来ＴＰＯの部分精製を行った。以下に概略を述べる。まず、限外濾過器により培養上清を約６倍に濃縮した後、Sephadex G-25カラムで20mM Tris-HCl（pH 8.0）にバッファー交換した。溶出液をQ-Sepharose FF カラムに添加し、20mM Tris-HCl（pH 8.0）で洗滌後、吸着画分を175mM NaClを含む20mM Tris-HCl（pH 8.0）で溶出した。この画分をWGA-Agaroseカラムに添加し、PBSで洗った後、吸着画分を0.2M GlcNAcと0.15M NaClを含む20mM Na Phosph ate（pH 7.2）により溶出した。この溶出液をTSK-gel AF-BLUE 650MHカラムに添加し、1M NaClを含む20mM Na Phosphate（pH7.2）で洗った後、2M NaSCNにより溶出した。これをPhenyl-S epharose 6 FF/LSカラムに添加し、1.5M硫酸アンモニウム（Ammonium Sul1ate）を含む50mM Na Phosphate（pH7.2）、次いで0.8M硫酸アンモニウムを含む36mM N a Phosphateで洗った後、20mM Na Phosphate（pH 7.2）により溶出した。この吸着画分を、濃縮後、逆相Vydac Protein C4カラム（The Separations Group社製カタログ番号214TP51015；直径１cm、ベッド高１５cm）で分画した。展開溶媒Ａに0.1％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに0.05％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用い、予めカラムを20％Ｂで平衡化し、サンプルを注入後、流速１ml／minで20％Ｂから40％Ｂまで90分の直線濃度勾配により溶出した。この結果、どの細胞株由来のＴＰＯ活性も、30％から43％濃度の１‐プロパノールで溶出された。各精製段階の標品をラットCFU-MKアッセイ系にて活性測定した結果、３種類の細胞株由来のＴＰＯ活性はいずれもＸＲＰ由来のＴＰＯ活性と極めて類似した挙動を示した（実施例１−２を参照）（表２に、ラットCFU-MKアッセイ系での各段階における相対比活性、活性収率などを記載）。さらに、最終段階の逆相カラムからの溶出画分をラットCFU-MKアッセイ系にて活性測定した結果、３種類の細胞株由来のＴＰＯ活性とＸＲＰ由来のＴＰＯ活性は同じピーク位置に溶出されていた。この逆相カラムの活性画分を中心に、ラットGpIIb/IIIa⁺CFU-MKの分離・濃縮過程の付着細胞除去段階で得られる非付着性細胞を用いてコロニーアッセイを行ったところ、いずれもラットCFU-MKアッセイ系での活性の溶出パターンにほぼ一致して巨核球コロニーの形成が認められ（表３）、また、ＸＲＰ由来のＴＰＯ活性と同様に、３種類の細胞株由来の活性はいずれも専ら巨核球コロニーを形成させ、他の系統のコロニーはほとんど形成させなかった。実施例１−２に記載した方法に従って、プールした逆相カラムの活性画分をSD Sポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動後にゲルから蛋白質を抽出して、ラットCFU-MKアッセイ系にて活性測定したところ、ＸＲＰ由来のＴＰＯは見かけの分子量17000〜22000、McA-RH8994細胞由来のＴＰＯは見かけの分子量33000 〜39000、H4-II-E細胞由来のＴＰＯは見かけの分子量31000〜38000、HTC細胞由来のＴＰＯは見かけの分子量 17000〜22000、および分子量28000〜35000を有していた。以上のように、McA-RH8994細胞、H4-II-E細胞、およびHTC細胞が産生するＴＰＯ活性は、ＸＲＰ由来のＴＰＯと比べて、見かけ上の分子量の点で生化学的性質を若干異にするものの、生物学的性質において同等であることが明らかとなった。本発明において、ここで特筆すべきことは、血液中に存在するＴＰＯ活性を持つ分子が、産生細胞において、あるいは産生細胞から分泌後に、分子内の特定な、あるいは不特定な位置で切断されたものである可能性を示唆する。また、ＴＰＯ遺伝子（mRNAやcDNA）においても様々な長さのものが存在する可能性をも示したものである。〈実施例５〉ｃＤＮＡライブラリー作製用発現ベクター（ｐＥＦ１８Ｓ）の構築ベクターへのｃＤＮＡ断片の組み込みが容易で、クローニングしたｃＤＮＡの発現効率が高いベクターを作製し、ＴＰＯｃＤＮＡのクローニングと発現に備えた。すなわち、発現効率が高いプロモーターとして知られるエロンゲーションファクター１α（ＥＦ１α）のプロモーターを、扱いやすい発現ベクターｐＭＥ１８ＳのＳＲαプロモーターと入れ替え、発現ベクターｐＥＦ１８Ｓを構築した（図６参照）。エロンゲーションファクター１αのプロモーターは発現ベクターｐＥＦ‐ＢＯＳ（Mizushimaら、Nucleic Acids Res.、18、5322、1990）１μｇを制限酵素HindIIIとEcoRIで部分的に消化した後、２％アガロースゲル（FMC BioP roducts社製）を用いた電気泳動にかけ、約1200bpのDNA断片を分離し、プレップ ‐Ａ‐ジーンDNA精製キット（バイオラッド社製；Willisら、BioTechniques、 9 、92-99、1990の方法にもとづいたもので、多孔性シリカベースのマトリックスを利用した吸着により選択的にＤＮＡを精製するキット）を用いて精製した。このＤＮＡ断片１００ｎｇを同様にHindIIIとEcoRIで消化した５０ｎｇの発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（Liuら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、90、8957-8961、1993）につなぎこんだ。宿主菌にはコンピテント・ハイE.coli DH５（東洋紡績社製；Hanahanら、J．Mol．Biol.、166、557-580、1983の方法の変法により作製したコンピテントな宿主菌）を用い、得られたコロニー１２個をランダムに選びプラスミドＤＮＡを精製し、それらＤＮＡの制限酵素での消化パターンにより目的のプラスミド（ｐＥＦ１８Ｓ）を含む１０クローンの中から１個を選択し、大量にプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドDNAの精製は本質的にMolecular Cloning［Sambrookら、Cold Sprin g Harbor Laboratory Press (1989)］に記載されているようにして実施した。すなわち、上記のようにして得られたクローンｐＭＥ１８Ｓを50μg/mlのAmpicili nを含む50mlのLB培地（１％Bacto-tryptone、0.5％Bacto-yeast extract、 0.5 ％NaCl）で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体を４mlのTEG-lysozyme（25 mM Tris・Cl（pH８）、10mM EDTA、50mM Glucose、0.5％lysozyme）溶液に懸濁し、８mlの0.2N NaOH/１%SDS溶液を加えてよく懸濁する。さらに３ M potassium/５M acetate溶液を６ml加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノール‐クロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはTE溶液（10mMトリス‐塩酸（pH7, 5）、１mM EDTA）に溶解後、RNase処理、フェノール‐クロロホルム（１１）処理を施し、エタノール沈殿を行なう。ペレットを再度TE溶液に溶解し、NaCl、ポリエチレングリコール3000をそれぞれ0.63M、7.5％になるように加えて遠心する。最後に、ペレットはTE溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。これにより約30 0μｇのプラスミドDNAを得た。このＤＮＡ１００μｇを制限酵素EcoRIおよびNot Iで完全に消化後、０．８％のアガロースゲル（FMC BioProducts社製）で泳動し、ベクター断片を回収後プレップ‐Ａ‐ジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）で精製しおよそ５５μｇのプラスミドＤＮＡを得た。このＤＮＡを以下のｃＤＮＡライブラリー作製に使用した。〈実施例６〉McA-RH8994細胞からのmRNAの精製実施例４のコロニーアッセイの結果より比較的活性の高かったMcA-RH8994細胞をラットＴＰＯｃＤＮＡクローニングの材料に選び以下の実験に供した。全RNAの単離は本質的にMolecular Cloning［Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。McA-RH8994 細胞を直径90mmのシャーレ15枚に完全に密に増殖させた後、シャーレから培養液を除き、１枚のシャーレ当り0.8mlの５Mグアニジン溶液（５Mグアニジンチオシアナート、５mMクエン酸ナトリウム（pH7.0）、0.1Mβ−メルカプトエタノール、0.5％ザルコシル硫酸ナトリウム）を加え、よく懸濁した後１本のチューブに混合液を集め、グアニジン溶液を加えて全量を20mlとした。この細胞が壊れて粘稠になった混合液は、18Gさらに21Gの注射針を装填した20ml容の注射器を用い、粘性がほとんどなくなるまでおよそ２０回吸入排出を繰り返した。ベックマン社製SW28ローターに合うポリアロマー製の遠心チューブに18mlの5.7M CsCl-0.1M E DTA（pH7.5）をクッションとして先に加えておき、チューブがほぼ満たされるように上述の混合液約20mlを層が乱れないように静かに重層した。このようにして調製された遠心チューブを20℃で25000r.p.m.、20時間遠心した後、得られたペレットを少量の80%エタノールを用いて２回洗浄した。ペレットはTE溶液に溶解せしめ、フェノール‐クロロホルム（１：１）にて抽出後、１／10量の３M 酢酸ナトリウムと2,5倍量のエタノールを加えてエタノール沈殿を行い全RNAを得た（約10⁸個の細胞より全RNA約2,5mgを得た）。全RNAからのポリ(A)⁺RNAの精製はOligotex^TM-dT30（Super）（日本合成ゴム／日本ロッシュ社製；ラテックス粒子の表面にオリゴｄＴが共有結合で固定してあり、ポリ(A)⁺RNA精製に使われるオリゴｄＴカラムと同様にポリ(A)⁺RNAの精製ができる）を用いて行った。全RNA約500μｇより20μｇのポリ(A)⁺RNAを得た。〈実施例７〉ラットcDNAライブラリーの構築実施例６で得られた５μｇのポリ(A)⁺RNAからTimeSaver^TMcDNA Synthesis Kit （Pharmacia社製；Okayama-Berg法：Mol．Cell．Biol.、 2、161-170、1982、の変法によるｃＤＮＡ合成法のキット）およびDIRECTIONAL CLONING TOOLBOX（Pha rmacia社製；NotI配列を含むｃＤＮＡ合成のためのプライマー：5′-AACTGGAAGA ATTCGCGGCCGCAGGAA(T)₁₈-3′（配列番号15）並びにEcoRI配列付加用アダプター： 5′-AATTCGGCACGAG-3′（配列番号16）および5′-CTCGTGCCG-3′（配列番号17）のセット）を用いて、５’端にEcoRI、３’端にNotI認識部位を持つ２本鎖cDNA を合成した。合成したcDNAは1.2μｇの予めEcoRIおよびNotIで処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓ（実施例５参照）と連結させ、8.4mlのコンピテント・ハイE.c oli DH5（東洋紡績社製）を形質転換した。その結果、5.3×10⁵ 個の形質転換体が得られた。〈実施例８〉ＰＣＲ法によるラットＴＰＯcDNA断片の取得（クローニング）実施例７で作製したMcA-RH8994cDNAライブラリー５３万クローンを50μg/mlの Ampicilinを含む50mlのLB培地で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体からQ IAGEN-tip100（DIAGEN社製；ＤＮＡ精製用シリカゲルベースの陰イオン交換カラム）を用いてMcA-RH8994cDNAライブラリープラスミドを精製し、約２００μｇのプラスミドＤＮＡを得た。実施例２に記載のペプチド断片ＡＰ８のアミノ酸配列に対応する２種類のアンチセンスヌクレオチドプライマーAP8-1R,AP8-2R、及びcDNAライブラリー作製に用いた図６に示したプラスミドベクターｐＥＦ１８Ｓのヒトエロンゲーションファクター１αの第１イントロンに対応するセンスヌクレオチドプライマーEF1α-1，EF1 α-2を合成した。合成にはアプライドバイオシステムズ社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（β‐シアノエチルアミダイト法にもとづく合成機）を使用し、同社製の合成DNA精製用ＯＰＣカラム（逆相シリカゲルを充填したカラムでトリチル基を持つ合成ＤＮＡを精製するカラム）を用いて精製した。精製した合成 DNAはＴＥ溶液に５０μＭとなるように溶解し、使用時まで−２０℃に保存した。以下用いる合成オリゴヌクレオチドは全て同様に合成並びに精製して使用した。プライマーAP8-1R,AP8-2Rは、連続した17個のヌクレオチドからなる混合型プライマーであり、タカハシらの研究にあるようにデオキシイノシンを使用した（ Takahashi，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)82，1931-1935(1985)）。プライマーEF1α-1,EF1α-2は、Uetsuki，et al.，J．Bio1．Chem．264，5791 -5798（1989）にあるゲノム配列の1491−1512、1513−1532に相当するヌクレオチド配列を基にして合成したそれぞれ21、20個のヌクレオチドからなるプライマーである。 McA-RH8994cDNAライブラリープラスミド３μgを鋳型とし、AP8-1R（500pmol）、EF1 α-1（100pmol）をプライマーとして、GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with A mpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製；ＰＣＲ用耐熱性Taqlポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰのセット）を用いて、GeneAmp^TM PCR System 9600（PERKIN-ELMER社製；ＰＣＲ用反応機）により100μｌの容量で PCR反応（95℃で２分間加熱後、95℃で１分間の変性条件、40℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で35回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。増幅されたＤＮＡ断片の特異性を上げるために、得られたＰＣＲ反応液１μｌを鋳型とし、EF1 α-2（100pmol）、AP8-2R（500pmol）をプライマーとして、同様に100μｌの容量でPCR反応（95℃で２分間加熱後、95 ℃で１分間の変性条件、45℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で35回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。ここで得られた反応液を、２％アガロースゲル（FMC BioProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、このPCR反応の主要産物である約３３０bpのDNA断片を分離し、プレップ‐Ａ‐ジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。このDNA断片をT4DNAリガーゼ（ライフテクノロジー社製）を用いてpCR^TMII （Invitrogen社製；ＰＣＲ産物ＴＡクローニング用ベクター：ＰＣＲに使用する耐熱性ポリメラーゼが末端トランスフェラーゼ活性を有するために、ＰＣＲで増幅したＤＮＡの３’末端にデオキシアデニル酸を１個付加する性質を利用し、５’‐ｄＴ突出末端を持つベクタ−pCR^TMIIにそのままサブクローニングする方法）ベクターにサブクローンした。任意に選択した28クローンについてＱＩＡＧＥＮ‐ｔｉｐ１００（DIAGEN社製）を使用してプラスミドＤＮＡを精製し、これをTaq Dy e Deoxy^TMTerminater Cycle Sequening Kit（アプライドバイオシステムズ社製；ＰＣＲを利用した、蛍光色素で行なうジデオキシ法：Sangerら、Proc．Natl． Acad．Sci．USA、74、5463-5467、1977）を用いて、アプライドバイオシステムズ社製373ADNAシークエンサー（蛍光シークエンサー）によりシークエンスし、各クローンの塩基配列を決定した。得られたDNA断片の中で、ＡＰ８のアミノ酸のＮ末端側３個（Ｉｌｅ／Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）‐Ｖａｌ‐ＰｒｏをAP8-2Rのプライマーに隣接してコードするものを選択し、全長をシークエンスしたところ、２６1bpを有するcDNAを含んでいた。このcDNA断片の１７３〜１７５の塩基配列はメチオニンをコードするものでありコーディングのフレームはＡＰ８のアミノ酸のフレームと一致した。またこの配列の前後はKozakの配列（Kozak,M.，Cell，44，283-292、1986）に適合することから翻訳の開始部位と推定され、ラットＴＰＯタンパク質のＮ末部分をコードするcDNA断片と考えられた。このcDNA断片をＡ１と命名した。ベクターの配列を除いたＡ１断片の塩基配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号１）に示した。〈実施例９〉ＰＣＲ法によるラットＴＰＯcDNAのスクリーニング前述のcDNAライブラリーを約１万クローンづつのプールに分け、50μg/mlのAm picilinを含む１mlのLB培地中で一夜培養した後、プラスミド自動分離装置PI-10 0（倉敷紡績社製、VER-3.0；アルカリＳＤＳ法：Molecular Cloning［Sambrook ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989］：の変法にもとづくプラスミドＤＮＡ自動抽出機）を用いてプラスミドDNAを抽出した。その1/30量を鋳型としてフラグメントＡ１をもとに設計した２種の合成オリゴヌクレオチド５’ＣＧＡＧＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧ３’（配列番号31）（配列番号１の配列の１-17のセンス配列；ＣＧＡＧはアダプターの配列）および５’ＣＡＧＡＧＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＧＧＴＧＡＧ３’（配列番号32）（配列番号１の配列の212-232のアンチセンス配列）をプライマーとして合成・精製し、GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TM DNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMPCR System9600（PERKIN-EL MER社製）によりPCR反応（94℃で30秒間の変性条件、66℃で30秒間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で30回の反応）を行った結果、100プール中３プールに236bpの特異的バンドが検出された。このうちの１プールを約900クローンづつのプールに分けプラスミドＤＮＡを抽出し、同様のPCR反応を行ったところ、1 00プール中３プールにバンドが検出された。さらにこのうちの１プールを40クローンづつのプールに分け、同様の選別を行なった結果100プール中３プールで特異的と考えられるバンドが観察された。これらのうち１プールを選び50μg/mlの Ampicilinを含むLBプレート（15％アガーを含むＬＢ培地）上に蒔き、出現した１つ１つのコロニーについてプラスミドＤＮＡを抽出し同様のPCR反応を行った結果、１００クローン中２クローンで陽性バンドを検出した。〈実施例１０〉ラットＴＰＯcDNAのシークエンスプラスミドDNAの精製は本質的にMolecular Cloning ［Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。実施例９で最終的に得られた２個のクローンを50μg/ml のAmpicilinを含む50mlのLB培地で一夜培養した後、実施例６と同様に精製し、最終的に約300μgのプラスミドDNAを得た。ここで得られたプラスミドDNAをTaq Dye Deoxy^TMTerminater Cycle Sequening Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、実施例８と同様にシークエンスし、ｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定した。その結果、２個のクローンの塩基配列は完全に一致し同一のクローンであることが明かとなった。この中から１クローンを選び該ｃＤＮＡを担持したプラスミドクローンをｐＥＦ１８Ｓ‐Ａ２α と命名した。塩基配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号２）に示した。配列表（配列番号２）に示す配列の特徴は顕著である。172bpの5’非翻訳領域後の配列は、メチオニンに始まる21個のタンパク質から成る分泌のためのシグナル配列と推定される、疎水性に富むアミノ酸をコードしている。このタンパク質は126個のアミノ酸残基を有し、停止コドン（ＴＡＡ）の後に1025ヌクレオチドの3’非翻訳配列及びポリＡ尾部の多数のアデニンが続く。このタンパク質中には、実施例２で解析された部分アミノ酸配列ＡＰ８に対応する配列のみが含まれていた（配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１２）。N−グリコシル化のための配列部位は存在しない。また、3’非翻訳配列末端近くの1624〜162 9のヌクレオチド配列は、コンセンサス配列とは異なるが、潜在的ポリアデニル化配列と考えられる。大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＥＦ１８Ｓ‐Ａ２αは１９９４年２月１４日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４５６５として寄託した。〈実施例１１〉ラットＴＰＯcDNAのＣＯＳ１細胞での発現及びＴＰＯ活性の確認プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αのCoS1細胞へのトランスフェクションは、クロロキン処理を含むDEAE‐デキストラン法（Sompayracら、Proc．Natl．Acad．S ci．USA 78巻、7575-7578頁、（1981）；Luthmanら、Nucl．Acids Res.、11巻、 1295-1308頁、（1983））に若干の改変を加えた以下の方法に従い実施した。10%FCSを含むDMEM培養液に浮遊させたCOS1細胞（ATCC CRL1650）を直径100mmの組織培養用プラスティックシャーレに入れ、５%炭酸ガス培養器中にて37℃で約40％コンフルエントになるまで培養した。一方、500μg/mlのDEAE ‐デキストラン（ファルマシア社）、80μMのクロロキン（シグマ社）、８％（v /v）のHBS（21mM HEPES‐145mM NaCl、pH7.1）及び９％（v/v）のNu-Serum（コラボレイティブ社）を含む４mlのDMEM培養液に30μｌのHBSに溶解したプラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２α（10μg）を混和し、トランスフェクション直前にDMEM 培養液で２度洗浄した上記のCOS1細胞に添加した後、５％炭酸ガス培養器中にて 37℃で５時間培養した。その後、培養上清を吸引除去しDMEM培養液でシャーレを２度洗浄した後、10％FCSを含むDMEM培養液を15ml加え、５％炭酸ガス培養器中にて37℃で３日ないしは５日間培養し、培養上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラットＣＦＵ‐ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αをトランスフェクションして発現させたCOS1細胞の培養上清中に用量依存的にTPO活性が認められ（図７）、また、ラットTPOの場合と同様に培養４日目に多数のcytoplasmic process formation形成が認められた。一方、インサートを含まないプラスミドｐＥＦ１８ＳをトランスフェクションしたCOS1細胞培養上清では TPO活性は検出されなかった（図７）。また、Ｍ‐０７ｅアッセイ系においても、プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αをトランスフェクションして発現させたCOS1 細胞の培養上清中に用量依存的にM-07e細胞増殖促進活性が認められ、インサートを含まないプラスミドｐＥＦ１８ＳをトランスフェクションしたCOS1細胞培養上清では活性が認められなかった。これらの結果から、ｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αが TPO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を担持していることが確認された。次に、このTPO活性のin vivo血小板増加作用を調べるため、部分精製品を調製した。調製過程でのTPO活性測定には、ラットCFU-MKアッセイ系を用いた。まず、プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞を、０．２ｍｇのＢＳＡを含む無血清培養液で３日間培養し、約５．８Ｌの無血清培養上清を得た。その無血清培養上清に、ｐ−ＡＰＭＳＦを最終濃度１ｍＭ加え、０．２２μｍの濾過フィルターで通過する濾液をとった。この体積５７９３ml （蛋白質濃度０．２２９ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量１３２６ｍｇ、相対活性１０００、総活性量１３２６０８０）に対し１０００ｍｌ当り0.85molesのNaCl（合計288ｇ）を加え、最終濃度0.822M NaCl，5849mlの溶液とした後、１M NaCl，20mM Na Phospha te pH7.2で予め平衡化してあったTSK-gel AF-BLUE 650MHカラム（トーソー社製、カタログ番号08705；直径５cm、ベッド高６cm）に、流速７ml/minで添加した。添加終了後、20mMNa Phosphate，１M NaCl，pH7.2で溶出される素通り（約790 0ml）を集め、これを限外濾過ユニット（フィルトロン社・オメガウルトラセット分子量8000カット）で濃縮し、素通り画分Ｆ１（460ml,蛋白質濃度2.11mg/m l,総蛋白質量973mg，相対活性16.3）を得た。次に、溶出液を２M NaSCNにかえ、溶出されたTSK-gel AF-BLUE 650MH吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（2840ml）を限外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径76ｍｍ）を用いて、6.81mlまで濃縮した。このＴＰＯ活性画分Ｆ２の総蛋白質量は12.5mg、このステップでのＦ２の蛋白質収量は0.62%であった。また、ＴＰＯの相対活性は、240であった。次に、 HiLoad 26/60 Superdex200pg（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17 -1071-01；直径2.6cm、ベッド高60cm）カラムに注入し、流速１ml/minで、50ｍＭのNaClを含む20mM Na Acetate，pH5.5 で展開した。展開開始後に溶出した194mlから260mlまでの範囲の画分にＴＰＯ活性が確認できた。そこで、これをまとめて、Superdex200pgのＴＰＯ活性画分Ｆ２（66ml，蛋白質濃度0.112mg/ml，総蛋白質量7.41mg,相対活性142860、総活性量1058600）とした。次に、展開溶媒Ａ（20mM Na Acetate，pH5.5）および展開溶媒Ｂ（500mMのNaClを含む20mM Na Phophate，pH7.2）を用意し、１００％Ａで平衡化した強陽イオン交換カラムのRESOURCE S（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-1178-01；直径0.64cm、ベッド高３cm）カラムに、流速１ml／ minで、注入した。次いで、流速0.3ml/minで、40分かけて100％Ａから１００％Ｂまでの直線濃度勾配にて展開した。アッセイの結果、広い範囲（５％Ｂから３２％Ｂの範囲）にＴＰＯ活性が溶出されていることが分かった。このTPO活性画分をまとめて、限外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径25ｍｍ）で濃縮し、RESOURCE SのＴＰＯ活性画分Ｆ２（1.65ml，蛋白質濃度4.74mg/ml,総蛋白質量7.82mg,相対活性71400、総活性量558600）を得ることができた。得られた標品は純粋なＴＰＯ標品ではなかったが、ラットCFU-MKアッセイ系において、十分に高い活性が確認されたので、マウスへの投与実験を実施した。即ち、投与前日に血小板数を測定しておいたＩＣＲ系マウス（９週齢；♂）の皮下へ、TPO部分精製品（474μｇ（100μｌ）／マウス／日）、対照としてBSA（200 μｇ（100μｌ）／マウス／日）、あるいは対照としてTPO部分精製品が溶解されている緩衝液と同じ組成の緩衝液（100μｌ／マウス／日）を５日間連日投与し、６日目に心臓より採血して血小板数を測定した（F800；東亜医用電子）。ＴＰＯ部分精製品投与マウスでは投与前に比べて平均して約2.14倍の血小板数の増加を認めた。また、投与群の間で比較すると、ＴＰＯ部分精製品投与マウスでは、 BSA投与マウスに比べて約1.74倍、あるいは緩衝液のみを投与したマウスに比べて約1.90倍の血小板数の増加を認めた。この結果から、TPOが生体内において血小板増加作用を有することが明らかとなった。なお、ＴＰＯ部分精製品投与マウスにおいて、マウスの急性期蛋白質の１種であるimmunosuppresive acidic prot ein（IAP）の増加が認められなかったことから、TPOは急性期蛋白質の誘導に関してIL-6やIL-11とは性格を異にすることが強く示唆された。〈実施例１２〉ラット各種組織でのＴＰＯｍＲＮＡの検出ラットＴＰＯｍＲＮＡがラット体内においてどの組織で発現しているかを確認するために、ラットの各種組織よりＲＮＡを抽出した。実施例１に記載されているものと同様にＸ線照射を行なった１１日目ないし１４日目のラット６匹より各種組織（脳、胸腺、肺、肝臓、心臓、脾臓、小腸、腎臓、精巣および骨髄細胞）を摘出し速やかに液体窒素で凍結した。全ＲＮＡの抽出にはＲＮＡ単離用試薬ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬）を使用した。凍結した組織の重量に応じた量のＩＳＯＧＥＮ試薬を加え、ホモジナイザー（ヒスコトロン；日音医理科器械製作所；ＮＳ ‐６０）により、組織が完全に破砕されるまで（およそ10000ＲＰＭで４５〜６０秒）処理した後、全ＲＮＡ抽出操作を行なった（ChomczynskiらのAcid Guanid ium Phenol Chroloform法にもとづく抽出法：Anal．Biochem.、162：156-159、1 987を参照）。その結果、それぞれの組織より1.1ｍｇ〜5.6ｍｇの全ＲＮＡが得られた。全RNAからポリ（A）⁺RNAの精製はOligotex^TM-dT30(Super) （日本合成ゴム／日本ロッシュ社製）を用いて行い全RNA約500μｇより20μｇのポリ（A）⁺RNAを得た。得られた各種組織のポリ（A）⁺RNAそれぞれ１μgよりランダムプライマーを使用してcDNAの１本鎖目を合成した。ポリ（A）⁺RNA１μｇを１０μｌの滅菌水に溶かし７０℃で１５分間加温後急冷し、７５pmoleランダムプライマー（宝酒造社製）、１０Ｕ RNase Inhibitor（ベーリンガーマンハイム社製）、５０mM Tr is-HCl（pH8.3）、７５ｍＭ KCl、３ｍＭMgCl₂、２００Ｕ superScript^TMII（ライフテクノロジー社製逆転写酵素）となるようにそれぞれの試薬を加え（全量２０μｌ）、３７℃で１時間保温した。反応液を７０℃で１０分間加熱し酵素を失活させた後−２０℃で使用時まで保存した。実施例１０で得られたラットＴＰＯのｃＤＮＡ配列より新たにＰＣＲ用プライマーを合成した。合成したプライマーの配列は以下の通り。ｒＴＰＯ‐Ｉ：５’‐ＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧ‐３’（配列番号３３）（配列番号２の347〜367）ｒＴＰＯ‐Ｎ：５’‐ＴＧＡＡＧＴＴＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴＣ‐３’（配列番号３４）（配列番号２の1005〜1025に対応するアンチセンス）合成したcDNA反応液のそれぞれ0.1容を鋳型に用いここで合成したプライマー（ｒＴＰＯ‐Ｉ、ｒＴＰＯ‐Ｎ）をそれぞれ１μＭ使用してＰＣＲを実施した。 GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMPCR System9600（PERKIN-ELMER社製）により100μｌの容量でPC R反応（95℃で２分間加熱後、95℃で１分間の変性条件、57℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で30回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。ここで得られた反応液を、２％アガロースゲル（FMC Bi oProducts社製）を用いた電気泳動にかけ増幅されたバンドを観察したところ、脳、肝臓、小腸並びに腎臓で特異的と考えられるバンドが観察された。この結果より、発現量の多少は判断できないがラットにおいてはこれらの組織でＴＰＯｍＲＮＡが発現していると考えられた。人においても同様な発現様式を示すことが示唆されるが実施例４の結果と合わせて考えると、肝臓がヒトＴＰＯｃＤＮＡ取得のための出発材料としては適当であると判断された。〈実施例１３〉ヒト正常肝臓由来cDNAライブラリーの構築実施例１２の結果より、肝臓をヒトＴＰＯｃＤＮＡクローニングのための材料に選び、市販の正常ヒト肝臓由来ポリ（A）⁺RNA（Clontech社製：ChomczynskiらのAcid Guanidium Phenol Chroloform法にもとづいて抽出したもの）５μｇを用い実施例７と同様にTimeSaver^TMcDNA Synthesis Kit（Pharmacia社製）およびDI RECTIONAL CLONING TOOLBOX（Pharmacia社製）を使用して、５’端にEcoRI、３ ’端にNotI認識部位を持つ２本鎖cDNΛを合成した。合成したcDNAは1.2μｇの予めEcoRIおよびNotIで処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓと連結させ、8.4mlのコンピテント・ハイE.coli DH5（東洋紡績社製）を形質転換した。その結果、1.2 ×10⁶個の形質転換体が得られた。〈実施例１４〉ＰＣＲによるヒトＴＰＯcDNA断片の取得（クローニング）市販の正常ヒト肝臓由来ポリ（A）⁺RNA（Clontech社製）１μｇよりランダムプライマーを使用してcDNAの１本鎖目を合成した。ポリ（A）⁺RNA１μｇを１０ μｌの滅菌水に溶かし７０ ℃で１５分間加温後急冷し、７５pmoleランダムプライマー（宝酒造社製）、１０Ｕ RNase Inhibitor（ベーリンガーマンハイム社製）、５０mM Tris-HCl(pH8. 3)、７５ｍＭ KCl、３ｍＭ MgCl2、２００Ｕ SuperScript^TMII（ライフテクノロジー社製）となるようにそれぞれの試薬を加え（全量２０μｌ）、３７℃で１時間保温した。反応液を７０℃で１０分間加熱し酵素を失活させた後−２０℃ で使用時まで保存した。ラットＴＰＯcDNA配列（配列番号２）よりＰＣＲ用プライマーを合成した。プライマーの配列は以下の通り。ｒＴＰＯ‐ＡＩＮ：５’‐ＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＣ−３ ’（配列番号３５）（配列番号２の173〜193）ｒＴＰＯ‐Ｎ：５’‐ＴＧＡＡＧＴＴＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴＣ‐３’（配列番号36）（配列番号２の1005〜1025に対応するアンチセンス）合成したcDNA反応液の0.1容を鋳型に用いここで合成したプライマー（ｒＴＰＯ‐ＡＩＮ、ｒＴＰＯ‐Ｎ）をそれぞれ１μＭ使用してＰＣＲを実施した。Gene Amp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMPCR System9600（PERKIN-ELMER社製）により 100μｌの容量でPCR反応（95℃で２分間加熱後、95℃で１分間の変性条件、40℃ で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で35回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。ここで得られた反応液を、２％アガロースゲル（FMC BioProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、このPCR反応の主要産物である約620bpのDNA断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。この精製したDNA断片をTaq Dye Deoxy^TMTerminater Cycle Sequening Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、アプライドバイオシステムズ社製37 3ADNAシークエンサーにより直接シークエンスしヌクレオチド配列を決定した。プライマー部分を除く塩基配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号３）に示した。このDNA断片はプライマー配列を除くと５８０ｂｐの長さを有し、ラットcDNA 塩基配列との比較を行なった結果、８６％の相同性を持つことが明かとなり、ヒトＴＰＯcDNAの一部をコードするDNA断片であると考えられた。〈実施例１５〉ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯcDNAのスクリ−ニング配列番号３をもとにヒトＴＰＯに対応するＰＣＲ用プライマーを合成した。配列は以下の通り。ｈＴＰＯ‐Ｉ：５’‐ＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧ‐３’（配列番号３７）（配列番号３の60-80）ｈＴＰＯ‐Ｊ：５’‐ＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣ‐３’（配列番号38）（配列番号３の479-499に対応するアンチセンス）実施例１３において構築したヒトcDNAライブラリーを増幅し約１０万個のクローンを１個の集団とするプールに分割し、５０μg/mlのAmpicilinを含む１mlのＬＢ培地中で一夜培養した後、プラスミド自動分離装置PI-100（倉敷紡績社製、 VER-3.0）を用いてプラスミドDNAを抽出した。抽出したDNAはTE溶液に溶解した。抽出したDNAの５％を鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ‐Ｉ、ｈＴＰＯ‐Ｊ）をそれぞれ１μＭ使ってＰＣＲを実施した。GeneAmp^TMPCR Rea gent Kli with AmpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、 GeneAmp^TMPCR System9600（PERKIN-ELMER社製）により20μｌの容量でPCR反応（ 95℃で１分間の変性条件、59℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で35回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った結果、９０プール中３プールで特異的と考えられるバンドが検出された。これらのうち１プールを選び、約５０００クローンづつのプールに分け９０プールよりプラスミドDNAを精製し、再度同一の条件でＰＣＲを実施した。その結果、５個のプールでバンドが検出された。これらより１プールを選択し２５０個のクローンを１プールとするサブプールに分け、９０プールについてプラスミドDNAを抽出した。これらについて同様にＰＣＲを行なった処、３個のプールでバンドが観察された。これらより１プールを選択し３０個のクローンを１プールとしてサブプールを作り、９０プールからプラスミドＤＮＡを精製しＰＣＲを実施した結果３個のプールでバンドが観察された。これらのうち１プールを選び５０μg/mlのAmpicili nを含むＬＢプレート上にまき、９０個のコロニーについて同様にプラスミドDNA を抽出しＰＣＲによる確認を行なった結果、最終的にクローンＨＬ３４を得た。〈実施例１６〉ヒトＴＰＯcDNAのシークエンスプラスミドDNAの精製は本質的にMolecular Cloning［Sambrookら、Cold Sprin g Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。クローンＨＬ３４を50μg/mlのAmpicilinを含む50mlのLB培地で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体を４mlのTEG-lysozyme溶液に懸濁し、8mlの0.2N NaOH/ １%SDS溶液を加えてよく懸濁する。さらに３M potassium/５M acetate溶液を６m l加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノールークロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはTE溶液に溶解後、RNAse処理、フェノール−クロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を行なう。ペレットを再度TE溶液に溶解し、NaCl、ポリエチレングリコール3000をそれぞれ0.63M、7.5％になるように加えて遠心する。最後に、ペレットはTE溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。これにより約 300μｇのプラスミドＤＮＡｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４を得た。精製したプラスミドDNAについてTaq Dye Deoxy^TM Terminater Cycle Sequening Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製373ADNAシークエンサーによりシークエンスし、全長のヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチド配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号４）に示した。ヌクレオチド配列決定に必要なプライマーは配列番号３の配列をもとに合成したプライマー並びに、それらのプライマーによるシークエンス反応で解析された内部配列をもとに設計した合成プライマーを使用した。その結果、得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４は８６１塩基対のｃＤＮＡ断片を含み、実施例２で分析されたラットＴＰＯの部分アミノ酸配列ＡＰ８（配列番号４：アミノ酸番号１〜１２）及びＴＰ２／ＴＰ３（配列番号４：アミノ酸番号１５７〜１６２）と相同性の高い配列が確認された。このＤＮＡ断片は、２５塩基目から始まるオープンリーディングフレームをコードしていると考えられたが、終止コドンは無く３’端には７６塩基からなるポリＡ尾部様配列を持っていた。ポリＡ尾部様配列直前までの２５３個のアミノ酸配列はラットＴＰＯｃＤＮＡのもの（配列番号２の１４７残基のアミノ酸配列部分）と比較すると８４％の相同性を持っておりラットＴＰＯに対応するヒトのｃＤＮＡの一部をコードするＤＮＡ断片と考えられた。終止コドンが無く３’ 端にポリＡ尾部様配列を持っていたことから、このクローンは完全なｃＤＮＡを反映するものではなく、ｃＤＮＡライブラリー作製時の人工産物であることが示唆された。〈実施例１７〉ヒトＴＰＯcDNAのＣＯＳ１細胞での発現及びＴＰＯ活性の確認得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８−ＨＬ３４のCOS１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミＤＮＡ１０μ ｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ‐デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日ないし５日後に培養上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラットＣＦＵ‐ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清では用量依存的にＴＰＯ活性が認められ（図８）、また、培養４日目に多数の巨核球による突起形成が観察された。一方、インサートを含まない発現プラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認められなかった（図８）。また、Ｍ‐０７ｅアッセイ系においてもｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清にのみＭ‐０７ｅ細胞増殖促進活性が認められた。これらの結果から、ｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４がＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ｃＤＮＡ断片を担持していることが判明した。また、ヒトＴＰＯがラットにも作用する（種特異性がない）ことも明らかとなった。〈実施例１８〉ヒトＴＰＯ欠失型ｃＤＮＡの発現及びＴＰＯ活性の確認実施例１５で得られたクローンＨＬ３４のヒトＴＰＯｃＤＮＡは、その３’側にポリＡ尾部様の連続配列を持っていたが、この配列はラットＴＰＯｃＤＮＡには観られず実験上の人工産物である可能性が示唆された。そこで、このポリＡ尾部様配列を欠失させたｃＤＮＡを作製し、発現させた蛋白質がＴＰＯとしての活性を示すか検討した。欠失体の作製にはＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用プライマーの配列を下記に示す。それぞれの５’端には制限酵素認識配列を付加してある（ｈＴＰＯ５にはEcoRI、ｈＴＰＯ３にはNotI並びに２つのストップコドンＴＡＡＴＧＡを付加した）。実施例１６で得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ５、ｈＴＰＯ３）各１０μＭを使ってＰＣＲを実施した。GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMPCR System9600 （PERKIN-ELMER社製）により100μｌの容量でPCR反応（95℃で１分間の変性条件、65℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で15回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。得られた約800ｂｐのバンドを制限酵素EcoRI並びにNotIで消化後精製し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした。得られた形質転換体より約800ｂｐのＤＮＡ断片を含むクローンを５個選択しプラスミドＤＮＡを大量調製した（方法は実施例５参照）。それぞれのプラスミドについては、ＰＣＲで増幅した部分の約800ｂｐ全領域に関してヌクレオチド配列の決定を行ない実施例１６で解析したヌクレオチド配列（配列番号４の1-780）と完全に一致していることを確認した。このプラスミドクローンをｐＨＴ１‐２３１と命名した。大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＴ１‐２３１は１９９４年２月１４日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４５６４として寄託した。得られたプラスミドのＣＯＳ１細胞での発現は実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ‐ デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日ないし５日後に培養上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して透析後、ラットＣＦＵ‐ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＨＴ１−２３１をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清ではＴＰＯ活性が認められ（図９）、また、培養４日目に多数の巨核球による突起形成が観察された。一方、ｃＤＮＡインサートを含まない発現プラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認められなかった（図９）。また、Ｍ‐０７ｅアッセイ系においてもｐＨＴ１−２３１をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清にのみＭ‐０７ｅ細胞増殖促進活性が認められた。これらの結果から、ｐＨＴ１−２３１に含まれるｃＤＮＡ断片はＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが明らかとなった。〈実施例１９〉ＰＣＲによるヒトＴＰＯＣ末側領域のクローニング実施例１５で得られたクローンＨＬ３４のヒトＴＰＯｃＤＮＡはその３’末端にポリＡ尾部様配列を持っており、３’部分は不完全なクローンであることが示唆された。そこで、ＰＣＲにより完全長の３’領域を取得することを試みた。実施例１６で決定した塩基配列よりＰＣＲ用５’側プライマーを４種類合成した。また、３’側プライマーとしてはポリＡ部分直後からの増幅を期待して３’端にミックスのヌクレオチドを４ベース含む以下のプライマーを合成した。また、ミックス部分を含まないアンカープライマーも合成した。実施例１４と同様にヒト正常肝臓由来ポリ（A）⁺RNA（Clontech社製）１μｇよりｃＤＮＡの１本鎖目を合成した。ただし、プライマーとしてはオリゴｄＴプライマー（Pharmacia社製のTimeSaver^TM cDNA Synthesis Kitに添付のものを0.5μｇ）を使用した。ｃＤＮＡ合成の反応液の0.1容を鋳型として１回目のＰＣＲを実施した。ＰＣＲにはGeneAmp^TMPCR Reagent Kit wｉth AmpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）並びに、GeneAmp^T ^M PCR System9600（PERKIN-ELMER社製）を用いた。プライマーにはｈＴＰＯ‐Ｈ（20μＭ）及びｈＴＰＯ３mix（10μＭ）を使用し50μｌの容量で反応を行なった（96℃２分間の後に、96℃１分間／48℃１分間／72℃１分間を10サイクル反応し、さらに72℃７分間）。１回目の反応液の0.1容を鋳型として２回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ‐Ｋ（20μＭ）及びｈＴＰＯ３mix（10μＭ）を使用し50μｌの容量で反応を行なった（96℃２分間の後に、96℃１分間／63℃１分間／72℃１分間を10サイクル反応し、さらに72℃７分間）。２回目の反応液の0.1容を鋳型として３回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ‐Ｎ（20μＭ）及びｈＴＰＯ３mix（10μＭ）を使用し50μｌの容量で反応を行なった（96℃２分間の後に、96℃１分間／63℃１分間／72℃１分間を10サイクル反応し、さらに72℃７分間）。３回目の反応液の0.1容を鋳型として４回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｏ（20μＭ）及びｈＴＰＯ３mix（10μＭ）を使用し50μｌの容量で反応を行なった（96℃２分間の後に、96℃１分間／63℃１分間／72℃１分間を10サイクル反応し、さらに72℃７分間）。４回目の反応液の0.1容を鋳型として５回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ‐Ｏ（20μＭ）及びｈＴＰＯ３anchor（20μＭ）を使用し50μｌの容量で反応を行なった（96℃２分間の後に、96℃１分間／58℃１分間／72℃１分間を10サイクル反応し、さらに72℃７分間）。ここで得られた反応液を、２％アガロースゲル（FMC BioProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、このPCR反応の主要産物である約６００bpのDNA断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。この精製したDNA断片をTaq Dye Deoxy^TMTerminater Cycle Sequening Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、アプライドバイオシステムズ社製 373ADNAシークエンサーにより直接シークエンスし塩基配列を決定した。塩基配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号５）に示した。このＤＮＡ断片はプライマーｈＴＰＯ‐Ｏに始まる１３０個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を持っており、さらに３’側に１８０塩基以上の配列が続いていた（577塩基目以降は解読できなかった）。このＤＮＡ断片にコードされるグリシンに始まる３０個のアミノ酸配列は配列番号４で記載したアミノ酸番号２０３〜２３２のアミノ酸配列と一致した。同時に１番から９４番目までの塩基配列も配列番号４の６９２〜７８５のものと一致していた。実施例１７のｃＤＮＡ断片の解析及び本例のＰＣＲ増幅断片の解析の結果より、配列番号６に記載するように、ヒトＴＰＯタンパク質は２１残基のシグナル配列を含む３５３個のアミノ酸からなると推定される。〈実施例２０〉ヒト正常肝臓由来cDNAライブラリーの再構築実施例１５で得られたクローンＨＬ３４は、オープンリーディングフレームに終止コドンを持たず、その３’末端にポリＡ尾部様配列を持っておりｃＤＮＡ合成の際の人工産物であることが考えられたため、新たに市販の正常ヒト肝臓由来ポリ（A）⁺RNA（Clontech 社製）５μｇを用い、ｃＤＮＡライブラリーを構築し直した。ｃＤＮＡの合成にはSuperScript^TMLambda System for cDNA Synthesis and λCloning Kit並びにS uperScript^TMII RNaseH-（ともにLIFE TECHNOLOGIES社製）を使用した。ポリ（A ）⁺ＲＮＡを熱変性後、Kitに付属のＮｏｔＩ配列付きオリゴｄＴをプライマーとして含む２０μｌの反応液（50mM Tris-HCl、pH8.3／75mM KCl／3mM MgCl₂／1mM DTT／1mM dNTP／200U SuperScript^TMII RNaseH-）に加え、３７℃で６０分間保温した。ｃＤＮＡの２本鎖目を合成（25mMTris-HCl、pH8.3、100mM KCl、５mM MgCl₂、各250μM dNTPs、５mM DTT、40U E．coli DNA polymeraseI、2U E．co li RNaseH、10U E.coli DNA ligaseを含む150μｌの反応液中で16℃２時間保温）後、10U T4 DNA polymaraseを加えさらに16℃で５分間保温した。反応液を65 ℃で10分間加熱後等量のフェノールークロロホルムで１回抽出し、SizeSep^TM400 spun column（Pharmacia社製のTimeSaver^TMcDNA Synthesis Kitに付属の低分子量DNA除去用スパンカラム）により400ｂｐより小さいｃＤＮＡを除いた。このサンプルにEcoRI Adaptor（Pharmacia社製のTimeSaver^TMcDNA Synlhesis Kitに付属のもの）を付加後制限酵素NotIで消化したものを、再度SizeSep^TM400spun columnにかけ、低分子量のＤＮＡを除去した。これによって得られた、５’端にEcoRI、３’端にN otI認識配列を持つ２本鎖cDNAはそれぞれ1.3μｇであり、予めEcoRIおよびNotI で処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓと連結させ、9.2mlのコンピテント・ハイE .coli DH5（東洋紡績社製）を形質転換した。その結果、得られたヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ｈＴＰＯ‐Ｆ１）は1.0×10⁶個の形質転換体を含むものであった。〈実施例２１〉ヒト肝臓cDNAライブラリ−ｈＴＰＯ‐Ｆ１からのＴＰＯｃＤＮＡクローンのスクリーニング配列表中の配列番号３及び６をもとにヒトＴＰＯcDNAに対応するＰＣＲ用プライマーを合成した。配列は以下の通り。ｈＴＰＯ‐Ｉ：５’‐ＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧ‐３’（配列番号48）（配列番号３の60-80）ｈＴＰＯ‐ＫＵ：５’‐ＡＧＧＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡ‐３’ （配列番号49）（配列番号６の901-921に対応するアンチセンス）実施例２０において構築したヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーｈＴＰＯ‐Ｆ１（ 1.0×10⁶個）を３つのプール（＃１〜３）に分割し凍結保存した。それぞれのプールよりプラスミドＤＮＡを調製し、その１％を鋳型として、合成したプライマー（ｈＴＰＯ‐Ｉ及びｈＴＰＯ‐ＫＵ）各１μMを用いてＰＣＲを行なった。Gen eAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TM DNA Polymerase（宝酒造社製）を使用して、GeneAmp^TMPCR System9600（PERKIN-ELMER社製）により100μｌの容量でＰＣＲ（95℃で１分間の変性条件、59℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で35回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った結果、＃３のプール由来のプラスミドＤＮＡを用いた場合に予想される大きさのＤＮＡが増幅された。そこで、この＃３のプールを15000個のサブプールに分割し、50μg/mlのAmpicillinを含む１mlのＬＢ培地中で１夜培養した後、プラスミド自動分離装置PI-100を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡはTE 溶液に溶解し、その５％を鋳型としてＰＣＲを実施した（使用したプライマー、反応条件は上記と同一である）。その結果、９０プール中６プールで予想される大きさのＤＮＡが増幅された。これらのうち１プールを選択し 1000個のクローンを１つの集団とするサブプールに分割し、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製しＰＣＲを行なったがＤＮＡの増幅は観察されなかった。一連のＰＣＲで増幅されるＤＮＡの電気泳動上のバンドの濃さは、サブプールを細かくして行くに連れ、薄くなってきた。そのため、求めるクローンの増殖が良くないためプラスミドＤＮＡの回収が悪く、ＰＣＲによる増幅が弱くなり最終的に増幅されなくなったことが考えられた。そこで＃３のプールに戻り、コロニーハイブリダイゼイションによるスクリーニングを行なうことにした。＃３のプールより、15cmのＬＢプレートあたり4100個のコロニーとなるようにクローンをまき、100枚のプレートを作製した。それぞれのプレートについて１枚づつレプリカプレートを作製し、それらのうち片方のプレートを３７℃でさらに６時間培養してからコロニーを回収しプラスミドＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡについて上記と同様のＰＣＲを実施したところ、100プール中１プールで予想される大きさのバンドの増幅が観察された。そこでこのプールのプレートより２枚のレプリカフィルターを作製した（PALL社製BIODYNE^TMA TRANSFER MEMBRANEを使用）。フィルターの変性は10％SDS10分間、0.5N NaOH/1.5M NaCl10分間、0.5M Tris-HCl（pH8 .0）/1.5M NaCl10分間行ない、30分間風乾後80℃の真空オーブン中で１時間ベーキングした。ベーキングしたフィルターは６×SSC（20×SSCは１ｌ中に175.3g N aCl）88.2gを含みpH7.0の溶液）/１％SDSで軽く洗浄後、プレハイブリダイゼイションを行なった。反応液の組成は50％ホルムアミド、５×SSC、５×Denhardt ’s solution（50×Denhardt’s solutionは500ml中に５g Ficoll、５g polyvin ylpyrrolidone、５g bovine serum albumin fraction Vを含む溶液）、１％SDS 、20μg/mlサケ精子ＤＮＡを含むもので、30mlの溶液中で42℃30分間振盪しながら保温した。プレハイブリダイゼイションを行なった後、同組成のハイブリダイゼイション溶液30mlと交換後、［α‐³²Ｐ］dCTP（アマシャム社製）で放射標識したプローブ（プラスミドｐＥＦ１８Ｓ‐ＨＬ３４のEcoRI/BamHI断片：配列番号４の５’末端から４５８塩基目までを精製し、ランダムプライマー法で標識したもの；Anal．Biochem.、132、6-13、1983に記載の方法を利用したアマシャム社製キットMegaprime DNA labelling systemを使用）を加え、４２℃で２０時間振盪しながら保温した。フィルターは２×SSC/0.1％SDS溶液中で４２℃３０分間洗浄後、さらに0.2×SSC/0 .1％SDS溶液中で４２℃３０分間洗浄した。フィルターを増強スクリーン及びX-O MATTMAR５フィルム（イーストマンコダック社製）により−７０℃１６時間オートラジオグラフィーを行なった。その結果、陽性と考えられるシグナルが１個観察された。そこで、もとのプレートよりシグナル周辺のコロニーをかきとり、１０cmのLBプレートにまきなおした。得られたコロニー５０個を培養しDNAを調製後プライマーｈＴＰＯ‐Ｉ及びｈＴＰＯ‐ＫＵを用いてＰＣＲを実施した（条件等は上記と同一）。その結果、１クローンのみ予想通りのバンドが増幅された。このクローンをｐＨＴＦ１と命名した。〈実施例２２〉ヒトＴＰＯcＤＮＡクローンｐＨＴＦ１のシークエンスプラスミドＤＮＡの精製は本質的にMolecular Cloning［Sambrookら、Cold Sp ring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。クローンｐＨＴＦ１を50μg/mlのAmpicillinを含む50mlのLB培地で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体を４mlのTEG-lysozyme溶液に懸濁し、８mlの0.2N NaOH/ １%SDS溶液を加えてよく懸濁する。さらに３M potassium/５M acetate溶液を６m l加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノール−クロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはTE溶液に溶解後、RNAse処理、フェノールークロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を行なう。ペレットを再度TE溶液に溶解し、NaCl、ポリエチレングリコール3000をそれぞれ0.63M、7.5％になるように加えて遠心する。最後に、ペレットはTE溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。これにより約 300μｇのプラスミドＤＮＡｐＨＴＦ１を得た。精製したプラスミドＤＮＡについてTaq Dye Deoxy^TMTerminater Cycle Sequen ing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製373ADNAシークエンサーによりシークエンスし、全長のヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチド配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号７）に示した。ヌクレオチド配列決定に必要なプライマーは配列番号６の配列をもとに合成したプライマヌクレオチドびに、それらのプライマーによるシークエンス反応で解析された内部配列をもとに設計した合成プライマーを使用した。その結果、得られたクローンｐＨＴＦ１は１７２１塩基対のｃＤＮＡ断片からなり、実施例２で分析されたアミノ酸配列ＡＰ８（配列番号７：アミノ酸番号１〜１２）及びＴＰ２／ＴＰ３（配列番号７：アミノ酸番号１５７〜１６２）と相同性の高い配列が確認された。このＤＮＡ断片は、１０１塩基目までの５’ノンコーディング領域に続く、１０２〜１０４塩基目にコードされるメチオニンに始まり１１５８〜１１６０塩基目にコードされるグリシンまで続く３５３個のアミノ酸からなるオープンリーディングフレームをコードしていると考えられ、それに続く停止コドン（ＴＡＡ）以降の３’ノンコーディング領域を５３１塩基と３０個のポリＡ尾部配列を持っていた。このオープンリーディングフレームにコードされると考えられるタンパク質のアミノ酸配列は配列番号６に記載の、ヒトＴＰＯの予想されるアミノ酸配列と完全に一致した。ヌクレオチド配列は配列番号６の配列より５’側で７７塩基分、３’側のポリＡ尾部配列直前までの領域で３４７塩基分長いｃＤＮＡをコードしていた。またヌクレオチド配列は、配列番号６と３箇所で異なっていた。異なるヌクレオチド配列は配列番号７のＡ（８４塩基目）が配列番号６ではＣ、Ａ（７４０塩基目）がＴ、Ｇ（１１９８塩基目）がＡであった。２番目の塩基（７４０塩基目）のみ、タンパク質のコーディング領域内の変異であったが、スレオニンの３番目のコドンであり、アミノ酸の変換は起こさなかった。この塩基配列の置換が何に起因するのかはこの時点では明らかでなかったが、得られたクローンｐＨＴＦ１の解析より、ヒトＴＰＯタンパク質は２１残基のシグナル配列を含む３５３個のアミノ酸からなることが確認できた。シグナル配列を除いたタンパク質の推定分子量は３５４６６であった。大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＴＦ１は１９９４年３月２４日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ‐４６１７として寄託した。〈実施例２３〉ヒトＴＰＯcDNAクローンｐＨＴＦ１のＣＯＳ１細胞での発現及びＴＰＯ活性の確認得られたクローンｐＨＴＦ１のＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ‐ デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して透析後、ラットＣＦＵ‐ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＨＴＦ１を発現させたＣＯＳ１細胞培養上清では用量依存的にＴＰＯ活性が認められたが、ｃＤＮＡインサートを含まない発現プラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ１培養上清では活性が認められなかった（図１０ａ）。類似の結果は、Ｍ‐０７ｅアッセイ系においても得られ、ｐＨＴＦ１を発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中に有意なＭ‐０７ｅ細胞増殖促進活性を認めた（図１０ｂ）。これらの結果から、ｐＨＴＦ１に含まれるｃＤＮＡはＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが明確になった。〈実施例２４〉ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのクローニングヒトＴＰＯｃＤＮＡをプローブとしてヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのクローニングを行なった。クローニングに使用したゲノミックライブラリーは東北大学遺伝子実験施設山本徳男教授よりいただいた（Sakaiら、J．Biol．Chem.、269、2173-2182、1994に記載のライブラリーで、ヒト染色体ＤＮＡを制限酵素Sau3AIによって部分分解したものをStratagene社製ファージベクターLambda EMBL3のBamHI部位につないで構築したライブラリー）。このライブラリーよりヒトＴＰＯｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングを実施したが、用いた手法はすべて本質的にMolecular Cloning ［Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。大腸菌ＬＥ３９２を宿主菌として、１５cmのNZYMプレート（1l中に10g NZamine、５g NaCl、５g bacto yeast extract、２g MgCl₄ 7H₂O 、15％agarを含むPH7.0のもの）１枚あたり３万個となるようにファージをまき、１８枚のプレートを作製した。それぞれのプレートより各２枚のレプリカフィルターを作製した（PALL社製BIODYNE^TMA TRANSFER MEMBRANEを使用）。フィルターの変性は0.5N NaOH/1.5M NaCl10分間、0.5M Tris-HCl（pH8.0）/1.5M NaCl10 分間行ない、30分間風乾し80℃の真空オーブン中で1.5時間ベーキングした。プレハイブリダイゼイションは50％ホルムアミド、５×SSC、５×Denhardt’s sol ution、１％SDS、20μg/mlサケ精子ＤＮＡを含む５００mlの溶液中で４２℃１時間行なった。プローブはヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片（配列番号７の塩基配列番号178-1025）をＰＣＲで増幅後精製したものをRandom Primer DNA labelling kit（宝酒造社製；Anal．Biochem. 、132、６-13、1983に記載のランダムプライマー法を利用したＤＮＡ標識キット）を用いて³²Ｐ標識したものを用いた。ＰＣＲに使用したプライマーの配列は以下の通り。ｈＴＰＯ‐Ｉ：５’‐ＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧ‐３’（配列番号50）（配列番号７の178-198）ｈＴＰＯ‐Ｎ：５’‐ＡＧＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＡＴＡＣＴＧＴＣＣ‐３’（配列番号51）（配列番号７の1005-1025に対応するアンチセンス）ハイブリダイゼイションはプレハイブリダイゼイションと同じ組成の溶液を５００ml使用し、放射標識したプローブを加え４２℃で２０時間行なった。フィルターは２×SSC/0.1％SDS溶液中室温で５分間づつ３回洗浄後、0.1×SSC/0.1％SD S溶液中で６８℃１時間の洗浄を行なったのち、増強スクリーン及びX-OMAT^TMAR ５フィルム（イーストマンコダック社製）により−７０℃１６時間オートラジオグラフィーを行なった。その結果、１３個の陽性シグナルが得られた。もとのプレートより１３個の陽性シグナル周辺のプラークを拾い上げ、１５cmのNZY Mプレート１枚あたり１０００プラークとなるようにまき直した。それぞれのプレートから各２枚のレプリカフィルターを作製し、上記と同じ条件でハイブリダイゼイションを実施した。その結果、１３組全てのフィルターで陽性シグナルが検出された。各プレートより１個づつプラークを単離し、Molecular Cloningに記載のPlate Lysate法でファージＤＮＡを調製した。１３クローンのファージＤＮＡについてｃＤＮＡのコーディング領域を含んでいるかどうかをＰＣＲによってチェックした。チェックに使用したプライマーの配列は以下の通り。ｈＴＰＯ‐Ｌ：５’‐ＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣ‐３’（配列番号52）（配列番号６の1-21）ｈＴＰＯ‐Ｆ：５’‐ＡＴＧＧＧＡＧＴＣＡＣＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴ‐３’（配列番号53）（配列番号６の127-147に対応するアンチセンス）ｈＴＰＯ‐Ｐ：５’‐ＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧ‐３’（配列番号54）（配列番号６の503-523）ｈＴＰＯ‐Ｖ：５’‐ＡＡＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡ‐３’（配列番号55）（配列番号６の1070-1090に対応するアンチセンス）これらのプライマーの組み合わせにてＰＣＲを実施したところ、１３クローンのうち５クローンはｃＤＮＡから予測されるアミノ酸のコーディング領域を全て含んでいると考えられた。これら５クローンに含まれる染色体ＤＮＡの長さは約２０kbpとそろっており、予備的に検討した制限酵素解析でもほぼ同一のパターンを示した。そこでこれらのクローンのうち１個（クローンλＨＧＴ１）を選択し、Southern blot解析を行なった。すなわち、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡ各１μｇを制限酵素EcoRIまたはHindIIIで完全に消化し、0.8％アガロースゲルで泳動後、PALL社製BIODYNE^TMA TRANSFER MEMBRANEに転写した。フィルターは３０分間風乾後80℃の真空オーブン中で２時間ベーキングした。プレハイブリダイゼイションは50％ホルムアミド、５×SSC、５×Denhardt’s solution、１％SDS、 20μg/mlサケ精子ＤＮＡを含む５０mlの溶液中で４２℃１時間行なった。プローブはヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片（配列番号７の塩基配列番号178-1025）をＰＣＲで増幅後精製したものをRandom Primer DNA la belling kit（宝酒造社製）を使用して³²Ｐ標識したものを用いた。ハイブリダイゼイションはプレハイブリダイゼイションと同じ組成の溶液を５０ml使用し、放射標識したプローブを加え４２℃で２０時間行なった。フィルターは２×SSC/ 0.1％SDS溶液中室温で５分間づつ３回洗浄後、0.1×SSC/0.1％SDS溶液中で６８ ℃１時間の洗浄を行なったのち、増強スクリーン及びX-OMATTMAR５フィルム（イーストマンコダック社製）により−７０℃１６時間オートラジオグラフィーを行なった。その結果、制限酵素HindIIIで消化した場合に約１０kbpの単一のバンドが観察された。そこで、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡ１０μｇを制限酵素HindII Iで消化後0.8％アガロースゲルで泳動し、10kbpのバンドを切り出して、プレップ‐Ａ‐ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、同様にHidIII で消化したクローニングベクターｐＵＣ１３（Pharmacia社製）にサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイE.coli DH5を使用した）。得られたクローンのうち、１０kbpのHindIII断片を含むクローンを選択しｐＨＧＴ１と命名した。ファージクローンλＨＧＴ１のおおまかな制限酵素地図を図１１に示す。〈実施例２５〉ヒトＴＰＯ染色体クローンｐＨＧＴ１のシークエンスｐＨＧＴ１クローンを培養しプラスミドＤＮＡの精製を行なった。方法は本質的にMolecular Cloning［Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1 989)］に記載されているようにして実施した。クローンｐＨＧＴ１を50μg/mlの Ampicillinを含む50mlのLB培地で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体を４ mlのTEG-lysozyme溶液に懸濁し、８mlの0.2N NaOH/１%SDS溶液を加えてよく懸濁する。さらに３M potassium/５M acetate溶液を６ml加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノールークロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはTE溶液に溶解後、 RNase処理、フェノールークロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を行なう。ペレットを再度TE溶液に溶解し、NaCl、ポリエチレングリコール3000 をそれぞれ0.63M、7.5％になるように加えて遠心する。最後に、ペレットはTE溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。これにより約300μｇのプラスミドＤＮＡｐＨＧＴ１を得た。精製したプラスミドＤＮＡについてTaq Dye Deoxy^TMTerminater Cycle Sequen ing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製373ADNAシークエンサーによりシークエンスし、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列から予想される、タンパク質コーディング領域周辺のヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチド配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号８）に示した。ヌクレオチド配列決定に必要なプライマーは実施例２２で使用した、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析に用いたもの並びに、それらのプライマーによるシークエンス反応で解析された内部配列をもとに設計した合成プライマーを使用した。その結果、プラスミドクローンｐＨＧＴ１が担持する染色体ＤＮＡは、配列番号６で予想されたアミノ酸のコーディング領域を全て含みその領域に関しては、ヌクレオチド配列は完全に一致していた。また、アミノ酸をコードするエクソンに相当する領域は４つのイントロンによって分断されており、イントロンの長さは５’側から順に231bp、286bp、1932bp、236bpであった。配列番号７に記載のｃＤＮＡヌクレオチド配列とは３箇所で異なっていた（図11）。異なるヌクレオチド配列は実施例２２で記載した箇所（配列番号６と７の相違点）と同一であり、配列番号７のＡ（８４塩基目）がＣ、Ａ（７４０塩基目）がＴ、Ｇ（１１９８塩基目）がＡであった。すなわち、実施例２１で取得したヒトＴＰＯｃＤＮＡクローンｐＨＴＦ１のヌクレオチド配列は、ヒト染色体のヌクレオチド配列と３箇所で異なることが明かとなった。そこで、このヌクレオチド配列の変異が本来の配列を反映するものであるか解析するために、スクリーニングで最終的に選択された５個の染色体ＤＮＡクローンのうち、ヌクレオチド配列を決定していない残りの４クローンについて、配列の決定を行なった。配列の解析はMolecular Cloningに記載のPlate Lysate法で調製したファージＤＮＡを使用した直接ヌクレオチド配列決定法で行なった。反応には上記３箇所のヌクレオチド配列変異点を解析できる位置の実施例２２で合成したシークエンスプライマー並びに、Taq Dye Deoxy^TMTerminater Cycle Sequening Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製373ADNA シークエンサーによりシークエンスした。その結果、４個全てのクローンで配列番号７の８４塩基目がＣ、７４０塩基目がＴであり、配列番号７のｃＤＮＡとは異なり、配列番号６のものと一致した。１１９８塩基目についてはＧのクローンが２個、Ａのクローンが２個であった。すなわち、染色体ＤＮＡ本来のヌクレオチド配列が２種類あることが明かとなった。この配列の違いが相同染色体に由来するものか、複数存在する遺伝子に由来するものかは、現時点では不明である。また、購入したClontech社製ポリ（A）⁺RNAがCaucasi an由来であるのに対し、染色体ＤＮＡの由来が日本人であることから、ヌクレオチド配列の変異は人種の違いに起因する可能性も示唆される。大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＧＴ１は１９９４年３月２４日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ‐４６１６として寄託した。〈実施例２６〉ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＯＳ１細胞での発現と活性確認サブクローニングして得られたプラスミドクローンｐＨＧＴ１には、インサート部分に３箇所、ベクター内に１箇所、合計４箇所のEcoRI認識配列が存在するが、インサート内の一番５’側のEcoRI認識配列とベクター内のEcoRI認識配列にはさまれる約4.3kbpのＤＮＡ断片に、ヒトＴＰＯタンパク質のコーディング領域が全て含まれることが、ヌクレオチド配列の解析から明らかになった。そこで、この断片をEcoRI処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにつなぎ、４個のヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＥＦＨＧＴＥ＃１‐４を得た（前述の図１１）。これらのプラスミドＤＮＡを調製し発現実験を行なった。プラスミドＤＮＡの精製は本質的にMolecular Cloning［Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(198 9)］に記載されているようにして実施し、約250μｇのプラスミドＤＮＡを得た。得られたクローンｐＥＦＨＧＴＥ＃１‐４のＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ‐デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して透析後、ラットＣＦＵ‐ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＥＦＨＧＴＥを発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中に用量依存的にＴＰＯ活性が認められ、一方、ＤＮＡインサートを含まない発現プラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認められなかった。クローン＃１〜４のいずれでもほぼ同様の結果が得られたが、代表例としてｐＥＦＨＧＴＥ＃１における結果を図１２ａに示した。また、Ｍ‐ ０７ｅアッセイ系においても、ｐＥＦＨＧＴＥを発現させたＣＯＳ１細胞培養上清にて用量依存的に有意なＭ‐０７ｅ細胞増殖促進活性が認められた。代表例として、ｐＥＦＨＧＴＥ＃１における結果を図１２ｂに示した。これらの結果より、得られたクローンｐＥＦＨＧＴＥ＃１〜４が担持するDNA はヒトＴＰＯの機能的染色体ＤＮＡであることが、明らかとなった。〈実施例２７〉ヒトＴＰＯ欠失型ＤＮＡの作製、ＣＯＳ１細胞での発現及びＴＰＯ活性の確認実施例１８の結果より、ヒトＴＰＯはそのカルボキシル側の除去後でさえ生物活性を発現しうることが明かとなったが、その活性発現に必要な領域を解析する目的で、欠失誘導体の作製並びに発現を行なった。この実施例で、ｐＨＴ１−２３１によってコードされるＴＰＯタンパク質（アミノ酸1-231）のカルボキシル末端から20、40、60又は68アミノ酸を欠失したＴＰＯ欠失誘導体について、ＴＰＯ in vitro生物活性能を調べた。最も短い誘導体（アミノ酸１〜163）は、実施例２に記載されるラット血漿ＴＰＯのＴＰ2/3に対応するアミノ酸配列を依然として含んでいた。実施例１８で得たプラスミドクローンｐＨＴ１−２３１のＤＮＡを鋳型として用いかつ合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲにより欠失プラスミドを作製した。ＰＣＲ用に作製したプライマーの配列は以下の通り。ｈＴＰＯ−５：５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣ−３’（配列番号56）（配列番号４の１−２１にＥｃｏＲＩ配列を付加したもの；表９に記載のものと同一）ｈＴＰＯ−Ｓ：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴ−３’（配列番号57）（配列番号４の５５５−５７６のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−１６３をコードする欠失誘導体作製用）ｈＴＰＯ−４：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＣＡＧＴＧＴＧＡＧＧＡＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号58）（配列番号４の５７６−６００のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ認識配列を付加；アミノ酸１−１７１をコードする欠失誘導体作製用）ｈＴＰＯ−３０：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＴＴＴＧＴＣ−３’（配列番号59）（配列番号４の６３６−６６０のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−１９１をコードする欠失誘導体作製用）ｈＴＰＯ−２：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＣＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＴ−３’（配列番号60）（配列番号４の６９６−７２０のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−２１１をコードする欠失誘導体作製用）実施例１８で得たクローンｐＨＴ１−２３１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ‐５を５’側として使用、ｈＴＰＯ−２、−３、４、−Ｓを３’側として使用）をそれぞれ１０μＭ使ってＰＣＲを実施した。GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMPCR System9600（PERKIN-ELMER社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ（95℃で１分間の変性条件、66℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で20回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲで得られたバンドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化後、１％アガロースゲル（FMC BioProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、それぞれのＰＣＲ反応の予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ‐Ａ‐ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コンピテント・ハイE.coliＤＨ５を使用）。得られた形質転換体のうち、それぞれ予想される長さのインサートを含むクローンをそれぞれ４個ないし５個づつ選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にMolecular Cloning［Sambrookら、Cold Spring Harbo r Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。一連の操作によってアミノ酸１−１６３をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−１６３＃１− ５）、アミノ酸１−１７１をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−１７１＃１−４）、アミノ酸１−１９１をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−１９１＃１−４）、アミノ酸１−２１１をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−２１１＃１−４）のプラスミドＤＮＡを得た。各プラスミドＤＮＡの全長増幅領域をヌクレオチド配列分析に掛けた結果、配列番号４に示されるヌクレオチド配列と完全に一致することが判明した。得られたそれぞれのクローンのＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ‐デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収した。培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して透析後、ラットＣＦＵ‐ ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＨＴ１−２１１、ｐＨＴ１−１９１、ｐＨＴ１−１７１、およびｐＨＴ１−１６３を発現させたいずれのＣＯＳ１細胞培養上清でも用量依存的にＴＰＯ活性を認めた。代表例としてｐＨＴ１−２１１＃１、ｐＨＴ１−１９１＃１、およびｐＨＴ１−１７１＃２における結果を図１３ａに、ｐＨＴ１−１６３＃２における結果を図１３ｂに示した。類似の結果は、Ｍ‐０７ｅアッセイ系においても得られ、ｐＨＴ１−２１１、ｐＨＴ１−１９１、ｐＨＴ１−１７１、およびｐＨＴ１−１６３を発現させたいずれのＣＯＳ１細胞培養上清でも用量依存的に有意なＭ‐０７ｅ細胞増殖促進活性を認めた。代表例として、ｐＨＴ１−２１１＃１、ｐＨＴ１−１９１＃１、ｐＨＴ１−１７１＃２、およびｐＨＴ１−１６３＃２における結果を図１４に示した。これらの結果より、ヒトＴＰＯタンパク質は、１６３位のＳｅｒの後のカルボキシル末端側部分を欠失させても、in vitroにおける生物活性が保持されることが明らかとなり、１６３位のＳｅｒまでのアミノ末端側部分の中に、ヒトＴＰＯの生物活性領域が含まれていることが示唆された。〈実施例２８〉ヒトＴＰＯＣ末側欠失体の作製、ＣＯＳ１細胞での発現及び活性確認ヒトＴＰＯ蛋白質の活性発現に必須な領域の解析を行なう目的で、実施例２７で得られた欠失体よりもさらにＣ末側アミノ酸を欠失させた誘導体を作製しＣＯＳ１細胞内でＴＰＯ活性を発現しうるかどうか検討した。実施例１６で得たプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ‐ＨＬ３４をもとに、１６３番目のセリンを基準にＣ末端側から順次アミノ酸を欠失させた発現プラスミドを構築した。これら欠失プラスミドの構築にはＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用に作製したプライマーの配列は、次の通りである。ｈＴＰＯ−５：５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣ−３’（配列番号61）（配列番号４の１−２１にＥｃｏＲＩ認識配列を付加したもの；実施例18に記載のものと同一）ｈＴＰＯ−１５０：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＡＡＧＣＡＴ−３’（配列番号62）（配列番号４の５１４−５３７のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ認識配列を付加；アミノ酸１−１５０をコードする欠失体作製用）ｈＴＰＯ−１５１：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＡＡ−３’（配列番号63）（配列番号４の５１８−５４０のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ認識配列を付加；アミノ酸１−１５１をコードする欠失体作製用）ｈＴＰＯ−１５３：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＣＣＣ−３’（配列番号64）（配列番号４の５２６− ５４６のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ認識配列を付加；アミノ酸１−１５３をコードする欠失体作製用）ｈＴＰＯ−１５４：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号65）（配列番号４の５２９− ５４９のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ認識配列を付加；アミノ酸１−１５４をコードする欠失体作製用）ｈＴＰＯ−１５５：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＧＴ−３’ （配列番号66）（配列番号４の５３２−５５２のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ認識を付加；アミノ酸１−１５５をコードする欠失体作製用）ｈＴＰＯ−１５６：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＴＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号67）（配列番号４の５３５− ５５５のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ認識配列を付加；アミノ酸１−１５６をコードする欠失体作製用）ｈＴＰＯ−１５７：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡ−３’（配列番号68）（配列番号４の５３８− ５５８のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ認識配列を付加；アミノ酸１−１５７をコードする欠失体作製用）。実施例１６で得たクローンｐＥＦ１８Ｓ‐ＨＬ３４のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−５を５’側として使用、ｈＴＰＯ−１５０、−１５１、−１５３、−１５４、−１５５、−１５６、−１５７を３’側として使用）をそれぞれ１０μＭ使ってＰＣＲを実施した。GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMPCR System 9600（PERKIN-ELMER社製）により１００μｌの容量でPCR反応（95℃で１分間の変性条件、66℃で１分間のアニール条件、72℃ で１分間の合成条件で20回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲで得られたバンドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化後、１％アガロースゲル（FMC BioProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、それぞれのＰＣＲ反応の予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ‐Ａ‐ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コンピテント・ハイE.coliＤＨ５を使用）。得られた形質転換体のうち、それぞれ予想される長さのインサートを含むクローンをそれぞれ３個ないし５個づつ選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にMolecu lar Cloning［Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。一連の操作によってアミノ酸番号１−１５０をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５０＃21、 22、25）、アミノ酸番号１−１５１をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５１＃16 、17、18）、アミノ酸番号１−１５３をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５３＃１−５）、アミノ酸番号１−１５４をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５４＃１ −５）、アミノ酸番号１−１５５をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５５＃１− ５）、アミノ酸番号１−１５６をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５６＃１−５）、アミノ酸番号１−１５７をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５７＃１−５）のプラスミドＤＮＡを得た。精製したプラスミドDNAｐＨＴ１−１５０＃21、22、25並びにｐＨＴ１−１５１＃16、17、18についてはTaq Dye Deoxy^TMTerminater CyclｅSequening Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製37 3ADNAシークエンサーによりシークエンスし、全長にわたり塩基配列の置換がなく、予想通りのTPOcDNA配列を持つことを確認した。得られたそれぞれのクローンのCOS１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ‐デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収した。培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、Ｍ -07eアッセイ系で評価した。その結果、１５１位のアミノ酸であるシステインを含む、それぞれアミノ酸１−１５１位、１−１５３位、１−１５４位、１−１５５位、１−１５６位、１−１５７位からなるＣ末側欠失誘導体をコードするクローンをトランスフェクションしたC0S1細胞培養上清中には用量依存的にＴＰＯ活性が検出された。しかしながら、１５１個目のシステインまでを欠失させたアミノ酸１−１５０位のＣ末側欠失誘導体をコードするクローンをトランスフェクションしたC0S1細胞培養上清中にはTPO活性が検出されなかった。〈実施例２９〉ヒトＴＰＯＮ末側欠失体の作製、ＣＯＳ１細胞での発現及び活性確認ヒトＴＰＯ蛋白質の活性発現に必須な領域の解析を行なう目的で、実施例２８で得られた欠失体をもとに、Ｎ末側アミノ酸を欠失させた誘導体を作製しＴＰＯ活性を発現しうるかどうか検討した。実施例１６で得たプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ‐ＨＬ３４並びに、実施例２７で得たプラスミドクローンｐＨＴ１−１６３をもとに、シグナル配列に続くＮ末端側アミノ酸を欠失させた発現プラスミドを構築した。構築にはＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用に作製したプライマーの配列は、次の通りである。ｈＴＰＯ−５：５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣ−３’（配列番号69）（配列番号４の１−２１にＥｃｏＲＩ認識配列を付加したもの；実施例18に記載のものと同一）ｈＴＰＯ３：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＴＴＣＧＴＧＴＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号70）（配列番号４の７５７− ７８０のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ認識配列を付加；アミノ酸１−２３１をコードする欠失体作製用に合成したものと同一）ｈＴＰＯ−Ｓ：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴ−３’（配列番号71）（配列番号４の５５５−５７６のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡとＴＧＡ及びＮｏｔＩ認識配列を付加；アミノ酸１−１６３をコードする欠失体作製用）ｈＴＰＯ−１３：５’−ＡＧＴＡＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧ−３’（配列番号72）（配列番号４の１２４−１７３；アミノ酸番号１−１２を欠失する誘導体作製用）ｈＴＰＯ−１３Ｒ：５’−ＣＡＴＧＧＧＡＧＴＣＡＣＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴＡＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’（配列番号73）（配列番号４の６４−８７並びに１２４−１４８のアンチセンス；アミノ酸番号１−１２を欠失する誘導体作製用）ｈＴＰＯ−７：５’−ＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号74）（配列番号４の１０６−１５４；アミノ酸番号１−６を欠失する誘導体作製用）ｈＴＰＯ−７Ｒ：５’−ＴＴＴＡＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＧＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’ （配列番号75）（配列番号４の６４−８７並びに１０６−１２９のアンチセンス；アミノ酸番号１−６を失する誘導体作製用）ｈＴＰＯ−８：５’−ＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＡ−３’ （配列番号76）（配列番号４の１０９−１５７；アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体作製用）ｈＴＰＯ−８Ｒ：５’−ＣＡＧＴＴＴＡＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＧＧＡＧＧＴＣＧＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’（配列番号77）（配列番号４の６４−８７並びに１０９−１３２のアンチセンス；アミノ酸番号１− ７を欠失する誘導体作製用）。（１）アミノ酸番号１−１２を欠失する誘導体（ｐＨＴ１３‐２３１）作製実施例１８で得たクローンｐＥＦ１８Ｓ‐ＨＬ３４のプラスミドＤＮＡ１．４ μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−１３及びｈＴＰＯ３を組で使用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−１３Ｒを組で使用）をそれぞれ５μ Ｍ使ってＰＣＲを実施した。GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TMDNA Polymerase （宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMPCR System 9600（PERKIN-ELMER社製）により１００μｌの容量でPCR反応（95℃で５分間変性後、95℃で１分間の変性条件、65℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で30回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（FMC BioProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ‐Ａ‐ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型として用い２回目のＰＣＲを実施した。合成したプライマー（ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ３を使用）をそれぞれ５μ Ｍ使ってＰＣＲを実施した。GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TMDNA Po lymerase（宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMPCR System 9600（PERKIN-ELMER社製）により１００μｌの容量でPCR反応（95℃で５分間変性後、95℃で１分間の変性条件、60℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で30回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（FMC BioProdu cts社製）を用いた電気泳動にかけ、予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ‐Ａ‐ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。制限酵素EcoRI並びにNotIで消化後、等量のフェノール／クロロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を行なった。遠心で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッファーに溶解後、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コンピテント・ハイE.coliＤＨ５を使用）。得られた形質転換体のうち、予想される長さのインサートを含むクローンを４５個選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にMolecular Cloning［Sambrookら、Cold Spring HarborLab oratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。アミノ酸番号１ −２３１をコードする蛋白質のうち１−１２を欠失する欠失誘導体（ｐＨＴ１３ −２３１）のプラスミドＤＮＡを得た。これらについてｈＴＰＯ‐５並びにｈＴＰＯ３のプライマーを用いたＰＣＲを行ない、４５クローンのうち８クローンで予想される大きさ程度のインサートが確認された。それらのうち３クローンついてはTaq Dye Deoxy^TMTerminater Cycle Se quening Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製373ADNAシークエンサーによりシークエンスし、１クローンで、予想通りの欠失が起こっており、またその他の部分も含めて全長にわたりヌクレオチド配列の置換等がなく、設計通りのTPOcDNA配列を持つクローンｐＨＴ１３− ２３１＃３が得られた。（２）アミノ酸番号１−６を欠失する誘導体（ｐＨＴ７−１６３）の作製上記（１）の欠失誘導体作製においては、ＴＰＯ蛋白質のＣ末端を２３１番目のアミノ酸として設計したが、Ｃ末端側はさらに欠失させてもＴＰＯ活性を発現しうることが確認されたため、今回の欠失体作製にあたってはＣ末端を１６３番目のアミノ酸までとして設計した。下記（３）においても同様に１６３番目のアミノ酸をＣ末端として設計した。実施例２７で得たクローンｐＨＴ１−１６３のプラスミドＤＮＡ１．４μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−７及びｈＴＰＯ−Ｓを組で使用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−７Ｒを組で使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。 GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMCR System 9600（PERKIN-ELMER社製）により１００μｌの容量でPCR反応（95℃で５分間変性後、95℃で１分間の変性条件、65℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で30回の反応を行い、さらに７分間72℃ でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（FMC BioProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ‐Ａ‐ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型として用い２回目のＰＣＲを実施した。合成したプライマー（ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−Ｓを使用）をそれぞれ５ μＭ使ってＰＣＲを実施した。GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMPCR System 9600（PERKIN-ELMER 社製）により１００μｌの容量でPCR反応（95℃で５分間変性後、95℃で１分間の変性条件、60℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で30回の反応を行い、さらに７分間72 ℃でインキュベート）を行った。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（FMC Bi oProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ‐Ａ‐ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。制限酵素EcoRI並びにNotIで消化後、等量のフェノール／クロロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を行なった。遠心で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッファーに溶解後、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コンピテント・ハイE.coliＤＨ５を使用）。得られた形質転換体のうち、予想される長さのインサートを含むクローンを３０個選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にMolecular Cloning［Sambrookら、Cold Spring Har bor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。配列番号４において、アミノ酸番号１−１６３をコードする蛋白質のうち１−６を欠失する欠失誘導体（ｐＨＴ７−１６３）のプラスミドＤＮＡを得た。これらのクローンにつてはｈＴＰＯ‐５並びにｈＴＰＯ‐Ｓをプライマーとして用いたＰＣＲを実施し、全てのクローンで予想される大きさ程度のインサートを含むことが確認された。これらのクローンより３個を選択し、Taq Dy e Deoxy^TMTerminater Cycle Sequening Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製373ADNAシークエンサーによりシークエンスし、２クローンで、予想通りの欠失が起こっており、またその他の部分も含めて全長にわたり塩基配列の置換等がなく、設計通りのTP0cDNA配列を持つ２個のクローンｐＨＴ７−１６３＃４、＃２９が得られた。（３）アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体（ｐＨＴ８−１６３）作製アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体（ｐＨＴ８−１６３）の作製方法は上記、アミノ酸番号１−６を欠失する誘導体（ｐＨＴ７−１６３）の作製と本質的には同様の方法で行なった。実施例２７で得たクローンｐＨＴ１−１６３のプラスミドＤＮＡ１．４μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−８及びｈＴＰＯ−Ｓを組で使用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−８Ｒを組で使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with Am pliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、 GeneAmp^TMPCR System 9600（PERKIN-ELMER社製）により１００μｌの容量でPCR 反応（95℃で５分間変性後、95℃で１分間の変性条件、65℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で30回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（FMC Bi oProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ‐Ａ‐ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型として用い２回目のＰＣＲを実施した。合成したプライマー（ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−Ｓを使用）をそれぞれ５ μＭ使ってＰＣＲを実施した。GeneAmp^TMPCR Reagent Kit with AmpliTaq^TMDNA Polymerase（宝酒造社製）を用いて、GeneAmp^TMPCR System 9600（PERKIN-ELMER 社製）により１００μｌの容量でPCR反応（95℃で５分間変性後、95℃で１分間の変性条件、60℃で１分間のアニール条件、72℃で１分間の合成条件で30回の反応を行い、さらに７分間72℃でインキュベート）を行った。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（FMC BioProducts社製）を用いた電気泳動にかけ、予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ‐Ａ‐ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。制限酵素EcoRI並びにNotIで消化後、等量のフェノール／クロロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を行なった。遠心で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッファーに溶解後、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コンピテント・ハイE.coliＤＨ５を使用）。得られた形質転換体のうち、予想される長さのインサートを含むクローンを３０個選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にMolecular Cloning ［Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。配列番号４において、アミノ酸番号１−１６３をコードする蛋白質のうち１−７を欠失する欠失誘導体（ｐＨＴ８−１６３）のプラスミドＤＮＡを得た。これらのクローンについてはｈＴＰＯ‐５並びにｈＴＰＯ‐Ｓをプライマーとして用いたＰＣＲを実施し、全てのクローンで予想される大きさ程度のインサートを含むことが確認された。これらのクローンより３個を選択し、Taq Dye Deoxy^TMTerminater Cycle Sequening Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製373ADNAシークエンサーによりシークエンスし、２クローンで、予想通りの欠失が起こって起こっており、またその他の部分も含めて全長にわたり塩基配列の置換等がなく、設計通りのTPOcDNA配列を持つ２個のクローンｐＨＴ８−１６３＃３３、＃４８が得られた。（４）欠失誘導体のＣＯＳ１細胞での発現とＴＰＯ活性の確認得られたそれぞれの欠失体クローンのCOS１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ‐デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収した。培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、M-07eアッセイ系で評価した。その結果、アミノ酸７−１６３位の欠失誘導体をコードするクローンをトランスフェクションしたCOS１細胞培養上清中に弱いながらも用量依存的にTPO活性を認めた。一方、アミノ酸８−１６３位、１３−２３１位の欠失誘導体をコードするクローンをトランスフェクションしたCOS１細胞培養上清中にはTPO活性が認められなかった。〈実施例３０〉ヒトＴＰＯ完全長ｃＤＮＡプラスミド（ｐＨＴＰ１）の作製配列番号６のように予想されたヒトＴＰＯｃＤＮＡのアミノ酸コーディング領域を全て持つ、動物細胞発現ベクターの構築を行なった。ＰＣＲによりヒトＴＰＯｃＤＮＡコーディング領域を全てカバーするＤＮＡ断片を以下の様に作製した。用いたプライマーのヌクレオチド配列は次の通りである。ｈＴＰＯ‐Ｉ：５’‐ＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧ‐３’（配列番号78）（配列番号６の105〜125）ＳＡ：５’‐ＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣ‐３’（配列番号 79）（配列番号６の745〜765に対応するアンチセンス）ｈＴＰＯ‐Ｐ：５’‐ＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧ‐３’（配列番号80）（配列番号６の503〜523）ｈＴＰＯ‐ＫＯ：５’‐ＧＡＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴ‐３’（配列番号81）（配列番号６の 1066〜1086に対応するアンチセンス配列に制限酵素NotIの認識配列並びにＧＡＧＡＧＡ配列（配列番号82）を付加したもの）。実施例１６で得られたクローンｐＥＦ１８Ｓ‐ＨＬ３４の３００ngを鋳型として１回目のＰＣＲを行なった。プライマーｈＴＰＯ−Ｉ並びにＳＡ各0.5μＭを用い、Vent R^TMDNA polymerase（New England BioLabs社製）１ユニットを使用して反応（96℃１分間、62℃１分間、72℃１分間という反応を30サイクル行なった後72℃７分間）を行なった。反応溶液の組成は以下の通り。最終濃度で10mM K Cl、10mM(NH₄)₂SO₄、20mM Tris-HCl(pH8.8)、２mM MgSO₄、0.1%Triton X-100、2 00μM dNTP mix。市販のヒト正常肝臓由来ポリ（Ａ）+ＲＮＡ（Clontech社製）１μｇを70℃で1 0分間加熱後氷上で急冷し、10mM DTT、500μM dNTP mix、25ng random primer（宝酒造社製）、10ユニット RNase Inhibitor（ベーリンガーマンハイム社製）、200ユニットSuperScript^TMII RNaseH-（LIFE TECHNOLOGIES社製）を加え、37 ℃で１時間保温しｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ反応液の20分の１量を鋳型として使用して２回目のＰＣＲを行なった。プライマーｈＴＰＯ‐Ｐ並びにｈＴＰＯ‐ＫＯ各2.5μＭ、2.5ユニットのAmpliT aq^TMDNA polymerase（宝酒造社製）を用いて反応（95℃１分間、58℃１分間、72 ℃１分間の反応を30サイクル）を行なった。第１及び第２回のＰＣＲ溶液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、それぞれ予想された大きさの主要なバンドをプレップ‐Ａ‐ジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。それぞれの精製量のうち各20分の１量を鋳型として３回目のＰＣＲを実施した。Vent R^TMDNA polymerase（New England BioL abs社製）１ユニットを使用して反応（96℃２分間加熱後、96℃２分間、72℃２分間、という反応を３サイクル行なった後72℃７分間）を行なった。この反応液にそれぞれ１μＭとなるようにｈＴＰＯ‐Ｉ並びにｈＴＰＯ‐ＫＯを加えた後、 96℃２分間の加熱を行ない、そののち96℃１分間、62℃１分間、72℃１分間の反応を25サイクル行なったあと72℃でさらに７分間反応させた。反応液を等量の水飽和フェノール‐クロロホルムで１回抽出後、さらに等量のクロロホルムで１回抽出したのち、エタノール沈殿（0.3M酢酸ナトリウム、0.5μｌベーリンガーマンハイム社製グリコーゲン、2.5倍量エタノール存在下）を行なってＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを制限酵素BamHI並びにNotIで消化後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、予想された大きさの主要なバンドをプレップ‐ Ａ‐ジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製したのち、予め同様に制限酵素BamHI並びにNotIで消化したpBluescriptII SK+ベクター（Stratage ne社）に連結後、コンピテントハイE.coli DH5（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたコロニーより４クローンを選びプラスミドＤＮＡを調製した。精製したプラスミドDNAについてはTaq Dye Deoxy^TMTerminater Cycle Sequening Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製37 3ADNAシークエンサーによりシークエンスし、BamHIからNotIにかけての領域に塩基配列の置換がなく、予想通りのTPOcDNA配列を持つことが確認できたクローンｐＢＬＴＰを得た。ｐＢＬＴＰを制限酵素EcoRI並びにBamHIで消化後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、高分子量のバンドをプレップ‐Ａ‐ジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。同様にｐＥＦ１８Ｓ‐ＨＬ３４も制限酵素処理し４５０ bpのバンドを精製した。それぞれのＤＮＡをLigationしコンピテントハイE.coli DH5（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、ヒトＴＰＯｃＤＮＡのインサートを含むクローンｐＢＬＴＥＮを得た。得られたｐＢＬＴＥＮを制限酵素EcoRI並びにNotIで消化後、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約1200bpのバンドをプレップ‐Ａ‐ジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した後、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓに連結しコンピテントハィE.coli DH5（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、ヒトＴＰＯｃＤＮＡのコーディング領域を全て含むクローンｐＨＴＰ１を得た。このクローンのプラスミドＤＮＡを大量に調製し以下の実験に使用した。プラスミドＤＮＡの調製は本質的にMolecular Cloning（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss、1989）に記載されているようにして実施した。〈実施例３１〉ＣＨＯ細胞内でのヒトＴＰＯ発現用の哺乳動物発現プラスミド、pDEF２０２-hTP O-P１の構築マウスDHFRミニ遺伝子を含むプラスミドpMG1、１μｇを制限酵素EcoRIとBamHI で処理した後、アガロースゲル電気泳動しマウスDHFRミニ遺伝子を含む断片（約 2.5kbp）を回収した。回収した断片を50mM Tris-HCl（pH7.5）、7mM MgCl₂、１m Mmercaptoethnol、0.2mM dNTPからなる反応液25μｌ中に溶解し、Klenowフラグメント２単位を加え、室温で３０分間反応させ、DNAの末端を平滑化した。次いで、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿後、10mM Tri-HCl（pH8.0 ）、１mM EDTAからなる TE溶液10μｌに溶解した。次に、得られたマウスDHFRミニ遺伝子を含む断片と動物細胞用発現ベクターpE F１８Sを制限酵素SmaIで処理した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）で脱リン酸化してえられたベクターDNAをT ４DNAリガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターpDEF２０２を得た。次に、このベクターpDEF２０２を制限酵素EcoRIとSpeIで処理し、アガロースゲル電気泳動で大きい方のベクターフラグメントを回収したのち、このフラグメントとヒトTPOcDNA（P1クローン）を含むプラスミドｐＨＴＰ１を制限酵素EcoRI とSpeIで処理して得られたヒトTPOcDNA（P1クローン）とをT ４DNA リガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターpDEF２０２-hTPO-P1得た。このプラスミドはSV４０の複製開始領域、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロモーター、SV４０初期ポリアデニル部位、マウスDHFRミニ遺伝子、pUC １８の複製開始領域、β‐ラクタマーゼ遺伝子（Amp^r）を含み、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロモーター下流にヒトTPOcDNAが接続されている。〈実施例３２〉ＣＨＯ細胞でのヒトＴＰＯの発現ＣＨＯ細胞（dhtr‐株、UrlaubとChasin；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；７７巻４２１６頁、１９８０）を６cm径のプレート（Falcon社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小必須培地（α-MEM（−）、チミジン、ヒポキサンチン添加）で培養増殖させ、これをリン酸カルシウム法（CellPhect、ファルマシア社製）によって形質転換した。すなわち、実施例３１で調製したpDEF２０２-hTPO-P1プラスミド１０μｇにバッファ−Ａ：１２０μｌおよびH₂O：１２０μｌを加え混合したのち、室温で１０分間放置した。つぎに、この溶液にバッファーＢ：１２０μｌを加え、再度混合したのち、室温で３０分間放置した。このDNA溶液をプレートに滴下したのち、CO₂インキュベーター中で６時間培養した。プレートから培地を除去し、α-MEM（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチルスルフォオキシド含有α-MEM（−）を添加し、室温で２分間処理した。次いで、１０％透析牛胎児血清含有非選択培地（前出α-MEM（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）を添加して２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清含有選択培地（α-MEM（−）、ヒポキサンチン、チミジン無添加）での選択をおこなった。選択は細胞をトリプシン処理した後、６cm径プレート１枚あたりを、１０cm径プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２０枚に分割したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換を行いながら培養を続行する事により実施した。細胞が増殖してきたプレートあるいはウエルについてはその培養上清中のヒトTPO活性をＭ−０７ｅアッセイ及びＢａ／Ｆ３アッセイを用いて測定したところ、いずれのアッセイ系においても活性が認められた。培養培地中にヒトTPOを分泌する細胞を、２５nMのメソトレキセートを含む選択培地でさらに選択し、高レベルのヒトＴＰＯを産生する細胞クローンを単離した。なお、CHO細胞の形質転換はCHO細胞に対しｐＨＴＰ１とpM G1を同時形質転換（co-transfection）することによっても行うことができる。プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１によって形質転換されたＣＨＯ細胞株（CHO-DUKXB11）は１９９５年１月３１日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４９８８として寄託されている。〈実施例３３〉X ６３．６．５．３．細胞用組換えベクター、BMCGSneo-hTPO-P1の構築動物細胞用発現ベクターBMCGSneo１μｇを制限酵素XhoIとNotIで処理した後、アガロースゲル電気ゲル電気泳動し、ベクターDNA部分を回収した。次いで得られたDNA断片とヒトTPOcDNAを含むプラスミドpBLTENを制限酵素XhoIとNotIで処理して得られたヒトTPO cDNA（P１クローン）とをT ４DNAリガーゼで結合させ、発現プラスミドBMCGSneo-hTPO-P1を得た。この発現プラスミドはサイトメガロウイルス初期プロモーター、ウサギβグロビン遺伝子由来のイントロンおよびポリアデニル部位ヒトβグロビン遺伝子の一部、ウシパピローマウイルス１遺伝子の６９％、チミジンキナーゼプロモーターおよびポリアデニル部位、ホスホトランスフェラーゼＩ（ネオマイシン耐性遺伝子）、pBR３２２の複製開始領域およびβ‐ラクタマーゼ遺伝子（Amp^r）を含みサイトメガロウイルスプロモーター下流にヒトTPO cDNAが接続されている。〈実施例３４〉X ６３．６．５．３．細胞での発現 X ６３．６．５，３．細胞は１０％牛胎児血清を含むDulbecco′s minimal e ssential（DME）培地中で培養増殖させ、これをエレクトロポレーション法によって形質転換した。すなわち、実施例３３で調製したBMCGSneo-hTPO-P1プラスミド２０μｇを１０⁷ 個の細胞を含むDME培地７５０μｌに加え、エレクトロポレーション用の４mmギャップのキュベットにセットし、４℃で１０分間放置した。このキュベットをエレクトロポレーション装置（BTX６００、BTX社製）にセットし、３８０V、２５m F、２４オングストロームの条件で遺伝子導入した。遺伝子導入後、キュベットを再び４℃で１５分間放置したのち、細胞を１０％牛胎児血清を含むDMEで一回洗浄した。次に細胞を５０mlの１０％牛胎児血清を含むDMEに懸濁し、９６ウエルプレート５枚に分割したのち、CO₂インキュベーター中で２日間培養した。その後、培養液を１mg/mlのG418（GIBC0社）、１０％牛胎児血清を含むDMEに交換し、以後３日ごとに培地交換した。細胞が増殖してきたウエルについてはその培養上清中のヒトTPO活性をＣＦＵ−ＭＫアッセイ、Ｍ −０７ｅアッセイ及びＢａ／Ｆ３アッセイを用いて測定したところ、いずれのアッセイ系においても活性が認められた。培養培地中にヒトTPOを分泌する形質転換体を限界希釈法により２回クローニングし、ヒトTPO産生細胞株を樹立した。〈実施例３５〉ヒトＴＰＯのＣＯＳ１細胞での大量発現ＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に記載のクロロキン処理を含むDEAE‐デキストラン法で実施した。COS1細胞（ATCC CRL1650）をコラーゲンコート処理した175cm²の培養フラスコ中で、10％（v/v）のFCSを含むIMDMを用いて、37℃の５%炭酸ガスインキュベーター内で約100％コンフルエントになるまで培養した。培養フラスコのコラーゲンコート処理は、1mM HClで0.3mg/mlに調製したコラーゲン溶液（イワキ社製Cellmatrix typeI-C）を175cm²の培養フラスコあたり25ml加え、室温で１時間放置後コラーゲン溶液を回収し、20〜50 mlのＰＢＳで１回洗浄することで行なった。トランスフェクションは175cm²の培養フラスコ１枚あたり、250μg/mlのDEAE‐デキストラン（ファルマシア社）、6 0μMのクロロキン（シグマ社）、および10％（v/v）のNu-Serum（コラボレイティブ社）を含む20mlのIMDM溶液に500μｌのHBSに溶解したプラスミドpHTP1（40 μｇ）を混和し、トランスフェクション直前にIMDMで１回洗浄した上記のCOS1細胞に添加した後、37℃の5％炭酸ガスインキュベーター内で３時間培養した。その後、培養上清を吸引除去しIMDMで１回洗浄した後、50mlの無血清培地を添加し、37℃の５％炭酸ガスインキュベーター内で培養し、５日後に培養上清を回収した。１回の操作には175cm²の培養フラスコ100から260枚を使用し、５〜131の培養上清を回収した。無血清培地の組成は、５μg/ml Insulin（シグマ社製）、５ μg/ml Transferrin（シグマ社製）、10μM monoethanolamine（和光純薬）、25 nM Sodium selenite（シグマ社製）、200μg/mlのBSA（ニチレイ社製脂肪酸フリー高純度ウシアルブミン）を含むIMDMである。〈実施例３６〉ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＰ１，Ｐ１クローン由来）の精製と活性確認ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＰ１由来）の活性と精製の実施例を以下に述べる。TPOの血小板増加作用を調べるため、部分精製品をまず調製し、かつ高純度のＴＰＯ標品を得るための精製を行った。以下の調製過程でのTPO活性測定には、Ｍ‐０７ｅアッセイ系を主に用いたが、ラットCFU-MKアッセイ系においても同様のＴＰＯ活性が示された。またこれらのアッセイに際し、最終濃度0.02〜0.05％のヒト血清アルブミン（HSA）を標品に添加した。まず、プラスミドｐＨＴＰ１を大橋、須藤の方法（Hideya Ohashi and Tadash i Sudo，Biosci．Biotech．Biochem.，58(4)，758-759，1994）を用いてトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞を、1000ml当たり0.2gのＢＳＡ、５mgの牛インシュリン、５mgのヒトトランスフェリンを含みかつ、0.02mMのモノエタノールアミン、25nMのSodium Seleniteを含む無血清ＩＭＤＭ培養液で５日間、５％炭酸ガス培養器中にて37℃で培養し、約７Ｌの無血清培養上清を得た。その無血清培養上清に、蛋白質分解酵素阻害剤であるp-APMSF及びPefabloc SC（4-(2-Aminoet hyl)-benzenesulfonyl fluoride hydrochloride, Ｍｅｒｋ社製、カタログ番号２４８３９）を最終濃度約１ｍＭ加え、０．２２μ ｍの濾過フィルターの濾液をとった。これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット分子量8000カット、またはミリポア社製・ＰＬＧＣペリコンカセット分子量10000カット）で約１０倍濃縮し、体積７２３ml（蛋白質濃度３．３８mg／ml）総蛋白質量２４４５ｍｇ、相対活性４３０００、総活性量１０５１０００００）に対し１０００ｍｌ当り1.6molesのAmmonium Sulfate （合計288ｇ）を加え、最終濃度1.5M Ammonium Sulfateを含む804mlの溶液とした後、1.25M Ammonium Sulfateを含む２0mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）で予め平衡化してあったMacro-Prep Methyl HICカラム（Bio-Rad社製、カタログ番号156-0080；直径５cm、ベッド高９cm）に、流速10ml/minで添加した。添加終了後、1.25M Ammonium Sulfateを含む２0mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）で溶出された素通り画分Ｆ１（2384ml，蛋白質濃度0.864mg/ml，総蛋白質量2061 mg,相対活性6000）を得た。次に、溶出液を20mM Na Citrate，pH5.8にかえ、溶出された画分Ｆ２（1092mI ，蛋白質濃度0.776mg/ml，総蛋白質量847mg，相対活性150000）を集めた。さらに、Macro-Prep Melhyl HICカラムＦ２（1081ml）を、20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.8）で予め平衡化したSP Sepharose Fast Flow（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-0729-01；直径３cm、ベッド高10cm）カラムに注入し、流速10ml/minで添加した。添加終了後、さらに110mM NaClを含む20 mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.6）で溶出されたものをまとめた画分Ｆ１（2 262ml，蛋白質濃度0.270mg/ml，総蛋白質量610mg，相対活性30000）を得た。次に、溶出液を400mM NaClを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.4）にかえ、溶出された画分Ｆ２（856ml，蛋白質濃度0.189mg/ml，総蛋白質量162mg，相対活性300000）を集めた。次に、溶出液を1000mM NaClを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）にかえ、溶出された画分Ｆ３（370ml，蛋白質濃度0.034mg/ ml，総蛋白質量12.6mg，相対活性150000）を集めた。さらに、SP Sepharose Fast Flowカラムにおいて主たるＴＰＯ活性画分Ｆ２（ 845ml）に、最終濃度約10%の１−プロパノールを加え、400mMのNaClを含む20mM クエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.4）で予め平衡化したLA-WGAカラム（ホーネン社製、カタログ番号WG-007；直径２cm、ベッド高14cm）カラムに注入し、流速３ml /minで添加した。添加終了後、400mMのNaClを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.4）と１−プロパノールの混液（９：１）で溶出されたものをまとめた画分Ｆ１（64.4ml，蛋白質濃度0.0178mg/ml，総蛋白質量1.15mg，相対活性17220 ）を得た。次に、溶出液を0.4M GIcNac，10%１−プロパノールを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.1）にかえ、溶出された画分Ｆ２（45ml，蛋白質濃度0 .0104mg/ml，総蛋白質量0.470mg，相対活性675000）を集めた。そこで、LA-WGAカラムにおいて主たるＴＰＯ活性画分Ｆ２（340ml）に、最終濃度約0.005%のTFAを加えた後、YMC-Pack CN-AP（ＹＭＣ社製、カタログ番号AP- 513；直径6mm、ベッド高250mm）カラムにて展開した。即ち、展開溶媒Ａに0.1％ TFA、展開溶媒Ｂに0,05％TFAを含む１-プロパノールを用い、15％Ｂで平衡化したYMC-Pack CN-APカラムに、流速0.6ml/minで注入した。注入終了後、15％Ｂから25％Ｂにプロパノール濃度を上げ、さらに25％Ｂから50％Ｂまで65分の直線濃度勾配で展開し、1.5ml（2.5min）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。それぞれ0.5μｌ（３０００分の１フラクション）を取りHSAを加え、限外濾過濃縮し、最終的に0.05％HSAを含む0.25mlのIMDMアッセイ培養液溶液とし、これをアッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号24〜30 （プロパノール濃度で35.0〜42.0％の範囲）に強いＴＰＯの活性（相対活性約63 0000〜4800000）があったため、ＴＰＯ活性画分ＦＡ（13.5ml）とした。そこでさらに、YMC-Pack CN-APで得られたＦＡを、展開溶媒Ａに0.1％TFA、展開溶媒Ｂに0.05％TFAを含む1-プロパノールを用いたCapcell Pak C1 300A（資生堂製、カタログ番号C1 TYPE：SG300A；直径4.6mm、ベッド高150mmに加え、直径4 .6mm、ベッド高 35mmのプレカラムを接続したもの）カラムにて展開した。即ち、YMC-Pack CN-APで得られたＦＡの一部（8.9ml）をとり、0.3mlのグリセロールを添加後、遠心エバポレーションで濃縮後、約2.5mlの10％Ｂ液を加え、20％Ｂで平衡化したCapcell Pak C1 300Aカラムに流速0.4ml/minで注入した。注入終了後、20％Ｂにて５分溶出した後、20％Ｂから40％Ｂまで50分の直線濃度勾配で展開し、１ml（2.5min）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。それぞれ１μｌ（１０００分の１フラクション）を取りHSAを加え、限外濾過濃縮し、最終的に0.05％HSAを含む0.25mlのIMDMアッセイ培養液溶液とし、これをアッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号20〜23 （プロパノール濃度で28.5〜32.5％の範囲）に強いＴＰＯの活性（相対活性約30 00000〜22500000）を示す高活性標品を得ることができた。〈実施例３７〉ＣＯＳ１細胞で発現したヒトＴＰＯの分子量測定ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＦ１、Ｆ１クローン由来）の分子量は、糖鎖が付加された結果、ペプチド鎖の大きさから推定しうる分子量よりも大きいことが考えられた。そこでまず、ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＦ１、Ｆ１クローン由来）を含む培養上清から部分精製ＴＰＯ画分を以下のように調製した。即ち、展開溶媒Ａ（0.1％トリフルオロ酢酸（TFA））および展開溶媒Ｂ（0.05％TFAを含む1-プロパノール）を用いて、２５％Ｂで予め平衡化したYMC-Pack PROTEIN-RP（ＹＭＣ社、カタログ番号A-PRRP-33-46-25；直径0.46 cm、ベッド高15cm）カラムに、培養上清0.3mlを注入し、流速0.4ml/minで５分２５％Ｂを通液した後、５０分間の２５％Ｂから５０％Ｂまでの直線濃度勾配にて分画した。ＴＰＯ活性は34.5％〜43.5％1-プロパノールの範囲に溶出され、これを遠心エバポレーションで乾固し、部分精製標品を得た。次に、実施例１に述べた非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから蛋白質抽出操作後、Ｍ‐０７ｅアッセイ系にてＴＰＯ活性を調べ、あるいは実施例４５に述べるウエスターン分析により、還元処理されたＤＰＣＩＩＩマーカーに対する分子量を測定した。この結果、見かけ上の分子量約６９０００〜９４０００の広い範囲にＴＰＯ活性が存在し、分子量の不均一性を確認できた。さらにこれと同様にして、Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（ジェンザイム社製、カタログ番号1472-00）によるＮ結合型糖鎖切断後のＴＰＯについて、還元処理されたＤＰＣＩＩＩマーカーに対する見かけ上の分子量を調べてみると、３６０００〜４００００となり、ペプチド鎖の大きさから推定しうる分子量約３５０００よりもなおも大きいことが判明し、Ｏ結合型糖鎖をも含むことが強く示唆された。これらと同様、ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＰ１、Ｐ１クローン由来）の見かけ上の分子量についても調べたところ、６３０００〜８３０００であった。〈実施例３８〉ヒトＴＰＯの生物学的特性主に発現プラスミドｐＨＴＦ１をＣＯＳ１細胞へトランスフェクションして得られたＴＰＯ活性を含有する培養上清を用いて、ヒトＴＰＯのヒト、およびラット血液系細胞に対する作用を調べた。ヒト臍帯血から調製したＣＤ３４⁺、ＤＲ⁺細胞画分を用いたコロニーアッセイ系で検定したところ、ヒトＴＰＯにより有意な数の巨核球コロニーが形成された。例えば、発現プラスミドｐＨＴ１−２３１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞培養上清を10％添加した条件下で、6000個のＣＤ３４⁺、ＤＲ⁺細胞から平均11.5個の巨核球コロニーが形成された。ヒト抹消血からFicoll-Paque を用いた比重遠心法にて得られた白血球画分からプラスティック付着性細胞を除去し、さらにＳＢＡ（ダイズアグルチニン）に親和性を有する細胞をＡＩＳマイクロセレクターＣＤ３４（旭メディカル株）を用いたパニング法にて除去し、最終的にＡＩＳマイクロセレクターＣＤ３４（旭メディカル株）を用いたパニング法にてＣＤ３４⁺細胞画分を得た。この細胞画分にヒトＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＦ１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞培養上清）を添加し、10日間液体培養したところ、サイズの大きいＧｐIIｂ／IIIａ⁺細胞の選択的増殖が認められ、さらにこのＧｐIIｂ／IIIａ⁺細胞では核の倍数性（ploidy）が増加していた。このことから、ヒトＴＰＯがヒト巨核球系前駆細胞に特異的に作用し、その増殖・分化を促進することが強く示唆された。ラット骨髄細胞から分離・精製したＧｐIIｂ／IIIａ⁺細胞画分、及びＧｐIIｂ／IIIａ⁺細胞画分を得る前段階のプラスティック非付着性細胞画分を用いたコロニーアッセイ系で検定したところ、ヒトＴＰＯにより有意な数の巨核球コロニーが形成された。例えば、発現プラスミドｐＨＴＦ１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞培養上清を20％添加した条件下で、培養５日目に1000個のＧｐIIｂ／IIIａ⁺細胞から平均34.5個の巨核球コロニー、また20000個のプラスティック非付着性細胞から平均28.5個の巨核球コロニーが形成された。さらに、プラスチック非付着細胞画分には巨核球系以外の様々な系統の前駆細胞が存在するが、ヒトＴＰＯの添加では巨核球コロニーしか形成されず、ヒトＴＰＯが巨核球系前駆細胞に特異的に作用することが強く示唆された。また、ラット骨髄由来のＧｐIIｂ／IIIａ⁺細胞画分をヒトＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＦ１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞培養上清を20％添加）の存在下に３〜５日間液体培養し、核の倍数性（ploidy）を調べたところ、培養５日目に明らかにploidyが増加していた。〈実施例３９〉グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）とヒトTPO（アミノ酸１−１７４）の融合タンパク質（以下、この融合タンパク質を「ＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）」と称す）の大腸菌発現用ベクターの構築大腸菌でのヒトTPOの発現を容易にするために、ヒトTPOをコードしかつ大腸菌優先コドンを含有する人工遺伝子を作製した。なお、このDNAヌクレオチド配列は大腸菌翻訳開始用のアミノ末端メチオニンコドン（ATG）を‐１の位置に有する。下記に示した１−１２の合成オリゴヌクレオチド：を作製し、２−１１の合成オリゴヌクレオチドをT4キナーゼ（ファルマシア社製）により1mM ATP，10mM Tris-acetate，10mM Mg-acetate，50 mM K-acetateの溶液中でリン酸化した。これらの合成オリゴヌクレオチドを６本の二本鎖DNAにするために１及び２；３及び４；５及び６；７及び８；９及び１０；１１及び１２それぞれの組み合わせの一本鎖DNAを10mM Tris/HCl（pH7.5），10mM MgCl₂，50m M NaClの溶液中でアニールした。次に１及び２；３及び４；５及び６の三組の二本鎖DNAと、７及び８；９及び１０；１１及び１２の三組の二本鎖DNAをそれぞれ T4リガーゼ（ライフテクノロジー社製）を用いて反応し、更にこれら二種の反応液を同様にしてT4リガーゼを用いて反応した。このライゲーション反応で得られたDNAをBamHI（ベーリンガーマンハイム社製）で消化後、２％のアガロースゲルで泳動し、約390−400bpの大きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンDNA精製キットで精製し、XbaI，BamHIで消化したpUC18にサブクローニングした（宿主はE.coli DH5αを使用した）。得られたクローンのうち、ヒトTPOをコードしかつ次に示したコドンを含有する人工遺伝子をもつクローンを、ヌクレオチド配列の解析により選択し、これをpUC18（XB）（1-123）とした。コーディング鎖のDNA配列を配列表（配列番号９）に示した。ヒト正常肝臓由来ポリ（A）⁺RNA１μｇよりcDNAの１本鎖目をオリゴｄＴプライマーをプライマーとして合成し、cDNA合成の反応液の0.1容を鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーにはhTPO-C及びhTPO-こ（EcoRI）を使用し、100μｌの容量で反応を行った（96℃２分間の後に、95℃１分間／58℃１分間／72℃１分間を30サイクル反応し、さらに72℃７分間）。これによって得られた、ヒトTPOcDN A断片をBamHIとEcoRIで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、約600bpの大きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンDNA精製キットで精製し、EcoRI ，BamHIで消化したpUC18にサブクローニングした（宿主はE,coli DH5αを使用した）。正しいヒトTPO塩基配列をコードするクローンを、塩基配列の解析により選択し、pUC18（BE）（124-332）とした。ここで用いたＰＣＲ用プライマーの配列は以下の通りである。ｈＴＰＯ−Ｃ：５’−ＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号95）（pHTF1クローンの329-349）ｈＴＰＯ−Ｚ（ＥｃｏＲＩ）：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴ−３’ （配列番号96）（pHTF1クローンの1143-1163に対応するアンチセンスにEcoRI配列を付加）。 pUC18（BE）（124-332）をBamHIとEcoRIで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、約600bpの大きさのヒトTPOcDNAのＣ末端側フラグメントを回収してプレップ −Ａ−ジーンDNA精製キットで精製し、EcoRI，BamHIで消化したpUC18（XB）（1- 123）にサブクローニングした（宿主はE.coli DH5αを使用した）。ここで得られたクローンをpUC18（XE）（1-332）とした。ヒトTPOcDNAのＣ末端側の種々のデリーションコンストラクトを作製し、それを発現させインビトロのヒトTPO活性の測定を行った実施例より、ヒトTPOアミノ酸１−１６３はヒトTPO活性を保持することが明らかになったので、このペプチド断片を含んだ発現ベクターを構築することにした。ここでは、ＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）の発現を行った。 pHTF1クローンの681−686（アミノ酸173−174）に相当する塩基配列は、制限酵素SacIにより認識されるので、この制限酵素認識部位を利用して２本の合成オリゴヌクレオチドにより終止コドンを導入した。具体的には、２本の合成オリゴヌクレオチドSSE1，SSE2を10mM Tris/HCl（pH7.5），10mM MgCl₂， 50mM NaClの溶液中でアニールし、ここで得られた二本鎖DNAを、SacI，EcoRIで消化してヒトTPOcDNAのＣ末端側約480bpを除いたpUC18（XE）（1-332）にDNA Li gation Kit（宝酒造社製）を用いて導入し、クローンpUC18（XS）（1-174）を得ることができた（宿主はE.coli DH5αを使用した）。ここで用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を下記に示した。 pUC18（XS）（1-174）をXbaI，EcoRIで消化後、２％のアガロースゲルで泳動し、ヒトTPOアミノ酸１−１７４をコードする約600bpの大きさのフラグメントを回収してプレップ‐A‐ジーンDNA精製キットで精製し、XbaI，EcoRIで消化したp Bluescript IISK⁺（ストラタジーン社製）にサブクローニングした（宿主はE.coli DH5αを使用した）。ここで得られたクローンをpBL（XS）（1-174）とした。さらに、これと同様にしてpBL（XS）（1-174）をXbaI，HindIIIで消化後、ヒトTPOアミノ酸１−１７４をコードする約550bpの大きさのフラグメントを回収してプレップ−A−ジーンDNA精製キットで精製し、XbaI，HindIIIで消化した pCFM536（特表示昭60-501988）にクローニングした（宿主はE.coli DH5αを使用した）。ここで得られたクローンをpCFM536/hT（1-174）とした。グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク発現ベクターであるpGEX-2T（ファルマシア社製）によって、ＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）を発現させるために、次のことを行った。pCFM536/hT（1-174）を鋳型として、２本のＰＣＲ用プライマーGEXI，GEX3を用いてＰＣＲを行った（96℃２分間の後に、95 ℃１分間／41℃１分間／72℃１分間を22サイクル反応し、さらに72℃７分間）。これによって得られた、ヒトTPOをコードする断片をNaeIとEcoRIで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、約550bpの大きさのフラグメントを回収してプレップ −A−ジーンDNA精製キットで精製し、EcoRI，SmaIで消化したpGEX-2Tにクローニングし（宿主はE.coli DH5を使用した）、正しいヒトTPO塩基配列をコードするクローンpGEX-2T/hT（1-174）を、塩基配列の解析により選択し、これをＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）発現用の形質転換体とした。ここで用いたＰＣＲ用プライマーの配列は以下の通りである。ＧＥＸ１：５′‐ＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴＧＴＧＡＣ‐３ ′（配列番号101）（配列番号１０の21-39にNaeI配列を付加）ＧＥＸ３：５′‐ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＣＡＧＴＧＴ‐３′（配列番号102）（配列番号１０の523-549のアンチセンス）。またこの発現プラスミドは、GSTタンパクに続いてトロンビン認識ペプチド、及びヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１７４）をコードする配列を含んでいる。トロンビン認識ペプチド、及びヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１７４）をコードする配列を配列表（配列番号１０）に示した。〈実施例４０〉ＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）の大腸菌での発現実施例３９で得られた形質転換株を、アンピシリン50μg/mlを含むＬＢ培地60 mlに37℃で一晩振盪培養し、この培養液25 mlをアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ培地1000mlに加えて、ＯＤはＡ₆₀₀が0.7− 0.8に至るまで37℃で振盪培養した。次いで最終濃度が、0.1mMになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間振盪培養して、ＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）の発現を誘導した。〈実施例４１〉大腸菌で発現したＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）の精製と活性確認ヒトTPOヌクレオチド配列をコードするクローンpGEX-2T/hT（1-174）由来ＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）生産組換体凍結菌体５．９ｇに水１０ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕した。遠心分離により、GST-TPO(1-174)を沈殿画分に回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。次に、回収されたGST- TPO(1-174)を含む沈殿画分に水５ｍｌを加えてけん濁した後、攪拌しながら１Ｍ Tris緩衝液ｐＨ８．５を６ｍｌ、１０Ｍ尿素１２０ｍｌ、水１６ｍｌを加えた。室温にて５分間攪拌可溶化後、溶液を４等分し、各々、以下のとおり（１）〜（４）の４種の操作を行った。（１）２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈した。これに還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンを加えて、各々、最終濃度５ｍＭ及び０．５ｍＭとし、４℃で一晩静置した。遠心分離により、上清中にGST-TPO(1-174)を回収し、これに２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で２倍希釈した後、酢酸を用いてｐＨ５．５に調整した。２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で平衡化したSP Sepharose Fast Flow（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-0729-01）陽イオン交換カラムにGST-TP O(1-174)を吸着させた。同樹脂を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で洗浄した後、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５を用いてGST-TPO(1-174)を溶出させた。溶出液１２９ｍｌに２．６ｍｌの１ＭTris緩衝液ｐＨ８．５を加えて、ｐＨを８．１にした後、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-0756- 01）カラムに添加しGST-TPO(1-174)を吸着させた。ＰＢＳで洗浄した後、１０ｍＭ還元型グルタチオンを含む２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ８．５でGST-TPO(1-174)を溶出させた。溶出液にトロンビン３７NIH Unitを加えて室温で４時間静置した後、ＰＢＳで１０倍希釈し、グルタチオンセファロース４Ｂカラムに添加し切断されたGSTを吸着させ、非吸着画分にTPO(1-174)を回収した。回収した非吸着画分を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で３倍希釈し、同緩衝液で平衡化したSP Sepharose Fast Flow陽イオン交換カラムに添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。（２）（１）の操作を全て０．１％ポリソルベート８０存在下で行った。（３）２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈した。これに還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンを加えて、各々、最終濃度５ｍＭ及び０．５ｍＭとし、４℃で一晩静置した。遠心分離により、上清中にGST-TPO(1-174)を回収し、これに２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で２倍希釈した後、酢酸を用いてｐＨ５．５に調整した。２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で平衡化したSP Sepharose Fast Flow陽イオン交換樹脂にGST-TPO(1-174)を吸着させた。同樹脂を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で洗浄した後、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５を用いてGST-TPO(1-174)を溶出させた。溶出液に１ＭTris緩衝液ｐＨ８．５を加えてｐＨを約８とし、トロンビン３２０NIH Unitを加えて室温で４時間静置した後、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で５倍希釈し、同緩衝液で平衡化したSP Sepharose Fas t Flow陽イオン交換カラムに添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。（４）（３）の操作を全て０．１％ポリソルベート８０存在下で行った。 SP Sepharose Fast Flow陽イオン交換クロマトグラフィーの塩化ナトリウム濃度約２００ｍＭから４００ｍＭで溶出された画分を、各々、IMDM培養液に対して十分に透析後、ラットCFU-MK系で評価した結果、容量依存的にTPO活性を認めた。同画分を還元剤存在下でのSDS-PAGEで分析した結果、この画分の主タンパク質バンドの一つとして分子量１９Ｋダルトンのバンドが検出された（純度１−２０％）。このバンドについて実施例１に記載された方法により、SDS-PAGE後、ＰＶＤＦ膜に転写しＮ末端シークエンス分析を行なった結果、このpGEX-2T/hT（1-17 4）由来の融合蛋白質として発現されるべきTPOの配列を含むことが確認できた。得られたＴＰＯの推定アミノ酸配列は［Ｇｌｙ^-1］ＴＰＯであり、トロンビン認識ペプチドリンカー配列と共にリンカー上に公知のトロンビン活性が付与される。〈実施例４２〉アミノ酸１（Ｓｅｒ→Ａｌａ）、アミノ酸３（Ａｌａ→Ｖａｌ）に置換をもっヒトTPO（アミノ酸１−１６３）の大腸菌用発現ベクターの構築実施例３９で作製したpUC18(XE)(1-332)をXbaI,EcoRIで消化後、２％のアガロースゲルで泳動し、ヒトTPOアミノ酸１−３３２をコードする約1000bpの大きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンDNA精製キットで精製し、XbaI, EcoRIで消化したpBluescript II SK+（ストラタジーン社製）にサブクローニングした（宿主はE.coli DH5αを使用した）。ここで得られたクローンをpBL(XE)( 1-332)とした。次にこのクローンpBL(XE)(1-332)のBamHI認識配列からアミノ酸１６３（366-4 89）までを大腸菌優先コドンに変更することとした。後記の１３−２０の合成オリゴヌクレオチドを作成し、１３及び１４；１５及び１６；１７及び１８の合成オリゴヌクレオチドを同チューブ中でT4キナーゼ（ファルマシア社製）を用いて 0.1mM ATP，10mM Tris-acetate，10mM Mg -acetate，50mM K-acetateの溶液中でリン酸化した。さらに1/10量の100mM Tris /HCl（pH7.5），100mM MgCl，500mM NaClの溶液を加え、水浴中で３分間煮沸した後、放置することにより２本鎖DNAとした。次に１３及び１４；１５及び１６；１７及び１８の三組の二本鎖DNAをDNAライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、これを鋳型として１９及び２０の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。これによって得られたＰＣＲ産物をBamHIとH idIIIで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、約１３０ｂｐの断片をプレップ −Ａ−ジーンDNA精製キットにより回収した。これをBamHIとHidIIIで消化したpB L（XE）（1-332）にサブクローニングした（宿主はE.coli DH5を使用した）。得られたクローンのうち以下に示した塩基配列を有するものをシークエンシングにより選択し、これをpBL(XH)(1-163)とした。さらに、ヒトTPO（アミノ酸１−１６３）の発現量を増すこと、またＮ末端のプロテアーゼによる分解を防ぐことを目的として、ヒトTPO（アミノ酸１−１６３）の１位のアミノ酸をＳｅｒ→Ａｌａに、３位のアミノ酸をＡｌａ→Ｖａｌに変換し（［Ａｌａ¹、Ｖａｌ³］ＴＰＯ（1-163））、更に‐１位にＬｙｓ、‐２位にＭｅｔをコードするような変異型ヒトTPO（アミノ酸１−１６３）（［Ｍｅｔ^-2、Ｌｙｓ^-1，、Ａｌａ¹、Ｖａｌ³］ＴＰＯ（1-163））（以下、このようなタンパク質を「ｈ６Ｔ（1-163）」と称す）を発現させるための発現ベクターの構築を行った。後記の４種の合成オリゴヌクレオチドを作製し、２‐９、３‐３の合成オリゴヌクレオチドをT4キナーゼ（ファルマシア社製）により1mM ATP，10mM Tris-acetate,10mM Mg-aceta te，50mM K-acetateの溶液中でリン酸化した。これらの合成オリゴヌクレオチドを２本の二本鎖DNAにするために１‐９及び２‐９；３‐３及び４‐３それぞれの組み合わせの一本鎖DNAを10mM Tris／HCl（pH7.5），10mM MgCl₂，50mM NaCl の溶液中でアニールした。次に１‐９及び２‐９；３‐３及び４‐３の二組の二本鎖DNAをDNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて反応した。このライゲーション反応で得られたDNAを、XbaI,NruIで消化したpBL(XH)(1-163)にサブクローニングし、塩基配列の解析により以下に示した合成オリゴヌクレオチドにより正しく置換されたクローンを選択し（宿主はE.coli DH5αを使用した）、これをpBL( XH)h6T(1-163)とした。 pBL(XH)h6T(1-163)をXbaI,HindIIIで消化後、変異型のヒトTPOアミノ酸１−１６３をコードする約500bpの大きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンDNA精製キットで精製し、XbaI,HindIIIで消化したpCFM536（特表昭60-50198 8）にクローニングした（宿主はpMW1（ATCC No.39933）で予め形質転換されたE.col i JM109を使用した）。ここで得られたクローンをpCFM536/h6T(1-163)とし、この発現ベクターを有する大腸菌株を変異型のヒトTPO、すなわちｈ６Ｔ（1-163）発現用の形質転換体とした。この発現プラスミドは、配列表（配列番号１１）に示されたDNA配列を含んでいる。〈実施例４３〉ｈ６Ｔ（1-163）の大腸菌での発現発現プラスミドpCFM536の発現制御は、λPLプロモーターによるが、これ自体が、cI857リプレッサー遺伝子の制御下にある。〈実施例４２〉で得られた形質転換株を、アンピシリン50μg/ml、テトラサイクリン12.5μg/mlを含むＬＢ培地 60mlに30℃で一晩振盪培養し、この培養液25mlをアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ培地1000mlに加えて、ＯＤはＡ₆₀₀が1.0-1.2に至るまで30℃で振盪培養した。次いで最終温度が、42℃になるように65℃の約330mlＬＢ培地を添加し、さらに３時間42℃で振盪培養してｈ６Ｔ（1-163）の発現を誘導した。〈実施例４４〉大腸菌で発現したｈ６Ｔ（1-163）の精製と活性確認 h6T(1-163)生産組換体凍結菌体３．６ｇに水１０ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去する。回収されたh6T(1-163)を含む沈殿画分に水７ｍｌを加えてけん濁した後、攪拌しながら１Ｍ Tris緩衝液ｐＨ８．５を３ｍｌを加えた後、尿素（終濃度８Ｍ）、塩酸グアニジン（終濃度６Ｍ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（終濃度２％）を各々加えて室温にて５−２０分間攪拌して可溶化した。これを２０ｍＭ Tris緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈し、４℃中にて一晩でタンパク質の巻き戻し（リフォールディング）操作を行なった。この際に、空気酸化の他、添加物としてグルタチオン及び硫酸銅を各々添加した。遠心分離により、上清中にh6T(1-163)を回収した。各々の回収画分について還元剤存在下でのSDS-PAGEで分析した結果、どの方法に於ても、この画分の主タンパク質バンドとして分子量約１８Ｋダルトンのバンドが検出された（純度３０−４０％）。このバンドについて実施例１に記載された方法により、SDS-PAGE後、ＰＶＤＦ膜に転写しＮ末端シークエンス分析を行なった結果、このpCFM536/h6T(1-163)由来の変異型ＴＰＯとして発現されるべきTPOの配列を含むことが確認できた。各々の画分をIMDM 培養液に対して十分に透析後、ラットCFU-MK系で評価した結果、全ての画分に於て用量依存的にTPO活性を認めた。〈実施例４５〉抗ＴＰＯペプチド抗体の作製と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ→ウエスターン分析によるＴＰＯの検出抗ＴＰＯ抗体が作製できれば、免疫学的手法によりＴＰＯの蛋白質を検出することができる。そこで、最初に判明したラットＴＰＯのアミノ酸配列のうち、比較的抗原として適していると考えられた３カ所の領域（以下に示す）を選び、Ta m（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85，5409-5413，1988）の方法により４本鎖のＭｕｌｔｉｐｌｅＡｎｔｉｇｅｎＰｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）型のペプチドを合成し、１００μｇずつ８回にわたってそれぞれウサギ２把に免疫した結果、これらの抗血清を得ることができた。合成ペプチド抗原に含まれるアミノ酸配列（a）ラットTPO(9-28)（ペブチドRT1領域）： PRLLNKLLRDSYLLH R RLSQ（配列番号116）（ただし24番目のＲは本来、遺伝子から決定されたアミノ酸残基はＳである）（b）ラットTPO(46-66)（ペプチドRT2領域）： FSLGEWKTQTEQSKAQDILGA（配列番号117）（c）ラットTPO(163-180)（ペプチドRT4領域）： SRTSQLLTLNKFPNRL L D（配列番号118）（ただし178番目〜180番目のＬＬＤは本来、遺伝子から決定されたアミノ酸残基ではＴＳＧである）次いで、これらの抗血清のうち、まず抗ＲＴ１ペプチド、抗ＲＴ２ペプチド抗体について、プロテインＡカラム（PROSEP-A；Bioprocessing Ltd社製、カタログ番号8427）を用いて、ＩｇＧ画分（それぞれ2344mg、1920mg）を得、これらのうちそれぞれ54mg、32mgをとり活性型ビオチン（NHS-LC-Biotin II、PIERCE社製、カタログ番号21336）とカップリングすることにより、ビオチン化した。。実施例１に述べた方法と同様に、組み換え体ＴＰＯを含む標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでＰＶＤＦあるいは、ニトロセルロース膜にエレクトロブロティングし、定法によりこれらのビオチン化抗体を一次抗体として用いてウェスタン分析を行った。即ち、ブロッティング後の膜を20mM Tris-HCl、0.5M NaCl（pH7.5）（ＴＢＳ）で５分洗浄し、0.1％Tween 20入りＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で５分２回洗浄後、ブロッキング剤（BlockAce、大日本製薬社製、カタログ番号uk-B25）で60分処理した。次に10μg／mlの濃度のビオチン化抗ＴＰＯペプチド抗体、0.05％BSA、10％ BlockAceを含むＴＴＢＳ溶液で60分後処理後、ＴＴＢＳで５分２回洗浄した。次にアルカリフォスファターゼ標識アビジン（Leinco Technologies社製、カタログ番号A108）を10％BlockAce、ＴＴＢＳ溶液で５０００倍希釈したものを含む溶液で３０分処理し、５分２回のＴＴＢＳ洗浄、５分間のＴＢＳ洗浄を行った後、アルカリフォスファターゼ基質（Bio-Rad社製、カタログ番号170-6432）により発色させた。以上のウエスタン分析は室温にて実施した。この結果、ＣＯＳ１細胞で発現した各種組み換えラットＴＰＯのみならず、ＣＯＳ１細胞及び大腸菌で発現した各種組み換えヒトＴＰＯ（具体的には、これまでの実施例に述べたＣＯＳ１細胞で発現したプラスミドｐＨＴＰ１あるいはプラスミドｐＨＴＦ１由来ヒトＴＰＯとそのＮ結合型糖鎖切断後のＴＰＯ、大腸菌で発現したＧＳＴ−ＴＰＯ（1-174）及びそのトロンビン消化後のＴＰＯ、大腸菌で発現した変異型ＴＰＯであるｈ６Ｔ(1-163)）をも認識することができた。そして、これら各種組み換えヒトＴＰＯの分析に用いることが可能となった。以上の手法と同様にして、抗ヒトＴＰＯペプチド抗体の作製が可能であることが示された。これらの手法で得た抗体により、ウェスタン分析のみならず、抗体カラムによるＴＰＯの精製をはじめ、通常考えられる抗体を用いたあらゆる免疫学的手法への応用が可能となる。また、配列番号７に示されるヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、比較的抗原として適していると考えられた６カ所の領域（表４に示す）を選び、４本鎖のＭｕｌｔｉｐｌｅＡｎｔｉｇｅｎＰｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）型のペプチドを合成し、１００μｇずつ８回にわたってそれぞれウサギ２把に免疫した。表４で示された各ペプチド領域のＣ末端にシステイン残基を結合させた１本鎖ペプチドを別途合成し、これを試験抗原として酵素免疫測定法を用いて抗体価を調べたところ、いずれの血清についても抗体価の上昇が確認されたので、これらを抗血清とした。抗体は、１種の抗原ペプチドにつきウサギ抗血清２把ずつ免疫したため、それぞれのウサギごとに抗体を分けて調製した。具体的には、これら由来するウサギの個体ごとに区別して、抗ＨＴ１ペプチド抗体では、それぞれ、抗ＨＴ１−１ペプチド抗体、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体の様に称する。以下に抗ＨＴ１−１ペプチド抗体についての精製を例として示す。まず、システイン残基を結合したＨＴ１の１本鎖ペプチド３０ｍｇを１２ｍｌのＳｕｌｆｏＬｉｎｋカップリングゲル（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カタログ番号４４８９５）に結合させた。即ち、ゲル体積の６倍容のカップリングバッファー（50mM Tris、5mM EDTA-Na pH8.5）で平衡化したゲルに、抗原の含まれるペプチド溶液を15分間カップリングさせた。次に30分間静置した後、ゲル体積の３倍容のカップリングバッファーでゲルを洗浄した。次に0.05M L-Cystein-HClを含むカップリングバッファーを、１ml/mlゲルの割合で添加し、15分間未反応基をブロックした。次に30分間静置した後、ゲル体積の８倍容のカップリングバッファーでゲルを洗浄した。以上のカップリングは室温で行った。このようにして、抗原領域を含むペプチドをカップリング効率２８．３％にてゲルに共有結合させ、１ｍｌゲル当たりに結合したペプチドが０．８ｍｇである抗原ペプチド抗原カラムを調製した。次に、全採血後の抗ＨＴ１−１ペプチド抗体を含む抗血清７８．４ｍｌのうち７６．７ｍｌ（蛋白質量３６２０ｍｇ）を予め１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した抗原カラムに添加し、さらに同緩衝液で洗浄後１０５．９ｍｌの素通り画分（蛋白質量３６８０ｍｇ）を得た。次に０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で吸着画分を溶出し、ただちに２１．１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．９）を加えて中和後、限外濾過（アミコン社製ＹＭ３０膜）にて濃縮し、１１．２ｍｌ（蛋白質量７７．７ｍｇ）の１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）の溶液中に精製された抗ＨＴ１−１ペプチド抗体を得ることができた。同様にして、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体（６０．０ｍｇ）、抗ＨＴ２−１ペプチド抗体（１８．８ｍｇ）、抗ＨＴ２−２ペプチド抗体（８．２ｍｇ）などを得ることができた。抗ＨＴ３〜６ペプチド抗体も同様にして得ることができる。アフィニティ精製した抗ＨＴ１−１ペプチド抗体、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体、抗ＨＴ２−１ペプチド抗体、抗ＨＴ２−２ペプチド抗体をそれぞれ３mgをとり活性型ビオチン（NHS-LC-Biotin II、PIERCE社製、カタログ番号21336）とカップリングすることにより、ビオチン化した。下記のアミノ酸配列：をコードする遺伝子を導入・発現させたＣＨＯ細胞の培養上清から部分精製された組換えヒトＴＰＯ標品を定法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでＰＶＤＦあるいはニトロセルロース膜にエレクトロブロティングし、上述の抗ＲＴペプチド抗体の場合と同様にウェスタン分析を行ったところ、それぞれの精製された抗体により、ヒトＴＰＯが認識、検出されることが確認できた。〈実施例４６〉抗ＴＰＯペプチド抗体カラムの調製実施例４５で得られた抗ラットＴＰＯペプチド抗体は、ラット及びヒトＴＰＯを認識することができたため、抗ＲＴ１ペプチド抗体、抗ＲＴ２ペプチド抗体の免疫グロブリン（ＩｇＧ）画分を以下のようにして、クロマトグラフィー担体に結合させ、抗ＴＰＯペプチド抗体カラムを作製した。材料となった抗体は、それぞれの抗原ペプチドにつきウサギ抗血清２把ずつから由来し、それぞれのウサギごとに抗体を分けて調製した。具体的には、抗ＲＴ１ペプチド抗体では、それぞれ、抗ＲＴ１−１ペプチド抗体と抗ＲＴ１−２ペプチド抗体と称し、抗ＲＴ２ペプチド抗体では、抗ＲＴ２−１ペプチド抗体と抗ＲＴ２−２ペプチド抗体と称す。これらを別々にして抗体カラムを調製したため、抗ＲＴ１ペプチド抗体カラムは２種（それぞれ抗ＲＴ１−１抗体カラム、抗ＲＴ１−２抗体カラムと称す）、抗ＲＴ２ペプチド抗体カラムは２種（それぞれ抗ＲＴ２−１抗体カラム、抗ＲＴ２−２抗体カラムと称す）、さらに抗ＲＴ１−２ペプチド抗体と抗ＲＴ２−１ペプチド抗体を混合してゲルにカップリングした抗体カラム（抗ＲＴ１−２＋２−１混合抗体カラム）、の５種類を調製した。各々の抗体を５mg/ml（抗ＲＴ１＋２ｍｉｘ抗体カラムでは抗ＲＴ１−２ペプチド抗体と抗ＲＴ２−１ペプチド抗体を等量混合した2.5mg/ml）の濃度で含む50 mM Na Phosphate，0.15M NaCl（pH8.0）の溶液とし、これを2.31mlとり、1.54m 体積の膨潤したホルミル活性化ゲル（Formyl-Cellulofine、チッソ株式会社製）と合わせ、４℃で２時間カップリング反応させた。次いで、10mg/mlの濃度の還元剤溶液（Trimethylamine borane(TMAB)、生化学工業製、カタログ番号680246 ）を1.1ml加え、さらに６時間カップリング反応させた後、遠心分離によりゲル部分のみを回収した。これに10mlの精製水を加え、遠心分離でゲル部分のみの回収といった操作を４回繰り返し、未反応の抗体を取り除いた。次に4.6mlのブロッキング緩衝液（0.2M Na Phosphate，１M et hanol amine(pH7.0)）と 1.1mlの還元剤溶液を加え、４℃で２時間以上処理することにより、未反応のゲルの活性基をブロックした。最後にゲルを遠心分離を用いて精製水、ＤＰＢＳで洗浄し、小カラムチューブに充填し、３Mチオシアン酸カリウム溶液、0.1Mグリシン-HCl（pH2.5）溶液で洗浄後、再度ＤＰＢＳで再平衡化して保存した。抗ＲＴ１−１抗体カラム、抗ＲＴ１−２抗体カラム、抗ＲＴ２−１抗体カラム、抗ＲＴ２−２抗体カラム、抗ＲＴ１−２＋２−１混合抗体カラムの５種類それぞれの抗ＴＰＯペプチド抗体ゲルでは、各ＩｇＧ画分のカップリング効率は順に９７．４％、９５．４％、９８．４％、９８．３％、９９．４％に達した。また、それぞれのゲル体積当たりにカップリングしたＩｇＧ画分量は、５．６ｍｇ／ｍｌゲル、５．８ｍｇ／ｍｌゲル、５．７ｍｇ／ｍｌゲル、５．７ｍｇ／ｍｌゲル、２．９ｍｇ／ｍｌゲルであった。従って、抗体の由来や抗原の違いによって、カップリング効率やカップリング量に大きな差がないことが確認できたため、これらの抗体カラムを利用して、以下、実施例４７に示す実験を行った。〈実施例４７〉発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた培養上清由来ＴＰＯの抗ＴＰＯ抗体カラム→逆相カラムクロマトグラフィーでの精製及び生物学的活性の確認以下の精製サンプルの評価のためのin vitroアッセイ方法は、Ｍ−０７ｅアッセイ系を用いた。発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた、実施例３５の培養上清由来ＴＰＯの部分精製標品（ＴＰＯが回収された主たる画分ではない画分、即ち、Macro-Prep Methyl HICカラムの素通り画分Ｆ１と、Ｆ２の後に20mM Na Citrate，pH5.8でカラム洗浄し溶出したＦ３、SP Sepharose Fast FlowカラムのＦ１とＦ３をまとめてＴＰＯサブプール画分（5463.79ml,蛋白質濃度0.490mg/ml，総蛋白質量2676mg，相対活性12100，総活性量32380000）とし、限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット分子量8000カット）でまず濃縮し、さらに溶媒をＤＰＢＳに置換し、小体積になってからはＹＭ−１０膜付き限外濾過ユニット（アミコン社製）を用いて最終的に120.2mlの0.05％アジ化ナトリウムを含むＤＰＢＳ溶液にした。次に実施例４６で調製した５種類の抗ＴＰＯペプチド抗体ゲルを全て混合し、１本の抗体カラム（直径1.6cm,ベッド高4.8cm,抗ＲＴ１＋２混合抗体カラムと称す）にまとめ、室温にて流速0.033ml/minでＴＰＯサブプール画分を添加した。添加終了後、ＤＰＢＳで溶出液の紫外線吸収が十分下がるまでを集め、さらにＹＭ−１０膜付き限外濾過ユニット（アミコン社製）で濃縮した素通り画分Ｆ１（82.62ml，蛋白質濃度14.3mg/ml，総蛋白質量1184mg，相対活性67500，相対活性量79900000）を集めた。次に酸性溶離液（0.1Mグリシン-HCl( pH2.5)）で溶出されるカラム吸着画分Ｆ２（92.97ml,蛋白質濃度0.12mg/ml,総蛋白質量11.1mg,総活性257100,総活性量2860000）を溶出した。素通り画分Ｆ１には相当量のＴＰＯ活性があったが、抗体カラムに吸着したＴＰＯについては約２０倍の相対活性の上昇が認められたため、さらに精製を行った。即ち、展開溶媒Ａに0.1％TFA、展開溶媒Ｂに0.05％TFAを含む1-プロパノールを用いたCapcell P ak C1 300A（資生堂製、カタログ番号C1 TYPE：SG300A；直径4.6mm、ベッド高15 0mmに加え、直径4.6mm、ベッド高35mmのプレカラムを接続したもの）カラムにて、抗体カラムで得られたＦ２に１０分の１体積の展開溶媒Ｂを加え、20％Ｂで平衡化したCapcell Pak C1 300Aカラムに流速0.4ml/minで注入した。注入終了後、20％Ｂにて５分溶出した後、20％Ｂから40％Ｂまで50分の直線濃度勾配で展開し、1ml（2.5min）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。それぞれ２μｌ（５００分の１フラクション）を取りHSAを加え、限外濾過濃縮し、最終的に0.02％HSAを含む0.25mlのIMDMアッセイ培養液溶液とし、これをアッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号20〜23（プロパノール濃度で28.5〜32.5％の範囲）に強いＴＰＯの活性を示す標品を得ることができた。またこれらの標品を〈実施例４５〉に述べた方法によりウエスターン分析をしたところ、ＤＰＣＩＩＩ分子量マーカーに対し、還元下において見かけ上の分子量が６００００〜７００００のＴＰＯが確かに存在し、これとは別に、３２０００〜４３０００、２００００〜３００００の分子量をもつ分子も存在していることが判明した。〈実施例４８〉発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた培養上清由来で、Capcell Pak C1 300Aカラムの段階まで精製されたＴＰＯの生物学的活性の確認実施例３６で精製されたＴＰＯ活性画分、即ちCapcell Pak C1 300Aカラムのチューブ番号20〜23（プロパノール濃度で28.5〜32.5％の範囲）までを集め、0.21mlのグリセロールを添加後遠心エバポレーションで濃縮した。これに６Ｍ塩酸グアニジン溶液0.21ｍｌを加えたものをＤＰＢＳで１mlに希釈後、Sephadex G25カラム（NAP-10，ファルマシアバイオテック社製、カタログ番号17-0854-01）で0.01％ＨＳＡを含むＤＰＢＳ溶液に置換し、さらに1.1mlの0 .01％ＨＳＡを含むＤＰＢＳを加えて、最終的にＴＰＯ活性画分ＦＡ（2.6ml）を調製した。この標品の生物学的ＴＰＯ活性をについて調べるために、in vivoアッセイを行った。即ち、１群４匹のICR系雄性マウス（８週齢）に、活性画分100 μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量８７４００を含む）を１日１回、５日間連日皮下投与した。対照として、0.01%HSAを含むＤＰＢＳ100μｌを同様のスケジュールで皮下投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌日に眼底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、F800）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了後において投与前と比較して平均で１．４２倍の血小板の増加を認め、対照群の血小板数と比較しても１．２３倍の高値を示し、両者の間に有意差（p<0.05，Student t-test）を認めた。この結果から、動物細胞で生産された上記のヒトＴＰＯが、生体内において血小板増加作用を有することが明らかとなった。〈実施例４９〉発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた、培養上清３３Ｌを出発材料にし、陽イオン交換カラムで得た粗精製ＴＰＯ画分の生物学的活性の確認（１）以下の精製サンプルの評価のためのin vitroアッセイ方法は、Ｍ−０７ｅアッセイ系を用いた。実施例３６で記載された方法と同様にして、３３Ｌの発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた無血清培養上清を得て、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。これを限外濾過ユニット（ミリポア社製・ＰＬＧＣペリコンカセット分子量10000カット）で約１０倍濃縮し、蛋白質分解酵素阻害剤であるp-APMSFを最終濃度約１ｍＭ加え、体積２０１８ml（蛋白質濃度３．２２ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量６５０２ｍｇ、相対活性６６０００、総活性量４２９１０００００）を得た。次に、限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット分子量30000カット）で濃縮工程を繰り返し、分子量３００００以上の画分（体積１１９０ml）蛋白質濃度２．５４ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量３０２０ｍｇ、相対活性８２５００、総活性量２４９００００００）と、分子量３００００以下の画分（体積２９７５ml 、蛋白質濃度０．４７１ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量１４０２ｍｇ、相対活性４５００、相対活性量６３１００００）を得ることができた。分子量３００００以下の画分にＴＰＯ活性が存在することは、ＴＰＯの動物細胞での発現・分泌の過程において、最終的に培養上清中に、低分子化したＴＰＯが含まれている可能性を示す。一方、分子量３００００以上の画分をさらに20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.1）に置換し、20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.1）で予め平衡化した SP Sepharose Fast Flow（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-072 9-01；直径2.6cm、ベッド高29cm）カラムに注入し、流速５ml/minで添加した。添加終了後、さらに20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.1）で洗浄溶出した。次に展開溶媒Ａに20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.1）、展開溶媒Ａ中に１M NaClを含む溶液を展開溶媒Ｂとして用い、流速３ml/minで０％Ｂから50％Ｂまで215分間、さらに50％Ｂから100％Ｂまで20分の直線濃度勾配で展開し、30ml（ 10min）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。これらの一部を取り、Ｍ−０７ｅアッセイ系で活性の分布を調べたところ、広範囲にわたりＴＰＯ活性が溶出されたことが判明した。そこで素通りを含め、50mM以下のNaClで溶出された画分をＦ１、ＴＰＯの主画分として５０〜１０００mMのNaCl で溶出された画分をＦ２としてまとめた。Ｆ１は体積１９５１ml（蛋白質濃度２．０５ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量３９９４ｍｇ、相対活性１３５００、総活性量５３９０００００）、Ｆ２は体積６４９．８ml（蛋白質濃度１．１１ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量７２１ｍｇ、相対活性２６８０００、総活性量１９３００００００）であった。（２）SP Sepharose Fast Flow Ｆ２の生物学的活性の確認（１）で分取したSP Sepharose Fast FlowのＦ２を２．５ml取り、Sephadex G 25カラム（NAP-25，ファルマシアバイオテック社製、カタログ番号17-0852--0 1）で0.01％ＨＳＡを含むＤＰＢＳ溶液３．５mlに置換し、このサンプル（蛋白質濃度１．４６ｍｇ／ｍｌ）の生物学的ＴＰＯ活性について調べるために、in vivo アッセイを行った。即ち、１群４匹のICR系雄性マウス（８週齢）に、活性画分100μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での総活性量１２３０００を含む）を１日１回、５日間連日皮下投与した。対照として、0.01%HSAを含むＤＰＢＳ100μlを同様のスケジュールで皮下投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌日に眼底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、F800）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了後において投与前と比較して平均で１．２９倍の血小板の増加を認め、対照群の血小板数と比較しても１．１２倍の高値を示し、両者の間に有意差（p<0.05，Student t-test）を認めた。この結果から、哺乳動物細胞で生産された上記のヒトＴＰＯが、生体内において血小板増加作用を有することが明らかとなった。〈実施例５０〉ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＨＯ細胞用組換え発現ベクター、pDEF２０２-ghTPO の構築ベクターpDEF２０２を制限酵素KpnIとSpeIで処理し、アガロースゲル電気泳動で小さい方のマウスDHFRミニ遺伝子とSV４０ポリアデニル化シグナルを含むフラグメントを回収したのち、このフラグメントとヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡを含むプラスミドpEFHGTEを制限酵素KpnIとSpeIで処理しSV４０ポリアデニル化シグナルを含む領域を除去したベクターDNAとをT ４DNAリガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターpDEF２０２-ghTPOを得た。このプラスミドはSV４０の複製開始領域、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロモーター、SV４０初期ポリアデニル部位、マウスDHFRミニ遺伝子、pUC１８の複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝子（Amp^r）を含み、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロモーター下流にヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡが接続されている。〈実施例５１〉ＣＨＯ細胞によるヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡの発現ＣＨＯ細胞（dhfr−株、UrlaubとChasin；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；７７巻４２１６頁、１９８０）を６cm径のプレート（Falcon社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小必須培地（α-MEM（−）、チミジン、ヒポキサンチン添加）で培養増殖させ、これをリン酸カルシウム法（CellPhect、ファルマシア社製）によって形質転換した。すなわち、実施例５０で調製したpDEF２０２-ghTPOプラスミド１０μgにバッファーＡ：１２０μlおよびH20：１２０μlを加え混合したのち、室温で１０分間インキュベートした。つぎに、この溶液にバッファーＢ：１２０μlを加え、再度混合したのち、室温で３０分間放置した。このDNA溶液をプレートに滴下したのち、CO₂インキュベーター中で６時間培養した。プレートから培地を除去し、α-ME M（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチルスルフォオキシド含有α-MEM（−）を添加し、室温で２分間処理した。次いで、１０％透析牛胎児血清含有非選択培地（前出α-MEM（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）を添加して２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清含有選択培地（α-MEM（−）、ヒポキサンチン、チミジン無添加）での選択をおこなった。選択は細胞をトリプシン処理した後、６cm径プレート１枚あたりを、１０cm径プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２０枚に分割したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換を行いながら培養を続行する事により実施した。細胞が増殖してきたプレートあるいはウエルについてその培養上清中のヒトＴＰＯ活性をＢａ／Ｆ３アッセイを用いて測定した結果、ヒトＴＰＯ活性が認められた。なお、ＣＨＯ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しpEFHGTEとpMG1を同時形質転換（co-transfection）することによっても行うことができる。〈実施例５２〉−１位にＬｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）（以下、このタンパク質を「ｈＭＫＴ（1-163）」と称す）の大腸菌用発現ベクターの構築及び発現の確認配列番号６のアミノ酸配列（１−１６３位）の−１位にＬｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたタンパク質を発現するため、実施例４２と同様にして、以下に示した１−１３、２−１３、３−３、４−３の合成オリゴヌクレオチドを用いて、ｈＭＫＴ（1-163）（［Ｍｅｔ^-2、Ｌｙｓ^-1］ＴＰＯ（1-163）とも称する）の大腸菌用発現ベクターpCFM536/hMKT(1-163)を構築した。この発現プラスミドは、配列表（配列番号１２）に示されたDNA配列を含んでいる。さらに、実施例４３と同様にして、ｈＭＫＴ（1-163）の発現を誘導した。ここで得られた発現タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＰＶＤＦ膜に転写し、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行った結果、発現されるべきｈＭＫＴ（1-163）のアミノ酸配列を含むことが確認できた。〈実施例５３〉大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ由来変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（1-163）の塩酸グアニジンとグルタチオンを用いたリフォールディング、精製及び生物学的活性の確認実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（1-163）生産組換体凍結菌体１．２ｇに水３ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去する。回収されたｈ６Ｔ（1- 163）を含む沈殿画分に水を加えてけん濁し、最終４ｍｌとした。攪拌しながら１ｍｌの１ＭTris緩衝液ｐＨ８．５を加えた後、２０ｍｌの８Ｍ塩酸グアニジンを加えて室温にて５分間攪拌して可溶化した。これを２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈し、５ｍＭ還元型グルタチオンと０．５ｍＭの酸化型グルタチオンを加えて攪拌し溶かした後、４℃中にて一晩静置した。遠心分離により、上清中にｈ６Ｔ（1-163）を回収した。得られた上清のうち１６０ｍｌをＹＭ１０限外濾過膜（アミコン社製）を用いて濃縮し、ＤＰＢＳにて緩衝液を置換して最終容量３．４ｍｌとした（蛋白濃度２．１８ｍｇ／ｍｌ）。この画分をIMDM培養液に対して十分に透析後、ラットCFU-MKアッセイ系で評価した結果、強いＴＰＯの活性（相対活性５８０００）を示した。上記の方法により調製したＴＰＯ活性画分についてin vivoアッセイを行った。１群４匹のICR系雄性マウス（７週齢）に、活性画分170μｌ（ラットCFU-MKアッセイ系での総活性量２２０００を含む）を１日１回、５日間連日皮下投与した。対照として、１群６匹の同様のマウスにＤＰＢＳ170μｌを同様のスケジュールで皮下投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌日、終了３日後に眼底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、F800）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了翌日において投与前と比較して平均で２．１５倍の血小板の増加を認め、また投与終了３日後においてもその効果は持続しており２．１３倍の高値を維持した。投与終了翌日及び３日後のいずれの日においても、血小板数は、それぞれの日の対照群のそれと比較して１．７３倍、１．８０倍と高値を示し、両者の間に有意差（p<0.001，Student t-test）を認めた。この結果から、大腸菌より生産され、上記の方法で調製したヒトＴＰＯが、生体内において血小板増加作用を有することが明らかとなった。〈実施例５４〉大腸菌で発現した変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（1-163）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムと硫酸銅を用いたリフォールディング、精製及び生物学的活性の確認実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（1-163）生産組換体凍結菌体０．６ｇに水３ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕した後、遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿画分に３．１ｍｌの水を加えて懸濁した後、０．１９ｍｌの１ＭTris緩衝液ｐＨ９．２、１１．２５μｌの１Ｍ DTT、３８μｌの０．５ＭE DTA、０．３８ｍｌの１０％デオキシコール酸ナトリウムを攪拌しながら加え、室温にて４０分間攪拌した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。沈殿に水４ｍｌを加えてけん濁した後、遠心分離によってｈ６Ｔ（1-163）を含む沈殿画分を回収した。得られた沈殿画分に水３．０ｍｌを加え懸濁した後、攪拌しながら０．２ｍｌの１ＭTris緩衝液ｐＨ８と１ｍｌの１０％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムを加えて室温にて２０分間攪拌して可溶化した。これに５μｌの１％硫酸銅を加え、室温にて一晩（約２０時間）攪拌した。遠心分離によりｈ６Ｔ（1-163）を含む上清画分を回収した後、上清５ｍｌに５ｍｌの水、１０ｍｌの２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ７．７加えた後、２．６ｇのDowex 1-x4，20-50mesh，chloride formイオン交換樹脂を加え、９０分間撹拌した。グラスフィルターを用いてイオン交換樹脂非吸着画分を回収した後、遠心分離によって上清を回収した。得られた上清を２０ｍＭTr is緩衝液ｐＨ７．７で平衡化したSP Sepharose Fast Flow陽イオン交換カラムに添加し、同緩衝液中でNaCl濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。溶出画分をIMDM培養液に対して十分に透析後、ラットCFU-MK アッセイ系で評価した結果、SP Sepharose Fast Flow陽イオン交換クロマトグラフィーのNaCl濃度約１００ｍＭ付近で溶出された画分に強いＴＰＯの活性（相対活性約１９００００００）を示した。この画分をウルトラフリーＣＬ分画分子量５０００限外濾過ユニット（ミリポア社製、型番UFC4LCC25）を用いて１．６倍濃縮した（２．５ｍｌ、蛋白濃度２５μｇ／ｍｌ）。同画分を還元剤存在下でSD S-PAGEで分析した結果、ＴＰＯのバンドが主バンドとして検出された（純度７０ −８０％）。上記の方法により調製したＴＰＯ活性画分についてin vivoアッセイを行った。１群４匹のICR系雄性マウス（８週齢）に、活性画分100μｌ（ラットCFU-MKアッセイ系での総活性量４７５００を含む）を１日１回、５日間連日皮下投与した。対照として、１００ｍＭNaClを含む２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ７．７ 100μｌを同様のスケジュールで皮下投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌日に眼底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、F800）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了後において投与前と比較して平均で１．７３倍の血小板の増加を認め、対照群の血小板数と比較しても１．５９倍の高値を示し、両者の間に有意差（p<0.01,Student t-test）を認めた。この結果から、大腸菌より生産され、上記の方法で調製したヒトＴＰＯが、生体内において血小板増加作用を有することが明らかとなった。〈実施例５５〉ＣＨＯ細胞の大量培養実施例３２においてヒトTPO発現プラスミドpDEF202-hTPO-P1をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られたヒトTPO産生ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ28-30細胞、２５nM MTX耐性）の大量培養は以下のようにして実施した。細胞を25nM MTXおよび10%FCSを含むDMEM/F -12培地（GIBCO社）を用いて培養増殖させた。この細胞をトリプシン溶液を用いて剥離したのち、２００mlの同培地を含むFalcon社製ローラーボトル（Falcon30 00）に１×10⁷個の細胞を接種し、３７℃で１rpmの回転速度で３日間培養した。３日後、培養液を吸引除去し、１００ｍｌのPBSで細胞培養表面をリンスしたのち、25nM MTXおよび10%FCSを含まないDMEM/F-12培地（GIBCO社）を200ml加え、３７℃、１rpmの回転速度で７日間培養し、７日後その培養上清を回収し、次の精製操作の出発材料にした。上記の操作をローラーボトル５００本分実施し、培養上清１００Ｌを得た。〈実施例５６〉ヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株からヒトＴＰＯの精製（１）実施例５５より無血清培養上清約１００Ｌを得て、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。これを限外濾過ユニット（ミリポア社製・ＰＬＴＫペリコンカセット分子量３００００カット）で濃縮かつ溶媒を精製水に置換し、蛋白質分解酵素阻害剤であるp-APMSF（和光純薬社製）を最終濃度１ｍＭ及びP efabloc SC（Merk社製）を最終濃度０．３５ｍＭ加え、体積３６２８ml（蛋白質濃度１．６０ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量５８０５ｍｇ、相対活性１２３００００、総活性量７１４９００００００）の分子量３００００以上の画分を得た。この画分を実施例４５で述べたウエスターン分析で調べたところ、分子量６６０００〜１０００００の範囲にＴＰＯ蛋白質が存在することが明らかとなった。さらによく調べてみると、これとは別に、より低分子のＴＰＯをも含まれていることが判明した。分子量３００００以下の限外濾液はこれとは別に限外濾過ユニット（ミリポア社製・ＰＬＧＣペリコンカセット分子量１００００カット）で濃縮したところ、体積１９０１ml（蛋白質濃度０．３６ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量６８４ｍｇ）相対活性２４５５００、総活性量１６７９０００００）であったため、低分子化したＴＰＯ分子が培養工程において生じたことが確認された。次に、分子量３００００以上の画分３６１４ｍｌに７６４ｇの硫酸アンモニウム、及び１４４．５ｍｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（pH５．５）を加え、最終濃度１．４１Ｍ硫酸アンモニウム、１７．７ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む４０８９ｍｌの溶液とし、生じた不溶物を遠心分離後可溶物を得た。これを１．２M硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（p H5.5）で予め平衡化してあったMacro-Prep Methyl HICカラム（Bio-Rad社製、カタログ番号156-0080；直径５cm、ベッド高24.5cm）に、流速約２５ml/minで添加した。添加終了後、１．２M硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）で溶出されたものを限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット分子量8000カット）で濃縮し、素通り画分Ｆ１（4455ml ，蛋白質濃度0.400mg/ml，総蛋白質量1780mg，相対活性1831000）を得た。次に、溶出液を20mM Na Citrate，pH6.0にかえ、溶出されたものを限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット分子量8000カット）で濃縮し、画分Ｆ２（1457ml，蛋白質濃度0.969mg/ml，総蛋白質量1411mg，相対活性17 15000）を集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、このＦ２には分子量６６０００〜１０００００の蛋白質が存在することが確認された。さらにウエスターン分析により、この蛋白質がＴＰＯであることが明らかとなった。次に、Macro-Prep Methyl HICカラムＦ２（1443ml）を、20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）で予め平衡化したSP Sepharose Fast Flow（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号17-0729-0 1；直径５cm、ベッド高12cm）カラムに注入し、流速15ml/minで添加した。添加終了後、さらに50mM NaClを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）で溶出されたものまでをまとめ、画分Ｆ１（3007ml，蛋白質濃度0.226mg/ml，総蛋白質量679mg，相対活性88830）を得た。次に、溶出液を750mM NaClを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.4）にかえ、溶出された画分Ｆ２（931ml，蛋白質濃度 0.763mg/ml，総蛋白質量710mg，相対活性5558000）を集めた。これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット分子量8000カット、及びアミコン社製ＹＭ３膜）で２０２ｍｌまで濃縮した。次に、SP Sepharose Fast FlowカラムのＴＰＯ活性画分Ｆ２の濃縮液（197ml ）をSephacryl S-200HRカラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号1 7-0584-05；直径7.5cm、ベッド高100cm）に注入し、流速3ml/minでゲル濾過を行った。溶離液体積１２００〜１７８５ｍｌ、１７８５〜２０１０ｍｌ、２０１０〜２２８０ｍｌ、２２８０〜３０００ｍｌの各範囲をまとめ、それぞれ画分Ｆ１（585ml，蛋白質濃度100mg/ ml，総蛋白質量589mg，相対活性4118000）、画分Ｆ２（225ml，蛋白質濃度0.263 /ml，総蛋白質量59.2mg，相対活性2509000）、画分Ｆ３（270ml，蛋白質濃度0.1 19/ml，総蛋白質量32.1mg，相対活性2535000）、画分Ｆ４（720ml，蛋白質濃度0 .0467/ml，総蛋白質量33.6mg，相対活性1155000）を得た。このように、分画されたＴＰＯ活性はゲル濾過法での分子量範囲が広いことが判明したため、ＳＤＳ −ＰＡＧＥ後、ウエスターン分析を実施したところ、Ｆ１ではほとんどが分子量６６０００〜１０００００のＴＰＯであったのに対し、Ｆ２、Ｆ３ではそれぞれ分子量３２０００〜６００００、分子量３２０００〜４２０００のＴＰＯ分子種が存在していた。いずれの分子量のＴＰＯ分子も全てＴＰＯ活性をもっていた。なお、分子量６６０００〜１０００００のＴＰＯ分子についてＮ末端アミノ酸配列分析を実施したところ、ヒトＴＰＯ遺伝子でコードされるタンパク質のアミノ酸配列を含むことが確認できた。また、分子量６６０００〜１０００００のＴＰＯ分子について、Ｎ‐グリカナーゼ（N-glycanase：Genzyme社製、カタログ番号1472-00）、ノイラミニダーゼ（Neuraminidase：ナカライテスク社製、カタログ番号242-29 SP）、エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（Endo-α-N-acetylgalactosaminidase：生化学工業製、カタログ番号100453）、およびＯ‐グリコシダーゼ（O-Glycosidase：Boehringer Mannheim Biochemica社製、カタログ番号1347101）の糖鎖切断酵素を単独あるいは組み合わせて酵素消化実験を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ、ＴＰＯのポリペプチド部分は理論値から推定される分子量約３６０００であり、Ｎ結合型糖鎖とＯ結合型糖鎖の両方を持つ糖タンパク質であることが判明した。〈実施例５７〉ヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株からヒトＴＰＯの精製（１）実施例５５と同様にして得られたCHO細胞無血清培養上清１Ｌに211.4ｇの硫酸アンモニウムを加え、0.2μmフィルター（Gelman Science社製、カタログ番号12992）で濾過し、予め1.2M硫酸アンモニウム，20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.6）で平衡化しておいたMacro-Prep Methyl HICカラム（Bio-Rad社製，カタログ番号156-0081，直径50mm、ベッド高90mm）に流速15ml/minで添加した。添加終了後、20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.6）450mlで溶出した。この溶出液をＶｙｄａｃ逆相C4カラム（The Separations Group社製、カタログ番号214BTP54，直径4.6mm，ベッド高250mm）に流速0.75ml/minで添加した。添加終了後、１５分間５％エタノールを含む10mM トリス緩衝液（pH6.4）（展開溶媒Ａ）で洗浄後、展開溶媒Ａから10mMトリス緩衝液（pH6.4）を含む９４％エタノール（展開溶媒Ｂ）まで６６分間の直線グラジエントで溶出した。このクロマトグラムを図１５に示した。ＴＰＯと思われる分子量約65000-100000の分子は、SDS-PAGEによる分析の結果、サンプル添加後の保持時間68-72分付近の画分に得ることができ、単一なバンドであることが確認できた（図１６参照）。さらにウエスターン分析により、このタンパク質がＴＰＯであることを確認した。このサンプルの一部を取り、Ｎ末端アミノ酸分析を行った結果、ヒトＴＰＯ遺伝子でコードされるタンパク質のアミノ酸配列を含むことが確認できた。〈実施例５８〉ヒトＴＰＯの昆虫細胞での発現用組換えウイルスの作製実施例３０で作製したｐＨＴＰ１を制限酵素EcoRI並びに NotIで消化後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約1200bpのバンドをプレップ -A-ジーンDNA精製キットを用いて精製した後、同様に制限酵素処理したトランスファーベクターｐＶＬ１３９３（インビトローゲン社製）に連結しコンピテントハイE.coli DH5（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、ヒトＴＰＯｃＤＮＡのコーディング領域を全て含むクローンｐＶＬ１３９３／ｈＴＰＯを得た。このクローンのプラスミドＤＮＡをMolecu lar Cloning（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）に記載されているようにして調製し、BaculoGold ^TM Transfection Kit（ファーミンゲン社製）を用いて昆虫細胞Ｓｆ２１（インビトローゲン社製）にトランスフェクション後、Ｓｆ‐９００培地（ライフテクノロジー社製）中で２７℃で４日間培養し、そのウイルスを含んだ上清を回収した。この上清を１０⁹〜１０⁵倍に希釈してその１ｍｌを用いて、３５mm径のシャーレ中で約７×１０⁵個のＳｆ２１細胞に２７℃で１時間感染させた。上清を抜きとりＳｆ‐９００培地を含む１％アガロースを流し込みアガロースが固まった後、加湿下で２７℃で６日間培養した。ここで形成されたシングルプラークをピックアップし、２００μｌのＳｆ−９００培地中でウイルスを溶出させた。このウイルスクローンを２４ウエルプレート中でＳｆ２１細胞に感染させウイルスの増幅を行った。得られたシングルプラーク由来のウイルス液の一部をフェノール／クロロホルム処理後、エタノール沈殿してウイルスＤＮＡを回収した。このウイルスＤＮＡを鋳型としてヒトＴＰＯｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、特異的なＤＮＡ断片が増幅されるか否かにより、ヒトＴＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを選択した。ここで得られたヒトＴＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを含む上清を用いてＳｆ２１細胞に感染させ、さらにウイルスの増幅を行った。〈実施例５９〉Ｓｆ２１昆虫細胞でのヒトＴＰＯの発現と活性確認１７５cm²の培養フラスコ中に、Ｓｆ２１細胞を約８０％コンフルエントになるまで培養し、実施例５８で作製したヒトＴＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを２７℃で１時間感染させた後、Ｓｆ−９００培地中で２７℃で４日間培養し、その上清を回収した。得られた培養上清をＮＡＰ^TM‐５カラム（ファルマシア社製）を用いてＩＭＤＭ培養液に置換し、これをラットＣＦＵ‐ＭＫアッセイ系及びＭ‐０７ｅアッセイ系にかけたところ、用量依存的に有意なＴＰＯ活性及びＭ‐０７ｅ細胞増殖促進活性が認められた。また、実施例４５に記載したのと同様のウエスタン分析により、Ｓｆ２１細胞で発現した組み換えヒトＴＰＯが確認された。〈実施例６０〉大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列を保有するクローンpCFM536/ｈ６Ｔ（1- 163）由来の変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（1-163）のＮ‐ラウロイルサルコシンナトリウムと硫酸銅を用いたリフォールディングとｈ６Ｔ（1-163）精製実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（1-163）生産組換体凍結菌体３０ｇに水３００ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機（１００００psi、Rannie High Pressure Laboratory）で菌体を破砕した後、遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿画分に９０ｍｌの水を加えて懸濁し、さらに撹拌しながら水を加えて液量を１５０ｍｌにした後、９ｍｌの１ＭTris緩衝液ｐＨ９．２、５４０μｌの１ＭDTT、１．８ｍｌの０．５ＭEDTA、１８ｍｌの１０％デオキシコール酸ナトリウムを攪拌しながら加え、室温にて３０分間攪拌した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。沈殿に１８０ｍｌの５ｍＭDTTを加えてけん濁した後、遠心分離によってｈ６Ｔ（1-163）を含む沈殿画分を回収した。得られた沈殿画分に水３００ｍｌを加え懸濁し、さらに撹拌しながら水を加えて液量を５７０ｍｌにした後、攪拌しながら３０ｍｌの１ＭTris緩衝液ｐＨ８と１５０ｍｌの１０％Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウムを加えて室温にて２０分間攪拌して可溶化した。これに７５０μｌの１％硫酸銅を加え、室温にて一晩（約２０時間）攪拌した。遠心分離によりｈ６Ｔ（1-163）を含む上清画分を回収した後、上清７５０ｍｌに７５０ｍｌの水、１５００ｍｌの２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ７．７加えた後、撹拌しながら３ｍｌのポリソルベート８０（日光ケミカルズ）を加えた。同溶液に６００ｇのDowex 1-x4，20-50 mesh，chlo ride formイオン交換樹脂を加え、室温にて９０分間撹拌した。グラスフィルターを用いてイオン交換樹脂非吸着画分を回収した後、７５０ｍｌの２０ｍＭTris 緩衝液ｐＨ７．７でイオン交換樹脂を洗浄した。イオン交換樹脂非吸着画分と洗浄液を合わせた溶液に２Ｎ水酸化ナトリウム加えてｐＨを９．２に調整し、０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ９．２で平衡化したＱ Sepharose Fast Flow陰イオン交換カラム（内径５ｃｍｘ１０ｃｍ）に添加し、非吸着画分を回収した。塩酸を用いて得られた非吸着画分のｐＨを７．２に調整し、０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭTr is緩衝液ｐＨ７．２で平衡化したSP Sepharose Fast Flow陽イオン交換カラム（内径５ｃｍｘ１０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。溶出液についてSD S-PAGEによって分析を行い、ＴＰＯ溶出画分を集めた。ＴＰＯ溶出画分にトリフルオロ酢酸を０．１％になる様に加え、カプセルパック５μｍ３００A Ｃ１カラム（内径２．１ｃｍｘ５ｃｍｘ２本、資生堂）に添加した後、０．１％トリフルオロ酢酸中で１−プロパノール濃度を上昇させる直線濃度勾配溶離法によって逆相ＨＰＬＣを行なった。溶出液について還元剤非存在下でのSDS-PAGEにより分析した結果及び逆相ＨＰＬＣでの溶出位置によって、３画分に分画し、各々について０．１％トリフルオロ酢酸を用いて３倍希釈した後、上記の逆相ＨＰＬＣカラムに添加し、同様の方法で再クロマトグラフィーを行なった。得られたＴＰＯ３画分を逆相ＨＰＬＣの溶出順にFr.S-a、Fr.S-b、 Fr.S-c（図１７参照）として還元剤非存在下でのSDS-PAGEで分析した結果、各々、分子量１８Ｋダルトン（FT.S-a）、１９Ｋダルトン（Fr.S-b）、１８Ｋダルトン（Fr.S-c）付近に単一のバンドとして検出された（図１８参照）。各々についてアミノ酸組成分析を行った結果、得られたアミノ酸組成はシークエンス情報からの理論値とほぼ一致し，またＮ末端アミノ酸配列分析の結果、予想される配列のみが得られた。またアミノ酸分析の結果から得られた各画分の蛋白質量は、各々、０．６４ｍｇ（Fr.S-a）１．８１ｍｇ（Fr.S-b）、３．４９ｍｇ（Fr.S-c）であった。各画分をIMDM培養液に対して十分に透析後、Ｍ−０７ｅアッセイを行った結果、相対活性約１６２００００（Fr.S-a）、相対活性約２３５０００００（Fr.S-b）、相対活性約７４６００００００（Fr.S-c）のＴＰＯ活性を示した。〈実施例６１〉大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列を保有するクローンpCFM536/ｈ６Ｔ（1- 163）由来の変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（1-163）の塩酸グアニジンとシステイン ‐シスチンを用いたリフオールディング及びｈ６Ｔ（1-163）の精製実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（1-163）生産組換体凍結菌体５０ｇに水５００ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機（１００００psi、Ranni e High Pressure Laboratory）で菌体を破砕した後、遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿画分に水を加えて懸濁し、さらに撹拌しながら水を加えて液量を２５０ｍｌにした後、１５ｍｌの１ＭTris緩衝液ｐＨ９．２、９００μｌの１Ｍ DTT、３ｍｌの０．５ＭEDTA、３０ｍｌの１０％デオキシコール酸ナトリウムを攪拌しながら加え、室温にて３０分間攪拌した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。沈殿に３００ｍｌの５ｍＭDT Tを加えてけん濁した後、遠心分離によってｈ６Ｔ（1-163）を含む沈殿画分を回収した。回収されたｈ６Ｔ（1-163）を含む沈殿画分に水を加えてけん濁し、最終１０４ｍｌとした。攪拌しながら２０ｍｌの１ＭTris緩衝液ｐＨ８．５を加えた後、３７６ｍｌの８Ｍ塩酸グアニジンを加えて室温にて１０分間攪拌して可溶化した。これに撹拌しながら２５００ｍｌの０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ８．５を加え、さらに１Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ８．５を２０００ｍｌ加えた後、５ｍＭシステインと０．５ｍＭシスチンを加えて攪拌し溶かした。４℃中にて一晩静置した後、遠心分離によって上清中にｈ６Ｔ（1-163）を回収した。得られた上清をプレップスケールUFカートリッジPLDC限外濾過膜（ミリポア）を用いて濃縮し、０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ９．２にて緩衝液を置換して最終容量約１０００ｍＬとした。これを０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ９．２で平衡化したＱ Sepharose Fa st Flow陰イオン交換カラム（内径５ｃｍｘ１０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行ない、塩化ナトリウム濃度２０ｍＭから１５０ｍＭ付近までの塩濃度で溶出された画分２４０ｍＬを回収した。得られた画分を２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ７．２で４倍に希釈して９６０ｍＬとし、酢酸を用いてｐＨを７．２に調整した。これを０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭTris緩衝液ｐＨ７．２で平衡化したSP Sepharose Fast Flow陽イオン交換カラム（内径５ｃｍｘ１０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。溶出液についてSDS-PAGEによって分析を行い、ＴＰＯ溶出画分を集めた。ＴＰＯ溶出画分にトリフルオロ酢酸を０．１％になる様に加え、カプセルパック５μｍ３００A Ｃ１カラム（内径２．１ｃｍｘ５ｃｍｘ２本、資生堂）に添加した後、０．１％トリフルオロ酢酸中で１−プロパノール濃度を上昇させる直線濃度勾配溶離法によって逆相ＨＰＬＣを行なった。溶出液について還元剤非存在下のSDS-PAGEにより分析した結果及び逆相ＨＰＬＣでの溶出位置によって２画分に分画した。得られたＴＰＯ溶出２画分を逆相ＨＰＬＣの溶出順にFr．Ｇ-a、Fr．Ｇ-d（図１７参照）として各々について還元剤非存在下でのSDS-PAGEで分析した結果、各々、分子量１８Ｋダルトン（Fr.G-a）、３２Ｋダルトン（Fr.G-d）付近に単一のバンドとして検出された（図１８参照）。また、還元剤存在下でのSDS-PAGE分析を行った結果、どちらの画分も分子量２０Ｋダルトン付近に単一のバンドとして検出された。各々についてアミノ酸組成分析を行った結果、得られたアミノ酸組成はシークエンス情報からの理論値とほぼ一致し，またＮ末端アミノ酸配列分析の結果、予想される配列のみが得られた。またアミノ酸分析の結果から得られた各画分の蛋白質量は、各々、２．５６ｍｇ（Fr.G-a）、１．１６ｍｇ（Fr.G-d）であった。各画分をIMDM培養液に対して十分に透析後、Ｍ−０７ｅアッセイを行った結果、相対活性約３９６００００（Fr.G-a）、相対活性約７７６００００（Fr.G-d）のＴＰＯ活性を示した。〈実施例６２〉部分長ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）（以下、このタンパク質を「hTPO１６３」と称す）のＣＨＯ細胞用組換えベクター、pDEF２０２-hTPO１６３の構築実施例３１で得られたベクターpDEF２０２を制限酵素EcoRIとSpeIで処理し、アガロースゲル電気泳動で大きい方のベクターフラグメントを回収したのち、このフラグメントと−２１から１６３位のアミノ酸までをコードするhTPO１６３ c DNA（配列番号１３参照）を含むプラスミドpEF18S-hTPO１６３を制限酵素EcoRI とSpeIで処理して得られたhTPO１６３ cDNAとをT ４ DNAリガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターpDEF２０２-hTPO１６３を得た。このプラスミドはSV ４０の複製開始領域、ヒトエロンゲーションファクター１−アルファプロモーター、SV４０初期ポリアデニル部位、マウスDHFRミニ遺伝子、pUC １８の複製開始領域、β‐ラクタマーゼ遺伝子（Amp^r）を含み、ヒトエロンゲーションファクター１−アルファプロモーター下流にhTPO１６３ cDNAが接続されている。〈実施例６３〉ＣＨＯ細胞によるhTPO１６３の発現ＣＨＯ細胞（dhfr‐株、UrlaubとChasin；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；７７巻４２１６頁、１９８０）を６cm径のプレート（Falcon社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小必須培地（α-MEM（−）、チミジン、ヒポキサンチン添加）で培養増殖させ、これをトランスフェクタム法（生化学工業社製）によって形質転換した。すなわち、実施例６２で調製したpDEF２０２-hTPO１６３プラスミド１０μgに０．３M NaCl２４０μlを加え混合したのち、トランスフェクタム２０μlとH₂O ２２０μlとの混合液を加え、再度混合した。このDNA溶液をプレートに滴下したのち、CO₂インキュベーター中で６時間培養した。プレートから培地を除去し、 α-MEM（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチルスルフォオキシド含有α-MEM（− ）を添加し、室温で２分間処理した。次いで、１０％透析牛胎児血清含有非選択培地（前出α-MEM（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）を添加して２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清含有選択培地（α-MEM（−）、ヒポキサンチン、チミジン無添加）での選択をおこなった。選択は細胞をトリプシン処理した後、６cm径プレート１枚あたりを、１０cm径プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２０枚に分割したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換を行いながら培養を続行する事により実施した。細胞が増殖してきたプレートあるいはウエルについてはその培養上清中のＴＰＯ活性をＢａ／Ｆ３アッセイ法を用いて測定したところ、ＴＰＯ活性が認められた。培養上清中にＴＰＯ活性の認められたものについては新しいプレートあるいはウエルに２５nMのメソトレキセートを含む選択培地で１：１５に細胞を分割し、培養を続行することによりメソトレキセートに耐性の細胞を増殖させてクローニングを行った。なお、ＣＨＯ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しpEF18S-hTPO１６３とpMG1を同時形質転換（co-transfection）することによっても行うことができる。プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３によって形質転換されたＣＨＯ細胞株（CHO-DUKXB11）は１９９５年１月３１日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４９８９として寄託されている。〈実施例６４〉ＣＨＯ細胞の大量培養実施例６３においてhTPO１６３発現プラスミドpDEF２０２-hTPO１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られたhTPO１６３産生ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ109細胞、10％透析牛胎仔血清含有選択培地［ヒポキサンチンとチミジンを含まないα−ＭＥＭ^-］中で上述のように選択して得られた細胞）の大量培養は以下のようにして実施した。細胞を10％FCSを含むDMEM/F-12培地（GIBCO社）を用いて培養増殖させた。この細胞をトリプシン溶液を用いて剥離したのち、２００ mlの同培地を含むFalcon社製ローラーボトル（Falcon3000）に1000万個の細胞を接種し、３７℃で１rpmの回転速度で３日間培養した。３日後、培養液を吸引除去し、１００ｍｌのPBSで細胞培養表面をリンスしたのち、10%FCSを含まないDME M/F-12培地（GIBCO社）を200ml加え、３７℃、１rpmの回転速度で７日間培養し、７日後その培養上清を回収し、次の精製操作の出発材料にした。上記の操作をローラーボトル３００本分実施し、無血清培養上清６０Lを得た。〈実施例６５〉hTPO１６３産生ＣＨＯ細胞株からhTPO１６３の精製（１）実施例６４より得られた無血清培養上清６０Ｌを得て、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。さらに限外濾過ユニット（フィルトロン社製・分子量１００００カット）を用いて濃縮画分（600ml、蛋白質濃度１１．２ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量６４３０ｍｇ）を得た。この画分を抗ＨＴ１ペプチド抗体を用いてウエスターン分析で調べたところ、見かけの分子量２００００〜２６０００の範囲に発現されたhTPO１６３蛋白質が存在することが明らかとなった。この濃縮培養上清５７３ｍｌを流速約20ml/minにて、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で予め平衡化してあったSephadex G-25 Fineカラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号17-0032-02；直径10cm、ベッド高30cm）にて処理することにより、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）溶液となった蛋白質画分Ｆ１（938ml，蛋白質濃度4.9mg/ml，総蛋白質量4594mg）を得た。このSephadex G-25 Fineカラム蛋白質画分９２９ｍｌを、予め１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）平衡化したSP Sepharose Fast Flow（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号17-0729-0 1；直径５cm、ベッド高12cm）カラムに流速15ml/minで添加した。添加終了後、さらに１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）、次いで１０％エタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で溶出されたものまでをまとめ、画分Ｆ１（1608ml，蛋白質濃度2.13mg/ml，総蛋白質量3426mg）を得た。次に、溶出液を１０ｍＭリン酸ナトリウム（pH6.8）中に７５０mM NaCl、２５％エタノールを含む緩衝液にかえ、溶出されたhTPO１６３の主たる溶出画分Ｆ２（651m l，蛋白質濃度1.67mg/ml，総蛋白質量1087mg）を集めた。 SP Sepharose Fast FlowカラムのＴＰＯ活性画分Ｆ２のうち２００ｍｌをとり、エタノール及び精製水を加え、最終エタノール濃度４５％の溶液３００ｍｌを調製した。ここでエタノール添加の結果生じた不溶物を遠心分離により取り除いた後、展開溶媒Ａ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.7））、展開溶媒Ｂ（９０％エタノールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.7））を用意し、予め５０％Ｂ液にて平衡化したSOURCE 15RPCカラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号17-0727-02；直径２cm、ベッド高20cm）に流速２ml/minで注入した。注入後、カラム非吸着物質がほぼ溶出するまで４５％Ｂ液にて洗浄した後、流速を1. 5ml/minにし、まず５分間５０％Ｂ、次いで５０％Ｂから１００％Ｂまで１４０分の直線濃度勾配の後、１００％Ｂ液にて３５分間展開した。この間５分（７．５ｍｌ）ごとに集められた溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスターン分析にかけ、hTPO１６３の溶出範囲を調べたところ、エタノール濃度６６％〜８７％の範囲に見かけの分子量約２００００から２６０００の高度に精製されたhTPO１６３が溶出されていることが判明した。これらのhTPO１６３のうち分子量の高いものほどより早く逆相カラムから溶出したことから、糖鎖がより多く結合したhTPO １６３分子ほど親水性が増していることが示唆された。 SOURCE 15RPCカラムのhTPO１６３溶出画分（エタノール濃度６８％〜８６．５％の範囲に溶出したhTPO１６３画分９０ｍｌ）のうち、８８．８ｍｌにＣＨＡＰＳを添加後、限外濾過法（アミコン社製、ＹＭ−３膜付き限外濾過ユニット）により濃縮、洗浄を行い、最終的に約５％エタノール、４ｍＭＣＨＡＰＳを含む２．５ｍｌの濃縮標品とした。この標品を予め１０％エタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で平衡化したSuperdex 75pgカラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号17-1070-01；直径2. 6cm、ベッド高60cm）に流速1.5ml/minで注入した。注入後６０分後から、６ｍｌ（４分）ごとに溶出画分を集めたところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験管番号１６番以降の画分にhTPO１６３が溶出しはじめ、少なくとも３１番目までの広い範囲にhTPO１６３が溶出していることを確認した。これは、ゲルろ過の標準分子量マーカー（Bio-Rad社製Gel Filtration Standard；カタログ番号151-1901及びCa lbiochem社製インシュリン；カタログ番号407696の混合物）に対して、分子量約４４０００から６０００の範囲に相当する。しかもこれらのhTPO１６３は糖がより多く付加された分子量の大きいものから順に溶出していると考えられた。試験管番号１６〜３１（溶出体積１８０〜２７６ｍｌ）の溶出範囲にあるすべてのhT PO１６３の分子種をまとめたものとして画分ＦＡを調製した。画分ＦＡとは別に、試験管番号１６〜１８（溶出体積１８０〜１９８ｍｌ）、試験管番号１９〜２４（溶出体積１９８〜２３４ｍｌ）、試験管番号２５〜３１（溶出体積２３４〜２７６ｍｌ）の各々の一部をとり、それぞれ画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬとした。つまり画分ＦＡは、実質的に画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬを合わせたものとなる。以上、図１９に示す。（２）次に（１）で述べたSuperdex 75pgカラムのhTPO１６３溶出画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡについて詳細に述べる。このようにして得られたhTPO１６３のＮ末端側のアミノ酸配列を実施例１に述べた方法と同様にして調べたところ、Ｎ末端のセリンの大部分は同定不能であったことより、Ｎ末端のセリンにＯ結合型糖鎖が付加されていることが強く示唆された。また、Ｎ末端のセリンに続く配列は遺伝子配列から期待されたアミノ酸配列であることが確認できた。アミノ酸組成分析（ＡｃｃＱ．Ｔａｇ法、ウォターズ社）の結果、ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡのhTPO１６３蛋白質（糖鎖を含まないペプチド部分）の濃度がそれぞれ１０．２ｎｇ／ｍｌ、６．２ｎｇ／ｍｌ、０．８４ｎｇ／ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌであった。これらの画分１００ｎｇをマルチゲル１５／２５（第一化学薬品社製１５〜２５％プレキャストポリアクリルアミドゲル）を用いて非還元条件或いはＤＴＴにより還元後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し銀染色（第一化学薬品社製）したところ、それぞれ極めて高純度なhTPO１６３標品であることが確認できた。還元条件下においてはＤＰＣＩＩＩ分子量マーカー（第一化学薬品社製）を標準として算出されたＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡのhTPO１６３の見かけの分子量はそれぞれ２４０００〜２１５００、２３０００〜２１０００、２３０００〜２０５００、２３５００〜２０５００であった（図２０を参照）。またウエスターン分析により還元条件下においてはビオチン標識ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Bio-Rad社製Biotynyla ted SDS-PAGE Standards，Broad Range；カタログ番号161-0319）を標準として算出されたＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡのhTPO１６３の見かけの分子量はそれぞれ２６０００〜２２０００、２５５００〜２２０００、２６０００〜２１０００、２６０００〜２１０００であった。ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの分子量の不均一性は、付加されたＯ結合型糖鎖の不均一性によることと推定できる。そこでＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの各画分をノイラミニダーゼ（Neuraminidase：ナカライテスク社製、カタログ番号242-29 SP）で酵素消化し、ＤＴＴで還元後ＳＤＳ− ＰＡＧＥで分析したところ、いずれの画分も見かけの分子量が１９０００付近となったことから、hTPO１６３蛋白質に付加された糖鎖のシアル酸の量の不均一性が確認されたのと同時に、ここで得られたhTPO１６３が糖蛋白質としてＣＨＯ細胞で発現されたものであることが明らかとなった。（３）（２）で得られたＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの各画分をＭ−０７ｅアッセイ系でin vitro活性を調べたところ、相対比活性は１ｍｇhTPO１６３蛋白質（糖鎖重量を含まないペプチド部分の重量）当たり、それぞれ５１１００００００、７７５００００００、１１５０００００００、７１５００００００であった。〈実施例６６〉−１位にＬｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたヒトＴＰＯ（アミノ酸１−３３２）（以下「ｈＭＫＴ（1-332）」と称す）の大腸菌用発現ベクターの構築及び発現ヒトＴＰＯ全長アミノ酸を大腸菌で発現させるためアミノ酸１６４以降のアミノ酸３３２までの使用コドンを以下に述べるように大腸菌優先コドンに変更した。２１及び２２；２３及び２４；２５及び２６；２７及び２８；２９及び３０；３１及び３２；３３及び３４；３５及び３６；３７及び３８；３９および４０の合成オリゴヌクレオチドを同チューブ中でT4キナーゼ（ファルマシア社製）を用いて0.1mM ATP，10mMTris-acetate，10mM Mg-acetate，50mM K-acetateの溶液中でリン酸化した。さらに1/10量の100mM Tris/HCl（pH7.5），100mM MgCl₂，500m M NaClの溶液を加え、水浴中で３分間煮沸した後、放置することにより二本鎖DN Aとした。次に２１及び２２；２３及び２４（組合わせＡ）、２５及び２６；２７及び２８；２９及び３０（組合わせＢ）、３１及び３２；３３及び３４（組合わせＣ）、３５及び３６；３７及び３８；３９及び４０（組合わせＤ）の四組の二本鎖DNAをDNAライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結後、さらに（組合わせA）及び（組合わせB）、（組合わせC）及び（組合わせD）をそれぞれ同様に連結し、得られた反応液を連結１及び連結２とした。これらの反応液を鋳型として、連結１については４１および４２、連結２については４３及び４４の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。連結１のＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物についてはSacI,EcoRV、連結２のＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物についてはEcoRV,HindIIIで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、それぞれ約２４０ｂｐ及び２５０ｂｐの断片をプレップ−A−ジーンDNA精製キットにより回収した。これら二本の断片ををSacIとHi ndIIIで消化したpBluescript II KS+（ストラタジーン社製）にサブクローニングした（宿主はE.coli DH5を使用した）。得られたクローンのうち表６に示したヌクレオチド配列を有するものをシークエンシングにより選択し、ここで得られたクローンをpBL(SH)(174-332)（配列番号154）とした。次に実施例４２で作成したpBL(XH)h6T(1-163)を鋳型とし、以下の４５及び４６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ここで得られたＰＣＲ産物についてはBamHI,SacIで消化後６％のポリアクリルアミドゲルで泳動し、約１６０ｂｐの断片をゲルより回収した。またpBL(SH)(174-332)をSacI ,HindIIIで消化して得られた約４８０ｂｐの断片をプレップ−A−ジーンDNA精製キットにより回収し、これら二本の断片をBamHIとHindIIIで消化したpBluescrip t II KS+（ストラタジーン社製）にサブクローニングした（宿主はE.coli DH5を使用した）。得られたクローンのうち表７に示した塩基配列を有するものをシークエンシングにより選択し、ここで得られたクローンをpBL(BH)(123-332)（配列番号１５７参照）とした。実施例４２で作成したpBL(XH)h6T(1-163)をBamHIとHindIIIで消化し、pBL(BH) (123-332)を同じ制限酵素で消化して得られた約６４０ｂｐの断片を連結してクローンpBL(XH)h6T(1-334)を作成した。さらに実施例５２で作成したPCFM536/hMK T(1-163)をXbaI,SfiIで消化して得られた約２７０ｂｐの断片を、同じ制限酵素で消化したpBL(XH)h6T(1-334)に連結してクローンpBL(XH)hMKT(1-334)を作成した。pBL(XH)hMKT(1-334)を XbaI,HindIIIで消化後、変異型のヒトTPOアミノ酸１−３３２をコードする約104 0bpの大きさのフラグメントを回収して精製後、XbaI,HindIIIで消化したpCFM536 （特表昭60-501988）にクローニングした（宿主はpMW1（ATCC No.39933）で予め形質転換されたE.coli JM109を使用した）。ここで得られたクローンをpCFM536/ hMKT(1-332)とし、この発現ベクターを有する大腸菌株を変異型のｈＭＫＴ（1-3 32）タンパク発現用の形質転換体とした。この発現プラスミドは、配列表（配列番号１４）に示されたDNA配列を含んでいる。ここで得られた形質転換株を、アンピシリン50μg/ml、テトラサイクリン12.5 μg/mlを含むＬＢ培地60mlに30℃で一晩振盪培養し、この培養液25mlをアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ培地1000mlに加えて、ＯＤはＡ₆₀₀が1.0-1.2に至るまで 30℃で振盪培養した。次いで最終温度が、42℃になるように65℃の約330mlＬＢ培地を添加し、さらに３時間42℃で振盪培養して変異型のヒトTPO、ｈＭＫＴ（1 -332）（［Ｍｅｔ^-2、Ｌｙｓ^-1］ＴＰＯ（1-332）とも称する）タンパクの発現を誘導した。この培養菌体を直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳ− ＰＡＧＥには第一化学社製のマルチゲル１５／２５を用い、泳動後にクマシーブルー染色を行ったところｈＭＫＴ（1-332）タンパク質の発現を誘導したものに関しては、分子量約３５ｋＤのところに発現誘導に特異的なタンパク質が検出された。一方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングし、実施例４５で作製した抗ＨＴ１ペプチド抗体と反応させ発色させたところ、分子量約３５ｋＤのところにバンドが検出されたことから、ｈＭＫＴ（1-332）の発現が確認された。〈実施例６７〉ヒトＴＰＯ置換誘導体の作製、ＣＯＳ７細胞での発現及び活性確認ヒトＴＰＯのアミノ酸の一部を置換した誘導体がＴＰＯ活性を有するかどうかを以下のとおり検討した。本実施例で用いた動物細胞発現ベクターpSMT201は以下のように作製した。まず、マウスエリスロポエチンレセプターcDNAを含む発現プラスミドpXM-mEPO Rn（Dana Farbor癌研究所D'Andrea博士より入手、Cell:57巻、277-285頁(1989) ）を制限酵素KpnIおよび EcoRIで処理した後、アガロースゲル電気泳動しマウスエリスロポエチンレセプターcDNA部分を除くpXMベクター断片を回収した。次に回収したpXM発現ベクターに種々のクローニング用制限酵素部位を導入するための２本の合成オリゴヌクレオチドをABI社製DNA合成機を用いて作製した。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を以下に示す。プライマー１：プライマー２：この２本のオリゴヌクレオチドを混合し、アニーリングさせ２本鎖オリゴヌクレオチドとした後、上記で回収したpXMベクター断片とをT ４DNAリガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターpDMT201を得た。次にこの発現ベクターpDMT201 に含まれるマウスDHFR cDNAを除去するためにpDMT201ベクター及びpEF18Sベクターを制限酵素NotＩおよびHpa Ｉで処理後アガロースゲル電気泳動し、pDMT201ベクターDNA由来の大きい方の断片とpEF18SベクターDNA由来の小さい方の断片を回収し、T ４DNAリガーゼ（宝酒造製）で結合させることにより発現ベクターpSMT201を得た。このベクターは、図２１に示したとおりSV４０の複製開始領域およびエンハンサー配列、アデノウィルス主要後期プロモーター配列、アデノウィルストリパータイトリーダー配列、スプライス信号配列、SV４０初期ポリアデニル部位配列、アデノウィルスVA RNA遺伝子配列、pUC１８の複製開始領域、β‐ラクタマーゼ遺伝子（Amp^r）を含み、目的とする遺伝子を連結するための制限酵素配列として、Bgl II、Pst I、Kpn I、Xho I、EcoRI、Sma I、S pe I、およびNot I部位を有する。実施例３０で示した完全長ヒトTPO cDNAを含むｐＨＴＰ１を制限酵素EcoRIおよびSpeIを用いて酵素消化し得られた完全長ヒトTPO cDNA断片を、同様に制限酵素消化したベクターpSMT201にサブクローニングすることによりプラスミドpSMT201-hTPOを得た。以上のようにして得たプラスミドpSMT201-hTPOを鋳型にして、まず誘導体作製用の鋳型となるプラスミドβGL-TPO/pBlueを以下のように作製した。 βGL-TPO/pBlueではヒトＴＰＯの5′非翻訳側に、Annweilerらの方法に従いウサギのβ‐グロビンリーダー配列の付加を試みた（Annweilerら、Nucleic Acids Research、19巻、3750頁）。まず以下に示す化学合成した２本のDNA鎖、そしてベクターBluescriptIISK+（東洋紡績社製）を制限酵素EcoRI及びSmaIで消化した断片とをライゲーションすることによりリーダー配列が挿入されたベクターβGL /pBlueを作製した。ＰＲに用いたプライマーの配列は以下の通り。 Sma-ATG：5′-GGCCCGGGATGGAGCTGACTGAATTGCTC-3′（配列番号162）（配列番号７の102-122にSmaI配列を付加したもの） end：5′-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3′（配列番号163）（配列番号７の1140-1160のアンチセンス、SpeI及びHindIII配列を付加）ＰＣＲはプラスミドpSMT201-hTPO DNA１ngを鋳型として使用し、合成したプライマーをそれぞれ10μM使って実施した。TaKaRa PCR Amplification Kit（宝酒造社製）を用いて、Programmable Thermal Controller（MJ Research社製）により100μｌの容量でＰＣＲ（94℃１分間、55℃２分間、72℃２分間を３サイクル、続けて94℃45秒間、55℃１分間、72℃１分間を20サイクル）を行った。ＰＣＲ産物をクロロホルム抽出し、エタノール沈殿を２回行った後100μｌのTEバッファーに溶解した。これを制限酵素SmaI、HindIIIで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を10μｌのTEバッファーに溶解後、同様に制限酵素消化したベクターβGL/pBlueにサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイE.coli JM109を使用）。得られた形質転換体のうち20 クローン選択し、プラスミドDNAを調製した。方法は本質的にMolecular Cloning ［Sambookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。精製したプラスミドDNAについてはTaq Dye Deoxy ^TM Term inater Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製373ADNAシークエンサーにより塩基配列の確認を行った。13GL-TPO/pBlueをコードするプラスミドは全長にわたり塩基配列の置換がなく予想通りのTPOcDNA配列を持つことを確認した。さらにβGL-TPO/pBlueを制限酵素BglII、SpeIで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を10μlのTEバッファーに溶解し、同様に制限酵素消化したベクターpSMT201にサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイE.coli JM109を使用）。本質的にMo lecular Cloning［Sambookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されている方法に従い、形質転換体からプラスミドDNAを調製した。得られた発現ベクターpSMT/βGL-TPOは、図２１に示したpSMT201ベクターのスプライス信号配列の下流にある制限酵素配列Bgl II／SpeＩ部位にβ‐グロビンリーダー配列及びヒトTPOcDNAが接続された構造を有している。このpSMT／βGL-TPOベクターをＣＯＳ７細胞へのトランスフェクション実験に用いた。ヒトＴＰＯ置換誘導体の作製にはＰＣＲを利用し、Itoらの方法に従った（Ito ら、Gene、102巻、67-70頁1991年）。ここでは、ヒトＴＰＯの２５位のＡｒｇ残基をＡｓｎ残基に置換した誘導体、並びに３３位のＨｉｓ残基をＴｈｒ残基に置換した誘導体の作製を試みた。これらの誘導体の各々を［Ａｓｎ²⁵］ＴＰＯ、［Ｔｈｒ³³］ＴＰＯと称する。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通り。 T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3′（配列番号164）（BluescriptIISK+のT7プロモーター領域に対応） ΔBglII：5′-AATTCCAAGATCACACACTTGC-3′（配列番号165）（制限酵素Bg1II認識配列置換用） end：5′-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3′（配列番号166）（配列番号７の1140-1160のアンチセンス、SpeI及びHindIII配列を付加） N3：5′-TGGGCACTGGCTCAGGTTGCTGTGAAGGACATGGG-3′（配列番号167）（配列番号７のArg25→Asn） 09:5′-TGTAGGCAAAGGGGTAACCTCTGGGCA-3′（配列番号168）（配列番号７のHis33 →Thr）第１段階のＰＣＲはプラスミドβGL-TPO/pB1ue DNA１ngを鋳型として使用し、合成したプライマーをそれぞれ10μM使って実施した。プライマーの組み合わせは［1］ΔBglIIとend、［2］T7とN3、［3］T 7と09である。TaKaRa PCR Amplification Kit（宝酒造社製）を用いて、Program mable Thermal Controller（MJ Research社製）により100μlの容量でＰＣＲ（9 4℃１分間、55℃２分間、72℃２分間を３サイクル、続けて94℃45秒間、55℃１分間、72℃１分間を17サイクル）を行った。それぞれのＰＣＲ産物をクロロホルム抽出し、エタノール沈殿を２度行った後100μlのTEバッファーに溶解した。このＰＣＲ産物を２種類１μlずつ用いて第２段階のＰＣＲを行った。鋳型の組み合わせは［1］と［2］のPCR産物、［1］と［3］のPCR産物である。用いたプライマーはすべてT7とendの組み合わせである。94℃で10分間インキュベートした後T aKaRa Taqを加え、94℃１分間、55℃２分間、72℃２分間を３サイクル、続けて9 4℃45秒間、55℃１分間、72℃１分間を９サイクル行った。それぞれのＰＣＲ産物に5mg/ml proteinase Kを１μl、0.5M EDTAを２μl、20%SDSを２μl加え37℃ で30分間保温しTaqを失活させた後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し20μlの滅菌水に溶解した。これを制限酵素BglII、SpeIで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を10μlのTEバッファーに溶解後、同様に制限酵素消化しアルカリホスファターゼ（仔ウシ腸、ベーリンガー・マンハイム社製）処理した発現ベクターpSMT201にサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイE.coli JM109を使用）。得られた形質転換体のうち、それぞれ２クローンずつ選択し、プラスミドDNAを調製した。方法は本質的にMolec ular Cloning［Sambookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。精製したプラスミドDNAについてはTaq Dye D eoxy ^TMTerminater Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製373ADNAシークエンサーにより塩基配列の確認を行った。プライマー［1］と［3］を用いるＰＣＲによって作成されたプラスミドはアミノ酸置換［Ｈｉｓ３３（ＣＡＣ）→Ｔｈｒ（ＡＣＣ）］をもち、かつ元のＣ末端（Ｇｌｙ３３２）に以下のアミノ酸配列ＴＳＩＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＶＨＨＨＨＨＨ（配列番号169）が付加されたＴＰＯ置換誘導体（０９／ＴＰＯ）をコードするｃＤＮＡが含まれていることが確認された。この誘導体は［Ｔｈｒ³³，Ｔｈｒ³³³，Ｓｅｒ³³⁴，Ｉｌｅ³³⁵，Ｇｌｙ³³⁶，Ｔｙｒ³³⁷，Ｐｒｏ³³⁸，Ｔｙｒ³³⁹，Ａｓｐ³⁴⁰，Ｖａｌ³⁴¹ ，Ｐｒｏ³⁴²，Ａｓｐ³⁴³，Ｔｙｒ³⁴⁴，Ａｌａ³⁴⁵，Ｇｌｙ³⁴⁶，Ｖａｌ³⁴⁷，Ｈｉｓ³⁴⁸，Ｈｉｓ³⁴⁹，Ｈｉｓ³⁵⁰，Ｈｉｓ³⁵¹，Ｈｉｓ³⁵²，Ｈｉｓ³⁵³］ＴＰＯと称する。一方、プライマー［1］と［2］を用いるＰＣＲによって作成されたプラスミドはアミノ酸置換［Ａｒｇ２５（ＡＧＡ）→Ａｓｎ（ＡＡＣ）］以外に更に１カ所のアミノ酸置換［Ｇｌｕ２３１（ＧＡＡ）→Ｌｙｓ（ＡＡＡ）］もち、かつＣ末端（Ｇｌｙ３３２）に以下のアミノ酸配列ＴＳＩＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＶＨＨＨＨＨＨが付加されたＴＰＯ置換誘導体（Ｎ３／ＴＰＯ）をコードするｃＤＮＡを含んでいることが判明した。この誘導体は［Ａｓｎ²⁵，Ｌｙｓ²³¹，Ｔｈｒ³³³ ，Ｓｅｒ³³⁴，Ｉｌｅ³³⁵，Ｇｌｙ³³⁶，Ｔｙｒ³³⁷，Ｐｒｏ³³⁸，Ｔｙｒ³³⁹，Ａｓｐ³⁴⁰，Ｖａｌ³⁴¹，Ｐｒｏ³⁴²，Ａｓｐ³⁴³，Ｔｙｒ³⁴⁴，Ａｌａ³⁴⁵，Ｇｌｙ³⁴⁶ ，Ｖａｌ³⁴⁷，Ｈｉｓ³⁴⁸，Ｈｉｓ³⁴⁹，Ｈｉｓ³⁵⁰，Ｈｉｓ³⁵¹，Ｈｉｓ³⁵²，Ｈｉｓ³⁵³］ＴＰＯと称する。得られたそれぞれのクローンのＣＯＳ７細胞へのトランスフェクションは、実施例３５に従いクロロキン処理を含むDEAE-デキストラン法で行った。すなわちプラスミドDNA40μgを使用し、トランスフェクション５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清をセントリコン-30（アミコン社製）で20倍に濃縮しＭ− ０７ｅアッセイ系で評価した。その結果、ヒトＴＰＯ置換誘導体Ｎ３／ＴＰＯ、０９／ＴＰＯをコードするプラスミドでトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞培養上清中に、いずれも用量依存的にＴＰＯ活性が検出された（図２２参照）。〈実施例６８〉ヒトＴＰＯ挿入・欠失誘導体の作製とＣＯＳ７細胞での発現及びＴＰＯ活性の確認 hTPO１６３にアミノ酸を挿入した誘導体またはhTPO１６３からアミノ酸を欠失した誘導体がＴＰＯ活性を有するかどうか検討した。作製した誘導体は配列番号13のHis33欠失体（［ΔＨｉｓ³³］ＴＰＯ（1-163）、dH33）、Gly116欠失体（［ΔＧｌｙ¹¹⁶］ＴＰＯ（1-163）、dG 116）、Arg117 欠失体（［ΔＡｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163）］、ｄＲ１１７）、His33とPro34の間への Thr挿入体（［Ｈｉｓ³³，Ｔｈｒ³³′，Ｐｒｏ³⁴］ＴＰＯ（1-163）、Ｔ３３’）、Ala挿入体（［Ｈｉｓ³³，Ａｌａ³³′，Ｐｒｏ³⁴］ＴＰＯ（1-163）、Ａ３３’ ）、Gly挿入体（［Ｈｉs³³，Ｇｌｙ³³′，Ｐｒｏ³⁴，Ｓｅｒ³⁸］ＴＰＯ（1−163 ）、Ｇ３３’）およびGly116とArg117の間へのAsn挿入体（［Ｇｌｙ¹¹⁶，Ａｓｎ¹¹⁶ ′，Ａｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163）、Ｎ１１６’）、Ala挿入体（［Ｇｌｙ¹¹⁶ ，Ａｌａ¹¹⁶′，Ａｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163）、Ａ１１６’）、Gly挿入体（［Ｇｌｙ¹¹⁶，Ｇｌｙ¹¹⁶′，Ａｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163）、Ｇ１１６’）である。これらの配列の全ては配列番号13に基づく。これらのうちＴ３３’、Ｎ１１６’はそれぞれムチン型糖鎖、Asn結合型糖鎖の導入を意図した誘導体である。誘導体の作製にはＰＣＲを利用し、Itoらの方法に従った（Itoら、Gene、102 巻、67-70頁、1991）。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通り。 dH33：5′-TGTAGGCAAAGGAACCTCTGGGCA-3′（配列番号172）（配列番号７のHis33 欠失体作製用） T33′：5′-TGTAGGCAAAGGAGTGTGAACCTCTGG-3′（配列番号173）（配列番号７のH is33とPro34の間へのThr挿入体作製用） A33′：5′-TGTAGGCAAAGGAGCGTGAACCTCTGG-3′（配列番号174）（配列番号７のH is33とPro34の間へのAla挿入体作製用） G33′：5′-TGTAGGCAAAGGTCCGTGAACCTCTGG-3′（配列番号175）（配列番号７のH is33とPro34の間へのGly挿入体作製用） dG116：5′-AGCTGTGGTCCTCTGTGGAGGAAG-3′（配列番号176）（配列番号７のGly1 16欠失体作製用） dR117：5′-GTGAGCTGTGGTGCCCTGTGGAGG-3′（配列番号177）（配列番号７のArg1 17欠失体作製用） N116′：5′-AGCTGTGGTCCTGTTGCCCTGTGGAGG-3′（配列番号178）（配列番号７の Gly116とArg117の間へのAsn挿入体作製用） A116′：5′-AGCTGTGGTCCTAGCGCCCTGTGGAGG-3′（配列番号179）（配列番号７の Gly116とArg117の間へのAlａ挿入体作製用） G116′：5′-AGCTGTGGTCCTTCCGCCCTGTGGAGG-3′（配列番号180）（配列番号７の Gly116とArg117の間へのGly挿入体作製用） dRI：5′-CGGGCTGCAGGATATCCAAGATCTCA-3′（配列番号181）（制限酵素EcoRI認識配列置換用） T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3′（配列番号182）（BluescriptIISK+のT7プロモーター領域に対応） endNotI：5′-GGGCGGCCGCTCAGCTGGGGACAGCTGTGGTGGG-3′（配列番号183）（配列番号７の633-653のアンチセンス、終止コドンとNotI認識配列を付加）第１段階のＰＣＲは実施例６７で作製したプラスミドβGL-TPO/pBlue DNA １n gを鋳型として使用し、合成したプライマーをそれぞれ10μM使って実施した。プライマーの組み合わせは［1］dRIとendNotI、［2］T7と変異導入プライマー（dH 33,A33′,G33′,T33′,dG116,dR117,A116′,G116′,N116′）である。TaKaRa PC R Amplification Kit（宝酒造社製）を用いて、Programmable Thermal Controll er（MJ Reserch社製）により100μlの容量でＰＣＲを行った。［1］の第１ＰＣＲ反応は、94℃１分間、45℃２分間、72℃２分間を３サイクル、続けて94℃45秒間、45℃１分間、72℃１分間を17サイクル。［2］の第１ＰＣＲ反応は、94℃１分間、55℃２分間、72℃２分間を３サイクル、続けて94℃45秒間、55℃１分間、 72℃１分間を17サイクル。それぞれのＰＣＲ産物をクロロホルム抽出し、エタノール沈殿を２度行った後100μlのTEバッファーに溶解した。次に、［1］と［2］のＰＣＲ産物をそれぞれ１μlずつ用いて第２段階のＰＣＲを行った。用いたプライマーはすべてT7とendNotIの組み合わせである。94℃ で10分間インキュベートした後TaKaRa Taqを加え、94℃１分間、55℃２分間、72℃２分間を３サイクル、続けて94℃45秒間、55℃１分間、72℃１分間を９サイクル行った。それぞれのＰＣＲ産物に5mg/ml proteinase Kを１μl、0.5M EDTAを２μl、20%SDSを２μl加え3 7℃で30分間保温しTaqを失活させた後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し20μlの滅菌水に溶解した。これを制限酵素EcoRI、NotIで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を10μl のTEバッファーに溶解後、同様に制限酵素消化しアルカリホスファターゼ（仔ウシ腸、ベーリンガー・マンハイム社製）処理した発現ベクターpEF18Sにサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイE.coli JM109を使用）。得られた形質転換体からプラスミドDNAを調製した。方法は本質的にMolecular Cloning［Sambookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されているようにして実施した。精製したプラスミドDNAについてはTaq Dye Deoxy^TM Terminater Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製373ADNAシークエンサーにより塩基配列の確認を行った。その結果、ｄＨ３３、Ａ３３’、Ｔ３３’、ｄＧ１１６、ｄＲ１１７、Ａ１１６’、Ｇ１１６’、Ｎ１１６’をコードするプラスミドは全長にわたり意図した部位以外に塩基配列の置換がなく予想通りのTPOcDNA配列を持つことを確認した。また、Ｇ３３’では意図した部位以外に１カ所のアミノ酸置換をもたらす塩基置換［Pro38(CCT)→Ser(TC T)］が認められた。得られたそれぞれのクローンのＣＯＳ７細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行った。すなわちプラスミドDNA10μgを使用し、クロロキン処理を含むDEAE-デキストラン法を用いたトランスフェクションを行い、４-５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清をＭ−０７ｅアッセイ系で評価した。その結果、アミノ酸挿入・欠失誘導体をコードするプラスミドでトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞培養上清中に、いずれも用量依存的にＴＰＯ活性が検出された（図２３参照）。ＴＰＯ誘導体をコードするｃＤＮＡを含まない発現プラスミドｐＥＦ１８ＳをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞培養上清には活性が認められなかった。〈実施例６９〉抗ヒトＴＰＯペプチド抗体の作製と精製（１）配列番号１９１に示されるヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、比較的抗原として適していると考えられた６ヵ所の領域（表８に示す）を選び、Tam（Proc ．Natl，Acad．Sci．USA，85，5409-5413，1988）の方法により４本鎖のＭｕｌｔｉｐｌｅＡｎｔｉｇｅｎＰｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）型のペプチドを合成し、１００μｇずつ８回にわたってそれぞれウサギ２把に免疫した。配列番号１１９〜１２４に示される各ペプチド領域（これらはそれぞれペプチド領域ＨＴ１〜６領域と称し、配列番号１９１の配列の８〜２８、４７〜６２、１０８〜１２６、１７２〜１９０、２６２〜２８４及び３０６〜３３２に相当する部分ペプチドである）のＣ末端にシステイン残基を結合させた１本鎖ペプチドを別途合成し、これを試験抗原として酵素免疫測定法を用いて抗体価を調べたところ、いずれの血清についても抗体価の上昇が確認されたので、これらを抗血清とした。なお、前述のＣ末端にシステイン残基を結合させた１本鎖合成ペプチドは、後述（２）の抗血清からのアフィニティ精製のための抗原としても用いた。（２）抗体は、１種の抗原ペプチドにつきウサギ２把ずつ免疫したため、それぞれのウサギごとに抗体を分けて調製した。具体的には、これら由来するウサギの個体ごとに区別して、抗ＨＴ１ペプチド抗体では、それぞれ、抗ＨＴ１−１ペプチド抗体、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体の様に称する。以下に抗ＨＴ１−１ペプチド抗体についての精製を例として示す。まず、システイン残基を結合したＨＴ１の１本鎖ペプチド３０ｍｇを１２ｍｌのＳｕｌｆｏＬｉｎｋカップリングゲル（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カタログ番号４４８９５）に結合させた。即ち、ゲル体積の６倍容のカップリングバッファー（50 mM Tris、5mM EDTA-Na pH8.5）で平衡化したゲルに、抗原の含まれるペプチド溶液を15分間カップリングさせる。次に30分間静置した後、ゲル体積の３倍容のカップリングバッファーでゲルを洗浄する。次に0.05M L-Cystein-HClを含むカップリングバッファーを、１ml/mlゲルの割合で添加し、15分間未反応基をブロックする。次に30分間静置した後、ゲル体積の８倍容のカップリングバッファーでゲルを洗浄する。以上のカップリングは室温で行った。このようにして、抗原領域を含むペプチドをカップリング効率２８．３％にてゲルに共有結合させ、１ｍｌゲル当たりに結合したペプチドが０．８ｍｇである抗原ペプチド抗原カラムを調製した。次に、全採血後の抗ＨＴ１ −１ペプチド抗体を含む抗血清７８．４ｍｌのうち７６．７ｍｌ（蛋白質量３６２０ｍｇ）を予め１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した抗原カラムに添加し、さらに同緩衝液で洗浄後１０５．９ｍｌの素通り画分（蛋白質量３６８０ｍｇ）を得た。次に０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で吸着画分を溶出し、ただちに２１．１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．９）を加えて中和後、限外濾過（アミコン社製ＹＭ３０膜）にて濃縮し、１１．２ｍｌ（蛋白質量７７．７ｍｇ）の１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）の溶液中に精製された抗ＨＴ１−１ペプチド抗体を得ることができた。同様にして、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体（６０．０ｍｇ）、抗ＨＴ２−１ペプチド抗体（１８．８ｍｇ）、抗ＨＴ２−２ペプチド抗体（８．２ｍｇ）などを得ることができた。抗ＨＴ３〜６ペプチド抗体も同様にして得ることができる。〈実施例７０〉ウエスターン分析によるＴＰＯの検出（１）実施例６９で得られた抗血清の評価をするために、以下のような試験を行った。配列番号６のアミノ酸配列−２１〜３３２をコードする遺伝子を導入・発現させたＣＨＯ細胞の培養上清から部分精製された組換えヒトＴＰＯ標品を常法に従い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、次いでＰＶＤＦあるいは、ニトロセルロース膜にエレクトロブロティングした。ブロッティング後の膜を２０mM Tris-HCl、0.5M NaCl（pH7.5）（ＴＢＳ）で５分洗浄し、0.1％Tween 20入りＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で５分２回洗浄後、ブロッキング剤（BlockAce、大日本製薬社製、カタログ番号ＵＫ−Ｂ２５）で60分処理した。抗ＨＴ１−１ペプチド抗体、抗ＨＴ２−１ペプチド抗体、抗ＨＴ３−２ペプチド抗体、抗ＨＴ４−１ペプチド抗体、抗ＨＴ５−２ペプチド抗体、抗ＨＴ６−１ペプチド抗体を含む抗血清を、それぞれ0.05％BSA、10％BlockAceを含むＴＴＢＳ溶液で1000倍希釈した抗体を一次抗体として用いてウェスタン分析を行った。即ち、抗ＴＰＯペプチド抗体、0.05％BSA、10％BlockAceを含むＴＴＢＳ溶液で60分後処理後、ＴＴＢＳで５分間洗浄した。次に抗ウサギＦ（ａｂ′）ヤギビオチン化抗体（CALTAG社製，カタログ番号L43015）、0.05％BSA、10％Blo ckAceを含むＴＴＢＳ溶液を二次抗体として60分処理後、ＴＴＢＳで５分２回洗浄した。次にアルカリフォスファターゼ標識アビジン（Leinco Technologies社製、カタログ番号A108）を10％BlockAce、ＴＴＢＳ溶液で５０００倍希釈したものを含む溶液で３０分処理し、５分２回のＴＴＢＳ洗浄、５分間のＴＢＳ洗浄を行った後、アルカリフォスファターゼ基質（Bio-Rad社製、カタログ番号170 643 2）により発色させた。以上のウエスタン分析は室温にて実施した。その結果、それぞれの抗血清により、ヒトＴＰＯが認識、検出されることが確認できた。（２）実施例６９でアフィニティ精製した抗ＨＴ１−１ペプチド抗体、抗ＨＴ１ −２ペプチド抗体、抗ＨＴ２−１ペプチド抗体、抗ＨＴ２−２ペプチド抗体をそれぞれ3mgをとり活性型ビオチン（NHS-LC-Biotin II、PIERCE社製、カタログ番号21336）とカップリングすることにより、ビオチン化した。上記（１）の組換えヒトＴＰＯ標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでＰＶＤＦあるいは、ニトロセルロース膜にエレクトロブロティングし、常法によりこれらのビオチン化抗体を一次抗体として用いてウェスタン分析を行った。即ち、ブロッティング後の膜をＴＢＳで５分洗浄し、ＴＴＢＳで５分２回洗浄後、ブロッキング剤（BlockAce）で60分処理した。次に１μg／mlの濃度のビオチン化抗ＴＰＯペプチド抗体、0.05％BSA、10％BlockAceを含むＴＴＢＳ溶液で60分後処理後、ＴＴＢＳで５分２回洗浄した。次にアルカリフォスファターゼ標識アビジン（Leinco Technologies社製、カタログ番号A108）を10％BlockAce、ＴＴＢＳ溶液で５０００倍希釈したものを含む溶液で３０分処理し、５分２回のＴＴＢＳ洗浄、５分間のＴＢＳ洗浄を行った後、アルカリフォスファターゼ基質（Bi o-Rad社製、カタログ番号170 6432）により発色させた。以上のウエスタン分析は室温にて実施した。その結果、それぞれの精製された抗体により、ヒトＴＰＯが認識、検出されることが確認できた。〈実施例７１〉抗ＴＰＯペプチド抗体カラムの調製とヒトＴＰＯの検出実施例６９で得られた抗ヒトＴＰＯペプチド抗体は、ヒトＴＰＯを認識することが確認されたため、これらを以下のようにして、クロマトグラフィー担体に結合させ、抗ＴＰＯペプチド抗体カラムを作製した。以下、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体で実施した例を示す。（１）抗体を5mg/mlの濃度で含む50mM Na Phosphate，0.15M NaCl（pH8.0）の溶液とし、これを0.8mlとり、1.54m体積の膨潤したホルミル活性化ゲル（Formyl-C ellulofine、チッソ株式会社製）と合わせ、４℃で２時間カップリング反応させた。次いで、10mg/mlの濃度の還元剤溶液（Trimethylamine borane（TMAB）、生化学工業製、カタログ番号680246）を1.1ml加え、さらに４時間カップリング反応させた後、遠心分離によりゲル部分のみを回収した。これに10mlの精製水を加え、遠心分離でゲル部分のみの回収といった操作を４回繰り返し、未反応の抗体を取り除いた。次に3.1mlのブロッキング緩衝液（0.2M NaPhosphate，1M ethano l amine（pH7.0））と1.1mlの還元剤溶液を加え、４℃で２時間以上処理することにより、未反応のゲルの活性基をブロックした。最後にゲルを遠心分離を用いて精製水、20mM Tris-HCl、0.15M NaCl（pH8.0）で洗浄し、小カラムチューブに充填し、3Mチオシアン酸ナトリウム溶液、0.1Mグリシン-HCl（pH2.5）溶液で洗浄後、再度20mM Tris-HCl、0.15 M NaCl（pH8.0）で再平衡化して保存した。抗ＨＴ１−２抗体カラムの抗ＴＰＯペプチド抗体ゲルでは、各ＩｇＧ画分のカップリング効率は９４．２％、に達した。また、ゲル体積当たりにカップリングしたＩｇＧ画分量は、１．９ｍｇ／ｍｌゲル、であった。同様に、ＴＰＯを抗原としないIgGを１mlゲル当たり２１．８mg結合させたゲルを調製し、これを（２）に述べるように、TPO抗体カラムの非特異的結合分子の除去を目的としたプレカラム（以下プレ抗体カラムと称す）として用いた。（２）以下に抗ＨＴ１−２抗体カラムでの別の例を説明する。配列番号１１９〜１２４のアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入・発現させたＣＨＯ細胞の培養上清から部分精製された組換えヒトＴＰＯ標品を（１）で調製したプレ抗体カラム（１ｍｌゲル）に添加し、この後ゲル体積の１０倍容の20 mM Tris-HCl pH8.0、0.15ＭNaClで素通り画分を集めた。次にゲル体積の１０倍容の酸性溶離液（0.1M Glycine-HCl（pH2.5））でプレ抗体カラム吸着画分を溶出させた。次にプレ抗体カラム素通り画分を（１）で調製した抗ＨＴ１−２抗体カラム（２ｍｌゲル）に添加後、ゲル体積の１０倍容の20mM Tr1s-HCl pH8.0、0 ,15 M NaClで洗浄し、抗ＨＴ１−２抗体カラム素通り画分を集めた。次にゲル体積の８倍容の酸性溶離液（0.1M Glycine-HCl(pH2.5)）で抗ＨＴ１−２抗体カラム吸着画分を溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでこれらの画分を調べたところ、ＴＰＯはプレ抗体カラムには吸着することがなく、かつ抗ＨＴ１−２抗体カラムには特異的に結合し、添加標品中のほとんどすべてのＴＰＯが結合したことが判明したので、１mlゲル当たり少なくとも２００〜３００μｇのＴＰＯが結合したことが確認できた。〈実施例７２〉ＴＰＯによる血小板増加作用あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、 F-800）にて血小板数を測定した正常な８週齢のICR系雄性マウス２０匹を無作為に４群に分けた。そのうちの１群（コントロール−iv群）には100μlのPBSを１日１回５日間連続で静脈内に投与し、他の１群（ＴＰＯ−iv群）には実施例５６で得られたSP Sepharose Fast FlowのヒトＴＰＯ活性画分F2の濃縮液をNAP-25カラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号17-0852-02）でPBSに置換し、さらにPBSで希釈したもののうち100μl（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量211,900を含む）を１日１回５日間連続で静脈内に投与した。また、別の１群（コントロール−sc群）には100μlのPBSを１日１回５日間連続で皮下に投与し、他の１群（ＴＰＯ−sc群）にはＴＰＯ-iv群と同様に100μlを１日１回５日間連続で皮下に投与した。投与開始後６、８、１０、１３、１５日目にそれぞれのマウスの眼窩静脈より経日的に採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、F-800）にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図２４に示した。すなわち、コントロール−iv群では血小板数は最も増加した６日目（０日目は投与した日である）においても投与前と比較して44％の増加であり、コントロール−sc群では最も増加した８日目において47％増加が観察されたにすぎなかった。その一方で、ＴＰＯ−iv群では６日目には投与前と比較して177％の増加がみられ、その後も増加を続け10日目には469％という最大の増加が観察された。また、ＴＰＯ−sc群では６日目にすでに347％の増加が見られ、８日後には最大の493％の増加が観察された。以上の結果より、ヒトＴＰＯは種差、投与ルートに関係なく血小板の増加作用を有することが確認された。〈実施例７３〉ＴＰＯによる血小板増加作用あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、 F-800）にて血小板数を測定した正常な11週齢のC3H/HeJ系雄性マウス１６匹を無作為に４群に分けた。そのうちの１群（コントロール群）には100μlのPBSを１日１回５日間連続で皮下に投与した。他の１群（ＴＰＯ−１群）には実施例５６で得られたSephacryl S-200HRのヒトＴＰＯ活性画分をNAP-25でPBSに置換し、さらにPBSで希釈したもののうち100μl（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量83, 000を含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与した。別の１群（ＴＰＯ−２群）にはＴＰＯ−１群で投与したＴＰＯ活性画分をさらにPBSで２倍に希釈したもののうち100μl（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量41,500を含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与した。また最後の１群（ＴＰＯ−３群）にはＴＰＯ− ２群で投与したＴＰＯ活性画分をさらにPBSで２倍に希釈したもののうち100μl （Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量20,750を含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与した。投与開始後６、８、１０、１２日目にそれぞれのマウスの眼窩静脈より経日的に採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、F-800）にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図２５に示した。すなわち、コントロール群では血小板数にほとんど変動が見られなかった。ＴＰＯ投与群では、いずれの群においても投与開始８日目に最大となるような血小板数の増加が認められた。また、各投与群の間には用量依存性が認められた。すなわち、ＴＰＯ−１群では、６日目に既に約 200％の増加が見られ、８日目には約270％にまで増加した。その後減少したが、１２日目においても約65の増加が見られコントロール群との間に有意差（p<0.01 ：ダネットの多重比較検定：Dunnet multiple comparison test）が認められた。ＴＰＯ−２群においても同様に増加が見られたが、増加作用はＴＰＯ−１群には及ばないものの６、８日目にはそれぞれ約140％、約160％の増加を認めた。また、１２日目にはコントロール群とほぼ同様のレベルにまで減少した。ＴＰＯ− ３群における増加作用はＴＰＯ−２群よりもさらに弱かったが、最高値に達した８日目には約110％の増加が見られており、コントロール群との間に有意差（p<0 .01）も認められた。以上の結果より、ヒトＴＰＯは、マウスの系統に関係なく血小板数を増加させること、またその作用には用量依存性があることが確認された。〈実施例７４〉ＴＰＯによる制がん剤投与による血小板減少症阻止効果８週齢のICR雄性マウス30匹に5-FUを200mg/kg体重の割合で静脈内投与した後、無作為に各々15匹の２群に分け、その翌日（Day １）より一方の群（コントロール群）には100μlのＰＢＳを１日１回５日間連続で皮下に投与した。またもう一方の群（ＴＰＯ群）には、実施例７２で用いたヒトＴＰＯ活性画分100μl（Ｍ −０７ｅアッセイ系での相対活性量211,900を含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与した。投与開始後Day４、６、８にそれぞれの群より各々５匹のマウスを無作為に抽出し、眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、E-2500 ）にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図２６に示した。すなわち、コントロール群では5-FU投与後血小板数は経日的に減少し、Day６には最低値（5-FU 投与前値の約28％）に達したが、Day８には減少の反動で約1.3倍にまで増加した。ＴＰＯ群においても5-FU投与後血小板数は経日的に減少し、Day６には最低値（5-FU投与前値の約52％）に達したがDay４と６の血小板数にほとんど差はなく、また、Day６においてはコントロール群に比して有意（p<0.05：ダネットの多重比較検定）に高値を維持した。Day ８においては、5-FU投与前値の約200％にまで増加した。以上の結果より、ヒトＴＰＯには、制がん剤による血小板減少を阻止する効果があることが確認された。〈実施例７５〉ＴＰＯによる血小板減少症治療効果７週齢のICR雄性マウス36匹に塩酸ニムスチン（ＡＣＮＵ）を50mg/kg体重の割合で静脈内投与した後、無作為に各々18匹の２群に分け、その翌日（Day １）より一方の群（コントロール群）には200μlのPBSを１日２回連日皮下投与し、またもう一方の群（ＴＰＯ群）には、実施例７３で用いたＴＰＯ活性画分にPBSで希釈せずに0.04％の割合でTween-80を添加したもの200μl（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量380,000を含む）を１日２回連日皮下投与した。投与開始後各々の群でマウスを無作為に３群に分け、それぞれをDay５、12に採血する群、Day８、14に採血する群そして Day10に採血する群とした。採血は眼窩静脈より行い、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、F-800）にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図２７に示した。すなわち、コントロール群ではＡＣＮＵ投与後に血小板数は経日的に減少し、Day８〜10で最低（各々ＡＣＮＵ投与前値の約29％）となり、Day12に約 49％、Day14に約74％に回復したにすぎなかった。一方ＴＰＯ群では、Day５にはＡＣＮＵ投与前値の約38％にまで減少した。その後は増加に転じ、ＡＣＮＵ投与前値に比してDay８では約63％にまで回復し、Day10以降はＡＣＮＵ投与前値以上の血小板数を示し、Day12では約300％、Day14では約400％にまで増加した。以上のように、コントロール群では減少の過程にあるDay８〜10において既にＴＰＯ群では増加に転じており、Day10で既にＡＣＮＵ投与前値以上の血小板数まで増加していることから、ヒトＴＰＯは制ガン剤により惹起される血小板減少からの回復を促進する効果を有することが確認された。なお、実施例７４の結果を併せてもヒトＴＰＯには制ガン剤の種類に関係なく血小板数の減少を阻止する効果および血小板減少からの回復を促進する効果を有することが期待される。〈実施例７６〉ＴＰＯによるＢＭＴ施行後の血小板減少症治療効果７週齢のC3H/HeN系の雄性マウス48匹に10Gyの放射線を全身照射した後、同系のマウスの骨髄細胞１×10⁶個を直ちに静脈内投与した。そこで無作為に２群に分け、翌日（Day １）より一方の群（コントロール群）にはPBSを、他方の群（ＴＰＯ群）には実施例７３で用いたＴＰＯ活性画分（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量44,000を含む）をそれぞれ１日１回100μlずつ20日間連日で皮下投与した。投与開始後Day５、10、14、21にそれぞれの群より各々６匹のマウスを無作為に抽出し、眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、E- 2500）にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図２８に示した。すなわち、いずれの群においてもＢＭＴ施行後に血小板数は経日的に減少し、Day10に最低（ＢＭＴ施行前の約３％）となった。その後は徐々に回復し、Day14にはコントロール群で約11％、ＴＰＯ群で約13％となった。Day21にはコントロール群では37％に回復したにすぎなかったが、ＴＰＯ群では約65％にまで回復し有意な回復促進効果が認められた。以上の結果より、実施例５６で調製されたヒトＴＰＯには、ＢＭＴ施行後の血小板数の回復を促進する効果があることが確認された。〈実施例７７〉ＴＰＯによる放射線照射後の血小板減少症治療効果８週齢のICR系の雄性マウス36匹に５GyのＸ線を全身照射した後、無作為に２群に分け、翌日（Day １）より一方の群（コントロール群）にはPBSを、他方の群（ＴＰＯ群）には実施例７３で用いたＴＰＯ活性画分（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量1,440,000を含む）をそれぞれ１日１回３日間連日で皮下投与し、翌日よりＭ−０７ｅアッセイ系での相対活性量360,000を１日１回７日間連日で皮下投与した。投与開始後各々の群でマウスを無作為に３群に分け、それぞれをDay４、11、21に採血する群、Day７、13に採血する群そしてDay９、15に採血する群とした。採血は眼窩静脈より行い、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、F-800）にて血小板数を測定した。図２９に血小板数の推移を示した。すなわち、コントロール群ではＸ線照射後に血小板数は経日的に減少し、Day９で最低（Ｘ線照射前値の約25％）となり、Day11に約38％、Day13に約67％に回復し、Da y15にＸ線照射前値にまで回復した。一方ＴＰＯ群では、Day７にはＸ線照射前値の約24％にまで減少した。その後は増加に転じ、Ｘ線照射前値に比してDay９では約82％にまで回復し、Day11以降はＸ線照射前値以上の血小板数を示し、Day21 までその傾向は維持された。以上のように、コントロール群では減少の過程にあるDay９において既にＴＰＯ群では増加に転じており、Day11で既にＸ線照射前値以上の血小板数まで増加し、その後も高値を維持した。一方、コントロール群ではＸ線照射前値以上の血小板数まで回復するために15日を要している。この結果より、実施例５６で産生されたヒトＴＰＯは放射線照射後の血小板減少からの回復期間を短縮することが認められ、放射線照射後の血小板減少症治療効果が認められた。〈実施例７８〉hTPO１６３による血小板増加作用あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、 F-800）にて血小板数を測定した正常なC3H/HeN系雄性マウス１５匹を無作為に４群（コントロール群、Ａ，Ｂ，Ｃ群）に分けた。１群（コントロール群）には０．１％のマウス血清を含むPBSを１日１回５日間連続で皮下に投与した。Ａ群には、実施例６５で得られたSP Sepharose Fast FlowのＴＰＯ活性画分を0.1％のマウス血清を含むＰＢＳで希釈しhTPO１６３を１日あたり、Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量として約40,000,000/kg体重、Ｂ群には同様にＭ−０７ｅアッセイ系での相対活性量として約8,000,000/kg体重、そしてＣ群にも同様にＭ−０７ｅアッセイ系としての相対活性量として約1,600,000/kg体重の割合で５日間連続で皮下に投与した。投与開始後６、８、１０、１２日目にそれぞれのマウスの眼窩静脈より経日的に採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、F-800）にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図３０に示した。すなわち、コントロール群では血小板数にほとんど変動が見られなかった。ＴＰＯ投与群では、いずれの群においても投与開始８日目に最大となるような血小板数の増加が認められた。また、各投与群の間には用量依存性が認められた。すなわち、Ａ群では、６日目に約88％、８日目に約100％の増加が見られ、１０日目においても約97％の増加を維持し、いずれもコントロール群との間に有意差（p<0.01：ダネットの多重比較検定）が認められた。Ｂ群においても同様に増加が見られたが、増加作用はＡ群には及ばないものの６、８日目にはそれぞれ約65％、約84％の増加を認め、コントロール群との間に有意差（p<0.01もしくは p<0.05：ダネットの多重比較検定）が認められた。Ｃ群における増加作用はＢ群よりもさらに弱かったが、最高値に達した８日目には約31％の増加が見られた。以上の結果より、実施例６５で産生されたhTPO１６３には、血小板数を増加きせること、またその作用には用量依存性があることが確認された。〈実施例７９〉hTPO１６３による血小板減少症治療効果８週齢のC3H/HeN雄性マウス100匹に塩酸ニムスチン（ＡＣＮＵ）を50mg/kg体重の割合で静脈内投与した後、無作為に各々25匹の４群（コントロール，Ａ，Ｂ，Ｃ群）に分け、その翌日（Day １）よりコントロール群にはPBSを5ml/kg体重の割合で１日１回連日皮下投与し、Ａ群には実施例６５で得られたSP Sepharose Fast FlowのＴＰＯ活性画分をＰＢＳで希釈し、hTPO１６３をＭ−０７ｅアッセイ系における相対活性量として約16,000 ,000/kg体重の割合で１日１回連日皮下投与した。Ｂ群には同様にＭ−０７ｅアッセイ系における相対活性量として約48,000,000/kg体重の割合で、またＣ群にはＭ−０７ｅアッセイ系における相対活性量として約160,000,000/kg体重の割合で１日１回連日皮下投与した。投与開始後各々の群でマウスを無作為に５群に分け、それぞれをDay５、８、1 0、12そして14に採血した。採血は眼窩静脈より行い、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、E-2500）にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図３１に示した。すなわち、コントロール群ではＡＣＮＵ投与後に血小板数は経日的に減少し、 Day８〜10で最低（ＡＣＮＵ投与前値の約15〜16％）となり、Day12に約28％、Da y14に約51％に回復したにすぎなかった。一方Ａ群では、Day８にはＡＣＮＵ投与前値の約25％にまで減少したが、その後は増加に転じ、Day10には約34％に、Day 12には約89％に、そしてDay14にはＡＣＮＵ投与前値以上にまで回復した。以上のように、いずれの群においても血小板数の最低値はDay８に観察されたが、ヒトＴＰＯ投与群ではコントロール群に比して減少が緩やかであり、最低値の底上げが見られた。また、コントロール群ではDay10においても血小板数の回復はほとんど見られなかったが、ヒトＴＰＯ投与群ではDay10には程度の差はあるが全ての群で血小板数の回復が観察され、50μg/kg投与群ではDay12にはすでにＡＣＮＵ投与前置以上にまで回復した。コントロール群ではDay14においてもＡＣＮＵ投与前置の約51％に回復したにすぎなかったことと比較すると、実施例６５で生産されたhTPO１６３は、血小板減少からの回復を促進する効果を有することが明らかとなった。以上、hTPO１６３は制ガン剤により惹起される血小板減少症に対する治療効果が認められた。以下、製剤例を示す。〈実施例８０〉実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、無菌処理した後−２０℃で凍結された凍結物を用いて注射剤とした。〈実施例８１〉実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。〈実施例８２〉実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍｌバイアル瓶に充填し注射剤とした。〈実施例８３〉実施例６５で得られたhTPO１６３画分を濃縮し、これを無菌処理した後−２０ ℃で凍結された凍結物を用いて注射剤とした。〈実施例８４〉実施例５６で得られたhTPO１６３画分を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。〈実施例８５〉実施例６５で得られたhTPO１６３画分を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍｌバイアル瓶に充填し注射剤とした。〈実施例８６〉実施例５７で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、これを無菌処理した後−２０ ℃で凍結された凍結物を用いて注射剤とした。〈実施例８７〉実施例５７で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。〈実施例８８〉実施例５７で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍｌバイアル瓶に充填し注射剤とした。〈実施例８９〉再生不良性イヌ血漿 Mazur，E．とSouth，K.，Exp．Hematol．13：1164-1172(1985)、Arriaga，M. ，South K.，Cohen J．L.及びMazur，E．M.，Blood 69：486-492(1987)、Mazur ，E.，Basilico，D.，Newton，J．L.，Cohen，J．L.，Charland，C.，Sohl，P． A.及びNarendran，A.，Blood 76：1771-1782(1990)の記載に準じて、但し総線量 450ラドの照射を施すことによってヘパリン処理再生不良性イヌ血漿（「ＡＰＫ９」）又は正常イヌ血漿（「ＮＫ９」）を調製した。〈実施例９０〉ヒト巨核球アッセイ下記の実施例に記載の多くの手順又は適切な代替手順に関する標準方法は、広く認知されている分子生物学マニュアル、例えばSambrookら編、Molecular Clon ing、２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1987)及びAusubelら編、Currenl Protocols in Molec uler Biology， Green associates/Wiley Interscieuce，New York(1990)に提供されている。ＡＰＫ９及び分画ＡＰＫ９を、ＣＤ34⁺前駆細胞からのヒト巨核球の発生を刺激する能力について、アッセイした。ＣＤ34選択細胞は、Hokom，M．H.，Choi， E.，Nichol，J．L.，Hornkohl，A.，Arakawa，T．及びHunt，P.，Molecular Bio logy of Haematopoiesis 3：15-31，1994の記載に準じて末梢血から得て、１% G lutamine Pen-strep(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)と10％ヘパリン処理ヒトＡＢ血漿（血小板数少ない）を補充したIscoveの改良Dulbecco培地（IMDM；GI BCO，Grand Island，NY）中でインキュベートした。この培地中にはさらに、２ −メルカプトエタノール（10^-4Ｍ）、ピルビン酸（110μg／ml）、コレステロール（7.8μg／ml）、アデノシン、グアニン、シチジン、ウリジン、チミジン、２ −デオキシシトシン、２−デオキシアデノシン、２−デオキシグアノシン（各10 μg／ml、Sigma）、ヒト組換えインスリン（10μg／ml）、ヒトトランスフェリン（300μg／ml）、ダイズ脂質（１％、Boehringer Mannheim，Indianapolis，I N）、ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（２ng/ml、Genzyme，Cambridge，MA）、ヒト組換え上皮細胞成長因子（15ng／ml）、血小板由来増殖因子（10ng／ml、Amgen，Inc.，Tho usand Oaks，CA）を含有させた。ＣＤ34選択細胞を、Terasaki式マイクロタイタープレート（Vanguard，Inc.，Neptune，NJ）のウェル中に培地１mlあたり２×1 0⁵細胞、最終容量15μlとなるように入れた。細胞を37℃８日間５％ＣＯ₂含有空気の存在下加湿箱中でインキュベートし、１％グルタルアルデヒドを用いて培養ウェルに直接固定し、モノクローナル抗体カクテル（抗ＧＰＩｂ、抗ＧＰIIＢ（ Boidesign）及び抗ＧＰＩｂ（Dako，Carpinteria，CA））と一緒にインキュベートした。免疫反応は、ストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ検出系（Hist o Mark，Kirgegaard及びPerry）を用いて発色させた。青色（blue color）によって識別される巨核球を、逆相顕微鏡下、倍率×100で計数した。結果は、ウェルあたりの巨核球平均数±平均標準誤差（ＳＥＭ）で示した。ある場合には、データは「巨核球ユニット／ml」で表わされ、この場合、ある与えられたサンプルが巨核球発生を誘起する度合がこの実験の陽性ＡＰＫ９コントロールに対して標準化された。１ユニットは、ＡＰＫ９標準１μlと同数の巨核球を生じさせる物質の量として定義される。活性は、５〜10μg／ml ＭＰＬ −Ｘ（可溶性Ｍｐｌ受容体）でブロックされうる場合、ＭＰＬリガンドによるものとして受入れられた。ＡＰＫ９は、この系でヒト巨核球発生を刺激する因子を含むことが実証されている。ＣＤ34選択細胞を10％ＮＫ９と８日間インキュベートすると、青色染色された巨核球をほとんど示さないが、該細胞を10％ＡＰＫ９と一緒にインキュベートすると青色染色巨核球が極めて多数認められた。図32から、ヒト巨核球培養系に添加するＭｐｌ−Ｘの濃度を上げていくと、巨核球の発生が増々ブロックされることが判る。５μg／ml以上のＭｐｌ−Ｘ濃度では、完全な阻害が起こる。この実験では、ＣＤ34選択細胞は５％ＡＰＫ９で刺激を受けたが、これは、Ｍｐｌ−Ｘ（多分Ｍｐｌリガンド）と相互作用する活性がヒト巨核球発生に必要であることを示すと共に、ＭｐｌリガンドがＡＰＫ９自体に存在していることを示している。さらに、この実験から、ヒト巨核球発生に必要なＭｐｌリガンド活性がＡＰＫ９中に存在することが立証された。ＡＰＫ９（135ml）をIscove培地で６倍に希釈し、Ｍｐｌ−Ｘアフィニティカラムに載せた。素通りする未結合物質を集めて、アッセイ前の元の容量まで濃縮した。結合物質は10mlの１M NaCl中に溶出し、そのプールの20％を透析ろ過し、アッセイのため４倍に濃縮した。培地単独でインキュベートしたＣＤ34選択細胞では、巨核球への発生がみられなかった。５％ＡＰＫ９（カラムに載置したのと同じプール）中でインキュベートした細胞は、ウェルあたり48±８個の巨核球の発生がみられた。10％の未結合物質中でインキュベートした細胞では巨核球の発生はみられなかった。10％の前記溶出プール中でインキュベートした細胞はウェルあたり 120±44個の巨核球細胞を発生させた。カラムロード（column load）、溶出プールの活性のいずれもこのアッセイにおいて５μg／ml Ｍｐｌ−Ｘにより実質的に完全に阻害された。〈実施例９１〉マウス又はヒトＭｐｌ受容体のマウス細胞系へのトランスフェクションＡ．マウスＭｐｌ受容体完全長のマウスＭｐｌ受容体ｃＤＮＡを、モロニーマウスザルコーマウィルスのＬＴＲ由来の転写プロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングした。この組換え体５μgと選択マーカープラスミドｐＷＬＮｅｏ（Stratagene ）１μg を、ＩＬ３依存性マウス細胞株（32Ｄ，クローン23；（Greenbergerら，PNAS80 ：2931-2936(1983)）中にコエレクトロポレート（co-electroporate）した。細胞を５日間培養し回収後、800μg／ml Geneticin（Ｇ418，Sigma）と１ng／mlマウスＩＬ−３を含有する選択培地中でインキュベートした。次いで、生存する細胞を２×10⁵細胞からなるプールに分割し、分析可能な細胞集団に増殖するまで培養を実施した。６個の細胞集団についてポリクローナルウサギ抗ペプチド血清を用いるＦＡＣＳ分析によりＭｐｌ受容体の細胞表面発現を調べた。先と同様の抗ペプチド血清を用いるＦＡＣＳによる分類のために１つの細胞集団を選択した。親細胞株の単一細胞クローンを10％ＡＰＫ９及びGeneticin中での増殖によって選抜した。35日間ＡＰＫ９中で選択後、細胞を１ng／mlマウスＩＬ−３中に維持した。サブクローンのうち１個（１Ａ６．１）を今回の試験に使用した。Ｂ．ヒトＭｐｌ受容体完全長のヒトＭｐｌ受容体配列（Vigon，I．ら、PNAS 89：5640-5644(1992)）を、モロニーマウスザルコーマウイルスの転写プロモーターを含有する発現ベクター（マウス受容体におけるのと同一のベクター）中にサブクローニングした。この組換え体６μgとアンフォトロフィックレトロウィルスパッケージングコンストラクト（amphotrophic retroviral packaging construct）（Landan，N．R．とL itiman，D．R.，J．Virology66：5110-5113(1992)）６μgを、ＣａＰＯ₄哺乳動物トランスフェクションキット（Stratagene社製）を用いて３×10⁶個の293細胞中にトランスフェクトした。この同じ細胞を２日後、また４日後に再びトランスフェクトした。最後のトランスフェクションの翌日に、293細胞をＩＬ−３依存性マウス細胞株（32Ｄ，クローン23；Greenbergerら、PNAS 80：2931-2936(1983 )）と一緒に培養した。24時間後、32Ｄ細胞を取り出し、ＢＳＡグラジェント（P ath-o-cyte；Mills Inc.）によって分離した。細胞を、１ng／mlマウスＩＬ−３中で増やし、20％ＡＰＫ９中での増殖によって選抜した。ポリクローナルウサギ抗ペプチド血清を用いるＦＡＣＳによって、受容体を細胞表面に発現している細胞を選抜した。これらの細胞は、アッセイに使用された。〈実施例９２〉Ｍｐｌリガンドの１Ａ６．１アッセイ１Ａ６．１細胞を培養液中のＩＬ−３を除くために洗浄し、Terasaki式マイクロタイタープレート中、10％牛胎仔血清（ＦＣＳ）、Geneticin（800μg／ml）及び１％pen/strep（Gibco）を含むたα −ＭＥＭ（Gibco）中に１ウェルあたり、15μl、1000個の細胞となるように入れ、テストサンプルを２倍希釈を繰り返して添加した。48時間後、ウェルあたりの生存細胞数を光顕的に測定した。１ユニットの活性は、ウェルあたり200個の生存細胞を生じさせる活性量として定義された。活性がアッセイの間に５〜10μg/ ml Ｍｐｌ−Ｘを含むことによって完全にブロックされうる場合には、該活性はＭｐｌリガンドによるものであるとして定義された。ＡＰＫ９中のＭｐｌリガンド活性は、再生不良性血漿１mlあたり平均4400±539ユニットであった。特に断わらない限り、Ｍｐｌリガンド活性のユニットは１Ａ６．１アッセイにおける定義とする。ヒトＭｐｌ受容体遺伝子でトランスフェクトされた細胞を用いたアッセイは、１Ａ６．１細胞におけるのと実質的に同一の方法で行なわれた。〈実施例９３〉Ｍｐｌリガンドが、マウス、イヌ、ブタ及びヒト由来の再生不良性血漿又は血清中に存在することの証明Ｍｐｌリガンドは、マウス、イヌ、ブタ及びヒト由来の再生不良性血漿又は血清中に存在する（表９）。血漿は、照射前及び12日間照射（500ラド）後のＢＤＦ１マウスから集められた。血漿を１Ａ６．１アッセイでテストした結果、2000ユニット／ml活性の存在が証明され、この活性はＭｐｌ−Ｘ（10μg／ml）で実質的に完全に阻害された。照射マウス血漿はまた、ヒト巨核球アッセイで陽性であり、1833ユニット／mlの活性を示した。次に、照射前及び10日間照射（450ラド）後のイヌから血漿を集めた。１Ａ６．１アッセイ及びヒト巨核球アッセイの両方で血漿をテストし、活性を検出すると共に、該活性は両アッセイにおいてＭｐｌ−Ｘ（10μg／ml）で完全に阻害された。次に、照射前及び10日間照射（650ラド）後のブタから血漿を集めた。１Ａ６．１アッセイ及びヒト巨核球アッセイの両方で血漿をテストした。両アッセイで、Ｍｐｌリガンド活性（10μg／ml Ｍｐｌ−Ｘで阻害可能）を示し、これは再生不良性イヌ血漿で見出された活性に相当していた。再生不良性ヒトから血清を得たが、この材料は骨髄移植患者から集められた。６人の患者からの血清を、１Ａ６．１アッセイで分析したところ、903ユニット／mlの活性を示し、その88％がＭｐｌリガンドに起因するものであった（10μg／ml Ｍｐｌ−Ｘで阻害可能）。14人の再生不良性患者由来の血清をさらに、ヒト巨核球アッセイでテストした。該血清は、941megユニット／mlの実質的活性を示し、これは10μg／ml Ｍｐｌ−Ｘで完全に阻害された。マウスＩＬ−３にする関するデータは、１Ａ６．１アッセイの特異性を実証するために包含される。この組換えサイトカインは該細胞系の増殖を誘発するが、10μg／ml Ｍｐｌ −Ｘによってブロックされない。〈実施例９４〉ヒトＴＰＯ誘導体の大腸菌における作製大腸菌で発現されるＴＰＯの生物活性、安定性、および溶解性の向上を試みて、ＴＰＯ誘導体を設計した。作製した誘導体は、配列番号１１のLeu129のArg置換体（［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹²⁹］ＴＰＯ（1-163）、Ｌ１２９Ｒ）、His133のArg置換体（［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³ ，Ａｒｇ¹³³］ＴＰＯ（1-163）、Ｈ１３３Ｒ）、Met143のArg置換体（［Ｍｅｔ^-2 ，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹⁴³］ＴＰＯ（1-163）、Ｍ１４３Ｒ）、Gly82のLeu置換体（［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ｌｅｕ⁸²］ＴＰＯ（1-163）、Ｇ８２Ｌ）、Gly146のLeu置換体（［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ｌｅｕ¹⁴⁶］ＴＰＯ（1-163）、Ｇ１４６Ｌ）、Ser148のpro置換体（［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ｐｒｏ¹⁴⁸］ＴＰＯ（1-163）、Ｓ１４８Ｐ）、Lys59のArg置換体（［Ｍｅｔ^-2，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³ ，Ａｒｇ⁵⁹］ＴＰＯ（1-163）、Ｋ５９Ｒ）およびGln115のArg置換体（［Ｍｅｔ^-2 ，Ｌｙｓ^-1，Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹¹⁵］ＴＰＯ（1-163）、Ｑ１１５Ｒ）である。ＴＰＯ誘導体作製のための鋳型としては、実施例４２に記載のｈ６Ｔ（1-163 ）を用い、以下に示すオリゴDNAを合成した。 L129R；5′-ATCTTC CGT TCTTTCCAGCACCT-3′（配列番号１１のLeu129のArg置換体作製用） H133R；5′-TCTTTCCAGCGT CTGCTGCGT-3′（配列番号１１のHis133のArg置換体作製用） M143R；5′-CGTTTCCTGCGT CTGGTTGGC-3′（配列番号１１のMet143のArg置換体作製用） G82L；5′-GGCCAGCTTCTG CCGACCTGCCT-3′（配列番号１１のGly82のLeu置換体作製用） G146L；5′-ATGCTGGTTCTG GGTTCTACCCT-3′（配列番号１１のGly146のLeu置換体作製用） S148P；5′-GTTGGCGGTCCG ACCCTGTGCG-3′（配列番号１１のSer148のPro置換体作製用） K59R；5′-GAAGAGACCCGC GCTCAGGACATCC-3′（配列番号１１のLys59のArg置換体作製用） Q115R；5′-CTGCCGCCACGT GGCCGTACCAC-3'′配列番号１１のGln115のArg置換体作製用）以下に示す変異プラスミドはすべてSculptorインビトロミュータジェネシスキット（Amersham社製）を用いて作製した。実施例４２に記載のプラスミドpCFM53 6/h6T(1-163)から得られるXba I-Hind III断片をBluescript II SK(-)（東洋紡績社製）のXba I-Hind III切断部位間に挿入して、プラスミドpSKTPOを作製した。プラスミドpSKTPOは大腸菌JM109に保持させた。ヘルパーファージM13KO7（宝酒造社製）を用いてpSKTPOから一本鎖DNAを調製し、上記の変異用合成オリゴDNA を用いて、キットに添付のプロトコールに従い、ＴＰＯ遺伝子に変異を導入した。供給者のプロトコールに従ってDNA配列決定キット（Applied Biosystems，USA ）を用いて配列分析を行ない、ＴＰＯが変異を受けていることを確認した。上記で作製したすべてのpSKTPOの誘導体よりXba I-Hind III断片を抽出し、プラスミドpCFM536のXba I-Hind III切断部位間に挿入した後、大腸菌261に形質転換し、目的とするＴＰＯ誘導体遺伝子を発現させる形質転換体を得た。変異体ｐＣＦＭ536で形質転換された大腸菌＃261の培養は、実施例４３に従って実施した。形質転換体の細胞ペレットを集め、少なくとも１日間冷凍庫中に保存した。得られた凍結菌体（約３ｇ）に、10 mM EDTA、10 mM DTT、１mM PMSFを含む20mMトリス緩衝液（ pH8.5）を約30mL加え、懸濁した後、氷冷下１分間の間隔をおいて１分間のソニケーション（超音波破砕機を使用）を５回行なった。破砕した菌体を15000rpmで１０分間遠心し、ペレットを集めた。このペレットに、８Mグアニジン塩酸塩、５mM EDTA、１mM PMSFを含む10mMトリス緩衝液（pH8.7）約30mLを加えて懸濁し、さらに約50mgのDTTを加え、室温にて１〜1.5時間攪拌し、蛋白質試料を還元した。還元後、希塩酸溶液を用いて試料のpHを５に調整し、希釈前４℃に放置した。還元した蛋白質試料を、30%グリセロール、３M尿素、３mMシスタミン、１mM L -システインを含む10mM CAPS緩衝液（pH10.5、約1.5Ｌ）に対して希釈した。希釈は、一晩かけて実施した。希釈後の試料溶液を少なくとも２日間攪拌し、8000 rpmで４５分間遠心し、不溶物を除去した。遠心後の上澄みを６Mリン酸を用いて pH6.8に調整し、イオン交換水で２倍に希釈した後、不溶物をフィルターペーパー（東洋濾紙製、#2、直径90mm）２枚を用いてろ過した。ろ液をイオン交換樹脂（CM-Sepharose fast flow、Pharmacia製）のカラム（2.6x 10cm）に吸着させた後、15%グリセロール、１M尿素を含む10mMリン酸緩衝液（pH6.8）約400mLで洗った後、15%グリセロールを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.2）でカラムを平衡化した。目的試料の溶出には、15%グリセロールを含む10mMリン酸緩衝液から0.5M 食塩を含む同緩衝液までの直線濃度勾配を用い、流速１mL/minで行なった。カラムからの蛋白質の溶出を280nmにおける紫外吸収で追跡し、目的蛋白質を含むフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し集めた。このフラクションを遠心濃縮器（Centriprep 10、Amicon社製）を用いて約２m Lに濃縮した後、逆相HPLC（Waters社製）を用いて精製した。この時、カラムにはWaters社製（Bondasphere C4（3.9x150mm）を用い、蛋白質の溶出には、0,05 ％TFA水溶液と、70%2-Propanol，30%CH₃ CNおよび0.02%TFAを含む液を用い、４０分間で0.5ml／minの流速で目的蛋白質を溶出させた。ＴＰＯ誘導体は、この条件では、いずれも約30分の位置に溶出された。精製されたＴＰＯ誘導体の活性測定を行なうため、精製した誘導体を１Lの10m Mリン酸緩衝液に対して２日間透析した後、遠心濃縮器（Centriprep 10、Amicon 社製）を用いて約0.1mg/ mlまで濃縮し、Ｍ−０７ｅアッセイに供した。ＴＰＯ誘導体は、いずれも対照ＴＰＯとして用いたｈ６Ｔ（1-163）とほぼ同様の生物活性を示した（図３３、図３４参照）。寄託物のリスト Escherichia coli（pHT1-231/DH5）： FERM BP-4564及びCCTCC-M95001 Escherichia coli（pEF18S-A2α/DH5）： FERM BP-4565及びCCTCC-M95002 Escherichia coli（pHGT1/DH5）： FERM BP-4616及びCCTCC-M95003 Escherichia coli（pHTF1/DH5）： FERM BP-4617及びCCTCC-M95004 Mouse-Mouse hybridoma P55： FERM BP-4563及びCCTCC-C95001 CHO28/1/1/3-C6： FERM BP-4988及びCCTCC-C95004 CHO163T-63-79-C1： FERM BP-4989及びCCTCC-C95005

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/26 9452−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 1/21 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 5/10 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/24 ＡＣＡＣ１２Ｐ 21/02 9455−4Ｃ 37/02 ＡＢＹ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号特願平6−155126 (32)優先日平６(1994)６月１日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号特願平6−167328 (32)優先日平６(1994)６月15日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号特願平6−193169 (32)優先日平６(1994)８月17日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号特願平6−227159 (32)優先日平６(1994)８月17日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号特願平6−193916 (32)優先日平６(1994)８月18日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号特願平6−304167 (32)優先日平６(1994)11月１日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号特願平6−298669 (32)優先日平６(1994)12月１日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号特願平6−341200 (32)優先日平６(1994)12月28日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者赤堀弘典群馬県高崎市石原町3439―78―２ (72)発明者黒木良太神奈川県横浜市金沢区能見台５―13―20― ２ (72)発明者清水敏之神奈川県横浜市金沢区能見台６―35―６― 101 (72)発明者武藤隆則神奈川県横浜市金沢区寺前２―８―４金沢八景寮102

Claims

【特許請求の範囲】１．血小板産生を特異的に刺激または増強する生物活性を有しかつ配列番号６のアミノ酸配列１〜332を有するトロンボポエチン（ＴＰＯ）ポリペプチド又はその誘導体。２．配列番号６のアミノ酸配列１〜163からなる請求項１に記載のＴＰＯポリペプチド誘導体。３．配列番号６のアミノ酸配列１〜232からなる請求項１に記載のＴＰＯポリペプチド誘導体。４．配列番号６のアミノ酸配列１〜151からなる請求項１に記載のＴＰＯポリペプチド誘導体。５．１〜６個のアミノ末端アミノ酸が欠失された請求項１、２又は３に記載のＴＰＯポリペプチド誘導体。６．［ΔＨｉｓ³³］ＴＰＯ（1-163）、［ΔＡｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163）及び［ΔＧｌｙ¹¹⁶］ＴＰＯ（1-163）からなる群から選択される請求項２記載のＴＰＯポリペプチド誘導体。７．［Ｈｉｓ³³，Ｔｈｒ³³′，Ｐｒｏ³⁴］ＴＰＯ（1-163）、［Ｈｉｓ³³，Ａｌａ³³′，Ｐｒｏ³⁴］ＴＰＯ（1-163）、［Ｈｉｓ³³，Ｇｌｙ³³′，Ｐｒｏ³⁴，Ｓｅｒ³⁸］ＴＰＯ（1-163）、［Ｇｌｙ¹¹⁶ ，Ａｓｎ¹¹⁶′，Ａｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163）、［Ｇｌｙ¹¹⁶，Ａｌａ¹¹⁶′，Ａｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1-163）、［Ｇｌｙ¹¹⁶，Ｇｌｙ¹¹⁶′，Ａｒｇ¹¹⁷］ＴＰＯ（1 -163）及び［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³］ＴＰＯ（1-163）からなる群から選択される請求項２に記載のＴＰＯポリペプチド誘導体。８．［Ｔｈｒ³³，Ｔｈｒ³³³，Ｓｅｒ³³⁴，Ｉｌｅ³³⁵，Ｇｌy³³⁶，Ｔｙｒ³³⁷，Ｐｒｏ³³⁸，Ｔｙｒ³³⁹，Ａｓｐ³⁴⁰，Ｖａｌ³⁴¹，Ｐｒｏ³⁴²，Ａｓｐ³⁴³，Ｔｙｒ³⁴⁴ ，Ａｌａ³⁴⁵，Ｇｌｙ³⁴⁶，Ｖａｌ⁴³⁷，Ｈｉｓ³⁴⁸，Ｈｉｓ³⁴⁹，Ｈｉｓ³⁵⁰，Ｈｉｓ³⁵¹，Ｈｉｓ³⁵²，Ｈｉｓ³⁵³］ＴＰＯ及び［Ａｓｎ²⁵，Ｌｙｓ²³¹，Ｔｈｒ³³³ ，Ｓｅｒ³³⁴，Ｉｌｅ³³⁵，Ｇｌy³³⁶，Ｔｙｒ³³⁷，Ｐｒｏ³³⁸，Ｔｙｒ³³⁹，Ａｓｐ³⁴⁰，Ｖａｌ³⁴¹，Ｐｒｏ³⁴²，Ａｓｐ³⁴³，Ｔｙｒ³⁴⁴，Ａｌａ³⁴⁵，Ｇｌｙ³⁴ ⁶ ，Ｖａｌ³⁴⁷，Ｈｉｓ³⁴⁸，Ｈｉｓ³⁴⁹，Ｈｉｓ³⁵⁰，Ｈｉｓ³⁵¹，Ｈｉｓ³⁵²，Ｈｉｓ³⁵³］ＴＰＯからなる群から選択される請求項１に記載のＴＰＯポリペプチド誘導体。９．［Ａｓｎ²⁵］ＴＰＯ及び［Ｔｈｒ³³］ＴＰＯからなる群から選択される請求項１に記載のＴＰＯポリペプチド誘導体。 10．［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹²⁹］ＴＰＯ（1-163）、［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³ ，Ａｒｇ¹³³］ＴＰＯ（1-163）、［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ¹⁴³］ＴＰＯ（1-1 63）、［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ｌｅｕ⁸²］ＴＰＯ（1-163）、［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³ ，Ｌｅｕ¹⁴⁶］ＴＰＯ（1-163）、［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ｐｒｏ¹⁴⁸］ＴＰＯ（1-1 63）、［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³，Ａｒｇ⁵⁹］ＴＰＯ（1-163）及び［Ａｌａ¹，Ｖａｌ³ ，Ａｒｇ¹¹⁵］ＴＰＯ（1-163）からなる群から選択される請求項２に記載のＴＰＯポリペプチド誘導体。 11．［Ａｒｇ¹²⁹］ＴＰＯ（1-163）、［Ａｒｇ¹³³］ＴＰＯ（1-163）、［Ａｒｇ¹⁴³］ＴＰＯ（1-163）、［Ｌｅｕ⁸²］ＴＰＯ（1-163）、［Ｌｅｕ¹⁴⁶］ＴＰＯ（1-163）、［Ｐｒｏ¹⁴⁸］ＴＰＯ（1-163）、［Ａｒｇ⁵⁹］ＴＰＯ（1-163）及び［Ａｒｇ¹¹⁵］ＴＰＯ（1-163）からなる群から選択される請求項２に記載のＴＰＯポリペプチド誘導体。 12．ポリマーに共有結合されている請求項１に記載のＴＰＯポリペプチド。 13．前記ポリマーがポリエチレングリコールである請求項12に記載のＴＰＯポリペプチド。 14．さらにアミノ酸Ｍｅｔ^-2−Ｌｙｓ^-1を有する請求項１〜13のいずれかに記載のＴＰＯポリペプチド。 15．さらにＭｅｔ^-1を有する請求項１〜13のいずれかに記載のＴＰＯポリペプチド。 16．さらにＧｌｙ^-1を有する請求項１〜13のいずれかに記載のＴＰＯポリペプチド。 17．請求項２、４又は６の成熟アミノ酸配列からなるポリペプチド。 18．請求項１〜11、14、15及び17のいずれかに記載のＴＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡ。 19．血小板産生を特異的に刺激または増強する生物活性を有するＴＰＯポリペプチドの発現を確実化するためのＤＮＡ配列であって、（ａ）配列番号194、195又は196に示されるＤＮＡ配列又はその相補鎖；（ｂ）厳格な条件下で（ａ）のＤＮＡ配列又はその断片とハイブリット形成するＤＮＡ配列；及び（ｃ）遺伝コードの縮重がなければ（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ配列とハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列からなる群から選択される前記ＤＮＡ配列。 20．請求項19に記載のｃＤＮＡ配列。 21．請求項19に記載のゲノムＤＮＡ配列。 22．請求項19に記載の合成ＤＮＡ配列。 23．ＴＰＯポリペプチドの製造方法であって、ａ）請求項18、19、20、21又は22に記載のＤＮＡによってコードされるポリペプチドを適切な宿主中で発現させ、及びｂ）前記ＴＰＯポリペプチドを単離する工程を包含する前記方法。 24．発現されるＴＰＯポリペプチドがＭｅｔ^-2−Ｌｙｓ^-1ポリペプチドであり、かつ前記単離ＴＰＯポリペプチドからＭｅｔ^-2−Ｌｙｓ^-1を切断する工程をさらに含む請求項23に記載の方法。 25．血小板産生を特異的に刺激または増強する生物活性を有するＴＰＯポリペプチドの発現を確実化するために使用するＤＮＡ配列であり、ＴＰＯポリペプチドコーディング配列のビン認識ペプチドをコードし、また該トロンビン認識ペプチドの５′側にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をさらにコードすることを特徴とするＤＮＡ配列。 26．配列番号６のアミノ酸配列１〜174からなるＴＰＯポリペプチドの発現を確実化するために使用する請求項25に記載のＤＮＡ配列。 27．血小板産生を特異的に刺激または増強する生物活性を有するＴＰＯポリペプチドの製造方法であって、ａ）請求項25又は26に記載のＤＮＡによってコードされるポリペプチドを適切な宿主中で発現し、ｂ）前記ＧＳＴ−（トロンビン認識ペプチド）−ＴＰＯポリペプチドを単離し、ｃ）単離されたＧＳＴ−（トロンビン認識ペプチド）−ＴＰＯポリペプチドをトロンビンで処理し、及びｄ）Ｇｌｙ^-1−ＴＰＯポリペプチドを単離する工程を包含する前記方法。 28．Ｇｌｙ^-1−ＴＰＯポリペプチドが［Ｇｌｙ^-1］ＴＰＯ（1-174）である請求項27に記載の方法。 29．単離されたＧｌｙ^-1−ＴＰＯポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列１〜174からなるＴＰＯ誘導体である請求項27又は28に記載の方法。 30．請求項23、24、27、28又は29に記載の方法によって得られるタンパク質生成物。 31．血小板産生を特異的に刺激または増強する生物活性を有するポリペプチドの発現を可能にするように、請求項18、19、20、21、22、25又は26に記載のＤＮＡ配列で形質転換又はトランスフェクションされた原核又は真核宿主細胞。 32．請求項１〜16及び30のいずれかに記載の有効量のポリペプチドを、医薬的に許容可能な担体と組合わせ含有する医薬組成物。 33．血小板障害の治療に使用するための請求項32に記載の医薬組成物。 34．血小板減少症の治療に使用するための請求項32に記載の医薬組成物。 35．化学療法、放射線療法又は骨髄移植によって誘発された血小板減少症の治療に使用するための請求項34に記載の医薬組成物。 36．請求項１〜16及び30のいずれかに記載の有効量のポリペプチドを、血小板障害をもつ患者に投与することからなる血小板障害を治療するための方法。 37．請求項１〜16及び30のいずれかに記載の有効量のポリペプチドを、血小板減少症をもつ患者に投与することからなる血小板減少症を治療するための方法。 38．化学療法、放射線療法又は骨髄移植によって誘発された血小板減少症を治療するための請求項37に記載の方法。 39．請求項１〜16及び30のいずれかに記載のポリペプチドと特異的に免疫反応性のある抗体。 40．請求項１〜16及び30のいずれかに記載のポリペプチドを単離するための、請求項39に記載の抗体の使用。 41．請求項１〜16及び30のいずれかに記載のポリペプチドを定量するための、請求項39に記載の抗体の使用。