HUT75656A - Protein having tpo activity - Google Patents

Description

A találmány tárgya új protein, amely a vérlemezkék in vivő termelődését specifikus módon serkentő vagy fokozó, megakariocita őssejtek proliferáciőját és illetve a differenciálódását növelő aktivitással rendelkezik.

találmány további tárgya az említett proteint kódoló DNS-szekvencia, valamint a protein előállítási eljárása.

A megakariociták elsősorban a csontvelőben található, sok citoplazmát tartalmazó, nagy, sokmagvú sejtek, melyek a vérlemezkéket hozzák létre. A megakariociták a csontvelőben lévő pluripotens, hematopoetikus stem-sejtekből származnak. A primitív pluripotens stem-sejt bizonyos mértékben megakariocita őssejtekké differenciálódik, melyekből a megakariocita vonal alakul ki. A megakariocita őssejtek ploriferálódnak és megakariocitákká differenciálódnak, melyek poliploidizáción és citoplazmikus érésen esnek át, s végül a keringési rendszerbe sejtmag nélküli citoplazmikus fragmenseket (nevezetesen a vérlemezkéket) bocsátanak ki.

Egy érett megakariocitából átlagosan 2000-4000 vérlemezke alakul ki. Bár a vérlemezkék képződése sok tekintetben nem világos, úgy tartják, hogy a megakariociták jellemzően a csontvelőben a sinus endothelium felületén lokalizálódnak és citoplazmikus folyamatokat hoznak létre, melyek kiterjednek a sinusoidokra, ahol vérlemezkékké fragmentálódásuk lezajlik.

A vérlemezkék képződését illetően sok homályos pont van, bár valószínű, hogy a megakariociták a csontvelői vénás • · »

··· ····· szinuszok hámjának dermális rétegében helyezkednek el, s a citoplazma áthatol a dermális rétegen, miáltal zsinórszerű kidudorodást hoz létre a vénás sinus belső falán, s innen szabadulnak ki a vérlemezkék.

Felvetették, hogy a vérképződés során a megakariociták termelődése és szabályozása specifikusan hat a vérlemezkék termelődésére. Egészséges emberekben vagy állatokban az hatásos vérlemezkék száma állandó, bár ismert, hogy antivérlemezke antitestet például egészséges állatoknak beadva a vérlemezkék száma azonnal csökken, majd ideiglenesen a normálisnál magasabb szintre emelkedik, végül normális szintre áll vissza. Szintén ismert, hogy vérlemezkék számának csökkenése trombocitopéniát, a vérlemezkék számának növekedése pedig trombocitosist okoz, még akkor is, ha az eritrociták és a leukociták száma normális.

A vérlemezkék legfontosabb funkciója a véralvadási folyamat során a vérrögök létrehozása. Ha a véralvadási mechanizmus a csökkent vérlemezkeszám következtében nem működik megfelelően, hemostasis felé mutató tendencia érvényesül.

A megakariociták és a trombociták képződésével kapcsolatban specifikus szabályozó mechanizmus létének lehetőségét vetették fel. A vérlemezkék egészséges emberekben és állatokban hatásos mennyiségben vannak jelen. Ismeretes azonban, hogy ha egy egészséges állatnak anti-vérlemezke antitestet adunk be. a vérlemezkék száma csak egy rövid ideig csökken hirtelen, majd időlegesen a normális szint fölé emelkedik, de végül a normális szintre áll vissza. Szintén ismert, hogy a vérlemezkék számának csökkenése (trombocitopénia) vagy növekedése (trombocitosis) normális számú eritrociták és leukociták jelenléte esetén is előfordul. Napjainkig a vérlemezkék termelődésében szerepet játszó specifikus szabályozó faktor (mint például az eritrociták kialakulásában az eritropoetin) sikeres izolálásáról és azonosításáról azonban nem számoltak be.

A vérlemezkék legfontosabb funkciója a véralvadási mechanizmusban a vérrögök kialakítása. Ha a véralvadási mechanizmus a trombocitopénia következtében károsul, vérzékenységi hajlam alakul ki. A rákok radioterápiás és kemoterápiás kezelésében a csontvelő szuppresszió okozta trombocitpénia halálos kimenetelű komplikáció, s az ilyen páciensek esetében a vérzékenységi hajlam megakadályozása érdekében vérlemezke-transzfúziót alkalmaznak. A vérlemezketranszfúziót csontvelőátültetésen átesett vagy aplasztikus vérszegénységben szenvedő páciensek esetében is alkalmazzák.

A vérlemezke-transzfúzióban alkalmazható vérlemezkéket egészséges vérrel rendelkező donorokból vérlemezkeferézissel készítik, de az ilyen vérlemezkék rövid ideig tárolhatók, s fennáll a baktériumok okozta fertőzéses szennyeződés lehetősége. A vérlemezke-transzfúzió további esetleges veszélyei, hogy a páciensek veszélyes vírusokkal, • · mint például humán immundeficiencia vírussal (HÍV) vágykülönböző hepatitis vírusokkal fertőződhetnek, a transzfúzionált vérlemezkék fő hiszokompatibilitási antigénjére (HLA) specifikus antitestek indukálódhatnak, valamint a transzfúzionált vérlemezkék közötti szennyezett limfocitáknak köszönhetően graft-versus-host betegséget (GVHD) oko zhat.

A fentiek következtében nagyon előnyös lenne, ha a trombocitopeniás páciensekben a belső vérlemezkeképződés lenne serkenthető, s ugyanakkor csökkenthető lenne a páciensek vérlemezke-transzfúziótól való függősége. Ezenkívül, ha radioterápiával vagy kemoterápiával kezelt rákos betegekben a trombocitopénia javítható vagy megelőzhető lenne, az ilyen kezeléseket biztonságosabbá tehetnénk, a kezelés intenzitását valószínűleg növelhetnénk, és a rákellenes hatások további javulását várhatnánk.

Fenti okok miatt a megakaritocita- és vérlemzeketermelődés szabályozásában szerepet játszó specifikus szabályozó faktorok izolálása és azonosítása érdekében számos intenzív vizsgálatot végeztek. Az in vitro vizsgálatok szerint a megakariocitaképződést (megakariocitopoesis) irányító szabályozó faktorok élesen két faktorra különíthetők (vö.

Williams és mtsi, J. Cell. Physiol., 110. 101-104, 1982). Az egyik a megakariocita kolónia-stimuláló faktor (Meg-CSF), amely a CFU-MK félszilárd tenyésztő tápközegben megakariocita telepeket kialakító proliierációját és differenciálódását serkenti. A másik a megakariocita stimuláló faktor (Meg-Pot) vagy trombopoezist stimuláló faktor vagy hasonló elnevezésű szabályozó faktor, amely főleg éretlen vagy érett megakariocitákra hat, fokozva differenciálódásukat és érésüket. A Meg-Pot néhány esetben a Meg-CSF aktivitással együtt detektálható. Ezenkívül, minthogy kísérletileg indukált trombocitopéniás állatokból vett szérumot vagy vérplazmát más normális állatoknak beadva a vérlemezkék száma csökkent, felvetették, hogy létezik egy trombopoetin (TPO) elnevezésű humorális faktor, amely a vérlemezkék in vivő termelődését képes elősegíteni.

Az utóbbi években néhány citokint (melyek génjeit klónozták) megakariocitaképződést és trombocitaképződést serkentő képességükre vizsgáltak. A humán IL-3 humán megakariocita telepek képződését serkentette (Brúnó és mtsi Exp. Hematol., 16. 371-377, 1988) > és — legalábbis majmokban — fokozta a vérlemezkék számát (Donahue és mtsi, Science, 241. 1820,

1988). Mivel az IL-3 olyan faktor, amely valamennyi vérképző sejt proliferációjára és differenciálódására kifejti hatását, megkülönböztethető a megakariocitaképződést és a vérlemezkék termelődését szabályozó specifikus szabályozó faktoroktól. A humán IL-6 nem mutatott Meg-CSF aktivitást, de az éretlen megakariocitákra kifejtette hatását, majd fokozta az érett megakariocitákká differenciálódásukat (Williams és mtsi, Exp. Hematol., Ifi, 69, 1990). Az IL-6 in vivő beadása főemlősökben vérlemezketermelődést indukált és elősegítette érésüket, valamint a csontvelő megakariociták • · · ·

- 7 -
ploiditását.	magasabb	érték	felé	tolta	el,	azonban
mellékhatásokat	is	okozott,	mint	például	a	testtömeg
csökkenését	és	akut	fázisú	protein	indukcióját	(Asano és

mtsi, Blood, 75. 1602-1605, 1990; Stahl és mtsi, Blood, 78. 1467-1475, 1991). A humán IL-11 egerekben nem mutatott MegCSF aktivitást, de Meg-Pot aktivitást fejtett ki és elősegítette a vérlemezketermelődést (Neben és mtsi, Blood, 81, 901-908, 1993). A humán LIF főemlősökben jelentősen fokozta a vérlemezkék számát (Mayer és mtsi, Blood, fii, 3226-3233, 1993), a megakariocitákra gyakorolt in vitro hatása azonban gyenge volt (Bursteln és mtsi, J. Cell. Physiol, lfifi, 305-312, 1992).

Annak ellenére, hogy ezen citokinek vérlemezke-fokozó faktorokként való klinikai alkalmazása várható, működésük nem specifikus a megakariocita sejtvonalra, s mellékhatásokat okoznak. Ilyenformán, a megakariocitavérlemezke rendszerre specifikus, kevesebb mellékhatást okozó vérlemezke-fokozó faktor kifejlesztése kívánatos.

Meg-CSF, Meg-Pot, illetve TPO aktivitást trombocitopéniás páciensek vagy állatok szérumában, vérplazmájában és vizeletében, valamint bizonyos kitenyésztett humán sejtvonalak tenyészetfelülúszóiban találtak. Jelenleg azonban nem ismert, hogy ezen aktivitások egy faktornak vagy több faktor kombinációjának köszönhetők-e, illetve, hogy ezek különböznek-e az ismert citokinektől.

···· ·· ···· ·* ·· ·«· ·····

Hoffmann és mtsi. felfedezték, hogy az aplasztikus vérszegénységben szenvedő páciensek széruma és az amegakariocitás trombocitopéniás purpura (bőrvérzés) Meg-CSF aktivitást mutatott, amely jelentősen fokozta a humán megakariocita telepképződést (Hoffmann és mtsi, N. Eng. J. Med., 305. 533-538, 1981). Mazur és mt3i. később beszámoltak arról, hogy az aplasztikus vérszegénységben szenvedő páciensek szérumában jelenlevő Meg-CSF aktivitás különbözött mind az IL-3-tól, mind a GM-CSF-től (Mazur és mtsi, Blood,

76. 290-297, 1990). Hasonló Meg-CSF aktivitást találtak az intenzív citotoxikus kemoterápiával kezelt rákos betegek szérumában és a csontvelőátültetésen átesett betegekben (Mazur és mtsi, Exp. Hematol., 12, 624-628, 1984; de Álarcon és Schmieder, Prog. Clin. Bio. Rés., 215, 335-340, 1986).

Hoffmann és mtsi. leírták, hogy hipomegakariocitás trombocitopéniában szenvedő páciensek vérplazmájából 46000 D látszólagos molekulatömegű Meg-CSF-et tisztítottak (Hoffmann és mtsi, J. Clin. Invest., 75. 1174-1182, 1985), de későbbi vizsgálatok során azt tapasztalták, hogy az anyag nem volt elég tiszta a pontos aminosav-szekvenáláshoz (Hoffmann,

Blood, 74, 1196-1212, 1989). Trombocitopéniás páciensek vérplazmájából, illetve idiopátiás trombocitopéniás purpuréban (ITP) szenvedő páciensek vizeletéből TPO-szerű aktivitással rendelkező anyagot tisztítottak részlegesen, amely egerekben fokozta a ⁷'^BSe-szelén-metionin újonnan kialakuló vérlemezkékbe történő beépülését. A plazmaeredetű faktor látszólagos molekulatömegét 40000 D-ban határozták meg (Grossi és mtsi, Hematologica, 72, 291-295, 1987;

- 9 « ·

Vannuchi és mtsi, Leukémia, 2, 236-240, 1988).

Meg-CSF és TPO-szerű aktivitást aplasztikus vérszegénységben és súlyos ITP-ben szenvedő páciensek vizeletmintáiban is kimutattak (Kawakita és mtsi, Br. J. Haematol., 48, 609-615, 1981; Kawakita és mtsi, Blood, 556-560, 1983). Kawakita és mtsi. beszámoltak arról is, hogy az aplasztikus vérszegénységben szenvedő páciensek vizeletmintáiban található Meg-CSF disszociációs körülmények között gélfiltrálással 45000 D látszólagos molekulatömegűnek mutatkozott (Kawakita és mtsi, Br. J. Haematol., 62.

715-722, 1986). Erikson-Miller és mtsi. szintén beszámoltak hasonló vizeletmintákból származó Meg-CSF tisztításáról, de szerkezetéről nem közöltek információkat (Erikson-Miller és mtsi., Blood Cell Growth Factors: their present and future use in hematology and oncology szerk.: Murphy, Alpha Med Press, Dayton, Ohio, 204-220. old., 1992). Turner és mtsi. csontvelőátültetésen átesett páciensek vizeletéből Meg-CSF

aktivitással	rendelkező	megakariocita	stimuláló faktort
(MSF) tisztítottak,	és	klónozták annak	génjét (Turnér	és
mtsi, Blood,	za,	P-	1106, 279a, 1991, [kivonat,	1.
kiegészítés]).	Ezen	MSF	molekulatömege	28000-35000 D	. E

faktor Meg-CSF-fel való azonosságát ezidáig trombocitopéniás páciensek szérumában és vérplazmájában mutatták ki, s vérlemezke-fokozó aktivitása tisztázásra vár.

Humán embrionális vese-eredetű sejtvonal (HEK sejtek) tenyészet felülúszőjából TPO-szerű aktivitással rendelkező, ·· «««· ·· *·

32000 D molekulatömegű anyagot tisztítottak, s biológiai és biokémiai tulajdonságait széles körűen vizsgálták, szerkezete azonban továbbra is ismeretlen (McDonald és mtsi, J. Láb. Clin. Med., 106. 162-174, 1985; McDonald, Int. J. Cell Cloning, Z, 139-155, 1989). Ezzel szemben más kutatók leírták, hogy a HEK sejtek kondicionált tápközegében (amely fokozza az in vitro megakariocita érést) tapasztalható fő aktivitás ismert citokineknek tulajdonítható, nevezetesen az IL-6-nak és az EPO-nak (Withy és mtsi, J. Cell. Physiol., IS, 362-372, 1992).

Az állati eredetű faktorokat illetően Evatt és mtsi.

beszámoltak arról, hogy anti-vérlemezke szérum injekcióval indukált trombocitopéniában szenvedő nyulakban olyan TPOszerű aktivitást találtak, amely nyulakban és egerekben fokozta a ^7BSe-szelén-metionin újonnan kialakuló vérlemezkékbe való beépülését (Evatt és mtsi, J. Láb. Clin. Med., 83. 364-371, 1974). Ezenkívül, az 1960-as és 1970-es évek között számos hasonló vizsgálatról számoltak be (pl. Odell és mtsi, Proc. Soc. Bioi. Med., 108, 428-431, 1961; Evatt és Levin, J. Clin. Invest., 48. 1615-1626, 1969; Harker, Am. J. Physiol, 218. 1376-1380, 1970; Shreiner és Levin, J. Clin. Invest., 42, 1709-1713, 1970; és Penington, Br. Med. J., 4, 606-608, 1970). Evatt és mtsi., valamint Hill és Levin trombocitopéniás nyulak vérplazmájából TPOszerű aktivitás részleges tisztítását végezték (Evatt és mtsi, Blood, 54, 377-388, 1979; Hill és Levin, Exp. Hematol., 14, 752-759, 1986). A későbbiekben folytatták e • ·· ···· • · · ·

- 11 faktor tisztítását, s a megakariociták differenciálódását és érését in vitro fokozó aktivitást, nevezetesen Meg-Pot aktivitást figyeltek meg, és gélfiltrálással kimutatták, hogy látszólagos molekulatömege 40000-46000 D (Keller és mtsi, Exp. Hematol., 16. 262-267, 1988; Hill és mtsi, Exp. Hematol., 20. 354-360, 1992). Mivel az IL-6 aktivitás az anti-vérlemezke szérummal indukált súlyos akut trombocitopéniában szenvedő nyulak vérplazmájában nem volt kimutatható, felvetették, hogy ez a ΤΡΟ-szerű aktivitás az

IL-6-tól eltérő faktornak tudható be (Hill és mtsi, Blood, Sfi, 346-351, 1992).

Tayrien és Rosenberg trombocitopéniás nyulak vérplazmájából és HEK sejtek tenyészetfelülúszójából szintén tisztítottak egy 15000 D látszólagos molakulatömegű faktort, amely patkány megakariocita sejtvonalban serkenti a 4. vérlemezke faktor termelését; szerkezetéről azonban nem közöltek információkat (Tayrien és Rosenberg, J. Bioi. Chem., 262.

3262-3268, 1987).

Nakeff anti-vérlemzke szérum beadásával indukált trombocitopéniában szenvedő egerek szérumában Meg-CSF aktivitást talált (Nakeff, Experimental Hematology Today szerk.: Baum és Ledney, Springer-Verlag, NY, 111-123. old., 1977). A trombocitopéniás nyulakból származó szérum másrészről fokozta a megakariociták érését (Keller és mtsi,

Exp. Hematol., Ifi, 262-267, 1988; Hill és mtsi. Exp.

Hematol., 12, 903-907, 1989) és serkentette a megakariociták

- 12 « · « · · ·« * · ···· · · «· ·· vérlemezkékké történő alakváltozását (Leven és Yee, Blood,

69. 1046-1052, 1989), de kimutatható Meg-CSF aktivitással nem rendelkezett.

Miura és mtsi. teljes testfelületet érintő szubletális besugárzással trombocitopéniássá tett patkányok vérplazmájában Meg-CSF aktivitást mutattak ki (Miura és mtsi, Blood, £3, 1060-1066, 1984), és felvetették, hogy a

Meg-CSF aktivitás in vivő indukciója a megakariociták csökkent számával, és nem a vérlemezkék csökkent számával áll kapcsolatban, mivel ez az aktivitás vérlemezketranszfűzióval nem változtatható (Miura és mtsi, Exp. Hematol., 16. 139-144, 1988). Mazur és South szubletálisan sugárkezelt kutyák szérumában Meg-CSF aktivitást mutattak ki, s leírták, hogy e faktor gélfiltrálással mért látszólagos molekulatömeg 175000 D volt (Mazur és South, Exp. Hematol., 13, 1164-1172, 1985). A fentieken kívül más kutatók is beszámoltak szérum-, vérplazma- és vizeleteredetű faktorokról, mint pl. Straneva és mtsi. (Straneva és mtsi, Exp. Hematol.. 15. 657-663, 1987).

Amint az eddigiekben leírtuk, trombocitopéniás páciensekből és állatokból származó biológiai mintákban különböző, megakariocitaképződést és trombocitaképződést serkentő aktivitásokat találtak, de ezen faktorok izolálása, biokémiai és biológiai azonosítása, valamint tulajdonságaik meghatározása sikertelen volt, mivel a természetes forrásokban (mint pl. vérben és vizeletben) igen kis •··« *· • · *··· ·· • · · • · 4 4 · · · «4 4 · · · 44 4« ··

- 13 mennyiségben találhatók.

A találmány tárgya TPO protein izolálása és azonosítása természetes forrásokból, mely TPO protein a vérlemezkék termelődését In vivő serkentő vagy fokozó és/vagy a megakariocita őssejtek proliferációját és differenciálódását fokozó aktivitással (a továbbiakban TPO aktivitással) rendelkezik. A találmány további tárgya a TPO proteint kódoló gén rekombináns DNS-technikákkal homogén minőségben és nagy mennyiségben történő izolálása. A találmány ezen céljainak sikeres megvalósítása a jelenleg alkalmazott vérlemezke-transzfúzió helyettesítését vagy gyakoriságának csökkentését eredményezi, s ezen új protein a vérlemezkékkel kapcsolatos betegségek kezeléséhez és diagnózisához is alkalmazható.

Ilyenformán, (i) TPO tisztított valamelyike:

a találmány tárgya aktivitással rendelkező proteint kódoló és izolált DNS szekvencia, amely az alábbiak (a) a szekvencialistában 194., 195. és 196. szekvenciaként bemutatott DNS-szekvenciák vagy azok komplementer szálai;

(b) az (a) pontban meghatározott DNS-szekvenciákhoz szigorú körülmények között hibridizáló DNS-szekvenciák vagy azok fragmensei; és (c) DNS-szekvenciák, melyek a genetikai kód degeneráltsága miatt hibridizálhatnak az (a) és (b) pontban ·♦·· *· ··«· ·« ·· **· ·«««« • · « « V *« ··· · · · « · ·« ··«· ·« ·· «·

- 14 meghatározott DNS-szekvenciákhoz;

(ii) eljárás TPO aktivitással rendelkező protein előállítására, melynek során az említett DNS-szekvenciával transzformált vagy transzfektált prokarióta vagy eukarióta sejteket megfelelő tápanyagellátás mellett a protein expresszióját lehetővé tevő módon növesztjük; és izoláljuk az említett DNS-szekvencia expresszálásával kapott kívánt protein terméket;

(iii) protein termék, melyet az említett DNS-szekvencia prokarióta vagy eukarióta gazdasejtben végzett expresszálásával kapunk.

A találmány további tárgya gyógyszerészeti készítmény, amely az említett TPO aktivitással rendelkező protein hatásos mennyiségét tartalmazza, valamint eljárás vérlemezkebetegségek, elsősorban trombocitopénia kezelésére, melynek során a betegségben szenvedő páciensnek az említett proteint adjuk be.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán XRP-ből származó Fenil-Sepharose 6 FF/LS F2 frakció Sephacryl S-200HR gélfiltrációs kormatográfiájának eredményét mutatjuk be.

A 2. ábrán XRP kis molekulatömegű TPO mintájából (Sephacryl

S-200HR F3 frakció) származó YMC-pack CN-AP TPO-aktív ·· *· frakció Capcell Pák Cl reverz fázisú kromatográfiásának eredményét mutatjuk be.

A 3. ábrán XRP kis molekulatömegű TPO mintájából származó

Capcell Pák Cl TPO-aktív frakció (FA) SDS-PAGE analízisének eredményét mutatjuk be.

A 4. ábrán SDS-PAGE analízissel izolált patkány TPO C18 reverz fázisú HPLC-vel készített peptidtérképeit mutatjuk be. A peptid-fragmenseket három proteázzal végzett szisztematikus hidrolízissel kaptuk.

Az 5. ábrán XRP-ből származó TPO aktivitást mutatunk be a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben.

w

A 6. ábrán a pEF18S expressziós vektor összeállítását mutatjuk be.

A 7. ábrán COS1 sejtek (melyekbe pEF18S-A2alfa vektort vittünk be) tenyészetfelülúszójának TPO aktivitását mutatjuk be a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben.

A 8. ábrán COS1 sejtek (melyekbe pEF18S-HL34 vektort vittünk be) tenyészetfelülúszójának TPO aktivitását mutatjuk be a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben.

A 9. ábrán COS1 sejtek (melyekbe pHTl-231 vektort vittünk be) tenyészetfelülúszójának TPO aktivitását mutatjuk be a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben.

A 10/a ábrán C0S1 sejtek (melyekbe pHTl vektort vittünk be) tenyészetfelülúszójának TPO aktivitását mutatjuk be a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben.

A 10/b ábrán COS1 sejtek (melyekbe pHTl vektort vittünk be) tenyészetfelülúszójának TPO aktivitását mutatjuk be az M-07e vizsgálati rendszerben.

A 11. ábrán a lambdaHGTl klón restrikciós térképét és a pHGTl és pEFHGTE vektor összeállítását mutatjuk be (E: EcoRI, H: HindlII, S: Sáli).

A 12/A ábrán COS1 sejtek (melyekbe pEFHGTE vektort vittünk be) tenyészetfelülúszójának TPO aktivitását mutatjuk be a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben.

A 12/B ábrán COS1 sejtek (melyekbe pEFHGTE vektort vittünk be) tenyészetfelülúszójának TPO aktivitását mutatjuk be az

M-07e vizsgálati rendszerben.

A 13/A ábrán COS1 sejtek (melyekbe pHTl-211#l, pHTl-191#l vagy pHTl-171#2 vektort vittünk be) tenyészetfelülúszójának TPO aktivitását mutatjuk be a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben.

A 13/B ábrán COS1 sejtek (melyekbe pHTl-163#2 vektort ··· ·· ·· vittünk be) tenyészetfelülúszójának TPO aktivitását mutatjuk be a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben.

A 14. ábrán COS1 sejtek (melyekbe pHTl-211#l, pHTl-191#l, pHTl-171#2 vagy pHTl-163#2 vektort vittünk be) tenyészetfelülúszójának TPO aktivitását mutatjuk be az M-07e vizsgálati rendszerben.

A 15. ábrán CHO sejtek (melyekbe pDEF202-hTP0-Pl plazmidot vittünk be, és hagytuk bennük a TPO-t expresszálódni) felülúszójából származó humán TPO tisztítása érdekében végzett reverz fázisú kromatográfia (Vydac C4 oszlop) kromatogramját mutatjuk be.

A 16. ábrán CHO sejtek (melyekbe pDEF202-hTP0-Pl plazmidot vittünk be, és hagytuk bennük a TPO-t expresszálódni) felülúszójából tisztított humán TPO SDS-PAGE analízissel végzett elválasztásának eredményét mutatjuk be.

A 17. ábrán E. coli-tál (melybe pCFM536/h6T(1-163) plazmidot vittünk be, és amelyben hagytuk expresszálódni a TPO-t) származó humán TPO tisztítása érdekében végzett reverz fázisú kromatográfia kromatogramját mutatjuk be.

A 18. ábrán az E. coli-tál (melybe pCFM536/h6T(1-163) plazmidot vittünk be, és amelyben hagytuk expresszálódni a

TPO-t) izolált és tisztított h6T(l-163) humán TPO változat

SDS-PAGE analízissel végzett elválasztásának eredményét mutatjuk be.

A 19. ábrán a pDEF202-hTP0163 humán TPO expressziós plazmid CHO sejtekbe történő transzfekelójával előállított hTPO163 protein tenyészetfelülúszó kiindulási anyagból való tisztítása érdekében Superdex 75 pg oszlopon végzett elúciójának mintázatát mutatjuk be. A protein mennyiségét 220 nm-nél határoztuk meg.

A 20. ábrán a pDEF202-hTP0163 humán TPO expressziós plazmid CHO sejtekbe történő transzfekelójával ellőállított hTP0163 protein tenyészetfelülúszó kiindulási anyagból való tisztítása érdekében Superdex 75 pg oszlopról eluált standard hTP0163 SDS-PAGE analízisének eredményét mutatjuk be. A hPTP0163-at a gélen ezüsttel festettük.

A 21. ábrán a pSMT201 expressziós vektor szerkezetét mutatjuk be.

A 22. ábrán a C0S7 sejtek (melyekbe GGL-TPO-t, N3/TP0-t vagy 09/TP0-t vittünk be, majd azokat a sejtekben expresszáltuk) tenyészetfelülúszójában M-07e vizsgálattal meghatározott TPO aktivitást bemutató grafikon látható.

A 23. ábrán a C0S7 sejtek (melyekbe a humán TPO inszerciós vagy deléciós származékát vittük be) tenyészetfelülúszóiban M-07e vizsgálattal meghatározott TPO aktivitást bemutató grafikon látható.

- 19 A 24. ábrán intravénás vagy szubkután injekcióval beadott TPO-val kezelt egerek emelt vérlemezkeszámát mutatjuk be.

A 25. ábrán szubkután TPO injekcióval kezelt egerek vérlemezkeszámának dózisfüggő növekedését mutatjuk be.

A 26. ábrán egerekben trombocitopénia indukálása érdekében 5-FU-val végzett kezelést követően a TPO-val indukált vérlemezkeszám növekedést mutatjuk be.

A 27. ábrán egerekben trombocitopénia indukálása érdekében végzett nimusztin-hidrokloridos kezelést követően a TPO-val indukált vérlemezkeszám növekedést mutatjuk be.

A 28. ábrán trombocitopéniás egerekben a csontvelőátültetés utáni TPO-val indukált vérlemezkeszám növekedést mutatjuk be.

A 29. ábrán egerekben trombocitopénia indukálása érdekében végzett röntgensugárzásos kezelést követően TPO-val indukált vérlemezkeszám növekedést mutatjuk be.

A 30. ábrán csonkított TPO (a 6. számú szekvencia 1-163. aminosavaiból álló protein) beadását követő dózisfüggő vérlemezkeszám növekedést mutatjuk be.

A 31. ábrán a trombocitopénia indukálása érdekében nimusztin-hidrokloriddal végzett kezelést követően a csonkított TPO (a 6. számú szekvencia 1-163. aminosavaiból álló protein) beadásának hatására bekövetkező vérlemezkeszám növekedést mutatjuk be.

A 32. ábrán bemutatjuk, hogy a humán megakariocita tenyészethez adott növekvő koncentrációjú Mpl-X növekvő mértékben gátolja a megakariociták fejlődését.

A 33. ábrán E.	co.Z.í-ban expresszált [Met-2	, Lys-1,	Alá1,
Val3, Alg133]TP0(1-163), [Met-2,	Lys-1,	Alá1,	Val3,
Pro148jTPO(1-163)	és [Met-2,	Lys-1,	Alá1,	Val3,
Arg11B]TP0(1-163)	TPO származékok	M-07e	vizsgálattal

meghatározott TPO aktivitását mutatjuk be.

A 34. ábrán E. coli-ban expresszált [Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³, Alg^12S]TP0(1-163), [Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³, Arg¹⁴³]TP0(1-163), [Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³, Leu^S2]TP0(l163), [Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³, Leu¹⁴³]TP0(1-163) és [Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³, Arg°®]TP0(1-163) TPO származékok

M-07e vizsgálattal meghatározott TPO aktivitását mutatjuk be.

A találmány serkentő vagy polipeptidek, aminosavaiból tartalmazzák.

tárgya a vérlemezketermelést specifikusan fokozó biológiai aktivitású trombopoetin (TPO) amelyek a 6. számú szekvencia 1-332. álló szekvenciát vagy annak származékát

A jellemző polipeptidek közé tartoznak a 6.

számú szekvencia 1-163. aminosavaiból; a 6. számú szekvencia

- 21 1-232. aminosavaiból; a 6. számú szekvencia 1-151.

aminosavaiból álló polipeptidek; a 2., 4. és 6. számú szekvencia aminosavaiból álló érett szekvencia, köztük azok, amelyekből deléció folytán 1-6 N-terminális aminosav hiányzik. A találmány egyéb jellemző polipeptidjei közé tartozik a [Thr³³, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile^33B, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³³, Tyr³³®, Asp³⁴°, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala^34B, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴³, His³⁴®, His^3B1, His^3B2, His^3B3]TPO, [Asn^2B, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile^33B, Gly³³³, Tyr³³⁷, Pro³³³, Tyr³³®, Asp³⁴°, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala^34B, Gly³⁴³, Val³⁴⁷, His³⁴³, His³⁴®, His^3B1, His³⁵², His^3B3]TPO és a [Thr³³]TPO. A találmány szerinti egyéb polipeptidek közé tartoznak a [4His³³]TP0( 1-163), [4Arg¹¹⁷]TP0(1-163), [4Gly¹¹³]TP0(1-163), [His³³, Thr³³', Pro³⁴]TPO(1-163), [His³³, Alá³³', Pro³⁴]TPO(1-163), [His³³, Gly³³', Pro³⁴, Ser³³ ]TPO( 1-163), [Gly^⁶, Asn¹¹³',

Arg¹¹⁷]TPO(1-163), . [Gly¹¹³, Alá¹¹³', Arg¹¹⁷]TP0(l-163), [Gly¹¹³, Gly¹¹³*, Arg¹¹⁷]TPO(1-163), [Alá¹, Val³, Arg¹²®]TPO(1-163), [Alá¹, Val³, Arg¹³³]TPO(1-163), [Alá¹, Val³, Arg¹⁴³]TPO(1-163), [Alá¹, Val³, Leu³²]TPO(1-163), [Alá¹, Val³, Leu¹⁴³]TPO(1-163), [Alá¹, Val³, Pro¹⁴³]TPO(1-163), Alá¹, Val³, Arg^B®]TPO(1-163) és [Alá¹, Val³, Arg^11B]TPO(1-163) TPO polipeptid-származékok.

A találmány szerinti TPO polipeptidek közé tartoznak azon polipeptidek is, amelyek kovalens kötéssel polimerhez, előnyösen polietilén-glikolhos kapcsolódnak. A találmány szerinti polipeptidek továbbá tartalmazhatnak [Met^-2-Lys^-1],

- 22 [Met^-1] vagy [Gly^-1] aminosavakat is. A találmány szerinti DNS-ek közé tartoznak a fentebb leírt TPO polipeptidet és származékokat kódoló DNS-ek, s előnyösen cDNS, genom DNS és szintetikusan előállított DNS-ek formájában bocsátjuk rendelkezésre.

A találmány további tárgya eljárások a fentebb leírt TPO polipeptid előállítására, melynek során egy találmány szerinti DNS által kódolt polipeptidet megfelelő gazdában expresszálunk, és izoláljuk az említett TPO polipeptidet. Olyan esetekben, ha az expresszált TPO polipeptid Met^-2-Lys^-1 polipeptid, az eljárás magában foglalhatja a Met^-2-Lys^-1 aminosavak említett izolált TPO polipeptidről való lehasításának lépését is.

A találmány további tárgya eljárások TPO polipeptidek, mint például glutation-S-transzferáz (GST) fúziós polipeptidek előállítására. Az eljárás során polipeptidet, trombin felismerési polipeptidet kódoló DNS-t megfelelő gazdába viszünk, izoláljuk a fúziós polipeptidet, és a GST részt trombinos kezeléssel eltávolítjuk. A kapott polipeptidek [Gly^-1] szerkezetűek.

N-terminális GST peptidet és TPO

A találmány további tárgya prokarióta vagy eukarióta gazdasejtek, melyeket egy találmány szerinti DNS-szekvenciával oly módon transzformálunk vagy transzfektálunk, hogy a gazdasejt számára lehetővé tegyük a

vérlemezketermelést specifikusan serkentő vagy fokozó biológiai aktivitású polipeptid expresszálását.

A találmány szerinti gyógyszerészeti készítmények gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval együtt hatásos mennyiségű TPO polipeptidet vagy polipeptid-származékot tartalmaznak, és vérlemezke-rendellenességek, különösen trombocitopénia, mint például kemoterápiával, radioterápiával vagy csontvelőátültetéssel indukált trombocitopénia kezeléséhez alkalmazhatók. A megfelelő kezelési eljárások szintén a találmány tárgyát képezik.

A találmány további tárgya a fentebb leírt TPO polipeptidekkel és azok származékaival specifikusan immunreaktív antitestek. Az ilyen antitestek alkalmasak a találmány szerinti TPO polipeptidek izolálási és mennyiségi meghatározási eljárásaiban való felhasználásra.

A találmány értelmében TPO aktivitással rendelkező proteint kódoló új DNS-szekvenciát bocsátunk rendelkezésre (a továbbiakban a találmány szerinti DNS-szekvencia'*). A találmány szerinti DNS-szekvencia a szekvencialistában bemutatott 2., 4. vagy 6. számú szekvenciával rendelkező aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciát jelenti.

A találmány szerinti DNS-szekvencia fogalmába tartozik a 2., 4. vagy 6. számú szekvenciával rendelkező, fentebb említett aminosav-szekvencia részlegesen (szubsztitúcióval, delécióval, inszercióval vagy addícióval) módosított változatát kódoló DNS-szekvencia, azzal a feltétellel, hogy az említett módosítások nem károsítják a TPO aktivitást. Ilyenformán, a TPO származékokat kódoló DNS-szekvenciák szintén a találmány tárgyát képezik.

Más szavakkal, a találmány szerinti DNS-szekvenciák közé olyan DNS-szekvenciák tartoznak, amelyek olyan protein molekulákat kódolnak, melyek aminosav-szekvenciája lényegében megegyezik a 2., 4. vagy 6. számú szekvencia használt aminosavaminosav-szekvenciájával. Az itt szekvenciája lényegében megegyezik a 2., 4. vagy 6. számú szekvencia aminosav-szekvenciájával” kifejezés azt jelenti, hogy az említett aminosav-szekvenciák közé tartoznak a 2., 4. vagy 6. számú szekvenciával rendelkezők, valamint azon 2., 4. vagy 6. számú szekvenciákkal rendelkezők, melyek szekvenciájukban részleges módosításokat, mint például szubsztitúciót, deléciót, inszerciót, addíciót vagy hasonlót tartalmaznak, feltéve, hogy az ilyen módosítások nem károsítják a TPO aktivitást.

A találmány szerinti DNS-szekvencia alapjában véve olyan DNS-szekvenciából áll, amely TPO aktivitással rendelkező proteint kódol.

Az aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvencia kifejezés valamennyi olyan DNS-szekvenciára vonatkozik, amely nukleotid-szekvenciájában degeneráltságot tartalmazhat.

• ·

- 25 A találmány szerinti DNS-szekvenciák közé tartoznak az alábbi szekvenciák is:

(a) a 7., 194., 195. és 196. számú szekvenciával rendelkező DNS-szekvenciák, vagy ezek komplementer szálai;

(b) szigorú feltételek . között az (a) pontban meghatározott DNS-szekvenciákkal hibridizáló DNS-szekvenciák vagy ezek fragmensei; vagy (c) Az (a) és (b) pontban meghatározott DNS-szekvenciákkal a genetikai kód degeneráltsága miatt hibridizáló DNS-szekvenciák.

Más szavakkal, a találmány szerinti DNS-szekvenciák közé tartoznak az alábbi szekvenciák is:

(a) DH5 E. coli törzs által hordozott pEF18S-A2alfa vektorba (deponálási szám: FERM BP-4565); DH5 E. coli törzs által hordozott pHTl-231 vektorba (deponálási szám: FERM BP-4564); DH5 E. coll törzs által hordozott pHTFl vektorba (deponálási szám: FERM BP-4617); DH5 E. coli törzs által hordozott pHGTl vektorba (deponálási szám: FERM BP-4616), foglalt DNS-szekvencia, amely egy TPO aktivitással rendelkező protein aminosav-szekvenciáját kódolja; vagy (b) az (a) pontban meghatározott DNS-szekvenciákkal vagy azok fragmenseivel (szigorú körülmények között) hibridizáló DNS-szekvenciák, melyek egy TPO aktivitású protein aminosavszekvenc iáját kódolják.

Az említett szigorú hibridizációs körülmények a találmány szerinti DNS-ek degenerált és/vagy egyedi szekvenciájú oligonukleotid primerek (próbák) alkalmazásával történő PCR amplifikálását leíró példákban alkalmazott körülményeket jelentik. Ld. pl.: Sambrook és mtsi.: Molecular Cloning, 11. és 14. fejezet, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989; és Ausubel és mtsi (szerk.), Current Protocols in Molecular Biology, 2.10 szakasz (unit), Current Protocols, USA, 1993.

A találmány szerinti DNS-szekvenciák közé tartozik a TPO aktivitású proteint kódoló DNS-szekvencia, amely a 6. számú szekvencia 1-163. aminosavait kódoló nukleotid-szekvenciát foglalja magában.

Az Ilyen DNS-szekvenciák a szekvenciák elején, végén vagy közbenső részén restrikciós enzimes hasítási helyekkel és/vagy további DNS-szekvenciákkal egészíthetők ki, melyek könnyen expresszálható vektorok előállítását segítik elő. Nem emlős gazda alkalmazása esetén a DNS-szekvenciába a gazdában történő génexpresszióhoz előnyös kodonokat foglalhatunk.

A találmány szerinti DNS-szekvenciák egy példája olyan cDNS molekula, amelyet úgy nyerünk, hogy emlősből (beleértve az embert) származó sejtekből mRNS-t készítünk, majd a cDNS-t ismert módszerekkel előállított cDNS könyvtárban screeneljük. Ebben az esetben az mRNS forrásaiként a patkány-máj sejt-eredetű McA-RH8994 sejtvonal sejtjei, HTC sejtek, H4-II-E sejtek, patkánymáj, vese, agy és vékonybél, emberi máj és hasonlók szolgálnak.

A találmány szerinti DNS-szekvenciák másik példája genom DNS, melyet emlősökből (beleértve az embert) származó sejtekből ismert módszerekkel készített genomkönyvtár hagyományos módon végzett screenelésével kapunk. Ebben az esetben a genom DNS forrásai közé emberből, patkányból, egérből és hasonlókból származó kromoszómális DNS készítmények tartoznak.

TPO származékot kódoló DNS-szekvenciát a fenti módon kapott, TPO aktivitású proteint kódoló cDNS-szekvenciából annak ismert, helyre irányuló mutagenezis alkalmazásával végzett módosításával nyerhetünk, miáltal a megfelelő aminosav-szekvencia részleges módosítását valósítjuk meg.

A találmány szerinti, TPO aktivitással rendelkező protein aminosav-szekvenciájának vagy DNS-szekvenciájának ismeretében a részlegesen módosított aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvencia kémiai szintézissel könnyen előállítható.

A találmány szerinti DNS-szekvencia alkalmas TPO aktivitással rendelkező protein különböző rekombináns DNStechnikák alkalmazásával nagy tömegben való előállításához.

A találmány szerinti DNS-szekvencia jelölt próbaként TPO-val rokon proteint kódoló gén izolálásához, illetve egyéb emlős fajok TPO-ját kódoló cDNS-ként és genom DNS-ként szintén alkalmazható, alkalmas továbbá emberek és egyéb emlős fajok génterápiájához. A találmány szerinti DNS-szekvencia ráadásul transzgénikus emlős fajok kifejlesztéséhez is alkalmas, melyek eukarióta gazdaként a TPO nagy mennyiségű előállításához alkalmazhatók (Palmiter és mtsi, Science,

222, 809-814, 1983).

A találmány további tárgya olyan vektor, amelybe a fentebb említett, TPO aktivitású proteint kódoló DNS-szekvenciát építettük be, továbbá az említett vektorral transzformált gazdasejtek, valamint eljárás TPO aktivitással rendelkező protein előállítására, amely az említett gazdasejtek tenyésztéséből és az expresszált TPO aktivitású protein elválasztásából és tisztításából áll.

Az ebben az esetben alkalmas gazdasejtek példái közé prokarióta sejtek, mint például E. coli sejtek és hasonlók, valamint eukarióta sejtek, .mint például élesztősejtek, rovarsejtek, emlőssejtek és hasonlók tartoznak. Az emlőssejtek jellemző példái közé tartoznak a COS sejtek, kínai (Chinese) hörcsög petefészek (CHO) sejtek, C-127 sejtek, fiatal hörcsög vese (BHK) sejtek és hasonlók. Az élesztők jellemző példái a sütőélesztő (Saccharomyces cerevisiae), metanolos asszimilációjú élesztő (Pichia pastoris) és hasonlók. A rovarsejtek jellemő példái a selyemhernyó tenyésztett sejtjei és hasonlók.

A fenti gazdasejtek transzformálásához alkalmazható vektorokat illetően a pKC30 (Shimatake H. és M. Rosenberg, Natúré, 292. 128-132, 1981), pTrc99A (Amman E. és mtsi., Gene, £3, 301-315, 1988) és hasonló vektorok az E. coli sejtek transzformálásához alkalmazhatók. Emlős sejtek transzformálásához pSV2-neo (Southern és Berg, J. Mól. Appl. Génét., 1, 327-341, 1982), pCAGGS (Niwa és mtsi, Gene, 1Q£, 193-200, 1991), pcDL-SRalfa296 (Takebe és mtsi, Mól. Cell. Bioi., £, 466-472, 1988) vagy hasonlók alkalmazhatók. Élesztősejtekhez pG-1 (Schena M. és Yamamoto K.R., Science, 241. 965-967, 1988) vagy hasonló alkalmazható. Selyemhernyósejtek transzformálásához rekombináns víruskonstrukcióhoz való transzfervektorként például pAc373 (Luckow és mtsi, Bio/Technology, £, 47-55, 1988) alkalmazható.

Az adott helyzettől függően ezen vektorok mindegyike tartalmazhat replikációs kezdőhelyet, szelekciós markért eke)t, promotert, stb., illetve eukarióta sejtekben való alkalmazáshoz RNS splicing helyet, poliadenilációs jelet, stb.

Emlőssejtekhez való vektorokban replikációs kezdőhelyként például SV40-ből, adenovírusből, szarvasmarha papilloma vírusból vagy hasonlókból származó szekvencia alkalmazható. E. coli sejtekhez való vektorokban ColEl-ből, R faktorból, F faktorból származó vagy hasonló szekvencia alkalmazható. Élesztősejtekhez való vektorokban 2 pun DNS-ből, ARSl-ből vagy hasonlókból származó szekvencia alkalmazható.

- 30 A génexpresszió promotereiként emlőssejtekhez való vektorokban például retrovírusból, polioma vírusból, adenovírusból, SV40-ből és hasonlókból származó promoterek alkalmazhatók. E. coli sejtekhez való vektorokban lambda fágból származó promoter, például a trp, lpp, lac, vagy tac promoter alkalmazható. Sütőélesztő-sejtekhez való vektorokban ADH, PH05, GDP, PGK vagy MAFalfa promoter, metanolos asszimiléciójú élesztősejtekhez való vektorokban pedig A0X1 vagy hasonló promoter alkalmazható. Selyemhernyó-sejtekhez való vektorokban sejtmagi polihedrózis vírusból származó promoter alkalmazható.

Az emlőssejtekhez való vektorokban alkalmazható szelekciós markerek jellemző példái a neomicin-(neo)-rezisztencia gén, timidin kináz (TK) gén, dihidrofolát reduktáz (DNFR) gén, E. coli xantin-guanin foszforibozil-transzferáz (Ecogpt) gén és hasonlók. A E. coli sejtekhez való vektorokban alkalmazható szelekciós markerek jellemző példái a kanamicin-rezisztencia gén, ampicillin-rezisztencia gén, tetraciklin-rezisztencia gén és hasonlók, az élesztősejtekhez alkalmas szelekciós markerek közé pedig a Leu2, Trpl, Ura3 és hasonló gének tartoznak.

TPO aktivitással rendelkező proteint a fentiekben leírt gazda-vektor rendszerek megfelelő kombinációinak alkalmazásával úgy állítunk elő, hogy alkalmas gazdasejteket a találmány szerinti gén fentebb említett vektor alkalmas helyére való inszertálásával kapott rekombináns DNS-sel ··· ««

-31transzformálunk, a kapott transzformánsokat tenyésztjük, majd a képződött sejtekből vagy tenyésztő tápközegből (vagy szűrletéből) elkülönítjük és tisztítjuk a szóban forgó polipeptidet. Ehhez az eljáráshoz általánosan használt módszerek alkalmazhatók.

A szóban forgó gén expresszálásakor az eredeti jelzőszekvenciát módosíthatjuk vagy egy másik proteinből származó jelzőszekvenciával helyettesíthetjük, annak érdekében, hogy az expresszált termék homogén Nterminálisát kapjuk. Az N-terminális homogenizélása az Nterminális szakasz (vagy közelébe eső) aminosav-gyökeinek módosításával (szubsztitúciójával vagy addíciójával) végezhető. Gazdasejtként E. coli alkalmazásával végzett expresszió esetében a szekvenciát metionin-gyökön kívül lizin-gyökkel is kiegészíthetjük.

A találmány szerinti TPO aktivitással rendelkező új proteinek (a továbbiakban a találmány szerinti proteinek) közé olyan proteinek tartoznak, amelyek mindegyike a 2., 4. vagy 6. számú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza. Azok a TPO származékok, amelyek aminosav-szekvenciáját (szubsztitúcióval, delécióval, inszercióval vagy addícióval) részlegesen módosítottuk, szintén a találmány tárgyát képezik, feltéve, hogy az említett módosítások nem károsítják a TPO aktivitást.

Más szavakkal, a találmány szerinti proteinek közé azok a »··· ·· • * protein molekulák tartoznak, amelyek aminosav szekvenciái lényegében megegyeznek a 2., 4. vagy 6. számú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciákkal.

A 2., 4. vagy 6. számú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciával lényegében megegyező aminosavszekvenciák kifejezés azt jelenti, hogy az említett aminosav-szekvenciák közé tartoznak a 2., 4. vagy 6. számú szekvenciában bemutatottak, valamint a 2., 4. vagy 6. számú szekvenciában bemutatott, részleges módosítást (mint például szubsztitúciót, deléciót, inszerciót, addíciót és hasonlót) tartalmazó szekvenciák, feltéve, hogy az említett módosítások nem károsítják a TPO aktivitást.

A találmány szerinti proteinek közé tartozik a 6. számú szekvencia 7-151. aminosavait tartalmazó, TPO aktivitású protein. Szintén a találmány szerinti proteinek közé tartozik a 6. számú szekvencia 1-163. aminosavait tartalmazó, TPO aktivitású protein.

A találmány szerinti egyéb TPO származékok példái közé tartozik egy olyan származék, amelynek in vivő stabilitását és tartósságát aminosav-módosítással (szubsztitúcióval, delécióval, inszercióval vagy addícióval) fokoztuk; egy olyan származék, melyben legalább egy lehetséges glikozilálási helyet delécióval vagy addícióval megváltoztattunk; valamint egy olyan származék melyben legalább egy cisztein-gyököt deletálunk vagy más aminosav·♦ ·· ·.

• ♦ · · ,

- 33 gyökkel (például alaninnal vagy szerinnel) helyettesítettünk.

A találmány szerinti proteinre előnyösen az jellemző, hogy cDNS molekulát, genom DNS molekulát vagy kémiai szintézissel előállított DNS-fragmenst tartalmazó rekombináns vektorral transzformált gazdasejtekből különítjük el és tisztítjuk.

Ha intracelluláris expressziót gazdaként baktérium, mint például E. coli alkalmazásával végzünk, olyan proteint kapunk, melyben a TPO aktivitású protein molekula Nterminális végéhez kezdő metionin-gyök kapcsolódik, s az így kapott protein szintén a találmány tárgyát képezi. Az alkalmazott gazdától függően az előállított TPO aktivitású protein lehet glikozilált vagy glikozilálatlan, s ezen proteinek mindegyike a találmány szerinti proteinek közé tartozik.

A találmány szerinti proteinek közé tartoznak továbbá a természetes forrásokból, mint például TPO aktivitással rendelkező sejttenyészeti tápközegből vagy emberi vizeletből, szérumból és vérplazmából tisztított és izolált, természetesen előforduló TPO-aktív proteinek.

Az említett természetes forrásokból származó TPO tisztítási eljárása szintén a találmány tárgyát képezi. Az ilyen tisztítási eljárás az általánosan alkalmazott proteintisztítási lépések valamelyikének vagy azok kombinációjának alkalmazásával valósítható meg; ilyenek az •••I. • · • · · *· ·* ·· *

·· ioncserélő kromatográfia, lektin-affinitás kromatográfia, triazin festék-affinitás kromatográfia, hidrofób kölcsönhatási kromatográfia, gélfiltrációs kromatográfia, reverz fázisú kormatográfia, heparin-affinitás kromatográfia, szulfátéit gélkromatográfia, hidroxilapatit kromatográfia, izoelektromos fókuszálásos kromatográfia, fém kelátkomplexképzési kromatográfia, preparatív elektroforézis, izoelektromos fókuszálásos gélelektroforézis és hasonlók. A

TPO találmányban leírt példákból levezethető fiziko-kémiai tulajdonságait felhasználva bizonyos technikák együttes alkalmazásával végzett tisztítási eljárás szintén a találmány tárgykörébe tartozik. A fentieken kívül antitest-affinitás kromatográfiát is alkalmazhatunk, melyhez TPO-t felismerni képes antitestet haszálunk. Kimutatták, hogy a TPO az Mpl liganduma (de Sauvage és mtsi, Natúré, 369. 533-538, 1994; Bartley és mtsi, Cell, 22, 1117-1124,

1994; Kaushansky és mtsi, Natúré, 369, 565-568, 1994), melynek segítségével a TPO olyan affinitásl géloszlop felhasználásává tisztítható, amelyben az Mpl a gyantához kapcsolódik. Közelebbről, az ilyen oszlop egyik példája egy Mpl-X oszlop, melyet úgy állítunk elő, hogy a gyantát az Mpl (gazdaként CHO sejtek alkalmazásával rekombináns DNStechnikákkal előállított) extracelluláris régiójához (Mpl-X) (Bartley és mtsi, 1994, ld. fentebb) kapcsoljuk.

A találmány szerinti TPO polipeptidek további jellemzője az Mpl receptorhoz, és specifikusan annak extracelluláris (szolubilis) doménjéhez való kötődési képességük.

···· ·· «··· «· ·· • · · · · ·« · . · · · · · ·· ·· *··· ’··* *·· <»*

A találmány további tárgya olyan protein, nevezetesen egy komplementer fordított protein (complementary inverted protein), melyet a TPO gén humán cDNS- vagy genom DNSszekvenc iájának proteint kódoló szálával komplementer DNS szál kódol (Tramontano és mtsi, Nucl. Acids Rés., 12, 5049-5059, 1984).

A találmány további tárgya egy találmány szerinti, detektálható markerrel (pl. ^12BI-izotóppal vagy biotinilálással) jelölt protein, ami lehetséges reagenst biztosít a TPO vagy TPO receptor-expresszáló sejtek szilárd mintákban (mint pl. szövetekben) és folyékony mintákban (mint pl. vérben, vizeletben és hasonlókban) történő kimutatásához és mennyiségi meghatározásához.

A találmány szerinti biotinilált protein autogén csontvelőátültetéskor a megakariociték csontvelőből történő eltávolítása érdekében immobilizált sztreptavidinhez való kapcsolása esetében, valamint autogén és allogén csontvelőátültetéskor az autogén vagy allogén megakariociták koncentrálása érdekében immobilizált sztreptavidinhez való kapcsolása esetében hasznos. A TPO toxinnal, például diftéria toxinnal vagy hasonlóval, valamint izotóppal való ricinnel, radioaktív terápiában konjugálása tumorellenes vagy csontvelőátületés érdekében végzett kondicionáláshoz alkalmazható.

A találmány további tárgya nukleinsav anyag, amely olyan ···· ·· .... ·. ..

·· ···· *·· *·.* esetben hasznos, ha detektálható markerrel, például radioaktív markerrel vagy nem radioaktív markerrel, pl. biotinnal jelöltük, vagy ha kromoszómatérképen a humán TPO gén és/vagy rokon géncsaládjának elhelyezkedésének kimutatásához hibridizációs eljárásban alkalmazzuk. Az ilyen anyag humán TPO génnel kapcsolatos rendellenességek DNS szintjén való igazolásában hasznos, és szomszédos génjeik és rendellenességeik bizonyításához való genetikai markerként alkalmazható.

A találmány további tárgya gyógyszerészeti készítmény, amely hasznos és hatásos diluenssel, antiszeptikus szerrel, szolubilizáló szerrel, emulgeátorral, adjuvánssal és/vagy vivőanyaggal együtt gyógyászatilag hatásos mennyiségű találmány szerinti proteint tartalmaz. Az itt használt gyógyászatilag hatásos mennyiség kifejezés olyan mennyiséget jelent, amely meghatározott állapotokhoz és azok kezeléséhez megállapított beadási módokhoz megfelelő gyógyászati hatást biztosít. E készítményeket folyadék, fagyasztva szárított vagy száraz készítményként alkalmazzuk, s tartalmaznak diluenst (például különböző pH-értékkel és ionerősséggel rendelkező puffereket, mint pl. Tris-HCl, foszfát-puffért); felületi adszorpciót adalékanyagot, mint pl. albumint vagy zselatint; felületaktív anyagot, mint pl. Tween 20-at, Tween 80-at, Pluronic F68-at vagy epesav sót; szolubilizáló szert, acetát- és megakadályozó mint pl. glicerint vagy polietilén-glikolt; antioxidánst, mint pl. aszkorbinsavat vagy nátrium-metabiszulfitot;

antiszeptikus anyagot, mint pl. timerozált, benzil-alkoholt vagy parabént; és vivőanyagot vagy tonizáló szert, pl. laktózt vagy mannitot. Olyan készítményt is alkalmazunk, amely a találmány szerinti proteint polimerhez, mint pl. polietilén-glikolhoz kovalens kötéssel kapcsolva tartalmazza; amelyben a protein fémionokkal kelátkomplexet képez; amelyben a protein szemcsés készítménybe ágyazódik; amely felületén polimer vegyületet, mint pl. politejeavat, poliglikolsavat vagy hidrogélt tartalmaz; vagy amelyben a protein liposzómákban, mikroemluzióban, micellákban, egyvagy többrétegű vezikulákban vagy szferoplasztokban helyezkedik el. Ezek a készítmények befolyásolják a TPO fizikai állapotát, oldékonyságát, stabilitását, In vivő kibocsátási sebességét és in vivő clearance-ét. A készítményt az alkalmazott TPO aktivitású protein fizikai és kémiai tulajdonságai alapján választjuk ki. A találmány további tárgya szemcsés készítmények, melyekben a szemcsék polimerrel, mint pl. poloxamerrel vagy poloxaminnal és TPOval vannak bevonva, mely utóbbi szövetspecifikus receptorok, ligandumok vagy antigének elleni antitestekhez vagy szövetspecifikus receptor ligandumokhoz kötődik. A találmány szerinti készítmények egyéb példái a védőbevonattal ellátott szemcsékből álló készítmények, melyek proteáz-inhibitort vagy penetrációt fokozó szert tartalmaznak, s amelyek különböző beadási módokon, mint pl. parenterálisan, tüdőn, orron vagy szájon keresztül alkalmazhatók.

A találmány szerinti proteint tartalmazó gyógyszerészeti • · ··

- 38 készítmények naponta több alkalommal, rendszerint a páciens állapotától és nemétől, a beadási módtól és hasonlóktól függően (TPO proteinre megadva) 0,05 jjg/testtömeg-kilogramm és 1 mg/testtömeg-kilogramm közötti mennyiségben adhatók be.

A találmány szerinti proteint tartalmazó gyógyszerészeti készítmények a tünetektől, a páciens nemétől és a beadási módtól függően az aktív hatóanyagot a későbbiekben leírt M-07e vizsgálat alapján 25 000 - 500 000 000 relatív aktivitással rendelkező aktív hatóanyag/testtömeg-kilogramm mennyiségben tartalmazó dózisban napi egyszeri vagy töbszöri alkalommal, hetente 1-7-szer adhatók be.

Kimutattuk, hogy a humán TPO aktivitása akkor is megmarad, ha az aminosav-gyököket (C-terminálisát illetően) a 6. számú szekvencia 152. aminosaváig deletáljuk, és ha (Nterminálisát illetően) az aminosavakat az aminosavszekvencia 6. aminosaváig deletáljuk.

Ennek megfelelően, a 6. számú szekvencia 7-151. aminosavaiból álló szekvenciát tartalmazó, és más részeiben (szubsztitúcióval, delécióval, inszercióval vagy addícióval) módosított, TPO aktivitású protein szintén előnyösen alkalmazható a találmány szerinti aktív hatóanyagként. Még előnyösebb TPO származék a 6. számú szekvencia 1-163. aminosaival rendelkező polipeptid.

Szintén a találmány tárgykörébe tartoznak azok a

- 39 készítmények, amelyek a találmány szerinti protein mellett tartalmaznak még legalább egy másik vérképzési faktort is, mint pl. EPO-t, G-CSF-et, GM-CSF-et, M-CSF-et, IL-l-et, IL-2-t, IL-3-at, IL-4-et, IL-5-öt, IL-6-ot, IL-7-et, IL-8-at, IL-9-et, IL-10-et, IL-ll-et, IL-12-t, IL-13-at, LIF-et vagy SCF-et.

A találmány szerinti protein önmagában vagy más vérképzési faktorokkal együtt hasznos a különböző tromocitopéniás betegségek kezelésében. Az egyéb vérképzési faktorok példái az EPO-, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5,

IL-6,, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF és

SCF.

Sok olyan vérlemezke-rendellenesség létezik, mint pl. a vérlemezketermelődés károsodásának vagy a vérlemezkék élettartama csökkenésének (amit a vérlemezkék lebomlása vagy elhasználódása okoz) köszönhető trombocitopénia, amely kezelhető a találmány szerinti proteinnel. A találmány szerinti protein például öröklött Fanconi anémia vagy kemoterápiával vagy sugárkezeléssel okozott aplasztikus anémia, gerincfejlődési zavar, akut velősejtes leukémia vagy csontvelőátültetés utáni aplasztikus krízis által indukált trombocitopéniában szenvedő páciensben a vérlemezkék helyreállításának fokozására alkalmazható, alkalmas továbbá a TPO csökkent termelődése által okozott trombocitopénia kezelésére is. A vérlemezkék vagy megakariociták csökkent élettartamának köszönhető trombocitopénia az idiopatikus

- 40 trombocitopéniás purpura, a hipoplasztikus anémia, a szerzett immundeficiencia szindróma (AIDS), a disszeminált intravaszkuláris koagulálódási szindróma és a trombózisos trombocitopénia. A találmány szerinti protein a vérlemezkék autotranszfúziója esetében is hasznos, melynek során a TPO-t a műtét előtt adjuk be a páciensének, hogy fokozzuk a páciens saját vérlemezkéinek számát, és az így növelt mennyiségű vérlemezkéket az operáció Idején transzfúziós vérlemezkékként alkalmazzuk.

A találmány szerinti protein egy másik alkalmazási lehetősége a vérlemezkék más vegyszerek, gyógyszerészeti hatóanyagok vagy gyógykezelések által okozott ideiglenes eltűnéséből vagy károsodásából eredő betegségek kezelése. A TPO az ilyen betegekben az új “intakt vérlemezkék felszabadulásának fokozása céljából alkalmazható.

A találmány további tárgya TPO-ra specifikus antitest. A találmány szerinti protein antigénként alkalmazható, és a megfelelő antitestek közé monoklonális, poliklonális és kiméra antitestek, nevezetesen rekombináns antitestek tartoznak, melyeket hagyományos módszerekkel állítunk elő. Ilyen anti-TPO antitestek előállításához antigénként humán TPO-t, vagy más módon, a humán TPO egy részéből álló peptidet alkalmazhatunk. Ha ilyen peptid antigén elleni antitestet alkalmazunk, az epitópot az antigén-régió specifikálásával határozhatjuk meg. Ha azonban az antigén antitestet alkalmazunk, az protein elleni (TPO) • · ·· ·· ·· antigén-régiót az antitest epitőpjának analizálásával határozhatjuk meg. Ilyen esetekben az így meghatározott epitóppal rendelkező antitesteket az egymástól például hozzáadott cukorláncaik fajtájában, peptidláncuk hosszúságában, stb. különböző TPO-k frakcionálásához, detektálásához, mennyiségi meghatározásához és tisztításához alkalmazhatjuk.

Olyan TPO peptidet szintetizálunk, amely az így kiválasztott aminosav-szekvenciát tartalmazza, s a peptidet megfelelő hordozó proteinhez kapcsoljuk, például albuminhoz, KLH-hoz (keyhole limpet hemocianin) vagy hasonlóhoz. Más lehetőség szerint, antigénként Tam módszerével összetett antigén peptid (MAP) típusba tartozó peptidet állítunk elő (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), fiü, 5409-5413, 1988). Az így létrehozott antigénnel (adjuvánssal vagy hasonlóval együtt) emlősöket, madarakat, például nyulakat, egereket, patkányokat, kecskéket, juhokat, csirkéket, hörcsögöket, lovakat, tengerimalacokat, stb. immunizálunk, hogy antitesteket termeljenek. Az Immunizált állatokból antiszérumot és sejteket veszünk, melyekből poliklonális antitestet nyerünk. Ha antigénként peptidet alkalmazunk, az epitóp az antigén-régió specifikálásával határozható meg. Ebben az esetben a különböző TPO molekulák különböző molekulátömegü régióit screeneljük és immunológiai módszerekkel azonosítjuk. Például peptid-deletált régiót screenelhetünk és azonosíthatunk. A kívánt antitestet expresszáló sejtekből antitest gént vagy génszakaszt klónozunk, hogy antitestmolekulát kapjunk, melyet génsebészeti módszerekkel expresszálunk.

A monoklonális antitest egy antigén egyetlen antigénhatású determinánsára specifikus, ellentétben a poliklonális antitesttel, amely általában különböző antigénhatású determinánsokra specifikus különböző antitestekből áll. A TPO-specifikus antitest alkalmas az antigén-antitest reakció segítségével végzett diagnózis és az analitikai vizsgálati eljárás szelektivitásának és specifitásának fokozására, valamint a TPO elválasztásának és tisztításának megvalósítására. Az ilyen antitestek továbbá a TPO szérumban való semlegesítéséhez vagy szérumból történő eltávolításához is alkalmazhatók. A monoklonális antitestek szintén alkalmasak a TPO kimutatására és mennyiségi meghatározására, például teljes vér szérumában.

módszerekkel affinitás

A találmány szerinti, humán TPO elleni antitest humán TPO tisztítása vagy izolálása érdekében végzett affinitás kromatográfiában ligandumként alkalmazható. Az antitestet a különböző enzimek rögzítéséhez alkalmazott hagyományos rögzíthetjük, hogy alkalmassá tegyük az kromatográfiában való felhasználásra.

Alkalmazhatunk például CNBr-dal aktivált Sepharose 4B hordozót (melyet a Pharmacia Fine Chemicals Co. gyárt) vagy hasonlót. A humán TPO rögzített anti-humán TPO antitest alkalmazásával történő tisztításához a rögzített anti-humán TPO antitestet egy oszlopba töltjük, és a humán TPO-t • ·♦ · tartalmazó folyadékot átengedjük az oszlopon. Ezen eljárással az oszlopban lévő hordozón nagy mennyiségű humán TPO adszorbeálódik. Az eluáláshoz oldószerként például glicin-HCl puffer (pH = 2,5), nátrium-klorid oldat, propionsav, dioxán, etilén-glikol, kaotróp só, guanidin-hidroklorid, karbamid, stb. alkalmazható. Ilyen oldszóerekkel végzett elúcióval nagy tisztaságú humán TPO eluálódik.

A találmány szerinti antitest humán TPO immunkémiai kvantitatív vizsgálattal, különösen szilárd fázisú réteges eljárással végzendő enzimes immunvizsgálattal történő meghatározásához is alkalmazható.

A monoklonális antitestek előnye, hogy hibridomasejtekkel olyan közegben termeltethetők, amely nem tartalmaz semmilyen más immunglobulin molekulát. A monoklonális antitestek hibridomasejtek tenyészetfelülúszójából vagy egerekben hibridomasejtek intraperitoneális injektálásával indukált hasvízből állíthatók elő. Az eredetileg Kohler és Milstein (Eur. J. Immunoi., fi, 511-519, 1976) által leírt hibridoma technika széles körben alkalmazható olyan hibrid sejtvonalak kialakításához, melyek számos specifikus antigén ellen nagy mennyiségű monoklonális antitesttel rendelkeznek.

A kívánt antitest fenti módon kapott antitest-tartalmú anyagból (pl. antiszérumból, stb.) történő izolálásához egy vagy több, proteinek tisztításához általánosan alkalmazott • ·

- 44 eljárást alkalmazhatunk, mint például affinitás kromatográfiát, pl. A protein-affinitás kromatográfiát, G protein-affinitás kromatográfiát, Avid gélkromatográfiát, anti-lmmunglobulin-rögzített gélkromatográfiát, stb.;

valamint kationcserélő kromatográfiát, anioncserélő kromatográfiát, lektin-affinitás kromatográfiát, festék adszorpciós kromatográfiát, hidrofób kölcsönhatási kromatográfiát, géláteresztési kromatográfiát, reverz fázisú kromatográfiát, hidroxcil-apatit kromatográfiát, fluorapatit kromatográfiát, fém kromatográfiát, izoelektromos megoszlási elektroforézist, stb.

antigén-affinitás tisztítási módszert is alkalmazhatunk, melynek során gél hordozót vagy membránt készítünk, melyhez kémiai kötéssel humán TPO proteint vagy az antigén-régióját vagy annak egy részét tartalmazó pepiidet, vagyis egy olyan molekulát kapcsolunk, amely képes felismerni a megcélzott antitestet, majd antitestet tartalmazó anyagot adunk hozzá, miáltal a megcélzott antitest a hordozón vagy membránon adszorbeálódik, s az így adszorbeált antitestet eluáljuk és alkalmas körülmények között kinyerjük.

ke1átkomplex-képzé s i pont kromatográfiát,

A fentieken kívül

A találmányban a polipeptidek nagy mennyiségű előállításához TPO polipeptidet kódoló exogén DNS-szekvenciákat is alkalmazhatunk. A polipeptidek expresszálásának vagy fokozott expresszálásának biztosítása érdekében a gazdasejtek transzformálásához például in vitro vagy ex vivő homológ rekombinációs eljárásokat alkalmazhatunk. Az • ·

- 45 előnyben részesített gazdasejtek közé tartoznak az emberi sejtek (pl. májsejtek, csontvelősejtek és hasonlók), melyekbe a celluláris genomban lévő target régióval homológ szegélyező szekvenciák alkalmazásával promoter vagy enhancer szekvenciát inszertálunk, ami a TPO polipeptid expresszióját, illetve fokozott expresszióját eredményezi; ld. pl. 5 272 071 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalom (PCT WO 90/14092, W0 91/06666 és W0 91/09955).

A találmány további tárgya eljárások a fentebb leírt TPO polipeptid előállítására, melyek a találmány szerinti DNS által kódolt polipeptid megfelelő gazdában történő expresszálásából és az említett TPO polipeptid izolálásából állnak. Amennyiben az expreszált TPO polipeptid Met^-2-Lys^-1 polipeptid, az említett eljárások egy további lépést is magukban foglalhatnak, melyben az említett izolált TPO polipeptidről lehasítjuk a Met~²-Lys^-1 részt.

A találmány további tárgya eljárások [Gly^-1] szerkezettel rendelkező TPO polipeptidek előállítására, melyek során a TPO polipeptidet kódoló szekvenciáktól 5' irányban elhelyezkedő, glutation-S-transzferázt kódoló DNS-t megfelelő gazdába juttatjuk, a GST és TPO polipeptidet kódoló szekvenciákat trombint felismerő polipeptidet kódoló DNS-sel választjuk el, izoláljuk a GST-TPO expressziós terméket, és az expresszált polipeptidet a GST aminosavak eltávolítása érdekében trombinnal kezeljük. A kapott TPO polipeptidek [Gly^-1] szerkezettel rendelkeznek.

• ·

- 46 Az alábbiakban a találmány részletes leírása következik.

(A) Patkány_TPO_tisztítása,_a_tisztított_patkány_IEQ részleges aminosav-szekvenciáinak_és_a tisztított patkány

TPO biológiai .ielisinzőinsk· .vizsgálata

Elsőként olyan proteint (patkány TPO) szándékoztunk tisztítani, amely a patkány CFU-MK proliferáciőját és differenciálódását fokozó aktivitással rendelkezik. A tisztítási vizsgálatban a különböző természetes források, a kromatografálásokhoz alkalmas gélek és az elválasztási módszerek kiválasztásához sok kísérletet és hibakutatást végeztünk. Végül röntgensugárzással vagy gammasugárzással indukált trombocitopéniában szenvedő patkányok vérplazmájából (a későbbiekben a hivatkozási példában leírt patkány CFU-MK vizsgálat alapján markerként TPO aktivitás alkalmazásával) sikerült TPO aktivitással rendelkező proteint tisztítani, illetve meghatározni a tisztított protein részleges aminosav-szekvenciáját (1. és 2. példa).

A vérplazma-eredetű patkány TPO biológiai tulajdonságainak vizsgálatát a 3. példában írjuk le.

A következőkben a patkány TPO tisztítását és a tisztított protein részleges aminosav-szekvenciájának meghatározását foglaljuk össze.

(i) Körülbelül 1100, röntgensugárzással vagy gamma- 47 «··« * · · • · · · ·· ♦«·· ·« sugárzással indukált trombocitopéniában szenvedő patkányból vérplazma mintát készítettünk, amelyet egymás után Sephadex G-25 kromatográfiával, anioncserélő kromatográfiával (QSepharose FF) és lektin kromatográfiával (WGA-Agarose) kezeltünk, miáltal WGA-Agarose-on adszorbeált TPO-aktív frakciót kaptunk.

(ii) A WGA-Agarose-on adszorbeált TPO-aktív frakciót egymás után triazinfesték-affinitás kromatográflával (TSK AF-BLUE 650 MH), hidrofób kölcsönhatási kromatográfiával (Phenyl Sepharose 6 FF/LS) és gélfiltrációs kromatográfiával (Sephacryl S-200 HR) kezeltük. Mivel a TPO aktivitás a Sephacryl S-200 HR gélfiltrálással négy csúcsra oszlott (FI a legnagyobb molekulatömegű frakció, melyet az F2, F3 és F4 követ) az F2 és F3 TPO aktív frakciók mindegyikét bekoncentráltuk, hogy F2 nagy molekulatömegű TPO mintát és F3 kis moleakulatömegű TPO mintát kapjunk, melyeket a következő tisztítási lépésekben elkülönítve alkalmaztunk.

(iii) Az F3 kis molekulatömegű TPO mintát egymás után preparatív reverz fázisú kromatográfiával, (YMC-Pack PROTEIN-RP), reverz fázisú kromatográfiával (YMC-Pack CN-AP) és egy másik reverz fázisú kromatográfiával (Capcell Pack Cl) kezeltük. Amikor az így kapott TPO-aktív frakciót Nátrium-dodecil-szulfát (SDS) poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) vizsgálva és a TPO-aktív anyagot a gélről leválasztva a TPO aktivitás jelenlétét nem redukáló körülmények között kb. 17000-19000 D látszólagos • ·

- 48 molekulatömegűnek megfelelő sávban mutattuk ki.

(iv) Következésképpen valamennyi TPO aktivitású frakciót nem redukáló körülmények között alkalmaztuk az SDS-PAGE analízishez, és PVDF membránra másoltuk. A PVDF membránon a proteint peptid fragmensekké daraboló szisztematikus korlátozott enzimatlkus hidrolízis elvégzésével meghatároztuk a patkány TPO protein részleges aminosavszekvenciáját. Két peptid-fragmens aminosav-szekvenciájának ismeretében patkány TPO gént klónoztunk.

(v) Az előzőtől függetlenül, a Sephacryl S-200 HR kromatográfiával kapott nagy molekulatömegű F2 TPO mintát a kis molekulatömegű F3 TPO minta esetében végzett módon tisztítottuk. Amikor az utolsó reverz fázisú kromatografálási lépésben (Capcell Pack Cl) kapott TPO-aktív frakciót SDS-PAGE analízisnek vetettük alá, és a TPO-aktív gélt leválasztottuk a gélről, a TPO aktivitás jelenlétét nem redukáló körülmények között kb. 17000-22000 D közötti látszólagos molekulatömegnek megfelelő sávban mutattuk ki.

LEJ_Δ_patkány_TPQ-termelő_sejtek_speclalizálása. mRNS előállítása és Patkány cDNS könyvtár készítése

Mivel a fenti módon tisztított patkány TPO vérplazmából származott, a cDNS-klónozáshoz alkalmazandó mRNS forrásaként szolgáló szervek és sejtek keresésére volt szükség. A patkány vérplazmából származó TPO biokémiai és biológiai tulajdonságai alapján különböző szervekben és sejttenyészetfelülúszókban TPO-aktivitást kerestünk. Eredményként az McA-RH8994, HTC és H4-II-E patkány máj sejt-eredetű sejtvonalak tenyészetfelülúszójában, valamint a patkány primer máj sejtek tenyészetfelülúszójában a patkány vérplazma-eredetűvel majdnem azonos TPO aktivitást találtunk (4. példa).

A pEF18S expressziós vektort a pME18S és pEFBOS expressziós vektorokból alakítottuk ki (5. példa). E vektor létrehozása könnyű cDNS-klónozást tett lehetővé olyan nagy hatékonyságú expressziós vektorok felhasználásával, melyek több, inszertek beépítéséhez alkalmazható klónozási hellyel rendelkeznek.

A cDNS könyvtárak készítéséhez a fenti expressziós vektoron kívül főleg pUC és pBR alapú plazmid-vektorok, és lambda alapú fágvektorok alkalmazhatók.

McA-RH8994 sejteket tenyésztettünk, guanidin-tiocianát oldat hozzáadásával homogenizáltuk, majd CsCl-os sűrűség-gradiens centrifugélással teljes RNS-t nyertünk (6. példa).

RNS-t forró fenolos módszerrel, guanidinsav-fenol-kloroform módszerrel és hasonlókkal is előállíthatunk.

Miután a teljes RNS-ből oligo dT-vel immobilizált latex részecskék alkalmazásával poli(A)* RNS-t tisztítottunk, • · ·· reverz transzkriptázzal (printerként oligo dT alkalmazásával, melyhez Not.1 restrikciós enzimfelismerési helyet adtunk) egyszálú cDNS-t szintetizáltunk, majd RN-áz H és E. coll DNS-polimeráz I alkalmazásával második cDNS szálat is szintetizáltunk. Az így kapott kétszálú cDNS-hez E’coRI adaptort kapcsoltunk, a kapott cDNS-t az 5. példában előállított, NotI és -EcoRI enzimmel emésztett pEF18S emlős sejtexpressziós vektorhoz ligáltuk, majd az így ligáit cDNSt a cDNS könyvtár létrehozása érdekében DH5 E. coll törzs kompetens sejtjeibe transzformáltuk (7. példa).

(C) Patkány_TPO cDNS_fr.aanens_előállítása_(klónozása)

ECExral

A polimeráz láncreakcióban (PCR) alkalmazandó degenerált primerek szintetizálása érdekében patkány vérplazmából tisztított patkány TPO részleges aminosav-szekvenciájából

DNS-szekvenciát származtattunk. Az alkalmazni kívánt primerek az itt használt primerektől eltérő elhelyezkedésű aminosav-szekvenciák alapján is szintetizálhatok. Inozin alkalmazása nélkül nagymértékben degenerált primerek is alkalmazhatók. Ezeken kívül, patkányban jól alkalmazható kodon alkalmazásával kevésbé degenerált primerek is alkalmazhatók (Wada és mtsi, Nucleic Acids Rés., Ifi,

2367-2411, 1990).

Amikor a fenti módon előállított cDNS könyvtár teljes részéből plazmid DNS-t vontunk ki, és templátként a kivont * · « • · • · * •· ····

DNS-t alkalmazva PCR reakciót végeztünk, kb. 300 bp-nak megfelelő sávot detektáltunk, amelyet nukleotid-szekvencla analízissel a patkány TPO egy részét kódoló DNS-fragmensként (A1 fragmens) határoztunk meg (8. példa).

Í.D.)_Δ_patkány_TPO cDNS screenelése PCR-ral: a patkány TPO cDNS szekvenálása és a TPO aktivitás igazolása

A fentiek szerint készített cDNS könyvtárt egyenként 10000 kiónt tartalmazó csoportokra (pool) osztottuk, s mind a 100 csoportból plazmid DNS-t vontunk ki. Amikor templátként az plazmid DNS csoportok felhasználásával és az A1 fragmens nukleotid-szekvenciája alapján újonnan szintetizált primerek alkalmazásával elvégeztük a PCR-t, 3 csoportban mutattunk ki specifikusnak ítélt sávokat. . E három csoport egyikét alcsoportokra osztottuk, melyek mindegyike kb. 900 kiónt tartalmazott, s a fentivel azonos módon végzett PCR megvalósításához 100 alcsoportból plazmid DNS-t tisztítottunk. Specifikus sávot három alcsoportban mutattunk ki. E csoportok közül egyet egyenként 40 kiónt tartalmazó alcsoportokra osztottunk, s végül mindegyik kiónt hasonló módon PCR-ral screeneltünk, s a pEF18S-A2alfa kiónt izoláltuk, amely úgy tűnt, hogy patkány TPO cDNS-t kódol (9. és 10. példa).

E klón nukleotid-szekvenciájának vizsgálatakor kimutattuk, hogy a patkány vérplazmából tisztított protein részleges aminosav-szekvenciáját kódolja, ami annak valószínűségét • ·

- 52 igazolja, hogy ez a klón tartalmazza a patkány TPO cDNS-t (10. példa).

Amikor a fenti módon nyert pEF18S-A2alfa kiónból plazmid DNS-t tisztítottunk, és azt COS 1 sejtekbe transzfektáltuk, a transzfektált sejtek tenyészetfelülúszójában TPOaktivitást észleltünk, ezáltal bebizonyítottuk, hogy a pEF18S-A2alfa klón patkány TPO-t kódoló cDNS-t tartalmaz. (11. példa).

(E) TPO mRNS kimutatása különböző patkányszövetekben

A TPO mRNS expressziót patkányszövetekben PCR-rel vizsgáltuk, és specifikus expressziót az agyban, májban, vékonybelekben és a vesében mutattunk ki (12. példa).

(F) Humán cDNS könyvtár készítése

A normális beszerezhető készítettünk

A 4. és 12. példa eredményei alapján a humán TPO cDNS klónozásához kiindulási szövetként a májat választottuk ki.

emberi májból származó, kereskedelemben mRNS alkalmazásával cDNS könyvtárt

A patkány cDNS könyvtárhoz hasonlóan pEF-18S vektor alkalmazásával cDNS-t szintetizáltunk (szintén az előzővel azonos módon), miáltal NotI és EcóRl restrikciós enzimek alkalmazásával irányítottan klónozott cDNS könyvtárt kaptunk. A könyvtár elkészítéséhez DH5 E. coli törzsbe vektorhoz ligáit cDNS-t vittünk be. A könyvtár kb. 1 200 000 kiónt tartalmazott (13. példa).

(G) Humán TPO cDNS-fraemens előállítása (klónozása) PCR-ral

A patkány TPO cDNS-t kódoló pEF18S-A2alfa klón nukleotid-szekvenciája alapján a PCR-hoz több prímért szintetizáltunk. Amikor a cDNS-t emberi májból származó, kereskedelmileg beszerezhető mRNS felhasználásával szintetizáltuk, és a PCR-t e primereket, illetve templátként cDNS alkalmazva végeztük, kb. 620 bp-nak megfelelő sávot figyeltünk meg. A nukleotid-szekvencia vizsgálatakor kimutattuk, hogy ez a klón a patkány TPO cDNS-sel kb. 68 %-os homológiát mutató DNS-fragmenst tartalmaz, bizonyítva ezáltal, hogy nagy a valószínűsége annak, hogy ez a humán TPO-t kódoló gén egy része (14. példa).

fül_A humán TPO cDNS screenelése PCR-ral: a humán TPO cDNS szekvenálása. és a TPO aktivitás Igazolása

A fentebb előállított cDNS könyvtárt amplifikáltuk, egyenként kb. 100 000 kiónt tartalmazó csoportokra oszottuk, s mind a 90 csoportból plazmid DNS-t vontunk ki. Amikor templátként az egyes csoportokból származó plazmid-DNS molekulák, illetve primerekként a 14. példában kapott humán TPO fragmensek nukleotid-szekvenciájának alkalmazásával PCR reakciókat végeztünk, három csoportban detektáltunk lehetséges sávokat. E csoportok egyikét egyenként 5000 kiónt tartalmazó alcsoportokra osztottuk, és mind a 90 • ·

- 54 alcsoportból plazmid DNS-t tisztítottunk. Amikor templátként az egyes csoportokból származó plazmid DNS alkalmazásával a fentivel megegyező módon PCR reakciókat végeztünk, három alcsoportban detektáltunk lehetséges sávokat. E csoportok egyikét egyenként 30 kiónt tartalmazó alcsoportokra osztva, majd mind a 90 alcsoportból plazmid DNS-t tisztítva, és azokkal PCR reakciót végezve három alcsoportban detektáltunk lehetséges sávokat. Ezután ezen alcsoportokból 90 telepet izoláltunk, és az egyes telepekből tisztított plazmid DNS-t PCR reakciónak vetettük alá, miáltal végül a HL34 elnevezésű kiónt kaptuk (15. példa).

Amikor ebben a kiónban a plazmid vizsgáltuk, kimutattuk, hogy tartalmaz, amely a nukleotid-szekvenciájával kb. 84 példa).

DNS nukleotid-szekvenciáját ez a klón olyan cDNS-t patkány TPO cDNS %-os homológiát mutat (16.

Amikor a klónozott plazmid DNS-t tisztítottuk és C0S1 sejtekbe transzfektáltuk, a transzfektált sejtek tenyészetfelülúszójában TPO aktivitást észleltünk, ezáltal bebizonyosodott, hogy ez a plazmid klón a humán TPO-t kódoló cDNS-t tartalmazza (17. példa).

Ez a cDNS azonban a klónozás mesterséges termékének tűnt, mivel ebben a kiónban nem találtunk terminációs kodont, 3'-végén pedig poli A farok-szerű szekvencia helyezkedett el. Következésképpen olyan expressziós vektort készítettünk, amely a poli A farok-szerű szekvenciának megfelelő rész kivételével kódolja az aminosav-szekvenciát. Az így kialakított vektort COS 1 sejtekben expresszálva a kapott tenyészetfelülúszóban TPO aktivitást észleltünk (18. példa).

A humán TPO 3'-vég régiójában lévő DNS-fragmenst PCR-ral állítottuk elő, hogy vizsgálni tudjuk a teljes hosszúságú cDNS-t.

E fragmens nukleotid-szekvenciájának meghatározása azt mutatta, hogy részben átfedő a 15. példában kapott HL34 kiónban lévő cDNS-sel. Számítottunk arra is, hogy a teljes hosszúságú humán TPO cDNS tartalmazhat nyitott leolvasási keretet, és hogy 353 aminosavból álló proteint kódol. Ilyenformán, feltételeztük, hogy a humán TPO 353 aminosavból áll, beleértve egy 21 aminosavból álló jelzőszekvenciát (19. példa).

A fenti klónozási eljáráson kívül a humán TPO cDNS klónozása próbaként patkány TPO cDNS falhasználásával, pUC- vagy pBRalapú plazmid vektor vagy lambda fág alapú vektor vagy hasonló alkalmazásával telephibridizációval vagy plakkhibridizációval is megvalósítható. Degenerált próba kialakításánál a degeneráltság mértékének csökkentése érdekében inozint alkalmazhatunk. Ha rendelkezésre áll egy olyan vizsgálati módszer, amellyel specifikus módon vagy nagy érzékenységgel kimutatható a TPO aktivitás, a találmányban alkalmazott expressziós könyvtár felhasználásával lehetőség nyílik expressziós klónozás elvégzésére.

Mivel normális emberi májban a humán TPO-t kódoló RNS mennyisége rendkívül alacsonynak tűnik (ld. 15. példa; az e példa eredménye alapján számított TPO-t kódoló RNS-tartalom 1 : 3 000 000), a kezelendő kiónok vagy plakkok nagy száma miatt, valamint amiatt, hogy a hibridizációs módszer érzékenysége és specifitása kisebb a PCR módszerénél, a próbaként szintetizált oligonukleotidot, patkány vagy humán TPO cDNS-t alkalmazó hibridizációs screenelést rendkívül nehéz megvalósítani. A 13. példában készített normál emberi máj cDNS könyvtárban kétmillió kiónnal, próbaként patkány TPO cDNS-fragmens alkalmazásával végeztünk telephibridizációt, de humán TPO cDNS kiónt nem tudtunk előállítani.

(I) Humán normális májból származó cDNS rekonstruálása

Mivel a 15. példában kapott HL34 klónról úgy tűnt, hogy nem teljes cDNS-t tartalmaz, a kereskedelemben beszerezhető normál humán máj-eredetű poli (A)* RNS készítmény alkalmazásával cDNS könyvtárat rekonstruáltunk, hogy teljes humán TPO cDNS-t nyerjünk. A vektorral ligáit cDNS- E. coli

DH5 sejtekbe történő bevitelével készített könyvtár (hTPOFl) 1,0 x 10® transzformánst tartalmazott (20. példa).

- 57 (J) TPO cDNS klón screenelése:_a_humán_ΤΕΏ_cDNS szekvencia-meghatározása_és_expresszálás.a; .a TPQ aktivitás igazolása

A PCR-hoz a 14. példában kapott részleges cDNS nukleotid-szekvenciája (3. számú szekv.) és a humán TPO 19. példában megjósolt teljes cDNS-ének nukleotid-szekvenciája (196. számú szekv.) alapján primereket szintetizáltunk.

A 20. példában készített humán máj cDNS könyvtárat (hTPO-Fl) három csoportra osztottuk. Templátként az egyes csoportokból készített plazmid-DNS, valamint szintetizált primerek alkalmazásával PCR reakciót végeztünk. A 3. csoportból származó plazmid-DNS alkalmazásakor a várt méretű DNSfragmens amplifikálódott. A 3. csoportot egyenként 15 000 transzformánst tartalmazó alcsoportokra osztottuk, s a screenelést PCR alkalmazásával a fentiek szerint végeztük. A 90 csoport közül hat esetében a várt méretű DNS amplifikációját tapasztaltuk. Amikor e pozitív csoportokat egyenként 1000 kiónt tartalmazó alcsoportokra osztottuk és plazmid DNS-t vontunk ki, és a fentivel azonos módon PCR-t végeztünk, DNS-amplifikációt nem tapasztaltunk. Ogy gondoltuk, hogy ezt a plazmid DNS alacsony szintű kinyerése okozza, ami annak köszönhető, hogy a szóban forgó klón a többinél lassabban növekszik. Az eredeti 3. csoportot ezért

100 LB lemezre olyan oltóanyag mérettel szélesztettük, hogy mindegyik LB lemezen 4100 telep nőjön, s az így oltott lemezekről másolati lemezt készítettünk. Amikor a lemezen nőtt telepekből kivont DNS-ek alkalmazásával a fentebb leírt módon PCR-t végeztünk, a 100 alcsoportból egyben a várt sáv amplifikálódását tapasztaltuk.

PCR-t és eljárások

Ezen alcsoport lemezéről két replika-filtert készítettünk, és a telephibridizációt a jelölt próba (a pEF18S-HL34 EcoRI/BamHI fragmense) alkalmazásával végeztük. A vizsgálat eredményeként egy pozitívnak ítélt jelet figyeltünk meg. A telepeket az eredeti lemezről gyűjtöttük össze, és újból LB lemezre oltottuk. A lemezen növesztett összesen 50 telepből DNS mintákat készítettünk, s azokat PCR-nak alávetve pHTFl elnevezésű kiónt kaptunk (21. példa). A cDNS klón screeneléséhez elsősorban hibridizációt, expressziós klónozást alkalmaztunk; ezen kombinálása fokozta a screenelés hatékonyságát és érzékenységét, illetve csökkentette munkaigényét. A pHTFl klón nukleotid-szekvenciájának meghatározásakor kimutattuk, hogy ez a klón nyitott leolvasási kerettel rendelkezik, s a protein (melyről úgy tartjuk, hogy a nyitott leolvasási keret kódolja) aminosav-szekvenciája tökéletesen egybeesett a humán TPO leszármaztatott aminosav-szekvenciájával (6. sz.

szekv.). A nukleotid-szekvencia a leszármaztatott szekvenciától (196. sz. szekv.) három helyen tért el, de ezek a különbségek nem okoztak aminosav-változást.

Bebizonyítottuk, . hogy a humán TPO protein 353 aminosavat tartalmaz, melyből 21 aminosav jelzőszekvenciát képez. pHTFl klónból plazmid DNS-t készítve, és az C0S1 sejtekbe transzfektálva a tenyészetfelülúszóban TPO aktivitást

észleltünk (23. példa).
(K) Humán TPO	kromoszómáiisDNS	screenelése
nlakk-hibridizációval:	a_humán_TPO kromoszomális DNS
szekvencia-meghatározása	. Ja expresszálása. a	TPO aktivitás

igazolása

Prof. T. Yamamototól (Gene Research Center, Tohoku

University) kapott genom könyvtárat 18 NZYM lemezre oltottunk, olyan mennyiségben, hogy egy lemez 30000 fágrészecskét tartalmazott. Az így elkészített 18 lemez mindegyikéről két másolati (replika) filterlenyomatot készítettünk. PCR-ral humán TPO cDNS fragmenst (a 7. sz. szekv. 178-1025. bázisai) amplifikáltunk és tisztítottunk. Próbaként a ³²P-izotóppal jelölt tisztított fragmenst alkalmazva plakk-hibridizációt végeztünk és 13 pozitív jelet kaptunk. A plakkokat az eredeti lemezről gyűjtöttük és ismét NZYM lemezekre oltottuk, olyan mennyiségben, hogy mindegyik lemezen 1000 plakk alakuljon ki. Az elkészített lemezek mindegyikéről két másolati filterlenyomatot készítettünk, s a plakk-hibridizációt a fentebb leírt feltételek mellett végeztük. A 13 csoport valamennyi filterén pozitív jeleket detektáltunk. Mindegyik lemezről egy-egy plakkot vettünk le, hogy fág DNS-t készítsünk. A 13 kiónból előállított DNS mintákban PCR-ral ellenőriztük a cDNS kódoló régió jelenlétét. A 13 klón közül ötről úgy tűnt, tartalmazta a cDNS-ből levezetett teljes aminosav-szekvenciát kódoló régiót. Következésképpen e kiónok egyikét (lamdaHGTl) kiválasztottuk és Southern biot technikával vizsgáltuk (a fentebb említett próbát alkalmazva). Mivel HindlII-mal végzett emésztés során egyetlen 10 kb-os sávot találtunk, a lamdaHGTl klón DNS-ét HindlII-mal emésztettük, majd agaróz gélelektroforézissel vizsgáltuk. A 10 kb-os sávot kivágtuk a gélről, tisztítottuk és pUC13 klónozó vektorba szubklónoztűk, miáltal pHGTl elnevezésű kiónt kaptunk (24. példa).

Az így kapott pHGTl klón nukleotid-szekvenclájának meghatározásakor a klón által hordozott kromoszómáiis DNS-ről megállapítottuk, hogy a 19. példában megjósolt teljes protein-kódoló régiót tartalmazta, s a kódoló régió nukleotid-szekvenciája teljesen megegyezett a megjósolt nukleotid-szekvenciával (196. sz. szekv.).

Az aminosav-kódoló exonnak megfelelő régió ezenfelül négy intront is tartalmazott, és a nukleotid-szekvencia eltért a

21. példában kapott pHTFl klón által hordozott teljes cDNS nukleotid-szekvenciájátó1. (7. sz. szekv.).

Amikor az öt kromoszomális DNS klón közül a screeneléssel egymástól függetlenül kiválasztott négy megmaradt klón nukleotid-szekvenciáját meghatároztuk, azt találtuk, hogy a négy klónból kettő azonos volt a pHGTl kiónnal, a másik kettő pedig azzal a különbséggel volt azonos vele, hogy a 3' nem kódoló régión belül különböző nukleotidot tartalmaztak (amint azt a pHTFl klón esetében megfigyeltük) (25. példa).

• ·

- 61 Az így kapott pHGTl plazmid klón egy EcoRI fragmensét egy PEF18S expressziós vektorhoz ligáltuk, miáltal pEFHGTE humán TPO expressziós plazmidot kaptunk. Amikor a plazmid DNS-t (pEFHGTE) előállítottuk és COS1 sejtekbe transzfektáltuk, a tenyészetfelülúszóban TPO aktivitást észleltünk (26. példa).

(L) Humán_deléciós_IRQ_származékok,_ezek COS1 sejtekben történő exuresszálása és a TPO aktivitás igazolása

A 18. és 22. példa eredményei rámutattak arra, hogy a humán TPO protein C-terminélis végének eltávolítása után is kifejti biológiai hatását. Ilyenformán, a biológiailag aktív részek további vizsgálata érdekében a deléciós származékokkal végeztünk kísérleteket. PCR-ral expressziós plazmidok sorozatát állítottuk elő, melynek során templátként a 18. példában előállított pHTl-231 plazmid klón DNS-ét, primerekként pedig szintetizált oligonukleotidokat alkalmaztunk.

Expressziós plazmidokat kaptunk, amelyek olyan humán TPO deléciós származékokat kódoló DNS-t tartalmaztak, melyekből a TPO protein C-terminális régiója hiányzott, vagyis a TPO protein aminosav-szekvenciájának 1-211., 1-191., 1-171. és

1-163. aminosavait kódoló deléciós származékokat kaptunk. A kiónokból plazmid DNS-t készítve, és azokat COS1 sejtekbe transzfektálva valamennyi tenyészetfelülúszóban TPO aktivitást detektáltunk (27. példa).

• ·

- 62 Amikor kialakítottuk a deléciós származékokat, melyekből deléció folytán a C-terminállson a 151. helyig hiányoztak aminosavak, illetve más származékokat, melyekből az Nterminális oldalon a 6., 7. és 12. helyig hiányoztak az aminosavak, és e származékok COS1 sejtekben végzett expresszálása után (a TPO aktivitást hordozó régió részletes vizsgálata érdekében) megmértük aktivitásukat, abban az esetben, ha az N-terminális oldali aminosavak a 7. helyig, illetve a C-terminális oldali aminosavak a 151. helyig hiányoztak, aktivitást nem tudtunk kimutatni. (28. és 29. példa).

Egy protein származékait, melyek rendelkeznek a protein biológiai aktivitásával, úgy kaphatjuk, hogy a proteint kódoló cDNS-t (delécióval, szubsztitúcióval, inszercióval vagy addícióval) módosítjuk. A módosításhoz olyan módszerek alkalmazhatók, mint a PCR, a helyre irányuló mutagenezis és a kémiai szintézis.

íhl_Humán_TPQ__expresszálása CHO sejtben és a TPO tisztítása pHTPl expressziós vektort alakítottunk ki, amely állati sejtekben a humán TPO leszármaztatott aminosav-szekvenciáját (6. sz. szekv.) kódoló cDNS-t expresszál (30. példa).

A pHTPl TPO cDNS régióját — CHO sejtekben való expresszálása érdekében — pDEF202-hTPO-Pl vektor kialakításához alkalmaztuk (31. példa).

A vektort CHO sejtekbe transzfektálva, majd a transzfektált sejteket szelektálva olyan transzfektált sejteket kaptunk, amelyekben a humán TPO cDNS-t hordozó expressziós vektor a CHO sejtek kromoszómáiba épült be (32. példa).

A 32. példában a humán TPO-t termelő CHO sejtvonalat (25 nM MTX-re rezisztens CHO 28-30 sejt) nagy mennyiségben tenyésztettük, melyet a pDEF202-hTP0-Pl humán TPO expressziós plazmid CHO sejtekbe történő transzfektálásával állítottunk elő (55. példa).

100 liter tenyészetfelülúszóból humán TPO-t tisztítottunk (56. példa).

Az 55. példában kapott tenyészetfelülúszóból más módon is tisztítottunk humán TPO-t (57. példa).

(N) Humán_TPO cDNS exnresszálása X63.6.5.3 sejtekben: az aktivitás igazolása

A 30. példában előállított pBLTEN plazmidban lévő TPO cDNS régió alkalmazásával az X63.6.5.3 sejtekben való felhasználáshoz BMCGSneo-hTPO-Pl expressziós vektort készítettünk (33. példa).

Az X63.6.5.3 sejteket e vektorral transzfektálva olyan • · transzformáns sejtet kaptunk, melyekben a humán cDNS-t tartalmazó expressziós vektor a kromoszómákba épült. E sejtet tenyésztve a tenyészetfelülúszóban TPO aktivitást detektáltunk (34. példa).

1QJ_&_humán_TPO_nagy_mennyiségű_expresszálása cosi sejtekben: a humán TPO tisztítása, molekulatömegének mérése.

valamint biológiai tulajdonságai

A 30. példában előállított pHTPl expressziós vektorral COSI sejteket transzfektáltunk, hogy nagy mennyiségű (összesen kb. 40 liter) tenyészetfelülúszót kapjunk, amely tartalmazza az expresszált terméket (35. példa).

A TPO-t a COSI sejtek 35. példában előállított (pHTPl expressziós vektor-eredetű TPO-t tartalmazó) szérummentes tenyészetfelülúszójának kb. 7 literéből tisztítottuk. Egymás után végzett hidrofób kölcsönhatási kromatográfiával, kationcserélő oszlopkromatográfiával, WGA oszlopkromatográfiával és reverz fázisú oszlopkromatográfiával nagy aktivitású TPO-t nyertünk (36. példa).

A COSI sejtek tenyészettelülúszójából fenti módon részlegesen tisztított TPO molekulatömeg-meghatározásnak vetettük alá, és megvizsgáltuk biológiai tulajdonságait (37. és 38. példa).

• ·· • · · · • · · · · · ·

- 65 (P) A humán TPO exoresszálása E. coli-ban

A glutation-S-transzferáz és a humán TPO (1-174. aminosavgyökök) alkotta fúziós protein [ GST-TPO( 1-174) '* ] E. coli-ban történő expressziójában való alkalmazáshoz pGEX-2T/hT(1-174) vektort készítettünk. Ebben az esetben a humán TPO cDNS nukleotid-szekvenciájának egy részét (kb. az 5' oldal felét) E. coli által előnyben részesített kodonokkal helyettesítettük (39. példa).

A GST-TPO(1-174) fúziós proteint E. coli-ban expresszáltűk, a kapott sejteket szétroncsoltuk, majd a kicsapódott frakcióban lévő GST-TPO(1-174) proteint szolubilizáltuk. A

TPO visszaredőződése és a tisztítás feltételeinek vizsgálatával (glutation-affinitás kromatográfia, kationcserélő kromatográfia és hasonlók) és a GST protein trombinnal való hasításával a tervezettnek megfelelően TPO aminosav-szekvenciát tartalmazó proteint tisztíthattunk. Bebizonyítottuk, hogy ez a protein a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben TPO aktivitást mutat (40. és 41. példa).

A h6T(1-163) elnevezésű mutációs humán TPO protein (melyben a humán TPO (1-163. aminosavak) 1. szerin (Ser) és a 3. alanin (Alá) gyökét alaninnal, illetve valinnal helyettesítettük, s amelyhez a -1 és -2 helyzetekben lizint (Lys), illetve metionint (Met) adtunk) E. coli-ban történő expresszálásában való alkalmazáshoz pCFM536/h6T(1-163)

- 66 vektort készítettünk. A humán TPO cDNS nukleotid-szekvencia (1-163. aminosavaknak megfelelő) teljes egészét (melyet ez a vektor hordoz) E. coll által előnyben részesített kodonokkal helyettesítettük (42. példa).

A h6T(1-163) proteint E. coli-ban expresszáltuk, a kapott sejteket lizáltuk, a kicsapódott frakcióban lévő h6T(1-163) proteint szolubilizáltuk, megvizsgáltuk az visszaredőződéshez szükséges feltételeket, miáltal a tervezettnek megfelelően TPO aminosav-szekvenciát tartalmazó proteint sikerült részlegesen tisztítanunk. Bebizonyítottuk, hogy ez a protein a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben TPO aktivitást mutat (43. és 44. példa).

A fentieken kívül egy pCFM536/hMKT(1-163) vektort készítettünk a hMKT(1-163) elnevezésű mutált humán TPO protein (melyhez a -1 és -2 helyzetben lizin (Lys), illetve metionin (Met) gyököt adtunk) E. coli-ban történő expressziójában való alkalmazáshoz. A hMKT(1-163) proteint a 43. példában leírt módon E. coli-ban expresszáltuk, az expresszált proteint SDS-PAGE vizsgálatnak vetettük alá, PVDF membránra vittük, majd N-terminális aminosav-szekvencia analízissel vizsgáltuk, miáltal bebizonyítottuk, hogy ez a protein a tervezett aminosav-szekvenciát tartalmazza (52.

példa).

A hMKT(1-332) elnevezésű mutált humán TPO protein (melyhez a -1 helyzetben lizin (Lys) gyököt, a -2 helyzetben pedig • ·

- 67 metionin (Met) gyököt kapcsoltunk) E. coli-ban történő expresszlójában való alkalmazáshoz pCFM536/hMKT(1-332) vektort készítettünk. A hMKT(1-332) proteint a 42. példában leírt módon E. coli-bon expresszáltuk, s expresszióját a 45. példában előállított humán TPO peptid elleni antitest alkalmazásával Western biot technikával igazoltuk (66.

példa).

1Q1_Anti-TPO_peptid_antitest_és_anti-TPO peptid antitest-oszlop előállítása

A 10. példában meghatározott patkány TPO aminosav-szekvencia három részleges régiójának megfelelő szintetizált peptidek alkalmazásával poliklonális nyúl anti-TPO peptid antitesteket készítettünk, és bebizonyítottuk, hogy ezek az antitestek patkány és humán TPO molekulákat képesek felismerni. Ezenkívül, a humán TPO aminosav-szekvenciájának (6. sz. szekv. vagy 7. sz. szekv.) hat részleges régiójának megfelelő peptideket szintetizáltunk, majd ezeket poliklonális nyúl anti-TPO peptid antitestek előállításához alkalmaztuk. Az előállított antitestekről bebizonyítottuk, hogy felismerik a humán TPO-t. (45. példa).

Bizonyos, TPO-hoz kötődési affinitást mutató molekulákkal, mint pl. anti-TPO antitestekkel, TPO receptorokkal és hasonlókkal töltött oszlopok alkalmazásával lehetőség nyílik a TPO affinitás oszlopkromatográfiás tisztítására. Következésképpen, a 45. példában kapott anti-TPO peptid antitest kötésével először anti-TPO antitest-oszlopot készítettünk (46. példa).

(R) COS1 sejtekben expresszált humán TPO tisztítása anti-TPO neptid_antitest-oszlop_alkalmazásával;_a humán TPO molekulatömegének és biológiai tulajdonságainak vizsgálata

A COS1 sejtek pHTPl expressziós vektorral végzett transzfekciójából származó tenyészetfelülúszót kiindulási anyagként alkalmazva részlegesen tisztított TPO-t nyertünk, és azt anti-TPO antitest-oszlopra vittük fel. Mivel a TPO aktivitás az adszorbeált frakcióban volt, ezt a frakciót a protein tisztítása, valamint molekulatömegének és biológiai tulajdonságainak vizsgálata érdekében reverz fázisú krómatográfiával tovább tisztítottuk (47. példa).

f_SJ_Δ_CŰS1_sejtekben_expresszált. részlegesen tisztított humán TPO_aktivitásának bizonyítása

A 36. példában tisztított ΤΡΟ-aktív frakciót, nevezetesen a COS1 sejtek pHTPl expressziós vektorral végzett transzfektálásával kapott tenyészetfelülúszóból Capcell Pák Cl 300A oszlopon végzett lépésig tisztított TPO mintát biológiai aktivitására teszteltük, hogy meghatározzuk, vajon az élő szervezetben kifejt-e vérlemezkeszám-növelő hatást (48. példa).

A COS1 sejtek pHTPl expressziós vektorral végzett

- 69 transzfektálásával kapott tenyészetfelülúszó 33 literéből kationcserélő oszlopon kapott nyers TPO frakciót szintén biológiai hatásaira teszteltük, hogy meghatározzuk, növeli-e a testben a vérlemezkék számát (49. példa).

(T) Humán TPO kromoszomális DNS exuresszálása CHO sejtekben:

az aktivitás igazolása

A humán TPO kromoszóma CHO sejtekben történő expresszálásában való alkalmazáshoz pDEF202-ghTPO vektort készítettünk (50. példa).

E vektort CHO sejtekbe juttatva olyan transzformáns sejtet kaptunk, amelyben a humán TPO kromoszomális DNS-ét tartalmazó vektor beépült a sejt saját kromoszómájába. E sejtklónt tenyésztve a tenyészetfelülúszóban TPO aktivitást detektáltunk (51. példa).

UJJ_EL._QQll-TQva. , expresszált_mutált_típusú_humán TPO részleges tisztítása és aktivitásának igazolása

A humán TPO nukleotid-szekvenciát tartalmazó pCFM536/h6T(1-163) kiónból származó, E. colí-ban expresszált mutált típusú humán TPO-t guanidin-hidrolkorid és glutation alkalmazásával visszaredőződésre késztettük, annak érdekében, hogy kimutassuk: az így kapott h6T(1-163) protein az élő szervezetben vérlemezkeszám növelő hatást fejt ki. (53. példa).

- 70 A humán TPO nukleotid-szekvenciát tartalmazó pCFM536/h6T(1-163) klónból származó, E. coll-ban expresszált mutációs típusú humán TPO-t nátrium-N-lauroil-szarkozinét és réz-szulfát alkalmazásával visszaredőződésre késztettük, majd kationcserélő kromatográfiának vetettük alá, annak érdekében, hogy kimutassuk: az így kapott h6T(1-163) protein az élő szervezetben vérlemezkeszám növelő hatást fejt ki.

(54. példa).

A h6T(1-163) mutációs típusú humán TPO visszaredőzését és tisztítását a fentieken kívül más eljárások alkalmazásával is elvégeztük (60. és 61. példa).

lűZJ_Humán TPO cDNS_expresszálása rovarsejtekben: az aktivitás azonosítása

Humán TPO rovarsejtekben végzett expresszálésához rekombináns vírust hoztunk létre (58. példa), és azt Sf 21 rovarsejtben expresszáltuk, majd a tenyészetfelülúszóban azonosítottuk a TPO aktivitást (59. példa).

1ÜJ_Humán TP.Q (1-163. aminosav) expreaszálása CHO sejtekben és tisztítása

A 7. sz. szekv. 1-163. aminosavaival rendelkező humán TPO protein (hTP0163) CHO sejtekben történő expressziójához pDEF202-hTP0163 vektort készítettünk. Ezt az expressziós vektort CHO sejtekbe transzfektáltuk, s az így kapott

* · · « « «, ···* ·· · * 99 hTP0163 proteint termelő CHO sejtvonalat nagy mennyiségben tenyésztettük. A tenyészet felülúszójából hTPO163 proteint tisztítottunk (62-65. példák).

(X) A humán TPO szubsztitúciós származékai

Egy N3/TPO elnevezésű származékot (melyben a 25. helyen lévő arginint (Arg) aszparaginnal (Asn), a 231. helyen lévő glutaminsavat (Glu) pedig lizinnel (Lys) helyettesítettük), valamint egy 09/TP0 elnevezésű származékot állítottunk elő, melyben a 33. helyen lévő hisztidint (His) treoninnal (Thr) helyettesítettük.

Az egyes származékokat kódoló plazmidokat C0S7 sejtekbe transzfektáltuk, s azokat a transzfekció után tenyésztettük. A tenyészetfelülúszóban TPO aktivitást mutattunk ki (67. példa).

E. coll expressziós rendszer alkalmazásával olyan származékokat állítottunk elő, melyekben a h6T(1-163) szekvencia egy aminosavát egy másik aminosawal helyettesítettük. (94. példa).

(Y) Humán TPO ínszerciós vagy deléciós származékai

A hTPQ163 proteinbe aminosavat inszertáltunk, vagy abból delécióval aminosavat távolítottunk el, majd a kapott származékokat kódoló plazmidokkal

COS7 sejteket ·· ·»*· ·· ·φ • · « * · « · transzfektáltunk. A C0S7 sejt-tenyészetek felülúszójóban TPO aktivitást mutattunk ki (68. példa).

A TPO aktivitás találmányunkban alkalmazott mérési módszerét (in vitro vizsgálati rendszer) a hivatkozási példában írjuk le.

(Z) Anti-humán TPO antitestek előállítása és tisztítása

A humán TPO peptid-fragmensei alkalmazásával poliklonális antitesteket állítottunk elő (69. példa), s azokat Western biot analízisben (70. példa) és anti-TPO antitest affinitási oszlopok kialakításában (71. példa) használtuk fel.

(AA) A humán TPO in vivő aktivitása

Indukált trombocitopéniában szenvedő egereknek tisztított TPO-t adtunk be, és ellenőriztük a vérlemezkék számának kontroll csoporthoz képest megfigyelhető változásait (72-79. példák). A trombocitopénia kezelésében hatásosan alkalmazható gyógyszerészeti készítményeket írunk le (80-89. példák).

(BB) TPO aktivitás, mint az MLP receptor kötődés függvénye

Vizsgálatot írunk le, melyben a TPO aktivitást az Mpl receptorhoz való specifikus kötődés értelmében határozzuk meg (SO-93. példák).

- 73 »·· *· • · · · * · ·· ·«·· ··

Hivatkozási példa

A) Patkány megakariocita őssejt vizsgálati rendszer (patkány

CFU-MK vizsgálati rendszer) (folvadéktenvészet rendszer)

A megakariociták aktív, energiafüggő folyamattal sűrű citoplazmájú szemcsékben szerotonint építenek be és tárolnak (Fedorko, Láb. Invest., SS, 310-320, 1977). Ez a jelenség kis és egymagvú acetil-kolin-észteráz-pozitív sejtekben is megfigyelhető, melyeket a CFU-MK és a felismerhető megakariociták közé sorolnak be (Bricker és Zuckerman, Exp. Hematol., 12. 672, 1984). A beépült szerotonin mennyisége a megakariociták méretének növekedése függvényében fokozódik (Schick és Weinetein, J. Láb. Clin. Med., SS, 607-615, 1981). Imeretes továbbá, hogy ez a jelenség a csontvelősejtek közül csak a megakariocitákra specifikus (Schick és Weinstein, J. Láb. Clin. Med., SS, 607-615, 1981). Vizsgálati rendszerünkben koncentrált patkány CFU-MK sejteket (GpIIb/IIIa* CFU-MK frakció, melyet a későbbiekben írunk le) tenyésztünk a vizsgálni kívánt minták a ¹⁴C-szerotonin (¹⁴C-hidroxi¹⁴C-5HT) CFU-MK-ból kifejlődő jelenlétében, és mérjük triptamin-kreatin-szulfát, megakariocitákba való beépülését.

E vizsgálati rendszer előnyei, hogy a szennyezett sejtek közvetett befolyása (például Meg-CSF aktivitás kialakulása a vizsgált faktortól eltérő bizonyos anyag által serkentett szennyezett sejtek által, vagy egy bizonyos faktor ···· ·· ··*· ·· «· • · · · · ·· « . · · · · * ·· • · · ···· · ·· ···· ·« ·· ·· képződése a szennyezett sejtek által, mely a vizsgált faktorral kombinált hatást fejt ki) csökkenthető, mivel a GpIIb/IIIa* CFU-MK frakcióban a CFU-MK sejtek százalékos aránya igen nagy (lásd a Vizsgálati eljárás részt), miközben a szennyező sejtek száma alacsony. A megfelelő tenyésztési körülmények ráadásul viszonylag hosszú ideig fenntarthatok, mivel az egy üregbe helyezett sejtek száma alacsony. A rendszer egy másik előnye, hogy a tenyésztési idő alatt a CFU-MK-ból aktív minta jelenlétében kifejlődő nagy, érett megakariociták száma fáziskontraszt mikroszkóppal vizuálisan detektálható, ami lehetővé teszi az aktivitás jelenlétének és mértékének kvalitatív megítélését.

A kvalitatív megítélés eredményei megfelelnek a ¹⁴Cszerotonin beépülésén alapuló mennyiségi meghatározás eredményeinek. Ilyenformán, a mennyiségi meghatározás megbízhatósága a kvalitatív megítélés együttes alkalmazásával tovább javítható.

Vizsgálati eljárás

A vizsgálat során alkalmazott nagy koncentrációjú patkány CFU-MK sejteket (GpIIb/IIIa·'· CFU-MK frakció) Miyazaki és mtsi. (Exp. Hematol., 20, 855-861, 1992) módszerének csekély módosításával állítjuk elő.

Röviden; 8-12 hetes hím Wister patkányok femur-ját és tibia-ját eltávolítjuk, hogy a leírt módon csontvelősejtszuszpenziót készítsünk. A csontvelősejt-szuszpenzió ···: .· • · .·· ·* • · · • ·· « · · · · · ···· ·« ·· ·» előállításához szuszpendáló tápközeget (a továbbiakban HATCH oldat) alkalmazunk: 13,6 mM trinátrium-citrát, 11,1 mM glükóz, 1 mM adenozin, 1 mM teofillin, 10 mM HEPES (pH = 7,25), 0,5 % szarvasmarha szérumalbumin (BSA; Path-O-Cyte 4, Seikagu Kogyo Co., Ltd.) és Ca²* és Mg²* ionoktól mentes Hanks-féle egyensúlyi sóoldat; ez a Levine és Fedorko által leírt (Blood, ££>, 713-725, 1977) megakariocita elválasztási tápközeg némileg módosított változata. Az így előállított csontvelősejt-szuszpenziót szakaszos Percoll sűrűséggradiens oldatra rétegezzük (sűrűség: 1,050 g/ml - 1,063 g/ml - 1,082 g/ml), melyet úgy készítünk, hogy Percoll oldatot (Pharmacia) HATCH oldattal hígítunk, majd 20 ’C-on 20 percig 400 x g-vel centrifugáljuk. A centrifugálás után az 1,063 g/ml és 1,082 g/ml sűrűségű réteg közötti sejteket kinyerjük. Mosás után a kinyert sejteket 10 % magzati borjúszérumot (FCS) tartalmazó Iscove-féle módosított Dulbecco tenyésztő tápközegben (IMDM) szuszpendáljuk, 100 mm átmérőjű műanyag szövettenyésztő csészékbe helyezzük, és 5 % CO2 inkubátorban 37 °C-on egy óra hosszat tenyésztjük. Az inkubálás után a nemtapadó sejteket kinyerjük, majd műanyag csészékben 37 ’C-on ismét egy óra hosszat inkubáljuk. A nemtapadó sejteket HATCH oldatban szuszpendáljuk, és 100 mm átmérőjű bakterológiai petricsészékben egy órán át inkubáljuk, melyekben előzetesen monoklonálls egér anti-patkány vérlemezke GpIIb/IIIa antitestet, P55 antitestet (Miyazaki és mtsi, Thromb. Rés., 59. 941-953, 1990) adszorbeáltunk. Inkubálás után a nemtadapó sejteket

HATCH oldattal végzett alapos mosással eltávolítottuk, s a ···· · · ···· • · · · megmaradt, immobilizált P55 antitesthez adszorbeálódott sejteket pipettával elkülönítjük és összegyűjtjük. Egy patkányból általában 3-4 x 10° sejtet nyerünk. Az így kapott sejtfrakció nagy koncentrációban tartalmaz CFU-MK-t (a továbbiakban GpIIb/IIIa* CFU-MK frakció), és ismeretes, hogy ez a sejtfrakció (telített koncentrációjú patkány IL-3 jelenlétében telepvizsgálati rendszerben végzett mérés során kapott eredmény alapján) kb. 5-10 % CFU-MK-t tartalmaz. A fentebb említett P55 antitest termelésére képes hibridomát 1994. február 14-én a FERM BP-4563 deponálási számon helyeztük letétbe (National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry).

Az így kapott GpIIb/IIIa* CFU-MK frakció sejtjeit 10 % FCS-t tartalmazó IMDM tenyészeti tápközegben szuszpendáljuk, és 96 üregű szövettenyésztő lemezre üregenként 10⁴ sejt mennyiségben osztjuk szét. Valamennyi üreghez adunk egy standard mintát (melyet a későbbiekben írunk le részletesen) vagy vizsgálandó mintát is, s így a tápközeg végtérfogatát 200 /fL/üreg értékre állítjuk be. Az így elkészített lemezt CO2-OS inkubátorba helyezzük és 37 ’C-on 4 napig inkubáljuk. Az inkubálás 4. napján a tenyésztés befejezése előtt 3 órával valamennyi üreghez 0,1 juCi (3,7 kBq) ¹⁴C-szerotonint adunk, s 37 ’C-on befejezzük az inkubálást. Három órás inkubálás után a lemezt 1000 fordulattal 3 percig centrifugáljuk, s a felülúszót leszívással eltávolítjuk.

percenkénti képződött

A lemez mosása érdekében valamennyi üreghez 0,05 % EDTA-t tartalmazó 200 pl PBS-t adunk, majd a lemezt centrifugáljuk és a felülúszót eltávolítjuk. Ezt a mosási műveletet megismételjük. Az így kapott sejtüledékekhez minden üregbe 200 pl 2 %-os Triton Χ-100-at adunk, majd a sejtek alapos llzálása érdekében a lemezt hozzávetőleg 5-10 percig rázattuk. A kapott sejtlizátum 150 pl-es részét kereskedelemben kapható, süvegalakú szilárd szcintillátorba (Ready Cap, Beckman) helyeztük, melyet a lizátum szárítása érdekében szárítókemencében egy éjszakán át 50 ^eC-on A következő napon a szcintillátort üvegfiolába hogy folyadék-szcintillációs számlálóval tartottunk.

helyeztük, megmérjük a ¹⁴C radioaktivitását.

Ebben az esetben majdnem ugyanazokat az eredményeket kaphatjuk, mint amikor az említett sejtlizátum acetil-kolinészteráz aktivitását Ishibashi és Burstein eljárása szerint (Blood, £Z, 1512-1514, 1986) ¹⁴C-szerotonin beépülés! vizsgálattal mérjük.

Standard minták

A standard minták elkészítéséhez először trombocitopéniás patkányokból vérplazmát készítettünk.

Normális, 7-8 hetes hím Wistar patkányokat a fentebb említett P55 antitest állatonként 0,5 mg dózisban, kb. 24 órás időközzel kétszeri alkalommal történő intravénás beadásával trombocitopéniássá tettünk. A második injekció után kb. 24 órával · éteres altatás közben 10 ml-es fecskendővel (melybe véralvadásgátlóként 1 ml 3,8 térfogat%os trinátrium-citrát oldatot tettünk) a hasi aortából vért vettünk. Az összegyűjtött vérmintát műanyag centrifugáló csövekbe osztottuk szét, és a csöveket a vérplazma frakció kinyerése érdekében 10 percig 1200 x g-vel centrifugáltuk. A kinyert vérplazma frakciót 1200 x g-vel ismét 10 percig centrifugáltuk, s a kialakult vérplazma frakciót kivettük, vigyázva arra, hogy a sejtekből, vérlemezkékből és hasonlókból álló üledéktől mentes legyen, majd összegyűjtöttük. (Az így nyert vérplazmát a továbbiakban TRP néven említjük). A TRP-ből az 1. példában leírt eljárás szerint nyert kalciummal kezelt TRP-t (C standard minta), a WGA-agaróz oszlopon kapott aktív frakciót (W standard minta), illetve a Fenil-Sepharose 6 FF/LS oszlopon kapott aktív frakciót (P standard minta) elegendő térfogatú IMDM tenyészeti tápközeggel szemben alaposan dializáltuk, és vizsgálati standardokként alkalmaztuk.

A patkány TPO 1. példában leírt tisztítási eljárásában a kezdeti szakaszban a C standard mintát alkalmaztuk, amit a tisztítási folyamat felénél a W standard mintára, majd a P standard mintára cseréltünk. A C standard minta specifikus aktivitását próbaképpen egynek vettük, és a W és P standard minták relatív aktivitását a definíció szerint számítottuk ki. Az egyes vizsgálati minták relatív aktivitását a standard minta dózis-reakció görbéjének és a vizsgálanadó • ·

- 79 minták dózis-reakció görbéjének összehasonlításával határoztuk meg, a vizsgálandó minta relatív aktivitását n értékként definiáltuk, amely a C standard minta aktivitásánál n-szer nagyobb aktivitást jelent.

B) Telepvizsgálati rendszer

Ebben a vizsgálati rendszerben a csontvelősejteket a vizsgálandó minta jelenlétében félszilárd tenyésztő tápközegben tenyésztjük, és a Meg-CSF aktivitást a CFU-MK proliferációja és differenciálódása által kialakított megakariocita telepek számának meghatározásával mérjük.

Vizsgálati .aLl ár ás isi_Elkülönítet len_patkány_csontvelősejtek és hasonlók esetében

Elkülönítetlen csontvelősejteket, a fentebb leírt A vizsgálati rendszerben a GpIIb/IIIa* CFU-MK frakció egyes elválasztási lépéseiben kapott sejteket vagy a GpIIb/IIIa* CFU-MK frakció sejtjeit, valamint 10 % FCS-t, 2 mM glutamint, mM nátrium-piruvát oldatot, 50 jJtt

2-merkapto-etanolt és 0,3 %-os agart (AGAR NOBLE, a DIFCO terméke) tartalmazó, 1 ml végtérfogatú IMDM tenyésztő tápközeget 35 mm-es műanyag szövettenyésztő csészébe helyeztünk, szobahőmérsékleten megszilárdítottuk, s 37 °C-on

CO2-0S inkubátorban tenyésztettük. Az elkülönítetlen • · ····

- 80 csontvelősejtek esetében az egyes csészékbe 2-4 x 10° darab, a Percoll sűrűség-gradiens lépésben kapott és a tapadó sejtek számának csökkentésével kapott sejtek esetében 2-5 x 10⁴ darab, a GpIIb/IIIa* CFU-MK frakció sejtjei esetében pedig 0,5-2 x 10³ darab sejtet helyeztünk. A tenyésztés 6. vagy 7. napja után az agarkorongokat kivettük a csészékből és tárgylemezekre (76 mm x 52 mm) helyeztük. Az agarkorongok szárítása érdekében a gél fölé egy darabka 50-_m nylon szitát és szűrőpapírt helyeztünk (ebben a sorrendben). A megszárított agarlapokat 5 percig 50 ’C-on forró lemezen hőkezeléssel rögzítettük, és 2-4 órán keresztül Jackson eljárása (Blood, 42, 413-421, 1973) szerint acetil-kolin-észteráz festőoldatban áztattuk. A megakariociták megfelelő festődésének megállapítása után az agarlapokat vízzel mostuk, szárítottuk, Harris-féle hematoxilin oldattal 30 másodpercig utófestést végeztünk, majd ismét vízzel mostuk és levegőn szárítottuk. A megakariocita telepek definíció szerint három vagy több szorosan . összeálló acetil-kolin-észteráz-pozitív sejtből állnak.

(b) Elkülönítetlen egér csontvelősejtek alkalmazása esetében

A telepvizsgálat a fenti (a) pontban leírt módon, csészénként 2-4 x 10^B darab sejt alkalmazásával végezhető.

Led_Humán csontvelősejtek vagy humán köldökzsinór vérsejtek alkalmazása esetén »·· ··

A humán csontvelősejtek vagy a humán köldökzsinór vérsejtek önmagukban vagy az alábbi módon dúsított CFU-MK frakciókként alkalmazhatók.

Először Lymphoprep-re (a Daiichi Kagaku Co., Ltd. terméke) csontvelő folyadékot vagy köldökzsinór vért rétegzünk és centrifugáljuk, majd a képződött határfelületi leukocita frakciót kinyerjük. Az így kinyert sejtfrakcióból avidinhez kötött mágneses gyöngyökkel eltávolítjuk azokat a sejteket, amelyekhez humán felületi antigénekre (CD2, CDllc és CD19) specifikus biotinilált monoklonális antitestek kötődnek. A mágneses gyöngy eljárással eltávolított sejteket főleg B-sejtek, T-sejtek, makrofágok és a granulociták egy része képezi. A megmaradt sejteket FITC-vel jelölt anti-CD34 antitesttel és PE-vel jelölt anti-HLA-DR antitesttel festjük, majd a CD34- és HLA-DR-pozitív frakciót sejtosztályozóval, pl. ELITE sejtosztályozóval (a COULTER terméke) kinyerjük. Ebben a frakcióban (a továbbiakban

CD34*DR+ CFU-MK frakció) sejteket. A humán sejtek bekoncentráljuk a CFU-MK telepvizsgálata a patkány csontvelősejtek esetében leírt eljárással azonos módon végezhető, azzal a különbséggel, hogy egy csészében 3-5 x 10³ CD34⁺DR'^h CFU-MK frakcióba tartozó sejtet alkalmazunk, a 10 %-os FCS helyett pedig 12,5 %-os humán AB vérplazma és 12,5 %-os FCS elegyét használjuk. A megakariocita telepek a tenyésztési időtartam 12-14 nap. A humán megakariocitákat lúgos foszfatáz kialakításához kimutatáshoz a anti-lúgos foszfatáz antitest eljárással GpIIb/IIIa • · megakariocita felületi antigénre specifikus egér monoklonális antitesttel (pl. Teramura és mtsi, Exp. Hematol., Ifi, 843-848, 1988) festjük, és a három vagy több megakariocitából álló telepeket számoljuk.

C) Humán megakarioblaszt_ge,itvonallal_végzett vizsgálati rendszer (M-07e vizsgálat)

Az M-07e sejtek (egy humán megakarioblaszt sejtvonal) a GM-CSF, IL-3, SCF, IL-2 és hasonlók hatására proliferálódnak (Avanzi és mtsi, J. Cell. Physiol., 145. 458-464, 1990). Mivel ezek a sejtek reagálnak a TPO-ra is, alkalmasak egy patkány CFU-MK vizsgálati rendszert helyettesítő vizsgálati rendszerben való felhasználásra.

Vizsgálati eljárás

A GM-CSF jelenlétében tartott M-07e sejteket kinyerjük, alaposan mossuk, majd 10 % FCS-t tartalmazó IMDM tápközegben szuszpendáljuk. A kapott M-07e sejtszuszpenziót 96 üregű szövettenyésztő lemez üregeibe osztjuk szét (üregenként 10⁴ sejt mennyiségben), és valamennyi üreghez standard mintát vagy vizsgálandó mintát is adunk, ezáltal a végtérfogatot üregenként 200 μΐ-re állítjuk be. Az így elkészített lemezt CO2-OS inkubátorba helyezzük és 37 °C-on 3 napig inkubáljuk. Az inkubálás 3. napja után a tenyésztés befejezése előtt 4 órával valamennyi üreghez 1 ^Ci (37 kBq.) ³H-timidint adunk. A tenyésztés befejezése után a sejteket üvegszálas szűrőn •· ·· · · sejtbetakarító készülék alkalmazásával összegyűjtjük, és a ³H radikoaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval (pl. Béta Plate, Pharmacia) mérjük.

D) Vizsgálati_rendszer._melyben_egér_Pro-B-sej tvonalat alkalmazunk (Ba/F3 vizsgálat)

A Ba/F3 egér Pro-B-sejtvonalról ismert, hogy IL-3, IL-4 és hasonlók hatására proliferálódik (Palacios és mtsi, Cell, 41, 727-734). Mivel BF-TE22 altörzse nemcsak az IL-3 és

IL-4, hanem a TPO hatására is proliferálódik, felhasználható a patkány CFU-MK vizsgálatot vagy a humán megakarioblaszt sejtvonallal végzett vizsgálatot (M-07e) helyettesítő vizsgálati renszerben, az alábbiak szerint. Röviden; Iscoveféle módosított DME tápközegben (IMDM, GIBCO) 1 ng/ml egér IL-3 jelenlétében növesztett BF-TE22 sejteket nyerünk ki, a sejteket háromszor IMDM-mel mossuk, majd 10 % FCS-t tartalmazó IMDM-ben szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót ezután 96 üregű szövettenyésztő lemez üregeibe osztjuk szét (üregenként 10⁴ sejt mennyiségben), és valamennyi üreghez standard mintát vagy vizsgálandó mintát is adunk, ezáltal a végtérfogatot üregenként 200 μΐ-re állítjuk be. Az így elkészített lemezt 5 %-os CO2 inkubátorban 2-3 napig inkubáljuk. Az inkubálás 2. vagy 3. napján valamennyi μΟΐ (37 kBq) ³H-timidint adunk, és a tenyésztést órán keresztül folytatjuk. A sejteket üvegszálas üreghez 1 további 4 szűrőn sejtbetakarító készülék alkalmazásával összegyűjtjük, és a ³H radikoaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval ····

- 84 mérjük. A TPO aktivitást tartalmazó tápközegben tenyésztett sejtek TPO koncentrációtól függő mértékű aktív proliferációt mutatnak, és ³H-timidint építenek be. E vizsgálat adatai megfelelnek az M-07e és CFU-MK vizsgálattal kapott adatoknak.

Az alábbi példákat a találmány további bemutatása érdekében írjuk le.

1-1 példa

Patkány TPO tisztítása anti-vérlemezke antitest beadásával indukált trombocitopéniában szenvedő patkányok vérplazmád ábó 1

Vérplazma készítése anti-vérlemezke_antitest_beadásával indukált trombocitopéniában szenvedő patkányokból

A hivatkozási példa A) részében leírt patkány megakariocita őssejt (CFU-MK) vizsgálati rendszer eljárásainak megfelelően kb. 1000 patkányból TRP-t tisztítottunk.

Patkány TPO tisztítása TRP-ből

Először kb. 1000 patkány TRP-jenek alkalmazásával végeztük a tisztítást, azzal a feltevéssel, hogy a TRP TPO-tartalma legfeljebb 1 : 3 000 000 lehet, és valamivel kevesebb, mint 1 pmól részlegesen tisztított TPO-t kaptunk. Bár rendszerint bonyolult, kísérletet tettünk a TPO részleges aminosav• ··

- 85 szekvenciáinak meghatározására, és — bár kis pontossággal — három részleges aminosav-szekvenciát kaptunk. E szekvenciák megegyeztek vagy hasonlóak voltak a májban termelődő szerin proteáz inhibitor (SPI) aminosavszekvenciájával. Ezen eredményekből nem volt világos, hogy a TPO a szerin proteáz inhibitoréhoz hasonló szerkezettel rendelkezik-e, vagy a szekvenciák a TPO-tól eltérő szennyező proteinektől származnak. E bizonytalan eredetű szekvenciák alkalmazásával patkány cDNS könyvtárból TPO gén klónoztunk, de potenciális TPO-kódoló géneket nem kaptunk. Ezek után intenzív vizsgálatokat végeztünk azon feltevés alapján, hogy a klónozás sikertelensége az analizált minta alacsony tisztaságának és elégtelen mennyiségének volt köszönhető. Az aminosav-analízishez szükséges tisztított minta előállítása érdekében a következő 1-2 példában leírt tisztítást végeztük el. Az 1-2 példában kapott eredményekből meglepő módon az állapítottuk meg, hogy a a TRP-ben vagy XRP-ben (amit a későbbiekben írunk le) a TPO-tartalom rendkívül kicsi; a vérplazma teljes proteintartalmára vonatkoztatva egy a százmilliótól egy az egybillióig terjed, így teljes tisztítása rendkívül nehéz.

1-2 példa

Patkány TPO tisztítása az egész testfelület röntgensugaras vagy gamma-sugaras kezelésével indukált trombocitopéniában szenvedő patkányok vérplazmájából

Vérplazma_készítése az egész testfelület röngensusaras vagy • «

- 86 gamma-sugaras kezelésével_Indukált_trombocitopéniában szenvedő patkányokká!

Normális, 7-8 hetes hím Wistar patkányokban egész testfelületük szubletális dózisban (6-7 Gy) végzett röntgensugárzásos vagy gamma-sugárzásos kezelésével trombocitopéniát indukáltunk. A besugárzás utáni 14. napon a patkányok vérét összegyűjtöttük, és a TRP-hez fentebb leírt módszer szerint vérplazma frakciót (a továbbiakban XRP) készítettünk.

Ebben az esetben a tisztításhoz kb. 1100 patkányból készített XRP-t (kb. 8 liter) alkalmaztunk.

Patkány TPQ tisztítása XRP-ből elérte a 493 000 mg-ot. tisztítási lépésekben

A kb. 1100 patkány vérplazma mintája egyszerre történő feldolgozáshoz túl sok volt, mivel teljes proteintartalma

Emiatt a vérplazma mintát az 1-4.

tételre osztottuk, melyek mindegyike kb. 100 patkánynak felel meg. A további 5-7. tisztítási lépésben a mintát hat adagra osztottuk. A 8. tisztítási lépésben és azután a kb. 1100 patkány összes vérplazmájából durván tisztított mintát alkalmaztunk. Az alábbiakban az XW9-es tétel és az XB6-os adag esetében leírjuk az egyes tisztítási lépések jellemző példáit.

A TPO aktivitást mindegyik tisztítási lépésben a hivatkozási • · a

- 87 példában leírt patkány CFU-MK vizsgálati rendszer alkalmazásával mértük. Ha másképpen nem jelezzük, valamennyi tisztítási lépést 4 ’C-on végeztük, kivéve a reverz fázisú kromatográfiákat és a felületaktív anyag jelenlétében végzett Superdex 75gp gélfiltrálást, melyeket szobahőmérsékleten végeztünk. A proteinek vizsgálatát Coomassie festék (a PIERCE által gyártott reagens-rendszer, katalógusszáma 23236X) kötési vizsgálattal vagy bicinchoninsav (a PIERCE által gyártott reagens-rendszer, katalógusszáma 23225) alkalmazásával végzett eljárással végeztük.

A tisztítás vázlatát az 1. táblázatban mutatjuk be.

• ·

1. TÁBLÁZAT

Patkány vérplazma TPO tisztítása

Lépés Teljes Relatív Teljes Kivont protein- aktivitás aktivitás aktivitás mennyiség (mg) (%)

Teljes vérplazma	493000	—	—	—
Ca-kezelt plazma/	480300	2	864600	100
G25
(Ioncsere):
Q-Sepharose FF	314400	9	704000	313
(Lektin) WGA-agaróz	15030	132	1987000	230
(Triazin festék) TSK-	•gél 4236	905	3834000	443
AF-Blue 650MH
(Hidrofób kh.) Fenil-	2762	847	2339000	271
Sepharose 6 FF/LS
(Gélfiltrálás):
S-200HR F3 (kis mól.	TPO) 51	20000	1020000	118
S-200HR F2 (nagy mól.	TPO) 262	7838	2055000	238
Kis molekulatömegű TPO	(az S-200HR F3-ból)
(Gélfiltrálás):
S-200HR F3 (kis mól.	TPO) 50,331	30 20000	1007000	116
(Reverz fázis):
YMC Protein-RP prep.	2,8540	130000	371000	43
(Reverz fázis):
YMC CN-AP	0,3730	800000	298400	35

* ♦

- 89 τ

1. TÁBLÁZAT (folytatás)

Lépés Teljes Relatív Teljes Kivont protein- aktivitás aktivitás aktivitás mennyiség (mg) (%) (Reverz fázis):

Capcell Pák Cl	0,0396	4890000	193600	22
(Elektroforézis):
15 % SDS-PAGE	0,0017	149000000	250300	29
(nem redukáló körűim.	között)
Naev molekulátömesű TPO	(az S-200HR F2-ből)
(Gélfiltrálás) S-200HR F2
(nagy mo1. TPO)	257,0000	7840	2015000	233
(Reverz fázis):
YMC Protein RP prep.	11,4000	227000	2588000	300
(Gélfiltrálás):
Superdex 75pg/CHAPS	1,1660	1750000 .	2041000	236
(Reverz fázis):
YMC CN-AP	0,6200	700000	434000	50
(Reverz fázis):
Capcell Pák Cl	0,0630 20000000	1260000	146
(Elektroforézis):
15 % SDS-PAGE	0,0030 330000000	990000	117
(nem redukáló körűim.	között)

• ·

- 90 (1) A patkány vérplazma kalcium-kloridos kezelése.

centrifugálása és proteáz-inhibitoros kezelése

XW9-es tétel esetében

Körülbelül 100 patkánynak megfelelő, -80 ’C-on tartott XRP-t (742 ml; 54,8 mg/ml protein-koncentráció; 40686 mg összes proteintartalom) felolvasztottunk, és polipropilén centrifugáló csövekbe (Nalgene) adagoltunk. Valamennyi csőbe 100 mM végkoncentrációban kalcium-klorid port adtunk. 4 ’Con egy éjszakáig tartó inkubálás után a kapott elegyet 8000 percenkénti fordulattal 60 percig centrifugáltuk. A kialakult TPO-aktív felülúszóhoz (742 ml; 54,9 mg.ml protein-koncentráció, 40740 mg összes proteintartalom) 1 mM végkoncentrációban pAPMSF proteáz-inhibitort [(p-aminodifenil )-metánszulfonil-f luorid-hidroklorid; a Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 010-10393 katalógusszámú terméke) adtunk. Az így kapott mintát használtuk a következő,

Sephadex G-25 oszlopon végzett puffercserés lépéshez.

Ezen a módon körülbelül 1100 patkányból származó teljes XRP (8814 ml össztérfogat, 493000 összes proteintartalom) kalcium-klorid/pAPMSF kezelését végeztük el, melynek során az XRP-t egyenként kb. 100 patkánynak megfelelő 11 tételre osztottuk, s a kezelést egymás után e tételek mindegyikével elvégeztük. A kapott 11 mintát a következő, Sephadex G-25 oszlopon végzett lépésben egymástól függetlenül kezeltük.

• ·

- 91 (2) Sephadex G-25 (puffercsere)

XW9-es tétel esetében

Az 1. lépésben végzett kalciumos kezelés után kapott felülúszót (742 ml; 54,9 mg/ml protein-koncentráció; 40740 mg összes proteintartalom) 40-70 ml/perc átfolyási sebességgel Sepbadex G-25 oszlopra (Pharmacia Biotech, No. 17-^0033-03, 11,3 cm átmérő, 47 cm töltetmagasság) vittük fel, melyet előzetesen 20 mM Tris-HCl pufferrel (pH = 8) ekvilibráltunk. Az eluálást ugyanezen pufferrel végeztük. A protein eluálása előtt az eluátum 1300 ml-es részét félretettük. Amikor az eluátumokban UV abszorpciót észleltünk, a frakciókat addig gyűjtöttük, míg az elektromos vezetőképesség el nem érte az 500 /íS/cm-t, s így 20 mM TrisHCl pufferrel (pH = 8,0) cserélt TPO-aktív protein frakciót kaptunk (1377 ml; 27,56 mg/ml protein-koncentráció; 37882 mg összes proteintartalom; 93 %-os proteinkitermelés). A frakcióban a TPO relatív aktivitása 2,3 volt.

A minták valamennyi tételének Sephadex G-25 oszlopos kezelésének eredményeként összesen 21117 ml Sephadex G-25 oszlopon TPO-aktív frakciót kaptunk (480300 mg összes proteintartalom; átlagos relatív aktivitás: 2; összes aktivitás: 864600).

(3) Q-Sepharose FF (erős anioncserélő kromatográfia)

XWQ-es tétel esetében

A fenti 2. lépésben a Sepharose G-25 oszlopon kapott TPOaktív frakciót (1377 ml; protein-koncentráció: 27,5 mg/ml; összes proteintartalom: 37841 mg; relatív aktivitás: 2,3) 40 ml/perc átfolyási sebességgel Q-Sepharose FF oszlopra (Pharmacia Biotech, No. 17-0510-01, 5 cm átmérő, 27 cm töltetmagasság) vittük fel, 20 mM Tris-HCl (pH = 8) pufferrel eluáltuk, és az oszlopon átfolyt FI frakciót összegyűjtöttük (3949 ml; protein-koncentráció: 0,98 mg/ml; összes proteintartalom: 3870 mg; relatív aktivitás: 0).

Ezután a puffért 175 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM Tris-HCl-ra (pH - 8) cseréltük, mellyel az F2 TPO frakciót eluáltuk (4375 ml; protein-koncentráció: 5,36 mg/ml).

Végül 1000 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM Tris-HCl pufferrel (pH - 8) az F3 frakciót eluáltuk (1221 ml; proteinkoncentráció: 3,9 mg.ml; összes proteintartalom: 4783 mg;

3,8). Az F2 TPO-aktív frakció összes 23440 mg-nak találtuk, s az F2 proteinkitermelése ebben a lépésben 61,9 %-os volt. A TPO relatív aktivitás:

proteintartalmát relatív aktivitása ráadásul 6,8-re emelkedett.

A Sephadex G-25 oszlopon TPO-aktív frakciók összes tételét Q-Sepharose FF oszlopon átengedve összesen 35842 ml Q93

Sepharose FF TPO-aktív F2 frakciót kaptunk (összes proteintártalom: 314384 mg; átlagos relatív aktivitás: 9;

összes aktivitás: 2 704 000).

(4) Búzacsíra agglutinin (WGA)-Agarose (lektin-affinitás kromatoeráfla)

XW9-es tétel esetében

A fenti 3. lépésben Q-Sepharose FF kezeléssel kapott TPOaktív F2 frakciót három részre osztottuk és 5 ml/perc átfolyási sebességgel WGA-Agarose oszlopra (a Honén Corp. 800273 katalógusszámú terméke; átmérő: 5 cm; töltetmagasság: 22,5 cm) vittük fel, és Dulbecco-féle izotóniás foszfátpufferrel (DPBS) eluáltuk. Az oszlopon átfolyt FI frakciót összegyűjtöttük (9336 ml; protein-koncentráció: 2,30 mg/ml; összes proteintartalom: 21407 mg; relatív aktivitás: 6,9).

A puffért ezzután 0,2 M N-acetil-D-glükóz-amint (GlcNAc; a Nacalai tesque 005-20 katalóguszámú terméke), 150 mM NaCl-ot és 0,02 % nátrium-az időt tartalmazó 20 mM nátrium-foszfát pufferre cseréltük, a kapott eluátumokat összegyűjtöttük és ultrafiltráló készülékkel (Omega Ultrasette, névleges molekulatömeg-átengedési határ: 8000 D; a Filtron terméke) bekoncentráltuk, miáltal az F2 WGA-Agarose TPO-aktív frakciót kaptuk (2993 ml; 0,376 mg/ml protein-koncentráció).

Az F2 TPO-aktív frakció Összes proteintartalma 1135 mg volt, kitertmelése pedig e lépésben 4,8 %. A TPO relatív aktivitása ráadásul 101-re emelkedett. Az így kapott F2 frakciót -80 ’C-on tároltuk.

A Q-Sepharose FF TPO-aktív F2 frakciók összes tételét WGA-Agarose oszlopon kezelve összesen 33094 ml WGA-Agarose TPO-aktív F2 frakciót kaptunk (összes proteintartalom: 15030 mg; átlagos relatív aktivitás: 132; összes aktivitás:

987 000).

(5) TSK-aél AF-BLUE 650.-MH.Ctriazinf esték-affinitás kromatográfia

XB6-qs adag, esetében

Az XW8-as tétel WGA-Agarose-on adszorbeálódó TPO-aktív frakcióját és az XW9-es tétel WGA-Agarose-on adszorbeálódó TPO-aktív F2 frakcióját (melyeket a fenti 4. lépésben 215 patkánynak megfelelő XRP-ből nyertünk) elegyítve az XB6-os kevert adagot kaptuk (5947 ml; protein-koncentráció: 0,388 mg/ml; összes protein: 2319 mg; relatív aktivitás: 150).

Az elegyített minta 5974 ml-nyi részét 1000 ml-re vonatkoztatva 0,85 mól NaCl-dal (összesen 296,76 g) elegyítettük, miáltal 6132 ml 0,822 M NaCl-koncentréciójú oldatot kaptunk, s ezt 7 ml/perc átfolyási sebességgel TSKgél AF-BLUE 650 MH oszlopra vittük fel (TOSOH CORP., katalógusszám: 08705; átmérő: 5 cm; töltetmagasság: 23 cm), melyet előzetesen 1 M NaCl-ot tartalmazó 20 mM nátriumfoszfát pufferrel (pH = 7,2) ekvilibráltunk.

átfolyási sebességgel összegyűjtöttük és

A felvitel befelyezése után a proteint 1M NaCl-ot tartalmazó 20 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH = 7,2) 10 ml/perc eluáltuk. A kapott eluátumokat ultrafiltrációs készülék (Omega

Ultrasette, névleges molekulatömeg-átengedési határ: 8000 D) alkalmazásával bekoncentráltuk, miáltal az FI átfolyt frakciót kaptuk (543 ml, protein-koncentráció: 2,05 mg/ml; összes proteintartalom: 1112 mg; relatív aktivitás: 31).

Az eluáló puffért ezután 2M NaSCN-ra cseréltük, és TSK-gel AF-BLUE 650 MH oszlopon adszorbeálódó TPO-aktív F2 frakciót eluáltunk (1427 ml; protein-koncentráció: 0,447 mg/ml).

Az F2 TPO-aktív frakció összes proteintartalma 638 mg, a proteinkitermelés pedig 27,5 % volt. A TPO relatív aktivitása 1500-ra emelkedett.

A WGA-Agarose oszlopon adszorbeálódó TPO-aktív F2 frakció valamennyi adagját TSK-gel AF-BLUE 650 MH oszlopon kezelve összesen 10655 ml TSK-gel AF-BLUE 650 MH TPO-aktív F2 frakciót kaptunk (összes proteintartalom: 4236 mg; átlagos relatív aktivitás: 905; összes aktivitás: 3 834 000).

(6) Fenil-Senharose 6 FF/LS (hidrofób kölcsönhatási kromatográfia

XB6-OS adag esetében

A TSK-gel AF-BLUE 650 MH TPO-aktív F2 frakció 1424 ml-nyi részét (protein-koncentráció: 0,477 mg/ml; összes proteintartalom: 638 mg; relatív aktivitás: 1500) 1000 ml-re vonatkoztatva 1,5 mól ammónium-szulfát porral (összesen

282.2 g) elegyítettük, miáltal 1581 ml 1,35 M ammóniumszulfát koncentrációjú oldatot kaptunk.

Ezt az oldatot 7 ml/perc átfolyási sebességgel Fenil-Sepharose 6 FF (Low Sub) oszlopra (Pharmacia Biotech, katalógusszám: 17-0965-05; átmérő 5 cm; töltetmagasság: 10 cm) vittük fel, melyet előzetesen 1,5 M ammónium-szulfátot tartalmazó 50 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH = 7,2) ekvilibráltunk. Az oldat felvitelének befejezése után az eluálást 10 ml/perc átfolyási sebességgel 0,8 M annóniumszulfátot tartalmazó 36 mM nátrium-foszfát pufferrel végeztük. A kapott eluátumokat (kb. 3610 ml) összegyűjtöttük és ultrafiltrációs egység (Omega Ultrasette, névleges molekulatömeg-átengedési határ: 8000 D) alkalmazásával bekoncentráltuk, miáltal az FI frakciót kaptuk (485 ml; protein-koncentráció: 0,194 mg/ml; összes proteintartalom;

94.2 mg; relatív aktivitás: 0).

Ezután az eluáló puffért 20 mM nátrium-foszfát pufferre (pH - 7,2) cseréltük, miáltal az eluált TPO-aktív F2 frakciót (kb. 3500 ml) kaptuk. Az eluált frakciót ultrafiltrációs készülék (Omega Ultrasette, névleges molekulatömeg• » * ·

- 97 átengedési határ: 8000 D) alkalmazásával bekoncentráltuk, s a vizsgálathoz mintát vettünk. E ponton az TPO-aktív F2 frakció protein-koncentrációja 1,45 mg/ml, összes proteintartalma 319 mg, proteinkitermelése pedig 50,0 % volt. A TPO relatív aktivitása 1,230 volt.

A TSK-gel AF-BLUE 650 MH oszlopon TPO-aktív F2 frakciók valamennyi adagját Fenil-Sepharose 6 FF/LS oszlopon átengedve összesen 1966 ml Fenil-Sepharose 6 FF/LS TPO-aktív F2 frakciót kaptunk (összes proteintartalom: 2762 mg; átlagos relatív aktivitás: 847, összes aktivitás: 2 339 000) (7) Sephacrvl S-200 HR (gélfiltrációs kromatoaráfia)

XB6-os adag esetében (vö. 1. ábra)

A Fenil-Sepharose 6 FF/LS oszlopon kapott TPO-aktív F2 frakciót (217 ml; protein-koncentráció: 1,45 mg/ml; összes proteintartalom: 315 mg; relatív aktivitás: 1230) 144,8 ml

5M NaCl oldattal elegyítettük, miáltal 362 ml 2M NaClkoncentrációjú oldatot kaptunk, s ' ezt az oldatot YM 3 membránnal (76 mm átmérő; az Amicon Corp. terméke) ultrafiltráló készülék alkalmazásával 50 ml-re koncentráltuk.

Ehhez az oldathoz azonos térfogatú 8 M karbamidot adtunk, miáltal kb. 100 ml 1 M NaCl-ot és 4 M karbamidot tartalmazó oldatot kaptunk. A kapott oldatot kb. 80 ml-re • ·

- 98 koncentráltuk, 88,78 ml-es mintát készítettünk belőle, majd Sephacryl S-200 HR oszlopra (a Pharmacia Biotech 17-0584-01 katalógusszámú terméke; átmérő; 7,5 cm; töltetmagassága 100 cm) vittük fel.

Az eluálást 3 ml/perc átfolyási sebességgel DPBS-sel végeztük, s az eluátumokat 1200 ml üres eluálófolyadék levétele után 45 ml-es részletekben 60 polipropilén csőbe gyűjtöttük. Minden második csővel elvégeztük a vizsgálatot, s a többit -85 °C-on tároltuk, míg az 1100 patkányból származó valamennyi minta Sephacryl S-200 HR kezelését el nem végeztük. A vizsgálati eredmények alapján az XB6-os adag frakcióit az alábbiak szerint csoportosítottuk:

(FI) 1-15. cső; az üres eluálófolyadék után lejött frakciók;

		molekulatömeg:	94	000 vagy több;
(F2)	16-26.	cső; molekulatömeg:	94	000-33 000;
(F3)	27-44.	cső; molekulatömeg:	33	000-3 000;
(F4)	45-55.	cső; molekulatömeg:	3	000 vagy kisebb.

A Fenil-Sepharose 6 FF/LS TPO-aktív F2 frakciók valamennyi adagját külön-külön Sephacryl S-200 HR oszlopra vittük, megvizsgáltuk és -85 °C-on tároltuk. Valamennyi adag Sephacryl S-200 HR oszlopon végzett kezelésének befejezése után, és közvetlenül a következő reverz fázisú kromatográfiás lépés (YMC-Pack PROTEIN-RP) előtt a tárolt mintákat felolvasztottuk és YM 3 membránnal (76 mm átmérő, Amicon) felszerelt ultrafiltráló készülékben bekoncentráltuk, miáltal az alábbi két mitát kaptuk. A Sephacryl S-200 HR kezeléssel kapott TPO-aktív F2 mintát a továbbiakban “nagy molekulatömegű F2 TPO mintának, az F3 mintát pedig kis molekulatömegű F3 TPO mintának nevezzük.

A nagy molekulátömegü F2 TPO mintát és a kis molekulatömegű F3 TPO mintát a gélfiltrációs kromatográfia különböző elúciós területeiről összegyűjtött frakciók, s emiatt a nagy molekulatömegű és kis molekulatömegű kifejezés nem valódi molekulatömegüket jelenti.

Molekulatömeg össztérfogat

Bekoncentrálás

Nagy molekulatömegű

F2 TPO minta

94000 - 33000

3420 ml

293 ml mg

838

055 000 utáni össztérfogat összes proteintartalom 262 Átlagos relatív aktivitás összes aktivitás

Kis molekulatömegű

F3 TPO minta

33000 - 3000

6480 ml

280 ml

51,3 mg

000

020 000

A kis molekulatömegű F3 TPO mintát és a nagy molekulatömegű F2 TPO mintát a következő lépésekkel külön-külön tisztítottuk.

A kis molekulátömegü F3 TPO mintát tisztítását az alábbi 8-11. lépésekben írjuk le.

- 100 (8) YMC-Pack PROTEIN-RP (reverz fázisú kromatografia)

A 7. lépésben kapott kis molekulatömegű F3 TPO mintát (összes proteintartalom: 50,3 mg; protein-koncentráció: 0,184 mg/ml; relatív aktivitás: 20 000; összes aktivitás: 1 007 000; össztérfogat: 274 ml) A oldószerrel (0,025 %-os trifluor-ecetsav (TFA)) és B oldószerrel (0,025 % TFA-t tartalmazó 1-propanol) elegyítettük, miáltal 508,63 ml Össztérfogatú, kb. 20 % propanol-, 0,012 % TFA- és 0,0989 mg/ml protein-koncentrációjú oldatot kaptunk. Az ezen oldat készítésekor képződött oldhatatlan anyagokat centrifugálással különítettük el, s a kapott felülúszót két, egyenként 254,3 ml térfogatú (25,2 mg proteintartalmú) részre osztottuk, s 2 ml/perc átfolyási sebességgel YMC-Pack PROTEIN-RP oszlopra (az YMC A-PRRP-33-03-15 katalógusszámú terméke; átmérő: 3 cm; töltetmagasság: 7,5 cm) vittük fel, melyet előzetesen 30 % B oldószerrel ekvillbráltunk. A centrifugálásból származó csapadékot 5 mM CHAPS-t (3-[3-kolamido-propil)-dimetil-ammónia]-l-propán-szulfonát; a Dojindo Laboratories 75612-03-3 katalógusszámú terméke) tartalmazó 20 ml 20 mM nátrium-acetátban (pH = 5,5) feloldottuk, és ezt az oldatot is felvittük az oszlopra.

A minta feltöltése után 50 ml oldószert (A és B oldószer 3:1 arányú elegye) engedtünk át az oszlopon, miáltal átfolyt frakciót kaptunk.

Ezután kromatografáló programot indítottunk el (120 perc, lineáris gradienssel 30 %-os B oldattól 45 %-os B oldatig), s az eluátumokat 10 ml-es

101 részletekben 36 polipropilén csőben gyűjtöttük össze. Ezt az eljárást a megmaradt mintával megismételtük, miközben az előző gyűjtőcsöveket használtuk, s így össszesen 36, egyenként 20 ml eluátumot tartalmazó csövet kaptunk. Az átfolyt frakciót ultrafiltráló készülékben YM 3 membránnal (76 mm átmérő, Amicon Corp.) közvetlenül 20 ml-re koncentráltuk.

Mindegyik átfolyt frakcióból 0,1 ml-nyi részletet, és az 1-36. csövek 20 ml-es frakcióit 20 pl 5 %-os BSA-val elegyítettük, bepárlássál szárítottuk, 0,25 ml IMDM vizsgálati

TPO-aktív feloldottuk, majd a tenyésztő tápközegben frakciók meghatározása érdekében vizsgáltuk.

A 17-27. számú frakciókban (36,0 % - 43,0 % propanolkoncentráció-tartomány) TPO aktivitást találtunk, s ezeket elegyítve a kis molekulatömegű F3 TPO mintából származó YMCPack PROTEIN-RP TPO-aktív F2 frakcióként alkalmaztuk. Ezt a frakciót a következő YMC-Pack CN-AP lépésben való felhasználásig -85 °C-on tartottuk.

Kis molekulatömegű F3 TPO mintából származó YMC-Pack

PROTEIN-RP TPO-aktív F2 frakció:

össztérfogat:

Protein-koncentráció:

összes proteintartalom

Relatív aktivitás:

220 ml

0,0130 mg/ml

2,85 mg

130 000 összes aktivitás:

371 000 • · * «- 102 (9) YMC-Pack CN-AP (reverz fázisú kromatográfia)

A fenti 8. lépésben kapott, kis molekulatömegű F3 TPO mintából származó YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-aktív F2 frakció

214,9 ml-nyi részletét (összes proteintartalom: 2,79 mg; protein-koncentráció: 0,0130 mg/ml; relatív aktivitás:

130 000; összes aktivitás: 36300) 0,6 ml 50 %-os glicerinnel elegyítettük és 1,8 ml-re koncentráltuk. A koncentrátumot végül 5 ml térfogatra egészítettük ki, amely 20 % vagy kevesebb propanolt és kb. 6 % glicerint tartalmazott.

A koncentrátumot a következő oszlopkromatográfiás műveletben való alkalmazáshoz 5 részre osztottuk (mindegyik művelethez 0,555 mg protein és 1 ml térfogat). Az így szétosztott mintákat 0,6 ml/perc átfolyási sebességgel YMC-Pack CN-APvel töltött oszlopra (az YMC AP-513 katalógusszámú terméke; átmérő 6 mm; töltetmagasság 250 mm) vittük fel, melyet előzetesen 15 %-os B oldószerrel ekvilibráltunk (A oldószerként 0,1 %-os TFA-t, B oldószerként pedig 0,05 % TFA-t tartalmazó 1-propanolt alkalmazva). A felvitel után a propanol koncentrációját a 15 %-os B oldat-koncentrációról 25 %-ra növeltük, s 65 percig 25 % - 50 % B oldatkoncentráció közötti lineáris gradienssel kromatografáltunk. Az utolsó, ötödik kromatografálás befejezése után az előbbivel megegyező összetételű, proteint nem tartalmazó 1 ml oldatot vittünk fel az oszlopra, s az oszlopban maradt TPO aktivitás kinyerése érdekében azonos módon kromatografáltuk. Mivel a hat kromatografálás eluátumainak • ·

- 103 összegyűjtéséhez ugyanazokat a polipropilén csöveket használtuk, összesen 44 darab, egyenként 7,2 ml eluátumot tartalmazó csövet kaptunk. A így kapott frakciók mindegyikének 30 pl-es részét (az egyes frakciók 1/240-ed része 20 μΐ BSA-val elegyítettük, bepárlássál szárítottuk, 0,25 ml IMDM vizsgálati tenyésztő tápközegben feloldottuk, majd a TPO-aktív frakciók meghatározása érdekében vizsgáltuk. A 28-33. csövekben (37,0 % - 42,0 % propanolkoncentráció) erős TPO aktivitást találtunk. E frakciókat elegyítve a kis molekulatömegű F3 TPO mintából származó YMCPack CN-AP fő TPO-aktív FA frakcióként alkalmaztuk.

Kis molekulatömegű F3 TPO

TPO-aktív FA frakció:

össztérfogat:

Protein-koncentráció:

összes proteintartalom:

Relatív aktivitás:

összes aktivitás:

mintából származó YMC-Pack CN-AP

43,20 ml

0,00863 mg/ml 0,373 mg

800 000

298 400 (10) Capcell Pák Cl 300 (befejező reverz fázisú kromatoaráfia)

A fenti 9. lépésben kapott, kis molekulatömegű F3 TPO mintából származó 43,20 ml TPO-aktív FA frakciót (összes proteintartalom: 0,372 mg; protein-koncentráció: 0,00863 mg/ml; relatív aktivitás: 800 000; összes aktivitás: 297500) 0,2 ml 50 %-os glicerinnel elegyítettük, és bekoncentrálva • ·

• · · · ·

- 104

0,1 ml glicerin-oldatot kaptunk.

Ezt az oldatot az A oldószer (0,1 % TFA) és a B oldószer (0,05 % TFA-t tartalmazó 1-propanol) 85:15 arányú elegyéből (15 % B) álló 2 ml oldattal elegyítettük, miáltal 2,1 ml, 14 % propanolt, kb. 4,8 % glicerint és 0,177 mg/ml proteint tartalmazó mintát kaptunk. Az így elkészített mintát Capcell Pák Cl 300A-val töltött oszlopra (a Siseido Co. Ltd. Cl Type:SG300A katalógusszámú terméke; átmérő: 4,6 mm; töltetmagasság: 250 mm) vittük fel, melyet előzetesen 15 %-os B oldószerrel ekvilibráltunk, és 0,4 ml/perc átfolyási sebességgel 65 percig 27 % és 38 % B oldószer-koncentráció közötti lineáris gradiennsel kromatográfáltuk. Az eluátumokat 0,6 ml-es részletenként 72 darab polipropilén csőbe gyűjtöttük.

Az így kapott frakciók mindegyikének 3 jul-nyi részét (az egyes frakciók 1/200-ad része) 20 μΐ 5 %-os BSA-val elegyítettük, a tápközeget 225 μΐ IMDM vizsgálati tenyésztő tápközegre cseréltük, s így 75-szeresére hígított frakciót vizsgáltunk.

Az elektroforézishez az egyes frakciók 1 pl-nyi részét (1/600 rész) mértük ki, bepárlással szárítottuk, és 95 °C-on 5 percig 10 μΐ SDS-PAGE-hez való nem redukáló mintapuff errel kezeltük. Az így kezelt mintát előregyártott 15-25 %-os SDS-poliakril-amid gél (Dalichi Pure Chemicals Co., Ltd.) alkalmazásával SDS-PAGE analízisnek vetettük alá, majd

105

2D-Silver Stain-II DAIICHI ezüstfestési készlettel (a

Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. 167997 katalógusszámú terméke; a továbbiakban ezüstfestési készlet”) festettük. Molekulatömeg-markerekként [DAIICHI]-III kis molekulatömegű markereket alkalmaztunk (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., katalógusszám: 181061; a továbbiakban DPCIII).

A fenti vizsgálat eredményeként a 35-43. csövekben lévő frakciókban (30,0 % - 32,5 % propanolkoncentráció-tartomány) jelentős TPO aktivitást találtunk. Ezek közül a 36-42. csövekben lévő frakciókat (30,5 % - 32,0 % propanolkoncentráció-tartomány) elegyítettük, és fő TPO-aktív FA frakcióként alkalmaztuk. Az eredményeket a 2. ábrán mutatjuk be.

Amikor a kromatogramról levezetett proteintartalmat összehasonlítottuk a vizsgálati eredményekkel, az így kapott frakcióról azt állapítottuk meg, hogy összes proteintartalma 39,6 ug, protein-koncentrációja 9,4 ^íg/ml, relatív aktivitása 4890000, összes aktivitása pedig 193600.

A 36-42. TPO-aktív frakciók SDS-PAGE mintázatainak vizsgálatával olyan sáv jelenlétét mutattuk ki, melynek festési denzitása összefüggést mutat az aktivitás nagyságával. Ráadásul e nem redukált sáv látszólagos molekulatömegét ugyanazon gélen lévő standard molekulatömegű (redukált) proteinekkel összehasonlítva 17000 és 19000 D közötti értékben állapítottuk meg, ami azt jelenti, hogy minden valószínűség szerint ez a sáv képviseli a TPO-t.

·· ··♦« ·· *· • * · · · • · · · *· • « · · · ·-* · »· ·< ··

- 106 (11) A TPO-aktív protein kivonása az elektroforézis gélről (15 % SDS-PAGE)

A TPO-aktív FA frakció analízisének példája

A kis molekulatömegű F3 TPO mintából származó, 10. lépésben kapott PTO-aktív FA frakció 4200 μΐ-éből (összes proteintartalom: 39,6 /jg; protein-koncentráció: 9,4 Aíg/ml;

relatív aktivitás: 4 890 000; összes aktivitás: 193 600) az aktív protein kivonásához 5,5 pl-t (1/764 rész), az ezüstfestéshez pedig 2,5 pl-t (1/1680 rész) megfelelő csövekbe tettünk, ezeket bepárlássál szárítottuk, 37 ^eC-on 1 órán keresztül 10 jjI SDS-PAGE-hez való nem redukáló mintapufferrel reagáltattuk, majd az SDS-reakció lejátszódása érdekében szobahőmérsékleten 18 óra hosszat állni hagytuk.

Molekulatömeg-markerként előfestett Low Rangé Markert (BioRad Laboratories, Inc., 161-0305) és az fentebb említett DPCIII-at alkalmaztuk. Microslab gél alkalmazásával a minták %-os SDS-PAGE analízisét 4 ’C-on általánosan alkalmazott eljárás (Laemmli, Natúré, 227. 680-685, 1970) szerint végeztük. Az elektroforézis befejezése után az ezüstfestéssel vizsgálni kívánt géldarabokat szikével azonnal kivágtuk, fixáló oldatba helyeztük, majd a fentebb említett ezüstfestési készlettel megfestettük.

Ettől függetlenül, a gél aktivitás kimutatásához használni kívánt molekulatömeg-tartományba eső részeit szikével 34

107 ·« ·· ♦· i · » · « kötet, 9, kiadványa) szeletre daraboltuk (az egyes szeletek 1,5-2,5 mm szélesek voltak), és ezeket Kobayashi némileg módosított eljárásával szétzúztuk (Kobayashi, M. , Seikagaku (Biochemistry), 59.

szám. 19S7; a Japanese Blochemical Society Az apró darabokra zúzott gélszeleteket 0,3 ml extraháló pufferrel (20 mM Tris-HCl, pH = 8; 500 mM NaCl; 0,05 % BSA) elegyítettük, és az elegyet 4 ’C-on hat óra hosszat rázattuk.

Az elegyhez 20 mM végkoncentrációban 500 mM kálium-foszfátot (pH = 6,8) adtunk. 4 ’C-on egy óráig végzett rázatás után a kapott elegyet Ultra Free C3GV 0,22 pm filtráló készülékbe (Millipore Corp., UFC3 OGV OS) tettük, és a kicsapódott SDS eltávolítása és a felülúszó folyadék kinyerése érdekében 15 percig 1000 x g-vel (4000 percenkénti fordulattal) centrifugáltuk. A szűrletet Ultra Free C3-LGC ultrafiltráló készülékbe (Millipore Corp., UFC3 LGC 00; névleges molekulatömeg-átengedési határ: 10000 D) helyeztük, és 3000 x g-vel (7000 percenkénti fordulattal) centrifugáltuk. Amikor a bekoncentrált oldat térfogata kb. 50 μΐ-t ért el, 300 μΐ 20 mM nátrium-foszfát puffért (pH = 7,2) adtunk hozzá, és ismételten ultrafiltráltuk.

A megmaradt SDS eltávolítása érdekében az ultrafiltrálást 300 jul 20 mM nátrium-foszfát puffer alkalmazásával kétszer megismételtük. Ezek után a minta (300 μΐ) készítéséhez való vizsgálati tenyésztő tápközegre cserélés érdekében hasonló lépést ismételtünk. A mitát azután sterilizáltuk és mértük

- 108 »··· ·· *·«« ·» ·· • * t · t · · ♦ ♦ · » ·· • · · · · · ···· ·« 4» ·»

TPO aktivitását.

Az eztüstfestéssel tisztán három protein sávot detektáltunk, melyek látszólagos molekulatömeg a DPCIII molekulatömeg markerek alapján 17000-19000, 14000 és 11000 volt.

Az előző 10. lépésben a Capcell Pák Cl oszlop TPO-aktív frakciójának elektroforézisével az aktivitás nagysága és a festés denzitása között összefüggést mutató sávot figyeltünk meg, amely 17000 és 19000 D közötti látszólagos molekulatömeggel rendelkezett. A 11. lépésben a TPO aktivitást szintén a 17000 és 19000 D közötti látszólagos molekulatömegű sávban mutattuk ki (vö. 3. ábra).

A fenti eredmények alapján bebizonyosodott, hogy a TPO-aktív proteint elektroforézis gélen kimutatható szinten tisztítottuk a Capcell Pák Cl 300A oszlopon. A 15 % SDS-PAGE analízissel kapott sáv ezüstfestéses denzitása alapján a lehetséges TPO protein (melynek látszólagos molekulatömege kb. 17000-19000 D) mennyisége az egész TPO-aktív frakcióban kb. 1,7 pg-nak adódott.

A nagy molekulatömegű F2 TPO minta tisztítását az alábbi 12., 13., 14. és 15. lépésben írjuk le.

(12) YMC-Pack PRQTEIN-RP (reverz fázisú kromatoeráfia)

A 7. lépésben kapott nagy molekulatömegű F3 TPO mintát

109 ···· ·» ·«·· ·· ·· • · · · · » · * • · « · · ·♦ ··· · ♦ · ♦ · ·* ·*·· ·« «· «» (összes proteintartalom: 257 mg; protein-koncentráció: 0,894 mg/ml; relatív aktivitás: 7840; összes aktivitás: 2015000; össztérfogat: 287 ml) 95,8 ml (a minta 1/3 része) B oldószerrel (0,025 % TFA-t tartalmazó 1-propanol) elegyítettük, miáltal 383 ml 25 % propanol-, 0,006 % TFA- és 0,671 mg/ml protein-koncentrációjú oldatot kaptunk. A oldószerként 0,025 %-os TFA-t alkalmaztunk. A minta elkészítésekor képződött oldhatatlan anyagokat centrifugálással különítettük el, s a felülúszót hat, egyenként 62,3 ml térfogatú (42,8 mg proteintartalmú) részre osztottuk, és 2 ml/perc átfolyási sebességgel YMC-Pack PROTEIN-RP-vel töltött oszlopra (az YMC A-PRRP-33-03-15 katalógusszámú terméke; átmérő: 3 cm; töltetmagasság: 7,5 cm) vittük fel, melyet előzetesen 30 % B oldószerrel ekvilibráltunk. A centrifugáláskor kapott csapadékot 5 mM CHAPS-t tartalmazó 10 ml 20 mM nátrium-acetátban (pH = 5,5) feloldottuk, és ezt az oldatot is felvittük az oszlopra.

A minta felvitele után kb. 50 ml oldószert (3:1 arányú A:B oldószer-elegy) engedtünk át az oszlopon, miáltal átfolyt frakciót kaptunk. A kromatografálást 30 % és 45 % B oldószer-koncentráció közötti lineáris gradienssel 120 percig végeztük, s az eluátumokat 15 ml-es részletekben 24 darab polipropilén csőbe gyűjtöttük össze. Ezt az eljárást mind a hat szétválasztott minta esetében megismételtük, melynek során ugyanazokat a csöveket használtuk, s így összesen 24 darab, egyenként 90 ml eluátumot tartalmazó csövet kaptunk. Az átfolyt frakciót és az 1. csőben lévő

110 ···· ·« ·*·9 ·· ** • · « · 4 ·>« « • · <·«··* • · · ···« · «· ···· ·* ·· 4« frakciót elegyítettük, és 76 mm átmérőjű YM3 membránnal (Amicon Corp.) felszerelt ultrafiltráló készülék alkalmazásával 90 ml-re koncentráltuk.

Valamennyi átfolyt frakció, valamint az 1. frakció 0,3 miét, valamint a 2-24. csövekben lévő frakciók 0,3 ml-es részleteit 10 pl 5 %-os BSA-val elegyítettük, bepárlással szárítottuk, 0,30 ml IMDM vizsgálati tenyésztő tápközegben feloldottuk, majd a TPO-aktív frakciók meghatározása érdekében vizsgáltuk. A 10-15. frakciókban 34,0-39,5 % propanol-koncentráció-tartomány) TPO-aktivitást észleltünk. Ezeket a frakciókat elegyítettük és nagy molekulatömegű F2

TPO mintából származó YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-aktív F2 frakcióként alkalmaztuk. Ezt a frakciót a következő YMC-Pack

CN-AP lépésben való felhasználásig -85 ’C-on tároltuk.

Nagy molekulatömegű F2 TPO mintából származó YMC-Pack

PROTEIN-RP TPO-aktív F2 frakció:

össztérfogat: 540 ml

Protein-koncentráció: 0,021 mg/ml összes proteintartalom: 11,4 mg

Relatív aktivitás: 227 000 összes aktivitás: 2 588 000 (13) Suoerdex 75 pg (gélfiltrációs kromatoaráfia CHAPS jelenlétében

A 12. lépésben kapott, nagy molekulatömegű F2 TPO mintából

111 ·· ···· ·· • · · · · • · · · • · * · ·«·♦· ·« ·· ·· • » ·· 4» származó YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-aktív F2 frakció (összes proteintartalom: 11,3 mg; protein-koncentráció: 0,021 mg/nl; relatív aktivitás: 227000; összes aktivitás: 2565000) 538,2 ml-ét 0,6 ml 50 %-os glicerinnel elegyítettük, és bepárlással bekoncentráltuk. Ehhez az elegyhez 18 ml 20 mM CHAPS-t adtunk, majd az elegyet kevertük és 41 órán keresztül 4 ’C-on inkubáltuk. Ezután az első mintát felvittük a HiLoad 26/60 Superdex 75 pg-vel töltött oszlopra (Pharmacia Biotech; katalógusszám: 17-1070-01; átmérő: 2,6 cm; töltetmagasság: 60 cm), és 5 mM CHAPS-t tartalmazó DPBSsel 1 ml/perc átfolyási sebességgel eluáltuk. Az egyes minták 4 ml-es részleteit (protein-koncentráció: 0,466 mg/ml; proteintartalom: 1,86 mg) vittük fel az oszlopra.

Ebben az esetben a Superdex 75 oszlopkromatografálást hatszor ismételtük, az YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-aktív frakciót hat részre osztva. Az egyes kromatografálásokkal kapott eluátumokat 5 ml-es részletekben 45 darab csőben gyűjtöttük össze, így a hat oszlopkromatografálás után végül 45, egyenként 30 ml eluátumból álló frakciót kaptunk.

Az egyes frakciók 0,1 ml-nyi részét 10 ul 5 %-os BSA-val elegyítettük, bepárlással szárítottuk, 0,25 ml IMDM vizsgálati tenyésztő tápközegben feloldottuk, majd a TPO-aktív frakciók meghatározása érdekében vizsgáltuk. A 13-31. frakciókban (molekulatömeg-tartomány: 78000-3000) TPO aktivitást találtunk. Ezeket a frakciókat elegyítettük, és a nagy molekulatömegű F2 TPO mintából származó Superdex 75 pg

112

F2 TPO-aktív frakcióként alkalmaztuk.

Nagy molekulatömegű F2 TPO

F2 TPO-aktív frakció:

össztérfogat:

Protein-koncentráció:

összes proteintartalom:

Relatív aktivitás:

összes aktivitás:

mintából származó Superdex 75 pg

540 ml

0,00216 mg/ml

1,17 mg

750 000

041 000 (14) YMC-Pack CN-AP (reverz fázisú kromatográfia)

A 13. lépésben kapott, nagy molekulatömegű F2 TPO mintából származó Superdex 75 pg F2 TPO-aktív frakció 540 ml-ének 513,2 ml-ét (összes proteintartalom: 1,11 mg; proteinkoncentráció: 0,00216 mg/ml; relatív aktivitás: 1750000; összes aktivitás: 1943000) 1/10 térfogat B oldószerrel (0,05 TFA-t tartalmazó 1-propanol) és 0,6 ml/perc átfolyási sebességgel YMC-Pack CN-AP-val töltött oszlopra (YMC; katalógusszám: AP-513; 6 mm átmérő; 250 mm töltetmagasság) vittük fel, melyet előzetesen 15 %-os B oldószerrel (0,1 %-os TFA-t és B oldószert alkalmazva) ekvilibráltunk. A felvitel után a propanol koncentrációját 15 %-os B oldószerkoncentrációról 25 %-os B oldószer-koncentrációra növeltük, s a kromatografálást 65 percig 25 % és 50 % B oldószerkoncentráció közötti lineáris gradienssel végeztük.

Az YMC-Pack CN-AP oszlopkromatográfia megkezdése előtt a • · ·

- 113 osztottuk, végeztük teljes kiindulási minta 1/20 részét kísérleti jelleggel kromatografáltuk, hogy megbizonyosodjunk az aktivitás pontos kinyeréséről. A megmaradt 19/20 részt ezután két mintára s a kromatografálást a két mintával külön-külön el. Más szavakkal, az oszlopkromatografálást háromszor Ismételtük. Mivel a három kromatografálás során az eluátumok összegyűjtéséhez ugyanazt a 44 darab polipropilén csövet használtuk, összesen 44 darab, egyenként 3,6 ml eluátumot tartalmazó csövet kaptunk.

A kapott frakciók mindegyikének 5 μΐ-nyi részét (az egyes frakciók 1/720 részét) 0,25 ml IMDM vizsgálati tenyésztő tápközeggel elegyítettük, majd meghatároztuk a TPO-aktív frakciókat. A 24-30 csövekben lévő frakciókban (36,0 % 42,0 % propanol-koncentráció) jelentős TPO aktivitást észleltünk. E frakciókat elegyítettük, és nagy molekulatömegű F2 TPO mintából származó YMC-Pack CN-AP FA fő

TPO-aktív frakcióként használtuk.

Nagy molekulatömegű F2 TPO

FA TPO-aktív frakció:

össztérfogat:

Protein-koncentráció:

összes proteintartalom:

Relatív aktivitás:

összes aktivitás:

mintából származó YMC-Pack CN-AP

25,20 ml

0,0246 mg/ml

0,620 mg

700 000

434 000 • ·

- 114 (15) Capcell Pák Cl 300 A (befejező reverz fázisú kEQ.matQ.gr. áf ia.)

A 14. lépésben kapott, nagy molekulatömegű F2 TPO mintából származó YMC-Pack CN-AP FA fő TPO-aktív frakció 25,20 ml-ének 24,66 ml-nyi részét (összes proteintartalom: 0,606 mg; protein-koncentráció: 0,0246 mg/ml; relatív aktivitás: 700000; összes aktivitás: 424000) 0,4 ml 50 %-os glicerinnel elegyítettük és bepárlással szárítottuk.

A fenti módon 2 ml koncentrált mintát kaptunk, melynek propanol-koncentrációja néhány százalék, glicerinkoncentrációja 10 %, és protein-koncentrációja 0,303 mg/ml volt. Ezt a mintát Capcell Pák Cl 300A-val töltött oszlopra (Shiseido Co., Ltd., katalógusszám: Cl Type:SG300A; átmérő 4,6 mm; töltetmagasság: 250 mm) vittük fel, melyet előzetesen 15 %-os B oldószerrel, A oldószer (0,1 %-os TFA) és B oldószer (0,05 % TFA-t tartalmazó 1-propanol) alkalmazásával ekvilibráltunk. A kromatografálást 0,4 ml/perc átfolyási sebességgel 27 % és 38 % B oldószerkoncentráció közötti lineáris gradienssel 65 percig végeztük. Az eluátumokat 0,6 pl-es részletekben 72 darab polipropilén csőben gyűjtöttük össze.

Az így kapott frakciók mindegyikének 0,75 pl-nyi részét (az egyes frakciók 1/800 részét) 20 pl 5 %-os BSA-val elegyítettük, a tápközeget 225 pl IMDM vizsgálati tenyésztő tápközegre cseréltük, és egy 300-szorosra hígított frakciót

115 vizsgáltunk.

Az elektroforézishez mintaként az egyes frakciók 2 ul-ét (a frakciók 1/300 részét) használtuk. A mintákat bepárlássál szárítottuk, 95 ’C-on 5 percig 10 pl SDS-PAGE-hez való nem redukáló minta-pufferrel kezeltük, majd 15-25 %-os előregyártott SDS-poliakril-amid gél (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) alkalmazásával SDS-PAGE analízisnek vetettük alá, és a fentebb említett ezüstfestési készlet alkalmazásával festettük. Molekulatömeg markerként az előzőekben leírt

DPCIII-at alkalmaztuk.

A fenti vizsgálat eredményeként a 33-39. csövekben lévő frakciókban (29,5-31,5 % propanol-koncentráció) jelentős TPO aktivitást észleltünk. Ezek közül a 34-39. frakciókat (30,0-31,5 % propanol-koncentráció) elegyítettük, és FA fő

TPO-aktív frakcióként alkalmaztuk. A fő TPO-aktív frakció

SDS-PAGE mintázatának vizsgálatával olyan sáv jelenlétét mutattuk ki, amelynek festődési denzitása összefüggést mutat az aktivitás nagyságával. A sáv látszólagos molekulatömege nem redukáló körülmények mellett 17000 és 19000 közötti, amely azonos a 10. lépésben leírt, kis molekulatömegű F3 TPO mintából származó TPO frakció esetében megfigyelt molekulatömeg-tartománnyal.

116

2. példa

A tisztított patkány TPO részleges aminosav-szekvenciáinak vizsgálata

A 10. tisztítási lépésben Capcell Pák Cl 300A oszlopon kapott TPO-aktív FA frakcióban talált lehetséges patkány TPO protein aminosav-szekvenciájának vizsgálatát Iwamatsu eljárása szerint végeztük (Iwamatsu és mtsi, Shin Kiso Seikagaku Jikken-ho (New Basic Biochemical Experiments), 4, 33-84, kiadó: Maruzen; Iwamatsu, A., Seikagaku (Biochemistry), 63. kötet, 2. szám, 139-143. old., 1991;

Iwamatsu, A., Electrophoresis, 12, 142-147, 1992). A mintát SDS-PAGE analízisnek vetettük alá, és elektromos úton polivinilidén-difluorid (PVDF) membránra vittük át. A PVDF membránon lévő protein redukciója és S-alkilezése után a proteint három proteázzal végzett szisztematikus és lépésenként! In sltu restrikciós enzimes hidrolízissel pepdit-fragmensekké emésztettük, melynek során a kapott fragmenseket minden egyes emésztési lépés után elkülönítettük és reverz fázisú kromatografiával tisztítottuk, és aminosav-szekvenciájukat nagy érzékenységű aminosav-szekvencia meghatározási módszerrel vizsgáltuk. Az alábbiakban részletesebben leírjuk az eljárást.

A lehetséges TPO protein vizsgálata a kis molekulatömegü F3

TPO mintából származó Capcell Pák Cl 300A FA TPO frakcióban (1) A Capcell Pák Cl 300A oszlop FA TPO frakciójának

117 bekoncentrálása (36-42. csövek)

Az aminosav-szekvencia meghatározáshoz az 1. példa 10. lépésében kapott, kis molekulatömegű F3 TPO mintából származó Capcell Pák Cl 300A oszlopon TPO-aktív FA frakció (összes proteintartalom: 39,6 χ/g; protein-koncentráció: 9,4 jjg/ml; relatív aktivitás: 4890000; összes aktivitás: 193000) 4200 μΙ-ének 4151 ul-ét (a teljes frakció 98,8 %-át) használtuk. A kromatogramból leszármaztatott összes protein tömege 39,1 pg volt, amelyből 1,6 pg volt az SDS-PAGE után ezüsttel festett lehetséges TPO protein, melynek látszólagos molekulatömege kb. 17000-19000.

Ezt a mintát glicerinnel elegyítettük és bepárlással bekoncentráltuk, miáltal 5 ul glicerin-oldatot kaptunk. Ehhez SDS-PAGE-hez való nem redukáló puffért és — pH-jának beállítása érdekében — 1M Tris-HCl puffért (pH = 8) adtunk, miáltal kb. 25 ul, 200 mM Tris-HCl-t (pH =8,0), 50 mM TrisHCl (pH = 6,8), 1,1 % SDS-t, 2 mM EDTA-t, 0,02 % bróm-fenolkéket és 30 % glicerint tartalmazó mintát kaptunk.

Az így elkészített mintát 14 óra hosszat szobahőmérsékleten tartottuk, majd a megfelelő SDS-reakció felesleges melegítés nélküli elvégzése érdekében 60 ’C-on 5 percig kezeltük. .

(2) Elektroforézis

Micro-slab géleket készítettünk (4,0 %-os akril-amid

118 felhalmozó gél és 15 %-os akril-amid elválasztó gél), s az SDS-PAGE analízist szobahőmérsékleten két óráig 12,5 mA áramerősségű, majd 17,5 mA áramerősségű egyenárammal végeztük. Molekulatömeg markerekként előfestett Low Rangé Markert (Bio-Raad, 161-0305) és DOCIII-at alkalmaztunk. Közvetlenül az elektroforézis után a kapott protein molekulákat PVDF membránra vittük (lásd a következő lépést).

A minta egy részét 15-25 %-os előregyártott poliakril-amid géllel (Multi Gél 15/25; Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., katalógusszám: 211072) végzett másik elektroforézises vizsgálatban is alkalmaztuk, nem redukáló körülmények között vagy a minta ditio-treitollal (DTT) végzett redukálása után. A kapott gélt a fentebb leírt ezüstfestési készlettel festve bebizonyosodott, hogy a TPO-nak feltételezett protein sáv molekulatömege nem redukáló körülmények között 19000 D, s a Capcell Pák Cl 300A oszlopon kapott lehetséges TPO protein tisztasága néhány százalékos volt. Ezenkívül, mivel a sáv mobilitása nem redukáló és redukáló körülmények között változó volt, felvetődött annak lehetősége, hogy a lehetséges protein legalább egy diszulfid kötést tartalmaz.

(3) A PVDF membránon lévő protein elektroblotos átvitele és a sáv kimutatása

A PVDF membránra (ProBlott, az Applied Biosystems 400994 katalógusszámú terméke) történő protein-átvitelt 160 mA áramerősségű egyenárammal (11-17 V) félszáraz átviteli

119 apparátus (Model KD-8460, a Marysol terméke) alkalmazásával egy óra hosszat folytattuk. Anolltként 0,3 M Tris-ből és 20 % metanolból álló oldatot (pH = 10,4), membrán átviteli oldatként 25 mM Tris-ből és 20 % metanolból álló oldatot (pH = 10,4), katolitként pedig 25 mM Tris-ből, 40 mM aminokapronsavból és 20 % metanolból álló oldatot (pH = 10,4) alkalmaztunk.

Az így átmásolt membránt Ponceau S festékoldattal (100 ml vízben 0,1 g Ponceau S és 1 ml ecetsav) festve sok sávot detektáltunk, és a sávok egyikéről bebizonyosodott, hogy a lehetséges TPO proteinnek felel meg, melynek molekulatömege kb. 19000 D. Ezt a sávot kivágtuk, és a következő peptid-fragmens-képzési lépésben használtuk fel.

(4) Peptid-fragmen3 kialakítása, oeutldtérképezés és aminosav-szekvencia analízis

Az PVDF membránra átmásolt és a membránon végzett redukció után S-alkilezett lehetséges TPO protein szisztematikus fragmentálása érdekében az alábbi három proteáz alkalmazásával lépésenkénti restrikciós enzimes hidrolízist végeztünk.

Első emésztés: Lizil endopeptidáz {Achromobacter lyticus m497-l, a Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 129-02541 katalógusszámú terméke).

Második emésztés: Asp-N endoproteináz (a Boehringer-Mannheim

120

Corp. 1054 589 katalógusszámú terméke).

Harmadik emésztés: Tripszin-TPCK (a Worthington Biochemical 3740 katalógusszámú terméke).

Az egyes enzimes emésztésekkel kapott peptid-fragmenseket kinyertük, Wakosil-II 5C18 C18 reverz fázisú oszlopra (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; átmérő: 2,0 mm; hosszúság:

150 mm) vittük fel és 30 ’C oszlophőmérséklet mellett 0,25 ml/perc átfolyási sebességgel A oldószer (0,05 % TFA) és B oldószer (izopropanol és acetonitril 7:3 arányú elegye, 0,02 % TFA) alkalmazásával 1 % és 50 % B-koncentráció közötti lineáris gradienssel 30 percig eluáltuk. E módszerrel peptidtérképezést végeztünk (ld. 4. ábra). A kapott peptidfragmenseket kinyertük és gázfázisú aminosav-szekvenáló (PPSQ-2; Shimadzu Corp.) alkalmazásával Edman-lebontást végeztünk. A szekvenálóból kinyert egyes aminosavakat, melyek N-terminálisát PTH-hoz kapcsoltuk, C18 reverz fázisú oszlopkromatográfia alkalmazásával izokratikus elúcióval azonosítottuk. Az eredményeket az alábbiakban foglaljuk össze.

A lizil endopeptidázzal végzett első emésztéssel kapott peptid-fragmensek aminosav-szekvenciái:

Fragmens Aminosav-szekvencia

AP3 (K)XYYESZ (X jelentése A, S, G, M vagy Q; Z jelentése E vagy K) (184. sz. szekv.)

121

ΑΡ6

ΑΡ7

ΑΡ8 • · ·· « • · • · (K)XRAAZ (X jelentése E vagy Q; Z jelentése E vagy N) (185. sz. szekv.) (K)AGXCSG (nem azonosítható teljesen) (186. sz. szekv.) (K)XPVPPACDPRLL (X jelentése I, T vagy S) (187. sz. szekv.)

AP12	(K)DSFLADVK (188.
AP5	(nem azonosítható)
AP20	(nem azonosítható)
AP21	(nem azonosítható)
AP23	(nem azonosítható)

Az Asp-N endopeptidázzal végzett második emésztéssel kapott peptid-fragmensek aminosav-szekvenciái:

Fragmens

Aminosav-szekvencia

ASP1	(nem	azonosítható)
ASP2	(nem	azonosítható)
ASP6	(nem	azonosítható)
ASP11	(nem	azonosítható)

A tripszin-TPCK alkalmazásával végzett harmadik emésztéssel kapott peptid-fragmensek aminosav-szekvenciái:

Fragmens Aminosav-szekvencia

TP2 (K vagy R)TLPTXAVP (189. sz. szekv.) ·

- 122 ΤΡ3 (K vagy R)TLPTXAVP

A fenti szekvenciákban a zárójelben lévő N-terminális aminosavakat a szisztematikus enzimes emésztésből származtattuk.

(5) A kapott aminosav-szekvenciák homológiájának vizsgálata (homológja keresés)

Hogy megtudjuk, vajon a fenti módon kapott aminosavszekvenciák megtalálhatók-e ismert, leírt proteinben, vagy létezik-e olyan protein, amely hasonló szekvenciákkal rendelkezik, az aminosav-szekvenciákat Mac Vector software (Kodak International Biotechnologies, Inc.) alkalmazásával vizsgáltuk. Az ismert proteinekről vagy ismert génekről szolgáló információkként az Entrez Release 6 adatbázist alkalmaztuk (National Center fór Biottechnology Information, National Library of Medicine, National Institute of Heealth, USA; 1993. augusztus 15.). Az ebben foglalt adatbázisok az alábbiak.

Entrez Release 6 adatbázis

NCBI-GenBank, 1993. augsztus 15. (Release 73.0)

EMBL, 1993. július 15. (Release 35.0 + újabb adatok)

DDBJ, 1993. július 15.

SWISS-PROT, 1993. április (Release 25.0)

PÍR, 1993. június 30. (Release 37.0)

PDB, 1993. április PRF, 1993. május

123 dbEST, 1993. július 15. (Release 1.10)

Egyesült Államok-beli és európai szabadalmak

A vizsgálat eredményeként megállapítottuk, hogy az AP12 (K)DSFLADVK szekvenciája tökéletesen megegyezett a patkány kortikoszteroid-kötő globulin (CBG) prekurzor (PÍR adatbázis, katalógusszám: A40066; Smith és Hammond, Rat corticosteroid-binding globulin: primary structure and messenger ribonucleic acid levels in the liver under different physiological conditions, Mól. Endocrinol., 3, 420-426, 1989) KDSFLADVK belső szekvenciájával.

További részletes vizsgálattal kimutattuk, hogy az AP3 fragmens (K)XYYESZ szekvenciájával (melyben X jelentése A, S, G, M vagy Q, és Z jelentése E vagy K) nagy hasonlóságot mutató KQYYESE szekvenciát (193. sz. szekv.) szintén tartalmazza a patkány CBG aminosav-szekvenciája. A patkány CBG-ben az AP12 és AP3 fragmenseknek megfelelő szekvenciák egymáshoz kapcsolódnak, s ezáltal a KDSFLADVKQYYESE (190. sz. szekv.) belső aminosav-szekvenciát alkotják.

Az AP12 és AP3 fragmensen kívül más fragmensek aminosav-szekvenciáját illetően egy olyan proteint vagy gént sem találtunk, mellyel hasonlóságot mutathatnánk ki.

- 124 3. példa

A trombocitopeniás patkányok vérplazmájából származó TPO biológiai tulajdonságainak vizsgálata (1) Patkány CFU-MK vizsgálati rendszer (folvadéktenvészeti rendszeri alkalmazásával

Az 5. ábrán jellemző példaként trombocitopéniás patkány vérplazmájából részlegesen tisztított TPO minta (az 1-2 példa 8. tisztítási lépésében leírt YMC Pack Protein-RP oszlopról származó F2 TPO-aktív frakció) alkalmazása esetén kapott dózisreakció-görbét mutatunk be. A tenyésztett sejteket szabályos időközönként mikroszkóp alatt vizsgálva a megakariociták fejlődését és érését, nevezetesen a sejtek méretének növekedését (valószínűleg a megakariociták számának növekedésével együtt) figyeltük meg. A vizsgálat 4. napján (amely a tenyésztés utolsó napja volt) egy különösen jellemző változást, a megakariociták nyúlványképzését észleltük (a 3. napon alig voltak felismerhetők). Az ilyen nyúlványképződést citoplazmikus nyúlványképződésnek (Leven és Yee, Blood, Q2., 1046-1052, 1987) vagy vérlemzkenyúlványképződésnek nevezik (Topp és mtsi, Blood, 76. 912-924, 1990), amelyet az érett megakariocitákból tpvábbdifferenciálódott vérlemezke előtti struktúrának tartanak, s úgy tartják, hogy ez a megakariociták differenciálódásának végső stádiuma, amely eddig in vitro volt kimutatható. Mivel a TPO mintát önmagában alkalmazva ilyen morfológiai változást gyakran észleltünk, lehetséges,

125 hogy ez a faktor önmagában képes serkenteni a CFU-MK proliferációját és differenciálódását, képes érett megakariocitákat felszabadítani.

termelni, es végül vérlemezkéket (2) Telepvizsgálati rendszer

Trombocitopéniás patkányok tisztított TPO mintát vérplazmájából részlegesen elkülönítetlen patkány csontvelősejtek, illetve a GpIIb/IIIa* CFU-MK frakció egyes elválasztási/koncentrálási lépéseiből származó sejtek alkalmazásával végzett telepvizsgálati rendszerrel vizsgálva a patkány vérplazmából származó TPO serkentette a megakariocita telepek kialakulását. Az egyéb citokinekkel, mint például patkány IL-3-mal, egér GM-CSF-fel vagy humán EPO-val indukált megakariocita telepekkel összehasonlítva a TPO-val indukált megakariocita telepekre az jellemző, hogy mindegyik telep kevesebb megakariocitából áll, de valamennyi megakariocita nagyobb méretű, ami fokozott érettséget jelent. Ráadásul, mivel a TPO más sejtvonalakból nem vagy csak néhány telepet képez, a TPO Meg-CSF aktivitása megakariocita-specifikusnak ítélhető. E tények alapján nyilvánvaló, hogy a TPO egyéb citokinektől (mint pl. a patkány IL-3, egér GM-CSF és humán EPO) eltérő biológiai tulajdonságokkal rendelkezik, és egyedülálló Meg-CSF aktivitást fejt ki.

A trombocitopéniáns patkányok vérplazmájából részlegesen

126 tisztított TPO minta emberi csontvelősejtekből, illetve humán köldökzsinór vérsejtekből származó CD34-·-, DR* sejtfrakciókra is kifejtette Meg-CSF hatását, és jelentős számú humán megakariocita telep kialakulását indukálta, jelezve, hogy ez a faktor nem faj specifikus.

4. példa

A patkány TPO-termelő sejtek speciallzálása (1) Patkány TPO-termelő szervek szűrése

A patkány TPO gén klónozásához alkalmazható mRNS forrás biztosítása érdekében patkány TPO-termelő szerveket kerestünk és specializáltunk. P55 antitest beadásával trombocitopéniássá tett patkányokból először szabályos időközönként csontvelő, tüdő, máj és lép mintákat vettünk, s sejtjeiket (a tüdő és máj esetében szövetmetszeteket) tenyésztettük, s a kapott tenyészetfelülúszó aktivitásait patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel vizsgáltuk. A kezdeti kísérletek azonban nem eredményeztek megkülönböztető eredményeket. Következésképpen, további kísérletet tettünk P55 antitest beadásával indukált trombocitopéniában szenvedő patkányok májából kollagenáz perfúzióval készített májsejtek tenyésztésére, melynek során figyelembe vettük azt a leírást, melyben patkányokban a máj és a TPO-termelés közötti kapcsolatról számolnak be (Siemensma és mtsi, J. Láb. din. Med. , 86. 817-833, 1975). Amikor a kapott tenyészetfelülúszót WGA-Agarose oszlopra vittük, majd az ··»»

- 127 adszorbeálódott frakciót Vydac fenil reverz fázisú oszlopon frakciónáltűk, a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben a patkány vérplazma-eredetű TPO aktivitás esetében kapotthoz nagyon hasonló aktivitást észleltünk. A normális patkány májsejtek tenyészetfelülúszójában gyenge, de szintén azonos aktivitást találtunk. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a máj lehet az egyik TPO-termelő szerv.

(2) Patkány TPO-termelő se.itvonalak keresése

A fenti eredmények alapján TPO-termelő sejtvonalakat kerestünk. Először mind a 20 patkánymáj-eredetű sejtvonalat megfelelő altenyészeti tápfolyadékban a sejtek majdnem konfluens állapotáig tenyésztettük, majd a tápközeget az előző, 5 % FCS-sel kiegészített megfelelő tápközeggel helyettesítettük, s a tenyésztést további három napig folytattuk. Amikor a TPO-termelés létezésének vizsgálata érdekében a képződött tenyészetfelülúszók mindegyikét a fenti 1. lépésben leírt eljárással részlegesen tisztítottuk, megkülönböztethetően TPO-aktivitást találtunk három patkány parenchimális máj sejt-eredetű sejtvonalban, nevezetesen az McA-RH8994 sejtekben (ATCC deponálási szám: CRL1602; Becker és mtsi, Oncodevelopmental Gene Expression, szerk: Fishman és Sell, Academic Press, NY, 259-270. oldal, 1976; a Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.-től vásároltuk), H4-II-E sejtekben (ATCC deponálási szám: CRL1548; Pitot és mtsi, Nat. Cancer Inst. Monogr., 12, 229-245, 1964; a Dainippon

Pharmaceutical Co., LTd.-től vásároltuk) és HTC sejtekben

- 128 (Thompson és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 56. 296-303, 1966; a Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.-tői vásároltuk).

(3) A TPO aktivitások részletes vizsgálata McA-RH8994.

H4-II-E és HTC sejtekben

E három patkány sejtvonal által kiválasztott TPO-aktív proteinek biokémiai és biológiai tulajdonságait részletesen vizsgáltuk, és összehasonlítottuk a patkány vérplazmaeredetű TPO tulajdonságaival.

Az McA-RH8994 sejteket 10 % FCS-t tartalmazó alfa-MEM(-) folyadéktenyészeti tápközegben szuszpendáltuk, és 1 x 10® sejt/lombik mennyiségben 175 cm²-es műanyag szövettenyésztő lombikba helyeztük. 5 %-os CO2 inkubátorban 37 ’C-on három napig végzett tenyésztés után a tápközeget 5 % FCS-t tartalmazó IMDM tenyésztő tápközegre cseréltük, és a tenyésztést további három napig folytattuk, s a képződött tenyészetfelülúszót kinyertük. A H4-II-E sejteket 10 % FCS-t tartalmazó Dulbecco-féle mósodított Eagle folyadéktenyészeti tápközegben (4,5 g/1 glükóz, a továbbiakban DMEM) szuszpendáltuk, és 5 x 10⁵ sejt/lombik mennyiségben 175 cm²-es műanyag szövettenyésztő lombikba helyeztük. 5 %-os CO2 inkubátorban 37 °C-on három napig végzett tenyésztés után a tápközeget 5 % FCS-t tartalmazó IMDM tenyésztő tápközegre cseréltük, és a tenyésztést további három napig folytattuk, s a képződött tenyészetfelülúszót kinyertük. A

HTC sejteket szintén 5 % FCS-t tartalmazó DMEM ····

- 129 folyadéktenyészeti tápközegben szuszpendáltuk, és 2,5 x 10^B sejt/lombik mennyiségben 175 cm²-es műanyag szövettenyésztő lombikba helyeztük. 5 %-os CO2 inkubátorban 37 °C-on három napig végzett tenyésztés után a tápközeget 5 % FCS-t tartalmazó IMDM tenyésztő tápközegre cseréltük, és a tenyésztést további három napig folytattuk, s a képződött tenyészetfelülúszót kinyertük.

A három sejtvonalból kapót tenyészetfelülúszók 2-2 literét alkalmazva a sejtvonal-eredetű TPO részleges tisztítását az XRP-ből származó TPO tisztításához az 1-2 példában leírt eljárás szerint végeztük. Az alábbiakban az eredmények összefoglalását írjuk le.

Először valamennyi tenyészetfelülúszót ultrafiltráló készülék alkalmazásával kb. hatszoros töménységűre koncentráltuk, és a tápközeget Sephadex G-25 oszlop alkalmazásával 20 mM Tris-HCl (pH = 8,0) pufferre cseréltük. A kapott eluátumot Q-Sepharose FF oszlopra vittük, melyet 20 mM Tris-HCl (pH = 8,0) pufferrel mostuk, majd az adszorbeálódott frakciót 175 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM

Tris-HCl (pH = 8,0) pufferrel eluáltuk. Az így eluált frakciót WGA-Agarose oszlopra vittük, melyet PES-sel mostunk, és az adszorbeált frakciót 0,2 M GlcNAc-t és 0,15 M

NaCl-ot tartalmazó 20 mM nátrium-foszfát (pH = 7,2) pufferrel eluáltuk. A kapott eluátumot TSK-gel AF-BLUE 650 MH oszlopra vittük, melyet 1 M NaCl-ot tartalmazó 20 mM nátrium-foszfát (pH - 7,2) pufferrel mostunk, majd az ···? ·· _ J30 - '*** ** ·· ·· adszorbeált frakciót 2 mM NaCSN-dal mostuk. A kapott eluátumot Fenil-Sepharose 6 FF/LS oszlopra vittük, melyet 1,5 M ammónium-szulfátot tartalmazó 50 mM nátrium-foszfát (pH = 7,2) pufferrel, majd 36 mM nátrium-foszfátot tartalmazó 0,8 M ammónium-szülfát oldattal mostunk, majd az adszorbeált frakciót 20 mM mM nátrium-foszfát (pH =7,2) pufferrel eluáltuk. Az így kapott adszorpciós frakciót bekoncentráltuk és reverz fázisú Vydac Protein C4 oszlop (The Separations Group 214TP51015 katalógusszámú terméke; átmérő 1 cm; töltetmagasság: 15 cm) alkalmazásával frakciónáltűk, melynek során a mintát az előzetesen 20 %-os B oldószerrel ekvilibrált C4 oszlopra vittük, és az elúciót 90 percig 20 % és 40 % közötti B oldószer-koncentráció közötti lineáris gradienssel, 1 ml/perc átfolyási sebességgel végeztük (az A kromatográfáló oldószerben 0,1 TFA-t, a B kromatografáló oldószerben pedig 0,05 % TFA-t tartalmazó 1-propanolt alkalmazva). Az ezen sejtvonalakból származó összes TPO-aktív protein 30 % és 43 % közötti 1-propanol-koncentrációnál eluálódott.

Az egyes tisztítási lépésekből származó minták TPO aktivitásának CFU-MK vizsgálati rendszerrel végzett mérésekor kapott eredmények azt mutatták, hogy a három sejtvonalban a TPO aktivitás az XRP-eredetű TPO-hoz hasonló mintázatokkal rendelkezett (vő. 1-2 példa). A patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel mért relatív aktivitást, aktivitás hozamot, stb. a 2. táblázatban mutatjuk be. Amikor az utolsó reverz fázisú oszlopról nyert eluátumokban a TPO aktivitást

131 patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel mértük, a három sejtvonal TPO aktivitását és az XRP-eredetű TPO-t ugyanazon csúcsterületen észleltük. Amikor a patkány GpIIb/IIIa-*· CFUMK elkülönítése és bekoncentrálása érdekében a tapadó sejtek számának csökkentésével kapott nemtapadó sejtek alkalmazásával a reverz fázisú oszlopról nyert TPO-aktív frakciók telepvizsgálatát elvégeztük, a Meg-CSF aktivitás elúciós mintázatai nagyon hasonlóak voltak a TPO aktivitás patkány CFU-MK vizsgálati rendszerben mért mintázataihoz (ld. 3. táblázat). Ráadásul, hasonlóan az XRP-eredetű TPO esetében tapasztaltakkal, a három sejtvonal TPO aktivitása más sejtvonalakkal egyáltalán nem vagy csak kevés telepet hozott létre.

A reverz fázisú oszlopról összegyűjtött aktív frakciók mindegyikét az 1-2 példában leírtak szerint SDS-PAGE analízisnek vetettük alá. A kapott gélből proteint kivonva és a TPO aktivitást patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel mérve az XRP-eredetű TPO látszólagos molekulatömege

17000-22000 D, az McA-RH8994 sejtvonal-eredetű TPO-é 3300039000 D, a H4-II-E-eredetű TPO-é 31000-38000 D, a HTCeredetű TPO-é pedig 17000-22000 D és 28000-35000 D volt.

Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az McA-RH8994, H4-II-E és HTC sejtek által termelt TPO proteinek biológiai tulajdonságaikat tekintve egyenértékűek az XRP-eredetű TPO-val, bár látszólagos molekulatömegüket illetően biokémiai tulajdonságaik némileg különböznek. A találmányunk • · · ·

- 132 jelentős felfedezése, hogy a vérben lévő TPO-aktív molekulák termelő sejtjeik specifikus vagy rendhagyó helyén, vagy a termelő sejtekből való kiválasztódás után lezajló részleges emésztés termékei lehetnek. Szintén felvetődik a különböző hosszúságú TPO gének (mRNS és cDNS) létezésének lehetősége.

2. TÁBLÁZAT

TPO tisztítása patkány sejtvonalakból

Sejtvonal: McA-RH8994 HTC H4-II-E

Lépés	TP1 mg)	RA2	TA3	TP (mg)	RA	TA	TP (mg)	RA	TA
Tenyészet-
felülúszó	4806	8	38450	5760	5	28800	4087	5	20440
SephadexG25	4824	16	77180	6458	12	77500	4011	5	20050
Q-Sepharose
FF	1973	20	39460	3113	15	46680	1821	15	27320
WGA-Agarose	76,0	1350	102600	132,0	250	33000	80,0	90	7200
TSK-gel AF-
Blue 650MH	5,0	12500	62500	9,2	7500	69000	5,4	150	810

Fenil-Sepharose

6FF/LS	14,7 500	73500 13,1 2500 32750	11,4 170 1940
Vydac (	Protein
C4	0,23	0,75 -	0,11 -

TP¹: összes proteintartalom; RA²: relatív aktivitás;

TA³: összes aktivitás.

·.> ./.:, : /.

- 133 3. TÁBLÁZAT

Patkány megakariocita telepképzés patkány TPO által (reverz fázisú C4 oszlop frakció)

Eluáló	XRP	McA-RH8994	HTC	H4-II-E
propanol konc.	telepek	telepek	telepek	telepek
30,0-32,6 %	0	33	4	18
32,6-34,7 %	0	132	19	50
34,7-36,7 %	67	290	291	230
36,7-38,8 %	70	214	183	103
38,8-40,9 %	2	15	5	28
40,9-43,0 %	0	4	0	4

5. példa

Expressziós vektor (pEF18S) előállítása a cDNS könyvtárhoz

A TPO cDNS klónozásában és expresszálásában való alkalmazáshoz olyan vektort készítettünk, amelybe könnyen beépíthetjük a cDNS-fragmenst, s amely a klónozott cDNS számára nagy expressziós hatékonyságot biztosít. A pME18S expressziós vektorból az SRalfa promotert EFlalfa elongációs faktor promoterrel helyettesítve (amely nagy expressziós hatékonyságú promoterként ismeretes) pEF18S expressziós vektort készítettünk (vö. 6. ábra). Az EFlalfa elongációs faktort úgy állítottuk elő, hogy a pEF-BOS (Mizushima és mtsi, Nucleic Acids Rés., Ifi, 5322, 1990) 1 ug-ját HindlII

134

Acad. Sci.

előzetesen és EcoRI restrikciós enzimekkel részleges emésztettük, az emésztett mintát 2 %-os agaróz gélen (FMC BioProducts) elektroforizáltuk, miáltal kb. 1200 bp hosszúságú DNS-fragmenst izoláltunk, és ezt a framgenst Prep-A-Gene 'DNS-tisztító készlet (a Bio-Rad Laboratories Inc. terméke; porózus szilicium-dioxid ágyazóanyaggal elősegített DNSadszorpcióval megvalósítható szelektív DNS-tisztításhoz alkalmazható készlet, melyet Willis és mtsi. által leírt eljárás (Bio Techniques, 2, 92-99, 1990) alapján fejlesztettek ki). Az így kapott DNS-fragmens 100 ng-ját 50 ng pME18S expressziós vektorral (Liu és mtsi, Proc. Natl.

USA, 22, 8957-8961, 1993) ligáltuk, melyet

HindlII-mal és EcoRI-gyel emésztettünk. A kereskedelemben beszerezhető Competent High E. coli DH5 gazdatörzs (a Toyobo Co., Ltd. terméke; Hanahan és mtsi. módszerének [J. Mól. Bioi., 166. 557-580, 1983] módosításával előállított kompetens E. coli törzs) sejtjeit a fenti vektorral transzformáltuk. A transzformált sejtek tenyésztése után véletlenszerűen 12 telepet választottunk ki, s az egyes telepekből plazmid DNS-t tisztítottunk. A

DNS-molekulák restrikciós enzimes emésztési mintázatainak vizsgálatával összesen 10 kiónt kaptunk, melyek a szóban forgó plazmidot (pEF18S) tartalmazták. E kiónok egyikét nagy mennyiségű plazmid-DNS előállítása érdekében tenyésztettük.

A plazmid-DNS tisztítását alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás szerint végeztük (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Eszerint a pEF18S

135 klónt 37 °C-on 50 pg/a\í ampicillint tartalmazó 50 ml LB tápközegben (1 % Bacto-trypton, 0,5 % Bacto-élesztő kivonat, 0,5 % NaCl) egy éjszakán keresztül tenyésztettük, s a centrifugálással összegyűjtött sejteket 4 ml TEG-lizozim oldatban (25 mM Tris-HCl (pH =8), 10 mM EDTA, 50 mM glükóz, 0,5 % llzozim) szuszpendáltuk. Ehhez a sejtek alapos szuszpendálása érdekében 8 ml 0,2 N Na0H/l% SDS oldatot, majd 6 ml 3M kélium/5M acetát oldatot adtunk. A szuszpenzió centrifugálása után a felülúszót 1:1 arányú fenol:kloroform eleggyel kezeltük, azonos térfogatú izopropanollal elegyítettük, majd centrifugáltuk. A kapott üledéket TE oldatban (10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 1 mM EDTA) feloldottuk, RN-ázzal, majd 1:1 arányú fenil-kloroform eleggyel kezeltük, végül etanollal kicsaptuk. A képződött üledéket ismét TE oldatban oldottuk, melyhez 0,63 M végkoncentrációban NaClot, 7,5 % végkoncentrációban pedig polietilén-glikol 3000-et adtunk. Centrifugálás után az üledéket TE oldatban feloldottuk és etanollal kicsaptuk. Ezzel az eljárással kb. 300 pg plazmid-DNS-t kaptunk. A DNS 100 ug részét EcoRI és NotI restrikciós enzimekkel teljesen emésztettük és 0,8 %-os agaróz gélen (az FMC BioProducts terméke) elektroforizáltuk, s az így nyert vektor-fragmenseket Prep-A-Gene DNS-tisztító készlettel (a Bio-Rad Laboratories Inc. terméke) tisztítottuk, miáltal kb. 55 ug plazmid-DNS-t kaptunk, melyet a cDNS könyvtár létrehozásához alkalmaztunk.

136

6. példa mRNS tisztítása McA-RH8994 sejtekből

A 4. példában végzett telepvizsgálatban viszonylag nagy aktivitást mutató McA-RH8994 sejteket választottuk ki a patkány TPO cDNS klónozásához, s az alábbi kísérleteket végeztük.

mm

Eszerint az átmérőjű

A teljes RNS izolálását alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás szerint végeztük (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)

McA-RH8994 sejteket 15 darab 90 tenyésztőcsészében konfluens állapot eléréséig növesztettük. A folyékony tápközeg eltávolítása után az egyes csészék sejtjeit 0,8 ml 5 M guanidin-oldatban (5 M guanidintiocianát, 5 mM nátrium-citrát (pH = 7,0), 0,1 M β-merkaptoetanol, 0,5 % nátrium-szarkozil-szulfát), és az egyes csészékben kapott szuszpenziókat egyetlen csőbe gyűjtöttük össze, melyben az össztérfogatot guanidin-oldattal 20 ml-re állítottuk be. A sejtek feltárása miatt viszkózussá vált elegyet 18-as tűvel felszerelt 20 ml-es fecskendővel, majd 21-es tűvel kb. 20-szor felszívtuk és kiürítettük, mindaddig, amíg az elegy majdnem teljesen hígan folyó nem lett. A Beckmann SW28 centrifugában alkalmazandó poliallomer centrifugáló csőbe alaprétegként 18 ml 5,7 M CsCl - 0,1 M EDTA (pH = 7,5) oldatot tettünk, s az alaprétegre óvatosan a fentebb említett kb. 20 ml térfogatú elegyet rétegeztük, oly módon, hogy a rétegek ne keveredjenek, és a csövek majdnem ti ·

- 137 megteljenek. Az így előkészített csövet 25000 percenkénti fordulattal 20 ’C-on 20 óra hosszat centrifugáltuk. A képződött üledéket kétszer kevés 80 %-os etanollal mostuk, TE-oldatban feloldottuk, 1:1 arányú fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, majd 1/10 térfogat 3 M nátrium-acetát oldattal és 2,5-szeres térfogat etanollal etanolos kicsapást végeztünk. Ezzel az eljárással kb. 10® sejtből kb. 2,5 mg teljes RNS-t nyertünk.

A teljes RNS-ből poli(A)* RNS-t 01igotex™-dT30 (Super) (a Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche terméke; az oligo dT molekulák kovalens kötéssel latex részecskéken vannak rögzítve, és a poli(A)* RNS tisztítása az ilyen célra általában használt oligo dT oszlop alkalmazásával hasonló módon végezhető) alkalmazásával tisztítottunk. Körülbelül 500 ug teljes RNS-ből 20 pg poli(A)·*· RNS-t állítottunk elő.

7. példa

Patkány cDNS könyvtár készítése

A 6. példában előállított 5 ug poli(A)·*· RNS-ből Time Saver™ cDNS-szintetizáló készlet (a Pharmacia terméke; Okayama és Berg [Mól. Cell. Bioi., 2, 161-170, 1982] módosított eljárásán alapuló cDNS-szintetizáló készlet) és DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX (a Pharmacia terméke; a cDNS-szintézisben való alkalmazáshoz NotI felismerési szekvenciát tartalmazó

5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA(T)is-3' primerből (15. sz. szekv.) és EcoRI felismerési szekvencia hozzákapcsolásához

138

5'-AATTCGGCACGAG-3' (16. sz. szekv.) és 5'-CTCGTGCCG-3' (17. sz. szekv.) adapterekből álló készlet) alkalmazásával olyan kétszálú cDNS-t szintetizáltunk, amely 5-végén EcoRI felismerési helyet, 3-végén pedig NotI felimerési helyet tartalmaz. A szintetizált cDNS-t 1,2 ug pEF18S expressziós vektorhoz ligáltuk (vő. 5. példa), melyet előzetesen EcoRIgyel és Notl-gyel emésztettünk, és a fentebb említett Competent High E. coli DH5 törzs (A Toyobo Co., Ltd. terméke) 8,4 ml-ébe transzformáltuk, miáltal 5,3 x 10® transzformánst kaptunk.

8. példa

Patkány TPO cDNS-fragmens előállítása (klónozása) PCR-ral

A 7. példában előállított McA-RH8994 cDNS könyvtár 530000 kiónját egy éjszakán keresztül 50 pg/ml ampicillint tartalmazó 50 ml LB tápközegben tenyésztettük, és a centrifugálással összegyűjtött sejtekből DNS-tisztításhoz való QIAGEN-tiplOO anioncserélő szilikagéloszlop (a DIAGEN terméke) alkalmazásával McA-RH8994 cDNS könyvtár plazmidokat tisztítottunk, s körülbelül 200 pg plazmld-DNS-t kaptunk.

Két anti-szensz nukleotid-primert, az AP8-lR-t és AP8-2R-t, melyek a 2. példában leírt AP8 peptid-fragmens aminosavszekvenc iá j ának felelnek meg, valamint a cDNS könyvtár előállításához alkalmazott pEF-18S plazmid vektor (6. ábra) 1-alfa humán elongációs faktora első intronjának megfelelő EFlalfa-1 és EFlalfa-2 szensz nukleotid-primereket • «

- 139 szintetizáltunk. E primereket 394DNA/RNA Synthesizer (a βciano-etil-amidit eljáráson alapuló szintetizátor; az Applied Biosystems terméke) alkalmazásával szintetizáltuk, és tisztításukat szintetikus DNS tisztításához való OPC oszlop (reverz fázisú szilikagél oszlop trifenil-metilcsoportokkal rendelkező szintetikus DNS tisztításához; az Applied Biosystems terméke) alkalmazásával végeztük. Valamennyi szintetizált és tisztított DNS-molekulát 50 iái végkoncentrációban TE-oldatban feloldottuk, és felhasználásig -20 ’C-on tároltuk. Az alábbi eljárásban alkalmazott szintetikus oligonukleotidokat hasonló módon szintetizáltuk és tisztítottuk.

Az AP8-1R és AP8-2R primerek 17 egymás utáni nukleotidból álló kevert primerek, melyekben dezoxi-inozin található, amint azt Takahashi és mtsi. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 02, 1931-1935, 1985) leírták.

A 21, illetve 20 nukleotidból álló EFlalfa-1 és EFlalfa-2 prímért Uetsuki és mtsi. (J. Bioi. Chem., 264. 5791-5798, 1989) által leírt genom-szekvencia 1491-1512. és 1513-1532.

nukleotidjai alapján szintetizáltuk.

AP8:

Ile Pro Val Pro Pro Alá Cys Asp Pro Arg Leu Leu (18. szekv.) Thr (19. szekv.)

Ser (20. szekv.)

- 140 ·«

AP8-1R: 3'-ACG	CTG	GGG	GCI	GAI	GA-5'	(21.	sz.	szekv.)
A	A	A	T	A	A	(22.	sz.	szekv.)
		T				(23.	sz.	szekv.)
		C				(24.	sz.	szekv.)

AP8-2R:	3'	-GGG	GGG	CGG	ACG	CTG	GG-5	' (25.	sz.	szekv.)
		A	A	A	A	A		(26.	sz.	szekv.)
		T	T	T				(27.	sz.	szekv.)
		C	C	C				(28.	sz.	szekv.)
EFla-1:	5'	-GGA	TCT	TGG	TTC	ATT	CTC	AAG-3'	(29.	sz. szekv.)
EFla-2:	5'	-CCT	CAG	ACA	GTG	GTT	CAA	AG-3'	(30.	sz. szekv.)

GeneAmp™ PCR system 9600 PCR-készülékkel (a Perkin-Elmer terméke) polimeráz láncreakciót végeztünk (100 μΐ térfogat, 95 ’C-on kétperces melegítés után összesen 35 ciklus, mindegyik ciklus 95 ’C-on 1 perces denaturálásból, 40 °C-on 1 perces hibridizálásból, és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt, melyek után végül 72 ’C-on 7 perces inkubálás következett) melynek során templátként az McA-RH8994 cDNS könyvtárból származó plazmid 3 ug-ját, primerekként AP8-lR-t (500 pmól) és EFlalfa-l-et (100 pmól), valamint AmpliTaq™ DNS-polimerázzal együtt GeneAmp™ PCR-reagens készletet (a Takara Shuzo Co., Ltd. hőstabil Taql polimerázt, reakciópuffért és PCR-hoz való dNTP-t tartalmazó terméke) alkalmaztunk. Az amplifikált DNS-fragmensek specifitásának fokozása érdekében újabb PCR-t végeztünk (100 μΐ térfogatban, 95 ’C-on kétperces melegítés után összesen 35

- 141 ciklussal; mindegyik ciklus 95 °C-on 1 perces denaturálásból, 40 ’C-on 1 perces hibridizélásból, és 72 ’Con 1 perces szintézisből állt, végül 72 ’C-on 7 perces inkubálás következett), melynek során templátként az így kapott PCR reakció-elégy 1 pg-ját, primerekként pedig EFlalfa-2-t (100 pmól) és AP8-2R-t (500 pmól) alkalmaztunk.

Az így kapott reakció-elegyet 2 %-os agaróz gélen (FMC BioProducts) elektroforizáltuk, miáltal a PCR főtermékeként izoláltunk,

DNS-tisztító kb. 330 melyet a készlet bp hosszúságú DNS-fragmenst fentebb említett Prep-A-Gene (Bio-Rad Laboratories, Inc.) alkalmazásával tisztítottunk. A tisztított DNS-fragmenst T4 DNS ligáz (a Life Technologies terméke) alkalmazásával pCR™

II vektorba (PCR termékek TA klónozásához alkalmazható vektor, az Invitrogen terméke) szubklónoztuk. Mivel a PCR-hoz alkalmazott hőstabil polimeráz terminális transzferáz aktivitással rendelkezik, az amplifikált DNS-fragmenst közvetlenül az 5'-dT ragadós véggel rendelkező pCR™II vektorba szubklónoztuk, az enzim azon tulajdonságát kihasználva, hogy a PCR-amplifikált DNS

3'-végéhez egy dezoxi-adenilsavat (dezoxi-adenozinmonofoszfátot) kapcsol. A kapott kiónokból véletlenszerűen kiválasztott 28 klónból QIAGEN-tiplOO (DIAGEN) alkalmazásával plazmid-DNS molekulákat tisztítottunk, és nukleotid-szekvenciáikat Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle

Sequening készlet [az Applied Biosystems terméke; Sanger és mtsi. didezoxi-módszere (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74.

• ·

- 142 5463-5467, 1977) alapján fluoreszcens festékek alkalmazásával végzett, PCR-ral segített nukleotidszekvencia-meghatározáshoz való készlet] alkalmazásával 373A DNS-szekvenálóval határoztuk meg.

Amikor az így kapott DNS-fragmensek közül kiválaszottuk a fentebb bemutatott, AP8-2R primerrel szomszédos AP8 aminosav-szekvenciájának (Ile/Thr/Ser)-Val-Pro három aminosavát kódoló DNS-fragmenst és teljes hosszúságában szekvenáltuk, megállapítottuk, hogy 261 bázispárból álló cDNS-t tartalmazott. E cDNS-fragmens 173-175. nukleotidjai metionint kódoltak, s a leolvasási keret egybeesett az AP8 aminosav-keretével. Mivel a DNS-fragmens 173-175. helyeit képező szekvencia megegyezett Kozák szekvenciájával (Kozák, M., Cell, 44, 238-292, 1986), úgy tűnik, hogy ez a cDNSfragmens tartalmazza a patkány TPO protein N-terminálisát kódoló transzlációs kezdő kodont. Ezt a cDNS-fragmenst Al-nek neveztük el. Az A1 fragmens nukleotid-szekvenciáját (a vektor-szekvencia nélkül) és az abból leszármaztatott aminosav-szekvenciát a szekvencialista 1. számú szekvenciájaként mutatjuk be.

9. példa

Patkány TPO cDNS klón screenelése PCR-ral

A fentebb említett cDNS könyvtárt egyenként kb. 10000 klónból álló csoportokra osztottuk, azokat a fentebb említett LB tápközeg (50 pg/ml ampicillint tartalmazó) 1 ml• « · · · · · • · · · · · ·· *· ·»·· ·· ·· ··

- 143 ében egy éjszakán keresztül tenyésztettük, majd PI-100 automata plazmid-izoláló készülékkel (VER-3.0, a Kurabo Industries, Ltd. terméke; Sambrook és mtsi. által leírt [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] alkáli-SDS eljárás módosításán alapuló automata plazmid-DNS-kivonó készülék) plazmid-DNS-kivonást végeztünk. Ettől függetlenül, az A1 cDNS-fragmens alapján az alábbi két oligonukleotidot szintetizáltuk:

5'-CGAGGGTGTACCTGGGTCCTG-3' (31. sz. szekv.) (az 1. sz. szekv. 1-17. helyeinek megfelelő szensz szekvencia; a CGAG adapter szekvenciát jelöl);

5'-CAGAGTTAGTCTTGCGGTGAG-3' (32. sz. szekv.) (az 1. sz.

szekv. 212-232. helyeinek megfelelő anti-szensz szekvencia).

Templátként a fentebb kapott plazmid-DNS minták 1/30 térfogatának, primerként a fentebb szintetizált két oligonukleotid, valamint AmpliTaq™ DNA Polymerase-zal (a Takara Shuzo Co. Ltd. terméke) GeneAmp™ PCR Reagent Kit (készlet) alkalmazásával GeneAmp™ PCR System 9600 készülékben (PERKIN-ELMER) PCR-reakciót végeztünk (összesen 30 ciklussal; mindegyik ciklus 94 ’C-on 30 másodperces denaturálásból, 66 °C-on 30 másodperces hibridizálásból és ’C-on 1 perces szintetizálásból állt). A vizsgált 100 klóncsoportból háromban 236 bp-os specifikus sávot mutattunk ki. Amikor e három csoport egyikét plazmid-DNS kivonása érdekében kb. 900 kiónt tartalmazó alcsoportokra osztottuk, és az előzővel megegyező módon PCR-t végeztünk, a 100 tesztelt alcsoport közül háromban mutattunk ki specifikus

144 sávot. Ezen alcsoportok egyikét 40 klónból álló további csoportokra osztva, és a fenti screenelési eljárást elvégezve a 100 tesztelt csoport közül háromban találtunk specifikus sávot. A három csoport egyikét 50 ug/ml ampicillinnel kiegészített LB lemezen (15 % agart tartalmazó LB tápközeg) tenyésztettük, és a kialakult telepek mindegyikét a fenti módon plazmid-DNS-kivonásnak és PCR-nak vetettük alá. A vizsgált 100 klón közül kettőben észleltünk pozitív sávot.

10. példa

Patkány TPO cDNS szekvenálása

A plazmid-DNS tisztítását alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) szerint végeztük. A 9. példában kapott mindkét kiónt egy éjszakán keresztül 50 ug/ml ampicillint tartalmazó 50 ml LB tápközegben tenyésztettük, és a 6. példában leírt módon végzett tisztítás után kb. 300 ug plazmid-DNS-t kaptunk.

Az így kapott plazmid-DNS-t a 8. példában leírt módon Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle szekvenáló készlet (Applied Biosystems) alkalmazásával szekvenáltuk, hogy meghatározzuk az A1 fragmenst tartalmazó teljes nukleotid-szekvenciát. A két klón nukleotid-szekvenciája teljesen egyforma volt, ami azt jelzi, hogy ezek azonos kiónok. Az egyik kiónt kiválasztottuk, és az e klón által hordozott plazmidot »» ·· «· • · · · · » · · · · • ♦ · ·

- 145 pEF18S-A2alfának neveztük el. Nukleotid-szekvenciáját és az abból leszármaztatott aminosav-szekvenciát a szekvenciálist

2. számú szekvenciájában mutatjuk be.

A 2. sz. szekv. sajátos tulajdonságokkal rendelkezik. A 172 bp hosszú 5' nem transzlálódó régiótól downstream irányban lévő szekvencia hidrofób aminosavakban gazdag aminosav-szekvenciát kódol, amely feltételezhetően egy 21 aminosavas, metioninnal kezdődő protein-szekréciós jelzőszekvencia. Ez a nukleotid-szekvencia 126 aminosavgyökből álló proteint kódol, valamint 1025 nukleotidból álló

3' nem transzlálódó szekvenciát és a terminációs kodont (TAA) követő poli A farokból áll. A protein a 2. példában vizsgált AP8 aminosav-szekvenciának megfelelő szekvenciát tartalmaz (a 2. sz. szekv. 1-12. aminosavai), de az Nglikoziláláshoz nem tartalmaz konszenzus-szekvenciát. A 3' nem transzlálódó szekvencia végének közelében elhelyezkedő 1624-1629. nukleotid-szekvencia nem konszenzus-szekvencia, de potenciális poliadenilációs szekvenciának tűnik.

A DH5 E. coli törzs által hordozott pEF18S-A2alfa vektort 1994. február 14-én FERM BP-4565 deponálási számon helyeztük letétbe (National Institute of Bioscience and Humán

Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japán).

• ·

- 146 11. példa

Patkány TPO cDNS expresszálása COSI sejtekben; a TPO aktivitás igazolása

A COSI sejtek pEF18S-A2alfa plazmiddal végzett transzfektálását a klorokinos kezelést magában foglaló

DEAE-dextrón eljárás (Sompayrac és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78. 7575-7578, 1981; Luthman és mtsi, Nucl. Acids Rés., 11. 1295-1308, 1983) csekély módosításával az alábbi módon végeztük. A COSI sejteket (ATCC CRL1650) a fentebb említett, 10 % FCS-t tartalmazó DMEM tápközegben szuszpendáltuk, 100 mm-es műanyag szövettenyésztő csészébe helyeztük, és 5 %-os CO2 inkubátorban 37 “C-on addig tenyésztettük, míg a sejtek kb. 40 %-os konfluens állapotot értek el. Ettől függetlenül, a 30 pl HBS-ben (21 mM HEPES, 145 mM NaCl, pH = 7,1) feloldott pEF18S-A2alfa plazmidot (10 pg) 500 pg/ml DEAE-dextránnal (Pharmacia), 80 klorokinnal (Sigma Chemical Co.), 8 V/V % HBS-sel és 9 V/V %

Nu-szérummal (Collaborative Research, Inc.) kiegészített 4 ml DMEM tenyésztő tápközeghez adtuk. Az így elkészített elegyet a fenti tenyésztett COSI sejtekhez adtuk, melyeket kétszer DMEM tápközeggel mostunk, s a tenyésztést az 5 %-os CO2 inkubátorban 37 ’C-on 5 órán át folytattuk. A csészében a tenyészetfelülúszót leszívással eltávolítottuk, a csészében maradt sejteket kétszer DMEM tápközeggel mostuk, 10 % FCS-t tartalmazó 15 ml DMEM tápközeggel kiegészítettük, és 5 %-os CO2 inkubátorban 37 ’C-on 3-5 napig tenyésztettük, majd kinyertük a tenyészetfelülúszót.

• ·

147

A kapott tenyészetfelülúszót IMDM tápközeggel szemben alaposan dlalizáltuk és patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel értékeltük. A COS1 sejtek (melyekben a PEF18SA2alfa plazmidot expresszáltuk) tenyészetfelülúszójában dózisfüggő TPO aktivitást észleltünk (7. ábra). Az XRPeredetű TPO esetében tapasztaltakhoz hasonlóan, a tenyésztés

4. napján sok megakariocita képzett citoplazmikus nyúlványokat. Ezzel ellentétben, az egyedül pEF18S plazmiddal transzfektált COS1 sejtek tenyészetfelülúszójában TPO aktivitást nem találtunk (7. ábra). Az M-07e vizsgálati rendszerben a COS1 sejtek (melyekben a PEF18S-A2alfa plazmidot expresszáltuk) tenyészetfelülúszójában — szintén dózisfüggő módon — észleltünk M-07e sejt-proliferációt fokozó aktivitást, azon COS1 sejtek felülúszójában azonban nem, amelyekben a pEF18S plazmidot önmagában expresszáltuk. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az A2alfa TPO aktivitással rendelkező proteint kódoló cDNS-t tartalmaz.

Ezután részlegesen tisztított TPO mintát készítettünk, hogy megvizsgáljuk e TPO aktivitás vérlemezketermelődést In vivő elősegítő képességét. Először pEF18S-A2alfa plazmiddal transzfektált COS1 sejteket három napig 0,2 mg BSA-vel kiegészített szérummentes tenyésztő tápközegben tenyésztettük, miáltal 5,8 liter szérummentes tenyészetfelülúszót kaptunk. A szérummentes tenyészetfelülúszóhoz 1 mM végkoncentrációban p-APMSF proteáz-inhibitort adtunk, és az elegyet 0,22 um-es filteren leszűrtük. A kapott szűrlet 5793 ml-éhez (protein-koncentráció: 0,229 mg/ml; Összes

- 148 » »* proteintartalom: 1326 mg; relatív aktivitás: 1000; összes aktivitás: 1326000) 1000 ml-re számítva 0,85 mól NaCl-ot adtunk (összesen 288 g-ot), miáltal 5849 ml 0,822 M NaClkoncentrációjú oldatot kaptunk. Az így elkészített oldatot 7 ml/perc átfolyási sebességgel TSK-gel AF-BLUE 650 MH oszlopra (Tosoh Corp., katalógusszám: 08705; átmérő: 5 cm; töltetmagasság: 6 cm) vittük, melyet előzetesen 1 M NaCl-ot tartalmazó 20 mM nátrium-foszfát (pH = 7,2) pufferrel ekvilibráltunk. A minta felvitele után 7900 ml eluátumot engedtünk át az oszlopon, s ezt követően 1 M NaCl-ot tartalmazó 20 mM nátrium-foszfát (pH = 7,2) pufferrel végeztük az elulálást. Ezt az eluátumot összegyűjtöttük és ultrafiltráló készülék (Omega Ultrasette, névleges molekulatömeg-átengedési határ: 8000 D; a Filtron terméke) alkalmazásával bekoncentráltuk, miáltal az FI átfolyt frakciót kaptuk (460 ml; protein-koncentráció: 2,11 mg/ml; összes proteintartalom: 973 mg; relatív aktivitás: 16,3). Ezután az eluáló oldatot 2M NaSCN-ra cseréltük, és az így eluált TSK-gel AF-BLUE 650 MH oszlopon adszorbeált TPO aktív F2 frakciót (2840 ml) YM 3 membránnal (Amicon Corp.; 76 mm átmérő) felszerelt ultrafiltráló készülék alkalmazásával

6,81 ml-re koncentráltuk. E TPO-aktív F2 frakció összes proteintartalma 12,5 mg, e lépésben a protein-kitermelése pedig 0,62 % volt. A TPO relatív aktivitását 240-nek számítottuk. Az F2 frakciót ezután HiLoad 26/60 Superdex 200 pg oszlopra (a Pharmacia Biotech 17-1071-01 katalógusszámú terméke; átmérő: 2,6 cm, töltethosszúság: 60 cm) vittük, és 1 ml/perc átfolyási sebességgel 50 mM NaCl-ot tartalmazó 20 • · • · · ·* «··» #· «· ··

149 mM nátrium-acetát oldattal (pH = 5,5) kromatografáltuk. A kromatografálás megkezdése után a felvitel utáni 194-260.

ml-nél lejött eluátumokban TPO aktivitást találtunk. Ezeket az eluátumokat Összegyűjtve a Superdex 200 pg TPO-aktív F2 frakciót kaptuk (66 ml; protein-koncentráció; 0,112 mg/ml; összes proteintartalom: 7,41 mg; relatív aktivitás: 142860; összes aktivitás: 1058600). Ezek után A puffért (20 mM nátrium-acetát oldat, pH = 5,5) és B puffért (500 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM nátrium-foszfát oldat, pH = 7,2) készítettünk, s a TPO-aktív frakciót 1 ml/perc átfolyási sebességgel RESOURCE S erős kationcserélő oszlopra (a Pharmacia Biotech 17-1178-01 számú terméke; átmérő: 0,64 cm; töltethosszúság: 3 cm) vittük fel, melyet előzetesen 100 %-os A pufferrel ekvilibráltunk. Az eluálást 100 % Akoncentrációtól 100 % B-koncentrációig terjedő lineáris gradienssel, 0,3 ml/perc átfolyási sebességgel 40 percig végeztük. A TPO aktivitást az eluátumok széles tartományában kimutattuk (5 % B-től 32 % B-ig). Ezeket a TPO-aktív eluátumokat összegyűjtöttük és YM3 membránnal (Amicon Corp., mm átmérő) felszerelt ultrafiltráló készülékkel bekoncentráltuk, miáltal RESOURCE S TPO-aktív F2 frakciót kaptunk (1,65 ml; protein-koncentráció: 4,74 mg/ml; Összes proteintartalom: 7,82 mg; relatív aktivitás: 71400; összes aktivitás: 558600).

A részlegesen tisztított TPO mintát kilenchetes hím ICR egereknek öt egymás utáni napon (egerenként napi 474 fjg [100 pl] mennyiségben) szubkután adtuk be. Az egerek ··· »· ·« • · · · » » · · ·· • · · · ·· ·· ··

150 vérlemezkeszámát a beadás előtti napon megmértük. Kontrollként hasonló módon BSA-t (egerenként napi 200 pg [100 pl] mennyiségben) vagy a részlegesen tisztított TPO oldószereként alkalmazott puffért (egerenként napi 100 pl mennyiségben) adtunk be. Az utolsó beadás utáni napon az egyes egerek szivéből vért vettünk, és hemocitométerrel (F800; a Toa Iyo Denshi terméke) meghatároztuk a vérlemezkeszámot. A részlegesen tisztított TPO-val kezelt egerekben a vérlemezkeszámhoz vérlemezkeszám a kezelés előtti képest 2,14-szeresére emelkedett. A kontroll csoportokkal összehasonlítva a részlegesen tisztított TPO-val kezelt egerek vérlemezkeszáma a BSA-val kezelt egerekénél 1,74-szer, a pufferrel kezelt egerekénél pedig 1,90-szer volt nagyobb. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a TPO elősegíti az in vivő vérlemezketermelést. Mivel az egér akut fázisú proteinként ismert immunszuppresszív savas protein (IAP) mennyisége a részlegesen tisztított TPO-val kezelt egerekben nem növekedett, arra következtettünk, hogy a TPO az akut fázisú protein indukcióját illetően különbözik az IL-6-tól és az

IL-ll-től.

12. példa

A TPO mRNS kimutatása patkányszövetekben

A pakány testében a TPO mRNS-t expresszáló szövet lokalizálása érdekében különböző patkányszövetekből RNS-t vontunk ki. összesen hat patkányt az 1. példában leírt módon ···· ·· ··«· ·· ·· • · * ·« bt >

. · · · · · ·· • · · «··* « ·· ···· ·· ·< *·

151 röntgensugárzással kezeltünk, s röntgensugárzás utáni 11-14. napon a patkányokból agyvelőt, thymust, tüdőt, májat, szivet, lépet, vékonybelet, vesét, herét es csontvelősejteket metszettünk ki, és azokat folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztottuk. Teljes RNS-t ISOGEN RNS-izoláló reagens (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) alkalmazásával izoláltunk. Az ISOGEN alkalmazandó mennyiségét az egyes fagyasztott szövetminták tömege alapján határoztuk meg, és a szövetmintát a hozzáadott reagenssel együtt homogenizátorral (Physcotron^R NS-60, a NITI-ON Medical & Physical Instruments MFG. Co. LTD terméke) a szövet teljes feltárásáig kezeltük (10000 percenkénti fordulattal hozzávetőleg 45-60 másodpercig). A szövethomogenátumból ezután Chomczynski és mtsi. guanidinsav fenol - kloroform módszerén (Anal. Biochem, 162. 156-159, 19S7) alapuló eljárás alkalmazásával teljes RNS-t vontunk ki. Az egyes szövetekből 1,1-5,6 mg teljes RNS-t nyertünk ki.

01igotex™-dT30 (Super) (a Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche terméke) alkalmazásával kb. 500 pg teljes RNS-ből 20 μ g poli (A)* RNS-t tisztítottunk.

Az egyes szövetekből nyert poli (A)·*· RNS 1 pg-jából random primer alkalmazásával cDNS első szálat szintetizáltunk. 1 μ% poli (A)* RNS-t 10 pl steril vízben feloldottunk, 70 °C-on 15 percig inkubáltuk, majd gyorsan lehűtöttük. Az oldathoz 75 pmól random prímért (Takara Shuzo Co. Ltd.), 10 egység ·»

- 152 RN-áz inhibitort (Boehringer-Mannheim Corp.), 50 mM Tris-HCl (pH = 8,3) puffért 75 mM KCl-ot, 3 mM MgCl2-ot és 200 egység Super Script™II-t (a Life Technologies által gyártott reverz transzkriptáz) adtunk. Az így elkészített oldatot (20 μΐ össztérfogat) 37 ’C-on egy óra hosszat inkubáltuk, s a kapott reakcióelegyet az enzim inaktiválása érdekében 70 °C-on 10 percig inkubáltuk, s felhasználásáig -20 °C-on tároltuk.

A PCR-hoz primereket a 10. példában kapott TPO cDNSszekvencia alapján szintetizáltunk. Az így szintetizált primerek az alábbi szekvenciáikkal rendelkeznek:

rTPO-I: 5'-CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG-3' (33. sz. szekv.) (a 2. sz. szekv. 347-367. helyei);

rTPO-N: 5'-TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC-3' (34. sz. szekv.) (a 2. sz. szekv. 1005-1025. helyeinek megfelelő anti-szensz primer).

Templátként az egyes szintetizált cDNS oldatok 1/10 térfogatát, primerekként az rTPÓ-I és rTPO-N 1-1 uM-ját, valamint AmpliTaq™ DNS Polymerase-zal GeneAmp™ PCR Reagent készletet (Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmazva GeneAmp™ PCR System 9600 készülékben (Perkin-Elmer) 100 μΐ térfogatban PCR-t végeztünk, melynek során az elegyet 2 percig 95 °C-on melegítettük, s összesen 30 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 95 °C-on 1 perces denaturálásból, 57 ’Con 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt, melyek után végül 72 ’C-on 7 perces • · ·

- 153 inkubálást végeztünk. Az így kapott reakcióélegyek mindegyikét 2 %-os agaróz gélen (FMC BioProducts) elektroforizálva és az amplifikált sávokat vizsgálva az agyból, májból, vékonybelekből és veséből származó mintákat tartalmazó géleken találtunk TPO mRNS-re specifikus sávokat. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy patkányban a TPO mRNS expressziója e szervek szöveteiben lejátszódik, bár az nem ítélhető meg pontosan. Ha 4. példa eredményeit és annak lehetőségét, hogy az emberi szervezetben hasonló expressziós mód létezhet, úgy tűnik, hogy a humán TPO cDNS előállításának megfelelő kiindulási anyaga a máj.

expresszió mennyisége tekintetbe vesszük a

13. példa

Humán normális májbői származó cDNS könyvtár készítése

A 12. példa eredményei alapján a humán TPO cDNS klónozásához a májat választottuk kiindulási anyagként. A 7. példában leírthoz hasonló módon kereskedelmileg beszerezhető normál humán máj-eredetű poli(A)⁺ RNS (Clontech; Chomczynski és mtsi. guanidinsav/fenol/kloroform módszere alapján kivont termék) 5 pg-jából 5'-végén EcoRI felismerési hellyel és 3'végén NotI felismerési hellyel rendelkező kétszálú cDNS-t szintetizáltunk, melynek során Time Saver™ cDNSszintetizáló készletet (Pharmacia) és DIRECTIONAL CLONING

TOOLBOX-ot (Pharmacia) alkalmaztunk. Az így szintetizált cDNS-t a fentebb említett pEF18S expressziós vektor 1,2 pg-javai ligáltuk, melyet előzetesen EcoRI-gyel és Notl-gyel • · • ·

- 154 emésztettünk, s a vektorral a fentebb említett Competent High E. coli DH5 törzs (Toyobo Co., Ltd. ) 8,4 ml-ét transzformáltuk, miáltal 1,2 x 10® transzformánst kaptunk.

14. példa

Humán TPO cDNS-fragmens készítése (klónozása) PCR-ral

Random primerek alkalmazásával 1 pg kereskedelmileg beszerezhető normál humán máj-eredetű poli(A)·*· RNS-ből (Clontech) cDNS első szálat szintetizáltunk. Eszerint 1 PS polKA)·*· RNS-t 10 μΐ steril vízben feloldottunk, az oldatot 70 ’C-on 15 percig inkübáltuk, majd gyorsan lehűtöttük. Az oldathoz 75 pmól random primereket (Takara Shuzo Co. Ltd.), 10 egység RN-áz inhibitort (Boehringer-Mannheim Corp.), 50 mM Tris-HCl (pH = 8,3) puffért, 75 mM KCl-ot, 3 mM MgCl2-ot és 200 egység Super Script™II reverz fázisú transzkriptázt (Life Technologies) adtunk. Az így elkészített oldathoz (20 μΐ össztérfogat) 37 ’C-on egy óra hosszat inkubáltuk, majd a reakcióelegyet az enzim inaktiválása érdekében 70 ’C-on 10 percig inkubáltuk, és felhasználásáig -20 ’C-on tároltuk.

A PCR-hoz alkalmazandó primereket a patkány TPO cDNSszekvencia (2. sz. szekv.) alapján szintetizáltuk. A szintetizált primerek az alábbi szekvenciákkal rendelkeznek:

rTPO-AIM: 5'-ATG C-AG CTG ACT GAT TTG CTC-3' (35. sz. szekv.) (a 2. sz. szekv. 173-193. helyei) rTPO-N: 5^J-TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC-3' (36. sz. szekv.) • ·

- 155 (a 2. sz. szekv. 1005-1025. helyeinek megfelelő anti-szensz primer).

Templátként a szintetizált cDNS oldat 1/10 térfogatát, primerekként az rTPO-AIN és rTPO-N 1-1 μΜ-ját, továbbá AmpliTaq™ DNS Polymerase-zal GeneAmp™ PCR Reagent készletet (Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmazva GeneAmp™ PCR System 9600 készülékben (Perkin-Elmer) 100 pl térfogatban PCR-t végeztünk, melynek során az elegyet 2 percig 95 ’C-on melegítettük, s összesen 35 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 95 °C-on 1 perces denaturálásból, 40 ’Con 1 perces hibridizálásból és 72 ^eC-on 1 perces szintézisből állt, melyek után végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk.

Az így kapott reakcióelegyek mindegyikét 2 %-os agaróz gélen (FMC BioProducts) elektroforizáltuk, miáltal a PCR főtermékeként kb. 620 kb-os DNS-fragmenst izoláltunk, melyet a fentebb említett Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet (Bio-Rad

Laboratories, Inc.) alkalmazásával tisztítottunk. A tisztított DNS-fragmens nukleotid-szekvenciáját 373A DNSszekvenálóval (Applied Biossystems) a fentebb említett Taq Dye Deoxy™ Terminator Cycle Sequening készlet (Applied Biosystems) alkalmazásával határoztuk meg. Az így meghatározott nukleotid-szekvenciát (a primer rész nélkül), és leszármaztatott aminosav-szekvenciáját a Szekvencialista

3. sz. szekvenciájaként mutatjuk be.

• · · • · • · · · · · · • · · · * · · • · · · · · · ·· ·♦·· ·· · V ··

- 156 E DNS-fragmens primer-szekvenciák nélküli hosszúsága 580 bp.

A humán cDNS a patkány cDNS nukleotid-szekvenciával 86 %-os homológiát mutatott, ami azt jelzi, hogy ez a DNS-fragmens a humán TPO cDNS egy részét teszi ki.

15. példa

A humán TPO cDNS klón screenelése PCR-ral

A 3. sz. szekv. alapján humán TPO-nak megfelelő primereket szintetizáltunk, melyek az alábbi szekvenciákkal rendelkeznek:

hTPO-I: 5'-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (37. sz. szekv.) (a 3. sz. szekv. 60-80. helyei) hTPO-J: 5'-TGA CGC AGA GGG TGG ACC CTC-3' (38. sz. szekv.) (a 3. sz. szekv. 479-499. helyeinek megfelelő anti-szensz primer).

A 13. példában készített humán cDNS könyvtárt amplifikáltűk és egyenként kb. 100 000 kiónból álló csoportokra osztottuk, ezeket 50 pg/ml ampicillint tartalmazó 1 ml LB tápközegben egy éjszakán át tenyésztettük, majd PI-100 automata plazmidizoláló készülékkel (VER-3.0, a Kurabo Industries, Ltd. terméke) plazmid-DNS-t vontunk ki. Az így kivont DNS-t TEoldatban oldottuk fel.

Templátként a kivont DNS minta 5 %-át, printerekként a hTPO-I és hTPO-J 1 μΜ-ját, és AmpliTaq™ DNS Polymerase-zal GeneAmp™ PCR Reagent készletetet (Takara Shuzo Co., Ltd.) • · • · • ·

- 157 alkalmazva GeneAmp™ PCR System 9600 készülékben (PerkinElmer) 20 pl térfogatban PCR-t végeztünk, melynek során összesen 35 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 95 °C-on 1 perces denaturálásból, 59 ’C-on 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt, végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk. A felhasznált 90 csoport közül háromban mutattunk ki specifikus sávot. E három csoport egyikét egyenként kb. 5000 kiónt tartalmazó alcsoportokra osztottuk, s a fentiek szerinti PCR elvégzése érdekében 90 alcsoportból plazmid-DNS-t tisztítottunk. Specifikus sávot 5 alcsoport esetében mutattunk ki. Ezen öt alcsoport egyikét további alcsoportokra oszottuk, melyek egyenként 250 kiónt tartalmaztak, s 90 alcsoportból plazmidDNS-t vontunk ki. A kivont mintákat a fentiek szerint PCRnek alávetve 3 álcsoportban találtunk specifikus sávot. E három alcsoport egyikét egyenként 30 kiónt tartalmazó további alcsoportokra osztottuk, s a fentiek szerinti PCR elvégzése érdekében 90 alcsoportból plazmid-DNS-t tisztítottunk. Három alcsoportban mutattunk ki specifikus sávot. E csoportok egyikét 50 ug/ml ampicillint tartalmazó, fentebb említett LB lemezen tenyésztettük, s az így kialakult 90 telepből plazmid-DNS-t vontunk ki, és a fentivel megegyező módon PCR-t végeztünk, miáltal a HL34 kiónt kaptuk.

• · « f*

- 158 16. példa

Humán TPO cDNS tisztítása

A plazmid-DNS tisztítását alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) szerint végeztük. A HL34 kiónt egy éjszakán keresztül 50 /Jg/ml ampicillint tartalmazó 50 ml LB tápközegben tenyésztettük, s a képződött, centrifugálással összegyűjtött sejteket a fentebb említett TEG-lizozim oldat 4 ml-ében szuszpendáltuk. Ehhez a sejtek alapos szuszpendálása érdekében 8 ml 0,2N NaOH/1% SDS oldatot, majd 6 ml 3M kálium/5M acetát oldatot adtunk. A szuszpenzió centrifugálása után a felülúszót 1:1 arányú fenol-kloroform eleggyel kezeltük, azonos térfogatú izopropanollal elegyítettük, majd centrifugáltuk. Az üledéket TE-oldatban oldottuk és RN-ázzal, majd 1:1 arányú fenol/kloroform eleggyel kezeltük, végül etanolos kicsapást végeztünk. A kapott üledéket ismét feloldottuk a TE-oldatban, melyhez 0,63 M végkoncentrációban NaCl-ot, 7,5 % végkoncentrációban pedig polietilén-glikol 3000-et adtunk. Centrifugálás után az üledéket TE-oldatban oldottuk és etanollal kicsaptuk. Ezzel az eljárással kb. 300 pg pEF18S-HL34 plazmid-DNS-t kaptunk.

A tisztított plazmid-DNS-t teljes nukleotid-szekvenciájának meghatározása érdekében a fentebb említett Taq Dye Deoxy™ Terminator Cycle Sequening készlet (Applied Biosystems) alkalmazásával 373A DNS-szekvenálóval (Applied Biossystems) « ·

- 159 határoztuk meg. A meghatározott nukleotid-szekvenciát és az abból leszármaztatott aminosav-szekvenciát a Szekvencialista

4. számú szekvenciájaként mutatjuk be. Ebben az esetben a nukleotid-szekvencia meghatározásához primerekként a 3. sz. szekvencia nukleotid-szekvenciája alapján szintetizált oligonukleotidokat, és a szekvencia-analízissel kapott belső szekvencia alapján kialakított szintetikus oligonukleotidokat alkalmaztunk.

Bebizonyosodott, hogy a pEF18S-HL34 plazmid klón 861 bp-os cDNS-fragmenst, továbbá a 2. példában vizsgált AP8 aminosav-szekvenciával (a 4. sz. szekv. 1-12. aminosavai) és

TP2/TP3 aminosav-szekvenciával (a 4. sz. szekv. 157-162.

aminosavai) homológ szekvenciákat tartalmaz. Ogy tűnik, ez a DNS-fragmens 25. nukleotidján kezdődő nyitott leolvasási keretet, és 3'-végén 76 bázisos poli A farok-szerű szekvenciát tartalmaz, terminációs kodont azonban nem. Közvetlenül a poli A farok-szerű szekvencia előtt 253 aminosav-gyökből álló aminosav-szekvenciája a patkány TPO cDNS megfelelő részével (a 2. sz. szekvenciában bemutatott 147 gyökből álló aminosav-szekvenciával) 84 %-os homológiát mutatott. Erről a kiónról megállapítottuk, hogy a patkány TPO cDNS-nek megfelelő humán cDNS egy részét magában foglaló DNS-fragmens. Ez a klón a terminációs kodon hiánya és 3'-végén a poli A farok-szerű szekvencia jelenléte miatt úgy tűnik, nem teljes cDNS, hanem a cDNS könyvtár készítése során képződött mesterséges termék.

• · ·

- 160

17. példa

Humán TPO cDNS expresszálása COS1 sejtekben; a TPO aktivitás igazolása

A pEF18S-HL34 plazmid klón C0S1 sejtekbe történő transzfekcióját a 11. példában leírt eljárás szerint végeztük. Eszerint 10 pg plazmid-DNS-t a klorokin-kezelést magában foglaló DEAE-dextrán eljárással transzfektáltunk. A C0S1 sejteket 37 ’C-on 3-5 napig tenyésztettük, majd összegyűjtöttük a felülúszót.

A tenyészetfelülúszót IMDM tenyésztő tápközeggel szemben

CFU-MK vizsgálati

C0S1 sejtek képzett hosszúkás ellentétben, azon a melyekben egyedül a intenzíven dializáltuk és patkány rendszerrel értékeltük. Azon tenyészetfelülúszójában, amelyekben a pEF18S-HL34 plazmidot expresszáltuk, dózisfüggő TPO aktivitást mutattunk ki (8. ábra). A tenyésztés négy napja után sok megakariocita citoplazmikus nyúlványokat. Ezzel C0S1 sejtek tenyészetfelülúszójában, PEF18S plazmidot expresszáltuk, TPO aktivitást nem tapasztaltunk (8. ábra). Az M-07e vizsgálati rendszerben M-07e sejtproliferációt fokozó hatást csak azon C0S1 sejtek tenyészetfelülúszójában tapasztaltunk, melyekben transzfekció útján a pEF18S-HL34 plazmidot expresszáltuk. Ezek az eredmények azt bizonyították, hogy a pEF18S-HL34 plazmid TPO aktivitással rendelkező proteint kódoló gént tartalmaz. Ezenkívül kimutattuk, hogy a humán TPO hat a patkány megakariocita őssejtekre (azaz nem fajspecifikus).

* · * ·· · ·

- 161 18. példa

Humán TPO deléciós típusú cDNS expresszálása és a TPO aktivitás igazolása

A 15. példában kapott HL34 klón olyan cDNS-t tartalmazott, amely 3'-végén (a patkány TPO cDNS-ben nem létező) poliA farok-szerű folytonos szekvenciát tartalmazott, s emiatt a kísérlet mesterséges termékének tűnt. Következésképpen, hogy megtudjuk, vajon a deléciós cDNS által expresszált protein rendelkezik-e TPO aktivitással, olyan cDNS molekulát készítettünk, amelyből delécióval eltávolítottuk a poli A farok-szerű szekvenciát. A deléciós cDNS-t PCR-ral állítottuk elő. A PCR-hoz az alábbi primer szekvenciákat alkalmaztuk, melyekhez 5'-végükön restrikciós enzim felismerési helyet adtunk (a hTP05-höz EcoRI helyet, a hTP03-hoz NotI helyet, valamint TAA és TGA stop kodonokat).

hTPO5: 5'-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (170.

sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 1-21. helyei) hTP03: 3'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT TCG TGT ATC CTG TTC AGG

TAT CC-3' (171. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 757-780.

helyeinek megfelelő anti-szensz primer).

Templátként a 16. példában kapott pEF18S-HL34 plazmid klón plazmid-DNS-ének 1 pg-ját, primerekként a hTP05 és hTP03 10-10 ^i-ját, valamint AmpliTáq™ DNS Polymerase-zal GeneAmp™ PCR Reagent készletet (Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmazva GeneAmp™ PCR System 9600 készülékben (PerkinElmer) 100 pl térfogatban PCR-t végeztünk, melynek során • · · ♦ ·« ···· ·· · · • · · ·· ·· »

162 összesen 15 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 95 ’C-on 1 perces denaturálásból, 65 ’C-on 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt, végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk. Az így kapott körülbelül 800 bp-os sávot EcoRI és NotI restrikciós enzimekkel emésztettük, majd az előzetesen ugyanezen enzimekkel kezelt pEF18S expressziós vektorba szubklónoztuk. A kapott transzformánsok közül a plazmid-DNS nagy mennyiségének 5. példában leírt eljárás szerint való előállításához öt olyan kiónt választottunk ki, melyek tartalmazták a kb. 800 bp-os DNS-fragmenst. Az egyes plazmidok kb. 800 bp-os amplifikált régióját teljes hosszúságában nukleotid-szekvencia analízisnek vetettük alá, hogy kimutassuk a 16. példában vizsgált nukleotidszekvenciával (a 4. sz. szekv. 1-780. helyei) való teljes azonosságát.

Az így kapott plazmid kiónt pHTl-231-nek neveztük el. A DH5

E. coli törzs által hordozott pHTl-231 vektort 1994. február

14-én FERM BP-4564 deponálási számon helyeztük letétbe (National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japán).

A így kapott plazmiddal a 11. példában leírt eljárás szerint C0S1 sejteket transzfektáltunk. Eszerint 10 pg plazmid-DNS-t a klorokin-kezelést magában foglaló DEAE-dextrán eljárással transzfektáltunk. A C0S1 sejteket 37 ’C-on 3-5 napig • ·

- 163 tenyésztettük, majd összegyűjtöttük a felülúszót.

A tenyészetfelülúszót IMDM tenyésztő tápközeggel szemben

CFU-MK vizsgálati C0S1 sejtek intenzíven dializáltuk és patkány rendszerrel értékeltük. Azon tenyészetfelülúszójában, amelyekben a pHTl-231 plazmidot expresszáltuk, TPO aktivitást mutattunk ki (9. ábra). A tenyésztés negyedik napján sok megakariocita képzett hosszúkás citoplazmikus nyúlványokat. Ezzel ellentétben, azon a COS1 sejtek tenyészetfelülúszójában, melyekben egyedül a pEF18S plazmidot expresszáltuk, TPO aktivitást nem tapasztaltunk (9. ábra). Az M-07e vizsgálati rendszerben M-07e sejtproliferációt fokozó hatást csak azon COS1 sejtek tenyészetfelülúszójában tapasztaltunk, melyekben pHTl-231 plazmidot expresszáltuk. Ezek az eredmények azt bizonyították, hogy a pHTl-231 plazmid TPO aktivitással rendelkező proteint kódoló cDNS-t tartalmaz.

19. példa

A humán TPO cDNS 3'-vég régiójának előállítása PCR-ral

A 15. példában előállított HL34 klón tartalmazta a poli(A) farok-szerű szekvenciát magában foglaló cDNS-t, ami arra utal, hogy a 3'-vég régió nem teljes. Emiatt PCR-ral teljes hosszúságú 3'-vég régiót próbáltunk kialakítani. A 16. példában meghatározott szekvenciák alapján az alábbi négy 5' oldali prímért szintetizáltuk a PCR-hoz:

hTPO-H: 5'-AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC-3' (39. sz. szekv.)

164 (a 4. ss. ssekv. 575-594. helyei) hTPO-K: 5'-ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC-3' (40. sz (a 4. sz. szekv. 595-615. helyei) hTPO-N: 5'-AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT-3' (41. sz (a 4. sz. szekv. 660-680. helyei) hTPO-O: 5'-AGG GAT TCA GAG CCA AGA TTC-3' (42. sz (a 4. sz. szekv. 692-721. helyei).

szekv. ) szekv.) szekv.)

A poli(A) rész elejétől kezdődő cDNS-amplifikálás érdekében az alábbi 3' oldali primereket szintetizáltuk, melyek kevert nukleotldokat taralmaznak. Kevert nem tartalmazó anchor (horgony) prímért is

3'-végükön primereket szintetizáltuk.

hTP03mix: 5'	-TAG CGG CCG C(T)i?G	GGG-3'	(43.	sz.	szekv.)
	A	AAA-3'	(44.	sz.	szekv.)
	C	TTT-3'	(45.	sz.	szekv.)
		CCC-3'	(46.	sz.	szekv.)
hTP03anchor:	5'-TAG CGG CCG C(T)n-	-3'	(47.	sz.	szekv.)

A cDNS első szálát a 14. példához hasonlóan kereskedelmileg beszerezhető normális humán máj sejt-eredetű poli(A)* RNS (Clontech) 1 pg-jából szintetizáltuk, de a szintézishez 0,5 pg oligo dT prímért alkalmaztunk (amely benne van a Pharmacia által gyártott TimeSaver™ cDNA Synthesis

Kit-ben). Templátként a szintetizált cDNS oldat 1/10 térfogatát, primerként a hTPO-H 20 £±l-ját és a hTP03mix 10 ját, valamint AmpliTaq™ DNS Polymerase-zal GeneAmp™ PCR

Reagent készletet (Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmazva

165

GeneAmp™ PCR System 9600 készülékben (Perkin-Elmer) 50 μΐ térfogatban PCR-t végeztünk, melynek során az elegyet 2 percig 96 ’C-on melegítettük, s összesen 10 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 96 ’C-on 1 perces denaturálásból, 48 ’C-on 1 perces hibridizálásból és 72 ’Con 1 perces szintézisből állt, végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk.

A második PCR-t templátként az első PCR-ból származó oldat 1/10 térfogatát, primerként a hTPO-K primer 20 /ü-ját és a hTP03mix primer 10 μΜ-ját alkalmazva 50 μΐ térfogatban végeztük, melynek sorén az elegyet 2 percig 96 ’C-on melegítettük, s összesen 10 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 96 ’C-on 1 perces denaturálásból, 63 ’Con 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt, végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk.

A harmadik PCR-t templátként a második PCR-ból származó oldat 1/10 térfogatát, primerként a hTPO-N primer 20 ^-ját és a hTP03mix primer 10 uM-ját alkalmazva 50 ul térfogatban végeztük, melynek során az elegyet 2 percig 96 ’C-on melegítettük, s összesen 10 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 96 ’C-on 1 perces denaturálásból, 63 ’Con 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt, végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk.

166

A negyedik PCR-t templátként a harmadik PCR-ból származó oldat 1/10 térfogatát, primerként a hTPO-O primer 20 μΜ-ját és a hTP03mix primer 10 Ml-ját alkalmazva 50 ul térfogatban végeztük, melynek során az elegyet 2 percig 96 °C-on melegítettük, s összesen 10 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 96 ’C-on 1 perces denaturálásból, 63 ’Con 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt, végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk.

Az ötödik PCR-t templátként a negyedik PCR-ból származó oldat 1/10 térfogatát, primerként a hTPO-O primer 20 ^ü-ját és a hTP03anchor primer 20 ^1-ját alkalmazva 50 jul térfogatban végeztük, melynek során az elegyet 2 percig 96 ’C-on melegítettük, s összesen 10 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 96 ’C-on 1 perces denaturálásból, 58 ’Con 1 perces hibridizálásból és 72 ‘C-on 1 perces szintézisből állt, végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk.

Az így kapott reakcióelegyet 2 %-os agaróz gélen (FMC BioProducts) elektroforizáltuk, s a PCR főtermékeként körülbelül 600 bp-os DNS-fragmenst izoláltunk, melyet azután a fentebb említett Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet (Bio-Rad

Laboratories, Inc.) alkalmazásával tisztítottunk. A tisztított DNS-fragmens nukleotid-szekvenciáját 373A DNSszekvenálóval (Applied Biosystems), a fentebb említett Taq

Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening Kit (Applied

167

Biosystems) alkalmazásával határoztuk meg. A meghatározott nukleotid-szekvenciát és az abból leszármaztatott nukleotidszekvenciát a Szekvencialista 5. számú szekvenciájaként mutatjuk be.

Ez a DNS-fragmens 130 aminosavat kódoló, a hTPO-O promerrel kezdődő nukleotid-szekvenciával rendelkezik, melyet 3-végén 180 nukleotid követ (az 577. nukleotid utáni szekvenciát nem tudtuk meghatározni). A glicinnel kezdődő, 30 aminosavból álló szekvencia megegyezik a 4. sz. szekv. 203-232.

aminosavaival. Az 1-94. nukleotidőkből álló nukleotid szekvencia megegyezik a 4. sz. szekv. 692-785. nukleotidjainak megfelelő szekvenciával.

A 17. példában kapott cDNS-fragmens és az ebben a példában PCR-amplifikéit fragmens szekvencia-analízisének eredményeként megállapítottuk, hogy a humán TPO protein 21 aminosavas jelzőszekvenciát tartalmazó 353 aminosavból áll (6. sz. szekv.).

20. példa

Normális humán máj-eredetű cDNS könyvtár rekonstruálása

Mivel a 15. példában kapott HL34 klón közvetlenül nyitott leolvasási keretének 3-végén terminációs kodonok nélkül poli(A) farok-szerű szekvenciát tartalmazott, s emiatt a cDNS-szintézis mesterséges termékének tűnt, 5 pg normális humán máj-eredetű poli(A)⁺ RNS készítmény (Clontech)

168 alkalmazásával cDNS könyvtárt rekonstruáltunk. A cDNS szintézisét cDNS-szintézishez való SuperScript™ Lambda System, Lamda Cloning Kit és SuperScript™ II RN-áz H~ (mindkettő a Life Technologies terméke) alkalmazásával végeztük. A poli(A)^ RNS-t melegítéssel denaturáltuk, majd 20 pl reakcióélégyhez adtuk, amely primerként a készletben (50 mM Tris-HCl, pH = 8,3; 75 mM KC1; 3 mM MgClz; 1 mM DTT; 1 mM dNTP elegy; 200 egység SuperScript™ II RN-áz H~) lévő,

NotI szekvenciát magában foglaló oligo dT-t tartalmaz. A reakcióelegyet 37 °C-on 60 percig inkubáltuk. A második cDNS szál 25 mM Tris-HCl (pH = 8,3) puffért, 100 mM KCl-ot, 5 mM MgCl2-ot, 250 /14 dNTP elegyet, 5 mM DTT-t, 40 egység E. coli DNS-polimeráz I-et, 2 egység E. coli RN-áz H-t és 10 egység E. coli DNS-ligázt tartalmazó 150 ul reakcióélégyben 16 °Con 2 órás inkubálással végzett szintézise után az oldathoz 10 egység T4 DNS-polimerázt adtunk, és a kapott elegyet 16 °C-on 5 percig inkubáltuk. A reakcióelegyet 10 percig 65 °C-on melegítettük, azonos térfogatú fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, és a 400 bp-nál rövidebb cDNS molekulákat SizeStep™ 400 centrifugált oszlop (a Pharmacia által gyártott TimeSaver™ cDNS-szintetizáló készlet részét képező, kis molekulatömegü DNS eltávolítására szolgáló centrifugált oszlop) alkalmazásával eltávolítottuk. EcoRI adaptor (a Pharmacia által gyártott Directional Cloning

Toolbox része) hozzáadása után az így kezelt mintát Notlgyel emésztettük, majd a kis molekulatömegü DNS eltávolítása érdekében ismét SizeStep™ 400 centrifugált oszlopra vittük. Az így szintetizált 1,3 pg kétszálú cDNS-t, amely 5'-végén

169 ··· ····· • · · · · · ·

EcoRI felismerési helyet, 3'-végén pedig NotI felismerési helyet tartalmaz, előzetesen EcoRI és NotI enzimekkel emésztett pEF18S expressziós vektorhoz ligáltuk, majd 9,2 ml Competent High E. coll DH5 (Toyobo Co., Ltd.) törzsbe transzformáltuk. Az így kapott humán máj cDNS könyvtár (hTPO-Fl) 1,0 x 10^e transzformánst tartalmazott.

21. példa

TPO cDNS klón screenelése hTPO-Fl humán máj cDNS könyvtárból

A PCR-hoz a Szekvencialistában bemutatott 3. és 6. számú szekvencia alapján humán TPO cDNS-nek megfelelő primereket szintetizáltunk, melyek az alábbi szekvenciákkal rendelkeznek:

hTPO-I: TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (48. sz. szekv.) (a 3. sz. szekv. 60-80. helyei) hTPO-KU: 5'-AGG ATG GGT TGG GGA AGG AGA-3' (49. sz. szekv.) (a 6. sz. szekv. 901-921. helyeinek megfelelő anti-szensz primer).

A 20. példában készített hTPO-Fl humán máj cDNS könyvtárat (1,0 x 10⁶ transzformáns) három csoportra osztottuk, s ezeket lefagyasztottuk. A PCR-t templátként az egyes csoportokból készített plazmid-DNS 2 /jg-ját, primerként a hTPO-I és hTPO-KU szintetizált primerek 1-1 /ái-ját, továbbá AmpliTaq™ DNS Polymerase-zal GeneAmp™ PCR Reagent készletet (Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmazva GeneAmp™ PCR System 9600 készülékben (Perkin-Elmer) 100 μΐ térfogatban

- 170 csoportot osztottuk, végeztük, melynek során összesen 35 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 95 ’C-on 1 perces denaturálásból, 59 ’C-on 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt, végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk. A 3. csoportból készített plazmid-DNS-t alkalmazva a várt méretű DNS-fragmenst amplifikáltuk. A 3.

egyenként 15000 transzformánst alcsoportokra és ezeket egy éjszakán keresztül 50 pg/ml ampicillint tartalmazó 1 ml LB tápközegben tenyésztettük, najd PI-100 automata plazmid-izoláló készülékkel plazmidDNS-t vontunk ki. A kinont DNS-t TE-oldatban oldottuk, és a kapott oldatok 5 %-át templátként használtuk a fentivel azonos primerek alkalmazásával és azonos körülmények között végzett PCR-hoz. A 90 csoport közül hatban észleltük a várt mérettel rendelkező DNS amplifikálódását. Amikor a pozitív csoportok egyikét egyenként 1000 kiónt tartalmazó alcsoportokra osztottuk, plazmid-DNS-t vontunk ki és a fentivel megegyező módon PCR-t végeztünk, DNS-amplifikációt nem tapasztaltunk. Az alcsoportot tovább felosztva a PCR sorozattal amplifikált DNS-fragmensek elektroforézis géljén a sávok denzitása csökkent, amit valószínűleg a plazmid-DNS szóban forgó klón gyenge növekedése miatti alacsony kinyerése okozott. Emiatt az eredeti 3. csoport alkalmazásával telephibridizációval újabb screenelést végeztünk.

A 3. csoportot 15 cm átmérőjű 100 LB agar lemezekre szélesztettük, olyan mennyiségben, hogy mindegyik LB • · • · ···· ·· ·· »·

- 171 agarlemezen 4100 telep nőjön. Miután az így oltott lemezekről másolati (replika) lemezt készítettünk, az egyik másolatot a lemezen nőtt telepek kinyerése és plazmid-DNS minták kivonása érdekében 37 C°-on 6 órán át tenyésztettük. E plazmid-DNS mintákkal a fenti módon PCR-t végezve 100 alcsoport közül egy esetében tapasztaltuk a várt mérettel megegyező sáv amplifikációját. Ezen alcsoportot tartalmazó lemezről BIODYNE™ A TRANSFER MEMBRÁNÉ (a PÁLL terméke) alkalmazásával másolati filtereket készítettünk. A filtereket 10 percig 10 %-os SDS-ben, 10 percig 0,5 N NaOH/l,5M NaCl oldatban és 10 percig 0,5M Tris-HCl (pH =

8,0)/l,5M NaCl oldatban (ebben a sorrendben) áztatva denaturáltuk, , majd 30 percig levegőn szárítottuk, s vákuum alatt 80 °C-on egy óra hosszat hőkezeltük. Az így túlszárított filtereket 1 % SDS-sel kiegészített 6 x SSC-vel (melyet 1 liter vízben 175,3 g NaCl-ot és 88,2 g nátriumcitrátot tartalmazó 20 x SSC törzsoldat [pH = 7,0] hígításával kaptunk) mostuk. A mosott filterek prehibridizálását 42 °C-on 30 ml reakcióélégyben rázatás mellett 30 percig végzett inkubálással hajtottuk végre, mely reakcióelegy 50 % formamidból, 5 x SSC-ből, 5 x Denhardtoldatból (melyet 500 ml vízben 5 g Ficoll-t, 5 g polivinilpirrolidont és 5 g szarvasmarha szérumalbumin V frakciót tartalmazó 50 x Denhardt-oldatból készítettünk), 1 % SDS-ből és 20 pg/ml 'lazacsperma DNS-ből állt. A prehibridizálás után a reakcióelegyet azonos összetételű 30 ml hibridizáló oldatra cseréltük, előzetesen [alfa-³²P]-dCTP-vel (Amersham) jelölt próbával elegyítettük, majd rázatás közben 42 °C-on • *

- 172 20 óra hosszat inkubáltuk. E kísérletben jelölt próbaként a pEF18S-HL34 plazmid EcoRI/BamHI fragmensét használtuk, amelyet a 4. számú szekvencia 5'-végétől 458. bázisáig terjedő szakaszának tisztításával, és a tisztított rész Megaprime DNA Labelling System (az Amersham által gyártott készlet, amely az Anal. Biochem.-ben [±22, 6-13, 1983] leírt eljáráson alapul) alkalmazásával random primer technikával történő jelölésével kaptunk. Az így kezelt filtereket 42 ’Con 30 percig 2 x SSC/0,1 % SDS oldattal, majd 42 ’C-on 30 percig 0,2 x SSC/0,1 % SDS oldattal mostuk. A filtereket ezután -70 ’C-on X-0MAT™ AR5 film (Eastman Kodak) és erősítőernyő alkalmazásával 16 órás autoradiográfiának vetettük alá. Eredményként egyetlen, pozitívnak ítélt jelet figyeltünk meg. Az e jelnek hozzávetőleg megfelelő telepeket az eredeti lemezről összegyűjtöttük, és ismét 10 cm-es LB agarlemezre oltottuk. A lemezen nőtt összesen 50 telepet egymástól elkülönítve tenyésztettük, s DNS-mintáikkal az említett hTPO-I és hTPO-KU primerek alkalmazásával a fentebb leírt körülmények között PCR-t végeztünk. A várt méretű sáv amplifikálódását csak egy klón esetében tapasztaltuk, s ezt pHTFl-nek neveztük el.

22. példa

A pHTFl humán TPO cDNS klón nukleotid-szekvenciájának meghatározása

A plazmid-DNS tisztítását alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor

173

Laboratory Press, 1989) szerint végeztük. A pHTFl kiónt egy éjszakán keresztül 50 /jg/ml ampicillint tartalmazó 50 ml LB tápközegben tenyésztettük. A képződött sejteket centrifugálással összegyűjtöttük és a fentebb említett TEG-lizozim oldat 4 ml-ében szuszpendáltuk. Ehhez a sejtek alapos szuszpendálása érdekében 8 ml 0,2N NaOH/1 % SDS oldatot, majd 6 ml 3M kálium/5M acetát oldatot adtunk. A szuszpenzió centrifugálása után a felülúszót 1:1 arányú fenol/kloroform eleggyel kezeltük, azonos térfogatú izopropanollal elegyítettük, majd centrifugáltuk. A kapott üledéket TE-oldatban feloldottuk és RN-ázzal, majd 1:1 arányú fenol/kloroform eleggyel kezeltük, végül etanolos kicsapást végeztünk. Az üledéket TE-oldatban újra feloldottuk, majd ehhez 0,63M végkoncentrációban NaCl-ot, illetve 7,5 % végkoncentrációban polietilén-glikol 3000-et adtunk. Centrifugálás után az üledéket TE-oldatban oldottuk és etanollal kicsaptuk, miáltal kb. 300 pg, pHTFl plazmidDNS-1 kaptunk.

A tisztított plazmid-DNS teljes nukleotid-szekvenciáját a fentebb említett Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening készlet (Applied Biosystems) alkalmazásával 373A DNSszekvenálóval (Applied Biosystems) határoztuk meg. A meghatározott nukleotid-szekvenciát, és a belőle leszármaztatott aminosav-szekvenciát a Szekvencialista 7.

számú szekvenciájában mutatjuk be. A nukleotid-szekvencia meghatározásához primerekként a 6. sz. szekv. nukleotidszekvenciája és szekvencia-reakcióanalízisével kapott belső

- 174 « · «··· szekvenciája alapján szintetizált oligonukleotidokat alkalmaztunk.

Bebizonyosodott, hogy a pHTFl klón 1721 bp hosszú cDNS fragmenst tartalmaz, s nagy homológiát mutat a 2. példában vizsgált AP8 (a 7. sz. szekv. 1-12. aminosavai) és TP2/TP3 aminosav-szekvenciákkal (a 7. sz. szekv. 157-162.

aminosavai). Ez a DNS-fragmens 101 bázisos 5' nemkódoló régióval, a 102-14. nukleotidok által kódolt metionin gyökkel kezdődő és az 1158-1160. nukleotidok által kódolt glicinnel végződő, 353 aminosavas nyitott leolvasási kerettel, az ezt követő terminációs kodonnal (TAA), 531 bázisból álló 3' nemkódoló régióval és 30 bázisos poli A farok szekvenciával rendelkezik. A nyitott leolvasási keret által kódolt protein aminosav-szekvenciája tökéletesen egybeesik a humán TPO megjósolt aminosav-szekvenciájával (6. sz. szekv.). A pHTFl cDNS-szekvenciája nagyobb méretű, mint a 6. sz. szekvenciában bemutatott feltételezett cDNSszekvencia; az 5' oldalon 77, a 3' oldalon a poli A farok szekvenciája előtt 347 további bázist tartalmaz. A nukleotid-szekvencia továbbá három ponton különbözik a 6. sz. szekvenciától. Eszerint, a 7. sz. szekvenciában a 84. A, 740. A és 1198. G a 6. sz. szekvenciában C, T, illetve A. Csak a 740. helyen lévő mutáció esik bele a proteint kódoló régióba, de ez a mutáció nem okozott aminosavcserét, mivel az A és T bázis egyaránt a treonin kodonjának harmadik bázisa. Bár ezen szubsztitúciók oka akkor ismeretlen volt, a pHTFl plazmid klón vizsgálatával bebizonyítottuk, hogy a » · • ·« • * · » · · · « · · » · >

«· «··* ·«

- 175 humán TPO protein 353 aminosav-gyökből áll, melyből 21 aminosav jelzőszekvenciát képez. A jelzőszekvencia nélküli érett protein molekulatömegét 35466 D-nak becsültük.

A DH5 E. coli törzs által hordozott pHTFl vektort 1994. március 24-én FERM BP-4617 deponálási számon helyeztük letétbe (National Institute of Bioscience and Humán

Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japán).

23. példa

A pHTFl humán TPO cDNS klón expresszálása COS1 sejtekben; a TPO aktivitás igazolása

A pHTFl plazmid klónnal a 11. példában leírt eljárás szerint transzfektáltuk a COS1 sejtet. Ennek megfelelően a transzfekciót a klorokinos kezelést magában foglaló DEAEdextrán eljárás alkalmazásával 10 pg plazmid-DNS-sel végeztük. A transzfektált C0S1 sejteket 37 ’C-on három napig tenyésztettük, és a tenyészetfelülúszőt összegyűjtöttük.

A tenyészetfelülúszőt IMDM tenyésztő tápközeggel szemben intenzíven dializáltuk és a patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel értékeltük. Dózisfüggő TPO aktivitást azon C0S1 sejtek tenyészetfelülúszójában mutattunk ki, amelyekben a pHTFl plazmidot expresszáltuk (10/A ábra). Ezzel szemben azon C0S1 sejtek tenyészetfelülúszójában, amelyekben önmagában

PEF18S plazmidot expresszáltuk.

nem

176 tapasztaltunk TPO aktivitást (10/A ábra). Az M-07e vizsgálati rendszerrel szintén hasonló eredményeket kaptunk. Azon COS1 sejtek tenyészetfelülúszója, amelyekben a pHTFl plazmidot expresszáltuk, dózisfüggő módon jelentősen fokozta az M-07e sejtek proliferációját (10/B ábra). Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a pHTFl TPO aktivitású proteint kódoló gént tartalmaz.

24. példa

Humán TPO kromoszómái Is DNS klónozása alkalmazott

Research

A humán TPO kromoszómáiis DNS-ének klónozását próbaként humán TPO cDNS alkalmazásával végeztük. A klónozáshoz genom könyvtárat Prof. T. Yamamoto (Gene Center, Tohoku University) bocsátotta rendelkezésünkre (ezt a könyvtárat Sakai és mtsi. írták le [J. Bioi. Chem., 269. 2173-2182, 1994], és úgy állították elő, hogy humán kromoszomális DNS-t Sau3Ai restrikciós enzimmel emésztettek, és a részlegesen emésztett DNS-t a Stratagene által gyártott Lambda EMBL3 fágvektor BamHI helyére ligálták). E könyvtár screenelését próbaként humán TPO cDNS felhsználásával alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) szerint végeztük. LE392 E. coli gazdatörzset alkalmazva a könyvtárat NZYM-et (1 liter vízben 10 g NZ amin, 5 g NaCl, 5 g Bacto élesztőkivonat, 2 g MgSO4-7H2O és 15 g agar) tartalmazó 15 cm-es lemezre oltottuk, olyan mennyiségben, hogy egy lemez 30000

- 177 fágrészecskét tartalmazott. Az így elkészített 18 lemez mindegyikéről BIODYNE™ A TRANSFER MEMBRÁNÉ (a PÁLL terméke) alkalmazásával két-két replika filtert készítettünk. A filtereket 10 percig 0,5 N NaOH/l,5M NaCl oldatban és 10 percig 0,5M Tris-HCl (pH = 8,0)/l,5M NaCl oldatban áztatva denaturáltuk, majd 30 percig levegőn szárítottuk, s vákuumkemencében 80 ’C-on egy óra hosszat hőkezeltük. Az így kezelt filterek prehibridizálását 42 ’C-on 500 ml reakcióé légyben 1 órás inkubálással végeztük, mely reakcióelegy 50 % formamidból, 5 x SSC-ből, 5 x Denhardtoldatból, 1 % SDS-ből és 20 ;2g/ml lazacsperma DNS-ből állt. A próbaként való alkalmazáshoz PCR-ral humán TPO cDNSfragmenst (a 7. sz. szekv. 178-1025. bázisai) amplifikáltunk, a fragmenst tisztítottuk, és azt Random Primer DNA Labelling készlet alkalmazásával (Takara Shuzo által gyártott DNS-jelölő készlet, amely az Anal. Biochemben leírt (132. 6-13, 1983) random primer eljáráson alapul) ³²Pizotóppal jelöltük. A PCR-hoz primerként alkalmazott szekvenciák az alábbiak voltak:

hTPO-I: TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (50. sz. szekv.) (a 7. sz. szekv. 178-198. bázisai) hTPO-N: 5'-AGG GAA GAG CGT ATA CTG TCC-3' (51. sz. szekv.) (a 7. sz. szekv. 1005-1025. bázisainak megfelelő anti-szensz primer).

Az izotóppal jelölt próba alkalmazásával a hibridizációt a prehibridizációs oldattal azonos összetételű, 500 ml reakcióelegyben 40 ’C-on 20 óra hosszat végeztük. A kapott *··· «V • * ·:

«« ►·

178 filtereket szobahőmérsékleten háromszor öt percig 0,1 x SSC/0,1 % SDS oldatban, majd 68 ’C-on egyszer egy óra hosszat 0,1 x SSC/0,1 % SDS oldatban mostuk. A filtereket ezután -70 °C-on X-OMAT™ AR5 film (Eastman Kodak) és erősítőernyő alkalmazásával 16 órás autoradiográfiának vetettük alá. Eredményként 13 pozitív jelet kaptunk. Az egyes pozitív jeleknek hozzávetőleg megfelelő plakkokat összegyűjtöttük az eredeti lemezekről, és azokat 15 cm-es NZYM lemezekre oltottuk, olyan mennyiségben, hogy mindegyik lemezen 1000 plakk alakuljon ki. A fentebb leírt körülmények közötti hibridizációhoz mindegyik lemezről két másolati filtert készítettünk. Eredményként mind a 13 csoport lemezén észleltünk pozitív jeleket. A Sambrook és mtsi. által leírt lemez-lizátum módszer alkalmazásával fág DNS készítéséhez valamennyi lemezről levettünk egy plakkot. A 13 klónból készített fág DNS mintákban PCR-ral ellenőriztük a cDNS kódoló régió jelenlétét, amely során az alábbi szekvenciákkal rendelkező primereket alkalmaztuk:

hTPO-L: 5'-GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (52. sz. szekv.) (a 6. sz. szekv. 1-21. helyei) hTPO-F: 5'-ATG GGA GTC ACG AAG CAG TTT-3' (53. sz. szekv.) (a 6. sz. szekv. 127-147. helyeinek megfelelő anti-szensz primer) hTPO-P: 5'-TGC GTT TCC TGA TGC TTG TAG-3' (54. sz. szekv.) (a 6. sz. szekv. 503-523. helyei) hTPO-C: 5'-AAC CTT ACC CTT CCT GAG ACA-3' (55. sz. szekv.) (a 6. sz. szekv. 1070-1090. helyeinek megfelelő anti-szensz primer).

» « •· ·· ····

179

E pirmer-kombinációk alkalmazásával elvégzett PCR után a 13 klón közül 5 tartalmazta a cDNS-ből előre megjósolt teljes aminosav-kódoló régiót. Ezen 5 kiónban lévő kromoszomális DNS molekulák egyformán kb. 20 kb hosszúságúak voltak, s az előzetes restrikciós enzimes vizsgálat során majdnem azonos mintázatot mutattak. Ilyenformán, az egyik kónt (lamdaHGTl) kiválasztottuk és Southern biot technikával vizsgáltuk. Eszerint a lamdaHGTl klón DNS-ének 1 pg-ját EcoRI és HindiII restrikciós enzimekkel teljesen emésztettük, 0,8 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, s a gélen megjelenő sávokat BIODYNE™ A TRANSFER MEMBRANE-ra (a PÁLL terméke) másoltuk.

A filtert 30 percig levegőn szárítottuk, majd vákuumkemencében 80 ‘C-on hőkezeltük. A prehibridizálást 42 ’C-on

500 ml, 50 % formamidból, 5 x SSC-ből, 5 x Denhardtoldatból, 1 % SDS-ből és 20 /jg/ml lazacsperma DNS-ből álló reakcióelegyben 1 órás inkubálással végeztük. A próbaként való alkalmazáshoz PCR-ral humán TPO cDNS-fragmenst (a 7. sz. szekv. 178-1025. bázisai) amplifikáltunk, a fragmenst tisztítottuk, és azt Random Primer DNA Labelling készlet alkalmazásával (Takara Shuzo) ³²P-izotóppal jelöltük. Az izotóppal jelölt próba alkalmazásával a hibridizációt a prehibridizációs oldattal azonos összetételű, 50 ml reakcióelegyben 40 ’C-on 20 óra hosszat végeztük. A kapott filtert szobahőmérsékleten háromszor öt percig 2 x SSC/0,1 %

SDS oldatban, majd 68 ’C-on egyszer egy óra hosszat 0,1 x

SSC/0,1 % SDS oldatban mostuk. A filtereket ezután -70 ‘C-on

X-OMAT™ AR5 film (Eastman Kodak) és erősítőernyő alkalmazásával 16 órás autoradiográfiának vetettük alá.

• · · • · ·

- 180

Eredményként a HindiII-mai végzett emésztés esetében egyetlen, kb. 10 kb-os sávot kaptunk. Következésképpen, a lamdaHGTl klón DNS-ének 10 yg-ját HindlII-mal emésztettük, 0,8 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, a 10 kb-os sávot kivágtuk a gélről, majd Prep-A-Gene DNS tisztító készlettel (Bio-Rad) tisztítottuk és előzetesen HindlII-mal emésztett pUC13 klónozó vektorba (Pharmacia) szubklónoztuk. Ebben az esetben gazdatörzsként DH5 Competent High E. coli törzset (a

T0Y0B0 terméke) alkalmaztunk.

Az így előállított kiónok közül a 10 kb-os HindlII fragmenst tartalmazó kiónt kiszelektáltuk és pHGTl-nek neveztük el.

A lambdaHGTl fág klón restrikciós térképét a 11. ábrán mutatjuk be.

25. példa

A pHGTl kromoszomáliö humán TPO klón nukleotid-ezekvenciájának meghatározása

A pHGTl klón tenyésztését és a plazmid-DNS tisztítását alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) szerint végeztük. A pHGTl kiónt egy éjszakán keresztül 50 pg/ml ampicillint tzrtalmazó 50 ml LB tápközegben tenyésztettük. A képződött sejteket centrifugálással összegyűjtöttük és a fentebb említett TEG-lizozim oldat 4 ml-ében szuszpendáltuk. Ehhez a sejtek alapos szuszpendálása érdekében 8 ml 0,2N

181

NaOH/1 % SDS oldatot, majd 6 ml 3M kálium/5M acetát oldatot adtunk. A szuszpenzió centrifugálása után a felülúszót 1:1 arányú fenol/kloroform eleggyel kezeltük, azonos térfogatú izopropanollal elegyítettük, majd centrifugáltuk. A kapott üledéket TE-oldatban feloldottuk és RN-ázzal, majd 1:1 arányú fenol/kloroform eleggyel kezeltük, végül etanolos kicsapást végeztünk. Az üledéket TE-oldatban újra feloldottuk, majd ehhez 0,63M végkoncentrációban NaCl-ot, illetve 7,5 % végkoncentrációban polietilén-glikol 3000-et adtunk. Centrifugálás után az üledéket TE-oldatban oldottuk és etanollal kicsaptuk, miáltal kb. 300 pg pHTFl plazmidDNS-t kaptunk.

A tisztított plazmid-DNS cDNS nukleotid-szekvenciából megjósolt protein-kódoló régiója körüli nukleotidszekvenciáját a fentebb említett Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening készlet (Applied Biosystems) alkalmazásával 373A DNS-szekvenálóval (Applied Biosystems) határoztuk meg. Az így meghatározott nukleotid-szekvenciát, és a belőle leszármaztatott aminosav-szekvenciát a Szekvencialista 8.

számú szekvenciájában mutatjuk be. A nukleotid-szekvencia meghatározásához primerekként a cDNS nukleotidszekvenoiájának meghatározásához a 22. példában alkalmazott oligonukleotidokat, és a szekvencia-reakcióanalízisükkel kapott belső szekvencia alapján kialakított szintetizált oligonukleotidokat alkalmaztunk.

Azt találtuk, hogy a pHGTl plazmid klón által hordozott

- 182 kromoszómáiis DNS a 6. számú szekvenciából leszármaztatott aminosav-szekvencia teljes kódoló régióját tartalmazza, és a kódoló régió nukleotid-szekvenciája teljesen megegyezett a

6. sz. szekv. kódoló régiójával. Ezenfelül, az aminosavkódoló exonnak megfelelő régió 4 intront tartalmazott, melyek hosszúsága az 5' oldaltól számítva rendre 231 bp, 286 bp, 1932 bp és 236 bp volt (11. ábra). A nukleotidszekvencia három helyen itt is különbözött a 7. sz. szekv. cDNS nukleotid-szekvenciájától, mégpedig ugyanazokon a helyeken, mint a 22. példában, (a 6. és 7. számú szekvenciák között). A különbségek: a 7. sz. szekvenciában a 84. A, a 740. A és 1198. G bázisok a 8. számú szekvenciában C, T, illetve A bázisok voltak. Ilyenformán kimutattuk, hogy a 21. példában előállított pHTFl humán TPO cDNS klón nukleotidszekvenciája hár.om helyen eltért a pHGTl humán kromoszómái is DNS klón szekvenciájától. Következésképpen, annak vizsgálata érdekében, hogy a pHTFl cDNS klón e mutációi a klomoszomális DNS-szekvenciát tükrözik-e, az öt kromoszomális DNS klón közül egymástól függetlenül screeneléssel kiválasztot másik négy klón nukleotid-szekvenciáját is meghatároztuk. A szekvencia-analízist a ’Molecular Cloning-ban leírt lemez lizátum eljárás szerint fág DNS minta alkalmazásával közvetlen nukleotid-szekvencia meghatározási módszerrel végeztük. Az egyes kiónokat a 22. példában alkalmazott primer szekvenciák (melyeket olyan szekvencia szakaszok alapján szintetizáltunk, hogy az említett három mutációs hely analizálható legyen), és a Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening készlet (Applied Biosystems)

183 felhasználásával a fentebb említett 373A DNS-szekvenálóval (Applied Biosystems) szekvenáltuk. Azt találtuk, hogy mind a négy klón nukleotid-szekvenciája azonos volt a 6. sz. szekv. nukleotid-szekvenciájával. E négy kiónban a 7. sz. szekv. 84. és 740. helyeinek megfelelő bázisok szubsztituáltak voltak, a 1198. helyen azonban két kiónban G, másik két kiónban A volt. Más szavakkal; kimutattuk, hogy az eredeti kromoszómáiis DNS két jellemző nukleotid-szekvencia típusa létezik. Jelenleg nem világos, hogy a nukleotid-szekvencia e különbségei homológ kromoszómából vagy több génből származnak-e. Ezenkívül felvetődik az a lehetőség, hogy a nukleotid-szekvencia különbségei a rasszok különbségeinek köszönhetők, mivel a Clontech-től vásárolt poli(A)* RNS kaukázusi, míg a kromoszomális DNS japán eredetű.

A DH5 E. coll törzs által hordozott pHGTl vektort 1994. március 24. FERM BP-4616 deponálási számon helyeztük letétbe (National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japán).

26. példa

Humán TPO kromoszomális DNS expresszálása COSI sejtekben és a TPO aktivitás igazolása

A szubklónozással kapott pHGTl plazmid klón összesen négy EcoRI felismerési helyet tartalmazott; hármat az inszertált részben, egyet pedig a vektorban. Nukleotid-szekvencia • ·

- 184 analízissel kimutattuk, hogy a teljes humán TPO proteint kódoló régió egy kb. 4,3 kb-os DNS-fragmensben volt jelen, amely az inszertált rész 5' végéhez legközelebbi EcoRI feliserési hely és a vektor EcoRI felismerési helye között helyezkedett el. Ilyenformán ezt a fragmenst EcoRI-gyel kezelt pEF18S expressziós vektorba ligáltuk, miáltal négy humán TPO expressziós plazmidot kaptunk (pEFHGTE#l-4) (Id. 11. ábra). E plazmid DNS-ek előállítása után expressziós kísérletet végeztünk. A plazmid-DNS tisztítását alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) szerint végeztük, miáltal 250 pg plazmid-DNS-t kaptunk.

Az így előállított pEFHGTE#l-4 kiónokkal a 11. példában leírt eljárás szerint transzfektáltuk a C0S1 sejteket, melynek során 10 pg plazmid-DNS-t a klorokinos kezelést magában foglaló DEAE-dextrán eljárással transzfektéltunk a sejtekbe. A transzfektált COS1 sejteket 37 ’C-on három napig inkubáltuk, majd összegyűjtöttük a tenyészetfelülúszókat.

A tenyészetfelülúszókat IMDM tenyésztő tápközeggel szemben intenzíven dializáltuk és patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel értékeltük. Dózisfüggő TPO aktivitást azon C0S1 sejtek tenyészetfelülúszójában észleltünk, amelyekben mind a négy kiónt (pEFHGTE#l-4) expresszáltuk. Ezzel szemben TPO aktivitást nem találtunk azon C0S1 sejtek tenyészetfelülúszójában, amelyekben önmagában a pEF18S plazmidot expresszáltuk. A pEFHGTE#! kiónnal kapott jellemző

- 185 -

adatokat a 12/A ábrán mutatjuk be. Az M-07e vizsgálati rendszerrel szintén hasonló eredményeket kaptunk. Azon COS1 sejtek tenyészetfelülúszója, amelyekben mind a négy kiónt (pEFHGTE#l-4) expresszáltuk, dózisfüggő módon jelentősen fokozta az M-07e sejtek proliferációját. A pEFHGTE#l kiónnal kapott jellemző adatokat a 12/B ábrán mutatjuk be.

Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a pEFHGTE#l-4 plazmid kiónok a humán TPO működőképes kromoszomális DNS-ét hordozzák.

27. példa

Humán TPO deléciós típusú DNS előállítása, expresszálása CO SÍ sejtekben és a TPO aktivitás igazolása

A 18. példában kapott eredmények azt jelezték, hogy a humán TPO C-terminális harmadának eltávolítása után is képes kifejteni biológiai hatását. Ilyenformán, a biológiailag aktív részek további értékelése érdekében deléciós származékokkal végeztünk kísérleteket. E példában azokat a TPO deléciós származékokat vizsgáltuk in vitro TPO biológiai aktivitásukat kifejtő képességükre, amelyekből a pHTl-132 által kódolt TPO protein (1-231. aminosavak) C-terminális végéből 20, 40, 60, illetve 68 aminosav hiányzott. A legrövidebb származék (1-163. aminosavak) is tartalmazta a patkány vérplazma TPO 2. példában leírt TP2/3 fragmensének megfelelő aminosav-szekvenciákat. A deléciós plazmidokat PCR-ral állítottuk elő, melynek során templátként a 18.

186 példában kapott pHTl-231 plazmid klón DNS-ét, primerekként pedig az alábbi szekvenciákkal rendelkező szintetizált oligonukleotidokat alkalmaztuk:

hTPO-5: 5'-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (56.

sz. szekv. ) (melyet úgy állítottunk elő, hogy a 4. sz. szekv. 1-21. helyeinek megfelelő szekvenciához EcoRI felismerési helyet adtunk; ez a szekvencia azonos a 18. példában leírt szekvenciával);

hTPO-S: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACA GCT GTG GTG GGT-3' (57. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 555-576. helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-163. aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz

TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk);

hTPO-4: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGT GTG AGG ACT AGA GAG

GTT CTG-3' (58. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 576-600.

helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-171.

aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk);

hTP0-30: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT CTG GCT GAG GCA GTG AAG

TTT GTC-3' (59. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 636-660.

helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-191.

aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk); és hTPO-2: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGA CCA GGA ATC TTG GCT

CTG AAT-3' (60. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 696-720.

• ·

- 187 helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-211.

aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk).

Templátként a 18. példában kapott pHTl-231 klón plazmid DNS-ének 1 pg-ját, primerekként az egyes szintetizált hTPO-5 (az 5' oldalhoz) és hTPO-2, -3, -4 és -S (a 3' oldalhoz) 10-10 /24-ját, továbbá AmpliTaq™ DNS-polimerázzal GeneAmp™

PCR Reagent készletet (Takara Shuzo) alkalmazva GeneAmp™ PCR System 9600 (PERKIN-ELMER) készülékben 100 pl térfogatban PCR-t végeztünk, melynek során összesen 20 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 95 ’C-on 1 perces denaturálásból, 65 ’C-on 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt, amit végül 72 ’C-on 7 perces inkubálás követett. Mindegyik PCR-ral kapott szóban forgó sávot EcoRI-gyel és Notl-gyel emésztettük, s az emésztett mintát az egyes PCR reakciókkal amplifikált, várt méretű fő DNS-fragmens izolálása érdekében 1 %-os agarózgélen (FMC-BioProducts) elektroforizáltuk. Az izolált

DNS-fragmenst Prep-A-Gene DNS-tisztítő készlet (Bio-Rad) alkalmazásával tisztítottuk, majd az előzetesen azonos restrikciós enzimekkel kezelt pEF18S expressziós vektorba szubklónoztuk. Ebben az esetben gazdatörzsként DH5 Competent-High E. coli törzset (T0Y0E0) alkalmaztunk. Az egyes PCR reakciókból származó transzfcrmánsok közül 4-5 a várt méretű inszertet tartalmazó kiónt választottunk ki, és ezekkel — alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás

188 (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) szerint — plazmid-DNS-t állítsunk elő. E műveletek során az 1-163. aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-163 #1-5), az 1-171. aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-171 #1-4), az 1-191. aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-191 #1-4) és az 1-211.

aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-211 #1-4) plazmid-DNS mintákat készítettünk. Az egyes plazmid-DNS-ek amplifikált régióit teljes hosszúságukban nukleotidszekvencia-analízissel vizsgáltuk, hogy kimutassuk a 4. sz. szekvenciában bemutatott nukleotid-szekvenciával való teljes azonosságukat.

Az így előállított kiónokat a 11. példa eljárása szerint transzfektáltuk a COS1 sejtekbe, melynek során a transzfekciót az egyes plazmid-DNS minták 10-10 /íg-jának alkalmazásával a klorokinos kezelést magában foglaló DEAEdextrán eljárással végeztük. A transzfektált COS1 sejteket 3 napig tenyésztettük, majd kinyertük a tenyészetfelülúszókat.

A tenyészetfelülúszókat	IMDM és	tenyésztő patkány	tápközeggel szemben
intenzíven	dializáltuk	CFU-MK	vizsgálati
rendszerrel	értékeltük.	TPO	aktivitást	, azon	COS1	sejtek
felülúszójában mutattunk	ki (dózisfüggő	módon),	melyekben a
pHTl-211,	pHTl-191,	pHTl-	171 vagy	pHTl-	163	kiónok

valamelyikét expresszáltuk. A pHTl-211#l, pHTl-191#l és pHTl-171#2 kiónokkal kapott jellemző adatokat a 13/A ábrán, a pHTl-163# klónnal kapottakat pedig a 13/B ábrán mutatjuk ·♦·· • · ··· ···· · • * ···· ·· ·» · ·

- 189 be. Az M07e vizsgálati rendszerben hasonló eredményeket kaptunk; azon COS1 sejtek felülúszója, amelyekben a pHTl-211, pHTl-191, pHTl-171 vagy pHTl-163 kiónok valamelyikét expresszáltuk, jelentősen fokozta az M-07e sejtek proliferációját. A pHTl-211#l, pHTl-191#l és pHTl-171#2, illetve pHTl-163# kiónokkal kapott jellemző adatokat a 14. ábrán mutatjuk be.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a humán TPO még azután is megtartja in vítro biológiai aktivitását, ha a 163. szerin-gyök utáni C-terminális felét eltávolítjuk, amiből arra következtethetünk, hogy a humán TPO biológiailag aktív része a 163. szerin-gyöknél végződő N-terminális részben helyezkedik el.

28. példa

C-terminális deléciós típusú humán TPO előállítása, expresszálása COS1 sejtekben, és aktivitásának vizsgálata

A humán TPO protein aktivitása kifejtéséhez nélkülözhetetlen régió vizsgálata érdekében a 27. példában kapott deléciós származékokból C-terminális aminosavakat távolítottunk el, s vizsgáltuk a COS1 sejtekben expresszálódott TPO aktivitást. A 16. példában kapott pEF18S-HL34 plazmid klón felhasználásával expressziós plazmidokat készítettünk, melyek C-terminális aminosavakat kódoló nukleotidszekvenciáit a 163. szerin-gyöktől kezdődően delécióval eltávolítottuk. A deléciós plazmidokat PCR alkalmazásával

- 190 ···· · · ···· ·· • · · · · • »· állítottuk elő, melyhez az alábbi szekvenciákkal rendelkező primereket szintetizáltunk:

hTPO-5: 5'-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (61. sz. szekv. ) (melyet úgy állítottunk elő, hogy a 4. sz. szekv. 1-21. helyeinek megfelelő szekvenciához EcoRI felismerési helyet adtunk; a 18. példában bemutatott szekvencia):

hTP0-150: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG AGG GTG GAC CCT CCT

ACA AGC AT-3 (62. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 514-537. helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-150.

aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk);

hTPO-151: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CAG AGG GTG GAC CCT

CCT ACA A-3' (63. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 518-540.

helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-151.

aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk);

hTPO-153: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CTG ACG CAG AGG GTG

GAC CC-3' (64. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 526-546.

helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-153.

aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk);

hTPO-154: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CGC CTG ACG CAG AGG

GTG GA-3' (65. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 529-549.

helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-154.

• ·

- 191 aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk);

hTPO-155: 5'-ITT GCG GCC GCT CAT TAG GCC CGC CTG ACG CAG

AGG GT-3' (66. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 532-552.

helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-155.

aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk);

hTPO-156: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT GGG GCC CGC CTG ACG

CAG AG-3' (67. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 535-555.

helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-156.

aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk); és hTPO-157: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG GGT GGG GCC CGC CTG

ACG CA-3' (68. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 538-558.

helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-157.

aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való alkalmazáshoz TAA és TGA terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk).

A PCR-t templátként a 16. példában kapott pEF18S-HL34 klón plazmid DNS-ének 1 pg-ját, primerekként az egyes szintetizált hTPO-5 (az 5' oldalhoz) és hTPO-150, -151,

-152, -153, -154, -155, -156 és -157 oligonukleotidok (a 3' oldalhoz) 10-10 pM-ját, továbbá AmpliTaq™ DNS-polimerázzal GeneAmp™ PCR Reagent készletet (Takara Shuzo) alkalmazva • ·

- 192 GeneAmp™ PCR System 9600 (PERKIN-ELMER) készülékben 100 ul térfogatban végeztük, melynek során összesen 20 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 95 °C-on 1 perces denaturálásból, 66 ‘C-on 1 perces hibridizálásból és 72 ’Con 1 perces szintézisből állt, amit végül 72 ’C-on 7 perces inkubálás követett. Mindegyik PCR-ral kapott szóban forgó sávot EcoRI-gyel és Notl-gyel emésztettük, s az emésztett mintát az egyes PCR reakciókkal amplifikált, várt méretű fő DNS-fragmens izolálása érdekében 1 %-os agarózgélen (FMCBioProducts) elektroforizáltuk. Az izolált DNS-fragmenst Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet (Bio-Rad) alkalmazásával tisztítottuk, majd az előzetesen azonos restrikciós enzimekkel kezelt pEF18S expressziós vektorba szubklónoztuk. Ebben az esetben gazdatörzsként DH5 Competent-High E. coli törzset (TOYOBO) alkalmaztunk. Az egyes PCR reakciókból származó transzformánsok közül 3-5, a várt méretű inszertet tartalmazó klónt választottunk ki, és ezekkel — alapvetően

Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Sprlng Harbor Laboratory Press, 1989) szerint — plazmid-DNS-t állítottunk elő.

E műveletek során az 1-150. aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-150 #21, 22 és 25), az 1-151. aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-151 #16, 17 és 18), az 1-153. aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-153 #1-5), az 1-154. aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-154 #1-5), az 1-155. aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-155 #1-5), az 1-156.

- 193 aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-156 #1-5) és az 1-157. aminosavakat kódoló deléciós származékból (pHTl-157 #1-5) plazmid-DNS mintákat készítettünk.

E tisztított plazmid-DNS minták közül a pHTl-150 #21, 22 és 25, valamint a pHTl-151 #16, 17 és 18 szekvenciáját Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening készlet (Applied Biosystems) felhasználásával 373A DNS-szekvenálóval (Applied Biosystems) ellenőriztük, s a várt TPO cDNS-szekvenciákat igazoltuk, melyek az egész nukleotid-szekvenciában nem tartalmaztak szubsztitúciót.

Az így előállított kiónokat a 11. példa eljárása szerint transzfektáltuk a COS1 sejtekbe, melynek során a transzfekciót az egyes plazmid-DNS minták 10-10 ug-jának alkalmazásával a klorokinos kezelést magában foglaló DEAEdextrán eljárással végeztük, és a transzfektált C0S1 sejtek 3 napos tenyésztése után nyertük ki a tenyészetfelülúszókat.

A tenyészetfelülúszókat IMDM tenyésztő tápközeggel szemben dializáltuk és patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel értékeltük. TPO aktivitást azon C0S1 sejtek felülúszójában mutattunk ki, melyeket az 1-151. aminosavból, 1-153. aminosavból, 1-154. aminosavból, 1-155. aminosavból, 1-156.

aminosavból, illetve 1-157. aminosavból álló C-terminélis deléciós származékot kódoló megfelelő klónnal transzfektáltunk. E származékok mindegyike a 151. helyen cisztein-gyököt tartalmaz. Azon C0S1 sejtek tenyészetfelülúszójában, melyeket az 1-150. aminosavakból • ·

- 194 álló C-terminális oldali deléciós származékot (melyből a 151. cisztein-gyököt is eltávolítottuk) kódoló kiónnal transzfektáltunk, TPO aktivitást nem észleltünk.

29. példa

N-terminális deléciós típusú humán TPO előállítása, expresszálása COS1 sejtekben és aktivitásának meghatározása

A humán TPO protein aktivitása kifejtéséhez nélkülözhetetlen régió vizsgálata érdekében a 28. példában kapott deléciós származékokból N-terminális aminosavakat távolítottunk el, s vizsgáltuk az így előállított deléciós származékok TPO aktivitásának expresszálódását. A 16. példában kapott pEF18S-HL34 és a 27. példában kapott pHTl-163 plazmid kiónok felhasználásával expressziós plazmidokat készítettünk, melyek jelzőszekvencia utáni N-terminális aminosavakat kódoló nukleotid-szekvenciáit delécióval eltávolítottuk. A deléciós plazmidokat PCR alkalmazásával állítottuk elő, melyhez az alábbi szekvenciákkal rendelkező primereket szintetizáltunk:

hTPO-5: 5'-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (69. sz. szekv.) (melyet úgy állítottunk elő, hogy a 4. sz. szekv. 1-21. helyeinek megfelelő szekvenciához EcoRI felismerési helyet adtunk; a 18. példában bemutatottal megegyező szekvencia):

hTP03: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT TCG TGT ATC CTG TTC

AGG TAT CC-3' (70. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 757-780.

helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet TAA és TGA »·»

- 195 terminációs kodon és egy NotI felismerési hely hozzáadásával készítettünk; ugyanezt a szekvenciát szintetizáltuk az 1-231. aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való felhasználáshoz):

hTPO-S: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACA GCT GTG

GTG GGT-3' (71. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 555-576. helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet az 1-163. aminosavakat kódoló deléciós származék előállításában való felhasználáshoz készítettünk);

hTPO-13: 5'-AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC

AGC AGA CTG AGC CAG TG-3' (72. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv.

124-173. helyeinek megfelelő szekvencia, amelyet olyan származék előállításában való felhasználáshoz készítettünk, amelyből az 1-12. aminosavak hiányzanak);

hTPO-13R: 5'-CAT GGG AGT CAC GAA GCA GTT TAC TGG ACA GCG

TTA GCC TTG CAG TTA G-3' (73. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 64-87. és 124-148. helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet olyan származék előállításában való felhasználáshoz készítettünk, amelyből az 1-12. aminosavak hiányzanak);

hTPO-7: 5'-TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT

GAC TCCCAT GTC CTT C-3' (74. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 106-154. helyeinek megfelelő szekvencia, amelyet olyan származék előállításában való felhasználáshoz készítettünk, amelyből az 1-6. aminosavak hiányzanak);

hTP0-7R: 5'-TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTC ACA GGA CAG CGT

TAG CCT TGC AGT TAG-3' (75. sz. szekv) (a 4. sz. szekv.

64-87. és 106-129. helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet olyan származék előállításában való felhasználáshoz • · • · • ·

- 196 készítettünk, amelyből az 1-6. aminosavak hiányzanak);

hTPO-8: 5'-GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC

TCC CAT GTC CTT CAC A-3' (76. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv. 109-157. helyeinek megfelelő szekvencia, amelyet olyan származék előállításában való felhasználáshoz készítettünk, amelyből az 1-7. aminosavak hiányzanak); és hTP0-8R: 5'-CAG TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTC GGA CAG CGT

TAG CCT TGC AGT TAG-3' (77. sz. szekv.) (a 4. sz. szekv.

64-87. és 109-132. helyeinek megfelelő antiszensz primer, amelyet olyan származék előállításában való felhasználáshoz készítettünk, amelyből az 1-7. aminosavak hiányzanak).

(1) PHT13-231_származék_előállítása,_melyből_az_1-12.

aminosavak deléció folytán hiányoznak

Templátként a 18. példában kapott pEF18S-HL34 klón plazmid DNS-ének 1,4 pg-ját, primerekként az egyes szintetizált oligonukleotidok 5-5 ^4-ját (az egyik kombinációban hTPO-13-at és hTP03-at, a másik kombinációban hTPO-5-öt és hTPO-13R-t) továbbá AmpliTaq™ DNS-polimerázzal GeneAmp™ PCR Reagent készletet (Takara Shuzo) alkalmazva GeneAmp™ PCR System 9600 (PERKIN-ELMER) készülékben 100 pl térfogatban PCR-t végeztünk, melynek során 95 °C-on 5 perces denaturálás után összesen 30 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 95 ’C-on 1 perces denaturálásból, 65 ’Con 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt, amit végül 72 ’C-on 7 perces inkubálás követett. A várt méretű fő DNS-fragmens izolálása érdekében ··· ··

4« ····

197 valamennyi PCR-terméket 1,2 %-os agarózgélen (FMCBioProducts) elektroforizáltuk, s az izolált DNS-fragmenst Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet (Bio-Rad) alkalmazásával tisztítottuk és 15 ul TE pufferben feloldottuk. Ezek után egy második PCR-t végeztünk, melynek során templátként az így előállított oldatok 1 pl-ét alkalmaztuk.

A második PCR-t a szintetizált primerek (hTPO-5 és hTP03) 5-5 jJtí- jának felhasználásával végeztük. AmpliTaq™ DNSpolimerázzal GeneAmp™ PCR Reagent készletet (Takara Shuzo) alkalmazva a PCR reakciót GeneAmp™ PCR System 9600 (PERKINELMER) készülékben 100 pl térfogatban végeztük, melynek során 95 ’C-on 5 perces denaturálás után összesen 30 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 95 ’C-on 1 perces denaturálásból, 60 ‘C-on 1 perces hibridizálásból és 72 ’Con 1 perces szintézisből állt, amit végül 72 ’C-on 7 perces inkubálás követett, A várt méretű fő DNS-fragmens izolálása érdekében valamennyi PCR-terméket 1,2 %-os agarózgélen (FMCBioProducts) elektroforizáltuk, s az izolált DNS-fragmenst Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet (Bio-Rad) alkalmazásával tisztítottuk és 15 pl TE pufferben feloldottuk. EcoRI és NotI restrikciós enzimekkel végzett emésztés után a kapott oldatot azonos térfogatú fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. Centrifugálás után a kapott csapadékot 15 pl TE pufferben feloldottuk és előzetesen a fenti restrikciós enzimekkel emésztett pEF18S expressziós vektorba szubklónoztuk. Ebben az esetben gazdatörzsként DH5 Competent-High E. coli törzset (T0Y0B0) ···· «· ·««· ·· * « · • · · • · · ·

198 alkalmaztunk. A kapott transzformánsok közül 45, a várt méretű inszertet tartalmazó kiónt választottunk ki, s ezekből alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) szerint plazmid-DNS-t állítottunk elő. Ilyenformán egy deléciós származék (pHT13-231) plazmid-DNS-ét állítottuk elő, amely olyan protein molekulát kódol, melyből az eredeti 1-231. aminosavakból álló szekvencia 1-12. aminosav-gyökei deléció folytán hiányoznak. Amikor e 45 kiónnal a hTPO-5 és hTP03 primerek alkalmazásával PCR-t végeztünk, 8 klón esetében találtunk hozzávetőleg várt méretű inszerteket. Ezek közül három klón szekvenciáját Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening készlet (Applied Biosystems) felhasználásával 373A DNS-szekvenálóval (Applied Biosystems) ellenőriztük, s pHT13-231 #3 kiónt kaptunk, amely a tervezettnek megfelelően a várt delécióval rendelkező TPO cDNS-szekvenciával rendelkezett, s az egész nukleotidszekvenciában nem tartalmazott szubsztitúciót vagy másféle mutációt.

12J_PHT7-163_származék_előállítása, melyben az 1-6.

aminosavak deléció folytán hiányoznak

Ebben az esetben a deléciós származékok előállításához

C-terminálisként a 163. aminosavat alkalmaztuk, mivel — annak ellenére, hogy a fenti (1) lépésben a deléciós származékok előállításához a 231. aminosavat jelöltük ki a TPO protein C-terminálisaként — azt találtuk, hogy a TPO ··

- 199 aktivitás akkor is expresszálható, ha további C-terminális aminosavakat deletélunk. Hasonló okok miatt a következő (3) lépésben szintén a 163. aminosavat alkalmaztuk C-terminálisként. A PCR-t templátként a 27. példában kapott pHTl-=-163 klón plazmid DNS-ének 1,4 pg-ját, primerekként az egyes szintetizált oligonukleotidok (az egyik kombinációban a hTPO-7 és hTPO-S, a másik kombinációban a hTPO-5 és hTP0-7R) 5-5 /±l-jét, továbbá AmpliTaq™ DNS-polimerázzal GeneAmp™ PCR Reagent készletet (Takara Shuzo) alkalmazva GeneAmp™ PCR System 9600 (PERKIN-ELMER) készülékben 100 ul térfogatban végeztük, melynek során 95 °C-on 5 perces denaturálás után összesen 30 ciklust ismételtünk (mely ciklusok mindegyike 95 °C-on 1 perces denaturálásból, 65 ’Con 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt), amit 72 ’C-on 7 perces inkübálás követett. A várt méretű fő DNS-fragmens izolálása érdekében valamennyi PCR-terméket 1,2 %-os agarózgélen (FMCBioProducts) elektroforizáltuk, s az izolált DNS-fragmenst Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet (Bio-Rad) alkalmazásával tisztítottuk és 15 pl TE pufferben feloldottuk. Ezek után templátként az így előállított oldatok 1 pl-nyi részét alkalmazva egy második PCR-t végeztünk.

A második PCR-t a szintetizált primerek (hTP0-5 és hTPO-S)

5-5 pM-jának felhasználásával végeztük. AmpliTaq™ DNSpolimerázzal GeneAmp™ PCR Reagent készletet (Takara Shuzo) alkalmazva a PCR reakciót GeneAmp™ PCR System 9600 (PERKINELMER) készülékben 100 pl térfogatban végeztük, melynek

200 során 95 °C-on 5 perces denaturálás után összesen 30 ciklust ismételtünk (mely ciklusok mindegyike 95 ’C-on 1 perces denaturálásból, 60 ’C-on 1 perces hibridizálásból és 72 ’Con 1 perces szintézisből állt), amit végül 72 ’C-on 7 perces inkubálás követett. A várt méretű fő DNS-fragmens izolálása érdekében valamennyi PCR-terméket 1,2 %-os agarózgélen (FMCBioProducts) elektroforizáltuk, s az izolált DNS-fragmenst Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet (Bio-Rad) alkalmazásával tisztítottuk és 15 μΐ TE pufferben feloldottuk. EcoRI és NotI restrikciós enzimekkel végzett emésztés után a kapott oldatot azonos térfogatú fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. Centrifugálás után a kapott csapadékot 15 ul TE pufferben feloldottuk és előzetesen a fenti restrikciós enzimekkel kezelt pEF18S expressziós vektorba szubklónoztuk. Ebben az esetben gazdatörzsként DH5 Competent-High E. coll törzset (TOYOBO) alkalmaztunk. A kapott transzformánsok közül 30, a várt méretű inszertet tartalmazó kiónt választottunk ki, s ezekből alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) szerint plazmid-DNS-t állítottunk elő. Ilyenformán egy deléciós származék (pHT7-163) plazmid-DNS-ét állítottuk elő, amely olyan protein molekulát kódol, melyből a 4. sz. szekv.

eredeti 1-163. aminosavaiból álló szekvencia 1-6. aminosavgyökei deléció folytán hiányoznak. Amikor e 30 kiónnal a hTPO-5 és hTPO-S primerek alkalmazásával PCR-t végeztünk, valamennyi klón esetében hozzávetőleg várt méretű inszertek létezését bizonyítottuk. Ezek közül három klón szekvenciáját

- 201

Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening készlet (Applied Biosystems) felhasználásával 373A DNS-szekvenálóval (Applied Biosystems) ellenőriztük, miáltal két kiónt, a pHT7-163 #4et és pHT7-163 #29-et kaptuk, amelyek a tervezettnek megfelelően a várt delécióval rendelkező TPO cDNSszekvenciával rendelkeztek, s az egész nukleotidszekvenciában nem tartalmaztak szubsztitúciót vagy másféle mutációt.

L2J_A PHT8-163 származék_előállítása, melyben az 1-7.

aminosav-gyökök deléció folytán hiányoznak

Alapvetően a fenti (2) lépésben a pHT7-163 származék előállításához leírt módon pHT8-163 származékot állítottunk elő, amely az 1-7. aminosavakat érintő deléciót tartalmaz. A PCR-t templátként a 27. példában kapott pHTl-163 klón plazmid DNS-ének 1,4 pg-ját, primerekként az egyes szintetizált oligonukleotidok (az egyik kombinációban a hTPO-8 és hTPO-S, a másik kombinációban a hTPO-5 és hTPO-8R) 5-5 iái-ját, továbbá AmpliTaq™ DNS-polimerázzal GeneAmp™ PCR Reagent készletet (Takara Shuzo) alkalmazva GeneAmp™ PCR System 9600 (PERKIN-ELMER) készülékben 100 pl térfogatban végeztük, melynek során 95 ’C-on 5 perces denaturálás után összesen 30 ciklust ismételtünk (mely ciklusok mindegyike 95 ’C-on 1 perces denaturálásból, 65 ’Con 1 perces hibridizálásból és 72 ’C-on 1 perces szintézisből állt), végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk. A várt méretű fő DNS-fragmens izolálása érdekében • ·

- 202 valamennyi PCR-terméket 1,2 %-os agarózgélen (FMCBioProducts) elektroforizáltuk, s az izolált DNS-fragmenst Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet (Bio-Rad) alkalmazásával tisztítottuk és 15 pl TE pufferben oldottuk. Ezek után templátként az így előállított oldatok 1 pl-nyi részét alkalmazva egy második PCR-t végeztünk.

A második PCR-t a szintetizált primerek (hTPO-5 és hTPO-S)

5-5 i±l-jának felhasználásával végeztük. AmpliTaq™ DNSpolimerázzal (Takara Shuzo) GeneAmp™ PCR Reagent készletet alkalmazva a PCR reakciót GeneAmp™ PCR System 9600 (PERKINELMER) készülékben 100 pl térfogatban végeztük, melynek során 95 ’C-on 5 perces denaturálás után összesen 30 ciklust ismételtünk, mely ciklusok mindegyike 95 ’C-on 1 perces denaturálásból, 60 ’C-on 1 perces hibridizálásból és 72 ’Con 1 perces szintézisből állt, amit végül 72 ’C-on 7 perces inkubálás követett. A várt méretű fő DNS-fragmens izolálása érdekében valamennyi PCR-terméket 1,2 %-os agarózgélen (FMCBioProducts) elektroforizáltuk, s az izolált DNS-fragmenst Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet (Bio-Rad) alkalmazásával tisztítottuk és 15 pl TE pufferben feloldottuk. EcoRI és NotI restrikciós enzimekkel végzett emésztés után a kapott oldatot azonos térfogatú fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. Centrifugálás után a kapott csapadékot 15 pl TE pufferben feloldottuk és előzetesen a fenti restrikciós enzimekkel kezelt pEF18S expressziós vektorba szubklónoztuk. Ebben az esetben gazdatörzsként DH5 Competent-High E. coli törzset (TOYOBO)

203 alkalmaztunk. A kapott transzformánsok közül 30, a várt méretű inszertet tartalmazó kiónt választottunk ki, s ezekből alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) szerint plazmid-DNS mintákat állítottunk elő. Ilyenformán egy deléciós származék (pHT8-163) plazmid-DNS-ét állítottuk elő, amely olyan protein molekulát kódol, melyből a 4. sz. szekv. eredeti 1-163. aminosavaiból álló szekvencia

1-6. aminosav-gyökei deléció folytán hiányoznak. Amikor e klónokkal a hTPO-5 és hTPO-S primerek alkalmazásával PCR-t végeztünk, valamennyi klón esetében hozzávetőleg várt méretű inszertek létezését bizonyítottuk. Ezek közül három klón szekvenciáját Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening készlet (Applied Biosystems) felhasználásával 373A DNSszekvenálóval (Applied Biosystems) ellenőriztük, miáltal két kiónt, a pHT8-163 #33-at és pHT8-163 #48-et kaptuk, amelyek a tervezettnek megfelelően a várt delécióval rendelkező TPO cDNS-szekvenciával rendelkeztek, s az egész nukleotidszekvenciában nem tartalmaztak szubsztitúciót vagy másféle mutációt.

14J_Deléciós_származék expresszálása C0S1 sejtekben; a TPQ aktivitás igazolása

A C0S1 sejteket a fentebb előállított deléciós kiónokkal a

11. példában leírt eljárás szerint transzfektáltuk. Eszerint a transzfekciót 10 jug plazmid-DNS alkalmazásával a klorokinos kezelést magában foglaló DEAE-dextrán eljárással

204 végeztük. A transzfektált C0S1 sejteket 37 ’C-on három napig inkubáltuk, majd összegyűjtöttük a tenyészetfelülúszókat. Az így kapott tenyészetfelülúszót IMDM tenyésztő tépközeggel szemben intenzíven dializáltuk és M-07e vizsgálati rendszerrel értékeltük.

A 7-163. aminosavakból álló deléciós származékot kódoló kiónnal transzfektált COSl sejtek tenyészetfelülúszójában gyenge, de jelentős TPO aktivitást mutattunk ki, míg a 8-163. aminosavakból vagy a 13-231. aminosavakból álló deléciós származékot kódoló kiónnal transzfektált COSl sejtek tenyészetfelülúszójában nem észleltünk TPO aktivitást.

30. példa

Teljes hosszúságú humán TPO cDNS plazmid (pHTPl) előállítása

Emlős sejtekben való expresszióhoz olyan expressziós vektort készítettünk, amely a humán TPO cDNS 6. sz. szekvenciában feltételezett valamennyi aminosav-kódoló régióját tartalmazta.

A teljes humán TPO cDNS kódoló régiót magában foglaló DNS-fragmens előállítása érdekében az alábbi módon PCR-t végeztünk.

Az alkalmazott primerek az alábbi nukleotid-szekvenciákkal rendelkeztek:

205 hTPO-I: 5'-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (78. sz. szekv.) (a 6. sz. szekv. 105-125. helyei);

SA: 5'-CAG GTA TCC GGG GAT TTG GTC-3' (79. sz. szekv.) (a 6. sz. szekv. 745-765, helyeinek megfelelő antiszensz primer);

hTPO-P: 5'-TGC GTT TCC TGA TGC TTG TAG-3' (80. sz. szekv.) (a 6. sz. szekv. 503-523. helyei); és hTPO-KO: 5'-GAG AGA GCG GCC GCT TAC CCT TCC TGA GAC AGA

TT-3' (81. sz. szekv) (e szekvenciát úgy állítottuk elő, hogy a 6. sz. szekv. 1066-1086. helyeinek megfelelő antiszensz szekvenciához NotI felismerési helyet és GAGAGA szekvenciát kapcsoltunk).

Az első PCR-hoz templátként a 16. példában kapott PEF18S-HL34 klón 300 ng-ját alkalmaztuk. A hTPO-I és SA primer 0,5-0,5 juM-ját és 1 egység Vént R™ DNS-polimerázt (New England Biolabs) alkalmazva a PCR-t összesen 30 ciklusban végeztük, mely ciklusok mindegyike 95 °C-on 1 perces, 62 ’C-on 1 perces és 72 ’C-on 1 perces inkubálásból állt, amit 72 ’C-on 7 perces utolsó inkubálás követett. A reakcióelegy összetétele (végkoncentrációkban): 10 mM KC1, 10 mM (NH₄)2S0₄, 20 mM Tris-HCl (pH = 8,8), 2 mM MgSCM, 0,1 % Triton X-100 és 200 mM dNTP elegy.

A normális humán májból származó, kereskedelemben beszerezhető poli(A)⁺ RNS készítmény (Clontech) egy mikrogrammját 70 ’C-on 10 percig melegítettük, jégen gyorsan lehűtöttük és 10 mM DTT-vel, 500 /JSA dNTP eleggyel, 25 ng

206 egység RN-áz

200 egység

TECHNOLOGIES) random primerrel (Takara Shuzo), 10 inhibitorral (Boehringer-Mannheim) és Super Ser ipt™ II RN-áz H~-val (LIFE elegyítettük, majd a cDNS szintetizálása érdekében 37 ’C-on egy óra hosszat inkubáltuk. Ezek után templátként a szintetizált cDNS reakcióelegyének 1/20 térfogatát, primerként 2,5 hTPO-P-t és 2,5 fit hTPO-KO-t, illetve 2,5 egység AmpliTaq™ DNS-polimerázt (Takara Shuzo) alkalmazva második PCR-t végeztünk, összesen 30 ciklust ismételve, melyek mindegyike 96 ’C-on 1 perces, 58 ’C-on 1 perces és 72 ’C-on 1 perces inkubálásból állt.

Az első és második PCR-ral kapott reakcióelegyek mindegyikét 1 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, hogy a várt méretű, megfelelő fő DNS-fragmenseket izoláljuk, melyeket Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet (Bio-Rad) alkalmazásával tisztítottunk. Ezek után egy harmadik PCR-t végeztünk, amelyhez templátként a fenti oldatok 1/20 térfogatát alkalmaztuk. Ezt a reakciót (96 ’C-on 2 perces melegítés, majd összesen 3 ciklus, melyek mindegyike 96 ’C-on 2 perces és 72 ’C-on 2 perces inkubálásból állt, s a ciklusok után 72 ’C-on 7 perces inkubálás következett) 1 egység Vént R™ DNS-polimeráz (New England Biolabs) alkalmazásával végeztük. A kapott reakcióelegyet 1 hTPO-I és 1 $ hTPO-KO primerrel elegyítettük, 96 ’C-on 2 percig melegítettük, majd 25 ciklusos reakciót végeztünk, mely ciklusok mindegyike 96 ’C-on 1 perces, 62 ’C-on 1 perces és 72 ’C-on 1 perces inkubálásból állt, amit a reakció végén 72 ’C-on 7 perces

207 inkubálás követett. A kapott reakcióelegyet azonos térfogatú, vízzel telített fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, majd azonos térfogatú kloroformmal, s az extraktumot a DNS kinyerése érdekében etanollal kicsaptuk (0,3 M nátrium-acetát és 0,5 ul glikogén [BoehringerMannheim] jelenlétében 2,5 térfogat etanol alkalmazásával). Az így kapott DNS-ty BamHI és NotI restrikciós enzimekkel emésztettük, 1 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, s az így izolált, várt mérettel rendelkező fő sávot Prep-A-Gene DNStisztító készlet alkalmazásával (Bio-Rad) tisztítottuk, előzetesen BamHI és NotI restrikciós enzimekkel emésztett pBluescript II SK* vektorba (Stratagene) ligáltuk, majd Competent-High DH5 E. coli törzsbe (TOYOBO) transzformáltuk. A kialakult telepekből plazmid-DNS minták előállításához 4 kiónt választottunk ki. A tisztított plazmid-DNS mintákat Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening készlet (Applied Biosystems) felhasználásával 373A DNS-szekvenálóval (Applied Biosystems) ellenőriztük, miáltal a pBLTP kiónt kaptuk, mely a tervezett TPO cDNS-szekvenciával rendelkezett, s a BamHI és NotI közötti régión belüli nukleotid-szekvenciában deléciót nem tartalmazott.

A pBLTP kiónt EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztettük és 1 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, s az izolált, nagy molekulatömegü sávot Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet alkalmazásával (Bio-Rad) tisztítottuk. Hasonló módon, a pEF18S-HL34 kiónt a restrikciós enzimekkel kezeltük, hogy kb. 450 bp-os DNS-fragmenst tisztítsunk.

208

Valamennyi így kapott DNS mintát ligáltuk és Competent-High DH5 E. coli törzsbe (TOYOBO) transzformáltuk. A kialakult telepekből plazmid-DNS mintákat készítettünk, miáltal a humán TPO cDNS inszertet tartalmazó pBLTEN kiónt kaptuk. Ezt a kiónt EcoRI és NotI restrikciós enzimekkel emésztettük, 1 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, s az izolált, kb. 1200 bp-os DNS-fragmenst Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet alkalmazásával (Bio-Rad) tisztítottuk, az előzetesen ugyanezen restrikciós enzimekkel emésztett pEF18S expressziós vektorral ligáltuk, majd Competent-High DH5 E. coli törzsbe (TOYOBO) transzformáltuk. A kialakult telepekből plazmid-DNS mintákat készítettünk, hogy a szóban forgó pHTPl kiónt kapjuk, amely a teljes humán TPO cDNS kódoló régiót tartalmazza. A kiónból nagy mennyiségben termeltünk plazmid-DNS-t, amit a következő kísérletekhez alkalmaztunk. A plazmid-DNS előállítását alapvetően Sambrook és mtsi. által leírt eljárás (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) szerint végeztük.

31. példa pDEF202-hTP0-Pl emlős expressziós plazmid készítése a humán TPO kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtekben történő expresszálásához

Egér dihidrofolát-reduktáz (DHFR) minigént tartalmazó pMGl plazmid egy mikrogrammját EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztettük, és az egér DHFR minigént tartalmazó (körülbelül 2,5 kb hosszúságú) fragmens izolálása érdekében • · · · * • · ·♦

- 209 agaróz gélelektroforézist végeztünk. Az izolált DNS-fragmenst 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) pufférből, 7 mM MgCl2-ból, 1 mM 2-merkapto-etanolból és 0,2 mM dNTP elegyből álló 25 ml reakcióelegyben oldottuk, 2 egység Klenowfragmenssel elegyítettük, majd szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk, hogy a DNS-fragmenst mindkét oldalán tompa végűvé alakítsuk. Fenol/kloroform eleggyel végzett kezelés és etanolos kicsapás után a kapott fragmenst 10 ml TE-oldatban (10 mM Tris-HCl (pH = 8,0)/1 mM EDTA) feloldottuk. A pEF18S emlős expressziós vektort Smal restrikciós enzimmel emésztettük, lúgos foszfatázzal (Takara Shuzo) defoszforiláltuk, majd T4 DNS-ligáz alkalmazásával egér DHFR minigént tartamazó DNS-fragmenssel ligáltuk.

Ezután az előállított pDEF202 expressziós plazmidot EcoRI és Spel restrikciós enzimekkel emésztettük, s agaróz gélen elektroforizáltuk, miáltal egy nagyobb DNS-fragmenst izoláltunk. A humán TPO cDNS-t (Pl klón) tartalmazó pHTPl plazmid EcoRI és Spel restrikciós enzimekkel végzett emésztésével kapott humán TPO cDNS-t T4 DNS-ligáz (Takara Shuzo) alkalmazásával a linearizált pDEF202 vektorral ligáltuk, miáltal a humán TPO cDNS expresszálásához alkalmas pDEF202-hTP0-Pl plazmidot kaptuk, amely a humán TPO cDNS transzkripciójához SV40 replikációs kezdőhelyet, humán elongációs faktor 1-alfa-promotert és SV40 korai poliadenilációs jelet, továbbá egér DHFR minigént, pUC18 replikációs kezdőhelyet és β-laktamáz gént (Amp^) tartalmaz.

210

32. példa

Humán TPO expresszálása CHO sejtekben

CHO sejteket (DHFR^- törzs; Urlaub és Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, H, 4216, 1980) 6 cm átmérőjű szövettenyésztő csészében (Falcon) 10 % magzati borjúszérumot (FCS) tartalmazó alfa-minimál esszenciális tápközegben (hipoxantinnal és timidinnel kiegészített alfaMEM(-)) tartottunk. A CHO sejteket a későbbiekben leírt kalcium-foszfát eljárással (CellPhect, a Pharmacia terméke) pDEF202-hTPO-Pl plazmiddal transzformáltuk. A 31. példában előállított pDEF202-hTPO-Pl plazmid 10 mikrogrammját 120 ml A pufferrel és 120 ml vízzel elegyítettük, s a kapott elegyet szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. Ehhez az oldathoz további 120 ml B puffért adtunk, és szobahőmérsékleten újabb 30 percig állni hagytuk. Ezt a DNS oldatot ezután a tenyészethez adtuk, és CO2 inkubátorban hat óra hosszat inkubáltuk. Hat óra elteltével a tenyészetet kétszer szérummentes alfa-MEM(-) oldattal mostuk, 10 % dimetil-szulfoxidot tartalmazó alfa-MEM(-) oldattal két percig kezeltük, majd két napig 10 % dializált FCS-t tartalmazó, nem szelektáló tápközegben (hipoxantinnal és timidinnel kiegészített alfa-MEM(-)) inkubáltuk. A kétnapos tenyésztés után a sejteket 10 % dializált FCS-t tartalmazó szelektáló tápközegben (alfa-MEM(-)) szelektáltuk. A DHFRpozitív fenotípusú transzformált sejtek szelektálásához a sejteket tripszin/EDTA eleggyel kezeltük és szelektáló tápközegben újraszuszpendáltuk. A 6 cm-es szövettenyésztő

211 csészében lévő sejteket öt 10 cm-es szövettenyésztő csészébe vagy 20 darab 24-üregű szövettenyésztő lemezre osztottuk szét, majd szelektáló tápközegben tenyésztettük. A tenyésztő tápközeget kétnaponként cserélük. A DHFR-pozitív fenotípussal rendelkező CHO sejtek tenyésztő tápközegében a humán TPO aktivitást CFU-MK, M072 vagy Ba/F3 vizsgálattal mértük. A tenyésztő tápközegbe humán TPO-t szekretáló sejteket 25 nM metotrexáttal kiegészített szelektáló tápközegben tovább szelektáltuk, hogy nagyobb mennyiségű humán TPO-t termelő sejtklónt izoláljunk.

Ebben az esetben a CHO sejtek transzfekciója a CHO sejtek pHTPl és pMGl plazmidokkal történő együttes transzfekelójával is végrehajtható.

A pDEF202-hTP0-Pl plazmiddal transzfektált CH0-DUKXB11 törzset 1995. január 31-én FERM BP-4988 deponálási számon helyeztük letétbe (National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan).

33. példa

BMCGSneo-hTPO-Pl rekombináns vektor előállítása X 63.6.5.3 sejtekben való alkalmazáshoz

A pBMCGSneo emlős expressziós vektor egy mikrogrammját Xhol és NotI restrikciós enzimekkel emésztettük, és a vektor DNS

- 212 rész izolálása érdekében agarózgél-elektroforézist végeztünk. Az izolált DNS-fragmens és a humán TPO cDNS-t tartalmazó pBLTEN plazmid Xhol és NotI restrikciós enzimekkel végzett emésztésével kapott humán TPO cDNS-t (Pl klón) T4 DNS-ligáz alkalmazásával ligáltuk, miáltal a szóban forgó pBMCGSneo-hTPO-Pl expressziós plazmidot kaptuk. Ez az expressziós vektor a humán TPO cDNS transzkripciójához citomegalovírus korai promotert, nyúl β-globin gén-eredetű intront és poliadenilált régiót, továbbá humán β-globin gént, a szarvasmarha papilloma vírus génjének 69 %-át, timidin kinázt és poliadenil régiót, foszfotranszferáz I gént (neomicin-rezisztencia gén), pBR 322 replikációs kezdőhelyet és β-laktamáz gént (Amp**) tartalmaz. A humán TPO cDNS-t a citomegalovírus promoter downstream helyére ligáltuk.

34. példa

Humán TPO expresszálása X 63.6.5.3 sejtekben

Az X 63.6.5.3 sejteket 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó

Dulbecco-féle minimális esszenciális (DME) tápközegben tenyésztettük. Az X 63.6.5.3 sejteket az alábbiakban leírt elektroporéciós eljárás alkalmazásával transzfektáltuk a BMCGSneo-hTPO plazmiddal.

A 33. példában előállított BMCGSneo-hTPO-Pl plazmid 20 mikrogrammját 10⁷ sejtet tartalmazó 750 pl DME tápközeghez adtuk, és az elegyet 4 mm-es hézagú elektroporációs • ·

- 213 küvettába helyeztük, majd 4 °C-on 10 percig állni hagytuk. A küvettát ezután elektroporációs készülékbe (BTX 600, a BTX terméke) helyeztük, hogy a génátvitelt megvalósítsuk (380 V, 25 mF, 24 Angström). A génátvitel után a küvettát 4 °C-on 15 percig ismét állni hagytuk, és a sejteket egyszer 10 % magzati borjúszérumaot tartalmazó DEM-mel mostuk. A transzfektált sejteket 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó ml DEM-ben szuszpendáltuk, a szuszpenziót 96-üregü szövettenyésztő lemez üregeibe szétosztottuk, majd CO2 inkubátorban két napig tenyésztettük. A kétnapos tenyésztés után a tenyésztő tápközeget 10 % magzati borjúszérumot és 1 mg/ml G418-at (GIBCO) tartalmazó DEM-re cseréltük, és a tápközeg ezután háromnaponként cseréltük. A transzformánsok tenyésztő tápközegében a humán TPO aktivitást CFU-MK, M-07e vagy Ba/F3 vizsgálattal mértük. A tenyésztő tápközegbe humán TPO-t szekretáló transzformánsokat kétszer korlátozó hígítással klónoztuk, hogy humán TPO-termelő sejtvonalakat alakítsunk ki.

35. példa

A humán TPO nagy mennyiségű expresszálása COS1 sejtekben

A C0S1 sejtek transzfektálását a 11. példában leírt, klorokinos kezelést magában foglaló DEAE-dextrán eljárás szerint végeztük. A C0S1 sejteket (ATCC CRL1650) kollagénnel bevont 175 cm²-es tenyésztőlombik alkalmazásával 10 % (V/V) FCS-t tartalmazó IMDM tápközegben 37 ’C-on 5 %-os CO2 inkubátorban kb. 100 %-os konfluens állapot eléréséig *· ···. ·· ..

- 214 tenyésztettük. A tenyésztőlombikok kollagénes bevonásához az egyes lombikokba 25 ml kollagén oldatot adtunk (Cellmatrix I-C típus, az Iwaki terméke), melynek koncentrációját 1 mM HCl-dal 0,3 mg/ml-re állítottuk be. A kollagén oldatot szobahőmérsékleten egy órás állás után távolítottuk el a lombikokból, melyeket egyszer 20-50 ml PBS-sel mostunk. A transzfekeióhoz 250 pg/ml DEAE-dextránt (Pharmacia), 60 klorokint (Sigma) és 10 % (V/V) Nu-szérumot (Collaborative) tartalmazó 20 ml oldatot előzetesen 500 pl HBS-ben oldott pHTPl plazmiddal (40 pg) elegyítettük, s a kapott elegyet közvetlenül a transzfekció előtt IMDM-mel mosott 175 cm²-es tenyésztőlombikban lévő, fentebb leírt COS1 sejtekhez adtuk, és a sejteket 37 ’C-on 5 %-os COz inkubátorban három óra hosszat inkubáltuk. Ezután a tenyészetfelülúszót leszívással eltávolítottuk, a sejteket egyszer IMDM tápközeggel mostuk, 50 ml szérummentes tápközeggel elegyítettük, majd 37 ’C-on 5 %-os COz inkubátorban öt napig tenyésztettük és kinyertük a tenyészetfelülúszót. Egy műveletben 100-260 175 cm²-es tenyésztőlombikot alkalmaztunk, és 5-13 liter tenyészetfelülúszót nyertünk ki. A szérummentes tápközeg előállításához az IMDM tápközeget 5 pg/ml inzulinnal (Sigma), 5 ug/ml transzferrinnel, (Sigma), 10 pM etanolaminnal (Wako Pure Chemical Industries), 25 nM nátriumszelenittel (Sigma) és 200 pg/ml BSA-val (nagy tisztaságú, zsírsavmentes szarvasmarha albumin; a Nochirei terméke) egészítettük ki.

- 215 36. példa pHTPl expressziós plazmidból (Pl klón) származó, C0S1 sejtekben expresszált teljes hosszúságú humán TPO tisztítása és biológiai aktivitása lépésekben vizsgálati

A következőkben pHTPl expressziós plazmidból (Pl klón) származó, COS1 sejtekben expresszált teljes hosszúságú humán

TPO aktivitását és tisztítását írjuk le. A vérlemezkeserkentő aktivitás vizsgálata érdekében először részlegesen tisztított terméket állítottunk elő. Az alábbi előállítási a TPO aktivitás méréséhez elsősorban az M-07e rendszert alkalmaztuk. A patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel hasonló TPO aktivitást találtunk. E vizsgálatok végzésekor az egyes mintákhoz 0,02-0,05 % végkoncentrációban humán szérumalbumint (HSA) adtunk.

Az Ohashi és Sudo eljárása (Hideya Ohashi és Tadashi Sudo, Biosci. Biotech. Biochem., 58(4). 75Θ-759, 1994) szerint pHTPl plazmiddal transzfektált C0S1 sejteket 5 %-os CO2 inkubátorban 37 °C-on 5 napig tenyésztettük, melynek során 1000 ml-ben 0,2 g BSA-t, 5 mg szarvasmarha inzulint, 5 mg humán transzferrint, 0,02 mM monoetanol-amint és 25 nM nátrium-szelenitet tartalmazó szérummentes IMDM tenyésztő tápközeget alkalmaztunk. A tenyésztéssel kb. 7 liter szérummentes tenyészetfelülúszót kaptunk. A szérummentes tenyészetfelülúszóhoz kb. 1 mM végkoncentrációban p-APMSF és Pefabloc SC (4-(2-amino-etil)-benzol-szulfonil-fluoridhidroklorid; a Merk 24839 katalógusszámú terméke)

• ·

- 216 proteolitikus enzim-inhibitorokat adtunk, majd a felülúszó kinyerése érdekében 0,2 /an-es filterrel szűrtük. A felülúszót ultrafiltráló készülék (Omega Ultrasette, névleges molekulatömeg-átengedési határ: 8000 D, a Filtron terméke; vagy PLGC Pellicon Casette, névleges molekulatömegátengedési határ: 10000 D, a Millipore terméke) alkalmazásával kb. 10-szeresére koncentráltuk. Az így kapott koncentrátum 723 ml-ét (protein-koncentráció: 3,38 mg/ml; összes proteintartalom: 2445 mg; relatív aktivitás: 43000; összes aktivitás: 105100100) 1000 ml-re vonatkoztatva 1,6 mól ammónium-szulfátot adtunk (összesen 288 g), miáltal 804 ml, 1,5 M ammónium-szulfát végkoncentrációjú oldatot kaptunk, majd ezt 10 ml/perc átfolyási sebességgel Macro-Prep Methyl HIC oszlopra (a Bio-Rad 156-0080 katalógusszámú terméke; átmérő 5 cm; töltetmagasság 9 cm) vittük, melyet előzetesen 1,5 M ammónium-szulfátot tartalmazó 20 mM nátrium-citrát (pH = 5,2) pufferrel ekvilibráltunk. A minta feltöltése után az eluálást 1,25 M ammónium-szulfátot tartalmazó 20 mM nátrium-citrát -(pH = 5,2) pufferrel végeztük, hogy az FI átfolyt frakciót kapjuk (2384 ml; protein-koncentráció: 0,864 mg/ml; összes proteintartalom: 2061 mg; relatív aktivitás: 6000).

Ezután az eluáló oldatot 20 mM Na-citrátra (pH = 5,8) cseréltük, s ezzel az F2 frakciót kaptuk (1092 ml; protein-koncentráció: 0,776 mg/ml; összes proteintartalom: 847 mg; relatív aktivitás: 150000).

- 217 ·» a

Az így kapott Macro-Prep Methyl HIC oszlop F2 frakciót (1081 ml) 10 ml/perc átfolyási sebességgel SP Sepharose Fást Flow oszlopra (a Pharmacia Biotech 17-0729-01 katalógusszámú terméke; átmérő: 3 cm; töltetmagasság: 10 cm) vittük, melyet előzetesen 20 mM nátrium-citrát (pH = 5,2) pufferrel ekvilibráltunk. A minta feltöltése után az eluálást 110 mM

NaCl-ot tartalmazó 20 mM nátrium-citrát (pH = 5,6) pufferrel végeztük, miáltal ez FI frakciót kaptuk (2262 ml; proteinkoncentráció: 0,270 mg/ml; összes proteintartalom: 610 mg; relatív aktivitás: 30000). Ezután az eluáló oldatot 400 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM Na-citrátra (pH = 5,4) cseréltük, s ezzel az F2 frakciót kaptuk (856 ml; protein-koncentráció: 0,189 mg/ml; összes proteintartalom: 162 mg; relatív aktivitás: 300000). Ezután az eluáló oldatot 1000 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM Na-citrátra (pH = 5,2) cseréltük, s ezzel az F3 eluált frakciót kaptuk (370 ml; protein-koncentráció: 0,034 mg/ml; összes proteintartalom: 12,6 mg; relatív aktivitás: 150000).

Az SP Sepharose Fást Flow oszloppal végzett lépéssel kapott fő TPO-aktív F2 frakciót (845 ml) kb. 10 % végkoncentrációjú 1-propanollal elegyítettük, és 3 ml/perc átfolyási sebességgel LA-WGA oszlopra (a Honén WG-007 katalógusszámú terméke; átmérő: 2 cm; töltetmagasság: 14 cm) vittük, melyet előzetesen 400 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM

Na-citrát (pH = 5,4) pufferrel ekvilibráltunk. A minta feltöltése után az eluálást 400 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM

Na-citrát (pH = 5,4) és 1-propanol 9:1 arányú elegyével ···· ·♦ ·

- 218 végeztük, miáltal az FI frakciót kaptuk (64,4 ml; proteinkoncentráció: 0,0178 mg/ml; összes proteintartalom: 1,15 mg; relatív aktivitás: 17220). Ezután az eluáló oldatot 0,4 M GlcNAc-t és 10 % 1-propanolt tartalmazó 20 mM nátrium-citrát (pH = 6,1) pufferre cseréltük, mellyel az F2 eluált frakciót gyűjtöttük össze (45 ml; protein-koncentráció: 0,0104 mg/ml; összes proteintartalom: 0,470 mg; relatív aktivitás:

675000).

Az LA-WGA oszlopon végzett lépéssel kapott fő TPO-aktív F2 frakciót kb. 0,005 % végkoncentrációban TFA-val elegyítettük és YMC-Pack CN-AP (az YMC AP-513 katalógusszámú terméke; átmérő 6 mm; töltetmagasság: 250 mm) oszlopkromatográfiát végeztünk. A kromatográfáló oldószerként 0,1 %-os TFA-t, B kromatográfáló oldószerként pedig 0,05 % TFA-t tartalmazó 1-propanolt alkalmaztunk. A mintát 0,6 ml/perc átfolyási sebességgel YMC-Pack CN-AP oszlopra vittük, melyet előzetesen 15 % B oldószerrel ekvilibráltunk. A minta feltöltése után a propanol-koncentrációt 15 % B oldatkoncentrációról 25 % B oldat-koncentrációra növeltük, és az elúciót 25 % B oldat-koncentráció és 50 % B oldatkoncentráció közötti lineáris gradienssel 65 percig végeztük, melynek során az eluátumokat polipropilén csövekben 1,5 ml-es (2,5 percenként) részletekben gyűjtöttük.

Az egyes csövekben az eluátum 0,5 pl-nyi (1/3000) részét HSA-val elegyítettük és ultrafiltrálással bekoncentráltuk, .· · \ ···: .··. .·

- 219 hogy a vizsgálatban a TPO-aktív frakciók azonosításához 0,05 % HSA-t tartalmazó 0,25 ml IMCM vizsgálati tenyésztőoldatot készítsünk. A 24-30. csövekben lévő frakciókban (melyek 35,0-42,0 % propanol-koncentráció-tartománynak felelnek meg) találtunk nagy TPO aktivitást (kb. 630000-4800000 relatív aktivitás). E frakciókat TPO-aktív FA frakcióként (13,5 ml) gyűjtöttük össze.

Az YMC-Pack CN-AP oszlopkromatográfiás lépéssel kapott FA frakciót Capcell Pák Cl 300A oszlopon (a Shiseido Cl TYPE:SG300A katalógusszámú terméke; átmérő: 4,6 mm; töltetmagasság: 150 mm) kromatografáltuk, melynek során A kromatografáló oldószerként 0,1 %-os TFA-t, B kromatografáló oldószerként pedig 0,05 % TFA-t tartalmazó 1-propanolt alkalmaztunk. YMC-Pack CN-AP oszlopkromatográfiás lépéssel kapott FA frakció 8,9 ml-ét 0,3 ml glicerinnel elegyítettük, centrifugálásos párologtatással bekoncentráltuk, majd kb. 2,5 ml 10 %-os B oldószerrel elegyítettük, és a kapott oldatot 0,4 ml/perc átfolyási sebességgel előzetesen 20 %-os B oldószerrel ekvilibrált Capcell Pák Cl 300A oszlopra vittük. A minta feltöltése után az eluálást először 5 percig 20 %-os B oldószerrel, majd 50 percig 20 % B oldatkoncentráció és 40 % B oldat-koncentráció közötti lineáris gradienssel végeztük, melynek során az eluátumokat polipropilén csövekben 1,5 ml-es (2,5 percenként) részletekben gyűjtöttük.

Az egyes csövekben az eluátum 1 j/L-nyi (1/1000) részét HSA220 ···♦ ·· • · * • *· (' ·· ····

• » 9 ·* ·» val elegyítettük és ultrafiltrálással bekoncentráltuk, hogy a vizsgálatban a TPO-aktív frakciók azonosításához 0,05 % HSA-t tartalmazó 0,25 ml IMDM vizsgálati tenyésztőoldatot készítsünk. A 20-23. csövekben lévő frakciókban (melyek 28,5-32,5 % propanol-koncentráció-tartománynak felelnek meg) találtunk nagy TPO aktivitást (kb. 3000000-22500000 relatív aktivitás). E frakciókat nagy aktivitású frakciókként gyűjtöttük össze.

37. példa

A COS1 sejtekben expresszált humán TPO molekulatömegének mérése

Feltételeztük, hogy a (pHTPl plazmidból [FI klón] származó) teljes hosszúságú hummán TPO molekulatömege valószínűleg nagyobb, mint amire a peptidlánc méretéből következtetni lehet, mivel cukor-lánc is kapcsolódik a molekulához. Ennek megfelelően, első lépésként C0S1 sejtekben expresszált teljes hosszúságú humán TPO-t (amely a pHTPl plazmidból [FI klón] származik) tartalmazó tenyészetfelülúszóból az alábbi módon részlegesen tisztított TPO-frakciót készítettünk. Eszerint, A kromatografáló oldószer (0,1 %-os trifluorecetsav, TFA) és B kromatografáló oldószer (0,05 % TFA-t tartalmazó 1-propanol) alkalmazásával a tenyészetfelülúszó 0,3 ml-ét YMC-Pack PORTEIN-RP oszlopra (az YMC APRRP-33-46-25 katalógusszámú terméke; átmérő 0,46 cm; töltemagasság: 15 cm) vitttük, melyet előzetesen 25 %-os B oldószerrel ekvilibráltunk. Az oszlopon 0,4 ml/perc

221

.... _a._s...., .... ... .:·.::. ·.:· ::· átfolyási sebességgel 5 percig 25 %-os B oldószert engedtünk át, majd a frakcionálást 25 % és 50 % között B oldószerkoncentráció közötti lineáris gradienssel 50 percig végeztük. A 34,5 % és 43,5 % propanol-koncentrációtartományba eső eluátumokban találtunk TPO aktivitást. Ezeket az eluátumokat centrifugálásos párologtatással szárazra pároltuk, miáltal részlegesen tisztított mintát kaptunk.

Miután az 1. példában leírtak szerint nem redukáló körülmények között végzett SDS-PAGE elektroforézis géljéről kivontuk a proteint, a TPO aktivitást az M-07e vizsgálati rendszerrel mértük, illetve molekulatömegét a 45. példában leírt Western analízis alkalmazásával redukált DPCIII markerek alapján határoztuk meg. TPO aktivitást széles, hozzávetőleg 69000 és 94000 D közötti látszólagos molekulatömeg-tartományban találtunk, miáltal bebizonyosodott a molekulatömeg változékonysága. A TPO Nglikozidos kötéstípussal kapcsolódó cukorláncainak Nglikanázzal (a Genzyme 1472-00 katalógusszámú terméke) végzett lehasítása után látszólagos molekulatömegét redukált DPCIII markerek alapján 36000-40000 D közöttinek mértük, ami nagyobb, mint amire a peptidlánc méretéből következtetni lehet. Ez arra utal, hogy a proteinben O-glikozidos kötéstípussal kapcsolódó cukorlánc is található.

Hasonló módon, a pHTPl plazmidból [FI klón] származó, COS1 sejtekben expresszált teljes hosszúságú humán TPO

Λ

222

.... ... ..._? ...

_e · · · · · »· •· ···· ’··* *·.* ♦»· látszólagos molekulatömege 63000 és 83000 D közöttinek bizonyult.

38. példa

A humán TPO biológiai jellemzői

A humán TPO humán és patkány vérképzési sejtekre gyakorolt hatásait vizsgáltuk, elsősorban a pHTFl plazmiddal transzfektált C0S1 sejtek tenyészetfelülúszójának alkalmazásával.

A humán köldökzsimór vérből készített CDSá^DR^ sejtfrakció alkalmazásával végzett telepvizsgálatban a humán TPO jelentős számú megakariocita telep kialakulását stimulálta. Például, a pHTl-231 plazmiddal transzfektált COS1 sejtek 10 %-os (V/V) tenyészetfelülúszójának jelenlétében 6000 darab CD34*DR· sejt 11,5 megakar iocita telepet hozott létre. A humán TPO perifériás vérben lévő humán megakariocita őssejtekre gyakorolt hatásának vizsgálata érdekében az alábbiak szerint humán perifériás vérből CD34* sejteket készítettünk. Humán perifériás vérből Ficoll-Paque sűrűséggradiens alapján kapott leukocita frakcióból kiválogattuk a műanyag csészékhez tapadó sejteket. A nem tapadó sejtek közül ezután AIS Microselecter SBA (Asahi Medical) alkalmazásával végzett mosással kiválogattuk az SBA (szójabab agglutinin)-pozitiv sejteket. A megmaradt sejteket AIS Microselecter CD 34 alkalmazásával inkubáltuk, s az adszorbeálódott CD34* sejteket összegyűjtöttük, és ezeket

223 • » · • « • ·

folyékony tápközegben transzfektált COS1 sejtek tenyészetfelülúszójának jelenlétében 10 napig tenyésztve nagy méretű GpIIb/IIIa* sejtek szelektív proliferációját tapasztaltuk, s ezen GpIIb/IIIa* sejtekben a ploiditás fokozódását észleltük. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a TPO szelektív hatást gyakorol a humán megakariocta sejtvonal őssejtjeire, és serkenti azok proliferációját és differenciálódását.

A patkány csontvelőből származó CFU-MK-t illetően nagymértékben koncentrált GpIIb/IIIa* sejtek, valamint a GpIIb/IIIa* sejtekkel végzett előző lépésben kapott, műanyaghoz nem tapadó sejtek alkalmazásával végzett telepvizsgálatban a humán TPO jelentős számú megakariocita telep kialakulását indukálta. Például, a transzfektált COS1 sejtek 20 %-os (V/V) tenyészetfelülúszója jelenlétében 1000 GpIIb/IIIa* sejt 34,5 megakariocita telepet, 20000 műanyaghoz nem tapadó sejt pedig 28,5 megakariocita telepet alakított ki. Ráadásul, annak ellenére, hogy a műanyaghoz nem tapadó sejtfrakció a CFU-MK-tól eltérő különböző vérképezési őssejteket is tartalmaz, a humán TPO jelenlétében csak megakariocita telepek alakultak ki, ami arra enged következtetni, hogy a humán TPO a megakariocita sejtvonal őssejtjeire fejti ki hatását. A patkány csontvelősejtekből nyert GpIIb/IIIa* sejteket folyadéktenyészetben 3-5 napig a transzfektált C0S1 sejtek 20 %-os (V/V) tenyészetfelülúszója jelenlétében tenyésztve a tenyésztés 5 napja sorén világosan megfigyelhető volt a

224 poliditás fokozódása.

39. példa

A glutation-S-transzferáz (GST) és a humán TPO (1-174. aminosavak) fúziós proteinjének [a továbbiakban

GST-TPO(1-174)] E. coliban való expresszálásához alkalmazható vektor előállítása

A humán TPO E. coli-bon való expresszálásának elősegítéséhez olyan mesterséges gént készítettünk, amely humán TPO-t kódol, és E. coli által előnyben részesített kodonokat tartalmaz. E DNS nukleotid-szekvenciája az E. coli-bon történő transzláció elindításához a -1 helyen N-terminális metionin kodont (ATG) tartalmaz.

Az alábbi szintetikus oligonukleotidokat állítottuk elő:

1. 5' -CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAGCCC

GGCTCCGCCAGCTTGTGACCTTCGTGTTCTGTCT-3' (83. sz. szekv.);

2. 5'-CAGTTTAGACAGAACACGAAGGTCACAAGCTGGCGG

AGCCGGGCTCATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT-3' (84. sz. szekv.);

3. 5'-AAACTGCTTCGCGACTCTCACGTGCTGCACTCTCG

TCTGTCCCAGTGCCCGGAAGTTCACCCGCTGCCG-3' (85. sz. szekv.);

4. 5'-CGGGGTCGGCAGCGGGTGAACTTCCGGGCACTGGG

ACAGACGAGAGTGCAGCACGTGAGAGTCGCGAAG-3' (86. sz. szekv.);

5. 5'-ACCCCGGTTCTGCTTCCGGCTGTCGACTTCTCCCT

GGTGAATGGAAAACCCAGATGGAAGAGACCAAA-3' (87. sz. szekv.);

6. 5'-CTGAGCTTTGGTCTCTTCCATCTGGGTTTTCCATT

CACCCAGGGAGAAGTCGACAGCCGGAAGCAGAAC-3' (88. sz. szekv.);

225

7. 5'-GCTCAGGACATCCTGGGTGCAGTAACTCTGCTTCT

GGAAGGCGTTATGGCTGCACGTGGCCAGCTTGGC-3' (89. sz. szekv.);

8. 5' -GGTCGGGCCAAGCTGGCCACGTGCAGCCATAACGC

CTTCCAGAAGCAGAGTTACTGCACCCAGGATGTC-3 (90. sz. szekv.);

. 5 -CCGACCTGCCTGTCCTTCCCTGCTTGGCCAGCTGTC

TGGCCAGGTTCGTCTGCTGCTCGGCGCTCTGCAG-3' (91. sz. szekv.);

. 5 ' -CAGAGACTGCAGAGCGCCGAGCAGACGAACCTGGC

CAGACAGCTGGCCAAGCAGGGAAGACAGGCA-3' (92. sz. szekv.);

11. 5 ' -TCTCTGCTTGGCACCCAGCTGCCGCCACAGGGCCG

TACCACTGCTCACAAGGATCCGAACGCTATCTTCC-3' (93. sz. szekv.);

12. 5'-AAGACAGGAAGATAGCGTTCGGATCCTTGTGAGCA

GTGGTACGGCCCTGTGGCGGCAGCTGGGTGCCAAG-3' (94. sz. szekv.).

A 2-11. szintetikus oligonukleotidokat 1 mM ATP-t, 10 mM Tris-acetátot, 10 mM Mg-acetátot és 50 mM K-acetátot tartalmazó oldatban T4 kinázzal (Pharmacia) foszforiláltuk. Annak érdekében, hogy e szintetikus oligonukleotidőkből hat kétszálú DNS-fragmenst készítsünk, az oligonukleotidokat párokba állítottuk (1. és 2., 3. és 4., 5. és 6., 7. és 8.,

9. és 10., 11. és 12.), és az egyes párokat 10 mM Tris/HCl (pH = 7,5) puffért, 10 mM MgClz-ot és 50 mM NaCl-ot tartalmazó oldatban hibridizáltuk. Ezután együtt az 1. +2., 3. + 4. és 5. + 6. párból készült kétszálú DNS-fragmenseket, illetve együtt a 7. + 8., 9. + 10. és 11. + 12. párból készült kétszálú fragmenseket T4 ligázzal (Life Technology) kezeltük, és a kapott két reakcióelegyet hasonló módon újra T4 ligázzal kezeltük. A ligálási reakcióval kapott DNSfragmenst BamHI (Boehringer-Mannheim) restrikciós enzimmel • · · « · · ο emésztettük és 2 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, miáltal 390-400 bp-os fragmenst kaptunk, melyet Prep-A-Gene DNStisztító készlet alkalmazásával tisztítottunk, és előzetesen Xbal és BamHI enzimekkel emésztett pUC18-ba szubklónoztuk (gazdasejtként E. coli DHőalfa törzset alkalmaztunk). Az így kapott kiónok közül nukleotid-szekvencia analízissel olyan kiónt választottunk ki, amely humán TPO-t kódoló és az alábbi, E. coli által előnyben részesített kodonokat tartalmazó génnel rendelkezik. Ezt a kiónt pUC18(XB)(1-123)-nak neveztük el. A kódoló szál nukleotidszekvenciáját a szekvencialista 9. számú szekvenciájában mutatjuk be.

10	1 20	30	40	50	60
CTAGAAAAAA	CCAAGGAGGT	AATAAATAAT	GAGCCCGGCT	CCGCCAGCTT	GTGACCTTCG
TTTTTT	GGTTCCTCCA	TTATTTATTA	CTCGGGCCGA	GGCGGTCGAA	CACTGGAAGC
Xbal	2
70	8.0	2 90	100	110	120
TGTTCTGTCT	AAACTGCTTC	GCGACTCTCA	CGTGCTGCAC	TCTCGTCTGT	CCCAGTGCCC
ACAAGACAGA	TTTGACGAAG	CGCTGAGAGT A	GCACGACGTG	AGAGCAGACA	GGGTCACGGG
130	140	Λ. 150	2 160	170	180
GGAAGTTCAC	CCGCTGCCGA	CCCCGGTTCT	GCTTCCGGCT	GTCGACTTCT	CCCTGGGTGA
CCTTCAAGTG	GGCGACGGCT	GGGGCCAAGA	CGAAGGCCGA	CAGCTGAAGA	GGGACCCACT
190	200	210	220	1 230	240
ATGGAAAACC	CAGATGGAAG	'agaccaaagc	TCAGGACATC	CTGGGTGCAG	TAACTCTGCT
TACCTTTTGG	GTCTACCTTC	TCTGGTTTCG	AGTCCTGTAG	GAGCCACGTC Q	ATTGAGACGA
250	260	270	280	A. •290	2. 300
TCTGGAAGGC	GTTATGGCTG.	CACGIGGCCA. -GCTTGGCCCG	ACCIGCCTGT.	CTTCCGTGCT.
AGACCTTCCG	CAATACCGAC	GTGCACCGGT	CGAACCGGGC	TGGACGGACA	GAAGGGACGA

in.

* *

- 227 310 320 330 340 350 360

TGGCCAGCTG TCTGGCCAGG TTCGTCTGCT GCTCGGCGCT CTGCAGTCTC TGCTTGGCAC

ACCGGTCGAC AGACCGGTCC AAGCAGACGA CGAGCCGCGA GACGTCAGAG ACGAACCGTG

UL 370 380 390 400 410 420

CCAGCTGCCG'. CCACAGGGCC GTACCACTG.CS TCACXAGGAT. .CCGAACGCTA: -.TGTTCC. GGTCGACGGC GGTGTCCCGG CATGGTGACG AGTGTTCCTA GGCTTGCGAT AGAAGGACAG AA

BamHI pg normális humán máj-eredetű poli (A)* RNS-ből oligo dT primer alkalmazásával egyszálú cDNS-t szintetizáltunk, és templátként a cDNS szintetizálási reakcióelegye 0,1-szeres térfogatának felhasználásával PCR-t végeztünk. A PCR-t primerként hTPO-C-t és hTPO-Z(EcoRI)-t alkalmazva 100 pl térfogatban végeztük (2 perces inkubálás 96 ’C-on, összesen 30 ciklus, mely ciklusok mindegyike 95 ’C-on 1 perces, 58 ’C-on 1 perces és 72 ’C-on 1 perces inkubálásból állt, s végül 72 ’C-on 7 perces inkubálást végeztünk). Az így kapott humán TPO cDNS-fragmenst BamHI és EcoRI enzimekkel emésztettük és 2 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, miáltal kb. 600 bp-os fragmenst izoláltunk, melyet Prep-A-Gene DNStisztító készlet alkalmazásával tisztítottunk és előzetesen

BamHI és EcoRI enzimekkel emésztett pUC18 vektorba szubklónoztunk (gazdasejtként E. coli DHSalfa törzset alkalmaztunk). A helyes humán TPO nukleotid-szekvenciát kódoló kiónt nukleotid-szekvencia analízissel választottuk ki, és pUC18(BE)(124-332)-nek neveztük el. A PCR-ban primerekként alkalmazott oligonukleotid-szekvenciák az alábbiak:

• · ·

- 228 hTPO-C: 5'-GGA GGA GAC CAA GGC ACA GGA-3' (95. sz. szekv) (a pHTFl klón 329-349. helyei); és hTPO-Z: (EcoRI): 5'-CCG GAA TTC TTA CCC TTC CTG AGA CAG

ATT-3' (96. sz. szekv.) (melyet úgy állítottunk elő, hogy a pHTFl klón 1143-1163. helyeinek megfelelő antiszensz primerhez EcoRI felismerési helyet adtunk).

A pUC18(BE)(124-332) kiónt BamHI és EcoRI enzimekkel emésztettük és a humán TPO cDNS C-terminális oldali, kb. 600 bp-os fragmensének kinyerése érdekében 2 %-os agarózgélen elektroforézist végeztünk. Az izolált fragmenst Prep-A-Gene

DNS-tisztító készlet alkalmazásával tisztítottuk és előzetesen BamHI és EcoRI enzimekkel emésztett pUC18(XB)(1-123) vektorba szubklónoztuk (gazdasejtként E.

coli DH5alfa törzset alkalmaztunk). Az így nyert kiónt pUC18(XE)(1-332)-nek neveztük el.

Mivel az egyik példában (melyben a humán TPO aktivitás ín vitro mérése érdekében különböző C-terminális deléciós humán

TPO cDNS-konstrukciókat készítettünk és expresszáltunk) bebizonyítottuk, hogy az 1-163,. aminosavakat tartalmazó humán TPO peptid-fragmens rendelkezik humán TPO aktivitással, olyan expressziós vektort készítettünk, amely ezt a peptid-fragmenst tartalmazta. Ebben az esetben a

GST-TPO(1-174)-et kódoló DNS-szekvencia expresszálását végeztük el.

Mivel a pHTFl klón 681-686. helyeinek (a 173. és 174.

• ·

- 229 aminosavnak) megfelelő nukleotid-szekvenciát a SacI restrikciós enzim felismeri, ezen enzim felismerési helyét felhasználva két szintetikus oligonukleotid alkalmazásával két terminális kodont építettünk be. Eszerint az SSE1 és SSE2 szintetikus oligonukleotidokat 10 mM Tris/HCl (pH = 7,5) puffért, 10 mM MgCls-ot és 50 mM NaCl-ot tartalmazó oldatban hibridizáltuk, és DNS-ligáló készlet (a Takara Shuzo terméke) alkalmazásával az így kapott kétszálú DNSfragmenst a pUC18(XE)(1-332) plazmidba építettük be, amelyből a humán TPO cDNS kb. 480 bp-os C-terminális fragmensét SácI és EcoRI enzimekkel végzett emésztéssel korábban eltávolítottuk, s így a pUC18(XS)(1-174) kiónt kaptuk (gazdasejtként E. coli DHöalfa törzset alkalmaztunk). Az alkalmazott szintetikus oligonukleotidok szekvenciája az alábbi:

SSE1: CTAATGAG (97. sz. szekv);

SSE2: AATTCTCATTAGAGCT (98. sz. szekv.);

2acl ££E1 EwRl

5'-CTAATGAG-3' (99. sz. szekv.)

3'-TCGAGATTACTCTTAA-5' (100. sz. szekv.)

SSE2

A fentiek szerint kapott p(JC18 (XS)(1-174) kiónt Xbal és EcoRI enzimekkel emésztettük és 2 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, hogy a humán TPO 1-174. aminosavait kódoló, kb. 600 bp-os fragmenst izoláljuk, melyet azután

Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet alkalmazásával tisztítottunk és előzetesen Xbal és EcoRI enzimekkel • ·

- 230 emésztett pBluescript IISK·*· vektorba (Stratagene) szubklónoztunk (gazdasejtként E. coli DHöalfa törzset alkalmaztunk). Az így kapott kiónt pBL(XS)(l-174)-nek neveztük el. Hasonlóan, a pBL(XS)(1-174) kiónt Xbal és HindlII enzimekkel emésztettük, hogy a humán TPO 1-174. aminosavait kódoló, kb. 550 bp-os fragmenst kapjuk, melyet azután Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet alkalmazásával tisztítottunk és előzetesen Xbal és HindlII enzimekkel emésztett pCFM536 vektorba (EP-A-136490 számú európai szabadalmi bejelentés) szubklónoztunk (gazdasejtként E. coli DH5alfa törzset alkalmaztunk). Az így kapott kiónt pCFM536/hT(1-174)-nek neveztük el.

Az alábbi kísérletet a GST-TP0(1-174) expresszálása érdekében végeztük, melynek során a glutation-S-transzferáz (GST) fúziós protein expressziós vektorát, a pGEX-2T-t (Pharmacia) alkalmaztuk. Templátként pCFM536/hT(1-174) és primerekként GÉZI és GEX3 alkalmazásával PCR-t végeztünk (2 perces inkubálás 96 ’C-on, összesen 22 ciklus, mely ciklusok mindegyike 95 ’C-on 1 perces, 41 ’C-on 1 perces és 72 ’C-on 1 perces inkubálásból állt, s végül 72 ’C-on 7 perces inkubálás következett). Az így kapott humán TPOkódoló régiót Nael és EcoRI enzimekkel emésztettük és 2 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, hogy kb. 550 bp-os fragmenst izoláljunk, melyet azután Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet alkalmazásával tisztítottunk és előzetesen EcoRI és Smal enzimekkel emésztett pGEX-2T vektorba klónoztunk (gazdasejtként E. coli DH5 törzset alkalmaztunk). Ezután a . ·;·· :

·* ···. ·· ..· _β<·

- 231 hibátlan humán TPO nukleotid-szekvenciát kódoló pGEX-2T/hT(1-174) elnevezésű kiónt a GST-TPO(1-174) expresszálásához alkalmazható transzformáns előállításához nukleotid-szekvencia analízissel választottuk ki. A PCR-hoz alkalmazott primerek nukleotid-szekvenciái a következők:

GEX1: 5'-ATC GCC GGC TCC GCC AGC TTG TGA C-3' (101. sz.

szekv) (melyet úgy állítottunk elő, hogy a 10. sz. szekv. 21-39. helyeinek megfelelő szekvenciához Nael felismerési s z e kve ne i át adtunk);

GEX3: 5'-GCC GAA TTC TCA TTA GAG CTC GTT CAG TGT-3' (102. sz. szekv.) (a 10. sz. szekv. 523-549. helyeinek megfelelő antiszensz primer).

A kapott expressziós plazmid GST-proteint, trombin felismerési peptidet és humán TPO-t (1-174. aminosav) kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. A trombin felismerési peptidet és humán TPO-t (1-174. aminosav) kódoló DNS-szekvenciát a szekvencialista 10. számú szekvenciájaként mutatjuk be.

40. példa

A GST-TPO (1-174) expresszálása E. coli-ban

A 39. példában előállított transzformánst 50 pg/ml ampicillint tartalmazó 60 ml LB tápközegben 37 °C-on egy éjszakán keresztül rázógépen tenyésztettük. A kapott tenyészoldat 25 ml-ét 1000 ml, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB tápközeghez adtuk, és 37 °C-on rázógépen tenyésztettük, míg az optikai denzitás (OD) Αβοο-nál el nem

232 érte a 0,7-0,8 értéket. A tenyészőldathoz 0,1 M végkoncentrációban IPTG-t adtunk, és a rázatás közbeni tenyésztést a GST-TP0(1-174) expressziójának indukálása érdekében további 3 óra hosszat folytattuk.

41. példa

Az E. coJl-ban expresszált GST-TPO(1-174) tisztítása és biológiai aktivitásának igazolása

A humán TPO nukleotid-szekvenciáját tartalmazó pGEX-2T/hT(1-174) kiónból származó GST-TPO(1-174)-et termelő rekombináns törzs fagyasztott sejtjeiből 5,9 g-ot 10 ml vízben szuszpendáltunk, s a sejteket nagynyomású dezintegráló berendezésben feltártuk. A szuszpenziót centrifugálva a GST-TP0(l-174)-et az üledék frakcióban nyertük ki, és a szennyezett proteineket, sejtalkotókat és egyebeket eltávolítottuk. Ezután a GST-TPO(1-174)-et tartalmazó üledék frakciót 5 ml vízben szuszpendáltuk, s ehhez keverés közben 6 ml 1 M Tris (pH = 8,5) puffért, 120 ml 10 M karbamidot és 16 ml vizet adtunk. Az elegyet az összetevők feloldása érdekében 5 percig kevertük, majd a kapott oldatot 4 egyenlő részre osztottuk, s a következő 1-4. lépéseket ezek alkalmazásával végeztük.

(1) A szétoszott minták egyikét 20 mM Tris (pH = 8,5) pufferrel tízszeresére hígítottuk. Ehhez 5 mM végkoncentrációban redukált típusú glutationt, 0,5 mM végkoncentrációban pedig oxidált típusú glutationt adtunk,

- 233 majd 4 ’C-on egy éjszakán át inkubáltuk. Az így elkészített elegyet centrifugáltuk, a GST-TPO(1-174)-et felülúszóként kinyertük, s ezt 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 5,5) kétszeresére hígítottuk, majd pH-ját ecetsawal 5,5-re állítottuk be. A GST-TPO(1-174)-et az oldatban SP Sepharose

Fást Flow kationcserélő oszlopra (Pharmacia Biotech, katalógusszám: 17-0729-01) vittük, melyet előzetesen 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 5,5) ekvilibráltunk. Miután az oszlopot 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH =5,5) mostuk, a GST-TPO(l-174)-et 500 mM nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 5,5) eluáltuk. Az eluátum 129 ml-nyi részét 2,6 ml 1M Tris pufferrel (pH = 8,5) elegyítettük, és a kapott, 8,1 pHértékű elegyet Glutathione Sepharose 4B oszlopra (Pharmacia Biotech, katalógusszám: 17-0756-01) vittük, hogy adszorbeáljuk a GST-TP0(1-174)-et. Miután az oszlopot PBSsel mostuk, a GST-TPO(l-174)-et 10 mM redukált glutationt tartalmazó 20 mM Tris pufferrel (pH = 8,5) eluáltuk. A kapott eluátumot 37 NIH egység trombinnal elegyítettük, szobahőmérsékleten 4 óra hosszat állni hagytuk, majd PBS-sel 10-szeresére hígítottuk, és az emésztett GST adszorbeálása és a nem adszorbeálódott frakcióban a TPO(1-174) kinyerése érdekében Glutathione Sepharose 4B oszlopra vittük. A kinyert nem adszorbeálódott frakciót 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 5,5) háromszorosára hígítottuk és SP

Sepharose Fást Flow kationcserélő oszlopra vittük, melyet előzetesen azonos pufferrel ekvilibráltunk. A szóban forgó vegyületet azonos pufferben oldott 0-500 mM nátrium-klórid

- 234 lineáris gradienssel eluáltuk.

(2) Az 1. lépés valamennyi műveletét 0,1 % poliszorbát 80 jelenlétében végeztük.

(3) A szétosztott minták egyikét 20 mM Tris pufferrel (pH =

8,5) 10-szeresére hígítottuk. Ehhez az oldathoz 5 mM végkoncentrációban redukált típusú glutationt, 0,5 mM végkoncentrációban pedig oxidált típusú glutationt adtunk, majd 4 °C-on egy éjszakán át állni hagytuk. Az így elkészített elegyet centrifugáltuk, a GST-TPO(1-174)-et felülúszóként kinyertük, s ezt 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 5,5) kétszeresére hígítottuk, majd pH-ját ecetsavval 5,5-re állítottuk be. A GST-TP0(l-174)-et az oldatban SP Sepharose Fást Flow kationcserélő gyantára vittük, melyet előzetesen 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 5,5) ekvilibráltunk. Miután a gyantát 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 5,5) mostuk, a GST-TPO(1-174)-et 500 mM nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 5,5) eluáltuk. Az éluátum pH-ját 1M Tris pufferrel (pH = 8,5) 8-ra állítottuk be, 320 NIH egység trombinnal elegyítettük, hogy a GST polipeptid-szekvenciáit a trombin felismerési pepdit linekrnél való hasítással eltávolítsuk, szobahőmérsékleten 4 óra hosszat állni hagytuk, 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 5,5) ötszörösére hígítottuk, majd előzetesen ugyanezen pufferrel ekvilibrált SP Sepharose Fást Flow ioncserélő oszlopra vittük, és a szóban forgó vegyületet azonos pufferben oldott 0-500 mM nátrium-klorid «*» ··

- 235 lineáris gradienssel eluáltuk.

(4) A 3. lépés valamennyi műveletét 0,1 % poliszorbát 80 jelenlétében végeztük.

Az SP Sepharose Fást Flow kationcserélő oszlopkromatográfiával kb. 200-400 mM nátrium-kloridkoncentrációnál kapott eluált frakciók mindegyikét IMDM tenyésztő tápközeggel szemben dializáltuk,, majd patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel értékeltük. A frakciókat redukálószer jelenlétében SDS-PAGE analízissel vizsgálva a frakció egyik fő protein sávjaként egy 19 kD-nak megfelelő molekulatömegű sávot mutattunk ki. (1-20 %-os tisztaság).

Amikor e sáv N-terminális szekvencia-analízisét az 1.

példában leírt SDS-PAGE analízissel és PVDF membránmásolattal elvégeztük, bebizonyosodott, hogy ez a sáv pGEX-2T/hT(1-174)-eredetű fúziós proteinként expresszálni kívánt TPO-szekvenciát tartalmaz. A trombin felismerési peptid-linker szekvenciája és a trombin linkerre gyakorolt hatása ismeretében a kapott TPO leszármaztatott aminosavszekvenciája [Gly^_1]TPO volt.

42. példa

Az 1. és 3. helyen szubsztituált (Ser —» Alá, illetve

Alá —» Val) humán TPO E. coli-ban való expresszálásához alkalmazható vektor előállítása

A 39. példában készített p(JC18(XE) (1-332) kiónt Xbal és «··· ·« »·«· ·»

- 236 Szintetikus lásd alább), és

EcoRI enzimekkel emésztettük, 2 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, miáltal a humán TPO1-332. aminosavait kódoló, kb. 1000 bp hosszúságú fragmenst kaptunk, amit Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet alkalmazásával tisztítottunk és előzetesen Xbal és EcoRI enzimekkel emésztett pBluescript II SK* vektorba (Stratagene) szubklónoztunk (gazdasejtként E. coli DHöalfa törzset alkalmaztunk). Az így kapott klónt pBL(XE)(1-332)-nek neveztük el. Ezután a pBL(XE)(1-332) klón egy régióját a BamHI felimerési helytől a 163. aminosavat kódoló nukleotidig (366-489. bázisok) E. coli által előnyben részesített kodonokra cseréltük.

oligonukleotidokat állítottunk elő, (13-20.

az egyes oligonukleotid párokat (13. és 14., 15. és 16., 17. és 18.) azonos csőben foszforiláltuk (amely 0,1 mM ATP-t, 10 mM Tris-acetátot, 10 mM Mg-acetátot és 50 mM K-acetátot tartalmazott). Az elegyhez 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) puffért, 100 mM MgCl2-ot és 500 mM NaCl-ot tartalmazó oldatát 1/10 térfogatát adtuk, a kapott oldatot forró vízfürdőben 3 percig melegítettük, majd hagytuk szobahőmérsékletre lehűlni, miáltal kétszálú cDNS-fragmenst kaptunk. Az így kapott három pár (a 13. és 14., 15. és 16., illetve 17. és 18. oligonukleotidból álló) kétszálú DNSfragmenst DNS-ligáló készlet (Takara Shuzo) alkalmazásával ligáltuk, és az így ligáit termékeket templátként, a 19. és 20. szintetikus oligonukleotidokat pedig primerekként alkalmazva PCR-t végeztünk. A kapott PCR-terméket BamHI és HindlII enzimekkel emésztettük, 2 %-os agarózgélen ··»·

- 237 * · · ·* ···· elektroforizáltuk, miáltal kb. 130 bp hosszúságú fragmenst

DNS-tisztító tisztított enzimekkel készlet fragmenst emésztett kaptunk, amit Prep-A-Gene alkalmazásával tisztítottunk. A előzetesen BamHI és HindlII pBL(XE)(1-332) vektorba szubklónoztuk (gazdasejtként E. coli DH5 törzset alkalmaztunk). Az így nyert kiónok közül szekvencia-analízissel az alábbi nukleotid-szekvenciákkal rendelkező kiónt választottuk ki, és pBL(XH)(1-163)-nak neveztük el.

13. 5' -GATCCGAACGCTATCTTCCTGTCTTTCCAGCACCTGCTGCGT-3' (103. sz. szekv.);

14. 5'-TTTGCCACGCAGCAGGTGCTGGAAAGACAGGAAGATAGCGTTCG-3' (104. sz. szekv.);

15. 5'-GGCAAAGTTCGTTTCCTGATGCTGGTTGGCGGTTCTACCCTG-3' (105. sz. szekv.);

16. 5'-ACGCACAGGGTAGAACCGCCAACCAGCATCAGGAAACGAAC-3' (106. sz. szekv.);

. 5 ' -TGCGTTCGTCGGGCGCCGCCAACCACTGCTGTTCCGTCTTAATGAA-3' (107. sz. szekv.);

18. 5'-AGCTTTCATTAAGACGGAACAGCAGTGGTTGGCGGCGCCCGACGA-3' (108. sz. szekv.);

19. 5'-AAGGATCCGAACGCTATCTTCCTG-3' (109. sz. szekv.);

20. 5'-AGAAGCTTTCATTAAGACGGAACA-3' (110. sz. szekv.).

A humán TPO (1-163. aminosavak) expressziója mennyiségének növelése és az N-terminális proteázok általi hidrolízisének megakadályozása érdekében egy, az 1. helyen (Ser -* Alá) és

238 (Pharmacia) szintetikus a 3. helyen (Alá -*· Val) szubsztituált mutációs típusú humán TPO (1-163. aminosavak) (a továbbiakban h6T(1-163)) ([Alá^{1 2}, Val^{3 4}]TPO(1-163)) expresszálásához expressziós vektort készítettünk, amely a -1 helyen lizint (Lys), a -2 helyen pedig metionint (Met) kódol ([Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³]TPO(1-163)). Négy szintetikus oligonukleotidot állítottunk elő (ld. alább), és a 2-9 és 3-3 szintetikus oligonukleotidokat 1 mM ATP-t, 10 mM Tris-acetátot, 10 mM Mg-acetátot és 50 mM K-acetátot tartalmazó T4 kinázzal foszforiláltuk. Annak érdekében, hogy ezen oligonukleotidokat kétszálú DNS-fragmensekké alakítsuk, az 1-9 és 2-9, illetve 3-3 és 4-3 egyszálú DNSfragmens párokat DNS-ligáló készlettel (Takara Shuzo) kezeltük. A ligálási reakcióval kapott DNS-fragmenst előzetesen Xbal és Nrul enzimekkel emésztett pBL(XH)(1-163) vektorba szubklónoztuk, és szekvencia-analízissel pontosan az alábbi szintetikus oligonukleotiddal helyettesített kiónt választottunk ki (gazdasejtként E. coli DHöalfa törzset alkalmaztunk), melyet pBL(XH)h6T(1-163)-nak neveztünk el.

1- 9 : 5' -CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAAAGCACCTGTACCA-3' (111. sz. szekv.);

2- 9 : 5' -CAGGTGGTACAGGTGCTTTCATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT-3' (112. sz. szekv.);

3- 3: 5'-CCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAACTGCTGCG-3' (113. sz. szekv.);

4- 3: 5'-CGCAGCAGTTTAGACAGGACCCGTAAATCACATG-3' (114. sz. szekv.);

239

1-9 20

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT _TTTTTT qGTTCCTCCA TTATTTATTA CTTTCGTGGA

Xbal

2=2

3-3 70

GTACCACCTG CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG

CATGGTGGAC GTACACTAAA TGCCCAGGAC AGATTTGACG ACGC (115. sz. szekv.)

A pBL(XH)(1-163) kiónt Xbal és Hindin enzimekkel emésztettük, miáltal kb. 500 bp hosszúságú fragmenst kaptunk, amely a mutációs típusú humán TPO 1-163. aminosavait kódolja. Ezt a fragmenst Prep-A-Gene DNStisztító készlet alkalmazásával tisztítottuk és pCFM536 vektorba (EP-A-136490 számú európai szabadalmi bejelentés) klónoztuk, melyet előzetesen Xbal és HindiII enzimekkel emésztettünk (gazdasejtként előzetesen pMWl-gyel [ATCC No.

39933] transzformált E. coli JM109 törzset használtunk). Az így kapott kiónt pCFM536/h6T(1-163)-nak neveztük el, és a mutációs típusú humán TPO, nevezetesen a h6T(1-163) expresszálásához ezt az expressziós vektort tartalmazó E. coli törzset alkalmaztuk. Ez az expressziós plazmid a szekvencialista 11. számú szekvenciájában bemutatott DNSszekvenciát tartalmazza.

• ·

- 240 43. példa

A h6T( 1-163) expresszálása E. coli-ban

A pCFM536 expressziós plazmid expresszióját a lambda-PL promoter szabályozza, amely a cI857 represszor gén szabályozása alatt áll. A 42. példában kapott transzformánst 60 ml, 50 pg/ml ampicillint és 12,5 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB tápközegben 30 “C-on egy éjszakán keresztül rázógépen tenyésztettük. A tenyészelegy 25 pl-ét 1000 ml, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB tápközeghez adtuk, és a rázógépen 37 ’C-on addig tenyésztettük, míg Αβοο-nál az 0D el nem érte az 1,0-1,2 értéket. Ezután kb. 330 ml 65 ’C-ra melegített LB tápközeget adtunk a tenyészelégyhez, miáltal a tápközeg hőmérsékletét 42 ’C-ra állítottuk be, és a h6T(1-163) expressziójának indukálása érdekében a rázótenyésztést 42 ’C-on három óra hosszat folytattuk.

44. példa

Az E. coli-ban expresszált h6T(1-163) tisztítása és biológiai aktivitásának igazolása

A h6T(1-163)-termelő rekombináns törzs fagyasztott sejtjeinek 3,6 g-ját 10 ml vízben szuszpendáltunk, s a sejteket nagynyomású dezintegráló berendezésben feltártuk. A szuszpenziót centrifugálva a GST-TP0(1-174)-et az üledék frakcióban nyertük ki, és a szennyezett proteineket, sejtalkotókat és egyebeket eltávolítottuk. Ezután a h6T(1-163)-t tartalmazó üledék-frakciót 7 ml vízben

241 szuszpendáltuk, s a szuszpenzióhoz keverés közben 3 ml 1 M Tris (pH = 8,5) puffért, majd 8 M végkoncentrációban karbamidot, 6 M végkocentrációban guanidin-hidrokloridot és 2 % végkoncentrációban nátrium-N-lauroil-szarkozinátot adtunk. Az elegyet az összetevők feloldása érdekében 5-20 percig kevertük, majd a a kapott oldatot 20 mM Tris pufferrel (pH = 8,5) 10-szeresére hígítottuk, és a protein újraredőződése érdekében egy éjszakán keresztül 4 ’C-on inkubáltuk. Ebben az esetben a levegő oxidáló hatása mellett adalékként glutationt és réz-szulfátot alkalmaztunk. A h6T(1-163)-t centrifugálás után a felülúszóban nyertük ki. A kinyert frakciók mindegyikét redukálószer jelenlétében SDSPAGE analízissel vizsgálva az összes frakció fő protein sávjaként 18 kD-nak megfelelő sávot mutattunk ki (30-40 %-os tisztaság). E sáv N-terminális szekvenciáját az 1. példában leírt SDS-PAGE analízissel és PVDF membrán-másolattal vizsgálva bebizonyítottuk, hogy ez a sáv tartalmazza a pCMF536/h6T(1-163)-eredetű mutációs típusú TPO-ként expresszálandó TPO-szekvenciát. Az egyes frakciókat IMDM tenyésztő tápközeggel szemben dializálva és patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel értékelve valamennyi frakcióban dózisfüggő TPO aktivitást észleltünk.

45. példa

Anti-TPO peptid antitest előállítása és a TPO kimutatása

SDS-PAGE és Western analízissel

Az anti-TPO peptid antitest sikeres előállítása lehetővé • ·

- 242 teszi a TPO protein immunológiai módszerekkel történő kimutatását. A bizonyított TPO aminosav-szekvenciák közül három olyan régiót választottunk ki (ld. alább) amelyek viszonylag alkalmas antigénnek bizonyultak. A kiválasztott régiók mindegyikével Tam eljárása szerint (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85. 5409-5413, 1988) négyszálú összetett antigén peptid (Multiple Antigén Peptide; MAP) típusú peptideket szintetizáltunk, majd a megfelelő anitszérum minták előállítása érdekében az egyes szintetizált peptidek mindegyikének 100 jug-jéval 8 alkalommal 2 nyulat immunizáltunk.

A szintetizált_peptid_antigénekben_található aminosavszekvenciák (a) Patkány TPO(9-28) (RT1 peptid-régió)

PRLLNKLLRDSYLLHRRLSQ (116. sz. szekv.) (A 24. helyen lévő R a génről meghatározott aminosav-gyökökben eredetileg S);

(b) Patkány TP0(46-66) (RT2 peptid-régió) FSLGEWKTQTEQSKAQDILGA (117. sz. szekv.);

(c) Patkány TPO(163-180) (RT4 peptid-régió) SRTSQLLTLNKFPNRLLD (118. sz. szekv.) (a 178-180. helyen lévő LLD a génről meghatározott aminosav-gyökökben eredetileg TSG).

Ezen antiszérum minták közül elsőként az anti-RTl és anti-RT2 peptidet protein A oszlopon (PROSEP-A; a • ·

243

Bioprocessing Ltd. 8427 katalógusszámú terméke) kromatográfáltuk, miáltal 2344 mg és 1920 mg IgG frakciót kaptunk, és e frakciók 54 mg-ját, illetve 32 mg-ját aktív biotinhoz (NHS-LC-Biotin II; a PIERCE 21336 katalógusszámú terméke) kapcsolva biotiniláltuk. A rekombináns TPO-t tartalmazó mintát SDS-PAGE analízissel, majd PVDF vagy nitrocellulóz membránon végzett elektroblot módszerrel vizsgáltuk (az 1. példában leírtak szerint), továbbá a biotinilált antitesteket első antitestekként alkalmazva hagyományos módon Western biot analízist végeztünk.

A lenyomatkészítés (blotting) után a membránt 20 mM TrisHCl-ból és 0,5 M NaCl-ból (pH = 7,5) álló oldattal (TBS) 5 percig, majd kétszer 5 percig 0,1 % Tween 20-at tartalmazó TBS-sel (TTBS) mostuk, és 60 percig blokkoló szerrel (BlockAce; a Dainippon Pharmaceutical uk-B25 katalógusszámú terméke) kezeltük. Ezután a membránt 60 percig 10 jíg/ml biotinilált anti-TPO peptid antitestet, 0,05 % BSA-t és 10 %

BlockAce-t tartalmazó TTBS oldattal kezeltük, majd kétszer 5 percig TTBS-sel mostuk. A membránt ezután 30 percig olyan oldattal kezeltük, amelyet lúgos foszfatázzal jelölt avidint (a Leinco Technologies A108 katalógusszámú terméke) 10 % BlockAce-t tartalmazó TTBS oldattal 5000-szeresére hígítva állítottunk elő, majd kétszer 5 percig TTBS-sel és 5 percig

TBS-sel mostuk, és a szín előhívását lúgos foszfatáz szubsztrát (a Bio-Rad 170-6432 katalógusszámú terméke) alkalmazásával végeztük. A fentiekben leírt western analízist szobahőmérsékleten végeztük.

• ·

244

A vizsgálat eredményeként nemcsak különböző (C0S1 sejtekben expresszált) patkány TPO proteineket, hanem különböző (COS1 sejtekben és E. coli sejtekben expresszált) rekombináns humán TPO proteineket is felismertünk (például COS1 sejtekben expresszált, pHTPl vagy pHTFl plazmid-eredetű humán TPO-t és N-glikozidos kötésének hasításával kapott származékát, E. coli-ban expresszált GST-TPO(l-174)-et és trombinnal emésztett származékát, továbbá E. coli-ban expresszált h6T(1-163)-at, amely egy mutációs típusú TPO). A kapott eredményeként lehetővé vált e különböző rekombináns humán TPO típusok vizsgálata is.

A fentiek mellett bebizonyítottuk az anti-humán TPO peptid antitestek előállításának lehetőségét. A fenti technikákkal kapott antitestek nemcsak a western analízishez alkalmazhatók, hanem a TPO antitest-oszlopokon végzett tisztításához és minden más, antitest felhasználásával végzett immunológiai eljáráshoz is.

A humán TPO aminosav-szekvenciában (7. sz. szekv.) hat olyan régiót választottunk ki, melyekről feltételeztük, hogy viszonylag megfelelő antigenitással rendelkeznek (ld. 4. táblázat). E régióknak megfelelő tetramer összetett antigén peptid (MAP) típusú peptideket szintetizáltunk Az egyes peptidekkel 8 alkalommal, alkalmanként 100 mg mennyiségben két nyulat immunizáltunk.

Ettől függetlenül olyan monomer peptidet is szintetizáltunk.

• »·

245 melyben a 4. táblázatban bemutatott valamennyi peptidrégió C-terminálisához egy cisztein-gyököt kapcsoltunk. Ezt a peptidet enzimes immunvizsgálat alkalmazásával végzett antitest-titer meghatározáshoz teszt-antigénként alkalmaztuk. A fentebb előállított szérum esetében bebizonyítottuk az antitest-titer emelkedését, így ezt a szérumot használtuk antisztérumként.

Az antitesteket úgy állítottuk elő, hogy az egyes antigénhatású peptidekkel két nyulat immunizáltunk, hogy azok peptid elleni antiszérumot termeljenek. A kapott két anti-HTl peptid antitestet megkülönböztetésül (az egyes nyulaktól függően) anti-HTl-1 peptid antitestnek és antiHT1-2 peptid antitestnek nevezzük.

Az anti-HTl-1 peptid antitest tisztításának egy példáját az alábbiakban mutatjuk be.

mg HT1 monomer peptidet, melyhez előzőleg cisztein-gyököt kapcsoltunk, 12 ml Sulfo-Link megkötő gélhez (Pierce, katalógusszám: 44895) kapcsoltuk. Röviden; az antigént tartalmazó peptid-oldatot 15 percig kapcsoltuk a gélhez, melyet előzőleg a gél térfogatához viszonyítva hatszoros térfogatú kapcsoló pufferrel (50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH = 8,5) ekvilibráltunk. 30 perces inkubálás után a gélt térfogatához viszonyítva háromszoros térfogatú kapcsoló pufferrel mostuk. A reagálatlan gyökök blokkolásához a gélhez (a gél térfogatára vonatkoztatva 1 ml/ml

246 mennyiségben) 15 percig 0,05 M cisztein-HCl-ot tartalmazó kapcsoló puffért adtunk. 30 perces inkübálás után a gélt térfogatához viszonyítva nyolcszoros térfogatú kapcsoló pufferrel mostuk. Valamennyi kapcsolási reakciót szobahőmérsékleten végeztük. A peptidet így 28,3 % kapcsolási hatásfokkal kovalensen kapcsoltuk a gélhez, majd a gél térfogatára vonatkoztatva 0,8 mg/ml peptidet tartalmazó antigén-oszlopot készítettünk.

Az egyik nyúlból vett, anti-HTl-1 peptid antitestet tartalmazó 76,7 ml (proteintartalom: 3620 mg) antiszérumot (eredeti mennyisége 78,4 ml) az előzőleg 150 mM NaCl-ot és 0,05 % nátrium-azidot tartalmazó 50 mM foszfát-puffferrel (pH = 8) ekvilibrált antigén oszlopra vittük, majd ugyanezen pufferrel mostuk, miáltal 105,9 ml átfolyt frakciót kaptunk (proteintartalom: 3680 mg). Az adszorbeált frakciót ezután 0,1 M citrát-pufferrel (pH = 3,0) mostuk, és azonnal 21,2 ml 0,1 M karbonát-pufferrel (pH = 9,9) semlegesítettük. Ezután az eluátum frakciót Amicon YM 30 membránt alkalmazva ultrafiltrálással bekoncentráltuk, miáltal 150 mM NaCl-ot és 0,05 % nátrium-azidot tartalmazó 50 mM foszfát-puffér (pH = 8) oldatban tisztított anti-HTl-1 peptidet kaptunk.

Hasonló módon állítottuk elő az alábbi antitesteket: antiHT1-2 peptid antitest (60,0 mg); anti-HT2-l peptid antitest (18,8 mg); anti-HT2-2 peptid antitest (8,2 mg), és hasonlók. Az anti-HT3 - anti-HT6 peptid antitestek szintén hasonló módon állíthatók elő.

247

Az affinitás-tisztított anti-HTl-1 peptid antitest, anti-HTl-2 peptid antitest, anti-HT2-l peptid antitest, illetve anti-HT2-2 peptid antitest 3 mg-ját aktivált biotinhoz való (Pierse, NHS-LC-Biotin II, katalógusszám: 21336) kapcsolással biotiniláltuk.

Valamennyi fenti antitest esetében azt tapasztaltuk, hogy a CHO sejtek (melyekben a 4. táblázatban bemutatott aminosav-szekvenciákat kódoló gént beépítettük és expresszáltuk) tenyészetfelülúszójából részlegesen tisztított rekombináns humán TPO standard SDS-PAGE *

analízisét követő Western biot analízis során (nitrocellulóz filteren vagy PVDF membránon) alkalmasak a humán TPO felismerésére és detektálására.

* ·

- 248 4. TÁBLÁZAT

A tetramer MAP típusú szintetikus peptid-antigénben lévő humán TPO aminosav-szekvenciák

HT1 humán TPO peptid-régió (8-28. aminosavak):

DLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQ (119

HT2 humán TPO peptid-régió (47-62. aminosavak):

SLGEWKTQMEETKAQD (120.

HT3 humán TPO peptid-régió (108-126. aminosavak) LGTQLPPQGRTTAHKDPNA (121.

HT4 humán TPO peptid-régió (172-190. aminosavak) NELPNRTSGLLETNFTASA (122.

HT5 humán TPO peptid-régió (262-284. aminosavak)

SLPPNLQPGYSPSPTHPPTGQYT (123.

HT6 humán TPO peptid-régió (306-332. aminosavak)

PSAPTPTPTSPLLNTSYTHSQNLSQEG (124.

sz. szekv) sz. szekv.) sz. szekv.) sz. szekv.) sz. szekv.) sz. szekv.)

46. példa

Anti-TPO peptid antitest-oszlop előállítása

Mivel a 45. példában kapott anti-patkány TPO peptid antitest képes volt a patkány és humán TPO molekulák felismerésére, az anti-RTl peptid antitest és az anti-RT2 peptid antitest immunglobulin (IgG) frakcióit az alábbi eljárás szerint kémiailag aktivált géloszlophoz kapcsoltuk, hogy anti-TPO peptid antitest-oszlopokat állítsunk elő. Mindkét alkalmazott antitestet egymástól függetlenül két-két nyúl

• · *

- 249 szérumából készítettük. Eszerint, az első két nyúlból készített anti-RTl peptid antitestet anti-RTl-1 és antiRT1-2 peptid antitestnek, a másik két nyúlból készített anti-RT2 peptid antitestet pedig anti-RT2-l és anti-RT2-2 peptid antitestnek neveztük el. Mivel ezeket az antitesteket egymástól függetlenül használtuk az antitest-oszlop előállításához, összesen öt oszlopot kaptunk, nevezetesen két anti-RTl peptid antitest-oszlopot (a továbbiakban antiRT1-1 antitest-oszlop és anti-RTl-2 antitest-oszlop); két anti-RT2 peptid antitest-oszlopot (a továbbiakban antiRT2-1 antitest-oszlop és anti-RT2-2 antitest-oszlop); valamint egy anti-RTl-2 + 2-1 kevert antitest-oszlopot, melyet úgy készítettünk, hogy az anti-RTl-2 peptid antitestet az anti-RT2-l peptid antitestei elegyítettük, és ezt az elegyet kapcsoltuk a gélhez.

Valamennyi antitestet 5 mg/ml végkoncentrációban (illetve az anti-RTl + 2 kevert antitest-oszlopnál az anti-RTl-2 peptidantitest és az anti-RT2-l peptid antitest esetében 2,5-2,5 mg/ml végkoncentrációban) 50 mM Na-foszfát és 0,15 M NaCl oldatában (pH = 8,0) oldottuk fel, és a kapott oldat 2,31 ml-ét 1,54 ml felduzzasztott formil-aktivált géllel (Formyl-Cellulofiné, a Chlsso terméke) elegyítettük, és 4 °C-on két óra hosszat kapcsolási reakciót végeztünk. Ehhez egy redukálószer (trimetil-borán, TMAB; a Seikagaku Kogyo 680246 katalógusszámú terméke) 10 mg/ml koncentrációjú oldatának 1,1 ml-ét adtuk, majd hat óra hosszat újabb kapcsolási reakciót végeztünk, és az elegyet a gél kinyerése

- 250 érdekében lecentrifugáltuk. A gélhez 10 ml tisztított vizet adtunk, s ezt ismét centrifugáltuk, és a reagálatlan antitesteket e lépés négyszeri ismétlésével eltávolítottuk. Ezután a kapott gélt 4,6 ml blokkoló oldattal (0,2 M Na-foszfát és 1 M etanol-amin, pH = 7,0) és 1,1 ml redukálószer-oldattal elegyítettük, majd a reagálatlan gél aktív csoportjainak blokkolása érdekében 4 ’C-on legalább két óra hosszat kezeltük. A gélt tisztított vízzel és DPBS-sel centrifugálás alkalmazásával mostuk, kis oszlopba töltöttük, 3 M kálium-tiocianát oldattal és 0,1 M glicin-HCl oldattal (pH = 2,5) mostuk, DPBS-sel ekvilibráltuk és elraktároztuk.

Az anti-RTl-1 antitest-oszlop, anti-RTl-2 antitest-oszlop, anti-RT2-l antitest-oszlop, anti-RT2-2 antitest-oszlop, és anti-RT-1-2 + 2-1 kevert antitest-oszlop anti-TPO peptid antitest géljében a megfelelő IgG frakciók kapcsolási hatásfoka sorban 97,4 %, 95,4 %, 98,4 %, 98,3 %, illetve

99,4 % volt. A kapcsolt IgG frakciók géltérfogatra vonatkoztatott mennyisége az előző sorrendben 5,6 mg/ml, 5,8 mg/ml, 5,7 mg/ml, 5,7 mg/ml, illetve 2,9 mg/ml volt. Mivel így bebizonyítottuk, hogy a kapcsolási hatásfok és a kapcsolt mennyiség az antitest eredete és az antigének közötti különbség összefüggésében nem változik jelentősen, a következő, 47. példában bemutatott kísérleteket ezen antitest-oszlopok alkalmazásával végeztük.

251

47. példa

A pHTPl expressziós vektorral transzformált COSl sejtek tenyészetfelülúszójából származó TPO tisztítása anti-TPO antitest-oszlop, majd reverz fázisú oszlopkromatográfia alkalmazásával, és biológiai aktivitásának igazolása

Az alábbi tisztítási minták értékeléséhez in vitro vizsgálatként az M-07e vizsgálati rendszert alkalmaztuk. A 35. példában pHTPl expressziós plazmiddal transzformált COSl sejtekből kapott tenyészetfelülúszóból származó részlegesen tisztított TPO mintákat (a fő TPO frakciótól eltérő frakciók, nevezetesen a Macro-Prep Methyl HIC oszlop FI és F3 frakciója, mely utóbbit a F2 frakció levétele után 20 mM Na-citráttal [pH = 5,8] végzett mosással kaptunk, illetve az SP Sepharose Fást Flow oszlop FI és F3 frakciói) elegyítettük, hogy egy TPO alcsoport (subpool) frakciót készítsünk (5463,79 ml; protein-koncentráció: 0,490 mg/ml; összes proteintartalom: 2676 mg; relatív aktivitás: 12100; összes aktivitás: 32380000), és ez ultrafiltáló készülékkel (Omega Ultraset, névleges molekulatömeg-átengedési határ: 8000 D; a Filtron terméke) bekoncentráltuk, majd a koncentrált frakció oldószerét DPBS-re cseréltük, és a kis térfogatú mintát YM-10 membránnal felszerelt ultrafiltáló készülékkel (Amicon) 0,05 % nátrium-azidőt tartalmazó 120,2 ml DPBS oldattá koncentráltuk. Ezután a 46. példában előállított mind az öt anti-TPO peptid antitest gélt összekevertük és egy antitest-oszlopot (átmérő 1,6 cm;

töltethosszúság: 4,8 cm; a továbbiakban RT1 + 2 kevert

I.

*·«· ·· • « · « · • · · «· ···♦

252 antitest oszlop) készítettünk belőlük. Erre az oszlopra a TPO alcsoport frakciót 0,033 ml/perc átfolyási sebességgel vittük fel. A minta feltöltése után DPBS-sel eluáltunk, s az eluátumokat addig gyűjtöttük, míg a az UV-abszorpció megfelelően alacsony nem lett, és az így összegyűjtött eluátumokat YM-10 membránnal felszerelt ultrafiltáló készülékkel (Amicon) bekoncentráltuk, miáltal az FI átfolyt frakciót kaptuk (82,62 ml; protein-koncentráció: 14,3 mg/ml; összes proteintartalom: 1184 mg; relatív aktivitás: 67500; összes aktivitás: 79900000). Ezután savas eluáló oldattal (0,1 M glicin-HCl, pH = 2,5) az oszlopon adszorbeált F2 frakciót (92,97 ml; protein-koncentráció: 0,12 mg/ml; összes proteintartalom: 11,1 mg; relatív aktivitás: 257100; összes aktivitás: 2860000) eluáltuk. Bár az átfolyt FI frakció tartalmazott még TPO aktivitást, az antitest-oszlopon adszorbeált TPO-t tovább tisztítottuk, mivel a relatív aktivitás kb. 20-szoros emelkedését mutatta. Capcell Pák Cl 300A oszlopon (a Shiseido Cl TYPE:SG300A katalógusszámú terméke; átmérő 4,6 mm; töltetmagasság: 150 mm; 4,6 mm átmérőjű és 35 mm töltetmagasságú előoszloppal csatlakoztattuk) 0,1 %-os TFA-t (A oldószer) és 0,05 % TFA-t tartalmazó 1-propanolt (B oldószer) alkalmazva oszlopkromatográfiát végeztünk, melynek során az antitestoszlopról levett F2 frakciót a B kromatografáló oldószer

1/10 térfogatával elegyítettük, és ezt az elegyet 0,4 ml/perc átfolyási sebességgel felvittük a Capcell Pák Cl 300A oszlopra, melyet előzetesen 20 %-os B oldószerrel ekvilibráltunk. A minta feltöltése után az eluálást 20 %-os ····

- 253 ►· ·· ·· • » · · » • · *» • ♦ · · ·· ··

B oldószerrel 5 percig, majd 20 % és 40 % B oldószer-koncentráció közötti lineáris gradienssel 50 percig végeztük, s az eluátumokat 1 ml-es részletekben (2,5 perc) polipropilén csövekbe gyűjtöttük.

60000-70000 jelenlétét

Az egyes csövekben lévő eluátumok 2 /íl-ét (1/5000 részét) HSA-val elegyítettük és ultrafiltrálással bekoncentráltuk, miáltal a TPO-aktív frakciók M-07e vizsgálattal történő azonosításához 0,25 ml, 0,02 % HSA-t tartalmazó IMDM tenyésztő tápközeg-oldatot kaptunk. A 20-23. csövekben lévő mintákban (28,5 % és 32,5 % közötti propanol-koncentrációtartomány) nagy TPO-aktivitást találtunk. Amikor ezeket a mintákat a 45. példában leírt eljárás szerint Western analízissel vizsgáltuk, olyan TPO jelenlétét igazoltuk, amelynek látszólagos molekulatömege (redukált körülmények között mérve) DPC III molekulatömeg markerek alapján D volt. Kimutattuk olyan egyéb molekulák is, melyek molekulatömege 32000-43000 és

20000-30000 D volt.

48. példa

A pHTPl expressziós vektorral transzformált COS1 sejtek tenyészettelülúszójábó1 származó, a Capcell Pák Cl 300A oszlopon végzett lépésig tisztított TPO biológiai aktivitásának igazolása

A 36. példában Capcell Pák Cl 300A oszlopon tisztított TPOaktív frakciókat (a 20-23. csövekben lévő frakciók; 28,5 % »·»* · „ _Α ⁹1 ·* «· • · · 4 · · · <*····

- 254 centrifugálásos oszlopon (ΝΑΡ-10; a katalógusszámú terméke) és 32,5 % közötti propanol-koncentráció-tartomány) összegyűjtöttük, 0,21 ml glicerinnel elegyítettük, majd párologtatással bekoncentráltuk. A koncentrátumot 0,21 ml 6 M guanidin-hidroklorid oldattal elegyítettük, DPBS-sel 1 ml-re hígítottuk, Sephadex G25 Pharmacia Biotech 17-0854-01 0,01 % HSA-t tartalmazó DPBS oldattal puffercserét végeztünk, majd 0,01 % HSA-t tartalmazó 1,1 ml DPBS oldattal elegyítettük, s így az FA TPO-aktív frakciót kaptuk (2,6 ml). E minta biológiai TPO aktivitásának vizsgálata érdekében in vivő vizsgálatot végeztünk. Az aktív frakciót 5 napon keresztül napi 100 ul dózisban (amely az M-07e vizsgálati rendszer alapján 110000 összes aktivitású) szubkután 8 hetes hím ICR egereknek adtuk be, csoportonként négy állatnak. Kontrollként hasonló módon 100 ul, 0,01 % HSA-t tartalmazó DPBS-t adtunk be.

Közvetlenül a kezelés előtt, illetve az utolsó beadás utáni napon a szemfenékből vért vettünk és mikrosejt-számlálóval (F800; Toa Iyo Denshi) megmértük a vérlemezkeszámot. A TPO-val kezelt csoportban a vérlemezkeszám a kezelés előtti szinthez vizsonyítva átlagosan kb. 1,42-szeresére emelkedett, és 1,23-szor magasabb volt a kontroll csoportban mért vérlemezkeszámnál (a kettő között szignifikáns különbséggel, p < 0,05, Student t-teszt). Ezen eredmények alapján bebizonyítottuk, hogy az emlőssejtekben termelt, fentebb említett humán TPO képes a vérlemezkeszám in vivő növelésére.

255 ··*· ·· * · * · ♦ a « • · · · _β ·· ···· «· »>» 4» » > «

49. példa

A COS1 sejtek pHTPl expressziós vektorral végzett transzfektálásával kapott 33 liter tenyészetfelülűszóból származó és kationcserélő oszlopon részlegesen tisztított nyers TPO frakció biológiai aktivitásiak igazolása (1) Az alábbi tisztított minták értékeléséhez in vitro vizsgálatként az M-07e vizsgálati rendszert alkalmaztuk. A 36. példában leírtakkal megegyező módon COS1 sejteket a pHTPl expressziós vektorral transzfektáltunk, és a tenyészetet 0,22 um-es filteren szűrve 33 liter szérummentes tenyészetfelülúszőt kaptunk. Ezt ultrafiltráló készülékkel (PLGC pellicon Casette, névleges molekulatömeg-átengedési határ: 10000 D; a Millipore terméke) kb. 10-szeresére koncentráltuk és kb. 1 mM végkoncentrációban p-APMSF proteáz-inhibitorral elegyítettük, miáltal 2018 ml térfogatú mintát kaptunk (protein-koncentráció: 3,22 mg/ml; összes proteintartalom: 6502 mg; relatív aktivitás: 66000; összes aktivitás: 429100000). Ezt amintát ultrafiltráló készülék alkalmazásával (Omega Ultraset, névleges molekulatömegátengedési határ: 30000 D; a Filtron terméke) bekoncentráltuk, miáltal egy 30000 D vagy nagyobb molekulatömegű frakciót (térfogat: 1190 ml; proteinkoncentráció: 2,54 mg/ml; összes proteintartalom: 3020 mg;

relatív aktivitás: 82500; összes aktivitás: 249000000), és egy 30000 D vagy kisebb molekulatömegű frakciót kaptunk (térfogat: 2947 ml; protein-koncentráció: 0,471 mg/ml;

összes proteintartalom: 1402 mg; relatív aktivitás: 4500;

256 összes aktivitás: 6310000). A 30000 D vagy kisebb molekulatömegű frakcióban a TPO aktivitás jelenléte annak lehetőségét jelzi, hogy a tenyészetfelülúszó olyan TPO-t tartalmaz, amelynek molekulatömege az expresszió és az állati sejtekből történő szekréció során csökkent. A 30000 D vagy nagyobb molekulatömegű frakciót 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 6,1) puffercserének vetettük alá, és 5 ml/perc átfolyási sebességgel SP Sepharose Fást Flow oszlopra (átmérő: 2,6 cm; töltetmagasság: 29 cm; a Pharmacia Biotech 17-0729-01 katalógusszámú terméke) töltöttük, melyet előzetesen 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH - 6,1) ekvilibráltunk. A minta feltöltése után az oszlopot 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 6,1) mostuk és ekvilibráltuk.

Az eluáláshoz A kromatografáló oldószerként 20 mM nátriumcitrát puffért (pH = 6,1), B kromatografáló oldószerként pedig az A oldószerből és 1 M NaCl-ból álló oldatot alkalmaztunk. Az eluálást 3 ml/perc átfolyási sebességgel 215 percig 0 % és 50 % B oldószer-koncentráció közötti lineáris gradienssel, majd 20 percig 50 % és 100 % B oldószer-koncentráció közötti lineáris gradienssel végeztük, és az eluátumokat 30 ml-es (10 perc) adagokban polipropilén csövekbe gyűjtöttük. Az összegyűjtött frakciók mindegyikének egy-egy részletét M-07e vizsgálati rendszerrel az aktivitás eloszlására vizsgáltuk, s a TPO aktivitás eluálódását széles tartományban észleltük. Következésképpen, az 50 mM vagy kisebb NaCl-koncentrációval eluált frakciókat, beleértve az átfolyt frakciót is, Fi frakcióként, az 50 mM és 1000 mM NaCl-koncentráció között eluálódott fő TPO frakciókat pedig • · · ·

- 257 F2 frakcióként gyűjtöttük össze. Az FI frakció térfogata 1951 ml (protein-koncentráció: 2,05 mg/ml; összes proteintartalom: 3994 mg; relatív aktivitás: 13500; összes aktivitás: 53900000), az F2 frakció térfogata pedig 649,8 ml volt (protein-koncentráció: 1,11 mg/ml; összes proteintartalom: 721 mg; relatív aktivitás: 268000; összes aktivitás: 193000000).

(2) Az SP Sepharose Fást Flow F2 frakció biológiai aktivitásának igazolása

Az előző lépésben elkülönített SP Sepharose Fást Flow F2 frakció 2,5 ml-es részét Sephadex G25 oszlopon (NAP-10; a Pharmacia Biotech 17-0854-01 katalógusszámú terméke) 0,01 % HSA-t tartalmazó 3,5 ml DPBS oldattal puffercserének vettettük alá, és e minta (1,46 mg/ml protein-koncentráció) biológiai TPO aktivitását in vivő vizsgálatban értékeltük. Eszerint az aktív frakciót 5 egymás utáni napon keresztül napi 100 μΐ dózisban (amely az M-07e vizsgálati rendszer alapján 123000 összes aktivitású) szubkután 8 hetes hím ICR egereknek adtuk be, csoportonként négy állatnak. Kontrollként hasonló módon 100 pl, 0,01 % HSA-t tartalmazó DPBS-t adtunk be. Közvetlenül a kezelés előtt, illetve az utolsó beadás utáni napon a szemfenékből vért vettünk és mikrosejt-számlálóval (F800; Toa Iyo Denshi) megmértük a vérlemezkeszámot. A TPO-val kezelt csoportban a vérlemezkeszám a kezelés előtti szinthez vizsonyítva átlagosan kb. 1,29-szeresére emelkedett, és 1,12-szer • · · · · · • · · · ··

258 magasabb volt a kontroll csoportban mért vérlemezkeszámnál (a kettő között szignifikáns különbséggel, p < 0,05, Student t-teszt). Ezen eredmények alapján bebizonyosodott, hogy az emlőssejtekben termelt, fentebb említett humán TPO képes a vérlemezkeszám in vivő növelésére.

50. példa pDEF202-ghTPO rekombináns vektor készítése a humán TPO kromoszomális DNS CHO sejtekben való expresszálásához

A pDEF202 vektort KpnI és Spel restrikciós enzimekkel emésztettük, majd agarózgélen elektroforizáltuk, hogy egér DHFR minigént és SV40 poliadenilációs jelet tartalmazó fragmenst izoláljunk. A pDEF202-ghTP0 expressziós vektort a kapott fragmenst T4 DNS-ligáz (Takara Shuzo) alkalmazásával egy vektor DNS-hez ligáivá kaptuk, mely vektor DNS-t úgy állítottuk elő, hogy a pEFHGTE plazmidból KpnI és Spel restrikciós enzimekkel eltávolítottunk egy SV40 poliadenilációs jelet tartalmazó régiót. A kapott plazmid a humán TPO gén transzkripciójához SV40 replikációs kezdőhelyet, humán elongációs faktor 1-alfa promotert, SV40 korai poliadenilációs jelet, valamint egér DHFR minigént, pUC18 replikációs kezdőhelyet és β-laktamáz gént (Amp^r) tartalmaz, és a humán elongációs faktor 1-alfa promoter downstream oldalához humán TPO-kromoszomális DNS kapcsolódik.

• · • ·

- 259 51. példa

A humán TPO kromoszómái is DNS expresszálása CHO sejtekben tartalmazó (timidinnel

CHO sejteket (dhfr^- törzs; Urlaub és Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 22, 4216, 1980) 10 % magzati borjúszérumot alfa-minimális esszenciális tápközegben és hipoxantinnal kiegészített alfa-MEM(-)) cm átmérőjű csészében (Falcon) tenyésztettünk, s a képződött sejteket kalcium-foszfát eljárással (CellPhect, Pharmacia) transzfektáltuk.

tartalmazó timidinnel

Az 50. példában előállított pDEF202-ghTP0 plazmid 10 pg-ját 120 pl A pufferrel és 120 pl vízzel elegyítettük, s a kapott elegyet szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. Ezt az oldatot 120 pl B pufferrel elegyítettük, és szobahőmérsékleten további 30 percig inkubáltuk. Az így elkészített DNS-oldatot a csészébe tettük és CO2 ikubátorban óra hosszat tenyésztettük. A tápközeg eltávolítása és a lemez alfa-MEM(-) tápközeggel végzett kétszeri mosása után 10 % dimetil-szulfoxidot tartalmazó alfa-MEM(-) tápközeget adtunk a csészhez, és szobahőmérsékleten 2 percig kezeltük. A lemezhez ezután 10 % dializált magzati borjúszérumot nem szelektáló tápközeget (hipoxantinnal és kiegészített alfa-MEM(-) [ld. az idézett forrást]) adtunk, 2 napig tenyésztettük, majd a sejteket 10 % dializált magzati borjúszérumot tartalmazó szelektáló tápközeg (hipoxantin és . timidin nélküli alfa-MEM(-)) alkalmazásával szelektáltuk, melynek során a sejteket • · • ·

- 260 tripszinnel kezeltük, az egy 6 cm átmérőjű csészében kezelt sejteket 5 darab 10 cm átmérőjű csészébe vagy 20 darab 24 üregű lemezre osztottuk szét, és a szelekciós tápközeget kétnaponta cserélve tovább folytattuk a tenyésztést. A humán TPO aktivitás jelenlétét azon csészék vagy üregek tenyészetfelülúszójában igazoltuk, melyekben a humán TPO aktivitást a Ba/F3 vizsgálattal mérve sejtproliferációt figyeltünk meg.

Ebben az esetben a CHO sejteket pEFHGTE és pMGl plazmidokkal végzett együttes transzfektálással is transzfektálhatjuk.

52. példa

Humán TPO protein (1-163. aminosavak; a továbbiakban hMKT(1-163)), melyhez a -1 helyen lizint (Lys), a -2 helyen pedig metionint (Met) kapcsoltunk, E. coli-ban történő expressziójához alkalmazható vektor előállítása és expresszálódásának igazolása

Azon protein expressziójának elvégzése érdekében, melynek 1.

és 3. aminosav-gyöke megegyezik a humán TPO protein (1-163. aminosavak) 1. és 3. gyökével, a hMKT(1-163) E. coli-ban történő expressziójában való alkalmazáshoz a 42. példában leírt módon pCFM536/hMKT(1-163) vektort (melyet [Met^-2, Lys^-1]TP0(1-163) néven is említünk) készítettünk, melynek során az alábbi 1-13, 2-13, 3-3 és 4-3 szintetikus oligonukleotidokat alkalmaztuk:

- 261 1- 13: 5'-CTAGAAAAAACCAAGGAAGGTAATAAATAATGAAATCTCCTGCACCA-3' (125. sz. szekv.);

2- 13: 5'-CAGGTGGTGCAGGAGATTTCATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT-3' (126. sz. szekv.);

3- 3: 5'-CCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAACTGCTGCG-3' (127. sz. szekv.);

4- 3: 5'-CGCAGCAGTTTAGACAGGACCCGTAAATCACATG-3' (128. sz. szekv.);

1-13 20 30

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT

TTTTTT GGTTCCTCCA TTATTTATTA

Xhal 2-13

60

GCACCACCTG CATGTGATTT

CGTGGTGGAC GTACACTAAA

Ez az expressziós plazmid a szekvenciájában bemutatott DNS hMKT(1-163) expresszióját ezek módon indukáltuk.

GAAATCTCCT

CTTTAGAGGA

3-3 70 80

ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG

TGCCCAGGAC AGATTTGACG ACGC

4=3 (129. sz. szekv.) szekvencialista 12. számú •szekvenciát tartalmazza. A után a 43. példában leírt

Az így kapott expresszált proteint SDS-PAGE analízissel vizsgálva, PVDF membránra másolva, majd N-terminális aminosav-szekvencia analízissel vizsgálva igazoltuk, hogy ez a protein az expresszálni kívánt hMKT(1-163) aminosav-

262 szekvenciáját tartalmazza.

53. példa

Az E. coli-tan expresszált humán TPO-ból származó humán h6T(1-163) TPO visszaredőzése guanidin-hidroklorid és glutation alkalmazásával, valamint tisztítása és biológiai aktivitásának igazolása

A 43. példában előállított h6T(l-163)-termelő rekombináns törzs fagyasztott sejtjeinek 1,2 g-ját 3 ml vízben szuszpendáltuk, s nagy nyomású dezintegráló készülék alkalmazásával feltártuk. A szuszpenziót centrifugálva kinyertük az üledék frakciót, és a szennyezett proteineket, sejtalkotókat és egyebeket eltávolítottuk. Ezután a h6T(l-163)-at tartalmazó üledék frakciót 4 ml vízben szuszpendáltuk, s ehhez keverés közben 1 ml 1 M Tris (pH = 8,5) puffért, majd 20 ml 8 M guanidin-hidrokloridot adtunk, s az elegyet az összetevők feloldása érdekében 5 percig szobahőmérsékleten kevertük. A kapott oldatot 20 mM Tris pufferrel (pH = 8,5) 10-szeresére hígítottuk, s a hígított oldatban keverés közben 5 mM redukált típusú glutationt és

0,5 mM oxidált típusú glutationt oldottunk, s az így kapott oldatot 4 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk. Centrifugálással a h6T(1-163)-at a felülúszóban nyertük ki. Az így kapott felülúszó 160 ml-ét YM10 ultrafiltráló membránnal (Amicon) bekoncentráltuk és DPBS-sel puffercserének vetettük alá, miáltal 3,4 ml, 2,18 mg/ml protein-koncentrációjú frakciót kaptunk. Ezt a frakciót IMDM tenyésztő tápközeggel szemben ···· ·· ·· ·«· ····· • · · · · · · ·· «··· ·· · · · ·

- 263 alaposan dializáltuk és CFU-MK vizsgálati rendszerrel értékeltük, miáltal nagy TPO aktivitást találtunk (relatív aktivitás: 58000).

A fentiek szerint előállított TPO-aktív frakciót ín vivő vizsgálatban használtuk. Eszerint, az aktív frakciót 5 egymást követő napon keresztül napi 170 pl dózisban (amely az M-07e vizsgálati rendszer alapján 22000 összes aktivitású) szubkután 7 hetes hím ICR egereknek adtuk be, csoportonként négy állatnak. .Kontrollként hasonló módon hat állatnak szubkután 170 pl DPBS-t adtunk be. Közvetlenül a kezelés előtt, illetve az utolsó beadás utáni napon a szemfenékből vért vettünk és mikrosejt-számlálóval (F800;

Toa Iyo Denshi) megmértük a vérlemezkeszámot. A TPO-val kezelt csoportban a vérlemezkeszám a kezelés befejezése utáni napon a kezelés előtti szinthez vizsonyítva átlagosan kb. 2,15-szeresére emelkedett, és a kezelés befejezése után három napig változatlan maradt (2,13-szoros értékkel). A kezelés befejezése utáni napon és három nappal később a vérlemezkeszám a TPO-val kezelt csoportban 1,73-szor, illetve 1,80-szor nagyobb volt, mint a kontroll csoportban (a kettő között szignifikáns különbséggel, p < 0,001,

Student t-teszt). Ezen eredmények azt bizonyítják, hogy az E. coli által termelt és a fenti eljárás szerint előállított humán TPO képes a vérlemezkeszám in vivő növelésére.

- 264

54. példa

Az E. colϊ-ban expresszált h6T(1-163) humán TPO visszaredőzése N-lauroil-szarkozinát és réz-szulfát alkalmazásával, tisztítása és biológiai aktivitásának igazolása

A 43. példában előállított h6T(1-163)-termelő rekombináns törzs fagyasztott sejtjeinek 0,6 g-ját 3 ml vízben szuszpendáltuk, s nagynyomású dezintegráló készülék alkalmazásával feltártuk. A szuszpenziót centrifugálva kinyertük az üledék frakciót, majd miután ezt 3,1 ml vízben szuszpendáltuk, keverés közben 0,19 ml 1 M Tris puffért (pH = 9,2), 11,25 μΐ 1M DTT-t, 38 ul 0,5 M EDTA-t és 0,38 ml 10 %-os nátrium-dezoxikolát oldatot adtunk hozzá, és a kapott elegyet szobahőmérsékleten 40 percig kevertük. Az elegyet az üledék frakció kinyerése és a szennyezett proteinek, sejtalkotók, stb. többségének eltávolítása érdekében centrifugáltuk. A kapott üledéket 4 ml vízben szuszpendáltuk és a h6T(1-163)-ot tartalmazó üledék frakció kinyerése érdekében centrifugáltuk. Áz így kinyert üledék frakciót 3,8 ml vízben szuszpendáltuk, s ehhez keverés közben 0,2 ml 1 M Tris (pH = 8) puffért és 1 ml 10 % nátrium-N-lauroilszarkozinátot adtunk, s az elegyet az összetevők feloldása érdekében szobahőmérsékleten 20 percig kevertük. A kapott oldatot 5 pl 1 %-os réz-szulfát oldattal elegyítettük és szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül (kb. 20 óra hosszat) kevertük. A kapott oldatot a h6T(1-163)-ot tartalmazó felülúszó frakció kinyerése érdekében »· ·· ···· ·· • * · · · · · » · · · · ·

- 265 centrifugáltuk, és a felülúszó 5 ml-ét 5 ml vízzel és 10 ml 20 mM Tris pufferrel (pH = 7,7), majd 2,6 g 20-50 szemcseméretű Dowex l-x4 klorid-alakú ioncserélő gyantával elegyítettük, és 90 percig kevertük. Az ioncserélő gyantát üvegszálas filter alkalmazásával eltávolítottuk, hogy kinyerjük a gyantán nem adszorbeálódott frakciót, melyet centrifugáltunk, s kinyertük a felülúszó frakciót. A felülúszót SP Sepharose Fást Flow kationcserélő oszlopra vittük, melyet előzetesen 20 mM Tris pufferrel (pH = 7,7) ekvilibráltunk, majd ugyanezen pufferrel 0-500 mM NaClkoncentráció közötti lineáris gradienssel eluáltuk. Miután az SP Sepharose Fást Flow kationcserélő oszlopról eluált valamennyi frakciót IMDM tenyésztő tápközeggel szemben alaposan dializáltuk, a TPO aktivitást patkány CFU-MK vizsgálati rendszerrel értékeltük, a kb. 100 mM NaClkoncentrációnál eluált frakcióban nagy TPO aktivitást észleltünk (relatív aktivitás: 19000000). Ezt a frakciót Ultra Free CL ultrafiltráló készülék (a Millipore UFC4LCC25 katalógusszámú terméke; névleges molekulatömeg-átengedési határ: 5000 D) alkalmazásával 1,6-szorosára koncentráltuk (2,5 ml; protein-koncentráció: 25 pg/ml). A koncentrált frakciót redukálószer jelenlétében SDS-PAGE analízissel vizsgálva fő sávként egy TPO-nak megfelelő sávot mutattunk ki (70-80 %-os tisztaság).

A fenti eljárással készített TPO-aktív frakciót in vivő vizsgáltuk. Eszerint, az aktív frakciót 5 egymás utáni napon keresztül napi 100 pl dózisban (amely az M-07e vizsgálati

266 rendszer alapján 47500 összes aktivitású) szübkután 8 hetes hím ICR egereknek adtuk be, csoportonként négy állatnak. Kontrollként hasonló módon, szubkután 100 pl, 100 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM Tris puffért (pH = 7,7) ádtunk be.

Közvetlenül a kezelés előtt, illetve az utolsó beadás utáni napon a szemfenékből vért vettünk és mikrosejt-számlálóval (F800; Toa Iyo Denshi) megmértük a vérlemezkeszámot. A TPOval kezelt csoportban a vérlemezkeszám a kezelés befejezése után a kezelés előtti szinthez vizsonyítva átlagosan kb. 1,73-szorosára emelkedett, és 1,59-szer magasabb volt a kontroll csoportban mért vérlemezkeszámnál (a kettő között szignifikáns különbséggel, p < 0,01, Student t-teszt). Ezen eredmények alapján bebizonyítottuk, hogy a fenti eljárással

E. coli-bon termelt, humán TPO képes a vérlemezkeszám in vivő növelésére.

55. példa

A CHO sejtek négy mennyiségben végzett tenyésztése

A humán TPO-t termelő CHO sejtvonal (CHO 28-30 sejt; 25 nM MTX-re rezisztens) — melyet a pDEF202-hTP0-Pl humán TPO expressziós plazmid CHO sejtekbe történő transzfektálésával állítottunk elő — nagy mennyiségben történő tenyésztését az alábbiak szerint végeztük. A CHO sejtvonalat 25 mM MTX-et és 10 % FCS-t tartalmazó DMEM/F-12 tenyésztő tápközegben tenyésztettük és szaporítottuk. Miután a sejteket tripszin-oldattal elkülönítettük, az előzővel megegyező 200 ml tápközeget tartalmazó hengeres palackba 1 x 10⁷ sejtet • ·

- 267 olátottunk, és ezeket 37 ’C-on három napig 1 percenkénti fordulattal görgetve tenyésztettük. A tenyésztés után a tenyészetfelülúszőt leszívással eltávolítottuk és a tapadó CHO sejteket 100 ml PBS-sel öblítettük. A palackba ezután 200 ml DMEM/F-12 tápközeget öntöttünk, mely sem 25 mM MTXet, sem 10 % FCS-t nem tartalmazott., és a sejteket 37 ’C-on 7 napig 1 percenkénti fordulattal görgetve tenyésztettük. A hétnapos tenyésztés után a tenyészetfelülúszőt kinyertük, és a következő tisztítási eljárás kiindulási anyagául használtuk. A fenti eljárást 500 hengeres palackban végeztük, miáltal 100 liter tenyészetfelülúszőt kaptunk.

56. példa

A humán TPO-termelő CHO sejtvonalból származó humán TPO tisztítása (1) Az 55. példában kapott körülbelül 100 liter szérummentes tenyészetfelülúszőt 0,22 pm-es filteren szűrtük, s a kapott szűrletet PLTK Pellicon cassette ultrafiltráló készüléken (a Millipore terméke; névleges molekulatömeg-átengedési határ: 30000 D) bekoncentráltuk. Miután a koncentrátum oldószerét tiszta vízre cseréltük, a vizes oldathoz 1 mM végkoncentrációban p-APMSF (Wako Pure Chemicals) és 0,35 mM végkoncentrációban Pefabloc SC (Merck) proteinázinhibitorokat adtunk, miáltal 30000 D vagy nagyobb molekulatömegű frakciót kaptunk (3628 ml; proteinkoncentráció: 1,60 mg/ml; összes proteintartalom: 5805 mg;

relatív aktivitás: 1230000; összes aktivitás: 7149000000). A • » · ·

- 268 frakciót a 45. példában leírt módon Western biot analízisnek vetettük alá. A TPO protein jelenlétét 66000 és 100000 D közötti molekulatömeg-tartományban mutattuk ki. Részletesebb vizsgálattal azt találtuk, hogy az átfolyt frakcióban a fenti TPO-nál alacsonyabb molekulatömegű TPO fajták voltak jelen.

A 30000 D-nál nem nagyobb molekulatömegű TPO-t tartalmazó ultrafiltrátumot PLTK Pellicon cassette ultrafiltráló készülék (a Millipore terméke; névleges molekulatömegátengedési határ: 10000 D) alkalmazásával bekoncentráltuk, miáltal 1901 ml kis molekulatömegű TPO frakciót kaptunk (protein-koncentráció: 0,36 mg/ml; összes proteintartalom:

684 mg; relatív aktivitás: 245500; összes aktivitás: 167 900 000). Ez azt mutatja, hogy a kis molekulatömegű TPO fajták a sejttenyésztés alatt képződtek.

Ezután a 30000 D vagy nagyobb molekulatömegű TPO-t tartalmazó 3641 ml térfogatú frakcióhoz 764 m ammónium-szulfátot és 144,5 ml 0,5 M nátrium-citrát (pH = 5,5) puffért adtunk, miáltal 1,41 M végkoncentrációban ammónium-szulfátot és 17,7 mM végkoncentrációban nátriumcitrát puffért tartalmazó 4089 ml oldatot kaptunk. Miután az oldhatatlan anyagokat centrifugálással eltávolítottuk, tiszta oldatot kaptunk.

A tiszta oldatot 25 ml/perc átfolyási sebességgel Macro-Prep Methyl HIC oszlopra (Bio-Rad, katalógusszám: 156-0080;

·«·· ·· ···· ·· ·· ·« · · · ·· · • · * · · · · ♦· ···· · · ·· ··

269 átmérő: 5 cm; töltetmagasság: 24,5 cm) vittük, melyet előzetesen 1,2 M ammónium-szulfátot tartalmazó 20 mM nátrium-cifrát (pH - 5,5) pufferrel ekvilibráltunk. Az oldat feltöltése után az eluálást 1,2 M ammónium-szulfátot tartalmazó 20 mM nátrium-citrát (pH = 5,5) pufferrel végeztük. Az eluált frakciót Omega Ultrasette ultrafiltráló készülékkel (Filtron; névleges molekulatömeg-átengedési határ: 8000 D) bekoncentráltuk, miáltal az FI átfolyt frakciót kaptuk (4455 ml; protein-koncentráció: 0,400 mg/ml; összes proteintartalom: 1780 mg; relatív aktivitás: 1831000).

Ezután eluáló pufferként 20 mM nátrium-citrát (pH - 5,5) puffért engedtünk át az olszopon, s az így kapott eluáltumot szintén Omega Ultrasette ultrafiltráló készülékkel (Filtron; névleges molekulatömeg-átengedési határ: 8000 D) bekoncentráltuk, miáltal az F2 frakciót kaptuk (1457 ml; protein-koncentráció: 0,969 mg/ml; összes proteintartalom:

1411 mg; relatív aktivitás: 1715000). Az F2 frakcióban 66000 D és 100000 D közötti molekulatömegű protein jelenlétét igazoltuk. Western biot analízissel kimutattuk, hogy ez a protein TPO volt.

A Macro-Prep Methyl HIC oszlopról eluált F2 frakciót (1443 ml) 15 ml/perc átfolyási sebességgel SP Sepharose Fást Flow kationcserélő oszlopra (Pharmacia Biotech, katalógusszám: 17-0729-01; átmérő: 5 cm; töltethosszúság: 12 cm) vittük, melyet előzetesen 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 6,0) ···· ·· ····

- 270 ekvilibráltunk. A minta felvitele után az eluálást 50 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 6,0) végeztük. Az eluátumot összegyűjtve FI frakciót kaptunk (3007 ml; protein-koncentráció: 0,226 mg/ml; összes proteintartalom: 679 mg; relatív aktivitás: 88830). Ezek után az eluáló puffért 750 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM nátrium-citrát pufferrel (pH = 5,4) helyettesítettük, s ezzel az F2 frakciót eluáltuk (931 ml; protein-koncentráció: 0,763 mg/ml; összes proteintartalom: 710 mg; relatív aktivitás; 5558000), melyet ultrafiltráló készülékekkel (Omega Ultrasette, Filtron, névleges molekulatömegátengedési határ: 8000 D; és Amicon, YM 3 membrán) 202 ml-re koncentráltunk.

Ezután a bekoncentrált, TPO-aktivitást tartalmazó F2 frakciót (197 ml) 3 ml/perc átfolyási sebességgel Sepharyl

S-200HR gélfiltrációs oszlopra (a Pharmacia Biotech 17-0584-05 katalógusszámú terméke; átmérő: 7,5 cm; töltetmagasság: 100 cm) vittük. Az 1200-1785. ml, 1785-2010.

ml, 2010-2280. ml és 2280-3000. ml eluátumokat elkülönítve gyűjtöttük össze, miáltal sorrendben az FI frakciót (585 ml; protein-koncentráció: 1,00 mg/ml; összes proteintartalom: 589 mg; relatív aktivitás: 4118000), F2 frakciót (225 ml; protein-koncentráció: 0,263 mg/ml; összes proteintartalom: 59,2 mg; relatív aktivitás: 2509000), F3 frakciót (270 ml; protein-koncentráció: 0,119 mg/ml; összes proteintartalom: 32,1 mg; relatív aktivitás: 2535000), illetve F4 frakciót (720 ml; protein-koncentráció: 0,0467 mg/ml; összes • ·

- 271 proteintartalom: 33,6 mg; relatív aktivitás: 1155000) kaptuk. A frakcionált TPO aktivitás a gélfiltrálással meghatározottak szerint széles molekulatömeg-tartományú volt. Miután a frakciókat SPS-PAGE és Western biot analízissel vizsgáltuk, azt találtuk, hogy az Fi frakció elsősorban 66000 D és 1000000 D közötti mo lekülatömegü TPO molekula fajtát; az F2 frakció 32000 D és 60000 D közötti molekulatömegű; az F3 frakció pedig 32000 D és 42000 D közötti molekulatömegű TPO molekula fajtát tartalmazott. Valamennyi TPO molekula rendelkezett TPO aktivitással.

A 66000-100000D molekulatömegű TPO molekulát N-terminális aminosav-szekvencia analízisének eredménye alapján bebizonyítottuk, hogy ez a TPO molekula a humán TPO gén által kódolt protein aminosav-szekvenciájával rendelkezik.

A 66000-100000 D molekulatömegű TPO molekulával enzimatikus emésztési kísérleteket végeztünk, melyek során egyesével vagy kombinációban glikozidáz enzimeket használtunk, nevezetesen N-glikanázt (Genzyme, katalógusszám: 1472-00), neuraminidázt (Nakarai-Tesqu, katalógusszám: 242-29SP), endo-alfa-N-acetil-galaktóz-aminidázt (Seikagaku Kogyo, katalógusszám: 100453) és O-glikozidázt (Boehringer-Mannheim Biochemica, katalógusszám: 1347101), majd SDS-PAGE analízist végeztünk. Azt találtuk, hogy a TPO polipeptid részének molekulatömege kb. 36000 D, ami elméleti molekulatömege és annak alapján, hogy a TPO N- és O-kötésű cukorláncokkal rendelkező glikoprotein, várható volt.

• ·

- 272 57. példa

Humán TPO-termelő CHO sejtvonalból származó humán TPO tisztítása (1) A CHO sejtek 55. példában leírt eljárás szerint kapott szérummentes tenyészetfelülúszójának 1 literéhez 211,4 g ammónium-szulfátot adtunk, majd az elegyet 0,2 pm-es filteren (Gelman Science, katalógusszám: 12992) leszűrtük. A szűrletet 15 ml/perc átfolyási sebességgel Macro-Prep Methyl HIC oszlopra (Bio-Rad, katalógusszám: 156-0081; átmérő: 50 mm; töltetmagasság: 90 mm) vittük, melyet előzetesen 1,2 M ammónium-szulfátot tartalmazó 20 mM nátrium-acetát pufferrel (pH = 5,6) ekvilibráltunk. A felvitel után az eluálást 450 ml, 1,2 M ammónium-szulfátot tartalmazó 20 mM nátrium-acetát pufferrel (pH = 5,6) végeztük. Az eluált frakciót 0,75 ml/perc átfolyási sebességgel reverz fázisú Vydac C4 oszlopra (The Separations Group, katalógusszám: 214BTP54; átmérő: 4,6 mm; töltetmagasság: 250 mm) vittük fel. Miután az oszlopot 15 percig 5 % etanolt tartalmazó 10 mM Tris pufferrel (pH - 6,4) (A kromatografáló oldószer) mostuk, és az eluálást az A kromatografáló oldószer és 94 % etanolt tartalmazó 10 mM Tris puffer (pH = 6,4) (*’B kromatografáló oldószer) közötti lineáris gradienssel 66 percig végeztük. A kapott kromatogramot a 15. ábrán mutatjuk be. Az SDS-PAGE analízis eredményeként 65000-100000 D molekulatömegnek megfelelő egyetlen sávot kaptunk, melyet TPO-nak véltünk, s amely a minta felvitele után a 68-72. percnek megfelelő retencióídejű frakciónak felelt meg (ld. 16. ábra). Western '· · • · · ·· • · · · · »

273 biot analízissel kimutattuk, hogy a kapott protein TPO.

A protein minta N-terminális aminosav-analízisével kimutattuk, hogy a protein a humán TPO gén által kódolt protein aminosav-szekvenciájával rendelkezett.

58. példa

Rekombináns vírus előállítása rovarsejten belüli humán TPO expresszióhoz

A 30. példában előállított pHTPl plazmidot EcoRI és NotI restrikciós enzimekkel emésztettük, majd 1 %-os agarózgélen elektroforizáltuk, miáltal 1200 bp-os sávot kaptunk, melyet Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet alkalmazásával tisztítottunk. A tisztított DNS-t az előző restrikciós enzimekkel előkezelt pVL 1393 transzfer vektorhoz (Invitrogen) ligáltuk, s ezt Competent-High DH5 E. coli törzsbe (Toyo Boseki) transzformáltuk. A kapott telepek közül kiválasztottuk a humán TPO cDNS teljes hosszúságú kódoló régióját tartalmazó pVL1393/hTPO kiónt. A kiónból ezután Sambrook és mtsi. eljárásával (Molecular Clonlng, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) plazmid DNS-t készítettünk, azt BaculoGold™ transzfektáló készlet (Farmingen) alkalmazásával Sf 21 rovarsejt-vonalba (Invitrogen) transzfektáltuk, és a transzfektált sejteket a vírust tartalmazó felülúszó kinyerése érdekében 27 ’C-on négy napig Sf-900 tápközegben (Lifetechnology) tenyésztettük. A felülúszót 1:10^θ - l:10⁵-re hígítottuk, és ·*·· ·· ···« ·« «· ·«· ····· • · · · · · · • · · ···· ·

- 274 kb. 7 x 10^e Sf 21 sejtet 27 ’C-on egy óra hosszat 35 mm átmérőjű palacserépben 1 ml hígított felülúszóvel fertőztünk. A felülúszó eltávolítása után a tenyészethez Sf-900 tápközegben 1 %-os forró agarózt adtunk, hagytuk megszilárdulni, majd párás levegőben 27 ’C-on hat napig tenyésztettük. Egy különálló plakkot levettünk, s ebből a vírust 200 ul Sf-900 tápközegben felszabadítottuk. A kapott virális klónnal 24-üregű lemezen Sf 21 sejteket fertőztünk meg, hogy elszaporítsuk a vírust. A vírust tartalmazó folyadék (melyben az egyedülálló plakk volt) egy részét fenol/kloroform eleggyel kezeltük, majd etanolos kicsapást végeztünk, 8 így vírus DNS-t nyertünk ki, melyet templátként alkalmaztunk a humán TPO cDNS-re specifikus primerekkel végzett PCR-hoz. A humán TPO cDNS-t tartalmazó rekombináns vírust a specifikus DNS-fragmens amplifikációja alapján választottuk ki. Ezután a vírus elszaporítása érdekében az Sf 21 sejteket a humán TPO cDNS-t hordozó rekombináns vírust tartalmazó felülúszóval fertőztük.

59. példa

A humán TPO expresszálása Sf 21 rovarsejtekben és a TPO aktivitás azonosítása

Sf 21 sejteket 175 cm²-es tenyésztőlombikban kb. 80 %-os konfluens állapot elérésig tenyésztettünk, majd 27 ’C-on egy óra hosszat az 58. példában előállított, humán TPO cDNS-t hordozó rekombináns vírussal fertőztük. Ezután a fertőzött sejteket 27 ’C-on 4 napig Sf-900 tápközegben tenyésztettük ·

• ··

- 275 és kinyertük a tenyészet felülúszóját. A felülúszót ezután NAP™-5 oszlopon (Pharmacia) IMDM tenyésztő tápközeggel helyettesítettük. A kapott felülúszókban a patkány CFU-MK és az M-07e vizsgálatban egyaránt jelentős dózisfüggő TPO aktivitást mutattunk ki. Az Sf 21 sejtekben expresszált rekombináns humán TPO-t a 45. példában leírtak szerint

Western biot analízissel is azonosítottuk.

60. példa

A pCFM536/h6T(1-163) kiónból származó, humán TPO bázissekvenciával rendelkező h6T(1-163) humán TPO változat nátrium-N-lauroil-szarkozinát és réz-szulfát alkalmazásával végzett visszaredőzése E. coli-ban való expresszálásával

A 43. példában előállított, h6T(1-163)-at termelő fagyasztott rekombináns mikroorganizmus 30 g-ját 300 ml vízben szuszpendáltuk, majd nagynyomású feltáró készülékben (6,93 x 10⁷ Pa; Rannie High Pressure Laboratory) feltártuk. A leülepedett frakciót 90 ml vízben szuszpendáltuk, s ehhez keverés közben 150 ml össztérfogatban vizet adtunk.Ezután az elegyhez keverés közben 9 ml 1 M Tris puffért (pH = 9,2), 540 pl 1 M DTT-t, 1,8 ml 0,5 M EDTA-t és 18 ml 10 %-os nátrium-dezoxikólsavat adtunk, majd szobahőmérsékleten 30 percig kevertük. A leülepedett frakciót centrifugálással kinyertük, és a szennyezett proteinek és mikroorganizmus darabok többségét eltávolítottuk. Az üledékhez 180 ml 5 mM DTT-t adtunk, miáltal szuszpenziót kaptunk, melyet a h6T(1-163)-at tartalmazó üledék frakció kinyerése érdekében ···· ·« ·»·· ·

- 276 elegyhez 750 ul szobahőmérsékleten hosszat) kevertük.

centrifugáltunk. A kapott üledékhez 300 ml vizet adva szuszpenziót készítettünk, melyhez keverés közben 570 ml folyadékmennyiségig vizet adtunk. Az elegyhez szobahőmérsékleten 30 ml 1 M Tris puffért (pH = 8) és 150 ml 10 %-os nátrium-N-lauroil-szarkozinátot adtunk, és a h6T(1-163) feloldása érdekében 20 percig kevertük. Ehhez az %-os réz-szulfátot adtunk és egy éjszakán keresztül (kb. 20 óra

Miután a h6T(1-163)-at tartalmazó felülúszó frakciót centrifugálással kinyertük, a 750 ml felülúszóhoz 750 ml vizet és 1500 ml 20 mM Tris puffért (pH = 7,7), majd keverés közben 3 ml poliszorbát 80-at (Nippon Chemicals) adtunk. A kapott oldathoz 600 g Dowex 1-X4 ioncserélő gyantát (20-50 szemcseméret, klorid alak) adtunk, majd szobahőmérsékleten 90 percig kevertük. Miután a nem adszorbeált frakciót üveszálas filteren kinyertük, az ioncserélő gyantát 750 ml 20 mM Tris pufferrel (pH = 7,7) mostuk. A nem adszorbeált frakció és a mosófrakció elegyítésével kapott oldatot 2N nátrium-hidroxid oldattal 9,2 pH-ra állítottuk be, majd 0,1 % poliszorbát 80-at tartalmazó 20 mM Tris pufferrel (pH = 9,2) ekvilibrált Q Sepharose Fást Flow anionocserélő oszlopra (ID 5 x 10 cm) vittük fel, hogy kinyerjük a nem adszorbeált frakciót. A kapott nem adszorbeált frakció pH-ját sósavval 7,2-re állítottuk be, majd 0,1 % poliszorbát 80-at tartalmazó 20 mM

Tris pufferrel (pH = 7,2) ekvilibrált SP Sepharose Fást Flow kationcserélő oszlopra vittük, és ugyanezen pufferben 0 M és 500 M NaCl-koncentráció közötti lineáris gradienssel

- 277 »·»· ·« ·*·· * • · * 4 Μ eluáltuk. Az eluált frakciókat SDS-PAGE analízissel vizsgáltuk, s a kapott TPO frakcióhoz 0,1 % koncentrációban trifluor-ecetsavat adtunk. Az oldatot Capcell Pák 5 μκι 300A Cl oszlopra (ID 2,1 cm x 5 cm x 2; Shiseido) vittük, 0,1 %-os trifluor-ecetsavban növekvő 1-propanol koncentrációval (lineáris gradienssel) eluálva reverz fázisú HPLC-t végeztünk. Az eluátumot redukálószer nélkül SDS-PAGE analízissel vizsgáltuk. A reverz fázisú HPLC-n mutatott elúciós elhelyezkedés alapján három frakciót frakcionáltunk, melyek mindegyikét 0,1 % trif luor-ecetsawal háromszorosára hígítottuk. A hígított frakciókat hasonló módon az előző reverz fázisú HPLC oszlopra vittük. A kapott három TPO frakciót (melyeket a reverz fázisú HPLC oszlopon mutatott elúciós sorrendjük alapján Fr. S-a, Fr. S-b és Fr. S-c jelzéssel azonosítottunk, ld. 17. ábra) redukálószer nélkül SDS-PAGE analízissel vizsgáltuk. A vizsgálat eredményeként kb. 18 kD-nál (Fr. S-a), kb. 19 kD-nál (Fr. S-b), illetve 18 kD-nál (Fr. S-c) különálló sávot detektáltunk (ld. 18.

ábra). Aminosav-analízisük után valamennyi meghatározott aminosav-összetétel majdnem megegyezett a szekvencia alapján becsült elméleti értékkel. Az N-terminális aminosav-analízis eredményei azt mutatták, hogy ezek a várt szekvenciák. Az egyes frakciók aminosav-analízissel meghatározott proteintartalma 0,64 mg (Fr. S-l), 1,81 mg (Fr. S-b), illetve 3,49 mg (Fr. S-c) volt. Az egyes frakciók IMDM teljes dializálása után M-07e Az egyes frakciókban a relatív TPO tápközeggel szembeni vizsgálatot végeztünk.

aktivitás kb. 1620000 (Fr. S-a), 23500000 (Fr. S-b), illetve

- 278 -

746000000 (Fr. S-c) volt.

61. példa

A pCFM536/h6T klónból származó, humán TPO bázissekvenciával rendelkező h6T(1-163) humán TPO változat guanidinhidroklorid és cisztein-cisztin alkalmazásával végzett visszaredőzése E. coli-ban való expresszálásával, és a h6T(1-163) tisztítása

A 43. példában előállított, h6T(l-163)-at termelő fagyasztott rekombináns mikroorganizmus 50 g-ját 500 ml vízben szuszpendáltuk, majd nagynyomású feltáró készülékben (6,93 x 10⁷ Pa; Rannie High Pressure Laboratory) feltártuk, és centrifugálás után kinyertük a leülepedett frakciót. A leülepedett frakciót vízben szuszpendáltuk, s folyadékmennyiségét víz hozzáadásával keverés közben 250 mire állítottuk be. Ezután az elegyhez keverés közben 15 ml 1 M Tris puffért (pH = 9,2), 900 jul 1 M DTT-t, 3 ml 0,5 M

EDTA-t és 30 ml 10 %-os nátrium-dezoxikólsavat adtunk, majd szobahőmérsékleten 30 percig kevertük. A leülepedett frakciót centrifugálással kinyertük, és a szennyezett proteinek és mikroorganizmus darabok, stb. többségét eltávolítottuk. Az üledékhez 300 ml 5 mM DTT-t adtunk, miáltal szuszpenziót kaptunk, melyből a h6T(l-163)-at tartalmazó üledék frakció centrifugálással nyertük ki. A h6T(1-163)-at tartalmazó, kinyert üledék frakciót 104 ml össztérfoatban vízben szuszpendáltuk, s ehhez keverés közben 20 ml 1M Tris puffért (pH = 8,5), majd 376 ml 8M guanidin279 ·*·· «V ··*» *· *» • » fc ·«·»» • · · · · ·· ··« · « * · · ·· ···· ·· ·> »· hidrokloridot adtunk, s a h6T(1-163) feloldása érdekében szobahőmérsékleten 10 percig kevertük. Ehhez az elegyhez keverés közben 0,1 % poliszorbát 80-at tartalmazó 2500 ml 20 mM Tris puffért (pH = 8,5), majd 1 M guanidin-hidrokloridot tartalmazó 200 ml 20 mM Tris puffért (pH = 8,5) adtunk, s végül 5 mM ciszteint és 0,5 mM cisztint adtunk hozzá. Az így kapott oldatot egy éjszakán keresztül 4 °C-on inkubáltuk, majd centrifugáltuk, miáltal a h6T(l-163)-at a felülúszóban nyertük ki, amit Prep Scale UF cartridge PLDC ultrafiltráló membrán (Millipore) alkalmazásával bekoncentráltunk. A koncentrátum pufferét 0,1 % poliszorbát 80-at tartalmazó 20 mM Tris pufferrel (pH = 9,2) helyettesítyettük, míg a végtérfogat el nem érte az 1000 ml-t. A kapott oldatot 0,1 % poliszorbát 80-at tartalmazó 20 mM Tris pufferrel (pH = 9,2) ekvilibrált Q Sepharose Fást Flow anionocserélő oszlopra (ID x 10 cm) vittük fel, majd a fenti pufferben 0 M és 500 M NaCl-koncentráció közötti lineáris gradienssel eluáltuk, s kb. 20 mM és kb. 150 mM közötti NaCl-koncentrációnál eluált frakciót (240 ml) nyertünk ki. A kapott frakciót 20 mM Tris pufferrel (pH = 7,2) négyszeresére (960 ml össztérfogatra) hígítottuk, majd a pH-t ecetsavval 7,2-re állítottuk be. Ezt az oldatot 0,1 % poliszorbát 80-at tartalmazó 20 mM Tris pufferrel (pH = 7,2) ekvilibrált SP Sepharose Fást Flow kationcserélő oszlopra (ID 5 cm x 10 cm) vittük fel majd a fenti pufferben 0 M és 500 M NaCl-koncentráció közötti lineáris gradienssel eluáltuk, majd a fenti pufferben 0 M és 500 M NaCl-koncentráció közötti lineáris gradienssel eluáltuk, s az eluátumot a TPO frakció izolálása érdekében • · ·

- 280 SDS-PAGE analízissel vizsgáltuk. A TPO frakcióhoz 0,1 % végkoncentrációban trifluor-ecetsavat adtunk. A kapott oldatot Capcell Pák 5 um 300A Cl oszlopra vittük (ID 2,1 cm x 5 xm x 2; Shiseido) és 0,1 %-os trifluor-ecetsavban növekvő 1-propanol koncentrációval (lineáris gradienssel) eluálva reverz fázisú HPLC-t végeztünk. Az eluátumot redukálószer nélkül SDS-PAGE analízissel vizsgáltuk, és a reverz fázisú HPLC-n mutatott elúciós elhelyezkedés alapján két frakcióra osztottuk. A két TPO frakciiót reverz fázisú

HPLC oszlopon mutatott elúciós sorrendjük alapján Fr. G-a és Fr. G-d jelöléssel azonosítottuk (17. ábra). Az egyes frakciókat redukálószer mélkül SDS-PAGE analízissel vizsgáltuk, miáltal egy kb. 18 kD-os (Fr. G-A) és egy kb. 32 kD molekulatömegű sávot (Fr. G-d) mutattunk ki (ld. 18. ábra). A fenti frakciók redukálószer jelenlétében végzett

SDS-PAGE analízisével mindkét frakcióban kb. 20 kD molekulatömegnek megfelelő sávot mutattunk ki. A frakciók aminosav-analízise azt mutatta, hogy aminosav-összetételük majdnem teljesen megegyezett a szekvenciák alapján becsült megfelelő elméleti értékkel. Ezenkívül, az N-terminális aminosav-analízis eredményei azt mutatták, hogy megegyeztek a várt szekvenciákkal. Az egyes frakciók aminosavanalízissel meghatározott proteintartalma 2,56 mg (Fr. G-A), illetve 1,16 mg (Fr. G-d) volt. Az egyes frakciók IMDM tenyésztő tápközeggel szembeni teljes dialízise után M-07e vizsgálatot végeztünk. Az Fr. G-a frakció relatív TPO aktivitása kb. 3960000, az Fr. G-d frakcióé kb. 7760000 volt.

281

62. példa pDEF202-hTP0163 rekombináns vektor előállítása a részleges hosszúságú humán TPO (1-163. amino savak; a továbbiakban hTPO163) CHO sejtekben történő expressziójához

A 31. példában előállított pDEF202 vektort EcoRI és Spel restrikciós enzimekkel kezeltük,, majd agarózgélelektroforézissel egy nagyobb vektor-fragmenst nyertünk ki. Ezt a fragmenst T4 DNS-ligáz (Takara Shuzo) alkalmazásával hTP0163 cDNS-hez ligáltuk (melyet úgy készítettünk, hogy a

-21-163. aminosavakat kódoló hTPO163-at (13. sz. szekv.) tartalmazó pEF18S-hTPO163 plazmidot EcoRI és Spel restrikciós enzimekkel kezeltük), miáltal a pDEF202-hTP0163 expressziós vektort kaptuk. Ez a plazmid SV40 replikációs kezdőhelyet, humán elongációs faktor 1-alfa promotert, SV40 korai poliadenilációs helyet, egér DHFR minigént, a pUC18 replikációs kezdőhelyét és β-laktamáz gént (Amp^r) tartalmaz, s a hTP0163 cDNS a humán elongációs faktor 1-alfa promotertől downstream irányban lévő helyhez kapcsolódik.

63. példa

A hTP0163 expresszálása CHO sejtekben

CHO sejtvonalat (dhfr- törzs; Urlaub és Chasin, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 77. 4216, 1980) 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó alfa-minimális esszenciális tápközegben (timidinnel és hipoxantinnal kiegészített alfa-MEM(-)) 6 cm átmérőjű csészében (Falcon) tenyésztettünk, majd a sejteket

282 pDEF202-hTP0163 plazmiddal a transzfektum eljárással (Seikagaku Kogyo K.K) transzformáltuk.

Azokat a aktivitást

Az 62. példában előállított pDEF202-hTP0163 plazmid 10 ugját 240 ul 0,3 M NaCl oldattal elegyítettük, majd 20 ul transzfektum és 220 ul víz elegyét adtuk hozzá. Ezt a DNSoldatot cseppenként adtuk a csészéhez, és CO2 inkubátorban 6 óra hosszat tenyésztettük. A tápközeget eltávolítottuk a csészéből, melyet kétszer alfa-MEM(-) tápközeggel mostunk, majd 10 % DMSO-t tartalmazó alfa-MEM(-) tápközeget adtunk hozzá és szobahőmérsékleten 2 percig inkubáltuk. A csészéhez ezután 10 % dializált magzati borjúszérumot tartalmazó nem szelektáló tápközeget (alfa-MEM(-) hipoxantinnal és timidinnel) adtunk, két napig tenyésztettük, majd 10 % dializált magzati borjúszérumot tartalmazó szelektáló tápközegben (alfa-MEM(-), hipoxantin és timidin nélkül) szelektálást végeztünk. A szelektálást a sejtek tripszines kezelésével valósítottuk meg, melynek során a fenti 6 cm csészéből a sejteket öt darab 10 cm-es csészébe vagy húsz darab 24-üregü lemezre osztottuk szét, és a tápközeget kétnaponta friss szelektáló tápközegre cserélve folytattuk a tenyésztést. A csészékből vagy az üregekből származó felülúszók TPO aktivitását Ba/F3 vizsgálattal detektáltuk.

sejteket, melyek tenyészet-felülúszójában TPO észleltünk, 25 mM metotrexátot tartalmazó szelekciós tápközeggel 1:15 sejtkoncentrációra való osztás után friss csészékbe vagy üregekbe helyeztük, és a metotrexát-rezisztens sejtek növesztése és klónozása

283 érdekében újratenyésztettük.

A CHO sejtek transzformálása más módon a pEF18S-hTP0163 és a pMGl CHO sejtekbe történő együttes transzfekciójával is megvalósítható.

A pDEF202-hTP0163 plazmiddal transzfektált CHO törzset (CHO-DUKXB11) 1995. január 31-én FERM BP-4989 deponálási számon helyeztük letétbe (National Instltute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japán).

64. példa

A CHO sejtek nagy mennyiségű tenyésztése

A 63. példában a pDEF202-hTP0163 hTP0163-expressziós plazmid CHO sejtekbe történő transzfektálásával kapott hTP0163termelő CHO sejtvonal (a fenti, 10 % dializált magzati borjúszérumot tartalmazó szelekciós tápközegben [hipoxantin és timidin nélküli alfa-MEM^-] végzett szelektálással kapott CHO 109 sejtek) nagy méretekben történő tenyésztését az alábbiak szerint végeztük. A CHO 109 sejteket 10 % FCS-t tartalmazó DMEM/F-12 tápközegben (GIBCO) tenyésztettük. A sejtek tripszin-oldattal végzett betakarítása (vagy tripszines kezelése) után 200 ml fenti tápközeget tartalmazó Falcon hengeres palackba tízmillió sejtet oltottunk, és a palackot 1 percenkénti fordulattal forgatva a sejteket 37

284 °C-on 3 napig tenyésztettük. A tenyésztő tápközeget leszívással eltávolítottuk és a sejttenyészet felszínét 100 ml PBS-sel öblítettük. A sejttenyészethez ezután 200 ml % FCS nélküli DMEM/F-12 tápközeget (GIBCO) adtunk, s a tenyésztést 37 ’C-on 1 percenkénti fordulattal 7 napig folytattuk. Az összegyűjtött tenyészetfelülűszót kiindulási anyagként használtuk a következő tisztítási lépéshez. 300 darab hengeres palackban végeztünk hasonló tenyésztést, miáltal összesen 60 liter szérummentes tenyészetfelülűszót kaptunk.

65. példa

A hTP0163 tisztítása hTPO163-at termelő CHO sejtvonalból (1) A 64. példában kapott 60 liter szérummentes tenyészetfelülúszót 0,22 pm-es filteren szűrtük, és a kapott szűrletet ultrafiltráló készülék (Filtron, moolekulatömegótengedési határ: 10000 D) alkalmazásával 600 ml-re koncentráltuk (protein-koncentráció: 11,2 mg/ml; összes proteintartalom: 6430 mg). A frakció anti-HTl peptid antitest alkalmazásával végzett Western analízisével 20000-26000 látszólagos molekulatömegű expresszált hTPO163 protein jelenlétét mutattuk ki.

A bekoncentrált tenyészetfelülűszót (537 ml) 10 mM nátriumfoszfát pufferrel (pH - 6,8) ekvilibrált Sephadex G-25 Fine oszlopon (Pharmacia-Biotech, katalógusszám: 17-0032-02; átmérő: 10 cm; töltetmagasság: 30 cm) kromatografáltuk, és ···· • ·

- 285 10 mM nátrium-foszfát pufferben (pH = 6,8) oldatként FI protein frakciót kaptunk (938 ml; protein-koncentráció: 4,9 mg/ml; összes proteintartalom: 4594 mg).

Ezt a protein frakciót (929 ml) 15 ml/perc átfolyási sebességgel SP Sepharose Fást Flow oszlopra (PharmaciaBiotech, katalógusszám: 17-0729-01; átmérő: 5 cm; töltetmagasság: 30 cm) töltöttük, melyet előzetesen 10 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH = 6,8) ekvilibráltunk. Az oszlopot 10 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH = 6,8), majd 10 % etanolt tartalmazó 10 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH = 6,8) eluáltuk. Az eluátumokat elegyítve FI frakciót kaptunk (1608 ml; protein-koncentráció: 2,13 mg/ml; összes proteintartalom: 3426 mg). A második eluálást 750 mM NaCl-ot és 25 % etanolt tartalmazó 10 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH = 6,8) végeztük, miáltal a fő hTPO163 F2 eluátum frakciót kaptuk (651 ml; protein-koncentráció: 1,67 mg/ml; összes proteintartalom: 1087 mg).

Az SP Sepharose Fást Flow oszlopról származó, TPO aktivitást tartalmazó F2 frakcióhoz (200 ml) etanolt és tisztított vizet adtunk, s így 300 ml 45 %-os végkoncentrációjú etanol oldatot kaptunk. Az etanol hozzáadásakor keletkezett oldhatatlan anyagot centrifugálással távolítottuk el. A felülúszót 2 ml/perc átfolyási sebességgel SOURCE 15RPC oszlopba (Pharmacia-Biotech, katalógusszám: 17-0727-02; átmérő: 2 cm; töltetmagasság: 20 cm) injektáltuk, melyet előzetesen 50 %-os A oldószer (10 mM nátrium-acetát puffer,

286 ···· ·· ···· · · ·· • · · ·· ·· · * · · · · · · pH = 6,7) + 50 % B oldószer (90 % etanolt tartalmazó 10 mM nátrium-acetát puffer, pH = 6,7) eleggyel ekvilibráltunk. Az oszlopot ezután az adszorbeálatlan anyagok közel teljes eluélásáig 55 % A oldószer + 45 % B oldószer eleggyel mostuk, majd az alábbi elúciós profillal 1,5 ml/perc átfolyási sebességgel végeztük az eluálást: 5 percig 50 %-os B oldószer; 140 percig 50 % és 100 % B-koncentráció közötti lineáris gradiens; majd 35 percig 100 %-os B oldószer. A frakciókat 5 percenként gyűjtöttük (ami 7,5 ml térfogatnak felel meg). A hTPO163 elúciós tartományának vizsgálatához valamennyi frakciót SDS-PAGE és Western biot.analízissel vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy a nagymértékben tisztított hTP0163, melynek látszólagos molekulatömege hozzávetőleg 20000-26000, a 66-87 % etanol-koncentráció tartományban eluálódott. E hTP0163 proteinek közül a nagyobb molekulatömegű hamarabb eluálódott a reverz fázisú oszlopról, ami azt sugallja, hogy a glikozilált hTP0163 molekula hidrofilitása nagyobb.

A SOLJRCE 15PRC oszlopról származó hTP0163 elúciós frakció (azaz a 68 % és 86,5 % etanol-koncentráció közötti tartományban eluálódott hTP0163 frakció [90 ml]) 88,8 ml-éhez CHAPS-t adtunk, az elegyet bekoncentráltuk és mostuk, miáltal 2,5 ml, kb. 5 % etanolt és 4 mM CHAPS-t tartalmazó koncentrátumot kaptunk, amit 1,5 ml/perc átfolyási sebességgel Superdex 75 pg oszlopra (PharmaciaBiotech, katalógusszám: 17-1070-01; átmérő: 2,6 cm; töltetmagasság: 60 cm) vittünk, melyet előzőleg 10 % etanolt • ·

287 tartalmazó 10 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH = 6,8) ekvilibráltunk. A feltöltés utáni 60. perctől minden 4. percben 6 ml-es elúciós frakciókat gyűjtöttünk. A hTPO163 a 16. számú csőben lévő frakciótól legalább a 31. csőben lévő frakcióig eluálódott, amit SDS-PAGE analízissel határoztunk meg. Ez az elúciós tartomány megfelel a standard molekulatömeg-markerek (Bio-Rad elegy, Gél Filtration Standard, katalógusszám: 151-1901; és Calbiochem, inzulin, katalógusszám: 407696) alkalmazásával végzett gélfiltrálással meghatározott kb. 44000-6000 molekulatömegtartománynak. Ráadásul úgy tűnt, hogy ezek a hTP0163 molekulák a csökkenő glikoziláltsági fok sorrendjében eluálódtak. A 16-31. csövekből (a 180. ml-től a 276. ml-ig terjedő elúciós térfogat) származó valamennyi hTPO163 fajtát FA frakcióként gyűjtöttük össze. Az FA frakción kívül az FH (16-18. csövek; 180-198. ml), FM (19-24. csövek; 198-234. ml) és FL frakciót (25-31. csövek; 234-276. ml) gyűjtöttük. Az FA frakciót az FH, FM és FL frakciók részleteinek elegyítésével is elkészítettük. A fenti a 19. ábrán látható.

(2) A következőkben a Superdex 75 pg oszlopról származó, (1) pontban felsorolt Fh, Fm, FI és FA elációs frakciókat jellemezzük be részletesebben. A fentiek szerint kapott hTP0163 fajták N-terminális aminosav-szekvenciáit az 1.

példában leírtak szerint határoztuk meg, de a legtöbb

N-terminális Ser-gyököt nem tudtuk azonosítani. Ez arra az N-terminális Ser-gyökhöz O-kötésű cukor Bebizonyítottuk, hogy az N-terminális utal, hogy kapcsolódik.

288

Yakuhín, alkalmazásával, alkalmazásával szerin-gyököt követő szekvencia megegyezik a hTPO génszekvenciájából leszármaztatható aminosav-szekvenciával. Az FH, FM, FL és FA frakciókban a hTP0163 proteinek aminosav-analízissel meghatározott (AccQ Tag eljárás; Wasters) koncentrációja 10,2 ng/ml, 6,2 ng/ml, 0,84 ng/ml, illetve 3,2 ng/ml volt, feltéve, hogy ezek a koncentrációk a cukorláncot nem tartalmazó peptid-részek koncentrációját jelentik. Ezeket a frakciókat (egyenként 100 ng) nem redukáló körülmények között multigel 15/25 (Dai-ichi Kagaku

15-25 %-os előregyártott poliakril-amid gél) vagy redukáló körülmények között DTT SDS-PAGE analízissel vizsgáltuk, majd ezüstfestést (Daiichi Pure Chemicals) végeztünk. Azt találtuk, hogy valamennyi frakció nagy tisztaságú hTP0163-at tartalmazott. A hTP0163 redukáló körülmények között standardként DPCIII molekulatömeg-marker (Daiichi Pure Chemicals) alapján számított látszólagos molekulatömege az

FH frakcióban 24000-21500 D, az FM frakcióban 23000-21000 D, az FL frakcióban 23000-20500 D, az FA frakcióban pedig

23500-20500 D volt. (ld. 20. ábra). A hTPO biotinnal jelölt SDS-PAGE standard (Bio-Rad, Biotynilated SDS-PAGE Standards, Broad Rangé; katalógusszám: 161-0319) alkalmazásával redukáló körülmények között Western biot analízissel számított látszólagos molekulatömege az FH frakcióban 2600022000 D, az FM frakcióban 23500-22000 D, az FL frakcióban

26000-21000 D, az FA frakcióban pedig 26000-21000 D volt. Az egyes frakciókban meghatározott molekulatömeg közötti heterogenitás az 0-kötésű cukorláncok heterogenitásának • ·

- 289 lehet a következménye. Ilyenformán, az egyes frakciókat neuraminidázzal (Neuraminidase, Nacalai tesque, katalógusszám: 242-29SP) emésztettük, DTT-vel redukáltuk, majd SDS-PAGE analízissel vizsgáltuk. A vizsgálat eredményeként valamennyi frakcióban 19000 D körüli látszólagos molekulatömeget mutattunk ki, ami azt jelzi, hogy a hTPO molekulatömegének heterogenitása elsősorban a hTP0163 proteinhez kapcsolódó cukorláncokban lévő sziálsav mennyiségének változékonyságának köszönhető, illetve, hogy a hTP0163 a CHO sejtekben glikoproteinként expresszálódik.

(3) A 2. pontban kapott FH, FM, FL és FA frakciókat M-07e vizsgálattal in vitro aktivitásra teszteltük. Az egyes frakciókban a relatív specifikus aktivitás a hTPO163 protein (cukorlánc nélküli peptid) lmg-jára vonatkoztatva sorrendben 511 000 000, 775 000 000, 1 150 000 000, illetve 715 000 000 volt.

66. példa

E. coli vektor készítése humán TPO (1-332. aminosavak; a szekvenciához -1 helyen lizin, -2 helyen metionin kapcsolódik [a továbbiakban hMKT(1-332)]) expresszálásához, és a hMKT(1-332) expresszálása

A humán TPO teljes hosszúságú aminosav-szekvenciájának E. coli-ban való expresszálásához a 164. aminosavtól a 332.

aminosavig terjedő kodonokat az alábbi, E. coli által előnyben részesített kodonokra cseréltük.

- 290

5. TÁBLÁZAT

21. 5' -CTCCCGAACCGTACCAGCGGCCTGCTGGAAACCAACTTTACCGCGAG-3' (130. sz. szekv.)

22. 5' -GGTAAAGTTGGTTTCCAGCAGGCCGCTGGTACGGTTCGGGAGCTCGT-3' (131. sz. szekv.)

23. 5 ' -CGCGCGTACCACCGGCAGCGGCCTGCTGAAATGGCAGCAGGGCTTTCGT-3 ' (132. sz. szekv.)

24. 5'-AGCCCTGCTGCCATTTCAGCAGGCCGCTGCCGGTGGTACGCGCGCTCGC-3' (133. sz. szekv.) . 5' -GCGAAAATCCCGGGCCTGCTGAACCAGACCAGCCGTAGCCTGGATCAGAT-3' (134. sz. szekv.)

26. 5'-ATCCAGGCTACGGCTGGTCTGGTTCAGCAGGCCCGGGATTTTCGCACGAA-3' (135. sz. szekv.) . 5' -CCCGGGCTATCTGAACCGTATCCATGAACTGCTGAACGGCACCCGTG-3' (136. sz. szekv.)

28. 5' -GTGCCGTTCAGCAGTTCATGGATACGGTTCAGATAGCCCGGGATCTG-3' (137. sz. szekv.) . 5 ' -GCCTGTTTCCGGGCCCGAGCCGTCGCACCCTGGGCGCGCCGGATATCAG-3' (138. sz. szekv.) . 5' -ATCCGGCGCGCCCAGGGTGCGACGGCTCGGGCCCGGAAACAGGCCACGG-3' (139. sz. szekv.)

31. 5' -ATCAGCTCTGGCACCAGCGATACCGGCAGCCTGCCGCCGAACCTGCAGCC-3' (140. sz. szekv.) . 5' -CAGGTTGGGCGGCAGGCTGCCGGTATCGCTGGTGCGAGAGCTGATATCCG-3' (141. sz. szekv.)

33. 5' -GGGCTATAGCCCGAGCCCGACCCATCCGCCGACCGGCCAGTATACCCTGTT-3 (142. sz. szekv.) ···· ·· ···· • · · · • · · • · · · · • · «««· ··

291

5. TÁBLÁZAT (folytatás)

34. 5'-GGTATACTGGCCGGTCGGCGGATGGGTCGGGCTCGGGCTATAGCCCGGCTG-3' (143. sz. szekv.) . 5' -TCCGCTGC.CGCCGACCCTGCCGACCCCGGTGGTTCAGCTGCATCCGCTGC-3 ' (144. sz. szekv.)

36. 5'-GGATGCAGCTGAACCACCGGGGTCGGCAGGGTCGGCGGCAGCGGAAACAG-3' (145. sz. szekv.)

37. 5'-TGCCGGATCCGAGCGCGCCGACCCCGACCCCGACCAGCCCGCTGCTGAACA-3' (146. sz. szekv.)

38. 5'-AGCAGCGGGCTGGTCGGGGTCGGGGTCGGCGCGCTCGGATCCGGCAGCAGC-3' (147. sz. szekv.)

39. 5'-CCAGCTATACCCATAGCCAGAACCTGAGCCAGGAAGGCTAATGAAGCTTGA-3' (148. sz. szekv.)

40. 5'-CTTCATTAGCCTTCCTGGCTCAGGTTCTGGCTATGGGTATAGCTGGTGTTC-3' (149. sz. szekv.)

41.	5'-ACGAGCTCCCGAACCGTACCA-3'	(150.	sz.	szekv
42.	5'-CTGATATCCGGCGCGCCCAGG-3'	(151.	sz.	szekv
43.	5'-CGGATATCAGCTCTGGCACCA-3'	(152.	sz.	szekv
44.	5'-TCAAGCTTCATTAGCCTTCCT-3'	(153.	sz.	szekv

A 21. és 22.; 23. és 24.; 25. és 26.; 27. és 28.; 29. és 30.; 31. és 32.; 33. és 34.; 35. és 36.; 37. és 38.; illetve 39. és 40. szintetikus oligonukleotidokat azonos csőben 0,1 mM ATP, 10 mM Tris-acetát, 10 mM Mg-acetát, 50 mM K-acetát oldatában T4 foszforiláltuk. A (pH = 7,5), 100 kinéz (Pharmacia) alkalmazásával reakcióelegyhez ezután 100 mM Tris/HCl mM MgCl2 és 500 mM NaCl oldatának 1/10 • *

- 292 térfogatát, 3 percig vízfürdőben forraltuk, s hagytuk lehűlni, miáltal kétszálú DNS képződött. A kétszálú DNS-ek négy csoportját, a 21. és 22. +23. és 24. oligonukleotidból álló A kombinációt; a 25. és 26. + 27. és 28. oligonukleotidból álló B kombinációt; a 31. és 32. + 33. és 34. oligonukleotidból álló C kombinációt; és a 35. és

36. + 37. és 38. oligonukleotidból álló D kombinációt külön-külön DNS-ligáló készlettel (Takara Shuzo) ligáltuk, majd az A kombinációt a B kombinációval, a C kombinációt pedig a D kombinációval ligáltuk, miáltal a ligálás-l-et és a ligálás-2-t kaptuk. A ligálás-l-et és a ligálás-2-t templátként alkalmazva PCR-t végeztünk, amely során primerekként a ligálás-l-hez a 41. és 42. oligonukleotidőt, a ligálás-2-höz pedig a 43. és 44. oligonukleotidőt alkalmaztuk. A ligálás-1 és a ligálás-2 PCR-termékeit SacI és EcoRV, illetve EcoRV és HindlII restrikciós enzimekkel emésztettük, majd 2 %-os agarózgélen elektroforizáltuk és Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet alkalmazásával tisztítottuk, miáltal kb. 240 bp-os, illetve kb. 250 bp-os fragmenseket kaptunk. Az így nyert két fragmenst előzetesen SacI és HindlII enzimekkel emésztett pBluescript II KS+ vektorba (Stratagene) szubklónoztuk (gazdasejtként E. coli DH5 törzset alkalmaztunk). A kialakult telepek közül szekvenálással a 6. táblázatban bemutatott bázisszekvenciával rendelkező klónt választottuk ki, és ezt pBL(SH)(174-332)-nek neveztük el (ld. 154. sz. szekv.) • · • ·

- 293 -

CTC

CCG

AAC

CGT

ACC

AGC

GGC

CTG

CTG

GAA

ACC

AAC

TTT

ACC

GCG

AGC

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Alá

Ser

174

180

GCG

CGT

ACC

ACC

GGC

AGC

GGC

CTG

CTG

AAA

TGG

CAG

CAG

GGC

TTT

CGT

Alá

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

190

200

GCG

AAA

ATC

CCG

GGC

CTG

CTG

AAC

CAG

ACC

AGC

CGT

AGC

CTG

GAT

CAG

Alá

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

210

220

ATC

CCG

GGC

TAT

CTG

AAC

CGT

ATC

CAT

GAA

CTG

CTG

AAC

GGC

ACC

CGT

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

230

GGC

CTG

TTT

CCG

GGC

CCG

AGC

CGT

CGC

ACC

CTG

GGC

GCG

CCG

GAT

ATC

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Alá

Pro

Asp

Ile

240

250

AGC

TCT

GGC

ACC

AGC

GAT

ACC

GGC

AGC

CTG

CCG

CCG

AAC

CTG

CAG

CCG

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

260

GGC

TAT

AGC

CCG

AGC

CCG

ACC

CAT

CCG

CCG

ACC

GGC

CAG

TAT

ACC

CTG

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

270

280

TTT

CCG

CTG

CCG

CCG

ACC

CTG

CCG

ACC

CCG

GTG

GTT

CAG

CTG

CAT

CCG

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

Pro

290

300

CTG

CTG

CCG

GAT

CCG

AGC

GCG

CCG

ACC

CCG

ACC

CCG

ACC

AGC

CCG

CTG

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Alá

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

310 ··**

- 294 • * · ·«··· • · · · ♦ ♦· • · · ··«« ·

6. TÁBLÁZAT (folytatás)

CTG

AAC

ACC

AGC

TAT

ACC

CAT

AGC

CAG

AAC

CTG

AGC

CAG

GAA

GGC TAA

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

320

330

332

TGA

AGC

TTG

A

Ezután templátként a 42. példában előállított pBL(XH)h6T(1-163) plazmiddal, primerekként az alábbi 45. és 46. szintetikus oligonukleotidők jelenlétében végeztünk PCR-t, majd a PCR-termékeket BamHI és SacI enzimekkel emésztettük és 6 %-os poliakril-amid gélen elektroforézist végeztünk, miáltal a gélről kb. 160 bp-os fragmenst nyertünk ki.

45: 5'-AAGGATCCGAACGCTATCTTCCTG-3' (155. sz. szekv.)

46: 5' -GGGAGCTCGTTCAGGGTCAGAACCAGA

GAGGTACGAGACGGAACAGCAGTGGTTGG-3' (156. sz. szekv.)

Hasonlóan, a pBL(SH)(174-332) plazmidot SacI és HindlII restrikciós enzimekkel emésztettük, az emésztett mintát

Prep-A-Gene DNS-tisztító készlet alkalmazásával tisztítottuk, miáltal kb. 480 bp-os fragmenst kaptunk. A fentebb előállított két fragmenst előzetesen BamHI és HindlII enzimekkel emésztett pBluescript II KS+ vektorba (Stratagene) szubklónoztuk (gazdasejtként E. coli DH5 törzset alkalmaztunk).

..., • ·

- 295 A kapott kiónok közül szekvenálással a 7. táblázatban bemutatott bázis-szekvenciával rendelkező kiónt választottuk ki, és pBL(BH)(123-332)-nek neveztük el (157. sz. szekv.).

7. TÁBLÁZAT

G GAT CCG AAC GCT ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC

Asp Pro Asn Alá Ile Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly

123 130

AAA

GTT

CGT

TTC

CTG

ATG

CTG

GTT

GGC

GGT

TCT

ACC

CTG

TGC

GTT

CGT

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

140

150

CGG

GCG

CCG

CCA

ACC

ACT

GCT

GTT

CCG

TCT

CGT

ACC

TCT

CTG

GTT

CTG

Arg

Alá

Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

160

ACC	CTG	AAC	GAG	CTC
Thr	Leu	Asn	Glu	Leu
170				174

A 42. példában előállított pBL(XH)h6T(1-163) plazmidot BamHI és HindlII enzimekkel emésztettük, s ugyanezen enzimekkel emésztettük a fentebb előállított pBL(BH)(123-332) plazmidot is, miáltal kb. 640 bp-os fragmenst kaptunk, s a két fragmenst együtt ligáivá a pBL(XH)h6T(1-334) plazmidot kaptuk. Ezután az 52. példában előállított pCFM536/hMKT(1-163) plazmidot Xbal és Sfil enzimekkel emésztve kb. 270 bp-os fragmenst kaptunk, melyet ugyanezekkel az enzimekkel emésztett pBL(XH)h6T(1-334) • ·« · *·

- 296 plazmiddal ligáltunk, s így a pBL(XH)hMKT(1-334). kiónt kaptuk. Miután a pBL(XH)hMKT(1-334) plazmidot Xbal és HindlII enzimekkel emésztettük, egy kb. 1040 bp-os fragmenst kaptunk, amely az 1-332. aminosavakból álló mutációs típusú humán TPO-t kódolja. Ezt a fragmenst tisztítás után Xbal és HindlII enzimekkel emésztett pCFM536 vektorba (EP-A-136490 számú európai szabadalmi bejelentés) klónoztuk (gazdasejtként pMWl plazmiddal (ATCC No. 39933) transzformált JM109 E. coli törzset alkalmaztunk). A kapott kiónt pCFM536/hMKT(1-332)-nek neveztük el, s a mutációs típusú hMKT(1-332) protein expresszálásához ezt az expressziós vektort hordozó E. coll törzset használtuk transzformánsként. A pCFM536/hMKT(1-332) expressziós plazmid a 14. számú szekvenciában bemutatott DNS-szekvenciát tartalmazza.

Az említett transzformánst 50 pg/ml ampicillint és 12,5 ug/ml tetraciklint tartalmazó 60 ml LB tápközegben 30 C-on egy éjszakán át tenyésztettük, majd a tenyészetet (25 ml) 1000 ml, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB tápközeghez adtuk, s 36 °C-on rázatás közben addig tenyésztettük, míg az ODeoo 1,0-1,2 értéket ért el. Ezután a tenyészethez kb. 330 ml 65 ’C-os LB tápközeget adtunk, hogy a tenyészet hőmérséklete 42 °C legyen, s a rázatásos tenyésztést a hMKT(1-332) humán TPO változat (más néven [Met^-2, Lys^-1]TP0(1-332) ) expressziójának indukálása érdekében 42 °C-on további 3 óra hosszat folytattuk.

297 ···· *· ·«<« • » · · < · · • · · · · ·· ··*» ·· ··

A kapott tenyészetet közvetlenül SDS-PAGE analízisnek vetettük alá, melynek során Multigel 15/25 gélt (Dai-ichi

Chemical Co.) használtunk. Elektroforézis és Coomassie Blue festés után az expresszió indukálására (a hMKT(1-332) protein expresszióját indukáló transzformánst illetően) specifikus proteint a gélen kb. 35 kD molekulatömegnél detektáltuk. SDS-PAGE analízis és elektroblot vizsgálat után (melyhez nitrocellulóz membránt alkalmaztunk) az expresszált proteint a 45. példában előállított anti-Hl peptid antitesttel reagáltattuk. Festés után hozzávetőleg 35 kD molekulatömegnek megfelelő sávot mutattunk ki, ami azt jelzi, hogy a hMKT(1-332) protein expresszálódott.

67. példa

Szubsztituált humán TPO származékok, azok C0S7 sejtekben történő expresszálása és aktivitásuk azonosítása

Az alábbi kísérletekben azt vizsgáltuk, hogy azok a származékok, melyekben a humán TPO aminosavait részlegesen másik aminosawal (amino savakkal) helyettesítettük, rendelkeznek-e TPO aktivitással.

Az állati sejtekben történő expresszióhoz, vagyis az e példában való alkalmazáshoz a pSMT201 vektort az alábbiak szerint készítettük.

Először az egér eritropoetin receptor cDNS-ét tartalmazó pXM-mEPORn expressziós vektort (melyet Dr. D'Andrea-tól ·· ···· ··

298 [Dana Farbor Canfer Institute] kaptunk; Cell, 57. 277-285, 1989) KpnI és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük és agarózgélen elektroforizáltuk, miáltal pXM vektort kaptunk, melyből az egér eritropoetin receptor cDNS-t eltávolítottuk. Ezután a különböző klónozó restrikciós 'helyek fenti expressziós vektorba történő beépítéséhez DNS-szintetizátor (ABI) alkalmazásával két oligonukleotidot szintetizáltunk, melyek az alábbi bázis-szekvenciákkal rendelkeztek:

primer-1:

5' -CCTCGAGGAATTCCTGCAGCCCGGGACTAGTATCGGCTACCCCTACGACGTCCCCGA

CTACGCCGGCGTCCATCACCATCACCATCACTGAGCGGCCGCC-3' (158 . sz. szekv. ) primer-2:

' -AATTGGCGGCCGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGAGCGCCGGCGTAGTCGGGGACGT

CGTAGGGGTAGCCGATACTAGTCCCGGGCTGCAGGAATTCCTCGAGGGTAC-3' (159. sz. szekv.)

A két oligonukleotidot összekevertük és hibridizáltuk, miáltal kétszálú oligonukleotidot kaptunk, melyet T4 DNSligáz (Takara Shuzo) jelenlétében a fentebb előállított pXM vektorba ligáivá a pDMT201 expressziós vektort kaptuk. Hogy a pDMT201 vektorból eltávolítsuk az egér DHFR cDNS-t, a pDMT201 és a pEF18S vektort külön-külön NotI és Hpal enzimekkel emésztettük, és agaróz gélelektroforézissel a PÜMT201 vektor DNS-ből származó nagyobb fragmenst és a PEF18S vektor DNS-ből származó kisebb fragmenst kaptunk. Ezeket a fragmenseket T4 DNS-ligáz (Takara Shuzo) alkalmazásával egymáshoz ligáltuk, miáltal a pSMT201 • Λ

- 299 adenovírus vezérlő jelzőszekvenciával, expressziós vektort kaptuk. A pSMT201 vektor (ld. 21. ábra) SV40 replikációs kezdőhellyel, enhancer szekvenciával, adenovírus fő kései promotert szekvenciával, háromrészes (leader) szekvenciával, splicing SV40 korai poliadenilációs hely szekvenciával, adenovírus VA RNS génszekvenciával, a pUC18 replikációs kezdőhelyével és β-laktamáz génnel (Amp*') rendelkezik, s egy kívánt gén ligálásához BglII, PstI, KpnI, Xhol, EcoRI, Smal, Spel és NotI restrikciós felismerési helyeket tartalmaz. A 30. példában bemutatott, teljes hosszúságú humán TPO cDNS-t tartalmazó pHTP-t EcoRI és Spel enzimekkel emésztve teljes hosszúságú humán TPO cDNS fragmenst kaptunk, melyet előzetesen ugyanezen enzimekkel emésztett pSMT3201 vektorba szubklónoztunk, s ezáltal a pSMT201-hTPO plazmidot állítottuk elő.

Az így kapott pSMT201-hTP0 plazmidot templátként alkalmazva először a szóban forgó származékok előállításához templátként használt BGL-TPO/pBlue plazmidot állítottuk elő.

A 6GL-TP0/pBlue plazmidban a humán TPO 5' nem transzlálódó régiójához az Annweiler-féle módszerrel (Annweiler és mtsi, Nucleic Acids Research, 12, 3750, 1991) nyúl β-globin leader szekvenciát kapcsoltunk. Ennek megvalósítása érdekében az alábbi két kémiailag szintetizált DNS szálat

5'-AATTCCAAGATCTCACACTTGCTTTTGACACAAC

TGTGTTTACTTGCAATCCCCCAAAACAGACAGACCC-3' (160. sz. szekv.),

5'-GGGTCTGTCTGTTTTGGGGGATTGCAAGTAAACA

CAGTTGTGTCAAAAGCAAGTGTGAGATCTTGG-3' (161. sz. szekv.), • · ·

- 300 a Bluescript II SK+ vektor (Toyo boseki) EcoRI és Smal enzimekkel végzett emésztésével kapott fragmenshez ligáltuk, miáltal a BGL/pBlue vektort állítottuk elő, melybe a vezérlő szekvenciát inszertáltuk.

Az alábbi primer szekvenciák alkalmazásával PCR-t végeztük: Sma-ATG: 5'-GGCCCGGGATGGAGCTGACTGAATTGCTC-3' (162.sz.szekv.) (azaz a 7. sz. szekv. 102-122. nukleotidjai, melyekhez Smal szekvenciát kapcsoltunk);

end: 5' -TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3' (162. sz. szekv.) (azaz a 7. sz. szék. 1140-1160 nukleotidjaiból álló antiszensz primer, melyhez Spel és HindiII szekvenciákat kapcsoltunk).

A PCRT-t templátként 1 ng pSMT201-hTP0 plazmid DNS és a szintetikus primerek 10 uM-jának alkalmazásával hajtottuk végre, melynek során TaKaRa PCR Amplifikáló készletet (Takara-Shuzo) és programozható hőszabályzót (Programmable

Thermal Controller) (MJ Research) használva a reakciót 100 μΐ össztérfogatban az alábbiak szerint végeztük: 3 ciklus (ciklusonként 94 °C-on 1 perc; 55 °C-on 2 perc; 72 °-on 2 perc); 20 ciklus (ciklusonként 94 ’C-on 45 másodperc; 55 ’Con 1 perc és 72 ’C-on 1 perc). A PCR-terméket kloroformmal extraháltuk, majd etanollal kétszer kicsaptuk és 100 ul TE pufferben szuszpendáltuk.

Ezután a PCR-terméket Smal és HimdIII restrikciós enzimekkel • * · · ·· · · ·« ·· · · • · · · · ·· · * · · · · · ·

301 emésztettük, fenol/kloroform eleggyel extraháltuk és etanollal kicsaptuk. A kapott csapadékot 10 pl TE pufferben oldottuk, majd az előzetesen azonos restrikciós enzimekkel emésztett GGL/pBlue vektorba klónoztuk (gazdatörzsként Competent High E. coli JM109 törzset (Toyo-boseki) alkalmaztunk). A kapott transzformánst sejtek közül 20 kiónt választottunk ki, melyekből lényegében Sambrook és mtsi. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1989) leírása szerint plazmid DNS-t készítettünk. A tisztított plazmid DNS-t Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems, Inc.) és 373A DNS-szekvenáló (Applied Biosystems, Inc.) alkalmazásával végzett szekvenálással azonosítottuk. Bebizonyítottuk, hogy a SGL-TPO/pBlue-t tartalmazó plazmid a várt TPO cDNSszekvenciával rendelkezik, s egész hosszúságában nem tartalmaz szubsztitúciót. Miután a SGL-TPO/pBlue-t BglII és Spel enzimekkel emésztettük, az emésztett mintát fenol/kloroform eleggyel extraháltuk és etanollal kicsaptuk. A kapott csapadékot 10 pl TE pufferben oldottuk, majd az előzetesen azonos restrikciós enzimekkel emésztett pSMT201 vektorba szubklónoztuk (gazdatörzsként Competent High E. coli JM109 törzset (Toyo-boseki) alkalmaztunk). Sambrook és mtsi. (ld, fentebb) leírása szerint a transzformáns sejtekből plazmid-DNS-t készítettünk. A kapott pSMT/CGL-TPO expressziós plazmidban a β-globin vezérlő szekvencia és a humán TPO cDNS a pSMT201 splice jelzőszekvenciájától downstream irányban a BglII/Spel restrikciós felimseréris helyhez kapcsolódik (21. ábra). A pSMT/BGL-TPO vektorral COS • · • · · · · • · · · · ·

- 302 sejteket transzfektáltunk.

Humán szubsztituált TPO származékok előállításához az Ito-féle eljárással PCR-t alkalmaztunk (Ito és mtsi, Gene, 102. 67-70, 1991). Jellemzésül két származékot állítottunk elő, melyekben a humán TPO 25. arginin gyökét aszparaginnal, illetve 33. hisztidin gyökét treoninnal helyettesítettük.

Ezek a származékok az [Asn^ZB]TP0 és [Thr³³]TP0. A PCR során az alábbi primereket alkalmaztuk:

T7: 5'TAATACGACTCACTATAGGGCG-3' (164. sz. szekv.) (a Bluescript II SK⁺ T7 promoter régiójának felel meg);

4BglII: 5'-AATTCCAAGATCACACACTTGC-3' (165. sz. szekv.) (a BglII felismerési szekvencia helyettesítéséhez);

end: 5'-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3' (166. sz.

szekv.) (a 7. sz. szekv. 1140-1160 nukleotidjaiból álló antiszensz primer, melyhez Spel és HindiII szekvenciákat kapcsoltunk);

N3: 5'-TGGGCACTGGCTCAGGTTGCTGTGAAGGACATGGG-3' (167. sz.

szekv.) (a 7. sz. szekv. 25. Arg gyökét Asn gyökre cseréltük);

09: 5'-TGTAGGCAAAGGGGTAACCTCTGGGCA-3' (168. sz. szekv.) (a 7. sz. szekv. 33. His gyökét Thr gyökre cseréltük).

Az első PCR-hoz templátként 1 ng β-GL-TPO/pBlue DNS-t, illetve az egyes szintetikus primerek 10 pg-ját alkalmaztuk. Az alkalmazott primer-kombinációk: [1] Δ BglII és end primer; [2] T7 és N3; és [3] T7 és 09. TaKaRa PCR

Amplifikáló készletet (Takara-Shuzo) és programozható • ·

- 303 hőszabályzót (Programmable Thermal Controller) (MJ Research) használva a PCR reakciót 100 jjI térfogatban az alábbiak szerint végeztük: 3 ciklus (ciklusonként 94 ’C-on 1 perc; 55 ’C-on 2 perc; 72 ’-on 2 perc); majd 17 ciklus (ciklusonként 94 ’C-on 45 másodperc; 55 ’C-on 1 perc és 72 ’C-on 1 perc). A PCR-termékeket kloroformmal extraháltuk, majd etanollal kétszer kicsaptuk és 100 μΐ TE pufferben szuszpendáltuk. A kapott PCR-termékeket (egyenként 1 μΐ) egy második PCR-nak vetettük alá. Templátként az [13/[2] és [13/[3] PCR-termékek kombinációit alkalmaztuk, mindkét esetben a T7 és end primer kombinációját használva. 94 ’C-on 10 percig történő inkubálás és TaKaRa Taq hozzáadása után a PCR-t az alábbiak szerint végeztük: 3 ciklus (ciklusonként 94 ’C-on 1 perc; 55 ’C-on 2 perc; 72 ’-on 2 perc); majd 9 ciklus (ciklusonként 94 ’C-on 45 másodperc; 55 ’C-on 1 perc és 72 ’C-on 1 perc). Valamennyi PCR-termékhez 1 ul proteináz K-t (5 mg/ml), 2 μ! 0,5M EDTA-t és 2 jul 20 %-os SDS-t adtunk, a Taq inaktiválása érdekében 37 ’C-on 30 percig inkubáltuk, fenol/kloroform eleggyel extraháltuk és etanollal kicsaptuk. Ezután a 20 jul steril vízben feloldott csapadékot BglII és Spel restrikciós enzimekkel emésztettük, majd fenol/kloroform eleggyel extraháltuk és etanollal kicsaptuk. Az így kapott csapadékot 10 μΐ TE pufferben oldottuk, majd az előzetesen a fenti restrikciós enzimekkel emésztett és borjú vékonybél lúgos foszfatázzal (Boehringer-Mannheim) kezelt pSMT201 expressziós vektorba szubklónoztuk ((gazdatörzsként Competent High E. coli JM109 törzset (Toyo-boseki) alkalmaztunk). A kapott transzformáns sejtek közül minden

304 esetben két klónt választottunk ki, mélyekből lényegében Sambrook és mtsi. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) leírása szerint plazmid DNS-t készítettünk. A tisztított plazmid DNS-t Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems, Inc.) és 373A DNS-szekvenáló (Applied Biosystems, Inc.) alkalmazásával szekvenáltuk. Az [1] és [3] primer alkalmazásával végzett PCR-ral előállított plazmid a 09/TP0 szubsztitúciós TPO származékot kódoló cDNS-t tartalmazott.

Igazoltuk az aminosav-szubsztitúciót [His33(CAC) -> Thr(ACC)], és az eredeti C-terminális (Gly332)

TSIGYPYDVPDYAGVHHHHH aminosav-szekvencia (169. sz. szekv.) hozzáadásával történő meghosszabbítását. Ez a származék a

[Thr33,	Thr333,	Ser334,	Ile33®,	Gly333,	Tyr337, Pro333,
Tyr339,	Asp34°,	Val341,	Pro342,	Asp343,	Tyr344, Alá34®,
Gly343,	Val347,	His343,	His349,	His3®3,	His351, His3®2,

His³®³]TP0.

Az [1] és E2] primer alkalmazásával végzett PCR-ral előállított plazmid az N3/TP0 szubsztitúciós TPO származékot kódoló cDNS-t tartalmazott. Igazoltuk az Arg25(AGA) -*·

Asn(AAC) és Glu231(GAA) -* Lys(AAA) szubsztitúciót, és az eredeti C-terminális (Gly332) TSIGYPYDVPDYAGVHHHHH aminosavszekvencia hozzáadáséval történő meghosszabbítását. Ez a származék a [Asn²⁵, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile^33e, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³³, Tyr³³⁹, Asp³⁴°, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³,

Tyr³⁴⁴, Alá³⁴⁵, Gly³⁴³, Val³⁴⁷, His³⁴®, His³⁴⁹, His³®³,

His³⁵

His³®²,

His^3B3]TPO.

305

Az egyes kiónokat a 35. példában leírt, klorokinos kezelést magában foglaló DEAE-dextrán eljárással transzfektáltuk a C0S7 sejtekbe. Röviden; a transzfekcióhoz az egyes plazmid DNS-ek 40 ug-ját használtuk, és öt nap elteltével kinyertük a tenyészetfelülúszókat, melyeket TPO aktivitásuk M-07e vizsgálattal történő értékelése érdekében Centricon-30 (Amicon) alkalmazásával 1/20 térfogatra koncentráltunk. Azon C0S7 sejtek tenyészetfelülúszójában, melyeket az N3/TP0, illetve 09/TPO szubsztitúciós TPO származékokat kódoló cDNS-t tartalmazó plazmidokkal transzformáltunk, dózisfüggő módon TPO aktivitást mutattunk ki (ld. 22. ábra).

68. példa

Inszerciós, illetve deléciós humán TPO származékok előállítása, COS7 sejtekben történő expresszálás és TPO aktivitásuk azonosítása

Ebben a példában a hTPO163 inszerciós, illetve deléciós származékainak TPO aktivitását bizonyítjuk be.

Az alábbi származék származék származék származék inszerciós

A33') és származékokat állítottuk elő: His33 deléciós ( [4His³³]TP0( 1-163), ( [4 Gly¹¹⁶]TPO(1-163), ( [dArg¹¹⁷]TP0( 1-163) , dH33); Glyllö-deléciós dG116); Argll7-deléciós dR117), Thr-inszerciós ([His³³, Thr³³', Pro³⁴]TPO(1-163), T33*), Alaszármazék ([His³³, Alá³³', Pro³⁴]TP0(1-163),

Gly-inszerciós származék ([His³³, Gly³³',

Pro³⁴]TPO(1-163), G33') (mely inszerciós származékokban • ·

- 306 Thr, Alá és Gly gyököt külön-külön a 33. hisztidin és a 34. prolin gyök közé inszertáltuk); Asn-inszerciós származék ([Gly¹¹⁶, Asn¹¹⁶', Arg¹¹⁷]TP0(1-163), N116'), Ala-inszerciós származék ([Gly¹¹⁶, Alá¹¹⁶', Arg¹¹⁷]TPO(1-163), A116') és

Gly-inszerciós származék ([Gly¹¹⁶, Gly¹¹⁶', Arg¹¹⁷]TP0(1163), G116'), mely utóbbiakban az Asn, Alá, illetve Gly gyököt külön-külön a 116. glicin és 117. arginin közé inszertáltuk). Valamennyi származék a 13. számú szekvencián alapul.

A T33' és N116' származékot mucin-típusú, illetve Asn-kötési típusú cukorláncok beviteléhez szántuk.

A fenti származékokat Ito és mts. (Gene, 102. 67-70, 1991) által leírt eljárás szerint PCR alkalmazásával állítottuk elő. A PCR-ban alkalmazott primer-szekvenciák az alábbiak:

dH33: 5'TGTAGGCAAAGGAACCTCTGGGCA-3' (172. sz. szekv) (a

7. számú szekvencián alapuló His33-deléciós származék előállításához);

T33': 5'-TGTAGGCAAAGGAGTGTGAACCTCTGG-3' (173. sz. szekv.) (a 7. sz. szekv. 33. His és 34. Pro gyöke közé inszertált treonin-gyököt tartalmazó Thr-inszerciós származék előállításához);

A33' : 5' -TGTAGGCAAAGGAGCGTGAACCTCTGG-3' (174. sz . szekv. ) (a 7. sz. szekv. 33. His és 34. Pro gyöke közé inszertált alanin-gyököt tartalmazó Ala-inszerciós származék előállításához);

G33': 5'-TGTAGGCAAAGGTCCGTGAACCTCTGG-3' (175. sz. szekv.)

- 307 (a 7. sz. szekv. 33. His és 34. Pro gyöke közé inszertált glicin-gyököt tartalmazó Gly-inszerciós származék előállításához);

dG116: 5'-AGCTGTGGTCCTCTGTGGAGGAAG-3' (176. sz. szekv.) (a 7. számú szekvencián alapuló Glyll6-deléciós származék előállításához);

dR117: 5'-GTGAGCTGTGGTGCCCTGTGGAGG-3' (177. sz. szekv.) (a 7. számú szekvencián alapuló Argll7-deléciós származék előállításához);

N116': 5'-AGCTGTGGTCCTGTTGCCCTGTGGAGG-3' (178. sz.szekv.) (a 7. sz. szekv. 116. Gly és 117. Arg gyöke közé inszertált aszparagin-gyököt tartalmazó Asn-inszerciós származék előállításéhoz);

A116': 5 ' -AGCTGTGGTCCTAGCGCCCTGTGGAGG-3' (179. sz.szekv.) (a 7. sz. szekv. 116. Gly és 117. Arg gyöke közé inszertált alanin-gyököt tartalmazó Ala-inszerciós származék előállításához);

G116': 5 '-AGCTGTGGTCCTTCCGCCCTGTGGAGG-3' (180. sz.szekv.) (a 7. sz. szekv. 116. Gly és 117. Arg gyöke közé inszertált glicin-gyököt tartalmazó Gly-inszerciós származék előállításához);

dRI: 5-CGGGCTGCAGGATATCCAAGATCTCA-3' (181. sz. szekv.) (az EcoRI felismerési szekvencia behelyettesítéséhez);

T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3' (182. sz. szekv.) (s

Bluescript II SK* T7 promoterének megfelelő szekvencia): és endNotl: 5'-GGGCGGCCGCTCAGCTGGGGACAGCTGTGGTGGG-3' (183.

sz. szekv.) (a 7. sz. szekv. 633-653. nukleotidjaiból álló szekvencia antiszensz szálam, melyhez terminációs kodcr.t és «···

- 308 NotI felismerési helyet kapcsoltunk).

Az első PCR-t templátként a 67. példában előállított ÖGLTPO/pBlue DNS 1 ng-jának, illetve a szintetikus primerek 10 μΜ-jának falhasználásával . végeztük. Az alkalmazott primerkombinációk: [1] dRI és endNotl vagy [2] T7 és mutált primerek (dH33, A33', G33', T33', dG116, dR117, A116', G116' és N116'). A PCR-t TaKaRa PCR Amplifikáló készletet (TakaraShuzo) és programozható hőszabályzót (Programmable Thermal Controller) (MJ Research) használva, 100 pl össztérfogatban végeztük. Az [1] primer-kombináció esetében 3 ciklust (ciklusonként 94 ’C-on 1 perc; 45 ’C-on 2 perc és 72 ’-on 2 perc); majd 17 ciklust (ciklusonként 94 ’C-on 45 másodperc;

’C-on 1 perc és 72 ’C-on 1 perc) ismételtünk. A [2] primer-kombináció esetében 3 ciklust (ciklusonként 94 ’C-on 1 perc; 55 ’C-on 2 perc és 72 ’-on 2 perc); majd 17 ciklust (ciklusonként 94 ’C-on 45 másodperc; 55 ’C-on 1 perc és 72 ’C-on 1 perc) ismételtünk. Valamennyi PCR-terméket kloroformmal extraháltunk, majd etanollal kétszer

kicsaptunk, és szuszpendáltuk.	a csapadékot	100		TE pufferben
Az [1] és [2]	PCR-termékek 1	/jl-ét	egy	második PCR-nak
vetettük alá,	melynek során	a T7	és	endNotl primer
kombinációj át	alkalmaztuk. 94	’C-on	10	percig történő

inkübálás után valamennyi PCR reakcióelegyhez TaKaRa Taq-ot adtunk. A második PCR-t az alábbiak szerint végeztük: 3 ciklus (ciklusonként 94 ’C-on 1 perc; 55 ’C-on 2 perc; 72

309 ’-οη 2 perc); majd 9 ciklus (ciklusonként 94 ’C-on 45 másodperc; 55 ’C-on 1 perc és 72 ’C-on 1 perc). Valamennyi PCR-termékhez 1 pl proteináz K-t (5 mg/ml), 2 pl 0,5M EDTA-t és 2 ul 20 %-os SDS-t adtunk, s az elegyeket a Taq inaktiválása érdekében 30 percig 37 ’C-on tartottuk. A PCRterméket fenol/kloroform eleggyel extraháltuk és etanollal kicsaptuk, majd 20 ul steril vízben feloldottuk. BglII és Spel restrikciós enzimekkel végzett emésztés után az oldatot fenol/kloroform eleggyel extraháltuk és etanollal kicsaptuk. Az így kapott csapadékot 10 ul TE pufferben oldottuk, majd az előzetesen a fenti restrikciós enzimekkel emésztett és borjú vékonybél lúgos foszfátázzál (Boehringer-Mannheim) kezelt pEF18S expressziós vektorba szubklónoztuk (gazdatörzsként Competent High E. coli JM109 törzset (Toyoboseki) alkalmaztunk). A kapott transzformánsból lényegében Sambrook és mtsi. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . 1989) leírása szerint plazmid DNS-t készítettünk. A tisztított plazmid DNS nukleotidszekvenciáját Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems, Inc.) és 373A DNS-szekvenáló (Applied Biosystems, Inc.) alkalmazásával határoztuk meg. Megállapítottuk, hogy a dH33, A33', T33', dG116, dR117, A116', G116' és N116' szubsztitúciós származékokat kódoló plazmidok a várt cDNS-szekvenciákkal rendelkeztek, s a kívánt helyeken kívül szubsztitúciót nem tartalmaztak. A G33' esetében a kívánt helyen kívüli bázis-szubsztitúciót [Pro38 (CCT) —*· Ser (TCT)J találtunk.

• · • ·

- 310 Az egyes kiónok C0S7 sejtekbe történő transzfektálását a 11. példában leírt eljárás szerint az egyes plazmid DNS-ek 10 μβ-jával a klorokinos kezelést magában foglaló DEAE-dextrán módszerrel végestük, és a 4-5. nap után kinyertük a tenyészetfelülúszót, melyet az M-07e vizsgálati rendszerrel értékeltünk. Az inszerciós vagy deléciós származékokat kódoló plazmidokkal transzfektált C0S7 sejtek felülúszójában dózis-függő TPO aktivitást mutattunk ki (ld. 23. ábra). Ezzel ellentétben azon C0S7 sejtek felülúszójában, melyeket TPO származékot kódoló cDNS-t nem tartalmazó pEF18S expressziós plazmiddal transzfektáltunk, nem találtunk TPO aktivitást.

69. példa

Anti-humán TPO peptid antitestek előállítása és tisztítása (1) A 191. sz. szekvenciával rendelkező humán TPO aminosav-szekvenciájából hat olyan régiót választottunk ki, melyeket antigénként viszonylag alkalmasnak ítéltünk (ld. 8. táblázat). E régiókból Tam eljárása szerint (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85. 5409-5413, 1988) összetett antigén peptid (MAP) típusú négyszálú peptidet szintetizáltunk. E peptid (alkalmanként) 100 ug-jával két nyulat nyolcszor immunizáltunk.

A fentiektől függetlenül egyszálú peptideket állítcctunk elő, oly módon, hogy az egyes peptid-régiók (119-124. sz. szekv.; HT1 - HT6 régiók: a 191. sz. szekv. 8-28., 47-62., ·· ··

- 311 108-126., 172-190., 262-284., illetve 306-332. aminosavainak megfelelő pepdit-fragmensek) C-terminálisához ciszteingyököt kapcsoltunk. E peptid-réglókat teszt-antigénként alkalmazva az immunizált nyulak szérumában enzimes immunvizsgálattal mértük az antitestértékeket, s valamennyi tesztelt szérum esetében az antitestérték emelkedését igazoltuk. Ennek megfelelően, ezeket a szérumokat antiszérumnak nevezzük.

A C-terminálisukhoz kötött cisztein-gyököt tartalmazó egyszálú szintetikus peptideket antigénként felhasználtuk az antiszérum tisztításához is.

(2) A fentebb említett antigén peptidek egyikével két nyulat immunizáltunk, s az ezekből származó antitesteket különkülön állítottuk elő. Az anti-HTl peptid antitestek esetében a két immunizált nyúlból anti-HTl-1 és anti-HTl-2 peptid antitestet kaptunk.

Példaként az anti-JTl-1 peptid antitest tisztítását írjuk le.

mg egyszálú (hozzákapcsolt cisztein-gyököt tartalmazó) HT1 peptidet 12 ml Sulfo Link Coupling Gel-hez (a Pierce Co. 44895 katalógusszámú terméke) kapcsoltunk; pontosabban az antigént tartalmazó peptid-oldatot kapcsoltuk a gélhez (15 perig), melyet előzőleg a gél térfogatára vonatkoztatva hatszoros térfogatú kapcsoló pufferrel (50 mM Tris, 5 mM

- 312

EDTA-Na, pH = 8,5) ekvilibráltunk. A gélt 30 percig állni hagytuk, majd térfogatára vonatkoztatva háromszoros térfogatú kapcsoló pufferrel mostuk. A gélhez ezután 1 ml/ml gél arányban 0,05 M L-cisztein-HCl-ot tartalmazó kapcsoló puffért adtunk, s így a nem kezelt csoportokat 15 percen keresztül blokkoltuk. 30 perces állás után a gélt nyolcszoros térfogat kapcsoló pufferrel mostuk. A fenti kapcsolási eljárást szobahőmérsékleten végeztük. Ezzel a módszerrel az antigén régiót tartalmazó peptidet kovalens kötéssel kapcsoltuk a gélhez (28,3 % kapcsolási hatásfokkal), miáltal 1 ml gélen 0,8 mg peptidet tartalmazó antigén-peptid gélt kaptunk, géloszlop formájában. Az egyes immunizált nyulak összes vérének összegyűjtése után 78,4 ml anti-HTl-1 peptid antitestet tartalmazó antiszérumot kaptunk. Az antiszérum 76,7 ml-ét (3620 mg proteintartalom) előzetesen 150 mM NaCl-ot és 0,05 % nátrium-azidot tartalmazó 50 mM foszfát-pufferrel (pH =8) ekvilibrált antigén oszlopra vittük, miáltal 105,9 ml átfoly frakciót kaptunk (proteintartalom 3680 mg). Az adszorbeált frakciót ezután 0,1 M citromsav pufferrel (pH = 3,0) eluáltuk, s 21,1 ml 0,1 M karbonát-puffer (pH = 9,9) hozzáadásával azonnal semlegesítettük, majd YM30 membrán (Amicon Co.) alkalmazásával bekoncentráltuk és 150 mM NaCl-ot és 0,05 % nátrium-azidot tartalmazó 50 mM foszfát-pufferben (pH = 8) tisztítottuk. Ilyenformán a pufferben 11,2 ml tisztított anti-HTl-1 peptid antitestet kaptunk (proteintartalom: 77,7 mg). A fentihez hasonlóan anti-HTl-2 peptid antitestet (18,8 mg), anti-HT2-2 peptid-antitestet (8,2 mg), stb. kaptunk.

• · *· «·

- 313 Az anti-HT3 - anti-HT6 antitesteket a fentivel azonos eljárással kaptuk.

70. példa

A TPO kimutatása Western biot analízissel (1) A 69. példában kapott antiszérumot az alábbi módszerrel tesztelve értékeltük.

A CHO sejtek (melyekbe a 6. sz. szekv. -21-332. aminosavát kódoló gént vittünk be, illetve azt bennük expresszáltuk) tenyészetének felülúszójából részlegesen tisztított rekombináns humán TPO standard mintát általános eljárással

SDS-poliakril-amid gélelektroforézisnek vetettünk alá, majd PVDF vagy nitrocellulóz membránon elektromos lenyomatkészítést (elektroblot) végeztünk. A lenyomatkészítés után a membránt 20 mM Tris-HCl-dal és 0,5 M NaCl-dal (pH = 7,5) (TBS) 5 percig, majd kétszer 5 percig

0,1 % Tween-20-at tartalmazó TBS-sel (TTBS) mostuk,.és 60 percig blokkoló szerrel (Block Ace, a Dai-Nippon Pharmaceutical Co. UK-B25 katalógusszámú terméke) kezeltük. Az anti-HTl-1, anti-HT2-l, anti-HT3-2, anti-HT4-l, antiHT5-2 és anti-HT6-l peptid antitestek valamelyikét tartalmazó antiszérumokat 0,05 % BSA-t és 10 % Block Ace-t tartalmazó TTBS oldattal ezerszeresére hígítottuk. A hígított antitesteket primer antitestekként használtuk a

Western analízishez. Részletesen; a fenti módon kezelt rekombináns humán TPO mintát az anti-TPO peptid antitestet, t

- 314 0,05 % BSA-t és 10 % Block Ace-t tartalmazó TTBS oldattal 60 percig kezeltük, majd TTBS oldattal 5 percig mostuk. A membránt azután 60 percig 0,05 % BSA-val és 10 % Block Acessel együtt (második antitestként) biotinilált antinyúl(ab') kecske antitestet (a Caltag Co. L43015 katalógusszámú terméke) tartalmazó TTBS oldattal kezeltük, majd kétszer öt percig TTBBS oldattal mostuk. Ezt 10 % Block

Ace-t tartalmazó TTBS oldattal 1:5000 arányban hígított, lúgos-foszfatázzal jelölt avidinnel (a Leinco Technologies Co. A108 katalógusszámú terméke) 30 percig kezeltük, majd kétszer 5 percig TTBS oldattal, aztán 5 percig TBS oldattal mostuk. A membránt lúgos foszfatáz szubsztráttal (Bio-Rad Co., katalógusszám: 170-6432) hívtuk elő. A leírt Western analízist szobahőmérsékleten végeztük, s bebizonyítottuk, hogy a humán TPO-t az antiszérum felismerte, és ezáltal kimutatható volt.

(2) A 69. példában affinitás kromatográfiával tisztított anti-HTl-1, anti-HTl-2, anti-HT2-l és ahti-HT2-2 peptid antitestek 3-3 mg-ját aktivált biotinhoz (NHS-LC-Biotin II, a Pierce Co. 21336 katalógusszámú terméke) kapcsolva biotiniláltuk. Az (1) lépésben alkalmazott rekombináns humán TPO-val megegyező standard mintát SDS-PAGE analízisnek vetettük alá, majd PVDF vagy nitrocellulóz membránon elektromos úton lenyomatot készítettünk, s primer antitestekként az egyes biotinilált antitesteket alkalmazva hagyományos Western analízist végeztünk. A membránt a lenyomatkészítést követően azonnal 5 percig TBS-sel, majd

315 • «•4 *» »»·· ·· ·4 ··*> «···· β · · · · ·· • · · · · · « « kétszer 5 percig TTBS-sel mostuk, s 60 percig blokkoló szerrel (Block Ace) kezeltük. A membránt ezután 60 percig 1 ug/ml biotinilált anti-TPO peptid antitestet, 0,05 % BSA-t és 10 % Block Ace-t tartalmazó TTBS oldattal kezeltük, és kétszer 5 percig TTBS-sel mostuk. A membránt 30 percig 10 % Block Ace-t tartalmazó TTBS oldattal 1:5000 arányban hígított, lúgos-foszfatázzal jelölt avidinnel (a Leinco Technologies Co. A108 katalógusszámú terméke) kezeltük, majd kétszer 5 percig TTBS oldattal, aztán 5 percig TBS oldattal mostuk. A membránt lúgos foszfatáz szubsztráttal (Bio-Rad

Co., katalógusszám: 170-6432) hívtuk elő. A leírt Western analízist szobahőmérsékleten végeztük, s bebizonyítottuk, hogy a humán TPO-t a tisztított antitestek felismerték, miáltal kimutatható volt.

71. példa

Anti-TPO peptid antitest-oszlopok készítése és a humán TPO kimutatása

A 69. példában előállított anti-humán TPO peptid antitestekről bebizonyítottuk, hogy felismerik a humán TPO-t. Ezeket az antitesteket anti-TPO peptid antitestoszlop készítése érdekében egymástól függetlenül kromatográfiás hordozóhoz kapcsoltuk. Példaként az antiHT1-2 peptid antitest-oszlop előállítását írjuk le.

(1) 5 mg/ml antitestet tartalmazó, 50 mM Na-foszfátból és

0,15 M NaCl-ból álló oldatot (pH = 8,0) készítettünk. Ezen

316 oldat 0,8 ml-ét 4 °C-on 2 óra hosszat 1,54 ml felduzzasztott formil-aktivált gélhez (Formyl-Gellulofine, Chisso Co.) kapcsoltuk, majd 10 mg/liter redukálószert (trimetil-borán, TMAB; a Seikagaku Kogyo K.K 680246 katalógusszámú terméke) tartalmazó 1,1 ml oldatot adtunk hozzá, s a kapcsolási reakciót további 4 óra hosszat folytattuk. Ezután a reakcióelegyből cewntrifugálással eltávolítottuk a gélt, majd 10 ml tiszta vizet adtunk hozzá, és a gélt centrifugálással ismét eltávolítottuk. Ezt négyszer megismételve eltávolítottuk a reagálatlan antitesteket. Az így tisztított gélt 4 °C-on 2 óra hosszat 2,1 ml blokkoló pufferrel (0,2 M Na-foszfát, 1 M etanol-amin, pH = 7,0) és a redukálószer 1,1 ml oldatával kezeltük, miáltal a nem reagált gél aktív csoportjait blokkoltuk. A kapott gélt végül centrifugálás alkalmazásával vízzel, 20 mM Tris-HCl és 0,15 M NaCl oldattal (pH = 8,0) mostuk. A gélt kis oszlopba töltöttük, melyet 3 M nátrium-toicianát oldattal és 0,1 M glicin-HCl (pH = 2,5) oldattal mostunk, majd 20 mM Tris-HCl és 0,15 M NaCl (pH = 8,0) oldattal ismét ekvilibráltuk. Az így elkészített oszlopot félretettük.

Az anti-HTl-2 antitest-oszlopon az anti-TPO peptid anitest gél kapcsolási hatásfoka az egyes IgG frakciókra max. 94,2 %. A gél térfogatára vonatkoztatva a gélhez kapcsolódó IgG frakció mennyisége 1,9 mg/ml. A fentivel megegyező módon gélt készítettünk, melyhez a gél térfogatára vonatkozhatva antigénként 21,8 mg/ml (TPO-val nem rendelkező) IgG-t kapcsoltunk. Az így kapott oszlopot a nem specifikusan

317 • ···· *· • · 9 · • · · · kötődő molekulák TPO antitest-oszlopokról való eltávolítása érdekében előoszlopként (a továbbiakban elő-antitest-oszlop) használtuk, amint azt a következő pontban leírjuk.

(2) Az alábbiakban másik példaként az anti-HTl-2 antitestoszlop előállítását írjuk le.

Az 1 ml gélt tartalmazó (1) pontban előállított előantitest-oszlophoz CHO sejtek (melyekbe a 119-124. számú szekvencia bármelyikének aminosav-szekvenciáját kódoló gént vittünk be, illetve azt bennük expresszáltuk) tenyészetének felülúszójából részlegesen tisztított rekombináns humán TPO standard mintát adtunk, s a gél térfogatára vonatkoztatva tízszeres térfogatú 20 mM Tris-HCl (pH = 8,0) és 0,15 M NaCl oldatot engedtünk át rajta. Az átfolyt frakciót összegyújtöttük, majd az elő-antitest-oszlopon adszorbeált frakciót a gélre vonatkoztatva tízszeres térfogatú savas eluenssel (0,1 M glicin-HCl, pH = 2,5) eluáltuk. Ezután az előző átfolyt frakciót az (1) pontban előállított (2 ml gélt tartalmazó) anti-HTl-2 antitest-oszlopra vittük, és az oszlopot 10-szeres géltérfogatú 20 mM Tris-HCl (pH = 8,0) és 0,15 M NaCl oldattal mostuk, s összegyűjtöttük az átfolyt frakciót. Az anti-HTl-2 oszlopon adszorbeált frakciót nyolcszoros géltérfogat savas eluenssel (0,1 M glicin-HCl, pH = 2,5). E frakciókat SDS-PAGE analízissel vizsgáltuk, s igazoltuk, hogy a TPO nem adszorbeálódott az elő-antitestoszlopon, miközben specifikusan kötődött az anti-HTl-2 oszlophoz (s ez utóbbihoz majdnem az összes TPO kötődött).

• · ···

318

Ezen eredmények alapján bebizonyosodott, hogy az anti-HTl-2 oszlophoz a gél térfogatára vonatkoztatva legalább 200-300 pg/ml TPO kötődött.

72. példa

A TPO vérlemezkszámot fokozó hatása nyolchetes normál hím ICR egeret (melyekből szemüregi vénájukon keresztül előzetesen vért vettünk, és F-800 [Toa Iyo Denshi] mikrosejt-számláló alkalmazásával meghatároztuk vérlemezkeszámukat) véletlenszerűen négy csoportra osztottunk. Az egyik csoport (kontroll-iv csoport) egereit öt egymás utáni napon keresztül naponta egyszer intravénásán 100 pl PBS-sel oltottuk. Egy másik csoportba (TPO-iv csoport) tartozó egereket öt egymás utáni napon keresztül naponta egyszer intravénásán az alábbiak szerint készített oldattal oltottuk: az SP Sepharose Fást Flow oszlop 56.

példában kapott TPO-aktív F2 frakciójának koncentrált oldatát NAP-25 oszlop (a Pharmacia Biotech 17-0852-02 katalógusszámú terméke) alkalmazásával PBS-sel helyettesítettük, majd PBS-sel hígítottuk (az M-07e vizsgálat alapján a relatív aktivitás: 211900). A következő csoport (kontroll-sc) egereit öt egymás utáni napon keresztül naponta egyszer szubkután 100 μΐ PBS-sel oltottuk. Δ negyedik csoportba (TPO-sc csoport) tartozó egereket a

TPO-iv csoporthoz hasonlóan öt egymás utáni napon keresztül naponta egyszer 100 pl oldattal szubkután oltottuk. Az injektálások megkezdésétől számított 6., 8., 10., 13. és 15.

319 »··· ·· »··« *» ·► • · · · « fc » t • · · · · ·· • · · «««te · ·· ···· ·· ·· <· napon valamennyi egér szemüregi vénájából vért vettünk, s mikrosejt-számlálóval (F-890, Toa Iyo Denshi) megszámoltuk a vérlemezkéket. A vérlemezkék számának változásait a 24.

ábrán mutatjuk be. Eszerint, a kontroll-iv csoportban a vérlemezkeszám a beadás előtti értékhez viszonyítva a 6. napon (amikor a vérlemezkeszám a legmagasabb volt; a 0. nap a beadás napja) 44 %-kal nőtt, a kontroll-sc csoportban pedig a 8. napon (amikor a vérlemezkeszám a legmagasabb volt) is csak 47 %-kal növekedett. A TPO-iv csoportban a vérlemezkeszám a beadás előtti értékhez viszonyítva a 6. napon 177 %-kal nőtt, a TPO-sc csoportban pedig már a 6. napon 347 %-os, a 8. napon pedig 493 %-os növekedést tapasztaltunk.

A fenti eredmények alapján bizonyossá vált, hogy a humán TPO a vérlemezkék számát típusaik különbségeitől, valamint a beadás módjától függetlenül fokozza.

73. példa

A TPO vérlemezkék számát fokozó hatása tizenegy hetes normál hím C3H/HeJ egeret (melyekből szemüregi vénájukon keresztül előzetesen vért vettünk, és F-SOO [Toa Iyo Denshi] mikrosejt-számláló alkalmazásával meghatároztuk vérlemezkeszámukat) véletlenszerűen négy csoportra osztottunk. Az egyik csoport (kontroll csoport) egereit öt egymás utáni napon keresztül naponta egyszer szubkután 100 pl PBS-sel oltottuk. Egy másik csoportba

320 (TPO-1 csoport) tartozó egereket öt egymás utáni napon keresztül naponta egyszer szubkután az alábbiak szerint készített oldat 100 μΐ-ével oltottuk: Sephacryl S-200HR oszlop 56. példában kapott TPO-aktív frakcióját NAP-25 oszlop (a Pharmacia Biotech 17-0852-02 katalógusszámú terméke) alkalmazásával PBS-sel helyettesítettük, majd PBSsel hígítottuk (az M-07e vizsgálat alapján a relatív aktivitás: 83000). A következő csoport (TPO-2 csoport) egereit öt egymás utáni napon keresztül naponta egyszer szubkután a TPO-1 csoportban alkalmazott TPO-aktív frakció PBS-sel készített kétszeres hígításának 100 μΐ-ével (relatív aktivitás M-07e vizsgálat alapján: 41500) oltottuk. A negyedik csoportba (TPO-3 csoport) tartozó egereket öt egymás utáni napon keresztül naponta egyszer szubkután a TPO-2 csoportban alkalmazott TPO-aktív frakció PBS-sel készített kétszeres hígításának 100 μΐ-ével (relatív aktivitás M-07e vizsgálat alapján: 20750) oltottuk.

Az injektálások megkezdésétől számított 6., 8., 10. és 12. napon valamennyi egér szemüregi vénájából vért vettünk, s mikrosejt-számlálóval (F-800, Toa Iyo Denshi) megszámoltuk a vérlemezkéket.

A vérlemezkék számának változásait a 25. ábrán mutatjuk be.

A kontroll csoportban a vérlemezkék számában jóformán semmilyen változást nem tapasztaltunk, míg a TPO-val injektált csoportokban nőtt a vérlemezkeszám, s mindegyik esetben az injektálás utáni 8. napon érte el csúcspontját. A • ·

- 321 csoportok között dózisfüggő különbségek voltak. A TPO-1 csoportban már a 6. napon kb. 200 %-os növekedést észleltünk, majd a 8. napon ez 270 %-ra nőtt, ezután azonban csökkenést tapasztatunk: a 12. napon már csak kb. 65 %-os növekedést észleltünk (a kontroll csoporthoz képest szignifikáns különbséggel; Dunnett-féle többszörös összehasonlító teszt alapján p < 0,01). A TPO-2 csoportban hasonló növekedést észleltünk, bár a fokozó hatás kisebb volt, mint a TPO-1 csoportban; a 6. napon 140 %-os, a 8. napon 160 %-os növekedést tapasztaltunk. A 12. napon a vérlemezkeszám majdnem a kontroll csoport szintjére csökkent. A TPO-3 csoportban a fokozó hatás még kisebb volt, mint a TPO-2 csoportban; a 8. napon volt a legmagasabb vérlemezkeszám, ami kb. 110 %-os növekedésnek felelt meg, a kontroll csoporthoz képes szignifikáns különbséggel (p < 0,01).

A fenti eredmények alapján bebizonyosodott, hogy a humán TPO az egértörzstől függetlenül fokozza a vérlemezkeszámot, s hatása dózisfügggő.

74. példa

A TPO rákellenes szer beadása okozta trombocitopéniára gyakorolt gátló hatása

Harminc nyolchetes hím ICR egeret 200 mg/kg 5-FU-val intravénásán oltottunk, majd az egereket véletlenszerűen egyenként 15 egérből álló két csoportra osztottuk. A

- 322 következő naptól (1. nap) kezdve az egyik (kontroll) csoportot öt egymást követő napon keresztül naponta egyszer szubkután 100 jul PBS-sel, míg a másik (TPO) csoportot (szintén öt egymást követő napon keresztül napi egy alkalommal) a 72. példában használt TPO-aktív frakció (relatív aktivitás az M-07e vizsgálat alapján: 211900) 100 tfl-ével szubkután oltottuk. A 4., 6. és 8. napon mindkét csoportból véletlenszerűen 5-5 egeret választottunk ki, s ezek szemüregi vénájából gyűjtött vérben mikrosejtszámlálóval (E-2500; a Toa Iyo Denshi terméke) meghatároztuk a vérlemezkék számát. A vérlemezkék számának változásait a

26. ábrán mutatjuk be. A kontroll csoportban a vérlemezkék száma az 5-FU beadása után a napok múlásával csökkent, és a

6. napon érte el a legkisebb értéket (az 5-FU beadása előtti szint kb. 28 %-át), bár a 8. napon a csökkenés hatására kb. 1,3-szeres emelkedést észleltünk. A vérlemezkék száma az

5-FU beadás után a TPO csoport esetében is csökkent (a napok előrehaladásával), és a 6. napon érte el a legkisebb értéket (az 5-FU beadása előtti szint kb. 52 %-át). A 4. és 6. napon azonban nagyon kis különbség volt a vérlemezkék száma között. A 6. napon a kontroll csoporthoz képest szignifikánsan (a Dunnet-féle sokszoros összehasonlító teszt alapján p < 0,05) magas érték maradt fenn. A 8. napon a vérlemezkék száma az 5-FU beadása előtti értékhez képesr 200 %-kal emelkedett.

A fentebb említett eredmények alapján bebizonyosodott, hogy a humán TPO gátolja a vérlemezkék rákellenes szer által • · · · · · • · · • * « • · · · • · · ·

- 323 okozott csökkenését.

75. példa

A TPO trombocitopéniára gyakorolt gyógyászati hatása héthetes hím ICR egérnek intravénásán nimusztinhidrokloridot (ACNU) (50 mg/kg) adtunk be, és az egereket véletlenszerűen két, egyenként 18 egérből álló csoportra osztottuk. A következő naptól (1. nap) kezdve az egyik (kontroll) csoportot egymást követő napokon naponta kétszer szubkután 200 pl PBS-sel, a másik csoportot pedig, szintén egymást követő napokon naponta kétszer szubkután a 73.

példában alkalmazott, PBS-sel végzett hígítás nélküli TPOaktív frakció (melyhez 0,04 % Tween 80-at adtunk) 200 elével (relatív aktivitás az M-07e vizsgálat alapján: 380000) oltottuk..

Az injektálás után a két csoportba tartozó egereket három csoportba osztottuk; az egyik csoportból az 5. és 12. napon, a másik csoportból a 8. és 14. napon, a harmadik csoportból pedig a 10. napon vettünk vért. A vért az egerek szemüregi vénájából vettük, s a vérlemezkék számát mikrosejtszámlálóval (F-800; Toa Iyo Denshi) határoztuk meg. A vérlemezkék számának változásait a 27. ábrán mutatjuk be.

Eszerint, a kontrol csoportban a vérlemezkék száma az ACNU beadása után a napok előrehaladtával csökkent, a 8-10. napon érte el minimumát (az ACNU beadása előtti érték kb. 29 %-a), s a 12. és 14. napon a vérlemezkeszám növekedése csak kb. 49 ····

- 324 %, illetve kb. 74 % volt. A TPO csoportban az 5. napon a vérlemezkék száma az ACNU beadása előtti szinthez viszonyítva kb. 38 %-ra csökkent, majd ezután a csökkenés növekedésbe ment át, így a 8. napon a vérlemezkeszám az ACNU beadása előtti szinthez viszonyítva kb. 63 % volt, a 10. napon és azután pedig az ACNU beadása előtti szint fölé emelkedett — a 12. napon kb. 300 %-os, a 14. napon kb. 400 %-os emelkedést jegyeztünk fel.

A 8-10. napon, amikor a kontroll csoportban vérlemezkeszám csökkenést tapasztaltunk, a TPO csoportban már növekedést észleltünk, s a 10. napon a vérlemezkeszám már magasabb volt, mint az ACNU beadása előtt. Ezek alapján bebizonyosodott, hogy a humán TPO elősegíti a rákellenes szer által okozott trombocitopénia javulását.

A 74. példa eredményeit is figyelembe véve azt várjuk, hogy a humán TPO a rákellenes szer típusától függetlenül gátolja a vérlemezkeszám csökkenését és elősegíti a trombocitopénia javulását.

76. példa

A TPO csontvelősejtek beadása (BMT) utáni trombocitopéniára gyakorolt gyógyászati hatása héthetes hím C3H/HeN egeret teljes testfelületükön 10 Gyvel radioaktív sugárkezelésnek vetettünk alá, s közvetlenül utána intravénásán ugyanezen törzsbe tartozó egerekből

- 325 származó 1 x 10⁶ csontvelősejtet injektáltunk beléjük. Az egereket ezután véletlenszerűen két csoportra osztottuk, s a következő naptól (1. nap) kezdve az egyik csoportot (kontroll csoport) PBS-sel, míg a másik csoportot (TPO csoport) a 73. példában alkalmazott TPO frakcióval (relatív aktivitás: 44000) oltottuk, mindkét esetben 20 egymást követő napon keresztül naponta egyszer 100 pl dózisban, szubkután.

Az injektálás megkezdése után az 5., 10., 14. és 21. napon véletlenszerűen 6-6 egeret választottunk ki, szemüregi

vénájukból vért vettünk,	s a	vérlemezkék	számát
mikrosejt-számlálóval (E-2500;	a Toa	Iyo Denshi	terméke)
meghatároztuk.
A vérlemezkeszám változásait	a 28.	ábrán mutatjuk be.

Eszerint, a BMT beadása után a vérlemezkeszám a napok előrehaladtával mindkét csoportban csökkent, s a 10. napon érte el minimumát (a BMT alkalmazása előtti szint kb. 3 %-át). Ezután fokozatos javulást jegyeztünk fel; a 14. napon a kontroll csoportban kb. 11 %-os, a TPO csoportban kb. 13 %-os szint mellett. A 21. napon a kontroll csoportban csak 37 %-os javulást tapasztaltunk, míg a TPO csoportban a javulás kb. 65 % volt, ami után jelentős felépülést elősegítő hatást tapasztaltunk. A fenti eredmények alapján bebizonyítottuk, hogy az 56. példa szerint előállított humán TPO elősegíti a vérlemezkeszám BMT alkalmazása utáni növekedését.

326

77. példa

A TPO radioaktív sugárkezelés utáni trombocitopéniára gyakorolt gyógyászati hatása nyolchetes hím ICR egeret teljes testfelületükön 5 Gy röntgensugárzással kezeltünk, és az egereket véletlenszerűen két csoportra osztottuk. A következő naptól (1. nap) kezdve az egyik csoportot (kontroll csoport) PBS-sel, míg a másik csoportot (TPO csoport) a 73. példában alkalmazott TPO frakcióval (relatív aktivitás az M-07e vizsgálat alapján: 1440000) három egymás utáni napon át naponta egyszer szubkután, majd a következő naptól kezdve szintén szubkután, hét egymás utáni napon keresztül naponta egyszer 360000 relatív aktivitású TPO frakcióval oltottuk. Az injektálás megkezdése után valamennyi csoportot véletlenszerűen három csoportra osztottuk: az elsőből a 4., 11. és 21. napon, a másodikból a 7. és 13. napon, a harmadikból pedig a 9. és 15. napon vettünk vért (a vérvétel a szemüregi vénából történt, és a vérlemezkeszámot mikrosejt-számlálóval (F-800;

Toa Iyo Denshi) határoztuk meg). A vérlemezkeszám változásait a 29. ábrán mutatjuk be. Eszerint, a kontroll csoportban a vérlemezkeszám a röntgensugárzás után a napok előrehaladásával csökkent, s a 9. napon érte el minimumát (a röntgensugárzás előtti szint kb. 25 %-át). A 11. és 13.

napon a vérlemezkeszám kb. 38 %-ra, illetve kb. 67 %-ra emelkedett, a 15. napon pedig elérte a röntgensugárzás előtti szintet. A TPO csoportban a vérlemezkeszám a 7. napon a röntgensugárzás előtti szint 24 %-ra csökkent, majd ezután *···

- 327 emelkedést tapasztaltunk, és a 9. napon kb. 82 %-ot ért el. A 11. napon és azután a vérlemezkeszám a besugárzás előtti szintnél magasabb volt, s ez a tendencia fennmaradt egészen a 21. napig. Amint említettük, a 9. napon, amikor a kontroll csoportban a vérlemezkeszám még csökkent, a TPO csoportban már emelkedett, és a 11. napon és azután a besugárzás előtti szintnél magasabb volt. Ezzel szemben, a kontroll csoportban a vérlemezkeszám eredeti szintre emelkedéséhez 15 napra volt szükség. Ezen eredmények alapján bebizonyosodott, hogy az 56. példában előállított humán TPO lerövidíti a vérlemezkeszám röntgensugárzás utáni helyreállásához szükséges időt, és a röntgensugárzás utáni trombocitopéniára gyógyászati hatást fejt ki.

78. példa

A hTP0163 vérlemezkeszám-növelő hatása egészséges hím C3H/HeN egérből szemüregi vénájukon keresztül vért vettünk, és mikrosejt-számlálóval (F-800; Toa

Iyo Denshi) meghatároztuk a vérlemezkék számát. Az egereket ezután véletlenszerűen négy csoportra: egy kontroll csoportra és A, B, valamint C csoportra osztottuk. A kontroll csoportban az egereket 0,1 % egérszérumot tartalmazó PBS-sel öt egymás utáni napon keresztül naponta egyszer szubkután oltottuk. Az A, B és C csoportba tartozó egereket öt egymás utáni napon keresztül az SP Sepharose

Fást Flow oszlop 65. példában kapott (0,1 % egérszérumot tartalmazó) TPO-aktív frakciójával szubkután oltottuk, a

328 hTP0163 M-07e vizsgálattal meghatározott relatív aktivitása alapján napi körülbelül 40 000 000/testtömeg-kilogramm, körülbelül 8 000 000/testtömeg-kilogramm, illetve körülbelül 1 600 000/testtömeg-kilogramm dózissal.

Az injektálás utáni 6., 8., 10. és 12. napon valamennyi egér szemüregi vénájából vért vettünk, és mikrosejt-számlálóval (F-800; Toa Iyo Denshi) meghatároztuk a vérlemezkék számát.

A vérlemezkeszám változásait a 30. ábrán mutatjuk be.

A kontroll csoportban a vérlemezkeszám szinte semmit nem változott, míg a TPO-val kezelt valamennyi csoportban vérlemezkeszám-növekedést figyeltünk meg, amely az injektálás utáni 8. napon érte el maximumát. A TPO csoportok között dózisfüggő kapcsolatot figyeltünk meg. Ilyenformán, az A csoportban a 6. napon kb. 88 %-os, a 8. napon kb. 100 %-os emelkedést jegyeztünk fel, s a vérlemezkeszám még a 10. napon is kb. 97 %-os emelt szinten maradt, miközben valamennyi érték szignifikáns különbséget mutat a kontroll csoporthoz képest (Dunnet-féle sokszoros összehasonlító teszt alapján p < 0,01). A B csoportban is hasonló vérlemezkeszám-növekedést tapasztaltunk, bár a növekedés mértéke kisebb volt, mint az A csoportban: a 6.

napon 65 %-os, a 8. napon pedig 84 %-os emelkedést jegyeztünk fel (a kontroll csoporthoz képest szignifikáns különbséggel; Dunnet-féle sokszoros összehasonlító teszt alapján p < 0,01, ill. 0,05). A C csoportban a vérlemezkeszám-növelő hatás még kisebb volt, mint a B • *

- 329 csoportban, a 8. napon (amikor a legnagyobb értéket jegyeztük fel) 31 %-os emelkedést észleltünk. Ezen eredmények alapján bebizonyosodott, hogy a 65. példában előállított hTPO163 fokozza a vérlemezkék számát, s dózisfüggő hatást mutat.

79. példa

A hTP0163 trombocitopéniára gyakorolt gyógyászati hatása

100 nyolchetes hím C3H/HeN egeret intravénásán 50 mg/kg nimusztin-hidrokloriddal (ACNU) oltottunk be, majd négy csoportot alakítottunk ki: egy kontroll csoportot, illetve A, B, és C csoportot (mindegyik csoport 25 egérből állt). A következő naptól (1. nap) a kontroll csoportba tartozó egereket egymás utáni napokon keresztül naponta egyszer szubkután 5 ml/kg PBS-sel oltottuk. Az A, B és C csoportba tartozó egereket egymás utáni napokon keresztül az SP

Sepharose Fást Flow oszlop 65. példában kapott (0,1 % egérszérumot tartalmazó) TPO-aktív frakciójával szubkután oltottuk, a hTP0163 M-07e vizsgálattal meghatározott relatív aktivitása alapján napi körülbelül 16 000 000/testtömegkilogramm, kb. 48 000 000/testtömeg-kilogramm, illetve kb. 160 000 000/testtömeg-kilogramm dózissal.

Az injektálás megkezdése után az egyes csoportokba tartozó egereket véletlenszerűen öt csoportra osztottuk, s az 5., 8., 10., 12. és 14. napon az egerek szemüregi vénájából vért vettünk, és mikrosejt-számlálóval (F-800; Toa Iyo Denshi) ····

- 330 »· ··· ·· meghatároztuk a vérlemezkék számát. A vérlemezkeszám változásait a 31. ábrán mutatjuk be. A kontroll csoportban a vérlemezkeszám az ACNU beadása után a napok elteltével csökkent, s a 8-10. napon érte el minimumát (az ACNU beadása előtti szint kb. 15-16 %-át). A 12. és 15. napon a vérlemezkeszám mindössze 28 %-ra, illetve 51 %-ra emelkedett. Az A csoportban a vérlemezkeszám a 8. napon az

ACNU beadása előtti érték kb. 25 %-ra csökkent. Ezután a vérlemezkeszám növekedni kezdett, és a 10. napon az eredeti érték kb. 34 %-ára, a 12. napon pedig kb. 89 %-ára emelkedett. A 14. napon a vérlemezkeszám magasabb volt, mint az ACNU beadása előtt.

Amint fentebb említettük, a legkisebb vérlemezkeszámot valamennyi csoport esetében a 8. napon észleltük. Azokban a csoportokban, melyeket TPO-val kezeltünk, a csökkenés lassabb volt, mint a kontroll csoportban. A kontroll csoportban a vérlemezkeszám a 10. napon alig emelkedett, míg a TPO-val kezelt csoportok mindegyikében — bár különböző mértékben — növekedést tapasztaltunk. Az 50 pg/kg dózissal kezelt csoportban a 12. napon az ACNU beadása előtti értéket meghaladó javulást észleltünk. Figyelembe véve, hogy a kontroll csoportban a 14. napon a vérlemezkék száma az ACNU beadása előtti érték csupán 54 %-ára emelkedett, nyilvánvaló, hogy a 65. példában előállított hTP0163 elősegíti a vérlemezkeszám csökkenésének visszafordítását. Ilyenformán bebizonyosodott, hogy a hTPO163 gyógyászati hatást gyakorol a rákellenes szer által okozott

- 331 ···· ·· • * · » trombocitopéniára.

Az alábbiakban gyógyszerészeti készítmények példáit írjuk le.

80. példa

Az 56. példában kapott humán TPO frakciót bekoncentráltuk, sterilizáltuk és -20 ’C-on fagyasztottuk, miáltal injekciós készítményként alkalmazható fagyasztott terméket kaptunk.

81. példa

Az 56. példában kapott humán TPO frakciót bekoncentráltuk, 5 ml-ét steril eljárással 10 ml-es üvegfiolába töltöttük, -20 ’C-on fagyasztva szárítottuk, s az üvegfiolát gunidugóval lezárva injekciós készítményként alkalmazható fagyasztva szárított terméket kaptunk.

82. példa

Az 56. példában kapott humán TPO frakciót bekoncentráltuk, steril filtrálással szűrtük, és 10 ml-es üvegfiolába töltöttük, miáltal injekciós készítményként alkalmazható terméket kaptunk.

332

83. példa

A 65. példában kapott hTP0163 frakciót bekoncentráltuk, sterilizáltuk és -20 ’C-on fagyasztottuk, miáltal injekciós készítményként alkalmazható fagyasztott terméket kaptunk.

84. példa

A 65. példában kapott humán TPO frakciót bekoncentráltuk, 5 ml-ét steril eljárással 10 ml-es üvegfiolába töltöttük, -20 ’C-on fagyasztva szárítottuk, s az üvegfiolát gunidugóval lezárva injekciós készítményként alkalmazható fagyasztva szárított terméket kaptunk.

85. példa

A 65. példában kapott humán TPO frakciót bekoncentráltuk, steril filtrálással szűrtük és 10 ml-es üvegfiolába töltöttük, miáltal injekciós készítményként alkalmazható terméket kaptunk.

86. példa

Az 57. példában kapott humán TPO frakciót bekoncentráltuk, sterilizáltuk és -20 ’C-on fagyasztottuk, miáltal injekciós készítményként alkalmazható fagyasztott terméket kaptunk.

V ····

333

87. példa

Az 57. példában kapott humán TPO frakciót bekoncentráltuk, 5 ml-ét steril eljárással 10 ml-es üvegfiolába töltöttük, -20 ’C-on fagyasztva szárítottuk, s az üvegfiolát gunidugóval lezárva injekciós készítményként alkalmazható fagyasztva szárított terméket kaptunk.

88. példa

A 65. példában kapott humán TPO frakciót bekoncentráltuk, steril filtrálással szűrtük és 10 ml-es üvegfiolába töltöttük, miáltal injekciós készítményként alkalmazható terméket kaptunk.

89. példa

Aplasztikus kutya vérplazma

Korábbi leírások szerint (Mazur, E. és South, K., Exp. Hematol., ±2, 1164-1172, 1985; Arriaga, M. , South, K.,

Cohen, J.L. és Mazur, E.M., Blood, SS, 486-492, 1987; Mazur, E., Basilico, D. , Newton, J.L., Cohen, J.L., Charland, C., Sohl, P.A. és Narendran, A., Blood, 76. 1771-1782, 1990) heparinnal kezelt aplasztikus kutya vérplazmát (APK9), illetve normális kutya vérplazmát (NK9) állítottunk elő, azzal a különbséggel, hogy a teljes testfelület besugárzását 450 rád dózissal végeztük.

334

90. példa

Humán megakariocita vizsgálat

Az alábbi példákban leírt eljárások standard módszerei, illetve alternatív eljárásaik széles körben elfogadott molekuláris biológiai kézikönyvekben megtalálhatók; pl. Sambrook és mtsi. (szerk.), Molecular Cloning, Második kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987); Ausubel és mtsi. (szerk.), Current Protocols in Molecular Biology, Green associates/Wiley Interscience, New York (1990).

Az APK9-et és a frakcionált APK9-et azon képességükre vizsgáltuk, hogy képesek-e serkenteni a humán megakariociták CD34·*· őssejtekből történő kifejlődését. A CD34-szelektált sejteket korábbi leírás szerint (Hokom, M.H., Choi, E., Nichol, J.L., Hornkohl, A., Arakawa, T. és Hunt, P., Molecular Biology of Haematopoiesis, 3, 15-31, 1994) perifériás vérsejtekből nyertük, és 1 % glutamin Pen-streppel (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) és 10 % heparinizált, kis vérlemezkeszámú humán AB vérplazmával kiegészített Iscove-féle módosított Eagle tápközegben (IMDM; GIBCO, Grand Island, NY) inkubáltuk. A tápközegben az alábbi összetevők voltak még jelen: 2-merkapoto-etanol (10^-4 M), piroszőlősav (110 ;jg/ml), koleszterin (7,8 £Jg/ml), adenozin, guanin, citidin, uridin, timidin, 2-dezoxi-citozin, 2-dezoxiadenozin, 2-dezoxi-guanozin (mindegyik 10 ^g/ml; Sigma) rekombináns humán inzulin (10 ^g/ml), humán transzferrin (300 ^g/ml), szójabab lipidek (1 %, Boehringer Mannheim, • ·

- 335

Indianapolis, IN), rekombináns humán bázikus fibroblaszt növekedési faktor (2 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), rekombináns humán epidermális növekedési faktor (15 ng/ml), vérlemezke-eredetű növekedési faktor (10 ng/ml, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA). A CD34-szelektált sejteket 15 ul végtérfogatban 2 x 10⁵ mennyiségben Terasaki-típusú mikrotiter lemezek (Vanguard, Inc., Neptune, NJ) üregeibe helyeztük. A sejteket párásított dobozokban 5 % COz-ot tartalmazó levegőben 37 ’C-on 8 napig inkubáltuk, 1 %-os glutár-aldehiddel közvetlenül a tenyésztő üregekhez rögzítettük, és monoklonális antitestek keverékével (anti-GPIb, anti-GPIIB, Biodesign) és anti-GPIIb-vel (Dako, Carpinteria, CA) együtt inkubáltuk. Az immunreakció előhívásához sztreptavidin-G-galaktozidáz detektáló rendszert (HistoMark, Kirkegaard and Perry) alkalmaztunk. A kék színnel azonosított megakariocitákat inverziós fáziskontraszt mikroszkóppal 100-szoros nagyítással számoltuk. Az eredményeket a megakariociták üregenként! száma ± középérték szórása (SEM) értékként adtuk meg. Néhány esetben az eredményeket megakariocita egység/ml értékként adtuk meg, amely esetben egy egység a vizsgált anyag azon mennyisége, amely ugyanannyi megakariocita kifejlődését eredményezi, mint 1 μΐ APK9 standard. Az aktivitást az MPL ligandumnak tudtuk be, ha az 5-10 ug/ml MPL-X-szel (szolubilis Mpl receptor) blokkolható volt.

Az APK9-ről kimutattuk, hogy olyan faktor(oka)t tartalmaz, amely(ek) e rendszerben serkenti(k) a humán megakariociták • · · ·

- 336 kifejlődését. A 10 % NK9 jelenlétében 8 napig inkubált CD34-szelektált sejtek elhanyagolható mennyiségű kékre festődő megakariocitát eredményeznek, míg a 10 % APK9 jelenlétében 8 napig inkubált CD34-szelektált sejtek nagy számú kékre festődő megakariocitát eredményeznek.

A 32. ábrán látható, hogy a humán megakariocita tenyészetrendszerhez adott Mpl-X növekvő koncentrációi egyre növekvő mértékben blokkolják a megakariociták fejlődését. 5 pg/ml-nél nagyobb Mpl-X-koncentrációknál a gátlás teljes. Ebben a kísérletben a CD34-szelektált sejteket 5 % APK9-cel stimuláltuk. Ez azt bizonyítja, hogy a humán megakariociták fejlődéséhez az Mpl-X-szel (feltételezett Mpl ligandum) kölcsönhatásba lépő aktivitás szükséges, s azt sugallja, hogy az Mpl ligandum magéban az APK9-ben van jelen.

Kimutattuk azt is, hogy a humán megakariociták fejlődéséhez szükséges Mpl ligandum aktivitás az APK9-ben helyezkedik el. Az APK9-et (135 ml) Iscove-féle tápközegben 9-szeresére hígítottuk, majd Mpl-X affinitás oszlopra vittük fel. A nem kötődő (átfolyt) anyagot összegyűjtöttük és a vizsgálat előtt eredeti térfogatára koncentráltuk. A kötött anyagot 10 ml 1 M NaCl oldatban eluáltuk, és az eluátum 20 %-át diafiltráltuk és a vizsgálathoz 4-szeresére koncentráltuk. A tápközegben önmagukban inkubált CD34-szelektált sejtek nem fejlődtek megakariocitákká. Az 5 % APK9 (az oszlopra felvitt frakcióval azonos) jelenlétében inkubált sejtekből üregenként 48 ± 8 megakariocita fejlődött ki. A nem kötődött · « ·

- 337 anyag 10 %-os koncentrációjával inkubált sejtek nem fejlődtek megakaripcitákká, míg az eluált frakció 10 %-os koncentrációjával inkubált sejtekből üregenként 120 ± 44 megakariocita fejlődött ki. Az oszlopra felvitt és az elúciós frakció aktivitása a vizsgálatban 5 ^g/ml Mpl-X-szel gyakorlatilag teljesen gátolható volt.

91. példa

Egér vagy humán Mpl receptor tranfektálása egér sejtvonalba

A) Egér Mpl receptor

A teljes hosszúságú egér Mpl receptor cDNS-t Moloney Murine Sarcomé vírus LTR-ből származó transzkripciós promotert tartalmazó expressziós vektorba szubklónoztuk. E konstrukció 5 í/g-ját és a pWLNeo szelektálható marker plazmid (Stratagene) 1 . pg-ját együttes elektroporációval IL-3-dependens egér sejtvonalba (32D, 23. klón; Greenberger és mtsi, PNAS, fí£), 2931-2936, 1983) vittük be. A sejteket 5 napig tenyésztettük, majd 800 pg/ml Geneticint (G418, Sigma) és 1 ng/ml egér IL-3-at tartalmazó szelekciós tápközegben inkubáltuk. Az életbenmaradt sejteket 2 x 10⁵ sejtből álló csoportokra osztottuk, s ezeket további vizsgálathoz alkalmas populáció kifejlődéséig tenyésztettük. Hat populációt poliklonális nyúl anti-peptid szérum alkalmazásával FACS analízissel az Mpl receptor felületi expressziójára teszteltünk. Az előbbi szérum alkalmazásával végzett FACS analízishez egy populációt választottunk ki. A • · · ♦ ·

- 338 szülői sejtvonal egysejtes kiónjait 10 % APK9 és Geneticin jelenlétében végzett növesztéssel szelektáltuk ki. APK9-ben 35 napig végzett szelekció után a sejteket 1 ng/ml koncentrációjú egér IL-3-ban tartottuk. Az egyik szubklónt (1A6.1) használtuk a kísérlethez.

B) Humán Mpl receptor

A teljes hosszúságú humán Mpl receptor szekvenciát (Vígon, I. és mtsi, PNAS, £3, 5640-5644, 1992) Moloney Murine

Sarcoma vírus transzkripciós promotert tartalmazó expressziós vektorba (az egér receptorhoz alkalmazottal azonos vektor) szubklónoztuk. E konstrukció 6 mikrogrammját és 6 mikrogramm amfotrőf retrovírus packaging konstrukciót (Landau, N.R., Littman, D.R. , J. Virology, £6, 5110-5113, 1992) CaP04 emlős transzfektáló készlet (Stratagene) 3 x 10⁶ darab 293 sejtbe szubklónoztuk. E nap múlva, majd négy nap múlva újratranszfektáltuk. Az utolsó transzfekció utáni napon a 293 sejteket IL-3-dependens egér sejtvonallal (32D, 23. klón; Greenberger és mtsi, PNAS, 80. 2931-2936, 1983) együtt tenyésztettük. 24 óra elteltével a 32D sejteket kinyertük és BSA gradiensben (Path-o-cyte; Mills Inc.) sávokat alakítottunk ki. A sejteket 1 ng/ml egér IL-3-ban majd 20 %-os APK9-ben növekedésre

A sejteket poliklonélis nyúl anti-peptid alkalmazásával sejteket két szaporítottuk, szelektáltuk.

szerűm alkalmazásával FACS analízissel receptor sejtfelületi expresszálására osztályoztuk. A kapott sejteket

339 a vizsgálatokban alkalmaztuk.

92. példa

Az Mpl ligandum 1A6.1 vizsgálata

Az 1Δ6.1 sejteket IL-3-tól mentesre mostuk, és üregenként 1000 sejt/15 pl összes col mennyiségben Terasaki típusú mikrotiter lemezeken 10 % magzati borjúszérummal (FCS),

Geneticinnel (800 pg/ml) és 1 % pen/strep-pel (Gibco) kiegészített alfa-MEM tápközegben (Gibco) a tesztminták 1:1 arányú sorozathígításával tenyésztettük. 48 óra elteltével az üregekben az életképes sejtek számát mikroszkóppal meghatároztuk. Egy aktivitási egység definíció szerint az az aktivitás, amely üregenként 200 életképes sejtet eredményez.

Az aktivitást az Mpl ligandumnak tudtuk be, ha a vizsgálatban 5-10 pg/ml Mpl-X-szel tejesen blokkolható volt. Az APK9-ben az Mpl ligandum aktivitás az aplasztikus vérplazma térfogatára vonatkoztatva átlagosan 4400 ± 539 egység/ml volt. Ha másképpen nem jelezzük, az Mpl ligandum aktivitás egységeit az 1A.1 vizsgálatban határozzuk meg.

A humán Mpl receptor génnek transzfektált sejtek esetében lényegében azonos módon végeztük, mint az 1A6.1 sejtekkel.

93. példa

Annak bizonyítása, hogy az Mpl ligandum jelen van az egérből, kutyából, sertésből és emberből származó szérumban vagy aplasztikus plazmában • · · · · · «··· · ·

340

Az Mpi ligandum jelen van az egér, kutya, sertés és ember forrásból származó szérumban vagy aplasztikus plazmában (9. táblázat). BDF1 egerekből a vérplazmát a besugárzás előtt és a besugárzás (500 rád) után 12 nappal vettünk. A vérplazmát az 1A6.1 vizsgálatban teszteltük, s 2000 egység/ml aktivitást mutattunk ki, ami Mpl-X-szel (10 ug/ml) teljesen gátolható volt. A sugárkezelt egér vérplazma a humán megakariocita vizsgálatban is pozitív volt; itt 1833 egység/ml aktivitást mutatott. Kutyákból a vérplazmát a besugárzás előtt, illetve a besugárzás (450 rád) után 10 nappal vettük, s az 1A6.1 vizsgálatban és a humán megakariocita vizsgálatban egyaránt teszteltük. Mindkét vizsgálatban kimutattuk az aktivitást, amely Mpl-X-szel (10 ug/ml) teljesen gátolható volt. Sertésekből a vérplazmát a besugárzás előtt, illetve a besugárzás (650 rád) után 10 nappal vettük, s az 1A6.1 vizsgálatban és a humán megakariocita vizsgálatban egyaránt teszteltük. A vérplazma mindkét vizsgálatban mutatott az aplasztikus kutya vérplazmában találthoz hasonló Mpl ligandum aktivitást (ami 10 ug/ml Mpl-X-szel teljesen gátolható volt). Apláziás emberekből szérumot vettünk. Ezt az anyagot csontvelőátültetésen átesett páciensektől páciensből származó szérumot az 1A6.1 teszteltünk, ahol 903 egység/ml aktivitást mutatott, melynek 88 %-a az Mpl ligandumnak volt köszönhető (10 ug/ml Mpl-Xszel gátolható volt). 14 aplasztikus páciensből származó szérumokat a humán megakariocita vizsgálatban is vettük. Hat vizsgálatban teszteltünk.

Csoportként jelentős, 941 meg. egység/ml • ·

- 341 aktivitást mutattak, amely 10 pg/ml Mpl-X-szel teljesen gátolható volt. Az egér IL-3 adatokat az 1A6.1 vizsgálat specifitásának bizonyítása érdekében mutatjuk be. Bár ez a rekombináns citokin indukálja a sejtvonal növekedését, 10 jjg/ml Mpl-X-szel nem gátolható.

9. TÁBLÁZAT

Faj	1A6.1 sejt vizsgálat (egység/ml)	Humán meg. vizsgálat (meg. egység/ml)
Tápközeg	+ Mpl-X	Tápközeg	+ Mpl-X
Normális egér	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0
Apláziás egér	2000	0	1833	—
Normális kutya	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0
Apláziás kutya	4400 ± 539	0 ± 0	792 ± 128	0 ± 0
Normális sertés	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0
Apláziás sertés	3866 ± 1136 0 ± 0	1284 ± 182	10 ± 10
Normális ember	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0	0 ± 0
Apláziás ember	903 ± 64	114 ± 33	941 ± 178	0 ± 0
Egér IL3	6000 ± 565	6000 ± 565	—	—

94. példa

E. coli. rendszerben expresszált humán TPO származékok előállítása

A biológiai aktivitás, stabilitás és oldékonyság fokozása • ·

- 342 érdekében számos TPO származékot terveztünk és expresszáltunk E. coíz-ban. A származékokat a 11. sz. szekv. aminosav-szekvenciájának felhasználásával alakítottuk ki; a származékok a következők: [Met~², Lys^-1, Alá¹, Val³, Arg¹²⁹]TPO(1-163), melyben a 129. leucin helyén arginin áll (más néven L129R); [Met~², Lys^-1, Alá¹, Val³, Arg¹³³]TPO(1163), melyben a 133. hisztidin helyén arginin áll (más néven H133R); [Met², Lys-¹, Alá¹, Val³, Arg¹⁴³]TPO(1-163), melyben a 143. metionin helyén arginin áll (más néven M143R); [Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³, Leu^S2]TPO(1-163), melyben a 82. glicin helyén leucin áll (más néven G82L); [Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³, Leu^14SJTPO(1-163), melyben a 146. glicin helyén leucin áll (más néven G146L); [Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³, Pro^14S]TPO(1-163), melyben a 148. szerin helyén prolin áll (más néven S148P); [Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³,

Arg^e9]TPO(1-163), melyben az 59. lizin helyén arginin áll (más néven K59R); [Met^-2, Lys^-1, Alá¹, Val³, Arg^11B]TPO(1163), melyben a 115. glutamin helyén arginin áll (más néven

Q115R).

A TPO származékok előállításához a 42. példában leírt h6T(1-163)-at használtuk templátként, s az alábbi szekvenciákkal rendelkező oligonukleotidokat szintetizáltuk: L129R: 5'-ATCTTCCGTTCTTTCCAGCACCT-3' (a 11. sz. szekv. 129.

leucin-gyöke helyén argininnel szubsztituált Argszubsztitúciós származék előállításához);

H133R: 5'-TCTTTCCAGCGTCTGCTGCGT-3' (a 11. sz. szekv. 133. hisztidin-gyöke helyén argininnel szubsztituált Arg···* ··

- 343 szubsztitúciós származék előállításához);

M143R: 5'-CGTTTCCTGCGTCTGGTTGGC-3' (a 11. sz. szekv. 143. metionin-gyöke helyén argininnel szubsztituált Argszubsztitúciós származék előállításához);

G82L: 5'-GGCCAGCTTCTGCCGACCTGGCCT-3' (a 11., sz. szekv. 82.

glicin-gyöke helyén leucinnal szubsztituált Leuszubsztitúciós származék előállításához);

G146L: 5'-ATGCTGGTTCTGGGTTCTACCCT-3' (a 11. sz. szekv. 146.

glicin-gyöke helyén leucinnal szubsztituált Leuszubsztitúciós származék előállításához);

S148P: 5'-GTTGGCGGTCCGACCCTGTGCG-3' (a 11. sz. szekv. 148.

szerin-gyöke helyén prolinnal szubsztituált Proszubsztitúciós származék előállításához);

K59R: 5'-GAAGAGACCCGCGCTCAGGACATCC-3' (a 11. sz. szekv. 59.

lizin-gyöke helyén argininnel szubsztituált Argszubsztitúciós származék előállításához);

Q115R: 5'-CTGCCGCCACGTGGCCGTACCAC-3' (a 11. sz. szekv. 115.

glutamin-gyöke helyén argininnel szubsztituált Argszubsztitúciós származék előállításához).

Sculptor in vitro mutagenezis készlet (Amersham) alkalmazásával mutáns plazmidokat állítottunk elő. A 42. példában leírt pCFM536/h6T(1-163) plazmidból származó XbalHindlII fragmenst Xbal és HindiII enzimekkel emésztett Bluescript II SK(-) fágemid vektorba (Stratagene,

California, USA) ligáltuk, miáltal a pSKTPO plazmidot kaptuk, melyet E. coli JM109 törzsbe transzformáltunk. A mutagenezishez a pSKTPO plazmidból egyszálú DNS-t M13KO7 • ·

344 helper fág (Takara Shuzo, Japán) alkalmazásával készítettünk. A TPO génbe a mutációkat a fentebb felsorolt oligonukleotidok alkalmazásával a forgalmazó útmutatása szerint vittük be. A szekvenálást DNS-szekvenáló készlet (Applied Biosystems, USA) alkalmazásával a forgalmazó útmutatása szerint végeztük, s igazoltuk a TPO mutációit.

A mutált pSKTPO-ból készített Xbal-HindlII fragmenseket Xbal és HindlII enzimekkel emésztett pCFM536 plazmidba ligáltuk. A mutált géneket hordozó pCFM536 plazmidokat E. coli 261 sejtekbe transzformáltuk, hogy a TPO származék géneket expresszáló transzformánsokat kapjunk.

A mutált pCFM536 plazmiddal transzformált E. coli 261 sejteket a 43. példa szerint korábbi leírás alapján tenyésztettük. A transzformánsok sejtüledékét összegyűjtöttük és legalább 1 napig fagyasztóban tartottuk. A fagyasztott sejtüledéket (3 g) 10 mM EDTA-t, 10 mM DTT-t és 1 mM PMSF-et tartalmazó 30 ml 20 mM Tris pufferben (pH =

8,5) szuszpendáltuk. A szuszpenziót jégen tartottuk, és ötször legalább 1 perces időközökkel hanghullámmal kezeltük. A hangkezelt sejteket 10 percig 15000 percenkénti fordulattal végzett centrifugálással gyűjtöttük össze.

Az üledéket 8M guanidium-kloridot, 5 mM EDTA-t és 1 mM PMSFet tartalmazó 30 ml 20 mM Tris pufferben (pH = 8,7) szuszpendáltuk, és 50 mg DTT hozzáadásával redukáltuk. 1-1,5 órás keverés után az oldat pH-ját híg sósavval 5,0-re • ·

- 345 állítottuk be, majd a hígítás előtt 4 °C-ra hűtöttük.

A minta-oldatot egy éjszakán keresztül fokozatosan 1,5 liter, 30 % glicerint, 3 M karbamidot, 3 mM ciszamint és 1 mM L-ciszteint tartalmazó 10 mM CAPS pufferhez (pH = 10,5) adtuk. Miután a mintát legalább két napig kevertük, a csapadékot 8000 percenkénti fordulattal 45 percig végzett centrifugálással távolítottuk el. Az oldat pH-ját 6 M foszforsavval 6,8-re állítottuk be, és kétszeresére hígítottuk. Az oldatot két lap 2-es szűrőpapíron ( 90 mm átmérő, Toyo szűrőpapír, Japán) szűrtük, majd CM-Sepharose Fást Flow oszlopra (2,6 cm x 10 cm) (Pharmacia) vittük fel. Az oszlopot 15 % glicerint és 1 M karbamidot tartalmazó 400 ml 10 mM foszfát-pufferrel (pH = 6,8) mostuk. A proteint 1,0 ml/perc átfolyási sebességgel 15 % glicerint tartalmazó 10 mM foszfát-puffer (pH = 7,2) és 0,5 M NaCl-ot tartalmazó 10 mM foszfát-puffer (pH = 7,2) közötti lineáris gradienssel eluáltuk az oszlopról. A protein elúcióját 280 nm-nél mért abszorbanciával ellenőriztük, és a TPO származékot tartalmazó frakciókat SDS-PAGE analízissel azonosítottuk, majd összegyűjtöttük.

A TPO frakciót (kb. 30 ml) Centriprep 10 (Amicon) alkalmazásával 2 ml-re koncentráltuk, a mutáns TPO-t uBondasphere 04 oszlopon (3,9 mm x 150 mm) reverz fázisú

HPLC-vel (Waters) tovább tisztítottuk. A protein eluálását 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel 0,05 %-os vizes TFA-oldat és 30 % CHsCN-ot és 0,02 % TFA-t tartalmazó 2-propanol • · ··» .·

- 346 közötti lineáris gradienssel 40 percig végeztük. Ilyen körülmények között a TPO származékok hozzávetőleg a 30. perc után eluálódtak.

A biológiai vizsgálathoz az így tisztított TPO mintát kétszer 1 liter 10 mM foszfát-pufferrel szemben két napig dializáltuk. Miután a mintát Centriprep 10 (Amicon) alkalmazásával hozzávetőleg 0,1 mg/ml-re koncentráltuk, a származékok biológiai aktivitását a korábban leírt M-07e vizsgálati rendszerrel határoztuk meg. Azt találtuk, hogy valamennyi mutáns a h6T(1-163) aktivitásával majdnem azonos aktivitással rendelkezett (ld. 33. és 34. ábra).

A letétbe helyezett anyagok jegyzéke:

Escherichia coli (pHTl-231/DH5):

FERM BP-4564 és CCTCC-M95001

Escherichia coli (pEF18S-A2 /DH5):

FERM BP-4565 és CCTCC-M95002

Escherichia coli (pHGTl/DH5):

FERM BP-4616 és CCTCC-M95003

Escherichia coli (pHTFl/DH5):

FERM BP-4617 és CCTCC-M95004

Egér-egér hibridoma P55:

FERM BP-4563 és CCTCC-C95001

CH028/1/1/3-C6:

FERM BP=4988 és CCTCC-C95004

CH0163T-63-79-C1:

FERM BP-4989 és CCTCC-C95005 »«·« ··

- 347 SZEKVENCIALISTA

SZEKVENCIÁK SZÁMA: 197

TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 261 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Rattus norvegicus (H) SEJTVONAL: McA-RH8994 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 1. SZ. SZEKV.:

GGTGTACCTG GGTCCTGAAG CCCTTCTTCA-CCTGGATA&A TTCCTTGGCC CACCTGTCCC 60

CACCCCACTC TGTGCAGAGG TACAAAAGCT CAAGCCGTCT CCATGGCCCC AGGAAAGATT 120

CAGGGGAGAG GCCCCACACA GGGAGCCACT GCAGTCAGAC ACCCTGGGCA GA 172

ATG

GAG

CTG

ACT

GAT

TTG

CTC

CTG

GTG

GCC

ATA

CTT

CTC

CTC

ACC

GCA

220

Met

Glu

Leu

Thr

Asp

Leu

Leu

Leu

Val

Alá

Xle

Leu

Leu

Leu

Thr

Alá

1

5

10

15

AGA

CTA

ACT

CTG

TCC

AGC

CCA

GTT

CCT.

CCC, GCC

TGT

GAC

CC

261

Arg

Leír

Thr

teu

Ser

Ser

Pro

Val

Pro

Pro

Alá

Cys

Αερ

20

25

TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 147 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein

348 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 2. SZ. SZEKV.:

Met

Glu

Leu

Thr

Asp

Leu

Leu

Leu

Val

Alá

Ile

Leu

Leu

Leu

Thr

Alá

-21

-20

-15

-10

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Pro

Pro

Alá

Cys

Asp

Pro

Arg

Leu

-5

1

5

10

Leu

Asn

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

15

20

25

Gin

Cys

Pro

Asp

Val

Asn

Pro

Leu

Ser

Ile

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

30

35

40

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Ser

Lys

45

50

55

Alá

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Alá

Val

Ser

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

60

65

70

75

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

80

85

90

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Alá

Leu

Gin

Gly

Leu

95

100

105

Leu

Gly

Thr

Gin

Val

Ser

Pro

Gin

Thr

Tyr

Arg

Asn

Tyr

Pro

Leu

Thr

110

115

120

Gin

Phe

Leu

125

TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (1) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 580 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVET TÍPUS: máj (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 3. SZ. SZEKV.:

CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Alá Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro

IS 10 IS

- 349 -

GCT CCT	CCT GCT	TGT GAC Cya. Asp	CTC Le»:	CGA GTC CTC AGT AAA CTG	CTT Leu 30	CGT Arg	GAC Asp	96
Alá.	Bro.	Pro.	Alá 20	ArgVai 25	Leu -Ser tysr -tétr-
TCC	CAT	GTC	CTT	CAC AGC	AGA	CTG AGC	CAG TGC CCA GAG	GTT	CAC	CCT	144
Ser	Hls	Val '35	Leu	Hls Ser	Arg	Leu Ser 40	Gin Cys Pro Glu 4S	Val	His	Pro
TTG	CCT	ACA	CCT	GTC CTG	CTG	CCT GCT	GTG GAC TTT AGC	TTG	GGA	GAA	192
Leu	Pro 50	Thr	Pro	Val Leu	Leu 55	Pro Alá	Val Aso Phe Ser 60	Leu	Gly	Glu
TGG	AAA	ACC	CÁG	ATG GAG	GAG	ACC AAG	GCA CAG GAC ATT	CTG	GGA	GCA	240
Tro .65	Lys	Thr	Gin	Met Glu 70	Glu	Thr Lys	Alá Gin Aso Ile 75	Leu	Gly	Alá 30
GTG	ACC	CTT	CTG	CTG GAG	GGA	GTG ATG	GCA GCA CGG GGA	CAA	CTG	GGA	233
Val	Thr	Leu	Leu	Leu Glu 85	Gly	Val Met	Alá Alá Arg Gly 90	Gin	Leu 95	Gly
CCC	ACT	TGC	CTC	TCA TCC	CTC	CTG GGG	CAG CTT TCT GGA	CAG	GTC	CGT .	336
Pro	Thr	Cys	Leu 100	Ser Ser	Leu	Leu Gly 105	Gin Leu Ser Gly	Gin 110	Val	Arg
CTC	CTC	CTT	GGG	GCC CTG	CAG	AGC CTC	CTT CGA ACC CAG	NNN	NNN	NNN	334
Leu	Leu	Leu 115	Gly	Alá Leu	Gin	Ser Leu 120	Leu Glv Thr Cin 125	Xaa	Xaa	Xaa
NNN	NNN	NNN	NCC	ACA GCT	CAC	AAG GAT	CCC AAT GCC ATC	TTC	CTG	AGC	432
Xaa	Xaa 130	Xaa	Xaa	Thr Alá	His 135	Lys Asp	Pro Asn Alá Ile 140	Phe	Leu	Ser
TTC	CAA	CAC	CTG	CTC CGA	GGA	AAG GTG	CGT TTC CTG ATG	CTT	GTA	GGA	480
Phe 145	Gin	HÍS	Leu	Leu Arg 150	Gly	Lys Val	Arg Phe Leu Hét 155	Leu	Val	Gly 160
GGG	TCC	ACC	CTC	TGC GTC	AGG	CGG GCC	CCA CCC ACC ACA	GCT	GTC	CCC	528
Gly	Ser	Thr	Leu	Cys Val 165	Arg	Arg Alá	Pro Pro Thr Thr 170 _ ·	Alá	Val 175	Pro
AGC	AGA	ACC	TCT	CTA GTC	CTC	ACA CTG	AAC GAG CTC CCA	AAC	AGG	ACT	576
Ser	Arg	Thr	Ser	Leu Val	Leu	Thr Leu	Asn Glu Leu Pro	Asn	Arg	Thr

180 1Θ5 190

TCT G 580

Ser

TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 253 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 4. SZ. SZEKV.:

- 350 -

Met -21

Glu -20

Leu

Thr

Glu

Leu

Leu -15

Leu

Val

Val

Met

Leu -10

Leu

Leu

Thr Alá

Arg -5

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser 1

Pro

Alá

Pro

Pro 5

Alá

Cys

Asp

Leu

Arg Val 10

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Val

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro-

Thx..-.Pra.

VaL

Leu. 40

Leu-

Pro. Alá

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Met 55

Glu

Glu

Thr Lys

Alá 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Alá

Val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val Met 75

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cvs 85

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu Gly 90

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Alá

Leu

Gin 105

Ser Leu .

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Thr

Alá 120

His

Lys Asp

Pro

Asn 125

Alá

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg Alá

140 145 150 1S5 | ί

Pro Pro Thr Thr Alá Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu 160 165 170

Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Aan Phe Thr i 175 180 185

Alá Ser Alá Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly 190 195 200

Phe Arg Alá Lys Xle Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu 205 210 215

Asp Gin Xle Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu

220 22S 230

TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 576 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez ···· ·· ··«· « 4 ·# ·«

- 351 (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVET TÍPUS: máj (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 5. SZ. SZEKV.:

AG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG 47

Gly Phe Arg Alá Lys Xle Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg

TCC Ser

1 CTG Leu

GAC Asp

CAA ATC

5 CCC Pro

GGA Gly

IQ. TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC

15

TTG Leu

95

Gin

Ile 20

Tyr

Leu Asn Arg 25

Ile

His

Glu

Leu 30

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

143

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

35

40

45

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC '

191.

Alá

Pro^Asp

Ile-

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

50

55

60

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

239

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

63

70

75

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

GTG

CTC

237

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

80

85

-

90

-

95

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

335

Gin

Leu

Hls

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Alá

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

100

105

110

ACC

AGC

CCT

CTT

CT A

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

TCC

CAG

AAT

CTG

TCT

333

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

Kis

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

115

120

125

CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCATG 432

Gin Glu Gly

130

TACAGCTCCC	TTCCCTGCAG	CGCGCCCCTG	GGAGACAACT	GGACAAGATT	TCCTACTTTC	4-92
TCCTGAAACC	CAAAGCCCTG	GTAAAAGGGA	TACACAGGAC	TGAAAAGGGA	ATCATTTTTC	552
ACTGTACATT	ATAAACCTTC	AGAA				576

TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 353 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris ·· ···· 4« «,*

352 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 6. SZ. SZEKV.:

Met -21

Glu -20

Leu

Thr

Glu

Leu

Leu -IS

Leu

Val

Val

Met

Leu -10

Leu

Leu

Thr

Alá

Arg -5

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser 1

Pro

Alá

Pro

Pro 5

Alá

Cys

Asp

Leu

Arg 10

Val

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Val

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cyg

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

Thr

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Alá

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

50 55

Alá '

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Alá

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

60

65c

—-

-

70 .

-

7S

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

80

85

90

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Alá

Leu

Gin

Ser

Leu

95

100

105

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Alá

His

Lys

Asp

110

115

120

Pro

Asn

Alá

Ilé

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

125

130

135

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

1 Alá

140

145

ISO

155

Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

160

165

170

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

175

180

185

Alá

Ser

ftla-

Arg-

•Thr

•Thr·

ciy

S'er

Gly

Leu

Leu

Lys

Tro

Gin

Gin

Gly

190

195

200

Phe

Arg

Alá

Lys

Ile

Pro

ciy

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

205

210

215

Aso

Gin

Ile

Pro

Gly

Tvr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Glv

220

/225

230

235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Alá

Pro

240

245

250

Asp

Ile

Ser

~Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

-

255

260

265

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

270

275

280

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

285 290 295

- 353 His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Alá Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser i 300. 305 310 315 í í

Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu I 320 32S 330 (

I

Gly TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 1721 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVET TÍPUS: máj (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 7. SZ. SZEKV.:

GCGGCACGAG GGGGGTGTCT GGCTGGCGTG GCTCCCTGTT TGGGGCCIGT-CCCCTGAATC- .... 60..

CTTCCTGGGG CCATGGAGGC CAGACAGACA CCCCGGCCAG A ATG GAG CTG ACT 113 |

Met Glu Leu Thr -21 -20 ;

GAA

TTG CTC CTC

GTG

GTC ATG

CTT

CTC

CTA

ACT

GCA

AGG

CTA

ACG

CTG

161

Glu

Leu Leu Leu

Val

Val Met

Leu

Leu

Leu

Thr

Alá

Arg

Leu

Thr

Leu

-15

-10

-5

TCC

AGC CCG GCT

CCT

CCT GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG..

2Q9

Ser

Ser. Pro Alá

Pro

Pro- Alá' Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

1

5

10

15

CTT

CGT GAC TCC

CAT

GTC CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

257

Leu

Arg Asp Ser

His

Val Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

20

25

30

GTT

CAC CCT TTG

CCT

ACA CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

305

Val

His Pro Leu

Pro

Thr Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

Val

Asp

Phe

Ser

35

40

45

TTG

GGA GAA TGG

AAA

ACC'CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAC

GCA

CAG

GAC'

ATT '

3 S'3

Leu

Gly Glu Trp

Lys

Thr Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Alá

Gin

Asp

Ile

50

55

60

CTG

GGA GCA CTG

ACC

CTT CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

401

Leu

Gly Alá Val

Thr

Leu Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Alá

Alá

Arg

Gly

65

70

75

• ·

- 354 -

CAA Gin 80

CTG Leu

GGA Gly

CCC Pro

ACT Thr

TGC Cys 85

CTC TCA TCC

CTC Leu

CTG Leu 90

GGG Gly

CAG Gin

CTT TCT

GGA Gly 9 5

449

Leu

Ser

Ser

Leu

Ser

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

497

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Alá

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr 110

Gin

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC '

545

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Thr

Alá 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Alá

Ile

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG .''

S93

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

641

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Alá

Pro

Pro

Thr

Thr

145 150 155

GCT GTC CCC

AGC Ser

AGA Arg

ACC Thr 165

TCT Ser

CTA GTC CTC ACA CTG AAC

GAG Glu

CTC Leu

CCA Pro 175

689

Alá 160

Val

Pro

Leu

Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

737

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Alá

Ser

Alá

Arg

•

180

185

190

ACA

ACT

GGC

TCT

GGG

CTT

CTG

AAG

TCG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

785 i

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Alá

Lys

1

195

200

205

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

833

Ile

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

Ile

Pro

210

215

220

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

881

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

225

230

23S

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

AGC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

929

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Al'a

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser

240

245

250

255

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

977

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

. 260 265 270

TCT

CCT TCC.

CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC CCT

; 1025

Ser

Pro Ser

Pro

Thr

HiS

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe Pro

275

280

285

CTT

CCA CCC

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG CTT

1073

Leu

Pro Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Vai

Gin

Leu

His

Pro

Leu Leu

290

295

300

CCT

GAC CCT

TCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA AAC

1121

Pro

Aso Pro.

Ser

Alá

Pro

Thr

.Pro

Thr

.Pro

Thr..

Ser

Pro.

Leu

Leu. Asu ·

....

305

310

315

ACA

TCC TAC

ACC

CAC

TCC

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GGG

TAAGGTTCTC

1170

Thr

Ser Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

320

325

330

			355 -
AGACACTGCC	GACATCAGCA	TTGTCTCGTG	TACAGCTCCC	TTCCCTGCAG	GGCGCCCCTG	1230
GGAGACAACT	GGACAAGATT	TCCTACTTTC	TCCTGAAACC	CAAAGCCCTG	GTAAAAGGGA	1290
TACACAGGAC	TGAAAAGGGA	ATCATTTTTC	ACTGTACATT	ATAAACCTTC	AG AAG CT ATT	1350
TTTTTAACCT	ATCAGCAATA	CTCATCAGAG	CAGCTAGCTC	TTTGGTCTAT	TTTCTGCAGA	1410
AATTTGCAAC	TCACTGATTC	TCTACATGCT	CTTTTTCTGT	GATAACTCTG	CAAAGCCCTG	1470
GGCTGGCCTG	GCAGTTGAAC	AGAGGGAGAG	ACTAACCTTG	AGTCAGAAAA	CAGAGAAAGG	1S30
GTAATTTCCT	TTGCTTCAAA	TTCAAGGCCT	TCCAACGCCC	CCATCCCCTT	TACTATCATT	1590
CTCAGTGGGA	CTCTGATCCC	ATATTCTTAA	CAGATCTTTA	CTCTTGAGAA	ATGAATAAGC	1650
TTTCTCTCAG	AAATGCTGTC	CCTATACACT	AGACAAAACT	GAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	1710
AAAAAAAAAA	A					1721

TUDNIVALÓK A 8. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 4506 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: genom DNS (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVET TÍPUS: perifériás leukociták (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 8. SZ. SZEKV.:

GAATTCAGGG CTTTGGCAGT TCCAGGCTGG TCAGCATCTC AAGCCCTCCC CAGCATCTGT 60

TCACCCTGCC AGGCAGTCTC TTCCTAGAAA CTTGGTTAAA TGTTCACTCT TCTTGCTACT 120

TTCAGGATAG ATTCCTCACC CTTGGCCCGC CTTTGCCCCS CCCTACT'CTG . CCCAGAAGTG 180

CAAGAGCCTA AGCCGCCTCC ATGGCCCCAG GAAGGATTCA GGGGAGAGGC CCCAAACAGG 240

GAGCCACGCC AGCCAGACAC CCCGGCCAGA ATG GAG CTG ACT G GTGAGAACAC 293

Met Glu Leu Thr -21 -20

ACCTGAGGGG CTAGGGCCAT ATGGAAACAT GACAGAAGGG GAGAGAGAAA GGAGACACGC 353

TGCAGGGGGC. AGGAAGCTGG.. GGGAACCCAT TCTCCCAAAA ..ATAAGGGGTC TGAGGGGTGG ^: 413

ATTCCCTGGG TTTCAGGTCT GGGTCCTGAA TGGGAATTCC TGGAATACCA GCTGACAATG 473

ATTTCCTCCT CATCTTTCAA CCTCACCTCT CCTCATCTAA G AA TTG CTC CTC

Glu Leu Leu Leu -IS

S2S • ·

- 356

GTG

GTC ATG

CTT

CTC

CTA

ACT

CCA

AGG

CTA

ACG

CTG

TCC

AGC

CCG

GCT

573

Val

Val Hét

Leu

Leu

Leu

Thr

Alá

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Alá

-10

-5

1.

CCT'

CCT GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

ACT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

621

Pro

Pro Alá

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

10 15

CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG GTGAGAACTC CCAACATTAT CCCCTTTATC 672

His Val Leu His Ser Arg Leu

25

CGCGTAACTG GTAAGACACC CATACTCCCA GGAAGACACC ATCACTTCCT	CTAACTCCTT	732
GACCCAATGA CTATTCTTCC CATATTGTCC CCACCTACTG ATCACACTCT	CTGACAAGGA	792
TTATTCTTCA CAATACAGCC CGCATTTAAA ACCTCTCGTC TAGAGATAGT	ACTCATGGAG	852
GACTAGCCTG CTTATTAGGC TACCATAGCT CTCTCTATTT CAGCTCCCTT	CTCCCCCCAC	912
CAATCTTTTT CAACAG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu	CCT ACA ’· Pro Thr	'961

35 í·

CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC , 1009'

Pro Val Leu Leu Pro Alá Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr

45 50

CAG ATG GTAAGAAAGC CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG TCTTCAGTTT 1065

Gin Hét

CCCACTGCTT	CCCATGGATT	CTCCAACATT	CTTGAGCTTT	TTAAAAATAT	CTCACCTTCA	1125
GCTTGGCCAC	CCTAACCCAA	TCTACATTCA	CCTATGATGA	TAGCCTGTGG	ATAAGATGAT	1185
GGCTTGCAGG	TCCAATATGT	GAATAGATTT	GAAGCTGAAC	ACCATGAAAA	GCTGGAGAGA	1245
AATCGCTCAT	GGCCATGCCT	TTGACCTATT	CCTGTTCAGT	CTTCTTAAAT	TGGCATGAAG	1305
AAGCAAGACT	CATATGTCAT	CCACAGATGA	CACAAAGCTG	GGAAGTACCA	CTAAAATAAC	1365
AAAAGACTGA	ATCAAGATTC	AAATCACTGA	AAGACTAGGT	CAAAAACAAG	GTGAAACAAC	1425
AGAGATATAA	ACTTCTACAT	GTGGGCCGGG	GGCTCACGCC	TGTAATCCCA	GCACTTTGGG	1485
AGGCCGAGGC	AGGCAGATCA	CCTGAGGGCA	GGAGTTTGAG	AGCAGCCTGG	CCAACATGGC	1545
GAAACCCCGT	CTCTACTAAG	'aatacaaaat	TAGCCGGGCA	TGGTAGTGCA	TGCCTGTAAT	1605
CCCAGCTACT	'TGGAAGGCTG	AAGCAGGAGA	ATCCCTTGAA	CCCAGGAGGT	GGAGGTTGTA	1665
GTGAGCTGAG	ATCATGCCAA	TGCACTCCAG	CCTGGGTGAC	AAGAGCAAAA	CTCCGTCTCA	1725
AAAAGAAAAA	AAAATTCTAC	ATGTGTAAAT	TAATGAGTAA	AGTCCTATTC	CAGCTTTCAG	1785
GCCACAATGC	CCTGCTTCCA	TCATTTAAGC	CTCTGGCCCT	KGCACTTCCT	ACGAAAAGGA	1845

TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT 1905 AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT' GTTTGATGTT'TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA 1965 GAACTCTATT CCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT 2025 GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT CTAGAAAGCA 2085 « ··

- 357 -

CCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT GTTTTATGGG CAATAGTTTA	AAAAACTAAA	2145
ATCTATCCTC AACAACCCTA CCGTCCCTTC TTCCTTCACG ACTCAGTCAG	GGAAGAAGGG	2205
CAGTTCCTAT CCGTCCCTTC TAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATT	ATGGTAGAGT	2265
CTCATACCTA'-CATTTAGTTT 'ÁTTTATTATT ATTATTTGAC» ACGGA’GTŐTC	ACTÍTATCCÓ	•Λ ,· 2325
CCAGGCTGGA GTGCAGTGGC ATGATCTCAA CTCACTGCAA CCTCAGCCTC	CCGGATTCAA	2385
GCGATTCTCC TGCCTCAGTC TCCCAAGTAG CTGGGATTAC AGGTGCCCAC	CGCCATGCCC	2445
AGCTAATTTT TGTATTTTTG GTAGAGATGG GGTTTCACCA TGTTGGCCAG	GCTGATCTTG	2505
AACTCCTGAC CTCAGGTGAT CCACCTGCCT CAGCCTCCCA AAGTGCTGGG	ATTACAGGCG	2565
TGAGCCACTG CACCCAGCCT TCATTCAGTT TAAAAATCAA ATGATCCTAA	GGTTTTGCAG	2625
CAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACC AAGAGGTAAA AGCTGTAACA	CGGCAGATTT	2685
CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC ACTGAAACCA AGTGTAAGAC	CAGGCTGGAC .	274S
TAGAGGACAC GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG CTGATGACCA GCTGTCGCGA	GACTGTGAAG	2305
GAATTCCTGC CCTGGGTGGG ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA	TCATTCACTC	2365
TGCTGGCTAC TCCTAAGGCT CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG	CAGTGCGCTT	2925
CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA Glu Glu Thr Lys Alá Gin Asp lle Leu Gly	2977

65

GCA Alá

GTG Val

ACC CTT

CTG Leu 70

CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG

GGA CAA Gly Gin 80

CTG Leu

3025

Thr

Leu

Leu Glu

Gly

Val

Met 75

Alá

Alá

Arg

GGA

CCC

ACT

TGC

CTC

TCA TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA CAG

GTC

3073

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly Gin

Val

85

90

95

CGT

CTC

CTC

CTT

GGG

GCC CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

3115

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Alá Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

100

105

110

GTAAGTCCCC

AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT

CTGACTCAGT CCCCCTAGAA

3175

GACCTGAGGG

AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA GCTCAAGGGC

AGAAGAGCTG ATCTACTAAG

3235

AGTGCTCCCT

GCCAGCCACA ATGCCTGGGT ACTGGCATCC

TGTCTTTCCT ACTTAGACAA

3295

GGGAGGCCTG

AGATCTGGCC CTGGTGTTTG GCCTCAGGAC

CATCCTCTGC CCTCAG

3351

CT.T

CCT

CCA CAG

GGC

AGG ACC

ACA,

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

'· AAT GCC

ATC '

3399

Leu

Pro

Pro Gin

Gly

Arg Thr

Thr

Alá

His

Lys

Asp

Pro

Asn Alá

He

115

120

125

TTC

CTG

AGC TTC

CAA

CAC CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC CTG

ATG

3447

Phe

Leu

Ser Phe

Gin

His Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe Leu

Hét

130 135 140

CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA 349 5

Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Alá Pro Pro Thr Thr

145 ISO : 155

GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA

Alá Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro

160 165 170 17S

3543 • · · ·

- 358 -

AAC

AGG

ACT TCT

GGA

TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

3S91

Asn

Arg

Thr Ser

Gly ISO

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Alá.

Ser

Alá 190

Arg

ACT

ACT ·

GGC- TCT.

GGG.

CTT

CTG-

AAC-

TCG ,

CAG;CAG,-GGA.

TTC

AGA .GCC

AAG -

·.· 3639·.

Thr

Thr-

Gly ..'Sér' 195

Gly-

Leír- Leu;

Lys·

Tfo* 20Ö

Gin-

Gin- Gly*PHe -Arg'' 205

Alá-

Lys ’

ATT

CCT

GGT CTG

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

3637

Ile

Pro

Gly Leu 210

Leu

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Aso 220

Gin

Ile

Pro

CGA

TAC

CTG AAC

AGG

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

3735

Gly

Tyr 225

Leu Asn

Arg

Ile

His 230

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

TTT

CCT

GGA CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

3733

Phe 240

Pro

Gly Pro

Ser

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Gly

Alá 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

GGA

ACA

TCA GAC

ACA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

3831

Gly

Thr

Ser Asp

Thr 260

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

TCT

CCT

TCC CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAC

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

3379

Ser

Pro

Ser Pro 27S

Thr

His

Pro

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

CTT

CCA

CCC ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

CTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

3927

Leu

Pro

Pro Thr 290

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Val

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

CCT

GAC

CCT TCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

3975

Pro

Asp 305

Pro Ser

Alá

Pro

Thr 310

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser 315

Pro

Leu

Leu

Asn

ACA Thr

TCC Ser

TAC ACC Tyr Thr

CAC His

TCC Ser

CAG Gin

AAT Asn

CTG Leu

TCT Ser

CAG Gin

GAA Glu

GGG Gly

TAAGGTTCTC

4024

320 325 330

AGACACTGCC	GACATCAGCA	TTGTCTCATG	TACAGCTCCC	TTCCCTGCAG	GGCGCCCCTG	4084
GGAGACAACT	GGACAAGATT	TCCTACTTTC	TCCTGAAACC	CAAAGCCCTG	GTAAAAGGGA	4144
TACACAGGAC	TGAAAAGGGA	ATCATTTTTC	ACTGTACATT	ATAAACCTTC	AGAAGCTATT -·	4204
TTTTTAAGCT	ATCAGCAATA	CTCATCAGAG	CAGCTAGCTC	TTTGGTCTAT	TTTCTGCAGA	4264
AATTTGCAAC	TCACTGATTC	TCTACATGCT	CTTTTTCTGT	GATAACTCTG	CAAAGGCCTG	4324
GGCTGGCCTG	GCAGTTGAAC	AGAGGGAGAG	ACTAACCTTG	AGTCAGAAAA	CAGAGAAAGG	4384
GTAATTTCCT	TTGCTTCAAA	TTCAAGGCCT	TCCAACGCCC	CCATCCCCTT	TACTATCATT	4444
CTCAGTGGGA	CTCTGATCCC	ATATTCTTAA	CAGATCTTTA	CTCTTGAGAA	ATGAATAAGC	4504
TT						4506

TUDNIVALÓK A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 416 bázispár

359 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 9. SZ. SZEKV.:

CTAGAAAAAA	CCAAGGACGT	AATAAATAAT	GAGCCCGGCT	CCGCCACCTT	GTGACCTTCG	60
TGTTCTGTCT	AAACTGCTTC	GCGACTCTCA	CGTGCTGCAC	TCTCGTCTGT	CCCAGTGCCC	120
GCAAGT-TCAC	.CCGCTGCCGA.'	CCCCCÖTTCT	GÍTTCCGÖCT' CTCGACTTCT' 'OCCTGGGTGÁ	iao
ATGGAAAACC	CAGATGGAAG	AGACCAAAGC	TCAGGACATC	CTGGGTGCAG	TAACTCTGCT	240
TCTGGAAGGC	GTTATGGCTG	CACGTGGCCA	GCTTGGCCCG	ACCTGCCTGT	CTTCCCTGCT.	300
TGGCCAGCTG	TCTGGCCAGG	TTCGTCTGCT	GCTCGGCGCT	CTGCAGTCTC	TGCTTGGCAC	360
CCAGCTGCCG	CCACAGGGCC	GTACCACTGC	TCACAAGGAT	CCGAACGCTA	TCTTCC	416

TUDNIVALÓK A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 179 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein

(xi

) SZEKV

ΈΝ0

IA LEÍRÁS:

10.

SZ

. SZEKV

•:

Leu

Val

Pro

Arg

Gly

Ser

Pro

Alá

Pro

Pro

Alá

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

-5

1

5

10

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

15

20

25

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

30

35

40

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Hét

Glu

Glu

Thr

Lys

45

50

55

Alá

Gin

Asp

He

Leu

Gly

Alá

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

60

65

70

75

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

80

85

90

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Alá

Leu

Gin

Ser

Leu

95

100

105

360

Leu

Gly

Thr Gin 110

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Thr Alá 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Alá.Xle

Phe

Leu

Ser 120.

Phe

Gin

His

Leu

Leu Arg 135

Gly

Lys-

Val

Arg 140

Phe

Leu Met

Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu 150

Cys Val

Arg

Arg

Alá 155

Pro

..Pro

Thr Thr

Alá 160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr 165

Ser

Leu Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn Glu Leu

TUDNIVALÓK A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 535 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 11. SZ. SZEKV.:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA ATG AAA GCA CCT GTA CCA CCT GCA 52

Met Lys Alá Pro Val Pro Pro Alá

-2

1

5

TCT

GAT

TTA

CGG

GTC

CTG

TCT

AAA

CTG

CTG

CGC

GAC

TCT

CAC

CTG

CTG

100

Cys

A3p

Leu

Arg

VaL

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

10

15

20

CAC

TCT

CGT

CTG

TCC

CAG

TGC

CCG

GAA

GTT

CAC

CCG

CTG

CCG

ACC

CCG

148

His

Ser

Arg

Leu

Ser

•Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

25

30

35

GTT

CTG

CTT

CCG

GCT

GTC

GAC

TTC

TCC

CTG

GGT

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

196

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

40

45

50

ATG

GAA

GAG

ACC

AAA

GCT

CAG

GAC

ATC

CTG

GGT

GCA

GTA

ACT

CTG

CTT

244

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Alá

Gin

Asp

He

Leu

Gly

Alá

Val

Thr

Leu

Leu

55

60

65

70

CTG

GAA

GGC

GTT

ATG

GCT

GCA

CGT

GGC

CAG

CTT

GGC

CCG

ACC

TGC

CTG

292

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

75

80

-

85

TCT

TCC

CTG

CTT

GGC

CAG

CTG

TCT

GGC

CAG

GTT

CGT

CTG

CTG

CTC

GGC

340

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

90

95

100

··«· ·· ···· · · • * * · · • · « · ·· · ♦·· ·· «·

- 361 -

GCT Alá

CTG Leu

CAG TCT

CTG Leu

CTT GGC

ACC Thr 110

CAG Gin

CTG Leu

CCG Pro

CCA CAG

GGC Gly

CGT Arg

ACC Thr

383

Gin 105

Ser

Leu

Gly

Pro

Gin 115

ACT

GCT

CAC

AAG

GAT

CCG

AAC

GCT

ATC

TTC

CTG

TCT

TTC

CAG

CAC

CTG

436

Thr

Alá

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Alá

He

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

120

125

130

CTG

CGT

GGC

AAA

GTT

CGT

TTC

CTG

ATG

CTG

GTT

GGC

GGT

TCT

ACC

CTG

434

Leu

Arg Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

135

140

145

ISO

-

TGC

GTT

CGT

CGG

GCG

CCG

CCA

ACC

ACT

GCT

GTT

CCG

TCT

TAATGAAAGC

533

Cys

Val

Arg

Arg

Alá

Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

Val

Pro

Ser

is s-.·. ' ιεσ

ΤΤ 535

TUDNIVALÓK A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 535 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 12. SZ. SZEKV.:

CTAGAAAAAJv CCAAGGAGGT AATAAATA' ATtU AAA? TCT CCf? GCA CCA· CCT- GOÁ Met Lya Ser Pro Alá Pro Pro Alá

-2 1 5

TGT Cys

GAT Asp

TTA Leu

CGG Arg 10

GTC Val

CTG Leu

TCT Ser

AAA Lys

CTG Leu 15

CTG Leu

CGC Arg

GAC Asp

TCT Ser

CAC His 20

GTG Val

CTG Leu

100

CAC

TCT

CGT

CTG

TCC

CAG

TGC

CCG

GAA

GTT

CAC

CCG

CTG

CCG

ACC

CCG

148

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

25

30

35

GTT

CTG

CTT

CCG

GCT

GTC

GAC

TTC

TCC

CTG

GGT

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

196

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Tr?

Lys

Thr

Gin

40

45

50

ATG

GAA

GAG

ACC

AAA

GCT

CAG

GAC

ATC

CTG

GGT

GCA

GTA

ACT

CTG

CTT

244

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Alá

Gin

A3p

He

Leu

Gly

Alá

Val

Thr

Leu

Leu

SS

60

65

70

- 362 ·« · · • ·

CTG Leu

GAA GGC

GTT Val

ATG Hét 75

GCT CCA CGT

GGC CAG Gly Gin 80

CTT Leu

GGC Gly

CCG Pro

ACC Thr

TGC Cys 85

CTG Leu

292

Glu

Gly

Alá

Alá

Arg

TCT

TCC

CTG

CTT

GGC

CAG

CTG

TCT

GGC

CAG

GTT

CGT

CTG

CTG

CTC

GGC

340

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

90

95

-

100

GCT

CTG

CAG

TCT

CTG

CTT

GGC

ACC

CAG

CTG

CCG

.CCA

CAG

GGC

CGT

ACC

388

Alá

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

105

110

115

ACT

GCT

CAC

AAG

GAT

CCG

AAC

GCT

ATC

TTC

CTG

TCT

TTC

CAG

CAC

CTG

436

Thr

Alá

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Alá

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

120

125

130

CTG

CGT

GGC

AAA

GTT

CGT

TTC

CTG

ATG

CTG

GTT

GGC

GGT

TCT

ACC

CTG

484

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Hét

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

135

140

14S

150

TGC

GTT

CGT

CGG

GCG

CCG

CCA

ACC

ACT

GCT

GTT

CCG

TCT

TAATGAAAGC

533

Cys

Val

Arg

Arg

Alá

Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

Val

Pro

Ser

155

160

TT

535

TUDNIVALÓK A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 555 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav
(C)	SZÁL:	kétszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVET TÍPUS: máj (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 13. SZ. SZEKV.:

ATG Hét -21

GAG Glu -20

CTG Leu

ACT Thr

GAA Glu

TTG Leu

CTC Leu -15

CTC Leu

GTG Val

GTC Val

ATG Hét

CTT Leu -10

CTC Leu

CTA Leu

ACT Thr

GCA Alá

48

AGG

CT A

ACG

CTG

TCC

AGC

CCG

GCT

CCT

CCT

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

96

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Alá

Pro

Pro

Alá

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

-5

1

5

10

CTC

AGT

•AAA

CTG

•'CTT

CGT;

GAC

• TCC'

CAT

GTC

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

144

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

20 25 • ··

Λ ·

- 363 -

CAG Gin

TGC Cys

CCA GAG CTT

CAC His

CCT Pro

TTG Leu 35

CCT Pro

ACA Thr

CCT Pro

GTC Val

CTG Leu 40

CTG Leu

CCT Pro

GCT Alá

192

Pro 30

Glu

Val

CTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

240

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

45

50

S5

-

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

CGA

GCA

CTG

ACC

CTT

CTG

CTG

GAG

GGA

CTG

ATG

288

Alá

Gin

Aep

Xle

Leu

Gly

Alá

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

60

65

70

7S ;

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

336

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

80

85

90

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

384

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Alá

Leu

Gin

Ser

Leu

95

100

105

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

432

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Alá

His

Lys

Asp

110

115

120

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

480

Pro

Asn

Alá

He

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

125

130

135

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

528

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Alá

140

145

150

155

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

TGA

555

Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

Val

Pro

Ser

160

TUDNIVALÓK A 14. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 1043 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	kétszálú
(D)	ALAK:	lineáris
MOLEKULA	TÍPUSA: szintetikus

(vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 14. SZ. SZEKV.:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA ATG AAA AGT CCT GCA CCA CCT. GCA 52

Met Lys Ser Pro Alá Pro Pro Alá

-2

1

5

TGT

GAT

TTA

CGG

GTC

CTG

TCT

AAA

CTG

CTG

CGC

GAC

TCT

CAC

GTG

CTG

100

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

10

15

20

- 364 -

CAC

TCT

CGT

CTG

TCC

CAG

TGC

CCG GAA

GTT

CAC

CCG

CTG

CCG

ACC

CCG

148

His

Ser .

Arg

Leu.

Ser .

Cin··.

Cys--

Pro» Glu.·-Vári' ·

H±a“

Pro·

Leu

P.ro:Í'«

Thr..·

Sra ~

·;

2S

30 ·

35

GTT

CTG

CTT

CCG

GCT

GTC

GAC

TTC TCC

CTG

GGT

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

196

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

Val

Asp

Phe Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

40

45

50

ATG

GAA

GAG

ACC

AAA

GCT

CAG

GAC ATC

CTG

GGT

GCA

GTA

ACT

CTG

CTT

244

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Alá

Gin

Asp Ile

Leu

Gly

Alá

Val

Thr

Leu

Leu

S5

60

65

70

CTG

GAA

GGC

GTT

ATG

GCT

GCA

CGT GGC

CAG

CTT

GGC

CCG

ACC

TGC

CTG

292

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Alá

Alá

Arg Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cvs

Leu

75

80

85

TCT

TCC

CTG

CTT

GGC

CAG

CTG

TCT GGC

CAG

GTT

CGT

CTG

CTG

CTC

GGC

340

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

90

95

100

CCT

CTG

CAG

TCT

CTC

CTT

GGC

ACC CAG

CTG

CCG

CCA

CAG

CGC

CGT

ACC

388

Alá

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr-

105

110

115

ACT

GCT

CAC

AAG

GAT

CCG

AAC

GCT ATC

TTC

CTG

TCT

TTC

CAG

CAC

CTG

436

Thr

Alá

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Alá Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

120

125

130

CTG

CGT

GGC

AAA

GTT

CGT

TTC

CTG ATG

CTG

GTT

GGC

G.GT

TCT

ACC

CTG

484

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu Met

Leu

Val

Gly -Gly

Ser

. Thr

Leu

135

140

145

150

TGC

GTT

CGT

CGG

GCG

CCG

CCA

ACC ACT

GCT

GTT

CCG

TCT

CGT

ACC

TCT

532

Cys

Val

Arg

Arg

Alá

Pro

Pro

Thr Thr

Alá

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

155

160

165

CTG

GTT

CTG

ACC

CTG

AAC

GAG

CTC CCG

AAC

CGT

ACC

AGC

GGC

CTG

CTG

. 580

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu Pro

Asn

. Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

170 175 180

GAA ACC AAC TTT

ACC Thr

GCG Alá

AGC GCG CGT

ACC Thr

ACC GGC AGC GGC

CTG Leu

CTG Leu

628

Glu Thr Asn

Phe

Ser

Alá 190

Arg

Thr

Gly

Ser 195

Gly

185

AAA

TGG

CAG

CAG

GGC

TTT

CGT

GCG

AAA

ATC

CCG

GGC

CTG

CTG

AAC

CAG

676

Lys

Tro

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Alá

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

-

200

205

210

ACC

AGC

CGT

AGC

CTG

GAT

CAG

ATC

CCG'

GGC

TAT

'CTG

AAC

CGT

ATC

CAT

724

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

215

220

225

230

GAA

CTG

CTG

AAC

GGC

ACC

CGT

GGC

CTG

TTT

CCG

GGC

CCG

AGC

CGT

CGC

772

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

235

240

245

ACC

CTG

GGC

GCG

CCG

GAT

ATC

AGC

TCT

GGC

ACC

AGC

GAT

ACC

GGC

AGC

820

Thr

Leu

Gly

Alá

Pro

Asp

Il.e

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

250.

255

260

CTG

CCG

CCG

AAC

CTG

CAG

CCG

GGC

TAT

AGC

CCG

AGC

CCG

ACC

CAT

CCG

868

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

265

270

275

- 365 • · · * • · « ·· • · Λ ·

CCG

ACC

GGC

CAG

TAT

ACC

CTG

TTT

CCG

CTG

CCG CCG

ACC

CTG

CCG

ACC

91Ó

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

280

285

290

CCG

GTG

GTT

CAG

CTG

CAT

CCG

CTG

CTG

CCG

GAT CCG-

.AGC

GCG

CCG.

AGC.

·· 96Ψ

Pro·

Val

Val

Gin-.

-Leu.,

Hisi 'Pro:

:.Led

. Leu-

Fxo

Asp 'Pro

Seri

AAla'.íPrti

•Th=íí'!. '

295

300

30S

310

CCG

ACC

CCG

ACC

AÓC

CCG

CTG

CTG

AAC

ACC

AGC TAT

ACC

CAT

AGC

CAG

1012

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser Tyr

Thr

His

Ser

Gin

315

320

325

AAC

CTG

ACC

CAG

CAA

GGC

TAATGAAGCT TGA

1043

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Glv

330

TUDNIVALÓK A 15. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 45 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 15. SZ. SZEKV.:

AACTGGAAGA ATTCGCGGCC GCAGGAATTT TTTTTTTTTT TTTTT 45

TUDNIVALÓK A 16. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 13 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 16. SZ. SZEKV.:

AATTCGGCAC GAG

366

TUDNIVALÓK A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 17. SZ. SZEKV.:

CTCGTGCCG 9

TUDNIVALÓK A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 18. SZ. SZEKV.:

Ile·Pro Val Pro Pro Alá Cys Asp Pro Arg Leu Leu

5 10

TUDNIVALÓK A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid ··«

1« ·* • * · ·

V · « · * ·· • · · «··· · •· ·*·· »· ··

- 367 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 19. SZ. SZEKV.:

Thr Pro Val Pro Pro Alá Cys Asp Pro Arg Leu Leu

10

TUDNIVALÓK A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 20. SZ. SZEKV.:

Ser Pro Val Pro Pro Alá Cys Asp Pro Arg Leu Leu

10

TUDNIVALÓK A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 17 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (ix) SAJÁTO SSÁG:

(A) NEV/KULCS: módosított bázis (B) ELHELYEZKEDÉS: 12. és 15.

(D) EGYÉB TUDNIVALÓ: /mód. bázis = i (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 21. SZ. SZEKV.:

ACGCTGGGGG CNGANGA •· ···»

368

TUDNIVALÓK A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 17 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (ix) SAJÁTOSSÁG:

(A) NÉV/KULCS: módosított bázis (B) ELHELYEZKEDÉS: 12. és 15.

(D) EGYÉB TUDNIVALÓ: /mód. bázis = i (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 22. SZ. SZEKV.:

ACACTAGGAT CNAANAA 17

TUDNIVALÓK A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 17 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (ix) SAJÁTOSSÁG:

(A) NÉV/KULCS: módosított bázis (B) ELHELYEZKEDÉS: 12. és 15.

(D) EGYÉB TUDNIVALÓ: /mód. bázis = i (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 23. SZ. SZEKV.:

ACGCTGGGTG CNGANGA • ·

369

TUDNIVALÓK Δ 24. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 17 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (ix) SAJÁTOSSÁG:

(A) NÉV/KULCS: módosított bázis (B) ELHELYEZKEDÉS: 12. és 15.

(D) EGYÉB TUDNIVALÓ: /mód. bázis = i (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 24. SZ. SZEKV.:

ACGCTGGGCG.CNGANGA 17

TUDNIVALÓK A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 17 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 25. SZ. SZEKV.:

GGGGGGCGGA CGCTGGG 17

TUDNIVALÓK A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 17 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav • »

- 370 (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 26. SZ. SZEKV.:

GGAGGACGAA CACTAGG 17

TUDNIVALÓK A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 17 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 27. SZ. SZEKV.:

GGTGGTCGTA CGCTGGG 17

TUDNIVALÓK A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 17 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 28. SZ. SZEKV.:

GGCGGCCGCA CGCTGGG 17

TUDNIVALÓK A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

371

(A)	HOSSZÚSÁG: 21 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris
MOLEKULA	TÍPUSA: egyéb nukleinsav

(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 29. SZ. SZEKV.:

GGATCTTGGT TCATTCTCAA G 21

TUDNIVALÓK A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 30. SZ. SZEKV.:

CCTCAGACAG TGGTTCAAAG 20

TUDNIVALÓK A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 31. SZ. SZEKV.:

CGAGGGTGTA CCTGGGTCCT G • ·

- 372 TUDNIVALÓK A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 32. SZ. SZEKV.:

CAGAGTTAGT CTTGCGGTGA G

TUDNIVALÓK A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 33. SZ. SZEKV.

CCTGTCCTGC TGCCTGCTGT G

TUDNIVALÓK A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 34. SZ. SZEKV.

• ·

- 373

TGAAGTTCGT CTCCAACAAT C 21

TUDNIVALÓK A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 35. SZ. SZEKV.:

ATGGAGCTGA CTGATTTGCT C 21

TUDNIVALÓK A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 36. SZ. SZEKV.:

TGAAGTTCGT CTCCAACAAT C 21

TUDNIVALÓK A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris • ·

374 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 37. SZ. SZEKV.

TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G

TUDNIVALÓK A 38. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 38. SZ. SZEKV.

TGACGCAGAG GGTGGACCCT C

TUDNIVALÓK A 39. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 39. SZ. SZEKV.

AGCAGAACCT CTCTAGTCCT C

TUDNIVALÓK A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav • · · · • · · ·

375 (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 40. SZ. SZEKV.:

ACACTGAACG AGCTCCCAAA C 21

TUDNIVALÓK A 41. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 41. SZ. SZEKV.:

AACTACTGGC TCTGGGCTTC T 21

TUDNIVALÓK A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 42. SZ. SZEKV.:

AGGGATTCAG AGCCAAGATT C 21

TUDNIVALÓK A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

• · · · · ·· · • · tilt*

376 (Δ) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 43. SZ. SZEKV.:

TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTGGG G 31

TUDNIVALÓK A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 44. SZ. SZEKV.:

TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTAAA A 31

TUDNIVALÓK A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 45. SZ. SZEKV.:

TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTCTT T 31 • ·

- 377 TUDNIVALÓK A 46. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 46. SZ. SZEKV.

TAGCGGCCGC _TTTTTTTTTT TTTTTTTGCC C

TUDNIVALÓK A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 47. SZ. SZEKV.

TAGCGGCCGC _{TTTTTTTTTT T}

TUDNIVALÓK A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 48. SZ. SZEKV.

• · · «· ·* · • · · · · ··

378

TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21

TUDNIVALÓK A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 49. SZ. SZEKV.:

AGGATGGGTT GGGGAAGGAG A 21

TUDNIVALÓK AZ 50. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 21 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 50. SZ. SZEKV.:

TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21

TUDNIVALÓK AZ 51. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris • ·

- 379 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 51. SZ. SZEKV.

AGGGAAGAGC GTATACTGTC C

TUDNIVALÓK AZ 52. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 52. SZ. SZEKV.

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC C

TUDNIVALÓK AZ 53. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 53. SZ. SZEKV.

ATGGGAGTCA CGAAGCAGTT T

TUDNIVALÓK AZ 54. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav

380 ·«· ·«··· • · * · · ·· (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 54. SZ. SZEKV.:

TGCGTTTCCT GATGCTTGTA G 21

TUDNIVALÓK AZ 55. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 55. SZ. SZEKV.:

AACCTTACCC TTCCTGAGAC A 21

TUDNIVALÓK AZ 56. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 56. SZ. SZEKV.:

T.TTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30

TUDNIVALÓK AZ 57. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

381

(A) HOSSZÚSÁG: 39 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 57. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTAGCT GGGGACAGCT GTGGTGGGT 39

TUDNIVALÓK AZ 58. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 42 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 58. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTACAG TGTGAGGACT AGAGAGGTTC TG 42

TUDNIVALÓK AZ 59. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 42 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 59. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTATCT GGCTGAGGCA GTGAAGTTTG TC

382

TUDNIVALÓK A 60. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 42 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 60. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTACAG ACCAGGAATC TTGGCTCTGAA T

TUDNIVALÓK A 61. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 61. SZ. SZEKV.:

TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30

TUDNIVALÓK A 62. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 41 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 62. SZ. SZEKV.:

..., ,..

TTTGCGGCCG CTCATTAGAG GGTGGACCCT CCTACAAGCA T 42

TUDNIVALÓK A 63. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 40 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 63. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTAGCA GAGGGTGGAC CCTCCTACAA 40

TUDNIVALÓK A 64. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 38 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 64. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTACCT GACGCAGAGG GTGGACCC 38

TUDNIVALÓK A 65. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 38 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

- 384 ···· ·» ♦· • · · · * • · · · · ·· • · · » · « · «♦ ···· ·· «· ·· (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 65. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTACCG CCTGACGCAG AGGGTGGA

TUDNIVALÓK A 66. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 38 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 66. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTAGGC CCGCCTGACG CAGAGGGT

TUDNIVALÓK A 67. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 38 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 67. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTCTGG GGCCCGCCTG ACGCAGAG

TUDNIVALÓK A 68. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 38 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav

385 (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 68. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTAGGG TGGGGCCCGC CTGACGCA 38

TUDNIVALÓK A 69. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 69. SZ. SZEKV.:

TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30

TUDNIVALÓK A 70. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 41 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 70. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTATTC GTGTATCCTG TTCAGGTATC C 41

TUDNIVALÓK A 71. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

386 (A) HOSSZÚSÁG: 39 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 71. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTAGCT GGGGACAGCT GTGGTGGGT 39

TUDNIVALÓK A 72. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 50 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 72. SZ. SZEKV.:

AGTAAACTGC TTCGTGACTC CCATGTCCTT CACAGCAGAC TGAGCCAGTG

TUDNIVALÓK A 73. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 49 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 73. SZ. SZEKV.:

CATGGGAGTC ACGAAGCAGT TTACTGGACA GCGTTAGCCT TGCAGTTAG

- 387 TUDNIVALÓK A 74. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 49 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 74. SZ. SZEKV.:

TGTGACCTCC GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGTGACTCCC ATGTCCTTC 49

TUDNIVALÓK A 75. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 48 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 75. SZ. SZEKV.:

TTTACTGAGG ACTCGGAGGT CACAGGACAG CGTTAGCCTT GCAGTTAG

TUDNIVALÓK A 76. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 49 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 76. SZ. SZEKV.:

388

GACCTCCGAG TCCTCAGTAA ACTGCTTCGT GACTCCCATG TCCTTCACA 49

TUDNIVALÓK A 77. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 48 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 77. SZ. SZEKV.:

CAGTTTACTG AGGACTCGGA GGTCGGACAG CGTTAGCCTT GCAGTTAG 48

TUDNIVALÓK A 78. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 78. SZ. SZEKV.:

TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21

TUDNIVALÓK A 79. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris

389 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 79. SZ. SZEKV.:

CAGGTATCCG GGGATTTGGT C 21

TUDNIVALÓK A 80. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 80. SZ. SZEKV.:

TGCGTTTCCT GATGCTTGTA G 21

TUDNIVALÓK A 81. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 35 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 81. SZ. SZEKV.:

GAGAGAGCGG CCGCTTACCC TTCCTGAGAC AGATT 35

TUDNIVALÓK A 82. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 6 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav • ·

390 (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 82. SZ. SZEKV.:

GAGAGA 6

TUDNIVALÓK A 83. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 70 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 83. SZ. SZEKV.:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAGCCCGGCT CCGCCAGCTT 50

GTGACCTTCG TGTTCTGTCT 70

TUDNIVALÓK A 84. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 72 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 84. SZ. SZEKV.:

CAGTTTAGAC AGAACACGAA GGTCACAAGC TGGCGGAGCC GGGCTCATTA 50

TTTATTACCT CCTTGGTTTT TT 72

391

TUDNIVALÓK A 85. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 69 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 85. SZ. SZEKV.:

AAACTGCTTC GCGACTCTCA CGTGCTGCAC TCTCGTCTGT CCCAGTGCCC

GGAAGTTCAC CCGCTGCCG

TUDNIVALÓK A 86. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 69 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 86. SZ. SZEKV.:

CGGGGTCGGC AGCGGGTGAA CTTCCGGGCA CTGGGACAGA CGAGAGTGCA

GCACGTGAGA GTCGCGAAG

TUDNIVALÓK A 87. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 69 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris

- 392 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 87. SZ. SZEKV.:

ACCCCGGTTC TGCTTCCGGC TGTCGACTTC TCCCTGGGTG AATGGAAAAC 50

CCAGATGGAA GAGACCAAA 69

TUDNIVALÓK A 88. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 69 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 88. SZ. SZEKV.:

CTGAGCTTTG GTCTCTTCCA TCTGGGTTTT CCATTCACCC AGGGAGAAGT 50

CGACAGCCGG AAGCAGAAC 69

TUDNIVALÓK A 89. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 69 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 89. SZ. SZEKV.:

GCTCAGGACA TCCTGGGTGC AGTAACTCTG CTTCTGGAAG GCGTTATGGC 50

TGCACGTGGC CAGCTTGGC 69

TUDNIVALÓK A 90. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ

393 (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 69 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 90. SZ. SZEKV.:

GGTCGGGCCA AGCTGGCCAC GTGCAGCCAT AACGCCTTCC AGAAGCAGAG 50

TTACTGCACC CAGGATGTC 69

TUDNIVALÓK A 91. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 69 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 91. SZ. SZEKV.:

CCGACCTGCC TGTCTTCCCT GCTTGGCCAG CTGTCTGGCC AGGTTCGTCT 50

GCTGCTCGGC GCTCTGCAG 69

TUDNIVALÓK A 92. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 66 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav * ·

- 394 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 92. SZ. SZEKV.:

CAGAGACTGC AGAGCGCCGA GCAGACGAAC CTGGCCAGAC AGCTGGCCAA 50

GCAGGGAAGA CAGGCA 66

TUDNIVALÓK A 93. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 70 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 93. SZ. SZEKV.:

TCTCTGCTTG GCACCCAGCT GCCGCCACAG GGCCGTACCA CTGCTCACAA 50

GGATCCGAAC GCTATCTTCC 70

TUDNIVALÓK A 94. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 70 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 94. SZ. SZEKV.:

AAGACAGGAA GATAGCGTTC GGATCCTTGT GAGCAGTGGT ACGGCCCTGT 50

GGCGGCAGCT GGGTGCCAAG 70

TUDNIVALÓK A 95. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

- 395 (A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 95. SZ. SZEKV.

GGAGGAGACC AAGGCACAGG A

TUDNIVALÓK A 96. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 96. SZ. SZEKV.

CCGGAATTCT TACCCTTCCT GAGACAGATT

TUDNIVALÓK A 97. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 8 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 97. SZ. SZEKV.

CTAATGAG • ··

- 396 TUDNIVALÓK A 98. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 16 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 98. SZ. SZEKV.:

AATTCTCATT AGAGCT

TUDNIVALÓK A 99. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 8 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 99. SZ. SZEKV.

CTAATGAG

TUDNIVALÓK A 100. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 16 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 100. SZ. SZEKV

397

AATTCTCATT AGAGCT 16

TUDNIVALÓK A 101. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 25 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 101. SZ. SZEKV.:

ATCGCCGGCT CCGCCAGCTT GTGAC 25

TUDNIVALÓK A 102. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 102. SZ. SZEKV.:

GCCGAATTCT CATTAGAGCT CGTTCAGTGT 30

TUDNIVALÓK A 103. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 42 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris ···· »·

- 396 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 103. SZ. SZEKV.:

GATCCGAACG CTATCTTCCT GTCTTTCCAG CACCTGCTGC GT 42

TUDNIVALÓK A 104. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 44 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 104. SZ. SZEKV.:

TTTGCCACGC AGCAGGTGCT GGAAAGACAG GAAGATAGCG TTCG 44

TUDNIVALÓK A 105. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 42 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 105. SZ. SZEKV.:

GGCAAAGTTC GTTTCCTGAT GCTGGTTGGC GGTTCTACCC TG 42

TUDNIVALÓK A 106. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 41 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav

- 399 (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 106. SZ. SZEKV.:

ACGCACAGGG TAGAACCGCC AACCAGCATC AGGAAACGAA C 41

TUDNIVALÓK A 107. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZOSÁG: 46 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 107. SZ. SZEKV.:

TGCGTTCGTC GGGCGCCGCC AACCACTGCT GTTCCGTCTT AATGAA 46

TUDNIVALÓK A 108. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 45 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 108. SZ. SZEKV.:

AGCTTTCATT AAGACGGAAC AGCAGTGGTT GGCGGCGCCC GACGA 45

TUDNIVALÓK A 109. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

400 (A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 109. SZ. SZEKV

AAGGATCCGA ACGCTATCTT CCTG

TUDNIVALÓK A 110. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 110. SZ. SZEKV

AGAAGCTTTC ATTAAGACGG AACA

TUDNIVALÓK A 111. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 46 bézispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 111. SZ. SZEKV.:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT GTACCA 46

- 401 TUDNIVALÓK A 112. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 46 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 112. SZ. SZEKV.:

CAGGTGGTAC AGGTGCTTTC ATTATTTATT ACCTCCTTGG TTTTTT 46

TUDNIVALÓK A 113. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 38 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 113. SZ. SZEKV.:

CCTGCATGTG ATTTACGGGT CCTGTCTAAA CTGCTGCG 38

TUDNIVALÓK A 114. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 34 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 114. SZ. SZEKV.:

402

CGCAGCAGTT TAGACAGGAC CCGTAAATCA CATG 34

TUDNIVALÓK A 115. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) 7HOSSZOSÁG: 84 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 115. SZ. SZEKV.:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT GTACCACCTG 50

CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG 84

TUDNIVALÓK A 116. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 20 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 116. SZ. SZEKV.:

Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu His

10 15

Arg Arg Leu Ser Gin

TUDNIVALÓK A 117. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

• · · · · · · • · · · · • · · · · · · • · ···· ·· ··

- 403 (A) HOSSZÚSÁG: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 117. SZ. SZEKV.:

Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Thr Glu Gin Ser Lys Alá

10 15

Gin Asp Ile Leu Gly Alá

TUDNIVALÓK A 118. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 18 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 118. SZ. SZEKV.:

Ser Arg Thr Ser Gin Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg

10 15

Leu Leu Asp

TUDNIVALÓK A 119. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

• ·

- 404 (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 119. SZ. SZEKV.:

Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu

5 10 15

His Ser Arg Leu Ser Gin

TUDNIVALÓK A 120. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 16 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 120. SZ. SZEKV.:

Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Alá Gin

10 15

Asp

TUDNIVALÓK A 121. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 19 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 121. SZ. SZEKV.:

405

Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Alá His Lys

10 15

Asp Pro Asn Alá

TUDNIVALÓK A 122. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 19 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 122. SZ. SZEKV.:

Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe

10 15

Thr Alá Ser Alá

TUDNIVALÓK A 123. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 23 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid

	(xi)	SZEKVENCIA	LEÍRÁS:	123.	SZ.	SZEKV.:
Ser	Leu	Pro Pro Asn	Leu Gin	Pro	Gly	Tyr Ser Pro	Ser Pro Thr
1		5				10	15
ΗΪ3	Pro	Pro Thr Gly	Gin Tyr	Thr

406

TUDNIVALÓK A 124. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid

	(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:	124. SZ. SZEKV.:
Pro	Ser Alá Pro Thr Pro Thr	Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr
1	5	10 15
Ser	Tyr Thr His Ser Gin Asn	Leu Ser Gin Glu Gly
	20	25

TUDNIVALÓK A 125. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 46 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 125. SZ. SZEKV.:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCT GCACCA 46

TUDNIVALÓK A 126. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 46 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú

407 ·· · ·· ·· · • · · · · · · (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 126. SZ. SZEKV.:

CAGGTGGTGC AGGAGATTTC ATTATTTATT ACCTCCTTGG TTTTTT 46

TUDNIVALÓK A 127. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 38 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 127. SZ. SZEKV.:

CCTGCATGTG ATTTACGGGT CCTGTCTAAA CTGCTGCG 38

TUDNIVALÓK A 128. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 34 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 128. SZ. SZEKV.:

CGCAGCAGTT TAGACAGGAC CCGTAAATCA CATG 34

TUDNIVALÓK A 129. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 84 bázispár • · • · ·

I ·· ·»·· ·· ·· ··

- 408 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 129. SZ. SZEKV.:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCT GCACCACCTG

CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG

TUDNIVALÓK A 130. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 47 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 130. SZ. SZEKV.:

CTCCCGAACC GTACCAGCGG CCTGCTGGAA ACCAACTTTA CCGCGAG 47

TUDNIVALÓK A 131. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 47 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 131. SZ. SZEKV.:

GGTAAAGTTG GTTTCCAGCA GGCCGCTGGT ACGGTTCGGG AGCTCGT 47

409 • · ····· • · · · · ·· ·· ·*«· ·· ·· ·«

TUDNIVALÓK A 132. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 49 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 132. SZ. SZEKV.:

CGCGCGTACC ACCGGCAGCG GCCTGCTGAA ATGGCAGCAG GGCTTTCGT 49

TUDNIVALÓK A 133. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 49 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav . (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 133. SZ. SZEKV.:

AGCCQTGCTG CCATTTCAGC AGGCCGCTGC CGGTGGTACG.CGCGCTCGC 49

TUDNIVALÓK A 134. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 50 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 134. SZ. SZEKV.:

• · ·

- 410

GCGAAAATCC CGGGCCTGCT GAACCAGACC AGCCGTAGCC TGGATCAGAT 50

TUDNIVALÓK A 135. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 50 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 135. SZ. SZEKV.:

ATCCAGGCTA CGGCTGGTCT GGTTCAGCAG GCCCGGGATT TTCGCACGAA 50

TUDNIVALÓK A 136. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 47 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS·: 136. SZ. SZEKV.:

CCCGGGCTAT CTGAACCGTA TCCATGAACT GCTGAACGGC ACCCGTG 47

TUDNIVALÓK A 137. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 47 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris

- 411 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 137. SZ. SZEKV.:

GTGCCGTTCA GCAGTTCATG GATACGGTTC AGATAGCCCG GGATCTG 47

TUDNIVALÓK A 138. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 49 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 138. SZ. SZEKV.:

GCCTGTTTCC GGGCCCGAGC CGTCGCACCC TGGGCGCGCC GGATATCAG 49

TUDNIVALÓK A 139. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 49 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 139. SZ. SZEKV.:

ATCCGGCGCG CCCAGGGTGC GACGGCTCGG GCCCGGAAAC AGGCCACGG 49

TUDNIVALÓK A 140. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 50 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav • · ««··

412 (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 140. SZ. SZEKV.:

ATCAGCTCTG GCACCAGCGA TACCGGCAGC CTGCCGCCGA ACCTGCAGCC 50

TUDNIVALÓK A 141. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 50 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 141. SZ. SZEKV.:

CAGGTTCGGC GGCAGGCTGC CGGTATCGCT GGTGCCAGAG CTGATATCCG 50

TUDNIVALÓK A 142. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 51 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 142. SZ. SZEKV.:

GGGCTATAGC CCGAGCCCGA CCCATCCGCC GACCGGCCAG TATACCCTGT T 51

TUDNIVALÓK A 143. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

• ·

- 413 (A) HOSSZÚSÁG: 51 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 143. SZ. SZEKV.:

GGTATACTGG CCGGTCGGCG GATGGGTCGG GCTCGGGCTA TAGCCCGGCT

TUDNIVALÓK A 144. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 50 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 144. SZ. SZEKV.:

TCCGCTGCCG CCGACCCTGC CGACCCCGGT GGTTCAGCTG CATCCGCTGC

TUDNIVALÓK A 145. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 50 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 145. SZ. SZEKV.:

GGATGCAGCT GAACCACCGG GGTCGGCAGG GTCGGCGGCA GCGGAAACAG 50 ·· • · • · • ·

414

TUDNIVALÓK A 146. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 51 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 146. SZ. SZEKV.:

TGCCGGATCC GAGCGCGCCG ACCCCGACCC CGACCAGCCC GCTGCTGAAC A 51

TUDNIVALÓK A 147. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 51 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 147. SZ. SZEKV.:

AGCAGCGGGC TGGTCGGGGT CGGGGTCGGC GCGCTCGGAT CCGGCAGCAG C 51

TUDNIVALÓK A 148. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 51 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 148. SZ. SZEKV.:

• · · ·

- 415 CCAGCTATAC CCATAGCCAG AACCTGAGCC AGGAAGGCTA ATGAAGCTTG A 51

TUDNIVALÓK A 149. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZOSÁG: 51 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 149. SZ. SZEKV.:

CTTCATTAGC CTTCCTGGCT CAGGTTCTGG CTATGGGTAT AGCTGGTGTT C 51

TUDNIVALÓK A 150. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 150. SZ. SZEKV.:

ACGAGCTCCC GAACCGTACC A 21

TUDNIVALÓK A 151. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris • ··

- 416 21 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 151. SZ. SZEKV

CTGATATCCG GCGCGCCCAG G

TUDNIVALÓK A 152. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 152. SZ. SZEKV

CGGATATCAG CTCTGGCACC A

TUDNIVALÓK A 153. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 153. SZ. SZEKV

TCAAGCTTCA TTAGCCTTCC T

TUDNIVALÓK A 154. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 490 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav

- 417 • ·· (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 154. SZ. SZEKV.:

CTC CCG AAC CGT ACC AGC GGC CTG CTG GAA ACC AAC TTT ACC GCG AGC 48

Leu Pro Aan Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Alá Ser

10 15

GCG CGT ACC ACC GGC AGC GGC CTG CTG AAA TGG CAG CAG GGC TTT CGT 9 6

Alá Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg

25 30

GCG AAA ATC CCG GGC CTG CTG AAC CAG ACC AGC CGT AGC CTG GAT CAG 144

Alá Lys	Ile 35	Pro Gly	Leu	Leu Asn Gin Thr 40	Ser	Arg	Ser 45	Leu	Asp Gin
ATC CCG	GGC	TAT CTG	AAC	CGT ATC CAT GAA	CTG	CTG	AAC	GGC	ACC CGT 192
Ile Pro	Gly	Tyr Leu	Asn	Arg Ile His Glu	Leu	Leu	Asn	Gly	Thr Arg
.50				55		60
GGC CTG	TTT	CCG GGC	CCG	AGC CGT CGC ACC	CTG	GGC	GCG	CCG	GAT ATC 240
Gly Leu	Phe	Pro Gly	Pro	Ser Arg Arg Thr	Leu	Gly	Alá	Pro	Asp Ile
65			70		75	. „ .			80
AGC TCT	GGC	ACC AGC	GAT	ACC GGC AGC CTG	CCG	CCG	AAC	CTG	CAG CCG 288
Ser Ser	Gly	Thr Ser	Asp	Thr Gly Ser Leu	Pro	Pro	Asn	Leu	Gin Pro
		85		90					95
GGC TAT	AGC	CCG AGC	CCG	ACC CAT CCG CCG	ACC	GGC	CAG	TAT	ACC CTG 336
Gly Tyr	Ser	Pro Ser	Pro	Thr His Pro Pro	Thr	Gly	Gin	Tyr	Thr Leu
		100		10S: -				110
TTT CCG	CTG	CCG CCG	ACC	CTG CCG ACC CCG	GTG	GTT	CAG	CTG	CAT CCG 384
Phe Pro	Leu	Pro Pro	Thr	Leu Pro Thr Pro	Val	Val	Gin	Leu	His Pro
	115			120			125
CTG CTG	CCG	GAT CCG	AGC	GCG CCG ACC CCG	ACC	CCG	ACC	AGC	CCG CTG 432
Leu Leu	Pro	Asp Pro	Ser	Alá Pro Thr Pro	Thr	Pro	Thr	Ser	Pro Leu
130				135		140
CTG AAC	ACC	AGC TAT	ACC	CAT AGC CAG AAC	CTG.. AGC CAG GAA	GGC TAA 480
Leu Asn	Thr	Ser Tyr	Thr	His Ser Gin Asn	Leu	Ser	Gin	Glu	Gly
14S			145		ISO
TGAAGCT	'TGA								490
TUDNIVALÓK A 155	. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú • *

- 418 24 (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 155. SZ. SZEKV.:

AAGGATCCGA ACGCTATCTT CCTG

TUDNIVALÓK A 156. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 156. SZ. SZEKV.:

GGGAGCTCGT TCAGGGTCAGAACCAGAGAG GTACGAGACG GAACAGCAGT

GGTTGG

TUDNIVALÓK A 157. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 157 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 157. SZ. SZEKV.:

G GAT CCG AAC GCT ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC 46

Asp Pro Asn Alá lle Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly

10 15

AAA GTT CGT TTC CTG ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 20 25 30

419

CGG

GCG

CCG

CCA

ACC

ACT

GCT

GTT

CCG

TCT

CGT

ACC

TCT

CTG

GTT

CTG

142

Arg

Alá

Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

.·

35

40

4S

ACC

CTG

AAC

GAG

CTC

157

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

50

TUDNIVALÓK A 158. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 100 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 158. SZ. SZEKV.:

CCTCGAGGAA TTCCTGCAGC CCGGGACTAG TATCGGCTAC CCCTACGACG

TCCCCGACTA CGCCGGCGTC CATCACCATC ACCATCACTG AGCGGCCGCC 100

TUDNIVALÓK A 159. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 108 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 159. SZ. SZEKV.:

AATTGGCGGC CGCTCAGTGA TGGTGATGGT GATGAGCGCC GGCGTAGTCG

GGGACGTCGT AGGGGTAGCC GATACTAGTC CCGGGCTGCA. GGAATTCCTC 100

GAGGGTAC

108

TUDNIVALÓK A 160. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ • · · ·

- 420 (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 70 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 160. SZ. SZEKV.:

AATTCCAAGA TCTCACACTT GCTTTTGACA CAACTGTGTT TACTTGCAAT 50

CCCCCAAAAC AGACAGACCC 70

TUDNIVALÓK A 161. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 66 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 161. SZ. SZEKV.:

GGGTCTGTCT GTTTTGGGGG ATTGCAAGTA AACACAGTTG TGTCAAAAGC

AAGTGTGAGA TCTTGG

TUDNIVALÓK A 162. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 29 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav

421 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 162. SZ. SZEKV.:

GGCCCGGGAT GGAGCTGACT GAATTGCTC 29

TUDNIVALÓK A 163. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 35 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 163. SZ. SZEKV.:

TCAAGCTTAC TAGTCCCTTC CTGAGACAGA TTCTG 35

TUDNIVALÓK A 164. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 164. SZ. SZEKV.:

TAATACGACT CACTATAGGG CG 22

TUDNIVALÓK A 165. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú

422 (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 165. SZ. SZEKV.:

AATTCCAAGA TCACACACTT GC 22 *

TUDNIVALÓK A 166. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 35 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 166. SZ. SZEKV.:

TCAAGCTTAC TAGTCCCTTCC CTGAGACAGA TTCTG 35

TUDNIVALÓK A 167. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 35 bázispár (B) . TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 167. SZ. SZEKV.:

TGGGCACTGG CTCAGGTTGC TGTGAAGGAC ATGGG 35

TUDNIVALÓK A 168. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár • · ··

- 423 • · · ♦ • · ·· • · · ·· ·· (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 168. SZ. SZEKV.:

TGTAGGCAAA GGGGTAACCT CTGGGCA 27

TUDNIVALÓK A 169. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 169. SZ. SZEKV.:

Thr Ser Ile Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Alá Gly Val

5 10 15

His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

TUDNIVALÓK A 170. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 170. SZ. SZEKV.:

424

TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30

TUDNIVALÓK A 171. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 41 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 171. SZ. SZEKV.:

TTTGCGGCCG CTCATTATTC GTGTATCCTG TTCAGGTATC C 41

TUDNIVALÓK A 172. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 172. SZ. SZEKV.:

TGTAGGCAAA GGAACCTCTG GGCA 24

TUDNIVALÓK A 173. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 27 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

- 425 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 173. SZ. SZEKV

TGTAGGCAAA GGAGTGTGAA CCTCTGG

TUDNIVALÓK A 174.' SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 174. SZ. SZEKV

TGTAGGCAAA GGAGCGTGAA CCTCTGG

TUDNIVALÓK A 175. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 175. SZ. SZEKV

TGTAGGCAAA GGTCCGTGAA CCTCTGG

TUDNIVALÓK A 176. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav

426 ·*»<►· . ···: ·· *· • · · · · . * · » ·· • »· · · ·· ·* ·· (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 176. SZ. SZEKV.:

AGCTGTGGTC CTCTGTGGAG GAAG 24

TUDNIVALÓK A 177. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 177. SZ. SZEKV.:

GTGAGCTGTG GTGCCCTGTG GAGG 24

TUDNIVALÓK A 178. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 27 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 178. SZ. SZEKV.:

AGCTGTGGTC CTGTTGCCCT GTGGAGG 27

TUDNIVALÓK A 179. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

427 *1 » · • · (A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 179. SZ. SZEKV

AGCTGTGGTC CTAGCGCCCT GTGGAGG

TUDNIVALÓK A 180. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 180. SZ. SZEKV

AGCTGTGGTC CTTCCGCCCT GTGGAGG

TUDNIVALÓK A 181. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 181. SZ. SZEKV

CGGGCTGCAG GATATCCAAG ATCTCA

428 ··«· -. . * · ·

TUDNIVALÓK A 182. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 182. SZ. SZEKV.:

TAATACGACT CACTATAGGG CG 22

TUDNIVALÓK A 183. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 34 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: egyéb nukleinsav (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 183. SZ. SZEKV.:

GGGCGGCCGC TCAGCTGGGG ACAGCTGTGG TGGG 34

TUDNIVALÓK A 184. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (ix) SAJÁTOSSÁG:

·· ··*·

- 429 (A) NÉV/KULCS: kevert sajátosság (D) EGYÉB TUDNIVALÓ: /megj.: a 2. aminosav Alá, Ser, Gly, Met vagy Gin (ix) SAJÁTOSSÁG:

(A) NÉV/KULCS: kevert sajátosság (D) EGYÉB TUDNIVALÓ: /megj.: a 7. aminosav Alá vagy Lys (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 184. SZ. SZEKV.:

Lys Xaa Tyr Tyr Glu Ser Xaa

5

TUDNIVALÓK A 185. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 6 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (ix) SAJÁTOSSÁG:

(A) NÉV/KULCS: kevert sajátosság (D) EGYÉB TUDNIVALÓ: /megj.: a 6. aminosav Glu vagy

Asp.

(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 185. SZ. SZEKV.:

Lys Glx Arg Alá Alá Xaa

TUDNIVALÓK A 186. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

430 (A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 186. SZ. SZEKV.:

Lys Alá Gly Xaa Cys Ser Gly

5

TUDNIVALÓK A 187. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 13 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (ix) SAJÁTOSSÁG:

(A) NÉV/KULCS: kevert sajátosság (D) EGYÉB TUDNIVALÓ: /megj.: a 2. aminosav Ile, Thr vagy Ser.

(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 187. SZ. SZEKV.:

Lys Xaa Pro Val Pro Pro Alá Cys Asp Pro Arg Leu Leu

10

TUDNIVALÓK A 188. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav • · ·

- 431 (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 188. SZ. SZEKV.:

Lys Asp Ser Phe Leu Alá Asp Val Lys

5

TUDNIVALÓK A 189. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (ix) SAJÁTOSSÁG:

(A) NÉV/KULCS: kevert sajátosság (D) EGYÉB TUDNIVALÓ: /megj.: a 1. aminosav lizin vagy arginin.

(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 189. SZ. SZEKV.:

Xaa Thr Leu Pro Thr Xaa Alá Val Pro

5

TUDNIVALÓK A 190. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 15 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris

- 432 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 190. SZ. SZEKV.:

Lys Asp Ser Phe Leu Alá Asp Val Lys Gin Tyr Tyr Glu Ser Glu

10 15

TUDNIVALÓK A 191. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 332 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 191. SZ. SZEKV.:

Ser

Pro

Alá

Pro

Pro

Alá

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

1

5

10

15

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

20

25

30

His

Pro

Leu

Pro

Thr -

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

35

40

45

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Alá

Gin

Asp

lle

Leu

50

55

60

Gly

Alá

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin

65

70

75

80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

85

50

95

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Alá

• Leu.

GLn.

Ser

Leu

Letr

Oly

Thr

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Alá

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Alá

lle

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

130

135

140

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Alá

Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

14 5

ISO

15S

160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr'<

Ser

Let/

Val

Le.u

Thr

Leu

Asn1

‘ Glu

Leu

Pro

Asn

165

170

175

- 433 -

Arg

Thr

Ser

Gly 1Θ0

Leu

Leu Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Alá

Ser

Alá 190

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Leu

Leu Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 20S

Alá

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Leu

Asn

Gin Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Aso 220

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr 22S

Leu

Aan

Arg

Ile

His Glu 230

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg Thr

Leu

Gly

Alá 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

Gly

Ser Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro Pro

Thr • 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr Pro 295

Val

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp 305

Pro

• Ser

Alá

Pro

Thr Pro 310

Thr

Pro

Thr

Ser 315

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr 320

Ser

Tyr

Thr

His

Ser 325

Gin Asn

Leu

Ser

Gin 330

Glu

Gly

TUDNIVALÓK A 192. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 1086 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 192. SZ. SZEKV.:

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG 51

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val -21 -20 -15

GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT Val Met Leu Leu Leu Thr Alá Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Alá Pro -10 -S 1 • · · ·

- 434 -

CCT GCT TGT GAC Pro. ALa. Cys. Asp 5

CTC Lear-

CGA GTC CTC AGT AAACT.G CTT . CGT GAC TCC CAT'

147

Arg' 10

val·· Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

GTC CTT CAC AGC

AGA

CTG

AGC CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

195

Val Leu Hi-a Ser

Arg

Leu

Ser GLn

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

25

30

3 5

ACA CCT GTC CTG

CTG

CCT

GCT GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG.

AAA. .....

... 243«.

Thr. Pro Val Leu-

Leu

Pro-·

Alá Val;

A-su·

Phé·;

:Ser

Leitó

Gly.'

Gt'ú

'Trp/

.L.ya'·'

40

4 5

50

ACC CAG ATG GAG

GAG

ACC

AAG GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

291

Thr Gin Met Glu

Glu

Thr

Lys Alá

GLn

Asp

Ile

Leu

Gly

Alá

Val

Thr

55

60

65

CTT CTG CTG GAG

GGA

GTG

ATG GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

339

Leu Leu Leu GLu

Gly

Val

Met Alá

Alá

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

70

75

80

TGC CTC TCA TCC

CTC

CTG

GGG CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

387

Cys Leu Ser Ser

Leu

Leu

Gly Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

•

85

90

95

100

CTT GGG GCC CTG

CAG

AGC

CTC CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

435

Leu Gly Alá Leu

Gin

Ser

Leu Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

105

110

115

AGG ACC ACA GCT

CAC

AAG

GAT CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

ACC

TTC

CAA

483

Arg Thr Thr Alá

His

Lys

Asp Pro

Asn

Alá

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Cin

120

125

130

CAC CTG CTC CGA

GGA

AAG

GTG CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

531

His Leu Leu Arg

Gly

Lys

Val Arg

Phe

Leu

Hét

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

135

140

145

ACC CTC TGC GTC

AGG

CGG

GCC CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

579

Thr Leu Cys Val

Arg

Arg

Alá Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

Val

Pro

Ser

Arg

150

-

155

160

ACC TCT CTA GTC

: CTC

ACA

CTG AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

627

Thr Ser Leu Val

Leu

Thr

Leu Asn

. Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

165 170 175 180

TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG 675

Leu Leu Glu Thr Aan Phe Thr Alá Ser Alá Arg Thr Thr Gly Ser Gly '

185 190 195

CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG 7 23

Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Alá Lys Ile Pro Gly Leu Leu

200 20S 210

AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG 771

Asn GLn Thr Ser Arg Ser Leu Asp GLn Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg

215 220 225

ATA CAC GAA.. CTC TTG- AAT -GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA 819 • Ile Hi-s Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser

230 235 240

CGC AGG ACC CTA GGA.GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA 867

Arg Arg Thr Leu Gly Alá Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr

245 · 250 255 260 • · ·

- 435 -

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

915

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro.

Thr-..

26.5.

270

275

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

953

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

280

285

290

ccc

ACC

CCT

CTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

1011

Pro

Thr

Pro

VaL

Val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Alá

295

300

305

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC..-.

;··.... 105.9_

Pro.

Thr

Pro

-Thr

'Pro·

•Thr

'•ser.

Proí'.Leu·

Leu-Kan

Thr,

Ser

•dfyr

- Thr4Hsr&.

310.

3Ί5·

320

TCC

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GGG

TAA

1086

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

325

330

TUDNIVALÓK A 193. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 193. SZ. SZEKV.: Lys Gin Tyr Tyr Glu Ser Glu

5

TUDNIVALÓK A 194. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZOSÁG: 1663 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez • ·

- ♦ · * * ' · · · ' · · · « · • · · ·· · · ·

- 436 (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Rattus norvegicus (H) SEJTVONAL: McA-RH8994 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 194. SZ. SZEKV.:

GGTGTACCTG GGTCCTGAAG CCCTTCTTCA CCTGGATAGA TTCCTTGGCC CACCTGTCCC 60

CACCCCACTC TGTGCAGAGG TACAAAAGCT CAAGCCGTCT CCATGGCCCC AGGAAAGATT 120

CAGGGGAGAG GCCCCACACA GGGAGCCACT GCAGTCAGAC ACCCTGGGCA GA ATG 175

Met -21

GAG GLu- -20

CTG ACT Leu Thx

GAT TTG Asp -Leu

CTC Leu -15

CTG Leu

GTG Val

GCC ATA CTT

CTC CTC

ACC GCA.. AGA

223.

Aia

Ile

Leu -10

Leu

Leu

Thr

Alá

Arg -5

CTA

ACT CTG

TCC AGC

CCA

GTT

CCT

CCC

GCC

TGT

GAC

CCC

AGA

CTC

CTA

271

Leu

Thr Leu

Ser Ser

Pro

Val

Pro

Pro

Alá

Cys

Asp

Pro

Arg

Leu

Leu

1

5

10

AAT

AAA CTG

CTT CGT

GAC

TCC

TAC

CTC

CTT

CAC

AGC

CGA

CTG

AGT

CAG

319

Asn

Lys Leu

Leu Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

15

20

25

TGT

CCT GAC

GTC AAC

CCT

TTG

TCT

ATC

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

367

Cys

Pro Asp

Val Asn

Pro

Leu

Ser

Ile

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

Val

30

35

40

GAC

TTT AGC

CTG GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ACC

GAA

CAG

AGC

AAG

GCA

415

Asp

Phe Ser

Leu Gly

Glu

Tr?

Lys

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Ser

Lys

Alá

45

50

S 5

60

CAG

GAC ATT

CTA GGG

GCA

GTG.

TCC.

„CTA.

CTG.

GAG

GGG

GTG

ATG, GCA '·

4 53

Gin

Asp ILet

Leu Gly

Alá-

• Val·.

,'Se‘r'

\L.au·

. Lan.

'L'eu.

Glu

•G.'Ly

,:v'aÉL'

'· MeV

•Al'a ·' ·'

.l l

6 5

70

75

GCA

CGA GGA

CAG TTG

GAA

CCC

TCC

TGC

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGA

CAG

511

Alá

Arg Gly

Gin Leu

Glu

Pro

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

80

85

90

CTT

TCT GGT

CAG GTT

CGC

CTC

CTC

TTG

GGA

GCC

CTG

CAG

GGC

CTC

CTA

559

Leu

Ser Gly

Gin Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Alá

Leu

Gin

Gly

Leu

Leu

95

100

105

GGA

ACC CAG

GTA AGT

CCC

CAG

ACC

TAT

AGA

AAC

TAC

CCT

CTT

ACT

CAG

607

Gly

~Thr Gin

Val Ser

Pro

Gin

Thr

Tyr

Arg

Asn

Tyr

Pro

Leu

Thr

Gin

110

115

120

TTC

CTC TAAGGACCTG

GGAAAAGACA AGGGATTCTA GATTCTAGGT

GTCTTCAGTG

663

Phe

Leu

125

TATGAAAGCT

GGTCTATACG GAGTGATGCT TCTCAGCCAC

AAT

ACCTGGG

TGCTGGCAGT

723

AAATCTTTCC

ACCTTAGTGA GAAGAGGCCT GATATGTGGG

CCAACTCACT

GGCCTCAGGC

783

CCATCCTCTG

CCTTCAGCTT CCTCCACAGG GCAGGACCAC

AGCTCACAAG

GACCCCAGTG

843

CCCTCTTCTT

GAGCTTGCAA CAACTGCTTC GGGGAAAGGT

GCGCTTCCTG

CTGCTGGTAG

903

AAGGTCCCGC

CCTCTGTGTC.ÁGACGGACCC TTCCCACCAC

AGCTGTCCCA

AGCAGAACCT

9 60

• ·· · ·· ·· • · • · • · · • ·

- 437 -

CTCAACTCCT	CACACTAAAC	AAGTTCCCAA	ACAGACTTCT	GGATTGTTGG	AGACGAACTT	1023
CAGTGTTGTA	GCCAGAACTG	CTGGCCCTGG	ACTTCTGAAC	AGGCTTCAAG	GATTCAGAGC	1083
CAAGATTATT	CCTGGTCAGC	TAAATCAAAC	CTCCGGGTCC	TTAGACCAAA	TCCCTGGATA	1143
CCTGAACGGG	ACACACGAAC	CTGTGAATGG	aactcatggG	CTCTTTGCTG	GGACCTCACT	1203
ACAGACCCTG	GAAGCCCCAG	ACGTTGTGCC	AGGAGCTTTC	AACAAAGGCT	CCTTGCCACT	1263
CAACCTCCAG	AGTGGACTTC	CTCCTATCCC	AAGCCTTGCT	GCTGATGGAT	ACACACTTTT	1323
CCCTCCTTCA	CCTACCTTCC	CCACCCCTGG	GTCTCCACCC	CAGCTCCCCC	CCGTTTCCTG	1383
ACCCCTCCAC	CACCATACCT	AACTCTACCA	ACCCTCATCC	AGGACTTGGT	CTCAGTAAGC	1443
GTCCCGTGCA	CTGGCACGGA	GCGCGATCGT	CTGCAACATC	TCTCAGGGGC	AAGCTTCCTC	1503
AGG'AAGGCTC	TGAGGCAGCT	CACTAGACAT	'CCTGCTCTCG	CCTAACGGGC	CCTGGGAAAG	1563
GGATACACAG	GCCAGGACAC	TGTACAACCT	TAGGAGCGAT	TTTTTTCTTA	ACCTATCAAC’	1623
AATATTCATC	AGAGCAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA			1663

TUDNIVALÓK A 195. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A)	HOSSZÚSÁG: 861 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	kétszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVET TÍPUS: máj (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 195. SZ. SZEKV.:

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG 51

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val -21 -20 -15

GTC Val

ATG Met

CTT Leu -10

CTC Leu

CTA Leu

ACT Thr

GCA Alá

AGG Arg -5

CTA Leu

ACG Thr

CTG Leu

TCC Ser

AGC Ser t_

CCG Pro

GCT Alá

CCT Pro

99

CCT

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

147

Pro

Alá

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

5

10

15

20

GTC

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

195

Val

Leu

HÍ3

ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

25

30

35

- 438 • · *··· ·· ·, * · · · » · • · · · ·· • · * · » ··♦· ·· ·· ··

ACA CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

243

Thr Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

40

45

50

ACC CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

291

Thr Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Alá

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Alá

Val

Thr

55

60

65

CTT CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

339

Leu Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

70

75

80

TGC CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

387

Cys Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

85

90

95

100

CTT GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

435

Leu Gly

Alá

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

105

110

115

AGG ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

483

Arg Thr

Thr

Alá

Hls

Lys

Asp

Pro

Asn

Alá

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

120

125

130

—

-......· -

CAC CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

531

His Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

135 140 145

ACC Thr

CTC Leu ISO

TGC Cys

GTC Val

AGG Arg

CGG Arg-

GCC ALa. 1S5

CCA Pro-

CCC ACC ACA GCT Pro Thr- Thr: :Ala· 160

GTC Val

CCC Pro

AGC Ser ·

AGA Arg·

579

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG CTC CCA AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

627

Thr 165

Ser

Leu

Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu Leu Pro Asn 175

Arg

Thr

Ser

Gly 180

TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA GCC AGA ACT

ACT

GGC

TCT

GGG

675

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Alá

Ser Alá Arg Thr 190

Thr

Gly

Ser 19 5

Gly

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA GCC AAG ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

723

Leu

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg Alá Lys Ile 205

Pro

Gly 210

Leu

Leu

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA ATC CCC GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

771

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asn 220

Gin Ile Pro Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

ΑΤΑ CAC GAA CTC TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 823

Ile Hls Glu Leu

230

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA. 851

TUDNIVALÓK A 196. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 1267 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav

439 (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVET TÍPUS: máj (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 196. SZ. SZEKV.:

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG SÍ

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val -21 -20 -IS

GTC Val

ATG Met

CTT Leu -10

CTC Leu

CTA Leu

ACT Thr

GCA AGG

CTA Leu

ACG Thr

CTG Leu

TCC AGC

CCG Pro

GCT Alá

CCT Pro

99

Alá

Arg -5

Ser

Ser 1

CCT

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

147

Pro

Alá

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

5

10

15

20

GTC

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

195

Val

Leu

Hls

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

25

30

35

ACA

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

243

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

45 50

ACC

CAG

ATG GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

291

Thr

Gin

Met Glu

Glu

Thr

Lys

Alá

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Alá

Val

Thr

55

60

65

CTT

CTG

CTG GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

339

Leu

Leu

Leu Glu

Gly

Val

Met

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

70

75

80

TGC

CTC

TCA' TCC

CTC CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

387

Cys

Leu

Ser Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

85

90

95

100

CTT

GGG

GCC CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

435

Leu

Gly

Alá Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

105

110

115

AGG

ACC

ACA GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

483

Arg

Thr

Thr Alá

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Alá

Ile

Phe

Leu

-.Ser,

• Phe

iGln

120

125

130

CAC

CTG

CTC CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

531

-His

Leu

Leu Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

135

140

145

ACC

CTC

TGC GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

579

Thr

Leu

Cys Val

Arg

Arg

Alá

Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

Val

Pro

Ser

Arg

150 155 160

ACC TCT 'CTA GTC-CTC A'CA,'.CTG AACá GAG . CTC.'CCA'^:'AAC AGGVACT-: TCT-'.’GGA' -í Thr Ser-Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Lau Pro Asn Arg Thr' Sér Gly 165 170 175 130

627 • · • · ·· • ·

- 440 -

• · · * · · · 4

♦ · · · »· ·· ··

* »*

TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

ACT

ACT

GGC

TCT

GGG

675

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Alá

Ser

Alá

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

185

190

195

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

723

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Alá

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Leu

200

205

210

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

771

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

215

220

225

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

GGA

ACT '

CGT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA 1

819

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

230

235

240

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

867

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Alá

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

245

250

255

260

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

915

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

265

270

275

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

963

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

230

285

290

CCC

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

1011

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Alá

295

300

305

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

1059

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

310 315 320

TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA 1113

Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly 325 330 ·

TTGTCTCATG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT 1173

TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA -1233 ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAA 1267

TUDNIVALÓK A 197. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 549 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris

441 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 197. SZ. SZEKV.:

CTG GTT Leu Val -5

CCG Pro

CGT Arg

GGA Gly

TCC Ser 1

CCG GCT Pro Alá

CCG Pro

CCA Pro 5

GCT Alá

TCT Cys

GAC Asp

Leu

CGT Arg 10

GTT Val

48

CTG'

TCT

AAA*'

CTG

CTT'

CGC

GAG TCT

ŐAC

GTG

CTG

CAC '

TCT

CGT

CTG

TCC

9ő'

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

15

20

25

CAG

TGC

CCG

GAA

GTT

CAC

CCG

CTG

CCG

ACC

CCG

GTT

CTG

CTT

CCG

GCT

144

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Alá

30

35

40

GTC

GAC

TTC

TCC

CTG

GGT

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ATG

GAA

GAG

ACC

AAA

192

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

45

SO

55

GCT

CAG

GAC

ATC

CTG

GGT

CCA

GTA

ACT

CTG

CTT

CTG

GAA

GGC

GTT

ATG

240

Alá

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Alá

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

60

65

70

7S

GCT

GCA

CGT

GGC

CAG

CTT

GGC

CCG

ACC

TGC

CTC

TCT

TCC

CTG

CTT

GGC

288

Alá

Alá

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cya

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

80

85

90

CAG

CTG

TCT

GGC

CAG

GTT

CGT

CTG

CTG

CTC

GGC

GCT

CTG

CAC

TCT

CTG

336

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Alá

Leu

Gin

Ser

Leu

95

100

10S

CTT

CGC

ACC

CAG

CTG

CCG

CCA

CAG

GGC

CGT

ACC

ACT

GCT

CAC

AAG

GAT

384

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Alá

His

Lys

Asp

110

US

120

CCC

AAT

GCC

ÁTC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

432

Pro

Asn

Alá

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

125

130

135

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGC

CCG

GCC

480

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Alá

140

145

ISO

15 5

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

528

Pro

Pro

Thr

Thr

Alá

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

160

165

170

AAC GAG CTC TAATGAGAAT TC Asn Glu Leu

Claims (38)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Trombopoetin (TPO) polipeptid, amely a vérlemezkék termelődését specifikusan serkentő vagy fokozó biológiai aktivitással rendelkezik, s amely a 6. számú szekvencia

   1-332. aminosavaiból álló szekvenciát tartalmazza, vagy ennek származéka.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék, amely a 6. számú szekvencia 1-163. aminosavait tartalmazó szekvenciából áll.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék, amely a 6. számú szekvencia 1-232. aminosavait tartalmazó szekvenciából áll.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék, amely a 6. számú szekvencia 1-151. aminosavait tartalmazó szekvenciából áll.
5. 5. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti TPO polipeptidszármazék, amelyből 1-6 N-terminális aminosav deléció folytán hiányzik.
6. 6. A 2. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék, amely a [4His³³]TP0(1-163), [4 Argn⁷]TPO( 1-163) és [AGly¹¹⁶]TPO(1-163) valamelyike.

   < »

   - 443
7. 7. A 2. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék, amely a [His³³, Thr³³', Pro³⁴]TPO(1-163), [His³³, Alá³³', Pro³⁴]TPO(1-163), [His³³, Gly³³', Pro³⁴, Ser³⁸]TPO(1-163), [Gly¹¹⁸, Asnii®', Arg¹¹⁷]TPO(1-163), [Gly¹¹⁸, Ala^®·, Arg¹¹⁷]TPO( 1-163), [Gly.ii®, Gly¹¹⁸', Arg¹¹⁷]TPO(1-163) és [Alá¹, Val³]TPO(1-163) származékok valamelyike.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék.

   amely a [Thr³³, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁸, Tyr³³⁷, Pro³³³, Tyr³³⁹, Asp³⁴°, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Alá³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴³, His³⁴⁹, His³⁵°, His³⁵¹, His³⁵², His^3e3]TP0 és az [Asn^2B, Lys²³¹ Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³³, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Typ339, Asp³⁴°, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala^34S, Gly³⁴⁸, Val³⁴⁷, His³⁴³, His³⁴⁹, Hls³⁵°, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³]TP0 származékok valamelyike.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék, amely az [Asn^2S]TPO és a [Thr³³]TPO származékok valamelyike.
10. 10. A 2. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék, amely az [Alá¹, Val³, Arg¹²⁹]TP0(1-163), [Alá¹, Val³, Arg¹³³]TP0(1-163), [Alá¹, Val³, Leu³²]TP0(1-163), [Alá¹, Val³, Leu¹⁴⁸]TP0(1-163), [Alá¹, Val³, Pro¹⁴⁸]TPO(1-163), [Alá¹, Val³, Arg⁵⁹]TP0(1-163) és [Alá¹, Val³,

    Arg^11E]TP0(1-163) származékok valamelyike.
11. 11. A 2. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék, • * ·· ·*··

    - 444 amely az [Arg^12S]TPO(1-163) , [Arg¹³³]TPO(1-163), [Leu⁸²]TPO(1-163), [Leu¹⁴³]TPO(1-163), [Pro¹⁴³]TPO(1-163), [Arg^B9]TPO(1-163) és [Arg¹¹⁵]TPO(1-163) származékok valamelyike.
12. 12. Az 1. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék, amely kovalensen kötődik egy polimerhez.
13. 13. A 12. igénypont szerinti TPO polipeptid-származék, amely az említett polmerként polietilén-glikolhoz kapcsolódik.
14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti TPO polipeptid, amely Met~²-Lys^-1 aminosavakat is tartalmaz.
15. 15. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti TPO polipeptid, amely Met^-1 aminosavat is tartalmaz.
16. 16. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti TPO polipeptid, amely Gly^-1 aminosavat is tartalmaz.
17. 17. Polipeptid, amely a 2., 4. vagy 6. számú szekvencia érett aminosav-szekvenciájából áll.
18. 18. DNS, amely az 1-14., 15. és 17. igénypontok bármelyike szerinti TPO polipeptidet kódolja
19. 19.

    DNS-szekvencia vérlemezkék termelődését

    - 445 specifikusan serkentő vagy fokozó biológiai aktivitással rendelkező TPO polipeptid expressziójának biztosításához, amely DNS-szekvencia az alábbiak valamelyike:

    (a) a 194., 195. vagy 196. számá szekvenciában bemutatott DNS-szekvenciák vagy azok komplementer szálai;

    (b) DNS-szekvenciák, melyek szigorú feltételek között az (a) pontban meghatározott DNS-szekvenciákhoz hibridizálnak, vagy ezek fragmensei;

    (c) DNS-szekvenciák, amelyek a genetikai kód degeneráltsága miatt hibridizálhatnak az (a) és (b) pontban meghatározott DNS-szekvenciákhoz.

    A 19. igénypont szerinti cDNS-szekvencia.

    A 19. igénypont szerinti genom DNS-szekvencia.
20. 22. A 19. igénypont szerinti mesterségesen előállított

    DNS-szekvencia.
21. 23. Eljárás TPO polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy 18., 19., 20., 21. vagy 22. igénypontok bármelyike szerinti DNS által kódolt polipeptidet megfelelő gazdaszervezetben expresszálunk; és (b) izoláljuk az említett TPO polipeptidet.
22. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve.

    hogy Met^-2-Lys^-1 polipeptidet expresszálunk, és további • ·*·· ·· »« • * · · · ♦

    446 lépésként az említett izolált TPO polipeptidről lehasítjuk a Met“²-Lys^_1 aminosavakat.
23. 25. DNS-szekvencia a vérlemezkék termelődését specifikusan serkentő vagy fokozó biológiai aktivitással rendelkező TPO polipeptid expressziójának biztosításához, mely DNS a TPO polipeptidet kódoló szekvenciáktól 5' irányban trombin felismerési peptidet, a trombin felismerési peptidtől 5' irányban pedig glutation-S-transzferázt (GST) is kódol.
24. 26. A 25. igénypont szerinti DNS-szekvencia a 6. számú szekvencia 1-174. aminosavaiból álló TPO polipeptid expressziójának biztosításához.
25. 27. Eljárás a vérlemezkék termelődését specifikusan serkentő vagy fokozó biológiai aktivitással rendelkező TPO polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy 25. vagy 26. igénypont szerinti DNS által kódolt polipeptidet megfelelő gazdaszervezetben expresszálunk;

    (b) izoláljuk az említett GST-(trombin-felismerési peptid)-TPO polipeptidet;

    (c) az izolált GST-(trombin-felismerési peptid)-TPO polipeptidet trombinnal kezeljük; és (d) Gly^-1-TPO polipeptidet izolálunk. ²⁸
26. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

    Gly-i-TPO polipeptidként a [Gly-!]TPO(1-174)

    447 • · · · · «·♦» «· t« polipeptidet izoláljuk.
27. 29. A 27. vagy 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Gly^-1-TPO polipeptidként a 6. számú szekvencia 1-174. aminosavait tartalmazó TPO-származékot izoláljuk.
28. 30. Protein termék, amelyet a 23., 24., 27., 28. vagy 29. igénypontok szerinti eljárással állítunk elő.
29. 31. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a 18., 19., 20., 21., 22., 25. vagy 26.

    igénypont bármelyike szerinti DNS-szekvenciával oly módon transzformáltuk vagy transzfektáltuk, hogy képes legyen expresszálni egy vérlemezketermelődést specifikusan serkentő vagy fokozó biológiai aktivitással rendelkező polipeptidet.
30. 32. Gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid hatásos mennyiségét gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal együtt tartalmazza.
31. 33. A 32. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy vérlemezke-rendellenességek kezelésére alkalmazható.
32. 34. A 32. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy trobocitopénia kezelésére ·· ···· ·< *«*

    - 448 alkalmazható.
33. 35. A 34. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy kemoterápiával, sugárterápiával vagy csontvelőátültetéssel indukált trombocitopénia kezelésére alkalmazható.
34. 36. Eljárás vérlemezke-rendellenességek kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegségben szenvedő pácienseknek az 1-16. és 30. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid hatásos mennyiségét adjuk be.
35. 37. Eljárás trombocitopénia kezelésére, azzal jellemezve, hogy a trombocitopéniában szenvedő pácienseknek az 1-16. és 30. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid hatásos mennyiségét adjuk be.
36. 38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kemoterápiával, sugárterápiával vagy csontvelőátültetéssel indukált trombocitopénia kezeléséhez alkalmazzuk.
37. 39. Antitest, amely specifikusan immunreaktív az 1-16. és 30. igénypontok bármelyike szerinti polipeptiddel.
38. 40. A 39. igénypont szerinti antitest alkalmazása az 1-16. és 30. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid izolálásához.

    ···; ·· . ···» ·*

    - 449 41. A 39. igénypont szerinti antitest alkalmazása az 1-16. és 30. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid mennyiségi meghatározásához.