BG63508B1 - Хематопоетичен протеин и материали и методи за неговото получаване - Google Patents

Хематопоетичен протеин и материали и методи за неговото получаване Download PDF

Info

Publication number
BG63508B1
BG63508B1 BG100771A BG10077196A BG63508B1 BG 63508 B1 BG63508 B1 BG 63508B1 BG 100771 A BG100771 A BG 100771A BG 10077196 A BG10077196 A BG 10077196A BG 63508 B1 BG63508 B1 BG 63508B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
amino acid
seq
acid residue
protein
nucleotide
Prior art date
Application number
BG100771A
Other languages
English (en)
Other versions
BG100771A (bg
Inventor
Richard Holly
Si Lok
Donald Foster
Frederick HAGEN
Kenneth Kaushansky
Joseph KUIJPER
Catherine Lofton-Day
Pieter OORT
Steven Burkhead
Original Assignee
Zymogenetics, Inc.
University Of Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymogenetics, Inc., University Of Washington filed Critical Zymogenetics, Inc.
Publication of BG100771A publication Critical patent/BG100771A/bg
Publication of BG63508B1 publication Critical patent/BG63508B1/bg

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/5055—Cells of the immune system involving macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/196—Thrombopoietin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0642—Granulocytes, e.g. basopils, eosinophils, neutrophils, mast cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до хематопоетични протеини и техни полипептидни фрагменти, включително протеини и полипептиди от мишки и хора, и до ДНК молекули, кодиращи протеините и полипептидите и вектории клетки, приложими при тяхнотополучаване. Протеините и полипептидите се използват за in vivo и ex vivo терапия, а така също като реагенти при клетъчни култури и за изследване на клетъчната пролиферация и развитие.

Description

(54) ХЕМАТОПОЕТИЧЕН ПРОТЕИН И МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
ЗА ПОЛУЧАВАНЕТО МУ
Кратка справка за сродни описания
Това описание е частично продължение на заявка pea No. 08/ 215,203, заявена на 21. март, 1994 а, която от своя страна е частично продължение на заявка pea. No. 08/ 203,197, заявена на 25. февруари, 1994 а, която е частично продължение на pea. No. 08/196,025, заявена на 14. февруари, 1994 година, които описания са висящи и са включени в литературната справка.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Хематопоеза е процесът на развитие и диференциация на кръвните клетки от плурипотентни стволови клетки на костния мозък. Този процес включва комплексно взаимодействие на полипептидни растежни фактори (цитокини), действащи чрез мембранно- свързани рецептори върху мишенните клетки. Действието на цитокиншпе води до клетъчна пролиферация и диференциация, с отговор по отношение на някои цитокини, който често е специфичен за линията и/ или за етапа на развитие. Развитието на отделен клетъчен тип, като напр. тромбоцитен, от сшволова клетка, може да изисква координираното действие на множество цитокини, действащи в определена последователност.
Познатите цитокини включват интерлевкините, като IL-1, IL- 2, IL- 3, IL - 6, IL- 8 и др.; и колоний стимулиращи фактори като G- CSF, МCSF, GM- CSF, еритропоетин (ЕРО), и др. Най- общо интерлевкините действат като медиатори на имунния и възпалителен отговор . Колоний стимулиращите фактори стимулират пролиферацията на получените от костния мозък клетки, активират зрелите левкоцити, и в друг случай формират неотделима част от отговора на гостоприемника спрямо възпаление, инфекция и имунологични предизвикателства
Множество цитокини са развити като терапевтични агенти.
Например еритропоетинът, който стимулира развитието на еритроцитите, се използва при лечение на анемия, възникваща при бъбречни увреждания. Множество от колоний стимулиращите фактори са използвани във връзка с хемотерапията при рак за ускоряване възстановяването на имунната система на пациента. Интерлевкин - 2, а- интерферон и γинтерферон се използват при лечение на определени видове рак. В телесната течност на тромбоцитопенични животни е установена активност, която стимулира мегакариоцитопоезата и тромбоцитопоезата,и която в литературата е описана като “тромбоцитопоетин” (McDonald, Exp.
Hematol. 16:201- 205,1988 and McDonald, Am. J. Ped. Hematol. Oncol. 14:8- 21, 1992 ). В продължение на повече от три десетилетия, факторът или факторите отговорни за тази активност не са били окончателно охарактеризирани, което частично се дължи на липса на добър източник, на липса на добри изпитвания и липса на познания за мястото (местата) на продуциране.
Слабите нарушения при кръВотечение (MBDs), свързвани с тромбоцитни дисфункции,са относително всеобщи (Bachmann, Seminars in Hematology 17:292 - 305,1980), тъй като има множество вродени нарушения във функционирането на тромбоцитите, включително синдрома на BernardSoulier (недостиг на тробмоцитен GPIb). Глансманова тромбластения (недостиг на GPIb и GPIIIa), вродена афибриногеемия (понижени или липсващи нива на фибриноген в плазма и тромбоцити) и сив тромбоцитен синдром (липса на а- гранули). В допълнение, налице са множество нарушения, свързани с тромбоцитна секреция, запазване недостига на пула, аномалии в обмяната на тромбоцитната арахидонова киселина, недостиг на тромбоцитната циклооксигеназа и тромбоксан синтетаза и нарушения в тромбоцитното активиране (Rao and Holmsen, Seminars in Hematology 23: 102-118,1986). Понастоящем, молекулярната основа йа повечето от тези нарушения не е добре известна.
Изолирането и охарактеризирането на тромбоцитните протеини би предоставило неоценими средства за изясняване подчертаните недостатъци в много тромбоцитни дисфункции. Голям лимитиращ етап при подробния молекулярен анализ води до затрудненото получаване на тРНК от тромбоцити или от техен предшевственик, мегакариоцитите за анализ и създаването на сДНК библиотека Тромбоцитите са лишени от ядро и транскрибция. Следите от тРНК. свързвани с тромбоцити^ трудно да бъдат изолирани и често са обект на деградация. Конструирането на тромбоцитни сДНК библиотеки се нуждае от много голямо количество тромбоцити, обикновено от 25 до 250 единици от цяла кръв (Izumi et al, Proc, Natl, Acad. Sci. USA 87: 7477 - 7481,1990; Wicki et al., Thrombosis and Haemostasis 61: 448 - 453, 1989; and Wenger et al., Blood 73: 1498 - 1503, 1989) или от множество пациенти с повишено количество на тромбоцити в кръвта, дължащо се на тромбоцитемия (Roth etal., Biochem. Biophys. Res. Comm. 160: 705 - 710,1989). Където е била изолирана тромбоцит- специфична ДНК, тРНК вероятно са най- стабилни или изобилстващи на общи тРНК видове и вероятно представят само малка фракция от общия кодиращ репертоар на тромбоцитите.
Алтернативен път към тромбоцитна сДНК библиотека е изолирането и конструирането на библиотека от тРНК, изолирана от мегакариоцити, директен предшевственик на тромбоцитите. Меаакариоцитите са полиплоидни клетки и се очаква да съдържат тРНК, кодираща пълния комплемент на тромбоцитни и мегакариоцитни протеини. Но се е оказало особено трудно изолирането на мегакариоцити в задоволително количество и чистота.
Последните постижения в молекулярната биология допринесоха особено много за разбирането нахематопоезата, но същевременно показаха, че процесът е изключително сложен. Докато много цитокини са охарактеризирани и някои са с доказано клинично приложение, все още остава необходимостта от допълнителни-агенти, стимулиращи пролиферацията и диференциацията на миелоидните и лимфоидни предшевственици и продуцирането на зрели кръвни клетки. Особена необходимост има от агенти, стимулиращи развитието и пролиферацията на клетки от мегакариоцитната линия, включително тромбоцити. Има нужда още и от агенти, които да могат да бъдат използавни при лечение на цитопении, включително тромбоцитопения, случаите на аномалия в количеството на циркулиращи тромбоцити ( по- малко от около 1 х 105 тромбоцити / тт3) и други тромбоцитни нарушения. Настоящото изобретение удовлетворява тези нужди и предоставя други, сродни преимущества.
СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Обект на настоящето изобретение е да се предоставят изолирани протеини с хематопоетична активност.
Друг обект на настоящето изобретение да се предоставят методи за продуциране на протеини с хематопоетична активност, а така също изолирани ДНК молекули, вектори и клетки, които да могат да бъдат използвани в рамките на тези метода
Друг обект на настоящето изобретение е да се предоставят антитела, които свързват епитоп нахематопоетичен протен.
Друг обект на настоящето изобретение е да се предоставят методи за стимулиране продуцирането на мегакариоцити, тромбоцити и неутрофили у бозайници, включително хора.
Друг обект-па настоящето изобретение е да се предостави разнообразие от средства, приложими при изследване развитието на костномозъчните клетки, тяхната диференциация и пролиферация; както и откриването на заболявания, характеризиращи се с аномалии в развитието, диференциацията и пролиферацията на костно- мозъчните клетки.
В рамките на един от своите аспекти , изобретението предоставя изолиран протеин, подбран от групата, състояща се от (а) протеин съдържащ последователността от аминокиселини със SEQ ID NO : 2 от амино/киселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 196; (Ь) протеини, включващи аминсккиселинната последователност със SEQ DD NO: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминожиселинен остатък 206; протеини, включващи аминожиселинната последователност със SEQ ID NO: 19 от аминожиселинен остатък 22 до аминожиселинен остатък 173; (d) протеини, включващи аминожиселинната последователност със SEQ ID NO: 19 от аминожиселинен остатък 22 go аминожиселинен остатък 175; (е) алелни варианти на (a), (b), (с) и (d); и (f) специфични хомолози на (a), (b), (с). (d) или (е) където протеините стимулират пролиферацията или диференциацията на миелоидни илилимфоидни прекурсори„В определени варианти на изпълнение, протеинът включва амино--киселинната последователност на SEQ ID NO : 2 от амино-киселинен остатък 45 до амино/киселинен остатък 379 или амино/киселнната последователност на SEQ ID NO: 19 от аминожиселинен остатък 22 до аминоктселинен остатък 353.
В един сходен аспект, изобретението предоставя изолирана полинуклеотидна молекула, кодираща протеин,както се заключава по- горе. В един вариант на изпълнение, полинуклеотидната молекула е ДНК молекула, включваща верига с нуклеотидна последователност със SEQ ID NO : 1 от нуклеотид 237 до нулеотид 692 или нуклеотидната последователност със SEQ ID NO : 18 от нуклеотид 64 до нуклеотид 519. В рамките на други варианти на изпълнение, молекулата включва нуклеотиди 237 -1241р 174 1241, 105 -1241, 105 - 722, 174 - 722 или 237 - 722 на SEQ ID NO: 1 или съответни участъци на SEQ ID N0 : 18. Изобретението по- нататък предлага алелни варианти на тези молекули и ДНК молекули,кодиращи хематопоетичен протеин, който е поне 80% идентичен по аминокиселинна последователност на протеина, кодиран от една от посочените части от SEQ DD NO : 1 или SEQ ID NO : 18. Предоставени са също и молекули, комплементарни на тези последователности.
В рамките на друг аспект, изобретението предоставя изолирана ДНК молекула, подбрана от групата,състояща се от (а) Есо RI-ΣΛο I инсерта на плазмид pZGmpl -1081 (АТСС 69566), (Ь) алелни варианти на (а), и (с) ДНК молекули, кодиращи протеин, който е поне 80% идентичен на амино— киселинната последователност на протеина, кодиран от (а) или (в), където изолираната ДНК молекула кодира протеин с хематопоетична активност.
Съобразно друг аспект, изобретението предоставя вектор за експресия, включващ следните оперативно свързани елементи: транскрибционен промотор; ДНК сегмент, подбран от групата, състояща се от (а) ДНК сегмент, кодиращ хематопоетичен протеин и съдържащ нуклеотидна последователност.както е показана на SEQ ID NO: 1 от нуклеотид 237 до нуклеотид 692. (Ь) ДНК сегменти, кодиращи хематопоетичен протеин и съдържащ нуклеотидна последователност,както е показано на SEQ ID NO : 18 от нуклеотид 64 до нуклеотид 519; (с) алелни варианти на (а) или (b), и (d) ДНК сегменти, кодиращи хематопоетичен протеин, който е поне 80% идентичен в аминожиселинната си последователност на протеин, кодиран от (а), (Ь) или (с); и транскрибционен терминатор.
Съгласно друг аспект, изобретението предоставя култивирана клетка, в която е въведен вектор за експресия, както е разкрито по- горе, където клетката експресира хематопоетичен протеин, кодиран от ДНК сегмента. В определени варианти на изпълнение, клетката е гъбна, клетка на бозайник или бактериална клетка.
Съобразно друг аспект, изобретението предоставя хематопоетичен протеин, който е кодиран от хетероложен ДНК сегмент, включен в наследствения материал на клетка на бозайник, различен от човек.
В рамките на друг аспект, изобретението предоставя методи за стимулиране продуцирането на тромбоцити у бозайник. Методите включват въвеждане в бозайника на терапевтично количество хематопоетичен протеин, подбран от групата, състояща се от (а) протеини, включващи аминожиселинната последователност от SEQ ID
NO: 2 om амино киселинен остатък 45 go амино киселинен остатък 196; (Ь) протеин, съдържащ последвателноста на амино киселините от SEQ ID NO : 19 от амино киселинен остатък 22 до амино киселинен остатък 173; (с) алелни варианти на (а) и (b); и (d) видове, хомоложни на (а), (Ь)или(с), където протеинът стимулира пролиферация или диференциация на миелоидни или лимфоидни прекурсори θ комбинация с фармацевтично приемлив носител.
Тези и други аспекти на изобретението стават очевидни на базата на изложеното по- долу подробно описание на изобретението и приложените към него фигури .
ПОЯСНЕНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ фигура 1 е частична рестрикционна карта на вектор pDX. Използваните символи са SV ori, произхождащ от репликация на SV40; SV40 Е, SV40 енхансер; MPL, аденовирусен голям късен промотор; L1 - 3, аденовирусен трипартиден лидер; ss. сигнали на разцепване; рА, полиаденовирусен сайт.
фигура 2 илюстрира структурата на плазмид pBJ3. Използваните символи са TPIp, ТРИ промотор, TPIt. ТРИ трминатор, ААТ, a- 1 антитрипсинова сДНК; алфа, алфа- факторен лидер; тТРО, миша ТРО кодираща последователност.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Преди да бъде описано в подробности настоящото изобретение, от полза ще бъде да се дадат определения на използваните тук термини:
Алелен вариант: Алтернативна форма на гена, която възниква при мутация, или пореден полипептид, кодиран от мутиралият ген. Гениите мутации могат да бъдат тихи (без изменение в кодираният полипептид) или могат да бъдат полипептиди с поредна полипептидна последователност.
сДНК: Комплементарна ДНК, получена при обратна транкрибция на информационна РНК матрица, или клон или амплификационно копие на такава молекула. Комплементарната ДНК може да бъде едно- верижна или дв^верижна.
Вектор на експресия: ДНК молекула, линейна или кръгова, която включва сегмент, кодиращ желания полипептид, оперативно свързан към допълнителни сегменти, които осигуряват неговата транскрибция. Такива допълнителни сегменти включват промоторни и терминаторни последователности, и може също да включват един или повече източници на 'й· репликация, един или повече селективни маркери, един енхансер, полиаденилационен сигнал и др. Обикновено векторите за експресия се получават от плазмидна или вирусна ДНК, или може да съдържат елементи и на двата. Терминът “оперативно свързан” показва, че сегментите са така съчетани, че функционират в съгласие с техните очаквани свойства, напр. транскрибцията се инициира в промотора и преминава през кодиращите елементи до терминатора.
Ген: Сегмент от хромозомна ДНК, който кодира полипептидна верига. Тенът включва един или повече участъци, кодиращи амино киселини, които в някои случаи са посипани с не- кодиращи “интервентни последователности” (“интрони”), заедно с фланкиращи, не- кодиращи участъци, които осигуряват транскрибцията на кодиращата последователност.
Молекули, комплементарни на: Полинуклеотидни молекули с последователност на базите, комплементарна и с обратна ориентация спрямо референтната последователност. Например, последователността 5’ ATGCACGGG 3 е комплементарна на 5’ CCCGTGCAT 3*.
Промотор : Част от гена, към която се свързва РНК полимераза и започва РНК синтезата.
Както е отбелязано по- горе, настоящото изобретение предоставя материали и методи, приложими за получаване на протени с хематопоетична активност. Както тук е използван, терминът “хематопоетичен” показва способността да се стимулира пролиферацията и / или диференциацията на миеломни или лимфоидни предшевственици, както е определено със стандартни проби. Виж, напр. Metcalf, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 5327-5330.1980; MecalfetaL, J. Cell Physiol 116: 198-206, 1983; and Metcalf et al., Exp. Heatol. 15:288 - 295.1987. Обикновено костно- мозъчните клетки се инкубират в присъствие на опитна проба и контролна проба. След това се отчита пролиферацията и диференциацията на културите чрез визуално изпитване и/ или оцветяване. Специално предпочитано е ММТ колориметричното изпитване на Mosman (J. Immunol. Meth. 65: 55 - 63,1983; включено в литературната справка), описано в подробности в примерите, които следват.
Настоящето изобретение се основава отчасти на установяването на активност, която стимулира клетъчният растеж чрез MPL рецептора. Този рецептор (Souyri et al, Cell 63: 1137 -1147, 1990) преди това откритие, е бил “самотен” рецептор, чиито природни връзки са били неизвестни. Чрез процеса на клониране и мутагенезис, описани в подробности в Примерите, които следват, изобретателят създава клетъчна линия, която е зависима при стимулиране с MPL рецепторно- свързана обмяна по отношение нейното оцеляване и растеж, и която е способна за автокринно стимулиране на рецептора. Установено е, че кондиционирана среда от тези интерлевкин - 3 (IL- 3) независими клетки поддържа растежа на клетките, експресиращи MPL рецептора и следователно в такъв случай са зависими от
IL- 3. Антитяло неутрализиращи експерименти показват, че тази активност не се дължи на IL- 3 или EL- 4, и че тя може да бъде неутрализирана от разтворима форма на MPL рецептора. След това се изготвя сДНК библиотека от IL- 3 независимата клетъчна ления. ДНК се използва за трансфекция на бъбречни клетки от новородени хамстери (ВНК) и средата от трансфектантите се изпитва за способността й да стимулира MPL- зависима клетъчна пролиферация. Изолиран е позитивен клон и е продуциран рекомбинантен MPL лиганд. Установено е, че рекомбинантният 9 протеин стимулира пролиферацията на широк спектър миелоидни лимфоидни г п рекурсори, и в частност, стимулира продуцирането на мегакариоцити и неутрофили от предшевственици на костно- мозъчни клетки. В допълнение, установено е^че рекомбинантният протеин стимулира продуцирането на тробоцшпи в опитни животни. С оглед на тези активности, протеинът е обозначен като тромбопоетичен (ТРО).
Настоящото изобретение предоставя изолирани полинуклеотидни молекули, кодиращи тромбопоетин. Полезни тромбопоетични молекули в това отношение включват тРНК, геномна ДНК, сДНК, синтетична ДНК и ДНК молекула, получена чрез свързване на фрагменти от различни източници. За получаване на рекомбинантен ТРО, в повечето експресионни системи се предпочитат ДНК молекули с липсващи интрони. Под “изолирани” се разбира, че молекулите са отделени от тяхната естествена генетична среда. Така, изобретението предлага ДНК молекули, свободни на други гени с които те обикновено се асоциират. По- специално, молекулите са свободни на излишни и нежелани кодиращи последователности, и са под форма, подходяща за използване в генетично конструирани продукционни системи.
Последователностите от сДНК клонове, кодиращи представителни миши и човешки ТРО протеини са показани на SEQ ID NO : 1 и SEQ ID NO: 18 и съответните амино-киселинни последователности, са показани на SEQ ID NO : 2 и SEQ ID NO: 19, респективно. Специалиста в областта лесно би разпознал, че последователностите са показани на SEQ ID NOS: 1, 2, 18 и 19 и че се очаква да съществуват геномните последователности, показани на SEQ ID NOS : 18 и 29, съответстващи на отделни алелни варианти. Алелни варианти на ДНК последователностите, показани на SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 18 u SEQ ID NO: 28, включително онези, включващи тихи мутации и тези, в които мутациите водят до изменения в аминожиселинните последоватлности. са включени в обхвата на настоящето изобретение, като протеини, които са алелни варианти на SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 19. За специалиста В областта ще бъде очевидна възможността за конструиране на места, които биха улеснили манипулирането на нуклеотидната последователност с помощта на алтернативни кодони.
Мишите и човешки последвателности, разкрити тук, са удобни средства за получаване на изолирани полинуклеотидни молекули, кодиращи ТРО протеини от други видове (^хомоложни видове”). Такива предпочитани хомоложни видове са говежди, кучешки, свински, овчи, конски и особено маймунски протеини. Методи за използване на секвенционна информация от един вид за клониране на съответна полинуклеотидна последователност от втори вид са добре познати в областта. Виж, например, Ausubel et aL, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. ДНК молекулите от настоящето изобретение, кодиращи ТРО?са обикновено поне 60%, за предпочитане поне 80%, и може би 90- 95% или повече идентични на последователността от SEQ ID NO : 1 SEQ и ID NO : 18 и техни алелни варианти. Тромбопоетиновите молекули се характеризират с тяхната способност специфично да се свързват към MPL рецептора от същия вид и да стимулират тромбоцитната продукция in vivo. В нормални опитни животни, ТРО може да повиши тромбоцитните нива до 100% или повече в рамките на 10 дни след началото на въвеждането.
Анализът на разпределението на тРНК показва, че тРНК кодиращи ТРО се намират в различни тъкани на животни и мишки, и изобилстват 8 бял дроб, черен дроб, сърце, скелетна мускулатура и бъбреци. Така, за изолиране на хомолози от други Видове, се изготвя сДНК библиотека, за предпочитане от една от тъканите, за които е установено че продуцира високи нива на тРНК. На специалистите в областта са добре познати методи за получаване на сДНК библиотеки. Виж, например, Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 и цитиранните литературни източници. За откриване на молекули, кодиращи ТРО, библиотеката след това се сондира с мишата или човешка сДНК, описана тук или с неин фрагмент или с една или повече малки сонди, основани на установените последователности. Особено полезни са сондите, включващи олигонуклеотид с дължина от около поне 14 или повече нуклеотида, които са поне 80% идентични на част от SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO: 28 или техни комплементарни последователности. Предпочита се сондирането да се осъществява при неособено строги хибридизационни условия, напр. около 2 х SSC и температура на хибридизацията от около 50° С с помощта на белязани проби. Молекулите, към които става хибридизирането^е откриват с помощта на стандартни техники. Позитивните клонове се потвърждават със секвенционен анализ и изпитвания за активността, като способност за свързване на хомоложен MPL рецептор (напр. MPL рецептор от същия вид като сДНК) или способност за стимулиране хематопоезата от хомоложни костно- мозъчни клетки. Както ще стане очевидно за специалиста в областта, могат да бъдат използвани и други методи за клониране.
Полинуклеотидни молекули, кодиращи ТРО (включително алелни варианти и специфични хомолози на описаните тук) могат също да бъдат изолирани чрез клониране от клетъчна линия, която продуцира MPL лиганда и проявява автокринно стимулиране на растежа. Накратко, факторзависимата клетъчна линия се трансфектира за експресиране на MPL рецептор (Vtgon etal.. Proc. Natl Acad. Sei USA 89:5640 -5644,1922; Skoda et al., EMBO J. 12:2645 - 2653,1993; and SEQ ID NO: 17), след което се подлага на мутагенеза, и се прави подбор на фактор- независимите клетки. Тези клетки след това се използват като източник на ТРО тРНК. Подходящите факторзависими клетъчни линии включват IL- 3- зависима BaF3 клетъчна линия {Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727 - 734,1985; Mathey- Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133 - 4135,1986), FDC- Pl ( Hapel et al., Leukemia 7:235 - 240,1993). Зависимите от растежния фактор клетъчни линии могат да бъдат създадени съгласно публикувани методи (напр. Greenberger et al., Leuemia Res. 8:363 - 375,1984; Dexter et al, in Baum et al. Eds., Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979,145 -156,1980). В обичайната процедура, клетките се отстраняват от предпочитаната в случая тъкан (напр. костен мозък, слезка, фетален черен дроб) и се култивират в конвенционална, допълнена със серум среда, като RPMI1640, допълнена с 10% фетален телешки серум (FBS), 15% конски серум и 10~в хидрокортизон. Неслепените клетки се отстраняват на едно- или дву- седмични интервали и културите се подхранват със свежа среда. Така събраните клетки се промиват и култивират в среда със съдържание на източник на растежен фактор (напр. RPMI1640 + 10% FBS + 5 - 20% WEHI - 3 кондиционирана среда като източник на IL- 3). Тези клетки се подхранват с прясна хранителна среда на интервали от една- две седмици и нарастват с нарастване на културата. След няколко седмици до няколко месеца, индивидуалните клонове се изолират чрез посяване на клетките върху полутвърда среда (напр. среда, съдържаща метилцелулоза) или чрез ограничаване на деленето. Зависимостта на клоновете от фактора се потвърждава чрез култивиране на отделни клонове в присъствие на растежен фактор. За получаване на висока честота на зависими от растежния фактор клетки може да бъде използвана ретровирусна инфекция или химичен мутааенезис. фактор- зависимите клетки се трансфектират за експресия на MPL рецептор, след това се подлагат на въздействие на мутагенни фактори, като химично третиране, излагане на ултравиолетова светлина, на рентгенови лъчи, или ретровирусен инсерционен мутааенезис. Мутиралите клетки след това се култивират при такива условия, че клетъчното оцеляване да е в зависимост от автокринното продуциране на растежен фактор, осъществяващо се в отсъствие на екзогенен растежен фактор(и), необходим за родителските клетки. Продуцирането на ТРО се потвърждава с изследване, като напр. изпитване на кондиционираната среда за клетки, експресиращи и неекспресиращи MPL рецептор или чрез тестуване активността на кондиционирана среда в присъствие на разтворим MPL рецептор или антитела срещу познати цитокини.
Настоящото изобретение предлага също изолирани протеини, по същество хомоложни на протеините от SEQ DD NO : 2 или SEQ ID NO : 19 и техни хомолози. Под “изолиран” се разбира протеин, който е установен в условия, различни от тяхната обичайна окръжаваща среда, такава с изключение на кръв и животинска тъкан. В предпочитаната форма, изолираният протеин е по същество свободен на други протеини, поспециално други протеини с животински произход. За предпочитане е предоставянето на протеини във високо пречистена форма, т. е. повече от 95% чисти, за предпочитане с чистота по- висока от 99%. Терминът “по същество хомоложен” се използва за отбелязване на протеини със секвенционна идентичност от порядъка на 50%, за предпочитане 60%, и найдобре поне 80%, спрямо последователностите, показани на SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO : 19 или техни видови хомолози. Такива протеини най- добре би било да бъдат поне 90% идентични, и още повече - 95% идентични на SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO : 19 или техни видови хомолози. Процент на секвенционна хомоложност се определя по обичайни методики. Виж, напр. Attschul et al., Bull. Math. Biol 48: 603 - 616,1986 and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Set USA 89: 10915 -10919,1992. Накратко, две аминожиселинни последователности се линеаризират за оптимизиране степента на отчитане на линеаризирането с помощта на изискването за прекъсване на отварянето 10, изискването за прекъсване на разширяването 1, и “ цвят 62” отчитащ матрикс на Henikoffand Henikoff, както е показано на Таблица 1 ( аминокиселините са означени чрез стандартния еднобуквен код). Процентът на идентичност се изчислява като :
Общ брой идентични двойки ____________________________________________________________________ х 100 [ дължина на дългата последователност плюс броя на прекъсванията, включени в дългата последователност с оглед линеаризиране на двете последователности]
ТАБЛИЦА 1
A R N D c Q E G H I L K M F P S T w Y V
A 4
R -1 5
N -2 0 6
D -2 -2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
E -1 0 0 2 -4 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 “X. -3 -4 -3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 л -3 1 -1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 X, -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 0 -1 -2 -1 4
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -3 -3 -1 Г -4 -3 -2 1
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 X. -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
По същество хомоложните протеини се характеризират с това, че притежават една или повече амино киселинни замествания, делеции или добавки. Тези изменения са за предпочитане малки, така че консервативни амино киселинни замествания, които не оказват особено въздействие на загъването или активността на протеина (виж Таблица 2); малки делеции, обикновено от една до около 30 амино киселини; и малки амино- или карбоксикрайни екстензии, като амино- краен метионинов остатък, малък линкерен пептид до около 20 -25 остатъка, или малка екстензия, която улеснява пречистването, като поли- хистидинов тракт, антигенен епитоп или сайт на свързване. Виж. най- общо Ford et al. , Protein Exspression and
Purification 2: 95 -107,1991. включен в литературната справка.
ТАБЛИ! ТА 2
Консервативни амино киселинни замествания
Основни:
аргинин лизин
Кисели:
хистидин глутаминова киселина аспарагинова киселина
Полярни:
глутамин
Хидрофобни:
аспарагин левцин изолевцин валии
Ароматни:
фенилаланин
Малки:
триптофан тирозин глицин аланин серин треонин метионин
Незаменимите аминокиселини в ТРО могат да бъдат идентифицирани съгласно известни за специалистите в областта процедури, като сайтнасочен мутагенез или сканиращ линеаризирането мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244,1081 -1085,1989). Според последните техники, самостоятелни аланинови мутации се въвеждат при всеки остатък в молекулата и получените в резултат мутантни молекули се тестуват за биологична активност (напр. рецепторно свързване, in vitro или in vivo пролиферативна активност) за идентифициране амино киселинни остатъци, които са критични за активността на молекулата. Местата на лигандрецепторно взаимодействие може също да бъдат определени чрез анализ на кристалната структура, както е определена с техники, като например магнитен резонанс, кристалография или фотоафинитетно белязане. Виж, например, de Vos et al., Science 255:306 - 312,1992; Smith et al., J.'Mol. Biol. 224 899 - 904,1992; Wlodaver et aL , FEBS Lett. 309:59 - 64,1992.
Най- общо, цитокините се предполага че притежават 4- алфа спирална структура, като първата и четвърта спирали са най- важни в лиганд- рецепторните взаимодействия и са по- добре съхранени между членовете на семейството. Съпоставени е човешките ТРО амино/киселинни последователности, показани на SEQ ID NO: 19, линеаризацията на цитокиновите последователности предполага, че тези спирали са свързани с амино киселинните остътци 29 и 53. 80 и 99,108 и 130, и 144 и 168, съответно (връзките са ± 4 остатъка). Хеликоидалните връзки на мишите (SEQ ID NO: 2) и други, различни от човешките ТРО,могат да бъдат определени чрез линеаризиране с човешка последователност. Други важни структурни аспекти на ТРО включват цистеиновите остатъци при позиции 51,73,129 и 195 на SEQ ID NO: 2 (съответстващи на позиции 28, 50, 106 и 172 на SEQ ID NO: 19).
В допълнение, протеините от настоящото изобретение (или техни полипептидни фрагменти), могат да бъдат присъединени към други биологично активни молекули, в частност други цитокини, за осигуряване на мулти- функционални молекули). Например, С- крайният участък на тромбопоетина може да бъде присъединен към други цитокини за усилване на техните биолоични свойства или ефективност на продукцията. Очевидно тромбопоетиновите молекули се състоят от два участъка. Първият (амино- краен) участък се състои от около приблизително 150 амино— киселини, сходен е по размер и носи структурно сходство с еритропоетин и някои други хематопоетични цитокини. След първия участък е разположен втори, състоящ се от около 180 аминожиселини, които имат структура, която не притежава подчертано сходстВо с която и да е от познатите протеинови структури по данни, с които разполагаме. Този втори участък е силно обогатен в N- свързаните места за гликозилация и на серинови, пролинови и треонинови остатъци, които са маркери за о- свързани места на гликозилация. Това очевидно високо въглехидратно съдържимо предполага, че тази област прави първия хидрофобен участък повече разтворим.
Експериментални данни показват, че въглехидратът, асоцииран с втория участък участва в интрацелуларното съдържимо и в секретирането протеина по време на неговата биосинтеза. Вторият участък също може да играе роля за стабилизиране на първия участък срещу протеолитичното разграждане и/ или за пролонгиране in vivo времето на полу- живот на молекулата, и може да потенцира трансмисивния сигнал или специфичната активност на протеина.
По този начин изобретението предлага серия от нови хибридни молекули, в които вторият участък на ТРО е присъединен към втори цитокин. Предпочита се присъединяването към С- крайният участък на ТРО към С- края на втория цитокин. Присъединяването се осъществява за предпочитане чрез разцепване на нивото на ДНК, което да позволи експресия на химерни молекули в системата за продуциране на рекомбинантни молекули Получените в резултат молекули след това се изпитват за такива свойства като подобрена разтворимост, подобрена стабилност, удължено време на полу- живот, или подобрени нива на експресия и секреция, и фармакодинамика. Специфични примери на такива химерни молекули са тези, при които вторият учстък на ТРО е присъединен към С- края на ЕРО, G- CSF, IL- 6, IL- 3 или IL-11. Както е отбелязано погоре, това се осъществява обикновено чрез сливане на ДНК. Така слятата ДНК след това се субклонира в подходящ вектор за експресия и се трансформира или трансфектира в гостоприемникова клетка или организми съгласно обичайни методики Получените в резултат слети протеини се пречистват с помощта на конвенционални техники на пречистване чрез хроматографиране (т. е. хроматографски техники) и техните свойства се сравняват с онези на природните, не- сляти, родителски цитокини Такива хибридни молекули могат по- нататък да включват допълнителни амино киселинни остатъци (напр. полипептиден линкер) между съставните протеини или полипептиди
В допълнение към хематопоетичните протеини, описани по- горе, настоящето изобретение ВключВа фрагменти на тези протеини и изолираните полинуклеотидни молекули, кодиращи фрагментите. От особен интерес са фрагменти с дължина от поне 10 аминокиселини, които се свързват към MPL рецептора, и полинуклеотидни молекули с дължина от поне 30 нуклеотиди, кодиращи такива полипептиди. Полипептиди от този тип се идентифицират с познати методи на изследване, като напр. чрез разграждане на интактния протеин или чрез синтез . на малки, припокриващи се полипептиди или полинуклеотиди (и експресиращи последните), незадължително в комбинация с техниките за структурен анализ, описани по- горе. Получените в резултат полипептиди след това се тестуват за способността им да свързват специфично MPL рецептора и да стимулират клетъчната пролиферация чрез MPL рецептора. Свързването се определя по конвенциални методики, като тази, описана от Klotz Science 217:1247,1982 („Scatchard analysis“). Накратко, маркиран с радиоизотоп полипептид се инкубира с MPL рецептор- носещи клетки в присъствието на немаркирани ТРО. Клетъчно- свързаният, белязан полипептид се отделя от свободния белязан полипептид чрез центрофугиране през фталатно масло. Афинитетът на свързване на изпитвания полипептид се определя чрез съпоставяне степента на свързване със свободния белязан на ординатата спрямо свързания белязан на абсцисата Сецифичността на свързване се определя чрез конкуренция с цитокини различни от ТРО. Рецепторното свързване може също да бъде определено чрез преципитиране на изпитваното вещество с имобилизиран MPL рецептор (или неговата лиганд- свързана екстрацелуларна област). Накратко, рецепторътили негова част се имобилизира върху неразтворима повърхност Изитваното вещество се маркира, напр. чрез метаболитно маркиране клетките на гостоприемниците в случай, че се изпитва рекомбинантно съединение, или по обичайни, in vitro методи на маркиране (напр. с радиоактивен йод). Белязаното съединение след това се комбинира с имобилизираният рецептор, несвързаният материал се отстранява и се определя свързаното, белязано съединение. Известни са множество методи за установяване на белязани вещества. Стимулирането на пролиферацията се определя удобно с помощта на МТТ колориметрично изпитване с MPL рецептор- носещи клетки. Полипептидите се изпитват за активност при различни концентрации, обикновено в интервал от 1 пт до 1 тМ.
Предлагат се също и по- големи полипептиди. достигащи до 50 или повече остатъка, за предпочитане 100 или повече остатъка, а още по- добре около 140 или повече, чак до пълния размер на зрелия протеин. Например, анализът и моделирането на аминсикиселинната последователност, показана на SEQ ID No : 2 с остатъци от 51 до 195, включително, или SEQ ID NO: 19 от остатък 28 до остатък 172, включително, предполага, че тези части от молекулите са цшпокиноподобни участъци, способни да се самоорганизират. Интересни са също така молекули, съдържащи ядро от този цитокиноподобен участък плюс един или повече допълнителни сегмента или участъци на първичния транслационен продукт. Други желани полипептиди са показани на Таблица 3.
ТАБЛИЦА 3
Миша ТРО ( SEQ ID NO : 2) :
Cys (остатък 51)- Vai (остатък 196)
Cys ¢51) - Pro (206)
Cys (51) - Thr (376)
Ser (45) - Cys (195)
Ser (45 ) - Vai (196)
Ser (45) - Pro (206)
Ser (45) - Thr (379)
Met (24) - Cys (195)
Met (24) - Vai (196)
Met (24) - Pro (206)
Met (24) - Thr (379)
Met (1) -- Cys (195)
Met (1) - Vai (196)
Met (1) - Thr (379)
Човешки TPO ( SEQ ID NO : 19)
Cys (28) - Vai (173)
Cys (28) -- Arg (175)
Cys (28) - Gly (353)
Ser (22) - Cys (172)
Ser (22) - Vai (173)
Ser (22) - Arg (175)
Ser (22) - Gly (353)
Met (1) - Cys (172)
Met (1) - Vai (173)
Met (1)- Arg (175)
Met (1) - Gly (353)
Специалист в областа лесно ще разбере, че междинните форми на молекулите (напр. притежаващите С - край между остатъци 196 и 206 на SEQ ID NO : 2 или тези притежаващи N- край между остатъци 22 и 28 на SEQ ID NO : 19) са също желани, както и една или повече амино кислинни замествания, делеции, инсерции. или N- или С- крайни екстензии, както е описано по- горе. Така, настоящото изобретение предоставя хематопоетични полипептиди от поне 10 амино киселинни остатъка, за предпочитане поне 50 остатъка, по- добре поне 100 остатъка и най- добре поне около 140 остатъка в дължина, където посочените полипептиди са по същество хомолжни на полипептидите със същата дължина от SEQ ID NO : 2 или SEQ ID NO : 19.
Протеините от настоящето изобретение могат да бъдат получени от манипулирани по генно инженерен път гостоприемникови клетки съгласно обичайните техники. Подходящи клетки гостоприемници са онези, които могат да бъдат транспортирани и.\и трансфектирани с екзогенна ДНК и да растат в култура. В тази група се включват бактерии, гъби и култивируеми клетки на висши еукариоти. Техниките за манипулиране на клонирани ДНК молекули и за включване на екзогенна ДНК в различни гостоприемникови клетки са описани от Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, and Ausubel et al., ibid., които са включени в литературната справка.
Най- общо, ДНК последователност, кодираща протеин от настоящото изобретение, е оперативно свързана към транскрибционен промопюр u mepMUHamop в рамките на вектор на експресия. Векторът, найобщо, ще съдържа един или повече селективни маркери или един или повече източници на репликация, макар за специалиста в областта да е известно, че в рамките на такива системи селективни маркери могат да бъдат предоставени от отделни вектори, и репликацията на екзогенната ДНК може да бъде осъществена чрез интегриране в генома на клетката гостоприемник. Подборът на промотори, терминатори, селективни маркери, вектори и други елементи, е обект на рутинен дизайн и е във възможностите на специалиста в областта. Много такива елементи са описани в литературата и са достъпни по търговски път.
За насочване протеина от настоящето изобретение по пътя на обмяната на гостоприемниковата клетка с оглед на секреция, във вектора за експресия се включва секреторна сигнална последователност (позната като лидерна последователност, препро последователност или пре последователност). Секреторната сигнална последователност се присъединява към ДНК последователността, кодираща протеин от настоящето изобретение в коректна ( правилна) четяща рамка. Обикновено секреторните сигнални последователности са разположени 5’ спрямо ДНК сигналната последователност (позната като лидерна последователност, препро последователност или пре последователност). Секреторната сигнална последователност се присъединява към ДНК последователността, кодираща протеин от настоящето изобретение в коректна' (правилна) четяща рамка. Обикновено секреторните сигнални последователности са разположени 5’ спрямо ДНК последователността, кодираща желания протеин, макар определени сигнахни последователности да са разположени навсякъде в ДНК последователността (виж, напр., Welch etal., U. S. Patent No. 5, 037, 743; Holland etal.. U. S. Patent No. 5,143 830 ). Секреторната сигнална последователност може да е нормално асоциирана , с протеин от настоящото изобретение, или може да бъде от ген, кодиращ друг секретиран протеин.
Дрождеви клетки, по- специално от рода Saccharomices, са предпочитан гостоприемник за използване съобразно настоящето изобретение. Методи за трансформиране на дрождеви клетки с екзогенна ДНК и за получаване на рекомбинантни протеини от тях, са описани напр. от Kawasaki, U. S. Patent No. 4,599, 311; Kawasaki et al., U. S. Patent No. 4. 931, 373; Brake, U. S. Patent No. 4. 870 008; Welch etal. ,U. S. Patent No. 5, 037 743; and Murray et al., U. S. Patent No.
4. 845 075, които са включени в литературната справка. Трансформираните клетки са подбрани по генотип, определен със селективния маркер, най- обща лекарствена устойчивост или способността им да растат в отсъствие на определени хранителни компоненти (напр. левцин). Предпочитана векторна система за приложение в дрожди е РОТ1 векторна система, описана от Kawasaki etal., (U. S. Patent No. 4,931,373), което позволява трансформираните клетки да бъдат подбрани по растежа им в глюкозосъдържаща среда. Предпочитана сигнална последователност за използване в дрожди е тази от MF cd гена на S. cerevisiae (Brake, ibid.; Kurjan etal. ,U. S. Patent No. 4,546 082). Подходящи промотори и терминатори за използване в дрожди включват тези, произхожзащи от гени за глйколитични ензими ( виж. напр. Kawasaki, U. S. Patent No. 4,599,311; Kmgsman etal., U. S. Patent No. 4, 615, 974; and Bitter, U. S. Patent No. Patent No. 4, 977, 092, включени в литературната справка) и гени за алкохол дехидрогеназа. Виж също патентни номера 4, 990, 446; 5, 063154; 5,139, 936 и 4, 661, 454 включени в литературната справка. Трансформационни системи за други дрожди, включително Hansenula potymorpha, Schisosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia quillermondu and Candida maltosa ca познати на специалистите 8 областта. Виж, напр. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 - 3465,1986 and Cregg, U. S. Patent No. 4, 882, 279.
Подходящи като гостоприемници са и клетки на гъби. Например, клетки па Aspergillus могат да бъдат използвани съгласно методите на McKnight et al., U. S. Patent No. 4, 935,349, включен в литературната справка. Методите за трансформиране на.Асгетопшт chrysogenum са описани от Suminoet al., U. S. Patent No. 5,162,228, включен в литературната справка. Методите за трансформиране на Neurospora са описани от Lambowitz, U. S. Patent No. 4. 486, 533, включен в литературната справка
Съгласно изобретението, предпочитан гостоприемник са също и култивирани клетки на бозайник. Методите за въвеждане на екзогенна ДНК в клетки гостоприемници на бозайник, предвиждат калциева фосфатмедиирана трансфекция (Wigler et al, Cell 14: 725,1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), електропорация (Neumann et al., EMBOJ. 1:841- 845,1982) u DEAE- декстран медиирана трансфекция (Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), които са включени в литературната справка. Продуцирането на рекомбинантни протеини в култивирани клетки на бозайник е разкрито, например, от Levinson et al., U.
S. PatentNo. 4, 713, 339; Hagen et al., U. S. Patent No. 4, 784, 950; Palmiter et al, U.
S. Patent No. 4, 579 821; and Ringold, U. S. PatentNo. 4, 656134, които са включени В литературната справка. Предпочитани култивирани клетки на бозайник Включват COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS- 7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 - 72,1977) и клетъчни линии от овариални клетки на китайски хамстер (напр. CHOI KI; ATCC No. CCL 61). Подходящи са и други познати в областта клетъчни линии, достъпни от обществени депозитарии като ATCC, Rockville, Maryland. Най-общо, предпочитат се строго транскрибционни промотори, като промотори от SV- 40 или цитомегаловирус. Виж, напр. U.S. Patent No. 4,956 288. Други подходящи промотори Включват металтионирани гени (U. S. Patent Nos. 4, 579, 821 и 4, 601, 978, които са включени в литературната справка) и аденовирусния голям късен промотор.
Лекарственият подбор се използва обикновено за подбор на култивирани клетки на бозайници, в които е инсертирана чужда ДНК. Такива клетки най- общо са наречени “трансфектанти”. Клетките, които са били култивирани в присъствието на селективния ген и са в състояние да преминат през желания ген до неговия предшевственик, са наречени стабилни трансфектанти”. Предпочитан селективен маркер е средство кодиращо устойчивост срещу антибиотика неомицин.Подбора се провежда в присъствие на лекарство от неомицинов тип, като G- 418 или подобни. Може да бъдат използвани също селекциони системи за повишаване нивото на експресия на желания ген, процес, наречен “амплификация”. Амплификацията се провежда чрез култивиране на трансфектанти в присъствие на ниски нива от селективния ген и след това повишаване на неговото количество за подбор на клетките, които продуцират високи нива на продуктите на въведените гени. Предпочитан амплификационен селективен маркер е дихидрофолатредуктаза, която придава устойчивост спрямо метбтрексат. Други устойчиви на лекарства гени (напр. хигромицин резистентни, мулти- лекарствено резистентни, пуромицин ацетилтрансфераза резистентни) също могат да бъдат използвани.
Като гостоприемници могат да бъдат използвани и други висши еукариотни клетки, вкючително клетки на насекоми, растения и птици. Трансформирането на клетки на насекоми и продуцирането на чужди протеини от тях е описано от Guarino et al., U. S. Patent No. 5,162, 222; Bang et al., U. S. Patent No. 4, 775, 624; и международна публикация WO! 06463, които са включени в литературната справка. Приложението naAgrobacterium rhizogenes като вектор за експресия на гени в растителни клетки е описано от Sinkar et al., J. Biosci (Bangarole) 11: 47 - 58,1987.
Предпочитани прокариотни клетки за приложеше като гостоприемници съгласно изобретението, са щамове от бактерията Echerichia coli, макар Bacillus и други родове също да могат да бъдат използвани. Техниките за трансформиране на тези гостоприемници и за експресиране на чужди ДНК последователности, клонирани в тях, са добре познати на специалистите в областта ( виж, напр. Sambrook et al., ibid.). При експресия на протеини в бактериален гостоприемник като Е. coli, протеинът може да бъде получен в цитоплазмата, обикновено като неразтворими гранули, или да бъде насочен към периплазматичното пространство от бактериалната последователност за секреция. В обикновения случай, клетките се лизират, и гранулите се възстановяват и денатурират с помощта, например, на гуанидин изотиоцианат. Денатурираният протеин след това се разтваря. В някои случаи протеинът може да бъде възстановен от периплазматичното пространство в разтворима и функционална форма чрез разрушаване на клетките (напр. чрез обработване с ултразвук или чрез осмотичен шок) за освоождаване на периплазматичното пространство и възстановяване на протеина.
Трансформираните и трансфектирани клетки на гостоприемници се култивират съгласно обичайни процедури и в среда за култивиране, съдържаща хранителни компоненти и други компоненти, необходими за растежа на избраните клетки гостоприемници. Известни са различни подходящи хранителни среди, включително дефинирана среда и комплексна среда, и обикновено включват източник на въглерод, есенциални аминокиселини, витамини и минерали. Средата може също да съдържа такива компоненти, като растежни фактори или серум, в зависимост от необходимостта. Хранителната средата е обикновено подбрана с оглед на клетките, съдържащи екзогенна ДНК, напр., подбор на лекарства или недостиг на необходими храни, която е допълнена със селективния маркер, носен от вектора на експресия или котрансфектирана в гостоприемниковата клетка.
Съгласно настоящето изобретение, може да бъде използвана техника за получаване на ТРО в трансгенни животни Предпочита се продуциране на ; протеини в млечните жлези на гостоприемниково женско животно.
Експресията в млечната жлеза и последващата секреция на желания протеин в млякото преодолява много трудности, съществуващи при изолиране на протеини от други източници Млякото се събира в голямо количество и добре охарактеризирано биохимично. Нещо повече, големите ·* млечни протеини присъстват в млякото във високи концентрации (от около *· 1 до 15 g! 1).
От търговски аспект, особено се предпочита използването на гостоприемници с висок добив на мляко. Малките животни като мишки и плъхове могат да бъдат използвани ( и се предпочитат в етапа на доказване на концепцията), но съгласно настоящото изобретение се предвижда използване на селскостопански животни, включително, но без да се ограничава до прасета, кози, овце и крави.Овцете са особено предпочитани благодарение на такива фактори,като предистория на трансгенезиса в този вид, добива на мляко, стойността и удобствата на съоръженията за събиране на млякото. Виж WO 88 00239 за сравнение на факторите, влияещи върху избора на вида гостоприемник. Желателно е да се подбере такъв гостоприемник, който е селекциониран за добив на мляко , като напр. East Friesland sheep, или за получаване на млечен щок чрез селекция на трансгенна линия в късна дата. Във всеки случай, следва да бъде използвано животно с добър здравен статус.
За получаване на експресия в млечната жлеза, се използва транскрибционен промотор от ген за млечен протеин. Гените за млечни протеини включват такива, кодиращи казеин (виж напр. U. S. Patent No. 5, 304 489 включен в литературната справка, бета лактоглобулин, а - лакталбумин и суроватъчен кисел протеин. Бета- лакталбуминовият (BLG) промотор се предпочита. В случая на овчия бета- лактоглобулинов ген, обикновено се използва участък от проксималната 406 Ьр на 5’ фланкираща последователност на гена, макар да се предпочитат големи части от 5' фланкиращата последователност, до 5 kbp, като -4.25 kbp ДНК сегмент, обхващащ 5 'фланкиращият промотор и некодиращата част на беталактоглобулиновия ген. Виж. Whitelaw et al., Biochem J. 286:31- 39,1992. подходящи са u други фрагменти на промоторна ДНК от други видове.
Други участъци от бета- лактоглобулиновия ген също могат да бъдат включени в структурите, както и геномните участъци от гена за експресия. Общоприето е сред специалистите в областта, че структурите без интрони, например, експресират по- лошо в сравнение със съдържащите такива ДНК последователности {виж Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836 - 840,1988; Palmiter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:478 - 482,1991; Whielaw et al., Transgenic Res. 1:3-13,1991; WO 89101343; WO 91/ 02318). B този аспект, се предпочита, където е възможно, да се използват геномни последователности,съдържащи всички или някои от природните интрони на гена, кодиращ желаният протеин или полипептид, така се предпочита включването на поне някои интрони от, напр. бета- лактоглобулиновия ген.
Един такъв участък е ДНК сегмент, който предлага интрон за разцепване и РНК полиаденилация от 3’ не- кодиращия участък от овчи беталактоглобулинов ген. При заместване на природната 3 ’ -некодираща последователност от гена, този овчи бета- лактоглобулинов сегмент може както да повиши, така и да стабилизира нивата на експресия на желания протеин или полипептид. В рамките на друг вариант на изпълнение, участъкът заобикалящ иницииращият ATG от ТРО последователността^ замества със съответни последователности от специфичен млечен ген. Такова заместване предлага предполагаема птьканно- специфична инициираща среда за повишаване на експресията. Удобно е да бъдат заместени пълният ТРО пре- про и 5'* не- кодиращите последователности с онези от, например, BGL гена, макар да могат да бъдат заместени и по- малки участъци.
За експресия на ТРО в трансгенни животни. ДНК сегмент, кодиращ ТРО оперативно се свързва към допълнителни ДНК сегменти, необходими за тяхното експресиране за получаване на експресионни единици. Такива допълнителни сегменти включват посочените по- горе промотори. както и последователности, които предлагат завършване на транскрибцията и полиаденилацията на тРНК. Експресионните единици по- нататък включват ДНК сегмент, кодиращ секреторна сигнална последователност, оперативно свързана към сегмента, кодиращ ТРО. Секреторната сигнална последователност може да бъде натиВна ТРО сигнална последователност или може да бъде такава от друг протеин, като млечен протеин. Виж, например, von Heinje, Nuc. Acids Res. 14: 4683- 4690, 1986; and Meade et al., U. S. Patent No. 4,873,316, които са включени в литературната справка.
Конструирането на експресионни единици за използване в трансгенни жиВотни се провежда удобно чрез инсертиране на ТРО последователност в плазмид или фагов вектор, съдържащ допълнителен ДНК сегменти, макар единицата за експресия да може да бъде конструирана по същество с която и да е последователност за свързване. Особено удобно е да се предложи вектор, съдържащ ДНК сегмент, който кодира млечен протеин с такъв ТРО полипептид, поради което става възможно сливане на ген, включващ експресионните контролни последователности за гена на млечния протеин. Във всеки случай, клонирането на експресионни единици в плазмиди или други вектори, улеснява амплификацията на ТРО последователността Амплификацията се провежда удобно в бактериални клетки в качеството им на гостоприемник (напр. Е. coli), като векторите в тези случаи задължително включват източник на репликация и селективен маркер, функционални 6 бактериалните гостоприемникови клетки.
След това единиците за експресия се въвеждат в оплодени яйца ( включително в ембриони в ранен стадий) от избрани видове гостоприемници. Въвеждането нахетероложна ДНК може да бъде осъществено по един от няколко възможни начина, включително микроинжектиране (Jaenisch, Science 240:1468 -1474,1988) или сайт- насочена интеграция с помощта на ембрионални стволови (ES) клетки (описано от Bradley et al., Bio/ Technology 534 - 539,1992). Яйцата след това се имплантират в овидукта или матката на псевдсибременни женски и се оставят да се развият до края на термина Потомство, носещо въведената ДНК 6 своята наследствена линия,може да пренесе тази ДНК в своето потомство по нормален, Менделов път, позволяващ развитието на трансгенни стада.
В дадената област са познати обичайните процедури за получаване на трансгенни животни. Виж, например, Hogan et al., Manipulating the Mouse Em brio: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bioj Technology 6: 179- 183,1988; Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645 - 651,1985;
Buhler et al., Bio/ Technology 8:140 -143,1990; Eert et al, Bio/ Technology 9: 835 838,1991; Krimpenfort et al., Biol Technology 9:844 - 847,1991; Wall et al., J. Cell. Biochem. 49; 113 - 120, 1992; U. S. Patents Nos. 4, 873 191 and 4, 873 316; WIPO публикации WO 88/ 00239, WO 92111757; and GB 87/ 00458, koumo са включени в литературната справка. Техниките за въвеждане на чужди ДНК последователности у животни и техните наследствени клетки са създадени в мишки. Веж, например, Gordon et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 7380 - 7384, 1980; Gordon and Ruddle, Science 214:1244 - 1246,1'981; Palmiter and Brinsier, Cell 41:343 - 345,1985; Brinster et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 82: 4438 - 4442,1985: and Hogan et al (ibid.). Тези техники са съответно адаптирани за приложение при по- големи животни, включително стадни видове (Виж напр. WIPO i публикации WO 88/ 00239, WO 90/ 05188, and WO 92/11757; and Simons et al. t Bio/ Technology 6: 179 - 183,1988). Като обобщение, при най- ефикасния начин, « използван за получаване на трансгенна мишка или стадо, в едно от προ- % ядрата на оплодено яйце се инжектират няколко стотици линейни молекули < от желаната ДНК съобразно стандартните техники в областта. Може да се използва и инжектиране на ДНК в цитоплазмата на зиготата. 1
Може да се използва и получаване на трансгенно растение. Експресията може да бъде генерализирана или насочена към специален орган, като грудка. Виж, напр. Hiatt, Nature 344: 469 - 479,1990: Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12: 449 - 453, 1992; Sijmons et al., Bio/ Technology 8:217 - 221, 1990; and European Patent Office Publ. EP 255, 378.
ТРО, изготвен съгласно настоящето изобретение, се пречиства с помощта на общоизвестни за областта методи, като афинитетно пречистване и разделяне, основано на размер, разтворимост и др. свойства на протеина. Когато протеин се продуцира в култивирани клетки на бозайник, се предпочита култивирането да бъде осъществено в свободна на серум среда е оглед ограничаване количеството на контаминиращ протеин.
Средата се събира и фракционира Предпочитани .методи за фракциониране включват афинитетна хроматография на конканавалин А или друг лектин, което прави възможно използването на присъстващия в протеина въглехидрат. Протеините могат също така да бъдат пречистени с помощта на имобилизиран .МРЕ рецепторен протеин или свързана част от него, или чрез използването на афинитетно маркиране (напр. полихистидин. субстанция Р или друг полипептид или протеин, за който с подходящо определено антитяло или друг свързващ агент.) Може да бъде създадено •пецифичен юайт на разцепване между желания протеин и афинитетното
Протеините от настоящето изобретение могат да бъдат прилагани като терапевтици там. където е необходимо, за повишаване
1ролиферацията на клетките в костния мозък, като напр. при третиране на цитопения. индуцирана от апластична. анемия, миелопластични синдроми.
хемотсрапия или вродени цитопении: при пациенти с присаден костен мозък;
у пациенти с присадени стволови клетки в периферната кръв; и при лечение на състояния. причиняващи нарушения на костния мозък, като миелодиспластичен синдром. Протеините са също приложими за повишаване продуцирането на тромооцити, ianp. при лечение на тромбоцитопения. Тромбоцитопенията се асоциира с разнородна група заболявания и клинични обстоятелства, които да дсйств и самостоятелно или съвместно за създаване на условието. Понижено количество на тромбоцитите може да доведе, напр. от нарушение в продуцирането на тромбоцитите (дължащо се на вродени нарушения като синдрома на Fanconi, trombocitonenoa absent radii синдром, аномалиите на Wiskott .Aldrich и May Hegglin, синдромите на Bernard- Soulier; Menneapolis: Epstein; Montreal platelet u Eckstein), абнормално разпределение на тромбоцитите. загуби дължащи се на масивни трансфузии. абнормални разрушения на тромбоцити. или абнормални отнемания на тромбоцити в слезката на болни ( дължащо се на цироза или вродени сърдечни аномачии). Например, използвани при химиотерапия на рак лекарства могат да супресират развитието на тромбоцитни предшевстващи клетки в костния мозък и получената в резултат тромбоцитопения ограничава химиотерапията и може да изисква кръвопреливания. В допълнение заболявания може да нарушатрфодуцирането на —ромооцитите и тяхното разпределениеРадиотерапията, използвана да убие подобни малиенени клетки уоива също и предшсвстВениците на тромбоцитите. Тромбоцитопения може да възникне
Z&.TH също и при различни тромбоциг и автоимунни нарушения, индицирани лекарства, неонатален алоимунитст. пренесен с тромбоцити алош.унцнеп вирусни (включително HIV) инфекции. Абнормените нарушения на тромбоцитите може да са резултат от {1) повишена консумация на тромбоцити при васкуларни трансфоманти или травмирани тъкани; uv имунни механизми. асоциирани с напр. лекарствено- индлщирана тромбоцитопения. идиопатична тромбоцитопения. хематологични налгиения като левкемияи лимфома или метастазен рак. включително на костния мозък. Други индик анслмя и лекарствено- индуцирана супресия на костн мозък, резултат от например, химиотерапия или лечение на HIV инфекцш
Тромбоцитопениятг, се манифестира като повишено кръвотечение, като напр. мукозни кръвотечения от назално- оралната област или гастроинтсстиналния тракт, а така също и отделяния от рани, язви или инжекционни места.
За фармацевтични нужди протеините от настоящето изобретение се формират с оглед парентерално. по- специално интравенозно или субкутанно приложение съгласно конвенционални методи. Интравенозното въвеждане се осъществява с ударна доза или инфузия през определен период от един до няколко часа. Най- общо, фармацевтичните форми включват хематопоетичен протеин в комбинация с фармацевтично приемлива среда, като физиологичен разтвор, буферна сол. 5% декстроза във вода или др. подобни формите по- нататък може да включват един или повече пълнители консерванти разтворители, буферни агенти, албумин за предотвратяване загубите на протеин и др. В допълнение.
хематопоетичните протеини от настоящото изобретение може да оъдат комбинирани с други цитокини. по- специално рано- действащи цитокини като стволово- клетъчен фактог·. IL- 3. IL- 6. IL- 11 или MG- C-SF. Когато сс .1U използва подобна комбинирана терапия, цитокините могат да бъдат комбинирани в самостоятелна форма или могат да бъдат въвеждани в отделни форми. Методи за формиране са добре известни в областта.
например, в Remington* s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing
Co., Easton PA. 1990. включени в литературната справка. Терапевтичните дози обикновено са в границите на ό. 1 до 100 pg; kg от теглото на пациента дневно, за предпочитане 0. 5 - 20/tg kg дневно, с точна доза, оперделена от клиницистите съобразно възприетите стандарти на основата на естеството и различията на условията на лечение, особеностите на пациента и др. Определянето на дозата е в рамките на възможностите на специалиста в областта. Протеините най- общо се въвеждат в период до 2 дни след химиотерапията или костно- мозъчната транспланшация или докато тромбоцитите достигнат количество > 20.000 /тт', за
CO предпочитане >50, 000 тт ’. В повечето случаи, протеините се въвеждат за период от седмица ши повече, по- често за период от един до три дни. Обикновено, под терапевтично количество от ТРО се разбира количеството, достатъчно да предизвика клинично значимо повишение на пролиферацията и/ или диференциацията налимфоидните ши предшевстващите клетки, което се проявява като повишение в циркулиращите нива на зрелите клетки (като тромбоцити или неутрофили) Лечението на тромбоцитните нарушения по такъв начин би продължило докато тромбоцитите достигнат поне 20. 000 тт? . за предпочитане 50 000 тт'. Протеините от настоящето изобретение могат да бъдат въвеждани също в комбинация с други цитокини като IL- 3. - 6. -11: стволово- клетъчен фактор: еритропоетин: G - CSF и GM- CSF. В рамкип# на режима на комбинираната терапия, дневните дози на други цитокини mF бъдат : ЕРО. < 150 U/ kg: GM- CSF. 5- 15 μζ: kg: IL - 3 pg kg: и G - CSF. 1 > 25 pg kg. Комбинирана терапия е ЕРО. например, е показана при анемични * пациенти е ниски нива на ЕРО.
Протеините на настоящето изобретение са също и л· за in vitro изследвания на диференциацията и развитието на хематопоетичните клетки, като напр. за изясняване механизмите на клетъчната .диференциация и за определяне линиите от зрели клетки, и може да намерят приложение като пролиферативни агенти в клетъчни култури.
Протеините от настоящето изобретение могат да бъдат използвани до и ex vivo . например като автоложни костно- мозъчни култури.
Накратко. костен мозък се отделя от пациента преди химиотерапия и му се въздейства с ТРО, незадължително в комбинация с един ши повече цитокини. Така третираният костен мозък след това се връща в пациента след химиотерапия за да ускори процеса на Възстановяване. В допълнение, протеините от настоящето изобретение могат да бъдат използвани и за ex vivo разпространение на предшевстващи клетки от костен мозък или от периферна кръв (РВРС). Преди химиотерапевтично третиране, костният мозък може да бъде стимулиран със стволове клетъчен фактор (SCF) или
G- CSF за освобождаване на ранни родителски клетки в периферното кръвообращение. Тези клетки могат да бъдат събрани и концентрирани от периферната кръв и след това да им се Въздейства в култура с ТРО, незадължително в комбинация с един цхи повече цитокини. включително, но
диференцират или пролиферират култури с висока плътност, които след тоВа могат да
доза хикгиотерапия.
Предлагат се и антитела, които свърз:
^ин епитоп от протеин ъахасно настоящето изобретение. .Такива антитела може да бъдат родхщирани посредством множсств
Получаването на моноклонални. различни от човешките антитела е добро .icp на животни като мишка, плъх, заек, коза, овца или морско свинче с рекомбинантен или тетичен ТРО щи с подбран полипептид от
о. Предпочита се животното да се имунизира, с високо пречистен протеин или полипептиден фрагмент. Предпочита се също да се въвежда протеина или полипептида t
Β~.,Κρ·Ι комбинация с аджувант. като напр имунния отговор. Макар единично инжектиране на антигена да е достатъчно за индуциране на антитяло продуциране в животното, найобщо се предпочита въвеждане на го.хяма начална доза, последвано от една или повече буетерни инжекции за период от няколко седмици до няколко месеца. Виж. напр. Hurrel. ed., Monoklonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boca Raton, FL, 1982, включено в литературната справка След това кръвта сс събира от животното и се съсирва, и антителата се извличат, от серума с помощта на обичайни техники като утаяване със соли, йонообменна хроматография. афинитетна хроматография или Високоскоростна течна хроматография.
Използването на моноклонаши антитела обикновено се предпочита при поликлонален антиссрум. Моноклоналните антитела предлагат преимуществото на лесно получаване. специфичност и репродуктивност. Методите за продуциране на моноклонални антите.ла., добре познати на специалистите в областта .. са описани, например. от Kohler and Milstem (Nature 256: 495, 1975 and Ear. J. Immunol 6: 511 ~ 519, 1976}. Виж. също HurreR, ibid, and Hart, U. S. Patent No. 5, 094, 941. които са включени в литературната справка. Накратко, антитялотродуциращите клетки получени, or имунизирани животните обезсмъртяват и изследват, или най- напред сс изследват за продуциране на антитяло. което се свързва към ГРО.
.? α·.>;
Антителата. различни от нов
Publ. WO 87/ 02671 WO/00616. които са включени в литературната спраВк
Накратко. човешки гени с константен участък се присъединяват към подходящи гени на човек иш от дууг източник с вариабилен участък. Например. аминоИшселинните последователности, които представят антиген- свързващите сайтове (CDRs. или комплементарно детерминиращите участъци) от родителско (различно от човешко) моноклонално антитяло сс трансплантират на ДНК ниво при човешк рамкова последователност с Вари=би\ен участък. Методите на niani техника са добре познати в областта, и са описани, например от Jones et al.
(Nature 326: 522- 525, 1986), Riechmann et al. (Nature 322:323· 327,1988) and Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. I SA 86:10029 -10033, 1989. Свързаните гени след това се трансфектират в гостоприемникови клетки съгласно познати процедури. В противоположност. моноклоналните антитялотродущиращи клетки могат да бъдат трансфектирани с клонирани човешки гени с постоянен участък, и химерните антитяло гени да се генерират чрез хомоложна рекомбинация. По този начин става възможно да се конструират моноклонални антитела със значителна част структурата, принадлежаща на човешката, поради което става възможно предлагането на антитела. които са по- подходящи за многократни въвеждания у пациенти хора.
Едноверижни антитела могат да. бъдат получени чрез експресия на рекомбинантен полипептид, който най- общо е съставен от вариабилна. лековерижна последователност, присъединена посредством линкерен полипептид към вариабилна тежксНВерижна последователност. Методите за продуциране на едноверижни антитела са. познати в областта и се описани, напр. от Davis at al (Bio Technology 9.· 165 -169, 1991).
Антитела. които се свързват към епитопи на. ТРО,се използват, например, при диагностика на заболявания. характеризиращи се например с редуцирани нива на тромбоцит·.·. мегакартцтш или друга прсдшсвстваищ клетки. които заболявания са свързани с недостатъчност на пролиферацията или диференциацията на предшевстващите клетки. Такава, диагностика обикновено се провежда чрез изпитване на кръв или плазма е помощта на обичайните имунологични методи като ензимхвързан имуносорбентен анализ или радиоилгунологични изследвания. Изследвания от този тип са добре познати на специалистите в областта. Виж. напр, Hart et al , Riochem. 29: 166- 172. 1990; Ma et al . British Journal of Haematology 80: 43142
436,1992: and Andre et al., Clin. Chem. 38( 5: 758- 763, 1992. Диагностичните изследвания за ТРО активност може да се използват за идентифициране на популации от пациенти, които като чс са повече повлияни от ТРО терапията. Антителата срещу ТРО също се използват за пречистване на ТРО. като напр. чрез прикрепване на антитялото към твърда повърхност, напр. определен матрикс. опакован в колона, и прекарването на разтвор.
съдържащ протеина през колоната. Свързаният протеин след това се елуира с подходящ буфер. Най- общо, протеинггее свързва към колоната при физиологични условия с ниска йонна сила и близко до неутралното pH.
Колоната след това се промива за елуиране на несвързаните контаминангт ‘зан протеин сс осъществява чрез изменение на бач или градиент) или ниско pH ниски от около 2. 5 трябва и а бъи
ЙГ'·
Настоящото изобретение предлага също методи за продуциране на тромбоцшпи, които могат да бъдат тромбоцититс се насочват към места на наранявания, счита се. че те с;:
медиатори на заздравява шията на рани и. при някои обстоятелства.
медиатори на патогенез •ата. Следователно, детайлното разбиране на
тромбоцитната и мегакариоцитната молекулярна биология, би дало възможност за улавяне взаимоотношенията между хомсостаза и клинично свързаните нарушения на тромбоцитните функции. Протеините от настоящото изобретение предлагат подобрени средства за получаване на мегакариоцитни или тромбоцитни сДНК библиотеки.
Рекомбинантният тромбопоетин при въвеждане у животни или прилагане към култивирани гръбначно-мозъчни или костно-мозъчни клетки индуцира пролиферация на мегакариоцити от предшеВстВащи клетки. Разпространението на мегакариоцити и техни предшебстВеници и съзряването на мегакариоцитите. последващо въвеждането на ТРО, позВоляВа изолиране на мегакариоцити с висока чистота и в достатъчно количество за изолиране на тРНК и конструриране на сДНК библиотека. При уточняване на ТРО дозата и режима на въвеждане, ранно или напълно съзрялите мегакариоцити и онези, които активно заменят тромооцитите. могат да бъдат разпространявани от гръбначно-мозъчни ши костномозъчни клетки. Съответно, могат да бъдат конструирани представително сДНК библиотеки. които да съответстват на ранни, междинни или късно стадии или на мегжсариопоезата.
Приложенията на получените в резултат сДНК библиотеки са много Такива библиотеки могат да бъдат използвани, на пример за идентифициране и клониране на ниски изобилстващи протеини, играещи роля в различни тромбоцитни дисфупъкции. Лекотата, с която мегакариоцитите на пациентите могат да бъдат разпространени и тяхната тРНКризолирана за лнализ. води до изясняване молекулярните основи на заболяването. Библиотеките са също и източник за клониране на нови растежни фактори и други протеини с потенциално терапеВтична приложимост. Към особено полезните. Вече клонирани протеини/се включват растсжниятфактор. получен от тромбоцити > Ross et al.. Cell 26: 155-169. 1986}: трансформирал; растежен фактор {MtUetich el al. t Blood 54: 1015 - 1023; Roberts and Spom, Growth Factors 8: I- Я 1993): растежен фактор, получен от тромбоцити на. ендотелни клетки {M'illetich et al., Blood 54: 1015 -1023,1979} u Pi7 - 4 ’.Doi et al . Mol. Cell. Biol 7:898 - 904. 1987; Boncz etal.. Blood 69 : 219 - 223,1987). Нови растежни Фактори могат да бъдат идентифицирани чрез функционално изследване на експрссионни сДНК библиотеки или чрез хибридизационно изследване с познати растежно факторни сонди. Изолирането на нови растежни фактори може също да бъде осъществено чрез полимеразна верижна реакция с помощта на дегенерирали праймери за съхранени участъци на познати растежни фактори. В допълнение, системното и пълно ДНК зъцщсгване на библиотека предоставя сДНК меггжариоцитна сДНК секвснционна. база данни. Такава база данни може да бъде разработена за полезни секвснции чрез различни компютърни търсещи алгоритми.
Мегакариоцитите. полудени,както е посочено по- горс^могат да сс използват за получаване на библиотека протеини. Тази библиотека е л.омгелементарна на сДНК оиблиопзската. Информацията за аминокиселините. получена от протеиновата библиптек^позВо.лява изолиране на
J ·*ί.6· сДНК. кодиращи протеинови инсврти. Използването на сетните за аминокиселинните последователности на протеина за конструиране на й· праймери за ДНК изолиране, отстранява проблемите, възникващи при < използването на конвенционалните методи за изготвяне на оиолиотеки ,
х. дължащо се на изобилието на тРНК . У двояването на протеин и сДНК библиотеки също улеснява, мишенното клониранс на последователности от особен интерес.
Протеинова библиотека се създава чрез скстралтране на протеини о?бти протеини или желан и фракции) от мегакариоцити съгласно изВсстни методи. след това разделяне на протеините чрез дву- иимснсионалнс гел електрофореза. Изолираните протеини слсд тоВа се подлагат на т situ разграждане с трипсин последвано от разделяне е мокро- борагпна HPLC. Разделените фрагменти след това сс анализират чрез масспсктромстрия. Полученият В резултат на маспрофил се изследва спрямо базата данни за протеиновата последователност за усттновяВаж протеиновата идентичност. Идентифицираните пептиди могат да бъдат съгласувани чрез разграждане по Edman # сДНК и протеиновите- библиотеки са ценен източник на нови протеини и на кодиращите ги последоватлностш Счита се. чс тромбоцититс са важни медиатори при заздравяването на рани, и при някои обстоятелства, при патогенезата. Идентифицирани са и са охарактеризирани много важни тромбоцитни протеини, включително полученият от тромбоцититс растежен фактор, трансформиращият растежен фактор - С полученият ?т тромбоцитите ендотелен . клетъчен растежен Фактор, и тромбоцитен фактор 4. Идентифицирането и охарактеризираното на други тромбецигг.ж: протеини би било изключително полезно при изясняване процесите на заздравяване на раните и патогенезата. и се очаква да се постигне получаването на важни терапевтични агенти и стратегии.
Както е описано в подробности по- доли. човешкият ТРО ген е локализиран в хромозома 3 ц 26. Тази информация, сумирана с П':.'Следователь.ос.тта на човешкия ТРО ген (SEQ ID NO: 28). позволява директното диги-носпшццране. чрез генетично изследване, на онаследени нарушения на ΊΤΌ гена иш регулирането на неговото експресиране. Такива нарушения може да включват редувания на промоторни последователи мш, водещи до повишаване или намаляване на експресионно ниво, хремошмни транслокации пои кодиращи или некодиращи участъци, и съпоставяне но регулаторни последовате.лности при ТРО локуса. В дадената област са известни различни методи за приложение при диагностициране. Например, праймери или хибридизационни сонди от поне 5 нуклеотида. за предпочитане 15 - 30 или повече в дъ.лжина. могат да бъдат конструирани от геномната последователност и да се използват за откриване на хромозомни абнормености или за измерване тРНК нивата. Известни са множество удобни, методи за откриване и измерване, Включително· разслояване по Southern*. полимеразна верижна реакция [MiUis, U. S. Patent No. 4 683 202) и лигазпа Верижна реакция (arany, PCR Methods and Applications 1: 5 -16, Cold Spring 11 arbor Laboratory Press, 1991}. Например. ДНК на пациент може да бъде разградена с един или повече рестрикционни ензими и да се прехвърли върху нитроцелулоза за получаване на разслояването no Southern. Разслояването след това се сондира за. установяване на големи изменения в размера на фрагмента. получени от мутации в мястото на рестрикция на разпознатата последователност. В друга процедура. анашзът на i-онормснитс генни последователности и сравняването на нормалните и ©
'тнормени последователности позволява конструирането на праймери. които могат да бъдат използвани за идентифициране на абнормения те. с. ззрушен или травслоциран ген). ДНК на пациента се амп.шфшщра чрез ж полимеразна Верижна реакция за установяване характеристиките на амплификационните продукти на нормалния ген или сецифични генни размествания.
Изобретението пс- нататък се илюстрира със следните примери, без да го ограничават,
Човешки MPL- Р и MPL - & рецепторна изоформа. кодираща. сДНКи.сс изолират от човешки сритроидни левкемични(НЕЕ)клетки(Д1ят« and Papayannopoulu, Science 216:1233-1235,1982 > чрез обратнотранскрибтазна верижна реакция (PCR) е помощта на праймери, създадени за публикуваната последователност, кодираща амино и карбоксилния. Край на рецепторите ί Vigon et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 564(1- 5644. 1992). Матрична HEL клетъчна сДНК се синтезира от поли d(T)- селекционирана поли (А)’ РНК с помощта на праймера ZC5499 (SEQ ID NO: 3). Тринадесет ul HEL клетъчна поли (А) ’ при концентрация от 1 ug ul се смесват с 3 Е 20 pmole/ul едноверажен праймер ZC5499 (SEQ ID NO: 3j. Сместа, се нагрява при 65°C за 4 минути и се охлажда върху лед.
Синтезата на първата верига сДНК се инициира при добавяне на 8 id от буфера за първата верига (250 тМ Tris- HCL. pH 5. '3. 375 тМ KCL 15 тМ МгС: и5 х SUPERSCRIPT 'v буфер: GiBCO BRL. Gmrersburg, MD). 4 ц cm ΗΊΟ тМ дитиотреитол u 3 Е разтвор на де:юксингкхеотид трифосфят. съдържащ по 10 т.М от άΑΤφ. бГТф. d ТТф и 5 - метил- оСТф (Phartnac^
Biotechnology hie., Piscataway, АТу Реакционната смес се инкгпира при 45°С за 4 MUHvmu. последвано от добавянето на Ш ц от 200 1.3 Е Рибонуклеазна Н обратна транскрибтаза (SUPERSCRIPT '· обратна трлвекриотаза: IBCO BRL) към РНК- праи.мерна смес. Реакцията ее инкубира при 45?С зи 1 час. последвано от инкчбаиия ппи 50°С за 15 минети. Шестдесет Е ТЕ (10 тМ Oris : HCL. pH 8. и. 1 т.М EDT.A) се добавят към реакцията, последвано от хро.матоарафиране ппез ?.е\ филтрационна колона с размер на порите 400 (CHROMA SPIN 4· ТЕ - 400' Е Clcntech Laboratories Inc.. Palo Aho. CAt за отстраняване на излишъка от пгаймепа.
HEL клетъчна сДНК от първата верига се използва като матрица за амплификация на човешка MPL-Р рецепторна сДНК е помощта на праймери. съответстващи на участъка, които кодира амино- и каобокси-краищапт на рецепторния протеин (Vigon et al,, ibid γ Ппаймсрите също всеки от тях включва различен рестрикционен сайт на разграждане за постигане на насочено клониране на амплифииирания nnocvkm (ZC5746. SEQ ID NO: 4.
съдържащ Eco RI сайта: ZC5762. SEQ ID NO: 5. съдържащ 10 g матрична сДНК. 50 pmoles от всеки праймер: 200 иМ от всеки дезоксинуклеотис трифосфат ( Phannacia LKB Biotechnology Inc. γ. 1 ul omlOxPCR буфер iPrumega Corp., Madison. WI); и 10 единици Tag полимераза (Roche Molecular
Systems, Inc., Branchburg, NJ). П цикъла (1 минута при 95“ С. 1 минута пра 60° С и 2 минути при 72° С с 1 допълнителна секунда. добавена към всеки успешен цикъл), последвано от 10 минутно инкубиране при 72- С,
Човешка MPL- К рецепторна с..ииК се изолира чрез амплифииипане с полимеразна верижна реакция от HEL клетъчна сДНК по начин, идентичен на MPL- Р рецепторната сДНК. описана по- гор зключение на това, че праймера ZC5762 (SEQ ID NO: 5) е изместен от ZC-5
PCR праймера ZC5742 е пецифи
742 (SEC ID N0:1) включва Xho I рестрикционният сайт за улесняване на клонирането.
>
Реакционните продукти се кстрахират двукратно с фенол/ хлороформ к след това веднъж с хлороформ и преципитирагс етанол. Следвайю разжажцането е Eco RI и Xho ситно смлян агарозен гел ( SEA. PLAQUE GTG 'у ситно смляна агароза:
FMC Corp., Rockland. ME). 1. 9 Kb амплифициран продукт. съответстваш на човешка MPL - Р рецепторна сДНК и 1 човешка MPL - K рецепторна сДНК. се възстановява от изрязания гел чрез разграждане на гслната матрица с агароза I ( New England Biolabs, Inc..
г*с
Beverly. М4/ последвано от преципитаиия c етанол, сДНК-ите се подлагат на субклониране във вектора рНюеясДп* - SK+ l.Siratagene Cloning Systems. La
Jolla, СА) за определяне чрез съаласлване.
Пр.имср II, Изолиране на миша MPL рецепторна с_ШК
Спленоцити от C57BLK$-db мишка се отделят и незабавно се поставят в течен азот. Обща РНК се изготвя от тъкан на слсзка е помощта на гуанидин изотиоцианат (Chirgwinet al .. Biochemisrty 18: 52-94.. I'd? 9} . последвано от етап на центрофугиране е CsC-I Спленоцитна поле (А) РНК се изолира е помощта на олиго целулознахроматография (Агй· mid Leder, Proc. Natl Acad. Sci. C.SA. 69: 1408-14)2. 1972).
Седем и половина μί от поло d(’D - селсю=иошт:тп пол.и(А)+ мита сплсноцитна РНК при концентрация 1. 7 ug μι се смесват с 3 и! от 20 рток а от праимера за първата верига Z.C6091 (SEQ ID УО: 7), съдържащ оестрикционния- сайт Not I. Сместа се загрява при 55° С в продължение нл 4 минути и се охлажда върху лед. Синтезата на първата верига на сДНК се ищщшра чрез добавяне на 8 μΐ 25G тМ Tris- НС. pH 8. 3. 375 тМ KCL ’5 ~.М MgCR (5 х SUPERSCRIPT' буфер: GIBCO BRIj. 4 ul отЮОтМ дитиотреитол и 3 μΐ разтвор на усзоксинуклесянид триосфат. съдържащ по ii тМ от dATP. dGTP. йТГР и 5 - метил- иСГР iPiiarmacut LKTi Biotechnology Ни .; Μ.,λί РНК- праймернзта смес. Реакционната смес се инкгбиря при 45;; С за 4 минути. последвано от добавяне на 10 ф 200 U id Рчазна Н' обратна тоанскрибтаза {Gl'BCO BRL). ЕФекпшвностпм на синтезата на. пърКатл веоиг-а се анализира Ь паралелни реакция ара добавянето на 10 рС1 от ' РооСРТ към 10 μΐ еднакви части от реакциошинпа смес _т маркиране ни реакцията за анализ. Реакциите се инкубират при 45 ' С за 1 час. последвано от инкубиране при 50° Сза 15 минути. Включеният ; Р- xdCPT в маркираната реакция се отстранява чрез хроматографиране Върм гел филтрационна колона с размер па порите 4(ХИCHROMA SPIN + TP - ;,i. Clonteeh
Laboratories Inc. ). Невключените hl Lt в небелязаната реакция за първата верига се отстраняват чрез двукратно прецепйтиранс на сДНК в присъствие на 8 иа гликогенов носител. 2. 5 амониев ацетат и 2. 5 обема етанол. Небелязаната сДНК се ресуспендира в 50 и! вода за използване 6 интезата на втората верига. Дължинап сДНК се определя чрез агарозна гел електрофореза
Ссштезата на втората верига се осъществява върху първата вер—ш^«.1 на.
ДНК при условия, които промотират първичната обработка на п ьрвап :а ерига е оглед синтезата на втората верига. което води до оформяне i 3--..
спирализацията на ДНК. Peakuuoi е приготвя при стайна температура и включва. 50 ц!
-%/-··
i.-k» и! от 100 ц] дитиотреитол. 2 и! разтвор.
съдържащ 10 т.М от всеки дезоксинукчеотид трифосфат. 3 d от 5 тМ ;
\AD. 1а и от 3 •j
IU
Е. coli ДЕК Уем England В in labs Inc. , Beverly,
UCh’
..-30 Е м! Е. coh ДНК поли.мераза 1 iAmersham Corp. . Arlington
Heights, IL > реакционната смес се инк/биоа при стайна температура. за .минути. последвано от добавяне на 1. 5 ui 2U jd Рназа И (G1BCO BRL).
Използва се паралелна реакция, ппи която павни части от по 10 d от сместа синтез на втората верига сс маокиоа чрез добавяне на 10 «Са 5Р оюСТР, за да се наблюдава ефективността на синтезата на втората верига.
Реакциите се инкубират при i.5c С за два часа, последвано от ипкуоираяе ог J.5 минути на стайна температура. Невключената ’iP - (xdCTP в маркираната.
реакция се отстранява. чрез.хроматографиране па гел филтрационна КХ ϊ.\ί.5|κί ν размер на порите 400 (Clantech Laboratories, Inc.} преди анализа е .агарозна. гел електрофореза. НемарКираната реакция завършва е две екстракции с фенол/ хлороформ и хлороформна екстракция. последвана от преципитиране е етанол в присъствието на 2. 5 М амонисб ацетат.
нфиаурация се разгражда е помощта на нуклеаза от Phaseo!us aureus. Реакционната. смес съдържа 100 Д еДНК от втората верига. 20 и! 1G х от посочения по- горе нуклеазен буфер ; Stratagene Cloning Systems. La Jolla, CA16 4 om 100 тМ дитиотреитол. 51. 5 Д вода u 12. 5 Д от разтвор 1: 1ϋ нуклеаза от Ph. aureus ( Promega Corp. : крайна концентрация 10. 5 U μ!} в нуклсазеп ч5уферен разтвор. Реакцията, сс инкхоира при л /с за т минути. 1'еакцията заВорих&а с дииа&яне нааи ui от ί М Tris: HCI. pH 8. ΰпоследвано от секвениионсн фенол/ хлороформ и хлороформни екстракции. както е описано по- горе. След екстракциите ДНК се утаява в етанол и щ ресусасндира във вода.
Краят на рссуспендираната сДНК сс формира така, че да завършва тъпо с помощта ка Т4 ДНК полимераза. сДНК. която се ресуспендира в 190 д водя, се смесва е 5G Д 5х Т4 ДНК полимеразен буфер (250 тМ Tris : НС4. pH 8. в, 2oU тМ КСТ _о mvl МсК- ), 3 «δ, I М дитиотреитол. в Д оаствор. съдържащ 10 тМ от всеки. yeookcmiyLieomug трифосфат и 4 р! от U ul Т4 ДНК полимераза ‘..Boehringer Mannheim Corp.. Indianapolis, IN}. Cscq инкубиране в продължение на 1 час при 10с С. реакцията завършва с добавяне >:п U.) Д от 0. 5 М EDTA. последва ч^ от серия лечол хлроформни и хлороормпи екстракции, както е описано п-л- горе. ДНК се хроматографира чп гел филтрационна колона, с размео на порите 400 {Clontech Laboratories In е., Palo Alto, СА} за отстраняване на следите c-m протеин и за отделяне на късите сДНК с дължината- малка от - 4(½) Ьр. ДНК се утаява с етанол в присъствие на 1.2 Д гликогенов носител и 2. 5 М амониев ацетат и се ресуспендира в 10 и! вода. На базата на включения·· 52Р - adCTP се установява, че сДНК е - 2 ug от изходните 12. 5 ug матрична тРНК.
Към 5‘ края на сДНК се свързват Eco RI адаптери, което да позвол.
клонирането в ламбда фазов вектор. 10 Д еднакви части от сДНК (~ 2 ugj ш от из ртоге и от с.со 1С ацгсптер (Pharmacia LKB BiotccJmology In oλ пг\ 4 ZUr»v2 .-fFV» Ζ» w c.Mvcuaiii v Q
U1 ΟΙΏ 15 L>: U* 14
Д 10х лигазсн буфер (Promega Corp. ). 1 ul от 10 т ΛΊ Ai ф U _
ДНК лигаза tPromega Corp. ). Реакциятасе прекъсва с добавяне на
-J вода и Ю Д ЗМ Хз ацетат. последвано от инкубиран <.<?> с за 30 минути. След инкубация. сДНК се екстрахира с Фенол хлороформ и хлороорм. както е описано по- ?.опеги преципитира В присъствие на 2. 5 амониев ацетат и 1 2 обема изопропанол. След центрофугиране, утайкат от сДНК се промива със 70-7· етанол. изсушава се на въздуха и се ресуспендира в 89 Д вода :>а УлесняВане насоченото клониране на сДНК 6 ламОда фагови.ч вектор. сДНК се разгражд c Not I. което води go получаване на сДНК с
Ьсо R1 и 3 * Not 1 лепливи краища. Рестрикционният сайт Not 1 η \но включен чрез праймера ZG00Q i SFQ гтл
I L ί r'
NO: /). Рестрикщ1оннопю разграждане се осъществява в реакция.
Включваща 89 и» от сДНК. описана по- горе. 10 и! от 6 тМ I ris : HQ .Ms Q . ISO тМ NaCI. 1 тМ D Π : 10 х 13 буфер. Promesa Corp. ?.
Разграждането се оса осъществява при 37c C за 1 час. Реакцията завършва серия от фенол: хлороформни и хл<
зроформни екстракции. сДНК е ъмива се със 71Q етанол. изсушава се на възи гч^г* ντ/^·-η «ат in < ΉΠ М> ι »1 Iv
V V- ρνχ I V ί < ·- ! 1-«Л U4{ ' it * / „.Λ .- LW i .-¼
Λ -. 4,.· λ гел натоварващ буфер (10 тМ
J ns
в. 125 с<. бромфенол блу).
Ресуспендираната сДНК се нагрява до 65°С за 5 минути,охлажда се върху лед и се подлага на електрофореза върху 0. 8% леснотопим агарозен гел : SEA PLAQUE GTG’M стопена агароза: FMC Corp. ;. Невключените адаптери и сДНК с дължина под 1. 6 КЬ в дължина се изрязват от гела. Поставят се електродите и електрофорезата протича де концентриране 6 близост до източника. Областта от гела. съдържаща концентрирана сДНК, се изрязва и се поставя в мШфофужна епруветка, и се определя приблизителният обем на гелнигпе срези.. Към епроветкшпе се добавя вода в обем, възлизащ приблизително трикратно на обема на зелншпе орезили ггарозата се стопява чрез нагряване до 65 С ;г П митти. След уравновесяването на пробата до 42° С. се добавят Ту: от 1 U. 'd агароза i йУгк England Biolabs. Inc. 5 и сместа се инкубира за 90 минути до разграждане на агарозата. След инкубация. към пробата се добавят 40 и! от 3 М Na ацетат и сместа се инкубира върху лед за 15 минути. Пробата се центрофугира на стайна температура при 14 000 х g за 15 минути за отстраняване на неразградената агароза. сДНК в утернатантата се преиипитира с етанол. промива се в 70G. етанол. изстиавасс на въздуха, и се ресуспендира в 37 d бода за киназната реакция за фосфорилиране на свързаните Eco RI адаптери.
Описаният по- горе 37 у сДНК разтвор се добавя към 10 и лигазен буфер {Straiagene Cloning Systems), и сместа се нагрява до 65 С за 5 минути. Сместа се охлажда върху лед и се добавят 5 и! от 10 т.М АТф и 3 d 10 I 4 d I'4 полинуклеотид киназа (Stratagene Cloning Systems). Реакцията се инкебира при 37s за 45 минути и завършва е нагряване до 65 С за 10 минути, последвано ат серия екстракции с фенол, хлороформ и моорофоом. фосфорилираната •сДНК се преципитира с етанол в присъствие на 2. 5 М амониев ацетат.
промива се с 70% етанол. изсушава се на въздуха и се ресуспендира в 12. 5 ц! вода. Установено е . че концентрацията на фосфорилираната сДНК е - 40 fmole/ μΐ.
Получената В резултат сДНК се клонира В ламбда фазовия Вектор /JBxCelP' {Pharmacia LKB Biotechnology Inc.}, предварително разграден c Eco RI u Not I и дефосфорилиран. Присъединяването на сДНК към вектора се осъществява в реакция, съдържаща - и! от 20 fmole/ μί от /£хСс1Г’·' фазови рамена. 4 и! вода. 1 и! 10х лизазен буфер (Promesa Corp.). 2 μί от 40 fmole' μΐ сДНК и 1 ul от 15 U/ μί Τ4 лигаза Promega Corp.). Свързването се осъществява, при 4° С за 48 часа. Приблизително 50% от сместа за свързване се включва във фаза с помощта на C4GAPACK л IT Gold Packing extract iStratagene Cloning Systems) съгласие: инструкциите на продавача. Полученапк; в резултат сДНК библиотека съдържа над 1. 5 х 10 независими рекомбинанти с ниВа на инсертирания фаг по- малко от 1- 5%·.
Белязана, с ; Р човешка MPL - К рецепторна сДНК сонда се използва изолиране на миша рецепторна сДНК от миша спленоцитна сДНКфазова библиотека. сДНК библиотеката се посява Върху клетки от щам Е. coh SURE τ (Stratagene Cloning Systems) при плътност от 40 000 до 50 000 PFU 150 тт диаметрова поничка фазовите плаки от тридесет и три панички прехвърлят върху найлонови мембрани (Hybon Л’7·1,1 Arlington Heights, IL) и cv обработват съобразно инструкциите на производителя. Обработените плаки се пекат за 2 часа при 80сС под Вакуум . последвано от няколко промивания при 70° С в буфер за промиване (0. 25 х SSC. 0. 25% SDS. 1 тМ EDTA) и се подлага на фенилхибрисизация за една, нощ при 65G С в хибридизационен разтВор (5 х SSC. 5 х разтвор на Dcnhardt, 0. 1% SDS. ’ тМ EDTA и 100 ug т’ температурно денатурирана спермална ДНК от пъстърва) 6 хибридизационна пещ {модел НВ- 2: Techne Inc., Princeton. NJ). След прехибридизация, хибридизационният разтвор се отстранява с пресен хибридизаиионен разтвор, съдържащ приблизително 2 х 100 срт/ mi от маркирана с 32 Р човешка MPL - К сДНК. получена с използването на.
търговско достъпен кит за маркиране (MEGAPRLME ™кит; Amerskam Cori.
Arlington Heights, IL). Пробата се денатурира при 98° С за 5 минути преди добавянето й към хибридизаиионния разтвор. Хибридизацията протича при
65° С за една нощ. филтрите се промиват при 55° С в буфер за промиване ( х SSC. 0. 25 усилващи екрани за 4 дни при 70°С върху филм XAR - 5 (Kodak Inc.., Rochestc
ЛТл Изолзвайки аоторадиографа като матрица, агарните пластинки е възстановяват от участъците на поничките, които съответстват н.
.а (рога за пречисгпоше на плакат·!. рЦаолимгЩи седем пречистени or плаката фаги. които носят инсерти. хибридизиращи към човешка MPL - К Hili Op HR проба. Обвивката на a ExCell фага с възстановява с помощта на in vivo пекомбинантна система в съответствие л инструкциите на пиодап
Идентичността на сДНК инсертите се потвърждава чрез ДНК секвенйране»
Изолираните клонове кодират протеин, проявяващ висока cmenei секвенционна идентичност спрямо човешкия MPL- Р рецептор ι докладваният наскоро миши MPL рецептор (Skoda et al.. EMEO J.
2653.1993). Седемте кюна попадат в класове, различаващи се от по три клона с деления на последователностите. кодиращи участък от би аминснкиселинни остатъка бизо go N- края. сДНК. кодираща протеина без деления се отнася към миша iun I MPL рецепторна сДНК. Тип II рецепторна сДНК не притежава последователности, кодиращи Тип 1 рецепторни остатъци 131 до 190 от SEQ ID NO : 17. В допълнение, рецепторите Tun I и II се отличават от докладваната миша МР1. рецепторна последователност (Skoda et al., ibid.) no присъствието на последователност. кодираща аминожиселинните остатъци Vai- Arg- Umber- Pro- Ala- Gly- Glu (SEQ ID NO: 9), инсертирани след аминожиселинен остатък 222 и чрез заместване на алициновия остатък със серин при позиция 241 (позиции. отнасящи се до Тип I миши рецептор).
Миша Tan I и Tun I! МРЕ рецепторна сДНК сс подлага на субклпнпране в плазмиден вектор pHZ-1 за скспресиране в клетки на бозайник. МлазмидъЬ ρΙΙΖ- 1 е един експресионен вектор, който може да бъде използван за * експресия на протеин в клетките на бозайник или в транслационна систсм*·’ от тРЖ на жабешки ооцити. които са били транскрибирани in vitro. ρΗΖ- Т експресионната единица включва миши металотионеинов- 1 промотсс. промотора на бактериофаг Т7. фланкиран чрез банки за множествено клониранс. съдържащи уникални рсстрикционни места за инссртиране ~а 1 кодиращи последователности, терминатора за човешкия хормон на растежа и терминатора на бактериофаг '17, В допълнение, ρΗΖ-1 съдържа един Е. coll източник на рспликация: бактериален бета лактамазен ген: селективна маркерна експресиона единица, съдържаща промотора SV40 и изходен, ген за резистентност на неомицин u SV40 траяскрибционният терминат-ар. За улесняване насоченото клониранс в ρΗΖ-1. се използва полимер аз на верижна реакция с участието на подходящи враймери за създаване на един Есо Ш и един Xho 1 сайт нагоре от транслационния кодон за иницииране, съответно надолу от транслационния терминаторен кодон. Полимсразната верижна реакция се осъществява в смес, съдържаща 10 μΙ. 10 х UET.M-Vм
ДНК полимеразен буфер (Roche Molecular Systems, inc., Branchburg, NJ). 6 ul 25 mM MgCL. 0. 2 ul разтВор на дезоксинуклеотид трифосфат. съдържащ по 10 тМ от dATP, dGTP. dTTP и. dCTP ( Pharmacia LKB Biotechnology Inc.). 2. 5 pi om 20 pmoie Д cm праймераZC6603 (SEQ ID NO: Sy 2.5 k от 26 pmoie/ ul от праймсра ZC5762 (SEQ ID NO: 5). 32. 8 μΐ Вода. 1 μί от бактериална култсра η ранна логаритмична. фаза, която дава мити MPL рецепторен пламна от Тип 1 или Tur: II и 1 ul от 6U/ μΐ ДНК полимераза (ULTMA'* полимераза: JRocht·: Moles-ular Systems, bu.. Branchburg, NJ). ИзползВан e. AmplWax ί Roche Molecular Systems, Inc.) съобразно UHmnvkuuume на продаВача. Полимеразната Верижна реакция се осъществим, в 25 цикъла (I минета πρι 95 G 1 минета при 55с С и 3 минути при 72с Ск последвано от инкубация за 10 минути при 72° С. Амплифицираните продукти се екстрахират серийно с фенол, хлороформ и хлороформ. след това се преципитират с етанол в присъствието на 6 tig носител на гликоген и 2. 5 М амониев ацетат. Утайката се ресуспендира в 87 ul вода^към която се добаВя 10 х Н буфер {Boeringer Mannhetm Carp.}. 2 μ от 10 U ul bco RI {Baeringer Mannheim ) u 1 j.1 ад 4П I/ jm Xho I fBoeringer Mannheim Corp. разграждането сс осъществява при 37s C за 1 час. Реакцията сс прекъсва чрез загряване до 65° С в продължение на 15 минути и се хроматографира на филтрационна колона с размер на порите 400 ( CHROMA SPIN -г ТЕ- 400: Ckmtech Laboratories Inc.),
Изолираните рецепторни инсерти, описани по- горе,се свързват в Есс RI и Xho I разградения и иефосфорилиран pHZ-1 вектор. Реакцията за свързване съдържа 1Д от 5С ng/Д изготвен pHZ- 1 вектор {Promega Corp.;.
11. 75 μΐ вода и 0. 25 μ от 4 I’ ul Т4 ДНК лигаза. {Stratagem: Cloning Systems). Свързаните ДНКи се трансфектират В Е. call (MAX EFFICIENCY DH10By компетентни клетки: GIBCO BRL) съобразно инструкциите на продавача. Валидността на мишите Тип 1 и Тип II MPL и човешките MPL - Р рецепторни инсерти в pHZ-1 се потвърждава чрез ДНК секвениране, Получените 8 резултат плазмиди pSLmpI- 8 и pSLmpI- 9 носят мишите Тип I и Тип II MPL рецепторни сДПКи. съответно. Плазмидът pSLmpI - 44 носи човекият MPL - Р сДНК инсерт.
Пример Ш. Конструиране на клетъчни линии ВаРЗ. скспресираши MPL.
рецешпрри
Интерлевкин- 3 зависимата пре- лимфоидна клетъчна линия ВаРЗ.
полхчена от миши костен мозък (Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727- 734,198.
Mathey- Prevotet al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133- 4135,1986), се съхранява в пълна среда (среда RPNfl 1640 (JRH Bioscience Inc., Lenexa. KS)?заместена c температурно инактивирзн фатален телешки серум, 4% кондициониране среда от култивирани WE111- 3 клетки (Becton Dickinson Labware, Bedford, МА), 2mM 1,- алутамин. 2- меркаптоетанол (1: 280 000 крайна концентрация и. BSN антибиотици (GIBCO BRL)). Пречистените с цезиев хлорид плазмиди pSLmpI- 8, pSLmpI- 9 и Simp·- 44 се линеаризират в Nde 1 сайта преди електропорация в клетките ВаРЗ. За електропорация последните се промиват еднократно в среда RPM1 1640 и се ресуспендират в RPM11640 средата при клетъчна плътност 10 клетки·' ml. Един ml от ресуспендираните BAF3 клетки се смесват с 30 ug от всяка от линеаризираните плазмидни ДНКи и се прехвърлят в отделни достъпни за електропорация камери (GIBCO BRL). След 15 минути инкубация на стайна температура, на клетките се правят два серийни шока (800 pFad' 300 V.:
(л·
1180 uFad; 300 V.) c помощта на апарат за електропорация (CELLPORATOR- GIBCO BRL). След 5 минути, което е времето за възстановяване, подложените на електропорация клетки се прехвърлят в 10 ml от пълната среда и се поставят в инкубатор за 15- 24 часа (37° С.
пълна среда, съдържаща 1600 ug,·' mi G41S и се посяват при лимитирани разреждания в 96 ямково блюдо с тъканна култура, за изолиране на устойчиви на G418 клонове. Експресията на MPL рецептори В устойчиви на се установява чоез Northern blot анализ на ВаРЗ т РНК на базата на наличието на MPL рецепторен транскрибт. Установено е. че клетъчна линия. означена като ЬаРо MPLR1.1. експресира висо ки нипа на гг
Tun I миша MPL рецепторна тРНК. и се използва за последващо изпитване за
MPL активност на свързване в кондиционирана среда на трансфектирани
ВНК 570 клетки. Клетъчната линия, експресираща Тип И рецепторна тРНК.
Прцмериу.. Прй.дуцир§ж..н.а4шп1вйр.им. мшжЛОД-.реисптор
Експресионен плазмид за бозайици, кодиращ разтворим миши Тип I MPL
Слчсппееионен плаз:
рецептор (pLDmpl- 53)^с продуццран чрез комбиниране на ДНК сегменти от мид за бозайници, съдържащ сДНК която кодира описания по- горе миши Тип 1 MPL рецептор в пълната му дължина, с Д iv сегмент от pSLmpl- 26. един експресионен плазмид. конструиран да продуцира разтворимия миши Тип IMPL рецептор в бактерия.
сДНК фрагмент, кодиращ миши Тип I MPL разтворим рецептор^ изолиран с PCR с помощта на праймершпе ZC6704 (SEQ ID NO
ZC6703 (SEQ ID NO: ll)„kamo за целта 6 качеството на матрица се използва рецепторният плазмид pSLmpl- 9 с пълната му дължина. За улесняване на насоченото клониране. праймерите ZC6704 и ZC6703. се включват в рестрикционни сайтове Eco RI u Xho I 8 техните съответни краища.
Праймерът ZC6703 консенсусна % ПГ·· мишенна последователност за протеин киназа. което да позволи in vitro маркиране на пречистения разтворим рецептор е ’ Р γ- АТф (Li er al, Proc.
съдържаща 10 ul 10 х ULTMA™ ДНК полимеразен буфер (Roche Molecular
Systems, Inc), 6 μΐ 25 mM ' MgCI_;. 0. 2 pl разтвор на дезоксинуклеотид
трифосфат, съдържащ nc i 10 mM orr. ήΑΤΡ. ciGTP. аТТР u dCTP [Pharmacol
LKB Biotechnology Inc.). 11 ul om 4. 55 pmole μ om праимера ZC6704 (SEQ 1$
No : 10). 21 in om _. ό ρη loie/ ul om праймера ZC6703 ( SEQ ID NO: 11).
50. 3 и! вода. 1 μί 50 ng, μΐ разграден с Hind Ш и Xba 1 плазмид pSLmpN 9 ΐι ί и! от 6 L;jμΐ LILTMA’·1 ДНК полимераза (Roche. Molecular Systems, Inc.}.
AmpliWax (RocheMolecular Systems. inc.} се използва в реакцията съгласно инструкциите на продавача Полимеразната верижни реакция протича за три цикъла (1 минута при 95°С. 1 минута при 50°С и 2 минути при 72СС), последвано от 11 цикъла при повишени хибридизационни изисквания (1 минута ри 95°С, 30 секунди при 55°С и 2 минути при 72СС). последвано от инкубация в продължение на 10 минути при 72°С, Амплифицираният продукт се екстрахира с фенол хлороформ и хлороформ, последвано от хроматографиране на филтрационна, колона с размер на порите 400 (Clontech
Laboratories, Inc). PCR продуктът се утаява с етанол 6 присъствие на 20 ug гликогенов носител и 2. 5 М амониев ацетат. Утайката се ресуспендира в ul 10х Н буфер ( Boehringer Mannheim Corp. ). 1 pi 10 U; ul Eco RI (Boehringer Mannheim Corp.)\i 1 μΐ om 40 U ul Xho I (Boehringer Mannheim Corp. }, разграждането се осъществява c нагряване go за 15 минути и се пречиства върху 0. 7% агарозен гел. Частично възстановяване от агарозния гел се осъществява чрез разграждане на годния мширикс е β- агароза I ( NeuEngland Biolabs).
Полученият в резултат PCR продукт кодипа X- копания екстрацелуларен участък на миши Тип 1 MPL рецептор ι остатъци 27 до 480 cm SEQ ID ХО. 17). В отсъствиет:· на Вероятния рсцеитсрен трансмембранен участък (остатъци 48? до 504 на SEQ ID ХП ·~γ.
ек.дресираният протеин, се очаква да бъде секретирач в присъствие на подходящ сигнален пептид. Миши Тип II разтвори?.: МЕо рецептор. кодиран: сДНК^е получава с помощта на PCR условията. опшанс :: горе, с изключение на това, че като матрица се използва pSLmpk 8- Валидността на двата рецепторни фрагмента сс потвърждава чрез ДНК секвениране.
Разтворимите миши Тип I и Тип П МРЕ рецептор кодиращи фрагмента се клонират в разградения с Eco Rl и Xho I вектор ?С>трА2 - 5 за получаване на pSLmpI - 26 и pSLmpi- l'. съответно. Плаз-шуът рОт.рА2· 5 е модификация на рОтрА2 \Ghrayab el al.. EAiBOJ. 3: 2437- 2112, 1984), бактериален вектор за експресия, създаден да насочи рекомбинашпния протеин към першъ-лазматичното пространство. рОтрА2- : е конструиран чрез заместване на 13 Ьр последователност мсждо Е:·’ R- и Bon. HI сайтовете на рОтрАЗ със синтетична 42 Ьр последователност. Тат последователност е създадена чрез лш^еализиране на два 42 т-жлеотидни комплементарни олигонуклеотида (ZC6707. SEQ ID ХО . 12: ZC 6706. SEQ ID NO: 13к които при удвояване на базите, фермтат Eco R1 и Ват Н! лепливи, краища. улеснявайки насоченото клештче В разграден с Есо
RI u Barn HI плазмид pOmpA2. Вътре В инссртираната последователност аа един Xho I сайт, включен с оглед на бактериална лидсрна последователност,и миши MPL разтворим рецептор, кодиращ сДНКи^ описани по- горе, а така също и един Вътрешен (в рамката) тракт от 6 шстидиноби кодона. локализирани 3’ на.ХЬо 1с който да позволи н рскомбинантния протеин да бъде пречистен с метал хелатна афинитета хроматография (Houchuli et al., Bur Techno!. 6:1321-1325, 1988).
: последователността, кодираща хистидиновия един ·-! Ζ _U и pSLmpl- 27 сс потвърждава с ДНК секвениране.
3'·' ници, продуциращ
4*.xlv.·.
MPL рецептор, е създаден чрез комбиниране на ДМКг сг.менти от nSLmpl- 9 за гена за резистентност нанеомицин). Eco R1 Ват Ш сДНК фрагментът юследоВатслност лстирана по време на конструиране на бактериалния ексаресионен
SLmpB 26. Ват HI фрагмента с дължина 416 Ьр от pSLmpl- 26 доставя диращата последователност за карбокси- терминалната част на азтворимия MPL рецептор, маркиращия киназата у астък. полахистидинобия тракт и транслиращия терминатор. Двата. фрагмент пречистват върху гел и сс клонират в Eco RI Ват Н1 сайтове на pBluescript Е KS ч- (Straiagene Cloning Systems) за получаване на плазмид pBS8. 76LD- 5. Правилно ориентиран Ват HI фрагмент. получен от pSLmpl- 26 и с размер 416 Ьр по отношение на получения от pSLmpl- Q Eco RL Ваш III фрагмент c дължина 1164 bp B pBS8. 76LD- се опреде.чрез PCR реакция с помощта на праймсршпе ZC 660? SEQ ID NO: 8) u. ZC 6703 (SEQ ID NO: 11). Сайта Xba I 6 рамките на поли- линкерната последователност от pBS8. 76LD- 5 позволява на реконструираната рецепторна ДНК да бъде изрязана като един Eco RI Xba 1 рраамент с дължина 1.5 кЬ заклониранс 8 p'HZ- 200 след разграждането на Вектора с Eco R1 и Xba 1. Полученият К резултат бозайнико^ експресионен плазмид. pLDmpi- 53. се изготвя в голямо количества за трансфекция 6 ВИК клетки.
Двадесет микрограмг от пречистения pLDmpi- 53 плазмид сс трансфектира в ВИК 570 Е\зтки с помощта на метода за преципитация с калциев фосфат. След 5 часа клетките се подлагат на шок с 15% глиисрсл за 3 минути за улесняване взиманет® на, ДНК. През цялата нощ се добавя прясна хранителна среда. Следващият ден клетките се подлагат на различни разреждания и се добавя селективна среда, съдържаща 1 цМ. метотрексат. След приблизително две седмици, се забелязват дискретни метотрексатрезистентни колонии. Резистентните колонии се събират и съхраняват като ясни клонове. Отработената танителна среда от събраните колонии незабавно се тестува зя присъствие на разтворим МРЕ рецепторен протеин.
Разтворим МРЕ рецепторен протеин се изолира по време на взаимодействието на поли- хистидиновия тракт. намиращ се в карбоксикрая на протеина с метал хелатна смола, съдържаща имобилизиран No' (IHSBfND : Navagen, Madison, FI;. Отработената, безсерумна културална среда от pLDmpi- 53 пула се прекарва Върху еВолата и свързаният протеин се елуира с 1М илшзазол. SDS- PAGE анализът показва единично свързване при -67 kDa. Този протеин е подложен на N- краен аминокисе.шнен анализ и потвърждава, че е мити МРЕ рецептор.
Разтворим миши MPL рецептор е пречистен от сбора на ВИК трансфсктанти. които са трансфектирани с разтворимия Тип 1 MPL рецептор, експрссиращ плазмида pLDmpl- 53. Пречистеният разтворим рецептор е имобилизиран върху CNBr- активиран SEPHAROSE ™ 4В (Pharmacia LKBBiotechnology. Inc.) матрикс. предимно както е посочено от производителя^ се използва за афинитетно пречистване на MPL активността в кондиционирана среда на 24- П- 5 клетки. Афинитетнияп
ХК16 ί Pharmacia LKB Biotechnology Inc. ;·.
матрикс е поставен в к
Кондиционираната i -1 tr— ft 7; I » · I ! Μ..»
Jiti Λ 5 клетките се концентрира върху 10 К меморана със язани m хи φυδρυ pL G Technology Corp.. Needham. M4) и се натоварва върху дъното на MPL рецепторна афинитетна. колона, при скорост I mL минута. Колоната се промива с разтвор на фосфатен буфер (PBS),съдържащ 0. 5 М ХаС! и 0,0!П натриев азид. MPL активността се елуира от колоната с ЗМ натриев тиоцианат (Sygma Chemical Company, Si Louis, МО) при скорост на потока. 0. 5 mi/ минута. Натриевият тиоиианап ду PBS. Активните фракции се идентифицира проба (описана в Пример VII).
отстранява чрез диализа орен чрез МТГ пролифераци
ТТ
1.Uзависими клетки, експресирашг стабилно трансфектиран Тип J миши MPL рецептор. Създадени са схема мутагенеза и за селекция на клетъчни линии, експресиращи MPI рецепторния · лиганд чрез млтагенеза на ВаЕЗ/ MPLRL ‘ клетки, и селекционирано за автокринен растеж в отсъствие на екзогенна. IL- 3.
Приблизително 1. 2 λ 10“ Bal‘3 MPLR1. 1 клетки се утаяват и се промиват с GM (RP.M1 1640 среда, заместена с 2- меркаптоетанол (1: 240 006 крайна концентрация). 2 т.М L- алутамин. 110 ug/ ml натриев пируват, 50 ug ml G 418 и 10%,инактиВиран на/г.орещо фетален телешки серум). Клетките се ресуспендират В 2 ml GM. съдържащ 0. 15% (ν·ν) от мутагена 2етилметансулфонат (EMSyu се инкубира за 2 часа при 37°С. След инкубация, клетките се промиват еднократно 6 PBS и еднократно в GM. и се посяват на 10 см панички при илътшюст^риблизшпелно 40 000 клетки ml в GM. заместена с 5G WEHI- 3 кондиционирана среда iBeclon Dickinson- Labware. Bedford, .ИУ като източник на. IL- 3. Преди подбора за. TL- 3- независим растеж, клетките се оставят за възстановяване с инкубационен нериос; седем дни при 37”С и 5% CO,. След периода на. възстановяване, културата сг сгъстява с жизнеспособни клетки. Клетките се промиват с GM и култивират в GM в отсъствие на WEHI- 3 кондиционирана среда. След единадесет дни от селекцията, се наблюдава малък брой жизнени клетки. Установено е. че плътността на жизнеспособните клетки в 1L- 3 независимата култура е 250 клетки ml. Един милилитър от. IL- 3 независимата култура се посява във всяка от 19-те ямки на 24ямковата културална паничка за по- нататъшно охарактеризирани.
AOiKj Ui.\U 01: ад ξ. -: iwi υ ί ί_·. Oil: . 'ii iu.!- ПО~ UClpC it!
независими
XiPLRl. 1 клетки се изпитва за пролиферативна активност върху БаГЗ
МР1..Р. кетки. Установено е. че кондиционираната среда от всички % И. 3 независими пула притежава активност в МТТ пролиферативна проба (описано в Пример \Ί1). Позитивната среда се изпитва отново за пролиферативна активност в присъствието на 2 ug/ mi плъиш анти- миши
IL- 4 или в присъствие на двете неутрализиращи антитела (Phanningen. San
Diego, СА) за идентифициране на IL- 3 растежно независими мутанти, експресиращи тези цитокини. (В предишен експеримент. е установено чс аГЗ клетки също отговарят на IL- 4 . Установено е. че само кондиционирана среда от клетки от паничка#!! (означени като “24- ц~ к\стки) притежават активност. която не се неутрализира cm IL- 3 или IL- 4 антитела.
Схемата за мутааенсзис и селекция, описани по- горе,се прилага спрямо пет други ВаГЗ MPLR1 клона ' ВаГЗ MPLRI клонове * 4. 9. 12 15 и 18. •означени като ВаГЗ MPLR1. 4. .9. .12. .15 и .18. съответно). За седемнадесет изолата с установено,че притежават кондиционирана среда. * която стимулира пролиферацията на ВаГЗ· MPLR1 клетките. Активността*· на всичките среди е установенолчс се неутрализира е анти- IL- 3 или IL- 4 антитела самостоятелно или в комбинация. Клоновете по- нататък но са '^характеризирани. «
Пролиферативната активност на кондиционираната среда от пула 24-* 11 е охарактеризирана подробно. Пулът 24-11 е подразделен на 19 субпула. и кондиционираната среда е тестувана отново за активност Всички деветнадесет субпула (т. е, 24-11-1 до 24-11- 19) стимулират пролиферация в И.- 3 растежно независими ВаГЗ MPLR1 клетки в отсъствие на екзогенна 1L- 3. .Активността не сс инхибира от IL- 3 или 1L- 4 неутрализиращи антитела ти от комбинация между тях.
За определяне специфичната 24- 11 активност са проведени два експеримента. Кондиционираната среда се изпитва за прели феративна активност под контрола на ВаГЗ клетки, които не експресират MPL рецептора. В отсъствие на екзогенна 1L- 3. пролиферация на контролни ВаГЗ клетки не се наблюдава в кондиционираната среда в който и да е от деветнадесетте 24- 11 субпула. Във вторият експеримент.
пролиферативната активност се изпшпВа по отношение на инхибиране с пречистен разтворим MPL рецептор. BaF3 MPLR1 клетки се култивират в GM среда, заместена с 50% 24-11 кондиционирана среда Към всяка проба се добавя Тип I миши разтворим МРкрцетпор до крайна концентрация от 0. 0. 0. 625,1. 25, 2. 5. 2, 5 или 5. 0 ug/ т·. Резултатите се получават четири дни покъсно с МТТ клетъчна пролифераиионна проба. Пролиферативната активност а 24 -11 кондиционирана. среда напълно е блокирана при 0. 625 до 1. 25 ugl ml разтворим MPL рецептор. Концентрациите на разтворим рецептор, които напълно инхибират актавносттаусямап! въздействие II.· 3 или IL- 4 стимулирането на BaF3 MPLR1 клетки. Резултатите показват. че разтворим MPL рецептор конкурира. за стшчг/латорната активност на 24 · 11 средата и е в съгласие с хшютезагпа.чс 24- 11 клетките експресират MPL рецепторния лиганд.
Клоновете, получени от 24-1 ΐ клетки^а изолирани чрез посяване при лимитиращи разреждания. Един к\?-. означен като 24-11-5 #3, показва високо ниво на пролиферативна активност в неговата кондиционирана среда, сродна на 24-11 пулп. Установено е. че пролиферативната активност е еднаква на 1: 2000 разреждане на кондиционирана среда от WEHI- 3 клетки \Becton Diekitis&n Labware).
нлТТ. 11- 5^ 3 сДНК библиотека
Тотална РНК се получава от -2. 7 х 1(Р 24-11 - 5# 3 клетки с помощта на гуанидин изотиоцианат. последвано от центрофугиране с C-sG {Chirgwin el al., ibid.). Поли (АД е изолиран с помощта на кит за изолиране
OLIGOTEX- dT- mPHK (Qiagen Inc., Chatsworth. СА). следвайки инструкциите на производителя.
Първата верига на сДНК от 24-11- 5*3 клетките се синтезира в четири отделни успоредни реакции. Всяка реакция съдържа 7 Е от поли d'T) селекционирана по.лщ А)‘ 24 -11- 5#3 РНК при концентрация от 1. 6 ug/ μ] и 2.
от 20 pmole.·' Е праймер за първата верига ZC6 съдържащ един Xho I рестрикционен сайт. Сместа се нагрява при 65°С за 4
БУФЕР: GIBCO BRL). 4 ui от 100 мМ дитиотреитол и а Е разтвор на.
uc30avuhvилеотид трифосфаш.. од оржсаи по 1G πιΝι от всеки UAi Р. 1Р.
i ТТР и 5 - метил- dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) в РНК праймерната смес. Реакционната смес се инкубира пг последвано от добавяне на 10 Е от 200 U Е рибонгклеазна Н обрати >
ί.
транскрибтаза (G1BCO BRL). Ефективността на синтезата на първата
Зерига се анализира в паралелна реакция чрез добавяне на 10 uCi от Р xdC ГР към 10 и! оавни части от една от реакционните смеси за маокигчше реакцията за анализ. Реакциите се инкубират при 45°С за един час. последвано от инкубация при 50°С за 15 минути Включената в маркираната реакция ί:Ρ юСТР се отстрстява чрез хроматографиране върху гел филтрационна колона с размер на порите 400 (ClontechLaboratories. Немаркираните реакции се събират и включените нуклеотиди се отстраняват чрез двук n rv
Ц/ии
ПИО преципитиране на сДНК в присъствие на. 32 цу гликогеноВ носител. 2. π М амониев ацетат и 2. 5 обема етанол. Немаркирапатз сДНК се ресуспендира в бе.лязаната първа Верига сДНК се определя чрез електрофореза на агарозсн гол.
Синтезата на Втората Верига на сДНК се осъществява върху първата верига на сДНК при условия. подпомагащи инициирането синтеза на втората верига върху първата, което води до формирането на фуркети ата ®орма ДНК. Провеждат се три отделни успоредни реакции на синтез на втората верига на ДНК. Всяка реакция за синтез на втората верига съдържа j от немгфкираната първа верига на сДНК. 16. 5 Д вода. 2С Д 5 х полимер аза I буфер (100 тМ Tris: Hcl. pH 7. 4.500 тМ KG. 25 тМ MgC!.. . 50 fhM ;лД ). SO,. 1 Д разтвор, съдържащ 10 пП от всекидезоксинуклеотид тгифосфат. 3 Д от 5 тМ £- XAD. 1 Д 3 U Д Е. coll ДНК лигаза (Aw England Biolabs Inc. λ Реакцията сс провежда на стайна температура и се ..-побира на стайна температура в продължение на 5 минути. последвано от избавяне на 1. 5 Д от 2 U Д РНаза Н (GIBCO ERL). Ашквотна проба от 10 Д пгп една от реакциите за. синтез на втората верига се маркира чрез добавяне на 10 uCi 7 Р- odCTP за наблюаване ефективността на синтеза» Реакциите се инкубират при 15°С в продължение на два часа, последвано огп и.чкуСшране в продължение на 15 мин на стайна температура Невключеният -р- -izdCTP в реакцията се отстраняВа посредством хроматографиране на сел Филтрационна колона е размер на порите 40G (Cioniech Laboratories s преди анализа с агарозна гел електрофореза. Немаркираните реакции се събират и се екстрахират е фенол/ хлороформ и хлороформ, последвано от ппеиипитация с етанол в присъствие на 2. 5 М амониев аиетапъ
Едноверижната ДНК от фуркетната форма се разгражда с помощта на нуклеаза от Phaseoius aureus. Реакционната смес съдържа 100 Д от втората верига на сДНК. 20 Д от 10 х нуклеазен буфер iStratagene Cloning
Systems), 16 Д 100 mM gumuompe
Д вода, 10 Д разреждащ нуклеазата буфер (Stratagene Cloning Systems) и б Д от 50 U/ Д нуклеаза (Promega Corp. ).
Реакцията се инкубира при 37®С за 30 минути. Реакцията се прекъсва с добавяне ца 20 Д от IM Tris: Н^
НС. pH 8. С последвано от редуващи се екстракции с фенол Х\ид;ОФОц-:?Л ι* ХЛО роформ както е описано по- горе.
Ч.··* ivv4 екстракциите , се xiumupa с етанол a vC DCCvCiiCiiQiipd. So бода.
Ресуспендираиата сДНК се формира така, че да завърши сляпо с Т4 и 5 х Гч ДНК полимеразен оуфср (—А тМ Ins : I-Ici. ρΐΐ 8. 0. 2о0 шХ1 KCi всеки дезоксинуклеотио трифосФ ν - ►' чу «. Т .
и 5 Д от 1 С Д Т4 ДНК полимераза 'Mt' (Boehrinser Mannheim Con?.). Слее инкубиране за 30 минути при 15° С, реакцията се прекъсва с добавян серия Фенол/ хлороформ и хлороформ екстракции , kakmo е описано по- го$Ь.
IHK се xDOMamoanadaoa на гел ο
*. X Λ <1 трационна колона с размер на порите 4СХ?
iClontecff Laboratories Inc Л за отстраняване на следите от протеин и зз отстпаняВане на късите сДНКи
ПЛ.
преиипитира с етанол в присъсг ug ашкогенов носител и 2. 5 М амониев ацетат и се ресуса adCTP. добивана с; 1ΉΚ се установява mPHK.
части от сДНК <~5 ug) и 21 Д о~ Q pmole Д Eco R!
LKB Biotechnology Inc.) вя с 4 Д.10 х лигазен буфер (Promega Corp. ), 3 Д om 10 mM ATP u 3 U 15 U ul T4 ДНК лигаза (Promega Corp. ). Реакцията се инкубира една нощ 48 часа) при 9° С. Реакцията се прекъсва чрез добавяне на 140 и! вода, 20 μΐ от 10 х Н буфер (BoehringerMannheim Corp.) и се инкубира при 65° в продължение на 4и минути След инкубация. сДНК се екстрттра е фенол .'хлороформ их-лороформ^както е описано по- горе и преипитира в присъствие на 2. 5 М амониев ацетат и 1. 2 обема изопропанол. След центрофугиране, утайката от сДНК се промива със 70% етанол. изсушава се на въздуха. и ресуспендира 3 89 Д вода.
За улесняване насоченото к.\?ниране на сДНК в ексресионсн вектор. сДНК сс разгражда с Xho I. което води до сДНК с 5' Eco RI леплив край ц 3' Aho 1 леплив, край. Xho 1 рестрикционният сайт В 3'края на сДНК е предварително въведен с помощта на праймера ZC6172 (SEQ ID NO : 14'^ разграждането с рсстрикиионни ензими се провежда в реакционна смес, съдържаща 89 и! от сДНК. описана по- горе. 10 μΐ от 10 х Н буфер (Promega Corp.} и 1. 5 tX 40 U ul Xho I { Promega Mannheim Corp/). Разграждането се осъщестВява при 3NC ·,,. л -шс. Реакцията се прекратява със серия екстракции' с фенол \..у:;:форм и хлороформ на гел филтрационна колон;, ·, размер на порите 400 (Ckmrvch Laboratories Inc.).
сДНК преципитира с етанол. промива се със 70% етанол. изсушава, се на въздуха и се ресуспендиоа в 20 и! от 1х гел натоварващ буфер (10 т.М Та> НС1. pH 8. 0. 1 тМ. EDTA 5% ашцерол и 0. 125 % броменол блу). Ресуспендираната сДНК се нагрява до 65 °C за 5 минути, охлажда се върху леи и се порлагат на електрофореза върху 0. 8% нискотопим агарозен гел iSE4 PL-t OUE GTG нпскотопача агароза; FMC Corp.). Контаминиращите адаптери и сДНК с 0 5 Кс дължина се изрязват от гела. Електродите се обръщат, и сДНК се подлага на електрофореза до концентрация * доближаваща се до източника. Областта от гола, съдържаща концентрираната сДНК се изрязва и се поставя 0 микрофужна епруветка, и се определя приблизителният обем на гелният срез. Към епруветката се добавя вода, която превишава приблизително трикратно обема на гелния срез (300 ul). и агарозата се стопява чрез нагряване до 65°С за 15 минути. След уравновесяване на пробата на 45°С. се добавят 5 μΐ от 11 μί р- агарсза I (New England Biolabs. Inc.), и сместа се инкубира за 90 минути на 45°C за разграждане на агарозата След инкубация. към пробата се добавят 40 Д от 3 М натриев ацетат. и сместа се инаубира върху лед за 15 минути. Пробата се центрофугира на 14. 000 х g за 15 минути на стайна темераптсра ии отстраняване на неразградената агароза. последвано от хроматографирщ-fe на гел филтрационна колона с размер на порите 400 (СютесЬ Laboratories). “ сДНК се преципитира с етанол. промива се със 70% етанол. изсушава се па “ въздуха и се ресуспендира В 70 Д вода за протичане на киназната реакция с оглед фосфорилиране на свързаните Eco RI адаптери. А
Към 70 id разтвор на сДНК се добавя 10 ui 10 х лигазен буфер iStratagcne Clauaig Systems). и сместа, се нагрява до 6547. за 5 минути. Сместа сс охлажда въпху лед и се добавят .16 Д 10 тМ АТР ц 4 Д от 10 L Д Т4 полинуклсотид киназа ( Stralagene Cloning Systems). Реакционната смес се инкубира при 374?. за 1 час и се прекъсва чрез нагряване до 65°C за 10 минути, последвано от сепия екстракции с фенол.· хлороформ и хлороформ, фосфорилираната сДНК се преципитира е етанол 6 присъствие на 2. 5 М амониев ацетат. шюмива се със етанол. изсушава се на въздуха и се ресуспендипа в 10 Д вода УстаноВяВа. се. че концентрацията на фосфорилиранатп сДНК е fmoie/ιφ
Експресионнияш вектор DX ( описан в Lr. S. Patent No. 4. 959. 318) (Figure) сс модифицира така, че да приеме 24-11- 5# 3 сДНК, която е била синтезирана с Есо RI - Xho 1 краища. Един ендогенен Sai 1 сайт в pDX се отстранява чрез разграждане на плазмида с Sal 1 и ре-циклизиране на плазмида след като Sai I лепливите краища бъдат направени тъпи с Т4 ДНК полимераза. Рециклизираният плазмид се разгражда с Есо R1 и към нсас с? прикрепя къса псйилинкерна последователност. състояща се от два комплементарни олигонуклеотида. ZC6936 (SEQ ID NO: 15)uZC6937 (SEQ ID NO : 16). за. получаване на плазмида pDX.ES. Включената поли.линкгрна последователност в pDX. ES съдържа Есо RI и Sal I сайтове за улесняване . насоченото клониране на 24-11-5 сДНК. синтезирана с Ес RI - Xho I кршсш.
Плазмидна сДНК библиотека се изготвя чрез свързване на Есо R1 Xho I 24-11-5 сДНК в разграден с Есо RI/ Sal I плазмид pDX. ES. Сместа т свързване се електропорира в Е. coll i Electromax компетентни клетки: GIBCO BRL. Gaithersburg. MD) c помощта на генен импулс импулсен контролер и 0. 2 см кювета {Bio- Rad Laboratories, Hercules, CAl при C. 2 KV. 400 ohm u 25 uFAD. Клетките се разреждат до 1. 5 nil в бульон на Luria и се тжибират на 37°С за 45 минути. последвано от добавяне на 0. 75 nd 507 глицерол. Трансфектираните клетки се съхраняват при - 70°С до употребата им. Осемнадесет Imoles сДНК дават повече от 700 000 независими рекомбинантни плазмида.
активност иДНК библиотеката 24 -11- 5# 3 се посява върху приблизително две хиляди 10 см в диаметър агарни пластинки с бульон на Luria, към който са добавени 100 ,ug/ ml ампицилин. Плътността на посяване е между 200 и 250 бактериални колонии за пластинка, Плазмидната ДНК за трансфекция в хстинка с помощта н:
юла за пречистване на ДНК MAGIC MINIPREPS'*' (Promega Corp.), съгласно инструкциите на производителя. Плазмидната ДНК се съхранява при -20° С до трансфектиране в ВНК 570 клетки.
Плазмидните пулове от 24-11- 5#3 сДНК. Всеки съдържащ приблизително 200 qo 250. сДНК клона, се птпяпгАек-пт.
f*tь too ri ή н ’тиг γύ ъгЪ’- i 11J./ Йл 1V ч '’*' iVS i помощта на 3:1 лшюзомни форми на 2.3- диолеилокси X- [2 (сперминекарбоксиамидо) етил] - X, X- диметил-1 ропанамишумтрифлуороацетат U С1^ОЛСил11фОСч)&Ги uQ ϊ във пода (WOFECTAMLNE ’м: GIBCO BRL). Към 20 ul разреден 1:10 разтвор на’
1POFESTAMINETV се добавят двадесет iu.
на стайна температура за 30 минути. След инкубацията. се добавят 66 Д свободна на серум среда (Hams F12: Dulbeccos MEM I: I),заместена c 2 mM’ to·
L- глттамши 0. j: mg пи натриев nupvBam. 5 ug.· пъ фстлтн. s0 ug; ms прансферин. 2 ng. ml селениум IV оксид и 25 mM HEPES буфер) към ДНК;
.iPOFbSTAMINE7* смес и се прехвърлят към 24 - ямкова микротитърн.
пластинка, съдържаща ~ 100 000 ВНК 570 клетки. Клетките се инкубирлт на
371:С в 5% СО- за4 часа, след което се добавят ДОС Е от ВНК растежна •еда (модифицирана Eagles среда от Dulbecco. заместена с 2 тМ L/· сутамин, 0. 11 mg/ ml натриев nupvBam. 5G инактивиран фетален телешки •epv.M и 100х PSN антибиотици (GIBCO BRL0)). Клет лте се uukvoupam в одължение на 16 часа. Средата се отстранява и се замества с 0. 5 ml ппясна
ВНК растежна среда, която се кондициониоа за 48 часа преди изпитването й за МРЕ активност.
Изпитването за клетъчна пролиферация се използва за установяване присъствието на MPL активност в кондиционирана среда на библиотечни трансфектирани ВНК 570 клетки. Една хилядна и! от 10® /mi от промити с ВаЕЗ·· MPLR1. 1 клетки в RPMI 1640 среда {JRR Bioscience Inc., Lenexa. KS) заместена c 2 тМ I.- амтпамин. PSX антибиотици iGIBCO B.RL). 0. OOCGoG. 2- меркаптоетанол u 10% инактивиран на/горещо фетален телешки серум. Изпитваните клетки се инкубират в продължение на 3 дни на 37°С в 5% въглероден двуокикцпреди изпитването им за пролиферация.
Клетъчната пролиферация в присъствие на МРЕ се определя количествено с помощта на колориметрачна проба на базата на метаболизма на 3- (4. 5- димешилтиазол-· 2 - ил)- 2.5- дифенил тетразолиум бромид (ММТ) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55- 63. 1983}. Двадесет d 10 mg. ml пазтвор на MMT ( Polyscience, Inc.. Warriiigion, PA ] се добавяш към 100 al ВаРЗ/ MPLR1. 1 изпитвани клетки, и сс инкубират ни 37®С. След 4 часа се добавят 200 и! 0. 04 N ИС1 Б изопропанол. разтворът се смесва и абсорбцията на пробата ее прочита на 570 шп на четящо устройство, модел ELISA EL320 (Bio- Тек Instruments Inc., Highland Park, IT).
Един плазмид ен пул. за който е установенсуче е позитивен, и който е означен като Т1081. се трансфектира в ВНК 570 клетки. Супернатантата от трансфектантите дава позитивен сигнал в МТТ пролиферативната проба. PCR и антитяло неутрализиращите експерименти показват, че активността не се дължи на IL- 3 или 1L- 4.
Плазмидите от позитивния пул се използват за трансформация па Е. coil DH10B. а клетките се посяват ( t- licurli зчаи < около 15- 20 колонии H2L поничка. 10 понички с приблизитс.хно 90 лОЛОНЯи на иЯничка и t> понички е около 250 колонии на поничка). Правят се репликата от всяка поничка и се съхраняват на 4°С. Колониите върху оригиналните панички се събират и се оставят да прорастат в течна среда за още няколко часа, след което се изготвя ДНК.
Плазмидната ДНК от субпуловете се трансфектира в ВНК 570 клетки, и клетъчните елтернатанти се събират и изпитват,както е описанс един cvcLnvx (#22) се установява че ' * ” 7 е позитивен чрез микроскспско и
У Останалите степ срещу контролните Bal· ’3 клетки и се установява. че нямат активност. В допълнение се установява.
че активността от трите позитиви уб^тула ;
инхибира от разтворимия
I MPL рецептор.
)т трите позитивни суби-жла се оставян прорастат за няколко часа, след то т! култури. Културите се развиват дефектира в ВНК 570 клетки и за активност. След един час повява, че клонът (означен като T1OS1
4.
Г ξ 1ГЧ г <.· U1 11
570 клетки. За всички 12 трансфектанти по-късно чрез изпитване се
ДНК от еднгют дванадесете позитивни колонии се трансформира г\ -« _otu
Parklawn Drive. Rockville. MD nog номер 69566.
Определена е нуклеотидната последователност на сДНК. кодираща хематопоетичния протеин · трембепоетин) 'SEQ ID NO: 1). Анализът на кодираната аминожисслинна последователност (SEQ ID NO: 2) показва, че амино края на зрелия протеин е г.пи аминокиселинен остатък 45. Два мстионинови кодона. при позиции 1Q5 и 174 на SEO ID NO: 1. се явяват иницииращи кодонщ като големият сайт на инициация се очаква да бъде при позиция 174.
•Т
-ична.сттионс гкп·.
О£ЕШЙ
От бедрената и подбедрена кости на женски CD-1 мишки в слсдродово състояние се събира костен мозък 6 25 ml CATCH буфер (99 mg теофилин. 0. 75 g натриев цитрат. 75 nig адгмозин. 20 ml 10л балансиран по Hank физиологичен разтвор, свободен на Са~: и Mg А за 200 ml в dH О; pH 7. 4). Клетките се суспендират в отсе.лна клетъчна суспенсия чрез пипетиране е 25 ml пипета. Обемггсе довеждг до 50 ml е САТН буфер, и клетките се събират при 1000 грт за 7 минута Утайката се ресуспендира в 25 ml CATCH буфер и се инкубират в Т75 тъкачно к}*лтурални колби за първия етап от прикрепяне към пластмаса при 3‘за 2 часа. Не-трикрепените клетки се събират чрез центрофугиране тт 1и00 грт за 7 минути като утаени клетки. Утайката се ресуспендира в 15 mi алфа- МЕМ ч- 109г FBS (ч-L- алутамин. Na пируват, и PSN антибиотици) и се инкубират в Т75 колби за втори етап на прикрепяне към пласпъмасцкактг е описано по- горе. След последното центрофугиране и ресуспендшране. клетките се преброяват. Половин милилитър клетки при 576 000 клетки / ml се посяват върху 24- ямкови тъкаино- кълтурални блюда у заедно с експериментална среда за контролни
ВНК клетки или с кондиционирана среда от ВНК клетки, трансфектирани с pZCmpI-1081. След тридневно инкубиране на 3?°С. клетките се събират и оцветяват както е описано по- рано.
Една сто и петдесета част μΐ от клетките се събират от контролната ямка, третирана със стандартна кондиционирана среда. 50 и! от клетките се събират от *ямка, третирана с кондиционирана среда от ВНК клетки, трансфектирани с pZGmpl-1081. Пробите се центрофугират и се изготвят стандартни микроскопски срезове.
Срезовете се фиксират с 100G метанол, след това се заливат с 1:1 Wright’s (0. 5 g Рингеров (Wringht) оцветител В 300 ml метанол/ вода за 6 минути, промиват се с вода и се изсушават. Срезовете след това се за лив ат с багрило на Гимза (Sigma Chemical Corp.) в буфер на Соренсен (2. 28 g-KH, РО,
2. 3S g NaPO, в 250 ml вода), промиват се с вода и се изсушават.
След доВсждане до необходимия обем. ВНК pZGmpI-1081 пробата от средата съдържа 120 мегакариоиити за 150 и! обем 3 сравнение с 9
Ί. Срезовете след то мегакариоцити за 150 и! обем от контролната среда. В допълнение, с ; микроскопско наблюдение е установено, че мегакариоиитите от третираната експериментална проба са значително по- големи по размер от контролните клетки и значително по- добре оцветяват полиядреното съдържимо.
Кондиционираната среда от мутантната ВаГЗ MPLR1. I линия 24-115# 3 се събира в отсъствие на серум и се концентрира двадесеткрапшоЪъоху 10 kd филтрационна мембрана Amicon Тпс. (Beveriy. МА). Събира се мозък от миши бедрени кости и се суспендира в модифицирана Iscove среда ст
Dulhecco (GIBCO BRL) + 15% фетален телешки серум (РСБ).След суспендиране ядрените клетки се преброяват и се посяват при 75 000 клетки/ ml c 0. 9 ml/ на паничка 6 среда, доведена до съдържание на 50% метилцелулоза, 15% FCS, 10% BSAu 0. 6% PSN (полу- твърда среда) в 1 ml тъканна култура. Добавят се различни кондиционирани среди и контролни проби до получаване на общ обем от 1 ml. Блюдата се инкубират при 37°С 5% въглероден двуокис за 6 дни и след това се изпитват микроскопски за наличие на гранулоцитно/ макрофагни (GM) колонии. Наблюдава се. че блюдата , инкубирани в присъствието на 24-11- 5 # 3 кондиционирана среда притежават слаба подобна на GMCSF активност. продуцирайки 25 изброен!
колонии, в сравнение с изброените ла. на брои при негативните контролни
130 на брой за блюдата , стимулирани с позитивна контрола
PWMSCM). изготвени чрез инкубиране на миши спленоцити за една, седмш в присъствието на митогена Ph\
Mannheim, IndianopoUs, IN) + 2 единици m! еритропоетин).
Събира се костен мозък от. миши бедрени кости и се суспендират
Ά.
FSC и ядрените клетки се събират и посяват в полу-ппвърда среда^както е описано по- горе. Клетките се използват за тестуване на мегакариоцитна колония, формираща активността на протеин, кодиран от pZGmpl-1081 инсерта.
Кондиционираната среда се тестува самостоятелно и в комбинация кондиционирана среда, на която е въздействало с митогена Phvtolacc.
americana. рекомбинанти мишиТк- 3. IL- 6 (Genzyme Corp.. Cambridge, МА).
IL-11 {Genzyme Corp.) или комбинация от тези фактори. PWMSCM се
използва като позитивна контрола. Н&^кондиционираната културална среда се използва като негативна конптоола.
X
Добавят се експериментални или контролни проби към костномозъчни култури до получаване на общ обем от 1 ml. Блюдата се инкубират в продължение на шест дни при 37°С в 5% въглероден двуокис, след което се изследват микроскопски за изброяване на мегакариоцитните колонии.
Резултатите са показа;
Сумарно. ВНК pZGmpI-1081 кондиционираната среда проявява мегакариоцитна колонийх-формиращг активност, която се повишава в присъствие на ранно действащи фактори при
Мегакариоцити
Колонни гЗезаплнЛро 1-ηυτπτ·«··»Λ'ΛП
PWMSCM7
ВНК/ pZGmpl-10812
ВНК pZGmpI-1081 4- PWMSCM15
IL- 31
IL- 3 - ВИК pZGmnb 1081S
IL- 60
IL-6 + ВНК/oZGmni -10816 tX
IL- 311
IL- 11 + BHK pZGmpl-10816
IL- 3 4- 1L- 62
IL- 3 + IL - 6 4- BI LK pZGmpl -1081
IL- 3 + IL-11
IL- 3 + IL-11 + ВНЮ pZGmpl-1081
In vivo активността на ВНК pZGmpl -1081 кондиционирана среда с изпитва в мишка. Свободна на серум среда се събира и концентрира петкратно с помощта на 10 Kd филтрационна мембрана (Amicon . In подобен начин. Шест BALB с мишки (Simonsen Laboratories. Inc.. Ο:
0. 5 ml от контралната, както и от кондиционираната сре
Кръвни е събират в дните 0. 3. и 7 и посятото съдържимо се изброяв от ВНК pZGmpl -1081 клетки е с тромбопоетинова активност
Изброени 110';
.Трглшране Q Лен 3 Т .
Контрола 141 141 s'7
Контрол? 159 149 ί
ВНК/ pZGmpl - 157 160 563
JJo 1 ВНК - pZGmpl- IOS 1 169 154 чач
BHK ; pZGmpl- 139 136 492
1081
BHKL pZGmpllC'81
135
1S7
554
ПрцмерДХ..Диолир1ше_на.човешки тромбопоетшюб ген
Човешка амплифицирана сливична Ламбда. FIX® геномна библиотека (Straiagene Cloning Systems) се екранира за ген. кодиращ човешки тромбопоетин с помощта на миша тр! рецепторна лигандна сДНК като проба.Библиотеката се титрува и 30 150- тт панички, инокулирани с клетки на Е. coli, щам LE- 392 {Stratagene Cloning Systems) се инфектират с 4 х г 10 формиращи плаки единици (PFU). Паничките се инкубират за една нощ ‘ при 37°С. HYBON- N “ (Amercham) мембрани се използват за направа на филтърните плаки с посевки съгласно инструкциите на производителя, филтрите се обработват чрез денатурация в разтвор, съдържащ 1 5 М NaCl и 0. 5 М NaOH за 7 минути на стайна температура, филтрите се оцветяват бързо върху филтърна хартия за отстраняване на излишъка от денатуриран разтвор, последвано от неутрализация в продължение на 5 минути в IM Tris - НС1 (pH 7. 5) и 1. 5 М NaCL фагова ДНК се фиксира върхх филтрите с 1 200 <Joules с UV енергия В STRATALINKER® UV (Stratagene Cloning Systems}. След Фиксирането, филтрите се промиват отново трикратно в С. 25 х SSC. 0. 25% SDS и 1 тМ EDTA при 65°С. След промиването. филтрите се прехибридизират в хибридизационен разтвор (5х SSC, 5х разтвор на Denhardt. 0. 2% SDS и 1 тМ EDTA), който се филтрува през 0. 45 иМ филтър. Непосредствено преди употреба, се добавя топлинно денатурирана спермална ДНК от пъстърва (крайна концентрация 100 ug, mL). филтрите се прехибридизират при 65°С за една нощ.
Миша ТРО сДНК в пълна дължина от pZGmpl-1081 се маркира е ; I помощта на MEGAPRIMETW ДНК маркираща система (Amercham) по метод.
препоръчан от производителя. Прехибридшационният разтВор се преместв заедно с пресен хибридизационен разтвор, съдържащ приблизително 1 х
IO’’ срт от пробата и се оставя да се хибридизира за една нощ при 65°С. След хибпидизипане. хибридизационният разтвор се отстранява и филтрите се м SDS и 1 тМ EDTA. След промиването, филтрите се промиват в осе\
L1L> CL* . при 50°С в разтвор за промиване. След последното промиване.
М.' i_i._ X »./ »*-хА xV А» ч : подлагат на авторадиографиране (X4i? - 5; Eastman Kodak Co.;
Rochester. AT ) за четири дни при - 70°С с интензифицирано изследване.
Изследването на авторадиографиранията показва няколко стотин частъка. които се хибридизират с маркираната проба. Всяка агарна пластинка се намокря за една нощ 3 1 mi SM. съдържащ ι% (ъл) хлороФорл·.
iManiatis et al.. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor.
NY. 19821. След инкубиране за една нощ, фазите от всяка плака се разреждат
Равни части от 5 и! се посяват върху клетки на. щам Е. coii
LE392. след което се инкубират при 37°С и се изготвят филтърните посявки.
прехибридизират се. хибридизират се, промиват се и се авторадио^афират както е описано по- горе.
Получените резултати показват силни позитивни сигнали от два първични ичолата. и слаби сигнали от 18 други. Агарните пластинки се Взимат от позитивните участъци за всеки от двадесетте сигнала. Агарните плаки се третират както е описано по- горе. Елуатите от всяка
S4 агарна пластинка се разреждат 1:100 6 SM. и раВни части от 1 и! се посяват с клетки на щам Е. coli LE392. Паничкшпе се инкубират и фазовите филтърни посяВки се изготвят и хибридизират както е описано по- горе, филтрите се промиват при 55°С В буфер за промиване. Резултатите от авторадиографирането показват участъци на хибриди на единични. дискретни фагови плаки от три оригинални изолата. 8- 3- 2, ΙΟΙ- 1 и 29- 2-1.
Ha фагоВите изолати 8- 3- 2.10-1-1 и 29 /.ZGmpl- H8, XZGnipI- H10 u /ZGmp’t- H29, съответно
Л''
ТТ ТГТ < *— ηπ·» тл*ОТП!ГП*^ .V* ал · Uhl Ж<-и1 liUj 1 i s.
L.AMBDASORB™ фазов адсорбент (Promega Corp., Madison. WT) съгласно ·# ч инструкциите на производителя. Човешки геномни _ιΗΚ инсерти от фаза. ( разделят от фагова векторна ДНК чрез разграждане с Xba 1 и преч истеане агарозна гел електрофореза. Всичките три фагови изолата съдържат последователности, които се хибридизират към миша тр! рецепторна лиганда сДНК проба,както е показано чрез Southern biot анализ (Maniatis er al.. ibid). фагът XZGmpI- H8 се анализира и се установява, че хибрид изпращите сс участъци на XZGnipi- Н8 остават на триХба / ДНК фрагмента с дължина
9. 5 kb. 2. 5 kb и 1 kb. фрагментът с дължина. 2. 5 kb се подлага на сгбклониране в Xba I. разграден с BLUESCRIBT · Il SK-r фаг (Stralagene
Cloning Systems), за получаване на плазмида pXZGmpl- HS2. 5.
Последователността на човешкия ТРО ген и кодираната аминокиселинна последователност са показани на SEO 1D ХО: 28 и SEQ ID ХО: 29.
Пример X. Изолиране на човешка тромбопоешинова сДНК в пълна дължина
Човешка ТРО, кодираща сДНК с пълна дължина се изолира с помощта на полимеразна верижна реакция от човешки чернодробни и бъбречни сДНК матрици чрез специфични праймери. получени от екзонова последовател: идентифицирана върху pZGmpI· Н82. 5 и от съхранена 5 ’ нетранслирана последователност на мишата ТРО сДНК
Селекционирани поли d(T) поли (А)+ РНКи от човешки бъбрек, черен дроб и сливици (Ctorttecli, Palo Alto, СА) се използват за синтез на първата верига сДНК. Всяка реакция се изготвя с помощта на 4 микрограма поли за пет минути и се охлажда върху лед. сДНК синтезата се инициира чрез дитиотреитол, 2 μι дезокситрифоефатен разтвор, съдържащ 10 шМ от всеки dAir. dGir, dl ГР a cl i r [Pharmacia LKB Biotechnology Inc.. Piscatawa
ЛТ), 2 μι 1 иС1/ ui '~Р - a- dCTP (Atnercham, Arlington Heights, IL) u S μ праймерните смеси Реакцията се инкубира при 45' С за 1 час и се разрежда д<
и! с ТЕ ( 10 mM Tris: Hci. pH λ C. I mM ΕΠΤΑ). сДНК се преципитир;
двукратно с добавяне на 50 ui 8 М амониев ацетат и 160 ui изопропанол.
Получените в резултат утаик».
ресуспендират В 10 и! ТЕ. Добива на първата верига сДНК от всяка реакция се изпитва за нивата на включените
Р -dCTP.
сДНК от първата верига от чернодробна, бъбречна и сливична тРНК се използва за генериране на два сДНК сегмента, един N- краен, възлизащ на една mpema u C- краен, възлизащ на две mpemu от последователността, с помощта на отделни полимеразни верижни реакции. В сДНК сегментите се въвежда един Κρη I рестрикционен сайт чрез изменение на една отделна база от геномната последователност чрез PCR мутагенеза с помощта на. праймсри ZC7422 (SEQ ID NO: 20) и ZC7423 {SEQ ID NO: 21).
Полученото в резултат нуклеотидно изменение създаВа един общ Крп! рестрикционен сайт без редуване на предсказаните кодиращи аминокиселини.
N- крайният сегмент се амплифицира в 50 Д реакция, съдържаща 5 ng матрична сДНК ( в отделни реакции за сДНКи от бъбреци, черен дроб и сливици), 80 pmoles от всеки олигонуклеотид ZC7424 (SEQ ID NO: 22) и ZC7422 (SEQ ID NO : 20), 5 Д от 2. 5 mN·! разтвор на дезоксинуклеотид трифосфат {Cetus Corp., Emervilie, СА}, 5 Д 10х PCR буфер (Promega Corp., Madison, WI) и 2. 5 единици Tag полимер полимеразната верижна реакция протича минута при 58°С и 1 минута при 72 °С>. последвано от инкубация в продължение на 7 минути при 72СС. Чсвствитишият праймер ZC7424
'.1
-id к Boehringer Mannheim).
ишича 5 35 цикъла (1 минута при 94°C.
Ί\υ
ID NO: 22) покрива мишия mpl рецепторен лиганд 5' нетранслиран участък и включва ATG иницииращият кодон. Антисенс праймерът ZC7422 ( SEQ ID NO: 20) включва последователност от участъка. кореспондиращ на екзоните 4 и 5 от човешката геномна ТРО ДНК.
C- крайният сегмент се амплифицира в 50 Д реакция, съдържаща 5 ng матрична сДНК (от човешки бъбреци. черен дроб и сливици, какп JO ν по- горе), 80 pmole от всеки от олигонуклеогпидите ZC7423 (SEQ ID NO: 21) и ZC7421 (SEQ ID NO: 23). 5 Д от 2.5 тМ разтвор на дезоксинуклеотид трифосфат (Cetus Corp.). 5 Д 10х PC-R буфер (Promega
Corp.) и 2. 5 единици Tag полимераза ( Boehringer Mannheim). Полимсразнаша верижна реакция протича в 35 цикъла (1 минута при 94°С, 1 минута при 65°С и 1. 5 минути при 72°С) последвано от инкгбиране в продължение на 7 минути при72°С. Сенс праймерът ZC7423 (SEQ ID N0 : 21) включва последователност от участъци, съответстващи на екзоните 4 и 5 от човешки геном от DPO ДНК. Антисенс праймерът ZC7421 (SEQ ID
ХО: 23) включва последователност от участъка, съответстващ на 3’ последователност от човешкия ген и съдържа кодон за крайна транслация.
Амплифицираните PCR продукти се анализират чрез директно ДНК секвениране и се субклонират в pGtM- Т iPremcga Corp.) за по- на TIlclIlI i> ШС11 спрямо човешки геномни последователности. ДНК последователност, кодипаща човешка ТРО е показана на SEQ ID ХО: 19. Секвенционвият анализ показва че сигнално пептидно разгаждане се появява при аминокиселини 22 (SEQ ID
19) и зрелият протеин започва при аминокиселина 22 (SEQ ID ХО :
pGEMι- Т като Eco RI- Крп! фрагмента и се присъединяват в Eco RI сайта на експресионния вектор
570 клетки с помощта на Lipofecmmne’'' (GIBCO BRL). 24 часа след трансфекцията, културалната среда DMEM + PSN -н 10% FCS) се за мества със свежа, сред а, и клетките се инкубират за 48 часа 8 отсъствие ι:
селективни средства. Кондиционираната среда СС 113Ω tin ιΓ· cl ЗП ПрС злиферативна по- горе. Резултатите ясно показват. че човешките ТРО в културалшипа среда стимулират пролифсрацията на BAF3 клетки, експресиращи мишият MPL рецептор.
сДНК се изготвя от чернодробна и от бъбречна тРНК. (получена от Clontech Laboratories, Inc. ) с помощта на SUPERSCRIPT ™ обратна транскрибтаза (GIBCO BRL) съобразно инструкциите на производителя. Получените от черен дроб и бъбреци човешки ТРО ~. IK клонове след това се изготвят чрез две PCR реакции (условия, показани на Таблица б).
Реакциите протичат в 35 цикъла при 94 °C за 1 минута, 58 °C за 1 минута ι — '4..· ·><Λ л.·
Г>
j г \/V.. w KJ KJlli. ι минутна инкубация при 72 °C.
·*· ng чернодробна или бъбречна сДНК
Λ» μΐ 10х Tag буфер (Boehringer Mannheim) ul Tag полимера за (Boehringer Mannheim)
и! олигонуклеотид ZC7423 (2С рМ μ!) (SEQ
ID NO:
20:
ος.
w fell dNTPs разтвор, съдържащ 2.3 тМ dGTP, л1Х.> ’л ,LU ϋ X Taq буфер (Boehringer Mannheim)
Taq по.лимсраза (Boehringer Mannheim)
PCR продуктите се трет l фенол/ хлороформ, изоамилоь алкохол и се пцсципит.ира.т с 9..*· /. re * v>ij. -...marsam се и сс pecvciieHuunam b ш и<
Н? О. Всеки продукт след шзвя се срязва с рестрикционните ензими Asp7!8 и
EcoRI и се подлагат на електрофореза върху агарозен гел. фрагменти с размери 450 bp (чернодробни и бъбречни) от Реакция #1 и 699 Ьр фрагмент!.
(чернодробни и бъбречни) от Реа се изрязват от гела и се елуират “1рС > ЦСНТПроф^/^ирЯНС НЯ <ХклН1_1ГПС uhu през найлонова вълна. PCR продуктите от Реакция # ΐ и Реакши се свързват заедно с вектора
f.
Zem229.R (депозиран в ATCC 12301 Parklawn Drive, Rockville. МП, на 28.
септември 1493 под номер -39447). яоито се изрязват с Eco RJ. поради което двата продукта се свързват при новосъздаденият сайт А$р718. Получените резултат плсймиди еа означени #10 (съдържащи получена от бъбреци сДНК)
Li т* -.8 (съдържащи чернодр* юни щпк*.
При секвениране на сДНКите. получените по Време на PCR реакциите грешки са разположени 5’ и 3’ от уникалния Arvll сайт 8 #28 и #10 плазмид итс. съответно. За създаване на свободна от грешки ТРО ДНК, от #10 се изолира един 826 bp EcoRI - Arvll 5’ фрагмент и един 283 bp Arvll- EcoRI 3' фрагмент от #28. Двата фрагмента се свързват заедно с вектора Zcm229R. който сс разгражда е EcoRI. Полученият в резултат плазмид е означен като pZGmpi124. Този плазмид е депозиран в АТСС като един трансформант на Е. coll DHlOb пое номер 69615.
За амплифициране на мегакариоцитните предшественици in vivo,20 мишки се инжектират интрапсритонсално Всеки ден с 40 000 единици на активност * (единиците са определени като 50 U' ml за получаване на една втора част степента на пролиферация на BaF3 Ml’LRl. 1 клетки в МТТ проба (Пример VII)) от рскомбинантен миши шромбопостин (концентрирана свободна от» серум кондиционирана среда от ВНК 570 клетки, стабилно трансфсктирани с миши тромбопоетинова сДНК). На петия ден от инжектирането, сс отделят слезките и се поставят в С$ГСН буфер 4- Hopes (балансиран разтвор на Hank (HBSS). свободен от калций и магнезий, 10 тМ Hopes (GIBCO BRL). 1. 4 тМ аденозин. 2. 74 тМ теофилин (Sigma Chemical Co.. St. Louis, MO) u 0. 38% натриев цитрат (J. T. Baker Inc., Philipsburg, NJ). pH доведено go 7. 40 c натриев хидроксид). Пет слезки. се обработват като във Всяка от тях се изрязвай се отделят клетки, които се поставят в CATCH буфер + Hepes. След това обема на клетките се повишава до 50 ml с 25 пиова пипета и клетките се центрофугират на 208 х за 7 минути в центрофуга модел Sorval TJ- 6. Всяка от клетъчните утайки сс ресуспендира в 10 ml il.
*· с.
буфер на CATCH 4- Hepes и се филтрира през 130 цт найлонова мрежа за получаване на едноклетъчна. суспенсия. Обемите се повишават до 50 т! с буфер на CATCH 4- Hepes и клетките се центрофугират за 15 минути при 33 х g. Клетките се промиват с допълнителни 50 ml САТН 4- Hepes и се центрофугират за още 10 минути при 33 х g. Клетъчните утайки се
Hepes и се полагат върху градиент на Percoll (Pharmacia LKB Biotechnology AB, Upsala, Sweden) (65.40 .
27% в lx GATCH буфер 4- Hepes. no 12 ml всеки в 50 ml центрофужна епруветка) и се центрофугират за 45 минути при 833 х g. Клетките межу.· G
163% слоеве на. Percoll се събират и обемите се повишават до 50 ml I IDJ шпелна среда (минимална есенциална ал рибонуклеозид- и дезоксирибонук .У ииактивиран на горещо
5% - ен фетален телешки серум. 2 тМ L- алу ί компонентите а средата са получени от JRH Biosciences, Lenexa, KS). 1 r натриев пируват 'brine Scientific. Santa Ana. СА.), 1 x PSN антибиотичн.
/ r n('~Y <
*._П OVA..'
BRL) и се добавят 1 000 единици на активност от рекомбинант миши тромбопоетин- mi ( свободна . . се ум кондиционирана среда от ВИК
570 клетки, стабилно трансфектирани с мишата тромбопоетинова сД1
Клетките след това се посяват върху 150 тт панички с тъканна 1 % CO · във въздух c температура 37°С. След три днщпрорастналите неслети клетки се събират в 50 ml центрофужни епруветки и се охлаждаш Върху \
Големите клетки се утаяват чрез центрофугиране при 33 х g за 15 мин при 4° С. Клетъчната утайка се ресуспендира в 50 ml CATCH буфер 4- Hepes на стайна температура и се центрофугират при 33 х ζ (Всички по нататъшни етапи се осъществяват на стайна температура). Това промиване се повтаря отново за получаване на по- висока чистота на зрелите мегакариоцити. Останалите клетки се ресуспендират в 15 ml CATCH -г Hepes ( общ обем) и се полагат Върху три градиента фетален телешки серум (JRH Biosciences) (65% и 40% разредени с CATCH буфер + Hepes) за седиментация при 1 х g в продължение на 30 минути. Дънните 5 ml от 65%· фракции се събират, разреждат се до 50 ml с CATCH буфер ч- Hepes и се центроугират за 10 минути при 33 х g. Утайките съдържат повече от 10 клетки. Клетките се изпитват за ацетилхо.линестсраза по метода на
ВшхДп er al.. (J. Cell Physiol. 122:159 -165. 1985) и се определят като зрели меткариоиитни клетки с чистота^по- голяма от 99%. Утаените клетки се .лизират в гуанидин тиоцианзт·· 2- меркаптаетанолов· разтВор за изолиране на РНК чрез центрофугиране с плътностсн градиент на цезиев хлорид.
сДНК се изготвя от мегакариоцитна РНК както с описано в Пример изаиионн oh
Към 1. 5 ml микрофужни епруветки върху лед се добавят : 1 gg XZgmpi НО. iZgmpl - НЮ или XZgmpl - Н29. съдържащи човешкият тромбопоетинов ген. 5 ш 10 х ник транслационен буфер (0. 5 М Tris/HG. 50 тМ MgCI ; .0. 5 mg ml BSA (свободна.orнуклеаза). 5 dразтвор на dXTPs (дезоксинуклеотид трифосфати). съдържащ 0.5 тМ dATP. 0. 5 тМ. dCTP. 5 Д 5 тМ Био-11 617ТР (5- Ν- [ N- биотинил- ε- аминокарпоил]- 3 - аминоалилТ 2’- дезоксиуридин' 5 '- трифосфапг Sygma Cemical Co.), 5 d WO mM DTT. 5 ul DV-аза I ( 1000 x разреждане :отщок 10 U uL Botitrmger Mannheim, свободна от рибонуклеаза). 2.
Д ДНК полимераза 1 ( 5 Ц· ,ul. Boehringer Mannheim), Η, Ο до краен обем 50 μΐ След смесване, реакцията се инкубира при 15°С за два часа 6 микроохладитсл на Boekcl. реакциите се прекъсват чрез добавяне на 5 ц (). 5 М EDTA. pH 7. 4 . Пробите се пречистват с помощта на ДНК пречиствателна колона на Sephadex-1 G- 50 (Worthington Biochemical Corporation. Freehold, NJ) съгласно инструкциите на производителя. За проверка размера на маркираните проби, 5 - 10 и! огп всяка проба, подлежаща преписване се смесва с 5 ц покриващ гела буфер (12, 5% фикол. 0. 2% бромфенол блу, 0.2 i V. Tris- ацетат. С. 1 М натриев ацетат. '1 мМ EDTA ) с се пропускат върху 7 % агарозен мини- гел при 80 V. л- Hind III фрагмента (GIBCO BRL) се използват като маркери за размера на базовите двойки (Ьр). Маркираната с длиюксигенин центромерна проба, специфична за хромовлмз 3 (D3Z1) се получава от Oncor (Gaithersburg, MD).
Метафазни хромозо.ми се получават от HEL клетъчна култура. 10С л CoicemidA (GIBCO BRL, 10 us' mJ шок) се добавят към средата от 100 х 15 тт петриева паничка.. използвана за. клетъчната култура и се инкубират при 37°С. След 2. 5 * 3 часа, средата се отстранява от петриевата паничка с помощта на 10 mi стерилна пластмасова пипета и се прехвърля към 15 mi полипропиленоВа комична епруветка (Blue Max ™, Becton Dickinson i. .>-.-··се 2 ml от PBS (i40 mM NaCl. 3 niM KCI. 8 mM Na3 HPO4. 1. 5 mM KH PO. pH 7. 2) към петриевата паничка за промиване, с помощта на .5 ml пластмасова пипета и се прехвърлят към конична епруветка Към петриевата. паничка се добавят 2 ml трипсин (GIBCO BRL. разтвор на щока) с помощта на пластмасова пипета, и петриевата паничка внимателно се разклаща и се поставя в инкубатор при 37°С- за 3- 5 минути. След това клетките се промиват от петриевата паничка с помощта на 5 ml стерилна пипета и се добаВят към епруветката със средата Епруветката с културата се центрофугира при 250 х g за 8 минути и всичко освен 0. 5 ml от супернатантата се отстранява. Утайката се ресуспендира чрез почукване, след това бавно и внимателно се добавят 8 т’ 0. 075 М KCL (предваршпелно затоплена до 37°), Суспензията внимателно се смесва и се поставя във водна бавя с температура 37°С за 10 минути. Разтворът се центрофугира при 250 х g за 5 минути и всичко с изключение на 0. 5 т! от супернатантата над утайката се отстранява. Утайката се ресуспендира чрез почукване в епруветката. Два ml студена метанол : оцетна киселина (3: 1) се добавят на капки с разклащане за фиксиране на клетките. По този начин се добавят общо 8 ml за фиксиране. Епруветката се поставя в хладилник за 20 минути. 4 последвано от центрофугиране 8 продължение на 5 минути при 250 g. 4 Супернатантата отново се аспирира и процесът на фиксиране се повтаря още два пъти. За развитие на метафазата, върху 25 х 75 тт предварително очистени, охладени стъклени пластинки ;I-IFR Scientific, Media, РА). върху всяка пластина се поставят 5 ui 50% оцетна киселина с 20 id Pipetman ’v {Gilson Medical Electronics, Inc., Middleton, И7). последвано от 5 μΐ от клетъчната суспензия. Пластинките се оставят да се изсушат на Въздуха и след това се поставят в пещ ( Boekel Industries. Inc.. Philadelphia. PA) при 42cC преди употреба. Пластинките се отчитат за подходящо развитие на метафазата с помощта на микроскоп, оборудван с фазово контрастен кондензатор. Някои препарати на метафазни хромозоми са G- свързани с подобрено от Guit багрило R66 на Giemsa (BDHLtd.. Dorset. England}. фотографирано и обезцветено преди изолзването му за хибридизационни експерименти. Препаратите с човешки метафазни хромозоми се инкубират за 2 часа 8 2 х SSC (0, 3 М NaCl. 0.03 М натриева нитрат. pH 7. 0), промиват се бързо ) Във вода и се оцветяват с модифицирано от Gum багрило на Giemsa, което е разредено 1: 4 в буферен разтвор на Giemsa. pH 6. 5 ( BDH Ltd.) и преди употреба се филтрува през филтър Whatman #1. Някои препарати най- напред се инкубират за 45 минути до 1 час в пещ на 90° и се оставя да се охлади, преди инкубиране в SSC. Препаратите след това се диференцират, в разтвор на буфер на Giemsa, изплакват се във вода и се изсушават на въздуха. подходящо развитие на метафазнихромозоми се фотографира на микроскоп Olymus с помощта на диапозитивен филм Kodak Ektachrome 400 . дигитализиран и съхраяан с помощта на Optronics (Go-eta. СА) ZVS- 47Е CCD RGB цветна видео4;амерна система и Optimus софтуер (от BioScan Inc., Edmonds. WA). Препаратите се обезцбетяват около 20 минути в 100% ЕЮН и се изсушават на въздуха преди по- нататъшно използване. Неупотребените препарати с метафазни хромозоми се съхраняват при - 70°С.
Хибридизационни смеси се изготват в 1. 5 т! стерилни микроцентрофужни епруветки чрез комбшшршх на 2. 5 ug конкурентна ДНК (Cot-1 ДНК. GIBCO ERE). 40 - 60 ng маркиран с биотинАТжтр! - Н8. XZgmpl- НЮ или XZgmpI- Н29 фаг ( съдържащ човешки . тромбопоетинов ген). 7 ug носеща ДНК . 1 т! ЗМ NaOAc и 2 обема етанол. които се изсушават под вакуум. Утайката се разтваря 8 10 и хибридизационен разтвор, състоящ се от 10% декстра.нов сулфат. 2 х SSC и 50 % формамид (EM Science. Gibbstown, NJ). пробата ;ι кенкуреншншиа ДНК се денатурират на 70 - 80°С за 5 минути, охлаждат се върху лед и се линеаризират при 37аС за 1-2 часа. Денатуриранепю на хромозимите се осъществява чре з потапяне на всеки препарат в 70% формамид. 2 х SSC при 70- 80К' за 5 минути.
последвано от незабавно охлаждане върху ледено-студен 70% етанол. след това в 100% етанол за 5 -10 минхти Всеки. Препаратите след тоВа се изсушават на Въздуха и затоплят до 42°С непосредствено преди пипетирането на хибридизационната смес върху тях с 20 μΐ Gilson
ί ο
i. Ο χ 18 mm, No. 1 покрития (VWR Scientific). Хибридизациите протичат във ilv -ci влажна камера за една нощ при 37. В някои случаи, след приолизител· хибридизационно време, към препаратите се добавя 5 - 10 ng денатурирана, .2.
Jv. \Ис»<ТГА£.е V 4u€.uhuVUb -iv -.r ixet. ilpuuu XU C' м vM'UipahvU
X SSC и 65%
Ζ*4 J П •%1ГТ'Л * Ο*ν· ·' < JT*, С*^ Ч. ν *ч
KzAilV i liC- Alv/Ku- «4 - i Vv iAi Ajifc UL»Ul i 1 Λ. A л Л' ·» \Х'?’’·?*, Q Π -V· CCf’’' .· 1 к,-» J л J АхLixl.VillМ 4» X пц» м- и л.
минути в 4 х SSC. 0. 05% полиоксистиленесорбитан монолаупат (Tween- 20
Sigma Chemical Co.). Това е последвано от 20 минутна преинкубаиия с 4 х SSC съдържащ з% ооезмаслено сухо м.\якс> Зьв Влажна камера (100 ui при покрития
За препаратите, които включват иентромернатахромозомна проба.
Г-П7 1 --7 L· оиотин след това се провежда 45 мин инкубация с 1:100 разреден беляза миши анти диаоксин {Sigma Chemical Co. ) в 4 x SSC 5% BSA.
последвано от той л- muhvuiHU промивания о 4 х SSC. 0. Оз % 1 ween- 20. Постхибридизаиионнитс етани след това протичат за всички препарати с 2и мин.
инкгоиране с флуоресцентни оелязан апииин Дчиогеасет AvhIiii UCS. v cclo laboratories. Burlingame. СА) (100 ul β 4 x SSC. 5% обезмаслено сухо мляко) npu 24 х 50 mm покритие.
След това препаратите се промиват 3 х 3 п<>следоано от 20 мин. инкущране биотинилиран кози анти- аВидин D ; зфинигдетно пречистен. Vector
Laboratories) (5 ml 6 4 x SSC. 5 обезмаслено сухо мляко) при покритие '2 х 50 mm. Препаратите се промиват отново 3x3 минути В 4 х SSC. 0. 05% Tween 20. последвано от друго инкубиранс с флуоресцентно- белязан авидин (100 Д' ml 6 4 х SSC. 5% обезмаслено мляко) при 24 х 50 ттпокритие. В някои с.у.чаи. сигналната амплификациона процедура се повтаря още един допълнителен път. Последното промиване се осъществява за 2 х 3 минути в 4 х SSC. 0. 05% Tween- 20 и 1 х 3 минути в 1 х PBS. Препаратите се монтират в среда, съдържаща 9 части глицерол съдържащ 2% 1.4- диазобицикло- (2. 2. 2)- октан (DABCO. разтворен при 70°С} и една част 0. 2 М Tris/ HQ. pH 7. 5 и 0. 25 - 0. 5 ug ml пропидиев йодид . Препаратите се наблюдават на. Olympus ВН2 микроскоп. снабден с ВН2- RFC рефлектиращо светлинно флуоресцентно съоръжение. РИ-10 ADS автоматична. фотомикрографска система, цветна видео камерна система Optronics ZVS- 47Е CCD RGB и филтърна система Chroma Technology Corp. (Brattlebow. FITCTexru Red за FITS визуализиране. Образите на метафазпите хромозоми се визуализират и съхраняват с помощта на Optronics видео камерна система и Optimus софтуер.
Предварителните резултати от процеса на физичното картиране показаВат. че локусът на човешкият тромбопоетинов ген е разположен дистално на д рамото на хромозома 3 в участъка Зд26.
Шазмидът pBJ5- 5 съдържа промотора 7777 от £ cerevisiac , афакторният лидер за секреция, мишата ТРО кодираща последователност (SEQ ID NO: 1) от bp 237 до 692. ΊΤΙ1 терминатор на транскрипция, 2 μ последователности за репликация 6 дрожди триозо фосфат изомеразен ген
9S om Schizosaccharomyces pombe (POTI ген) за селекция в дрожди. Този плазмид е конструиран да насочи секрецията на миши ТРО протеин съдържащ амино* киселини 45- 196 от SEQ ID N0: 2.
За конструиране на pBJ3- 5. pMVRl (фигура 2) се разгражда с SphI и Xbal и векторната основа съдържаща 5’ част от ТРИ промотора и ТРИ тсрминатор се възстановява. Във векторната основа -след това се инсертират следните фрагменти:
1) Един SphI/ Hindlll фрагмент, получен от pBSlll който съдържа 3’ част от ТРИ промотор и а- факторният лидер. Плазмидът pBS114 е дрождев совалков вектор, който съдържа ТРИ промотора и а- факторният лидер, последвано от полилинкерна последователност, която включва Hindlll сайт.
2) PCR- генериран Hindlll Sall фрагмент, съдържащ Hindlll сайт.
£ конструиран така, че да бъде в рамка с Hindlll сайт 8 афакторният лидер, Кех2 протеолитичен сайт на разграждане и *
Полученият 6 резултат плазмид, обозначен като pBJ3 (фигура 2), след това се разгражда с Bglll и Xhol за да освободи цялата експресионна касета, съдържаща промотора, лидера, ТРО кодиращата последователност и терминатора. Този Bglll/ Xhol фрагмент се инсертира в pRPOT ( описан в US Patent No. 5 128 321. включен в литературната справка), който е бил разграден с BamHI и Xhol. Полученият в резултат плазмид е обозначен като pBJ3- 5.
Щамът Str. cerevisiae JG134 (МАТа игаЗ-52 1еи2- Δ 2 рер4- Δ1 31ril:
UR-13 ./) се трансформира cpBJ3-5 u pRPOT чрез литиево-ацетатна процедура (както най- общо е описана от Ito et al., J. Bacterial 153:163-168.
1983). Трансформантшпе се подбират по техния растеж върху глюкозоVT • i _ г -
pRPOT се съдържаща среда. JG134/ pBJ3 - 5
И
течна среда за три дниКултуралната среда, се отделя от клетките чр
центрофугиране и се анализира чрез изпитване за клетъчна пролиферац
BAF3 клетки, съдържащи MPL рецептор. Средата от щам JG134,’ pBJ3
pRPOT е неактивна. Този резултат показва, че дрождите могат да секретират биологично активна форма на ТРО.
Плазмидна ДНК от две 5 т!нощни бактериални култури, трансформирани с pZGmpI-124 се получава чрез алкален лизис на Клетките . последвано от свързване на ДНК към смола (с помощта на Magic Minipreps'*· Sampler кит от Promega Corp.). ДНК луира със 75 id 10 тМ Tris. 1 mM EDTApHS.O.
100
ВНК 570 клетъчни култури при 50 000 клетки на ямка се трансфектират с pZGmp!-124 ДНК. Добавят се 20 Д разреден 1:10 LIPOFECTAMINE™ (GIBCO BRL) към 20 Д плазмидна ДНК и 160 Д свободна от серум среда (F DV среда [1:1 смес на DMEM и F12 на Нат].
заместена с 10 gg/ ml фетуин, 2 ng/ ml селен, 5 pg/’ ml инсулин, 10 pg/ ml трансферин, 2 mM L- алутамин, 110 mg/ ml натриев пируват, 25 mM HEPES и
0. 1 тМ разтвор на не- есенциални а.мино/киселини (GIBCO BRL) за 30 мин на стайна температура преди да се добавят ВНК 570 клетките и се инкубират за 4 часа при 37°С. След това се добавят 200 Д от растежната среда (DMEM (Biowhittaker) заместена с 2 тМ L- глутамин, 110 pm ml натриев пируват. С.
mg/ ml пеницилин, 0. 05 mg ml стрептомицин. 0. 01 mg/ ml неомицин. 25 mM HEPES. 10% фстален телешки серум) и клетките се инкубират за една нощ' при 37°С. Културалната среда след това се премества заедно с расп среда, съдържаща 5% фетален телешки серум и се инкубира при 37°С В ж продължение на 4 часа.
Кондиционираната среда от ВНК 570 трансфектанти след това се изпитва за способността им да предизвикат клетъчна пролиферация в ВаЕЗ клетки, експресиращи мишият MPL рецептор. Клетките се култивират в BaFS среда i JRH Biosciences) заместена с 10% фетален телешки серум, 2 тМ L- глутамин, 1 тМ натриев пируват. 10 тМ НЕРвл.в.
цМ р- меркаптоетанол. 0. 05 mg- ml пеницилин. 0. 05 mg/ ml стрептомицин. С. 01 mg ml неомицин и 4G V V кондиционирана среда от култури на WEHE 3 клетки ( миши интерлевкин - 3, културален заместител. Collaborative Biomedical Products)). Преди изпитването. BaF3 клетките се разреждат и ресуспендират 6 IL- 3 - свободна BaF3 среда до 10 000 Клетки/ 100 Д.
Добавят се 100 Д от кондиционираната среда от ВНК клтки.
101 трансфектирани с pZGmpI -124 и културите се инкубират при 37°С. След това Клетките се оценяват визуално за удължаването им след 30 минути и след 24 часа. Изпитват се също и негативните контроли, съдържащи ВаРЗ среда без IL- 3 и позитивна контрола от кондиционирана среда от ВНК 570 Клетки, трансфектирани с миша ТРО ДНК. Резултатите показват, че няма удължаване на ВаГЗ Клетки в негативната контрола, известно удължаване на Клетките в позитивната контрола и значимо такова - в трансфектирани с pZGmpI-124 клетки.
150 - mm тъканнс културални пластинки, съдържащи клетки, коин продуцират ТРО или нормални ВНК клетки, се маркират за 18 антибиотици и 200 gCi ’’ S* Express (Amersham, Arlington Heights, IL) концентрира 15 пъти с помощтана Centriprep-10 ™ (Amkon, Inc.).
• V* получената в резултат 0. 7 ml концентрирана супернатавта се смесва с 40 Д разтворим MPL рецептор с поли- хистидинова опашка, който е прикрепе;
към CNBr-Sepharose 4B (Phtumacia) според инструкциите на npogar
Сместа се инкубира в продължение на два часа върху’ лед, при f't
Клетките се промиват еднократно'с PBS. след това се лизират с I
RIP буфер ( 10 тМ iris. oil /. ч. 1% дезоксихолат, 1% тритон X-100. С. 1%.
SDS, 5 тМ EDTA, 0.15 М ХаС1). Лизатът се центрофугира за от< . iTap <11'151 I i til 1С на неразтворимите частици и се добавят 40 μι MPL- Sepharose както по· горе.
1G2
MPL- Sepharose след това се утаява с ниско скоростна центрофуга и супернатантите от средата и клетъчният лизат се отстраняват. Утайката се промива четирикратно с PBS. съдържаща 0. 5 М NaCL След последното промиване, PBS се отстранява и се добавят 40 μΐ от 2Х буфер (10% глицерол. 4% -SDS, 50 тМ Tris. pH 7. 0,1 тМ EDTA.0. 05% бромфенол блу). съдържащ 4% бета- меркаптоетанол.
Пробите след тоВа се варят 6 продължение на пет минути и 18 и! от всяка се натоварват върху 10- 20G градиентен мини- гел (Integrated Separation Systems), след това се подлагат на електрофореза при 100 V за приблизително два часа. Гелът се фиксира за тридесет минути (В 40% метанол. 16% ледена оцетна киселина и дистилирана вода). след това се потопява в Amplify™ (Amercham) за двадесет минути. След изсушаване, гелът се експонира за една нощ. Ивицата -70 RD е твърде добре видима линия . съответстваща на зрялата среда от клетки, трансфектирани с ТРО сДНК. Ивицата не присъства в зрялата среда от 5НК клетки или клетъчни лизати от която А.
да е друга клетъчна линия.
От изложеното по- горе става ясно, че макар с оа*,ед илюстрация тук да са описани специфични варианти на изпълнение на изобретението.
възможни са различни модификации без да се излиза от духа и обхвата на изобретението. Съответно, изобретението не е ограничено, с изключение на приложените патентни пр
103
СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩд ИНФОРМАЦИЯ
1201 rastiake Avenue East
Seauie
WA
US f S’ » \ 41 ί
Ч-/ Lil vcl ϋ. Wasidncioii
Vv A
МЕТОДИ
U А ЦД u i- :ΤΎ у \Л \
X- KAJ- K2- 1J~ 1 V.» . TX 2
БРОИ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ 29 . . . 4 ТПТТ1 Ο 4 Τ “<-Ч ПТ-*/—Z-ч Г Τ m'T—Γ Τ Τ ΓΎ Д .m (1\ i .-идг La. лп лмгиС--^п_;х_л.1Д4-1л:
ί Aj АДРЕС: .ТутоСепеигс·. Inc.
(Б) УД; ILIA : 120’ Easiiaiu A'.enue East
i f Ί I' P A Д: ScalTk
1 f
U i УТТ :4 ' 1Цг* A WA
ί j CTP. A 'i..i <4 · » ’ ч ·. ; \iu. а. ч . . \ i
/ 7 4 U / ZIP : 98102
(v) KOMI IrOTbPRO 4s;. φΟΡΜΑ :
(А) СРЕДЕН КЛАС ; флапи guck iB) компютър : IBM pc съвместим
104 (С) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА : PC DOS MS DOS (DI СОФТУЕР : Patcntln Release #1. 0. Version #1. 25 (vi) НАСТОЯЩИ ДАННИ ЗА ЗАЯВИТЕЛЯ:
(A) НОМЕР НА ЗАЯВИТЕЛЯ:
(B) ДАТА ДА ЗАЯВЯВАНЕ:
(C) КЛАСИфИКШИЯ:
(viii) ПАТЕНТЕН ПРЕД СТАВИТЕ А:
F А \ ν·-ν;
(В) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР : 31 64S (А) СВЕДЕНИЯ ЗА ТЕ ХЕКОМТПИКАЦИЯ:
{А) ТЕЛЕФОН: 206-442· ϋύΟΰ exi 66”3 <δ» ТЕЛЕФАКС: 20ή 442-6678 (21 ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEO ID N0:1:
U) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА· ’4S6 дВойки пято , 14·. ·?-ί лг г: f { ϊΗαΑ 1 tl\ КЛС Oil. И Ή КлК CAlkLi f C) ВЕРИЖНОСТ : овойвоВеошкна ;D| ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii; МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (γϋΙ ИЗТОЧНИК:
(B) OOH: K;£i ?к) ХАРАКТЕРЕН ТИ к (A) ИМЕ. КЛЮЧ . CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 105 . . 124) (xi) ОПИСАНИЕ НЛ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO· Е
CCTCGTGCCG GTCCTGAGGC ССТТСТССАС CCGGACAGAG TCCTTGGCCC АССТСТСТСС
CACCCGACTC TGCCGAAAGA AGCACAGAAG CTCAAGCCGC СТСС ATG GCC CCA GGA
Met Ala Pro Gly 1
116
105
164
AAG ATT CAG Lys lie Gin
CTG GCC AGA Leu Ala Arg
GGG AGA GGC CCC ATA CAG GGA GCC ACT TCA GTT AGA CAC
Gly Arg Gly Pro lie Gin Gly Ala Thr Ser Vai Arg His
10 15 20
ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC CTG GCG GCC ATG CTT СП
Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu
212
GCA GTG GCA AGA CTA ACT CTG TCC AGC CCC GTA GCT CCT GCC TGT GAC Asp 260
Ala Vai Ala Arg 40 Leu Thr Leu Ser Ser Pro 45 Vai Ala Pro Ala 50 Cys
CCC AGA CTC CTA AAT AAA CTG CTG CGT GAC TCC CAC CTC CTT CAC AGC 308
Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser
55 60 65
CGA CTG AGT CAG TGT CCC GAC GTC GAC CCT TTG TCT ATC CCT GTT CTG 356
Arg Leu Ser G1 n Cys Pro Asp Vai Asp Pro Leu Ser lie Pro Vai Leu
70 75 80
CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC CTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ACG GAA 404
Leu Pro Al a Vai Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Thr Glu
85 90 95 100
CAG AGC AAG GCA CAG GAC ATT CTA GGG GCA GTG TCC CTT CTA CTG GAG 452
Gin Ser Lys Ala Gin Asp lie Leu Gly Ala Vai Ser Leu Leu Leu Glu
105 110 115
GGA GTG ATG GCA GCA CGA GGA CAG TTG GAA CCC TCC TGC CTC TCA TCC 500
Gly Vai Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser
120 125 130
CTC CTG GGA CAG CTT TCT GGG CAG GTT CGC CTC CTC TTG GGG GCC CTG 548
Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Vai Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu
135 140 145
CAG GGC CTC CTA GGA ACC CAG CTT CCT CTA CAG GGC AGG ACC ACA GCT 596
Gin Gly Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Leu Gin Gly Arg Thr Thr Ala
150 155 160
CAC AAG GAC CCC AAT GCC CTC TTC TTG AGC TTG CAA CAA CTG CTT CGG 644
His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gin Gin Leu Leu Arg
165 170 175 180
GGA AAG GTG CGC TTC CTG CTT CTG GTA GAA GGT CCC ACC CTC TGT GTC 692
Gly Lys Vai Arg Phe Leu Leu Leu Vai Glu Gly Pro Thr Leu Cys Vai
185 190 195
AGA CGG ACC CTG CCA ACC ACA GCT GTC CCA AGC AGT ACT TCT CAA CTC 740
Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Al a Vai Pro Ser Ser ihr Ser Gin Leu
200 205 210
106
СТС Leu АСА CTA AAC AAG TTC Asn Lys Phe CCA Pro AAC AGG ACT TCT GGA П6 HG GAG ACG 788
Thr Leu 215 Asn 220 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr 225
AAC ПС AGT GTC ACA GCC AGA ACT GCT GGC CCT GGA cn CTG AGC AGG 836
Asn Phe Ser Vai Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg
230 235 240
СП CAG GGA TTC AGA GTC AAG АП ACT CCT GGT CAG CTA AAT CAA ACC 884
Leu Gin Gly Phe Arg Vai Lys lie Thr Pro Gly Gin Leu Asn GTn Thr
245 250 255 260
TCC AGG TCC CCA GTC CAA ATC TCT GGA TAC CTG AAC AGG ACA CAC GGA 932
Ser Arg Ser Pro Vai G1 n lie Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly
265 270 275
CCT GTG AAT GGA ACT CAT GGG CTC TTT GCT GGA ACC TCA CTT CAG ACC 980
Pro Vai Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gin Thr
280 285 290
CTG GAA GCC TCA GAC ATC TCG CCC GGA GCT TTC AAC AAA GGC TCC CTG 1028
Leu Glu Ala Ser Asp lie Ser Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu
295 300 305 -
GCA TTC AAC CTC CAG GGT GGA cn CCT CCT TCT CCA AGC CTT GCT CCT 1076
Ala Phe Asn Leu Gin Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro
310 315 320
GAT GGA CAC ACA CCC TTC CCT CCT TCA CCT GCC TTG CCC ACC ACC CAT 1124
Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His
325 330 335 340
GGA TCT CCA CCC CAG CTC CAC CCC CTG ПТ CCT GAC CCT TCC ACC ACC 1172
Gly Ser Pro Pro Gin Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr
345 350 355
ATG CCT AAC TCT ACC GCC CCT CAT CCA GTC ACA ATG TAC CCT CAT CCC 1220
Met Pro Asn Ser Thr Al a Pro His Pro Vai Thr Met Tyr Pro His Pro
360 365 370
AGG AAT TTG TCT CAG GAA ACA TAGCGCGGGC ACTGGCCCAG TGAGCGTCTG 1271
Arg Asn Leu Ser Gin Glu Thr
375
107
I
CAGCTTCTCT CGGGGACAAG CTTCCCCAGG
ATGTTCTGCT TTCACCTAAA AGGCCCTGGG
ATTTTAGGAG CTATTTTTTT TTAACCTATC
TTGGTCTATT TTCGGTATAA ATTTGAAAAT
AAGGCT6AGA GGCAGCTGCA TCTGCTCCAG1331
GAAGGGATAC ACAGCACTGG AGATTGTAAA1391
AGCAATATTC ATCAGAGCAG CTAGCGATCT1451
CACTAI486 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:2:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА : 379 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ТОПОЛОГИЯ: ливеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: протеин (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:2:
Met Ala Pro Gly Lys lie Gin Gly Arg Gly Pro lie Gin Gly Ala Thr
1 5 10 15 -
Ser Vai Arg His Leu Ala Arg Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala
20 25 30
Ala Met Leu Leu Ala Vai Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Vai Ala
35 40 45
Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His
50 55 60
Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Asp Vai Asp Pro Leu Ser
65 70 75 80
lie Pro Vai Leu Leu Pro Ala Vai Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys
85 90 95
Thr Gin Thr Glu Gin Ser Lys Ala Gin Asp lie Leu Gly Ala Vai Ser
100 105 110
Leu Leu Leu Glu Gly Vai Met Ala Al a Arg Gly Gin Leu Glu Pro Ser
115 120 125
108
Cys Leu Ser 130 Ser Leu Leu Gly Gin 135 Leu Ser Gly Gin Vai 140 Arg Leu Leu
Leu Gly Ala Leu Gin Gly Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Leu Gin Gly
145 150 155 160
Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gin
165 170 175
Gin Leu Leu Arg Gly Lys Vai Arg Phe Leu Leu Leu Vai Glu Gly Pro
180 185 190
Thr Leu Cys Vai Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Ser
195 200 205
Thr Ser Gin Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly
210 215 220
Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Vai Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly
225 230 235 240
Leu Leu Ser Arg Leu Gin Gly Phe Arg Vai Lys lie Thr Pro Gly Gin
245 250 255
Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Pro Vai Gin lie Ser Gly Tyr Leu Asn
260 265 270
Arg Thr Hi s Gly Pro Vai Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr
275 280 285
Ser Leu Gin Thr Leu Glu Ala Ser Asp lie Ser Pro Gly Ala Phe Asn
290 295 300
Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu Gin Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro
305 310 315 320
Ser Leu Ala Pro Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu
325 330 335
Pro Thr Thr His Gly Ser Pro Pro Gin Leu His Pro Leu Phe Pro Asp
340 345 350
Pro Ser Thr Thr Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Vai Thr Met
355 360 365
Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser Gin Glu Thr
370 375
109 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ГО NO: 3:
(0 ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 42 gBouku бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ:. линейна (νϋ) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
(В) КЛОН: ZC5499 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:3:
CCtAGCCACTT tctgcactcc tcgaottitt τττίτπτττ тт (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 4:
(ОсХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 45 двойки бази (B) ТИП : нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едиоверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (νύ) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
(В) КЛОН: ZC5746 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:4:
GACtAGAGACtA GAGAATTCAT GCCCTCCTGG СтСССТСГТСА tggtc
110
GAGCACAGAA TTCACTACTC GAGGCGGCCG СГГГ1ТГПТ ΊΤΠΤΠΤΓ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 8:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 45gBotiku бази (B) ТИП: нуклеиноВа киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна {vii) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК (В) KAOH:ZC6603 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:8:
GAGGAATTCG CAGAAGCCAT GCCCTCTTGG GCCCTCTTCA TGGTC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 9:
(^^ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 8 аминокиселини (B) ТИП: аминожиселима (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 9:
Vai Arg Thr Ser Pro Ala Gly Glu ι 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 10:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 48 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) топология: линейна
111 (vii) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
(В) КЛОН: ZC6704 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 10:
GAAGAGGAAT TCACCATGGA TGTCTTCTTG CTGGCCTTGG GCACAGAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 11:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 60 gBouku бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (vii) ИЗТОЧНИК:
(В) KAOH:ZC6703 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:11:
CGACTTTACC TCGAGTGCTA CTGATGCTCT TCTGCCAGCA GTCTCGGAGC CCGTGGAGC CCGTGGACAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 12:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛHOCTTA (A) ДЪЛЖИНА: 42 gBouku бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (vii) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
(В) КЛОН: ZC6707 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 12:
ААТТССтССАТ GGGACTCGAG CATCACCATC ACCATCACTG AG
112 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 13:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛ НОСНА - (A) ДЪЛЖ1ТНА: 42 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна <vii) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
(В) КЛОН: ZC6706 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:13:
GATCCTCAGT GATGGTGATG GTGATGCTCG AGTCCCATGG CG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0: 14:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА 47 дВойкн бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (vii) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
(В) КЛОН: ZC6172 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:14:
GTCGGTGCTC AGCATTCACT ACTCGAGGGT
ΤΓΤΙΤΤΤ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEO ID NO: 15:
(I). ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА' (A) ДЪЛЖИНА: 28 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (νϋ) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
113 (В) КЛОН: ZC6936 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 15
AATTGGCGGC CGCGTCGACT CGTGGATG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 16:
(ip ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛ ЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪАЖИТТА: 28 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноВеоижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (vii) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
(В) КЛОН: ZC6937 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 16:
ААТГСАТССА CGAGTCGACG CGGCCGCC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 17:
(i) 'ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 633 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: протеин (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 17:
Mel Pro Ser Trp Ala Leu Phe Met Vai Thr Ser Cys Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Asn Gin Ala Gin Vai Thr Ser Gin Asp Vai Phe Leu Leu Ala
20 25 30
Leu Gly Thr Glu Pro Leu Asn Cys Phe Ser Gin Thr Phe Glu Asp Leu
35 40 45
Thr Cys Phe Trp Asp Glu Glu Glu Ala Ala Pro Ser Gly Thr Tyr Gin
50 55 60
Leu Leu Tyr Ala Tyr Arg Gly Glu Lys Pro Arg Al a Cys Pro Leu Tyr n4
65 70 75 80
Ser Gin
Ala Gin
Asn Vai
Ser Vai
130
Ser Gin
145 lie Ser
Ser Asn
Cys Cys
Pro Pro
210
Thr Ser
225
Cys Leu
Arg Ser
Ser Phe
Leu Gin
290
Gin Gin
305
Ser Vai
Asp Glu
100
Ser Leu
115
Gly Leu
Pro Gly
Asp Phe
Ala Thr
180
Pro Thr
195
Cys Vai
Pro Ala
Vai Ser
Gin Pro
260
Pro Vai
275
Cys Phe
Asp Arg
Pro
Vai
Asn
Pro
Glu
Leu
165
Ala
Leu
His
Gly
Gly
245
Asp
Thr
Thr
Thr
Thr Phe
Arg Leu
Gin Thr
Ala Pro
135
Leu Gin
150
Arg His
Pro Ser
Trp Met
Pro Thr
215
Glu Ala
230
Leu Gin
Gly Vai
Vai Asp
Leu Asp
295
Ser Ser
310
Gly Thr
Phe Phe
105
Leu lie
120
Pro Arg lie His Glu Leu Vai lie
185
Pro Asn
200
Ala Ser Pro Phe Ala Gly Ser Leu
265
Leu Pro
280
Leu Lys
Gin Gly
Arg Tyr
Pro Leu
Gin Arg
Vai lie
Trp Glu
155
Arg Tyr
170
Gin Leu
Pro Vai
Gin Pro
Leu Thr
235
Lys Ser
250
Arg Gly
Gly Asp
Met Vai
Phe Phe
315
Vai Cys
His Leu
Vai Leu
125
Lys Ala
140
Ala Pro
Gly Pro
Leu Ser
Pro Vai
205
His Gly
220
Vai Lys
Tyr Trp
Ser Trp
Ala Vai
285
Thr Cys
300
Arg His
Gin
Trp
110
Phe
Arg
Ala
Thr
Thr
190
Leu
Pro
Gly
Leu
Gly
270
Thr
Gin
Ser
Phe Pro
Vai Lys
Vai Asp
Gly Gly
Pro Glu
160
Asp Ser
175
Glu Thr
Asp Gin
Vai Arg
Gly Ser
240
Gin Leu
255
Pro Trp lie Gly
Trp Gin
Arg Thr
320
115
Arg Cys Cys Pro Thr Asp Arg Asp Pro Thr Trp Glu Lys Cys Glu Glu
325 330 335
Glu Glu Pro Arg Pro Gly Ser Gin Pro Ala Leu Vai Ser Arg Cys His
340 345 350
Phe Lys Ser Arg Asn Asp Ser Vai He His lie Leu Vai Glu Vai Thr
355 360 365
Thr Ala Gin Gly Ala Vai His Ser Tyr Leu Gly Ser Pro Phe Trp He
370 375 380
His Gin Al a Vai Leu Leu Pro Thr Pro Ser Leu His Trp Arg Glu Vai
385 390 395 400
Ser Ser Gly Arg Leu Glu Leu Glu Trp Gin His Gin Ser Ser Trp Ala
405 410 415
Ala Gin Glu Thr Cys Tyr Gin Leu Arg Tyr Thr Gly Glu Gly Arg Glu
420 425 430
Asp Trp Lys Vai Leu Glu Pro Ser Leu Gly Ala Arg Gly Gly Thr Leu
435 440 445 -
Glu Leu Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Ser Leu Gin Leu Arg Ala Arg Leu
450 455 460
Asn Gly Pro Thr Tyr Gin Gly Pro Trp Ser Ala Trp Ser Pro Pro Ala
465 470 475 480
Arg Vai Ser Thr Gly Ser Glu Thr Ala Trp lie Thr Leu Vai Thr Al a
485 490 495
Leu Leu Leu Vai Leu Ser Leu Ser Al a Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu
500 505 510
Lys Trp Gin Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp
515 520 525
Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Vai Leu Gly Gin Tyr Leu Arg Asp
530 535 540
Thr Ala Al a Leu Ser Pro Ser Lys Al a Thr Vai Thr Asp Ser Cys Glu
545 550 555 560
Glu Vai Glu Pro Ser Leu Leu Glu lie Leu Pro Lys Ser Ser Glu Ser
565 570 575
Thr Pro Leu Pro 580 Leu Cys Pro Ser Gin 585 Pro Gin Met Asp Tyr 590 Arg Gly
Leu Gin Pro 595 Cys Leu Arg Thr Met 600 Pro Leu Ser Vai Cys 605 Pro Pro Met
Ala Glu 610 Thr Gly Ser Cys Cys 615 Thr Thr His lie Ala 620 Asn His Ser Tyr
Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gin Gin Pro
625 630 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 18:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 1062 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойно верижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (xi) ОСОБЕНОСТИ:
(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 1.. 1059 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 18:
ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 48
Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Vai Vai Met Leu Leu Leu Thr Ala
1 5 10 15
AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 96
Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Al a Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Vai
20 25 30
CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC 144
Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Vai Leu His Ser Arg Leu Ser
40 45
117
CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT Ala 192
Gin Cys 50 Pro Glu Vai His Pro Leu Pro 55 Thr Pro Vai Leu 60 Leu Pro
GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG 240
Vai Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys
65 70 75 80
GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG 288
Ala Gin Asp lie Leu Gly Ala Vai Thr Leu Leu Leu Glu Gly Vai Met
85 90 95
GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG 336
Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
100 105 110
CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC 384
Gin Leu Ser Gly Gin Vai Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu
115 120 125
CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT 432
Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
130 135 140
CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG 480
Pro Asn Ala He Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Vai
145 150 155 160
CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 528
Arg Phe Leu Met Leu Vai Gly Gly Ser Thr Leu Cys Vai Arg Arg Ala
165 170 175
CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG 576
Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser Leu Vai Leu Thr Leu
180 185 190
AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT 624
Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
195 200 205
GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA 672
Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly
210 215 220
118
THIIW -Jin .и11М/1М1МШ1^ш'жтП|11Ц.М»1Д).!11>.1.и<и.1 ,.-.ιΐ.ΐΊΑ^'ί-Ι1.- Г *
ттс Phe 225 AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC Ser CTG Leu 240
Arg Ala Lys lie Pro 230 Gly Leu Leu Asn Gin 235 Thr Ser Arg
GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA
Asp Gin lie Pro Gly Tyr Leu Asn Arg lie His Glu Leu Leu Asn Gly
245 250 255
ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG
Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Al a Pro
260 265 270
GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC
Asp lie Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
275 280 285
CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT
Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr
290 295 300
ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC
Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Vai Vai Gin Leu
305 310 315 320
CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC
His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser
325 330 335
CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA
Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu
340 345 350
720
768
816
864
912
960 ·
1008
1056
GGG TAA
Gly (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO: 19:
ii) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЬАЖИНА: 353 аминокиселини (B) ТИП: амино/киселива (Di ТОПОЛОГИЯ: линейна
1062
119
Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Vai Vai 10 Met Leu Leu .и Thr 15 Ala
1 5
Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Vai
20 25 30
Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Vai Leu His Ser Arg Leu Ser
35 40 45
G1 n Cys Pro Glu Vai His Pro Leu Pro Thr Pro Vai Leu Leu Pro Ala
50 55 60
Vai Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr G1 n Met Glu Glu Thr Lys
65 70 75 80
Ala Gin Asp lie Leu Gly Ala Vai Thr Leu Leu Leu Glu Gly Vai Met
85 90 95
Al a Al a Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
100 105 110
Gin Leu Ser Gly Gin Vai Arg Leu Leu Leu Gly Al a Leu Gin Ser Leu
115 120 125
Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Al a His Lys Asp
130 135 140
Pro Asn Al a lie Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Vai
145 150 155 160
Arg Phe Leu Met Leu Vai Gly Gly Ser Thr Leu Cys Vai Arg Arg Al a
165 170 175
Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser Leu Vai Leu Thr Leu
180 185 190
Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
195 200 205
Al a Ser Al a Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly
210 215 220
120 (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 20:
GGAAGCTGGG TACCAAGGAG GCT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:21:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА ( А) ДЪЛЖИНА: 23 gBouku бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) топология: линейна (vii) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧИК:
(В) КЛОН: ZC7423 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0: 21:
AGCCTCCTTG GTACCCAGCT ТСС (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 22:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 20 двойки бази (B) Ί11Π: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (vii) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
( В) КЛОН :ZC7121 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQIDNO:
TTAGACACCT GGCCAGAATG
121 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:23:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 24 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:23:
TGATGTCGGC AGTGTCTGAG ААСС (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 24:
(ή ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 29 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) топология: линейна (νϋ) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК :
(В) КЛОН: ZC7454 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
CCGGAATTCT TAGACACCTG GCCAGAATG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:25:
<i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 33 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) топология: линейна (νϋ) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
(В) КЛОН: ZC7453 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEO ID N0:25:
CCGGAATTCT GATGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC
122 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 26:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 33 gBouku бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (хи) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
(В) КЛОН: ZC731S (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 26:
TACCGAA'ITC TAGACACAGA GGGTGGGACC TTC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 27:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 30 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (vi) НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:
(В) KAOH:ZC7319 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 27:
ACACTGAATT СТТСТССАСС CGGACAGAGT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEO ID NO: 28:
d) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 4823 gBouku бази (B) ТИП: нуклеиноВа киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)
123 (ix) ОСОБЕНОСТИ:
(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : свързва (632 .. 644. 876 . . 1003, 1290 .. 1376, 3309 . 3476, 3713 . . 4375) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 23:
CTTTCTTGCT ТТСТТТСТТТ СТТТСТТТСТ ТТСТТТТТТТ TTTTTGAGAC GGAGTTTCAC60
TCTTATTGCC CAGGCTGGAG TGCAATGGTG CGATCTCGGC TCACCACAAC CTCCGCCTCC120
CAGGTACAAG CGATTCTCCT GTCTCAGCCT CCCAAGTAGC TTGGATTACA GGCATGAACC180
ACCACACCCT GCTAGTTTTT TTGTATTTCG TAGAGCCGGG GTTTCACCAT GTTAGTGAGG240
CTGGTGGCGA ACTCCTGACC TCAGGTGATC CACCCGCCTT GGACTCCCAA AGTGCTGGGA300
TTACAGGCAT GAGCCACTGC ACCCGGCA-A CCATATGCTT TCATCACAAG AAAATGTGAG360
AGAATTCAGG GCTTTGGCAG TTCCAGGCTG GTCAGCATCT CAAGCCCTCC CCAGCATCTG420
TTCACCCTGC CAGGCAGTCT CTTCCTAG.AA ACTTGGTTAA ATGTTCACTC TTCTTGCTAC480
TTTCAGGATA GATTCTTCAC CCTTGGTCCG CCTTTGCCCC АСССТАСТСТ GCCCAGAAGT540
GCAAGAGCCT AAGCCGCCTC CATGGCCCCA GGAAGGATTC AGGGGAGAGG CCCCAAACAG600
GGAGCCACGC CAGCCAGACA CCCCGGCCAG A ATG GAG CTG ACT G GTGAGAACAC 654 Met Glu Leu Thr
ACCTGAGGGG CTAGGGCCAT ATGGAAACAT GACAGAAGGG GAGAGAGAAA GGAGACACGC714
TGCAGGGGGC AGGAAGCTGG GGGAACCCAT TCTCCCAAAA ATAAGGGGTC TGAGGGGTGG774
ATTCCCTGGG TTTCAGGTCT GGGTCCTGAA TGGGAATTCC TGGAATACCA GCTGACAATG834
ATTTCCTCCT CATCTTTCAA CCTCACCTCT CCTCATCTAA G AA TTG CTC CTC886
Glu Leu Leu Leu
GTG GTC ATG CTT СТС CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT934
Vai Vai Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser ProAla
1520
CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC982
Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Vai Leu Ser Lys Leu Leu Arg AspSer
30 3540
124
CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG GTGAGAACTC CCAACATTAT CCCCTTTATC1033
His Vai Leu His Ser Arg Leu
CGCGTAACTG GTAAGACACC CATACTCCCA GGAAGACACC ATCACTTCCT CTAACTCCTT1093
GACCCAATGA CTATTCTTCC CATATTGTCC CCACCTACTG ATCACACTCT CTGACAAGGA1153
TTATTCTTCA CAATACAGCC CGCATTTAAA AGCTCTCGTC TAGAGATAGT ACTCATGGAG1213
GACTAGCCTG CTTATTAGGC TACCATAGCT CTCTCTATTT CAGCTCCCTT CTCCCCCCAC1273
CAATCTTTTT CAACAG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA1322
Ser Gin Cys Pro Glu Vai His Pro Leu Pro Thr
5055
CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC1370
Pro Vai Leu Leu Pro Ala Vai Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr
6570
CAG ATG GTAAGAAAGC CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG TCTTCAGTTT1426
Gin Met
CCCACTGCTT CCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTT TTAAAAATAT CTCACCTTCA1486
GCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCA CCTATGATGA TAGCCTGTGG ATAAGATGAT1546
GGCTTGCAGG TCCAATATGT GAATAGATTT GAAGCTGAAC ACCATGAAAA GCTGGAGAGA1606
AATCGCTCAT GGCCATGCCT TTGACCTATT CCCGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG1666
AAGCAAGACT CATATGTCAT CCACAGATGA CACAAAGCTG GGAAGTACCA CTAAAATAAC1726
AAAAGACTGA ATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGT CAAAAACAAG GTGAAACAAC1786
AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG GGCTCACGCC TGTAATCCCA GCACTTTGGG1846
AGGCCGAGGC AGGCAGATCA CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG AGCAGCCTGG CCAACATGGC1906
GAAACCCCGT CTCTACTAAG AATACAGAAT TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT1966
CCCAGCTACT TGGAAGGCTG AAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGT GGAGGTTGTA2026
GTGAGCTGAG ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC AAGAGCMAA CTCCGTCTCA2086
125
AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC CAGCTTTCAG2146
GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT AGCACTTCCT ACGAAAAGGA2206
TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT2266
AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT GTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA2326
GAACTCTATT CCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT2386
GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT CTAGAAAGCA2446
GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT GTTTTATGGG CAATAGTTTA AAAAACTAAA2506
ATCTATCCTC AAGAACCCTA GCGTCCCTTC TTCCTTCAGG ACTGAGTCAG GGAAGAAGGG2566
CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC TAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATT ATGGTAGAGT2626
CTCATACCTA CATTTAGTTT ATTTATTATT ATTATTTGAG ACGGAGTCTC ACTCTATCCC2686
Ί CCAGGCTGGA GTGCAGTGGC ATGATCTCAA CTCACTGCAA CCTCAGCCTC CCGGATTCAA 2746
GCGATTCTCC TGTCTCAGTC TCCCAAGTAG CTGGGATTAC AGGTGCCCAC CACCATGCCC2806
AGCTAATTTG TGTATTTGTG GTAGAGATGG GGTTTCACCA TGTTGGGCAG GCTGATCTTG2866
AACTCCTGAC CTCAGGTGAT CCACCTGCCT CAGCCTCCCA AAGTGCTGGG ATTACAGGCG2926
TGAGCCACTG CACCCAGCCT TCATTCAGTT TAAAAATCAA ATGATCCTAA GGTTTTGCAG2986
CAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACC AAGAGGTAAA AGCTGTAACA GGGCAGATTT3046
CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC ACTGAAACCA AGTGTAAGAC CAGGCTGGAC3106
TAGAGGACAC GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG CTGATGACCA GCTGTCGGGA GACTGTGAAG3166
GAATTCCTGC CCTGGGTGGG ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC3226
TGCTGGCTAC TCCTAAGGCT CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAGTGCGCTT3286
CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA3338
Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu Gly
8085
126
GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG3386
Ala Vai Thr Leu Leu Leu Glu Gly Vai Met Ala Ala Arg Gly GinLeu
95100
GGA CCC ACT TGC СТС TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC3434
Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly GinVai
105 110115
CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG3476
Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin
120 125130
GTAAGTCCCC AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT CTGACTCAGT CCCCCTAGAA3536
GACCTGAGGG AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA GCTCAAGGGC AGAAGAGCTG ATCTACTAAG3596
AGTGCTCCCT GCCAGCCACA ATGCCTGGGT ACTGGCATCC TGTCTTTCCT ACTTAGACAA3656
GGGAGGCCTG AGATCTGGCC CTGGTGTTTG GCCTCAGGAC CATCCTCTGC CCTCAG3712
CTT CCT CCA CAG Pro Gin 135 GGC Gly AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC 3760
Leu Pro Arg Thr Thr 140 Ala Hi s Lys Asp Pro 145 Asn Ala lie
TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG 3808
Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Vai Arg Phe Leu Met
150 155 160
CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA 3856
Leu Vai Gly Gly Ser Thr Leu Cys Vai Arg Arg Al a Pro Pro Thr Thr
165 170 175 180
GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA 3904
Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser Leu Vai Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro
185 - 190 195
AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA 3952
Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg
200 205 210
ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG 4000
Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Al a Lys
215 220 225
127
ATT CCT GGT CTG CTG AAC Asn CAA Gin 235 ACC TCC AGG TCC CTG Ser Leu 240 GAC CAA ATC CCC Pro 4048
lie Pro Gly Leu Leu Thr Ser Arg Asp Gin lie
230
GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC 4096
Gly Tyr Leu Asn Arg lie His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu
245 250 255 260
TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA 4144
Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Al a Pro Asp lie Ser Ser
265 270 275
GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT 4192
Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr
280 285 290
TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT 4240
Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe Pro
295 300 305
CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT 4288
Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Vai Vai Gin Leu His Pro Leu Leu
310 315 320
CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC 4336
Pro Asp Pro Ser Al a Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn
325 330 335 340
ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC 4385
Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly
345 350
AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG 4445
GGAGACAACT GGACAAGATT TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA 4505
TACACAGGAC TGAAAAGGGA ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT 4565
TTTTTAAGCT ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCAGA 4625
AATTTGCAAC TCACTGATTC TCAACATGCT CTTTTTCTGT GATAACTCTG CAAAGACCTG 4685
GGCTGGCCTG GCAGTTGAAC AGAGGGAGAG ACTAACCTTG AGTCAGAAAA CAGAGGAAGG 4745
GTAATTTCCT TTGCTTCAAA TTCAAGGCCT TCCAACGCCC CCATCCCCTT TACTATCATT 4805
128 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 29:
(ib ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪАЖШЬ-Х: 353 аминоДиселина (B) ТИП: аминсДиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН. ТИП: протеин (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0: 29:
Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Vai Vai Met Leu Leu Leu Thr Ala
1 5 10 15
Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Vai
20 25 30
Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Vai Leu His Ser Arg Leu Ser
35 40 45
Gin Cys Pro Glu Vai His Pro Leu Pro Thr Pro Vai Leu Leu Pro Ala
50 55 60
Vai Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys
65 70 75 80
Ala Gin Asp lie Leu Gly Al a Vai Thr Leu Leu Leu Glu Gly Vai Met
85 90 95
Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
100 105 110
Gin Leu Ser Gly Gin Vai Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu
115 120 125
Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gl n Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
130 135 140
129
Pro Asn 145 Ala lie Phe Leu 150 Ser Phe Gin His Leu 155 Leu Arg Gly Lys Vai 160
Arg Phe Leu Met Leu Vai Gly Gly Ser Thr Leu Cys Vai Arg Arg Ala
165 170 175
Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser Leu Vai Leu Thr Leu
180 185 190
Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
195 200 205
Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly
210 215 220
Phe Ara Ala Lys lie Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu
225 230 235 240
Asp Gin lie Pro Gly Tyr Leu Asn Arg He His Glu Leu Leu Asn Gly
245 250 255
Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro
260 265 270 -
Asp lie Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
275 280 285
Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr Hi s Pro Pro Thr Gly Gin Tyr
290 295 300
Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Vai Vai Gin Leu
305 310 315 320
His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Al a Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser
325 330 335
Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu
340 345 350
Gly

Claims (41)

  1. Патентни претенции
    1. Изолиран протеин, подбран от групата, състояща се от:
    a) протеини, включващи аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 196;
    b) протеини, включващи аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 206;
    c) протеини, включващи аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 19 от аминокиселинен остатък 22 до аминокиселинен остатък 173;
    d) протеини, включващи аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 19 от аминокиселинен остатък 22 до аминокиселинен остатък 175;
    e) алелни варианти на (а), (Ь), (с) или (d);
    f) видови хомолози на (а), (Ь), (с) и (d) или (е), стимулиращи пролиферацията или диференциацията на миелоидни или лимфоидни предшес твеници.
  2. 2. Изолиран протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 379.
  3. 3. Изолиран протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 19 от аминокиселинен остатък 22 до аминокиселинен остатък 353.
  4. 4. Изолиран протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че представлява миши протеин.
  5. 5. Изолиран протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че представлява човешки протеин.
  6. 6. Изолиран протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва:
    аминокиселинната последователност, показана на SEQ
    ID N0: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 379;
    аминокиселинната последователност, показана на SEQ ID
    N0: 2 от аминокиселинен остатък 24 до аминокиселинен остатък 196;
    аминокиселинната последователност, показана на SEQ
    ID N0: 2 от аминокиселинен остатък 24 до аминокиселинен остатък 206;
    131 аминокиселинната последователност, показана на SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 24 до аминокиселинен остатък 379;
    аминокиселинната последователност, показана на SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 1 до аминокиселинен остатък 196;
    аминокиселинната последователност, показана на SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 1 до аминокиселинен остатък 206;
    аминокиселинната последователност, показана на SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 1 до аминокиселинен остатък 379.
  7. 7. Изолиран протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва:
    аминокиселинната последователност, показана на SEQ аминокиселинен остатък 1 до аминокиселинен остатък 173;
    аминокиселинната последователност, показана на SEQ аминокиселинен остатък 1 до аминокиселинен остатък 175;
    аминокиселинната последователност, показана на SEQ аминокиселинен остатък 1 до аминокиселинен остатък 353;
    аминокиселинната последователност, показана на SEQ аминокиселинен остатък 22 до аминокиселинен остатък 353.
    ID
    ID
    ID
    ID
    NO:
    NO:
    NO:
    NO:
    от от от от
  8. 8. Изолиран протеин, състоящ се по същество от аминокиселинна последователност, подбрана от групата, която включва:
    - аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 196;
    - аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 206;
    - аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 379;
    - аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 19 от аминокиселинен остатък 22 до аминокиселинен остатък 175;
    - аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 19 от аминокиселинен остатък 22 до аминокиселинен остатък 353.
  9. 9. Изолиран протеин, стимулиращ пролиферацията или диференциацията на миелоидни или лимфоидни прекурсори, който включва един сегмент, поне 80% идентичен на аминокиселинно ниво с аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 196 или аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 19
    132 от аминокиселинен остатък 22 до аминокиселинен остатък 173.
  10. 10. Изолирана полинуклеотидна молекула, кодираща протеин съгласно претенция 1.
  11. 11. Изолирана полинуклеотидна молекула съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че представлява ДНК-молекула, която от своя страна включва кодираща верига, съдържаща нуклеотидната последователност на SEQ ID NO: 1 от нуклеотид 237 до нуклеотид 692.
  12. 12. Изолирана полинуклеотидна молекула съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че представлява ДНК молекула, която от своя страна включва кодираща верига, съдържаща нуклеотидната последователност на SEQ ID NO: 18 от нуклеотид 64 до нуклеотид 519.
  13. 13. Изолирана полинуклеотидна молекула съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че кодира аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 196.
  14. 14. Изолирана полинуклеотидна молекула съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че кодира аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 19 от аминокиселинен остатък 22 до аминокиселинен остатък 173.
  15. 15. Изолирана полинуклеотидна молекула, подбрана от групата, състояща се от:
    a) ДНК молекули, кодиращи хематопоетичен протеин и включващи нуклеотидна последователност, както е показано на SEQ ID NO: 1 от нуклеотид 137 до нуклеотид 692;
    b) ДНК молекули, кодиращи хематопоетичен протеин и включващи нуклеотидна последователност, както е показано на SEQ ID NO: 18 от нуклеотид 64 до нуклеотид 519;
    c) алелни варианти на (а) или (Ь);
    d) ДНК молекули, кодиращи хематопоетичен протеин, който е поне 80% идентичен на аминокиселинната последователност на протеина, кодиран от (а), (Ь) или (с); и
    e) молекули, комплементарни на (а), (Ь), (с) или (d).
  16. 16. Изолирана полинуклеотидна молекула съгласно претенция 15, кодираща хематопоетичен протеин, който е поне 90% идентичен на аминокиселинната последователност на протеина, кодиран от (а), (Ь) или (с).
    133
  17. 17. Изолирана полинуклеотидна молекула съгласно претенция 15, характеризираща се с това, че включва нуклеотид 237 до нуклеотид 722 от SEQ ID NO: 1 или нуклеотид 64 до нуклеотид 525 от SEQ ID NO: 18.
  18. 18. Изолирана ДНК молекула, подбрана от групата, състояща се от:
    a) Eco RI-Xho инсерта на плазмид pZGmpI-1081 (АТСС 69566);
    b) алелни варианти на (а);
    c) ДНК молекули, кодиращи протеин, който е поне 80% идентичен на аминокиселинната последователност на протеин, кодиран от (а) или (Ь), където изолираната ДНК молекула кодира протеин с хематопоетична активност.
  19. 19. Изолирана ДНК молекула съгласно претенция 18, характеризираща се с това, че кодира полипептид, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 196.
  20. 20. Вектор за експресия, включващ следните оперативно свързани елементи:
    транскрибционен промотор;
    ДНК сегмент, подбран от групата, състояща се от:
    (a) ДНК сегменти, кодиращи хематопоетичен протеин и включващи нуклеотидна последователност, както е показано на SEQ ID NO: 1 от нуклеотид 237 до нуклеотид 692;
    (b) ДНК сегменти, кодиращи хематопоетичен протеин и включващи нуклеотидна последователност, както е показано на SEQ ID N0: 18 от нуклеотид 64 до нуклеотид 519;
    (c) алелни варианти на (а) и (Ь);
    (d) ДНК сегменти, кодиращи хематопоетичен протеин, който е поне 80% идентичен по аминокиселинна последователност на протеин, кодиран от (а), (Ь) или (с); и транскрибционен терминатор.
  21. 21. Вектор за експресия съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че посоченият ДНК сегмент кодира хематопоетичен протеин, който е поне 90% идентичен на аминокиселинната последователност на протеина, кодиран от (а), (Ь) или (с).
  22. 22. Вектор за експресия съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че посоченият ДНК сегмент включва нуклеотид 237 до нуклеотид 722
    134 от SEQ ID NO: 1 или нуклеотид 64 до нуклеотид 525 от SEQ ID NO: 18.
  23. 23. Вектор за експресия съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че включва още секреторна сигнална последователност, оперативно свързана към ДНК сегмента.
  24. 24. Култивирана клетка, в която е въведен вектора за експресия съгласно претенция 20, която клетка експресира хематопоетичен протеин, кодиран от ДНК сегмента.
  25. 25. Култивирана клетка съгласно претенция 24, характеризираща се с това, че представлява клетка на гъба.
  26. 26. Култивирана клетка съгласно претенция 25, характеризираща се с това, че представлява дрождева клетка.
  27. 27. Култивирана клетка съгласно претенция 24, характеризираща се с това, че представлява клетка на бозайник.
  28. 28. Култивирана клетка съгласно претенция 24, характеризираща се с това, че представлява бактериална клетка.
  29. 29. Клетка на бозайник, различен от човек, в зародишната линия на която е бил въведен хетероложен ДНК сегмент, подбран от групата, състояща се от:
    (a) ДНК сегменти, кодиращи хематопоетичен протеин и включващи нуклеотидна последователност, както е показано на SEQ ID NO: 1 от нуклеотид 237 до 692;
    (b) ДНК сегменти, кодиращи хематопоетичен протеин и включващи нуклеотидна последователност, както е показано на SEQ ID N0: 18 от нуклеотид 64 до нуклеотид 519;
    (c) алелни варианти на (а) или (Ь); и (d) ДНК сегменти, кодиращи хематопоетичен протеин, който е поне 80% идентичен по аминокиселинна последователност на протеина, кодиран от (а), (Ь) или (с);
    където посоченият бозайник продуцира хематопоетичен протеин, кодиран от посочения ДНК сегмент.
  30. 30. Бозайник, различен от човека, съгласно претенция 29, подбран от групата, включваща свиня, коза, овца, едър рогат добитък и мишка.
  31. 31. Бозайник, различен от човека, съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че посоченият ДНК сегмент включва нуклеотид 237 до нуклеотид 722 от SEQ ID NO: 1 или нуклеотид 64 до нуклеотид 525 от SEQ ID NO: 18.
    135
  32. 32. Метод за получаване на хематопоетичен протеин, характеризиращ се с това, че се култивира клетка, в която е въведен вектор за експресия, съгласно претенция 20, при което посочената клетка експресира хематопоетичен протеин, кодиран от ДНК сегмента, се възстановява хематопоетичният протеин.
  33. 33. Метод съгласно претенция 32, характеризиращ се с това, че посоченият хематопоетичен протеин се секретира от посочената клетка и се възстановява от средата, в която клетката е култивирана.
  34. 34. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва протеин съгласно претенция 1 в комбинация с подходящ фармацевтичен вехикулум.
  35. 35. Антитяло, което се свързва с епитоп на протеина съгласно претенция 1.
  36. 36. Метод за стимулиране продуцирането на тромбоцитите у бозайник, характеризиращ се с това, че се въвежда у посочения бозайник терапевтично ефективно количество от хематопоетичен протеин, подбран от групата, състояща се от:
    a) протеини, включващи аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 2 от аминокиселинен остатък 45 до аминокиселинен остатък 196;
    b) протеини, включващи аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 19 от аминокиселинен остатък 22 до аминокиселинен остатък 173;
    c) алелни варианти на (а) или (Ь);
    d) видове, хомоложни на (а), (Ь) или (с), характеризиращ се с това, че посоченият протеин стимулира пролиферацията или диференциацията на миелоидни или лимфоидни прекурсори, в комбинация с подходящ във фармацевтично отношение носител.
  37. 37. Проба, която включва олигонуклеотид от поне 14 нуклеотида, чиято последователност е поне 80% идентична на част със същата дължина от:
    (a) SEQ ID NO: 1;
    (b) SEQ ID NO: 18;
    (c) SEQ ID NO: 28; или (d) последователности, комплементарни на SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 28.
  38. 38. Метод за установяване в смес от ДНК молекули на ДНК молекула, кодираща тромбопоетин, характеризиращ се с това, че включва сондиране
    136 на смес от ДНК молекули със сонда, която включва един олигонуклеотид с поне 14 нуклеотида, чиято последователност е поне 80% идентична на част със същата дължина от:
    (a) SEQ ID NO: 1;
    (b) SEQ ID NO: 18;
    (c) SEQ ID NO: 28; или (d) последователности, комплементарни на SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 28; и установяване на ДНК молекули, към която хибридизира посочената сонда.
  39. 39. Метод за стимулиране клетъчната пролиферация, характеризиращ се с това, че към култивирани костно-мозъчни клетки се добавя изолиран протеин съгласно претенция 1, в количество, достатъчно да стимулира клетъчната пролиферация.
  40. 40. Метод съгласно претенция 39, характеризиращ се с това, че посочените клетки са мегакариоцити или мегакариоцитни прекурсори.
  41. 41. Метод за пречистване на тромбопоетин, характеризиращ се с това, че включва:
    - разтвор, съдържащ тромбопоетин, се излага на въздействието на антитяло, прикачено към твърда повърхност, като посоченото антитяло се свързва с един епитоп на протеина съгласно претенция 1;
    - посоченото антитяло за отстраняване на несвързаните замърсители се промива;
    - свързаният тромбопоетин от посоченото антитяло се елуира;
    - посоченият елуиран тромбопоетин се възстановява.
BG100771A 1994-02-14 1996-08-06 Хематопоетичен протеин и материали и методи за неговото получаване BG63508B1 (bg)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19602594A 1994-02-14 1994-02-14
US20319794A 1994-02-25 1994-02-25
US21520394A 1994-03-21 1994-03-21
US25249194A 1994-06-01 1994-06-01
PCT/US1994/008806 WO1995021920A1 (en) 1994-02-14 1994-08-05 Hematopoietic protein and materials and methods for making it

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG100771A BG100771A (bg) 1997-08-29
BG63508B1 true BG63508B1 (bg) 2002-03-29

Family

ID=27498094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG100771A BG63508B1 (bg) 1994-02-14 1996-08-06 Хематопоетичен протеин и материали и методи за неговото получаване

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5989537A (bg)
EP (1) EP0745125A1 (bg)
JP (1) JPH09508797A (bg)
KR (1) KR100289201B1 (bg)
CN (1) CN1148408A (bg)
AU (1) AU691828B2 (bg)
BG (1) BG63508B1 (bg)
BR (1) BR9408534A (bg)
CA (1) CA2183266A1 (bg)
CZ (1) CZ221496A3 (bg)
FI (1) FI963185A (bg)
HU (1) HUT75359A (bg)
NO (1) NO963371L (bg)
NZ (1) NZ271230A (bg)
PL (1) PL178384B1 (bg)
SK (1) SK100896A3 (bg)
WO (1) WO1995021920A1 (bg)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1103782C (zh) * 1994-03-31 2003-03-26 安姆根有限公司 单聚乙二醇化的mgdf多肽
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
TW387940B (en) * 1995-01-17 2000-04-21 Kirin Brewery Anti-tpo monodonal antibody
CA2212006A1 (en) 1995-02-03 1996-08-08 G.D. Searle & Co. Novel c-mpl ligands
US5696250A (en) * 1995-02-15 1997-12-09 Amgen Inc. DNA encoding megakaryocyte growth and development factor analogs
US5989538A (en) * 1995-02-15 1999-11-23 Amgen Inc. Mpl ligand analogs
TW434020B (en) * 1995-03-15 2001-05-16 Kirin Brewery Methods for preventing adsorption of thrombopoietin (TPO), and stable top-containing compositions
TW434021B (en) * 1995-03-15 2001-05-16 Kirin Brewery Methods for preventing adsorption of thrombopoietin (TPO), and stable TPO-containing compositions
US6251864B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5869451A (en) * 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
EP0885242B1 (en) 1995-06-07 2008-03-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor
TW497972B (en) * 1995-06-08 2002-08-11 Kirin Brewery Stable thrombopoietin (TPO)-containing lyophilized compositions
US6060052A (en) * 1995-10-30 2000-05-09 Systemix, Inc. Methods for use of Mpl ligands with primitive human hematopoietic stem cells
US5792850A (en) * 1996-05-23 1998-08-11 Zymogenetics, Inc. Hematopoietic cytokine receptor
US7091311B2 (en) 1996-06-07 2006-08-15 Smithkline Beecham Corporation Peptides and compounds that bind to a receptor
US6884419B1 (en) * 1996-12-23 2005-04-26 Kyowa Hakko Kogyo, Co., Ltd. hG-CSF fusion polypeptide having c-mpl activity, DNA coding for same and methods of treating anemia using same
US20030228666A1 (en) 1998-06-30 2003-12-11 Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd. Novel human thrombopoietin mutein
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
HU228582B1 (en) 1998-10-23 2013-04-29 Kirin Amgen Inc Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity
CA2354325C (en) 1998-12-07 2011-08-16 Zymogenetics, Inc. Growth factor homolog zvegf3
US6776984B1 (en) 1999-08-20 2004-08-17 George R. Schwartz Induced regeneration and repair of damaged neurons and nerve axon myelin
CY2010012I2 (el) 2000-05-25 2020-05-29 Novartis Ag Μιμητικα θρομβοποιητινης
DE60128093T2 (de) 2000-06-30 2007-12-27 Zymogenetics, Inc., Seattle Interferon-ähnliches protein zcyto21
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
EP1336846A1 (en) * 2002-02-13 2003-08-20 Procorde GmbH Method for generating recombinant human platelets for identifying therapeutic target proteins
WO2003080806A2 (en) * 2002-03-18 2003-10-02 National Jewish Medical And Research Center Method for production of neutrophils and uses therefor
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
DE10227611A1 (de) * 2002-06-20 2004-01-15 Bionethos Holding Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Vermehrung und Differenzierung von Zellen in Anwesenheit von Wachstumsfaktoren und einer biologischen Matrix oder Trägerstruktur
US20040028661A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-12 Bartelmez Stephen H. Expansion of cells using thrombopoietin and anti-transforming growth factor-beta
AU2003276846A1 (en) * 2002-08-09 2004-02-25 Xencor Thrombopoiesis-stimulating proteins having reduced immunogenicity
NZ566812A (en) 2002-09-18 2009-07-31 Ortho Mcneil Pharm Inc Methods of increasing platelet and hematopoietic stem cell production
US20090048318A1 (en) * 2003-04-29 2009-02-19 Connie Erickson-Miller Methods for treating degenerative diseases/injuries
EP1622609A4 (en) 2003-04-29 2008-09-03 Smithkline Beecham Corp METHODS OF TREATING DEGENERATIVE DISEASES / LESIONS
US20090143453A1 (en) * 2003-04-29 2009-06-04 Connie Erickson-Miller Methods for treating degenerative diseases/injuries
US20100004302A1 (en) * 2003-04-29 2010-01-07 Connie Erickson-Miller Methods for Treating Degenerative Diseases/Injuries
US20090298179A1 (en) * 2003-04-29 2009-12-03 Connie Erickson-Miller Methods For Treating Degenerative Diseases/Injuries
CN1910200A (zh) 2003-08-07 2007-02-07 津莫吉尼蒂克斯公司 Il－28和il－29的均一化制剂
LT1675606T (lt) 2003-08-28 2017-11-10 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Peptidai ir junginiai, kurie jungiasi prie trombopoetino receptorių
US7723295B2 (en) 2003-08-28 2010-05-25 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Peptides and compounds that bind to a receptor
DK2213295T3 (da) * 2003-10-24 2013-05-06 Nora Therapeutics Inc Fremgangsmåde til opnåelse af data, som er nyttige til identifikation af en patient, som er udsat for risiko for at have vanskeligheder ved at opretholde en graviditet
US8338373B2 (en) * 2003-10-24 2012-12-25 Nora Therapeutics, Inc. Method for reducing the risk of spontaneous abortion in a human female subject
US20090226397A1 (en) * 2003-10-24 2009-09-10 Nora Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing the likelihood of implantation failure or miscarriage in recipients of artificial insemination
DK2233150T3 (en) 2003-12-30 2016-12-12 Augustinus Bader Erythropoietin for use in the treatment of wounds or transplantation of cells
CA2572765C (en) 2004-07-08 2013-05-21 Amgen Inc. Compound having improved bioefficiency when administered in a multidose regimen
US8252587B2 (en) * 2004-10-25 2012-08-28 Celerant Therapeutics, Inc. Methods of expanding myeloid cell populations and uses thereof
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
WO2007102946A2 (en) 2006-01-23 2007-09-13 Amgen Inc. Crystalline polypeptides
US7981425B2 (en) 2006-06-19 2011-07-19 Amgen Inc. Thrombopoietic compounds
MX2009012609A (es) 2007-05-22 2009-12-07 Amgen Inc Composiciones y metodos para producir proteinas de fusion bioactivas.
EP2390261A4 (en) 2009-01-20 2012-11-14 Hanall Biopharma Co Ltd MODIFIED HUMAN THROMBOPOIETIN POLYPEPTIDE FRAGMENT AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5154921A (en) * 1990-07-13 1992-10-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Promotion of maturation of hematopoietic progenitor cells
US5571686A (en) * 1994-04-14 1996-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Method of using megapoietin for prolonging the survival & viability of platlets

Also Published As

Publication number Publication date
NO963371D0 (no) 1996-08-13
BR9408534A (pt) 1997-08-05
CZ221496A3 (en) 1997-07-16
NO963371L (no) 1996-10-11
US5989537A (en) 1999-11-23
PL178384B1 (pl) 2000-04-28
AU7481094A (en) 1995-08-29
SK100896A3 (en) 1997-10-08
PL315914A1 (en) 1996-12-09
FI963185A0 (fi) 1996-08-14
JPH09508797A (ja) 1997-09-09
CA2183266A1 (en) 1995-08-17
HUT75359A (en) 1997-05-28
EP0745125A1 (en) 1996-12-04
FI963185A (fi) 1996-08-14
WO1995021920A1 (en) 1995-08-17
CN1148408A (zh) 1997-04-23
KR100289201B1 (ko) 2001-05-02
BG100771A (bg) 1997-08-29
AU691828B2 (en) 1998-05-28
HU9602224D0 (en) 1996-10-28
NZ271230A (en) 1998-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG63508B1 (bg) Хематопоетичен протеин и материали и методи за неговото получаване
RO117110B1 (ro) POLIPEPTIDA LIGAND mpl, ACID NUCLEIC, CARE O CODIFICA, VECTOR DE EXPRESIE, PROCEDEU PENTRU PRODUCEREA POLIPEPTIDEI LIGAND, SI COMPOZITIE FARMACEUTICA CU ACEASTA
JP2002516103A (ja) インターロイキン２１およびインターロイキン２２
WO1995021919A2 (en) Protein having tpo activity
UA73719C2 (en) Human interleukin-2 mutant which activates preferably t-cells as compared with natural killer cells, pharmaceutical composition, polynucleotide, vector, procariotic cell, a method for the stimulation of immune system
JP2002502589A (ja) ４５個のヒト分泌タンパク質
JP2002533058A (ja) ９７個のヒト分泌タンパク質
KR20010042364A (ko) 성숙 ＦＬＩＮＴ(ｍＦＬＩＮＴ) 폴리펩타이드 또는 ＴＮＦ수용체인 ＯＰＧ3의 치료학적 용도
US20090028831A1 (en) Stem cell regulator, compositions and methods of use
WO1996020955A1 (en) Purified thrombopoietin and method of making it
RU2233881C2 (ru) Средства и способ получения гемопоэтического белка
CN1153780C (zh) 具有血小板生成素活性的蛋白质
AU723793B2 (en) Hematopoietic protein and materials and methods for making it
KR20010043090A (ko) 신규인 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코드화하는 ｃＤＮＡ및 그 용도
JP2002502601A (ja) 樹状富化分泌リンパ球活性化分子
TW498079B (en) Protein having TPO activity
JP2991640B2 (ja) ヒトｔｐｏ活性を有するタンパク質
JPH08228781A (ja) Ｔｐｏ活性を有するタンパク質をコードするｄｎａ
JP2001501456A (ja) 分泌蛋白およびそれらをコードするポリヌクレオチド