JP2991640B2 - ヒトｔｐｏ活性を有するタンパク質 - Google Patents
ヒトｔｐｏ活性を有するタンパク質Info
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Description
【産業上の利用分野】本発明は巨核球前駆細胞の増殖お
よび分化を促進するか、又は生体内で特異的に血小板の
産生を刺激、または増強する活性を有する新規タンパク
質、及びそのようなタンパク質の用途に関する。
よび分化を促進するか、又は生体内で特異的に血小板の
産生を刺激、または増強する活性を有する新規タンパク
質、及びそのようなタンパク質の用途に関する。
【従来の技術】巨核球は主に骨髄中で観察される、多核
で細胞質が豊富な大型の細胞であり、血小板を産生す
る。巨核球の源は骨髄中の多能性幹細胞である。多能性
幹細胞がある程度分化して、巨核球系だけに方向付けら
れた巨核球前駆細胞（ＣＦＵ−ＭＫ）となり、さらに増
殖・分化して巨核球となる。巨核球はさらに核の倍数性
の増加（ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、細胞質
の成熟（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｔｕｒａｔｉｏ
ｎ）を遂げて、最終的に無核の細胞質断片である血小板
を血液循環へ放出する。１個の成熟した巨核球から平均
して２０００〜４０００個の血小板が生成される。血小
板の産生機序については不明な点が多いが、巨核球は骨
髄の静脈洞の内皮下に局在しており、その細胞質が、内
皮を貫通して、静脈洞内壁にひも状の突起を出し、血小
板を放出すると考えられている。このような巨核球造
血、および血小板産生に関して、特異的な産生調節機構
の存在が示唆されてきた。健常人や正常な動物では、有
効な血小板数が維持されているが、例えば、正常な動物
へ抗血小板抗体を投与すると、短時間で急激に血小板だ
けが減少し、その後増加し始め、さらに一過性に正常値
を越えるが、最終的には再び正常値に戻ることが知られ
ている。また、臨床においても、赤血球数や白血球数が
正常であるにもかかわらず、血小板数の低下（血小板減
少症）や血小板増加症に陥ることが分かっている。しか
しながら、現在までのところ、そのような産生機構を担
う特異的な調節因子（例えば、赤血球産生におけるエリ
スロポイエチンのような存在）の単離、同定は成功して
いない。血小板の最も重要な機能は、止血機構における
止血栓の形成である。血小板減少により、止血機構が正
常に作働しなくなると、出血傾向を示す。癌の放射線療
法や化学療法では、骨髄抑制による血小板減少症は致命
的な合併症であり、そのような癌患者には出血傾向を防
ぐための血小板輸血が施される。また、血小板輸血は骨
髄移植を受けた患者や再生不良性貧血の患者にも施され
る。そのような血小板輸血のための血小板は、健常な血
液提供者の血液から血小板フェレーシスによって調製さ
れるが、輸血用血小板は貯蔵寿命が短く、細菌感染によ
る汚染の可能性がある。また患者をヒト免疫不全ウィル
ス（ＨＩＶ）または各種の肝炎ウィルスの様な危険なウ
ィルスにさらしたり、患者に輸血血小板表面の組織適合
性抗原（ＨＬＡ）に対する抗体を誘導したり、あるいは
輸血用血小板に混入するリンパ球により移植片対宿主病
（ＧＶＨＤ）を引き起こしたりする危険性がある。従っ
て、血小板減少症患者で、内在性の血小板産生を刺激
し、同時に血小板輸血依存を減らすことができれば、極
めて有益である。また、癌の放射線療法や化学療法を受
けている患者で、血小板減少を是正または防止すること
ができれば、それらの治療を一層安全にし、治療の集中
度を高めることが可能となり、さらに一層の制癌効果が
期待できるであろう。そのような理由から、巨核球およ
び血小板の産生調節に関与する特異的な調節因子の分
離、同定のための数多くの研究が熱心に行なわれてき
た。試験管内の研究によれば、巨核球系細胞の増殖・分
化の過程に関与する調節因子は次の二つに大別されると
考えられている（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１０巻、１０１−１０４
頁、（１９８２）を参照）。巨核球コロニー刺激因子
（Ｍｅｇ−ＣＳＦ）はＣＦＵ−ＭＫの増殖・分化を促進
する調節因子であり、実験上、半固形の培養液中で巨核
球からなる集塊（コロニー）の形成を誘導する活性を有
する。もう一つの調節因子は、巨核球増幅因子（Ｍｅｇ
−Ｐｏｔ）、巨核球刺激因子、血小板生成刺激因子など
と呼ばれ、主にＣＦＵ−ＭＫ以降の分化段階の巨核球に
働き、分化・成熟を促進させる。実験上では、しばしば
Ｍｅｇ−ＣＳＦ活性を増幅する活性として検出される。
また、実験的に血小板減少症にした動物の血小板減少期
の血清や血漿を別の正常動物に注入すると、血小板が増
加することから、生体内で血小板増加作用を有する体液
性因子の存在が考えられており、スロンボポエチン（ｔ
ｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）と呼ばれる。近
年遺伝子がクローニングされたサイトカインのいくつか
について、試験管内での巨核球系細胞への作用および血
小板増加作用が調べられている。ヒトＩＬ−３はヒト巨
核球コロニーの形成を刺激し（Ｂｒｕｎｏら、Ｅｘｐ．
Ｈｅｍａｔｏｌ．、１６巻、３７１−３７７頁、（１９
８８））、少なくともサルでは血小板数の増加をもたら
す（Ｄｏｎａｈｕｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻、１
８２０・頁、（１９８８））。しかし、ＩＬ−３はすべ
ての造血細胞の増殖、分化に影響を及ぼす因子であり、
巨核球造血、および血小板産生の特異的調節因子とは区
別することができる。ヒトＩＬ−６はＭｅｇ−ＣＳＦ活
性は示さないが、未熟な巨核球に作用して成熟巨核球へ
の分化を促進する（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｅｘｐ，Ｈｅ
ｍａｔｏｌ．、１８巻、６９−頁、（１９９０）。マウ
スやサルにおいて、血小板増加作用を示し、骨髄巨核球
の大きさ、および核の倍数性を増加させるが、体重の減
少や急性期蛋白質の誘導などの副作用も認められている
（Ａｓａｎｏら、Ｂｌｏｏｄ、７５巻、１６０２−１６
０５頁、（１９９０）；Ｓｔａｈｌら、Ｂｌｏｏｄ、７
８巻、１４６７−１４７５頁、（１９９１））。ヒトＩ
Ｌ−１１もＭｅｇ−ＣＳＦ活性は示さず、Ｍｅｇ−Ｐｏ
ｔ活性を発揮し、マウスを用いて血小板増加作用が報告
されている（Ｎｅｂｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、８１巻、９０
１−９０８頁、（１９９３））。また、ヒトＬＩＦはサ
ルにおいて、有意に血小板数を増加させるが（Ｍａｙｅ
ｒら、Ｂｌｏｏｄ、８１巻、３２２６−３２３３頁、
（１９９３））、試験管内での巨核球への作用は微弱で
ある （Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．、１５３巻、３０５−３１２頁、（１９９
２））。これらのサイトカインには血小板増加因子とし
ての臨床応用の可能性が期待されているが、巨核球系だ
けに特異的に作用するものではなく、また、副作用も認
められる。従って、臨床においては、より副作用が少な
い、巨核球−血小板系に特異的な血小板増加因子が待望
されている。古くから血小板減少症のヒトや動物の血
清、血漿、尿あるいはある種のヒト培養細胞株の上清中
に、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−Ｐｏｔ、あるいはＴＰＯ
活性の存在が報告されているが、このような因子が単独
で、あるいは複数存在して活性が発揮されるのか、また
既知因子との異同など、ほとんど未解明のままである。
ヒト生体由来の因子について、Ｈｏｆｆｍａｎらは血小
板の減少に加え、骨髄巨核球の減少した再生不良性貧血
や、無巨核球性血小板減少性紫斑病の患者の血清の中
に、健常人のそれに比べて、有意に高いＭｅｇ−ＣＳＦ
活性を見いだし（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．
Ｍｅｄ．、３０５巻、５３３−５３８頁、（１９８
１））、Ｍａｚｕｒらはさらに、再生不良性貧血患者の
血清中のこのＭｅｇ−ＣＳＦ活性はＩＬ−３あるいはＧ
Ｍ−ＣＳＦとは異なることを示した（Ｍａｚｕｒら、Ｂ
ｌｏｏｄ、７６巻、２９０−２９７頁、（１９９
０））。類似のＭｅｇ−ＣＳＦ活性は、集中的に化学療
法を施した癌患者や骨髄移植を施した患者の血清中にも
検出されている（Ｍａｚｕｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．、１２巻、６２４−６２８頁、（１９８４）；ｄｅ
ＡｌａｒｃｏｎとＳｃｈｍｉｅｄｅｒ、Ｐｒｏｇ Ｃ
ｌｉｎ．Ｂｉｏ．Ｒｅｓ．、２１５巻、３３５−３４０
頁、（１９８６））。Ｈｏｆｆｍａｎらは、骨髄巨核球
低形成の血小板減少症患者の血漿から、見かけの分子量
４６０００を有するＭｅｇ−ＣＳＦを精製したと報告し
たが（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．、７５巻、１１７４−１１８２頁、（１９８
５））、その後の研究で精製標品の純度がアミノ酸配列
を決定するには不十分であることが判明している（Ｈｏ
ｆｆｍａｎ、Ｂｌｏｏｄ、７４巻、１１９６−１２１２
頁、（１９８９））。類似の血小板減少症患者由来の血
漿、あるいは特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）患者
の尿から、マウスでの７５Ｓｅ−セレノメチオニン（
７５Ｓｅ−ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）の新生
血小板への取り込みを促進させるＴＰＯ様活性が部分精
製され、血漿由来の活性については見かけの分子量４０
０００を有することが示されている（Ｇｒｏｓｓｉら、
Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、７２巻、２９１−２９５
頁、（１９８７）；Ｖａｎｎｕｃｃｈｉら、Ｌｅｕｋｅ
ｍｉａ、２巻、２３６−２４０頁、（１９８８）。再生
不良性貧血や重症のＩＴＰ患者の尿中にも、Ｍｅｇ−Ｃ
ＳＦ活性やＴＰＯ様活性が検出されている（Ｋａｗａｋ
ｉｔａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ，、４８巻、６
０９−６１５頁、（１９８１）；Ｋａｗａｋｉｔａら、
Ｂｌｏｏｄ、６１巻、５５６−５６０頁、（１９８
３））。さらに、Ｋａｗａｋｉｔａらは、再生不良性貧
血患者の尿抽出物に含まれるＭｅｇ−ＣＳＦ活性は、解
離条件下のゲル濾過で見かけの分子量４５０００を有す
ることを報告している（Ｋａｗａｋｉｔａら、Ｂｒ．
Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ、６２巻、７１５−７２２頁、
（１９８６））。Ｅｒｉｋｓｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒらも、
同様の試料からのＭｅｇ−ＣＳＦの精製を報告している
が、その構造は明らかにされていない（Ｅｒｉｋｓｏｎ
−Ｍｉｌｌｅｒら、“Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗ
ｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ；ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｓｅｎｔ
ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｕｓｅ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｌ
ｏｇｙ ａｎｄ ｏｎｃｏｌｏｇｙ”ｅｄ．ｂｙ Ｍｕ
ｒｐｈｙ、ＡｌｐｈａＭｅｄ Ｐｒｅｓｓ、Ｄａｙｔｏ
ｎ、Ｏｈｉｏ、２０４−２２０頁、（１９９２））。Ｔ
ｕｒｎｅｒらは、骨髄移植を施行された患者の尿からＭ
ｅｇ−ＣＳＦ活性を有する巨核球刺激因子（ＭＳＦ）を
精製し、その遺伝子をクローニングした（Ｔｕｒｎｅｒ
ら、Ｂｌｏｏｄ、７８巻、１１０６頁２７９ａ、（１９
９１）（ａｂｓｔｒ．、ｓｕｐｐｌ．１）。このＭＳＦ
は、分子量２８０００から３５０００を有するタンパク
質の二量体である。この因子が、これまで血小板減少症
患者の血清や血漿中に検出されてきたＭｅｇ−ＣＳＦと
同じ因子か否か、また生体内において血小板増加作用を
有するか否かは不明である。また、ヒト胎児腎臓由来細
胞株（ＨＥＫ細胞）の培養上清から分子量３２０００の
ＴＰＯ様活性が精製され、様々な性状が調べられている
が、いまだにその構造は明らかにされていない（ＭｃＤ
ｏｎａｌｄら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１０
６巻、１６２−１７４頁、（１９８５）；ＭｃＤｏｎａ
ｌｄ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ、７巻、
１３９−１５５頁、（１９８９））。一方で、別の研究
者により、このＨＥＫ細胞のならし培養液中に存在す
る、試験管内での巨核球の成熟を促進する主要な活性
は、この細胞が産生する既知サイトカイン、即ち、ＩＬ
−６とＥＰＯに依るという報告もある（Ｗｉｔｈｙら、
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５巻、３３６２−
３７２頁、（１９９２））。動物由来の因子について、
Ｅｖａｔｔらは、抗血小板抗体を注入したウサギの血小
板減少期の血漿中にウサギおよびマウスにおいて７５Ｓ
ｅ−セレノメチオニンの新生血小板への取り込みを促進
させるＴＰＯ様活性を報告している（Ｅｖａｔｔら、
Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、８３巻、３６４−３
７１頁、（１９７４））。その他にも１９６０年代から
１９７０年代にかけて類似の報告がいくつも見られる
（例えば、Ｏｄｅｌ１ら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｏｌ．
Ｍｅｄ．、１０８巻、４２８−４３１頁、（１９６
１）；ＥｖａｔｔとＬｅｖｉｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ、４８巻、１６１５−１６２６頁、（１９６
９）；Ｈａｒｋｅｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２
１８巻、１３７６−１３８０頁、（１９７０）；Ｓｈｒ
ｅｉｎｅｒとＬｅｖｉｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ，、４９巻、１７０９−１７１３頁、（１９７０）；
Ｐｅｎｉｎｇｔｏｎ、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．、１巻、６０
６−６０８頁、（１９７０））。Ｅｖａｔｔら、および
ＨｉｌｌとＬｅｖｉｎは、抗血小板抗体投与により誘導
した血小板減少期のウサギの血漿から、ＴＰＯ様活性を
部分精製し（Ｅｖａｔｔら、Ｂｌｏｏｄ、５４巻、３７
７−３８８頁、（１９７９）；ＨｉｌｌとＬｅｖｉｎ、
Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１４巻、７５２−７５９
頁、（１９８６））、その後さらに、試験管内において
巨核球の分化、成熟を促進させる活性、即ちＭｅｇ−Ｐ
ｏｔ活性を指標にしてこの因子の精製を進め、ゲル濾過
上で見かけの分子量４００００〜４６０００を有するこ
とを明らかにしたが、完全精製には至っていない（Ｋｅ
ｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１６巻、２６
２−２６７頁、（１９８８）；Ｈｉｌｌら、Ｅｘｐ．Ｈ
ｅｍａｔｏｌ．、２０巻、３５４−３６０頁、（１９９
２））。抗血小板抗体投与で誘導した重症の急性血小板
減少症のウサギの血漿中にはＩＬ−６活性が検出されな
いことから、このＴＰＯ様活性はＩＬ−６とは異なる分
子によって担われていることが示されている（Ｈｉｌｌ
ら、Ｂｌｏｏｄ、８０巻、３４６−３５１頁、（１９９
２））。ＴａｙｒｉｅｎとＲｏｓｅｎｂｅｒｇも、同様
のウサギの血漿、あるいはＨＥＫ細胞の培養上清から、
巨核球系のラット培養細胞株において血小板第４因子の
産生を刺激する見かけの分子量１５０００を有する因子
を精製したが、その構造は明らかにされていない（Ｔａ
ｙｒｉｅｎとＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．、２６２巻、３２６２−３２６８頁、（１９８
７））。また、Ｎａｋｅｆｆは、抗血小板抗体投与によ
り血小板減少にしたマウスの血清中にＭｅｇ−ＣＳＦ活
性を見いだしている（Ｎａｋｅｆｆ、“Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ”ｅ
ｄ．ｂｙ Ｂａｕｍ ａｎｄ Ｌｅｄｎｅｙ、Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、１１１−１２３頁、
（１９７７））。一方、同様の処置で血小板減少にした
ウサギの血漿中には、試験管内において、巨核球の成熟
を促進したり（Ｋｅｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．、１６巻、２６２−２６７頁、（１９８８）；Ｈｉ
ｌｌら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１７巻、９０３−
９０７頁、（１１）８９）、巨核球の血小板への形態変
化（ＬｅｖｅｎとＹｅｅ、Ｂｌｏｏｄ、６９巻、１０４
６−１０５２頁、（１９８７））を刺激する活性は検出
されているが、Ｍｅｇ−ＣＳＦ活性は認められていな
い。このような違いが何に起因するのか、理由は不明で
ある。Ｍｉｕｒａらは、亜致死線量の放射線を全身照射
したラットの血小板減少期の血漿中にＭｅｇ−ＣＳＦ活
性を検出し（Ｍｉｕｒａら、Ｂｌｏｏｄ、６３巻、１０
６０−１０６６頁、（１９８４））、この活性が血小板
輸血によって減少しないことから、生体内でのＭｅｇ−
ＣＳＦ活性の誘導には、血小板の減少ではなく、巨核球
の減少が必要であるとしている（Ｍｉｕｒａら、Ｅｘ
ｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１６巻、１３９−１４４頁、
（１９８８））。ＭａｚｕｒとＳｏｕｔｈは、放射線照
射により再生不良性貧血にしたイヌの血清中にＭｅｇ−
ＣＳＦ活性を検出し、ゲル濾過上で見かけの分子量１７
５０００を有することを報告している（ＭａｚｕｒとＳ
ｏｕｔｈ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１３巻、１１６
４−１１７２頁、（１９８５））。その他に、血清、血
漿、あるいは尿に由来する因子が、Ｓｔｒａｎｅｖａら
（Ｓｔｒａｎｅｖａら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１
５巻、６５７−６６３頁、（１９８７）などによっても
報告されている。このように、血小板減少症のヒトや動
物の生体試料の中に、巨核球造血、および血小板生成を
促進する因子の存在が確認されているにもかかわらず、
現在までにそのような因子の単離、生化学的ならびに生
物学的な同定、および特性決定は、天然の供給源、例え
ば血液や尿の中にそのような因子が極端に微量でしか存
在しないために成功していない。
で細胞質が豊富な大型の細胞であり、血小板を産生す
る。巨核球の源は骨髄中の多能性幹細胞である。多能性
幹細胞がある程度分化して、巨核球系だけに方向付けら
れた巨核球前駆細胞（ＣＦＵ−ＭＫ）となり、さらに増
殖・分化して巨核球となる。巨核球はさらに核の倍数性
の増加（ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、細胞質
の成熟（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｔｕｒａｔｉｏ
ｎ）を遂げて、最終的に無核の細胞質断片である血小板
を血液循環へ放出する。１個の成熟した巨核球から平均
して２０００〜４０００個の血小板が生成される。血小
板の産生機序については不明な点が多いが、巨核球は骨
髄の静脈洞の内皮下に局在しており、その細胞質が、内
皮を貫通して、静脈洞内壁にひも状の突起を出し、血小
板を放出すると考えられている。このような巨核球造
血、および血小板産生に関して、特異的な産生調節機構
の存在が示唆されてきた。健常人や正常な動物では、有
効な血小板数が維持されているが、例えば、正常な動物
へ抗血小板抗体を投与すると、短時間で急激に血小板だ
けが減少し、その後増加し始め、さらに一過性に正常値
を越えるが、最終的には再び正常値に戻ることが知られ
ている。また、臨床においても、赤血球数や白血球数が
正常であるにもかかわらず、血小板数の低下（血小板減
少症）や血小板増加症に陥ることが分かっている。しか
しながら、現在までのところ、そのような産生機構を担
う特異的な調節因子（例えば、赤血球産生におけるエリ
スロポイエチンのような存在）の単離、同定は成功して
いない。血小板の最も重要な機能は、止血機構における
止血栓の形成である。血小板減少により、止血機構が正
常に作働しなくなると、出血傾向を示す。癌の放射線療
法や化学療法では、骨髄抑制による血小板減少症は致命
的な合併症であり、そのような癌患者には出血傾向を防
ぐための血小板輸血が施される。また、血小板輸血は骨
髄移植を受けた患者や再生不良性貧血の患者にも施され
る。そのような血小板輸血のための血小板は、健常な血
液提供者の血液から血小板フェレーシスによって調製さ
れるが、輸血用血小板は貯蔵寿命が短く、細菌感染によ
る汚染の可能性がある。また患者をヒト免疫不全ウィル
ス（ＨＩＶ）または各種の肝炎ウィルスの様な危険なウ
ィルスにさらしたり、患者に輸血血小板表面の組織適合
性抗原（ＨＬＡ）に対する抗体を誘導したり、あるいは
輸血用血小板に混入するリンパ球により移植片対宿主病
（ＧＶＨＤ）を引き起こしたりする危険性がある。従っ
て、血小板減少症患者で、内在性の血小板産生を刺激
し、同時に血小板輸血依存を減らすことができれば、極
めて有益である。また、癌の放射線療法や化学療法を受
けている患者で、血小板減少を是正または防止すること
ができれば、それらの治療を一層安全にし、治療の集中
度を高めることが可能となり、さらに一層の制癌効果が
期待できるであろう。そのような理由から、巨核球およ
び血小板の産生調節に関与する特異的な調節因子の分
離、同定のための数多くの研究が熱心に行なわれてき
た。試験管内の研究によれば、巨核球系細胞の増殖・分
化の過程に関与する調節因子は次の二つに大別されると
考えられている（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１０巻、１０１−１０４
頁、（１９８２）を参照）。巨核球コロニー刺激因子
（Ｍｅｇ−ＣＳＦ）はＣＦＵ−ＭＫの増殖・分化を促進
する調節因子であり、実験上、半固形の培養液中で巨核
球からなる集塊（コロニー）の形成を誘導する活性を有
する。もう一つの調節因子は、巨核球増幅因子（Ｍｅｇ
−Ｐｏｔ）、巨核球刺激因子、血小板生成刺激因子など
と呼ばれ、主にＣＦＵ−ＭＫ以降の分化段階の巨核球に
働き、分化・成熟を促進させる。実験上では、しばしば
Ｍｅｇ−ＣＳＦ活性を増幅する活性として検出される。
また、実験的に血小板減少症にした動物の血小板減少期
の血清や血漿を別の正常動物に注入すると、血小板が増
加することから、生体内で血小板増加作用を有する体液
性因子の存在が考えられており、スロンボポエチン（ｔ
ｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）と呼ばれる。近
年遺伝子がクローニングされたサイトカインのいくつか
について、試験管内での巨核球系細胞への作用および血
小板増加作用が調べられている。ヒトＩＬ−３はヒト巨
核球コロニーの形成を刺激し（Ｂｒｕｎｏら、Ｅｘｐ．
Ｈｅｍａｔｏｌ．、１６巻、３７１−３７７頁、（１９
８８））、少なくともサルでは血小板数の増加をもたら
す（Ｄｏｎａｈｕｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻、１
８２０・頁、（１９８８））。しかし、ＩＬ−３はすべ
ての造血細胞の増殖、分化に影響を及ぼす因子であり、
巨核球造血、および血小板産生の特異的調節因子とは区
別することができる。ヒトＩＬ−６はＭｅｇ−ＣＳＦ活
性は示さないが、未熟な巨核球に作用して成熟巨核球へ
の分化を促進する（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｅｘｐ，Ｈｅ
ｍａｔｏｌ．、１８巻、６９−頁、（１９９０）。マウ
スやサルにおいて、血小板増加作用を示し、骨髄巨核球
の大きさ、および核の倍数性を増加させるが、体重の減
少や急性期蛋白質の誘導などの副作用も認められている
（Ａｓａｎｏら、Ｂｌｏｏｄ、７５巻、１６０２−１６
０５頁、（１９９０）；Ｓｔａｈｌら、Ｂｌｏｏｄ、７
８巻、１４６７−１４７５頁、（１９９１））。ヒトＩ
Ｌ−１１もＭｅｇ−ＣＳＦ活性は示さず、Ｍｅｇ−Ｐｏ
ｔ活性を発揮し、マウスを用いて血小板増加作用が報告
されている（Ｎｅｂｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、８１巻、９０
１−９０８頁、（１９９３））。また、ヒトＬＩＦはサ
ルにおいて、有意に血小板数を増加させるが（Ｍａｙｅ
ｒら、Ｂｌｏｏｄ、８１巻、３２２６−３２３３頁、
（１９９３））、試験管内での巨核球への作用は微弱で
ある （Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．、１５３巻、３０５−３１２頁、（１９９
２））。これらのサイトカインには血小板増加因子とし
ての臨床応用の可能性が期待されているが、巨核球系だ
けに特異的に作用するものではなく、また、副作用も認
められる。従って、臨床においては、より副作用が少な
い、巨核球−血小板系に特異的な血小板増加因子が待望
されている。古くから血小板減少症のヒトや動物の血
清、血漿、尿あるいはある種のヒト培養細胞株の上清中
に、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−Ｐｏｔ、あるいはＴＰＯ
活性の存在が報告されているが、このような因子が単独
で、あるいは複数存在して活性が発揮されるのか、また
既知因子との異同など、ほとんど未解明のままである。
ヒト生体由来の因子について、Ｈｏｆｆｍａｎらは血小
板の減少に加え、骨髄巨核球の減少した再生不良性貧血
や、無巨核球性血小板減少性紫斑病の患者の血清の中
に、健常人のそれに比べて、有意に高いＭｅｇ−ＣＳＦ
活性を見いだし（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．
Ｍｅｄ．、３０５巻、５３３−５３８頁、（１９８
１））、Ｍａｚｕｒらはさらに、再生不良性貧血患者の
血清中のこのＭｅｇ−ＣＳＦ活性はＩＬ−３あるいはＧ
Ｍ−ＣＳＦとは異なることを示した（Ｍａｚｕｒら、Ｂ
ｌｏｏｄ、７６巻、２９０−２９７頁、（１９９
０））。類似のＭｅｇ−ＣＳＦ活性は、集中的に化学療
法を施した癌患者や骨髄移植を施した患者の血清中にも
検出されている（Ｍａｚｕｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．、１２巻、６２４−６２８頁、（１９８４）；ｄｅ
ＡｌａｒｃｏｎとＳｃｈｍｉｅｄｅｒ、Ｐｒｏｇ Ｃ
ｌｉｎ．Ｂｉｏ．Ｒｅｓ．、２１５巻、３３５−３４０
頁、（１９８６））。Ｈｏｆｆｍａｎらは、骨髄巨核球
低形成の血小板減少症患者の血漿から、見かけの分子量
４６０００を有するＭｅｇ−ＣＳＦを精製したと報告し
たが（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．、７５巻、１１７４−１１８２頁、（１９８
５））、その後の研究で精製標品の純度がアミノ酸配列
を決定するには不十分であることが判明している（Ｈｏ
ｆｆｍａｎ、Ｂｌｏｏｄ、７４巻、１１９６−１２１２
頁、（１９８９））。類似の血小板減少症患者由来の血
漿、あるいは特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）患者
の尿から、マウスでの７５Ｓｅ−セレノメチオニン（
７５Ｓｅ−ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）の新生
血小板への取り込みを促進させるＴＰＯ様活性が部分精
製され、血漿由来の活性については見かけの分子量４０
０００を有することが示されている（Ｇｒｏｓｓｉら、
Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、７２巻、２９１−２９５
頁、（１９８７）；Ｖａｎｎｕｃｃｈｉら、Ｌｅｕｋｅ
ｍｉａ、２巻、２３６−２４０頁、（１９８８）。再生
不良性貧血や重症のＩＴＰ患者の尿中にも、Ｍｅｇ−Ｃ
ＳＦ活性やＴＰＯ様活性が検出されている（Ｋａｗａｋ
ｉｔａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ，、４８巻、６
０９−６１５頁、（１９８１）；Ｋａｗａｋｉｔａら、
Ｂｌｏｏｄ、６１巻、５５６−５６０頁、（１９８
３））。さらに、Ｋａｗａｋｉｔａらは、再生不良性貧
血患者の尿抽出物に含まれるＭｅｇ−ＣＳＦ活性は、解
離条件下のゲル濾過で見かけの分子量４５０００を有す
ることを報告している（Ｋａｗａｋｉｔａら、Ｂｒ．
Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ、６２巻、７１５−７２２頁、
（１９８６））。Ｅｒｉｋｓｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒらも、
同様の試料からのＭｅｇ−ＣＳＦの精製を報告している
が、その構造は明らかにされていない（Ｅｒｉｋｓｏｎ
−Ｍｉｌｌｅｒら、“Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗ
ｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ；ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｓｅｎｔ
ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｕｓｅ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｌ
ｏｇｙ ａｎｄ ｏｎｃｏｌｏｇｙ”ｅｄ．ｂｙ Ｍｕ
ｒｐｈｙ、ＡｌｐｈａＭｅｄ Ｐｒｅｓｓ、Ｄａｙｔｏ
ｎ、Ｏｈｉｏ、２０４−２２０頁、（１９９２））。Ｔ
ｕｒｎｅｒらは、骨髄移植を施行された患者の尿からＭ
ｅｇ−ＣＳＦ活性を有する巨核球刺激因子（ＭＳＦ）を
精製し、その遺伝子をクローニングした（Ｔｕｒｎｅｒ
ら、Ｂｌｏｏｄ、７８巻、１１０６頁２７９ａ、（１９
９１）（ａｂｓｔｒ．、ｓｕｐｐｌ．１）。このＭＳＦ
は、分子量２８０００から３５０００を有するタンパク
質の二量体である。この因子が、これまで血小板減少症
患者の血清や血漿中に検出されてきたＭｅｇ−ＣＳＦと
同じ因子か否か、また生体内において血小板増加作用を
有するか否かは不明である。また、ヒト胎児腎臓由来細
胞株（ＨＥＫ細胞）の培養上清から分子量３２０００の
ＴＰＯ様活性が精製され、様々な性状が調べられている
が、いまだにその構造は明らかにされていない（ＭｃＤ
ｏｎａｌｄら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１０
６巻、１６２−１７４頁、（１９８５）；ＭｃＤｏｎａ
ｌｄ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ、７巻、
１３９−１５５頁、（１９８９））。一方で、別の研究
者により、このＨＥＫ細胞のならし培養液中に存在す
る、試験管内での巨核球の成熟を促進する主要な活性
は、この細胞が産生する既知サイトカイン、即ち、ＩＬ
−６とＥＰＯに依るという報告もある（Ｗｉｔｈｙら、
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５巻、３３６２−
３７２頁、（１９９２））。動物由来の因子について、
Ｅｖａｔｔらは、抗血小板抗体を注入したウサギの血小
板減少期の血漿中にウサギおよびマウスにおいて７５Ｓ
ｅ−セレノメチオニンの新生血小板への取り込みを促進
させるＴＰＯ様活性を報告している（Ｅｖａｔｔら、
Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、８３巻、３６４−３
７１頁、（１９７４））。その他にも１９６０年代から
１９７０年代にかけて類似の報告がいくつも見られる
（例えば、Ｏｄｅｌ１ら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｏｌ．
Ｍｅｄ．、１０８巻、４２８−４３１頁、（１９６
１）；ＥｖａｔｔとＬｅｖｉｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ、４８巻、１６１５−１６２６頁、（１９６
９）；Ｈａｒｋｅｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２
１８巻、１３７６−１３８０頁、（１９７０）；Ｓｈｒ
ｅｉｎｅｒとＬｅｖｉｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ，、４９巻、１７０９−１７１３頁、（１９７０）；
Ｐｅｎｉｎｇｔｏｎ、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．、１巻、６０
６−６０８頁、（１９７０））。Ｅｖａｔｔら、および
ＨｉｌｌとＬｅｖｉｎは、抗血小板抗体投与により誘導
した血小板減少期のウサギの血漿から、ＴＰＯ様活性を
部分精製し（Ｅｖａｔｔら、Ｂｌｏｏｄ、５４巻、３７
７−３８８頁、（１９７９）；ＨｉｌｌとＬｅｖｉｎ、
Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１４巻、７５２−７５９
頁、（１９８６））、その後さらに、試験管内において
巨核球の分化、成熟を促進させる活性、即ちＭｅｇ−Ｐ
ｏｔ活性を指標にしてこの因子の精製を進め、ゲル濾過
上で見かけの分子量４００００〜４６０００を有するこ
とを明らかにしたが、完全精製には至っていない（Ｋｅ
ｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１６巻、２６
２−２６７頁、（１９８８）；Ｈｉｌｌら、Ｅｘｐ．Ｈ
ｅｍａｔｏｌ．、２０巻、３５４−３６０頁、（１９９
２））。抗血小板抗体投与で誘導した重症の急性血小板
減少症のウサギの血漿中にはＩＬ−６活性が検出されな
いことから、このＴＰＯ様活性はＩＬ−６とは異なる分
子によって担われていることが示されている（Ｈｉｌｌ
ら、Ｂｌｏｏｄ、８０巻、３４６−３５１頁、（１９９
２））。ＴａｙｒｉｅｎとＲｏｓｅｎｂｅｒｇも、同様
のウサギの血漿、あるいはＨＥＫ細胞の培養上清から、
巨核球系のラット培養細胞株において血小板第４因子の
産生を刺激する見かけの分子量１５０００を有する因子
を精製したが、その構造は明らかにされていない（Ｔａ
ｙｒｉｅｎとＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．、２６２巻、３２６２−３２６８頁、（１９８
７））。また、Ｎａｋｅｆｆは、抗血小板抗体投与によ
り血小板減少にしたマウスの血清中にＭｅｇ−ＣＳＦ活
性を見いだしている（Ｎａｋｅｆｆ、“Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ”ｅ
ｄ．ｂｙ Ｂａｕｍ ａｎｄ Ｌｅｄｎｅｙ、Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、１１１−１２３頁、
（１９７７））。一方、同様の処置で血小板減少にした
ウサギの血漿中には、試験管内において、巨核球の成熟
を促進したり（Ｋｅｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．、１６巻、２６２−２６７頁、（１９８８）；Ｈｉ
ｌｌら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１７巻、９０３−
９０７頁、（１１）８９）、巨核球の血小板への形態変
化（ＬｅｖｅｎとＹｅｅ、Ｂｌｏｏｄ、６９巻、１０４
６−１０５２頁、（１９８７））を刺激する活性は検出
されているが、Ｍｅｇ−ＣＳＦ活性は認められていな
い。このような違いが何に起因するのか、理由は不明で
ある。Ｍｉｕｒａらは、亜致死線量の放射線を全身照射
したラットの血小板減少期の血漿中にＭｅｇ−ＣＳＦ活
性を検出し（Ｍｉｕｒａら、Ｂｌｏｏｄ、６３巻、１０
６０−１０６６頁、（１９８４））、この活性が血小板
輸血によって減少しないことから、生体内でのＭｅｇ−
ＣＳＦ活性の誘導には、血小板の減少ではなく、巨核球
の減少が必要であるとしている（Ｍｉｕｒａら、Ｅｘ
ｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１６巻、１３９−１４４頁、
（１９８８））。ＭａｚｕｒとＳｏｕｔｈは、放射線照
射により再生不良性貧血にしたイヌの血清中にＭｅｇ−
ＣＳＦ活性を検出し、ゲル濾過上で見かけの分子量１７
５０００を有することを報告している（ＭａｚｕｒとＳ
ｏｕｔｈ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１３巻、１１６
４−１１７２頁、（１９８５））。その他に、血清、血
漿、あるいは尿に由来する因子が、Ｓｔｒａｎｅｖａら
（Ｓｔｒａｎｅｖａら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１
５巻、６５７−６６３頁、（１９８７）などによっても
報告されている。このように、血小板減少症のヒトや動
物の生体試料の中に、巨核球造血、および血小板生成を
促進する因子の存在が確認されているにもかかわらず、
現在までにそのような因子の単離、生化学的ならびに生
物学的な同定、および特性決定は、天然の供給源、例え
ば血液や尿の中にそのような因子が極端に微量でしか存
在しないために成功していない。
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、巨核球前駆細胞の増殖および分化を促進するか、お
よび／又は生体内で特異的に血小板の産生を刺激、また
は増強する活性（ＴＰＯ活性）を有するタンパク質（Ｔ
ＰＯ）を天然の供給源から単離・同定し、更にはそのよ
うなタンパク質をコードする遺伝子を単離することによ
って組換えＤＮＡ技術を用いて、該タンパク質を均質に
大量生産する手段を提供することにある。それが可能と
なれば、現在採用されている血小板輸血にとって代わる
か、頻度を減らすことができ、あるいは血小板障害の治
療および診断にも使うことができる。
は、巨核球前駆細胞の増殖および分化を促進するか、お
よび／又は生体内で特異的に血小板の産生を刺激、また
は増強する活性（ＴＰＯ活性）を有するタンパク質（Ｔ
ＰＯ）を天然の供給源から単離・同定し、更にはそのよ
うなタンパク質をコードする遺伝子を単離することによ
って組換えＤＮＡ技術を用いて、該タンパク質を均質に
大量生産する手段を提供することにある。それが可能と
なれば、現在採用されている血小板輸血にとって代わる
か、頻度を減らすことができ、あるいは血小板障害の治
療および診断にも使うことができる。
【課題を解決するための手段】本発明によれば、ＴＰＯ
活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする新
規ＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と言う）が提供さ
れる。本発明のＤＮＡとしては、配列番号１６に示され
たアミノ酸配列をコードするＤＮＡがある。本発明のＤ
ＮＡには、配列番号１６に示されたアミノ酸配列およ
び、ＴＰＯ活性を保持する限りにおいてそのアミノ酸配
列の一部が改変（置換、欠失、挿入、および／または付
加）されているもの、即ち、ＴＰＯ誘導体をコードする
ＤＮＡが含まれる。別の言い方をすれば、本発明のＤＮ
Ａとしては、アミノ酸配列が実質的に配列番号１６に示
されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含まれる。こ
こで言う、「実質的に配列番号１６に示されたアミノ酸
配列」とは、配列番号１６に示されたアミノ酸配列」に
加えて、「ＴＰＯ活性を保持する限りにおいて、配列番
号１６に示されたアミノ酸配列の一部に置換、欠失、挿
入および／または付加などがあるアミノ酸配列」を含む
ものである。なお、ここで言う「アミノ酸配列をコード
するＤＮＡ」とは縮重関係にあるすべての塩基配列を有
するＤＮＡを意味している。更に、本発明のＤＮＡは、
ＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡであって、以下（ａ）〜（ｃ）から選ばれる
ＤＮＡを包含する。 （ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６に示
されたＤＮＡまたはそれらの相補鎖 （ｂ）（ａ）のＤＮＡまたはその断片と（厳格な条件下
で）ハイブリッド形成するＤＮＡ （ｃ）遺伝コードの縮重がなければ（ａ）、（ｂ）のＤ
ＮＡとハイブリッド形成しうるＤＮＡ。 また、別の言い方をすれば、本発明のＤＮＡは以下の
（ａ）、（ｂ）のいずれかに示されたＤＮＡも包含す
る。 （ａ）大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＥＦ１８Ｓ
−Ａ２α（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４５６５）に組込
まれているＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ、または大腸菌ＤＨ５に担持され
たベクターｐＨＴ１−２３１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４５６４）に組込まれているＴＰＯ活性を有するタン
パク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ （ｂ）ＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡであって、（ａ）のＤＮＡまたはその
断片と（厳格な条件下で）ハイブリッド形成するＤＮ
Ａ。 ここで“厳格な”ハイブリダイゼーション条件という表
現は、縮重配列の、および／または単一配列のオリゴヌ
クレオチドプライマー（プローブ）を用いることにより
行う、本発明においてＤＮＡのＰＣＲ増幅をとりあげた
一連の実施例において使用されるものである。例とし
て、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）の
第１１章および第１４章、あるいは、Ａｕｓｕｂｅｌら
編“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９３）のユニ
ット２．１０を参照のこと。本発明のＤＮＡとしては配
列番号１６に示されたアミノ酸配列のうち、１位から１
６３位のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、か
つＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも
含まれる。このようなＤＮＡは、制限酵素による切断部
位の供与、および／または、発現を容易にするような発
現ベクター構築のための開始部、終止部または中間部へ
のＤＮＡの付加的供与を含むことができる。また、非哺
乳類宿主を選択する場合には、それにおける発現に好ま
しいコドン（優先コドン）を組み込んでも良い。本発明
のＤＮＡとしては、ヒトをはじめとする哺乳動物細胞な
どからｍＲＮＡを調製した後、既知の方法で作製された
ｃＤＮＡライブラリーから、既知の方法によってスクリ
ーニングすることによって得られたｃＤＮＡがある。こ
の場合のｍＲＮＡの供給源としては、ラット肝臓細胞由
来の細胞株ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞、ＨＴＣ細胞、Ｈ
４−ＩＩ−Ｅ細胞、ラット肝臓、腎臓、脳、小腸、ヒト
肝臓等が挙げられる。また、本発明のＤＮＡとしては、
ヒトをはじめとする哺乳動物細胞から既知の方法で作製
されたゲノムライブラリーから既知の方法でスクリーニ
ングされたゲノムＤＮＡであってもよい。この場合のゲ
ノムＤＮＡの供給源としては、ヒト、ラット、マウス等
の染色体ＤＮＡが挙げられる。また、このようにして得
られた、ＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードするｃ
ＤＮＡを周知の部位特異的突然変異法を用いて修飾する
ことによって、一部のアミノ酸配列が改変されたもの、
即ちＴＰＯ誘導体をコードするＤＮＡを得ることができ
る。また、本明細書中で開示されたＴＰＯ活性を有する
タンパク質のアミノ酸配列／塩基配列に基づいて、その
一部のアミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードす
るＤＮＡは、その一部または全部を化学合成することに
よっても当業者が容易に得ることができる。本発明のＤ
ＮＡは、種々の遺伝子組換え技術によってＴＰＯ活性を
有するタンパク質を大量生産するために有用な物質であ
る。更に、本発明のＤＮＡは、ＴＰＯの関連タンパク質
をコードする遺伝子、並びに他の哺乳動物のＴＰＯのｃ
ＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡを単離する場合に標識化プ
ローブとして用いるのに適した物質である。また、ヒト
および他の哺乳類種における遺伝子療法において有用で
ある。本発明のＤＮＡは、大量のＴＰＯおよびＴＰＯ生
産のための真核宿主として用いることができるトランス
ジェニック哺乳類種の開発に有用である（Ｐａｌｍｉｔ
ｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、８０９−８１４、
（１９８３））。また、本発明によれば、上記ＴＰＯ活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ
ベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿
主細胞を培養し、産生されたＴＰＯ活性を有するタンパ
ク質を分離・精製することを特徴とするＴＰＯ活性を有
するタンパク質の製造方法が提供される。この場合の宿
主細胞としては、原核生物（例えば細菌、好ましくは大
腸菌）、真核生物（例えば酵母、昆虫、あるいは哺乳動
物）細胞を用いることができる。哺乳動物細胞の例とし
ては、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈ
ｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、Ｘ６
３．６．５．３．細胞、Ｃ−１２７細胞、ＢＨＫ（Ｂａ
ｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ヒト由来
細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）等があげられる。酵母の
例としては、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やメタノール資化性酵母（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等があげられる。昆虫細
胞の例としては、蚕培養細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）
等があげられる。これらの宿主細胞を形質転換させるた
めに用いられるベクターには、大腸菌用としてｐＫＣ３
０（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ Ｈ．ａｎｄ Ｍ．Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ、２９２、１２８−１３２、１
９８１）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍａｎｎ Ｅ．ら、Ｇｅ
ｎｅ６、６９、３０１−３１５、１９８８）等があげら
れる。哺乳動物細胞用としてはｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１、３２７−３４１、１９８２）、
ｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａら；Ｇｅｎｅ、１０８、１９３
−２００、１９９１）、あるいはｐｃＤＬ−ＳＲ α２
９６（Ｔａｋｅｂｅら；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．、８、４６６−４７２、１９８８）等がある。酵母
用としてはｐＧ−１（Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．ａｎｄ Ｙａ
ｍａｍｏｔｏ Ｋ．Ｒ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１、９
６５−９６７、１９８８）等がある。蚕細胞用として
は、組み換えウイルス作製用トランスファーベクターｐ
Ａｃ３７３（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、６、４７−５５、１９８８）等がある。これら
のベクターは必要に応じて複製起点、選択マーカー、プ
ロモーターを含み、さらに真核細胞用のベクターには、
必要に応じてＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シ
グナル等が付加される。複製起点として、哺乳動物細胞
用ベクターには、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピ
ローマウイルス由来のもの等を用いることができる。大
腸菌用ベクターとしては、ＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子
由来のもの等を用いることができる。酵母用としては２
μｍＤＮ ＡＲＳ１由来のもの等を用いることができ
る。遺伝子発現用プロモーターとして哺乳動物細胞用ベ
クターには、ウイルス由来であるレトロウイルス、ポリ
オーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０由来のもの
等あるいは、染色体由来のもの（例えば、ＥＦ１−α）
等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしてはバ
クテリオファージλ由来のものや、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｌ
ａｃ、ｔａｃプロモーター等を用いることができる。パ
ン酵母用としてはＡＤＨ、ＰＨ０５、ＧＰＤ、ＰＧＫ、
ＭＡＦαプロモーター、メタノール資化性酵母について
はＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。蚕細
胞用ベクターとしては核多角体病ウイルス由来のもの等
を用いることができる。選択マーカーとして、哺乳動物
細胞用ベクターには、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝
子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還
元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺
伝子等を用いることができる。大腸菌用ベクターとして
は、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝
子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができ
る。酵母用としてはＬｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝
子等を用いることができる。以上の様な宿主−ベクター
系を用いてＴＰＯ活性を有するタンパク質を得るために
は、上記ベクターの適当な部位に該遺伝子を組み込んだ
組み換えＤＮＡ体により、宿主細胞を形質転換させた
後、得られた形質転換体を培養し、さらに細胞内あるい
は培養液から該ポリペプチドを分離・精製すればよい。
これらに用いられる手段・方法は公知のものを組み合わ
せて行なうことができる。宿主を用いて発現させる場合
に、その発現産物のＮ末端をより確実に均一化するた
め、本来のシグナル配列を改変したり、他のタンパク質
のシグナル配列を用いてもよい。また、Ｎ末端およびそ
の近傍のアミノ酸残基を改変（置換、あるいは付加）す
ることに（例えば、大腸菌を用いて発現させる場合にメ
チオニン残基に加え、リジン残基を加えるなど）よって
も、Ｎ末端を均一化することが可能である。また、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：Ｇｌｕｔ
ａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とＴＰ
Ｏとをトロンビン認識ペプチドを介した融合タンパク質
として適当な宿主にて発現させ、単離した後、その融合
タンパク質をトロンビン処理することにより、ＧＳＴ部
分を除去し、−１位にグリシン残基が付加されたＧｌｙ
−１ＴＰＯタンパク質を得ることができる。本発明のＴ
ＰＯ活性を有する新規タンパク質（以下、「本発明のタ
ンパク質」と言う）としては、配列番号１６に示された
アミノ酸配列から成るタンパク質がある。また、本発明
にはＴＰＯ活性を保持する限り、その一部のアミノ酸配
列が改変（置換、欠失、挿入、および／または付加）さ
れたもの、即ちＴＰＯ誘導体も含まれる。別の言い方を
すれば、本発明のタンパク質としては、アミノ酸配列が
実質的に配列番号１６に示されたアミノ酸配列であるよ
うなタンパク質が含まれる。ここで言う、「実質的に配
列番号１６に示されたアミノ酸配列」とは、「配列番号
１６に示されたアミノ酸配列」に加えて、「ＴＰＯ活性
を保持する限りにおいて、配列番号１６に示されたアミ
ノ酸配列の一部に置換、欠失、挿入および／または付加
などがあるアミノ酸配列」を含むものである。本発明の
タンパク質としては、配列番号１６に示されたアミノ酸
配列の７位から１５１位のアミノ酸配列を含み、かつＴ
ＰＯ活性を有するタンパク質も含まれる。より具体的に
は、配列番号６に示されたアミノ酸配列のうち、１位か
ら２３１位、１位から２１１位、１位〜１９１位、１位
〜１７１位、１位〜１６３位、１位〜１５７位、１位〜
１５６位、１位〜１５５位、１位〜１５４位、１位〜１
５３位、１位〜１５１位及び７位〜１６３位からなるヒ
トＴＰＯタンパク質が本発明のタンパク質として挙げら
れる。更には、上記７位から１５１位の配列内部または
外部に、ＴＰＯ活性を損なわない範囲で、少なくとも１
つのアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を
有しているタンパク質も本発明のタンパク質に含まれ
る。本発明のＴＰＯ誘導体の他の例としては、例えば、
アミノ酸の改変（置換、欠失、挿入および／または付
加）を行うことによって安定性や体内での持続性の向上
を図ったもの、糖鎖の付加する１つ以上の潜在的部位を
欠失または付加して変化させたもの、１つ以上のシステ
イン残基を欠失させるか、またはシステインを他のアミ
ノ酸残基（例えば、アラニンまたはセリン残基）で置換
したものなどが挙げられる。一般にタンパク質の熱力学
的安定性を向上させる方法として、プロリン残基の導入
とグリシン残基の除去が有効であることが理論的に示さ
れている。（Ｍａｔｔｈｅｗｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，６６６３−
６６６７．１９８７）。そこで、安定性の向上を目的と
したＴＰＯ誘導体を設計する場合、プロリン残基を導入
したＴＰＯ誘導体およびグリシン残基を除去したＴＰＯ
誘導体を考えることができる。ヒトＴＰＯへのプロリン
残基の導入部位の選定には、例えば、このものに高い相
同性を有する他の生物種由来のＴＰＯ（マウスＴＰＯ：
Ｓｉ Ｌｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．３６９巻、５６５−５６８頁、（１９
９４）、イヌＴＰＯ：Ｔ．Ｄ．Ｂａｒｔｌｅｙら、ｃｅ
ｌｌ ７７巻、１１１７−１２４頁、（１９９４））の
アミノ酸配列を利用することができる。例えば、ヒト型
とラット型のアミノ酸配列（配列番号１５）を比較し、
ヒト型ではプロリンではないがラット型ではプロリンを
有する部位、あるいは、ヒト型ではグリシンだがラット
型ではグリシン以外のアミノ酸を有する部位を選ぶこと
ができる。例えばこのような部位として、配列番号１６
に示されたヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、９位のロ
イシン残基、８２位のグリシン残基、１４６位のグリシ
ン残基、１４８位のセリン残基などが挙げられ、それら
のグリシン残基を他のアミノ酸残基に置換した誘導体
や、セリン残基をプロリン残基に置換した誘導体などが
考えられる。また、一般にタンパク質は、疎水性アミノ
酸を内側に、親水性アミノ酸を外側に立体構造が形成さ
れることから、タンパク質表面に存在するアミノ酸をよ
り親水性の高い荷電性アミノ酸に置換することによって
タンパク質の溶解性の向上を期待することができる。ヒ
トＴＰＯの場合でも、このような観点から誘導体を設計
することができる。例えば、１４位のリジン残基、５２
位のリジン残基、５９位のリジン残基、１１５位のグル
タミン残基、１１９位のトレオニン残基、１３８位のリ
ジン残基をそれぞれアルギニン残基に置換したものなど
が挙げられる。更には、ＴＰＯとアミノ酸配列における
類似性が指摘されているＥｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ
（ＥＰＯ）において、一次構造上４番目に位置するヘリ
ックス（Ｄヘリックス）を予測し、正電荷を導入したと
ころ、生物活性の向上が認められている（特開平３−７
２８８５）ことから、ＴＰＯについてもそのアミノ酸配
列からＤヘリックスを予測し、ＴＰＯ誘導体を設計する
ことができる。一般にタンパク質のＤヘリックスの予測
には、例えば、金久らによる二次構造予測プログラムＩ
ＤＥＡＳ（金久、ＩＤＥＡＳ ｕｓｅｒ’ｓ ｍａｎｕ
ａｌ）等が使用できる。次に、Ｄヘリックスが位置する
と予測された領域で、外側に位置するアミノ酸を推定
し、正電荷を導入する候補となるアミノ酸残基を選定す
る。このような候補の選定は、例えば、目的領域の車輪
モデル（Ｓｈｉｆｆｅｒ とＥｄｍｕｎｄｓｏｎ，Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｊ．７，１２１−１３５．１９６７）を作
成することにより可能である。ヒトＴＰＯの場合、Ｄヘ
リックスの位置は１２６番目から１４２番目の領域と予
測されるが、この領域で選定されるアミノ酸残基として
例えば、１２９位のロイシン残基、１３３位のヒスチジ
ン残基、１４３位のメチオニン残基等が挙げられる。従
って、これらのアミノ酸残基をアルギニン残基、あるい
はリジン残基に置換して正電荷を導入するような誘導体
が考えられる。本発明のＴＰＯ誘導体をより具体的に例
示すれば、少なくとも、ヒトＴＰＯの１位のセリン残基
がアラニン残基に、かつ３位のアラニン残基がバリン残
基に置換されたタンパク質、２５位のアルギニン残基が
アスパラギン残基に置換されたタンパク質、３３位のヒ
スチジン残基がトレオニン残基に置換されたタンパク
質、２５位のアルギニン残基がアスパラギン残基に、か
つ２３１位のグルタミン酸残基がリジン残基に置換され
たタンパク質、更にこれらのタンパク質のＣ末端にＴｈ
ｒＳｅｒＩｌｅＧｌｙＴｙｒＰｒｏＴｙｒＡｓｐＶａｌ
ＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｌａＧｌｙＶａｌＨｉｓＨｉｓＨ
ｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓのポリペプチドが付加されたタ
ンパク質を挙げることができる。更には、少なくとも、
３３位のヒスチジン残基が欠失したタンパク質、１１６
位のグリシン残基が欠失したタンパク質、１１７位のア
ルギニン残基が欠失したタンパク質、３３位のヒスチジ
ン残基と３４位のプロリン残基の間にトレオニン残基が
挿入されたタンパク質、３３位のヒスチジン残基と３４
位のプロリン残基の間にアラニン残基が挿入されたタン
パク質、３３位のヒスチジン残基と３４位のプロリン残
基の間にグリシン残基が挿入されたタンパク質、３３位
のヒスチジン残基と３４位のプロリン残基の間にグリシ
ン残基が挿入され、かつ３８位のプロリン残基がセリン
残基に置換されたタンパク質、１１６位のグリシン残基
と１１７位のアルギニン残基の間にアスパラギン残基が
挿入されたタンパク質、１１６位のグリシン残基と１１
７位のアルギニン残基の間にアラニン残基が挿入された
タンパク質、１１６位のグリシン残基と１１７位のアル
ギニン残基の間にグリシン残基が挿入されたタンパク質
を挙げることができる。また、少なくとも、１２９位の
ロイシン残基がアルギニン残基に置換されたタンパク
質、１３３位のヒスチジン残基がアルギニン残基に置換
されたタンパク質、１４３位のメチオニン残基がアルギ
ニン残基に置換されたタンパク質、８２位のグリシン残
基がロイシン残基に置換されたタンパク質、１４６位の
グリシン残基がロイシン残基に置換されたタンパク質、
１４８位のセリン残基がプロリン残基に置換されたタン
パク質、５９位のリジン残基がアルギニン残基に置換さ
れたタンパク質、１１５位のグルタミンがアルギニン残
基に置換されたタンパク質が挙げられる。また、本発明
のＴＰＯタンパク質としては、配列番号１６に示される
アミノ酸配列を有するヒトＴＰＯ、および前述の誘導体
の−２位にメチオニン残基、かつ−１位にリジン残基が
付加されたタンパク質、−１位にメチオニン残基が付加
されたタンパク質も含まれる。好ましくは、本発明のタ
ンパク質は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または化学合成
により得られるＤＮＡを含む組換えベクターで、形質転
換された宿主細胞から分離・精製して得られたものであ
ることを特徴とする。宿主として、細菌（例えば、大腸
菌）を用いて菌体内発現を行う場合には、ＴＰＯ活性を
有するタンパク質のＮ末端側に開始メチオニン残基の付
加されたタンパク質が得られるが、このようなタンパク
質も本発明に含まれる。また、用いる宿主によっては、
産生されるＴＰＯ活性を有するタンパク質はグリコシル
化されている場合もあるし、あるいはグリコシル化され
ていない場合もあるがいずれも、本発明のタンパク質に
含まれる。また、本発明のタンパク質としては、天然の
供給源（例えば、ＴＰＯ活性を含むならし培地、または
ヒト尿、血清、血漿）から精製および単離されたＴＰＯ
活性を有する天然のタンパク質も含まれる。また、本発
明によれば、そのような天然の供給源からＴＰＯを精製
する方法を包含する。そのような精製法としては、一般
にタンパク質の精製に用いる工程（イオン交換クロマト
グラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィ
ー、色素吸着クロマトグラフィー、疎水相互クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィ
ー、硫酸化ゲルクロマトグラフィー、ハイドロキシルア
パタイトクロマトグラフィー、金属キレーティングクロ
マトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、分取電気
泳動法、および等電点電気泳動法など）の一つ以上を組
み合わせた方法がある。また、後述の実施例から推定し
うるＴＰＯの物理化学的な性質を利用して組み合わせる
ことのできる方法も本発明に含まれる。さらには、ＴＰ
Ｏを認識することのできる抗体を用いた抗体カラムをも
用いることができる。また、ＴＰＯはＭｐｌのリガンド
であることが判明したことから（ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ
ら、Ｎａｔｕｒｅ３６９巻５３３−５３８頁（１９９
４）、Ｂａｒｔｌｅｙら、Ｃｅｌｌ ７７巻１１１７−
１１２４頁（１９９４）、Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３６９巻５６５−５６８頁（１９９
４））、Ｍｐｌを活性化ゲルにカップリングさせること
でアフィニティーゲルカラムを調製し、これを利用する
ことによってもＴＰＯを精製することができる。より具
体的には、Ｍｐｌの細胞外領域（Ｍｐｌ−Ｘ）をＣＨＯ
細胞を宿主として用いた遺伝子組換え法により生産・調
製し、調製されたＭｐｌ−Ｘカラムが挙げられる（前述
のＢａｒｔｌｅｙら（１９９４））。本発明は更に、Ｔ
ＰＯのヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの蛋白質コード
鎖と相補的なＤＮＡの部分によってコードされる種類の
タンパク質、即ちＴｒａｍｏｎｔａｎｏら（Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２、５０４９−５０５９（１
９８４））が記載したような“相補的逆方向蛋白質”を
含む。本発明には、固体組織および血液または尿のよう
な液体試料中のＴＰＯまたはその受容体保有細胞の検出
および定量に有用な試薬を提供するために、検出可能な
マーカー物質で標識（例えば１２５Ｉで放射能標識する
か、またはビオチニル化する）された本発明のタンパク
質も含まれる。ビオチニル化された本発明のタンパク質
は、自己骨髄移植において骨髄から巨核芽球性細胞を除
去するために固定化ストレプトアビジンと結合する場合
に有用である。更には、自己または同種異系骨髄移植の
場合に自己または同種異系巨核球系細胞を濃縮するため
に固定化ストレプトアビジンと結合する場合に有用であ
る。リシン、ジフテリア毒素のような毒素とＴＰＯとの
毒素結合体、および放射性同位元素は、抗癌療法に対し
て、または骨髄移植のコンディショニング養生法として
有用である。また、本発明は、検出可能マーカー（例え
ば放射能標識、またはビオチンのような非同位元素標
識）で標識される場合や、染色体地図におけるヒトＴＰ
Ｏ遺伝子位置および／または任意の関連遺伝子ファミリ
ーの位置を突き止めるためのハイブリダイゼーション法
に用いるのに有用な核酸物質も提供する。それらは、Ｄ
ＮＡレベルでヒトＴＰＯ遺伝子障害を確認するためにも
有用であって、隣接遺伝子およびそれらの障害を確認す
るための遺伝子マーカーとしても用いられる。さらに、
本発明には、有用で好適な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、
乳化剤、アジュバントおよび／または担体とともに治療
上有効量の本発明のタンパク質を含有する医薬組成物も
含まれる。本明細書中で用いる“治療上有効量”という
用語は、指定の条件および投与法に対して治療効果を提
供する量を示す。このような組成物は、液体であるか、
あるいは凍結乾燥またはさもなくば乾燥された剤形であ
って、種々のｐＨ、およびイオン強度から成る緩衝剤
（例えばトリス−塩酸、酢酸塩、燐酸塩）より選択した
希釈剤、表面に吸着しないようにするためのアルブミン
またはゼラチンのような添加剤、界面活性剤（例えばＴ
ｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
Ｆ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えばグリセロー
ル、ポリエチレングリコール）、酸化防止剤（例えばア
スコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例
えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、
賦形剤または等張化剤（例えばラクトース、マンニトー
ル）を配合した製剤が含まれる。また、蛋白質に対する
ポリエチレングリコールのような重合体との共有結合、
金属イオンとの錯体化、あるいはポリ乳酸、ポリグリコ
ール酸、ヒドロゲルなどのような重合化合物の粒状製剤
中またはその表面上への、あるいはリポソーム、ミクロ
エマルジョン、ミセル、単層または多層小胞、赤血球ゴ
ースト、またはスフェロプラスト中への当該物質の取り
込みを包含する。このような組成物は、ＴＰＯの物理的
状態、溶解性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、ｉｎ
ｖｉｖｏクリアランスに影響を及ぼすと思われるの
で、組成物の選択は、ＴＰＯ活性を有する蛋白質の物理
的および化学的特性による。さらに、重合体（例えばポ
ロキサマーまたはポロキサミン）と、組織特異的受容
体、配位子または抗原に対する抗体に結合するか、ある
いは組織特異的受容体の配位子に結合するＴＰＯとで被
覆される粒状組成物も本発明に包含される。本発明の組
成物の別の剤形としては、非経口、経肺、経鼻、および
経口を含めた種々の投与経路のため、粒状形態、保護被
膜、プロテアーゼ阻害剤、または吸収促進剤を配合す
る。本発明のタンパク質を含有する医薬組成物は、活性
成分として通常０．０５μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ
体重を、病状、性別及び投与経路等に応じて、一日数回
程度投与することができる。本発明のタンパク質を含有
する医薬組成物は、活性成分として後述のＭ−０７ｅア
ッセイにおける相対活性量通常２５，０００〜５００，
０００，０００／ｋｇ体重を、病状、性別及び投与経路
等に応じて、一日一回〜数回、１週間に１〜７日間程度
投与することができる。更に本発明は、本発明のタンパ
ク質に加えてＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−
ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｉ
Ｌ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、Ｉ
Ｌ−１０、１Ｌ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＬＩ
Ｆ、ＳＣＦのような因子の１つ以上を付加的造血因子と
して含有する組成物を包含する。本発明のタンパク質
は、単独あるいは他の付加的造血因子との組み合わせて
も、多数の血小板減少症の治療に有用である。他の付加
的造血因子としては、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ
−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ
−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１
３、ＬＩＦ、ＳＣＦを挙げることができる。本発明によ
れば、本発明のタンパク質を有効成分とし、制ガン剤や
免疫抑制剤の投与による化学療法や放射線療法、あるい
は骨髄移植（ＢＭＴ）における血小板減少症の治療剤が
提供される。更に、血小板障害、例えば、血小板産生障
害や血小板の寿命短縮（血小板破壊の亢進、あるいは血
小板消費の亢進）による血小板減少を特徴とし、本発明
のタンパク質で治療可能な多数の疾患が存在する。例え
ば、先天性のファンコニ貧血、化学療法や放射線療法に
伴う再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白
血病、または骨髄移植のような骨髄形成不全による血小
板減少症などが挙げられ、このような患者の血小板の回
復を促進するために用いることができる。また、ＴＰＯ
産生異常による血小板減少症にも有用である。血小板や
巨核球の寿命短縮による血小板減少症としては例えば、
特発性血小板減少性紫斑病、後天性免疫不全症候群（Ａ
ＩＤＳ）、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少
症などがあり、このような患者の血小板回復促進にも有
用である。更に、外科手術前にＴＰＯを投与して自分の
血小板を増加させ、その血小板を自分の手術時に輸血用
血小板として用いる（自己血小板輸血）への用途として
も有用である。さらに本発明のタンパク質の別の用途
は、例えば他の化学薬品または医薬品、または治療的措
置による一過性の血小板の欠損または損傷によってもた
らされた障害の処置である。ＴＰＯは、そのような患者
で新しい“無傷の”血小板の放出を促進するのに用いる
ことができる。本発明はさらにＴＰＯに特異的に結合す
る抗体、およびそれを得るための抗原を提供する。本発
明のタンパク質または抗原決定基を有する該タンパク質
の部分断片が抗原として使い得る。そのような抗体は、
モノクローナルおよびポリクローナル抗体の双方、およ
び既知の方法によって作製したキメラ抗体、即ち“組換
え”抗体などを含む。種々の抗原決定基（エピトープ）
に対する種々の抗体を一般に含有する慣用的抗体（ポリ
クローナル）製剤に対比して、モノクローナル抗体は各
々、抗原上の単一抗原決定基に対する抗体である。ＴＰ
Ｏに対する特異抗体は、抗原−抗体反応を用いる診断お
よび分析的アッセイ法の選択性および特異性を改良した
り、ＴＰＯを分離・精製するのに有用である。さらに、
それらは、血清からＴＰＯを中和または除去するのに用
いられる。モノクローナル抗体の利点は、それらが、他
の免疫グロブリンが混入していない培地中でハイブリド
ーマ細胞によって合成され得ることである。モノクロー
ナル抗体は、ハイブリドーマ細胞の培養上清から、また
はマウスにハイブリドーマ細胞を腹腔内接種することに
よって誘導される腹水から調製される。Ｋｏｈｌｅｒと
Ｍｉｌｓｔｅｉｎが最初に記載したハイブリドーマ技術
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６、５１１−５１９
（１９７１））は、多数の特異抗原に対する高レベルの
モノクローナル抗体を保有するハイブリッド細胞系を生
成するために広く用い得る。以下、本発明を更に詳細に
説明する。 （Ａ）ラットＴＰＯの精製〜ラット精製ＴＰＯの部分ア
ミノ酸配列の分析〜ラット精製ＴＰＯの生物学的特性の
分析 本発明者らは、まずラットＣＦＵ−ＭＫの増殖・分化促
進活性を有するタンパク質（ラットＴＰＯ）の精製を試
みた。本精製では、種々の天然の供給源の選択、更に
は、クロマトグラフィー担体の選択、分離手段の選択な
ど、精製の組立について数々の試行錯誤を繰り返した。
その結果、本発明者らは、Ｘ線、あるいはγ線照射によ
り誘導した血小板減少症ラットの血漿より、後述の＜参
考例＞に記載したラットＣＦＵ−ＭＫアッセイに基づく
ＴＰＯ活性を指標として、ＴＰＯ活性を有するタンパク
質を精製し、その部分アミノ酸配列を決定した＜実施例
１〜２＞。また、その血漿由来ラットＴＰＯの生物学的
特性について試験した＜実施例３＞。なお、精製から、
精製されたラットＴＰＯの部分アミノ酸配列の決定まで
の概要は以下の通りである。 （１） Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板減少症ラ
ット約１１００匹分の血漿を集め、Ｓｅｐｈａｄｅｋ
Ｇ−２５クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）、更にレク
チンクロマトグラフィー（ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ）の
ステップまで進め、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ
活性画分を得た。 （２） 次に、このＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ
活性画分を色素吸着アフィニティークロマトグラフィー
（ＴＳＫ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ＭＨ）、疎水相互作
用クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ．６ ＦＦ／ＬＳ）、ゲル濾過クロマトグラフィー
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ）までの処理
を実施した。このＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ Ｈ
Ｒにおいては、ＴＰＯ活性は４つのピーク（分子量の大
きいものから、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４）に分かれたの
で、ＴＰＯ活性画分Ｆ２とＦ３とをそれぞれ濃縮し、高
分子ＴＰＯ標品Ｆ２、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３として、そ
れぞれ個別に次の精製ステップに進めた。 （３） 低分子ＴＰＯ標品Ｆ３を分取逆相クロマトグラ
フィー（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥ ＩＮ−Ｒ
Ｐ）、逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＰａｃｋＣＮ
−ＡＰ）、更に逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌ
ｌ Ｐａｃｋ Ｃ１）で分離した。得られたＴＰＯ活性
画分を、ＳＤＳゲル電気泳動にかけ、電気泳動ゲルから
ＴＰＯ活性の抽出を行ったところ、非還元下で見かけ上
分子量約１７０００〜１９０００のバンドにＴＰＯ活性
が存在することが確認できた。 （４） そこで、全てのＴＰＯ活性画分を非還元下でＳ
ＤＳゲル電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜に転写した。次い
で、ＰＶＤＦ膜上タンパク質の系統的な限定酵素分解に
よるペプチド断片化を実施し、ラットＴＰＯタンパク質
の部分アミノ酸配列を決定することができた（２つの断
片のアミノ酸配列情報を基にラットＴＰＯの遺伝子クロ
ーニングを実施した。）。 （５） 一方、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ
からの高分子ＴＰＯ標品Ｆ２についても、低分子ＴＰＯ
標品Ｆ３と同様に精製を進め、最終ステップの逆相クロ
マトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｃｋ Ｃ１）で
得られたＴＰＯ活性画分をＳＤＳゲル電気泳動にかけ、
ＴＰＯ活性の抽出を行った。活性を調べてみると、Ｆ３
由来のＴＰＯと同じく、非還元下で見かけ上分子量約１
７０００〜２２０００のバンドにＴＰＯ活性が存在する
ことが確認できた。 （Ｂ）ラットＴＰＯ産生細胞の特定化〜ｍＲＮＡの調製
〜ラットｃＤＮＡライブラリーの構築 精製したラットＴＰＯは血漿由来であるため、ｃＤＮＡ
クローニングのためには、ｍＲＮＡの供給源となる臓器
あるいは細胞を選抜する必要があった。そこでラット血
漿由来ＴＰ０の生化学的性質と生物学的性質に基づい
て、種々の臓器、あるいは細胞の培養上清中のＴＰＯ活
性をスクリーニングした。その結果、ラット肝臓細胞由
来の細胞株であるＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞、ＨＴＣ細
胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞の培養上清中、並びにラットの
初代肝臓細胞の培養上清中にもラット血漿由来ＴＰＯと
ほぼ同等のＴＰＯ活性を見いだした＜実施例４＞。一
方、サル細胞（ＣＯＳ１細胞）でのｃＤＮＡ発現ベクタ
ーｐＥＦ１８Ｓを、２種類の発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ
並びにｐＥＦＢＯＳを組み合わせて構築した＜実施例５
＞。このベクターの構築によりインサートの組み込みに
使用できる多種類のクローニング部位を持つ、発現効率
の高いベクターを用いてｃＤＮＡをクローニングするこ
とが容易となった。ｃＤＮＡライブラリーの構築には上
記の発現ベクターの他にｐＵＣ系やｐＢＲ系のプラスミ
ドベクター、λ系のファージベクター等が主に使用され
る。本発明者らは、ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞を培養
し、グアニジンチオシアナート溶液を加えてホモジナイ
ズ後、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法により全ＲＮＡを得た＜
実施例６＞。ＲＮＡの調製は熱フェノール法や酸性グア
ニジンフェノールクロロホルム法等でも行なうことが出
来る。この全ＲＮＡからオリゴｄＴ固定化ラテックス粒
子によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した後、制限酵素Ｎ
ｏｔＩ切断配列を付加したオリゴｄＴをプライマーとし
て逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＮａｓ
ｅ ＨおよびＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩを用
いて、２本鎖ｃＤＮＡを得た。得られた２本鎖のｃＤＮ
ＡにＥｃｏＲＩリンカーを付加し、これを実施例５で構
築したｃＤＮＡ発現ベクターｐＥＦ１８ＳをＮｏｔＩと
ＥｃｏＲＩで切断したものとつなぎ合わせて、コンピテ
ントな大腸菌ＤＨ５株を形質転換させ、ｃＤＮＡライブ
ラリーを構築した＜実施例７＞。 （Ｃ）ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得
（クローニング） ラット血漿より精製したラットＴＰＯの部分アミノ酸配
列をもとに、その配列をコードすると考えられるＤＮＡ
配列を予測し、ポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ
ＣＲ）に使用する縮重プライマーを合成した。使用する
プライマーは、本発明で用いたプライマー以外の位置の
アミノ酸配列に基づくものであってもよい。また、イノ
シンを使わず縮重度の高いプライマーを用いることも出
来る。更に、ラットにおいて使用頻度の高いコドンを使
用して縮重度を減らしたプライマーを設計することも出
来る（ＷａｄａらＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１８、２３６７〜２４１１、１９９０参照）。先
に作製したｃＤＮＡライブラリー全体よりプラスミドＤ
ＮＡを抽出し、このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し
たところ約３３０ｂｐのバンドが検出され、塩基配列を
決定したところ、ラットＴＰＯの遺伝子の一部をコード
するＤＮＡ断片（Ａ１断片）であることが分かった＜実
施例８＞。 （Ｄ）ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡのスクリー
ニング〜ラットＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス〜発現確
認 先に構築したｃＤＮＡライブラリーを約１万クローンず
つのプールに分け、それらのうち１００プールからプラ
スミドＤＮＡを抽出した。これらＤＮＡを鋳型とし、Ａ
１断片の塩基配列をもとに新たに合成したプライマーを
使用してＰＣＲを行なったところ、１００プール中３プ
ールに特異的と考えられるバンドが検出された。そこ
で、これらのうち１プールを選び、このプールをさらに
約９００クローンずつのサブプールに分け、それらのう
ち１００プールについて同様のＰＣＲを行なったとこ
ろ、３サブプールでバンドが検出された。これらのうち
１プールを選択し、更に、４０クローンずつのサブプー
ルに分け、最終的には１クローンづつ同様のＰＣＲによ
る選別を行なった結果、ラットＴＰＯ遺伝子ｃＤＮＡ断
片を担持したプラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αを持つク
ローンの単離に成功した＜実施例９〜１０＞。このｃＤ
ＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、ラット血漿中よ
り精製し部分的に決定したアミノ酸配列をコードしてい
ることが明らかとなり、ラットＴＰＯ遺伝子であると考
えられた＜実施例１０＞。上記のようにして得られたク
ローンよりプラスミドＤＮＡを精製し、ＣＯＳ１細胞に
トランスフェクションしたところ、その培養上清中にＴ
ＰＯ活性を検出することができた。この結果、得られた
ｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αはラットＴＰＯをコードしている
ｃＤＮＡを担持していることが確認できた＜実施例１１
＞。 （Ｅ）ラット各種組織でのＴＰＯｍＲＮＡの検出 ラット体内におけるＴＰＯｍＲＮＡの発現組織をＰＣＲ
によって解析し、脳、肝臓、小腸、並びに腎臓において
特異的な発現を検出した＜実施例１２＞。 （Ｆ）ヒトｃＤＮＡライブラリーの構築 実施例４および１２の結果より、ヒトＴＰＯｃＤＮＡク
ローニングのための出発組織として肝臓を選択した。そ
こで、市販の正常ヒト肝臓由来のｍＲＮＡより、ｃＤＮ
Ａライブラリーを構築した。ベクターにはラットのライ
ブラリーと同様にｐＥＦ１８Ｓを用い、ラットの場合と
同じ操作でｃＤＮＡを合成し制限酵素ＮｏｔＩとＥｃｏ
ＲＩ部位を利用した方向性を持ったライブラリーとし
た。大腸菌株ＤＨ５に導入し作製したライブラリーのク
ローンの数は約１２０万個であった＜実施例１３＞。 （Ｇ）ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得
（クローニング） ｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αに担持されたラットＴＰＯをコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列をもとに、数種類のＰＣＲ用
プライマーを合成した。市販の正常ヒト肝臓由来のｍＲ
ＮＡよりｃＤＮＡを合成し、これらのプライマーを用い
てＰＣＲを実施したところ、６２０ｂｐ前後のバンドが
観察された。塩基配列を決定したところ、ラットＴＰＯ
と約８６％の相同性を有するＤＮＡ断片であることが明
らかとなり、ヒトＴＰＯをコードする遺伝子の一部であ
ると考えられた＜実施例１４＞。 （Ｈ）ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯｃＤＮＡのスクリーニ
ング〜ヒトＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス〜発現確認 先に調製したヒトｃＤＮＡライブラリーを増幅し、約１
０万クローンずつのプールに分割し、９０個のプールか
らプラスミドを抽出した。これらのＤＮＡを鋳型とし、
実施例１４で得られたヒトーＴＰＯ断片の塩基配列を基
に新たに合成したプライマーを用いてＰＣＲを行なった
ところ、３個のプールでバンドが観察された。これらよ
り１個のプールを選択し、５０００個のクローンを１プ
ールとするサブプールに分け、それらのうちの９０プー
ルよりプラスミドＤＮＡを精製した。これらを鋳型とし
て同様のＰＣＲを実施したところ、５個のサブプールで
バンドが検出された。そこで、これらより１プールを選
び２５０個のクローンを１プールとするサブプールに更
に分割し、それらのうちの９０プールよりプラスミドＤ
ＮＡを精製し再度ＰＣＲによる検出を行なったところ、
３個のプールでバンドが観察された。そこで、このうち
１プールを選び、３０個のクローンを１プールとするサ
ブプールに分割し、それらのうちの９０プールからプラ
スミドＤＮＡを精製しＰＣＲを実施した結果、３個のプ
ールでバンドが観察された。これらのうち１プールより
９０個のコロニーを拾い、プラスミドＤＮＡを調製し、
ＰＣＲを実施することで最終的にクローンＨＬ３４を得
た＜実施例１５＞。このクローンが持つプラスミドＤＮ
Ａの塩基配列を決定したところ、ラットＴＰＯの塩基配
列と約８４％程度の相同性を持つｃＤＮＡを担持してい
ることが明らかとなった＜実施例１６＞。このクローン
のプラスミドＤＮＡを精製し、ＣＯＳ１細胞にトランス
フェクションしたところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検
出され、このクローンが持つプラスミドＤＮＡはヒトＴ
ＰＯをコードする遺伝子ｃＤＮＡ断片を担持しているこ
とが確認された＜実施例１７＞。しかしながら、このｃ
ＤＮＡ断片は終止コドンが無く、また、ポリＡ尾部様配
列を３’端に持っており、これはクローニングの際の人
工産物であると考えられた。そこで、ポリＡ尾部様配列
直前までのアミノ酸をコードする発現ベクターを構築
し、ＣＯＳ１細胞での発現を行なったところ、培養上清
中にＴＰＯ活性が検出された＜実施例１８＞。完全長ｃ
ＤＮＡの構造を解析するためにＰＣＲを利用しヒトＴＰ
Ｏ３’末端側のＤＮＡ断片を得た。この断片の塩基配列
を決定したところ、実施例１５で得たクローンＨＬ３４
のｃＤＮＡとオーバーラップすることがわかり、オープ
ンリーディングフレームも延び全体で３５３個のアミノ
酸からなる蛋白質をコードすることが予想された。すな
わちヒトＴＰＯタンパク質は２１個のシグナル配列を含
む３５３個のアミノ酸からなることが示唆された＜実施
例１９＞。ヒトＴＰＯのｃＤＮＡクローニングは、上記
のようなクローニング法以外にも、ｐＵＣ系やｐＢＲ系
のプラスミドベクター、λ系のファージベクター等を使
用して構築したライブラリーを利用し、ラットＴＰＯｃ
ＤＮＡ断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼイ
ションあるいはプラークハイブリダイゼイションによっ
ても行なうことができる。縮重プローブの設計にあたっ
ては、縮重の度合いを減少させるためにイノシンを使う
こともできる。ＴＰＯ活性を特異的に、また感度良く検
出できるアッセイ法が利用できる場合には、本発明で用
いた様な発現ライブラリーを使用した発現クローニング
も行なうことができる。しかしながら、実施例１５で記
載するように正常ヒト肝臓においてはヒトＴＰＯをコー
ドするＲＮＡの含量は著しく低いと考えられるため（こ
の実施例から算出される含量は３００万個に１個の割合
であった）、合成したオリゴヌクレオチドプローブやラ
ットやヒトＴＰＯのｃＤＮＡ断片をプローブとして用い
るハイブリダイゼイションによるスクリーニング方法で
は、処理するクローンやプラークの数が膨大なものにな
り、また、ハイブリダイゼイションの感度や特異性がＰ
ＣＲ法に及ばないため困難を極めることが予想される。
実際に本発明者らも実施例１３において作製した正常ヒ
ト肝臓ｃＤＮＡライブラリー２００万クローンについ
て、ラットＴＰＯｃＤＮＡ断片をプローブとしたコロニ
ーハイブリダイゼイションを実施したが、ヒトＴＰＯｃ
ＤＮＡクローンを得ることは出来なかった。 （Ｉ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡライブラリーの再構築 実施例１５で得られたクローンＨＬ３４は不完全なｃＤ
ＮＡを含むクローンであると考えられたため、完全長の
ヒトＴＰＯｃＤＮＡを得る目的で、市販の正常ヒト肝臓
由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いてヒトＴＰＯｃＤＮＡ
ライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ１）を構築し直した。大腸
菌株ＤＨ５に導入し作製したライブラリーのクローンの
数は約１００万個であった。＜実施例２０＞ （Ｊ）コロニーハイブリダイゼーションによるヒトＴＰ
ＯｃＤＮＡの再スクリーニング〜ヒトＴＰＯｃＤＮＡの
シークエンス〜発現確認 実施例１４で得られた部分長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩
基配列（配列番号３）、および実施例１９において推定
された完全長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列（配列番
号６）をもとに、ＰＣＲ用プライマーを合成した。実施
例２０で構築したｃＤＮＡライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ
１）を３つのプール（＃１〜３）に分割し、それぞれの
プールよりプラスミドＤＮＡを調製し、これらのＤＮＡ
を鋳型として合成したプライマーを用いてＰＣＲを実施
した。＃３のプール由来のＤＮＡを用いた場合に予想さ
れる大きさのＤＮＡが増幅されたため、＃３のプールを
１５０００個づつのサブプールに分割し、先の合成プラ
イマーでＰＣＲを実施したところ、９０プール中６プー
ルで予想される大きさのＤＮＡが増幅された。これらよ
り１個のプールを選択し、１０００個のクローンを１プ
ールとするサブプールに分け、プラスミドＤＮＡを調製
しＰＣＲを行ったが、ＤＮＡの増幅は観察されなかっ
た。これは、求めるクローンの増殖が他のクローンより
遅いためにプラスミドＤＮＡの回収率が悪くなったこと
が原因と考えられた。そこで、＃３のプールに戻り、Ｌ
Ｂプレート１枚あたり４１００個のコロニーとなるよう
にクローンをまき、１００枚のプレート、並びにそれぞ
れのレプリカプレートを作製した。プレートのコロニー
から抽出したＤＮＡについて先と同様にＰＣＲを行った
ところ、１００プール中１プールでバンドの増幅が観察
された。このプールのプレートより２枚のレプリカフィ
ルターを作製し、放射標識プローブ（プラスミドｐＥＦ
１８Ｓ−ＨＬ３４のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片）を用
いたコロニーハイブリダイゼーションを行った。その結
果、陽性シグナルが１個観察されたため、元のプレート
よりコロニーを拾い、ＬＢプレートにまき直して得られ
たコロニー５０個よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣ
Ｒを実施することにより、最終的にクローンｐＨＴＦ１
を得た。＜実施例２１＞ このようにＤＮＡクローンのスクリーニングにおいて
は、ハイブリダイゼイション、ＰＣＲ、発現クローニン
グ等が主に用いられるが、これらを適宜組み合わせてス
クリーニングの効率、感度を上昇させる、あるいは、労
力を低減させることができる。ここで得られたクローン
ｐＨＴＦ１の塩基配列を決定したところ、オープンリー
ディングフレームが存在し、このオープンリーディング
フレームにコードされると考えられるタンパク質のアミ
ノ酸配列は、実施例１９で推定されたヒトＴＰＯのアミ
ノ酸配列（配列番号６）と完全に一致した。塩基配列は
配列番号６とは３箇所で異なっていたが、アミノ酸の変
換は起こさなかった。これによりヒトＴＰＯタンパク質
は２１残基のシグナル配列を含む３５３個のアミノ酸か
らなることが確認できた。＜実施例２２＞ 上記のようにして得られたクローンｐＨＴＦ１よりプラ
スミドＤＮＡを調製し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェク
ションしたところ、その培養上清中にＴＰＯ活性を検出
することができた。＜実施例２３＞ （Ｋ）プラークハイブリダイゼーションによるヒトＴＰ
Ｏ染色体ＤＮＡのスクリーニング〜ヒトＴＰＯ染色体Ｄ
ＮＡのシークエンス〜発現確認 東北大学遺伝子実験施設 山本徳男教授より頂いたヒト
ゲノミックライブラリーより、ＮＺＹＭプレート１枚あ
たり３万個となるようにファージをまき、１８枚のプレ
ート、並びにそれぞれのレプリカフィルターを作製し
た。クローンｐＨＴＦ１に含まれるヒトＴＰＯｃＤＮＡ
断片（配列番号７の塩基配列番号１７８−１０２５）を
ＰＣＲで増幅後精製し３２Ｐ標識したものをプローブと
して用いて、プラークハイブリダイゼーションを行っ
た。その結果、１３個の陽性シグナルが検出されたた
め、それぞれ元のプレートよりプラークを拾い、ＮＺＹ
プレート１枚あたり１０００プラークとなるようにま
き直して、それぞれより作製したレプリカフィルターに
ついて再度プラークハイブリダイゼーションを実施し
た。その結果、１３組すべてのフィルターで陽性シグナ
ルが検出されたため、プラークを単離し、ファージＤＮ
Ａを調製し、１３クローンそれぞれについてヒトＴＰＯ
ｃＤＮＡのコーディング領域を含んでいるかどうかをＰ
ＣＲによりチェックした。１３クローン中５クローン
は、ｃＤＮＡから予想されるコーディング領域を全て含
んでいると考えられたため、１クローン（λＨＧＴ１）
を選択し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ解析（用いたプロ
ーブは先と同じ）を行った。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
消化した場合に約１０ｋｂｐの単一バンドが観察された
ので、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで消化後アガロースゲルで泳動し、１０ｋｂｐの
バンドを切り出して精製し、クローニングベクターｐＵ
Ｃ１３にサブクローニングし、最終的にクローンｐＨＧ
Ｔ１を得た。＜実施例２４＞ このクローンの塩基配列を決定したところ、担持されて
いる染色体ＤＮＡは、配列番号６に示したヒトＴＰＯタ
ンパク質のコーディング領域をすべて含み、その領域に
関しては塩基配列は完全に一致した。また、エクソンに
相当する領域は４つのイントロンで分断されており、実
施例２１で取得したクローンｐＨＴＦ１に担持されてい
る完全長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列とは３箇所で
異なることが判明した。最終的に選択された５クローン
のうち残りの４クローンについても塩基配列の決定を行
ったところ、２箇所はクローンｐＨＧＴ１と一致し、残
りの１箇所については２クローンがｐＨＧＴ１と一致
し、もう２クローンｐＨＴＦ１と一致していた。＜実施
例２５＞ 上記のようにして得られたプラスミドクローンｐＨＧＴ
１のＥｃｏＲＩ断片を発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにつな
ぎ、ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＥＦＨＧＴＥを調製
し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションしたところ、
その培養上清中にＴＰＯ活性を検出することができた。
＜実施例２６＞ （Ｌ）ヒトＴＰＯ欠失誘導体の作製〜ＣＯＳ１細胞での
発現〜活性確認 実施例１８並びに２２の結果よりヒトＴＰＯタンパク質
はその活性発現に全長のアミノ酸を必要としないことが
予想された。そこでヒトＴＰＯタンパク質の活性発現に
必要な領域を解析する目的で、実施例１８で得たクロー
ンｐＨＴ１−２３１のプラスミドＤＮＡを鋳型とし、合
成したプライマーでＰＣＲを行うことにより、ヒトＴＰ
Ｏタンパク質のＣ末端側を欠失させた発現プラスミド、
即ち、アミノ酸１−２１１位、１−１９１位、１−１７
１位、および１−１６３位をコードする欠失誘導体のプ
ラスミドＤＮＡを得た。得られたそれぞれのプラスミド
ＤＮＡをＣＯＳ１細胞へトランスフェクションしたとこ
ろ、いずれの培養上清中においてもＴＰＯ活性が検出さ
れた。＜実施例２７＞ ＴＰＯ活性を担う領域をさらに詳細に検討するために、
Ｃ末側より１５１番目のアミノ酸まで順次欠失させた誘
導体並びに、Ｎ末側６、７、１２番目のアミノ酸まで欠
失させた誘導体を作製し、ＣＯＳ１細胞で発現させ活性
を検出したところ、Ｎ末側では７番目のアミノ酸まで欠
失させた場合に、Ｃ末側では１５１番目のアミノ酸まで
欠失させた場合に活性が検出できなくなった。＜実施例
２８、２９＞ このように得られたｃＤＮＡをもとに誘導体（欠失、置
換、挿入、付加等）を作製することにより、本来のタン
パク質の活性を担う改変型タンパク質を得ることができ
る。この場合に用いる手法としては、ＰＣＲ法、Ｓｉｔ
ｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法、化
学合成法等がある。 （Ｍ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣＨＯ細胞での発現〜精製 配列番号６のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ動物細
胞用発現プラスミド、ｐＨＴＰ１を構築した。＜実施例
３０＞ このｐＨＴＰ１のＴＰＯｃＤＮＡ領域を用い、ＣＨＯ細
胞発現用ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１を構
築した。＜実施例３１＞ このベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションし選
択を行った結果、染色体中にヒトＴＰＯをコードする発
現ベクターが組み込まれた形質転換細胞が得られた。こ
の細胞クローンを培養したところ培養上清中にＴＰＯ活
性が検出された。＜実施例３２＞ 実施例３２において、ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥ
Ｆ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１をＣＨＯ細胞にトランスフェ
クションして得られたヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株（Ｃ
ＨＯ２８−３０細胞、２５ｎＭ ＭＴＸ耐性）を大量培
養した＜実施例５５＞。その培養上清１００Ｌからヒト
ＴＰＯを精製した。＜実施例５６＞ また、別法により実施例５５で得られた培養上清からＴ
ＰＯを精製した。＜実施例５７＞ （Ｎ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＸ６３．６．５．３．細胞
での発現〜活性確認 実施例３０で調製されたプラスミド、ＰＢＬＴＥＮのＴ
ＰＯｃＤＮＡ領域を用い、Ｘ６３．６．５．３細胞用発
現ベクター、ＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１を構築
した。＜実施例３３＞ このベクターをＸ６３．６．５．３細胞にトランスフェ
クションしたところ、染色体中にヒトＴＰＯをコードす
る発現ベクターを組み込んだ、形質転換細胞が得られ
た。この細胞を培養したところ、培養上清中にＴＰＯ活
性が検出された。＜実施例３４＞ （Ｏ）ヒトＴＰＯのＣＯＳ１細胞での大量発現〜精製〜
分子量測定、生物学的特性 実施例３０で調製された発現ベクター、ｐＨＴＰ１をＣ
ＯＳ１細胞にトランスフェクションし発現させた培養上
清を大量（合計約４０ｌ）に調製した。＜実施例３５＞ 実施例３５の方法で調製された発現ベクター、ｐＨＴＰ
１由来ＴＰＯを含むＣＯＳ１細胞無血清培養上清約７ｌ
から、ＴＰＯの精製を行った。疎水相互作用クロマトグ
ラフィー、陽イオン交換カラム、ＷＧＡカラム、逆相カ
ラムの各段階を経て、高活性のＴＰＯを得ることができ
た。＜実施例３６＞ このようにＣＯＳ１細胞培養上清より部分精製されたＴ
ＰＯについて、分子量測定、および生物学的特性の分析
を行った。＜実施例３７、３８＞ （Ｐ）ヒトＴＰＯの大腸菌における発現 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとヒトＴＰＯ
（アミノ酸１−１７４位）の融合タンパク質（「ＧＳＴ
−ＴＰＯ（１−１７４）」）の大腸菌発現用ベクター、
ｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）を構築した。この
際のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列の一部（５’側およ
そ半分の領域）は大腸菌優先コドンに変換した。＜実施
例３９＞ ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を大腸菌で発現させ、菌
体を破砕後、沈殿画分に含まれるＧＳＴ−ＴＰＯ（１−
１７４）の可溶化を行った。次に、ＴＰＯの巻き戻し
（リフォールディング）条件の検討、精製条件の検討
（グルタチオンアフィニティーカラム、陽イオン交換カ
ラム等）、トロンビン消化によるＧＳＴ蛋白質領域の切
断などの段階を組み合わせた結果、設計通りのＴＰＯの
アミノ酸配列を含む蛋白質が部分精製できた。この蛋白
質はラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にてＴＰＯ活性を有
することが確認できた。＜実施例４０、４１＞ また、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３位）の１位のＳ
ｅｒ残基をＡｌａ残基に、かつ３位のＡｌａ残基をＶａ
ｌ残基に変換し、さらに−１位にＬｙｓ残基、−２位に
Ｍｅｔ残基を付加した変異型ヒトＴＰＯタンパク質
（「ｈ６Ｔ（１−１６３）」と称す）の大腸菌発現用ベ
クター、ｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）を構築
した。このベクターが担持するヒトＴＰＯｃＤＮＡによ
ってコードされるアミノ酸（１−１６３）の塩基配列は
全て大腸菌での優先コドンに変換した。＜実施例４２＞ ｈ６Ｔ（１−１６３）を大腸菌で発現させ、菌体を破砕
後、沈殿画分に含まれるｈ６Ｔ（１−１６３）の可溶化
を検討、リフォールディング条件の検討を実施した結
果、設計通りのＴＰＯのアミノ酸配列を含むタンパク質
が部分精製できた。このタンパク質はラットＣＦＵ−Ｍ
Ｋアッセイ系にてＴＰＯ活性を有することが確認でき
た。＜実施例４３、４４＞ さらに、ヒトＴＰＯｃＤＮＡ（アミノ酸１−１６３）の
−１位にＬｙｓ残基、−２位にＭｅｔ残基を付加した変
異型ヒトＴＰＯタンパク質（「ｈＭＫＴ（１−６３）」
と称す）の大腸菌発現用ベクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭ
ＫＴ（１−１６３）を構築した。ｈＭＫＴ（１−１６
３）を実施例４３と同様に大腸菌で発現させ、得られた
発現タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＰＶＤＦ膜に転写
し、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行った結果、設計通りの
アミノ酸配列を含むことが確認できた。＜実施例５２＞ また、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−３３２位）の−１位に
Ｌｙｓ残基、−２位にＭｅｔ残基を付加した変異型ヒト
ＴＰＯタンパク質（「ｈＭＫＴ（１−３３２）」と称
す）の大腸菌発現用ベクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ
（１−３３２）を構築した。ｈＭＫＴ（１−３３２）を
実施例４２と同様に大腸菌で発現させ、後述の実施例４
５で作製した抗ヒトＴＰＯペプチド抗体を用いたウェス
タンブロッティングにより発現を確認した。＜実施例６
６＞ （Ｑ）抗ＴＰＯペプチド抗体の作製〜抗ＴＰＯペプチド
抗体カラムの調製 実施例１０にて判明されているラットＴＰＯのアミノ酸
配列のうち、３箇所の部分領域に相当するペプチドを合
成し、ウサギポリクローナル抗ＴＰＯペプチド抗体を作
製した。これらの抗体がラット及びヒトＴＰＯを認識す
ることを確認した。また、配列番号６（もしくは配列番
号７）に示されるヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、６
箇所の部分領域に相当するペプチドを合成し、ウサギポ
リクロナール抗ＴＰＯペプチド抗体を作製した。これら
の抗体がヒトＴＰＯを認識することを確認した。＜実施
例４５＞ ＴＰＯに対して結合親和性を持つような分子、即ち、抗
ＴＰＯ抗体、ＴＰＯ受容体などをカラム坦体に結合さ
せ、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによりＴ
ＰＯを精製する方法が考えられる。そこでまず実施例４
５で得られた抗ＴＰＯペプチド抗体をゲル坦体に結合さ
せた抗ＴＰＯ抗体カラムを調製した。＜実施例４６＞ （Ｒ）ＣＯＳ１細胞で発現させたヒトＴＰＯの抗ＴＰＯ
ペプチド抗体カラムを用いた精製〜分子量測定、生物学
的特性 発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェ
クションした培養上清を材料として部分精製ＴＰＯを得
て、これを抗ＴＰＯ抗体カラムにかけた。吸着画分にＴ
ＰＯ活性を有することが確認できたので、これをさらに
逆相カラムクロマトグラフィーにかけ精製し、その分子
量と生物学的活性を調べた。＜実施例４７＞ （Ｓ）ＣＯＳ１細胞で発現させたヒトＴＰＯの部分精製
標品の活性確認 実施例３６で精製されたＴＰＯ活性画分、すなわち、発
現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェク
ションして得られた培養上清由来で、Ｃａｐｃｅｌｌ
Ｐａｋ Ｃ１ ３００Ａカラムの段階まで精製されたＴ
ＰＯの生物学的活性を調べた結果、生体内において血小
板増加作用を有することがわかった。＜実施例４８＞ また、発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトラン
スフェクションして得られた、培養上清３３Ｌを出発材
料にし、陽イオン交換カラムで得られた粗精製ＴＰＯ画
分の生物学的活性を調べた結果、生体内において血小板
増加作用を有することがわかった。＜実施例４９＞ （Ｔ）ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＨＯ細胞での発現〜
活性確認 ＣＨＯ細胞でのヒトＴＰＯ染色体発現ベクター、ｐＤＥ
Ｆ２０２−ｇｈＴＰＯを構築した。＜実施例５０＞ このベクターをＣＨＯ細胞に導入したところ、染色体中
にヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡを担持する発現ベクターが組
み込まれた形質転換細胞が得られた。この細胞を培養し
たところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。＜実
施例５１＞ （Ｕ）大腸菌で発現させた変異型ヒトＴＰＯの部分精製
〜活性確認 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異
型ヒトＴＰＯについて、塩酸グアニジンとグルタチオン
を用いたリフォールディング操作を行い、ここで得たｈ
６Ｔ（１−１６３）が、生体内において血小板増加作用
を有することを確認した。＜実施例５３＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異
型ヒトＴＰＯについて、Ｎ−ラウロイルサルコシンナト
リウムと硫酸銅を用いたリフォールディング操作を行
い、さらに陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精
製したｈ６Ｔ（１−１６３）が、生体内において血小板
増加作用を有することを確認した。＜実施例５４＞ また、更に別法を用いて、変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ
（１−１６３）のリフォールディング〜精製を行った。
＜実施例６０、６１＞ （Ｖ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡの昆虫細胞での発現〜活性確
認 ヒトＴＰＯの昆虫細胞での発現用組換えウィルスを作製
し＜実施例５８＞、昆虫細胞Ｓｆ２１で発現させ、培養
上清中の活性を確認した。＜実施例５９＞ （Ｗ）ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３位）のＣＨＯ細
胞での発現〜精製 配列番号６に示したヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、
１−１６３位のアミノ酸配列を有するヒトＴＰＯタンパ
ク質（「ｈＴＰＯ１６３」と称す）のＣＨＯ細胞発現用
ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３を構築した。
発現ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ
細胞にトランスフェクションして得られたｈＴＰＯ１６
３産生ＣＨＯ細胞株を大量培養し、その培養上清からｈ
ＴＰＯ１６３を精製した。＜実施例６２〜６５＞ （Ｘ）ヒトＴＰＯ誘導体の作成 ヒトＴＰＯの２５位のＡｒｇ残基がＡｓｎ残基に、２３
１位のＧｌｕ残基がＬｙｓ残基にそれぞれ置換され、更
にＣ末端に付加的ペプチドを有する誘導体（「Ｎ３／Ｔ
ＰＯ」と称す）、および３３位のＨｉｓ残基がＴｈｒ残
基に置換され、更にＣ末端に付加的ペプチドを有する誘
導体（「Ｏ９／ＴＰＯ」と称す）をコードするプラスミ
ドでトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞培養上清中
にＴＰＯ活性が検出された。＜実施例６７＞ ｈＴＰＯ１６３にアミノ酸を挿入した誘導体またはｈＴ
ＰＯ１６３のアミノ酸の一部を欠失させた誘導体をコー
ドするプラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ７
細胞培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。＜実施例６
８＞ ｈ６Ｔ（１−１６３）を鋳型として、大腸菌を用いてＴ
ＰＯ誘導体を作製し、そのＴＰＯ活性を確認した。＜実
施例７７＞ （Ｙ）ＴＰＯによる薬理作用 実施例５６で得られたヒトＴＰＯの静脈内投与、並びに
皮下投与による正常マウスにおける血小板増加作用を確
認した。＜実施例６９、７０＞ また、実施例５６で得られたヒトＴＰＯが、制ガン剤投
与による血小板減少の阻止効果および血小板減少からの
血小板数回復促進効果、更にはＢＭＴ（骨髄移植）施行
後、並びに放射線照射後の血小板数の回復促進効果を有
することを確認した。＜実施例７１〜７４＞ また、実施例６５で得られたヒトＴＰＯの正常マウスに
おける血小板増加作用、および制ガン剤投与による血小
板減少からの血小板数回復促進効果を確認した。＜実施
例７５、７６＞ （Ｚ）ヒトＴＰＯ製剤の調製 ヒトＴＰＯを有効成分とする製剤の調製例を示した。＜
製剤実施例１〜９＞ なお、本発明において用いたＴＰＯ活性の測定方法（ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系）を＜参考例＞として以下に
説明する。 ＜参考例＞ Ａ．ラット巨核球前駆細胞（ＣＦＵ−ＭＫ）アッセイ
（ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ）系（液体培養系） 巨核球は、エネルギー依存性に細胞外のセロトニン（ｓ
ｅｒｏｔｏｎｉｎ）を取り込んで、濃染顆粒に蓄積する
（Ｆｅｄｏｒｋｏ、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、３６巻、
３１０−３２１頁、（１９７７））。この現象は、少な
くともＣＦＵ−ＭＫと認識可能な巨核球の間の分化段階
に位置する小型で単核のアセチルコリン陽性細胞におい
てすでに認められ（ＢｒｉｃｋｅｒとＺｕｃｋｅｒｍａ
ｎ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１２巻、６７２−６７
５頁、（１９８４））、その後、巨核球サイズの増大に
応じてｓｅｒｏｔｏｎｉｎの取り込み量が増加する（Ｓ
ｃｈｉｃｋとＷｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｅｄ．、９８巻、６０７−６１５頁、（１９８
１））。しかも、骨髄細胞の中では巨核球系細胞だけに
特異的である（ＳｃｈｉｃｋとＷｅｉｎｓｔｅｉｎ、
Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、９８巻、６０７−６
１５頁、（１９８１））ことが知られている。本アッセ
イ系は、高度に濃縮されたラットＣＦＵ−ＭＫ（ＧｐＩ
Ｉｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分；後述）を被検検体
の存在下に培養し、巨核球の増殖・分化を１４Ｃ−セロ
トニン（１４Ｃ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ ｔｒｙｐｔａｍ
ｉｎｅ ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈａｔｅ；
１４Ｃ−５ＨＴ））の取り込みを指標とした測定法であ
る。本アッセイ系の利点は、用いる細胞に含まれるＣＦ
Ｕ−ＭＫの割合が極めて高く（後述の「アッセイ方法」
参照）、これに反して混入するＴＰＯの標的細胞以外の
細胞が少ないので、混入細胞による間接的影響（例え
ば、本因子以外の何らかの物質が混入細胞に作用してＭ
ｅｇ−ＣＳＦ活性を誘導させたり、混入細胞が本因子と
協同作用する何らかの因子を産生したりするなど）を軽
減することができ、また、１つのウエルの中で培養する
全細胞数が少なくてすむために、比較的長い期間良好な
培養環境を維持することができることにある。さらに、
培養期間中に活性標品によってＣＦＵ−ＭＫから生成し
た数多くのサイズの大きい成熟巨核球を位相差顕微鏡下
に観察することができ、活性の有無や程度を定性的に判
定できることも利点である。この定性判定の結果は１４
Ｃ−セロトニンの取り込みによる定量結果と良く対応し
ている。従って、定性判定を併用することにより、定量
結果の信頼性を高めることができる。 「アッセイ方法」まず、アッセイに用いる高度に濃縮さ
れたラットＣＦＵ−ＭＫ（「ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋Ｃ
ＦＵ−ＭＫ画分」）を既に報告している方法（Ｍｉｙａ
ｚａｋｉら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０巻、８５
５〜８６１頁、（１９９２年））を若干改良した方法に
従って調製した。その概略は次のとおりである。Ｗｉｓ
ｔａｒ系ラット（♂、８〜１２週齢）の大腿骨、および
脛骨を摘出し、常法に従い、骨髄細胞浮遊液を調製す
る。骨髄細胞浮遊液の調製には、ＬｅｖｉｎｅとＦｅｄ
ｏｒｋｏが報告した巨核球分離用媒体（Ｌｅｖｉｎｅと
Ｆｅｄｏｒｋｏ、Ｂｌｏｏｄ、５０巻、７１３−７２５
頁、（１９７７））を若干改良した媒体（１３．６ｍＭ
クエン酸三ナトリウム、１１．１ｍＭグルコース、１ｍ
Ｍアデノシン、１ｍＭテオフィリン、１０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ７．２５）、０．５％ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略す）（Ｐａｔｈ−Ｏ−Ｃｙｔｅ
４；生化学工業）、およびＣａ２＋とＭｇ２＋を含まな
いＨａｎｋｓ平衡塩類溶液からなる溶液：以下、ＨＡＴ
ＣＨ溶液と略す）を用いる。骨髄細胞浮遊液を、Ｐｅｒ
ｃｏｌｌ原液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をＨＡＴＣＨ
溶液で希釈して調製したＰｅｒｃｏｌｌ不連続密度勾配
溶液（密度；１．０５０ｇ／ｍｌ／１．０６３ｇ／ｍｌ
／１．０８２ｇ／ｍｌ）の上に重層し、２０℃にて４０
０×ｇで２０分間遠心する。遠心後、密度１．０６３ｇ
／ｍｌと１．０８２ｇ／ｍｌの界面に集まった細胞を回
収する。細胞を洗滌後、１０％ウシ胎仔血清（以下ＦＣ
Ｓと略す）を含むＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培
養液（以下ＩＭＤＭ培養液と略す）で浮遊させ、直径１
００ｍｍの組織培養用プラスティックディッシュに入れ
て、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で１時間培養す
る。培養後、非付着性細胞画分を回収し、再び直径１０
０ｍｍのプラスティックディッシュに入れ、さらに３７
℃で１時間培養した後、非付着性細胞画分を集める。回
収した細胞をＨＡＴＣＨ溶液に再浮遊させ、予めマウス
モノクローナル抗ラット血小板ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗
体であるＰ５５抗体（Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｔｈｒｏｍ
ｂ．Ｒｅｓ．、５９巻、９４１−９５３頁、（１９９
０））を吸着させておいた細菌検査用１００ｍｍペトリ
ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ１００５；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に入れ、室温で１時間静置す
る。その後、非吸着細胞をＨＡＴＣＨ溶液で十分に洗
滌、除去した後、固相化Ｐ５５抗体に吸着した細胞をピ
ペッティングにてはがし、回収する。通常、ラット１匹
から３〜４×１０５個の細胞が得られる。得られた細胞
画分にはラットＣＦＵ−ＭＫが高度に濃縮されており
（以下、「ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分」
と言う）、後述するコロニーアッセイ系における飽和濃
度のラットＩＬ−３存在下の検定により通常５〜１０％
程度のＣＦＵ−ＭＫが含まれることが分かっている。な
お、上記Ｐ５５抗体を産生するハイブリドーマ（ｐ５５
細胞）は、１９９４年２月１４日付で通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４５６３として寄託されている。次に、得られたＧｐ
ＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分を１０％ＦＣＳを
含むＩＭＤＭ培養液で再浮遊させ、組織培養用９６ウエ
ル平底プレートへ１ウエル当たり１０４個の細胞が入る
ように分配し、さらにＩＭＤＭ培養液に対して十分に透
析した標準品（後に詳述する）や、被検検体を加え、最
終培養液量を２００μｌ／ウエルにする。プレートを炭
酸ガス培養器に入れ、３７℃で４日間培養する。４日目
の培養終了３時間前に１ウエル当たり０．１μＣｉ
（３．７ＫＢｑ）の１４Ｃ−セロトニンを添加し、引き
続き３７℃で培養する。培養終了後、プレートを１００
０ｒｐｍにて、３分間遠心し、上清を吸引除去する。続
いて、０．０５％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１ウエル当た
り２００μｌ加えて遠心し、上清を吸引除去し、細胞を
洗滌する。この洗滌操作をもう一度繰り返す。得られた
細胞ペレットへ２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１ウエ
ル当たり２００μｌ加え、プレートをプレートミキサー
で５〜１０分程度振蕩し、細胞を十分に溶解する。得ら
れた細胞溶解液のうちの１５０μｌを市販のカップ状の
固体シンチレーター（Ｒｅａｄｙ Ｃａｐ；Ｂｅｃｋｍ
ａｎ社製）の中へ移し、一晩５０℃の乾燥器中に静置し
て、乾固させる。翌日、Ｒｅａｄｙ Ｃａｐをガラスバ
イアルに入れ、液体シンチレーションカウンターにて
１４Ｃの放射活性を測定する。なお、上述の細胞溶解液
中のアセチルコリンエステラーゼ活性をＩｓｈｉｂａｓ
ｈｉとＢｕｒｓｔｅｉｎの方法（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉと
Ｂｕｒｓｔｅｉｎ、Ｂｌｏｏｄ、６７巻、１５１２−１
５１４頁、（１９８６））に従って測定しても、１４Ｃ
−セロトニンの取り込みによる定量結果と極めて類似し
た結果が得られる。「標準品」 まず、標準品の作製に用いる血小板減少症ラ
ット血漿を以下の方法で調製した。７〜８週齢のＷｉｓ
ｔａｒ系正常ラット（♂）へ、前述したＰ５５抗体を１
回の投与量を０．５ｍｇとして、約２４時間間隔で２
回、静脈注射し、２回目の投与の約２４時間後の血小板
減少期にエーテル麻酔下に開腹し、予め抗凝固剤として
１ｍｌの３．８％（ｖ／ｖ）クエン酸三ナトリウム溶液
を吸い上げておいた１０ｍｌ用注射筒を用いて腹大動脈
から採血した。血液をプラスティック製の遠心チューブ
に移し、１２００×ｇで、１０分間遠心し、血漿画分を
回収した。この血漿画分を再度１２００×ｇで、１０分
間遠心し、遠心後、細胞や血小板などからなるペレット
を吸い上げないように十分に気をつけながら血漿画分を
回収し、プールした（以下、このようにして得られた血
漿を「ＴＲＰ」と言う）。続いて、ＴＲＰから実施例１
に記載する方法に従って調製したＣａ処理ＴＲＰ（標準
品Ｃ）、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅカラム活性画分（標準
品Ｗ）、あるいはＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６ ＦＦ／ＬＳカラム活性画分（標準品Ｐ）を、十分量
のＩＭＤＭ培養液に対して徹底的に透析し、活性検定用
の標準品とした。なお、実施例１に示したラットＴＰＯ
精製過程においては、初期は標準品Ｃを用いたが、途中
から標準品Ｗ、さらにその後は標準品Ｐを用いた。恣意
的に標準品Ｃの活性を１と定義し、それを基に標準品Ｗ
および標準品Ｐの相対活性を求めた。被検検体の相対活
性の求め方は、標準品と被検検体との用量反応曲線を描
き、被検検体の活性が標準品Ｃの活性のｎ倍であったと
き、その検体の相対活性をｎとした。 Ｂ．コロニーアッセイ系 骨髄細胞を半固型の培養液中で被検検体の存在下に培養
し、ＣＦＵ−ＭＫが増殖・分化して形成される巨核球コ
ロニーの数を算定することによりＭｅｇ−ＣＳＦ活性を
測定するアッセイ法である。 「アッセイ法」 （ａ）ラット非分離骨髄細胞などを用いる場合 ラット非分離骨髄細胞、前記Ａ．のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩ
ａ＋ＣＦＵ−ＭＫの分離・濃縮操作の各段階で得られる
細胞、あるいはＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画
分、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン
酸ナトリウム、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、
０．３％の寒天（ＡＧＡＲ ＮＯＢＬＥ、ＤＩＦＣＯ社
製）を含む最終液量１ｍｌのＩＭＤＭ培養液を直径３５
ｍｍの組織培養用プラスチックディッシュに入れて室温
で固化させた後、炭酸ガス培養器中にて３７℃で培養す
る。通常、１つのディッシュ当たりのまき込み細胞数
を、非分離骨髄細胞、Ｐｅｒｃｏｌｌ遠心分離段階およ
びプラスティックディッシュ付着性細胞除去段階の細
胞、およびＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分
で、それぞれ、２〜４×１０５、２〜５×１０４、０．
５〜２×１０３個とする。６〜７日目に寒天ゲルをディ
ッシュから取り出してスライドガラス（７６ｍｍ×５２
ｍｍ）に受け、孔径５０μｍのナイロンメッシュ、続い
て濾紙をのせて水分を吸収し、それらを除いてから室温
で十分に乾燥させる。５０℃のホットプレート上で５分
間熱固定した後、Ｊａｃｋｓｏｎの方法（Ｊａｃｋｓｏ
ｎ、Ｂｌｏｏｄ、４２巻、４１３−４２１頁、（１９７
３））に従って調製したアセチルコリンエステラーゼ染
色液に２〜４時間浸し、巨核球が十分に染色されている
のを確認してから取りだして水洗し、乾燥後Ｈａｒｒｉ
ｓヘマトキシリン液にて３０秒間、後染色を施し、水
洗、風乾させる。アセチルコリンエステラーゼ陽性の巨
核球３個以上から成る集塊を一つのコロニーとして巨核
球コロニー数を算定する。 （ｂ）マウスの非分離骨髄細胞を用いる場合 １つのディッシュ当たりのまき込み細胞数を２〜４×１
０５個として、上記（ａ）と同様の方法で行なうことが
できる。 （ｃ）ヒト骨髄細胞やヒト臍帯血細胞を用いる場合 ヒト骨髄細胞やヒト臍帯血細胞をそのまま用いることも
できるが、以下のようにそれらから濃縮したＣＦＵ−Ｍ
Ｋ画分を用いることができる。 まず骨髄液、あるいは臍帯血をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ
（第一化学社製）上に重層し、遠心後、界面に集まった
白血球画分を回収する。この細胞画分から、ビオチン化
したヒトの細胞表面抗原（ＣＤ２、ＣＤ１１ｃ、および
ＣＤ１９）に対するビオチン化したモノクローナル抗体
が結合する細胞を、アビジンを結合させた磁気ビーズを
用いて除去する。この磁気ビーズ法で除去できる細胞
は、主にＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、および一部
の顆粒球である。残った細胞を、ＦＩＴＣ標識された抗
ＣＤ３４抗体、およびＰＥ標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗
体で染色し、続いてセルソーター（例えば、ＥＬＩＴ
Ｅ；ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いて、ＣＤ３４陽性、か
つＨＬＡ−ＤＲ陽性の細胞画分を回収する。この画分に
ＣＦＵ−ＭＫが濃縮されている（ＣＤ３４＋ＤＲ＋ＣＦ
Ｕ−ＭＫ画分と略す）。ヒトのコロニーアッセイは、上
記のラットの骨髄細胞を用いたコロニーアッセイとほぼ
同様の方法で行なうが、１つのプラスティックディッシ
ュ当たりのＣＤ３４＋ＤＲ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分のまき込
み数を３〜５×１０３個とし、１０％ＦＣＳの代わりに
１２．５％ヒトＡＢ血漿と１２．５％ＦＣＳの混合物を
用いる。また、巨核球コロニーを形成させるまでの培養
期間は１２日間から１４日間である。ヒト巨核球の検出
には、巨核球の表面抗原であるヒトＧｐＩＩｂ／ＩＩＩ
ａに対するマウスモノクローナル抗体を用いたアルカリ
フォスファターゼ−抗アルカリフォスファターゼ抗体法
で巨核球を免疫染色し（例えば、Ｔｅｒａｍｕｒａら、
Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１６巻、８４３−８４８頁、
（１９８８））、３個以上の巨核球からなるコロニーを
巨核球コロニーとして算定する。 Ｃ．ヒト巨核芽球性細胞株を用いたアッセイ系（Ｍ−０
７ｅアッセイ） ヒト巨核芽球性細胞株であるＭ−０７ｅ細胞は、ＧＭ−
ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−２などに応答して増
殖する細胞株であることが知られているが（Ａｖａｎｚ
ｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１４５巻、４
５８−４６４頁、（１９９０）、Ｋｉｓｓら、Ｌｅｕｋ
ｅｍｉａ、７巻、）、ＴＰＯにも応答することが判明
し、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系の代替アッセイ法と
して使うことができる。 「アッセイ法」ＧＭ−ＣＳＦ存在下に継代培養している
Ｍ−０７ｅ細胞を回収し、十分に洗滌後、１０％ＦＣＳ
を含むＩＭＤＭ培養液に再浮遊させる。組織培養用９６
ウエル平底プレートへ１ウエル当たりの細胞数が１０４
個になるようにＭ−０７ｅ細胞を入れ、さらに標準品、
および被検検体を加えて、最終液量を２００μｌ／ウエ
ルにする。プレートを５％炭酸ガス培養器に入れ、３７
℃で、３日間培養する。３日目の培養終了４時間前に１
μＣｉ（３７ＫＢｑ）／ウエルの３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉ
ｎｅを添加し、培養終了後、セルハーベスターで細胞を
ガラス繊維フィルター上に集め、３Ｈの放射活性を液体
シンチレーションカウンター（例えば、ベータプレー
ト；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にて測定する。なお、Ｍ
−０７ｅアッセイにおける相対活性量の定義は、前述
Ａ．のラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおける定義と同じ
である。 Ｄ．マウスプロＢ細胞株を用いたアッセイ系（Ｂａ／Ｆ
３アッセイ） マウスプロＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−３やＩＬ
−４などに応答して増殖する細胞株であることが知られ
ている（Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｃｅｌｌ、４１巻、７２
７−７３４頁）。その亜株であるＢＦ−ＴＥ２２細胞は
ＩＬ−３やＩＬ−４ばかりでなくＴＰＯに応答し、細胞
増殖する事が判明し、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイやヒ
ト巨核芽球性細胞株を用いたアッセイ（Ｍ−０７ｅアッ
セイ）の代替アッセイ法として用いることができる。こ
のアッセイ系の概要は以下の通りである。まず、１ｎｇ
／ｍｌのマウスＩＬ−３存在下に継代培養しているＢＦ
−ＴＥ２２細胞を回収し、イスコフ改変ＤＭＥ培地（Ｉ
ＭＤＭ；ＧＩＢＣＯ社）で３回洗浄したのちに、１０％
ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地に再懸濁させる。次に、組織
培養用９６ウエル平底プレートに１ウエルあたり細胞数
が１ｘ１０４個になるように細胞を接種し、さらにＴＰ
Ｏ標準品あるいは被検検体を加えて、最終液量を２００
ｍｌ／ウエルとなるようにし、プレートを５％炭酸ガス
培養器中で２−３日間培養する。２または３日目の培養
終了４時間前に１ｍＣｉ（３７ＫＢｑ）／ウエルの３Ｈ
−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを添加し、さらに培養を継続す
る。培養終了後、セルハーベスターを用いて細胞をガラ
ス繊維フィルター上に回収し、細胞に取り込まれた３Ｈ
の放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定
する。本アッセイ系ではＴＰＯ活性を含まない被検検体
では、細胞はほぼ死滅し３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅをほ
とんど取り込まないのに対し、ＴＰＯ活性を含む被検検
体では、細胞はＴＰＯ濃度依存的に活発な増殖を示し３
Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取り込みが認められる。ま
た、本アッセイは、Ｍ−０７ｅアッセイやＣＦＵ−ＭＫ
アッセイとパラレルな結果を示す。
活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする新
規ＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と言う）が提供さ
れる。本発明のＤＮＡとしては、配列番号１６に示され
たアミノ酸配列をコードするＤＮＡがある。本発明のＤ
ＮＡには、配列番号１６に示されたアミノ酸配列およ
び、ＴＰＯ活性を保持する限りにおいてそのアミノ酸配
列の一部が改変（置換、欠失、挿入、および／または付
加）されているもの、即ち、ＴＰＯ誘導体をコードする
ＤＮＡが含まれる。別の言い方をすれば、本発明のＤＮ
Ａとしては、アミノ酸配列が実質的に配列番号１６に示
されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含まれる。こ
こで言う、「実質的に配列番号１６に示されたアミノ酸
配列」とは、配列番号１６に示されたアミノ酸配列」に
加えて、「ＴＰＯ活性を保持する限りにおいて、配列番
号１６に示されたアミノ酸配列の一部に置換、欠失、挿
入および／または付加などがあるアミノ酸配列」を含む
ものである。なお、ここで言う「アミノ酸配列をコード
するＤＮＡ」とは縮重関係にあるすべての塩基配列を有
するＤＮＡを意味している。更に、本発明のＤＮＡは、
ＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡであって、以下（ａ）〜（ｃ）から選ばれる
ＤＮＡを包含する。 （ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６に示
されたＤＮＡまたはそれらの相補鎖 （ｂ）（ａ）のＤＮＡまたはその断片と（厳格な条件下
で）ハイブリッド形成するＤＮＡ （ｃ）遺伝コードの縮重がなければ（ａ）、（ｂ）のＤ
ＮＡとハイブリッド形成しうるＤＮＡ。 また、別の言い方をすれば、本発明のＤＮＡは以下の
（ａ）、（ｂ）のいずれかに示されたＤＮＡも包含す
る。 （ａ）大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＥＦ１８Ｓ
−Ａ２α（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４５６５）に組込
まれているＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ、または大腸菌ＤＨ５に担持され
たベクターｐＨＴ１−２３１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４５６４）に組込まれているＴＰＯ活性を有するタン
パク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ （ｂ）ＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡであって、（ａ）のＤＮＡまたはその
断片と（厳格な条件下で）ハイブリッド形成するＤＮ
Ａ。 ここで“厳格な”ハイブリダイゼーション条件という表
現は、縮重配列の、および／または単一配列のオリゴヌ
クレオチドプライマー（プローブ）を用いることにより
行う、本発明においてＤＮＡのＰＣＲ増幅をとりあげた
一連の実施例において使用されるものである。例とし
て、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）の
第１１章および第１４章、あるいは、Ａｕｓｕｂｅｌら
編“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９３）のユニ
ット２．１０を参照のこと。本発明のＤＮＡとしては配
列番号１６に示されたアミノ酸配列のうち、１位から１
６３位のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、か
つＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも
含まれる。このようなＤＮＡは、制限酵素による切断部
位の供与、および／または、発現を容易にするような発
現ベクター構築のための開始部、終止部または中間部へ
のＤＮＡの付加的供与を含むことができる。また、非哺
乳類宿主を選択する場合には、それにおける発現に好ま
しいコドン（優先コドン）を組み込んでも良い。本発明
のＤＮＡとしては、ヒトをはじめとする哺乳動物細胞な
どからｍＲＮＡを調製した後、既知の方法で作製された
ｃＤＮＡライブラリーから、既知の方法によってスクリ
ーニングすることによって得られたｃＤＮＡがある。こ
の場合のｍＲＮＡの供給源としては、ラット肝臓細胞由
来の細胞株ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞、ＨＴＣ細胞、Ｈ
４−ＩＩ−Ｅ細胞、ラット肝臓、腎臓、脳、小腸、ヒト
肝臓等が挙げられる。また、本発明のＤＮＡとしては、
ヒトをはじめとする哺乳動物細胞から既知の方法で作製
されたゲノムライブラリーから既知の方法でスクリーニ
ングされたゲノムＤＮＡであってもよい。この場合のゲ
ノムＤＮＡの供給源としては、ヒト、ラット、マウス等
の染色体ＤＮＡが挙げられる。また、このようにして得
られた、ＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードするｃ
ＤＮＡを周知の部位特異的突然変異法を用いて修飾する
ことによって、一部のアミノ酸配列が改変されたもの、
即ちＴＰＯ誘導体をコードするＤＮＡを得ることができ
る。また、本明細書中で開示されたＴＰＯ活性を有する
タンパク質のアミノ酸配列／塩基配列に基づいて、その
一部のアミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードす
るＤＮＡは、その一部または全部を化学合成することに
よっても当業者が容易に得ることができる。本発明のＤ
ＮＡは、種々の遺伝子組換え技術によってＴＰＯ活性を
有するタンパク質を大量生産するために有用な物質であ
る。更に、本発明のＤＮＡは、ＴＰＯの関連タンパク質
をコードする遺伝子、並びに他の哺乳動物のＴＰＯのｃ
ＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡを単離する場合に標識化プ
ローブとして用いるのに適した物質である。また、ヒト
および他の哺乳類種における遺伝子療法において有用で
ある。本発明のＤＮＡは、大量のＴＰＯおよびＴＰＯ生
産のための真核宿主として用いることができるトランス
ジェニック哺乳類種の開発に有用である（Ｐａｌｍｉｔ
ｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、８０９−８１４、
（１９８３））。また、本発明によれば、上記ＴＰＯ活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ
ベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿
主細胞を培養し、産生されたＴＰＯ活性を有するタンパ
ク質を分離・精製することを特徴とするＴＰＯ活性を有
するタンパク質の製造方法が提供される。この場合の宿
主細胞としては、原核生物（例えば細菌、好ましくは大
腸菌）、真核生物（例えば酵母、昆虫、あるいは哺乳動
物）細胞を用いることができる。哺乳動物細胞の例とし
ては、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈ
ｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、Ｘ６
３．６．５．３．細胞、Ｃ−１２７細胞、ＢＨＫ（Ｂａ
ｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ヒト由来
細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）等があげられる。酵母の
例としては、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やメタノール資化性酵母（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等があげられる。昆虫細
胞の例としては、蚕培養細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）
等があげられる。これらの宿主細胞を形質転換させるた
めに用いられるベクターには、大腸菌用としてｐＫＣ３
０（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ Ｈ．ａｎｄ Ｍ．Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ、２９２、１２８−１３２、１
９８１）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍａｎｎ Ｅ．ら、Ｇｅ
ｎｅ６、６９、３０１−３１５、１９８８）等があげら
れる。哺乳動物細胞用としてはｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１、３２７−３４１、１９８２）、
ｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａら；Ｇｅｎｅ、１０８、１９３
−２００、１９９１）、あるいはｐｃＤＬ−ＳＲ α２
９６（Ｔａｋｅｂｅら；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．、８、４６６−４７２、１９８８）等がある。酵母
用としてはｐＧ−１（Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．ａｎｄ Ｙａ
ｍａｍｏｔｏ Ｋ．Ｒ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１、９
６５−９６７、１９８８）等がある。蚕細胞用として
は、組み換えウイルス作製用トランスファーベクターｐ
Ａｃ３７３（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、６、４７−５５、１９８８）等がある。これら
のベクターは必要に応じて複製起点、選択マーカー、プ
ロモーターを含み、さらに真核細胞用のベクターには、
必要に応じてＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シ
グナル等が付加される。複製起点として、哺乳動物細胞
用ベクターには、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピ
ローマウイルス由来のもの等を用いることができる。大
腸菌用ベクターとしては、ＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子
由来のもの等を用いることができる。酵母用としては２
μｍＤＮ ＡＲＳ１由来のもの等を用いることができ
る。遺伝子発現用プロモーターとして哺乳動物細胞用ベ
クターには、ウイルス由来であるレトロウイルス、ポリ
オーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０由来のもの
等あるいは、染色体由来のもの（例えば、ＥＦ１−α）
等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしてはバ
クテリオファージλ由来のものや、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｌ
ａｃ、ｔａｃプロモーター等を用いることができる。パ
ン酵母用としてはＡＤＨ、ＰＨ０５、ＧＰＤ、ＰＧＫ、
ＭＡＦαプロモーター、メタノール資化性酵母について
はＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。蚕細
胞用ベクターとしては核多角体病ウイルス由来のもの等
を用いることができる。選択マーカーとして、哺乳動物
細胞用ベクターには、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝
子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還
元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺
伝子等を用いることができる。大腸菌用ベクターとして
は、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝
子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができ
る。酵母用としてはＬｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝
子等を用いることができる。以上の様な宿主−ベクター
系を用いてＴＰＯ活性を有するタンパク質を得るために
は、上記ベクターの適当な部位に該遺伝子を組み込んだ
組み換えＤＮＡ体により、宿主細胞を形質転換させた
後、得られた形質転換体を培養し、さらに細胞内あるい
は培養液から該ポリペプチドを分離・精製すればよい。
これらに用いられる手段・方法は公知のものを組み合わ
せて行なうことができる。宿主を用いて発現させる場合
に、その発現産物のＮ末端をより確実に均一化するた
め、本来のシグナル配列を改変したり、他のタンパク質
のシグナル配列を用いてもよい。また、Ｎ末端およびそ
の近傍のアミノ酸残基を改変（置換、あるいは付加）す
ることに（例えば、大腸菌を用いて発現させる場合にメ
チオニン残基に加え、リジン残基を加えるなど）よって
も、Ｎ末端を均一化することが可能である。また、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：Ｇｌｕｔ
ａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とＴＰ
Ｏとをトロンビン認識ペプチドを介した融合タンパク質
として適当な宿主にて発現させ、単離した後、その融合
タンパク質をトロンビン処理することにより、ＧＳＴ部
分を除去し、−１位にグリシン残基が付加されたＧｌｙ
−１ＴＰＯタンパク質を得ることができる。本発明のＴ
ＰＯ活性を有する新規タンパク質（以下、「本発明のタ
ンパク質」と言う）としては、配列番号１６に示された
アミノ酸配列から成るタンパク質がある。また、本発明
にはＴＰＯ活性を保持する限り、その一部のアミノ酸配
列が改変（置換、欠失、挿入、および／または付加）さ
れたもの、即ちＴＰＯ誘導体も含まれる。別の言い方を
すれば、本発明のタンパク質としては、アミノ酸配列が
実質的に配列番号１６に示されたアミノ酸配列であるよ
うなタンパク質が含まれる。ここで言う、「実質的に配
列番号１６に示されたアミノ酸配列」とは、「配列番号
１６に示されたアミノ酸配列」に加えて、「ＴＰＯ活性
を保持する限りにおいて、配列番号１６に示されたアミ
ノ酸配列の一部に置換、欠失、挿入および／または付加
などがあるアミノ酸配列」を含むものである。本発明の
タンパク質としては、配列番号１６に示されたアミノ酸
配列の７位から１５１位のアミノ酸配列を含み、かつＴ
ＰＯ活性を有するタンパク質も含まれる。より具体的に
は、配列番号６に示されたアミノ酸配列のうち、１位か
ら２３１位、１位から２１１位、１位〜１９１位、１位
〜１７１位、１位〜１６３位、１位〜１５７位、１位〜
１５６位、１位〜１５５位、１位〜１５４位、１位〜１
５３位、１位〜１５１位及び７位〜１６３位からなるヒ
トＴＰＯタンパク質が本発明のタンパク質として挙げら
れる。更には、上記７位から１５１位の配列内部または
外部に、ＴＰＯ活性を損なわない範囲で、少なくとも１
つのアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を
有しているタンパク質も本発明のタンパク質に含まれ
る。本発明のＴＰＯ誘導体の他の例としては、例えば、
アミノ酸の改変（置換、欠失、挿入および／または付
加）を行うことによって安定性や体内での持続性の向上
を図ったもの、糖鎖の付加する１つ以上の潜在的部位を
欠失または付加して変化させたもの、１つ以上のシステ
イン残基を欠失させるか、またはシステインを他のアミ
ノ酸残基（例えば、アラニンまたはセリン残基）で置換
したものなどが挙げられる。一般にタンパク質の熱力学
的安定性を向上させる方法として、プロリン残基の導入
とグリシン残基の除去が有効であることが理論的に示さ
れている。（Ｍａｔｔｈｅｗｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，６６６３−
６６６７．１９８７）。そこで、安定性の向上を目的と
したＴＰＯ誘導体を設計する場合、プロリン残基を導入
したＴＰＯ誘導体およびグリシン残基を除去したＴＰＯ
誘導体を考えることができる。ヒトＴＰＯへのプロリン
残基の導入部位の選定には、例えば、このものに高い相
同性を有する他の生物種由来のＴＰＯ（マウスＴＰＯ：
Ｓｉ Ｌｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．３６９巻、５６５−５６８頁、（１９
９４）、イヌＴＰＯ：Ｔ．Ｄ．Ｂａｒｔｌｅｙら、ｃｅ
ｌｌ ７７巻、１１１７−１２４頁、（１９９４））の
アミノ酸配列を利用することができる。例えば、ヒト型
とラット型のアミノ酸配列（配列番号１５）を比較し、
ヒト型ではプロリンではないがラット型ではプロリンを
有する部位、あるいは、ヒト型ではグリシンだがラット
型ではグリシン以外のアミノ酸を有する部位を選ぶこと
ができる。例えばこのような部位として、配列番号１６
に示されたヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、９位のロ
イシン残基、８２位のグリシン残基、１４６位のグリシ
ン残基、１４８位のセリン残基などが挙げられ、それら
のグリシン残基を他のアミノ酸残基に置換した誘導体
や、セリン残基をプロリン残基に置換した誘導体などが
考えられる。また、一般にタンパク質は、疎水性アミノ
酸を内側に、親水性アミノ酸を外側に立体構造が形成さ
れることから、タンパク質表面に存在するアミノ酸をよ
り親水性の高い荷電性アミノ酸に置換することによって
タンパク質の溶解性の向上を期待することができる。ヒ
トＴＰＯの場合でも、このような観点から誘導体を設計
することができる。例えば、１４位のリジン残基、５２
位のリジン残基、５９位のリジン残基、１１５位のグル
タミン残基、１１９位のトレオニン残基、１３８位のリ
ジン残基をそれぞれアルギニン残基に置換したものなど
が挙げられる。更には、ＴＰＯとアミノ酸配列における
類似性が指摘されているＥｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ
（ＥＰＯ）において、一次構造上４番目に位置するヘリ
ックス（Ｄヘリックス）を予測し、正電荷を導入したと
ころ、生物活性の向上が認められている（特開平３−７
２８８５）ことから、ＴＰＯについてもそのアミノ酸配
列からＤヘリックスを予測し、ＴＰＯ誘導体を設計する
ことができる。一般にタンパク質のＤヘリックスの予測
には、例えば、金久らによる二次構造予測プログラムＩ
ＤＥＡＳ（金久、ＩＤＥＡＳ ｕｓｅｒ’ｓ ｍａｎｕ
ａｌ）等が使用できる。次に、Ｄヘリックスが位置する
と予測された領域で、外側に位置するアミノ酸を推定
し、正電荷を導入する候補となるアミノ酸残基を選定す
る。このような候補の選定は、例えば、目的領域の車輪
モデル（Ｓｈｉｆｆｅｒ とＥｄｍｕｎｄｓｏｎ，Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｊ．７，１２１−１３５．１９６７）を作
成することにより可能である。ヒトＴＰＯの場合、Ｄヘ
リックスの位置は１２６番目から１４２番目の領域と予
測されるが、この領域で選定されるアミノ酸残基として
例えば、１２９位のロイシン残基、１３３位のヒスチジ
ン残基、１４３位のメチオニン残基等が挙げられる。従
って、これらのアミノ酸残基をアルギニン残基、あるい
はリジン残基に置換して正電荷を導入するような誘導体
が考えられる。本発明のＴＰＯ誘導体をより具体的に例
示すれば、少なくとも、ヒトＴＰＯの１位のセリン残基
がアラニン残基に、かつ３位のアラニン残基がバリン残
基に置換されたタンパク質、２５位のアルギニン残基が
アスパラギン残基に置換されたタンパク質、３３位のヒ
スチジン残基がトレオニン残基に置換されたタンパク
質、２５位のアルギニン残基がアスパラギン残基に、か
つ２３１位のグルタミン酸残基がリジン残基に置換され
たタンパク質、更にこれらのタンパク質のＣ末端にＴｈ
ｒＳｅｒＩｌｅＧｌｙＴｙｒＰｒｏＴｙｒＡｓｐＶａｌ
ＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｌａＧｌｙＶａｌＨｉｓＨｉｓＨ
ｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓのポリペプチドが付加されたタ
ンパク質を挙げることができる。更には、少なくとも、
３３位のヒスチジン残基が欠失したタンパク質、１１６
位のグリシン残基が欠失したタンパク質、１１７位のア
ルギニン残基が欠失したタンパク質、３３位のヒスチジ
ン残基と３４位のプロリン残基の間にトレオニン残基が
挿入されたタンパク質、３３位のヒスチジン残基と３４
位のプロリン残基の間にアラニン残基が挿入されたタン
パク質、３３位のヒスチジン残基と３４位のプロリン残
基の間にグリシン残基が挿入されたタンパク質、３３位
のヒスチジン残基と３４位のプロリン残基の間にグリシ
ン残基が挿入され、かつ３８位のプロリン残基がセリン
残基に置換されたタンパク質、１１６位のグリシン残基
と１１７位のアルギニン残基の間にアスパラギン残基が
挿入されたタンパク質、１１６位のグリシン残基と１１
７位のアルギニン残基の間にアラニン残基が挿入された
タンパク質、１１６位のグリシン残基と１１７位のアル
ギニン残基の間にグリシン残基が挿入されたタンパク質
を挙げることができる。また、少なくとも、１２９位の
ロイシン残基がアルギニン残基に置換されたタンパク
質、１３３位のヒスチジン残基がアルギニン残基に置換
されたタンパク質、１４３位のメチオニン残基がアルギ
ニン残基に置換されたタンパク質、８２位のグリシン残
基がロイシン残基に置換されたタンパク質、１４６位の
グリシン残基がロイシン残基に置換されたタンパク質、
１４８位のセリン残基がプロリン残基に置換されたタン
パク質、５９位のリジン残基がアルギニン残基に置換さ
れたタンパク質、１１５位のグルタミンがアルギニン残
基に置換されたタンパク質が挙げられる。また、本発明
のＴＰＯタンパク質としては、配列番号１６に示される
アミノ酸配列を有するヒトＴＰＯ、および前述の誘導体
の−２位にメチオニン残基、かつ−１位にリジン残基が
付加されたタンパク質、−１位にメチオニン残基が付加
されたタンパク質も含まれる。好ましくは、本発明のタ
ンパク質は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または化学合成
により得られるＤＮＡを含む組換えベクターで、形質転
換された宿主細胞から分離・精製して得られたものであ
ることを特徴とする。宿主として、細菌（例えば、大腸
菌）を用いて菌体内発現を行う場合には、ＴＰＯ活性を
有するタンパク質のＮ末端側に開始メチオニン残基の付
加されたタンパク質が得られるが、このようなタンパク
質も本発明に含まれる。また、用いる宿主によっては、
産生されるＴＰＯ活性を有するタンパク質はグリコシル
化されている場合もあるし、あるいはグリコシル化され
ていない場合もあるがいずれも、本発明のタンパク質に
含まれる。また、本発明のタンパク質としては、天然の
供給源（例えば、ＴＰＯ活性を含むならし培地、または
ヒト尿、血清、血漿）から精製および単離されたＴＰＯ
活性を有する天然のタンパク質も含まれる。また、本発
明によれば、そのような天然の供給源からＴＰＯを精製
する方法を包含する。そのような精製法としては、一般
にタンパク質の精製に用いる工程（イオン交換クロマト
グラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィ
ー、色素吸着クロマトグラフィー、疎水相互クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィ
ー、硫酸化ゲルクロマトグラフィー、ハイドロキシルア
パタイトクロマトグラフィー、金属キレーティングクロ
マトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、分取電気
泳動法、および等電点電気泳動法など）の一つ以上を組
み合わせた方法がある。また、後述の実施例から推定し
うるＴＰＯの物理化学的な性質を利用して組み合わせる
ことのできる方法も本発明に含まれる。さらには、ＴＰ
Ｏを認識することのできる抗体を用いた抗体カラムをも
用いることができる。また、ＴＰＯはＭｐｌのリガンド
であることが判明したことから（ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ
ら、Ｎａｔｕｒｅ３６９巻５３３−５３８頁（１９９
４）、Ｂａｒｔｌｅｙら、Ｃｅｌｌ ７７巻１１１７−
１１２４頁（１９９４）、Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３６９巻５６５−５６８頁（１９９
４））、Ｍｐｌを活性化ゲルにカップリングさせること
でアフィニティーゲルカラムを調製し、これを利用する
ことによってもＴＰＯを精製することができる。より具
体的には、Ｍｐｌの細胞外領域（Ｍｐｌ−Ｘ）をＣＨＯ
細胞を宿主として用いた遺伝子組換え法により生産・調
製し、調製されたＭｐｌ−Ｘカラムが挙げられる（前述
のＢａｒｔｌｅｙら（１９９４））。本発明は更に、Ｔ
ＰＯのヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの蛋白質コード
鎖と相補的なＤＮＡの部分によってコードされる種類の
タンパク質、即ちＴｒａｍｏｎｔａｎｏら（Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２、５０４９−５０５９（１
９８４））が記載したような“相補的逆方向蛋白質”を
含む。本発明には、固体組織および血液または尿のよう
な液体試料中のＴＰＯまたはその受容体保有細胞の検出
および定量に有用な試薬を提供するために、検出可能な
マーカー物質で標識（例えば１２５Ｉで放射能標識する
か、またはビオチニル化する）された本発明のタンパク
質も含まれる。ビオチニル化された本発明のタンパク質
は、自己骨髄移植において骨髄から巨核芽球性細胞を除
去するために固定化ストレプトアビジンと結合する場合
に有用である。更には、自己または同種異系骨髄移植の
場合に自己または同種異系巨核球系細胞を濃縮するため
に固定化ストレプトアビジンと結合する場合に有用であ
る。リシン、ジフテリア毒素のような毒素とＴＰＯとの
毒素結合体、および放射性同位元素は、抗癌療法に対し
て、または骨髄移植のコンディショニング養生法として
有用である。また、本発明は、検出可能マーカー（例え
ば放射能標識、またはビオチンのような非同位元素標
識）で標識される場合や、染色体地図におけるヒトＴＰ
Ｏ遺伝子位置および／または任意の関連遺伝子ファミリ
ーの位置を突き止めるためのハイブリダイゼーション法
に用いるのに有用な核酸物質も提供する。それらは、Ｄ
ＮＡレベルでヒトＴＰＯ遺伝子障害を確認するためにも
有用であって、隣接遺伝子およびそれらの障害を確認す
るための遺伝子マーカーとしても用いられる。さらに、
本発明には、有用で好適な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、
乳化剤、アジュバントおよび／または担体とともに治療
上有効量の本発明のタンパク質を含有する医薬組成物も
含まれる。本明細書中で用いる“治療上有効量”という
用語は、指定の条件および投与法に対して治療効果を提
供する量を示す。このような組成物は、液体であるか、
あるいは凍結乾燥またはさもなくば乾燥された剤形であ
って、種々のｐＨ、およびイオン強度から成る緩衝剤
（例えばトリス−塩酸、酢酸塩、燐酸塩）より選択した
希釈剤、表面に吸着しないようにするためのアルブミン
またはゼラチンのような添加剤、界面活性剤（例えばＴ
ｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
Ｆ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えばグリセロー
ル、ポリエチレングリコール）、酸化防止剤（例えばア
スコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例
えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、
賦形剤または等張化剤（例えばラクトース、マンニトー
ル）を配合した製剤が含まれる。また、蛋白質に対する
ポリエチレングリコールのような重合体との共有結合、
金属イオンとの錯体化、あるいはポリ乳酸、ポリグリコ
ール酸、ヒドロゲルなどのような重合化合物の粒状製剤
中またはその表面上への、あるいはリポソーム、ミクロ
エマルジョン、ミセル、単層または多層小胞、赤血球ゴ
ースト、またはスフェロプラスト中への当該物質の取り
込みを包含する。このような組成物は、ＴＰＯの物理的
状態、溶解性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、ｉｎ
ｖｉｖｏクリアランスに影響を及ぼすと思われるの
で、組成物の選択は、ＴＰＯ活性を有する蛋白質の物理
的および化学的特性による。さらに、重合体（例えばポ
ロキサマーまたはポロキサミン）と、組織特異的受容
体、配位子または抗原に対する抗体に結合するか、ある
いは組織特異的受容体の配位子に結合するＴＰＯとで被
覆される粒状組成物も本発明に包含される。本発明の組
成物の別の剤形としては、非経口、経肺、経鼻、および
経口を含めた種々の投与経路のため、粒状形態、保護被
膜、プロテアーゼ阻害剤、または吸収促進剤を配合す
る。本発明のタンパク質を含有する医薬組成物は、活性
成分として通常０．０５μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ
体重を、病状、性別及び投与経路等に応じて、一日数回
程度投与することができる。本発明のタンパク質を含有
する医薬組成物は、活性成分として後述のＭ−０７ｅア
ッセイにおける相対活性量通常２５，０００〜５００，
０００，０００／ｋｇ体重を、病状、性別及び投与経路
等に応じて、一日一回〜数回、１週間に１〜７日間程度
投与することができる。更に本発明は、本発明のタンパ
ク質に加えてＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−
ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｉ
Ｌ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、Ｉ
Ｌ−１０、１Ｌ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＬＩ
Ｆ、ＳＣＦのような因子の１つ以上を付加的造血因子と
して含有する組成物を包含する。本発明のタンパク質
は、単独あるいは他の付加的造血因子との組み合わせて
も、多数の血小板減少症の治療に有用である。他の付加
的造血因子としては、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ
−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ
−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１
３、ＬＩＦ、ＳＣＦを挙げることができる。本発明によ
れば、本発明のタンパク質を有効成分とし、制ガン剤や
免疫抑制剤の投与による化学療法や放射線療法、あるい
は骨髄移植（ＢＭＴ）における血小板減少症の治療剤が
提供される。更に、血小板障害、例えば、血小板産生障
害や血小板の寿命短縮（血小板破壊の亢進、あるいは血
小板消費の亢進）による血小板減少を特徴とし、本発明
のタンパク質で治療可能な多数の疾患が存在する。例え
ば、先天性のファンコニ貧血、化学療法や放射線療法に
伴う再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白
血病、または骨髄移植のような骨髄形成不全による血小
板減少症などが挙げられ、このような患者の血小板の回
復を促進するために用いることができる。また、ＴＰＯ
産生異常による血小板減少症にも有用である。血小板や
巨核球の寿命短縮による血小板減少症としては例えば、
特発性血小板減少性紫斑病、後天性免疫不全症候群（Ａ
ＩＤＳ）、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少
症などがあり、このような患者の血小板回復促進にも有
用である。更に、外科手術前にＴＰＯを投与して自分の
血小板を増加させ、その血小板を自分の手術時に輸血用
血小板として用いる（自己血小板輸血）への用途として
も有用である。さらに本発明のタンパク質の別の用途
は、例えば他の化学薬品または医薬品、または治療的措
置による一過性の血小板の欠損または損傷によってもた
らされた障害の処置である。ＴＰＯは、そのような患者
で新しい“無傷の”血小板の放出を促進するのに用いる
ことができる。本発明はさらにＴＰＯに特異的に結合す
る抗体、およびそれを得るための抗原を提供する。本発
明のタンパク質または抗原決定基を有する該タンパク質
の部分断片が抗原として使い得る。そのような抗体は、
モノクローナルおよびポリクローナル抗体の双方、およ
び既知の方法によって作製したキメラ抗体、即ち“組換
え”抗体などを含む。種々の抗原決定基（エピトープ）
に対する種々の抗体を一般に含有する慣用的抗体（ポリ
クローナル）製剤に対比して、モノクローナル抗体は各
々、抗原上の単一抗原決定基に対する抗体である。ＴＰ
Ｏに対する特異抗体は、抗原−抗体反応を用いる診断お
よび分析的アッセイ法の選択性および特異性を改良した
り、ＴＰＯを分離・精製するのに有用である。さらに、
それらは、血清からＴＰＯを中和または除去するのに用
いられる。モノクローナル抗体の利点は、それらが、他
の免疫グロブリンが混入していない培地中でハイブリド
ーマ細胞によって合成され得ることである。モノクロー
ナル抗体は、ハイブリドーマ細胞の培養上清から、また
はマウスにハイブリドーマ細胞を腹腔内接種することに
よって誘導される腹水から調製される。Ｋｏｈｌｅｒと
Ｍｉｌｓｔｅｉｎが最初に記載したハイブリドーマ技術
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６、５１１−５１９
（１９７１））は、多数の特異抗原に対する高レベルの
モノクローナル抗体を保有するハイブリッド細胞系を生
成するために広く用い得る。以下、本発明を更に詳細に
説明する。 （Ａ）ラットＴＰＯの精製〜ラット精製ＴＰＯの部分ア
ミノ酸配列の分析〜ラット精製ＴＰＯの生物学的特性の
分析 本発明者らは、まずラットＣＦＵ−ＭＫの増殖・分化促
進活性を有するタンパク質（ラットＴＰＯ）の精製を試
みた。本精製では、種々の天然の供給源の選択、更に
は、クロマトグラフィー担体の選択、分離手段の選択な
ど、精製の組立について数々の試行錯誤を繰り返した。
その結果、本発明者らは、Ｘ線、あるいはγ線照射によ
り誘導した血小板減少症ラットの血漿より、後述の＜参
考例＞に記載したラットＣＦＵ−ＭＫアッセイに基づく
ＴＰＯ活性を指標として、ＴＰＯ活性を有するタンパク
質を精製し、その部分アミノ酸配列を決定した＜実施例
１〜２＞。また、その血漿由来ラットＴＰＯの生物学的
特性について試験した＜実施例３＞。なお、精製から、
精製されたラットＴＰＯの部分アミノ酸配列の決定まで
の概要は以下の通りである。 （１） Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板減少症ラ
ット約１１００匹分の血漿を集め、Ｓｅｐｈａｄｅｋ
Ｇ−２５クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）、更にレク
チンクロマトグラフィー（ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ）の
ステップまで進め、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ
活性画分を得た。 （２） 次に、このＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ
活性画分を色素吸着アフィニティークロマトグラフィー
（ＴＳＫ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ＭＨ）、疎水相互作
用クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ．６ ＦＦ／ＬＳ）、ゲル濾過クロマトグラフィー
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ）までの処理
を実施した。このＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ Ｈ
Ｒにおいては、ＴＰＯ活性は４つのピーク（分子量の大
きいものから、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４）に分かれたの
で、ＴＰＯ活性画分Ｆ２とＦ３とをそれぞれ濃縮し、高
分子ＴＰＯ標品Ｆ２、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３として、そ
れぞれ個別に次の精製ステップに進めた。 （３） 低分子ＴＰＯ標品Ｆ３を分取逆相クロマトグラ
フィー（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥ ＩＮ−Ｒ
Ｐ）、逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＰａｃｋＣＮ
−ＡＰ）、更に逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌ
ｌ Ｐａｃｋ Ｃ１）で分離した。得られたＴＰＯ活性
画分を、ＳＤＳゲル電気泳動にかけ、電気泳動ゲルから
ＴＰＯ活性の抽出を行ったところ、非還元下で見かけ上
分子量約１７０００〜１９０００のバンドにＴＰＯ活性
が存在することが確認できた。 （４） そこで、全てのＴＰＯ活性画分を非還元下でＳ
ＤＳゲル電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜に転写した。次い
で、ＰＶＤＦ膜上タンパク質の系統的な限定酵素分解に
よるペプチド断片化を実施し、ラットＴＰＯタンパク質
の部分アミノ酸配列を決定することができた（２つの断
片のアミノ酸配列情報を基にラットＴＰＯの遺伝子クロ
ーニングを実施した。）。 （５） 一方、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ
からの高分子ＴＰＯ標品Ｆ２についても、低分子ＴＰＯ
標品Ｆ３と同様に精製を進め、最終ステップの逆相クロ
マトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｃｋ Ｃ１）で
得られたＴＰＯ活性画分をＳＤＳゲル電気泳動にかけ、
ＴＰＯ活性の抽出を行った。活性を調べてみると、Ｆ３
由来のＴＰＯと同じく、非還元下で見かけ上分子量約１
７０００〜２２０００のバンドにＴＰＯ活性が存在する
ことが確認できた。 （Ｂ）ラットＴＰＯ産生細胞の特定化〜ｍＲＮＡの調製
〜ラットｃＤＮＡライブラリーの構築 精製したラットＴＰＯは血漿由来であるため、ｃＤＮＡ
クローニングのためには、ｍＲＮＡの供給源となる臓器
あるいは細胞を選抜する必要があった。そこでラット血
漿由来ＴＰ０の生化学的性質と生物学的性質に基づい
て、種々の臓器、あるいは細胞の培養上清中のＴＰＯ活
性をスクリーニングした。その結果、ラット肝臓細胞由
来の細胞株であるＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞、ＨＴＣ細
胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞の培養上清中、並びにラットの
初代肝臓細胞の培養上清中にもラット血漿由来ＴＰＯと
ほぼ同等のＴＰＯ活性を見いだした＜実施例４＞。一
方、サル細胞（ＣＯＳ１細胞）でのｃＤＮＡ発現ベクタ
ーｐＥＦ１８Ｓを、２種類の発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ
並びにｐＥＦＢＯＳを組み合わせて構築した＜実施例５
＞。このベクターの構築によりインサートの組み込みに
使用できる多種類のクローニング部位を持つ、発現効率
の高いベクターを用いてｃＤＮＡをクローニングするこ
とが容易となった。ｃＤＮＡライブラリーの構築には上
記の発現ベクターの他にｐＵＣ系やｐＢＲ系のプラスミ
ドベクター、λ系のファージベクター等が主に使用され
る。本発明者らは、ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞を培養
し、グアニジンチオシアナート溶液を加えてホモジナイ
ズ後、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法により全ＲＮＡを得た＜
実施例６＞。ＲＮＡの調製は熱フェノール法や酸性グア
ニジンフェノールクロロホルム法等でも行なうことが出
来る。この全ＲＮＡからオリゴｄＴ固定化ラテックス粒
子によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した後、制限酵素Ｎ
ｏｔＩ切断配列を付加したオリゴｄＴをプライマーとし
て逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＮａｓ
ｅ ＨおよびＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩを用
いて、２本鎖ｃＤＮＡを得た。得られた２本鎖のｃＤＮ
ＡにＥｃｏＲＩリンカーを付加し、これを実施例５で構
築したｃＤＮＡ発現ベクターｐＥＦ１８ＳをＮｏｔＩと
ＥｃｏＲＩで切断したものとつなぎ合わせて、コンピテ
ントな大腸菌ＤＨ５株を形質転換させ、ｃＤＮＡライブ
ラリーを構築した＜実施例７＞。 （Ｃ）ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得
（クローニング） ラット血漿より精製したラットＴＰＯの部分アミノ酸配
列をもとに、その配列をコードすると考えられるＤＮＡ
配列を予測し、ポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ
ＣＲ）に使用する縮重プライマーを合成した。使用する
プライマーは、本発明で用いたプライマー以外の位置の
アミノ酸配列に基づくものであってもよい。また、イノ
シンを使わず縮重度の高いプライマーを用いることも出
来る。更に、ラットにおいて使用頻度の高いコドンを使
用して縮重度を減らしたプライマーを設計することも出
来る（ＷａｄａらＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１８、２３６７〜２４１１、１９９０参照）。先
に作製したｃＤＮＡライブラリー全体よりプラスミドＤ
ＮＡを抽出し、このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し
たところ約３３０ｂｐのバンドが検出され、塩基配列を
決定したところ、ラットＴＰＯの遺伝子の一部をコード
するＤＮＡ断片（Ａ１断片）であることが分かった＜実
施例８＞。 （Ｄ）ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡのスクリー
ニング〜ラットＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス〜発現確
認 先に構築したｃＤＮＡライブラリーを約１万クローンず
つのプールに分け、それらのうち１００プールからプラ
スミドＤＮＡを抽出した。これらＤＮＡを鋳型とし、Ａ
１断片の塩基配列をもとに新たに合成したプライマーを
使用してＰＣＲを行なったところ、１００プール中３プ
ールに特異的と考えられるバンドが検出された。そこ
で、これらのうち１プールを選び、このプールをさらに
約９００クローンずつのサブプールに分け、それらのう
ち１００プールについて同様のＰＣＲを行なったとこ
ろ、３サブプールでバンドが検出された。これらのうち
１プールを選択し、更に、４０クローンずつのサブプー
ルに分け、最終的には１クローンづつ同様のＰＣＲによ
る選別を行なった結果、ラットＴＰＯ遺伝子ｃＤＮＡ断
片を担持したプラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αを持つク
ローンの単離に成功した＜実施例９〜１０＞。このｃＤ
ＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、ラット血漿中よ
り精製し部分的に決定したアミノ酸配列をコードしてい
ることが明らかとなり、ラットＴＰＯ遺伝子であると考
えられた＜実施例１０＞。上記のようにして得られたク
ローンよりプラスミドＤＮＡを精製し、ＣＯＳ１細胞に
トランスフェクションしたところ、その培養上清中にＴ
ＰＯ活性を検出することができた。この結果、得られた
ｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αはラットＴＰＯをコードしている
ｃＤＮＡを担持していることが確認できた＜実施例１１
＞。 （Ｅ）ラット各種組織でのＴＰＯｍＲＮＡの検出 ラット体内におけるＴＰＯｍＲＮＡの発現組織をＰＣＲ
によって解析し、脳、肝臓、小腸、並びに腎臓において
特異的な発現を検出した＜実施例１２＞。 （Ｆ）ヒトｃＤＮＡライブラリーの構築 実施例４および１２の結果より、ヒトＴＰＯｃＤＮＡク
ローニングのための出発組織として肝臓を選択した。そ
こで、市販の正常ヒト肝臓由来のｍＲＮＡより、ｃＤＮ
Ａライブラリーを構築した。ベクターにはラットのライ
ブラリーと同様にｐＥＦ１８Ｓを用い、ラットの場合と
同じ操作でｃＤＮＡを合成し制限酵素ＮｏｔＩとＥｃｏ
ＲＩ部位を利用した方向性を持ったライブラリーとし
た。大腸菌株ＤＨ５に導入し作製したライブラリーのク
ローンの数は約１２０万個であった＜実施例１３＞。 （Ｇ）ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得
（クローニング） ｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αに担持されたラットＴＰＯをコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列をもとに、数種類のＰＣＲ用
プライマーを合成した。市販の正常ヒト肝臓由来のｍＲ
ＮＡよりｃＤＮＡを合成し、これらのプライマーを用い
てＰＣＲを実施したところ、６２０ｂｐ前後のバンドが
観察された。塩基配列を決定したところ、ラットＴＰＯ
と約８６％の相同性を有するＤＮＡ断片であることが明
らかとなり、ヒトＴＰＯをコードする遺伝子の一部であ
ると考えられた＜実施例１４＞。 （Ｈ）ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯｃＤＮＡのスクリーニ
ング〜ヒトＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス〜発現確認 先に調製したヒトｃＤＮＡライブラリーを増幅し、約１
０万クローンずつのプールに分割し、９０個のプールか
らプラスミドを抽出した。これらのＤＮＡを鋳型とし、
実施例１４で得られたヒトーＴＰＯ断片の塩基配列を基
に新たに合成したプライマーを用いてＰＣＲを行なった
ところ、３個のプールでバンドが観察された。これらよ
り１個のプールを選択し、５０００個のクローンを１プ
ールとするサブプールに分け、それらのうちの９０プー
ルよりプラスミドＤＮＡを精製した。これらを鋳型とし
て同様のＰＣＲを実施したところ、５個のサブプールで
バンドが検出された。そこで、これらより１プールを選
び２５０個のクローンを１プールとするサブプールに更
に分割し、それらのうちの９０プールよりプラスミドＤ
ＮＡを精製し再度ＰＣＲによる検出を行なったところ、
３個のプールでバンドが観察された。そこで、このうち
１プールを選び、３０個のクローンを１プールとするサ
ブプールに分割し、それらのうちの９０プールからプラ
スミドＤＮＡを精製しＰＣＲを実施した結果、３個のプ
ールでバンドが観察された。これらのうち１プールより
９０個のコロニーを拾い、プラスミドＤＮＡを調製し、
ＰＣＲを実施することで最終的にクローンＨＬ３４を得
た＜実施例１５＞。このクローンが持つプラスミドＤＮ
Ａの塩基配列を決定したところ、ラットＴＰＯの塩基配
列と約８４％程度の相同性を持つｃＤＮＡを担持してい
ることが明らかとなった＜実施例１６＞。このクローン
のプラスミドＤＮＡを精製し、ＣＯＳ１細胞にトランス
フェクションしたところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検
出され、このクローンが持つプラスミドＤＮＡはヒトＴ
ＰＯをコードする遺伝子ｃＤＮＡ断片を担持しているこ
とが確認された＜実施例１７＞。しかしながら、このｃ
ＤＮＡ断片は終止コドンが無く、また、ポリＡ尾部様配
列を３’端に持っており、これはクローニングの際の人
工産物であると考えられた。そこで、ポリＡ尾部様配列
直前までのアミノ酸をコードする発現ベクターを構築
し、ＣＯＳ１細胞での発現を行なったところ、培養上清
中にＴＰＯ活性が検出された＜実施例１８＞。完全長ｃ
ＤＮＡの構造を解析するためにＰＣＲを利用しヒトＴＰ
Ｏ３’末端側のＤＮＡ断片を得た。この断片の塩基配列
を決定したところ、実施例１５で得たクローンＨＬ３４
のｃＤＮＡとオーバーラップすることがわかり、オープ
ンリーディングフレームも延び全体で３５３個のアミノ
酸からなる蛋白質をコードすることが予想された。すな
わちヒトＴＰＯタンパク質は２１個のシグナル配列を含
む３５３個のアミノ酸からなることが示唆された＜実施
例１９＞。ヒトＴＰＯのｃＤＮＡクローニングは、上記
のようなクローニング法以外にも、ｐＵＣ系やｐＢＲ系
のプラスミドベクター、λ系のファージベクター等を使
用して構築したライブラリーを利用し、ラットＴＰＯｃ
ＤＮＡ断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼイ
ションあるいはプラークハイブリダイゼイションによっ
ても行なうことができる。縮重プローブの設計にあたっ
ては、縮重の度合いを減少させるためにイノシンを使う
こともできる。ＴＰＯ活性を特異的に、また感度良く検
出できるアッセイ法が利用できる場合には、本発明で用
いた様な発現ライブラリーを使用した発現クローニング
も行なうことができる。しかしながら、実施例１５で記
載するように正常ヒト肝臓においてはヒトＴＰＯをコー
ドするＲＮＡの含量は著しく低いと考えられるため（こ
の実施例から算出される含量は３００万個に１個の割合
であった）、合成したオリゴヌクレオチドプローブやラ
ットやヒトＴＰＯのｃＤＮＡ断片をプローブとして用い
るハイブリダイゼイションによるスクリーニング方法で
は、処理するクローンやプラークの数が膨大なものにな
り、また、ハイブリダイゼイションの感度や特異性がＰ
ＣＲ法に及ばないため困難を極めることが予想される。
実際に本発明者らも実施例１３において作製した正常ヒ
ト肝臓ｃＤＮＡライブラリー２００万クローンについ
て、ラットＴＰＯｃＤＮＡ断片をプローブとしたコロニ
ーハイブリダイゼイションを実施したが、ヒトＴＰＯｃ
ＤＮＡクローンを得ることは出来なかった。 （Ｉ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡライブラリーの再構築 実施例１５で得られたクローンＨＬ３４は不完全なｃＤ
ＮＡを含むクローンであると考えられたため、完全長の
ヒトＴＰＯｃＤＮＡを得る目的で、市販の正常ヒト肝臓
由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いてヒトＴＰＯｃＤＮＡ
ライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ１）を構築し直した。大腸
菌株ＤＨ５に導入し作製したライブラリーのクローンの
数は約１００万個であった。＜実施例２０＞ （Ｊ）コロニーハイブリダイゼーションによるヒトＴＰ
ＯｃＤＮＡの再スクリーニング〜ヒトＴＰＯｃＤＮＡの
シークエンス〜発現確認 実施例１４で得られた部分長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩
基配列（配列番号３）、および実施例１９において推定
された完全長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列（配列番
号６）をもとに、ＰＣＲ用プライマーを合成した。実施
例２０で構築したｃＤＮＡライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ
１）を３つのプール（＃１〜３）に分割し、それぞれの
プールよりプラスミドＤＮＡを調製し、これらのＤＮＡ
を鋳型として合成したプライマーを用いてＰＣＲを実施
した。＃３のプール由来のＤＮＡを用いた場合に予想さ
れる大きさのＤＮＡが増幅されたため、＃３のプールを
１５０００個づつのサブプールに分割し、先の合成プラ
イマーでＰＣＲを実施したところ、９０プール中６プー
ルで予想される大きさのＤＮＡが増幅された。これらよ
り１個のプールを選択し、１０００個のクローンを１プ
ールとするサブプールに分け、プラスミドＤＮＡを調製
しＰＣＲを行ったが、ＤＮＡの増幅は観察されなかっ
た。これは、求めるクローンの増殖が他のクローンより
遅いためにプラスミドＤＮＡの回収率が悪くなったこと
が原因と考えられた。そこで、＃３のプールに戻り、Ｌ
Ｂプレート１枚あたり４１００個のコロニーとなるよう
にクローンをまき、１００枚のプレート、並びにそれぞ
れのレプリカプレートを作製した。プレートのコロニー
から抽出したＤＮＡについて先と同様にＰＣＲを行った
ところ、１００プール中１プールでバンドの増幅が観察
された。このプールのプレートより２枚のレプリカフィ
ルターを作製し、放射標識プローブ（プラスミドｐＥＦ
１８Ｓ−ＨＬ３４のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片）を用
いたコロニーハイブリダイゼーションを行った。その結
果、陽性シグナルが１個観察されたため、元のプレート
よりコロニーを拾い、ＬＢプレートにまき直して得られ
たコロニー５０個よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣ
Ｒを実施することにより、最終的にクローンｐＨＴＦ１
を得た。＜実施例２１＞ このようにＤＮＡクローンのスクリーニングにおいて
は、ハイブリダイゼイション、ＰＣＲ、発現クローニン
グ等が主に用いられるが、これらを適宜組み合わせてス
クリーニングの効率、感度を上昇させる、あるいは、労
力を低減させることができる。ここで得られたクローン
ｐＨＴＦ１の塩基配列を決定したところ、オープンリー
ディングフレームが存在し、このオープンリーディング
フレームにコードされると考えられるタンパク質のアミ
ノ酸配列は、実施例１９で推定されたヒトＴＰＯのアミ
ノ酸配列（配列番号６）と完全に一致した。塩基配列は
配列番号６とは３箇所で異なっていたが、アミノ酸の変
換は起こさなかった。これによりヒトＴＰＯタンパク質
は２１残基のシグナル配列を含む３５３個のアミノ酸か
らなることが確認できた。＜実施例２２＞ 上記のようにして得られたクローンｐＨＴＦ１よりプラ
スミドＤＮＡを調製し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェク
ションしたところ、その培養上清中にＴＰＯ活性を検出
することができた。＜実施例２３＞ （Ｋ）プラークハイブリダイゼーションによるヒトＴＰ
Ｏ染色体ＤＮＡのスクリーニング〜ヒトＴＰＯ染色体Ｄ
ＮＡのシークエンス〜発現確認 東北大学遺伝子実験施設 山本徳男教授より頂いたヒト
ゲノミックライブラリーより、ＮＺＹＭプレート１枚あ
たり３万個となるようにファージをまき、１８枚のプレ
ート、並びにそれぞれのレプリカフィルターを作製し
た。クローンｐＨＴＦ１に含まれるヒトＴＰＯｃＤＮＡ
断片（配列番号７の塩基配列番号１７８−１０２５）を
ＰＣＲで増幅後精製し３２Ｐ標識したものをプローブと
して用いて、プラークハイブリダイゼーションを行っ
た。その結果、１３個の陽性シグナルが検出されたた
め、それぞれ元のプレートよりプラークを拾い、ＮＺＹ
プレート１枚あたり１０００プラークとなるようにま
き直して、それぞれより作製したレプリカフィルターに
ついて再度プラークハイブリダイゼーションを実施し
た。その結果、１３組すべてのフィルターで陽性シグナ
ルが検出されたため、プラークを単離し、ファージＤＮ
Ａを調製し、１３クローンそれぞれについてヒトＴＰＯ
ｃＤＮＡのコーディング領域を含んでいるかどうかをＰ
ＣＲによりチェックした。１３クローン中５クローン
は、ｃＤＮＡから予想されるコーディング領域を全て含
んでいると考えられたため、１クローン（λＨＧＴ１）
を選択し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ解析（用いたプロ
ーブは先と同じ）を行った。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
消化した場合に約１０ｋｂｐの単一バンドが観察された
ので、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで消化後アガロースゲルで泳動し、１０ｋｂｐの
バンドを切り出して精製し、クローニングベクターｐＵ
Ｃ１３にサブクローニングし、最終的にクローンｐＨＧ
Ｔ１を得た。＜実施例２４＞ このクローンの塩基配列を決定したところ、担持されて
いる染色体ＤＮＡは、配列番号６に示したヒトＴＰＯタ
ンパク質のコーディング領域をすべて含み、その領域に
関しては塩基配列は完全に一致した。また、エクソンに
相当する領域は４つのイントロンで分断されており、実
施例２１で取得したクローンｐＨＴＦ１に担持されてい
る完全長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列とは３箇所で
異なることが判明した。最終的に選択された５クローン
のうち残りの４クローンについても塩基配列の決定を行
ったところ、２箇所はクローンｐＨＧＴ１と一致し、残
りの１箇所については２クローンがｐＨＧＴ１と一致
し、もう２クローンｐＨＴＦ１と一致していた。＜実施
例２５＞ 上記のようにして得られたプラスミドクローンｐＨＧＴ
１のＥｃｏＲＩ断片を発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにつな
ぎ、ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＥＦＨＧＴＥを調製
し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションしたところ、
その培養上清中にＴＰＯ活性を検出することができた。
＜実施例２６＞ （Ｌ）ヒトＴＰＯ欠失誘導体の作製〜ＣＯＳ１細胞での
発現〜活性確認 実施例１８並びに２２の結果よりヒトＴＰＯタンパク質
はその活性発現に全長のアミノ酸を必要としないことが
予想された。そこでヒトＴＰＯタンパク質の活性発現に
必要な領域を解析する目的で、実施例１８で得たクロー
ンｐＨＴ１−２３１のプラスミドＤＮＡを鋳型とし、合
成したプライマーでＰＣＲを行うことにより、ヒトＴＰ
Ｏタンパク質のＣ末端側を欠失させた発現プラスミド、
即ち、アミノ酸１−２１１位、１−１９１位、１−１７
１位、および１−１６３位をコードする欠失誘導体のプ
ラスミドＤＮＡを得た。得られたそれぞれのプラスミド
ＤＮＡをＣＯＳ１細胞へトランスフェクションしたとこ
ろ、いずれの培養上清中においてもＴＰＯ活性が検出さ
れた。＜実施例２７＞ ＴＰＯ活性を担う領域をさらに詳細に検討するために、
Ｃ末側より１５１番目のアミノ酸まで順次欠失させた誘
導体並びに、Ｎ末側６、７、１２番目のアミノ酸まで欠
失させた誘導体を作製し、ＣＯＳ１細胞で発現させ活性
を検出したところ、Ｎ末側では７番目のアミノ酸まで欠
失させた場合に、Ｃ末側では１５１番目のアミノ酸まで
欠失させた場合に活性が検出できなくなった。＜実施例
２８、２９＞ このように得られたｃＤＮＡをもとに誘導体（欠失、置
換、挿入、付加等）を作製することにより、本来のタン
パク質の活性を担う改変型タンパク質を得ることができ
る。この場合に用いる手法としては、ＰＣＲ法、Ｓｉｔ
ｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法、化
学合成法等がある。 （Ｍ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣＨＯ細胞での発現〜精製 配列番号６のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ動物細
胞用発現プラスミド、ｐＨＴＰ１を構築した。＜実施例
３０＞ このｐＨＴＰ１のＴＰＯｃＤＮＡ領域を用い、ＣＨＯ細
胞発現用ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１を構
築した。＜実施例３１＞ このベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションし選
択を行った結果、染色体中にヒトＴＰＯをコードする発
現ベクターが組み込まれた形質転換細胞が得られた。こ
の細胞クローンを培養したところ培養上清中にＴＰＯ活
性が検出された。＜実施例３２＞ 実施例３２において、ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥ
Ｆ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１をＣＨＯ細胞にトランスフェ
クションして得られたヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株（Ｃ
ＨＯ２８−３０細胞、２５ｎＭ ＭＴＸ耐性）を大量培
養した＜実施例５５＞。その培養上清１００Ｌからヒト
ＴＰＯを精製した。＜実施例５６＞ また、別法により実施例５５で得られた培養上清からＴ
ＰＯを精製した。＜実施例５７＞ （Ｎ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＸ６３．６．５．３．細胞
での発現〜活性確認 実施例３０で調製されたプラスミド、ＰＢＬＴＥＮのＴ
ＰＯｃＤＮＡ領域を用い、Ｘ６３．６．５．３細胞用発
現ベクター、ＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１を構築
した。＜実施例３３＞ このベクターをＸ６３．６．５．３細胞にトランスフェ
クションしたところ、染色体中にヒトＴＰＯをコードす
る発現ベクターを組み込んだ、形質転換細胞が得られ
た。この細胞を培養したところ、培養上清中にＴＰＯ活
性が検出された。＜実施例３４＞ （Ｏ）ヒトＴＰＯのＣＯＳ１細胞での大量発現〜精製〜
分子量測定、生物学的特性 実施例３０で調製された発現ベクター、ｐＨＴＰ１をＣ
ＯＳ１細胞にトランスフェクションし発現させた培養上
清を大量（合計約４０ｌ）に調製した。＜実施例３５＞ 実施例３５の方法で調製された発現ベクター、ｐＨＴＰ
１由来ＴＰＯを含むＣＯＳ１細胞無血清培養上清約７ｌ
から、ＴＰＯの精製を行った。疎水相互作用クロマトグ
ラフィー、陽イオン交換カラム、ＷＧＡカラム、逆相カ
ラムの各段階を経て、高活性のＴＰＯを得ることができ
た。＜実施例３６＞ このようにＣＯＳ１細胞培養上清より部分精製されたＴ
ＰＯについて、分子量測定、および生物学的特性の分析
を行った。＜実施例３７、３８＞ （Ｐ）ヒトＴＰＯの大腸菌における発現 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとヒトＴＰＯ
（アミノ酸１−１７４位）の融合タンパク質（「ＧＳＴ
−ＴＰＯ（１−１７４）」）の大腸菌発現用ベクター、
ｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）を構築した。この
際のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列の一部（５’側およ
そ半分の領域）は大腸菌優先コドンに変換した。＜実施
例３９＞ ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を大腸菌で発現させ、菌
体を破砕後、沈殿画分に含まれるＧＳＴ−ＴＰＯ（１−
１７４）の可溶化を行った。次に、ＴＰＯの巻き戻し
（リフォールディング）条件の検討、精製条件の検討
（グルタチオンアフィニティーカラム、陽イオン交換カ
ラム等）、トロンビン消化によるＧＳＴ蛋白質領域の切
断などの段階を組み合わせた結果、設計通りのＴＰＯの
アミノ酸配列を含む蛋白質が部分精製できた。この蛋白
質はラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にてＴＰＯ活性を有
することが確認できた。＜実施例４０、４１＞ また、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３位）の１位のＳ
ｅｒ残基をＡｌａ残基に、かつ３位のＡｌａ残基をＶａ
ｌ残基に変換し、さらに−１位にＬｙｓ残基、−２位に
Ｍｅｔ残基を付加した変異型ヒトＴＰＯタンパク質
（「ｈ６Ｔ（１−１６３）」と称す）の大腸菌発現用ベ
クター、ｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）を構築
した。このベクターが担持するヒトＴＰＯｃＤＮＡによ
ってコードされるアミノ酸（１−１６３）の塩基配列は
全て大腸菌での優先コドンに変換した。＜実施例４２＞ ｈ６Ｔ（１−１６３）を大腸菌で発現させ、菌体を破砕
後、沈殿画分に含まれるｈ６Ｔ（１−１６３）の可溶化
を検討、リフォールディング条件の検討を実施した結
果、設計通りのＴＰＯのアミノ酸配列を含むタンパク質
が部分精製できた。このタンパク質はラットＣＦＵ−Ｍ
Ｋアッセイ系にてＴＰＯ活性を有することが確認でき
た。＜実施例４３、４４＞ さらに、ヒトＴＰＯｃＤＮＡ（アミノ酸１−１６３）の
−１位にＬｙｓ残基、−２位にＭｅｔ残基を付加した変
異型ヒトＴＰＯタンパク質（「ｈＭＫＴ（１−６３）」
と称す）の大腸菌発現用ベクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭ
ＫＴ（１−１６３）を構築した。ｈＭＫＴ（１−１６
３）を実施例４３と同様に大腸菌で発現させ、得られた
発現タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＰＶＤＦ膜に転写
し、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行った結果、設計通りの
アミノ酸配列を含むことが確認できた。＜実施例５２＞ また、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−３３２位）の−１位に
Ｌｙｓ残基、−２位にＭｅｔ残基を付加した変異型ヒト
ＴＰＯタンパク質（「ｈＭＫＴ（１−３３２）」と称
す）の大腸菌発現用ベクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ
（１−３３２）を構築した。ｈＭＫＴ（１−３３２）を
実施例４２と同様に大腸菌で発現させ、後述の実施例４
５で作製した抗ヒトＴＰＯペプチド抗体を用いたウェス
タンブロッティングにより発現を確認した。＜実施例６
６＞ （Ｑ）抗ＴＰＯペプチド抗体の作製〜抗ＴＰＯペプチド
抗体カラムの調製 実施例１０にて判明されているラットＴＰＯのアミノ酸
配列のうち、３箇所の部分領域に相当するペプチドを合
成し、ウサギポリクローナル抗ＴＰＯペプチド抗体を作
製した。これらの抗体がラット及びヒトＴＰＯを認識す
ることを確認した。また、配列番号６（もしくは配列番
号７）に示されるヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、６
箇所の部分領域に相当するペプチドを合成し、ウサギポ
リクロナール抗ＴＰＯペプチド抗体を作製した。これら
の抗体がヒトＴＰＯを認識することを確認した。＜実施
例４５＞ ＴＰＯに対して結合親和性を持つような分子、即ち、抗
ＴＰＯ抗体、ＴＰＯ受容体などをカラム坦体に結合さ
せ、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによりＴ
ＰＯを精製する方法が考えられる。そこでまず実施例４
５で得られた抗ＴＰＯペプチド抗体をゲル坦体に結合さ
せた抗ＴＰＯ抗体カラムを調製した。＜実施例４６＞ （Ｒ）ＣＯＳ１細胞で発現させたヒトＴＰＯの抗ＴＰＯ
ペプチド抗体カラムを用いた精製〜分子量測定、生物学
的特性 発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェ
クションした培養上清を材料として部分精製ＴＰＯを得
て、これを抗ＴＰＯ抗体カラムにかけた。吸着画分にＴ
ＰＯ活性を有することが確認できたので、これをさらに
逆相カラムクロマトグラフィーにかけ精製し、その分子
量と生物学的活性を調べた。＜実施例４７＞ （Ｓ）ＣＯＳ１細胞で発現させたヒトＴＰＯの部分精製
標品の活性確認 実施例３６で精製されたＴＰＯ活性画分、すなわち、発
現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェク
ションして得られた培養上清由来で、Ｃａｐｃｅｌｌ
Ｐａｋ Ｃ１ ３００Ａカラムの段階まで精製されたＴ
ＰＯの生物学的活性を調べた結果、生体内において血小
板増加作用を有することがわかった。＜実施例４８＞ また、発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトラン
スフェクションして得られた、培養上清３３Ｌを出発材
料にし、陽イオン交換カラムで得られた粗精製ＴＰＯ画
分の生物学的活性を調べた結果、生体内において血小板
増加作用を有することがわかった。＜実施例４９＞ （Ｔ）ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＨＯ細胞での発現〜
活性確認 ＣＨＯ細胞でのヒトＴＰＯ染色体発現ベクター、ｐＤＥ
Ｆ２０２−ｇｈＴＰＯを構築した。＜実施例５０＞ このベクターをＣＨＯ細胞に導入したところ、染色体中
にヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡを担持する発現ベクターが組
み込まれた形質転換細胞が得られた。この細胞を培養し
たところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。＜実
施例５１＞ （Ｕ）大腸菌で発現させた変異型ヒトＴＰＯの部分精製
〜活性確認 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異
型ヒトＴＰＯについて、塩酸グアニジンとグルタチオン
を用いたリフォールディング操作を行い、ここで得たｈ
６Ｔ（１−１６３）が、生体内において血小板増加作用
を有することを確認した。＜実施例５３＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異
型ヒトＴＰＯについて、Ｎ−ラウロイルサルコシンナト
リウムと硫酸銅を用いたリフォールディング操作を行
い、さらに陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精
製したｈ６Ｔ（１−１６３）が、生体内において血小板
増加作用を有することを確認した。＜実施例５４＞ また、更に別法を用いて、変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ
（１−１６３）のリフォールディング〜精製を行った。
＜実施例６０、６１＞ （Ｖ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡの昆虫細胞での発現〜活性確
認 ヒトＴＰＯの昆虫細胞での発現用組換えウィルスを作製
し＜実施例５８＞、昆虫細胞Ｓｆ２１で発現させ、培養
上清中の活性を確認した。＜実施例５９＞ （Ｗ）ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３位）のＣＨＯ細
胞での発現〜精製 配列番号６に示したヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、
１−１６３位のアミノ酸配列を有するヒトＴＰＯタンパ
ク質（「ｈＴＰＯ１６３」と称す）のＣＨＯ細胞発現用
ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３を構築した。
発現ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ
細胞にトランスフェクションして得られたｈＴＰＯ１６
３産生ＣＨＯ細胞株を大量培養し、その培養上清からｈ
ＴＰＯ１６３を精製した。＜実施例６２〜６５＞ （Ｘ）ヒトＴＰＯ誘導体の作成 ヒトＴＰＯの２５位のＡｒｇ残基がＡｓｎ残基に、２３
１位のＧｌｕ残基がＬｙｓ残基にそれぞれ置換され、更
にＣ末端に付加的ペプチドを有する誘導体（「Ｎ３／Ｔ
ＰＯ」と称す）、および３３位のＨｉｓ残基がＴｈｒ残
基に置換され、更にＣ末端に付加的ペプチドを有する誘
導体（「Ｏ９／ＴＰＯ」と称す）をコードするプラスミ
ドでトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞培養上清中
にＴＰＯ活性が検出された。＜実施例６７＞ ｈＴＰＯ１６３にアミノ酸を挿入した誘導体またはｈＴ
ＰＯ１６３のアミノ酸の一部を欠失させた誘導体をコー
ドするプラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ７
細胞培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。＜実施例６
８＞ ｈ６Ｔ（１−１６３）を鋳型として、大腸菌を用いてＴ
ＰＯ誘導体を作製し、そのＴＰＯ活性を確認した。＜実
施例７７＞ （Ｙ）ＴＰＯによる薬理作用 実施例５６で得られたヒトＴＰＯの静脈内投与、並びに
皮下投与による正常マウスにおける血小板増加作用を確
認した。＜実施例６９、７０＞ また、実施例５６で得られたヒトＴＰＯが、制ガン剤投
与による血小板減少の阻止効果および血小板減少からの
血小板数回復促進効果、更にはＢＭＴ（骨髄移植）施行
後、並びに放射線照射後の血小板数の回復促進効果を有
することを確認した。＜実施例７１〜７４＞ また、実施例６５で得られたヒトＴＰＯの正常マウスに
おける血小板増加作用、および制ガン剤投与による血小
板減少からの血小板数回復促進効果を確認した。＜実施
例７５、７６＞ （Ｚ）ヒトＴＰＯ製剤の調製 ヒトＴＰＯを有効成分とする製剤の調製例を示した。＜
製剤実施例１〜９＞ なお、本発明において用いたＴＰＯ活性の測定方法（ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系）を＜参考例＞として以下に
説明する。 ＜参考例＞ Ａ．ラット巨核球前駆細胞（ＣＦＵ−ＭＫ）アッセイ
（ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ）系（液体培養系） 巨核球は、エネルギー依存性に細胞外のセロトニン（ｓ
ｅｒｏｔｏｎｉｎ）を取り込んで、濃染顆粒に蓄積する
（Ｆｅｄｏｒｋｏ、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、３６巻、
３１０−３２１頁、（１９７７））。この現象は、少な
くともＣＦＵ−ＭＫと認識可能な巨核球の間の分化段階
に位置する小型で単核のアセチルコリン陽性細胞におい
てすでに認められ（ＢｒｉｃｋｅｒとＺｕｃｋｅｒｍａ
ｎ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１２巻、６７２−６７
５頁、（１９８４））、その後、巨核球サイズの増大に
応じてｓｅｒｏｔｏｎｉｎの取り込み量が増加する（Ｓ
ｃｈｉｃｋとＷｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｅｄ．、９８巻、６０７−６１５頁、（１９８
１））。しかも、骨髄細胞の中では巨核球系細胞だけに
特異的である（ＳｃｈｉｃｋとＷｅｉｎｓｔｅｉｎ、
Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、９８巻、６０７−６
１５頁、（１９８１））ことが知られている。本アッセ
イ系は、高度に濃縮されたラットＣＦＵ−ＭＫ（ＧｐＩ
Ｉｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分；後述）を被検検体
の存在下に培養し、巨核球の増殖・分化を１４Ｃ−セロ
トニン（１４Ｃ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ ｔｒｙｐｔａｍ
ｉｎｅ ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈａｔｅ；
１４Ｃ−５ＨＴ））の取り込みを指標とした測定法であ
る。本アッセイ系の利点は、用いる細胞に含まれるＣＦ
Ｕ−ＭＫの割合が極めて高く（後述の「アッセイ方法」
参照）、これに反して混入するＴＰＯの標的細胞以外の
細胞が少ないので、混入細胞による間接的影響（例え
ば、本因子以外の何らかの物質が混入細胞に作用してＭ
ｅｇ−ＣＳＦ活性を誘導させたり、混入細胞が本因子と
協同作用する何らかの因子を産生したりするなど）を軽
減することができ、また、１つのウエルの中で培養する
全細胞数が少なくてすむために、比較的長い期間良好な
培養環境を維持することができることにある。さらに、
培養期間中に活性標品によってＣＦＵ−ＭＫから生成し
た数多くのサイズの大きい成熟巨核球を位相差顕微鏡下
に観察することができ、活性の有無や程度を定性的に判
定できることも利点である。この定性判定の結果は１４
Ｃ−セロトニンの取り込みによる定量結果と良く対応し
ている。従って、定性判定を併用することにより、定量
結果の信頼性を高めることができる。 「アッセイ方法」まず、アッセイに用いる高度に濃縮さ
れたラットＣＦＵ−ＭＫ（「ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋Ｃ
ＦＵ−ＭＫ画分」）を既に報告している方法（Ｍｉｙａ
ｚａｋｉら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０巻、８５
５〜８６１頁、（１９９２年））を若干改良した方法に
従って調製した。その概略は次のとおりである。Ｗｉｓ
ｔａｒ系ラット（♂、８〜１２週齢）の大腿骨、および
脛骨を摘出し、常法に従い、骨髄細胞浮遊液を調製す
る。骨髄細胞浮遊液の調製には、ＬｅｖｉｎｅとＦｅｄ
ｏｒｋｏが報告した巨核球分離用媒体（Ｌｅｖｉｎｅと
Ｆｅｄｏｒｋｏ、Ｂｌｏｏｄ、５０巻、７１３−７２５
頁、（１９７７））を若干改良した媒体（１３．６ｍＭ
クエン酸三ナトリウム、１１．１ｍＭグルコース、１ｍ
Ｍアデノシン、１ｍＭテオフィリン、１０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ７．２５）、０．５％ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略す）（Ｐａｔｈ−Ｏ−Ｃｙｔｅ
４；生化学工業）、およびＣａ２＋とＭｇ２＋を含まな
いＨａｎｋｓ平衡塩類溶液からなる溶液：以下、ＨＡＴ
ＣＨ溶液と略す）を用いる。骨髄細胞浮遊液を、Ｐｅｒ
ｃｏｌｌ原液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をＨＡＴＣＨ
溶液で希釈して調製したＰｅｒｃｏｌｌ不連続密度勾配
溶液（密度；１．０５０ｇ／ｍｌ／１．０６３ｇ／ｍｌ
／１．０８２ｇ／ｍｌ）の上に重層し、２０℃にて４０
０×ｇで２０分間遠心する。遠心後、密度１．０６３ｇ
／ｍｌと１．０８２ｇ／ｍｌの界面に集まった細胞を回
収する。細胞を洗滌後、１０％ウシ胎仔血清（以下ＦＣ
Ｓと略す）を含むＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培
養液（以下ＩＭＤＭ培養液と略す）で浮遊させ、直径１
００ｍｍの組織培養用プラスティックディッシュに入れ
て、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で１時間培養す
る。培養後、非付着性細胞画分を回収し、再び直径１０
０ｍｍのプラスティックディッシュに入れ、さらに３７
℃で１時間培養した後、非付着性細胞画分を集める。回
収した細胞をＨＡＴＣＨ溶液に再浮遊させ、予めマウス
モノクローナル抗ラット血小板ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗
体であるＰ５５抗体（Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｔｈｒｏｍ
ｂ．Ｒｅｓ．、５９巻、９４１−９５３頁、（１９９
０））を吸着させておいた細菌検査用１００ｍｍペトリ
ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ１００５；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に入れ、室温で１時間静置す
る。その後、非吸着細胞をＨＡＴＣＨ溶液で十分に洗
滌、除去した後、固相化Ｐ５５抗体に吸着した細胞をピ
ペッティングにてはがし、回収する。通常、ラット１匹
から３〜４×１０５個の細胞が得られる。得られた細胞
画分にはラットＣＦＵ−ＭＫが高度に濃縮されており
（以下、「ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分」
と言う）、後述するコロニーアッセイ系における飽和濃
度のラットＩＬ−３存在下の検定により通常５〜１０％
程度のＣＦＵ−ＭＫが含まれることが分かっている。な
お、上記Ｐ５５抗体を産生するハイブリドーマ（ｐ５５
細胞）は、１９９４年２月１４日付で通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４５６３として寄託されている。次に、得られたＧｐ
ＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分を１０％ＦＣＳを
含むＩＭＤＭ培養液で再浮遊させ、組織培養用９６ウエ
ル平底プレートへ１ウエル当たり１０４個の細胞が入る
ように分配し、さらにＩＭＤＭ培養液に対して十分に透
析した標準品（後に詳述する）や、被検検体を加え、最
終培養液量を２００μｌ／ウエルにする。プレートを炭
酸ガス培養器に入れ、３７℃で４日間培養する。４日目
の培養終了３時間前に１ウエル当たり０．１μＣｉ
（３．７ＫＢｑ）の１４Ｃ−セロトニンを添加し、引き
続き３７℃で培養する。培養終了後、プレートを１００
０ｒｐｍにて、３分間遠心し、上清を吸引除去する。続
いて、０．０５％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１ウエル当た
り２００μｌ加えて遠心し、上清を吸引除去し、細胞を
洗滌する。この洗滌操作をもう一度繰り返す。得られた
細胞ペレットへ２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１ウエ
ル当たり２００μｌ加え、プレートをプレートミキサー
で５〜１０分程度振蕩し、細胞を十分に溶解する。得ら
れた細胞溶解液のうちの１５０μｌを市販のカップ状の
固体シンチレーター（Ｒｅａｄｙ Ｃａｐ；Ｂｅｃｋｍ
ａｎ社製）の中へ移し、一晩５０℃の乾燥器中に静置し
て、乾固させる。翌日、Ｒｅａｄｙ Ｃａｐをガラスバ
イアルに入れ、液体シンチレーションカウンターにて
１４Ｃの放射活性を測定する。なお、上述の細胞溶解液
中のアセチルコリンエステラーゼ活性をＩｓｈｉｂａｓ
ｈｉとＢｕｒｓｔｅｉｎの方法（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉと
Ｂｕｒｓｔｅｉｎ、Ｂｌｏｏｄ、６７巻、１５１２−１
５１４頁、（１９８６））に従って測定しても、１４Ｃ
−セロトニンの取り込みによる定量結果と極めて類似し
た結果が得られる。「標準品」 まず、標準品の作製に用いる血小板減少症ラ
ット血漿を以下の方法で調製した。７〜８週齢のＷｉｓ
ｔａｒ系正常ラット（♂）へ、前述したＰ５５抗体を１
回の投与量を０．５ｍｇとして、約２４時間間隔で２
回、静脈注射し、２回目の投与の約２４時間後の血小板
減少期にエーテル麻酔下に開腹し、予め抗凝固剤として
１ｍｌの３．８％（ｖ／ｖ）クエン酸三ナトリウム溶液
を吸い上げておいた１０ｍｌ用注射筒を用いて腹大動脈
から採血した。血液をプラスティック製の遠心チューブ
に移し、１２００×ｇで、１０分間遠心し、血漿画分を
回収した。この血漿画分を再度１２００×ｇで、１０分
間遠心し、遠心後、細胞や血小板などからなるペレット
を吸い上げないように十分に気をつけながら血漿画分を
回収し、プールした（以下、このようにして得られた血
漿を「ＴＲＰ」と言う）。続いて、ＴＲＰから実施例１
に記載する方法に従って調製したＣａ処理ＴＲＰ（標準
品Ｃ）、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅカラム活性画分（標準
品Ｗ）、あるいはＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６ ＦＦ／ＬＳカラム活性画分（標準品Ｐ）を、十分量
のＩＭＤＭ培養液に対して徹底的に透析し、活性検定用
の標準品とした。なお、実施例１に示したラットＴＰＯ
精製過程においては、初期は標準品Ｃを用いたが、途中
から標準品Ｗ、さらにその後は標準品Ｐを用いた。恣意
的に標準品Ｃの活性を１と定義し、それを基に標準品Ｗ
および標準品Ｐの相対活性を求めた。被検検体の相対活
性の求め方は、標準品と被検検体との用量反応曲線を描
き、被検検体の活性が標準品Ｃの活性のｎ倍であったと
き、その検体の相対活性をｎとした。 Ｂ．コロニーアッセイ系 骨髄細胞を半固型の培養液中で被検検体の存在下に培養
し、ＣＦＵ−ＭＫが増殖・分化して形成される巨核球コ
ロニーの数を算定することによりＭｅｇ−ＣＳＦ活性を
測定するアッセイ法である。 「アッセイ法」 （ａ）ラット非分離骨髄細胞などを用いる場合 ラット非分離骨髄細胞、前記Ａ．のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩ
ａ＋ＣＦＵ−ＭＫの分離・濃縮操作の各段階で得られる
細胞、あるいはＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画
分、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン
酸ナトリウム、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、
０．３％の寒天（ＡＧＡＲ ＮＯＢＬＥ、ＤＩＦＣＯ社
製）を含む最終液量１ｍｌのＩＭＤＭ培養液を直径３５
ｍｍの組織培養用プラスチックディッシュに入れて室温
で固化させた後、炭酸ガス培養器中にて３７℃で培養す
る。通常、１つのディッシュ当たりのまき込み細胞数
を、非分離骨髄細胞、Ｐｅｒｃｏｌｌ遠心分離段階およ
びプラスティックディッシュ付着性細胞除去段階の細
胞、およびＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分
で、それぞれ、２〜４×１０５、２〜５×１０４、０．
５〜２×１０３個とする。６〜７日目に寒天ゲルをディ
ッシュから取り出してスライドガラス（７６ｍｍ×５２
ｍｍ）に受け、孔径５０μｍのナイロンメッシュ、続い
て濾紙をのせて水分を吸収し、それらを除いてから室温
で十分に乾燥させる。５０℃のホットプレート上で５分
間熱固定した後、Ｊａｃｋｓｏｎの方法（Ｊａｃｋｓｏ
ｎ、Ｂｌｏｏｄ、４２巻、４１３−４２１頁、（１９７
３））に従って調製したアセチルコリンエステラーゼ染
色液に２〜４時間浸し、巨核球が十分に染色されている
のを確認してから取りだして水洗し、乾燥後Ｈａｒｒｉ
ｓヘマトキシリン液にて３０秒間、後染色を施し、水
洗、風乾させる。アセチルコリンエステラーゼ陽性の巨
核球３個以上から成る集塊を一つのコロニーとして巨核
球コロニー数を算定する。 （ｂ）マウスの非分離骨髄細胞を用いる場合 １つのディッシュ当たりのまき込み細胞数を２〜４×１
０５個として、上記（ａ）と同様の方法で行なうことが
できる。 （ｃ）ヒト骨髄細胞やヒト臍帯血細胞を用いる場合 ヒト骨髄細胞やヒト臍帯血細胞をそのまま用いることも
できるが、以下のようにそれらから濃縮したＣＦＵ−Ｍ
Ｋ画分を用いることができる。 まず骨髄液、あるいは臍帯血をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ
（第一化学社製）上に重層し、遠心後、界面に集まった
白血球画分を回収する。この細胞画分から、ビオチン化
したヒトの細胞表面抗原（ＣＤ２、ＣＤ１１ｃ、および
ＣＤ１９）に対するビオチン化したモノクローナル抗体
が結合する細胞を、アビジンを結合させた磁気ビーズを
用いて除去する。この磁気ビーズ法で除去できる細胞
は、主にＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、および一部
の顆粒球である。残った細胞を、ＦＩＴＣ標識された抗
ＣＤ３４抗体、およびＰＥ標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗
体で染色し、続いてセルソーター（例えば、ＥＬＩＴ
Ｅ；ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いて、ＣＤ３４陽性、か
つＨＬＡ−ＤＲ陽性の細胞画分を回収する。この画分に
ＣＦＵ−ＭＫが濃縮されている（ＣＤ３４＋ＤＲ＋ＣＦ
Ｕ−ＭＫ画分と略す）。ヒトのコロニーアッセイは、上
記のラットの骨髄細胞を用いたコロニーアッセイとほぼ
同様の方法で行なうが、１つのプラスティックディッシ
ュ当たりのＣＤ３４＋ＤＲ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分のまき込
み数を３〜５×１０３個とし、１０％ＦＣＳの代わりに
１２．５％ヒトＡＢ血漿と１２．５％ＦＣＳの混合物を
用いる。また、巨核球コロニーを形成させるまでの培養
期間は１２日間から１４日間である。ヒト巨核球の検出
には、巨核球の表面抗原であるヒトＧｐＩＩｂ／ＩＩＩ
ａに対するマウスモノクローナル抗体を用いたアルカリ
フォスファターゼ−抗アルカリフォスファターゼ抗体法
で巨核球を免疫染色し（例えば、Ｔｅｒａｍｕｒａら、
Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１６巻、８４３−８４８頁、
（１９８８））、３個以上の巨核球からなるコロニーを
巨核球コロニーとして算定する。 Ｃ．ヒト巨核芽球性細胞株を用いたアッセイ系（Ｍ−０
７ｅアッセイ） ヒト巨核芽球性細胞株であるＭ−０７ｅ細胞は、ＧＭ−
ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−２などに応答して増
殖する細胞株であることが知られているが（Ａｖａｎｚ
ｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１４５巻、４
５８−４６４頁、（１９９０）、Ｋｉｓｓら、Ｌｅｕｋ
ｅｍｉａ、７巻、）、ＴＰＯにも応答することが判明
し、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系の代替アッセイ法と
して使うことができる。 「アッセイ法」ＧＭ−ＣＳＦ存在下に継代培養している
Ｍ−０７ｅ細胞を回収し、十分に洗滌後、１０％ＦＣＳ
を含むＩＭＤＭ培養液に再浮遊させる。組織培養用９６
ウエル平底プレートへ１ウエル当たりの細胞数が１０４
個になるようにＭ−０７ｅ細胞を入れ、さらに標準品、
および被検検体を加えて、最終液量を２００μｌ／ウエ
ルにする。プレートを５％炭酸ガス培養器に入れ、３７
℃で、３日間培養する。３日目の培養終了４時間前に１
μＣｉ（３７ＫＢｑ）／ウエルの３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉ
ｎｅを添加し、培養終了後、セルハーベスターで細胞を
ガラス繊維フィルター上に集め、３Ｈの放射活性を液体
シンチレーションカウンター（例えば、ベータプレー
ト；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にて測定する。なお、Ｍ
−０７ｅアッセイにおける相対活性量の定義は、前述
Ａ．のラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおける定義と同じ
である。 Ｄ．マウスプロＢ細胞株を用いたアッセイ系（Ｂａ／Ｆ
３アッセイ） マウスプロＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−３やＩＬ
−４などに応答して増殖する細胞株であることが知られ
ている（Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｃｅｌｌ、４１巻、７２
７−７３４頁）。その亜株であるＢＦ−ＴＥ２２細胞は
ＩＬ−３やＩＬ−４ばかりでなくＴＰＯに応答し、細胞
増殖する事が判明し、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイやヒ
ト巨核芽球性細胞株を用いたアッセイ（Ｍ−０７ｅアッ
セイ）の代替アッセイ法として用いることができる。こ
のアッセイ系の概要は以下の通りである。まず、１ｎｇ
／ｍｌのマウスＩＬ−３存在下に継代培養しているＢＦ
−ＴＥ２２細胞を回収し、イスコフ改変ＤＭＥ培地（Ｉ
ＭＤＭ；ＧＩＢＣＯ社）で３回洗浄したのちに、１０％
ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地に再懸濁させる。次に、組織
培養用９６ウエル平底プレートに１ウエルあたり細胞数
が１ｘ１０４個になるように細胞を接種し、さらにＴＰ
Ｏ標準品あるいは被検検体を加えて、最終液量を２００
ｍｌ／ウエルとなるようにし、プレートを５％炭酸ガス
培養器中で２−３日間培養する。２または３日目の培養
終了４時間前に１ｍＣｉ（３７ＫＢｑ）／ウエルの３Ｈ
−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを添加し、さらに培養を継続す
る。培養終了後、セルハーベスターを用いて細胞をガラ
ス繊維フィルター上に回収し、細胞に取り込まれた３Ｈ
の放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定
する。本アッセイ系ではＴＰＯ活性を含まない被検検体
では、細胞はほぼ死滅し３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅをほ
とんど取り込まないのに対し、ＴＰＯ活性を含む被検検
体では、細胞はＴＰＯ濃度依存的に活発な増殖を示し３
Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取り込みが認められる。ま
た、本アッセイは、Ｍ−０７ｅアッセイやＣＦＵ−ＭＫ
アッセイとパラレルな結果を示す。
【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明
する。 ＜実施例１−１＞抗血小板抗体投与による血小板減少症
ラットの血漿からのラットＴＰＯ精製 「抗血小板抗体投与による血小板減少症ラットの血漿の
調製」前述の＜参考例＞Ａ．ラット巨核球前駆細胞（Ｃ
ＦＵ−ＭＫ）アッセイ系に記載の方法でラット約１００
０匹分のＴＲＰを調製し、精製の供給源とした。 「ＴＲＰからのラットＴＰＯの精製」当初、ＴＲＰ中の
ＴＰＯ含有量は多くとも３００万分の１程度であろうと
の推定に基づき、ラット約１０００匹分のＴＲＰを材料
に精製を進めた結果、１ｐｍｏｌｅ弱のラットＴＰＯの
部分精製標品を得た。次にこの標品の部分アミノ酸配列
の分析を試行し、３種の部分アミノ酸配列の結果を得
た。これらは肝臓でつくられるセリンプロテアーゼイン
ヒビター（ＳＰＩ）のアミノ酸配列と一致しているか、
類似したものであった。従って、ＴＰＯがセリンプロテ
アーゼインヒビターと類似した構造をもつものであると
いう可能性、及びＴＰＯ以外の混入タンパク質由来の配
列である可能性のいずれについても否定はできなかっ
た。これらの不確定な配列をもとにラットｃＤＮＡライ
ブラリーからのＴＰＯ遺伝子クローニングを実施した
が、結局、候補遺伝子を得ることはできなかった。これ
は、分析した標品の純度と量に不足があったためと考
え、あらためて鋭意研究を重ねることとなった。アミノ
酸配列分析のために必要な最終精製標品を得るため、次
の実施例１−２に述べる精製を行った。尚、特筆すべき
ことは、本実施例１−２による結果より、ＴＲＰあるい
はＸＲＰ（後述）に存在するＴＰＯ量は、驚くべきこと
に全血漿蛋白質の１億分の１から１０億分の１と推定さ
れ、これを精製することが通常は極めて困難であるほ
ど、微量の含有量であることが判明した。 ＜実施例１−２＞Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板
減少症ラットの血漿からのラットＴＰＯの精製 「Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板減少症ラットの
血漿の調製」亜致死線量（６〜７Ｇｙ）のＸ線、あるい
はγ線を７〜８週齢のＷｉｓｔａｒ系正常ラット（♂）
へ全身照射し、血小板減少期の１４日目に採血し、前述
のＴＲＰと同様の操作で血漿画分を調製した（以下、こ
の血漿を「ＸＲＰ」と言う。）。ここでは、合計してラ
ット約１１００匹分のＸＲＰ（約８Ｌ）を精製の供給源
とした。 「ＸＲＰからのラットＴＰＯの精製」ラット約１１００
匹分の血漿の総蛋白質量は４９３０００ｍｇにも達する
ため、一度に処理することができなかった。そこで、以
下に述べる精製ステップのうち、（１）〜（４）では約
１００匹ずつ１１のロットに分けて実施した。次いで
（５）〜（７）では６つのバッチに分けて実施した。
（８）以降は約１１００匹分から粗精製されたものをま
とめて実施した。このうち、あるひとつのロット（ＸＷ
９）、バッチ（ＸＢ６）における精製例を代表として説
明のために挙げ、併せて精製の各ステップについて述べ
る。尚、精製の全ステップに於いて、ＴＰＯ活性は前述
の＜参考例＞に記載したラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系
を用いて測定した。逆相クロマトグラフィーを室温で実
施した以外は、特に記載しない限り４℃で精製を行っ
た。また、蛋白質の定量は、クーマジー色素結合法（Ｐ
ＩＥＲＣＥ社製試薬、カタログ番号２３２３６Ｘ）、ま
たは、ビシンコニン酸法（ＰＩＥＲＣＥ社製試薬、カタ
ログ番号２３２２５）を用いて実施した。精製の概要
を、表１に示した。
する。 ＜実施例１−１＞抗血小板抗体投与による血小板減少症
ラットの血漿からのラットＴＰＯ精製 「抗血小板抗体投与による血小板減少症ラットの血漿の
調製」前述の＜参考例＞Ａ．ラット巨核球前駆細胞（Ｃ
ＦＵ−ＭＫ）アッセイ系に記載の方法でラット約１００
０匹分のＴＲＰを調製し、精製の供給源とした。 「ＴＲＰからのラットＴＰＯの精製」当初、ＴＲＰ中の
ＴＰＯ含有量は多くとも３００万分の１程度であろうと
の推定に基づき、ラット約１０００匹分のＴＲＰを材料
に精製を進めた結果、１ｐｍｏｌｅ弱のラットＴＰＯの
部分精製標品を得た。次にこの標品の部分アミノ酸配列
の分析を試行し、３種の部分アミノ酸配列の結果を得
た。これらは肝臓でつくられるセリンプロテアーゼイン
ヒビター（ＳＰＩ）のアミノ酸配列と一致しているか、
類似したものであった。従って、ＴＰＯがセリンプロテ
アーゼインヒビターと類似した構造をもつものであると
いう可能性、及びＴＰＯ以外の混入タンパク質由来の配
列である可能性のいずれについても否定はできなかっ
た。これらの不確定な配列をもとにラットｃＤＮＡライ
ブラリーからのＴＰＯ遺伝子クローニングを実施した
が、結局、候補遺伝子を得ることはできなかった。これ
は、分析した標品の純度と量に不足があったためと考
え、あらためて鋭意研究を重ねることとなった。アミノ
酸配列分析のために必要な最終精製標品を得るため、次
の実施例１−２に述べる精製を行った。尚、特筆すべき
ことは、本実施例１−２による結果より、ＴＲＰあるい
はＸＲＰ（後述）に存在するＴＰＯ量は、驚くべきこと
に全血漿蛋白質の１億分の１から１０億分の１と推定さ
れ、これを精製することが通常は極めて困難であるほ
ど、微量の含有量であることが判明した。 ＜実施例１−２＞Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板
減少症ラットの血漿からのラットＴＰＯの精製 「Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板減少症ラットの
血漿の調製」亜致死線量（６〜７Ｇｙ）のＸ線、あるい
はγ線を７〜８週齢のＷｉｓｔａｒ系正常ラット（♂）
へ全身照射し、血小板減少期の１４日目に採血し、前述
のＴＲＰと同様の操作で血漿画分を調製した（以下、こ
の血漿を「ＸＲＰ」と言う。）。ここでは、合計してラ
ット約１１００匹分のＸＲＰ（約８Ｌ）を精製の供給源
とした。 「ＸＲＰからのラットＴＰＯの精製」ラット約１１００
匹分の血漿の総蛋白質量は４９３０００ｍｇにも達する
ため、一度に処理することができなかった。そこで、以
下に述べる精製ステップのうち、（１）〜（４）では約
１００匹ずつ１１のロットに分けて実施した。次いで
（５）〜（７）では６つのバッチに分けて実施した。
（８）以降は約１１００匹分から粗精製されたものをま
とめて実施した。このうち、あるひとつのロット（ＸＷ
９）、バッチ（ＸＢ６）における精製例を代表として説
明のために挙げ、併せて精製の各ステップについて述べ
る。尚、精製の全ステップに於いて、ＴＰＯ活性は前述
の＜参考例＞に記載したラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系
を用いて測定した。逆相クロマトグラフィーを室温で実
施した以外は、特に記載しない限り４℃で精製を行っ
た。また、蛋白質の定量は、クーマジー色素結合法（Ｐ
ＩＥＲＣＥ社製試薬、カタログ番号２３２３６Ｘ）、ま
たは、ビシンコニン酸法（ＰＩＥＲＣＥ社製試薬、カタ
ログ番号２３２２５）を用いて実施した。精製の概要
を、表１に示した。
【表１】 （１）ラット血漿の塩化カルシウム処理・遠心処理・蛋
白質分解酵素阻害剤処理−８０℃で保存した約１００匹
分のＸＲＰ（７４２ｍｌ，蛋白濃度５４．８ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量４０６８６ｍｇ）を解凍し、ポリプロピ
レン製遠心チューブ（ナルゲン社製）に移した。これに
各々最終濃度１００ｍＭになるように塩化カルシウム粉
末を加え、４℃で一晩静置した。次に８０００ＲＰＭで
６０分遠心後、上清を回収した。ＴＰＯ活性を含むこの
上清（７４２ｍｌ，蛋白濃度５４．９ｍｇ／ｍｌ，総蛋
白質量４０７４０ｍｇ）に、最終濃度１ｍＭの蛋白質分
解酵素阻害剤であるｐ−ＡＰＭＳＦ（ｐ−アミノジフェ
ニルメタンスルホニルフルオリド 塩酸塩、和光純薬工
業、カタログ番号０１０−１０３９３）を加え、次に述
べるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムによるバッファ
ー交換のステップへ進めた。このようにして、約１００
匹分ごとにひとつのロットにまとめ、塩化カルシウム・
ｐ−ＡＰＭＳＦ処理し、合計１１ロット、約１１００匹
分のＸＲＰ（総体積８１８４ｍｌ、総蛋白質量４９３０
０７ｍｇ）の処理を繰り返し、それぞれＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５カラムへ進めた。 （２）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５＜バッファー交換＞ （１）で得られた塩化カルシウム処理後の上清（７４２
ｍｌ，蛋白濃度５４．９ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量４０７
４０ｍｇ）を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８で
予め平衡化してあったＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍカ
ラム（ファルマシア バイオテク社製、カタログ番号１
７−００３３−０３；直径１１．３ｃｍ、ベッド高４７
ｃｍ）に流速４０〜７０ｍｌ／ｍｉｎで添加し、蛋白質
が溶出してくるまでの１３００ｍｌを捨てた。次に、紫
外吸収が立ち上がってきた時点から、電気伝導度が５０
０μＳ／ｃｍに達するまでを集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ８溶液に置換されたＴＰＯ活性を含む蛋
白質画分（１３７７ｍｌ，蛋白濃度２７．５６ｍｇ／ｍ
ｌ）を回収した。ＴＰＯ活性画分の総蛋白質量は、３７
８８２ｍｇ、このステップでの蛋白収量は、９３％であ
った。また、ＴＰＯの相対活性は、２．３であった。こ
のようにして、全ロットについてそれぞれＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−２５カラムを実施した結果、合計すると、総
体積 ２１１１７ｍｌ、総蛋白質量 ４８０３０６ｍ
ｇ、平均相対活性 １．８、相対活性量 ８６４６００
のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のＴＰＯ活性画分を得
た。 （３）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ＜強陰イオン交換
クロマトグラフィー＞ （２）で得られたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ＭのＴＰ
Ｏ活性画分（１３７５ｍｌ，蛋白濃度２７．５ｍｇ／ｍ
ｌ、総蛋白質量３７８４１ｍｇ、相対活性２．３）を流
速４０ｍｌ／ｍｉｎで、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ
（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号１７−０
５１０−０１；直径 ５ｃｍ、ベッド高 ２７ｃｍ）に
添加し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８で素通る
画分Ｆ１（３９４９ｍｌ，蛋白濃度０．９８ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量３８７０ｍｇ，相対活性０）を溶出し
た。次に、１７５ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８緩衝液に換えて、ＴＰＯ活性画分
Ｆ２（４３７５ｍｌ，蛋白濃度５．３６ｍｇ／ｍｌ）を
溶出した。最後に、１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８緩衝液で、Ｆ３（１２
２１ｍｌ，蛋白濃度３．９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量４７
８３ｍｇ，相対活性３．８）を溶出した。ＴＰＯ活性画
分Ｆ２の総蛋白質量は、２３４４０ｍｇ、このステップ
でのＦ２の蛋白収量は、６１．９％であった。また、Ｔ
ＰＯの相対活性は、６．８に上昇した。このようにし
て、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のＴＰＯ活性画分の全
ロットをＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦにかけた結果、合
計すると総体積 ３５８４２ｍｌ、総蛋白質量 ３１４
３８４ｍｇ、平均相対活性 ８．６、相対活性量 ２７
０４０００のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦのＴＰＯ活
性画分Ｆ２を得た。 （４）小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）−Ａｇａｒｏｓ
ｅ＜レクチンアフィニティークロマトグラフィー＞ （３）で得られたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦのＴＰ
Ｏ活性画分Ｆ２を３回に分けて、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓ
ｅ（ホーネン社製、カタログ番号８００２７３；直径
５ｃｍ、ベッド高 ２２．５ｃｍ）に流速５ｍｌ／ｍｉ
ｎで添加し、ダルベッコ氏リン酸等張緩衝液（ＤＰＢ
Ｓ）で素通る画分Ｆ１（９３３６ｍｌ，蛋白濃度２．３
０ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量２１４０７ｍｇ，相対活性
６．９）を得た。次に、０．２Ｍ Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ、ナカライ社製、カタログ
番号００５−２０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２
％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ，ｐＨ７．２緩衝液により溶出されたプール
を、限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウル
トラセット分子量８０００カット）で濃縮し、ＷＧＡ−
Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（２９９３ｍ
ｌ，蛋白濃度０．３７６ｍｇ／ｍｌ）を得た。このＴＰ
Ｏ活性画分Ｆ２の総蛋白質量は、１１２５ｍｇ、このス
テップでのＦ２の蛋白収量は、４．８％であった。ま
た、ＴＰＯの相対活性は、１０１に上昇した。ここで得
られたＦ２は−８０℃で保存した。このようにして、Ｑ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦのＴＰＯ活性画分Ｆ２の全
ロットについて、繰り返しＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅにか
けた結果、総体積 ３３０９４ｍｌ、総蛋白質量 １５
０３０ｍｇ、平均相対活性 １３２、相対活性量１９８
７０００のＷＧＡ−ＡｇａｒｏｓｅのＴＰＯ活性画分Ｆ
２を得た。 （５）ＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ ＭＨ
＜色素吸着アフィニティークロマトグラフィー＞ （４）で得られた、合計２１５匹分のＸＲＰから出発し
たロットＸＷ８のＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活
性画分とロットＸＷ９のＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着Ｔ
ＰＯ活性画分Ｆ２をバッチＸＢ６としてまとめた（５９
７４ｍｌ，蛋白濃度０．３８８ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量
２３１９ｍｇ、相対活性１５０）。この体積５９７４ｍ
ｌに対し、０．８５ｍｏｌｅｓのＮａＣｌ（２９６．７
６ｇ）を加え、最終濃度０．８２２Ｍ ＮａＣｌ，６１
３２ｍｌの溶液とした後、１Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ
Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２で予め平衡化し
てあったＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ Ｍ
Ｈカラム（トーソー社製、カタログ番号０８７０５；直
径 ５ｃｍ、ベッド高 ２３ｃｍ）に、流速７ｍｌ／ｍ
ｉｎで添加した。添加終了後、流速１０ｍｌ／ｍｉｎに
て、２０ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１Ｍ Ｎａ
ｃｌ，ｐＨ７．２で溶出される素通り（約８４７０ｍ
ｌ）を集め、これを限外濾過ユニット（フィルトロン社
製、オメガウルトラセット分子量８０００カット）で濃
縮し、素通り画分Ｆ１（５４３ｍｌ，蛋白濃度２．０５
ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１１１２ｍｇ，相対活性３１）
を得た。次に、溶出液を２Ｍ ＮａＳＣＮにかえ、溶出
されたＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ＭＨ
吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（１４２７ｍｌ，蛋白濃度０．
４４７ｍｇ／ｍｌ）を得た。このＴＰＯ活性画分Ｆ２の
総蛋白質量は６３８ｍｇ、このステップでのＦ２の蛋白
収量は２７．５％であった。また、ＴＰＯの相対活性
は、１５００に上昇した。このようにして、ＷＧＡ−Ａ
ｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２の全バッチについ
て、各々ＴＳＫ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ＭＨにかけた
結果、総体積 １０６５５ｍｌ、総蛋白質量４２３６ｍ
ｇ、平均相対活性 ９０５、相対活性量３８３４０００
のＴＳＫ−ｇｅｌＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ＭＨのＴＰＯ
活性画分Ｆ２を得た。 （６）Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ／
ＬＳ＜疎水相互作用クロマトグラフィー＞ （５）で得られたＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６
５０ ＭＨのＴＰＯ活性画分Ｆ２（１４２４ｍｌ，蛋白
濃度０．４４７ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量６３８ｍｇ、相
対活性１５００）の体積１４２４ｍｌに対し、１．５ｍ
ｏｌｅｓのＡｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｏｌｆａｔｅ（２８
２．２ｇ）の粉末を加え、最終濃度１．３５Ｍ Ａｍｍ
ｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ，１５８１ｍｌの溶液とし
た。これを１．５Ｍ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔ
ｅ，５０ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２
で予め平衡化してあったＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ６ ＦＦ（Ｌｏｗ Ｓｕｂ）カラム（ファルマシ
アバイオテク社製、カタログ番号１７−０９６５−０
５；直径 ５ｃｍ、ベッド高 １０ｃｍ）に、流速７ｍ
ｌ／ｍｉｎにて添加し、添加終了後、溶出液を０．８Ｍ
Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ，３６ｍＭ Ｎａ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅにかえ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎに
て溶出される画分（約３１６０ｍｌ）までを集め、これ
を限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウルト
ラセット分子量８０００カット）で濃縮し、Ｆ１（４８
５ｍｌ，蛋白濃度０．１９４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量９
４．２ｍｇ，相対活性０）を得た。次に、溶出液を２０
ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２にかえ、
溶出されたＴＰＯ活性画分Ｆ２（約３５００ｍｌ）を得
た。これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメ
ガウルトラセット分子量８０００カット）で濃縮し、一
旦サンプリングした。この段階のＴＰＯ活性画分Ｆ２
（２２０ｍｌ）の蛋白濃度は１．４５ｍｇ／ｍｌ，総蛋
白質量３１９ｍｇ、このステップでのＦ２の蛋白収量
は、５０．０％であった。また、ＴＰＯの相対活性は、
１２３０であった。このようにして、ＴＳＫ−ｇｅｌ
ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ＭＨ のＴＰＯ活性画分Ｆ２の
全バッチについて、繰り返しＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅＦＦ／ＬＳにかけた結果、総体積 １９６６ｍ
ｌ、総蛋白質量 ２７６２ｍｇ、平均相対活性 ８４
７、相対活性量 ２３３９０００のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ／ＬＳのＴＰＯ活性画分Ｆ２を得
た。 （７）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ＜ゲル濾
過クロマトグラフィー＞ （６）で得られたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６ ＦＦ／ＬＳのＴＰＯ活性画分Ｆ２（２１７ｍｌ，蛋
白濃度 １．４５ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量３１５ｍｇ、
相対活性１２３０）に、１４４．８ｍｌの５Ｍ ＮａＣ
ｌ溶液を加えて３６２ｍｌの２Ｍ ＮａＣｌとした後、
さらに限外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直
径７６ｍｍ）で約５０ｍｌまで濃縮した。これに８Ｍ尿
素を等量体積（５０ｍｌ）加え、最終濃度１Ｍ ＮａＣ
ｌ、４Ｍ尿素の溶液約１００ｍｌにした。さらに約８０
ｍｌまで濃縮し、最終的に８８．７８ｍｌのサンプルに
し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲカラム（フ
ァルマシア バイオテク社製、カタログ番号１７−０５
８４−０１；直径 ７．５ｃｍ、ベッド高 １００ｃ
ｍ）に、注入した。その後３ｍｌ／ｍｉｎの流速にてＤ
ＰＢＳで展開し、ボイド体積（１２００ｍｌ）以降４５
ｍｌずつ６０本のポリプロピレン製チューブに集めた。
この溶出パターンを図１に示した。２本ごとにアッセイ
にかけ、残りは１１００匹分の全てのＳｅｐｈａｃｒｙ
ｌ Ｓ−２００ＨＲのプロセスを終えるまで、−８５℃
にて凍結保存した。アッセイの結果よりＸＢ６では以下
のようにフラクションをまとめた（図１）。 （Ｆ１）チューブ番号 １〜１５（ボイド体積付近の分
子量９４０００以上の画分） （Ｆ２）チューブ番号 １６〜２６（分子量９４０００
〜３３０００） （Ｆ３）チューブ番号 ２７〜４４（分子量３３０００
〜３０００） （Ｆ４）チューブ番号 ４５〜５５（分子量３０００以
下） このようにして、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６ ＦＦ／ＬＳで得たＴＰＯ活性画分Ｆ２の全バッチに
ついて、各々Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲにか
け、それぞれのフラクションについてアッセイを行な
い、−８５℃にて凍結保存をした。すべてのバッチにつ
いてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ終了後、次
の逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯ
ＴＥＩＮ−ＲＰ）を実施する直前に解凍をし、限外濾過
ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径７６ｍｍ）で
濃縮し、下記の２つの標品を得た。以下、このＳｅｐｈ
ａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲのＴＰＯ活性画分Ｆ２の
濃縮標品を「高分子ＴＰＯ標品Ｆ２」、Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ Ｓ−２００ＨＲのＴＰＯ活性画分Ｆ３の濃縮標品
を「低分子ＴＰＯ標品Ｆ３」と言う。ここで述べる高分
子ＴＰＯ標品Ｆ２、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３とは便宜上、
ゲル濾過クロマトグラフィーで溶出位置の異なった画分
をまとめたものを称するのであって、必ずしも真の分子
量を表現したものではない。
白質分解酵素阻害剤処理−８０℃で保存した約１００匹
分のＸＲＰ（７４２ｍｌ，蛋白濃度５４．８ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量４０６８６ｍｇ）を解凍し、ポリプロピ
レン製遠心チューブ（ナルゲン社製）に移した。これに
各々最終濃度１００ｍＭになるように塩化カルシウム粉
末を加え、４℃で一晩静置した。次に８０００ＲＰＭで
６０分遠心後、上清を回収した。ＴＰＯ活性を含むこの
上清（７４２ｍｌ，蛋白濃度５４．９ｍｇ／ｍｌ，総蛋
白質量４０７４０ｍｇ）に、最終濃度１ｍＭの蛋白質分
解酵素阻害剤であるｐ−ＡＰＭＳＦ（ｐ−アミノジフェ
ニルメタンスルホニルフルオリド 塩酸塩、和光純薬工
業、カタログ番号０１０−１０３９３）を加え、次に述
べるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムによるバッファ
ー交換のステップへ進めた。このようにして、約１００
匹分ごとにひとつのロットにまとめ、塩化カルシウム・
ｐ−ＡＰＭＳＦ処理し、合計１１ロット、約１１００匹
分のＸＲＰ（総体積８１８４ｍｌ、総蛋白質量４９３０
０７ｍｇ）の処理を繰り返し、それぞれＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５カラムへ進めた。 （２）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５＜バッファー交換＞ （１）で得られた塩化カルシウム処理後の上清（７４２
ｍｌ，蛋白濃度５４．９ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量４０７
４０ｍｇ）を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８で
予め平衡化してあったＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍカ
ラム（ファルマシア バイオテク社製、カタログ番号１
７−００３３−０３；直径１１．３ｃｍ、ベッド高４７
ｃｍ）に流速４０〜７０ｍｌ／ｍｉｎで添加し、蛋白質
が溶出してくるまでの１３００ｍｌを捨てた。次に、紫
外吸収が立ち上がってきた時点から、電気伝導度が５０
０μＳ／ｃｍに達するまでを集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ８溶液に置換されたＴＰＯ活性を含む蛋
白質画分（１３７７ｍｌ，蛋白濃度２７．５６ｍｇ／ｍ
ｌ）を回収した。ＴＰＯ活性画分の総蛋白質量は、３７
８８２ｍｇ、このステップでの蛋白収量は、９３％であ
った。また、ＴＰＯの相対活性は、２．３であった。こ
のようにして、全ロットについてそれぞれＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−２５カラムを実施した結果、合計すると、総
体積 ２１１１７ｍｌ、総蛋白質量 ４８０３０６ｍ
ｇ、平均相対活性 １．８、相対活性量 ８６４６００
のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のＴＰＯ活性画分を得
た。 （３）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ＜強陰イオン交換
クロマトグラフィー＞ （２）で得られたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ＭのＴＰ
Ｏ活性画分（１３７５ｍｌ，蛋白濃度２７．５ｍｇ／ｍ
ｌ、総蛋白質量３７８４１ｍｇ、相対活性２．３）を流
速４０ｍｌ／ｍｉｎで、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ
（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号１７−０
５１０−０１；直径 ５ｃｍ、ベッド高 ２７ｃｍ）に
添加し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８で素通る
画分Ｆ１（３９４９ｍｌ，蛋白濃度０．９８ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量３８７０ｍｇ，相対活性０）を溶出し
た。次に、１７５ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８緩衝液に換えて、ＴＰＯ活性画分
Ｆ２（４３７５ｍｌ，蛋白濃度５．３６ｍｇ／ｍｌ）を
溶出した。最後に、１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８緩衝液で、Ｆ３（１２
２１ｍｌ，蛋白濃度３．９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量４７
８３ｍｇ，相対活性３．８）を溶出した。ＴＰＯ活性画
分Ｆ２の総蛋白質量は、２３４４０ｍｇ、このステップ
でのＦ２の蛋白収量は、６１．９％であった。また、Ｔ
ＰＯの相対活性は、６．８に上昇した。このようにし
て、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のＴＰＯ活性画分の全
ロットをＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦにかけた結果、合
計すると総体積 ３５８４２ｍｌ、総蛋白質量 ３１４
３８４ｍｇ、平均相対活性 ８．６、相対活性量 ２７
０４０００のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦのＴＰＯ活
性画分Ｆ２を得た。 （４）小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）−Ａｇａｒｏｓ
ｅ＜レクチンアフィニティークロマトグラフィー＞ （３）で得られたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦのＴＰ
Ｏ活性画分Ｆ２を３回に分けて、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓ
ｅ（ホーネン社製、カタログ番号８００２７３；直径
５ｃｍ、ベッド高 ２２．５ｃｍ）に流速５ｍｌ／ｍｉ
ｎで添加し、ダルベッコ氏リン酸等張緩衝液（ＤＰＢ
Ｓ）で素通る画分Ｆ１（９３３６ｍｌ，蛋白濃度２．３
０ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量２１４０７ｍｇ，相対活性
６．９）を得た。次に、０．２Ｍ Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ、ナカライ社製、カタログ
番号００５−２０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２
％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ，ｐＨ７．２緩衝液により溶出されたプール
を、限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウル
トラセット分子量８０００カット）で濃縮し、ＷＧＡ−
Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（２９９３ｍ
ｌ，蛋白濃度０．３７６ｍｇ／ｍｌ）を得た。このＴＰ
Ｏ活性画分Ｆ２の総蛋白質量は、１１２５ｍｇ、このス
テップでのＦ２の蛋白収量は、４．８％であった。ま
た、ＴＰＯの相対活性は、１０１に上昇した。ここで得
られたＦ２は−８０℃で保存した。このようにして、Ｑ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦのＴＰＯ活性画分Ｆ２の全
ロットについて、繰り返しＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅにか
けた結果、総体積 ３３０９４ｍｌ、総蛋白質量 １５
０３０ｍｇ、平均相対活性 １３２、相対活性量１９８
７０００のＷＧＡ−ＡｇａｒｏｓｅのＴＰＯ活性画分Ｆ
２を得た。 （５）ＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ ＭＨ
＜色素吸着アフィニティークロマトグラフィー＞ （４）で得られた、合計２１５匹分のＸＲＰから出発し
たロットＸＷ８のＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活
性画分とロットＸＷ９のＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着Ｔ
ＰＯ活性画分Ｆ２をバッチＸＢ６としてまとめた（５９
７４ｍｌ，蛋白濃度０．３８８ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量
２３１９ｍｇ、相対活性１５０）。この体積５９７４ｍ
ｌに対し、０．８５ｍｏｌｅｓのＮａＣｌ（２９６．７
６ｇ）を加え、最終濃度０．８２２Ｍ ＮａＣｌ，６１
３２ｍｌの溶液とした後、１Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ
Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２で予め平衡化し
てあったＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ Ｍ
Ｈカラム（トーソー社製、カタログ番号０８７０５；直
径 ５ｃｍ、ベッド高 ２３ｃｍ）に、流速７ｍｌ／ｍ
ｉｎで添加した。添加終了後、流速１０ｍｌ／ｍｉｎに
て、２０ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１Ｍ Ｎａ
ｃｌ，ｐＨ７．２で溶出される素通り（約８４７０ｍ
ｌ）を集め、これを限外濾過ユニット（フィルトロン社
製、オメガウルトラセット分子量８０００カット）で濃
縮し、素通り画分Ｆ１（５４３ｍｌ，蛋白濃度２．０５
ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１１１２ｍｇ，相対活性３１）
を得た。次に、溶出液を２Ｍ ＮａＳＣＮにかえ、溶出
されたＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ＭＨ
吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（１４２７ｍｌ，蛋白濃度０．
４４７ｍｇ／ｍｌ）を得た。このＴＰＯ活性画分Ｆ２の
総蛋白質量は６３８ｍｇ、このステップでのＦ２の蛋白
収量は２７．５％であった。また、ＴＰＯの相対活性
は、１５００に上昇した。このようにして、ＷＧＡ−Ａ
ｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２の全バッチについ
て、各々ＴＳＫ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ＭＨにかけた
結果、総体積 １０６５５ｍｌ、総蛋白質量４２３６ｍ
ｇ、平均相対活性 ９０５、相対活性量３８３４０００
のＴＳＫ−ｇｅｌＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ＭＨのＴＰＯ
活性画分Ｆ２を得た。 （６）Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ／
ＬＳ＜疎水相互作用クロマトグラフィー＞ （５）で得られたＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６
５０ ＭＨのＴＰＯ活性画分Ｆ２（１４２４ｍｌ，蛋白
濃度０．４４７ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量６３８ｍｇ、相
対活性１５００）の体積１４２４ｍｌに対し、１．５ｍ
ｏｌｅｓのＡｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｏｌｆａｔｅ（２８
２．２ｇ）の粉末を加え、最終濃度１．３５Ｍ Ａｍｍ
ｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ，１５８１ｍｌの溶液とし
た。これを１．５Ｍ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔ
ｅ，５０ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２
で予め平衡化してあったＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ６ ＦＦ（Ｌｏｗ Ｓｕｂ）カラム（ファルマシ
アバイオテク社製、カタログ番号１７−０９６５−０
５；直径 ５ｃｍ、ベッド高 １０ｃｍ）に、流速７ｍ
ｌ／ｍｉｎにて添加し、添加終了後、溶出液を０．８Ｍ
Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ，３６ｍＭ Ｎａ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅにかえ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎに
て溶出される画分（約３１６０ｍｌ）までを集め、これ
を限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウルト
ラセット分子量８０００カット）で濃縮し、Ｆ１（４８
５ｍｌ，蛋白濃度０．１９４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量９
４．２ｍｇ，相対活性０）を得た。次に、溶出液を２０
ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２にかえ、
溶出されたＴＰＯ活性画分Ｆ２（約３５００ｍｌ）を得
た。これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメ
ガウルトラセット分子量８０００カット）で濃縮し、一
旦サンプリングした。この段階のＴＰＯ活性画分Ｆ２
（２２０ｍｌ）の蛋白濃度は１．４５ｍｇ／ｍｌ，総蛋
白質量３１９ｍｇ、このステップでのＦ２の蛋白収量
は、５０．０％であった。また、ＴＰＯの相対活性は、
１２３０であった。このようにして、ＴＳＫ−ｇｅｌ
ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ＭＨ のＴＰＯ活性画分Ｆ２の
全バッチについて、繰り返しＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅＦＦ／ＬＳにかけた結果、総体積 １９６６ｍ
ｌ、総蛋白質量 ２７６２ｍｇ、平均相対活性 ８４
７、相対活性量 ２３３９０００のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ／ＬＳのＴＰＯ活性画分Ｆ２を得
た。 （７）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ＜ゲル濾
過クロマトグラフィー＞ （６）で得られたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６ ＦＦ／ＬＳのＴＰＯ活性画分Ｆ２（２１７ｍｌ，蛋
白濃度 １．４５ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量３１５ｍｇ、
相対活性１２３０）に、１４４．８ｍｌの５Ｍ ＮａＣ
ｌ溶液を加えて３６２ｍｌの２Ｍ ＮａＣｌとした後、
さらに限外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直
径７６ｍｍ）で約５０ｍｌまで濃縮した。これに８Ｍ尿
素を等量体積（５０ｍｌ）加え、最終濃度１Ｍ ＮａＣ
ｌ、４Ｍ尿素の溶液約１００ｍｌにした。さらに約８０
ｍｌまで濃縮し、最終的に８８．７８ｍｌのサンプルに
し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲカラム（フ
ァルマシア バイオテク社製、カタログ番号１７−０５
８４−０１；直径 ７．５ｃｍ、ベッド高 １００ｃ
ｍ）に、注入した。その後３ｍｌ／ｍｉｎの流速にてＤ
ＰＢＳで展開し、ボイド体積（１２００ｍｌ）以降４５
ｍｌずつ６０本のポリプロピレン製チューブに集めた。
この溶出パターンを図１に示した。２本ごとにアッセイ
にかけ、残りは１１００匹分の全てのＳｅｐｈａｃｒｙ
ｌ Ｓ−２００ＨＲのプロセスを終えるまで、−８５℃
にて凍結保存した。アッセイの結果よりＸＢ６では以下
のようにフラクションをまとめた（図１）。 （Ｆ１）チューブ番号 １〜１５（ボイド体積付近の分
子量９４０００以上の画分） （Ｆ２）チューブ番号 １６〜２６（分子量９４０００
〜３３０００） （Ｆ３）チューブ番号 ２７〜４４（分子量３３０００
〜３０００） （Ｆ４）チューブ番号 ４５〜５５（分子量３０００以
下） このようにして、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６ ＦＦ／ＬＳで得たＴＰＯ活性画分Ｆ２の全バッチに
ついて、各々Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲにか
け、それぞれのフラクションについてアッセイを行な
い、−８５℃にて凍結保存をした。すべてのバッチにつ
いてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ終了後、次
の逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯ
ＴＥＩＮ−ＲＰ）を実施する直前に解凍をし、限外濾過
ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径７６ｍｍ）で
濃縮し、下記の２つの標品を得た。以下、このＳｅｐｈ
ａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲのＴＰＯ活性画分Ｆ２の
濃縮標品を「高分子ＴＰＯ標品Ｆ２」、Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ Ｓ−２００ＨＲのＴＰＯ活性画分Ｆ３の濃縮標品
を「低分子ＴＰＯ標品Ｆ３」と言う。ここで述べる高分
子ＴＰＯ標品Ｆ２、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３とは便宜上、
ゲル濾過クロマトグラフィーで溶出位置の異なった画分
をまとめたものを称するのであって、必ずしも真の分子
量を表現したものではない。
【表２】 以降、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３と高分子ＴＰＯ標品Ｆ２と
をそれぞれ次の精製ステップに進めた。以下（８）〜
（１１）に低分子ＴＰＯ標品Ｆ３の精製の各ステップに
ついて述べる。 （８）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ＜逆相
クロマトグラフィー＞ （７）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３（総蛋白質量５
０．３ｍｇ，蛋白濃度０．１８４ｍｇ／ｍｌ，相対活性
２００００，相対活性量１００７０００、総体積２７４
ｍｌ）に展開溶媒Ａ（０．０２５％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ））および展開溶媒Ｂ（０．０２５％ ＴＦＡ
を含む１−プロパノール）を加え、最終体積５０８．６
３ｍｌ、最終プロパノール濃度約２０％、ＴＦＡ濃度
０．０１２％、蛋白濃度０．０９８９ｍｇ／ｍｌに調製
した。ここで不溶物の発生があったので、これを遠心
し、上清のみを２５４．３ｍｌ（２５．２ｍｇ）ずつ２
回に分けて、予め３０％Ｂで平衡化してあったＹＭＣ−
Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社、カタログ
番号Ａ−ＰＲＲＰ−３３−０３−１５；直径 ３ｃｍ、
ベッド高 ７．５ｃｍ）カラムに流速２ｍｌ／ｍｉｎで
添加した。沈殿物は５ｍＭのＣＨＡＰＳ（３−［（３−
コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパ
ンスルフォナート；同仁化学研究所製、カタログ番号７
５６２１−０３−３）を含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、
ｐＨ５．５を２０ｍｌ加えて可溶化し、合わせてカラム
に送り込んだ。サンプルを添加した後、約５０ｍｌの溶
媒（展開溶媒Ａ：展開溶媒Ｂ＝３：１）を通液し、まず
素通り画分を集めた。次に展開プログラム（１２０分の
３０％Ｂ〜４５％Ｂの直線濃度勾配）を開始して、１０
ｍｌずつ合計３６本のフラクションをポリプロピレン製
チューブに集め取った。これを繰り返して同じチューブ
に集めたため、最終的に２０ｍｌずつ、合計３６本フラ
クションとなった。素通り画分はそのまま限外濾過ユニ
ット（アミコン社製；ＹＭ ３膜、直径７６ｍｍ）で２
０ｍｌまで濃縮した。素通り画分及びチューブ番号１〜
３６の各２０ｍｌのフラクションより０．１ｍｌ取り、
２０μｌの５％ ＢＳＡを添加後遠心エバポレーション
で乾固し、最終的に０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培
養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定
した。この結果、チューブ番号１７〜２７（プロパノー
ル濃度で３６．０〜４３．０％の範囲）にＴＰＯの活性
があり、これを低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−Ｐ
ａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２と
した。次のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰに進める直前
まで−８５℃で保存した。 低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯ
ＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２ 総体積 ２２０ｍｌ 蛋白濃度 ０．０１３０ｍｇ／ｍｌ 総蛋白質量 ２．８５ｍｇ 相対活性 １３００００ 相対活性量 ３７１０００ （９）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰ＜逆相クロマトグ
ラフィー＞ （８）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−
Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２
のうち２１４．９ｍｌ（総蛋白質量２．７９ｍｇ，蛋白
濃度０．０１３０ｍｇ／ｍｌ，相対活性１３００００，
相対活性量３６３００）に、５０％グリセロールを０．
６ｍｌ加え、１．８ｍｌまで濃縮した。最終的に体積５
ｍｌで、プロパノール濃度は２０％以下、グリセロール
は約６％であった。これを５回（各回の注入蛋白質量
０．５５５ｍｇ，体積１ｍｌ）に分けて実施した。毎回
ごとに、展開溶媒Ａに０．１％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに
０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用い、１５
％Ｂで平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰ（ＹＭ
Ｃ社製、カタログ番号ＡＰ−５１３；直径 ６ｍｍ、ベ
ッド高２５０ｍｍ）カラムに、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ
で注入した。注入終了後、１５％Ｂから２５％Ｂにプロ
パノール濃度を上げ、さらに２５％Ｂから５０％Ｂまで
６５分の直線濃度勾配で展開した。最後の回に、蛋白を
含まない同じ組成の溶液１ｍｌを注入、展開し、カラム
内に残存するＴＰＯ活性の回収を行った。合計６回分同
じポリプロピレン製チューブに集めたため、各フラクシ
ョンは、７．２ｍｌずつ４４本となった。このうち３０
μｌ（２４０分の１フラクション）を取り２０μｌの５
％ＢＳＡを加え、遠心エバポレーションで乾固し、最終
的に０．２４ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に溶解し、
アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結
果、チューブ番号２８〜３３（プロパノール濃度で３
７．０〜４２．０％の範囲）に強いＴＰＯの活性があっ
たため、これを低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来ＹＭＣ−Ｐａ
ｃｋ ＣＮ−ＡＰのメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとし
た。 低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−
ＡＰのＴＰＯ活性画分ＦＡ 総体積 ４３．２０ｍｌ 蛋白濃度 ０．００８６３ｍｇ／ｍｌ 総蛋白質量 ０．３７３ｍｇ 相対活性 ８０００００ 相対活性量 ２９８４００ （１０）Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃｌ ３００Ａ＜最
終の逆相クロマトグラフィー＞ （９）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＴＰＯ活
性画分ＦＡ４３．２０ｍｌのうち４３．１２ｍｌ（総蛋
白質量０．３７２ｍｇ，蛋白濃度０．００８６３ｍｇ／
ｍｌ，相対活性８０００００，相対活性量２９７６０
０）に、０．２ｍｌの５０％グリセロールを加え、０．
１ｍｌのグリセロール溶液となるまで濃縮した。これに
展開溶媒Ａ（０．１％ ＴＦＡ）：展開溶媒Ｂ（０．０
５％ＴＦＡを含む１−プロパノール）＝８５：１５（１
５％Ｂ）の溶液２ｍｌを加えて、最終的に、体積２．１
ｍｌ、プロパノール濃度が約１４％、グリセロールが約
４．８％、蛋白濃度０．１７７ｍｇ／ｍｌのサンプルに
調製した。これを１５％Ｂで平衡化したＣａｐｃｅｌｌ
Ｐａｋ Ｃｌ ３００Ａ（資生堂製、カタログ番号Ｃ
１ＴＹＰＥ：ＳＧ３００Ａ；直径 ４．６ｍｍ、ベッド
高 ２５０ｍｍ）カラムに注入し、２７％Ｂから３８％
Ｂまで６５分の直線濃度勾配で流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ
で展開し、ポリプロピレン製チューブ７２本に０．６ｍ
ｌずつ集めた。各フラクションから、３μｌ（２００分
の１フラクション）を取り２０μｌの５％ＢＳＡを加
え、最終的に２２５μｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に置
換し、オリジナル体積から７５倍希釈したものをアッセ
イにかけた。各フラクションから、電気泳動のために１
μｌ（６００分の１フラクション）を取り、遠心エバポ
レーションし、還元剤を含まないＳＤＳゲル電気泳動サ
ンプルバッファーを１０μｌ加え、９５℃で５分処理し
た。これを１５−２５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドプ
レキャストゲル（第一化学薬品社製）を用いてＳＤＳゲ
ル電気泳動し、２Ｄ−銀染色試薬・「第一」銀染色キッ
ト（第一化学薬品社製、カタログ番号１６７９９７、以
下「銀染色キット」と言う）で染色した。分子量マーカ
ーには「第一」・ＩＩＩ低分子量マーカー（第一化学薬
品社製、カタログ番号１８１０６１、以下「ＤＰＣＩＩ
Ｉ」と言う）を用いた。以上の分析の結果、チューブ番
号３５〜４３（プロパノール濃度で３０．０〜３２．５
％の範囲）に明らかにＴＰＯの活性があった。このうち
チューブ番号３６〜４２（プロパノール濃度で３０．５
〜３２．０％の範囲）をメインのＴＰＯ活性画分ＦＡと
した。以上の結果を図２に示した。蛋白質量をクロマト
グラムから推定し、アッセイの結果と合わせて評価する
と、総蛋白質量３９．６μｇ，蛋白濃度９．４μｇ／ｍ
ｌ，相対活性４８９００００，相対活性量１９３６００
となった。ＴＰＯ活性画分チューブ番号３６〜４２のＳ
ＤＳゲル電気泳動像を調べてみると、活性の強さと、染
色された濃さが相関するバンドが存在することが明らか
となった。しかもこのバンドの分子量は、見かけ上、即
ち還元状態での標準分子量蛋白に対し、１７０００〜１
９０００の位置にあり、ＴＰＯの候補となる有力なバン
ドであることがわかった。 （１１）電気泳動ゲルからのＴＰＯ活性の抽出＜１５％
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動＞ＴＰＯ活性画分ＦＡの分析例 （１０）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＴＰＯ
活性画分ＦＡ ４２００μｌ（総蛋白質量３９．６μ
ｇ，蛋白濃度９．４μｇ／ｍｌ，相対活性４８９０００
０，相対活性量１９３６００）の内、５．５μｌ（７６
４分の１フラクション）を活性抽出のため、２．５μｌ
（１６８０分の１フラクション）を銀染色のためにそれ
ぞれサンプルチューブに取り、遠心エバポレーション
し、還元剤不含のＳＤＳゲル電気泳動サンプルバッファ
ー１０μｌを加え、３７℃１時間処理後、室温で１８時
間放置することによりＳＤＳ化した。分子量マーカーに
は、プレステインド・ローレンジマーカー（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ社１６１−０３０５）、及びＤＰＣＩＩＩマーカー
を用いた。これらのサンプルを常法（Ｌａｅｍｍｌｉ、
Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０−６８５頁、（１９７
０））に従って、マイクロスラブゲルを用いた１５％Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を４℃にて実施し
た。泳動終了後、直ちに銀染色に付す部分をナイフで切
断し固定液に入れ、銀染色キットを用いて銀染色した。
一方、活性を切り出すべき部分を、分子量の全域に渡っ
て、ナイフを用いて幅１．５〜２．５ｍｍの３４本のゲ
ルにスライスし、小林の方法（小林幹彦、生化学、第５
９巻、第９号（１９８７））を改良した方法でゲルの破
砕を行った。微細な断片に破砕されたゲルに各々０．３
ｍｌの抽出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ８，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ＢＳＡ）を
加え、４℃で６時間振とうし、抽出を行った。次に最終
濃度２０ｍＭの５００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．８
を加え、４℃で１時間振とうし、沈殿したＳＤＳを除く
ためウルトラフリーＣ３ＧＶ０．２２μｍフィルター付
濾過ユニット（ミリポア社製、型番ＵＦＣ３ ＯＧＶ
ＯＳ）に移し、１０００ｘｇ（４０００ＲＰＭ）で１５
分間遠心し、濾液を回収した。これをウルトラフリーＣ
３−ＬＧＣ分子量１００００カット限外濾過ユニット
（ミリポア社製、型番ＵＦＣ３ ＬＧＣ ００）に移し
３０００ｘｇ（７０００ＲＰＭ）で遠心した。濃縮液が
約５０μｌに達した時点で、３００μｌの２０ｍＭＮａ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２のバッファーを加
え、再び限外濾過を行った。これを２回繰り返し、残存
するＳＤＳを除去した。さらにアッセイ培養液に対し同
様な操作を繰り返し、最終的に３００μｌに調製した。
これを滅菌し、ＴＰＯ活性を測定した。このような実験
の結果、銀染色で明瞭に検出できた蛋白質は、ＤＰＣＩ
ＩＩマーカーに対し、見かけ上の分子量約１７０００〜
１９０００、１４０００、１１０００の３種であった。
Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＣｌカラムのＴＰＯ活性画分
の電気泳動で、活性の強さと、染色されたバンドの濃さ
が相関する見かけ上の分子量が約１７０００〜１９００
０のバンドが観察できたが、本実験においてもＴＰＯ活
性が検出された見かけ上の分子量は約１７０００〜１９
０００であった。以上の結果を図３に示した。以上の結
果、ＴＰＯ活性を示す蛋白質は、最終的に電気泳動ゲル
上で確認可能なまでにＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃｌ
３００Ａカラムの活性画分中に精製されたと確認でき
た。このサンプルを１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（非還元下）して銀染色されたバンドの濃さ
から、全ＴＰＯ活性画分中の見かけ上の分子量約１７０
００〜１９０００のＴＰＯ候補蛋白質の量は、約１．７
μｇであった。以下（１２）〜（１５）に高分子ＴＰＯ
標品Ｆ２の精製の各ステップについて述べる。 （１２）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ＜逆
相クロマトグラフィー＞ （７）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２（総蛋白質量２
５７ｍｇ，蛋白濃度０．８９４ｍｇ／ｍｌ，相対活性７
８４０，相対活性量２０１５０００、総体積２８７ｍ
ｌ）に展開溶媒Ａ（０．０２５％ ＴＦＡ）およびサン
プルの３分の１容の９５．８ｍｌの展開溶媒Ｂ（０．０
２５％ＴＦＡを含む１−プロパノール）を加え、最終体
積３８３ｍｌ、最終プロパノール濃度約２５％、ＴＦＡ
濃度０．００６％、蛋白濃度０．６７１ｍｇ／ｍｌとし
た。ここで不溶物の発生があったので、遠心後の上清の
みを６２．３ｍｌ（４２．８ｍｇ）ずつ６回に分けて、
予め３０％Ｂで平衡化してあったＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐ
ＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社製、カタログ番号Ａ−Ｐ
ＲＲＰ−３３−０３−１５；直径 ３ｃｍ、ベッド高
７．５ｃｍ）カラムに流速２ｍｌ／ｍｉｎで注入した。
沈殿物は５ｍＭのＣＨＡＰＳを含む２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ５．５を１０ｍｌ加えて可溶化できたので、
合わせてカラムに送り込んだ。それぞれサンプルを注入
した後、約５０ｍｌの溶媒（展開溶媒Ａ：展開溶媒Ｂ＝
３：１）を通液し、素通り画分を集めた後、展開プログ
ラム（１２０分の３０％Ｂから４５％Ｂの直線濃度勾
配）を開始し、１５ｍｌずつ合計２４本のフラクション
をポリプロピレン製チューブに集め取った。１回目から
６回目まで同じ様に繰り返し、最終的に９０ｍｌずつの
フラクションが２４本となった。素通り画分とチューブ
番号１はそのまま限外濾過ユニット（アミコン社製；Ｙ
Ｍ ３膜、直径７６ｍｍ）で９０ｍｌまで濃縮した。素
通りを含むチューブ番号１から２４までのフラクション
より０．３ｍｌ取り、１０μｌの５％ＢＳＡを添加後遠
心エバポレーションで乾固し、最終的に０．３ｍｌのＩ
ＭＤＭアッセイ培養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰ
Ｏ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号１０〜
１５（プロパノール濃度で３４．０〜３９．５％の範
囲）にＴＰＯの活性があり、これを高分子ＴＰＯ標品Ｆ
２由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴ
ＰＯ活性画分Ｆ２とした。次のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ
−ＡＰに進める直前まで、−８５℃で保存した。高分子
ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩ
Ｎ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２ 総体積 ５４０ｍｌ 蛋白濃度 ０．０２１ｍｇ／ｍｌ 総蛋白質量 １１．４ｍｇ 相対活性 ２２７０００ 相対活性量 ２５８８０００ （１３）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ＜ＣＨＡＰＳ存
在下でのゲル濾過クロマトグラフィー＞ （１２）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ
−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ
２のうち、５３８．２ｍｌ（総蛋白質量１１．３ｍｇ，
蛋白濃度０，０２１ｍｇ／ｍｌ，相対活性２２７００
０，相対活性量２５６５０００）に５０％グリセロール
を０．６ｍｌ添加後、遠心エバポレーション濃縮した。
次に、６ｍｌの２０ｍＭ ＣＨＡＰＳを加えた。さら
に、１８ｍｌの２０ｍＭ ＣＨＡＰＳを加え攪拌し、４
℃に移し、４１時間後に最初のサンプルをＨｉＬｏａｄ
２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ（ファルマシ
ア バイオテク社製、カタログ番号１７−１０７０−０
１；直径 ２．６ｃｍ、ベッド高 ６０ｃｍ）カラムに
注入し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、５ｍＭ ＣＨＡＰＳを
含むＤＰＢＳで展開した。一回に４ｍｌ（蛋白濃度０．
４６６ｍｇ／ｍｌ，蛋白質量１．８６ｍｇ）のサンプル
をカラムに注入した。６回目に分けてカラムで展開し、
全てのＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰ
Ｏ活性画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇカラムで分
取した。フラクションは５ｍｌずつ６回分、即ち合計３
０ｍｌのフラクションが４５本となった。それぞれのフ
ラクションより０．１ｍｌ取り、１０μｌの５％ ＢＳ
Ａを添加後、遠心エバポレーションで乾固し、最終的に
０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に溶解し、アッ
セイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チ
ューブ番号１３〜３１（分子量で７８０００〜３０００
の範囲）にＴＰＯの活性があったため、これを高分子Ｔ
ＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇのＴ
ＰＯ活性画分Ｆ２とした。 高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５
ｐｇのＴＰＯ活性画分Ｆ２ 総体積 ５４０ｍｌ 蛋白濃度 ０．００２１６ｍｇ／ｍｌ 総蛋白質量 １．１７ｍｇ 相対活性 １７５００００ 相対活性量 ２０４１０００ （１４）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰ＜逆相クロマト
グラフィー＞ （１３）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐ
ｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇのＴＰＯ活性画分Ｆ２（分子量
７８０００〜３０００）５４０ｍｌのうち、５１３．２
ｍｌ（総蛋白質量１．１１ｍｇ，蛋白濃度０．００２１
６ｍｇ／ｍｌ，相対活性１７５００００，相対活性量１
９４３０００）に１０分の１容の展開液Ｂ（０．０５％
ＴＦＡを含む１−プロパノール）を加えた後、展開溶
媒Ａ（０．１％ ＴＦＡ）と展開液Ｂを用いて１５％Ｂ
で平衡化したＹＭＣ−ＰａｃｋＣＮ−ＡＰ（ＹＭＣ社
製、カタログ番号ＡＰ−５１３；直径 ６ｍｍ、ベッド
高２５０ｍｍ）カラムに、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで注
入した。注入終了後、１５％Ｂから２５％Ｂにプロパノ
ール濃度を上げ、さらに２５％Ｂから５０％Ｂまでの６
５分の直線濃度勾配で展開した。ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ
Ｎ−ＡＰカラムに進めるにあたり、全インプットサンプ
ルの２０分の１をまずパイロット的に進め、活性が良好
に回収できることを確認できた。そこで、残りの２０分
の１９を２回に分けて分取した。つまり合計３回の展開
をおこなった。計３回分で分取された各フラクションを
同じポリプロピレン製チューブ４４本に集めたので、合
計３，６ｍｌずつとなった。このうち５μｌ（７２０分
の１フラクション）を取り、最終的に０．２５ｍｌのＩ
ＭＤＭアッセイ培養液に置換した。アッセイの結果、チ
ューブ番号２４〜３０（プロパノール濃度で３６．０〜
４２．０％の範囲）に極めて強いＴＰＯの活性があった
ため、これを高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ−Ｐａ
ｃｋ ＣＮ−ＡＰのメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとし
た。 高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５
ｐｇのＴＰＯ活性画分ＦＡ 総体積 ２５．２０ｍｌ 蛋白濃度 ０．０２４６ｍｇ／ｍｌ 総蛋白質量 ０．６２０ｍｇ 相対活性 ７０００００ 相対活性量 ４３４０００ （１５）Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃｌ ３００Ａ＜最
終の逆相クロマトグラフィー＞ （１４）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ
−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰのＴＰＯ活性画分ＦＡ２５．２
０ｍｌのうち、２４．６６ｍｌ（総蛋白質量０．６０６
ｍｇ，蛋白濃度０．０２４６ｍｇ／ｍｌ，相対活性７０
００００，相対活性量４２４０００）に、０．４ｍｌの
５０％グリセロールを加え、遠心エバポレーションで濃
縮した。最終的に、プロパノール濃度は数％、グリセロ
ールは１０％、蛋白濃度０．３０３ｍｇ／ｍｌの２ｍｌ
のサンプルとなった。展開溶媒Ａ（０．１％ ＴＦ
Ａ）、展開溶媒Ｂ（０．０５％ ＴＦＡを含む１−プロ
パノール）を用いて、１５％Ｂで平衡化したＣａｐｃｅ
ｌｌ Ｐａｋ Ｃｌ３００Ａ（資生堂 カタログ番号Ｃ
ｌ ＴＹＰＥ：ＳＧ３００Ａ；直径 ４．６ｍｍ、ベッ
ド高 ２５０ｍｍ）カラムに注入し、２７％Ｂから３８
％Ｂまで６５分の直線濃度勾配で流速０．４ｍｌ／ｍｉ
ｎで展開し、ポリプロピレン製チューブ７２本に０．６
ｍｌずつ集めた。各フラクションから、０．７５μｌ
（８００分の１フラクション）を取り、２０μｌの５％
ＢＳＡ を加え、最終的に２２５μｌのＩＭＤＭアッセ
イ培養液に置換し、オリジナル体積から３００倍希釈し
たものをアッセイにかけた。各フラクションから、電気
泳動のために２μｌ（３００分の１フラクション）を取
り、遠心エバポレーションし、１０μｌの還元剤を含ま
ないＳＤＳ電気泳動サンプルバッファーを加え、９５℃
で５分処理した。これを１５〜２５％ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドプレキャストゲル（第一化学薬品製）を用い
てＳＤＳゲル電気泳動し、銀染色キットで染色した。分
子量マーカーにはＤＰＣＩＩＩマーカーを用いた。以上
の分析の結果、チューブ番号３３〜３９（プロパノール
濃度で２９．５〜３１．５％の範囲）に明らかにＴＰＯ
の活性があった。このうち、チューブ番号３４〜３９
（プロパノール濃度で３０．０〜３１．５％の範囲）を
メインのＴＰＯ活性画分ＦＡとした。メインのＴＰＯ活
性画分のＳＤＳゲル電気泳動像を調べてみると、（１
０）に述べた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３から出発したものと
同じく見かけ上１７０００〜２２０００の分子量範囲
に、活性の強さと、染色された濃さが相関するバンドが
存在することが明らかとなった。 ＜実施例２＞ ラット精製ＴＰＯの部分アミノ酸配列の分析 岩松の方法（岩松ら、新基礎生化学実験法、第４巻、３
３〜８４頁（丸善刊）；岩松明彦、生化学、第６３巻、
第２号、１３９−１４３頁、（１９９１）；Ａｋｉｈｉ
ｒｏ Ｉｗａｍａｓｔｕ、Ｅｌｅｃｔｏｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ、第１３巻、１４２−１４７頁、（１９９２））
により、実施例１の（１０）で得られたＣａｐｃｅｌｌ
Ｐａｋ Ｃｌ ３００ＡカラムのＴＰＯ画分ＦＡ中の
ラットＴＰＯ候補タンパク質のアミノ酸配列の分析を行
った。即ち、サンプルをＳＤＳゲル電気泳動し、電気的
にポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写し
た。次いで、ＰＶＤＦ膜上の蛋白質を還元Ｓ−アルキル
化した後、系統的、段階的に３種のプロテアーゼで限定
酵素分解し、ペプチドフラグメント化し、これを逆相ク
ロマトグラフィーで分離精製し、得られたペプチドを高
感度アミノ酸配列決定法により分析した。以下にその詳
細を述べる。低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ
Ｃｌ ３００ＡのＴＰＯ画分ＦＡのＴＰＯ候補蛋白質の
分析例 （１）Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃｌ ３００Ａカラム
のＴＰＯ画分ＦＡ（チューブ番号３６〜４２）の濃縮 実施例１の（１０）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由
来の、ＣａｐｃｅｌｌＰａｋ Ｃｌ３００ＡカラムのＴ
ＰＯ活性画分ＦＡ（チューブ番号３６〜４２）４２００
μｌ（総蛋白質量３９．６μｇ，蛋白濃度９．４μｇ／
ｍｌ，相対活性４８９００００，相対活性量１９３６０
０）のうち、４１５１μｌ（全フラクションの９８．８
％）をアミノ酸配列のための分折に進めた。クロマトグ
ラムから推定される蛋白質量は３９．１μｇであるが、
このうちＳＤＳゲル電気泳動で銀染色された見かけ上の
分子量約１７０００〜１９０００のＴＰＯ候補蛋白質の
量は、約１．６μｇであった。このサンプルにグリセロ
ールを添加し、遠心エバポレーションで濃縮し、５μｌ
のグリセロール溶液とした。これに還元剤を含まないＳ
ＤＳ電気泳動サンプルバッファー、及びｐＨを調整する
ために１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８を加え、最終的
に、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，１．１％ＳＤ
Ｓ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２％ ＢＰＢ，３０％グ
リセロールを含む約２５μｌのサンプルにした。このサ
ンプルを過度に加熱することなく十分にＳＤＳ化するた
めに、まず室温に１４時間置き、次に６０℃で５分処理
した。 （２）電気泳動 常法に従って、マイクロスラブゲル（４．０％アクリル
アミド濃縮ゲル、１５％アクリルアミド分離ゲル）を調
製し、ＳＤＳゲル電気泳動を室温下で１２．５ｍＡ、次
いで１７．５ｍＡの一定電流にて２時間かけて実施し
た。分子量マーカーには、プレステインド・ローレンジ
マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社 １６１−０３０５）、
及びＤＰＣＩＩＩマーカーを用いた。泳動終了後直ちＰ
ＶＤＦ膜に転写した（次項）。また、分析に付したサン
プルの一部を、非還元のまま、及びジチオスレイトール
（ＤＴＴ）で還元化し、１５〜２５％ポリアクリルアミ
ドプレキャストゲル（第一化学薬品社製；マルチゲル１
５／２５、カタログ番号２１１０７２）で電気泳動し
た。これを銀染色キットを用いて銀染色したところ、Ｔ
ＰＯと期待されたバンドは、還元下において分子量約１
９０００であり、Ｃａｐｃｅｌｌ ＰａｋＣｌ ３００
ＡカラムでのＴＰＯ活性画分中のＴＰＯ候補蛋白質の純
度が、数％程度であることが確認できた。また非還元・
還元それぞれの移動度が異なるため、分子内部に少なく
とも一つ以上のＳ−Ｓ結合を持つことが示唆された。 （３）ＰＶＤＦ膜へのエレクトロブロット法による転写
・バンドの検出 セミドライ転写装置（マリソル社製、ウエットフォー転
写装置モデルＫＳ−８４６０）を用いて、常法に従い、
１６０ｍＡ（１１〜１７Ｖ）の一定電流で１時間かけて
ＰＶＤＦ膜（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｏＢ
ｌｏｔｔ、カタログ番号４００９９４）に転写を行っ
た。陽極液に、０．３Ｍ Ｔｒｉｓ，２０％メタノー
ル，ｐＨ１０．４、転写膜液に、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−
２０％メタノール，ｐＨ１０．４、陰極液に、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ，４０ｍＭ アミノカプロン酸，２０％メタ
ノール，ｐＨ１０．４を用いた。転写された膜をポンソ
ーＳ染色液（１００ｍｌ中０．１ｇのポンソーＳと１ｍ
ｌの酢酸を含む）で染色したところ、複数のバンドが染
色され、この中にＴＰＯと期待された分子量約１９００
０のバンドを確認することができた。これを切り出し、
ペプチドの断片化に進めた。（次項） （４）ペプチドフラグメント化とペプチドマッピング・
アミノ酸配列分析 ＰＶＤＦ膜上に転写・還元Ｓ−アルキル化されたＴＰＯ
候補蛋白質の断片化を系統的に行うために、次の三つの
プロテアーゼにより、段階的に限定的酵素分解を行っ
た。 一次消化 リシルエンドペプチダーゼ（Ａｃｈｒｏｍｂ
ａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ ｍ４９７−１、和光純薬
工業製、カタログ番号１２９−０２５４１） 二次消化 エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ベーリン
ガー・マンハイム社製、カタログ番号１０５４ ５８
９） 三次消化 トリプシン−ＴＰＣＫ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔ
ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製、カタログ番号３
７４０） 各々の酵素消化で得られたペプチド断片を回収し、展開
溶媒Ａに０．０５％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに０．０２％Ｔ
ＦＡを含むイソプロパノール：アセトニトリル＝７：３
の混液を用いて、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ Ｃ
１８ 逆相カラム（和光純薬工業製；直径２．０ｍｍ、
長さ１５０ｍｍ）で、カラム温度３０℃、流速０．２５
ｍｌ／分、１％Ｂから５０％Ｂを３０分の直線濃度勾配
にて展開することによりマッピング（図４）し、得られ
たペプチドフラグメントを回収した。それぞれのペプチ
ドフラグメントを気相アミノ酸シークエンサー（島津製
作所製、ＰＰＳＱ−２）にてエドマン分解後、順次回収
されたＮ末端のＰＴＨアミノ酸を、アイソクラティック
溶出法によるＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーにて
同定を行った。この結果を次にまとめた。 一次消化 リシルエンドペプチダーゼによるペプチド断
片のアミノ酸配列 フラグメント名 アミノ酸配列
をそれぞれ次の精製ステップに進めた。以下（８）〜
（１１）に低分子ＴＰＯ標品Ｆ３の精製の各ステップに
ついて述べる。 （８）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ＜逆相
クロマトグラフィー＞ （７）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３（総蛋白質量５
０．３ｍｇ，蛋白濃度０．１８４ｍｇ／ｍｌ，相対活性
２００００，相対活性量１００７０００、総体積２７４
ｍｌ）に展開溶媒Ａ（０．０２５％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ））および展開溶媒Ｂ（０．０２５％ ＴＦＡ
を含む１−プロパノール）を加え、最終体積５０８．６
３ｍｌ、最終プロパノール濃度約２０％、ＴＦＡ濃度
０．０１２％、蛋白濃度０．０９８９ｍｇ／ｍｌに調製
した。ここで不溶物の発生があったので、これを遠心
し、上清のみを２５４．３ｍｌ（２５．２ｍｇ）ずつ２
回に分けて、予め３０％Ｂで平衡化してあったＹＭＣ−
Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社、カタログ
番号Ａ−ＰＲＲＰ−３３−０３−１５；直径 ３ｃｍ、
ベッド高 ７．５ｃｍ）カラムに流速２ｍｌ／ｍｉｎで
添加した。沈殿物は５ｍＭのＣＨＡＰＳ（３−［（３−
コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパ
ンスルフォナート；同仁化学研究所製、カタログ番号７
５６２１−０３−３）を含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、
ｐＨ５．５を２０ｍｌ加えて可溶化し、合わせてカラム
に送り込んだ。サンプルを添加した後、約５０ｍｌの溶
媒（展開溶媒Ａ：展開溶媒Ｂ＝３：１）を通液し、まず
素通り画分を集めた。次に展開プログラム（１２０分の
３０％Ｂ〜４５％Ｂの直線濃度勾配）を開始して、１０
ｍｌずつ合計３６本のフラクションをポリプロピレン製
チューブに集め取った。これを繰り返して同じチューブ
に集めたため、最終的に２０ｍｌずつ、合計３６本フラ
クションとなった。素通り画分はそのまま限外濾過ユニ
ット（アミコン社製；ＹＭ ３膜、直径７６ｍｍ）で２
０ｍｌまで濃縮した。素通り画分及びチューブ番号１〜
３６の各２０ｍｌのフラクションより０．１ｍｌ取り、
２０μｌの５％ ＢＳＡを添加後遠心エバポレーション
で乾固し、最終的に０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培
養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定
した。この結果、チューブ番号１７〜２７（プロパノー
ル濃度で３６．０〜４３．０％の範囲）にＴＰＯの活性
があり、これを低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−Ｐ
ａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２と
した。次のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰに進める直前
まで−８５℃で保存した。 低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯ
ＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２ 総体積 ２２０ｍｌ 蛋白濃度 ０．０１３０ｍｇ／ｍｌ 総蛋白質量 ２．８５ｍｇ 相対活性 １３００００ 相対活性量 ３７１０００ （９）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰ＜逆相クロマトグ
ラフィー＞ （８）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−
Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２
のうち２１４．９ｍｌ（総蛋白質量２．７９ｍｇ，蛋白
濃度０．０１３０ｍｇ／ｍｌ，相対活性１３００００，
相対活性量３６３００）に、５０％グリセロールを０．
６ｍｌ加え、１．８ｍｌまで濃縮した。最終的に体積５
ｍｌで、プロパノール濃度は２０％以下、グリセロール
は約６％であった。これを５回（各回の注入蛋白質量
０．５５５ｍｇ，体積１ｍｌ）に分けて実施した。毎回
ごとに、展開溶媒Ａに０．１％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに
０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用い、１５
％Ｂで平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰ（ＹＭ
Ｃ社製、カタログ番号ＡＰ−５１３；直径 ６ｍｍ、ベ
ッド高２５０ｍｍ）カラムに、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ
で注入した。注入終了後、１５％Ｂから２５％Ｂにプロ
パノール濃度を上げ、さらに２５％Ｂから５０％Ｂまで
６５分の直線濃度勾配で展開した。最後の回に、蛋白を
含まない同じ組成の溶液１ｍｌを注入、展開し、カラム
内に残存するＴＰＯ活性の回収を行った。合計６回分同
じポリプロピレン製チューブに集めたため、各フラクシ
ョンは、７．２ｍｌずつ４４本となった。このうち３０
μｌ（２４０分の１フラクション）を取り２０μｌの５
％ＢＳＡを加え、遠心エバポレーションで乾固し、最終
的に０．２４ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に溶解し、
アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結
果、チューブ番号２８〜３３（プロパノール濃度で３
７．０〜４２．０％の範囲）に強いＴＰＯの活性があっ
たため、これを低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来ＹＭＣ−Ｐａ
ｃｋ ＣＮ−ＡＰのメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとし
た。 低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−
ＡＰのＴＰＯ活性画分ＦＡ 総体積 ４３．２０ｍｌ 蛋白濃度 ０．００８６３ｍｇ／ｍｌ 総蛋白質量 ０．３７３ｍｇ 相対活性 ８０００００ 相対活性量 ２９８４００ （１０）Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃｌ ３００Ａ＜最
終の逆相クロマトグラフィー＞ （９）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＴＰＯ活
性画分ＦＡ４３．２０ｍｌのうち４３．１２ｍｌ（総蛋
白質量０．３７２ｍｇ，蛋白濃度０．００８６３ｍｇ／
ｍｌ，相対活性８０００００，相対活性量２９７６０
０）に、０．２ｍｌの５０％グリセロールを加え、０．
１ｍｌのグリセロール溶液となるまで濃縮した。これに
展開溶媒Ａ（０．１％ ＴＦＡ）：展開溶媒Ｂ（０．０
５％ＴＦＡを含む１−プロパノール）＝８５：１５（１
５％Ｂ）の溶液２ｍｌを加えて、最終的に、体積２．１
ｍｌ、プロパノール濃度が約１４％、グリセロールが約
４．８％、蛋白濃度０．１７７ｍｇ／ｍｌのサンプルに
調製した。これを１５％Ｂで平衡化したＣａｐｃｅｌｌ
Ｐａｋ Ｃｌ ３００Ａ（資生堂製、カタログ番号Ｃ
１ＴＹＰＥ：ＳＧ３００Ａ；直径 ４．６ｍｍ、ベッド
高 ２５０ｍｍ）カラムに注入し、２７％Ｂから３８％
Ｂまで６５分の直線濃度勾配で流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ
で展開し、ポリプロピレン製チューブ７２本に０．６ｍ
ｌずつ集めた。各フラクションから、３μｌ（２００分
の１フラクション）を取り２０μｌの５％ＢＳＡを加
え、最終的に２２５μｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に置
換し、オリジナル体積から７５倍希釈したものをアッセ
イにかけた。各フラクションから、電気泳動のために１
μｌ（６００分の１フラクション）を取り、遠心エバポ
レーションし、還元剤を含まないＳＤＳゲル電気泳動サ
ンプルバッファーを１０μｌ加え、９５℃で５分処理し
た。これを１５−２５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドプ
レキャストゲル（第一化学薬品社製）を用いてＳＤＳゲ
ル電気泳動し、２Ｄ−銀染色試薬・「第一」銀染色キッ
ト（第一化学薬品社製、カタログ番号１６７９９７、以
下「銀染色キット」と言う）で染色した。分子量マーカ
ーには「第一」・ＩＩＩ低分子量マーカー（第一化学薬
品社製、カタログ番号１８１０６１、以下「ＤＰＣＩＩ
Ｉ」と言う）を用いた。以上の分析の結果、チューブ番
号３５〜４３（プロパノール濃度で３０．０〜３２．５
％の範囲）に明らかにＴＰＯの活性があった。このうち
チューブ番号３６〜４２（プロパノール濃度で３０．５
〜３２．０％の範囲）をメインのＴＰＯ活性画分ＦＡと
した。以上の結果を図２に示した。蛋白質量をクロマト
グラムから推定し、アッセイの結果と合わせて評価する
と、総蛋白質量３９．６μｇ，蛋白濃度９．４μｇ／ｍ
ｌ，相対活性４８９００００，相対活性量１９３６００
となった。ＴＰＯ活性画分チューブ番号３６〜４２のＳ
ＤＳゲル電気泳動像を調べてみると、活性の強さと、染
色された濃さが相関するバンドが存在することが明らか
となった。しかもこのバンドの分子量は、見かけ上、即
ち還元状態での標準分子量蛋白に対し、１７０００〜１
９０００の位置にあり、ＴＰＯの候補となる有力なバン
ドであることがわかった。 （１１）電気泳動ゲルからのＴＰＯ活性の抽出＜１５％
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動＞ＴＰＯ活性画分ＦＡの分析例 （１０）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＴＰＯ
活性画分ＦＡ ４２００μｌ（総蛋白質量３９．６μ
ｇ，蛋白濃度９．４μｇ／ｍｌ，相対活性４８９０００
０，相対活性量１９３６００）の内、５．５μｌ（７６
４分の１フラクション）を活性抽出のため、２．５μｌ
（１６８０分の１フラクション）を銀染色のためにそれ
ぞれサンプルチューブに取り、遠心エバポレーション
し、還元剤不含のＳＤＳゲル電気泳動サンプルバッファ
ー１０μｌを加え、３７℃１時間処理後、室温で１８時
間放置することによりＳＤＳ化した。分子量マーカーに
は、プレステインド・ローレンジマーカー（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ社１６１−０３０５）、及びＤＰＣＩＩＩマーカー
を用いた。これらのサンプルを常法（Ｌａｅｍｍｌｉ、
Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０−６８５頁、（１９７
０））に従って、マイクロスラブゲルを用いた１５％Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を４℃にて実施し
た。泳動終了後、直ちに銀染色に付す部分をナイフで切
断し固定液に入れ、銀染色キットを用いて銀染色した。
一方、活性を切り出すべき部分を、分子量の全域に渡っ
て、ナイフを用いて幅１．５〜２．５ｍｍの３４本のゲ
ルにスライスし、小林の方法（小林幹彦、生化学、第５
９巻、第９号（１９８７））を改良した方法でゲルの破
砕を行った。微細な断片に破砕されたゲルに各々０．３
ｍｌの抽出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ８，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ＢＳＡ）を
加え、４℃で６時間振とうし、抽出を行った。次に最終
濃度２０ｍＭの５００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．８
を加え、４℃で１時間振とうし、沈殿したＳＤＳを除く
ためウルトラフリーＣ３ＧＶ０．２２μｍフィルター付
濾過ユニット（ミリポア社製、型番ＵＦＣ３ ＯＧＶ
ＯＳ）に移し、１０００ｘｇ（４０００ＲＰＭ）で１５
分間遠心し、濾液を回収した。これをウルトラフリーＣ
３−ＬＧＣ分子量１００００カット限外濾過ユニット
（ミリポア社製、型番ＵＦＣ３ ＬＧＣ ００）に移し
３０００ｘｇ（７０００ＲＰＭ）で遠心した。濃縮液が
約５０μｌに達した時点で、３００μｌの２０ｍＭＮａ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２のバッファーを加
え、再び限外濾過を行った。これを２回繰り返し、残存
するＳＤＳを除去した。さらにアッセイ培養液に対し同
様な操作を繰り返し、最終的に３００μｌに調製した。
これを滅菌し、ＴＰＯ活性を測定した。このような実験
の結果、銀染色で明瞭に検出できた蛋白質は、ＤＰＣＩ
ＩＩマーカーに対し、見かけ上の分子量約１７０００〜
１９０００、１４０００、１１０００の３種であった。
Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＣｌカラムのＴＰＯ活性画分
の電気泳動で、活性の強さと、染色されたバンドの濃さ
が相関する見かけ上の分子量が約１７０００〜１９００
０のバンドが観察できたが、本実験においてもＴＰＯ活
性が検出された見かけ上の分子量は約１７０００〜１９
０００であった。以上の結果を図３に示した。以上の結
果、ＴＰＯ活性を示す蛋白質は、最終的に電気泳動ゲル
上で確認可能なまでにＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃｌ
３００Ａカラムの活性画分中に精製されたと確認でき
た。このサンプルを１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（非還元下）して銀染色されたバンドの濃さ
から、全ＴＰＯ活性画分中の見かけ上の分子量約１７０
００〜１９０００のＴＰＯ候補蛋白質の量は、約１．７
μｇであった。以下（１２）〜（１５）に高分子ＴＰＯ
標品Ｆ２の精製の各ステップについて述べる。 （１２）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ＜逆
相クロマトグラフィー＞ （７）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２（総蛋白質量２
５７ｍｇ，蛋白濃度０．８９４ｍｇ／ｍｌ，相対活性７
８４０，相対活性量２０１５０００、総体積２８７ｍ
ｌ）に展開溶媒Ａ（０．０２５％ ＴＦＡ）およびサン
プルの３分の１容の９５．８ｍｌの展開溶媒Ｂ（０．０
２５％ＴＦＡを含む１−プロパノール）を加え、最終体
積３８３ｍｌ、最終プロパノール濃度約２５％、ＴＦＡ
濃度０．００６％、蛋白濃度０．６７１ｍｇ／ｍｌとし
た。ここで不溶物の発生があったので、遠心後の上清の
みを６２．３ｍｌ（４２．８ｍｇ）ずつ６回に分けて、
予め３０％Ｂで平衡化してあったＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐ
ＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社製、カタログ番号Ａ−Ｐ
ＲＲＰ−３３−０３−１５；直径 ３ｃｍ、ベッド高
７．５ｃｍ）カラムに流速２ｍｌ／ｍｉｎで注入した。
沈殿物は５ｍＭのＣＨＡＰＳを含む２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ５．５を１０ｍｌ加えて可溶化できたので、
合わせてカラムに送り込んだ。それぞれサンプルを注入
した後、約５０ｍｌの溶媒（展開溶媒Ａ：展開溶媒Ｂ＝
３：１）を通液し、素通り画分を集めた後、展開プログ
ラム（１２０分の３０％Ｂから４５％Ｂの直線濃度勾
配）を開始し、１５ｍｌずつ合計２４本のフラクション
をポリプロピレン製チューブに集め取った。１回目から
６回目まで同じ様に繰り返し、最終的に９０ｍｌずつの
フラクションが２４本となった。素通り画分とチューブ
番号１はそのまま限外濾過ユニット（アミコン社製；Ｙ
Ｍ ３膜、直径７６ｍｍ）で９０ｍｌまで濃縮した。素
通りを含むチューブ番号１から２４までのフラクション
より０．３ｍｌ取り、１０μｌの５％ＢＳＡを添加後遠
心エバポレーションで乾固し、最終的に０．３ｍｌのＩ
ＭＤＭアッセイ培養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰ
Ｏ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号１０〜
１５（プロパノール濃度で３４．０〜３９．５％の範
囲）にＴＰＯの活性があり、これを高分子ＴＰＯ標品Ｆ
２由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴ
ＰＯ活性画分Ｆ２とした。次のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ
−ＡＰに進める直前まで、−８５℃で保存した。高分子
ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩ
Ｎ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２ 総体積 ５４０ｍｌ 蛋白濃度 ０．０２１ｍｇ／ｍｌ 総蛋白質量 １１．４ｍｇ 相対活性 ２２７０００ 相対活性量 ２５８８０００ （１３）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ＜ＣＨＡＰＳ存
在下でのゲル濾過クロマトグラフィー＞ （１２）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ
−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ
２のうち、５３８．２ｍｌ（総蛋白質量１１．３ｍｇ，
蛋白濃度０，０２１ｍｇ／ｍｌ，相対活性２２７００
０，相対活性量２５６５０００）に５０％グリセロール
を０．６ｍｌ添加後、遠心エバポレーション濃縮した。
次に、６ｍｌの２０ｍＭ ＣＨＡＰＳを加えた。さら
に、１８ｍｌの２０ｍＭ ＣＨＡＰＳを加え攪拌し、４
℃に移し、４１時間後に最初のサンプルをＨｉＬｏａｄ
２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ（ファルマシ
ア バイオテク社製、カタログ番号１７−１０７０−０
１；直径 ２．６ｃｍ、ベッド高 ６０ｃｍ）カラムに
注入し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、５ｍＭ ＣＨＡＰＳを
含むＤＰＢＳで展開した。一回に４ｍｌ（蛋白濃度０．
４６６ｍｇ／ｍｌ，蛋白質量１．８６ｍｇ）のサンプル
をカラムに注入した。６回目に分けてカラムで展開し、
全てのＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰ
Ｏ活性画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇカラムで分
取した。フラクションは５ｍｌずつ６回分、即ち合計３
０ｍｌのフラクションが４５本となった。それぞれのフ
ラクションより０．１ｍｌ取り、１０μｌの５％ ＢＳ
Ａを添加後、遠心エバポレーションで乾固し、最終的に
０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に溶解し、アッ
セイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チ
ューブ番号１３〜３１（分子量で７８０００〜３０００
の範囲）にＴＰＯの活性があったため、これを高分子Ｔ
ＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇのＴ
ＰＯ活性画分Ｆ２とした。 高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５
ｐｇのＴＰＯ活性画分Ｆ２ 総体積 ５４０ｍｌ 蛋白濃度 ０．００２１６ｍｇ／ｍｌ 総蛋白質量 １．１７ｍｇ 相対活性 １７５００００ 相対活性量 ２０４１０００ （１４）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰ＜逆相クロマト
グラフィー＞ （１３）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐ
ｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇのＴＰＯ活性画分Ｆ２（分子量
７８０００〜３０００）５４０ｍｌのうち、５１３．２
ｍｌ（総蛋白質量１．１１ｍｇ，蛋白濃度０．００２１
６ｍｇ／ｍｌ，相対活性１７５００００，相対活性量１
９４３０００）に１０分の１容の展開液Ｂ（０．０５％
ＴＦＡを含む１−プロパノール）を加えた後、展開溶
媒Ａ（０．１％ ＴＦＡ）と展開液Ｂを用いて１５％Ｂ
で平衡化したＹＭＣ−ＰａｃｋＣＮ−ＡＰ（ＹＭＣ社
製、カタログ番号ＡＰ−５１３；直径 ６ｍｍ、ベッド
高２５０ｍｍ）カラムに、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで注
入した。注入終了後、１５％Ｂから２５％Ｂにプロパノ
ール濃度を上げ、さらに２５％Ｂから５０％Ｂまでの６
５分の直線濃度勾配で展開した。ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ
Ｎ−ＡＰカラムに進めるにあたり、全インプットサンプ
ルの２０分の１をまずパイロット的に進め、活性が良好
に回収できることを確認できた。そこで、残りの２０分
の１９を２回に分けて分取した。つまり合計３回の展開
をおこなった。計３回分で分取された各フラクションを
同じポリプロピレン製チューブ４４本に集めたので、合
計３，６ｍｌずつとなった。このうち５μｌ（７２０分
の１フラクション）を取り、最終的に０．２５ｍｌのＩ
ＭＤＭアッセイ培養液に置換した。アッセイの結果、チ
ューブ番号２４〜３０（プロパノール濃度で３６．０〜
４２．０％の範囲）に極めて強いＴＰＯの活性があった
ため、これを高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ−Ｐａ
ｃｋ ＣＮ−ＡＰのメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとし
た。 高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５
ｐｇのＴＰＯ活性画分ＦＡ 総体積 ２５．２０ｍｌ 蛋白濃度 ０．０２４６ｍｇ／ｍｌ 総蛋白質量 ０．６２０ｍｇ 相対活性 ７０００００ 相対活性量 ４３４０００ （１５）Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃｌ ３００Ａ＜最
終の逆相クロマトグラフィー＞ （１４）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ
−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰのＴＰＯ活性画分ＦＡ２５．２
０ｍｌのうち、２４．６６ｍｌ（総蛋白質量０．６０６
ｍｇ，蛋白濃度０．０２４６ｍｇ／ｍｌ，相対活性７０
００００，相対活性量４２４０００）に、０．４ｍｌの
５０％グリセロールを加え、遠心エバポレーションで濃
縮した。最終的に、プロパノール濃度は数％、グリセロ
ールは１０％、蛋白濃度０．３０３ｍｇ／ｍｌの２ｍｌ
のサンプルとなった。展開溶媒Ａ（０．１％ ＴＦ
Ａ）、展開溶媒Ｂ（０．０５％ ＴＦＡを含む１−プロ
パノール）を用いて、１５％Ｂで平衡化したＣａｐｃｅ
ｌｌ Ｐａｋ Ｃｌ３００Ａ（資生堂 カタログ番号Ｃ
ｌ ＴＹＰＥ：ＳＧ３００Ａ；直径 ４．６ｍｍ、ベッ
ド高 ２５０ｍｍ）カラムに注入し、２７％Ｂから３８
％Ｂまで６５分の直線濃度勾配で流速０．４ｍｌ／ｍｉ
ｎで展開し、ポリプロピレン製チューブ７２本に０．６
ｍｌずつ集めた。各フラクションから、０．７５μｌ
（８００分の１フラクション）を取り、２０μｌの５％
ＢＳＡ を加え、最終的に２２５μｌのＩＭＤＭアッセ
イ培養液に置換し、オリジナル体積から３００倍希釈し
たものをアッセイにかけた。各フラクションから、電気
泳動のために２μｌ（３００分の１フラクション）を取
り、遠心エバポレーションし、１０μｌの還元剤を含ま
ないＳＤＳ電気泳動サンプルバッファーを加え、９５℃
で５分処理した。これを１５〜２５％ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドプレキャストゲル（第一化学薬品製）を用い
てＳＤＳゲル電気泳動し、銀染色キットで染色した。分
子量マーカーにはＤＰＣＩＩＩマーカーを用いた。以上
の分析の結果、チューブ番号３３〜３９（プロパノール
濃度で２９．５〜３１．５％の範囲）に明らかにＴＰＯ
の活性があった。このうち、チューブ番号３４〜３９
（プロパノール濃度で３０．０〜３１．５％の範囲）を
メインのＴＰＯ活性画分ＦＡとした。メインのＴＰＯ活
性画分のＳＤＳゲル電気泳動像を調べてみると、（１
０）に述べた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３から出発したものと
同じく見かけ上１７０００〜２２０００の分子量範囲
に、活性の強さと、染色された濃さが相関するバンドが
存在することが明らかとなった。 ＜実施例２＞ ラット精製ＴＰＯの部分アミノ酸配列の分析 岩松の方法（岩松ら、新基礎生化学実験法、第４巻、３
３〜８４頁（丸善刊）；岩松明彦、生化学、第６３巻、
第２号、１３９−１４３頁、（１９９１）；Ａｋｉｈｉ
ｒｏ Ｉｗａｍａｓｔｕ、Ｅｌｅｃｔｏｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ、第１３巻、１４２−１４７頁、（１９９２））
により、実施例１の（１０）で得られたＣａｐｃｅｌｌ
Ｐａｋ Ｃｌ ３００ＡカラムのＴＰＯ画分ＦＡ中の
ラットＴＰＯ候補タンパク質のアミノ酸配列の分析を行
った。即ち、サンプルをＳＤＳゲル電気泳動し、電気的
にポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写し
た。次いで、ＰＶＤＦ膜上の蛋白質を還元Ｓ−アルキル
化した後、系統的、段階的に３種のプロテアーゼで限定
酵素分解し、ペプチドフラグメント化し、これを逆相ク
ロマトグラフィーで分離精製し、得られたペプチドを高
感度アミノ酸配列決定法により分析した。以下にその詳
細を述べる。低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ
Ｃｌ ３００ＡのＴＰＯ画分ＦＡのＴＰＯ候補蛋白質の
分析例 （１）Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃｌ ３００Ａカラム
のＴＰＯ画分ＦＡ（チューブ番号３６〜４２）の濃縮 実施例１の（１０）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由
来の、ＣａｐｃｅｌｌＰａｋ Ｃｌ３００ＡカラムのＴ
ＰＯ活性画分ＦＡ（チューブ番号３６〜４２）４２００
μｌ（総蛋白質量３９．６μｇ，蛋白濃度９．４μｇ／
ｍｌ，相対活性４８９００００，相対活性量１９３６０
０）のうち、４１５１μｌ（全フラクションの９８．８
％）をアミノ酸配列のための分折に進めた。クロマトグ
ラムから推定される蛋白質量は３９．１μｇであるが、
このうちＳＤＳゲル電気泳動で銀染色された見かけ上の
分子量約１７０００〜１９０００のＴＰＯ候補蛋白質の
量は、約１．６μｇであった。このサンプルにグリセロ
ールを添加し、遠心エバポレーションで濃縮し、５μｌ
のグリセロール溶液とした。これに還元剤を含まないＳ
ＤＳ電気泳動サンプルバッファー、及びｐＨを調整する
ために１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８を加え、最終的
に、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，１．１％ＳＤ
Ｓ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２％ ＢＰＢ，３０％グ
リセロールを含む約２５μｌのサンプルにした。このサ
ンプルを過度に加熱することなく十分にＳＤＳ化するた
めに、まず室温に１４時間置き、次に６０℃で５分処理
した。 （２）電気泳動 常法に従って、マイクロスラブゲル（４．０％アクリル
アミド濃縮ゲル、１５％アクリルアミド分離ゲル）を調
製し、ＳＤＳゲル電気泳動を室温下で１２．５ｍＡ、次
いで１７．５ｍＡの一定電流にて２時間かけて実施し
た。分子量マーカーには、プレステインド・ローレンジ
マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社 １６１−０３０５）、
及びＤＰＣＩＩＩマーカーを用いた。泳動終了後直ちＰ
ＶＤＦ膜に転写した（次項）。また、分析に付したサン
プルの一部を、非還元のまま、及びジチオスレイトール
（ＤＴＴ）で還元化し、１５〜２５％ポリアクリルアミ
ドプレキャストゲル（第一化学薬品社製；マルチゲル１
５／２５、カタログ番号２１１０７２）で電気泳動し
た。これを銀染色キットを用いて銀染色したところ、Ｔ
ＰＯと期待されたバンドは、還元下において分子量約１
９０００であり、Ｃａｐｃｅｌｌ ＰａｋＣｌ ３００
ＡカラムでのＴＰＯ活性画分中のＴＰＯ候補蛋白質の純
度が、数％程度であることが確認できた。また非還元・
還元それぞれの移動度が異なるため、分子内部に少なく
とも一つ以上のＳ−Ｓ結合を持つことが示唆された。 （３）ＰＶＤＦ膜へのエレクトロブロット法による転写
・バンドの検出 セミドライ転写装置（マリソル社製、ウエットフォー転
写装置モデルＫＳ−８４６０）を用いて、常法に従い、
１６０ｍＡ（１１〜１７Ｖ）の一定電流で１時間かけて
ＰＶＤＦ膜（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｏＢ
ｌｏｔｔ、カタログ番号４００９９４）に転写を行っ
た。陽極液に、０．３Ｍ Ｔｒｉｓ，２０％メタノー
ル，ｐＨ１０．４、転写膜液に、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−
２０％メタノール，ｐＨ１０．４、陰極液に、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ，４０ｍＭ アミノカプロン酸，２０％メタ
ノール，ｐＨ１０．４を用いた。転写された膜をポンソ
ーＳ染色液（１００ｍｌ中０．１ｇのポンソーＳと１ｍ
ｌの酢酸を含む）で染色したところ、複数のバンドが染
色され、この中にＴＰＯと期待された分子量約１９００
０のバンドを確認することができた。これを切り出し、
ペプチドの断片化に進めた。（次項） （４）ペプチドフラグメント化とペプチドマッピング・
アミノ酸配列分析 ＰＶＤＦ膜上に転写・還元Ｓ−アルキル化されたＴＰＯ
候補蛋白質の断片化を系統的に行うために、次の三つの
プロテアーゼにより、段階的に限定的酵素分解を行っ
た。 一次消化 リシルエンドペプチダーゼ（Ａｃｈｒｏｍｂ
ａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ ｍ４９７−１、和光純薬
工業製、カタログ番号１２９−０２５４１） 二次消化 エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ベーリン
ガー・マンハイム社製、カタログ番号１０５４ ５８
９） 三次消化 トリプシン−ＴＰＣＫ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔ
ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製、カタログ番号３
７４０） 各々の酵素消化で得られたペプチド断片を回収し、展開
溶媒Ａに０．０５％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに０．０２％Ｔ
ＦＡを含むイソプロパノール：アセトニトリル＝７：３
の混液を用いて、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ Ｃ
１８ 逆相カラム（和光純薬工業製；直径２．０ｍｍ、
長さ１５０ｍｍ）で、カラム温度３０℃、流速０．２５
ｍｌ／分、１％Ｂから５０％Ｂを３０分の直線濃度勾配
にて展開することによりマッピング（図４）し、得られ
たペプチドフラグメントを回収した。それぞれのペプチ
ドフラグメントを気相アミノ酸シークエンサー（島津製
作所製、ＰＰＳＱ−２）にてエドマン分解後、順次回収
されたＮ末端のＰＴＨアミノ酸を、アイソクラティック
溶出法によるＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーにて
同定を行った。この結果を次にまとめた。 一次消化 リシルエンドペプチダーゼによるペプチド断
片のアミノ酸配列 フラグメント名 アミノ酸配列
【表３】
【表４】
【表５】 以上の配列のうち、（）付きで示したものは、系統的酵
素消化から演繹推定しうるアミノ酸残基である。 （５）得られたアミノ酸配列の類似性分析＜ホモロジー
サーチ＞ 得られたアミノ酸配列が、すでに報告されている既知の
蛋白質に含まれているかどうか、あるいは、類似配列を
もつ蛋白質があるかどうかについて、配列解析ソフトウ
ェアであるマックベクター（Ｋｏｄａｋ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）を用いて分析した。既知蛋白質あるいは既知遺伝
子の情報は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｒｅｌｅａｓｅ ６データ
ベース（米国 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏ
ｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、１９９３年８月１５日発行）
を利用した。これに含まれる各種データベースは以下の
通りである。 この結果、ＡＰ１２の配列（Ｋ）ＤＳＦＬＡＤＶＫは、
ラットのＣｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎ
ｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＣＢＧ）ｐｒｅｃｕｒｓｏｆ
〔ＰＩＲデータベース登録番号 Ａ４００６６；ｓｍｉ
ｔｈ ａｎｄＨａｍｍｏｎｄ；“Ｒａｔ ｃｏｒｔｉｃ
ｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇｇｌｏｂｕｌｉｎ：
ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｓ
ｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌ
ｅｖｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅｌｉｖｅｒ ｕｎｄｅｒ ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎ
ｄｉｔｉｏｎｓ．”Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，
（１９８９），３，４２０−４２６，］の内部配列ＫＤ
ＳＦＬＡＤＶＫと完全一致した。さらによく調べてみる
と、ＡＰ３の配列（Ｋ）ＸＹＹＥＳＺ（（ＸはＡ、Ｓ、
Ｇ、Ｍ、Ｑのどれか）、（ＺはＥまたはＫ））と類似性
の高いＫＱＹＹＥＳＥという配列が、ラットＣＢＧのア
ミノ酸配列に含まれていることが判明した。これらのＡ
Ｐ１２、ＡＰ３に相当する配列はラットＣＢＧでは連続
しており、ＫＤＳＦＬＡＤＶＫＱＹＹＥＳＥという内部
アミノ酸配列に相当する。しかしながら、ＡＰ１２、Ａ
Ｐ３以外のフラグメントのアミノ酸配列に関しては、類
似性を考慮すべき既知の蛋白質や遺伝子は見つからなか
った。 ＜実施例３＞ 血小板減少症ラット血漿由来ＴＰＯの生物学的特性分析 （１） ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系（液体培養系）
において 代表例として、血小板減少症ラット血漿からのＴＰＯ部
分精製標品（実施例１の（８）に記載したＹＭＣ Ｐａ
ｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＰカラムＴＰＯ活性画分Ｆ
２）を用いた場合の用量反応曲線を図５に示した。培養
を経時的に顕微鏡下で観察したところ、日を追って巨核
球の分化、成熟の進行、即ち細胞サイズの増大が認めら
れ、おそらく、細胞の増加も起こっていることと思われ
た。特に顕著な変化として、培養最終日の４日目に数多
くの巨核球による突起形成が認められた（培養３日目で
はほとんど認められない）。この突起形成は、ｃｙｔｏ
ｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
（ＬｅｖｅｎとＹｅｅ、Ｂｌｏｏｄ、６９巻、１０４６
−１０５２頁、（１９８７））、あるいは、ｐｒｏｐｌ
ａｔｅｌｅｔ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
（Ｔｏｐｐら、Ｂｌｏｏｄ７、７６巻、９１２−９２４
頁、（１９９０））などと呼ばれ、巨核球からさらに分
化の進んだ血小板の前駆構造体であり、現在までのとこ
ろｉｎ ｖｉｔｒｏで観察できる巨核球分化の最終形態
と考えられている。ＴＰＯ標品単独でこのような形態変
化が高い頻度で認められたことから、本因子は単独でＣ
ＦＵ−ＭＫの増殖・分化を促進し、成熟巨核球を生成さ
せ、さらに最終的に血小板産生まで進行させる可能性が
考えられる。 （２） コロニーアッセイ系において 血小板減少症ラット血漿からのＴＰＯ部分精製標品につ
いて、ラットの非分離骨髄細胞、分離・濃縮各段階の細
胞、あるいはＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分
を用いたコロニーアッセイ系で検定したところ、ラット
血漿由来のＴＰＯは、巨核球コロニーを形成させた。Ｔ
ＰＯによって形成される巨核球コロニーと他の既知サイ
トカイン、即ち、ラットＩＬ−３、マウスＧＭ−ＣＳ
Ｆ、あるいはヒトＥＰＯによって形成される巨核球コロ
ニーを比較すると、ＴＰＯによって形成される巨核球コ
ロニーには、個々のコロニーを構成する巨核球数は少な
いが、各々の巨核球のサイズが大きい、即ち成熟度が進
んでいるという特徴がある。さらに、他の細胞系統のコ
ロニーはほとんど形成されず、ＴＰＯが示すＭｅｇ−Ｃ
ＳＦ活性は巨核球特異的な活性と考えられる。これらの
ことから、ＴＰＯは、本コロニーアッセイ系においてＭ
ｅｇ−ＣＳＦ活性を発揮する他の既知サイトカイン、即
ち、ラットＩＬ−３、マウスＧＭ−ＣＳＦ、あるいはヒ
トＥＰＯとは、生物学的特性を異にし、ユニークなＭｅ
ｇ−ＣＳＦ活性を発揮することが明白となった。ヒト骨
髄細胞、あるいはヒト臍帯血細胞由来のＣＤ３４＋ＤＲ
＋細胞画分に対しても血小板減少症ラット血漿からのＴ
ＰＯ部分精製標品はＭｅｇ−ＣＳＦ活性を示し、有意な
数のヒト巨核球コロニーを形成させた。このことは本因
子に種特異性のないことを示している。 ＜実施例４＞ ラットＴＰＯ産生細胞の特定化 （１） ラットＴＰＯ産生臓器の探索 まず、ラットＴＰＯの部分アミノ酸配列に基づくラット
ＴＰＯ遺伝子のクローニング、あるいは発現クローニン
グのためのｍＲＮＡ供給源を確保する目的で、ラットＴ
ＰＯ産生臓器の探索、特定化を行った。当初、Ｐ５５抗
体投与により血小板減少症にしたラットから経時的に骨
髄、肺、肝臓、脾臓を摘出し、その細胞（肺、肝臓の場
合は臓器切片）の培養上清を採取し、ラットＣＦＵ−Ｍ
Ｋアッセイ系にて上清中の活性を評価したが、明確な結
果は得られなかった。続いて、ラットにおける肝臓とＴ
ＰＯ産生との関連性を示唆する報告（Ｓｉｅｍｅｎｓｍ
ａら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、８６巻、８１
７−８３３頁、（１９７５））を考慮して、Ｐ５５抗体
投与により血小板減少症にしたラットの肝臓からコラゲ
ナーゼかん流法にて調製した肝細胞を培養し、その上清
からＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅカラムに吸着した画分をＶ
ｙｄａｃ ｐｈｅｎｙｌ逆相カラムに展開したところ、
ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にてラット血漿由来ＴＰ
Ｏ活性と同じ位置に極めて類似した活性が認められた。
正常ラット肝細胞の培養上清からも弱いながらも活性が
認められた。これらの結果から、肝臓がＴＰＯ産生臓器
の１つである可能性が強く示唆された。 （２） ラットＴＰＯ産生細胞株のスクリーニング 上記の結果を基に、ラットＴＰＯ産生細胞株のスクリー
ニングを行った。まず、２０種類のラット肝臓由来細胞
株をそれぞれの継代培養用の培養液中でほぼコンフルエ
ントになるまで培養した後、培養液に含まれる血清を５
％ＦＣＳに統一したそれぞれの培養液で置換して、さら
に３日間培養を継続し、それぞれの培養上清を採取し
た。その上清を（１）に記した方法で部分精製して、Ｔ
ＰＯ産生の有無を調べたところ、３種類のラット肝実質
細胞由来細胞株、即ち、ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞（Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１６０２、Ｂｅｃｋｅｒら、“Ｏ
ｎｃｏｄｅｖｅｌｏｔｅｎｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ”ｅｄ．ｂｙＦｉｓｈｍａｎ ａｎｄ ｓ
ｅｌｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ．、ＮＹ、２５９
−２７１頁、（１９７６）、大日本製薬より購入）、Ｈ
４−ＩＩ−Ｅ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１５４８、
Ｐｉｔｏｔら、Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．Ｍｏ
ｎｏｇｒ．、１３巻、２２９−２４５頁、（１９６
４）、大日本製薬より購入）、およびＨＴＣ細胞（Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、５６巻、２９６−３０３頁、（１９６
６）、大日本製薬より購入）から明らかにＴＰＯ活性の
産生が確認された。 （３） ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細
胞、およびＨＴＣ細胞が産生するＴＰＯ活性の詳細な分
析 これらの３種類のラット細胞株から分泌されるＴＰＯ活
性と平行して精製を進めていたラット血漿由来のＴＰＯ
活性を、生化学的性質と生物学的性質の両面からさらに
詳細に比較検討した。ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞を１０
％ＦＣＳを含むａｌｐｈａ−ＭＥＭ（−）培養液に浮遊
させて、底面積１７５ｃｍ２の組織培養用培養プラステ
ィックフラスコに１×１０６個／フラスコになるように
入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で３日間培養し
た後、５％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液に置き換え、さ
らに３日間培養し、上清を回収した。Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細
胞を１０％ＦＣＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌ
ｅ培養液（グルコース４．５ｇ／ｌ含有）（以下、ＤＭ
ＥＭ培養液）に浮遊させて、底面積１７５ｃｍ２の組織
培養用プラスティックフラスコに５×１０５個／フラス
コになるように入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃
で３日間培養した後、５％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液
に置き換え、さらに３日間培養し、上清を回収した。ま
た、ＨＴＣ細胞を５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養液に浮
遊させて、底面積１７５ｃｍ２の組織培養用プラスティ
ックフラスコに２．５×１０５個／フラスコになるよう
に入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で３日間培養
した後、５％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液に置き換え、
さらに３日間培養し、上清を回収した。このようにして
得た３種類の細胞株の培養上清それぞれ２リットルか
ら、実施例１−２に記載したＸＲＰからのＴＰＯの精製
法に従って、細胞株由来ＴＰＯの部分精製を行った。以
下に概略を述べる。まず、限外濾過器により培養上清を
約６倍に濃縮した後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム
で２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にバッ
ファー交換した。溶出液をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ
Ｆカラムに添加し、２０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）で洗滌後、吸着画分を１７５ ｍＭ ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶
出した。この画分をＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅカラムに添
加し、ＰＢＳで洗った後、吸着画分を０．２ ＭＧｌｃ
ＮＡｃと０．１５ Ｍ ＮａＣｌを含む２０ ｍＭ Ｎ
ａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．２）により溶出し
た。この溶出液をＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６
５０ＭＨカラムに添加し、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０
ｍＭ ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．２）で洗った
後、２Ｍ ＮａＳＣＮにより溶出した。これをＰｈｅｎ
ｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ／ＬＳカラムに添
加し、１．５Ｍ硫酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ
Ｓｕｌｆａｔｅ）を含む５０ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ（ｐＨ７．２）、次いで０．８ Ｍ 硫酸アンモ
ニウムを含む３６ ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅで
洗った後、２０ ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐ
Ｈ７．２）により溶出した。この吸着画分を、濃縮後、
逆相Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４カラム（Ｔｈｅ
Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ社製 カタログ
番号２１４ＴＰ５１０１５；直径１ｃｍ、ベッド高１５
ｃｍ）で分画した。展開溶媒Ａに０．１％ＴＦＡ、展開
溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用
い、予めカラムを２０％Ｂで平衡化し、サンプルを注入
後、流速１ｍｌ／ｍｉｎで２０％Ｂから４０％Ｂまで９
０分の直線濃度勾配により溶出した。この結果、どの細
胞株由来のＴＰＯ活性も、３０％から４３％濃度の１−
プロパノールで溶出された。各精製段階の標品をラット
ＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にて活性測定した結果、３種類
の細胞株由来のＴＰＯ活性はいずれもＸＲＰ由来のＴＰ
Ｏ活性と極めて類似した挙動を示した（実施例１−２を
参照）（表６に、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系での各
段階における相対比活性、活性収率などを記載）。さら
に、最終段階の逆相カラムからの溶出画分をラットＣＦ
Ｕ−ＭＫアッセイ系にて活性測定した結果、３種類の細
胞株由来のＴＰＯ活性とＸＲＰ由来のＴＰＯ活性は同じ
ピーク位置に溶出されていた。この逆相カラムの活性画
分を中心に、ラットＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−Ｍ
Ｋの分離・濃縮過程の付着細胞除去段階で得られる非付
着性細胞を用いてコロニーアッセイを行ったところ、い
ずれもラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系での活性の溶出パ
ターンにほぼ一致して巨核球コロニーの形成が認められ
（表７）、また、ＸＲＰ由来のＴＰＯ活性と同様に、３
種類の細胞株由来の活性はいずれも専ら巨核球コロニー
を形成させ、他の系統のコロニーはほとんど形成させな
かった。実施例１−２に記載した方法に従って、プール
した逆相カラムの活性画分をＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に供し、泳動後にゲルから蛋白質を抽出し
て、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にて活性測定したと
ころ、ＸＲＰ由来のＴＰＯは見かけの分子量１７０００
〜２２０００、ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞由来のＴＰＯ
は見かけの分子量３３０００〜３９０００、Ｈ４−ＩＩ
−Ｅ細胞由来のＴＰＯは見かけの分子量３１０００〜３
８０００、ＨＴＣ細胞由来のＴＰＯは見かけの分子量１
７０００〜２２０００、および分子量２８０００〜３５
０００を有していた。以上のように、ＭｃＡ−ＲＨ８９
９４細胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞、およびＨＴＣ細胞が産
生するＴＰＯ活性は、ＸＲＰ由来のＴＰＯと比べて、見
かけ上の分子量の点で生化学的性質を若干異にするもの
の、生物学的性質において同等であることが明らかとな
った。本発明において、ここで特筆すべきことは、血液
中に存在するＴＰＯ活性を持つ分子が、産生細胞におい
て、あるいは産生細胞から分泌後に、分子内の特定な、
あるいは不特定な位置で切断されたものである可能性を
示唆する。また、ＴＰＯ遺伝子（ｍＲＮＡやｃＤＮＡ）
においても様々な長さのものが存在する可能性をも示し
たものである。
素消化から演繹推定しうるアミノ酸残基である。 （５）得られたアミノ酸配列の類似性分析＜ホモロジー
サーチ＞ 得られたアミノ酸配列が、すでに報告されている既知の
蛋白質に含まれているかどうか、あるいは、類似配列を
もつ蛋白質があるかどうかについて、配列解析ソフトウ
ェアであるマックベクター（Ｋｏｄａｋ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）を用いて分析した。既知蛋白質あるいは既知遺伝
子の情報は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｒｅｌｅａｓｅ ６データ
ベース（米国 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏ
ｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、１９９３年８月１５日発行）
を利用した。これに含まれる各種データベースは以下の
通りである。 この結果、ＡＰ１２の配列（Ｋ）ＤＳＦＬＡＤＶＫは、
ラットのＣｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎ
ｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＣＢＧ）ｐｒｅｃｕｒｓｏｆ
〔ＰＩＲデータベース登録番号 Ａ４００６６；ｓｍｉ
ｔｈ ａｎｄＨａｍｍｏｎｄ；“Ｒａｔ ｃｏｒｔｉｃ
ｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇｇｌｏｂｕｌｉｎ：
ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｓ
ｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌ
ｅｖｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅｌｉｖｅｒ ｕｎｄｅｒ ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎ
ｄｉｔｉｏｎｓ．”Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，
（１９８９），３，４２０−４２６，］の内部配列ＫＤ
ＳＦＬＡＤＶＫと完全一致した。さらによく調べてみる
と、ＡＰ３の配列（Ｋ）ＸＹＹＥＳＺ（（ＸはＡ、Ｓ、
Ｇ、Ｍ、Ｑのどれか）、（ＺはＥまたはＫ））と類似性
の高いＫＱＹＹＥＳＥという配列が、ラットＣＢＧのア
ミノ酸配列に含まれていることが判明した。これらのＡ
Ｐ１２、ＡＰ３に相当する配列はラットＣＢＧでは連続
しており、ＫＤＳＦＬＡＤＶＫＱＹＹＥＳＥという内部
アミノ酸配列に相当する。しかしながら、ＡＰ１２、Ａ
Ｐ３以外のフラグメントのアミノ酸配列に関しては、類
似性を考慮すべき既知の蛋白質や遺伝子は見つからなか
った。 ＜実施例３＞ 血小板減少症ラット血漿由来ＴＰＯの生物学的特性分析 （１） ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系（液体培養系）
において 代表例として、血小板減少症ラット血漿からのＴＰＯ部
分精製標品（実施例１の（８）に記載したＹＭＣ Ｐａ
ｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＰカラムＴＰＯ活性画分Ｆ
２）を用いた場合の用量反応曲線を図５に示した。培養
を経時的に顕微鏡下で観察したところ、日を追って巨核
球の分化、成熟の進行、即ち細胞サイズの増大が認めら
れ、おそらく、細胞の増加も起こっていることと思われ
た。特に顕著な変化として、培養最終日の４日目に数多
くの巨核球による突起形成が認められた（培養３日目で
はほとんど認められない）。この突起形成は、ｃｙｔｏ
ｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
（ＬｅｖｅｎとＹｅｅ、Ｂｌｏｏｄ、６９巻、１０４６
−１０５２頁、（１９８７））、あるいは、ｐｒｏｐｌ
ａｔｅｌｅｔ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
（Ｔｏｐｐら、Ｂｌｏｏｄ７、７６巻、９１２−９２４
頁、（１９９０））などと呼ばれ、巨核球からさらに分
化の進んだ血小板の前駆構造体であり、現在までのとこ
ろｉｎ ｖｉｔｒｏで観察できる巨核球分化の最終形態
と考えられている。ＴＰＯ標品単独でこのような形態変
化が高い頻度で認められたことから、本因子は単独でＣ
ＦＵ−ＭＫの増殖・分化を促進し、成熟巨核球を生成さ
せ、さらに最終的に血小板産生まで進行させる可能性が
考えられる。 （２） コロニーアッセイ系において 血小板減少症ラット血漿からのＴＰＯ部分精製標品につ
いて、ラットの非分離骨髄細胞、分離・濃縮各段階の細
胞、あるいはＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分
を用いたコロニーアッセイ系で検定したところ、ラット
血漿由来のＴＰＯは、巨核球コロニーを形成させた。Ｔ
ＰＯによって形成される巨核球コロニーと他の既知サイ
トカイン、即ち、ラットＩＬ−３、マウスＧＭ−ＣＳ
Ｆ、あるいはヒトＥＰＯによって形成される巨核球コロ
ニーを比較すると、ＴＰＯによって形成される巨核球コ
ロニーには、個々のコロニーを構成する巨核球数は少な
いが、各々の巨核球のサイズが大きい、即ち成熟度が進
んでいるという特徴がある。さらに、他の細胞系統のコ
ロニーはほとんど形成されず、ＴＰＯが示すＭｅｇ−Ｃ
ＳＦ活性は巨核球特異的な活性と考えられる。これらの
ことから、ＴＰＯは、本コロニーアッセイ系においてＭ
ｅｇ−ＣＳＦ活性を発揮する他の既知サイトカイン、即
ち、ラットＩＬ−３、マウスＧＭ−ＣＳＦ、あるいはヒ
トＥＰＯとは、生物学的特性を異にし、ユニークなＭｅ
ｇ−ＣＳＦ活性を発揮することが明白となった。ヒト骨
髄細胞、あるいはヒト臍帯血細胞由来のＣＤ３４＋ＤＲ
＋細胞画分に対しても血小板減少症ラット血漿からのＴ
ＰＯ部分精製標品はＭｅｇ−ＣＳＦ活性を示し、有意な
数のヒト巨核球コロニーを形成させた。このことは本因
子に種特異性のないことを示している。 ＜実施例４＞ ラットＴＰＯ産生細胞の特定化 （１） ラットＴＰＯ産生臓器の探索 まず、ラットＴＰＯの部分アミノ酸配列に基づくラット
ＴＰＯ遺伝子のクローニング、あるいは発現クローニン
グのためのｍＲＮＡ供給源を確保する目的で、ラットＴ
ＰＯ産生臓器の探索、特定化を行った。当初、Ｐ５５抗
体投与により血小板減少症にしたラットから経時的に骨
髄、肺、肝臓、脾臓を摘出し、その細胞（肺、肝臓の場
合は臓器切片）の培養上清を採取し、ラットＣＦＵ−Ｍ
Ｋアッセイ系にて上清中の活性を評価したが、明確な結
果は得られなかった。続いて、ラットにおける肝臓とＴ
ＰＯ産生との関連性を示唆する報告（Ｓｉｅｍｅｎｓｍ
ａら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、８６巻、８１
７−８３３頁、（１９７５））を考慮して、Ｐ５５抗体
投与により血小板減少症にしたラットの肝臓からコラゲ
ナーゼかん流法にて調製した肝細胞を培養し、その上清
からＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅカラムに吸着した画分をＶ
ｙｄａｃ ｐｈｅｎｙｌ逆相カラムに展開したところ、
ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にてラット血漿由来ＴＰ
Ｏ活性と同じ位置に極めて類似した活性が認められた。
正常ラット肝細胞の培養上清からも弱いながらも活性が
認められた。これらの結果から、肝臓がＴＰＯ産生臓器
の１つである可能性が強く示唆された。 （２） ラットＴＰＯ産生細胞株のスクリーニング 上記の結果を基に、ラットＴＰＯ産生細胞株のスクリー
ニングを行った。まず、２０種類のラット肝臓由来細胞
株をそれぞれの継代培養用の培養液中でほぼコンフルエ
ントになるまで培養した後、培養液に含まれる血清を５
％ＦＣＳに統一したそれぞれの培養液で置換して、さら
に３日間培養を継続し、それぞれの培養上清を採取し
た。その上清を（１）に記した方法で部分精製して、Ｔ
ＰＯ産生の有無を調べたところ、３種類のラット肝実質
細胞由来細胞株、即ち、ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞（Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１６０２、Ｂｅｃｋｅｒら、“Ｏ
ｎｃｏｄｅｖｅｌｏｔｅｎｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ”ｅｄ．ｂｙＦｉｓｈｍａｎ ａｎｄ ｓ
ｅｌｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ．、ＮＹ、２５９
−２７１頁、（１９７６）、大日本製薬より購入）、Ｈ
４−ＩＩ−Ｅ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１５４８、
Ｐｉｔｏｔら、Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．Ｍｏ
ｎｏｇｒ．、１３巻、２２９−２４５頁、（１９６
４）、大日本製薬より購入）、およびＨＴＣ細胞（Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、５６巻、２９６−３０３頁、（１９６
６）、大日本製薬より購入）から明らかにＴＰＯ活性の
産生が確認された。 （３） ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細
胞、およびＨＴＣ細胞が産生するＴＰＯ活性の詳細な分
析 これらの３種類のラット細胞株から分泌されるＴＰＯ活
性と平行して精製を進めていたラット血漿由来のＴＰＯ
活性を、生化学的性質と生物学的性質の両面からさらに
詳細に比較検討した。ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞を１０
％ＦＣＳを含むａｌｐｈａ−ＭＥＭ（−）培養液に浮遊
させて、底面積１７５ｃｍ２の組織培養用培養プラステ
ィックフラスコに１×１０６個／フラスコになるように
入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で３日間培養し
た後、５％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液に置き換え、さ
らに３日間培養し、上清を回収した。Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細
胞を１０％ＦＣＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌ
ｅ培養液（グルコース４．５ｇ／ｌ含有）（以下、ＤＭ
ＥＭ培養液）に浮遊させて、底面積１７５ｃｍ２の組織
培養用プラスティックフラスコに５×１０５個／フラス
コになるように入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃
で３日間培養した後、５％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液
に置き換え、さらに３日間培養し、上清を回収した。ま
た、ＨＴＣ細胞を５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養液に浮
遊させて、底面積１７５ｃｍ２の組織培養用プラスティ
ックフラスコに２．５×１０５個／フラスコになるよう
に入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で３日間培養
した後、５％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液に置き換え、
さらに３日間培養し、上清を回収した。このようにして
得た３種類の細胞株の培養上清それぞれ２リットルか
ら、実施例１−２に記載したＸＲＰからのＴＰＯの精製
法に従って、細胞株由来ＴＰＯの部分精製を行った。以
下に概略を述べる。まず、限外濾過器により培養上清を
約６倍に濃縮した後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム
で２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にバッ
ファー交換した。溶出液をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ
Ｆカラムに添加し、２０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）で洗滌後、吸着画分を１７５ ｍＭ ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶
出した。この画分をＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅカラムに添
加し、ＰＢＳで洗った後、吸着画分を０．２ ＭＧｌｃ
ＮＡｃと０．１５ Ｍ ＮａＣｌを含む２０ ｍＭ Ｎ
ａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．２）により溶出し
た。この溶出液をＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６
５０ＭＨカラムに添加し、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０
ｍＭ ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．２）で洗った
後、２Ｍ ＮａＳＣＮにより溶出した。これをＰｈｅｎ
ｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ／ＬＳカラムに添
加し、１．５Ｍ硫酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ
Ｓｕｌｆａｔｅ）を含む５０ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ（ｐＨ７．２）、次いで０．８ Ｍ 硫酸アンモ
ニウムを含む３６ ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅで
洗った後、２０ ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐ
Ｈ７．２）により溶出した。この吸着画分を、濃縮後、
逆相Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４カラム（Ｔｈｅ
Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ社製 カタログ
番号２１４ＴＰ５１０１５；直径１ｃｍ、ベッド高１５
ｃｍ）で分画した。展開溶媒Ａに０．１％ＴＦＡ、展開
溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用
い、予めカラムを２０％Ｂで平衡化し、サンプルを注入
後、流速１ｍｌ／ｍｉｎで２０％Ｂから４０％Ｂまで９
０分の直線濃度勾配により溶出した。この結果、どの細
胞株由来のＴＰＯ活性も、３０％から４３％濃度の１−
プロパノールで溶出された。各精製段階の標品をラット
ＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にて活性測定した結果、３種類
の細胞株由来のＴＰＯ活性はいずれもＸＲＰ由来のＴＰ
Ｏ活性と極めて類似した挙動を示した（実施例１−２を
参照）（表６に、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系での各
段階における相対比活性、活性収率などを記載）。さら
に、最終段階の逆相カラムからの溶出画分をラットＣＦ
Ｕ−ＭＫアッセイ系にて活性測定した結果、３種類の細
胞株由来のＴＰＯ活性とＸＲＰ由来のＴＰＯ活性は同じ
ピーク位置に溶出されていた。この逆相カラムの活性画
分を中心に、ラットＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−Ｍ
Ｋの分離・濃縮過程の付着細胞除去段階で得られる非付
着性細胞を用いてコロニーアッセイを行ったところ、い
ずれもラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系での活性の溶出パ
ターンにほぼ一致して巨核球コロニーの形成が認められ
（表７）、また、ＸＲＰ由来のＴＰＯ活性と同様に、３
種類の細胞株由来の活性はいずれも専ら巨核球コロニー
を形成させ、他の系統のコロニーはほとんど形成させな
かった。実施例１−２に記載した方法に従って、プール
した逆相カラムの活性画分をＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に供し、泳動後にゲルから蛋白質を抽出し
て、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にて活性測定したと
ころ、ＸＲＰ由来のＴＰＯは見かけの分子量１７０００
〜２２０００、ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞由来のＴＰＯ
は見かけの分子量３３０００〜３９０００、Ｈ４−ＩＩ
−Ｅ細胞由来のＴＰＯは見かけの分子量３１０００〜３
８０００、ＨＴＣ細胞由来のＴＰＯは見かけの分子量１
７０００〜２２０００、および分子量２８０００〜３５
０００を有していた。以上のように、ＭｃＡ−ＲＨ８９
９４細胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞、およびＨＴＣ細胞が産
生するＴＰＯ活性は、ＸＲＰ由来のＴＰＯと比べて、見
かけ上の分子量の点で生化学的性質を若干異にするもの
の、生物学的性質において同等であることが明らかとな
った。本発明において、ここで特筆すべきことは、血液
中に存在するＴＰＯ活性を持つ分子が、産生細胞におい
て、あるいは産生細胞から分泌後に、分子内の特定な、
あるいは不特定な位置で切断されたものである可能性を
示唆する。また、ＴＰＯ遺伝子（ｍＲＮＡやｃＤＮＡ）
においても様々な長さのものが存在する可能性をも示し
たものである。
【表６】
【表７】 ＜実施例５＞ ｃＤＮＡライブラリー作製用発現ベクター（ｐＥＦ１８
Ｓ）の構築 ベクターへのｃＤＮＡ断片の組み込みが容易で、クロー
ニングしたｃＤＮＡの発現効率が高いベクターを作製
し、ＴＰＯｃＤＮＡのクローニングと発現に備えた。す
なわち、発現効率が高いプロモーターとして知られるエ
ロンゲーションファクター１α（ＥＦ１α）のプロモー
ターを、扱いやすい発現ベクターｐＭＥ１８ＳのＳＲα
プロモーターと入れ替え、発現ベクターｐＥＦ１８Ｓを
構築した（図６参照）。エロンゲーションファクター１
αのプロモーターは発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉ
ｚｕｓｈｉｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１８、５３２２、１９９０）１μｇを制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで部分的に消化した後、２％
アガロースゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社
製）を用いた電気泳動にかけ、約１２００ｂｐのＤＮＡ
断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット
（バイオラッド社製；Ｗｉｌｌｉｓら、ＢｉｏＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ、９、９２−９９、１９９０の方法にもと
づいたもので、多孔性シリカベースのマトリックスを利
用した吸着により選択的にＤＮＡを精製するキット）を
用いて精製した。このＤＮＡ断片１００ｎｇを同様にＨ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した５０ｎｇの発現ベ
クターｐＭＥ１８Ｓ（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、８９５７−８９６
１、１９９３）につなぎこんだ。宿主菌にはコンピテン
ト・ハイ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５（東洋紡績社製；Ｈａ
ｎａｈａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，、１６６、５５
７−５８０、１９８３の方法の変法により作製したコン
ピテントな宿主菌）を用い、得られたコロニー１２個を
ランダムに選びプラスミドＤＮＡを精製し、それらＤＮ
Ａの制限酵素での消化パターンにより目的のプラスミド
（ｐＥＦ１８Ｓ）を含む１０クローンの中から１個を選
択し、大量にプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミド
ＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）］に記載されているようにして実施した。
すなわち、上記のようにして得られたクローンｐＭＥ１
８Ｓを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含む５０
ｍｌのＬＢ培地（１％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、
０．５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、
０．５％ＮａＣｌ）で一夜培養した後、遠心分離により
得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙｓｏｚｙｍｅ（２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、
５０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．５％ｌｙｓｏｚｙｍ
ｅ）溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ／１％
ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ ｐｏｔ
ａｓｓｉｕｍ／５Ｍ ａｃｅｔａｔｅ溶液を６ｍｌ加え
てよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノー
ル−クロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパ
ノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはＴ
Ｅ溶液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）に溶解後、ＲＮａｓｅ処理、フェノール−
クロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を
行なう。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、Ｎａｃｌ、
ポリエチレングリコール３０００をそれぞれ０．６３
Ｍ、７．５％になるように加えて遠心する。最後に、ペ
レットはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。こ
れにより約３００μｇのプラスミドＤＮＡを得た。この
ＤＮＡ１００μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ
で完全に消化後、０．８％のアガロースゲル（ＦＭＣ
ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）で泳動し、ベクター断片
を回収後プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイ
オラッド社製）で精製しおよそ５５μｇのプラスミドＤ
ＮＡを得た。このＤＮＡを以下のｃＤＮＡライブラリー
作製に使用した。 ＜実施例６＞ ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞からのｍＲＮＡの精製 実施例４のコロニーアッセイの結果より比較的活性の高
かったＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞をラットＴＰＯｃＤＮ
Ａクローニングの材料に選び以下の実験に供した。全Ｒ
ＮＡの単離は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂ ｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１
９８９）］に記載されているようにして実施した。Ｍｃ
Ａ−ＲＨ８９９４細胞を直径９０ｍｍのシャーレ１５枚
に完全に密に増殖させた後、シャーレから培養液を除
き、１枚のシャーレ当り０．８ｍｌの５Ｍグアニジン溶
液（５Ｍグアニジンチオシアナート、５ｍＭクエン酸ナ
トリウム（ｐＨ７．０）、０．１Ｍβ−メルカプトエタ
ノール、０．５％ザルコシル硫酸ナトリウム）を加え、
よく懸濁した後１本のチューブに混合液を集め、グアニ
ジン溶液を加えて全量を２０ｍｌとした。この細胞が壊
れて粘稠になった混合液は、１８Ｇさらに２１Ｇの注射
針を装填した２０ｍｌ容の注射器を用い、粘性がほとん
どなくなるまでおよそ２０回吸入排出を繰り返した。ベ
ックマン社製ＳＷ２８ローターに合うポリアロマー製の
遠心チューブに１８ｍｌの５．７Ｍ ＣｓＣｌ−０．１
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）をクッションとして先に加
えておき、チューブがほぼ満たされるように上述の混合
液約２０ｍｌを層が乱れないように静かに重層した。こ
のようにして調製された遠心チューブを２０℃で２５０
００ｒ．ｐ．ｍ．、２０時間遠心した後、得られたペレ
ットを少量の８０％エタノールを用いて２回洗浄した。
ペレットはＴＥ溶液に溶解せしめ、フェノール−クロロ
ホルム（１：１）にて抽出後、１／１０量の３Ｍ酢酸ナ
トリウムと２．５倍量のエタノールを加えてエタノール
沈殿を行い全ＲＮＡを得た（約１０８個の細胞より全Ｒ
ＮＡ約２．５ｍｇを得た）。全ＲＮＡからのポリ（Ａ）
＋ＲＮＡの精製はＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０（Ｓ
ｕｐｅｒ）（日本合成ゴム／日本ロッシュ社製；ラテッ
クス粒子の表面にオリゴｄＴが共有結合で固定してあ
り、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ精製に使われるオリゴｄＴカラ
ムと同様にポリ（Ａ）＋ＲＮＡの精製ができる）を用い
て行った。全ＲＮＡ約５００μｇより２０μｇのポリ
（Ａ）＋ＲＮＡを得た。 ＜実施例７＞ ラットｃＤＮＡライブラリーの構築 実施例５で得られた５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡからＴ
ｉｍｅＳａｖｅｒＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製；Ｏｋａｙａｍａ−Ｂ
ｅｒｇ法：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，、２、１６１
−１７０、１９８２、の変法によるｃＤＮＡ合成法のキ
ット）およびＤＩＲＥＣＴＩＯＮＡＬＣＬＯＮＩＮＧ
ＴＯＯＬＢＯＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製；ＮｏｔＩ配
列を含むｃＤＮＡ合成のためのプライマー：５′−ＡＡ
ＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡ
（Ｔ）１８−３′並びにＥｃｏＲＩ配列付加用アダプタ
ー：５′−ＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧ−３′および
５′−ＣＴＣＧＴＧＣＣＧ−３′のセット）を用いて、
５’端にＥｃｏＲＩ、３’端にＮｏｔＩ認識部位を持つ
２本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは１．２
μｇの予めＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで処理した発現ベ
クターｐＥＦ１８Ｓ（実施例５参照）と連結させ、８．
４ｍｌのコンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５（東
洋紡績社製）を形質転換した。その結果、５．３×１０
５個の形質転換体が得られた。 ＜実施例８＞ ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得（クロ
ーニング） 実施例７で作製したＭｃＡ−ＲＨ８９９４ｃＤＮＡライ
ブラリー５３万クローンを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃ
ｉｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した後、
遠心分離により得た菌体からＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ１０
０（ＤＩＡＧＥＮ社製；ＤＮＡ精製用シリカゲルベース
の陰イオン交換カラム）を用いてＭｃＡ−ＲＨ８９９４
ｃＤＮＡライブラリープラスミドを精製し、約２００μ
ｇのプラスミドＤＮＡを得た。実施例２に記載のペプチ
ド断片ＡＰ８のアミノ酸配列に対応する２種類のアンチ
センスヌクレオチドプライマーＡＰ８−１Ｒ，ＡＰ８−
２Ｒ、及びｃＤＮＡラブプラリー作製に用いた図６に示
したプラスミドベクターｐＥＦ１８Ｓのヒトエロンゲー
ションファクター１αの第１イントロンに対応するセン
スヌクレオチドプライマーＥＦ１α−１，ＥＦ１α−２
を合成した。合成にはアプライドバイオシステムズ社製
３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（β−シアノエチ
ルアミダイト法にもとづく合成機）を使用し、同社製の
合成ＤＮＡ精製用ＯＰＣカラム（逆相シリカゲルを充填
したカラムでトリチル基を持つ合成ＤＮＡを精製するカ
ラム）を用いて精製した。精製した合成ＤＮＡはＴＥ溶
液に５０μＭとなるように溶解し、使用時まで−２０℃
に保存した。以下用いる合成オリゴヌクレオチドは全て
同様に合成並びに精製して使用した。プライマーＡＰ８
−１Ｒ，ＡＰ８−２Ｒは、連続した１７個のヌクレオチ
ドからなる混合型プライマーであり、タカハシらの研究
にあるようにデオキシイノシンを使用した（Ｔａｋａｈ
ａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２，１９３１−１９３５（１
９８５））。プライマーＥＦ１ α−１，ＥＦ１α−２
は、Ｕｅｔｓｕｋｉ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈ
ｅｍ．２６４，５７９１−５７９８（１９８９）にある
ゲノム配列の１４９１−１５１２、１５１３−１５３２
に相当する塩基配列を基にして合成したそれぞれ２１、
２０個のヌクレオチドからなるプライマーである。合成
したプライマーの配列を表８に示す。
Ｓ）の構築 ベクターへのｃＤＮＡ断片の組み込みが容易で、クロー
ニングしたｃＤＮＡの発現効率が高いベクターを作製
し、ＴＰＯｃＤＮＡのクローニングと発現に備えた。す
なわち、発現効率が高いプロモーターとして知られるエ
ロンゲーションファクター１α（ＥＦ１α）のプロモー
ターを、扱いやすい発現ベクターｐＭＥ１８ＳのＳＲα
プロモーターと入れ替え、発現ベクターｐＥＦ１８Ｓを
構築した（図６参照）。エロンゲーションファクター１
αのプロモーターは発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉ
ｚｕｓｈｉｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１８、５３２２、１９９０）１μｇを制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで部分的に消化した後、２％
アガロースゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社
製）を用いた電気泳動にかけ、約１２００ｂｐのＤＮＡ
断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット
（バイオラッド社製；Ｗｉｌｌｉｓら、ＢｉｏＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ、９、９２−９９、１９９０の方法にもと
づいたもので、多孔性シリカベースのマトリックスを利
用した吸着により選択的にＤＮＡを精製するキット）を
用いて精製した。このＤＮＡ断片１００ｎｇを同様にＨ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した５０ｎｇの発現ベ
クターｐＭＥ１８Ｓ（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、８９５７−８９６
１、１９９３）につなぎこんだ。宿主菌にはコンピテン
ト・ハイ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５（東洋紡績社製；Ｈａ
ｎａｈａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，、１６６、５５
７−５８０、１９８３の方法の変法により作製したコン
ピテントな宿主菌）を用い、得られたコロニー１２個を
ランダムに選びプラスミドＤＮＡを精製し、それらＤＮ
Ａの制限酵素での消化パターンにより目的のプラスミド
（ｐＥＦ１８Ｓ）を含む１０クローンの中から１個を選
択し、大量にプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミド
ＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）］に記載されているようにして実施した。
すなわち、上記のようにして得られたクローンｐＭＥ１
８Ｓを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含む５０
ｍｌのＬＢ培地（１％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、
０．５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、
０．５％ＮａＣｌ）で一夜培養した後、遠心分離により
得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙｓｏｚｙｍｅ（２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、
５０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．５％ｌｙｓｏｚｙｍ
ｅ）溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ／１％
ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ ｐｏｔ
ａｓｓｉｕｍ／５Ｍ ａｃｅｔａｔｅ溶液を６ｍｌ加え
てよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノー
ル−クロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパ
ノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはＴ
Ｅ溶液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）に溶解後、ＲＮａｓｅ処理、フェノール−
クロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を
行なう。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、Ｎａｃｌ、
ポリエチレングリコール３０００をそれぞれ０．６３
Ｍ、７．５％になるように加えて遠心する。最後に、ペ
レットはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。こ
れにより約３００μｇのプラスミドＤＮＡを得た。この
ＤＮＡ１００μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ
で完全に消化後、０．８％のアガロースゲル（ＦＭＣ
ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）で泳動し、ベクター断片
を回収後プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイ
オラッド社製）で精製しおよそ５５μｇのプラスミドＤ
ＮＡを得た。このＤＮＡを以下のｃＤＮＡライブラリー
作製に使用した。 ＜実施例６＞ ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞からのｍＲＮＡの精製 実施例４のコロニーアッセイの結果より比較的活性の高
かったＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞をラットＴＰＯｃＤＮ
Ａクローニングの材料に選び以下の実験に供した。全Ｒ
ＮＡの単離は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂ ｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１
９８９）］に記載されているようにして実施した。Ｍｃ
Ａ−ＲＨ８９９４細胞を直径９０ｍｍのシャーレ１５枚
に完全に密に増殖させた後、シャーレから培養液を除
き、１枚のシャーレ当り０．８ｍｌの５Ｍグアニジン溶
液（５Ｍグアニジンチオシアナート、５ｍＭクエン酸ナ
トリウム（ｐＨ７．０）、０．１Ｍβ−メルカプトエタ
ノール、０．５％ザルコシル硫酸ナトリウム）を加え、
よく懸濁した後１本のチューブに混合液を集め、グアニ
ジン溶液を加えて全量を２０ｍｌとした。この細胞が壊
れて粘稠になった混合液は、１８Ｇさらに２１Ｇの注射
針を装填した２０ｍｌ容の注射器を用い、粘性がほとん
どなくなるまでおよそ２０回吸入排出を繰り返した。ベ
ックマン社製ＳＷ２８ローターに合うポリアロマー製の
遠心チューブに１８ｍｌの５．７Ｍ ＣｓＣｌ−０．１
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）をクッションとして先に加
えておき、チューブがほぼ満たされるように上述の混合
液約２０ｍｌを層が乱れないように静かに重層した。こ
のようにして調製された遠心チューブを２０℃で２５０
００ｒ．ｐ．ｍ．、２０時間遠心した後、得られたペレ
ットを少量の８０％エタノールを用いて２回洗浄した。
ペレットはＴＥ溶液に溶解せしめ、フェノール−クロロ
ホルム（１：１）にて抽出後、１／１０量の３Ｍ酢酸ナ
トリウムと２．５倍量のエタノールを加えてエタノール
沈殿を行い全ＲＮＡを得た（約１０８個の細胞より全Ｒ
ＮＡ約２．５ｍｇを得た）。全ＲＮＡからのポリ（Ａ）
＋ＲＮＡの精製はＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０（Ｓ
ｕｐｅｒ）（日本合成ゴム／日本ロッシュ社製；ラテッ
クス粒子の表面にオリゴｄＴが共有結合で固定してあ
り、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ精製に使われるオリゴｄＴカラ
ムと同様にポリ（Ａ）＋ＲＮＡの精製ができる）を用い
て行った。全ＲＮＡ約５００μｇより２０μｇのポリ
（Ａ）＋ＲＮＡを得た。 ＜実施例７＞ ラットｃＤＮＡライブラリーの構築 実施例５で得られた５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡからＴ
ｉｍｅＳａｖｅｒＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製；Ｏｋａｙａｍａ−Ｂ
ｅｒｇ法：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，、２、１６１
−１７０、１９８２、の変法によるｃＤＮＡ合成法のキ
ット）およびＤＩＲＥＣＴＩＯＮＡＬＣＬＯＮＩＮＧ
ＴＯＯＬＢＯＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製；ＮｏｔＩ配
列を含むｃＤＮＡ合成のためのプライマー：５′−ＡＡ
ＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡ
（Ｔ）１８−３′並びにＥｃｏＲＩ配列付加用アダプタ
ー：５′−ＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧ−３′および
５′−ＣＴＣＧＴＧＣＣＧ−３′のセット）を用いて、
５’端にＥｃｏＲＩ、３’端にＮｏｔＩ認識部位を持つ
２本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは１．２
μｇの予めＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで処理した発現ベ
クターｐＥＦ１８Ｓ（実施例５参照）と連結させ、８．
４ｍｌのコンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５（東
洋紡績社製）を形質転換した。その結果、５．３×１０
５個の形質転換体が得られた。 ＜実施例８＞ ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得（クロ
ーニング） 実施例７で作製したＭｃＡ−ＲＨ８９９４ｃＤＮＡライ
ブラリー５３万クローンを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃ
ｉｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した後、
遠心分離により得た菌体からＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ１０
０（ＤＩＡＧＥＮ社製；ＤＮＡ精製用シリカゲルベース
の陰イオン交換カラム）を用いてＭｃＡ−ＲＨ８９９４
ｃＤＮＡライブラリープラスミドを精製し、約２００μ
ｇのプラスミドＤＮＡを得た。実施例２に記載のペプチ
ド断片ＡＰ８のアミノ酸配列に対応する２種類のアンチ
センスヌクレオチドプライマーＡＰ８−１Ｒ，ＡＰ８−
２Ｒ、及びｃＤＮＡラブプラリー作製に用いた図６に示
したプラスミドベクターｐＥＦ１８Ｓのヒトエロンゲー
ションファクター１αの第１イントロンに対応するセン
スヌクレオチドプライマーＥＦ１α−１，ＥＦ１α−２
を合成した。合成にはアプライドバイオシステムズ社製
３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（β−シアノエチ
ルアミダイト法にもとづく合成機）を使用し、同社製の
合成ＤＮＡ精製用ＯＰＣカラム（逆相シリカゲルを充填
したカラムでトリチル基を持つ合成ＤＮＡを精製するカ
ラム）を用いて精製した。精製した合成ＤＮＡはＴＥ溶
液に５０μＭとなるように溶解し、使用時まで−２０℃
に保存した。以下用いる合成オリゴヌクレオチドは全て
同様に合成並びに精製して使用した。プライマーＡＰ８
−１Ｒ，ＡＰ８−２Ｒは、連続した１７個のヌクレオチ
ドからなる混合型プライマーであり、タカハシらの研究
にあるようにデオキシイノシンを使用した（Ｔａｋａｈ
ａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２，１９３１−１９３５（１
９８５））。プライマーＥＦ１ α−１，ＥＦ１α−２
は、Ｕｅｔｓｕｋｉ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈ
ｅｍ．２６４，５７９１−５７９８（１９８９）にある
ゲノム配列の１４９１−１５１２、１５１３−１５３２
に相当する塩基配列を基にして合成したそれぞれ２１、
２０個のヌクレオチドからなるプライマーである。合成
したプライマーの配列を表８に示す。
【表８】 ＭｃＡ−ＲＨ８９９４ｃＤＮＡライブラリープラスミド
３μｇを鋳型とし、ＡＰ８−１Ｒ（５００ｐｍｏｌ）、
ＥＦ１ α−１（１００ｐｍｏｌ）をプライマーとし
て、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉ
ｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＴＭＤＮＡ Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製；ＰＣＲ用耐熱性ＴａｑＩ
ポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰのセット）を
用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９
６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製；ＰＣＲ用反応
機）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で２
分間加熱後、９５℃で１分間の変性条件、４０℃で１分
間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３５回
の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）
を行った。増幅されたＤＮＡ断片の特異性を上げるため
に、得られたＰＣＲ反応液１μｌを鋳型とし、ＥＦ１
α−２（１００ｐｍｏｌ）、ＡＰ８−２Ｒ（５００ｐｍ
ｏｌ）をプライマーとして、同様に１００μｌの容量で
ＰＣＲ反応（９５℃で２分間加熱後、９５℃で１分間の
変性条件、４５℃で１分間のアニール条件、７２℃で１
分間の合成条件で３５回の反応を行い、さらに７分間７
２℃でインキュベート）を行った。ここで得られた反応
液を、２％アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕ
ｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、このＰＣＲ反応
の主要産物である約３３０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、
プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド
社製）を用いて精製した。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（ライフテクノロジー社製）を用いてｐＣＲ
ＴＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製；ＰＣＲ産物ＴＡ
クローニング用ベクター：ＰＣＲに使用する耐熱性ポリ
メラーゼが末端トランスフェラーゼ活性を有するため
に、ＰＣＲで増幅したＤＮＡの３’末端にデオキシアデ
ニル酸を１個付加する性質を利用し、５’−ｄＴ突出末
端を持つベクターｐＣＲＴＭＩＩにそのままサブクロー
ニングする方法）ベクターにサブクローンした。任意に
選択した２８クローンについてＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ１
００（ＤＩＡＧＥＮ社製）を使用してプラスミドＤＮＡ
を精製し、これをＴａｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅ
ｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｉｎｇＫ
ｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製；ＰＣＲを利用
した、蛍光色素で行なうジデオキシ法：Ｓａｎｇｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
７４、５４６３−５４６７、１９７７）を用いて、アプ
ライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエン
サー（蛍光シークエンサー）によりシークエンスし、各
クローンの塩基配列を決定した。得られたＤＮＡ断片の
中で、ＡＰ８のアミノ酸のＮ末端側３個（Ｉｌｅ／Ｔｈ
ｒ／Ｓｅｒ）−Ｖａｌ−ＰｒｏをＡＰ８−２Ｒのプライ
マーに隣接してコードするものを選択し、全長をシーク
エンスしたところ、２６１ｂｐを有するｃＤＮＡを含ん
でいた。このｃＤＮＡ断片の１７３〜１７５の塩基配列
はメチオニンをコードするものでありコーディングのフ
レームはＡＰ８のアミノ酸のフレームと一致した。また
この配列の前後はＫｏｚａｋの配列（Ｋｏｚａｋ，
Ｍ．，Ｃｅｌｌ，４４，２８３−２９２、１９８６）に
適合することから翻訳の開始部位と推定され、ラットＴ
ＰＯタンパク質のＮ末部分をコードするｃＤＮＡ断片と
考えられた。このｃＤＮＡ断片をＡ１と命名した。ベク
ターの配列を除いたＡ１断片の塩基配列およびそれから
演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号１）に示し
た。 ＜実施例９＞ ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡのスクリーニング 前述のｃＤＮＡライブラリーを約１万クローンづつのプ
ールに分け、５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含
む１ｍｌのＬＢ培地中で一夜培養した後、プラスミド自
動分離装置ＰＩ−１００（倉敷紡績社製、ＶＥＲ−３．
０；アルカリＳＤＳ法：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９８９］：の変法にもとづくプラスミドＤＮＡ自
動抽出機）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。その
１／３０量を鋳型としてフラグメントＡ１をもとに設計
した２種の合成オリゴヌクレオチド ５’ＣＧＡＧＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧ３’
（配列番号１の配列の１−１７のセンス配列；ＣＧＡＧ
はアダプターの配列）および５’ＣＡＧＡＧＴＴＡＧＴ
ＣＴＴＧＣＧＧＴＧＡＧ３’（配列番号１の配列の２１
２−２３２のアンチセンス配列）をプライマーとして合
成・精製し、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎ
ｔＫｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、Ｇｅｎｅ
ＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００（ＰＥＲＫＩ
Ｎ−ＥＬＭＥＲ社製）によりＰＣＲ反応（９４℃で３０
秒間の変性条件、６６℃で３０秒間のアニール条件、７
２℃で１分間の合成条件で３０回の反応）を行った結
果、１００プール中３プールに２３６ｂｐの特異的バン
ドが検出された。このうちの１プールを約９００クロー
ンづつのプールに分けプラスミドＤＮＡを抽出し、同様
のＰＣＲ反応を行ったところ、１００プール中３プール
にバンドが検出された。さらにこのうちの１プールを４
０クローンづつのプールに分け、同様の選別を行なった
結果１００プール中３プールで特異的と考えられるバン
ドが観察された。これらのうち１プールを選び５０μｇ
／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含むＬＢプレート（１５
％アガーを含むＬＢ培地）上に蒔き、出現した１つ１つ
のコロニーについてプラスミドＤＮＡを抽出し同様のＰ
ＣＲ反応を行った結果、１００クローン中２クローンで
陽性バンドを検出した。 ＜実施例１０＞ ラットＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実
施した。実施例９で最終的に得られた２個のクローンを
５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含む５０ｍｌの
ＬＢ培地で一夜培養した後、実施例５と同様に精製し、
最終的に約３００μｇのプラスミドＤＮＡを得た。ここ
で得られたプラスミドＤＮＡをＴａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏ
ｘｙＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社
製）を用いて、実施例８と同様にシークエンスし、ｃＤ
ＮＡ全長の塩基配列を決定した。その結果、２個のクロ
ーンの塩基配列は完全に一致し同一のクローンであるこ
とが明かとなった。この中から１クローンを選び該ｃＤ
ＮＡを担持したプラスミドクローンをｐＥＦ１８Ｓ−Ａ
２αと命名した。塩基配列およびそれから演繹されるア
ミノ酸配列を配列表（配列番号２）に示した。配列表
（配列番号２）に示す配列の特徴は顕著である。１７２
ｂｐの５’非翻訳領域後の配列は、メチオニンに始まる
２１個のタンパク質から成る分泌のためのシグナル配列
と推定される、疎水性に富むアミノ酸をコードしてい
る。このタンパク質は１２６個のアミノ酸残基を有し、
停止コドン（ＴＡＡ）の後に１０２２塩基の３’非翻訳
配列及びポリＡ尾部の多数のアデニンが続く。このタン
パク質中には、実施例２で解析された部分アミノ酸配列
ＡＰ８に対応する配列のみが含まれていた（配列番号２
におけるアミノ酸番号１〜１２）。Ｎ−グリコシル化の
ための配列部位は存在しない。また、３’非翻訳配列末
端近くの１６２４〜１６２９の塩基配列は、コンセンサ
ス配列とは異なるが、潜在的ポリアデニル化配列と考え
られる。大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＥＦ１８
Ｓ−Ａ２αは１９９４年２月１４日付で通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５６５として寄託した。これはまた、１９９５年
３月２２日付で中華民国食品工業発展研究所（ＦＩＲＤ
Ｉ）に受託番号９４００８３として寄託した。 ＜実施例１１＞ ラットＴＰＯｃＤＮＡのＣＯＳ１細胞での発現〜活性確
認 プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αのＣＯＳ１細胞へのト
ランスフェクションは、クロロキン処理を含むＤＥＡＥ
−デキストラン法（ｓｏｍｐａｙｒａｃら、Ｐｒｏｃ・
Ｎａｎｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８巻、７５７
５−７５７８頁、（１９８１）；Ｌｕｔｈｍａｎら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１１巻、１２９５−１
３０８頁、（１９８３））に若干の改変を加えた以下の
方法に従い実施した。１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養
液に浮遊させたＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
０）を直径１００ｍｍの組織培養用プラスティックシャ
ーレに入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で約４０
％コンフルエントになるまで培養した。一方、５００μ
ｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア
社）、８０μＭのクロロキン（シグマ社）、８％（ｖ／
ｖ）のＨＢＳ（２１ｍＭＨＥＰＥＳ−１４５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ ７．１）及び９％（ｖ／ｖ）のＮｕ−Ｓｅ
ｒｕｍ（コラボレイティブ社）を含む４ｍｌのＤＭＥＭ
培養液に３０μｌのＨＢＳに溶解したプラスミドｐＥＦ
１８Ｓ−Ａ２α（１０μｇ）を混和し、トランスフェク
ション直前にＤＭＥＭ培養液で２度洗浄した上記のＣＯ
Ｓ１細胞に添加した後、５％炭酸ガス培養器中にて３７
℃で５時間培養した。その後、培養上清を吸引除去しＤ
ＭＥＭ培養液でシャーレを２度洗浄した後、１０％ＦＣ
Ｓを含むＤＭＥＭ培養液を１５ｍｌ加え、５％炭酸ガス
培養器中にて３７℃で３日ないしは５日間培養し、培養
上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に
対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で
評価した。その結果、プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２α
をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞の
培養上清中に用量依存的にＴＰＯ活性が認められ（図
７）、また、ラットＴＰの場合と同様に培養４日目に多
数のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ形成が認められた。一方、インサートを含
まないプラスミドｐＥＦ１８Ｓをトランスフェクション
したＣＯＳ１細胞培養上清ではＴＰＯ活性は検出されな
かった（図７）。また、Ｍ−０７ｅアッセイ系において
も、プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αをトランスフェク
ションして発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中に用量
依存的にＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性が認められ、イン
サートを含まないプラスミドｐＥＦ１８Ｓをトランスフ
ェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認めら
れなかった。これらの結果から、ｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２α
がＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を
担持していることが確認された。次に、このＴＰＯ活性
の血小板増加作用を調べるため、部分精製品を調製し
た。調製過程でのＴＰＯ活性測定には、ラットＣＦＵ−
ＭＫアッセイ系を用いた。まず、プラスミドｐＥＦ１８
Ｓ−Ａ２αをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞
を、０．２ｍｇのＢＳＡを含む無血清培養液で３日間培
養し、約５．８Ｌの無血清培養上清を得た。その無血清
培養上清に、ｐ−ＡＰＭＳＦを最終濃度１ｍＭ加え、
０．２２μｍの濾過フィルターで通過する濾液をとっ
た。この体積５７９３ｍｌ（蛋白質濃度０．２２９ｍｇ
／ｍｌ、総蛋白質量１３２６ｍｇ、相対活性１０００、
相対活性量１３２６０８０）に対し１０００ｍｌ当り
０．８５ｍｏｌｅｓ のＮａＣｌ（合計２８８ｇ）を加
え、最終濃度０．８２２Ｍ ＮａＣｌ，５８４９ｍｌの
溶液とした後、１Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＮａＰｈｏ
ｓｐｈａｔｅ ｐＨ７．２で予め平衡化してあったＴＳ
Ｋ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ ＭＨカラム（ト
ーソー社製、カタログ番号０８７０５；直径５ｃｍ、ベ
ッド高 ６ｃｍ）に、流速７ｍｌ／ｍｉｎで添加した。
添加終了後、２０ｍＭＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ，１Ｍ
ＮａＣｌ，ｐＨ７．２で溶出される素通り（約７９００
ｍｌ）を集め、これを限外濾過ユニット（フィルトロン
社・オメガウルトラセット 分子量８０００カット）で
濃縮し、素通り画分Ｆ１（４６０ｍｌ，蛋白質濃度２，
１１ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量９７３ｍｇ，相対活性１
６．３）を得た。次に、溶出液を２Ｍ ＮａＳＣＮにか
え、溶出されたＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５
０ＭＨ 吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（２８４０ｍｌ）を限
外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径７６ｍ
ｍ）を用いて、６．８１ｍｌまで濃縮した。このＴＰＯ
活性画分Ｆ２の総蛋白質量は１２．５ｍｇ、このステッ
プでのＦ２の蛋白質収量は０．６２％であった。また、
ＴＰＯの相対活性は、２４０であった。次に、ＨｉＬｏ
ａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（フ
ァルマシア バイオテク社製、カタログ番号１７−１０
７１−０１；直径２．６ｃｍ、ベッド高 ６０ｃｍ）カ
ラムに注入し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、５０ｍＭのＮａ
ｃｌを含む２０ｍＭ Ｎａ Ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ５．
５で展開した。展開開始後に溶出した１９４ｍｌから２
６０ｍｌまでの範囲の画分にＴＰＯ活性が確認できた。
そこで、これをまとめて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐ
ｇのＴＰＯ活性画分Ｆ２（６６ｍｌ，蛋白質濃度０．１
１２ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量７．４１ｍｇ，相対活性１
４２８６０、相対活性量１０５８６００）とした。次
に、展開溶媒Ａ（２０ｍＭ Ｎａ Ａｃｅｔａｔｅ，ｐ
Ｈ５．５）および展開溶媒Ｂ（５００ｍＭのＮａｃｌを
含む２０ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２）
を用意し、１００％Ａで平衡化した強陽イオン交換カラ
ムのＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｓ（ファルマシア バイオテク
社製、カタログ番号１７−１１７８−０１；直径 ０．
６４ｃｍ、ベッド高 ３ｃｍ）カラムに、流速１ｍｌ／
ｍｉｎで、注入した。次いで、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ
で、４０分かけて１００％Ａから１００％Ｂまでの直線
濃度勾配にて展開した。アッセイの結果、広い範囲（５
％Ｂから３２％Ｂの範囲）にＴＰＯ活性が溶出されてい
ることが分かった。このＴＰＯ活性画分をまとめて、限
外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径２５ｍ
ｍ）で濃縮し、ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＳのＴＰＯ活性画分
Ｆ２（１．６５ｍｌ，蛋白質濃度４．７４ｍｇ／ｍｌ，
総蛋白質量７．８２ｍｇ，相対活性７１４００、相対活
性量５５８６００）を得ることができた。得られた標品
は純粋なＴＰＯ標品ではなかったが、ラットＣＦＵ−Ｍ
Ｋアッセイ系において、十分に高い活性が確認されたの
で、マウスへの投与実験を実施した。即ち、投与前日に
血小板数を測定しておいたＩＣＲ系マウス（９週齢；
♂）の皮下へ、ＴＰＯ部分精製品（４７４μｇ（１００
μｌ）／マウス／日）、対照としてＢＳＡ（２００μｇ
（１００μｌ）／マウス／日）、あるいは対照としてＴ
ＰＯ部分精製品が溶解されている緩衝液と同じ組成の緩
衝液（１００μｌ／マウス／日）を５日間連日投与し、
６日目に心臓より採血して血小板数を測定した（Ｆ８０
０；東亜医用電子）。ＴＰＯ部分精製品投与マウスでは
投与前に比べて平均して約２．１４倍の血小板数の増加
を認めた。また、投与群の間で比較すると、ＴＰＯ部分
精製品投与マウスでは、ＢＳＡ投与マウスに比べて約
１．７４倍、あるいは緩衝液のみを投与したマウスに比
べて約１．９０倍の血小板数の増加を認めた。この結果
から、ＴＰＯが生体内において血小板増加作用を有する
ことが明らかとなった。なお、ＴＰＯ部分精製品投与マ
ウスにおいて、マウスの急性期蛋白質の１種であるｉｍ
ｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｉｖｅ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ（ＩＡＰ）の増加が認められなかったことか
ら、ＴＰＯは急性期蛋白質の誘導に関してＩＬ−６やＩ
Ｌ−１１とは性格を異にすることが強く示唆された。 ＜実施例１２＞ ラット各種組織でのＴＰＯｍＲＮＡの検出 ラットＴＰＯｍＲＮＡがラット体内においてどの組織で
発現しているかを確認するために、ラットの各種組織よ
りＲＮＡを抽出した。実施例１に記載されているものと
同様にＸ線照射を行なった１１日目ないし１４日目のラ
ット６匹より各種組織（脳、胸腺、肺、肝臓、心臓、脾
臓、小腸、腎職、精巣および骨髄細胞）を摘出し速やか
に液体窒素で凍結した。全ＲＮＡの抽出にはＲＮＡ単離
用試薬ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬）を使用した。凍結した
組織の重量に応じた量のＩＳＯＧＥＮ試薬を加え、ホモ
ジナイザー（ヒスコトロン；日音医理科器械製作所；Ｎ
Ｓ−６０）により、組織が完全に破砕されるまで（およ
そ１００００ＲＰＭで４５〜６０秒）処理した後、全Ｒ
ＮＡ抽出操作を行なった（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらの
Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ Ｐｈｅｎｏｌ Ｃｈｒ
ｏｌｏｆｏｒｍ法にもとづく抽出法：Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．、１６２：１５６−１５９、１９８７を参
照）。その結果、それぞれの組織より１．１ｍｇ〜５．
６ｍｇの全ＲＮＡが得られた。全ＲＮＡからポリ（Ａ）
＋ＲＮＡの精製はＯｌｉｇｏｔｅｘ ＴＭ−ｄＴ３０
（Ｓｕｐｅｒ）（日本合成ゴム／日本ロッシュ社製）を
用いて行い全ＲＮＡ約５００μｇより２０μｇのポリ
（Ａ）＋ＲＮＡを得た。得られた各種組織のポリ（Ａ）
＋ＲＮＡそれぞれ１μｇよりランダムプライマーを使用
してｃＤＮＡの１本鎖目を合成した。ポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａ １μｇを１０μｌの滅菌水に溶かし７０℃で１５分
間加温後急冷し、７５ｐｍｏｌｅランダムプライマー
（宝酒造社製）、１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ（ベーリンガーマンハイム社製）、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２、２００Ｕ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ
ＴＭＩＩ（ライフテクノロジー社製逆転写酵素）となる
ようにそれぞれの試薬を加え（全量２０μｌ）、３７℃
で１時間保温した。反応液を７０℃で１０分間加熱し酵
素を失活させた後−２０℃で使用時まで保存した。実施
例１０で得られたラットＴＰＯのｃＤＮＡ配列より新た
にＰＣＲ用プライマーを合成した。合成したプライマー
の配列は以下の通り。 合成したｃＤＮＡ反応液のそれぞれ０．１容を鋳型に用
いここで合成したプライマー（ｒＴＰＯ−Ｉ、ｒＴＰＯ
−Ｎ）をそれぞれ１μＭ使用してＰＣＲを実施した。Ｇ
ｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｗ
ｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭ
ＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５
℃で２分間加熱後、９５℃で１分間の変性条件、５７℃
で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で
３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベ
ート）を行った。ここで得られた反応液を、２％アガロ
ースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用
いた電気泳動にかけ増幅されたバンドを観察したとこ
ろ、脳、肝臓、小腸並びに腎臓で特異的と考えられるバ
ンドが観察された。この結果より、発現量の多少は判断
できないがラットにおいてはこれらの組織でＴＰＯｍＲ
ＮＡが発現していると考えられた。人においても同様な
発現様式を示すことが示唆されるが実施例４の結果と合
わせて考えると、肝臓がヒトＴＰＯｃＤＮＡ取得のため
の出発材料としては適当であると判断された。 ＜実施例１３＞ ヒト正常肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーの構築 実施例１２の結果より、肝臓をヒトＴＰＯｃＤＮＡクロ
ーニングのための材料に選び、市販の正常ヒト肝臓由来
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：ｃｈｏｍ
ｃｚｙｎｓｋｉらのＡｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ Ｐ
ｈｅｎｏｌ Ｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍ法にもとづいて抽出
したもの）５μｇを用い実施例７と同様にＴｉｍｅＳａ
ｖｅｒＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）およびＤＩＲＥＣＴＩＯＮ
ＡＬ ＣＬＯＮＩＮＧ ＴＯＯＬＢＯＸ （Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社製）を使用して、５’端にＥｃｏＲＩ、３’
端にＮｏｔＩ認識部位を持つ２本鎖ｃＤＮＡを合成し
た。合成したｃＤＮＡは１．２μｇの予めＥｃｏＲＩお
よびＮＯｔＩで処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓと連
結させ、８．４ｍｌのコンピテント・ハイ Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。その結
果、１．２×１０６個の形質転換体が得られた。 ＜実施例１４＞ ＰＣＲによるヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得（クローニ
ング） 市販の正常ヒト肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ社製）１μｇよりランダムプライマーを使用し
てｃＤＮＡの１本鎖目を合成した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ
１μｇを１０μｌの滅菌水に溶かし７０℃で１５分間加
温後急冷し、７５ｐｍｏｌｅ ランダムプライマー（宝
酒造社製）、１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
（ベーリンガーマンハイム社製）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ
ＭｇＣｌ２、２００Ｕ Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ
ＩＩ（ライフテクノロジー社製）となるようにそれぞれ
の試薬を加え（全量２０μｌ）、３７℃で１時間保温し
た。反応液を７０℃で１０分間加熱し酵素を失活させた
後−２０℃で使用時まで保存した。ラットＴＰＯｃＤＮ
Ａ配列（配列番号２）よりＰＣＲ用プライマーを合成し
た。プライマーの配列は以下の通り。 合成したｃＤＮＡ反応液の０．１容を鋳型に用いここで
合成したプライマー（ｒＴＰＯ−ＡＩＮ、ｒＴＰＯ−
Ｎ）をそれぞれ１μＭ使用してＰＣＲを実施した。Ｇｅ
ｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉ
ｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ （宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭ
ＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５
℃で２分間加熱後、９５℃で１分間の変性条件、４０℃
で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で
３５回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベ
ート）を行った。ここで得られた反応液を、２％アガロ
ースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用
いた電気泳動にかけ、このＰＣＲ反応の主要産物である
約６２０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジ
ーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精
製した。この精製したＤＮＡ断片をＴａｑ Ｄｙｅ Ｄ
ｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅ
ｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ
社製）を用いて、アプライドバイオシステムズ社製３７
３ＡＤＮＡシークエンサーにより直接シークエンスし塩
基配列を決定した。プライマー部分を除く塩基配列およ
びそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号
３）に示した。このＤＮＡ断片はプライマー配列を除く
と５８０ｂｐの長さを有し、ラットｃＤＮＡ塩基配列と
の比較を行なった結果、８６％の相同性を持つことが明
かとなり、ヒトＴＰＯｃＤＮＡの一部をコードするＤＮ
Ａ断片であると考えられた。 ＜実施例１５＞ ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯｃＤＮＡのスクリーニング 配列表−配列番号３をもとにヒトＴＰＯに対応するＰＣ
Ｒ用プライマーを合成した。配列は以下の通り。 実施例１３において構築したヒトｃＤＮＡライブラリー
を増幅し約１０万個のクローンを１個の集団とするプー
ルに分割し、５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含
む１ｍｌのＬＢ培地中で一夜培養した後、プラスミド自
動分離装置ＰＩ−１００（倉敷紡績社製、ＶＥＲ−３．
０）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤ
ＮＡはＴＥ溶液に溶解した。抽出したＤＮＡの５％を鋳
型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−Ｉ、
ｈＴＰＯ−Ｊ）をそれぞれ１μＭ使ってＰＣＲを実施し
た。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉ
ｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ
ＴＭＰＣＲＳｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−Ｅ
ＬＭＥＲ社製）により２０μｌの容量でＰＣＲ反応（９
５℃で１分間の変性条件、５９℃で１分間のアニール条
件、７２℃で１分間の合成条件で３５回の反応を行い、
さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った結果、
９０プール中３プールで特異的と考えられるバンドが検
出された。これらのうち１プールを選び、約５０００ク
ローンづつのプールに分け９０プールよりプラスミドＤ
ＮＡを精製し、再度同一の条件でＰＣＲを実施した。そ
の結果、５個のプールでバンドが検出された。これらよ
り１プールを選択し２５０個のクローンを１プールとす
るサブプールに分け、９０プールについてプラスミドＤ
ＮＡを抽出した。これらについて同様にＰＣＲを行なっ
た処、３個のプールでバンドが観察された。これらより
１プールを選択し３０個のクローンを１プールとしてサ
ブプールを作り、９０プールからプラスミドＤＮＡを精
製しＰＣＲを実施した結果３個のプールでバンドが観察
された。これらのうち１プールを選び５０μｇ／ｍｌの
Ａｍｐｉｃｉｌｉｎを含むＬＢプレート上にまき、９０
個のコロニーについて同様にプラスミドＤＮＡを抽出し
ＰＣＲによる確認を行なった結果、最終的にクローンＨ
Ｌ３４を得た。 ＜実施例１６＞ ヒトＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして
実施した。クローンＨＬ３４を５０μｇ／ｍｌのＡｍｐ
ｉｃｉｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した
後、遠心分離により得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙｓ
ｏｚｙｍｅ溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ
／１％ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ
ｐｏｔａｓｓｉｕｍ／５Ｍ ａｃｅｔａｔｅ溶液を６ｍ
ｌ加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフ
ェノール−クロロホルム（１：１）処理後、等量のイソ
プロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレッ
トはＴＥ溶液に溶解後、ＲＮＡｓｅ処理、フェノール−
クロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を
行なう。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、ＮａＣｌ、
ポリエチレングリコール３０００をそれぞれ０．６３
Ｍ、７．５％になるように加えて遠心する。最後に、ペ
レットはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。こ
れにより約３００μｇのプラスミドＤＮＡ ｐＥＦ１８
Ｓ−ＨＬ３４を得た。精製したプラスミドＤＮＡについ
てＴａｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅ
ｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプラ
イドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオ
システムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシ
ークエンスし、全長の塩基配列を決定した。塩基配列お
よびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番
号４）に示した。塩基配列決定に必要なプライマーは配
列番号３の配列をもとに合成したプライマー並びに、そ
れらのプライマーによるシークエンス反応で解析された
内部配列をもとに設計した合成プライマーを使用した。
その結果、得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ−
ＨＬ３４は８６１塩基対のｃＤＮＡ断片を含み、実施例
２で分析されたラットＴＰＯの部分アミノ酸配列ＡＰ８
（配列番号４：アミノ酸番号１〜１２）及びＴＰ２／Ｔ
Ｐ３（配列番号４：アミノ酸番号１５７〜１６２）と相
同性の高い配列が確認された。このＤＮＡ断片は、２５
塩基目から始まるオープンリーディングフレームをコー
ドしていると考えられたが、終止コドンは無く３’端に
は７６塩基からなるポリＡ尾部様配列を持っていた。ポ
リＡ尾部様配列直前までの２５３個のアミノ酸配列はラ
ットＴＰＯｃＤＮＡのもの（配列番号２の１４７残基の
アミノ酸配列部分）と比較すると８４％の相同性を持っ
ておりラットＴＰＯに対応するヒトのｃＤＮＡの一部を
コードするＤＮＡ断片と考えられた。終止コドンが無く
３’端にポリＡ尾部様配列を持っていたことから、この
クローンは完全なｃＤＮＡを反映するものではなく、ｃ
ＤＮＡライブラリー作製時の人工産物であることが示唆
された。 ＜実施例１７＞ ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣＯＳ１細胞での発現〜活性確認 得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８−ＨＬ３４のＣ
ＯＳ １細胞へのトランスフェクションは、実施例１１
に従って行なった。すなわちプラスミＤＮＡ１０μｇを
使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法
を用いたトランスフェクションを行ない、３日ないし５
日後に培養上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤ
Ｍ培養液に対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫア
ッセイ系で評価した。その結果、ｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３
４をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞
培養上清では用量依存的にＴＰＯ活性が認められ（図
８）、また、培養４日目に多数の巨核球による突起形成
が観察された。一方、インサートを含まない発現プラス
ミドをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清
では活性が認められなかった（図８）。また、Ｍ−０７
ｅアッセイ系においてもｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４をトラ
ンスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清
にのみＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性が認められた。これ
らの結果から、ｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４がＴＰＯ活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子ｃＤＮＡ断片を担
持していることが判明した。また、ヒトＴＰＯがラット
にも作用する（種特異性がない）ことも明らかとなっ
た。 ＜実施例１８＞ ヒトＴＰＯ欠失型ｃＤＮＡの発現〜活性確認 実施例１５で得られたクローンＨＬ３４のヒトＴＰＯｃ
ＤＮＡは、その３’側にポリＡ尾部様の連続するアデニ
ン配列を持っていたが、この配列はラットＴＰＯｃＤＮ
Ａには観られず実験上の人工産物である可能性が示唆さ
れた。そこで、このポリＡ尾部様の連続するアデニン配
列を欠失させたｃＤＮＡを作製し、発現させた蛋白質が
ＴＰＯとしての活性を示すか検討した。欠失体の作製に
はＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用プライマーの配列を表９
に示す。それぞれの５’端には制限酵素認識配列を付加
してある（ｈＴＰＯ５にはＥｃｏＲＩ、ｈＴＰＯ３には
ＮｏｔＩ並びに２つのストップコドンＴＡＡＴＧＡを付
加した）。
３μｇを鋳型とし、ＡＰ８−１Ｒ（５００ｐｍｏｌ）、
ＥＦ１ α−１（１００ｐｍｏｌ）をプライマーとし
て、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉ
ｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＴＭＤＮＡ Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製；ＰＣＲ用耐熱性ＴａｑＩ
ポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰのセット）を
用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９
６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製；ＰＣＲ用反応
機）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で２
分間加熱後、９５℃で１分間の変性条件、４０℃で１分
間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３５回
の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）
を行った。増幅されたＤＮＡ断片の特異性を上げるため
に、得られたＰＣＲ反応液１μｌを鋳型とし、ＥＦ１
α−２（１００ｐｍｏｌ）、ＡＰ８−２Ｒ（５００ｐｍ
ｏｌ）をプライマーとして、同様に１００μｌの容量で
ＰＣＲ反応（９５℃で２分間加熱後、９５℃で１分間の
変性条件、４５℃で１分間のアニール条件、７２℃で１
分間の合成条件で３５回の反応を行い、さらに７分間７
２℃でインキュベート）を行った。ここで得られた反応
液を、２％アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕ
ｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、このＰＣＲ反応
の主要産物である約３３０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、
プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド
社製）を用いて精製した。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（ライフテクノロジー社製）を用いてｐＣＲ
ＴＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製；ＰＣＲ産物ＴＡ
クローニング用ベクター：ＰＣＲに使用する耐熱性ポリ
メラーゼが末端トランスフェラーゼ活性を有するため
に、ＰＣＲで増幅したＤＮＡの３’末端にデオキシアデ
ニル酸を１個付加する性質を利用し、５’−ｄＴ突出末
端を持つベクターｐＣＲＴＭＩＩにそのままサブクロー
ニングする方法）ベクターにサブクローンした。任意に
選択した２８クローンについてＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ１
００（ＤＩＡＧＥＮ社製）を使用してプラスミドＤＮＡ
を精製し、これをＴａｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅ
ｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｉｎｇＫ
ｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製；ＰＣＲを利用
した、蛍光色素で行なうジデオキシ法：Ｓａｎｇｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
７４、５４６３−５４６７、１９７７）を用いて、アプ
ライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエン
サー（蛍光シークエンサー）によりシークエンスし、各
クローンの塩基配列を決定した。得られたＤＮＡ断片の
中で、ＡＰ８のアミノ酸のＮ末端側３個（Ｉｌｅ／Ｔｈ
ｒ／Ｓｅｒ）−Ｖａｌ−ＰｒｏをＡＰ８−２Ｒのプライ
マーに隣接してコードするものを選択し、全長をシーク
エンスしたところ、２６１ｂｐを有するｃＤＮＡを含ん
でいた。このｃＤＮＡ断片の１７３〜１７５の塩基配列
はメチオニンをコードするものでありコーディングのフ
レームはＡＰ８のアミノ酸のフレームと一致した。また
この配列の前後はＫｏｚａｋの配列（Ｋｏｚａｋ，
Ｍ．，Ｃｅｌｌ，４４，２８３−２９２、１９８６）に
適合することから翻訳の開始部位と推定され、ラットＴ
ＰＯタンパク質のＮ末部分をコードするｃＤＮＡ断片と
考えられた。このｃＤＮＡ断片をＡ１と命名した。ベク
ターの配列を除いたＡ１断片の塩基配列およびそれから
演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号１）に示し
た。 ＜実施例９＞ ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡのスクリーニング 前述のｃＤＮＡライブラリーを約１万クローンづつのプ
ールに分け、５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含
む１ｍｌのＬＢ培地中で一夜培養した後、プラスミド自
動分離装置ＰＩ−１００（倉敷紡績社製、ＶＥＲ−３．
０；アルカリＳＤＳ法：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９８９］：の変法にもとづくプラスミドＤＮＡ自
動抽出機）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。その
１／３０量を鋳型としてフラグメントＡ１をもとに設計
した２種の合成オリゴヌクレオチド ５’ＣＧＡＧＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧ３’
（配列番号１の配列の１−１７のセンス配列；ＣＧＡＧ
はアダプターの配列）および５’ＣＡＧＡＧＴＴＡＧＴ
ＣＴＴＧＣＧＧＴＧＡＧ３’（配列番号１の配列の２１
２−２３２のアンチセンス配列）をプライマーとして合
成・精製し、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎ
ｔＫｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、Ｇｅｎｅ
ＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００（ＰＥＲＫＩ
Ｎ−ＥＬＭＥＲ社製）によりＰＣＲ反応（９４℃で３０
秒間の変性条件、６６℃で３０秒間のアニール条件、７
２℃で１分間の合成条件で３０回の反応）を行った結
果、１００プール中３プールに２３６ｂｐの特異的バン
ドが検出された。このうちの１プールを約９００クロー
ンづつのプールに分けプラスミドＤＮＡを抽出し、同様
のＰＣＲ反応を行ったところ、１００プール中３プール
にバンドが検出された。さらにこのうちの１プールを４
０クローンづつのプールに分け、同様の選別を行なった
結果１００プール中３プールで特異的と考えられるバン
ドが観察された。これらのうち１プールを選び５０μｇ
／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含むＬＢプレート（１５
％アガーを含むＬＢ培地）上に蒔き、出現した１つ１つ
のコロニーについてプラスミドＤＮＡを抽出し同様のＰ
ＣＲ反応を行った結果、１００クローン中２クローンで
陽性バンドを検出した。 ＜実施例１０＞ ラットＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実
施した。実施例９で最終的に得られた２個のクローンを
５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含む５０ｍｌの
ＬＢ培地で一夜培養した後、実施例５と同様に精製し、
最終的に約３００μｇのプラスミドＤＮＡを得た。ここ
で得られたプラスミドＤＮＡをＴａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏ
ｘｙＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社
製）を用いて、実施例８と同様にシークエンスし、ｃＤ
ＮＡ全長の塩基配列を決定した。その結果、２個のクロ
ーンの塩基配列は完全に一致し同一のクローンであるこ
とが明かとなった。この中から１クローンを選び該ｃＤ
ＮＡを担持したプラスミドクローンをｐＥＦ１８Ｓ−Ａ
２αと命名した。塩基配列およびそれから演繹されるア
ミノ酸配列を配列表（配列番号２）に示した。配列表
（配列番号２）に示す配列の特徴は顕著である。１７２
ｂｐの５’非翻訳領域後の配列は、メチオニンに始まる
２１個のタンパク質から成る分泌のためのシグナル配列
と推定される、疎水性に富むアミノ酸をコードしてい
る。このタンパク質は１２６個のアミノ酸残基を有し、
停止コドン（ＴＡＡ）の後に１０２２塩基の３’非翻訳
配列及びポリＡ尾部の多数のアデニンが続く。このタン
パク質中には、実施例２で解析された部分アミノ酸配列
ＡＰ８に対応する配列のみが含まれていた（配列番号２
におけるアミノ酸番号１〜１２）。Ｎ−グリコシル化の
ための配列部位は存在しない。また、３’非翻訳配列末
端近くの１６２４〜１６２９の塩基配列は、コンセンサ
ス配列とは異なるが、潜在的ポリアデニル化配列と考え
られる。大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＥＦ１８
Ｓ−Ａ２αは１９９４年２月１４日付で通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５６５として寄託した。これはまた、１９９５年
３月２２日付で中華民国食品工業発展研究所（ＦＩＲＤ
Ｉ）に受託番号９４００８３として寄託した。 ＜実施例１１＞ ラットＴＰＯｃＤＮＡのＣＯＳ１細胞での発現〜活性確
認 プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αのＣＯＳ１細胞へのト
ランスフェクションは、クロロキン処理を含むＤＥＡＥ
−デキストラン法（ｓｏｍｐａｙｒａｃら、Ｐｒｏｃ・
Ｎａｎｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８巻、７５７
５−７５７８頁、（１９８１）；Ｌｕｔｈｍａｎら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１１巻、１２９５−１
３０８頁、（１９８３））に若干の改変を加えた以下の
方法に従い実施した。１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養
液に浮遊させたＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
０）を直径１００ｍｍの組織培養用プラスティックシャ
ーレに入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で約４０
％コンフルエントになるまで培養した。一方、５００μ
ｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア
社）、８０μＭのクロロキン（シグマ社）、８％（ｖ／
ｖ）のＨＢＳ（２１ｍＭＨＥＰＥＳ−１４５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ ７．１）及び９％（ｖ／ｖ）のＮｕ−Ｓｅ
ｒｕｍ（コラボレイティブ社）を含む４ｍｌのＤＭＥＭ
培養液に３０μｌのＨＢＳに溶解したプラスミドｐＥＦ
１８Ｓ−Ａ２α（１０μｇ）を混和し、トランスフェク
ション直前にＤＭＥＭ培養液で２度洗浄した上記のＣＯ
Ｓ１細胞に添加した後、５％炭酸ガス培養器中にて３７
℃で５時間培養した。その後、培養上清を吸引除去しＤ
ＭＥＭ培養液でシャーレを２度洗浄した後、１０％ＦＣ
Ｓを含むＤＭＥＭ培養液を１５ｍｌ加え、５％炭酸ガス
培養器中にて３７℃で３日ないしは５日間培養し、培養
上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に
対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で
評価した。その結果、プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２α
をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞の
培養上清中に用量依存的にＴＰＯ活性が認められ（図
７）、また、ラットＴＰの場合と同様に培養４日目に多
数のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ形成が認められた。一方、インサートを含
まないプラスミドｐＥＦ１８Ｓをトランスフェクション
したＣＯＳ１細胞培養上清ではＴＰＯ活性は検出されな
かった（図７）。また、Ｍ−０７ｅアッセイ系において
も、プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αをトランスフェク
ションして発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中に用量
依存的にＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性が認められ、イン
サートを含まないプラスミドｐＥＦ１８Ｓをトランスフ
ェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認めら
れなかった。これらの結果から、ｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２α
がＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を
担持していることが確認された。次に、このＴＰＯ活性
の血小板増加作用を調べるため、部分精製品を調製し
た。調製過程でのＴＰＯ活性測定には、ラットＣＦＵ−
ＭＫアッセイ系を用いた。まず、プラスミドｐＥＦ１８
Ｓ−Ａ２αをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞
を、０．２ｍｇのＢＳＡを含む無血清培養液で３日間培
養し、約５．８Ｌの無血清培養上清を得た。その無血清
培養上清に、ｐ−ＡＰＭＳＦを最終濃度１ｍＭ加え、
０．２２μｍの濾過フィルターで通過する濾液をとっ
た。この体積５７９３ｍｌ（蛋白質濃度０．２２９ｍｇ
／ｍｌ、総蛋白質量１３２６ｍｇ、相対活性１０００、
相対活性量１３２６０８０）に対し１０００ｍｌ当り
０．８５ｍｏｌｅｓ のＮａＣｌ（合計２８８ｇ）を加
え、最終濃度０．８２２Ｍ ＮａＣｌ，５８４９ｍｌの
溶液とした後、１Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＮａＰｈｏ
ｓｐｈａｔｅ ｐＨ７．２で予め平衡化してあったＴＳ
Ｋ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５０ ＭＨカラム（ト
ーソー社製、カタログ番号０８７０５；直径５ｃｍ、ベ
ッド高 ６ｃｍ）に、流速７ｍｌ／ｍｉｎで添加した。
添加終了後、２０ｍＭＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ，１Ｍ
ＮａＣｌ，ｐＨ７．２で溶出される素通り（約７９００
ｍｌ）を集め、これを限外濾過ユニット（フィルトロン
社・オメガウルトラセット 分子量８０００カット）で
濃縮し、素通り画分Ｆ１（４６０ｍｌ，蛋白質濃度２，
１１ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量９７３ｍｇ，相対活性１
６．３）を得た。次に、溶出液を２Ｍ ＮａＳＣＮにか
え、溶出されたＴＳＫ−ｇｅｌ ＡＦ−ＢＬＵＥ ６５
０ＭＨ 吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（２８４０ｍｌ）を限
外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径７６ｍ
ｍ）を用いて、６．８１ｍｌまで濃縮した。このＴＰＯ
活性画分Ｆ２の総蛋白質量は１２．５ｍｇ、このステッ
プでのＦ２の蛋白質収量は０．６２％であった。また、
ＴＰＯの相対活性は、２４０であった。次に、ＨｉＬｏ
ａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（フ
ァルマシア バイオテク社製、カタログ番号１７−１０
７１−０１；直径２．６ｃｍ、ベッド高 ６０ｃｍ）カ
ラムに注入し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、５０ｍＭのＮａ
ｃｌを含む２０ｍＭ Ｎａ Ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ５．
５で展開した。展開開始後に溶出した１９４ｍｌから２
６０ｍｌまでの範囲の画分にＴＰＯ活性が確認できた。
そこで、これをまとめて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐ
ｇのＴＰＯ活性画分Ｆ２（６６ｍｌ，蛋白質濃度０．１
１２ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量７．４１ｍｇ，相対活性１
４２８６０、相対活性量１０５８６００）とした。次
に、展開溶媒Ａ（２０ｍＭ Ｎａ Ａｃｅｔａｔｅ，ｐ
Ｈ５．５）および展開溶媒Ｂ（５００ｍＭのＮａｃｌを
含む２０ｍＭ Ｎａ Ｐｈｏｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２）
を用意し、１００％Ａで平衡化した強陽イオン交換カラ
ムのＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｓ（ファルマシア バイオテク
社製、カタログ番号１７−１１７８−０１；直径 ０．
６４ｃｍ、ベッド高 ３ｃｍ）カラムに、流速１ｍｌ／
ｍｉｎで、注入した。次いで、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ
で、４０分かけて１００％Ａから１００％Ｂまでの直線
濃度勾配にて展開した。アッセイの結果、広い範囲（５
％Ｂから３２％Ｂの範囲）にＴＰＯ活性が溶出されてい
ることが分かった。このＴＰＯ活性画分をまとめて、限
外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径２５ｍ
ｍ）で濃縮し、ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＳのＴＰＯ活性画分
Ｆ２（１．６５ｍｌ，蛋白質濃度４．７４ｍｇ／ｍｌ，
総蛋白質量７．８２ｍｇ，相対活性７１４００、相対活
性量５５８６００）を得ることができた。得られた標品
は純粋なＴＰＯ標品ではなかったが、ラットＣＦＵ−Ｍ
Ｋアッセイ系において、十分に高い活性が確認されたの
で、マウスへの投与実験を実施した。即ち、投与前日に
血小板数を測定しておいたＩＣＲ系マウス（９週齢；
♂）の皮下へ、ＴＰＯ部分精製品（４７４μｇ（１００
μｌ）／マウス／日）、対照としてＢＳＡ（２００μｇ
（１００μｌ）／マウス／日）、あるいは対照としてＴ
ＰＯ部分精製品が溶解されている緩衝液と同じ組成の緩
衝液（１００μｌ／マウス／日）を５日間連日投与し、
６日目に心臓より採血して血小板数を測定した（Ｆ８０
０；東亜医用電子）。ＴＰＯ部分精製品投与マウスでは
投与前に比べて平均して約２．１４倍の血小板数の増加
を認めた。また、投与群の間で比較すると、ＴＰＯ部分
精製品投与マウスでは、ＢＳＡ投与マウスに比べて約
１．７４倍、あるいは緩衝液のみを投与したマウスに比
べて約１．９０倍の血小板数の増加を認めた。この結果
から、ＴＰＯが生体内において血小板増加作用を有する
ことが明らかとなった。なお、ＴＰＯ部分精製品投与マ
ウスにおいて、マウスの急性期蛋白質の１種であるｉｍ
ｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｉｖｅ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ（ＩＡＰ）の増加が認められなかったことか
ら、ＴＰＯは急性期蛋白質の誘導に関してＩＬ−６やＩ
Ｌ−１１とは性格を異にすることが強く示唆された。 ＜実施例１２＞ ラット各種組織でのＴＰＯｍＲＮＡの検出 ラットＴＰＯｍＲＮＡがラット体内においてどの組織で
発現しているかを確認するために、ラットの各種組織よ
りＲＮＡを抽出した。実施例１に記載されているものと
同様にＸ線照射を行なった１１日目ないし１４日目のラ
ット６匹より各種組織（脳、胸腺、肺、肝臓、心臓、脾
臓、小腸、腎職、精巣および骨髄細胞）を摘出し速やか
に液体窒素で凍結した。全ＲＮＡの抽出にはＲＮＡ単離
用試薬ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬）を使用した。凍結した
組織の重量に応じた量のＩＳＯＧＥＮ試薬を加え、ホモ
ジナイザー（ヒスコトロン；日音医理科器械製作所；Ｎ
Ｓ−６０）により、組織が完全に破砕されるまで（およ
そ１００００ＲＰＭで４５〜６０秒）処理した後、全Ｒ
ＮＡ抽出操作を行なった（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらの
Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ Ｐｈｅｎｏｌ Ｃｈｒ
ｏｌｏｆｏｒｍ法にもとづく抽出法：Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．、１６２：１５６−１５９、１９８７を参
照）。その結果、それぞれの組織より１．１ｍｇ〜５．
６ｍｇの全ＲＮＡが得られた。全ＲＮＡからポリ（Ａ）
＋ＲＮＡの精製はＯｌｉｇｏｔｅｘ ＴＭ−ｄＴ３０
（Ｓｕｐｅｒ）（日本合成ゴム／日本ロッシュ社製）を
用いて行い全ＲＮＡ約５００μｇより２０μｇのポリ
（Ａ）＋ＲＮＡを得た。得られた各種組織のポリ（Ａ）
＋ＲＮＡそれぞれ１μｇよりランダムプライマーを使用
してｃＤＮＡの１本鎖目を合成した。ポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａ １μｇを１０μｌの滅菌水に溶かし７０℃で１５分
間加温後急冷し、７５ｐｍｏｌｅランダムプライマー
（宝酒造社製）、１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ（ベーリンガーマンハイム社製）、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２、２００Ｕ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ
ＴＭＩＩ（ライフテクノロジー社製逆転写酵素）となる
ようにそれぞれの試薬を加え（全量２０μｌ）、３７℃
で１時間保温した。反応液を７０℃で１０分間加熱し酵
素を失活させた後−２０℃で使用時まで保存した。実施
例１０で得られたラットＴＰＯのｃＤＮＡ配列より新た
にＰＣＲ用プライマーを合成した。合成したプライマー
の配列は以下の通り。 合成したｃＤＮＡ反応液のそれぞれ０．１容を鋳型に用
いここで合成したプライマー（ｒＴＰＯ−Ｉ、ｒＴＰＯ
−Ｎ）をそれぞれ１μＭ使用してＰＣＲを実施した。Ｇ
ｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｗ
ｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭ
ＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５
℃で２分間加熱後、９５℃で１分間の変性条件、５７℃
で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で
３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベ
ート）を行った。ここで得られた反応液を、２％アガロ
ースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用
いた電気泳動にかけ増幅されたバンドを観察したとこ
ろ、脳、肝臓、小腸並びに腎臓で特異的と考えられるバ
ンドが観察された。この結果より、発現量の多少は判断
できないがラットにおいてはこれらの組織でＴＰＯｍＲ
ＮＡが発現していると考えられた。人においても同様な
発現様式を示すことが示唆されるが実施例４の結果と合
わせて考えると、肝臓がヒトＴＰＯｃＤＮＡ取得のため
の出発材料としては適当であると判断された。 ＜実施例１３＞ ヒト正常肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーの構築 実施例１２の結果より、肝臓をヒトＴＰＯｃＤＮＡクロ
ーニングのための材料に選び、市販の正常ヒト肝臓由来
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：ｃｈｏｍ
ｃｚｙｎｓｋｉらのＡｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ Ｐ
ｈｅｎｏｌ Ｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍ法にもとづいて抽出
したもの）５μｇを用い実施例７と同様にＴｉｍｅＳａ
ｖｅｒＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）およびＤＩＲＥＣＴＩＯＮ
ＡＬ ＣＬＯＮＩＮＧ ＴＯＯＬＢＯＸ （Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社製）を使用して、５’端にＥｃｏＲＩ、３’
端にＮｏｔＩ認識部位を持つ２本鎖ｃＤＮＡを合成し
た。合成したｃＤＮＡは１．２μｇの予めＥｃｏＲＩお
よびＮＯｔＩで処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓと連
結させ、８．４ｍｌのコンピテント・ハイ Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。その結
果、１．２×１０６個の形質転換体が得られた。 ＜実施例１４＞ ＰＣＲによるヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得（クローニ
ング） 市販の正常ヒト肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ社製）１μｇよりランダムプライマーを使用し
てｃＤＮＡの１本鎖目を合成した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ
１μｇを１０μｌの滅菌水に溶かし７０℃で１５分間加
温後急冷し、７５ｐｍｏｌｅ ランダムプライマー（宝
酒造社製）、１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
（ベーリンガーマンハイム社製）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ
ＭｇＣｌ２、２００Ｕ Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ
ＩＩ（ライフテクノロジー社製）となるようにそれぞれ
の試薬を加え（全量２０μｌ）、３７℃で１時間保温し
た。反応液を７０℃で１０分間加熱し酵素を失活させた
後−２０℃で使用時まで保存した。ラットＴＰＯｃＤＮ
Ａ配列（配列番号２）よりＰＣＲ用プライマーを合成し
た。プライマーの配列は以下の通り。 合成したｃＤＮＡ反応液の０．１容を鋳型に用いここで
合成したプライマー（ｒＴＰＯ−ＡＩＮ、ｒＴＰＯ−
Ｎ）をそれぞれ１μＭ使用してＰＣＲを実施した。Ｇｅ
ｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉ
ｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ （宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭ
ＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５
℃で２分間加熱後、９５℃で１分間の変性条件、４０℃
で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で
３５回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベ
ート）を行った。ここで得られた反応液を、２％アガロ
ースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用
いた電気泳動にかけ、このＰＣＲ反応の主要産物である
約６２０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジ
ーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精
製した。この精製したＤＮＡ断片をＴａｑ Ｄｙｅ Ｄ
ｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅ
ｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ
社製）を用いて、アプライドバイオシステムズ社製３７
３ＡＤＮＡシークエンサーにより直接シークエンスし塩
基配列を決定した。プライマー部分を除く塩基配列およ
びそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号
３）に示した。このＤＮＡ断片はプライマー配列を除く
と５８０ｂｐの長さを有し、ラットｃＤＮＡ塩基配列と
の比較を行なった結果、８６％の相同性を持つことが明
かとなり、ヒトＴＰＯｃＤＮＡの一部をコードするＤＮ
Ａ断片であると考えられた。 ＜実施例１５＞ ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯｃＤＮＡのスクリーニング 配列表−配列番号３をもとにヒトＴＰＯに対応するＰＣ
Ｒ用プライマーを合成した。配列は以下の通り。 実施例１３において構築したヒトｃＤＮＡライブラリー
を増幅し約１０万個のクローンを１個の集団とするプー
ルに分割し、５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含
む１ｍｌのＬＢ培地中で一夜培養した後、プラスミド自
動分離装置ＰＩ−１００（倉敷紡績社製、ＶＥＲ−３．
０）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤ
ＮＡはＴＥ溶液に溶解した。抽出したＤＮＡの５％を鋳
型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−Ｉ、
ｈＴＰＯ−Ｊ）をそれぞれ１μＭ使ってＰＣＲを実施し
た。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉ
ｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ
ＴＭＰＣＲＳｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−Ｅ
ＬＭＥＲ社製）により２０μｌの容量でＰＣＲ反応（９
５℃で１分間の変性条件、５９℃で１分間のアニール条
件、７２℃で１分間の合成条件で３５回の反応を行い、
さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った結果、
９０プール中３プールで特異的と考えられるバンドが検
出された。これらのうち１プールを選び、約５０００ク
ローンづつのプールに分け９０プールよりプラスミドＤ
ＮＡを精製し、再度同一の条件でＰＣＲを実施した。そ
の結果、５個のプールでバンドが検出された。これらよ
り１プールを選択し２５０個のクローンを１プールとす
るサブプールに分け、９０プールについてプラスミドＤ
ＮＡを抽出した。これらについて同様にＰＣＲを行なっ
た処、３個のプールでバンドが観察された。これらより
１プールを選択し３０個のクローンを１プールとしてサ
ブプールを作り、９０プールからプラスミドＤＮＡを精
製しＰＣＲを実施した結果３個のプールでバンドが観察
された。これらのうち１プールを選び５０μｇ／ｍｌの
Ａｍｐｉｃｉｌｉｎを含むＬＢプレート上にまき、９０
個のコロニーについて同様にプラスミドＤＮＡを抽出し
ＰＣＲによる確認を行なった結果、最終的にクローンＨ
Ｌ３４を得た。 ＜実施例１６＞ ヒトＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして
実施した。クローンＨＬ３４を５０μｇ／ｍｌのＡｍｐ
ｉｃｉｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した
後、遠心分離により得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙｓ
ｏｚｙｍｅ溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ
／１％ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ
ｐｏｔａｓｓｉｕｍ／５Ｍ ａｃｅｔａｔｅ溶液を６ｍ
ｌ加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフ
ェノール−クロロホルム（１：１）処理後、等量のイソ
プロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレッ
トはＴＥ溶液に溶解後、ＲＮＡｓｅ処理、フェノール−
クロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を
行なう。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、ＮａＣｌ、
ポリエチレングリコール３０００をそれぞれ０．６３
Ｍ、７．５％になるように加えて遠心する。最後に、ペ
レットはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。こ
れにより約３００μｇのプラスミドＤＮＡ ｐＥＦ１８
Ｓ−ＨＬ３４を得た。精製したプラスミドＤＮＡについ
てＴａｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅ
ｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプラ
イドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオ
システムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシ
ークエンスし、全長の塩基配列を決定した。塩基配列お
よびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番
号４）に示した。塩基配列決定に必要なプライマーは配
列番号３の配列をもとに合成したプライマー並びに、そ
れらのプライマーによるシークエンス反応で解析された
内部配列をもとに設計した合成プライマーを使用した。
その結果、得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ−
ＨＬ３４は８６１塩基対のｃＤＮＡ断片を含み、実施例
２で分析されたラットＴＰＯの部分アミノ酸配列ＡＰ８
（配列番号４：アミノ酸番号１〜１２）及びＴＰ２／Ｔ
Ｐ３（配列番号４：アミノ酸番号１５７〜１６２）と相
同性の高い配列が確認された。このＤＮＡ断片は、２５
塩基目から始まるオープンリーディングフレームをコー
ドしていると考えられたが、終止コドンは無く３’端に
は７６塩基からなるポリＡ尾部様配列を持っていた。ポ
リＡ尾部様配列直前までの２５３個のアミノ酸配列はラ
ットＴＰＯｃＤＮＡのもの（配列番号２の１４７残基の
アミノ酸配列部分）と比較すると８４％の相同性を持っ
ておりラットＴＰＯに対応するヒトのｃＤＮＡの一部を
コードするＤＮＡ断片と考えられた。終止コドンが無く
３’端にポリＡ尾部様配列を持っていたことから、この
クローンは完全なｃＤＮＡを反映するものではなく、ｃ
ＤＮＡライブラリー作製時の人工産物であることが示唆
された。 ＜実施例１７＞ ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣＯＳ１細胞での発現〜活性確認 得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８−ＨＬ３４のＣ
ＯＳ １細胞へのトランスフェクションは、実施例１１
に従って行なった。すなわちプラスミＤＮＡ１０μｇを
使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法
を用いたトランスフェクションを行ない、３日ないし５
日後に培養上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤ
Ｍ培養液に対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫア
ッセイ系で評価した。その結果、ｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３
４をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞
培養上清では用量依存的にＴＰＯ活性が認められ（図
８）、また、培養４日目に多数の巨核球による突起形成
が観察された。一方、インサートを含まない発現プラス
ミドをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清
では活性が認められなかった（図８）。また、Ｍ−０７
ｅアッセイ系においてもｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４をトラ
ンスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清
にのみＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性が認められた。これ
らの結果から、ｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４がＴＰＯ活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子ｃＤＮＡ断片を担
持していることが判明した。また、ヒトＴＰＯがラット
にも作用する（種特異性がない）ことも明らかとなっ
た。 ＜実施例１８＞ ヒトＴＰＯ欠失型ｃＤＮＡの発現〜活性確認 実施例１５で得られたクローンＨＬ３４のヒトＴＰＯｃ
ＤＮＡは、その３’側にポリＡ尾部様の連続するアデニ
ン配列を持っていたが、この配列はラットＴＰＯｃＤＮ
Ａには観られず実験上の人工産物である可能性が示唆さ
れた。そこで、このポリＡ尾部様の連続するアデニン配
列を欠失させたｃＤＮＡを作製し、発現させた蛋白質が
ＴＰＯとしての活性を示すか検討した。欠失体の作製に
はＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用プライマーの配列を表９
に示す。それぞれの５’端には制限酵素認識配列を付加
してある（ｈＴＰＯ５にはＥｃｏＲＩ、ｈＴＰＯ３には
ＮｏｔＩ並びに２つのストップコドンＴＡＡＴＧＡを付
加した）。
【表９】 実施例１６で得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ
−ＨＬ３４のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用
し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ５、ｈＴＰＯ３）各
１０μＭを使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐ
ＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｍ
ｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒
造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓ
ｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）に
より１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で１分間の
変性条件、６５℃で１分間のアニール条件、７２℃で１
分間の合成条件で１５回の反応を行い、さらに７分間７
２℃でインキュベート）を行った。得られた約８００ｂ
ｐのバンドを制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化
後精製し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ
１８Ｓにサブクローニングした。得られた形質転換体よ
り約８００ｂｐのＤＮＡ断片を含むクローンを５個選択
しプラスミドＤＮＡを大量調製した（方法は実施例５参
照）。それぞれのプラスミドについては、ＰＣＲで増幅
した部分の約８００ ｂｐ全領域に関して塩基配列の決
定を行ない実施例１６で解析した塩基配列（配列番号４
の１−７８０）と完全に一致していることを確認した。
このプラスミドクローンをｐＨＴ１−２３１と命名し
た。大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＴ１−２３
１は１９９４年２月１４日付で通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４５
６４として寄託した。これはまた、１９９５年３月２２
日付で中華民国 食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に
受託番号９４００８２として寄託した。得られたプラス
ミドのＣＯＳ１細胞での発現は実施例１１に従って行な
った。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しク
ロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いた
トランスフェクションを行ない、３日ないし５日後に培
養上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液
に対して透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価
した。その結果、ｐＨＴ１−２３１をトランスフェクシ
ョンして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清ではＴＰＯ活
性が認められ（図９）、また、培養４日目に多数の巨核
球による突起形成が観察された。一方、ｃＤＮＡインサ
ートを含まない発現プラスミドをトランスフェクション
したＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認められなかった
（図９）。また、Ｍ−０７ｅアッセイ系においてもｐＨ
Ｔ１−２３１をトランスフェクションして発現させたＣ
ＯＳ１細胞培養上清にのみＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性
が認められた。これらの結果から、ｐＨＴ１−２３１に
含まれるｃＤＮＡ断片はＴＰＯ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であることが明らかとなった。 ＜実施例１９＞ ＰＣＲによるヒトＴＰＯＣ末側領域のクローニング 実施例１５で得られたクローンＨＬ３４のヒトＴＰＯｃ
ＤＮＡはその３’末端にポリＡ尾部様配列を持ってお
り、３’部分は不完全なクローンであることが示唆され
た。そこで、ＰＣＲにより完全長の３’領域を取得する
ことを試みた。実施例１６で決定した塩基配列よりＰＣ
Ｒ用５’側プライマーを４種類合成した。
−ＨＬ３４のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用
し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ５、ｈＴＰＯ３）各
１０μＭを使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐ
ＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｍ
ｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒
造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓ
ｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）に
より１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で１分間の
変性条件、６５℃で１分間のアニール条件、７２℃で１
分間の合成条件で１５回の反応を行い、さらに７分間７
２℃でインキュベート）を行った。得られた約８００ｂ
ｐのバンドを制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化
後精製し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ
１８Ｓにサブクローニングした。得られた形質転換体よ
り約８００ｂｐのＤＮＡ断片を含むクローンを５個選択
しプラスミドＤＮＡを大量調製した（方法は実施例５参
照）。それぞれのプラスミドについては、ＰＣＲで増幅
した部分の約８００ ｂｐ全領域に関して塩基配列の決
定を行ない実施例１６で解析した塩基配列（配列番号４
の１−７８０）と完全に一致していることを確認した。
このプラスミドクローンをｐＨＴ１−２３１と命名し
た。大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＴ１−２３
１は１９９４年２月１４日付で通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４５
６４として寄託した。これはまた、１９９５年３月２２
日付で中華民国 食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に
受託番号９４００８２として寄託した。得られたプラス
ミドのＣＯＳ１細胞での発現は実施例１１に従って行な
った。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しク
ロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いた
トランスフェクションを行ない、３日ないし５日後に培
養上清を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液
に対して透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価
した。その結果、ｐＨＴ１−２３１をトランスフェクシ
ョンして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清ではＴＰＯ活
性が認められ（図９）、また、培養４日目に多数の巨核
球による突起形成が観察された。一方、ｃＤＮＡインサ
ートを含まない発現プラスミドをトランスフェクション
したＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認められなかった
（図９）。また、Ｍ−０７ｅアッセイ系においてもｐＨ
Ｔ１−２３１をトランスフェクションして発現させたＣ
ＯＳ１細胞培養上清にのみＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性
が認められた。これらの結果から、ｐＨＴ１−２３１に
含まれるｃＤＮＡ断片はＴＰＯ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であることが明らかとなった。 ＜実施例１９＞ ＰＣＲによるヒトＴＰＯＣ末側領域のクローニング 実施例１５で得られたクローンＨＬ３４のヒトＴＰＯｃ
ＤＮＡはその３’末端にポリＡ尾部様配列を持ってお
り、３’部分は不完全なクローンであることが示唆され
た。そこで、ＰＣＲにより完全長の３’領域を取得する
ことを試みた。実施例１６で決定した塩基配列よりＰＣ
Ｒ用５’側プライマーを４種類合成した。
【表１０】 また、３’側プライマーとしてはポリＡ部分直後からの
増幅を期待して３’端にミックスのヌクレオチドを４ベ
ース含む以下のプライマーを合成した。また、ミックス
部分を含まないアンカープライマーも合成した。
増幅を期待して３’端にミックスのヌクレオチドを４ベ
ース含む以下のプライマーを合成した。また、ミックス
部分を含まないアンカープライマーも合成した。
【表１１】 実施例１４と同様にヒト正常肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）１μｇよりｃＤＮＡの１
本鎖目を合成した。ただし、プライマーとしてはオリゴ
ｄＴプライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍｅＳ
ａｖｅｒＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ
に添付のものを０．５μｇ）を使用した。ｃＤＮＡ合成
の反応液の０．１容を鋳型として１回目のＰＣＲを実施
した。ＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇ
ｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （宝酒造社製）並びに、
ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００
（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）を用いた。プライマ
ーにはｈＴＰＯ−Ｈ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ｍｉｘ
（１０μＭ）を使用し５０μｌの容量で反応を行なった
（９６℃２分間の後に、９６℃ １分間／４８℃ １分
間／７２℃ １分間を１０サイクル反応し、さらに７２
℃ ７分間）。１回目の反応液の０．１容を鋳型として
２回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−
Ｋ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ｍｉｘ（１０μＭ）を使
用し５０μｌの容量で反応を行なった（９６℃２分間の
後に、９６℃ １分間／６３℃ １分間／７２℃ １分
間を１０サイクル反応し、さらに７２℃ ７分間）。２
回目の反応液の０．１容を鋳型として３回目のＰＣＲを
行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｎ（２０μＭ）及
びｈＴＰＯ３ｍｉｘ（１０μＭ）を使用し５０μｌの容
量で反応を行なった（９６℃ ２分間の後に、９６℃
１分間／６３℃ １分間／７２℃ １分間を１０サイク
ル反応し、さらに７２℃ ７分間）。３回目の反応液の
０．１容を鋳型として４回目のＰＣＲを行なった。プラ
イマーにはｈＴＰＯ−Ｏ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ｍ
ｉｘ（１０μＭ）を使用し５０μｌの容で反応を行なっ
た（９６℃ ２分間の後に、９６℃１分間／６３℃ １
分間／７２℃ １分間を１０サイクル反応し、さらに７
２℃１分間）。４回目の反応液の０．１容を鋳型として
５回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−
Ｏ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ａｎｃｈｏｒ（２０μ
Ｍ）を使用し５０μｌの容量で反応を行なった（９６℃
２分間の後に、９６℃ １分間／５８℃ １分間／７
２℃ １分間を１０サイクル反応し、さらに７２℃ ７
分間）。ここで得られた反応液を、２％アガロースゲル
（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気
泳動にかけ、このＰＣＲ反応の主要産物である約６００
ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮ
Ａ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。
この精製したＤＮＡ断片をＴａｑＤｙｅ Ｄｅｏｘｙ
ＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎ
ｉｎｇ Ｋｉｔ （アプライドバイオシステムズ社製）
を用いて、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤ
ＮＡシークエンサーにより直接シークエンスし塩基配列
を決定した。塩基配列およびそれから演繹されるアミノ
酸配列を配列表（配列番号５）に示した。このＤＮＡ断
片はプライマーｈＴＰＯ−Ｏに始まる１３０個のアミノ
酸をコードする塩基配列を持っており、さらに３’側に
１８０塩基以上の配列が続いていた（５７７塩基目以降
は解読できなかった）。このＤＮＡ断片にコードされる
グリシンに始まる３０個のアミノ酸配列は配列番号４で
記載したアミノ酸番号２０３〜２３２のアミノ酸配列と
一致した。同時に１番から９４番目までの塩基配列も配
列番号４の６９２〜７８５のものと一致していた。実施
例１７のｃＤＮＡ断片の解析及び本例のＰＣＲ増幅断片
の解析の結果より、配列番号６に記載するように、ヒト
ＴＰＯタンパク質は２１残基のシグナル配列を含む３５
３個のアミノ酸からなると推定される。なお、配列番号
６に示されたヒトＴＰＯタンパク質の成熟タンパク質部
分に相当するアミノ酸配列を配列番号１６として示し
た。 ＜実施例２０＞ ヒト正常肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーの再構築 実施例１５で得られたクローンＨＬ３４は、オープンリ
ーディングフレームに終止コドンを持たず、その３’末
端にポリＡ尾部様配列を持っておりｃＤＮＡ合成の際の
人工産物であることが考えられたため、新たに市販の正
常ヒト肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
社製）５μｇを用い、ｃＤＮＡライブラリーを構築し直
した。ｃＤＮＡの合成にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ
Ｌａｍｂｄａ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ λＣｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ並
びにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ ＲＮａｓｅＨ−
（ともにＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を
使用した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを熱変性後、Ｋｉｔに付
属のＮｏｔＩ配列付きオリゴｄＴをプライマーとして含
む２０μｌの反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．３／７５ｍＭＫＣｌ／３ｍＭ ＭｇＣｌ２／１ｍ
Ｍ ＤＴＴ／１ｍＭ ｄＮＴＰ／２００ＵＳｕｐｅｒＳ
ｃｒｉｐｔＴＭＩＩ ＲＮａｓｅＨ−）に加え、３７℃
で６０分間保温した。ｃＤＮＡの２本鎖目を合成（２５
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１００ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２５０μＭ ｄＮＴＰ
ｓ、５ｍＭ ＤＴＴ、４０Ｕ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、２Ｕ Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮ
ａｓｅＨ、１０Ｕ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｌｉｇａｓ
ｅを含む１５０μｌの反応液中で１６℃２時間保温）
後、１０Ｕ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍａｒａｓｅを加
えさらに１６℃で５分間保温した。反応液を６５℃で１
０分間加熱後等量のフェノール−クロロホルムで１回抽
出し、ＳｉｚｅＳｅｐＴＭ４００ ｓｐｕｎ ｃｏｌｕ
ｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍｅＳａｖｅｒ
ＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔに付属の低
分子量ＤＮＡ除去用スパンカラム）により４００ ｂｐ
より小さいｃＤＮＡを除いた。このサンプルにＥｃｏＲ
Ｉ Ａｄａｐｔｏｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍ
ｅＳａｖｅｒＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔに付属のもの）を付加後制限酵素ＮｏｔＩで消化した
ものを、再度ＳｉｚｅＳｅｐＴＭ４００ ｓｐｕｎ ｃ
ｏｌｕｍｎにかけ、低分子量のＤＮＡを除去した。これ
によって得られた、５’端にＥｃｏＲＩ、３’端にＮｏ
ｔＩ認識配列を持つ２本鎖ｃＤＮＡはそれぞれ１．３μ
ｇであり、予めＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで処理した発
現ベクターｐＥＦ１８Ｓと連結させ、９．２ｍｌのコン
ピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５（東洋紡績社製）
を形質転換した。その結果、得られたヒト肝臓ｃＤＮＡ
ライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ１）は１．０×１０６個の
形質転換体を含むものであった。 ＜実施例２１＞ ＞ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーｈＴＰＯ−Ｆ１からの
ＴＰＯｃＤＮＡクローンのスクリーニング 配列表−配列番号３及び６をもとにヒトＴＰＯｃＤＮＡ
に対応するＰＣＲ用プライマーを合成した。配列は以下
の通り 実施例２０において構築したヒト肝臓ｃＤＮＡライブラ
リーｈＴＰＯ−Ｆ１（１．０×１０６個）を３つのプー
ル（＃１〜３）に分割し凍結保存した。それぞれのプー
ルよりプラスミドＤＮＡを調製し、その１％を鋳型とし
て、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−Ｉ及びｈＴＰＯ−
ＫＵ）各１μＭを用いてＰＣＲを行なった。ＧｅｎｅＡ
ｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ
ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造社製）を使用して、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ
社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ（９５℃で１分
間の変性条件、５９℃で１分間のアニール条件、７２℃
で１分間の合成条件で３５回の反応を行い、さらに７分
間７２℃でインキュベート）を行った結果、＃３のプー
ル由来のプラスミドＤＮＡを用いた場合に予想される大
きさのＤＮＡが増幅された。そこで、この＃３のプール
を１５０００個のサブプールに分割し、５０μｇ／ｍｌ
のＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含む１ｍｌのＬＢ培地中で１
夜培養した後、プラスミド自動分離装置ＰＩ−１００を
用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは
ＴＥ溶液に溶解し、その５％を鋳型としてＰＣＲを実施
した（使用したプライマー、反応条件は上記と同一であ
る）。その結果、９０プール中６プールで予想される大
きさのＤＮＡが増幅された。これらのうち１プールを選
択し１０００個のクローンを１つの集団とするサブプー
ルに分割し、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製しＰ
ＣＲを行なったがＤＮＡの増幅は観察されなかった。一
連のＰＣＲで増幅されるＤＮＡの電気泳動上のバンドの
濃さは、サブプールを細かくして行くに連れ、薄くなっ
てきた。そのため、求めるクローンの増殖が良くないた
めプラスミドＤＮＡの回収が悪く、ＰＣＲによる増幅が
弱くなり最終的に増幅されなくなったことが考えられ
た。そこで＃３のプールに戻り、コロニーハイブリダイ
ゼイションによるスクリーニングを行なうことにした。
＃３のプールより、１５ｃｍのＬＢプレートあたり４１
００個のコロニーとなるようにクローンをまき、１００
枚のプレートを作製した。それぞれのプレートについて
１枚づつレプリカプレートを作製し、それらのうち片方
のプレートを３７℃でさらに６時間培養してからコロニ
ーを回収しプラスミドＤＮＡを抽出した。これらのＤＮ
Ａについて上記と同様のＰＣＲを実施したところ、１０
０プール中１プールで予想される大きさのバンドの増幅
が観察された。そこでこのプールのプレートより２枚の
レプリカフィルターを作製した（ＰＡＬＬ社製ＢＩＯＤ
ＹＮＥＴＭＡ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥを
使用）。フィルターの変性は１０％ＳＤＳ １０分間、
０．５Ｎ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ １０分間、
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１．５Ｍ
ＮａＣｌ １０分間行ない、３０分間風乾後８０℃の
真空オーブン中で１時間ベーキングした。ベーキングし
たフィルターは６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは１ｌ中に１
７５．３ｇＮａＣｌ、８８．２ｇを含みｐＨ７．０の溶
液）／１％ＳＤＳで軽く洗浄後、プレハイブリダイゼイ
ションを行なった。反応液の組成は５０％ホルムアミ
ド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕ
ｔｉｏｎ（５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉ
ｏｎは５００ｍｌ中に５ｇ Ｆｉｃｏｌｌ、５ｇ ｐｏ
ｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、５ｇ ｂｏｖ
ｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ Ｖを含む溶液）、１％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌサケ
精子ＤＮＡを含むもので、３０ｍｌの溶液中で４２℃３
０分間振盪しながら保温した。プレハイブリダイゼイシ
ョンを行なった後、同組成のハイブリダイゼイション溶
液３０ｍｌと交換後、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシ
ャム社製）で放射標識したプローブ（プラスミドｐＥＦ
１８Ｓ−ＨＬ３４のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片：配列
番号４の５’末端から４５８塩基目までを精製し、ラン
ダムプライマー法で標識したもの；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．、１３２、６−１３、１９８３に記載の方法を
利用したアマシャム社製キットＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮ
Ａ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用）を加
え、４２℃で２０時間振盪しながら保温した。フィルタ
ーは２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で４２℃３０分
間洗浄後、さらに０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液
中で４２℃３０分間洗浄した。フィルターを増強スクリ
ーン及びＸ−ＯＭＡＴＴＭＡＲ５フィルム（イーストマ
ンコダック社製）により−７０℃１６時間オートラジオ
グラフィーを行なった。その結果、陽性と考えられるシ
グナルが１個観察された。そこで、もとのプレートより
シグナル周辺のコロニーをかきとり、１０ｃｍのＬＢプ
レートにまきなおした。得られたコロニー５０個を培養
しＤＮＡを調製後プライマーｈＴＰＯ−Ｉ及びｈＴＰＯ
−ＫＵを用いてＰＣＲを実施した（条件等は上記と同
一）。その結果、１クローンのみ予想通りのバンドが増
幅された。このクローンをｐＨＴＦ１と命名した。 ＜実施例２２＞ ヒトＴＰＯ ｃＤＮＡクローンｐＨＴＦ１のシークエン
ス プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実
施した。クローンｐＨＴＦ１を５０μｇ／ｍｌのＡｍｐ
ｉｃｉｌｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養し
た後、遠心分離により得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙ
ｓｏｚｙｍｅ溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ／１％ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ
ｐｏｔａｓｓｉｕｍ／５Ｍ ａｃｅｔａｔｅ溶液を６
ｍｌ加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清は
フェノールークロロホルム（１：１）処理後、等量のイ
ソプロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレ
ットはＴＥ溶液に溶解後、ＲＮＡｓｅ処理、フェノール
ークロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿
を行なう。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、Ｎａｃ
ｌ、ポリエチレングリコール３０００をそれぞれ０．６
３Ｍ、７．５％になるように加えて遠心する。最後に、
ペレットはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。
これにより約３００μｇのプラスミドＤＮＡｐＨＴＦ１
を得た。精製したプラスミドＤＮＡについてＴａｑ Ｄ
ｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシ
ステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社
製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンス
し、全長の塩基配列を決定した。塩基配列およびそれか
ら演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号７）に示
した。塩基配列決定に必要なプライマーは配列番号６の
配列をもとに合成したプライマー並びに、それらのプラ
イマーによるシークエンス反応で解析された内部配列を
もとに設計した合成プライマーを使用した。その結果、
得られたクローンｐＨＴＦ１は１７２１塩基対のｃＤＮ
Ａ断片からなり、実施例２で分析されたアミノ酸配列Ａ
Ｐ８（配列番号７：アミノ酸番号１〜１２）及びＴＰ２
／ＴＰ３（配列番号７：アミノ酸番号１５７〜１６２）
と相同性の高い配列が確認された。このＤＮＡ断片は、
１０１塩基目までの５’ノンコーディング領域に続く、
１０２〜１０４塩基目にコードされるメチオニンに始ま
り１１５８〜１１６０塩基目にコードされるグリシンま
で続く３５３個のアミノ酸からなるオープンリーディン
グフレームをコードしていると考えられ、それに続く停
止コドン（ＴＡＡ）以降の３’ノンコーディング領域を
５３１塩基と３０個のポリＡ尾部配列を持っていた。こ
のオープンリーディングフレームにコードされると考え
られるタンパク質のアミノ酸配列は配列番号６に記載
の、ヒトＴＰＯの予想されるアミノ酸配列と完全に一致
した。塩基配列は配列番号６の配列より５’側で７７塩
基分、３’側のポリＡ尾部配列直前までの領域で３４７
塩基分長いｃＤＮＡをコードしていた。また塩基配列
は、配列番号６と３箇所で異なっていた。異なる塩基配
列は配列番号７のＡ（８４塩基目）が配列番号６では
Ｃ、Ａ（７４０塩基目）がＴ、Ｇ（１１９８塩基目）が
Ａであった。２番目の塩基（７４０塩基目）のみ、タン
パク質のコーディング領域内の変異であったが、スレオ
ニンの３番目のコドンであり、アミノ酸の変換は起こさ
なかった。この塩基配列の置換が何に起因するのかはこ
の時点では明らかでなかったが、得られたクローンｐＨ
ＴＦ１の解析より、ヒトＴＰＯタンパク質は２１残基の
シグナル配列を含む３５３個のアミノ酸からなることが
確認できた。シグナル配列を除いたタンパク質の推定分
子量は３５４６６であった。大腸菌ＤＨ５に担持された
ベクターｐＨＴＦ１は１９９４年３月２４日付けで通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４６１７として寄託した。これはまた、
１９９５年３月２２日付で中華民国 食品工業発展研究
所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９４００８５として寄託し
た。 ＜実施例２３＞ ヒトＴＰＯｃＤＮＡクローンｐＨＴＦ１のＣＯＳ１細胞
での発現〜活性確認 得られたクローンｐＨＴＦ１のＣＯＳ１細胞へのトラン
スフェクションは、実施例１１に従って行なった。すな
わちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使用しクロロキン処理
を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたトランスフェ
クションを行ない、３日後に培養上清を回収した。得ら
れた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して透析後、ラット
ＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＨＴ
Ｆ１を発現させたＣＯＳ１細胞培養上清では用量依存的
にＴＰＯ活性が認められたが、ｃＤＮＡインサートを含
まない発現プラスミドをトランスフェクションしたＣＯ
Ｓ１培養上清では活性が認められなかった（図１０
ａ）。類似の結果は、Ｍ−０７ｅアッセイ系においても
得られ、ｐＨＴＦ１を発現させたＣＯＳ１細胞培養上清
中に有意なＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性を認めた（図１
０ｂ）。これらの結果から、ｐＨＴＦ１に含まれるｃＤ
ＮＡはＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子であることが明確になった。 ＜実施例２４＞ ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのクローニング ヒトＴＰＯｃＤＮＡをプローブとしてヒトＴＰＯ染色体
ＤＮＡのクローニングを行なった。クローニングに使用
したゲノミックライブラリーは東北大学 遺伝子実験施
設山本徳男教授よりいただいた（Ｓａｋａｉら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、２１７３−２１８２、１
９９４に記載のライブラリーで、ヒト染色体ＤＮＡを制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩによって部分分解したものをＳｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ社製ファージベクターＬａｍｂｄａ Ｅ
ＭＢＬ３のＢａｍＨＩ部位につないで構築したライブラ
リー）。このライブラリーよりヒトＴＰＯｃＤＮＡをプ
ローブとしてスクリーニングを実施したが、用いた手法
はすべて本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８
９）］に記載されているようにして実施した。大腸菌Ｌ
Ｅ３９２を宿主菌として、１５ｃｍのＮＺＹＭプレート
（１ｌ中に１０ｇ ＮＺａｍｉｎｅ、５ｇ Ｎａｃｌ、
５ｇ ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２ｇ
ＭｇＣｌ４７Ｈ２Ｏ、１５％ａｇａｒを含む。ｐＨ
７．０のもの）１枚あたり３万個となるようにファージ
をまき、１８枚のプレートを作製した。それぞれのプレ
ートより各２枚のレプリカフィルターを作製した（ＰＡ
ＬＬ社製ＢＩＯＤＹＮＥＴＭＡ ＴＲＡＮＳＦＥＲ Ｍ
ＥＭＢＲＡＮＥを使用）。フィルターの変性は０．５Ｎ
ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ １０分間、０．５Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ １０分間行ない、３０分間風乾し８０℃の真空オー
ブン中で１．５時間ベーキングした。プレハイブリダイ
ゼイションは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１％ＳＤＳ、
２０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む５００ｍｌの溶液
中で４２℃１時間行なった。プローブはヒトＴＰＯｃＤ
ＮＡ断片（配列番号７の塩基配列番号１７８−１０２
５）をＰＣＲで増幅後精製したものをＲａｎｄｏｍ Ｐ
ｒｉｍｅｒ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ（宝
酒造社製；Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３２、６−
１３、１９８３に記載のランダムプライマー法を利用し
たＤＮＡ標識キット）を用いて３２Ｐ標識したものを用
いた。ＰＣＲに使用したプライマーの配列は以下の通
り。 ハイブリダイゼイションはプレハイブリダイゼイション
と同じ組成の溶液を５００ｍｌ使用し、放射標識したプ
ローブを加え４２℃で２０時間行なった。フィルターは
２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中室温で５分間づつ３
回洗浄後、１．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で６
８℃１時間の洗浄を行なったのち、増強スクリーン及び
Ｘ−ＯＭＡＴＴＭＡＲ５フィルム（イーストマンコダッ
ク社製）により−７０℃１６時間オートラジオグラフィ
ーを行なった。その結果、１３個の陽性シグナルが得ら
れた。もとのプレートより１３個の陽性シグナル周辺の
プラークを拾い上げ、１５ｃｍのＮＺＹＭプレート１枚
あたり１０００プラークとなるようにまき直した。それ
ぞれのプレートから各２枚のレプリカフィルターを作製
し、上記と同じ条件でハイブリダイゼイションを実施し
た。その結果、１３組全てのフィルターで陽性シグナル
が検出された。各プレートより１個づつプラークを単離
し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載のＰｌ
ａｔｅ Ｌｙｓａｔｅ法でファージＤＮＡを調製した。
１３クローンのファージＤＮＡについてｃＤＮＡのコー
ディング領域を含んでいるかどうかをＰＣＲによってチ
ェックした。チェックに使用したプライマーの配列は以
下の通り。 これらのプライマーの組み合わせにてＰＣＲを実施した
ところ、１３クローンのうち５クローンはｃＤＮＡから
予測されるアミノ酸のコーディング領域を全て含んでい
ると考えられた。これら５クローンに含まれる染色体Ｄ
ＮＡの長さは約２０ｋｂｐとそろっており、予備的に検
討した制限酵素解析でもほぼ同一のパターンを示した。
そこでこれらのクローンのうち１個（クローンλＨＧＴ
１）を選択し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ解析を行な
った。すなわち、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡ各１μｇ
を制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで完全に消
化し、０．８％アガロースゲルで泳動後、ＰＡＬＬ社製
ＢＩＯＤＹＮＥＴＭＡ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲ
ＡＮＥに転写した。フィルターは３０分間風乾後８０℃
の真空オーブン中で２時間ベーキングした。プレハイブ
リダイゼイションは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、
５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１％Ｓ
ＤＳ、２０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む５０ｍｌの
溶液中で４２℃１時間行なった。プローブはヒトＴＰＯ
ｃＤＮＡ断片（配列番号７の塩基配列番号１７８−１０
２５）をＰＣＲで増幅後精製したものをＲａｎｄｏｍ
Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ
（宝酒造社製）を使用して３２Ｐ標識したものを用い
た。ハイブリダイゼイションはプレハイブリダイゼイシ
ョンと同じ組成の溶液を５０ｍｌ使用し、放射標識した
プローブを加え４２℃で２０時間行なった。フィルター
は２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中室温で５分間づつ
３回洗浄後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で
６８℃１時間の洗浄を行なったのち、増強スクリーン及
びＸ−ＯＭＡＴＴＭＡＲ５フィルム（イーストマンコダ
ック社製）により−７０℃１６時間オートラジオグラフ
ィーを行なった。その結果、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
消化した場合に約１０ｋｂｐの単一のバンドが観察され
た。そこで、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡ１０μｇを制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後０．８％アガロースゲル
で泳動し、１０ｋｂｐのバンドを切り出して、プレップ
−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で
精製し、同様にＨｉｎｄＩＩＩで消化したクローニング
ベクターｐＵＣ１３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にサブ
クローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント
・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を使用した）。得られたク
ローンのうち、１０ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む
クローンを選択しｐＨＧＴ１と命名した。ファージクロ
ーンλＨＧＴ１のおおまかな制限酵素地図を図１１に示
す。 ＜実施例２５＞ ヒトＴＰＯ染色体クローンｐＨＧＴ１のシークエンス ｐＨＧＴ１クローンを培養しプラスミドＤＮＡの精製を
行なった。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｔｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）］に記載されているようにして実施した。
クローンｐＨＧＴ１を５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌ
ｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した後、遠
心分離により得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙｓｏｚｙ
ｍｅ溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ／１％
ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ ｐｏｔ
ａｓｓｉｕｍ／５Ｍ ａｃｅｔａｔｅ溶液を６ｍｌ加え
てよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノー
ルークロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパ
ノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはＴ
Ｅ溶液に溶解後、ＲＮａｓｅ処理、フェノールークロロ
ホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を行な
う。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、ＮａＣｌ、ポリ
エチレングリコール３０００をそれぞれ０．６３Ｍ、
７．５％になるように加えて遠心する。最後に、ペレッ
トはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。これに
より約３００μｇのプラスミドＤＮＡｐＨＧＴ１を得
た。精製したプラスミドＤＮＡについてＴａｑ Ｄｙｅ
ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステ
ムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３
７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、ｃ
ＤＮＡの塩基配列から予想される、タンパク質コーディ
ング領域周辺の塩基配列を決定した。塩基配列およびそ
れから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号８）
に示した。塩基配列決定に必要なプライマーは実施例２
２で使用した、ｃＤＮＡの塩基配列解析に用いたもの並
びに、それらのプライマーによるシークエンス反応で解
析された内部配列をもとに設計した合成プライマーを使
用した。その結果、プラスミドクローンｐＨＧＴ１が担
持する染色体ＤＮＡは、配列番号６で予想されたアミノ
酸のコーディング領域を全て含みその領域に関しては、
塩基配列は完全に一致していた。また、アミノ酸をコー
ドするエクソンに相当する領域は４つのイントロンによ
って分断されており、イントロンの長さは５’側から順
に２３１ｂｐ、２８６ｂｐ、１９３２ｂｐ、２３６ｂｐ
であった。配列番号７に記載のｃＤＮＡ塩基配列とは３
箇所で異なっていた。異なる塩基配列は実施例２２で記
載した箇所（配列番号６と７の相違点）と同一であり、
配列番号７のＡ（８４塩基目）がＣ、Ａ（７４０塩基
目）がＴ、Ｇ（１１９８塩基目）がＡであった。すなわ
ち、実施例２１で取得したヒトＴＰＯｃＤＮＡクローン
ｐＨＴＦ１の塩基配列は、ヒト染色体の塩基配列と３箇
所で異なることが明かとなった。そこで、この塩基配列
の変異が本来の配列を反映するものであるか解析するた
めに、スクリーニングで最終的に選択された５個の染色
体ＤＮＡクローンのうち、塩基配列を決定していない残
りの４クローンについて、配列の決定を行なった。配列
の解析はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の
Ｐｌａｔｅ Ｌｙｓａｔｅ法で調製したファージＤＮＡ
を使用した直接塩基配列決定法で行なった。反応には上
記３箇所の塩基配列変異点を解析できる位置の実施例２
２で合成したシークエンスプライマー並びに、Ｔａｑ
Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃ
ｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオ
システムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ
社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンス
した。その結果、４個全てのクローンで配列番号７の８
４塩基目がＣ、７４０塩基目がＴであり、配列番号７の
ｃＤＮＡとは異なり、配列番号６のものと一致した。１
１９８塩基目についてはＧのクローンが２個、Ａのクロ
ーンが２個であった。すなわち、染色体ＤＮＡ本来の塩
基配列が２種類あることが明かとなった。この配列の違
いが相同染色体に由来するものか、複数存在する遺伝子
に由来するものかは、現時点では不明である。また、購
入したＣｌｏｎｔｅｃｈ社製ポリ（Ａ）＋ＲＮＡがＣａ
ｕｃａｓｉａｎ由来であるのに対し、染色体ＤＮＡの由
来が日本人であることから、塩基配列の変異は人種の違
いに起因する可能性も示唆される。大腸菌ＤＨ５に担持
されたベクターｐＨＧＴ１は１９９４年３月２４日付け
で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６１６として寄託した。これは
また、１９９５年３月２２日付で中華民国 食品工業発
展研究所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９４００８４として
寄託した。 ＜実施例２６＞ ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＯＳ１細胞での発現と活性
確認 サブクローニングして得られたプラスミドクローンｐＨ
ＧＴ１には、インサート部分に３箇所、ベクター内に１
箇所、合計４箇所のＥｃｏＲＩ認識配列が存在するが、
インサート内の一番５’側のＥｃｏＲＩ認識配列とベク
ター内のＥｃｏＲＩ認識配列にはさまれる約４．３ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片に、ヒトＴＰＯタンパク質のコーディン
グ領域が全て含まれることが、塩基配列の解析から明ら
かになった。そこで、この断片をＥｃｏＲＩ処理した発
現ベクターｐＥＦ１８Ｓにつなぎ、４個のヒトＴＰＯ発
現プラスミドｐＥＦＨＧＴＥ＃１−４を得た（前述の図
１１）。これらのプラスミドＤＮＡを調製し発現実験を
行なった。プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているよ
うにして実施し、約２５０μｇのプラスミドＤＮＡを得
た。得られたクローンｐＥＦＨＧＴＥ＃１−４のＣＯＳ
１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従っ
て行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使用
しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用
いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清
を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対し
て透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した。
その結果、ｐＥＦＨＧＴＥを発現させたＣＯＳ１細胞培
養上清中に用量依存的にＴＰＯ活性が認められ、一方、
ＤＮＡインサートを含まない発現プラスミドをトランス
フェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認め
られなかった。クローン＃１〜４のいずれでもほぼ同様
の結果が得られたが、代表例としてｐＥＦＨＧＴＥ＃１
における結果を図１２ａに示した。また、Ｍ−０７ｅア
ッセイ系においても、ｐＥＦＨＧＴＥを発現させたＣＯ
Ｓ１細胞培養上清にて用量依存的に有意なＭ−０７ｅ細
胞増殖促進活性が認められた。代表例として、ｐＥＦＨ
ＧＴＥ＃１における結果を図１２ｂに示した。これらの
結果より、得られたクローンｐＥＦＨＧＴＥが担持する
ＤＮＡはヒトＴＰＯの機能的染色体ＤＮＡであること
が、明らかとなった。 ＜実施例２７＞ ヒトＴＰＯ欠失誘導体の作製とＣＯＳ１細胞での発現〜
活性確認 実施例１８の結果より、ヒトＴＰＯは完全長でなくても
活性を発現しうることが明かとなったが、その活性発現
に必要な領域を解析する目的で、欠失誘導体の作製並び
に発現を行なった。実施例１８で得たプラスミドクロー
ンｐＨＴ１−２３１をもとにＣ末端側から順次２０個の
アミノ酸を欠失させた発現プラスミド並びにＴＰ２／３
の直後（１６３番目）までのアミノ酸を含む発現プラス
ミドを作製した。作製にはＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用
に作製したプライマーの配列は以下の通り。 実施例１８で得たクローンＰＨＴ１−２３１のプラスミ
ドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用し、合成したプライマ
ー（ｈＴＰＯ−５を５’側として使用、ｈＴＰＯ−２、
−３、−４、−Ｓを３’側として使用）をそれぞれ１０
μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣ
Ｒ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈＡｍｐｌｉＴａ
ｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を
用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９
６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００
μｌの容量でＰＣＲ（９５℃で１分間の変性条件、６６
℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件
で２０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュ
ベート）を行った。それぞれのＰＣＲで得られたバンド
を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化後、１％アガ
ロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を
用いた電気泳動にかけ、それぞれのＰＣＲ反応の予想さ
れる大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ
−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製
し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓ
にサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製
コンピテント・ハイ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を使用）。
得られた形質転換体のうち、それぞれ予想される長さの
インサートを含むクローンをそれぞれ４個ないし５個づ
つ選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的
にＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載さ
れているようにして実施した。一連の操作によってアミ
ノ酸１−１６３をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−１
６３＃１−５）、アミノ酸１−１７１をコードする欠失
誘導体（ｐＨＴ１−１７１＃１−４）、アミノ酸１−１
９１をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−１９１＃１−
４）、アミノ酸１−２１１をコードする欠失誘導体（ｐ
ＨＴ１−２１１＃１−４）のプラスミドＤＮＡを得た。
精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａｑ Ｄｙｅ
ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓ
ｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム
ズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７
３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、全長
にわたり塩基配列の置換がなく、予想通りのＴＰＯｃＤ
ＮＡ配列を持つことを確認した。得られたそれぞれのク
ローンのＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実
施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ
各１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デ
キストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、
３日後に培養上清を回収した。培養上清をＩＭＤＭ培養
液に対して透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評
価した。その結果、ｐＨＴ１−２１１、ｐＨＴ１−１９
１、ｐＨＴ１−１７１、およびｐＨＴ１−１６３を発現
させたいずれのＣＯＳ１細胞培養上清でも用量依存的に
ＴＰＯ活性を認めた。代表例としてｐＨＴ１−２１１＃
１、ｐＨＴ１−１９１＃１、およびｐＨＴ１−１７１＃
２における結果を図１３ａに、ｐＨＴ１−１６３＃２に
おける結果を図１３ｂに示した。類似の結果は、Ｍ−０
７ｅアッセイ系においても得られ、ｐＨＴ１−２１１、
ｐＨＴ１−１９１、ｐＨＴ１−１７１、およびｐＨＴ１
−１６３を発現させたいずれのＣＯＳ１細胞培養上清で
も用量依存的に有意なＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性を認
めた。代表例として、ｐＨＴ１−２１１＃１、ｐＨＴ１
−１９１＃１、ｐＨＴ１−１７１＃２、およびｐＨＴ１
−１６３＃２における結果を図１４に示した。これらの
結果より、ヒトＴＰＯタンパク質を構成するアミノ酸３
５３個（２１個のシグナル配列を含む）のうち、１６４
位のアルギニン以降のアミノ酸を欠失させても、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおける活性が保持されることが明らかとな
り、１６４位のアルギニンより前に、ＴＰＯ活性発現の
ために必須な領域が含まれていることが示唆された。 ＜実施例２８＞ ヒトＴＰＯ Ｃ末側欠失体の作製とＣＯＳ１細胞での発
現〜活性確認 ヒトＴＰＯ蛋白質の活性発現に必須な領域の解析を行な
う目的で、実施例２７で得られた欠失体よりもさらにＣ
末側アミノ酸を欠失させた誘導体を作製しＴＰＯ活性を
発現しうるかどうか検討した。実施例１６で得たプラス
ミドクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４をもとに、１６３
番目のセリンを基準にＣ末端側から順次アミノ酸を欠失
させた発現プラスミドを構築した。構築にはＰＣＲを利
用した。ＰＣＲ用に作製したプライマーの配列は、次の
通りである。 実施例１６で得たクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のプ
ラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用し、合成したプ
ライマー（ｈＴＰＯ−５を５’側として使用、ｈＴＰＯ
−１５０、−１５１、−１５３、−１５４、−１５５、
−１５６、−１５７を３’側として使用）をそれぞれ１
０μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｎ Ａｍｐｌｉ
ＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社
製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅ
ｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により
１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で１分間の変性
条件、６６℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間
の合成条件で２０回の反応を行い、さらに７分間７２℃
でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲで得ら
れたバンドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化
後、１％アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃ
ｔｓ 社製）を用いた電気泳動にかけ、それぞれのＰＣ
Ｒ反応の予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離
し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラ
ッド社製）で精製し、同様に制限酵素処理した発現ベク
ターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌とし
ては東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ Ｄ
Ｈ５を使用）。得られた形質転換体のうち、それぞれ予
想される長さのインサートを含むクローンをそれぞれ３
個ないし５個づつ選択し、プラスミドＤＮＡを調製し
た。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１
９８９）］に記載されているようにして実施した。一連
の操作によって配列番号４において、アミノ酸番号１−
１５０をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５０＃２１、
２２、２５）、アミノ酸番号１−１５１をコードする欠
失体（ｐＨＴ１−１５１＃１６、１７、１８）、アミノ
酸番号１−１５３をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５
３＃１−５）、アミノ酸番号１−１５４をコードする欠
失体（ｐＨＴ１−１５４＃１−５）、アミノ酸番号１−
１５５をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５５＃１−
５）、アミノ酸番号１−１５６をコードする欠失体（ｐ
ＨＴ１−１５６＃１−５）、アミノ酸番号１−１５７を
コードする欠失体（ｐＨＴ１−１５７＃１−５）のプラ
スミドＤＮＡを得た。精製したプラスミドＤＮＡ ｐＨ
Ｔ１−１５０＃２１、２２、２５並びにｐＨＴ１−１５
１＃１６、１７、１８についてはＴａｑ Ｄｙｅ Ｄｅ
ｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社
製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３Ａ
ＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、全長にわ
たり塩基配列の置換がなく、予想通りのＴＰＯｃＤＮＡ
配列を持つことを確認した。得られたそれぞれのクロー
ンのＣＯＳ １細胞へのトランスフェクションは、実施
例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ各
１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキ
ストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３
日後に培養上清を回収した。培養上清をＩＭＤＭ培養液
に対して十分に透析後、Ｍ−０７ｅアッセイ系で評価し
た。その結果、１５１位のアミノ酸であるシステインを
含む、それぞれアミノ酸１−１５１位、１−１５３位、
１−１５４位、１−１５５位、１−１５６位、１−１５
７位からなるＣ末側欠失誘導体をコードするクローンを
トランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清中には
用量依存的にＴＰＯ活性が検出された。しかしながら、
１５１個目のシステインまでを欠失させたアミノ酸１−
１５０位のＣ末側欠失誘導体をコードするクローンをト
ランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清中にはＴ
ＰＯ活性が検出されなかった。 ＜実施例２９＞ ヒトＴＰＯ Ｎ末側欠失体の作製とＣＯＳ１細胞での発
現〜活性確認 ヒトＴＰＯ蛋白質の活性発現に必須な領域の解析を行な
う目的で、実施例２８で得られた欠失体をもとに、Ｎ末
側アミノ酸を欠失させた誘導体を作製しＴＰＯ活性を発
現しうるかどうか検討した。実施例１８で得たプラスミ
ドクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４並びに、実施例２７
で得たプラスミドクローンｐＨＴ１−１６３をもとに、
シグナル配列に続くＮ末端側アミノ酸を欠失させた発現
プラスミドを構築した。構築にはＰＣＲを利用した。Ｐ
ＣＲ用に作製したプライマーの配列は、次の通りであ
る。 （１）アミノ酸番号１−１２を欠失する誘導体（ｐＨＴ
１３−２３１）作製 実施例１８で得たクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のプ
ラスミドＤＮＡ１．４μｇを鋳型として使用し、合成し
たプライマー（ｈＴＰＯ−１３及びｈＴＰＯ３を組で使
用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−１３Ｒを組で使用）
をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡ
ｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ
ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社
製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５
分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６５℃で１分
間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回
の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）
を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガロース
ゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ 社製）を用い
た電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要なＤＮ
Ａ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キッ
ト（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッ
ファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型として用い
２回目のＰＣＲを実施した。合成したプライマー（ｈＴ
ＰＯ−５並びにｈＴＰＯ３を使用）をそれぞれ５μＭ使
ってＰＣＲを実施した。 ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ
Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用
いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６
００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μ
ｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性後、９５℃
で１分間の変性条件、６０℃で１分間のアニール条件、
７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を行い、さら
に７分間７２℃でインキュベート）を行った。ＰＣＲ産
物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄ
ｕｃｔｓ 社製）を用いた電気泳動にかけ、予想される
大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジ
ーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、
１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、等量のフェノール／クロ
ロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を行なった。遠心
で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッファーに溶解後、
同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサ
ブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コン
ピテント・ハイ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を使用）。得ら
れた形質転換体のうち、予想される長さのインサートを
含むクローンを４５個選択し、プラスミドＤＮＡを調製
した。方法は本質的に Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）］に記載されているようにして実施した。
配列番号４において、アミノ酸番号１−２３１をコード
する蛋白質のうち１−１２を欠失する欠失誘導体（ｐＨ
Ｔ１３−２３１）のプラスミドＤＮＡを得た。これらに
ついてｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ３のプライマーを用
いたＰＣＲを行ない、４５クローンのうち８クローンで
予想される大きさ程度のインサートが確認された。それ
らのうち３クローンついては Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏ
ｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕ
ｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社
製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３Ａ
ＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、１クロー
ンで、予想通りの欠失が起こっており、またその他の部
分も含めて全長にわたり塩基配列の置換等がなく、設計
通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持つクローンｐＨＴ１３−
２３１＃３が得られた。 （２）アミノ酸番号１−６を欠失する誘導体（ｐＨＴ７
−１６３）の作製 上記（１）の欠失誘導体作製においては、ＴＰＯ蛋白質
のＣ末端を２３１番目のアミノ酸として設計したが、Ｃ
末端側はさらに欠失させてもＴＰＯ活性を発現しうるこ
とが確認されたため、今回の欠失体作製にあたってはＣ
末端を１６３番目のアミノ酸までとして設計した。下記
（３）においても同様に１６３番目のアミノ酸をＣ末端
として設計した。実施例２７で得たクローンｐＨＴ１−
１６３のプラスミドＤＮＡ１．４μｇを鋳型として使用
し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−７及びｈＴＰＯ−
Ｓを組で使用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−７Ｒを組
で使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。Ｇ
ｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲＲｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉ
ｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣ
Ｒ Ｓｙｓｔｅｍ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ
社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で
５分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６５℃で１
分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０
回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベー
ト）を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガロ
ースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ 社製）を
用いた電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要な
ＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製
キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥ
バッファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型として
用い２回目のＰＣＲを実施した。合成したプライマー
（ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−Ｓを使用）をそれぞれ
５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｍｐｌｉ
ＴａｑＴＭ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社
製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅ
ｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により
１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性
後、９５℃で１分間の変性条件、６０℃で１分間のアニ
ール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を
行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行っ
た。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ Ｂ
ｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ 社製）を用いた電気泳動にか
け、予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プ
レップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社
製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。
制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、等量のフ
ェノール／クロロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を
行なった。遠心で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッフ
ァーに溶解後、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐ
ＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東
洋紡績社製コンピテント・ハイ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
を使用）。得られた形質転換体のうち、予想される長さ
のインサートを含むクローンを３０個選択し、プラスミ
ドＤＮＡを調製した。方法は本質的に Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ ［（１９８９）］に記載されているよう
にして実施した。配列番号４において、アミノ酸番号１
−１６３をコードする蛋白質のうち１−６を欠失する欠
失誘導体（ｐＨＴ７−１６３）のプラスミドＤＮＡを得
た。これらのクローンにつてはｈＴＰＯ−５並びにｈＴ
ＰＯ−Ｓをプライマーとして用いたＰＣＲを実施し、全
てのクローンで予想される大きさ程度のインサートを含
むことが確認された。これらのクローンより３個を選択
し、ＴａｑＤｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅ
ｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプラ
イドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオ
システムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシ
ークエンスし、２クローンで、予想通りの欠失が起こっ
ており、またその他の部分も含めて全長にわたり塩基配
列の置換等がなく、設計通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持
つ２個のクローンｐＨＴ７−１６３＃４、＃２９が得ら
れた。 （３）アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体（ｐＨＴ８
−１６３）作製 アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体（ｐＨＴ８−１６
３）の作製方法は上記、アミノ酸番号１−６を欠失する
誘導体（ｐＨＴ７−１６３）の作製と本質的には同様の
方法で行なった。実施例２７で得たクローンｐＨＴ１−
１６３のプラスミドＤＮＡ１．４μｇを鋳型として使用
し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−８及びｈＴＰＯ−
Ｓを組で使用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−８Ｒを組
で使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。Ｇ
ｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗ
ｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭ
ＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５
℃で５分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６５℃
で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で
３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベ
ート）を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガ
ロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ 社製）
を用いた電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要
なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精
製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴ
Ｅバッファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型とし
て用い２回目のＰＣＲを実施した。合成したプライマー
（ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−Ｓを使用）をそれぞれ
５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｍｐｌｉ
ＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社
製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅ
ｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により
１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性
後、９５℃で１分間の変性条件、６０℃で１分間のアニ
ール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を
行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行っ
た。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ Ｂ
ｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ 社製）を用いた電気泳動にか
け、予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プ
レップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社
製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。
制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、等量のフ
ェノール／クロロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を
行なった。遠心で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッフ
ァーに溶解後、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐ
ＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東
洋紡績社製コンピテント・ハイ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
を使用）。得られた形質転換体のうち、予想される長さ
のインサートを含むクローンを３０個選択し、プラスミ
ドＤＮＡを調製した。方法は本質的に Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実
施した。配列番号４において、アミノ酸番号１−１６３
をコードする蛋白質のうち１−７を欠失する欠失誘導体
（ｐＨＴ８−１６３）のプラスミドＤＮＡを得た。これ
らのクローンについてはｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−
Ｓをプライマーとして用いたＰＣＲを実施し、全てのク
ローンで予想される大きさ程度のインサートを含むこと
が確認された。これらのクローンより３個を選択し、Ｔ
ａｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライド
バイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシス
テムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシーク
エンスし、２クローンで、予想通りの欠失が起こって起
こっており、またその他の部分も含めて全長にわたり塩
基配列の置換等がなく、設計通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列
を持つ２個のクローンｐＨＴ８−１６３＃３３、＃４８
が得られた。 （４）欠失誘導体のＣＯＳ１細胞での発現とＴＰＯ活性
の確認 得られたそれぞれの欠失体クローンのＣＯＳ １細胞へ
のトランスフェクションは、実施例１１に従って行なっ
た。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しクロ
ロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたト
ランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収
した。培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析
後、Ｍ−０７ｅアッセイ系で評価した。その結果、アミ
ノ酸７−１６３位の欠失誘導体をコードするクローンを
トランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清中に弱
いながらも用量依存的にＴＰＯ活性を認めた。一方、ア
ミノ酸８−１６３位、１３−２３１位の欠失誘導体をコ
ードするクローンをトランスフェクションしたＣＯＳ１
細胞培養上清中にはＴＰＯ活性が認められなかった。 ＜実施例３０＞ ヒトＴＰＯ完全長ｃＤＮＡプラスミド（ｐＨＴＰ１）の
作製 配列番号６のように予想されたヒトＴＰＯｃＤＮＡのア
ミノ酸コーディング領域を全て持つ、動物細胞発現ベク
ターの構築を行なった。ＰＣＲによりヒトＴＰＯｃＤＮ
Ａコーディング領域を全てカバーするＤＮＡ断片を以下
の様に作製した。用いたプライマーの塩基配列は次の通
りである。 実施例１６で得られたクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４
の３００ｎｇを鋳型として１回目のＰＣＲを行なった。
プライマーｈＴＰＯ−Ｉ並びにＳＡ各０．５μＭを用
い、Ｖｅｎｔ ＲＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ 社製）１
ユニットを使用して反応（９６℃１分間、６２℃１分
間、７２℃１分間という反応を３０サイクル行なった後
７２℃７分間）を行なった。反応溶液の組成は以下の通
り。最終濃度で１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２
ＳＯ４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
８）、２ｍＭＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ。市販のヒト正常
肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｃｈ社製）１
μｇを７０℃で１０分間加熱後氷上で急冷し、１０ｍＭ
ＤＴＴ、５００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ、２５ｎｇ ｒ
ａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、１０ユニッ
トＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ベーリンガーマン
ハイム社製）、２００ユニット ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ
ｔＴＭＩＩ ＲＮａｓｅＨ−（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯ
ＬＯＧＩＥＳ 社製）を加え、３７℃で１時間保温しｃ
ＤＮＡを合成した。合成したＣＤＮＡ反応液の２０分の
１量を鋳型として使用して２回目のＰＣＲを行なった。
プライマーｈＴＰＯ−Ｐ並びにｈＴＰＯ−ＫＯ各２．５
μＭ、２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて反応（９
５℃１分間、５８℃１分間、７２℃１分間の反応を３０
サイクル）を行なった。２回のＰＣＲ溶液を１％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、それぞれ予想された大きさの
主要なバンドをプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット
（バイオラッド社製）を用いて精製した。それぞれの精
製量のうち各２０分の１量を鋳型として３回目のＰＣＲ
を実施した。Ｖｅｎｔ ＲＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ 社
製）１ユニットを使用して反応（９６℃２分間加熱後、
９６℃２分間、７２℃２分間、という反応を３サイクル
行なった後７２℃７分間）を行なった。この反応液にそ
れぞれ１μＭとなるようにｈＴＰＯ−Ｉ並びにｈＴＰＯ
−ＫＯを加えた後、９６℃２分間の加熱を行ない、その
のち９６℃１分間、６２℃１分間、７２℃１分間の反応
を２５サイクル行なったあと７２℃でさらに７分間反応
させた。反応液を等量の水飽和フェノール−クロロホル
ムで１回抽出後、さらに等量のクロロホルムで１回抽出
したのち、エタノール沈殿（０．３Ｍ酢酸ナトリウム、
０．５μｌベーリンガーマンハイム社製グリコーゲン、
２．５倍量エタノール存在下）を行なってＤＮＡを回収
した。回収したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ並びにＮｏ
ｔＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、予想
された大きさの主要なバンドをプレップ−Ａ−ジーンＤ
ＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した
のち、予め同様に制限酵素ＢａｍＮＩ並びにＮｏｔＩ消
化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ベクター
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に連結後、コンピテントハ
イＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換し
た。得られたコロニーより４クローンを選びプラスミド
ＤＮＡを調製した。精製したプラスミドＤＮＡについて
はＴａｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅ
ｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｉｎｇＫｉｔ（アプライ
ドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシ
ステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシー
クエンスし、ＢａｍＨＩからＮｏｔＩにかけての領域に
塩基配列の置換がなく、予想通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列
を持つことが確認できたクローンｐＢＬＴＰを得た。ｐ
ＢＬＴＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＢａｍＨＩで消化
後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、高分子量のバン
ドをプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラ
ッド社製）を用いて精製した。同様にｐＥＦ１８Ｓ−Ｈ
Ｌ３４も制限酵素処理し４５０ｂｐのバンドを精製し
た。それぞれのＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎしコンピテン
トハイＥ，ｃｏｌｉ ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転
換した。得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製
し、ヒトＴＰＯｃＤＮＡのインサートを含むクローンｐ
ＢＬＴＥＮを得た。得られたｐＢＬＴＥＮを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、１％アガロースゲル
電気泳動にかけ、約１２００ｂｐのバンドをプレップ−
Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用
いて精製した後、同様に制限酵素処理した発現ベクター
ｐＥＦ１８Ｓに連結しコンピテントハイＥ．ｃｏｊｉ
ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたコロ
ニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、ヒトＴＰＯｃＤＮ
Ａのコーディング領域を全て含むクローンｐＨＴＰ１を
得た。このクローンのプラスミドＤＮＡを大量に調製し
以下の実験に使用した。プラスミドＤＮＡの調製は本質
的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載
されているようにして実施した。 ＜実施例３１＞ ＣＨＯ細胞用組換えベクター、ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰ
Ｏ−Ｐ １の構築 マウスＤＨＦＲミニ遺伝子を含むプラスミドｐＭＧ１、
１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理した
後、アガロースゲル電気泳動しマウスＤＨＦＲミニ遺伝
子を含む断片（約２．５ｋｂｐ）を回収した。回収した
断片を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｎｏ
ｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰからなる反応液２５μｌ中に
溶解し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２単位を加え、室温
で３０分間反応させ、ＤＮＡの末端を平滑化した。次い
で、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿
後、１０ｍＭ Ｔｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡからなる溶液１０μｌに溶解した。次に、得
られたマウスＤＨＦＲミニ遺伝子を含む断片と動物細胞
用発現ベクターｐＥＦ１８Ｓを制限酵素ＳｍａＩで処理
した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）で脱リ
ン酸化してえられたベクターＤＮＡをＴ ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターｐＤＥＦ２
０２を得た。次に、このベクターｐＤＥＦ２０２を制限
酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理し、アガロースゲル電
気泳動で大きい方のベクターフラグメントを回収したの
ち、このフラグメントとヒトＴＰＯ ｃＤＮＡ（Ｐ１ク
ローン）を含むプラスミドｐＨＴＰ１を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＳｐｅＩで処理して得られたヒトＴＰＯ ｃＤＮ
Ａ（Ｐ１クローン）とをＴ ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
製）で結合させ、発現ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰ
Ｏ−Ｐ１得た。このプラスミドはＳＶ４０の複製開始領
域、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロ
モーター、ＳＶ４０初期ポリアデニル部位、マウスＤＨ
ＦＲミニ遺伝子、ｐＵＣ１８の複製開始領域、β−ラク
タマーゼ遺伝子（Ａｍｐｒ）を含み、ヒトエロンゲーシ
ョンファクタ−１−アルファプロモーター下流にヒトＴ
ＰＯ ｃＤＮＡが接続されている。 ＜実施例３２＞ ＣＨＯ細胞でのヒトＴＰＯの発現 ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉ
ｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；
７７巻４２１６頁、１９８０）を６ｃｍ径のプレート
（Ｆａｌｃｏｎ社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小
必須培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチ
ン添加）で培養増殖させ、これをリン酸カルシウム法
（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ、ファルマシア社製）によって形
質転換した。すなわち、実施例３１で調製したｐＤＥＦ
２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１プラスミド１０μｇにバッファ
ーＡ：１２０μｌおよびＨ２Ｏ：１２０μｌを加え混合
したのち、室温で１０分間放置した。つぎに、この溶液
にバッファーＢ：１２０μｌを加え、再度混合したの
ち、室温で３０分間放置した。このＤＮＡ溶液をプレー
トに滴下したのち、ＣＯ２インキュベーター中で６時間
培養した。プレートから培地を除去し、α−ＭＥＭ
（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチルスルフォオキシ
ド含有α−ＭＥＭ（−）を添加し、室温で２分間処理し
た。次いで、１０％透析牛胎児血清含有非選択培地（前
出α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）
を添加して２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清
含有選択培地（α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チ
ミジン無添加）での選択をおこなった。選択は細胞をト
リプシン処理した後、６ｃｍ径プレート１枚あたりを、
１０ｃｍ径プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２
０枚に分割したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換
を行いながら培養を続行する事により実施した。細胞が
増殖してきたプレートあるいはウエルについてはその培
養上清中のヒトＴＰＯ活性をＭ−０７ｅアッセイ及びＢ
ａ／Ｆ３アッセイを用いて測定したところ、いずれのア
ッセイ系においても活性が認められた。培養上清中にヒ
トＴＰＯ活性の認められたものについては新しいプレー
トあるいはウエルに２５ｎＭのメソトレキセートを含む
選択培地で１：１５に細胞を分割し、培養を続行するこ
とによりメソトレキセートに耐性の細胞を増殖させてク
ローニングを行った。なお、ＣＨＯ細胞の形質転換はＣ
ＨＯ細胞に対しｐＨＴＰ１とｐＭＧ１を同時形質転換
（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することによって
も行うことができる。プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴ
ＰＯ−Ｐ１によって形質転換されたＣＨＯ細胞株（ＣＨ
Ｏ−ＤＵＫＸＢ１１）は１９９５年１月３１日付で通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４９８８として寄託されている。これは
また、１９９５年３月２２日付で中華民国食品工業発展
研究所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９６００２３として寄
託されている。 ＜実施例３３＞ Ｘ６３．６．５．３．細胞用組換えベクター、ＢＭＣＧ
Ｓｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１の構築 動物細胞用発現ベクターＢＭＣＧＳｎｅｏ１μｇを制限
酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩで処理した後、アガロースゲル
電気ゲル電気泳動し、ベクターＤＮＡ部分を回収した。
次いで得られたＤＮＡ断片とヒトＴＰＯ ｃＤＮＡを含
むプラスミドｐＢＬＴＥＮを制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔ
Ｉで処理して得られたヒトＴＰＯ ｃＤＮＡ（Ｐ １ク
ローン）とをＴ ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、発現プ
ラスミドＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１を得た。こ
の発現プラスミドはサイトメガロウイルス初期プロモー
ター、ウサギβグロビン遺伝子由来のイントロンおよび
ポリアデニル部位ヒトβグロビン遺伝子の一部、ウシパ
ピローマウイルス１遺伝子の６９％、チミジンキナーゼ
プロモーターおよびポリアデニル部位、ホスホトランス
フェラーゼＩ（ネオマイシン耐性遺伝子）、ｐＢＲ３２
２の複製開始領域おびβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ
ｒ）を含みサイトメガロウイルスプロモーター下流にヒ
トＴＰＯ ｃＤＮＡが接続されている。 ＜実施例３４＞ Ｘ６３．６．５．３．細胞での発現 Ｘ６３．６．５．３．細胞は１０％牛胎児血清を含むＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ′ｓｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａ
ｌ（ＤＭＥ）培地中で培養増殖させ、これをエレクトロ
ポレーション法によって形質転換した。すなわち、実施
例３３で調製したＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１プ
ラスミド２０μｇを１０７個の細胞を含むＤＭＥ培地７
５０μｌに加え、エレクトロポレーション用の４ｍｍギ
ャップのキュベットにセットし、４℃で１０分間放置し
た。このキュベットをエレクトロポレーション装置（Ｂ
ＴＸ６００、ＢＴＸ社製）にセットし、３８０Ｖ、２５
ｍＦ、２４オングストロームの条件で遺伝子導入した。
遺伝子導入後、キュベットを再び４℃で１５分間放置し
たのち、細胞を１０％牛胎児血清を含むＤＭＥで一回洗
浄した。次に細胞を５０ｍｌの１０％牛胎児血清を含む
ＤＭＥに懸濁し、９６ウエルプレート５枚に分割したの
ち、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。その
後、培養液を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ
社）、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥに交換し、以後３
日ごとに培地交換した。細胞が増殖してきたウエルにつ
いてはその培養上清中のヒトＴＰＯ活性をＣＦＵ−ＭＫ
アッセイ、Ｍ−０７ｅアッセイ及びＢａ／Ｆ３アッセイ
を用いて測定したところ、いずれのアッセイ系において
も活性が認められた。培養上清中にヒトＴＰＯ活性の認
められたものについては耐性の細胞を増殖させて、２回
クローニングを行い、ヒトＴＰＯ産生細胞株を樹立し
た。 ＜実施例３５＞ ヒトＴＰＯのＣＯＳ１細胞での大量発現 ＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１
に記載のクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン
法で実施した。ＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
０）をコラーゲンコート処理した１７５ｃｍ２の培養フ
ラスコ中で、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを含むＩＭＤＭ
を用いて、３７℃の５％炭酸ガスインキュベーター内で
約１００％コンフルエントになるまで培養した。培養フ
ラスコのコラーゲンコート処理は、１ｍＭ ＨＣｌで
０．３ｍｇ／ｍｌに調製したコラーゲン溶液（イワキ社
製Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ｔｙｐｅＩ−Ｃ）を１７５ｃ
ｍ２の培養フラスコあたり２５ｍｌ加え、室温で１時間
放置後コラーゲン溶液を回収し、２０〜５０ｍｌのＰＢ
Ｓで１回洗浄することで行なった。トランスフェクショ
ンは１７５ｃｍ２の培養フラスコ１枚あたり、２５０μ
ｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア
社）、６０μＭのクロロキン（シグマ社）、および１０
％（ｖ／ｖ）のＮｕ−Ｓｅｒｕｍ（コラボレイティブ
社）を含む２０ｍｌのＩＭＤＭ溶液に５００μｌのＨＢ
Ｓに溶解したプラスミドｐＨＴＰ１（４０μｇ）を混和
し、トランスフェクション直前にＩＭＤＭで１回洗浄し
た上記のＣＯＳ１細胞に添加した後、３７℃の５％炭酸
ガスインキュベーター内で３時間培養した。その後、培
養上清を吸引除去しＩＭＤＭで１回洗浄した後、５０ｍ
ｌの無血清培地を添加し、３７℃の５％炭酸ガスインキ
ュベーター内で培養し、５日後に培養上清を回収した。
１回の操作には１７５ｃｍ２の培養フラスコ１００から
２６０枚を使用し、５〜１３ｌの培養上清を回収した。
無血清培地の組成は、５μｇ／ｍｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ
（シグマ社製）、５μｇ／ｍｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉ
ｎ（シグマ社製）、１０μＭ ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌ
ａｍｉｎｅ（和光純薬）、２５ｎＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓ
ｅｌｅｎｉｔｅ（シグマ社製）、２００μｇ／ｍｌのＢ
ＳＡ（ニチレイ社製脂肪酸フリー高純度ウシアルブミ
ン）を含むＩＭＤＭである。 ＜実施例３６＞ ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラス
ミドｐＨＴＰ１，Ｐ１クローン由来）の精製と活性確認 ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラス
ミドｐＨＴＰ１由来）の活性と精製の実施例を以下に述
べる。ＴＰＯの血小板増加作用を調べるため、部分精製
品をまず調製し、かつ高純度のＴＰＯ標品を得るための
精製を行った。以下の調製過程でのＴＰＯ活性測定に
は、Ｍ−０７ｅアッセイ系を主に用いたが、ラットＣＦ
Ｕ−ＭＫアッセイ系においても同様のＴＰＯ活性が示さ
れた。またこれらのアッセイに際し、最終濃度０．０２
〜０．０５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を標品に
添加した。まず、プラスミドｐＨＴＰ１を大橋、須藤の
方法（Ｈｉｄｅｙａ Ｏｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｄａ
ｓｈｉ Ｓｕｄｏ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，５８（４），７５８−７５９，１９９
４）を用いてトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞
を、１０００ｍｌ当たり０．２ｇのＢＳＡ、５ｍｇの牛
インシュリン、５ｍｇのヒトトランスフェリンを含みか
つ、０．０２ｍＭのモノエタノールアミン、２５ｎＭの
Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｌｅｎｉｔｅを含む無血清ＩＭＤＭ
培養液で５日間、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で培
養し、約７Ｌの無血清培養上清を得た。その無血清培養
上清に、蛋白質分解酵素阻害剤であるｐ−ＡＰＭＳＦ及
びＰｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ（４−（２−Ａｍｉｎｏｅｔ
ｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏ
ｒｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｍｅｒｋ社
製、カタログ番号２４８３９）を最終濃度約１ｍＭ加
え、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。こ
れを限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウル
トラセット分子量８０００カット、またはミリポア社製
・ＰＬＧＣペリコンカセット 分子量１００００カッ
ト）で約１０倍濃縮し、体積７２３ｍｌ（蛋白質濃度
３．３８ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量２４４５ｍｇ、相対活
性４３０００、相対活性量１０５１０００００）に対し
１０００ｍｌ当り１．６ｍｏｌｅｓのＡｍｍｏｎｉｕｍ
Ｓｕｌｆａｔｅ（合計２８８ｇ）を加え、最終濃度
１．５Ｍ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅを含む８
０４ｍｌの溶液とした後、１．２５Ｍ Ａｍｍｏｎｉｕ
ｍ Ｓｕｌｆａｔｅを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．２）で予め平衡化してあったＭａｃｒ
ｏ−Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣカラム（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ社製、カタログ番号１５６−００８０；直径５ｃ
ｍ、ベッド高９ｃｍ）に、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで添加
した。添加終了後、１．２５Ｍ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓ
ｕｌｆａｔｅを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．２）で溶出された素通り画分Ｆ１（２３８４
ｍｌ，蛋白質濃度０．８６４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量２
０６１ｍｇ，相対活性６０００）を得た。次に、溶出液
を２０ｍＭ Ｎａ Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ５．８にか
え、溶出された画分Ｆ２（１０９２ｍｌ，蛋白質濃度
０．７７６ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量８４７ｍｇ，相対活
性１５００００）を集めた。さらに、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒ
ｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣカラム Ｆ２（１０８１ｍ
ｌ）を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
８）で予め平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａ
ｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア バイオテク社製、カタ
ログ番号１７−０７２９−０１；直径３ｃｍ、ベッド高
１０ｃｍ）カラムに注入し、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで添
加した。添加終了後、さらに１１０ｍＭ ＮａＣｌを含
む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で
溶出されたものをまとめた画分Ｆ１（２２６２ｍｌ，蛋
白質濃度０．２７０ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量６１０ｍ
ｇ，相対活性３００００）を得た。次に、溶出液を４０
０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．４）にかえ、溶出された画分Ｆ２（８５
６ｍｌ，蛋白質濃度０．１８９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量
１６２ｍｇ，相対活性３０００００）を集めた。次に、
溶出液を１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）にかえ、溶出された
画分Ｆ３（３７０ｍｌ，蛋白質濃度０．０３４ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量１２．６ｍｇ，相対活性１５００００）
を集めた。さらに、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ Ｆｌｏｗカラムにおいて主たるＴＰＯ活性画分Ｆ２
（８４５ｍｌ）に、最終濃度約１０％の１−プロパノー
ルを加え、４００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）で予め平衡化したＬ
Ａ−ＷＧＡカラム（ホーネン社製、カタログ番号ＷＧ−
００７；直径２ｃｍ、ベッド高１４ｃｍ）カラムに注入
し、流速３ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、４０
０ｍＭのＮａｃｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．４）と１−プロパノールの混液（９：
１）で溶出されたものをまとめた画分Ｆ１（６４．４ｍ
ｌ，蛋白質濃度０．０１７８ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量
１．１５ｍｇ，相対活性１７２２０）を得た。次に、溶
出液を０．４Ｍ ＧｌｃＮａｃ，１０％１−プロパノー
ルを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
１）にかえ、溶出された画分Ｆ２（４５ｍｌ，蛋白質濃
度０．０１０４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量０．４７０ｍ
ｇ，相対活性６７５０００）を集めた。そこで、ＬＡ−
ＷＧＡカラムにおいて主たるＴＰＯ活性画分Ｆ２（３４
０ｍｌ）に、最終濃度約０．００５％のＴＦＡを加えた
後、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰ（ＹＭＣ社製、カタ
ログ番号ＡＰ−５１３；直径６ｍｍ、ベッド高２５０ｍ
ｍ）カラムにて展開した。即ち、展開溶媒Ａに０．１％
ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡを含む１−プロ
パノールを用い、１５％Ｂで平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃ
ｋ ＣＮ−ＡＰカラムに、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで注
入した。注入終了後、１５％Ｂから２５％Ｂにプロパノ
ール濃度を上げ、さらに２５％Ｂから５０％Ｂまで６５
分の直線濃度勾配で展開し、１．５ｍｌ（２．５ｍｉ
ｎ）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。それぞれ
０．５μｌ（３０００分の１フラクション）を取りＨＳ
Ａを加え、限外濾過濃縮し、最終的に０．０５％ＨＳＡ
を含む０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液溶液と
し、これをアッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定し
た。この結果、チューブ番号２４〜３０（プロパノール
濃度で３５．０〜４２．０％の範囲）に強いＴＰＯの活
性（相対活性約６３００００〜４８０００００）があっ
たため、ＴＰＯ活性画分ＦＡ（１３．５ｍｌ）とした。
そこでさらに、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰで得られ
たＦＡを、展開溶媒Ａに０．１％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに
０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用いたＣａ
ｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１ ３００Ａ（資生堂製、カタ
ログ番号Ｃ１ＴＹＰＥ：ＳＧ３００Ａ；直径４．６ｍ
ｍ、ベッド高１５０ｍｍに加え、直径４．６ｍｍ、ベッ
ド高３５ｍｍのプレカラムを接続したもの）カラムにて
展開した。即ち、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰで得ら
れたＦＡの一部（８．９ｍｌ）をとり、０．３ｍｌのグ
リセロールを添加後、遠心エバポレーションで濃縮後、
約２．５ｍｌの１０％Ｂ液を加え、２０％Ｂで平衡化し
たＣａｐｃｅｌｌ ＰａｋＣ１ ３００Ａカラムに流速
０．４ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入終了後、２０％Ｂ
にて５分溶出した後、２０％Ｂから４０％Ｂまで５０分
の直線濃度勾配で展開し、１ｍｌ（２．５ｍｉｎ）ずつ
ポリプロピレン製チューブに集めた。それぞれ１μｌ
（１０００分の１フラクション）を取りＨＳＡを加え、
限外濾過濃縮し、最終的に０．０５％ＨＳＡを含む０．
２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液溶液とし、これをア
ッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、
チューブ番号２０〜２３（プロパノール濃度で２８．５
〜３２．５％の範囲）に強いＴＰＯの活性（相対活性約
３００００００〜２２５０００００）を示す高活性標品
を得ることができた。 ＜実施例３７＞ ＣＯＳ１細胞で発現したヒトＴＰＯの分子量測定 ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラス
ミドｐＨＴＦ１、Ｆ１クローン由来）の分子量は、糖鎖
が付加された結果、ペプチド鎖の大きさから推定しうる
分子量よりも大きいことが考えられた。そこでまず、Ｃ
ＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミ
ドｐＨＴＦ１、Ｆ１クローン由来）を含む培養上清から
部分精製ＴＰＯ画分を以下のように調製した。即ち、展
開溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））およ
び展開溶媒Ｂ（０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノー
ル）を用いて、２５％Ｂで予め平衡化したＹＭＣ−Ｐａ
ｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社、カタログ番号
Ａ−ＰＲＲＰ−３３−４６−２５；直径０．４６ｃｍ、
ベッド高１５ｃｍ）カラムに、培養上清０．３ｍｌを注
入し、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで５分２５％Ｂを通液し
た後、５０分間の２５％Ｂから５０％Ｂまでの直線濃度
勾配にて分画した。ＴＰＯ活性は３４．５％〜４３．５
％１−プロパノールの範囲に溶出され、これを遠心エバ
ポレーションで乾固し、部分精製標品を得た。次に、実
施例１に述べた非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから蛋
白質抽出操作後、Ｍ−０７ｅアッセイ系にてＴＰＯ活性
を調べ、あるいは実施例４５に述べるウエスターン分析
により、還元処理されたＤＰＣＩＩＩマーカーに対する
分子量を測定した。この結果、見かけ上の分子量約６９
０００〜９４０００の広い範囲にＴＰＯ活性が存在し、
分子量の不均一性を確認できた。さらにこれと同様にし
て、Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（ジェンザイム社製、カタ
ログ番号１４７２−００）によるＮ結合型糖鎖切断後の
ＴＰＯについて、還元処理されたＤＰＣＩＩＩマーカー
に対する見かけ上の分子量を調べてみると、３６０００
〜４００００となり、ペプチド鎖の大きさから推定しう
る分子量約３５０００よりもなおも大きいことが判明
し、Ｏ結合型糖鎖をも含むことが強く示唆された。これ
らと同様、ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ
（発現プラスミドｐＨＴＰ１、Ｐ１クローン由来）の見
かけ上の分子量についても調べたところ、６３０００〜
８３０００であった。 ＜実施例３８＞ヒトＴＰＯの生物学的特性 主に発現プラスミドｐＨＴＦ１をＣＯＳ１細胞へトラン
スフェクションして得られたＴＰＯ活性を含有する培養
上清を用いて、ヒトＴＰＯのヒト、およびラット血液系
細胞に対する作用を調べた。ヒト臍帯血から調製したＣ
Ｄ３４＋、ＤＲ＋細胞画分を用いたコロニーアッセイ系
で検定したところ、ヒトＴＰＯにより有意な数の巨核球
コロニーが形成された。例えば、発現プラスミドｐＨＴ
１−２３１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ
１細胞培養上清を１０％添加した条件下で、６０００個
のＣＤ３４＋、ＤＲ＋細胞から平均１１．５個の巨核球
コロニーが形成された。ヒト抹消血からＦｉｃｏｌｌ−
Ｐａｑｕｅを用いた比重遠心法にて得られた白血球画分
からプラスティック付着性細胞を除去し、さらにＳＢＡ
（ダイズアグルチニン）に親和性を有する細胞をＡＩＳ
マイクロセレクターＣＤ３４（旭メディカル株）を用い
たパニング法にて除去し、最終的にＡＩＳマイクロセレ
クターＣＤ３４（旭メディカル株）を用いたパニング法
にてＣＤ３４＋細胞画分を得た。この細胞画分にヒトＴ
ＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＦ１をトランスフェクショ
ン、発現させたＣＯＳ１細胞培養上清）を添加し、１０
日間液体培養したところ、サイズの大きいＧｐＩＩｂ／
ＩＩＩａ＋細胞の選択的増殖が認められ、さらにこのＧ
ｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋細胞では核の倍数性（ｐｌｏｉｄ
ｙ）が増加していた。このことから、ヒトＴＰＯがヒト
巨核球系前駆細胞に特異的に作用し、その増殖・分化を
促進することが強く示唆された。ラット骨髄細胞から分
離・精製したＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋細胞画分、及びＧ
ｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋細胞画分を得る前段階のプラステ
ィック非付着性細胞画分を用いたコロニーアッセイ系で
検定したところ、ヒトＴＰＯにより有意な数の巨核球コ
ロニーが形成された。例えば、発現プラスミドｐＨＴＦ
１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞培
養上清を２０％添加した条件下で、培養５日目に１００
０個のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋細胞から平均３４．５個
の巨核球コロニー、また２００００個のプラスティック
非付着性細胞から平均２８．５個の巨核球コロニーが形
成された。さらに、プラスチック非付着細胞画分には巨
核球系以外の様々な系統の前駆細胞が存在するが、ヒト
ＴＰＯの添加では巨核球コロニーしか形成されず、ヒト
ＴＰＯが巨核球系前駆細胞に特異的に作用することが強
く示唆された。また、ラット骨髄由来のＧｐＩＩｂ／Ｉ
ＩＩａ＋細胞画分をヒトＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴ
Ｆ１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞
培養上清を２０％添加）の存在下に３〜５日間液体培養
し、核の倍数性（ｐｌｏｉｄｙ）を調べたところ、培養
５日目に明らかにｐｌｏｉｄｙが増加していた。 ＜実施例３９＞ グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とヒ
トＴＰＯ（アミノ酸１−１７４）の融合タンパク質（以
下、この融合タンパク質を「ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７
４）」と称す）の大腸菌発現用ベクターの構築 大腸菌でのヒトＴＰＯの発現を容易にするために、ヒト
ＴＰＯをコードしかつ大腸菌優先コドンを含有する人工
遺伝子を作製した。なお、このＤＮＡ塩基配列は大腸菌
翻訳開始用のアミノ末端メチオニンコドン（ＡＴＧ）を
−１の位置に有する。表１２に示した１−１２の合成オ
リゴヌクレオチドを作製し、２−１１の合成オリゴヌク
レオチドをＴ４キナーゼ（ファルマシア社製）により１
ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，
１０ｍＭ Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，５０ｍＭ Ｋ−ａｃ
ｅｔａｔｅの溶液中でリン酸化した。これらの合成オリ
ゴヌクレオチドを６本の二本鎖ＤＮＡにするために１及
び２；３及び４；５及び６；７及び８；９及び１０；１
１及び１２それぞれの組み合わせの一本鎖ＤＮＡを１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２，５０ｍＭ ＮａＣｌの溶液中でアニールし
た。次に１及び２；３及び４；５及び６の三組の二本鎖
ＤＮＡと、７及び８；９及び１０；１１及び１２の三組
の二本鎖ＤＮＡをそれぞれＴ４リガーゼ（ライフテクノ
ロジー社製）を用いて反応し、更にこれら二種の反応液
を同様にしてＴ４リガーゼを用いて反応した。このライ
ゲーション反応で得られたＤＮＡをＢａｍＨＩ（ベーリ
ンガーマンハイム社製）で消化後、２％のアガロースゲ
ルで泳動し、約３９０−４００ｂｐの大きさのフラグメ
ントを回収してプレップ７Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット
で精製し、ＸｂａＩ，ＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１８
にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
αを使用した）。得られたクローンのうち、表１３に示
したヒトＴＰＯをコードしかつ大腸菌優先コドンを含有
する人工遺伝子をもつクローンを、塩基配列の解析によ
り選択し、これをｐＵＣ１８（ＸＢ）（１−１２３）と
した。表１３のコーディング鎖のＤＮＡ配列を配列表
（配列番号９）に示した。
Ａ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）１μｇよりｃＤＮＡの１
本鎖目を合成した。ただし、プライマーとしてはオリゴ
ｄＴプライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍｅＳ
ａｖｅｒＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ
に添付のものを０．５μｇ）を使用した。ｃＤＮＡ合成
の反応液の０．１容を鋳型として１回目のＰＣＲを実施
した。ＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇ
ｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （宝酒造社製）並びに、
ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００
（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）を用いた。プライマ
ーにはｈＴＰＯ−Ｈ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ｍｉｘ
（１０μＭ）を使用し５０μｌの容量で反応を行なった
（９６℃２分間の後に、９６℃ １分間／４８℃ １分
間／７２℃ １分間を１０サイクル反応し、さらに７２
℃ ７分間）。１回目の反応液の０．１容を鋳型として
２回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−
Ｋ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ｍｉｘ（１０μＭ）を使
用し５０μｌの容量で反応を行なった（９６℃２分間の
後に、９６℃ １分間／６３℃ １分間／７２℃ １分
間を１０サイクル反応し、さらに７２℃ ７分間）。２
回目の反応液の０．１容を鋳型として３回目のＰＣＲを
行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｎ（２０μＭ）及
びｈＴＰＯ３ｍｉｘ（１０μＭ）を使用し５０μｌの容
量で反応を行なった（９６℃ ２分間の後に、９６℃
１分間／６３℃ １分間／７２℃ １分間を１０サイク
ル反応し、さらに７２℃ ７分間）。３回目の反応液の
０．１容を鋳型として４回目のＰＣＲを行なった。プラ
イマーにはｈＴＰＯ−Ｏ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ｍ
ｉｘ（１０μＭ）を使用し５０μｌの容で反応を行なっ
た（９６℃ ２分間の後に、９６℃１分間／６３℃ １
分間／７２℃ １分間を１０サイクル反応し、さらに７
２℃１分間）。４回目の反応液の０．１容を鋳型として
５回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−
Ｏ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ａｎｃｈｏｒ（２０μ
Ｍ）を使用し５０μｌの容量で反応を行なった（９６℃
２分間の後に、９６℃ １分間／５８℃ １分間／７
２℃ １分間を１０サイクル反応し、さらに７２℃ ７
分間）。ここで得られた反応液を、２％アガロースゲル
（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気
泳動にかけ、このＰＣＲ反応の主要産物である約６００
ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮ
Ａ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。
この精製したＤＮＡ断片をＴａｑＤｙｅ Ｄｅｏｘｙ
ＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎ
ｉｎｇ Ｋｉｔ （アプライドバイオシステムズ社製）
を用いて、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤ
ＮＡシークエンサーにより直接シークエンスし塩基配列
を決定した。塩基配列およびそれから演繹されるアミノ
酸配列を配列表（配列番号５）に示した。このＤＮＡ断
片はプライマーｈＴＰＯ−Ｏに始まる１３０個のアミノ
酸をコードする塩基配列を持っており、さらに３’側に
１８０塩基以上の配列が続いていた（５７７塩基目以降
は解読できなかった）。このＤＮＡ断片にコードされる
グリシンに始まる３０個のアミノ酸配列は配列番号４で
記載したアミノ酸番号２０３〜２３２のアミノ酸配列と
一致した。同時に１番から９４番目までの塩基配列も配
列番号４の６９２〜７８５のものと一致していた。実施
例１７のｃＤＮＡ断片の解析及び本例のＰＣＲ増幅断片
の解析の結果より、配列番号６に記載するように、ヒト
ＴＰＯタンパク質は２１残基のシグナル配列を含む３５
３個のアミノ酸からなると推定される。なお、配列番号
６に示されたヒトＴＰＯタンパク質の成熟タンパク質部
分に相当するアミノ酸配列を配列番号１６として示し
た。 ＜実施例２０＞ ヒト正常肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーの再構築 実施例１５で得られたクローンＨＬ３４は、オープンリ
ーディングフレームに終止コドンを持たず、その３’末
端にポリＡ尾部様配列を持っておりｃＤＮＡ合成の際の
人工産物であることが考えられたため、新たに市販の正
常ヒト肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
社製）５μｇを用い、ｃＤＮＡライブラリーを構築し直
した。ｃＤＮＡの合成にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ
Ｌａｍｂｄａ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ λＣｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ並
びにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ ＲＮａｓｅＨ−
（ともにＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を
使用した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを熱変性後、Ｋｉｔに付
属のＮｏｔＩ配列付きオリゴｄＴをプライマーとして含
む２０μｌの反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．３／７５ｍＭＫＣｌ／３ｍＭ ＭｇＣｌ２／１ｍ
Ｍ ＤＴＴ／１ｍＭ ｄＮＴＰ／２００ＵＳｕｐｅｒＳ
ｃｒｉｐｔＴＭＩＩ ＲＮａｓｅＨ−）に加え、３７℃
で６０分間保温した。ｃＤＮＡの２本鎖目を合成（２５
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１００ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２５０μＭ ｄＮＴＰ
ｓ、５ｍＭ ＤＴＴ、４０Ｕ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、２Ｕ Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮ
ａｓｅＨ、１０Ｕ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｌｉｇａｓ
ｅを含む１５０μｌの反応液中で１６℃２時間保温）
後、１０Ｕ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍａｒａｓｅを加
えさらに１６℃で５分間保温した。反応液を６５℃で１
０分間加熱後等量のフェノール−クロロホルムで１回抽
出し、ＳｉｚｅＳｅｐＴＭ４００ ｓｐｕｎ ｃｏｌｕ
ｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍｅＳａｖｅｒ
ＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔに付属の低
分子量ＤＮＡ除去用スパンカラム）により４００ ｂｐ
より小さいｃＤＮＡを除いた。このサンプルにＥｃｏＲ
Ｉ Ａｄａｐｔｏｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍ
ｅＳａｖｅｒＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔに付属のもの）を付加後制限酵素ＮｏｔＩで消化した
ものを、再度ＳｉｚｅＳｅｐＴＭ４００ ｓｐｕｎ ｃ
ｏｌｕｍｎにかけ、低分子量のＤＮＡを除去した。これ
によって得られた、５’端にＥｃｏＲＩ、３’端にＮｏ
ｔＩ認識配列を持つ２本鎖ｃＤＮＡはそれぞれ１．３μ
ｇであり、予めＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで処理した発
現ベクターｐＥＦ１８Ｓと連結させ、９．２ｍｌのコン
ピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５（東洋紡績社製）
を形質転換した。その結果、得られたヒト肝臓ｃＤＮＡ
ライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ１）は１．０×１０６個の
形質転換体を含むものであった。 ＜実施例２１＞ ＞ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーｈＴＰＯ−Ｆ１からの
ＴＰＯｃＤＮＡクローンのスクリーニング 配列表−配列番号３及び６をもとにヒトＴＰＯｃＤＮＡ
に対応するＰＣＲ用プライマーを合成した。配列は以下
の通り 実施例２０において構築したヒト肝臓ｃＤＮＡライブラ
リーｈＴＰＯ−Ｆ１（１．０×１０６個）を３つのプー
ル（＃１〜３）に分割し凍結保存した。それぞれのプー
ルよりプラスミドＤＮＡを調製し、その１％を鋳型とし
て、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−Ｉ及びｈＴＰＯ−
ＫＵ）各１μＭを用いてＰＣＲを行なった。ＧｅｎｅＡ
ｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ
ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造社製）を使用して、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ
社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ（９５℃で１分
間の変性条件、５９℃で１分間のアニール条件、７２℃
で１分間の合成条件で３５回の反応を行い、さらに７分
間７２℃でインキュベート）を行った結果、＃３のプー
ル由来のプラスミドＤＮＡを用いた場合に予想される大
きさのＤＮＡが増幅された。そこで、この＃３のプール
を１５０００個のサブプールに分割し、５０μｇ／ｍｌ
のＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含む１ｍｌのＬＢ培地中で１
夜培養した後、プラスミド自動分離装置ＰＩ−１００を
用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは
ＴＥ溶液に溶解し、その５％を鋳型としてＰＣＲを実施
した（使用したプライマー、反応条件は上記と同一であ
る）。その結果、９０プール中６プールで予想される大
きさのＤＮＡが増幅された。これらのうち１プールを選
択し１０００個のクローンを１つの集団とするサブプー
ルに分割し、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製しＰ
ＣＲを行なったがＤＮＡの増幅は観察されなかった。一
連のＰＣＲで増幅されるＤＮＡの電気泳動上のバンドの
濃さは、サブプールを細かくして行くに連れ、薄くなっ
てきた。そのため、求めるクローンの増殖が良くないた
めプラスミドＤＮＡの回収が悪く、ＰＣＲによる増幅が
弱くなり最終的に増幅されなくなったことが考えられ
た。そこで＃３のプールに戻り、コロニーハイブリダイ
ゼイションによるスクリーニングを行なうことにした。
＃３のプールより、１５ｃｍのＬＢプレートあたり４１
００個のコロニーとなるようにクローンをまき、１００
枚のプレートを作製した。それぞれのプレートについて
１枚づつレプリカプレートを作製し、それらのうち片方
のプレートを３７℃でさらに６時間培養してからコロニ
ーを回収しプラスミドＤＮＡを抽出した。これらのＤＮ
Ａについて上記と同様のＰＣＲを実施したところ、１０
０プール中１プールで予想される大きさのバンドの増幅
が観察された。そこでこのプールのプレートより２枚の
レプリカフィルターを作製した（ＰＡＬＬ社製ＢＩＯＤ
ＹＮＥＴＭＡ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥを
使用）。フィルターの変性は１０％ＳＤＳ １０分間、
０．５Ｎ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ １０分間、
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１．５Ｍ
ＮａＣｌ １０分間行ない、３０分間風乾後８０℃の
真空オーブン中で１時間ベーキングした。ベーキングし
たフィルターは６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは１ｌ中に１
７５．３ｇＮａＣｌ、８８．２ｇを含みｐＨ７．０の溶
液）／１％ＳＤＳで軽く洗浄後、プレハイブリダイゼイ
ションを行なった。反応液の組成は５０％ホルムアミ
ド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕ
ｔｉｏｎ（５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉ
ｏｎは５００ｍｌ中に５ｇ Ｆｉｃｏｌｌ、５ｇ ｐｏ
ｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、５ｇ ｂｏｖ
ｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ Ｖを含む溶液）、１％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌサケ
精子ＤＮＡを含むもので、３０ｍｌの溶液中で４２℃３
０分間振盪しながら保温した。プレハイブリダイゼイシ
ョンを行なった後、同組成のハイブリダイゼイション溶
液３０ｍｌと交換後、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシ
ャム社製）で放射標識したプローブ（プラスミドｐＥＦ
１８Ｓ−ＨＬ３４のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片：配列
番号４の５’末端から４５８塩基目までを精製し、ラン
ダムプライマー法で標識したもの；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．、１３２、６−１３、１９８３に記載の方法を
利用したアマシャム社製キットＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮ
Ａ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用）を加
え、４２℃で２０時間振盪しながら保温した。フィルタ
ーは２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で４２℃３０分
間洗浄後、さらに０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液
中で４２℃３０分間洗浄した。フィルターを増強スクリ
ーン及びＸ−ＯＭＡＴＴＭＡＲ５フィルム（イーストマ
ンコダック社製）により−７０℃１６時間オートラジオ
グラフィーを行なった。その結果、陽性と考えられるシ
グナルが１個観察された。そこで、もとのプレートより
シグナル周辺のコロニーをかきとり、１０ｃｍのＬＢプ
レートにまきなおした。得られたコロニー５０個を培養
しＤＮＡを調製後プライマーｈＴＰＯ−Ｉ及びｈＴＰＯ
−ＫＵを用いてＰＣＲを実施した（条件等は上記と同
一）。その結果、１クローンのみ予想通りのバンドが増
幅された。このクローンをｐＨＴＦ１と命名した。 ＜実施例２２＞ ヒトＴＰＯ ｃＤＮＡクローンｐＨＴＦ１のシークエン
ス プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実
施した。クローンｐＨＴＦ１を５０μｇ／ｍｌのＡｍｐ
ｉｃｉｌｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養し
た後、遠心分離により得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙ
ｓｏｚｙｍｅ溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ／１％ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ
ｐｏｔａｓｓｉｕｍ／５Ｍ ａｃｅｔａｔｅ溶液を６
ｍｌ加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清は
フェノールークロロホルム（１：１）処理後、等量のイ
ソプロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレ
ットはＴＥ溶液に溶解後、ＲＮＡｓｅ処理、フェノール
ークロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿
を行なう。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、Ｎａｃ
ｌ、ポリエチレングリコール３０００をそれぞれ０．６
３Ｍ、７．５％になるように加えて遠心する。最後に、
ペレットはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。
これにより約３００μｇのプラスミドＤＮＡｐＨＴＦ１
を得た。精製したプラスミドＤＮＡについてＴａｑ Ｄ
ｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシ
ステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社
製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンス
し、全長の塩基配列を決定した。塩基配列およびそれか
ら演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号７）に示
した。塩基配列決定に必要なプライマーは配列番号６の
配列をもとに合成したプライマー並びに、それらのプラ
イマーによるシークエンス反応で解析された内部配列を
もとに設計した合成プライマーを使用した。その結果、
得られたクローンｐＨＴＦ１は１７２１塩基対のｃＤＮ
Ａ断片からなり、実施例２で分析されたアミノ酸配列Ａ
Ｐ８（配列番号７：アミノ酸番号１〜１２）及びＴＰ２
／ＴＰ３（配列番号７：アミノ酸番号１５７〜１６２）
と相同性の高い配列が確認された。このＤＮＡ断片は、
１０１塩基目までの５’ノンコーディング領域に続く、
１０２〜１０４塩基目にコードされるメチオニンに始ま
り１１５８〜１１６０塩基目にコードされるグリシンま
で続く３５３個のアミノ酸からなるオープンリーディン
グフレームをコードしていると考えられ、それに続く停
止コドン（ＴＡＡ）以降の３’ノンコーディング領域を
５３１塩基と３０個のポリＡ尾部配列を持っていた。こ
のオープンリーディングフレームにコードされると考え
られるタンパク質のアミノ酸配列は配列番号６に記載
の、ヒトＴＰＯの予想されるアミノ酸配列と完全に一致
した。塩基配列は配列番号６の配列より５’側で７７塩
基分、３’側のポリＡ尾部配列直前までの領域で３４７
塩基分長いｃＤＮＡをコードしていた。また塩基配列
は、配列番号６と３箇所で異なっていた。異なる塩基配
列は配列番号７のＡ（８４塩基目）が配列番号６では
Ｃ、Ａ（７４０塩基目）がＴ、Ｇ（１１９８塩基目）が
Ａであった。２番目の塩基（７４０塩基目）のみ、タン
パク質のコーディング領域内の変異であったが、スレオ
ニンの３番目のコドンであり、アミノ酸の変換は起こさ
なかった。この塩基配列の置換が何に起因するのかはこ
の時点では明らかでなかったが、得られたクローンｐＨ
ＴＦ１の解析より、ヒトＴＰＯタンパク質は２１残基の
シグナル配列を含む３５３個のアミノ酸からなることが
確認できた。シグナル配列を除いたタンパク質の推定分
子量は３５４６６であった。大腸菌ＤＨ５に担持された
ベクターｐＨＴＦ１は１９９４年３月２４日付けで通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４６１７として寄託した。これはまた、
１９９５年３月２２日付で中華民国 食品工業発展研究
所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９４００８５として寄託し
た。 ＜実施例２３＞ ヒトＴＰＯｃＤＮＡクローンｐＨＴＦ１のＣＯＳ１細胞
での発現〜活性確認 得られたクローンｐＨＴＦ１のＣＯＳ１細胞へのトラン
スフェクションは、実施例１１に従って行なった。すな
わちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使用しクロロキン処理
を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたトランスフェ
クションを行ない、３日後に培養上清を回収した。得ら
れた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して透析後、ラット
ＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＨＴ
Ｆ１を発現させたＣＯＳ１細胞培養上清では用量依存的
にＴＰＯ活性が認められたが、ｃＤＮＡインサートを含
まない発現プラスミドをトランスフェクションしたＣＯ
Ｓ１培養上清では活性が認められなかった（図１０
ａ）。類似の結果は、Ｍ−０７ｅアッセイ系においても
得られ、ｐＨＴＦ１を発現させたＣＯＳ１細胞培養上清
中に有意なＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性を認めた（図１
０ｂ）。これらの結果から、ｐＨＴＦ１に含まれるｃＤ
ＮＡはＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子であることが明確になった。 ＜実施例２４＞ ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのクローニング ヒトＴＰＯｃＤＮＡをプローブとしてヒトＴＰＯ染色体
ＤＮＡのクローニングを行なった。クローニングに使用
したゲノミックライブラリーは東北大学 遺伝子実験施
設山本徳男教授よりいただいた（Ｓａｋａｉら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、２１７３−２１８２、１
９９４に記載のライブラリーで、ヒト染色体ＤＮＡを制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩによって部分分解したものをＳｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ社製ファージベクターＬａｍｂｄａ Ｅ
ＭＢＬ３のＢａｍＨＩ部位につないで構築したライブラ
リー）。このライブラリーよりヒトＴＰＯｃＤＮＡをプ
ローブとしてスクリーニングを実施したが、用いた手法
はすべて本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８
９）］に記載されているようにして実施した。大腸菌Ｌ
Ｅ３９２を宿主菌として、１５ｃｍのＮＺＹＭプレート
（１ｌ中に１０ｇ ＮＺａｍｉｎｅ、５ｇ Ｎａｃｌ、
５ｇ ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２ｇ
ＭｇＣｌ４７Ｈ２Ｏ、１５％ａｇａｒを含む。ｐＨ
７．０のもの）１枚あたり３万個となるようにファージ
をまき、１８枚のプレートを作製した。それぞれのプレ
ートより各２枚のレプリカフィルターを作製した（ＰＡ
ＬＬ社製ＢＩＯＤＹＮＥＴＭＡ ＴＲＡＮＳＦＥＲ Ｍ
ＥＭＢＲＡＮＥを使用）。フィルターの変性は０．５Ｎ
ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ １０分間、０．５Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ １０分間行ない、３０分間風乾し８０℃の真空オー
ブン中で１．５時間ベーキングした。プレハイブリダイ
ゼイションは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１％ＳＤＳ、
２０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む５００ｍｌの溶液
中で４２℃１時間行なった。プローブはヒトＴＰＯｃＤ
ＮＡ断片（配列番号７の塩基配列番号１７８−１０２
５）をＰＣＲで増幅後精製したものをＲａｎｄｏｍ Ｐ
ｒｉｍｅｒ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ（宝
酒造社製；Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３２、６−
１３、１９８３に記載のランダムプライマー法を利用し
たＤＮＡ標識キット）を用いて３２Ｐ標識したものを用
いた。ＰＣＲに使用したプライマーの配列は以下の通
り。 ハイブリダイゼイションはプレハイブリダイゼイション
と同じ組成の溶液を５００ｍｌ使用し、放射標識したプ
ローブを加え４２℃で２０時間行なった。フィルターは
２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中室温で５分間づつ３
回洗浄後、１．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で６
８℃１時間の洗浄を行なったのち、増強スクリーン及び
Ｘ−ＯＭＡＴＴＭＡＲ５フィルム（イーストマンコダッ
ク社製）により−７０℃１６時間オートラジオグラフィ
ーを行なった。その結果、１３個の陽性シグナルが得ら
れた。もとのプレートより１３個の陽性シグナル周辺の
プラークを拾い上げ、１５ｃｍのＮＺＹＭプレート１枚
あたり１０００プラークとなるようにまき直した。それ
ぞれのプレートから各２枚のレプリカフィルターを作製
し、上記と同じ条件でハイブリダイゼイションを実施し
た。その結果、１３組全てのフィルターで陽性シグナル
が検出された。各プレートより１個づつプラークを単離
し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載のＰｌ
ａｔｅ Ｌｙｓａｔｅ法でファージＤＮＡを調製した。
１３クローンのファージＤＮＡについてｃＤＮＡのコー
ディング領域を含んでいるかどうかをＰＣＲによってチ
ェックした。チェックに使用したプライマーの配列は以
下の通り。 これらのプライマーの組み合わせにてＰＣＲを実施した
ところ、１３クローンのうち５クローンはｃＤＮＡから
予測されるアミノ酸のコーディング領域を全て含んでい
ると考えられた。これら５クローンに含まれる染色体Ｄ
ＮＡの長さは約２０ｋｂｐとそろっており、予備的に検
討した制限酵素解析でもほぼ同一のパターンを示した。
そこでこれらのクローンのうち１個（クローンλＨＧＴ
１）を選択し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ解析を行な
った。すなわち、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡ各１μｇ
を制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで完全に消
化し、０．８％アガロースゲルで泳動後、ＰＡＬＬ社製
ＢＩＯＤＹＮＥＴＭＡ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＭＥＭＢＲ
ＡＮＥに転写した。フィルターは３０分間風乾後８０℃
の真空オーブン中で２時間ベーキングした。プレハイブ
リダイゼイションは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、
５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１％Ｓ
ＤＳ、２０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む５０ｍｌの
溶液中で４２℃１時間行なった。プローブはヒトＴＰＯ
ｃＤＮＡ断片（配列番号７の塩基配列番号１７８−１０
２５）をＰＣＲで増幅後精製したものをＲａｎｄｏｍ
Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ
（宝酒造社製）を使用して３２Ｐ標識したものを用い
た。ハイブリダイゼイションはプレハイブリダイゼイシ
ョンと同じ組成の溶液を５０ｍｌ使用し、放射標識した
プローブを加え４２℃で２０時間行なった。フィルター
は２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中室温で５分間づつ
３回洗浄後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で
６８℃１時間の洗浄を行なったのち、増強スクリーン及
びＸ−ＯＭＡＴＴＭＡＲ５フィルム（イーストマンコダ
ック社製）により−７０℃１６時間オートラジオグラフ
ィーを行なった。その結果、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
消化した場合に約１０ｋｂｐの単一のバンドが観察され
た。そこで、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡ１０μｇを制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後０．８％アガロースゲル
で泳動し、１０ｋｂｐのバンドを切り出して、プレップ
−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で
精製し、同様にＨｉｎｄＩＩＩで消化したクローニング
ベクターｐＵＣ１３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にサブ
クローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント
・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を使用した）。得られたク
ローンのうち、１０ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む
クローンを選択しｐＨＧＴ１と命名した。ファージクロ
ーンλＨＧＴ１のおおまかな制限酵素地図を図１１に示
す。 ＜実施例２５＞ ヒトＴＰＯ染色体クローンｐＨＧＴ１のシークエンス ｐＨＧＴ１クローンを培養しプラスミドＤＮＡの精製を
行なった。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｔｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）］に記載されているようにして実施した。
クローンｐＨＧＴ１を５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌ
ｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した後、遠
心分離により得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙｓｏｚｙ
ｍｅ溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ／１％
ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ ｐｏｔ
ａｓｓｉｕｍ／５Ｍ ａｃｅｔａｔｅ溶液を６ｍｌ加え
てよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノー
ルークロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパ
ノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはＴ
Ｅ溶液に溶解後、ＲＮａｓｅ処理、フェノールークロロ
ホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を行な
う。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、ＮａＣｌ、ポリ
エチレングリコール３０００をそれぞれ０．６３Ｍ、
７．５％になるように加えて遠心する。最後に、ペレッ
トはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。これに
より約３００μｇのプラスミドＤＮＡｐＨＧＴ１を得
た。精製したプラスミドＤＮＡについてＴａｑ Ｄｙｅ
ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステ
ムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３
７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、ｃ
ＤＮＡの塩基配列から予想される、タンパク質コーディ
ング領域周辺の塩基配列を決定した。塩基配列およびそ
れから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号８）
に示した。塩基配列決定に必要なプライマーは実施例２
２で使用した、ｃＤＮＡの塩基配列解析に用いたもの並
びに、それらのプライマーによるシークエンス反応で解
析された内部配列をもとに設計した合成プライマーを使
用した。その結果、プラスミドクローンｐＨＧＴ１が担
持する染色体ＤＮＡは、配列番号６で予想されたアミノ
酸のコーディング領域を全て含みその領域に関しては、
塩基配列は完全に一致していた。また、アミノ酸をコー
ドするエクソンに相当する領域は４つのイントロンによ
って分断されており、イントロンの長さは５’側から順
に２３１ｂｐ、２８６ｂｐ、１９３２ｂｐ、２３６ｂｐ
であった。配列番号７に記載のｃＤＮＡ塩基配列とは３
箇所で異なっていた。異なる塩基配列は実施例２２で記
載した箇所（配列番号６と７の相違点）と同一であり、
配列番号７のＡ（８４塩基目）がＣ、Ａ（７４０塩基
目）がＴ、Ｇ（１１９８塩基目）がＡであった。すなわ
ち、実施例２１で取得したヒトＴＰＯｃＤＮＡクローン
ｐＨＴＦ１の塩基配列は、ヒト染色体の塩基配列と３箇
所で異なることが明かとなった。そこで、この塩基配列
の変異が本来の配列を反映するものであるか解析するた
めに、スクリーニングで最終的に選択された５個の染色
体ＤＮＡクローンのうち、塩基配列を決定していない残
りの４クローンについて、配列の決定を行なった。配列
の解析はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の
Ｐｌａｔｅ Ｌｙｓａｔｅ法で調製したファージＤＮＡ
を使用した直接塩基配列決定法で行なった。反応には上
記３箇所の塩基配列変異点を解析できる位置の実施例２
２で合成したシークエンスプライマー並びに、Ｔａｑ
Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃ
ｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオ
システムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ
社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンス
した。その結果、４個全てのクローンで配列番号７の８
４塩基目がＣ、７４０塩基目がＴであり、配列番号７の
ｃＤＮＡとは異なり、配列番号６のものと一致した。１
１９８塩基目についてはＧのクローンが２個、Ａのクロ
ーンが２個であった。すなわち、染色体ＤＮＡ本来の塩
基配列が２種類あることが明かとなった。この配列の違
いが相同染色体に由来するものか、複数存在する遺伝子
に由来するものかは、現時点では不明である。また、購
入したＣｌｏｎｔｅｃｈ社製ポリ（Ａ）＋ＲＮＡがＣａ
ｕｃａｓｉａｎ由来であるのに対し、染色体ＤＮＡの由
来が日本人であることから、塩基配列の変異は人種の違
いに起因する可能性も示唆される。大腸菌ＤＨ５に担持
されたベクターｐＨＧＴ１は１９９４年３月２４日付け
で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６１６として寄託した。これは
また、１９９５年３月２２日付で中華民国 食品工業発
展研究所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９４００８４として
寄託した。 ＜実施例２６＞ ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＯＳ１細胞での発現と活性
確認 サブクローニングして得られたプラスミドクローンｐＨ
ＧＴ１には、インサート部分に３箇所、ベクター内に１
箇所、合計４箇所のＥｃｏＲＩ認識配列が存在するが、
インサート内の一番５’側のＥｃｏＲＩ認識配列とベク
ター内のＥｃｏＲＩ認識配列にはさまれる約４．３ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片に、ヒトＴＰＯタンパク質のコーディン
グ領域が全て含まれることが、塩基配列の解析から明ら
かになった。そこで、この断片をＥｃｏＲＩ処理した発
現ベクターｐＥＦ１８Ｓにつなぎ、４個のヒトＴＰＯ発
現プラスミドｐＥＦＨＧＴＥ＃１−４を得た（前述の図
１１）。これらのプラスミドＤＮＡを調製し発現実験を
行なった。プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているよ
うにして実施し、約２５０μｇのプラスミドＤＮＡを得
た。得られたクローンｐＥＦＨＧＴＥ＃１−４のＣＯＳ
１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従っ
て行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使用
しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用
いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清
を回収した。得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対し
て透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した。
その結果、ｐＥＦＨＧＴＥを発現させたＣＯＳ１細胞培
養上清中に用量依存的にＴＰＯ活性が認められ、一方、
ＤＮＡインサートを含まない発現プラスミドをトランス
フェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認め
られなかった。クローン＃１〜４のいずれでもほぼ同様
の結果が得られたが、代表例としてｐＥＦＨＧＴＥ＃１
における結果を図１２ａに示した。また、Ｍ−０７ｅア
ッセイ系においても、ｐＥＦＨＧＴＥを発現させたＣＯ
Ｓ１細胞培養上清にて用量依存的に有意なＭ−０７ｅ細
胞増殖促進活性が認められた。代表例として、ｐＥＦＨ
ＧＴＥ＃１における結果を図１２ｂに示した。これらの
結果より、得られたクローンｐＥＦＨＧＴＥが担持する
ＤＮＡはヒトＴＰＯの機能的染色体ＤＮＡであること
が、明らかとなった。 ＜実施例２７＞ ヒトＴＰＯ欠失誘導体の作製とＣＯＳ１細胞での発現〜
活性確認 実施例１８の結果より、ヒトＴＰＯは完全長でなくても
活性を発現しうることが明かとなったが、その活性発現
に必要な領域を解析する目的で、欠失誘導体の作製並び
に発現を行なった。実施例１８で得たプラスミドクロー
ンｐＨＴ１−２３１をもとにＣ末端側から順次２０個の
アミノ酸を欠失させた発現プラスミド並びにＴＰ２／３
の直後（１６３番目）までのアミノ酸を含む発現プラス
ミドを作製した。作製にはＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用
に作製したプライマーの配列は以下の通り。 実施例１８で得たクローンＰＨＴ１−２３１のプラスミ
ドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用し、合成したプライマ
ー（ｈＴＰＯ−５を５’側として使用、ｈＴＰＯ−２、
−３、−４、−Ｓを３’側として使用）をそれぞれ１０
μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣ
Ｒ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈＡｍｐｌｉＴａ
ｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を
用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９
６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００
μｌの容量でＰＣＲ（９５℃で１分間の変性条件、６６
℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件
で２０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュ
ベート）を行った。それぞれのＰＣＲで得られたバンド
を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化後、１％アガ
ロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を
用いた電気泳動にかけ、それぞれのＰＣＲ反応の予想さ
れる大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ
−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製
し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓ
にサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製
コンピテント・ハイ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を使用）。
得られた形質転換体のうち、それぞれ予想される長さの
インサートを含むクローンをそれぞれ４個ないし５個づ
つ選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的
にＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載さ
れているようにして実施した。一連の操作によってアミ
ノ酸１−１６３をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−１
６３＃１−５）、アミノ酸１−１７１をコードする欠失
誘導体（ｐＨＴ１−１７１＃１−４）、アミノ酸１−１
９１をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−１９１＃１−
４）、アミノ酸１−２１１をコードする欠失誘導体（ｐ
ＨＴ１−２１１＃１−４）のプラスミドＤＮＡを得た。
精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａｑ Ｄｙｅ
ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓ
ｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム
ズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７
３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、全長
にわたり塩基配列の置換がなく、予想通りのＴＰＯｃＤ
ＮＡ配列を持つことを確認した。得られたそれぞれのク
ローンのＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実
施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ
各１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デ
キストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、
３日後に培養上清を回収した。培養上清をＩＭＤＭ培養
液に対して透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評
価した。その結果、ｐＨＴ１−２１１、ｐＨＴ１−１９
１、ｐＨＴ１−１７１、およびｐＨＴ１−１６３を発現
させたいずれのＣＯＳ１細胞培養上清でも用量依存的に
ＴＰＯ活性を認めた。代表例としてｐＨＴ１−２１１＃
１、ｐＨＴ１−１９１＃１、およびｐＨＴ１−１７１＃
２における結果を図１３ａに、ｐＨＴ１−１６３＃２に
おける結果を図１３ｂに示した。類似の結果は、Ｍ−０
７ｅアッセイ系においても得られ、ｐＨＴ１−２１１、
ｐＨＴ１−１９１、ｐＨＴ１−１７１、およびｐＨＴ１
−１６３を発現させたいずれのＣＯＳ１細胞培養上清で
も用量依存的に有意なＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性を認
めた。代表例として、ｐＨＴ１−２１１＃１、ｐＨＴ１
−１９１＃１、ｐＨＴ１−１７１＃２、およびｐＨＴ１
−１６３＃２における結果を図１４に示した。これらの
結果より、ヒトＴＰＯタンパク質を構成するアミノ酸３
５３個（２１個のシグナル配列を含む）のうち、１６４
位のアルギニン以降のアミノ酸を欠失させても、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおける活性が保持されることが明らかとな
り、１６４位のアルギニンより前に、ＴＰＯ活性発現の
ために必須な領域が含まれていることが示唆された。 ＜実施例２８＞ ヒトＴＰＯ Ｃ末側欠失体の作製とＣＯＳ１細胞での発
現〜活性確認 ヒトＴＰＯ蛋白質の活性発現に必須な領域の解析を行な
う目的で、実施例２７で得られた欠失体よりもさらにＣ
末側アミノ酸を欠失させた誘導体を作製しＴＰＯ活性を
発現しうるかどうか検討した。実施例１６で得たプラス
ミドクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４をもとに、１６３
番目のセリンを基準にＣ末端側から順次アミノ酸を欠失
させた発現プラスミドを構築した。構築にはＰＣＲを利
用した。ＰＣＲ用に作製したプライマーの配列は、次の
通りである。 実施例１６で得たクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のプ
ラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用し、合成したプ
ライマー（ｈＴＰＯ−５を５’側として使用、ｈＴＰＯ
−１５０、−１５１、−１５３、−１５４、−１５５、
−１５６、−１５７を３’側として使用）をそれぞれ１
０μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｎ Ａｍｐｌｉ
ＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社
製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅ
ｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により
１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で１分間の変性
条件、６６℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間
の合成条件で２０回の反応を行い、さらに７分間７２℃
でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲで得ら
れたバンドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化
後、１％アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃ
ｔｓ 社製）を用いた電気泳動にかけ、それぞれのＰＣ
Ｒ反応の予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離
し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラ
ッド社製）で精製し、同様に制限酵素処理した発現ベク
ターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌とし
ては東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ Ｄ
Ｈ５を使用）。得られた形質転換体のうち、それぞれ予
想される長さのインサートを含むクローンをそれぞれ３
個ないし５個づつ選択し、プラスミドＤＮＡを調製し
た。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１
９８９）］に記載されているようにして実施した。一連
の操作によって配列番号４において、アミノ酸番号１−
１５０をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５０＃２１、
２２、２５）、アミノ酸番号１−１５１をコードする欠
失体（ｐＨＴ１−１５１＃１６、１７、１８）、アミノ
酸番号１−１５３をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５
３＃１−５）、アミノ酸番号１−１５４をコードする欠
失体（ｐＨＴ１−１５４＃１−５）、アミノ酸番号１−
１５５をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５５＃１−
５）、アミノ酸番号１−１５６をコードする欠失体（ｐ
ＨＴ１−１５６＃１−５）、アミノ酸番号１−１５７を
コードする欠失体（ｐＨＴ１−１５７＃１−５）のプラ
スミドＤＮＡを得た。精製したプラスミドＤＮＡ ｐＨ
Ｔ１−１５０＃２１、２２、２５並びにｐＨＴ１−１５
１＃１６、１７、１８についてはＴａｑ Ｄｙｅ Ｄｅ
ｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社
製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３Ａ
ＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、全長にわ
たり塩基配列の置換がなく、予想通りのＴＰＯｃＤＮＡ
配列を持つことを確認した。得られたそれぞれのクロー
ンのＣＯＳ １細胞へのトランスフェクションは、実施
例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ各
１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキ
ストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３
日後に培養上清を回収した。培養上清をＩＭＤＭ培養液
に対して十分に透析後、Ｍ−０７ｅアッセイ系で評価し
た。その結果、１５１位のアミノ酸であるシステインを
含む、それぞれアミノ酸１−１５１位、１−１５３位、
１−１５４位、１−１５５位、１−１５６位、１−１５
７位からなるＣ末側欠失誘導体をコードするクローンを
トランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清中には
用量依存的にＴＰＯ活性が検出された。しかしながら、
１５１個目のシステインまでを欠失させたアミノ酸１−
１５０位のＣ末側欠失誘導体をコードするクローンをト
ランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清中にはＴ
ＰＯ活性が検出されなかった。 ＜実施例２９＞ ヒトＴＰＯ Ｎ末側欠失体の作製とＣＯＳ１細胞での発
現〜活性確認 ヒトＴＰＯ蛋白質の活性発現に必須な領域の解析を行な
う目的で、実施例２８で得られた欠失体をもとに、Ｎ末
側アミノ酸を欠失させた誘導体を作製しＴＰＯ活性を発
現しうるかどうか検討した。実施例１８で得たプラスミ
ドクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４並びに、実施例２７
で得たプラスミドクローンｐＨＴ１−１６３をもとに、
シグナル配列に続くＮ末端側アミノ酸を欠失させた発現
プラスミドを構築した。構築にはＰＣＲを利用した。Ｐ
ＣＲ用に作製したプライマーの配列は、次の通りであ
る。 （１）アミノ酸番号１−１２を欠失する誘導体（ｐＨＴ
１３−２３１）作製 実施例１８で得たクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のプ
ラスミドＤＮＡ１．４μｇを鋳型として使用し、合成し
たプライマー（ｈＴＰＯ−１３及びｈＴＰＯ３を組で使
用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−１３Ｒを組で使用）
をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡ
ｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ
ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社
製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５
分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６５℃で１分
間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回
の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）
を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガロース
ゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ 社製）を用い
た電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要なＤＮ
Ａ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キッ
ト（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッ
ファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型として用い
２回目のＰＣＲを実施した。合成したプライマー（ｈＴ
ＰＯ−５並びにｈＴＰＯ３を使用）をそれぞれ５μＭ使
ってＰＣＲを実施した。 ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ
Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用
いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６
００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μ
ｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性後、９５℃
で１分間の変性条件、６０℃で１分間のアニール条件、
７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を行い、さら
に７分間７２℃でインキュベート）を行った。ＰＣＲ産
物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄ
ｕｃｔｓ 社製）を用いた電気泳動にかけ、予想される
大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジ
ーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、
１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、等量のフェノール／クロ
ロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を行なった。遠心
で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッファーに溶解後、
同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサ
ブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コン
ピテント・ハイ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を使用）。得ら
れた形質転換体のうち、予想される長さのインサートを
含むクローンを４５個選択し、プラスミドＤＮＡを調製
した。方法は本質的に Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）］に記載されているようにして実施した。
配列番号４において、アミノ酸番号１−２３１をコード
する蛋白質のうち１−１２を欠失する欠失誘導体（ｐＨ
Ｔ１３−２３１）のプラスミドＤＮＡを得た。これらに
ついてｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ３のプライマーを用
いたＰＣＲを行ない、４５クローンのうち８クローンで
予想される大きさ程度のインサートが確認された。それ
らのうち３クローンついては Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏ
ｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕ
ｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社
製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３Ａ
ＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、１クロー
ンで、予想通りの欠失が起こっており、またその他の部
分も含めて全長にわたり塩基配列の置換等がなく、設計
通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持つクローンｐＨＴ１３−
２３１＃３が得られた。 （２）アミノ酸番号１−６を欠失する誘導体（ｐＨＴ７
−１６３）の作製 上記（１）の欠失誘導体作製においては、ＴＰＯ蛋白質
のＣ末端を２３１番目のアミノ酸として設計したが、Ｃ
末端側はさらに欠失させてもＴＰＯ活性を発現しうるこ
とが確認されたため、今回の欠失体作製にあたってはＣ
末端を１６３番目のアミノ酸までとして設計した。下記
（３）においても同様に１６３番目のアミノ酸をＣ末端
として設計した。実施例２７で得たクローンｐＨＴ１−
１６３のプラスミドＤＮＡ１．４μｇを鋳型として使用
し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−７及びｈＴＰＯ−
Ｓを組で使用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−７Ｒを組
で使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。Ｇ
ｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲＲｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉ
ｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣ
Ｒ Ｓｙｓｔｅｍ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ
社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で
５分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６５℃で１
分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０
回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベー
ト）を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガロ
ースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ 社製）を
用いた電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要な
ＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製
キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥ
バッファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型として
用い２回目のＰＣＲを実施した。合成したプライマー
（ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−Ｓを使用）をそれぞれ
５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｍｐｌｉ
ＴａｑＴＭ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社
製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅ
ｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により
１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性
後、９５℃で１分間の変性条件、６０℃で１分間のアニ
ール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を
行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行っ
た。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ Ｂ
ｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ 社製）を用いた電気泳動にか
け、予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プ
レップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社
製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。
制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、等量のフ
ェノール／クロロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を
行なった。遠心で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッフ
ァーに溶解後、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐ
ＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東
洋紡績社製コンピテント・ハイ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
を使用）。得られた形質転換体のうち、予想される長さ
のインサートを含むクローンを３０個選択し、プラスミ
ドＤＮＡを調製した。方法は本質的に Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ ［（１９８９）］に記載されているよう
にして実施した。配列番号４において、アミノ酸番号１
−１６３をコードする蛋白質のうち１−６を欠失する欠
失誘導体（ｐＨＴ７−１６３）のプラスミドＤＮＡを得
た。これらのクローンにつてはｈＴＰＯ−５並びにｈＴ
ＰＯ−Ｓをプライマーとして用いたＰＣＲを実施し、全
てのクローンで予想される大きさ程度のインサートを含
むことが確認された。これらのクローンより３個を選択
し、ＴａｑＤｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅ
ｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプラ
イドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオ
システムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシ
ークエンスし、２クローンで、予想通りの欠失が起こっ
ており、またその他の部分も含めて全長にわたり塩基配
列の置換等がなく、設計通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持
つ２個のクローンｐＨＴ７−１６３＃４、＃２９が得ら
れた。 （３）アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体（ｐＨＴ８
−１６３）作製 アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体（ｐＨＴ８−１６
３）の作製方法は上記、アミノ酸番号１−６を欠失する
誘導体（ｐＨＴ７−１６３）の作製と本質的には同様の
方法で行なった。実施例２７で得たクローンｐＨＴ１−
１６３のプラスミドＤＮＡ１．４μｇを鋳型として使用
し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−８及びｈＴＰＯ−
Ｓを組で使用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−８Ｒを組
で使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。Ｇ
ｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗ
ｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭ
ＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５
℃で５分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６５℃
で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で
３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベ
ート）を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガ
ロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ 社製）
を用いた電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要
なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精
製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴ
Ｅバッファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型とし
て用い２回目のＰＣＲを実施した。合成したプライマー
（ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−Ｓを使用）をそれぞれ
５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰ
ＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｍｐｌｉ
ＴａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社
製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ Ｓｙｓｔｅ
ｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により
１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性
後、９５℃で１分間の変性条件、６０℃で１分間のアニ
ール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を
行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行っ
た。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ Ｂ
ｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ 社製）を用いた電気泳動にか
け、予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プ
レップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社
製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。
制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、等量のフ
ェノール／クロロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を
行なった。遠心で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッフ
ァーに溶解後、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐ
ＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東
洋紡績社製コンピテント・ハイ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
を使用）。得られた形質転換体のうち、予想される長さ
のインサートを含むクローンを３０個選択し、プラスミ
ドＤＮＡを調製した。方法は本質的に Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実
施した。配列番号４において、アミノ酸番号１−１６３
をコードする蛋白質のうち１−７を欠失する欠失誘導体
（ｐＨＴ８−１６３）のプラスミドＤＮＡを得た。これ
らのクローンについてはｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−
Ｓをプライマーとして用いたＰＣＲを実施し、全てのク
ローンで予想される大きさ程度のインサートを含むこと
が確認された。これらのクローンより３個を選択し、Ｔ
ａｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライド
バイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシス
テムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシーク
エンスし、２クローンで、予想通りの欠失が起こって起
こっており、またその他の部分も含めて全長にわたり塩
基配列の置換等がなく、設計通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列
を持つ２個のクローンｐＨＴ８−１６３＃３３、＃４８
が得られた。 （４）欠失誘導体のＣＯＳ１細胞での発現とＴＰＯ活性
の確認 得られたそれぞれの欠失体クローンのＣＯＳ １細胞へ
のトランスフェクションは、実施例１１に従って行なっ
た。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しクロ
ロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたト
ランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収
した。培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析
後、Ｍ−０７ｅアッセイ系で評価した。その結果、アミ
ノ酸７−１６３位の欠失誘導体をコードするクローンを
トランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清中に弱
いながらも用量依存的にＴＰＯ活性を認めた。一方、ア
ミノ酸８−１６３位、１３−２３１位の欠失誘導体をコ
ードするクローンをトランスフェクションしたＣＯＳ１
細胞培養上清中にはＴＰＯ活性が認められなかった。 ＜実施例３０＞ ヒトＴＰＯ完全長ｃＤＮＡプラスミド（ｐＨＴＰ１）の
作製 配列番号６のように予想されたヒトＴＰＯｃＤＮＡのア
ミノ酸コーディング領域を全て持つ、動物細胞発現ベク
ターの構築を行なった。ＰＣＲによりヒトＴＰＯｃＤＮ
Ａコーディング領域を全てカバーするＤＮＡ断片を以下
の様に作製した。用いたプライマーの塩基配列は次の通
りである。 実施例１６で得られたクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４
の３００ｎｇを鋳型として１回目のＰＣＲを行なった。
プライマーｈＴＰＯ−Ｉ並びにＳＡ各０．５μＭを用
い、Ｖｅｎｔ ＲＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ 社製）１
ユニットを使用して反応（９６℃１分間、６２℃１分
間、７２℃１分間という反応を３０サイクル行なった後
７２℃７分間）を行なった。反応溶液の組成は以下の通
り。最終濃度で１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２
ＳＯ４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
８）、２ｍＭＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ。市販のヒト正常
肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｃｈ社製）１
μｇを７０℃で１０分間加熱後氷上で急冷し、１０ｍＭ
ＤＴＴ、５００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ、２５ｎｇ ｒ
ａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、１０ユニッ
トＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ベーリンガーマン
ハイム社製）、２００ユニット ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ
ｔＴＭＩＩ ＲＮａｓｅＨ−（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯ
ＬＯＧＩＥＳ 社製）を加え、３７℃で１時間保温しｃ
ＤＮＡを合成した。合成したＣＤＮＡ反応液の２０分の
１量を鋳型として使用して２回目のＰＣＲを行なった。
プライマーｈＴＰＯ−Ｐ並びにｈＴＰＯ−ＫＯ各２．５
μＭ、２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて反応（９
５℃１分間、５８℃１分間、７２℃１分間の反応を３０
サイクル）を行なった。２回のＰＣＲ溶液を１％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、それぞれ予想された大きさの
主要なバンドをプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット
（バイオラッド社製）を用いて精製した。それぞれの精
製量のうち各２０分の１量を鋳型として３回目のＰＣＲ
を実施した。Ｖｅｎｔ ＲＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ 社
製）１ユニットを使用して反応（９６℃２分間加熱後、
９６℃２分間、７２℃２分間、という反応を３サイクル
行なった後７２℃７分間）を行なった。この反応液にそ
れぞれ１μＭとなるようにｈＴＰＯ−Ｉ並びにｈＴＰＯ
−ＫＯを加えた後、９６℃２分間の加熱を行ない、その
のち９６℃１分間、６２℃１分間、７２℃１分間の反応
を２５サイクル行なったあと７２℃でさらに７分間反応
させた。反応液を等量の水飽和フェノール−クロロホル
ムで１回抽出後、さらに等量のクロロホルムで１回抽出
したのち、エタノール沈殿（０．３Ｍ酢酸ナトリウム、
０．５μｌベーリンガーマンハイム社製グリコーゲン、
２．５倍量エタノール存在下）を行なってＤＮＡを回収
した。回収したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ並びにＮｏ
ｔＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、予想
された大きさの主要なバンドをプレップ−Ａ−ジーンＤ
ＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した
のち、予め同様に制限酵素ＢａｍＮＩ並びにＮｏｔＩ消
化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ベクター
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に連結後、コンピテントハ
イＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換し
た。得られたコロニーより４クローンを選びプラスミド
ＤＮＡを調製した。精製したプラスミドＤＮＡについて
はＴａｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅ
ｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｉｎｇＫｉｔ（アプライ
ドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシ
ステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシー
クエンスし、ＢａｍＨＩからＮｏｔＩにかけての領域に
塩基配列の置換がなく、予想通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列
を持つことが確認できたクローンｐＢＬＴＰを得た。ｐ
ＢＬＴＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＢａｍＨＩで消化
後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、高分子量のバン
ドをプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラ
ッド社製）を用いて精製した。同様にｐＥＦ１８Ｓ−Ｈ
Ｌ３４も制限酵素処理し４５０ｂｐのバンドを精製し
た。それぞれのＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎしコンピテン
トハイＥ，ｃｏｌｉ ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転
換した。得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製
し、ヒトＴＰＯｃＤＮＡのインサートを含むクローンｐ
ＢＬＴＥＮを得た。得られたｐＢＬＴＥＮを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、１％アガロースゲル
電気泳動にかけ、約１２００ｂｐのバンドをプレップ−
Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用
いて精製した後、同様に制限酵素処理した発現ベクター
ｐＥＦ１８Ｓに連結しコンピテントハイＥ．ｃｏｊｉ
ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたコロ
ニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、ヒトＴＰＯｃＤＮ
Ａのコーディング領域を全て含むクローンｐＨＴＰ１を
得た。このクローンのプラスミドＤＮＡを大量に調製し
以下の実験に使用した。プラスミドＤＮＡの調製は本質
的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載
されているようにして実施した。 ＜実施例３１＞ ＣＨＯ細胞用組換えベクター、ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰ
Ｏ−Ｐ １の構築 マウスＤＨＦＲミニ遺伝子を含むプラスミドｐＭＧ１、
１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理した
後、アガロースゲル電気泳動しマウスＤＨＦＲミニ遺伝
子を含む断片（約２．５ｋｂｐ）を回収した。回収した
断片を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｎｏ
ｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰからなる反応液２５μｌ中に
溶解し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２単位を加え、室温
で３０分間反応させ、ＤＮＡの末端を平滑化した。次い
で、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿
後、１０ｍＭ Ｔｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡからなる溶液１０μｌに溶解した。次に、得
られたマウスＤＨＦＲミニ遺伝子を含む断片と動物細胞
用発現ベクターｐＥＦ１８Ｓを制限酵素ＳｍａＩで処理
した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）で脱リ
ン酸化してえられたベクターＤＮＡをＴ ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターｐＤＥＦ２
０２を得た。次に、このベクターｐＤＥＦ２０２を制限
酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理し、アガロースゲル電
気泳動で大きい方のベクターフラグメントを回収したの
ち、このフラグメントとヒトＴＰＯ ｃＤＮＡ（Ｐ１ク
ローン）を含むプラスミドｐＨＴＰ１を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＳｐｅＩで処理して得られたヒトＴＰＯ ｃＤＮ
Ａ（Ｐ１クローン）とをＴ ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
製）で結合させ、発現ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰ
Ｏ−Ｐ１得た。このプラスミドはＳＶ４０の複製開始領
域、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロ
モーター、ＳＶ４０初期ポリアデニル部位、マウスＤＨ
ＦＲミニ遺伝子、ｐＵＣ１８の複製開始領域、β−ラク
タマーゼ遺伝子（Ａｍｐｒ）を含み、ヒトエロンゲーシ
ョンファクタ−１−アルファプロモーター下流にヒトＴ
ＰＯ ｃＤＮＡが接続されている。 ＜実施例３２＞ ＣＨＯ細胞でのヒトＴＰＯの発現 ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉ
ｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；
７７巻４２１６頁、１９８０）を６ｃｍ径のプレート
（Ｆａｌｃｏｎ社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小
必須培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチ
ン添加）で培養増殖させ、これをリン酸カルシウム法
（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ、ファルマシア社製）によって形
質転換した。すなわち、実施例３１で調製したｐＤＥＦ
２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１プラスミド１０μｇにバッファ
ーＡ：１２０μｌおよびＨ２Ｏ：１２０μｌを加え混合
したのち、室温で１０分間放置した。つぎに、この溶液
にバッファーＢ：１２０μｌを加え、再度混合したの
ち、室温で３０分間放置した。このＤＮＡ溶液をプレー
トに滴下したのち、ＣＯ２インキュベーター中で６時間
培養した。プレートから培地を除去し、α−ＭＥＭ
（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチルスルフォオキシ
ド含有α−ＭＥＭ（−）を添加し、室温で２分間処理し
た。次いで、１０％透析牛胎児血清含有非選択培地（前
出α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）
を添加して２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清
含有選択培地（α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チ
ミジン無添加）での選択をおこなった。選択は細胞をト
リプシン処理した後、６ｃｍ径プレート１枚あたりを、
１０ｃｍ径プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２
０枚に分割したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換
を行いながら培養を続行する事により実施した。細胞が
増殖してきたプレートあるいはウエルについてはその培
養上清中のヒトＴＰＯ活性をＭ−０７ｅアッセイ及びＢ
ａ／Ｆ３アッセイを用いて測定したところ、いずれのア
ッセイ系においても活性が認められた。培養上清中にヒ
トＴＰＯ活性の認められたものについては新しいプレー
トあるいはウエルに２５ｎＭのメソトレキセートを含む
選択培地で１：１５に細胞を分割し、培養を続行するこ
とによりメソトレキセートに耐性の細胞を増殖させてク
ローニングを行った。なお、ＣＨＯ細胞の形質転換はＣ
ＨＯ細胞に対しｐＨＴＰ１とｐＭＧ１を同時形質転換
（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することによって
も行うことができる。プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴ
ＰＯ−Ｐ１によって形質転換されたＣＨＯ細胞株（ＣＨ
Ｏ−ＤＵＫＸＢ１１）は１９９５年１月３１日付で通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４９８８として寄託されている。これは
また、１９９５年３月２２日付で中華民国食品工業発展
研究所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９６００２３として寄
託されている。 ＜実施例３３＞ Ｘ６３．６．５．３．細胞用組換えベクター、ＢＭＣＧ
Ｓｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１の構築 動物細胞用発現ベクターＢＭＣＧＳｎｅｏ１μｇを制限
酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩで処理した後、アガロースゲル
電気ゲル電気泳動し、ベクターＤＮＡ部分を回収した。
次いで得られたＤＮＡ断片とヒトＴＰＯ ｃＤＮＡを含
むプラスミドｐＢＬＴＥＮを制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔ
Ｉで処理して得られたヒトＴＰＯ ｃＤＮＡ（Ｐ １ク
ローン）とをＴ ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、発現プ
ラスミドＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１を得た。こ
の発現プラスミドはサイトメガロウイルス初期プロモー
ター、ウサギβグロビン遺伝子由来のイントロンおよび
ポリアデニル部位ヒトβグロビン遺伝子の一部、ウシパ
ピローマウイルス１遺伝子の６９％、チミジンキナーゼ
プロモーターおよびポリアデニル部位、ホスホトランス
フェラーゼＩ（ネオマイシン耐性遺伝子）、ｐＢＲ３２
２の複製開始領域おびβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ
ｒ）を含みサイトメガロウイルスプロモーター下流にヒ
トＴＰＯ ｃＤＮＡが接続されている。 ＜実施例３４＞ Ｘ６３．６．５．３．細胞での発現 Ｘ６３．６．５．３．細胞は１０％牛胎児血清を含むＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ′ｓｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａ
ｌ（ＤＭＥ）培地中で培養増殖させ、これをエレクトロ
ポレーション法によって形質転換した。すなわち、実施
例３３で調製したＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１プ
ラスミド２０μｇを１０７個の細胞を含むＤＭＥ培地７
５０μｌに加え、エレクトロポレーション用の４ｍｍギ
ャップのキュベットにセットし、４℃で１０分間放置し
た。このキュベットをエレクトロポレーション装置（Ｂ
ＴＸ６００、ＢＴＸ社製）にセットし、３８０Ｖ、２５
ｍＦ、２４オングストロームの条件で遺伝子導入した。
遺伝子導入後、キュベットを再び４℃で１５分間放置し
たのち、細胞を１０％牛胎児血清を含むＤＭＥで一回洗
浄した。次に細胞を５０ｍｌの１０％牛胎児血清を含む
ＤＭＥに懸濁し、９６ウエルプレート５枚に分割したの
ち、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。その
後、培養液を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ
社）、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥに交換し、以後３
日ごとに培地交換した。細胞が増殖してきたウエルにつ
いてはその培養上清中のヒトＴＰＯ活性をＣＦＵ−ＭＫ
アッセイ、Ｍ−０７ｅアッセイ及びＢａ／Ｆ３アッセイ
を用いて測定したところ、いずれのアッセイ系において
も活性が認められた。培養上清中にヒトＴＰＯ活性の認
められたものについては耐性の細胞を増殖させて、２回
クローニングを行い、ヒトＴＰＯ産生細胞株を樹立し
た。 ＜実施例３５＞ ヒトＴＰＯのＣＯＳ１細胞での大量発現 ＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１
に記載のクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン
法で実施した。ＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
０）をコラーゲンコート処理した１７５ｃｍ２の培養フ
ラスコ中で、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを含むＩＭＤＭ
を用いて、３７℃の５％炭酸ガスインキュベーター内で
約１００％コンフルエントになるまで培養した。培養フ
ラスコのコラーゲンコート処理は、１ｍＭ ＨＣｌで
０．３ｍｇ／ｍｌに調製したコラーゲン溶液（イワキ社
製Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ｔｙｐｅＩ−Ｃ）を１７５ｃ
ｍ２の培養フラスコあたり２５ｍｌ加え、室温で１時間
放置後コラーゲン溶液を回収し、２０〜５０ｍｌのＰＢ
Ｓで１回洗浄することで行なった。トランスフェクショ
ンは１７５ｃｍ２の培養フラスコ１枚あたり、２５０μ
ｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア
社）、６０μＭのクロロキン（シグマ社）、および１０
％（ｖ／ｖ）のＮｕ−Ｓｅｒｕｍ（コラボレイティブ
社）を含む２０ｍｌのＩＭＤＭ溶液に５００μｌのＨＢ
Ｓに溶解したプラスミドｐＨＴＰ１（４０μｇ）を混和
し、トランスフェクション直前にＩＭＤＭで１回洗浄し
た上記のＣＯＳ１細胞に添加した後、３７℃の５％炭酸
ガスインキュベーター内で３時間培養した。その後、培
養上清を吸引除去しＩＭＤＭで１回洗浄した後、５０ｍ
ｌの無血清培地を添加し、３７℃の５％炭酸ガスインキ
ュベーター内で培養し、５日後に培養上清を回収した。
１回の操作には１７５ｃｍ２の培養フラスコ１００から
２６０枚を使用し、５〜１３ｌの培養上清を回収した。
無血清培地の組成は、５μｇ／ｍｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ
（シグマ社製）、５μｇ／ｍｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉ
ｎ（シグマ社製）、１０μＭ ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌ
ａｍｉｎｅ（和光純薬）、２５ｎＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓ
ｅｌｅｎｉｔｅ（シグマ社製）、２００μｇ／ｍｌのＢ
ＳＡ（ニチレイ社製脂肪酸フリー高純度ウシアルブミ
ン）を含むＩＭＤＭである。 ＜実施例３６＞ ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラス
ミドｐＨＴＰ１，Ｐ１クローン由来）の精製と活性確認 ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラス
ミドｐＨＴＰ１由来）の活性と精製の実施例を以下に述
べる。ＴＰＯの血小板増加作用を調べるため、部分精製
品をまず調製し、かつ高純度のＴＰＯ標品を得るための
精製を行った。以下の調製過程でのＴＰＯ活性測定に
は、Ｍ−０７ｅアッセイ系を主に用いたが、ラットＣＦ
Ｕ−ＭＫアッセイ系においても同様のＴＰＯ活性が示さ
れた。またこれらのアッセイに際し、最終濃度０．０２
〜０．０５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を標品に
添加した。まず、プラスミドｐＨＴＰ１を大橋、須藤の
方法（Ｈｉｄｅｙａ Ｏｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｄａ
ｓｈｉ Ｓｕｄｏ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，５８（４），７５８−７５９，１９９
４）を用いてトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞
を、１０００ｍｌ当たり０．２ｇのＢＳＡ、５ｍｇの牛
インシュリン、５ｍｇのヒトトランスフェリンを含みか
つ、０．０２ｍＭのモノエタノールアミン、２５ｎＭの
Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｌｅｎｉｔｅを含む無血清ＩＭＤＭ
培養液で５日間、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で培
養し、約７Ｌの無血清培養上清を得た。その無血清培養
上清に、蛋白質分解酵素阻害剤であるｐ−ＡＰＭＳＦ及
びＰｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ（４−（２−Ａｍｉｎｏｅｔ
ｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏ
ｒｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｍｅｒｋ社
製、カタログ番号２４８３９）を最終濃度約１ｍＭ加
え、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。こ
れを限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウル
トラセット分子量８０００カット、またはミリポア社製
・ＰＬＧＣペリコンカセット 分子量１００００カッ
ト）で約１０倍濃縮し、体積７２３ｍｌ（蛋白質濃度
３．３８ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量２４４５ｍｇ、相対活
性４３０００、相対活性量１０５１０００００）に対し
１０００ｍｌ当り１．６ｍｏｌｅｓのＡｍｍｏｎｉｕｍ
Ｓｕｌｆａｔｅ（合計２８８ｇ）を加え、最終濃度
１．５Ｍ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅを含む８
０４ｍｌの溶液とした後、１．２５Ｍ Ａｍｍｏｎｉｕ
ｍ Ｓｕｌｆａｔｅを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．２）で予め平衡化してあったＭａｃｒ
ｏ−Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣカラム（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ社製、カタログ番号１５６−００８０；直径５ｃ
ｍ、ベッド高９ｃｍ）に、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで添加
した。添加終了後、１．２５Ｍ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓ
ｕｌｆａｔｅを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．２）で溶出された素通り画分Ｆ１（２３８４
ｍｌ，蛋白質濃度０．８６４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量２
０６１ｍｇ，相対活性６０００）を得た。次に、溶出液
を２０ｍＭ Ｎａ Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ５．８にか
え、溶出された画分Ｆ２（１０９２ｍｌ，蛋白質濃度
０．７７６ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量８４７ｍｇ，相対活
性１５００００）を集めた。さらに、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒ
ｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣカラム Ｆ２（１０８１ｍ
ｌ）を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
８）で予め平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａ
ｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア バイオテク社製、カタ
ログ番号１７−０７２９−０１；直径３ｃｍ、ベッド高
１０ｃｍ）カラムに注入し、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで添
加した。添加終了後、さらに１１０ｍＭ ＮａＣｌを含
む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で
溶出されたものをまとめた画分Ｆ１（２２６２ｍｌ，蛋
白質濃度０．２７０ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量６１０ｍ
ｇ，相対活性３００００）を得た。次に、溶出液を４０
０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．４）にかえ、溶出された画分Ｆ２（８５
６ｍｌ，蛋白質濃度０．１８９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量
１６２ｍｇ，相対活性３０００００）を集めた。次に、
溶出液を１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）にかえ、溶出された
画分Ｆ３（３７０ｍｌ，蛋白質濃度０．０３４ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量１２．６ｍｇ，相対活性１５００００）
を集めた。さらに、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ Ｆｌｏｗカラムにおいて主たるＴＰＯ活性画分Ｆ２
（８４５ｍｌ）に、最終濃度約１０％の１−プロパノー
ルを加え、４００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）で予め平衡化したＬ
Ａ−ＷＧＡカラム（ホーネン社製、カタログ番号ＷＧ−
００７；直径２ｃｍ、ベッド高１４ｃｍ）カラムに注入
し、流速３ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、４０
０ｍＭのＮａｃｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．４）と１−プロパノールの混液（９：
１）で溶出されたものをまとめた画分Ｆ１（６４．４ｍ
ｌ，蛋白質濃度０．０１７８ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量
１．１５ｍｇ，相対活性１７２２０）を得た。次に、溶
出液を０．４Ｍ ＧｌｃＮａｃ，１０％１−プロパノー
ルを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
１）にかえ、溶出された画分Ｆ２（４５ｍｌ，蛋白質濃
度０．０１０４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量０．４７０ｍ
ｇ，相対活性６７５０００）を集めた。そこで、ＬＡ−
ＷＧＡカラムにおいて主たるＴＰＯ活性画分Ｆ２（３４
０ｍｌ）に、最終濃度約０．００５％のＴＦＡを加えた
後、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰ（ＹＭＣ社製、カタ
ログ番号ＡＰ−５１３；直径６ｍｍ、ベッド高２５０ｍ
ｍ）カラムにて展開した。即ち、展開溶媒Ａに０．１％
ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡを含む１−プロ
パノールを用い、１５％Ｂで平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃ
ｋ ＣＮ−ＡＰカラムに、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで注
入した。注入終了後、１５％Ｂから２５％Ｂにプロパノ
ール濃度を上げ、さらに２５％Ｂから５０％Ｂまで６５
分の直線濃度勾配で展開し、１．５ｍｌ（２．５ｍｉ
ｎ）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。それぞれ
０．５μｌ（３０００分の１フラクション）を取りＨＳ
Ａを加え、限外濾過濃縮し、最終的に０．０５％ＨＳＡ
を含む０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液溶液と
し、これをアッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定し
た。この結果、チューブ番号２４〜３０（プロパノール
濃度で３５．０〜４２．０％の範囲）に強いＴＰＯの活
性（相対活性約６３００００〜４８０００００）があっ
たため、ＴＰＯ活性画分ＦＡ（１３．５ｍｌ）とした。
そこでさらに、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰで得られ
たＦＡを、展開溶媒Ａに０．１％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに
０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用いたＣａ
ｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１ ３００Ａ（資生堂製、カタ
ログ番号Ｃ１ＴＹＰＥ：ＳＧ３００Ａ；直径４．６ｍ
ｍ、ベッド高１５０ｍｍに加え、直径４．６ｍｍ、ベッ
ド高３５ｍｍのプレカラムを接続したもの）カラムにて
展開した。即ち、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ−ＡＰで得ら
れたＦＡの一部（８．９ｍｌ）をとり、０．３ｍｌのグ
リセロールを添加後、遠心エバポレーションで濃縮後、
約２．５ｍｌの１０％Ｂ液を加え、２０％Ｂで平衡化し
たＣａｐｃｅｌｌ ＰａｋＣ１ ３００Ａカラムに流速
０．４ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入終了後、２０％Ｂ
にて５分溶出した後、２０％Ｂから４０％Ｂまで５０分
の直線濃度勾配で展開し、１ｍｌ（２．５ｍｉｎ）ずつ
ポリプロピレン製チューブに集めた。それぞれ１μｌ
（１０００分の１フラクション）を取りＨＳＡを加え、
限外濾過濃縮し、最終的に０．０５％ＨＳＡを含む０．
２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液溶液とし、これをア
ッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、
チューブ番号２０〜２３（プロパノール濃度で２８．５
〜３２．５％の範囲）に強いＴＰＯの活性（相対活性約
３００００００〜２２５０００００）を示す高活性標品
を得ることができた。 ＜実施例３７＞ ＣＯＳ１細胞で発現したヒトＴＰＯの分子量測定 ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラス
ミドｐＨＴＦ１、Ｆ１クローン由来）の分子量は、糖鎖
が付加された結果、ペプチド鎖の大きさから推定しうる
分子量よりも大きいことが考えられた。そこでまず、Ｃ
ＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミ
ドｐＨＴＦ１、Ｆ１クローン由来）を含む培養上清から
部分精製ＴＰＯ画分を以下のように調製した。即ち、展
開溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））およ
び展開溶媒Ｂ（０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノー
ル）を用いて、２５％Ｂで予め平衡化したＹＭＣ−Ｐａ
ｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社、カタログ番号
Ａ−ＰＲＲＰ−３３−４６−２５；直径０．４６ｃｍ、
ベッド高１５ｃｍ）カラムに、培養上清０．３ｍｌを注
入し、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで５分２５％Ｂを通液し
た後、５０分間の２５％Ｂから５０％Ｂまでの直線濃度
勾配にて分画した。ＴＰＯ活性は３４．５％〜４３．５
％１−プロパノールの範囲に溶出され、これを遠心エバ
ポレーションで乾固し、部分精製標品を得た。次に、実
施例１に述べた非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから蛋
白質抽出操作後、Ｍ−０７ｅアッセイ系にてＴＰＯ活性
を調べ、あるいは実施例４５に述べるウエスターン分析
により、還元処理されたＤＰＣＩＩＩマーカーに対する
分子量を測定した。この結果、見かけ上の分子量約６９
０００〜９４０００の広い範囲にＴＰＯ活性が存在し、
分子量の不均一性を確認できた。さらにこれと同様にし
て、Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（ジェンザイム社製、カタ
ログ番号１４７２−００）によるＮ結合型糖鎖切断後の
ＴＰＯについて、還元処理されたＤＰＣＩＩＩマーカー
に対する見かけ上の分子量を調べてみると、３６０００
〜４００００となり、ペプチド鎖の大きさから推定しう
る分子量約３５０００よりもなおも大きいことが判明
し、Ｏ結合型糖鎖をも含むことが強く示唆された。これ
らと同様、ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ
（発現プラスミドｐＨＴＰ１、Ｐ１クローン由来）の見
かけ上の分子量についても調べたところ、６３０００〜
８３０００であった。 ＜実施例３８＞ヒトＴＰＯの生物学的特性 主に発現プラスミドｐＨＴＦ１をＣＯＳ１細胞へトラン
スフェクションして得られたＴＰＯ活性を含有する培養
上清を用いて、ヒトＴＰＯのヒト、およびラット血液系
細胞に対する作用を調べた。ヒト臍帯血から調製したＣ
Ｄ３４＋、ＤＲ＋細胞画分を用いたコロニーアッセイ系
で検定したところ、ヒトＴＰＯにより有意な数の巨核球
コロニーが形成された。例えば、発現プラスミドｐＨＴ
１−２３１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ
１細胞培養上清を１０％添加した条件下で、６０００個
のＣＤ３４＋、ＤＲ＋細胞から平均１１．５個の巨核球
コロニーが形成された。ヒト抹消血からＦｉｃｏｌｌ−
Ｐａｑｕｅを用いた比重遠心法にて得られた白血球画分
からプラスティック付着性細胞を除去し、さらにＳＢＡ
（ダイズアグルチニン）に親和性を有する細胞をＡＩＳ
マイクロセレクターＣＤ３４（旭メディカル株）を用い
たパニング法にて除去し、最終的にＡＩＳマイクロセレ
クターＣＤ３４（旭メディカル株）を用いたパニング法
にてＣＤ３４＋細胞画分を得た。この細胞画分にヒトＴ
ＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＦ１をトランスフェクショ
ン、発現させたＣＯＳ１細胞培養上清）を添加し、１０
日間液体培養したところ、サイズの大きいＧｐＩＩｂ／
ＩＩＩａ＋細胞の選択的増殖が認められ、さらにこのＧ
ｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋細胞では核の倍数性（ｐｌｏｉｄ
ｙ）が増加していた。このことから、ヒトＴＰＯがヒト
巨核球系前駆細胞に特異的に作用し、その増殖・分化を
促進することが強く示唆された。ラット骨髄細胞から分
離・精製したＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋細胞画分、及びＧ
ｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋細胞画分を得る前段階のプラステ
ィック非付着性細胞画分を用いたコロニーアッセイ系で
検定したところ、ヒトＴＰＯにより有意な数の巨核球コ
ロニーが形成された。例えば、発現プラスミドｐＨＴＦ
１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞培
養上清を２０％添加した条件下で、培養５日目に１００
０個のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋細胞から平均３４．５個
の巨核球コロニー、また２００００個のプラスティック
非付着性細胞から平均２８．５個の巨核球コロニーが形
成された。さらに、プラスチック非付着細胞画分には巨
核球系以外の様々な系統の前駆細胞が存在するが、ヒト
ＴＰＯの添加では巨核球コロニーしか形成されず、ヒト
ＴＰＯが巨核球系前駆細胞に特異的に作用することが強
く示唆された。また、ラット骨髄由来のＧｐＩＩｂ／Ｉ
ＩＩａ＋細胞画分をヒトＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴ
Ｆ１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞
培養上清を２０％添加）の存在下に３〜５日間液体培養
し、核の倍数性（ｐｌｏｉｄｙ）を調べたところ、培養
５日目に明らかにｐｌｏｉｄｙが増加していた。 ＜実施例３９＞ グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とヒ
トＴＰＯ（アミノ酸１−１７４）の融合タンパク質（以
下、この融合タンパク質を「ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７
４）」と称す）の大腸菌発現用ベクターの構築 大腸菌でのヒトＴＰＯの発現を容易にするために、ヒト
ＴＰＯをコードしかつ大腸菌優先コドンを含有する人工
遺伝子を作製した。なお、このＤＮＡ塩基配列は大腸菌
翻訳開始用のアミノ末端メチオニンコドン（ＡＴＧ）を
−１の位置に有する。表１２に示した１−１２の合成オ
リゴヌクレオチドを作製し、２−１１の合成オリゴヌク
レオチドをＴ４キナーゼ（ファルマシア社製）により１
ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，
１０ｍＭ Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，５０ｍＭ Ｋ−ａｃ
ｅｔａｔｅの溶液中でリン酸化した。これらの合成オリ
ゴヌクレオチドを６本の二本鎖ＤＮＡにするために１及
び２；３及び４；５及び６；７及び８；９及び１０；１
１及び１２それぞれの組み合わせの一本鎖ＤＮＡを１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２，５０ｍＭ ＮａＣｌの溶液中でアニールし
た。次に１及び２；３及び４；５及び６の三組の二本鎖
ＤＮＡと、７及び８；９及び１０；１１及び１２の三組
の二本鎖ＤＮＡをそれぞれＴ４リガーゼ（ライフテクノ
ロジー社製）を用いて反応し、更にこれら二種の反応液
を同様にしてＴ４リガーゼを用いて反応した。このライ
ゲーション反応で得られたＤＮＡをＢａｍＨＩ（ベーリ
ンガーマンハイム社製）で消化後、２％のアガロースゲ
ルで泳動し、約３９０−４００ｂｐの大きさのフラグメ
ントを回収してプレップ７Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット
で精製し、ＸｂａＩ，ＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１８
にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
αを使用した）。得られたクローンのうち、表１３に示
したヒトＴＰＯをコードしかつ大腸菌優先コドンを含有
する人工遺伝子をもつクローンを、塩基配列の解析によ
り選択し、これをｐＵＣ１８（ＸＢ）（１−１２３）と
した。表１３のコーディング鎖のＤＮＡ配列を配列表
（配列番号９）に示した。
【表１２】
【表１３】 ヒト正常肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ １μｇよりｃＤ
ＮＡの１本鎖目をオリゴｄＴプライマーをプライマーと
して合成し、ｃＤＮＡ合成の反応液の０．１容を鋳型と
してＰＣＲを行った。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｃ及び
ｈＴＰＯ−こ（ＥｃｏＲＩ）を使用し、１００μｌの容
量で反応を行った（９６℃２分間の後に、９５℃１分間
／５８℃１分間／７２℃１分間を３０サイクル反応し、
さらに７２℃７分間）。これによって得られた、ヒトＴ
ＰＯｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化後２
％のアガロースゲルで泳動し、約６００ｂｐの大きさの
フラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精
製キットで精製し、ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで消化した
ｐＵＣ１８にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ５αを使用した）。正しいヒトＴＰＯ塩基配列
をコードするクローンを、塩基配列の解析により選択
し、ｐＵＣ１８（ＢＥ）（１２４，３３２）とした。こ
こで用いたＰＣＲ用プライマーの配列は以下の通りであ
る。 ｐＵＣ１８（ＢＥ）（１２４−３３２）をＢａｍＨＩと
ＥｃｏＲＩで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、約
６００ｂｐの大きさのヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣ末端側フ
ラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製
キットで精製し、ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで消化したｐ
ＵＣ１８（ＸＢ）（１−１２３）にサブクローニングし
た（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを使用した）。ここ
で得られたクローンをｐＵＣ１８（ＸＥ）１−３３２）
とした。ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣ末端側の種々のデリー
ションコンストラクトを作製し、それを発現させインビ
トロのヒトＴＰＯ活性の測定を行った実施例より、ヒト
ＴＰＯアミノ酸１−１６３はヒトＴＰＯ活性を保持する
ことが明らかになったので、このペプチド断片を含んだ
発現ベクターを構築することにした。ここでは、ＧＳＴ
−ＴＰＯ（１−１７４）の発現を行った。ｐＨＴＦ１ク
ローンの６８１−６８６（アミノ酸１７３−１７４）に
相当する塩基配列は、制限酵素ＳａｃＩにより認識され
るので、この制限酵素認識部位を利用して２本の合成オ
リゴヌクレオチドにより終止コドンを導入した。具体的
には、２本の合成オリゴヌクレオチドＳＳＥ１，ＳＳＥ
２を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＮａＣｌの溶液中でアニ
ールし、ここで得られた二本鎖ＤＮＡを、ＳａｃＩ，Ｅ
ｃｏＲＩで消化してヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣ末端側約４
８０ｂｐを除いたｐＵＣ１８（ＸＥ）（１−３３２）に
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用
いて導入し、クローンｐＵＣ１８（ＸＳ）（１−１７
４）を得ることができた（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
αを使用した）。ここで用いた合成オリゴヌクレオチド
の配列を表１４に示した。
ＮＡの１本鎖目をオリゴｄＴプライマーをプライマーと
して合成し、ｃＤＮＡ合成の反応液の０．１容を鋳型と
してＰＣＲを行った。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｃ及び
ｈＴＰＯ−こ（ＥｃｏＲＩ）を使用し、１００μｌの容
量で反応を行った（９６℃２分間の後に、９５℃１分間
／５８℃１分間／７２℃１分間を３０サイクル反応し、
さらに７２℃７分間）。これによって得られた、ヒトＴ
ＰＯｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化後２
％のアガロースゲルで泳動し、約６００ｂｐの大きさの
フラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精
製キットで精製し、ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで消化した
ｐＵＣ１８にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ５αを使用した）。正しいヒトＴＰＯ塩基配列
をコードするクローンを、塩基配列の解析により選択
し、ｐＵＣ１８（ＢＥ）（１２４，３３２）とした。こ
こで用いたＰＣＲ用プライマーの配列は以下の通りであ
る。 ｐＵＣ１８（ＢＥ）（１２４−３３２）をＢａｍＨＩと
ＥｃｏＲＩで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、約
６００ｂｐの大きさのヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣ末端側フ
ラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製
キットで精製し、ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで消化したｐ
ＵＣ１８（ＸＢ）（１−１２３）にサブクローニングし
た（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを使用した）。ここ
で得られたクローンをｐＵＣ１８（ＸＥ）１−３３２）
とした。ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣ末端側の種々のデリー
ションコンストラクトを作製し、それを発現させインビ
トロのヒトＴＰＯ活性の測定を行った実施例より、ヒト
ＴＰＯアミノ酸１−１６３はヒトＴＰＯ活性を保持する
ことが明らかになったので、このペプチド断片を含んだ
発現ベクターを構築することにした。ここでは、ＧＳＴ
−ＴＰＯ（１−１７４）の発現を行った。ｐＨＴＦ１ク
ローンの６８１−６８６（アミノ酸１７３−１７４）に
相当する塩基配列は、制限酵素ＳａｃＩにより認識され
るので、この制限酵素認識部位を利用して２本の合成オ
リゴヌクレオチドにより終止コドンを導入した。具体的
には、２本の合成オリゴヌクレオチドＳＳＥ１，ＳＳＥ
２を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＮａＣｌの溶液中でアニ
ールし、ここで得られた二本鎖ＤＮＡを、ＳａｃＩ，Ｅ
ｃｏＲＩで消化してヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣ末端側約４
８０ｂｐを除いたｐＵＣ１８（ＸＥ）（１−３３２）に
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用
いて導入し、クローンｐＵＣ１８（ＸＳ）（１−１７
４）を得ることができた（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
αを使用した）。ここで用いた合成オリゴヌクレオチド
の配列を表１４に示した。
【表１４】 ｐＵＣ１８（ＸＳ）（１−１７４）をＸｂａＩ，Ｅｃｏ
ＲＩで消化後、２％のアガロースゲルで泳動し、ヒトＴ
ＰＯアミノ酸１−１７４をコードする約６００ｂｐの大
きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤ
ＮＡ精製キットで精製し、ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩで消化
したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ＋（ストラタジ
ーン社製）にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ５αを使用した）。ここで得られたクローンを
ｐＢＬ（ＸＳ）（１−１７４）とした。さらに、これと
同様にしてｐＢＬ（ＸＳ）（１−１７４）をＸｂａＩ，
ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ヒトＴＰＯアミノ酸１−１７
４をコードする約５５０ｂｐの大きさのフラグメントを
回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製
し、ＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＦＭ５３
６（特表示昭６０−５０１９８８）にクローニングした
（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを使用した）。ここで
得られたクローンをｐＣＦＭ５３６／ｈＴ（１−１７
４）とした。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）との融合タンパク発現ベクターであるｐＧＥ
Ｘ−２Ｔ（ファルマシア社製）によって、ＧＳＴ−ＴＰ
Ｏ（１−１７４）を発現させるために、次のことを行っ
た。ｐＣＦＭ５３６／ｈＴ（１−１７４）を鋳型とし
て、２本のＰＣＲ用プライマーＧＥＸ１，ＧＥＸ３を用
いてＰＣＲを行った（９６℃２分間の後に、９５℃１分
間／４１℃１分間／７２℃１分間を２２サイクル反応
し、さらに７２℃７分間）。これによって得られた、ヒ
トＴＰＯをコードする断片をＮａｅＩとＥｃｏＲＩで消
化後２％のアガロースゲルで泳動し、約５５０ｂｐの大
きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤ
ＮＡ精製キットで精製し、ＥｃｏＲＩ，Ｓｍａｌで消化
したｐＧＥＸ−２Ｔにクローニングし（宿主はＥ．ｃｏ
ｌｉ ＤＨ５を使用した）、正しいヒトＴＰＯ塩基配列
をコードするクローンｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７
４）を、塩基配列の解析により選択し、これをＧＳＴ−
ＴＰＯ（１−１７４）発現用の形質転換体とした。ここ
で用いたＰＣＲ用プライマーの配列は以下の通りであ
る。 またこの発現プラスミドは、ＧＳＴタンパクに続いてト
ロンビン認識配列、及びヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１７
４）をコードする配列を含んでいる。トロンビン認識配
列、及びヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１７４）をコードす
る配列を配列表（配列番号１０）に示した。 ＜実施例４０＞ ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）の大腸菌での発現 実施例３９で得られた形質転換株を、アンピシリン５０
μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地６０ｍｌに３７℃で一晩振盪
培養し、この培養液２５ｍｌをアンピシリン５０μｇ／
ｍｌを含むＬＢ培地１０００ｍｌに加えて、ＯＤはＡ
６００が０．７−０．８に至るまで３７℃で振盪培養し
た。次いで最終濃度が、０．１ｍＭになるようにＩＰＴ
Ｇを添加し、さらに３時間振盪培養して、ＧＳＴ−ＴＰ
Ｏ（１−１７４）の発現を誘導した。 ＜実施例４１＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）由来ＧＳＴ
−ＴＰＯ（１−１７４）の精製と活性確認 ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＧＥＸ−２
Ｔ／ｈＴ（１−１７４）由来ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７
４）生産組換体凍結菌体５．９ｇに水１０ｍｌを加えて
けん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕した。遠心分離によ
り、ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を沈殿画分に回収
し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。次
に、回収されたＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を含む沈
殿画分に水５ｍｌを加えてけん濁した後、攪拌しながら
１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を６ｍｌ、１０Ｍ尿素１
２０ｍｌ、水１６ｍｌを加えた。室温にて５分間攪拌可
溶化後、溶液を４等分し、各々、以下のとおり（１）〜
（４）の４種の操作を行った。（１）２０ｍＭＴｒｉｓ
緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈した。これに還元型グル
タチオンと酸化型グルタチオンを加えて、各々、最終濃
度５ｍＭ及び０．５ｍＭとし、４℃で一晩静置した。遠
心分離により、上清中にＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）
を回収しこれに２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
５．５で２倍希釈した後、酢酸を用いてｐＨ５．５に調
整した。２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５
で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆ
ｌｏｗ（ファルマシア バイオテク社製、カタログ番号
１７−０７２９−０１）陽イオン交換カラムにＧＳＴ−
ＴＰＯ（１−１７４）を吸着させた。同樹脂を２０ｍＭ
クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で洗浄した後、５
００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ５．５を用いてＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１
７４）を溶出させた。溶出液１２９ｍｌに２．６ｍｌの
１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加えて、ｐＨを８．１
にした後、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシ
ア バイオテク社製、カタログ番号１７−０７５６−０
１）カラムに添加しＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を吸
着させた。ＰＢＳで洗浄した後、１０ｍＭ還元型グルタ
チオンを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５でＧＳ
Ｔ−ＴＰＯ（１−１７４）を溶出させた。溶出液にトロ
ンビン３７ＮＩＨ Ｕｎｉｔを加えて室温で４時間静置
した後、ＰＢＳで１０倍希釈し、グルタチオンセファロ
ース４Ｂカラムに添加し切断されたＧＳＴを吸着させ、
非吸着画分にＴＰＯ（１−１７４）を回収した。回収し
た非吸着画分を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
５．５で３倍希釈し、同緩衝液で平衡化したＳＰ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラム
に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５
００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なっ
た。 （２）（１）の操作を全て０．１％ポリソルベート８０
存在下で行った。 （３）２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈
した。これに還元型グルタチオンと酸化型グルタチオン
を加えて、各々、最終濃度５ｍＭ及び０．５ｍＭとし、
４℃で一晩静置した。遠心分離により、上清中にＧＳＴ
−ＴＰＯ（１−１７４）を回収し、これに２０ｍＭクエ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で２倍希釈した後、酢
酸を用いてｐＨ５．５に調整した。２０ｍＭクエン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ５．５で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換樹脂にＧ
ＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を吸着させた。同樹脂を２
０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で洗浄した
後、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５を用いてＧＳＴ−ＴＰＯ
（１−１７４）を溶出させた。溶出液に１ ＭＴｒｉｓ
緩衝液ｐＨ８．５を加えてｐＨを約８とし、トロンビン
３２０ＮＩＨ Ｕｎｉｔを加えて室温で４時間静置した
後、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で５
倍希釈し、同緩衝液で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラムに添加
し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍ
Ｍまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。 （４）（３）の操作を全て０．１％ポリソルベート８０
存在下で行った。 （１）〜（４）の操作で得られたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換クロマトグラフ
ィーの塩化ナトリウム濃度約２００ｍＭから４００ｍＭ
で溶出された画分を、各々、ＩＭＤＭ培養液に対して十
分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫ系で評価した結果、容
量依存的にＴＰＯ活性を認めた。同画分を還元剤存在下
でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、この画分の主タ
ンパク質バンドの一つとして分子量１９Ｋダルトンのバ
ンドが検出された（純度１−２０％）。このバンドにつ
いて実施例１に記載された方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後、ＰＶＤＦ膜に転写しＮ末端シークエンス分析を行
なった結果、このｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）
由来の融合蛋白質として発現されるべきＴＰＯの配列を
含むことが確認できた。 ＜実施例４２＞ アミノ酸１（Ｓｅｒ→Ａｌａ）、アミノ酸３（Ａｌａ→
Ｖａｌ）に変換したヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）
の大腸菌用発現ベクターの構築 実施例３９で作製したｐＵＣ１８（ＸＥ）（１−３３
２）をＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩで消化後、２％のアガロー
スゲルで泳動し、ヒトＴＰＯアミノ酸１−３３２をコー
ドする約１０００ｂｐの大きさのフラグメントを回収し
てプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製し、Ｘ
ｂａＩ，ＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）にサブクローニ
ングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを使用し
た）。ここで得られたクローンをｐＢＬ（ＸＥ）（１−
３３２）とした。次にこのクローンｐＢＬ（ＸＥ）（１
−３３２）のＢａｍＨＩ認識配列からアミノ酸１６３
（３６６−４８９）までを大腸菌優先コドンに変更する
こととした。表に示した１３−２０の合成オリゴヌクレ
オチドを作成し、１３及び１４；１５及び１６；１７及
び１８の合成オリゴヌクレオチドを同チューブ中でＴ４
キナーゼ（ファルマシア社製）を用いて０．１ｍＭ Ａ
ＴＰ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１０ｍＭ
Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，５０ ｍＭ Ｋ−ａｃｅｔａ
ｔｅの溶液中でリン酸化した。さらに１／１０量の１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ
ＭｇＣｌ２，５００ｍＭ ＮａＣｌの溶液を加え、水
浴中で３分間煮沸した後、放置することにより２本鎖Ｄ
ＮＡとした。次に１３及び１４；１５及び１６；１７及
び１８の三組の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて連結し、これを鋳型として
１９及び２０の合成オリゴヌクレオチドをプライマーと
してＰＣＲ反応を行った。これによって得られたＰＣＲ
産物をＢａｍＨＩとＨｉｄＩＩＩで消化後２％のアガロ
ースゲルで泳動し、約１３０ｂＰの断片をプレップ−Ａ
−ジーンＤＮＡ精製キットにより回収した。これをＢａ
ｍＨＩとＨｉｄＩＩＩで消化したｐＢＬ（ＸＥ）（１−
３３２）にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５を使用した）。得られたクローンのうち表１５
に示した塩基配列を有するものをシークエンシングによ
り選択し、これをｐＢＬ（ＸＨ）（１−１６３）とし
た。
ＲＩで消化後、２％のアガロースゲルで泳動し、ヒトＴ
ＰＯアミノ酸１−１７４をコードする約６００ｂｐの大
きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤ
ＮＡ精製キットで精製し、ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩで消化
したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ＋（ストラタジ
ーン社製）にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ５αを使用した）。ここで得られたクローンを
ｐＢＬ（ＸＳ）（１−１７４）とした。さらに、これと
同様にしてｐＢＬ（ＸＳ）（１−１７４）をＸｂａＩ，
ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ヒトＴＰＯアミノ酸１−１７
４をコードする約５５０ｂｐの大きさのフラグメントを
回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製
し、ＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＦＭ５３
６（特表示昭６０−５０１９８８）にクローニングした
（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを使用した）。ここで
得られたクローンをｐＣＦＭ５３６／ｈＴ（１−１７
４）とした。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）との融合タンパク発現ベクターであるｐＧＥ
Ｘ−２Ｔ（ファルマシア社製）によって、ＧＳＴ−ＴＰ
Ｏ（１−１７４）を発現させるために、次のことを行っ
た。ｐＣＦＭ５３６／ｈＴ（１−１７４）を鋳型とし
て、２本のＰＣＲ用プライマーＧＥＸ１，ＧＥＸ３を用
いてＰＣＲを行った（９６℃２分間の後に、９５℃１分
間／４１℃１分間／７２℃１分間を２２サイクル反応
し、さらに７２℃７分間）。これによって得られた、ヒ
トＴＰＯをコードする断片をＮａｅＩとＥｃｏＲＩで消
化後２％のアガロースゲルで泳動し、約５５０ｂｐの大
きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤ
ＮＡ精製キットで精製し、ＥｃｏＲＩ，Ｓｍａｌで消化
したｐＧＥＸ−２Ｔにクローニングし（宿主はＥ．ｃｏ
ｌｉ ＤＨ５を使用した）、正しいヒトＴＰＯ塩基配列
をコードするクローンｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７
４）を、塩基配列の解析により選択し、これをＧＳＴ−
ＴＰＯ（１−１７４）発現用の形質転換体とした。ここ
で用いたＰＣＲ用プライマーの配列は以下の通りであ
る。 またこの発現プラスミドは、ＧＳＴタンパクに続いてト
ロンビン認識配列、及びヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１７
４）をコードする配列を含んでいる。トロンビン認識配
列、及びヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１７４）をコードす
る配列を配列表（配列番号１０）に示した。 ＜実施例４０＞ ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）の大腸菌での発現 実施例３９で得られた形質転換株を、アンピシリン５０
μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地６０ｍｌに３７℃で一晩振盪
培養し、この培養液２５ｍｌをアンピシリン５０μｇ／
ｍｌを含むＬＢ培地１０００ｍｌに加えて、ＯＤはＡ
６００が０．７−０．８に至るまで３７℃で振盪培養し
た。次いで最終濃度が、０．１ｍＭになるようにＩＰＴ
Ｇを添加し、さらに３時間振盪培養して、ＧＳＴ−ＴＰ
Ｏ（１−１７４）の発現を誘導した。 ＜実施例４１＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）由来ＧＳＴ
−ＴＰＯ（１−１７４）の精製と活性確認 ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＧＥＸ−２
Ｔ／ｈＴ（１−１７４）由来ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７
４）生産組換体凍結菌体５．９ｇに水１０ｍｌを加えて
けん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕した。遠心分離によ
り、ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を沈殿画分に回収
し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。次
に、回収されたＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を含む沈
殿画分に水５ｍｌを加えてけん濁した後、攪拌しながら
１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を６ｍｌ、１０Ｍ尿素１
２０ｍｌ、水１６ｍｌを加えた。室温にて５分間攪拌可
溶化後、溶液を４等分し、各々、以下のとおり（１）〜
（４）の４種の操作を行った。（１）２０ｍＭＴｒｉｓ
緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈した。これに還元型グル
タチオンと酸化型グルタチオンを加えて、各々、最終濃
度５ｍＭ及び０．５ｍＭとし、４℃で一晩静置した。遠
心分離により、上清中にＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）
を回収しこれに２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
５．５で２倍希釈した後、酢酸を用いてｐＨ５．５に調
整した。２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５
で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆ
ｌｏｗ（ファルマシア バイオテク社製、カタログ番号
１７−０７２９−０１）陽イオン交換カラムにＧＳＴ−
ＴＰＯ（１−１７４）を吸着させた。同樹脂を２０ｍＭ
クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で洗浄した後、５
００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ５．５を用いてＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１
７４）を溶出させた。溶出液１２９ｍｌに２．６ｍｌの
１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加えて、ｐＨを８．１
にした後、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシ
ア バイオテク社製、カタログ番号１７−０７５６−０
１）カラムに添加しＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を吸
着させた。ＰＢＳで洗浄した後、１０ｍＭ還元型グルタ
チオンを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５でＧＳ
Ｔ−ＴＰＯ（１−１７４）を溶出させた。溶出液にトロ
ンビン３７ＮＩＨ Ｕｎｉｔを加えて室温で４時間静置
した後、ＰＢＳで１０倍希釈し、グルタチオンセファロ
ース４Ｂカラムに添加し切断されたＧＳＴを吸着させ、
非吸着画分にＴＰＯ（１−１７４）を回収した。回収し
た非吸着画分を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
５．５で３倍希釈し、同緩衝液で平衡化したＳＰ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラム
に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５
００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なっ
た。 （２）（１）の操作を全て０．１％ポリソルベート８０
存在下で行った。 （３）２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈
した。これに還元型グルタチオンと酸化型グルタチオン
を加えて、各々、最終濃度５ｍＭ及び０．５ｍＭとし、
４℃で一晩静置した。遠心分離により、上清中にＧＳＴ
−ＴＰＯ（１−１７４）を回収し、これに２０ｍＭクエ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で２倍希釈した後、酢
酸を用いてｐＨ５．５に調整した。２０ｍＭクエン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ５．５で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換樹脂にＧ
ＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を吸着させた。同樹脂を２
０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で洗浄した
後、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５を用いてＧＳＴ−ＴＰＯ
（１−１７４）を溶出させた。溶出液に１ ＭＴｒｉｓ
緩衝液ｐＨ８．５を加えてｐＨを約８とし、トロンビン
３２０ＮＩＨ Ｕｎｉｔを加えて室温で４時間静置した
後、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で５
倍希釈し、同緩衝液で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラムに添加
し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍ
Ｍまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。 （４）（３）の操作を全て０．１％ポリソルベート８０
存在下で行った。 （１）〜（４）の操作で得られたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換クロマトグラフ
ィーの塩化ナトリウム濃度約２００ｍＭから４００ｍＭ
で溶出された画分を、各々、ＩＭＤＭ培養液に対して十
分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫ系で評価した結果、容
量依存的にＴＰＯ活性を認めた。同画分を還元剤存在下
でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、この画分の主タ
ンパク質バンドの一つとして分子量１９Ｋダルトンのバ
ンドが検出された（純度１−２０％）。このバンドにつ
いて実施例１に記載された方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後、ＰＶＤＦ膜に転写しＮ末端シークエンス分析を行
なった結果、このｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）
由来の融合蛋白質として発現されるべきＴＰＯの配列を
含むことが確認できた。 ＜実施例４２＞ アミノ酸１（Ｓｅｒ→Ａｌａ）、アミノ酸３（Ａｌａ→
Ｖａｌ）に変換したヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）
の大腸菌用発現ベクターの構築 実施例３９で作製したｐＵＣ１８（ＸＥ）（１−３３
２）をＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩで消化後、２％のアガロー
スゲルで泳動し、ヒトＴＰＯアミノ酸１−３３２をコー
ドする約１０００ｂｐの大きさのフラグメントを回収し
てプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製し、Ｘ
ｂａＩ，ＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）にサブクローニ
ングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを使用し
た）。ここで得られたクローンをｐＢＬ（ＸＥ）（１−
３３２）とした。次にこのクローンｐＢＬ（ＸＥ）（１
−３３２）のＢａｍＨＩ認識配列からアミノ酸１６３
（３６６−４８９）までを大腸菌優先コドンに変更する
こととした。表に示した１３−２０の合成オリゴヌクレ
オチドを作成し、１３及び１４；１５及び１６；１７及
び１８の合成オリゴヌクレオチドを同チューブ中でＴ４
キナーゼ（ファルマシア社製）を用いて０．１ｍＭ Ａ
ＴＰ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１０ｍＭ
Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，５０ ｍＭ Ｋ−ａｃｅｔａ
ｔｅの溶液中でリン酸化した。さらに１／１０量の１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ
ＭｇＣｌ２，５００ｍＭ ＮａＣｌの溶液を加え、水
浴中で３分間煮沸した後、放置することにより２本鎖Ｄ
ＮＡとした。次に１３及び１４；１５及び１６；１７及
び１８の三組の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて連結し、これを鋳型として
１９及び２０の合成オリゴヌクレオチドをプライマーと
してＰＣＲ反応を行った。これによって得られたＰＣＲ
産物をＢａｍＨＩとＨｉｄＩＩＩで消化後２％のアガロ
ースゲルで泳動し、約１３０ｂＰの断片をプレップ−Ａ
−ジーンＤＮＡ精製キットにより回収した。これをＢａ
ｍＨＩとＨｉｄＩＩＩで消化したｐＢＬ（ＸＥ）（１−
３３２）にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５を使用した）。得られたクローンのうち表１５
に示した塩基配列を有するものをシークエンシングによ
り選択し、これをｐＢＬ（ＸＨ）（１−１６３）とし
た。
【表１５】 さらに、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）の発現量を
増すこと、またＮ末端のプロテアーゼによる分解を防ぐ
ことを目的として、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）
の１位のアミノ酸をＳｅｒ→Ａｌａに、３位のアミノ酸
をＡｌａ→Ｖａｌに変換し、更に−１位にＬｙｓ、−２
位にＭｅｔをコードするような変異型ヒトＴＰＯ（アミ
ノ酸１−１６３）（以下、このようなタンパク質を「ｈ
６Ｔ（１−１６３）」と称す）を発現させるための発現
ベクターの構築を行った。表に示した４種の合成オリゴ
ヌクレオチドを作製し、２−９、３−３の合成オリゴヌ
クレオチドをＴ４キナーゼ（ファルマシア社製）により
１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，
１０ｍＭ Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，５０ｍＭ Ｋ−ａｃ
ｅｔａｔｅの溶液中でリン酸化した。これらの合成オリ
ゴヌクレオチドを２本の二本鎖ＤＮＡにするために１−
９及び２−９；３−３及び４−３それぞれの組み合わせ
の一本鎖ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＮａＣｌ
の溶液中でアニールした。次に１−９及び２−９；３−
３及び４−３の二組の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ Ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて反応した。こ
のライゲーション反応で得られたＤＮＡを、ＸｂａＩ，
ＮｒｕＩで消化したｐＢＬ（ＸＨ）（１−１６３）にサ
ブクローニングし、塩基配列の解析により表１６に示し
た合成オリゴヌクレオチドにより正しく置換されたクロ
ーンを選択し（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを使用し
た）、これをｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−１６３）とし
た。
増すこと、またＮ末端のプロテアーゼによる分解を防ぐ
ことを目的として、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）
の１位のアミノ酸をＳｅｒ→Ａｌａに、３位のアミノ酸
をＡｌａ→Ｖａｌに変換し、更に−１位にＬｙｓ、−２
位にＭｅｔをコードするような変異型ヒトＴＰＯ（アミ
ノ酸１−１６３）（以下、このようなタンパク質を「ｈ
６Ｔ（１−１６３）」と称す）を発現させるための発現
ベクターの構築を行った。表に示した４種の合成オリゴ
ヌクレオチドを作製し、２−９、３−３の合成オリゴヌ
クレオチドをＴ４キナーゼ（ファルマシア社製）により
１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，
１０ｍＭ Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，５０ｍＭ Ｋ−ａｃ
ｅｔａｔｅの溶液中でリン酸化した。これらの合成オリ
ゴヌクレオチドを２本の二本鎖ＤＮＡにするために１−
９及び２−９；３−３及び４−３それぞれの組み合わせ
の一本鎖ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＮａＣｌ
の溶液中でアニールした。次に１−９及び２−９；３−
３及び４−３の二組の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ Ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて反応した。こ
のライゲーション反応で得られたＤＮＡを、ＸｂａＩ，
ＮｒｕＩで消化したｐＢＬ（ＸＨ）（１−１６３）にサ
ブクローニングし、塩基配列の解析により表１６に示し
た合成オリゴヌクレオチドにより正しく置換されたクロ
ーンを選択し（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを使用し
た）、これをｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−１６３）とし
た。
【表１６】 ｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−１６３）をＸｂａＩ，Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで消化後、変異型のヒトＴＰＯアミノ酸１−
１６３をコードする約５００ｂｐの大きさのフラグメン
トを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで
精製し、ＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＦＭ
５３６（特表昭６０−５０１９８８）にクローニングし
た（宿主はｐＭＷ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９９３３）で
予め形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を使用し
た）。ここで得られたクローンをｐＣＦＭ５３６／ｈ６
Ｔ（１−１６３）とし、この発現ベクターを有する大腸
菌株を変異型のヒトＴＰＯ、すなわちｈ６Ｔ（１−１６
３）発現用の形質転換体とした。この発現プラスミド
は、配列表（配列番号１１）に示されたＤＮＡ配列を含
んでいる。 ＜実施例４３＞ ｈ６Ｔ（１−１６３）の大腸菌での発現 発現プラスミドｐＣＦＭ５３６の発現制御は、λＰＬプ
ロモーターによるが、これ自体が、ｃＩ８５７リプレッ
サー遺伝子の制御下にある。＜実施例４２＞で得られた
形質転換株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、テトラサ
イクリン１２．５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地６０ｍｌに
３０℃で一晩振盪培養し、この培養液２５ｍｌをアンピ
シリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１０００ｍｌに加
えて、ＯＤはＡ６００が１．０−１．２に至るまで３０
℃で振盪培養した。次いで最終温度が、４２℃になるよ
うに６５℃の約３３０ｍｌＬＢ培地を添加し、さらに３
時間４２℃で振盪培養してｈ６Ｔ（１−１６３）の発現
を誘導した。 ＜実施例４４＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来ｈ６
Ｔ（１−１６３）の精製と活性確認 ｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体凍結菌体３．６ｇに水
１０ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕し
た。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋
白質、菌体成分等を除去する。回収されたｈ６Ｔ（１−
１６３）を含む沈殿画分に水７ｍｌを加えてけん濁した
後、攪拌しながら１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を３
ｍｌを加えた後、尿素（終濃度８Ｍ）、塩酸グアニジン
（終濃度６Ｍ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム
（終濃度２％）を各々加えて室温にて５−２０分間攪拌
して可溶化した。これを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ
８．５で１０倍希釈し、４℃中にて一晩でタンパク質の
巻き戻し（リフォールディング）操作を行なった。この
際に、空気酸化の他、添加物としてグルタチオン及び硫
酸銅を各々添加した。遠心分離により、上清中にｈ６Ｔ
（１−１６３）を回収した。各々の回収画分について還
元剤在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、どの方
法に於ても、この画分の主タンパク質バンドとして分子
量約１８Ｋダルトンのバンドが検出された（純度３０−
４０％）。このバンドについて実施例１に記載された方
法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写しＮ
末端シークエンス分析を行なった結果、このｐＣＦＭ５
３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来の変異型ＴＰＯとして
発現されるべきＴＰＯの配列を含むことが確認できた。
各々の画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラ
ットＣＦＵ−ＭＫ系で評価した結果、全ての画分に於て
容量依存的にＴＰＯ活性を認めた。 ＜実施例４５＞ 抗ＴＰＯペプチド抗体の作製と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ→ウ
エスターン分析によるＴＰＯの検出 抗ＴＰＯ抗体が作製できれば、免疫学的手法によりＴＰ
Ｏの蛋白質を検出することができる。そこで、最初に判
明したラットＴＰＯのアミノ酸配列のうち、比較的抗原
として適していると考えられた３カ所の領域（表１７に
示す）を選び、Ｔａｍ（Ｐｒｏｃ・Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５４０９−５４１３，１９
８８）の方法により４本鎖のＭｕｌｔｉＰｌｅ Ａｎｔ
ｉｇｅｎＰｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）型のペプチドを合成
し、１００μｇずつ８回にわたってそれぞれウサギ２把
に免疫した結果、これらの抗血清を得ることができた。合成ペプチド抗原に含まれるアミノ酸配列
ｎｄＩＩＩで消化後、変異型のヒトＴＰＯアミノ酸１−
１６３をコードする約５００ｂｐの大きさのフラグメン
トを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで
精製し、ＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＦＭ
５３６（特表昭６０−５０１９８８）にクローニングし
た（宿主はｐＭＷ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９９３３）で
予め形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を使用し
た）。ここで得られたクローンをｐＣＦＭ５３６／ｈ６
Ｔ（１−１６３）とし、この発現ベクターを有する大腸
菌株を変異型のヒトＴＰＯ、すなわちｈ６Ｔ（１−１６
３）発現用の形質転換体とした。この発現プラスミド
は、配列表（配列番号１１）に示されたＤＮＡ配列を含
んでいる。 ＜実施例４３＞ ｈ６Ｔ（１−１６３）の大腸菌での発現 発現プラスミドｐＣＦＭ５３６の発現制御は、λＰＬプ
ロモーターによるが、これ自体が、ｃＩ８５７リプレッ
サー遺伝子の制御下にある。＜実施例４２＞で得られた
形質転換株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、テトラサ
イクリン１２．５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地６０ｍｌに
３０℃で一晩振盪培養し、この培養液２５ｍｌをアンピ
シリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１０００ｍｌに加
えて、ＯＤはＡ６００が１．０−１．２に至るまで３０
℃で振盪培養した。次いで最終温度が、４２℃になるよ
うに６５℃の約３３０ｍｌＬＢ培地を添加し、さらに３
時間４２℃で振盪培養してｈ６Ｔ（１−１６３）の発現
を誘導した。 ＜実施例４４＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来ｈ６
Ｔ（１−１６３）の精製と活性確認 ｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体凍結菌体３．６ｇに水
１０ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕し
た。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋
白質、菌体成分等を除去する。回収されたｈ６Ｔ（１−
１６３）を含む沈殿画分に水７ｍｌを加えてけん濁した
後、攪拌しながら１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を３
ｍｌを加えた後、尿素（終濃度８Ｍ）、塩酸グアニジン
（終濃度６Ｍ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム
（終濃度２％）を各々加えて室温にて５−２０分間攪拌
して可溶化した。これを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ
８．５で１０倍希釈し、４℃中にて一晩でタンパク質の
巻き戻し（リフォールディング）操作を行なった。この
際に、空気酸化の他、添加物としてグルタチオン及び硫
酸銅を各々添加した。遠心分離により、上清中にｈ６Ｔ
（１−１６３）を回収した。各々の回収画分について還
元剤在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、どの方
法に於ても、この画分の主タンパク質バンドとして分子
量約１８Ｋダルトンのバンドが検出された（純度３０−
４０％）。このバンドについて実施例１に記載された方
法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写しＮ
末端シークエンス分析を行なった結果、このｐＣＦＭ５
３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来の変異型ＴＰＯとして
発現されるべきＴＰＯの配列を含むことが確認できた。
各々の画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラ
ットＣＦＵ−ＭＫ系で評価した結果、全ての画分に於て
容量依存的にＴＰＯ活性を認めた。 ＜実施例４５＞ 抗ＴＰＯペプチド抗体の作製と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ→ウ
エスターン分析によるＴＰＯの検出 抗ＴＰＯ抗体が作製できれば、免疫学的手法によりＴＰ
Ｏの蛋白質を検出することができる。そこで、最初に判
明したラットＴＰＯのアミノ酸配列のうち、比較的抗原
として適していると考えられた３カ所の領域（表１７に
示す）を選び、Ｔａｍ（Ｐｒｏｃ・Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５４０９−５４１３，１９
８８）の方法により４本鎖のＭｕｌｔｉＰｌｅ Ａｎｔ
ｉｇｅｎＰｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）型のペプチドを合成
し、１００μｇずつ８回にわたってそれぞれウサギ２把
に免疫した結果、これらの抗血清を得ることができた。合成ペプチド抗原に含まれるアミノ酸配列
【表１７】 次いで、これらの抗血清のうち、まず抗ＲＴ１ペプチ
ド、抗ＲＴ２ペプチド抗体について、プロテインＡカラ
ム（ＰＲＯＳＥＰ−Ａ；Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
Ｌｔｄ社製、カタログ番号８４２７）を用いて、ＩｇＧ
画分（それぞれ２３４４ｍｇ、１９２０ｍｇ）を得、こ
れらのうちそれぞれ５４ｍｇ、３２ｍｇをとり活性型ビ
オチン（ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ ＩＩ、ＰＩＥＲ
ＣＥ社製、カタログ番号２１３３６）とカップリングす
ることにより、ビオチン化した。。実施例１に述べた方
法と同様に、組み換え体ＴＰＯを含む標品をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにかけ、次いでＰＶＤＦあるいは、ニトロセルロ
ース膜にエレクトロブロティングし、定法によりこれら
のビオチン化抗体を一次抗体として用いてウェスタン分
析を行った。即ち、ブロッティング後の膜を２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）
（ＴＢＳ）で５分洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０入り
ＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で５分２回洗浄後、ブロッキング剤
（ＢｌｏｃｋＡｃｅ、大日本製薬社製、カタログ番号ｕ
ｋ−Ｂ２５）で６０分処理した。次に１０μｇ／ｍｌの
濃度のビオチン化抗ＴＰＯペプチド抗体、０．０５％Ｂ
ＳＡ、１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅを含むＴＴＢＳ溶液で６
０分後処理後、ＴＴＢＳで５分２回洗浄した。次にアル
カリフォスファターゼ標識アビジン（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号Ａ１０８）
を１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅ、ＴＴＢＳ溶液で５０００倍
希釈したものを含む溶液で３０分処理し、５分２回のＴ
ＴＢＳ洗浄、５分間のＴＢＳ洗浄を行った後、アルカリ
フォスファターゼ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、カタログ
番号１７０−６４３２）により発色させた。以上のウエ
スタン分析は室温にて実施した。この結果、ＣＯＳ１細
胞で発現した各種組み換えラットＴＰＯのみならず、Ｃ
ＯＳ１細胞及び大腸菌で発現した各種組み換えヒトＴＰ
Ｏ（具体的には、これまでの実施例に述べたＣＯＳ１細
胞で発現したプラスミドｐＨＴＰ１あるいはプラスミド
ｐＨＴＦ１由来ヒトＴＰＯとそのＮ結合型糖鎖切断後の
ＴＰＯ、大腸菌で発現したＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７
４）及びそのトロンビン消化後のＴＰＯ、大腸菌で発現
した変異型ＴＰＯであるｈ６Ｔ（１−１６３））をも認
識することができた。そして、これら各種組み換えヒト
ＴＰＯの分析に用いることが可能となった。以上の手法
と同様にして、抗ヒトＴＰＯペプチド抗体の作製が可能
であることが示された。これらの手法で得た抗体によ
り、ウェスタン分析のみならず、抗体カラムによるＴＰ
Ｏの精製をはじめ、通常考えられる抗体を用いたあらゆ
る免疫学的手法への応用が可能となる。また、配列番号
６に示されるヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、比較的
抗原として適していると考えられた６カ所の領域（表１
９に示す）を選び、Ｔａｍ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５４０９−５４１３，１
９８８）の方法により４本鎖のＭｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎ
ｔｉｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）型のペプチドを
合成し、１００μｇずつ８回にわたってそれぞれウサギ
２把に免疫した。表１９で示された各ペプチド領域のＣ
末端にシステイン残基を結合させた１本鎖ペプチドを別
途合成し、これを試験抗原として酵素免疫測定法を用い
て抗体価を調べたところ、いずれの血清についても抗体
価の上昇が確認されたので、これらを抗血清とした。抗
体は、１種の抗原ペプチドにつきウサギ抗血清２把ずつ
免疫したため、それぞれのウサギごとに抗体を分けて調
製した。具体的には、これら由来するウサギの個体ごと
に区別して、抗ＨＴ１ペプチド抗体では、それぞれ、抗
ＨＴ１−１ペプチド抗体、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体の
様に称する。以下に抗ＨＴ１−１ペプチド抗体について
の精製を例として示す。まず、システイン残基を結合し
たＨＴ１の１本鎖ペプチド３０ｍｇを１２ｍｌのＳｕｌ
ｆｏＬｉｎｋカップリングゲル（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カ
タログ番号４４８９５）に結合させた。即ち、ゲル体積
の６倍容のカップリングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ ｐＨ８．５）で平衡化し
たゲルに、抗原の含まれるペプチド溶液を１５分間カッ
プリングさせた。次に３０分間静置した後、ゲル体積の
３倍容のカップリングバッファーでゲルを洗浄した。次
に０．０５Ｍ Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎ−ＨＣｌを含むカッ
プリングバッファーを、１ｍｌ／ｍｌゲルの割合で添加
し、１５分間未反応基をブロックした。次に３０分間静
置した後、ゲル体積の８倍容のカップリングバッファー
でゲルを洗浄した。以上のカップリングは室温で行っ
た。このようにして、抗原領域を含むペプチドをカップ
リング効率２８．３％にてゲルに共有結合させ、１ｍｌ
ゲル当たりに結合したペプチドが０．８ｍｇである抗原
ペプチド抗原カラムを調製した。次に、全採血後の抗Ｈ
Ｔ１−１ペプチド抗体を含む抗血清７８．４ｍｌのうち
７６．７ｍｌ（蛋白質量３６２０ｍｇ）を予め１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した抗原カラムに
添加し、さらに同緩衝液で洗浄後１０５．９ｍｌの素通
り画分（蛋白質量３６８０ｍｇ）を得た。次に０．１Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で吸着画分を溶出し、た
だちに２１．１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．
９）を加えて中和後、限外濾過（アミコン社製ＹＭ３０
膜）にて濃縮し、１１．２ｍｌ（蛋白質量７７．７ｍ
ｇ）の１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリ
ウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）の溶液中に
精製された抗ＨＴ１−１ペプチド抗体を得ることができ
た。同様にして、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体（６０．０
ｍｇ）、抗ＨＴ２−１ペプチド抗体（１８．８ｍｇ）、
抗ＨＴ２−２ペプチド抗体（８．２ｍｇ）などを得るこ
とができた。抗ＨＴ３〜６ペプチド抗体も同様にして得
ることができる。アフィニティ精製した抗ＨＴ１−１ペ
プチド抗体、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体、抗ＨＴ２−１
ペプチド抗体、抗ＨＴ２−２ペプチド抗体をそれぞれ３
ｍｇをとり活性型ビオチン（ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉ
ｎ ＩＩ、ＰＩＥＲＣＥ社製、カタログ番号２１３３
６）とカップリングすることにより、ビオチン化した。
ド、抗ＲＴ２ペプチド抗体について、プロテインＡカラ
ム（ＰＲＯＳＥＰ−Ａ；Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
Ｌｔｄ社製、カタログ番号８４２７）を用いて、ＩｇＧ
画分（それぞれ２３４４ｍｇ、１９２０ｍｇ）を得、こ
れらのうちそれぞれ５４ｍｇ、３２ｍｇをとり活性型ビ
オチン（ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ ＩＩ、ＰＩＥＲ
ＣＥ社製、カタログ番号２１３３６）とカップリングす
ることにより、ビオチン化した。。実施例１に述べた方
法と同様に、組み換え体ＴＰＯを含む標品をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにかけ、次いでＰＶＤＦあるいは、ニトロセルロ
ース膜にエレクトロブロティングし、定法によりこれら
のビオチン化抗体を一次抗体として用いてウェスタン分
析を行った。即ち、ブロッティング後の膜を２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）
（ＴＢＳ）で５分洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０入り
ＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で５分２回洗浄後、ブロッキング剤
（ＢｌｏｃｋＡｃｅ、大日本製薬社製、カタログ番号ｕ
ｋ−Ｂ２５）で６０分処理した。次に１０μｇ／ｍｌの
濃度のビオチン化抗ＴＰＯペプチド抗体、０．０５％Ｂ
ＳＡ、１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅを含むＴＴＢＳ溶液で６
０分後処理後、ＴＴＢＳで５分２回洗浄した。次にアル
カリフォスファターゼ標識アビジン（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号Ａ１０８）
を１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅ、ＴＴＢＳ溶液で５０００倍
希釈したものを含む溶液で３０分処理し、５分２回のＴ
ＴＢＳ洗浄、５分間のＴＢＳ洗浄を行った後、アルカリ
フォスファターゼ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、カタログ
番号１７０−６４３２）により発色させた。以上のウエ
スタン分析は室温にて実施した。この結果、ＣＯＳ１細
胞で発現した各種組み換えラットＴＰＯのみならず、Ｃ
ＯＳ１細胞及び大腸菌で発現した各種組み換えヒトＴＰ
Ｏ（具体的には、これまでの実施例に述べたＣＯＳ１細
胞で発現したプラスミドｐＨＴＰ１あるいはプラスミド
ｐＨＴＦ１由来ヒトＴＰＯとそのＮ結合型糖鎖切断後の
ＴＰＯ、大腸菌で発現したＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７
４）及びそのトロンビン消化後のＴＰＯ、大腸菌で発現
した変異型ＴＰＯであるｈ６Ｔ（１−１６３））をも認
識することができた。そして、これら各種組み換えヒト
ＴＰＯの分析に用いることが可能となった。以上の手法
と同様にして、抗ヒトＴＰＯペプチド抗体の作製が可能
であることが示された。これらの手法で得た抗体によ
り、ウェスタン分析のみならず、抗体カラムによるＴＰ
Ｏの精製をはじめ、通常考えられる抗体を用いたあらゆ
る免疫学的手法への応用が可能となる。また、配列番号
６に示されるヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、比較的
抗原として適していると考えられた６カ所の領域（表１
９に示す）を選び、Ｔａｍ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５４０９−５４１３，１
９８８）の方法により４本鎖のＭｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎ
ｔｉｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）型のペプチドを
合成し、１００μｇずつ８回にわたってそれぞれウサギ
２把に免疫した。表１９で示された各ペプチド領域のＣ
末端にシステイン残基を結合させた１本鎖ペプチドを別
途合成し、これを試験抗原として酵素免疫測定法を用い
て抗体価を調べたところ、いずれの血清についても抗体
価の上昇が確認されたので、これらを抗血清とした。抗
体は、１種の抗原ペプチドにつきウサギ抗血清２把ずつ
免疫したため、それぞれのウサギごとに抗体を分けて調
製した。具体的には、これら由来するウサギの個体ごと
に区別して、抗ＨＴ１ペプチド抗体では、それぞれ、抗
ＨＴ１−１ペプチド抗体、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体の
様に称する。以下に抗ＨＴ１−１ペプチド抗体について
の精製を例として示す。まず、システイン残基を結合し
たＨＴ１の１本鎖ペプチド３０ｍｇを１２ｍｌのＳｕｌ
ｆｏＬｉｎｋカップリングゲル（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カ
タログ番号４４８９５）に結合させた。即ち、ゲル体積
の６倍容のカップリングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ ｐＨ８．５）で平衡化し
たゲルに、抗原の含まれるペプチド溶液を１５分間カッ
プリングさせた。次に３０分間静置した後、ゲル体積の
３倍容のカップリングバッファーでゲルを洗浄した。次
に０．０５Ｍ Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎ−ＨＣｌを含むカッ
プリングバッファーを、１ｍｌ／ｍｌゲルの割合で添加
し、１５分間未反応基をブロックした。次に３０分間静
置した後、ゲル体積の８倍容のカップリングバッファー
でゲルを洗浄した。以上のカップリングは室温で行っ
た。このようにして、抗原領域を含むペプチドをカップ
リング効率２８．３％にてゲルに共有結合させ、１ｍｌ
ゲル当たりに結合したペプチドが０．８ｍｇである抗原
ペプチド抗原カラムを調製した。次に、全採血後の抗Ｈ
Ｔ１−１ペプチド抗体を含む抗血清７８．４ｍｌのうち
７６．７ｍｌ（蛋白質量３６２０ｍｇ）を予め１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した抗原カラムに
添加し、さらに同緩衝液で洗浄後１０５．９ｍｌの素通
り画分（蛋白質量３６８０ｍｇ）を得た。次に０．１Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で吸着画分を溶出し、た
だちに２１．１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．
９）を加えて中和後、限外濾過（アミコン社製ＹＭ３０
膜）にて濃縮し、１１．２ｍｌ（蛋白質量７７．７ｍ
ｇ）の１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリ
ウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）の溶液中に
精製された抗ＨＴ１−１ペプチド抗体を得ることができ
た。同様にして、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体（６０．０
ｍｇ）、抗ＨＴ２−１ペプチド抗体（１８．８ｍｇ）、
抗ＨＴ２−２ペプチド抗体（８．２ｍｇ）などを得るこ
とができた。抗ＨＴ３〜６ペプチド抗体も同様にして得
ることができる。アフィニティ精製した抗ＨＴ１−１ペ
プチド抗体、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体、抗ＨＴ２−１
ペプチド抗体、抗ＨＴ２−２ペプチド抗体をそれぞれ３
ｍｇをとり活性型ビオチン（ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉ
ｎ ＩＩ、ＰＩＥＲＣＥ社製、カタログ番号２１３３
６）とカップリングすることにより、ビオチン化した。
【表１９】 のアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入・発現させた
ＣＨＯ細胞の培養上清から部分精製された組換えヒトＴ
ＰＯ標品を定法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次い
でＰＶＤＦあるいはニトロセルロース膜にエレクトロブ
ロティングし、上述の抗ＲＴペプチド抗体の場合と同様
にウェスタン分析を行ったところ、それぞれの精製され
た抗体により、ヒトＴＰＯが認識、検出されることが確
認できた。 ＜実施例４６＞ 抗ＴＰＯペプチド抗体カラムの調製 実施例４５で得られた抗ラットＴＰＯペプチド抗体は、
ラット及びヒトＴＰＯを認識することができたため、抗
ＲＴ１ペプチド抗体、抗ＲＴ２ペプチド抗体の免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ）画分を以下のようにして、クロマトグ
ラフィー坦体に結合させ、抗ＴＰＯペプチド抗体カラム
を作製した。材料となった抗体は、それぞれの抗原ペプ
チドにつきウサギ抗血清２把ずつから由来し、それぞれ
のウサギごとに抗体を分けて調製した。具体的には、抗
ＲＴ１ペプチド抗体では、それぞれ、抗ＲＴ１−１ペプ
チド抗体と抗ＲＴ１−２ペプチド抗体と称し、抗ＲＴ２
ペプチド抗体では、抗ＲＴ２−１ペプチド抗体と抗ＲＴ
２−２ペプチド抗体と称す。これらを別々にして抗体カ
ラムを調製したため、抗ＲＴ１ペプチド抗体カラムは２
種（それぞれ抗ＲＴ１−１抗体カラム、抗ＲＴ１−２抗
体カラムと称す）、抗ＲＴ２ペプチド抗体カラムは２種
（それぞれ抗ＲＴ２−１抗体カラム、抗ＲＴ２−２抗体
カラムと称す）、さらに抗ＲＴ１−２ペプチド抗体と抗
ＲＴ２−１ペプチド抗体を混合してゲルにカップリング
した抗体カラム（抗ＲＴ１−２＋２−１混合抗体カラ
ム）、の５種類を調製した。各々の抗体を５ｍｇ／ｍｌ
（抗ＲＴ１＋２ｍｉｘ抗体カラムでは抗ＲＴ１−２ペプ
チド抗体と抗ＲＴ２−１ペプチド抗体を等量混合した
２．５ｍｇ／ｍｌ）の濃度で含む５０ｍＭ Ｎａ Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）
の溶液とし、これを２．３１ｍｌとり、１．５４ｍ体積
の膨潤したホルミル活性化ゲル（Ｆｏｒｍｙｌ−Ｃｅｌ
ｌｕｌｏｆｉｎｅ、チッソ株式会社製）と合わせ、４℃
で２時間カップリング反応させた。次いで、１０ｍｇ／
ｍｌの濃度の還元剤溶液（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎ
ｅ ｂｏｒａｎｅ（ＴＭＡＢ）、生化学工業製、カタロ
グ番号６８０２４６）を１．１ｍｌ加え、さらに６時間
カップリング反応させた後、遠心分離によりゲル部分の
みを回収した。これに１０ｍｌの精製水を加え、遠心分
離でゲル部分のみの回収といった操作を４回繰り返し、
未反応の抗体を取り除いた。次に４．６ｍｌのブロッキ
ング緩衝液（０．２Ｍ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１
Ｍ ｅｔｈａｎｏｌ ａｍｉｎｅ（ｐＨ７．０））と
１．１ｍｌの還元剤溶液を加え、４℃で２時間以上処理
することにより、未反応のゲルの活性基をブロックし
た。最後にゲルを遠心分離を用いて精製水、ＤＰＢＳで
洗浄し、小カラムチューブに充填し、３Ｍチオシアン酸
カリウム溶液、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．
５）溶液で洗浄後、再度ＤＰＢＳで再平衡化して保存し
た。抗ＲＴ１−１抗体カラム、抗ＲＴ１−２抗体カラ
ム、抗ＲＴ２−１抗体カラム、抗ＲＴ２−２抗体カラ
ム、抗ＲＴ１−２＋２−１混合抗体カラムの５種類それ
ぞれの抗ＴＰＯペプチド抗体ゲルでは、各ＩｇＧ画分の
カップリング効率は順に９７．４％、９５．４％、９
８．４％、９８．３％、９９．４％に達した。また、そ
れぞれのゲル体積当たりにカップリングしたＩｇＧ画分
量は、５．６ｍｇ／ｍｌゲル、５．８ｍｇ／ｍｌゲル、
５．７ｍｇ／ｍｌゲル、５．７ｍｇ／ｍｌゲル、２．９
ｍｇ／ｍｌゲルであった。従って、抗体の由来や抗原の
違いによって、カップリング効率やカップリング量に大
きな差がないことが確認できたため、これらの抗体カラ
ムを利用して、以下、実施例４７に示す実験を行った。 ＜実施例４７＞ 発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェ
クションして得られた培養上清由来ＴＰＯの抗ＴＰＯ抗
体カラム→逆相カラムクロマトグラフィーでの精製〜生
物学的活性の確認 以下の精製サンプルの評価のためのｉｎ ｖｉｔｒｏア
ッセイ方法は、Ｍ−０７ｅアッセイ系を用いた。発現ベ
クターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクショ
ンして得られた、実施例３５の培養上清由来ＴＰＯの部
分精製標品（ＴＰＯが回収された主たる画分ではない画
分、即ち、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩ
Ｃカラムの素通り画分Ｆ１と、Ｆ２の後に２０ｍＭ Ｎ
ａ Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ５．８でカラム洗浄し溶出し
たＦ３、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏ
ｗカラムのＦ１とＦ３をまとめてＴＰＯサブプール画分
（５４６３．７９ｍｌ，蛋白質濃度０．４９０ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量２６７６ｍｇ，相対活性１２１００，相
対活性量３２３８００００）とし、限外濾過ユニット
（フィルトロン社製・オメガウルトラセット 分子量８
０００カット）でまず濃縮し、さらに溶媒をＤＰＢＳに
置換し、小体積になってからはＹＭ−１０膜付き限外濾
過ユニット（アミコン社製）を用いて最終的に１２０．
２ｍｌの０．０５％アジ化ナトリウムを含むＤＰＢＳ溶
液にした。次に実施例４６で調製した５種類の抗ＴＰＯ
ペプチド抗体ゲルを全て混合し、１本の抗体カラム（直
径１．６ｃｍ，ベッド高４．８ｃｍ，抗ＲＴ１＋２混合
抗体カラムと称す）にまとめ、室温にて流速０．０３３
ｍｌ／ｍｉｎでＴＰＯサブプール画分を添加した。添加
終了後、ＤＰＢＳで溶出液の紫外線吸収が十分下がるま
でを集め、さらにＹＭ−１０膜付き限外濾過ユニット
（アミコン社製）で濃縮した素通り画分Ｆ１（８２．６
２ｍｌ，蛋白質濃度１４．３ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１
１８４ｍｇ，相対活性６７５００，相対活性量７９９０
００００）を集めた。次に酸性溶離液（０．１Ｍグリシ
ン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５））で溶出されるカラム吸着画
分Ｆ２（９２．９７ｍｌ，蛋白質濃度０．１２ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量１１．１ｍｇ，相対活性２５７１００，
相対活性量２８６００００）を溶出した。素通り画分Ｆ
１には相当量のＴＰＯ活性があったが、抗体カラムに吸
着したＴＰＯについては約２０倍の相対活性の上昇が認
められたため、さらに精製を行った。即ち、展開溶媒Ａ
に０．１％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡを含
む１−プロパノールを用いたＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ
Ｃ１ ３００Ａ（資生堂製、カタログ番号Ｃ１ ＴＹＰ
Ｅ：ＳＧ３００Ａ；直径 ４．６ｍｍ、ベッド高 １５
０ｍｍに加え、直径４．６ｍｍ、ベッド高 ３５ｍｍの
プレカラムを接続したもの）カラムにて、抗体カラムで
得られたＦ２に１０分の１体積の展開溶媒Ｂを加え、２
０％Ｂで平衡化したＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１ ３
００Ａカラムに流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注
入終了後、２０％Ｂにて５分溶出した後、２０％Ｂから
４０％Ｂまで５０分の直線濃度勾配で展開し、１ｍｌ
（２．５ｍｉｎ）ずつポリプロピレン製チューブに集め
た。それぞれ２μｌ（５００分の１フラクション）を取
りＨＳＡを加え、限外濾過濃縮し、最終的に０．０２％
ＨＳＡを含む０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液溶
液とし、これをアッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定
した。この結果、チューブ番号２０〜２３（プロパノー
ル濃度で２８．５〜３２．５％の範囲）に強いＴＰＯの
活性を示す標品を得ることができた。またこれらの標品
を＜実施例４５＞に述べた方法によりウエスターン分析
をしたところ、ＤＰＣＩＩＩ分子量マーカーに対し、還
元下において見かけ上の分子量が６００００〜７０００
０のＴＰＯが確かに存在し、これとは別に、３２０００
〜４３０００、２００００〜３００００の分子量をもつ
分子も存在していることが判明した。 ＜実施例４８＞ 発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェ
クションして得られた培養上清由来で、Ｃａｐｃｅｌｌ
Ｐａｋ Ｃ１ ３００Ａカラムの段階まで精製された
ＴＰＯの生物学的活性の確認 実施例３６で精製されたＴＰＯ活性画分、即ちＣａｐｃ
ｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１３００Ａカラムのチューブ番号２
０〜２３（プロパノール濃度で２８．５〜３２．５％の
範囲）までを集め、０．２１ｍｌのグリセロールを添加
後遠心エバポレーションで濃縮した。これに６Ｍ塩酸グ
アニジン溶液０．２１ｍｌを加えたものをＤＰＢＳで１
ｍｌに希釈後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＮＡ
Ｐ−１０，ファルマシア バイオテック社製、カタログ
番号１７−０８５４−０１）で０．０１％ＨＳＡを含む
ＤＰＢＳ溶液に置換し、さらに１．１ｍｌの０．０１％
ＨＳＡを含むＤＰＢＳを加えて、最終的にＴＰＯ活性画
分ＦＡ（２．６ｍｌ）を調製した。この標品の生物学的
ＴＰＯ活性をについて調べるために、ｉｎ ｖｉｖｏア
ッセイを行った。即ち、１群４匹のＩＣＲ系雄性マウス
（８週齢）に、活性画分１００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセ
イ系での相対活性量８７４００を含む）を１日１回、５
日間連日皮下投与した。対照として、０．０１％ＨＳＡ
を含むＤＰＢＳ１００μｌを同様のスケジュールで皮下
投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌日に眼
底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ８０
０）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、
投与終了後において投与前と比較して平均で１．４２倍
の血小板の増加を認め、対照群の血小板数と比較しても
１．２３倍の高値を示し、両者の間に有意差（ｐ＜０，
０５，Ｓｔｕｄｅｎｔｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。この結
果から、動物細胞で生産された上記のヒトＴＰＯが、生
体内において血小板増加作用を有することが明らかとな
った。 ＜実施例４９＞ 発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェ
クションして得られた、培養上清３３Ｌを出発材料に
し、陽イオン交換カラムで得た粗精製ＴＰＯ画分の生物
学的活性の確認 （１）以下の精製サンプルの評価のためのｉｎ ｖｉｔ
ｒｏアッセイ方法は、Ｍ−０７ｅアッセイ系を用いた。
実施例３６で記載された方法と同様にして、３３Ｌの発
現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェク
ションして得られた無血清培養上清を得て、０．２２μ
ｍの濾過フィルターの濾液をとった。これを限外濾過ユ
ニット（ミリポア社製・ＰＬＧＣペリコンカセット 分
子量１００００カット）で約１０倍濃縮し、蛋白質分解
酵素阻害剤であるｐ−ＡＰＭＳＦを最終濃度約１ｍＭ加
え、体積２０１８ｍｌ（蛋白質濃度３．２２ｍｇ／ｍ
ｌ、総蛋白質量６５０２ｍｇ、相対活性６６０００、相
対活性量４２９１０００００）を得た。次に、限外濾過
ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット分
子量３００００カット）で濃縮工程を繰り返し、分子量
３００００以上の画分（体積１１９０ｍｌ、蛋白質濃度
２．５４ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量３０２０ｍｇ、相対活
性８２５００、相対活性量２４９００００００）と、分
子量３００００以下の画分（体積２９７５ｍｌ、蛋白質
濃度０．４７１ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量１４０２ｍｇ、
相対活性４５００、相対活性量６３１００００）を得る
ことができた。分子量３００００以下の画分にＴＰＯ活
性が存在することは、ＴＰＯの動物細胞での発現・分泌
の過程において、最終的に培養上清中に、低分子化した
ＴＰＯが含まれている可能性を示す。一方、分子量３０
０００以上の画分をさらに２０ｍＭクエン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．１）に置換し、２０ｍＭクエン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．１）で予め平衡化したＳＰ Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア
バイオテク社製、カタログ番号１７−０７２９−０１；
直径 ２．６ｃｍ、ベッド高 ２９ｃｍ）カラムに注入
し、流速５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、さら
に２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）で
洗浄溶出した。次に展開溶媒Ａに２０ｍＭクエン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．１）、展開溶媒Ａ中に１Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む溶液を展開溶媒Ｂとして用い、流速３ｍｌ
／ｍｉｎで０％Ｂから５０％Ｂまで２１５分間、さらに
５０％Ｂから１００％Ｂまで２０分の直線濃度勾配で展
開し、３０ｍｌ（１０ｍｉｎ）ずつポリプロピレン製チ
ューブに集めた。これらの一部を取り、Ｍ−０７ｅアッ
セイ系で活性の分布を調べたところ、広範囲にわたりＴ
ＰＯ活性が溶出されたことが判明した。そこで素通りを
含め、５０ｍＭ以下のＮａＣｌで溶出された画分をＦ
１、ＴＰＯの主画分として５０〜１０００ｍＭのＮａＣ
ｌで溶出された画分をＦ２としてまとめた。Ｆ１は体積
１９５１ｍｌ（蛋白質濃度２．０５ｍｇ／ｍｌ、総蛋白
質量３９９４ｍｇ、相対活性１３５００、相対活性量５
３９０００００）、Ｆ２は体積６４９．８ｍｌ（蛋白質
濃度１．１１ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量７２１ｍｇ、相対
活性２６８０００、相対活性量１９３００００００）で
あった。 （２）ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
Ｆ２の生物学的活性の確認 （１）で分取したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
ＦｌｏｗのＦ２を２．５ｍｌ取り、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ２５カラム（ＮＡＰ−２５，ファルマシアバイオテ
ック社製、カタログ番号１７−０８５２−−０１）で
０．０１％ＨＳＡを含むＤＰＢＳ溶液３．５ｍｌに置換
し、このサンプル（蛋白質濃度１．４６ｍｇ／ｍｌ）の
生物学的ＴＰＯ活性について調べるために、ｉｎ ｖｉ
ｖｏアッセイを行った。即ち、１群４匹のＩＣＲ系雄性
マウス（８週齢）に、活性画分１００μｌ（Ｍ−０７ｅ
アッセイ系での相対活性量３１５０を含む）を１日１
回、５日間連日皮下投与した。対照として、０．０１％
ＨＳＡを含むＤＰＢＳ１００μｌを同様のスケジュール
で皮下投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌
日に眼底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ
８００）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群で
は、投与終了後において投与前と比較して平均で１．２
９倍の血小板の増加を認め、対照群の血小板数と比較し
ても１．１２倍の高値を示し、両者の間に有意差（ｐ＜
０．０５，Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。
この結果から、動物細胞で生産された上記のヒトＴＰＯ
が、生体内において血小板増加作用を有することが明ら
かとなった。 ＜実施例５０＞ ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＨＯ細胞用組換え発現ベク
ター、ｐＤＥＦ２０２−ｇｈＴＰＯの構築 ベクターｐＤＥＦ２０２を制限酵素ＫｐｎＩとＳｐｅＩ
で処理し、アガロースゲル電気泳動で小さい方のマウス
ＤＨＦＲミニ遺伝子とＳＶ４０ポリアデニル化シグナル
を含むフラグメントを回収したのち、このフラグメント
とヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡを含むプラスミドｐＥＦＨＧ
ＴＥを制限酵素ＫｐｎＩとＳｐｅＩで処理しＳＶ４０ポ
リアデニル化シグナルを含む領域を除去したベクターＤ
ＮＡとをＴ ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合さ
せ、発現ベクターｐＤＥＦ２０２−ｇｈＴＰＯを得た。
このプラスミドはＳＶ４０の複製開始領域、ヒトエロン
ゲーションファクタ−１−アルファプロモーター、ＳＶ
４０初期ポリアデニル部位、マウスＤＨＦＲミニ遺伝
子、ｐＵＣ１８の複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝
子（Ａｍｐｒ）を含み、ヒトエロンゲーションファクタ
−１−アルファプロモーター下流にヒトＴＰＯ染色体Ｄ
ＮＡが接続されている。 ＜実施例５１＞ ＣＨＯ細胞によるヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡの発現 ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉ
ｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；
７７巻４２１６頁、１９８０）を６ｃｍ径のプレート
（Ｆａｌｃｏｎ社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小
必須培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチ
ン添加）で培養増殖させ、これをリン酸カルシウム法
（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ、ファルマシア社製）によって形
質転換した。すなわち、実施例５０で調製したｐＤＥＦ
２０２−ｇｈＴＰＯプラスミド１０μｇにバッファー
Ａ：１２０μｌおよびＨ２０：１２０μｌを加え混合し
たのち、室温で１０分間放置した。つぎに、この溶液に
バッファーＢ：１２０μｌを加え、再度混合したのち、
室温で３０分間放置した。このＤＮＡ溶液をプレートに
滴下したのち、ＣＯ２インキュベーター中で６時間培養
した。プレートから培地を除去し、α−ＭＥＭ（−）に
て２回洗浄後、１０％ジメチルスルフォオキシド含有α
−ＭＥＭ（−）を添加し、室温で２分間処理した。次い
で、１０％透析牛胎児血清含有非選択培地（前出α−Ｍ
ＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）を添加し
て２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清含有選択
培地（α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン無
添加）での選択をおこなった。選択は細胞をトリプシン
処理した後、６ｃｍ径プレート１枚あたりを、１０ｃｍ
径プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２０枚に分
割したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換を行いな
がら培養を続行する事により実施した。細胞が増殖して
きたプレートあるいはウエルについてその培養上清中の
ヒトＴＰＯ活性をＢａ／Ｆ３アッセイを用いて測定した
結果、ヒトＴＰＯ活性が認められた。なお、ＣＨＯ細胞
の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＥＦＨＧＴＥとｐＭＧ
１を同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
することによっても行うことができる。 ＜実施例５２＞ −１位にＬｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたヒトＴＰ
Ｏ（アミノ酸１−１６３）（以下、このタンパク質を
「ｈＭＫＴ（１−１６３）」と称す）の大腸菌用発現ベ
クターの構築〜発現・発現の確認 配列番号６のアミノ酸配列（１−１６３位）の−１位に
Ｌｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたタンパク質を発現
するため、実施例４２と同様にして、以下の表１８に示
した１−１３、２−１３、３−３、４−３の合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて、ｈＭＫＴ（１−１６３）の大腸
菌用発現ベクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（１−１６
３）を構築した。
ＣＨＯ細胞の培養上清から部分精製された組換えヒトＴ
ＰＯ標品を定法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次い
でＰＶＤＦあるいはニトロセルロース膜にエレクトロブ
ロティングし、上述の抗ＲＴペプチド抗体の場合と同様
にウェスタン分析を行ったところ、それぞれの精製され
た抗体により、ヒトＴＰＯが認識、検出されることが確
認できた。 ＜実施例４６＞ 抗ＴＰＯペプチド抗体カラムの調製 実施例４５で得られた抗ラットＴＰＯペプチド抗体は、
ラット及びヒトＴＰＯを認識することができたため、抗
ＲＴ１ペプチド抗体、抗ＲＴ２ペプチド抗体の免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ）画分を以下のようにして、クロマトグ
ラフィー坦体に結合させ、抗ＴＰＯペプチド抗体カラム
を作製した。材料となった抗体は、それぞれの抗原ペプ
チドにつきウサギ抗血清２把ずつから由来し、それぞれ
のウサギごとに抗体を分けて調製した。具体的には、抗
ＲＴ１ペプチド抗体では、それぞれ、抗ＲＴ１−１ペプ
チド抗体と抗ＲＴ１−２ペプチド抗体と称し、抗ＲＴ２
ペプチド抗体では、抗ＲＴ２−１ペプチド抗体と抗ＲＴ
２−２ペプチド抗体と称す。これらを別々にして抗体カ
ラムを調製したため、抗ＲＴ１ペプチド抗体カラムは２
種（それぞれ抗ＲＴ１−１抗体カラム、抗ＲＴ１−２抗
体カラムと称す）、抗ＲＴ２ペプチド抗体カラムは２種
（それぞれ抗ＲＴ２−１抗体カラム、抗ＲＴ２−２抗体
カラムと称す）、さらに抗ＲＴ１−２ペプチド抗体と抗
ＲＴ２−１ペプチド抗体を混合してゲルにカップリング
した抗体カラム（抗ＲＴ１−２＋２−１混合抗体カラ
ム）、の５種類を調製した。各々の抗体を５ｍｇ／ｍｌ
（抗ＲＴ１＋２ｍｉｘ抗体カラムでは抗ＲＴ１−２ペプ
チド抗体と抗ＲＴ２−１ペプチド抗体を等量混合した
２．５ｍｇ／ｍｌ）の濃度で含む５０ｍＭ Ｎａ Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）
の溶液とし、これを２．３１ｍｌとり、１．５４ｍ体積
の膨潤したホルミル活性化ゲル（Ｆｏｒｍｙｌ−Ｃｅｌ
ｌｕｌｏｆｉｎｅ、チッソ株式会社製）と合わせ、４℃
で２時間カップリング反応させた。次いで、１０ｍｇ／
ｍｌの濃度の還元剤溶液（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎ
ｅ ｂｏｒａｎｅ（ＴＭＡＢ）、生化学工業製、カタロ
グ番号６８０２４６）を１．１ｍｌ加え、さらに６時間
カップリング反応させた後、遠心分離によりゲル部分の
みを回収した。これに１０ｍｌの精製水を加え、遠心分
離でゲル部分のみの回収といった操作を４回繰り返し、
未反応の抗体を取り除いた。次に４．６ｍｌのブロッキ
ング緩衝液（０．２Ｍ Ｎａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１
Ｍ ｅｔｈａｎｏｌ ａｍｉｎｅ（ｐＨ７．０））と
１．１ｍｌの還元剤溶液を加え、４℃で２時間以上処理
することにより、未反応のゲルの活性基をブロックし
た。最後にゲルを遠心分離を用いて精製水、ＤＰＢＳで
洗浄し、小カラムチューブに充填し、３Ｍチオシアン酸
カリウム溶液、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．
５）溶液で洗浄後、再度ＤＰＢＳで再平衡化して保存し
た。抗ＲＴ１−１抗体カラム、抗ＲＴ１−２抗体カラ
ム、抗ＲＴ２−１抗体カラム、抗ＲＴ２−２抗体カラ
ム、抗ＲＴ１−２＋２−１混合抗体カラムの５種類それ
ぞれの抗ＴＰＯペプチド抗体ゲルでは、各ＩｇＧ画分の
カップリング効率は順に９７．４％、９５．４％、９
８．４％、９８．３％、９９．４％に達した。また、そ
れぞれのゲル体積当たりにカップリングしたＩｇＧ画分
量は、５．６ｍｇ／ｍｌゲル、５．８ｍｇ／ｍｌゲル、
５．７ｍｇ／ｍｌゲル、５．７ｍｇ／ｍｌゲル、２．９
ｍｇ／ｍｌゲルであった。従って、抗体の由来や抗原の
違いによって、カップリング効率やカップリング量に大
きな差がないことが確認できたため、これらの抗体カラ
ムを利用して、以下、実施例４７に示す実験を行った。 ＜実施例４７＞ 発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェ
クションして得られた培養上清由来ＴＰＯの抗ＴＰＯ抗
体カラム→逆相カラムクロマトグラフィーでの精製〜生
物学的活性の確認 以下の精製サンプルの評価のためのｉｎ ｖｉｔｒｏア
ッセイ方法は、Ｍ−０７ｅアッセイ系を用いた。発現ベ
クターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクショ
ンして得られた、実施例３５の培養上清由来ＴＰＯの部
分精製標品（ＴＰＯが回収された主たる画分ではない画
分、即ち、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩ
Ｃカラムの素通り画分Ｆ１と、Ｆ２の後に２０ｍＭ Ｎ
ａ Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ５．８でカラム洗浄し溶出し
たＦ３、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏ
ｗカラムのＦ１とＦ３をまとめてＴＰＯサブプール画分
（５４６３．７９ｍｌ，蛋白質濃度０．４９０ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量２６７６ｍｇ，相対活性１２１００，相
対活性量３２３８００００）とし、限外濾過ユニット
（フィルトロン社製・オメガウルトラセット 分子量８
０００カット）でまず濃縮し、さらに溶媒をＤＰＢＳに
置換し、小体積になってからはＹＭ−１０膜付き限外濾
過ユニット（アミコン社製）を用いて最終的に１２０．
２ｍｌの０．０５％アジ化ナトリウムを含むＤＰＢＳ溶
液にした。次に実施例４６で調製した５種類の抗ＴＰＯ
ペプチド抗体ゲルを全て混合し、１本の抗体カラム（直
径１．６ｃｍ，ベッド高４．８ｃｍ，抗ＲＴ１＋２混合
抗体カラムと称す）にまとめ、室温にて流速０．０３３
ｍｌ／ｍｉｎでＴＰＯサブプール画分を添加した。添加
終了後、ＤＰＢＳで溶出液の紫外線吸収が十分下がるま
でを集め、さらにＹＭ−１０膜付き限外濾過ユニット
（アミコン社製）で濃縮した素通り画分Ｆ１（８２．６
２ｍｌ，蛋白質濃度１４．３ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１
１８４ｍｇ，相対活性６７５００，相対活性量７９９０
００００）を集めた。次に酸性溶離液（０．１Ｍグリシ
ン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５））で溶出されるカラム吸着画
分Ｆ２（９２．９７ｍｌ，蛋白質濃度０．１２ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量１１．１ｍｇ，相対活性２５７１００，
相対活性量２８６００００）を溶出した。素通り画分Ｆ
１には相当量のＴＰＯ活性があったが、抗体カラムに吸
着したＴＰＯについては約２０倍の相対活性の上昇が認
められたため、さらに精製を行った。即ち、展開溶媒Ａ
に０．１％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡを含
む１−プロパノールを用いたＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ
Ｃ１ ３００Ａ（資生堂製、カタログ番号Ｃ１ ＴＹＰ
Ｅ：ＳＧ３００Ａ；直径 ４．６ｍｍ、ベッド高 １５
０ｍｍに加え、直径４．６ｍｍ、ベッド高 ３５ｍｍの
プレカラムを接続したもの）カラムにて、抗体カラムで
得られたＦ２に１０分の１体積の展開溶媒Ｂを加え、２
０％Ｂで平衡化したＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１ ３
００Ａカラムに流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注
入終了後、２０％Ｂにて５分溶出した後、２０％Ｂから
４０％Ｂまで５０分の直線濃度勾配で展開し、１ｍｌ
（２．５ｍｉｎ）ずつポリプロピレン製チューブに集め
た。それぞれ２μｌ（５００分の１フラクション）を取
りＨＳＡを加え、限外濾過濃縮し、最終的に０．０２％
ＨＳＡを含む０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液溶
液とし、これをアッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定
した。この結果、チューブ番号２０〜２３（プロパノー
ル濃度で２８．５〜３２．５％の範囲）に強いＴＰＯの
活性を示す標品を得ることができた。またこれらの標品
を＜実施例４５＞に述べた方法によりウエスターン分析
をしたところ、ＤＰＣＩＩＩ分子量マーカーに対し、還
元下において見かけ上の分子量が６００００〜７０００
０のＴＰＯが確かに存在し、これとは別に、３２０００
〜４３０００、２００００〜３００００の分子量をもつ
分子も存在していることが判明した。 ＜実施例４８＞ 発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェ
クションして得られた培養上清由来で、Ｃａｐｃｅｌｌ
Ｐａｋ Ｃ１ ３００Ａカラムの段階まで精製された
ＴＰＯの生物学的活性の確認 実施例３６で精製されたＴＰＯ活性画分、即ちＣａｐｃ
ｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１３００Ａカラムのチューブ番号２
０〜２３（プロパノール濃度で２８．５〜３２．５％の
範囲）までを集め、０．２１ｍｌのグリセロールを添加
後遠心エバポレーションで濃縮した。これに６Ｍ塩酸グ
アニジン溶液０．２１ｍｌを加えたものをＤＰＢＳで１
ｍｌに希釈後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＮＡ
Ｐ−１０，ファルマシア バイオテック社製、カタログ
番号１７−０８５４−０１）で０．０１％ＨＳＡを含む
ＤＰＢＳ溶液に置換し、さらに１．１ｍｌの０．０１％
ＨＳＡを含むＤＰＢＳを加えて、最終的にＴＰＯ活性画
分ＦＡ（２．６ｍｌ）を調製した。この標品の生物学的
ＴＰＯ活性をについて調べるために、ｉｎ ｖｉｖｏア
ッセイを行った。即ち、１群４匹のＩＣＲ系雄性マウス
（８週齢）に、活性画分１００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセ
イ系での相対活性量８７４００を含む）を１日１回、５
日間連日皮下投与した。対照として、０．０１％ＨＳＡ
を含むＤＰＢＳ１００μｌを同様のスケジュールで皮下
投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌日に眼
底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ８０
０）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、
投与終了後において投与前と比較して平均で１．４２倍
の血小板の増加を認め、対照群の血小板数と比較しても
１．２３倍の高値を示し、両者の間に有意差（ｐ＜０，
０５，Ｓｔｕｄｅｎｔｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。この結
果から、動物細胞で生産された上記のヒトＴＰＯが、生
体内において血小板増加作用を有することが明らかとな
った。 ＜実施例４９＞ 発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェ
クションして得られた、培養上清３３Ｌを出発材料に
し、陽イオン交換カラムで得た粗精製ＴＰＯ画分の生物
学的活性の確認 （１）以下の精製サンプルの評価のためのｉｎ ｖｉｔ
ｒｏアッセイ方法は、Ｍ−０７ｅアッセイ系を用いた。
実施例３６で記載された方法と同様にして、３３Ｌの発
現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェク
ションして得られた無血清培養上清を得て、０．２２μ
ｍの濾過フィルターの濾液をとった。これを限外濾過ユ
ニット（ミリポア社製・ＰＬＧＣペリコンカセット 分
子量１００００カット）で約１０倍濃縮し、蛋白質分解
酵素阻害剤であるｐ−ＡＰＭＳＦを最終濃度約１ｍＭ加
え、体積２０１８ｍｌ（蛋白質濃度３．２２ｍｇ／ｍ
ｌ、総蛋白質量６５０２ｍｇ、相対活性６６０００、相
対活性量４２９１０００００）を得た。次に、限外濾過
ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット分
子量３００００カット）で濃縮工程を繰り返し、分子量
３００００以上の画分（体積１１９０ｍｌ、蛋白質濃度
２．５４ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量３０２０ｍｇ、相対活
性８２５００、相対活性量２４９００００００）と、分
子量３００００以下の画分（体積２９７５ｍｌ、蛋白質
濃度０．４７１ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量１４０２ｍｇ、
相対活性４５００、相対活性量６３１００００）を得る
ことができた。分子量３００００以下の画分にＴＰＯ活
性が存在することは、ＴＰＯの動物細胞での発現・分泌
の過程において、最終的に培養上清中に、低分子化した
ＴＰＯが含まれている可能性を示す。一方、分子量３０
０００以上の画分をさらに２０ｍＭクエン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．１）に置換し、２０ｍＭクエン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．１）で予め平衡化したＳＰ Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア
バイオテク社製、カタログ番号１７−０７２９−０１；
直径 ２．６ｃｍ、ベッド高 ２９ｃｍ）カラムに注入
し、流速５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、さら
に２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）で
洗浄溶出した。次に展開溶媒Ａに２０ｍＭクエン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．１）、展開溶媒Ａ中に１Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む溶液を展開溶媒Ｂとして用い、流速３ｍｌ
／ｍｉｎで０％Ｂから５０％Ｂまで２１５分間、さらに
５０％Ｂから１００％Ｂまで２０分の直線濃度勾配で展
開し、３０ｍｌ（１０ｍｉｎ）ずつポリプロピレン製チ
ューブに集めた。これらの一部を取り、Ｍ−０７ｅアッ
セイ系で活性の分布を調べたところ、広範囲にわたりＴ
ＰＯ活性が溶出されたことが判明した。そこで素通りを
含め、５０ｍＭ以下のＮａＣｌで溶出された画分をＦ
１、ＴＰＯの主画分として５０〜１０００ｍＭのＮａＣ
ｌで溶出された画分をＦ２としてまとめた。Ｆ１は体積
１９５１ｍｌ（蛋白質濃度２．０５ｍｇ／ｍｌ、総蛋白
質量３９９４ｍｇ、相対活性１３５００、相対活性量５
３９０００００）、Ｆ２は体積６４９．８ｍｌ（蛋白質
濃度１．１１ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量７２１ｍｇ、相対
活性２６８０００、相対活性量１９３００００００）で
あった。 （２）ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
Ｆ２の生物学的活性の確認 （１）で分取したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
ＦｌｏｗのＦ２を２．５ｍｌ取り、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ２５カラム（ＮＡＰ−２５，ファルマシアバイオテ
ック社製、カタログ番号１７−０８５２−−０１）で
０．０１％ＨＳＡを含むＤＰＢＳ溶液３．５ｍｌに置換
し、このサンプル（蛋白質濃度１．４６ｍｇ／ｍｌ）の
生物学的ＴＰＯ活性について調べるために、ｉｎ ｖｉ
ｖｏアッセイを行った。即ち、１群４匹のＩＣＲ系雄性
マウス（８週齢）に、活性画分１００μｌ（Ｍ−０７ｅ
アッセイ系での相対活性量３１５０を含む）を１日１
回、５日間連日皮下投与した。対照として、０．０１％
ＨＳＡを含むＤＰＢＳ１００μｌを同様のスケジュール
で皮下投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌
日に眼底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ
８００）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群で
は、投与終了後において投与前と比較して平均で１．２
９倍の血小板の増加を認め、対照群の血小板数と比較し
ても１．１２倍の高値を示し、両者の間に有意差（ｐ＜
０．０５，Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。
この結果から、動物細胞で生産された上記のヒトＴＰＯ
が、生体内において血小板増加作用を有することが明ら
かとなった。 ＜実施例５０＞ ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＨＯ細胞用組換え発現ベク
ター、ｐＤＥＦ２０２−ｇｈＴＰＯの構築 ベクターｐＤＥＦ２０２を制限酵素ＫｐｎＩとＳｐｅＩ
で処理し、アガロースゲル電気泳動で小さい方のマウス
ＤＨＦＲミニ遺伝子とＳＶ４０ポリアデニル化シグナル
を含むフラグメントを回収したのち、このフラグメント
とヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡを含むプラスミドｐＥＦＨＧ
ＴＥを制限酵素ＫｐｎＩとＳｐｅＩで処理しＳＶ４０ポ
リアデニル化シグナルを含む領域を除去したベクターＤ
ＮＡとをＴ ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合さ
せ、発現ベクターｐＤＥＦ２０２−ｇｈＴＰＯを得た。
このプラスミドはＳＶ４０の複製開始領域、ヒトエロン
ゲーションファクタ−１−アルファプロモーター、ＳＶ
４０初期ポリアデニル部位、マウスＤＨＦＲミニ遺伝
子、ｐＵＣ１８の複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝
子（Ａｍｐｒ）を含み、ヒトエロンゲーションファクタ
−１−アルファプロモーター下流にヒトＴＰＯ染色体Ｄ
ＮＡが接続されている。 ＜実施例５１＞ ＣＨＯ細胞によるヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡの発現 ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉ
ｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；
７７巻４２１６頁、１９８０）を６ｃｍ径のプレート
（Ｆａｌｃｏｎ社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小
必須培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチ
ン添加）で培養増殖させ、これをリン酸カルシウム法
（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ、ファルマシア社製）によって形
質転換した。すなわち、実施例５０で調製したｐＤＥＦ
２０２−ｇｈＴＰＯプラスミド１０μｇにバッファー
Ａ：１２０μｌおよびＨ２０：１２０μｌを加え混合し
たのち、室温で１０分間放置した。つぎに、この溶液に
バッファーＢ：１２０μｌを加え、再度混合したのち、
室温で３０分間放置した。このＤＮＡ溶液をプレートに
滴下したのち、ＣＯ２インキュベーター中で６時間培養
した。プレートから培地を除去し、α−ＭＥＭ（−）に
て２回洗浄後、１０％ジメチルスルフォオキシド含有α
−ＭＥＭ（−）を添加し、室温で２分間処理した。次い
で、１０％透析牛胎児血清含有非選択培地（前出α−Ｍ
ＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）を添加し
て２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清含有選択
培地（α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン無
添加）での選択をおこなった。選択は細胞をトリプシン
処理した後、６ｃｍ径プレート１枚あたりを、１０ｃｍ
径プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２０枚に分
割したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換を行いな
がら培養を続行する事により実施した。細胞が増殖して
きたプレートあるいはウエルについてその培養上清中の
ヒトＴＰＯ活性をＢａ／Ｆ３アッセイを用いて測定した
結果、ヒトＴＰＯ活性が認められた。なお、ＣＨＯ細胞
の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＥＦＨＧＴＥとｐＭＧ
１を同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
することによっても行うことができる。 ＜実施例５２＞ −１位にＬｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたヒトＴＰ
Ｏ（アミノ酸１−１６３）（以下、このタンパク質を
「ｈＭＫＴ（１−１６３）」と称す）の大腸菌用発現ベ
クターの構築〜発現・発現の確認 配列番号６のアミノ酸配列（１−１６３位）の−１位に
Ｌｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたタンパク質を発現
するため、実施例４２と同様にして、以下の表１８に示
した１−１３、２−１３、３−３、４−３の合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて、ｈＭＫＴ（１−１６３）の大腸
菌用発現ベクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（１−１６
３）を構築した。
【表１８】 この発現プラスミドは、配列表（配列番号１２）に示さ
れたＤＮＡ配列を含んでいる。さらに、実施例４３と同
様にして、ｈＭＫＴ（１−１６３）の発現を誘導した。
ここで得られた発現タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＰＶ
ＤＦ膜に転写し、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行った結
果、発現されるべきｈＭＫＴ（１−１６３）のアミノ酸
配列を含むことが確認できた。 ＜実施例５３＞大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列
をコードするクローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１
６３）由来変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）の
塩酸グアニジンとグルタチオンを用いたリフォールディ
ング〜精製〜生物学的活性の確認実施例４３で調製され
たｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体凍結菌体１．２ｇに
水３ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕し
た。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋
白質、菌体成分等を除去する。回収されたｈ６Ｔ（１−
１６３）を含む沈殿画分に水を加えてけん濁し、最終４
ｍｌとした。攪拌しながら１ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液
ｐＨ８．５を加えた後、２０ｍｌの８Ｍ塩酸グアニジン
を加えて室温にて５分間攪拌して可溶化した。これを２
０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈し、５ｍ
Ｍ還元型グルタチオンと０．５ｍＭの酸化型グルタチオ
ンを加えて攪拌し溶かした後、４℃中にて一晩静置し
た。遠心分離により、上清中にｈ６Ｔ（１−１６３）を
回収した。得られた上清のうち１６０ｍｌをＹＭ１０限
外濾過膜（アミコン社製）を用いて濃縮し、ＤＰＢＳに
て緩衝液を置換して最終容量３．４ｍｌとした（蛋白濃
度２．１８ｍｇ／ｍｌ）。この画分をＩＭＤＭ培養液に
対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で
評価した結果、強いＴＰＯの活性（相対活性５８００
０）を示した。上記の方法により調製したＴＰＯ活性画
分についてｉｎ ｖｉｖｏアッセイを行った。１群４匹
のＩＣＲ系雄性マウス（７週齢）に、活性画分１７０μ
ｌ（ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系での相対活性量２２
０００を含む）を１日１回、５日間連日皮下投与した。
対照として、１群６匹の同様のマウスにＤＰＢＳ１７０
μｌを同様のスケジュールで皮下投与した。採血は、投
与開始直前及び投与終了翌日、終了３日後に眼底より行
い、血球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ８００）を用い
て血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了翌
日において投与前と比較して平均で２．１５倍の血小板
の増加を認め、また投与終了３日後においてもその効果
は持続しており２．１３倍の高値を維持した。投与終了
翌日及び３日後のいずれの日においても、血小板数は、
それぞれの日の対照群のそれと比較して１．７３倍、
１．８０倍と高値を示し、両者の間に有意差（ｐ＜０．
００１，Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。こ
の結果から、大腸菌より生産され、上記の方法で調製し
たヒトＴＰＯが、生体内において血小板増加作用を有す
ることが明らかとなった。 ＜実施例５４＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異
型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）のＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウムと硫酸銅を用いたリフォールディ
ング〜精製〜生物学的活性の確認 実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換
体凍結菌体０．６ｇに水３ｍｌを加えてけん濁し、高圧
破砕機で菌体を破砕した後、遠心分離により沈殿画分を
回収した。沈殿画分に３．１ｍｌの水を加えて懸濁した
後、０．１９ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２、１
１．２５μｌの１Ｍ ＤＴＴ、３８μｌの０．５ＭＥＤ
ＴＡ、０．３８ｍｌの１０％デオキシコール酸ナトリウ
ムを攪拌しながら加え、室温にて４０分間攪拌した。遠
心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、
菌体成分等を除去した。沈殿に水４ｍｌを加えてけん濁
した後、遠心分離によってｈ６Ｔ（１−１６３）を含む
沈殿画分を回収した。得られた沈殿画分に水３．８ｍｌ
を加え懸濁した後、攪拌しながら０．２ｍｌの１ＭＴｒ
ｉｓ緩衝液ｐＨ８と１ｍｌの１０％Ｎ−ラウロイルサル
コシンナトリウムを加えて室温にて２０分間攪拌して可
溶化した。これに５μｌの１％硫酸銅を加え、室温にて
一晩（約２０時間）攪拌した。遠心分離によりｈ６Ｔ
（１−１６３）を含む上清画分を回収した後、上清５ｍ
ｌに５ｍｌの水、１０ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐ
Ｈ７．７加えた後、２．６ｇのＤｏｗｅｘ １−ｘ４，
２０−５０ｍｅｓｈ，ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｆｏｒｍ イ
オン交換樹脂を加え、９０分間撹拌した。グラスフィル
ターを用いてイオン交換樹脂非吸着画分を回収した後、
遠心分離によって上清を回収した。得られた上清を２０
ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７で平衡化したＳＰ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラ
ムに添加し、同緩衝液中でＮａＣｌ濃度０Ｍから５００
ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。溶
出画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラット
ＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した結果、ＳＰ Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅＦａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換クロマト
グラフィーのＮａＣｌ濃度約１００ｍＭ付近で溶出され
た画分に強いＴＰＯの活性（相対活性約１９０００００
０）を示した。この画分をウルトラフリーＣＬ分画分子
量５０００限外濾過ユニット（ミリポア社製、型番ＵＦ
Ｃ４ＬＣＣ２５）を用いて１．６倍濃縮した（２．５ｍ
ｌ、蛋白濃度２５μｇ／ｍｌ）。同画分を還元剤存在下
でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、ＴＰＯのバンドが
主バンドとして検出された（純度７０−８０％）。上記
の方法により調製したＴＰＯ活性画分についてｉｎ ｖ
ｉｖｏアッセイを行った。１群４匹のＩＣＲ系雄性マウ
ス（８週齢）に、活性画分１００μｌ（ラットＣＦＵ−
ＭＫアッセイ系での相対活性量４７５００を含む）を１
日１回、５日間連日皮下投与した。対照として、１００
ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７
１００μｌを同様のスケジュールで皮下投与した。採血
は、投与開始直前及び投与終了翌日に眼底より行い、血
球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ８００）を用いて血小
板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了後におい
て投与前と比較して平均で１．７３倍の血小板の増加を
認め、対照群の血小板数と比較しても１．５９倍の高値
を示し、両者の間に有意差（ｐ＜０．０１，Ｓｔｕｄｅ
ｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。この結果から、大腸菌
より生産され、上記の方法で調製したヒトＴＰＯが、生
体内において血小板増加作用を有することが明らかとな
った。 ＜実施例５５＞ ＣＨＯ細胞の大量培養 実施例３２においてヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥＦ
２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１をＣＨＯ細胞にトランスフェク
ションして得られたヒトＴＰＯ 産生ＣＨＯ細胞株（Ｃ
ＨＯ２８−３０細胞、２５ｎＭ ＭＴＸ耐性）の大量培
養は以下のようにして実施した。細胞を２５ｎＭ ＭＴ
Ｘおよび１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地
（ＧＩＢＣＯ社）を用いて培養増殖させた。この細胞を
トリプシン溶液を用いて剥離したのち、２００ｍｌの同
培地を含むＦａｌｃｏｎ社製ローラーボトル（Ｆａｌｃ
ｏｎ３０００）に１×１０７個の細胞を接種し、３７℃
で１ｒｐｍの回転速度で３日間培養した。３日後、培養
液を吸引除去し、１００ｍｌのＰＢＳで細胞培養表面を
リンスしたのち、２５ｎＭ ＭＴＸおよび１０％ＦＣＳ
を含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ社）を
２００ｍｌ加え、３７℃、１ｒｐｍの回転速度で７日間
培養し、７日後その培養上清を回収し、次の精製操作の
出発材料にした。上記の操作をローラーボトル５００本
分実施し、培養上清１００Ｌを得た。 ＜実施例５６＞ ヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株からヒトＴＰＯの精製 （１）実施例５５より無血清培養上清約１００Ｌを得
て、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。こ
れを限外濾過ユニット（ミリポア社製・ＰＬＴＫペリコ
ンカセット 分子量３００００カット）で濃縮かつ溶媒
を精製水に置換し、蛋白質分解酵素阻害剤であるｐ−Ａ
ＰＭＳＦ（和光純薬社製）を最終濃度１ｍＭ及びＰｅｆ
ａｂｌｏｃ ＳＣ （Ｍｅｒｋ社製）を最終濃度０．３
５ｍＭ加え、体積３６２８ｍｌ（蛋白質濃度１．６０ｍ
ｇ／ｍｌ、総蛋白質量５８０５ｍｇ、相対活性１２３０
０００、相対活性量７１４９００００００）の分子量３
００００以上の画分を得た。この画分を実施例４５で述
べたウエスターン分析で調べたところ、分子量６６００
０〜１０００００の範囲にＴＰＯ蛋白質が存在すること
が明らかとなった。さらによく調べてみると、これとは
別に、より低分子のＴＰＯをも含まれていることが判明
した。分子量３００００以下の限外濾液はこれとは別に
限外濾過ユニット（ミリポア社製・ＰＬＧＣペリコンカ
セット 分子量１００００カット）で濃縮したところ、
体積１９０１ｍｌ（蛋白質濃度０．３６ｍｇ／ｍｌ、総
蛋白質量６８４ｍｇ、相対活性２４５５００、相対活性
量１６７９０００００）であったため、低分子化したＴ
ＰＯ分子が培養工程において生じたことが確認された。
次に、分子量３００００以上の画分３６１４ｍｌに７６
４ｇの硫酸アンモニウム、及び１４４．５ｍｌの０．５
Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、最
終濃度１．４１Ｍ硫酸アンモニウム、１７．７ｍＭのク
エン酸ナトリウム緩衝液を含む４０８９ｍｌの溶液と
し、生じた不溶物を遠心分離後可溶物を得た。これを
１．２Ｍ 硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭクエン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で予め平衡化してあった
Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＭｅｔｈｙｌＨＩＣ カラム
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社製、カタログ番号１５６−００８
０；直径５ｃｍ、ベッド高 ２４．５ｃｍ）に、流速約
２５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、１．２Ｍ硫
酸アンモニウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５．５）で溶出されたものを限外濾過ユニット
（フィルトロン社製・オメガウルトラセット 分子量８
０００カット）で濃縮し、素通り画分Ｆ１（４４５５ｍ
ｌ，蛋白質濃度０．４００ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１７
８０ｍｇ，相対活性１８３１０００）を得た。次に、溶
出液を２０ｍＭ Ｎａ Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ６．０に
かえ、溶出されたものを限外濾過ユニット（フィルトロ
ン社製・オメガウルトラセット 分子量８０００カッ
ト）で濃縮し、画分Ｆ２ （１４５７ｍｌ，蛋白質濃度
０．９６９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１４１１ｍｇ， 相
対活性１７１５０００）を集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より、このＦ２には分子量６６０００〜１０００００の
蛋白質が存在することが確認された。さらにウエスター
ン分析により、この蛋白質がＴＰＯであることが明らか
となった。次に、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ
ＨＩＣ カラム Ｆ２（１４４３ｍｌ）を、２０ｍＭ
クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化
したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
（ファルマシア バイオテク社製、カタログ番号１７−
０７２９−０１；直径 ５ｃｍ、ベッド高 １２ｃｍ）
カラムに注入し、流速１５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添
加終了後、さらに５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭク
エン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出されたも
のまでをまとめ、画分Ｆ１（３００７ｍｌ，蛋白質濃度
０．２２６ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量６７９ｍｇ，相対活
性８８８３０）を得た。次に、溶出液を７５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．４）にかえ、溶出された画分Ｆ２（９３１ｍｌ，蛋
白質濃度０．７６３ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量７１０ｍ
ｇ，相対活性５５５８０００）を集めた。これを限外濾
過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット
分子量８０００カット、及びアミコン社製ＹＭ３膜）
で２０２ｍｌまで濃縮した。次に、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗカラムのＴＰＯ活性画分Ｆ
２の濃縮液（１９７ｍｌ）をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−
２００ＨＲ カラム（ファルマシア・バイオテク社製、
カタログ番号１７−０５８４−０５；直径７．５ｃｍ、
ベッド高 １００ｃｍ）に注入し、流速３ｍｌ／ｍｉｎ
でゲル濾過を行った。溶離液体積１２００〜１７８５ｍ
ｌ、１７８５〜２０１０ｍｌ、２０１０〜２２８０ｍ
ｌ、２２８０〜３０００ｍｌの各範囲をまとめ、それぞ
れ画分Ｆ１（５８５ｍｌ，蛋白質濃度１．００ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量５８９ｍｇ，相対活性４１１８００
０）、画分Ｆ２（２２５ｍｌ，蛋白質濃度０．２６３／
ｍｌ，総蛋白質量５９．２ｍｇ，相対活性２５０９００
０）、画分Ｆ３（２７０ｍｌ，蛋白質濃度０．１１９／
ｍｌ，総蛋白質量３２．１ｍｇ，相対活性２５３５００
０）、画分Ｆ４（７２０ｍｌ，蛋白質濃度０．０４６７
／ｍｌ，総蛋白質量３３．６ｍｇ，相対活性１１５５０
００）を得た。このように、分画されたＴＰＯ活性はゲ
ル濾過法での分子量範囲が広いことが判明したため、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスターン分析を実施したとこ
ろ、Ｆ１ではほとんどが分子量６６０００〜１００００
０のＴＰＯであったのに対し、Ｆ２、Ｆ３ではそれぞれ
分子量３２０００〜６００００、分子量３２０００〜４
２０００のＴＰＯ分子種が存在していた。いずれの分子
量のＴＰＯ分子も全てＴＰＯ活性をもっていた。なお、
分子量６６０００〜１０００００のＴＰＯ分子について
Ｎ末端アミノ酸配列分析を実施したところ、ヒトＴＰＯ
遺伝子でコードされるタンパク質のアミノ酸配列を含む
ことが確認できた。また、分子量６６０００〜１０００
００のＴＰＯ分子について、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇ
ｌｙｃａｎａｓｅ：Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、カタログ番号
１４７２−００）、ノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｎ
ｉｄａｓｅ：ナカライテスク社製、カタログ番号２４２
−２９ ＳＰ）、エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサ
ミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−α−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａ
ｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ：生化学工業製、カタログ
番号１００４５３）、およびＯ−グリコシダーゼ（０−
Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製、カタログ番
号１３４７１０１）の糖鎖切断酵素を単独あるいは組み
合わせて酵素消化実験を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥ調べたと
ころ、ＴＰＯのポリペプチド部分は理論値から推定され
る分子量約３６０００であり、Ｎ結合型糖鎖とＯ結合型
糖鎖の両方を持つ糖タンパク質であることが判明した。 ＜実施例５７＞ ヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株からヒトＴＰＯの精製 （１）実施例５５と同様にして得られたＣＨＯ細胞無血
清培養上清１Ｌに２１１．４ｇの硫酸アンモニウムを加
え、０．２μｍフィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ社製、カタログ番号１２９９２）で濾過し、予め
１．２Ｍ硫酸アンモニウム，２０ｍＭ 酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．６）で平衡化しておいたＭａｃｒｏ−
Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ社製，カタログ番号 １５６−００８１，直径５０ｍ
ｍ、ベッド高９０ｍｍ）に流速１５ｍｌ／ｍｉｎで添加
した。添加終了後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．６）４５０ｍｌで溶出した。この溶出液をＶｙｄ
ａｃ 逆相 Ｃ４ カラム（Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉ
ｏｎｓ ＧｒｏｕＰ社製、カタログ番号２１４ＢＴＰ５
４，直径４．６ｍｍ，ベッド高２５０ｍｍ）に流速０．
７５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、１５分間５
％エタノールを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．
４）（展開溶媒Ａ）で洗浄後、展開溶媒Ａから１０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ６．４）を含む９４％エタノール
（展開溶媒Ｂ）まで６６分間の直線グラジエントで溶出
した。このクロマトグラムを図１５に示した。ＴＰＯと
思われる分子量約６５０００−１０００００の分子は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、サンプル添加後の
保持時間６８−７２分付近の画分に得ることができ、単
一なバンドであることが確認できた（図１６参照）。さ
らにウエスターン分析により、このタンパク質がＴＰＯ
であることを確認した。このサンプルの一部を取り、Ｎ
末端アミノ酸分析を行った結果、ヒトＴＰＯ遺伝子でコ
ードされるタンパク質のアミノ酸配列を含むことが確認
できた。 ＜実施例５８＞ ヒトＴＰＯの昆虫細胞での発現用組換えウイルスの作製 実施例３０で作製したｐＨＴＰ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ
並びにＮｏｔＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約１２００ｂｐのバンドをプレップ−Ａ−ジーン
ＤＮＡ 精製キットを用いて精製した後、同様に制限酵
素処理したトランスファーベクターｐＶＬ１３９３（イ
ンビトローゲン社製）に連結しコンピテントハイＥ．ｃ
ｏｌｉ ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。得ら
れたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、ヒトＴＰ
ＯｃＤＮＡのコーディング領域を全て含むクローンｐＶ
Ｌ１３９３／ｈＴＰＯを得た。このクローンのプラスミ
ドＤＮＡをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記
載されているようにして調製し、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ
ＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファーミン
ゲン社製）を用いて昆虫細胞Ｓｆ２１（インビトローゲ
ン社製）にトランスフェクション後、Ｓｆ−９００培地
（ライフテクノロジー社製）中で２７℃で４日間培養
し、そのウイルスを含んだ上清を回収した。この上清を
１０９〜１０５倍に希釈してその１ｍｌを用いて、３５
ｍｍ径のシャーレ中で約７×１０５個のＳｆ２１細胞に
２７℃で１時間感染させた。上清を抜きとりＳｆ−９０
０培地を含む１％アガロースを流し込みアガロースが固
まった後、加湿下で２７℃で６日間培養した。ここで形
成されたシングルプラークをピックアップし、２００μ
ｌのＳｆ−９００培地中でウイルスを溶出させた。この
ウイルスクローンを２４ウエルプレート中でＳｆ２１細
胞に感染させウイルスの増幅を行った。得られたシング
ルプラーク由来のウイルス液の一部をフェノール／クロ
ロホルム処理後、エタノール沈殿してウイルスＤＮＡを
回収した。このウイルスＤＮＡを鋳型としてヒトＴＰＯ
ｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、
特異的なＤＮＡ断片が増幅されるか否かにより、ヒトＴ
ＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを選択した。ここ
で得られたヒトＴＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルス
を含む上清を用いてＳｆ２１細胞に感染させ、さらにウ
イルスの増幅を行った。 ＜実施例５９＞ Ｓｆ２１昆虫細胞でのヒトＴＰＯの発現と活性確認 １７５ｃｍ２の培養フラスコ中に、Ｓｆ２１細胞を約８
０％コンフルエントになるまで培養し、実施例５８で作
製したヒトＴＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを２
７℃で１時間感染させた後、Ｓｆ−９００培地中で２７
℃で４日間培養し、その上清を回収した。得られた培養
上清をＮＡＰＴＭ−５カラム（ファルマシア社製）を用
いてＩＭＤＭ培養液に置換し、これをラットＣＦＵ−Ｍ
Ｋアッセイ系及びＭ−０７ｅアッセイ系にかけたとこ
ろ、用量依存的に有意なＴＰＯ活性及びＭ−０７ｅ細胞
増殖促進活性が認められた。また、実施例４５に記載し
たのと同様のウエスタン分析により、Ｓｆ２１細胞で発
現した組み換えヒトＴＰＯが確認された。 ＜実施例６０＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異
型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）のＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウムと硫酸銅を用いたリフォールディ
ング法とリフォールディング〜精製 実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換
体凍結菌体３０ｇに水３００ｍｌを加えてけん濁し、高
圧破砕機（１００００ｐｓｉ、ＲａｎｎｉｅＨｉｇｈ
Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で菌体を破
砕した後、遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿画
分に９０ｍｌの水を加えて懸濁し、さらに撹拌しながら
水を加えて液量を１５０ｍｌにした後、９ｍｌの１ＭＴ
ｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２、５４０μｌの１ＭＤＴＴ、
１．８ｍｌの０．５ＭＥＤＴＡ、１８ｍｌの１０％デオ
キシコール酸ナトリウムを攪拌しながら加え、室温にて
３０分間攪拌した。遠心分離により沈殿画分を回収し、
大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。沈殿に１
８０ｍｌの５ｍＭＤＴＴを加えてけん濁した後、遠心分
離によってｈ６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分を回収
した。得られた沈殿画分に水３００ｍｌを加え懸濁し、
さらに撹拌しながら水を加えて液量を５７０ｍｌにした
後、攪拌しながら３０ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８
と１５０ｍｌの１０％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリ
ウムを加えて室温にて２０分間攪拌して可溶化した。こ
れに７５０μｌの１％硫酸銅を加え、室温にて一晩（約
２０時間）撹拌した。遠心分離によりｈ６Ｔ（１−１６
３）を含む上清画分を回収した後、上清７５０ｍｌに７
５０ｍｌの水、１５００ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液
ｐＨ７．７加えた後、撹拌しながら３ｍｌのポリソルベ
ート８０（日光ケミカルズ）を加えた。同溶液に６００
ｇのＤｏｗｅｘ １−ｘ４，２０−５０ｍｅｓｈ，ｃｈ
ｌｏｒｉｄｅｆｏｒｍ イオン交換樹脂を加え、室温に
て９０分間撹拌した。グラスフィルターを用いてイオン
交換樹脂非吸着画分を回収した後、７５０ｍｌの２０ｍ
ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７でイオン交換樹脂を洗浄し
た。イオン交換樹脂非吸着画分と洗浄液を合わせた溶液
に２Ｎ水酸化ナトリウム加えてｐＨを９．２に調整し、
０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩
衝液ｐＨ９．２で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換カラム（内径５ｃｍ
ｘ １０ｃｍ）に添加し、非吸着画分を回収した。塩酸
を用いて得られた非吸着画分のｐＨを７．２に調整し、
０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩
衝液ｐＨ７．２で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラム（内径５ｃｍ
ｘ １０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウ
ム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によっ
て溶出を行なった。溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって分析を行い、ＴＰＯ溶出画分を集めた。ＴＰ０溶
出画分にトリフルオロ酢酸を０．１％になる様に加え、
カプセルパック５μｍ３００Ａ Ｃ１カラム（内径２．
１ｃｍ ｘ ５ｃｍ ｘ ２本、資生堂）に添加した
後、０．１％トリフルオロ酢酸中で１−プロパノール濃
度を上昇させる直線濃度勾配溶離法によって逆相ＨＰＬ
Ｃを行なった。溶出液について還元剤非存在下でのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分析した結果及び逆相ＨＰＬＣでの
溶出位置によって、３画分に分画し、各々について０．
１％トリフルオロ酢酸を用いて３倍希釈した後、上記の
逆相ＨＰＬＣカラムに添加し、同様の方法で再クロマト
グラフィーを行なった。得られたＴＰＯ３画分を逆相Ｈ
ＰＬＣの溶出順にＦｒ．Ｓ−ａ、Ｆｒ．Ｓ−ｂ、Ｆｒ．
Ｓ−ｃ（図１７参照）として還元剤非存在下でのＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分析した結果、各々、分子量１８Ｋダルト
ン（Ｆｒ．Ｓ−ａ）、１９Ｋダルトン（Ｆｒ．Ｓ−
ｂ）、１８Ｋダルトン（Ｆｒ．ｓ−ｃ）付近に単一のバ
ンドとして検出された（図１８参照）。各々についてア
ミノ酸組成分析を行った結果、得られたアミノ酸組成は
シークエンス情報からの理論値とほぼ一致し，またＮ末
端アミノ酸配列分析の結果、予想される配列のみが得ら
れた。またアミノ酸分析の結果から得られた各画分の蛋
白質量は、各々、０．６４ｍｇ（Ｆｒ．Ｓ−ａ）１．８
１ｍｇ（Ｆｒ．Ｓ−ｂ）、３．４９ｍｇ（Ｆｒ．Ｓ−
ｃ）であった。各画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に
透析後、Ｍ−０７ｅアッセイを行った結果、相対活性約
１６２００００（Ｆｒ．Ｓ−ａ）、相対活性約２３５０
００００（Ｆｒ．Ｓ−ｂ）、相対活性約７４６００００
００（Ｆｒ．Ｓ−ｃ）のＴＰＯ活性を示した。 ＜実施例６１＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異
型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）の塩酸グアニジン
とシステイン−シスチンを用いたリフォールディング〜
精製 実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換
体凍結菌体５０ｇに水５００ｍｌを加えてけん濁し、高
圧破砕機（１００００ｐｓｉ、ＲａｎｎｉｅＨｉｇｈ
Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で菌体を破
砕した後、遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿画
分に水を加えて懸濁し、さらに撹拌しながら水を加えて
液量を２５０ｍｌにした後、１５ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩
衝液ｐＨ９．２、９００μｌの１ＭＤＴＴ、３ｍｌの
０．５ＭＥＤＴＡ、３０ｍｌの１０％デオキシコール酸
ナトリウムを攪拌しながら加え、室温にて３０分間攪拌
した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在
蛋白質、菌体成分等を除去した。沈殿に３００ｍｌの５
ｍＭＤＴＴを加えてけん濁した後、遠心分離によってｈ
６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分を回収した。回収さ
れたｈ６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分に水を加えて
けん濁し、最終１０４ｍｌとした。攪拌しながら２０ｍ
ｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加えた後、３７６
ｍｌの８Ｍ塩酸グアニジンを加えて室温にて１０分間攪
拌して可溶化した。これに撹拌しながら２５００ｍｌの
０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩
衝液ｐＨ８．５を加え、さらに１Ｍ塩酸グアニジンを含
む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を２０００ｍｌ加
えた後、５ｍＭシステインと０．５ｍＭシスチンを加え
て撹拌し溶かした。４℃中にて一晩静置した後、遠心分
離によって上清中にｈ６Ｔ（１−１６３）を回収した。
得られた上清をプレップスケールＵＦカートリッジＰＬ
ＤＣ限外濾過膜（ミリポア）を用いて濃縮し、０．１％
ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ
９．２にて緩衝液を置換して最終容量約１０００ｍＬと
した。これを０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍ
ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２で平衡化したＱ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換カラム
（内径５ｃｍ ｘ １０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で
塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度
勾配法によって溶出を行ない、塩化ナトリウム濃度２０
ｍＭから１５０ｍＭ付近までの塩濃度で溶出された画分
２４０ｍＬを回収した。得られた画分を２０ｍＭＴｒｉ
ｓ緩衝液ｐＨ７．２で４倍に希釈して９６０ｍＬとし、
酢酸を用いてｐＨを７．２に調整した。これを０．１％
ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ
７．２で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラム（内径５ｃｍ ｘ １
０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０
Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を
行なった。溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分
析を行い、ＴＰＯ溶出画分を集めた。ＴＰＯ溶出画分に
トリフルオロ酢酸を０．１％になる様に加え、カプセル
パック５μｍ３００ＡＣ１カラム（内径２．１ｃｍ ｘ
５ｃｍ ｘ ２本、資生堂）に添加した後、０．１％
トリフルオロ酢酸中で１−プロパノール濃度を上昇させ
る直線濃度勾配溶離法によって逆相ＨＰＬＣを行なっ
た。溶出液について還元剤非存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析した結果及び逆相ＨＰＬＣでの溶出位置によ
って２画分に分画した。得られたＴＰＯ溶出２画分を逆
相ＨＰＬＣの溶出順にＦｒ．Ｇ−ａ、Ｆｒ．Ｇ−ｄ（図
１７参照）として各々について還元剤非存在下でのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析した結果、各々、分子量１８Ｋダル
トン（Ｆｒ，Ｇ−ａ）、３２Ｋダルトン（Ｆｒ．Ｇ−
ｄ）付近に単一のバンドとして検出された（図１８参
照）。また、還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を
行った結果、どちらの画分も分子量２０Ｋダルトン付近
に単一のバンドとして検出された。各々についてアミノ
酸組成分析を行った結果、得られたアミノ酸組成はシー
クエンス情報からの理論値とほぼ一致し，またＮ末端ア
ミノ酸配列分析の結果、予想される配列のみが得られ
た。またアミノ酸分析の結果から得られた各画分の蛋白
質量は、各々、２．５６ｍｇ（Ｆｒ．Ｇ−ａ）、１．１
６ｍｇ（Ｆｒ．Ｇ−ｄ）であった。各画分をＩＭＤＭ培
養液に対して十分に透析後、Ｍ−０７ｅアッセイを行っ
た結果、相対活性約３９６００００（Ｆｒ．Ｇ−ａ）、
相対活性約７７６００００（Ｆｒ．Ｇ−ｄ）のＴＰＯ活
性を示した。 ＜実施例６２＞ 部分長ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）（以下、この
タンパク質を「ｈＴＰＯ１６３」と称す）のＣＨＯ細胞
用組換えベクター、ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３の
構築 実施例３１で得られたベクターｐＤＥＦ２０２を制限酵
素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理し、アガロースゲル電気
泳動で大きい方のベクターフラグメントを回収したの
ち、このフラグメントと−２１から１６３位のアミノ酸
までをコードするｈＴＰＯ１６３ｃＤＮＡ（配列表 配
列番号１３参照）を含むプラスミドｐＥＦ１８Ｓ−ｈＴ
ＰＯ１６３を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理して
得られたｈＴＰＯ１６３ｃＤＮＡ とをＴ ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターｐＤＥ
Ｆ２０２−ｈＴＰＯ １６３を得た。このプラスミドは
ＳＶ４０の複製開始領域、ヒトエロンゲーションファク
ター１−アルファプロモーター、ＳＶ４０初期ポリアデ
ニル部位、マウスＤＨＦＲミニ遺伝子、ｐＵＣ １８の
複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐｒ）を
含み、ヒトエロンゲーションファクター１−アルファプ
ロモーター下流にｈＴＰＯ１６３ｃＤＮＡが接続されて
いる。 ＜実施例６３＞ ＣＨＯ細胞によるｈＴＰＯ１６３の発現 ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉ
ｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；
７７巻４２１６頁、１９８０）を６ｃｍ径のプレート
（Ｆａｌｃｏｎ社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小
必須培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチ
ン添加）で培養増殖させ、これをトランスフェクタム法
（生化学工業社製）によって形質転換した。すなわち、
実施例６２で調製したｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ １６
３プラスミド１０μｇに０．３Ｍ ＮａＣｌ２４０μｌ
を加え混合したのち、トランスフェクタム２０μｌとＨ
２Ｏ２２０μｌとの混合液を加え、再度混合した。この
ＤＮＡ 溶液をプレートに滴下したのち、ＣＯ２インキ
ュベーター中で６時間培養した。プレートから培地を除
去し、α−ＭＥＭ（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチ
ルスルフォオキシド含有α−ＭＥＭ（−）を添加し、室
温で２分間処理した。次いで、１０％透析牛胎児血清含
有非選択培地（前出α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチ
ン、チミジン添加）を添加して２日間培養したのち、１
０％透析牛胎児血清含有選択培地（α−ＭＥＭ（−）、
ヒポキサンチン、チミジン無添加）での選択をおこなっ
た。選択は細胞をトリプシン処理した後、６ｃｍ径プレ
ート１枚あたりを、１０ｃｍ径プレート５枚あるいは２
４ウエルプレート２０枚に分割したのち、２日ごとに選
択培地にて培地交換を行いながら培養を続行する事によ
り実施した。細胞が増殖してきたプレートあるいはウエ
ルについてはその培養上清中のＴＰＯ活性をＢａ／Ｆ３
アッセイ法を用いて測定したところ、ＴＰＯ活性が認め
られた。培養上清中にＴＰＯ活性の認められたものにつ
いては新しいプレートあるいはウエルに２５ｎＭのメソ
トレキセートを含む選択培地で１：１５に細胞を分割
し、培養を続行することによりメソトレキセートに耐性
の細胞を増殖させてクローニングを行った。なお、ＣＨ
Ｏ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＥＦ１８Ｓ−ｈ
ＴＰＯ １６３とｐＭＧ１を同時形質転換（ｃｏ−ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することによっても行うことが
できる。プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３に
よって形質転換されたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ＤＵＫＸ
Ｂ１１）は１９９５年１月３１日付で通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４９８９として寄託されている。これはまた、１９９
５年３月２２日付で中華民国 食品工業発展研究所（Ｆ
ＩＲＤＩ）に受託番号９６００２４として寄託されてい
る。 ＜実施例６４＞ ＣＨＯ細胞の大量培養 実施例６３においてｈＴＰＯ１６３発現プラスミドｐＤ
ＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ細胞にトランスフ
ェクションして得られたｈＴＰＯ１６３産生ＣＨＯ細胞
株（ＣＨＯ１０９細胞、ＯｎＭ ＭＴＸ耐性）の大量培
養は以下のようにして実施した。細胞を１０％ＦＣＳを
含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣ０社）を用いて
培養増殖させた。この細胞をトリプシン溶液を用いて剥
離したのち、２００ｍｌの同培地を含むＦａｌｃｏｎ社
製ローラーボトル（Ｆａｌｃｏｎ３０００）に１０００
万個の細胞を接種し、３７℃で１ｒｐｍの回転速度で３
日間培養した。３日後、培養液を吸引除去し、１００ｍ
ｌのＰＢＳで細胞培養表面をリンスしたのち、１０％Ｆ
ＣＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ
社）を２００ｍｌ加え、３７℃、１ｒｐｍの回転速度で
７日間培養し、７日後その培養上清を回収し、次の精製
操作の出発材料にした。上記の操作をローラーボトル３
００本分実施し、無血清培養上清６０Ｌを得た。 ＜実施例６５＞ ｈＴＰＯ１６３産生ＣＨＯ細胞株からｈＴＰＯ１６３の
精製 （１）実施例６４より得られた無血清培養上清６０Ｌを
得て、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。
さらに限外濾過ユニット（フィルトロン社製・分子量１
００００カット）を用いて濃縮画分（６００ｍｌ、蛋白
質濃度１１．２ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量６４３０ｍｇ）
を得た。この画分を抗ＨＴ１ペプチド抗体を用いてウエ
スターン分析で調べたところ、見かけの分子量２０００
０〜２６０００の範囲に発現されたｈＴＰＯ１６３蛋白
質が存在することが明らかとなった。この濃縮培養上清
５７３ｍｌを流速約２０ｍｌ／ｍｉｎにて、１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化して
あったＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆｉｎｅカラム
（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号１７−
００３２−０２；直径１０ｃｍ、ベッド高３０ｃｍ）に
て処理することにより、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．８）溶液となった蛋白質画分Ｆ１（９３８
ｍｌ，蛋白質濃度４．９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量４５９
４ｍｇ）を得た。このＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆ
ｉｎｅカラム蛋白質画分９２９ｍｌを、予め１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）平衡化したＳＰ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシ
ア・バイオテク社製、カタログ番号１７−０７２９−０
１；直径５ｃｍ、ベッド高 １２ｃｍ）カラムに流速１
５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、さらに１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、次いで１０
％エタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．８）で溶出されたものまでをまとめ、画分Ｆ
１（１６０８ｍｌ，蛋白質濃度２．１３ｍｇ／ｍｌ，総
蛋白質量３４２６ｍｇ）を得た。次に、溶出液を１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中に７５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２５％エタノールを含む緩衝液にかえ、溶出さ
れたｈＴＰＯ１６３の主たる溶出画分Ｆ２（６５１ｍ
ｌ，蛋白質濃度１．６７ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１０８
７ｍｇ）を集めた。ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ ＦｌｏｗカラムのＴＰＯ活性画分Ｆ２のうち２００
ｍｌをとり、エタノール及び精製水を加え、最終エタノ
ール濃度４５％の溶液３００ｍｌを調製した。ここでエ
タノール添加の結果生じた不溶物を遠心分離により取り
除いた後、展開溶媒Ａ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．７））、展開溶媒Ｂ（９０％エタノールを含
む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７））を用
意し、予め５０％Ｂ液にて平衡化したＳＯＵＲＣＥ１５
ＲＰＣカラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタロ
グ番号１７−０７２７−０２；直径２ｃｍ、ベッド高２
０ｃｍ）に流速２ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入後、カ
ラム非吸着物質がほぼ溶出するまで４５％Ｂ液にて洗浄
した後、流速を１．５ｍｌ／ｍｉｎにし、まず５分間５
０％Ｂ、次いで５０％Ｂから１００％Ｂまで１４０分の
直線濃度勾配の後、１００％Ｂ液にて３５分間展開し
た。この間５分（７．５ｍｌ）ごとに集められた溶出画
分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスターン分析にかけ、ｈ
ＴＰＯ１６３の溶出範囲を調べたところ、エタノール濃
度６６％〜８７％の範囲に見かけの分子量約２００００
から２６０００の高度に精製されたｈＴＰＯ１６３が溶
出されていることが判明した。これらのｈＴＰＯ１６３
のうち分子量の高いものほどより早く逆相カラムから溶
出したことから、糖鎖がより多く結合したｈＴＰＯ１６
３分子ほど親水性が増していることが示唆された。ＳＯ
ＵＲＣＥ １５ＲＰＣカラムのｈＴＰＯ１６３溶出画分
（エタノール濃度６８％〜８６．５％の範囲に溶出した
ｈＴＰＯ１６３画分９０ｍｌ）のうち、８８．８ｍｌに
ＣＨＡＰＳを添加後、限外濾過法（アミコン社製、ＹＭ
−３膜付き限外濾過ユニット）により濃縮、洗浄を行
い、最終的に約５％エタノール、４ｍＭＣＨＡＰＳを含
む２．５ｍｌの濃縮標品とした。この標品を予め１０％
エタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ
カラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号
１７−１０７０−０１；直径２．６ｃｍ、ベッド高６０
ｃｍ）に流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入後６
０分後から、６ｍｌ（４分）ごとに溶出画分を集めたと
ころ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験管番号１６番以降の
画分にｈＴＰＯ１６３が溶出しはじめ、少なくとも３１
番目までの広い範囲にｈＴＰＯ１６３が溶出しているこ
とを確認した。これは、ゲルろ過の標準分子量マーカー
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
Ｓｔａｎｄａｒｄ；カタログ番号１５１−１９０１及び
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製インシュリン；カタログ番号
４０７６９６の混合物）に対して、分子量約４４０００
から６０００の範囲に相当する。しかもこれらのｈＴＰ
Ｏ１６３は糖がより多く付加された分子量の大きいもの
から順に溶出していると考えられた。試験管番号１６〜
３１（溶出体積１８０〜２７６ｍｌ）の溶出範囲にある
すべてのｈＴＰＯ１６３の分子種をまとめたものとして
画分ＦＡを調製した。画分ＦＡとは別に、試験管番号１
６〜１８（溶出体積１８０〜１９８ｍｌ）、試験管番号
１９〜２４（溶出体積１９８〜２３４ｍｌ）、試験管番
号２５〜３１（溶出体積２３４〜２７６ｍｌ）の各々の
一部をとり、それぞれ画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬとした。つ
まり画分ＦＡは、実質的に画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬを合わ
せたものとなる。以上、図１９に示す。 （２）次に（１）で述べたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ
カラムのｈＴＰＯ１６３溶出画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及
びＦＡについて詳細に述べる。このようにして得られた
ｈＴＰＯ１６３のＮ末端側のアミノ酸配列を実施例１に
述べた方法と同様にして調べたところ、Ｎ末端のセリン
の大部分は同定不能であったことより、Ｎ末端のセリン
にＯ結合型糖鎖が付加されていることが強く示唆され
た。また、Ｎ末端のセリンに続く配列は遺伝子配列から
期待されたアミノ酸配列であることが確認できた。アミ
ノ酸組成分析（ＡｃｃＱ．Ｔａｇ法、ウォターズ社）の
結果、ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡのｈＴＰＯ１６３蛋白
質（糖鎖を含まないペプチド部分）の濃度がそれぞれ１
０．２ｎｇ／ｍｌ、６．２ｎｇ／ｍｌ、０．８４ｎｇ／
ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌであった。これらの画分１００
ｎｇをマルチゲル１５／２５（第一化学薬品社製１５〜
２５％プレキャストポリアクリルアミドゲル）を用いて
非還元条件或いはＤＴＴにより還元後、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを実施し銀染色（第一化学薬品社製）したところ、そ
れぞれ極めて高純度なｈＴＰＯ１６３標品であることが
確認できた。還元条件下においてはＤＰＣＩＩＩ分子量
マーカー（第一化学薬品社製）を標準として算出された
ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡのｈＴＰＯ１６３の見かけの
分子量はそれぞれ２４０００〜２１５００、２３０００
〜２１０００、２３０００〜２０５００、２３５００〜
２０５００であった（図２０を参照）。またウエスター
ン分析により還元条件下においてはビオチン標識ＳＤＳ
−ＰＡＧＥスタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社製 Ｂｉ
ｏｔｙｎｙｌａｔｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓｔａｎｄ
ａｒｄｓ，Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ；カタログ番号１６
１−０３１９）を標準として算出されたＦＨ、ＦＭ、Ｆ
Ｌ及びＦＡのｈＴＰＯ１６３の見かけの分子量はそれぞ
れ２６０００〜２２０００、２５５００〜２２０００、
２６０００〜２１０００、２６０００〜２１０００であ
った。ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの分子量の不均一性
は、付加されたＯ結合型糖鎖の不均一性によることと推
定できる。そこでＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの各画分を
ノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ナカ
ライテスク社製、カタログ番号２４２−２９ ＳＰ）で
酵素消化し、ＤＴＴで還元後ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
たところ、いずれの画分も見かけの分子量が１９０００
付近となったことから、ｈＴＰＯ１６３蛋白質に付加さ
れた糖鎖のシアル酸の量の不均一性が確認されたのと同
時に、ここで得られたｈＴＰＯ１６３が糖蛋白質として
ＣＨＯ細胞で発現されたものであることが明らかとなっ
た。 （３）（２）で得られたＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの各
画分をＭ−０７ｅアッセイ系でｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を
調べたところ、相対比活性は１ｍｇｈＴＰＯ１６３蛋白
質（糖鎖重量を含まないペプチド部分の重量）当たり、
それぞれ５１１００００００、７７５００００００、１
１５０００００００、７１５００００００であった。 ＜実施例６６＞ −１位にＬｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたヒトＴＰ
Ｏ（アミノ酸１−３３２）（以下「ｈＭＫＴ（１−３３
２）」と称す）の大腸菌用発現ベクターの構築及び発現 ヒトＴＰＯ全長アミノ酸を大腸菌で発現させるためアミ
ノ酸１６４以降のアミノ酸３３２までの使用コドンを以
下に述べるように大腸菌優先コドンに変更した。表２０
に示した２１−４０の合成オリゴヌクレオチドを作成し
た。
れたＤＮＡ配列を含んでいる。さらに、実施例４３と同
様にして、ｈＭＫＴ（１−１６３）の発現を誘導した。
ここで得られた発現タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＰＶ
ＤＦ膜に転写し、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行った結
果、発現されるべきｈＭＫＴ（１−１６３）のアミノ酸
配列を含むことが確認できた。 ＜実施例５３＞大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列
をコードするクローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１
６３）由来変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）の
塩酸グアニジンとグルタチオンを用いたリフォールディ
ング〜精製〜生物学的活性の確認実施例４３で調製され
たｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体凍結菌体１．２ｇに
水３ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕し
た。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋
白質、菌体成分等を除去する。回収されたｈ６Ｔ（１−
１６３）を含む沈殿画分に水を加えてけん濁し、最終４
ｍｌとした。攪拌しながら１ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液
ｐＨ８．５を加えた後、２０ｍｌの８Ｍ塩酸グアニジン
を加えて室温にて５分間攪拌して可溶化した。これを２
０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈し、５ｍ
Ｍ還元型グルタチオンと０．５ｍＭの酸化型グルタチオ
ンを加えて攪拌し溶かした後、４℃中にて一晩静置し
た。遠心分離により、上清中にｈ６Ｔ（１−１６３）を
回収した。得られた上清のうち１６０ｍｌをＹＭ１０限
外濾過膜（アミコン社製）を用いて濃縮し、ＤＰＢＳに
て緩衝液を置換して最終容量３．４ｍｌとした（蛋白濃
度２．１８ｍｇ／ｍｌ）。この画分をＩＭＤＭ培養液に
対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で
評価した結果、強いＴＰＯの活性（相対活性５８００
０）を示した。上記の方法により調製したＴＰＯ活性画
分についてｉｎ ｖｉｖｏアッセイを行った。１群４匹
のＩＣＲ系雄性マウス（７週齢）に、活性画分１７０μ
ｌ（ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系での相対活性量２２
０００を含む）を１日１回、５日間連日皮下投与した。
対照として、１群６匹の同様のマウスにＤＰＢＳ１７０
μｌを同様のスケジュールで皮下投与した。採血は、投
与開始直前及び投与終了翌日、終了３日後に眼底より行
い、血球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ８００）を用い
て血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了翌
日において投与前と比較して平均で２．１５倍の血小板
の増加を認め、また投与終了３日後においてもその効果
は持続しており２．１３倍の高値を維持した。投与終了
翌日及び３日後のいずれの日においても、血小板数は、
それぞれの日の対照群のそれと比較して１．７３倍、
１．８０倍と高値を示し、両者の間に有意差（ｐ＜０．
００１，Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。こ
の結果から、大腸菌より生産され、上記の方法で調製し
たヒトＴＰＯが、生体内において血小板増加作用を有す
ることが明らかとなった。 ＜実施例５４＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異
型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）のＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウムと硫酸銅を用いたリフォールディ
ング〜精製〜生物学的活性の確認 実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換
体凍結菌体０．６ｇに水３ｍｌを加えてけん濁し、高圧
破砕機で菌体を破砕した後、遠心分離により沈殿画分を
回収した。沈殿画分に３．１ｍｌの水を加えて懸濁した
後、０．１９ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２、１
１．２５μｌの１Ｍ ＤＴＴ、３８μｌの０．５ＭＥＤ
ＴＡ、０．３８ｍｌの１０％デオキシコール酸ナトリウ
ムを攪拌しながら加え、室温にて４０分間攪拌した。遠
心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、
菌体成分等を除去した。沈殿に水４ｍｌを加えてけん濁
した後、遠心分離によってｈ６Ｔ（１−１６３）を含む
沈殿画分を回収した。得られた沈殿画分に水３．８ｍｌ
を加え懸濁した後、攪拌しながら０．２ｍｌの１ＭＴｒ
ｉｓ緩衝液ｐＨ８と１ｍｌの１０％Ｎ−ラウロイルサル
コシンナトリウムを加えて室温にて２０分間攪拌して可
溶化した。これに５μｌの１％硫酸銅を加え、室温にて
一晩（約２０時間）攪拌した。遠心分離によりｈ６Ｔ
（１−１６３）を含む上清画分を回収した後、上清５ｍ
ｌに５ｍｌの水、１０ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐ
Ｈ７．７加えた後、２．６ｇのＤｏｗｅｘ １−ｘ４，
２０−５０ｍｅｓｈ，ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｆｏｒｍ イ
オン交換樹脂を加え、９０分間撹拌した。グラスフィル
ターを用いてイオン交換樹脂非吸着画分を回収した後、
遠心分離によって上清を回収した。得られた上清を２０
ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７で平衡化したＳＰ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラ
ムに添加し、同緩衝液中でＮａＣｌ濃度０Ｍから５００
ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。溶
出画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラット
ＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した結果、ＳＰ Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅＦａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換クロマト
グラフィーのＮａＣｌ濃度約１００ｍＭ付近で溶出され
た画分に強いＴＰＯの活性（相対活性約１９０００００
０）を示した。この画分をウルトラフリーＣＬ分画分子
量５０００限外濾過ユニット（ミリポア社製、型番ＵＦ
Ｃ４ＬＣＣ２５）を用いて１．６倍濃縮した（２．５ｍ
ｌ、蛋白濃度２５μｇ／ｍｌ）。同画分を還元剤存在下
でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、ＴＰＯのバンドが
主バンドとして検出された（純度７０−８０％）。上記
の方法により調製したＴＰＯ活性画分についてｉｎ ｖ
ｉｖｏアッセイを行った。１群４匹のＩＣＲ系雄性マウ
ス（８週齢）に、活性画分１００μｌ（ラットＣＦＵ−
ＭＫアッセイ系での相対活性量４７５００を含む）を１
日１回、５日間連日皮下投与した。対照として、１００
ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７
１００μｌを同様のスケジュールで皮下投与した。採血
は、投与開始直前及び投与終了翌日に眼底より行い、血
球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ８００）を用いて血小
板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了後におい
て投与前と比較して平均で１．７３倍の血小板の増加を
認め、対照群の血小板数と比較しても１．５９倍の高値
を示し、両者の間に有意差（ｐ＜０．０１，Ｓｔｕｄｅ
ｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。この結果から、大腸菌
より生産され、上記の方法で調製したヒトＴＰＯが、生
体内において血小板増加作用を有することが明らかとな
った。 ＜実施例５５＞ ＣＨＯ細胞の大量培養 実施例３２においてヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥＦ
２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１をＣＨＯ細胞にトランスフェク
ションして得られたヒトＴＰＯ 産生ＣＨＯ細胞株（Ｃ
ＨＯ２８−３０細胞、２５ｎＭ ＭＴＸ耐性）の大量培
養は以下のようにして実施した。細胞を２５ｎＭ ＭＴ
Ｘおよび１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地
（ＧＩＢＣＯ社）を用いて培養増殖させた。この細胞を
トリプシン溶液を用いて剥離したのち、２００ｍｌの同
培地を含むＦａｌｃｏｎ社製ローラーボトル（Ｆａｌｃ
ｏｎ３０００）に１×１０７個の細胞を接種し、３７℃
で１ｒｐｍの回転速度で３日間培養した。３日後、培養
液を吸引除去し、１００ｍｌのＰＢＳで細胞培養表面を
リンスしたのち、２５ｎＭ ＭＴＸおよび１０％ＦＣＳ
を含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ社）を
２００ｍｌ加え、３７℃、１ｒｐｍの回転速度で７日間
培養し、７日後その培養上清を回収し、次の精製操作の
出発材料にした。上記の操作をローラーボトル５００本
分実施し、培養上清１００Ｌを得た。 ＜実施例５６＞ ヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株からヒトＴＰＯの精製 （１）実施例５５より無血清培養上清約１００Ｌを得
て、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。こ
れを限外濾過ユニット（ミリポア社製・ＰＬＴＫペリコ
ンカセット 分子量３００００カット）で濃縮かつ溶媒
を精製水に置換し、蛋白質分解酵素阻害剤であるｐ−Ａ
ＰＭＳＦ（和光純薬社製）を最終濃度１ｍＭ及びＰｅｆ
ａｂｌｏｃ ＳＣ （Ｍｅｒｋ社製）を最終濃度０．３
５ｍＭ加え、体積３６２８ｍｌ（蛋白質濃度１．６０ｍ
ｇ／ｍｌ、総蛋白質量５８０５ｍｇ、相対活性１２３０
０００、相対活性量７１４９００００００）の分子量３
００００以上の画分を得た。この画分を実施例４５で述
べたウエスターン分析で調べたところ、分子量６６００
０〜１０００００の範囲にＴＰＯ蛋白質が存在すること
が明らかとなった。さらによく調べてみると、これとは
別に、より低分子のＴＰＯをも含まれていることが判明
した。分子量３００００以下の限外濾液はこれとは別に
限外濾過ユニット（ミリポア社製・ＰＬＧＣペリコンカ
セット 分子量１００００カット）で濃縮したところ、
体積１９０１ｍｌ（蛋白質濃度０．３６ｍｇ／ｍｌ、総
蛋白質量６８４ｍｇ、相対活性２４５５００、相対活性
量１６７９０００００）であったため、低分子化したＴ
ＰＯ分子が培養工程において生じたことが確認された。
次に、分子量３００００以上の画分３６１４ｍｌに７６
４ｇの硫酸アンモニウム、及び１４４．５ｍｌの０．５
Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、最
終濃度１．４１Ｍ硫酸アンモニウム、１７．７ｍＭのク
エン酸ナトリウム緩衝液を含む４０８９ｍｌの溶液と
し、生じた不溶物を遠心分離後可溶物を得た。これを
１．２Ｍ 硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭクエン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で予め平衡化してあった
Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＭｅｔｈｙｌＨＩＣ カラム
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社製、カタログ番号１５６−００８
０；直径５ｃｍ、ベッド高 ２４．５ｃｍ）に、流速約
２５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、１．２Ｍ硫
酸アンモニウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５．５）で溶出されたものを限外濾過ユニット
（フィルトロン社製・オメガウルトラセット 分子量８
０００カット）で濃縮し、素通り画分Ｆ１（４４５５ｍ
ｌ，蛋白質濃度０．４００ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１７
８０ｍｇ，相対活性１８３１０００）を得た。次に、溶
出液を２０ｍＭ Ｎａ Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ６．０に
かえ、溶出されたものを限外濾過ユニット（フィルトロ
ン社製・オメガウルトラセット 分子量８０００カッ
ト）で濃縮し、画分Ｆ２ （１４５７ｍｌ，蛋白質濃度
０．９６９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１４１１ｍｇ， 相
対活性１７１５０００）を集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より、このＦ２には分子量６６０００〜１０００００の
蛋白質が存在することが確認された。さらにウエスター
ン分析により、この蛋白質がＴＰＯであることが明らか
となった。次に、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ
ＨＩＣ カラム Ｆ２（１４４３ｍｌ）を、２０ｍＭ
クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化
したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
（ファルマシア バイオテク社製、カタログ番号１７−
０７２９−０１；直径 ５ｃｍ、ベッド高 １２ｃｍ）
カラムに注入し、流速１５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添
加終了後、さらに５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭク
エン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出されたも
のまでをまとめ、画分Ｆ１（３００７ｍｌ，蛋白質濃度
０．２２６ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量６７９ｍｇ，相対活
性８８８３０）を得た。次に、溶出液を７５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．４）にかえ、溶出された画分Ｆ２（９３１ｍｌ，蛋
白質濃度０．７６３ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量７１０ｍ
ｇ，相対活性５５５８０００）を集めた。これを限外濾
過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット
分子量８０００カット、及びアミコン社製ＹＭ３膜）
で２０２ｍｌまで濃縮した。次に、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗカラムのＴＰＯ活性画分Ｆ
２の濃縮液（１９７ｍｌ）をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−
２００ＨＲ カラム（ファルマシア・バイオテク社製、
カタログ番号１７−０５８４−０５；直径７．５ｃｍ、
ベッド高 １００ｃｍ）に注入し、流速３ｍｌ／ｍｉｎ
でゲル濾過を行った。溶離液体積１２００〜１７８５ｍ
ｌ、１７８５〜２０１０ｍｌ、２０１０〜２２８０ｍ
ｌ、２２８０〜３０００ｍｌの各範囲をまとめ、それぞ
れ画分Ｆ１（５８５ｍｌ，蛋白質濃度１．００ｍｇ／ｍ
ｌ，総蛋白質量５８９ｍｇ，相対活性４１１８００
０）、画分Ｆ２（２２５ｍｌ，蛋白質濃度０．２６３／
ｍｌ，総蛋白質量５９．２ｍｇ，相対活性２５０９００
０）、画分Ｆ３（２７０ｍｌ，蛋白質濃度０．１１９／
ｍｌ，総蛋白質量３２．１ｍｇ，相対活性２５３５００
０）、画分Ｆ４（７２０ｍｌ，蛋白質濃度０．０４６７
／ｍｌ，総蛋白質量３３．６ｍｇ，相対活性１１５５０
００）を得た。このように、分画されたＴＰＯ活性はゲ
ル濾過法での分子量範囲が広いことが判明したため、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスターン分析を実施したとこ
ろ、Ｆ１ではほとんどが分子量６６０００〜１００００
０のＴＰＯであったのに対し、Ｆ２、Ｆ３ではそれぞれ
分子量３２０００〜６００００、分子量３２０００〜４
２０００のＴＰＯ分子種が存在していた。いずれの分子
量のＴＰＯ分子も全てＴＰＯ活性をもっていた。なお、
分子量６６０００〜１０００００のＴＰＯ分子について
Ｎ末端アミノ酸配列分析を実施したところ、ヒトＴＰＯ
遺伝子でコードされるタンパク質のアミノ酸配列を含む
ことが確認できた。また、分子量６６０００〜１０００
００のＴＰＯ分子について、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇ
ｌｙｃａｎａｓｅ：Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、カタログ番号
１４７２−００）、ノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｎ
ｉｄａｓｅ：ナカライテスク社製、カタログ番号２４２
−２９ ＳＰ）、エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサ
ミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−α−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａ
ｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ：生化学工業製、カタログ
番号１００４５３）、およびＯ−グリコシダーゼ（０−
Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製、カタログ番
号１３４７１０１）の糖鎖切断酵素を単独あるいは組み
合わせて酵素消化実験を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥ調べたと
ころ、ＴＰＯのポリペプチド部分は理論値から推定され
る分子量約３６０００であり、Ｎ結合型糖鎖とＯ結合型
糖鎖の両方を持つ糖タンパク質であることが判明した。 ＜実施例５７＞ ヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株からヒトＴＰＯの精製 （１）実施例５５と同様にして得られたＣＨＯ細胞無血
清培養上清１Ｌに２１１．４ｇの硫酸アンモニウムを加
え、０．２μｍフィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ社製、カタログ番号１２９９２）で濾過し、予め
１．２Ｍ硫酸アンモニウム，２０ｍＭ 酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．６）で平衡化しておいたＭａｃｒｏ−
Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ社製，カタログ番号 １５６−００８１，直径５０ｍ
ｍ、ベッド高９０ｍｍ）に流速１５ｍｌ／ｍｉｎで添加
した。添加終了後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．６）４５０ｍｌで溶出した。この溶出液をＶｙｄ
ａｃ 逆相 Ｃ４ カラム（Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉ
ｏｎｓ ＧｒｏｕＰ社製、カタログ番号２１４ＢＴＰ５
４，直径４．６ｍｍ，ベッド高２５０ｍｍ）に流速０．
７５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、１５分間５
％エタノールを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．
４）（展開溶媒Ａ）で洗浄後、展開溶媒Ａから１０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ６．４）を含む９４％エタノール
（展開溶媒Ｂ）まで６６分間の直線グラジエントで溶出
した。このクロマトグラムを図１５に示した。ＴＰＯと
思われる分子量約６５０００−１０００００の分子は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、サンプル添加後の
保持時間６８−７２分付近の画分に得ることができ、単
一なバンドであることが確認できた（図１６参照）。さ
らにウエスターン分析により、このタンパク質がＴＰＯ
であることを確認した。このサンプルの一部を取り、Ｎ
末端アミノ酸分析を行った結果、ヒトＴＰＯ遺伝子でコ
ードされるタンパク質のアミノ酸配列を含むことが確認
できた。 ＜実施例５８＞ ヒトＴＰＯの昆虫細胞での発現用組換えウイルスの作製 実施例３０で作製したｐＨＴＰ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ
並びにＮｏｔＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約１２００ｂｐのバンドをプレップ−Ａ−ジーン
ＤＮＡ 精製キットを用いて精製した後、同様に制限酵
素処理したトランスファーベクターｐＶＬ１３９３（イ
ンビトローゲン社製）に連結しコンピテントハイＥ．ｃ
ｏｌｉ ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。得ら
れたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、ヒトＴＰ
ＯｃＤＮＡのコーディング領域を全て含むクローンｐＶ
Ｌ１３９３／ｈＴＰＯを得た。このクローンのプラスミ
ドＤＮＡをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記
載されているようにして調製し、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ
ＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファーミン
ゲン社製）を用いて昆虫細胞Ｓｆ２１（インビトローゲ
ン社製）にトランスフェクション後、Ｓｆ−９００培地
（ライフテクノロジー社製）中で２７℃で４日間培養
し、そのウイルスを含んだ上清を回収した。この上清を
１０９〜１０５倍に希釈してその１ｍｌを用いて、３５
ｍｍ径のシャーレ中で約７×１０５個のＳｆ２１細胞に
２７℃で１時間感染させた。上清を抜きとりＳｆ−９０
０培地を含む１％アガロースを流し込みアガロースが固
まった後、加湿下で２７℃で６日間培養した。ここで形
成されたシングルプラークをピックアップし、２００μ
ｌのＳｆ−９００培地中でウイルスを溶出させた。この
ウイルスクローンを２４ウエルプレート中でＳｆ２１細
胞に感染させウイルスの増幅を行った。得られたシング
ルプラーク由来のウイルス液の一部をフェノール／クロ
ロホルム処理後、エタノール沈殿してウイルスＤＮＡを
回収した。このウイルスＤＮＡを鋳型としてヒトＴＰＯ
ｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、
特異的なＤＮＡ断片が増幅されるか否かにより、ヒトＴ
ＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを選択した。ここ
で得られたヒトＴＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルス
を含む上清を用いてＳｆ２１細胞に感染させ、さらにウ
イルスの増幅を行った。 ＜実施例５９＞ Ｓｆ２１昆虫細胞でのヒトＴＰＯの発現と活性確認 １７５ｃｍ２の培養フラスコ中に、Ｓｆ２１細胞を約８
０％コンフルエントになるまで培養し、実施例５８で作
製したヒトＴＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを２
７℃で１時間感染させた後、Ｓｆ−９００培地中で２７
℃で４日間培養し、その上清を回収した。得られた培養
上清をＮＡＰＴＭ−５カラム（ファルマシア社製）を用
いてＩＭＤＭ培養液に置換し、これをラットＣＦＵ−Ｍ
Ｋアッセイ系及びＭ−０７ｅアッセイ系にかけたとこ
ろ、用量依存的に有意なＴＰＯ活性及びＭ−０７ｅ細胞
増殖促進活性が認められた。また、実施例４５に記載し
たのと同様のウエスタン分析により、Ｓｆ２１細胞で発
現した組み換えヒトＴＰＯが確認された。 ＜実施例６０＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異
型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）のＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウムと硫酸銅を用いたリフォールディ
ング法とリフォールディング〜精製 実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換
体凍結菌体３０ｇに水３００ｍｌを加えてけん濁し、高
圧破砕機（１００００ｐｓｉ、ＲａｎｎｉｅＨｉｇｈ
Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で菌体を破
砕した後、遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿画
分に９０ｍｌの水を加えて懸濁し、さらに撹拌しながら
水を加えて液量を１５０ｍｌにした後、９ｍｌの１ＭＴ
ｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２、５４０μｌの１ＭＤＴＴ、
１．８ｍｌの０．５ＭＥＤＴＡ、１８ｍｌの１０％デオ
キシコール酸ナトリウムを攪拌しながら加え、室温にて
３０分間攪拌した。遠心分離により沈殿画分を回収し、
大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。沈殿に１
８０ｍｌの５ｍＭＤＴＴを加えてけん濁した後、遠心分
離によってｈ６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分を回収
した。得られた沈殿画分に水３００ｍｌを加え懸濁し、
さらに撹拌しながら水を加えて液量を５７０ｍｌにした
後、攪拌しながら３０ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８
と１５０ｍｌの１０％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリ
ウムを加えて室温にて２０分間攪拌して可溶化した。こ
れに７５０μｌの１％硫酸銅を加え、室温にて一晩（約
２０時間）撹拌した。遠心分離によりｈ６Ｔ（１−１６
３）を含む上清画分を回収した後、上清７５０ｍｌに７
５０ｍｌの水、１５００ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液
ｐＨ７．７加えた後、撹拌しながら３ｍｌのポリソルベ
ート８０（日光ケミカルズ）を加えた。同溶液に６００
ｇのＤｏｗｅｘ １−ｘ４，２０−５０ｍｅｓｈ，ｃｈ
ｌｏｒｉｄｅｆｏｒｍ イオン交換樹脂を加え、室温に
て９０分間撹拌した。グラスフィルターを用いてイオン
交換樹脂非吸着画分を回収した後、７５０ｍｌの２０ｍ
ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７でイオン交換樹脂を洗浄し
た。イオン交換樹脂非吸着画分と洗浄液を合わせた溶液
に２Ｎ水酸化ナトリウム加えてｐＨを９．２に調整し、
０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩
衝液ｐＨ９．２で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換カラム（内径５ｃｍ
ｘ １０ｃｍ）に添加し、非吸着画分を回収した。塩酸
を用いて得られた非吸着画分のｐＨを７．２に調整し、
０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩
衝液ｐＨ７．２で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラム（内径５ｃｍ
ｘ １０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウ
ム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によっ
て溶出を行なった。溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって分析を行い、ＴＰＯ溶出画分を集めた。ＴＰ０溶
出画分にトリフルオロ酢酸を０．１％になる様に加え、
カプセルパック５μｍ３００Ａ Ｃ１カラム（内径２．
１ｃｍ ｘ ５ｃｍ ｘ ２本、資生堂）に添加した
後、０．１％トリフルオロ酢酸中で１−プロパノール濃
度を上昇させる直線濃度勾配溶離法によって逆相ＨＰＬ
Ｃを行なった。溶出液について還元剤非存在下でのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分析した結果及び逆相ＨＰＬＣでの
溶出位置によって、３画分に分画し、各々について０．
１％トリフルオロ酢酸を用いて３倍希釈した後、上記の
逆相ＨＰＬＣカラムに添加し、同様の方法で再クロマト
グラフィーを行なった。得られたＴＰＯ３画分を逆相Ｈ
ＰＬＣの溶出順にＦｒ．Ｓ−ａ、Ｆｒ．Ｓ−ｂ、Ｆｒ．
Ｓ−ｃ（図１７参照）として還元剤非存在下でのＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分析した結果、各々、分子量１８Ｋダルト
ン（Ｆｒ．Ｓ−ａ）、１９Ｋダルトン（Ｆｒ．Ｓ−
ｂ）、１８Ｋダルトン（Ｆｒ．ｓ−ｃ）付近に単一のバ
ンドとして検出された（図１８参照）。各々についてア
ミノ酸組成分析を行った結果、得られたアミノ酸組成は
シークエンス情報からの理論値とほぼ一致し，またＮ末
端アミノ酸配列分析の結果、予想される配列のみが得ら
れた。またアミノ酸分析の結果から得られた各画分の蛋
白質量は、各々、０．６４ｍｇ（Ｆｒ．Ｓ−ａ）１．８
１ｍｇ（Ｆｒ．Ｓ−ｂ）、３．４９ｍｇ（Ｆｒ．Ｓ−
ｃ）であった。各画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に
透析後、Ｍ−０７ｅアッセイを行った結果、相対活性約
１６２００００（Ｆｒ．Ｓ−ａ）、相対活性約２３５０
００００（Ｆｒ．Ｓ−ｂ）、相対活性約７４６００００
００（Ｆｒ．Ｓ−ｃ）のＴＰＯ活性を示した。 ＜実施例６１＞ 大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするク
ローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異
型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）の塩酸グアニジン
とシステイン−シスチンを用いたリフォールディング〜
精製 実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換
体凍結菌体５０ｇに水５００ｍｌを加えてけん濁し、高
圧破砕機（１００００ｐｓｉ、ＲａｎｎｉｅＨｉｇｈ
Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で菌体を破
砕した後、遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿画
分に水を加えて懸濁し、さらに撹拌しながら水を加えて
液量を２５０ｍｌにした後、１５ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩
衝液ｐＨ９．２、９００μｌの１ＭＤＴＴ、３ｍｌの
０．５ＭＥＤＴＡ、３０ｍｌの１０％デオキシコール酸
ナトリウムを攪拌しながら加え、室温にて３０分間攪拌
した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在
蛋白質、菌体成分等を除去した。沈殿に３００ｍｌの５
ｍＭＤＴＴを加えてけん濁した後、遠心分離によってｈ
６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分を回収した。回収さ
れたｈ６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分に水を加えて
けん濁し、最終１０４ｍｌとした。攪拌しながら２０ｍ
ｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加えた後、３７６
ｍｌの８Ｍ塩酸グアニジンを加えて室温にて１０分間攪
拌して可溶化した。これに撹拌しながら２５００ｍｌの
０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩
衝液ｐＨ８．５を加え、さらに１Ｍ塩酸グアニジンを含
む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を２０００ｍｌ加
えた後、５ｍＭシステインと０．５ｍＭシスチンを加え
て撹拌し溶かした。４℃中にて一晩静置した後、遠心分
離によって上清中にｈ６Ｔ（１−１６３）を回収した。
得られた上清をプレップスケールＵＦカートリッジＰＬ
ＤＣ限外濾過膜（ミリポア）を用いて濃縮し、０．１％
ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ
９．２にて緩衝液を置換して最終容量約１０００ｍＬと
した。これを０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍ
ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２で平衡化したＱ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換カラム
（内径５ｃｍ ｘ １０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で
塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度
勾配法によって溶出を行ない、塩化ナトリウム濃度２０
ｍＭから１５０ｍＭ付近までの塩濃度で溶出された画分
２４０ｍＬを回収した。得られた画分を２０ｍＭＴｒｉ
ｓ緩衝液ｐＨ７．２で４倍に希釈して９６０ｍＬとし、
酢酸を用いてｐＨを７．２に調整した。これを０．１％
ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ
７．２で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラム（内径５ｃｍ ｘ １
０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０
Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を
行なった。溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分
析を行い、ＴＰＯ溶出画分を集めた。ＴＰＯ溶出画分に
トリフルオロ酢酸を０．１％になる様に加え、カプセル
パック５μｍ３００ＡＣ１カラム（内径２．１ｃｍ ｘ
５ｃｍ ｘ ２本、資生堂）に添加した後、０．１％
トリフルオロ酢酸中で１−プロパノール濃度を上昇させ
る直線濃度勾配溶離法によって逆相ＨＰＬＣを行なっ
た。溶出液について還元剤非存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析した結果及び逆相ＨＰＬＣでの溶出位置によ
って２画分に分画した。得られたＴＰＯ溶出２画分を逆
相ＨＰＬＣの溶出順にＦｒ．Ｇ−ａ、Ｆｒ．Ｇ−ｄ（図
１７参照）として各々について還元剤非存在下でのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析した結果、各々、分子量１８Ｋダル
トン（Ｆｒ，Ｇ−ａ）、３２Ｋダルトン（Ｆｒ．Ｇ−
ｄ）付近に単一のバンドとして検出された（図１８参
照）。また、還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を
行った結果、どちらの画分も分子量２０Ｋダルトン付近
に単一のバンドとして検出された。各々についてアミノ
酸組成分析を行った結果、得られたアミノ酸組成はシー
クエンス情報からの理論値とほぼ一致し，またＮ末端ア
ミノ酸配列分析の結果、予想される配列のみが得られ
た。またアミノ酸分析の結果から得られた各画分の蛋白
質量は、各々、２．５６ｍｇ（Ｆｒ．Ｇ−ａ）、１．１
６ｍｇ（Ｆｒ．Ｇ−ｄ）であった。各画分をＩＭＤＭ培
養液に対して十分に透析後、Ｍ−０７ｅアッセイを行っ
た結果、相対活性約３９６００００（Ｆｒ．Ｇ−ａ）、
相対活性約７７６００００（Ｆｒ．Ｇ−ｄ）のＴＰＯ活
性を示した。 ＜実施例６２＞ 部分長ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）（以下、この
タンパク質を「ｈＴＰＯ１６３」と称す）のＣＨＯ細胞
用組換えベクター、ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３の
構築 実施例３１で得られたベクターｐＤＥＦ２０２を制限酵
素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理し、アガロースゲル電気
泳動で大きい方のベクターフラグメントを回収したの
ち、このフラグメントと−２１から１６３位のアミノ酸
までをコードするｈＴＰＯ１６３ｃＤＮＡ（配列表 配
列番号１３参照）を含むプラスミドｐＥＦ１８Ｓ−ｈＴ
ＰＯ１６３を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理して
得られたｈＴＰＯ１６３ｃＤＮＡ とをＴ ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターｐＤＥ
Ｆ２０２−ｈＴＰＯ １６３を得た。このプラスミドは
ＳＶ４０の複製開始領域、ヒトエロンゲーションファク
ター１−アルファプロモーター、ＳＶ４０初期ポリアデ
ニル部位、マウスＤＨＦＲミニ遺伝子、ｐＵＣ １８の
複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐｒ）を
含み、ヒトエロンゲーションファクター１−アルファプ
ロモーター下流にｈＴＰＯ１６３ｃＤＮＡが接続されて
いる。 ＜実施例６３＞ ＣＨＯ細胞によるｈＴＰＯ１６３の発現 ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉ
ｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；
７７巻４２１６頁、１９８０）を６ｃｍ径のプレート
（Ｆａｌｃｏｎ社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小
必須培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチ
ン添加）で培養増殖させ、これをトランスフェクタム法
（生化学工業社製）によって形質転換した。すなわち、
実施例６２で調製したｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ １６
３プラスミド１０μｇに０．３Ｍ ＮａＣｌ２４０μｌ
を加え混合したのち、トランスフェクタム２０μｌとＨ
２Ｏ２２０μｌとの混合液を加え、再度混合した。この
ＤＮＡ 溶液をプレートに滴下したのち、ＣＯ２インキ
ュベーター中で６時間培養した。プレートから培地を除
去し、α−ＭＥＭ（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチ
ルスルフォオキシド含有α−ＭＥＭ（−）を添加し、室
温で２分間処理した。次いで、１０％透析牛胎児血清含
有非選択培地（前出α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチ
ン、チミジン添加）を添加して２日間培養したのち、１
０％透析牛胎児血清含有選択培地（α−ＭＥＭ（−）、
ヒポキサンチン、チミジン無添加）での選択をおこなっ
た。選択は細胞をトリプシン処理した後、６ｃｍ径プレ
ート１枚あたりを、１０ｃｍ径プレート５枚あるいは２
４ウエルプレート２０枚に分割したのち、２日ごとに選
択培地にて培地交換を行いながら培養を続行する事によ
り実施した。細胞が増殖してきたプレートあるいはウエ
ルについてはその培養上清中のＴＰＯ活性をＢａ／Ｆ３
アッセイ法を用いて測定したところ、ＴＰＯ活性が認め
られた。培養上清中にＴＰＯ活性の認められたものにつ
いては新しいプレートあるいはウエルに２５ｎＭのメソ
トレキセートを含む選択培地で１：１５に細胞を分割
し、培養を続行することによりメソトレキセートに耐性
の細胞を増殖させてクローニングを行った。なお、ＣＨ
Ｏ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＥＦ１８Ｓ−ｈ
ＴＰＯ １６３とｐＭＧ１を同時形質転換（ｃｏ−ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することによっても行うことが
できる。プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３に
よって形質転換されたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ＤＵＫＸ
Ｂ１１）は１９９５年１月３１日付で通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４９８９として寄託されている。これはまた、１９９
５年３月２２日付で中華民国 食品工業発展研究所（Ｆ
ＩＲＤＩ）に受託番号９６００２４として寄託されてい
る。 ＜実施例６４＞ ＣＨＯ細胞の大量培養 実施例６３においてｈＴＰＯ１６３発現プラスミドｐＤ
ＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ細胞にトランスフ
ェクションして得られたｈＴＰＯ１６３産生ＣＨＯ細胞
株（ＣＨＯ１０９細胞、ＯｎＭ ＭＴＸ耐性）の大量培
養は以下のようにして実施した。細胞を１０％ＦＣＳを
含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣ０社）を用いて
培養増殖させた。この細胞をトリプシン溶液を用いて剥
離したのち、２００ｍｌの同培地を含むＦａｌｃｏｎ社
製ローラーボトル（Ｆａｌｃｏｎ３０００）に１０００
万個の細胞を接種し、３７℃で１ｒｐｍの回転速度で３
日間培養した。３日後、培養液を吸引除去し、１００ｍ
ｌのＰＢＳで細胞培養表面をリンスしたのち、１０％Ｆ
ＣＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ
社）を２００ｍｌ加え、３７℃、１ｒｐｍの回転速度で
７日間培養し、７日後その培養上清を回収し、次の精製
操作の出発材料にした。上記の操作をローラーボトル３
００本分実施し、無血清培養上清６０Ｌを得た。 ＜実施例６５＞ ｈＴＰＯ１６３産生ＣＨＯ細胞株からｈＴＰＯ１６３の
精製 （１）実施例６４より得られた無血清培養上清６０Ｌを
得て、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。
さらに限外濾過ユニット（フィルトロン社製・分子量１
００００カット）を用いて濃縮画分（６００ｍｌ、蛋白
質濃度１１．２ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量６４３０ｍｇ）
を得た。この画分を抗ＨＴ１ペプチド抗体を用いてウエ
スターン分析で調べたところ、見かけの分子量２０００
０〜２６０００の範囲に発現されたｈＴＰＯ１６３蛋白
質が存在することが明らかとなった。この濃縮培養上清
５７３ｍｌを流速約２０ｍｌ／ｍｉｎにて、１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化して
あったＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆｉｎｅカラム
（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号１７−
００３２−０２；直径１０ｃｍ、ベッド高３０ｃｍ）に
て処理することにより、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．８）溶液となった蛋白質画分Ｆ１（９３８
ｍｌ，蛋白質濃度４．９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量４５９
４ｍｇ）を得た。このＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆ
ｉｎｅカラム蛋白質画分９２９ｍｌを、予め１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）平衡化したＳＰ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシ
ア・バイオテク社製、カタログ番号１７−０７２９−０
１；直径５ｃｍ、ベッド高 １２ｃｍ）カラムに流速１
５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、さらに１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、次いで１０
％エタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．８）で溶出されたものまでをまとめ、画分Ｆ
１（１６０８ｍｌ，蛋白質濃度２．１３ｍｇ／ｍｌ，総
蛋白質量３４２６ｍｇ）を得た。次に、溶出液を１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中に７５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２５％エタノールを含む緩衝液にかえ、溶出さ
れたｈＴＰＯ１６３の主たる溶出画分Ｆ２（６５１ｍ
ｌ，蛋白質濃度１．６７ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１０８
７ｍｇ）を集めた。ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ ＦｌｏｗカラムのＴＰＯ活性画分Ｆ２のうち２００
ｍｌをとり、エタノール及び精製水を加え、最終エタノ
ール濃度４５％の溶液３００ｍｌを調製した。ここでエ
タノール添加の結果生じた不溶物を遠心分離により取り
除いた後、展開溶媒Ａ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．７））、展開溶媒Ｂ（９０％エタノールを含
む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７））を用
意し、予め５０％Ｂ液にて平衡化したＳＯＵＲＣＥ１５
ＲＰＣカラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタロ
グ番号１７−０７２７−０２；直径２ｃｍ、ベッド高２
０ｃｍ）に流速２ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入後、カ
ラム非吸着物質がほぼ溶出するまで４５％Ｂ液にて洗浄
した後、流速を１．５ｍｌ／ｍｉｎにし、まず５分間５
０％Ｂ、次いで５０％Ｂから１００％Ｂまで１４０分の
直線濃度勾配の後、１００％Ｂ液にて３５分間展開し
た。この間５分（７．５ｍｌ）ごとに集められた溶出画
分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスターン分析にかけ、ｈ
ＴＰＯ１６３の溶出範囲を調べたところ、エタノール濃
度６６％〜８７％の範囲に見かけの分子量約２００００
から２６０００の高度に精製されたｈＴＰＯ１６３が溶
出されていることが判明した。これらのｈＴＰＯ１６３
のうち分子量の高いものほどより早く逆相カラムから溶
出したことから、糖鎖がより多く結合したｈＴＰＯ１６
３分子ほど親水性が増していることが示唆された。ＳＯ
ＵＲＣＥ １５ＲＰＣカラムのｈＴＰＯ１６３溶出画分
（エタノール濃度６８％〜８６．５％の範囲に溶出した
ｈＴＰＯ１６３画分９０ｍｌ）のうち、８８．８ｍｌに
ＣＨＡＰＳを添加後、限外濾過法（アミコン社製、ＹＭ
−３膜付き限外濾過ユニット）により濃縮、洗浄を行
い、最終的に約５％エタノール、４ｍＭＣＨＡＰＳを含
む２．５ｍｌの濃縮標品とした。この標品を予め１０％
エタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ
カラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号
１７−１０７０−０１；直径２．６ｃｍ、ベッド高６０
ｃｍ）に流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入後６
０分後から、６ｍｌ（４分）ごとに溶出画分を集めたと
ころ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験管番号１６番以降の
画分にｈＴＰＯ１６３が溶出しはじめ、少なくとも３１
番目までの広い範囲にｈＴＰＯ１６３が溶出しているこ
とを確認した。これは、ゲルろ過の標準分子量マーカー
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
Ｓｔａｎｄａｒｄ；カタログ番号１５１−１９０１及び
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製インシュリン；カタログ番号
４０７６９６の混合物）に対して、分子量約４４０００
から６０００の範囲に相当する。しかもこれらのｈＴＰ
Ｏ１６３は糖がより多く付加された分子量の大きいもの
から順に溶出していると考えられた。試験管番号１６〜
３１（溶出体積１８０〜２７６ｍｌ）の溶出範囲にある
すべてのｈＴＰＯ１６３の分子種をまとめたものとして
画分ＦＡを調製した。画分ＦＡとは別に、試験管番号１
６〜１８（溶出体積１８０〜１９８ｍｌ）、試験管番号
１９〜２４（溶出体積１９８〜２３４ｍｌ）、試験管番
号２５〜３１（溶出体積２３４〜２７６ｍｌ）の各々の
一部をとり、それぞれ画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬとした。つ
まり画分ＦＡは、実質的に画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬを合わ
せたものとなる。以上、図１９に示す。 （２）次に（１）で述べたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ
カラムのｈＴＰＯ１６３溶出画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及
びＦＡについて詳細に述べる。このようにして得られた
ｈＴＰＯ１６３のＮ末端側のアミノ酸配列を実施例１に
述べた方法と同様にして調べたところ、Ｎ末端のセリン
の大部分は同定不能であったことより、Ｎ末端のセリン
にＯ結合型糖鎖が付加されていることが強く示唆され
た。また、Ｎ末端のセリンに続く配列は遺伝子配列から
期待されたアミノ酸配列であることが確認できた。アミ
ノ酸組成分析（ＡｃｃＱ．Ｔａｇ法、ウォターズ社）の
結果、ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡのｈＴＰＯ１６３蛋白
質（糖鎖を含まないペプチド部分）の濃度がそれぞれ１
０．２ｎｇ／ｍｌ、６．２ｎｇ／ｍｌ、０．８４ｎｇ／
ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌであった。これらの画分１００
ｎｇをマルチゲル１５／２５（第一化学薬品社製１５〜
２５％プレキャストポリアクリルアミドゲル）を用いて
非還元条件或いはＤＴＴにより還元後、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを実施し銀染色（第一化学薬品社製）したところ、そ
れぞれ極めて高純度なｈＴＰＯ１６３標品であることが
確認できた。還元条件下においてはＤＰＣＩＩＩ分子量
マーカー（第一化学薬品社製）を標準として算出された
ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡのｈＴＰＯ１６３の見かけの
分子量はそれぞれ２４０００〜２１５００、２３０００
〜２１０００、２３０００〜２０５００、２３５００〜
２０５００であった（図２０を参照）。またウエスター
ン分析により還元条件下においてはビオチン標識ＳＤＳ
−ＰＡＧＥスタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社製 Ｂｉ
ｏｔｙｎｙｌａｔｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓｔａｎｄ
ａｒｄｓ，Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ；カタログ番号１６
１−０３１９）を標準として算出されたＦＨ、ＦＭ、Ｆ
Ｌ及びＦＡのｈＴＰＯ１６３の見かけの分子量はそれぞ
れ２６０００〜２２０００、２５５００〜２２０００、
２６０００〜２１０００、２６０００〜２１０００であ
った。ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの分子量の不均一性
は、付加されたＯ結合型糖鎖の不均一性によることと推
定できる。そこでＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの各画分を
ノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ナカ
ライテスク社製、カタログ番号２４２−２９ ＳＰ）で
酵素消化し、ＤＴＴで還元後ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
たところ、いずれの画分も見かけの分子量が１９０００
付近となったことから、ｈＴＰＯ１６３蛋白質に付加さ
れた糖鎖のシアル酸の量の不均一性が確認されたのと同
時に、ここで得られたｈＴＰＯ１６３が糖蛋白質として
ＣＨＯ細胞で発現されたものであることが明らかとなっ
た。 （３）（２）で得られたＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの各
画分をＭ−０７ｅアッセイ系でｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を
調べたところ、相対比活性は１ｍｇｈＴＰＯ１６３蛋白
質（糖鎖重量を含まないペプチド部分の重量）当たり、
それぞれ５１１００００００、７７５００００００、１
１５０００００００、７１５００００００であった。 ＜実施例６６＞ −１位にＬｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたヒトＴＰ
Ｏ（アミノ酸１−３３２）（以下「ｈＭＫＴ（１−３３
２）」と称す）の大腸菌用発現ベクターの構築及び発現 ヒトＴＰＯ全長アミノ酸を大腸菌で発現させるためアミ
ノ酸１６４以降のアミノ酸３３２までの使用コドンを以
下に述べるように大腸菌優先コドンに変更した。表２０
に示した２１−４０の合成オリゴヌクレオチドを作成し
た。
【表２０】 ２１及び２２；２３及び２４；２５及び２６；２７及び
２８；２９及び３０；３１及び３２；３３及び３４；３
５及び３６；３７及び３８；３９および４０の合成オリ
ゴヌクレオチドを同チューブ中でＴ４キナーゼ（ファル
マシア社製）を用いて０．１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１０ｍＭＭｇ−ａｃｅｔａ
ｔｅ，５０ ｍＭ Ｋ−ａｃｅｔａｔｅの溶液中でリン
酸化した。さらに１／１０量の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／
ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０
０ｍＭ ＮａＣｌの溶液を加え、水浴中で３分間煮沸し
た後、放置することにより二本鎖ＤＮＡとした。次に２
１及び２２；２３及び２４（組合わせＡ）、２５及び２
６；２７及び２８；２９及び３０（組合わせＢ）、３１
及び３２；３３及び３４（組合わせＣ）、３５及び３
６；３７及び３８；３９及び４０（組合わせＤ）の四組
の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ ライゲーションキット（宝酒
造社製）を用いて連結後、さらに（組合わせＡ）及び
（組合わせＢ）、（組合わせＣ）及び（組合わせＤ）を
それぞれ同様に連結し、得られた反応液を連結１及び連
結２とした。これらの反応液を鋳型として、連結１につ
いては４１および４２、連結２については４３及び４４
の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反
応を行った。連結１のＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物
についてはＳａｃＩ，ＥｃｏＲＶ、連結２のＰＣＲ反応
で得られたＰＣＲ産物についてはＥｃｏＲＶ，Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、それぞ
れ約２４０ｂｐ及び２５０ｂｐの断片をプレップ−Ａ−
ジーンＤＮＡ精製キットにより回収した。これら二本の
断片ををＳａｃＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋（ストラタジーン社製）
にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
を使用した）。得られたクローンのうち表２１に示した
塩基配列を有するものをシークエンシングにより選択
し、ここで得られたクローンをｐＢＬ（ＳＨ）（１７４
−３３２）とした。
２８；２９及び３０；３１及び３２；３３及び３４；３
５及び３６；３７及び３８；３９および４０の合成オリ
ゴヌクレオチドを同チューブ中でＴ４キナーゼ（ファル
マシア社製）を用いて０．１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１０ｍＭＭｇ−ａｃｅｔａ
ｔｅ，５０ ｍＭ Ｋ−ａｃｅｔａｔｅの溶液中でリン
酸化した。さらに１／１０量の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／
ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０
０ｍＭ ＮａＣｌの溶液を加え、水浴中で３分間煮沸し
た後、放置することにより二本鎖ＤＮＡとした。次に２
１及び２２；２３及び２４（組合わせＡ）、２５及び２
６；２７及び２８；２９及び３０（組合わせＢ）、３１
及び３２；３３及び３４（組合わせＣ）、３５及び３
６；３７及び３８；３９及び４０（組合わせＤ）の四組
の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ ライゲーションキット（宝酒
造社製）を用いて連結後、さらに（組合わせＡ）及び
（組合わせＢ）、（組合わせＣ）及び（組合わせＤ）を
それぞれ同様に連結し、得られた反応液を連結１及び連
結２とした。これらの反応液を鋳型として、連結１につ
いては４１および４２、連結２については４３及び４４
の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反
応を行った。連結１のＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物
についてはＳａｃＩ，ＥｃｏＲＶ、連結２のＰＣＲ反応
で得られたＰＣＲ産物についてはＥｃｏＲＶ，Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、それぞ
れ約２４０ｂｐ及び２５０ｂｐの断片をプレップ−Ａ−
ジーンＤＮＡ精製キットにより回収した。これら二本の
断片ををＳａｃＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋（ストラタジーン社製）
にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
を使用した）。得られたクローンのうち表２１に示した
塩基配列を有するものをシークエンシングにより選択
し、ここで得られたクローンをｐＢＬ（ＳＨ）（１７４
−３３２）とした。
【表２１】 次に実施例４２で作成したｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−
１６３）を鋳型とし、以下の４５及び４６の合成オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、こ
こで得られたＰＣＲ産物についてはＢａｍＨＩ，Ｓａｃ
Ｉで消化後６％のポリアクリルアミドゲルで泳動し、約
１６０ｂｐの断片をゲルより回収した。またｐＢＬ（Ｓ
Ｈ）（１７４−３３２）をＳａｃＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで
消化して得られた約４８０ｂｐの断片をプレップーＡ−
ジーンＤＮＡ精製キットにより回収し、これら二本の断
片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ （ストラタジーン社製）
にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
を使用した）。 得られたクローンのうち表２２に示した塩基配列を有す
るものをシークエンシングにより選択し、ここで得られ
たクローンをｐＢＬ（ＢＨ）（１２３．３３２）とし
た。
１６３）を鋳型とし、以下の４５及び４６の合成オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、こ
こで得られたＰＣＲ産物についてはＢａｍＨＩ，Ｓａｃ
Ｉで消化後６％のポリアクリルアミドゲルで泳動し、約
１６０ｂｐの断片をゲルより回収した。またｐＢＬ（Ｓ
Ｈ）（１７４−３３２）をＳａｃＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで
消化して得られた約４８０ｂｐの断片をプレップーＡ−
ジーンＤＮＡ精製キットにより回収し、これら二本の断
片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ （ストラタジーン社製）
にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
を使用した）。 得られたクローンのうち表２２に示した塩基配列を有す
るものをシークエンシングにより選択し、ここで得られ
たクローンをｐＢＬ（ＢＨ）（１２３．３３２）とし
た。
【表２２】 実施例４２で作成したｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−１６
３）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢＬ
（ＢＨ）（１２３−３３２）を同じ制限酵素で消化して
得られた約６４０ｂｐの断片を連結してクローンｐＢＬ
（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−３３４）を作成した。さらに実施
例５２で作成したＰＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（１−１６
３）をＸｂａＩ，ＳｆｉＩで消化して得られた約２７０
ｂｐの断片を、同じ制限酵素で消化したｐＢＬ（ＸＨ）
ｈ６Ｔ（１−３３４）に連結してクローンｐＢＬ（Ｘ
Ｈ）ｈＭＫＴ（１−３３４）を作成した。ｐＢＬ（Ｘ
Ｈ）ｈＭＫＴ（１−３３４）をＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化後、変異型のヒトＴＰＯアミノ酸１−３３２を
コードする約１０４０ｂｐの大きさのフラグメントを回
収して精製後、ＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐ
ＣＦＭ５３６（特表昭６０−５０１９８８）にクローニ
ングした（宿主はｐＭＷ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９９３
３）で予め形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を
使用した）。ここで得られたクローンをｐＣＦＭ５３６
／ｈＭＫＴ（１−３３２）とし、この発現ベクターを有
する大腸菌株を変異型のｈＭＫＴ（１−３３２）タンパ
ク発現用の形質転換体とした。この発現プラスミドは、
配列表（配列番号１４）に示されたＤＮＡ配列を含んで
いる。ここで得られた形質転換株を、アンピシリン５０
μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン１２．５μｇ／ｍｌを含
むＬＢ培地６０ｍｌに３０℃で一晩振盪培養し、この培
養液２５ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ
培地１０００ｍｌに加えて、ＯＤはＡ６００が１．０−
１．２に至るまで３０℃で振盪培養した。次いで最終温
度が、４２℃になるように６５℃の約３３０ｍｌＬＢ培
地を添加し、さらに３時間４２℃で振盪培養して変異型
のヒトＴＰＯ、ｈＭＫＴ（１−３３２）タンパクの発現
を誘導した。この培養菌体を直接サンプルとして用いて
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには第一
化学社製のマルチゲル１５／２５を用い、泳動後にクマ
シーブルー染色を行ったところｈＭＫＴ（１−３３２）
タンパク質の発現を誘導したものに関しては、分子量約
３５ｋＤのところに発現誘導に特異的なタンパク質が検
出された。一方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲル上のタンパ
ク質をニトロセルロース膜にエレクトロプロッティング
し、実施例４５で作製した抗ＨＴ１ペプチド抗体と反応
させ発色させたところ、分子量約３５ｋＤのところにバ
ンドが検出されたことから、ｈＭＫＴ（１−３３２）の
発現が確認された。 ＜実施例６７＞ ヒトＴＰＯ置換誘導体の作製とＣＯＳ７細胞での発現〜
活性確認 ヒトＴＰＯのアミノ酸の一部を置換した誘導体が活性を
有するかどうかを以下のとおり検討した。本実施例で用
いた動物細胞発現ベクターｐＳＭＴ２０１は以下のよう
に作製した。まず、マウスエリスロポエチンレセプター
ｃＤＮＡを含む発現プラスミドｐＸＭ−ｍＥＰＯＲｎ
（Ｄａｎａ Ｆａｒｂｏｒ 癌研究所Ｄ′−Ａｎｄｒｅ
ａ博士より入手、Ｃｅｌｌ：５７巻、２７７−２８５頁
（１９８９））を制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで
処理した後、アガロースゲル電気泳動しマウスエリスロ
ポエチンレセプターｃＤＮＡ部分を除くｐＸＭ ベクタ
ー断片を回収した。次に回収したｐＸＭ発現ベクターに
種々のクローニング用制限酵素部位を導入するための２
本の合成オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製ＤＮＡ合成機
を用いて作製した。合成したオリゴヌクレオチドの塩基
配列を以下に示す。 この２本のオリゴヌクレオチドを混合し、アニーリング
させ２本鎖オリゴヌクレオチドとした後、上記で回収し
たｐＸＭベクター断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
製）で結合させ、発現ベクターｐＤＭＴ２０１を得た。
次にこの発現ベクターｐＤＭＴ２０１に含まれるマウス
ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを除去するためにｐＤＭＴ２０１ベ
クター及びｐＥＦ１８Ｓベクターを制限酵素Ｎｏｔ Ｉ
およびＨｐａ Ｉで処理後アガロースゲル電気泳動し、
ｐＤＭＴ２０１ベクターＤＮＡ由来の大きい方の断片と
ｐＥＦ１８ＳベクターＤＮＡ由来の小さい方の断片を回
収し、Ｔ ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合させる
ことにより発現ベクターｐＳＭＴ２０１を得た。このベ
クターは、図２１に示したとおりＳＶ４０の複製開始領
域およびエンハンサー配列、アデノウィルス主要後期プ
ロモーター配列、アデノウィルストリパータイトリーダ
ー配列、スプライス信号配列、ＳＶ４０初期ポリアデニ
ル部位配列、アデノウィルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子配列、
ｐＵＣ １８の複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝子
（Ａｍｐｒ）を含み、目的とする遺伝子を連結するため
の制限酵素配列として、ＢｇＩ ＩＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｋ
ｐｎＩ、Ｘｈｏ Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｓｍａ Ｉ、Ｓｐｅ
Ｉ、およびＮｏｔ Ｉ部位を有する。実施例３０で示
した完全長ヒトＴＰＯ ｃＤＮＡを含むｐＨＴＰ１を制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびｓｐｅＩを用いて酵素消化し得
られた完全長ヒトＴＰＯ ｃＤＮＡ断片を、同様に制限
酵素消化したベクターｐＳＭＴ２０１にサブクローニン
グすることによりプラスミドｐＳＭＴ２０１−ｈＴＰＯ
を得た。以上のようにして得たプラスミドｐＳＭＴ２０
１−ｈＴＰＯを鋳型にして、まず誘導体作製用の鋳型と
なるプラスミドβＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅを以下のよ
うに作製した。βＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅではヒトＴ
ＰＯの５′非翻訳側に、Ａｎｎｗｅｉｌｅｒらの方法に
従いウサギのβ−グロビンリーダー配列の付加を試みた
（Ａｎｎｗｅｉｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９巻、３７５０頁）。まず以下
に示す化学合成した２本のＤＮＡ鎖、そしてベクターＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（東洋紡績社製）を制限
酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで消化した断片とをライゲ
ーションすることによりリーダー配列が挿入されたベク
ターβＧＬ／ｐＢｌｕｅを作製した。 ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通り。 ＰＣＲはプラスミドｐＳＭＴ２０１−ｈＴＰＯ ＤＮＡ
１ｎｇを鋳型として使用し、合成したプライマーをそれ
ぞれ１０μＭ使って実施した。ＴａＫａＲａＰＣＲ Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用
いて、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に
より１００μｌの容量でＰＣＲ（９４℃１分間、５５℃
２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５
秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を２０サイクル）を
行った。ＰＣＲ産物をクロロホルム抽出し、エタノール
沈殿を２回行った後１００μｌのＴＥバッファーに溶解
した。これを制限酵素ｓｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化
後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を
行った。得られた沈殿を１０μｌのＴＥバッファーに溶
解後、同様に制限酵素消化したベクターβＧＬ／ｐＢｌ
ｕｅにサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コ
ンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を使用）。
得られた形質転換体のうち２０クローン選択し、プラス
ミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実
施した。精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａｑＤ
ｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオ
システムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ
社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーにより塩基配列の確
認を行った。βＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅをコードする
プラスミドは全長にわたり塩基配列の置換がなく予想通
りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持つことを確認した。さらに
βＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅを制限酵素ＢｇｌＩＩ、Ｓ
ｐｅＩで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿を行った。得られた沈殿を１０μｌのＴＥバ
ッファーに溶解し、同様に制限酵素消化したベクターｐ
ＳＭＴ２０１にサブクローニングした（宿主菌は東洋紡
績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を
使用）。本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
［Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８
９）］に記載されている方法に従い、形質転換体からプ
ラスミドＤＮＡを調製した。得られた発現ベクターｐＳ
ＭＴ／βＧＬ−ＴＰＯは、図２１に示したｐＳＭＴ２０
１ベクターのスプライス信号配列の下流にある制限酵素
配列Ｂｇｌ ＩＩ／Ｓｐｅ Ｉ部位にβ−グロビンリー
ダー配列及びヒトＴＰＯｃＤＮＡが接続された構造を有
している。このｐＳＭＴ／βＧＬ−ＴＰＯベクターＣＯ
Ｓ７細胞へのトランスフェクション実験に用いた。ヒト
ＴＰＯ置換誘導体の作製にはＰＣＲを利用し、Ｉｔｏら
の方法に従った（Ｉｔｏ ら、Ｇｅｎｅ、１０２巻、６
７−７０頁 １９９１年）。ここでは、ヒトＴＰＯの２
５位のＡｒｇ残基をＡｓｎ残基に置換した誘導体、並び
に３３位のＨｉｓ残基をＴｈｒ残基に置換した誘導体の
作製を試みた。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下
の通り。 第１段階のＰＣＲはプラスミドβＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌ
ｕｅ ＤＮＡ１ｎｇを鋳型として使用し、合成したプラ
イマーをそれぞれ１０μＭ使って実施した（プライマー
の組み合わせは［１］△ＢｇｌＩＩとｅｎｄ、［２］Ｔ
７とＮ３、［３］Ｔ７と０９）。ＴａＫａＲａ ＰＣＲ
ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造社製）を
用いて、Ｐｒｏｇｒａｍｍｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に
より１００μｌの容量でＰＣＲ（９４℃１分間、５５℃
２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５
秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を１７サイクル）を
行った。それぞれのＰＣＲ産物をクロロホルム抽出し、
エタノール沈殿を２度行った後１００μｌのＴＥバッフ
ァーに溶解した。このＰＣＲ産物を２種類１μｌずつ用
いて第２段階のＰＣＲを行った。鋳型の組み合わせは
［１］と［２］のＰＣＲ産物、［１］と［３］のＰＣＲ
産物である。用いたプライマーはすべてＴ７とｅｎｄの
組み合わせである。９４℃で１０分間インキュベートし
た後ＴａＫａＲａ Ｔａｑを加え、９４℃１分間、５５
℃２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４
５秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を９サイクル行っ
た。それぞれのＰＣＲ産物に５ｍｇ／ｍｌ ｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅ Ｋを１μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡを２μ
ｌ、２０％ＳＤＳを２μｌ加え３７℃で３０分間保温し
Ｔａｑを失活させた後、フェノール／クロロホルム抽
出、エタノール沈殿し２０μｌの滅菌水に溶解した。こ
れを制限酵素ＢｇｌＩＩＩ、ＳｐｅＩで消化後、フェノ
ール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。得
られた沈殿を１０μｌのＴＥバッファーに溶解後、同様
に制限酵素消化しアルカリホスファターゼ（仔ウシ腸、
ベーリンガー・マンハイム社製）処理した発現ベクター
ｐＳＭＴ２０１にサブクローニングした（宿主菌は東洋
紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９
を使用）。得られた形質転換体のうち、それぞれ２クロ
ーンずつ選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は
本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａ
ｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に
記載されているようにして実施した。精製したプラスミ
ドＤＮＡについてはＴａｑＤｙｅ Ｄｅｏｘｙ ＴＭＴ
ｅｒｍｉｎａｔｅｒＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、
アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシーク
エンサーにより塩基配列の確認を行った。［１］と
［３］のＰＣＲ産物に由来するプラスミドには意図した
アミノ酸置換［ＨｉＳ３３（ＣＡＣ）→Ｔｈｒ（ＡＣ
Ｃ）］をもち、かつＣ末端（Ｇｌｙ３３２）に以下のア
ミノ酸配列からなるペプチドが付加されたＴＰＯ置換誘
導体（０９／ＴＰＯ）をコードするｃＤＮＡが含まれて
いることが確認された。一方、［１］と［２］のＰＣＲ
産物に由来するプラスミドは意図したアミノ酸置換［Ａ
ｒｇ２５（ＡＧＡ）→Ａｓｎ（ＡＡＣ）］以外に更に１
カ所のアミノ酸置換［Ｇｌｕ２３１（ＧＡＡ）→Ｌｙｓ
（ＡＡＡ）］もち、かつＣ末端（Ｇｌｙ３３２）に以下
のアミノ酸配列からなるペプチドが付加されたＴＰＯ置
換誘導体（Ｎ３／ＴＰＯ）をコードするｃＤＮＡを含ん
でいることが判明した。 ペプチド： ＴＳＩＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＶＨＨＨＨＨＨ 得られたそれぞれのクローンのＣＯＳ７細胞へのトラン
スフェクションは、実施例３５に従いクロロキン処理を
含むＤＥＡＥ−デキストラン法で行った。すなわちプラ
スミドＤＮＡ４０μｇを使用し、トランスフェクション
５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清をセン
トリコン−３０（アミコン社製）で２０倍に濃縮しＭ−
０７ｅアッセイ系で評価した。その結果、ヒトＴＰＯ置
換誘導体Ｎ３／ＴＰＯ、０９／ＴＰＯをコードするプラ
スミドでトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞培養上清中
に、いずれも用量依存的にＴＰＯ活性が検出された（図
２２参照）。 ＜実施例６８＞ ヒトＴＰＯ挿入・欠失誘導体の作製とＣＯＳ７細胞での
発現〜活性確認 ｈＴＰＯ１６３にアミノ酸を挿入した誘導体またはｈＴ
ＰＯ１６３からアミノ酸を欠失した誘導体が活性を有す
るかどうか検討した。作製した誘導体は配列番号１３の
Ｈｉｓ３３欠失体（ｄＨ３３）、Ｇｌｙ１１６欠失体
（ｄＧ１１６）、Ａｒｇ１１７欠失体（ｄＲ１１７）、
Ｈｉｓ３３とＰｒｏ３４間へのＴｈｒ挿入体（Ｔ３
３’）、Ａｌａ挿入体（Ａ３３’）、Ｇｌｙ挿入体（Ｇ
３３’）およびＧｌｙ１１６とＡｒｇ１１７の間へのＡ
ｓｎ挿入体（Ｎ１１６’）、Ａｌａ挿入体（Ａ１１
６’）、Ｇｌｙ挿入体（Ｇ１１６’）である。これらの
うちＴ３３’、Ｎ１１６’はそれぞれムチン型糖鎖、Ａ
ｓｎ結合型糖鎖の導入を意図した誘導体である。誘導体
の作製にはＰＣＲを利用し、Ｉｔｏらの方法に従った
（Ｉｔｏら、Ｇｅｎｅ、１０２巻、６７−７０頁、１９
９１）。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通
り。 第１段階のＰＣＲは実施例６７で作製したプラスミドβ
ＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅ ＤＮＡ１ｎｇを鋳型として
使用し、合成したプライマーをそれぞれ１０μＭ使って
実施した。プライマーの組み合わせは［１］ｄＲＩとｅ
ｎｄＮｏｔＩ、［２］Ｔ７と変異導入プライマー（ｄＨ
３３，Ａ３３′，Ｇ３３′，Ｔ３３′，ｄＧ１１６，ｄ
Ｒ１１７，Ａ１１６′，Ｇ１１６′，Ｎ１１６′）であ
る。ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、Ｐｒｏｇｒａｍｍ
ｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ
Ｒｅｓｅｒｃｈ社製）により１０μｌの容量でＰＣＲを
行った。［１］の反応は、９４℃１分間、４５℃２分
間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５秒
間、４５℃１分間、７２℃１分間を１７サイクル。
［２］の反応は、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃
２分間を３サイクル、続けて９４℃４５秒間、５５℃１
分間、７２℃１分間を１７サイクル。それぞれのＰＣＲ
産物をクロロホルム抽出し、エタノール沈殿を２度行っ
た後１００μｌのＴＥバッファーに溶解した。次に、
［１］と［２］のＰＣＲ産物をそれぞれ１μｌずつ用い
て第２段階のＰＣＲを行った。用いたプライマーはすべ
てＴ７とｅｎｄＮｏｔＩの組み合わせである。９４℃で
１０分間インキュベートした後ＴａＫａＲａ Ｔａｑを
加え、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃２分間を３
サイクル、続けて９４℃４５秒間、５５℃１分間、７２
℃１分間を９サイクル行った。それぞれのＰＣＲ産物に
５ｍｇ／ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ を１μｌ、
０．５Ｍ ＥＤＴＡを２μｌ、２０％ＳＤＳを２μｌ加
え３７℃で３０分間保温しＴａｑを失活させた後、フェ
ノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し２０μｌ
の滅菌水に溶解した。これを制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｎｏ
ｔＩで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノ
ール沈殿を行った。得られた沈殿を１０μｌのＴＥバッ
ファーに溶解後、同様に制限酵素消化しアルカリホスフ
ァターゼ（仔ウシ腸、ベーリンガー・マンハイム社製）
処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニング
した（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９を使用）。得られた形質転換体から
プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａｍｂｏｏｋら、ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにし
て実施した。精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａ
ｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃ
ｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライド
バイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシス
テムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーにより塩基配
列の確認を行った。その結果、ｄＨ３３、Ａ３３’、Ｔ
３３’、ｄＧ１１６、ｄＲ１１７、Ａ１１６’、Ｇ１１
６’、Ｎ１１６’をコードするプラスミドは全長にわた
り意図した部位以外に塩基配列の置換がなく予想通りの
ＴＰＯｃＤＮＡ配列を持つことを確認した。また、Ｇ３
３’では意図した部位以外に１カ所のアミノ酸置換をも
たらす塩基置換［Ｐｒｏ３８（ＣＣＴ）→Ｓｅｒ（ＴＣ
Ｔ）］が認められた。得られたそれぞれのクローンのＣ
ＯＳ７細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に
従って行った。すなわちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使
用し、クロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法
を用いたトランスフェクションを行い、４−５日後に培
養上清を回収した。回収した培養上清をＭ−０７ｅアッ
セイ系で評価した。その結果、アミノ酸挿入・欠失誘導
体をコードするプラスミドでトランスフェクトしたＣＯ
Ｓ７細胞培養上清中に、いずれも用量依存的にＴＰＯ活
性が検出された（図２３参照）。ＴＰＯ誘導体をコード
するｃＤＮＡを含まない発現プラスミドｐＥＦ１８Ｓを
トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞培養上清には活
性が認められなかった。 ＜実施例６９＞ ＴＰＯによる血小板増加作用 あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンタ
ー（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定
した正常な８週齢のＩＣＲ系雄性マウス２０匹を無作為
に４群に分けた。そのうちの１群（コントロール−ｉｖ
群）には１００μｌのＰＢＳを１日１回５日間連続で静
脈内に投与し、他の１群（ＴＰＯ−ｉｖ群）には実施例
５６で得られたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
ＦｌｏｗのヒトＴＰＯ活性画分Ｆ２の濃縮液をＮＡＰ−
２５カラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ
番号１７−０８５２−０２）でＰＢＳに置換し、さらに
ＰＢＳで希釈したもののうち１００μｌ（Ｍ−０７ｅア
ッセイ系での相対活性量２１１，９００を含む）を１日
１回５日間連続で静脈内に投与した。また、別の１群
（コントロール−ｓｃ群）には１００μｌのＰＢＳを１
日１回５日間連続で皮下に投与し、他の１群（ＴＰＯ−
ｓｃ群）にはＴＰＯ−ｉｖ群と同様に１００μｌを１日
１回５日間連続で皮下に投与した。投与開始後６、８、
１０、１３、１５日目にそれぞれのマウスの眼窩静脈よ
り経日的に採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用
電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定した。血小板
数の推移を図２４に示した。すなわち、コントロール−
ｉｖ群では血小板数は最も増加した６日目においても投
与前と比較して４４％の増加であり、コントロール−ｓ
ｃ群では最も増加した８日目において４７％増加が観察
されたにすぎなかった。その一方で、ＴＰＯ−ｉｖ群で
は６日目には投与前と比較して１７７％の増加がみら
れ、その後も増加を続け１０日目には４６９％という最
大の増加が観察された。また、ＴＰＯ−ｓｃ群では６日
目にすでに３４７％の増加が見られ、８日後には最大の
４９３％の増加が観察された。以上の結果より、ヒトＴ
ＰＯは種差、投与ルートに関係なく血小板の増加作用を
有することが確認された。 ＜実施例７０＞ ＴＰＯによる血小板増加作用 あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンタ
ー（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定
した正常な１１週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪ系雄性マウス１６
匹を無作為に４群に分けた。そのうちの１群（コントロ
ール群）には１００μｌのＰＢＳを１日１回５日間連続
で皮下に投与した。他の１群（ＴＰＯ−１群）には実施
例５６で得られたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ
のヒトＴＰＯ活性画分Ｆ１をＮＡＰ−２５でＰＢＳに置
換し、さらにＰＢＳで希釈したもののうち１００μｌ
（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量８３，０００を
含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与した。別の１
群（ＴＰＯ−２群）にはＴＰＯ−１群で投与したＴＰＯ
活性画分をさらにＰＢＳで２倍に希釈したもののうち１
００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量４１，
５００を含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与し
た。また最後の１群（ＴＰＯ−３群）にはＴＰＯ−２群
で投与したＴＰＯ活性画分をさらにＰＢＳで２倍に希釈
したもののうち１００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での
相対活性量２０，７５０を含む）を１日１回５日間連続
で皮下に投与した。投与開始後６、８、１０、１２日目
にそれぞれのマウスの眼窩静脈より経日的に採血し、マ
イクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）
にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図２５に示
した。すなわち、コントロール群では血小板数にほとん
ど変動が見られなかった。ＴＰＯ投与群では、いずれの
群においても投与開始８日目に最大となるような血小板
数の増加が認められた。また、各投与群の間には用量依
存性が認められた。すなわち、ＴＰＯ−１群では、６日
目に既に約２００％の増加が見られ、８日目には約２７
０％にまで増加した。その後減少したが、１２日目にお
いても約６５の増加が見られコントロール群との間に有
意差（ｐ〈０．０１：ダネットの多重比較検定：Ｄｕｎ
ｎｅｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔ
ｅｓｔ）が認められた。ＴＰＯ−２群においても同様に
増加が見られたが、増加作用はＴＰＯ−１群には及ばな
いものの６、８日目にはそれぞれ約１４０％、約１６０
％の増加を認めた。また、１２日目にはコントロール群
とほぼ同様のレベルにまで減少した。ＴＰＯ−３群にお
ける増加作用はＴＰＯ−２群よりもさらに弱かったが、
最高値に達した８日目には約１１０％の増加が見られて
おり、コントロール群との間に有意差（ｐ〈０．０１）
も認められた。以上の結果より、ヒトＴＰＯは、マウス
の系統に関係なく血小板数を増加させること、またその
作用には用量依存性があることが確認された。 ＜実施例７１＞ ＴＰＯによる制がん剤投与による血小板減少症阻止効果 ８週齢のＩＣＲ雄性マウス３０匹に５−ＦＵを２００ｍ
ｇ／ｋｇ体重の割合で静脈内投与した後、無作為に各々
１５匹の２群に分け、その翌日（Ｄａｙ １）より一方
の群（コントロール群）には１００μｌのＰＢＳを１日
１回５日間連続で皮下に投与した。またもう一方の群
（ＴＰＯ群）には、実施例６９で用いたヒトＴＰＯ活性
画分Ｆ２ １００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対
活性量２１１，９００を含む）を１日１回５日間連続で
皮下に投与した。投与開始後Ｄａｙ４、６、８にそれぞ
れの群より各々５匹のマウスを無作為に抽出し、眼窩静
脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子
製、Ｅ−２５００）にて血小板数を測定した。血小板数
の推移を図２６に示した。すなわち、コントロール群で
は５−ＦＵ投与後血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ
６には最低値（５−ＦＵ投与前値の約２８％）に達した
が、Ｄａｙ ８には減少の反動で約１．３倍にまで増加
した。ＴＰＯ群においても５−ＦＵ投与後血小板数は経
日的に減少し、Ｄａｙ ６には最低値（５−ＦＵ投与前
値の約５２％）に達したがＤａｙ ４と６の血小板数に
ほとんど差はなく、また、Ｄａｙ６においてはコントロ
ール群に比して有意（ｐ〈０．０５：ダネットの多重比
較検定）に高値を維持した。Ｄａｙ ８においては、５
−ＦＵ投与前値の約２００％にまで増加した。以上の結
果より、ヒトＴＰＯには、制がん剤による血小板減少を
阻止する効果があることが確認された。 ＜実施例７２＞ ＴＰＯによる血小板減少症治療効果 ７週齢のＩＣＲ雄性マウス３６匹に塩酸ニムスチン（Ａ
ＣＮＵ）を５０ｍｇ／ｋｇ体重の割合で静脈内投与した
後、無作為に各々１８匹の２群に分け、その翌日（Ｄａ
ｙ １）より一方の群（コントロール群）には２００μ
ｌのＰＢＳを１日２回連日皮下投与し、またもう一方の
群（ＴＰＯ群）には、実施例７０で用いたＴＰＯ活性画
分Ｆ１にＰＢＳで希釈せずに０．０４％の割合でＴｗｅ
ｅｎ−８０を添加したもの２００μｌ（Ｍ−０７ｅアッ
セイ系での相対活性量３６０，０００を含む）を１日２
回連日皮下投与した。投与開始後各々の群でマウスを無
作為に３群に分け、それぞれをＤａｙ ５、１２に採血
する群、Ｄａｙ ８、１４に採血する群そしてＤａｙ１
０に採血する群とした。採血は眼窩静脈より行い、マイ
クロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）に
て血小板数を測定した。血小板数の推移を図２７に示し
た。すなわち、コントロール群ではＡＣＮＵ投与後に血
小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ８〜１０で最低（各々
ＡＣＮＵ投与前値の約２９％）となり、Ｄａｙ１２に約
４９％、Ｄａｙ１４に約７４％に回復したにすぎなかっ
た。一方ＴＰＯ群では、Ｄａｙ ５にはＡＣＮＵ投与前
値の約３８％にまで減少した。その後は増加に転じ、Ａ
ＣＮＵ投与前値に比してＤａｙ ８では約６３％にまで
回復し、Ｄａｙ１０以降はＡＣＮＵ投与前値以上の血小
板数を示し、Ｄａｙ１２では約３００％、Ｄａｙ１４で
は約４００％にまで増加した。以上のように、コントロ
ール群では減少の過程にあるＤａｙ ８〜１０において
既にＴＰＯ群では増加に転じており、Ｄａｙ１０で既に
ＡＣＮＵ投与前値以上の血小板数まで増加していること
から、ヒトＴＰＯは制ガン剤により惹起される血小板減
少からの回復を促進する効果を有することが確認され
た。なお、実施例７１の結果を併せてもヒトＴＰＯには
制ガン剤の種類に関係なく血小板数の減少を阻止する効
果および血小板減少からの回復を促進する効果を有する
ことが期待される。 ＜実施例７３＞ ＴＰＯによるＢＭＴ施行後の血小板減少症治療効果 ７週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ系の雄性マウス４８匹に１０Ｇ
ｙの放射線を全身照射した後、同系のマウスの骨髄細胞
１×１０６個を直ちに静脈内投与した。そこで無作為に
２群に分け、翌日（Ｄａｙ １）より一方の群（コント
ロール群）にはＰＢＳを、他方の群（ＴＰＯ群）には実
施例７０で用いたＴＰＯ活性画分Ｆ１（Ｍ−０７ｅアッ
セイ系での相対活性量４４，０００を含む）をそれぞれ
１日１回１００μｌずつ２０日間連日で皮下投与した。
投与開始後Ｄａｙ ５、１０、１４、２１にそれぞれの
群より各々６匹のマウスを無作為に抽出し、眼窩静脈よ
り採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、
Ｅ−２５００）にて血小板数を測定した。血小板数の推
移を図２８に示した。すなわち、いずれの群においても
ＢＭＴ施行後に血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ１０
に最低（ＢＭＴ施行前の約３％）となった。その後は徐
々に回復し、Ｄａｙ１４にはコントロール群で約１１
％、ＴＰＯ群で約１３％となった。Ｄａｙ２１にはコン
トロール群では３７％に回復したにすぎなかったが、Ｔ
ＰＯ群では約６５％にまで回復し有意な回復促進効果が
認められた。以上の結果より、実施例５６で精製された
ヒトＴＰＯには、ＢＭＴ施行後の血小板数の回復を促進
する効果があることが確認された。 ＜実施例７４＞ ＴＰＯによる放射線照射後の血小板減少症治療効果 ８週齢のＩＣＲ系の雄性マウス３６匹に５ＧｙのＸ線を
全身照射した後、無作為に２群に分け、翌日（Ｄａｙ
１）より一方の群（コントロール群）にはＰＢＳを、他
方の群（ＴＰＯ群）には実施例７０で用いたＴＰＯ活性
画分Ｆ１（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量１，４
４０，０００を含む）をそれぞれ１日１回３日間連日で
皮下投与し、翌日よりＭ−０７ｅアッセイ系での相対活
性量３６０，０００を１日１回７日間連日で皮下投与し
た。投与開始後各々の群でマウスを無作為に３群に分
け、それぞれをＤａｙ ４、１１、２１に採血する群、
Ｄａｙ ７、１３に採血する群そしてＤａｙ９、１５に
採血する群とした。採血は眼窩静脈より行い、マイクロ
セルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血
小板数を測定した。図２９に血小板数の推移を示した。
すなわち、コントロール群ではＸ線照射後に血小板数は
経日的に減少し、Ｄａｙ９で最低（Ｘ線照射前値の約２
４％）となり、Ｄａｙ１１に約３８％、Ｄａｙ１３に約
６７％に回復し、Ｄａｙ１５にＸ線照射前値にまで回復
した。一方ＴＰＯ群では、Ｄａｙ ７にはＸ線照射前値
の約２４％にまで減少した。その後は増加に転じ、Ｘ線
照射前値に比してＤａｙ ９では約８２％にまで回復
し、Ｄａｙ１１以降はＸ線照射前値以上の血小板数を示
し、Ｄａｙ２１までその傾向は維持された。以上のよう
に、コントロール群では減少の過程にあるＤａｙ ９に
おいて既にＴＰＯ群では増加に転じており、Ｄａｙ１１
で既にＸ線照射前値以上の血小板数まで増加し、その後
も高値を維持した。一方、コントロール群ではＸ線照射
前値以上の血小板数まで回復するために１５日を要して
いる。この結果より、実施例５６で精製されたヒトＴＰ
Ｏは放射線照射後の血小板減少からの回復期間を短縮す
ることが認められ、放射線照射後の血小板減少症治療効
果が認められた。 ＜実施例７５＞ ｈＴＰＯ１６３による血小板増加作用 あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンタ
ー（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定
した正常なＣ３Ｈ／ＨｅＮ系雄性マウス１５匹を無作為
に４群（コントロール群、Ａ，Ｂ，Ｃ群）に分けた。１
群（コントロール群）には０．１％のマウス血清を含む
ＰＢＳを１日１回５日間連続で皮下に投与した。Ａ群に
は、実施例６５で得られたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＦａｓｔＦｌｏｗのＴＰＯ活性画分Ｆ２を０．１％のマ
ウス血清を含むＰＢＳで希釈しｈＴＰＯ１６３を１日あ
たり、Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量として約４
０，０００，０００／ｋｇ体重、Ｂ群には同様にＭ−０
７ｅアッセイ系での相対活性量として約８，０００，０
００／ｋｇ体重、そしてＣ群にも同様にＭ−０７ｅアッ
セイ系としての相対活性量として約１，６００，０００
／ｋｇ体重の割合で５日間連続で皮下に投与した。投与
開始後６、８、１０、１２日目にそれぞれのマウスの眼
窩静脈より経日的に採血し、マイクロセルカウンター
（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定し
た。血小板数の推移を図３０に示した。すなわち、コン
トロール群では血小板数にほとんど変動が見られなかっ
た。ＴＰＯ投与群では、いずれの群においても投与開始
８日目に最大となるような血小板数の増加が認められ
た。また、各投与群の間には用量依存性が認められた。
すなわち、Ａ群では、６日目に約８８％、８日目に約１
００％の増加が見られ、１０日目においても約９７％の
増加を維持し、いずれもコントロール群との間に有意差
（ｐ〈０．０１：ダネットの多重比較検定）が認められ
た。Ｂ群においても同様に増加が見られたが、増加作用
はＡ群には及ばないものの６、８日目にはそれぞれ約６
５％、約８４％の増加を認め、コントロール群との間に
有意差（ｐ〈０．０１もしくはｐ〈０．０５：ダネット
の多重比較検定）が認められた。Ｃ群における増加作用
はＢ群よりもさらに弱かったが、最高値に達した８日目
には約３１％の増加が見られた。以上の結果より、実施
例６５で精製されたｈＴＰＯ１６３には、血小板数を増
加させること、またその作用には用量依存性があること
が確認された。 ＜実施例７６＞ ｈＴＰＯ１６３による血小板減少症治療効果 ８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ雄性マウス１００匹に塩酸ニム
スチン（ＡＣＮＵ）を５０ｍｇ／ｋｇ体重の割合で静脈
内投与した後、無作為に各々２５匹の４群（コントロー
ル，Ａ，Ｂ，Ｃ群）に分け、その翌日（Ｄａｙ １）よ
りコントロール群にはＰＢＳを５ｍｌ／ｋｇ体重の割合
で１日１回連日皮下投与し、Ａ群には実施例６５で得ら
れたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの
ＴＰＯ活性画分Ｆ２をＰＢＳで希釈し、ｈＴＰＯ１６３
をＭ−０７ｅアッセイ系における相対活性量として約１
６，０００，０００／ｋｇ体重の割合で１日１回連日皮
下投与した。Ｂ群には同様にＭ−０７ｅアッセイ系にお
ける相対活性量として約４８，０００，０００／ｋｇ体
重の割合で、またＣ群にはＭ−０７ｅアッセイ系におけ
相対活性量として約１６０，０００，０００／ｋｇ体重
の割合で１日１回連日皮下投与した。投与開始後各々の
群でマウスを無作為に５群に分け、それぞれをＤａｙ
５、８、１０、１２そして１４に採血した。採血は眼窩
静脈より行い、マイクロセルカウンター（東亜医用電子
製、Ｅ−２５００）にて血小板数を測定した。血小板数
の推移を図３１に示した。すなわち、コントロール群で
はＡＣＮＵ投与後に血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ
８〜１０で最低（ＡＣＮＵ投与前値の約１５〜１６
％）となり、Ｄａｙ１２に約２８％、Ｄａｙ１４に約５
１％に回復したにすぎなかった。一方Ａ群では、Ｄａｙ
８にはＡＣＮＵ投与前値の約２５％にまで減少した
が、その後は増加に転じ、Ｄａｙ１０には約３４％に、
Ｄａｙ１２には約８９％に、そしてＤａｙ１４にはＡＣ
ＮＵ投与前値以上にまで回復した。Ｂ群では、Ｄａｙ
８にはＡＣＮＵ投与前値の約２３％にまで減少したが、
その後は増加に転じ、Ｄａｙ１０にはすでに約６４％に
まで回復し、Ｄａｙ１４にはＡＣＮＵ投与前値以上にま
で回復した。また、Ｃ群においても同様にＤａｙ１０以
降に増加に転じ、Ｄａｙ１２以降にはＡＣＮＵ投与前以
上にまで回復した。以上のように、いずれの群において
も血小板数の最低値はＤａｙ ８に観察されたが、ヒト
ＴＰＯ投与群ではコントロール群に比して減少が緩やか
であり、最低値の底上げが見られた。また、コントロー
ル群ではＤａｙ１０においても血小板数の回復はほとん
ど見られなかったが、ヒトＴＰＯ投与群ではＤａｙ１０
には程度の差はあるが全ての群で血小板数の回復が観察
され、５０μｇ／ｋｇ投与群ではＤａｙ１２にはすでに
ＡＣＮＵ投与前置以上にまで回復した。コントロール群
ではＤａｙ１４においてもＡＣＮＵ投与前置の約５１％
に回復したにすぎなかったことと比較すると、参考例２
で生産されたｈＴＰＯ１６３は、血小板減少からの回復
を促進する効果を有することが明らかとなった。以上、
実施例６５で精製されたｈＴＰＯ１６３は制ガン剤によ
り惹起される血小板減少症に対する治療効果が認められ
た。 ＜実施例７７＞ ヒトＴＰＯ誘導体の大腸菌における作製 大腸菌で発現されるＴＰＯの生物活性、安定性、および
溶解性の向上を試みて、ＴＰＯ誘導体を設計し、作製し
た。作製した誘導体は、配列番号１１のＬｅｕ１２９の
Ａｒｇ置換体（Ｌ１２９Ｒ）、Ｈｉｓ１３３のＡｒｇ置
換体（Ｈ１３３Ｒ）、Ｍｅｔ１４３のＡｒｇ置換体（Ｍ
１４３Ｒ）、Ｇｌｙ８２のＬｅｕ置換体（Ｇ８２Ｌ）、
Ｇｌｙ１４６のＬｅｕ置換体（Ｇ１４６Ｌ）、Ｓｅｒ１
４８のＰｒｏ置換体（Ｓ１４８Ｐ）、Ｌｙｓ５９のＡｒ
ｇ置換体（Ｋ５９Ｒ）およびＧｌｎ１１５のＡｒｇ置換
体（Ｑ１１５Ｒ）である。ＴＰＯ誘導体作製のための鋳
型としては、実施例４２に記載のｈ６Ｔ（１−１６３）
を用い、変異導入のため以下に示すオリゴＤＮＡを合成
した。 以下に示す変異プラスミドはすべてＳｃｕｌｐｔｏｒイ
ンビトロミュータジェネシスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ
社製）を用いて作製した。実施例４２に記載のプラスミ
ドｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）から得られる
Ｘｂａ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＩＩ ＳＫ−（東洋紡績社製）のＸｂａ Ｉ−Ｈ
ｉｎｄ ＩＩＩ切断部位間に挿入して、プラスミドｐＳ
ＫＴＰＯを作製した。プラスミドｐＳＫＴＰＯは大腸菌
ＪＭ１０９に保持させた。ヘルパーファージＭ１３Ｋ０
７（宝酒造社製）を用いてｐＳＫＴＰＯから一本鎖ＤＮ
Ａを調整し、上記の変異用合成オリゴＤＮＡを用いて、
キットに添付のプロトコールに従い、変異プラスミドを
作製した。得られた候補プラスミドについて挿入断片の
塩基配列を決定し、目的とする部位が変異されているこ
とを確認した。上記で作製したすべてのｐＳＫＴＰＯの
誘導体よりＸｂａ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を抽出
し、プラスミドｐＣＦＭ５３６のＸｂａ Ｉ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位間に挿入した後、大腸菌２６１に形質
転換し、目的とするＴＰＯ誘導体を発現させる形質転換
体を完成させた。目的とするＴＰＯ誘導体をコードする
遺伝子を含む形質転換体の培養は、実施例４３に従って
実施した。得られたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体の
凍結菌体（約３ｇ）に、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ
ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ８．５）を約３０ｍＬ加え、懸濁した後、氷冷
下１分間の間隔をおいて１分間のソニケーション（超音
波破砕機を使用）を５回行なった。破砕した菌体を遠心
チューブに移し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠
心し、ペレットを集めた。このペレットに、８Ｍグアニ
ジン塩酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦを含
む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）約３０ｍＬを加
えて懸濁し、さらに約５０ｍｇのＤＴＴを加え、室温に
て１〜２時間攪拌し、蛋白質試料を還元した。還元後、
２Ｍ塩酸溶液を用いて試料のｐＨを５に調整し、４℃に
放置した。還元した蛋白質試料を、３０％グリセロー
ル、３Ｍ尿素、３ｍＭシスタミン、１ｍＭ Ｌ−システ
インを含む１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．５、
約１．５Ｌ）に対して希釈した。希釈は、室温で一晩か
けて実施した。希釈後の試料溶液を室温で２日間攪拌
し、試料蛋白質を充分に酸化した後、８０００ｒｐｍで
４５分間遠心し、不溶物を除去した。遠心後の上澄みを
６Ｍリン酸を用いてｐＨ６．８に調整し、イオン交換水
で２倍に希釈した後、不溶物をフィルターペーパー（東
洋濾紙製、＃２、直径９０ｍｍ）２枚を用いてろ過し
た。ろ液をイオン交換樹脂（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）のカラ
ム（２．６ｘ１０ｃｍ）に吸着させた後、１５％グリセ
ロール、１Ｍ尿素を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）約４００ｍＬで洗った後、１５％グリセロール
を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）約３００ｍ
Ｌでカラムを平衡化した。目的試料の溶出には、１５％
グリセロールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液から０．５Ｍ
食塩を含む同緩衝液までの直線濃度勾配を用い、流速１
ｍＬ／ｍｉｎで行なった。カラムからの蛋白質の溶出を
２８０ｎｍにおける紫外吸収で追跡し、目的蛋白質を含
むフラクションを集めた（約３０〜４０ｍＬ）。このフ
ラクションを遠心濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １
０、Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて約２ｍＬに濃縮した
後、逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて精製し
た。この時、カラムにはＷａｔｅｒｓ社製μＢｏｎｄａ
ｓｐｈｅｒｅ Ｃ４（３．９ｘ１５０ｍｍ）を用い、蛋
白質の溶出には、０．０５％ＴＦＡ溶液である溶離液Ａ
と、７０％２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ，３０％ＣＨ３ＣＮお
よび０．０２％ＴＦＡを含む溶離液Ｂを用い、Ｂ溶離液
の濃度を４０分間で１％から１００％まで変化させ、目
的蛋白質を溶出させた。ＴＰＯ誘導体は、この条件で
は、いずれも約３０分の位置に溶出された。精製された
ＴＰＯ誘導体の活性測定を行なうため、溶出された誘導
体を集め、２Ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液に対して２日間
透析した後、遠心濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １
０、Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮し、Ｍ−０７ｅア
ッセイに供した。調製された各ＴＰＯ誘導体は、いずれ
も対照として用いたｈ６Ｔ（１−１６３）と同様の生物
活性を示した（図３２、図３３参照）。以下、製剤例を
示す。 ＜製剤実施例１＞実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分
を濃縮し、無菌処理した後−２０℃で凍結された凍結物
を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例２＞実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分
を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍ
ｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍
結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例３＞実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分
を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍｌバイアル瓶に
充填し注射剤とした。 ＜製剤実施例４＞実施例６５で得られたｈＴＰＯ１６３
画分を濃縮し、これを無菌処理した後−２０℃で凍結さ
れた凍結物を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例５＞実施例５６で得られたｈＴＰＯ１６３
画分を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に
５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓し
た凍結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例６＞実施例６５で得られたｈＴＰＯ１６３
画分を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍｌバイアル
瓶に充填し注射剤とした。 ＜製剤実施例７＞参考例実施例５７で得られたヒトＴＰ
Ｏ画分を濃縮し、これを無菌処理した後−２０℃で凍結
された凍結物を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例８＞実施例５７で得られたヒトＴＰＯ画分
を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍ
ｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍
結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例９＞実施例５７で得られたヒトＴＰＯ画分
を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍｌバイアル瓶に
充填し注射剤とした。
３）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢＬ
（ＢＨ）（１２３−３３２）を同じ制限酵素で消化して
得られた約６４０ｂｐの断片を連結してクローンｐＢＬ
（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−３３４）を作成した。さらに実施
例５２で作成したＰＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（１−１６
３）をＸｂａＩ，ＳｆｉＩで消化して得られた約２７０
ｂｐの断片を、同じ制限酵素で消化したｐＢＬ（ＸＨ）
ｈ６Ｔ（１−３３４）に連結してクローンｐＢＬ（Ｘ
Ｈ）ｈＭＫＴ（１−３３４）を作成した。ｐＢＬ（Ｘ
Ｈ）ｈＭＫＴ（１−３３４）をＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化後、変異型のヒトＴＰＯアミノ酸１−３３２を
コードする約１０４０ｂｐの大きさのフラグメントを回
収して精製後、ＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐ
ＣＦＭ５３６（特表昭６０−５０１９８８）にクローニ
ングした（宿主はｐＭＷ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９９３
３）で予め形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を
使用した）。ここで得られたクローンをｐＣＦＭ５３６
／ｈＭＫＴ（１−３３２）とし、この発現ベクターを有
する大腸菌株を変異型のｈＭＫＴ（１−３３２）タンパ
ク発現用の形質転換体とした。この発現プラスミドは、
配列表（配列番号１４）に示されたＤＮＡ配列を含んで
いる。ここで得られた形質転換株を、アンピシリン５０
μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン１２．５μｇ／ｍｌを含
むＬＢ培地６０ｍｌに３０℃で一晩振盪培養し、この培
養液２５ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ
培地１０００ｍｌに加えて、ＯＤはＡ６００が１．０−
１．２に至るまで３０℃で振盪培養した。次いで最終温
度が、４２℃になるように６５℃の約３３０ｍｌＬＢ培
地を添加し、さらに３時間４２℃で振盪培養して変異型
のヒトＴＰＯ、ｈＭＫＴ（１−３３２）タンパクの発現
を誘導した。この培養菌体を直接サンプルとして用いて
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには第一
化学社製のマルチゲル１５／２５を用い、泳動後にクマ
シーブルー染色を行ったところｈＭＫＴ（１−３３２）
タンパク質の発現を誘導したものに関しては、分子量約
３５ｋＤのところに発現誘導に特異的なタンパク質が検
出された。一方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲル上のタンパ
ク質をニトロセルロース膜にエレクトロプロッティング
し、実施例４５で作製した抗ＨＴ１ペプチド抗体と反応
させ発色させたところ、分子量約３５ｋＤのところにバ
ンドが検出されたことから、ｈＭＫＴ（１−３３２）の
発現が確認された。 ＜実施例６７＞ ヒトＴＰＯ置換誘導体の作製とＣＯＳ７細胞での発現〜
活性確認 ヒトＴＰＯのアミノ酸の一部を置換した誘導体が活性を
有するかどうかを以下のとおり検討した。本実施例で用
いた動物細胞発現ベクターｐＳＭＴ２０１は以下のよう
に作製した。まず、マウスエリスロポエチンレセプター
ｃＤＮＡを含む発現プラスミドｐＸＭ−ｍＥＰＯＲｎ
（Ｄａｎａ Ｆａｒｂｏｒ 癌研究所Ｄ′−Ａｎｄｒｅ
ａ博士より入手、Ｃｅｌｌ：５７巻、２７７−２８５頁
（１９８９））を制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで
処理した後、アガロースゲル電気泳動しマウスエリスロ
ポエチンレセプターｃＤＮＡ部分を除くｐＸＭ ベクタ
ー断片を回収した。次に回収したｐＸＭ発現ベクターに
種々のクローニング用制限酵素部位を導入するための２
本の合成オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製ＤＮＡ合成機
を用いて作製した。合成したオリゴヌクレオチドの塩基
配列を以下に示す。 この２本のオリゴヌクレオチドを混合し、アニーリング
させ２本鎖オリゴヌクレオチドとした後、上記で回収し
たｐＸＭベクター断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
製）で結合させ、発現ベクターｐＤＭＴ２０１を得た。
次にこの発現ベクターｐＤＭＴ２０１に含まれるマウス
ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを除去するためにｐＤＭＴ２０１ベ
クター及びｐＥＦ１８Ｓベクターを制限酵素Ｎｏｔ Ｉ
およびＨｐａ Ｉで処理後アガロースゲル電気泳動し、
ｐＤＭＴ２０１ベクターＤＮＡ由来の大きい方の断片と
ｐＥＦ１８ＳベクターＤＮＡ由来の小さい方の断片を回
収し、Ｔ ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合させる
ことにより発現ベクターｐＳＭＴ２０１を得た。このベ
クターは、図２１に示したとおりＳＶ４０の複製開始領
域およびエンハンサー配列、アデノウィルス主要後期プ
ロモーター配列、アデノウィルストリパータイトリーダ
ー配列、スプライス信号配列、ＳＶ４０初期ポリアデニ
ル部位配列、アデノウィルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子配列、
ｐＵＣ １８の複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝子
（Ａｍｐｒ）を含み、目的とする遺伝子を連結するため
の制限酵素配列として、ＢｇＩ ＩＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｋ
ｐｎＩ、Ｘｈｏ Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｓｍａ Ｉ、Ｓｐｅ
Ｉ、およびＮｏｔ Ｉ部位を有する。実施例３０で示
した完全長ヒトＴＰＯ ｃＤＮＡを含むｐＨＴＰ１を制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびｓｐｅＩを用いて酵素消化し得
られた完全長ヒトＴＰＯ ｃＤＮＡ断片を、同様に制限
酵素消化したベクターｐＳＭＴ２０１にサブクローニン
グすることによりプラスミドｐＳＭＴ２０１−ｈＴＰＯ
を得た。以上のようにして得たプラスミドｐＳＭＴ２０
１−ｈＴＰＯを鋳型にして、まず誘導体作製用の鋳型と
なるプラスミドβＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅを以下のよ
うに作製した。βＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅではヒトＴ
ＰＯの５′非翻訳側に、Ａｎｎｗｅｉｌｅｒらの方法に
従いウサギのβ−グロビンリーダー配列の付加を試みた
（Ａｎｎｗｅｉｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９巻、３７５０頁）。まず以下
に示す化学合成した２本のＤＮＡ鎖、そしてベクターＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（東洋紡績社製）を制限
酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで消化した断片とをライゲ
ーションすることによりリーダー配列が挿入されたベク
ターβＧＬ／ｐＢｌｕｅを作製した。 ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通り。 ＰＣＲはプラスミドｐＳＭＴ２０１−ｈＴＰＯ ＤＮＡ
１ｎｇを鋳型として使用し、合成したプライマーをそれ
ぞれ１０μＭ使って実施した。ＴａＫａＲａＰＣＲ Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用
いて、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に
より１００μｌの容量でＰＣＲ（９４℃１分間、５５℃
２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５
秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を２０サイクル）を
行った。ＰＣＲ産物をクロロホルム抽出し、エタノール
沈殿を２回行った後１００μｌのＴＥバッファーに溶解
した。これを制限酵素ｓｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化
後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を
行った。得られた沈殿を１０μｌのＴＥバッファーに溶
解後、同様に制限酵素消化したベクターβＧＬ／ｐＢｌ
ｕｅにサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コ
ンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を使用）。
得られた形質転換体のうち２０クローン選択し、プラス
ミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実
施した。精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａｑＤ
ｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオ
システムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ
社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーにより塩基配列の確
認を行った。βＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅをコードする
プラスミドは全長にわたり塩基配列の置換がなく予想通
りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持つことを確認した。さらに
βＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅを制限酵素ＢｇｌＩＩ、Ｓ
ｐｅＩで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿を行った。得られた沈殿を１０μｌのＴＥバ
ッファーに溶解し、同様に制限酵素消化したベクターｐ
ＳＭＴ２０１にサブクローニングした（宿主菌は東洋紡
績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を
使用）。本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
［Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８
９）］に記載されている方法に従い、形質転換体からプ
ラスミドＤＮＡを調製した。得られた発現ベクターｐＳ
ＭＴ／βＧＬ−ＴＰＯは、図２１に示したｐＳＭＴ２０
１ベクターのスプライス信号配列の下流にある制限酵素
配列Ｂｇｌ ＩＩ／Ｓｐｅ Ｉ部位にβ−グロビンリー
ダー配列及びヒトＴＰＯｃＤＮＡが接続された構造を有
している。このｐＳＭＴ／βＧＬ−ＴＰＯベクターＣＯ
Ｓ７細胞へのトランスフェクション実験に用いた。ヒト
ＴＰＯ置換誘導体の作製にはＰＣＲを利用し、Ｉｔｏら
の方法に従った（Ｉｔｏ ら、Ｇｅｎｅ、１０２巻、６
７−７０頁 １９９１年）。ここでは、ヒトＴＰＯの２
５位のＡｒｇ残基をＡｓｎ残基に置換した誘導体、並び
に３３位のＨｉｓ残基をＴｈｒ残基に置換した誘導体の
作製を試みた。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下
の通り。 第１段階のＰＣＲはプラスミドβＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌ
ｕｅ ＤＮＡ１ｎｇを鋳型として使用し、合成したプラ
イマーをそれぞれ１０μＭ使って実施した（プライマー
の組み合わせは［１］△ＢｇｌＩＩとｅｎｄ、［２］Ｔ
７とＮ３、［３］Ｔ７と０９）。ＴａＫａＲａ ＰＣＲ
ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造社製）を
用いて、Ｐｒｏｇｒａｍｍｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に
より１００μｌの容量でＰＣＲ（９４℃１分間、５５℃
２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５
秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を１７サイクル）を
行った。それぞれのＰＣＲ産物をクロロホルム抽出し、
エタノール沈殿を２度行った後１００μｌのＴＥバッフ
ァーに溶解した。このＰＣＲ産物を２種類１μｌずつ用
いて第２段階のＰＣＲを行った。鋳型の組み合わせは
［１］と［２］のＰＣＲ産物、［１］と［３］のＰＣＲ
産物である。用いたプライマーはすべてＴ７とｅｎｄの
組み合わせである。９４℃で１０分間インキュベートし
た後ＴａＫａＲａ Ｔａｑを加え、９４℃１分間、５５
℃２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４
５秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を９サイクル行っ
た。それぞれのＰＣＲ産物に５ｍｇ／ｍｌ ｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅ Ｋを１μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡを２μ
ｌ、２０％ＳＤＳを２μｌ加え３７℃で３０分間保温し
Ｔａｑを失活させた後、フェノール／クロロホルム抽
出、エタノール沈殿し２０μｌの滅菌水に溶解した。こ
れを制限酵素ＢｇｌＩＩＩ、ＳｐｅＩで消化後、フェノ
ール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。得
られた沈殿を１０μｌのＴＥバッファーに溶解後、同様
に制限酵素消化しアルカリホスファターゼ（仔ウシ腸、
ベーリンガー・マンハイム社製）処理した発現ベクター
ｐＳＭＴ２０１にサブクローニングした（宿主菌は東洋
紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９
を使用）。得られた形質転換体のうち、それぞれ２クロ
ーンずつ選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は
本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａ
ｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に
記載されているようにして実施した。精製したプラスミ
ドＤＮＡについてはＴａｑＤｙｅ Ｄｅｏｘｙ ＴＭＴ
ｅｒｍｉｎａｔｅｒＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、
アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシーク
エンサーにより塩基配列の確認を行った。［１］と
［３］のＰＣＲ産物に由来するプラスミドには意図した
アミノ酸置換［ＨｉＳ３３（ＣＡＣ）→Ｔｈｒ（ＡＣ
Ｃ）］をもち、かつＣ末端（Ｇｌｙ３３２）に以下のア
ミノ酸配列からなるペプチドが付加されたＴＰＯ置換誘
導体（０９／ＴＰＯ）をコードするｃＤＮＡが含まれて
いることが確認された。一方、［１］と［２］のＰＣＲ
産物に由来するプラスミドは意図したアミノ酸置換［Ａ
ｒｇ２５（ＡＧＡ）→Ａｓｎ（ＡＡＣ）］以外に更に１
カ所のアミノ酸置換［Ｇｌｕ２３１（ＧＡＡ）→Ｌｙｓ
（ＡＡＡ）］もち、かつＣ末端（Ｇｌｙ３３２）に以下
のアミノ酸配列からなるペプチドが付加されたＴＰＯ置
換誘導体（Ｎ３／ＴＰＯ）をコードするｃＤＮＡを含ん
でいることが判明した。 ペプチド： ＴＳＩＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＶＨＨＨＨＨＨ 得られたそれぞれのクローンのＣＯＳ７細胞へのトラン
スフェクションは、実施例３５に従いクロロキン処理を
含むＤＥＡＥ−デキストラン法で行った。すなわちプラ
スミドＤＮＡ４０μｇを使用し、トランスフェクション
５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清をセン
トリコン−３０（アミコン社製）で２０倍に濃縮しＭ−
０７ｅアッセイ系で評価した。その結果、ヒトＴＰＯ置
換誘導体Ｎ３／ＴＰＯ、０９／ＴＰＯをコードするプラ
スミドでトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞培養上清中
に、いずれも用量依存的にＴＰＯ活性が検出された（図
２２参照）。 ＜実施例６８＞ ヒトＴＰＯ挿入・欠失誘導体の作製とＣＯＳ７細胞での
発現〜活性確認 ｈＴＰＯ１６３にアミノ酸を挿入した誘導体またはｈＴ
ＰＯ１６３からアミノ酸を欠失した誘導体が活性を有す
るかどうか検討した。作製した誘導体は配列番号１３の
Ｈｉｓ３３欠失体（ｄＨ３３）、Ｇｌｙ１１６欠失体
（ｄＧ１１６）、Ａｒｇ１１７欠失体（ｄＲ１１７）、
Ｈｉｓ３３とＰｒｏ３４間へのＴｈｒ挿入体（Ｔ３
３’）、Ａｌａ挿入体（Ａ３３’）、Ｇｌｙ挿入体（Ｇ
３３’）およびＧｌｙ１１６とＡｒｇ１１７の間へのＡ
ｓｎ挿入体（Ｎ１１６’）、Ａｌａ挿入体（Ａ１１
６’）、Ｇｌｙ挿入体（Ｇ１１６’）である。これらの
うちＴ３３’、Ｎ１１６’はそれぞれムチン型糖鎖、Ａ
ｓｎ結合型糖鎖の導入を意図した誘導体である。誘導体
の作製にはＰＣＲを利用し、Ｉｔｏらの方法に従った
（Ｉｔｏら、Ｇｅｎｅ、１０２巻、６７−７０頁、１９
９１）。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通
り。 第１段階のＰＣＲは実施例６７で作製したプラスミドβ
ＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅ ＤＮＡ１ｎｇを鋳型として
使用し、合成したプライマーをそれぞれ１０μＭ使って
実施した。プライマーの組み合わせは［１］ｄＲＩとｅ
ｎｄＮｏｔＩ、［２］Ｔ７と変異導入プライマー（ｄＨ
３３，Ａ３３′，Ｇ３３′，Ｔ３３′，ｄＧ１１６，ｄ
Ｒ１１７，Ａ１１６′，Ｇ１１６′，Ｎ１１６′）であ
る。ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、Ｐｒｏｇｒａｍｍ
ｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ
Ｒｅｓｅｒｃｈ社製）により１０μｌの容量でＰＣＲを
行った。［１］の反応は、９４℃１分間、４５℃２分
間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５秒
間、４５℃１分間、７２℃１分間を１７サイクル。
［２］の反応は、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃
２分間を３サイクル、続けて９４℃４５秒間、５５℃１
分間、７２℃１分間を１７サイクル。それぞれのＰＣＲ
産物をクロロホルム抽出し、エタノール沈殿を２度行っ
た後１００μｌのＴＥバッファーに溶解した。次に、
［１］と［２］のＰＣＲ産物をそれぞれ１μｌずつ用い
て第２段階のＰＣＲを行った。用いたプライマーはすべ
てＴ７とｅｎｄＮｏｔＩの組み合わせである。９４℃で
１０分間インキュベートした後ＴａＫａＲａ Ｔａｑを
加え、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃２分間を３
サイクル、続けて９４℃４５秒間、５５℃１分間、７２
℃１分間を９サイクル行った。それぞれのＰＣＲ産物に
５ｍｇ／ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ を１μｌ、
０．５Ｍ ＥＤＴＡを２μｌ、２０％ＳＤＳを２μｌ加
え３７℃で３０分間保温しＴａｑを失活させた後、フェ
ノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し２０μｌ
の滅菌水に溶解した。これを制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｎｏ
ｔＩで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノ
ール沈殿を行った。得られた沈殿を１０μｌのＴＥバッ
ファーに溶解後、同様に制限酵素消化しアルカリホスフ
ァターゼ（仔ウシ腸、ベーリンガー・マンハイム社製）
処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニング
した（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９を使用）。得られた形質転換体から
プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｓａｍｂｏｏｋら、ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにし
て実施した。精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａ
ｑ Ｄｙｅ ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ Ｃ
ｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライド
バイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシス
テムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーにより塩基配
列の確認を行った。その結果、ｄＨ３３、Ａ３３’、Ｔ
３３’、ｄＧ１１６、ｄＲ１１７、Ａ１１６’、Ｇ１１
６’、Ｎ１１６’をコードするプラスミドは全長にわた
り意図した部位以外に塩基配列の置換がなく予想通りの
ＴＰＯｃＤＮＡ配列を持つことを確認した。また、Ｇ３
３’では意図した部位以外に１カ所のアミノ酸置換をも
たらす塩基置換［Ｐｒｏ３８（ＣＣＴ）→Ｓｅｒ（ＴＣ
Ｔ）］が認められた。得られたそれぞれのクローンのＣ
ＯＳ７細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に
従って行った。すなわちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使
用し、クロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法
を用いたトランスフェクションを行い、４−５日後に培
養上清を回収した。回収した培養上清をＭ−０７ｅアッ
セイ系で評価した。その結果、アミノ酸挿入・欠失誘導
体をコードするプラスミドでトランスフェクトしたＣＯ
Ｓ７細胞培養上清中に、いずれも用量依存的にＴＰＯ活
性が検出された（図２３参照）。ＴＰＯ誘導体をコード
するｃＤＮＡを含まない発現プラスミドｐＥＦ１８Ｓを
トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞培養上清には活
性が認められなかった。 ＜実施例６９＞ ＴＰＯによる血小板増加作用 あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンタ
ー（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定
した正常な８週齢のＩＣＲ系雄性マウス２０匹を無作為
に４群に分けた。そのうちの１群（コントロール−ｉｖ
群）には１００μｌのＰＢＳを１日１回５日間連続で静
脈内に投与し、他の１群（ＴＰＯ−ｉｖ群）には実施例
５６で得られたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
ＦｌｏｗのヒトＴＰＯ活性画分Ｆ２の濃縮液をＮＡＰ−
２５カラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ
番号１７−０８５２−０２）でＰＢＳに置換し、さらに
ＰＢＳで希釈したもののうち１００μｌ（Ｍ−０７ｅア
ッセイ系での相対活性量２１１，９００を含む）を１日
１回５日間連続で静脈内に投与した。また、別の１群
（コントロール−ｓｃ群）には１００μｌのＰＢＳを１
日１回５日間連続で皮下に投与し、他の１群（ＴＰＯ−
ｓｃ群）にはＴＰＯ−ｉｖ群と同様に１００μｌを１日
１回５日間連続で皮下に投与した。投与開始後６、８、
１０、１３、１５日目にそれぞれのマウスの眼窩静脈よ
り経日的に採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用
電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定した。血小板
数の推移を図２４に示した。すなわち、コントロール−
ｉｖ群では血小板数は最も増加した６日目においても投
与前と比較して４４％の増加であり、コントロール−ｓ
ｃ群では最も増加した８日目において４７％増加が観察
されたにすぎなかった。その一方で、ＴＰＯ−ｉｖ群で
は６日目には投与前と比較して１７７％の増加がみら
れ、その後も増加を続け１０日目には４６９％という最
大の増加が観察された。また、ＴＰＯ−ｓｃ群では６日
目にすでに３４７％の増加が見られ、８日後には最大の
４９３％の増加が観察された。以上の結果より、ヒトＴ
ＰＯは種差、投与ルートに関係なく血小板の増加作用を
有することが確認された。 ＜実施例７０＞ ＴＰＯによる血小板増加作用 あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンタ
ー（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定
した正常な１１週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪ系雄性マウス１６
匹を無作為に４群に分けた。そのうちの１群（コントロ
ール群）には１００μｌのＰＢＳを１日１回５日間連続
で皮下に投与した。他の１群（ＴＰＯ−１群）には実施
例５６で得られたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ
のヒトＴＰＯ活性画分Ｆ１をＮＡＰ−２５でＰＢＳに置
換し、さらにＰＢＳで希釈したもののうち１００μｌ
（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量８３，０００を
含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与した。別の１
群（ＴＰＯ−２群）にはＴＰＯ−１群で投与したＴＰＯ
活性画分をさらにＰＢＳで２倍に希釈したもののうち１
００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量４１，
５００を含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与し
た。また最後の１群（ＴＰＯ−３群）にはＴＰＯ−２群
で投与したＴＰＯ活性画分をさらにＰＢＳで２倍に希釈
したもののうち１００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での
相対活性量２０，７５０を含む）を１日１回５日間連続
で皮下に投与した。投与開始後６、８、１０、１２日目
にそれぞれのマウスの眼窩静脈より経日的に採血し、マ
イクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）
にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図２５に示
した。すなわち、コントロール群では血小板数にほとん
ど変動が見られなかった。ＴＰＯ投与群では、いずれの
群においても投与開始８日目に最大となるような血小板
数の増加が認められた。また、各投与群の間には用量依
存性が認められた。すなわち、ＴＰＯ−１群では、６日
目に既に約２００％の増加が見られ、８日目には約２７
０％にまで増加した。その後減少したが、１２日目にお
いても約６５の増加が見られコントロール群との間に有
意差（ｐ〈０．０１：ダネットの多重比較検定：Ｄｕｎ
ｎｅｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔ
ｅｓｔ）が認められた。ＴＰＯ−２群においても同様に
増加が見られたが、増加作用はＴＰＯ−１群には及ばな
いものの６、８日目にはそれぞれ約１４０％、約１６０
％の増加を認めた。また、１２日目にはコントロール群
とほぼ同様のレベルにまで減少した。ＴＰＯ−３群にお
ける増加作用はＴＰＯ−２群よりもさらに弱かったが、
最高値に達した８日目には約１１０％の増加が見られて
おり、コントロール群との間に有意差（ｐ〈０．０１）
も認められた。以上の結果より、ヒトＴＰＯは、マウス
の系統に関係なく血小板数を増加させること、またその
作用には用量依存性があることが確認された。 ＜実施例７１＞ ＴＰＯによる制がん剤投与による血小板減少症阻止効果 ８週齢のＩＣＲ雄性マウス３０匹に５−ＦＵを２００ｍ
ｇ／ｋｇ体重の割合で静脈内投与した後、無作為に各々
１５匹の２群に分け、その翌日（Ｄａｙ １）より一方
の群（コントロール群）には１００μｌのＰＢＳを１日
１回５日間連続で皮下に投与した。またもう一方の群
（ＴＰＯ群）には、実施例６９で用いたヒトＴＰＯ活性
画分Ｆ２ １００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対
活性量２１１，９００を含む）を１日１回５日間連続で
皮下に投与した。投与開始後Ｄａｙ４、６、８にそれぞ
れの群より各々５匹のマウスを無作為に抽出し、眼窩静
脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子
製、Ｅ−２５００）にて血小板数を測定した。血小板数
の推移を図２６に示した。すなわち、コントロール群で
は５−ＦＵ投与後血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ
６には最低値（５−ＦＵ投与前値の約２８％）に達した
が、Ｄａｙ ８には減少の反動で約１．３倍にまで増加
した。ＴＰＯ群においても５−ＦＵ投与後血小板数は経
日的に減少し、Ｄａｙ ６には最低値（５−ＦＵ投与前
値の約５２％）に達したがＤａｙ ４と６の血小板数に
ほとんど差はなく、また、Ｄａｙ６においてはコントロ
ール群に比して有意（ｐ〈０．０５：ダネットの多重比
較検定）に高値を維持した。Ｄａｙ ８においては、５
−ＦＵ投与前値の約２００％にまで増加した。以上の結
果より、ヒトＴＰＯには、制がん剤による血小板減少を
阻止する効果があることが確認された。 ＜実施例７２＞ ＴＰＯによる血小板減少症治療効果 ７週齢のＩＣＲ雄性マウス３６匹に塩酸ニムスチン（Ａ
ＣＮＵ）を５０ｍｇ／ｋｇ体重の割合で静脈内投与した
後、無作為に各々１８匹の２群に分け、その翌日（Ｄａ
ｙ １）より一方の群（コントロール群）には２００μ
ｌのＰＢＳを１日２回連日皮下投与し、またもう一方の
群（ＴＰＯ群）には、実施例７０で用いたＴＰＯ活性画
分Ｆ１にＰＢＳで希釈せずに０．０４％の割合でＴｗｅ
ｅｎ−８０を添加したもの２００μｌ（Ｍ−０７ｅアッ
セイ系での相対活性量３６０，０００を含む）を１日２
回連日皮下投与した。投与開始後各々の群でマウスを無
作為に３群に分け、それぞれをＤａｙ ５、１２に採血
する群、Ｄａｙ ８、１４に採血する群そしてＤａｙ１
０に採血する群とした。採血は眼窩静脈より行い、マイ
クロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）に
て血小板数を測定した。血小板数の推移を図２７に示し
た。すなわち、コントロール群ではＡＣＮＵ投与後に血
小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ８〜１０で最低（各々
ＡＣＮＵ投与前値の約２９％）となり、Ｄａｙ１２に約
４９％、Ｄａｙ１４に約７４％に回復したにすぎなかっ
た。一方ＴＰＯ群では、Ｄａｙ ５にはＡＣＮＵ投与前
値の約３８％にまで減少した。その後は増加に転じ、Ａ
ＣＮＵ投与前値に比してＤａｙ ８では約６３％にまで
回復し、Ｄａｙ１０以降はＡＣＮＵ投与前値以上の血小
板数を示し、Ｄａｙ１２では約３００％、Ｄａｙ１４で
は約４００％にまで増加した。以上のように、コントロ
ール群では減少の過程にあるＤａｙ ８〜１０において
既にＴＰＯ群では増加に転じており、Ｄａｙ１０で既に
ＡＣＮＵ投与前値以上の血小板数まで増加していること
から、ヒトＴＰＯは制ガン剤により惹起される血小板減
少からの回復を促進する効果を有することが確認され
た。なお、実施例７１の結果を併せてもヒトＴＰＯには
制ガン剤の種類に関係なく血小板数の減少を阻止する効
果および血小板減少からの回復を促進する効果を有する
ことが期待される。 ＜実施例７３＞ ＴＰＯによるＢＭＴ施行後の血小板減少症治療効果 ７週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ系の雄性マウス４８匹に１０Ｇ
ｙの放射線を全身照射した後、同系のマウスの骨髄細胞
１×１０６個を直ちに静脈内投与した。そこで無作為に
２群に分け、翌日（Ｄａｙ １）より一方の群（コント
ロール群）にはＰＢＳを、他方の群（ＴＰＯ群）には実
施例７０で用いたＴＰＯ活性画分Ｆ１（Ｍ−０７ｅアッ
セイ系での相対活性量４４，０００を含む）をそれぞれ
１日１回１００μｌずつ２０日間連日で皮下投与した。
投与開始後Ｄａｙ ５、１０、１４、２１にそれぞれの
群より各々６匹のマウスを無作為に抽出し、眼窩静脈よ
り採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、
Ｅ−２５００）にて血小板数を測定した。血小板数の推
移を図２８に示した。すなわち、いずれの群においても
ＢＭＴ施行後に血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ１０
に最低（ＢＭＴ施行前の約３％）となった。その後は徐
々に回復し、Ｄａｙ１４にはコントロール群で約１１
％、ＴＰＯ群で約１３％となった。Ｄａｙ２１にはコン
トロール群では３７％に回復したにすぎなかったが、Ｔ
ＰＯ群では約６５％にまで回復し有意な回復促進効果が
認められた。以上の結果より、実施例５６で精製された
ヒトＴＰＯには、ＢＭＴ施行後の血小板数の回復を促進
する効果があることが確認された。 ＜実施例７４＞ ＴＰＯによる放射線照射後の血小板減少症治療効果 ８週齢のＩＣＲ系の雄性マウス３６匹に５ＧｙのＸ線を
全身照射した後、無作為に２群に分け、翌日（Ｄａｙ
１）より一方の群（コントロール群）にはＰＢＳを、他
方の群（ＴＰＯ群）には実施例７０で用いたＴＰＯ活性
画分Ｆ１（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量１，４
４０，０００を含む）をそれぞれ１日１回３日間連日で
皮下投与し、翌日よりＭ−０７ｅアッセイ系での相対活
性量３６０，０００を１日１回７日間連日で皮下投与し
た。投与開始後各々の群でマウスを無作為に３群に分
け、それぞれをＤａｙ ４、１１、２１に採血する群、
Ｄａｙ ７、１３に採血する群そしてＤａｙ９、１５に
採血する群とした。採血は眼窩静脈より行い、マイクロ
セルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血
小板数を測定した。図２９に血小板数の推移を示した。
すなわち、コントロール群ではＸ線照射後に血小板数は
経日的に減少し、Ｄａｙ９で最低（Ｘ線照射前値の約２
４％）となり、Ｄａｙ１１に約３８％、Ｄａｙ１３に約
６７％に回復し、Ｄａｙ１５にＸ線照射前値にまで回復
した。一方ＴＰＯ群では、Ｄａｙ ７にはＸ線照射前値
の約２４％にまで減少した。その後は増加に転じ、Ｘ線
照射前値に比してＤａｙ ９では約８２％にまで回復
し、Ｄａｙ１１以降はＸ線照射前値以上の血小板数を示
し、Ｄａｙ２１までその傾向は維持された。以上のよう
に、コントロール群では減少の過程にあるＤａｙ ９に
おいて既にＴＰＯ群では増加に転じており、Ｄａｙ１１
で既にＸ線照射前値以上の血小板数まで増加し、その後
も高値を維持した。一方、コントロール群ではＸ線照射
前値以上の血小板数まで回復するために１５日を要して
いる。この結果より、実施例５６で精製されたヒトＴＰ
Ｏは放射線照射後の血小板減少からの回復期間を短縮す
ることが認められ、放射線照射後の血小板減少症治療効
果が認められた。 ＜実施例７５＞ ｈＴＰＯ１６３による血小板増加作用 あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンタ
ー（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定
した正常なＣ３Ｈ／ＨｅＮ系雄性マウス１５匹を無作為
に４群（コントロール群、Ａ，Ｂ，Ｃ群）に分けた。１
群（コントロール群）には０．１％のマウス血清を含む
ＰＢＳを１日１回５日間連続で皮下に投与した。Ａ群に
は、実施例６５で得られたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＦａｓｔＦｌｏｗのＴＰＯ活性画分Ｆ２を０．１％のマ
ウス血清を含むＰＢＳで希釈しｈＴＰＯ１６３を１日あ
たり、Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量として約４
０，０００，０００／ｋｇ体重、Ｂ群には同様にＭ−０
７ｅアッセイ系での相対活性量として約８，０００，０
００／ｋｇ体重、そしてＣ群にも同様にＭ−０７ｅアッ
セイ系としての相対活性量として約１，６００，０００
／ｋｇ体重の割合で５日間連続で皮下に投与した。投与
開始後６、８、１０、１２日目にそれぞれのマウスの眼
窩静脈より経日的に採血し、マイクロセルカウンター
（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定し
た。血小板数の推移を図３０に示した。すなわち、コン
トロール群では血小板数にほとんど変動が見られなかっ
た。ＴＰＯ投与群では、いずれの群においても投与開始
８日目に最大となるような血小板数の増加が認められ
た。また、各投与群の間には用量依存性が認められた。
すなわち、Ａ群では、６日目に約８８％、８日目に約１
００％の増加が見られ、１０日目においても約９７％の
増加を維持し、いずれもコントロール群との間に有意差
（ｐ〈０．０１：ダネットの多重比較検定）が認められ
た。Ｂ群においても同様に増加が見られたが、増加作用
はＡ群には及ばないものの６、８日目にはそれぞれ約６
５％、約８４％の増加を認め、コントロール群との間に
有意差（ｐ〈０．０１もしくはｐ〈０．０５：ダネット
の多重比較検定）が認められた。Ｃ群における増加作用
はＢ群よりもさらに弱かったが、最高値に達した８日目
には約３１％の増加が見られた。以上の結果より、実施
例６５で精製されたｈＴＰＯ１６３には、血小板数を増
加させること、またその作用には用量依存性があること
が確認された。 ＜実施例７６＞ ｈＴＰＯ１６３による血小板減少症治療効果 ８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ雄性マウス１００匹に塩酸ニム
スチン（ＡＣＮＵ）を５０ｍｇ／ｋｇ体重の割合で静脈
内投与した後、無作為に各々２５匹の４群（コントロー
ル，Ａ，Ｂ，Ｃ群）に分け、その翌日（Ｄａｙ １）よ
りコントロール群にはＰＢＳを５ｍｌ／ｋｇ体重の割合
で１日１回連日皮下投与し、Ａ群には実施例６５で得ら
れたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの
ＴＰＯ活性画分Ｆ２をＰＢＳで希釈し、ｈＴＰＯ１６３
をＭ−０７ｅアッセイ系における相対活性量として約１
６，０００，０００／ｋｇ体重の割合で１日１回連日皮
下投与した。Ｂ群には同様にＭ−０７ｅアッセイ系にお
ける相対活性量として約４８，０００，０００／ｋｇ体
重の割合で、またＣ群にはＭ−０７ｅアッセイ系におけ
相対活性量として約１６０，０００，０００／ｋｇ体重
の割合で１日１回連日皮下投与した。投与開始後各々の
群でマウスを無作為に５群に分け、それぞれをＤａｙ
５、８、１０、１２そして１４に採血した。採血は眼窩
静脈より行い、マイクロセルカウンター（東亜医用電子
製、Ｅ−２５００）にて血小板数を測定した。血小板数
の推移を図３１に示した。すなわち、コントロール群で
はＡＣＮＵ投与後に血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ
８〜１０で最低（ＡＣＮＵ投与前値の約１５〜１６
％）となり、Ｄａｙ１２に約２８％、Ｄａｙ１４に約５
１％に回復したにすぎなかった。一方Ａ群では、Ｄａｙ
８にはＡＣＮＵ投与前値の約２５％にまで減少した
が、その後は増加に転じ、Ｄａｙ１０には約３４％に、
Ｄａｙ１２には約８９％に、そしてＤａｙ１４にはＡＣ
ＮＵ投与前値以上にまで回復した。Ｂ群では、Ｄａｙ
８にはＡＣＮＵ投与前値の約２３％にまで減少したが、
その後は増加に転じ、Ｄａｙ１０にはすでに約６４％に
まで回復し、Ｄａｙ１４にはＡＣＮＵ投与前値以上にま
で回復した。また、Ｃ群においても同様にＤａｙ１０以
降に増加に転じ、Ｄａｙ１２以降にはＡＣＮＵ投与前以
上にまで回復した。以上のように、いずれの群において
も血小板数の最低値はＤａｙ ８に観察されたが、ヒト
ＴＰＯ投与群ではコントロール群に比して減少が緩やか
であり、最低値の底上げが見られた。また、コントロー
ル群ではＤａｙ１０においても血小板数の回復はほとん
ど見られなかったが、ヒトＴＰＯ投与群ではＤａｙ１０
には程度の差はあるが全ての群で血小板数の回復が観察
され、５０μｇ／ｋｇ投与群ではＤａｙ１２にはすでに
ＡＣＮＵ投与前置以上にまで回復した。コントロール群
ではＤａｙ１４においてもＡＣＮＵ投与前置の約５１％
に回復したにすぎなかったことと比較すると、参考例２
で生産されたｈＴＰＯ１６３は、血小板減少からの回復
を促進する効果を有することが明らかとなった。以上、
実施例６５で精製されたｈＴＰＯ１６３は制ガン剤によ
り惹起される血小板減少症に対する治療効果が認められ
た。 ＜実施例７７＞ ヒトＴＰＯ誘導体の大腸菌における作製 大腸菌で発現されるＴＰＯの生物活性、安定性、および
溶解性の向上を試みて、ＴＰＯ誘導体を設計し、作製し
た。作製した誘導体は、配列番号１１のＬｅｕ１２９の
Ａｒｇ置換体（Ｌ１２９Ｒ）、Ｈｉｓ１３３のＡｒｇ置
換体（Ｈ１３３Ｒ）、Ｍｅｔ１４３のＡｒｇ置換体（Ｍ
１４３Ｒ）、Ｇｌｙ８２のＬｅｕ置換体（Ｇ８２Ｌ）、
Ｇｌｙ１４６のＬｅｕ置換体（Ｇ１４６Ｌ）、Ｓｅｒ１
４８のＰｒｏ置換体（Ｓ１４８Ｐ）、Ｌｙｓ５９のＡｒ
ｇ置換体（Ｋ５９Ｒ）およびＧｌｎ１１５のＡｒｇ置換
体（Ｑ１１５Ｒ）である。ＴＰＯ誘導体作製のための鋳
型としては、実施例４２に記載のｈ６Ｔ（１−１６３）
を用い、変異導入のため以下に示すオリゴＤＮＡを合成
した。 以下に示す変異プラスミドはすべてＳｃｕｌｐｔｏｒイ
ンビトロミュータジェネシスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ
社製）を用いて作製した。実施例４２に記載のプラスミ
ドｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）から得られる
Ｘｂａ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＩＩ ＳＫ−（東洋紡績社製）のＸｂａ Ｉ−Ｈ
ｉｎｄ ＩＩＩ切断部位間に挿入して、プラスミドｐＳ
ＫＴＰＯを作製した。プラスミドｐＳＫＴＰＯは大腸菌
ＪＭ１０９に保持させた。ヘルパーファージＭ１３Ｋ０
７（宝酒造社製）を用いてｐＳＫＴＰＯから一本鎖ＤＮ
Ａを調整し、上記の変異用合成オリゴＤＮＡを用いて、
キットに添付のプロトコールに従い、変異プラスミドを
作製した。得られた候補プラスミドについて挿入断片の
塩基配列を決定し、目的とする部位が変異されているこ
とを確認した。上記で作製したすべてのｐＳＫＴＰＯの
誘導体よりＸｂａ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を抽出
し、プラスミドｐＣＦＭ５３６のＸｂａ Ｉ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位間に挿入した後、大腸菌２６１に形質
転換し、目的とするＴＰＯ誘導体を発現させる形質転換
体を完成させた。目的とするＴＰＯ誘導体をコードする
遺伝子を含む形質転換体の培養は、実施例４３に従って
実施した。得られたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体の
凍結菌体（約３ｇ）に、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ
ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ８．５）を約３０ｍＬ加え、懸濁した後、氷冷
下１分間の間隔をおいて１分間のソニケーション（超音
波破砕機を使用）を５回行なった。破砕した菌体を遠心
チューブに移し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠
心し、ペレットを集めた。このペレットに、８Ｍグアニ
ジン塩酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦを含
む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）約３０ｍＬを加
えて懸濁し、さらに約５０ｍｇのＤＴＴを加え、室温に
て１〜２時間攪拌し、蛋白質試料を還元した。還元後、
２Ｍ塩酸溶液を用いて試料のｐＨを５に調整し、４℃に
放置した。還元した蛋白質試料を、３０％グリセロー
ル、３Ｍ尿素、３ｍＭシスタミン、１ｍＭ Ｌ−システ
インを含む１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．５、
約１．５Ｌ）に対して希釈した。希釈は、室温で一晩か
けて実施した。希釈後の試料溶液を室温で２日間攪拌
し、試料蛋白質を充分に酸化した後、８０００ｒｐｍで
４５分間遠心し、不溶物を除去した。遠心後の上澄みを
６Ｍリン酸を用いてｐＨ６．８に調整し、イオン交換水
で２倍に希釈した後、不溶物をフィルターペーパー（東
洋濾紙製、＃２、直径９０ｍｍ）２枚を用いてろ過し
た。ろ液をイオン交換樹脂（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）のカラ
ム（２．６ｘ１０ｃｍ）に吸着させた後、１５％グリセ
ロール、１Ｍ尿素を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）約４００ｍＬで洗った後、１５％グリセロール
を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）約３００ｍ
Ｌでカラムを平衡化した。目的試料の溶出には、１５％
グリセロールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液から０．５Ｍ
食塩を含む同緩衝液までの直線濃度勾配を用い、流速１
ｍＬ／ｍｉｎで行なった。カラムからの蛋白質の溶出を
２８０ｎｍにおける紫外吸収で追跡し、目的蛋白質を含
むフラクションを集めた（約３０〜４０ｍＬ）。このフ
ラクションを遠心濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １
０、Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて約２ｍＬに濃縮した
後、逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて精製し
た。この時、カラムにはＷａｔｅｒｓ社製μＢｏｎｄａ
ｓｐｈｅｒｅ Ｃ４（３．９ｘ１５０ｍｍ）を用い、蛋
白質の溶出には、０．０５％ＴＦＡ溶液である溶離液Ａ
と、７０％２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ，３０％ＣＨ３ＣＮお
よび０．０２％ＴＦＡを含む溶離液Ｂを用い、Ｂ溶離液
の濃度を４０分間で１％から１００％まで変化させ、目
的蛋白質を溶出させた。ＴＰＯ誘導体は、この条件で
は、いずれも約３０分の位置に溶出された。精製された
ＴＰＯ誘導体の活性測定を行なうため、溶出された誘導
体を集め、２Ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液に対して２日間
透析した後、遠心濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １
０、Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮し、Ｍ−０７ｅア
ッセイに供した。調製された各ＴＰＯ誘導体は、いずれ
も対照として用いたｈ６Ｔ（１−１６３）と同様の生物
活性を示した（図３２、図３３参照）。以下、製剤例を
示す。 ＜製剤実施例１＞実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分
を濃縮し、無菌処理した後−２０℃で凍結された凍結物
を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例２＞実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分
を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍ
ｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍
結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例３＞実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分
を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍｌバイアル瓶に
充填し注射剤とした。 ＜製剤実施例４＞実施例６５で得られたｈＴＰＯ１６３
画分を濃縮し、これを無菌処理した後−２０℃で凍結さ
れた凍結物を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例５＞実施例５６で得られたｈＴＰＯ１６３
画分を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に
５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓し
た凍結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例６＞実施例６５で得られたｈＴＰＯ１６３
画分を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍｌバイアル
瓶に充填し注射剤とした。 ＜製剤実施例７＞参考例実施例５７で得られたヒトＴＰ
Ｏ画分を濃縮し、これを無菌処理した後−２０℃で凍結
された凍結物を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例８＞実施例５７で得られたヒトＴＰＯ画分
を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍ
ｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍
結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤実施例９＞実施例５７で得られたヒトＴＰＯ画分
を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍｌバイアル瓶に
充填し注射剤とした。
【配列表】
【図１】ＸＲＰからのラットＴＰＯ精製における、ゲル
濾過クロマトグラフィー（ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２
００ＨＲカラム）のクロマトグラム及びラットＣＦＵ−
ＭＫアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
濾過クロマトグラフィー（ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２
００ＨＲカラム）のクロマトグラム及びラットＣＦＵ−
ＭＫアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図２】ＸＲＰ由来のラット低分子ＴＰＯ標品精製にお
ける逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ
Ｃｌ ３００Ａカラム）のクロマトグラム、及びラッ
トＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラ
フ。
ける逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ
Ｃｌ ３００Ａカラム）のクロマトグラム、及びラッ
トＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラ
フ。
【図３】ＸＲＰ由来のラット低分子ＴＰＯ標品精製にお
ける逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ
Ｃｌ ３００Ａカラム）のＴＰＯ活性画分ＦＡ（チュ
ーブ番号３６〜４２）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分離を示す写真、及びラットＣＦＵ−
ＭＫアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
ける逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ
Ｃｌ ３００Ａカラム）のＴＰＯ活性画分ＦＡ（チュ
ーブ番号３６〜４２）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分離を示す写真、及びラットＣＦＵ−
ＭＫアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図４】ＸＲＰ由来のラット低分子ＴＰＯ標品精製にお
ける逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ
Ｃｌ ３００Ａカラム）のＴＰＯ活性画分ＦＡの、３
段階消化によるペプチドマップを示すグラフ。
ける逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ
Ｃｌ ３００Ａカラム）のＴＰＯ活性画分ＦＡの、３
段階消化によるペプチドマップを示すグラフ。
【図５】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるラット血
漿由来ＴＰＯ活性を示すグラフ。
漿由来ＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図６】発現ベクターｐＥＦ１８Ｓの構築を示す概念
図。
図。
【図７】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＥＦ１
８Ｓ−Ａ２αを導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上
清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
８Ｓ−Ａ２αを導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上
清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図８】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＥＦ１
８Ｓ−ＨＬ３４を導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養
上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
８Ｓ−ＨＬ３４を導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養
上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図９】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＨＴ１
−２３１を導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中
のＴＰＯ活性を示すグラフ。
−２３１を導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中
のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１０ａ】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＨ
ＴＦ１を導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中の
ＴＰＯ活性を示すグラフ。
ＴＦ１を導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中の
ＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１０ｂ】Ｍ−０７ｅアッセイにおけるｐＨＴＦ１を
導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活
性を示すグラフ。
導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活
性を示すグラフ。
【図１１】ファージクローンλＨＧＴ１の制限酵素地図
の概略。（図中、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ、Ｓ：ｓａｌ Ｉを示す。）
の概略。（図中、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ、Ｓ：ｓａｌ Ｉを示す。）
【図１２ａ】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＥ
ＦＨＧＴＥを導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中
のＴＰＯ活性を示すグラフ。
ＦＨＧＴＥを導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中
のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１２ｂ】Ｍ−０７ｅアッセイにおけるｐＥＦＨＧＴ
Ｅを導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ
活性を示すグラフ。
Ｅを導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ
活性を示すグラフ。
【図１３ａ】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおける、お
よびｐＨＴ１−２１１＃１、およびｐＨＴ１−１９１＃
１、およびｐＨＴ１−１７１＃２を導入・発現させたＣ
ＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
よびｐＨＴ１−２１１＃１、およびｐＨＴ１−１９１＃
１、およびｐＨＴ１−１７１＃２を導入・発現させたＣ
ＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１３ｂ】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＨ
Ｔ１−１６３＃２を導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養
上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
Ｔ１−１６３＃２を導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養
上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１４】Ｍ−０７ｅアッセイにおけるｐＨＴ１−２１
１＃１、ｐＨＴ１−１９１＃１、ｐＨＴ１−１７１＃
２、およびｐＨＴ１−１６３＃２を導入・発現させたＣ
ＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
１＃１、ｐＨＴ１−１９１＃１、ｐＨＴ１−１７１＃
２、およびｐＨＴ１−１６３＃２を導入・発現させたＣ
ＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１５】ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１を導入・発
現させたＣＨＯ細胞の培養上清からのヒトＴＰＯ精製に
おける、逆相クロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ Ｃ４カ
ラム）のクロマトグラム。
現させたＣＨＯ細胞の培養上清からのヒトＴＰＯ精製に
おける、逆相クロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ Ｃ４カ
ラム）のクロマトグラム。
【図１６】ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１を導入・発
現させたＣＨＯ細胞の培養上清から精製されたヒトＴＰ
ＯのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
離を示す写真。
現させたＣＨＯ細胞の培養上清から精製されたヒトＴＰ
ＯのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
離を示す写真。
【図１７】ｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）を導
入・発現させた大腸菌からのヒトＴＰＯの精製におけ
る、逆相クロマトグラフィーのクロマトグラム。
入・発現させた大腸菌からのヒトＴＰＯの精製におけ
る、逆相クロマトグラフィーのクロマトグラム。
【図１８】ｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）を導
入・発現させた大腸菌から分離・精製された変異型ヒト
ＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）のＳＯＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動による分離を示す写真。
入・発現させた大腸菌から分離・精製された変異型ヒト
ＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）のＳＯＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動による分離を示す写真。
【図１９】ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥＦ２０２−
ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションし
て得られた培養上清を出発材料にしたｈＴＰＯ１６３の
精製におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムでのｈ
ＴＰＯ１６３の溶出。蛋白質は２２０ｎｍの紫外吸収で
測定した。
ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションし
て得られた培養上清を出発材料にしたｈＴＰＯ１６３の
精製におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムでのｈ
ＴＰＯ１６３の溶出。蛋白質は２２０ｎｍの紫外吸収で
測定した。
【図２０】ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥＦ２０２−
ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションし
て得られた培養上清を出発材料にしたｈＴＰＯ１６３の
精製において、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムで得
られたｈＴＰＯ１６３標品のＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動写真。各ｈＴＰＯ１６３は銀染色され
た。
ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションし
て得られた培養上清を出発材料にしたｈＴＰＯ１６３の
精製において、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムで得
られたｈＴＰＯ１６３標品のＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動写真。各ｈＴＰＯ１６３は銀染色され
た。
【図２１】発現ベクターｐＳＭＴ２０１の構造を示す
図。
図。
【図２２】Ｍ−０７ｅアッセイにおけるβＧＬ−ＴＰ
Ｏ、Ｎ３／ＴＰＯ、Ｏ９／ＴＰＯを導入・発現させたＣ
ＯＳ７細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
Ｏ、Ｎ３／ＴＰＯ、Ｏ９／ＴＰＯを導入・発現させたＣ
ＯＳ７細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図２３】Ｍ−０７ｅアッセイにおけるヒトＴＰＯ挿入
・欠失誘導体を導入・発現させたＣＯＳ７細胞培養上清
中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
・欠失誘導体を導入・発現させたＣＯＳ７細胞培養上清
中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図２４】ヒトＴＰＯを正常マウスに静脈内投与、また
は皮下投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
は皮下投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図２５】ヒトＴＰＯを正常マウスに投与量を変えて皮
下投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
下投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図２６】マウスに制ガン剤（５−ＦＵ）を投与した後
にヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示すグ
ラフ。
にヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示すグ
ラフ。
【図２７】マウスに制ガン剤（ＡＣＮＵ）を投与した後
にヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示すグ
ラフ。
にヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示すグ
ラフ。
【図２８】マウスにＢＭＴ（骨髄移植）を施行した後に
ヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示すグラ
フ。
ヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示すグラ
フ。
【図２９】放射線照射後のマウスにヒトＴＰＯを投与し
た場合の血小板数の推移を示すグラフ。
た場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図３０】ｈＴＰＯ１６３を正常マウスに皮下投与した
場合の血小板数の推移を示すグラフ。
場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図３１】マウスに制ガン剤（ＡＣＮＵ）を投与した後
にｈＴＰＯ１６３を投与した場合の血小板数の推移を示
すグラフ。
にｈＴＰＯ１６３を投与した場合の血小板数の推移を示
すグラフ。
【図３２】大腸菌で発現されたヒトＴＰＯ誘導体（Ｈ１
３３Ｒ、Ｓ１４８Ｐ、Ｑ１１５Ｒ）のＭ−０７ｅアッセ
イにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
３３Ｒ、Ｓ１４８Ｐ、Ｑ１１５Ｒ）のＭ−０７ｅアッセ
イにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図３３】大腸菌で発現されたヒトＴＰＯ誘導体（Ｍ１
４３Ｒ、Ｌ１２９Ｒ、Ｇ８２Ｌ、Ｇ１４６Ｌ、Ｋ５９
Ｒ）のＭ−０７ｅアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグ
ラフ。
４３Ｒ、Ｌ１２９Ｒ、Ｇ８２Ｌ、Ｇ１４６Ｌ、Ｋ５９
Ｒ）のＭ−０７ｅアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグ
ラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願平6−167328 (32)優先日 平６(1994)６月15日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平6−227159 (32)優先日 平６(1994)８月17日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平6−193169 (32)優先日 平６(1994)８月17日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平6−304167 (32)優先日 平６(1994)11月１日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平6−298669 (32)優先日 平６(1994)12月１日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平6−341200 (32)優先日 平６(1994)12月28日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４５６３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４５６４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４５６５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４６１６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４６１７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４９８８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４９８９ 早期審査対象出願 (72)発明者 岩松 明彦 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒麟麦酒株式会社 基盤技術研究所内 (72)発明者 赤堀 弘典 群馬県高崎市宮原町３ 麒麟麦酒株式会 社 医薬探索研究所内 (72)発明者 黒木 良太 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒麟麦酒株式会社 基盤技術研究所内 (72)発明者 清水 敏之 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒麟麦酒株式会社 基盤技術研究所内 (72)発明者 武藤 隆則 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒麟麦酒株式会社 基盤技術研究所内 (56)参考文献 特表 平９−508262（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/19 C12N 1/21 C12N 5/10 C12P 21/02 C07K 14/52 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＧＯ)
Claims (29)
- 【請求項１】アミノ酸配列が、配列番号16に示された配
列または該配列の一部に置換、欠失、挿入、および／ま
たは付加がある配列からなり、かつヒトＴＰＯ活性を有
するタンパク質。 - 【請求項２】アミノ酸配列が、配列番号16の１位から23
1位の配列または該配列の一部に置換、欠失、挿入、お
よび／または付加がある配列からなり、かつヒトＴＰＯ
活性を有するタンパク質。 - 【請求項３】アミノ酸配列が、配列番号16の１位から16
3位の配列または該配列の一部に置換、欠失、挿入、お
よび／または付加がある配列からなり、かつヒトＴＰＯ
活性を有するタンパク質。 - 【請求項４】配列番号16に示されたアミノ酸配列を含
み、かつヒトＴＰＯ活性を有するタンパク質。 - 【請求項５】配列番号16の１位から231位のアミノ酸配
列を含み、かつヒトＴＰＯ活性を有するタンパク質。 - 【請求項６】配列番号16の１位から163位のアミノ酸配
列を含み、かつヒトＴＰＯ活性を有するタンパク質。 - 【請求項７】配列番号16の７位から151位のアミノ酸配
列を含み、かつヒトＴＰＯ活性を有するタンパク質。 - 【請求項８】アミノ酸配列が配列番号16に示された配列
からなり、かつヒトＴＰＯ活性を有するタンパク質。 - 【請求項９】アミノ酸配列が配列番号16の１位から231
位の配列からなり、かつヒトＴＰＯ活性を有するタンパ
ク質。 - 【請求項１０】アミノ酸配列が配列番号16の１位から16
3位の配列からなり、かつヒトＴＰＯ活性を有するタン
パク質。 - 【請求項１１】少なくとも以下の（ａ）〜（ｖ）に示す
いずれかのアミノ酸の変異を有する請求項１〜３のいず
れか1項に記載のタンパク質： （ａ）１位のセリン残基がアラニン残基に、かつ３位の
アラニン残基がバリン残基に置換されている； （ｂ）25位のアルギニン残基がアスパラギン残基に置換
されている； （ｃ）33位のヒスチジン残基がトレオニン残基に置換さ
れている； （ｄ）25位のアルギニン残基がアスパラギン残基に、か
つ231位のグルタミン酸残基がリジン残基に置換されて
いる； （ｅ）33位のヒスチジン残基が欠失している； （ｆ）116位のグリシン残基が欠失している； （ｇ）117位のアルギニン残基が欠失している； （ｈ）33位のヒスチジン残基と34位のプロリン残基の間
にトレオニン残基が挿入されている； （ｉ）33位のヒスチジン残基と34位のプロリン残基の間
にアラニン残基が挿入されている； （ｊ）33位のヒスチジン残基と34位のプロリン残基の間
にグリシン残基が挿入されている； （ｋ）33位のヒスチジン残基と34位のプロリン残基の間
にグリシン残基が挿入され、かつ38位のプロリン残基が
セリン残基に置換されている； （ｌ）116位のグリシン残基と117位のアルギニン残基の
間にアスパラギン残基が挿入されている； （ｍ）116位のグリシン残基と117位のアルギニン残基の
間にアラニン残基が挿入されている； （ｎ）116位のグリシン残基と117位のアルギニン残基の
間にグリシン残基が挿入されている； （ｏ）129位のロイシン残基がアルギニン残基に置換さ
れている； （ｐ）133位のヒスチジン残基がアルギニン残基に置換
されている； （ｑ）143位のメチオニン残基がアルギニン残基に置換
されている； （ｒ）82位のグリシン残基がロイシン残基に置換されて
いる； （ｓ）146位のグリシン残基がロイシン残基に置換され
ている； （ｔ）148位のセリン残基がプロリン残基に置換されて
いる； （ｕ）59位のリジン残基がアルギニン残基に置換されて
いる； （ｖ）115位のグルタミン残基がアルギニン残基に置換
されている。 - 【請求項１２】Ｃ末端にさらにＴｈｒＳｅｒＩｌｅＧｌ
ｙＴｙｒＰｒｏＴｙｒＡｓｐＶａｌＰｒｏＡｓｐＴｙｒ
ＡｌａＧｌｙＶａｌＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨ
ｉｓのポリペプチドが付加されたものである請求項１〜
11のいずれか1項に記載のタンパク質。 - 【請求項１３】−２位にＭｅｔ残基、かつ−１位にＬｙ
ｓ残基がさらに付加されたものである請求項１〜11のい
ずれか1項に記載のタンパク質。 - 【請求項１４】−１位にＭｅｔ残基がさらに付加された
ものである請求項１〜11のいずれか1項に記載のタンパ
ク質。 - 【請求項１５】−１位にＧｌｙ残基がさらに付加された
ものである請求項１〜11のいずれか１項に記載のタンパ
ク質。 - 【請求項１６】請求項１〜15のいずれか１項に記載のタ
ンパク質をコードするＤＮＡで形質転換されたＣＨＯ細
胞を培養し、分離・精製することによって得ることので
きるヒトＴＰＯ活性を有するタンパク質。 - 【請求項１７】受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６１７の大
腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＴＦ１に組み込ま
れている、ヒトＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ
酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡで真核細胞を
形質転換し、該細胞を培養し、分離・精製することによ
って得ることのできるヒトＴＰＯ活性を有するタンパク
質。 - 【請求項１８】受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６１７の大
腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＴＦ１に組み込ま
れている、ヒトＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ
酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡで哺乳動物細
胞を形質転換し、該細胞を培養し、分離・精製すること
によって得ることのできるヒトＴＰＯ活性を有するタン
パク質。 - 【請求項１９】プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−
Ｐ１によって形質転換されたＣＨＯ細胞株（受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４９８８）を培養し、分離・精製するこ
とによって得ることのできるヒトＴＰＯ活性を有するタ
ンパク質。 - 【請求項２０】プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１
６３によって形質転換されたＣＨＯ細胞株（受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４９８９）を培養し、分離・精製するこ
とによって得ることのできるヒトＴＰＯ活性を有するタ
ンパク質。 - 【請求項２１】重合体と共有結合した請求項１〜20のい
ずれか１項に記載のタンパク質。 - 【請求項２２】重合体がポリエチレングリコールである
請求項21に記載のタンパク質。 - 【請求項２３】請求項１〜20のいずれか１項に記載のタ
ンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む、血小板の
産生を刺激または増強するための医薬組成物。 - 【請求項２４】該タンパク質が重合体と共有結合したも
のである請求項23に記載の医薬組成物。 - 【請求項２５】該重合体がポリエチレングリコールであ
る請求項24に記載の医薬組成物。 - 【請求項２６】請求項１〜22のいずれか１項に記載のタ
ンパク質を有効成分として含む血小板増加剤。 - 【請求項２７】請求項１〜22のいずれか１項に記載のタ
ンパク質を有効成分として含む血小板障害治療剤。 - 【請求項２８】請求項１〜22のいずれか１項に記載のタ
ンパク質を有効成分として含む血小板減少症治療剤。 - 【請求項２９】血小板減少症が化学療法、放射線療法ま
たは骨髄移植におけるものである請求項28に記載の血小
板減少症治療剤。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP7161363A JP2991640B2 (ja) | 1994-02-14 | 1995-04-27 | ヒトｔｐｏ活性を有するタンパク質 |
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| JP7984294 | 1994-03-25 | ||
| JP15512694 | 1994-06-01 | ||
| JP16732894 | 1994-06-15 | ||
| JP19316994 | 1994-08-17 | ||
| JP22715994 | 1994-08-17 | ||
| JP30416794 | 1994-11-01 | ||
| JP29866994 | 1994-12-01 | ||
| JP6-304167 | 1994-12-28 | ||
| JP6-79842 | 1994-12-28 | ||
| JP6-39090 | 1994-12-28 | ||
| JP6-167328 | 1994-12-28 | ||
| JP34120094 | 1994-12-28 | ||
| JP6-155126 | 1994-12-28 | ||
| JP6-227159 | 1994-12-28 | ||
| JP6-341200 | 1994-12-28 | ||
| JP6-298669 | 1994-12-28 | ||
| JP6-193169 | 1994-12-28 | ||
| JP7161363A JP2991640B2 (ja) | 1994-02-14 | 1995-04-27 | ヒトｔｐｏ活性を有するタンパク質 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7063298A Division JP2991630B2 (ja) | 1994-02-14 | 1995-02-14 | ヒトｔｐｏ活性を有するタンパク質をコードするｄｎａ |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35505295A Division JP3635142B2 (ja) | 1994-02-14 | 1995-11-17 | 抗ｔｐｏ抗体の作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08277296A JPH08277296A (ja) | 1996-10-22 |
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ID=27579902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7161363A Expired - Fee Related JP2991640B2 (ja) | 1994-02-14 | 1995-04-27 | ヒトｔｐｏ活性を有するタンパク質 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2991640B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999057147A1 (fr) * | 1998-04-30 | 1999-11-11 | Kirin Brewery Company, Limited | Mutants de la thrombopoietine humaine |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US185607A (en) * | 1876-12-19 | Improvement in coal-hods |
-
1995
- 1995-04-27 JP JP7161363A patent/JP2991640B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08277296A (ja) | 1996-10-22 |
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