JP2002502601A - 樹状富化分泌リンパ球活性化分子 - Google Patents

樹状富化分泌リンパ球活性化分子

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、樹状富化分泌リンパ球活性化分子と呼ばれる新規のヒトタンパク質およびこのタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。このヒトタンパク質を産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法もまた提供される。本発明はさらに、この新規なヒトタンパク質に関する障害を診断および処置するための有用な診断方法および治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、分泌リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーのメンバーである
ポリペプチドをコードする、新規なヒト遺伝子に関する。より詳細には、本発明
は、樹状富化分泌リンパ球活性化分子または「Ｄ−ＳＬＡＭ」と名付けられた新
規なヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、
Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド、ならびにベクター、宿主細胞、Ｄ−ＳＬＡＭポリペ
プチドに対する抗体、およびＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを産生するための組換え
方法に関する。免疫系に関する障害を検出するための診断方法、およびこのよう
な障害を処置するための治療方法もまた提供される。本発明はさらに、Ｄ−ＳＬ
ＡＭ活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方
法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである、ＳＬＡＭは、未
処置のＴ細胞およびＢ細胞の活性化後に急速に誘導される（Ｃｏｃｋｓ，Ｂ．Ｇ
．、「Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｔ−Ｃｅ
ｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ ３７６：２６０−２６３（１９
９５）；Ａｖｅｒｓａ，Ｇ．、「Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｇ
ｎａｌｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌｅ （ＳＬＡＭ） ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｓｕｌ
ｔｓ ｉｎ Ｉｌ−２−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ
−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ
ＩＦＮ−γ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．４０３６−４０４４（
１９９７））。多機能性の７０ｋＤの糖タンパク質である、ＳＬＡＭは、免疫細
胞の増殖および分化を引き起こす（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ｊ．、「Ｓｏｌｕｂｌｅ
ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ Ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌｉ
ｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ （
ＳＬＡＭ） Ｉｎｄｕｃｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｇ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃ
ｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：９９３−１００４（１９９７））。
免疫応答を誘発するために、分泌形態のＳＬＡＭ、ならびに膜結合型ＳＬＡＭの
両者は、相互作用すると考えられる。
【０００３】 樹状細胞（ＤＣ）は、初期免疫応答に関与する主要な抗原提示細胞であること
もまた公知であり；これらの主要な機能は、組織中の抗原を得ること、リンパ系
器官へ移動すること、およびＴ細胞を活性化することである（Ｍｏｈａｍａｄｚ
ａｄｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３１０２−３１０６（１９９
６））。実際に、ＤＣは通常、粘膜上の炎症部位に到達する最初の免疫細胞であ
る（例えば、Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４１１
１−４１１７（１９９５）を参照のこと）。免疫細胞の活性化および／または増
殖を導くＤＣとＴ細胞との間の相互作用を媒介し得る、新規なポリペプチド因子
を同定する不断の必要性が存在する。しかし今日まで、ＳＬＡＭ分子はＤＣ細胞
上で同定されていない。
【０００４】 従って、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）の増殖、活性化、生存、お
よび／または分化に影響するポリペプチドの必要性が存在する。なぜなら、この
ような調節の障害が、免疫系に関する障害に関与し得るからである。それゆえ、
このような障害の検出、予防、寛解、または矯正に役割を果たし得る、そのよう
なヒトポリペプチドの同定および特徴づけの必要性が存在する。
【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、Ｄ−ＳＬＡＭの新規なポリヌクレオチドおよびそのコードされるポ
リペプチドに関する。さらに、本発明は、ベクター、宿主細胞、抗体、ならびに
そのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための組換え方法に関する
。そのポリペプチドに関する障害を検出する診断方法、およびこのような障害を
処置する治療方法もまた提供される。本発明はさらに、Ｄ−ＳＬＡＭの結合パー
トナーを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００６】 （発明の詳細な説明） （定義） 以下の定義は、本明細書を通して使用される特定の用語の理解を容易にするた
めに提供される。
【０００７】 本発明において、「単離された」とは、その本来の環境（例えば、それが天然
に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、したがって、天然
の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単離されたポリヌク
レオチドは、ベクターまたは物質の組成物の一部であり得るか、あるいは細胞中
に含まれ得、そしてなお「単離される」。なぜなら、ベクター、物質の組成物、
または特定の細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境ではないからである。
【０００８】 本発明において、「分泌」Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質とは、ＥＲ、分泌小胞、ま
たは細胞外間隙にシグナル配列の結果として指向され得るタンパク質、ならびに
シグナル配列を必ずしも含まないが細胞外間隙に放出されるＤ−ＳＬＡＭタンパ
ク質をいう。Ｄ−ＳＬＡＭ分泌タンパク質が、細胞外間隙に放出される場合、こ
のＤ−ＳＬＡＭ分泌タンパク質は、「成熟」Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質を産生する
ために細胞外プロセシングを受け得る。細胞外間隙への放出は、エキソサイトー
シスおよびタンパク質分解切断を含む多くの機構によって生じ得る。
【０００９】 本明細書で使用される場合、Ｄ−ＳＬＡＭ「ポリヌクレオチド」とは、配列番
号１に含まれる核酸配列を有する分子、またはＡＴＣＣに寄託されたクローン内
に含まれるｃＤＮＡをいう。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、５’お
よび３’非翻訳配列、シグナル配列を含むかもしくは含まないコード領域、分泌
タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、ならびにこ
の核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメイン、および改変体を含み得る。
さらに、本明細書で使用される場合、Ｄ−ＳＬＡＭ「ポリペプチド」とは、広く
定義される場合、ポリヌクレオチドから生じた翻訳されたアミノ酸配列を有する
分子をいう。
【００１０】 特定の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、３００ｋｂ、２００
ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または７．５ｋｂより小さ
い長さである。さらなる実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、Ｄ−
ＳＬＡＭコード配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含むが、任意の
Ｄ−ＳＬＡＭイントロンの全て、または一部を含まない。別の実施態様において
、Ｄ−ＳＬＡＭコード配列を含む核酸は、ゲノムの隣接遺伝子（すなわち、ゲノ
ムにおけるＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の５’側または３’側）のコード配列を含まない
。
【００１１】 本発明において、配列番号１として同定される全長Ｄ−ＳＬＡＭ配列は、寄託
クローンの重複配列により生成された（コンティグ分析）。配列番号１の全ての
、またはほとんどの配列を含む代表的なクローンは、アメリカンタイプカルチャ
ーコレクション（「ＡＴＣＣ」）に１９８８年２月６日に寄託され、ＡＴＣＣ受
託番号２０９６２３を付与された。ＡＴＣＣは、アメリカ合衆国、バージニア２
０１１０−２２０９、マナサス、Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ大学 １０８０１に位置す
る。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際承認に係るブ
ダペスト条約の条項によって行われた。
【００１２】 Ｄ−ＳＬＡＭ「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下で、配列番号１に含まれる配列、その相補体、または寄託クロー
ン内のｃＤＮＡにハイブリダイズし得るそれらのポリヌクレオチドを含む。「ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５
×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン
、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一
晩インキュベーション、次いで０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗
浄することをいう。
【００１３】 中程度に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件でＤ−ＳＬＡ
Ｍポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、
ホルムアミド濃度（より低い割合のホルムアミドが、ストリンジェンシーの低下
を生じる）；塩条件、または温度の操作によって行われる。例えば、中程度に高
いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ
；０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％
ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを
含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１
％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、さらにより低いストリンジ
ェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行
われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行われ得る。
【００１４】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の包含および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、お
よび市販の製品処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の包含は、適合性
の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００１５】 もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオ
チドが、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば
、実際の任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするので、「ポリヌ
クレオチド」の定義に包含されない。
【００１６】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変
ＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領
域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖
および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分
子から構成され得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしく
はＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。
Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドはまた、安定性のために、または他の理由のため
に改変された、１つ以上の改変された塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含
み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイ
ノシンのような普通でない塩基が挙げられる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮ
Ａに対して行われ得；従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、また
は代謝的に改変された形態を含む。
【００１７】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、
すなわち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結した
アミノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のア
ミノ酸を含み得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような
天然のプロセスによって、または当該技術分野で周知の化学的改変技術によって
のいずれかで改変され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細
な研究論文、ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格
、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むＤ−ＳＬＡＭ
ポリペプチドのどこにでも生じ得る。同じ型の改変が、所定のＤ−ＳＬＡＭポリ
ペプチド中のいくつかの部位で同じまたは種々の程度で存在し得ることが理解さ
れる。また、所定のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドは多くの型の改変を含み得る。Ｄ
−ＳＬＡＭポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得
、そしてＤ−ＳＬＡＭポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状であ
り得る。環状、分枝状および分枝した環状Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、天然の
翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変と
しては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共
有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合
、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シス
テインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グ
リコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシ
ング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化
のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介の付加、およびユ
ビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ
ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， 第２版， Ｔ．Ｅ．
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ Ｃ
ＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ．
Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ， １−１２頁 （１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ １８２：６２６−６４６ （１９９０）；Ｒａｔｔａｎら， Ａｎｎ Ｎ
Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２ （１９９２）を参照のこと）。
【００１８】 「配列番号１」とは、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド配列をいい、一方、「配
列番号２」とは、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド配列をいう。
【００１９】 「生物学的活性を有する」Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドとは、特定の生物学的ア
ッセイで測定した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても、Ｄ−ＳＬＡＭ
ポリペプチド（成熟形態を含む）の活性と類似であるが、必ずしも同一ではない
活性を示すポリペプチドをいう。用量依存性が存在する場合、Ｄ−ＳＬＡＭポリ
ペプチドの用量依存性と同一である必要はないが、むしろＤ−ＳＬＡＭポリペプ
チドと比較した場合に、所定の活性における用量依存性に実質的に類似する（す
なわち、候補ポリペプチドは、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドと比較して、より大き
な活性を示すか、または約１／２５以上、そして好ましくは約１／１０以上の活
性、そして最も好ましくは約１／３以上の活性を示す）。
【００２０】 （Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよびポリペプチド） クローンＨＤＰＪＯ３９は、樹状細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離された。
このクローンは、配列番号２として同定された全体のコード領域を含む。寄託ク
ローンは、２８５アミノ酸残基の推定オープンリーディングフレームをコードす
る、全３２２０ヌクレオチドを有するｃＤＮＡを含む（図１Ａ〜１Ｄを参照のこ
と）。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド位置９２に位置するＮ末
端メチオニンから始まり、そしてヌクレオチド位置９４７の終止コドンで終わる
。Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の推定分子量は、約３４．２ｋＤａである。
【００２１】 引き続くノザン分析もまた、樹状細胞、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ節、脾臓、胸
腺、小腸、および子宮組織におけるＤ−ＳＬＡＭの発現を示し、造血性特異的発
現と一致するパターンを示した。発現は、免疫認識に関する組織において最も高
く、樹状細胞およびＡＰＣにおける富化された発現と一致する。プロセシングさ
れなかったＲＮＡ前駆体を示しているであろう７〜９ｋｂの少量の転写物ととも
に、約３．５〜４．０ｋｂの単一の主要な転写物が観察される。主要な３．５〜
４ｋｂの転写物の発現は、リンパ節、脾臓、胸腺において最も高く、およびより
少ない程度で小腸において高い。７〜９ｋｂ転写物の最も高い発現は、子宮にお
いて観察される。
【００２２】 ＢＬＡＳＴ分析を使用して、配列番号２は、分泌リンパ球活性化分子（ＳＬＡ
Ｍ）ファミリーのメンバーに相同性を示すことが見出される。特に、配列番号２
は、ＳＬＡＭ（受託番号ｇｉ／９８４９６９）についてのヒトｍＲＮＡの翻訳産
物（図２）（配列番号３）に相同性を示すドメインを含み、これらは以下の保存
ドメインを含む：（ａ）約アミノ酸２３３〜２５５に位置する推定膜貫通ドメイ
ン；（ｂ）約アミノ酸２３〜２３２に位置する推定細胞外ドメイン；および（ｃ
）約アミノ酸２５６〜２８５に位置する推定細胞内ドメイン。Ｄ−ＳＬＡＭのこ
れらのポリペプチドフラグメントは、本発明において特に意図される。ＳＬＡＭ
（受託番号ｇｉ／９８４９６９）は、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化ならびに増殖
に重要であると考えられているため、ＳＬＡＭ（受託番号ｇｉ／９８４９６９）
とＤ−ＳＬＡＭとの間の相同性は、Ｄ−ＳＬＡＭもまたＴ細胞およびＢ細胞の活
性化ならびに増殖に関与し得ることを示唆する。
【００２３】 さらに、コードされるポリペプチドは、約アミノ酸１〜２２に位置する推定リ
ーダー配列を有する（図１Ａ〜１Ｄを参照のこと）。また、約アミノ酸２３〜２
３２を含むＤ−ＳＬＡＭの推定分泌形態も、図１Ａ〜１Ｄにおいて示される。Ｄ
−ＳＬＡＭのこれらのポリペプチドフラグメントは、本発明において特に意図さ
れる。
【００２４】 配列番号１として同定されたＤ−ＳＬＡＭヌクレオチド配列は、寄託クローン
から、およびいくつかの場合において、さらなる関連するＤＮＡクローンから得
られた、部分的に相同な（「重複する」）配列から構築された。重複配列は、高
い重複性の単一の連続した配列（通常、各々のヌクレオチドの位置で３〜５の重
複配列）に構築され、配列番号１として同定される最終的な配列を生じる。
【００２５】 従って、配列番号１および翻訳された配列番号２は、十分に正確であり、そし
てそうでなければ、当該分野において周知でありかつ以下でさらに記載される種
々の使用に適切である。例えば、配列番号１は、配列番号１において含まれる核
酸配列または寄託クローンに含まれるｃＤＮＡを検出する核酸ハイブリダイゼー
ションプローブを設計するために有用である。これらのプローブはまた、生物学
的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズし、それにより本発明の種々の法医学
の方法、および診断の方法を可能にする。同様に、配列番号２から同定されるポ
リぺプチドは、Ｄ−ＳＬＡＭに特異的に結合する抗体を作製するために使用され
得る。
【００２６】 それにもかかわらず、配列決定反応によって生成されるＤＮＡ配列は、配列決
定のエラーを含み得る。エラーは、誤って同定されたヌクレオチドとして、また
は生成されたＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存在す
る。誤って挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列
のリーディングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場合に
おいて、作製されるＤＮＡ配列は、たとえ実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例え
ば、１０００塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入
または欠失）を超えて同一であり得るとしても、推定アミノ酸配列は、実際のア
ミノ酸配列とは異なる。
【００２７】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこ
れらの適用のために、本発明は、配列番号１として同定された、生成されたヌク
レオチド配列、および配列番号２として同定された、推定の翻訳されたアミノ酸
配列のみならず、ＡＴＣＣに寄託されたＤ−ＳＬＡＭのヒトｃＤＮＡを含むプラ
スミドＤＮＡのサンプルもまた提供する。寄託されたＤ−ＳＬＡＭクローンのヌ
クレオチド配列は、公知の方法に従って、寄託されたクローンの配列決定によっ
て容易に決定され得る。次いで、推定Ｄ−ＳＬＡＭアミノ酸配列は、このような
寄託物から確認され得る。さらに、寄託されたクローンによってコードされるタ
ンパク質のアミノ酸配列はまた、ペプチド配列決定によって、または寄託された
ヒトＤ−ＳＬＡＭ ｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞中でタンパク質を発現し、こ
のタンパク質を収集し、そしてその配列を決定することによって、直接的に決定
され得る。
【００２８】 本発明はまた、配列番号１、配列番号２、または寄託されたクローンに対応す
るＤ−ＳＬＡＭ遺伝子に関する。Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子は、本明細書中に開示され
る配列情報を使用して、公知の方法に従って単離され得る。このような方法は、
開示された配列からプローブまたはプライマーを調製する工程、およびゲノム材
料の適切な供給源からＤ−ＳＬＡＭ遺伝子を同定または増幅する工程を包含する
。
【００２９】 本発明においてまた提供されるものは、Ｄ−ＳＬＡＭの種相同体である。種相
同体は、本明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプライマーを作
製し、そして所望の相同体について適切な核酸供給源をスクリーニングすること
によって単離および同定され得る。
【００３０】 Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このような
ポリぺプチドとしては、単離された天然に存在するポリぺプチド、組換え産生さ
れたポリぺプチド、合成的に生成されたポリぺプチド、またはこれらの方法の組
合せによって生成されたポリぺプチドが挙げられる。このようなポリぺプチドを
調製するための手段は、当該分野において十分に理解される。
【００３１】 Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟形態を含む）であ
り得るか、またはより大きいタンパク質（例えば、融合タンパク質）の部分であ
り得る（以下を参照のこと）。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を
補助する配列（例えば、複数のヒスチジン残基）、または組換え産生の間の安定
性のためのさらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有
利である。
【００３２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは実質的に精製される。Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチド（分泌されるポリ
ぺプチドを含む）の組換え産生されたバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）は、Ｓｍｉ
ｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載さ
れる１工程の方法によって実質的に精製され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドは
また、当該分野において周知である方法におけるＤ−ＳＬＡＭタンパク質に対し
て惹起される本発明の抗体を使用して、天然のまたは組換えの供給源から精製さ
れ得る。
【００３３】 （ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの改変体） 「改変体」は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが
、その本質的な特性を維持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一
般的に、改変体は、全般にかなり類似しており、そして多数の領域においてＤ−
ＳＬＡＭのポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
【００３４】 本発明の参照ヌクレオチド配列に少なくとも、例えば９５％「同一」であるヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がＤ−Ｓ
ＬＡＭのポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列のそれぞれの１００ヌ
クレオチドあたり５つまでのポイントミューテーション（点変異）を含み得るこ
とを除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列に同一であるこ
とを意図する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一で
あるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列にお
いてヌクレオチドの５％までが欠失もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか
、または参照配列における全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが参照
配列に挿入され得る。問い合わせ配列は、配列番号１の示す全配列、ＯＲＦ（オ
ープンリーディングフレーム）、または本明細書に記載された任意の特定のフラ
グメントであり得る。
【００３５】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが本発明のヌクレ
オチド配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９
％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを用いて慣習的に決定
され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最適な全長の適
合を決定するための好ましい方法はまた、全体的な配列整列と呼ばれ、Ｂｒｕｔ
ｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：
２３７〜２４５）に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決
定され得る。配列整列において、この問い合わせ配列および対象配列は両方とも
ＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る
。上記の全体的な配列整列の結果は、同一性％である。同一性％を計算するため
のＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは、
以下である：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａ
ｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎ
ｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏ
ｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ
０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ
のいずれか短い方。
【００３６】 対象配列が、内部欠失のためではなく、５’または３’欠失のために問い合わ
せ配列よりも短い場合、手動の補正が、その結果に対してなされなければならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性％を計算する場合に、対象配列
の５’および３’短縮化を計算しないためである。５’または３’末端で短縮化
された対象配列について、問い合わせ配列と比較して、同一性％は、一致／整列
しない対象配列の５’および３’にある、問い合わせ配列の塩基の数を、問い合
わせ配列の総塩基のパーセントとして計算することによって補正される。ヌクレ
オチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列化の結果によって決
定される。次いで、このパーセンテージは、同一性％から減算され、特定のパラ
メーターを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されて、最終的
な同一性％スコアに到達する。この補正されたスコアは、本発明の目的のために
使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列化によって示されるように、対象配列
の５’および３’塩基の外側の塩基（これは、問い合わせ配列に一致／整列され
ない）のみが、同一性％スコアを手動で調整する目的のために計算される。
【００３７】 例えば、９０塩基の対象配列が、同一性％を決定するために、１００塩基の問
い合わせ配列に対して整列される。欠失は、対象配列の５’末端で起こり、従っ
て、ＦＡＳＴＤＢ整列化は、５’末端において最初の１０塩基の一致／整列を示
さない。１０個の不対塩基は、配列の１０％（５’および３’末端の一致しない
塩基数／問い合わせ配列における塩基の総数）を表し、従って、１０％は、ＦＡ
ＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性％スコアから減数される。残りの
９０塩基が完全に一致した場合、最終的な同一性％は、９０％である。別の例に
おいて、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較される。こ
のとき、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’に塩基が
ないので、欠失は内部の欠失である。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算され
た同一性％は、手動で補正されない。再度、問い合わせ配列に一致／整列されな
い対象配列の５’および３’の塩基のみが、手動で補正される。どんな他の手動
補正も、本発明の目的のためになされない。
【００３８】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に少なくとも、例えば９５％「同一」である
アミノ酸配列を有するポリヌクレオチドとは、対象ポリペプチド配列が問い合わ
せアミノ酸配列のそれぞれの１００アミノ酸あたり５つまでのアミノ酸変化を含
み得ることを除けば、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、問い合わせ配列に同
一であることを意図する。言い換えれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列
においてアミノ酸残基の５％までが挿入、欠失、（消去）または別のアミノ酸で
置換され得る。これらの参照配列の変化は、参照配列の残基中に個々にか、また
は参照配列内の１つ以上の連続基においてかのいずれかで散在する、参照アミノ
酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で、またはそれらの末端位置
の間のいずれでも生じ得る。
【００３９】 実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列に、または寄託されたＤＮＡクローンによりコードされるアミノ
酸配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同
一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを用いて慣習的に決定され
得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最適な全長の適合を
決定するための好ましい方法はまた、全体的な配列整列と呼ばれ、Ｂｒｕｔｌａ
ｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３
７〜２４５）に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定さ
れ得る。配列整列において、この問い合わせ配列および対象配列は、両方ともヌ
クレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである
。上記の全体的な配列整列の結果は、同一性％である。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整
列において使用される好ましいパラメーターは、以下である：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｐ
ＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏ
ｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ
Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ
＝配列長、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝
０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのい
ずれか短い方。
【００４０】 対象配列が、内部欠失ではなくＮまたはＣ末端欠失のために、問い合わせ配列
より短い場合、手動補正が結果に対してなされるべきである。これは、ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムが全同一性％を算出する際、対象配列のＮ末端およびＣ末端切断
を考慮しないためである。Ｎ末端およびＣ末端で切断される対象配列について、
問い合わせ配列に比べ、同一性％は、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い
合わせ配列の残基（対応する対象残基と一致／整列しない）の数を、問い合わせ
配列の全塩基のパーセントとして算出することによって補正される。残基が一致
／整列するか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果によって決定される
。次いでこのパーセンテージを、同一性％から減算し、特定のパラメーターを使
用して上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出し、最終的な同一性％スコアを
求める。この最終的な同一性％スコアは、本発明の目的のために使用されるもの
である。対象配列のＮ末端およびＣ末端に対する残基（これは、問い合わせ配列
と一致／整列されない）のみを、同一性％スコアの手動調節の目的とみなす。す
なわち、問い合わせ残基のみが対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外
側に位置する。
【００４１】 例えば、９０アミノ酸残基対象配列は、同一性％を決定する１００残基の問い
合わせ配列と整列される。対象配列のＮ末端で欠失が生じると、それによってＦ
ＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端で最初の１０残基の一致／整列を示さない。
１０の対でない残基は、配列の１０％（一致しないＮ末端およびＣ末端の残基の
数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表わす。そのため、ＦＡＳＴＤＢプログ
ラムより算出される同一性％スコアから１０％を減算する。残りの９０残基が完
全に一致する場合、最終的な同一性％は、９０％になる。別の例では、９０残基
の対象配列は、１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は内
部欠失であり、問い合わせと一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端で
残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出される同一性％は、手
動で補正されない。もう一度、対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側に位置する
残基（問い合わせ配列と一致／整列しない）のみが、ＦＡＳＴＤＢアライメント
に提示されるように、手動で補正される。他の手動補正は、本発明の目的のため
には行われない。
【００４２】 Ｄ−ＳＬＡＭ改変体は、コード領域、非コード領域または両方における変化を
含み得る。特に好ましいのは、サイレントな置換、付加または欠失を生じるがコ
ードされるポリペプチドの特性または活性は変えない変化を含むポリヌクレオチ
ド改変体である。遺伝コードの縮重によるサイレントな置換により産生されるヌ
クレオチドの改変体が好ましい。さらに５〜１０、１〜５または１〜２のアミノ
酸が任意の組み合わせで置換、欠失または付加される改変体もまた好ましい。Ｄ
−ＳＬＡＭのポリヌクレオチド改変体は、種々の理由、例えば、特定の宿主に対
するコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンをＥ．ｃｏｌｉのよ
うな細菌宿主により好まれるコドンに変える）ために産生され得る。
【００４３】 天然に存在するＤ−ＳＬＡＭ改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そし
て生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１
つをいう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ、Ｂ．，編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
およびＳｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。）これらの対立遺伝子改変体
は、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルのいずれかで変化し得
る。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発性の技術によりまたは直接
の合成により産生され得る。
【００４４】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を用いて、改変体は、Ｄ
−ＳＬＡＭポリペプチドの特徴を改善または変化するように作製され得る。例え
ば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的に損失することなく、分泌タ
ンパク質のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．、２６８：２９８４〜２９８８（１９９３）の著者らは、３個、８個ま
たは２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を失った後でさえ、ヘパリン結合活性を
有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告している。同様に、インターフェロンγは
、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０アミノ酸残基を欠失させた後に
１０倍まで高い活性を示す（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
７：１９９〜２１６（１９８８））。
【００４５】 さらに、改変体が、しばしば天然に存在するタンパク質の活性と同様の生物学
的活性を保持することを豊富な証拠が実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび共同
研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２１０５〜２２１１１（１９９
３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの大規模な変異性分析を実施した。彼ら
は、ランダム変異誘発を用い、３，５００を超える個々のＩＬ−１ａ変異体を作
製した。この変異体は、分子の全長にわたって１変異体あたり平均して２．５の
アミノ酸が変化していた。複数の変異体が、可能性のあるあらゆるアミノ酸位置
で試験された。研究者らは、「［ほとんど］の分子が［結合または生物学的活性
］のいずれへの影響もわずかなまま変化され得る」ことを見出した。（要約を参
照のこと）実際、試験された３，５００を超えるヌクレオチド配列のうちわずか
２３の特有のアミノ酸配列が、野生型と活性の有意に異なるタンパク質を産生し
た。
【００４６】 さらに、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じる場合でさえ、他の生物学
的活性はなお維持され得る。例えば、分泌形態を認識する抗体を誘発そして／ま
たは抗体に結合する欠失改変体の能力は、分泌型形態の大部分より少ない残基が
Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合、維持されるようである。タンパク質の
Ｎ末端残基またはＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫原性
活性を維持するか否かは、本明細書に記載される慣用的な方法および当該分野で
公知の別の方法により容易に決定され得る。
【００４７】 従って、本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示すＤ−ＳＬＡＭポリペプ
チド改変体を含む。このような改変体は、当該分野で公知である一般的な規則に
従って、活性にほとんど影響しないように選択される欠失、挿入、反転、反復、
および置換を含む。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をいかにして
作製するかに関するガイダンスがＢｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで著者らは、
変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主だった戦略が存在
することを示している。
【００４８】 最初の戦略は、進化のプロセスの間の天然の選択によるアミノ酸置換の寛容性
を開発する。異なる種におけるアミノ酸配列の比較により、保存されるアミノ酸
が、同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能に関して
重要であるようである。対照的に、置換が天然の選択により受け入れられるアミ
ノ酸位置は、これらの位置がタンパク質の機能に関して重要でないことを示す。
従って、アミノ酸置換を受容する位置は、タンパク質の生物学的活性をなお維持
しながら改変され得る。
【００４９】 第２の戦略は、タンパク質の機能に重要な領域を同定するためにクローン化さ
れた遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を用いる。
例えば、部位指向性変異誘発性またはアラニンスキャンニング変異誘発性（分子
内のあらゆる残基での単一アラニン変異の導入）が用いられ得る。（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１〜１０８５（
１９８９））。次いで、得られた変異体分子は生物学的活性について試験され得
る。
【００５０】 著者らが述べるように、これらの２つの戦略は、タンパク質がアミノ酸置換に
驚くほど寛容性であることを明らかにしてきた。著者らは、タンパク質の特定の
アミノ酸部位でどのアミノ酸変化が許容性であると思われるかをさらに示してい
る。例えば、ほとんどの（タンパク質の３次元構造のなかに）埋没したアミノ酸
残基は、非極性側鎖を必要とし、一方で表面側鎖のほとんどの特徴は、一般に保
存されない。さらに、許容的な保存的アミノ酸置換は、脂肪性または疎水性アミ
ノ酸のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基Ｓｅｒ
およびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基Ａｓｎお
よびＧｌｎの置換；塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの交換；芳香族残基
Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの置換、ならびに小分子量のアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅ
ｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙの置換に関与する。
【００５１】 保存的アミノ酸置換に加えて、Ｄ−ＳＬＡＭの改変体は、（ｉ）置換されたア
ミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるアミノ酸であり得るか、もしくはあ
り得ない１つ以上の非保存的なアミノ酸残基との置換、または（ｉｉ）置換基を
有する１つ以上のアミノ酸残基との置換、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと
別の化合物、例えばポリペプチドの安定性および／もしくは溶解度を上昇する化
合物との融合（例えば、ポリエチレングリコール）、または（ｉｖ）ポリペプチ
ドとＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドのようなさらなるアミノ酸、またはリーダー
配列もしくは分泌配列、または精製を容易にする配列との融合を含む。このよう
な改変ポリペプチドは、本明細書における教示から当業者の範囲内であるとみな
される。
【００５２】 例えば、他の荷電アミノ酸または中性アミノ酸とともに荷電アミノ酸のアミノ
酸置換を含有するＤ−ＳＬＡＭポリペプチド改変体は、凝集の低下のような改善
した特徴を有するタンパク質を産生し得る。薬学的な処方物の凝集は、凝集物の
免疫原性活性により、活性を低下し、そしてクリアランスの増加の両方をする。
（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１〜３４
０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ３６：８３８〜８４５（
１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄ Ｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７〜３７７（１９９
３））。
【００５３】 本発明のさらなる実施態様は、少なくとも１アミノ酸置換、ただし５０アミノ
酸置換以下であり、なおより好ましくは、４０アミノ酸置換以下、さらにより好
ましくは、３０アミノ酸置換以下、そしてさらになおより好ましくは２０アミノ
酸置換以下を含むアミノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのアミノ酸配
列を含む、ポリペプチドに関する。当然ながら、漸増する好ましさの順序で、ペ
プチドまたはポリペプチドは、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのアミノ酸配列を含む
アミノ酸配列を有することが非常に好ましく、このアミノ酸配列は、少なくとも
１つ、ただし１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸置換以
下を含む。特定の実施態様において、図１Ａ〜１Ｄのアミノ酸配列またはそれら
のフラグメント（例えば、成熟形態および／または本明細書において記載される
他のフラグメント）において、付加、置換および／または欠失の数は、１〜５、
５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０または５０〜１５０であり、保存的
アミノ酸置換が好ましい。
【００５４】 （ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのフラグメント） 本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」は、寄託されたクローン
に含まれる核酸配列または配列番号１に示される核酸配列を有する短いポリヌク
レオチドをいう。短いヌクレオチドフラグメントは、好ましくは、少なくとも約
１５ｎｔ長、そしてより好ましくは、少なくとも約２０ｎｔ長、なおより好まし
くは、少なくとも約３０ｎｔ長、そしてなおより好ましくは、少なくとも約４０
ｎｔ長である。フラグメント「少なくとも２０ｎｔ長」は、例えば、寄託された
クローンに含まれるｃＤＮＡ配列または配列番号１に示されるヌクレオチド配列
由来の２０以上の連続的な塩基を含むことを意図する。これらのヌクレオチドフ
ラグメントは、本明細書において議論したように、診断プローブおよびプライマ
ーとして有用である。当然ながら、より長いフラグメント（例えば、５０、１５
０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）が好ましい。
【００５５】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例としては、
例えば、配列番号１の末端まで、およそのヌクレオチド数１〜５０、５１〜１０
０、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０
１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５
０、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８０
１〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、もしくは９００の配列を有する
フラグメントまたは寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡが挙げられる。この
状況において、「約」は、特定の列挙される範囲（これは、末端または両方の末
端のいずれかでいくつかの（５、４、３、２または１）ヌクレオチドより大きな
または小さな範囲である）を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、生物
学的活性を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これらのポリヌ
クレオチドは、本明細書において議論されたようにプローブまたはプライマーと
して用いられ得る。
【００５６】 本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」は、配列番号２に含まれ
る短いアミノ酸配列、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードさ
れる短いアミノ酸配列をいう。タンパク質フラグメントは、「独立して存在（ｆ
ｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」され得るか、またはフラグメントが領域の一部（
最も好ましくは単一の連続領域として）を形成する、より長いポリペプチドの中
に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例え
ば、コード領域の末端まで、およそのアミノ酸数にして１〜２０、２１〜４０、
４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、１２１〜１４０、１
４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２
４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、もしくは２８１のフラグメントが挙げ
られる。さらに、ポリペプチドフラグメントは、約２０、３０、４０、５０、６
０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５
０のアミノ酸長であり得る。この状況において、「約」は、特定の列挙される範
囲（これは、最後のまたは両方の最後のいずれかでいくつかの（５、４、３、２
または１）アミノ酸より大きなまたは小さな範囲である）を含む。
【００５７】 好ましいポリペプチドフラグメントは、分泌Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質および成
熟形態を含む。さらに好ましいポリペプチドフラグメントは、分泌型Ｄ−ＳＬＡ
Ｍタンパク質またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端または両方からの欠失残
基の連続系列を有する成熟形態を含む。例えば、１〜６０の範囲の任意の数のア
ミノ酸が、分泌されたＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたは成熟形態のいずれかのア
ミノ末端から欠失され得る。同様に、１〜３０の範囲の任意の数のアミノ酸が、
分泌されたＤ−ＳＬＡＭタンパク質または成熟形態のカルボキシ末端から欠失さ
れ得る。さらに、上記アミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合
わせが好ましい。同様に、これらのＤ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグメントをコ
ードするポリヌクレオチドフラグメントがまた好ましい。
【００５８】 詳細には、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式 ｍ−２８５に
より記載され得る。ここでｍは、２〜２８４の整数であり、ｍは、配列番号２に
おいて同定されるアミノ酸残基の位置と対応する。さらに詳細には、本発明は、
配列番号２の以下の残基のアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなるポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【００５９】
【表１】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含
される。
【００６０】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのＣ末端欠失はまた、一般式１−ｎにより
記載され得る。ここでｎは、２〜２８４の整数であり、ｎは、配列番号２におい
て同定されるアミノ酸残基の位置と対応する。さらに詳細には、本発明は、配列
番号２の以下の残基のアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなるポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【００６１】
【表２】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含
される。
【００６２】 さらに、上記に列挙された任意のＮ末端欠失またはＣ末端欠失が、Ｎ末端欠失
およびＣ末端欠失されたＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを産生するために組み合わせ
られ得る。本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上
のアミノ酸が欠失されたポリペプチドを提供する。これは、一般的に配列番号２
のｍ〜ｎ残基を有することが記載され得る（ここでｎおよびｍは上記で記載され
た整数である）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、
本発明により包含される。
【００６３】 さらに、好ましいＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体は、Ｄ−ＳＬＡＭ
の推定分泌型を含むか、またはそれからなる。Ｄ−ＳＬＡＭの好ましい分泌形態
は、配列番号２の以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【００６４】
【表３】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含
される。
【００６５】 また、構造的なまたは機能的なドメインにより特徴付けられるＤ−ＳＬＡＭの
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドフラグメントが好ましい。本発明の好まし
い実施態様は、αヘリックス領域およびαヘリックス形成領域（「α−領域」）
、βシート領域およびβシート形成領域（「β−領域」）、ターン領域およびタ
ーン形成領域（「ターン−領域」）、コイル領域およびコイル形成領域（「コイ
ル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可
撓性領域、表面形成領域、基質結合領域および高抗原性指数領域を含むフラグメ
ントを含む。図において示すように、このような好ましい領域は、Ｇａｒｎｉｅ
ｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領域およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−
Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔ
ｌｅの親水性領域、および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα両親媒性領域お
よびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可塑性（可撓性）領域、Ｅ
ｍｉｎｉ表面形成領域ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指数領域を含
む。保存されたドメインにはいる配列番号２のポリペプチドフラグメントは、本
発明により特に意図される。（図３参照のこと。）さらにこれらのドメインをコ
ードするポリヌクレオチドフラグメントもまた、意図される。
【００６６】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＤ−ＳＬＡＭフラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントは、同じ活性を表すが、Ｄ−ＳＬＡＭポリ
ペプチドの活性と同一である必要はないフラグメントである。このフラグメント
の生物学的な活性は、所望の活性の改善、または望ましくない活性の低下を含み
得る。
【００６７】 しかし、ＥＳＴ配列のような多数のポリヌクレオチド配列は、公的に入手可能
であり、そして配列データベースを通じて接近可能である。これらの配列のいく
つかは、配列番号１に関し、そして本発明の構想の前に公的に利用可能であった
かもしれない。好ましくは、このような関連のポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。例えば、以下のＥＳＴは、好ましくは本発明から除外さ
れる：ＡＡ９１７３３５；ＡＩ０９４８１８、ＡＩ２９８４１３；Ｎ６２５２２
；ＡＡ６２７５２２；Ｒ１１６３５；ＡＡ３２０４０８；ＡＡ３７９１１２；Ｒ
０９８４１；Ｚ２０３２０；Ｎ７９４２１；Ｄ４５８００；Ｔ９８９５９；ＡＡ
２１７２９０；Ｎ３０１９７；ＡＡ２８６１３２；およびＡＡ６３３９８３（こ
れにより、その全体が参考として援用される。）。しかし、あらゆる関連配列を
列挙することは煩わしい。従って、好ましくは、一般式ａ〜ｂにより記載された
ヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドが本発明から除外される。
ここでａは、配列番号１の１〜３２０６の間の任意の整数であり、ｂは、１５〜
３２２０の整数であり、ａおよびｂの両方は、配列番号１に示されるヌクレオチ
ド残基の位置と対応し、そしてｂは、＋１４以上である。
【００６８】 （エピトープおよび抗体） 本発明において、「エピトープ」は、動物、特にヒトにおいて抗原性活性また
は免疫原性活性を有するＤ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグメントをいう。本発明
の好ましい実施態様は、エピトープおよびこのフラグメントをコードするポリヌ
クレオチドを含むＤ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグメントに関する。抗体が結合
し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。対照
的に、「免疫原性エピトープ」は、抗体応答を惹起するタンパク質の一部分とし
て定義される。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。
【００６９】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段により作製され
得る。（例えば、米国特許番号第４，６３１，２１１号にさらに記載されるＨｏ
ｕｇｈｔｅｎ、Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２：５１３１〜５１３５（１９８５）を参照のこと）。
【００７０】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも７個、より好
ましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ
酸の配列を含む。抗原性エピトープは、このエピトープに特異的に結合する抗体
（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有用である（例えば、Ｗｉｌｓ
ｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，
Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこ
と。）。
【００７１】 同様に、免疫原生のエピトープは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導
するために用いられ得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（前出）；Ｗｉｌｓ
ｏｎら（前出）；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好まし
い免疫原性エピトープは、分泌されたタンパク質を含む。免疫原性エピトープは
、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギ
またはマウス）に対して、あるいは十分に長い場合では（少なくとも約２５アミ
ノ酸）、キャリアを用いずに提示され得る。しかし、８〜１０程度のわずかなア
ミノ酸を含む免疫原性エピトープが、変性されたポリペプチドの直鎖エピトープ
に（非常に少なくとも）結合し得る抗体を惹起するのに十分であることが見られ
た（例えば、ウエスタンブロッティングにおいて）。
【００７２】 ＤＮＡｓｔａｒ分析を用いて、配列番号２は、以下のアミノ酸で抗原性を見出
された：２９〜３２、３９〜４５、４８〜５０、５２〜５９、６４〜７２、７６
〜７８、９１〜１０１、１０６〜１１４、１２１〜１２８、１３６〜１４６、１
６２〜１７８、１９０〜１９８、２１６〜２３３、および２５７〜２８５。従っ
て、これらの領域は、ＨＤＰＪＯ３９によりコードされるタンパク質に対する抗
体を産生するためのエピトープとして用いられ得る。
【００７３】 本明細書で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗
体」（Ｍａｂ）は、インタクトな分子ならびにタンパク質に特異的に結合し得る
抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含む
ことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクトな抗
体のＦｃフラグメントを欠落し、循環からより迅速に除去され、そしてインタク
トな抗体より少ない非特異的な組織への結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕ
ｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。従って、これらのフラグ
メントおよび、ＦＡＢの産物または他の免疫グロブリン発現ライブラリーは、好
ましい。さらに、本発明の抗体は、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体を含
む。
【００７４】 （融合タンパク質） 任意のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドは、融合タンパク質を産生するために使用さ
れ得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、第２のタンパク質に融合される
場合、抗原性タグとして使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドに対して惹起
される抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭに結合することによって、この第２のタンパク質を
間接的に検出するために使用され得る。さらに、分泌されるタンパク質は、細胞
位置を輸送シグナルに基づいて標的化するので、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、
他のタンパク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
【００７５】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドと融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列
のみならず、また他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である
必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【００７６】 さらに、融合タンパク質はまた、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの特徴を改良する
ために操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、
宿主細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を
改良するためにＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプ
チド部分は、精製を容易にするためにＤ−ＳＬＡＭポリペプチドに付加され得る
。このような領域は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの最終調製の前に除去され得る
。ポリペプチドの取り扱いを容易にするためのペプチド部分の付加は、当該分野
でよく知られ、そして慣用技術である。
【００７７】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド（フラグメント、そして特にエピトープを
含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わせられ得
、キメラポリぺプチドを生じる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そ
してインビボにおいて増加した半減期を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ
４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重
鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載して
いる（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３
３１： ８４〜８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起
因する）を有する融合タンパク質はまた、単量体タンパク質またはタンパク質フ
ラグメント単独よりも、他の分子を結合しそして中和するのに、より効率的であ
り得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８
〜３９６４（１９９５））。
【００７８】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応特許第２０４５８６９
号）は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは
、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として
使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発
見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニス
トを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分
と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２〜５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９〜９４７１（１９９５）を参照のこと）
。
【００７９】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、マーカー配列（例えば、Ｄ−ＳＬＡＭ
の精製を容易にするペプチド）に融合され得る。好ましい実施態様において、マ
ーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベ
クター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａ
ｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これら
の多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１〜８２４（１９８９
）に記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製
を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、イン
フルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ
ら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））。
【００８０】 従って、任意のこれら上記の融合物は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドを使用して操作され得る。
【００８１】 （ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生） 本発明はまた、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、お
よび組換え技術によるポリペプチドの産生に関する。例えば、ベクターは、ファ
ージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルス
ベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複
製欠損であり得る。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、補完性（ｃｏｍｐｌ
ｅｍｅｎｔｉｎｇ）宿主細胞にのみ生じる。
【００８２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを
含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウ
ム沈澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベク
ターがウイルスである場合、ウィルスベクターは、適切なパッケージング細胞株
を使用してインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され
得る。
【００８３】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げ
れば、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモータ
ー、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、Ｓ
Ｖ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイ
ルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプ
ロモーターは当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結の
ための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む
。構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開
始コドン、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置される終結コドン
（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００８４】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌
において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐
性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍ細胞）；酵母細胞のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、
２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞；ならびに植物
細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞についての適切な培養培
地および条件は、当該分野で公知である。
【００８５】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２
３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの
中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳ
ＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切なベク
ターは当業者に容易に明らかである。
【００８６】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）のような多く
の標準的な研究室マニュアルに記載される。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、実際
、組換えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが特に意図され
る。
【００８７】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、
酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロ
マトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そ
して精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ
」）が精製のために使用される。
【００８８】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド、および好ましくは分泌形態はまた、以下から回収
され得る：直接単離されるかまたは培養されるかにかかわらず、体液、組織およ
び細胞を含む天然の供給源から精製される産物；化学的合成手順の産物；ならび
に、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細
胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生された
産物。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、Ｄ−ＳＬＡＭポリペ
プチドは、グリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよ
い。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として
、いくつかの場合において、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従っ
て、一般に、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、すべて
の真核生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去されるこ
とが、当該分野において周知である。ほとんどのタンパク質においてＮ末端メチ
オニンはまた、ほとんどの原核生物において効率的に除去されるが、いくつかの
タンパク質について、この原核生物除去プロセスは、非効率的であり、Ｎ末端メ
チオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存する。
【００８９】 本明細書中で議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加えて、
本発明はまた、内因性遺伝物質（例えば、Ｄ−ＳＬＡＭコード配列）を欠損する
かまたは置換するようにか、ならびに／あるいは本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチドと作動可能に関連し、そして内因性Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドを活
性化するか、変更するか、および／または増幅する遺伝物質（例えば、異種ポリ
ヌクレオチド配列）を含むように操作されている、脊椎動物起源、特に哺乳動物
起源の、初代宿主細胞、次代宿主細胞、および不死化宿主細胞を含む。例えば、
当該分野で公知である技術を使用し、相同組換えを通じて、異種制御領域（例え
ば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を内因性Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド配列と作動可能に関連させ得る（例えば、米国特許第５，６４１，６７
０号（１９９７年６月２４日公開）；国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１（１９
９６年９月２６日公開）；国際出願番号ＷＯ９４／１２６５０（１９９４年８月
４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと。各々の開示は、そ
れらの全体が参考として援用される）。
【００９０】 （Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの使用） 本明細書中で同定されるＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、多数の方法におい
て試薬として使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり
、そして公知の技術を利用する。
【００９１】 実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬が現在ほとん
ど利用可能ではないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性が存在するま
まである。
【００９２】 簡単に言うと、配列は、配列番号１に示される配列からＰＣＲプライマー（好
ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって染色体にマッピングされ得る
。プライマーが、ゲノムＤＮＡ中の１つより多くの予測されたエキソンにまたが
らないように、プライマーは、コンピューター分析を使用して選択され得る。次
いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰ
ＣＲスクリーニングに使用される。配列番号１に対応するヒトＤ−ＳＬＡＭ遺伝
子を含むハイブリッドのみが、増幅したフラグメントを産生する。
【００９３】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰ
ＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て、１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチドの準局在化（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染
色体フラグメントのパネルで達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピング
ストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート（ｌ
ａｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、およ
び染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーション
による前選択を含む。
【００９４】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレ
ッドの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して達成さ
れ得る。この技術は、５００または６００塩基ほどの短さのポリヌクレオチドを
使用する；しかし２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい。
この技術の総説に関しては、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ
ｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｐｅｒ
ｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【００９５】 染色体マッピングについては、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、個々に（単
一染色体またはその染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（
複数部位および／または複数染色体をマークするために）使用され得る。好まし
いポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの非コード領域に対応する。なぜなら、コード
配列は、遺伝子ファミリー内で保存される傾向がより高く、従って、染色体マッ
ピングの間に交差ハイブリダイゼーションの機会が増加するからである。
【００９６】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオ
チドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置
と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確立す
る（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉ
ａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通して
オンラインで利用可能である）において見出される）。１メガベースマッピング
解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体領域
に正確に位置決めされるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子の１つ
であり得る。
【００９７】 従って、一旦、同時遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間でのＤ
−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る
。まず、染色体中の可視的構造変化（例えば、欠失または転座）は染色体スプレ
ッドにおいて、またはＰＣＲによって試験される。構造的変化が存在しない場合
、点変異の存在が確認される。何人かのまたは全ての罹患された個体で観察され
たが、正常な個体では観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を引き起こ
し得ることを示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のＤ−ＳＬＡＭポリペプ
チドおよび対応する遺伝子の完全な配列決定は、変異を多型性と区別するために
要求される。新しい多型性が同定される場合、この多型ポリペプチドはさらなる
連鎖分析のために使用され得る。
【００９８】 さらに、非罹患個体と比較した罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現が
、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変化
（変化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカーまたは予後マー
カーとして使用され得る。
【００９９】 前記に加えて、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、三重らせん形成またはアン
チセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御するために使用され得
る。両方の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に依存する
。これらの技術に関して、好ましいポリヌクレオチドは通常、２０〜４０塩基長
であり、そして転写に関与する遺伝子領域（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（アンチセン
ス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉ
ｇｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈ
ｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））のいずれかに相補的である。三重
らせん形成は、最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、アンチセン
スＲＮＡハイブリダイゼーションは、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻
止する。両方の技術は、モデル系において効果的であり、そして本明細書に開示
される情報は、疾患を処置するための試みにおいて、アンチセンスまたは三重ら
せんポリヌクレオチドを設計するために使用され得る。
【０１００】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝
子治療の１つの目標は、遺伝子欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有す
る生物へ正常遺伝子を挿入することである。Ｄ−ＳＬＡＭは、高度に正確な様式
でこのような遺伝子欠損を標的とする手段を提供する。別の目標は、宿主ゲノム
中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入することであり、それによって宿主細
胞中に新しい形質を生成する。
【０１０１】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同
定するために有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フ
ラグメント長の多型性（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、
個体のゲノムＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するた
めの独特なバンドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この
方法は、「認識票（Ｄｏｇ ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、
または盗まれたりすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る）の現在の
限界を受けない。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなる
ＤＮＡマーカーとして使用され得る。
【０１０２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際
の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰのための代替として
使用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡ（これは、次いで
配列決定され得る）を増幅しそして単離するためのＰＣＲプライマーを調製する
ために使用され得る。各々の個体が独特のＤＮＡ配列のセットを有するので、こ
の技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、独特のＩＤデータベースが個体
に対して確立されると、個体が生存していようとまたは死亡していようと、その
個体のポジティブ同定が、極めて小さな組織サンプルから行われ得る。
【０１０３】 法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用することから利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例
えば、血液、唾液、精液など）のような非常にわずかな生物学的サンプルから採
取されたＤＮＡ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。ある先行技術において
、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多型遺伝子座から増幅された遺伝子
配列は、個体を同定するために法医学生物学において使用される。（Ｅｒｌｉｃ
ｈ， Ｈ．， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃ
ｏ． （１９９２））。一旦、これらの特異的多型遺伝子座が増幅されると、こ
れらは１つ以上の制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺
伝子に対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロットについてのバンドのセッ
トの同定を生じる。同様に、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、法医学的目的の
ための多型性マーカーとして使用され得る。
【０１０４】 また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提示される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、Ｄ−ＳＬＡＭ配列から調製される特定の組織に
特異的なＤＮＡプローブまたはプライマーを含み得る。このような試薬のパネル
は、種および／または器官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これら
の試薬は、夾雑物について組織培養物をスクリーニングするために使用され得る
。
【０１０５】 Ｄ−ＳＬＡＭは、樹状細胞、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ節、脾臓、胸腺、小腸、
および子宮において発現されることが見出されるので、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレ
オチドは、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の差示的同定のため
のハイブリダイゼーションプローブとして有用である。同様に、ポリペプチドお
よびＤ−ＳＬＡＭポリペプチドに指向される抗体は、組織または細胞型の差示的
同定に対する免疫学的プローブを提供するために有用である。さらに、上記の組
織または細胞、特に免疫系の多くの障害について、「標準的」なＤ−ＳＬＡＭ遺
伝子の発現レベル（すなわち、免疫系障害を有さない個体由来の健常組織におけ
るＤ−ＳＬＡＭの発現レベル）に対して、有意により高いかまたはより低いレベ
ルのＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された
特定の組織（例えば、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、血清、血
漿、尿、滑液または髄液）中で、検出され得る。
【０１０６】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、この方法は、（ａ）個体の細胞
または体液中のＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）こ
のＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の発現レベルを標準的なＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の発現レベル
と比較する工程を包含し、これによって、標準的な発現レベルと比較して、アッ
セイされたＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の発現レベルの増加または減少が、免疫系におけ
る障害を示す。
【０１０７】 少なくとも、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、サザンゲルでの分子量マーカ
ーとして、特定の細胞型における特定のｍＲＮＡの存在に関する診断用プローブ
として、新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスでの公知の配列を「差し引
き」するためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着させ
るためのオリゴマーを選択および作製するため、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮ
Ａ抗体を惹起させるため、ならびに免疫応答を誘発する抗原として、使用され得
る。
【０１０８】 （Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの使用） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、多くの方法に使用され得る。以下の記載は、例
示としてみなされるべきであり、そして公知の技術を利用する。
【０１０９】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、抗体に基づいた技術を使用して生物学的サンプ
ル中のタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織にお
けるタンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（Ｊａ
ｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１
９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０
８７−３０９６（１９８７））。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用であ
る、抗体に基づいた他の方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）お
よびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイが含まれる。適切な
抗体アッセイの標識は、当該分野で公知であり、そして例えば、グルコースオキ
シダーゼのような酵素標識、ならびにヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１
４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、お
よびテクネチウム（９９ｍＴｃ）のような放射性同位体、ならびにフルオレセイ
ンおよびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。
【０１１０】 生物学的サンプル中の分泌タンパク質レベルをアッセイすることに加えて、タ
ンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質をインビボ
で画像化するための抗体の標識またはマーカーとしては、Ｘ線ラジオグラフィー
、ＮＭＲまたはＥＳＲにより検出可能なものが挙げられる。Ｘ線ラジオグラフィ
ーについては、適切な標識は、検出可能な放射線を発するが、被験体に対して明
白には有害ではない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位体を含む。Ｎ
ＭＲおよびＥＳＲに適切なマーカーには、例えば重水素のような検出可能な特徴
的なスピンを有するものが含まれ、これは、関連したハイブリドーマのための栄
養素を標識することにより抗体に取り込まれ得る。
【０１１１】 放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過
性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像
化部分で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動
物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズ
および用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部
分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、
ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０
ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは
、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像
化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅ
ｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ
Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１
３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０１１２】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、この方法は、（ａ）個体の細胞
または体液中のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの発現をアッセイする工程；（ｂ）こ
の遺伝子発現レベルを標準的な遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、これ
によって、標準的な発現レベルと比較して、アッセイされたＤ−ＳＬＡＭポリペ
プチドの遺伝子発現レベルの増加または減少が、障害を示す。
【０１１３】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを用いて疾患を処置し得る。例えば、患者
は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド（例えば、インスリン）の非存在またはレベルの
減少を元に戻すこと、異なるポリペプチド（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘ
モグロビンＳ）の非存在またはレベルの減少を補充すること、ポリペプチド（例
えば、ガン遺伝子）の活性を阻害すること、ポリペプチドの活性を（例えば、レ
セプターに結合することによって）活性化すること、遊離リガンド（例えば、炎
症を低減させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）について膜結合レセプ
ターと競合させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること、また
は所望の応答（例えば、血管の増殖）をもたらすことに取り組む際に、Ｄ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドが投与され得る。
【０１１４】 同様に、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを指向する抗体もまた使用されて疾患を処
置し得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを指向する抗体の投与は、ポリペ
プチドに結合し、そしてポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の
投与は、例えば、膜に結合したポリペプチド（レセプター）へ結合することによ
り、ポリペプチドを活性化し得る。
【０１１５】 少なくとも、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用
され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドはまた、抗体を惹起するために使用され得
、次いで、この抗体を使用して、宿主細胞の形質転換を評価する方法として、組
換え細胞からのタンパク質発現を測定する。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド
を使用して、以下の生物学的活性を試験し得る。
【０１１６】 （Ｄ−ＳＬＡＭの生物学的活性） Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよびポリペプチドをアッセイに用いて、１つ
以上の生物学的活性について試験し得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドが、特定のアッセイにおいて活性を示す場合、Ｄ−ＳＬＡＭは、生
物学的活性に関連した疾患に関与し得るようである。従って、Ｄ−ＳＬＡＭを用
いて、関連する疾患を処置し得る。
【０１１７】 Ｄ−ＳＬＡＭは、分泌性リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーのメンバ
ーに相同な細胞表面レセプターであり、従って、他のＳＬＡＭファリミーメンバ
ーに類似する活性を有するはずである。文献中の現在の研究は、ＳＬＡＭがそれ
自体と会合し得、そしてこの同型相互作用がＢ細胞およびＴ細胞を活性化し得る
ことを実証する。従って、Ｄ−ＳＬＡＭは、Ｂ細胞およびＴ細胞の表面上の、Ｓ
ＬＡＭ、Ｄ−ＳＬＡＭ（同型相互作用）、または他のＢ細胞およびＴ細胞レセプ
ター分子と特異的に相互作用し、免疫細胞の、活性化、増殖、生存、および／ま
たは分化に影響を与え得る。同様に、可溶性Ｄ−ＳＬＡＭは、治療での使用また
は免疫調節のための重要な同時刺激性分子であり得る。リガンド（例えば、抗体
）は、Ｄ−ＳＬＡＭ、ＳＬＡＭ、または他の樹状細胞レセプターに結合すること
により可溶性Ｄ−ＳＬＡＭの作用を模倣し得る。
【０１１８】 Ｄ−ＳＬＡＭの結合は、他の細胞型、特にＴ細胞およびＢ細胞からのインター
フェロンγの産生を誘導する（データは示さず）。この結合は、膜結合Ｄ−ＳＬ
ＡＭとの同型会合、ＳＬＡＭとの会合、あるいは他のＴ細胞またはＢ細胞レセプ
ターとの会合を通じて生じ得る。リガンド（例えば、抗体）は、Ｄ−ＳＬＡＭ、
ＳＬＡＭ、または他の樹状細胞レセプターへの結合により可溶性Ｄ−ＳＬＡＭに
よるインターフェロンγの誘導を模倣し得る。
【０１１９】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭの組織分布によって、このタンパク質はまた、樹状細胞
または抗原提示細胞を刺激する際に役割を果たし得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭの
分泌型（細胞外ドメインまたは全長型を含む）は、同型様式で、樹状細胞または
抗原提示細胞の表面上に位置するＤ−ＳＬＡＭ分子に結合し得、そして刺激し得
る。結合はまた、ＳＬＡＭ、または他の樹状細胞表面レセプターに生じ得る。こ
の結合は、樹状細胞または抗原提示細胞の生存、増殖、分化、活性化または成熟
を調節し、抗原認識および免疫応答をもたらし得る。さらに、リガンド（例えば
、抗体）は、Ｄ−ＳＬＡＭ、ＳＬＡＭ、または他の樹状細胞レセプターへの結合
により可溶性Ｄ−ＳＬＡＭの作用を模倣し得る。
【０１２０】 従って、Ｄ−ＳＬＡＭは、治療分子として有用であり得る。それは、造血細胞
、特に、Ｂ細胞およびＴ細胞の増殖、活性化、成熟、生存、および／または分化
を制御するために使用され得る。特に、Ｄ−ＳＬＡＭは、免疫調節を媒介するた
めの有用な治療剤であり得、そして患者の免疫系のＴｈ０−ＴＨ１−ＴＨ２プロ
フィールに影響を与え得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭは、Ｔｈ０−ＴＨ１経路に対
する免疫応答を駆動し得る。免疫細胞のこの制御は、免疫障害（例えば、自己免
疫疾患または免疫抑制（以下を参照））の処置に特に重要である。好ましくは、
免疫障害の処置を、Ｄ−ＳＬＡＭの分泌型、遺伝子治療、またはエキソビボ適用
を使用することで実行し得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭのインヒビター（ブロッキ
ング抗体または変異型のいずれか）は、Ｄ−ＳＬＡＭの発現を調節し得る。これ
らのインヒビターは、Ｄ−ＳＬＡＭの誤った調節に関連する疾患（例えば、Ｔ細
胞リンパ腫）を処置するために有用であり得る。
【０１２１】 （免疫活性） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、免疫細胞の増殖、分化
、または動員（走化性）を活性化または阻害することによって、免疫系の不全ま
たは障害を処置する際に有用であり得る。免疫細胞は、多能性幹細胞から骨髄性
細胞（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）およびリンパ系細胞（
Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を産生する、造血と呼ばれるプロセスを介して発
生する。これらの免疫不全または障害の病因は、遺伝性、体細胞性（例えば、癌
またはいくつかの自己免疫障害）、後天性（例えば、化学療法または毒素による
）、または感染性であり得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたは検出因子として使
用され得る。
【０１２２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、造血細胞の不全または
障害を処置または検出する際に有用であり得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまた
はポリヌクレオチドは、特定（または多くの）型の造血細胞の減少に関連する障
害を処置する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増
加させるために使用され得る。免疫学的不全症候群の例には以下が挙げられるが
、それらに限定されない：血液タンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリン血
症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全
、ディジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症
候群、リンパ球減少症、食細胞殺菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）
、ヴィスコット‐オールドリッチ障害、貧血、血小板減少症、または血色素尿症
。
【０１２３】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、止血活性
（出血の停止）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節するために使用され得る
。例えば、止血活性または血栓崩壊活性を増加させることによって、Ｄ−ＳＬＡ
Ｍポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、血液凝固障害（例えば、無線維素原
血症、因子不全（ｆａｃｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ））、血小板障害（例え
ば、血小板減少症）、または外傷、手術、もしくは他の原因から生じる創傷を処
置するために使用され得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を低減し得
るＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、心臓発作（梗塞）、発
作、または瘢痕の処置において重要な凝固を阻害または溶解するために使用され
得る。
【０１２４】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、自己免疫障害を処
置または検出する際に有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞による
、自己の外来物質としての不適切な認識から生じる。この不適切な認識は、宿主
組織の崩壊を導く免疫応答を生じる。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分
化、または走化性を阻害し得るＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドの投与は、自己免疫障害を予防する際の有効な治療であり得る。
【０１２５】 Ｄ−ＳＬＡＭによって処置または検出され得る自己免疫障害の例には、以下が
挙げられるがそれらに限定されない：アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症
候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッド
パスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎
、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッフ
マン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎、
ギヤン‐バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症眼病。
【０１２６】 同様に、喘息（特に、アレルギー性喘息）または他の呼吸器問題のようなアレ
ルギー反応および状態はまた、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドによって処置され得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭは、アナフィラキシー、抗原性
分子に対する過敏症、または血液型群不適合を処置するために使用され得る。
【０１２７】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、器官拒絶または対
宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置および／または予防するために使用され得る
。器官拒絶は、免疫応答を介する移植された組織の宿主免疫細胞崩壊によって生
じる。同様に、免疫応答はまたＧＶＨＤに関与するが、この場合において外来の
移植された免疫細胞は、宿主組織を崩壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分
化、または走化性を阻害するＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチド
の投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤを予防する際に有効な治療であり得る。
【０１２８】 同様に、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、炎症を調
節するために使用され得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌク
レオチドは、炎症応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの
分子は、以下を含む炎症状態（慢性状態および急性状態の両方）を処置するため
に使用され得る：感染と関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、ま
たは全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再灌流傷害、内毒素致死、関
節炎、補体媒介超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導肺傷害、
炎症性腸疾患、クローン病、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−
１）の過剰産生から生じる状態。
【０１２９】 （過剰増殖性障害） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、新生物を含む過剰増殖
性障害を処置または検出するために使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドま
たはポリヌクレオチドは、直接的相互作用または間接的相互作用を介して、障害
の増殖を阻害し得る。あるいは、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドは、過剰増殖性障害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。
【０１３０】 例えば、免疫応答を増加させること、特に過剰増殖性障害の抗原性質を増加さ
せることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員させることによっ
て、過剰増殖性障害を処置し得る。この免疫応答は、存在する免疫応答を増強さ
せることによって、または新しい免疫応答を開始させることによってのいずれか
で増加され得る。あるいは、免疫応答を低減させることもまた、化学療法剤のよ
うな過剰増殖性障害を処置する方法であり得る。
【０１３１】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドによって処置または検出さ
れ得る過剰増殖性障害の例には、以下に位置する新生物が挙げられるがそれらに
限定されない：腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎
、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頸部、神経
（中枢神経および末梢神経）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、お
よび泌尿器。
【０１３２】 同様に、他の過剰増殖性障害はまた、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドによって処置または検出され得る。そのような過剰増殖性障害の例に
は、以下が挙げられるがそれらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、リン
パ増殖性（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害、パラプロテイン血
症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｎマクロ
グロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および上記で列挙した器官系に位置
される新形成以外の任意の他の過剰増殖性疾患。
【０１３３】 （感染性疾患） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染性因子を処置また
は検出するために使用され得る。例えば、免疫応答を増加させることによって、
特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、
感染性疾患を処置し得る。免疫応答は、存在する免疫応答を増強することによっ
て、または新しい免疫応答を開始させることによってのいずれかで増加され得る
。あるいは、Ｄ-ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、免疫応 答を必ずしも誘発させることなく、感染性因子を直接的に阻害し得る。
【０１３４】 ウイルスは、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドによって処置
または検出され得る疾患または症状を生じ得る感染性因子のうちの１つの例であ
る。ウイルスの例には、以下のＤＮＡウイルス科およびＲＮＡウイルス科が挙げ
られるがそれらに限定されない：アルボウイルス科、アデノウイルス科、アレナ
ウイルス科、アルテリウイルス科、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カル
シウイルス科、コルチコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイ
ルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科
（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状ヘルペス）、モノネガウ
イルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹
ウイルス、ラブドウイルス科）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエ
ンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックス
ウイルス科（例えば、天然痘またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロ
タウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイ
ルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス）。これらの科に入るウ
イルスは、以下を含むがそれらに限定されない種々の疾患または症状を生じ得る
：関節炎、気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、脳炎、眼感染（例えば
、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、慢性活動性、δ
）、髄膜炎、日和見感染（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水
痘、出血熱、麻疹、おたふくかぜ、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ
、白血病、風疹、性感染病、皮膚病（例えば、カポージいぼ）、およびウイルス
血症。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらの症状また
は疾患のうちのいずれかを処置または検出するために使用され得る。
【０１３５】 同様に、疾患または症状を生じ得、そしてＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまた
はポリペプチドによって処置または検出され得る細菌性因子または真菌性因子に
は、以下のグラム陰性およびグラム陽性の細菌科および真菌が含まれるがそれら
に限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃ
ｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ
、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉ
ｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏ
ｓｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌ
ｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅ
ｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ
、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎ
ｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ感
染（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓ
ｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ
、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃａｌ。これらの細菌科または真菌科は、以下を含むがそれらに限定されな
い疾患または症状を生じ得る：菌血症、心内膜炎、眼感染（結膜炎、結核症、ブ
ドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染（例えば、ＡＩＤＳ関連感染）、爪周囲炎、人
工器官関連感染、ライター病、気道感染（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血
症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎
、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、らい病、パラ結核、結核、狼
瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、
皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚嚢腫（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血
症、尿路感染症、創傷感染。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチド
は、これらの症状または疾患のうちのいずれかを処置または検出するために使用
され得る。
【０１３６】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドによって処置また
は検出され得る疾患または症状を生じる寄生虫性因子は、以下の科を含むがそれ
らに限定されない：Ａｍｅｂｉａｓｉｓ、Ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄ
ｉｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａ
ｓｉｓ、Ｄｏｕｒｉｎｅ、Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ、Ｇｉａｒｄｉａｓｉｓ
、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｉａｓｉｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒ
ｉａｓｉｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ、
およびＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ。これらの寄生虫は、以下を含むがそれらに限定
されない種々の疾患または症状を生じ得る：疥癬、ツツガムシ病、眼感染、腸疾
患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染（例
えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。Ｄ- ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、任意のそれらの症状または疾
患を処置または検出するために使用され得る。
【０１３７】 好ましくは、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用する処
置は、有効量のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを患者へ投与することによって、また
は患者から細胞を取り出し、この細胞にＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドを供給し
、そしてこの操作した細胞をこの患者に戻すこと（エキソビボ治療）によっての
いずれかであり得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドは、ワクチン中の抗原として使用され、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し
得る。
【０１３８】 （再生） Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、細胞を分化、増殖、お
よび誘引し、組織の再生を導くために使用され得る。（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６
：５９〜８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生は、先天性欠陥、外傷（
創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、年齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節
症（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周疾患、肝不全）、手術（美容形成
外科手術を含む）、線維症、再灌流傷害、または全身性サイトカイン損傷によっ
て損傷を受けた組織を修復、置換、または保護するために使用され得る。
【０１３９】 本発明を用いて再生され得る組織には、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓
、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、血管系（血管およびリ
ンパ管を含む）、神経、造血組織、および骨格組織（骨、軟骨、腱、および靱帯
）が挙げられる。好ましくは、再生は、瘢痕がないか、または瘢痕が減少して生
じる。再生にはまた、新脈管形成が挙げられ得る。
【０１４０】 さらにＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、治癒するのが困
難な組織の再生を増加させ得る。例えば、増加した腱／靭帯の再生は、損傷後の
回復時間を早める。本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチド
はまた、損傷を回避する努力において予防的に使用され得る。処置され得る特定
の疾患には、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損が挙げられ
る。非治癒創傷の組織再生のさらなる例には、圧迫潰瘍（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｕ
ｌｃｅｒ）、血管不全と関連する潰瘍、外科的創傷、および外傷性創傷が挙げら
れる。
【０１４１】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるためにＤ
−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用することによって再生さ
れ得る。この方法を用いて処置され得る疾患には、中枢神経系疾患および末梢神
経系疾患、ニューロパシー、または機械的障害および外傷性障害（例えば、脊髄
障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。特に
、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢性ニューロパシー（例えば、化学療法また
は他の医学的療法から生じる）、局在化されたニューロパシー、および中枢神経
系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋
萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、Ｄ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて処置され得る。
【０１４２】 （走化性） Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化性活性を有し得る
。走化性分子は、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖性
の部位）に、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、マスト細胞、
好酸球、上皮細胞、および／または内皮細胞）を誘引または動員させる。次いで
、動員された細胞は、特定の外傷または異常を撃退および／または治癒し得る。
【０１４３】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定の細胞の走化性活
性を増大し得る。次いで、これらの走化性分子は、身体中の特定の位置に標的化
される細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、また
は任意の免疫系障害を処置するために使用され得る。例えば、走化性分子は、免
疫細胞を傷害を受けた位置に誘引することによって、組織に対する創傷および他
の外傷を処置するために使用され得る。走化性分子として、Ｄ−ＳＬＡＭはまた
、創傷を処置するために使用され得る線維芽細胞を誘引し得る。
【０１４４】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドは走化性活性を阻害し得る
こともまた意図される。これらの分子はまた、障害を処置するために使用され得
た。従って、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化性のイ
ンヒビターとして使用され得る。
【０１４５】 （結合活性） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、Ｄ−ＳＬＡＭに結合する分子、またはＤ−ＳＬ
ＡＭが結合する分子をスクリーニングするために使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭと
分子との結合は、結合したＤ−ＳＬＡＭまたは分子の活性を活性化（アゴニスト
）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような分子の例
は、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、または低
分子を含む。
【０１４６】 好ましくは、分子は、Ｄ−ＳＬＡＭの天然のリガンド（例えば、リガンドのフ
ラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模
倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： 第５章（１９９１）を参照のこ
と）。同様に、分子は、Ｄ−ＳＬＡＭが結合する天然のレセプター、または少な
くともＤ−ＳＬＡＭによって結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、
活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、分子は、公知の技術
を用いて合理的に設計され得る。
【０１４７】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、Ｄ−ＳＬＡＭを、分
泌タンパク質としてまたは細胞膜上でのいずれかで発現する適切な細胞を産生す
る工程を包含する。好ましい細胞は、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、
またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞を含む。次いで、Ｄ−ＳＬＡＭを発現する細胞（
または、発現されたポリペプチドを含む細胞膜）は、好ましくは、Ｄ−ＳＬＡＭ
または分子のいずれかの結合、刺激、または活性の阻害を観察するための分子を
潜在的に含む試験化合物と接触される。
【０１４８】 アッセイは、Ｄ−ＳＬＡＭへの候補化合物の結合を簡単に試験し得、ここで結
合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおい
て検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がＤ−ＳＬＡＭへの結合によっ
て生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０１４９】 あるいは、アッセイは、細胞を含まない調製物、固体支持体に固定されたポリ
ペプチド／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され
得る。アッセイはまた、Ｄ−ＳＬＡＭを含む溶液を候補化合物と混合する工程、
Ｄ−ＳＬＡＭ／分子の活性または結合を測定する工程、およびＤ−ＳＬＡＭ／分
子の活性または結合を、標準と比較する工程を簡単に包含し得る。
【０１５０】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるＤ−ＳＬＡＭ
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭへの直接的もしくは間
接的な結合のいずれか、またはＤ−ＳＬＡＭとの基質についての競合によって、
Ｄ−ＳＬＡＭのレベルまたは活性を測定し得る。
【０１５１】 これらの上記のアッセイのすべては、診断マーカーまたは予後マーカーとして
使用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、Ｄ−ＳＬＡＭ／分
子を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者におけ
る特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、ア
ッセイは、適切に操作された細胞または組織からのＤ−ＳＬＡＭの産生を阻害ま
たは増強し得る因子を発見し得る。
【０１５２】 従って、本発明は、以下の工程を含む本発明のＤ−ＳＬＡＭに結合する化合物
を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物をＤ−ＳＬＡＭとともにイン
キュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程。さらに
、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包
含する：（ａ）候補化合物をＤ−ＳＬＡＭとともにインキュベートする工程、（
ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）Ｄ−ＳＬＡＭの生物学的活
性が改変されているか否かを決定する工程。
【０１５３】 （他の活性） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、上記で議論したよ
うに、造血系統以外の胚幹細胞の分化または増殖を増加または低減させ得る。
【０１５４】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、身長、体重、髪の
色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、サイズ、および形のような哺乳
動物の特徴を調節するため（例えば、美容手術）に使用され得る。同様に、Ｄ−
ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、異化作用、同化作用、プロセ
シング、利用、およびエネルギー貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物代謝を調節するた
めに使用され得る。
【０１５５】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、バイオリズム、概日リ
ズム（ｃａｒｉｃａｄｉｃ ｒｈｙｔｈｍ）、うつ病（抑うつ性障害を含む）、
暴力の傾向、痛みに対する耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビン様活性また
はインヒビン様活性による）、ホルモンレベルまたは内分泌レベル、食欲、性欲
、記憶、ストレス、または他の認識の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物
の精神状態または身体的状態を変化させるために使用され得る。
【０１５６】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、例えば、貯蔵能力
、脂肪含量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、また
は他の栄養成分を増加または低減するための、食物添加剤または保存剤として使
用され得る。
【０１５７】 本発明を一般的に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照してより容易に
理解される。この実施例は、例示の目的で提供され、そして限定を意図されない
。
【０１５８】 （実施例） （実施例１：Ｄ−ＳＬＡＭ ｃＤＮＡクローンの寄託されたサンプルからの
単離） Ｄ−ＳＬＡＭについてのｃＤＮＡを、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ３．０（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ． Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ６００９、Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８９７）のＳａｌＩ／ＮｏｔＩマルチクローニング
部位に挿入する。ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ３．０はアンピシリン耐性遺伝子を含み
、そしてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからも入手可能であるＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ１０Ｂ株に形質転換し得る。（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆ
ｏｃｕｓ １５：５９−（１９９３）を参照のこと）。
【０１５９】 寄託されたサンプルからＤ−ＳＬＡＭを単離するために２つのアプローチが使
用され得る。第一に、３０〜４０ヌクレオチドを有する配列番号１の特定のポリ
ヌクレオチドを、報告されている配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓのＤＮＡ合成装置を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば
、32Ｐ−γ−ＡＴＰで、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、そして
慣用の方法に従って精製する。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１
９８２））。プラスミド混合物を、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給
業者によって提供される技術または関連の刊行物もしくは特許において提供され
る技術）を用いて、適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な選択薬
剤、例えば、アンピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５０の形質転換体
（コロニー）の密度でプレートする。これらのプレートを、細菌コロニースクリ
ーニングについての慣用の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（
１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）または当業者に公知の他の技術に従って
、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【０１６０】 あるいは、配列番号１の両端（すなわち、クローンの５’ＮＴおよび３’ＮＴ
によって囲まれる配列番号１の領域内）に由来する、１７〜２０ヌクレオチドの
２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託されたｃＤＮＡプラ
スミドを鋳型として用いて、Ｄ−ＳＬＡＭ ｃＤＮＡを増幅する。ポリメラーゼ
連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、０．５μｇの上記ｃＤＮＡ鋳型との反応
混合物の２５μｌ中で実施する。簡便な反応混合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ 、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．２５ユニットの
Ｔａｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣＲ（９４℃での変性を１分間；
５５℃でのアニーリングを１分間；７２℃での伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを用いて実施する。増幅産
物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そして予想される分子量のＤＮＡバ
ンドを切り出し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ産物をサブクローニン
グおよび配列決定することによって選択された配列であることを確認する。
【０１６１】 寄託されたクローンに存在しないかもしれないＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の５’非コ
ード部分または３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能で
ある。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープロー
ビング、特異的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である
５’および３’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。
例えば、５’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の５’末端の欠失を
生成するために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））
。
【０１６２】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的のＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の公知の配列に特
異的なプライマーを含むプライマーセットを使用して、Ｄ−ＳＬＡＭの全長遺伝
子の５’部分をＰＣＲ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そ
してこれを使用して全長遺伝子を生成し得る。
【０１６３】 この上記の方法は、ポリＡ＋ＲＮＡを使用し得るが、所望の供給源から単離さ
れた総ＲＮＡを用いて開始する。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファ
ターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮＡ
の５’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであり
、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除
去するために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。この
反応は、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結
され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。
【０１６４】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。第一鎖合成反応物を、連結され
たＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の
配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のための鋳型
として使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして分析して５’末
端配列がＤ−ＳＬＡＭ遺伝子に属することを確認する。
【０１６５】 （実施例２：Ｄ−ＳＬＡＭゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号１に対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。
【０１６６】 （実施例３：Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの組織分布） Ｄ−ＳＬＡＭのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに
よって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用いて決定する
。例えば、実施例１に記載される方法によって生成されるＤ−ＳＬＡＭプローブ
を、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に従って、Ｐ 32 で標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造
者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、精製した標識
プローブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する。
【０１６７】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号Ｐ
Ｔ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに曝露し
、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０１６８】 （実施例４：Ｄ−ＳＬＡＭの染色体マッピング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号Ｘの５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０１６９】 （実施例５：Ｄ−ＳＬＡＭの細菌性発現） 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドをコードするＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチ
ドを、実施例１に概説するように、ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応する
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し、挿入フラグメントを合
成する。ｃＤＮＡ挿入物を増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクタ
ーに増幅産物をクローニングするために、好ましくはプライマーの５’末端にＢ
ａｍＨＩおよびＸｂａＩのような制限部位を含むべきである。例えば、ＢａｍＨ
ＩおよびＸｂａＩは、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．
， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミド
ベクターは、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ で調節可能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（Ｒ
ＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位
をコードする。
【０１７０】 ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながらｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、ｌａｃＩリプ
レッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を与えるプラスミドｐＲ ＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、それらのＬＢプレー
ト上で生育できる能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性
コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認
する。
【０１７１】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養に接種す
るために使用する。細胞を、０．４〜０．６の間の吸光度６００（Ｏ．Ｄ．600 ）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレ
ッサーの不活化によりＰ／Ｏの明確化を誘導し、遺伝子発現の増加を導く。
【０１７２】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる
。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニ
ッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラムにロ
ードする（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）より入手可能）。６×Ｈｉｓタグを
有するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１
工程手順で精製され得る（詳細には、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１９
９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，（前出）を参照のこと）。
【０１７３】 手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ８のカラムにロード
し、カラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ８で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ６で洗浄し、最後にポリペプ
チドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ５で溶出する。
【０１７４】 次いで、精製したＤ−ＳＬＡＭタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）または５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ ６の緩衝液および２００ｍＭ Ｎ
ａＣｌに対して透析することにより再生させる。あるいは、Ｄ−ＳＬＡＭタンパ
ク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに固定化している間に、首尾よく再折り畳みされ得る
。推奨条件は以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、２０％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．
４中の６Ｍ〜１Ｍ尿素の直線勾配を使用する再生。再生は１．５時間以上の時間
にわたって行うべきである。再生後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添
加によって溶出する。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ 酢酸ナトリウム
、ｐＨ ６の緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終の透析工程によっ
て除去する。精製したＤ−ＳＬＡＭタンパク質を、４℃で保存するか、または−
８０℃で凍結する。
【０１７５】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメント
を含み、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ寄託番号２０９６
４５、１９９８年２月２５日に寄託。）。このベクターは以下を含む：１）選択
マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏ
ｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレー
ター配列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプ
レッサー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオ
ペレーター配列を合成的に作製する。
【０１７６】 ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きなフラグ
メント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対である
べきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。ＤＮＡ
挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ
、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲプラ
イマーを使用して、実施例１に記載されるＰＣＲプロトコールに従って生成する
。ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物お
よびベクターを標準的なプロトコールに従って連結する。
【０１７７】 操作されたベクターは、上記のプロトコールにおいて、細菌系でタンパク質を
発現させるために容易に置換され得る。
【０１７８】 （実施例６：封入体からのＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの精製） 以下の別の方法は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドが封入体の形態で存在する場合
に、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを精製するために使
用され得る。他に指定されない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行
われる。
【０１７９】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液中に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。
【０１８０】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる。
次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液
と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを
、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を使用して再度洗浄する。
【０１８１】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。
【０１８２】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。
【０１８３】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄化するために、予め準備した４０ｍＭ
酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍ
メンブレンフィルターを備える接触濾過ユニット（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｉ
ｌｔｒａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を使用する。濾過し
たサンプルを、陽イオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓ
ｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする。カラムを４０ｍＭ 酢
酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩衝液中の２５０ｍＭ 、５０
０ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣｌで、段階的な様式で溶出
する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を継続的にモニターする。画分を収集
し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。
【０１８４】 次いでＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と
混合する。次いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン（Ｐｏ
ｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および弱
アニオン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２０カラムを
１０カラム容量の直線的勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム
、ｐＨ６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５
の範囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ280モニタリング下で収 集する。次いで、（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した）ポリペ
プチドを含む画分をプールする。
【０１８５】 得られたＤ−ＳＬＡＭポリペプチドは、上記の再折畳み工程および精製工程の
後で９５％より高い純度を示すべきである。５μｇの精製タンパク質がロードさ
れる場合、いかなる主たる夾雑バンドも、クマシーブルー染色した１６％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルから観察されないはずである。精製Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質はま
た、エンドトキシン／ＬＰＳ夾雑物について試験され得、そして代表的には、Ｌ
ＰＳ含量はＬＡＬアッセイに従って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０１８６】 （実施例７：バキュロウイルス発現系におけるＤ−ＳＬＡＭのクローニングお
よび発現） この実施例では、Ｄ−ＳＬＡＭを発現するために、プラスミドシャトルベクタ
ーｐＡ２を使用してＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入す
る。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多
核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢ
ａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような便利な制限部位を含む。シミ
アンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデ
ニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは
、同方向にある弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ
由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル
化シグナルを含む。挿入された遺伝子は両方の側で、クローン化したＤ−ＳＬＡ
Ｍポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する、野生型ウイルス
ＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのためのウイルス配列と隣接する。
【０１８７】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌など（必要とされる場合、シグナルペプチドおよびインフレームなＡＵ
Ｇを含む）のために適切に配置されたシグナルを提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０１８８】 具体的には、寄託されたクローンに含まれるＤ−ＳＬＡＭ ｃＤＮＡ配列（こ
れは、ＡＵＧ開始コドンおよび天然に付随する任意のリーダー配列を含む）を、
実施例１に記載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在する
シグナル配列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第２
のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、ベクターは、Ｓｕｍｍｅｒｓら
（「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）
）に記載される標準的な方法を用いて、バキュロウイルスリーダー配列を含むよ
うに改変し得る（ｐＡ２ ＧＰ）。
【０１８９】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲル
から単離する。次いでフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び１％
アガロースゲルで精製する。
【０１９０】 プラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。
次いでＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎ
ｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲルから単離する
。
【０１９１】 フラグメントおよび脱リン酸化したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用
いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
ａ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換し、そ
して培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由来の
ＤＮＡを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同
定する。クローン化したフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認する
。
【０１９２】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に
同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡお
よび５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイ
クロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポ
フェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５分間
インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清グレース
培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。次いでプレートを２７℃で５時間
インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除去し
、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。
次いで培養を２７℃で４日間継続する。
【０１９３】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって記載
されたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロー
スゲルを、ｇａｌ発現クローン（青色に着色したプラークを生ずる）の容易な同
定および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークアッセイ」の
詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，（９−１０頁）によって配布される、昆虫細胞培養およびバ
キュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なインキュ
ベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッター（例えば、Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２０
０μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そして組換
えバキュロウイルスを含む懸濁液を、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９細胞
に感染させるために使用する。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集し
、次いで４℃で貯蔵する。
【０１９４】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯＩ」
）でポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスに感染させる。放射性標識
したタンパク質を所望する場合には、６時間に後培地を除去し、そしてメチオニ
ンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）に置き換え
る。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システイ
ン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間インキ
ュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパク質および細胞
内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで（放射性標識した場合）オートラジ
オグラフィーによって分析する。
【０１９５】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたＤ−ＳＬＡＭタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【０１９６】 （実施例８：哺乳動物細胞におけるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの発現） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る。代表的な哺乳
動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を仲介するプロモーターエレメント
、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必
要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック配列、お
よび、ＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター部位に隣接する介在配
列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター
、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（
ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて
達成される。しかし、細胞内エレメント（例えば、ヒトアクチンプロモーター）
もまた、使用され得る。
【０１９７】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃ
ａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、
ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならび
にｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞は、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞、
マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞およ
びＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
【０１９８】 あるいは、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、染色体に組み込まれたＤ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチドを含む、安定な細胞株中で発現され得る。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、
ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択マーカーを用いる同時トランスフ
ェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０１９９】 トランスフェクトされたＤ−ＳＬＡＭ遺伝子はまた、大量のコードされたタン
パク質を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）
マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株の開発に
有用である。（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３
：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４
３（１９９０）：Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｎｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の
有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈ
ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉ
ｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９
２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、
そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み
込まれた、増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）お
よびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０２００】 プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ寄託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）およびＣＭＶエンハンサー
（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））のフラグ
メントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８の制限酵素切
断部位を有するマルチクローニングサイトは、Ｄ−ＳＬＡＭのクローニングを容
易にする。ベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロインシュリン遺伝
子のポリアデニル化および終結シグナル、ならびにＳＶ４０初期プロモーターの
制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０２０１】 具体的には、プラスミドｐＣ６またはｐＣ４は、適切な制限酵素によって消化
され、次いで当該分野で公知の手順よって、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ）を使用して脱リン酸化する。次いで、ベクターを１％アガロースゲ
ルから単離する。
【０２０２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、実施例１に概説するプロトコルに従って増
幅される。天然に存在するシグナル配列が、分泌タンパク質を産生するために使
用される場合、ベクターは、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは
、天然に存在するシグナル配列が使用されない場合には、細胞からこのタンパク
質を分泌させるために、ベクターは異種シグナル配列を含むように改変され得る
（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０２０３】 増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから
単離する。次いで、フラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び１％ア
ガロースゲル上で精製する。
【０２０４】 次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲ
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクター
を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１また
はＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６またはｐＣ４
に挿入されたフラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定す
る。
【０２０５】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を、リ
ポフェクチンを用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと共に同時トラン
スフェクトする（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、
優性選択マーカーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する
酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理
し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ
／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニング
プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４日後
、単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃度（
５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６
ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、メトトレキサ
ートの最高濃度で増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、５μ
Ｍ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレートに
移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるま
で繰り返す。Ｄ−ＳＬＡＭの発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタ
ンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０２０６】 （実施例９：Ｎ末端および／またはＣ末端欠失変異体の構築） 以下の一般的な方法を使用して、Ｎ末端またはＣ末端欠失Ｄ−ＳＬＡＭ欠失変
異体をクローン化し得る。一般に、約１５〜２５ヌクレオチドの２つのオリゴヌ
クレオチドプライマーは、配列番号１のポリヌクレオチドの所望の５’および３
’位置に由来する。プライマーの５’および３’の位置を、所望のＤ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチドフラグメントに基づいて決定する。開始コドンおよび終止コド
ンを、必要ならば、ポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるＤ−Ｓ
ＬＡＭポリぺプチドフラグメントを発現するように、５’および３’プライマー
にそれぞれ加える。好ましいＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドフラグメントは、本
明細書中の「ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリぺプチドフラグメント」
の節において上記に開示される、Ｎ末端およびＣ末端の欠失変異体をコードする
フラグメントである。
【０２０７】 所望のベクター中でＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドフラグメントのクローニン
グを容易にするための制限部位を含む、さらなるヌクレオチドもまた、５’およ
び３’プライマー配列に加え得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドフラグメント
を、適切なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーならびに本明細書中で議論され
る条件もしくは当該分野に公知の条件を使用して、ゲノムＤＮＡからまたは寄託
されたｃＤＮＡクローンから増幅する。本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド
フラグメントによってコードされるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグメントは、
同様の一般的な様式で、完全長のポリぺプチドとして発現され得、そして精製さ
れ得るが、特定のフラグメントと完全長のポリぺプチドとの間の化学的特徴およ
び物理的特徴の相違に起因して、慣用的な改変が必要とされ得る。
【０２０８】 本発明を限定しない例示的な手段としては、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグ
メント（Ｌｅｕ−３５〜Ｔｈｒ−２７６）をコードするポリヌクレオチドを、以
下のように増幅し、そしてクローン化する：Ｌｅｕ−３５で始まるポリぺプチド
フラグメントのＮ末端部分をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、インフ
レームで制限部位に続いて開始コドンを含む５’プライマーを生成する。Ｔｈｒ
−２７６で終了するＤ−ＳＬＡＭポリぺプチドフラグメントのＣ末端部分をコー
ドするポリヌクレオチド配列を用いて、インフレームで制限酵素部位に続いて終
止コドンを含む相補的な３’プライマーを生成する。
【０２０９】 増幅したポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターを、プライマー中
の部位を認識する制限酵素で消化する。次いで、消化したポリヌクレオチドを共
に連結する。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドフラグメントを、好ましくは、プロ
モーターから下流に、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグメントコード領域を配置
する様式で、制限された発現ベクターに挿入する。連結混合液を、標準的な手順
を用いて、および本明細書の実施例に記載されるようにコンピテントＥ．ｃｏｌ
ｉ細胞中に形質転換する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そして
クローン化されたＤＮＡの同一性を制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によ
って確認する。
【０２１０】 （実施例１０：Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質融合物） Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。こ
れらの融合タンパク質を、種々の適用について使用し得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡ
Ｍポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、お
よびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照
のこと；ＥＰ Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら
、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。同様に、ＩｇＧ−１、Ｉ
ｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。Ｄ
−ＳＬＡＭポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細
胞局在に標的化し得、一方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融
合タンパク質の活性を増大または減少させ得る。融合タンパク質もまた、１つよ
り多い機能を有するキメラ分子を生成し得る。最後に、融合タンパク質は、非融
合タンパク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大
させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型を、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への
融合を概説する以下のプロトコル、または実施例５に記載されるプロトコルを改
変することによって作製し得る。
【０２１１】 手短に言えば、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分を、以下に記載の配列の５’および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅し得る。これらのプライマー
もまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニング
を容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０２１２】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）を使用する場合、ヒトＦｃ部分
を、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結し得る。３’ＢａｍＨＩ部位を破壊する
べきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターを、Ｂａ
ｍＨＩによって再び制限処理し、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載す
るＰＣＲプロトコルによって単離されたＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドを、この
ＢａｍＨＩ部位に連結する。終止コドンを有さないポリヌクレオチドが、クロー
ン化され、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意のこと。
【０２１３】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列を使用としない場合、ベクターを、異種シグナル配列を含むよ
うに改変し得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０２１４】
【化１】 （実施例１１：ポリぺプチドからの抗体の産生） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ、第２章を参照のこと）。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭを発現する細胞は
、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与される。好
ましい方法において、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の調製物が調製され、そして精製
されて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる。次いで、このような調
製物は、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために動物に導入
される。
【０２１５】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
そのタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このよう
な手順は、動物（好ましくは、マウス）をＤ−ＳＬＡＭポリぺプチドで免疫化す
ること、またはより好ましくは、分泌Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチド発現細胞を用い
る免疫化を含む。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養さ
れ得る；しかし、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そし
て約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および
約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変Ｅａｇｌｅ
培地において細胞を培養することが好ましい。
【０２１６】 このようなマウスの脾細胞が抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合
される。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しか
し、ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好
ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に
維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２
５−２３２ （１９８１））に記載されるように限界希釈によってクローニング
する。次いで、このような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞は、Ｄ−Ｓ
ＬＡＭポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッ
セイされる。
【０２１７】 あるいは、Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディ
オタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法
は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第２の抗体に結合する抗体を得ること
が可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体
が使用されて、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動
物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、ハイブリドー
マ細胞は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質特異的抗体に結合するその能力がＤ−ＳＬＡ
Ｍによってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリー
ニングされる。このような抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質特異的抗体に対する
抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＤ−ＳＬＡＭタン
パク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
【０２１８】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明の抗体の他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を
使用して、タンパク質分解性切断によって産生される。あるいは、分泌Ｄ−ＳＬ
ＡＭタンパク質結合フラグメントが、組換えＤＮＡ技術の適用により、または合
成化学を通して産生され得る。
【０２１９】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用すること
によって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知であ
る（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（
１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；
Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、
ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１
；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０２２０】 （実施例１２：高処理能力スクリーニングアッセイのためのＤ−ＳＬＡＭタン
パク質の産生） 以下のプロトコルは、試験されるＤ−ＳＬＡＭポリぺプチドを含有する上清を
産生する。次いで、この上清は、実施例１４〜２１に記載されるスクリーニング
アッセイにおいて使用され得る。
【０２２１】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作用溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。その溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２
チャンネルピペッターが、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る
）。ポリ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化
生理食塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に
残すべきであり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティン
グし得る。
【０２２２】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０5細胞／ウ ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋ
ｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）
を含む）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。
【０２２３】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８〜１０に記載す
る方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現ベ
クターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。マ
ルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔｉ
ｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下げ
たりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、マ
ルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウェ
ルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つの
プレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべきで
ある。
【０２２４】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つお
きにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ
／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次
いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時
間インキュベートする。
【０２２５】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、またはＨＧＳ ＣＨＯ−５培地（１１６．６
ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2（無水物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4−５Ｈ2 Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ3）3−９Ｈ2Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦ ｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ；３１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇ
Ｃｌ2；４８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ4；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；
２４００．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ3；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2 Ｏ；７１．０２ｍｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4− ７Ｈ2Ｏ；０．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステ ロール；０．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍ
ｇ／Ｌのリノール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ミリスチン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのｐａｌ
ｍｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミチン酸；１００ｍｇ／Ｌ
のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌのステアリン酸；２．２０
ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グルコース；１３０．８５
ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アルギニン−ＨＣｌ
；７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ2Ｏ；６．６５ｍｇ／ｍｌのＬ− アスパラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン２ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；３１ ．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタ
ミン酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８．７５ｍｇ／ｍｌのグリ
シン；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；１０６．９７ ｍｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍｌのＬ−ロイシン；１６
３．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニ
ン；６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−
プロリン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−
スレオニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファン；９１．７９ｍｇ／ｍ
ｌのＬ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２Ｈ2Ｏ；および９９．６ ５ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビオチン；３．２４ｍｇ／
ＬのＤ−Ｃａパントテン酸塩；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コリン；４．６５ｍｇ
／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３．０２ｍｇ／Ｌのナイ
アシンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ；０．０３１ｍｇ／Ｌ
のピリドキシンＨＣｌ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン；３．１７ｍｇ／Ｌ
のチアミンＨＣｌ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；および０．６８０ｍｇ／Ｌ
のビタミンＢ12；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／ＬのＮａヒポキ
サンチン塩；０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌのプトレシンナ
トリウム−２ＨＣｌ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；０．００６７
ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミン；０．１２２ｍ
ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄；リノール酸と複合体化した４１．７０ｍｇ／Ｌのメチ
ル−Ｂ−シクロデキストリン；３３．３３ｍｇ／Ｌのオレイン酸と複合体化した
メチル−Ｂ−シクロデキストリン；酢酸レチナールと複合体化した１０ｍｇ／Ｌ
のメチル−Ｂ−シクロデキストリン）のいずれかの適切な培地を調製する。浸透
圧モル濃度を、２ｍＭグルタミンおよび１×ペンストレップを用いて３２７ｍＯ
ｓｍに調整する。（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ ＤＭＥＭ中にＢ
ＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ） １００ｇを溶解する）。培地を濾過し
、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレンコニカル中に
収集する。
【０２２６】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５または７２時間、３７℃でインキュベートする：１％
ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。
【０２２７】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１４〜２
１に記載するアッセイにおいて使用し得る。
【０２２８】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク質
として）か、またはＤ−ＳＬＡＭによって誘導される他のタンパク質の発現（こ
れは、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来することが特に理解される
。従って、本発明はさらに、特定のアッセイにおける活性によって特徴づけられ
る上清中のタンパク質を同定する方法を提供する。
【０２２９】 （実施例１３：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路と呼ばれる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路の活性化タンパク質は、多くの遺伝子
のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントまたはインター
フェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これらのエレメン
トに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させる。
【０２３０】 ＧＡＳおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデューサーおよ
びアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれる転写因子のクラスによって
認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓｔａｔ１お
よびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広範であるよ
うに）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定されており、
そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘルパークラ
スＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼ばれたが、
骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。それは、多く
のサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。
【０２３１】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋ」）ファミリ
ーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質か
ら核へ移動する。Ｊａｋは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリーを表
し、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これらのキ
ナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞において触媒的に
不活性である。
【０２３２】 Ｊａｋは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活性
化される（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋを活性
化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：（ａ）
クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、
ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンについてのレセプター
を含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−１０
を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保存さ
れたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳモチ
ーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号５）をコードする膜
近接領域）を共有する。
【０２３３】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋは活性化され、これは
次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメントに
結合する。この全プロセスは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含される
。
【０２３４】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示す
ために使用され得る。例えば、成長因子およびサイトカインは、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路を活性化することが知られている（以下の表を参照のこと）。従って、レ
ポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ−ＳＴ
ＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。
【０２３５】
【表４】 実施例１４〜１５に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を産生する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインを
用いる誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に証明されたＧＡＳ結合部位の
４つの直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５
７−４６８（１９９４））、他のＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントを代わりに使
用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対して相補
的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライマーの
配列は以下である：
【０２３６】
【化２】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
ＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号７）。
【０２３７】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：
【０２３８】
【化３】 次に、ＳＶ４０プロモーターに結合したこのＧＡＳプロモーターエレメントを
用いて、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター
分子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、
明らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター
分子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知の
レポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパ
ク質が挙げられる。
【０２３９】 合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントと確認された上記の配列を、Ｇ
ＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＳＶ４０プロモーターを、増幅した
ＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントで効率的に置換し、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＸｈｏＩを用いて、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【０２４０】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター（例えば、ｐＧＦＰ
−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞に
トランスフェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１４〜１５に記載され
るようにＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。
【０２４１】 他の構築物を、上記の記載を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１６および１７に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターをこれらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得る
。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモータ
ーを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、ＧＡ
Ｓ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、もしくはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得
る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細
胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞
）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る
。
【０２４２】 （実施例１４：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを、Ｄ−ＳＬＡＭ上清がＴ細胞を増殖および／または分化さ
せるかどうかを決定することにより、Ｄ−ＳＬＡＭのＴ細胞の活性を評価するた
めに使用する。Ｔ細胞の活性を実施例１３で作製したＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ
構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋ−
ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイに使用したＴ
細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１５２）であるが、
Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５２）およびＭｏｌｔ−４細
胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた使用し得る。
【０２４３】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクト（以下に記載のトランスフェクション手順
）する。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのゲンチシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して耐性
であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、漸増
する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選択し
たクローンの用量応答を示す。
【０２４４】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、スケールアップするか、または複数で実施するかのいずれ
かである。Ｊｕｒｋａｔ細胞を１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを有するＲＰＭＩ＋１
０％血清中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組み合
わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを添加
し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
【０２４５】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０7個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０7細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、１ｍｌのＯＰＴＩ−
ＭＥＭ中の１×１０7個の細胞をＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間 インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の
血清を添加する。
【０２４６】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌゲンチシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。これ
らの細胞を実施例１２に記載されるプロトコルにより産生されるようなＤ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドまたはＤ−ＳＬＡＭ誘導ポリペプチドを含む上清で処理する。
【０２４７】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の細胞密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべきで
ある。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。１
枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレー
トについて１億個の細胞）を必要とする。
【０２４８】 細胞を、１２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに分与す
るために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、１２チ
ャンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり
１００，０００個の細胞を添加する）。
【０２４９】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして供する。
【０２５０】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ター中に４８時間置く（注：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）
。次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを、１２チャンネルのピペットを用
いて、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンの
カバーを用いて）覆うべきであり、そして実施例１８に従うＳＥＡＰアッセイを
行うまで、−２０℃で保存する。残存する処理した細胞を含むプレートを４℃に
置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを繰り返すための
物質の供給源として供する。
【０２５１】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。
【０２５２】 （実施例１５：骨髄性の活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを、Ｄ−ＳＬＡＭが骨髄性細胞を増殖または分化させるかど
うかを決定することによりＤ−ＳＬＡＭの骨髄性の活性を評価するために使用す
る。骨髄性細胞の活性を実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅ
ｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋ
−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用さ
れた骨髄性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株）で
あるが、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使用し得る。
【０２５３】 Ｕ９３７細胞を、実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ7個 のＵ９３７細胞を収集し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン
を補充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培
地中で増殖させる。
【０２５４】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、および６７５μＭ ＣａＣｌ2 を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
【０２５５】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
【０２５６】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。
【０２５７】 これらの細胞を１×１０8個の細胞を収集すること（これは１０枚の９６ウェ ルプレートアッセイのために十分である）により試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０5細胞／ｍｌの最終密度で細胞 を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞をプレ
ートする（すなわち、１×１０5細胞／ウェル）。
【０２５８】 実施例１２に記載されるプロトコルにより調製された上清を５０μｌ添加する
。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１０
０ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性
化させることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロ
ールウェルにおいて観察される。ＳＥＡＰは、実施例１８に記載のプロトコルに
従って上清をアッセイする。
【０２５９】 （実施例１６：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に連結したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、Ｄ−ＳＬＡＭによって細胞の活性化を評価し得る。
【０２６０】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ）の細胞）は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデ
カノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経発育因子）、およびＥＧＦ（上
皮増殖因子））での活性化により増殖および／または分化することが公知である
。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポータ
ーに連結したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランス
フェクトすることにより、Ｄ−ＳＬＡＭによってＰＣ１２細胞の活性化を評価し
得る。
【０２６１】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用い
て、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る：
【０２６２】
【化４】 次いで、実施例１３において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを線状化し、ＧＡＳ
／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらの同じ酵素を用
いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターとを
連結する。
【０２６３】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ． カタログ番号０
８−１１５）の、３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を、１つの
１０ｃｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートの１ウェルあたり５
０ｍｌ添加し、そして２時間風乾させる。
【０２６４】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を
補充した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１
２４４９−７８Ｐ）、５％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１
６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから
４つへの分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り
出し、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。
【０２６５】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１２に記載のリポフェクタミン（
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）プロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェ
クトする。ＥＧＲ−ＳＥＡＰ／ＰＣ１２の安定な細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ
４１８中で細胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的
増殖のために使用するが、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍ
ｌのＧ４１８中で再増殖させるべきである。
【０２６６】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
ある細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリー
ニングする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。
次いで、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ Ｆ
ＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓させる。
【０２６７】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中でよく懸濁する。細胞数をカウントし、そ
してより低血清の培地に添加し、５×１０5細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達さ せる。
【０２６８】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０5細胞／ウェルに等しい）。実施例１２により産生された５０μｌの上清を、 ３７℃で４８〜７２時間加える。陽性コントロールとして、ＥＧＲを通してＰＣ
１２細胞を活性化することが公知の増殖因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経発
育因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導が
陽性コントロールウェルにおいて見られる。ＳＥＡＰは実施例１８に従って、上
清をアッセイする。
【０２６９】 （実施例１７：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−ＫＢ（核因子ＫＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−ＫＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−ＫＢは、アポトーシスから細胞を保護すると思われる）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。
【０２７０】 刺激されない条件において、ＮＦ−ＫＢは、Ｉ−ＫＢ（インヒビターＫＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−ＫＢはリン酸化され、そ
して分解（ｄｅｇｒａｄｅ）され、ＮＦ−ＫＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）
を引き起こし、これにより標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−ＫＢにより活
性化される標的遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ
−１およびクラス１ＭＨＣが挙げられる。
【０２７１】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
ＫＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１２におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−ＫＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置の際に有用である。例えば、ＮＦ−Ｋ
Ｂのインヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−ＫＢの活性化に関連するこれら
の疾患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。
【０２７２】 ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−ＫＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号１１）の４つの縦列コピー、ＳＶ４０初
期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そして
ＸｈｏＩ部位に隣接する：
【０２７３】
【化５】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号７）。
【０２７４】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実行する。
得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして
ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ
３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認す
る：
【０２７５】
【化６】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０フラグメントと置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、従って哺乳動物の発現系には好ましくな
い。
【０２７６】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−ＫＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
特に、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を制限処理
した後に、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１に挿入し、
ＧＦＰ遺伝子を置換した。
【０２７７】 一旦、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例１４に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法がまた、実施例１４に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
【０２７８】 （実施例１８：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例１４〜１７に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、
アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。
【０２７９】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。
【０２８０】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液で満たす。５０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液で満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、各回で
５つのプレートを処理し、そして１０分後に２つ目のセットを開始するべきであ
る。
【０２８１】 ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。
【０２８２】
【表５】 （実施例１９：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定する高処理能
力スクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合が、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とは公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を
行うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセ
イを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、ま
たは蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよ
うに容易に改変され得る。
【０２８３】 以下のアッセイは、蛍光定量画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子が、本明細書で
用いられるカルシウム蛍光分子であるｆｌｕｏ−３の代わりに使用され得る。
【０２８４】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が清澄なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ2 インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）で二回洗浄し、最後の
洗浄後、１００μｌの緩衝液を残す。
【０２８５】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯ中に作製する。細胞にｆｌｕｏ−３を負荷するため
、１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレ
ートをＣＯ2インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレ ートをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳを用いて４回洗浄し、１００μｌの緩衝
液を残す。
【０２８６】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌの円錐チューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０6細胞／ｍｌに再懸濁す る。細胞懸濁液１ｍｌにつき、１０％プルロン酸ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌのｆ
ｌｕｏ−３溶液４μｌを加える。次いで、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６
０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０6細胞／ｍｌに再懸濁し、 そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。次いで、プレートをＤｅｎｌｅｙ ＣｅｌｌＷ
ａｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μｌ
にする。
【０２８７】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−３のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。
【０２８８】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷ；（２）曝露時
間は、０．４秒間；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２；（４）励起は４８８
ｎｍ；（５）放射は５３０ｎｍ；および（６）サンプル添加は５０μｌ。５３０
ｎｍにおける放射の増加は、細胞内Ｃａ++濃度の増加を生じる、分子（Ｄ-ＳＬ ＡＭまたはＤ-ＳＬＡＭによって誘導される分子のいずれか）によって生じる細 胞外シグナル伝達事象を示す。 （実施例２０：チロシンキナーゼ活性を同定する高処理能力スクリーニングアッ
セイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲のマイトジェン因子および代謝性増殖因子の
レセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知である大きなＲＰＴＫファ
ミリーが存在する。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌される低分子量タンパ
ク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質も含む。
【０２８９】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化に関与
し、レセプターサブユニットのリン酸基転移および細胞質チロシンキナーゼの活
性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（例えば、
ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシンキナーゼ
、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質ゾルプロ
テインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカインスー
パーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ
およびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介する。
【０２９０】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、Ｄ-ＳＬＡ ＭまたはＤ-ＳＬＡＭによって誘導される分子が、チロシンキナーゼシグナル伝 達経路を活性化し得るか否かの同定は興味深い。従って、以下のプロトコルを設
計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るそのような分子を同
定する。
【０２９１】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで２回、３０分間リンスして滅菌し、水でリ
ンスし、そして一晩乾燥させる。いくつかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養
グレードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジ
ン（５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌ）、あるいは仔ウシ血清で２時間コーティングし、ＰＢＳでリンスし、そし
て４℃で保存する。増殖培地に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡ
ｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ
）が記載するように、ａｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間
接的に定量することにより、これらのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレ
ートカバー＃３０７１を使用し、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅ
ｅｎ Ｐｌａｔｅを被覆する。Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞
培養プレートはまた、いくつかの増殖実験において使用され得る。
【０２９２】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地内で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１２で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０
．１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ Ｎａ4Ｐ2Ｏ7およびＢｏｅｈｅｒ ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手し
たプロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加
し、そしてプレートを回転振盪器上にて４℃で５分間振盪する。次いで、プレー
トを真空トランスファーマニホルド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎ
ｉｆｏｌｄ）に置き、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底
の０．４５ｍｍ膜を通して濾過する。抽出物をバキュームマニホルドの底の９６
ウェル捕獲／アッセイプレートに回収し、そして直ちに氷上に置く。遠心分離に
より明澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェル
の含有物を取り出し、そして４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。
【０２９３】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては１つの方法
を記載する。
【０２９４】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用され得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃ
ｄｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に対応）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミ
ノ酸１〜１７に対応）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの
基質であり、そしてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能であ
る。
【０２９５】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加し、次いでＡＴＰ／Ｍｇ2+（５ｍ
Ｍ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）１０μｌ、次いで５×アッセイ緩衝液（４ ０ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍ
Ｍ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ）１０μｌ、次いでバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後に水
５μｌを加える。成分を穏やかに混合し、そして反応混合物を３０℃で２分間プ
レインキュベートする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えること
によって反応を開始させる。
【０２９６】 次いで、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ１０μｌを添加して反応物を氷上に置くことに
より、チロシンキナーゼアッセイ反応を停止させる。
【０２９７】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を決定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏｓｉ
ｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウェル
に添加し、そして３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように洗
浄する。
【０２９８】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用することにより、４０５ｎｍでのサンプルの吸
光度を測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルを、ＥＬＩＳＡリーダ
ーを使用して定量し、これはチロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【０２９９】 （実施例２１：リン酸化活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 実施例２０に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性のアッセイに可能性のあ
る代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内
シグナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る
。例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−
２キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８
ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉
特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の
分子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホトレオニ
ン分子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子をＥｒｋ−１または
Ｅｒｋ−２について置換することにより検出し得る。
【０３００】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次いでプレートをＰＢＳでリンスし、そして３％ＢＳＡ／ＰＢＳ
によりＲＴで１時間ブロックする。次いでプロテインＧプレートをＥｒｋ−１お
よびＥｒｋ−２に対する２つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル
）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時
間）する。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクロ
ーナル抗体を置換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３
〜５回リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で保存する。
【０３０１】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、そして増殖培地中で一晩培養する。次いで、細胞を基本
培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、次いでＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）
または実施例１２で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次いで、細胞を
可溶化し、そして抽出物をアッセイプレート内に直接濾過する。
【０３０２】 抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次いで、プレートを、Ｅｒｋ−１および
Ｅｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクロー
ナル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を
標準的な手順によりビオチン化する。次いで、結合したポリクローナル抗体をＷ
ａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ装置内でユーロピウムストレプトアビジンおよびユー
ロピウム蛍光増強剤と共に連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）こと
によって定量する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、Ｄ-ＳＬ ＡＭまたはＤ-ＳＬＡＭによって誘導される分子によるリン酸化を示す。
【０３０３】 （実施例２２：Ｄ-ＳＬＡＭ遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたＲＮＡを単離する。次いでｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次いでこのｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の
緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；およ
び７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。
【０３０４】 次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐ
ｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、５’末端にＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。Ｄ-ＳＬＡ Ｍの選択したエキソンのイントロン−エキソン境界をまた決定し、そしてゲノム
ＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いでＤ-ＳＬＡＭについて疑わし い変異を有するＰＣＲ産物をクローン化および配列決定し、直接配列決定の結果
を確認する。
【０３０５】 Ｄ−ＳＬＡＭのＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ，
Ｍ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（
１９９１）に記載のようにＴテール（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）ベクターにクローン化
し、そしてＴ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には存在しないＤ-ＳＬＡＭ における変異により同定する。
【０３０６】 ゲノム再配置もまた、Ｄ-ＳＬＡＭ遺伝子における改変を決定する方法として 観察する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキ
シ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用い
てニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｇ．ら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３５：７３−９９（１９９１）に記載のようにＦ
ＩＳＨを行う。Ｄ-ＳＬＡＭのゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーシ ョンのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイ
ブリダイゼーションを行う。
【０３０７】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドール（ｐｈｅｎｙｌｉｄｏｌｅ
）およびヨウ化プロピジウムで対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わ
せを生成する。正確なマッピングのための整列イメージを、三重バンドフィルタ
ーセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，Ｖ
Ｔ）と冷却電荷結合素子カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａ
Ｚ）および可変励起波長フィルター（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．
Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））とを組み合わせて用
いて得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （
Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ．）を使用
して、画像収集、分析および染色体部分長測定を行う。Ｄ-ＳＬＡＭ（プローブ によりハイブリダイズされた）のゲノム領域の染色体変化を、挿入、欠失および
転座として同定する。これらＤ-ＳＬＡＭの変化を関連疾患の診断マーカーとし て使用する。
【０３０８】 （実施例２３：生物学的サンプル中のＤ-ＳＬＡＭの異常レベルを検出する方 法） Ｄ-ＳＬＡＭのポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてＤ-Ｓ
ＬＡＭレベルの上昇または低下が検出される場合、このポリペプチドは、特定表
現型のマーカーである。検出方法は数多くあり、従って当業者は以下のアッセイ
をそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。
【０３０９】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のＤ-ＳＬＡＭを検出する。マイクロタイタープレートのウェ ルを、Ｄ-ＳＬＡＭに対する特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用 いてコーティングする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのい
ずれかであって、実施例１１に記載の方法により産生される。ウェルに対するＤ
-ＳＬＡＭの非特異的結合が減少するように、このウェルをブロックする。
【０３１０】 次に、コーティングしたウェルを、Ｄ−ＳＬＡＭ含有サンプルと共にＲＴで２
時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用して
結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗浄
し、非結合Ｄ−ＳＬＡＭを除去する。
【０３１１】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
【０３１２】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数
スケール）にＤ−ＳＬＡＭポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（直線スケール）に
蛍光または吸光度をプロットする。標準曲線を用いてサンプル中のＤ−ＳＬＡＭ
濃度を補間する。
【０３１３】 （実施例２４：ポリペプチドの処方） Ｄ−ＳＬＡＭ組成物を、個々の患者の臨床状態（特に、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプ
チド単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の
他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的
とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
【０３１４】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるＤ−ＳＬＡＭの合計薬学
的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあ
るが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホ
ルモンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好まし
くはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である
。連続投与する場合、代表的には、Ｄ−ＳＬＡＭを約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５
０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（
例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液も
また使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置
後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
【０３１５】 Ｄ−ＳＬＡＭを含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎ
ｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点
滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーと
して投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体ま
たは液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細
書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下およ
び関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０３１６】 Ｄ−ＳＬＡＭはまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性組成物
の適切な例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品の形態の半透
過性ポリマーマトリックスを包含する。徐放性マトリックスとしては、ポリラク
チド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン
酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ， Ｕ．ら
、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−
ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．
Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＲ．Ｌａｎｇ
ｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニ
ルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ
酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。徐放性組成物はまた、リポソームに
封入されたＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを包含する。Ｄ−ＳＬＡＭを含有するリポ
ソームは、それ自体が公知である方法により調製される：ＤＥ３，２１８，１２
１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２
：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３
２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２
，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０
４５号および第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、
リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、
脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最
適分泌ポリペプチド治療のために調整される。
【０３１７】 非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、Ｄ−ＳＬＡＭは、そ
れを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量
および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合す
るものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合す
ることにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および
ポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０３１８】 一般に、Ｄ−ＳＬＡＭを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはそ
の両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、
生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア
、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャ
リアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロー
ス溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒク
ルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０３１９】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロ
ースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール
またはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；およ
び／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界
面活性剤が挙げられる。
【０３２０】 Ｄ−ＳＬＡＭは、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好まし
くは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に
処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することによ
り、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
【０３２１】 治療的投与に用いられるＤ−ＳＬＡＭは無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例
えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成さ
れる。一般に、治療用ポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器
、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたは
バイアルに配置される。
【０３２２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、
密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物
として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾
過した１％（ｗ／ｖ）Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして
得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥したＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを注射
用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【０３２３】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした一つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関
する政府機関による承認を表す。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭを他の治療用化合物と組
み合わせて使用し得る。
【０３２４】 （実施例２５：Ｄ−ＳＬＡＭのレベル低下を処置する方法） 本発明は、身体におけるＤ−ＳＬＡＭ活性のレベル低下を必要とした個体を処
置するための方法に関し、この方法は、そのような個体に治療学的有効量のＤ−
ＳＬＡＭアンタゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する。本発明におけ
る使用のための好ましいアンタゴニストは、Ｄ−ＳＬＡＭ特異的抗体である。
【０３２５】 さらに、個体におけるＤ−ＳＬＡＭの標準または正常発現レベルの低下により
引き起こされる状態は、Ｄ−ＳＬＡＭ（好ましくは分泌形態の）を投与すること
により処置し得ることが理解される。従って、本発明はまた、Ｄ−ＳＬＡＭポリ
ペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方法は、この
ような個体に、このような個体でＤ−ＳＬＡＭの活性レベルを増加させる量のＤ
−ＳＬＡＭを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０３２６】 例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチド
を、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポ
リペプチドは分泌形態である。投与および処方に基づく投薬計画の正確な詳細は
、実施例２４に提供されている。
【０３２７】 （実施例２６：Ｄ−ＳＬＡＭのレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、身体におけるＤ−ＳＬＡＭ活性のレベル増加を必要とした個体
を処置するための方法に関し、この方法は、そのような個体に治療学的有効量の
Ｄ−ＳＬＡＭまたはそのアゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する。
【０３２８】 アンチセンス技術を使用してＤ−ＳＬＡＭの産生を阻害する。この技術は、ガ
ンのような様々な病因に起因するＤ−ＳＬＡＭポリペプチド（好ましくは分泌形
態の）のレべルを低下させる方法の１つの例である。
【０３２９】 例えば、Ｄ−ＳＬＡＭのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチ
センスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ
／ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば
、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチド
処方は、実施例２４に提供されている。
【０３３０】 （実施例２７：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを発現し得る線維芽細
胞を患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者
から得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。組織
の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、ほぼ１０片を各フラスコに置く。
このフラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４
時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そ
して新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間
インキュベートする。
【０３３１】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、さらに大
きなフラスコにスケールアップする。
【０３３２】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。
【０３３３】 Ｄ−ＳＬＡＭをコードするｃＤＮＡを、実施例１に記載のそれぞれ５’および
３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、
５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅
したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの
存在下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントを連結するのに適
した条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換
する。次に、それを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティングし、ベクター
が正確に挿入された目的のＤ−ＳＬＡＭを有することを確認する。
【０３３４】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次に、Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に
加え、パッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージン
グ細胞はＤ−ＳＬＡＭ遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パ
ッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【０３３５】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地をミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれたプ
ロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる
。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロデ
ューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新鮮
培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞が
感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓの
ような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要であ
る。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分析し、Ｄ−ＳＬ
ＡＭタンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０３３６】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。
【０３３７】 （実施例２８：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。遺伝子治療法は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド
の発現を増大または減少させるために、裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアン
チセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）Ｄ−ＳＬＡＭ配列の動物への導入に関する。この
Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、プロモーターまたは標的組織によるＤ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに作動可能に連結
され得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公
知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第
５，６９３，６２２号、同第５，７０５，１５１号、同第５，５８０，８５９号
；Ｔａｂａｔａ Ｈら、（１９９７） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３
５（３）：４７０−４７９， Ｃｈａｏ Ｊら、（１９９７） Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ． Ｒｅｓ． ３５（６）：５１７−５２２， Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．（１
９９７） Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８
， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら（１９９６） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３（５）
：４０５−４１１， Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔ
ｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３２９０（本明細書中に参考として援用され
る）を参照のこと。
【０３３８】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達
する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙
空間への注射）によって送達され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物は
、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０３３９】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡは、細胞への侵入を補
助、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドはまた、当業
者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅ
ｒ Ｐ．Ｌ．ら （１９９５） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７
２：１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂら、（１９９５）Ｂｉｏｌ．
Ｃｅｌｌ ８５（１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。
【０３４０】 遺伝子治療方法において使用されたＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドベクター構
築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列を含ま
ない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ＤＮＡの発現
を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列
を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成
の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、
６ヶ月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された
。
【０３４１】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺
、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢
、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含す
る）の間隙空間に送達され得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網
線維間のムコ多糖基質、血管もしくは室の壁における弾性線維、線維性組織のコ
ラーゲン線維、または筋肉細胞を覆う結合組織もしくは骨の裂孔中の同じ基質を
包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液によ
り占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下に記載の理由の
ために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合
に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達さ
れ、その細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全
には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）におい
て達成され得る。インビボ筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発
現する能力において、特に適格である。
【０３４２】 裸のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効
投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好
ましくは、投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そ
してより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろ
ん、当業者が認識するように、この投薬量は、注射の組織部位に従って変化する
。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そし
て処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間
隙空間への非経口注射経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用い
られ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への
送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＤ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチド構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテ
ーテルによって動脈に送達され得る。
【０３４３】 インビボでの筋肉における注入Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの用量応答効果
を、以下のようにして決定する。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドをコードするｍＲＮ
Ａの生成のための適切なＤ−ＳＬＡＭ鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法
論に従って調製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または直鎖状のいずれかであり得
る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいず
れかである。次いで、マウスの四頭筋に、多様な量の鋳型ＤＮＡを注射する。
【０３４４】 ５〜６週齢の雌および雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％Ａｖｅ
ｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿前部で
行い、そして四頭筋を直接可視化する。Ｄ−ＳＬＡＭ鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌ
のキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、
筋肉の遠位挿入部位から膝に約０．５ｃｍで、そして約０．２ｃｍの深さで注射
する。縫合を、将来的な局在化のための注射部位にわたって行い、そして皮膚を
ステンレス鋼クリップで閉じる。
【０３４５】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、Ｄ
−ＳＬＡＭタンパク質発現について組織化学的に染色する。Ｄ−ＳＬＡＭタンパ
ク質発現についての時間経過は、異なるマウスからの四頭筋を異なる時間で採取
すること以外は、同様な様式で行い得る。注射後の筋肉中のＤ−ＳＬＡＭ ＤＮ
Ａの持続性を、注射マウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよ
びＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウス
における上記実験の結果は、裸のＤ−ＳＬＡＭ ＤＮＡを用いて、ヒトおよび他
の動物において適切な投薬量および他の処置パラメーターを推定するために使用
され得る。
【０３４６】 （実施例２９：Ｄ−ＳＬＡＭトランスジェニック動物） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され
得る。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍ
ｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒ
ヒ、サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は
、トランスジェニック動物を作製するために用いられ得る。特定の実施態様にお
いて、本明細書に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺
伝子治療プロトコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現の
ために用いられる。
【０３４７】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列
（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚へのレトロ
ウイルス媒介遺伝子移入；胚幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら
、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクトロ
ポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−
１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（
例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照
のこと）；胚多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の導入
および胚盤胞へのこの幹細胞の再移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉ
ｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含むが
これらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にその全
体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍ
ａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９
）を参照のこと。
【０３４８】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の核の除核した卵母細胞への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。
【０３４９】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。
【０３５０】 手短に言えば、このような技術が、利用されるべきである場合、内在性遺伝子
に対して相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との
相同な組換えを介して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌク
レオチド配列の機能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた
、特定の細胞型に選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入され
た細胞型においてのみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不
活化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは
当業者に明らかである。
【０３５１】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、動物組織の分析により導入遺伝
子の組み込みが起きたことを確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。
【０３５２】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物の群落を生成し得る。そのような交配
戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別々の系統を樹立するための
１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相加
的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェ
ニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析に
よる動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部位
に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の交
雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合系
統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切である異なるバックグラウンド上に
導入遺伝子を配置するための交配。
【０３５３】 本発明のトランスジェニック動物は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの生物学的機
能の精巧化、異常なＤ−ＳＬＡＭ発現に関連する状態および／または障害の研究
、ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合物についての
スクリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない使用を有す
る。
【０３５４】 （実施例３０：Ｄ−ＳＬＡＭノックアウト動物） 内因性Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子発現はまた、標的化された相同性組換えを使用して
Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノッ
クアウトする」ことによって減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃ
ｃｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、
Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本
明細書中でその全体が参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチ
ド配列（この遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡ
に隣接される、本発明の変異性の非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関
連のないＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカー
と共にあるいはこれらを用いずに使用し、インビボで本発明のポリペプチドを発
現する細胞をトランスフェクトし得る。別の実施態様において、当該分野で公知
の技術を、目的の遺伝子を含むが、発現しないノックアウトを細胞中で生じるた
めに使用する。標的化された相同性組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は
、標的化遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対
する改変が不活性な標的化遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され
得る研究および農業分野に特に適応する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅ
ｃｃｈｉ １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。
しかし、このアプローチは、当業者に明白な、適切なウイルスベクターを使用し
て、組換えＤＮＡ構築物がインビボで要求された部位に直接投与され、または標
的化される場合、ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。
【０３５５】 本発明のさらなる実施態様において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝的に操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺
伝的に操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する
。このような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ド
ナーから入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）
、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この
細胞を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に
導入遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順
（プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポ
ソームなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明
のポリペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および
／または本発明のポリペプチドに関連する内因性の制御配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝的に操作する。本発明のポリペプ
チドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまた
はプロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの
発現および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好
ましくは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患
者中へ全身的に導入し得る。
【０３５６】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝的に操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；
遺伝的に操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し
得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号およびＭ
ｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照の
こと。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０３５７】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞を被包性の形態で導入し得、構成成分の即時の細胞外環
境との交換が可能である間は、導入細胞が宿主免疫系によって認識され得ない。
【０３５８】 本発明の「ノックアウト」動物は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの生物学的機能
の精巧化、異常なＤ−ＳＬＡＭ発現に関連する状態および／または障害の研究、
ならびにこのような状態および／または障害を改善させる場合に有効な化合物に
ついてのスクリーニングにおいて有用な動物モデル系を含むが、それらに限定さ
れない使用を有する。
【０３５９】 本発明は、前記の説明および実施例において詳細に記載される場合以外にも実
施され得ることは明らかである。本発明の多数の改変および変更が、上記の教示
を考慮して可能であり、従って添付の特許請求の範囲内である。
【０３６０】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、これによって、本明細書中に参考として援用される。さらに、配列表は、本
明細書中で参考として援用される。
【０３６１】
【表６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｄは、Ｄ−ＳＬＡＭのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定
アミノ酸配列（配列番号２）を示す。約アミノ酸１〜２２に位置する、予想され
るリーダー配列は、下線が付されている。
【図２】 図２は、ＢＬＡＳＴ分析により決定された、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質のアミノ
酸配列とヒトＳＬＡＭの翻訳産物（受託番号ｇｉ／９８４９６９）（配列番号３
）との間の同一の領域を示す。２つのポリペプチド間の同一アミノ酸は、白抜き
で示され、一方保存アミノ酸は、四角で囲まれる。白抜きされた、および／また
は四角で囲まれたアミノ酸領域を試験することにより、当業者は、２つのポリペ
プチド間の保存ドメインを容易に同定し得る。これらの保存ドメインは、本発明
の好ましい実施態様である。
【図３】 図３は、Ｄ−ＳＬＡＭアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコ
イル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および
表面の可能性を示し、全てはデフォルト設定を使用して作成された。「抗原性指
数またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフにおいて、正のピークは、Ｄ−ＳＬ
ＡＭタンパク質の高度な抗原性領域（すなわち、本発明のエピトープ含有ペプチ
ドが得られ得る領域）の位置を示す。これらのグラフに規定されるドメインは、
本発明に意図される。図３にグラフで要約されたデータの表示は、表１に見出さ
れ得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 31/04 29/00 31/12 31/04 35/00 31/12 37/02 35/00 37/08 37/02 43/00 １０７ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/705 43/00 １０７ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｚ 5/10 33/50 Ｐ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/48 33/566 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/53 21/08 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ヤング， ポール アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザーズバーグ， ベックウイズ ス トリート 122

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号１のポリヌクレオチドフラグメントまたはＡＴＣＣ寄託番号２
    ０９６２３に含まれるｃＤＮＡ配列のポリヌクレオチドフラグメント； （ｂ）配列番号２のポリペプチドフラグメントまたはＡＴＣＣ寄託番号２０９
    ６２３に含まれるｃＤＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号２のポリペプチドドメインまたはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２
    ３に含まれるｃＤＮＡ配列をコードする、ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号２のポリペプチドエピトープまたはＡＴＣＣ寄託番号２０９６
    ２３に含まれるｃＤＮＡ配列をコードする、ポリヌクレオチド； （ｅ）生物学的活性を有する、配列番号２のポリペプチドまたはＡＴＣＣ寄託
    番号２０９６２３に含まれるｃＤＮＡ配列をコードする、ポリヌクレオチド； （ｆ）配列番号１の改変体であるポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号１の対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号２の種相同体をコードするポリヌクレオチド； （ｉ）（ａ）〜（ｈ）において特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つに
    ストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、こ
    こで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列
    を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌ
    クレオチド、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
    するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、成熟形態または分泌
    タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された
    核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号２として同
    定される配列をコードするヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６
    ２３に含まれるコード配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号１の全体の
    ヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３に含まれるｃＤＮＡ配
    列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
    らの連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかから
    の連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクタ
    ー。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換え宿主細
    胞を作製する方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞
    。
  10. 【請求項１０】 ベクター配列を含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号２またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３に含まれるコードされ
    た配列の、ポリペプチドフラグメント； （ｂ）生物学的活性を有する、配列番号２またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２
    ３に含まれるコードされた配列の、ポリペプチドフラグメント； （ｃ）配列番号２またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３に含まれるコードされ
    た配列の、ポリペプチドドメイン； （ｄ）配列番号２またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３に含まれるコードされ
    た配列の、ポリペプチドエピトープ； （ｅ）分泌タンパク質の成熟形態； （ｆ）全長分泌タンパク質； （ｇ）配列番号２の改変体； （ｈ）配列番号２の対立遺伝子改変体；または （ｉ）配列番号２の種相同体、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    単離されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記成熟形態または前記全長分泌タンパク質が、Ｃ末端ま
    たはＮ末端のいずれかからの連続するアミノ酸欠失を含む、請求項１１に記載の
    単離されたポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
    合する、単離された抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
    組換え宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、 （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換
    え宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または緩和する方法であって、
    請求項１１に記載のポリペプチドの治療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工
    程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 分泌タンパク質の発現または活性に関係付けられる被験体
    における病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であ
    って、 （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおいて変異の存在または非存在を
    決定する工程；および （ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状
    態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 分泌タンパク質の発現または活性に関係付けられる被験体
    における病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であ
    って、 （ａ）生物学的サンプルにおいて請求項１１に記載のポリペプチドの発現の存
    在または量を決定する工程、および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または
    病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
    を同定する方法であって、 （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触させる工程；
    および （ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすかどうかを決定す
    る工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 配列番号２のｃＤＮＡ配列に対応する、遺伝子。
  22. 【請求項２２】 生物学的アッセイにおいて活性を同定する方法であって、
    ここで該方法が、以下： （ａ）細胞において配列番号１を発現させる工程； （ｂ）その上清を単離する工程； （ｃ）生物学的アッセイにおいて活性を検出する工程；および （ｄ）該活性を有する該上清においてタンパク質を同定する工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法によって産生される、産物。
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