JP2001520039A - ヒト腫瘍壊死因子レセプター様タンパク質、ｔｒ１１，ｔｒ１１ｓｖ１およびｔｒ１１ｓｖ２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍壊死因子レセプターのファミリーの新規なメンバーに関する。本発明は、ヒトＴＲ１１レセプター、ＴＲ１１ＳＶ１レセプターおよびＴＲ１１ＳＶ２レセプターをコードする単離された核酸分子を提供する。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２のポリペプチドもまた、それらを産生するためのベクターとして、宿主細胞として、および組換え方法として同様に提供される。本発明はさらに、ＴＲ１１レセプター、ＴＲ１１ＳＶ１レセプター、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターの活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。ＴＲ１１レセプター、ＴＲ１１ＳＶ１レセプター、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターの異常な発現に関連する疾患状態を検出するための診断方法もまた、提供する。さらに、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２のレセプターを発現する細胞の異常な増殖および分化に関連する疾患状態を処置するための治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーの新規なメンバーに
関する。より詳細には、ヒトＴＮＦレセプター関連タンパク質（本明細書におい
て、図１Ａおよび１ＢのＴＲ１１レセプターという）、ならびにその２つのスプ
ライス改変体（本明細書において、それぞれ図２Ａおよび２Ｂならびに３Ａおよ
び３Ｂの、ＴＲ１１ＳＶ１レセプターおよびＴＲ１１ＳＶ２レセプターといい、
それぞれがマウス糖質コルチコイド誘導腫瘍壊死因子レセプターファミリー関連
遺伝子（ＧＩＴＲ）と相当な相同性を有する）をコードする、単離された核酸分
子が提供される。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチド
もまた提供される。さらに、これらを産生するためのベクター、宿主細胞、およ
び組換え法が提供される。本発明はまた、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ
１１ＳＶ２のレセプターポリペプチドの活性の阻害および増強の両方、ならびに
ＴＲ１１レセプター遺伝子発現の検出のための診断方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびβ（ＴＮＦ−βまたはリンホトキシ
ン）は、ポリぺプチドメディエーターの広範なクラスの関連するメンバーである
。ポリぺプチドメディエーターには、インターフェロン、インターロイキン、お
よび成長（増殖）因子（総称してサイトカインと呼ばれる）が含まれる（Ｂｅｕ
ｔｌｅｒ， Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ， Ａ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．， ７：６２５−６５５ （１９８９））。

【０００３】 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）は、元来、その抗腫瘍活性の結
果として発見されたが、現在は、宿主において生物学的なプロセスおよび病理学
の重要な役割を演じる多面的なサイトカインとして認識される。現在までに、Ｔ
ＮＦ関連サイトカインファミリー、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−
α）、ＬＴ−β、ＴＲＡＩＬ、ならびにＦａｓレセプター、ＣＤ３０、ＣＤ２７
、ＣＤ４０（ＣＤＷ４０としても知られる）、ＯＸ４０、および４−１ＢＢレセ
プターのリガンドの１０個という公知のメンバーが存在する。これらのタンパク
質は、ＴＮＦ−βを除き、膜アンカーとしてしばしば使用される保存Ｃ末端配列
および可変Ｎ末端配列を有する。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの両方が、ＴＮＦ
レセプターに結合した場合、ホモトリマーとして機能する。

【０００４】 ＴＮＦは、多くの細胞型（単球、線維芽細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（Ｎ
Ｋ）細胞を含む）によって、そして主に、活性化されたマクロファージによって
産生される。ＴＮＦ−αは、腫瘍の迅速な壊死、免疫刺激、自己免疫疾患、移植
片拒絶、抗ウイルス応答の生成、敗血症性ショック、大脳マラリア、細胞傷害性
、化学治療の間に生成される電離放射線の有害な効果（例えば、酵素の変性、脂
質の過酸化、およびＤＮＡ損傷）に対する防禦（Ｎａｔａら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． １３６（７）：２４８３（１９８７））、成長（増殖）調節、脈管内皮
効果、および代謝効果における役割を有することが報告されている。ＴＮＦ−α
はまた、内皮細胞による種々の因子（ＰＡＩ−１、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−６を含む）の分泌を誘発して、細胞増殖を促進する。さらに、ＴＮＦ−αは
、Ｅセレクチン、ＩＣＡＭ−１、およびＶＣＡＭ−１のような種々の細胞接着分
子をアップレギュレートする。ＴＮＦ−αおよびＦａｓリガンドはまた、プログ
ラムされた細胞死を誘導することが示されている。

【０００５】 ＴＮＦ−βは、抗ウイルス状態および腫瘍壊死の誘導、多形核白血球の活性化
、クラスＩ主要組織適合性複合体抗原の内皮細胞上への誘導、接着分子の内皮上
への誘導、ならびに成長ホルモン刺激を含む多くの活性を有する（Ｒｕｄｄｌｅ
， Ｎ．およびＨｏｍｅｒ， Ｒ．， Ｐｒｏｇ． Ａｌｌｅｒｇｙ， ４０：
１６２−１８２（１９８８））。

【０００６】 ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの両方は、成長（増殖）調節に関与し、そしてい
くつかの分化段階での造血細胞と相互作用し、種々のタイプの前駆細胞の増殖阻
害し、そして未成熟骨髄性単球の増殖を誘導する（Ｐｏｒｔｅｒ，Ａ．，Ｔｉｂ
ｔｅｃｈ ９：１５８−１６２（１９９１））。

【０００７】 「ノックアウト」マウスを用いた最近の研究は、ＴＮＦ−β産生に欠損がある
マウスが、末梢リンパ器官の異常な発達および脾臓の構造における形態学的な変
化を示すことを示した（Ａｇｇａｒｗａｌら、Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅ
ｔｗ， ７（２）： ９３−１２４（１９９６）で概説）。リンパ器官に関して
、膝窩の、鼠径部の、大動脈傍の、腸間膜の、腋窩の、および子宮頸部のリンパ
節は、ＴＮＦ−β −／−マウスにおいて発達しなかった。さらに、ＴＮＦ−β
−／−マウスからの末梢血は、正常マウスに比較して白血球の３倍の減少を含
んだ。しかし、ＴＮＦ−β −／−マウス由来の末梢血は、その正常の対応物に
比較して４倍多いＢ細胞を含んでいた。さらに、ＴＮＦ−βは、ＴＮＦ−αとは
対照的に、ＥＢＶ感染Ｂ細胞の増殖を誘導することが示された。これらの結果は
、ＴＮＦ−βが、リンパ球の発達に関与することを示す。

【０００８】 ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βによって媒介される種々の細胞性応答の誘導にお
ける最初の工程は、特定の細胞表面または可溶性レセプターへの結合である。約
５５ｋＤａ（ＴＮＦ−ＲＩ）および約７５ｋＤａ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）の２つの異
なるＴＮＦレセプターが同定されており（Ｈｏｈｍａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．， ２６４：１４９２７−１４９３４（１９８９））、そして両方の
レセプター型に対応するヒトｃＤＮＡおよびマウスｃＤＮＡが、単離され、そし
て特徴づけられている（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら、Ｃｅｌｌ， ６１：３５１（１
９９０））。両方のＴＮＦ−Ｒは、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域
を含む細胞表面レセプターの代表的な構造を共有する。

【０００９】 これらの分子は、細胞に結合した形態においてだけでなく、インタクトなレセ
プターの切断された細胞外ドメイン（Ｎｏｐｈａｒら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ， ９（１０）：３２６９−７６（１９９０））、およびさもなくば膜貫通ド
メインが欠失したインタクトなレセプターからなる可溶性形態においても存在す
る。ＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲＩＩの細胞外ドメインは、２８％の同一性を
共有し、そして有意なサブユニット間配列相同性を有する４つの反復システイン
リッチモチーフによって特徴づけられる。大部分の細胞型および組織は、両方の
ＴＮＦレセプターを発現するようであり、そして両方のレセプターが、シグナル
伝達において活性であるが、それらは異なる細胞性応答を媒介し得る。さらに、
ＴＮＦ−ＲＩＩは、ＰＣＴ ＷＯ ９４／０９１３７に示されるように、ＴＮＦ
によるヒトＴ細胞増殖のみを媒介することが示された。

【００１０】 ＴＮＦ−ＲＩ依存性応答には、Ｃ−ＦＯＳ、ＩＬ−６、およびマンガンスーパ
ーオキシドジスムターゼｍＲＮＡの蓄積、プロスタグランジンＥ２合成、ＩＬ−
２レセプターならびにＭＨＣクラスＩおよびＩＩ細胞表面抗原の発現、成長（増
殖）阻害、ならびに細胞傷害性が含まれる。ＴＮＦ−ＲＩはまた、ホスホリパー
ゼＡ₂、プロテインキナーゼＣ，ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ 、およびスフィンゴミエリナーゼのようなセカンドメッセンジャー系を誘発する
（Ｐｆｅｆｆｅｒｋら、Ｃｅｌｌ， ７３：４５７−４６７（１９９３））。

【００１１】 いくつかのインターフェロンおよび他の因子が、ＴＮＦ−Ｒの発現を調節する
ことが示されている。例えば、レチノイン酸は、いくつかの細胞型においてＴＮ
Ｆレセプターの産生を誘導する一方、他の細胞において産生をダウンレギュレー
トすることが示されている。さらに、ＴＮＦ−αは、両方の型のレセプターの局
在化をもたらすことが示されている。ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ−ＲＩの内部移行お
よびＴＮＦ−ＲＩＩの分泌を誘導する（Ａｇｇａｒｗａｌら、前出、において総
説される）。従って、両方のＴＮＦ−Ｒの産生および内部移行は、種々の因子に
よって調節される。

【００１２】 酵母ツーハイブリッド系ならびに同時沈降および精製の両方は、両方の型のＴ
ＮＦ−Ｒに会合するリガンドを同定するために使用されてきた（Ａｇｇａｒｗａ
ｌら、前出；Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．５：３９２−３９９（１９９５）において概説される）。いくつかのタ
ンパク質が同定されており、それらは、マウスＴＮＦ−Ｒの細胞質ドメインと相
互作用する。これらのタンパク質のうち２つは、アポトーシスのバキュロウイル
スインヒビターに関連するようであり、これはプログラムされた細胞死の調節に
おけるＴＮＦ−Ｒの直接的役割を示唆する。

【００１３】 従って、細胞増殖および分化のような細胞の過程の調節に関与するサイトカイ
ンおよびサイトカイン様分子についてのレセプターとして機能するポリペプチド
についての必要性が存在する。なぜならば、このような調節の妨害は、ホメオス
タシス、血管形成、腫瘍転移、細胞遊走および神経形成の関連する障害に関与し
得るからである。従って、このような障害の検出、予防、寛解、調節または修正
において役割を果たし得る、このようなヒトポリペプチドの同定および特徴づけ
の必要性が存在する。

【００１４】 （発明の要旨） 本発明は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）、図２Ａおよび図２Ｂ（配列番
号４）、ならびに図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号６）で示されたアミノ酸配列を
それぞれ有するＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターを
コードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子、あるいは、１９９７年
１０月７日に、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３４０、２０９３４１、および２０９３
４２としてそれぞれ寄託された、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１Ｓ
Ｖ２レセプターをコードするｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配
列を提供する。アメリカンタイプカルチャーコレクションは、１０８０１ Ｂｏ
ｕｌｅｖａｒｄ大学、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９に位置す
る。本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、および
この組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細
胞を作製する方法、ならびに組換え技術によって、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、
およびＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドあるいはペプチドの産生のためにそれらを使
用する方法に関する。

【００１５】 本発明はさらに、本明細書中で記載されるポリヌクレオチドによってコードさ
れるアミノ酸配列を有する、単離されたＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ
１１ＳＶ２ポリペプチドを提供する。

【００１６】 本発明はまた、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプター
によって誘導される細胞応答を増強または阻害し得る化合物を同定するためのス
クリーニング方法を提供する。この方法は、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴ
Ｒ１１ＳＶ２レセプターを発現する細胞を、候補化合物と接触させる工程、細胞
応答をアッセイする工程、および標準細胞応答（この標準は候補化合物の非存在
下で接触がなされた場合にアッセイされる）に対してこの細胞応答を比較する工
程であって、それによってこの標準に対して増加した細胞応答が、この化合物が
アゴニストであることを示し、そしてこの標準に対して減少した細胞応答は、こ
の化合物がアンタゴニストであることを示す工程を包含する。

【００１７】 別の局面では、アゴニストおよびアンタゴニストのためのスクリーニングアッ
セイが提供される。これはＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レ
セプターに対する細胞リガンドの結合において候補化合物が有する効果を決定す
る工程を包含する。特に、この方法は、リガンドポリペプチドおよび候補化合物
とＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターを接触させる工
程、および候補化合物の存在に起因して、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴ
Ｒ１１ＳＶ２レセプターへのリガンドの結合が増強するかまたは減少するかを決
定する工程を包含する。

【００１８】 本発明はさらに、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプタ
ー発現における変化に起因する異常な細胞増殖から生じる疾患状態の診断または
予後の間に、有用な診断方法を提供する。

【００１９】 本発明におけるさらなる局面は、体の中でＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、および
ＴＲ１１ＳＶ２レセプター活性の増強レベルを必要とする個体を処置するための
方法に関する。この方法は、そのような個体に、治療的に有効な量の、本発明の
単離されたＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドあるい
はそのアゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する。

【００２０】 本発明のなおさらなる局面は、体の中でＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ
１１ＳＶ２レセプター活性の減少レベルを必要とする個体を処置するための方法
に関与し、この方法は、このような個体に治療的に有効な量の、本発明の単離さ
れたＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターアンタゴニス
トを含む組成物を投与する工程を包含する。

【００２１】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドの可溶性型を提供する。可溶性ペプチ
ドは、アミノ酸配列によって規定され、ここでその配列は膜貫通ドメインを欠損
するポリペプチド配列を含む。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ
２レセプターのような可溶性型は、このレセプターの膜結合形態のアンタゴニス
トとして有用である。

【００２２】 （好ましい実施態様の詳細な説明） 本発明は、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する（図１Ａおよ
び図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂ、ならびに図３Ａおよび図３Ｂ（それぞれ、配列
番号２、配列番号４、および配列番号６））。それらのアミノ酸配列は、クロー
ン化されたｃＤＮＡを配列決定することによって決定された。図１Ａおよび図１
Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂ、ならびに図３Ａおよび図３Ｂにそれぞれ示される、こ
のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２タンパク質は、ヒトｍＧＩ
ＴＲレセプター様タンパク質（図２（配列番号７））と配列相同性を共有する。
１９９７年の１０月７日、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ
）、１０８０１ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ大学、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉ
ａ ２０１１０−２２０９において、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１
１ＳＶ２をコードするプラスミドＤＮＡの寄託がなされ、与えられた受託番号は
それぞれ、２０９３４０、２０９３４１、および２０９３４２である。図１Ａお
よび図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂ、ならびに図３Ａおよび図３Ｂ（それぞれ、配
列番号１、配列番号３、および配列番号５）に示されるヌクレオチド配列は、そ
れぞれＡＴＣＣ受託番号２０９３４０、２０９３４１、および２０９３４２にお
けるクローンと同じアミノ酸コード配列を含むｃＤＮＡクローン（それぞれ、Ｃ
ｌｏｎｅ ＩＤ ＨＨＥＡＣ７１、ＨＣＦＡＺ２２、およびＨＴ５ＥＡ７８）を
配列決定することにより得られた。ＴＲ１１をコードする寄託されたクローンは
、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に含まれる。ＴＲ１１ＳＶ１をコードする寄託さ
れたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に含まれる。ＴＲ１１ＳＶ２をコードす
る寄託されたクローンは、ｐＳｐｏｒｔ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に含まれる。

【００２３】 本明細書中で使用されるように、「ＴＲ１１タンパク質」、「ＴＲ１１ＳＶ１
タンパク質」、「ＴＲ１１ＳＶ２タンパク質」、「ＴＲ１１レセプター」、「Ｔ
Ｒ１１ＳＶ１レセプター」、「ＴＲ１１ＳＶ２レセプター」、「ＴＲ１１レセプ
タータンパク質」、「ＴＲ１１ＳＶ１レセプタータンパク質」、「ＴＲ１１ＳＶ
２レセプタータンパク質」、「ＴＲ１１ポリペプチド」、「ＴＲ１１ＳＶ１ポリ
ペプチド」、および「ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチド」は、アミノ酸配列同一性の
領域、および図１Ａおよび図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂ、ならびに図３Ａおよび
図３Ｂ（それぞれ、配列番号２、配列番号４、および配列番号６）に示されるタ
ンパク質に対応するレセプター活性を有するタンパク質をコードするゲノムＤＮ
Ａ配列の選択的スプライシングから生じる全てのタンパク質をいう。図１Ａおよ
び図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂ、ならびに図３Ａおよび図３Ｂに示されるＴＲ１
１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２タンパク質は、そのようなレセプタ
ータンパク質の例である。

【００２４】 （核酸分子） 他に示されない場合、本明細書においてＤＮＡ分子を配列決定することによっ
て決定される全てのヌクレオチド配列は、自動化されたＤＮＡシークエンサー（
例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ ３７
３）を使用することで決定された。そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子に
よりコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記の決定されたＤＮ
Ａ配列の翻訳によって推定された。従って、当該分野で公知のように、この自動
化されたアプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列に関して、本明細書中
で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含み得る。自動化
により決定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌク
レオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％の同一性、さらに代表的
には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％の同一性である。この実際
の配列は、当該分野において周知である手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他の手
段によって、さらに正確に決定され得る。また当該分野で公知であるように、決
定されたヌクレオチド配列における１つの挿入または欠失（実際の配列と比較し
た場合）は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを生じる。それは
、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定のアミノ酸配列が、配
列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列と全く異なり
、これはそのような挿入または欠失の部位から開始する。

【００２５】 本明細書中で提供される情報（例えば、図１Ａおよび図１Ｂ、図２Ａおよび図
２Ｂ、ならびに図３Ａおよび図３Ｂにおけるヌクレオチド配列）を使用して、Ｔ
Ｒ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドをコードする本発
明の核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、開
始物質としてｍＲＮＡを使用するｃＤＮＡのクローニングに使用される手順）を
使用することで入手され得る。本発明の例示では、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号
１）に記載される核酸分子は、Ｔヘルパー細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー
で発見された。図１Ａに示されるＴＲ１１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡク
ローンは、試験したその他のｃＤＮＡライブラリーのいずれにおいても見出され
なかった。図２Ａおよび２Ｂ（配列番号３）に記載される核酸分子は、ＰＨＡを
用いて１６時間刺激したＴ細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーで発見された。
図２Ａおよび図２Ｂに示されるＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａクローンは、試験したその他のｃＤＮＡライブラリーのいずれにおいても見出
されなかった。最後に、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号５）に記載される核酸分子
は、活性化されたＴ細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーで発見された。図３Ａ
および図３Ｂに示されるＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクロ
ーンは、試験したその他のｃＤＮＡライブラリーのいずれにおいても見出されな
かった。

【００２６】 図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）のＴＲ１１ｃＤＮＡの配列決定されたヌク
レオチド配列は、約２４１個のアミノ酸残基のタンパク質（約２５個のアミノ酸
残基の潜在的に予測される１つのリーダー配列を伴い、そして約２５，１１３Ｄ
ａの推定分子量である）をコードするオープンリーディングフレームを含む。潜
在的に予測される成熟ＴＲ１１レセプターのアミノ酸配列は、図１Ａおよび図１
Ｂにアミノ酸残基約２６から残基約２３４に示される（配列番号２においてアミ
ノ酸残基１から２０９）。図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）に示されるＴＲ１
１タンパク質は、コンピュータープログラム「Ｂｅｓｔｆｉｔ」を使用すると、
配列番号７（図４Ａおよび図４Ｂを参照）に示されるマウスｍＧＩＴＲレセプタ
ータンパク質と約５８．６％の同一性および約７４．１％の類似性である。

【００２７】 図２Ａおよび図２Ｂ（配列番号３）のＴＲ１１ＳＶ１ｃＤＮＡの配列決定され
たヌクレオチド配列は、約２６，０２９Ｄａの推定分子量である約２４１個のア
ミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。図
２Ａおよび図２Ｂ（配列番号４）に示されるＴＲ１１タンパク質は、コンピュー
タープログラム「Ｂｅｓｔｆｉｔ」を使用すると、配列番号７（図４Ａおよび図
４Ｂを参照）に示されるマウスｍＧＩＴＲレセプタータンパク質と約５３．１％
の同一性および約６７．５％の類似性である。

【００２８】 図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号５）のＴＲ１１ＳＶ２ｃＤＮＡの配列決定され
たヌクレオチド配列は、約２４０個のアミノ酸残基のタンパク質（約１９個のア
ミノ酸残基の潜在的に予測される１つのリーダー配列を伴い、そして約２５，７
２７Ｄａの推定分子量である）をコードするオープンリーディングフレームを含
む。潜在的に予測される成熟ＴＲ１１ＳＶ２レセプターのアミノ酸配列は、図３
Ａおよび図３Ｂにアミノ酸残基約２０から残基約２４０に示される（配列番号６
ではアミノ酸残基１から２２１）。図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号６）に示され
るＴＲ１１ＳＶ２タンパク質は、コンピュータープログラム「Ｂｅｓｔｆｉｔ」
を使用すると、配列番号７（図４Ａおよび図４Ｂを参照）に示されるマウスＧＩ
ＴＲレセプタータンパク質と約５８．６％の同一性および約７４．１％の類似性
である。

【００２９】 ＧＩＴＲは、細胞外ドメインにおける３つのシステイン偽性リピートによって
特徴付けられる２２８個のアミノ酸のタイプＩ膜貫通タンパク質であり、そして
細胞内ドメイン中のＣＤ２７および４−１ＢＢと類似する。ＧＩＴＲは、Ｔ細胞
誘導性アポトーシスを特異的に防禦するが、Ｆａｓ誘発性、デキサメタゾン処置
、またはＵＶ照射を含む他のアポトーシスシグナルは防禦しない。従って、ＧＩ
ＴＲは腫瘍壊死因子／神経成長因子レセプターファミリーの新しいメンバーであ
り、そしてＴ細胞レセプター媒介性細胞死の調節に関与するようである（Ｎｏｃ
ｅｎｔｉｎｉ ＧらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：６
２１６-６２２１（１９９７））。マウスＧＩＴＲとのアミノ酸レベルでの高度 な保存性に基づくと、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２はまた
、細胞型特異的レセプター媒介性の細胞成長、分化、および究極的には細胞死の
調節に関与し得るようである。

【００３０】 示されるように、本発明はまた、本発明のＴＲ１１レセプターおよびＴＲ１１
ＳＶ２レセプターの成熟形態を提供する。シグナル仮説に従うと、哺乳動物細胞
によって分泌されるタンパク質は、粗小胞体を横切って成長するタンパク質鎖の
輸送が一旦開始されると、成熟タンパク質から切断されるシグナルまたは分泌リ
ーダー配列を有する。ほとんどの哺乳動物細胞、および昆虫細胞でさえも、同様
の特異性で以って分泌されたタンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合、
分泌されたタンパク質の切断は、完全に均一でなく、これはこのタンパク質の２
つ以上の成熟型を生じる。さらに、分泌されたタンパク質の切断特異性は、究極
的には、完全なタンパク質の一次構造（すなわち、ポリペプチドのアミノ酸配列
に固有である）によって決定される。従って、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号２０
９３４０および２０９３４２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされ、
ならびにそれぞれ、図１Ａおよび図１Ｂならびに図３Ａおよび図３Ｂ（それぞれ
、配列番号２および配列番号６）に示されるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ１１
およびＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。
「ＡＴＣＣ寄託番号２０９３４０および２０９３４２に含まれるｃＤＮＡクロー
ン」によってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ１１およびＴＲ１１Ｓ
Ｖ２ポリペプチドは、寄託されたクローンのヒトＤＮＡ配列によりコードされる
完全オープンリーディングフレームの哺乳動物細胞（例えば、以下に述べるＣＯ
Ｓ細胞）で発現することによって産生されるＴＲ１１およびＴＲ１１ＳＶ２レセ
プターの成熟形態を意味する。

【００３１】 タンパク質が分泌リーダーならびにこのリーダー配列のための切断点を有する
か否かを予測する方法が利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（Ｖｉｒｕｓ
Ｒｅｓ． ３：２７１−２８６（１９８５））およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：４６８３−４６９０（１９８６
））の方法が使用し得る。これらの各方法についての既知の哺乳動物分泌タンパ
ク質の切断点を予測することの正確さは、７５〜８０％の範囲である（ｖｏｎ
Ｈｅｉｎｊｅ、前出）。しかし、２つの方法は、所定のタンパク質について同じ
予測される切断点を常に生じるわけではない。

【００３２】 現在の場合では、図１Ａおよび図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂ、ならびに図３Ａ
および図３Ｂ（配列番号２、配列番号４、および配列番号６）に示される完全な
ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドの予測されるア
ミノ酸配列は、コンピュータープログラム（「ＰＳＯＲＴ」）（Ｋ．Ｎａｋａｉ
およびＭ．Ｋａｎｅｈｉｓａ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７−９１１（１
９９２））によって分析された。これは、アミノ酸配列に基づくタンパク質の細
胞内位置を予測するための専門システムである。このコンピュータの局在化予測
の一部として、ＭｃＧｅｏｃｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が組み込まれ
ている。ＰＳＯＲＴプログラムによる分析は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２
における−１および＋１）のアミノ酸２５と２６との間の切断部位を予測した。
従って、配列番号２で示されるＴＲ１１タンパク質についての潜在的なリーダー
配列は、配列番号２のアミノ酸残基−２５〜−１からなることが予測されるが、
予測される成熟ＴＲ１１タンパク質は、配列番号２で示されるＴＲ１１タンパク
質についてアミノ酸残基１〜２０９からなる。さらに、ＰＳＯＲＴプログラムに
よる分析は、配列番号４で示されるＴＲ１１ＳＶ１タンパク質についてシグナル
ペプチド切断部位を予測しなかった。最後に、ＰＳＯＲＴプログラムによる分析
は、図３Ａおよび図３Ｂで示されるアミノ酸１９と２０との間に（配列番号６に
おいて−１および＋１）１つのシグナルペプチド切断部位を予測した。従って、
配列番号６で示されるＴＲ１１ＳＶ２タンパク質についての潜在的なリーダー配
列は、配列番号６のアミノ酸残基−１９〜−１からなることが予測される。その
一方、予測される成熟ＴＲ１１ＳＶ２タンパク質は、配列番号６で示されるＴＲ
１１ＳＶ２タンパク質についてアミノ酸残基１〜２２１からなる。

【００３３】 しかし、当業者が理解するように、配列決定のエラーの可能性、ならびに異な
る既知のタンパク質（ＡＴＣＣ寄託番号２０９３４０、２０９３４１、および２
０９３４２のｃＤＮＡによってそれぞれコードされるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１
、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターポリペプチド）におけるリーダーについての
切断部位の変動性は、約２４１個のアミノ酸（しかし、２２４〜２５１の範囲の
任意のアミノ酸）、約２４１個のアミノ酸（しかし、２３１〜２５１の範囲の任
意のアミノ酸）、および約２４０個のアミノ酸（しかし、２３０〜２５０の範囲
の任意のアミノ酸）を含む。さらに、これらのタンパク質の予測されるリーダー
配列は、約２５、０、および１９であるが、実際のリーダーはそれぞれ、約１５
〜約３５、約２０〜約４０、約９〜約２９の範囲の任意のアミノ酸であり得る。

【００３４】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングまたは合成的に生産されるｃＤＮＡ
ならびにゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮＡは、二本鎖または一本鎖
であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡはコード鎖（また、センス鎖として知ら
れる）であり得、あるいは非コード鎖（また、アンチセンス鎖と呼ばれる）であ
り得る。

【００３５】 「単離された」核酸分子は、その天然の環境から取り出されたＤＮＡまたはＲ
ＮＡである核酸分子を意図する。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子
は、本発明の目的に単離された考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例
は、異種宿主細胞中に維持された組換えＤＮＡ分子または溶液中の（部分的にま
たは実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明
のＤＮＡ分子のインビトロまたはインビボのＲＮＡ転写物を含む。本発明に従っ
て単離された核酸分子はさらに、合成的に生産されたそのような分子を含む。

【００３６】 本発明の単離された核酸分子は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）に示され
るオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；図１Ａおよび図
１Ｂ（配列番号２；最後の約２０９のアミノ酸）に示される成熟ＴＲ１１レセプ
ターのコード配列を含むＤＮＡ分子；ならびに遺伝コードの縮重に起因して上記
の配列とは実質的に異なるが、なお図１Ａ（配列番号２）に示されるＴＲ１１レ
セプタータンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子を包含する。本発明の単
離された核酸分子は、図２Ａおよび図２Ｂ（配列番号３）に示されるオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；図２Ａおよび図２Ｂ（配列番
号４；最後の約２４１のアミノ酸）に示される成熟ＴＲ１１ＳＶ１レセプターの
コード配列を含むＤＮＡ分子；ならびに遺伝コードの縮重に起因して上記の配列
とは実質的に異なるが、なお図２Ａおよび図２Ｂ（配列番号４）に示されるＴＲ
１１ＳＶ１レセプタータンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子を包含する
。本発明の単離された核酸分子は、図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号５）に示され
るオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；図３Ａおよび図
３Ｂ（配列番号６；最後の約２２１のアミノ酸）に示される成熟ＴＲ１１ＳＶ２
レセプターのコード配列を含むＤＮＡ分子；ならびに遺伝コードの縮重に起因し
て上記の配列とは実質的に異なるが、なお図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号６）に
示されるＴＲ１１ＳＶ２レセプタータンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分
子を包含する。もちろん、遺伝コードは、当該分野で周知である。従って、この
ような縮重した改変体を生成することは当業者にとって慣用的である。

【００３７】 別の局面において、本発明は、１９９７年１０月７日にそれぞれ、ＡＴＣＣ受
託番号２０９３４０、２０９３４１、および２０９３４２として寄託されたプラ
スミド中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有す
るＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドをコードする
単離された核酸分子を提供する。さらなる実施態様において、これらの核酸分子
は、Ｎ末端メチオニンを欠いた成熟ポリペプチドまたは全長ポリペプチドをコー
ドする。本発明はさらに、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）、図２Ａおよび図
２Ｂ（配列番号３）、ならびに図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号５）に示されるヌ
クレオチド配列、上記の寄託クローンに含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列を
有する単離された核酸分子、あるいは上記の配列の１つに相補的な配列を有する
核酸分子を提供する。このような単離された分子（特にＤＮＡ分子）は、染色体
とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのための、お
よび例えば、ノーザンブロット分析によるヒト組織における本発明のＴＲ１１、
ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプター遺伝子の発現を検出するため
のプローブとして有用である。

【００３８】 さらに、本発明は、以下の関連ｃＤＮＡクローン：ＨＨＥＡＣ７１ＲＡ（配列
番号８）およびＨＣＦＡＺ２２Ｒ（配列番号９）から決定された配列番号１、配
列番号３ならびに配列番号５の広範な部分に関連するヌクレオチド配列を有する
核酸分子を提供する。

【００３９】 本発明はさらに、本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関
する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１Ａおよび１Ｂ、２Ａ
および２Ｂ、ならびに３Ａおよび３Ｂ（それぞれ、配列番号１、配列番号３、お
よび配列番号５）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフ
ラグメントとは、少なくとも約１５ｎｔ長、そしてより好ましくは少なくとも約
２０ｎｔ長、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ長、そしてさらにより好
ましくは、少なくとも約４０ｎｔ長のフラグメントを意図し、これらは本明細書
中に議論される診断プローブおよびプライマーとして有用である。当然のことな
がら、５０〜４００ｎｔ長のより長いフラグメントもまた、寄託ｃＤＮＡのヌク
レオチド配列、または図１Ａおよび１Ｂ、２Ａおよび２Ｂ、ならびに３Ａおよび
３Ｂ（それぞれ、配列番号１、配列番号３、および配列番号５）に示されるヌク
レオチド配列の全てではないにしろほとんどに対応するフラグメントと同様に、
本発明に従えば有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントとは
、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１Ａおよび１Ｂ、２Ａおよび
２Ｂ、ならびに３Ａおよび３Ｂ（それぞれ、配列番号１、配列番号３、および配
列番号５）に示されるヌクレオチド配列由来の２０以上の連続した塩基を含むフ
ラグメントを意図する。さらに、本発明はまた、図１Ａおよび１Ｂ、２Ａおよび
２Ｂ、ならびに３Ａおよび３Ｂ（それぞれ、配列番号１、配列番号３、および配
列番号５）に示される配列、または図１Ａおよび１Ｂ、２Ａおよび２Ｂ、ならび
に３Ａおよび３Ｂ（それぞれ、配列番号１、配列番号３、および配列番号５）に
示される配列に相補的な任意の配列を有するポリヌクレオチドを含有する、核酸
分子の単離されたフラグメントに関し、ここで該フラグメントは、配列番号１、
配列番号３、または配列番号５由来の少なくとも３０〜５０の連続したヌクレオ
チドを含有するが、ただし該単離された核酸分子は、配列番号８、配列番号９ま
たはそれらの任意のサブフラグメントではない。

【００４０】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：図
１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のＴＲ１１レセプタータンパク質細胞外ドメイン
（図１Ａおよび１Ｂにおいて２６付近〜１６２付近のアミノ酸残基（配列番号２
におけるアミノ酸残基１〜１３７）を構成すると予期される）を含むポリペプチ
ド；図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）のＴＲ１１ＳＶ１レセプタータンパク質細
胞外ドメイン（図２Ａおよび２Ｂにおいて１付近〜１６２付近のアミノ酸残基（
配列番号４におけるアミノ酸残基１〜１６２）を構成すると予期される）を含む
ポリペプチド；図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）のＴＲ１１ＳＶ２レセプタータ
ンパク質細胞外ドメイン（図３Ａおよび３Ｂにおいて２０付近〜１６８付近のア
ミノ酸残基（配列番号６におけるアミノ酸残基１〜１４９）を構成すると予期さ
れる）を含むポリペプチド；ＴＲ１１レセプター膜貫通ドメイン（図１Ａおよび
１Ｂにおけるアミノ酸残基１６３〜１７９（配列番号２におけるアミノ酸残基１
３８〜１５４））を含むポリペプチド；ＴＲ１１ＳＶ１レセプター膜貫通ドメイ
ン（図２Ａおよび２Ｂにおけるアミノ酸残基１６３〜１７９（配列番号４におけ
るアミノ酸残基１６３〜１７９））を含むポリペプチド；ＴＲ１１ＳＶ２レセプ
ター膜貫通ドメイン（図３Ａおよび３Ｂにおけるアミノ酸残基１６９〜１８５（
配列番号６におけるアミノ酸残基１５０〜１６６））を含むポリペプチド；ＴＲ
１１レセプター細胞内ドメイン（図１Ａおよび１Ｂにおいて１８０付近〜２３４
付近のアミノ酸残基（配列番号２におけるアミノ酸残基１５５〜２０９）を構成
すると予期される）を含むポリペプチド；ＴＲ１１ＳＶ１レセプター細胞内ドメ
イン（図２Ａおよび２Ｂにおいて１８０付近〜２４１付近のアミノ酸残基（配列
番号４におけるアミノ酸残基１８０〜２４１）を構成すると予期される）を含む
ポリペプチド；ＴＲ１１ＳＶ２レセプター細胞内ドメイン（図３Ａおよび３Ｂに
おいて１８６付近〜２４０付近のアミノ酸残基（配列番号６におけるアミノ酸残
基１６７〜２２１）を構成すると予期される）を含むポリペプチド；図１Ａおよ
び１Ｂ（配列番号２）のＴＲ１１レセプタータンパク質細胞外および細胞内ドメ
インを含み、膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠いた、ポリペプチド；図２Ａ
および２Ｂ（配列番号４）のＴＲ１１ＳＶ１レセプタータンパク質細胞外および
細胞内ドメインを含み、膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠いた、ポリペプチ
ド；ならびに図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）のＴＲ１１ＳＶ２レセプタータン
パク質細胞外および細胞内ドメインを含み、膜貫通ドメインの全てまたは一部を
欠いた、ポリペプチド。

【００４１】 リーダー配列に関する上記のように、細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを
構成するアミノ酸残基は、コンピューター分析によって予測された。従って、当
業者が理解するように、これらドメインを構成するアミノ酸残基は、各ドメイン
を規定するため使用される判断基準に依存して、わずかに（例えば、１付近〜１
５付近のアミノ酸残基だけ）変化し得る。

【００４２】 本発明の好ましい核酸フラグメントはまた、ＴＲ１１レセプタータンパク質の
エピトープを有する部分をコードする核酸分子を含有する。詳細には、本発明の
このような核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：配列番号２
のＡｒｇ−２付近〜Ｇｌｙ−１１付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列
番号２のＴｈｒ−１８付近〜Ａｒｇ−２６付近のアミノ酸残基を含むポリペプチ
ド；配列番号２のＡｒｇ−３４付近〜Ｃｙｓ−４２付近のアミノ酸残基を含むポ
リペプチド；配列番号２のＡｒｇ−３１付近〜Ｇｌｕ−３９付近のアミノ酸残基
を含むポリペプチド；配列番号２のＧｌｙ−３８付近〜Ａｓｐ−４６付近のアミ
ノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２のＧｌｙ−７４付近〜Ｓｅｒ−８２付
近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２のＧｌｕ−１００付近〜Ａｓ
ｐ−１０８付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２のＰｈｅ−１１
８付近〜Ａｌａ−１２６付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の
Ｇｌｙ−１３１付近〜Ｇｌｙ−１３９付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；
配列番号２のＰｒｏ−１７８付近〜Ｃｙｓ−１８６付近のアミノ酸残基を含むポ
リペプチド；配列番号２のＳｅｒ−１９７付近〜Ｇｌｙ−２０５付近のアミノ酸
残基を含むポリペプチド。 本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントがＴ Ｒ１１レセプターの抗原領域であることを決定した。ＴＲ１１タンパク質のその
ようなエピトープを有する他の部分を決定する方法は、以下に詳細に記載される
。

【００４３】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、ＴＲ１１ＳＶ１レセプタータンパク質
のエピトープを有する部分をコードする核酸分子をさらに含有する。詳細には、
本発明のこのような核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：配
列番号４のＡｌａ−２付近〜Ｉｌｅ−１０付近のアミノ酸残基を含むポリペプチ
ド；配列番号４のＡｓｎ−１１付近〜Ｇｌｙ−１９付近のアミノ酸残基を含むポ
リペプチド；配列番号４のＴｈｒ−２７付近〜Ｓｅｒ−３５付近のアミノ酸残基
を含むポリペプチド；配列番号４のＴｒｐ−３８付近〜Ｇｌｕ−４６付近のアミ
ノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４のＧｌｙ−４２付近〜Ｓｅｒ−５０付
近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４のＧｌｕ−３１付近〜Ｇｌｕ
−４６付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４のＣｙｓ−６１付近
〜Ｇｌｕ−６９付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４のＧｌｙ−
９９付近〜Ｓｅｒ−１０７付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４
のＧｌｕ−１２５付近〜Ａｓｐ−１３３付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド
；配列番号４のＰｈｅ−１４３付近〜Ａｌａ−１５１付近のアミノ酸残基を含む
ポリペプチド；配列番号４のＧｌｙ−１５６付近〜Ｇｌｙ−１６４付近のアミノ
酸残基を含むポリペプチド；配列番号４のＣｙｓ−１９６付近〜Ｌｅｕ−２０４
付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４のＰｒｏ−２０９付近〜Ｓ
ｅｒ−２１７付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４のＳｅｒ−２
２９付近〜Ｇｌｙ−２３７付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド。本発明者ら
は、上記ポリペプチドフラグメントがＴＲ１１ＳＶ１レセプターの抗原領域であ
ることを決定した。ＴＲ１１ＳＶ１タンパク質のそのようなエピトープを有する
他の部分を決定する方法は、以下に詳細に記載される。

【００４４】 本発明の好ましい核酸フラグメントはまた、ＴＲ１１ＳＶ２レセプタータンパ
ク質のエピトープを有する部分をコードする核酸分子を含有する。詳細には、本
発明のこのような核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：配列
番号６のＧｌｎ−１付近〜Ｃｙｓ−９付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；
配列番号６のＧｌｙ−５付近〜Ａｒｇ−１３付近のアミノ酸残基を含むポリペプ
チド；配列番号６のＴｈｒ−１８付近〜Ａｒｇ−２６付近のアミノ酸残基を含む
ポリペプチド；配列番号６のＴｈｒ−２９付近〜Ｐｒｏ−３７付近のアミノ酸残
基を含むポリペプチド；配列番号６のＣｙｓ−４８付近〜Ｇｌｕ−５６付近のア
ミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６のＶａｌ−８７付近〜Ｐｈｅ−９５
付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６のＨｉｓ−１１１付近〜Ｔ
ｈｒ−１１９付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６のＰｈｅ−１
３０付近〜Ａｌａ−１３８付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６
のＧｌｙ−１４３付近〜Ｇｌｙ−１５１付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド
；配列番号６のＰｒｏ−１９０付近〜Ｃｙｓ−１９８付近のアミノ酸残基を含む
ポリペプチド；配列番号６のＳｅｒ−２０９付近〜Ｇｌｙ−２１７付近のアミノ
酸残基を含むポリペプチド。本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントがＴ
Ｒ１１ＳＶ２レセプターの抗原領域であることを決定した。ＴＲ１１ＳＶ２タン
パク質のそのようなエピトープを有する他の部分を決定する方法は、以下に詳細
に記載される。

【００４５】 別の局面において、本発明は、上記の本発明の核酸分子（例えば、それぞれＡ
ＴＣＣ受託番号２０９３４０、２０９３４１、および２０９３４２に含まれるｃ
ＤＮＡクローン）のうちの一つのポリヌクレオチドの一部分とストリンジェント
な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する単離された核酸分子
を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、以下を
含む溶液における４２℃での一晩のインキュベーション、その後約６５℃にて０
．１×ＳＳＣにおけるフィルターの洗浄を意図する：５０％ホルムアミド、５×
ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デ
キストラン、および２０ｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡ。

【００４６】 ポリヌクレオチドの「一部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、
参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そして好まし
くは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そして
さらに好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。これらは、上記し、そして以下に詳
細に議論される診断プローブおよびプライマーとして有用である。

【００４７】 例えば、「長さが少なくとも２０ｎｔ」のポリヌクレオチドの部分とは、参照
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または図
１Ａおよび１Ｂ、図２Ａおよび２Ｂ、図３Ａおよび３Ｂ（それぞれ、配列番号１
、配列番号３、および配列番号５）に示されるヌクレオチド配列）からの２０以
上の連続したヌクレオチドを意図する。

【００４８】 当然のことながら、ポリＡ配列（例えば、ｃＤＮＡ配列の３’末端ポリ（Ａ）
域）にのみ、またはＴ（またはＵ）残基の相補的な部分（ｓｔｒｅｔｃｈ）にの
みハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部分にハイブリダ
イズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、
そのようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）伸長部またはその相補体を含む任意
の核酸分子（例えば、特に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズす
るからである。

【００４９】 示されるように、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプ
チドをコードする本発明の核酸分子は、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列自体を
コードする核酸分子；成熟ポリペプチドおよびさらなる配列をコードする配列（
例えば、可能性のあるリーダーまたはシグナルペプチド配列（例えばプレ、また
はプロ、またはプレプロタンパク配列）をコードする配列）；上記のさらなるコ
ード配列を伴ってまたは伴わずに、さらなる非コード配列（例えば、イントロン
および非コード５’および３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（例
えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合
およびｍＲＮＡの安定性において役割を演じる転写非翻訳配列を含むがこれらに
限定されない）を伴う、成熟ポリペプチドのコード配列；さらなるアミノ酸（例
えば、さらなる機能性を提供するもの）をコードするさらなるコード配列を含み
得るが、これらに限定されない。従って、ポリペプチドをコードする配列は、マ
ーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードす
る配列）と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において
、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば、ｐ
ＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中に提供されるタグであり、これらの
うちの多くのものは市販されている。Ｇｅｎｔｚら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９））に記載されるよう
に、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製のために提供さ
れる。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質（これは、Ｗｉｌ
ｓｏｎら（Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））により記載されている）に由
来するエピトープに対応する、精製に有用な別のペプチドである。以下に議論す
るように、他のこのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端でＩｇＧ−Ｆｃと
融合したＴＲ１１レセプターを含む。

【００５０】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、これはＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターの部分、アナログまたは誘導体をコー
ドする。改変体（例えば、天然の対立遺伝子改変体）は天然に生じ得る。「対立
遺伝子改変体」とは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつ
かの別の形態のひとつを意図する。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然には
生じない改変体は、当該分野に公知の変異誘発技術を使用して生成され得る。

【００５１】 このような改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失または付加（これらは１つ以
上のヌクレオチドを含み得る）により生成した改変体を含む。この改変体は、コ
ード領域、非コード領域または両方で変化され得る。コード領域での変化は、保
存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を生成し得る。これらの
中で特に好ましいものは、サイレントな置換、付加および欠失であり、これらは
ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターまたはその部分の特
性および活性を変化させない。保存的置換は、このことに関してもまた特に好ま
しい。

【００５２】 本発明のさらなる実施態様には、以下のヌクレオチド配列に少なくとも９０％
同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または
９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された
核酸分子を含む：（ａ）図１Ａおよび１Ｂに示される完全なアミノ酸配列（配列
番号２のアミノ酸残基−２５〜２０９）を有するＴＲ１１ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；（ｂ）図２Ａおよび２Ｂに示される完全なアミノ酸配列
（配列番号４のアミノ酸残基１〜２４１）を有するＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）図３Ａおよび３Ｂに示される完全なアミ
ノ酸配列（配列番号６のアミノ酸残基６の−１９〜２２１）を有するＴＲ１１Ｓ
Ｖ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）図１Ａおよび１Ｂに示
される完全なアミノ酸配列であるが、Ｎ−末端メチオニンを欠失するアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド（すなわち、配列番号２のアミノ酸−２４〜２０９
）；（ｅ）図２Ａおよび２Ｂに示される完全なアミノ酸配列であるが、Ｎ−末端
メチオニンを欠失するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド（すなわち、配列
番号４のアミノ酸２〜２４１）；（ｆ）図３Ａおよび３Ｂに示される完全なアミ
ノ酸配列であるが、Ｎ−末端メチオニンを欠失するアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド（すなわち、配列番号６のアミノ酸−１８〜２２１）；（ｇ）図１Ａ
および１Ｂの２６〜２３４位のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸残基１〜２
０９）を含む、推定成熟ＴＲ１１レセプターをコードするヌクレオチド配列；（
ｈ）図２Ａおよび２Ｂの１〜２４１位にあるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ
酸残基１〜２４１）を含む、推定成熟ＴＲ１１ＳＶ１レセプターをコードするヌ
クレオチド配列；（ｉ）図３Ａおよび３Ｂの２０〜２４０位のアミノ酸配列（配
列番号６のアミノ酸残基１〜２２１）を含む、推定成熟ＴＲ１１ＳＶ２レセプタ
ーをコードするヌクレオチド配列；（ｊ）ＡＴＣＣ受託番号２０９３４０に含ま
れるｃＤＮＡクローンによりコードされる、リーダー配列を含む完全なアミノ酸
配列を有するＴＲ１１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｋ）ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９３４１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる、リ
ーダー配列を含む完全なアミノ酸配列を有するＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；（ｌ）ＡＴＣＣ受託番号２０９３４２に含まれるｃ
ＤＮＡクローンによりコードされる、リーダー配列を含む完全なアミノ酸配列を
有するＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｍ）ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９３４０に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミ
ノ酸配列を有する成熟ＴＲ１１レセプターをコードするヌクレオチド配列；（ｎ
）ＡＴＣＣ受託番号２０９３４１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされ
るアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ１１ＳＶ１レセプターをコードするヌクレオチ
ド配列；（ｏ）ＡＴＣＣ受託番号２０９３４２に含まれるｃＤＮＡクローンによ
りコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ１１ＳＶ２レセプターをコードす
るヌクレオチド配列；（ｐ）ＴＲ１１レセプター細胞外ドメインをコードするヌ
クレオチド配列；（ｑ）ＴＲ１１ＳＶ１レセプター細胞外ドメインをコードする
ヌクレオチド配列；（ｒ）ＴＲ１１ＳＶ２レセプター細胞外ドメインをコードす
るヌクレオチド配列；（ｓ）ＴＲ１１レセプター膜貫通ドメインをコードするヌ
クレオチド配列；（ｔ）ＴＲ１１ＳＶ１レセプター膜貫通ドメインをコードする
ヌクレオチド配列；（ｕ）ＴＲ１１ＳＶ２レセプター膜貫通ドメインをコードす
るヌクレオチド配列；（ｖ）ＴＲ１１レセプター細胞内ドメインをコードするヌ
クレオチド配列；（ｗ）ＴＲ１１ＳＶ１レセプター細胞内ドメインをコードする
ヌクレオチド配列；（ｘ）ＴＲ１１ＳＶ２レセプター細胞内ドメインをコードす
るヌクレオチド配列；（ｙ）ＴＲ１１レセプターの、膜貫通ドメインの全てまた
は一部を欠失した細胞外および細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｚ）ＴＲ１１ＳＶ１レセプターの、膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠失し
た細胞外および細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ａａ）ＴＲ１
１ＳＶ２レセプターの、膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠失した細胞外およ
び細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｂｂ） （ａ）、（
ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（
ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（
ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）または（ａａ）の任意
のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列 本発明のさらなる核酸の実施態様は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換で
あるが、５０を超えない保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは、４０を超
えない保存的アミノ酸置換、なおより好ましくは３０を超えない保存的アミノ酸
置換、そしてなおさらにより好ましくは、２０を超えない保存的アミノ酸置換、
を含有するアミノ酸配列を有する、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１および／またはＴ
Ｒ１１ＳＶ２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む
単離された核酸分子に関する。当然ながら、なおますます好ましくなる順に、Ｔ
Ｒ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドのアミノ酸配列をコ
ードするポリヌクレオチドが、７〜１０、５〜１０、３〜７、３〜５、２〜５、
１〜５、１〜３、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１を超えない保
存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有することが、非常に好ましい。

【００５３】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、および該
組換えベクターを含有する宿主細胞、ならびにそのようなベクターおよび宿主細
胞を作成する方法、そしてそれらを使用して組換え技術によりＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１もしくはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはペプチドを生産するための
方法に関する。

【００５４】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドをコードする参
照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一の」ヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、
このポリヌクレオチド配列がＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２レ
セプターをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つ
までの点変異を含み得ることを除いて、参照配列に同一であることを意図する。
換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌク
レオチドが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、また
は参照配列において全ヌクレオチドの５％までの多くのヌクレオチドが、参照配
列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’
もしくは３’末端位置において、または参照配列中のヌクレオチドの間に個々に
、もしくは参照配列内の１つ以上の連続した群のいずれかで散在して、これらの
末端位置の間の任意の位置で生じ得る。

【００５５】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１Ａおよび１Ｂ、図２
Ａおよび２Ｂ、ならびに／もしくは図３Ａおよび３Ｂに示されるヌクレオチド配
列または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に少なくとも９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、例えば
、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ
，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通
りに決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局
所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も相同性の高いセグメント
を見出す（ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃ
ｓ ２：４８２−４８９ （１９８１））。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配
列整列プログラムを使用して、特定の配列が本発明による参照配列に、例えば９
５％同一であるか否かを決定する場合、当然のことながらパラメーターは、同一
性パーセントが、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そ
して参照配列のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容
されるように設定される。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間で
の最良の全体的な一致（全体的配列整列とも言及される）を決定するための好ま
しい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ． ６：
２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュー
タープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列お
よび対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換する
ことによって変換され得る。上記の配列全体の整列の結果は同一性パーセントで
示す。ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍ
ａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎ
ａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａ
ｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．０５、
Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらか
より短い方）である。

【００５６】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’短縮および３’短縮を考慮しないからである。５’末端または３’末端で
短縮される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、
問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’
および３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される
。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によ
って決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ
、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され
、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本
発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように
、問い合わせ配列と一致／整列されていない、対象配列の５’および３’塩基の
外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定され
る。

【００５７】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に対して整列される。対象配列の５’末端で欠失が生じ、そ
してそのために、ＦＡＳＴＤＢ整列は５’末端で最初の１０塩基の一致／整列を
示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３
’末端での塩基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は
、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差
し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセン
トは９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列は、１００塩基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’に塩基がない。この場合、
ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び
、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手
動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的ではなされない。

【００５８】 本出願は、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２レセプター活性を
有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、図１Ａおよび１Ｂ（配列番
号１）、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号３）、ならびに図３Ａおよび３Ｂ（配列番
号５）に示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列と少なくとも９
０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸分子に言
及する。これは、特定の核酸分子がＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１Ｓ
Ｖ２レセプター活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は
、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、また
はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用するかをなお知って
いるからである。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２レセプター活
性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とり
わけ（１）ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２レセプター遺伝子ま
たはその対立遺伝子またはそのスプライスバリアント（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉ
ａｎｔｓ）をｃＤＮＡライブラリーから単離すること；（２）Ｖｅｒｍａおよび
共同研究者（Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８８））に記載の、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１Ｓ
Ｖ２レセプター遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開
物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；お
よび、（３）特定の組織におけるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ
２レセプターｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙げられ
る。

【００５９】 しかし、実際に、それぞれＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２レ
セプター活性を有するポリペプチドをコードする図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１
）、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号３）、ならびに図３Ａおよび３Ｂ（配列番号５
）に示されるヌクレオチド配列あるいは寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に少なく
とも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を
有する核酸分子が好ましい。「ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２
レセプター活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにお
いて測定される場合に、本発明のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ
２レセプター（全長タンパク質、スプライスバリアント（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒ
ｉａｎｔｓ）または好ましくは成熟タンパク質のいずれか）の活性と類似する（
しかし、必ずしも同一ではない）活性を示すポリペプチドが意図される。例えば
、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２レセプター活性は、ＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質が
リンパ球増殖を阻害する能力を決定することによって測定され得る。ＴＲ１１、
ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２レセプター活性はまた、ポリペプチド（例
えば、遊離であるかまたは細胞表面上に発現された同族のリガンド）を１つ以上
のレセプターを発現する無傷の細胞における増殖活性を与える能力を決定するこ
とによって測定され得る。

【００６０】 当然のことながら、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、寄託されたｃＤ
ＮＡの核酸配列あるいは図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）、図２Ａおよび２Ｂ（
配列番号３）ならびに図３Ａおよび３Ｂ（配列番号５）に示される核酸配列に少
なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配
列を有する核酸分子の多くが「ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２
レセプター活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実
際に、これらのヌクレオチド配列のいずれかの縮重改変体は全て同じポリペプチ
ドをコードするので、これは上記の比較アッセイを実施することなしでさえ当業
者に明らかである。縮重改変体でないそのような核酸分子について、合理的な数
がまたＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２タンパク質活性を有する
ポリペプチドをコードすることが、当該分野でさらに認識される。これは、当業
者が、タンパク質の機能に有意に影響する可能性が低いか、または有意には影響
しそうにないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸の第
二の脂肪族アミノ酸への置換）を完全に知っているからである。

【００６１】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をどのように作製するかに関す
るガイダンスは、Ｂｏｗｉｅおよび共同研究者「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈ
ｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒ
ａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｕｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供される。ここで
著者らは、タンパク質が、アミノ酸置換に驚くほど寛容であることを示す。

【００６２】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクタ
ーで遺伝子操作される宿主細胞、ならびに組換え技術によるＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントの産生に
関する。

【００６３】 ポリヌクレオチドは、宿主中における増殖のために選択マーカーを含むベクタ
ーと連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物の
ような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイ
ルスである場合、ウィルスベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用して
インビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質導入され得る。

【００６４】 ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げれば、例えば、ファージ
λＰＬプロモーター、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモータ
ー、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期
プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連
結されるべきである。他の適切なプロモーターは当業者に公知である。発現構築
物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、および転写領域において、翻訳
のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコ
ード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドン、および翻訳されるためのポリ
ペプチドの末端に適切に位置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）
を含む。

【００６５】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、またはネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌にお
いて培養するためのテトラサイクリン、またはアンピシリン耐性遺伝子を含む。
適切な異種宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；
酵母細胞のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏ
ｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞を含むが、これらに
限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野
で公知である。

【００６６】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＨＥ４、ｐＱＥ７０
、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター
、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８
Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入
手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤ
Ｒ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を含む。好ましい真
核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、
ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある
。他の適切なベクターは当業者に容易に明らかである。

【００６７】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）のような多く
の標準的研究室マニュアルに記載される。

【００６８】 ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そし
て分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。例えば、さ
らなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞における、精製の間の、
またはそれに続く取り扱いおよび保存の間の、安定性および持続性を改善するた
めに、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容
易にするためにポリペプチドへ付加され得る。このような領域は、ポリペプチド
の最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定
性を改善するため、および精製を容易にするために、ペプチド部分をポリペプチ
ドへ付加することは、当該分野でよく知られており、そして慣用技術である。好
ましい融合タンパク質は、タンパク質の可溶化のために有用な免疫グロブリン由
来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ対応出願
第２０４５８６９号）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに、免疫グ
ロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの
場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有
利であり、したがって、例えば、改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−
Ａ ０２３２ ２６２）。他方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、
記載される有利な様式で、発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部
分を欠失させ得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断におけ
る使用に対して障害となると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のた
めの抗原として使用される場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ５レ
セプターのようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するた
めの高処理能力スクリーニングアッセイの目的で、Ｆｃ部分と融合されている。
Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ 第８巻：５２−５８（１９９５）、およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏ
ｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ 第２７０巻：第１６号；９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。

【００６９】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターは、硫酸アンモニ
ウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換
え細胞培養物から回収され得、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体
クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使用される。本発明のポリ
ペプチドは、天然に精製された産物、化学的合成手順の産物、および原核生物宿
主または真核生物宿主から組換え技術によって産生された産物（例えば、細菌細
胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）を包含す
る。組換え産生手順に使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グ
リコシル化されてもよく、またはグリコシル化されなくてもよい。さらに、本発
明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの場合にお
いて、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。

【００７０】 （ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドならびにフ
ラグメント) ＴＲ１１ポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例は、例えば、配列番号１
または寄託されたクローンにおいて含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド番号の約１
〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２
５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５
００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５０、７
５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、または９５
１〜最後、からの配列を有するフラグメントを含む。ＴＲ１１ＳＶ１ポリヌクレ
オチドフラグメントの代表的な例は、例えば、配列番号３または寄託されたクロ
ーンにおいて含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド番号の約１〜５０、５１〜１００
、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１
〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０
、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００
〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１００７、または９５１
〜最後、からの配列を有するフラグメントを含む。ＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオ
チドフラグメントの代表的な例は、例えば、配列番号５または寄託されたクロー
ンにおいて含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド番号の約１〜５０、５１〜１００、
１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜
３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、
５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜
８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０
５０、１０５１〜最後、からの配列を有するフラグメントを含む。この状況にお
いて、「約」は、特に列挙される範囲を、いずれかの末端もしくは両方の末端で
、いくつか（５、４、３、２、もしくは１個）のヌクレオチドだけより大きなま
たはより小さな範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活
性を有するポリぺプチドをコードする。より好ましくは、これらのポリヌクレオ
チドは、本明細書において考察されるようにプローブまたはプライマーとして使
用され得る。

【００７１】 本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２、配列番号
４、配列番号６の中に含まれる、あるいは寄託されたクローンに含まれるｃＤＮ
Ａによってコードされる短いアミノ酸配列をいう。タンパク質フラグメントは、
「独立している」ものであり得るか、あるいはより大きなポリペプチド内に含ま
れ得、そのフラグメントは、そのポリペプチドの一部または一領域、最も好まし
くは、単一の連続的な領域を形成している。本発明の代表的なポリペプチドフラ
グメントの例としては、例えば、配列番号２のおよそのアミノ酸番号１〜２０、
２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、１２１
〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０
、２２１からコード領域の末端；配列番号４のおよそのアミノ酸番号１〜２０、
２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、１２１
〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０
、２２１〜コード領域の末端；あるいは、配列番号６のおよそのアミノ酸番号１
〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０
、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１
〜２２０、２２１からコード領域の末端が挙げられる。さらに、ポリペプチドフ
ラグメントは、長さがおよそ２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０
、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０アミノ酸であり得る
。この文脈の「およそ」とは、一端または両端のいずれかで、いくつかの（５、
４、３、２、または１）アミノ酸だけより大きいあるいはより小さい、特に引用
された範囲を含む。

【００７２】 しかし、ＥＳＴ配列のような多くのポリヌクレオチド配列は公に利用可能であ
り、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいく
らかは、配列番号１、配列番号３、および／または配列番号５に関連し、本発明
の着想の前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連
するポリヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連する配
列を列挙することは煩わしい。同様に、好ましくは、本発明からは、一般式ａ¹ −ｂ¹により記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａ¹は配列番号１の１〜９６
９の任意の整数であり、ｂ¹は１５〜９８３の整数であり、ここでａ¹およびｂ¹ の両方は配列番号１に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここで
ｂ¹はａ¹＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
同様に、好ましくは、本発明からは、一般式ａ²−ｂ²により記載されるヌクレオ
チド配列（ここで、ａ²は配列番号３の１〜９９３の任意の整数であり、ｂ²は１
５〜１００７の整数であり、ここでａ²およびｂ²の両方は配列番号３に示される
ヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂ²はａ²＋１４以上である）を
含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。従って、好ましくは、本発明か
らは、一般式ａ³−ｂ³により記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａ³は配列 番号５の１〜１０６０の任意の整数であり、ｂ₃は１５〜１０７４の整数であり 、ここでａ₃およびｂ₃の両方は配列番号５に示されるヌクレオチド残基の位置に
対応し、そしてここでｂ³はａ³＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレ
オチドが除外される。

【００７３】 特定の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの長さは、３００ｋｂ、
２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または７．５ｋｂよ
りも小さい。さらなる実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＲ
１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のコード配列の少なくとも１５の
連続したヌクレオチドを含むが、しかし任意のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、また
はＴＲ１１ＳＶ２のイントロンの全て、あるいは一部分を含まない。別の実施態
様において、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のコード配列を
含む核酸は、ゲノム上の隣接遺伝子（すなわち、ゲノム内のＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２遺伝子の５’または３’側）のコード配列を含ま
ない。

【００７４】 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、あ
るいは図１Ａおよび１Ｂ、２Ａおよび２Ｂ、ならびに３Ａおよび３Ｂ（それぞれ
、配列番号２、配列番号４および配列番号６）のアミノ酸配列を有する単離され
たＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２のポリペプチド、あるいは
前述のポリペプチドの一部を包含するペプチドまたはポリペプチドを提供する。

【００７５】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、および／またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドの特
徴を改良あるいは変質させるためには、タンパク質工学を用い得る。当業者に公
知の組換えＤＮＡ技術を使用して、単一の、または複数のアミノ酸置換、欠失、
付加、あるいは融合タンパク質を含む新規な変異タンパク質またはムテインを創
製し得る。そのような改変されたポリペプチドは、例えば、活性の増強、または
安定性の増加を示し得る。さらに、それらはより高い収率で精製され得、そして
少なくとも特定の精製および保存条件下では、それに対応する天然ポリペプチド
よりさらなる溶解性を示し得る。

【００７６】 例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパクの成熟形態を
含む多くのタンパク質に対して、１つ以上のアミノ酸を、そのＮ末端またはＣ末
端から実質的な生物学的機能の損失なく欠失し得ることは、当該分野で公知であ
る。例えば、Ｒｏｎおよび共同研究者（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２
９８４−２９８８（１９９３））は、３、８、あるいは２７のＮ末端アミノ酸残
基を失った場合でさえも、ヘパリン結合活性を有する改変されたＫＧＦタンパク
質を報告した。同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムラインの多くの例が公
知である。例えば、インターフェロンγは、そのタンパク質のカルボキシ末端か
ら８〜１０アミノ酸残基の欠失により１０倍までのより高い活性を示した。（Ｄ
ｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８
８））。

【００７７】 このように、タンパク質のＮ末端から１つ以上のアミノ酸の欠失が、そのタン
パク質の１つ以上の生物学的機能の損失する改変を生じるとしても、他の生物学
的活性はまだ保持され得る。このように、短縮されたＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１
、および／またはＴＲ１１ＳＶ２ムテインの、抗体（そのタンパク質の完全な、
または成熟した形態を認識する）を誘導および／またはそれに結合する能力は、
一般には、完全、または成熟タンパク質の大部分の残基を、そのＮ末端から除去
しない場合は、保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠いた特定のポリ
ペプチドが、そのような免疫学的活性を保持しているかどうかは、本明細書およ
び当業者に公知の他に記載されている慣用的方法で容易に決定し得る。多くのＮ
末端アミノ酸残基が欠失されたＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、および／またはＴＲ
１１ＳＶ２ムテインは、いくらかの生物学的あるいは免疫原性活性を残し得るよ
うである。実際に、６つほどのＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ
２のアミノ酸残基から構成されたペプチドは、頻繁に、免疫応答を引き起こし得
る。

【００７８】 従って、本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるＴＲ１
１アミノ酸配列のアミノ末端から位置番号２２９のロイシン残基までの１つ以上
の残基を欠失したポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１
２）のｎ¹〜２３４残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、 ｎ¹は２〜２２９の範囲の整数であり、そして２３０は、ＴＲ１１タンパク質の 少なくとも免疫原性活性に必要と思われる完全ＴＲ１１ポリペプチドのＮ末端か
ら最初の残基の位置である。

【００７９】 より詳細には、本発明は、図１Ａおよび１Ｂに示されるＴＲ１１アミノ酸配列
（配列番号２として示される配列と同一のもので、例外として、配列番号２のア
ミノ酸残基は、推定シグナルペプチドの位置に対応して、−２５から２０９まで
連続的に番号を付けているが、図１Ａおよび１Ｂのアミノ酸残基は、そのＮ末端
からＣ末端までを１から２３４と連続的に番号を付けている）の以下の残基のア
ミノ酸配列を含む、あるいは、以下の残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【００８０】

【化１】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる
。

【００８１】 さらに、タンパク質のＣ末端から１つ以上のアミノ酸の欠失が、そのタンパク
質の１つ以上の生物学的機能の損失する改変を生じるとしても、他の生物学的活
性はまだ保持され得る。このように、短縮されたＴＲ１１ムテインの、抗体（そ
のタンパク質の完全な、または成熟した型を認識する）を誘導および／またはそ
れに結合する能力は、一般には、完全、または成熟タンパク質の大部分の残基を
、そのＮ末端から除去しない場合は、保持される。完全なタンパク質のＣ末端残
基を欠いた特定のポリペプチドが、そのような免疫学的活性を保持するかどうか
は、本明細書および当業者に公知の他に記載されている慣用方法で容易に決定さ
れ得る。多くのＣ末端アミノ酸残基が欠失されたＴＲ１１ムテインは、いくらか
の生物学的あるいは免疫原性活性を保持し得るようである。実際に、６つほどの
ＴＲ１１のアミノ酸残基から構成されたペプチドは、頻繁に、免疫応答を引き起
こし得る。

【００８２】 従って、本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるＴＲ１
１アミノ酸配列のカルボキシ末端から位置番号６のアラニン残基までの１つ以上
のポリペプチドを欠失したポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１Ａおよび１Ｂ（配
列番号２）の１〜ｍ¹残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで 、ｍ¹は６〜２３４の範囲の整数であり、そして６は、ＴＲ１１タンパク質の少 なくとも免疫原性活性に必要と思われる完全ＴＲ１１ポリペプチドのＣ末端から
最初の残基の位置である。

【００８３】 より詳細には、本発明は、図１Ａおよび１Ｂに示されるＴＲ１１配列（配列番
号２として示される配列と同一のものであるが、例外として、配列番号２のアミ
ノ酸残基は、推定シグナルペプチドの位置に対応して、−２５から２０９まで連
続的に番号を付けているが、図１Ａおよび１Ｂのアミノ酸残基は、そのＮ末端か
らＣ末端までを１から２３４と連続的に番号を付けている）の以下の残基のアミ
ノ酸配列を含む、あるいは、以下の残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを提供する。

【００８４】

【化２】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。

【００８５】 本発明はまた、可溶性のＴＲ１１ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシ
ル末端の両方から１つ以上のアミノ酸を欠失したポリペプチドを提供し、これは
、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のｎ¹〜ｍ¹残基を有するものとして通常記載
され得、ここで、ｎ¹およびｍ¹は前述の整数である。

【００８６】 本発明はさらに、配列番号４に示されるＴＲ１１ＳＶ１アミノ酸配列のアミノ
末端から位置番号２３６のロイシン残基までの、１つ以上の残基を欠失したポリ
ペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提
供する。特に、本発明は、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）のｎ²〜２４１残基 のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｎ²は２〜２３６の範囲 の整数であり、そして２３７は、ＴＲ１１ＳＶ１タンパク質の少なくとも免疫原
性活性に必要と思われる完全ＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチドのＮ末端から最初の残
基の位置である。

【００８７】 より詳細には、本発明は、図２Ａおよび２Ｂに示されるＴＲ１１ＳＶ１アミノ
酸配列（配列番号４として示される配列と同一のものである）の以下の残基のア
ミノ酸配列を含む、あるいは、以下の残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【００８８】

【化３】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる
。

【００８９】 前述のように、タンパク質のＣ末端から１つ以上のアミノ酸の欠失が、そのタ
ンパク質の１つ以上の生物学的機能を損失する改変を生じるとしても、他の生物
学的活性はまだ保持され得る。このように、短縮されたＴＲ１１ＳＶ１１ムテイ
ンの、抗体（そのタンパク質の完全な、または成熟した型を認識する）を誘導お
よび／またはそれに結合する能力は、一般には、完全、または成熟タンパク質の
大部分の残基を、そのＣ末端から除去しない場合は、保持される。完全なタンパ
ク質のＣ末端残基を欠いた特定のポリペプチドが、そのような免疫学的活性を保
持するかどうかは、本明細書および当業者に公知の他に記載されている慣用的方
法で容易に決定され得る。多くのＣ末端アミノ酸残基が欠失されたＴＲ１１ＳＶ
１ムテインは、いくらかの生物学的あるいは免疫原性活性を保持し得るようであ
る。実際に、６つほどのＴＲ１１ＳＶ１のアミノ酸残基から構成されたペプチド
は、頻繁に、免疫応答を引き起こし得る。

【００９０】 従って、本発明はさらに、配列番号４に示されるＴＲ１１ＳＶ１アミノ酸配列
のカルボキシ末端から位置番号６のアルギニン残基までの１つ以上の残基を欠失
したポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを提供する。特に、本発明は、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）の１〜ｍ² 残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｍ²は６〜２４１の 範囲の整数であり、そして６は、ＴＲ１１ＳＶ１タンパク質の少なくとも免疫原
性活性に必要と思われる完全ＴＲ１１ポリペプチドのＣ末端から最初の残基の位
置である。

【００９１】 より詳細には、本発明は、図２Ａおよび２Ｂに示されるＴＲ１１ＳＶ１配列（
配列番号４として示される配列と同一のものである）の以下の残基のアミノ酸配
列を含む、あるいは、以下の残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを提供する。

【００９２】

【化４】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。

【００９３】 本発明はまた、ＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル
末端の両方から１つ以上のアミノ酸を欠失したポリペプチドを提供し、これは、
図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）のｎ²〜ｍ²残基を有するものとして通常記載さ
れ得、ここで、ｎ²およびｍ²は前述の整数である。

【００９４】 さらに本発明は、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）に示されるＴＲ１１ＳＶ２
アミノ酸配列のアミノ末端から位置番号２３５のロイシン残基までの１つ以上の
残基を欠失したポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドをさらに提供する。特に、本発明は、図３Ａおよび３Ｂ（配列番
号６）のｎ³〜２４０残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで 、ｎ³は２〜２３５の範囲の整数であり、そして２３６は、ＴＲ１１ＳＶ２タン パク質の少なくとも免疫原性活性に必要と思われる完全ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプ
チドのＮ末端から最初の残基の位置である。

【００９５】 より詳細には、本発明は、図３Ａおよび３Ｂに示されるＴＲ１１ＳＶ２アミノ
酸配列（配列番号６として示される配列と同一のものであるが、例外として、配
列番号６のアミノ酸残基は、推定シグナルペプチドの位置に対応して、−１９か
ら２２１まで連続的に番号を付けているが、図３Ａおよび３Ｂのアミノ酸残基は
、そのＮ末端からＣ末端までを１から２４０と連続的に番号を付けている）の以
下の残基のアミノ酸配列を含む、あるいは、以下の残基のアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【００９６】

【化５】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる
。

【００９７】 また前述のように、タンパク質のＣ末端から１つ以上のアミノ酸の欠失が、そ
のタンパク質の１つ以上の生物学的機能を損失する改変を生じるとしても、他の
生物学的活性はまだ保持され得る。このように、短縮されたＴＲ１１ＳＶ２ムテ
インの、抗体（そのタンパク質の完全な、または成熟した型を認識する）を誘導
および／またはそれに結合する能力は、一般には、完全または成熟タンパク質の
大部分の残基をそのＣ末端から除去しない場合は、保持される。完全タンパク質
のＣ末端残基を欠いた特定のポリペプチドが、そのような免疫学的活性を保持す
るかどうかは、本明細書および当業者に公知の他に記載されている慣用的方法で
容易に決定され得る。多くのＣ末端アミノ酸残基が欠失されたＴＲ１１ＳＶ２ム
テインは、いくらかの生物学的あるいは免疫原生活性を保持し得るようである。
実際に、６つほどのＴＲ１１ＳＶ２のアミノ酸残基から構成されたペプチドは、
頻繁に、免疫応答を引き起こし得る。

【００９８】 従って、本発明はさらに、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）に示されるＴＲ１
１ＳＶ２アミノ酸配列のカルボキシ末端から、位置番号６のアラニン残基までの
１つ以上の残基を欠失したポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図３Ａおよび３Ｂ（配
列番号６）の１〜ｍ³残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで 、ｍ³は６〜２４０の範囲の整数であり、そして６は、ＴＲ１１ＳＶ２タンパク 質の少なくとも免疫原性活性に必要と思われる完全ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチド
のＣ末端から最初の残基の位置である。

【００９９】 より詳細には、本発明は、図３Ａおよび図３Ｂに示した、ＴＲ１１ＳＶ２配列
（これは、配列番号６と示した配列と同一である。図３Ａおよび図３Ｂのアミノ
酸残基が、Ｎ末端からＣ末端へ向かって１から２４０まで連続して番号付けされ
ていることを除いては、配列番号６のアミノ酸残基は、予想されたシグナルペプ
チドの位置を反映して、−１９から２２１まで連続して番号付けられる）の配列
の、以下の残基のアミノ酸配列を含有、あるいはそれらからなるポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを提供する。

【０１００】

【化６】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。

【０１０１】 本発明はまた、ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドのアミノおよびカルボキシルの両
方の末端から、１つ以上のアミノ酸を欠失したポリペプチドを提供する。これは
、図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号６）のｎ³−ｍ³残基を持つように一般的に記載
され得る。ここで、ｎ³およびｍ³は、整数である。

【０１０２】 さらに、本発明は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示したＴＲ１１アミノ
酸配列の予想されている細胞外ドメインのアミノ末端から、１つ以上のアミノ酸
残基が欠失されたポリペプチド（１５６位のグリシン残基まで）、およびそのよ
うなポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを、さらに提供し得る。特に、
本発明は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の残基ｎ⁴−１６２のアミノ酸配列 を含むポリペプチドを提供する（ｎ⁴は、２５〜１５６の範囲の整数であり、そ して１５７位は、ＴＲ１１タンパク質の、予想される細胞外ドメインの免疫原性
の活性に少なくとも必要とされると考えられているＴＲ１１ポリペプチドの、予
想される細胞外ドメインのＮ末端からの１位の残基である。

【０１０３】 より詳細には、本発明は、図１Ａおよび１Ｂに示した、ＴＲ１１のアミノ酸配
列（これは、配列番号２に示した配列と同一であり、図１Ａおよび１Ｂのアミノ
酸残基が、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、１〜２３４まで連続して番号付けられ
ることを除いては、配列番号２のアミノ酸残基は予想されるシグナルペプチドの
位置を反映て、−２５〜２０９まで連続して番号付けられる）以下の残基のアミ
ノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドをコードしたポリヌク
レオチドを提供する。

【０１０４】

【化７】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる
。

【０１０５】 本発明は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示した、ＴＲ１１のアミノ酸配
列の予想されている細胞外ドメインのカルボキシ末端から、１つ以上の残基が欠
失されたポリペプチド（３１位のグリシン残基まで）およびそのようなポリペプ
チドをコードしたポリヌクレオチドを、さらに提供する。特に、本発明は、図１
Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の残基２５−ｍ⁴のアミノ酸配列を含むポリペプチ ドを提供する（ｍ⁴は、３１〜１６２の範囲の整数であり、そして３０は、ＴＲ １１タンパク質の、免疫原性の活性に少なくとも必要とされると考えられている
ＴＲ１１ポリペプチドの、予想される細胞外ドメインのＣ末端からの１位の残基
である。

【０１０６】 より詳細には、本発明は、図１Ａおよび１Ｂに示した、ＴＲ１１配列（配列番
号２に示した配列と同一であり、図１Ａおよび１Ｂのアミノ酸残基が、Ｎ末端か
らＣ末端へ向かって、１〜２３４まで連続して番号付けられることを除いては、
配列番号２のアミノ酸残基は予想されるシグナルペプチドの位置を反映して、−
２５〜２０９に連続的に番号付けられる）の以下の残基のアミノ酸配列を含むか
、あるいはそれらからなるポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを提供す
る。

【０１０７】

【化８】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。

【０１０８】 本発明はまた、可溶性ＴＲ１１ポリペプチドのアミノおよびカルボキシルの両
方の末端から、１つ以上のアミノ酸を欠失したポリペプチドを提供する。これは
、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）のｎ⁴−ｍ⁴残基を持つように一般的に記載
され得る。ここで、ｎ⁴およびｍ⁴は、上記のように整数である。

【０１０９】 さらに、本発明は、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）に示した、ＴＲ１１ＳＶ
１アミノ酸配列の予想されている細胞外ドメインのアミノ末端から、１つ以上の
アミノ酸残基が欠失されたポリペプチド（１５６位のグリシン残基まで）および
そのようなポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを、さらに提供し得る。
特に、本発明は、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）の残基ｎ⁵−１６２のアミノ 酸配列を含むポリペプチドを提供する（ｎ⁵は、１〜１５６の範囲の整数であり 、そして１５７は、ＴＲ１１ＳＶ１タンパク質の、予想される細胞外ドメインの
免疫原性の活性に少なくとも必要とされると考えられているＴＲ１１ＳＶ１ポリ
ペプチドの、予想される細胞外ドメインのＮ末端からの１位の残基である。

【０１１０】 より詳細には、本発明は、図２Ａおよび図２Ｂ（配列番号４）に示した、ＴＲ
１１ＳＶ１アミノ酸配列の以下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれか
らなるポリペプチドをコードした、ポリヌクレオチドを提供する。

【０１１１】

【化９】 これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる
。

【０１１２】 本発明は、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）に示した、ＴＲ１１ＳＶ１アミノ
酸配列の予想されている細胞外ドメインのカルボキシ末端から、１つ以上の残基
が欠失されたポリペプチド（６位のアルギニン残基まで）およびそのようなポリ
ペプチドをコードしたポリヌクレオチドを、さらに提供する。特に、本発明は、
図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）の残基１−ｍ⁵のアミノ酸配列を含むポリペプ チドを提供する（ｍ⁵は、６〜１６２の範囲の整数であり、そして６は、ＴＲ１ １ＳＶ１タンパク質の、免疫原性の活性に少なくとも必要とされると考えられて
いるＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチドの、予想される細胞外ドメインのＣ末端からの
１位置の残基である。

【０１１３】 より詳細には、本発明は、図２Ａおよび図２Ｂ（配列番号４）に示したＴＲ１
１ＳＶ１配列の配列の以下の残基のアミノ酸配列を含むかあるいはこれらからな
るポリペプチドをコードした、ポリヌクレオチドを提供する。

【０１１４】

【化１０】 これらのポリヌクレオチドをコードした、ポリペプチドが提供される。

【０１１５】 本発明はまた、可溶性ＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチドのアミノおよびカルボキシ
ルの両方の末端から、１つ以上のアミノ酸を欠失したポリペプチドを提供する。
これは、図２Ａおよび図２Ｂ（配列番号４）のｎ⁵−ｍ⁵残基を持つように一般的
に記載され得る。ここで、ｎ⁵およびｍ⁵は上記のように整数である。

【０１１６】 さらに、本発明は、図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号６）に示した、ＴＲ１１Ｓ
Ｖ２アミノ酸配列の予想されている細胞外ドメインのアミノ末端から、１つ以上
のアミノ酸残基が欠失されたポリペプチド（１６２位のグリシン残基まで）およ
びそのようなポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを、さらに提供する。
特に、本発明は、図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号６）の残基ｎ⁵−１６８のアミ ノ酸配列を含むポリペプチドを提供する（ｎ⁶は、２０〜１６２の範囲の整数で あり、そして１６３は、ＴＲ１１ＳＶ２タンパク質の、予想される細胞外ドメイ
ンの免疫原性の活性に少なくとも必要とされると考えられているＴＲ１１ＳＶ２
ポリペプチドの、予想される細胞外ドメインのＮ末端からの１位の残基である。

【０１１７】 より詳細には、本発明は、図３Ａおよび図３Ｂに示した、ＴＲ１１ＳＶ２アミ
ノ酸配列（配列番号６と示した配列と同一である。図３Ａおよび図３Ｂのアミノ
酸残基がＮ末端からＣ末端へ向かって１から２４０まで連続して番号付けられる
ことを除いては、配列番号６のアミノ酸残基は、予想されたシグナルペプチドの
位置を反映して、−１９から２２１まで連続して番号付けられる）の配列の以下
の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドをコード
した、ポリヌクレオチドを提供する。

【０１１８】

【化１１】 これらのポリヌクレオチドをコードした、ポリペプチドが、本発明に含まれる。

【０１１９】 本発明は、図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号６）に示した、ＴＲ１１ＳＶ２のア
ミノ酸配列の予想されている細胞外ドメインのカルボキシ末端から、１つ以上の
アミノ酸残基が欠失されたポリペプチド（２６位のプロリン残基まで）およびそ
のようなポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを、さらに提供し得る。特
に、本発明は、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）の残基２０−ｍ⁶のアミノ酸配 列を含むポリペプチドを提供する（ｍ⁶は、２６〜１６８の範囲の整数であり、 そして２６は、ＴＲ１１ＳＶ２タンパク質の免疫原性の活性に少なくとも必要と
されると考えられているＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドの、予想される細胞外ドメ
インのＣ末端からの１位の残基である。

【０１２０】 より詳細には、本発明は、図３Ａおよび図３Ｂに示した、ＴＲ１１ＳＶ２配列
（これは、配列番号６と示した配列と同一である。図３Ａおよび図３Ｂのアミノ
酸残基がＮ末端からＣ末端へ向かって１から２４０まで連続して番号付けられる
ことを除いては、配列番号６のアミノ酸残基は、予想されたシグナルペプチドの
位置を反映して、−１９から２２１まで連続して番号付けられる）配列の以下の
残基のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドをコードし
た、ポリヌクレオチドを提供する。

【０１２１】

【化１２】 これらのポリペプチドをコードした、ポリヌクレオチドがまた提供される。

【０１２２】 本発明はまた、ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドのアミノおよびカルボキシルの両
方の末端から、１つ以上のアミノ酸を欠失したポリペプチドを提供する。これは
、図３Ａおよび図３Ｂ（配列番号６）のｎ⁶−ｍ⁶残基を持つように一般的に記載
され得る。ここで、ｎ⁶およびｍ⁶は、上記のように整数である。

【０１２３】 本発明のポリペプチドは、膜の結合であってもよいし、可溶性の循環形態であ
ってもよい。可溶性ペプチドは、ここでは、膜貫通ドメインを欠いたポリペプチ
ド配列を含むアミノ酸配列により定義される。

【０１２４】 本発明のポリペプチドは、膜貫通領域、ならびに細胞内および細胞外領域を有
する膜結合レセプターとして存在し得るか、またはそれらは、ここでは膜貫通ド
メインを欠いている可溶性の形態で存在し得る。ＴＲ１１，ＴＲ１１ＳＶ１、お
よびＴＲ１１ＳＶ２レセプターのそのような形態の１つの例は、膜貫通、細胞内
および細胞外のドメインを含む、図１Ａおよび図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂ、そ
して図３Ａおよび図３Ｂ（各々、配列番号２、配列番号４および配列番号６）に
示されるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターである。
従って、これらのＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプター
の形態は、これらのタンパク質が発現される、細胞の細胞質膜に局在するようで
ある。

【０１２５】 当該分野において、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプ
ターのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能に重要な変化を
与えずに変化し得ることが認識されている。もし、そのような配列の違いが考え
られるなら、それらは、活性を決定するタンパク質の重要な部位であるというこ
とを、意味する。従って、本発明は、実質的なＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およ
びＴＲ１１ＳＶ２レセプター活性を示すか、または以下で論じられるタンパク質
部位のようなＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２タンパク質の領
域を含む、種々のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプター
をさらに含む。そのような変異体は、欠失、挿入、反転、反復および型の置換を
含む。上記に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントであ
りそうかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら（「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔ
ｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌ
ｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０））によって執筆さ
れた刊行物に見出され得る。

【０１２６】 従って、図１Ａおよび図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂ、そして図３Ａおよび図３
Ｂ（それぞれ、配列番号２、配列番号４および配列番号６）のポリペプチドコピ
ーのフラグメント、誘導体またはアナログあるいは寄託したｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基ま
たは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこ
のような置換されるアミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基
であってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ以上の
アミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが
、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール
）のような別の化合物と融合されているもの、あるいは（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融
合領域ペプチドもしくはリーダー、または分泌配列もしくは成熟ポリペプチドの
精製のために使用される配列またはプロタンパク質といった、さらなるアミノ酸
が成熟ポリペプチドに融合されているもの。このようなフラグメント、誘導体お
よびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。

【０１２７】 特に興味深いものは、別の荷電したアミノ酸での、および中性または負電荷の
アミノ酸での荷電したアミノ酸の置換である。後者は減少した正電荷を有するタ
ンパク質を生じ、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２タンパク質
の特徴を改良する。凝集の防止が高度に所望される。タンパク質の凝集は、活性
の損失を生じるだけでなく、それらは免疫原性であり得るので、薬学的処方物を
調製する場合にも問題であり得る（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ． ２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａ
ｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ
．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ １０：３０７−３７７（１９９３））。

【０１２８】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化し得る。
Ｏｓｔａｄｅら（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８（１９９３））は、す
でに記載された２つの型のＴＮＦレセプターの１つのみへのＴＮＦ−αの選択的
な結合を生じる特定の変異を記載する。従って、本発明のＴＲ１１、ＴＲ１１Ｓ
Ｖ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターは、天然の変異または人工操作のいずれ
かに由来する１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。

【０１２９】 記載されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存
的アミノ酸置換のような、小さな性質の変化が好ましい（表１を参照のこと）。

【０１３０】

【表１】 本発明の実施態様は、本明細書に記載されたＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およ
び／またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチド配列と比較した場合、本明細書に記
載されたＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、および／またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を含むが、しかし、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含
むアミノ酸配列を持つ、しかし５０以下の保存的アミノ酸置換、より好ましくは
、４０を超えない保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは、３０を超えない
保存的アミノ酸置換、そしてまださらに好ましくは、２０を超えない保存的アミ
ノ酸置換をもつアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。

【０１３１】 機能に必須である本発明のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２タ
ンパク質におけるアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング
変異誘発のような当該分野に公知の方法により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈ
ａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８
９））。後者の手順は、分子内の全ての残基に１つのアラニン変異を導入する。
次いで得られる変異分子は、インビトロでのレセプター結合のような生物学的活
性またはインビトロ増殖活性について試験される。リガンド-レセプター結合に 重要な部位はまた、結晶構造解析、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構
造分析により決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８
９９−９０４(１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：３０ ６−３１２（１９９２））。

【０１３２】 本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供される。「単離さ
れたポリペプチド」は、その自然な環境から除去したポリペプチドと解釈される
。従って、組換え宿主細胞中に産生されかつ含まれるポリペプチドは、本発明の
目的において「単離された」とみなされる。また、単離されたポリペプチド」と
して解釈されるのは、組換え宿主から、部分的または実質的に、精製されている
ポリペプチドである。例えば、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２
レセプターの組換え生成したバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，
Ｇｅｎｅ６７：３１−４０（１９８８）において記載される１工程の方法によっ
て、実質的に精製され得る。

【０１３３】 本発明のポリペプチドはまた：（ａ）リーダーを含む、寄託されたｃＤＮＡに
よりコードされるＴＲ１１ポリペプチド；（ｂ）リーダーを含む、寄託されたｃ
ＤＮＡによりコードされるＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチド；（ｃ）リーダーを含む
、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチド；（ｄ）
リーダーを含まない、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるＴＲ１１ポリペプ
チド（すなわち、成熟タンパク質）；（ｅ）リーダーを含まない、寄託されたｃ
ＤＮＡによりコードされるＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチド（すなわち、成熟タンパ
ク質）；（ｆ）リーダーを含まない、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるＴ
Ｒ１１ＳＶ２ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；（ｇ）リーダーを含
む、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のＴＲ１１ポリペプチド；（ｈ）リーダー
を含む、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）のＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチド；（ｉ
）リーダーを含む、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）のＴＲ１１ＳＶ２ポリペプ
チド；（ｊ）リーダーを含むがＮ末端のメチオニンを含まない、図１Ａおよび１
Ｂ（配列番号２）のＴＲ１１ポリペプチド；（ｋ）リーダーを含むがＮ末端のメ
チオニンを含まない、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）のＴＲ１１ＳＶ１ポリペ
プチド；（ｌ）リーダーを含むがＮ末端のメチオニンを含まない、図３Ａおよび
３Ｂ（配列番号６）のＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチド；（ｍ）リーダーを含まない
、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のポリペプチド；（ｎ）リーダーを含まない
、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）のポリペプチド；（ｏ）リーダーを含まない
、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）のポリペプチド；（ｐ）図１Ａおよび１Ｂ（
配列番号２）で示される、ＴＲ１１レセプターの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイ
ン、および細胞内ドメイン；（ｑ）図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）で示される
、ＴＲ１１ＳＶ１レセプターの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内
ドメイン；（ｒ）図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）で示される、ＴＲ１１ＳＶ２
レセプターの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン；ならび
に、上記のポリペプチドと、少なくとも８０％同一の、より好ましくは少なくと
も９０％または９５％同一の、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％
、９８％または９９％同一のポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０
のアミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０のアミノ酸とともにこのよう
なポリペプチドの一部を含む。

【０１３４】 少なくとも例えば、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペ
プチドの参照のアミノ酸配列と９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプ
チドとは、ポリペプチドのアミノ酸配列が、ポリペプチド配列がＴＲ１１、ＴＲ
１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２レセプターの参照のアミノ酸配列の各１００
アミノ酸あたり５アミノ酸までの改変を含み得る場合を除いて、参照の配列と同
一である、と解釈される。換言すれば、参照のアミノ酸配列と少なくとも９５％
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列中のアミノ酸
残基の５％まで、欠失または他のアミノ酸に置換され得る、あるいは参照配列中
の全アミノ酸残基の５％までの多数のアミノ酸が、参照配列の中に挿入され得る
。参照配列の配列のこれらの改変は、参照のアミノ酸配列のアミノもしくはカル
ボキシ末端部位、または参照の配列の残基の中で個々、もしくは参照の配列の中
で１つ以上の連続した群、のいずれかに分散したこれらの末端部位の間のどこか
で生じ得る。

【０１３５】 実際に、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号
２）、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）、および／または図３Ａおよび３Ｂ（配
列番号６）に示されるアミノ酸配列、それぞれ寄託されたｃＤＮＡクローンＨＨ
ＥＡＣ７１、ＨＴ５ＥＡ７８、およびＨＣＦＡＺ２２によりコードされるアミノ
酸配列、あるいはそのフラグメントと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗ
ｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖ
ｅｒｓｉｏｎ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇ
ｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコ
ンピュータープログラムを用いて慣習的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは
任意の他の配列整列プログラムを使用して、特定の配列が、例えば本発明による
参照配列に９５％同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん
、同一性の割合が、参照アミノ酸配列の全長にわたって計算されるように、そし
て参照配列のアミノ酸残基の数の５％までの相同性におけるギャップが許容され
るように、設定される。

【０１３６】 特定の実施態様において、参照（問い合わせ）配列（本発明の配列）と対象配
列との間の同一性（全体的配列整列としても参照される）は、Ｂｒｕｔｌａｇお
よび共同研究者ら（Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ． ６：２３７−２４
５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラ
ムを使用して決定される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラ
メーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃ
ｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏ
ｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ
＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５
、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ
＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。本実施
態様に従って、対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のため
ではなく）問い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされな
けらばならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセン
トを算定する場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないとい
う事実を考慮する。Ｎ末端およびＣ末端で切断される対象配列について、問い合
わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセント
として、対応する対象残基と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端側
である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一
致／整列されているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定
される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記の
ＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用して計算され、最終
的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのス
コアは、本実施態様の目的で使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整
列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセント
のスコアを手動で調整する目的で考慮される。すなわち、対象配列の最も遠いＮ
末端およびＣ末端残基の外側の問い合わせ残基位置のみである。例えば、９０ア
ミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００残基の問い
合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡ
ＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の
不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端での残基の数
／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。残りの
９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別
の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較され
る。この時点で、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ配列と一致／整
列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳ
ＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再び、Ｆ
ＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列
のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補
正は、本実施態様の目的のためにはなされない。

【０１３７】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
または分子篩いゲル濾過カラムでの分子量マーカーとして使用され得る。

【０１３８】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチドのエピトープ
部分は、本明細書中に記載されるポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトー
プである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗
体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し
得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク
質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない
。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。

【０１３９】 抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一
部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およ
びＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒ
ｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６を参照のこと。タンパク
質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で頻繁に示され、
単純な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク
質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端またはカ
ルボキシル末端にも、制限されない。

【０１４０】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、それゆえ、本
発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起す
るのに有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、３７：７６７−７７８
（１９８４）の７７７を参照のこと。本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドお
よびポリペプチドは、好ましくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含ま
れる少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、そして最も好ましくは約１５
〜約３０アミノ酸の間の配列を含む。

【０１４１】 ＴＲ１１レセプター特異抗体を産生するために用いられ得る、抗原性ポリペプ
チドまたはペプチドの非限定的例は：配列番号２における約Ａｒｇ−２〜約Ｐｒ
ｏ−１１由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約Ｔｈｒ
−１８〜約Ａｒｇ−２６由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２に
おける約Ａｒｇ−３４〜約Ｃｙｓ−４２由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド
；配列番号２における約Ａｒｇ−３１〜約Ｇｌｕ−３９由来のアミノ酸残基を含
むポリペプチド；配列番号２における約Ｇｌｙ−３８〜約Ａｓｐ−４６由来のア
ミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約Ｇｌｙ−７４〜約Ｓｅｒ
−８２由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約Ｇｌｕ−
１００〜約Ａｓｐ−１０８由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２
における約Ｐｈｅ−１１８〜約Ａｌａ−１２６由来のアミノ酸残基を含むポリペ
プチド；配列番号２における約Ｇｌｙ−１３１〜約Ｇｌｙ−１３９由来のアミノ
酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約Ｐｒｏ−１７８〜約Ｃｙｓ−
１８６由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号２における約Ｓ
ｅｒ−１９７〜約Ｇｌｙ−２０５由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド、を含
む。上記に示されるように、本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントがＴ
Ｒ１１レセプタータンパク質の抗原性領域であることを決定した。

【０１４２】 ＴＲ１１ＳＶ１レセプター特異抗体を産生するために用いられ得る、抗原性ポ
リペプチドまたはペプチドの非限定的例は：配列番号４における約Ａｌａ−２〜
約Ｉｌｅ−１０由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約
Ａｓｎ−１１〜約Ｇｌｙ−１９由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番
号４における約Ｔｈｒ−２７〜約Ｓｅｒ−３５由来のアミノ酸残基を含むポリペ
プチド；配列番号４における約Ｔｒｐ−３８〜約Ｇｌｕ−４６由来のアミノ酸残
基を含むポリペプチド；配列番号４における約Ｇｌｙ−４２〜約Ｓｅｒ−５０由
来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約Ｇｌｕ−３１〜約
Ｇｌｕ−４６由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約Ｃ
ｙｓ−６１〜約Ｇｌｕ−６９由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号
４における約Ｇｌｙ−９９〜約Ｓｅｒ−１０７由来のアミノ酸残基を含むポリペ
プチド；配列番号４における約Ｇｌｕ−１２５〜約Ａｓｐ−１３３由来のアミノ
酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約Ｐｈｅ−１４３〜約Ａｌａ−
１５１由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約Ｇｌｙ−
１５６〜約Ｇｌｙ−１６４由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４
における約Ｃｙｓ−１９６〜約Ｌｅｕ−２０４由来のアミノ酸残基を含むポリペ
プチド；配列番号４における約Ｐｒｏ−２０９〜約Ｓｅｒ−２１７由来のアミノ
酸残基を含むポリペプチド；および配列番号４における約Ｓｅｒ−２２９〜約Ｇ
ｌｙ−２３７由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド、を含む。上記に示される
ように、本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントがＴＲ１１ＳＶ１レセプ
タータンパク質の抗原性領域であることを決定した。

【０１４３】 ＴＲ１１ＳＶ２レセプター特異抗体を産生するために用いられ得る、抗原性ポ
リペプチドまたはペプチドの非限定的例は：配列番号６における約Ｇｌｎ−１〜
約Ｃｙｓ−９由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６における約Ｇ
ｌｙ−５〜約Ａｒｇ−１３由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６
における約Ｔｈｒ−１８〜約Ａｒｇ−２６由来のアミノ酸残基を含むポリペプチ
ド；配列番号６における約Ｔｈｒ−２９〜約Ｐｒｏ−３７由来のアミノ酸残基を
含むポリペプチド；配列番号６における約Ｃｙｓ−４８〜約Ｇｌｕ−５６由来の
アミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６における約Ｖａｌ−８７〜約Ｐｈ
ｅ−９５由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６における約Ｈｉｓ
−１１１〜約Ｔｈｒ−１１９由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号
６における約Ｐｈｅ−１３０〜約Ａｌａ−１３８由来のアミノ酸残基を含むポリ
ペプチド；配列番号６における約Ｇｌｙ−１４３〜約Ｇｌｙ−１５１由来のアミ
ノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６における約Ｐｒｏ−１９０〜約Ｃｙｓ
−１９８由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号６における約
Ｓｅｒ−２０９〜約Ｇｌｙ−２１７由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド、を
含む。上記に示されるように、本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントが
ＴＲ１１ＳＶ２レセプタータンパク質の抗原性領域であることを決定した。

【０１４４】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは任意の従来の手段によ
って産生され得る。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ．Ｒ．Ａ．（１９８５）、Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ
：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔ
ｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
２：５１３１−５１３５。この「同時多重ペプチド合成（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏ
ｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＭＰＳ）
」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１
，２１１号に記載される。

【０１４５】 当業者に理解されるように、本発明のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ
１１ＳＶ２ポリペプチド、ならびに上記のエピトープを保有するフラグメントは
、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わせられ得、キメラ
ポリぺプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてイ
ンビボにおける増大した半減期を示す。このことは、例えばヒトＣＤ４ポリペプ
チドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽
鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている
（ＥＰＡ ３９４，８２７； Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１
： ８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因す
る）を有する融合タンパク質もまた、単量体ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、および
ＴＲ１１ＳＶ２レセプタータンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも
、他の分子に結合しそして中和するのにさらに効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏ
ｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５
））。

【０１４６】 （疾患状態の検出） ＴＮＦファミリーリガンドは、本発明のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ
１１ＳＶ２レセプターを含む、ＴＮＦファミリーレセプターへの結合によって種
々の細胞応答を誘導する。ＴＮＦ−β（ＴＮＦレセプタータンパク質の有力なリ
ガンド）は、リンパ球発達、腫瘍壊死、抗ウイルス状態の誘導、多形核白血球の
活性化、クラスＩ主要組織適合性複合体抗原の内皮細胞上への誘導、接着分子の
内皮上への誘導、ならびに成長ホルモン刺激を含む多くの生物学的プロセスに関
与することが公知である（ＲｕｄｄｌｅおよびＨｏｍｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅ
ｒｇｙ，４０：１６２−１８２（１９８８））。ＴＮＦ−α（これもまた、ＴＮ
Ｆレセプタータンパク質のリガンド）は、腫瘍の迅速な壊死、免疫刺激、自己免
疫疾患、移植片拒絶、抗ウイルス応答の生成、敗血症性ショック、大脳マラリア
、細胞傷害性、化学治療経過の間に生成されるイオン化放射線の有害な効果（例
えば、酵素の変性、脂質の過酸化、およびＤＮＡ損傷）に対する防禦（Ｎａｔａ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（７）：２４８３（ １９８７）；Ｐｏｒｔｅ ｒ，Ｔｉｂｔｅｃｈ ９：１５８−１６２（１９９１））、成長調節、脈管内皮
効果、および代謝効果における役割を有することが報告されている。ＴＮＦ−α
はまた、内皮細胞による種々の因子（ＰＡＩ−１、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよ
びＩＬ−６を含む）の分泌を誘発して、細胞増殖を促進する。加えて、ＴＮＦ−
αは、Ｅセレクチン、ＩＣＡＭ−１、およびＶＣＡＭ−１のような種々の細胞接
着分子をアップレギュレートする。ＴＮＦ−αおよびＦａｓリガンドはまた、プ
ログラムされた細胞死を誘導することが示されている。ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ−２
Ｌとしてまた知られる）は、種々の形質変換細胞株においてアポトーシスを迅速
に誘導する、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーのメンバーである。Ｔ
ＲＡＩＬに対するヒトのレセプターは、ＴＮＦレセプターファミリーの記載され
ていないメンバーであることが見出され、死レセプター（ＤＲ）−４と命名され
た（Ｐａｎ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１１−１１３（１９９７)） 。

【０１４７】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のポリペプチドを発現して
いる細胞、およびＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタ
ーリガンドに対して強力な細胞応答を有すると考えられる細胞としては、活性化
Ｔ細胞が挙げられる。「ＴＮＦ−ファミリーリガンドに対する細胞応答」は、Ｔ
ＮＦファミリーリガンドによって誘導される、細胞、細胞株、組織、組織培養、
または患者の、任意の遺伝子型の変化、表現形の変化、および／または形態的な
変化を意図する。示されるように、このような細胞応答としては、ＴＮＦファミ
リーリガンドに対する正常な生理学的応答だけではなく、増加した細胞増殖また
は増加した細胞増殖の阻害に関連する疾患（例えば、アポトーシスの阻害による
）もまた挙げられる。アポトーシスすなわち、プログラムされた細胞死は、免疫
系の末梢Ｔリンパ球の欠損に関与する生理学的機構であって、その調節不全は多
くの異なる病原性過程の原因となり得る。（Ａｍｅｉｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．，ＡＩＤ
Ｓ ８：１１９７−１２１３（１９９４）；Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｈ．ら，Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７９−２８９（１９９４））。

【０１４８】 異常な細胞の生存に関連する特定の疾患状態を有する哺乳動物中の特定の組織
は、対応する「標準的」哺乳動物（すなわち、疾患状態を有さない同種の哺乳動
物）と比較した場合、有意に変化したレベルのＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およ
びＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質、ならびにＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１
、およびＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質をコードするｍＲＮＡを発現す
ると考えられる。さらに、これらのタンパク質のいくつかの形態は分泌されるの
で、上昇したレベルのＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセ
プタータンパク質が、疾患状態を有さない同種の哺乳動物由来の血清と比較した
場合、疾患状態を有する哺乳動物由来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、
および髄液）において検出され得ると考えられる。従って、本発明は、疾患状態
の診断の間に有用な診断方法を提供する。これは、哺乳動物細胞または体液中の
ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質をコ
ードする遺伝子の発現レベルをアッセイする工程、および遺伝子発現レベルを標
準的なＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２のレセプター遺伝子発
現レベルと比較する工程を含み、この方法によって標準に対する遺伝子発現レベ
ルにおける増大または減少が異常な細胞の生存に関連する特定の疾患状態の指標
である。

【０１４９】 本発明のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプターが関
与する疾患状態の診断が、従来方法に従って既に作製されているので、本発明は
予後指標として有用である。予後において、有意に異常であるＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプター遺伝子発現を示す患者は、より低
いレベルで遺伝子を発現する患者と比較してより悪い臨床結果を経験する。

【０１５０】 「ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質
をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイすること」により、最初の生物学的
サンプルにおけるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタ
ータンパク質のレベル、またはＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ
２のレセプタータンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを、直接的（例えば、絶
対的タンパク質レベルまたは絶対的ｍＲＮＡレベルを測定また推定することによ
り）または相対的（例えば、第二の生物学的サンプルにおけるＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質レベルまたはｍＲＮＡ
レベルと比較することにより）のいずれかで、定性的または定量的に測定および
推定することが意図される。

【０１５１】 好ましくは、第一の生物学的試料におけるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または
ＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質レベル、またはｍＲＮＡレベルは、標準
のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質レ
ベル、またはｍＲＮＡレベルと比較して測定または推定される。その標準は、疾
患状態を有さない個体から得られた第二の生物学的サンプルから採取される。当
該分野において理解されるように、一旦、標準のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、ま
たはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質レベル、またはｍＲＮＡレベルが既
知となると、それは比較のための標準として繰り返し使用され得る。

【０１５２】 「生物学的サンプル」により、個体、細胞株、組織培養物、あるいはＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質またはｍＲＮ
Ａを含む他の供給源から得られる任意の生物学的サンプルが意図される。生物学
的サンプルとしては、分泌された成熟ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１
１ＳＶ２のレセプタータンパク質を含む哺乳動物の体液（例えば、血清、血漿、
尿、滑液、および髄液）、ならびに胸腺、前立腺、心臓、胎盤、筋肉、肝臓、脾
臓、肺、腎臓、および他の組織が挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液
を得るための方法は当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む
場合、組織生検が好ましい供給源である。

【０１５３】 増殖した細胞の生存またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、ガン
（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異のガン、およびホルモン依存性腫瘍）；
自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎慢性
関節リウマチ、およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイ
ルス、およびアデノウイルス）、情報（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）対宿主性移植
片病、急性移植片拒絶反応、および慢性移植片拒絶が挙げられる。減少した細胞
の生存またはアポトーシスの増加に関連する疾患としては、ＡＩＤＳ；神経変性
疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜
色素変性症、小脳性変性）；脊髄形成異常性症候群（例えば、再生不良性貧血）
、虚血性損傷（例えば、心筋梗塞、発作、および再灌流障害により生じる）、毒
誘導肝臓疾患（例えば、アルコールによる）、敗血症性ショック、悪液質、およ
び食欲不振が挙げられる。

【０１５４】 可溶性レセプターのレベルを検出するために利用可能なアッセイは当業者に周
知である。例えば、放射免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット
分析、そして好ましくはＥＬＩＳＡアッセイが使用され得る。

【０１５５】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質に
特異的抗体は、インタクトなＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２
のレセプタータンパク質またはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対して惹
起され得る。これらタンパク質またはフラグメントは、アルブミンのようなキャ
リアタンパク質と共に、またはそれが充分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）
場合はキャリアを伴わずに、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提
示され得る。

【０１５６】 本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル
抗体」（ｍＡｂ）は、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセ
プタータンパク質に特異的に結合し得るインタクトな分子および抗体フラグメン
ト（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメント）を含むことを意味する。
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントはインタクトな抗体のＦｃフラグメント
を欠いており、循環によってより迅速に除去され、そしてインタクトな抗体より
少ない非特異的組織結合をほとんど有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅ
ｄ． ２４：３１６−３２５（１９８３））。従って、これらのフラグメントが 好ましい。

【０１５７】 本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、ＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質またはその抗
原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘
導するために動物に投与され得る。好ましい方法において、ＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質の調製物は、それが天然
の混入物を実質的に含まないように調製され、そして精製される。次いで、この
ような調製物は、より大きな特異的活性のポリクローナル抗血清を産生するため
に動物に導入される。

【０１５８】 最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（あるいはそ
のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質結
合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技
術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅ
ｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら
、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎ
ｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８１）５６３−６
８１頁）を用いて調製され得る。一般に、このような手順は、ＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質抗原、またはより好ま
しくはＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２レセプタータンパク質
発現細胞を用いて動物（好ましくは、マウス）を免疫する工程を包含する。適切
な細胞は、抗ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータ
ンパク質抗体に結合するそれらの能力によって認識され得る。このような細胞は
、任意の適切な組織培養培地中で培養され得る；しかし、１０％ウシ胎児血清（
約５６℃で非働化した）を補充し、約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，００
０Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補
充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地中で細胞を培養することが好ましい。このよ
うなマウスの脾細胞が抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意
の適切な骨髄腫細胞株が、本発明に従って使用され得る；しかし、アメリカンタ
イプカルチャーコレクション，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手
可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰＯ）を使用することが好ましい。融合後、得られた
ハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地中で選択的に維持され、次いでＷａｎｄｓら（
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１））に記
載されているような限界希釈によってクローニングされる。次いで、このような
選択によって得られたハイブリドーマ細胞は、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およ
びＴＲ１１ＳＶ２のレセプタータンパク質抗原に結合し得る抗体を分泌するクロ
ーンを同定するためにアッセイされる。

【０１５９】 （ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターの機能のア
ゴニストおよびアンタゴニスト） ひとつの局面において、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドによって誘導さ
れるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２の活性（例えば、細胞増
殖、造血性発生）を阻害する方法に関し、この方法は、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ
１、またはＴＲ１１ＳＶ２のポリペプチドを発現する細胞に、ＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプター媒介シグナル伝達を減少し得る有
効量のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプターリガンド
、アナログ、またはアゴニストを投与する工程を含む。好ましくは、ＴＲ１１、
ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプター媒介シグナル伝達を、増加
された細胞増殖を提示する疾患を処置するために増加させる。アンタゴニストは
、可溶性形態のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプター
、およびＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のポリペプチドを指
向する抗体を含み得、これは、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ
２のレセプター媒介シグナル伝達を阻害する。好ましくは、ＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプター媒介シグナル伝達を減少させて、疾
患を処置する。

【０１６０】 さらなる局面において、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドによって誘導さ
れる細胞増殖を増加するための方法に関し、この方法は、ＴＲ１１、ＴＲ１１Ｓ
Ｖ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のポリペプチドを発現する細胞に、ＴＲ１１、ＴＲ
１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプター媒介シグナル伝達を増加し得る
有効量のアゴニストを投与する工程を含む。好ましくは、ＴＲ１１、ＴＲ１１Ｓ
Ｖ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプター媒介シグナル伝達を、減少された細胞
増殖が提示される疾患を処置するために増加させる。本発明のアゴニストは、Ｔ
Ｒ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプター媒介シグナル伝達
を刺激し、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のポリペプチドを
指向するモノクローナル抗体を含む。好ましくは、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、
またはＴＲ１１ＳＶ２のレセプター媒介シグナル伝達を増加させて、疾患を処置
する。

【０１６１】 「アゴニスト」により、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２の
ポリペプチドによって媒介される細胞の増殖および分化を増強し得る、天然に存
在する化合物および合成化合物が意図される。このようなアゴニストは、ＴＲ１
１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２レセプターの発現を増加するか、ま
たは発現されたレセプターの感受性を増加する薬剤を含む。「アンタゴニスト」
によって、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２媒介細胞増殖およ
び分化を阻害し得る、天然に存在する化合物および合成化合物が意図される。こ
のようなアンタゴニストは、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２
のレセプターの発現を減少するか、または発現されたレセプターの感受性を減少
する薬剤を含む。本発明の任意の候補の「アゴニスト」または「アンタゴニスト
」が細胞の増殖および分化を増強または阻害し得るか否かは、当該分野で公知の
ＴＮＦファミリーリガンド／レセプター細胞応答アッセイ（以下でより詳細に記
載されるものを含む）を用いて決定され得る。

【０１６２】 １つのそのようなスクリーニング技術は、レセプターの活性化によって生じる
細胞外のｐＨ変化を測定する系において、レセプターを発現する細胞（例えば、
トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）の使用を含む（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４６：１８１−２９６（１９８９年１０月）において記載される）。例えば、
化合物が本発明のレセプターポリペプチドを発現している細胞と接触され得、第
２次メッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）を測定し、潜
在的化合物がレセプターを活性化または阻害するか否かを決定し得る。

【０１６３】 別のそのようなスクリーニング技術は、レセプターをコードするＲＮＡをＸｅ
ｎｏｐｕｓ卵母細胞に導入し、一過性にそのレセプターを発現させる工程を含む
。次いで、レセプターの活性化を阻害すると考えられる化合物をスクリーニング
する場合において、レセプターと卵母細胞をレセプターリガンドおよびスクリー
ニングされる化合物と接触し、次に、カルシウムシグナルの阻害または活性化を
検出し得る。

【０１６４】 他の方法は、本発明のアンタゴニストによるレセプターポリペプチドの活性化
を阻害する化合物を、細胞の表面上にレセプターを有する細胞への標識したリガ
ンドの結合の阻害を測定することによって、スクリーニングする工程を包含する
。そのような方法は、細胞がその表面上でレセプターを発現するように、真核生
物細胞を、レセプターをコードするＤＮＡでトランスフェクトする工程、および
標識形態の公知のリガンドの存在下で細胞を化合物と接触させる工程を含む。リ
ガンドは、例えば放射能によって標識され得る。レセプターに結合した標識リガ
ンドの量を、例えば、レセプターの放射活性を測定することによって測定する。
レセプターに結合する標識したリガンドの減少によって決定されるように化合物
がレセプターに結合する場合、標識したリガンドのレセプターへの結合は、阻害
される。

【０１６５】 本発明の可溶性形態のポリペプチドは、上記に記載されるリガンド結合アッセ
イにおいて利用され得る。これらの形態のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴ
Ｒ１１ＳＶ２のレセプターは、分泌された後、細胞外の培地においてリガンドと
接触する。次いで、分泌されたタンパク質がＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または
ＴＲ１１ＳＶ２のレセプターリガンドに結合するかどうかについて測定される。

【０１６６】 本発明のアゴニストおよびアンタゴニストについてのさらなるスクリーニング
アッセイは，Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．およびＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）にお
いて記載される。

【０１６７】 従って、さらなる局面において、候補アゴニストまたはアンタゴニストがＴＮ
Ｆファミリーリガンドに対する細胞応答を増強または阻害し得るか否かを決定す
るためのスクリーニング方法が提供される。本方法は、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ
１、またはＴＲ１１ＳＶ２のポリペプチドを発現する細胞を、候補化合物および
ＴＮＦファミリーリガンドと接触させる工程、細胞応答をアッセイする工程、な
らびに細胞応答を標準的な細胞応答（標準は、候補化合物の非存在下でリガンド
との接触がなされる場合にアッセイされる）と比較する工程を含み、それによっ
て標準を越えて増加した細胞応答は、候補化合物がリガンド／レセプターシグナ
ル伝達経路のアゴニストであることを示し、そして標準と比較して減少した細胞
応答は、候補化合物がリガンド／レセプターシグナル伝達経路のアンタゴニスト
であることを示す。「細胞応答をアッセイする工程」によって、候補化合物およ
び／またはＴＮＦファミリーリガンドに対する細胞応答を定性的または定量的に
測定すること（例えば、Ｔ細胞増殖における増加もしくは減少、またはトリチウ
ム化チミジン標識を測定あるいは推定すること）が意図される。本発明によって
、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドを発現する細
胞は、内在性に、または外来性に投与されたＴＮＦファミリーリガンドのいずれ
かと接触され得る。

【０１６８】 さらなる局面において、胸腺細胞増殖アッセイを、リガンドならびに可能性の
ある薬物の候補の両方を同定するために利用し得る。例えば、胸腺細胞を、組織
から分離し、そして培養培地において増殖させる。ＤＮＡ前駆体（例えば、［³ Ｈ］−チミジンまたは５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ））の取 り込みを、ＤＮＡ合成および細胞増殖についてのパラメーターとしてモニターす
る。ＤＮＡ中にＢｒｄＵを取り込んだ細胞を、ＢｒｄＵに対するモノクローナル
抗体を用いて検出し、そして酵素または蛍光色素結合二次抗体によって測定し得
る。反応を、蛍光比色法によってか、または分光光度法によって定量する。２つ
のコントロールウェルおよび実験ウェルを上記のようにセットする。ＴＮＦ−β
または同属のリガンドをすべてのウェルに添加し、一方で本発明の可溶性レセプ
ターポリペプチドを第２のコントロールウェルに個々に添加する。実験ウェルは
スクリーニングするべき化合物を含む。スクリーニングするべき化合物が上記の
相互作用を刺激または阻害する能力を定量し得る。

【０１６９】 本発明によるアゴニストは、例えばＴＮＦファミリーリガンドペプチドフラグ
メント、トランスフォーミング増殖因子、神経伝達物質（例えば、グルタミン酸
、ドーパミン、Ｎ−メチルーＤ−アスパラギン酸）のような化合物を含む。好ま
しいアゴニストとして、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のポ
リペプチドまたはそのフラグメントに対して惹起されるポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体を含む。ＴＮＦファミリーレセプターに対して惹起される
そのようなアゴニスト抗体は、Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９２９２−９２９６（１９９１）；
Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．およびＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）に開示される。Ｐ
ＣＴ出願ＷＯ ９４／０９１３７もまた参照のこと。さらに好ましいアゴニスト
は、例えばシスプラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノ
シド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキサート、およびビンクリスチンの
ような化学療法剤を含む。他のものは、エタノールおよびアミロイドペプチドを
含む（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４５７−１４５８（１９９５））。

【０１７０】 本発明によるアンタゴニストは、可溶形状のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およ
びＴＲ１１ＳＶ２レセプターを含む（例えば、それぞれ図１Ａおよび１Ｂ、２Ａ
および２Ｂ、ならびに３Ａおよび３Ｂに示され、全長レセプターの細胞外領域の
リガンド結合ドメインを含むＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２
レセプターのフラグメント）。レセプターのそのような可溶性形態は、天然に存
在するか、または合成であり得、ＴＮＦファミリーリガンドへの結合についてレ
セプターの細胞表面結合形態と競合することによって、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ
１、およびＴＲ１１ＳＶ２媒介シグナル伝達と拮抗する。本発明のアンタゴニス
トはまた、ＴＮＦファミリーリガンドおよびＴＲ１１−、ＴＲ１１ＳＶ１−、お
よびＴＲ１１ＳＶ２−Ｆｃ融合タンパク質に特異的な抗体を含む。

【０１７１】 「ＴＮＦファミリーリガンド」によって、ＴＮＦレセプターファミリーのメン
バーに結合し得、そしてリガンド／レセプターシグナル伝達経路を誘導し得る、
天然に存在するリガンド、組換えリガンド、および合成リガンドを意図する。Ｔ
ＮＦリガンドファミリーのメンバーは、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ
−α、ＴＮＦ−βとしても知られる）、ＬＴ−β（ＬＴ−α２−βヘテロ三量体
複合体で見出される）、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−
ｌＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、および神経成長因子（ＮＧＦ）を含むがこれらに限定さ
れない。

【０１７２】 ＴＮＦ−αは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）による感染からマウ
スを保護することが示されている。Ｒｏｓｓｏｌ−Ｖｏｔｈ，Ｒら、Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４３−１４７（１９９１）。ＴＮＦ−αの保護効果の機
構は、知られていないが、インターフェロンもＮＫ細胞殺傷もいずれも関与しな
いようである。ＴＮＦＲファミリーの１つのメンバーは、ＨＳＶ−１の細胞への
侵入を媒介することが知られている。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｒら、Ｅｕｒ．Ｃ
ｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｗｔ．７：１５９（１９９６）。さらに、このＴＮＦＲの
細胞外ドメインに特異的な抗体が、ＨＳＶ−１の細胞への侵入を阻止する。従っ
て、本発明のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２アンタゴニスト
は、ＴＮＦＲが媒介するウイルスの細胞への侵入を妨げる能力がある、ＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２のアミノ酸配列および抗体を含む。こ
のような配列および抗体は、ウイルスとの結合に関する、細胞表面に局在化する
ＴＮＦＲとの競合、あるいは細胞表面レセプターとのウイルスの結合の直接的阻
止のいずれかによって、機能し得る。

【０１７３】 本発明による抗体は、本発明のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１Ｓ
Ｖ２レセプター免疫原を使用する任意の種々の方法によって、調製され得る。こ
のようなＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプター免疫原は
、以下が挙げられる。図１Ａおよび１Ｂ、２Ａおよび２Ｂ、および３Ａおよび３
Ｂに示されるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプタータン
パク質（それぞれ、配列番号２、配列番号４、および配列番号６であり、これら
はリーダー配列を含み得るか、あるいは含み得ない）、およびレセプター（ＴＲ
１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターのリガンド結合ドメイ
ン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを含む）のポリペプチド
フラグメント、あるいはその任意の組合せ。

【０１７４】 本発明によるポリクローナルおよびモノクローナル抗体のアゴニストまたはア
ンタゴニストは、ＴａｒｔａｇｌｉａおよびＧｏｅｄｄｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６７（７）：４３４０〜４３０７（１９９２）；Ｔａｒｔａｇｌｉａ
ら、Ｃｅｌｌ、７３：２１３〜２１６（１９９３）、およびＰＣＴ出願ＷＯ９４
／０９１３７において開示される方法に従って惹起され得る。本明細書中で使用
されるように用語「抗体」(Ａｂ)または「モノクローナル抗体」(ｍＡｂ)は、抗
原に結合し得るインタクトな分子ならびにそのフラグメント（例えば、Ｆａｂお
よびＦ（ａｂ’）フラグメント）を含むことが意味される。ＦａｂおよびＦ（ａ
ｂ’）フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環から
より迅速にクリアランスされ、そしてインタクトな抗体のより少ない非特異的組
織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６〜３２５
（１９８３））。

【０１７５】 好ましい方法において、本発明による抗体はｍＡｂである。そのようなｍＡｂ
は、ハイブリドーマ技術を用いて調製され得る（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｌｓ
ｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）および米国特許
第４，３７６，１１０号；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１
９８０；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１
３巻（Ｂｕｒｄｏｎら編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４
））。

【０１７６】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプタードメインを結合
するタンパク質および他の化合物もまた、本発明による候補アゴニストおよびア
ンタゴニストである。そのような結合化合物を、酵母ツーハイブリッドシステム
を用いて「捕獲」し得る（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３４０
：２４５−２４６（１９８９））。改変型の酵母ツーハイブリッドシステムは、
Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔおよび共同研究者によって記載されている（Ｇｙｕｒｉ
ｓら、Ｃｅｌｌ ７５：７９１−８０３（１９９３）；Ｚｅｒｖｏｓ Ａ．Ｓ．
ら、Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２（１９９３））。好ましくは、本発明に従
って、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、お
よびＴＲ１１ＳＶ２レセプターのリガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、細胞
内ドメイン、および膜貫通ドメインのいずれかに結合する化合物を捕獲する。そ
のような化合物は、本発明の良好な候補アゴニストおよびアンタゴニストである
。

【０１７７】 上記のツーハイブリッドアッセイを使用して、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、お
よびＴＲ１１ＳＶ２レセプターの細胞内ドメイン、またはその部分は、インビボ
でレセプターと相互作用する細胞タンパク質を同定するために使用され得る。こ
のようなアッセイはまた、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レ
セプター機能の潜在的アゴニスト活性または潜在的アンタゴニスト活性を有する
リガンドを同定するために使用され得る。このスクリーニングアッセイは、以前
に、ネズミのＴＮＦ−ＲＩＩの細胞質ドメインと相互作用するタンパク質を同定
するために使用され、そして関連タンパク質２つの関連タンパク質レセプターの
同定を導いてきた（Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ７８：６８１（１９９４）
。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターの細胞質ドメイ
ンと結合する、このようなタンパク質およびアミノ酸配列は、本発明の良い候補
アゴニストおよび候補アンタゴニストである。

【０１７８】 他のスクリーニング技術は、本発明のポリペプチドを発現する細胞（例えば、
トランスフェクトしたＣＨＯ細胞）の、レセプター活性化によって引き起こされ
る細胞外ｐＨ変化を測定するシステム（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１８
１−２９６（１９８９）に記載されるような）における使用を含む。別の例にお
いて、可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストを、本発明のポリペプチド
を発現する細胞と接触させ得、そして第２メッセンジャー応答（例えば、シグナ
ル伝達）を測定して、可能性のあるアンタゴニストまたはアゴニストが有効であ
るか否かを決定し得る。

【０１７９】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターアゴニストを用
いて、リガンド活性（例えば、腫瘍増殖の阻害、および特定の移植可能な腫瘍の
壊死）を刺激し得る。また、アゴニストを用いて、細胞分化（例えば、Ｔ細胞、
線維芽細胞、および造血細胞の分化）を刺激し得る。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１
、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターに対するアゴニストはまた、微生物に対する
宿主の防禦におけるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２の役割を
増大し得、そして関連する疾患（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ
ｓからの感染のような感染）およびＣｈｌａｍｉｄｉａｅを予防し得る。また、
アゴニストを用いて、放射線治療の過程で生成される電離放射線の有害な効果（
例えば、酵素の変性、脂質の過酸化、およびＤＮＡ損傷）に対して保護し得る。

【０１８０】 本発明のレセプターポリペプチドに対するアゴニストを用いて、微生物に対す
る宿主の防禦におけるＴＮＦの役割を増大し得、そして関連する疾患を予防し得
る。また、アゴニストを用いて、放射線治療の過程で生成される電離放射線の有
害な効果（例えば、酵素の変性、脂質の過酸化、およびＤＮＡ損傷）に対して保
護し得る。

【０１８１】 また、アゴニストを用いて、抗ウイルス応答を媒介し、増殖を調節し、免疫応
答を媒介し、そしてリンパ球の増殖および分化の速度を増大させることによって
、ＨＩＶのような疾患に関連する免疫不全症を処置し得る。

【０１８２】 本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストを用いて、リガンド活性（例え
ば、腫瘍増殖の刺激、および特定の移植可能な腫瘍の壊死）を阻害し得る。また
、アンタゴニストを用いて、細胞分化（例えば、Ｔ細胞、線維芽細胞、および造
血細胞の分化）を阻害し得る。アンタゴニストを用いて、ＡＩＤＳのような自己
免疫疾患（例えば、対宿主性移植片拒絶、および同種異系移植拒絶、およびＴ細
胞媒介自己免疫疾患）を処置し得る。Ｔ細胞増殖は２型ＴＮＦレセプターを介し
て刺激されることが示されている。従って、レセプターを拮抗することは、Ｔ細
胞の増殖を妨げ、そしてＴ細胞媒介自己免疫疾患を処置し得る。

【０１８３】 ＡＩＤＳを定義する免疫不全の状態は、ＣＤ４⁺Ｔリンパ球の数および機能に おける減少の対して２次的である。最近の報告は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の日々の損失 を、３．５×１０⁷細胞と２×１０⁹細胞の間である（Ｗｅｉ Ｘ．ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ３７３：１１７〜１２２（１９９５））と評価している。ＨＩＶ感染の環境
におけるＣＤ４⁺Ｔ細胞の消耗の１つの原因は、ＨＩＶ誘導アポトーシスである と考えられる。実際、ＨＩＶ誘導アポトーシス細胞死は、インビトロだけではな
く、より重要なことに、感染した個体においても（Ａｍｅｉｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．、
ＡＩＤＳ ８：１１９７〜１２１３（１９９４）；Ｆｉｎｋｅｌ，Ｔ．Ｈ．、お
よびＢａｎｄａ，Ｎ．Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６０５
〜６１５（１９９５）；Ｍｕｒｏ−Ｃａｃｈｏ，Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５４：５５５５〜５５６６（１９９５））証明されている。さらに、アポ
トーシスおよびＣＤ４⁺Ｔリンパ球枯渇は、ＡＩＤＳの異なる動物モデル（Ｂｒ ｕｎｎｅｒ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４１〜４４４（１９９５）；Ｇ
ｏｕｇｅｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ ９：５５３〜５６３（１９９３））において、密接な相互関係があり、そ
して、アポトーシスは、ウイルス複製がＡＩＤＳを生じないこれらの動物モデル
中で観察されない（Ｇｏｕｇｅｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ９：５５３〜５６３（１９９３））。さらなるデー
タは、ＨＩＶに感染した個体からの、感染していないが、プライムされた、ある
いは活性化されたＴリンパ球が、ＴＮＦファミリーリガンドＦａｓＬと遭遇した
後、アポトーシスを経験することを示す。ＨＩＶ感染後に死を生じる単核細胞株
を使用して、Ｕ９３７細胞のＨＩＶとの感染が、ＦａｓＬのデノボ発現を生じる
こと、およびＦａｓＬが、ＨＩＶ誘導アポトーシスを媒介する（Ｂａｄｌｅｙ，
Ａ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１９９〜２０６（１９９６））ことが例証
されている。さらに、ＴＮＦファミリーリガンドは、感染していないマクロファ
ージにおいて検出され、そしてその発現は、ＨＩＶ感染後に調節されておらず、
感染していないＣＤ４⁺Ｔリンパ球の選択的殺傷を生じる（Ｂａｄｌｅｙ，Ａ． Ｄ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１９９〜２０６（１９９６））。

【０１８４】 同種異系移植拒絶において、レシピエント動物の免疫系は、あらかじめ応答す
るようにプライムされていない。なぜなら、ほとんどの部分に対する免疫系は、
環境抗原によってのみプライムされるからである。同一種の他のメンバーからの
組織は、例えば、ウイルスおよび細菌が提示されているのと同じ様式では、提示
されない。同種異系移植片拒絶の場合、免疫抑制的なレジメンが設計されて、免
疫系がエフェクター段階に到達するのを防ぐ。しかし、異種移植片拒絶の免疫プ
ロフィールは、同種異系移植片拒絶よりも疾患反復に類似し得る。疾患反復の場
合、天然の島細胞の破壊によって証明されるように、その免疫系はすでに活性化
されている。従って、疾患反復において免疫系は、すでにエフェクター段階にあ
る。本発明のアンタゴニストは、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１Ｓ
Ｖ２が媒介するリンパ球増殖および分化の速度を減少させることによって、同種
異系移植片および異種移植片の両方に対する免疫応答を抑制し得る。このような
アンタゴニストは、実施態様５に記載されるＴＲ１１−Ｆｃ、ＴＲ１１ＳＶ１−
Ｆｃ、およびＴＲ１１ＳＶ２−Ｆｃ融合タンパク質を含む。従って、本発明はさ
らに、免疫応答の抑制の方法を提供する。

【０１８５】 さらに、ＴＮＦ−αは、自己免疫から生じる糖尿病になる傾向がある動物系に
おいて、糖尿病を予防することが示されている。Ｐｏｒｔｅｒ，Ａ．、Ｔｉｂｔ
ｅｃｈ ９：１５８〜１６２（１９９１）を参照のこと。従って、本発明のアゴ
ニストおよびアンタゴニストは、１型糖尿病のような自己免疫疾患の処置におい
て有用であり得る。

【０１８６】 さらに、細胞増殖および細胞分化において、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およ
びＴＲ１１ＳＶ２レセプターによって果たされる役割は、本発明のアゴニストお
よびアンタゴニストが、これらのレセプターの異常型細胞発現に関する疾患状態
の処置のために有用であり得ることを示す。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、および
ＴＲ１１ＳＶ２レセプターは、ある環境において炎症応答を誘導し得、そしてア
ンタゴニストは、この応答を阻止するための有用な試薬であり得る。従って、Ｔ
Ｒ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターアンタゴニスト（例
えば、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターの可溶形態
；中和抗体）は、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、敗血症、および炎症
性腸疾患のような、炎症性疾患の処置にとって有用であり得る。

【０１８７】 また、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターに対する
アンタゴニストを使用して、深刻な臨床状態のままである敗血症性ショックを処
置および／または予防し得る。敗血症性ショックは、病原体から直接生じるより
も、ＴＮＦおよびＩＬ−１のようなタンパク質因子によって媒介される過度の宿
主応答から生じる。例えば、リポ多糖類は、その血清濃度の強力かつ一過性の増
大を導くＴＮＦの放出を引き出すことが示されている。ＴＮＦは、過剰量に投与
されると、ショックおよび組織損傷を引き起こす。従って、ＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターのアンタゴニストは、ＴＮＦの作用を
阻止し、そして敗血症ショックを処置／予防すると考えられている。これらのア
ンタゴニストはまた、ＴＮＦの高い血清レベルと相互関係がある子供の髄膜炎菌
血症を処置するために使用され得る。

【０１８８】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターに対するアンタ
ゴニストによって処置され得る他の障害には、ＴＮＦレセプターリガンドによっ
て媒介される炎症、および細菌感染悪液質および大脳マラリアが含まれる。ＴＲ
１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターアンタゴニストはまた
、ＴＮＦのようなレセプターに対するリガンドによって媒介される炎症を処置す
るために使用され得る。

【０１８９】 （ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２の生物学的活性） ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドをアッセイに用いて、１つ以上の生物学的活性について試験し得る。
ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドが、特定のアッセイにおいて活性を示すならば、ＴＲ１１、ＴＲ１１Ｓ
Ｖ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２は、生物学的活性に関連した疾患に関与し得る可
能性が高い。従って、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２を用い
て、関連する疾患を処置し得る。

【０１９０】 （免疫活性） ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドは、免疫細胞の増殖、分化、または移動（走化性）の活性化もしく
は阻害によって、免疫系の不全または障害を処置するのに有用であり得る。免疫
細胞は、造血と称されるプロセスを介して発生し、多能性幹細胞から骨髄性細胞
（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）およびリンパ系（Ｂおよび
Ｔリンパ球）細胞を産生する。これらの免疫不全または障害の病因は、遺伝性、
体細胞性（例えば、ガンまたはいくつかの自己免疫障害）、後天性（例えば、化
学治療または毒素による）、または感染性であり得る。さらに、ＴＲ１１、ＴＲ
１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、
特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたは検出因子として使用され得る。

【０１９１】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドは、造血細胞の不全または障害を処置または検出するに有用であり
得る。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドを使用して、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関
連する障害を処置するための取り組みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の
分化および増殖を増加させ得る。免疫学的な不全症候群の例には、以下が挙げら
れるがそれらに限定されない：血液タンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリ
ン血症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫
不全、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着
不全症候群、リンパ球減少、食細胞殺菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩ
Ｄ）、ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少症、または血色素
尿。

【０１９２】 さらに、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドま
たはポリヌクレオチドはまた、止血活性（出血を停止する）または血栓崩壊活性
（血餅の形成）を調節するために使用され得る。例えば、止血または血栓崩壊活
性を増加させることによって、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１Ｓ
Ｖ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、血液凝固障害（例えば、無フィブ
リノーゲン血症、因子欠乏）、血液血小板障害（例えば、血小板減少症）、また
は外傷、手術もしくは他の原因から生じる創傷を処置するために使用され得る。
あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る、ＴＲ１１、ＴＲ１１Ｓ
Ｖ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて、
凝固を阻害または溶解し得、これは、心臓発作（梗塞）、発作、または瘢痕の処
置に重要であり得る。

【０１９３】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドはまた、自己免疫障害を処置または検出するのに有用であり得る。
多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって、自己を外来物質として不適切に認識
することからもたらされる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊を導く免疫応
答を生じる。それゆえ、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻
害し得るＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまた
はポリヌクレオチドの投与は、自己免疫障害を予防するのに有効な治療であり得
る。

【０１９４】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２によって処置または検出
され得る自己免疫障害の例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されな
い：アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎
、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病
、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、結膜炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多
発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺
炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギヤンバレー症候群、インス
リン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼病。

【０１９５】 同様に、例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸問題のような
アレルギー性反応および状態はまた、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ
１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドにより処置され得る。さらに、
ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２を用いてアナフィラキシー
、抗原性分子に対する過敏症、または血液型不適合性を処置し得る。

【０１９６】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドはまた、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置およ
び／または予防するために用いられ得る。器官拒絶は、宿主免疫細胞が免疫応答
を介して移植された組織を破壊することにより生じる。同様に、免疫応答はまた
、ＧＶＨＤに関与しているが、この場合、外来の移植された免疫細胞は宿主組織
を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害するＴＲ
１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤを予防するのに有効な治療であり得る
。

【０１９７】 同様に、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドま
たはポリヌクレオチドはまた、炎症を調節するために用いられ得る。例えば、Ｔ
Ｒ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、または、ＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリヌク
レオチドは、炎症性応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これら
の分子は、以下を含む炎症状態（慢性および急性の両方の状態）を処置するため
に使用され得る：感染に関連した炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、ま
たは全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再灌流傷害、内毒素死亡、関
節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺傷
害、炎症性腸疾患、クローン病、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩ
Ｌ−１）の過剰産生からもたらされる状態。

【０１９８】 （過剰増殖障害） ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリヌク
レオチドは、新生物を含む過剰増殖障害を処置または検出するのに使用され得る
。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリヌク
レオチドは直接的または間接的相互作用を通じて障害の増殖を阻害し得る。ある
いは、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドは過剰増殖障害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。

【０１９９】 例えば、免疫応答の増加、特に過剰障害の抗原性性質を増加させることにより
、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することにより、過剰増殖障害は処
置され得る。この免疫応答は既存の免疫応答の増強または新しい免疫応答の開始
のいずれかにより、増加し得る。あるいは、免疫応答の減少はまた、化学療法剤
のような、過剰増殖障害を処置する方法であり得る。

【０２００】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドによって処置または検出され得る過剰増殖障害の例は、以下に位置する
新生物を含むが、これらに限定されない：腹部、骨、胸部、消化系、肝臓、膵臓
、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼
、頭および首、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓
、胸郭および尿生殖器。

【０２０１】 同様に、他の過剰増殖障害はまた、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１
ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドによって処置または検出され得る。
このような過剰増殖障害の例は、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖障害、パ
ラプロテイン血症、紫斑、サルコードシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレ
ームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症および上記に列挙される
器官系に位置する新生物以外の他の任意の過剰増殖疾患を含むが、これらに限定
されない。

【０２０２】 （感染疾患） ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリヌク
レオチドは感染性因子の処置または検出に使用され得る。例えば、免疫応答の増
加により、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化の増加により、感
染性疾患は処置され得る。この免疫応答は既存の免疫応答の増強または新しい免
疫応答の開始のいずれかによって、増加し得る。あるいは、ＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、免疫
応答を必ずしも惹起せずに、感染性因子を直接阻害し得る。

【０２０３】 ウイルスは、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドにより処置または検出され得る疾患または症状を生じ得る
感染性因子の１例である。ウイルスの例は以下のＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウ
イルスの科を含むが、これらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス
科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス
科、カリチウイルス科、シルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロ
ナウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎ウイルス）、ヘル
ペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純疱疹ウイルス、帯状疱疹
ウイルス）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラ
ミクソウイルス科、麻疹ウイルス属、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイル
ス科（例えば、インフルエンザウイルス）、パポバウイルス科、パルボウイルス
科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡ウイルスまたはワ
クシニアウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイル
ス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス
科（例えば、ルビウイルス）。これらの科の範囲内にあるウイルスは、以下を含
むが、これらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、
細気管支炎、脳炎、眼の感染（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝
炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性、急性、デルタ型）、髄膜炎、日和見感染（
例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、おたふ
く風邪、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症
、皮膚病（例えば、カポージ、疣）、およびウイルス血症。ＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは任意のこれ
らの症状または疾患の処置または検出に使用され得る。

【０２０４】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、そしてＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１ま
たはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置または検出
され得る、細菌性または真菌性の因子は、以下のグラム陰性およびグラム陽性の
細菌の科および真菌を含むが、これらに限定されない：放線菌目（例えば、コリ
ネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ノルカジア属（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ
））、アスペルギルス症、バチルス科（例えば、炭疽、クロストリジウム属）、
バクテロイデス科、ブラストミセス症、ボルデテラ症、ボレリア症、ブルセラ症
、カンジダ症、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、コクジジオ
イデス真菌症、クリプトコックス症、皮膚真菌症（Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅ
ｓ）、腸内細菌科（クレブシエラ属、サルモネラ属、セラチア属、エルジニア属
）、エルジペロスリックス属、ヘリコバクター属、レジオネラ症（Ｌｅｇｉｏｎ
ｅｌｌｏｓｉｓ）、レプトスピラ症、リステリア属、マイコプラスマ目、ナイセ
リア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）（例えば、アシネトバクター属、淋病、
髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ））、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌ
ｌａｃｅａ）感染（例えば、アクチノバチルス属、ヘモフィルス属、パスツレラ
属）、シュードモナス属、リケッリア科（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）、ク
ラミジア科、梅毒（Ｓｙｐｈｉｌｉｓ）、ブドウ球菌。これらの細菌または真菌
の科は以下を含むが、これらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：
菌血症、心内膜炎、眼の感染（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感
染（例えば、ＡＩＤＳに関係した感染）、爪郭炎、プロテーゼ関連感染、ライタ
ー病、気道感染（例えば、百日咳または蓄膿症、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻
き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジ
ア、梅毒、ジフテリア、らい病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽
、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染症、皮膚の疾患（例えば、小胞
炎、皮膚真菌性（Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ）、毒血症、尿路感染症、創傷
感染。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドは任意のこれらの症状または疾患の処置または検出に使用され得る
。

【０２０５】 さらに、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドま
たはポリペプチドにより処置または検出され得る疾患または症状を生じる寄生因
子は以下の科を含むが、これらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コク
シジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、交疫、外部寄生（Ｅｃ
ｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ）、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫病、リーシュマニア症、
タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス症。
これらの寄生生物は種々の疾患または症状を引き起こし得る。このような疾患ま
たは症状には、疥癬、ツツガムシ病、眼感染、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジ
ア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラ
リア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症が含まれるが、これらに限定されな
い。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドは任意のこれらの症状または疾患の処置または検出に使用され得る。

【０２０６】 好ましくは、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドま
たはポリヌクレオチドを使用した処置は、有効量のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１ま
たはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドを患者に投与すること、または患者から細胞を
取り出し、その細胞に、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌ
クレオチドを供給し、そして操作した細胞を患者へ戻すこと（エキソビボ治療）
のいずれかによって可能である。さらに、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ
１１ＳＶ２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染性疾患に対する免疫応
答を誘発するワクチンにおける抗原として使用され得る。

【０２０７】 （再生） ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは組織の再生へと導く細胞の分化、増殖、および誘引に使用され得る（
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生 は、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば
、骨粗鬆症、変形性関節症（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周疾患、肝
不全）、美容形成外科手術を含む手術、線維症、再灌流障害、または全身性サイ
トカイン損傷により損傷した組織の修復、置換または保護に使用され得る。

【０２０８】 本発明を使用して再生され得る組織は、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓
、皮膚、内皮）、筋肉組織（平滑筋、骨格筋、または心筋）、血管組織（血管内
皮を含む）、神経組織、造血組織および骨格組織（骨、軟骨、腱、および靭帯）
を含む。好ましくは、再生は、瘢痕なしで、または瘢痕が減少して起こる。再生
はまた新脈管形成を含み得る。

【０２０９】 さらに、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは、治癒が困難な組織の再生を増加させ得る。例えば、増加し
た腱／靭帯の再生は、損傷後の回復時間を速める。本発明のＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、損傷
を避ける試みにおいて予防的に使用され得る。処置され得る特異的疾患は、腱炎
、 手根管症候群、および他の腱または靭帯の欠損を含む。非治癒性創傷の組織の再
生のさらなる例は、褥瘡性潰瘍、血管不全に伴う潰瘍、手術創傷および外傷損傷
を含む。

【０２１０】 同様に、神経組織および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるため
に、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドを使用して再生され得る。この方法を使用して処置し得る疾患は、中
枢および末梢神経系の疾患、神経障害、または機械的および外傷性障害（例えば
、脊髄障害、頭部外傷、脳血管性疾患および発作）を含む。詳細には、末梢神経
の損傷に関係する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学療法か
ら生ずる）、局在的神経障害、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー
病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ド
レーガー症候群）は全て、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを使用して処置され得る。

【０２１１】 （走化性） ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単球、線維
芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞
）を炎症、感染、または過剰増殖部位のような体内の特定部位へ誘引または動員
する。次いで、動員される細胞は特定の外傷または異常を退治および／または治
癒し得る。

【０２１２】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは、特定の細胞の走化性活性を増強し得る。次いで、これらの走化性分
子は、体内の特定の位置へと標的化される細胞の数を増加させることによって、
炎症、感染、過剰増殖障害、または任意の免疫系障害を処置するために使用され
得る。例えば、走化性分子は、免疫細胞を損傷した位置へと誘引することによっ
て、創傷および組織の他の外傷処置に使用され得る。走化性分子として、ＴＲ１
１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２はまた、線維芽細胞を誘引し得た。こ
のことは、創傷の処置に使用され得る。

【０２１３】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドが走化性活性を阻害し得ることがまた、意図される。これらの分子はま
た、障害の処置に使用され得る。従って、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ
１１ＳＶ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは走化性のインヒビターとして
使用され得る。

【０２１４】 （投与の態様） 本明細書中で記載されたアゴニストまたはアンタゴニストは、インビトロ、エ
キソビボ、またはインビボで、本発明のレセプターを発現する細胞へ投与され得
る。「有効量」のアゴニストまたはアンタゴニストの投与によって、ＴＮＦファ
ミリーのリガンドに対する細胞の応答を増強または阻害するのに十分な量である
化合物の量が意図され、そしてポリペプチドを含む。特に、「有効量」のアゴニ
ストまたはアンタゴニストの投与によって、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴ
Ｒ１１ＳＶ２レセプター媒介活性を増強または阻害するために有効な量が、意図
される。もちろん、細胞の増殖および／または分化が増強される場合、本発明に
よる、アゴニストは、ＴＮＦファミリーリガンドと共に同時投与され得る。当業
者は、アゴニストまたはアンタゴニストの有効量は、経験的に決定され得、そし
て純粋な形態または薬学的に受容可能な塩、エステルまたはプロドラッグの形態
で使用され得ることを認識する。アゴニストまたはアンタゴニストは、１つ以上
の薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて組成物中で投与され得る。

【０２１５】 ヒトの患者に投与した場合、本発明の化合物および組成物の１日の全使用量は
堅実な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることは、理解される。任意
の特定の患者に対する特異的な治療有効用量のレベルは、医療分野における周知
の要因に依存する。

【０２１６】 一般的提案として、一用量あたりの経口的に投与されるＴＲ１１、ＴＲ１１Ｓ
Ｖ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドの全薬学的有効量は、上記に記したよう
に、これは治療的裁量がなされるが、患者の体重の約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍ
ｇ／ｋｇ／日の範囲である。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１
ｍｇ／ｋｇ／日、およびヒトに対して最も好ましくは、ホルモンについて約０．
０１ｍｇ／ｋｇ／日と１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。続けて与える場合、代表
的には、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドは約１μ
ｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１から４回
の注入または継続的皮下注入（例えばミニポンプを用いる）により、投与される
。 静脈内用バッグ溶液もまた、使用され得る。

【０２１７】 本発明のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２レセプターポリペプ
チドを含む薬学的組成物は、経口的、直腸的、非経口的、槽内に（ｉｎｔｒａｃ
ｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内に、腹腔内に、局所的（散剤、軟膏、点滴剤、また
は経皮パッチによるような）、口腔または経口または鼻内スプレーとして、投与
され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」により、任意の型の非毒性の固体、
半固体、または液体の充填剤、希釈剤、被包物質または処方補助剤が意味される
。本明細書で使用した用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、槽内（ｉｎ
ｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、皮下および関節内注射および注入を含む投与態様をい
う。

【０２１８】 本発明を一般に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照すればより容
易に理解される。実施例は、例示として提供され、そして限定することは意図さ
れない。

【０２１９】 （実施例） （実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴＲ８の発現および精製） 細菌性発現ベクターｐＱＥ６０は、この実施例において、細菌性発現のために
使用される（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃ
ｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０はアンピシリン抗生物質
耐性（「Ａｍｐ^r」）をコードし、そして細菌性複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰ ＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、ニッケル−ニトリロ
−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）親和性樹脂固体（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出
による）を使用する親和性精製を可能にするヒスチジン残基をコードする６コド
ン、および適切な単一制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、ポリペ
プチドをコードするＤＮＡフラグメントが、ポリペプチドのカルボキシル基末端
に共有結合した６Ｈｉｓ残基（すなわち、「６× Ｈｉｓ タグ」）を有するポ
リペプチドを生成するといった方法で挿入され得るように、配置される。しかし
、この実施例において、ポリペプチドコード配列は６Ｈｉｓコドンの翻訳が妨げ
られて、それ故、このポリペプチドが６× Ｈｉｓ タグなしで生産されるよう
に挿入される。

【０２２０】 あるいは、新しいｐＨＥ４シリーズの細菌性発現ベクター、特に、ｐＨＥ４−
５ベクターはこの実施例において細菌性発現に対して使用され得る。別のＯＲＦ
をコードする挿入物を含むｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３ベクタープラスミドＤ
ＮＡ（ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８隣接制限部位を用いて、当業者は、ｐＨＥ４
−５ベクター内の無関係なＯＲＦを本発明のＯＲＦと置換するための現在の分子
生物技術を容易に使用できた）を１９９７年９月３０日にアメリカンタイプカル
チャーコレクション，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ
，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に寄託し、そし
て、ＡＴＣＣ受託番号２０９３１１が与えられた。この細菌性発現ベクターｐＨ
Ｅ４−５は、選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、Ｅ．
ｃｏｌｉの複製起点、Ｔ５ファージプロモーター配列、２つのｌａｃオペレータ
ー配列、シャイン−ダルガーノ配列、およびラクトンオペロンリプレッサー遺伝
子（ｌａｃＩｑ）を含む。ｐＨＥ４−５ベクターのプロモーター配列およびオペ
レーター配列は合成によって作製した。核酸配列の合成生産は当該分野において
周知である（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ ９５／９６ Ｃａｔａｌｏｇ，２１５−２１
６頁、ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ，１０２０ Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ
，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ ９４３０３） 疎水性リーダー配列を欠損しているＴＲ１１タンパク質の所望される部分をコ
ードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して寄託し
たｃＤＮＡクローンから増幅する。このＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは
、ＴＲ１１タンパク質の所望される部分のアミノ末端配列、およびｃＤＮＡをコ
ードする配列の３’側の寄託した構築物３’における配列にアニールする。ｐＱ
Ｅ６０ベクターにおけるクローニングを容易にするための制限部位を含むさらな
るヌクレオチドを、それぞれ５’配列および３’配列に付加する。

【０２２１】 ＴＲ１タンパク質の可溶性細胞外ドメインのクローニングにおいて、５’プラ
イマーは配列：５’−ＣＧＣ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＣ
Ｃ Ｇ−３’（配列番号１０）を有する（下線部のＮｃｏ Ｉ制限部位に続いて
図１Ａおよび１Ｂ中のＴＲ１１配列の細胞外ドメインのアミノ末端コード配列と
相補的な１３ヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド１８４〜１９５）を含む
）。当業者は、もちろん、タンパク質コード配列における５’プライマーが始ま
る点は、成熟型より短いかまたは長い完全なタンパク質の所望される部分を増幅
するために変更され得ることを認識する。可溶性細胞外ドメインに対する３’プ
ライマーは配列：５’ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＧＧ
Ｃ Ｇ３’（配列番号１１）を有する（下線部のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位に続
いて、ＴＲ１１レセプターの細胞外ドメインをコードする図１Ａおよび１Ｂに示
されるヌクレオチド配列の細胞外ドメイン部分の３’末端と相補的な１３ヌクレ
オチド（配列番号１におけるヌクレオチド５９０−６０２）を含む）。

【０２２２】 増幅されたＴＲ１１ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を、Ｎｃ
ｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、次いで、消化されたＤＮＡを共に連
結する。制限処理されたｐＱＥ６０ベクター内へのＴＲ１１ ＤＮＡの挿入は、
ＴＲ１１タンパク質コード領域を、ＩＰＴＧ誘導可能なプロモーターより下流に
、そして開始ＡＵＧを有するインフレームで配置する。

【０２２３】 連結混合液を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）に記載されているような標準的な方法を用いコ
ンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。ｌａｃリプレッサーを発現し、
そしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎ^r」）を与えるプラスミドｐＲＥＰ４の多コ ピーを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５／ｒｅｐ４株を、本明細書に記載した例示的な
実施例を実行するために用いる。ＴＲ１１タンパク質を発現するために適切であ
る多くの株のうちの１つであるこの株は、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、前出から市
販されている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下で、Ｌ
Ｂプレート上で増殖する能力により同定する。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニ
ーから単離し、そしてクローニングされたＤＮＡの同一性を、制限分析、ＰＣＲ
およびＤＮＡ配列決定により確認した。

【０２２４】 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカ
ナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中で、液体培養で１晩
（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、約１：２５〜１：２５０の希釈で
、大規模培養に播種するために用いる。細胞を、光学濃度６００ｎｍ（「ＯＤ６
００」）で０．４と０．６との間まで増殖する。次いで、イソプロピル−ｂ−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、ｌａｃＩリプレッサーを不活性
化することにより、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターから転写を誘導する
ために、最終濃度１ｍＭに加える。引き続き細胞を、さらに３〜４時間インキュ
ベートする。次いで、細胞を、遠心分離により収集する。

【０２２５】 次に、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で、４℃で３〜４時間、細胞を攪
拌する。遠心分離により、細胞破片を除去し、そしてＴＲ１１細胞外ドメインポ
リペプチドを含む上清を２００ｍＭ ＮａＣｌを補充した５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６）に対して透析する。あるいは、プロテアーゼインヒビターを
含む５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）に対して透析することにより、タンパク質を首尾よく再び折り畳
み得る。再生後、イオン交換、疎水性相互作用およびサイズ排除クロマトグラフ
ィーにより、タンパク質を精製し得る。あるいは、純粋なＴＲ１１細胞外ドメイ
ンポリペプチドを得るために、抗体カラムのような親和性クロマトグラフィーの
工程を使用し得る。精製タンパク質を４℃で貯蔵するか、または−８０℃で冷凍
する。

【０２２６】 類似のアプローチが、Ｅ．ｃｏｌｉでＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２を
発現するためのｐＱＥ６０を基にした細菌発現構築物を産生するために容易に設
計され得、そして利用され得ることを、当業者は理解する。これは、ＴＲ１１Ｓ
Ｖ１およびＴＲ１１ＳＶ２に対する特異的遺伝子配列と組み合わせた類似の制限
エンドヌクレアーゼ認識配列を含むＰＣＲプライマーを設計すること、および上
記のように進行することにより行なわれる。

【０２２７】 （実施例２（ａ）：バキュロウイルス発現系におけるＴＲ１１タンパク質の可
溶性フラグメントのクローニングおよび発現） 本実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２ＧＰを用いて、天然に
結合した分泌シグナル（リーダー）配列を欠損している、図１Ａおよび１Ｂに示
したＴＲ１１レセプタータンパク質の成熟細胞外ドメインをコードするクローニ
ングされたＤＮＡをバキュロウイルス内に挿入した。バキュロウイルスリーダー
およびＳｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１
５５５（１９８７）に記載のような標準的な方法を用いて、このタンパク質を発
現した。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ
核多角体病（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルス（ＡｃＭＮ
ＰＶ）の強力なポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターに続いて、
バキュロウイルスｇｐ６７タンパク質の分泌シグナルペプチド（リーダー）およ
びＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８のような簡便な制限部位を含む。効
率的なポリアデニル化のために、シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリ
アデニル化部位を用いる。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは
、同じ方向で弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ
由来のβガラクトシダーゼ遺伝子、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル
化シグナルを含む。クローニングされたポリヌクレオチドを発現する生存能力の
あるウイルスを産生するために、挿入遺伝子を、野生型ウイルスＤＮＡを有する
細胞媒介相同組換えのためのウイルス配列に両側で隣接させた。

【０２２８】 当業者が容易に理解するように、構築物が必要とされるシグナルペプチドおよ
びインフレームＡＵＧを含む転写、翻訳、分泌などのための適切に配置されたシ
グナルを提供する限りは、多くの他のバキュロウイルスベクターが、上記のベク
ター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）の代わりに
用いられ得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ １７０：３１〜３９に記載される。

【０２２９】 寄託されたクローン（ＡＴＣＣ受託番号２０９３４０）におけるＴＲ１１レセ
プタータンパク質のリーダー（図１Ａおよび１Ｂに示されるアミノ酸１〜１６２
）を有する本質的に細胞外のドメインをコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子
の関連のある５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて増幅する。上記の５’プライマーは、下線部のＢａｍＨＩ制限酵素部
位、Ｋｏｚａｋ，Ｍ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７〜９５０（１９８
７）により記載された、真核細胞における翻訳の開始のために効率的なシグナル
を含む配列：５−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＣＣ
Ｇ−３’（配列番号１２）に続いて、図１Ａおよび１Ｂにおいて示されるＴＲ１
１タンパク質の配列をコードする１３塩基（配列番号１におけるヌクレオチド１
９３〜２０５）を有する。３’プライマーは、下線部のＡｓｐ７１８制限部位を
含む配列：５’ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＧＧＣ Ｇ
−３’（配列番号１３）に続き、図１Ａおよび１Ｂにおける配列（配列番号１に
おけるヌクレオチド５９０〜６０２）をコードしている配列に相補的な１３ヌク
レオチドを有する。

【０２３０】 市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ，Ｃａ）を用いて増幅したフラグメントを１％アガロースゲルから単離
した。次いで、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で、このフラグメントを消化し、
そして１％アガロース上で精製した。このフラグメントを、本明細書において「
Ｆ１」と命名する。

【０２３１】 プラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し，そして子牛
腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、市販のキット（「Ｇｅｎｅ
ｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、
１％アガロースゲルからＤＮＡを単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中
で「Ｖ１」と命名する。

【０２３２】 フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
と共に連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を、連結混合液で形質転換し、
そして培養プレート上に広げる。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のような別の適切
なＥ．ｃｏｌｉ宿主もまた使用し得る。ＰＣＲ方法を用いてヒトＴＲ１１配列を
有するプラスミドを含む細菌を同定する、ここで、上記のプライマーの１つを用
いて、遺伝子を増幅し、そして第２のプライマーはベクター内のウェルに由来し
、その結果、ＴＲ１１遺伝子フラグメントを含む細菌コロニーだけがＤＮＡ増幅
を示す。ＤＮＡ配列決定によりクローニングされたフラグメントの配列を確認す
る。このプラスミドを、本明細書中でｐＢａｃＴＲ１１−Ｔと命名する。

【０２３３】 Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ８４：７４１３
〜７４１７（１９８７）に記載されたリポフェクチン法を用いて、１．０μｇの
市販されている直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ｂａ
ｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ．）で、５μｇのｐＢａｑＴＲ１１−Ｔを同時トランスフェクトする。１μ
ｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＴ
Ｒ１１−Ｔを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイター
プレートの滅菌ウェルで混合する。後で、１０μｌのリポフェクチンおよび９０
μｌのグレース培地を添加し，混合し，そして室温で１５分間インキュベートす
る。次いで、トランスフェクション混合物を、Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ １７１１）を播種した１ｍｌの無血清グレース培地を含む３５ｍｍ組織培養
プレートに滴下により添加する。プレートを新たな添加溶液を混合するために後
ろに傾ける。次いで、プレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後
、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清
で補充された１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。プレートを、インキュベー
ターに戻し、そして培養を２７℃で４日間続ける。

【０２３４】 ４日後、上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によ
る記載と同様にプラークアッセイを行った。青色染色されたプラークを産生する
ゲル発現クローンの容易な同定および単離を可能にするために、「Ｂｌｕｅ Ｇ
ａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用いた。（この型の「プラークアッセイ」の
詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用
者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。適切なインキュベーショ
ン後，青色染色されたプラークを、マイクロピペッター（例えば，エッペンドル
フ）のチップで突く。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレ
ース培地を含む微量遠心管中に再懸濁し、そして組換えバキュロウイルスを含む
上清を用いて、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染させる。４日
後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いでそれらを４℃で保存する。
組換えウイルスを、Ｖ−ＴＲ１１−Ｔと呼ぶ。

【０２３５】 使用した遺伝子の発現を確認するために、Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢ
Ｓを補充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯ
Ｉ」）で組換えバキュロウイルスＶ−ＴＲ１１Ｔで感染させる。６時間後、その
培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ ＩＩ培
地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍ
Ｄから市販されている）に置き換える。４２時間後、５Ｃｉの³⁵Ｓ−メチオニン
および５Ｃｉの³⁵Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されている）を、
タンパク質を放射性標識するために添加する。細胞をさらに１６時間インキュベ
ートし、次いで細胞を遠心分離により収集する。上清中のタンパク質ならびに細
胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、続いてオートラジオグラフ
ィーを行なう。精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定を、
成熟タンパク質のアミノ末端配列ならびに、次いで分泌シグナルペプチド切断点
および長さを決定するために使用する。

【０２３６】 （実施例２（ｂ） バキュロウイルス発現系におけるＴＲ１１タンパク質の
全長遺伝子のクローニングおよび発現） 実施例２（ａ）に記載のＴＲ１１レセプターの短縮型のクローニングおよび発
現と同様に、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に記載の全長ＴＲ１１レセプター
を発現する組換えバキュロウイルスを作製した。

【０２３７】 この実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して、天然に
結合した分泌シグナル（リーダー）配列を含む完全なタンパク質をコードする、
クローニングされたＤＮＡを、成熟ＴＲ１１タンパク質を発現するためにバキュ
ロウイルス内に挿入する。ｐＡ２ベクターの他の特質は、実施例２（ａ）で使用
されたｐＡ２ＧＰベクターに関して記載する。

【０２３８】 図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示したＡＵＧ開始コドンおよび天然に結合
したリーダー配列を含む蓄積されたクローンにおける全長ＴＲ１１タンパク質を
コードするｃＤＮＡ配列を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。上記の５’プライマーは、下線部
のＢａｍＨＩ制限酵素部位、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６
：９４７〜９５０に記載されるように真核細胞（イタリック体で）において転写
の開始のための効率的なシグナルを含む配列：５−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ Ｃ
ＣＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＣＧ ＧＧＧ ＣＧ−３’
（配列番号１４）に続いて、図１Ａおよび１Ｂに示したＴＲ１１タンパク質をコ
ードする配列の１６塩基（配列番号１におけるヌクレオチド１１８〜１３５）を
有する。本目的のための適切な３’プライマーは、下線部のＡｓｐ７１８制限部
位を含む配列：５’ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＧＴＣ
ＴＣＣ Ｃ−３’（配列番号１５）に続いて、図１Ａおよび１Ｂにおいてコー
ドする配列に相補的な１６ヌクレオチド（配列番号１におけるヌクレオチド８０
４〜８１９）を有する。

【０２３９】 増幅されたフラグメントを単離し、プラスミドｐＢａｃＴＲ１１を作製するた
めに実施例２（ａ）に記載するように制限酵素で消化する。

【０２４０】 ５μｇのｐＢａｃＴＲ１１を、全量２００μｌの無血清培地中で、１μｇのＢ
ａｃｕｌｏＧｏｌｄ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ウイルスＤＮＡおよび１０μｌの
リポフェクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と共に同時
トランスフェクトする。感染後（ｐｉ）４〜５日で、初代のウイルスを収集し、
そしてプラークアッセイに用いる。プラーク精製されたウイルスを、実施例２（
ａ）に記載のように、引き続き増幅し、そして凍結する。

【０２４１】 発現タンパク質を放射性標識するために、Ｓｆ９細胞を、０．５×１０⁶細胞 ／ｍｌを含む２．０ｍｌの細胞懸濁液を用い、１２ウェルディッシュに播種し、
そして４時間付着させる。細胞を感染するために１〜２のＭＯＩで、組換えバキ
ュロウイルスを用いる。４時間後、培地を、メチオニンおよびシステインを欠い
た１．０ｍｌの無血清培地（−Ｍｅｔ／−Ｃｙｓ）で置換する。ｐｉ３日で、培
養培地を、２μＣｉの各［³⁵Ｓ］−Ｍｅｔおよび［³⁵Ｓ］−Ｃｙｓを含む０．５
ｍｌの−Ｍｅｔ／−Ｃｙｓで置換する。１６時間細胞を標識し、その後、培養培
地を取り除き、そして遠心分離により明澄化する（上清）。０．２ｍｌの溶解緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９；１３０ｍＭ ＮａＣｌ；０．２ｍＭ
ＥＤＴＡ；０．５ｍＭ ＤＴＴおよび０．５％ ｖｏｌ／ｖｏｌ ＮＰ−４０
）の添加により、ディッシュ中で細胞を溶解し、次いで、ｄＨ₂Ｏで１．０ｍｌ まで希釈する（細胞抽出物）。それぞれ３０μｌの上清および細胞抽出物を、１
５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する。タンパク質ゲルを染色し、脱色し、増幅
し、乾燥し、そしてオートラジオグラフィーを行なう。組換えタンパク質に一致
する標識化バンドは、１６〜７２時間の露光後に現れる。

【０２４２】 当業者は、類似のアプローチが、ｐＡ２ＧＰ−およびｐＡ２−に基づくバキュ
ロウイルス発現構築物を、昆虫細胞でのＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２の
発現のために作製するために容易に設計され得、そして利用され得ることを理解
する。これは、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２の遺伝子特異的配列と結合
した類似の制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むＰＣＲプライマーを設計する
こと、および上記のように進行することにより行なわれる。

【０２４３】 （実施例３：哺乳動物細胞におけるＴＲ１１のクローニングおよび発現） 代表的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポ
リアデニル化のために必要とされるシグナルを含む。さらなるエレメントは、エ
ンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列およびＲＮＡスプライシングのためのドナーおよび
アクセプター部位に隣接した介在配列を含む。高度に効率的な転写は、ＳＶ４０
由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端配列（ＬＴＲ
Ｓ）（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）、およびサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて、達成される。しかし、細胞性エレメン
トもまた、使用され得る（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。本発明を実行
するために使用するための適切な発現ベクターは、例えば、ＰＳＶＬおよびＰＭ
ＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ
（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）および
ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターを含む。使用され得
る哺乳動物宿主細胞は、ヒトＨｅＬａ２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マ
ウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、ウズ
ラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞を含む。

【０２４４】 あるいは、遺伝子は、染色体内に組み込まれた遺伝子を含む安定細胞株におい
て発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、またはハイグロマイシンの
ような選択マーカーとの同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた
細胞の同定および単離を可能にする。

【０２４５】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百またはさらに数千のコピーを保持する細胞株を開発するため
に有用である。他の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンテース（ＧＳ；
Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７〜２７９（１９９１）；
Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９〜１７
５（１９９２））である。これらのマーカーを用いて、哺乳動物細胞を、選択的
な培地中で増殖し、そして最高の耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株
は、染色体内に組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞を、しばしばタンパク質の産生のために使用す
る。

【０２４６】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８４４７（１９９５年３月）およびＣＭＶエンハンサ
ーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１〜５３０（１９
８５））を含む。多重クローニング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ
、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容
易にする。ベクターは、さらに３’イントロン、ラットプレプロインシュリン遺
伝子のポリアデニル化および終結シグナルを含む。

【０２４７】 （実施例３（ａ） ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現） 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ，Ｉｎｃ．より得られ得る）内にＴＲ１１タンパク質の可溶性細胞外部分
をコードするｃＤＮＡをクローニングすることにより、発現プラスミドであるｐ
ＴＲ１１ＨＡを作製する。

【０２４８】 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは、以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよ
び他の原核細胞における増殖に効率的なＥ．ｃｏｌｉ複製起点；（２）プラスミ
ドを含む原核細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核細胞にお
ける増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー
、ＳＶ４０イントロン；（５）ヘマグルチニンフラグメントをコードするいくつ
かのコドン（すなわち、精製を容易にするための「ＨＡ」タグ）、続いて、ｃＤ
ＮＡがＣＭＶプロモーターの発現制御の下に都合よく配置され得、そしてポリリ
ンカーにおける制限部位によりＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナ
ルに作動可能に連結され得るように配置された終結コドンおよびポリアデニル化
シグナル。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）
により記載されたインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに
一致する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認識する抗
体を用いて組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする。ｐｃＤＮＡ
ＩＩＩは、さらにネオマイシン選択マーカーを含む。

【０２４９】 ＴＲ１１タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを、組換えタンパク質の
発現が、ＣＭＶプロモーターにより支配されるように、ベクターのポリリンカー
領域内にクローニングする。プラスミド構築ストラテジーは、以下である。寄託
されたクローンのＴＲ１１ｃＤＮＡを、上記のＥ．ｃｏｌｉにおけるＴＲ１１の
発現のためのベクターの構築とほとんど同じに、都合のよい制限部位を含むプラ
イマーを用いて増幅する。本実施例で使用される適切なプライマーは、以下であ
る。下線部のＢａｍＨＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列（イタリック体で）、ＡＵＧ開始
コドンおよび完全なＴＲ１１の５’コード領域の１３のさらなるコドンを含む５
’プライマーは、以下の配列を有する：５’−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ
ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＣＣ Ｇ−３’（配列番号１６
）。３’プライマーは、下線部のＸｂａＩ制限部位に続く、停止コドン、６×ヒ
スチジンタグをコードしている配列、および図１Ａおよび１Ｂにおけるコード配
列（配列番号１におけるヌクレオチド５９０〜６０２）に相補的な１５ヌクレオ
チドを含む配列：５’ＣＧＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＡＧＣ ＧＴＡ ＧＴ
Ｃ ＴＧＧ ＧＡＣ ＧＴＣ ＧＴＡ ＴＧＧ ＧＴＡ ＴＴＡ ＧＧＣ ＴＣ
Ｔ ＧＣＣ ＧＧＣ Ｇ−３’（配列番号１７）を有する。

【０２５０】 ＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクターであるｐｃＤＮＡＩ／Ａ
ｍｐを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで連結する。連結混合液を、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ，１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７）に形質転換し、そして形質転換された培養物
を、アンピシリン培地プレート上に広げ、次いで、それをアンピシリン耐性コロ
ニーの増殖を可能にするためにインキュベートする。プラスミドＤＮＡを、耐性
コロニーから単離し、そして制限分析または他の手段により、ＴＲ１１コードフ
ラグメントの存在について調べる。

【０２５１】 組換えＴＲ１１の発現のために、ＣＯＳ細胞を、上記のように、例えば、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）
に記載のようにＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを用いて、発現ベクターを用いてトラ
ンスフェクトする。細胞を、ベクターによるＴＲ１１の発現のための条件下でイ
ンキュベートする。

【０２５２】 ＴＲ１１−ＨＡ融合タンパク質の発現を、放射標識化および免疫沈降法によっ
て、例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される方法を用いて検出する。このために、トラン
スフェクション２日後に、細胞を、³⁵［Ｓ］−システインを含有する培地中で８
時間インキュベーションすることにより標識する。細胞および培地を回収し、そ
して細胞を、界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｎ
Ｐ−４０、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ
７．５））で、Ｗｉｌｓｏｎら、前出に記載の通りに洗浄および溶解する。タン
パク質を、細胞溶解物および培養培地から、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用
いて沈降させる。次いで、沈降したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオー
トラジオグラフィーにより分析する。予測されたサイズの発現産物が細胞溶解物
中に見られ、これはネガティブコントロールには見られない。

【０２５３】 （実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現） ベクターｐＣ４を、ＴＲ１１タンパク質の発現のために使用する。プラスミド
ｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘
導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマウスＤ
ＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉
酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療
剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトト
レキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、よく
考証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．，Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｂｅ
ｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．，１９７８，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭ
ａ，Ｃ．１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０９
７：１０７−１４３、Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．，
１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８を参照のこと）。漸増
濃度のＭＴＸにおける細胞増殖は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵
素ＤＨＦＲを過剰産生することによってこの薬物への耐性を発達させる。第二の
遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、これは、通常、同時増幅され、そし
て過剰発現される。このアプローチが、１，０００を越えるコピーの増幅遺伝子
を有する細胞株を開発するために用いられ得ることは当該分野で公知である。続
いて、メトトレキサートが取り除かれる場合、宿主細胞の１以上の染色体に組み
込まれた増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。

【０２５４】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長
末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８５年３月：４３８−４
４７）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハン
サー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））から
単離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可
能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８の制限酵素切断部位である。
これらのクローニング部位の後ろに、プラスミドは、ラットプレプロインシュリ
ン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモ
ーターもまた、発現のために使用され得る（例えば、ヒトアクチンプロモーター
、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば
、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）からの長末端反復）。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−
ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系および類似の系を用いて、哺乳動物細胞
において調節された方法でＴＲ８タンパク質を発現し得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．
およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他
のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）も同様に使
用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定な細胞株もまた、
選択マーカー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシン）との同時
トランスフェクトに基づいて選択され得る。最初は１より多くの選択マーカー（
例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが有利である。

【０２５５】 プラスミドｐＣ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次いで
仔ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化す
る。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単離する。

【０２５６】 そのリーダー配列を含む完全ＴＲ１１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、
例えば、上記の実施例２に示したバキュロウイルスｐＡベクターにおけるクロー
ニングのために用いた５’プライマーおよび３’プライマーと同じ配列を有する
遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて増幅する。

【０２５７】 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８
で消化し、次いで１％アガロースゲルで再び精製する。次いで、単離したフラグ
メントおよび脱リン酸化ベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。次
いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換
し、そして例えば、制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグ
メントを含む細菌を同定する。

【０２５８】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェ
クチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ
２−ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは、
優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質への耐性を与える酵素をコー
ドするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を
補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、ハイ
ブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の、１
０、２５または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１
８を補充したαマイナスＭＥＭ中に播種する。約１０〜１４日後、単一のクロー
ンをトリプシン処理し、次いで種々の濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１０
０ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿ま
たは１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖
するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、
１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１０
０〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝
子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析、ま
たは逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。

【０２５９】 当業者は、類似のアプローチが容易に設計および利用されて、哺乳動物細胞に
おけるＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２の発現のためにｐｃＤＮＡＩＩＩベ
ースのおよびｐＣ４ベースの細菌性発現構築物を生成し得ることを認識する。こ
れは、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２についての遺伝子特異的配列と組み
合わせた、類似の制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含有するＰＣＲプライマー
を設計し、そして上記のように手続きすることによりなされる。

【０２６０】 （実施例４：ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２ ｍＲＮＡ発
現の組織分布） ノーザンブロット分析を、ヒト組織におけるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およ
びＴＲ１１ＳＶ２遺伝子発現を調べるために、特に、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら
により記載される方法を用いて行う。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１
１ＳＶ２タンパク質のヌクレオチド配列全体を含有するｃＤＮＡプローブ（それ
ぞれ、配列番号１、配列番号３、および配列番号５）を、³²Ｐを用いて、ｒｅｄ
ｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）を用いて製造者の説明書に従って標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲ
ＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精
製する。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織を、ＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２ ｍＲＮＡについて調べる。

【０２６１】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含有する複数組織ノー
ザン（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そして標識プローブ
を用い、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
）を用いて製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って調べる。ハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄の後、ブロットをフィルムに取り付け、そして−７０
℃で一晩露光し、そしてフィルムを標準的手順に従って現像する。

【０２６２】 （実施例５（ａ）：ＴＲ１１−Ｆｃ（ＴＲ１１−Ｉｇ融合タンパク質）の発現
および精製、ならびに切断されたＴＲ１１） 翻訳されたＴＲ１１レセプターの推定膜貫通ドメインを、非極性二重層貫通（
ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ）へリックスを同定するためにＧｏｌｄｍａｎら（Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：３２
１−３５３（１９８６））の方法を用いて、疎水性により決定する。推定リーダ
ーペプチドおよび細胞外ドメインをコードする、この膜貫通ドメインの上流領域
を、Ｆｃ融合タンパク質の生成のために選択する。プライマーを、寄託したクロ
ーンから対応するコード領域を、ＰＣＲによって増幅するように、Ｂｇｌ ＩＩ
部位、第Ｘａ因子プロテアーゼ部位、およびＡｓｐ７１８部位を３’末端に付加
して設計する。これを、ＣＯＳＦｃｌｉｎｋにクローン化してＴＲ１１−Ｆｃｌ
ｉｎｋプラスミドを得る。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＡｓｐ７１８で消化
し、そしてＣＯＳＦｃｌｉｎｋプラスミド（Ｊｏｈａｎｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５））に連結してＴＲ１１−
Ｆｃｌｉｎｋを生成する。

【０２６３】 ＣＯＳ細胞を、ＴＲ１１−Ｆｃｌｉｎｋで一過性にトランスフェクトし、そし
て得られる上清を、プロテインＡアガロースで免疫沈降する。ヤギ抗ヒトＦｃ抗
体を用いての免疫沈降物のウェスタンブロット分析は、グリコシル化ＴＲ１１−
Ｆｃについて予測されたサイズ（６５，９４０ｋＤよりも大きい）と強力なバン
ドの一貫性を示す。１５Ｌの一過性のＣＯＳトランスフェクションを行い、得ら
れる上清を精製する。精製されたタンパク質を用いて、マウスを免疫し、続いて
ｍＡｂの生成のためにＤＮＡを注射する。

【０２６４】 ＣＨＯ細胞を、ＴＲ１１−Ｆｃｌｉｎｋでトランスフェクトして安定な細胞株
を生成する。５つの株を拡大のためにドットブロット分析により選択し、そして
シェーカーフラスコに適応させる。最大レベルのＴＲ１１−Ｆｃタンパク質発現
を有する株を、ウェスタンブロット分析により同定する。この株の上清から精製
したＴＲ１１−Ｆｃタンパク質を、フローサイトメトリーによる細胞結合研究の
ために、インタクトなタンパク質として、または第Ｘａ因子切断およびビオチン
化後いずれかで用いる。

【０２６５】 当業者は、類似のアプローチが、Ｆｃ融合タンパク質としてＴＲ１１ＳＶ１お
よびＴＲ１１ＳＶ２の発現のための発現構築物を生成するために容易に設計およ
び利用され得ることを認識する。これは、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２
についての遺伝子特異的配列と組み合わせた、類似の制限エンドヌクレアーゼ認
識配列を含有するＰＣＲプライマーを設計し、そして上記のように手続きするこ
とによりなされる。

【０２６６】 （実施例５（ｂ）：ＣＨＯ Ｅ１Ａ馴化培地からのＴＲ１１−Ｆｃの精製、続
いてＴＲ１１の切断およびビオチン化） （アッセイ） 精製を通じての産物の純度を、還元条件下および非還元条件下で泳動した１５
％ Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でモニタリングする。タンパク質
濃度を、配列から算出されたレセプターおよびキメラについてのＡ₂₈₀推定消衰 係数によりモニタリングする。

【０２６７】 （ＴＲ１１−Ｆｃ融合タンパク質のプロテインＧクロマトグラフィー） 以下に記載する全ての工程を、４℃にて行う。１５ＬのＣＨＯ馴化培地（ＣＭ
；細胞培養物中での採取後０．２μ濾過）を、１９９ｃｍ／時間の線形流速でプ
ロテインＧの５×１０ｃｍカラムにアプライする。このカラムを、１００ｍＭグ
リシン（ｐＨ２．５）で予め洗浄し、そして２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０
ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７）で平衡化した後、サンプルを適用する。ＣＭをロ
ードした後、カラムを５カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩
化ナトリウム（ｐＨ７）で洗浄し、そして１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）で
溶出させる。溶出物を、３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）で直ちに中和し、そして
０．２μで濾過する。

【０２６８】 （濃縮／透析） プロテインＧ溶出物を、３０Ｋメンブレンを取り付けたＡｍｉｃｏｎ攪拌セル
において約１０倍に濃縮する。濃縮物を、緩衝液に対して透析する。

【０２６９】 （遊離のレセプターを生じるための第Ｘａ因子切断および精製） ＴＲ１１−Ｆｃを、１：２００のｅ：ｓ比で５０μｇの第Ｘａ因子に添加する
。この混合物を、４℃にて一晩インキュベートする。

【０２７０】 （遊離ＴＲ１１レセプターのプロテインＧクロマトグラフィー） プロテインＧの１ｍｌカラムを、重力流を用いる使い捨てカラムにおいて、２
０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．５）で平衡化す
る。切断されたレセプターを、このカラムに３回通し、その後、カラムを、Ａ_{28 0} 吸光度が見られなくなるまで２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナト リウム（ｐＨ６．５）で洗浄する。このカラムを、２．５ｍｌの１００ｍＭグリ
シン（ｐＨ２．５）で溶出させ、８３μｌの３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）で中
和する。ＴＲ８は、非結合画分に溶出する。

【０２７１】 （濃縮） プロテインＧカラムからの非結合画分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０Ｋセル（
Ａｍｉｃｏｎ）において、０．７のＡ₂₈₀消衰係数により評価される約３．５ｍ ｇ／ｍｌの最終濃度まで濃縮する。

【０２７２】 （Ｍｏｎｏ Ｓクロマトグラフィー） 濃縮サンプルを、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）を用いて５ｍｌまで希
釈し、そして２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）で平衡化した０．５×５ｃｍ
Ｍｏｎｏ Ｓカラムに、３００ｃｍ／時の線形流速でアプライする。このカラ
ムを２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）で洗浄し、そして２０ｍＭリン酸ナト
リウム（ｐＨ６）から２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ６
）までの２０カラム容量の線形勾配を用いて溶出させる。ＴＲ１１タンパク質は
、非結合画分に溶出する。

【０２７３】 （濃縮／透析） Ｍｏｎｏ Ｓカラムからの非結合画分を、上記のようにＣｅｎｔｒｉｃｏｎ
１０Ｋセルを用いて１ｍｌに濃縮し、そして２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０
ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７）に対して透析する。

【０２７４】 （ビオチン化） 約１〜２ｍｇ／ｍｌの０．５ｍｇのＴＲ１１を、１００ｍＭホウ酸塩（ｐＨ８
．５）に対して透析する。２０倍モル過剰のＮＨＳ−ＬＣ Ｂｉｏｔｉｎを添加
し、そしてこの混合物をローテータで４℃にて一晩置く。ビオチン化ＴＲ１１を
、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７）に対して透
析し、滅菌濾過し、そして−７０℃にて保存する。ビオチン化を、ストレプトア
ビジンＨＲＰでプローブしたウェスタンブロットにおいて行い、続いてＥＣＬ試
薬で発色させる。

【０２７５】 （実施例６：ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２の染色体マッ
ピング） オリゴヌクレオチドプライマーセットを、配列番号１、配列番号３、または配
列番号５の５’末端の配列に従って設計する。このプライマーは、好ましくは、
約１００ヌクレオチドにまたがる。次いで、このプライマーセットを、以下の設
定条件下でのポリメラーゼ連鎖反応において用いる：９５℃にて３０秒間；５６
℃にて１分間；７０℃にて１分間。このサイクルを３２回繰り返し、その後、７
０℃にて５分間の１回のサイクルを行った。ヒト、マウス、およびハムスターの
ＤＮＡを、個々の染色体または染色体フラグメントを含有する体細胞ハイブリッ
ドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ．）に加えて、テンプレートとして用いる。反応物
を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれかで分
析する。染色体マッピングは、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００ｂｐ
のＰＣＲフラグメントの存在により決定される。

【０２７６】 （実施例７：Ｎ末端および／またはＣ末端欠失変異体の構築） 以下の一般的アプローチを用いて、Ｎ末端またはＣ末端が欠失したＴＲ１１、
ＴＲ１１ＳＶ１、ＴＲ１１ＳＶ２欠失変異体をクローニングし得る。一般に、約
１５〜２５ヌクレオチドの２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１
（または、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２のＮ末端またはＣ末端欠失を構
築する場合はそれぞれ、配列番号３および５から）の所望の５’位置および３’
位置のポリヌクレオチドに由来する。当業者は、本実施例で概説した手順がまた
、ＴＲ１１欠失の代わりにＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２のＮ末端および
Ｃ末端欠失を生成するために容易に用いられ得ることを認識する。５’位置のプ
ライマーおよび３’位置のプライマーを、所望のＴＲ１１ポリヌクレオチドフラ
グメントに基づいて決定する。必要な場合は、開始コドンおよび停止コドンを、
それぞれ、５’プライマーおよび３’プライマーに付加して、ポリヌクレオチド
フラグメントによりコードされるＴＲ１１ポリペプチドフラグメントを発現する
。好ましいＴＲ１１ポリヌクレオチドフラグメントは、明細書の「ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドフラグメント」の節において上記で開示されたＮ末端お
よびＣ末端の欠失変異体をコードするポリヌクレオチドフラグメントである。

【０２７７】 所望のベクターにおいてＴＲ１１ポリヌクレオチドフラグメントのクローニン
グを促進する制限部位を含有するさらなるヌクレオチドもまた、５’プライマー
および３’プライマーの配列に付加され得る。ＴＲ１１ポリヌクレオチドフラグ
メントを、ゲノムＤＮＡから、または寄託されたｃＤＮＡクローンから、適切な
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーおよび本明細書中で考察したかまたは当該
分野で公知の条件を用いて増幅する。本発明のＴＲ１１ポリヌクレオチドフラグ
メントによりコードされるＴＲ１１ポリペプチドフラグメントは、全長ポリペプ
チドと同じ一般的な様式で発現および精製され得るが、特定のフラグメントと全
長ポリペプチドとの間の化学的および物理的特性の相違に起因して慣用的な改変
が必要であり得る。

【０２７８】 本発明を例示するための限定しない手段として、ＴＲ１１ポリペプチドフラグ
メントＲ−５９からＰ−１６２をコードするポリヌクレオチドを、以下の通りに
増幅およびクローニングする：制限酵素部位、続いてＲ−５９で始まるポリペプ
チドフラグメントのＮ末端部分をコードするポリヌクレオチド配列とインフレー
ムな開始コドンを含有する５’プライマーを作製する。制限酵素部位、続いてＰ
−１６２で終わるＴＲ１１ポリペプチドフラグメントのＣ末端部分をコードする
ポリヌクレオチド配列とインフレームな停止コドンを含有する相補的な３’プラ
イマーを作製する。

【０２７９】 増幅したポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターを、プライマーに
おける部位を認識する制限酵素で消化する。次いで、消化したポリヌクレオチド
を、一緒に連結する。ＴＲ１１ポリヌクレオチドフラグメントを、制限処理され
た発現ベクターに、好ましくはＴＲ１１ポリペプチドフラグメントコード領域を
プロモーターの下流に配置する様式で挿入する。連結混合物を、コンピテントＥ
．ｃｏｌｉ細胞に、標準的手順を用いて、および本明細書中の実施例に記載した
通りに形質転換する。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し、そしてク
ローニングしたＤＮＡの正体を、制限分析、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定によ
り確認する。

【０２８０】 （実施例８：ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のタンパク質
融合物） ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリぺプチドを、好ましく
は、他のタンパク質に融合する。これらの融合タンパク質を、種々の適用につい
て使用し得る。例えば、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリ
ぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマ
ルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例１を参照のこと
；ＥＰ Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−
３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。ＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリぺプチドに融合した核局在化シグ
ナルは、タンパク質を特定の細胞下局在に標的化し得る。一方、共有結合ヘテロ
ダイマーまたはホモダイマーは、融合タンパク質の活性を増大または減少させ得
る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有するキメラ分子を作製し得る
。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の
可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型
は、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を概説する以下のプロトコル、または実
施例１に記載されるプロトコルを改変することによって作製され得る。

【０２８１】 手短には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’末端および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマ
ーはまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニン
グを容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。

【０２８２】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）が使用される場合、ヒトＦｃ部
分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊
されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが
、ＢａｍＨＩによって再び制限処理され、ベクターを線状化し、そしてＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドが、このＢａｍＨＩ
部位に連結される。ポリヌクレオチドは、停止コドンなしにクローン化され、そ
うでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意すること。

【０２８３】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）。

【０２８４】

【化１３】 （実施例９：抗体の産生） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと。）例えば、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、
またはＴＲ１１ＳＶ２を発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生
を誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、ＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２タンパク質の調製物が調製され、そして精製さ
れて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにする。次いで、このような調製物
は、動物に導入されて、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成する。

【０２８５】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
そのタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このような
手順は、動物（好ましくは、マウス）をＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ
１１ＳＶ２ポリぺプチドで免疫すること、またはより好ましくは、分泌ＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリぺプチド発現細胞での免疫を含む
。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養され得る；しかし
、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌ
の非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／
ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変Ｅａｇｌｅ培地において細
胞を培養することが好ましい。

【０２８６】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合
される。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しか
し、ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好
ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に
維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２
５−２３２（１９８１））に記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、次いでＴＲ１１、
ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌す
るクローンを同定するためにアッセイされる。

【０２８７】 あるいは、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリぺプチドに
結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順
において生成し得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ
第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この
方法に従って、タンパク質特異的抗体が、動物（好ましくは、マウス）を免疫す
るために使用される。次いで、このような動物の脾細胞を使用して、ハイブリド
ーマ細胞を産生する。そして、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、ＴＲ
１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２タンパク質特異的抗体に結合する
能力がＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２によってブロックされ
得る抗体を産生するクローンを同定する。このような抗体は、ＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイ
プ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、また
はＴＲ１１ＳＶ２タンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。

【０２８８】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明の抗体の他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を
使用して、タンパク質分解性切断によって産生される。あるいは、分泌ＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２タンパク質結合フラグメントは、組換
えＤＮＡ技術の適用により、または合成化学により産生され得る。

【０２８９】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好適であり得る。このような抗体は、上記のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用することに
よって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知である
。（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（
１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；
Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、
ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１
；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。） （実施例１０：高処理能力スクリーニングアッセイのためのＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２タンパク質の産生） 以下のプロトコルは、実施例１および７で構築したＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１
、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリぺプチドの可溶性または細胞外部分を含有する、試
験されるべき上清を産生する。次いで、この上清は、以下の実施例に記載される
スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。

【０２９０】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、室温で２０分間インキュベートする
。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２チャンネル
ピペッターは、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る）。ポリ−
Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水
）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残すべきで
あり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし得る。

【０２９１】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０⁵細胞／ウ ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。

【０２９２】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８〜１０に記載す
る方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現ベ
クターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。マ
ルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔｉ
ｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下げ
たりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、マ
ルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウェ
ルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つの
プレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべきで
ある。

【０２９３】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つお
きにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ
／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次
いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時
間インキュベートする。

【０２９４】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、またはＨＧＳ ＣＨＯ−５培地（１１６．６
ｍｇ／ＬのＣａＣｌ₂（無水物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ₄−５Ｈ₂ Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ₃）₃−９Ｈ₂Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦ ｅＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ；３１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇ
Ｃｌ₂；４８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ₄；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；
２４００．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ₃；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｈ₂ Ｏ；７１．０２ｍｇ／ＬのＮａ₂ＨＰＯ₄；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ₄− ７Ｈ₂Ｏ；０．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステ ロール；０．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍ
ｇ／Ｌのリノール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ミリスチン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミ
トオレイン酸（ｐａｌｍｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミ
チン酸；１００ｍｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ステアリン酸；２．２０ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グ
ルコース；１３０．８５ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ；７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ₂Ｏ；６ ．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン
２ＨＣｌ−Ｈ₂Ｏ；３１．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５ ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８
．７５ｍｇ／ｍｌのグリシン；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ
−Ｈ₂Ｏ；１０６．９７ｍｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍ ｌのＬ−ロイシン；１６３．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍ
ｇ／ｍｌのＬ−メチオニン；６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４
０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロリン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１
．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファ
ン；９１．７９ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２
Ｈ₂Ｏ；９９．６５ｍｇ／ＬのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビオチン； ３．２４ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａパントテン酸；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コリン；
４．６５ｍｇ／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３．０２ｍ
ｇ／Ｌのナイアシンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ；０．０
３１ｍｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン；３．
１７ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；０．６８０ｍ
ｇ／ＬのビタミンＢ₁₂；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／ＬのＮａ
ヒポキサンチン；０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌのプトレシ
ンナトリウム−２ＨＣｌ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；０．００
６７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミン；０．１２
２ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄；４１．７０ｍｇ／Ｌのリノール酸と複合体化した
メチル−Ｂ−シクロデキストリン；３３．３３ｍｇ／Ｌのオレイン酸と複合体化
したメチル−Ｂ−シクロデキストリン；ならびに１０ｍｇ／Ｌの酢酸レチナール
と複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン）のいずれかの適切な培地を調
製する。モル浸透圧濃度３２７ｍＯｓｍ）に２ｍｍグルタミンおよび１×ペンス
トレップで調整する。（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ ＤＭＥＭ中
にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ） １００ｇを溶解する）。培地を濾
過し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレンコニカル
中に収集する。

【０２９５】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５または７２時間、３７℃でインキュベートする：１％
ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。

【０２９６】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を以下の実施例に
記載するアッセイにおいて使用し得る。

【０２９７】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２ポリぺプチド
から直接に（例えば、可溶性タンパク質として）か、またはＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２によって誘導される他のタンパク質の発現（これ
は、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来することが特に理解される。
従って、本発明はさらに、特定のアッセイにおける活性によって特徴づけられる
上清中のタンパク質を同定する方法を提供する。

【０２９８】 （実施例１１：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路と呼ばれる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路の活性化タンパク質は、多くの遺伝子
のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントまたはインター
フェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これらのエレメン
トに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させる。

【０２９９】 ＧＡＳおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデューサーおよ
びアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれる転写因子のクラスによって
認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓｔａｔ１お
よびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広範であるよ
うに）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定されており、
そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘルパークラ
スＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼ばれたが、
骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。それは、多く
のサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。

【０３００】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋｓ」）ファミ
リーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質
から核へ移動する。Ｊａｋｓは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリー
を表わし、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これ
らのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞において触
媒的に不活性である。

【０３０１】 Ｊａｋｓは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活
性化される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変。）
Ｊａｋｓを活性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分け
られる：（ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−
７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、
Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンについ
てのレセプターを含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、お
よびＩＬ−１０を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ
（４つの保存されたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、および
ＷＳＸＷＳモチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号５）
をコードする膜近接領域）を共有する。

【０３０２】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋｓは活性化され、これ
は次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメント
に結合する。この全プロセスは、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含さ
れる。

【０３０３】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示
すために使用され得る。例えば、成長因子およびサイトカインは、Ｊａｋｓ−Ｓ
ＴＡＴ経路を活性化することが知られている。（以下の表を参照のこと）。従っ
て、レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。

【０３０４】

【表２】 実施例１４〜１５に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を産生する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインで
の誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に証明されたＧＡＳ結合部位の４つ
の直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １： ４５７
−４６８ （１９９４））、他のＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントを代わりに使
用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対して相補
的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライマーの
配列は以下である：

【０３０５】

【化１４】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴ
ＡＧＧＣ：３’（配列番号２０）。

【０３０６】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：

【０３０７】

【化１５】 次に、ＳＶ４０プロモーターに連結したこのＧＡＳプロモーターエレメントを
用いて、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター
分子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、
明らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター
分子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知の
レポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパ
ク質が挙げられる。

【０３０８】 合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントと確認された上記の配列を、Ｇ
ＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用
いて、ＳＶ４０プロモーターを、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメ
ントで効率的に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。

【０３０９】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター（例えば、ｐＧＦＰ
−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞に
トランスフェクトすれば、このベクターは、以下の実施例に記載されるようにＧ
ＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。

【０３１０】 他の構築物を、上記の記載を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を含
むレポーター分子の構築を、以下の実施例に記載する。しかし、多くの他のプロ
モーターをこれらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得る。例えば、
ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモーターを単独で
、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、ＧＡＳ／ＮＦ−
ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得る。同様に、
他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細胞）、Ｒｅｈ
（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞）、または心
筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る。

【０３１１】 （実施例１２：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを、例えば、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１Ｓ
Ｖ２上清がＴ細胞を増殖または分化させるか否かを決定することにより、ＴＲ１
１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２のＴ細胞活性を評価するために使用
する。Ｔ細胞の活性を上記の実施例で作製したＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物
を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴ
ＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイに使用したＴ細
胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１５２）であるが、Ｍ
ｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５２）およびＭｏｌｔ−４細胞
（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた使用し得る。

【０３１２】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクト（以下に記載のトランスフェクション手順
）する。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して
耐性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、
漸増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選
択したクローンの用量応答を示す。

【０３１３】 具体的には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェル
について十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な
細胞を産生するために、スケールアップするか、または複数で実施するかのいず
れかである。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％血清および１％のＰｅｎ−Ｓ
ｔｒｅｐ中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組み合
わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを添加
し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。

【０３１４】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０⁷個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０⁷細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、１ｍｌのＯＰＴＩ−
ＭＥＭ中の１×１０⁷個の細胞をＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間 インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の
血清を添加する。

【０３１５】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％ 血清
、１ｍｇ／ｍｌジェンティシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する
。これらの細胞を上記の実施例に記載されるプロトコルにより産生されるような
ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチド、またはＴＲ
１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２で誘導されたポリペプチドを含む
上清で処理する。

【０３１６】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべきである
。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。１枚の
９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレートに
ついて１億個の細胞）を必要とする。

【０３１７】 細胞を、１２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに分与す
るために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。１２チャンネルのピペットを
用いて、２００μｌの細胞をそれぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり１
００，０００個の細胞を添加する）。

【０３１８】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして供する。

【０３１９】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ターに４８時間置く（注：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）。
次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用いて
、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンのカバ
ーを用いて）覆うべきであり、そして以下の実施例に従ってＳＥＡＰアッセイを
行うまで、−２０℃で保存する。残存する処理した細胞を含むプレートを４℃に
置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを繰り返すための
物質の供給源として供する。

【０３２０】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。

【０３２１】 （実施例１３：骨髄活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２が骨
髄細胞を増殖または分化させるか否かを決定することによりＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２の骨髄活性を評価するために使用する。骨髄細胞
の活性を実施例において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評
価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグ
ナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用した骨髄細胞は、
Ｕ９３７、前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株であるが、ＴＦ−１、Ｈ
Ｌ６０、またはＫＧ１も使用し得る。

【０３２２】 Ｕ９３７細胞を、実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ５： ２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ ⁷ 個のＵ９３７細胞を回収し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常 、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン
を補充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培
地中で増殖させる。

【０３２３】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および６７５μＭ ＣａＣｌ₂ を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。

【０３２４】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。

【０３２５】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。

【０３２６】 これらの細胞を１×１０⁸個の細胞を回収すること（これは１０枚の９６ウェ ルプレートアッセイのために十分である）により試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０⁵細胞／ｍｌの最終密度で細胞 を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞をプレ
ートする（すなわち、１×１０⁵細胞／ウェル）。

【０３２７】 実施例１２に記載されるプロトコルにより調製された上清を５０μｌ添加する
。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１０
０単位／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性化さ
せることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロール
ウェルにおいて観察される。ＳＥＡＰは、実施例に記載のプロトコルに従って上
清をアッセイする。

【０３２８】 （実施例１４：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２
による細胞の活性化を評価し得る。

【０３２９】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ ｃｅｌｌ））は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テト
ラデカノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ
（上皮増殖因子））での活性化により増殖および／または分化することが公知で
ある。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポ
ーターに結合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトラ
ンスフェクトすることにより、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ
２によるＰＣ１２細胞の活性化を評価し得る。

【０３３０】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６： ８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用
いて、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る：

【０３３１】

【化１６】 次いで、実施例１３において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを線状化し、ＧＡＳ
／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を用
いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターとを
連結する。

【０３３２】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ． カタログ番号０
８−１１５）の３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を１つの１０
ｃｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０μｌ
添加し、そして２時間風乾させる。

【０３３３】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充
した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４
４９−７８Ｐ）、５％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４
０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから４つ
への分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り出し
、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。

【０３３４】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１２に記載のＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅプロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェクトする。ＥＧＲ−Ｓ
ＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させ
ることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的増殖のために使用するが、
１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖さ
せるべきである。

【０３３５】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
ある細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリー
ニングする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。
次いで、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ Ｆ
ＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓させる。

【０３３６】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中でよく懸濁する。細胞数をカウントし、そ
してより低血清の培地に添加し、５×１０⁵細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達さ せる。

【０３３７】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０⁵細胞／ウェルに等しい）。実施例１０により産生された５０μｌの上清を、 ３７℃で４８〜７２時間加える。陽性コントロールとして、ＥＧＲを介してＰＣ
１２細胞を活性化することが公知の成長因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経成
長因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導が
陽性コントロールウェルにおいて見られる。ＳＥＡＰは実施例に従って、上清を
アッセイする。

【０３３８】 （実施例１５：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−κＢ（核因子κＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−κＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−κＢは、アポトーシスから細胞を保護すると思われる）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発達、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。

【０３３９】 刺激されない条件において、ＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢ（インヒビターκＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−κＢはリン酸化され、そ
して分解（ｄｅｇｒａｄｅｄ）され、ＮＦ−κＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ
）を引き起こし、これにより標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−κＢにより
活性化される標的遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡ
Ｍ−１およびクラス１ＭＨＣが挙げられる。

【０３４０】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
κＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１２におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−κＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置に有用である。例えば、ＮＦ−κＢの
インヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−κＢの活性化に関連するこれらの疾
患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。

【０３４１】 ＮＦ−κＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−κＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号２４）の４つの直列のコピー、ＳＶ４０
初期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そし
てＸｈｏＩ部位に隣接する：

【０３４２】

【化１７】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号２６）。

【０３４３】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐβ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して行う。得ら
れたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＢＬ
ＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７プライマーお
よびＴ３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを
確認する：

【０３４４】

【化１８】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−κＢ／ＳＶ４０フラグメントと置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、そしてそれゆえ哺乳動物の発現系には好
ましくない。

【０３４５】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−κＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
詳細には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限した後に、ＮＦ−κＢ
／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入し、
ＧＦＰ遺伝子を置換した。

【０３４６】 一旦、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、そし
て維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をアッセ
イするための方法がまた、実施例に記載される。陽性コントロールとして、外因
性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、およびＨ１１に
添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。

【０３４７】 （実施例１６：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） これらの実施例に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥＡ
Ｐ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇ
ｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐｉ
ｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、ア
ッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。

【０３４８】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。

【０３４９】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液を満たす。５０ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液を満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、１回に
５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始するべきである。

【０３５０】 ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。

【０３５１】

【表３】 （実施例１７：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定する高処理能
力スクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、さらに膜電位を変化させること
は公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を行
うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセイ
を記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、また
は蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよう
に容易に改変し得る。

【０３５２】 以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を本明細書で用
いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−３の代わりに使用し得る。

【０３５３】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ₂ インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で二回洗浄し、最後の洗浄後、緩衝液１００μｌを残す。

【０３５４】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−３を負荷するため、
１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレー
トをＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレー トをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、緩衝液１００μｌを残
す。

【０３５５】 非接着細胞については、細胞を培養培地から遠心沈澱する。細胞を、５０ｍｌ
のコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０⁶細胞／ｍｌに再懸濁す る。細胞懸濁液各１ｍｌあたり、１０％プルロン酸ＤＭＳＯ溶液中の４μｌの１
ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３を加える。次いで、チューブを３７℃の水浴中に３０
〜６０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０⁶細胞／ｍｌに再懸濁 し、そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注する。プレートを１
０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ Ｃｅｌｌ
Ｗａｓｈ中で２００μｌで１回洗浄した後、最終容量を１００μｌにする吸引工
程を行う。

【０３５６】 細胞に基づかないアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−３のような蛍
光分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。

【０３５７】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷであり；（２）
曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり；
（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）発光は５３０ｎｍであり；そして（６）
サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍにおける発光の増加は、ＴＲ１１、
ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２のいずれかの分子、または、ＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２によって誘導される分子によって引
き起こされる細胞外シグナル伝達事象（これは細胞内Ｃａ⁺⁺濃度の増加を生じる
）を示す。

【０３５８】 （実施例１８：チロシンキナーゼ活性を同定する高処理能力スクリーニングア
ッセイ） タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、膜貫通キナーゼおよび細胞質キナ
ーゼの多様な群を表す。レセプタータンパク質チロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
には、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲のマイトジェン性および代謝性成長因子のレ
セプターがある。さらに、対応するリガンドが未知である大きなＲＰＴＫファミ
リーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌される低分子量タンパク質を
含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質も含む。

【０３５９】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化には、リガンド媒介レセプター二量体化が含
まれ、このリガンド媒介レセプター二量体化は、レセプターサブユニットのリン
酸基転移および細胞質チロシンキナーゼの活性化を生じる。細胞質チロシンキナ
ーゼとしては、ｓｒｃファミリー（例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、
ｆｙｎ）のレセプター関連チロシンキナーゼ、ならびにＪａｋファミリーのよう
な非レセプター結合型および細胞質ゾルタンパク質チロシンキナーゼが挙げられ
る。これらのメンバーは、サイトカインスーパーファミリー（例えば、インター
ロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦおよびレプチン）のレセプターによ
ってトリガーされるシグナル伝達を媒介する。

【０３６０】 広範な公知因子がチロシンキナーゼ活性を刺激し得るため、ＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１もしくはＴＲ１１ＳＶ２、またはＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１もしくはＴ
Ｒ１１ＳＶ２により誘導される分子がチロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性
化し得るかどうかを同定することは、興味深い。従って、チロシンキナーゼシグ
ナル伝達経路を活性化し得る分子を同定するために、以下のプロトコルが設計さ
れる。

【０３６１】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。このプレートを１００％エタノールで３０分間、二回リンスして滅菌し、水
でリンスし、そして一晩乾燥させる。いくつかのプレートを、１００ｍｌの細胞
培養グレードのＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポ
リリジン（５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あ
るいは仔ウシ血清で２時間コートし、ＰＢＳでリンスし、そして４℃で貯蔵する
。増殖培地に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するよう
に、ａｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量することに
より、これらのプレート上での細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７
１を使用してＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅを
覆う。Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、い
くつかの増殖実験において使用し得る。

【０３６２】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地中で一
晩培養する。無血清基本培地中で２４時間インキュベートして細胞を静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１０で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０
．１％ＳＤＳ，２ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄、２ｍＭ Ｎａ₄Ｐ₂Ｏ₇およびＢｏｅｈｅｒ ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手し
たプロテアーゼインヒビターのカクテル（＃１８３６１７０））を各ウェルに添
加し、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪させる。次に、プレー
トを真空トランスファーマニホールド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａ
ｎｉｆｏｌｄ）に配置し、そしてハウスバキュームを使用して各ウェル底の０．
４５ｍｍ膜を通じて抽出物を濾過する。抽出物をバキュームマニホールドの底の
９６ウェル捕獲／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離
により明澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェ
ルの内容物を取り出し、４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。

【０３６３】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つ
を記載する。

【０３６４】 一般に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化する
能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目的
に使用し得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄｃ
２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ酸
１〜１７に相当）が挙げられる。両ペプチドは、一定の範囲のチロシンキナーゼ
の基質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。

【０３６５】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを加え、次いで順に、ＡＴＰ／Ｍｇ²⁺（
５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）１０μｌ、５×アッセイ緩衝液（４０ ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＭｎＣｌ₂、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ）１０μｌ、バナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、そして水５μｌを加
える。これら成分を穏やかに混合し、この反応混合物を３０℃で２分間プレイン
キュベートする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えて反応を開始
させる。

【０３６６】 次に、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ１０μｌを添加して反応物を氷上に置くことによ
り、チロシンキナーゼアッセイ反応を終了させる。

【０３６７】 反応混合物の５０μｌアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モジ
ュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキナ
ーゼ活性を測定する。これにより、ストレプトアビジンコートした９６ウェルプ
レートとビオチン化ペプチドとを結合させる。ＭＴＰモジュールを３００μｌ／
ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ホス
ホチロシン抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウ
ェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように洗浄
する。

【０３６８】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（３０分間まで）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を
測定する。結合したペルオキシダーゼの活性レベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用
して定量する。これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。

【０３６９】 （実施例１９：リン酸化活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 実施例に記載のタンパク質チロシンキナーゼ活性アッセイに対して可能な代替
法および／または補完法として、主要な細胞内シグナル伝達中間体の活性化（リ
ン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。例えば、下記のように、一つの
特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２キナーゼのチロシンリン酸化を
検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８ ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナー
ゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、Ｉ
ＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の分子のリン酸化、ならびに他の任
意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニン分子を、以下のアッ
セイにおいてこれらの分子でＥｒｋ−１またはＥｒｋ−２を置き換えることによ
り検出し得る。

【０３７０】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次に、このプレートをＰＢＳでリンスし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで
ＲＴにて１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１および
Ｅｒｋ−２に対する２つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（
Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理する（ＲＴにて１
時間）。（他の分子を検出するため、上記の任意の分子を検出するモノクローナ
ル抗体と交換することにより、この工程を容易に改変し得る。）ＰＢＳで３〜５
回リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で貯蔵する。

【０３７１】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培地（Ｄ
ＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、ＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または実施例１
２で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し、抽出物
を直接アッセイプレート中に濾過する。

【０３７２】 抽出物を用いてＲＴにて１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスす
る。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル
）をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１および
Ｅｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクロー
ナル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴにて１時間）。この抗体
を標準的な手順によりビオチン化する。次に、結合したポリクローナル抗体を、
Ｗａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ装置において、ユーロピウム−ストレプトアビジン
およびユーロピウム蛍光増強試薬と連続してインキュベートすることによって定
量する（時間分解性蛍光）。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、
ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２、またはＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２により誘導された分子によるリン酸化を示す
。

【０３７３】 （実施例２０：ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２遺伝子に
おける変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者由来のＲ
ＮＡを単離する。次に、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分野で公知
のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。次に、こ
のｃＤＮＡを、配列番号１、配列番号２、または配列番号５における目的の領域
を取り囲むプライマーを用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆され
るＰＣＲ条件は、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０
６（１９９１）に記載の緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で
６０〜１２０秒間；および７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。

【０３７４】 次に、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’末端においてＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。ＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２の選択したエキソンのイントロン−
エキソン境界もまた決定し、ゲノムＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。
次に、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２に変異を疑われるＰ
ＣＲ産物のクローン化および配列決定を行い、直接配列決定の結果を確認する。

【０３７５】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２のＰＣＲ産物を、Ｈｏｌ
ｔｏｎ，Ｔ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（１９９１）に記載のようにＴテール化ベ
クターにクローン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には存在しない
、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２中の変異により同定する
。

【０３７６】 ゲノム再配置もまた、ＴＲ１１遺伝子における変化を決定する方法として観察
する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキシ−
ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いてニ
ックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９９１）に記載のようにＦＩＳＨ
を行う。ＴＲ１１ゲノム遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーションのために、
大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを行う。

【０３７７】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピングの
ための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却した電荷結合素子カメラ
（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および多様な励起波長フィ
ルター（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐ
ｌ．，８：７５（１９９１））とを組み合わせて用いて得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａ
ｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析および
染色体部分長測定を行う。（プローブがハイブリダイズした）ＴＲ１１、ＴＲ１
１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２のゲノム領域の染色体変化を、挿入、欠失お
よび転座として同定する。これらＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１
ＳＶ２の変化を関連疾患の診断マーカーとして使用する。

【０３７８】 （実施例２１：生物学的サンプル中のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴ
Ｒ１１ＳＶ２の異常レベルを検出する方法） ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドは、生物学
的サンプル中で検出され得、そしてＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１
１ＳＶ２レベルの上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特定
表現型のマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以下
のアッセイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解され
る。

【０３７９】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、サンプル中、好ましくは、
生物学的サンプル中のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２を検
出する。マイクロタイタープレートのウェルを、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、も
しくはＴＲ１１ＳＶ２に対する特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで
用いてコーティングする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルの
いずれかであって、実施例に記載の方法により産生される。ウェルに対するＴＲ
１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２の非特異的結合が減少するよう
に、このウェルをブロックする。

【０３８０】 次に、コーティングしたウェルを、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ
１１ＳＶ２を含有するサンプルを用いてＲＴで２時間を超えてインキュベートす
る。好ましくは、サンプルの系列希釈物を使用して結果を確認すべきである。次
に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗浄して、結合していないＴＲ１
１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２を除去する。

【０３８１】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄して、結合していない結合体を除去する。

【０３８２】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。この反応をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。
コントロールサンプルの系列希釈物を使用して標準曲線を作成し、そしてＸ軸（
対数目盛）にＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチド
濃度を、そしてＹ軸（線形目盛）に蛍光または吸光度をプロットする。標準曲線
を用いてサンプル中のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２の濃
度を内挿する。

【０３８３】 （実施例２２：ポリペプチドの処方） ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２組成物を、個々の患者の
臨床状態（特に、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプ
チド単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および実務者に公知の
他の因子を考慮に入れ、適正医療基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ）に一致する様式で処方および投薬する。従って、本明細書における目的
のための「有効量」は、このような考慮により決定される。

【０３８４】 一般的提案として、非経口的に投与されるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしく
はＴＲ１１ＳＶ２の、用量当りの総薬学的有効量は、患者体重につき約１μｇ／
ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記のように、これは治療的裁
量に属する。さらに好ましくは、このホルモンに関しては、この用量は、少なく
とも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、ヒトについて最も好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋ
ｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、Ｔ
Ｒ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約
５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で、１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注
入（例えばミニポンプを用いて）のいずれかにより投与する。静脈内バッグ溶液
もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および処置後に応答が
生じる間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。

【０３８５】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２を含む薬学的組成物を、
経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、
点滴剤、または経皮パッチによるような）、口腔内に、あるいは経口または鼻腔
スプレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体
、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材、または任意の型の製剤補助剤を
いう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨
内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。

【０３８６】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２はまた、徐放性システム
により適切に投与される。徐放性組成物の適切な例は、成形品（例えば、フィル
ム）またはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを包含する
。徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートと
のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７
−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．
Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７
７（１９８１）、およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−
１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら）、ま
たはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられ
る。徐放性組成物はまた、リポソームに封入されたＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、
もしくはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドを包含する。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、
もしくはＴＲ１１ＳＶ２を含有するリポソームは、それ自体公知である方法によ
り調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗ
ａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−
４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４
６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８
００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；な
らびにＥＰ１０２，３２４。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å
）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロール
よりも多く、選択された比率は、最適分泌ポリペプチド治療のために調整される
。

【０３８７】 非経口投与のために、１つの実施態様において、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、
もしくはＴＲ１１ＳＶ２は、一般に、それを所望の純度で、薬学的に受容可能な
キャリア（すなわち、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がな
く、かつ処方物の他の成分と適合するもの）と、単位投薬量の注射可能な形態（
溶液、懸濁液、または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この
処方物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが
知られている他の化合物を含まない。

【０３８８】 一般に、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２を液体キャリア
または微細に分割した固体キャリアあるいはその両方と均一かつ緊密に接触させ
て処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。
好ましくは、キャリアは、非経口的キャリアであり、より好ましくはレシピエン
トの血液と等張な溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、
生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性
油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に
本明細書において有用である。

【０３８９】 キャリアは、微量の添加剤（等張性および化学的安定性を高める物質）を適切
に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対し
て毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、
酢酸および他の有機酸またはその塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗
酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギ
ニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンの
ようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、
グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロース
またはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、
二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまた
はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／
またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活
性剤が挙げられる。

【０３９０】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２は、代表的には、約０．
１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約
３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記のいくつかの賦形剤
、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポリペプチド塩が形成される
ことは理解される。

【０３９１】 治療的投与に用いられるべきＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１Ｓ
Ｖ２は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で
濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療用ポリペプチド
組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穿刺可能な
ストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアル内に置かれる。

【０３９２】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２は、通常、単位用量また
は複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成
用凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌバイ
アルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴ
Ｒ１１ＳＶ２ポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結
乾燥する。凍結乾燥したＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴＲ１１ＳＶ２ポ
リペプチドを、静菌注射水を用いて再構成することにより、注入溶液を調製する
。

【０３９３】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物製剤の製
造、使用または販売を規制する政府当局が定めた形式の告知が、このような容器
に添付され得、この告知は、政府当局による、ヒトへの投与のための製造、使用
または販売の認可を表示する。さらに、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、もしくはＴ
Ｒ１１ＳＶ２は、他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。

【０３９４】 （実施例２３：ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２のレベルの減
少を処置する方法） 本発明は、体内のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２の活性のレ
ベルの減少の必要がある個体を処置するための方法に関する。この方法は、治療
有効量のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２アンタゴニストを含む
組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。本発明における使用のため
の好ましいアンタゴニストは、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２
特異的抗体である。

【０３９５】 さらに、個体におけるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２の標準
的または正常な発現レベルにおける減少によって生じる条件は、ＴＲ１１、ＴＲ
１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２を、好ましくは分泌形態で投与することによっ
て処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドのレベルの増加を必要とする個体の処
置の方法を提供する。この方法は、このような個体におけるＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２の活性レベルを増加する量のＴＲ１１、ＴＲ１１Ｓ
Ｖ１またはＴＲ１１ＳＶ２を含む薬学的組成物をそのような個体に投与する工程
を包含する。

【０３９６】 例えば、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドのレベ
ルが減少した患者は、６連続日にわたって一日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇの
ポリペプチドを受ける。好ましくは、このポリペプチドは分泌形態である。投与
および処方に基づく投与スキームの正確な詳細は、実施例２２に提供される。

【０３９７】 （実施例２４：ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２のレベルの増
加を処置する方法） 本発明はまた、体内のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２の活性
のレベルの増加を必要とする個体を処置するための方法に関する。この方法は、
ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１もしくはＴＲ１１ＳＶ２またはそのアゴニストの治療
有効量を含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。

【０３９８】 アンチセンス技術を使用して，ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ
２の産生を阻害する。この技術は、種々の病因（例えば、ガン）に起因する、Ｔ
Ｒ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチド（好ましくは分泌形
態）のレベルを減少する方法の一例である。

【０３９９】 例えば、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２のレベルの異常増加
と診断された患者にアンチセンスポリヌクレオチドが、０．５、１．０、１．５
、２．０および３．０ｍｇ／ｋｇ日で２１日間にわたって静脈投与される。この
処置は、その処置が充分に寛容された場合、７日間の休養期間の後に反復される
。アンチセンスポリヌクレオチドの処方物は、実施例２２に提供される。

【０４００】 （実施例２５：エキソビボで遺伝子治療を使用する処置方法） 遺伝子治療の１つの方法は、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２
ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移植する方法である。一般に、線
維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を組織培養培地中に
配置し、小片に分割する。小塊の組織を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、ほ
ぼ１０片を各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室
温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコ
の底に固定させたままにし、そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリ
ンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に
、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。

【０４０１】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、さらに大
きなフラスコにスケールアップする。

【０４０２】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。

【０４０３】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２をコードするｃＤＮＡを、上
記の実施例に記載のそれぞれ５’および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマ
ーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み
、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙ
マウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフ
ラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物
を二つのフラグメントを連結するのに適した条件下で維持する。次に、連結混合
物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する。次に、それを、カナマイシンを含
む寒天上にプレーティングし、ベクターが正確に挿入されたＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２を有することを確認する。

【０４０４】 両種向性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウ
シ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ
改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中の組織培養でコンフルエントな密度まで増
殖させる。次に、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２遺伝子を含む
ＭＳＶベクターを培地に加え、パッケージング細胞にベクターを形質導入する。
このとき、パッケージング細胞はＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ
２遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、このパッケージング細
胞をプロデューサー細胞という）。

【０４０５】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地をミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれたプ
ロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞に感染させる
。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロデ
ューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新鮮
培地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞が
感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏまたはｈｉｓの
ような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要であ
る。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分析し、ＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２タンパク質が産生されているか否かを決
定する。

【０４０６】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。

【０４０７】 （実施例２６：インビボでの遺伝子治療を用いる処置の方法） 本発明の別の局面は、インビボ遺伝子治療方法を用いて障害、疾患、および状
態を処置することである。この遺伝子治療方法は、裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡお
よびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１
１ＳＶ２配列を動物に導入してＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２
ポリペプチドの発現を増加または減少させることに関する。このＴＲ１１、ＴＲ
１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチドを、標的組織によるＴＲ１１
、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドの発現に必要なプロモータ
ーまたは任意のほかの遺伝的エレメントに作動可能に連結し得る。このような遺
伝子治療および送達技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９
０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５，６９３，６２２号、同
５，７０５，１５１号、同５，５８０，８５９号；Ｔａｂａｔａ Ｈ．ら（１９
９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９、Ｃｈａｏ
Ｊら（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２
、Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．
７（５）：３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら、（１９９６）Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．３（５）：４０５−４１１、Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、（１９９６
）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３２９０（本明細書にお
いて参考として援用される）を参照のこと。

【０４０８】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチド構築物を、
動物の細胞へ注射可能な物質を送達する任意の方法、例えば、組織（例えば、心
臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間質空間への注射によって送達し得る。
ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチド構築物を、薬
学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達し得る。

【０４０９】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡとは、ウイルス配列、ウ
イルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチンまたは沈澱剤などを含む、細胞
への進入を補助、促進または容易にする作用をする送達ビヒクルをいずれも含ま
ない配列をいう。しかし、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリ
ヌクレオチドはまた、リポソーム処方物において送達され得る（例えば、Ｆｅｌ
ｇｎｅｒ Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：
１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら、（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ ８５（１）：１−７に教示されるもの）。これは、当業者に周知の方法に
よって調製され得る。

【０４１０】 この遺伝子治療方法において使用されるＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ
１１ＳＶ２ポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み
込まれないか、または複製を可能にする配列を含まない構築物である。当業者に
公知の任意の強力なプロモーターを、ＤＮＡの発現の駆動のために使用し得る。
他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要
な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究
によって、非複製性のＤＮＡ配列が細胞に導入されて６ヶ月までの期間の間所望
のポリペプチドの産生を提供し得ることを示した。

【０４１１】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチド構築物は、
動物内の組織の間質空間に送達され得、これには、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、
脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸
、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織のものが含まれる
。この組織の間質空間は、細胞間液、器官組織の細網線維の間のムコ多糖類マト
リクス、管または室（房）の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維
、あるいは筋肉を覆う結合組織内または骨小窩内の同じマトリクスを含む。これ
は同様に循環中の血漿およびリンパチャネルのリンパ液によって占められる空間
である。筋肉組織の間質空間への送達が以下に記載する理由のために好ましい。
これらは、これらの細胞を含む組織への注入によって簡便に送達され得る。これ
らは、好ましくは、分化した持続的で非分裂性の細胞へと送達し、そして発現さ
せるが、送達および発現は、分化していないかまたはあまり完全には分化してい
ない細胞（例えば、血液幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成し得る。イ
ンビボ筋肉細胞は、それらがポリヌクレオチドを取り込みそして発現する能力に
おいて特に適合している。

【０４１２】 裸のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチド注入に
ついて、有効投薬用量のＤＮＡまたはＲＮＡは、約０．０５ｇ／ｋｇ体重〜約５
０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ
／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋ
ｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。当然、当業者が理解するように、この投薬量は、注
入の組織部位に従って変動する。適切かつ有効な投薬量の核酸配列は、当業者に
よって容易に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。
好ましい投与経路は、組織の間質空間への注入という非経口経路による。しかし
、他の非経口経路もまた使用し得る（例えば、特に肺または気道組織、咽頭また
は鼻粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入）。さらに、裸のＴＲ１１、
ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリヌクレオチド構築物を、この手順にお
いて使用されるカテーテルによる血管形成の間に動脈へと送達し得る。

【０４１３】 筋肉へインビボで注入されたＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２
ポリヌクレオチドの用量応答効果を以下のように決定する。ＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチドをコードする、ｍＲＮＡの産生のため
に適切なＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２テンプレートＤＮＡを
、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。このテンプレートＤＮＡは、
環状または線状でありうるが、裸のＤＮＡまたはリポソームと複合体化されたＤ
ＮＡとしてのいずれかで使用され得る。次いで、マウスの四肢筋肉にこのテンプ
レートＤＮＡの種々の量を注入する。

【０４１４】 ５〜６週齢の雌性および雄性Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、０．３ｍｌの２．５％Ａ
ｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することによって麻酔する。前大腿に１．５ｃｍの切
込みを入れ、そして四頭筋を直接可視化する。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１または
ＴＲ１１ＳＶ２テンプレートＤＮＡを、１分間かけて、膝に向って筋肉の遠位挿
入部位から約０．５ｃｍで、そして約０．２ｃｍの深さに、２７ゲージの針を通
して１ｃｃシリンジ中の０．１ｍｌのキャリア中で注入する。さらなる局在化の
ために、その注入部位にわたって縫合糸を施し、そしてその皮膚をステンレス鋼
クリップで閉じる。

【０４１５】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を四頭筋全体
を切除することによって調製する。個々の四頭筋の５つの１５μｍの切片ごとに
ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２タンパク質発現について組織化
学的に染色する。ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２タンパク質発
現についての時間経過を、異なるマウスからの四頭筋を異なる時点で採取したこ
とを除いて類似の様式で行い得る。注入後のＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴ
Ｒ１１ＳＶ２ ＤＮＡの筋肉での持続を、注入したマウスおよびコントロールマ
ウスからの総細胞ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後のサザンブロット分析
によって決定し得る。マウスにおける上記の実験の結果を使用して、ＴＲ１１、
ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２の裸のＤＮＡを用いたヒトおよび他の動物
における適切な投薬量および他の処置パラメータを推定し得る。

【０４１６】 本発明は、上記の説明および実施例で詳細に記載した通り以外にも、実施し得
ることは明らかである。

【０４１７】 本発明の数多くの改変および変更は、上記の教示を考慮すれば可能であり、そ
してそれ故、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。

【０４１８】 本明細書において引用した全ての文献（特許、特許出願、雑誌論文、抄録、実
験マニュアル、書籍または他の開示を含む）の全開示は、本明細書中で参考とし
て援用される。

【０４１９】 さらに、本明細書とともに提出した配列表、ならびに米国仮特許出願第６０／
０６３，２１２号（１９９７年１０月２１日出願）（この出願に対して、本願は
、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく出願日の利益を主張する）とともに提出
した配列表および図４Ａは、コンピューターおよび紙の形態の両方の形態で、各
々がその全体が参考として本明細書において援用される。

【０４２０】

【表４】

【０４２１】

【表５】

【０４２２】

【表６】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａおよび１Ｂは、ＴＲ１１レセプターの、ヌクレオチド配列（配列番号１
）および推定のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。完全なポリペプチドについ
て、約２５アミノ酸残基の潜在的な分泌リーダー配列が予想された。この予想分
泌リーダー配列には、図１Ａおよび１Ｂにおいて下線を引いている（配列番号２
におけるアミノ酸残基−２５〜−１）。推定の全アミノ酸配列は、２３４アミノ
酸残基を含み、そして約２５，１１３Ｄａの推定分子量を有する。さらに、図１
Ａおよび１Ｂにおいて約２６〜約１６２のアミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸
残基１〜１３７）は、細胞外ドメインを構成すること；約１６３〜約１７９のア
ミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸残基１３８〜１５４）は、膜貫通ドメインを
構成すること；および約１８０〜約２３４のアミノ酸残基（配列番号２のアミノ
酸残基１５５〜２０９）は、細胞内ドメインを構成することが予想される。

【図２】 図２Ａおよび２Ｂは、ＴＲ１１ＳＶ１レセプターの、ヌクレオチド配列（配列
番号３）および推定のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。推定の全アミノ酸配
列は、２４１アミノ酸残基を含み、そして約２６，０２９Ｄａの推定分子量を有
する。さらに、図２Ａおよび２Ｂにおいて約１〜約１６２のアミノ酸残基（配列
番号４のアミノ酸残基１〜１６２）は、細胞外ドメインを構成すること；約１６
３〜約１７９のアミノ酸残基（配列番号４のアミノ酸残基１６３〜１７９）は、
膜貫通ドメインを構成すること；および約１８０〜約２４１のアミノ酸残基（配
列番号４のアミノ酸残基１８０〜２４１）は、細胞内ドメインを構成することが
予想される。

【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、ＴＲ１１ＳＶ２レセプターの、ヌクレオチド配列（配列
番号５）および推定のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。完全なポリペプチド
について、約１９アミノ酸残基の潜在的な分泌リーダー配列が予想された。この
予想分泌リーダー配列には、図３Ａおよび３Ｂにおいて下線を引いている（配列
番号６におけるアミノ酸残基−１９〜−１）。推定の全アミノ酸配列は、２４０
アミノ酸残基を含み、そして約２５，７２７Ｄａの推定分子量を有する。さらに
、図１Ａおよび１Ｂにおいて約２０〜約１６８のアミノ酸残基（配列番号６のア
ミノ酸残基１〜１４９）は、細胞外ドメインを構成すること；約１６３〜約１８
５のアミノ酸残基（配列番号６のアミノ酸残基１５０〜１６６）は、膜貫通ドメ
インを構成すること；および約１８６〜約２４０のアミノ酸残基（配列番号６の
アミノ酸残基１６７〜２２１）は、細胞内ドメインを構成することが予想される
。 単独の潜在的なアスパラギン結合型グリコシル化部位を、ＴＲ１１、ＴＲ１１
ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２のアミノ酸配列中に印をつけている。グリコシル
化の潜在的部位は、図１Ａおよび１Ｂ中のアスパラギン−１４６（配列番号２、
中のアスパラギン−１２１）であり、図２Ａおよび２Ｂ中のアスパラギン−１４
６（配列番号４、中のアスパラギン−１４６）であり、そして、図３Ａおよび３
Ｂ中のアスパラギン−１５２（配列番号６、中のアスパラギン−１３３）である
。潜在的なグリコシル化部位は、図１Ａおよび１Ｂ、２Ｂおよび２Ｂならびに３
Ａおよび３Ｂにおいて、アミノ酸配列中にアスパラギン（Ｎ）の太字の１文字略
語と対になったヌクレオチド配列上の太字枠記号（＃）を用いてマークしている
。 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２と密接に関係したマウスＧ
ＩＴＲ（これらの配列のアラインメントは図４Ａおよび４Ｂに示す）との間の高
い同一性の領域には、図１Ａおよび１Ｂ、２Ｂおよび２Ｂならびに３Ａおよび３
Ｂにおいて、二重下線で線引きしている。これらの領域は、制限するものではな
く、そして図１Ａおよび１Ｂ、２Ｂおよび２Ｂならびに３Ａおよび３Ｂにおいて
、保存ドメイン（（ＣＤ）−ＩＩ、ＣＤ−ＩＩＩ、ＣＤ−ＩＶ、ＣＤ−Ｖ、ＣＤ
−ＶＩ、ＣＤ−ＶＩＩ、ＣＤ−ＩＸおよびＣＤ−Ｘ）として標識される。保存ド
メイン（ＣＤ）−Ｉは、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２でのみ見出され（
すなわち図２Ｂおよび２Ｂならびに３Ａおよび３Ｂ）、そしてＣＤ−ＶＩＩＩは
ＴＲ１１ＳＶ１でのみ見出される（すなわち、図２Ａおよび２Ｂ）。

【図４】 図４Ａおよび４Ｂは、マウスの糖質コルチコイド誘導腫瘍壊死因子レセプター
ファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）レセプター様分子、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ
１、およびＴＲ１１ＳＶ２（それぞれ、配列番号７、配列番号２、配列番号４お
よび配列番号６）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。この図で示されるＴ
Ｒ１１アミノ酸配列のナンバリングは、それぞれ図１Ａおよび１Ｂ、２Ｂおよび
２Ｂならびに３Ａおよび３Ｂにおいて、示されたナンバリングに対応する。この
アラインメントは、ＤＮＡ＊Ｓｔａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓコ
ンピュータープログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）の「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」
モジュールを用いて生み出された。ＴＲ１１のアミノ酸残基と同一性を有さない
ｍＧＩＴＲ、ＴＲ１１ＳＶ１およびＴＲ１１ＳＶ２のアミノ酸残基は、アライン
メント中で黒でハイライトしている。ｍＧＩＴＲのＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、
Ｕ８２５３４である（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇら、Ｃｉｒｃ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：６２１６−６２２１（１９９７））。

【図５】 図５，６、および７は、それぞれ図１Ａおよび１Ｂ、２Ｂおよび２Ｂならびに
３Ａおよび３ＢのＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプター
アミノ酸配列の構造分析を示す。α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領
域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可橈性領域；抗原性指数ならびに表面
確率が示される。 ＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータープログラムはまた、表の様式で、図５，６お
よび７において示された同一のデータを示す。このような表の様式は、本発明の
１つ以上の局面の実施を補助し得る。ここでは、本発明の特定の構造または他の
特徴が本明細書の図５，６および７に示されたデータに従って描写されている。
図５，６および／もしくは７に示されたデータから同定され得る、またはデフォ
ルト設定にセットされたＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータープログラムを用いた同
一のデータから慣用的に生成した表の表示から同定され得る、本発明のポリペプ
チドのこのような構造もしくは他の特徴、またはこのようなポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドのこのような構造もしくは他の特徴は、以下を含むがこ
れに限定されない：α領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；α領域−Ｃｈｏｕ
−Ｆａｓｍａｎ；β領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；β領域−Ｃｈｏｕ−
Ｆａｓｍａｎ；ターン領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ターン領域−Ｃｈ
ｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；コイル領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；コイル領域
−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；親水性プロット−Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ；
α両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；β両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；
可撓性領域−Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ；抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗ
ｏｌｆ；および表面確率プロット−Ｅｍｉｎｉ。これらの構造をコードするポリ
ヌクレオチドまたは他の特徴は、本発明の好ましい実施態様である。

【図６】 図５，６、および７は、それぞれ図１Ａおよび１Ｂ、２Ｂおよび２Ｂならびに
３Ａおよび３ＢのＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプター
アミノ酸配列の構造分析を示す。α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領
域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可橈性領域；抗原性指数ならびに表面
確率が示される。 ＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータープログラムはまた、表の様式で、図５，６お
よび７において示された同一のデータを示す。このような表の様式は、本発明の
１つ以上の局面の実施を補助し得る。ここでは、本発明の特定の構造または他の
特徴が本明細書の図５，６および７に示されたデータに従って描写されている。
図５，６および／もしくは７に示されたデータから同定され得る、またはデフォ
ルト設定にセットされたＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータープログラムを用いた同
一のデータから慣用的に生成した表の表示から同定され得る、本発明のポリペプ
チドのこのような構造もしくは他の特徴、またはこのようなポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドのこのような構造もしくは他の特徴は、以下を含むがこ
れに限定されない：α領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；α領域−Ｃｈｏｕ
−Ｆａｓｍａｎ；β領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；β領域−Ｃｈｏｕ−
Ｆａｓｍａｎ；ターン領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ターン領域−Ｃｈ
ｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；コイル領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；コイル領域
−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；親水性プロット−Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ；
α両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；β両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；
可撓性領域−Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ；抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗ
ｏｌｆ；および表面確率プロット−Ｅｍｉｎｉ。これらの構造をコードするポリ
ヌクレオチドまたは他の特徴は、本発明の好ましい実施態様である。

【図７】 図５，６、および７は、それぞれ図１Ａおよび１Ｂ、２Ｂおよび２Ｂならびに
３Ａおよび３ＢのＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２レセプター
アミノ酸配列の構造分析を示す。α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領
域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可橈性領域；抗原性指数ならびに表面
確率が示される。 ＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータープログラムはまた、表の様式で、図５，６お
よび７において示された同一のデータを示す。このような表の様式は、本発明の
１つ以上の局面の実施を補助し得る。ここでは、本発明の特定の構造または他の
特徴が本明細書の図５，６および７に示されたデータに従って描写されている。
図５，６および／もしくは７に示されたデータから同定され得る、またはデフォ
ルト設定にセットされたＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータープログラムを用いた同
一のデータから慣用的に生成した表の表示から同定され得る、本発明のポリペプ
チドのこのような構造もしくは他の特徴、またはこのようなポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドのこのような構造もしくは他の特徴は、以下を含むがこ
れに限定されない：α領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；α領域−Ｃｈｏｕ
−Ｆａｓｍａｎ；β領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；β領域−Ｃｈｏｕ−
Ｆａｓｍａｎ；ターン領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ターン領域−Ｃｈ
ｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；コイル領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；コイル領域
−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；親水性プロット−Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ；
α両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；β両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；
可撓性領域−Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ；抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗ
ｏｌｆ；および表面確率プロット−Ｅｍｉｎｉ。これらの構造をコードするポリ
ヌクレオチドまたは他の特徴は、本発明の好ましい実施態様である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム. アメリカ合衆国 メリーランド 20832, オルニー， ヘリテッジ ヒルズ ドラ イブ 18528

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下からなる群より選択される配列に少なくとも９５％の同
   一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分
   子： （ａ）図１Ａおよび１Ｂに示される全アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸残
   基−２５〜２０９）を有するＴＲ１１ポリぺプチドをコードするヌクレオチド配
   列； （ｂ）図２Ａおよび２Ｂに示される全アミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸残
   基１〜２４１）を有するＴＲ１１ＳＶ１ポリぺプチドをコードするヌクレオチド
   配列； （ｃ）図３Ａおよび３Ｂに示される全アミノ酸配列（配列番号６のアミノ酸残
   基−１９〜２２１）を有するＴＲ１１ＳＶ２ポリぺプチドをコードする、ヌクレ
   オチド配列； （ｄ）図１Ａおよび１Ｂに示される全アミノ配列をコードするが、Ｎ末端メチ
   オニンを欠く、ヌクレオチド（すなわち配列番号２のアミノ酸残基−２４〜２０
   ９）； （ｅ）図２Ａおよび２Ｂに示される全アミノ配列をコードするが、Ｎ末端メチ
   オニンを欠く、ヌクレオチド（すなわち配列番号４のアミノ酸残基２〜２４０）
   ； （ｆ）図３Ａおよび３Ｂに示される全アミノ配列をコードするが、Ｎ末端メチ
   オニンを欠く、ヌクレオチド（すなわち配列番号６のアミノ酸残基−１８〜２２
   １）； （ｇ）図１Ａおよび１Ｂのアミノ酸配列２６位から２３４位まで（配列番号２
   のアミノ酸残基１〜２０９）を含む推定成熟ＴＲ１１レセプターをコードする、
   ヌクレオチド配列； （ｈ）図３Ａおよび３Ｂのアミノ酸配列２０位から２４０位まで（配列番号６
   のアミノ酸残基１〜２２１）を含む推定成熟ＴＲ１１ＳＶ２レセプターをコード
   する、ヌクレオチド配列； （ｉ）ＡＴＣＣ受託番号２０９３４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
   ードされる全アミノ酸配列を有するＴＲ１１ポリぺプチドをコードする、ヌクレ
   オチド配列； （ｊ）ＡＴＣＣ受託番号２０９３４１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
   ードされる全アミノ酸配列を有するＴＲ１１ＳＶ１ポリぺプチドをコードする、
   ヌクレオチド配列； （ｋ）ＡＴＣＣ受託番号２０９３４２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
   ードされる全アミノ酸配列を有するＴＲ１１ＳＶ２ポリぺプチドをコードする、
   ヌクレオチド配列； （ｌ）ＡＴＣＣ受託番号２０９３４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
   ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ１１レセプターをコードする、ヌクレ
   オチド配列； （ｍ）ＡＴＣＣ受託番号２０９３４１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
   ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ１１ＳＶ１レセプターをコードする、
   ヌクレオチド配列； （ｎ）ＡＴＣＣ受託番号２０９３４２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
   ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ１１ＳＶ２レセプターをコードする、
   ヌクレオチド配列； （ｏ）ＴＲ１１レセプター細胞外ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｐ）ＴＲ１１ＳＶ１レセプター細胞外ドメインをコードする、ヌクレオチド
   配列； （ｑ）ＴＲ１１ＳＶ２レセプター細胞外ドメインをコードする、ヌクレオチド
   配列； （ｒ）ＴＲ１１レセプター膜貫通ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｓ）ＴＲ１１ＳＶ１レセプター膜貫通ドメインをコードする、ヌクレオチド
   配列； （ｔ）ＴＲ１１ＳＶ２レセプター膜貫通ドメインをコードする、ヌクレオチド
   配列； （ｕ）ＴＲ１１レセプター細胞内ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｖ）ＴＲ１１ＳＶ１レセプター細胞内ドメインをコードする、ヌクレオチド
   配列； （ｗ）ＴＲ１１ＳＶ２レセプター細胞内ドメインをコードする、ヌクレオチド
   配列； （ｘ）膜貫通ドメインのすべてまたは一部を欠失し、ＴＲ１１レセプター細胞
   外ドメインおよび細胞内ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｙ）膜貫通ドメインのすべてまたは一部を欠失し、ＴＲ１１ＳＶ１レセプタ
   ー細胞外ドメインおよび細胞内ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｚ）膜貫通ドメインのすべてまたは一部を欠失し、ＴＲ１１ＳＶ２レセプタ
   ー細胞外ドメインおよび細胞内ドメインをコードする、ヌクレオチド配列；およ
   び （ａａ）(ａ)、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
   （ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、
   （ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、(ｗ)、（ｘ）、（ｙ）または（ｚ）
   のいずれか１つのヌクレオチド配列に相補的な、ヌクレオチド配列。
2. 【請求項２】請求項１に記載の核酸分子であって、ここで前記ポリヌクレオ
   チドは、ＡＴＣＣ受託番号２０９３４２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
   ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ１１ＳＶ２レセプターポリペプチドを
   コードする、ヌクレオチド配列を有する、核酸分子。
3. 【請求項３】 請求項１の(ａ)、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）
   、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）
   、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、(ｗ)、（ｘ）、
   （ｙ）、（ｚ）または（ａａ）に記載のヌクレオチド配列に同一のヌクレオチド
   配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
   条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であっ
   て、ここで該ハイブリダイズするポリヌクレオチドが、Ａ残基のみ、またはＴ残
   基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェン
   トなハイブリダイゼーション条件下ではハイブリダイズしない、単離された核酸
   分子。
4. 【請求項４】 請求項１の(ａ)、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）
   、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）
   、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、(ｗ)、（ｘ）、
   （ｙ）、（ｚ）または（ａａ）に記載のアミノ酸配列を有するＴＲ１１、ＴＲ１
   １ＳＶ１、またはＴＲ１１ＳＶ２レセプターのエピトープ保有部分のアミノ酸配
   列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、以下： 配列番号２の約Ａｒｇ−２位からＧｌｙ−１１位までのアミノ酸残基を含むポ
   リぺプチド；配列番号２の約Ｔｈｒ−１８位から約Ａｒｇ−２６位までのアミノ
   酸残基を含むポリぺプチド；配列番号２の約Ａｒｇ−３４位から約Ｃｙｓ−４２
   位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号２の約Ａｒｇ−３１位から
   約Ｇｌｕ−３９位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号２の約Ｇｌ
   ｙ−３８位からＡｓｐ−４６位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番
   号２の約Ｇｌｙ−７４位から約Ｓｅｒ−８２位までのアミノ酸残基を含むポリぺ
   プチド；配列番号２の約Ｇｌｕ−１００位から約Ａｓｐ−１０８位までのアミノ
   酸残基を含むポリぺプチド；配列番号２の約Ｐｈｅ−１１８位から約Ａｌａ−１
   ２６位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号２の約Ｇｌｙ−１３１
   位からＧｌｙ−１３９位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号２の
   約Ｐｒｏ−１７８位から約Ｃｙｓ−１８６位までのアミノ酸残基を含むポリぺプ
   チド；および配列番号２の約Ｓｅｒ−１９７位から約Ｇｌｙ−２０５位までのア
   ミノ酸残基、を含むポリぺプチドからなる群より選択されるＴＲ１１レセプター
   ポリぺプチドのエピトープ保有部分をコードする、単離された核酸分子。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、以下： 配列番号４の約Ａｌａ−２位からＩｌｅ−１０位までのアミノ酸残基を含むポ
   リぺプチド；配列番号４の約Ａｓｎ−１１位から約Ｇｌｙ−１９位までのアミノ
   酸残基を含むポリぺプチド；配列番号４の約Ｔｈｒ−２７位から約Ｓｅｒ−３５
   位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号４の約Ｔｒｐ−３８位から
   約Ｇｌｕ−４６位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号４の約Ｇｌ
   ｙ−４２位からＳｅｒ−５０位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番
   号４の約Ｇｌｕ−３１位から約Ｇｌｕ−４６位までのアミノ酸残基を含むポリぺ
   プチド；配列番号４の約Ｃｙｓ−６１位から約Ｇｌｕ−６９位までのアミノ酸残
   基を含むポリぺプチド；配列番号４の約Ｇｌｙ−９９位から約Ｓｅｒ−１０７位
   までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号４の約Ｇｌｕ−１２５位から
   Ａｓｐ−１３３位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号４の約Ｐｈ
   ｅ−１４３位から約Ａｌａ−１５１位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；
   配列番号４の約Ｇｌｙ−１５６位から約Ｇｌｙ−１６４位までのアミノ酸残基を
   含むポリぺプチド；配列番号４の約Ｃｙｓ−１９６位から約Ｌｅｕ−２０４位ま
   でのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号４の約Ｐｒｏ−２０９位から約
   Ｓｅｒ−２１７位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；および配列番号４の
   約Ｓｅｒ−２２９位からＧｌｙ−２３７位までのアミノ酸残基、を含むポリぺプ
   チドからなる群より選択されるＴＲ１１ＳＶ１レセプターポリぺプチドのエピト
   ープ保有部分をコードする、単離された核酸分子。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、以下： 配列番号６の約Ｇｌｎ−１位からＣｙｓ−９位までのアミノ酸残基を含むポリ
   ぺプチド；配列番号６の約Ｇｌｙ−５位から約Ａｒｇ−１３位までのアミノ酸残
   基を含むポリぺプチド；配列番号６の約Ｔｈｒ−１８位から約Ａｒｇ−２６位ま
   でのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号６の約Ｔｈｒ−２９位から約Ｐ
   ｒｏ−３７位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号６の約Ｃｙｓ−
   ４８位からＧｌｕ−５６位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号６
   の約Ｖａｌ−８７位から約Ｐｈｅ−９５位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチ
   ド；配列番号６の約Ｈｉｓ−１１１位から約Ｔｈｒ−１１９位までのアミノ酸残
   基を含むポリぺプチド；配列番号６の約Ｐｈｅ−１３０位から約Ａｌａ−１３８
   位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号６の約Ｇｌｙ−１４３位か
   らＧｌｙ−１５１位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド；配列番号６の約Ｐ
   ｒｏ−１９０位から約Ｃｙｓ−１９８位までのアミノ酸残基を含むポリぺプチド
   ；および配列番号６の約Ｓｅｒ−２０９位から約Ｇｌｙ−２１７位までのアミノ
   酸残基、を含むポリぺプチドを含むポリぺプチドからなる群より選択されるＴＲ
   １１ＳＶ２レセプターポリぺプチドのエピトープ保有部分をコードする、単離さ
   れた核酸分子。
8. 【請求項８】 以下からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチ
   ドを含む、単離された核酸分子： （ａ）配列番号１に示された配列のフラグメントのヌクレオチド配列であって
   、ここで、該フラグメントは、配列番号１から、少なくとも３０〜５０の連続す
   るヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列であって、ただし該単離された核酸分
   子は、配列番号８、配列番号９またはそれらの任意のサブフラグメントでない； （ｂ）配列番号３に示された配列のフラグメントのヌクレオチド配列であって
   、ここで、該フラグメントは、配列番号３から、少なくとも３０〜５０の連続す
   るヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列であって、ただし該単離された核酸分
   子は、配列番号８、配列番号９またはそれらの任意のサブフラグメントでない； （ｃ）配列番号５に示された配列のフラグメントのヌクレオチド配列であって
   、ここで、該フラグメントは、配列番号５から、少なくとも３０〜５０の近接す
   るヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列であって、ただし該単離された核酸分
   子は、配列番号８、配列番号９またはそれらの任意のサブフラグメントでない； （ｄ）上記、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的なヌク
   レオチド配列。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入する
   工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法によって産生された、組換えベクタ
    ー。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する
    工程を包含する、組換え宿主細胞を作製するための方法。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の方法によって産生された、組換え宿主
    細胞。
13. 【請求項１３】 ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１またはＴＲ１１ＳＶ２ポリぺプ
    チドを産生するための組換えをする方法であって、請求項１２に記載の組換え宿
    主細胞を、該ポリぺプチドが発現されるような条件下で培養する工程、および該
    ポリぺプチドを回収する工程、を包含する、方法。
14. 【請求項１４】 以下からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同
    一であるアミノ配列を有する、単離されたポリぺプチド： （ａ）リーダーを含む、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるＴＲ１１ポ
    リペプチド； （ｂ）リーダーを含まない、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるＴＲ１
    １ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）； （ｃ）リーダーを含む、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のＴＲ１１ポリペプ
    チド； （ｄ）リーダーを含むがＮ末端メチオニンを欠く、図１Ａおよび１Ｂ（配列番
    号２）のＴＲ１１ポリペプチド； （ｅ）リーダーを含まない、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のポリペプチド
    ； （ｆ）図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるＴＲ１１レセプターの細胞
    外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン； （ｇ）寄託されたｃＤＮＡによりコードされるＴＲ１１ＳＶ１の全ポリペプチ
    ド； （ｈ）寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ＴＲ１１ＳＶ１のポリペプ
    チド； （ｉ）図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）のＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチド； （ｊ）リーダーを含むがＮ末端メチオニンを含まない、図２Ａおよび２Ｂ（配
    列番号４）のＴＲ１１ＳＶ１ポリペプチド； （ｋ）図２Ａおよび２Ｂ（配列番号４）に示す、ＴＲ１１ＳＶ１レセプターの
    細胞外ドメイン； （ｌ）リーダーを含む、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるＴＲ１１ＳＶ
    ２ポリペプチド； （ｍ）リーダーを含まない、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるＴＲ１１
    ＳＶ２ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）； （ｎ）リーダーを含む、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）のＴＲ１１ＳＶ２ポ
    リペプチド； （ｏ）リーダーを含むがＮ末端メチオニンを含まない、図３Ａおよび３Ｂ（配
    列番号６）のＴＲ１１ＳＶ２ポリペプチド； （ｐ）リーダーを含まない、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）のポリペプチド
    ；および （ｑ）図３Ａおよび３Ｂ（配列番号６）に示す、ＴＲ１１ＳＶ２レセプターの
    細胞外ドメイン；
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のポリぺプチドに特異的に結合する、抗
    体。
16. 【請求項１６】 請求項１４に記載のポリペプチド、またはそのアゴニスト
    もしくはアンタゴニストの有効量を、薬学的に許容されるキャリアとの混合中で
    、処置される個体に導入する工程を包含する、異常な細胞生存と関連する疾患状
    態を処置する方法。
17. 【請求項１７】 請求項１４に記載のポリペプチド、またはそのアゴニスト
    もしくはアンタゴニストの有効量を、薬学的に許容されるキャリアとの混和物中
    で、処置される個体に導入する工程を包含する、異常な細胞生存と関連する疾患
    状態を処置する方法。
18. 【請求項１８】 以下の工程を含む、請求項１４に記載のポリペプチドのア
    ゴニストおよびアンタゴニストについてスクリーニングする方法： （ａ）ＴＲ１１レセプターを発現する細胞に候補化合物を接触させる工程、 （ｂ）細胞応答をアッセイする工程、および （ｃ）該候補化合物の非存在下で形成される標準的な細胞応答に対して該細胞
    応答を比較する工程；ここで、該標準を上回った細胞応答は、該化合物がアゴニ
    ストであることを示し、そして該標準を下回った細胞応答は、該化合物がアンタ
    ゴニストであることを示す。