JP2002501077A - Ｍｅｔｈ１およびｍｅｔｈ２のポリヌクレオチドおよびポリペプチド - Google Patents

Ｍｅｔｈ１およびｍｅｔｈ２のポリヌクレオチドおよびポリペプチド

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、トロンボスポンジンに関する新規な抗新脈管形成タンパク質に関する。より詳細には、ヒトＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２をコードする単離された核酸分子が提供される。ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２ポリペプチドはまた、この物質を産生するためのベクター、宿主細胞、および組換え方法であるように提供される。癌の予想のための診断方法、ならびにＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の量の増加を必要とする個人の処置のための治療方法もまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （連邦政府の助成金による研究および開発） 本発明の開発中に実行された研究の一部は、米国政府基金を利用した。米国政
府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、トロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）に関する、
新規な抗新脈管形成タンパク質に関する。より具体的には、ヒトＭＥＴＨ１およ
びＭＥＴＨ２（ＭＥとはメタロプロテアーゼ、そしてＴＨとはトロンボスポンジ
ン）をコードする単離された核酸分子が提供される。ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ
２ポリペプチドはまた、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２ポリペプチドを産生するた
めのベクター、宿主細胞および組換え方法として提供される。癌の予後について
の診断方法および漸増量のＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を必要とする個体を処置
するための治療方法もまた、提供される。
【０００３】 （関連分野） 新脈管形成（予め存在している血管系からの新しい血管の形成）は、正常な成
人では厳密に調節されたプロセスである。生理学的環境下では、新しい毛細血管
の増殖は、血管増殖を刺激するかまたは阻害するかのいずれかのために作用する
、増殖調節タンパク質の相互作用により厳密に制御される。通常、これらの力の
間のつりあいは、阻害のために傾けられ、そして結果的に、血管増殖が制限され
る。しかし、特定の病理学的環境下では、局所的な阻害制御は、新脈管形成誘導
剤の増加した活性を制限し得ない。新脈管形成は、癌の転移において鍵となる工
程であり（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：２７〜３１（１９９５
））、そして異常な創傷治癒、炎症、慢性関節リウマチ、乾癬、および糖尿病性
網膜症では、病理学に必須であり（Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５
：４４２〜４４７（１９８７））、これらの病理学的実体が血管増殖の薬理学的
抑制および／または遺伝的抑制により調節され得るという期待を生じる（Ｉｒｕ
ｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ．７８：６７２〜６７７ １
９９７））。
【０００４】 トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）は、活性化血小板から放出され、そして増
殖している細胞から分泌される、４５０ｋＤａの抗新脈管形成接着性糖タンパク
質である（Ａｄａｍｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２
９８６１〜８６５（１９９７）中で概説される）。ＴＳＰ−１は、Ｎ連結グリコ
シル化およびアスパラギン残基のβ水酸化により翻訳後に修飾される、１１５２
アミノ酸残基ポリペプチドから構成される各サブユニットを有する、ホモ三量体
である。
【０００５】 ＴＳＰ−１タンパク質およびｍＲＮＡレベルは、種々の因子により調節される
。ＴＳＰ−１タンパク質レベルは、ＩＬ−１αおよびＴＮＦαにより下方制御さ
れる。ＴＳＰ−１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、
およびｂＦＧＦを含むポリペプチドの増殖因子により上方制御され（Ｂｏｒｎｓ
ｔｅｉｎ、Ｆａｓｅｂ Ｊ．６：３２９０〜３２９９（１９９２））、そしてま
た、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子産物の発現レベルにより調節される（Ｄａｍ
ｅｒｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１５８２〜１５８４（１９９４））。ト
ロンボスポンジンファミリーの少なくとも４つの他のメンバーが、同定されてい
る：ＴＳＰ−２、ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４、およびＴＳＰ−５（ＣＯＭＰとも呼
ばれる）。当該分野において、新脈管形成の調節に関与する他の分子を同定する
必要性がある。
【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または１９９８年１月１５日
にＡＴＣＣ寄託番号２０９５８１として細菌宿主中で寄託されたｃＤＮＡクロー
ンによりコードされたアミノ酸配列を有する、ＭＥＴＨ１ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。
【０００７】 本発明はまた、配列番号４に示されるアミノ酸配列、または１９９８年１月１
５日にＡＴＣＣ寄託番号２０９５８２として細菌宿主中で寄託されたｃＤＮＡク
ローンによりコードされたアミノ酸配列を有する、ＭＥＴＨ２ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。
【０００８】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、および組
換えベクターを含む宿主細胞ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製
する方法、ならびに組換え技術によりＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチド
またはペプチドの産生のためにこれらを使用する方法に関する。
【０００９】 本発明はさらに、本明細書中で記載されるポリヌクレオチドによりコードされ
るアミノ酸配列を有する単離されたＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドを
提供する。
【００１０】 本発明はさらに、癌の診断または予後の間に有用である診断方法を提供する。
【００１１】 本発明のさらなる局面は、身体中で増加したレベルのＭＥＴＨ１またはＭＥＴ
Ｈ２活性を必要とする個体を処置するための方法に関し、これらは、治療的に有
効量の本発明の単離されたＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドあるいはそ
れらのアゴニストを含む組成物をこのような個体に投与する工程を含む。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】 （詳細な説明） ＴＳＰ−１の抗新脈管形成性のドメインをコードするｃＤＮＡを用いてｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明は、２つの新規なタ
ンパク質、ＴＳＰ−１の抗新脈管形成性ドメイン、メタロプロテイナーゼドメイ
ン、およびジスインテグリン様ドメインを含むＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２（血
管内皮成長アンタゴニストについては、それぞれ、ＶＥＧＡ−１およびＶＥＧＡ
−２とも呼ばれる）を同定した。本発明者らは、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２の
両方が抗新脈管形成性活性を有することを実証した。
【００１５】 従って、本発明は、クローン化ｃＤＮＡを配列決定することによって決定され
た配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ１ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明のＭＥＴＨ
１タンパク質は、トロンボスポンジン−１およびｐＮＰＩと配列相同性を共有す
る。配列番号１に示されるヌクレオチド配列は、１９９８年１月１５日にアメリ
カンタイプカルチャーコレクション、１０８０１、ユニバーシティー ブールバ
ード、マナサース、バージニア ２０１１０−２２０９に寄託され、そして受託
番号２０９５８１を与えられたｃＤＮＡクローンを配列決定することによって得
られた。ｃＤＮＡクローンは、ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含有され、そし
てＭＥＴＨ１配列を含み、配列番号２のアミノ酸１〜９５０をコードする。
【００１６】 本発明はまた、クローン化ｃＤＮＡを配列決定することによって部分的に決定
された配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ２ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明のＭＥ
ＴＨ２タンパク質は、トロンボスポンジン−１およびｐＮＰＩと配列相同性を共
有する。配列番号３に示されるヌクレオチド配列を、ｃＤＮＡクローンを配列決
定することによって部分的に得、これを、アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン、１０８０１、ユニバーシティー ブールバード、マナサース、バージニア
、２０１１０−２２０９に１９９８年１月１５日に寄託し、受託番号２０９５８
２を与えられた。ｃＤＮＡクローンは、ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含有さ
れ、部分ＭＥＴＨ２配列を含み、配列番号４のアミノ酸１１２−８９０をコード
する。
【００１７】 （核酸分子） 本明細書でＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されたヌクレオチド配
列のいくつかを、自動化ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を使用して決定し、そ
して本明細書で決定されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの全て
のアミノ酸配列は、上記のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって予想され
た。従って、当該分野で公知のように、この自動化アプローチによって決定され
た任意のＤＮＡ配列について、本明細書で決定された任意のヌクレオチド配列は
、いくらかの誤差を含み得る。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、
代表的には、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、少
なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９
９．９％同一である。実際の配列は、当該分野で周知の手動ＤＮＡ配列決定法を
含む他のアプローチによって、より正確に決定され得る。同様に当該分野で公知
のように、実際の配列と比較しての、決定されたヌクレオチド配列における単一
の挿入または欠失は、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定ア
ミノ酸配列が、そのような挿入または欠失の点で開始して配列決定されたＤＮＡ
分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なるように、ヌクレ
オチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こす。
【００１８】 本明細書で提供される情報（例えば、配列番号１または配列番号３のヌクレオ
チド配列）を使用することにより、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドを
コードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手
順（例えば、ｍＲＮＡを開始物質として使用してｃＤＮＡをクローニングするた
めの手順）を使用して得られ得る。本発明の例示として、配列番号１に記載され
る核酸分子は、ヒト心臓に由来するｃＤＮＡライブラリーにおいて見出され、そ
して配列番号３に記載される核酸分子は、ヒト肺に由来するｃＤＮＡライブラリ
ーにおいて見出された。配列番号１のＭＥＴＨ１ ｃＤＮＡの決定されたヌクレ
オチド配列は、約２８のアミノ酸残基の推定リーダー配列を含む、約９５０アミ
ノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。本発
明者らは、配列番号３のＭＥＴＨ２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が、約２３ア
ミノ酸残基の推定リーダー配列を含む、約８９０のアミノ酸残基のタンパク質を
コードするオープンリーディングフレームを含有することを決定した。
【００１９】 本発明はまた、本発明のＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２タンパク質の成熟形態を
提供する。シグナル仮説に従うと、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質
は、一旦粗面小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の移出が開始されると成熟タ
ンパク質から切断される、シグナルまたは分泌リーダー配列を有する。ほとんど
の哺乳動物細胞および昆虫細胞でさえ、分泌タンパク質を同じ特異性で切断する
。しかし、いくつかの場合には、分泌されたタンパク質の切断は完全に均一では
なく、このことによりそのタンパク質に関して２つ以上の成熟種を生じる。さら
に、分泌されたタンパク質の切断特異性は、完全タンパク質の一次構造によって
最終的に決定されること、すなわち、そのポリペプチドのアミノ酸配列に固有で
あることが長い間公知であった。それゆえ、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０９
５８１として同定され、そして配列番号２に示される宿主に含まれるｃＤＮＡク
ローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ１ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、配列番号４に示され
るアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列を提供する。ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１として同定される宿主に含まれ
るｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ１
タンパク質は、寄託された宿主中のベクターに含まれるクローンのヒトＤＮＡ配
列によってコードされる完全オープンリーディングフレームの哺乳動物細胞（例
えば、以下に記載のＣＯＳ細胞）における発現によって産生されるＭＥＴＨ１タ
ンパク質の成熟形態を意味する。以下に示されるように、ＡＴＣＣ受託番号２０
９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有す
る成熟ＭＥＴＨ１は、配列番号２に示される推定「成熟」ＭＥＴＨ１タンパク質
（約２９から約９５０までのアミノ酸）とは、コンピューター分析に基づいて推
定される切断部位の精度に依存して、異なるかもしれないし、異ならないかもし
れない。そして成熟ＭＥＴＨ２は、コンピューター分析に基づいて推定された切
断部位の精度に依存して、配列番号４に示される推定「成熟」ＭＥＴＨ２タンパ
ク質（約２４から約８９０までのアミノ酸）とは、異なるかもしれないし、異な
らないかもしれない。
【００２０】 タンパク質が分泌リーダーならびにそのリーダー配列についての切断点を有す
るか否かを予測する方法が利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈの方法（Ｖ
ｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５））およびｖｏｎ Ｈｅｉｎ
ｊｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９
８６））が使用され得る。これらの方法の各々についての公知の哺乳動物分泌タ
ンパク質の切断点を予測することの精度は、７５〜８０％の範囲である。ｖｏｎ
Ｈｅｉｎｊｅ（前出）。しかし、２つの方法は、所定のタンパク質について同
一の予測される切断点をつねに産生するわけではない。
【００２１】 本件では、本発明の完全ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２ポリペプチドの予測され
るアミノ酸配列は、コンピュータープログラム（「ＰＳＯＲＴ」）（Ｋ．Ｎａｋ
ａｉおよびＭ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７−９１１（
１９９２））によって分析され、これは、アミノ酸配列に基づいてタンパク質の
細胞位置を予測するための専門家システムである。このコンピューターによる位
置の予測の一部として、ＭｃＧｅｏｃｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が組
み込まれている。ＰＲＯＲＴプログラムによる分析は、配列番号２におけるアミ
ノ酸２８と２９との間、および配列番号４におけるアミノ酸２３と２４との間の
切断部位を予測した。その後、完全アミノ酸配列は、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの（
−１，−３）規則（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出）の単純形態を適用することに
よって視覚的な検査によりさらに分析された。従って、ＭＥＴＨ１タンパク質の
リーダー配列は、配列番号２の約１〜約２８までのアミノ酸残基からなり、一方
、成熟ＭＥＴＨ１タンパク質は、約２９〜約９５０までの残基からなると予想さ
れ；そしてＭＥＴＨ２タンパク質のリーダー配列は、配列番号４の約１〜約２３
までのアミノ酸残基からなり、一方、成熟ＭＥＴＨ２タンパク質は、約２４〜約
８９０までの残基からなると予想される。代替の推定成熟ＭＥＴＨ１タンパク質
は、配列番号２の残基３０〜９５０からなる。
【００２２】 当業者が理解するように、配列決定誤差の可能性、および異なる公知のタンパ
ク質におけるリーダーについての切断部位の可変性のために、寄託されたｃＤＮ
Ａによってコードされる推定のＭＥＴＨ１ポリペプチドは、約９５０アミノ酸を
含むが、９１０〜９９０アミノ酸の範囲のどこかであり得；そしてこのタンパク
質の予想されるリーダー配列は、約２８アミノ酸であるが、約１８〜約３８アミ
ノ酸の範囲のどこかであり得る。また、予想されるＭＥＴＨ２ポリペプチドは、
約８９０アミノ酸を含むが、８５０〜約９３０アミノ酸の範囲のどこかであり得
る；そしてこのタンパク質の予想されるリーダー配列は、約２３アミノ酸である
が、約１３〜約３３アミノ酸の範囲のどこかであり得る。
【００２３】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより、または合成的に産生して得
られるｃＤＮＡおよびゲノムｃＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖ま
たは一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖とし
ても知られる）であり得るか、またはそれは非コード鎖（アンチセンス鎖ともい
われる）であり得る。
【００２４】 「単離された」核酸分子は、天然の環境から排除されている核酸分子、ＤＮＡ
またはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本
発明の目的のために単離されたと見なされる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる
例には、異種宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子あるいは溶液中の精
製された（部分的または実質的に）ＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分
子には、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロのＲＮＡ転写物が含ま
れる。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に産生されたこのような分子
をさらに含む。
【００２５】 本発明の単離された核酸分子には、配列番号１に示されるオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；成熟ＭＥＴＨ１タンパク質のコード配
列を含むＤＮＡ分子；および上記のものとは実質的に異なるが、遺伝コードの縮
重により、なおＭＥＴＨ１タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子が含ま
れる。配列番号３に示されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤ
ＮＡ分子；成熟ＭＥＴＨ２タンパク質のコード配列を含むＤＮＡ分子；および上
記のものとは実質的に異なるが、遺伝子コードの縮重のため、なおＭＥＴＨ２タ
ンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子もまた含まれる。当然に、遺伝コー
ドは、当該分野で周知である。従って、このような縮重改変体を生成することは
当業者には慣用的である。
【００２６】 別の局面において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１として１９９８
年１月１５日に寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡクローン、またはＡＴ
ＣＣ受託番号２０９５８２として１９９８年１月１５日に寄託されたプラスミド
に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列をそれぞれ有す
るＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を
提供する。さらなる実施態様において、成熟ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペ
プチドあるいはＮ末端メチオニンを欠失する全長ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポ
リペプチドをコードする核酸分子が提供される。本発明はまた、配列番号１また
は配列番号３に示されるヌクレオチド配列、あるいは上記の寄託されたクローン
に含まれるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有する
単離された核酸分子、あるいは上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分
子を提供する。このような単離された分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのイン
サイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのための、およびヒト
組織におけるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２遺伝子の発現を、例えば、ノーザンブ
ロット分析により検出するためのプローブとして有用である。
【００２７】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１または配列
番号３に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメント
とは、本明細書で議論される診断用プローブおよびプライマーとして有用な、少
なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、なおより
好ましくは、少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは、少なくとも
約４０ｎｔ長のフラグメントを意図する。当然に、より大きいフラグメントであ
る５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、
５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、
９５０、１０００、１０５０、１１００、１２００、１３００、１４００、１５
００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２０
０、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００
、または３０００ｎｔ長のフラグメントもまた、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列、または配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列のほ
とんど（全てでなければ）に対応するフラグメントと同様に、本発明に従って有
用である。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントにより、寄託されたｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列、または配列番号１または配列番号３に示されるヌク
レオチド配列からの２０以上の連続する塩基を含むフラグメントが意図される。
【００２８】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２タンパク
質のエピトープ保有部分をコードする核酸分子を含む。ＭＥＴＨ１およびＭＥＴ
Ｈ２タンパク質のエピトープ保有部分を決定するための方法は、以下に詳細に記
載される。
【００２９】 本発明の他の好ましい核酸フラグメントには、以下をコードする核酸分子が含
まれる：ＭＥＴＨ１のメタロプロテアーゼドメインである配列番号２のアミノ酸
２３５〜４５９；ＭＥＴＨ１のジスインテグリンドメインである配列番号２のア
ミノ酸４６０〜５４４；ＭＥＴＨ１の第１ＴＳＰ様ドメインである配列番号２の
アミノ酸５４５〜５９８；ＭＥＴＨ１の第２ＴＳＰ様ドメインである配列番号２
のアミノ酸８４１〜８９４；ＭＥＴＨ１第３ＴＳＰ様ドメインである配列番号２
のアミノ酸８９５〜９３４；配列番号２のアミノ酸５３６〜６１３；配列番号２
のアミノ酸５４９〜５６３；ＭＥＴＨ２のメタロプロテアーゼドメインである配
列番号４のアミノ酸２１４〜４３９；ＭＥＴＨ２のジスインテグリンドメインで
ある配列番号４のアミノ酸４４０〜５２９；ＭＥＴＨ２の第１ＴＳＰ様ドメイン
である配列番号４のアミノ酸５３０〜５８３；ＭＥＴＨ２の第２ＴＳＰ様ドメイ
ンである配列番号４のアミノ酸８３７〜８９０；配列番号４のアミノ酸２８０〜
６０６；および配列番号４のアミノ酸５２９〜５４８。
【００３０】 さらに、本発明者らは、配列番号１に示される配列の部分に関連する以下のｃ
ＤＮＡクローンを同定した：ＨＯＵＣＱ１７ＲＡ（配列番号１４）、ＨＰＬＢＭ
１１Ｒ（配列番号１５）、ＨＧＢＩ０７Ｒ（配列番号１６）、ＨＮＴＭＡ４９Ｒ
（配列番号１７）、ＨＮＡＬＥ２７Ｒ（配列番号１８）、およびＨＩＢＤＢ４５
Ｒ（配列番号１９）。
【００３１】 以下の公開されたＥＳＴ（これらは、配列番号１の部分に関連する）もまた同
定されている：Ｄ６７０７６（配列番号２０）、ＡＢ００１７３５（配列番号２
１）、Ｘ１４７８７（配列番号２２）、Ｕ６４８５７（配列番号２３）、Ｘ０４
６６５（配列番号２４）、Ｍ６４８６６（配列番号２５）、Ｌ０７８０３（配列
番号２６）、Ｕ０８００６（配列番号２７）、Ｍ１６９７４（配列番号２８）、
Ｌ１３８５５（配列番号２９）、ＡＬ０２１５２９（配列番号３０）、Ｄ８６０
７４（配列番号３１）、Ｌ０５３９０（配列番号３２）、Ｚ６９３６１（配列番
号３３）、Ｘ９９５９９（配列番号３４）、ＡＦ０１８０７３（配列番号３５）
、Ｌ２３７６０（配列番号３６）、Ｚ４６９７０（配列番号３７）、ＡＣ００４
４４９（配列番号３８）、Ｚ６９５８９（配列番号３９）、Ｚ２２２７９（配列
番号４０）、およびＸ１７５２４（配列番号４１）。
【００３２】 本発明者らはまた、配列番号３の部分に関連する以下のｃＤＮＡクローンを同
定した：ＨＣＥ４Ｄ６９ＦＰ０２（配列番号４２）、ＨＩＢＤＢ４５Ｆ（配列番
号４３）、ＨＫＩＸＨ６４Ｒ（配列番号４４）、ＨＩＢＤＢ４５Ｒ（配列番号１
９）、ＨＣＥ３Ｚ９５Ｒ（配列番号４５）、ＨＴＬＥＱ９０Ｒ（配列番号４６）
、ＨＭＷＥＦ４５Ｒ（配列番号４７）、ＨＴＯＦＣ３４ＲＡ（配列番号４８）、
ＨＨＦＤＩ２０Ｒ（配列番号４９）、ＨＭＳＨＹ４７Ｒ（配列番号５０）、ＨＣ
ＥＳＦ９０Ｒ（配列番号５１）、ＨＭＣＡＯ４６Ｒ（配列番号５２）、ＨＴＴＡ
Ｑ６７Ｒ（配列番号５３）、ＨＦＫＣＦ１９Ｆ（配列番号５４）、ＨＭＣＡＳ３
１Ｒ（配列番号５５）、ＨＭＷＧＰ２６Ｒ（配列番号５６）、ＨＬＨＴＰ３６Ｒ
（配列番号５７）、ＨＥ８ＡＮ１１Ｒ（配列番号５８）、ＨＥＯＮＮ７３Ｒ（配
列番号５９）、ＨＢＮＢＧ５３Ｒ（配列番号６０）、およびＨＭＳＣＨ９４Ｒ（
配列番号６１）。
【００３３】 以下の公開されたＥＳＴ（これらは配列番号３に示される配列の部分に関連す
る）もまた同定されている：Ｄ６７０７６（配列番号２０）、ＡＢ００１７３５
（配列番号２１）、ＡＢ００５２８７（配列番号６２）、Ｘ８７６１９（配列番
号６３）、Ｘ１４７８７（配列番号２２）、Ｘ０４６６５（配列番号２４）、Ｍ
８７２７６（配列番号６４）、Ｍ６２４５８（配列番号６５）、ＡＢ００２３６
４（配列番号６６）、ＡＢ００５２９７（配列番号６７）、Ｘ６９１６１（配列
番号６８）、Ｘ１６６１９（配列番号６９）、Ｉ３６４４８（配列番号７０）、
Ｌ１２２６０（配列番号７１）、Ｉ３６３５２（配列番号７２）、Ｘ１５８９８
（配列番号７３）、Ｉ０７７８９（配列番号７４）、Ｉ０８１４４（配列番号７
５）、Ｕ３１８１４（配列番号７６）、およびＡＦ００１４４４（配列番号７７
）。
【００３４】 特定の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、３００ｋｂ、２００ｋｂ
、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または７．５ｋｂ長未満である
。さらなる実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＭＥＴＨ１またはＭＥ
ＴＨ２コード配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むが、いずれの
ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２イントロンの全部または部分も含まない。別の実施
態様では、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２コード配列を含む核酸は、ゲノムの隣接
遺伝子のコード配列を含まない（すなわち、ゲノム中のＭＥＴＨ１またはＭＥＴ
Ｈ２遺伝子に対して５’または３’である）。
【００３５】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１また
はＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレ
オチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子
を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」により、以下
を含む溶液：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍ
Ｍクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５
×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性
剪断サケ精子ＤＮＡ、における４２℃での一晩のインキュベーション、続いて０
．１×ＳＳＣ中で約６５℃でのそのフィルターの洗浄を意図する。
【００３６】 ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドにより、
参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好
ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは、少なくとも約３０ｎｔ
、そしてさらにより好ましくは、約３０、４０、５０、６０、もしくは７０ｎｔ
にハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意
図する。これらは、上記で議論し、そして以下により詳細に議論するように、診
断プローブおよびプライマーとして有用である。
【００３７】 例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの部分により、参照ポ
リヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡまたは、配列番号１もしくは配列
番号３に示されるヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列からの２０以上の連続
するヌクレオチドを意図する。当然に、ポリＡ配列（例えば、配列番号１および
配列番号３にそれぞれ示されるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ ｃＤＮＡの３’末
端ポリ（Ａ）トラクト）、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的ストレッチにの
みハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイ
ズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれる。なぜなら、この
ようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補鎖を含む任意
の核酸分子（例えば、実際的には、任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリ
ダイズするからである。
【００３８】 中程度に高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件でＭＥＴＨ１ま
たはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子がまた意図され
る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は
、主にホルムアミド濃度（ホルムアミドのより低いパーセンテージは、より低い
ストリンジェンシーをもたらす）；塩条件、または温度を操作することにより達
成される。例えば、中程度に高ストリンジェンシーの条件には、６×ＳＳＰＥ（
２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ
サケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩のインキュベーシ
ョン；続いて１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳでの５０℃での洗浄が含まれる。さ
らに、より低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーションに続いて行われる洗浄は、より高い塩濃度で行われ得る（例
えば、５×ＳＳＣ）。
【００３９】 上記の条件のバリエーションは、ハイブリダイゼーション実験におけるバック
グラウンドを抑制するために使用される代替のブロッキング剤を含ませることお
よび／または置換することによって達成され得ることに留意すること。代表的な
ブロッキング試薬には、Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性
サケ精子ＤＮＡ、および市販の特許処方物が含まれる。特定のブロッキング試薬
を含ませることは、適合性の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条
件の改変を必要とし得る。
【００４０】 当然に、ポリＡ+配列にのみハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、 配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末端ポリＡ+トラクト）、あるいはＴ（ またはＵ）残基の相補的ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチド
は、「ポリヌクレオチド」の定義に含まれない。なぜなら、このようなポリヌク
レオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補鎖を含む任意の核酸分子（例
えば、実際的には、任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするから
である。
【００４１】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオ
チドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得、これらは、非改変Ｒ
ＮＡもしくは非改変ＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例
えば、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖
のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本
鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖
、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖の領域の混合物であ
り得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。さらに、
ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまた
はＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ＭＥＴＨ１ま
たはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドはまた、安定性のために、または他の理由の
ために改変された１つ以上の改変された塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡの骨格
を含み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およ
びイノシンのような普通でない塩基が挙げられる。種々の改変が、ＤＮＡおよび
ＲＮＡに対して行われ得；従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素学的
、または代謝的に改変された形態を含む。
【００４２】 「配列番号１」はＭＥＴＨ１ポリヌクレオチド配列をいい、一方、「配列番号
２」はＭＥＴＨ１ポリペプチド配列をいう。「配列番号３」はＭＥＴＨ２ポリヌ
クレオチド配列をいい、一方、「配列番号２」はＭＥＴＨ２ポリペプチド配列を
いう。
【００４３】 示されるように、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドをコードする本
発明の核酸分子としては以下を挙げ得るが、これらに限定されない：成熟ポリペ
プチドのアミノ酸配列を単独でコードする配列；成熟ポリぺプチドについてのコ
ード配列およびさらなる配列（例えば、リーダー配列または分泌配列をコードす
る配列）（例えば、プレ−もしくはプロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列）
；上述のさらなるコード配列を有するかもしくは有さない成熟ポリぺプチドのコ
ード配列と共に、さらなる非コード配列（例えば、イントロンおよび非コード５
’および３’配列（例えば、転写、スプライシングを含むｍＲＮＡプロセシング
、およびポリアデニル化シグナルに役割（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮ
Ａの安定性）を果たす転写される非翻訳配列）を含むがこれらに限定されない配
列）；さらなるアミノ酸（例えば、さらなる機能性を提供する配列）をコードす
るさらなるコード配列。従って、ポリぺプチドをコードする配列は、マーカー配
列（例えば、融合されたポリぺプチドの精製を容易にするペプチドをコードする
配列）に融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、
マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥ
ベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、これら
の多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９
）に記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製
を提供する。「ＨＡ」タグは、精製のために有用な別のペプチドタグであり、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応し、これは、Ｗｉ
ｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）に記載されている。
以下で議論されるように、他のこのような融合タンパク質としては、Ｎ末端また
はＣ末端でＦｃに融合されたＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２が挙げられる。
【００４４】 本発明は、さらに、本発明の核酸分子の改変体に関連し、これは、ＭＥＴＨ１
タンパク質またはＭＥＴＨ２タンパク質の部分、アナログ、または誘導体をコー
ドする。改変体は天然に存在し得る（例えば、天然の対立遺伝子改変体）。「対
立遺伝子改変体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子
のいくつかの代替の形態のうちの１つが意図される。Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編，Ｇｅ
ｎｅｓ ＩＩ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野に公知の変異誘発技術を使用して
生成され得る。
【００４５】 このような改変体としては、１つ以上のヌクレオチドを含み得る、ヌクレオチ
ドの置換、欠失、または付加によって生成される改変体が挙げられる。これらの
改変体は、コード領域、非コード領域、または両方において変更され得る。コー
ド領域における変更は、保存的なまたは非保存的なアミノ酸の置換、欠失、また
は付加を生成し得る。これらの間で特に好ましいものは、ＭＥＴＨ１もしくはＭ
ＥＴＨ２のタンパク質またはそれらの部分の特性および活性を変化させない、サ
イレントな置換、付加および欠失である。このことについて特に好ましいのはま
た、保存的置換である。
【００４６】 本発明のさらなる実施態様は、以下のヌクレオチド配列に、少なくとも９５％
同一なヌクレオチド配列、そしてより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、
９８％、または９９％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む
単離された核酸分子を含む：配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列；配列番号２のアミノ酸配列を有するがＮ末端のメ
チオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号２の約２
９位〜約９５０位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列；配列番号２の約３０位〜約９５０位のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃ
ＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列；ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡク
ローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ１ポリぺプチド
をコードするヌクレオチド配列；配列番号２のアミノ酸２３５〜４５９をコード
するヌクレオチド配列（ＭＥＴＨ１のメタロプロテアーゼドメイン）；配列番号
２のアミノ酸４６０〜５４４をコードするヌクレオチド配列（ＭＥＴＨ１のディ
スインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）ドメイン）；配列番号２のアミノ酸
５４５〜５９８をコードするヌクレオチド配列（ＭＥＴＨ１の第１のＴＳＰ様ド
メイン）；配列番号２のアミノ酸８４１〜８９４をコードするヌクレオチド配列
（ＭＥＴＨ１の第２のＴＳＰ様ドメイン）；配列番号２のアミノ酸８９５〜９３
４をコードするヌクレオチド配列（ＭＥＴＨ１の第３のＴＳＰ様ドメイン）；配
列番号２のアミノ酸５３６〜６１３をコードするヌクレオチド配列；配列番号２
のアミノ酸５４９〜５６３をコードするヌクレオチド配列；配列番号４のアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４のアミ
ノ酸配列を有するがＮ末端のメチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列；配列番号４の約２４位〜約８９０位のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４の約１１２位〜約８９０位の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ＡＴＣＣ受
託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ＡＴＣＣ受託番号２
０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有
する成熟ＭＥＴＨ２ポリぺプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４の
アミノ酸２１４〜４３９をコードするヌクレオチド配列（ＭＥＴＨ２のメタロプ
ロテアーゼドメイン）；配列番号４のアミノ酸４４０〜５２９をコードするヌク
レオチド配列（ＭＥＴＨ２のディスインテグリンドメイン）；配列番号４のアミ
ノ酸５３０〜５８３をコードするヌクレオチド配列（ＭＥＴＨ２の第１のＴＳＰ
様ドメイン）；配列番号４のアミノ酸８３７〜８９０をコードするヌクレオチド
配列（ＭＥＴＨ２の第２のＴＳＰ様ドメイン）；配列番号４のアミノ酸２８０〜
６０６をコードするヌクレオチド配列；配列番号４のアミノ酸５２９〜５４８を
コードするヌクレオチド配列；または上記のヌクレオチド配列のいずれかと相補
的なヌクレオチド配列。
【００４７】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配
列に、例えば、少なくとも９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ＭＥＴＨ１またはＭＥ
ＴＨ２のポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチ
ドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、このポリヌクレオチドの配
列が参照配列に対して同一であることを意図する。すなわち、参照ヌクレオチド
配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得
るために、参照配列のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るかまたは別のヌ
クレオチドで置換され得るか、あるいは参照配列中の総ヌクレオチドの５％まで
の多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は
、参照ヌクレオチド配列の５’末端位置もしくは３’末端位置で生じ得るか、ま
たは参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連
続した群においてのいずれかで散在されてこれらの末端位置間のどこにでも生じ
得る。
【００４８】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１もしくは配列
番号３に示されるヌクレオチド配列に対して、または受託されたＤＮＡクローン
のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一であるか否かは、従来通りに、公知のコンピュータープログラム
（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ対応バージョン８，Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ
５３７１１））を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈおよ
びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍ
ａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用
し、２つの配列間で相同性が最良のセグメントを見出す。特定の配列が、例えば
、本発明に従う参照配列に９５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓ
ｔｆｉｔもしくは他の任意の配列整列プログラムを使用する場合、パラメーター
は、当然、同一性パーセントが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって算出され
、そして参照配列のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが
許容されるように設定される。
【００４９】 問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体的な一致（
全体的配列整列としても参照される）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕ
ｔｌａｇら、Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９
０）のアルゴリズムに基づいてＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用し
て決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方と
もＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得
る。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＤＮＡ配列
のＦＡＳＴＤＢ整列に使用される、パーセント同一性を算出するための好ましい
パラメーターは以下の通りである：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐ
ｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａ
ｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、
Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚ
ｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌ
クレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）。
【００５０】 対象配列が、５’末端欠失または３’末端欠失により（内部欠失のためではな
く）問い合わせ配列よりも短い場合、手動補正が結果に対してなされなければな
らない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが同一性パーセントを算定する場合に
、対象配列の５’末端切断および３’末端切断を考慮しないからである。問合せ
配列に対して５’末端または３’末端で切断される対象配列について、同一性パ
ーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対象配列の５’側お
よび３’側である一致／整列しない問い合わせ配列の塩基の数を計算することに
よって補正される。ヌクレオチドが一致／整列されているか否かは、ＦＡＳＴＤ
Ｂ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パー
セントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメー
ターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この
補正されたスコアは、本発明の目的で使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列
によって表示されるような、問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列の
５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動
で調整する目的で計算される。
【００５１】 例えば、９０残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列と整列される。欠失が本配列の５’末端で生じ、そしてそれ
故に、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端での最初の１０塩基の一致／整列を示さな
い。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’末端および３’
末端での塩基の数／問い合わせ配列中の塩基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０塩基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない
。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正
されない。再び、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’側および３
’側の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のために
はなされない。
【００５２】 本出願は、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の活性を有するポリペプチドをコード
するか否かに拘らず、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列または
受託されたｃＤＮＡの核酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％ま
たは９９％同一な核酸分子に関する。これは、なぜなら、特定の核酸分子がＭＥ
ＴＨ１またはＭＥＴＨ２の活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ
、当業者はこの核酸分子の、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての使用方法を依然として理解す
るからである。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の活性を有するポリペプチドをコー
ドしない本発明の核酸分子の使用としては、特に、（１）ｃＤＮＡライブラリー
におけるＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２の遺伝子、またはそれらの対立遺伝子改
変体の単離；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）に記載される通りの、ＭＥＴＨ１ま
たはＭＥＴＨ２の遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期の染色
体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」
）；および（３）特定の組織におけるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のｍＲＮＡ発
現を検出するためのノーザンブロット分析が挙げられる。
【００５３】 しかし、配列番号１または配列番号３に示される核酸配列に、あるいは受託さ
れたｃＤＮＡの核酸配列に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしく
は９９％同一な配列を有し、実際に、ＭＥＴＨ１またはＭＲＴＨ２のタンパク質
活性を有するポリぺプチドをコードする核酸分子が好ましい。「ＭＥＴＨ１活性
を有するポリぺプチド」によって、特定の生物学的アッセイにおいてＭＥＴＨ１
の活性を示すポリぺプチドが意図される。例えば、ＭＥＴＨ１タンパク質活性は
、絨毛尿膜アッセイ（Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ
ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７８（１）：６７２−６７７（１９９７））
、または角膜ポケット（ｃｏｒｎｅａ ｐｏｃｋｅｔ）アッセイ（Ｔｏｌｓｍａ
ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２２：４９７−５１１（１９９３））を使用し
て測定され得る。この両アッセイは以下の実施例４に記載される。「ＭＥＴＨ２
活性を有するポリぺプチド」によって、特定の生物学的アッセイにおいてＭＥＴ
Ｈ２の活性を示すポリぺプチドが意図される。例えば、ＭＥＴＨ２タンパク質活
性はまた、絨毛尿膜アッセイ（Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅら、Ｔｈｒｏｍｂｏ
ｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７８（１）：６７２−６７７（１９
９７））、または角膜ポケットアッセイ（Ｔｏｌｓｍａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１２２：４９７−５１１（１９９３））を使用して測定され得る。この両
アッセイは以下の実施例４に記載される。
【００５４】 概略すると、絨毛尿膜アッセイにおいては、目的の潜在的に抗新脈管形成性の
化合物を、新脈管形成増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ）と共に、Ｉ型コラーゲンペ
レット（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に加える。このサンプルを混合し、そしてナイロン
メッシュ上に配置し、重合させる。重合化が完了した後、このメッシュを１２日
齢のニワトリ胚の絨毛尿膜上に配置し、そして３７℃で２４時間配置する。次い
で、この胚に蛍光薬剤（例えば、ＦＩＴＣ−デキストラン）を注射し、このメッ
シュを固定し、そして蛍光顕微鏡下での観察のために取り付ける。
【００５５】 角膜ポケットアッセイにおいては、目的の化合物および新脈管形成増殖因子（
例えば、ｂＦＧＦ）を含むハイドロン（ｈｙｄｒｏｎ）ペレットを、ラットもし
くはマウスの角膜の縁から１〜２ｍｍの所へ移植する。応答を、ある一定の期間
（例えば、５日間）の後に調べる。新脈管形成の程度を、角膜の縁（ｌｉｍｂ）
から移動した毛細血管を測定することによって評価する。
【００５６】 当然、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、受託されたｃＤＮＡの核酸配
列または配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列に、少なくとも９５
％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を有する多数の核酸分子
が、「ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のタンパク質活性を有する」ポリぺプチドを
コードすることを即座に認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変
体は全て同じポリぺプチドをコードするため、このことは、当業者にとって、上
記に記載した比較アッセイを行わなくても明らかである。縮重改変体でないこの
ような核酸分子について、妥当数がまた、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のタンパ
ク質活性を有するポリぺプチドをコードすることが、当該分野においてさらに認
識される。これは、なぜなら、当業者は、タンパク質の機能に有意に影響を与え
る可能性が少なそうであるか、もしくは影響を与えないようであるかのいずれか
のアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸で置換
すること）を十分に認識するからである。
【００５７】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関する手引きは、
Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ
ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａ
ｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７
：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここにおいてこの著者らは、タ
ンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど寛容性であることを示す。
【００５８】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクタ
ーで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるＭＥＴＨ１ポリペプチ
ドもしくはＭＥＴＨ２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントの産生に関する
。
【００５９】 ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクタ
ーに連結され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物
のような沈澱物中か、または荷電した脂質との複合体中で導入される。ベクター
がウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイン
ビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【００６０】 ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（例えば、少し名を挙げると、ファ
ージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモー
ター、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後
期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に
連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現
構築物は、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写される領域
中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転
写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきポリペプチドの始めに翻訳開
始コドンを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ
、またはＵＡＧ）を含む。
【００６１】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細
菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性
遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ
．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（
例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９
細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫
細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主
細胞のための適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
【００６２】 細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、お
よびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓ
ｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；なら
びにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐ
ＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベ
クターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およ
びｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰ
Ｖ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他
の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００６３】 本発明の実施における発現ベクターの使用に加えて、本発明はさらに、目的の
タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたオペレーター
エレメントおよびプロモーターエレメントを含む新規な発現ベクターを含む。こ
のようなベクターの一例は、以下で詳細に記載されるｐＨＥ４−５である。
【００６４】 図８および９にまとめるように、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号１２）の構
成要素は、以下を含む：１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランス
フェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター
配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダルガーノ配列、６
）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ
）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プ
ロモーター配列およびオペレーター配列を合成的に作製した。核酸配列の合成的
作製は、当該分野で周知である。ＣＬＯＮＴＥＣＨ ９５／９６ Ｃａｔａｌｏ
ｇ、２１５〜２１６頁、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、１０２０ Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ
Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、９４３０３。ＭＥＴＨ１をコード
するヌクレオチド配列（配列番号２）またはＭＥＴＨ２をコードするヌクレオチ
ド配列（配列番号４）は、ｐＨＥ４−５ベクターのＮｄｅＩ部位とＡｓｐ７１８
部位との間にこれらのヌクレオチド配列を挿入することにより、プロモーターお
よびオペレーターに作動可能に連結される。
【００６５】 上述のように、ｐＨＥ４−５ベクターは、ｌａｃＩｑ遺伝子を含む。ｌａｃＩ
ｑは、ｌａｃＩ遺伝子の対立遺伝子であり、ｌａｃＩ遺伝子は、ｌａｃオペレー
ターの強固な調節を付与する。Ａｍａｎｎ，Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１〜
３１５（１９８８）；Ｓｔａｒｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ ５１：２５５〜２６７（１
９８７）。ｌａｃＩｑ遺伝子は、ｌａｃオペレーター配列に結合し、そして下流
（すなわち、３’側の）配列の転写を阻止する、リプレッサータンパク質をコー
ドする。しかし、ｌａｃＩｑ遺伝子産物は、ラクトースまたは特定のラクトース
アナログ（例えば、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
）のいずれかの存在下で、ｌａｃオペレーターから解離する。従って、ＭＥＴＨ
１またはＭＥＴＨ２は、ｐＨＥ４−５ベクターを含む非誘導宿主細胞において、
感知可能な量で産生されない。しかし、ＩＰＴＧのような薬剤の添加によるこれ
らの宿主細胞の誘導は、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のコード配列の発現を生じ
る。
【００６６】 ｐＨＥ４−５ベクターのプロモーター／オペレーター配列（配列番号１３）は
、Ｔ５ファージプロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列を含む。１つ
のオペレーターは、転写開始部位の５’側に位置し、そしてもう他方は、同じ部
位の３’側に位置する。これらのオペレーターは、ｌａｃＩｑ遺伝子産物と組合
せて存在する場合、ｌａｃオペロンインデューサー（例えば、ＩＰＴＧ）の非存
在下での、下流配列の強固な抑制を与える。このｌａｃオペレーターの下流に位
置する作動可能に連結された配列の発現は、ｌａｃオペロンインデューサー（例
えば、ＩＰＴＧ）の添加により誘導され得る。ｌａｃＩｑタンパク質へのｌａｃ
インデューサーの結合は、ｌａｃオペレーター配列からのそれらの解放、および
作動可能に連結された配列の転写の開始を生じる。遺伝子発現のｌａｃオペロン
調節は、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｔ．、ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴ
ＲＹ ＷＩＴＨ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳ、第４版（１９
９７）、８０２〜８０７頁に概説される。
【００６７】 ｐＨＥ４シリーズのベクターは、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のコード配列を
除く、ｐＨＥ４−５ベクターの全ての構成要素を含む。ｐＨＥ４ベクターの特徴
は、最適化された合成Ｔ５ファージプロモーター、ｌａｃオペレーター、および
シャイン−ダルガーノ配列を含む。さらに、これらの配列はまた、最適に間隔を
空けられ、その結果、挿入された遺伝子の発現は強固に調節され得、そして高レ
ベルの発現が誘導に際して生じる。
【００６８】 本発明のタンパク質の産生における使用に適切な公知の細菌性プロモーターの
中には、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７
プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲおよびＰＬプロモーター、ならびに
ｔｒｐプロモーターを含む。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初
期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウ
イルス（ＲＳＶ））、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウス
メタロチオネイン−Ｉプロモーター）が挙げられる。
【００６９】 ｐＨＥ４−５ベクターはまた、ＡＵＧ開始コドンの５’側にシャイン−ダルガ
ーノ配列を含む。シャイン−ダルガーノ配列は、一般に、ＡＵＧ開始コドンの約
１０ヌクレオチド上流（すなわち、５’側）に位置する短い配列である。これら
の配列は、本質的には、原核生物リボソームを、ＡＵＧ開始コドンに導く。
【００７０】 従って、本発明はまた、本発明のタンパク質の産生に有用な発現ベクターに関
する。本発明のこの局面は、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号１２）に例示され
る。
【００７１】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような多くの標
準的実験室マニュアルに記載されている。
【００７２】 ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そし
て分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。例えば、さ
らなるアミノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域が、宿主細胞における、精製の間
の、または続く取り扱いおよび保存の間の、安定性および持続性を改善するため
に、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易
にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの
最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性
を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへ
の付加は、当該分野でよく知られており、そして慣用的な技術である。好ましい
融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために有用である免疫グロブリン由
来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ対応出願
第２０４５８６９号）は、別のヒトタンパク質、またはその一部とともに免疫グ
ロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの
場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有
利であり、従って、例えば、改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ
０２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載
される有利な様式で、発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分が
欠失され得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使
用に対して障害となると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための
抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えば、ｈＩＬ５
レセプターのようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定する
ための高処理能力スクリーニングアッセイの目的でＦｃ部分と融合されている。
Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８
（１９９５）、およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７０（１６）：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。
【００７３】 ＭＥＴＨ１タンパク質またはＭＥＴＨ２タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱
またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー
、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培
養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグ
ラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは
、天然の供給源からの精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主また
は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、およ
び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え
産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコ
シル化されていても、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発
明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改
変された開始メチオニン残基を含み得る。
【００７４】 （ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２のポリペプチドおよびフラグメント） 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、も
しくは配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離されたＭＥＴＨ１ポリペプチド
、または上記ポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供す
る。本発明はまた、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、も
しくは配列番号４のアミノ酸配列を有する、単離されたＭＥＴＨ２ポリペプチド
、または上記ポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供す
る。
【００７５】 ＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプチドは、ペプチド結合また
は改変されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒ
ｅ）によって互いに連結したアミノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードす
る２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ＭＥＴＨ１ポリペプチドまたは
ＭＥＴＨ２ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスによっ
て、または当該技術分野で周知の化学修飾技術によってのいずれかで、改変され
得る。このような修飾は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、ならびに
多くの研究文献に十分記載される。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およ
びアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭ
ＥＴＨ２ポリペプチドのどこでも生じ得る。同じ型の修飾が、所定のＭＥＴＨ１
ポリペプチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプチド中のいくつかの部位で同じまたは種
々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のＭＥＴＨ１ポリペプチド
またはＭＥＴＨ２ポリペプチドは多くの型の修飾を含み得る。ＭＥＴＨ１ポリペ
プチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分
枝状であり得、そしてこれらのポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、
環状であり得る。環状、分枝状および分枝した環状ＭＥＴＨ１ポリペプチドまた
はＭＥＴＨ２ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合
成方法によって作製され得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−
リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチ
ドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共
有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成
、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル
化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリス
トイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化の
ようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介の付加、およびユビ
キチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ Ａ
ＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉ
ｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ
ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏ
ｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１−１２頁（１９８
３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６
（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４
８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００７６】 ＭＥＴＨ１ポリペプチドおよびＭＥＴＨ２ポリペプチドのいくつかのアミノ酸
配列が、これらのタンパク質の構造または機能に有意な影響を与えることなく、
変更され得ることが当該分野において認識される。配列におけるこのような差異
が意図される場合、タンパク質上に、活性を決定する重要な領域が存在すること
が思い出されるべきである。
【００７７】 本発明者らは、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２が、インビトロおよびインビボで
新脈管形成を阻害することを示した。ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２は各々、メタ
ロプロテアーゼドメイン、ジスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）ドメイ
ン、およびＴＳＰ様ドメインを含む。メタロプロテアーゼドメインは、触媒的に
活性であり得る。ジスインテグリンドメインは、インテグリンと相互作用するこ
とにより新脈管形成を阻害する際に役割を果たし得る。なぜなら、インテグリン
は、増殖シグナルおよび移動シグナルの両方の媒介のために必須であるからであ
る。本発明者らは、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２のＴＳＰ様ドメインに由来する
ペプチドが、インビトロおよびインビボで新脈管形成を阻害することを示した。
【００７８】 従って、本発明は、実質的なＭＥＴＨ１ポリペプチド活性を示すＭＥＴＨ１ポ
リペプチドの改変体、または以下で議論されるタンパク質部分のようなＭＥＴＨ
１タンパク質の領域を含むＭＥＴＨ１ポリペプチドの改変体；および実質的なＭ
ＥＴＨ２ポリペプチド活性を示すＭＥＴＨ２ポリペプチドの改変体、または以下
で議論されるタンパク質部分のようなＭＥＴＨ２タンパク質の領域を含むＭＥＴ
Ｈ１ポリペプチドの改変体をさらに含む。このような変異体は、欠失、挿入、逆
位、反復、および型置換を含む。上記のように、どのアミノ酸の変化が表現型的
にサイレントであるようであるかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．
ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ
Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０
（１９９０）において見出され得る。
【００７９】 従って、配列番号２または配列番号４のポリペプチドのフラグメント、誘導体
またはアナログ、あるいは寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
のフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保
存的なアミノ酸残基または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ
酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードに
よりコードされるものであってもよいしそうでなくともよいもの、あるいは（ｉ
ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリ
ペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させるための化合物（例えば、ポリエ
チレングリコール）のような別の化合物と融合したもの、あるいは（ｉｖ）さら
なるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド配列、またはリーダー配
列もしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精
製について使用される配列）が成熟ポリペプチドと融合したものであり得る。こ
のようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示より当業者の
範囲内であると考えられる。
【００８０】 特に興味深いのは、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸、および中性
のアミノ酸、または負に荷電したアミノ酸での置換である。後者は、結果として
、正の電荷が減少したタンパク質を生じてＭＥＴＨ１タンパク質またはＭＥＴＨ
２タンパク質の特徴を改善する。凝集の防止は非常に望ましい。タンパク質の凝
集は活性を減少させるだけではなく、凝集体は免疫原性であり得ることから薬学
的処方物を調製する場合にも問題であり得る（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．
Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら
、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、
Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９９３））。
【００８１】 示されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意には影響を与えない
保存的アミノ酸置換のような、重要でない性質の変化が好ましい（表３を参照の
こと）。
【００８２】
【表３】 もちろん、当業者が行うアミノ酸置換の数は、多くの因子（上記の因子を含む
）に依存する。一般的に言うと、任意の所定のＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリ
ペプチドについてのアミノ酸置換の数は、５０、４０、３０、２０、１０、５、
または３以下である。
【００８３】 本発明のＭＥＴＨ１タンパク質およびＭＥＴＨ２タンパク質中の機能に不可欠
なアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的突然変異またはアラ
ニン走査突然変異（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１０８１−１０８５（１９８９））により同定され得る。後者の手順は
、その分子中の各残基に１つのアラニン変異を導入する。次いで、生じた変異体
分子は、インビトロまたはインビボでの新脈管形成の阻害のような生物学的活性
について試験される。また、新脈管形成の阻害に重要な部位は、結晶化、核磁気
共鳴、または光親和性標識のような構造解析により決定され得る（Ｓｍｉｔｈら
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖ
ｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【００８４】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。「単離
されたポリペプチド」により、その天然の環境から取り出されたポリペプチドが
意図される。従って、組換え宿主細胞中で産生されたポリペプチドおよび／また
は組換え宿主細胞中に含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離され
たと考えられる。また、「単離されたポリペプチド」として、組換え宿主細胞ま
たは天然の供給源から、部分的または実質的に精製されたポリペプチドも意図さ
れる。例えば、組換えにより産生されたバージョンのＭＥＴＨ１ポリペプチドま
たはＭＥＴＨ２ポリペプチドは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ
６７：３１−４０（１９８８）に記載される１ステップの方法により実質的に精
製され得る。
【００８５】 本発明のポリペプチドには、以下：リーダーを含む、寄託されたｃＤＮＡにコ
ードされるＭＥＴＨ１ポリペプチド；寄託されたｃＤＮＡにコードされる成熟Ｍ
ＥＴＨ１ポリペプチドからリーダーを除いたポリペプチド（すなわち、成熟タン
パク質）；配列番号２のアミノ酸約１〜約９５０を含むポリペプチド；配列番号
２のアミノ酸約２〜約９５０を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸約２９
〜約９５０を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸約３０〜約９５０を含む
ポリペプチド；ＭＥＴＨＩのメタロプロテアーゼドメイン（配列番号２のアミノ
酸２３５〜４５９）を含むポリペプチド；ＭＥＴＨＩのディスインテグリン（ｄ
ｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）ドメイン（配列番号２のアミノ酸４６０〜５４４）を含
むポリペプチド；ＭＥＴＨＩの第１のＴＳＰ様ドメイン（配列番号２のアミノ酸
５４５〜５９８）を含むポリペプチド；ＭＥＴＨＩの第２のＴＳＰ様ドメイン（
配列番号２のアミノ酸８４１〜８９４）を含むポリペプチド；ＭＥＴＨＩの第３
のＴＳＰ様ドメイン（配列番号２のアミノ酸８９５〜９３４のアミノ酸）を含む
ポリペプチド；配列番号２のアミノ酸５３６〜６１３を含むポリペプチド；配列
番号２のアミノ酸５４９〜５６３を含むポリペプチド；リーダーを含む、寄託さ
れたｃＤＮＡにコードされるＭＥＴＨ２ポリペプチド；寄託されたｃＤＮＡにコ
ードされる成熟ＭＥＴＨ２ポリペプチドからリーダーを除いたポリペプチド（す
なわち、成熟タンパク質）；配列番号４のアミノ酸約１〜約８９０を含むポリペ
プチド；配列番号４のアミノ酸約２〜約８９０を含むポリペプチド；配列番号４
のアミノ酸約２４〜約８９０を含むポリペプチド；配列番号４のアミノ酸約１１
２〜約８９０を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ２のメタロプロテアーゼドメイン（
配列番号４のアミノ酸２１４〜４３９）を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ２のディ
スインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）ドメイン（配列番号４のアミノ酸４
４０〜５２９）を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ２の第１のＴＳＰ様ドメイン（配
列番号４のアミノ酸５３０〜５８３）を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ２の第２の
ＴＳＰ様ドメイン（配列番号４のアミノ酸８３７〜８９０）を含むポリペプチド
；配列番号４のアミノ酸２８０〜６０６を含むポリペプチド；配列番号４のアミ
ノ酸５２９〜５４８を含むポリペプチド、ならびに上記のポリペプチドに少なく
とも９５％同一なポリペプチド、およびより好ましくは少なくとも９６％、９７
％、９８％、または９９％同一なポリペプチドが挙げられ、そしてまた、少なく
とも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むこのよ
うなポリペプチドの一部もまた挙げられる。
【００８６】 ＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプチドの参照アミノ酸配列と
、少なくとも、例えば、９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドに
より、そのポリペプチドのアミノ酸配列がＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭＥＴ
Ｈ２ポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たり５つまでのアミノ酸
の変更を含み得ることを除くと参照配列と同一である、ポリペプチドのアミノ酸
配列が意図される。換言すると、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一なア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照アミノ酸配列の５％までの
アミノ酸残基が、削除され得るか、または別のアミノ酸で置換され得るか、ある
いは、参照配列の総アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が、参照配列に挿入
され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくは
カルボキシ末端部分で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも、
参照配列中の残基間で個々に、または参照配列内の１つ以上のコンティグなグル
ープにおいてのいずれかで、散在されて、生じ得る。
【００８７】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、配列番号２もしくは
配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、または寄託されたｃＤＮＡクロー
ンによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％、あるいは９９％同一であるか否かは、従来的に、公知のコンピュ
ータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８
ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ
ｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔ
ｆｉｔまたは他の配列アルゴリズムプログラムを使用して、特定の配列が、例え
ば、本発明に従う参照配列に９５％同一であるかを決定する場合、もちろん、同
一性パーセンテージが参照アミノ酸配列の全長にわたり計算され、そして参照配
列中においてアミノ酸残基の総数の５％まで、相同性のギャップが可能であるよ
うなパラメーターが設定される。
【００８８】 問い合わせ配列（本発明の配列）と本配列との間での最良の全体的な一致（全
体的配列整列ともいわれる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ
ら、Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアル
ゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得
る。配列整列において、問い合わせ配列および本配列は、両方ともヌクレオチド
配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全
体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整
列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕ
ｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎ
ａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０
、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉ
ｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または本ア
ミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【００８９】 本配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い
合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない
。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場
合に、本配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末端お
よびＣ末端で切断される本配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パー
セントは、問い合わせ配列の総残基のパーセントとして、対応する本残基と一致
／整列しない本配列のＮ末端およびＣ末端にある問い合わせ配列の残基の数を計
算することによって補正される。残基が一致／整列されているか否かは、ＦＡＳ
ＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、同
一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定の
パラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達す
る。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的のために使用され
るものである。問い合わせ配列と一致／整列していない本配列のＮ末端およびＣ
末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で考慮さ
れる。すなわち、本配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側の問い合わせ
残基位置のみである。
【００９０】 例えば、９０アミノ酸残基の本配列が、同一性パーセントを決定するために１
００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が本配列のＮ末端で生じ、それゆ
えＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示さない。１
０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端での残
基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログ
ラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。
残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％であ
る。別の例において、９０残基の本配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ配列と一致／
整列しない本配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳ
ＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。またして
も、ＦＡＳＴＤＢ整列において示されるような、問い合わせ配列と一致／整列し
ない本配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。他の
手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００９１】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
または分子ふるいゲル濾過カラムに対する分子量マーカーとして有用である。
【００９２】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチド、またはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピト
ープは、本明細書中に記載されるポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原
エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、全タンパク質が免疫原である場
合に、抗体応答を惹起するタンパク質の一部として定義される。一方、抗体が結
合し得るタンパク質分子の領域が、「抗原エピトープ」として定義される。タン
パク質の免疫原性エピトープの数は、一般に、抗原エピトープの数よりも少ない
。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。
【００９３】 抗原エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領
域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部
を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応す
る抗血清を慣用的に惹起し得ることが、当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅ、Ｊ．Ｇ．ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅａｃｔ
ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０〜６６６（１９８３）を参照のこと。タンパ
ク質反応性血清を惹起し得るペプチドは、タンパク質の１次配列中にしばしば表
され、１組の単純な化学的規則により特徴付けられ得、そしてインタクトなタン
パク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、またアミノ末端
もしくはカルボキシ末端にも限定されない。
【００９４】 従って、本発明の抗原エピトープ保有ペプチドまたは抗原エピトープ保有ポリ
ペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗
体を含む）を惹起するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ
３７：７６７〜７７８（１９８４）の７７７頁を参照のこと。
【００９５】 本発明の抗原エピトープ保有ペプチドまたは抗原エピトープ保有ポリペプチド
は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中に含まれる、好ましくは、少なくと
も７つの、より好ましくは少なくとも９つの、および最も好ましくは、およそ少
なくとも約１５〜約３０の間のアミノ酸の配列を含む。
【００９６】 本発明の抗原エピトープ保有ペプチドおよび抗原エピトープ保有ポリペプチド
は、任意の従来の手段により生成され得る。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、「Ｇ
ｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈ
ａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖ
ｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１〜５１３５（１９８５）。この「同時複数ペプチド
合成（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎらに与えられた米国特許第４
，６３１，２１１号（１９８６）にさらに記載される。
【００９７】 当業者が理解するように、上記の本発明のＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭＥ
ＴＨ２ポリペプチドおよびそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン
（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わされ、キメラポリペプチドを生じ得
る。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボで半減期の増
加を示す。このことは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第１の２つのドメイ
ンおよび哺乳動物免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の定常領域の種々のドメイン
からなるキメラタンパク質（ＥＰＡ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら
、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４〜８６（１９８８））に関して、示されている。
ＩｇＧ部分に起因してジスルフィド結合された二量体構造を有する融合タンパク
質はまた、単量体ＭＥＴＨ１タンパク質またはＭＥＴＨ２タンパク質あるいはタ
ンパク質フラグメント単独よりも、結合が有効でありそして他の分子を中和し得
る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８〜３
９６４（１９９５））。
【００９８】 （ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２の、ポリヌクレオチドならびにポリペプチドフ
ラグメント） 本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、寄託されたクロー
ンに含まれるか、または配列番号１もしくは配列番号３に示される、核酸配列を
有する短いポリヌクレオチドをいう。この短いヌクレオチドフラグメントは、好
ましくは、少なくとも約１５ヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも約
２０ヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド、および
さらにより好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチドの長さである。「少なくと
も２０ヌクレオチドの長さ」のフラグメントは、例えば、寄託されたクローンに
含まれるｃＤＮＡ配列または配列番号１もしくは配列番号３において示されるヌ
クレオチド配列からの２０個以上連続した塩基を含むことが意図される。これら
のヌクレオチドフラグメントは、本明細書中で考察されるように、診断プローブ
およびプライマーとして有用である。もちろん、より大きなフラグメント（例え
ば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）が好ましい。
【００９９】 さらに、ＭＥＴＨ１ポリヌクレオチドフラグメントまたはＭＥＴＨ２ポリヌク
レオチドフラグメントの代表的な例は、例えば、配列番号１もしくは配列番号３
または寄託されたクローンにおいて含まれるｃＤＮＡの、ヌクレオチド番号約１
〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２
５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５
００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５０、７
５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１
０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１
５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５
０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１
〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、
１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、１８５１〜１
９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、あるいは２００１〜最後、
の配列を有するフラグメントを含む。この状況において、「約」は、具体的に列
挙される範囲、いずれかの末端もしくは両方の末端で、いくつか（５、４、３、
２、もしくは１個）のヌクレオチドだけより大きなまたはより小さな範囲を含む
。好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活性を有するポリぺプチドを
コードする。より好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、本明細書において
考察されるようにプローブまたはプライマーとして使用され得る。
【０１００】 本発明において、「ポリぺプチドフラグメント」とは、配列番号２または配列
番号４に含まれ、または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコード
される、短いアミノ酸配列をいう。タンパク質フラグメントは、「そのまま（ｆ
ｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、またはそのフラグメントが部分ま
たは領域を形成する、より大きなポリぺプチド内に、最も好ましくは単一の連続
した領域として、含まれ得る。本発明のポリぺプチドフラグメントの代表的な例
は、例えばコード領域あるいは配列番号２または配列番号４の、アミノ酸番号の
約１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１
２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２
０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、もしくは２
８１〜最後のフラグメントを含む。さらに、ポリぺプチドフラグメントは、約２
０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１
３０、１４０、または１５０アミノ酸の長さであり得る。この状況において、「
約」は、具体的に列挙される範囲、いずれかの末端または両方の末端で、いくつ
かの（５、４、３、２、または１個）アミノ酸長だけ、より大きなまたはより小
さな範囲を含む。
【０１０１】 好ましいポリぺプチドフラグメントは、分泌ＭＥＴＨ１タンパク質または分泌
ＭＥＴＨ２タンパク質およびその成熟形態を含む。さらに好ましいポリぺプチド
フラグメントは、アミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその両方から、連
続した一連の欠失された残基を有する、分泌ＭＥＴＨ１タンパク質もしくは分泌
ＭＥＴＨ２タンパク質またはその成熟形態を含む。例えば、１〜６０個の範囲の
任意の数のアミノ酸が、分泌ＭＥＴＨ１ポリペプチドもしくは分泌ＭＥＴＨ２ポ
リペプチドまたはその成熟形態のいずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様
に、１〜３０個の範囲の任意数のアミノ酸が、分泌ＭＥＴＨ１タンパク質もしく
は分泌ＭＥＴＨ２タンパク質または成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る
。さらに、上述のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組み合わせが
好ましい。同様に、これらのＭＥＴＨ１ポリペプチドフラグメントもしくはＭＥ
ＴＨ２ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドフラグメントも
また、好ましい。
【０１０２】 特に、ＭＥＴＨ１ポリペプチドのＮ−末端欠失は、一般式ｍ−９５０によって
記載され得る。ここで、ｍは２〜９４９の整数であり、ここで、ｍは配列番号２
で同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、配列番号２に示され
る、本発明のＭＥＴＨ１ポリペプチドのＮ−末端欠失は、配列番号２の以下の残
基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０１０３】
【化１】
【０１０４】 さらに、ＭＥＴＨ１ポリペプチドのＣ−末端欠失はまた、一般式１−ｎによっ
て記載され得る。ここで、ｎは２〜９５０の整数であり、ここで、ｎは配列番号
２で同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、配列番号２に示さ
れる本発明のＭＥＴＨ１ポリペプチドのＣ−末端欠失は、配列番号２の以下の残
基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０１０５】
【化２】 例えば、上記に列挙したＮ−末端欠失またはＣ−末端欠失のいずれかが、Ｎ−末
端欠失およびＣ−末端欠失ＭＥＴＨ１ポリペプチドを産生するために組み合わせ
られ得る。
【０１０６】 さらに、ＭＥＴＨ２ポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ−８９０によって
記載され得る。ここで、ｍは２〜８８９の整数であり。ここで、ｍは配列番号４
で同定されるアミノ酸残基の部分に対応する。好ましくは、配列番号４に示され
る、本発明のＭＥＴＨ２ポリペプチドのＮ末端欠失は、配列番号４の以下の残基
のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０１０７】
【化３】
【０１０８】 さらに、ＭＥＴＨ２ポリペプチドのＣ末端欠失はまた、一般式１−ｎによって
記載され得る。ここで、ｎは２〜８９０の整数であり。ここで、ｎは配列番号４
で同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、配列番号４に示され
る、本発明のＭＥＴＨ２ポリペプチドのＣ末端欠失は、配列番号４の以下の残基
のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０１０９】
【化４】 好ましくは、上記に列挙されたＮ末端欠失またはＣ末端欠失のいずれかは、Ｎ末
端およびＣ末端が欠失したＭＥＴＨ２ポリペプチドを生成するために組み合わさ
られ得る。
【０１１０】 本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方から欠失した１つ以
上のアミノ酸を有するポリペプチド（これは、配列番号２または配列番号４のｍ
−ｎ残基を有するように一般的に記載され得、ここでｎおよびｍは、上記のよう
な整数である）を提供する。
【０１１１】 構造的または機能的ドメインによって特徴付けられるＭＥＴＨ１またはＭＥＴ
Ｈ２のポリペプチドフラグメントおよびポリヌクレオチドフラグメントもまた好
ましい。本発明の好ましい実施態様としては、αヘリックスおよびαヘリックス
形成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」）、タ
ーンおよびターン形成領域（「ターン領域」）コイルおよびコイル形成領域（「
コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、
可撓性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含むフラ
グメントが挙げられる。図において示されるように、そのような好ましい領域は
、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領域、およびコイル
領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ
−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα
およびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ
表面形成領域、ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域を含む。保
存ドメイン内に含まれる配列番号２のポリペプチドフラグメントは、特に本発明
により意図される（図１０および１１ならびに表１および２を参照のこと）。さ
らに、これらのドメインをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた意図
される。
【０１１２】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＭＥＴＨ１フラグメントまた
はＭＥＴＨ２フラグメントである。生物学的に活性なフラグメントとはＭＥＴＨ
１ポリペプチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプチドの活性と、同一である必要なない
が、類似した活性を示すフラグメントである。そのフラグメントの生物学的活性
は、改善された所望の活性または減少した所望されない活性を含み得る。
【０１１３】 しかし、多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公的に入手
可能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配
列のいくつかは、配列番号１または配列番号３に関連し、そして本発明の着想の
前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリ
ヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙する
ことは煩わしい。従って、好ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載
されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号１の１〜９３６の任意の整数で
あり、ｂは１５〜９５０の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１に
示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上であ
る）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。さらに、好ましくは、本
発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配
列番号３の１〜８７６の任意の整数であり、ｂは１５〜８９０の整数であり、こ
こでａおよびｂの両方は配列番号３に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し
、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが
除外される。
【０１１４】 （エピトープおよび抗体） 本発明において、「エピトープ」とは、動物において、特にヒトにおいて、抗
原性または免疫原性活性を有するＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリぺプチドフラ
グメントをいう。本発明の好ましい実施態様は、エピトープを含むＭＥＴＨ１ま
たはＭＥＴＨ２ポリぺプチドフラグメント、およびこのフラグメントをコードす
るポリヌクレオチドに関する。抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗
原性エピトープ」と定義される。対照的に、「免疫原性エピトープ」は、抗体応
答を誘発するタンパク質の一部と定義される。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９
８３）を参照のこと）。
【０１１５】 エピトープとして機能するフラグメントは任意の従来の手段によって産生され
得る（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ．Ｒ．Ａ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５ （１９８５）、米国特
許第４，６３１，２１１号でさらに記載される、を参照のこと）。
【０１１６】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは少なくとも７つ、より好ま
しくは少なくとも９つ、そして最も好ましくは約１５〜約３０アミノ酸の間の配
列を含む。抗原性エピトープは、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクロ
ーナル抗体を含む）を惹起するために有用である（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃ
ｅｌｌ ３７：７６７−７７８ （１９８４）； Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ， Ｊ．
Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９： ６６０−６６６ （１９８３）を参照のこ
と）。
【０１１７】 同様に、免疫原性エピトープは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導す
るために使用され得る（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出； Ｗｉｌｓｏｎ
ら、前出； Ｃｈｏｗ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８２： ９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ， Ｆ． Ｊ．ら
、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２３４７−２３５４ （１９８５）を
参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは分泌タンパク質を含む。免疫原性
エピトープは、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）にアルブミンのようなキ
ャリアタンパク質とともに提示され得るか、または免疫原性エピトープが十分に
長い場合（少なくとも、約２５アミノ酸）には、キャリアなしで提示され得る。
しかし、わずか８〜１０アミノ酸を含む免疫原性エピトープは、変性ポリペプチ
ドにおいて（例えば、ウエスタンブロッティングにおいて）、少なくとも線状エ
ピトープに結合し得る抗体を惹起するのに十分であることが示されている。
【０１１８】 ＤＮＡｓｔａｒ分析を使用して、配列番号２は、以下のアミノ酸で抗原性であ
ることが見出された：
【０１１９】
【化５】 従って、これらの領域は、ＭＥＴＨ１ ｃＤＮＡによってコードされるタンパク
質に対して抗体を産生するエピトープとして使用され得る。
【０１２０】 ＤＮＡｓｔａｒ分析を使用して、配列番号４は、以下のアミノ酸で抗原性であ
ることが見出された：
【０１２１】
【化６】 従って、これらの領域は、ＭＥＴＨ２ ｃＤＮＡによってコードされるタンパク
質に対して抗体を産生するエピトープとして使用され得る。
【０１２２】 本明細書中で使用される用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」
（Ｍａｂ）は、タンパク質に特異的に結合し得るインタクトな分子および抗体フ
ラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを
意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクトな抗体のＦ
ｃフラグメントを欠き、循環からより迅速に排除され、そしてインタクトな抗体
よりも少ない非特異的組織結合を有し得る。（Ｗａｈｌら、 Ｊ． Ｎｕｃｌ．
Ｍｅｄ． ２４： ３１６−３２５ （１９８３））。従って、これらのフラ
グメントは、ＦＡＢの産物または他の免疫グロブリン発現ライブラリーと同様に
好ましい。さらに、本発明の抗体はキメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体を
含む。
【０１２３】 （融合タンパク質） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の任意のポリペプチドは、融合タンパク質を産生
するために使用され得る。例えば、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチド
は、第２のタンパク質と融合される場合、抗原性タグとして使用され得る。ＭＥ
ＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドに対して惹起される抗体は、ＭＥＴＨ１
またはＭＥＴＨ２に結合することによって、第２のタンパク質を間接的に検出す
るために使用され得る。さらに、分泌されるタンパク質は、輸送シグナルに基づ
いく細胞位置を標的化するので、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドは
、他のタンパク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
【０１２４】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドと融合され得るドメインの例は、
異種シグナル配列のみならず、また他の異種機能性領域をも含む。この融合は、
必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０１２５】 さらに、融合タンパク質はまた、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチド
の特徴を改良するために操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電ア
ミノ酸の領域が、宿主細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定
性および持続性を改良するために、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドの
Ｎ末端へ付加され得る。また、ペプチド部分は精製を容易にするために、ＭＥＴ
Ｈ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドへ付加され得る。このような領域は、ＭＥＴ
Ｈ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチ
ドの取り扱いを容易にするためのペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られ
る慣用の技術である。
【０１２６】 さらに、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチド（フラグメント、そして
特にエピトープを含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と
組み合わせられ得、キメラポリぺプチドを生じる。これらの融合タンパク質は精
製を容易にし、そしてインビボにおける増大した半減期を示す。１つの報告され
た例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免
疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタン
パク質を記載している（ＥＰ Ａ ３９４，８２７； Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら
、Ｎａｔｕｒｅ ３３１： ８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量
体構造（ＩｇＧに起因する）を有する融合タンパク質もまた、単量体分泌タンパ
ク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和す
るのにさらに効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。
【０１２７】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応特許第２０４５８６９
号）は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは
、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として
使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発
見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニス
トを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分
と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）
。
【０１２８】 さらに、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドはマーカー配列（例えば
、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の精製を容易にするペプチド）に融合され得る。
好ましい実施態様において、そのマーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒ
スチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５
９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）にお
いて提供されるタグ）であり、これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販され
ている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジ
ンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製のために有用な別のペ
プチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来
のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４
））。
【０１２９】 従って、任意のこれら上記の融合物は、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを使用して操作され得る。
【０１３０】 （ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の生物学的活性） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドおよびポリペプチドをアッセ
イに用いて、１つ以上の生物学的活性について試験し得る。ＭＥＴＨ１またはＭ
ＥＴＨ２のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、特定のアッセイにおいて活
性を示すならば、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２は、生物学的活性に関連した疾患
に関与し得る可能性が高い。従って、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を用いて、関
連する疾患を処置し得る。
【０１３１】 （免疫活性） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、免疫
細胞の増殖、分化、または移動（走化性）の活性化もしくは阻害によって、免疫
系の不全または障害を処置するのに有用であり得る。免疫細胞は、造血と称され
るプロセス、すなわち、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球
、およびマクロファージ）およびリンパ系（ＢおよびＴリンパ球）細胞を産生す
るプロセスを通じて発生する。これらの免疫不全または障害の病因は、遺伝性、
体細胞性（例えば、ガンまたはいくつかの自己免疫障害）、後天性（例えば、化
学療法または毒素による）、または感染性であり得る。さらに、ＭＥＴＨ１また
はＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定の免疫系疾患また
は障害のマーカーまたは検出因子として使用され得る。
【０１３２】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、造血
細胞の不全または障害を処置または検出するに有用であり得る。ＭＥＴＨ１また
はＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して、特定の（また
は多くの）型の造血細胞の減少に関連する障害を処置するための取り組みにおい
て、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させ得る。免疫学的な
不全症候群の例には、以下が挙げられるがそれらに限定されない：血液タンパク
質障害（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血
管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、
ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少、食細胞殺菌機能
不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット−オールドリッチ障害、
貧血、血小板減少症、または血色素尿。
【０１３３】 さらに、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
はまた、止血活性（出血を停止する）または血栓崩壊活性（血餅の形成）を調節
するために使用され得る。例えば、止血または血栓崩壊活性を増加させることに
よって、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
、血液凝固障害（例えば、無フィブリノーゲン血症、因子欠乏）、血液血小板障
害（例えば、血小板減少症）、または外傷、手術もしくは他の原因から生じる創
傷を処置するために使用され得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減
少させ得る、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドを用いて、凝固を阻害または溶解し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）
、発作、または瘢痕の処置に重要であり得る。
【０１３４】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、
自己免疫障害を処置または検出するのに有用であり得る。多くの自己免疫障害は
、免疫細胞によって、自己を外来物質として不適切に認識することからもたらさ
れる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊を導く免疫応答を生じる。それゆえ
、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害し得るＭＥＴＨ１ま
たはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与は、自己免疫障害
を予防するのに有効な治療であり得る。
【０１３５】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２によって処置または検出され得る自己免疫障害の
例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：アディソン病、溶血
性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎
、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋
無力症、神経炎、結膜炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、
ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトー
デス、自己免疫性肺炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、お
よび自己免疫炎症性眼病。
【０１３６】 同様に、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸問題のようなアレルギ
ー性反応および状態もまた、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドにより処置され得る。さらに、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を
用いてアナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏症、または血液型不適合性を
処置し得る。
【０１３７】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、
器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置および／または予防するた
めに用いられ得る。器官拒絶は、宿主免疫細胞が免疫応答を通じて移植された組
織を破壊することにより生じる。同様に、免疫応答はまた、ＧＶＨＤに関与して
いるが、この場合、外来の移植された免疫細胞は宿主組織を破壊する。免疫応答
、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害するＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ
２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤを
予防するのに有効な治療であり得る。
【０１３８】 同様に、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
はまた、炎症を調節するために用いられ得る。例えば、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴ
Ｈ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、炎症性応答に関与する細胞の増
殖および分化を阻害し得る。これらの分子は、以下を含む炎症状態（慢性および
急性の両方の状態）を処置するために使用され得る：感染に関連した炎症（例え
ば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、
虚血性再灌流傷害、内毒素死亡、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイト
カインまたはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病、またはサイ
トカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰産生からもたらされる状態。
【０１３９】 （過剰増殖性障害） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、新生
物を含む過剰増殖性障害を処置または検出するために使用され得る。ＭＥＴＨ１
またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、直接的相互作用ま
たは間接的相互作用を通じて障害の増殖を阻害し得る。あるいは、ＭＥＴＨ１ま
たはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、過剰増殖性障害を阻
害し得る他の細胞を増殖させ得る。
【０１４０】 例えば、免疫応答を増加させることによって、特に過剰増殖性障害の抗原性の
質を上げることによって、またはＴ細胞の増殖、分化、もしくは遊走によって、
過剰増殖性障害は処置され得る。この免疫応答は、存在する免疫応答を増強させ
るかまたは新たな免疫応答を開始させるかのいずれかによって上昇され得る。あ
るいは、免疫応答の減少はまた、化学療法剤のような過剰増殖性障害を処置する
方法であり得る。
【０１４１】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処
置されるかまたは検出され得る過剰増殖性障害の例には、以下に見出される新生
物が含まれるがこれらに限定されない：腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓
、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼
、頭部および頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、
脾臓、胸部、ならびに泌尿生殖器。
【０１４２】 同様に、他の過剰増殖性障害もまた、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌク
レオチドまたはポリペプチドにより処置または検出され得る。このような過剰増
殖性障害の例には、以下が挙げられるがこれらに限定されない：高ガンマグロブ
リン血症、リンパ球増殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシ
ス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、
組織球増殖症、および任意のその他の過剰増殖性疾患、加えて上記に列挙した器
官系に見出される新生物。
【０１４３】 （感染性疾患） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染
因子を処置または検出するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させる
ことによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させる
ことによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、存在する免疫応答を上
昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得
る。あるいは、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドはまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る
。
【０１４４】 ウイルスは、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドにより処置または検出され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の
一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡウイルス科が挙
げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナ
ウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリチ
ウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス
科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例
えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状ヘルペス）、モノネガウイル
ス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、モルビリ
ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエ
ンザ）、パポーバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポック
スウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロ
タウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイ
ルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入
るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き
起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、脳炎、眼
性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ
型、Ｅ型、活動性慢性、デルタ）、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）
、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パライン
フルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染病、皮膚病（例えば
、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状または疾患が処
置または検出され得る。
【０１４５】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドによって処置または検出され得る細菌性因
子または真菌性因子は、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌科および真菌類
を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄ
ｉａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎ
ｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌ
ａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃ
ｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏ
ｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍ
ａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉ
ｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅ
ｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌ
ｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓ
ｍａｔａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅ
ｌｌａｃｅａの感染症（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅ
ｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、および
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むが
これらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼
感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤ
Ｓに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感
染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤
痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒
、ジフテリア、らい病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風
、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌
症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。Ｍ
ＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、任
意のこれらの症状または疾患を処置または検出し得る。
【０１４６】 さらに、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
により処置または検出され得る疾患または症状を引き起こす寄生生物性因子とし
ては以下のファミリーが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベ
シア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、交疫、外
部寄生生物症（Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ）、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫病、
リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およ
びＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定さ
れない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染
症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見
感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラス
マ症。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用
いて、任意のこれらの症状または疾患を処置または検出し得る。
【０１４７】 好ましくは、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドを用いる処置は、患者に有効量のＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチ
ドを投与するか、または患者から細胞を取り出して、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ
２のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして患者に操作した細胞を戻す（
エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る。さらに、ＭＥＴＨ１また
はＭＥＴＨ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ワクチン中の抗原とし
て用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０１４８】 （再生） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて
、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生を用い
て、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば
、骨粗鬆症、変形性関節症（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不
全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害、または全身性サイトカイ
ン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、または保護し得る。
【０１４９】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
脈管（脈管内皮を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、および靭帯
）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生じる。再
生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０１５０】 さらに、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、治癒するのが困難な組織の再生を増加し得る。例えば、腱／靭帯再生を増大
させることによって、損傷後の回復時間が早まる。本発明のＭＥＴＨ１またはＭ
ＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、損傷を回避する試みに
おいて予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群
、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例
は、圧迫性潰瘍（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｕｌｃｅｒ）、脈管不全、外科的創傷、お
よび外傷性創傷に関連する潰瘍を含む。
【０１５１】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるためにＭ
ＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用するこ
とによって再生され得る。本方法を用いて処置され得る疾患は、中枢神経系疾患
および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的および外傷性障害（例えば、脊
髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））を含む。詳細には
、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医
学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神経系疾患（例えば、アルツ
ハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシ
ャイ−ドレーガー症候群）はすべて、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドを用いて処置され得る。
【０１５２】 （走化性） ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化
性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、
Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞、および／または内皮細胞）を、身体中の
特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部位）に誘引または移動さ
せる。次いで、移動した細胞は、特定の外傷もしくは異常性を撃退および／また
は治癒し得る。
【０１５３】 ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定
の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの走化性分子を使用して、身
体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させることによって、炎症、感染
、過剰増殖性障害、または任意の免疫系障害を処置し得る。例えば、走化性分子
を使用して、免疫細胞を傷害を受けた位置に誘引することによって、組織に対す
る創傷および他の外傷を処置し得る。走化性分子として、ＭＥＴＨ１もしくはＭ
ＥＴＨ２はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され
得る。
【０１５４】 ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが走化性
活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分子はまた、障害を処置する
ために使用され得る。従って、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチド
またはポリペプチドは、走化性のインヒビターとして使用され得る。
【０１５５】 （結合活性） ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２ポリペプチドは、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ
２に結合する分子、またはＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２が結合する分子をスク
リーニングするために使用され得る。ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２と分子との
結合は、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２または結合した分子の活性を活性化（ア
ゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような
分子の例は、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、
または低分子を含む。
【０１５６】 好ましくは、分子は、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２の天然のリガンド（例え
ば、リガンドのフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、
もしくは機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： 第５章（１９
９１）を参照のこと）。同様に、分子は、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２が結合
する天然のレセプター、または少なくともＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２によっ
て結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連し
得る。いずれの場合においても、分子は、公知の技術を用いて合理的に設計され
得る。
【０１５７】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、ＭＥＴＨ１もしくは
ＭＥＴＨ２を、分泌タンパク質としてまたは細胞膜上でのいずれかで発現する適
切な細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞は、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ． ｃｏｌｉ由来の細胞を含む。次いで、ＭＥＴＨ１
もしくはＭＥＴＨ２を発現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細
胞膜）は、好ましくは、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２または分子のいずれかの
結合、刺激、または活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む試験化合物
と接触される。
【０１５８】 アッセイは、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２への候補化合物の結合を簡単に試
験し得、ここで結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関す
るアッセイにおいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がＭＥＴＨ１
もしくはＭＥＴＨ２への結合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験
し得る。
【０１５９】 あるいは、アッセイは、細胞を含まない調製物、固体支持体に付着されたポリ
ペプチド／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され
得る。アッセイはまた、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２を含む溶液を候補化合物
と混合する工程、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２／分子の活性または結合を測定
する工程、およびＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２／分子の活性または結合を、標
準と比較する工程を簡単に包含し得る。
【０１６０】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるＭＥＴＨ１も
しくはＭＥＴＨ２のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ＭＥＴＨ１もしく
はＭＥＴＨ２の直接的もしくは間接的な結合のいずれか、またはＭＥＴＨ１もし
くはＭＥＴＨ２との基質についての競合によって、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ
２のレベルまたは活性を測定し得る。
【０１６１】 これらの上記のアッセイのすべては、診断マーカーまたは予後マーカーとして
使用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ＭＥＴＨ１もしく
はＭＥＴＨ２分子を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、ま
たは患者における特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得
る。さらに、アッセイは、適切に操作された細胞または組織からのＭＥＴＨ１も
しくはＭＥＴＨ２の産生を阻害または増強し得る因子を発見し得る。
【０１６２】 従って、本発明は、以下の工程を含む、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２に結合
する化合物を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物をＭＥＴＨ１もし
くはＭＥＴＨ２とともにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか
否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタ
ゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候補化合物をＭＥＴＨ１もしくはＭ
ＥＴＨ２とともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする
工程、および（ｂ）ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２の生物学的活性が改変されて
いるか否かを決定する工程。
【０１６３】 （他の活性） ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、
先に議論されるように造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化もしくは増殖を増加
または減少し得る。
【０１６４】 ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、
哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合
、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科）、を調整するために使用さ
れ得る。同様に、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２ポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギーの貯蔵
に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。
【０１６５】 ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、バイ
オリズム、概日リズム、うつ病（抑うつ性障害を含む）、暴力の傾向、痛みへの
耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性によって）、
ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他
の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を
変更するために使用され得る。
【０１６６】 ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、
例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネ
ラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品添加物ま
たは保存剤として使用され得る。
【０１６７】 本発明を一般に記載してきたが、この本発明は、以下の実施例を参照すること
によってより容易に理解される。実施例は、例示のために提供されるのであって
、制限することを意図するものではない。
【０１６８】 （癌の診断および予後） 癌を有する哺乳動物における特定の組織は、対応する「標準」哺乳動物、すな
わち、癌を有さない同じ種の哺乳動物に比較された場合に有意に減少されたレベ
ルのＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質およびＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴ
Ｈ２タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現すると考えられる。さらに、減少さ
れたレベルのＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２タンパク質が、癌を有する哺乳動物由
来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）において、癌を有さな
い同じ種の哺乳動物由来の血清に比較された場合に検出され得ると考えられる。
従って、本発明は、腫瘍診断の間に有用な診断方法を提供する。これは、哺乳動
物細胞または体液においてＭＥＴＨ１タンパク質をコードする遺伝子の発現レベ
ルをアッセイする工程、およびこの遺伝子発現レベルを、標準的なＭＥＴＨ１遺
伝子発現レベルと比較する工程を包含し、これにより、標準を下回る遺伝子発現
レベルの減少は、特定の腫瘍の指標である。本発明はまた、腫瘍診断の間に有用
な診断方法を提供する。これは、哺乳動物細胞または体液においてＭＥＴＨ２タ
ンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする工程、およびこの遺伝
子発現レベルを、標準的なＭＥＴＨ２遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し
、これにより、標準を下回る遺伝子発現レベルの減少は、特定の腫瘍の指標であ
る。
【０１６９】 腫瘍診断が既に従来の方法に従って行われている場合、本発明は、予後指標と
して有用であり、それにより、減少したＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２遺伝子発
現を示す患者は、より低いレベルでこの遺伝子を発現する患者に比較して、悪い
臨床結果を経験する。
【０１７０】 「ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質をコードする遺伝子の発現レベル
をアッセイする」とは、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質のレベルまた
はＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを、
第一の生物学的試料において、直接的（例えば、絶対タンパク質レベルまたはｍ
ＲＮＡレベルを決定するまたは見積もることにより）または相対的（例えば、第
二の生物学的試料におけるＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質レベルまた
はｍＲＮＡレベルに対して比較することにより）のいずれかで、質的もしくは量
的に測定するまたは見積もることを意図している。
【０１７１】 好ましくは、第一の生物学的試料中のＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク
質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定または見積もり、そして標準ＭＥＴＨ１も
しくはＭＥＴＨ２タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較する。この標準
は、癌を有さない個体から得られた第二の生物学的試料から採られる。当該分野
で理解されるように、いったん標準のＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質
レベルまたはｍＲＮＡレベルが公知になると、これは、比較のための標準として
繰り返し用いられ得る。
【０１７２】 「生物学的試料」とは、ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質またはｍＲ
ＮＡを含有する個体、細胞株、組織培養物、あるいは他の供給源から得られる任
意の生物学的試料が意図される。生物学的試料は、分泌された成熟ＭＥＴＨ１も
しくはＭＥＴＨ２タンパク質を含有する哺乳動物体液（例えば、血清、血漿、尿
、滑液、および髄液）、ならびに副腎、甲状腺、胃、脳、心臓、胎盤、肺、肝臓
、筋肉、腎臓、膵臓、精巣および卵巣組織（ＭＥＴＨ１について）；ならびに前
立腺、小腸、結腸、脳、および肺組織（ＭＥＴＨ２について）を包含する。
【０１７３】 本発明は、哺乳動物において癌を検出するために有用である。特に、本発明は
、哺乳動物において以下のタイプの癌の診断の間、有用である：胸部、卵巣、前
立腺、肝臓、肺、膵臓、結腸、および精巣。好ましい哺乳動物は、サル（ｍｏｎ
ｋｅｙ）、サル（ａｐｅ）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、およびヒ
トを包含する。特に好ましいのはヒトである。
【０１７４】 総細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）に記載の一工程グアニジウ
ム−チオシアン酸塩−フェノール−クロロホルム法を用いて生物学的試料から単
離され得る。ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質をコードするｍＲＮＡレ
ベルは、次いで、任意の適当な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザ
ンブロット分析（Ｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ ６３：３０３−３１２（１９９０
））、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング（Ｆｕｊｉｔａら、Ｃｅｌｌ ４９：３５７
−３６７（１９８７））、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖
反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｍａｋｉｎｏら、Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅ ２：２９５−３０１（１９９０））、ならびにリガーゼ連鎖反応と組み合
わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を包含する。
【０１７５】 生物学的試料においてＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質レベルをアッ
セイすることは、抗体ベースの技術を使用して起こり得る。例えば、組織におけ
るＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法
を用いて研究され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））。
【０１７６】 ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な
他の抗体ベースの方法は、免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩ
ＳＡ）および放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ））を包含する。
【０１７７】 適切な標識は、当該分野で公知であり、酵素標識（例えば、グルコースオキシ
ダーゼ）および放射性同位元素（例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ
）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネ
チウム（99mＴｃ）、および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミ ン）、およびビオチンを包含する。
【０１７８】 （投与様式） 血管供給の増加が、腫瘍進行および転移の中心的な役割を果たし、従って、新
脈管形成のインヒビターが、癌患者のためのアジュバント療法として有効である
ことが立証され得ることが認識される。現在認識されている新脈管形成抑制剤の
いくつかは、重度の副作用に起因して全身処置のための十分な候補ではない。本
発明者らは、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２が、インビトロおよびインビボの両方
での新脈管形成の強力なインヒビターであることを見出した。ＭＥＴＨ１および
ＭＥＴＨ１の利点は、これらのインヒビターが、生理学的な新脈管形成の抑制と
通常、関連しており、従って、それらには、他の新脈管形成インヒビターに比べ
て毒性および内皮特異性がないことである。さらに、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ
２は、器官特異性に対して可能な利点を提供する制限された発現パターンを示す
。
【０１７９】 従って、本発明のポリペプチドは、癌を処置するために使用され得る。本発明
のＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２ポリペプチドはまた、新脈管形成に関連した他の
障害（異常創傷治癒、炎症、慢性関節リウマチ、乾癬、子宮内膜出血障害、糖尿
病網膜症、斑変性のいくつかの形態、血管腫、および動脈−静脈先天異常を包含
する）を有する個体を処置するために使用され得る。
【０１８０】 従って、本発明は、個体において新脈管形成を阻害する方法を提供する。この
方法は、このような個体に、このような個体におけるＭＥＴＨ１活性レベルを増
加させるのに有効な、本発明の単離されたＭＥＴＨ１ポリペプチドの有効量を含
む薬学的組成物を投与する工程を包含する。本発明はまた、個体において新脈管
形成を阻害する方法を提供する。この方法は、このような個体に、このような個
体におけるＭＥＴＨ２活性レベルを増加させるのに有効な、本発明の単離された
ＭＥＴＨ２ポリペプチドの有効量を含む薬学的組成物を投与する工程を包含する
。
【０１８１】 このようにして新脈管形成を阻害するために使用され得るＭＥＴＨ１ポリペプ
チドは、以下を包含する：リーダーを含む、寄託されたｃＤＮＡによってコード
されたＭＥＴＨ１ポリペプチド；リーダーのない、寄託されたｃＤＮＡによって
コードされた成熟ＭＥＴＨ１ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；配列
番号２におけるアミノ酸約１〜約９５０を含むポリペプチド；配列番号２におけ
るアミノ酸約２〜約９５０を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸約
２９〜約９５０を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸約３０〜約９
５０を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ１のメタロプロテアーゼドメイン、配列番号
２におけるアミノ酸２３５〜４５９を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ１のジスイン
テグリンドメイン、配列番号２におけるアミノ酸４６０〜５４４を含むポリペプ
チド；ＭＥＴＨ１の第一のＴＳＰ様ドメイン、配列番号２におけるアミノ酸５４
５〜５９８を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ１の第二のＴＳＰ様ドメイン、配列番
号２におけるアミノ酸８４１〜８９４を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ１の第三の
ＴＳＰ様ドメイン、配列番号２におけるアミノ酸８９５〜９３４を含むポリペプ
チド；配列番号２におけるアミノ酸５３６〜６１３を含むポリペプチド；および
配列番号２におけるアミノ酸５４９〜５６３を含むポリペプチド。
【０１８２】 このようにして新脈管形成を阻害するために使用され得るＭＥＴＨ２ポリペプ
チドは、以下を包含する：リーダーを含む、寄託されたｃＤＮＡによってコード
されたＭＥＴＨ２ポリペプチド；リーダーのない、寄託されたｃＤＮＡによって
コードされた成熟ＭＥＴＨ２ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；配列
番号４におけるアミノ酸約１〜約８９０を含むポリペプチド；配列番号４におけ
るアミノ酸約２〜約８９０を含むポリペプチド；配列番号４におけるアミノ酸約
２４〜約８９０を含むポリペプチド；配列番号４におけるアミノ酸約１１２〜約
８９０を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ２のメタロプロテアーゼドメイン、配列番
号４におけるアミノ酸２１４〜４３９を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ２のジスイ
ンテグリンドメイン、配列番号４におけるアミノ酸４４０〜５２９を含むポリペ
プチド；ＭＥＴＨ２の第一のＴＳＰ様ドメイン、配列番号４におけるアミノ酸５
３０〜５８３を含むポリペプチド；ＭＥＴＨ２の第二のＴＳＰ様ドメイン、配列
番号４におけるアミノ酸８３７〜８９０を含むポリペプチド；配列番号４におけ
るアミノ酸２８０〜６０６を含むポリペプチド；および配列番号４におけるアミ
ノ酸５２９〜５４８を含むポリペプチド。
【０１８３】 一般的な事柄として、１用量あたり非経口投与されるＭＥＴＨ１もしくはＭＥ
ＴＨ２ポリペプチドの全薬学的有効量は、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ
／日（患者体重）の範囲であるが、しかし、上述のように、これは、治療の裁量
にかけられる。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／
日であり、そしてヒトにとってより好ましくは、そのポリペプチドについて約０
．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。連続的に与えられた場合、ＭＥＴＨ１もしく
はＭＥＴＨ２ポリペプチドは、代表的には、１日あたり１〜４回の注射によるか
または連続皮下注入（例えば、ミニポンプを使用する）によるかのいずれかで、
約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で投与される。静脈
バック溶液もまた使用され得る。
【０１８４】 本発明のＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２を含有する薬学的組成物は、経口、直
腸、非経口、槽内、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、滴、または経皮パッチに
よるとして）、口腔内、または経口もしくは経鼻スプレーとして投与され得る。
「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性固体、半固体、または液体の充填
剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意のタイプの処方補助剤を意味する。本
明細書中で使用される用語「非経口」は、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨下、皮下
、および関節内の注射および注入を含む投与様式をいう。
【０１８５】 （染色体アッセイ） 本発明の核酸分子はまた、染色体の同定に有用である。配列を個々のヒト染色
体上での特定の位置に特異的に標的化し、そしてそれとハイブリダイズさせ得る
。本発明による染色体に対するＤＮＡのマッピングは、それらの配列と疾患に関
連する遺伝子とを相関付ける際において重要な第１の工程である。
【０１８６】 この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開示されるｃ
ＤＮＡを使用して、ＭＥＴＨ１タンパク質遺伝子またはＭＥＴＨ２タンパク質遺
伝子のゲノムＤＮＡをクローニングする。これは、種々の周知技術およびライブ
ラリー（これは、一般に市販される）を用いて達成し得る。次いで、ゲノムＤＮ
Ａを、この目的のための周知技術を用いてインサイチュ染色体マッピングのため
に使用する。
【０１８７】 さらに、いくつかの場合において、ＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５
ｂｐ）をｃＤＮＡから調製することによって、配列を染色体にマッピングし得る
。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター解析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の
１つより多くのエクソンにまたがらないプライマーを迅速に選択する。従って、
これは増幅過程を複雑にする。次いで、これらのプライマーを個々のヒト染色体
を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用する。
【０１８８】 ｃＤＮＡクローンの中期の染色体スプレッドに対する蛍光インサイチュハイブ
リダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用して、１つの工程において正確な染色
体位置を提供し得る。この技術は、５０ｂｐまたは６０ｂｐほどの短さのｃＤＮ
Ａ由来のプローブを用いて使用され得る。この技術の総説については、Ｖｅｒｍ
ａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓ
ｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ（１９８８）を参照のこと。
【０１８９】 一旦配列が、正確な染色体の位置にマッピングされると、その染色体上の配列
の物理的な位置は、遺伝子マップデータと相関付けされ得る。そのようなデータ
は、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎ
ｃｅ Ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗ
ｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙよりオンラインで入手可能）に見出
される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係
は、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を通じて同定される。
【０１９０】 次に、罹患している個体と罹患していない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム
配列における差異を決定することが、必要である。変異が、罹患している個体の
いくつかまたは全てにおいて観察されるが、いずれの正常な個体においては観察
されない場合、この変異は、疾患の原因因子のようである。
【０１９１】 本発明を一般的に記載したが、本発明は以下の実施例を参照してより容易に理
解される。そしてこれは例示の目的で提供され、限定を意図しない。
【０１９２】 （実施例） （実施例１：ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２の同定およびクローニング） ＴＳＰ様ドメインを有する新規の遺伝子を検索するために、およそ９００，０
０の発現配列タグ（ＥＳＴ）からなる大きなヒトｃＤＮＡデータべースをＴＳＰ
１の第２のＩ型反復に相同な配列についてスクリーニングした。いくつかのＥＳ
Ｔを、ＴＳＰ様ドメインを有するタンパク質をコードすると予測した。ヒトの心
臓および肺ライブラリー由来の２つのｃＤＮＡクローンを、さらに配列決定し、
そして機能解析のために選択した。
【０１９３】 製造業者の指示書に従ってｃＤＮＡ末端５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）ＰＣＲ技術
（Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ増幅キット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＭＥ
ＴＨ１のアミノ末端を得た。ＭＥＴＨ２のアミノ末端を５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを
通じて部分的に得、そして後に確認しゲノムスクリーニングによって完全にした
。ゲノムスクリーニングについて、ＢＡＣクローン（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ）をＰＣＲによって始めに同定した。続いて、１５０〜２００ｂｐの配列を
含む陽性ＢＡＣクローンを、ｐＧＥＭベクターに小さなフラグメントとしてサブ
クローニングし、配列決定した。
【０１９４】 推定アミノ酸配列の分析ならびにＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＳｗｉｓｓ
Ｐｒｏｔデータベースとの比較は、これらの遺伝子が、それらのＮＨ2末端にお けるレプロリジン（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ）ファミリーに対する相同性を有し、
そしてＣＯＯＨ末端にいくつかのＴＳＰ様モチーフを有するメタロプロテアーゼ
の新規のファミリーに属することを示唆した。これらのｃＤＮＡをＭＥＴＨ１お
よびＭＥＴＨ２と名付けた；ＭＥは、メタロプロテアーゼ、ならびにＴＨは、ト
ロンボスポンジンを示す。ＭＥＴＨ１のマウスホモログを同定し、そしてＡＤＡ
ＭＴＳ１と名付けた（Ｋｕｎｏ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：５
５６−５６２（１９９７））。ヒト配列とマウス配列との直接的な比較は、高い
レベルの保存を示した（８３．４％アミノ酸同一性）。従って、ＭＥＴＨ２につ
いてのホモログをさらには同定しなかった。
【０１９５】 興味深いことには、近年同定された、ｐＮＰＩ（プロコラーゲンＩ Ｎ−プロ
テイナーゼ）と命名されたタンパク質；（Ｃｏｌｉｄｇｅ、Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２３７４−２３７９（１９９７）
）は、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２に対する著しい配列類似性および構造類似性
を示した（図３）。本明細書に記載される新規のタンパク質のように、ｐＮＰＩ
もまた、メタロプロテイナーゼ（レプロリジンサブファミリー）およびカルボキ
シル末端でＴＳＰドメインを含む。ｐＮＰＩの配列は、ウシ起源の配列であるが
、配列アラインメントは、同一の構造的特徴を示した。ＭＥＴＨ１とＭＥＴＨ２
との間のアミノ酸類似性は、５１．７％であり、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２と
ｐＮＰＩとの間の相同性は、それぞれより少ない３３．９％および３６．３％で
ある。
【０１９６】 配列分析は、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２のＯＲＦが、それぞれ９５０および
８９０アミノ酸のタンパク質をコードすることを示した。３つ全てのタンパク質
において、ＮＨ2末端は、推定シグナルペプチド、続いてアミノ酸３００あたり の別の推定膜貫通ドメイン（これは、親水性プロットから推定される）を含む。
これらのタンパク質がその膜に結合するか否かは明らかでない。しかし、所定の
予備データを考慮すると、この第２の膜貫通ドメインが疎水性ポケットからなる
こと、そしてＭＥＴＨ１、ＭＥＴＨ２およびｐＮＰＩが実は分泌タンパク質であ
るということは、より可能性がある。シグナルペプチドからＮＨ2末端は、亜鉛 メタロプロテアーゼのサブファミリーに対して相同性を有し、そしてプロドメイ
ン、メタロプロテアーゼドメイン、およびシステインリッチ領域に細分類され得
る。
【０１９７】 プロドメインとメタロプロテアーゼドメインとの間の境界に局所化される、図
３においてＭＥＴＨ１およびＭＲＴＨ２中の二重下線を引いた配列は、哺乳動物
サブチリシン（例えば、フェーリン）についての潜在的な切断部位である（Ｂａ
ｒｒ，１９９１）。タンパク質分解性プロセスは、ＳＶＭＰにおいて起こり、可
溶性のメタロプロテアーゼおよびディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ
）を生じ（Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．およびＦｏｘ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４８：３４５−３６８（１９９５））、そしてそのプ
ロセスはまた、いくつかのＡＤＡＭにおいて検出されている（Ｗｏｌｓｂｅｒｇ
，Ｔ．Ｇ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ １８０：３８９−４０１（１９９６）によって総説される）。この点
で、予備実験は、タンパク質分解プロセスが、少なくともＭＥＴＨ１において生
じることを示唆する。さらに、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２はともに、機能的に
重要な特定のアミノ酸の保存に起因する触媒作用活性であると推定されるＺｎ2+ 結合部位を提示する（図３中の点線）（Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｎ．Ｄ．およびＢａ
ｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４８：１８３−２
２８（１９９５））。このことは、これらのタンパク質が活性プロテアーゼであ
り得ることを示唆する。メタロプロテアーゼドメインに続き、２つの推定ディス
インテグリンループを含むシステインリッチ領域が存在する（Ｗｏｌｓｂｅｒｇ
，Ｔ．Ｇ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ １８０：３８９−４０１（１９９６））（図３中で矢印によってマー
クされる）。ディスインテグリンドメインは、ヘビ毒液メタロプロテアーゼ（Ｓ
ＶＭＰ）およびＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイ
ンを含む哺乳動物タンパク質）中のメタロプロテアーゼのスーパーファミリー内
に見出され、そして、ＳＶＭＰ中でそれらのリガンドへのインテグリンの結合を
阻害する可能な機能を有する。逆に、膜アンカータンパク質の一部としての、Ａ
ＤＡＭディスインテグリン様ドメインは、細胞−細胞相互作用を崩壊するよりも
むしろ促進し得る（Ｗｏｌｓｂｅｒｇ，Ｔ．Ｇ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｍ．，
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８０：３８９−４０１（１９
９６））。ＴＳＰ様ドメインは、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２タンパク質のＣＯ
ＯＨ側半分に位置する。ＭＥＴＨ１は、未知の機能を有するスペーサー領域によ
って分離される２つの保存されたＴＳＰドメイン、およびより低い相同性である
サブドメイン、第２の抗−抗原性領域に続く５つのシステインのみを含む。ＭＥ
ＴＨ２は、そのスペーサー領域により分離される２つのＴＳＰドメインを含む。
ＴＳＰ１およびＴＳＰ２のドメインと、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２のＴＳＰ様
ドメインとのアラインメントを図５に示す。相同性は、全てのＴＳＰ反復の間の
アミノ酸類似性１９．２％〜５２％の間で変化する。１〜６と番号付けられたシ
ステインおよびトリプトファンは（アステリスクにより標識される）、高度に保
存される。
【０１９８】 ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロットにより、ゲノムにおけるＭＥＴＨ１および
ＭＥＴＨ２の存在が示された。ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２プローブは、異なる
サイズのバンドを示し、このことは、それらが異なる遺伝子から転写されること
を示唆する。
【０１９９】 Ｉ型反復のコンセンサス配列は、完全に保存される６つのシステインを有する
１６残基を含む。代表的には、それは、ヘパリンに結合することもまた示されて
いる配列モチーフＷＳＸＷＳ（配列番号８２）で始まる（Ｇｕｏ，Ｎ．ら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９３４９−１９３５５（１９９２））。ヘパリ
ンに対するこの領域の親和性は、ＴＳＰ−１の抗新脈管形成活性の一部を提案す
る（Ｇｕｏ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．４９（１９９７））。ＴＳ
Ｐのタンパク質ファミリーの内の５つのメンバーの間で、ＴＳＰ−１およびＴＳ
Ｐ−２のみが、新脈管形成を阻害し、そしてＩ型反復を含む（Ｔｏｌｓｍａ、Ｓ
．Ｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２２：４９７−５１１（１９９３）；Ｋｙ
ｒｉａｋｉｄｅｓ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４０：４１９−４
３０（１９９８））。Ｉ型またはプロパージン反復はおそらく、５００および９
００年前の間のエキソン混合によりＴＳＰ１および２の前駆体に付加された（Ａ
ｄａｍｓ，Ｊ．ら、Ｔｈｅ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ Ｇｅｎｅ Ｆａｍ
ｉｌｙ、第１版 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ
ｃｅ Ｕｎｉｔ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編）、Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ、Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９５））。このドメインの獲得は、新脈管形成の調節
のような機能を有するＴＳＰ１およびＴＳＰ２の前駆体を提供したようである。
より最近では、ｐ５３によって調節されるその能力について脳のライブラリーか
ら単離されるタンパク質である、ＢＡＩ−１（脳性新脈管形成インヒビター−１
）もまた、ＴＳＰ−１のＩ型反復を含むこと、およびこの分子に対して抗新脈管
形成の可能性を提供することが示されている（Ｎｉｓｈｉｍｏｒｉ，Ｈ．ら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ １５：２１４５−２１５０（１９９７））。にもかかわらず、
さらなる配列または状況もまた重要であるようである。なぜなら、Ｉ型反復を含
む他のタンパク質が明らかなまたはより達成された抗新脈管形成特性（例えば、
プロパージン、Ｆ−スポンジン、および補体ファミリーの他のメンバー）を有す
るようではないからである。
【０２００】 それらの抗新脈管形成特性に加えて、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２においてＴ
ＳＰ反復の存在のために、これらのタンパク質は、ＴＳＰのスーパーファミリー
のメンバーと本来見なされた。にもかかわらず、それらは、他のＴＳＰに対して
さらなる相同性を有さず、そして実際、ＴＳＰ１およびＴＳＰ２に対する類似性
は、Ｉ型反復に制限される。さらに、タンパク質はまた、ＡＤＡＭファミリーの
メンバーに対して強力な配列相同性および構造相同性を有する。これらの特徴に
より、Ｋｕｎｏおよび共同研究者らはＭＥＴＨ１のマウスホモログに対してＡＤ
ＡＭＴＳと名づけた（Ｋｕｎｏ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：５
５６−５６２（１９９７））。ｐＮＰＩの新しい同定およびその本明細書中に記
載のタンパク質に対する著しい配列相同性は、これら３つのタンパク質全てをメ
タロスポンジンと名付けられたサブファミリーにおいてグループ分けすることを
促す。この点において、ｐＮＩＰが、抗新脈管形成特性を有するか否かも、ある
いはＭＥＴＨ１および／またはＭＥＴＨ２が、α１（Ｉ）プロコラーゲンのアミ
ノ末端プロペプチドの切断に関与するか否かも、明らかではない。
【０２０１】 （実施例２：ノーザンおよびサザンブロット分析） 総ＲＮＡを、先に記載されるように、グアニジニウム−イソチオシアナート抽
出により細胞から精製した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ
，Ｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７））。製
造業者の条件に従って、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ＢＭＢ，Ｉ
ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）キットを用いて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出し
た。他のポリ（Ａ）＋ＲＮＡブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ
，ＣＡ）から購入した。以下を含む溶液中で、４２℃で１２〜１８時間プレハイ
ブリダイゼーションを実施した：５０％ホルムアミド、６×ＳＳＰＥ、１×Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの熱変性サケ精子
ＤＮＡ。標識したｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを、同じ溶液中
で４２℃１２〜１８時間で進行させた。ＴＳＰ１およびＭＥＴＨ１プローブは、
ヒトｃＤＮＡの全体と一致した。ＭＥＴＨ２プローブは、ヒトｃＤＮＡ由来のＫ
ｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに対応した。グリセルアルデヒド−３−リン酸
−デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）の１．３Ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントを使用し
て、ロード効率および転写効率（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）に
ついて基準化した。膜をＫｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘ ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ
，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）にさらした。
【０２０２】 サザンブロットについて、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）より購入
したヒトゲノムＤＮＡを、６５℃で１０分間加熱し、そしてＥｃｏＲＩおよびＰ
ｓｔＩを用いて３７℃で一晩消化した。５μｇの消化されたＤＮＡを１％アガロ
ースゲルにおいて分離し、ナイロン（ｎｙｔｒａｎ）膜へ転写し、紫外線光によ
って架橋した。ｃＤＮＡプローブ、ならびにプレハイブリダイゼーションおよび
ハイブリダイゼーション条件をノーザンブロットについて記載された条件と同一
にした。ブロットを高ストリンジェンシー（０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、
５０℃）で洗浄した。
【０２０３】 ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２の発現パターンを、成体組織および胚組織の両方
において調べた。ノーザンブロット分析を高ストリンジェンシー条件下で、ヒト
組織由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含むブロットを用いて実施した。ＭＥＴＨ１お
よびＭＥＴＨ２転写物は、４．６Ｋｂおよび３．７Ｋｂの単一バンドをそれぞれ
示した。大量のＭＥＴＨ１ ｍＲＮＡ発現が副腎、心臓、胎盤、続いて骨格筋、
甲状腺、胃において観察された。分析した胚組織から、腎臓がＭＥＴＨ１ ｍＲ
ＮＡの最も高い発現を示した。にもかかわらず、ＭＥＴＨ１ ｍＲＮＡのより弱
い発現が、分析した全ての組織において見られた。ＭＥＴＨ２ ｍＲＮＡの分布
は、より制限され、そしてＭＥＴＨ１の分布より弱い。最も高い発現が、成体お
よび胚の両方の肺において見られた。興味深いことに、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴ
Ｈ２の発現は、重複しないようである。この組み合わせにおいて、その構造的類
似性およびそれらの発現パターンは、転写調節がさらに異なる機能的重複を示唆
する。同じブロットにおけるＴＳＰ１転写物の発現レベルをまた、比較目的のた
めに分析する。ＴＳＰ１ ｍＲＮＡの最も高い発現は、成人の胎盤および分析し
た全ての胚組織において見られた。ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２とは対照的に、
本発明者らは、実験した全ての他の組織において、ＴＳＰ１転写産物の一定した
レベルを観察した。
【０２０４】 細胞型分布もまた、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノーザンブロット分析により研究さ
れた。ＭＥＴＨ１ ｍＲＮＡは、皮膚線維芽細胞、脈管平滑筋、子宮内膜間質細
胞、ならびに２つの癌細胞株（ＨｅＬａおよびＧ６３１、それぞれ腺癌および黒
色腫）において、低いレベルで、検出可能であった。ＭＥＴＨ２ ｍＲＮＡは、
ＳＷ４８０、結腸癌細胞株上にのみ検出されたが、他のいずれの細胞株、および
分析した主な株においても発現は見られなかった。
【０２０５】 新脈管形成および抗新脈管形成因子の群が特定の器官で血管網形成を調節する
可能性について、真実でありそうだが証明されていない仮説が、頻繁に議論され
ている。明らかに異なり、ほとんど重複しないＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２の発
現パターンは、少なくとも全体のレベルに関して当惑した。ＴＳＰ１およびＴＳ
Ｐ２はまた、高いレベルのアミノ酸類似性である同一の構造を共有し、さらにそ
れらの発現パターンは、有意に異なる（Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ、Ｍ．Ｌ．
、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．１９７：４０−５６（１９９３））。この差異は、先に示唆
されたそれらのプロモーターおよび異なる調節機構における異なるシス作用性エ
レメントに基づくようである。ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２のプロモーターは、
特徴付けられていないが、それらは、各遺伝子の調節について独特の特徴を提供
するようである。にもかかわらず、実証された抗新脈管形成特性を有する、１つ
のモチーフである、抗新脈管形成／Ｉ型反復が、異なる組織特異性を有するいく
つかのタンパク質において存在する可能性は魅力がある。あるいは、同じファミ
リーで密接に関連するメンバーの間の配列における小さな差異は、機能的重複を
超える重要さを保持し得る。ＴＳＰ１およびＴＳＰ２の場合、著しい構造的類似
性、およびおそらく機能的に共通した抗新脈管形成特性を有することは別として
、ＴＳＰ１およびＴＳＰ２はまた、それらの自体の機能の提示をするようであり
、そしてそれらの相対的類似性によって共有されないようである。これは、これ
らの遺伝子について２つのノックアウトの結果で明らかになった。ＴＳＰ１ヌル
動物は、初期の肺障害（Ｌａｗｌｅｒ、Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
１０１：９８２−９９２（１９９８））、および第２の脈管異常を示したが、特
定の病的状態下または制限された器官のセットにおいてのみ示した。対照的に、
ＴＳＰノックアウトマウスは、皮膚、腱、および骨の実行結果に関して、予期し
なかったコラーゲンアセンブリ異常を示した（Ｋｙｒｉａｋｉｄｅｓ，Ｔ．Ｒら
、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４０：４１９−４３０（１９９８））。さらに、
これらの動物はまた、真皮の毛細管密度において全体的に増加するようである。
新しく記載されたメタロスポンジンファミリーのメンバーの間の類似点が機能的
にどのように移動（ｔｒａｎｓｌａｔｅ）するのかは、理解されない。明らかに
、ｐＮＩＰは、Ｉ型プロコラーゲンのＮ末端の切断によって活性なタンパク質分
解活性を提示することが示されている（Ｃｏｌｉｄｇｅ，Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２３７４−２３７９（１９９７））。
【０２０６】 機能的に有益な第２の領域は、ディスインテグリンドメインに対応する。この
ドメインは、αＩＩｂβ３に結合し、凝固をブロックする血小板相互作用を阻害
することが示されているヘビ毒液メタロプロテアーゼの関連するメンバーにおい
てより十分に特徴付けられている（Ｐｆａｆｆ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ
Ｃｏｍｍｕｎ．２：４９１−５０１（１９９４）；Ｕｓａｍｉ，Ｙ．ら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１：３３１−３３９
（１９９４））。このディスインテグリンモチーフは、ＲＧＤまたはアスパラギ
ン酸の位置で負に荷電した残基を頻繁に含む、１３〜１５のドメインからなる。
ＲＧＤまたは等価物が、インテグリンに結合し、そしてアンタゴニストまたはシ
グナル伝達リガンドとして作用する（Ｗｏｌｓｂｅｒｇ，Ｔ．Ｇ．およびＷｈｉ
ｔｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８０：３８
９−４０１（１９９６））。ＭＥＴＨ２は、ディスインテグリンドメインに対し
てアミノ末端側に位置するＲＧＤ配列を有するが、ＭＥＴＨ１は、有さない。さ
らに、両方の分子は、比較的高いが完全でない、ディスインテグリンモチーフ内
のシステインの保存の程度を提示する。これは、この領域の三次構造、およびイ
ンテグリンと相互作用する能力において重要な役割を提示するようである。さら
に、これらのドメインのいくつかは、機能的接着分子、特に膜貫通領域を有する
接着細胞分子として作用することが示されている（Ｗｏｌｓｂｅｒｇ，Ｔ．Ｇ．
およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
１８０：３８９−４０１（１９９６））。これは、これらの両方のタンパク質が
分泌されるようであるので、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２についてあてはまるよ
うではない。
【０２０７】 （実施例３：組換えタンパク質の発現および精製） 短縮形融合タンパク質の発現のための組換え構築物は、以下のようでであった
：（１）ｐＲＳＥＴ−ＭＥＴＨ１−Ｉ型：ＭＥＴＨ１ ｎｔ １６０５−１８３
９（開始コドンから）を、以下のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によ
り増幅した：５’−ＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＧ−３’
（配列番号：７８）および５’−ＧＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＧＴＴＣ
Ｃ−３’（配列番号：７９）。次いで増幅フラグメントを、ｐＲＳＥＴベクター
のＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ部位中にサブクローン化した；（２）ｐＧＥＸ−Ｍ
ＥＴＨ１−ＴＳＰは、ｐＲＳＥＴ−ＭＥＴＨ１−ＴＳＰからのＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントを、ｐＧＥＸ−５Ｘベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のＳｍａＩ部位中に、平滑
末端連結によって連結することにより生成した；（３）ｐＧＥＸ−１．０−ＭＥ
ＴＨ２：ＭＥＴＨ２ｃＤＮＡのフラグメントｎｔ８３８−１８１８（開始コドン
から）を、ｐＧＥＭ−２ＴＫのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位中に連結した。この
ＭＥＴＨ２フラグメントを、以下のプライマー：５’−ＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＧ
ＡＴＣＣＧＡＧＧＴＧ−３’（配列番号８０）および５’−ＧＣＡＧＧＡＧＡＡ
ＴＴＣＣＧＴＣＣＡＴＧ−３’（配列番号８１）を用いるＰＣＲにより増幅し、
ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を生成した；（４）ｐＧＥＸ−ＭＥＴＨ２
−ＴＳＰ：ｐＧＥＸ−１．０−ＭＥＴＨ２から単離した０．５Ｋｂ ＸｍａＩ−
ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＧＥＸ−２ＴＫベクターのＸｍａＩおよびＥｃｏ
ＲＩ部位中にサブクローン化した。すべての構築物は、配列決定して配列忠実性
および正確なオープンリーディングフレームを確認した。
【０２０８】 組換えタンパク質を、６Ｈ−ＭＥＴＨ１、プラスミドｐＲＳＥＴ−ＭＥＴＨ１
−ＴＳＰで発現した組換えタンパク質、ＧＳＴ−ＭＥＴＨ１、プラスミドｐＧＥ
Ｘ−ＭＥＴＨ１−ＴＳＰで発現したタンパク質、およびＧＳＴ−ＭＥＴＨ２、プ
ラスミドｐＧＥＸ−ＭＥＴＨ２−ＴＳＰで発現したタンパク質と命名した。
【０２０９】 発現プラスミドを、ＢＬ２１：ＤＥ３ Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に形質転換
し、そして融合タンパク質を、以下の製造業者の推奨に従って誘導した。要約す
れば、誘導した細菌ペレットを、ＰＢＳ中に再懸濁し、そして氷上で１分間音波
処理した。次いで、この懸濁液を、室温で２０分間、１％トリトンＸ−１００の
存在下でインキュベートし、そして４#Ｃで遠心分離した。次いで、ヒスチジン タグ化融合タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏ
ｒｔｈ、ＣＡ）上で、２０ｍｌの上清液を、１ｍｌのビーズ（５０％スラリー）
と、２時間４#Ｃでインキュベートすることにより精製した。懸濁液を、カラム 中に移し、そして１０ｍＭイミダゾール、次いで５０ｍＭイミダゾール、そして
最後に１００ｍＭイミダゾールを含む、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄した。こ
のタンパク質を、ＰＢＳ中の５００ｍＭイミダゾールで溶出した。この組換えタ
ンパク質を含むフラクションを、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに対して
透析した。サンプルを、４#Ｃで３０分間遠心分離し、タンパク質の一部は可溶 性でなく、そして遠心分離の間に失なわれた。上清液を、−７０#Ｃで貯蔵し、 そして増殖、角膜ポケットおよび絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイのために用いた。
【０２１０】 ＧＳＴ融合タンパク質の精製には、抽出物を遠心分離により清澄化し、そして
ＧＳＴアフィニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に付与した。このカラムを
、０．１ｍＭ還元グルタチオンの存在下、ＰＢＳ−１％トリトンＸ−１００で、
次いで、０．５ｍＭ還元グルタチオンの存在下の同緩衝液洗浄した。融合タンパ
ク質は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中の１０ｍＭ還元グルタチオ
ンで溶出した。このタンパク質を含む画分をＤＭＥＭに対して透析し、−７０# Ｃで貯蔵し、そして増殖、角膜ポケットおよび絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイのた
めに用いた。
【０２１１】 組換えタンパク質の完全性および純度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅで染
色した１２．５％または１５％アクリルアミドゲル中で分析した。
【０２１２】 ＴＳＰの第１の２つのＩ型反復を含む組換えＧＳＴ融合タンパク質もまた、機
能的アッセイで用いられる前にＤＭＥＭに対して透析した。インタクトなＴＳＰ
１は、従前に記載のように（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｄ．Ｄ．，ら、Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ
Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：２１７−２２２（１９９４））、血小板か
ら精製した。
【０２１３】 ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２ ＴＳＰドメインが、新脈管形成組換え融合タン
パク質のレギュレーターとして機能し得るという仮説を試験するために、細菌中
で生成した。構築物は、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の第１のＴＳＰドメインを
含んだ。このドメインは、最も保存された、ＴＳＰ１の第２のＩ型反復と５２％
のアミノ酸類似性である（このドメインは、ＣＤ３６に対する推定の結合部位を
含む）。すべての組換えタンパク質は、ネイティブな条件下で単離され、それら
の二次構造を可能な限り保存した。６Ｈ−ＭＥＴＨ１およびＧＳＴ−ＭＥＴＨ１
は、ヒスチジンタグまたはＧＳＴに融合したＭＥＴＨ１の第１のＴＳＰ様ドメイ
ンをそれぞれ含んだ。ＭＥＴＨ１組換えタンパク質は、精製および構造的利点の
ため、２つの異なるタグとともに作成された。サイズにおける差異は、タグのサ
イズ、６ＫＤａヒスチジンおよび２７ＫＤａ ＧＳＴに起因する。ＧＳＴ−ＭＥ
ＴＨ２は、これもまたＧＳＴに融合したＭＥＴＨ２の第１のＴＳＰドメインを含
んだ。ＴＳＰ１の最後の２つのＩ型反復に対応するフラグメントもまた、ＧＳＴ
に融合し、そして血小板から精製したインタクトのＴＳＰ１をポジティブコント
ロールとして用いた。さらに、ＧＳＴ単独を、ネガティブコントロールとしてす
べての実験に含めた。
【０２１４】 （実施例４：ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２中のＴＳＰドメインは、インビボの
新脈管形成を破壊する） （角膜ポケットアッセイ） Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒの雌および雄を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（
Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、そしてペレットの移植用に８−１０週齢を用
いた。角膜ポケットは、Ｋｅｎｙｏｎおよび同僚（Ｋｅｎｙｏｎ、Ｂ．Ｍ．，ら
、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：１６２５−１
６３２（１９９６））に記載のようにほとんど改変せずに実施した。要約すれば
、１０μｇの組換えｂＦＧＦプラス５ｍｇのスクラルフェートの溶液を、１０μ
ｌのＨｙｄｒｏｎ（エタノール中２００ｍｇ／ｍｌ；Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃ
ｋ、ＮＪ）および目的の組換えタンパク質（２μｇ）と混合した。次いでこの懸
濁液を、滅菌ナイロンメッシュ膜（ｓｑｕａｒｅ）（ポアサイズ５００μｍ；Ｔ
ｅｔｋｏ Ｉｎｃ．，ＢｒｉａｒｃｌｉｆｆＭａｏｒ，ＮＹ）上に塗沫し、そし
て３０分間乾燥させた。このメッシュのファイバーを引っ張り、−２０#Ｃで貯 蔵された５００μｍ3のペレットを生成した。均一サイズのペレットを顕微鏡下 で選択し、そしてアッセイに用いた。
【０２１５】 マウスはＡｖｅｒｔｉｎで麻酔した。Ｎｉｋｏｎ ＳＭＺ−Ｕ解剖顕微鏡を用
い、外科用ブレードの補助により角膜中に切開を作成した。ポケット中に単一の
ペレットを移植した。ペレット移植の５日後、角膜新脈管形成を評価し、そして
写真撮影した。
【０２１６】 （ＣＡＭアッセイ） 絨毛尿膜アッセイは、胚発達１２−１４日のＬｅｇｈｏｒｎニワトリ胎児（Ｓ
ＰＡＦＡＳ、ＭＡ）に対して実施した。マトリゲル（７５０μｇ／ｍｌ）、ＶＥ
ＧＦ（２５０ｎｇ／メッシュ）および試験されるべきタンパク質またはペプチド
を混合し、ナイロンメッシュ（ポアサイズ２５０μｍ；Ｔｅｔｋｏ Ｉｎｃ．）
上に置き、次いで３７#Ｃで３０分間および４#Ｃで２時間インキュベートし、重
合を誘導した。ポジティブ（マトリゲルおよびＶＥＧＦ）およびネガティブ（Ｖ
ＥＧＦ単独）コントロールもまた、各ＣＡＭについて調製した。重合メッシュを
、ＣＡＭの第３の外部領域上に置き、そして２４時間インキュベートした。血管
を見えるようにするため、４００μｌのフルオレセインイソチオシアネートデキ
ストラン（１０ｍｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ）をニワトリ血流中に注入した。５−１
０分のインキュベーション後、ニワトリを３．７％ホルムアミドで５分間局所的
に固定した。次いでこのメッシュを解剖し、そしてスライド上にマウントした。
フルオレセイン強度を、コンピューター支援イメージプログラム（ＮＩＨ Ｉｍ
ａｇｅ １．５９）を用いて分析した。
【０２１７】 これらのアッセイで用いたペプチドは、Ｃｈｉｒｏｎ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ
）により合成された。配列は、アミノ酸：Ｐ−ＴＳＰ１、４３０−４４７；Ｐ−
ＭＥＴＨ１、５４９−５６３；Ｐ−ＭＥＴＨ２、５２９−５４８に対応した。
【０２１８】 新脈管形成または抗新脈管形成応答の評価は、この応答を評価するために用い
られるアッセイの感度および特異性に濃密に依存する。これらフラグメントのイ
ンビボの抗新脈管形成活性を評価するために、２つの一般的かつ良く承認された
新脈管形成アッセイ：角膜ポケットおよび絨毛尿膜を用いた。角膜の視感度、接
触性、および無血管状態は、高度に有利であり、そして新生血管応答の可視化お
よび試験物質の局所適用を容易にする。既知量の血管新生因子（単数または複数
）を、角膜眼中に作成されたポケット中にペレットとして移植する。新脈管形成
インヒビターを試験するため、この分子を、同一ペレット中に刺激剤とともに移
植し、そして応答を刺激剤単独と比較する。
【０２１９】 これらの実験では、ｂＦＧＦを血管形成刺激剤として用いた。組換えタンパク
質を含むペレットを、マウス角膜中に移植し、そしてそれらのｂＦＧＦで誘導さ
れる新脈管形成応答を阻害する活性を、コントロールのそれと比較した。ＧＳＴ
を含むｂＦＧＦペレットを移植したとき、新たな毛細管血管が、５日以内に、角
膜縁から角膜を横切ってかつペレット中に生育した。対照的に、ｂＦＧＦペレッ
トへのＧＳＴ−ＭＥＴＨ１またはＧＳＴ−ＭＥＴＨ２の添加は、血管成長を完全
になくした。表４は、実施した４１アッセイから得られた結果の要約を含む。血
小板から精製したインタクトなＴＳＰ１およびＧＳＴ−ＴＳＰ１をポジティブコ
ントロールとして用いた。すべてのアッセイを、同一濃度で実施し、これは、新
脈管形成の阻害において、ＭＥＨＴ１およびＭＥＨＴ２が、ＴＳＰ１のそれと類
似の効力を有することを示唆した。さらに、標準濃度の半分で用いたとき、弱い
が、認知し得る応答が観察され、用量依存的効果を示した。
【０２２０】
【表４】
【０２２１】 ＣＡＭアッセイでは、新脈管形成応答を、新脈管形成増殖因子を含むマトリッ
クスポリマー内で生育する血管の数を測定することにより分析する。組換えＭＥ
ＴＨ１およびＭＥＴＨ２タンパク質が、ＶＥＧＦにより誘導されたＣＡＭアッセ
イにおける新生血管形成を阻害したか否かを測定するために、ＶＥＧＦおよび組
換えタンパク質を含むマトリゲルポリマーをＣＡＭ中に移植した。処理あたり３
つの異なるポリマーを含んだ実験の定量分析を図６Ａに示す。ＶＥＧＦプラス５
μｇのＧＳＴ−ＭＥＴＨ１またはＧＳＴ−ＭＥＴＨ２を含むマトリゲルポリマー
は、血管成長において８０％を超える阻害を引き起こした。同様の効力が、ＴＳ
Ｐ１のＩ型反復由来のＧＳＴ組換えタンパク質を用いて見出された。さらに、Ｍ
ＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２中のＴＳＰドメインの抗新脈管形成効果は、１５μｇ
／ｍｌのタンパク質を用いたときの血管成長の完全阻害とともに用量依存的であ
った（図６ＣおよびＤ）。同じ濃度のＧＳＴ単独は、ＶＥＧＦで刺激される新脈
管形成に対して有意な影響は有さなかった。
【０２２２】 ヒトＴＳＰ１の第２または第３のＩ型反復からの合成ペプチドは、インタクト
なＴＳＰ１のその抗新脈管形成効果を模倣し得る（Ｔｏｌｓｍａ、Ｓ．Ｓ．，ら
、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２２：４９７−５１１（１９９３））。実際、１
９残基のポリペプチドは、ラット角膜におけるインビボ新生血管形成をブロック
し、かつ培養内皮細胞のｂＦＧＦで誘導される移動を阻害するに十分であること
が示された（Ｖｏｇｅｌ，Ｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：７４−
８４（１９９３））；Ｔｏｌｓｍａ，Ｓ．Ｓ．，ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１２２：４９７−５１１（１９９３））。ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２ ＴＳＰ
ドメインについて同じことが真実であったか否かを試験するために、同じ領域由
来のペプチドを合成し、そしてそれらの抗新脈管形成活性をＣＡＭアッセイで評
価した。結果を図６Ｂに示す。ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２両者のＴＳＰドメイ
ン由来のペプチドは、ＴＳＰ１のそれと同様に、ＶＥＧＦで誘導される新脈管形
成をブロックした。対照的に、スクランブルペプチドは、有意な効果は有さなか
った。
【０２２３】 （実施例５：増殖アッセイ） ヒト真皮内皮細胞（ＨＤＥＣ）を単離し、そして１５％ウシ胎児血清，２５μ
ｇ／ｍｌ ｃＡＭＰ、および１μ／ｍｌのハイドロコルチゾン−２１−アセテー
トを補填したＥＢＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中、Ｖ
ｉｔｒｏｇｅｎTM被覆ペトリ皿上で増殖させ、そして３−６の継代から用いた。
細胞を、０．２％ＢＳＡを含むフェノールレッドフリーのＥＢＭを用い、４８時
間、集密単層のインキュベーションにより静止状態にした。ヒト真皮線維芽細胞
は、新生児包皮からそして酵素的解離により単離した。線維芽細胞および平滑筋
細胞の両者は、１０％ウシ胎児血清を補填したＤＭＥＭ中に維持した。ヒト乳房
上皮細胞（ＨＭＥＣ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓから購入し、そして推奨される培
地（乳房上皮増殖培地、ＭＥＧＭ）中で維持した。
【０２２４】 継代３〜６の間の静止状態ヒト真皮内皮細胞を、組換えタンパク質の存在下ま
たは非存在下で、０．２％ＢＳＡ、０．１％ウシ胎児血清および１ｎｇ／ｍｌの
ｂＦＧＦで補填したＥＢＭ中、ＶｉｔｒｏｇｅｎTM被覆２４ウェルプレート上に
プレートし、そして５％ＣＯ2で、３７#Ｃ、４８時間インキュベートした。血管
平滑筋（ＶＳＭ）および線維芽細胞増殖アッセイには、細胞を、同じ条件下で、
しかし、ＥＢＭの代わりにＤＭＥＭを用いてインキュベートした。ヒト乳房上皮
細胞をそれらの増殖培地上でインキュベートした。［3Ｈ］−チミジン（１μＣ ｉ／μｌ）のパルスを、回収前の最後の４時間の間に付加した。細胞を洗浄し、
そして１０％ＴＣＡ中で固定した。［3Ｈ］−チミジンの取り込みは、従前に記 載のように（Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ、Ｍ．Ｌ．＆Ｓａｇｅ、Ｅ．Ｈ．，Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：４１４（１９９３））、シンチレーション
計数により測定した。
【０２２５】 統計学的分析は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＩｎ−Ｓｔａｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ
（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。正規分布と仮定し
て、データを一元ＡＮＯＶＡにより、次いで群間の比較のためのＴ検定Ｄｕｎｎ
ｅｔｔ検定または群間の多重比較のためのスチューデント−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｌ
ｅｕｓ検定のいずれかで分析した。
【０２２６】 ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２が新生血管形成を阻害する機構に踏み入った洞察
を得るために、内皮細胞増殖に対する精製組換え融合タンパク質の直接効果を試
験した。血清飢餓内皮細胞を、ｂＦＧＦおよびＦＣＳを含む増殖培地中にプレー
トした。組換えタンパク質（３μｇ／ｍｌ）は、プレーティングと同時に添加し
た。４０％（ＧＳＴ−ＭＥＴＨ１）、４５％（６Ｈ−ＧＳＴ）または３６％（Ｇ
ＳＴ−ＭＥＴＨ２）阻害が、ＧＳＴ単独を添加したときの有意でない効果とは対
照的に観察された。ＴＳＰ１のＩ型反復からの組換えタンパク質は、類似の阻害
効果を有していた（図７Ａ）。さらに、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２により媒介
される増殖の抑制は、図７Ｅに示されるように、用量依存的であった。この阻害
は、処置の１日後程度で観察され、そしてこの阻害効果は、中毒性ではなく、か
つ可逆的であった。なぜなら、組換えタンパク質の除去および引き続く増殖因子
単独の添加は、内皮細胞増殖の回復をもたらしたからである。
【０２２７】 内皮上のＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２に対する抗増殖効果の細胞特異性は、種
々の非内皮細胞に対するさらなる増殖アッセイにより評価した。増殖の有意な阻
害は、線維芽細胞または平滑筋細胞培養に対しては観察されなかった。対照的に
、これら２つの細胞型に対する有意ではないが、再現性のある増殖の刺激が観察
され得た。この結果は、組換えタンパク質調製物中の、細胞増殖の任意の可能な
非特異的インヒビターの存在を排除する。しかし、乳房上皮細胞に対して、ＭＥ
ＴＨ１およびＭＥＴＨ２は、内皮細胞に対するのと同じ程度まで細胞増殖を阻害
した。興味深いことに、ＴＳＰ１はまた、インビトロおよびトランスジェニック
モデルの両方で乳房上皮細胞増殖を抑制する。
【０２２８】 ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２が、ディスインテグリンとして作用し得る可能性
は、それらの抗新脈管形成性質と一致する。明らかに、抗体を用いるαｖβ３お
よびβ１インテグリンの遮断は、発生の間および腫瘍中の両方の新生血管形成を
阻害することが示されている（Ｂｒｏｏｋｓ、Ｐ．Ｃ．，ら、Ｃｅｌｌ ８５：
６８３−６９３（１９９６）；Ｂｏｏｋｓ、Ｐ．Ｃ．，ら、Ｃｅｌｌ ９２：３
９１−４００（１９９８）；Ｓｅｎｇｅｒ、Ｄ．Ｒ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３６１２−１３６１７（１９９７））。
インテグリンは、増殖および移動シグナルの両方の媒介に必須であり（Ｓｃｈｗ
ａｒｔｚ、Ｍ．Ａ．＆Ｉｎｇｂｅｒ、Ｄ．Ｅ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ
５：３８９−３９３（１９９４））、したがってこれらのシグナルの妨害は、新
脈管形成プロセスに高度に有害であり得る。新脈管形成の機能的アッセイは、Ｍ
ＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２中のＩ型反復のみを含む組換えタンパク質で実施した
。
【０２２９】 ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２の血管阻害活性に関するそれらの作用の機構は、
未知である。現在まで、本発明者らは、これらのタンパク質が、分泌されかつ内
皮細胞に結合するという証拠を有する。さらなる調査は、レセプターおよびシグ
ナル伝達機構の同定に向けて案内される。ＴＳＰ１から学んだレッスンから得ら
れるありそうな仮説は、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２の両方が、ＣＤ３６に結合
することである。最近、このスカベンジャーレセプターは、ＴＳＰ−１がその抗
新脈管形成効果を奏するシグナルの媒介に関与した（Ｄａｗｓｏｎ、Ｄ．Ｗ．，
ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：７０７−７１７（１９９７））。ＣＳＶ
ＴＣＧ（配列番号８３）（Ａｓｃｈ、Ａ．Ｓ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ ２６２：１
４３６−１４３９（１９９３）；Ｃａｔｉｍｅｌ、Ｂ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．２８４：２３１−２３６（１９９２））およびＧＣＱＸＲ（配列番号８４）
配列の両方が、ＣＤ３６に対する主要な結合成分として提案されている（Ｄａｗ
ｓｏｎ、Ｄ．Ｗ．，ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：７０７−７１７（１
９９７））。ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２は、これらの領域の両方においてほぼ
完全な保存を有する。補完的そしてまた同様の出来事は、ＭＥＴＨ１およびＭＥ
ＴＨ２のｂＦＧＦへの結合である。ヘパリンおよびｂＦＧＦへの結合が、ＴＳＰ
１の抗新脈管形成活性の一部分として提案されている（Ｇｕｏ、Ｎら、Ｊ．Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．４９（１９９７））。この性質は、これもまたＭＥＴＨ１
およびＭＥＴＨ２中で保存されているＷＳＸＷＳ（配列番号８２）モチーフによ
り媒介されるようである。さらなる努力は、これらの新規タンパク質により媒介
される抗新脈管形成性質に関与するシグナルに対して、および細胞外環境のプロ
テアーゼとしてそれらの可能性に対して焦点を当てる。
【０２３０】 （実施例６：ＭＥＴＨ１またはＭＲＴＨ２ ｃＤＮＡクローンの寄託されたサ
ンプルからの単離） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を寄託サンプルから単離するために２つのアプロ
ーチが使用され得る。第一に、寄託されたクローンを当業者に公知の技術（例え
ば、ベクター供給者によって提供される技術または関連の刊行物もしくは特許に
おいて提供される技術）を用いて、適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート
（適切な選択薬剤、例えば、アンピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５
０の形質転換体（コロニー）の密度で播種する。次いで、単一コロニーを使用し
て、当業者に周知の核酸単離技術を使用してＤＮＡを生成した。（例えば、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【０２３１】 あるいは、配列番号１または配列番号３の両端（すなわち、クローンの５’Ｎ
Ｔおよび３’ＮＴによって囲まれる配列番号１または配列番号３の領域内）に由
来する、１７〜２０ヌクレオチドの２つのプライマーを合成し、そしてこれらを
使用して、寄託されたｃＤＮＡプラスミドをテンプレートとして使用して、ＭＥ
ＴＨ１またはＭＥＴＨ２のｃＤＮＡを増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応を、慣用
の条件下で、例えば、０．５μｇの上記ｃＤＮＡテンプレートとの反応混合物の
２５μｌ中で実施する。好都合な反応混合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣｌ2、 ０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．２５ユニットのＴａｑ
ポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣＲ（９４℃での変性を１分間；５５℃
でのアニールを１分間；７２℃での伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを用いて実施する。増幅産物をアガロ
ースゲル電気泳動により分析し、そして予想される分子量のＤＮＡバンドを切り
出し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ産物をサブクローニングおよび配
列決定することによって選択された配列であることを確認する。
【０２３２】 寄託されたクローンに存在しないかもしれないＭＥＴＨ１の遺伝子またはＭＥ
ＴＨ２遺伝子の５’非コード部分または３’非コード部分の同定のために、いく
つかの方法が利用可能である。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定され
ない：フィルタープローブ探索、特異的プローブを使用するクローン富化、およ
び当該分野で周知である５’および３’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかま
たは同一のプロトコル。例えば、５’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転
写物の５’末端の欠失を生成するために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａ
ｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１（７）：１６８３−
１６８４（１９９３））。
【０２３３】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的のＭＥＴＨ１遺伝子またはＭＥＴＨ２遺
伝子の公知の配列に特異的なプライマーを含むプライマーセットを使用して、Ｍ
ＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ増幅する。次いで、
この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全長遺伝子を生成し得
る。
【０２３４】 ポリＡ＋ＲＮＡが、使用され得るが、この上記の方法は、所望の供給源から単
離された全ＲＮＡを用いて開始する。次いで、ＲＮＡ調製物を、後のＲＮＡリガ
ーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮＡの５’リン酸基を排除するために、
必要ならばホスファターゼで処理し得る。次いで、ホスファターゼを不活化する
べきであり、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャッ
プ構造を除去するために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理するべきで
ある。この反応は、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオ
チドに連結され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。
【０２３５】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第一鎖合成反応物を連
結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の
公知の配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のため
のテンプレートとして使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして
分析して５’末端配列がＭＥＴＨ１遺伝子またはＭＥＴＨ２遺伝子に属すること
を確認する。
【０２３６】 （実施例７：ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の細菌性発現） 本発明のＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプチドをコードする
ＭＥＴＨ１ヌクレオチドまたはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドを、実施例５に概説
するように、そのＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを使用して増幅し、挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ
挿入物を増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクター内に増幅産物を
クローニングするために、好ましくはプライマーの５’末端にＢａｍＨＩおよび
ＸｂａＩのような制限部位を含むべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａ
Ｉは、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｃｈａｔ
ｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは
、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可能 なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６
−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードす
る。ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅さ
れたフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維
持しながらｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで連結混合物を、ｌａｃＩリプ
レッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を与えるプラスミドｐＲ ＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ． ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ
， Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、ＬＢプレート上
で生育できるそれらの能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン
耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって
確認する。
【０２３７】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養に接種す
るために使用する。細胞を、０．４〜０．６の間の吸光度６００（Ｏ．Ｄ．600 ）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレ
ッサーの不活化によりＰ／Ｏの活性化を誘導し、遺伝子発現の増加を導く。
【０２３８】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる
。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニ
ッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラムにロ
ードする（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ． 前出より入手可能）。６×Ｈｉｓタグを
有するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１
工程手順で精製され得る（詳細には、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ （１
９９５） ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， 前出を参照のこと）。
【０２３９】 手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ８のカラムにロード
し、カラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ８で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ６で洗浄し、最後にポリペプ
チドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ５で溶出する。
【０２４０】 次いで、精製したＭＥＴＨ１タンパク質またはＭＥＴＨ２タンパク質を、リン
酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ ６の緩
衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析することにより再生させる。ある
いは、ＭＥＴＨ１タンパク質またはＭＥＴＨ２タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラム
に固定化している間に、首尾よく再折り畳みされ得る。推奨条件は以下の通りで
ある：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０％ グ
リセロール、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ７．４中の６Ｍ〜１Ｍ尿素
の直線勾配を使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて行うべきであ
る。再生後、タンパク質を２５０ ｍＭ イミダゾールの添加によって溶出させ
る。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ ６の緩
衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。精
製したＭＥＴＨ１タンパク質またはＭＥＴＨ２ポリペプチドタンパク質を、４℃
で保存するか、または−８０℃で冷凍する。
【０２４１】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、ｐＨＥ４ａと呼ばれる、ＭＥ
ＴＨ１ポリヌクレオチドまたはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドに作動可能に連結さ
れたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含む発現ベクターを
含む（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５、１９９８年２月２５日に寄託。）。この
ベクターは以下を含む：１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランス
フェラーゼ遺伝子、２）Ｅ． ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモータ
ー配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダルガーノ配列、
および６）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（
ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）に
由来する。プロモーター配列およびオペレーター配列を合成的に作製する。
【０２４２】 ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きなフラグ
メント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対である
べきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。ＤＮＡ
挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ
、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲプラ
イマーを使用して、実施例５に記載のＰＣＲプロトコールに従って生成する。Ｐ
ＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物および
ベクターを標準的なプロトコールに従って連結する。
【０２４３】 操作されたベクターは、上記のプロトコールにおいて、細菌系でタンパク質を
発現させるために容易に置換され得る。
【０２４４】 （実施例８：封入体からのＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプ
チドの精製） 以下の別の方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたＭＥＴＨ１ポリペプチドまた
はＭＥＴＨ２ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、そのポリペプチド
を精製するために使用され得る。他に指定されない場合には、以下のすべての工
程は４〜１０℃で行われる。
【０２４５】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。
【０２４６】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる
。次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌまでＮａＣｌ溶液と混合
し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを、０．
５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を使
用して再度洗浄する。
【０２４７】 得られた洗浄した封入体を、１．５ Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２
〜４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄
し、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧ
ｕＨＣｌ抽出を可能にする。
【０２４８】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折り畳みした
希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で
保つ。
【０２４９】 再折り畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、あらかじめ準備した
４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．
１６μｍメンブレンフィルターを備える接触濾過ユニット（例えば、Ｆｉｌｔｒ
ｏｎ）を使用する。濾過したサンプルを、陽イオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏ
ｓ ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードす
る。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩衝
液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣｌ
で、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を継続的にモ
ニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。
【０２５０】 次いでＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプチドを含む画分をプ
ールし、そして４容量の水と混合する。次いで希釈されたサンプルを、あらかじ
め準備した強陰イオン（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）および弱陰イオン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐ
ｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする
。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラム
を、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する
。次いでＣＭ−２０カラムを１０カラム容量の直線的勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ
、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ
酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５の範囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定
常Ａ280モニタリング下で収集する。次いで、（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅによって判明した）ポリペプチドを含む画分をプールする。
【０２５１】 得られたＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプチドは、上記の再
折り畳みおよび精製工程の後で９５％より高い純度を示すべきである。５μｇの
精製タンパク質がロードされる場合、主要な混入物のバンドは、クマシーブルー
染色した１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから全く観察されないはずである。精製Ｍ
ＥＴＨ１タンパク質またはＭＥＴＨ２タンパク質はまた、エンドトキシン／ＬＰ
Ｓ混入について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬＡＬアッセイに
従って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０２５２】 （実施例９：バキュロウイルス発現系におけるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の
クローニングおよび発現） 本実施例では、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を発現するために、プラスミドシ
ャトルベクターｐＡ２を使用してＭＥＴＨ１ポリヌクレオチドまたはＭＥＴＨ２
ポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入する。この発現ベクターは、Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の
強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ
７１８のような便利な制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）
のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウ
イルスの容易な選択のために、プラスミドは、同方向にある弱いＤｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａプロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝
子は両方の側で、クローン化されたＭＥＴＨ１ポリヌクレオチドまたはＭＥＴＨ
２ポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成するために、野生型ウ
イルスＤＮＡとの細胞媒介性相同組換えのためのウイルス配列と隣接する。
【０２５３】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌など（必要とされる場合、シグナルペプチドおよびインフレームなＡＵ
Ｇを含む）のために適切に配置されたシグナルを提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０２５４】 詳細には、寄託されたクローンに含まれるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のｃＤ
ＮＡ配列（ＡＵＧ開始コドンおよび任意の天然に付随するリーダー配列を含む）
を、実施例５に記載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在
するシグナル配列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは
第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、ベクターは、Ｓｕｍｍｅｒ
ｓら（「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８
７））に記載される標準的な方法を用いて改変して、バキュロウイルスリーダー
配列を含ませ得る（ｐＡ２ ＧＰ）。
【０２５５】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲル
から単離する。次いでフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び１％
アガロースゲルで精製する。
【０２５６】 プラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸し得る。次
いでＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ
．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲルから単離する。
【０２５７】 フラグメントおよび脱リン酸したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い
て互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ
）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換し、そし
て培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由来のＤ
ＮＡを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同定
する。クローニングしたフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認する
。
【０２５８】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄa ｂａｃｕｌｏｖｉ ｒｕｓ ＤＮＡ」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）
とともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄaウイルス ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を
含む、マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０
μｌのリポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温
で１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血
清グレース培地１ｍｌを含む３５ｍｍ組織培養プレートに播種されたＳｆ９昆虫
細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。次いで、プレートを２
７℃で５時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレー
トから除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地
を添加する。次いで、培養を２７℃で４日間継続する。
【０２５９】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出によって記載さ
れたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロース
ゲルを、ｇａｌが発現しているクローン（青色に着色したプラークを生ずる）の
容易な同定および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークアッ
セイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，９−１０頁によって頒布される、昆虫細胞培養およ
びバキュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なイン
キュベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッター（例えば、
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、
２００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そして
組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を、３５ｍｍ皿に播種したＳｆ９細胞に感
染させるために使用する。４日後、これらの培養皿の上清を採集し、次いで４℃
に貯蔵する。
【０２６０】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱不活性化ＦＢＳを補充したグ
レース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯＩ
」）でポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスで感染させる。放射性標
識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そしてメチオ
ニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）に置き換
える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システ
イン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間イン
キュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパク質および細
胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで（放射性標識した場合）オートラ
ジオグラフィーによって分析する。
【０２６１】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたＭＥＴＨ１タンパク質またはＭＥＴＨ２タンパク質のアミノ末端配列を
決定し得る。
【０２６２】 （実施例１０：哺乳動物細胞におけるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の発現） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る
。代表的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を仲介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリ
アデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コ
ザック配列、および、ＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター部位に
隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期および後
期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来
の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモ
ーターを用いて達成される。しかし、細胞内エレメント（例えば、ヒトアクチン
プロモーター）もまた、使用され得る。
【０２６３】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃ
ａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ ３７１４６）
、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、なら
びにｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物
宿主細胞は、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞
、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞、Ｃｏｓ ７細
胞およびＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
【０２６４】 あるいは、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドは、染色体に組み込まれ
たＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドを含む、安定な細胞株中で発現
され得る。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択可
能なマーカーを用いる同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細
胞の同定および単離を可能にする。
【０２６５】 トランスフェクトされたＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２遺伝子はまた、大量のコ
ードされたタンパク質を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸
還元酵素）マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する
細胞株の開発に有用である。（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ， Ｊ．Ｌ．
およびＭａ，Ｃ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９
７：１０７−１４３（１９９０）：Ｐａｇｅ， Ｍ．Ｊ．およびＳｙｎｄｅｎｈ
ａｍ，Ｍ．Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を
参照のこと）。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）
である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２２７：２７７−２７９ （
１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：
１６９−１７５ （１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞
を選択培地中で増殖させ、そしてもっとも高い耐性を有する細胞を選択する。こ
れらの細胞株は、染色体に組み込まれた、増幅された遺伝子を含む。チャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにし
ばしば使用される。
【０２６６】 プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７
（１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶエンハン
サー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））の
フラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制
限酵素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、ＭＥＴＨ１またはＭ
ＥＴＨ２のクローニングを容易にする。このベクターはまた、３’イントロン、
ラットプレプロインシュリン遺伝子のポリアデニル化および終結シグナル、なら
びに、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０２６７】 天然に存在するシグナル配列が、分泌タンパク質を産生するために使用される
場合、このベクターは、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天
然に存在するシグナル配列が使用されない場合には、このベクターは、細胞から
タンパク質を分泌する試みにおいて異種シグナル配列を含むように改変され得る
（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０２６８】 次いで、増幅フラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして市販のキット
（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
ａ．）を使用して１％アガロースゲル上で精製する。次いで、単離されたフラグ
メントおよび脱リン酸化したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次
いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、
そしてプラスミドｐＣ６またはｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を、
例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【０２６９】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を、リ
ポフェクチンを用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏとともに同時トラ
ンスフェクトする（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは
、優性選択マーカーであるところの、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性
を付与する酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ
／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリ
プシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートお
よび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマク
ローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０
〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異
なる濃度（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使
用して、６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、メ
トトレキサートの最高濃度で増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２
μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェル
プレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが
得られるまで繰り返す。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の遺伝子産物の発現を、例
えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬ
Ｃ分析によって分析する。
【０２７０】 （実施例１１：Ｎ−末端および／またはＣ−末端欠失変異体の構築） 以下の一般的なアプローチを使用して、Ｎ−末端またはＣ−末端欠失ＭＥＴＨ
１およびＭＥＴＨ２欠失変異体をクローニングし得る。一般的に、約１５〜２５
ヌクレオチドの２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１または配列
番号３のポリヌクレオチドの所望の５’および３’位置に由来する。プライマー
の５’および３’位置は、所望のＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチド
フラグメントに基づいて決定される。開始コドンおよび終止コドンは、必要な場
合、ポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるＭＥＴＨ１またはＭＥ
ＴＨ２ポリペプチドフラグメントを発現するために、５’および３’プライマー
にそれぞれ付加される。好ましいＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチド
フラグメントは、本明細書の「ポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメン
ト」の節で上記に開示されるＮ−末端およびＣ−末端欠失変異体をコードするポ
リヌクレオチドフラグメントである。
【０２７１】 所望のベクター中のＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドフラグメン
トのクローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドもま
た、５’および３’プライマー配列に添加され得る。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ
２ポリヌクレオチドフラグメントを、ゲノムＤＮＡまたは寄託されたｃＤＮＡク
ローンから、適切なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーおよび本明細書中で考
察した条件もしくは当該分野で公知の条件を使用して増幅する。本発明のＭＥＴ
Ｈ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるＭＥ
ＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドフラグメントを、全長のポリペプチドとし
て同じ一般的な様式で、発現および精製し得るが、特定のフラグメントと全長ポ
リペプチドとの間の化学的および物理的特性における違いのために、慣用的な改
変が必要であり得る。
【０２７２】 例示の手段として、そして本発明を限定するためにではなく、ＭＥＴＨ１ポリ
ペプチドフラグメントＤ−４０〜Ｓ−９５０またはＭＥＴＨ２ポリペプチドフラ
グメントＬ−２０〜Ｓ−８９０をコードするポリヌクレオチドを、以下のように
増幅およびクローニングする：制限酵素部位、続いてＤ−４０またはＬ−２０で
それぞれ開始するポリペプチドフラグメントのＮ−末端部分をコードするポリヌ
クレオチド配列とインフレームに開始コドンを含む５’プライマーを生成する。
制限酵素部位、続いてＳ−９５０またはＬ−８９０でそれぞれ終止するＭＥＴＨ
１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドフラグメントのＣ−末端部分をコードするポリ
ヌクレオチド配列とインフレームに終止コドンを含む相補的な３’プライマーを
生成する。
【０２７３】 増幅したポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターを、プライマー中
の部位を認識する制限酵素を用いて消化する。次いで、消化したポリヌクレオチ
ドを互いに連結する。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドフラグメン
トを、好ましくは、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドフラグメントコー
ド領域を、プロモーターから下流に配置する様式で、制限酵素処理されたベクタ
ー中に挿入する。連結混合物を、標準的な手順を使用して、そして本明細書中の
実施例に記載されるように、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。耐性
コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、そしてクローニングしたＤＮＡの同一
性を、制限分析、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２７４】 （実施例１２：ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のタンパク質融合物） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドは、好ましくは、他のタンパク質に
融合される。これらの融合タンパク質は、種々の適用について使用され得る。例
えば、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プ
ロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトース結合タンパク質への融合は、精
製を容易にする（実施例７を参照のこと；ＥＰ Ａ ３９４，８２７もまた参照
のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８
８））。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は、イン
ビボでの半減期を増大させる。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドに融合
した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞下の局在に標的化し得る。一
方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融合タンパク質の活性を増
大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有するキメ
ラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して
、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の融合タ
ンパク質の全ての型は、ポリペプチドのＩｇＧ分子への融合を概説する以下のプ
ロトコル、または実施例７に記載されるプロトコルを改変することによって作製
され得る。
【０２７５】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’および３’
末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマーは
また、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニングを
容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０２７６】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）が使用される場合、ヒトＦｃ部
分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊
されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが
、ＢａｍＨＩによって再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例５に記
載するＰＣＲプロトコルによって単離されたＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌ
クレオチドが、このＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドは、終
止コドンなしにクローン化され、そうでなければ、融合タンパク質は産生されな
いことに注意すること。
【０２７７】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０２７８】
【化７】
【０２７９】 （実施例１３：抗体の産生） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと。）例えば、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２
を発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物
に投与される。好ましい方法において、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２タンパク質
の調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないよう
にする。次いで、このような調製物は、より大きな比活性のポリクローナル抗血
清を生成するために、動物に導入される。
【０２８０】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
そのタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：
２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このような手順は
、動物（好ましくは、マウス）をＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリぺプチドで免
疫化すること、またはより好ましくは、分泌されるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２
ポリぺプチド発現細胞での免疫化を含む。このような細胞は、任意の適切な組織
培養培地において培養され得る；しかし、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働
化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍ
ｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥ
ａｒｌｅ改変Ｅａｇｌｅ培地において細胞を培養することが好ましい。
【０２８１】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合
される。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しか
し、ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好
ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に
維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２
５−２３２（１９８１））に記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。このような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞は、次いでＭＥＴＨ１
またはＭＥＴＨ２ポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定する
ためにアッセイされる。
【０２８２】 あるいは、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリぺプチドに結合し得るさらなる抗
体を、抗イディオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。
このような方法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する
抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパ
ク質特異的抗体が使用されて、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで
、このような動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして
、ハイブリドーマ細胞は、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２タンパク質特異的抗体に
結合する能力がＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２によってブロックされ得る抗体を産
生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、Ｍ
ＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体
を含み、そして動物を免疫してさらなるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２タンパク質
特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
【０２８３】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明の抗体の他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を
使用して、タンパク質分解性切断によって産生される。あるいは、分泌されるＭ
ＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２タンパク質結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の
適用を通して、または合成化学を通して産生され得る。
【０２８４】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用すること
によって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知であ
る。（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９： １２０
２（１９８５）； Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４ （１９
８６）； Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕ
ｃｈｉら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７
０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３ （１９８
４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参
照のこと）。
【０２８５】 （実施例１４：高処理能力スクリーニングアッセイのためのＭＥＴＨ１または
ＭＥＴＨ２タンパク質の産生） 以下のプロトコルは、試験されるべきＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリぺプチ
ドを含有する上清を産生する。次いで、この上清は、実施例１６〜２３に記載さ
れるスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
【０２８６】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、室温で２０分間インキュベートする
。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２チャンネル
ピペッターは、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る）。ポリ−
Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水
）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残すべきで
あり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし得る。
【０２８７】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０5細胞／ウ ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。
【０２８８】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例１０〜１２に記載
する方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現
ベクターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。
マルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔ
ｉｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下
げたりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、
マルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウ
ェルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つ
のプレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべき
である。
【０２８９】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つお
きにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ
／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次
いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時
間インキュベートする。
【０２９０】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、またはＨＧＳ−ＣＨＯ−５培地（１１６．６
ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2（無水物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4−５Ｈ2 Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ3）3−９Ｈ2Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦ ｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ；３１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇ
Ｃｌ2；４８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ4；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；
２４００．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ3；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2 Ｏ；７１．０２ｍｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4− ７Ｈ2Ｏ；０．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステ ロール；０．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍ
ｇ／Ｌのリノール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ミリスチン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミ
トオレイン酸（ｐａｌｍｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミ
チン酸；１００ｍｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ステアリン酸；２．２０ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グ
ルコース；１３０．８５ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ；７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ2Ｏ；６ ．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン
２ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；３１．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５ ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８
．７５ｍｇ／ｍｌのグリシン；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ
−Ｈ2Ｏ；１０６．９７ｍｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍ ｌのＬ−ロイシン；１６３．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍ
ｇ／ｍｌのＬ−メチオニン；６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４
０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロリン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１
．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファ
ン；９１．７９ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２
Ｈ2Ｏ；および９９．６５ｍｇ／ＬのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビオ チン；３．２４ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａパントテン酸；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コ
リン；４．６５ｍｇ／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３．
０２ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ；
０．０３１ｍｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン
；３．１７ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；および
０．６８０ｍｇ／ＬのビタミンＢ12；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍ
ｇ／ＬのＮａヒポキサンチン；０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／
Ｌのプトレシンナトリウム−２ＨＣｌ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウ
ム；０．００６７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミ
ン；０．１２２ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄；リノール酸と複合体化した４１．７
０ｍｇ／Ｌのメチル−Ｂ−シクロデキストリン；オレイン酸と複合体化した３３
．３３ｍｇ／Ｌのメチル−Ｂ−シクロデキストリン；レチナール酢酸と複合体化
した１０ｍｇ／Ｌのメチル−Ｂ−シクロデキストリン）のいずれかの適切な培地
を調製する。２ｍＭグルタミンおよび１×ペンストレップを用いて、浸透圧を３
２７ｍＯｓｍ）に調整する。（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ ＤＭ
ＥＭ中にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ） １００ｇを溶解する）。培
地を濾過し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレンコ
ニカル中に収集する。
【０２９１】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５または７２時間、３７℃でインキュベートする：１％
ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。
【０２９２】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１６〜２
３に記載するアッセイにおいて使用し得る。
【０２９３】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリぺプチドから直接に（例えば、
分泌タンパク質として）か、またはＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２によって誘導さ
れる他のタンパク質の発現（これは、次いで上清中に分泌される）のいずれかに
由来することが特に理解される。従って、本発明はさらに、特定のアッセイにお
ける活性によって特徴づけられる上清中のタンパク質を同定する方法を提供する
。
【０２９４】 （実施例１５：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路と呼ばれる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路の活性化タンパク質は、多くの遺伝子
のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントまたはインター
フェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これらのエレメン
トに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させる。
【０２９５】 ＧＡＳおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデューサーおよ
びアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれる転写因子のクラスによって
認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓｔａｔ１お
よびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広範であるよ
うに）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定されており、
そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘルパークラ
スＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼ばれたが、
骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。それは、多く
のサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。
【０２９６】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋｓ」）ファミ
リーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質
から核へ移動する。Ｊａｋｓは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリー
を表わし、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これ
らのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞において触
媒的に不活性である。
【０２９７】 Ｊａｋｓは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活
性化される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変。）Ｊａｋｓ
を活性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：
（ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳ
Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンについてのレセ
プターを含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ
−１０を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの
保存されたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷ
Ｓモチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号８２）をコー
ドする膜近接領域）を共有する。
【０２９８】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋｓは活性化され、これ
は次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメント
に結合する。この全プロセスは、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含さ
れる。
【０２９９】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示
すために使用され得る。例えば、成長因子およびサイトカインは、Ｊａｋｓ−Ｓ
ＴＡＴ経路を活性化することが知られている。（以下の表を参照のこと）。従っ
て、レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。
【０３００】
【表５】
【０３０１】 実施例１６〜１７に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を産生する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインで
の誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に証明されたＧＡＳ結合部位の４つ
の直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５７−
４６８（１９９４））、他のＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントを代わりに使用し
得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対して相補的な
１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライマーの配列
は以下である：
【０３０２】
【化８】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴ
ＡＧＧＣ：３’（配列番号８７）。
【０３０３】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：
【０３０４】
【化９】 次に、ＳＶ４０プロモーターに結合したこのＧＡＳプロモーターエレメントを
用いて、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター
分子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、
明らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター
分子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知の
レポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパ
ク質が挙げられる。
【０３０５】 合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントと確認された上記の配列を、Ｇ
ＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用
いて、ＳＶ４０プロモーターを、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメ
ントで効率的に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【０３０６】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター（例えば、ｐＧＦＰ
−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞に
トランスフェクトすれば、このベクターは、実施例１６〜１７に記載されるよう
にＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。
【０３０７】 他の構築物を、上記の記載を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１８および１９に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターをこれらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得る
。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモータ
ーを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、ＧＡ
Ｓ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得る
。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細胞
）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞）
、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る。
【０３０８】 （実施例１６：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを使用し、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の上清がＴ細胞を増
殖および／または分化させるか否かを決定することにより、ＭＥＴＨ１またはＭ
ＥＴＨ２のＴ細胞活性を評価する。Ｔ細胞の活性を実施例１５で作製したＧＡＳ
／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させ
る因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。こ
のアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩ
Ｂ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５２
）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた使
用し得る。
【０３０９】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクト（以下に記載のトランスフェクション手順
）する。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して
耐性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、
漸増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選
択したクローンの用量応答を示す。
【０３１０】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、スケールアップするか、または複数で実施するかのいずれ
かである。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％血清および１％のＰｅｎ−Ｓｔ
ｒｅｐ中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組み合わ
せる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを添加し
、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
【０３１１】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０7個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０7細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、１ｍｌのＯＰＴＩ−
ＭＥＭ中の１×１０7個の細胞をＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間 インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の
血清を添加する。
【０３１２】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌジェネティシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。
これらの細胞を、実施例１４に記載されるプロトコルにより産生されるようなＭ
ＥＴＨ１ポリペプチドもしくはＭＴＥＨ２ポリペプチドまたはＭＥＴＨ１もしく
はＭＴＥＨ２が誘導したポリペプチドを含む上清で処理する。
【０３１３】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして５００，０００細胞／ｍｌ
の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべきである。必
要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。１枚の９６
ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレートについ
て１億個の細胞）を必要とする。
【０３１４】 細胞を、１２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに分与す
るために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、１２チ
ャンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり
１００，０００個の細胞を添加する）。
【０３１５】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして供する。
【０３１６】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ターに４８時間置く（注：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）。
次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用いて
、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンのカバ
ーを用いて）覆うべきであり、そして実施例２０に従うＳＥＡＰアッセイを行う
まで、−２０℃で保存する。残存する処理した細胞を含むプレートを４℃に置き
、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを繰り返すための物質
の供給源として供する。
【０３１７】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。
【０３１８】 （実施例１７：骨髄性の活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを使用し、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２が骨髄性細胞を増殖
および／または分化させるか否かを決定することによりＭＥＴＨ１またはＭＥＴ
Ｈ２の骨髄性の活性を評価する。骨髄性細胞の活性を実施例１５において産生さ
れたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性
を増加させる因子は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化させる能力を
示す。このアッセイに使用した骨髄性細胞は、Ｕ９３７、前単球（ｐｒｅ−ｍｏ
ｎｏｃｙｔｅ）細胞株であるが、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使用し得
る。
【０３１９】 Ｕ９３７細胞を、実施例１５において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０7個の Ｕ９３７細胞を回収し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１０
０単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充
した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中で
増殖させる。
【０３２０】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、および６７５μＭ ＣａＣｌ2 を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
【０３２１】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
【０３２２】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。
【０３２３】 これらの細胞を１×１０8個の細胞を回収すること（これは１０枚の９６ウェ ルプレートアッセイのために十分である）により試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０5細胞／ｍｌの最終密度で細胞 を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞をプレ
ートする（すなわち、１×１０5細胞／ウェル）。
【０３２４】 実施例１４に記載されるプロトコルにより調製された上清を５０μｌ添加する
。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１０
０単位／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性化さ
せることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロール
ウェルにおいて観察される。ＳＥＡＰは、実施例２０に記載のプロトコルに従っ
て上清をアッセイする。
【０３２５】 （実施例１８：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、細胞の活性化をＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２によっ
て評価し得る。
【０３２６】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫細胞（ｐｈｅｎｏｃｈｒ
ｏｍｏｃｙｔｏｍａ ｃｅｌｌ））は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（
テトラデカノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥ
ＧＦ（上皮増殖因子））での活性化により増殖および／または分化することが公
知である。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰ
レポーターに結合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定に
トランスフェクトすることにより、ＰＣ１２細胞のＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２
による活性化を評価し得る。
【０３２７】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６： ８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用
いて、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る：
【０３２８】
【化１０】 次いで、実施例１５において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを線状化し、ＧＡＳ
／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を用
いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターとを
連結する。
【０３２９】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ． カタログ番号０
８−１１５）の３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を１つの１０
ｃｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０μｌ
添加し、そして２時間風乾させる。
【０３３０】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充
した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４
４９−７８Ｐ）、５％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４
０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから４つ
への分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り出し
、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。
【０３３１】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１４に記載のＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅプロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェクトする。ＥＧＲ−Ｓ
ＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させ
ることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的増殖のために使用するが、
１〜２ヶ月毎に、細胞を２〜３継代の間、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増
殖させるべきである。
【０３３２】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
ある細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリー
ニングする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。
次いで、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ Ｆ
ＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓させる。
【０３３３】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中でよく懸濁する。細胞数をカウントし、そ
してより低血清の培地を添加し、５×１０5細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達さ せる。
【０３３４】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０5細胞／ウェルに等しい）。実施例１４により産生された５０μｌの上清を、 ３７℃で４８〜７２時間加える。陽性コントロールとして、ＥＧＲを介してＰＣ
１２細胞を活性化することが公知の成長因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経成
長因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導が
陽性コントロールウェルにおいて見られる。ＳＥＡＰは実施例２０に従って、上
清をアッセイする。
【０３３５】 （実施例１９：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−κＢ（核因子κＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−κＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−κＢは、アポトーシスから細胞を保護すると思われる）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。
【０３３６】 刺激されない条件において、ＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢ（インヒビターκＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−κＢはリン酸化され、そ
して分解（ｄｅｇｒａｄｅｄ）され、ＮＦ−κＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ
）を引き起こし、これにより標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−κＢにより
活性化される標的遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡ
Ｍ−１およびクラス１ＭＨＣが挙げられる。
【０３３７】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
κＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１４におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−κＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置に有用である。例えば、ＮＦ−κＢの
インヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−κＢの活性化に関連するこれらの疾
患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。
【０３３８】 ＮＦ−κＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−κＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号９１）の４つの直列のコピー、ＳＶ４０
初期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そし
てＸｈｏＩ部位に隣接する：
【０３３９】
【化１１】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号９３）。
【０３４０】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して行う。得ら
れたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＢＬ
ＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ３プ
ライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認する：
【０３４１】
【化１２】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−κＢ／ＳＶ４０フラグメントと置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、そしてそれゆえ哺乳動物の発現系には好
ましくない。
【０３４２】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−κＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
詳細には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限した後に、ＮＦ−κＢ
／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入し、
ＧＦＰ遺伝子を置換した。
【０３４３】 一旦、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例１６に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法がまた、実施例１６に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
【０３４４】 （実施例２０：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例１６〜１９に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、
アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。
【０３４５】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。
【０３４６】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液を満たす。５０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液を満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、１回に
５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始するべきである。
【０３４７】 ルミノメーターで相対的光単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取る。ブラン
クとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加は、レポー
ター活性を示す。
【０３４８】
【表６】
【０３４９】 （実施例２１：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定する高処理能
力スクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、さらに膜電位を変化させること
は公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清を同定する
ためにアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッ
セイを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、
または蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出する
ために容易に改変し得る。
【０３５０】 以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を本明細書で用
いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−３の代わりに使用し得る。
【０３５１】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ2 インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で二回洗浄し、最後の洗浄後、緩衝液１００μｌを残す。
【０３５２】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−３を負荷するため、
１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレー
トをＣＯ2インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレー トをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、緩衝液１００μｌを残
す。
【０３５３】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０6細胞／ｍｌに再懸 濁する。細胞懸濁液１ｍｌあたり、１ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３の１０％プルロ
ン酸ＤＭＳＯ溶液４μｌを加える。次に、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６
０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０6細胞／ｍｌに再懸濁し、 そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ ＣｅｌｌＷａ
ｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μｌに
する。
【０３５４】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−３のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。
【０３５５】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷであり；（２）
曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり；
（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）発光は５３０ｎｍであり；そして（６）
サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍにおける発光の増加は、細胞内Ｃａ ++ 濃度の増加を生じる、分子（ＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２、またはＭＥＴＨ
１もしくはＭＥＴＨ２によって誘導される分子のいずれか）によって生じた細胞
外シグナリング事象を示す。
【０３５６】 （実施例２２：チロシンキナーゼ活性を同定する高処理能力スクリーニングア
ッセイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲の有糸分裂促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）お
よび代謝性成長因子のレセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知であ
る大きなＲＰＴＫファミリーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌され
る低分子量タンパク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質
も含む。
【０３５７】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化に関与
し、レセプターサブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキナーゼ
の活性化が起こる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（例え
ば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシンキナ
ーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質ゾル
プロテインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカイン
スーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−Ｃ
ＳＦおよびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介する
。
【０３５８】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、ＭＥＴＨ１
もしくはＭＥＴＨ２またはＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２によって誘導される分
子が、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るか否かを同定すること
は興味深い。従って、以下のプロトコルを設計して、チロシンキナーゼシグナル
伝達経路を活性化し得るこのような分子を同定する。
【０３５９】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで３０分間、二回リンスして滅菌し、水でリ
ンスした後、一晩乾燥させる。幾つかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グレ
ードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジン（
５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるいは仔
ウシ血清で２時間コートし、ＰＢＳでリンスした後、４℃で貯蔵する。増殖培地
に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するように、ａｌａ
ｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量することにより、これ
らのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用し、
Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅを覆う。Ｆａｌ
ｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、いくつかの増殖
実験において使用し得る。
【０３６０】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地内で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１４で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０
．１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ Ｎａ4Ｐ2Ｏ7およびＢｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手した
プロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加し
、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪する。次に、プレートを真
空トランスファーマニホールド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎｉｆ
ｏｌｄ）に設置し、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底の
０．４５ｍｍ膜で濾過する。抽出物をバキュームマニホールドの底の９６ウェル
捕獲／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により明澄
化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェルの含有物
を取り出し、４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。
【０３６１】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つ
を記載する。
【０３６２】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用し得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄ
ｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ
酸１〜１７に相当）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの基
質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。
【０３６３】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加した後、順に、ＡＴＰ／Ｍｇ2+（
５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）１０μｌ、５×アッセイ緩衝液（４０ ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ）１０μｌ、バナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後に水５μｌを
加える。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２分間プレインキュベー
トする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えて反応を開始させる。
【０３６４】 次に、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ１０μｌを添加することによりチロシンキナーゼ
アッセイ反応を停止させ、反応物を氷上に置く。
【０３６５】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を測定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏ
ｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウ
ェルに添加した後、３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように
洗浄する。
【０３６６】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を
測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用
して定量し、これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【０３６７】 （実施例２３：リン酸化活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 実施例２２に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性アッセイの可能性のある
代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内シ
グナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。
例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２
キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８Ｍ
ＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特異
的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の分子
、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニン分
子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子でＥｒｋ−１またはＥｒ
ｋ−２を置き換えることにより検出し得る。
【０３６８】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次に、プレートをＰＢＳでリンスし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより
ＲＴで１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２に対する二つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時間）す
る。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクローナル
抗体と交換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３〜５回
リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で貯蔵する。
【０３６９】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培地（Ｄ
ＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、ＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または実施例１
４で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し、そして
抽出物を濾過して直接アッセイプレート内へ入れる。
【０３７０】 抽出物とともにＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクローナ
ル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を標
準的な手順によりビオチン化する。次に、結合ポリクローナル抗体をユーロピウ
ムストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光増強剤とＷａｌｌａｃ ＤＥＬＦ
ＩＡ装置内で連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）ことによって定量
する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、ＭＥＴＨ１もしくはＭ
ＥＴＨ２またはＭＥＴＨ１もしくはＭＥＴＨ２より誘導された分子によるリン酸
化を示す。
【０３７１】 （実施例２４：ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の遺伝子における変化の決定方法
） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたＲＮＡを単離する。次に、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次に、このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の
緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；およ
び７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。
【０３７２】 次に、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’末端にＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。ＭＥＴＨ１また
はＭＥＴＨ２の選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、そ
してゲノムＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次に、ＭＥＴＨ１または
ＭＥＴＨ２において疑わしい変異を有するＰＣＲ産物のクローン化および配列決
定を行い、直接配列決定の結果を確認する。
【０３７３】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．および
Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１
９：１１５６（１９９１）に記載のようにＴテールベクターにクローン化し、そ
して、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には存在しないＭＥＴＨ１または
ＭＥＴＨ２での変異により同定する。
【０３７４】 ゲノム再配置もまた、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の遺伝子における改変を決
定する方法として観察する。単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキ
シ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用い
てニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ， Ｃｇ．ら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３５： ７３−９９（１９９１）に記載のよう
にＦＩＳＨを行う。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のゲノムの遺伝子座への特異的
ハイブリダイゼーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標
識プローブとのハイブリダイゼーションを行う。
【０３７５】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピングの
ための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメラ（Ｐ
ｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィルター
とを組み合わせて用いて得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａ
ｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉ
ｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析および
染色体断片長測定を行う。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のゲノム領域（プローブ
がハイブリダイズした）の染色体変化を、挿入、欠失および転座として同定する
。これらのＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の変化を関連疾患の診断マーカーとして
使用する。
【０３７６】 （実施例２５：生物学的サンプル中のＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の異常レベ
ルを検出する方法） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され
得、そしてＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のレベルの上昇または低下が検出される
なら、このポリペプチドは、特定表現型のマーカーである。検出方法は数多くあ
り、そしてそれ故、当業者は以下のアッセイをそれらの特定の必要性に適合する
ように改変し得ることが理解される。
【０３７７】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を検出する。マイクロタイター
プレートのウェルを、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２に対する特異的抗体を最終濃
度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用いてコーティングする。この抗体は、モノクロー
ナルまたはポリクローナルのいずれかであって、そして実施例１３に記載の方法
により産生される。ウェルに対するＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の非特異的結合
が減少するように、このウェルをブロックする。
【０３７８】 次に、コーティングしたウェルを、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２含有サンプル
を用いてＲＴで２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系
列希釈を使用して結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または
蒸留水で三回洗浄し、非結合ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を除去する。
【０３７９】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、そして室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イ
オン水または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
【０３８０】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数
スケール）にＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（
線形スケール）に蛍光または吸光度をプロットする。標準曲線を用いてサンプル
中のＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の濃度を補間する。
【０３８１】 （実施例２６：ポリペプチドの処方） ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の組成物を、個々の患者の臨床状態（特に、ＭＥ
ＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチド単独処置の副作用）、送達部位、投与方
法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏ
ｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬す
る。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行っ
て決定される。
【０３８２】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるＭＥＴＨ１またはＭＥＴ
Ｈ２の合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ
／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ま
しくは、このホルモンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／
日、そして最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／
ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、ＭＥＴＨ１またはＭＥ
ＴＨ２を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１
〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかに
より投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必
要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化する
ようである。
【０３８３】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口
的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、
軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または
鼻腔スプレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の
固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤
をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸
骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０３８４】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２はまた、徐放性システムにより適切に投与される
。徐放性組成物の適切な例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形
品の形態の半透過性ポリマーマトリックスを包含する。徐放性マトリックスとし
ては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、
Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍ
ａｎ， Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３）
）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．
Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およ
びＲ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））
、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ−（−）−
３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。徐放性組成物はまた
、リポソームに封入されたＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドを包含す
る。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を含有するリポソームは、それ自体が公知であ
る方法により調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８
５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：
４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ
８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８
３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，
５４５号；ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約
２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル
％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適分泌ポリペプチド治療の
ために調整される。
【０３８５】 非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、ＭＥＴＨ１またはＭ
ＥＴＨ２は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわ
ち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他
の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳
濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、
酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物
を含まない。
【０３８６】 一般に、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を液体キャリアまたは微細分割固体キャ
リアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、
必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非
経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。
このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およ
びデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのよう
な非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０３８７】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、そしてこのような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハ
ク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸
のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、
ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グ
ロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；
グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；
セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む
、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニ
トールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン
；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオ
ン性界面活性剤が挙げられる。
【０３８８】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ
／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このよう
なビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使
用することにより、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
【０３８９】 治療的投与に用いられるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２は無菌状態であり得る。
滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態
は容易に達成される。一般に、治療用ポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポー
トを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶
液バッグまたはバイアルに配置される。
【０３９０】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドは、通常、単位用量または複数用
量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するため
の凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバ
イアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプ
チド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥し
たＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のポリペプチドを注射用静菌水を用いて再構成し
て注入溶液を調製する。
【０３９１】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした一つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関
する政府機関による承認を表す。さらに、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を他の治
療用化合物と組み合わせて使用し得る。
【０３９２】 （実施例２７：ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のレベルの低下を処置する方法） 本発明は、体中でＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の活性のレベルの低下を必要と
する個体を処置するための方法に関し、これは、治療的有効量のＭＥＴＨ１また
はＭＥＴＨ２アンタゴニストを含有する組成物をこのような個体に投与する工程
を包含する。本発明の使用のための好ましいアンタゴニストは、ＭＥＴＨ１また
はＭＥＴＨ２特異的抗体である。
【０３９３】 さらに、個体におけるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の標準的な発現レベルまた
は正常な発現レベルの低下により引き起こされる状態は、好ましくは、分泌形態
で、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を投与することによって処置され得ることが理
解される。従って、本発明はまた、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドの
レベルの増加の必要な個体の処置方法を提供し、これは、このような個体におけ
るＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の活性レベルを増加させるためのＭＥＴＨ１また
はＭＥＴＨ２の量を含む薬学的組成物をこのような個体に投与する工程を包含す
る。
【０３９４】 例えば、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドのレベルの低下を有する患
者は、連続６日間、０．１〜１００ μｇ／ｋｇ用量のこのポリペプチドを毎日
受ける。好ましくは、このポリペプチドは、分泌形態で存在する。投与および処
方に基づいた、投与スキームの正確な詳細を実施例２６に提供する。
【０３９５】 （実施例２８：ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２のレベルの上昇を処置するための
方法） 本発明はまた、体中でＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２活性のレベルの増加の必要
な個体を処置するための方法に関し、これは、治療的有効量のＭＥＴＨ１または
ＭＥＴＨ２あるいはそれらのアゴニストを含有する組成物をこのような個体に投
与する工程を包含する。
【０３９６】 アンチセンス技術をＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の産生を阻害するために使用
する。この技術は、癌のような種々の病因のための、好ましくは分泌形態である
ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドのレベルの低下の方法の１つの例であ
る。
【０３９７】 例えば、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の異常なレベル上昇を有すると診断され
た患者にアンチセンスポリヌクレオチドを０．５、１．０、１．５、２．０およ
び３．０ｍｇ／ｋｇ 日で２１日間、静脈投与する。この処置が十分に寛容な場
合、この処置を残り７日間の休薬期間の後、繰り返す。アンチセンスポリヌクレ
オチドの処方を実施例２６に提供する。
【０３９８】 （実施例２９：遺伝子治療を使用した処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、線維芽細胞を患者に移植し、これは、ＭＥＴＨ１
またはＭＥＴＨ２ポリペプチドを発現し得る。一般に、線維芽細胞を皮膚生検に
よって被験体から得る。得た組織を組織培養培地に置床し、そして小片に分離す
る。この組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に置き、約１０個の小片を
各フラスコに置床する。このフラスコを倒置し、きつく栓をし、そして室温で一
晩放置する。室温で２４時間後、このフラスコを反転し、そして組織塊をこのフ
ラスコの底に固着したままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％ ＦＢＳ、
ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２ 培地）を加え
る。次いでフラスコを３７℃で約１週間、インキュベートする。
【０３９９】 この時点で、新鮮培地を添加し、引き続いて数日毎に交換する。さらなる２週
間の培養の後、線維芽細胞の単層が出現する。この単層をトリプシン処理し、そ
してより大きいフラスコに拡大する。
【０４００】 モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接する、ｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓ
ｃｈｍｅｉｅｒ、Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ ７：２１９−２５（１９８８））をＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、引き続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処
理する。この直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズ
を用いて精製する。
【０４０１】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２をコードするｃＤＮＡをＰＣＲプライマーを用い
て増幅し得、このプライマーは、実施例５に示されるように、５’および３’末
端配列にそれぞれ対応する。好ましくは、５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を
含み、そして３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量のモロニーマ
ウス肉腫ウイルスの直鎖状骨格ならびに増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で共に加える。生じた混合物を
２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。次いで、この連結物混合
物を細菌ＨＢ１０１を形質転換するために使用し、次いでこの細菌をベクターが
適切に挿入されたＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２を含むことを確認する目的で、カ
ナマイシンを含有する寒天上にプレーティングする。
【０４０２】 両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を１０％ 仔ウ
シ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ）においてコンフルエントな密度まで組織培養物中で増
殖させる。次いで、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２遺伝子を含むＭＳＶベクターを
培地に添加し、そしてパッケージング細胞をこのベクターで形質導入する。この
パッケージング細胞は、現在、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２遺伝子を含む感染性
ウイルス粒子を産生する（このパッケージング細胞を現在プロデューサー細胞と
いう）。
【０４０３】 新鮮な培地を形質導入したプロデューサー細胞に添加し、引き続いて培地をコ
ンフルエントなプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから収穫する。感染性ウ
イルス粒子含む使用済み培地をミリポアーフィルターを通してろ過し、付着した
プロデューサー細胞を除去する。次いで、この培地を使用し、線維芽細胞を感染
させる。培地をサブコンフルエントな線維芽細胞プレートから除去し、そしてプ
ロデューサー細胞からの培地に迅速に置換する。この培地を除去し、そして新鮮
な培地に置換する。ウイルスの力価が高い場合、次いで実質的に、全ての線維芽
細胞は感染され、選択は全く必要ない。力価が大変低い場合、次いで選択マーカ
ー（例えば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用する
必要がある。一旦、線維芽細胞を効率的に感染させると、この線維芽細胞を分析
し、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２タンパク質を産生しているかどうか決定する。
【０４０４】 次いで、操作された線維芽細胞を単独またはサイトデックス３ミクロキャリア
ビーズ上でコンフルエントまで増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する。
【０４０５】 （実施例３０：遺伝子治療を使用した処置の方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置するためにインビボで遺伝
子治療方法を使用する工程である。遺伝子治療方法は、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴ
Ｈ２ポリペプチドの発現を増加または減少させるための、裸の核酸（ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）ＭＥＴＨ１またはＭ
ＥＴＨ２配列の動物への導入に関する。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレ
オチドを標的組織によるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリペプチドの発現に必要
なプロモーターまたは他の任意の遺伝的エレメントと作動可能に連結し得る。こ
のような遺伝子治療および送達技術ならびに方法は、当該分野で公知である（例
えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５，６９３，
６２２号、同第５，７０５，１５１号、同第５，５８０，８５９号；Ｔａｂａｔ
ａ Ｈら、（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−
４７９、Ｃｈａｏ、Ｊら、（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６
）：５１７−５２２、Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕ
ｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｂ．ら、（
１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（５）：４０５−４１１、Ｔｓｕｒｕｍｉ
Ｙ．ら、（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３２
９０を参照のこと（本明細書中に参考として援用される））。
【０４０６】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチド構築物は、動物の細胞に注入物
質を送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など
）の間隙空間への注入）によって送達され得る。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポ
リヌクレオチド構築物を薬学的に受容可能な液体または水性キャリアにおいて送
達し得る。
【０４０７】 用語「裸の」ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）とは、ウイルス性の配
列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチンまたは沈降剤などを含む
、細胞中への侵入を補助、促進または容易にするために作用する任意の送達ビヒ
クルから遊離した配列のことをいう。しかし、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリ
ヌクレオチドもまた、リポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ．Ｌ．ら
（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９および
Ａｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら、（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５（１）：１
−７において教示される処方物）で送達し得、これは、当業者に周知の方法によ
って調製され得る。
【０４０８】 遺伝子治療方法において使用されるＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオ
チドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノム内に組み込まれもしないし、そ
れらが複製を可能とする配列を含まない構築物である。当業者に公知の任意の強
力なプロモーターをＤＮＡの発現を駆動するために使用し得る。他の遺伝子治療
技術とは異なり、標的細胞に裸の核酸配列を導入する１つの大きな利点は、細胞
におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製Ｄ
ＮＡ配列が細胞内に導入され、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を
提供し得ることが示されている。
【０４０９】 ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチド構築物を動物内の組織（筋肉、
皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓
、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組
織を含む）の間隙空間に送達し得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の
細網線維間のムコ多糖類マトリックス、管または室の壁における弾性線維、線維
組織のコラーゲン線維あるいは結合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔における
その同じマトリックスを含む。組織の間隙空間は同様に、循環中の血漿およびリ
ンパチャネルのリンパ液で占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達
は、以下に議論される理由のため好ましい。ポリヌクレオチド構築物は、これら
の細胞を含む組織中への注入によって都合よく送達され得る。ポリヌクレオチド
構築物は、好ましくは分化した非分割細胞に送達され、そして持続して発現され
るが、送達および発現は、例えば血液幹細胞または皮膚線維芽細胞のような非分
化細胞または完全には分化していない細胞中で達成され得る。インビボで、筋肉
細胞は、ポリヌクレオチドを吸収し、そして発現するそれらの能力において特に
適している。
【０４１０】 裸のＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチド注入のために、有効なＤＮ
ＡまたはＲＮＡの投与量は、約０．０５ｇ/ｋｇ体重〜約５０ｍｇ/ｋｇ体重の範
囲に存在する。好ましくは、この投与量は、約０．００５ｍｇ/ｋｇ〜約２０ｍ ｇ/ｋｇであり、そしてより好ましくは約０．０５ｍｇ/ｋｇ〜約５ｍｇ/ｋｇで ある。もちろん、当業者が理解するように、この投与量は、注入する組織部位に
よって異なる。適切かつ有効な核酸配列の投与量は、当業者によって容易に決定
され得、そして処置されている条件および投与経路に依存し得る。好ましい投与
経路は、組織の間隙空間中への非経口の注入経路によってである。しかし、他の
非経口経路（例えば、特に肺組織または気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への送
達のためのエアロゾル処方物の吸入）もまた使用され得る。さらに裸のＭＥＴＨ
１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチド構築物をその手順で使用されるカテーテル
による血管形成中の動脈に送達し得る。
【０４１１】 インビボで筋肉中に注入したＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレオチドの
用量応答効果を以下のように決定する。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ポリヌクレ
オチドをコードするｍＲＮＡの生成のための適切なＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２
鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。この鋳型ＤＮＡ
（これは、環状かもしくは直鎖状のいずれかであり得る）を、裸のＤＮＡまたは
リポソームで複合体化したＤＮＡのいずれかとして使用する。次いで、マウスの
四頭筋に種々の量の鋳型ＤＮＡを注射する。
【０４１２】 ５〜６週令の雌および雄Ｂａｌｂ/Ｃマウスを０．３ｍｌの２．５％アベルチ ン（Ａｖｅｒｉｎ）で腹腔内注射によって麻酔する。１．５ｃｍの切開を前大腿
（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｔｈｉｇｈ）上に作製し、そして四頭筋を直接可視化する
。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２鋳型ＤＮＡを０．１ｍｌのキャリア中で、膝中の
筋肉の遠位（末端）の挿入部位から約０．５ｃｍおよび深さ約０．２ｃｍにおい
て、１分間にわたって２７番径の針を通して１ｃｃのシリンジで注入する。縫合
を将来の局在化のための注入部位にわたって配置し、そしてその皮膚をステンレ
ススティールクリップでふさぐ。
【０４１３】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日間）後、筋肉抽出物を完全な四
頭筋を切除することによって調製する。個々の四頭筋の１５μｍの断面を、５断
面ごとにＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２タンパク質発現のために組織学的に染色す
る。ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２タンパク質発現の時間経過を、異なったマウス
由来の四頭筋を異なった時間に収穫することを除いて、同様の様式で行い得る。
注入後の筋肉中でのＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ ＤＮＡの持続性を、全細胞Ｄ
ＮＡならびに注入されたマウスおよびコントロールマウス由来のＨＩＲＴ上清を
調製後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記の実験の
結果を使用し、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２の裸のＤＮＡを使用する、ヒトおよ
び他の動物における適切な投与量ならびに他の処置パラメーターを推定し得る。
【０４１４】 本発明が前述の説明および実施例で詳細に記載される場合とは異なって実施さ
れ得ることは明らかである。
【０４１５】 本発明の多数の改変および変更が上記の教示を考慮すると可能であり、従って
、添付の特許請求の範囲内にある。
【０４１６】 本明細書中で引用されるすべての刊行物（特許、特許出願、学術雑誌、実験マ
ニュアル、書籍または他の書類を含む）の全開示はその結果、参考として援用さ
れる。
【０４１７】
【表７】
【０４１８】
【表８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＭＥＴＨ１のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配
列（配列番号２）を示す。このタンパク質は、約２８のアミノ酸残基の推定リー
ダー配列（下線）を有する。
【図２】 図２は、ＭＥＴＨ２のヌクレオチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配
列（配列番号４）を示す。このタンパク質は、約２３のアミノ酸残基の推定リー
ダー配列（下線）を有する。
【図３Ａ】 図３は、ＭＥＴＨ１（配列番号２）およびＭＥＴＨ２（配列番号４）のアミノ
酸配列の、これらに最も近いホモログであるウシメタロプロテアーゼ（ｐＮＰ１
）（配列番号５）のアミノ酸配列との比較を示す。同一アミノ酸を囲む。配列お
よび構造的な相同性により推定される機能ドメインを標識し、これらは、メタロ
プロテアーゼドメインにおけるシグナルペプチド（一重線）、哺乳動物のサブチ
リシンに対して可能性のある切断部位（二重下線）、亜鉛結合部位（点線）、お
よび推定ディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）ループ（矢印）を含む
。
【図３Ｂ】 図３は、ＭＥＴＨ１（配列番号２）およびＭＥＴＨ２（配列番号４）のアミノ
酸配列の、これらに最も近いホモログであるウシメタロプロテアーゼ（ｐＮＰ１
）（配列番号５）のアミノ酸配列との比較を示す。同一アミノ酸を囲む。配列お
よび構造的な相同性により推定される機能ドメインを標識し、これらは、メタロ
プロテアーゼドメインにおけるシグナルペプチド（一重線）、哺乳動物のサブチ
リシンに対して可能性のある切断部位（二重下線）、亜鉛結合部位（点線）、お
よび推定ディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）ループ（矢印）を含む
。
【図４】 図４は、ＭＥＴＨ１、ＭＥＴＨ２、およびｐＮＰ１の一次構造を示し、これら は、プロドメイン、触媒メタロプロテアーゼドメイン、システインに富んだディ
スインテグリンドメイン、ＴＳＰ様ドメイン、スペーサー領域および異なる数の
ＴＳＰ様ドメイン（ＭＥＴＨ１については３つ、ＭＥＴＨ２については２つ、お
よびｐＮＰ１については４つ）を含む。
【図５】 図５は、ＭＥＴＨ１（配列番号２）およびＭＥＴＨ２（配列番号４）のＴＳＰ
様ドメインの、ＴＳＰ１（配列番号６、７、および８）ならびにＴＳＰ２（配列
番号９，１０、および１１）のＴＳＰ様ドメインとの比較を示す。システインを
１〜６と番号付けし、トリプトファンを星印により印を付ける。
【図６Ａ】 図６は、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２のＴＳＰ様ドメイン由来のペプチドおよ
び組換えタンパク質が、ＶＥＧＦ誘導性新脈管形成をブロックすることを示す。
新脈管形成を、マトリゲル上で硬化したＶＥＧＦを含むナイロンメッシュを使用
して１２〜１４日齢胚由来のＣＡＭについて、ならびにこのペプチドまたは組換
えタンパク質の存在下または非存在下において誘導した。毛細血管の密度を、実
施例４に記載されるように評価した。陽性コントロールおよび陰性コントロール
は、それぞれ、ＶＥＧＦ単独およびビヒクル単独を含んだ。（Ａ）組換えタンパ
ク質の存在下でＶＥＧＦにより誘導される新脈管形成応答の定量。ＴＳＰ１、精
製された血小板ＴＳＰ１、ＧＳＴ、精製されたＧＳＴ、ＧＳＴ−ＴＳＰ１、ＧＳ
Ｔ−ＭＥＴＨ１、およびＧＳＴ−ＭＥＴＨ２は、実施例４に記載される。新脈管
形成指数は、ＶＥＧＦマトリゲルからの脈管応答を１００％とみなし、そしてバ
ックグランドレベル（マトリゲル単独）を差し引きして表される。アッセイを少
なくとも２回繰り返した。各々の処置を３連で行った。値は平均を示し、バーは
標準偏差を示す。*ｐ＜０．００１。
【図６Ｂ】 図６は、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２のＴＳＰ様ドメイン由来のペプチドおよ
び組換えタンパク質が、ＶＥＧＦ誘導性新脈管形成をブロックすることを示す。
新脈管形成を、マトリゲル上で硬化したＶＥＧＦを含むナイロンメッシュを使用
して１２〜１４日齢胚由来のＣＡＭについて、ならびにこのペプチドまたは組換
えタンパク質の存在下または非存在下において誘導した。毛細血管の密度を、実
施例４に記載されるように評価した。陽性コントロールおよび陰性コントロール
は、それぞれ、ＶＥＧＦ単独およびビヒクル単独を含んだ。（Ｂ）以下のペプチ
ドの存在下または非存在下でＶＥＧＦにより誘導された新脈管形成応答の定量；
Ｐ−ＴＳＰ１、Ｐ−ＭＥＴＨ１、およびＰ−ＭＥＴＨ２（ペプチドは、それぞれ
、ＴＳＰ、ＭＥＴＨ１、およびＭＥＴＨ２のＩ型反復に由来した）；ＳＣ１およ
びＳＣ２は、コントロールとして使用されるスクランブルペプチドである。新脈
管形成指数は、ＶＥＧＦマトリゲルからの脈管応答を１００％とみなし、そして
バックグランドレベル（マトリゲル単独）を差し引きして表される。アッセイを
少なくとも２回繰り返した。各々の処置を３連で行った。値は平均を示し、バー
は標準偏差を示す。*ｐ＜０．００１。
【図６Ｃ】 図６は、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２のＴＳＰ様ドメイン由来のペプチドおよ
び組換えタンパク質が、ＶＥＧＦ誘導性新脈管形成をブロックすることを示す。
新脈管形成を、マトリゲル上で硬化したＶＥＧＦを含むナイロンメッシュを使用
して１２〜１４日齢胚由来のＣＡＭについて、ならびにこのペプチドまたは組換
えタンパク質の存在下または非存在下において誘導した。毛細血管の密度を、実
施例４に記載されるように評価した。陽性コントロールおよび陰性コントロール
は、それぞれ、ＶＥＧＦ単独およびビヒクル単独を含んだ。（Ｃ）ＧＳＴ−ＭＥ
ＴＨ１の存在下でのＶＥＧＦ誘導性新脈管形成の用量応答。新脈管形成指数は、
ＶＥＧＦマトリゲルからの脈管応答を１００％とみなし、そしてバックグランド
レベル（マトリゲル単独）を差し引きして表される。アッセイを少なくとも２回
繰り返した。各々の処置を３連で行った。値は平均を示し、バーは標準偏差を示
す。*ｐ＜０．００１。
【図６Ｄ】 図６は、ＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２のＴＳＰ様ドメイン由来のペプチドおよ
び組換えタンパク質が、ＶＥＧＦ誘導性新脈管形成をブロックすることを示す。
新脈管形成を、マトリゲル上で硬化したＶＥＧＦを含むナイロンメッシュを使用
して１２〜１４日齢胚由来のＣＡＭについて、ならびにこのペプチドまたは組換
えタンパク質の存在下または非存在下において誘導した。毛細血管の密度を、実
施例４に記載されるように評価した。陽性コントロールおよび陰性コントロール
は、それぞれ、ＶＥＧＦ単独およびビヒクル単独を含んだ。（Ｄ）ＧＳＴ−ＭＥ
ＴＨ２の存在下でのＶＥＧＦ誘導性新脈管形成の用量応答。新脈管形成指数は、
ＶＥＧＦマトリゲルからの脈管応答を１００％とみなし、そしてバックグランド
レベル（マトリゲル単独）を差し引きして表される。アッセイを少なくとも２回
繰り返した。各々の処置を３連で行った。値は平均を示し、バーは標準偏差を示
す。*ｐ＜０．００１。
【図７Ａ】 図７は、ｂＦＧＦで刺激された細胞増殖に対するＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２
組換えタンパク質の効果を示す。細胞を、ｂＦＧＦおよび試験される組換えタン
パク質（図で示されない場合、３μｇ／ｍｌ）を含む培地中で２４ウェルプレー
ト上で培養した。コントロールは、ビヒクルまたはＧＳＴ組換えタンパク質単独
を含んだ。（Ａ）、ＨＤＥＣは、ヒト皮膚内皮細胞；実験を少なくとも２回繰り
返した。各々の処置を３連で行った。値は平均を表し、バーは標準偏差を示す。 * ｐ＜０．０１。
【図７Ｂ】 図７は、ｂＦＧＦで刺激された細胞増殖に対するＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２
組換えタンパク質の効果を示す。細胞を、ｂＦＧＦおよび試験される組換えタン
パク質（図で示されない場合、３μｇ／ｍｌ）を含む培地中で２４ウェルプレー
ト上で培養した。コントロールは、ビヒクルまたはＧＳＴ組換えタンパク質単独
を含んだ。（Ｂ）、ＨＭＥＣは、ヒト乳房上皮細胞、実験を少なくとも２回繰り
返した。各々の処置を３連で行った。値は平均を表し、バーは標準偏差を示す。 * ｐ＜０．０１。
【図７Ｃ】 図７は、ｂＦＧＦで刺激された細胞増殖に対するＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２
組換えタンパク質の効果を示す。細胞を、ｂＦＧＦおよび試験される組換えタン
パク質（図で示されない場合、３μｇ／ｍｌ）を含む培地中で２４ウェルプレー
ト上で培養した。コントロールは、ビヒクルまたはＧＳＴ組換えタンパク質単独
を含んだ。（Ｃ）ＨＤＦは、ヒト皮膚線維芽細胞；実験を少なくとも２回繰り返
した。各々の処置を３連で行った。値は平均を表し、バーは標準偏差を示す。* ｐ＜０．０１。
【図７Ｄ】 図７は、ｂＦＧＦで刺激された細胞増殖に対するＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２
組換えタンパク質の効果を示す。細胞を、ｂＦＧＦおよび試験される組換えタン
パク質（図で示されない場合、３μｇ／ｍｌ）を含む培地中で２４ウェルプレー
ト上で培養した。コントロールは、ビヒクルまたはＧＳＴ組換えタンパク質単独
を含んだ。（Ｄ）、ＳＭＣは、平滑筋細胞；実験を少なくとも２回繰り返した。
各々の処置を３連で行った。値は平均を表し、バーは標準偏差を示す。*ｐ＜０ ．０１。
【図７Ｅ】 図７は、ｂＦＧＦで刺激された細胞増殖に対するＭＥＴＨ１およびＭＥＴＨ２
組換えタンパク質の効果を示す。細胞を、ｂＦＧＦおよび試験される組換えタン
パク質（図で示されない場合、３μｇ／ｍｌ）を含む培地中で２４ウェルプレー
ト上で培養した。コントロールは、ビヒクルまたはＧＳＴ組換えタンパク質単独
を含んだ。（Ｅ）ＨＤＥＣ増殖に対するＧＳＴ−ＭＥＴＨ１およびＧＳＴ−ＭＥ
ＴＨ２の用量応答。実験を少なくとも２回繰り返した。各々の処置を３連で行っ
た。値は平均を表し、バーは標準偏差を示す。*ｐ＜０．０１。
【図８】 図８は、ｐＨＥ４−５発現ベクター（配列番号１２）およびサブクローン化さ
れたＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２ ｃＤＮＡコード配列の模式表示を示す。カナ
マイシン耐性マーカー遺伝子、ＭＥＴＨ１またはＭＥＴＨ２コード配列、ｏｒｉ
Ｃ配列、およびｌａｃＩｑコード配列の位置を示す。
【図９】 図９は、ｐＨＥプロモーター（配列番号１３）の調節エレメントのヌクレオチ
ド配列を示す。２つのｌａｃオペレーター配列、シャイン−ダルガルノ配列（Ｓ
／Ｄ）、ならびに末端ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位（イタリック体）
を示す。
【図１０】 図１０は、ＭＥＴＨ１アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコイ
ル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および表
面確率を示し、そして全てがデフォルト設定を使用して作製された。「抗原性指
数またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」の図において、陽性ピークは、ＭＥＴＨ１
またはＭＥＴＨ２タンパク質の高抗原性領域（すなわち、本発明のエピトープ保
有ペプチドが入手され得る領域）の位置を示す。これらの図により規定されるド
メインは、本発明によって意図される。図１０で図示して要約されるデータの表
の表現は、表１に見出され得る。
【図１１】 図１１は、ＭＥＴＨ２アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコイ
ル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および表
面確率を示し、そして全てがデフォルト設定を使用して作製された。「抗原性指
数またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」の図において、陽性ピークは、ＭＥＴＨ１
またはＭＥＴＨ２タンパク質の高抗原性領域（すなわち、本発明のエピトープ保
有ペプチドが入手され得る領域）の位置を示す。これらの図により規定されるド
メインは、本発明によって意図される。図１１で図示して要約されるデータの表
の表現は、表２に見出され得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 イルエラ−アリスペ， ルイザ アメリカ合衆国 カリフォルニア 90024， ロサンジェルス， ホームビー アベニ ュー 1342 (72)発明者 ヘイスティングス， グレッグ エイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 91320， サウザンド オークス， ミドオーエン グレン コート 1615 (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルニー， ヘリテッジ ヒルズ ドラ イブ 18528 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA11 CA04 DA02 DA05 EA04 GA11 4B064 AG01 CA19 CC24 DA03 DA13 4B065 AA01X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 BA01 BA22 BA23 CA53 ZA331 ZA332 ZA891 ZA892 ZB111 ZB112 ZB151 ZB152 ZB261 ZB262 4H045 AA10 BA10 CA40 DA89 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜９５０を含むポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチド； （ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜９５０を含むポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチド； （ｃ）配列番号２のアミノ酸２９〜９５０を含むポリペプチドをコードするポ
    リヌクレオチド； （ｄ）配列番号２のアミノ酸３０〜９５０を含むポリペプチドをコードするポ
    リヌクレオチド； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ１ポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列を含むポリヌクレオチド； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ１ポリペプチドをコードするヌク
    レオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜８９０を含むポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチド； （ｈ）配列番号４のアミノ酸２〜８９０を含むポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチド； （ｉ）配列番号４のアミノ酸２４〜８９０を含むポリペプチドをコードするポ
    リヌクレオチド； （ｊ）配列番号４のアミノ酸１１２〜８９０を含むポリペプチドをコードする
    ポリヌクレオチド； （ｋ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ２ポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列を含むポリヌクレオチド； （ｌ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ２ポリペプチドをコードするヌク
    レオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｍ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
    （ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、または（ｌ）のポリヌクレオチドを改変することによ
    って生成されるポリヌクレオチド改変体であって、ここで： （ｉ）該改変は、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換、またはそれらの
    任意の組み合わせを含み；かつ （ｉｉ）該改変の数は、改変されてないポリヌクレオチドに存在するヌクレ
    オチドの総数の５％以下である、ポリヌクレオチド； （ｎ）配列番号２のアミノ酸２３５〜４５９をコードするポリヌクレオチド； （ｏ）配列番号２のアミノ酸４６０〜５４４をコードするポリヌクレオチド； （ｐ）配列番号２のアミノ酸５４５〜５９８をコードするポリヌクレオチド； （ｑ）配列番号２のアミノ酸８４１〜８９４をコードするポリヌクレオチド； （ｒ）配列番号２のアミノ酸８９５〜９３４をコードするポリヌクレオチド； （ｓ）配列番号２のアミノ酸５３６〜６１３をコードするポリヌクレオチド； （ｔ）配列番号２のアミノ酸５４９〜５６３をコードするポリヌクレオチド； （ｕ）配列番号４のアミノ酸２１４〜４３９をコードするポリヌクレオチド； （ｖ）配列番号４のアミノ酸４４０〜５２９をコードするポリヌクレオチド； （ｗ）配列番号４のアミノ酸５３０〜５８３をコードするポリヌクレオチド； （ｘ）配列番号４のアミノ酸８３７〜８９０をコードするポリヌクレオチド； （ｙ）配列番号４のアミノ酸２８０〜６０６をコードするポリヌクレオチド； （ｚ）配列番号４の５２９〜５４８アミノ酸をコードするポリヌクレオチド；
    および （ａａ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）
    、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）
    、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、または
    （ｚ）の任意のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、 からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 配列番号２のＭＥＴＨ１ポリペプチドまたは配列番号４のＭ
    ＥＴＨ２ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌ
    クレオチドを含む、単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号１のコード領域の５０連続ヌクレオチド、ただし該ヌクレオチ
    ド配列は、配列番号１４〜４１のいずれか１つ、またはそれらのサブフラグメン
    トのいずれでもない、ヌクレオチド；および （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、 からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号３のコード領域の５０連続ヌクレオチド、ただし該ヌクレオチ
    ド配列は、配列番号１９〜２２、２４、４２〜７７またはそれらのサブフラグメ
    ントのいずれでもない、ヌクレオチド；および （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、 からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の単離された核酸分子を、プロモーターに作
    動可能に連結してベクターに挿入する工程を含む、組換えベクターの作製方法。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の方法により作製された、組換えベクター。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程
    を包含する、組換え宿主細胞の作製方法。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法によって作製された、組換え宿主細胞
    。
  9. 【請求項９】 ＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプチドを産
    生するための組換え方法であって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で
    請求項８に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収
    する工程を包含する、方法。
  10. 【請求項１０】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜９５０； （ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜９５０； （ｃ）配列番号２のアミノ酸２９〜９５０； （ｄ）配列番号２のアミノ酸３０〜９５０； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ１ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ１ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜８９０； （ｈ）配列番号４のアミノ酸２〜８９０； （ｉ）配列番号４のアミノ酸２４〜８９０； （ｊ）配列番号４のアミノ酸１１２〜８９０； （ｋ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるＭＥＴＨ２ｃＤＮＡクローン
    によってコードされるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ２ポリペプチドのアミノ酸
    配列； （ｌ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるＭＥＴＨ２ｃＤＮＡクローン
    によってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ２ポリペプチドのアミ
    ノ酸配列； （ｍ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
    （ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、または（ｌ）のポリペプチドを改変することにより作
    製されるポリペプチド改変体のアミノ酸配列であって、ここで： （ｉ）該改変は、アミノ酸の挿入、欠失もしくは置換、またはそれらの任意
    の組み合わせを含み；かつ （ｉｉ）該改変の数は、改変されてないアミノ酸配列に存在するアミノ酸の
    総数の５％以下である、アミノ酸配列； （ｎ）配列番号２のアミノ酸２３５〜４５９； （ｏ）配列番号２のアミノ酸４６０〜５４４； （ｐ）配列番号２のアミノ酸５４５〜５９８； （ｑ）配列番号２のアミノ酸８４１〜８９４； （ｒ）配列番号２のアミノ酸８９５〜９３４； （ｓ）配列番号２のアミノ酸５３６〜６１３； （ｔ）配列番号２のアミノ酸５４９〜５６３； （ｕ）配列番号４のアミノ酸２１４〜４３９； （ｖ）配列番号４のアミノ酸４４０〜５２９； （ｗ）配列番号４のアミノ酸５３０〜５８３； （ｘ）配列番号４のアミノ酸８３７〜８９０； （ｙ）配列番号４のアミノ酸２８０〜６０６； （ｚ）配列番号４の５２９〜５４８アミノ酸；および （ａａ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）
    、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）
    、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、または
    （ｚ）のポリペプチドのいずれか１つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列、 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 組換え宿主細胞で産生される、請求項１０に記載の単離さ
    れたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記組換え宿主細胞が哺乳動物である、請求項１１に記載
    の単離されたポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 ＭＥＴＨ１ポリペプチドまたはＭＥＴＨ２ポリペプチドを
    コードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、ここで１〜５
    ０の保存的アミノ酸置換を除けば、該ポリペプチドは以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸約１〜約９５０； （ｂ）配列番号２のアミノ酸約２〜約９５０； （ｃ）配列番号２のアミノ酸約２９〜約９５０； （ｄ）配列番号２のアミノ酸約３０〜約９５０； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるＭＥＴＨ１ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされる成熟ＭＥＴＨ１ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｇ）配列番号４のアミノ酸約１〜約８９０； （ｈ）配列番号４のアミノ酸約２〜約８９０； （ｉ）配列番号４のアミノ酸約２４〜約８９０； （ｊ）配列番号４のアミノ酸約１１２〜約８９０； （ｋ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるＭＥＴＨ２ポリペプチドのアミノ酸配列；および （ｌ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされる成熟ＭＥＴＨ２ポリペプチドのアミノ酸配列 からなる群から選択される配列を有する、単離された核酸分子。
  14. 【請求項１４】 単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、１
    〜５０の保存的アミノ酸置換を除き、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸約１〜約９５０； （ｂ）配列番号２のアミノ酸約２〜約９５０； （ｃ）配列番号２のアミノ酸約２９〜約９５０； （ｄ）配列番号２のアミノ酸約３０〜約９５０； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ１ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ１ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｇ）配列番号４のアミノ酸約１〜約８９０； （ｈ）配列番号４のアミノ酸約２〜約８９０； （ｉ）配列番号４のアミノ酸約２４〜約８９０； （ｊ）配列番号４のアミノ酸約１１２〜約８９０； （ｋ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ２ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｌ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ２ポリペプチドのアミノ酸配列；
    および （ｍ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
    （ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、または（ｌ）のポリペプチドのいずれか１つのエピト
    ープ保有部分のアミノ酸配列、 からなる群から選択される配列を有する、単離されたポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜９５０を含むポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチド； （ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜９５０を含むポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチド； （ｃ）配列番号２のアミノ酸２９〜９５０を含むポリペプチドをコードするポ
    リヌクレオチド； （ｄ）配列番号２のアミノ酸３０〜９５０を含むポリペプチドをコードするポ
    リヌクレオチド； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ１ポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列を含むポリヌクレオチド； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ１ポリペプチドをコードするヌク
    レオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜８９０を含むポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチド； （ｈ）配列番号４のアミノ酸２〜８９０を含むポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチド； （ｉ）配列番号４のアミノ酸２４〜８９０を含むポリペプチドをコードするポ
    リヌクレオチド； （ｊ）配列番号４のアミノ酸１１２〜８９０を含むポリペプチドをコードする
    ポリヌクレオチド； （ｋ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ２ポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列を含むポリヌクレオチド； （ｌ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ２ポリペプチドをコードするヌク
    レオチド配列を含むポリヌクレオチド；および （ｍ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
    （ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、または（ｌ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的
    なヌクレオチド配列、からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも
    ９５％同一であるポリヌクレオチドを含み、 ここで 同一性％は、以下のパラメーター：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕ
    ｐｌｅ＝４、ミスマッチペナルティー＝１、連結ペナルティー＝３０、無作為化
    群長さ＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイ
    ズペナルティー＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド
    配列長のいずれか短い方、でＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて算
    出される、単離された核酸分子。
  16. 【請求項１６】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸約１〜約９５０； （ｂ）配列番号２のアミノ酸約２〜約９５０； （ｃ）配列番号２のアミノ酸約２９〜約９５０； （ｄ）配列番号２のアミノ酸約３０〜約９５０； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ１ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ１ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｇ）配列番号４のアミノ酸約１〜約８９０； （ｈ）配列番号４のアミノ酸約２〜約８９０； （ｉ）配列番号４のアミノ酸約２４〜約８９０； （ｊ）配列番号４のアミノ酸約１１２〜約８９０； （ｋ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有するＭＥＴＨ２ポリペプチドのアミノ酸配列；およ
    び （ｌ）ＡＴＣＣ受託番号２０９５８２に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＥＴＨ２ポリペプチドのアミノ酸配列；
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと９５％同一性を
    有するポリペプチドを含み、 ここで 同一性％は、以下のパラメーター：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌ
    ｅ＝２、ミスマッチペナルティー＝１、連結ペナルティー＝２０、無作為化群長
    さ＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペ
    ナルティー＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列長の
    いずれか短い方、でＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて算出される
    、単離されたポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 請求項１０に記載のポリペプチドの有効量を個体に投与す
    る工程を包含する、該個体において新脈管形成を阻害するための、方法。
  18. 【請求項１８】 配列番号２のアミノ酸配列ｍ〜ｎを含むポリペプチドであ
    って、ここでｍは１〜９５０の整数であり、かつｎは、１０〜９５０の整数であ
    る、ポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 配列番号４のアミノ酸配列ｍ〜ｎを含むポリペプチドであ
    って、ここでｍは１〜８９０の整数であり、かつｎは、１０〜８９０の整数であ
    る、ポリペプチド。
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