KR20010086224A - Ｍｅｔｈ1 및 ｍｅｔｈ2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 - Google Patents

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루이자 이루엘라-아리스페
그렉 에이. 해스팅즈
스티븐 엠. 루벤
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추후제출
베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터
휴먼 게놈 사이언시즈, 인크.
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Abstract

본 발명은 트롬보스폰딘과 관련된 신규 맥관형성 억제 단백질에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 인간 METH1 및 METH2를 암호하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, METH1 및 METH2 폴리펩티드도 제공하며, 또한 이를 제조하는 재조합 방법, 벡터 및 숙주 세포도 제공한다. 또, METH1 또는 METH2를 증가량 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 치료 방법 및 암의 예후를 측정하는 진단 방법도 제공한다.

Description

ＭＥＴＨ1 및 ＭＥＴＨ2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드{METH1 AND METH2 POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES}
기존 맥관 구조로부터 새로운 혈관을 형성하는 현상인 맥관형성은 정상의 성인에게서 엄격하게 조절되는 과정이다. 생리적 환경하에서, 새로운 모세관의 성장은, 혈관 성장을 자극하거나 억제하는 성장 조절 단백질의 상호작용에 의해 엄격하게 조절된다. 일반적으로, 이러한 작용 간의 균형은 억제 쪽으로 치우쳐 있고, 결과적으로 혈관 성장은 억제된다. 하지만, 특정 병리학적 환경하에서 국소적 억제조절은 맥관형성 유도인자의 활성 증가를 억제할 수 없다. 맥관형성은 암 전이의 주요 단계이며[Folkman,Nature Med. 1:27-31(1995)], 비정상적 상처 치유, 염증, 류마티스성 관절염, 건선 및 당뇨병성 막망증에서는 병리학에 필수 성분[Folkmanet al., Science 235:442-447(1987)]으로서, 이러한 병리학적 실체가 혈관 성장의 약리학적 및/또는 유전자적 억제에 의해 조절될 수 있다는 희망을 준다[Iruela-Arispeet al., Thromb.Haem.78:672-677(1997)].
트롬보스폰딘-1(TSP-1)은 활성화된 혈소판에서 방출되고 성장 세포에 의해 분비되는 450 kDa의 맥관형성 억제성 유착성 당단백질이다[Adams,Int.J.Biochem.Cell.Biol. 29:861-865(1997)]. TSP-1은 동종삼량체인데, 각 서브유니트는 1152개 아미노산 잔기의 폴리펩티드로 구성되고, 아스파라긴 잔기의 베타 히드록실화 및 N-결합된 글리코실화에 의해 해독후 변형된다.
TSP-1 단백질 및 mRNA 농도는 다양한 인자에 의해 조절된다. TSP-1 단백질 농도는 IL-1 알파 및 TNF 알파에 의해 억제조절된다. TSP-1 mRNA 및 단백질 농도는 PDGF, TGF-베타 및 bFGF를 비롯한 폴리펩티드 성장 인자에 의해 상승조절되고[Bornstein,Faseb J.6:3290-3299(1992)], 또 p53 종양 억제인자 유전자 생성물의 발현 정도에 의해 조절된다[Dameronet al., Science 265:1582-1584(1994)]. 동정된 기타 다른 트롬보스폰딘 계에 속하는 최소 4 군은 다음과 같다: TSP-2, TSP-3, TSP-4 및 TSP-5(또한, COMP라 고도 부름)이다. 따라서, 당해 기술 분야에서는 맥관형성의 조절과 관련된 기타 다른 분자의 동정이 필요로 되고 있다.
연방 정부 지원 연구 및 개발
본 발명의 개발 동안 수행한 본 연구의 일부는 미국 정부 기금을 이용하였다. 따라서, 미국 정부는 본 발명의 일부 권리를 갖고 있다.
본 발명은 트롬보스폰딘과 관련된 신규의 맥관형성 억제 단백질에 관한 것이다. 구체적으로, 인간 METH1 및 METH2(ME는 메탈로프로테아제를 의미하고 TH는 트롬보스폰딘을 의미한다)를 암호하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, METH1 및 METH2 폴리펩티드도 제공하며, 또한 이를 제조하는 재조합 방법 벡터 및 숙주 세포도 제공한다. 또, METH1 또는 METH2를 증가량 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 치료 방법 및 암의 예후를 측정하는 진단 방법도 제공한다.
도 1은 METH1의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열 번호 2)을 도시한 것이다. 이 단백질은 약 28개 아미노산 잔기(밑줄침)의 추론된 리더 서열을 갖고 있다.
도 2는 METH2의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 3) 및 추론된 아미노산 서열(서열 번호 4)을 도시한 것이다. 이 단백질은 약 23개 아미노산 잔기(밑줄침)의 추론된 리더 서열을 갖고 있다.
도 3은 METH1(서열 번호 2)과 METH2(서열 번호 4)의 아미노산 서열과 이들의 가장 근접한 동족체인 소 메탈로프로테아제(pNP1)(서열 번호 5)의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 박스친 부분은 동일한 아미노산이다. 서열 및 구조 상동성에 의해 추론된 기능성 도메인에는 다음과 같이 표지하였다. 시그널 펩티드(단일선), 포유류 서브틸리신에 대한 잠재적 절단 부위(이중 밑줄선), 메탈로프로테아제 도메인 중의 아연 결합 부위(점선) 및 추정상의 디스인테그린 루프(화살표).
도 4는 METH1, METH2 및 pNPI의 1차 구조를 도시한 것이다. 이 구조는 프로도메인, 촉매성 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 고밀도 디스인테그린 도메인, TSP 유사 도메인, 스페이서 영역 및 다양한 수의 TSP 유사 도메인(MEHT1의 경우 3개, METH2의 경우 2개 및 pNP1의 경우 4개)을 포함한다.
도 5는 METH1(서열 번호 2)과 METH2(서열 번호 4)의 TSP 유사 도메인과 TSP1(서열 번호 6, 7 및 8) 및 TSP2(서열 번호 9, 10 및 11)의 도메인을 비교한 것이다. 시스테인은 1에서 6까지 번호를 매기고 트립토판은 별표로 표시하였다.
도 6은 METH1 및 METH2의 TSP 유사 도메인에서 유래되는 펩티드 및 재조합 단백질이 VEGF 유도된 맥관형성을 차단한다는 것을 도시한 것이다. 매트리겔 상에 주조된 VEGF를 함유하는 나일론 메시를 사용하여 상기 펩티드 또는 재조합 단백질의 존재 또는 부재하에 12 내지 14일령의 배(胚)로부터 CAM 상에 맥관형성을 유도하였다. 모세관의 밀도는 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가하였다. 양성 및 음성의 대조군은 각각 VEGF 단독물과 부형제 단독물로 구성하였다. (A) 재조합 단백질의 존재하에 VEGF에 의해 유도된 맥관형성 반응의 정량. TSP1, 정제된 혈소판 TSP1, GST, 정제된 GST, GST-TSP1, GST-METH1 및 GST-METH2는 실시예 4에 설명되어 있다. (B) 펩티드 P-TSP1, P-METH1 및 P-METH2(각각 TSP, METH1 및 METH2의 타입 I 반복체로 유도된 펩티드)의 존재 또는 부재하에 VEGF에 의해 유도된 맥관형성 반응의 정량; SC1 및 SC2는 대조군으로 사용된 스크램블 펩티드이다. (C) GST-METH1의 존재하에 나타나는 VEGF 유도성 맥관형성의 용량 반응 곡선. (D) GST-METH2의 존재하에 나타나는 VEGF 유도성 맥관형성의 용량 반응 곡선. 맥관형성 지수는 VEGF 매트리겔 유래의 맥관 반응을 100%로 간주하고 배경 농도(매트리겔 자체)를 감하여 나타내었다. 분석은 2회 이상 반복하였다. 각 처리는 3반복으로 실시하였다. 결과값은 평균으로 나타내고, 막대는 표준 편차를 나타낸다.*p<0.001.
도 7은 bFGF 자극된 세포 증식에 대한 METH1 및 METH2 재조합 단백질의 효과를 도시한 것이다. 세포는 시험될 재조합 단백질(그래프에 표시되지 않은 경우에는 3 ㎍/㎖)과 bFGF를 함유하는 배지를 주입한 24 웰 평판에서 배양하였다. 대조군에는 부형제 또는 GST 재조합 단백질만을 첨가하였다. (A) HDEC(인간 피부 내피 세포; (B) HMEC(인간 유방 상피 세포); (C) HDF(인간 피부 섬유아세포); (D), SMC(평활근 세포); (E) HDEC 증식에 대한 GST-METH1 및 GST-METH2의 용량 반응. 실험은 2회 이상 반복하였다. 각 처리는 3반복으로 실시하였다. 결과값은 평균으로 나타내고, 막대는 표준 편차를 나타낸다.*p<0.01.
도 8은 pHE4-5 발현 벡터(서열 번호 12)의 모식도와 서브클로닝된 METH1 또는 METH2 cDNA 암호 서열을 도시한 것이다. 가나마이신 내성 마커유전자, METH1 또는 METH2 암호 서열, oriC 서열 및lacIq 암호 서열을 표시하였다.
도 9는 pHE 프로모터의 조절 인자를 나타내는 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다(서열 번호 13). 2개의lac오퍼레이터 서열, 샤인 달가노 서열(S/D) 및 말단HindIII 및NdeI 제한 부위(이탤리체)가 표시되어 있다.
도 10은 METH1 아미노산 서열을 분석한 결과를 도시한 것이다. 디폴트 세팅을 사용하여 얻은 α, β, 턴 및 코일 영역; 친수성 및 소수성; 양친매성 영역; 가요성 영역; 항원 지수 및 표면 확률을 제시하였다. "항원 지수 또는 제임슨 울프" 그래프에서, 양성 피크는 METH1 또는 METH2 단백질의 고도 항원성 영역, 즉 본 발명의 에피토프 보유 펩티드가 얻어질 수 있는 영역의 위치를 나타낸다. 이 그래프에 의해 한정된 도메인은 본 발명에서 심층 연구하였다. 도 10에 그래프로 도시된 데이터는 표 1의 기재 내용에 기초한 것이다.
도 11은 METH2 아미노산 서열을 분석한 결과를 도시한 것이다. 디폴트 세팅을 사용하여 얻은 α, β, 턴 및 코일 영역; 친수성 및 소수성; 양친매성 영역; 가요성 영역; 항원 지수 및 표면 확률을 제시하였다. "항원 지수 또는 제임슨 울프" 그래프에서, 양성 피크는 METH1 또는 METH2 단백질의 고도 항원성 영역, 즉 본 발명의 에피토프 보유 펩티드가 얻어질 수 있는 영역의 위치를 나타낸다. 이 그래프에 의해 한정된 도메인은 본 발명에서 심층 연구하였다. 도 11에 그래프로 도시된데이터는 표 2의 기재 내용에 기초한 것이다.
상세한 설명
본 발명자들은 TSP-1의 맥관형성 억제 도메인을 암호하는 cDNA로 cDNA 라이브러리를 선별하여 2가지 신규 단백질, 즉 TSP-1의 맥관형성 억제 도메인, 메탈로프로테이나제 도메인 및 디스인테그린 유사 도메인을 포함하는 METH1 및 METH2(맥관 내피 성장 길항물질로서 VEGA-1 및 VEGA-2라 각각 일컬어짐)을 동정하였다. 본 발명자들은 상기 METH1 및 METH2가 모두 맥관형성 억제 활성이 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 서열 번호 2에 도시한 아미노산 서열을 가진 METH1 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드 함유의 분리된 핵산 분자를 제공한다. 상기 서열은 클로닝된 cDNA를 서열분석하여 결정한 것이다. 본 발명의 METH1 단백질은 트롬보스폰딘-1 및 pNPI와 서열 상동성을 공유한다. 서열 번호 1에 도시한 뉴클레오티드 서열은 미국 모식균 배양 수집소(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 부울러바드 10801)에 1998년 1월 15일자로 수탁된 수탁 번호 209581인 cDNA 클론을 서열분석하여 얻었다. ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론은 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 950을 암호하는 METH1 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 클로닝된 cDNA를 서열분석하여 부분적으로 결정된 서열 번호 4에 도시한 아미노산 서열을 가진 METH2 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드 함유의 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 METH2 단백질은 트롬보스폰딘-1 및 pNPI와 서열 상동성을 공유한다. 서열 번호 3에 도시한 뉴클레오티드 서열은 미국 모식균 배양 수집소(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 부울러바드 10801)에 1998년 1월 15일자로 수탁된 수탁 번호 209582인 cDNA 클론을 서열분석하여 부분적으로 얻었다. ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론은 서열 번호 4의 아미노산 112 내지 890을 암호하는 부분 METH2 서열을 포함한다.
핵산 분자
본 명세서에 기재된 DNA 분자를 서열분석하여 결정한 뉴클레오티드 서열의 일부는 자동 DNA 서열분석기(예, 어플라이드 바이오시스템스, 인크 제품인 Model373)를 사용하여 결정하였고, 본 명세서에서 결정한 DNA 분자가 암호하는 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 전술한 바와 같이 결정한 DNA 서열을 해독하여 추론한 것이다. 따라서, 이 자동화 방법에 의해 측정된 모든 DNA 서열에 대해 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 본 명세서에서 측정된 모든 뉴클레오티드 서열은 약간의 오류를 포함할 수 있다. 자동화에 의해 측정된 뉴클레오티드 서열은 서열분석된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 일반적으로 약 90% 이상의 동일성, 보다 일반적으로는 약 95% 이상 내지 약 99.9% 이상의 동일성이 있다. 실제 서열은 당해 기술 분야에 공지된 수동 DNA 서열분석 방법을 비롯한 다른 방법에 의해 보다 정확하게 결정될 수 있다. 또한, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 실제 서열과 비교하여 볼 때 서열분석된 뉴클레오티드 서열의 단일 삽입이나 결실은 뉴클레오티드 서열의 해독시 프레임 이동을 일으킬 수 있고, 그 결과 서열 분석된 뉴클레오티드 서열이 암호하는 추론된 아미노산 서열은 상기 삽입이나 결실 지점에서 시작하는, 서열분석된 DNA 분자에 의해 실제 암호된 아미노산 서열과 완전히 다르게 된다.
서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열과 같은 본 명세서에 제공된 정보를 사용하면, METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 본 발명의 핵산 분자를, 출발 물질로서 mRNA를 사용하여 cDNA를 클로닝하는 방법과 같은 표준 클로닝 및 선별 방법에 따라 얻을 수 있다. 본 발명의 실시양태로서, 서열 번호 1에 기재된 핵산 분자는 인간 심장에서 얻은 cDNA 라이브러리에서 발견하였고, 서열 번호 3에 기재된 핵산 분자는 인간 폐에서 얻은 cDNA 라이브러리에서 발견하였다. 서열 번호 1로 표시되는 METH1 cDNA의 서열분석된 뉴클레오티드 서열은 약 28개 아미노산 잔기의 추론된 리더 서열을 포함하는 약 950개 아미노산 잔기의 단백질을 암호하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 본 발명자들이 분석한 바로서, 서열 번호 3으로 표시되는 METH2 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 약 23개 아미노산 잔기의 추론된 리더 서열을 포함하는 약 890개 아미노산 잔기의 단백질을 암호하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 METH1 단백질과 METH2 단백질의 성숙 형태를 제공한다. 시그널 가설에 따르면, 포유류 세포가 분비하는 단백질은 시그널 또는 분비 리더 서열을 보유한다. 이 서열은 조 소포체를 따라 성장 단백질쇄가 배출되기 시작하면 성숙 단백질로부터 절단되는 시그널 서열 또는 분비 리더 서열을 보유한다. 대부분의 포유류 세포 및 심지어 곤충 세포는 특이성이 동일한 분비 단백질을 절단한다. 하지만, 몇몇 경우에는 분비 단백질의 절단이 대체로 균일하지 않아 단백질의 2종 이상의 성숙 종을 산출한다. 또한, 분비 단백질의 절단 특이성은 궁극적으로 완전 단백질의 1차 구조, 즉 폴리펩티드의 아미노산 서열 자체에 의해 결정된다는 것은 오래전부터 알려진 사실이다. 따라서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 209581로 수탁된 숙주 중에 포함되어 있는 cDNA 클론에 의해 암호되고 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가진 성숙 METH1 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열 번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가진 성숙 METH2 폴리펩티드가 암호하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. ATCC 수탁 번호 209581로 수탁된 숙주에 포함되어 있는 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 보유한 성숙 METH1 단백질이란, 수탁된 숙주의 벡터내에 함유된 클론의 인체 DNA 서열이 암호하는 완전한 오픈 리딩 프레임의 발현에 의해 포유류 세포(예, 하기 기재되는 바와 같은 COS 세포)에서 생성되는 METH1 단백질의 성숙 형태를 의미한다. 하기 기재되듯이, ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 성숙 METH1은 컴퓨터 분석에 기초하여 추정된 절단 부위의 정확도에 따라 서열 번호 2에 제시된 추정된 "성숙" METH1 단백질(약 29에서 약 950까지의 아미노산)과 상이하거나 상이하지 않을 수 있다. 또한, 성숙 METH2도 컴퓨터 분석에 기초하여 추정된 절단 부위의 정확도에 따라 서열 번호 4에 제시된 추정된 "성숙" METH2 단백질(약 24에서 약 890까지의 아미노산)과 상이하거나 상이하지 않을 수 있다.
단백질이 분비 리더 서열 뿐만 아니라 이 리더 서열의 절단점도 보유하는지를 추정하는 방법은 널리 알려져 있다. 예컨대, 맥제오크(McGeoch, Virus Res. 3:271-286(1985)] 및 본 하인예[von Heinje, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690(1986)]의 방법들을 사용할 수 있다. 이들 각 방법에서 공지의 포유류 분비 단백질의 절단점을 추정하는 방법의 정확도는 75 내지 80% 범위이다(상기 von Heinje의 문헌 참조). 하지만, 상기 2가지 방법은 소정의 단백질에 대하여 항상 동일한 추정 절단점을 얻어내지는 못한다.
본 경우에는, 본 발명의 완전한 METH1 및 METH2 폴리펩티드의 추정된 아미노산 서열을 컴퓨터 프로그램("PSORT")으로 분석하였다[K.Nakai and M.Kanehisa, Genomics 14: 897-911(1992)]. 이 프로그램은 아미노산 서열에 기초하여 단백질의 세포 위치를 추정하는 전문 시스템이다. 이러한 전산식 위치 추정 방법의 일부로서 맥게오크와 본 하인예의 방법을 포함한다. PSORT 프로그램으로 분석한 결과, 절단 부위가 서열 번호 2의 아미노산 28과 29 사이와 서열 번호 4의 아미노산 23과 24 사이인 것으로 추정되었다. 그 다음, 완전한 아미노산 서열을, 본 하인예의 (-1, -3) 규칙의 단순 형식을 적용하여 육안 조사로 더 분석하였다. 그 결과, METH1 단백질의 리더 서열은 서열 번호 2의 약 1 내지 약 28에 기재된 아미노산 잔기로 구성되는 것으로 추정되고, 성숙 METH1 단백질은 약 29 내지 약 950의 잔기로 구성되는 것으로 추정되며, METH2 단백질의 리더 서열은 서열 번호 4에 기재된 약 1 내지 약 23의 아미노산 잔기로 구성되는 것으로 추정되고, 성숙 METH2 단백질은 약 24 내지 약 890의 잔기로 구성되는 것으로 추정된다. 또 다른 추정 성숙 METH1 단백질은 서열 번호 2의 잔기 30 내지 950으로 구성되는 것이다.
당업자라면 서열 분석의 오류와 여러 공지 단백질에서 리더 서열에 대한 절단 부위의 가변성 때문에, 수탁된 cDNA에 의해 암호되는 추정 METH1 폴리펩티드는 약 950개의 아미노산을 포함하지만, 910개 내지 990개의 범위에 속하는 임의의 길이일 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 또한, 추정 METH2 폴리펩티드는 약 890개의 아미노산을 포함하지만, 850 내지 약 930개 아미노산 범위에 속하는 임의의 길이일 수 있고, 이 단백질의 추정 리더 서열은 약 23개 아미노산이지만, 약 13 내지 약 33개 아미노산 범위에 속하는 임의의 길이일 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는, 제시된 바와 같이 mRNA와 같은 RNA의 형태이거나 또는 클로닝에 의해 얻거나 합성하여 제조한 cDNA 및 게놈 DNA를 비롯한 DNA 형태일 수 있다. 이 DNA는 1본쇄 또는 2본쇄일 수 있다. 1본쇄 DNA 또는 RNA는 센스 가닥으로 알려지기도 한 암호 가닥이거나 또는 안티센스 가닥이라고도 일컫는 비암호 가닥일 수도 있다.
"분리된" 핵산 분자란, 천연 환경에서 분리된 핵산 분자인 DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 벡터에 함유된 재조합체 DNA 분자는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주한다. 분리된 DNA 분자의 또 다른 예로는 이종 숙주 세포에 유지되는 재조합 DNA 분자 또는 용액 중의 정제된(부분 또는 실질상 정제) DNA 분자를 포함한다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 또한, 본 발명에 기재된 분리된 핵산 분자는 합성 제조된 상기 분자를 포함한다.
본 발명에 기재된 분리된 핵산 분자는 서열 번호 1에 제시된 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 DNA 분자; 성숙 METH1 단백질의 암호 서열을 포함하는 DNA 분자; 및 전술한 서열과 실질상 상이하지만 유전자 암호의 축퇴에 의해서 METH1 단백질을 그대로 암호하는 서열을 함유하는 DNA 분자를 포함한다. 또한, 서열 번호 3에 제시된 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 DNA 분자; 성숙 METH2 단백질의 암호 서열을 포함하는 DNA 분자; 및 전술한 서열과 실질상 상이하지만 유전자 암호의 축퇴에 의해서 METH2 단백질을 그대로 암호하는 서열을 함유하는 DNA 분자를 포함한다. 물론, 유전자 암호는 당해 기술 분야에 공지된 것이다. 따라서, 이러한 축퇴성 변형체를 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 통상적인 공정이다.
또 다른 목적으로, 본 발명은 각 ATCC 수탁 번호 209581(1998.1.15 수탁) 또는 ATCC 수탁 번호 209582(1998.1.15 수탁)로 수탁된 플라스미드 중에 함유된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 실시양태로, N 말단 메티오닌이 결실된 전길이 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 성숙 METH1이나 METH2 폴리펩티드를 암호하는 핵산 분자도 제공한다. 또한, 본 발명은 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 전술한 수탁 클론 중에 함유된 METH1 또는 METH2 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 가진 분리된 핵산 분자 또는 이들 서열 중 어느 하나에 상보적인 서열을 가진 핵산 분자를 제공한다. 이러한 분리된 분자, 구체적으로 DNA 분자는 유전자 지도화를 위한 프로브로서, 염색체와의 동일계내 하이브리드화에 의한 프로브로서, 인간 조직에서의 METH1 또는 METH2 유전자의 발현을 검출하기 위한 프로브로서, 예컨대 노던 블롯 분석용 프로브로서 유용하다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 분리된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 수탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열이나 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가진 분리된 핵산 분자의 단편이란, 뉴클레오티드 길이가 약 15 nt 이상, 보다 바람직하게는 약 20 nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30 nt 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 약 40 nt 이상이며, 본 명세서에 기재된 바와 같이 진단 프로브 및 프라이머로서 유용한 단편을 의미한다. 물론, 길이가 이보다 긴 단편, 즉 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000 nt인 단편도 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 서열이나 수탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열 전체는 아니더라도 대부분의 서열에 상응하는 단편과 마찬가지로 본 발명에 유용하다. 길이가 20 nt 이상인 단편이란, 예컨대 수탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열 유래의 20 이상의 인접 염기를 포함하는 단편을 의미한다.
본 발명의 바람직한 핵산 단편으로는 METH1 또는 METH2 단백질의 에피토프 함유 부분을 암호하는 핵산 분자를 포함한다. MEHT1 및 METH2 단백질의 에피토프 보유 부분을 결정하는 방법은 이하에 상세하게 설명하겠다.
본 발명의 다른 바람직한 핵산 단편으로는, 다음과 같은 영역을 암호하는 핵산 분자를 포함한다: METH1의 메탈로프로테아제 도메인(서열 번호 2의 아미노산 235 내지 459); METH1의 디스인테그린 도메인(서열 번호 2의 아미노산 460 내지 544); METH1의 제1 TSP 유사 도메인(서열 번호 2의 아미노산 545 내지 598); METH1의 제2 TSP 유사 도메인(서열 번호 2의 아미노산 841 내지 894); METH1의 제3 TSP 유사 도메인(서열 번호 2의 895 내지 934); 서열 번호 2의 아미노산 536 내지 613; 서열 번호 2의 아미노산 549 내지 563; METH2의 메탈로프로테아제 도메인(서열 번호 4의 아미노산 214 내지 439); METH2의 디스인테그린 도메인(서열 번호 4의 아미노산 440 내지 529); METH2의 제1 TSP 유사 도메인(서열 번호 4의 아미노산 530 내지 583); METH2의 제2 TSP 유사 도메인(서열 번호 4의 아미노산 837 내지 890); 서열 번호 4의 아미노산 280 내지 606; 및 서열 번호 4의 아미노산 529 내지 548을 포함한다.
또한, 본 발명자들은 서열 번호 1에 제시된 서열 중 일부에 관한 다음과 같은 cDNA 클론을 동정하였다. HOUCQ17RA(서열 번호 14); HPLBM11R(서열 번호 15); HGBI07R(서열 번호 16); HNTMA49R(서열 번호 17); HNALE27R(서열 번호 18) 및 HIBDB45R(서열 번호 19).
또한, 서열 번호 1의 일부와 관련된 다음과 같은 시판 EST도 동정하였다. D67076(서열 번호 20), AB001735(서열 번호 21), X14787(서열 번호 22), U64857(서열 번호 23), X04665(서열 번호 24), M64866(서열 번호 25), L07803(서열 번호 26), U08006(서열 번호 27), M16974(서열 번호 28), L13855(서열 번호 29), AL021529(서열 번호 30), D86074(서열 번호 31), L05390(서열 번호 32), Z69361(서열 번호 33), X99599(서열 번호 34), AF018073(서열 번호 35), L23760(서열 번호 36), Z46970(서열 번호 37), AC004449(서열 번호 38), Z69589(서열 번호 39), Z22279(서열 번호 40), 및 X17524(서열 번호 41).
또한, 본 발명자들은 서열 번호 3의 일부에 관한 다음과 같은 cDNA 클론을 동정하였다. HCE4D69FP02(서열 번호 42), HIBDB45F(서열 번호 43), HKIXH64R(서열 번호 44), HIBDB45R(서열 번호 19), HCE3Z95R(서열 번호 45), HTLEQ90R(서열 번호 46), HMWEF45R(서열 번호 47), HTOFC34RA(서열 번호 48), HHFDI20R(서열 번호 49), HMSHY47R(서열 번호 50), HCESF90R(서열 번호 51), HMCAO46R(서열 번호 52), HTTAQ67R(서열 번호 53), HFKCF19F(서열 번호 54), HMCAS31R(서열 번호 55),HMWGP26R(서열 번호 56), HLHTP36R(서열 번호 57), HE8AN11R(서열 번호 58), HEONN73R(서열 번호 59), HBNBG53R(서열 번호 60) 및 HMSCH94R(서열 번호 61).
또, 서열 번호 3에 제시된 서열 중 일부에 관한 다음과 같은 시판 EST도 동정되었다. D67076(서열 번호 20), AB001735(서열 번호 21), AB005287(서열 번호 62), X87619(서열 번호 63), X14787(서열 번호 22), X04665(서열 번호 24), M87276(서열 번호 64), M62458(서열 번호 65), AB002364(서열 번호 66), AB005297(서열 번호 67), X69161(서열 번호 68), X16619(서열 번호 69), I36448(서열 번호 70), L12260(서열 번호 71), I36352(서열 번호 72), X15898(서열 번호 73), I07789(서열 번호 74), I08144(서열 번호 75), U31814(서열 번호 76) 및 AF001444(서열 번호 77).
구체적인 실시양태로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 길이가 300kb, 200kb, 100kb, 50kb, 15kb, 10kb 또는 7.5kb 이하이다. 또 다른 실시양태로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 METH1 또는 METH2 암호 서열의 15개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하지만, METH1 또는 METH2 인트론은 전혀 또는 일부라도 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태로서, METH1 또는 METH2 암호 서열을 포함하는 핵산은 게놈 인접 유전자(즉, 게놈내 METH1 또는 METH2 유전자의 5' 또는 3'쪽 인접 유전자)의 암호 서열은 포함하지 않는다.
또 다른 목적으로, 본 발명은 전술한 본 발명의 핵산 분자, 예를 들어 ATCC 수탁 번호 209581 또는 ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 보유한 폴리뉴클레오티드의 일부에, 엄중 하이브리드화 조건하에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. "엄중 하이브리드화 조건"이란 50% 포름아미드, 5x SSC(750 mM NaCl, 75 mM 구연산 3나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 황산덱스트란 및 20 ㎍/㎖의 변성 전단된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액에서 42 ℃하에 하룻밤 동안 항온처리하고, 그 다음 약 65 ℃하에 필터를 0.1x SSC로 세척하는 것을 의미한다.
폴리뉴클레오티드의 "일부"에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드란 약 15개 이상의 뉴클레오티드(nt), 보다 바람직하게는 약 20개 nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30개 nt 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 대조 폴리뉴클레오티드의 약 30, 40, 50, 60 또는 70개 nt에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같은 진단 프로브 및 프라이머로서 유용하고, 하기 상세하게 설명된다.
폴리뉴클레오티드의 일부, 예컨대 "길이가 20개 nt 이상"이란 대조 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열(예, 수탁된 cDNA 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열)에 인접한 20개 또는 그 이상의 인접 서열을 의미한다. 물론, 폴리 A 서열(예컨대, 서열 번호 1 및 서열 번호 3에 각각 제시된 METH1 또는 METH2 cDNA의 3' 말단 폴리(A) 트랙) 또는 T(또는 U) 잔기의 상보성 스트레치에만 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산 일부와 하이브리드시키는데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않을 것이다. 그 이유는 그러한 폴리뉴클레오티드는 폴리(A) 스트레치 또는 이의 보체를 포함하는 모든 핵산 분자(예, 실질상 모든 2본쇄 cDNA 클론)에 하이브리드하기 때문이다.
또한, 약간 높은 엄중도 하이브리드화 조건하에 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하는 핵산 분자도 본 발명에 포함된다. 하이브리드화 및 시그널 검출의 변화는 포름아미드 농도(포름아미드 농도의 저하는 엄중도의 저하를 산출함), 염농도 또는 온도의 조작을 통해 주로 실시한다. 예를 들어, 약간 높은 엄중도 조건으로는 6x SSPE(20x SSPE = 3 M NaCl; 0.2 M NaH2PO4; 0.02 M EDTA, pH 7.4), 0.5% SDS, 30% 포름아미드, 100 ㎍/㎖ 연어 정자 차단용 DNA를 함유하는 용액에서 37 ℃하에 하룻밤 동안 항온처리하고, 그 다음 50 ℃에서 1x SSPE, 0.1% SDS로 세척하는 단계를 포함한다. 또한, 낮은 엄중도를 산출하기 위하여, 엄중도 하이브리드화 후 실시하는 세척을 보다 높은 염 농도(예, 5x SSC)에서 실시할 수 있다.
주지할 사항은 하이브리드화 실험에서 배경 농도를 억제하기 위해 사용되는 교번적 차단 시약의 첨가 및/또는 치환을 통해 상기 조건을 변화시킬 수 있다는 점이다. 일반적인 차단 시약으로는 덴하르트 시약, BLOTTO, 헤파린, 변성 연어 정자 DNA 및 구득용이한 독점권 있는 제제를 포함한다. 하지만, 특정 차단 시약의 첨가는 상용성의 문제로 인하여 전술한 하이브리드화 조건의 변화를 일으킬 수도 있다.
물론, 폴리A+ 서열(예, 서열 목적에 제시된 cDNA의 모든 3' 말단 폴리A+ 트랙) 또는 T(또는 U) 잔기의 상보성 스트레치에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드는 "폴리뉴클레오티드"의 정의에 포함하지 않는다. 그 이유는, 그런 폴리뉴클레오티드는 폴리(A) 스트레치 또는 이의 보체(예, 실질상 모든 2본쇄 cDNA 클론)를 함유하는 모든 핵산 분자에 하이브리드하기 때문이다.
METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 미변형된 RNA 또는 DNA나 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 모든 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 예를 들어, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 1본쇄 및 2본쇄 DNA, 1본쇄 영역과 2본쇄 영역의 혼합체인 DNA, 1본쇄 및 2본쇄 RNA, 및 1본쇄 영역과 2본쇄 영역의 혼합체인 RNA, 1본쇄이거나 또는 보다 일반적으로는 2본쇄이거나 또는 1본쇄 영역과 2본쇄 영역의 혼합물일 수 있는 RNA와 DNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함할 수 있다. 또한, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA를 포함하는 3본쇄 영역을 포함할 수 있다. 또, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 안정성이나 다른 이유로 인하여 변형된 DNA 또는 RNA 백본이나 1 이상의 변형 염기를 포함할 수 있다. "변형" 염기란, 예컨대 이노신과 같은 이상 염기 및 트리틸화된 염기를 포함한다. DNA와 RNA에는 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 즉 "폴리뉴클레오티드"에는 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
"서열 번호 1"은 METH1 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이고, "METH2"는 METH1 폴리펩티드 서열에 관한 것이다. "서열 번호 3"은 METH2 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이고, "서열 번호 4"는 METH2 폴리펩티드 서열에 관한 것이다.
전술한 바와 같이, METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 본 발명의 핵산 분자는 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호하는 분자 자체; 성숙 폴리펩티드와 부가 서열, 예컨대 프리단백질 서열, 프로단백질 서열 또는 프리프로단백질 서열과 같은 분비 또는 리더 서열을 암호하는 서열; 전술한 부가 암호 서열의 존재또는 부재하에, 부가적인 비암호 서열(예컨대, 비제한적인 인트론 및 비암호성 5' 서열 및 3' 서열, 예, 전사, 접목과 폴리아데닐화 시그널을 비롯한 mRNA 프로세싱, 예컨대 mRNA의 리보솜 결합 및 안정성에 관여하는, 전사되지만 해독되지 않는 서열)과 결합된 성숙 폴리펩티드의 암호 서열; 부가 기능을 제공하는 아미노산과 같은 부가 아미노산을 암호하는 부가 암호 서열을 포함할 수 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 즉, 폴리펩티드를 암호하는 서열은 마커 서열, 예컨대 융합 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 암호하는 서열에 융합될 수 있다. 이러한 본 발명의 목적에 특히 바람직한 실시양태로서, 마커 아미노산 서열로는 많은 예 중에서 대부분 구득이 용이한 헥사 히스티딘 펩티드, 예컨대 pQE 벡터(퀴아겐, 인크. 제품)에 구비되어 있는 태그가 있다. 예컨대, 문헌[Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824(1989)]에 제시된 바와 같이 헥사 히스티딘은 융합 단백질의 정제를 편리하게 해준다. "HA" 태그는 정제에 유용한 또 다른 펩티드로서, 문헌[Wilson et al., Cell 37:767-778(1984)]에 기재된 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 유래의 에피토프에 상응한다. 하기 기재되는 바와 같이, 기타 다른 융합 단백질로는 N 말단이나 C 말단이 Fc에 융합된 METH1 또는 METH2를 포함한다.
또한, 본 발명은 METH1 또는 METH2 단백질의 일부, 유사체 또는 유도체를 암호하는 본 발명에 따른 핵산 분자의 변형체에 관한 것이다. 변형체는 천연 발생인 것, 예컨대 천연의 대립유전자 변형체일 수 있다. "대립유전자 변형체"란 유기체의 염색체 상에 존재하는 소정의 유전자좌를 차지하는 유전자의 여러 교번적 형태 중 하나를 의미한다[Lewin, B., ed., Genes II, John Wiley & Sons, New York(1985)].비천연 발생의 변형체는 당해 기술 분야에 공지된 돌연변이유발 기법을 사용하여 얻을 수 있다.
이러한 변형체로는 1 이상의 뉴클레오티드와 관련이 있을 수 있는, 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 부가에 의해 생성되는 것을 포함한다. 변형체는 암호 영역의 변형체, 비암호 영역의 변형체 또는 둘 모두일 수 있다. 암호 영역의 변형은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 생성할 수 있다. 이 중에서 특히 바람직한 것은 침묵 치환, 첨가 및 결실로서, METH1 또는 METH2 단백질이나 이의 일부의 성질과 활성을 변화하지 않는 것이다. 또한, 이와 관련하여 특히 바람직한 것은 보전적 치환이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열과 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성이 있는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지지만 N 말단 메티오닌은 결실된 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 2에 기재된 서열 중 약 29 내지 약 950 위치에 있는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 2에 기재된 서열 중 약 30 내지 약 950 위치에 있는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 성숙 METH1 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 2의 아미노산 235 내지 459를 암호하는 뉴클레오티드 서열(METH1의 메탈로프로테아제 도메인); 서열 번호 2의 아미노산 460 내지 544를 암호하는 뉴클레오티드 서열(METH1의 디스인테그린 도메인); 서열 번호 2의 아미노산 545 내지 598을 암호하는 뉴클레오티드 서열(METH1의 제1 TSP 유사 도메인); 서열 번호 2의 아미노산 841 내지 894를 암호하는 뉴클레오티드 서열(METH1의 제2 TSP 유사 도메인); 서열 번호 2의 아미노산 895 내지 934를 암호하는 뉴클레오티드 서열(METH1의 제3 TSP 유사 도메인); 서열 번호 2의 아미노산 536 내지 613을 암호하는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 2의 아미노산 549 내지 563을 암호하는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 4의 아미노산 서열은 가지지만 N 말단 메티오닌은 결실된 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 4에 있는 약 24 내지 약 890 위치에 있는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 4의 약 112 내지 약 890의 위치에 있는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; ATCC 수탁 번호 209582로 수탁된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; ATCC 수탁 번호 209582로 수탁된 cDNA 클론에 의해 암호된 아미노산 서열을 갖는 성숙 METH2 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 4의 아미노산 214 내지 439를 암호하는 뉴클레오티드 서열(METH2의 메탈로프로테아제 도메인); 서열 번호 4의 아미노산 440 내지 529를 암호하는 뉴클레오티드 서열(METH2의 디스인테그린 도메인); 서열 번호 4의 아미노산 530 내지 583을 암호하는 뉴클레오티드 서열(METH2의 제1 TSP 유사 도메인); 서열 번호 4의 아미노산837 내지 890을 암호하는 뉴클레오티드 서열(METH2의 제2 TSP 유사 도메인); 서열 번호 4의 아미노산 280 내지 606을 암호하는 뉴클레오티드 서열; 서열 번호 4의 아미노산 529 내지 548을 암호하는 뉴클레오티드 서열; 또는 전술한 뉴클레오티드 서열 중 임의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 대조 뉴클레오티드 서열과 최소한, 예컨대 95% "동일성"이 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란, METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 대조 뉴클레오티드 서열 중 각 100개의 뉴클레오티드 당 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것 외에는, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 대조 서열과 동일한 것을 의미한다. 즉, 대조 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 동일성이 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위하여 대조 서열 중의 최대 5%의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환 또는 결실되거나, 대조 서열내 총 뉴클레오티드 중 최대 5%에 해당하는 뉴클레오티드의 수가 대조 서열 중에 삽입될 수도 있다. 이와 같은 대조 서열의 변이는 대조 뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 위치나, 이 말단 위치 사이의 임의의 위치에, 대조 서열내 뉴클레오티드 사이에 각각 산재하거나 대조 서열내에 1 이상의 인접 기로 존재할 수 있다.
실질상, 임의의 특정 핵산 분자가 예컨대 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 수탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성이 있는지는, Bestfit 프로그램(WisconsinSequence Analysis Package, Version 8 for Unix, 미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹 제품)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 편리하게 측정할 수 있다. 베스트피트는 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489(1981)]에 기재된 국소 상동성 알고리듬을 사용하여 두 서열간의 최상의 상동성 분절을 탐색한다. 특정 서열이 본 발명에 기재된 대조 서열과 예컨대 95% 동일성이 있는지를 측정하기 위하여 베스트피트 또는 기타 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 대조 뉴클레오티드 서열의 총 길이에 대하여 동일성 %가 계산되고 대조 서열내 뉴클레오티드 총 수의 최대 5% 정도의 상동성 갭이 허용되도록 매개변수가 설정되어야 한다.
글로벌 서열 정렬이라고도 일컬어지는 주체 서열과 시험 서열(본 발명의 서열)간의 최고의 총 정합을 측정할 수 있는 바람직한 방법은 문헌[Brutlag et al., Comp.Appl.Biosci.6:237-245(1990)]에 기재된 알고리듬에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정할 수 있다. 서열 정렬시, 주체 서열과 시험 서열은 둘다 DNA 서열이다. RNA 서열은 U를 T로 전환시킨 뒤 비교하면 된다. 상기 글로벌 서열 정렬의 결과는 동일성%이다. 동일성%를 계산하는 DNA 서열의 FASTDB 정렬에 사용되는 바람직한 매개변수로는 매트릭스 = 귀일법, k-튜플 = 4, 부정합 패널티 = 1, 결합 패널티 = 30, 무작위 그룹 길이 = 0, 컷오프 스코어 = 1, 갭 패널티 = 5, 갭 사이즈 패널티 = 0.05, 윈도우 사이즈 = 500 또는 주체 뉴클레오티드 서열의 길이(보다 짧은 쪽)가 있다.
주체 서열이 내부 결실이 아닌 5' 결실 또는 3' 결실로 인하여 시험 서열보다 짧으면, 결과는 수작업에 의해 보정이 이루어져야 한다. 그 이유는 FASTDB 프로그램이 동일성%를 계산할 때 시험 서열의 5 절두 및 3' 절두를 계산해 넣고 있지 않기 때문이다. 시험 서열과 비교했을 때 주체 서열이 5' 말단 또는 3' 말단 절두형인 경우, 동일성%는 주체 서열의 5'와 3'에 있지만 정합/정렬성이 아닌 시험 서열의 염기 수를 시험 서열의 총 염기수의 비율%로서 계산하여 보정한다. 뉴클레오티드가 정합/정렬성인지는 FASTDB 서열 정렬의 결과로 결정한다. 이 비율을, 특정 매개변수를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성%에서 감하여 최종의 동일성%를 얻는다. 이와 같이 보정된 결과가 본 발명의 목적에 사용되는 것이다. 시험 서열에는 정합/정렬되지 않고 FASTDB 정렬시 제시되는 시험 서열의 5' 염기 및 3' 염기 외측에 있는 염기는 단지 동일성% 결과를 수작업으로 조정하는 경우에만 계산에 이용된다.
예를 들어, 90개 염기 주체 서열이 100개 염기의 시험 서열과 정렬되어 동일성%를 측정하는 경우, 주체 서열의 5' 말단은 결실된다. 따라서, FASTDB 정렬은 5' 말단의 처음 10개 염기에 대한 정합/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 못한 염기는 서열의 10%를 차지하고(정합되지 않은 5' 말단과 3' 말단의 염기 수/시험 서열내 염기의 총수), 따라서 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성% 결과에서 10%를 감한다. 나머지 90개 염기가 완벽하게 정합된다면 최종 동일성%는 90%일 것이다. 다른 실시예에서, 90개 염기 시험 서열을 100개 염기 시험 서열과 비교한다. 결실이 내부적이라면 시험 서열과 정합/정렬되지 dskg는 주체 서열의 5' 말단이나 3' 말단 상의 염기는 없다. 이 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성%는 수작업으로 보정될 수 없다. 다시 말하면, 시험 서열과 정합/정렬되지 않는 주체 서열의 5' 및 3' 염기만이 수작업으로 보정가능하다. 본 발명의 목적을 위하여 기타 다른 수작업에 의한 보정이 이루어질 필요는 없다.
본 발명은 METH1 또는 METH2 활성이 있는 폴리펩티드를 암호하는지에 관계없이 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 핵산 서열 또는 수탁된 cDNA의 핵산 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성이 있는 핵산 분자에 관한 것이다. 이것은 특정 핵산 분자가 METH1 또는 METH2 활성이 있는 폴리펩티드를 암호하지 않을지라도, 그 핵산 분자를 예컨대 하이브리드화 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 사용하는 방식을 당업자라면 잘 알고 있을 것이기 때문이다. METH12 또는 METH2 활성이 있는 폴리펩티드를 암호하지 않는 본 발명의 핵산 분자의 용도로는, 특히 (1) cDNA 라이브러리에서 METH1 또는 METH2 유전자 또는 이것의 대립유전자 변형체를 분리하는 용도; (2) 문헌[Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pregamon Press, New York(1988)]에 기재된 바와 같이 METH1 또는 METH2 유전자의 정확한 염색체 위치를 제공하기 위한 중기 염색체 스프레드에 대한 동일계내 하이브리드화(예, "FISH"); 및 (3) 특정 조직에서 METH1 또는 METH2 mRNA 발현의 검출에 사용되는 노던 블롯 분석용이 있다.
하지만, 바람직한 것은, 사실상 METH1 또는 METH2 단백질 활성이 있는 폴리펩티드를 암호하는 수탁된 cDNA의 핵산 서열이나 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 핵산 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성이 있는 서열을 갖는 핵산 분자이다. "METH1 활성이 있는 폴리펩티드"란 특정 생물학적 분석에서 METH1 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 예컨대, METH1 단백질 활성은 이하 실시예 4에 기재되는 각막 포켓 분석법[Tolsmaet al., J.Cell.Biol.122:497-511(1993)] 또는 융모요막의 막 분석법[Iruela-Arispeet al., Thrombosis and Haemostasis 78(1): 672-677(1997)]을 사용하여 측정할 수 있다.
간단히 설명하면, 융모요막 분석법에서는 목적으로 하는 잠재적 항맥관형성 화합물을 bFGF와 같은 맥관형성 성장 인자와 함께 I형 콜라겐 펠릿(비트로겐)에 첨가한다. 이 시료를 혼합하고 나일론 메시에 배치한 뒤 중합시킨다. 중합이 완료된 후 메시를 12일령된 병아리 배(胚)의 융모요막 상에 배치하고 37 ℃하에 24 시간 동안 방치한다. 그 다음, 배에 형광제(예, FITC 덱스트란)를 주사하고, 메시를 형광 현미경 하에 관찰할 수 있도록 장착, 고정시킨다.
각막 포켓 분석법에서는, 목적 화합물과 맥관형 성장 인자(예, bFGF)를 함유하는 하이드론 펠릿을 래트 또는 마우스 각막의 둘레에서 1 내지 2 ㎜ 떨어진 위치에 이식한다. 일정 기간 동안, 예컨대 5일 동안 반응을 조사한다. 맥관형성의 정도는 각막의 둘레로부터 이동하는 모세관을 측정하여 평가한다.
물론, 유전자 암호의 축퇴성 때문에 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 핵산 서열이나 수탁된 cDNA의 핵산 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성이 있는 서열을 갖는 다수의 핵산 분자가 "METH1 또는 METH2 단백질 활성이 있는" 폴리펩티드를 암호한다는 점은 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 사실, 이러한 뉴클레오티드 서열의 축퇴성 변형체는 모두 동일한 폴리펩티드를 암호하기 때문에전술한 비교 분석을 실시하지 않아도 당업자라면 잘 식별할 수 있을 것이다. 또한, 이러한 핵산 분자가 축퇴성 변형체가 아닌 경우에는 적당한 수의 핵산 분자가 METH1 또는 METH2 단백질 활성이 있는 폴리펩티드를 암호한다는 것을 당업자라면 잘 알 것이다. 그 이유는, 당업자라면 단백질 기능에 유의적 효과를 미칠 가능성이 적거나 가능성이 없는 아미노산 치환(예, 하나의 지방족 아미노산을 다른 지방족 아미노산으로 치환하는 것)을 잘 알고 있기 때문이다.
예를 들어, 표현형적 침묵 아미노산 치환을 제조하는 방법에 관한 참고 문헌으로는 문헌[Bowie, J.U. et al., "Deciphering the message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions." Science 247:1306-1310(1990)]이 있고, 이 문헌에서 저자는 단백질의 아미노산 치환에 대한 놀라운 내성을 개시하고 있다.
벡터 및 숙주 세포
또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터에 의해 유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기법으로 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드는 숙주내 전파에 대한 선택가능한 마커를 포함하는 벡터에 결합될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예컨대 인산칼슘 침전물 중에서 또는 하전된 지질과의 혼합물 중에서 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우에는, 적당한 팩키징 세포주를 사용하여 시험관내에서 팩키징된 다음 숙주 세포내로 형질도입될 수 있다.
DNA 삽입체는 적당한 프로모터, 예컨대 파지 람다 PL 프로모터, 대장균lac,trp및tac프로모터, SV40 초기 프로모터와 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터에 작동가능하게 결합되어야 한다. 다른 적합한 프로모터들도 당업자에게 잘 알려져 있다. 발현 작제물은 전사 개시, 종결 부위 및 전사된 영역에 있는 해독용 리보솜 결합 부위를 더 포함한다. 이 작제물에 의해 발현된 성숙 전사체의 암호 부위는 처음에 해독 개시부위와 해독된 폴리펩티드의 말단에 적당하게 위치한 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함하는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, 발현 벡터는 1 이상의 선택성 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 마커로는 진핵세포 세포 배양물용의 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성과 대장균 및 기타 박테리아 배양용 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성 유전자가 있다. 적당한 숙주의 대표적인 예로는, 박테리아 세포, 예, 대장균, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella typhimurium) 세포; 진균 세포, 예컨대 효소 세포; 곤충 세포, 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포, 예컨대 CHOm COS 및 보웨스 흑색종 세포; 및 식물 세포가 있다. 전술한 숙주세포에 대한 적당한 배양 배지와 조건에 대해서는 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
박테리아에 사용하기에 바람직한 벡터 중에는 pQE70, pQE60 및 pQE-9(퀴아겐의 시판품); pBS 벡터, 파지스크립트 벡터, 블루스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(스트라타진의 시판품); 및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(파마시아의 시판품)가 있다. 바람직한 진핵 벡터중에는 pWLNEO, pSV2CAT,pOG44, pXT1 및 pSG(스트라타진 제품); 및 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(파마시아 시판품)이 있다. 기타 다른 적합한 벡터도 당업자라면 잘 알 것이다.
본 발명을 실시하는데 있어서의 발현 벡터의 사용 외에도, 본 발명은 목적 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 인자 및 오퍼레이터 인자를 포함하는 신규 발현 벡터를 제공한다. 이러한 벡터의 1가지 예로는 하기 상세하게 설명되는 pHE4-5가 있다.
도 8 및 도 9에 요약한 바와 같이, pHE4-5 벡터의 성분(서열 번호 12)으로는 1) 선택 마커로서의 네오마이신포스포트란스퍼라제 유전자, 2) 대장균의 복제 오리진, 3) T5 파지 프로모터 서열, 4) 2개의lac오퍼레이터 서열, 5) 샤인 델가노 서열, 6) 락토스 오페론 억제인자 유전자(lacIq)가 있다. 복제 오리진(oriC)은 pUC19(LTI, 미국 매릴랜드주 게터스버그 소재)에서 유래하는 것이다. 프로모터 서열과 오퍼레이터 서열은 합성적으로 제조하였다. 핵산 서열의 합성 제조에 대해서는 당해 기술 분야에 공지되어 있다[CLONTECH 95/96 카탈로그, 페이지 215-216, COLNTECH, 미국 캘리포니아주 94303 팔로 알토 이스트 미다우 서클 1020 소재]. METH1(서열 번호 2) 또는 METH2(서열 번호 4)를 암호하는 뉴클레오티드 서열은 pHE4-5 벡터의 NdeI 및 Asp718 부위 사이에 그 뉴클레오티드 서열을 삽입함으로써 프로모터와 오퍼레이터에 작동가능하게 결합된다.
전술한 바와 같이, pHE4-5 벡터는lacIq 유전자를 포함한다.lacIq는lac오퍼레이터를 엄격히 조절하는lacI 유전자의 대립유전자이다[Amann, E. et al., Gene 69:301-315(1988); Stark, M., Gene 51:255-267(1987)].lacIq 유전자는lac오퍼레이터 서열에 결합하고 하류(즉, 3') 서열의 전사를 차단하는 억제인자 단백질을 암호한다. 하지만,lacIq 유전자 생성물은 락토스 또는 특정 락토스 유사체, 예컨대 이소프로필 B-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 중 어느 한 성분의 존재하에lac오퍼레이터로부터 해리된다. 따라서, METH1 또는 METH2는 pHE4-5 벡터를 함유하는 비유도성 숙주 세포내에서는 인지할 수 있는 정도의 양으로 생성되지 않는다. 하지만, IPTG와 같은 제제를 첨가하여 숙주 세포를 유도하면 METH1 또는 METH2 암호 서열을 발현하게 된다.
pHE4-5 벡터의 프로모터/오퍼레이터 서열(서열 번호 13)은 T5 파지 프로모터와 2개의lac오퍼레이터 서열을 포함한다. 제1 오퍼레이터는 전사 개시 부위의 5'쪽에 위치하고 제2 오퍼레이터는 전사 개시 부위의 3'쪽에 위치한다. 이 오퍼레이터들은lacIq 유전자 생성물과 함께 존재하는 경우lac오페론 유도제, 예컨대 IPTG가 없어도 하류 서열을 엄격하게 억제한다.lac오퍼레이터의 하류에 위치한 작동가능하게 결합된 서열의 발현은 IPTG와 같은lac오페론 유도제의 첨가에 의해 유도될 수 있다.lacIq 단백질에 대한lac유도제의 결합은lac오퍼레이터 서열로부터lac단백질을 방출시키고 작동가능하게 결합된 서열의 전사를 개시시킨다. 유전자 발현의lac오페론 조절에 대해서는 문헌[Devlin, T., TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS, 4th Edition(1997), p. 802-807].
pHE4계의 벡터는 METH1 또는 METH2 암호 서열을 제외한 pHE4-5 벡터의 모든 성분을 포함한다. pHE4 벡터의 특징은 최적화된 합성 T5 파지 프로모터,lac오퍼레이터 및 샤인-델가노 서열을 포함한다. 또한, 이들 서열은 삽입 유전자의 발현이엄격하게 조절되고 유도시 고도의 발현이 일어나도록 적절하게 이격되어 배치된다.
본 발명의 단백질을 생성하는 데 사용하기에 적합한 공지의 박테리아 프로모터에는 대장균lacI 및lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터,gpt프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터,trp프로모터가 있다. 적합한 진핵 프로모터로는 CMV 인접 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스[예컨대, 루이스 육종 바이러스(RSV)] LTR의 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터가 있다.
또한, pHE4-5 벡터는 AUG 개시 코돈의 5'쪽에 샤인-델가노 서열을 포함한다. 샤인-델가노 서열은 AUG 개시 코돈에서 약 10개 뉴클레오티드의 상류(즉, 5')에 일반적으로 위치하는 짧은 서열이다. 이 서열은 주로 진핵 리보솜을 AUG 개시 코돈으로 유도한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 단백질을 생성하기에 유용한 발현 벡터에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 목적은 pHE4-5 벡터(서열 번호 12)를 통해 예시된다.
숙주 세포내로 작제물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE 덱스트란 매개 형질감염, 양이온 지질 매개의 형질감염, 전기침투, 형질도입, 감염 또는 기타 다른 방법에 의해 실시될 수 있다. 이러한 방법에 대해서는 많은 표준 실험서[예, Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology(1986)]에 개시되어 있다.
폴리펩티드는 변형 형태, 예컨대 융합 단백질 형태로 발현될 수 있으며, 분비 시그널 뿐만 아니라 부가적인 이종의 기능성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일정 영역의 부가 아미노산, 특히 하전 아미노산은 폴리펩티드의 N 말단에 첨가되어, 정제 동안 또는 후속되는 취급과 보관 동안 숙주 세포내 안정성과 지속성을 향상시킬 수 있다. 또한, 정제를 용이하게 하기 위하여 펩티드 부를 폴리펩티드에 첨가할 수 있다. 이 영역은 폴리펩티드의 최종 제조 이전에 제거될 수 있다. 무엇보다도 분비 또는 배출성을 부여하고, 안정성을 개선시키며, 정제를 용이하게 하기 위하여 폴리펩티드에 펩티드 부를 부가하는 방법은 당해 기술 분야에 통상적인 기술이다. 바람직한 융합 단백질은 단백질의 가용화에 유용한 면역글로불린 유래의 이종 영역을 포함한다. 예를 들어, EP-A-O 464 533(카나다 대응 특허 2045869)은 면역글로불린 분자의 불변부 중 여러 부분을 다른 인간 단백질 또는 이것의 일부와 함께 포함하는 융합 단백질을 개시하고 있다. 많은 경우, 융합 단백질 중의 Fc 부분은 치료 및 진단에 사용하기에 매우 유리한데, 그 이유는 예컨대 개선된 약력학적 성질을 제공하기 때문이다(EP-A 0 232 262). 한편, 몇가지 경우에는 개시된 유리한 방법으로 융합 단백질을 발현, 검출 및 정제한 후 Fc 부분은 삭제할 수 있어야 바람직한 경우가 있다. 이러한 경우는, Fc 부분이 치료 및 진단에 사용시 방해가 되는 것으로 입증된 경우인데, 그 예로는 융합 단백질이 면역화용 항원으로서 사용되어야만 하는 경우이다. 약물 발견을 위하여, 예컨대 hIL5 수용체와 같은 인간 단백질을 고처리량의 선별 분석 용도로 Fc 부와 융합시켜 hIL-5의 길항물질을 동정한 바 있다[D. Bennett et al., J.Mol.Recognition 8:52-58(1995) 및 K.Johanson et al., J.of Biol.Chem. 270(16):9459-9471(1995)].
METH1 또는 METH2 단백질은 황산암모늄 또는 에탄올 침전법, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한 공지의 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 특히, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")를 정제시 이용하는 것이 가장 좋다. 본 발명의 폴리펩티드로는 천연 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물 및 진핵 숙주 또는 원핵 숙주(예컨대, 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포)로부터 재조합 기법에 의해 생성된 생성물이 있다. 재조합 생성 절차에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 몇가지 경우 숙주 매개의 진행 결과로서 변형된 메티오닌 잔기를 처음에 포함할 수 있다.
METH1 및 METH2 폴리펩티드 및 단편
본 발명은 수탁된 cDNA에 의해 암호된 아미노산 서열 또는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가진 분리된 METH1 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드의 일부를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 수탁된 cDNA가 암호하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가진 분리된 METH2 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 일부를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합, 즉 펩티드 이소스테어에 의해 서로 결합된 아미노산으로 구성될 수 있고 20개의 유전자 암호 아미노산 이외에 다른 아미노산을 포함할 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 천연 과정, 예컨대 해독후 프로세싱이나, 또는 당해 기술 분야에 공지된화학적 변형 기법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 기본 서적과 보다 상세하게는 전공 연구서 뿐만 아니라 다량의 연구지에 상세하게 개시되어 있다. 변형은 펩티드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 말단이나 카르복시 말단을 비롯한 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 중의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 또한, 당연한 것이지만, 소정의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 중의 여러 부위에 동일한 정도 또는 상이한 정도로 동일한 유형의 변형이 제공될 수도 있다. 또, 소정의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 다양한 유형의 변형을 포함할 수도 있다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 예컨대 유비퀴틴화의 결과로서 분지화될 수 있으며, 분지와 함께 또는 분지 없이 고리형이 될 수도 있다. 고리형, 분지형 및 분지 고리형의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 해독후 자연적 과정으로부터 얻어지거나 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 변형으로는, 아세틸화, 아실화, ADP 리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 부의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마 카르복실화, 글리코실화, GPI 고착 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백분해적 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 대한 전이 RNA 매개의 아미노산 첨가(예컨대 아르기닐화) 및 유비퀴틴화가 있다.[예컨대, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E.Creighton, W.H. Freeman and Company, New York(1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12(1983); Seifteret al., Meth Enzymol 182:626-646(1990); Rattan et al.,Ann NY Acad Sci 663:48-62(1992)].
또한, METH1 및 METH2 폴리펩티드의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에 유의적인 영향을 미침이 없이 변화될 수 있다는 것은 자명한 것이다. 서열의 이러한 차이를 포함시키고자 한다면, 활성을 결정하는 단백질 상의 절대적 부위가 있음을 주의해야 한다.
본 발명자들은 METH1 및 METH2가 시험관내 및 생체내에서 맥관형성을 억제한다는 것을 확인하였다. METH1 및 METH2는 각각 메탈로프로테아제 도메인, 디스인테그린 도메인 및 TSP 유사 도메인을 포함한다. 메탈로프로테아제 도메인은 촉매에 의해 활성화될 수 있다. 디스인테그린 도메인은 인테그린과 상호작용하여 맥관형성을 억제하는 역할을 한다. 그 이유는 인테그린이 증식 및 이동 시그널의 매개에 필수 역할을 하기 때문이다. 또한, 본 발명자들은 METH1 및 METH2의 TSP 유사 도메인 유래의 펩티드가 시험관내 및 생체내 맥관형성을 억제한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 하기 기재되는 단백질 부분과 같은 METH1 단백질의 영역을 포함하거나 또는 실질상 METH1 폴리펩티드 활성을 나타내는 METH1 폴리펩티드의 변형체; 및 하기 기재되는 단백질 부분과 같은 METH2 단백질의 영역을 포함하거나 또는 실질상 METH2 폴리펩티드 활성을 나타내는 METH2 폴리펩티드의 변형체를 포함한다. 이러한 돌연변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 형별 치환을 포함한다. 전술한 바와 같이, 표현형적으로 침묵성인 아미노산 변화에 대해서는 문헌[Bowie,J.U.,et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,"Science 247:1306-1310(1990)]을 참조할 수 있다.
따라서, 수탁된 cDNA가 암호하거나 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 기재된 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 1 이상의 아미노산 잔기가 보전적 아미노산 잔기 또는 비보전적 아미노산 잔기(바람직하게는 보전적 아미노산 잔기)로 치환되고, 이러한 치환된 아미노산 잔기가 그 유전자 코드에 의해 암호되거나 암호되지 않는 것이거나, (ii) 1 이상의 아미노산 잔기가 치환체기를 포함하는 것이거나, (iii) 성숙 폴리펩티드가 다른 화합물, 예컨대 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합된 것이거나, (iv) 부가 아미노산이 성숙 폴리펩티드, 예컨대 IgG Fc 융합 영역 펩티드 또는 프로단백질 서열이나 성숙 폴리펩티드의 정제에 이용되는 서열이나 리더 서열 또는 분비 서열에 융합된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 본 명세서에 개시된 교시로부터 당업자라면 충분히 얻을 수 있는 범위내의 것으로 추정된다.
특히 바람직한 것은, 하전 아미노산이 다른 하전 아미노산 및 중성이나 음하전 아미노산으로 치환된 것이다. 중성이나 음하전 아미노산으로의 치환은 단백질의 양하전을 감소시켜 METH1 또는 METH2 단백질의 특성을 개선시킬 수 있다. 응집 방지는 매우 바람직한 처리이다. 단백질의 응집은 활성 상실 뿐 아니라 면역원성을 유발할 수 있어 약제 제조시에 문제를 일으킬 수 있다[Pinckardet al., Clin.Exp.Immunol. 2:331-340(1967); Robbinset al., Diabetes 36:838-845(1987); Clelandet al., Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993)].
전술한 바와 같이, 변화는 단백질의 폴딩이나 활성에 유의적인 영향을 미치지 않는 보전적 아미노산 치환과 같은 작은 성질 변화인 것이 바람직하다(표 3 참조).
보전적 아미노산 치환
방향족 페닐알라닌트립토판티로신
소수성 로이신이소로이신발린
극성 글루타민아스파라긴
염기성 아르기닌리신히스티딘
산성 아스파르트산글루탐산
소형 알라닌세린트레오닌메티오닌글리신
물론, 당업자가 실시할 수 있는 아미노산 치환의 수는 전술한 것을 비롯한 많은 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 소정의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 대한 아미노산 치환의 수는 50, 40, 30, 20, 10, 5 또는 3 보다 많지 않아야 한다.
본 발명의 METH1 및 METH2 단백질에 있어서 기능에 필수적인 역할을 하는 아미노산은 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 부위 지시성 돌연변이유발 또는 알라닌 주사 돌연변이유발 등의 방법으로 동정할 수 있다[Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085(1989)]. 알라닌 주사 돌연변이유발법은 분자내 각 잔기마다 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그 결과 얻어지는 돌연변이체 분자를, 그 다음시험관내 또는 생체내 맥관형성 억제와 같은 생물학적 활성에 대하여 시험한다. 또한, 맥관형성 억제에 중요한 부위는 결정학, 핵자기공명 또는 광친화성 표지법과 같은 구조 분석에 의해 측정될 수 있다[Smith et al., J.Mol.Biol. 224:899-904(1992) and de Vos et al., Science 255:306-312(1992)].
본 발명의 폴리펩티드는 분리 형태로 제공되는 것이 바람직하다. "분리된 폴리펩티드"란 천연 환경에서 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 즉, 재조합 숙주 세포내에 포함 및/또는 생성된 폴리펩티드는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주된다. 또한, "분리된 폴리펩티드"란 재조합 숙주 세포 또는 천연원에서 부분적 또는 실질상 정제된 폴리펩티드를 의미한다. 예컨대, METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 재조합 생성체는 문헌[Smith and Johnson,Gene 67:31-40(1988)]에 개시된 1단계 방법에 의해 실질적으로 정제될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드로는 리더를 포함하는 수탁된 cDNA가 암호하는 METH1 폴리펩티드; 리더 없이 수탁된 cDNA에 의해 암호된 성숙 METH1 폴리펩티드(즉, 성숙 단백질); 서열 번호 2의 아미노산 약 1 내지 약 950을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 약 2 내지 약 950을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 약 29 내지 약 950을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 약 30 내지 약 950을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 235 내지 459인 METH1의 메탈로프로테아제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 460 내지 544인 METH1의 디스인테그린 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 545 내지 598인 METH1의 제1 TSP 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드;서열 번호 2의 아미노산 841 내지 894인 METH1의 제2 TSP 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 895 내지 934인 METH1의 제3 TSP 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 536 내지 613을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 549 내지 563을 포함하는 폴리펩티드; 리더를 포함하는 수탁된 cDNA가 암호하는 METH2 폴리펩티드; 리더 없이 수탁된 cDNA가 암호하는 성숙 METH2 폴리펩티드(즉, 성숙 단백질); 서열 번호 4의 아미노산 약 1 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 약 2 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 약 24 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 약 112 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 214 내지 439인 METH2의 메탈로프로테아제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 440 내지 529인 METH2의 디스인테그린 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 530 내지 583인 METH2의 제1 TSP 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 837 내지 890인 METH2의 제2 TSP 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 280 내지 606을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 529 내지 548을 포함하는 폴리펩티드; 뿐만 아니라 전술한 폴리펩티드와의 동일성이 95% 이상, 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인 폴리펩티드를 포함하며, 또한 아미노산이 30개 이상, 보다 바람직하게는 약 50개 이상인 상기 폴리펩티드의 단편을 포함하기도 한다.
"동일성"이 예컨대 95% 이상인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드란, 이 폴리펩티드의 아미노산 서열이 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 대조 아미노산 중 각 100 아미노산 당 최대 5개의 아미노산 변화를 포함하는 것을 제외하고는 대조 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 환언하면, 대조 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성이 있는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 얻기 위해서는, 대조 서열내 아미노산 잔기의 최대 5%가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 대조 서열내 총 아미노산 잔기의 5% 이하에 해당하는 아미노산 수가 대조 서열에 삽입될 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 대조 서열의 변화는 대조 아미노산 서열의 아미노 말단이나 카르복시 말단에서 또는 말단 위치 사이의 임의의 위치에서, 대조 서열내 잔기 사이에 개별적으로 산재성으로 나타나거나 또는 대조 서열내 1 이상의 인접 군으로 나타날 수 있다.
실질상, 임의의 특정 폴리펩티드가 예컨대 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는 수탁된 cDNA 클론의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성이 있는지는, Bestfit 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, 미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹 제품)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 편리하게 측정할 수 있다. 특정 서열이 본 발명에 기재된 대조 서열과 예컨대 95% 동일성이 있는지를 측정하기 위하여 베스트피트 또는 기타 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 대조 아미노산 서열의 총 길이에 대하여 동일성 %가 계산되고 대조 서열내 아미노산 잔기 총 수의 최대 5% 정도의 상동성 갭이 허용되도록 매개변수가 설정되어야 한다.
글로벌 서열 정렬이라고도 일컬어지는 주체 서열과 시험 서열(본 발명의 서열)간의 최고의 총 정합을 측정할 수 있는 바람직한 방법은 문헌[Brutlag et al., Comp.Appl.Biosci.6:237-245(1990)]에 기재된 알고리듬에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정할 수 있다. 서열 정렬시, 주체 서열과 시험 서열은 둘다 아미노산 서열이다. 상기 글로벌 서열 정렬의 결과는 동일성%이다. 동일성%를 계산하는 FASTDB 아미노산 정렬에 사용되는 바람직한 매개변수로는 매트릭스 = PAMO, k-튜플 = 2, 부정합 패널티 = 1, 결합 패널티 = 20, 무작위 그룹 길이 = 0, 컷오프 스코어 = 1, 갭 패널티 = 5, 갭 사이즈 패널티 = 0.05, 윈도우 사이즈 = 500 또는 주체 아미노산 서열의 길이(보다 짧은 쪽)가 있다.
주체 서열이 내부 결실이 아닌 N 말단 결실 또는 C 말단 결실로 인하여 시험 서열보다 짧으면, 결과에 수작업에 의해 보정이 이루어져야 한다. 그 이유는 FASTDB 프로그램이 동일성%를 계산할 때 시험 서열의 N 말단 및 C 말단 절두를 계산해 넣고 있지 않기 때문이다. 시험 서열과 비교했을 때 주체 서열이 N 말단 또는 C 말단 절두형인 경우, 동일성%는 주체 서열의 N 및 C 말단에 있지만 정합/정렬성이 아닌 시험 서열의 잔기 수를 시험 서열의 총 잔기수의 비율%로서 계산하여 보정한다. 잔기가 정합/정렬성인지는 FASTDB 서열 정렬의 결과로 결정한다. 이 비율을, 특정 매개변수를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성%에서 감하여 최종의 동일성%를 얻는다. 이와 같이 보정된 결과가 본 발명의 목적에 사용되는 것이다. 시험 서열에는 정합/정렬되지 않고 주체 서열의 N 및 C 말단에 대한 잔기만이 단지 동일성% 결과를 수작업으로 조정하는 경우에만 계산에 이용된다. 즉, 주체 서열의 최외각 N 및 C 말단 잔기 외측에 있는 시험 잔기 위치만이 조정된다.
예를 들어, 90개 아미노산 주체 서열이 100개 잔기의 시험 서열과 정렬되어 동일성%를 측정하는 경우, 주체 서열의 N 말단은 결실된다. 따라서, FASTDB 정렬은 N 말단의 처음 10개 잔기에 대한 정합/정렬을 나타내지 못한다. 10개의 쌍을 이루지 못한 잔기는 서열의 10%를 차지하고(정합되지 않은 N 말단과 C 말단의 잔기 수/시험 서열내 잔기의 총수), 따라서 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성% 결과에서 10%를 감한다. 나머지 90개 잔기가 완벽하게 정합된다면 최종 동일성%는 90%일 것이다. 다른 실시예에서, 90개 잔기 시험 서열을 100개 잔기 시험 서열과 비교한다. 결실이 내부적이라면 시험 서열과 정합/정렬되지 않는 주체 서열의 N 말단이나 C 말단 상의 잔기는 없다. 이 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성%는 수작업으로 보정될 수 없다. 다시 말하면, 시험 서열과 정합/정렬되지 않는, FASTDB 정렬에서 나타나는 바와 같은 주체 서열의 N 및 C 말단 단부 외측에 있는 잔기 위치만이 수작업으로 보정가능하다. 본 발명의 목적을 위하여 기타 다른 수작업에 의한 보정이 이루어질 필요는 없다.
본 발명의 폴리펩티드는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용하는 분자체 겔 여과 컬럼이나 SDS-PAGE 겔에서 분자량 마커로서 유용하다.
또 다른 목적으로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프 보유 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 부분의 에피토프는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"란 전체 단백질이 면역원성일 때 항체 응답 반응을 유인하는 단백질의일부를 의미한다. 한편, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역은 "항원성 에피토프"라 부른다. 일반적으로, 단백질의 면역원성 에피토프의 수는 항원성 에피토프의 수보다 적다. 예컨대, 문헌[Geysemet al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1983)].
항원성 에피토프를 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드(항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 포함)의 선별과 관련하여, 단백질 서열의 일부와 유사한 비교적 짧은 합성 펩티드가 부분적으로 유사한 단백질과 반응하는 항혈청을 통상적으로 유인할 수 있다는 것은 당업계에 잘 알려진 사실이다. 예를 들어, 문헌[Sutcliffe, J.G.et al., "Antibodies that react with predetermined sites on proteins",Science 219:660-666(1983)]. 단백질 반응성 혈청을 유인할 수 있는 펩티드는 흔히 단백질의 1차 서열로 표시되고, 간단한 화학적 규칙 세트로 나타낼 수 있으며, 천연 단백질(즉, 면역원성 에피토프)의 면역우성 영역이나 아미노 말단이나 카르복실 말단에 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로널 항체를 비롯한 항체 유발에 유용하다. 예컨대, 문헌[Wilson et al., Cell 37:7667-778(1984), 777]을 참조할 수 있다.
본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 포함되는 아미노산 중 바람직하게는 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개, 가장 바람직하게는 최소한 약 15개 내지 약 30개를 포함하는 서열을포함한다.
본 발명의 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 종래의 모든 수단으로 제조할 수 있다. 문헌[Houghten, R.A., "General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids",Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:5131-5135(1985)]. "동시 다중 펩티드 합성(Simultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)" 공정은 미국 특허 제4,631,211호(Houghten et al.(1986)에 상세하게 설명되어 있다.
당업자에게는 자명하듯이, 본 발명의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 및 전술한 이것의 에피토프 보유 단편은 면역글로불린(IgG)의 불변부 중 일부와 결합하여 키메라 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이 융합 단백질은 정제 용이성과 생체내 반감기의 증가를 보여준다. 이에 대해서는, 예컨대 포유류 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄에 있는 불변부의 여러 도메인과 인체 CD4 폴리펩티드의 처음 2개의 도메인으로 이루어진 키메라 단백질에 의해 확인된 바 있다[EPA394,827; Trauneckeret al., Nature 331:84-86(1988)]. IgG 부분에 의해 이황화물 결합된 이량체 구조를 보유하는 융합 단백질은 단량체 METH1 또는 METH2 단백질이나 단백질 단편 단독물 이외의 다른 분자를 결합 및 중화시키는데 보다 효과적일 수 있다[Fountoulakis et al., J.Biochem., J.Biochem. 270:3958-3964(1995)].
METH1 및 METH2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 단편
본 명세서에서, "폴리뉴클레오티드 단편"이란 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재되거나 수탁된 클론에 포함된 핵산 서열을 가진 짧은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 짧은 뉴클레오티드 단편은 길이가 바람직하게는 약 15 nt 이상, 보다 바람직하게는 약 20 nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30 nt 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는, 약 40 nt 이상인 것이다. "길이가 20 nt 이상"인 단편은, 예컨대 서열 번호 1이나 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열이나 수탁된 클론에 포함된 cDNA 클론에 포함된 cDNA 서열 유래의 20개 또는 그 이상의 인접 염기를 포함하는 것이다. 이 뉴클레오티드 단편은 본 명세서에 기재된 바와 같이 진단 프로브 및 프라이머로서 유용하다. 물론, 보다 큰 단편(예, 50, 150, 500, 600, 2000 뉴클레오티드)도 바람직하다.
더욱이, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편의 대표적인 예로는, 뉴클레오티드 번호 약 1 내지 50, 51 내지 100, 101 내지 150, 151 내지 200, 201 내지 250, 251 내지 300, 301 내지 350, 351 내지 400, 401 내지 450, 451 내지 500, 501 내지 550, 551 내지 600, 651 내지 700, 701 내지 750, 751 내지 800, 800 내지 850, 851 내지 900, 901 내지 950, 951 내지 1000, 1001 내지 1050, 1051 내지 1100, 1101 내지 1150, 1151 내지 1200, 1201 내지 1250, 1251 내지 1300, 1301 내지 1350, 1351 내지 1400, 1401 내지 1450, 1451 내지 1500, 1501 내지 1550, 1551 내지 1600, 1601 내지 1650, 1651 내지 1700, 1701 내지 1750, 1751 내지 1800, 1801 내지 1850, 1851 내지 1900, 1901 내지 1950, 1951 내지 2000, 또는 2001 내지 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 말단이나 수탁된 클론에 포함된 cDNA의 말단까지의 서열을 가진 단편을 포함한다. 여기에서, "약"이란 어느 한 말단에서 또는 양말단에서 여러(5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개) 뉴클레오티드가 더 크거나 또는 더 작은 특정 범위를 의미한다. 바람직하게는, 이 단편은 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드를 암호하는 것이다. 보다 바람직하게는, 이 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "폴리펩티드 단편"이란 수탁된 클론내 포함된 cDNA에 의해 암호되거나 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 포함된 짧은 아미노산을 의미한다. 단백질 단편은 "자립성"이거나 또는 그 단편이 일정 부분이나 영역을 형성하고 있는, 가장 바람직하게는 단일 연속 영역으로서 형성되어 있는 보다 큰 폴리펩티드내에 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 단편의 대표적인 예로는, 예컨대 아미노산 번호 약 1 내지 20, 21 내지 40, 41 내지 60, 61 내지 80, 81 내지 100, 102 내지 120, 121 내지 140, 141 내지 160, 161 내지 180, 181 내지 200, 201 내지 220, 221 내지 240, 241 내지 260, 261 내지 280, 또는 281 내지 암호 영역이나 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 말단까지의 단편이 있다. 더욱이, 폴리펩티드 단편은 길이가 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개 또는 150개일 수 있다. 여기에서, "약"이란 용어는, 한정된 특정 범위와, 어느 한 말단이나 양 말단에 여러(5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개) 아미노산이 보다 많거나 보다 적은 범위를 포함한다.
바람직한 폴리펩티드 단편으로는, 성숙 형태 뿐만 아니라 분비형 METH1 또는 METH2 단백질을 포함한다. 또 다른 바람직한 폴리펩티드 단편으로는, 아미노 말단이나 카르복시 말단, 또는 양 말단으로부터 연속적인 일련의 결실 잔기를 보유하는성숙 형태 또는 분비형 METH1 또는 METH2 단백질을 포함한다. 예컨대, 1 내지 60개 범위 중 임의의 수의 아미노산이 분비형 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 성숙 형태의 아미노 말단으로부터 결실될 수 있다. 이와 마찬가지로, 1 내지 30개 범위 중 임의 수의 아미노산이 분비형 METH1 또는 METH2 단백질 또는 성숙 형태의 카르복시 말단으로부터 결실될 수 있다. 또한, 상기 아미노 말단 결실 및 카르복시 말단 결실의 임의의 조합이 바람직하다. 이와 마찬가지로, 이 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편을 암호하는 폴리뉴클레오티드 단편 역시 바람직하다.
구체적으로, METH1 폴리펩티드의 N 말단 결실체는 일반식 m-950으로 표시할 수 있다. 여기에서 m은 2 내지 949의 정수로서, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 잔기의 위치에 상응한다. 바람직하게는, 서열 번호 2에 제시된 본 발명의 METH1 폴리펩티드의 N 말단 결실체로는, 다음과 같은 잔기의 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. G-2~S-950; N-3~S-950; A-4~S-950; E-5~S-950; R-6~S-950; A-7~S-950; P-8~S-950; G-9~S-950; S-10~S-950; R-11~S-950; S-12~S-950; F-13~S-950; G-14~S-950; P-15~S-950; V-16~S-950; P-17~S-950; T-18~S-950; L-19~S-950; L-20~S-950; L-21~S-950; L-22~S-950; A-23~S-950; A-24~S-950; A-25~S-950; L-26~S-950; L-27~S-950; A-28~S-950; V-29~S-950; S-30~S-950; D-31~S-950; A-32~S-950; L-33~S-950; G-34~S-950; R-35~S-950; P-36~S-950; S-37~S-950; E-38~S-950; E-39~S-950; D-40~S-950; E-41~S-950; E-42~S-950; L-43~S-950; V-44~S-950; V-45~S-950; P-46~S-950; E-47~S-950; L-48~S-950; E-49~S-950; R-50~S-950; A-51~S-950; P-52~S-950; G-53~S-950; H-54~S-950; G-55~S-950; T-56~S-950;T-57~S-950; R-58~S-950; L-59~S-950; R-60~S-950; L-61~S-950; H-62~S-950; A-63~S-950; F-64~S-950; D-65~S-950; Q-66~S-950; Q-67~S-950; L-68~S-950; D-69~S-950; L-70~S-950; E-71~S-950; L-72~S-950; R-73~S-950; P-74~S-950; D-75~S-950; S-76~S-950; S-77~S-950; F-78~S-950; L-79~S-950; A-80~S-950; P-81~S-950; G-82~S-950; F-83~S-950; T-84~S-950; L-85~S-950; Q-86~S-950; N-87~S-950; V-88~S-950; G-89~S-950; R-90~S-950; K-91~S-950; S-92~S-950; G-93~S-950; S-94~S-950; E-95~S-950; T-96~S-950; P-97~S-950; L-98~S-950; P-99~S-950; E-100~S-950; T-101~S-950; D-102~S-950; L-103~S-950; A-104~S-950; H-105~S-950; C-106~S-950; F-107~S-950; Y-108~S-950; S-109~S-950; G-110~S-950; T-111~S-950; V-112~S-950; N-113~S-950; G-114~S-950; D-115~S-950; P-116~S-950; S-117~S-950; S-118~S-950; A-119~S-950; A-120~S-950; A-121~S-950; L-122~S-950; S-123~S-950; L-124~S-950; C-125~S-950; E-126~S-950; G-127~S-950; V-128~S-950; R-129~S-950; G-130~S-950; A-131~S-950; F-132~S-950; Y-133~S-950; L-134~S-950; L-135~S-950; G-136~S-950; E-137~S-950; A-138~S-950; Y-139~S-950; F-140~S-950; I-141~S-950; Q-142~S-950; P-143~S-950; L-144~S-950; P-145~S-950; A-146~S-950; A-147~S-950; S-148~S-950; E-149~S-950; R-150~S-950; L-151~S-950; A-152~S-950; T-153~S-950; A-154~S-950; A-155~S-950; P-156~S-950; G-157~S-950; E-158~S-950; K-159~S-950; P-160~S-950; P-161~S-950; A-162~S-950; P-163~S-950; L-164~S-950; Q-165~S-950; F-166~S-950; H-167~S-950; L-168~S-950; L-169~S-950; R-170~S-950; R-171~S-950; N-172~S-950; R-173~S-950; Q-174~S-950; G-175~S-950; D-176~S-950; V-177~S-950; G-178~S-950;G-179~S-950; T-180~S-950; C-181~S-950; G-182~S-950; V-183~S-950; V-184~S-950; D-185~S-950; D-186~S-950; E-187~S-950; P-188~S-950; R-189~S-950; P-190~S-950; T-191~S-950; G-192~S-950; K-193~S-950; A-194~S-950; E-195~S-950; T-196~S-950; E-197~S-950; D-198~S-950; E-199~S-950; D-200~S-950; E-201~S-950; G-202~S-950; T-203~S-950; E-204~S-950; G-205~S-950; E-206~S-950; D-207~S-950; E-208~S-950; G-209~S-950; P-210~S-950; Q-211~S-950; W-212~S-950; S-213~S-950; P-214~S-950; Q-215~S-950; D-216~S-950; P-217~S-950; A-218~S-950; L-219~S-950; Q-220~S-950; G-221~S-950; V-222~S-950; G-223~S-950; Q-224~S-950; P-225~S-950; T-226~S-950; G-227~S-950; T-228~S-950; G-229~S-950; S-230~S-950; I-231~S-950; R-232~S-950; K-233~S-950; K-234~S-950; R-235~S-950; F-236~S-950; V-237~S-950; S-238~S-950; S-239~S-950; H-240~S-950; R-241~S-950; Y-242~S-950; V-243~S-950; E-244~S-950; T-245~S-950; M-246~S-950; L-247~S-950; V-248~S-950; A-249~S-950; D-250~S-950; Q-251~S-950; S-252~S-950; M-253~S-950; A-254~S-950; E-255~S-950; F-256~S-950; H-257~S-950; G-258~S-950; S-259~S-950; G-260~S-950; L-261~S-950; K-262~S-950; H-263~S-950; Y-264~S-950; L-265~S-950; L-266~S-950; T-267~S-950; L-268~S-950; F-269~S-950; S-270~S-950; V-271~S-950; A-272~S-950; A-273~S-950; R-274~S-950; L-275~S-950; Y-276~S-950; K-277~S-950; H-278~S-950; P-279~S-950; S-280~S-950; I-281~S-950; R-282~S-950; N-283~S-950; S-284~S-950; V-285~S-950; S-286~S-950; L-287~S-950; V-288~S-950; V-289~S-950; V-290~S-950; K-291~S-950; I-292~S-950; L-293~S-950; V-294~S-950; I-295~S-950; H-296~S-950; D-297~S-950; E-298~S-950;Q-299~S-950; K-300~S-950; G-301~S-950; P-302~S-950; E-303~S-950; V-304~S-950; T-305~S-950; S-306~S-950; N-307~S-950; A-308~S-950; A-309~S-950; L-310~S-950; T-311~S-950; L-312~S-950; R-313~S-950; N-314~S-950; F-315~S-950; C-316~S-950; N-317~S-950; W-318~S-950; Q-319~S-950; K-320~S-950; Q-321~S-950; H-322~S-950; N-323~S-950; P-324~S-950; P-325~S-950; S-326~S-950; D-327~S-950; R-328~S-950; D-329~S-950; A-330~S-950; E-331~S-950; H-332~S-950; Y-333~S-950; D-334~S-950; T-335~S-950; A-336~S-950; I-337~S-950; L-338~S-950; F-339~S-950; T-340~S-950; R-341~S-950; Q-342~S-950; D-343~S-950; L-344~S-950; C-345~S-950; G-346~S-950; S-347~S-950; Q-348~S-950; T-349~S-950; C-350~S-950; D-351~S-950; T-352~S-950; L-353~S-950; G-354~S-950; M-355~S-950; A-356~S-950; D-357~S-950; V-358~S-950; G-359~S-950; T-360~S-950; V-361~S-950; C-362~S-950; D-363~S-950; P-364~S-950; S-365~S-950; R-366~S-950; S-367~S-950; C-368~S-950; S-369~S-950; V-370~S-950; I-371~S-950; E-372~S-950; D-373~S-950; D-374~S-950; G-375~S-950; L-376~S-950; Q-377~S-950; A-378~S-950; A-379~S-950; F-380~S-950; T-381~S-950; T-382~S-950; A-383~S-950; H-384~S-950; E-385~S-950; L-386~S-950; G-387~S-950; H-388~S-950; V-389~S-950; F-390~S-950; N-391~S-950; M-392~S-950; P-393~S-950; H-394~S-950; D-395~S-950; D-396~S-950; A-397~S-950; K-398~S-950; Q-399~S-950; C-400~S-950; A-401~S-950; S-402~S-950; L-403~S-950; N-404~S-950; G-405~S-950; V-406~S-950; N-407~S-950; Q-408~S-950; D-409~S-950; S-410~S-950; H-411~S-950; M-412~S-950; M-413~S-950; A-414~S-950; S-415~S-950; M-416~S-950; L-417~S-950; S-418~S-950;N-419~S-950; L-420~S-950; D-421~S-950; H-422~S-950; S-423~S-950; Q-424~S-950; P-425~S-950; W-426~S-950; S-427~S-950; P-428~S-950; C-429~S-950; S-430~S-950; A-431~S-950; Y-432~S-950; M-433~S-950; I-434~S-950; T-435~S-950; S-436~S-950; F-437~S-950; L-438~S-950; D-439~S-950; N-440~S-950; G-441~S-950; H-442~S-950; G-443~S-950; E-444~S-950; C-445~S-950; L-446~S-950; M-447~S-950; D-448~S-950; K-449~S-950; P-450~S-950; Q-451~S-950; N-452~S-950; P-453~S-950; I-454~S-950; Q-455~S-950; L-456~S-950; P-457~S-950; G-458~S-950; D-459~S-950; L-460~S-950; P-461~S-950; G-462~S-950; T-463~S-950; S-464~S-950; Y-465~S-950; D-466~S-950; A-467~S-950; N-468~S-950; R-469~S-950; Q-470~S-950; C-471~S-950; Q-472~S-950; 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K-935~S-950; K-936~S-950; P-937~S-950; K-938~S-950; H-939~S-950; F-940~S-950; l-941~S-950; D-942~S-950; F-943~S-950; C-944~S-950; T-945~S-950.
더욱이, METH1 폴리펩티드의 C 말단 결실체는 일반식 1-n으로 표시할 수 있다. 여기에서 n은 2 내지 950의 정수로서, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 잔기의 위치에 상응한다. 바람직하게는, 서열 번호 2에 제시된 본 발명의 METH1 폴리펩티드의 C 말단 결실체로는, 다음과 같은 잔기의 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. M-l~C-949; M-l~E-948; M-l~A-947; M-l~M-946; M-l~T-945; M-l~C-944; M-1~F-943; M-l~D-942; M-l~I-941; M-l~F-940; M-l~H-939; M-l~K-938; M-l~P-937; M-l~K-936; M-l~K-935; M-l~L-934; M-l~P-933; M-l~D-932; M-l~C-931; M-l~S-930; M-l~E-.929; M-l~H-928; M-l~S-927; M-l~L-926; M-l~V-925; M-1~G-924; M-l~G-923; M-l~D-922; M-l~H-921; M-l~S-920; M-l~L-919; M-l~C-918; M-l~K-9I7; M-l~L-916; M-l~S-915; M-l~R-914; M-l~K-913; M-l~K-912; M-l~Y-911; M-l~G-910; M-l~K-909; M-l~G-908; M-l~C-907; M-l~T.906; M-l~K-905; M-l~S-904; M-l~C-903; M-l~S-902; M-l~S-901; M-l~W-900; M-l~E-899; M-l~G-898; M-l~L-897;M-l~Q-896; M-l~W-895; M-l~Q-894; M-l~P-893; M-l~C-892; M-l~P-89I; M-l~H-890; M-l~D-889; M-l~A-888; M-l~C-887; M-l~P-886; M-l~R-885; M-l~T-884; M-l~S-883; M-l~A-882; M-l~P-881; M-l~K-880; M-l~V-879; M-l~E-878; M-l~K-877; M-l~A-876; M-l~C-875; M-l~E-874; M-l~S-873; M-l~A-872; M-l~P-871; M-l~Q-870; M-l~G-869; M-l~N-868; M-l~I-867; M-l~D-866; M-l~R-865; M-l~C-864; M-l~E-863; M-l~V-862; M-l~L-861; M-l~R-860; M-l~R-859; M-l~Q-858; M-l~W-857; M-l~G-856; M-l~L-855; M-l~E-854; M-l~C-853; M-l~S-852; M-l~K-851; M-l~S-850; M-l~C-849; M-l~E-848; M-l~G-847; M-l~W-846; M-l~E-845; M-l~E-844; M-l~I-843; M-l~V-842; M-l~W-841; M-l~A-840; M-l~S-839; M-l~F-838; M-l~T-837; M-l~P-836; M-l~I-835; M-l~A-834; M-l~N-833; M-l~F-832; M-l~S-831; M-l~E-830; M-l~K-829; M-l~K-828; M-l~K-827; M-l~K-826; M-l~V-825; M-l~F-824; M-l~Y-823; M-l~T-822; M-l~Y-821; M-l~K-820; M-l~I-819; M-l~K-818; M-l~P-817; M-l~R-8I6; M-l~L-815; M-l~A-8l4; M-l~N-813; M-l~G-812; M-1~V-811; M-l~T-810; M-l~L-809; M-l~V-808; M-l~Q-807; M-l~I-806; M-l~T-805; M-l~L-804; M-l~P-803; M-l~E-802; M-l~K-801; M-l~L-800; M-l~P-799; M-l~S-798; M-l~F-797; M-l~S-796; M-l~R-795; M-l~I-794; M-l~R-793; M-l~E-792; M-l~L-791; M-l~A-790; M-l~A-789; M-l~S-788; M-l~S-787; M-l~G-786; M-l~S-785; M-l~Y-784; M-l~R-783; M-l~L-782; M-l~V-781; M-l~V-780; M-l~G-779; M-l~K-778; M-l~Y-777; M-l~M-776; M-l~I-775; M-l~D-774; M-l~Q-773; M-l~E-772; M-l~L-771; NI-l~T-770; M-l~S-.769; M-l~L-768; M-l~T-767; M-l~Y-766; M-l~D-765; M-l~G-764; M-l~N-763; M-l~L-762; M-l~I-761; M-l~Y-760; M-l~T-759; M-l~G-758; M-l~D-757; M-l~A-756; M-l~A-755; M-l~K-754; M-l~I-753; M-l~A-752; M-l~L-75l; M-l~F-750; M-l~S-749; M-l~G-748; M-l~N-747; M-l~N-746; M-l~R-745; M-l~S-744; M-l~G-743; M-l~R-742; M-l~Q-741; M-l~N-740; M-l~R-739; M-l~Q-738; M-l~K-737; M-l~V-736; M-l~E-735; M-l~I-734; M-l~N-733; M-l~T-732; M-l~A-731; M-l~G-730; M-l~T-729; M-l~P-728; M-l~I-727; M-l~T-726; M-l~I-725; M-l~I-724; M-l~D-723; M-l~H-722; M-l~Y-721; M-l~G-720; M-l~P-719; M-l~K-718; N1-l~A-717; M-l~S-716; M-l~T-715; M-l~V-714; M-l~S-7l3; M-l~G-7l2; M-l~S-7I1; M-l~I-7l0; M-l~K-709; M-l~K-708; M-l~C-707; M-l~T-706; M-l~S-705; M-l~G-704; M-l~N-703; M-l~G-702; M-l~G-701; M-l~C-700; M-l~V-699; M-l~G-698; M-l~C-697; M-l~K-696; M-l~D-695; M-l~F-694; M-l~K-693; M-l~K-692; N4-l~K-691; M-l~S-690; M-l~D-689; M-l~I-688; M-l~l-687; M-l~R-686; M-l~D-685; M-l~C-684; M-l~G-683; M-l~A-682; M-l~K-681; M-l~V-680; M-l~C-679; M-l~Q-678; M-l~G-677; M-l~Q-676; M-l~V-675; M-l~C-674; M-l~V-673; M-l~S-672; M-l~T-671; M-l~S-670; M-l~D-669; M-1~P-668; M-l~S-667; M-l~C-666; M-l~P-665; M-l~T-664; M-l~G-663; M-1~D-662; M-l~V-661; M-l~V-660; M-l~K-659; M-l~P-658; M-l~Q-657; M-l~L-656; M-l~V-655; M-l~F-654; M-l~F-653; M-l~Y-652; M-l~G-651; M-l~I-650; M-l~G-649; M-l~K-648; M-l~A-647; M-l~Q-646; M-l~C-645; M-l~l-644; M-l~L-643; M-l~K-642; M-l~C-641; M-l~R-640; M-l~D-639; M-l~K-638; M-l~P-637; M-l~S-636; M-l~V-635; M-l~G-634; M-l~A-633; M-l~Y-632; M-l~K-631; M-l~P-630; M-l~I-629; M-l~W-628; M-l~E-627; M-l~V-626; M-l~A-625; M-l~P-624; M-l~G-623; M-l~S-622; M-l~G-621; M-l~F-620; M-l~S-619; M-l~A-618;M-1~K-617; M-1~S-616; M-l~F-615; M-l~E-614; M-l~N-613; M-l~H-612; M-l~A-611; M-l~E-610; M-l~C-609; M-l~Q-608; M-l~E-607; M-l~E-606; M-l~R-605; M-l~F-604; M-l~T-603; M-l~K-602; M-l~G-60l; M-l~N-600; M-l~N-599; M-l~D-598; M-l~P-597; M-l~C-596; M-l~D-595; M-l~E-594; M-l~L-593; M-l~N-592; M-l~C-591; M-l~S-590; M-l~R-589; M-l~Y-588; M-l~R-587; M-1~V-586; M-l~R-585; M-l~K-584; M-l~G-583; M-l~E-582; M-l~C-581; M-l~Y-580; M-l~K-579; M-l~G-578; M-l~G-577; M-l~N-576; M-l~K-575; M-l~P-574; M-l~V-573; M-l~P-572; M-l~N-571; M-l~D-570; M-l~C-569; M-l~E-568; M-l~R-567; M-l~M-566; M-l~T-565; M-l~Y-564; M-l~Q-563; M-l~V-562; M-l~G-561; M-l~G-560; M-l~G-559; M-l~C-558; M-l~T-557; M-l~R-556; M-l~S-555; M-l~C-554; M-l~D-553; M-l~G-552; M-l~W-551; M-l~P-550; M-l~G-549; M-l~W-548; M-l~M-547; M-l~G-546; M-l~W-545; M-l~S-544; M-l~G-543; M-l~H-542; M-l~F-541; M-l~P-540; M-l~T-539; M-l~D-538; M-l~F-537; M-l~H-536; M-l~K-535; M-l~R-534; M-l~D-533; M-l~T-532; M-l~K-531; M-l~N-530; M-l~V-529; M-l~C-528; M-l~K-527; M-l~G-526; M-l~N-525; M-l~I-524; M-l~C-523; M-l~W-522; M-l~K-521; M-l~G-520; M-l~E-519; M-l~G-518; M-l~C-517; M-l~S-516; M-l~T-515; M-l~G-514; M-l~D-513; M-l~A-512; M-l~W-511; M-l~P-510; M-l~F-509; M-l~H-508; M-l~K-507; M-l~T-506; M-l~Q-505; M-l~C-504; M-l~V-503; M-l~L-502; M-l~V-501; M-l~G-500; M-l~G-499; M-l~S-498; M-l~T-497; M-l~G-496; M-l~T-495; M-l~C-494; M-l~W-493; M-l~L-492; M-l~T-491; M-l~S-490; M-l~C-489; M-l~T-488; M-l~S-487; M-1~A-486; M-l~A-485; M-l~D-484; M-l~P-483; M-l~C-482; M-l~H-481; M-l~K-480; M-l~S-479; M-l~D-478;M-l~E-477; M-l~G-476; M-l~F-475; M-l~T-474; M-1~F-473; M-l~Q-472; M-l~C-471; M-l~Q-470; M-l~R-469; M-l~N-468; M-l~A-467; M-l~D-466; M-l~Y-465; M-l~S-464; M-l~T-463; M-l~G-462; M-l~P-461; M-l~L-460; M-l~D-459; M-l~G-458; M-1~P-457; M-l~L-456; M-l~Q-455; M-l~I-454; M-l~P-453; M-l~N-452; M-l~Q-451; M-l~P-450; M-l~K-449; M-l~D-448; M-l~M-447; M-l~L-446; M-l~C-445; M-l~E-444; M-l~G-443; M-l~H-442; M-l~G-441; M-l~N-440; M-l~D-439; M-l~L-438; M-l~F-437; M-l~S-436; M-l~T-435; M-l~I-434; M-l~M-433; M-l~Y-432; M-l~A-43l; M-l~S-430; M-l~C-429; M-l~P-428; M-l~S-427; M-l~W-426; M-l~P-425; M-l~Q-424; M-l~S-423; M-l~H-422; M-l~D-421; M-l~L-420; M-l~N-419; M-l~S-418; M-l~L-417; M-l~M-416; M-l~S-415; M-l~A-4l4; M-l~M-413; M-l~M-412; M-l~H-411; M-l~S-410; M-l~D-409; M-l~Q-408; M-l~N-407; M-l~V-406; M-l~G-405; M-l~N-404; M-l~L-403; M-l~S-402; M-l~A-401; M-l~C-400; M-l~Q-399; M-l~K-398; M-l~A-397; M-l~D-396; M-l~D-395; M-l~H-394; M-l~P-393; M-l~M-392; M-l~N-391; M-l~F-390; M-l~V-389; M-l~H-388; M-l~G-387; M-l~L-386; M-l~E-385; M-l~H-384; M-l~A-383; M-l~T-382; M-l~T-381; M-l~F-380; M-l~A-379; M-l~A-378; M-l~Q-377; M-l~L-376; M-l~G-375; M-l~D-374; M-l~D-373; M-l~E-372; M-l~l-371; M-l~V-370; M-l~S-369; M-l~C-368; M-l~S-367; M-l~R-366; M-l~S-365; M-l~P-364; M-l~D-363; M-l~C-362; M-l~V-36I; M-l~T-360; M-l~G-359; M-l~V-358; M-l~D-357; M-l~A-356; M-l~M-355; M-l~G-354; M-l~L-353; M-l~T-352; M-l~D-351; M-l~C-350; M-l~T-349; M-l~Q-348; M-l~S-347; M-l~G-346; M-l~C-345; M-l~L-344; M-l~D-343; M-l~Q-342; M-l~R-341; M-l~T-340; M-l~F-339; M-l~L-338;M-l~I-337; M-l~A-336; M-l~T-335; M-l~D-334; M-l~Y-333; M-l~H-332; M-l~E-331; M-l~A-330; M-l~D-329; M-l~R-328; M-l~D-327; M-l~S-326; M-l~P-325; M-l~P-324; M-l~N-323; M-l~H-322; M-l~Q-321; M-l~K-320; M-l~Q-319; M-l~W-318; M-l~N-317; M-l~C-316; M-l~F-315; M-l~N-314; M-l~R-313; M-l~L-3I2; M-1~T-311; M-l~L-310; M-l~A-309; M-l~A-308; M-l~N-307; M-l~S-306; M-l~T-305; M-l~V-304; M-l~E-303; M-l~P-302; M-l~G-301; M-l~K-300; M-l~Q-299; M-l~E-298; M-l~D-297; M-l~H-296; M-l~I-295; M-l~V-294; M-l~L-293; M-l~I-292; M-l~K-291; M-l~V-290; M-l~V-289; M-l~V-288; M-l~L-287; M-l~S-286; M-l~V-285; M-l~S-284; M-l~N-283; M-l~R-282; M-l~I-281; M-l~S-280; M-l~P-279; M-l~H-278; M-l~K-277; M-l~Y-276; M-l~L-275; M-l~R-274; M-l~A-273; M-l~A-272; M-l~V-271; M-l~S-270; M-l~F-269; M-l~L-268; M-l~T-267; M-l~L-266; M-l~L-265; M-l~Y-264; M-l~H-263; M-l~K-262; M-l~L-261; M-1~G-260; M-l~S-259; M-l~G-258; M-l~H-257; M-l~F-256; M-l~E-255; M-l~A-254; M-l~M-253; M-l~S-252; M-l~Q-251; M-l~D-250; M-l~A-249; M-l~V-248; M-l~L-247; M-l~M-246; M-l~T-245; M-l~E-244; M-l~V-243; M-l~Y-242; M-l~R-241; M-l~H-240; M-l~S-239; M-l~S-238; M-l~V-237; M-l~F-236; M-l~R-235; M-l~K-234; M-l~K-233; M-l~R-232; M-l~I-231; M-l~S-230; M-l~G-229; M-l~T-228; M-1~G-227; M-l~T-226; M-l~P-225; M-l~Q-224; M-l~G-223; M-l~V-222; M-l~G-221; M-l~Q-220; M-l~L-2l9; M-l~A-218; M-l~P-217; M-l~D-2l6; M-l~Q-2l5; M-l~P-214; M-l~S-213; M-l~W-212; M-l~Q-211; M-l~P-210; M-l~G-209; M-l~E-208; N1-I~D-207; M-l~E-206; M-l~G-205; M-l~E-204; M-1~T-203; M-l~G-202; M-l~E-201; M-l~D-200; M-l~E-199; M-l~D-198;M-l~E-l97; M-l~T-196; M-l~E-195; M-l~A-194; M-l~K-l93; M-l~G-192; M-l~T-191; M-l~P-l90; M-l~R-189; M-l~P-188; M-l~E-187; M-l~D-186; M-l~D-185; M-l~V-184; M-l~V-183; M-1~G-182; M-l~C-181; M-l~T-180; M-l~G-179; M-l~G-l78; M-l~V-177; M-l~D-176; M-l~G-175; M-l~Q-174; M-l~R-173; M-l~N-172; M-l~R-171; M-l~R-170; M-l~L-169; M-l~L-168; M-l~H-167; M-l~F-166; M-l~Q-165; M-l~L-164; M-l~P-163; M-l~A-162; M-l~P-16l; M-l~P-l60; M-l~K-159; M-l~E-158; M-l~G-157; M-l~P-156; M-l~A-155; M-l~A-154; M-l~T-153; M-l~A-152; M-l~L-151; M-l~R-150; M-l~E-149; M-l~S-148; N4-l~A-147; M-l~A-146; M-l~P-145; M-l~L-l44; M-I~P-143; M-l~Q-142; M-l~I-141; M-l~F-140; M-l~Y-139; M-l~A-l38; M-1~E-l37; M-l~G-136; M-l~L-135; M-l~L-134; M-l~Y-133; M-l~F-132; N4-l~A-131; M-l~G-130; M-l~R-129; M-l~V-128; M-l~G-127; M-l~E-l26; M-l~C-125; M-l~L-124; M-l~S-123; M-l~L-122; M-l~A-12l; M-l~A-120; M-l~A-119; M-l~S-l18; M-l~S-1I7; M-l~P-116; M-l~D-l15; M-l~G-114; M-l~N-1l3; M-l~V-112; M-l~T-111; M-l~G-110; M-l~S-109; M-l~Y-108; M-l~F-107; M-l~C-106; M-l~H-105; M-l~A-l04; M-l~L-103; M-l~D-102; M-l~T-10l; M-l~E-l00; M-l~P-99; M-l~L-98; M-l~P-97; M-l~T-96; M-l~E-95; M-l~S-94; M-l~G-93; M-l~S-92; M-l~K-91; M-l~R-90; M-l~G-89; M-l~V-88; M-l~N-87; M-l~Q-86; M-l~L-85; M-l~T-84; M-l~F-83; M-l~G-82; M-l~P-81; M-l~A-80; M-l~L-79; M-l~F-78; M-l~S-77; M-l~S-76; M-l~D-75; M-l~P-74; M-l~R-73; M-l~L-72; M-l~E-71; M-l~L-70; M-l~D-69; M-l~L-68; M-l~Q-67; M-l~Q-66; M-l~D-65; N1-l~F-64; M-l~A-63; M-l~H-62; M-l~L-61; N1-l~R-60; M-l~L-59; M-l~R-58; M-l~T-57; M-l~T-56; M-l~G-55; M-l~H-54; M-l~G-53; M-l~P-52; M-l~A-5l; M-l~R-50; M-l~E-49; M-l~L-48; M-l~E-47; M-l~P-46; M-l~V-45; M-l~V-44; M-l~L-43; M-l~E-42; M-l~E-41; M-l~D-40; M-l~E-39; M-l~E-38; M-l~S-37; M-l~P-36; M-l~R-35; M-l~G-34; M-l~L-33; M-l~A-32; M-l~D-31; M-l~S-30; M-l~V-29; M-l~A-28; M-l~L-27; M-l~L-26; M-l~A-25; M-l~A-24; M-l~A-23; M-l~L-22; M-l~L-21; M-l~L-20; M-l~L-19; M-l~T-18; M-l~P-I7; M-l~V-16; M-l~P-15; M-l~G-14; M-l~F-13; M-l~S-12; M-l~R-11; M-l~S-10; M-l~G-9; M-l~P-8; M-l~A-7. 예컨대, 전술한 N 말단 결실체 또는 C 말단 결실체 중 임의 서열은 결합하여 N 말단 및 C 말단 결실된 METH1 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
또한, METH2 폴리펩티드의 N 말단 결실체는 일반식 m-890으로 표시할 수 있다. 여기에서 m은 2 내지 889의 정수로서, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 잔기의 위치에 상응한다. 바람직하게는, 서열 번호 4에 제시된 본 발명의 METH2 폴리펩티드의 N 말단 결실체로는, 다음과 같은 잔기의 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 있다. F-2~L-890; P-3~L-890; A-4~L-890; P-5~L-890; A-6~L-890; A-7~L-890; P-8~L-890; R-9~L-890; W-10~L-890; L-ll~L-890; P-12~L-890; F-13~L-890; L-14~L-890; L-15~L-890; L-16~L-890; L-17~L-890; L-18~L-890; L-19~L-890; L-20~L-890; L-21~L-890; L-22~L-890; P-23~L-890; L-24~L-890; A-25~L-890; R-26~L-890; G-27~L-890; A-28~L-890; P-29~L-890; A-30~L-890; R-31~L-890; P-32~L-890; A-33~L-890; A-34~L-890; G-35~L-890; G-36~L-890; Q-37~L-890; A-38~L-890; S-39~L-890; E-40~L-890; L-41~L-890; V-42~L-890; V-43~L-890; P-44~L-890; T-45~L-890; R-46~L-890; L-47~L-890; P-48~L-890; G-49~L-890; S-50~L-890; A-51~L-890; G-52~L-890; E-53~L-890; L-54~L-890; A-55~L-890; L-56~L-890; H-57~L-890; L-58~L-890; S-59~L-890; A-60~L-890; F-61~L-890; G-62~L-890; K-63~L-890; G-64~L-890; F-65~L-890; V-66~L-890; L-67~L-890; R-68~L-890; L-69~L-890; A-70~L-890; P-7l~L-890; D-72~L-890; D-73~L-890; S-74~L-890; F-75~L-890; L-76~L-890; A-77~L-890; P-78~L-890; E-79~L-890; F-80~L-890; K-8l~L-890; I-82~L-890; E-83~L-890; R-84~L-890; L-85~L-890; G-86~L-890; G-87~L-890; S-88~L-890; G-89~L-890; R-90~L-890; A-91~L-890; T-92~L-890; G-93~L-890; G-94~L-890; E-95~L-890; R-96~L-890; G-97~L-890; L-98~L-890; R-99~L-890; G-l00~L-890; C-10l~L-890; F-102~L-890; F-103~L-890; S-104~L-890; G-105~L-890; T-106~L-890; V-l07~L-890; N-108~L-890; G-109~L-890; E-110~L-890; P-111~L-890; E-112~L-890; S-113~L-890; L-114~L-890; A-115~L-890; A-116~L-890; V-117~L-890; S-1l8~L-890; L-119~L-890; C-120~L-890; R-121~L-890; G-122~L-890; L-I23~L-890; S-124~L-890; G-125~L-890; S-l26~L-890; F-I27~L-890; L-l28~L-890; L-129~L-890; D-130~L-890; G-131~L-890; E-132~L-890; E-133~L-890; F-134~L-890; T-l35~L-890; I-136~L-890; Q-137~L-890; P-138~L-890; Q-139~L-890; G-140~L-890; A-l41~L-890; G-142~L-890; G-143~L-890; S-144~L-890; L-145~L-890; A-146~L-890; Q-147~L-890; P-148~L-890; H-149~L-890; R-150~L-890; L-l51~L-890; Q-152~L-890; R-153~L-890; W-l54~L-890; G-155~L-890; P-156~L-890; A-157~L-890; G-158~L-890; A-159~L-890; R-160~L-890; P-161~L-890; L-162~L-890; P-163~L-890; 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A-665~L-890; G-666~L-890; C-667~L-890; D-668~L-890; H-669~L-890; V-670~L-890; V-671~L-890; D-672~L-890; S-673~L-890; P-674~L-890; R-675~L-890; K-676~L-890; L-677~L-890; D-678~L-890; K-679~L-890; C-680~L-890; G-681~L-890; V-682~L-890; C-683~L-890; G-684~L-890; G-685~L-890; K-686~L-890; G-687~L-890; N-688~L-890; S-68g~L-890; C-690~L-890; R-69I~L-890; K-692~L-890; V-693~L-890; S-694~L-890; G-695~L-890; S-696~L-890; L-697~L-890; T-698~L-890; P-699~L-890; T-700~L-890; N-70l~L-890; Y-702~L-890; G-703~L-890; Y-704~L-890; N-705~L-890; D-706~L-890; I-707~L-890; V-708~L-890; T-709~L-890; I-710~L-890; P-71l~L-890; A-712~L-890; G-713~L-890; A-714~L-890; T-715~L-890; N-716~L-890; I-717~L-890; D-718~L-890; V-719~L-890; K-720~L-890; Q-721~L-890; R-722~L-890; S-723~L-890; H-724~L-890; P-725~L-890; G-726~L-890; V-727~L-890; Q-728~L-890; N-729~L-890; D-730~L-890; G-731~L-890; N-732~L-890; Y-733~L-890; L-734~L-890; A-735~L-890; L-736~L-890; K-737~L-890; T-738~L-890; A-739~L-890; D-740~L-890; G-741~L-890; Q-742~L-890; Y-743~L-890; L-744~L-890; L-745~L-890; N-746~L-890; G-747~L-890; N-748~L-890; L-749~L-890; A-750~L-890; l-751~L-890; S-752~L-890; A-753~L-890; I-754~L-890; E-755~L-890; Q-756~L-890; D-757~L-890; I-758~L-890; L-759~L-890; V-760~L-890; K-761~L-890; G-762~L-890; T-763~L-890; I-764~L-890; L-765~L-890; K-766~L-890; Y-767~L-890; S-768~L-890: G-769~L-890; S-770~L-890; I-771~L-890; A-772~L-890;T-773~L-890; L-774~L-890; E-775~L-890; R-776~L-890; L-777~L-890; Q-778~L-890; S-779~L-890; F-780~L-890; R-781~L-890; P-782~L-890; L-783~L-890; p-784~L-890; E-785~L-890; P-786~L-890; L-787~L-890; T-788~L-890; V-78g~L-890; Q-790~L-890; L-791~L-890; L-792~L-890; T-793~L-890; V-794~L-890; P-795~L-890; G-796~L-890; E-797~L-890; V-798~L-890; F-799~L-890; P-800~L-890; P-80l~L-890; K-802~L-890; V-803~L-890; K-804~L-890; Y-805~L-890; T-806~L-890; F-807~L-890; F-808~L-890; V-809~L-890; P-810~L-890; N-811~L-890; D-812~L-890; V-813~L-890; D-814~L-890; F-815~L-890; S-816~L-890; M-817~L-890; Q-818~L-890; S-819~L-890; S-820~L-890; K-821~L-890; E-822~L-890; R-823~L-890; A-824~L-890; T-825~L-890; T-826~L-890; N-827~L-890; I-828~L-890; I-829~L-890; Q-830~L-890; P-831~L-890; L-832~L-890; L-833~L-890; H-834~L-890; A-835~L-890; Q-836~L-890; W-837~L-890; V-838~L-890; L-839~L-890; G-840~L-890; D-841~L-890; W-842~L-890; S-843~L-890; E-844~L-890; C-845~L-890; S-846~L-890; S-847~L-890; T-848~L-890; C-849~L-890; G-850~L-890; A-851~L-890; G-852~L-890; W-853~L-890; Q-854~L-890; R-855~L-890; R-856~L-890; T-857~L-890; V-858~L-890; E-859~L-890; C-860~L-890; R-86l~L-890; D-862~L-890; P-863~L-890; S-864~L-890; G-865~L-890; Q-866~L-890; A-867~L-890; S-868~L-890; A-869~L-890; T-870~L-890; C-871~L-890; N-872~L-890; K-873~L-890; A-874~L-890; L-875~L-890; K-876~L-890; P-877~L-890; E-878~L-890; D-879~L-890; A-880~L-890; K-881~L-890; P-882~L-890; C-883~L-890; E-884~L-890; S-885~L-890.
더욱이, METH2 폴리펩티드의 C 말단 결실체는 일반식 1-n으로 표시할 수 있다. 여기에서 n은 2 내지 890의 정수로서, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 잔기의 위치에 상응한다. 바람직하게는, 서열 번호 4에 제시된 본 발명의 METH2 폴리펩티드의 C 말단 결실체로는, 다음과 같은 잔기의 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. M-l~P-889; M-l~C-888; M-l~L-887; M-l~Q-886; M-l~S-885; M-l~E-884; M-l~C-883; M-l~P-882; M-l~K-881; M-l~A-880; M-l~D-879; M-l~E-878; M-l~P-877; M-l~K-876; M-l~L-875; M-l~A-874; M-l~K-873; M-l~N-872; M-l~C-871: M-l~T-870; M-l~A-869; M-l~S-868; M-l~A-867; M-l~Q-866; M-l~G-865; M-l~S-864; M-l~P-863; M-l~D-862; M-l~R-861; M-l~C-860; M-l~E-859; M-l~V-858; M-l~T-857; M-l~R-856; M-l~R-855; M-l~Q-854; M-l~W-853; M-l~G-852; M-l~A-851; M-l~G-850; M-l~C-849; M-l~T-848; M-l~S-847; M-l~S-846; M-1~C-845; M-l~E-844; M-l~S-843; M-l~W-842; M-l~D-841; M-l~G-840; M-l~L-839; M-l~V-838; M-l~W-837; M-l~Q-836; M-l~A-835; M-l~H-834; M-l~L-833; M-l~L-832; M-l~P-831; M-l~Q-830; M-l~I-829; M-l~I-828; M-l~N-827; M-l~T-826; M-l~T-825; M-l~A-824; M-l~R-823; M-l~E-822; M-l~K-821; M-l~S-820; M-l~S-819; M-l~Q-818; M-l~M-817; M-l~S-816; M-l~F-815; M-l~D-814; M-l~V-813; M-l~D-812; M-l~N-81l; M-l~P-810; M-l~V-809; M-1~F-808; M-l~F-807; M-l~T-806; M-l~Y-805; M-l~K-804; M-l~V-803; M-l~K-802; M-l~P-801; M-l~P-800; M-l~F-799; M-l~V-798; M-l~E-797; M-l~G-796; M-l~P-795; M-l~V-794; M-l~T-793; M-l~L-792; M-l~L-791; M-l~Q-790; M-l~V-789; M-l~T-788; M-l~L-787; M-l~P-786; M-l~E-785; M-1~P-784; M-l~L-783; M-l~P-782; M-l~R-781; M-l~F-780; M-l~S-779; M-l~Q-778; M-l~L-777; M-l~R-776; M-l~E-775; M-l~L-774; M-l~T-773; M-l~A-772; M-l~I-771; M-l~S-770; M-l~G-769; M-l~S-768; M-l~Y-767; M-1~K-766; M-l~L-765; M-l~I-764; M-l~T-763; M-l~G-762; M-l~K-761; M-l~V-760; M-l~L-759; M-l~I-758; M-l~D-757; M-l~Q-756; M-l~E-755; M-l~I-754; M-l~A-753; M-l~S-752; M-l~I-751; M-l~A-750; M-l~L-749; M-l~N-748; M-l~G-747; M-l~N-746; M-l~L-745; M-l~L-744; M-l~Y-743; M-l~Q-742; M-l~G-741; M-l~D-740; M-l~A-739; M-l~T-738; M-l~K-737; M-l~L-736; M-l~A-735; M-l~L-734; M-l~Y-733; M-l~N-732; M-l~G-731; M-l~D-730; M-l~N-729; M-l~Q-728; M-1~V-727; M-l~G-726; M-l~P-725; M-l~H-724; M-l~S-723; M-l~R-722; M-l~Q-72I; M-l~K-720; M-l~V-719; M-l~D-718; M-l~I-717; M-l~N-7l6; M-l~T-715; M-l~A-7l4; M-l~G-7l3; M-l~A-712; M-l~P-711; M-l~I-710; M-l~T-709; M-l~V-708; M-l~I-707; M-l~D-706; M-l~N-705; M-1~Y-704; M-l~G-703; M-l~Y-702; M-l~N-701; M-l~T-700; M-l~P-699; M-l~T-698; M-l~L-697; M-l~S-696; M-l~G-695; M-l~S-694; M-l~V-693; M-l~K-692; M-l~R-691; M-l~C-690; M-l~S-689; M-l~N-688; M-l~G-687; M-l~K-686; M-l~G-685; M-l~G-684; M-l~C-683; M-l~V-682; M-l~G-681; M-l~C-680; M-l~K-679; M-l~D-678; M-l~L-677; M-l~K-676; M-l~R-675; M-l~P-674; M-l~S-673; M-l~D-672; M-l~V-671; M-l~V-670; M-l~H-669; M-l~D-668; M-l~C-667; M-l~G-666; M-l~A-665; M-l~K-664; M-l~V-663; M-l~C-662; M-l~Q-661; M-l~G-660; M-l~R-659; M-l~V-658; M-l~C-657; M-l~I-656; M-l~A-655; M-l~L-654; M-l~T-653; M-l~E-652; M-l~P-65l; M-l~G-650; M-l~C-649; M-l~L-648; M-l~T-647; M-l~G-646; M-l~D-645; M-l~I-644; M-l~V-643; M-l~K-642; M-l~A-641; M-l~E-640; M-l~F-639; M-l~V-638; M-l~K-637; M-l~F-636; M-l~E-635; M-l~S-634; M-l~R-633; M-l~G-632; M-l~R-631; M-l~A-630; M-l~R-629; M-l~C-628; M-l~F-627; M-l~L-626; M-1~K-625; M-l~C-624; M-l~R-623; M-l~D-622; M-l~R-621; M-1~P-620; M-l~S-619; M-l~V-618; M-l~G-617; M-l~A-6l6; M-l~Y-615; M-l~K-614; M-l~P-613; M-l~V-612; M-l~W-611; M-l~Q-6l0; M-l~L-609; M-l~L-608; M-l~N-607; M-l~G-606; M-l~D-605; M-l~M-604; M-l~D-603; M-l~T-602; M-l~Y-601; M-l~N-600; M-l~Y-599; M-l~A-598; M-l~N-597; M-l~Y-596; M-l~K-595; M-l~E-594; M-l~C-593; M-l~Q-592; M-l~Q-59l; M-l~E-590; M-l~R-589; M-l~F-588; M-l~S-587; M-l~K-586; M-l~G-585; M-l~D-584; M-l~P-583; M-l~P-582; M-l~C-581; M-l~E-580; M-l~E-579; M-l~T-578; M-l~H-577; M-l~C-576; M-l~S-575; M-l~Q-574; M-l~Y-573; M-l~K-572; M-l~A-571; M-l~R-570; M-l~R-569; M-l~G-568; M-l~L-567; M-l~C-566; M-l~Y-565; M-l~R-564; M-l~G-563; M-l~G-562; M-l~N-561; M-l~Q-560; M-l~P-559; M-l~E-558; M-l~P-557; M-l~D-556; M-l~K-555; M-l~C-554; M-l~E-553; M-l~R-552; M-l~H-551; M-l~S-550; M-l~F-549; M-l~Q-548; M-l~V-547; M-l~G-546; M-1~G-545; M-l~G-544; M-l~C-543; M-l~T-542; M-l~R-541; M-l~S-540; M-l~C-539; M-l~E-538; M-l~G-537; M-l~V-536; M-l~P-535; M-l~G-534; M-l~W-533; M-l~P-532; M-l~A-531; M-l~W-530; M-l~G-529; M-l~G-528; M-l~D-527; M-l~V-526; 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또한, 본 발명은 아미노 말단과 카르복시 말단 양쪽에서 1 이상의 아미노산이 결실되어 있는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드는 일반적으로 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 잔기 m-n을 보유하는 것으로 나타낼 수 있는데, 여기에서 n 및 m은 전술한 바와 같은 정수이다.
또한, 구조적 도메인이나 기능적 도메인을 특징으로 하는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 단편이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시양태로는, α나선 및 α나선 형성 영역("α-영역"), β시트 및 β시트 형성 영역("β영역"), 턴 및 턴 형성 영역("턴 영역"), 코일 및 코일 형성 영역("코일 영역), 친수성 영역, 소수성 영역, α양친매성 영역, 가요성 영역, 표면 형성 영역, 기질 결합영역 및 고항원지수 영역을 포함하는 단편이 있다. 도면에 도시된 바와 같이, 이러한 바람직한 영역으로는 가니어-롭슨 α영역, β영역, 턴 영역 및 코일 영역, 쵸우-파스만 α영역, β영역 및 턴 영역, 카이트-두리틀 친수성 영역 및 소수성 영역, 아이젠버그 α 및 β 양친매성 영역, 카플러스-슐쯔 가요성 영역, 에미니 표면 형성 영역 및 제임슨 울프 고항원성 지수 영역이 있다. 보존적 도메인에 포함되어 있는 서열 번호 2에 기재된 폴리펩티드 단편은 특히 본 발명에 포함되는 것이다(도 10 및 도11과 표 1 및 2 참조). 더욱이, 이들 도메인을 암호하는 폴리뉴클레오티드 단편 역시 본 발명에 포함되는 것이다.
다른 바람직한 단편은 생물학적 활성 METH1 또는 METH2 단편이다. 생물학적 활성 단편은 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 활성과 반드시 동일한 것은 아니지만 유사한 활성을 나타내는 것이다. 단편의 생물학적 활성으로는 바람직한 활성의 증가 또는 바람직하지 않은 활성의 감소가 있다.
하지만, EST 서열과 같은 다수의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 데이터베이스를 통해 얻을 수 있고 구득 용이하다. 이러한 서열 중 몇가지는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3과 관련된 것으로서, 본 발명의 개시 이전에 구득 용이한 것일 수도 있다. 따라서, 이러한 관련 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 범위에서 특이적으로 배제되는 것이 바람직하다. 하지만, 모든 관련 서열을 기재하는 것은 매우 곤란한 일이다. 따라서, 바람직하게 본 발명에서 배제되는 것은 일반식 a-b로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드이다. 여기에서, a는 서열 번호 1의 1 내지 936 사이의 임의의 정수이고, b는 15 내지 950 사이의 정수로서, a와 b는 둘다 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 잔기의 위치에 상응하고, b는 a+14이거나 이보다 큰 수이다. 더욱이, 일반식 a-b로 표시되는 것으로, a는 서열 번호 1 내지 876 사이의 임의의 정수이고, b는 15 내지 890 사이의 정수이며, a와 b 둘다 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 잔기의 위치에 상응하는 것이며 b는 a+14이거나 이보다 큰 수를 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드도 본 발명에서 배제되는 것이다.
에피토프 및 항체
본 발명에서, "에피토프"란 동물, 특히 인간 중에서 항원 활성 또는 면역원성 활성을 나타내는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 에피토프를 포함하는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편, 뿐만 아니라 이 단편을 암호하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역은 "항원성 에피토프"라 정의한다. 이와 반대로, "면역원성 에피토프"란 항체 반응을 유인하는 단백질의 일부를 의미한다[예컨대, Geysenet al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81:3998-4002(1983)].
에피토프로서 작용하는 단편은 종래의 모든 수단에 의해 제조될 수 있다[미국 특허 제4,631,211호에 상세하게 기재된 문헌(예컨대, Houghten, R.A., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:5131-5135(1985))을 참조하라].
본 발명에서, 항원성 에피토프는 바람직하게는 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상, 가장 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개 아미노산의 서열을 포함한다. 항원성 에피토프는 이 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로널 항체를 비롯한항체를 유발시키는데 유용하다[예컨대 문헌 Wilson et al., Cell 37:767-778(1984); Sutcliffe, J.G. et al., Science 219:660-666(1983)].
이와 마찬가지로, 면역원성 에피토프는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 항체를 유도하는데 사용될 수 있다[예컨대, Sutcliffe et al., 상기 문헌 참조; Wilson et al., 상기 문헌 참조; Chow,M.et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:910-914; 및 Bittle, F.J.et al., J.Gen.Virol. 66:2347-2354(1985)]. 바람직한 면역원성 에피토프로는 분비형 단백질이 있다. 면역원성 에피토프는 담체 단백질, 예컨대 알부민과 함께 또는 길이가 충분히 길다면(약 25개 아미노산 이상) 담체 없이 동물 시스템으로 제공될 수 있다. 하지만, 8개 내지 10개 정도의 적은 아미노산을 포함하는 면역원성 에피토프도 변성 폴리펩티드내에 존재하는 아주 최소한의 선형 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 유발시키기에 충분한 것으로 확인되었다(예, 웨스턴 블롯팅시).
DNAstar 분석시, 서열 번호 2는 다음과 같은 아미노산에서 항원성을 나타내는 것으로 확인되었다. 2 내지 14, 32 내지 44, 47 내지 60, 66 내지 78, 87 내지 103, 109 내지 118, 146 내지 162, 168 내지 180, 183 내지 219, 223 내지 243, 275 내지 284, 296 내지 306, 314 내지 334, 341 내지 354, 357 내지 376, 392 내지 299, 401 내지 410, 418 내지 429, 438 내지 454, 456 내지 471, 474 내지 488, 510 내지 522, 524 내지 538, 550 내지 561, 565 내지 626, 630 내지 643, 659 내지 671, 679 내지 721, 734 내지 749, 784 내지 804, 813 내지 820, 825 내지 832, 845 내지 854, 860 내지 894, 899 내지 917, 919 내지 924 및 928 내지 939. 따라서, 이러한 영역은 METH1 cDNA가 암호하는 단백질에 대한 항체를 생성하는 에피토프로서 사용될 수 있다.
DNAstar 분석시, 서열 번호 4는 다음과 같은 아미노산에서 항원성을 나타내는 것으로 확인되었다. 26 내지 38, 45 내지 52, 69 내지 76, 80 내지 99, 105 내지 113, 129 내지 136, 138 내지 217, 254 내지 263, 273 내지 289, 294 내지 313, 321 내지 331, 339 내지 356, 371 내지 383, 417 내지 427, 438 내지 443, 459 내지 471, 479 내지 505, 507 내지 526, 535 내지 546, 550 내지 607, 615 내지 640, 648 내지 653, 660 내지 667, 669 내지 681, 683 내지 704, 717 내지 732, 737 내지 743, 775 내지 787, 797 내지 804, 811 내지 825, 840 내지 867 및 870 내지 884. 따라서, 이러한 영역은 METH2 cDNA가 암호하는 단백질에 대한 항체를 생성하는 에피토프로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "항체"(Ab) 또는 "모노클로널 항체"(Mab)란 용어는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 본래의 분자 뿐만 아니라 항체 단편(예컨대, Fab 및 F(ab')2단편)도 포함하는 것이다. Fab 및 F(ab')2단편은 혈행에서 보다 신속하게 제거되는 본래 항체의 Fc 단편이 결실된 것으로, 본래 항체 보다 비특이적 조직 결합성이 적다[Wahl et al., J.Nucl.Med. 24:316-325(1983)]. 따라서, 이들 단편과, FAB 또는 다른 면역글로불린 발현 라이브러리의 생성물 역시 바람직하다. 더욱이, 본 발명의 항체로는 키메라 항체, 단일쇄 항체 및 인체화된 항체가 있다.
융합 단백질
융합 단백질의 제조에는 모든 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 예를 들어, 제2 단백질에 융합시켰을 때 METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 항원성 태그로 사용될 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 대해 유발된 항체는 METH1 또는 METH2에 결합하고 있는 제2 단백질을 간접적으로 검출하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 분비형 단백질은 트래피킹 시그널을 기본으로 한 세포 위치를 표적으로 하기 때문에, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 다른 단백질과 융합되었을 때 표적 분자로서 사용될 수 있다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드와 융합될 수 있는 도메인의 예로는 이종 시그널 서열 뿐만 아니라 기타 다른 이종의 기능성 영역이 있다. 융합은 반드시 직접적인 융합일 필요는 없고 링커 서열을 통해 일어날 수도 있다.
더욱이, 융합 단백질에는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 특성을 향상시키도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 일정 영역의 부가 아미노산, 특히 하전된 아미노산을 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 N 말단에 첨가하면 숙주 세포로부터 정제하는 동안 또는 후속 취급 및 보관하는 동안 안정성과 지속성을 증가시킬 수 있다. 또, METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 펩티드 부를 첨가하면 정제를 용이하게 할 수 있다. 이러한 영역은 최종 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 제조 이전에 제거될 수 있다. 폴리펩티드의 취급을 용이하게 위한 펩티드 부의 부가 처리는 당해 기술 분야에 통상적인 기술이다.
더욱이, 단편 및 특히 에피토프를 비롯한 METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 면역글로불린(IgG)의 불변부의 일부와 결합시켜 키메라형 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 정제를 용이하게 하고 생체내 증가된 반감기를 나타낸다. 보고되어 있는 일예는 인체 CD4 폴리펩티드의 처음 2개의 도메인과 포유류 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변부 중 다양한 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다[EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84 내지 86(1988)]. 이황화물 결합된 이량체 구조(IgG에 의한)를 가진 융합 단백질 역시 단량체 분비형 단백질이나 단백질 단편 단독 보다 다른 분자를 결합 및 중화시키는데 보다 효과적일 수 있다[Fountoulakis et al., J.Biochem. 270:3958-3964(1995)].
이와 마찬가지로, EP-A-0 464 533(캐나다 대응 특허 2045869)은 다른 인간 단백질 또는 이것의 일부와 함께 면역글로불린 분자의 불변부 중 다양한 부분을 포함하는 융합 단백질에 대하여 개시하고 있다. 대부분의 경우, 융합 단백질 중의 Fc 부분은 치료 및 진단에 유리하여, 예컨대 개선된 약력학적 성질을 제공할 수 있다(EP-A 0232 262). 또는, 융합 단백질이 발현, 검출 및 정제된 후에는 Fc 부분을 삭제하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질이 면역화용 항원으로 사용된다면 Fc 부분은 치료 및 진단을 방해할 수 있다. 약물의 규명시에는, 예컨대 hIL-5와 같은 인간 단백질을, 고처리량의 선별 분석용으로서의 Fc 부와 융합시켜 hIL-5의 길항물질을 동정할 수 있다[D.Bennett et al., J.Molecular Recognition 8:52-58(1995); K.Johanson et al., J.Biol.Chem. 270:9459-9471(1995)].
더욱이, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 마커 서열, 예컨대 METH1 또는 METH2의 정제를 용이하게 하는 펩티드에 융합시킬 수 있다. 바람직한 실시양태로서, 마커 아미노산 서열로는 헥사 히스티딘 펩티드, 예컨대 pQE 벡터(미국 캘리포니아주 91311 채스워스 이튼 애비뉴 9259에 소재하는 퀴아겐, 인크 제품)에 제공된태그 등이 있으며, 그 대부분은 구득이 용이하다. 문헌[Gentz et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:821-824(1989)]에 기재된 바와 같이, 예컨대 헥사 히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그, "HA" 태그는 인플루엔자 헤마글루티딘 단백질 유래의 에피토프에 상응한다[Wilson et al., Cell 37:767(1984)].
따라서, 이러한 융합체들은 모두 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 조작될 수 있다.
METH1 또는 METH2의 생물학적 활성
METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 1 이상의 생물학적 활성을 시험하기 위한 분석법에 사용될 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드가 특정 분석법에서 활성을 나타낸다면 METH1 또는 METH2는 그 생물학적 활성과 관련된 질환과 관련이 있을 가능성이 있다. 따라서, METH1 또는 METH2는 관련 질환을 치료하는데 사용될 수 있을 것이다.
면역 활성
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 면역 세포의 증식, 분화 또는 이동(화학주성)을 활성화 또는 억제시켜 면역계의 결손이나 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 면역 세포는 조혈이라고 하는 과정을 통해 발생되고, 다능성 간(幹) 세포로부터 골수양 세포(혈소판, 적혈구 세포, 호중구 및 대식세포) 및 림프종 세포(B 림프구 및 T 림프구)를 생성한다. 이러한 면역 결손 또는 장애로 나타나는 병인은 유전성, 체세포성(예컨대, 암이나 일부 자가면역 질환), 후천성(예,화학요법 또는 독소) 또는 감염성일 수 있다. 더욱이, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 특정 면역계 질환이나 장애의 마커 또는 검출인자로서 사용될 수 있다.
METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조혈 세포의 결손이나 장애를 치료 또는 검측하는데 유용할 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 특정(또는 다수) 유형의 조혈 세포의 감소와 관련된 질환을 치료하기 위한 시도에서 다능성 간 세포를 비롯한 조혈 세포의 분화 및 증식을 증가시키는데 사용될 수 있다. 면역학적 결손 증후군의 예로는 혈액 단백질 장애(예, 무감마글로불린혈증, 저감마글로불린혈증), 모세혈관확장성 운동실조증, 일반적인 다양한 면역결핍증, 디죠지 증후군, HIV 감염, HTLB-BLV 감염, 백혈구 부착 결손 증후군, 림프구감소증, 식세포 살균성 이상, 중증 복합 면역결핍증(SCID), 비스코트-울드리치 장애, 빈혈증, 혈소판감소증 또는 혈색소뇨증이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
또한, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 지혈성(출혈 정지) 또는 혈전용해 활성(응혈 형성)을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 지혈 또는 혈전용해 활성을 증가시키면, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 혈액 응고 장애(예, 무섬유소원혈증, 인자 결손), 혈액 혈소판 장애(예, 혈소판감소증), 또는 외상, 수술 또는 기타 원인에서 초래되는 상처를 치료하는데 사용될 수 있다. 또는, 지혈 또는 혈전용해 활성을 감소시킬 수 있는 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 심장 발작(경색), 발작 또는 반흔의 치료에 중요한 응혈을 억제하거나 용해시키는데 사용될 수 있다.
또한, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 자가면역 질환의 치료 또는 검출에 유용할 수 있다. 다수의 자가면역 장애는 면역 세포가 자신을 이종 물질로서 부적절하게 인식하여 나타나는 것이다. 이러한 부적절한 인식은 숙주 조직을 파괴시키는 면역 반응을 초래한다. 따라서, 면역 반응, 구체적으로 T 세포의 증식, 분화 또는 화학주성을 억제할 수 있는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 투여는 자가면역 장애를 예방하는데 있어 효과적인 치료법일 수 있다.
METH1 또는 METH2에 의해 치료 또는 검출될 수 있는 자가면역 장애의 예로는 애드손 질환, 용혈성 빈혈증, 항인지질 증후군, 류마티스양 관절염, 피부염, 알레르기성 뇌척수염, 사구체신염, 굳파스쳐 증후군, 그레이브스 질환, 다발성 경화증, 중증근무력증, 신경염, 안염, 수포성 유천포창, 천포창, 다내분비질환, 자반병, 라이터 질환, 스티프-맨 증후군, 자가면역 갑상선염, 전신 홍반성 낭창, 자가면역 폐염, 길레인-바레 증후군, 인슐린 의존성 진성 당뇨병 및 자가면역 염증 안질환이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
이와 마찬가지로, 알레르기 반응 및 증상, 예컨대 천식(구체적으로, 알레르기 천식) 또는 기타 다른 호흡 문제 역시 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 치료될 수 있다. 더욱이, METH1 또는 METH2는 아나필락시스, 항원성 분자에 대한 과민증 또는 혈액 그룹 부적합성을 치료하는데 사용될 수 있다.
METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 기관 거부 또는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 기관 거부는 면역 반응을 통해 이식된 조직의 숙주 면역 세포 파괴에 의해 일어난다. 이와 마찬가지로, GVHD에도 면역 반응이 관여하나, 이 경우에 이종의 이식된 면역 세포는 숙주 조직을 파괴한다. 면역 반응, 구체적으로 T 세포의 증식, 분화 또는 화학주성을 억제하는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 투여는 기관 거부 또는 GVHD를 예방하는데 있어 효과적인 치료법일 수 있다.
이와 마찬가지로, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 염증 변조에도 사용될 수 있다. 예컨대, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 염증 반응과 관련된 세포의 증식 및 분화를 억제할 수 있다. 이들 분자는 만성 상태 및 급성 상태의 염증 증상, 예컨대 감염과 관련된 염증(예, 패혈성 쇼크, 패혈증 또는 전신성 염증 응답 증후군(SIRS)), 허혈성 재관류 상해, 내독소 치사율, 관절염, 보체 매개의 과민성 거부, 신염, 시토킨 또는 케모킨 유도성 폐 상해, 염증성 장 질환, 크론병 또는 시토킨(예, TNF 또는 IL-1) 과잉 생산에 의한 염증을 치료하는데 사용될 수 있다.
과증식 장애
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 종양을 비롯한 과증식 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 직접 또는 간접 상호작용을 통해 장애의 증식을 억제할 수 있다. 또는, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 과증식 장애를 억제할수 있는 다른 세포를 증식시킬 수 있다.
예컨대, 면역 반응을 증가시켜, 특히 과증식 장애의 항원성 성질을 증가시키거나 T 세포를 증식, 분화 또는 이동시킴으로써 과증식 장애를 치료할 수 있다. 이러한 면역 반응은 기존의 면역 반응을 향상시키거나 새로운 면역 반응을 개시시켜 증가시킬 수 있다. 또는, 면역 반응의 감소 역시 과증식 장애를 치료하는 방법일 수 있다. 그 예로는 화학치료제가 있다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 치료 또는 검출될 수 있는 과증식 장애의 예로는, 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 하수체, 정소, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두부와 경부, 신경(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉곽 및 요생식기에 위치한 종양을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다.
이와 마찬가지로, 다른 과증식 장애 역시 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 치료 또는 검출될 수 있다. 이러한 과증식 장애의 예로는, 저감마글로불린혈증, 림프증식 장애, 이상단백혈증, 홍반, 유육종증, 세자리 증후군, 발덴스트론 마크로글로불린혈증, 고세 질환, 조직구증 및 전술한 기관계에서 발생되는 종양 이외의 기타 다른 과증식 질환이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
감염 질환
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 감염 인자를 치료 또는 검출하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 면역 반응을 증가시키면, 특히 B 세포 및/또는 T 세포의 증식 및 분화를 증가시키면 감염 질환을 치료할 수 있다. 면역 반응은 기존의 면역 반응을 증가시키거나 또는 새로운 면역 반응을 개시시켜 증가시킬 수 있다. 또는, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 면역 반응을 유인함이 없이, 감염 인자를 직접 억제할 수도 있다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 치료 또는 검출될 수 있는 질환이나 증후군을 유발할 수 있는 감염 인자의 일 예는 바이러스이다. 이러한 바이러스의 예로는, 다음과 같은 DNA 및 RNA 바이러스 과가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 아르보바이러스, 아데노바이러스과, 아레나바이러스과, 아테리바이러스, 비르나바이러스과, 부나이아바이러스과, 칼리시바이러스과, 서코바이러스과, 코로나바이러스과, 플라비바이러스과, 헤파드나바이러스과(간염), 헤르페스바이러스과(예, 시토메가로바이러스, 단순 헤르페스, 헤르페스 조스터), 모노네가바이러스(예, 파라믹소바이러스과, 보르빌리바이러스, 라브도바이러스과), 오르토믹소바이러스과(예, 인플루엔자), 파포바바이러스과, 파르보바이러스과, 피코나바이러스과, 폭스바이러스과(예, 소두 또는 백시니아), 레오바이러스과(예, 로타바이러스), 레트로바이러스과(HTLV-1, HTLV-II, 렌티바이러스) 및 토가바이러스과(예, 루비바이러스). 이러한 과에 속하는 바이러스는 다양한 질환 또는 증후군을 유발할 수 있다. 그 예로는 관절염, 세기관지염, 뇌염, 눈감염(예, 결막염, 각막염), 만성 피로 증후군, 간염(A, B, C, E, 만성 활성, 델타), 수막염, 기회성 감염(예, AIDS), 폐렴, 버킷 림프종, 수두, 출혈열, 홍역, 볼거리, 파라인플루엔자, 광견병, 일반 감기, 소아마비, 백혈병, 풍진, 성적 전달 질환, 피부 질환(예, 카포시증, 사마귀) 및 바이러스혈증이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이러한 증후군이나 질환의 치료 또는 검출에 사용될 수 있다.
이와 마찬가지로, 질병이나 증후군을 유발할 수 있고 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 치료 또는 검출될 수 있는 박테이라 또는 진균 인자로는, 다음과 같은 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 과 및 진균이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 악티노바이세탈레스(예, 코리네박테리움, 마이코박테리움, 노르카디아), 아스퍼질로시스, 바실러스과(예, 안트락스, 클로스트리디움), 박테로이드과, 블라스토미세스증, 보르데텔라, 보렐리아, 브루셀라증, 칸디다증, 캄필로박터, 콕시디오이세스증, 효모균증, 더마토사이코시스, 장내세균과(크렙시엘라, 살모넬라, 세라티아, 예르시니아), 에리시펠로트릭스, 헬리코박터, 레지오넬라증, 렙토스피로증, 리스테리아, 마이코플라즈마목, 나이세리아과(예, 아시네토바실러스, 고노레아, 수막염증), 파스퇴렐라과 감염(예, 악티노바실러스, 헤모필러스, 파스퇴렐라), 슈도모나스, 리켓치아과, 클라디미아과, 사이필리스 및 스타필로코커스과가 있다. 이러한 박테리아 또는 진균과는 비제한적으로 다음과 같은 질병이나 증후군을 유발할 수 있다.
균혈증, 심내막염, 안염(결막염, 결핵, 포도막염), 치은염, 기회성 감염(예, AIDS 관련 감염), 조위염, 인공기관 감염, 라이터병, 기도 감염, 예컨대 백일해 또는 축농, 패혈증, 라임병, 묘조병, 이질, 파라티푸스열, 식중독, 장티푸스, 폐렴, 임질, 수막염, 클라미디아, 매독, 디프테리아, 나병, 부결핵증, 결핵증, 낭창, 보툴리누스 중독증, 괴저, 파상풍, 농가진, 류마티스열, 성홍열, 성적 전달 질환, 피부 질환(예, 봉와염, 더마토사이코시스), 독혈증, 요로 감염, 상처 감염.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이러한 모든 증후군이나 질환을 치료 또는 검출하는 데 사용될 수 있다.
더욱이, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 치료 또는 검출될 수 있는 질환이나 증후군을 유발하는 기생체로는 다음과 같은 과가 있지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 아메비아시스, 바베시오시스, 코시디오시스, 크립토스포리디오시스, 디엔타모에비아시스, 도우린, 엑토파라지트, 지아디아시스, 헬민티아시스, 레쉬마니아시스, 테일레리아시스, 톡소플라스모시스, 트립파노소미아시스 및 트리코모나스. 이러한 기생체는 다음과 같은 다양한 질환이나 증후군을 유발할 수 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
피선, 쓰쓰가무시병, 안염, 장질환(예, 이질, 람블편모충증), 간질환, 폐질환, 기회성 감염(예, AIDS 관련), 말라리아, 임신 합병증 및 톡소플라스마병.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이러한 모든 증후군이나 질환을 치료 또는 검출하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용한 치료는 유효량의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 환자에게 투여하거나, 또는 환자로부터 세포를 분리한 뒤, 이 세포에 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 공급하고, 이와 같은 조작된 세포를 환자에게 환원시켜(생체외 요법) 투여할 수 있다. 더욱이, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 감염 질환에 대한면역 반응을 유발시키는 백신 중의 항원으로서 사용될 수 있다.
재생
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 세포를 분화, 증식 및 유인하여 조직의 재생을 유도하는 데 사용될 수 있다[Science276:59-87(1997) 참조]. 조직 재생은 선천성 결함, 외상(상처, 화상, 절개 또는 궤양), 연령, 질병(예, 골다공증, 골관절염, 치주 질환, 간 손상), 성형 수술을 비롯한 외과 수술, 섬유증, 재관류 상해 또는 전신성 시토킨 손상에 의한 손상된 조직을 수복, 대체 또는 보호하는 데 사용될 수 있다.
본 발명을 사용하여 재생될 수 있는 조직으로는, 기관(예, 췌장, 간, 소장, 신장, 피부, 내피), 근육(평활근, 골격근 또는 심근), 혈관(혈관 내피 포함), 신경, 조혈 및 골격(뼈, 연골, 건 및 인대) 조직을 포함한다. 재생은 반흔 없이 또는 반흔을 줄이면서 일어나는 것이 바람직하다. 또한, 재생은 맥관형성을 포함할 수 있다.
더욱이, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 치유하기 어려운 조직의 재생을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 건/인대 재생 속도의 증가는 손상 후 회복 기간을 단축시킬 것이다. 본 발명에 기재된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 상해를 피하기 위한 방안으로 예방적으로 사용될 수도 있다. 치료될 수 있는 구체적인 질환으로는, 건염, 수근 터널 증후군 및 기타 다른 건 또는 인대 결함이 있다. 비치유성 상처를 조직 재생시킬 수 있는 또 다른 예로는 압박성 궤양, 혈관 불량과 관련된 궤양, 수술 및 외상을 포함한다.
이와 마찬가지로, 신경 및 뇌 조직 역시 신경 세포를 증식 및 분화시키는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 재생시킬 수 있다. 이 방법에 의해 치료될 수 있는 질환으로는, 중추 및 말초 신경계 질환, 신경증 또는 기계적 질환 및 외상 질환(예, 척수 질환, 두부 외상, 뇌혈관 질환 및 발작)이 있다. 구체적으로, 말초 신경 상해와 관련된 질환, 말초 신경병(예, 화학요법이나 기타 의학적 요법에 의한 질환), 국소 신경병 및 중추 신경계 질환(예, 알쯔하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측면 경화증 및 샤이 드래거 증후군)은 모두 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 치료할 수 있다.
화학주성
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 화학주성 활성이 있다. 화학주성 분자는 세포(예, 단핵구, 섬유아세포, 호중구, T 세포, 비만 세포, 호산구, 상피 세포 및/또는 내피 세포)를 체내의 특정 부위, 예컨대 염증, 감염 또는 과증식 부위로 유인하거나 이동시킨다. 이동된 세포는 특정 외상이나 이상과 싸우고(또는) 치유할 수 있다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 특정 세포의 화학주성 활성을 증가시킬 수 있다. 이러한 화학주성 분자는 체내의 특정 위치를 표적으로 하는 세포의 수를 증가시켜 염증, 감염, 과증식 질환 또는 기타 모든 면역계 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 화학주성 분자는 면역 세포를 상해 부위로 유인하여 조직에 대한 상처 및 기타 외상을 치료하는 데 사용할 수 있다.화학주성 분자로서, METH1 또는 METH2는 또한 상처 치료에 사용될 수 있는 섬유아세포를 유인할 수 있다.
또한, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 화학주성 활성을 억제할 수도 있는 것으로 생각된다. 이 분자 역시 질환 치료에 사용될 수 있다. 즉, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 화학주성의 억제제로서 사용될 수 있다.
결합 활성
`METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 METH1 또는 METH2에 결합하는 분자 또는 METH1 또는 METH2가 결합하는 분자를 선발하는 데 사용될 수 있다. METH1 또는 METH2와 분자의 결합은 METH1 또는 METH2 또는 결합된 분자의 활성을 활성화(작동물질), 증가, 억제(길항물질) 또는 감소시킬 수 있다. 이러한 분자의 예로는 항체, 올리고뉴클레오티드, 단백질(예, 수용체) 또는 소형 분자가 있다.
상기 분자는 METH1 또는 METH2의 천연 리간드와 밀접한 관련이 있는 것으로서, 예컨대 리간드의 단편, 천연 기질, 리간드, 구조적 또는 기능적 유사체인 것이 바람직하다[Coliganet al., Current Protocols in Immunology 1(2): 5장(1991)]. 이와 마찬가지로, 상기 분자는 METH1 또는 METH2가 결합하는 천연 수용체 또는 최소한 METH1 또는 METH2가 결합할 수 있는 수용체의 단편(예, 활성 부위)과 밀접한 관련이 있는 것일 수 있다. 어떤 것이든지, 상기 분자는 공지의 기법을 사용하여 적당하게 고안될 수 있다.
이와 같은 분자의 선발 과정은 세포 막 상에 또는 분비형 단백질로서 METH1또는 METH2를 발현하는 적당한 세포를 제조하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 세포로는 포유류, 효모, 드로소필라 또는 대장균 유래의 세포가 있다. 그 다음, METH1 또는 METH2를 발현하는 세포(또는 발현된 폴리펩티드를 함유하는 세포막)를, 상기 분자를 포함할 가능성이 있는 시험 화합물과 접촉시켜, 상기 분자나 METH1 또는 METH2의 결합이나, 활성의 자극 또는 억제를 관찰하는 바람직하다.
이러한 분석법은 단순히 METH1 또는 METH2에 대한 후보 화합물의 결합을 시험하는 것일 수 있으며, 여기에서 결합은 표지에 의해 검출하거나 또는 표지된 경쟁인자와의 경쟁 작용을 포함하는 분석법으로 검출한다. 또한, 분석법은 METH1 또는 METH2에 결합시 발생되는 시그널을 후보 화합물이 생성하는 지를 시험하는 것일 수도 있다.
또는, 분석법은 무세포 제조물, 고체 지지체에 부착시킨 폴리펩티드/분자, 화학적 라이브러리 또는 천연 산물의 혼합물을 사용하여 실시할 수 있다. 또한, 분석법은 간단하게 METH1 또는 METH2를 함유하는 용액과 후보 화합물을 혼합하는 단계, METH1 또는 METH2/분자 활성이나 결합을 측정하는 단계 및 METH1 또는 METH2/분자 활성이나 결합을 표준과 비교하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
특히, 모노클로널 항체 또는 폴리클로널 항체를 사용하여 시료(예, 생물학적 시료) 중의 METH1 또는 METH2 농도 또는 활성을 측정하는 ELISA 분석법이 바람직하다. 여기에서, 항체는 METH1 또는 METH2에 직접 또는 간접적으로 결합하여, 또는 기질에 대하여 METH1 또는 METH2와 경쟁하여 METH1 또는 METH2 농도 또는 활성을 측정할 수 있다.
전술한 모든 분석법은 진단 마커 또는 예후적 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 분석법을 사용하여 발견한 분자는 질환을 치료하거나 METH1 또는 METH2 분자를 활성화 또는 억제하여 환자내 특정 결과(예, 혈관 성장)를 유발하는 데 사용될 수 있다. 또한, 분석법은 적당하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 METH1 또는 METH2의 생성을 억제 또는 향상시킬 수 있는 제제를 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명은 (a) METH1 또는 METH2와 후보 결합 화합물을 항온처리하는 단계, (b) 결합의 발생 여부를 측정하는 단계를 포함하여, METH1 또는 METH2에 결합하는 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 (a) METH1 또는 METH2와 후보 화합물을 항온처리하는 단계, (b) 생물학적 활성을 분석하는 단계 및 (c) METH1 또는 METH2의 생물학적 활성의 변화 여부를 측정하는 단계를 포함하여 작동물질/길항물질을 동정하는 방법을 포함한다.
기타 활성
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 전술한 바와 같은 조혈 계통 외에도 배 간세포의 분화 또는 증식을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
또한, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 포유류 특성, 예컨대 신장, 체중, 모발색, 눈색, 피부, 지방 조직의 비율, 착색화, 크기 및 형태(예, 성형)를 변조하는 데에도 사용될 수 있다. 이와 유사하게, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이화작용, 동화작용, 프로세싱, 이용률 및 에너지 저장에 영향을 미치는 포유류 대사를 조절하는 데 사용될 수 있다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 바이오리듬, 24시간주기 리듬, 우울(우울성 질환 포함), 폭력적 경향, 동통에 대한 내성, 재생능(바람직하게는 액티빈 또는 인히빈 유사 활성에 의한 재생능), 호르몬 농도 또는 내분비물 농도, 식욕, 리비도, 기억력, 스트레스 또는 기타 인식 성질에 영향을 주어 포유류 정신 상태 또는 신체 상태를 변화시키는 데 사용될 수 있다.
또한, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 예컨대 저장능, 지방 함량, 지질, 단백질, 탄수화물, 비타민, 무기물, 보조인자 또는 기타 영양 성분을 증가 또는 감소시키는 식품 첨가제 또는 보존제로서 사용될 수 있다.
이상, 본 발명에 대하여 개괄적으로 설명하였으며, 이하 실시예를 통해 보다 상세하게 설명하겠다. 하지만, 이 실시예는 단지 예시적인 것으로, 본 발명을 한정하는 것이 아니다.
암 진단 및 예후
암에 걸린 포유류 중의 특정 조직은 대응하는 "표준" 표유류, 즉 암에 걸리지 않은 동종의 포유류와 비교하였을 때 METH1 또는 METH2 단백질을 암호하는 mRNA 및 METH1 또는 METH2 단백질의 발현량이 상당히 감소되는 것으로 생각된다. 또한, METH1 또는 METH2 단백질의 감소된 양은 포유류 유래의 특정 체액(예, 혈청, 혈장, 요 및 척수액)과 암에 걸리지 않은 동종의 포유류 유래의 혈청을 비교하였을 때 관찰될 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명은 종양 진단시 유용한 확인 방법을 제공한다. 이 방법은 포유류 세포 또는 체액내 METH1 단백질을 암호하는 유전자의 발현 농도를 분석하는 단계 및 이 유전자의 발현 농도와 표준 METH1 유전자 발현 농도를 비교하는 단계를 포함하여, 표준 이하로 유전자 발현 농도가 감소되면특정 종양이 있는 것임을 확인한다. 또한, 본 발명은 포유류 세포 또는 체액내 METH2 단백질을 암호하는 유전자의 발현 농도를 분석하는 단계 및 이 유전자의 발현 농도와 표준 METH2 유전자 발현 농도를 비교하는 단계를 포함하여, 표준 이하로 유전자 발현 농도가 감소되면 특정 종양이 있는 것임을 확인하는, 종양 진단시에 유용한 확인 방법을 제공한다.
종래의 방법으로 종양 진단을 이미 실시한 경우라면, 본 발명은 METH1 또는 METH2 유전자 발현의 감소를 나타내는 환자가 그 유전자를 저농도로 발현하는 환자에 비하여 더 악화된 임상적 결과를 갖게 될 것임을 예측하는 예후적 지표제로서 유용하다.
"METH1 또는 METH2 단백질을 암호하는 유전자의 발현 농도의 분석"이란 제1 생물학적 시료 중의 METH1 또는 METH2 단백질의 농도 또는 METH1 또는 METH2 단백질을 암호하는 mRNA의 농도를 직접적으로(예컨대, 절대 단백질 농도 또는 mRNA 농도의 측정 또는 산정) 또는 상대적으로(예컨대, 제2 생물학적 시료 중의 METH1 또는 METH2 단백질 농도 또는 mRNA 농도와 비교하여), 정성 또는 정량적으로 측정 또는 산정하는 것을 의미한다.
제1 생물학적 시료 중의 METH1 또는 METH2 단백질 농도 또는 mRNA 농도를 측정 또는 산정하고, 표준 METH1 또는 METH2 단백질 농도 또는 mRNA 농도와 비교하는 것이 바람직하다. 여기에서, 표준은 암에 걸리지 않은 개체에서 얻은 제2 생물학적 시료에서 취한 것이다. 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 표준 METH1 또는 METH2 단백질 농도 또는 mRNA 농도가 일단 공지되면, 비교용 표준으로서 반복하여 사용될 수 있다.
"생물학적 시료"란 METH1 또는 METH2 단백질 또는 mRNA를 포함하는 개체, 세포주, 조직 배양물 또는 기타 다른 공급원에서 얻은 모든 생물학적 시료를 의미한다. 생물학적 시료로는, 분비된 성숙 METH1 또는 METH2 단백질을 포함하는 포유류 체액(예, 혈청, 혈장, 요, 활액 및 척수액), 부신, 갑상선, 위, 뇌, 심장, 태반, 폐, 간, 근육, 신장, 췌장, 정소 및 난소 조직(METH1의 경우) 및 전립선, 소장, 결장, 뇌 및 폐 조직(METH2의 경우)이 있다.
본 발명은 포유류내 암 검측에 유용하다. 특히, 본 발명은 포유류 중의 다음과 같은 유형의 암을 진단하는 데 유용하다. 유방암, 난소암, 전립선암, 간암, 폐암, 췌장암, 결장암 및 정소암. 바람직한 포유류로는 원숭이, 꼬리없는 원숭이, 고양이, 개, 소, 돼지, 말, 토끼 및 인간이 있다. 특히 바람직한 것은 인간이다.
총 세포 RNA는 문헌[Chomczunski and Sacchi,Anal.Biochem. 162:156-159(1987)]에 기재된 1단계 구아니디늄-티오시아네이트-페놀-클로로포름 방법을 사용하여 생물학적 시료로부터 분리할 수 있다. 그 다음, 적당한 임의의 방법을 사용하여 METH1 또는 METH2 단백질을 암호하는 mRNA의 농도를 분석한다. 그 예로는, 노던 블롯 분석[Harada et al., Cell 63:303-312(1990)], S1 뉴클레아제 지도화[Fujita et al., Cell 49:357-367(1987)], 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 폴리머라제 연쇄 반응과 조합된 역전사(RT-PCR)[Makino et al., Technique 2:295-301(1990)] 및 리가제 연쇄 반응과 조합된 역전사(RT-LCR)가 있다.
생물학적 시료 중의 METH1 또는 METH2 단백질 농도의 분석은 항체를 기본으로 하는 기법을 사용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 조직 중의 METH1 또는 METH2 단백질 발현은 고전적 면역조직학적 방법으로 연구할 수 있다[Jalkanen, M., et al., J.Cell.Biol. 101:976-985(1985); Jalkanen,M., et al., J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987)].
METH1 또는 METH2 단백질 유전자 발현을 검측하는데 유용한 기타 다른 항체를 기본으로 한 방법으로는, 효소 결합 면역흡착성 분석법(ELISA) 및 방사능면역분석법(RIA)과 같은 면역분석법이 있다.
적합한 표지에 대해서는 당해 기술 분야에 공지되어 있는데, 그 예로는 효소 표지(예, 글루코스 옥시다제), 방사능동위원소[예, 요오드(125I,121I), 탄소(14C), 황(35S), 3중 수소(3H), 인듐(112In) 및 테크네튬(99mTc)], 및 형광 표지(예, 플루오레세인 및 로다민) 및 비오틴이 있다.
투여 방식
혈관 공급의 증가는 종양 진행과 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 맥관형성의 억제제는 암 환자에 대한 보조 요법으로서 효과가 있다고 할 수 있다. 하지만, 현재 알려져 있는 일부 맥관형성 억제제는 심한 부작용 때문에 전신 치료에는 바람직하지 않다. 본 발명자들은 METH1 또는 METH2가 시험관내 및 생체내 모두에서 맥관형성의 강력한 억제제라는 것을 확인하였다. 이러한 억제제는 일반적으로 생리학적 맥관형성의 억제와 연관이 있고, 따라서 다른 맥관형성 억제제보다 낮은 독성과 내피 특이성을 제공한다는 점에 METH1 및 METH2의 잇점이 있다. 또한, METH1 및 METH2는 기관 특이성에 대한 잇점의 가능성을 제공하는 제한된 발현 패턴을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 암 치료에 이용할 수 있다. 본 발명의 METH1 및 METH2 폴리펩티드는 맥관형성과 관련된 다른 질환이 있는 개체의 치료에 사용할 수 있는데, 그 예로는 이상 상처 치유, 염증, 류마티스양 관절염, 건선, 자궁내막 출혈 질환, 당뇨병성 망막증, 반점 변성의 일부 형태, 혈관종 및 동맥-정맥 기형이 있다.
즉, 본 발명은 상기 개체 중의 METH1 활성의 농도를 증가시키기에 효과적인 유효량의 본 발명의 분리된 METH1 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체내 맥관형성을 억제하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 개체 중의 METH2 활성의 농도를 증가시키기에 효과적인 유효량의 본 발명의 분리된 METH2 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체내 맥관형성을 억제하는 방법을 제공한다.
이러한 방식으로 맥관형성을 억제하는 데 사용할 수 있는 METH1 폴리펩티드로는, 리더를 포함하는 수탁된 cDNA가 암호하는 METH2 폴리펩티드, 리더 없이 수탁된 cDNA에 의해 암호된 성숙 METH2 폴리펩티드(즉, 성숙 단백질); 서열 번호 4의 아미노산 약 1 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 약 2 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 약 24 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 약 112 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 214 내지 439인 METH2의 메탈로프로테아제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 440 내지 529인 METH2의 디스인테그린 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 530 내지 583인 METH2의 제1 TSP 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 837 내지 890인 METH2의 제2 TSP 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 280 내지 606을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 529 내지 548을 포함하는 폴리펩티드가 있다.
일반적인 제안으로서, 투여량 당 비경구적으로 투여되는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 총 약학적 유효량은 환자의 체중 당 약 1 ㎍/㎏/일 내지 10 ㎎/㎏/일의 범위이지만, 전술한 바와 같이 이 범위는 치료적 판단에 따라 달라질 수 있다. 보다 바람직하게는, 이 투여량이 0.01 ㎎/㎏/일 이상, 인간에 대하여 가장 바람직하게는 약 0.01 내지 1 ㎎/㎏/일의 폴리펩티드이다. 연속 투여하는 경우, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 일반적으로 약 1 ㎍/㎏/시간 내지 약 50 ㎍/㎏/시간의 투여 속도로, 미니펌프 등을 사용하여 1일 당 1 내지 4회 또는 연속 경피 주입하여 투여한다. 또한, 정맥내 백 용액이 사용될 수도 있다.
본 발명의 METH1 또는 METH2를 포함하는 약학 조성물은 경구, 직장, 비경구, 조내, 질내, 복강내, 국소(산제, 연고, 점적액 또는 경피 패치로서), 협측 또는 경구 또는 비측 분무제로서 투여될 수 있다. "약학적 허용성 담체"란 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충진제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 모든 제형의 제제 보조제를 의미한다. 본 명세서에 사용된 "비경구"란 용어는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 의미한다.
염색체 분석
또한, 본 발명의 핵산 분자는 염색체 동정에 매우 중요하다. 이 서열은 각 인간의 염색체 상의 특정 위치를 특이적으로 표적으로 하여 하이브리드할 수 있다. 따라서, DNA를 본 발명에 따라 염색체에 지도화하는 단계는 그 서열들과 질병 관련 유전자와의 상관관련을 규명하는 데 중요한 제1 단계이다.
이와 관련된 특정의 바람직한 실시양태로서, 본 명세서에 개시된 cDNA는 METH1 또는 METH2 단백질 유전자의 게놈 DNA를 클로닝하는데 사용된다. 이것은 일반적으로 구득 용이한 라이브러리와 공지된 각종 기법을 사용하여 실시할 수 있다. 그 다음, 게놈 DNA를, 이러한 목적으로 공지된 기법을 사용하여 동일계내 염색체 지도화하는데 사용한다.
또한, 몇가지 경우에는, cDNA 유래의 PCR 프라이머(바람직하게는 15 내지 25 bp)를 제조하여 서열을 염색체에 지도화할 수 있다. 게놈 DNA 중의 1 엑손내에 존재하는 프라이머를 신속하게 선택하기 위해서는 유전자의 3' 비해독 영역을 컴퓨터 분석해야 하고, 이것은 증폭 과정을 복잡하게 한다. 이와 같은 프라이머는 그 다음 각 인간의 염색체를 포함하는 체세포 하이브리드를 PCR 선별하는데 사용된다.
중기 염색체 스프레드에 대한 cDNA 클론의 형광 동일계내 하이브리드화("FISH")는 1 단계로 정확한 염색체 위치를 제공하는데 사용될 수 있다. 이 기법에는 50 bp 또는 60 bp 만큼 짧은 cDNA 유래의 프로브가 사용된다. 이 기법에 대해서는 문헌[Verma et al., Human Chromosomes: A Manual Of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)].
일단 서열이 정확한 염색체 위치에 지도화되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치를 유전자 지도 데이터와 비교한다. 이러한 데이터는 예컨대 존스 홉킨스 대학의 웰치 메디칼 도서관을 통해 온라인될 수 있는 V.McKusick,Mendelian Inheritance In Man에서 찾을 수 있다. 동일 염색체 영역에 지도화된 질병과 유전자간의 관련성은 계통 분석(물리적 인접 유전자의 공동유전성)을 통해 동정한다.
그 다음, 질병에 걸린 개체와 질병에 걸리지 않은 개체 간의 게놈 서열이나 cDNA의 차이를 측정하는 것이 필요하다. 그 결과, 돌연변이가 정상 개체에서는 관찰되지 않고 질환 개체 중 일부 또는 전체에서 관찰된다면, 그 돌연변이가 그 질병의 원인 인자일 가능성이 있다.
이상, 본 발명에 대하여 개괄적으로 설명하였으며, 이하 실시예를 통해 보다 상세하게 설명하겠다. 하지만, 이 실시예는 단지 예시적인 것으로, 본 발명을 한정하는 것이 아니다.
발명의 개요
본 발명은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 1998년 1월 15일자에 ATCC 수탁 번호 209581로 박테리아 숙주로서 수탁된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 METH1 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 1998년 1월 15일자에 ATCC 수탁 번호 209582로 박테리아 숙주로서 수탁된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 METH2 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포 뿐만 아니라 이 벡터와 숙주 세포의 제조 방법 및 재조합 기법에 의해 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 펩티드를 제조하는데 사용되는 상기 벡터와 숙주 세포의 용도를 제공한다.
또, 본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드가 암호하는 아미노산 서열을 가진 분리된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 암의 진단이나 예후에 유용한 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 분리된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드나 이것의 작동물질을 치료적 유효량으로 포함하는 조성물을, 체내 METH1 또는 METH2 활성의 증가를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 상기 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
실시예 1: METH1 및 METH2의 동정 및 클로닝
TSP 유사 도메인을 갖는 신규 유전자를 탐색하기 위하여, 약 90000개의 발현 서열 태그(EST)로 구성된 대형 인간 cDNA 데이터베이스를 사용하여 TSP1의 제2 타입 I 반복체와 상동성인 서열을 선발하였다. 여러개의 EST가 TSP 유사 도메인을 갖는 단백질을 암호하는 것으로 예상되었다. 인간 심장 및 폐 라이브러리 유래의 2개의 cDNA 클론을 추가 서열분석하고 기능 분석으로 선택하였다.
METH1의 아미노 말단 단부는 cDNA 단부의 5' 신속 증폭(RACE) PCR기법[Marathon cDNA 증폭 키트, 클론테크)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 얻었다. METH2의 아미노 말단 단부는 5' RACE PCR을 통해 부분적으로 얻고, 이후 게놈 선발에 의해 확인하고 완성하였다. 게놈 선발에서는, 먼저 PCR로 BAC 클론(Genome Systems)을 동정하였다. 서열 150 내지 200 bp를 포함하는 양성의 BAC 클론을, 그 다음 소형 단편으로서 pGEM 벡터에 서브클로닝하고 서열분석하였다.
추론된 아미노산 서열을 진뱅크(GenBank, EMBL 및 SwissProt) 데이터베이스와 분석 및 비교한 결과, 이 유전자들이 NH2 말단 단부에 레프로리신계와 상동성이 있고 COOH 말단 단부에 여러 TSP 유사 모티프를 가진 신규 메탈로프로테아제 군에 속하는 것으로 추정되었다. 이들 cDNA를 METH1 및 METH2라 불렀다(ME는 메탈로프로테아제의 약어이고, TH는 트롬보스폰딘의 약어이다). METH1의 마우스 동족체는 동정되어 ADAMTS1이라 불리고 있다[Kuno, K., et al., J.Biol.Chem. 272:556-562(1997)]. 인간과 마우스의 서열을 직접 비교해본 결과, 고도의 보존성이 관찰되었다(83.4% 아미노산 동일성). 지금까지 METH2에 대한 동족체가 동정된 적은 없다.
흥미롭게도, 최근 동정된 pNPI[프로콜라겐 I N-프로테이나제; Colidge, A.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94:2374-2379(1997)]라고 불리는 단백질은 METH1 및 METH2와 놀라운 서열 및 구조 유사성을 나타내었다(도 3). 본 명세서에 개시된 신규 단백질처럼, pNPI 역시 카르록시 말단 단부에 TSP 도메인과 메탈로프로테이나제(리프롤리신 아군)를 포함한다. pNPI의 서열은 소에서 얻은 것이지만, 서열 정렬은 동일한 구조적 특징을 나타내었다. METH1과 METH2 간의 아미노산 유사성은 51.7%이고, METH1 또는 METH2와 pNPI 간의 상동성은 각각 보다 적은 33.9% 및36.3%이었다.
서열을 분석한 결과, METH1과 METH2의 ORF는 각각 950개 및 890개 아미노산의 단백질을 암호하는 것으로 관찰되었다. 3가지 단백질 모두에서, NH2말단 단부는 추정상의 시그널 펩티드와 그 다음 아미노산 300 부근에 친수성 플롯으로부터 추론된 또 다른 추정상의 경막 도메인을 포함한다. 이러한 단백질이 막에 결합되어 있는 지는 명확하지 않다. 하지만, 예비 데이터를 볼 때, 제2 경막 도메인은 소수성 포켓을 구성할 가능성이 크고, METH1, METH2 및 pNPI는 사실상 분비형 단백질일 것이다. 시그널 펩티드 다음의 NH2말단 단부는 아연 메탈로프로테아제의 상과와 상동성이 있는 것으로, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인 고밀도 영역으로 나누어질 수 있다.
프로도메인과 메탈로프로테아제 도메인 사이의 경계에 있는 도 3에 도시한 METH1 및 METH2의 2중선으로 밑줄친 서열은 푸린(Barr, 1991)과 같은 포유류 서브틸리신에 대한 잠재적 절단 부위이다. 단백분해적 프로세싱은 SVMP에서 일어나, 가용성 메탈로프로테아제 및 디스인테그린을 생성하며(Bjarnason,J.B. & Fox,J.W.,Methods Enzymol. 248:345-368(1995)], 일부 ADAM에서도 검출되었다[Wolsberg,T.G. & White,J.M., Developmental Biology 180:389-401(1996)]. 이런 점에서, 예비 실험은 단백분해적 프로세싱이 최소한 METH1에서 일어난다고 암시한다. 또한, METH1 및 METH2는 모두 기능적으로 중요한 특정 아미노산을 보존하기 때문에 촉매적으로 활성인 것으로 추정되는[Rawlings,N.D & Barrett,A.J., Methods Enzymol. 248:183-228(1995)] Zn2+결합 부위를 보유한다(도 3의 점선). 이것은 이 단백질들이 활성 프로테아제라는 것을 암시한다. 메탈로프로테아제 도메인 다음에, 2개의 추정상의 디스인테그린 루프를 포함하는 시스테인 고밀도 영역이 있다[Wolsberg, T.G. & White,J.M., Development Biology 180:389-401(1996)](도 4에 화살표로 표시됨). 디스인테그린 도메인은 뱀독 메탈로프로테아제(SVMP) 및 ADAM(디스인테그린과 메탈로프로테아제 도메인을 포함하는 포유류 단백질)이 포함되는 메탈로프로테아제의 상과 내에서 발견되며, 인테그린이 SVMP내에 존재하는 이들의 리간드에 결합하는 것을 억제할 수 있는 기능이 있다. 이와 반대로, 막 고착 단백질의 일부분으로서, ADAM-디스인테그린 유사 도메인은 세포간 상호작용을 붕괴하기 보다는 촉진할 수 있다[Wolsberg, T.G. & White, J.M., Development Biology 180:389-401(1996)]. TSP 유사 도메인은 METH1 및 METH2 단백질의 COOH 측 절반 쪽에 위치한다. METH1은 기능이 알려지지 않은 스페이서 영역으로 분리된 2개의 보존성 TSP 도메인과, 상동성이 적은 서브도메인 및 제2 맥관형성 억제 영역 다음의 단지 5개의 시스테인을 포함한다. METH2는 스페이서 영역에 의해 분리된 2개의 TSP 도메인을 포함한다. METH1 및 METH2의 TSP 유사 도메인과 TSP1 및 TSP2를 정렬하여 도 5에 도시하였다. 모든 TSP 반복체간에는 19.2% 내지 52% 아미노산 유사성 범위에서 상동성의 차이가 있다. 1번에서 6번까지 번호를 매긴 시스테인과 별표로 표지된 트립토판은 고도로 보존적이다.
인간 게놈 DNA를 서던 블롯 분석한 결과, 게놈내 METH1 및 METH2의 존재가 확인되었다. METH1 및 METH2 프로브는 여러 크기의 밴드를 나타내었는데, 이것은상기 프로브가 여러 유전자에서 전사된다는 것을 암시한다.
타입 I 반복체의 콘센서스 서열은 완전 보전성인 6개의 시스테인과 함께 16개의 잔기를 포함한다. 일반적으로, 이 서열은 헤파린에 결합하는 것으로 밝혀진 서열 모티프 WSXWS(서열 번호 82)로 시작한다[Guo,N., et al., J.Biol.Chem. 267:19349-19355(1992)]. 헤파린에 대한 이 영역의 친화성은 TSP-1의 맥관형성 억제 활성의 일부라고 제안되었다[Guo,N.,et al., J.Peptide Res. 49(1997)]. TSP계의 단백질 중 5군에서, 단지 TSP-1 및 TSP-2 만이 맥관형성을 억제하고 타입 I 반복체를 포함한다[Tolsma, S.S., et al., J.Cell.Biol. 122:497-511(1993); Kyriakides,T.R., et al., J.Cell.Biol. 140:419-430(1998)]. 상기 타입 I 또는 프로페르딘 반복체는 500년과 900년 전쯤 사이에 엑손 셔플링에 의해 TSP1 및 TSP2의 전구체에 첨가되었을 것으로 추정된다[Adams, J., et al., The Thrombospondin Gene Family, 1 Ed. Molecular Biology Intelligence Unit(Springer, Ed.), R.G.Landes Company, Germany(1995)]. 이러한 도메인의 획득이, 신규 혈관 형성의 조절과 같은 기능을 갖는 TSP1 및 TSP2의 전구체를 제공했을 가능성이 있다. 보다 최근에는, p53에 의해 조절되는 성질에 의하여 뇌 라이브러리에서 분리된 단백질인 BAI-1(뇌 맥관형성 억제제-1)이 TSP-1의 타입 I 반복체를 포함하고 이 분자에 맥관형성 억제 가능성을 제공하는 것으로 관찰되었다[Nishimori, H.,et al., Oncogene 15:2145-2150(1997)]. 그러나, 부가 서열 역시 중요한 것으로 보이는데, 그 이유는 타입 I 반복체를 포함하는 기타 다른 단백질, 예컨대 프로페르딘, F-스폰딘 및 기타 보체계의 성분이 명확하거나 잘 규명된 맥관형성 성질을 나타내지 않기 때문이다.
맥관형성 성질과 함께 METH1 및 METH2 내의 TSP 반복체의 존재로 인하여, 이 단백질들은 근본적으로 TSP 상과의 일원으로 간주되었다. 그러나, 다른 TSP와 추가 상동성이 없는 바, 사실상 TSP1 및 TSP2에 대한 유사성은 타입 I 반복체에 제한되었다. 또한, 이 단백질들은 ADAM 계의 성분들과도 상당한 서열 및 구조 상동성을 나타내었다. 이러한 특징으로 인하여, 쿠노와 그의 동료들은 ADAMTS를 METH1의 마우스 동족체라고 불렀다[Kuno, K., et al., J.Biol.Chem. 272:556-562(1997)]. 최근 동정된 pNPI와 본 명세서에 개시된 단백질들에 대한 놀라운 서열 상동성은 이들 3가지 단백질이 모두 메탈로스폰딘이라고 하는 아과에 속하게 하였다. 이러한 점에서, pNIP가 맥관형성 억제 성질이 있는지 또는 METH1 및/또는 METH2가 α1(I) 프로콜라겐의 아미노 말단 프로펩티드의 절단시 침전하는지는 명확하지 않다.
실시예 2 : 노던 블롯 및 서던 블롯 분석
총 RNA는 전술한 바와 같이 구아니디늄-이소티오시아네이트 추출에 의해 세포로부터 정제하였다[Chomczynski, P. & Sacchi, N.,Anal. Biochem. 162:156-159(1987)]. 폴리(A)+RNA는 제조 조건에 따라 뵈링서 맨하임(BMB, 인디애나주 인디애나폴리스 소재) 키트를 사용하여 추출하였다. 다른 폴리(A)+RNA 블롯은 클론테크(미국 캘리포니아주 팔로 알토에 소재)에서 구입하였다. 예비하이브리드화는 50% 포름아미드, 6X SSPE, 1X 덴하르트 용액, 0.1% SDS 및 열변성된 연어 정자 DNA 100 ㎍/㎖를 함유하는 용액에서 42 ℃ 하에 12 내지 18 시간 동안 항온처리하여 실시하였다. 표지된 cDNA 프로브와의 하이브리드화는 동일한 용액에서 42 ℃하에 12 내지 18 시간 동안 진행시켰다. TSP1 및 METH1 프로브는 전체 인간 cDNA에 해당하는 것을 사용하였다. METH2 프로브는 인간 cDNA 유래의KpnI-EcoRI 단편에 해당하는 것을 사용하였다. 글리세르알데히드-3-포스페이트-디하이드로게나제(GPDH)의 1.3 Kb PstI 단편은 장입과 전이 효율을 표준화하기 위하여 사용하였다. 막은 코닥 Biomax MS 필름(미국 코네티컷주 뉴 해븐에 소재하는 코닥 제품)에 노출시켰다.
서던 블롯을 위하여, 프로메가(미국 위스콘신주 매디슨 소재)에서 구입한 인간 게놈 DNA를 65 ℃에서 10 분동안 가열하고 37 ℃에서 하룻밤 동안 EcoRI 및 PstI으로 분해하였다. 분해된 DNA 5 ㎍을 1% 아가로스 겔로 분리하고, 나이트란 막으로 전이시킨 뒤 자외선으로 가교시켰다. cDNA 프로브 뿐만 아니라 예비하이브리드화 및 하이브리드화 조건은 노던 블롯에 기재된 바와 동일하였다. 블롯을 고엄중도(0.2X SSC, 0.2% SDS, 50 ℃)로 세척하였다.
METH1 및 METH2의 발현 패턴은 성인 조직과 배 조직에서 조사하였다. 노던 블롯 분석은 인간 조직 유래의 폴리(A)+RNA를 포함하는 블롯으로 고엄중도 조건하에 실시하였다. METH1 및 METH2 전사체는 각각 4.6 Kb 및 3.7 Kb의 단일 밴드를 나타냈다. 부신, 심장, 태반, 그 다음으로 골격근, 갑상선 및 위에서 풍부한 METH1 mRNA 발현율이 관찰되었다. 분석된 배 조직에서는 신장이 최고의 METH1 mRNA 발현율을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 분석된 모든 조직에서는 보다 약한 METH1 mRNA 발현율을 나타내었다. METH2 mRNA의 분포는 METH1의 경우보다 제한적이고 약하게 나타났다. 배 및 성인 모두의 경우에는 폐에서 최고의 발현율을 나타내었다.복합적으로 볼 때, 구조 유사성과 이들의 발현 패턴은 기능적 풍부성이 있지만 전사 조절의 상이성을 암시한다. 또한, 동일 블롯에서의 TSP1 전사체의 발현 농도를 분석하여 비교하였다. TSP1 mRNA 최고의 발현은 성인 태반과 분석된 모든 배 조직에서 관찰되었다. METH1 및 METH2와는 대조적으로, 조사된 기타 모든 조직에서는 TSP1 전사체의 일정한 농도가 관찰되었다.
또한, 세포 유형에 따른 분포는 폴리(A)+RNA의 노던 블롯 분석으로 연구하였다. METH1 mRNA는 피부 섬유아세포, 혈관 평활근, 자궁내막 기질 세포 및 2종의 암 세포주인 HeLa 및 G631, 아데노육종 및 흑색종에서 저농도로 검출되었다. METH2 mRNA는 결장 암종 세포주인 SW480에서만 관찰되고, 분석된 기타 모든 세포주 또는 원시 세포주에서는 관찰되지 않았다.
맥관형성 및 맥관형성 억제 인자의 그룹이 특정 기관에서 혈관 망 형성을 조절할 것이라는 가능성에 대해서는 입증되지는 않았지만, 사실일 가능성이 있는 가설로 종종 토론되었다. 명확히 구별되고 거의 중복성이 아닌 METH1 및 METH2의 발현 패턴은 최소한 총 농도를 살펴볼 때 당황스런 것이었다. 또한, TSP1 및 TSP2는 동일한 구조의 고도의 아미노산 유사성을 갖고 있지만, 이들의 발현 패턴은 상당히 상이하다[Iruela-Arispe, M.L., Dev.Dyn. 197:40-56(1993)]. 이와 같은 차이는 전술한 바와 같이 상이한 조절 기작과 프로모터에 있는 상이한 시스 작용성 인자에 근거할 것으로 추정된다. METH1 및 METH2의 프로모터는 특성규명되지는 않았지만, 각 유전자를 조절하는데 있어 독특한 특징을 제공하는 것 같다. 그럼에도 불구하고, 맥관형성 억제 성질이 입증된 하나의 모티프인 맥관형성/타입 I 반복체가 상이한 조직 특이성이 있는 여러 단백질에 존재할 것이라는 가능성이 주장되고 있다. 또는, 동일 계에 속하는 관련성이 큰 군 간의 서열의 작은 차이가 기능적 중복 이상의 유의성을 보유할 수 있다. TSP1 및 TSP2의 경우에, 현저한 구조적 유사성과 아마도 기능적으로 공통적인 맥관형성 억제 성질이 있는 것 외에, TSP1과 TSP2는 이들의 유사 관계물에 의해 공유되는 것이 아니라 각각의 고유 기능이 있는 것으로 보인다. 이것은, 이들 유전자에 대한 2가지 녹아웃 결과로 입증되었다. TSP1 대조 동물은 1차적으로 폐질환[Lawler, J.,et al., J.Clin.Invest. 101:982-992(1998)]과 2차적으로 혈관 이상을 나타내었는데, 이러한 질환은 단지 특정 병리학적 세팅이나 한정된 기관 군에서만 나타났다. 이와 대조적으로, TSP2 녹아웃 마우스는 예상치않은 콜라겐 어셈블리 이상을 피부, 건 및 뼈에 수반되는 결과와 함께 나타내었다[Kyriakides, T.R., et al., J.Cell.Biol. 140:419-430(1998)]. 또한, 이들 동물은 피부내 모세관 밀도에 총 증가를 나타낸다. 메탈로스폰딘계의 새로운 구성원간의 유사성이 어떻게 기능적으로 해독되는 지에 대해서는 알 수 없다. 하지만, 분명한 것은, pNIP가 타입 I 프로콜라겐의 N 말단을 절단하여 활성적인 단백분해 활성을 나타내는 것으로 확인되었다[Colidge,A.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94:2374-2379(1997)].
기능적으로 관심이 있는 제2 영역은 디스인테그린 도메인에 해당한다. 이 도메인은 αIIbβ3에 결합하고 혈소판 상호작용 차단 응고를 억제하는 것으로 밝혀진 뱀독 메탈로프로테아제의 관련 구성원들에 의해 상세하게 특성규명되어 있다[Pfaff,M., et al., Cell Adhes Commun. 2:491-501(1994); Usami,Y., et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun. 201:331-339(1994)]. 이 디스인테그린 모티프는 흔히 아스파르트산 위치에 음하전 잔기 또는 RGD를 포함하는 13 내지 15개 도메인을 포함한다. RGD 또는 이의 등가체는 인테그린에 결합하여 작동물질 또는 시그널링 리간드로서 작용한다[Wolsberg,T.G. & White,J.M.,Developmental Biology 180:389-401(1996)]. METH1은 제외하고 METH2는 디스인테그린 도메인의 아미노 말단에 위치한 RGD 서열을 갖고 있다. 또한, 이 두 분자는 디스인테그린 모티프내에 완전하지는 않지만 비교적 높은 시스테인 보존도를 갖고 있다. 이것은 이 영역의 3차 구조와 인테그린과의 상호작용에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 또한, 이 도메인 중 일부, 특히 경막 영역을 가진 부분은 기능적 부착 분자로서 작용하는 것으로 확인되었다[Wolsberg,T.G. & White,J.M., Developmental Biology 180:389-401(1996)]. 따라서, 이것은 모두 분비형인 METH1 및 METH2에는 해당하지 않는 것으로 보인다.
실시예 3: 재조합 단백질의 발현 및 정제
절두형 융합 단백질을 발현시키기 위한 재조합 작제물은 다음과 같이 제조하였다. 즉 (1) pRSET-METH1-Type I: METH1 nt 1605-1839(출발 코돈에서 부터)을 다음과 같은 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭시켰다. 5'GCA TTT TGG ATC CGC TT TTC ATG-3'(서열 번호 78) 및 5'-GTT GTG TGC TGC AGA TTG TTC C-3'(서열 번호 79). 그 다음, 증폭된 단편을 pRSET 벡터의 BamHI 및 PstI 부위에 서브클로닝하였다. (2) 상기 pRSET-METH1-TSP 유래의 BamHI-EcoRI 단편을 pGEX-5X 벡터(파마시아 바이오테크 인크. 제품; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)의 SmaI부위에 평활말단 결찰에 의해 결찰시켜 pGEX-METH1-TSP를 제조하였다. (3) pGEX-1.0-METH2[METH2 cDNA의 nt838-1818 단편(출발 코돈에서부터)]은 pGEM-2TK의 BamHI-EcoRI 부위에 결찰시켰다. METH2 단편은 BamHI 및 EcoRI 제한 부위를 생성하는 다음과 같은 프라이머: 5'-GAAAAATGGGGATCCGAGGTG-3'(서열 번호 80) 및 5'-GCAGGAGAATTCCGTCCATG-3'(서열 번호 81)를 사용하여 증폭시켰다. (4) pGEX-METH2-TSP(pGEX-1.0-METH2로부터 분리된 0.5 Kb XmaI-EcoRI 단편)는 pGEX-2TK 벡터의 XmaI 및 EcoIR 부위에 서브클로닝하였다. 모든 작제물은 서열 신뢰성과 정확한 오픈 리딩 프레임을 입증하기 위하여 서열분석하였다.
재조합 단백질은 6H-METH1(플라스미드 pRSET-METH1-TSP에 의해 발현된 재조합 단백질), GST-METH1(플라스미드 pGEX-METH1-TSP와 GST-METH2에 의해 발현된 단백질) 및 GST-METH2(플라스미드 pGEX-METH2-TSP에 의해 발현된 단백질)로 불렀다.
발현 플라스미드를 사용하여 BL21:DE3 대장균 균주(스트라타진 클로닝 시스템스, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 형질전환시키고, 다음과 같이 제조자의 지시에 따라 융합 단백질을 유도하였다. 간력히 설명해보면, 유도된 박테리아 펠릿을 PBS에 재현탁하고, 얼음 상에서 1 분 동안 초음파처리하였다. 이 현탁액을 그 다음 1% 트리톤 X-100의 존재하에 RT에서 20 분 동안 항온처리하고 4 ℃에서 원심분리하였다. 상청액 20 ㎖를 비드(50% 슬러리) 1 ㎖와 4 ℃에서 2 시간 동안 항온처리하여 Ni-NTA 비드(퀴아겐 제품, 미국 캘리포니아주 채스워스 소재) 상에서 히스티딘 태그된 융합 단백질을 정제하였다. 이 현탁액을 컬럼으로 이동시키고, 10 mM 이미다졸을 함유하는 10 컬럼 부피량의 PBS, 그 다음 50 mM 이미다졸, 마지막으로 100 mM 이미다졸을 함유하는 PBS로 세척하였다. 단백질은 500mM 이미다졸을 함유하는 PBS로 용출시켰다. 재조합 단백질을 함유하는 분획은 페놀 레드 제거된 DMEM으로 투석하였다. 시료를 4 ℃에서 40 분동안 원심분리하였고, 단백질 중 일부는 용해되지 않아, 원심분리 동안 제거되었다. 상청액은 -70 ℃에서 보관하여, 증식, 각막 포켓 및 융모요막(CAM) 분석 시 사용하였다.
GST 융합 단백질의 정제를 위하여, 추출물을 원심분리하여 청징화한 뒤, GST 친화성 컬럼(파마시아)에 장입하였다. 컬럼은 0.1 mM 환원 글루타치온이 첨가된 PBS-1% 트리톤 X-100으로 세척하고, 그 다음 0.5 mM 환원 글루타치온 첨가된 동일 완충액으로 세척하였다. 융합 단백질의 용출은 10 mM 환원 글루타치온이 첨가된 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 실시하였다. 단백질을 함유하는 분획을 DMEM에 대하여 투석하고, -70 ℃에 보관하였다가, 증식, 각막 포켓 및 융모요막(CAM) 분석에 사용하였다.
재조합 단백질의 완전성과 순도는 12.5% 또는 15% 아크릴아미드 겔에서 쿠마시 블루로 염색하여 분석하였다.
TSP의 처음 2가지 타입 I 반복체를 포함하는 재조합 GST 융합 단백질은 기능적 분석에 사용하기 전에 DMEM에 대하여 투석하였다. 천연의 TSP1은 전술한 바와 같이 혈소판에서 정제되었다[Roberts,D.D. et al., J.Tissue Cult.Methods 16:217-222(1994)].
METH1 및 METH2 TSP 도메인이 맥관형성의 조절인자로서 작용할 것이라는 가설을 입증하기 위하여, 재조합 융합 단백질을 박테리아에서 생성하였다. 이 작제물은 METH1 또는 METH2의 처음 TSP 도메인을 포함하였다. 이 도메인은 보존성이 가장 크고, TSP1의 제2의 타입 I 반복체와 아미노산 유사성이 52%였다(이 도메인은 CD36에 대한 추정상의 결합 부위를 포함함). 모든 재조합 단백질은 가능한 한 2차 구조를 보존하기 위하여 천연 조건하에서 분리하였다. 6H-METH1 및 GST-METH1은 각각 히스티딘 태그 또는 GST에 융합된 METH1의 제1 TSP 유사 도메인을 포함하였다. METH1 재조합 단백질에는 정제 및 구조적 잇점을 이유로 2가지 다른 태그를 부착시켰다. 따라서, 태그 크기의 차이로, 즉 히스티딘 6 KDa와 GST 27 KDa로 크기에 차이가 났다. GST-METH2는 GST에 융합된 METH2의 제1 TSP 도메인을 포함하였다. TSP1의 마지막 2개의 타입 I 반복체에 해당하고, GST에 융합시킨 단편과 혈소판에서 정제된 천연의 TSP1를 양성 대조군으로 사용하였다. 또한, GST 단독물을 음성 대조군으로 모든 실험에 포함시켰다.
실시예 4 : 생체내 맥관형성을 방해하는 METH1 및 METH2 내의 TSP 도메인
각막 포켓 분석법
스위스 웹스터 암컷 및 수컷은 챨스 리버(미국 매사츄세츠주 보스톤 소재)에서 구입하였고, 8 내지 10 주령을 펠릿 이식용으로 사용하였다. 각막 포켓 분석법은 약간의 변형외에는 켄욘과 그의 동료[Kenyon,B.M., et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:1625-1632(1996)]가 개시한 바와 같이 실시하였다. 간략히 설명하면, 재조합 bFGF 10 ㎍과 수크랄페이트 5 ㎎을 포함하는 용액을 하이드론(에탄올 중의 200 ㎎/㎖; 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅) 10 ㎕ 및 목적의 재조합 단백질(2 ㎍)과 혼합하였다. 이 현탁액을 멸균 나일론 메시 스퀘어(소공 크기500 ㎛; 테트코 인크., 미국 뉴저지주 브리아클리프 마노 소재) 상에 침윤시키고 30 동안 건조시켰다. 그 다음, 메시의 섬유를 잡아당겨 500 ㎛3의 펠릿을 생성하고, 이것은 -20 ℃에서 보관하였다. 현미경하에서 균일한 크기의 펠릿을 선발하고 분석에 사용하였다.
마우스를 아버틴(Avertin)으로 마취시켰다. 수술용 칼과 함께 니콘 SMZ-U 절제용 현미경을 사용하여 각막을 절제하였다. 포켓에 하나의 펠릿을 이식하였다. 펠릿을 이식한 지 5일 후 각막의 맥관형성 정도를 평가하고 사진촬영하였다.
CAM 분석
융모요막 분석법은 배 발생 12 내지 14일령의 레곤(Leghorn) 병아리 배(SPAFAS, MA)에 대하여 실시하였다. 마트리겔(750 ㎍/㎖), VEGF(250 ng/메시) 및 시험될 단백질이나 펩티드를 혼합하고, 나일론 메시(포어 크기 250 ㎛; 테코 인크) 상에 놓은 뒤, 37 ℃에서 30 분간, 그 다음 4 ℃에서 2 시간 동안 연속 항온처리하여 중합을 유도하였다. 또한, 각 CAM을 위하여 양성 대조군(마트리겔 및 VEGF)과 음성 대조군(VEGF 단독)을 제조하였다. 중합된 메시를 CAM의 제3 외측 영역 위치에 놓고, 24 시간 동안 항온처리하였다. 혈관을 가시화하기 위하여 병아리 혈류에 플루오레세인 이소티오시아네이트 덱스트란(10 ㎎/㎖, 시그마) 400 ㎕를 주사하였다. 5 내지 10분동안 항온처리한 후, 병아리를 3.7 % 포름알데히드로 5 분 동안 국소 고정시켰다. 메시를 그 다음 절제하여 슬라이드 상에 올려놓았다. 컴퓨터 보조 이미지 프로그램(NIH Image 1.59)을 사용하여 형광성 강도를 분석하였다.
이 분석법에 사용된 펩티드는 키론(미국 노스캐롤라이나주 랠라이 소재)에의해 합성되었다. 서열은 아미노산 P-TSP1(430-447), P-METH1(549-563), P-METH2(529-548)에 해당하였다.
맥관형성 또는 맥관형성 억제 반응의 평가는 반응 평가에 사용된 분석법의 감도와 특이성에 크게 좌우된다. 이들 단편의 생체내 맥관형성 억제 활성을 평가하기 위하여 2가지 널리 알려진 맥관형성 분석법인 각막 포켓법 및 융모요막 분석법을 사용하였다. 각막의 육안관찰성, 접근용이성 및 무혈관성은 매우 바람직하며, 시험 물질의 국소 투여 및 혈관신생을 용이하게 한다. 눈의 각막에 만들어진 포켓에 공지량의 맥관형성 인자를 펠릿으로서 이식한다. 맥관형성 억제제를 시험하기 위하여 분자를 동일 펠릿 중에 자극제와 함께 이식하고, 그 반응을 자극제 단독물의 반응과 비교한다.
이 실험에서, bFGF는 맥관형성 자극인자로서 사용하였다. 재조합 단백질을 포함하는 펠릿을 마우스 각막에 이식하고, bFGF 유도 맥관형성 반응을 억제하는 성질을 대조군과 비교하였다. GST를 함유하는 bFGF 펠릿을 이식하였을 때, 새로운 모세 혈관이 5일 내에 각막 둘레에서부터 각막을 따라 펠릿내로 성장하였다. 이와 반대로, bFGF 펠릿에 GST-METH1 또는 GST-METH2를 첨가한 결과 혈관 성장이 완전하게 사라졌다. 표 4는 41일간의 분석으로부터 얻어진 결과를 요약한 것이다. 혈소판에서 정제한 천연의 TSP1과 GST-TSP1을 양성 대조군으로 사용하였다. 모든 분석은 동일한 농도에서 실시하였다. 그 결과, METH1 및 METH2는 맥관형성의 억제에 있어 TSP1과 유사한 억제능이 있는 것으로 암시되었다. 또한, 표준 농도의 절반이 사용된 경우에도 약하지만 확인가능한 반응이 관찰되었고, 이것은 용량 의존적 효과를시사하는 것이다.
각막 포켓 분석에서 METH1 및 METH2 재조합 단백질의 활성
bFGF 펠릿 맥관형성된 각막/총 각막
부형제 5/5
TSP1 0/5
GST 11/11
GST-TSP1-TI 1/4
GST-METH1-TSP 0/8
GST-METH2-TSP 0/8
CAM 분석에서 맥관형성 반응은 맥관형성 성장 인자를 포함하는 매트릭스 중합체내에서 성장하는 혈관의 수를 측정하여 분석한다. 재조합 METH1 및 METH2 단백질이 VEGF에 의해 유도된 CAM 분석에서 혈관신생을 억제하는 지를 측정하기 위하여, VEGF와 재조합 단백질을 함유하는 마트리겔 중합체를 CAM에 이식하였다. 각 처리 마다 3가지 다른 중합체를 포함하는 실험의 정량 분석 결과는 도 6A에 도시하였다. VEGF와 GST-METH1 또는 GST-METH2 5 ㎍을 포함하는 마트리겔 중합체는 혈관 성장을 80% 이상 억제하였다. 이와 유사한 억제능이 TSP1의 타입 I 반복체에서 유래된 GST 재조합 단백질을 사용하였을 때 관찰되었다. 또한, METH1 및 METH2 내에 존재하는 TSP 도메인의 맥관형성 억제 효과는 용량 의존적으로, 단백질 15 ㎍/㎖을 사용하였을 때 혈관 성장이 완전 억제되었다(도 6c 및 도 6d). 동일 농도에서 GST 단독물은 VEGF 자극 맥관형성에 어떤 유의적인 영향도 미치지 않았다.
인간 TSP1의 제2 또는 제3 타입 I 반복체 유래의 합성 펩티드는 천연 TSP1의 맥관형성 억제 효과를 모방할 수 있다[Tolsma, S.S., et al., J.Cell.Biol. 122:497-511(1993)]. 사실상, 19 잔기 폴리펩티드는 래트 각막내의 생체내 혈관신생을 차단하고 배양된 내피 세포의 bFGF 유도성 이동을 억제하기에 충분한 것으로 확인되었다[Vogel, T., et al., J.Cell.Biochem. 53:74-84(1993); Tolsma,S.S.,et al., J.Cell.Biol. 122:497-511(1993)]. METH1 및 METH2 TSP 도메인에서도 마찬가지 결과가 얻어지는 지를 시험하기 위하여, 동일 영역에서 유래된 펩티드를 합성하고 이들의 맥관형성 활성을 CAM 분석으로 평가하였다. 그 결과를 도 6b에 도시하였다. METH1 및 METH2의 양 TSP 도메인으로부터 유래된 펩티드는 TSP1과 유사하게 VEGF 유도성 맥관형성을 차단하였다. 이에 반해, 스크램블 펩티드는 유의적인 효과를 나타내지 않았다.
실시예 5 : 증식 분석법
인간 피부 내피 세포(HDEC)를 분리하여, 15% 태내 송아지 혈청, 25 ㎍/㎖ cAMP 및 1 ㎍/㎖ 하이드로코르티손-21-아세테이트를 보충한 EBM(클론텍스 제품, 미국 캘리포니아주 산디에고 소재)을 주입한 Vitrogen™ 코팅된 페트리디시 상에서 증식시켰다. 그 다음, 3 내지 6회 계대시킨 후, 얻어지는 세포를 사용하였다. 세포는 0.2% BSA를 함유하는 페놀 레드 제거된 EBM 하에 48 시간 동안 응집성 단층을 항온처리하여 정지상태로 만들었다. 인간 피부 섬유아세포는 신생아 포피에서 분리하고 효소적 해리시켰다. 섬유아세포와 평활근 세포를 둘다 10% 태내 소혈청이 보충된 DMEM에서 유지시켰다. 인간 유방 상피 세포(HMEC)는 클론텍스에서 구입하고 추천된 배지(유방 상피 성장 배지, MEGM)에서 유지시켰다.
3회 내지 6회 계대시킨 정지상태의 인간 피부 내피 세포를, 재조합 단백질의 존재 또는 부재하에 0.2% BSA, 0.1% 태내 송아지 혈청 및 1 ng/㎖ bFGF 보충된 EBM을 주입한 Vitrogen™ 코팅된 24 웰 평판에 평판배양하고 5% CO2, 37 ℃하에 48 시간 동안 항온처리하였다. 혈관 평활근(VSM) 및 섬유아세포 증식 분석을 위하여, 세포를 EBM 대신에 DMEM을 사용하는 것을 제외하고는 동일 조건하에 세포를 항온배양하였다. 인간 유방 상피 세포를 그 증식 배지에서 항온배양하였다. 수거하기 4 시간 전에 [3H]-티미딘(1 μCi/㎕) 펄스를 첨가하였다. 세포를 세척하고 10% TCA로 고정시켰다. [3H]-티미딘을 병입시켜 전술한 바와 같이 신틸레이션 계수로 측정하였다[Iruela-Arispe, M.L.&Sage,E.H., J.Cell.Biochem. 52:414(1993)].
매킨토시 제품인 In-Stat 소프트웨어(그래프 패드 소프트웨어)를 사용하여 통계 분석을 실시하였다. 정상 분포를 추정하여, 데이터를 1 방식 ANOVA로 분석한 다음, 그룹 간의 비교를 위하여 T 시험 던넷 시험 또는 그룹 간의 다중 비교를 위하여 스투던트-뉴만-클레우스 시험으로 분석하였다.
METH1 및 METH2가 혈관신생을 억제하는 기작을 규명하기 위하여, 내피 세포 증식에 대한 정제된 재조합 융합 단백질의 직접적인 효과를 시험하였다. 혈청 결핍된 내피 세포는 bFGF 및 FCS를 함유하는 성장 배지에 평판배양하였다. 평판배양과 동시에 재조합 단백질(3㎍/㎖)을 첨가하였다. GST 단독물의 첨가시 관찰되는 미량의 효과와는 대조적으로 40%(GST-METH1), 45%(6H-GST) 또는 36%(GST-METH2)의 억제율이 관찰되었다. TSP1의 타입 I 반복체 유래의 재조합 단백질은 유사한 억제 효과를 갖고 있었다(도 7a). 또한, METH1 또는 METH2가 매개하는 증식의 억제는 용량 의존적이었으며, 도 7e에 도시하였다. 처리 후 1일째부터 억제가 관찰되었지만 억제 효과는 독성적이지 않았고, 재조합 단백질의 제거와 후속되는 성장 인자만의 첨가가 내피 세포 증식을 회복시키는 바 가역적이었다.
내피세포에 대한 METH1 및 METH2의 증식억제 효과의 세포 특이성은 각종 비내피 세포에 대한 추가 증식 분석으로 평가하였다. 섬유아세포 또는 평활근 세포 배양물에서는 유의적인 증식 억제 효과가 관찰되지 않았다. 이와 반대로, 이들 두 세포 종류에 대한 현저하지는 않지만 재현성있는 증식 자극 효과가 관찰되었다. 이러한 결과는 재조합 단백질 제조물 내에 세포 성장의 비특이적 억제제 존재 가능성을 배제하는 것이다. 하지만, 유방 상피 세포에 대하여 METH1 및 METH2는 내피 세포만큼의 세포 증식을 억제하였다. 흥미로운 것은, TSP1 역시 시험관내 및 돌연변이 모델에서 유방 상피 세포 증식을 억제한다는 점이다.
METH1 및 METH2가 디스인테그린으로 작용할 것이라는 가능성은 이들의 맥관형성 억제 활성과 일치하는 것이다. 분명한 것은, αvβ3 및 β1 인테그린을 항체로 차단시키면 종양내 및 종양의 발생 동안 혈관신생을 억제하는 것으로 관찰되었다[Brooks, P.C., et al., Cell 85:683-693(1996); Brooks, P.C., et al., Cell 92:391-400(1998); Senger,D.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13612-13617(1997)]. 인테그린은 증식 및 이동 시그널의 매개에 중요한 역할을 하고[Schwartz, M.A. & Ingber, D.E., Mol.Biol.Cell 5:389-393(1994)], 따라서 이들 시그널의 간섭은 맥관형성 과정에 매우 바람직하지 않을 수 있다. 맥관형성의 기능적 분석은 METH1 및 METH2 중의 타입 I 반복체만을 포함하는 재조합 단백질을 사용하여 실시하였다.
METH1 및 METH2 작용의 맥관 억제 활성과 관련된 기작은 알려져 있지 않다. 현재, 본 발명자들은 이 단백질들이 분비성이고 내피 세포에 결합한다는 증거를 가지고 있다. 또한, 수용체의 동정과 시그널 도입 기작에 대해서도 연구되었다. TSP1로부터 알게된 연구 결과로부터 도출된 가설은 METH1 및 METH2가 CD36에 결합한다는 것이다. 최근, 이 스캐빈저 수용체는 TSP-1이 맥관형성 억제 효과를 나타나는 시그널의 매개에 관계하는 것으로 보고되었다[Dawson,D.W., et al., J.Cell.Biol. 138:707-717(1997)]. 서열 CSVTCG(서열 번호 83)(Asch,A.S.et al., Nature 262:1436-1439(1993); Catimel, B., et al., Biochem.J. 284:231-236(1992)] 및 GCQXR(서열 번호 84)은 CD36에 대한 1차 결합 모티프로서 제안되었다[Dawson, D.W., et al., J.Cell.Biol. 138:707-717(1997)]. METH1 및 METH2는 이들 영역 모두에서 거의 완전하게 보존되었다. 상보적이면서 발생 가능성이 있는 것은 bFGF에 대한 METH1 및 METH2의 결합이다. 헤파린 및 bFGF에 대한 겨랗??은 TSP1의 맥관형성 억제 활성의 일부분인 것으로 제안되었다[Guo,N., et al., J.Peptide Res. 49(1997)]. 이러한 성질은 METH1 및 METH2에서 역시 보존적인 WSXWS(서열 번호 82) 모티프를 통해 매개되는 것으로 나타난다. 앞으로는, 이러한 신규 단백질이 매개하는 맥관형성 억제 성질에 관여하는 시그널과 세포외 환경의 프로테아제로서의 잠재성에 대하여 노력을 기울여야 할 것이다.
실시예 6: 수탁 시료로부터 METH1 또는 METH2 cDNA 클론의 분리
수탁 시료로부터 METH1 또는 METH2를 분리하는데에는 2가지 방법을 사용할 수 있다. 첫째, 수탁 클론을 사용하여 당해 기술 분야에 공지된 기법에 따라, 예컨대 벡터 공급자가 제시한 방법이나 관련 문헌 또는 특허에 공지된 방법으로 적합한 숙주[예, XL-1 블루(스트라타진 제품)]를 형질전환시킨다. 형질전환체를 평판 당 약 150 형질전환체(콜로니)의 밀도로 1.5% 한천 평판(암피실린과 같은 적합한 선택제 포함)에 평판배양하였다. 그 다음, 단일 콜로니를 사용하여 당해 기술 분야에 공지된 핵산 분리 기법을 사용하여 DNA를 제조하였다[예, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edit., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).]
또는, 서열 번호1 또는 서열 번호 3의 양 말단에서 유래된 17개 내지 20개 뉴클레오티드의 2개의 프라이머(즉, 클론의 5'NT 및 3'NT에 결합된 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 영역내 존재)를 합성하고, 주형으로 수탁된 cDNA 플라스미드를 사용하여 METH1 또는 METH2 cDNA를 증폭시켰다. 폴리머라제 연쇄 반응은 일반적인 조건, 예컨대 상기 cDNA 주형 0.5 ㎍을 보유한 반응 혼합물 25 ㎕에서 실시하였다. 사용하기 좋은 반응 혼합물은 1.5 내지 5 mM MgCl2, 0.01%(w/v) 젤라틴, 20 μM의 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pmol의 각 프라이머 및 0.25 유니트의 Taq 폴리머라제이다. PCR은 퍼킨 엘러 세투스 자동 가열 순환기를 사용하여 35회(변성 94 ℃에서 1분; 어닐링 55 ℃에서 1분; 신장 72 ℃에서 1분) 실시하였다. 증폭 생성물은 아가로스 겔 전기영동으로 분석하고, 예상 분자량을 가진 DNA 밴드를 절제하여 정제하였다. DNA 생성물을 서브클로닝하고 서열분석하여 그 PCR 생성물이 선택된 서열인 것을 입증하였다.
수탁 클론에 존재하지 않을 수 있는 METH1 또는 METH2 유전자의 5' 또는 3'비암호 부분을 동정하는 방법에는 여러 가지 방법이 있다. 이 방법으로는, 필터 탐침, 특정 프로브를 이용한 클론 농축 및 당해 기술 분야에 공지된 5' 및 3' "RACE" 프로토콜과 유사하거나 동일한 프로토콜이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 5'RACE와 유사한 방법은 목적한 전길이 전사체 중 결실된 5' 단부를 만드는데 유용하다[Fromont-Racine et al., Nucleic Acids Res. 21(7):1683-1684(1993)].
간략히 설명하면, 특정 RNA 올리고뉴클레오티드를 전길이 유전자 RNA 전사체를 포함할 가능성이 있는 RNA 집단의 5' 단부에 결찰시킨다. 결찰된 RNA 올리고뉴클레오티드에 특이적인 프라이머와 당해의 METH1 또는 METH2 유전자의 공지 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 METH1 EH는 METH2 전길이 유전자의 5' 부분을 증폭시켰다. 이와 같이 증폭된 생성물을 그 다음 서열분석하고 전길이 유전자의 생성에 사용하였다.
전술한 방법은 폴리A+RNA가 사용될 수는 있지만, 바람직한 공급원에서 분리된 총 RNA를 사용하여 시작한다. 그 다음, RNA 제조물은, 필요한 경우 이후 RNA 리가제 단계를 방해할 수 있는 분해 또는 손상된 RNA 상의 5' 인산염기를 제거하기 위하여 포스파타제로 처리할 수 있다. 그 후, 포스파타제는 불활성화시켜야 하고, 이 RNA를 전령 RNA의 5' 단부에 존재하는 캡 구조를 제거하기 위하여 담배 산 파이로포스파타제로 처리하였다. 이 반응은 캡 절단된 RNA의 5' 단부에 5' 인산염기를 남겨, 그 후 T4 RNA 리가제를 사용하여 RNA 올리고뉴클레오티드에 결찰시킬 수 있다.
이와 같이 변형된 RNA 제조물은 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하는 제1 가닥 cDNA 합성의 주형으로 사용된다. 합성된 제1 가닥은 결찰된 RNA 올리고뉴클레오티드에 특이적인 프라이머와 당해 유전자의 공지 서열에 특이적인 프라이머를 사용하는 목적한 5' 단부의 PCR 증폭의 주형으로 사용한다. 얻어지는 생성물을 그 다음 서열분석하여, 5' 단부 서열이 METH1 또는 METH2 유전자에 속하는 것을 확인한다.
실시예 7 : METH1 또는 METH2의 박테리아 발현
본 발명의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 실시예 5에 개략된 바와 같이 DNA 서열의 5' 단부와 3' 단부에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켜 삽입 단편을 합성하였다. cDNA 삽입체를 증폭시키는데 사용된 프라이머는, 바람직하게는 프라이머의 5' 단부에 BamHI 및 XbaIrhk 같은 제한 부위를 포함하여 증폭된 생성물을 발현 벡터에 클로닝할 수 있어야 한다. 예를 들어, BamHI 및 XbaI은 박테리아 발현 벡터 pQE-9 상의 제한 효소 부위에 상응한다(퀴아겐 인크. 제품, 미국 캘리포니아주 채스워스 소재). 이 플라스미드 벡터는 항생제 내성(Ampr), 박테리아 복제 기원(ori), IPTG 조절성 프로모터/오퍼레이터(P/O), 리보솜 결합 부위(RBS), 6-히스티딘 태그(6-His) 및 제한 효소 클로닝 부위를 암호한다. pQE-9 벡터를 BamHI 및 XbaI으로 분해하고, 박테리아 RBS에서 리딩 프레임이 개시되게 유지하면서 증폭된 단편을 pQE-9 벡터에 결찰시킨다. 그 다음, 이 결찰 혼합물을 사용하여, lacI 억제인자를발현하며 가나마이신 내성(Kanr)을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다중 카피를 포함하는 대장균 균주 M15/rep4(퀴아겐 인크 제품)를 형질전환시킨다. 형질전환체를 LB 평판 상에서의 증식성으로 동정하고, 암피실린/가나마이신 내성 콜로니를 선발한다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한 효소분석으로 확인한다.
바람직한 작제물을 함유하는 클론은 Amp(100 ㎍/㎖) 및 Kan(25㎍/㎖)이 보충된 LB 배지에서 액체 배양으로 하룻밤(O/N) 동안 증식시킨다. 대량 배양을 위하여 O/N 배양물을 1:100 내지 1:250의 비율로 접종한다. 세포를 광학밀도 600(O.D.600)이 0.4 내지 0.6이 되게 증식시킨다. 그 다음, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토 피라노사이드)를 최종 농도가 1 mM이 되게 첨가한다. IPTG는 lacI 억제인자를 불활성화시키고 P/O를 제거하여 유전자 발현을 증가시킨다.
세포는 3 내지 4 시간 동안 더 증식시킨다. 그 다음, 세포를 원심분리로 수거한다(6000 x g에서 20분). 세포 펠릿을 카오트로픽제인 6 몰의 구아니딘 HCl 중에서 4 ℃하에 3 내지 4 시간 동안 교반하여 가용화시킨다. 세포 찌꺼기는 원심분리로 제거하고, 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 니켈-니트릴로-트리아세트산("Ni-NTA") 친화성 수지 컬럼(퀴아겐 인크에서 입수) 상에 장입한다. 6 x His 태그를 가진 단백질은 Ni-NTA 수지에 높은 친화성으로 결합하며 간단하게 1단계 절차로 정제할 수 있다(상세한 내용은 QIAexpressionist(1995) 퀴아겐 인크. 상기 참조하기 바란다).
간략히 설명하면, 상청액을 6M 구아니딘-HCl(pH 8) 중의 컬럼에 장입하고,이 컬럼을 먼저 6M 구아니딘 HCl(pH 8) 10 부피, 그 다음 6 M 구아니딘-HCl(pH 6) 10 부피로 세척하고 마지막으로 폴리펩티드를 6 M 구아니딘-HCl(pH 5)로 용출시킨다.
정제된 METH1 또는 METH2 단백질은 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 50 mM Na 아세테이트(pH 6) 완충액 + 200 mM NaCl에 대하여 투석하여 복원시킨다. 또는, Ni-NTA 컬럼 상에 고정화시킨 상태에서 METH1 또는 METH2 단백질을 충분히 재폴딩시킬 수 있다. 바람직한 조건은 프로테아제 억제제를 포함하는 500 mM NaCl, 20% 글리세롤, 20 mM Tris/HCl(pH 7.4)에서 선형 6M-1M 우레아 구배를 사용하여 복원시키는 것이다. 복원은 1.5 시간 이상 동안 실시되어야 한다. 복원 후, 단백질은 250 mM 이미다졸을 첨가하여 용출시킨다. 이미다졸은 PBS 또는 50 mM 아세트산나트륨(pH 6) 완충액 + 200 mM NaCl에 대한 최종 투석 단계로 제거한다. 정제된 METH1 또는 METH2 단백질은 -80 ℃에서 동결하거나 4 ℃에서 보관한다.
상기 발현 벡터외에도, 본 발명은 또한 pHE4a(ATCC 수탁 번호 209645, 수탁일 1998.2.25)라고 불리는, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합된 파지 오퍼레이터 및 프로모터 인자를 포함하는 발현 벡터를 더 포함한다. 이 벡터는 1) 선택 마커로서 네오마이신포스포트란스퍼라제 유전자, 2) 대장균의 복제 기원, 3) T5 파지 프로모터 서열, 4) 2개의 lac 오퍼레이터 서열, 5) 샤인-델가노 서열 및 6) 락토스 오페론 억제인자 유전자(lacIq)를 포함한다. 복제 오리진(oriC)은 pUC19(LTI, 미국 매릴랜드주 개터스버그 소재)에서 유래되는 것이다. 프로모터 서열과 오퍼레이터 서열은 합성하여 제조한다.
DNA는 벡터를 NdeI 및 XbaI, BamHI, XhoI 또는 Asp 718로 제한 분해하고, 제한분해된 생성물을 겔 상에 전개시키고, 보다 큰 단편(스터퍼 단편은 약 310 염기쌍이어야 한다)을 분리하여 pHEa에 삽입할 수 있다. 이 DNA 삽입체는 실시예 5에 기재된 PCR 프로토콜에 따라, NdeI 및 XbaI, BamHI, XhoI 또는 Asp 718(3' 프라이머)에 대한 제한 부위를 가진 PCR 프라이머를 사용하여 제조한다. 이 PCR 삽입체는 겔 정제하고 상용가능한 효소로 제한분해한다. 삽입체와 벡터는 표준 프로토콜에 따라 결찰시킨다.
유전자조작된 벡터는 박테리아 시스템에서 단백질을 발현하도록 상기 프로토콜에서 용이하게 치환시킬 수 있다.
실시예 8: 봉입체로부터의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 정제
봉입체 형태로 존재하는 경우 대장균에서 발현되는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 정제하는데 다음과 같은 대안적 방법을 사용할 수 있다. 다른 기재가 없는 한, 모두 다음과 같은 단계를 4 내지 10 ℃에서 실시한다.
대장균 발효의 생산 단계를 완료한 즉시, 세포 배양물은 4 내지 10 ℃로 냉각하고, 15,000 rpm(Heraeus Sepatech)에서 연속 원심분리하여 세포를 수거하였다. 세포 페이스트의 단위 중량당 예상되는 단백질 수율과 요구되는 정제 단백질의 양에 기초하여, 적당한 세포 페이스트 양(중량)을, 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7.4를 함유하는 완충 용액에 현탁시킨다. 세포를 고전단 혼합기를 사용하여 균질 현탁액으로 분산시킨다.
그 다음, 이 용액을 미량유동기(Microfluidics, Corp. 또는 APV Gaulin,Inc.)를 통해 4000 내지 6000 psi에서 2회 통과시켜 세포를 용해시켰다. 균질액은 최종 농도가 0.5M이 되는 NaCl 용액과 혼합한 다음, 7000 x g에서 15 분 동안 원심분리하였다. 얻어지는 펠릿을 0.5M NaCl, 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7.4를 사용하여 다시 세척하였다.
얻어지는 세척된 봉입체를 1.5 M 구아니딘 염산염(GuHCl)으로 2 내지 4 시간 동안 가용화하였다. 7000 xg에서 15 분 동안 원심분리한 후, 펠릿을 분리하고 폴리펩티드를 포함하는 상청액을 4 ℃에서 하룻밤 동안 항온처리하여 GuHCl을 더 추출시켰다.
고속 원심분리(30,000 x g)로 불용성 입자를 제거한 후, GuHCl 추출물을 50 mM 나트륨, pH 4.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA를 함유하는 20 부피량의 완충액과 강력한 교반하에 신속하게 혼합하여 GuHCl 가용화된 단백질을 재폴딩시킨다. 재폴딩된 단백질 희석 용액은 추가 정제 단계 이전에 혼합함이 없이 4 ℃에서 12 시간 동안 유지시킨다.
재폴딩된 폴리펩티드 용액을 청징화하기 위하여, 미리 적당한 표면적의 0.16 ㎛ 막 필터(예, Filtron)를 구비하고 40 mM 아세트산나트륨(pH 6.0)으로 평형화시켜 준비한 접선 여과 단위를 사용한다. 여과된 시료를 양이온 교환 수지(예, Poros HS-50, Perseptive Biosystems) 상에 장입한다. 컬럼을 40 mM 아세트산 나트륨(pH 6.0)으로 세척하고, 동일 완충액 중의 250 mM, 500 mM, 1000 mM 및 1500 mM NaCl로 단계별로 용출시킨다. 용출액의 280 nm에서의 흡광도를 연속 모니터한다. 분획을 수집하고 SDS-PAGE로 추가 분석한다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 포함하는 분획을 그 다음 수집하고 4 부피의 물과 혼합한다. 희석된 시료를, 미리 준비한 직렬로 배열된 강 음이온 교환 수지(Poros HQ-50, Perseptive Biosystems) 및 약 음이온 교환 수지(Poros CM-20, Perseptive Biosystems) 컬럼 세트에 장입하였다. 이 컬럼의 평형화는 40 mM 아세트산 나트륨(pH 6.0)으로 실시한다. 양 컬럼의 세척은 40 mM 아세트산 나트륨(pH 6.0), 200 mM NaCl로 실시한다. 그 다음, CM-20 컬럼을 0.2M NaCl, 50 mM 아세트산 나트륨(pH 6.0) 내지 1.0M NaCl, 50 mM 아세트산나트륨(pH 6.5) 범위의 10 컬럼 부피의 선형 구배를 사용하여 용출시킨다. 용출액을 일정한 A280하에서 모니터하여 분획을 수집한다. 그 다음, 폴리펩티드를 포함하는 분획(예컨대, 16% SDS-PAGE에 의해 결정됨)을 수집한다.
그 결과 얻어지는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 상기 재폴딩 및 정제 단계 후 95% 이상의 순도를 나타내어야 한다. 정제 단백질 5 ㎍을 장입하였을 때 쿠마시 블루 염색된 16% SDS-PAGE 겔에서는 어떤 주요한 오염물 밴드도 관찰되지 않아야 한다. 또한, 정제된 METH1 또는 METH2 단백질은 내독소/LPS 오염에 대하여 시험하고, 일반적으로 LPS 함량은 LAL 분석 결과 0.1 ng/㎖ 미만이었다.
실시예 9 : 바큘로바이러스 발현계에서의 METH1 또는 METH2의 클로닝과 발현
본 실시예에서는 바큘로바이러스에 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 METH1 또는 METH2를 발현하도록 하기 위하여 플라스미드 tu틀 벡터 pA2를 사용한다. 이 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 다각체병 바이러스(AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터와 그 다음 사용하기 좋은 제한 부위(예컨대, BamHI, XbaI 및 Asp718)를 포함한다. 효과적인 폴리아데닐화를 위하여 시미안 바이러스 40("SV40")의 폴리아데닐화 부위를 사용한다. 재조합 바이러스를 용이하게 선발하기 위하여, 플라스미드에 동일 배향으로 약한 드로소필라 프로모터의 제어하에 대장균 유래의 β-갈락토시다제 유전자와, 그 다음 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 시그널을 첨가한다. 삽입된 유전자에는 양측에 야생형 바이러스 DNA와 세포 매개 동종 재조합되는 바이러스 서열이 인접하여 클로닝된 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 발현하는 생존 바이러스를 생성한다.
상기 벡터 대신에 기타 많은 바큘로바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 그 예로는 당업자라면 쉽게 알 수 있는 pAc373, pVL941 및 pAcIM1이 있으며, 작제물이 전사, 해독, 분비 등을 위한 적당하게 배치된 시그널, 예컨대 시그널 펩티드 및 필요한 경우 인프레임 AUG를 제공한다면 모두 이용가능하다. 이러한 벡터에 대해서는 문헌[Luckow et al., Virology 170:31-39(1989)]에 개시되어 있다.
구체적으로, AUG 개시 코돈과 모든 천연 결합된 리더 서열을 포함하여 수탁된 클론내에 포함된 METH1 또는 METH2 cDNA 서열은 실시예 5에 기재된 PCR 프로토콜을 사용하여 증폭시킨다. 분비형 단백질을 생성하기 위하여 천연 발생의 시그널 서열이 사용된다면 pA2 벡터에는 제2의 시그널 펩티드가 필요치 않다. 또는, 벡터는 문헌[Summers et al., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Precedures," Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555(1987)]에 기재된 표준 방법을 사용하여 바큘로바이러스 리더 서열을 포함하도록 변형시킬 수 있다(pA2 GP).
증폭된 단편은 시판되는 키트("Geneclean," BIO 101 Inc., 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리한다. 그 다음, 단편을 적당한 제한 효소로 분해하고, 그 다음 1% 아가로스 겔상에서 정제한다.
이 플라스미드를 대응하는 제한 효소로 분해하고, 경우에 따라 소 내장 포스파타제를 사용하여 당해 기술 분야에 공지된 통상적 절차에 따라 탈인산화시킬 수 있다. 그 다음, DNA를 시판용 키트("Geneclean," BIO 101 Inc., 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리한다.
이 단편과 탈인산화된 플라스미드를 T4 DNA 리가제와 함께 결찰시킨다. 대장균 HB101 또는 기타 적합한 대장균 숙주(예, XL-1 Blue, 스트라타진 클로닝 시스템스 제품, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 결찰 혼합물로 형질전환시키고 배양 평판 상에 스프레딩한다. 플라스미드를 함유하는 박테리아를 각 콜로니의 DNA를 분해하고 분해 생성물을 겔 전기영동으로 분석하여 동정한다. 클로닝된 단편의 서열은 DNA 서열분석으로 확인한다.
상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드 5 ㎍을, 문헌[Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:7413-7417(1987)]에 기재된 리포펙션 방법을 사용하여 시판되는 선형화된 바큘로바이러스 DNA("BaculoGolda바큘로바이러스 DNA" 파밍겐 제품, 미국 캘리포니아주 산디에고 소재) 1.0 ㎍과 동시형질감염시킨다. 즉, BaculoGolda바이러스 DNA 1 ㎍과 플라스미드 5 ㎍을, 무혈청 그레이스 배지(라이프 테크놀로지스 인크. 제품, 미국 매릴랜드주 게터스버그 소재) 50 ㎕를 함유하는 미량역가 평판의 멸균 웰에서 혼합한다. 그 다음, 리포펙틴 10 ㎕와 그레이스 배지 90 ㎕를 첨가하고, 혼합한 뒤, 실온에서 15 분 동안 항온처리한다. 그 후, 형질감염 혼합물을, 혈청 제거된 그레이스 배지 1 ㎖를 주입한 35 ㎜ 조직 배양판에 접종한 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 그 다음, 평판을 27 ℃에서 5 시간 동안 항온처리한다. 그 후, 평판으로부터 형질감염 용액을 제거하고, 10% 태내 송아지 혈청 보충된 그레이스 곤충 배지 1 ㎖를 첨가한다. 그 후, 27 ℃에서 4 일 동안 배양을 지속한다.
4일 후, 상청액을 수집하고 문헌[Summers and Smith, 상기 문헌 설명 참조]에 기재된 바와 같이 플라크 분석을 실시한다. "Blue Gal"(라이프 테크놀로지스 인크 제품, 게터스버그 소재)을 주입한 아가로스 겔을 사용하여, 청색 염색된 플라크를 생성하는 gal 발현 클론을 용이하게 동정 및 분리한다. [이러한 유형의 "플라크 분석"에 대한 상세한 설명은 라이프 테크놀로지스 인크(게터스버그 소재)에서 배포한 곤충 세포 배양 및 바큘로바이러스학 안내서(9쪽 내지 10쪽)에 개시되어 있다]. 적당한 항온처리후, 청색 염색된 플라크를 마이크로피펫터(예, 에펜도르프)의 팁으로 취한다. 그레이스 배지 200 ㎕를 함유하는 미량원심분리 관에, 재조합 바이러스를 함유하는 한천을 재현탁하고, 이 재조합 바큘로바이러스를 함유하는 현탁액을 사용하여 35 ㎜ 접시에 접종된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후, 이 배양 접시의 상청액을 수거하여, 4 ℃에 보관한다.
폴리펩티드의 발현을 입증하기 위하여, 10% 열불활성화된 FBS 보충된 그레이스 배지에서 Sf9 세포를 증식시킨다. 이 세포를 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 바큘로바이러스로 감염다중도("MOI")가 약 2가 되게 감염시킨다. 방사능표지된 단백질이 필요하다면, 6 시간 후 배지를 제거하고 메티오닌과 시스테인이 없는 SF900 II 배지[라이프 테크놀로지스 인크(미국 매릴랜드주 록빌 소재) 제품]로 대체한다. 42 시간 후,35S-메티오닌 5 μCi와35S-시스테인 5 μCi(아머샴 제품)를 첨가한다. 이 세포들을 16 시간 동안 더 항온배양한 다음, 원심분리하여 수거한다. 상청액 중의 단백질 뿐만 아니라 세포내 단백질도 SDS-PAGE와 그 다음 자동방사능사진(방사능표지된 경우)으로 분석한다.
정제 단백질의 아미노 말단에 있는 아미노산 서열을 미량서열분석하면 생성된 METH1 또는 METH2 단백질의 아미노 말단 서열을 측정할 수 있다.
실시예 10 : 포유류 세포에서의 METH1 또는 METH2의 발현
METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 일반적인 포유류 발현 벡터로는 mRNA의 전사 개시를 매개하는 프로모터 인자, 단백질 암호 서열 및 전사 종결과 전사체의 폴리아데닐화에 필요한 시그널을 포함한다. 부가 인자로는, 인헨서, 코작 서열 및 RNA 스플라이싱을 위한 공여체 및 수용체 부위가 인접해있는 중재 서열을 포함한다. 고도로 효율적인 전사는 SV40의 초기 프로모터와 후기 프로모터, 레트로바이러스(예, RSV, HTLVI, HIVI) 유래의 장 말단 반복체(LTR) 및 시토메갈로바이러스의 초기 프로모터에 의해 달성된다. 하지만, 세포 인자 역시 사용될 수 있다(예, 인간 액틴 프로모터).
본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합한 발현 벡터로는, 예컨대 pSVL 및pMSG(파마시아제품, 스웨덴 웁살라 소재), pRSVcat(ATCC 37152), pSV2DHFR(ATCC 37146), pBC12MI(ATCC 67109), pCMVSport 2.0 및 pCMVSport 3.0와 같은 벡터가 있다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포로는, 인간 Hela, 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos1, Cos7 및 CV1, 메추라기 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포가 있다.
또는, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드가 염색체에 통합된 적합한 세포주에서 발현시킬 수 있다. DHFR, gpt, 네오마이신, 하이그로마이신과 같은 적합한 마커로의 동시형질감염은 형질감염된 세포를 용이하게 동정 및 분리될 수 있도록 한다.
또한, 형질감염된 METH1 또는 METH2 유전자는 다량의 암호된 단백질을 발현하도록 증폭시킬 수 있다. DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소) 마커는 당해 유전자의 수백 카피 또는 심지어 수천 카피를 보유하는 세포를 발생시키는데 유용하다[예컨대, Alt, F.W., et al., J.Biol.Chem. 253:1357-1370(1978); Hamlin, J.L. and Ma, C., Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143(1990); Page, M.J. and Sydenham, M.A., Biotechnology 9:64-68(1991)]. 또 다른 유용한 선택 마커는 효소 글루타민 신타제(GS)[Murphy et al., Biochem J. 227:277-279(1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175(1992)]. 이러한 마커를 사용하여 포유류 세포를 선택 배지에서 증식시키고 최고 내성이 있는 세포를 선발한다. 이러한 세포주는 염색체에 통합된 증폭 유전자를 포함한다. 중국 햄스터 난소(CHO) 및 NSO 세포도 종종 단백질의 생산에 사용된다.
플라스미드 pSV2-DHFR(ATCC 수탁 번호 37146), 발현 벡터 pC4(ATCC 수탁 번호 209646) 및 pC6(ATCC 수탁 번호 209647)의 유도체는 라우스 육종 바이러스의 강한 프로모터(LTR)[Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447(March, 1985)] + CMV 인헨서의 단편[Boshart et al., Cell 41:521-530(1985)]을 포함한다. 다중 클로닝 부위, 예컨대 제한 효소 절단 부위로 BamHI, XbaI 및 Asp718을 갖는 다중 클로닝 부위는 METH1 또는 METH2의 클로닝을 용이하게 한다. 또한, 벡터에는 3' 인트론, 래트 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 및 종결 시그널, 및 SV40 초기 프로모터의 제어하의 마우스 DHFR 유전자를 포함한다.
천연 발생의 시그널 서열이 분비형 단백질을 생산하는 데 사용되는 경우에는 벡터에 제2의 시그널 펩티드가 필요하지 않다. 또는, 천연 발생의 시그널 서열이 사용되지 않는 경우에는, 단백질을 세포로부터 분비시키기 위하여 이종 시그널 서열을 포함하도록 벡터를 변형시킬 수 있다(예, WO 96/34891 참조).
그 다음, 증폭 단편을 적당한 제한 효소로 분해하고, 시판용 키트("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca)를 사용하여 1% 아가로스 겔상에서 정제한다. 분리된 단편과 탈인산화된 벡터를 그 다음 T4 DNA 리가제로 결찰시킨다. 그 후, 대장균 HB101 또는 XL-1 Blue 세포를 형질전환시키고, 박테리아가 플라스미드 pC6 또는 pC4에 삽입된 단편을 포함하는 지를 제한 효소 분석 등으로 동정한다.
활성 DHFR 유전자가 결실된 중국 햄스터 난소 세포도 형질감염에 사용된다. 발현 플라스미드 pC6 또는 pC4 5 ㎍을 플라스미드 pSVneo 0.5 ㎍과 리포펙틴을 사용하여 동시형질감염시킨다(Felgner et al., 상기 문헌 참조). 플라스미드 pSV2-n대는 우성 선택 마커인, G418을 비롯한 일군의 항생제에 대한 내성을 부여하는 효소를 암호하는 Tn5 유래의 neo 유전자를 포함한다. 세포를 1 ㎎/㎖ G418 보충된 알파 마이너스 MEMdp 접종한다. 2일 후, 세포를 트립신처리하고, 10, 25 또는 50 ng/㎖ 메토트렉세이트 + 1 ㎎/㎖ G418이 보충된 알파 마이너스 MEM을 주입한 하이브리도마 클로닝 평판(Greiner, 독일)에 접종한다. 약 10 내지 14일 후, 단일 클론을 트립신처리하고, 여러 농도의 메토트렉세이트(50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)를 사용하는 6웰 페트리 접시 또는 10 ㎖ 플라스크에 접종한다. 최고 농도의 메토트렉세이트에서 성장하는 클론을, 보다 고농도의 메토트렉세이트(1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 mM, 20 mM)를 함유하는 새로운 6웰 평판에 전이시킨다. 100 내지 200 μM에서 성장하는 클론이 얻어질 때까지 이와 동일한 절차를 반복한다. METH1 또는 METH2의 발현은, 예컨대 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯이나 역상 HPLC 분석으로 분석한다.
실시예 11: N 말단 및/또는 C 말단 결실 돌연변이체의 작제
다음과 같은 일반 방법을 사용하여 N말단 또는 C말단 결실된 METH1 또는 METH2 결실 돌연변이체를 클로닝한다. 일반적으로, 약 15 내지 25개 뉴클레오티드로 된 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 목적 5' 위치 및 3' 위치에서 유래하는 것이다. 프라이머의 5' 위치 및 3' 위치는 바람직한 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편에 기초하여 결정한다. 필요한 경우, 폴리뉴클레오티드 단편이 암호하는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편을 발현시키기 위하여 각각 5' 프라이머 및 3' 프라이머에 개시 및 종결 코돈을 첨가한다. 바람직한 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편은 본 명세서의 "폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 단편" 부분에서 전술한 N 말단 및 C 말단 결실 돌연변이체를 암호하는 것이다.
또한, 바람직한 벡터에 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편의 클로닝을 용이하게 하는 제한 부위를 포함하는 추가 뉴클레오티드를 5' 및 3' 프라이머 서열에 첨가할 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편은 본 명세서에 기재되거나 당해 기술 분야에 공지된 적당한 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 조건을 사용하여 게놈 DNA 또는 수탁된 cDNA 클론으로부터 증폭시킨다. 본 발명의 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편이 암호하는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편은 전길이 폴리펩티드와 동일한 일반 방식으로 발현 및 정제할 수 있다. 물론, 특정 단편과 전길이 폴리펩티드 간의 화학적 성질 및 물리적 성질의 차이 때문에 통상적인 변법이 필요할 수도 있다.
본 발명을 한정하지 않으면서 예시하는 수단으로서, METH1 폴리펩티드 단편 D-40 내지 S-950 또는 METH2 폴리펩티드 단편 L-20 내지 L-890을 암호하는 폴리뉴클레오티드는 다음과 같이 증폭 및 클로닝한다. 제한 부위와 그 다음 개시 코돈 및 이와 프레임이 맞게 결합된 D-40 또는 L-20으로 각각 시작하는 폴리펩티드 단편의 N 말단 부위를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' 프라이머를 제조한다. 또한, 제한 부위와 그 다음 개시 코돈 및 이와 프레임이 맞게 결합된 S-950 또는 L-890으로 각각 끝나는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편의 C 말단 부위를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 상보적인 3' 프라이머를 제조한다.
증폭된 폴리뉴클레오티드 단편 및 발현 벡터를, 프라이머내 부위를 인지하는 제한 효소로 분해한다. 분해된 폴리뉴클레오티드를 함께 결찰시킨다. METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편을, 바람직하게는 프로모터의 하류에 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편 암호 영역이 배치되는 방식으로 제한 발현 벡터에 삽입한다. 결찰 혼합물을 사용하여, 본 명세서의 실시예에 기재된 표준 절차에 따라 컴피턴트 대장균 세포를 형질전환시킨다. 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 클로닝된 DNA를 제한 분석, PCR 및 DNA 서열분석으로 확인한다.
실시예 12 : METH1 또는 METH2의 단백질 융합체
METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 다른 단백질과 바람직하게 융합될 수 있다. 이 융합 단백질은 각종 용도에 사용될 수 있다. 예컨대, His 태그, HA 태그, 단백질 A, IgG 도메인 및 말토스 결합 단백질에 대한 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 융합은 정제를 용이하게 해준다[예, 실시예 7; EP A 394,827; Traunecker, et al., Nature 331:84-86(1988) 참조]. 이와 마찬가지로, IgG-1, IgG-3 및 알부민에 대한 융합은 생체내 반감기를 증가시킨다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 융합된 핵 국재화 시그널은 그 단백질을 특정 준세포 위치로 표적화할 수 있는 반면, 공유 이종이량체 또는 동종이량체는 융합 단백질의 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 또한, 융합 단백질은 1 이상의 기능을 갖는 키메라 분자를 생성할 수 있다. 마지막으로, 융합 단백질은 비융합 단백질과 비교하여 볼 때 융합 단백질의 용해성 및/또는 안정성을 증가시킬 수 있다. 전술한 융합 단백질의 모든 유형은 IgG 분자에 대한 폴리펩티드의 융합에 대하여 개략한 다음과 같은 프로토콜이나 실시예 7에 설명된프로토콜을 변형시켜 제조할 수 있다.
간략히 설명하면, IgG 분자의 인간 Fc 부분은 하기 기재되는 서열의 5' 말단과 3' 말단에 전개되는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킬 수 있다. 또한, 이 프라이머들은 발현 벡터, 바람직하게는 포유류 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 하는 사용하기 좋은 제한 효소 부위를 보유해야 한다.
예를 들어, pC4(수탁 번호 209646)가 사용된다면, 인간 Fc 부분은 BamHI 클로닝 부위에 결찰시킬 수 있다. 3' BamHI 부위는 제거되어야 한다. 그 다음, 인간 Fc 부분를 포함하는 벡터를 BamHI으로 제한 분해하여 벡터를 선형화하고, 실시예 5에 기재된 PCR 프로토콜로 분리한 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 상기 BamHI 부위에 결찰시킨다. 폴리뉴클레오티드는 종결 코돈없이 클로닝해야 한다. 그렇지 않으면 융합 단백질은 생성되지 않을 것이다.
천연 발생의 시그널 서열이 분비형 단백질을 생성하는 데 사용된다면, pC4에는 제2 시그널 펩티드가 필요하지 않는다. 또는, 천연 발생의 시그널 서열이 사용되지 않는 경우에는, 단백질을 세포로부터 분비시키기 위하여 이종 시그널 서열을 포함하도록 벡터를 변형시킬 수 있다(예, WO 96/34891 참조).
인간 IgG Fc 영역
실시예 13: 항체 생산
본 발명의 항체는 다양한 방법으로 제조할 수 있다(Current Protocols 2장 참조). 예를 들어, 폴리클로널 항체를 포함하는 혈청 생성을 유도하기 위하여 METH1 또는 METH2를 발현하는 세포를 동물에 투여한다. 바람직한 방법으로서, METH1 또는 METH2 단백질의 제조물을 제조하고 천연 오염물이 거의 없어지도록 정제한다. 이러한 제조물을 그 다음 동물에 도입시켜 비활성이 보다 큰 폴리클로널 항혈청을 생성한다.
가장 바람직한 방법으로서, 본 발명의 항체는 모노클로널 항체(또는 이의 단백질 결합 단편)이다. 이러한 모노클로널 항체는 하이브리도마 기법을 사용하여 제조할 수 있다. (Kohler et al., Nature 256:495(1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511(1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292(1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp.563-681(1981)]. 일반적으로, 이러한 절차는 동물(바람직하게는 마우스)을 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 보다 바람직하게는 분비형 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 발현 세포로 면역화하는 것을 포함한다. 이러한 세포는 모든 적합한 조직 배양 배지에서 배양할 수 있지만, 10% 태내 송아지 혈청(약 56 ℃에서 불활성화)이 보충되고, 약 10 g/l 비필수 아미노산, 약 1000 U/㎖ 페니실린 및 약 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 어얼스 변형 이글 배지에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
이러한 마우스의 비장세포를 추출하여 적합한 골수종 세포주와 융합한다. 모든 적합한 골수종 세포주를 본 발명에 따라 이용할 수 있지만, ATCC에서 입수용이한 양친 골수종 세포주(SP20)을 이용하는 것이 바람직하다. 융합 후, 결과적으로 얻어지는 하이브리도마 세포는 HAT 배지에서 선택적으로 유지하고, 그 다음 문헌[Wands et al.,Gastroenterology 80:225-232(1981)]에 기재된 한계 희석으로 클로닝한다. 이러한 선택을 통해 얻어진 하이브리도마 세포를 그 다음 분석하여, METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 동정한다.
또는, METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 결합할 수 있는 또 다른 항체는 항유전인자형 항체를 사용하여 2단계 절차로 제조할 수 있다. 이러한 방법은 항체 자체가 항원이고, 따라서 제2 항체에 결합하는 항체를 얻을 수 있다는 사실을 이용한다. 이러한 방법에 따라, 단백질 특이 항체를 사용하여 동물, 바람직하게는 마우스를 면역화시킨다. 이러한 동물의 비장세포를 사용하여 하이브리도마 세포를 제조하고, 이 하이브리도마 세포를 선발하여 METH1 또는 METH2 단백질 특이 항체에 대한 결합능이 METH1 또는 METH2에 의해 차단될 수 있는 항체를 생성하는 클론을 동정한다. 이러한 항체는METH1 또는 METH2 단백질 특이 항체에 대한 항유전인자형 항체를 포함하고, 동물을 면역화하는데 사용하여 또 다른 METH1 또는 METH2 단백질 특이 항체의 형성을 유도할 수 있다.
본 발명의 항체의 Fab 및 F(ab')2 및 기타 다른 단편은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 사용할 수 있다. 이러한 단편은 일반적으로 파파인(Fab 단편 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생성)과 같은 효소를 사용하여 단백분해 절단으로 생성한다. 또는, 분비형 METH1 또는 METH2 단백질 결합 단편은 재조합 DNA 기술이나 합성 화학 기법을 통해 제조할 수 있다.
인간 중에서 항체를 생체내 사용하기 위해서는, "인체화된" 키메라 모노클로널 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체는 전술한 모노클로널 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 유래의 유전자 작제물을 사용하여 제조할 수 있다. 키메라 항체의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다[Morrison, Science 229:1202(1985); Oi et al., BioTechniques 4:214(1986); Cabilly et al., 미국 특허 제4,816,567호; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 8702671; Boulianneet al., Nature 312:643(1984); Neuberger et al., Nature 314:268(1985)].
실시예 14: 고처리량 선별 분석을 위한 METH1 또는 METH2 단백질의 제조
다음과 같은 프로토콜은 시험될 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 생성한다. 이 상청액은 그 다음, 실시예 16 내지 23에 기재되는 선발 분석법에 사용할 수 있다.
첫째, 폴리 D-리신(644 587 뵈링거 맨하임) 모 용액(PBS 중의 1 ㎎/㎖)을 PBS(칼슘 또는 마그네슘 제거됨 17-516F Biowhittaker) 중에 1:20으로 희석하여 작업 용액 50 ㎍/㎖로 만든다. 이 용액 200 ㎕를 각 웰(24웰 평판)에 첨가하고 실온에서 20 분 동안 항온처리한다. 각 웰 상에 용액을 분배한다(주: 12 채널 피펫터에 하나 걸른 채널 상의 팁을 사용할 수 있다). 폴리D 리신 용액을 흡인건조하고 1 ㎖ PBS(인산염 완충 식염수)로 세척한다. PBS는 세포를 평판배양하기 전까지 웰에 유지되어야 하고, 평판은 최고 2주 전에 폴리리신으로 미리 코팅되어 있을 수 있다.
293T 세포(P+20을 통과한 세포는 보유하지 않음)를 5 ㎖ DMEM[둘베코 변형 이글 배지)(4.5 G/L 글루코스 및 L-글루타민(12-604F Biowhittaker)/10% 열불활성화된 FBS(14-503F Biowhittaker)/1x Penstep(17-602E Biowhittaker) 보유)]에 2 x 105세포/웰의 농도로 평판배양한다. 세포를 하룻밤 동안 증식시킨다.
다음날, 멸균 용액 용기(300 ㎕ 리포펙타민(18324-012 Gibco/BRL) 및 5 ㎖ Optimem I(31985070 Gibco/BRL)/96웰 평판)에서 함께 혼합한다. 소량의 다중 채널 피펫터를 사용하여 실시예 10 내지 12에 기재된 방법으로 제조한 폴리뉴클레오티드 삽입체를 포함하는 발현 벡터 약 2 ㎍씩을 적합하게 표지된 96웰 둥근 바닥 평판에주입한다. 다중 채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 리포펙타민/Optimem I 혼합물 50 ㎕를 첨가한다. 위아래로 천천히 피펫팅하여 혼합한다. 실온에서 15 내지 45 분 동안 항온처리한다. 약 20분 후, 다중채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 Optimem I 150 ㎕를 첨가한다. 대조군으로, 삽입체가 결실된 벡터 DNA 1 평판은 각 형질감염 세트로 형질감염시켜야 한다.
바람직하게는, 형질감염은 다음과 같이 태그 티밍(tag-teaming)에 의해 실시하는 것이 좋다. 태그 티밍에 의해 시간에 맞게 작업물을 반으로 나누고, 세포는 PBS 상에 지나치게 오랫동안 두지 않아야 한다. 먼저, 사람 A가 4개의 24웰 평판의 세포로부터 배지를 흡인제거하고, 그 다음 사람 B가 각 웰을 0.5 내지 1 ㎖ PBS로 세정한다. 그 후, 사람 A가 PBS 세정액을 흡인제거하고, 사람 B가 하나 걸른 채널 상의 팁을 장착한 12 채널 피펫터를 사용하여 DNA/리포펙트아민/OptimemI 복합체 200 ㎕를 먼저 홀수 웰에, 그 다음 짝수 웰에 첨가하여 24웰 평판의 각 웰에 첨가한다. 37 ℃에서 6 시간 동안 항온배양한다.
세포를 항온배양하면서, 적당한 배지, 1x penstrep이 첨가된 DMEM 중의 1% BSA 또는 HGS CHO-5 배지(CaCl2(무수물) 116.6 ㎎/L; CuSO4-5H2O 0.00130 ㎎/L; Fe(NO3)3-9H2O 0.050 ㎎/L ; FeSO4-7H2O 0.417 ㎎/L; KCl 311.80 ㎎/L ; MgCl228.64 ㎎/L ; MgSO448.84 ㎎/L ; NaCl 6995.50 ㎎/L ; NaHCO32400.0 ㎎/L ; NaH2PO4-H2O 62.50 ㎎/L; Na2HPO471.02 ㎎/L; ZnSO4-7H2O 0.4320 ㎎/L ; 아라키돈산 0.002 ㎎/L ; 콜레스테롤 1.022 ㎎/L ; DL-알파-토코페롤-아세테이트 0.070 ㎎/L ; 리놀레산0.0520 ㎎/L ; 리놀렌산 0.010 ㎎/L ; 미리스트산 0.010 ㎎/L ; 올레산 0.010 ㎎/L ; 팔미트르산 0.010 ㎎/L ; 팔미트산 0.010 ㎎/L ; Pluronic F-68 100 ㎎/L ; 스테아르산 0.010 ㎎/L ; Tween 80 2.20 ㎎/L ; D-Glucose 4551 ㎎/L ; L-알라닌 130.85 ㎎/㎖ ; L-아르기닌-HCl 147.50 ㎎/㎖ ; L-아스파라긴-H2O 7.50 ㎎/㎖ ; L-아스파르트산 6.65 ㎎/㎖; L-시스틴-2HCL-H2O 29.56 ㎎/㎖; L-시스텐-2HCl 31.29 ㎎/㎖; L-글루탐산 7.35 ㎎/㎖; L-글루타민 365.0 ㎎/㎖; 글리신 18.75 ㎎/㎖; L-히스티딘-HCl-H2O 52.48 ㎎/㎖; L-이소로이신 106.97 ㎎/㎖; L-로이신 111.45 ㎎/㎖; L-리신 HCl 163.75 ㎎/㎖; L-메티오닌 32.34 ㎎/㎖; L-페닐알라닌 68.48 ㎎/㎖; L-프롤린 40.0 ㎎/㎖; L-세린 26.25 ㎎/㎖; L-트레오닌 101.05 ㎎/㎖; L-트립토판 19.22 ㎎/㎖; L-티로신-2Na-2H2O 91.79 ㎎/㎖; 및 L-발린 99.65 ㎎/㎖; 비오틴 0.0035 ㎎/L; D-Ca 판토테네이트 3.24 ㎎/L; 염화콜린 11.78 ㎎/L; 폴산 4.65 ㎎/L; i-이노시톨 15.60 ㎎/L; 니아신아미드 3.02 ㎎/L; 피리독살 HCl 3.00 ㎎/L; 피리독신 HCl 0.031 ㎎/L; 리보플라빈 0.319 ㎎/L; 티아민 HCl 3.17 ㎎/L; 티미딘 0.365 ㎎/L; 비타민 B120.680 ㎎/L; HEPES 완충액 25 mM; Na 하이포크산틴 2.39 ㎎/L; 리포산 0.105 ㎎/L; 나트륨 푸트레신-2HCl 0.081 ㎎/L; 피루브산나트륨 55.0 ㎎/L; 나트륨 셀레나이트 0.0067 ㎎/L; 에탄올아민 20 μM; 구연산제2철 0.122 ㎎/L; 리놀레산과 의 메틸-B-시클로덱스트린 복합체 41.70 ㎎/L; 올레산과의 메틸-B-시클로덱스트린 복합체 33.33 ㎎/L; 레티날아세테이트와의 메틸-B-시클로덱스트린 복합체 10 ㎎/L)를 제조한다. 2 mM 글루타민과 1x penstrep으로 삼투압농도를327 mOsm로 조정한다(BSA(81-068-3 Bayer) 100 g을 1L DMEM에 용해시켜 10% BSA 모용액을 제조한다). 배지를 여과하고 내독소 분석을 위하여 15 ㎖ 원추형 폴리스티렌 용기에 50 ㎕를 수거한다.
형질감염 반응은 항온배양 말기에 바람직하게는 태그 티밍에 의해 종결시킨다. 사람 A는 형질감염 배지를 흡인제거하고, 사람 B는 각 웰에 1.5 ㎖의 적당한 배지를 첨가한다. 37 ℃에서 사용된 배지에 따라 45 시간(1% BSA의 경우) 또는 72 시간(CHO-5의 경우)동안 항온배양한다.
4일째, 300 ㎕ 다중채널 피펫터를 사용하여 1 ㎖ 깊이의 웰 평판에 600 ㎕를 주입하고 나머지 상청액은 2 ㎖ 깊이 웰에 주입한다. 각 웰의 상청액은 그 다음 실시예 16 내지 23에 기재된 분석법에 사용할 수 있다.
상청액을 사용하여 하기 기재된 분석법 중 임의의 방법으로 활성을 얻는 경우, 그 활성은 METH1 또는 METH2 폴리펩티드로부터 직접(예, 분비형 단백질로서) 얻거나 또는 다른 단백질의 발현을 유도하고, 그 다음 상청액으로 분비되는 METH1 또는 METH2에 의해 얻어진다. 따라서, 본 발명은 특정 분석법에서 활성을 특징적으로 나타내는 상청액 중의 단백질을 동정하는 방법을 제공한다.
실시예 15: GAS 리포터 작제물의 작제
세포의 분화 및 증식에 관여하는 시그널 도입 경로로서 Jaks-STATs 경로라고 불리는 것이 있다. Jaks-STATs 경로는 많은 유전자의 프로모터에 위치한 감마 활성화 부위 "GAS" 인자 또는 인터페론 민감성 응답 인자("ISRE")에 결합한다. 이들 인자에 대한 단백질의 결합은 관련 유전자의 발현을 변화시킨다.
GAS 및 ISRE 인자는 시그널 형질도입인자 및 전사 활성화인자 또는 "STATs"라고 불리는 일군의 전사 인자에 의해 인지된다. STATs계에는 6가지 군이 있다. Stat1 및 Stat3은 Stat2(IFN-알파에 대한 반응이 널리 보급된 경우)와 마찬가지로 많은 세포 종류에 존재한다. Stat4는 보다 제한적이고, IL-12로 처리한 후의 세포인 T 헬퍼 클래스 I에서 발견되지만 다른 많은 세포 종류에는 없다. Stat5는 본래 유방 성장 인자로 불리는 것이지만, 골수양 세포를 비롯한 기타 다른 세포에서 고농도로 발견된다. 또한, 많은 시토킨에 의해 조직 배양 세포에서 활성화될 수 있다.
STATs는 자누스 키나제("Jaks") 계로 알려진 일군의 키나제에 의해 티로신 인산화시 활성화되어 세포질에서 핵으로 전위된다. Jaks는 가용성 티로신 키나제의 특정 군을 나타내는 것으로, Tyk2, Jak1, Jak2 및 Jak3이 있다. 이들 키나제는 유의적인 서열 유사성이 있고 일반적으로 휴지 세포에서는 촉매적으로 불활성이다.
Jaks는 하기 표[문헌 Schidler and Darnell, Ann.Rev.Biochem. 64:621-51(1995)을 검토하여 만듬]에 요약된 다양한 수용체에 의해 활성화된다. Jaks를 활성화시킬 수 있는 시토킨 수용체계는 다음과 같이 2군으로 분류된다. (a) 클래스 1에는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, Epo, PRL, GH, G-CSF, GM-CSF, LIF, CNTF 및 트롬보포이에틴에 대한 수용체를 포함한다. (b) 클래스 2에는 IFN-a, IFN-g 및 IL-10을 포함한다. 클래스 1 수용체는 보존적 시스테인 모티프(4개의 보존적 시스테인과 1개의 트립토판 세트) 및 WSXWS 모티프(Trp-Ser-Xxx-Trp-Ser(서열 번호 82)를 암호하는 막 근접 영역)를 공유한다.
따라서, 수용체에 리간드가 결합되면 Jaks는 활성화되고, 그 다음 STATs를 활성화시킨 후, 전위하여 GAS 인자에 결합한다. 이러한 전체 과정은 Jaks-STATs 시그널 도입 경로에 포함된다.
즉, GAS 또는 ISRE 인자의 결합에 의해 반영되는 Jaks-STATs 경로의 활성화는 세포의 증식 및 분화에 관여하는 단백질의 동정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 성장 인자 및 시토킨은 Jaks-STATs 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다(하기 표 참조). 따라서, 리포터 분자에 결합된 GAS 인자를 사용하면 Jaks-STATs 경로의 활성인자를 동정할 수 있다.
JAKs STATS GAS(인자) 또는 ISRE
리간드 tyk2 Jak1 Jak2 Jak3
IFN 계
IFN-a/BIFN-gIl-10 ++ ++? -+? --- 1,2,311,3 ISREGAS(IRF1＞Lys6＞IFP)
gp130 계
IL-6(다형성)Il-11(다형성)OnM(다형성)LIF(다형성)CNTF(다형성)G-CSF(다형성)IL-12(다형성) +???-/+?+ ++++++- +?+++?+ ??????+ 1,31,31,31,31,31,31,3 GAS(IRF1＞Lys6＞IFP)
g-C 계
IL-2(림프구)IL-4(림프/골수종)IL-7(림프구)IL-9(림프구)IL-13(림프구)IL-15 -----? ++++++ ----?? ++++?+ 1,3,565565 GASGAS(IRF1=IFP＞＞Ly6)(IgH)GASGASGASGAS
gp140 계
IL-3(골수종)IL-5(골수종)GM-CSF(골수종) --- --- +++ --- 555 GAS(IRF1＞IFP＞＞Ly6)GASGAS
성장 호르몬 계
GHPRLEPO ??? -+/-- +++ --- 51,3,55 GAS(B-CAS＞IRF1=IFP＞Ly6)
수용체 티로신 키나제
EGFPDGFCSF-1 ??? +++ +++ --- 1,31,31,3 GAS(IRF1)GAS(IRF1 제외)
프로모터 인자를 포함하는 합성 GAS(실시예 16 및 17에 기재된 생물학적 분석법에 사용됨)를 작제하기 위하여 PCR계 전략을 사용하여 GAS-SV40 프로모터 서열을 제조한다. 5' 프라이머는 IRF1 프로모터에서 발견되고 일정 시토킨에 의해 유도시 STATs에 결합하는 것으로 종래 입증된 바 있는[Rothman et al., Immunity 1:457-468(1994)] GAS 결합 부위의 4개의 직렬 카피를 포함한다. 또한, 다른 GAS 또는 ISRE 인자도 대신 사용될 수 있다. 5' 프라이머는 SV40 초기 프로모터 서열에 상보적인 18 bp의 서열을 포함하고, XhoI 부위가 인접된다. 5' 프라이머의 서열은다음과 같다.
하류 프라이머는 SV40 프로모터에 상보적이고 HindIII 부위가 인접된다. 5'GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC 3'(서열 번호 87).
PCR 증폭은 클론테크에서 입수한 B-gal:프로모터 플라스미드내에 존재하는 SV40 프로모터 주형을 사용하여 실시한다. 얻어지는 PCR 단편은 XhoI/HindIII로 분해하고 BLSK2-(스트라타진)에 서브클로닝한다. 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용한 서열분석으로 삽입체가 다음과 같은 서열을 포함하는 것으로 확인되었다.
SV40 프로모터에 결합된 GAS 프로모터 인자를 사용하여 GAS:SEAP2 리포터 작제물을 그 다음 유전자조작한다. 여기에서, 리포터 분자는 분비형 알칼리 포스파타제 또는 "SEAP"이다. 하지만, 분명한 것은 본 실시예 또는 기타 다른 모든 실시예에서 SEAP 대신에 모든 리포터 분자가 사용될 수 있다는 것이다. SEAP 대신에 사용될 수 있는 공지의 리포터 분자로는 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 녹색 형광성 단백질(GFP) 또는 항체에 의해 검출될 수 있는 모든 단백질이 있다.
상기 서열 확인된 합성 GAS-SV40 프로모터 인자를, HindIII 및 XhoI를 사용하여 클론테크에서 입수한 pSEAP-프로모터 벡터내로 서브클로닝하여, SV40 프로모터를 증폭된 GAS:SV40 프로모터 인자로 효과적으로 치환시켜 GAS-SEAP 벡터를 만들었다. 하지만, 이 벡터는 네오마이신 내성 유전자를 포함하지 않는 바, 포유류 발현계에는 바람직하지 않다.
따라서, GAS-SEAP 리포터를 발현하는 포유류의 안정한 세포주를 제조하기 위하여, GAS-SEAP 벡터로부터 SalI 및 NotI을 사용하여 GAS-SEAP 카세트를 분리하고, 다중 클로닝 부위내의 상기 제한 부위를 사용하여 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 백본 벡터[예, pGFP-1(클론테크)]내로 삽입하여, GAS-SEAP/N대 벡터를 만든다. 이 벡터로 포유류 세포를 형질감염시키면, 이 벡터는 실시예 16 및 17에 기재된 바와 같이 GAS 결합용 리포터 분자로서 사용될 수 있다.
다른 작제물도 전술한 설명에 따라 GAS를 다른 프로모터 서열로 치환시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, NFK-B 및 EGR 프로모터 서열을 포함하는 리포터 분자의 작제에 대해서는 실시예 18 및 19에 설명되어 있다. 또한, 기타 많은 프로모터들이 본 실시예에 기재된 프로토콜에 따라 치환될 수 있다. 예를 들어, SRE, IL-2, NFAT 또는 오스테오칼신 프로모터는 단독 또는 조합적으로 치환될 수 있다(예, GAS/NF-KB/EGR, GAS/NF-KB, Il-2/NFAT 또는 NF-KB/GAS). 이와 마찬가지로, 리포터 작제물활성을 시험하기 위하여 다음과 같은 세포주를 사용할 수 있다. HELA(상피), HUVEC(내피), R도(B세포), Saos-2(골아세포), HUVAC(대동맥) 또는 카디오미오사이트.
실시예 16 : T-세포 활성에 대한 고처리량 선별 분석법
다음과 같은 프로토콜을 사용하여 METH1 또는 METH2 상청액이 T 세포를 증식 및/또는 분화시키는 지를 측정하여 METH1 또는 METH2의 T세포 활성을 평가하였다. T 세포 활성은 실시예 15에서 제조된 GAS/SEAP/Neo 작제물을 사용하여 평가한다. 그 결과, SEAP 활성을 증가시키는 인자는 Jaks-STATs 시그널 도입 경로를 활성화하는 성질이 있음을 나타낸다. 이 분석법에 사용된 T 세포는 Jurkat T 세포(ATCC 수탁 번호 TIB-152)이다. 또한, Molt-3 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1552) 및 Molt-4 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1582)도 사용할 수 있다.
Jurkat T-세포는 림프아세포 CD4+ Th1 헬퍼 세포이다. 안정한 세포주를 제조하기 위하여, 약 2 백만 Jurkat 세포를 DMRIE-C(라이프 테크놀로지스)(하기 기재된 형질감염 절차)를 사용하여 GAS-SEAP/neo 벡터로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 웰 당 약 20000 세포의 밀도로 접종하고, 1 ㎎/㎖ 젠티신에 대하여 내성이 있는 형질감염체를 선발하였다. 내성 콜로니를 증식시키고, 그 다음 인터페론 감마의 농도를 증가시키면서 그 응답 반응을 시험하였다. 선택된 클론의 용량 응답 반응이 확인되었다.
구체적으로, 다음과 같은 프로토콜은 세포 200 ㎕를 함유하는 75웰에서 충분한 세포를 생성시킨다. 즉, 다중 96웰 평판에 사용하기에 충분한 세포를 만들기 위하여 증량하거나 여러번 세포를 생성시킨다. Jurkat 세포는 1% Pen-Strep이 보충된 RPMI + 10% 혈청에서 유지시킨다. OPTI-MEM(라이프 테크놀로지스) 2.5 ㎖를 T25 플라스크에서 플라스미드 DNA 10 ㎍과 혼합한다. DMRIE-C 50 ㎕를 함유하는 OPTI-MEM 2.5 ㎖를 첨가하고, 15 내지 45 분 동안 실온에서 항온처리한다.
항온처리 기간 동안, 세포 농도를 계수하고, 필요한 세포수(형질감염 당 107)를 침전시킨 뒤, OPTI-MEM에 최종 농도가 107세포/웰이 되게 재현탁시킨다. 그 다음, OPTI-MEM 중의 1x107세포 1 ㎖를 T25 플라스크에 첨가하고 37 ℃에서 6 시간 동안 항온처리한다. 항온처리후, RPMI+15% 혈청 10 ㎖를 첨가한다.
Jurkat:GAS-SEAP 안정한 리포터 주는 RPMI+10% 혈청, 1 ㎎/㎖ 젠티신 및 1% Pen-Strep에서 유지시킨다. 이 세포를 실시예 14에 기재된 프로토콜에 따라 제조된 METH1 또는 METH2 유도 폴리펩티드 또는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 함유하는 상청액으로 처리한다.
상청액으로 처리하는 당일에 세포는 세척한 후, 1 ㎖당 500,000 세포의 밀도로 새 RPMI + 10% 혈청에 재현탁시킨다. 필요한 세포의 정확한 수는 선별되는 상청액의 수에 따라 달라진다. 96웰 평판 1개인 경우에는, 약 천만개의 세포(10개 평판인 경우에는 1억개 세포)가 필요로 된다.
이 세포를 삼각형 보관 용기로 전이시켜, 세포를 12 채널 피펫을 사용하여 96웰 접시에 분배한다. 12 채널 피펫을 사용하여 세포 200 ㎕를 각 웰에 전이시킨다(결국 1웰 당 100,000개 세포가 첨가됨).
모든 평판에 접종한 후, 상청액을 함유하는 96웰 평판으로부터 각 웰로 12 채널 피펫을 사용하여 상청액 50 ㎕를 직접 이동시킨다. 또한, 분석의 추가 양성 대조군으로서 외래의 인터페론 감마 일정량(0.1, 1.0, 10 ng)을 첨가한다.
상청액으로 처리된 Jurkat 세포를 함유하는 96웰 접시는 항온배양기에서 48 시간동안 방치한다(주: 시간은 48 내지 72 시간 사이에서 변화가능). 각 웰의 시료 35 ㎕를 그 다음 12 채널 피펫을 사용하여 불투명 96웰 평판으로 이동시킨다. 불투명 평판은 셀로판 커버를 사용하여 피복해야 하고, 실시예 20에 따라 SEAP 분석을 실시할 때까지 -20 ℃에서 보관한다. 나머지 처리된 세포를 함유하는 평판은 4 ℃에서 보관하고 필요한 경우 특정 웰에 대하여 분석을 반복할 때 공급물로서 사용한다.
양성 대조군으로, Jurkat T 세포를 활성화시키는 것으로 공지된 인터페론 감마 100 유니트/㎖를 사용할 수 있다. 일반적으로 양성 대조군 웰에서는 30배 이상의유도가 관찰된다.
실시예 17 : 골수종 활성을 동정하는 고처리량의 선별 분석법
다음과 같은 프로토콜을 사용하여 METH1 또는 METH2가 골수종 세포를 증식 및/또는 분화시키는 지를 측정하여 METH1 또는 METH2의 골수종 활성을 측정한다. 골수종 세포 활성은 실시예 15에서 생성된 GAS/SEAP/Neo 작제물을 사용하여 골수종 세포 활성을 평가한다. 즉, SEAP 활성을 증가시키는 인자는 Jaks-STATS 시그널 형질도입 경로를 활성화하는 성질을 나타낸다. 본 분석법에 사용된 골수종 세포는 예비단핵구 세포주인 U937이다. 또한, TF-1, HL60 또는 KG1이 사용될 수도 있다.
실시예 15에서 생성된 GAS/SEAP/Neo 작제물로 U937 세포를 일시적으로 형질감염시키기 위하여, DEAE 덱스트란 방법[Kharbanda et al., 1994, Cell Growth & Differentiation 5:259-265)을 사용한다. 먼저, 2x10e7U937 세포를 수거하고 PBS로 세척한다. U937 세포는 일반적으로 페니실린 100 유니트/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎎/㎖가 보충된 10% 열불활성화 태내 송아지 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 증식시킨다.
다음, 이 세포를 DEAE-덱스트란 0.5 ㎎/㎖, GAS-SEAP2 플라스미드 DNA 8 ㎍, NaCl 140 mM, KCl 5 mM, Na2HPO4·7H2O 375 μM, MgCl21mM 및 CaCl2675 μM을 함유하는 20 mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충액 1 ㎖에 현탁시킨다. 37 ℃에서 45 분 동안 항온배양한다.
세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지로 세척한 다음, 완전 배지 10 ㎖ 중에 재현탁하고 37 ℃에서 36 시간 동안 항온배양한다.
이 세포를 G418 400 ㎍/㎖ 중에서 증식시켜 GAS-SEAP/U937 안정한 세포를 얻는다. G418 결실 배지는 1 내지 2 개월 마다 증식시키기 위하여 사용하였고, 세포는 2 세대 동안 G418 400 ㎍/㎖ 중에서 재증식시켜야 한다.
이 세포들은 1x108세포(이 정도이면 10개의 96웰 평판 분석법에 충분함)를 수거하고 PBS로 세척하여 시험한다. 세포를 전술한 증식 배지 200 ㎖에 최종 농도가 5 x 105세포/㎖가 되게 현탁시킨다. 96웰 평판에 웰당 세포 200 ㎕(또는 1 x105세포/웰)를 평판배양한다.
실시예 14에 기재된 프로토콜에 따라 제조한 상청액 50 ㎕를 첨가한다. 37 ℃에서 48 내지 72시간 동안 항온배양한다. 양성 대조군으로, U937 세포를 활성화하는 것으로 공지된 인터페론 감마 100 유니트/㎖를 사용할 수 있다. 양성 대조 웰에서는 일반적으로 30배 이상의 유도가 관찰된다. 실시예 20에 기재된 프로토콜에 따라 상청액을 SEAP 분석한다.
실시예 18: 신경원 활성을 동정하는 고처리량 선별 방법
세포가 분화 및 증식될 때, 일군의 유전자는 다양한 여러 시그널 형질도입 경로를 통해 활성화된다. 이러한 유전자 중 하나인 EGR1(초기 증식 반응 유전자 1)은 활성화시 각종 조직과 세포 종류에서 유도된다. EGR1의 프로모터는 이러한 유도에 한 역할을 한다. 리포터 분자에 결합된 EGR1 프로모터를 사용하면, 세포의 활성화를 METH1 또는 METH2로 측정할 수 있다.
구체적으로, 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 PC12 세포주내의 신경원 활성을 평가한다. PC12 세포(래트 페노크로모사이토마 세포)는 다양한 유사분열촉진인자, 예컨대 TPA(테트라데카노일 포르볼 아세테이트), NGF(신경 성장 인자) 및 EGF(상피 성장 인자)에 의해 활성화시 증식 및/또는 분화하는 것으로 알려져 있다. 이 처리 동안 EGR1 유전자 발현이 활성화된다. 따라서, SEAP 리포터에 결합된 EGR 프로모터를 포함하는 작제물로 PC12 세포를 안정하게 형질감염시켜 METH1 또는 METH2에 의해 PC12 세포의 활성화를 평가할 수 있다.
EGR/SEAP 리포터 작제물은 다음과 같은 프로토콜에 따라 어셈블리할 수 있다. EGR-1 프로모터 서열(-633 내지 +1)[Sakamoto K et al., Oncogene 6:867-871(1991)]은 다음과 같은 프라이머를 사용하여 인간 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시킬 수 있다.
5' GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG 3'(서열 번호 89).
5' GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC 3'(서열 번호 90).
실시예 15에서 제조된 GAS:SEAP/N대 벡터를 사용하여, EGR1 증폭된 생성물을 이 벡터에 삽입할 수 있다. 제한 효소 XhoI/HindIII를 사용하여 GAS:SEAP/Neo 벡터를 선형화하고 GAS/SV40 스터퍼를 제거한다. 동일한 효소를 사용하여 EGR1 증폭 생성물을 제한 분해한다. 벡터와 EGR1 프로모터를 결찰시킨다.
세포 배양을 위한 96웰 평판을 준비하기 위하여, 코팅 용액(30% 에탄올 중의 콜라겐 타입 I(Upstate Biotech Inc. Cat#08-115) 1:30 희석물(여과 살균됨))을 96웰 평판의 웰 당 50 ㎖ 또는 10 ㎝ 평판 마다 첨가하고 2 시간 동안 공기 건조시킨다.
PC12 세포는 예비코팅된 10 ㎝ 조직 배양 접시에서 10% 말 혈청(JRH BIOSCIENCES, Cat#12449-78P), 5% 열불활성화된 태내 송아지 혈청(FBS)과 함께 보충적으로 페니실린 100 유니트/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖을 포함하는 RPMI-1640 배지(Bio Whittaker)에서 통상적으로 증식시킨다. 1 내지 4개 분할을 3 내지 4일마다 실시한다. 세포를 평판으로부터 긁어 분리하고 15회 이상 위아래로 피펫팅하여 재현탁시킨다.
실시예 14에 기재된 리포펙트아민 프로토콜을 사용하여 EGR/SEAP/Neo 작제물로 PC12를 형질감염시킨다. 이 세포를 G418 300 ㎍/㎖ 중에서 증식시켜 EGR-SEAP/PC12 안정 세포를 얻는다. G418 결실 배지는 1 내지 2 개월 마다 통상적인 증식에 사용하였고, 세포는 2 세대 동안 G418 300 ㎍/㎖ 중에서 재증식시켜야 한다.
신경원 활성을 분석하기 위하여, 약 70 내지 80% 응집성의 세포를 보유한 10 ㎝ 평판에서 사용된 배지를 제거하여 선별한다. 세포를 즉시 PBS(인산염 완충 식염수)로 세척한다. 그 다음, 저 혈청 배지(1% 말 혈청과 0.5% FBS를 항생제와 함께 포함하는 RPMI-1640)에서 세포를 하룻밤 동안 영양 결핍 상태로 유지시킨다.
다음날 아침, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척한다. 평판에서 세포를 긁어내어, 이 세포를 저혈청 배지 2 ㎖ 중에 잘 현탁시킨다. 세포수를 계수하고, 세포 밀도가 5 x 105세포/㎖가 되게 보다 많은 저혈청 배지를 첨가한다.
96웰 평판의 각 웰에 세포 현탁액 200 ㎕를 첨가한다(1 x 105세포/웰에 해당). 실시예 14에서 제조한 상청액 50 ㎕를 첨가하고, 37 ℃에서 48 내지 72 시간 동안 처리한다. 양성 대조군으로, EGR을 통해 PC12 세포를 활성화시키는 것으로 공지된 성장 인자, 예컨대 신경원 성장 인자(NGF) 50 ng/㎕을 사용할 수 있다. 양성 대조군 웰에서는 일반적으로 SEAP가 50배 이상 유도되는 것으로 관찰되었다. 실시예 20에 따라 상청액을 SEAP 분석한다.
실시예 19: T세포 활성에 대한 고처리량의 선별 분석법
NF-KB(핵인자 KB)는 염증성 시토킨 IL-1 및 TNF, CD30 및 CD40, 림프독소 알파 및 림프독소 베타를 비롯한 다양한 제제에 의해, LPS나 트롬빈에 노출시, 그리고 특정 바이러스 유전자 생성물의 발현에 의해 활성화되는 전사 인자이다. 전사 인자로서, NF-KB는 면역 세포 활성화, 고사 제어(NF-KB는 고사로부터 세포를 차단하는 것으로 보인다), B 세포 및 T 세포 발생, 항바이러스 반응 및 항미생물 반응, 그리고 다중 스트레스 반응과 관련된 유전자의 발현을 조절한다.
비자극 조건하에서, NF-KB는 I-KB(억제제-KB)에 의해 세포질 내에 보유된다. 하지만, 자극시, I-KB는 인산화되고 분해되어 NF-KB를 핵으로 왕복이동시키고, 그 결과 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다. NF-KB에 의해 활성화된 표적 유전자로는 IL-2, IL-6, GM-CSF, ICAM-1 및 클래스 1 MHC가 있다.
일정 범위의 자극에 응답 반응하는 주요 역할과 성질로 인하여, NF-KB 프로모터 인자를 이용하는 리포터 작제물은 실시예 14에서 제조된 상청액을 선별하는데 사용된다. NF-KB의 활성인자 또는 억제인자는 질병 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, NF-KB의 억제제는 류마티스양 관절염과 같은 NF-KB의 급성 또는 만성 활성화와 관련된 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
NF-KB 프로모터 인자를 함유하는 벡터를 작제하기 위하여, PCR계 전략을 이용한다. 상류 프라이머는 NF-KB 결합 부위(GGGGACTTTCCC)(서열 번호 91)의 4개의 직렬 카피, SV40 초기 프로모터 서열의 5' 말단에 상보적인 서열의 18 bp를 포함하고, XhoI 부위가 인접된다.
5'GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCCTGCCATCTCAATTAG 3'(서열 번호 92).
하류 프라이머는 SV40 프로모터의 3' 말단에 상보적인 것이고, HindIII 부위가 인접된다.
5'GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC3'(서열 번호 93).
PCR 증폭은 클론테크에서 입수한 pB-gal:프로모터 플라스미드에 존재하는 SV40 프로모터 주형을 사용하여 실시한다. 그 결과 얻어지는 PCR 단편을 XhoI 및 HindIII로 분해하고 BLSK2-(스트라타진)에 서브클로닝한다. T7 및 T3 프라이머로 서열분석한 결과, 삽입체가 다음과 같은 서열을 포함한다는 것을 확인하였다.
그 다음, pSEAP2-프로모터 플라스미드(클론테크)에 존재하는 SV40 최소 프로모터 인자를 XhoI 및 HindIII를 사용하여 이 NF-KB/SV40 단편으로 치환시킨다. 하지만, 이 벡터는 네오마이신 내성 유전자를 포함하지 않는 바, 포유류 발현계에는 바람직하지 않다.
따라서, 포유류의 안정한 세포주를 제조하기 위하여, 제한 효소 SalI 및 NotI을 사용하여 상기 NF-KB/SEAP 벡터로부터 NF-KB/SV40/SEAP 카세트를 분리하고, 네오마이신 내성을 함유하는 벡터에 삽입한다. 구체적으로, NF-KB/SV40/SEAP 카세트는, SalI 및 NotI으로 pGFP-1을 제한 분해한 후 GFP 유전자를 치환시킨 pGFP-1(클론테크)에 삽입하였다.
일단 NF-KB/SV40/SEAP/Neo 벡터가 만들어지면, 안정한 Jurkat T 세포를 만들고 실시예 16에 기재된 프로토콜에 따라 유지시킨다. 이와 마찬가지로, 이러한 안정한 Jurkat T 세포로 상청액을 분석하는 방법 역시 실시예 17에 기재되어 있다. 양성 대조군으로, 외인성 TNF 알파(0.1, 1, 10 ng)을 웰 H9, H10 및 H11에 첨가하였고, 그 결과 일반적으로 5 내지 10배의 활성화가 관찰되었다.
실시예 20 : SEAP 활성 분석법
실시예 16 내지 19에 기재된 분석법의 리포터 분자로서, SEAP 활성은 다음과 같은 일반적인 방법에 따라 Tropix Phospho-light Kit(Cat.BP-400)를 사용하여 분석한다. Tropix Phospho-light Kit는 하기 사용된 희석, 분석 및 반응 완충액을 공급한다.
분배기에 2.5x 희석 완충액을 주입하고, 상청액 35 ㎕를 함유하는 Optiplate에 2.5x 희석 완충액 15 ㎕를 분배한다. 평판을 플라스틱 밀봉제로 밀봉하고 65 ℃에서 30 분 동안 항온배양한다. 불균일한 가열을 피하기 위하여 Optiplate는 분리시킨다.
시료를 실온에서 15분 동안 냉각시킨다. 분배기를 비운 뒤, 분석 완충액을 충전한다. 분석 완충액 50 ㎕를 첨가하고 실온에서 5 분 동안 항온배양한다. 분배기를 비운 뒤, 반응 완충액(하기 표 참조)을 충전한다. 반응 완충액 50 ㎕를 첨가한 후 실온에서 20 분 동안 항온배양한다. 화학발광 시그널의 강도는 시간 의존적이므로, 발광계에서 5개의 평판을 약 10분 판독하고, 매번 5개의 평판을 처리하며 제2 세트는 10 분 후에 개시시킨다.
발광계로 상대적 광 유니트를 판독한다. H12를 대조군으로 하고, 결과를 인쇄한다. 화학발광성의 증가는 리포터의 활성을 시사한다.
반응 완충액 조성:
평판 번호 반응 완충액 희석물(㎖) CSPD(㎖)
10 60 3
11 65 3.25
12 70 3.5
13 75 3.75
14 80 4
15 85 4.25
16 90 4.5
17 95 4.75
18 100 5
19 105 5.25
20 110 5.5
21 115 5.75
22 120 6
23 125 6.25
24 130 6.5
25 135 6.75
26 140 7
27 145 7.25
28 150 7.5
29 155 7.75
30 160 8
31 165 8.25
32 170 8.5
33 175 8.75
34 180 9
35 185 9.25
36 190 9.5
37 195 9.75
38 200 10
39 205 10.25
40 210 10.5
41 215 10.75
42 220 11
43 225 11.25
44 230 11.5
45 235 11.75
46 240 12
47 245 12.25
48 250 12.5
49 255 12.75
50 260 13
실시예 21: 소분자 농도 및 막 투과성의 변화를 동정하는 고처리량 선별분석법
수용체에 대한 리간드의 결합은 막 전위를 변화시킬 뿐만 아니라 칼슘, 칼륨, 나트륨과 같은 소분자의 세포내 농도 및 pH를 변화시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 변화는 특정 세포의 수용체에 결합하는 상청액을 동정하는 분석법으로 측정할 수 있다. 칼슘 분석에 대해서는 다음과 같은 프로토콜을 사용할 수 있지만, 이 프로토콜은 칼륨, 나트륨, pH, 막 전위 또는 형광 프로브에 의해 검출가능한 기타 다른 소분자의 변화를 검출하기 위하여 쉽게 변형시킬 수 있다.
다음 분석에서는 소분자에 결합하는 형광 분자(Molecular Probes)의 변화를 측정하기 위하여 형광측정 영상화 평판 판독기("FLIPR")를 사용한다. 분명한 것은, 여기에서 사용된 칼슘 형광 분자 fluo-3 대신에 소분자를 검출하는 모든 형광 분자를 사용할 수 있다는 것이다.
세포를 부착시키기 위하여, 투명 바닥을 가진 Co-star 블랙 96웰 평판에 세포를 10,000 내지 20,000 세포/웰로 접종한다. 이 평판을 CO2항온배양기에서 20 시간 동안 항온배양한다. 부착 세포를 Biotek 세척기에서 HBSS(항크스 완충 식염수) 200 ㎕로 2회 세척하고, 최종 세척 후 완충액 100 ㎕를 남겼다.
fluo-3 1 ㎎/㎖ 모용액은 10% 플루론산 DMSO 중에 제조하였다. fluo-3을 가진 세포를 장입하기 위하여, 각 웰에 12 ㎍/㎖ fluo-3 50 ㎕를 첨가한다. 평판을 CO2항온배양기에서 37 ℃하에 60 분 동안 항온배양한다. 평판을 Biotek 세척기에서 HBSS로 4회 세척하고, 마지막에 완충액 100 ㎕를 남긴다.
비부착성 세포는, 배양 배지로부터 침전시킨다. 세포를 50 ㎖ 원추형 튜브에 HBSS로 2 내지 5 x 106세포/㎖의 농도로 재현탁시킨다. 세포 현탁액 1 ㎖마다 10% 플루론산 DMSO 중의 1 ㎎/㎖ fluo-3 용액 4 ㎕를 첨가한다. 그 다음, 튜브를 37 ℃ 수조에서 30 내지 60 분 동안 방치한다. 이 세포를 HBSS로 2회 세척하고, 1x106세포/㎖로 재현탁한 뒤, 미량평판에 100 ㎕/웰씩 분배한다. 이 평판을 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리한다. 이 평판을 그 다음 Denley CellWash에서 200 ㎕로 즉시 세척한 다음, 흡인 단계를 통해 최종 부피를 100 ㎕로 만들었다.
비세포계 분석에서는, 각 웰에 fluo-3과 같은 형광 분자를 첨가한다. 상청액을 웰에 첨가하고 형광성 변화를 검측한다.
세포내 칼슘의 형광성을 측정하기 위하여, FLIPR을 다음과 같은 변수로 조정한다. (1) 시스템 이득 300 내지 800 mW; (2) 노출 시간 0.4초; (3) 카메라 F/정지 F/2; (4) 여기 488 nm; (5) 방출 533 nm; (6) 시료 첨가 50 ㎕. 530 nm에서의 방출 증가는 세포외 시그널링 과정이 분자에 의해 유발되어 분자, 즉 METH1 또는 METH2나 METH1 또는 METH2에 의해 유도된 분자에 의해 유발된다는 것을 시사하며, 결과적으로 세포내 Ca++농도의 증가를 초래한다.
실시예 22: 티로신 키나제 활성을 동정하는 고처리량 선별 분석법
단백질 티로신 키나제(PTK)는 상이한 군의 경막 및 세포질 키나제이다. 수용체 단백질 티로신 키나제(RPTK) 군에는, 일정 범위의 유사분열촉진인자 및 대사 성장 인자(예컨대 PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF)에 대한 수용체 및 인슐린 수용체 아과가 있다. 또한, 대응 리간드가 알려져 있지 않은 RPTK의 대형 군이 있다. RPTK의 리간드로는 주로 분비형인 소단백질 뿐만 아니라 막결합 단백질 및 세포외 매트릭스 단백질이 있다.
리간드에 의한 RPTK의 활성화는 리간드 매개의 수용체 이량체화를 포함하며, 그 결과 수용체 서브유니트의 트란스인산화 및 세포질 티로신 키나제의 활성화가 얻어진다. 세포질 티로신 키나제로는 src계(예, src, yes, lck, lyn, fyn)의 수용체 결합된 티로신 키나제 및 비수??체 결합형 및 세포질 단백질 티로신 키나제(예, Jak계)가 있으며, 이들의 구성원은 수용체의 시토킨 상과(예, 인터루킨, 인터페론, GM-CSF 및 렙틴)에 의해 자극되는 시그널 형질도입을 매개한다.
다양한 범위의 공지 인자가 티로신 키나제 활성을 자극할 수 있기 때문에, METH1 또는 METH2 자체, 또는 METH1 또는 METH2에 의해 유도된 분자가 티로신 키나제 시그널 형질도입 경로를 활성화시킬 수 있는 지를 동정하는 것이 중요하다. 따라서, 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 티로신 키나제 시그널 도입 경로를 활성화시킬 수 있는 분자를 동정한다.
날제 눈크(Nalge Nunc, 미국 일리노이주 나퍼빌 소재)에서 구입한 96웰 Loprodyne Silent Screen Plate에서 웰 당 약 25,000 세포의 밀도로 표적 세포(예, 원시 각질세포)를 접종한다. 이 평판을 100% 에탄올로 30 분간 2회 세정하여 살균하고, 물로 세정한 뒤 하룻밤 동안 건조한다. 일부 평판은 세포 배양 등급의 타입 I 콜라겐(50 ㎎/㎖), 젤라틴(2%) 또는 폴리리신(50 ㎎/㎖)(이 시약 모두는 미국 미주리주 세인트루이스에 소재하는 시그마 케미칼스에서 구입할 수 있음) 또는 벡톤디킨슨(미국 매사추세츠주 베드포드 소재)에서 구입한 10% 마트리겔, 소 혈청 100 ㎖로 2 시간 동안 코팅하고, PBS로 세정한 뒤 4 ℃에서 저장한다. 이들 평판에서의 세포 성장은 성장 배지에 5000세포/웰를 접종하고, 48 시간 후 알라마 바이오사이언시스, 인크.(미국 캘리포니아주 사크라멘토 소재) 제조자의 지시에 따라 alamarBlue를 사용하여 세포수를 간접 정량하였다. 로프로다인 사일런트 스크린 평판(Loprodyne Silent Screen Plate)을 피복하기 위하여, 벡톤 디킨슨(미국 매사츄세츠주 베드포드 소재) 제품인 팔콘 평판 커버 #3071을 사용하였다. 팔콘 마이크로테스트 III 세포 배양물 평판은 또한 일부 증식 실험에도 사용할 수 있다.
추출물을 제조하기 위하여, A431 세포를 로프로다인 평판(20,000/200 ㎖/웰)의 나일론 막에 접종하고 완전 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 세포를 무혈청 기본 배지에서 24 시간 동안 항온배양하여 정지상태로 만들었다. 실시예 14에서 제조한 상청액 50 ㎕ 또는 EGF(60 ng/㎖)로 5 내지 20 분간 처리한 후, 배지를 제거하고, 각 웰에 추출 완충액(20 mM HEPES pH 7.5, 0.15 M NaCl, 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 2mM Na3VO4, 2mM Na4P2O7및 뵈링거 맨하임(미국 인디애나주 인디아나폴리스 소재)에서 입수한 프로테아제 억제제(#1836170) 칵테일) 100 ㎖를 첨가하고, 이 평판을 회전식 진탕기에서 4 ℃하에 5 분 동안 진탕시킨다. 그 다음, 평판을 진공 전이 매니폴드에 배치하고 추출물을 하우스 진공을 사용하여 각 웰의 0.45 ㎜ 막 바닥을 통해 여과하였다. 진공 매니폴드의 바닥에 부착된 96웰 캐치/분석 평판에 추출물을 수집하고, 수집 즉시 얼음 상에 방치하였다. 원심분리에 의해 청징화된 추출물을 얻기 위하여, 세정제로 5분 동안 가용화한 후 각 웰의 함유물을 분리하여4 ℃하에 16,000xg에서 15 분 동안 원심분리하였다.
여과된 추출물의 티로신 키나제 활성 정도를 시험한다. 티로신 키나제 활성을 검출하는 많은 방법이 알려져 있기는 하지만, 여기에서는 1가지 방법을 사용하였다.
일반적으로, 상청액의 티로신 키나제 활성은 특정 기질(비오틴화된 펩티드) 상의 티로신 잔기를 인산화하는 성질을 측정하여 평가한다. 본 목적에 사용될 수 있는 비오틴화 펩티드로는 PSK1(세포 분열 키나제 cdc2-p34의 아미노산 6 내지 20에 해당) 및 PSK2(가스트린의 아미노산 1 내지 17에 해당)가 있다. 이 두 펩티드는 일정 범위의 티로신 키나제에 대한 기질로서, 뵈링거 맨하임에서 입수용이하다.
티로신 키나제 반응은 다음과 같은 성분을 순차로 첨가하여 실시한다. 먼저, 5 μM 비오틴화 펩티드 10 ㎕를 첨가하고, 그 다음 ATP/Mg2+(5 mM ATP/50 mM MgCl2) 10 ㎕, 5 x 분석 완충액(40mM 이미다졸 염산염, pH 7.3, 40 mM 베타-글리세로인산염, 1mM EGTA, 100 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 0.5 ㎎/㎖ BSA) 10 ㎕, 바나듐산나트륨(1 mM) 5 ㎕ 및 물 5 ㎕를 첨가한다. 이 성분들을 천천히 혼합하고, 반응 혼합물을 30 ℃에서 2 분 동안 예비항온배양한다. 이 반응물에 대조용 효소 또는 여과된 상청액 10 ㎕를 첨가하여 반응을 개시시킨다.
그 다음, 티로신 키나제 분석 반응은 120 mM EDTA 10 ㎕를 첨가하여 종결시키고 반응물을 얼음상에 방치한다.
티로신 키나제 활성은 반응 혼합물 50 ㎕ 일정량을 미량역가 평판(MTP) 모듈로 옮기고, 37 ℃에서 20 분 동안 항온배양하여 측정한다. 이것은, 스트렙트아비딘 코팅된 96웰 평판을 비오티닐화 펩티드와 결합시킨다. 이 MTP 모듈을 PBS 300 ㎕/웰로 4회 세척한다. 말 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합시킨 항포스포티로신 항체(항-P-Tyr-POD(0.5 μ/㎖)) 75 ㎕를 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 항온배양한다. 웰을 전술한 바와 같이 세척한다.
퍼옥시다제 기질 용액(뵈링거 맨하임) 100 ㎕를 첨가하고 실온에서 5 분 이상(최고 30 분) 동안 항온처리한다. 시료의 흡광도를 ELISA 판독기를 사용하여 405 nm에서 측정한다. 결합된 퍼옥시다제 활성의 양은 ELISA 판독기를 사용하여 정량하고 티로신 키나제 활성의 정도를 조사한다.
실시예 23: 인산화 활성을 동정하는 고처리량 선별 분석법
실시예 22에 기재된 단백질 티로신 키나제 활성의 분석에 대한 가능한 대안예 및/또는 상응예로서, 주요 세포내 시그널 형질도입 중간체의 활성화(인산화)를 검측하는 분석법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 하기 기재되는 바와 같은 특정 분석법으로 Erk-1 및 Erk-2 키나제의 티로신 인산화를 검출할 수 있다. 하지만, 다른 분자, 예컨대 Raf, JNK, p38 MAP, Map 키나제 키나제(MEK), MEK 키나제, Src, 근육 특이 키나제(MuSK), IRAK, Tec 및 Janus, 뿐만 아니라 기타 다른 포스포세린, 포스포티로신 또는 포스포트레오닌 분자의 인산화는, 이들 분자를 다음과 같은 분석법에서 Erk-1 및 Erk-2로 치환시켜 검출할 수 있다.
구체적으로, 분석 평판은 96웰 ELISA 평판의 웰을 단백질 G(1 ㎍/㎖) 0.1 ㎖로 실온(RT)에서 2 시간 동안 코팅하여 제조한다. 이 평판을 그 다음 PBS로 세정하고, 3% BSA/PBS로 RT에서 1 시간 동안 차단한다. 단백질 G 평판을 그 다음 Erk-1 및 Erk-2에 대한 2가지 모노클로널 항체(100 ng/웰)로 처리한다(RT에서 1 시간)(Santa Cruz Biotechnology).(다른 분자의 검출시에는, 전술한 분자 중 임의의 분자를 검출하는 모노클로널 항체를 치환시켜 이 단계를 용이하게 변형시킬 수 있다). PBS로 3 내지 5회 세정한 후, 평판을 사용할 때까지 4 ℃에서 보관한다.
A431 세포를 96웰의 로프로다인 여과평판에 20000/웰의 농도로 접종하고 성장 배지에서 하룻밤 동안 항온배양한다. 그 다음, 세포를 기본 배지(DMEM)에서 48 시간 동안 영양 결핍 상태에서 유지시키고, 그 후 실시예 14에서 얻은 상청액 50 ㎕ 또는 EGF(6 ng/웰)로 5 내지 20 분 동안 처리한다. 그 후, 세포를 가용화시키고, 추출물을 분석 평판으로 직접 여과시킨다.
추출물을 실온에서 1 시간 동안 항온처리한 후, 웰을 다시 세정한다. 양성 대조군으로, A431 추출물 대신에 시판용 MAP 키나제(10 ng/웰) 제제를 사용한다. 평판을 그 다음 Erk-1 및 Erk-2 키나제의 인산화된 에피토프를 특이적으로 인지하는 시판용 폴리클로널(토끼) 항체(1 ㎍/㎖)로 처리한다(실온에서 1 시간). 이 항체를 표준 절차에 따라 비오틴화한다. 그 다음, 결합된 폴리클로널 항체를 유로퓸(Europium)-스트렙트아비딘 및 유로퓸 형광 향상 시약과 함께 월락 DELFIA 기구(시간 분할된 형광성)에서 연속 항온처리하여 정량한다. 배경 보다 증가된 형광 시그널은 METH1 또는 METH2 자체, 또는 METH1 또는 METH2에 의해 유도된 분자에 의한 인산화를 시사한다.
실시예 24: METH1 또는 METH2 유전자의 변화를 측정하는 방법
당해의 표현형(예컨대, 질환)을 나타내는 환자 개체 또는 전체 군에서 유래되는 RNA를 분리한다. 그 다음, 이 RNA 시료로부터 당해 기술 분야에 공지된 프로토콜을 사용하여 cDNA를 제조한다(Sambrook 참조). 이 cDNA를 PCR용 주형으로 사용하고, 프라이머로는 서열 번호 1에 기재된 바람직한 영역 주위의 프라이머를 이용한다. 제안된 PCR 조건으로는, 95 ℃에서 30초; 52 내지 58 ℃에서 60 내지 120초; 70 ℃에서 60 내지 120초의 사이클 35회로 구성되고, 문헌[Sidransky, D. et al., Science 252:706(1991)]에 기재된 완충 용액을 사용한다.
그 다음, PCR 생성물은 5' 말단에 T4 폴리뉴클레오티드 키나제가 표지된 프라이머와 SequiTherm 폴리머라제(Epicentre Technologies)를 사용하여 서열분석한다. 또한, METH1 또는 METH2에서 선택된 엑손의 인트론-엑손 경계를 결정하고, 그 결과를 확인하기 위하여 게놈 PCR 생성물을 분석한다. 그 다음, METH1 또는 METH2내에 추정되는 돌연변이를 보유한 PCR 생성물을 클로닝하고 서열분석하여 직접 서열분석의 결과를 확인한다.
METH1 또는 METH2의 PCR 생성물은 문헌[Holton,T.A. and Graham,M.W., Nucleic Acids Research 19:1156(1991)]에 기재된 바와 같은 T 테일형 벡터에 클로닝하고 T7 폴리머라제(유나이티드 스테이츠 바이오케미칼 제품)로 서열분석한다. 질병에 걸리지 않은 개체에 존재하지 않는 METH1 또는 METH2내의 돌연변이로 질병에 걸린 개체를 확인한다.
또한, 게놈 재배열은 METH1 또는 METH2 유전자내 변화를 측정하는 방법으로서 확인한다. 분리된 게놈 클론은 문헌[Johnson, Cg. et al., Methods Cell Biol.35: 73-99(1991)]에 기재된 바와 같이 수행되는 FISH 및 디곡시게닌데옥시-우리딘 5'-트리포스페이트(뵈링거 맨하임)로 닉해독한다. 표지된 프로브와의 하이브리드화는 METH1 또는 METH2 게놈 유전자좌에 대하여 특이적 하이브리드하는 과량의 인간 cot-1 DNA를 사용하여 실시한다.
염색체는 4,6-디아미노-2-페닐리돌과 프로피듐 요오다이드와 대비염색하면 C 밴드와 R 밴드의 조합을 생성한다. 정확하게 지도화하기 위한 정렬된 이미지는 저온의 하전 커플링된 장치 카메라(Photometrics, Tucson, AZ)와 다양한 여기 파장 필터[Johnson, Cv. et al., Genet.Anal.Tech.Appl. 8:75(1991)]와 함께 3중 밴드 필터 세트(Chroma Technology, Brattleboro, VT)를 사용하여 얻는다. 이미지 수집, 분석 및 염색체 분별 길이 측정은 ISee Graphical Program System(Inovision Corporation, Durham, NC)을 사용하여 실시한다. METH1 또는 METH2(프로브에 의해 하이브리드화됨)의 게놈 영역의 염색체 변화는 삽입, 결실 및 전위로서 동정한다. 이들 METH1 또는 METH2 변화는 관련 질환에 대한 진단 마커로서 사용한다.
실시예 25 : 생물학적 시료 중의 METH1 또는 METH2의 이상 농도를 측정하는 방법
METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 생물학적 시료 중에서 검출될 수 있는데, METH1 또는 METH2의 증가 또는 감소 농도가 검출된다면 이 폴리펩티드는 특정 표현형의 마커이다. 검출 방법은 다양하다. 따라서, 다음과 같은 분석법을 특정 요구 조건에 맞도록 당업자라면 변형시킬 수 있다.
예컨대, 항체 샌드위치 ELISA는 시료, 바람직하게는 생물학적 시료 중의METH1 또는 METH2를 검출하는 데 사용한다. 미량역가 평판의 웰은 METH1 또는 METH2에 대한 특정 항체로 최종 농도가 0.2 내지 10 ㎍/㎖가 되게 코팅한다. 이 항체는 모노클로널이거나 폴리클로널이며, 실시예 13에 기재된 방법에 의해 생산된다. 웰은 METH1 또는 METH2가 웰에 비특이적 결합되지 않도록 차단시킨다.
그 다음, 코팅 웰을 METH1 또는 METH2를 함유하는 시료와 실온에서 >2 시간 동안 항온처리한다. 바람직하게는, 유효 결과를 얻기 위하여 시료의 일련의 희석물을 사용하는 것이 좋다. 그 다음, 평판을 탈이온수 또는 증류수로 3회 세척하여 결합되지 않은 METH1 또는 METH2를 제거한다.
그 후, 25 내지 400 ng 농도의 특정 항체-알칼리 포스파타제 접합체 50 ㎕를 첨가하고, 실오에서 2 시간 동안 항온배양한다. 평판을 다시 탈이온수 또는 증류수로 3회 세척하여 결합되지 않은 접합체를 제거한다.
4-메틸움벨리페릴 포스페이트(MUP) 또는 p-니트로페닐 포스페이트(NPP) 기질 용액 75 ㎕를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 항온처리한다. 반응액을 미량역가 평판 판독기로 측정한다. 대조 시료의 연속 희석물을 사용하여 표준 곡선을 작도하고 X축(로그 스케일)에 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 농도를, Y축(직선 스케일)에 형광도 또는 흡광도를 플롯팅한다. 표준 곡선을 사용하여 시료 중의 METH1 또는 METH2의 농도를 삽입한다.
실시예 26 : 폴리펩티드의 제형화
METH1 또는 METH2 조성물을 제조하여, 환자의 임상적 상태(특히 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단독물로의 치료시 부작용), 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획및 처치의가 알고 있는 기타 인자를 고려하여 의학적 실시에 바람직하게 조제한다. 따라서, 이러한 고려 하에 본 발명의 용도의 "유효량"을 결정한다.
일반적 소견으로서, 비경구적으로 투여되는 METH1 또는 METH2의 투여량 당 총 약학적 유효량은 치료적 판단에 따라 달라질 수 있는 것이지만, 환자 체중의 약 1 ㎍/㎏/일 내지 10 ㎎/㎏/일 범위이다. 보다 바람직하게는, 이 투여량은 0.01 ㎎/㎏/일 이상인 것이 좋고, 가장 바람직하게는 인간에 대해 호르몬 약 0.01 내지 1 ㎎/㎏/일인 것이 좋다. 연속 투여하는 경우, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 일반적으로 약 1 ㎍/㎏/시간 내지 약 50 ㎍/㎏/시간의 투여 속도로, 미니펌프 등을 사용하여 1일 당 1 내지 4회 또는 연속 경피 주입하여 투여한다. 또한, 정맥내 백 용액이 사용될 수도 있다. 변화를 관찰하는데 필요한 치료 기간 및 응답 반응이 나타나는 치료 후의 간격은 목적 효과에 따라 달라지는 것으로 보인다.
METH1 또는 METH2를 포함하는 약학 조성물은 경구, 직장, 비경구, 조내, 질내, 복강내, 국소(산제, 연고, 젤, 점적액 또는 경피 패치로서), 협측 또는 경구 또는 비측 분무제로서 투여될 수 있다. "약학적 허용성 담체"란 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충진제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 모든 제형의 제제 보조제를 의미한다. 본 명세서에 사용된 "비경구"란 용어는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 의미한다.
또한, METH1 또는 METH2는 지속 방출 시스템에 의해 적합하게 투여된다. 지속 방출 조성물의 적합한 예는 성형 물품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스, 예컨대 필름 또는 마이크로캡슐이다. 지속 방출 매트릭스로는 폴리락타이드(미국 특허제3,773,919호, EP 58,481), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체[Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556(1983)], 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)[R.Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 15:167-277(1981) 및 R.Langer, Chem.Tech. 12:98-105(1982)], 에틸렌 비닐 아세테이트(R.Langer et al.) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988)이 있다. 지속 방출 조성물로는 리포좀 포획된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드가 있다. METH1 또는 METH2를 포함하는 리포좀은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 제조한다. DE3,218,121; Epstein et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692(1985); Hwang et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:4030-4034(1980); EP52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP142,641; 일본 특허 출원 번호 83-118008; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324가 있다. 보통, 리포좀은 지질 함량이 콜레스테롤 약 30 mol% 이상인 소형(약 200 내지 800 Å) 단층라멜라 형으로서, 지질 함량의 선택 비율은 분비형 폴리펩티드 요법에 최적이 되게 조정된다.
비경구 투여시, 일 실시양태로서, METH1 또는 METH2는 일반적으로 단위 투여량의 주사형 형태(용액, 현탁액 또는 유탁액)를 바람직한 순도에서 약학적 허용성 담체, 즉 사용되는 투여량과 농도에서 수용체에게 비독성이고 제제의 다른 성분과 상용될 수 있는 담체와 혼합하여 제조한다. 예를 들어, 제제는 산화제 및 폴리펩티드에 유해한 것으로 공지된 기타 다른 화합물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
일반적으로, 제제는 METH1 또는 METH2를 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 접촉시켜 제조한다. 그 다음, 필요하다면 생성물을 바람직한 제형으로 성형한다. 바람직하게는, 담체는 비경구 담체, 보다 바람직하게는 수용체의 혈액과 등장성인 용액인 것이 좋다. 이러한 담체 부형제의 예로는 물, 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이 있다. 리포좀 뿐만 아니라 고정용 오일 및 에틸 올레이트와 같은 비수성 부형제도 역시 본 발명에 유용하다.
담체는 등장성과 화학적 안정성을 향상시키는 물질과 같은 소량의 첨가제를 포함하는 것이 적합하다. 이러한 물질은 사용된 투여량과 농도에서 수용체에게 비독성인 것으로, 인산염, 구연산염, 숙신산염, 아세트산, 및 기타 다른 유기산이나 이으 염과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 산화방지제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드, 예컨대 폴리아르기닌 또는 트리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체(예, 폴리비닐피롤리돈); 아미노산(예, 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌); 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예컨대 셀룰로스 또는 이의 유도체, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제(예, EDTA); 당 알코올(예, 만니톨 또는 소르비톨); 나트륨과 같은 반대이온; 및/또는 폴리소르베이트, 폴리옥사머 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제가 있다.
METH1 또는 METH2는 일반적으로 이러한 부형제 중에 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖, 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/㎖의 농도로, pH 약 3 내지 8 하에 제조한다. 전술한 부형제, 담체 또는 안정화제 중 특정 성분의 사용시 폴리펩티드의 염이 형성될 수 있다는 것은 자명한 사항이다.
치료적 투여용으로 사용되는 METH1 또는 METH2는 멸균성일 수 있다. 멸균이란 멸균 여과 막(예, 0.2 미크론 막)을 통해 여과하면 용이하게 실시된다. 치료용 폴리펩티드 조성물은 일반적으로 멸균 투입구를 가진 용기, 예컨대 피하주사용 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 가진 정맥내 용액 백이나 용기에 주입된다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 일반적으로 단위 또는 다중 용량의 용기, 예컨대 밀봉 앰플이나 바이엘에 수성 용액 또는 복원가능한 동결건조 제제로서 보관될 수 있다. 동결건조 제형의 일예로서, 10 ㎖ 용기에 멸균 여과된 1%(w/v) 수성 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 용액 5 ㎖를 충전하고 그 혼합물을 동결건조한다. 주입 용액은 동결건조 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 정균성 주사용수로 복원시켜 제조한다.
또한, 본 발명은 1 이상의 용기에 본 발명의 약학 조성물에 포함된 성분 중 1 이상을 충전한 약학 팩이나 킷트를 제공한다. 이러한 용기와 함께 약제나 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 부처가 지시한 형태의 주의문이 포함될 수 있고, 이 주의문에는 인간 투여용의 경우에는 제조, 사용 또는 판매 대리인의 승인이 있어야 한다. 또한, METH1 또는 METH2는 다른 치료 화합물과 함께 이용될 수 있다.
실시예 27 : METH1 또는 METH2의 감소 농도를 치료하는 방법
본 발명은 METH1 또는 METH2 길항물질의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을, 체내 METH1 또는 METH2 활성 농도의 감소를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 상기 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 길항물질은 METH1 또는 METH2 특이적 항체이다.
더욱이, 개체내 METH1 또는 METH2의 표준 또는 정상 발현 농도의 감소로 유발되는 질환은 METH1 또는 METH2를 바람직하게는 분비형태로 투여하여 치료할 수 있다는 것은 자명한 사실이다. 따라서, 본 발명은 일정량의 METH1 또는 METH2를 포함하는 약학 조성물을, METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 증가 농도를 필요로 하는 개체에게 투여하여 그 개체 중에서의 METH1 또는 METH2의 활성 농도를 증가시키는 것이 특징인, 상기 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
예를 들어, METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 농도가 감소된 환자에게는 폴리펩티드 0.1 내지 100 ㎍/㎏을 연속 6일 동안 매일 투여한다. 폴리펩티드는 분비형인 것이 바람직하다. 투여 및 조제를 비롯한 투여 형식의 정확한 세부 사항은 실시예 26에 제시한 바와 같다.
실시예 28 : METH1 또는 METH2의 증가 농도를 치료하는 방법
또한, 본 발명은 치료적 유효량의 METH1 또는 METH2 또는 이의 작동물질을 포함하는 조성물을, 체내 METH1 또는 METH2 활성의 증가 농도를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 상기 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
안티센스 기법은 METH1 또는 METH2의 생성을 억제하는 데 사용된다. 이 기법은 다양한 병인, 예컨대 암으로 인한 METH1 또는 METH2 폴리펩티드(바람직하게는, 분비 형태)의 농도를 감소시키는 방법의 일예이다.
예를 들어, METH1 또는 METH2의 함량이 비정상적으로 높은 것으로 확인된 환자에게 안티센스 폴리뉴클레오티드를 0.5, 1.0, 2.0 및 3.0 ㎎/㎏/일의 함량으로 21일 동안 정맥내 투여한다. 이 치료에 잘 견딘다면 치료를 7일간 중지한 후, 다시반복한다. 안티센스 폴리뉴클레오티드의 제형에 대해서는 실시예 26에 설명한 바와 같다.
실시예 29: 유전자 요법에 의한 치료 방법(생체외 요법)
유전자 요법의 1가지 방법은 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 발현할 수 있는 섬유아세포를 환자에게 이식하는 것이다. 일반적으로, 섬유아세포는 피부 생검에 의해 검체로부터 얻는다. 얻은 조직을 조직 배양 배지에 놓고, 작은 조각으로 분리한다. 작은 조직 덩어리를 조직 배양 플라스크의 습윤 표면에 놓는데, 각 플라스크에 약 10개의 조각을 놓는다. 이 플라스크를 뒤집어 밀봉한 뒤, 실온에서 하룻밤 동안 방치한다. 실온에서 24 시간 후, 플라스크를 원상태로 전환시킨 뒤, 조직 덩어리를 플라스크의 바닥에 고정시키고, 새 배지(예, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 보유한 햄(Ham) F12 배지)를 첨가한다. 그 다음, 이 플라스크를 37 ℃에서 약 1 주일 동안 항온배양한다.
그 후, 새 배지를 첨가하고, 이어서 3 내지 4일 마다 교환한다. 2주간 더 배양한 후, 섬유아세포의 단층이 관찰된다. 이 단층을 트립신처리하고 보다 큰 플라스크에 이식한다.
몰로니 쥐 육종 바이러스의 장말단 반복체가 인접해 있는 pMV-7[Kirschmeier, P.T. et al., DNA 7:219-25(1988)]을 EcoRI 및 HindIII로 분해하고, 그 다음 소장 포스파타제로 처리한다. 선형 벡터를 아가로스 겔에서 분리하고 유리 비드를 사용하여 정제한다.
METH1 또는 METH2를 암호하는 cDNA는 실시예 5에서 전술한 바와 같이 5' 및3' 말단 서열에 각각 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 바람직하게는, 5' 프라이머는 EcoRI 부위를 포함하고, 3' 프라이머는 HindIII 부위를 포함하는 것이 좋다. 몰로니 쥐 육종 바이러스 선형 백본과 증폭된 EcoRI 및 HindIII 단편을, T4 DNA 리가제의 존재하에 동등량으로 함께 첨가한다. 얻어지는 혼합물을 두 단편을 결찰시키기에 적당한 조건하에 유지한다. 그 다음, 결찰 혼합물을 사용하여 박테리아 HB101을 형질전환시키고, 이것을 가나마이신을 함유하는 한천상에 평판배양하여, 벡터가 정확하게 삽입된 METH1 또는 METH2를 포함하는 지를 확인한다.
양종향성(兩種向性) pA317 또는 GP+am12 패키징 세포를 10% 소혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신과 함께 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 응집성 밀도까지 조직 배양하여 증식시킨다. 그 다음, 이 배지에 METH1 또는 METH2 유전자를 포함하는 MSV 벡터를 첨가하고, 이 벡터로 패키징 세포를 형질도입시킨다. 이 패키징 세포는 METH1 또는 METH2 유전자를 포함하는 감염성 바이러스 입자를 생성한다(이 패키징 세포를 생산자 세포라 부른다).
형질도입된 생산자 세포에 새 배지를 첨가하고, 이어서 응집성 생산자 세포 10 ㎝ 평판으로부터 배지를 수거한다. 소모된 배지는 감염성 바이러스 입자를 포함하고, 밀리포어 필터를 통해 여과하여 착탈된 생산자 세포를 제거하고, 이 배지를 다시 사용하여 섬유아세포를 감염시킨다. 준응집성 섬유아세포 평판으로부터 배지를 분리하고, 생산자 세포 유래의 배지로 신속하게 대체한다. 이 배지를 제거하고 새로운 배지로 대체한다. 바이러스의 역가가 높다면, 사실상 모든 섬유아세포가 감염된 것으로 선발할 필요가 없다. 역가가 매우 낮다면, neo 또는 his와 같은 선발 마커를 보유한 레트로바이러스 벡터를 사용할 필요가 있다. 섬유아세포가 충분히 감염되었으면 섬유아세포를 분석하여 METH1 또는 METH2 단백질이 생성되는지를 측정한다.
유전자조작된 섬유아세포를 단독으로 또는 시토덱스(cytodex) 3 마이크로캐리어 비드 상에서 응집성까지 증식시킨 후, 그 다음 숙주에 이식한다.
실시예 30: 유전자 요법을 이용한 치료 방법(생체내 요법)
본 발명의 또 다른 목적은 장애, 질환 및 증상을 치료하기 위한 생체내 유전자 요법을 사용하는 것이다. 이 유전자 요법은 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 발현을 증가 또는 감소시키기 위하여 동물에게 나출 핵산(DNA, RNA 및 안티센스 DNA 또는 RNA) METH1 또는 METH2 서열을 도입시키는 것에 관한 것이다. METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 프로모터 또는 표적 조직이 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 발현하는데 필요한 기타 다른 유전 인자에 작동가능하게 결합될 수 있다. 이러한 유전자 요법 및 전달 기법과 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, WO90/11092, WO98/11779; 미국 특허 5693622, 5705151, 5580859; Tabata H. et al.(1997) Cardiovasc. Res. 35(3):470-479, Chao, J. et al.(1997) Pharmacol.Res. 35(6);517-522, Wolff J.A.(1997) Neuromuscul. Disord. 7(5):314-318, Schwartz,B. et al.(1996) Gene Ther. 3(5):405-411, Tsurumi Y. et al. (1996) Circulation 94(12):3281-3290(본 발명에 참고 인용됨) 참조.
METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물은 동물 세포로 주사 물질을 전달하는 모든 방법, 예컨대 조직(심장, 근육, 피부, 폐, 간, 소장 등)의 간질성 공간으로 주사하여 전달할 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물은 약학적 허용성 액체 또는 수성 담체에 의해 전달될 수 있다.
"나출" 폴리뉴클레오티드, DNA 또는 RNA란 용어는 세포로의 도입을 보조, 촉진 또는 용이하게 하는 작용을 하는 임의의 전달 부형제가 없는 서열로서, 예컨대 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포좀 제제, 리포펙틴 또는 침전제 등이 있다. 하지만, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있는 리포좀 제제로 전달할 수도 있다[예, 문헌 Felgner P.L.et al.(1995) Ann.NY Acad.Sci. 772:126-139 및 Abdallah B. et al.(1995) Biol.Cell 85(1):1-7 참조].
유전자 요법 방법에 사용되는 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 벡터 작제물은 숙주 게놈내로 통합되지 않거나 복제를 허용하는 서열을 포함하지 않는 작제물이 바람직하다. DNA의 발현을 유도하는 데에는 당해 기술 분야에 공지된 강한 프로모터가 모두 사용될 수 있다. 다른 유전자 치료 요법과 달리, 표적 세포내로 나출 핵산 서열을 도입하는 방법의 1가지 주요 장점은 세포내에서 한시적인 폴리뉴클레오티드 합성 성질이다. 비복제성 DNA 서열은 세포에 도입되면 최고 6개월 동안 바람직한 폴리펩티드의 생성을 제공하는 것으로 확인되었다.
METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물은 근육, 피부, 뇌, 폐, 장, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담즙, 위, 소장, 정소, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 선 및 연결 조직을 비롯한 동물내 조직의 간질 공간으로 전달될 수 있다. 조직의 간질 공간에는 세포간 유체, 기관 조직의 망섬유 중에 존재하는 뮤코다당류 기질, 혈관 또는 실의 벽에 있는 탄성 섬유, 섬유상 조직의 콜라겐 섬유 또는 근육 세포를 덮고있는 결합 조직내 또는 골강내 존재하는 동일 기질을 포함한다. 이와 마찬가지로 림프 채널의 림프액과 혈액의 혈장이 존재하는 공간도 있다. 근육 조직의 간질 공간으로의 전달은 하기 기재되는 측면에서 바람직하다. 이들 세포를 포함하는 조직으로 주사에 의해 편리하게 전달될 수 있다. 특히, 혈액이나 피부 섬유아세포의 간세포와 같은 비분화성 또는 부분 분화성 세포에서 전달과 발현이 이루어질 수도 있지만, 분화되는 지속적인 비분열성 세포로 전달되어 발현되는 것이 바람직하다. 생체내 근육 세포는 폴리뉴클레오티드를 흡수하고 발현하는 성질 면에서 특히 바람직하다.
나출 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 주사시, DNA 또는 RNA의 유효 투여량은 약 0.05 g/㎏체중 내지 약 50 ㎎/㎏체중의 범위이다. 이 투여량은 바람직하게는 약 0.005 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏ 범위, 보다 바람직하게는 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏ 범위가 좋다. 물론, 당업자라면, 이 투여량이 주사되는 조직 부위에 따라 달라질 수 있다는 것을 잘 알 것이다. 핵산 서열의 적당하면서 효과적인 투여량은 당업자라면 쉽게 결정할 수 있는 것으로, 치료 질환 및 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 투여 경로는 조직의 간질 공간내로 주사하는 비경구 경로이다. 하지만, 기타 다른 비경구 경로, 예컨대 폐 또는 기관지 조직, 인후 및 코의 점막으로 특별히 전달하기 위한 분무질 제제의 흡입으로 투여될 수도 있다. 또한, 나출 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물은 혈관성형술 동안 이 절차에 사용된 카테터를 통해 동맥으로 전달될 수 있다.
생체내 근육에 주사된 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드의 용량 응답 효과는 다음과 같이 측정한다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 mRNA를 제조하기 위하여 적합한 METH1 또는 METH2 주형 DNA를 표준 재조합 DNA 기법에 따라 제조한다. 원형 또는 선형일 수 있는 주형 DNA는 나출 DNA 또는 리포좀과의 복합체로서 사용된다. 그 다음, 주형 DNA의 각종 함량을 마우스의 사두 근육에 주사한다.
5 내지 6주령의 암컷 및 수컷 Balb/C 마우스에게 2.5% 아버틴 0.3 ㎖를 복강내 주사하여 마취시킨다. 전대퇴를 1.5 ㎝ 절제하면 사두 근육이 직접 보인다. 근육의 원삽입 부위에서 무릎으로 약 5 ㎝ 거리와 약 0.2 ㎝ 깊이를 두고 0.1 ㎖ 담체 중의 METH1 또는 METH2 주형 DNA를 1 cc 주사기를 이용하여 27 게이지의 바늘을 통해 1분 동안 주사한다. 이후의 국재화를 위하여 주사 부위 상에 봉합을 실시하고 피부는 스테인레스 스틸 클립으로 밀봉해 놓는다.
적당한 항온처리 기간(예, 7일) 후, 전체 사두를 절제하여 근육 추출물을 제조한다. 각 사두 근육 15 ㎛ 단편 15개를 모두 METH1 또는 METH2 단백질 발현에 대하여 조직화학적으로 염색한다. METH1 또는 METH2 단백질 발현을 위한 경과 시간은 유사하게 실험하지만, 다른 마우스 유래의 사두는 상이한 시간에 수거한다. 주사 후 근육내 METH1 또는 METH2 DNA의 존속성은 주사를 맞은 마우스와 대조 마우스로부터 총 세포 DNA 및 HIRT 상청액을 제조한 후 서던 블롯 분석하여 측정할 수 있다. 마우스에 대한 상기 실험 결과는 METH1 또는 METH2 나출 DNA를 사용하여 인간 및 기타 다른 동물에 대한 적당한 투여량 및 기타 다른 치료 변수를 유추하는데 이용할 수 있다.
본 발명은 전술한 상세한 설명과 실시예에 구체적으로 기재된 것 이외에 다른 양태로 실시될 수 있다는 것은 자명한 것이다.
전술한 교시로부터 본 발명의 다양한 변형과 수정이 가능하며, 이것은 본 발명의 범위에 속하는 것이다.
본 명세서에 기재된 모든 문헌(특허, 특허 출원, 정지 간행물, 실험서, 서적 또는 기타 문서)의 개시 내용은 전체적으로 본 발명에 인용되는 것이다.
수탁미생물에 관한 표시(PCT Rule 13bis)
A. 하기 제시된 내용은 명세서 93쪽 7 내지 19 행에 기재된 미생물에 관한 것이다.
B. 수탁물 동정
수탁 기관명미국 모식균 배양 수집소
수탁 기관 주소미국 버지니아주 20110-2209 전주소: 미국 매릴랜드주 20852 록빌마나사스 유니버시티 부울러바드 파크론 드라이브 1230110801
수탁일1998. 1. 15 수탁번호209581
C. 추가표시
DNA 플라스미드 HOUCQ17
D. 표시가 적용되는 지정국
E.표시의 부가사항
수탁미생물에 관한 표시(PCT Rule 13bis)
A. 하기 제시된 내용은 명세서 93쪽 7 내지 19 행에 기재된 미생물에 관한 것이다.
B. 수탁물 동정
수탁 기관명미국 모식균 배양 수집소
수탁 기관 주소미국 버지니아주 20110-2209 전주소: 미국 매릴랜드주 20852 록빌마나사스 유니버시티 부울러바드 파크론 드라이브 1230110801
수탁일1998. 1. 15 수탁번호209582
C. 추가표시
DNA 플라스미드 HCE4D69
D. 표시가 적용되는 지정국
E.표시의 부가사항

Claims (19)

  1. (a) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 1 내지 950을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 2 내지 950을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (c) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 29 내지 950을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (d) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 30 내지 950을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (e) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 METH1 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
    (f) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 METH1 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
    (g) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 1 내지 890을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (h) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 2 내지 890을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (i) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 24 내지 890을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (j) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 112 내지 890을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (k) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
    (l) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 METH2 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
    (m) (i) 변형으로서 뉴클레오티드 삽입, 결실, 치환 또는 이의 임의의 조합이 있고,
    (ii) 변형의 수는 미변형 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드 총 수의 5% 이하에 해당하는 것인,
    상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k) 또는 (l)의 폴리뉴클레오티드를 변형시켜 제조되는 폴리뉴클레오티드 변형체,
    (n) 서열 번호 2의 아미노산 235 내지 459를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (o) 서열 번호 2의 아미노산 460 내지 544를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (p) 서열 번호 2의 아미노산 545 내지 598을 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (q) 서열 번호 2의 아미노산 841 내지 894를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (r) 서열 번호 2의 아미노산 895 내지 934를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (s) 서열 번호 2의 아미노산 536 내지 613을 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (t) 서열 번호 2의 아미노산 549 내지 563을 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (u) 서열 번호 4의 아미노산 214 내지 439를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (v) 서열 번호 4의 아미노산 440 내지 529를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (w) 서열 번호 4의 아미노산 530 내지 583을 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (x) 서열 번호 4의 아미노산 837 내지 890을 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (y) 서열 번호 4의 아미노산 280 내지 606을 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (z) 서열 번호 4의 아미노산 529 내지 548을 암호하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (aa) 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y) 또는 (z)의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  2. 서열 번호2에 기재된 METH1 폴리펩티드 또는 서열 번호 4에 기재된 METH2 폴리펩티드의 에피토프 보유 부분의 아미노산 서열을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  3. (a) 서열 번호 1의 암호 영역 중 50개의 인접 뉴클레오티드(단, 이 뉴클레오티드 서열에서 서열 번호 14 내지 41에 기재된 서열 중 어느 한 서열은 제외된다)또는 이것의 임의의 단편;
    (b) 상기 (a)에 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  4. (a) 서열 번호 3의 암호 영역 중 50개의 인접 뉴클레오티드(단, 이 뉴클레오티드 서열에서 서열 번호 19 내지 22, 24, 42 내지 77에 기재된 서열 중 어느 한 서열은 제외된다) 또는 이것의 임의의 단편;
    (b) 상기 (a)에 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  5. 제1항의 분리된 핵산 분자를, 프로모터에 작동가능하게 결합된 벡터에 삽입하는 것을 포함하여, 재조합 벡터를 제조하는 방법.
  6. 제5항의 방법으로 제조된 재조합 벡터.
  7. 제6항에 기재된 재조합 벡터를 숙주 세포내로 도입시키는 것을 포함하여, 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법.
  8. 제7항의 방법으로 제조된 재조합 숙주 세포.
  9. 제8항에 기재된 재조합 숙주 세포를 METH1 또는 METH2 폴리펩티드가 발현될 수 있는 조건하에서 배양하는 단계 및 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하여, METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 제조하는 재조합 방법.
  10. (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 950;
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 2 내지 950;
    (c) 서열 번호 2의 아미노산 29 내지 950;
    (d) 서열 번호 2의 아미노산 30 내지 950;
    (dd) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 METH1 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (e) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 METH1 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (f) 서열 번호 4의 아미노산 1 내지 890;
    (g) 서열 번호 4의 아미노산 2 내지 890;
    (h) 서열 번호 4의 아미노산 24 내지 890;
    (i) 서열 번호 4의 아미노산 112 내지 890;
    (j) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 METE2 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 METH2 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (k) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 METE2 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 METH2 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (l) (i) 변형으로서 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이의 임의의 조합이 있고,
    (ii) 변형의 수는 미변형 아미노산 서열에 존재하는 아미노산 총 수의 5% 이하에 해당하는 것인,
    상기 (a), (b), (c), (d), (dd), (e), (f), (g), (h), (i), (j) 또는 (k)의 폴리펩티드를 변형시켜 제조되는 폴리펩티드 변형체의 아미노산 서열;
    (m) 서열 번호 2의 아미노산 235 내지 459;
    (n) 서열 번호 2의 아미노산 460 내지 544;
    (o) 서열 번호 2의 아미노산 545 내지 598;
    (p) 서열 번호 2의 아미노산 841 내지 894;
    (q) 서열 번호 2의 아미노산 895 내지 934;
    (r) 서열 번호 2의 아미노산 536 내지 613;
    (s) 서열 번호 2의 아미노산 549 내지 563;
    (t) 서열 번호 4의 아미노산 214 내지 439;
    (u) 서열 번호 4의 아미노산 440 내지 529;
    (v) 서열 번호 4의 아미노산 530 내지 583;
    (w) 서열 번호 4의 아미노산 837 내지 890;
    (x) 서열 번호 4의 아미노산 280 내지 606;
    (y) 서열 번호 4의 아미노산 529 내지 548; 및
    (z) 상기 (a), (b), (c), (d), (dd), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k),(l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x) 또는 (y)의 폴리펩티드 중 어느 하나의 에피토프 보유 부분의 아미노산 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 재조합 숙주 세포에서 생성되는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 포유류인 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
  13. 보존적 아미노산 치환이 50개 중 1인 것을 제외하고는,
    (a) 서열 번호 2에 기재된 약 1 내지 약 950의 아미노산;
    (b) 서열 번호 2에 기재된 약 2 내지 약 950의 아미노산;
    (c) 서열 번호 2에 기재된 약 29 내지 약 950의 아미노산;
    (d) 서열 번호 2에 기재된 약 30 내지 약 950의 아미노산;
    (e) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 METH1 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (f) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 성숙 METH1 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (g) 서열 번호 4에 기재된 약 1 내지 약 890의 아미노산;
    (h) 서열 번호 4에 기재된 약 2 내지 약 890의 아미노산;
    (i) 서열 번호 4에 기재된 약 24 내지 약 890의 아미노산;
    (j) 서열 번호 4에 기재된 약 112 내지 약 890의 아미노산;
    (k) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 METH2 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (l) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 성숙 METH2 폴리펩티드의 아미노산 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 서열을 보유하는, METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  14. 보존적 아미노산 치환이 50개 중 1인 것을 제외하고는,
    (a) 서열 번호 2에 기재된 약 1 내지 약 950의 아미노산;
    (b) 서열 번호 2에 기재된 약 2 내지 약 950의 아미노산;
    (c) 서열 번호 2에 기재된 약 29 내지 약 950의 아미노산;
    (d) 서열 번호 2에 기재된 약 30 내지 약 950의 아미노산;
    (e) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 METH1 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (f) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 성숙 METH1 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (g) 서열 번호 4에 기재된 약 1 내지 약 890의 아미노산;
    (h) 서열 번호 4에 기재된 약 2 내지 약 890의 아미노산;
    (i) 서열 번호 4에 기재된 약 24 내지 약 890의 아미노산;
    (j) 서열 번호 4에 기재된 약 112 내지 약 890의 아미노산;
    (k) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 METH2 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (l) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 성숙 METH2 폴리펩티드의 아미노산 서열; 및
    (m) 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k) 또는 (l)의 폴리펩티드 중 어느 하나의 에피토프 보유 부분의 아미노산 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 서열을 보유하는, 분리된 폴리펩티드.
  15. (a) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 1 내지 950을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 2 내지 950을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (c) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 29 내지 950을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (d) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 30 내지 950을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (e) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 METH1 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
    (f) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 METH1 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
    (g) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 1 내지 890을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (h) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 2 내지 890을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (i) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 24 내지 890을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (j) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 112 내지 890을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드;
    (k) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
    (l) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 METH2 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (m) 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k) 또는 (l) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 폴리뉴클레오티드와 동일성이 95% 이상인 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 동일성%는 매개변수가 매트릭스 = 귀일법, k-튜플 = 4, 부정합 패널티 = 1, 결합 패널티 = 30, 무작위 그룹 길이 = 0, 컷오프 스코어 = 1, 갭 패널티 = 5, 갭 사이즈 패널티 = 0.05, 윈도우 사이즈 = 500 또는 주체 뉴클레오티드 서열의 길이(보다 짧은 쪽)인 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 계산되는 것이 특징인, 분리된 핵산 분자.
  16. (a) 서열 번호 2에 기재된 약 1 내지 약 950의 아미노산;
    (b) 서열 번호 2에 기재된 약 2 내지 약 950의 아미노산;
    (c) 서열 번호 2에 기재된 약 29 내지 약 950의 아미노산;
    (d) 서열 번호 2에 기재된 약 30 내지 약 950의 아미노산;
    (e) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 METH1 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (f) ATCC 수탁 번호 209581에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 성숙 METH1 폴리펩티드의 아미노산 서열;
    (g) 서열 번호 4에 기재된 약 1 내지 약 890의 아미노산;
    (h) 서열 번호 4에 기재된 약 2 내지 약 890의 아미노산;
    (i) 서열 번호 4에 기재된 약 24 내지 약 890의 아미노산;
    (j) 서열 번호 4에 기재된 약 112 내지 약 890의 아미노산;
    (k) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을가진 METH2 폴리펩티드의 아미노산 서열; 및
    (l) ATCC 수탁 번호 209582에 포함된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 성숙 METH2 폴리펩티드의 아미노산 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드와 동일성이 95%인 폴리펩티드를 포함하고, 여기에서 동일성%는 매개변수가 매트릭스 = PAM0, k-튜플 = 2, 부정합 패널티 = 1, 결합 패널티 = 20, 무작위 그룹 길이 = 0, 컷오프 스코어 = 1, 갭 패널티 = 5, 갭 사이즈 패널티 = 0.05, 윈도우 사이즈 = 500 또는 주체 뉴클레오티드 서열의 길이(보다 짧은 쪽)인 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 계산되는 것이 특징인, 분리된 폴리펩티드.
  17. 제10항에 기재된 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체 중의 맥관형성을 억제하는 방법.
  18. 서열 번호 2의 아미노산 서열 m-n을 포함하고, 여기에서 m은 1 내지 950의 정수이고, n은 10 내지 950의 정수인 것이 특징인 폴리펩티드.
  19. 서열 번호 4의 아미노산 서열 m-n을 포함하고, 여기에서 m은 1 내지 890의 정수이고, n은 10 내지 890의 정수인 것이 특징인 폴리펩티드.
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