KR20030000011A - Ｍｅｔｈ－１ 및 ｍｅｔｈ－２ 폴리뉴클레오티드 및폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 항혈관형성성 단백질, 트롬보스폰딘에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 인간 METH1 및 METH2를 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공된다. METH1 및 METH2 폴리펩티드와, 벡터, 숙주 및 이를 제조하는 재조합 방법도 제공된다. 암의 진단을 위한 진단 방법과, METH1 및 METH2 양의 증가가 필요한 개체를 치료하는 치료 방법도 제공된다. 또한 METH1 또는 METH2를 사용하여 혈관형성을 억제하는 방법도 제공된다.
Description
관련 기술
혈관형성, 즉, 기존의 맥관구조에서 신규한 혈관의 형성은 정상적 성인에서는 엄격하게 조절되는 과정이다. 생리적 환경하에서, 신규한 모세혈관의 성장이 혈관 성장을 저해하거나 자극하는 작용을 하는 성장 조절 단백질의 상호작용에 의하여 엄격하게 조절된다. 일반적으로, 이러한 작용간의 균형은 억제를 하는 방향으로 기울며 결과적으로 혈관 성장이 제어된다. 그러나, 특정 병리적 상태하에서, 국소적 억제 조절은 혈관형성 유도제의 활성 상승을 제어할 수 없다. 혈관형성은 암의 전이에서 중요한 단계이고(Folkman, Nature Med. 1:27-31(1995)), 비정상 상처의 치료, 염증, 류마티스 관절염, 건선 및 당뇨병 망막증의 병리학에 필수적이며(Folkman et al., Science 235:442-447 (1987)), 이러한 병리적 실체는 혈관 성장의 약학적 및/또는 유전적 억제에 의하여 조절될 수 있다는 희망을 제시한다(Iruela-Arispe et al., Thromb. Haem. 78:672-677 (1997)).
트롬보스폰딘-1(TSP-1)은 450kDa, 항-혈관형성 접착성 당단백질로서, 활성화된 혈소판으로부터 방출되며 성장하는 세포에 의하여 분리된다(Adams, Int. J. Biochem. Cell. Biol. 29:861-867 (1997)). TSP-1은 동종삼량체이며, 각 서브유니트는 아스파라긴 잔기의 베타-히드록실화 및 N-연결된 당화에 의하여 후변역 개질된 1152 아미노산 잔기 폴리펩티드로 이루어졌다.
TSP-1 단백질 및 mRNA 수준은 다양한 인자에 의하여 조절된다. TSP-1 단백질 수준은 IL-1 알파 및 TNF 알파에 의하여 하향조절된다. TSP-1 mRNA 및 단백질 수준은 PDGF, TGF-베타 및 bFGF를 포함하는 폴리펩티드 성장 인자에 의하여 상향 조절되고(Bornstein, Faseb J. 6:3209-3299 (1992)), 또한 p53 종양 억제인자 유전자 생성물의 발현 수준에 의하여 조절된다(Dameron et al., Science 265: 1582-1584 (1994)). 트롬보플라스틴 족의 4개 이상의 기타 일원이 동정되었다: TSP-2, TSP-3,TSP-4 및 TSP-5(소위 COMP). 혈관형성의 조절에 관련된 다른 분자를 동정하는 것이 당업계에서 요구된다.
연방정부에서 지원한 연구 개발하에 수행된 발명의 권리에 대한 언급
본 발명의 개발중 수행된 일부 연구는 미국 정부 보조금을 이용하였다. 미국 정부는 본 발명의 일부 권리를 보유할 것이다.
발명의 분야
본 발명은 신규한 항-혈관형성 단백질, 트롬보스폰딘에 관한 것이다. 구체적으로는, 인간 METH1 및 METH2(메탈로프로테아제에 대해서는 ME, 및 트롬보스폰딘에 대해서는 TH)를 암호화하는 핵산 분자 분리물을 제공한다. METH1 및 METH2 폴리펩티드는 벡터, 숙주 세포 및 이들을 생산하는 재조합 방법으로서 제공된다. 또한 METH1 또는 METH2 양의 증가가 요구되는 개체를 치료하는 치료 방법 및 암의 예휴를 위한 진단 방법을 제공한다. 또한 METH1 또는 METH2를 사용하여 혈관형성을 저해하는 방법을 제공한다.
도 1a-c는 METH1의 뉴클레오티드(서열번호 1) 및 추론된 아미노산(서열번호 2)의 서열을 나타낸다. 단백질은 약 28개 아미노산 잔기의 예측되는 리더 서열(밑줄)을 갖는다.
도 2a-b는 METH2의 뉴클레오티드(서열번호 3) 및 추론된 아미노산(서열번호4) 서열을 나타낸다. 단백질은 약 23개 아미노산 잔기(밑줄)의 예측된 리더 서열을 갖는다.
도 3a-c는 METH1(서열번호 2) 및 METH2(서열번호 4)의 아미노산 서열과 이것의 밀접한 상동체, 소의 메탈로프로테아제(pNPI)(서열번호 5)의 비교를 나타낸다. 동일한 아미노산은 박스로 구분된다. 메탈로프로테아제 도메인내 시그널 펩티드(한줄), 포유동물 서브틸리신에 대한 잠재적 절단 부위(이중 밑줄), 아연-결합 부위(점선; METH1의 아미노산 383-395 및 METH2의 363-375) 및 잠정적 디스인테그린 루프(화살표)를 포함하는, 서열 및 구조적 동일성에 의하여 예측되는 기능성 도메인이 표지된다.
도4는 예비도메인, 촉매적 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부한 디스인테그린 도메인, TSP-유사 도메인, 스페이서 영역 및 상이한 수의 TSP-유사 도메인(METH1에는 3개, MEPH2에는 2개 및 pMPI에는 1개)을 포함하는 MEPH1, MEPH2 및 pNPI의 1차 구조를 나타낸다.
도 5는 METH1(서열번호 2) 및 METH2(서열번호 4)의 TSP-유사 도메인과 이것의 TSP1(서열번호 6, 7 및 8) 및 TSP2(서열번호 9, 10 및 11)의 비교를 나타낸다. 시스테인은 1 내지 6으로 번호를 매기고 트립토판은 별표로 표시된다.
도 6a-6d는 METH1 및 METH2의 TSP-유사 도메인으로부터 유래된 펩티드 및 재조합 펩티드가 VEGF-유도된 혈관형성을 차단하는 것을 나타낸다. 혈관형성은 펩티드 또는 재조합 단백질의 존재 또는 부재시 마트리겔상에 존재하는 VEGF를 함유하는 나일론 메쉬를 사용하여 12-14-일된 태아로부터 CAM성에서 유도되었다. 모세혈관 밀도는 실시예4에서 기재된 바와 같이 평가되었다. 양성 및 음성 대조구는 VEGF 및 비히클을 각각 단독으로 유도하였다. (a) 재조합 단백질의 존재하에서 VEGF에 의하여 유도되는 혈관형성 반응의 정량화. TSP1, 정제된 혈소판 TSP1, GST, 정제된 GST, GST-TSP1, GST-METH1 및 GST-METH2를 실시예4에서 기재하였다. (b) 펩티드의 부재 또는 존재하에서 VEGF에 의하여 유도되는 혈관형성 반응의 정량화; P-TSP-1, P-METH1 및 P-METH2(TSP, METH1 및 METH2 각각의 유형 I로부터 유래된 펩티드); SC1 및 SC2는 대조구로서 사용되는 스크램블 펩티드이다. (c) GST-METH1의 존재시 VEGF-유도된 혈관형성의 용량-반응성. (d) GST-METH2의 존재하에서 VEGF-유도된 혈관형성의 용량-반응성. 혈관형성 지수는 VEGF-매트리겔로부터 맥관 반응을 100%로서 고려하고 배경 수준(매트리겔 자체)을 공제하여 표현한다. 분석을 적어도 2회 반복하였다. 각 처리는 3개로 작성하였다. 값은 평균값을 나타내고, 막대기는 표준편차를 지시한다. *p<0.001.
도 7a-e는 bFGF-자극된 세포 증식에 대한 METH1 및 METH2 재조합 단백질의 영향을 나타낸다. 세포는 시험을 하기 위하여 bFGF 및 재조합 단백질을 함유하는 배지중에 24-웰 플레이트에 배양하였다(3 ug/ml, 그래프에 표시안됨). 대조구는 비히클 또는 GST 재조합 단백질 단독을 포함한다. (a), HDEC, 인간 피부 내피 세포; (b), HMEC, 인간 포유류 외피 세포; (c), HDF, 인간 피부 섬유아세포; (d), SMC, 평활근; (e) HDEC 증식에 대한 GST-METH1 및 GST-METH2의 용량-반응성. 실험을 적어도 2회 반복하였다. 각 처리는 3조로 작성하였다. 값은 평균을 나타내고, 막대기는 표준 편차를 지시한다. *p<0.01.
도 8은 pHE4-5 발현 벡터(서열번호 12) 및 서브클론된 METH1 또는 METH2 cDNA 코딩 서열의 도식적 제시를 나타낸다. 카나마이신 내성 마커 유전자, METH1 또는 METH2 코딩 서열, oriC 서열 및 lacIq 코딩 서열의 위치가 표시되어 있다.
도 9는 pHE 프로모터(서열번호 13)의 조절 인자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 2개의 lac 조절인자 서열, 샤인-델가노 서열(S/D) 및 말단 HindII 및 NdeI 제한 부위(이탤릭체)가 표시되어 있다.
도 10은 METH1 아미노산 서열의 분석을 나타낸다. 알파, 베타, 턴 및 코일 영역; 친수성 및 소수성; 양쪽성 영역; 가요성 영역; 항원 지수 및 표면 확률이 제시된다. 또한 모두 디폴트 세팅을 사용하여 생성하였다. "항원 지수 또는 제임슨-울프" 그래프에서 양성 피크는 METH1 또는 METH2 단백질의 고도의 항원 영역, 즉 본 발명의 에피토프-보유 펩티드가 획득될 수 있는 영역의 위치를 나타낸다. 이러한 그래프에 의하여 정의된 도메인이 본 발명에 의하여 숙고된다. 도10에 그래픽으로 요약된 데이터의 표는 표 1에서 제시되어 있다.
도 11은 METH2 아미노산 서열의 분석을 나타낸다. 알파, 베타, 턴 및 코일 영역; 친수성 및 소수성; 양쪽성 영역; 가요성 영역; 항원 지수 및 표면 확률이 제시된다. 또한 모두 디폴트 세팅을 사용하여 생성하였다. "항원 지수 또는 자메슨-울프" 그래프에서 양성 피크는 METH1 또는 METH2 단백질의 고도의 항원 영역, 즉 본 발명의 에피토프-보유 펩티드가 획득될 수 있는 영역의 위치를 나타낸다. 이러한 그래프에 의하여 정의된 도메인이 본 발명에 의하여 숙고된다. 도11에 그래픽으로 요약된 데이터의 표는 표 2에서 제시되어 있다.
[표 1]
[표 2]
발명의 상세한 설명
TSP-1의 항-혈관형성 도메인을 암호화하는 cDNA로 cDNA 라이브러리를 스크린함으로써 본 발명의 발명자는 2개의 신규한 단백질, METH1 및 METH2(또한 맥관 내피 성장 길항제에 대하여 각각 VEGA-1 및 VEGA-2로 명명)을 동정하였다. 이는 TSP-1의 항-혈관형성 도메인, 메탈로프로티나제 도메인 및 디스인테그린-유사 도메인을 포함한다. 본 발명자들은 METH1 및 METH2 양자가 항-혈관형성 활성을 갖는다는 것을 보여주었다.
따라서, 본 발명은 서열번호 2에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 METH1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 분리물을 제공한다. 상기 서열번호 2는 클론된 cDNA를 서열결정함으로써 결정되었다. 본 발명의 METH1 단백질은 트롬보스폰딘-1 및 pNPI과 서열 상동성을 공유한다. 서열번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열은 cDNA 클론(미국 배양물 수집소에 1998년 1월 15일자로 기탁, 버지니아주 20110-2209 마낫사스 유니버시티 불르버드 10801, 기탁번호 209581)을 서열결정함으로써 얻었다. ATCC 기탁번호 209581에 포함된 cDNA 클론은 서열번호 2의 아미노산 112-950를 암호화하는 METH1 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 분리물을 제공한다. 상기 서열번호 4는 클론된 cDNA를 서열결정함으로써 부분적으로 결정되었다. 본 발명의 METH2 단백질은 트롬보스폰딘-1 및 pNPI과 서열 상동성을 공유한다. 서열번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열은 cDNA 클론(미국 배양물 수집소에 1998년 1월 15일자로 기탁, 버지니아주 20110-2209 마낫사스 유니버시티 불르버드 10801, 기탁번호 209582)을 서열결정함으로써 부분적으로 얻었다. ATCC 기탁번호 209582에 포함된 cDNA 클론은 서열번호 4의 아미노산 112-890를 암호화하는 부분 METH2 서열을 포함한다. 완전 METH2 서열을 포함하는 cDNA 클론을 미국 배양물 수집소(버지니아주 20110-2209 마낫사스 유니버시티 불르버드 10801, 기탁번호 PTA 1478)에 2000년 3월 14일자로 기탁하였다.
핵산 분자
본원의 DNA 분자를 서열결정함으로써 결정되는 일부 뉴클레오티드 서열은 자동화된 DNA 서열분석기(예, 어플라이드 바이오시스템의 모델 1373)를 사용하여 결정하였고, 본원에서 결정된 DNA 분자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 상술된 바와 같이 결정된 DNA 서열의 번역에 의하여 예측되었다. 따라서, 자동화된 방법에 의하여 결정되는 임의의 DNA 서열에 대한 공지의 기술과 같이, 본원에서 결정된 임의의 뉴클레오티드 서열은 일부 에러를 포함할 것이다. 자동화에 의하여 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열결정된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 통상 약 90% 이상 상동이고, 더욱 전형적으로는 약 95% 이상 내지 99.9% 이상 상동이다. 실제 서열은 공지된 수동 DNA 서열결정 방법을 포함하는 기타 접근법에 의하여 더욱 정확하게 결정될 수 있다. 당업계에서 공지된 바와 같이, 실제 서열에 비겨하여 결정된 뉴클레오티드 서열중에 단일 삽입 또는 결실은 뉴클레오티드 서열의 번역시 프레임 시프트를 일으켜, 결정된 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 예측되는 아미노산 서열이 상기 삽입 또는 결실의 포인트에서 시작하여 서열결정된 DNA 분자에 의하여 실제로 암호화되는 아미노산 서열과 완전히 상이할 수 있다.
서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드와 같이, 본원에서 제공된 정보를 사용하여, METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 본원 발명의 핵산 분자를 표준 클로닝 및 스크린 방법, 예를 들면 출발 물질로서 mRNA를 사용한 cDNA 클로닝을 위한 방법을 사용하여 획득할 수 있다. 본 발명의 예로서, 서열번호 1에 제시된핵산 분자는 인간 심장에서 유래된 cDNA 라이브러리에서 발견되었고 서열번호 3에 제시된 핵산 분자는 인간 폐로부터 유래된 cDNA 라이브러리에서 발견되었다. 서열번호 1의 METH1 cDNA의 결정된 뉴클레오티드 서열은 약 28 아미노산 잔기의 예측되는 리더 서열을 포함하는 약 950 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방 해독 구조를 포함한다. 본 발명자들은 서열번호 3의 METH2 cDNA의 뉴클레오티드 서열이 약 23 아미노산 잔기의 예측되는 리더 서열을 포함하는 약 890 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방 해독 구조를 포함한다는 사실을 발견하였다.
본 발명은 또한 본 발명의 METH1 및 METH2 단백질의 성숙한 형태를 제공한다. 시그널 가설에 따르면, 포유류 세포에 의하여 분비되는 단백질은 조면 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 쇄의 인출이 개시되면 성숙한 단백질로부터 절단되는 시그널 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 대부분의 포유류 세포 및 심지어 곤충 세포는 동일한 특이성을 갖는 분비된 단백질을 절단한다. 그러나, 일부 경우에 분비된 단백질의 절단은 완전한 형태가 아니다. 이는 단백질상에서 2 이상의 성숙한 종류를 야기한다. 또한, 분비된 단백질의 절단 특이성은 완전한 단백질의 일차 구조, 즉 폴리펩티드의 아미노산 서열에 고유성에 의하여 궁극적으로 결정된다는 것은 이미 잘 알려진 사실이다. 따라서, 본 발명은 서열번호 2에 제시되고 ATCC 기탁번호 209581로 동정되는 숙주에 포함되는 cDNA 클론에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 METH1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. ATCC 기탁번호 209581로 동정되는숙주에 포함되는 cDNA 클론에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 METH1 단백질은 기탁된 숙주내 벡터에 포함된 클론의 인간 DNA 서열에 의하여 암호화되는 완전한 개방 해독 구조의 포유류 세포(예, 상술된 바와 같이 COS 세포)내 발현에 의하여 생성되는 METH1 단백질의 성숙한 형태를 의미한다. 하기에 기재된 바와 같이, ATCC 기탁번호 209581에 포함되는 cDNA 클론에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 METH1은 컴퓨터 분석에 기초한 절단 부위의 예측의 정확성에 따라 서열번호 2(아미노산 약 29 내지 약 950)에 제시된 예측된 "성숙한" METH1 단백질과 상이할 수도 있고 상이하지 않을 수도 있다; 또한 성숙한 METH2는 컴퓨터 분석에 기초한 절단 부위의 예측의 정확성에 따라 서열번호 4(아미노산 약 24 내지 약 890)에 제시된 예측되는 "성숙한" METH2 단백질과 상이할 수도 있고 상이하지 않을 수도 있다. 또한, 단백질의 성숙한 형태는 프로도메인이 절단된 후(예, 메탈로프로테아제 도메인/시스테인-풍부 영역에 위치한 프로도메인에서 먼 제2 절단) 추가적 처리가 일어날 것이다. 따라서, 단백질의 "성숙한" 형태는 프로도메인의 절단에 의하여 생성되는 상기 형태뿐 아니라 단백질의 기타 처리된 형태를 포함한다.
단백질이 제2 리더 및 리더 서열에 대한 절단 포인트를 갖는지 예측하는 방법이 이용가능하다. 예를 들면, McGeoch의 방법(Virus Res. 3:271-286(1985)) 및 von Heinje의 방법(Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986))이 사용가능하다. 이러한 각 방법에 있어서 공지의 포유류 분비 단백질의 절단 포인트의 예측에 대한 정확성은 75-80% 범위에 있다(상기 von Heinje의 문헌 참조). 그러나, 상기 두 방법은 주어진 단백질에 대한 동일한 예측되는 절단 포인트(들)를 항상 생성하는 것은 아니다.
본 경우에서, 본 발명의 완전한 METH1 및 METH2 폴리펩티드의 예측되는 아미노산 서열은 컴퓨터 프로그램("PSORT")에 의하여 분석하였다(K. Nakai 및 M. Kanehisa, Genomics 14:897-911 (1992)). 상기 프로그램은 아미노산 서열에 기초한 단백질의 세포 위치를 예측하기 위한 전문가 시스템이다. 위치의 컴퓨터 예측의 일부로서, McGeoch 및 von Heinje의 방법을 통합한다. PSORT 프로그램에 의한 분석은 서열번호 2의 아미노산 28 및 29과 서열번호 4의 아미노산 23 및 24 사이의 절단 부위를 예측하였다. 따라서, 완전한 아미노산 서열은 von Heinje의 (-1, -3) 규칙의 단순한 형태를 적용하여, 시각 조사에 의하여 추가로 분석하였다(von Heinje 참조). 따라서, METH1 단백질의 리더 서열은 서열번호 2의 약 1 내지 약 28의 아미노산 잔기로 구성됨이 예측된 반면, 성숙한 METH1 단백질은 약 29 내지 약 950의 잔기로 구성됨이 예측되며; METH2 단백질의 리더 서열이 서열번호 4의 약 1 내지 약 23의 아미노산 잔기로 구성됨이 예측되고, 성숙한 METH2 단백질은 약 24 내지 약 890의 잔기로 구성됨이 예측된다. 대안적인 예측되는 성숙한 METH1 단백질은 서열번호 2의 30 내지 950 잔기로 구성된다. 또다른 대안적인 예측되는 성숙한 METH1 단백질은 서열번호 2의 35 내지 950 잔기로 구성된다. 대안적인 예측되는 성숙한 METH2 단백질은 서열번호 4의 31 내지 890 잔기로 구성된다.
당업자의 평가에 따르면, 서열결정 에러의 가능성 및 기타 공지의 단백질내 리더에 대한 절단 부위의 다양성 때문에, 기탁되는 cDNA에 의하여 암호화되는 예측되는 METH1 폴리펩티드는 약 950 아미노산을 포함하나, 910-990 아미노산의 범위내 어디라도 존재할 수 있다; 그리고 단백질의 예측되는 리더 서열은 약 28 아미노산이나, 약 18 내지 약 38 아미노산의 범위에서 어디라도 존재할 수 있다. 대안적 예측된 METH1 폴리펩티드는 서열번호 125에 제시되며, N-말단상의 추가적 18 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 예측된 METH2 폴리펩티드는 약 890 아미노산을 포함하나, 850 내지 약 930 아미노산의 범위에서 어디라도 존재할 수 있다; 그리고 상기 단백질의 예측되는 리더 서열은 약 23 아미노산이나 약 13 내지 약 33 아미노산의 범위에서 어디라도 존재할 수 있다.
지시된 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 클로닝되거나 합성적으로 생산되어 얻어지는 RNA의 형태, 예컨대 mRNA, 또는 DNA의 형태, 예컨대 cDNA 및 게놈 DNA일 수 있다. DNA는 이본쇄 또는 단일쇄일 수 있다. 단일쇄 DNA 또는 RNA는 센스 스트랜드로 알려진 코딩 스트랜드이거나, 안티-센스 스트랜드로 알려진 논-코딩 스트랜드일 것이다.
핵산 분자 "분리물"이란 고유 환경으로부터 분리된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들면, 벡터에 포함된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 생각된다. DNA 분자 분리물의 추가적 예는 이종 숙주 세포내에서 유지되는 재조합 DNA 분자 또는 용액중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) DNA 분자를 포함한다. RNA 분자 분리물은 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 핵산 분자 분리물은 합성적으로 생산된 상기 분자를 추가로 포함한다.
본 발명의 핵산 분자 분리물은 서열번호 1에 제시된 개방 해독 구조(ORF)를 포함하는 DNA 분자; 성숙한 METH1 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자; 및 상술된 서열과 실질적으로 다른 서열을 포함하나 유전자 코드의 축퇴로 인하여 METH1 단백질을 여전히 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 또한 서열번호 3에 제시된 개방 해독 구조(ORF)를 포함하는 DNA 분자; 성숙한 METH2 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자; 및 상술된 서열과 실질적으로 다른 서열을 포함하나 유전자 코드의 축퇴로 인하여 METH2 단백질을 여전히 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 물론, 유전자 코드는 당업계에 공지되었다. 따라서, 당업자는 상기 축퇴 변이체를 용이하게 생성할 수 있을 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전장 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 성숙한, 프로단백질, 단백질의 가공된 형태, 결실 돌연변이체, 치환 변이체, 대립유전자 변이체, 유사체, 유도체 등을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 양태로, 본 발명은 1998년 1월 15일자 ATCC 기탁번호 209581 또는 1998년 1월 14일자 ATCC 기탁번호 209582로 각각 기탁된 플라스미드내에 함유된 cDNA 클론에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 갖는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드; 또는 2000년 3월 14일자 ATTC 기탁번호 PTA 1478로 기탁된 플라스미드내에 함유된 cDNA 클론에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 갖는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 분리물을 제공한다. 또다른 양태로, N-말단 메티오닌이 결실된 성숙한 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 전장 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 분리물 또는 상술된 기탁된 클론내에 함유된 METH1 또는 METH2 cDNA의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 서열의 하나에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다. 상기 분리된 분자, 특정 DNA 분자 분리물은 염색체와 동일계 혼성화에 의하여 유전자 맵핑 및 인간 조직에서 METH1 또는 METH2 유전자의 발현 검색, 예를 들면 노던 브롯 분석을 위한 프로브로서 유용하다.
본 발명은 또한 본원에서 설명된 핵산 분자 분리물의 단편에 관한 것이다. 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA의 뉴클레오디트 서열을 갖는 핵산 분자 분리물의 단편은 약 15 nt 이상, 바람직하게는 약 20 nt 이상, 더욱 바람직하게는 약 30 nt 이상 및 매우 바람직하게는 약 40 nt 이상의 길이의 단편을 의미하며, 본원에서 설명된 바와 같이 진단 프로브 또는 프라이머로서 유용하다. 물론, 길이가 더 긴 단편 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 또는 3000 nt이 또한 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 또는 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 대부분에 상응하는 단편으로서 본 발명에 따라 유용하다. 예를 들면, 길이가 20 nt 이상인 단편은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열로부터 20 또는 그 이상의 인접한 염기를 포함하는 단편을 의미한다.
본 발명의 바람직한 핵산 단편은 METH1 또는 METH2 단백질의 에피토프-함유 부분을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. METH1 및 METH2 단백질의 에피토프-함유부분을 결정하는 방법은 다음에서 설명한다.
본 발명의 기타 바람직한 핵산 단편은 METH1의 메탈로프로테아제 도메인, 서열번호 2의 아미노산 235 내지 459; METH1의 디스인테그린 도메인, 서열번호 2의 아미노산 460 내지 544; METH1의 제1 TSP-유사 도메인, 서열번호 2의 아미노산 545 내지 598; METH1의 제2 TSP-유사 도메인, 서열번호 2의 아미노산 841 내지 894; METH1의 제3 TSP-유사 도메인, 서열번호 2의 아미노산 895 내지 934; 서열번호 2의 아미노산 536 내지 613; 서열번호 2의 아미노산 549 내지 563; METH2의 메탈로프로테아제 도메인, 서열번호 4의 아미노산 214 내지 439; METH2의 디스인테그린 도메인, 서열번호 4의 아미노산 440 내지 529; METH2의 제1 TSP-유사 도메인, 서열번호 4의 아미노산 530 내지 583; METH2의 제2 TSP-유사 도메인, 서열번호 4의 아미노산 837 내지 890; 서열번호 4의 아미노산 280 내지 606; 서열번호 4의 아미노산 529 내지 548; 및 상기 도메인의 조합을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
따라서, 바람직한 구체예는 시그널 서열이 결핍된 METH1 또는 METH2 단백질을 암호화하는 핵산 분자(절단이 METH1에 대하여 일어나고 METH2에 대하여 대략 약 1-24 내지 약 1-34 및 약 1-23 내지 약 1-30에서 일어난다); 시그널 서열 및 프로도메인이 결핍된 METH1 또는 METH2 단백질(프로도메인에 대한 절단은 아미노산 약 232 내지 236 사이의 METH1 및 아미노산 약 211 내지 215 사이의 METH2에서 일어날 수 있다); 시그널 서열, 프로도메인 및 메탈로프로테아제 도메인이 결핍된 METH1 또는 METH2 단백질; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인 풍부 도메인이 결핍된 METH1 또는 METH2 단백질; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1이 결핍된 METH1 또는 METH2 단백질; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2가 결핍된 METH1 또는 METH2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 또한 상기 핵산에 의하여 암호화하는 폴리펩티드가 바람직하다.
유사하게, 바람직한 구체예는 TSP3가 결핍된 METH1 단백질; TSP2 및 TSP3가 결핍된 METH1 단백질; TSP1, TSP2 및 TSP3가 결핍된 METH1 단백질; 시스테인-풍부 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3가 결핍된 METH1 단백질; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인-풍부 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3가 결핍된 METH1 단백질; 및 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인-풍부 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3가 결핍된 METH1 단백질; TSP2가 결핍된 METH2 단백질; TSP1 및 TSP2가 결핍된 METH2 단백질; 시스테인-풍부 도메인, TSP1 및 TSP2가 결핍된 METH2 단백질; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인-풍부 도메인, TSP1 및 TSP2가 결핍된 METH2 단백질; 및 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인-풍부 도메인, TSP1 및 TSP2가 결핍된 METH2 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 또한 상기 핵산에 의하여 암호화되는 폴리펩티드가 바람직하다.
또한 METH1 도메인의 임의의 배합을 암호화하는 핵산 분자가 바람직하다. 예를 들면, 다음의 METH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 바람직하다: 시그널 서열 및 프로도메인; 시그널 서열, 프로도메인 및 메탈로프로테아제 도메인; 시그널 서열 및 메탈로프로테아제 도메인; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 시그널 서열 및 시스테인풍부 도메인; 시그널 서열, 메틸로프로테아제 도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 시그널 서열, 프로도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 시그널 서열 및 TSP1; 시그널 서열, 프로도메인 및 TSP1; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP1; 시그널 서열,메탈로프로테아제 도메인 및 TSP1; 시그널 서열, 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 시그널 서열, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, 및 TSP1; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 시그널 서열, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 서열, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인 및 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP3; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP3; 시그널 서열, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP3;시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP3; 시그널 서열, TSP1 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인, TSP1 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메닝, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP3; 시그널 서열, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, TSP1, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, TSP1, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP3; 시그널 서열, 시스테인 풍부 도메인, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, 시스테인 풍부 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP3; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP3; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP3; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, TSP2 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP3; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP2 및 TSP3; 프로도메인 및 메탈로프로테아제 도메인; 프로도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 프로도메인 및 TSP1; 프로도메인 및 TSP2; 프로도메인 및 TSP3; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP1; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP3; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP3; 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP3; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인,TSP1, TSP2 및 TSP3; 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP2 및 TSP3; 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP3; 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP2 및 TSP3; 프로도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, TSP1 및 TSP3; 프로도메인, TSP2 및 TSP3; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP3; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP2 및 TSP3; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP2 및 TSP3; 프로도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, TSP1 및 TSP3; 프로도메인, TSP2 및 TSP3; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP3; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP2 및 TSP3; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 도메인, TSP1 및 TSP3; 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인;메탈로프로테아제 도메인 및 TSP1; 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP2; 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP3; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP3; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP3; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP2 및 TSP3; 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP3; 메탈로프로테아제 도메인, TSP2 및 TSP3; 메탈로프로테아제 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3; 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 시스테인 풍부 도메인 및 TSP3; 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP3; 시스테인 풍부 도메인, TSP2 및 TSP3; 시스테인 풍부 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3; TSP1 및 TSP2; TSP1 및 TSP3; TSP2 및 TSP3; 및/또는 TSP1, TSP2 및 TSP3. 상기 도메인은 천연 발생적인 분자보다 동일한 순서 또는 상이한 순서로 METH1 분자에서 존재할 것이다. 또한 상기 핵산에 의하여 암호화되는 폴리펩티드가 바람직하다.
또한, METH2 도메인의 임의의 조합을 암호화하는 핵산이 바람직하다. 예를들면, METH2의 다음 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 바람직하다: 시그널 서열 및 프로도메인; 시그널 서열, 프로도메인 및 메탈프로테아제 도메인; 시그널 서열 및 메탈로프로테아제 도메인; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 시그널 서열, 및 시스테인 풍부 도메인; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 시그널 서열, 프로도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 시그널 서열 및 TSP1; 시그널 서열, 프로도메인 및 TSP1; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP1; 시그널 서열,메탈로프로테아제 도메인 및 TSP1; 시그널 서열, 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 시그널 서열, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 시그널 서열 , TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제도메인, TSP1 및 TSP2; 시그널 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, 및 TSP2; 시그널 서열, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인 및 메탈로프로테아제 도메인; 프로도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 프로도메인 및 TSP1; 프로도메인 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 프로도메인; 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP1; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, TSP1 및 TSP2; 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인 풍부 도메인; 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP1; 메탈로프로테아제 도메인 및 TSP2; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2; 메탈로프로테아제 도메인, TSP1 및 TSP2; 시스테인 풍부 도메인 및 TSP1; 시스테인 풍부 도메인 및 TSP2; 시스테인 풍부 도메인, TSP1 및 TSP2. 이러한 도메인은 자연 발생적인 분자에서 보다 동일하거나 상이한 순서로 METH2 분자에서 존재할 수 있다. 또한 상기 핵산에 의하여 암호화되는 폴리펩티드가 바람직하다.
게다가, METH1 및 METH2 도메인은 하이브리드 분자를 형성하기 위하여 결합될 수 있다. 임의의 METH1의 도메인은 METH2의 임의의 도메인과 결합하여 하이브리드 분자를 형성할 수 있다. 예를 들면, METH1의 TSP1 도메인은 METH2의 TSP1으로 대체할 수 있어 하이브리드 분자를 형성할 수 있으며, METH1 분자의 나머지는 손상되지 않는다. 또한, METH1의 TSP1 도메인은 METH1 분자의 나머지를 손상시키지 않고 METH2 도메인의 TSP2 도메인으로 대체된다. 또한, METH1의 TSP1 도메인은 METH2의 TSP2 도메인으로 대체되어, 임의의 추가적 METH1 및/또는 METH2 서열 없이 하이브리드 분자를 형성할 수 있다. 상기 도메인은 천연 발생하는 분자에서 발생하듯이 동일 또는 상이하게 존재할 수 있다. 또한 상기 핵산에 의하여 암호화되는 폴리펩티드가 바람직하다.
추가적 구체예는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 상기에서 하나 이상의 TSP 도메인은 기타 공지된 TSP 도메인으로 대체되었다; 메탈로프로테아제 도메인은 또다른 공지 메탈로프로테아제 도메인으로 대체되었다; 디스인테그린 도메인은 또다른 공지 디스인테그린 도메인으로 대체되었다. 하나 또는 2 이상의 도메인은 이러한 방식으로 대체되었다. 예를 들면, 메탈로프로테아제 및 디스인테그린 도메인 양자가 대체될 수 있다. 또다른 방법으로, 모든 3개의 TSP 도메인이 대체될 수 있다. 또한 상기 핵산에 의하여 암호화되는 폴리펩티드가 바람직하다.
바람직한 구체예는 수개, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1 아미노산 잔기가 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 첨가되는 것을 제외하고는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다.
또한, 본 발명은 서열번호1에 제시된 서열의 일부와 관련된 다음의 cDNA 클론을 동정하였다: HOUCQ17RA (서열번호:14), HPLBM11R (서열번호:15), HGBI07R (서열번호:16), HNTMA49R (서열번호:17), HNALE27R (서열번호:18), 및 HIBDB45R (서열번호:19).
서열번호 1의 일부와 관련된 다음의 공중의 EST가 또한 동정되었다: D67076 (서열번호:20), AB001735 (서열번호:21), X14787 (서열번호:22), U64857 (서열번호:23), X04665 (서열번호:24), M64866 (서열번호:25), L07803 (서열번호:26), U08006 (서열번호:27), M16974 (서열번호:28), L13855 (서열번호:29), AL021529 (서열번호:30), D86074 (서열번호:31), L05390 (서열번호:32), Z69361 (서열번호:33), X9959 (서열번호:34), AF018073 (서열번호:35), L23760 (서열번호:36), Z46970 (서열번호:37), AC004449 (서열번호:38), Z69589 (서열번호:39), Z22279 (서열번호:40), X17524 (서열번호:41), AI126019 (서열번호:103), AI571069 (서열번호:104), AI148739 (서열번호:105), AI335849 (서열번호:106, AA677116 (서열번호:107), H27128 (서열번호:108), AA368429 (서열번호:109), AA345812 (서열번호:110), AA373718 (서열번호:111), AI537518 (서열번호:112), N88341 (서열번호:113), C03600(서열번호:114), AA066142 (서열번호:115), AI40095 (서열번호:94), AA288689 (서열번호:116), AI464076 (서열번호:97), R13547 (서열번호:117), R19976 (서열번호:118), Z43925 (서열번호:119), AA670987(서열번호:120), AA635657 (서열번호:96), W24878 (서열번호:121), W47316 (서열번호:122), W35345 (서열번호:123), 및 N27243 (서열번호:124).
또한, 본 발명은 서열번호 3의 일부와 관련된 다음의 cDNA 클론을 동정하였다: HCE4D69FP02 (서열번호:42), HIBDB45F (서열번호:43), HKIXH64R (서열번호:44), HIBDB45R (서열번호:19), HCE3Z95R (서열번호:45), HTLEQ90R (서열번호:46), HMWEF45R (서열번호:47), HTOFC34RA (서열번호:48), HHFDI20R (서열번호:49), HMSHY47R (서열번호:50), HCESF90R (서열번호:51), HMCAO46R (서열번호:52), HTTAQ67R (서열번호:53), HFKCF19F (서열번호:54), HMCAS31R (서열번호:55), HMWGP26R (서열번호56), HLHTP36R (서열번호:57), HE8AN11R (서열번호:58), HEONN73R (서열번호:59), HBNBG53R (서열번호:60), 및 HMSCH94R (서열번호:61).
서열번호 3에 제시된 서열의 일부와 관련된 다음의 공중 EST를 동정하였다: D67076 (서열번호:20), AB001735 (서열번호:21), AB005287 (서열번호:62), X87619 (서열번호:63), X14787 (서열번호:22), X04665 (서열번호:24), M87276 (서열번호:64), M62458 (서열번호:65), AB002364 (서열번호:66), AB005297 (서열번호:67), X69161 (서열번호:68), X16619 (서열번호:69), I36448 (서열번호:70), L12260 (서열번호:71), I36352 (서열번호:72), X15898 (서열번호:73), I07789 (서열번호:74), I08144 (서열번호:75), U31814 (서열번호:76), AF001444 (서열번호:77), AI400905 (서열번호:94), AI378857 (서열번호:95), AA635657 (서열번호:96), AI464076 (서열번호:97), CO6578 (서열번호:98), AA855532(서열번호:99), H11881 (서열번호:100), AA350801 (서열번호:101), 및 AA350802 (서열번호:102).
특정 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 300 kb, 200 kb, 100 kb, 50 kb, 15 kb, 10 kb 또는 7.5 kb 길이 이하이다. 추가적 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 METH1 또는 METH2 코딩 서열의 인접 뉴클레오티드 15 이상을 포함하나, 임의의 METH1 또는 METH2 인트론의 전부 또는 일부를 포함한다. 또다른 구체예에서, 핵산은 METH1 또는 METH2 코딩 서열을 포함하는 핵산은 게놈 플랭킹(flanking) 유전자의 코딩 서열(즉, 게놈에서 METH1 또는 METH2 유전자의 5' 또는 3')을 포함하지 않는다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 엄격한 혼성화 조건하에서 상술된 본 발명의 핵산 분자중 폴리뉴클레오티드의 일부, 예를 들면 ATCC 기탁번호 209581; ATCC 기탁번호 209582 또는 ATCC 기탁번호 PTA 1478에 함유된 cDNA 클론에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 분리물을 제공한다. "엄격한 혼성화 조건"은 50% 포름아미드, 5×SSC(750 mM NaCl, 75 mM 트리소디움 시트레이트), 50 mM 인산나트륨(pH7.6), 5×덴하르드츠 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 ug/ml 변성된 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액중 42℃에서 밤새 항온처리한 후 약 65℃에서 0.1 ×SSC 중 필터를 세척하는 것을 의미한다.
폴리펩티드의 "일부"에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 기준 폴리뉴클레오티드의 약 15 이상의 뉴클레오티드(nt), 바람직하게는 약 20 nt 이상, 더욱 바람직하게는 약 30 nt 이상 및 더욱 바람직하게는 약 30, 40, 50, 60 또는 70 nt에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이것은 상기 및 하기에 설명된 바와 같이 진단적 프로브 및 프라이머로서 사용된다.
"20 nt 길이 이상"의 폴리뉴클레오티드의 일부는 예를 들면 기준 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA)의 뉴클레오티드 서열로부터 20 이상의 인접 뉴클레오티드를 의미한다. 물론, 폴리 A 서열(예, 서열번호 1 및 서열번호 3 에 각각 제시된 METH1 또는 METH2 cDNA의 3' 말단 폴리(A) 트랙) 또는 T(또는 U) 잔기의 상보적 스트레치에만 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산의 일부에 혼성화하는데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않는다. 왜냐하면 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리(A) 스트레치 또는 이것의 보충물(예, 실제로 임의의 이본쇄 cDNA 클론)을 함유하는 임의의 핵산 분자에 혼성화할 것이기 때문이다.
또한, 적당히 높은 엄격한 혼성화 조건하에서 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 핵산 분자를 고려하게 된다. 혼성화의 엄격성 중의 변화 및 신호 검출이 포름아미드 농도(낮은 퍼센트의 포름아미드는 낮은 엄격성을 야기); 염 조건 또는 온도의 조작을 통하여 일차적으로 수행된다. 예를 들면, 적당히 높은 엄격한 조건은 6X SSPE(20X SSPE=3M NaCl; 0.2 M NaH2PO4; 0.02 M EDTA, pH7.4), 0.5% SDS, 30% 포름아미드, 100 ug/ml 연어 정자 차단 DNA를 포함한 용액중에 3℃에서 밤새 항온처리한 후 1XSSPE, 0.1% SDS로 50℃에서 세척하는 것을 포함한다. 또한, 매우 낮은 엄격성을 달성하기 위하여, 엄격한 혼성화 후 수행되는 세척을 높은 염 농도(예, 5X SSC)에서 수행할 수 있다.
상기 조건에서 변형은 혼성화 실험에서 배경을 억제하는데 사용되는 대안적 차단 시약의 포함 및/또는 치환을 통하여 수행될 수 있음을 주의해야 한다. 통상 차단 시약은 덴하르츠 시약, BLOTTO, 헤파린, 변성된 연어 정자 DNA 및 시판되는 제제를 포함한다. 특정 차단 시약의 포함은 혼화성의 문제로 인하여 상술되는 혼성화 조건의 변이를 요구할 수 있다.
물론, 폴리 A+ 서열(예, 서열 목록에 제시된 cDNA의 임의의 3' 말단 폴리 A+ 트랙) 또는 T(또는 U) 잔기의 상보적 스트레치에만 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 "폴리뉴클레오티드"의 정의에 포함되지 않을 것이다. 왜냐하면 이러한 폴리뉴클레오티드는 폴리(A) 스트레치 또는 이것의 보체(예, 실제로 임의의 이본쇄 cDNA 클론)을 함유하는 임의의 핵산 분자에 혼성화할 것이기 때문이다.
METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 이는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들면, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 단일쇄 DNA 및 이본쇄 DNA, 단일쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물인 DNA, 단일쇄 RNA 및 이본쇄 RNA 및 단일쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물인 RNA, 단일쇄 또는 통상 이본쇄일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자, 단일쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물로 구성될 수 있다. 또한, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 양자를 포함하는 삼중 나선 영역으로 구성될 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 또는 이상의 변형된 염기 또는 안정성 또는 기타 이유로 인하여 변형된 DNA 또는 RNA 주쇄를 포함할 것이다. "변형된" 염기는 예컨대 트리틸화된 염기 및 특별한 염기, 예를 들면 이노신을 포함한다. 다양한 변형은 DNA 및 RNA에서 만들어질 수 있다; 따라서, "폴리뉴클레오테드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
"서열번호 1"은 METH1 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하고, "서열번호 2"는 METH1 폴리펩티드 서열을 의미한다. "서열번호 3"은 METH2 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하고, "서열번호 4"는 METH2 폴리펩티드 서열을 의미한다.
지시된 바와 같이, METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 성숙한 폴리펩티드 자체의 아미노산 서열을 암호화하는 것; 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 서열과 추가적 서열, 예를 들면 리더 또는 분비 서열을 암호하하는 서열, 예를 들면, 프리단백질 또는 프로단백질 또는 프리프로단백질 서열; 상술된 추가적 코딩 서열의 존재와 상관없이 추가적 논코딩 서열화 함께 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열, 예를 들면 인트론 및 논코딩 5' 및 3' 서열, 예를 들면 전사, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널, 예를 들면 리보좀 결합 및 mRNA의 안정화를 포함하는 mRAN 프로세싱에 작용하는 전사되고 비번역된 서열을 포함하며 이에 제한되는 것은 아님; 추가적 아미노산을 암호화하는 추가적 코딩 서열, 예컨대 추가적 기능성을 제공. 따라서, 폴리펩티드를 암호하하는 서열은 마커 서열, 예를 들면 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 암호화하는 서열에 융합될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 마커 서열, 예를 들면 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 암호화하는 서열을 포함한다.본 발명의 양태의 바람직한 특정 구체예에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 시판되는 많은 마커 중에서 pQE 벡터(Qiagen, Ine.)에 제공되는 태그 이다. 문헌[Gentz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824(1989)]에 기재된 바와 같이, 예컨대, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 간편한 정제를 제공한다. "HA" 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 정제에 유용한 또다른 펩티드이다[Wilson 등, Cell 37: 767-778 (1984)]. 하기에 기재된 바와 같이, 기타 융합 단백질은 N 말단 또는 C 말단에 Fc에 융합된 METH1 또는 METH2를 포함한다. 기타 융합 단백질은 N 말단 또는 C 말단에 Fc에 융합된 METH1 또는 METH2를 포함한다. 기타 융합 단백질은 N 말단 또는 C 말단에서 Flag 또는 Fc 에 융합된 METH1 또는 METH2 단편을 포함한다. METH1 또는 METH2 단편, 예를 들면 N- 말단 또는 C-말단에서 Fc 또는 Fla에 융합되는, 서열번호 2에 기재된 H541-Q894, M1-P799, F236-E614, 또는 K801-Q950의 단편이 특히 바람직하다.
상술한 바와 같이, METH1 또는 METH2는 FLAG 폴리펩티드 서열과 융합될 수 있다(참조, 미국 특허 제4,851,341호, 참조 Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988). FLAG 폴리펩티드 서열은 고도의 항원성이며 특이적 모노클로날 항체에 의한 결합용 에피토프를 제공하여, 발현되는 재조합 단백질의 신속한 정제를 가능하게 한다. 이러한 서열은 Asp-Lys 쌍에 직접 뒤따르는 잔기에서 소 점막성 엔테로키나아제에 의하여 특이적으로 절단된다.
본 발명은 추가로 METH1 또는 METH2 단백질의 일부, 유사체 또는 유도체를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자의 변이체에 관한 것이다. 천연 대립유전자 변이체등의 변이체는 자연 발생할 수 있다. "대립유전자 변이체"란 유기체의 염색체 상의 소정 위치를 점유하는 유전자의 몇개의 대체 형태 중 하나를 의미한다. Lewin B. ed., Genes II, John Wiley & Sons, NY(1985). 비자연발생적 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이유발 기법을 사용하여 제조할 수 있다.
이러한 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 첨가로 제조한 것들을 포함한다. 상기 변이체는 코딩 영역, 논-코딩 영역, 또는 양자에서 변형될 수 있다. 코딩 영역에서 변형은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 생성할 것이다. METH1 또는 METH2 단백질 또는 이것의 일부의 성질 및 활성을 변형시키지 않고 잠재성 치환, 첨가 및 결실이 이중 특히 바람직하다. 이러한 관점에서 보존적 치환이 특히 바람직하다.
본 발명의 추가적 구체예는 뉴클레오티드 서열이 80% 이상, 바람직하게는 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 분리물; N-말단 메티오닌이 결실된 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열; 서열번호 2에 제시된 약 29 내지 950 위치의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 2에 제시된 약 30 내지 약 950의 위치에 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; ATCC 기탁번호 209581에 함유된 cDNA 클론에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드; ATCC 기탁번호 209581에 함유된 cDNA 클론에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 METH1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열; 서열번호 2에 제시된 아미노산 235 내지 459를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(METH1의 메탈로프로테아제 도메인); 서열번호 2에 제시된 아미노산 460 내지 544를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(METH1의 디스인테그린 도메인); 서열번호 2에 제시된 아미노산 545 내지 598을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(METH1의 제1 TSP-유사 도메인); 서열번호 2에 제시된 아미노산 841 내지 894를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(METH1의 제2 TSP-유사 도메인); 서열번호 2에 제시된 아미노산 895 내지 934를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(METH1의 제3 TSP-유사 도메인); 서열번호 2에 제시된 아미노산 536 내지 613을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 2에 제시된 아미노산 549 내지 563을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; N-말단 메티오닌이 결실된 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 4에 제시된 약 24 내지 약 890의 위치에 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 4에 제시된 약 112 내지 약 890의 위치에 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; ATCC 기탁번호 209582 또는 PTA 1478에 함유된 cDNA 클론에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드; ATCC 기탁번호 209582 또는 PTA 1478에 함유된 cDNA 클론에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 METH1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열; 서열번호 4에 제시된 아미노산 214 내지 439를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(METH2의 메탈로프로테아제 도메인); 서열번호 4에 제시된 아미노산 440 내지 529를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(METH2의 디스인테그린 도메인); 서열번호 4에 제시된 아미노산 530 내지 583을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(METH2의 제1 TSP-유사 도메인); 서열번호 4에 제시된 아미노산 837 내지 890를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(METH2의 제2 TSP-유사 도메인); 서열번호 4에 제시된 아미노산 280 내지 606을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 4에 제시된 아미노산 529 내지 548을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 임의의 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드 서열에 예컨대 95% 이상 "상동성"인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드 서열의 각 100 뉴클레오티드당 5개 이하 포인트 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제외하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열에 상동성임을 의미한다. 즉, 기준 뉴클레오티드 서열에 95 % 이상 상동인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오디트를 얻기 위하여, 기준 서열중 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 또는 또다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 기준 서열중 총 뉴클레오티드의 5% 이하 수의 뉴클레오티드가 기준 서열내로 삽입될 것이다. 기준 서열의 이러한 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 기에서 또는 기준 서열내 뉴클레오티드 중에서 각각 산재된 상기 말단 사이의 어느 위치에서 일어날 것이다.
실제 문제에서, 임의의 특정 핵산 분자는 예를 들면 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열에 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열에 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동성인지 여부가 공지의 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 베스티프 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스용 버젼 8, 제네틱 컴퓨터 그룹, 유니버시티 리서치 파크, 575 사이언스 드라이브, 메디슨 WI53711)을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 2 서열간에 상동성이 최상인 단편을 찾기 위하여, 베스티프는 스미스 앤드 워터만의 국소 상동성 알고리즘(Advance in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981))을 사용한다. 특정 서열이 예컨대 본 발명에 따른 기준 서열에 95% 상동인지 여부를 결정하기 위하여 베스티프 또는 임의의 기타 서열 알고리즘 프로그램을 사용하는 경우, 물론 변수를 고정하고 상동성 백분율을 전장 기준 뉴클레오티드 서열에 대하여 산출하고 기준 서열중 뉴클레오티드 총 수의 5% 이하의 상동성 갭을 허용한다.
글로벌 서열 배열로 명명되는, 문제 서열(본 발명의 서열)과 주제 서열간의 최상 총 매치를 결정하기 위한 바람직한 방법은 Brutlag 등의 알고리즘 방법(Comp. Appl. Biosci. 6:237-245 (1990))에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정할 수 있다. 서열 배열에서, 문제 서열과 주제 서열은 모두 DNA 서열이다. RNA 서열은 U를 T로 변환시킴으로써 비교할 수 있다. 상기 글로벌 서열 배열의 결과는 상동성 백분율이다. 백분율 상동성을 계산하기 위한 DNA 서열의 FASTDB 배열에 사용되는 바람직한 변수는 행렬=유니터리, k-한벌=4, 부정합 벌점=1, 결합 벌점=30, 무작위 그룹 길이=0, 컷오프 점수=1, 갭 벌점=5, 갭 크기=0.05, 윈도우 크기=500 또는 주제 뉴클레오티드 서열의 길이, 짧은 길이.
내부 결실때문이 아니라 5' 또는 3' 결질로 인하여 주제 서열이 문제 서열보다 짧으면, 결과를 얻기 위하여 수동 교정을 해야 한다. 이것은 상동성 백분율 계산시 FASTDB 프로그램이 주제 서열의 5' 및 3' 절단을 설명하지 못하기 때문이다. 문제 서열에 비하여 5' 또는 3' 말단에서 절단된 주제 서열에 있어서, 상동성 백분율은 문제 서열의 총 염기의 백분율로서, 정합/정렬이 되지 않은 주제 서열의 5' 및 3'인 문제 서열의 염기 수를 계산함으로써 교정된다. 뉴클레오티드가 정합/정렬인지 여부는 FASTDB 서열 배열의 결과에 의하여 측정된다. 이러한 백분율은 상동성 백분율로부터 공제되어, 최종 상동성 점수 백분율에 도달하기 위하여 특정 변수를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의하여 계산된다. 이러한 교정된 점수는 본 발명의 목적을 위하여 사용되는 것이다. 문제 서열과 정합/정렬되지 않는, 주제 서열의 5' 및 3' 염기 밖의 유일한 염기는 FASTDB 배열에 의하여 제시된 바와 같이 상동성 백분율 점수를 수동적으로 조절하기 위한 목적으로 계산된다.
예를 들면, 90 염기 주제 서열은 상동성 백분율을 결정하기 위하여 100 염기 문제 서열에 배열된다. 결실은 주제 서열의 5'에서 일어나며, 따라서, FASTDB 배열은 5' 말단에 첫 10 염기의 정합/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 못한 서열은 서열의 10%을 나타내고(부정합된 5' 및 3' 말단에서 염기 수/문제 서열중 총 염기 수), 따라서, 10%는 FASTDB 프로그램에 의하여 계산되는 상동성 점수 백분율로부터 공제된다. 남아있는 90 염기가 완전히 정합된다면, 최종 상동성 백분율은 90% 일 것이다. 또다른 예로, 90 염기 주제 서열은 100 염기 문제 서열과 비교된다. 이 경우 결실은 내부이고, 문제 서열과 정합/정렬되지 않는 주제 서열의5' 또는 3' 말단에 염기가 존재하지 않는다. 이 경우, FASTDB에 의하여 계산되는 상동성 백분율은 수동적으로 교정되지 않는다. 다시 한번, 문제 서열과 정합/정렬하지 않는 주제 서열의 5' 또는 3' 유일한 염기는 수동적으로 교정되지 않는다. 기타 수동적 교정은 본 발명의 목적을 위하여 이루어지는 것이 아니다.
본 발명은 METH1 또는 METH2 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는지 여부에 상관없이, 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 핵산 서열 또는 기탁된 cDNA의 핵산 서열에 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동인 핵산 분자 관한 것이다. 이것은 특정 핵산 분자가 METH1 또는 METH2 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않는 경우에도, 당업자가 혼성화 프로브 또는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 핵산 분자를 사용하는 방법을 여전히 알 수 있기 때문이다. METH1 또는 METH2활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않는 본 발명의 핵산 분자의 용도는 서로 (1) cDNA 라이브러리중에서 METH1 또는 MERH2 유전자 또는 이것의 대립유전자 변이체를 분리하는 것; (2) METH1 또는 MERH2 유전자의 정확한 염색체 위치를 제공하기 위하여 유사분열 중기 염색체 전개에 동일계 혼성화(예, "FISH"), Verma 등의 문헌참조[Human Chromosomes; A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)]; 및 (3) 특정 조직에서 METH1 또는 METH2 발현을 검색하기 위한 노던 블롯 분석법을 포함한다.
본 발명은 METH1 또는 METH2 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않는 기탁된 cDNA의 핵산 서열 또는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 핵산 서열에 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동인 핵산 분자 관한 것이다. "METH1 활성을 갖는 폴리펩티드"는 특정 생물학적 분석에서 METH1 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면, METH1 단백질 활성은 융모요막 분석(Iruela-Arispe et al., Thrombosis and Haemostasts 78(1):672-677 (1997)) 또는 각막 포켓 분석(Tolsma et al., J. Cell. Biol. 122:497-511 (1993))을 사용하여 측정할 수 있으며, 모두 실시예4에 기술되어 있다. "METH2 활성을 갖는 폴리펩티드"는 특정 생물학적 분석에서 METH2 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면, METH2 단백질 활성은 또한 융모요막 분석(Iruela-Arispe et al., Thrombosis and Haemostasts 78(1):672-677 (1997)) 또는 각막 포켓 분석(Tolsma et al., J. Cell. Biol. 122:497-511 (1993))을 사용하여 측정할 수 있으며, 모두 실시예4에 기술되어 있다.
간단히, 융모요막 분석에서, 관심있는 잠재적 항-혈관형성 화합물을 bFGF와 같은 항혈관형성 성장 인자와 함께 유형 I 콜라겐 펠렛에 첨가한다(Vistrogen). 상기 표본을 혼합하고 나일론 메쉬위에 놓는다. 그리고 중합화시킨다. 중합화가 완성된 후, 메쉬를 12일된 닭 태아의 융모요막위에 놓고 24시간동안 37℃에서 방치한다. 태아는 FITC-덱스트란과 같은 형광 제제로 주사하고, 메쉬를 고정하고 형광 현미경하에서 관찰을 위하여 올려놓는다.
각막 포켓 분석에서, 목적하는 화합물 및 bFGF와 같은 항혈관형성 성장 인자를 포함하는 하이드론 펠렛을 래트 또는 마우스의 각막의 경계로부터 1 내지 2 mm에 주입한다. 5일 정도의 기간후 반응을 조사한다. 항혈관형성의 정도를 각막의 경계로부터 이동하는 모세혈관을 측정함으로써 평가한다.
물론, 유전자 코드의 축퇴로 인하여, 당업자는 기탁된 cDNA의 핵산 서열 또는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 핵산 서열에 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동인 서열을 갖는 다수의 핵산 분자가 "METH1 또는 METH2 단백질 활성을 갖는" 폴리펩티드를 암호화할 것임을 즉각적으로 인식할 것이다. 사실, 이러한 뉴클레오티드 서열의 축퇴성 변이체가 동일한 폴리펩티드를 암호화하기 때문에, 상술된 비교 분석을 수행하지 않아도 당업자에게 명백할 것이다. 축퇴성 변이체가 아닌 상기 핵산 분자에 있어서, 합리적 수는 METH1 또는 METH2 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 것임이 당업계에서 추가로 인식될 것이다. 이것은 당업자가 단백질 기능을 상당히 영향을 미칠 것 같지 않거나 덜 미칠 것 같은 아미노산 치환(예를 들면, 하나의 지방족 아미노산을 제2 지방족 아미노산으로 치환)을 충분히 인식할 것이기 때문이다.
특히, 다음의 하나 이상의 핵산 치환 및/또는 결실을 METH2 핵산에 제공한다: 위치 3의 "T"를 "C"로 치환; 위치 32의 "T"를 "C"로 치환; 위치 37의 "T"를 "C"로 치환; 위치 65-67의 "TGC" 결실; 위치 199의 "T"를 "C"로 치환; 위치 303의 "T"를 "C"로 치환; 위치 306의 "T"를 "C"로 치환; 위치 309의 "T"를 "C"로 치환; 위치 950의 "T"를 "C"로 치환; 위치 1292의 "T"를 "G"로 치환; 위치 1577의 "T"를 "C"로 치환; 및/또는 위치 2377의 "A"를 "G"로 치환. 이와 유사하게, 하나 이상의 다음 아미노산 치환 및/또는 결실을 METH2 폴리펩티드에 제공한다: 위치 2의 "F"를 "L"로 치환; 위치 12의 "L"를 "P"로 치환; 위치 14의 "F"를 "L"로 치환; 위치 23의 "L"을 결실; 위치 318의 "L"를 "P"로 치환; 위치 432의 "G"를 "A"로 치환; 위치527의 "V"를 "A"로 치환; 및/또는 위치 794의 "T"를 "A"로 치환.
예를 들면, 표현적으로 잠재성 아미노산 치환을 만드는 방법에 관한 안내서는 Bowie, J. U. 등의 "Deciphering the Message in Protein SequenceL Tolerance to Amino Acid Substitutions,", Science 247:1306-1310 (1990)에서 제공되며, 여기에서는 저자가 단백질이 아미노산 치환의 상당한 용인을 지적하고 있다.
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 분자 분리물을 포하하는 벡터, 재조합 벡터로 유전 공학적으로 처리된 숙주 세포 및 재조합 기술에 의하여 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 이것의 단편 생성에 관한 것이다. 무세포 번역 시스템은 또한 본 발명의 DNA 작제물로부터 유래한 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 숙주내 번식을 위한 선택성 마커를 포함하는 벡터에 결합될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침강, 예를 들면 칼슘 포스페이트 침강 또는 하전된 지질과의 착물로 도입된다. 벡터가 바이러스라면, 적절한 패키지 세포주를 사용하여 시험관내에서 패키지될 수 있으며 이후 숙주 세포내로 도입된다.
DNA 삽입체는 적절한 프로모터, 예를 들면 파지 람다 PL 프로모터, E.coli lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터에 작동적으로 연결되어야 한다. 기타 적절한 프로모터는 당업자가 알 수 있을 것이다. 발현 작제물은 전사 개시, 종결, 전사 영역을 위한 부위, 번역을 위한 리보좀 결합 부위를 추가로 포함할 것이다. 작제물에 의하여 발현되는 성숙한 전사체의 코딩 부분은 초기의 번역 개시 및 번역되는 폴리펩티드의 말단에 적절하게 위치한 종말 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함한다.
지시된 바와 같이, 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마터를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 마커는 디히드로폴레이트 환원 효소, G418 또는 진핵 세포 배양물에 대한 네오마신 내성 및 E.col. 및 기타 박테리아에서 배양을 위한 테트라시클린, 카나마이신 또는 암피실린 내성을 포함한다. 적절한 숙주의 대표적 예는 박테리아 세포, 예를 들면 E.coli, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피뮤리움 세포; 진균 세포, 예를 들면 효모 세포(예, 사카로마이세스 세레비지에 또는 피키아 파스토리스(ATCC 기탁번호 201178)); 곤충 세포, 예를 들면 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포; 동물 세포, 예를 들면 CHO, COS, 293, 및 보우스 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적절한 배양 매개물 및 상술된 숙주 세포를 위한 조건이 당업계에 알려져 있다.
박테리아에 유용한 바람직한 벡터는 QIAGEN에서 시판하는 pQE70, pQE60 및 pQE-9; 스트라타진 클로닝 시스템, 인크.에서 시판하는 p블루스크립트 벡터, 파지스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pMH18A, pMH46A; 및 파마시아 바이오테크, 인크에서 시판하는 ptrc991, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5를 포함한다. 바람직한 진핵 벡터 중에 스트라타진에서 시판하는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 및 파마시아에서 시판하는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL을 포함한다. 효모계에서 사용되는 바람직한 발현 벡터는 pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ,pGAPZ알파, pPICP, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K 및 PAO815(캘리포니아주 칼바드의 인비트로겐에서 모두 시판)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 기타 적절한 벡터는 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
또한, 본 발명의 실행시 발현 벡터의 사용시 본 발명은 목적하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 작동인자 및 프로모터 인자을 포함하는 신규한 발현 벡터를 추가로 포함한다. 상기 벡터의 한예는 pHE4-5이며 이것은 하기에 기술되어 있다.
도8 및 9에 요약되어 있는 바와 같이, pHE4-5 벡터(서열번호 12)의 성분은 1) 선택성 마커로서 네오마이신포스포트랜스퍼라아제 유전자, 2) E.coli의 복제 개시점, 3) T5 파지 프로모터 서열, 4) 2개의 lac 작동인자 서열, 5) 샤인-델가노 서열, 6) 락토스 오페론 억제인자 유전자(lacIq)를 포함한다. 복제 개시점(oriC)는 pUC19(LTI, 게티스버그, MD)로부터 유래된다. 프로모터 서열 및 작동인자 서열을 합성적으로 제조하였다. 핵산 서열의 합성은 당업계에 이미 공지되었다. CLONTECH 95/96 카탈로그, 215-216면, 캘리포니아주 94303의 팔로 알토의 메도우 서클 1020에 소재하는 CLONTECH. METH1(서열번호 2) 또는 METH2(서열번호 4)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 pHE4-5 벡터의 NdeI 및 Asp781 부위 사이에 뉴클레오티드 서열을 삽입함으로써 프로모터 및 작동인자에 작동적으로 결합된다.
상술된 바와 같이, pHE4-5 벡터는 lacIq 유전자를 포함한다. LacIq는 lac 작동인자의 확실한 조절을 부여하는 lacI 유전자의 대립유전자이다. Amann, E 등, Gene 69:301-315(1988); Stak, M., Gene 51:255-267 (1987). lacIq 유전자는 lac작동인자 서열에 결합하고 하류(즉, 3') 서열의 전자를 차단하는 억제인자 유전자를 암호화한다. 그러나, lacIq 유전자 생성물은 락토즈 또는 특정 락토즈 유사체, 즉 이소프로필 B-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 존재시 lac 작동인자로부터 분리된다. METH1 또는 METH2 는 따라서 pHE4-5 벡터를 함유하는 유도되지 않은 숙주 세포내에 상당한 양으로 생성되지 않는다. 그러나, IPTG와 같은 제제의 첨가에 의한 이러한 숙주 세포의 유도는 METH1 또는 METH2 코딩 서열의 발현을 야기한다.
pHE4-5 벡터(서열번호 13)의 프로모터/작동인자 서열은 T5 파지 프로모터 및 24개의 lac 작동인자 서열을 포함한다. 하나의 작동인자는 전사 개시 부위의 5'에 위치하고 다른 작동인자는 동일한 부위의 3'에 위치한다. 이러한 작동인자는 lacIq 유전자 생성물과 배합되어 존재하는 경우 lac 오페론 유도인자, 예컨대, IPTG의 부재시 하류 서열의 정확한 억제를 부여한다. lac 작동인자로부터 하류에 위치하는 작동적으로 연결된 서열의 발현이 IPTG와 같은 lac 오페론 유도인자의 첨가에 의하여 유도될 수 있다. lacIq 단백질에 lac 유도인자가 결합하면 lac 작동인자 서열로부터 이들이 방출되어 작동적으로 연결된 서열이 전사 개시된다. 유전자 발현의 Lac 오페론 조절은 문헌[Devlin, T., TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS, 제4판(1997), 802-807면]에 제시되어 있다.
pHE4의 연속된 벡터는 METH1 또는 METH2 코딩 서열을 제외한 pHE4-5 벡터의 성분 모두를 함유한다. pHE4 벡터의 특성은 최적화된 합성 T5 파지 프로모터, lac 프로모터 및 샤인-델가노 서열을 포함한다. 추가로, 이러한 서열은 최적으로 간격이 떨어져 위치하므로 삽입된 유전자의 발현이 정확하게 조절되어 고 농도의 발현이 유도시 일어난다.
본 발명의 단백질의 생성에 사용하기 적절한 공지의 박테리아 프로모터중에서 E.coli lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터 및 trp 프로모터를 포함한다. 적절한 진핵 프로모터는 CMV 즉각적 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예를 들면 라우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터, 예를 들면 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함한다.
pHE4-5 벡터는 또한 AUG 개시 코돈의 5' 샤인-델가노 서열을 포함한다. 샤인-델가노 서열은 AUG 개시 코돈으로부터 약 10 뉴클레오티드 상류(즉, 5')에 일반적으로 위치하는 짧은 서열이다. 이러한 서열은 AUG 개시 코돈에 필수적으로 원핵 리포좀을 위치시킨다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질의 생성에 유용한 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태는 pHE4-5 벡터(서열번호 12)에 의하여 예시화된다.
숙주 세포내로 작제물을 도입하는 것은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 양이온 지질-매개된 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 기타 방법에 의하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 표준 실험실 매뉴얼, 예를 들면 Davis 등, Basic Methods In Molecular Biology(1986)에 기재되어 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드가 재조합 벡터가 결핍된 숙주 세ㅗ에 의하여 발현될 수 있음이 구체적으로 고려된다.
폴리펩티드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있으며, 분비 시그널 및 추가적 이종 기능성 영역을 포함할 것이다. 예를 들면, 추가적 아미노산, 구체적으로 하전된 아미노산의 영역을 폴리펩티드의 N-말단에 추가하여, 정제, 이후 취급 및 저장동안 숙주 세포내에서 안정성 및 지속성을 향상시킬 수 있다. 또한, 펩티드 부분은 폴리펩티드에 첨가항 정제를 용이하게 할 수 있다. 상기 영역은 폴리펩티드의 최종 제조 단계 이전에 제거될 수 있다. 분비 또는 배출을 가능하게 하고 안정성을 향상시키며 정제를 용이하게 하는 펩티드 부분의 폴리펩티드에의 추가는 당업계에서 통상적 기술이다. 바람직한 융합 단백질은 단백질을 가용화하기에 유용한 면역글로블린으로부터 이종의 영역을 포함한다. 예를 들면, EP-A-O 464 533(캐나다 대응출원 2045869)은 또다른 인간 단백질 또는 이것의 일부와 함께 면역글로블린 분자의 불변부의 다양한 부분을 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 다수의 경우에, 융합 단백질에서 Fc 부분은 치료 및 진단의 사용에 매우 유용하며, 따라서 약물동력학적 성질의 향상(EP-A 0232262)이 일어난다. 반면에, 일부 용도에서 융합 단백질이 발현되고 제거되고 기술된 유리한 방법으로 정제된 후에 Fc 부분을 제거하는 것이 바람직하다. Fc 부분은 치료 및 진단에 유용한 장애가 있은 것으로 증명되는 경우, 예를 들면, 융합 단백질이 면역화를 위하여 항원으로 사용되는 경우가 그러하다. 약물 발견에서, 예를 들면, 인간 단백질, 예컨대 hIL5-수용체는 고용량 스크린 분석의 목적으로 Fc 단백질과 융합되어 hIL-5의 길항제를 동정하였다. 참조, D. Bennett 등, Mol. Recognition 8:52-58 (1995) 및 K.Johanson 등, J. of Biol. Chem. 270 (16):9459-9471 (1995).
METH1 또는 METH2 단백질을 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침강, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파티트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 공지의 방법에 의하여 재조합 세포 배양물로부터 회수하고 정제할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")는 정제를 위하여 사용하는 것이 매우 바람직하다.
METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드 및 바람직하게는 분비된 형태는 또한 다음으로부터 회수될 수 있다: 천연원으로부터 정제된 생성물, 체액, 조직 및 세포를 포함. 직접 분리되거나 배양됨; 및 원핵 또는 진핵 숙주, 예를 들면 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포로부터 재조합 기법에 의하여 생성되는 생성물. 재조합 생성 방법에서 사용되는 숙주에 따라, METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드는 당화 또는 비당화될 수 있다. 게다가, METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드는 또한 숙주-매개된 방법의 결과로서 일부의 경우에 초기 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 것이다. 따라서, 번역 개시 코돈에 의하여 암호화되는 N-말단 메티오닌은 일반적으로 진핵세포중 번역후 임의의 단백질로부터 고효율로 제거되는 것이 당업계에 공지되어 있다. 대부분의 단백질에서 N-말단 메티오닌은 대부분의 원핵생물에서 효율적으로 제거되는 반면, 일부 단백질은 N-말단 메티오닌이 공유적으로 연결된 아미노산의 성질에 따라 상기 원핵생물의 제거 과정에서 비효과적이다.
한 구체예에서, 효소 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 진핵세포계에서 METH1 및/또는 METH2 단백질을 발현하는데 사용된다. 피키아 파르토리스는 이것의단일 탄소원으로서 메탄올을 대사시킬 수 있는 메틸로트로프성 효모이다. 메탄올 대사 경로에서 주요 단계는 O2를 사용하여 메탄올을 포름알데히드로 산화시키는 것이다. 이러한 반응은 효소 알코올 산화효소에 의하여 촉매된다. 단일 탄소원으로서 메탄올을 대사시키기 위하여, 피키아 파스토리스는 O2에 대한 알코올 산화효소의 상대적으로 낮은 친화도에 부분적으로 기인하여, 알코올 산화효소의 고농도를 생성할 것이다. 결과적으로, 주탄소원으로 메탄올에 의존하는 성장 배지중에서 2종 알코올 산화효소 유전자(AOXI)중의 하나의 프로모터 영역은 고도로 활성이다. 메탄올의 존재시, AOXI 유전자로부터 생성되는 알코올 산화효소는 피키아 파스토리스내 총 가용성 단백질의 약 30% 이하를 포함한다. 참조, Ellis, S.B., 등, Mol.Cell.Biol. 5:1111-21(1985); Koutz, P.J. 등, Yeast 5:167-77 (1989); Tschopp, J.F., 등, Nucl. Acids Res. 15:3859-76(1987). 따라서, 이종 코딩 서열, 예를 들면, 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 모든 또는 일부 AOXI 조절 서열의 전사 조절하에서 메탄올의 존재하에서 성장한 피키아 효모에서 예외적으로 높은 수준으로 발현된다.
한 구체예에서, 플라스미드 벡터 pPIC9K는 본원에서 설명한 바와 같이 문헌["Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology, " D.R. Higgins 및 Cregg, eds. The Humans Press, Totowa, NJ, 1998]에 기재된 바와 같이 실질적으로 피키아 효소계에서 본 발명의 NETH1 및/또는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 발현하는데 사용된다. 이러한 발현 벡터는 다중 클로닝 부위의 상류에 위치한 피키아 파스토리스 알칼리 포스파타제(PHO) 분비 시그널 펩티드(즉, 리더)에 연결된 강한 AOX1 프로모터에 의하여 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 단백질의 발현 및 분비를 가능하게 한다.
제안된 발현 작제물이 전사, 번역, 분비(가능하면) 등에 대한 적절하게 위치한 시그널, 예를 들면 인-프레임 AUG을 제공하는 한, 당업자가 용이하게 평가할 수 있듯이, 다수의 기타 효모 벡터는 pPIC9K 대신에, 예를 들면 pYES2, pYDa, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZ알파, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K 및 PAO815를 사용할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이종 코딩 서열의 고농도 발현은 예를 들면 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드가 본 발명의 이종 폴리펩티드를 발현 벡터, 예를 들면, pGAPZ 또는 pGAPZ알파내로 클로닝하고 메탄올의 부재하에서 효모 배양물을 성장시킴으로써 달성될 수 있다.
본원에서 설명된 벡터 작제물을 함유하는 숙주 세포를 포함할 뿐 아니라, 본원 발명은 또한 척추동물 기원, 특히 포유동물 기원의 1차, 2차 및 고정화된 숙주 세포를 포함한다. 상기 숙주 세포는 내인성 유전 물질(예, METH1 및/또는 METH2 코딩 서열)을 결실하거나 또는 대체하도록 조작되거나 및/또는 본원 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 결합되고 내인성 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 활성, 변형 및/또는 증폭시키는 유전 물질(예, 이종 폴리뉴클레오티드 서열)을 포함하도록 조작된다. 예를 들면, 공지의 방법은 상동성 재조합에 의하여 이종의 조절 서열(예, 프로모터 및/또는 인헨서) 및 내인성 METH1및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 서열과 작동적으로 결합시켜 신규한 전사 단위를 형성하는데 사용될 수 있다(참조예, 미국 특허 제5,641,670호, 1997년 6월 24일에 발행; 미국 특허 제5,733761호, 1998년 3월 31일에 발행; 국제 공개 WO 96/29411, 1996년 9월 26일 공개; 국제 공개 WO 94/12650, 1994년 8월 4일 공개; Koller 등, Natl. Acad. Sci. USA 86:8923-8935 (1989); 및 Sijlstra 등, Nature 342;435-438 (1989), 상기 공개는 전체가 참고로 본원에서 인용됨) .
본 발명의 폴리펩티드는 천연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 방법의 생성물 및 원핵 또는 진핵 숙주, 예를 들면, 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포로부터 재조합 기법에 의하여 제조되는 생성물을 포함한다. 재조합 생성 방법에서 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 당화 또는 비당화될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 숙주-매개된 과정의 결과로서 일부 경우에 초기 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 것이다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업게의 공지 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다(참조예, Creighton, 1983, Proteins; Structure and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., 및 Hunkapiller, M., 등, 1984, nature 310:105-111). 예를 들면, 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드의 단편에 상응하는 펩티드는 펩티드 합성기를 사용함으로써 합성될 수 있다. 나아가, 필요하다면, 비고유적 아미노산 또는 화학적 아미노산 유도체가 치환 또는 첨가로서 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드내로 유도될 수 있다. 비고유적 아미노산은 통상적 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부틸산, a-아미노 이소부틸산, 4-아미노부틸산,Abu, 2-아미노 부틸산, g-Abu, e-Ahx, 6-아미노 헥사노산, Aib, 2-아미노 이소부틸산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, b-알라닌, 플루오로-아미노산, 고안된 아미노산, 예를 들면, b-메틸 아미노산, Ca-메틸 아미노산, Na-메틸 아미노산, 및 일반적 아미노산 유사체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 나아가, 아미노산은 D(왼쪽 방향) 또는 L(오른쪽 방향)일 수 있다.
비천연적으로 발생하는 변이체는 공지된 돌연변이 발생법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 매개된 돌연변이유발법, 알라닌 스캐닝, PCR 돌연변이유발법, 부위 지정된 돌연변이유발법(참조예, Carter 등, Nucl. Acids Res, 13:4331 (1986); 및 Zoller 등, Nucl.Acids Resl 10:6487(1982)), 카세트 돌연변이유발법(Wells 등, Gene 34:315(1985)), 제한 선택 돌연변이유발법(예, Wells 등, Philos. Trnas. R. Soc. London SerA 317:415(1986))을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다
본 발명은 공지의 보호기 및 차단기, 단백질분해성 절단, 항체 분자 또는 기타 세포 리간드에 연결에 의하여 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 유도화에 의하여 번역후 또는 번역동안 상이하게 변형되는 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드를 포함한다. 임의의 다수 화학적 변형은 공지의 기술(예를 들면, 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4; 아세틸화, 포름화, 산화,환원; 투니카마이신의 존재하에서 대사적 합성에 의한 특이적 화학적 절단을 포함하며 이에 한정되는 것은 아님)에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명에 의하여 포함되는 추가적 후번역-변형은 예를 들면, N-연결된 또는 O-연결된 탄화수소 쇄, N-말단 또는 C-말단의 처리, 아미노사 주쇄에 화학부분의 부착, N-연결된 또는 O-연결된 탄화수소 쇄의 화학적 변형 및 원핵 숙주 세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 첨가 또는 결실을 포함한다. 폴리펩티드는 또한 검측가능한 표지, 예를 들면 효소적, 형광적, 동위원소적, 또는 친화성 표지로 변형되어 단백질의 검색 및 분리를 가능하게 한다.
또한, 용해도, 안정성 및 폴리펩티드의 순환 시간의 증가 또는 면역원성의 감소(미국 특허 제4,179,337호 참조)와 같은 추가적 이점을 제공할 수 있는 METH1 및/또는 METH2의 화학적으로 변형된 유도체가 본 발명에 의하여 제공될 수 있다. 유도체를 위한 화학적 부분은 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올 등과 같은 수용성 중합체로부터 선택될 수 있다. 폴리펩티드는 임의의 위치에서 분자내에서 변형될 수 있거나 또는 예정된 위치에서 분자내에서 변형될 수 있으며 1, 2, 3 또는 그 이상의 부착되는 화학 부분을 포함할 것이다.
중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜에 있어서, 취급 및 제조에 용이한 바람직한 분자량은 약 1kDa 내지 약 100kDa 사이(용어 "약"은 폴리에틸렌 글리콜의 제조시 일부 분자가 기술된 분자량보다 다소 크거나 다소 작은 것을 의미)이다. 바람직한 치료 프로필(예, 서방성방출 기간, 생물학적 활성에 대한 효과, 취급 용이성, 항원성의 정도 및 결핍 및 치료적 단백질 유사체에 폴리에틸렌 글리콜의 기타 공지된 효과)에 따라 다른 크기로 사용될 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 평균 분자량이 약 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000 또는 100,000 kDa일 수 있다.
상술된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 분지된 구조를 가질 것이다. 분지된 폴리에틸렌 글리콜은 예컨대, 미국 특허 제 5,643,575호; Morprugo 등, Appl. Biochem. Biothechonol. 56:59-72(1996); Vorobjev 등, Neclesides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); 및 Caliceti 등, Bioconjug. Chem. 10:638-646(1999), 이들의 공개 내용은 본원에서 참고로 인용됨.
폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 기타 화학 부분)는 단백질의 항원 도메인 또는기능 도메인에 미치는 영향을 고려하여 단백질에 부착이 되어야 한다. 당업자에게 이용가능한 다수의 부착 방법이 있다. 예를 들면 본원에서 참고로 인용되고 있는 EP 0 401 384(PEG를 G-CSF에 커플링). 참고예, Malik 등, Exp. Hematol. 20:1028-1035(1992)(테실 클로라이드를 사용하여 페길화를 보고). 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 유리 아미노기 또는 유리 카르복시기와 같은 반응기에 의하여 아미노산잔기를 통하여 공유적으로 결합할 것이다. 반응기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합될 수 있는 기이다. 유리 아미노기를 갖는 아미노 잔기는 라이신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기를 포함할 것이다: 유리 카르복시기를 갖는 것은 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 설프히드릴기는 또한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 부착을 위한 반응기로서 사용될 것이다. N-말단 또는 라이신 기에 부착과 같은 아미노기에의 부착은 치료용으로 바람직하다.
상술한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 임의의 다수 아미노산 잔기에 대한 연결에 의하여 단백질에 부착될 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 라이신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인 잔기에의 공유 결합에 의하여 단백질에 연결될 수 있다. 하나 또는 이상의 반응 화학을 이용하여 단백질의 특이적 아미노산 잔기(예, 라이신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인)에 또는 단백질의 1 이상의 유형의 아미노산 잔기(예, 라이신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 이들의 배합)에 폴리에틸렌 글리콜을 부착할 수 있다.
N-말단에 화학적으로 변형된 단백질이 특히 요구될 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜을 본 발명의 조성물의 예로서 사용하여, 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자(분자량, 분지 등), 반응 믹스에서 단백질(또는 펩티드) 분자에 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율, 수행된 페길화 반응의 유형 및 선택된 N-말단 페길화 단백질을 획득하는 방법으로부터 선택할 수 있다. N-말단 페길화 제제를 획득하는 방법(즉, 필요하다면 기타 모노페길화 부분으로부터 이러한 부분을 분리)은 페길화 단백질 분자의 군으로부터 N-말단 페길화 물질을 정제하는 단계에 의한다. N-말단 변형에서 화학적으로 변형된 선택 단백질은 특정 단백질에서 유도화에 용이한 1차 아미노기(라이신 대 N-말단)의 다른 유형의 상이한 반응성을 이용하는 환원성 알킬화에 의하여 수행될 수 있다. 적절한 반응 조건하에서, 카보닐기 함유 중합체를 갖는 N-말단의 실질적인 선택적 유도화가 달성된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 단백질의 페길화는 임의의 수단에 의하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 직접 또는 간접 링커에 의하여 단백질에 부착될 수 있다. 단백질에 폴리에틸렌 글리콜의 링커없는 시스템은 Delgado 등, Crit Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304(1992); Francis 등, Inertn. J. of Hematol. 68:1-18(1998); 미국 특허 제4,002,531호; 미국 특허 제5,349,052; WO 95/06058; 및 WO 98/32466, 상기 문헌들이 공개 내용은 본원에서 참고로 인용됨.
간접 링커의 사용없이 폴리에틸렌 글리콜을 단백질의 아미노산 잔기에 직접 부착하는 한 시스템은 트레실화 MPEG를 이용한다. 상기 트레실화 MPEG는 트레시클로라이드(ClSO2CH2CF3)를 사용하여 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(MPEG)의 변형에 의하여 생성된다. 트레실화 MPEG와 단백질의 반응시, 폴리에틸렌 글리콜은 단백질의 아민기에 직접 부착된다. 따라서, 본 발명은 2,2,2-트리플루오로에탄 설포닐기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 분자아 본 발명의 단백질을 반응시킴으로써 생서되는 단백질-폴리에틸렌 글리콜 접합체를 포함한다.
또한, 폴리에틸렌 글리콜은 다수의 상이한 간접 링커를 사용하는 단백질에부착될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,612,460호(공개 내용은 본원에서 참고로 인용됨)은 단백질에 폴리에틸렌 글리콜을 연결하기 위한 우레탄 링커를 개시한다. 폴리에틸렌 글리콜이 링커에 의하여 단백질에 부착된 단백질-폴리에틸렌 글리콜 접합체는 또한 MPEG-숙신이미딜숙시네이트, 1,1'-카보닐디이미다졸로 활성화된 MPEG 화합물을 단백질과 반응시켜 생성될 수 있다. 다수의 추가적 폴리에틸렌 글리콜 유도체 및 폴리에틸렌 글리콜을 단백질에 부착하기 위한 반응 화학이 WO 98/32466(공개 내용은 본원에서 참고로 인용됨)에 공개된다. 본원에서 설명된 반응 화학을 사용한 페길화 단백질 생성물은 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명의 각 단백질에 부착된 폴리에틸렌 글리콜 부분의 수(즉, 치환의 저도)는 또한 다양할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 페길화 단백질은 평균 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합될 수 있다. 유사하게는, 평균 치환 정도는 단백질당 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19 또는 18-20 폴리에틸렌 글리콜 부분의 범위 내이다. 치환 정도를 결정하는 방법은 예를 들면, Delgago 등의 방법[Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304(1992)]과 같다.
본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드는 단량체 또는 다량체(즉, 이량체, 삼량체, 사량체 및 더 큰 다량체)일 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드의 단량체 및 다량체, 이들의 제조 방법 및 이들을 포함하는 조성물(바람직하게는, 약학 조성물)에 관한 것이다. 특정 구체옐서, 본발명의 폴리펩티드는 단량체, 이량체, 삼량체 또는 사량체이다. 구체예뿐 아니라, 본 발명의 다량체는 이량체 이상, 삼량체 이상 또는 사량체 이상이다.
본 발명에 의하여 포괄되는 다량체는 동종다량체 또는 이종다량체일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 동종다량체(homomer)는 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드 만을 포함하는 다량체를 의미한다(METH1 및/또는 METH2 단편, 변이체, 스플라이스 변이체 및 융합 단백질, 본원에서 상술됨). 상기 동종다량체는 동일한 또는 상이한 아미노산 서열을 갖는 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드를 포함할 것이다. 특정 구체예로서, 본 발명의 동종다량체는 동일한 아미노산 서열을 갖는 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드만을 포함하는 다량체이다. 또다른 구체예로서, 본 발명의 동종다량체는 상이한 아미노산 서열을 갖는 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드를 포함하는 다량체이다. 구체예로서, 본 발명의 다량체는 동종다량체(예, 동일한 또는 상이한 아미노산 서열을 갖는 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드를 포함) 또는 이종다량체(예, 동일한 및/또는 아미노산 서열을 갖는 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드만을 포함)이다. 또다른 구체예로서, 본 발명의 동종다량체는 적어도 동종이량체, 적어도 동종삼량체 또는 적어도 동종사량체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 이종다량체는 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드 및 하나 이상의 이종 폴리펩티드(즉, 상이한 단백질의 폴리펩티드)를 포함하는 다량체를 의미한다. 구체예로서, 본 발명의 다량체는 이종이량체, 이종삼량체, 또는 이종사량체이다. 추가적 구체예로서, 본 발명의 동종다량체는 적어도 동종이량체, 적어도 동종삼량체, 또는 적어도 동종사량체이다.
본 발명의 다량체는 소수성, 친수성, 이온 및/또는 공유적 결합의 결과일 수 있고/있어나, 예를 들면 리포좀 형성에 의하여 간접적으로 연결될 수 있다. 따라서, 한 예로서, 본 발명의 다량체는 예를 들면도종이량체 또는 동종삼량체는 본 발명의 폴리펩티드가 용액내에서 서로 접촉하는 경우에 형성된다. 또다른 구체예로서, 본 발명의 이종다량체, 예를 들면 이종삼량체 또는 이종사량체는 본 발명의 폴리펩티드가 항체를 본 발명의 폴리펩티드(본 발명의 융합 단백질에서 이종 폴리펩티드 서열에 항체를 포함)에 용액내 접촉시키는 경우에 형성된다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 다량체는 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드와 및/또는 사이에 공유 결합에 의하여 형성된다. 상기 공유 결합은 폴리펩티드 서열(예, 서열번호 2 또는 4에 제시, 또는 클론 HATCK89 또는 ATCC 기탁번호 209581 또는 209582 또는 PTA 1478로 기탁된 클론에 의하여 암호화되는 폴리펩티드에 포함되는)내 함유된 1 이상의 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 한 예로서, 공유 결합은 천연(즉, 천연 발생) 폴리펩티드에서 상호작용하는 폴리펩티드 서열내에 존재하는 시스테인 사이의 교차 결합이다. 또다른 예로서, 공유 결합은 화학 또는 재조합 조작의 결과이다. 이와는 달리, 상기 공유 결합은 METH1 및/또는 METH2 융합 단백질중 이종 폴리펩티드 서열내 포함되는 1 이상의 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 한 예로서, 공유 결합은 본 발명의 융합 단백질에 함유된 이종 서열간에 존재한다(참조예, 미국 특허 제5,478,925호). 특정 구체예로서, 공유 결합은 본 발명의 METH1 및/또는 METH2-Fc 융합 단백질에 함유되는 이종 서열 사이에 존재한다(상술된 바와 같음). 또다른 구체예로서, 본 발명의 융합 단백질의 공유 결합은 예컨대, 오스테오프로테게린(참조예, 국제 공개 WO 98/49305, 본원에서 참고로 인용)과 같은 공유적으로 결합된 다량체를 형성할 수 있는 또다른 섬유아세포 성장 인자 족에서 유래한 이종 폴리펩티드 서열 사이에 존재한다. 또다른 구체예에서, 2 이상의 본 발명의 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통하여 연결된다. 예들은 미국 특허 제5,073,627호(본원에서 참고로 인용)에 개시된 펩티드 링커를 포함한다. 본 발명의 다중 폴리펩티드를 포함하는 단백질은 통상적 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
본 발명의 다량체 폴리펩티드를 제조하는 또다른 방법은 류신 지퍼 또는 이소류신 지퍼 폴리펩티드 서열에 융합되는 본 발명의 폴리펩티드의 사용을 포함한다. 류신 지퍼 및 이소류신 지퍼 도메인은 이들이 발견되는 단백질의 다량체 형성을 촉진시키는 폴리펩티드이다. 류신 지퍼는 수개의 DNA-결합 단백질에서 처음으로 동정되었다(Landshulz 등, Science 240:1759, (1988)). 또한 다양한 상이한 단백질에서 발견되었다. 공지의 류신 지퍼 중에 이량화 또는 삼량화하는 자연발생적 펩티드 및 이것의 유도체가 존재한다. 본 발명의 가용성 다량체 단백질을 제조에 적절한 류신 지퍼 도메인의 예는 PCT 출원에서 기재되어 있다. 용액내 이량체 형성 또는 삼량체 형성하는 폴리펩티드 서열에 융합되는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 재조합 융합 단백질은 적절한 숙주 세포에서 발현되고, 생성되는 가용성 다량체 융합 단백질은 공지의 기술을 사용하여 배양 상청액으로부터 회수된다.
본 발명의 삼량체 폴리펩티드는 생물학적 활성의 향상이라는 이점을 제공할 것이다. 바람직한 류신 지퍼 및 이소류신 지퍼는 삼량체를 형성하는 것이 바람직하다. 한 실시예는 Hopper 등의 문헌(FEBS Letters 344:191, (1994)) 및 미국 특허제08/446,922호(본원에서 참고로 인용됨)에 기재된 바와 같이, 폐 계면활성제 단백질 D(SPD)에서 유래하는 류신 지퍼이다. 천연 발생적 삼량체 단백질로부터 유래하는 기타 펩티드는 본 발명의 삼량체 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 것이다.
또다른 실시예에서, 본 발명의 단백질은 Flag(등록상표) 폴리펩티드 서열을 포함하는 본 발명의 융합 단백질에 함유되는 Flag(등록상표) 폴리펩티드 서열 간의 상호작용에 의하여 결합된다. 추가적 구체예에서, 본 발명의 단백질 결합은 본 발명의 Flag(등록상표) 융합 단백질 및 항-Flag(등록상표) 항체에 포함된 이종 폴리펩티드 서열간의 상호작용에 의하여 결합된다.
본 발명의 다량체는 당업계에 공지된 화학적 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 다량체에 함유되는 것이 바람직한 폴리펩티드는 당업계에 공지된 링커 분자 및 링커 분자 길이 최적화 기술을 사용하여 화학적으로 교차 결합할 수 있다(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨). 추가로, 본 발명의 다량체는 다량체내 함유되는 것이 바람직한 폴리펩티드의 서열내에 위치된 시스테인 잔기 사이에 하나 이상의 분자간 교차 결합을 형성하기 위하여 당업계의 공지 기술을 사용하여 생성될 수 있다(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨). 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 시스테인 또는 비오틴의 첨가로 인하여 통상적으로 변형될 수 있고, 공지 기술을 하나 이상의 상기 변형된 폴리펩티드를 포함하는 다량체를 생성하는데 응용할 수 있다(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨). 또한, 공지 기술은 본 발명의 다량체에포함되는 것이 바람직한 폴리펩티드 성분을 포함하는 리포좀을 생성하기 위하여 응용될 수 있다(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨).
이와는 달리, 본 발명의 다량체는 당업계에 공지된 유전 공학 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 다량체에 포함되는 폴리펩티드는 본원에서 기술되는 융합 단백질 기법 또는 이와는 다른 공지 기술(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨)을 사용하여 재조합적으로 생성된다. 특정 구체예로서, 본 발명의 동종이량체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 링커 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리펩티드 서열을 결찰시키고, 이어서 최초 C-말단에서 N-말단의 역 방향으로(리더 서열 결실) 폴리펩티드의 번역된 생성물을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오티드에 추가로 결찰시킴으로써 생성된다((참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨). 또다른 구체예로서, 본원에 기재된 재조합 기술 또는 공지의 다른 기술은, 경막 도메인(또는 소수성 또는 시그널 펩티드)를 포함하고, 리포좀으로 막 재구성 기법(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨)에 의하여 통합될 수 있는 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 생성하는데 응용한다.
METH1 및 METH2 폴리펩티드 및 단편
본 발명은 기탁된 cDNA에 의하여 암호화되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 또는 상술된 폴리펩티드의 일부를 포함하는 펩티드 또는폴리펩티드를 갖는 METH1 폴리펩티드 분리물을 추가로 제공한다. 또한 본 발명은 기탁된 cDNA에 의하여 암호화되는 아미노산 서열 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는 상술된 폴리펩티드의 일부를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 갖는 METH2 폴리펩티드 분리물을 추가로 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 전장 폴리펩티드 및 성숙한, 프로단백질, 단백질의 가공된 형태, 결실 변이체, 치환 변이체, 대립유전자 변이체, 유사체, 유도체 등을 포함한다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의하여 서로 연결되는 아미노산, 즉 펩티드 이형질체로 구성될 수 있고, 20 유전자-암호화된 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 것이다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 천연 방법, 예를 들면 후번역 단계 또는 당업계에 공지된 화학 변형 기법에 의하여 변형될 수 있다. 상기 변형은 매우 상세한 모노그래프 및 기본 텍스트 및 풍부한 연구 문헌에 잘 기술되어 있다. 변형은 펩티드 주쇄, 아미노산 측쇄 및 아미노 말단 또는 카르복시 말단을 포함한 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 동일한 형태의 변형인 기존의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 수개 위치에서 동일한 또는 다양한 정돌 나타날 수 있다. 또한, 기존의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 다양한 형태의 변형을 포함할 것이다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 예를 들면 편재화의 결과로서 분지화될 수 있고, 이들은 분지의 유무와 관계없이 환형일 수 있다. 환형, 분지형 및 지환형 NETH1 또는 METH2 폴리펩티드는 후번역 천연 단계로부터 발생될 수 있거나 또는 합성 방법에 의하여 제조될수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유적 부착, 헴 부분의 공유적 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 부착, 리피드 또는 리피드 유도체의 공유적 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유적 부착, 가교, 폐환, 이황화 결합 형성, 디메틸하, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로굴루타메이트의 형성, 포밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록시화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 단백질에 아미노산의 트랜스-RNA 매개 첨가, 예를 들면 아르기닐화, 및 편재화를 포함한다[참조, 예를 들면, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2판, T.E. Cerighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1-12 (1983); Seifter 등, Meth Enzymol 182;626-646(1990); Rattan 등, Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)].
METH1 및 METH2 폴리펩티드의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능의 상당한 영향없이 다양화될 수 있음이 인식될 것이다. 서열의 이러한 상이점을 고려한다면, 활성을 결정하는 단백질상에서 결정적 위치가 있을 것이라는 점을 알 수 있을 것이다.
본 발명자들은 METH1 및 METH2가 시험관내 또는 생체내 항혈관형성을 저해하는 것을 보여주었다. METH1 및 METH2 각각은 메탈로프로테아제 도메인, 디스인테그린 도메인 및 TSP-유사 도메인을 포함한다. 메탈로프로테아제 도메인은 촉매적 활성일 것이다. 디스인테그린 도메인은 인테그린과 상호작용함으로써 항혈관형성을 저해하는데 역할을 할 것이다. 왜냐하면 인테그린은 증식 시그널 및 이동 시그널 모두의 매개에 필수적이기 때문이다. 본 발명자들은 METH1 및 METH2의 TSP-유사 도메인에서 유래한 펩티드가 생체내 또는 시험관내 항혈관형성을 저해하는 것을 보여주었다.
따라서, 본 발명은 실질적인 METH1 폴리펩티드 활성을 보여주거나 또는 하기에 기재된 단백질 일부와 같은 METH1 단백질의 일부를 포함하는 METH1 폴리펩티드의 변이; 및 실질적으로 METH2 폴리펩티드 호라성을 나타내거나 또는 하기에 기재된 단백질의 일부와 같은 METH2 단백질의 일부를 포함하는 METH2 폴리펩티드의 변이를 추가로 포함한다. 상기 변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 치환 유형을 포함한다. 상술된 바와 같이, 아미노산 변화가 표현형적 잠재일 수 있다는 고려에 대한 안내서는 Bowie, J.U. 등의 문헌["Deciphering the Messate in Protein Sequence: Tolerance to Amino Acid Substitutions,", Science 247:1306-1310 (1990)]에서 찾을 수 있다.
따라서, 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 기탁된 cDNA에 의하여 암호화되는 폴리펩티드 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기로 치환되고 그러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의하여 암호화되거나 암호화되지 않는 것; 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것; 또는 (iii) 성숙한 폴리펩티드가 또다른 화합물, 예를 들면 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 것, 또는 (iv) 추가적 아미노산이 성숙한 폴리펩티드에 융합되는 것, 예를 들면 IgG Fc 융합 영역 펩티드 또는 리더 또는 분비 서열 또는 성숙한 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열의 정제를 위한 서열일 수 있다. 상기 단편, 유도체 및 유사체는 본원에 교시된 것으로부터 당업자의 범위내에서 결정될 수 있다.
하전된 아미노산을 또다른 하전된 아미노산, 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산으로의 치환이 특히 관심의 대상이다. 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산으로의 치환은 METH1 또는 METH2 단백질의 특성을 향상기키기 위한 환원된 양성 전하를 갖는 단백질을 생성한다. 집합화를 저해하는 것이 바람직하다. 단백질의 집합화는 활성의 결핍을 야기할 뿐 아니라 약학 제제를 제조하는 경우 문제를 일으킬 수 있다. 이는 면역원성 때문이다. 참조, Pinckard 등, Clin Exp. Immunol. 2:331-349 (1967); Robbins 등, Diabetes 36:838-845(1987)); Cleland 등, Crit, Rev. Therapeutic Drug Carrier System 10:307-377 (1993).
기술된 바와 같이, 변화는 단백질의 활성 또는 접힘에 심하게 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환과 같은 중요하지 않은 성질의 변화가 바람직하다.
| 보존적 아미노산 치환 | |
| 방향족 | 페닐알라닌 |
| 트립토판 | |
| 티로신 | |
| 소수성 | 류신 |
| 이소류신 | |
| 발린 | |
| 극성 | 글루타민 |
| 아스파라긴 | |
| 염기성 | 아르기닌 |
| 라이신 | |
| 히스티딘 | |
| 산성 | 아스파르트산 |
| 글루탐산 | |
| 소형 | 알라닌 |
| 세린 | |
| 트레오닌 | |
| 메티오닌 | |
| 글리신 |
물론, 당업자가 만들 수 있는 아미노산 치환의 수는 전술한 것들을 비롯하여 여러 인자에 따라 달라진다. 일반적으로 말하면, 어떤 주어진 METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 대한 아미노산 치환 수는 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 이상은 아닐 것이다.
특히, 바람직한 METH1 분자는 다음 보존적 치환 중 하나 이상을 포함한다: A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M1; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G2; Q로 치환된 N3; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A4; D로 치환된 E5; H, 또는 K로 치환된 R6; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A7; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G9; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S10; H, 또는 K로 치환된 R11; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S12; W, 또는 Y로 치환된 F13; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G14; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V16; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T18; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L19; A, G, I, S,T, M, 또는 V로 치환된 L20; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L21; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L22; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A23; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A24; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A25; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L26; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L27; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A28; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V29; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S30; E로 치환된 D31; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A32; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L33; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G34; H, 또는 K로 치환된 R35; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S37; D로 치환된 E38; D로 치환된 E39; E로 치환된 D40; D로 치환된 E41; D로 치환된 E42; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L43; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V44; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V45; D로 치환된 E47; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L48; D로 치환된 E49; H, 또는 K로 치환된 R50; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A51; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G53; K, 또는 R로 치환된 H54; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G55; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T56; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T57; H, 또는 K로 치환된 R58; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L59; H, 또는 K로 치환된 R60; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L61; K, 또는 R로 치환된 H62; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A63; W, 또는 Y로 치환된 F64; E로 치환된 D65; N으로 치환된 Q66; N으로 치환된 Q67; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L68; E로 치환된 D69; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L70; D로 치환된 E71; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된L72; H, 또는 K로 치환된 R73; E로 치환된 D75; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S76; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S77; W, 또는 Y로 치환된 F78; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L79; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A80; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G82; W, 또는 Y로 치환된 F83; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T84; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L85; N으로 치환된 Q86; Q로 치환된 N87; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V88; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G89; H, 또는 K로 치환된 R90; H, 또는 R로 치환된 K91; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S92; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G93; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S94; D로 치환된 E95; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T96; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L98; D로 치환된 E100; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T101; E로 치환된 D102; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L103; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A104; K, 또는 R로 치환된 H105; W, 또는 Y로 치환된 F107; F, 또는 W로 치환된 Y108; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S109; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G110; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T111; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V112; Q로 치환된 N113; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G114; E로 치환된 D115; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S117; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S118; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A119; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A120; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A121; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L122; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S123; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L124; D로 치환된E126; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G127; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V128; H, 또는 K로 치환된 R129; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G130; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A131; W, 또는 Y로 치환된 F132; F, 또는 W로 치환된 Y133; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 LI34; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L135; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G136; D로 치환된 E137; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A138; F, 또는 W로 치환된 Y139; W, 또는 Y로 치환된 F140; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I141; N으로 치환된 Q142; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L144; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A146; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A147; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S148; D로 치환된 E149; H, 또는 K로 치환된 R150; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L151; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A152; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T153; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A154; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A155; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G157; D로 치환된 E158; H, 또는 R로 치환된 K159; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A162; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L164; N으로 치환된 Q165; W, 또는 Y로 치환된 F166; K, 또는 R로 치환된 H167; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L168; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L169; H, 또는 K로 치환된 R170; H, 또는 K로 치환된 R171; Q로 치환된 N172; H, 또는 K로 치환된 R173; N으로 치환된 Q174; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G175; E로 치환된 D176; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V177; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G178; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G179; A,G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T180; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G182; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V183; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V184; E로 치환된 D185; E로 치환된 D186; D로 치환된 E187; H, 또는 K로 치환된 R189; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T191; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G192; H, 또는 R로 치환된 K193; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A194; D로 치환된 E195; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T196; D로 치환된 E197; E로 치환된 D198; D로 치환된 E199; E로 치환된 D200; D로 치환된 E201; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G202; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T203; D로 치환된 E204; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G205; D로 치환된 E206; E로 치환된 D207; D로 치환된 E208; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G209; N으로 치환된 Q211; F, 또는 Y로 치환된 W212; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S213; N으로 치환된 Q215; E로 치환된 D216; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A218; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L219; N으로 치환된 Q220; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G221; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V222; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G223; N으로 치환된 Q224; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T226; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G227; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T228; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G229; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S230; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I231; H, 또는 K로 치환된 R232; H, 또는 R로 치환된 K233; H, 또는 R로 치환된 K234; H, 또는 K로 치환된 R235; W, 또는 Y로 치환된 F236; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V237; A, G, I, L,T, M, 또는 V로 치환된 S238; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S239; K, 또는 R로 치환된 H240; H, 또는 K로 치환된 R241; F, 또는 W로 치환된 Y242; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V243; D로 치환된 E244; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T245; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M246; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L247; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V248; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A249; E로 치환된 D250; N으로 치환된 Q251; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S252; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M253; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A254; D로 치환된 E255; W, 또는 Y로 치환된 F256; K, 또는 R로 치환된 H257; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G258; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S259; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G260; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L261; H, 또는 R로 치환된 K262; K, 또는 R로 치환된 H263; F, 또는 W로 치환된 Y264; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L265; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L266; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T267; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L268; W, 또는 Y로 치환된 F269; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S270; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V271; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A272; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A273; H, 또는 K로 치환된 R274; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L275; F, 또는 W로 치환된 Y276; H, 또는 R로 치환된 K277; K, 또는 R로 치환된 H278; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S280; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I281; H, 또는 K로 치환된 R282; Q로 치환된 N283; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S284; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V285; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S286; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L287; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V288; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V289; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V290; H, 또는 R로 치환된 K291; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I292; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L293; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V294; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I295; K, 또는 R로 치환된 H296; E로 치환된 D297; D로 치환된 E298; N으로 치환된 Q299; H, 또는 R로 치환된 K300; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G301; D로 치환된 E303; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V304; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T305; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S306; Q로 치환된 N307; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A308; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A309; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L310; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T311; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L312; H, 또는 K로 치환된 R313; Q로 치환된 N314; W, 또는 Y로 치환된 F315; Q로 치환된 N317; F, 또는 Y로 치환된 W318; N으로 치환된 Q319; H, 또는 R로 치환된 K320; N으로 치환된 Q321; K, 또는 R로 치환된 H322; Q로 치환된 N323; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S326; E로 치환된 D327; H, 또는 K로 치환된 R328; E로 치환된 D329; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A330; D로 치환된 E331; K, 또는 R로 치환된 H332; F, 또는 W로 치환된 Y333; E로 치환된 D334; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T335; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A336; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I337; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L338; W, 또는 Y로 치환된 F339; A, G, I, L,S, M, 또는 V로 치환된 T340; H, 또는 K로 치환된 R341; N으로 치환된 Q342; E로 치환된 D343; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L344; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G346; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S347; N으로 치환된 Q348; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T349; E로 치환된 D351; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T352; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L353; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G354; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M355; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A356; E로 치환된 D357; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V358; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G359; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T360; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V361; E로 치환된 D363; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S365; H, 또는 K로 치환된 R366; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S367; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S369; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V370; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I371; D로 치환된 E372; E로 치환된 D373; E로 치환된 D374; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G375; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L376; N으로 치환된 Q377; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A378; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A379; W, 또는 Y로 치환된 F380; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T381; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T382; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A383; K, 또는 R로 치환된 H384; D로 치환된 E385; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L386; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G387; K, 또는 R로 치환된 H388; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V389; W, 또는 Y로 치환된 F390; Q로 치환된 N391; A, G, I, L, S, T,또는 V로 치환된 M392; K, 또는 R로 치환된 H394; E로 치환된 D395; E로 치환된 D396; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A397; H, 또는 R로 치환된 K398; N으로 치환된 Q399; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A401; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S402; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L403; Q로 치환된 N404; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G405; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V406; Q로 치환된 N407; N으로 치환된 Q408; E로 치환된 D409; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S410; K, 또는 R로 치환된 H411; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M412; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M413; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A414; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S415; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M416; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L417; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S418; Q로 치환된 N419; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L420; E로 치환된 D421; K, 또는 R로 치환된 H422; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S423; N으로 치환된 Q424; F, 또는 Y로 치환된 W426; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S427; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S430; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A431; F, 또는 W로 치환된 Y432; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M433; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I434; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T435; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S436; W, 또는 Y로 치환된 F437; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L438; E로 치환된 D439; Q로 치환된 N440; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G441; K, 또는 R로 치환된 H442; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G443; D로 치환된 E444; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된L446; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M447; E로 치환된 D448; H, 또는 R로 치환된 K449; N으로 치환된 Q451; Q로 치환된 N452; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I454; N으로 치환된 Q455; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L456; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G458; E로 치환된 D459; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L460; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G462; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T463; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S464; F, 또는 W로 치환된 Y465; E로 치환된 D466; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A467; Q로 치환된 N468; H, 또는 K로 치환된 R469; N으로 치환된 Q470; N으로 치환된 Q472; W, 또는 Y로 치환된 F473; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T474; W 또는 Y로 치환된 F475; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G476; D로 치환된 E477; E로 치환된 D478; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S479; H, 또는 R로 치환된 K480; K, 또는 R로 치환된 H481; E로 치환된 D484; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A485; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A486; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S487; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T488; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S490; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T491; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L492; F, 또는 Y로 치환된 W493; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T495; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G496; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T497; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S498; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G499; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G500; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V501; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L502; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V503; N으로 치환된 Q505; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T506; H, 또는 R로 치환된 K507; K, 또는 R로 치환된 H508; W, 또는 Y로 치환된 F509; F, 또는 Y로 치환된 W511; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A512; E로 치환된 D513; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G514; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T515; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S516; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G518; D로 치환된 E519; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G520; H, 또는 R로 치환된 K521; F, 또는 Y로 치환된 W522; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I524; Q로 치환된 N525; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G526; H, 또는 R로 치환된 K527; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V529; Q로 치환된 N530; H, 또는 R로 치환된 K531; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T532; E로 치환된 D533; H, 또는 K로 치환된 R534; H, 또는 R로 치환된 K535; K, 또는 R로 치환된 H536; W, 또는 Y로 치환된 F537; E로 치환된 D538; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T539; W, 또는 Y로 치환된 F541; K, 또는 R로 치환된 H542; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G543; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S544; F, 또는 Y로 치환된 W545; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G546; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M547; F, 또는 Y로 치환된 W548; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G549; F, 또는 Y로 치환된 W551; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G552; E로 치환된 D553; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S555; H, 또는 K로 치환된 R556; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T557; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G559; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G560; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G561; A, G,I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V562; N으로 치환된 Q563; F, 또는 W로 치환된 Y564; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T565; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M566; H, 또는 K로 치환된 R567; D로 치환된 E568; E로 치환된 D570; Q로 치환된 N571; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V573; H, 또는 R로 치환된 K575; Q로 치환된 N576; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G577; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G578; H, 또는 R로 치환된 K579; F, 또는 W로 치환된 Y580; D로 치환된 E582; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G583; H, 또는 R로 치환된 K584; H, 또는 K로 치환된 R585; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V586; H, 또는 K로 치환된 R587; F, 또는 W로 치환된 Y588; H, 또는 K로 치환된 R589; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S590; Q로 치환된 N592; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L593; D로 치환된 E594; E로 치환된 D595; E로 치환된 D598; Q로 치환된 N599; Q로 치환된 N600; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G601; H, 또는 R로 치환된 K602; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T603; W, 또는 Y로 치환된 F604; H, 또는 K로 치환된 R605; D로 치환된 E606; D로 치환된 E607; N으로 치환된 Q608; D로 치환된 E610; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A611; K, 또는 R로 치환된 H612; Q로 치환된 N613; D로 치환된 E614; W, 또는 Y로 치환된 F615; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S616; H, 또는 R로 치환된 K617; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A618; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S619; W, 또는 Y로 치환된 F620; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G621; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S622; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G623; G, I, L, S, T, M, 또는 V로치환된 A625; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V626; D로 치환된 E627; F, 또는 Y로 치환된 W628; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I629; H, 또는 R로 치환된 K631; F, 또는 W로 치환된 Y632; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A633; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G634; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V635; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S636; H, 또는 R로 치환된 K638; E로 치환된 D639; H, 또는 K로 치환된 R640; H, 또는 R로 치환된 K642; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L643; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I644; N으로 치환된 Q646; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A647; H, 또는 R로 치환된 K648; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G649; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I650; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G651; F, 또는 W로 치환된 Y652; W, 또는 Y로 치환된 F653; W, 또는 Y로 치환된 F654; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V655; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L656; N으로 치환된 Q657; H, 또는 R로 치환된 K659; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V660; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V661; E로 치환된 D662; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G663; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T664; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S667; E로 치환된 D669; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S670; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T671; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S672; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V673; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V675; N으로 치환된 Q676; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G677; N으로 치환된 Q678; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V680; H, 또는 R로 치환된 K681; G, I, L, S, T, M, 또는V로 치환된 A682; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G683; E로 치환된 D685; H, 또는 K로 치환된 R686; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I687; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I688; E로 치환된 D689; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S690; H, 또는 R로 치환된 K691; H, 또는 R로 치환된 K692; H, 또는 R로 치환된 K693; W, 또는 Y로 치환된 F694; E로 치환된 D695; H, 또는 R로 치환된 K696; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G698; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V699; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G701; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G702; Q로 치환된 N703; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G704; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S705; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T706; H, 또는 R로 치환된 K708; H, 또는 R로 치환된 K709; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I710; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S711; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G712; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S713; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V714; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T715; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S716; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A717; H, 또는 R로 치환된 K718; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G720; F, 또는 W로 치환된 Y721; K, 또는 R로 치환된 H722; E로 치환된 D723; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I724; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I725; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T726; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I727; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T729; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G730; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A731; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T732; Q로 치환된 N733; A, G,L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I734; D로 치환된 E735; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V736; H, 또는 R로 치환된 K737; N으로 치환된 Q738; H, 또는 K로 치환된 R739; Q로 치환된 N740; N으로 치환된 Q741; H, 또는 K로 치환된 R742; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G743; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S744; H, 또는 K로 치환된 R745; Q로 치환된 N746; Q로 치환된 N747; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G748; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S749; W, 또는 Y로 치환된 F750; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L751; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A752; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I753; H, 또는 R로 치환된 K754; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A755; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A756; E로 치환된 D757; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G758; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T759; F, 또는 W로 치환된 Y760; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I761; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L762; Q로 치환된 N763; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G764; E로 치환된 D765; F, 또는 W로 치환된 Y766; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T767; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L768; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S769; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T770; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L771; D로 치환된 E772; N으로 치환된 Q773; E로 치환된 D774; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I775; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M776; F, 또는 W로 치환된 Y777; H, 또는 R로 치환된 K778; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G779; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V780; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V781; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L782; H, 또는 K로 치환된 R783; F, 또는 W로 치환된 Y784; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S785; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G786; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S787; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S788; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A789; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A790; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L791; D로 치환된 E792; H, 또는 K로 치환된 R793; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I794; H, 또는 K로 치환된 R795; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S796; W, 또는 Y로 치환된 F797; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S798; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L800; H, 또는 R로 치환된 K801; D로 치환된 E802; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L804; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T805; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I806; N으로 치환된 Q807; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V808; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L809; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T810; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V811; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G812; Q로 치환된 N813; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A814; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L815; H, 또는 K로 치환된 R816; H, 또는 R로 치환된 K818; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I819; H, 또는 R로 치환된 K820; F, 또는 W로 치환된 Y821; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T822; F, 또는 W로 치환된 Y823; W, 또는 Y로 치환된 F824; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V825; H, 또는 R로 치환된 K826; H, 또는 R로 치환된 K827; H, 또는 R로 치환된 K828; H, 또는 R로 치환된 K829; D로 치환된 E830; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S831; W, 또는 Y로 치환된 F832; Q로 치환된 N833; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A834; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I835; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T837; W, 또는 Y로 치환된 F838; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S839; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A840; F, 또는 Y로 치환된 W841; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V842; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I843; D로 치환된 E844; D로 치환된 E845; F, 또는 Y로 치환된 W846; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G847; D로 치환된 E848; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S850; H, 또는 R로 치환된 K851; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S852; D로 치환된 E854; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L855; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G856; F, 또는 Y로 치환된 W857; N으로 치환된 Q858; H, 또는 K로 치환된 R859; H, 또는 K로 치환된 R860; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L861; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V862; D로 치환된 E863; H, 또는 K로 치환된 R865; E로 치환된 D866; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I867; Q로 치환된 N868; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G869; N으로 치환된 Q870; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A872; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S873; D로 치환된 E874; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A876; H, 또는 R로 치환된 K877; D로 치환된 E878; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V879; H, 또는 R로 치환된 K880; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A882; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S883; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T884; H, 또는 K로 치환된 R885; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A888; E로 치환된 D889; K, 또는 R로 치환된 H890; N으로 치환된 Q894; F, 또는 Y로 치환된 W895; N으로 치환된 Q896; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L897; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G898; D로 치환된 E899; F, 또는 Y로 치환된 W900; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S901; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S902; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S904; H, 또는 R로 치환된 K905; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T906; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G908; H, 또는 R로 치환된 K909; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G910; F, 또는 W로 치환된 Y911; H, 또는 R로 치환된 K912; H, 또는 R로 치환된 K913; H, 또는 K로 치환된 R914; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S915; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L916; H, 또는 R로 치환된 K917; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L919; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S920; K, 또는 R로 치환된 H921; E로 치환된 D922; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G923; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G924; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V925; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L926; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S927; K, 또는 R로 치환된 H928; D로 치환된 E929; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S930; E로 치환된 D932; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L934; H, 또는 R로 치환된 K935; H, 또는 R로 치환된 K936; H, 또는 R로 치환된 K938; K, 또는 R로 치환된 H939; W, 또는 Y로 치환된 F940; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I941; E로 치환된 D942; W, 또는 Y로 치환된 F943; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T945; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M946; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A947; D로 치환된 E948; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S950.
다음과 같은 비보존적 치환 중 하나 이상을 보유한 METH1 폴리펩티드도 바람직하다: D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M1; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G2; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N3; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A4; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E5; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R6; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A7; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P8; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G9; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S10; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R11; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S12; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F13; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G14; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P15; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V16; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P17; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T18; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L19; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L20; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L21; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L22; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A23; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A24; D, E, H, K, R, N, Q, F, W,Y, P, 또는 C로 치환된 A25; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L26; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L27; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A28; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V29; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S30; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D31; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A32; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L33; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G34; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R35; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P36; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S37; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E38; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E39; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D40; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E41; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E42; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L43; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V44; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V45; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P46; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E47; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L48; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E49; D, E, A, G, I, L, S, T,M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R50; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A51; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P52; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G53; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H54; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G55; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T56; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T57; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R58; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L59; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R60; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L61; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H62; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A63; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F64; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D65; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q66; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q67; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L68; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D69; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L70; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E71; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L72; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R73; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P74; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D75; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S76; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S77; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F78; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L79; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A80; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P81; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G82; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F83; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T84; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L85; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q86; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N87; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V88; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G89; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R90; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K91; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S92; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G93; D, E, H, K, R, N3 Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S94; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E95; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T96; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P97; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L98; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는C로 치환된 P99; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E100; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T101; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D102; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L103; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A104; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H105; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C106; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F107; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y108; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S109; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G110; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T111; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V112; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N113; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G114; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D115; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P116; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S117; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S118; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A119; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A120; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A121; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L122; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S123; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y,P, 또는 C로 치환된 L124; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C125; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E126; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G127; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V128; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R129; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G130; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A131; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F132; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y133; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L134; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L135; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G136; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E137; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A138; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y139; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F140; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I141; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q142; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P143; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L144; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P145; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A146; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A147; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는C로 치환된 S148; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E149; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R150; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L151; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A152; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T153; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A154; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A155; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P156; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G157; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E158; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K159; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P160; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P161; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A162; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P163; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L164; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q165; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F166; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H167; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L168; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L169; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R170; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R171; D, E, H, K, R, A, G,I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N172; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R173; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q174; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G175; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D176; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V177; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G178; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G179; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T180; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V3 N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C181; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G182; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V183; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V184; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D185; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D186; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E187; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P188; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R189; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P190; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T191; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G192; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K193; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A194; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된E195; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T196; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E197; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D198; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E199; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D200; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E201; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G202; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T203; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E204; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G205; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E206; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D207; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E208; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G209; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P210; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q211; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W212; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S213; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P214; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q215; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D216; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P217; D, E,H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A218; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L219; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q220; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G221; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V222; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G223; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q224; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P225; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T226; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G227; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T228; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G229; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S230; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I231; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R232; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K233; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K234; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R235; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F236; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V237; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S238; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S239; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H240; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R241; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V,P, 또는 C로 치환된 Y242; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V243; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E244; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T245; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M246; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L247; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V248; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A249; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D250; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q251; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S252; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M253; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A254; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E255; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F256; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H257; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G258; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S259; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G260; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L261; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K262; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H263; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y264; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L265; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L266; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P,또는 C로 치환된 T267; D, E, H, K, K N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L268; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F269; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S270; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V271; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A272; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A273; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R274; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L275; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y276; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K277; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H278; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P279; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S280; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I281; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R282; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N283; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S284; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V285; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S286; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L287; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V288; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V289; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V290; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K291; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로치환된 I292; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L293; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V294; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I295; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H296; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D297; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E298; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q299; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K300; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G301; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P302; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E303; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V304; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T305; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S306; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N307; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A308; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A309; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L310; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T311; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L312; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R313; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N314; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F315; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C316; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N317; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W318; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q319; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K320; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q321; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H322; D, E, H, K, K A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N323; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P324; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P325; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S326; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D327; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R328; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D329; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A330; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E331; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H332; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y333; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D334; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T335; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A336; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I337; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L338; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L,S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F339; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T340; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R341; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q342; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N으로 치환된; Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D343; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L344; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C345; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G346; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S347; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q348; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T349; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C350; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D351; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T352; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L353; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G354; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M355; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A356; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D357; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V358; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G359; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T360; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V361; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C362; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y,P, 또는 C로 치환된 D363; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P364; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S365; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R366; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S367; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C368; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S369; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V370; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I371; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E372; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D373; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D374; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G375; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L376; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q377; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A378; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A379; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F380; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T381; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T382; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A383; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H384; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E385; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L386; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G387; D, E,A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H388; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V389; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F390; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N391; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M392; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P393; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H394; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D395; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D396; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A397; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K398; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q399; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C400; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A401; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S402; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L403; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N404; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y3 P, 또는 C로 치환된 G405; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V406; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N407; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q408; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D409; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S410; D, E, A, G, I,L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H411; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M412; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M413; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A414; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S415; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M416; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L417; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S418; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N419; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L420; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D421; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H422; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S423; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q424; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P425; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W426; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S427; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P428; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C429; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S430; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A431; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y432; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M433; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I434; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는C로 치환된 T435; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S436; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F437; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L438; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D439; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N440; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G441; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H442; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G443; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E444; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C445; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L446; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M447; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D448; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K449; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P450; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q451; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N452; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P453; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I454; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q455; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L456; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P457; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G458; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D459; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L460; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P461; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G462; D, E, H, K, K N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T463; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S464; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y465; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D466; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A467; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N468; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R469; D, E, H, K, I, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q470; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C471; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q472; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F473; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T474; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F475; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G476; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E477; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D478; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S479; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K480; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H481; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C482; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P483; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D484; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A485; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A486; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S487; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T488; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C489; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S490; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T491; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L492; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W493; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C494; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T495; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G496; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T497; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S498; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G499; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G500; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V501; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L502; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V503; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C504; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q505; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P,또는 C로 치환된 T506; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K507; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H508; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F509; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P510; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W511; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A512; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D513; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G514; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T515; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S516; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C517; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G518; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E519; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G520; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K521; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W522; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C523; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I524; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N525; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G526; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K527; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C528; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V529; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N530; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K531; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T532; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D533; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R534; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K535; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H536; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F537; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D538; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T539; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P540; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F541; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H542; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G543; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S544; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W545; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G546; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M547; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W548; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G549; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P550; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W551; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G552;H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D553; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C554; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S555; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R556; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T557; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C558; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G559; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G560; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G561; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V562; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q563; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y564; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T565; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M566; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R567; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E568; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C569; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D570; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N571; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P572; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V573; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P574; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V,N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K575; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N576; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G577; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G578; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K579; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y580; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C581; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E582; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G583; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K584; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R585; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V586; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R587; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y588; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R589; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S590; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C591; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N592; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L593; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E594; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D595; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C596; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된P597; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D598; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N599; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N600; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G601; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K602; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T603; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F604; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R605; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E606; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E607; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q608; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C609; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E610; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A611; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H612; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N613; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E614; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F615; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S616; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K617; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A618; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된S619; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F620; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G621; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S622; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G623; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P624; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A625; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V626; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E627; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W628; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I629; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P630; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K631; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y632; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A633; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G634; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V635; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S636; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P637; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K638; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D639; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R640; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C641; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K642; D, E, H, K, R, N, Q, F, W,Y, P, 또는 C로 치환된 L643; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I644; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C645; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q646; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A647; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K648; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G649; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I650; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G651; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y652; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F653; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F654; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V655; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L656; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q657; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P658; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K659; R, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V660; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V661; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D662; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G663; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T664; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P665; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C666; D, E, H, K,R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S667; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P668; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D669; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S670; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T671; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S672; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V673; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C674; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V675; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q676; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G677; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q678; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C679; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V680; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K681; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A682; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G683; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C684; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D685; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R686; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I687; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I688; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D689; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S690; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K691; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K692; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K693; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F694; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D695; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K696; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C697; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G698; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V699; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C700; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G701; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G702; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N703; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G704; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S705; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T706; D, E, H, K, K A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C707; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K708; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K709; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I710; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S711; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G712; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S713; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는C로 치환된 V714; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T715; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S716; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A717; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K718; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P719; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G720; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y721; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H722; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D723; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I724; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I725; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T726; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I727; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P728; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T729; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G730; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A731; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T732; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N733; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I734; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E735; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V736; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K737; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q738; D, E, A, G, I, L,S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R739; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N740; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q741; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R742; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G743; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S744; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R745; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N746; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N747; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G748; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S749; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F750; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L751; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A752; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I753; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K754; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A755; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A756; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D757; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G758; D, E, H, K, I, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T759; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y760; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I761; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L762; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F,W, Y, P, 또는 C로 치환된 N763; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G764; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D765; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y766; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T767; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L768; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S769; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T770; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L771; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E772; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q773; H, K, R, A, G, I, L,S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D774; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I775; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M776; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y777; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K778; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G779; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V780; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V781; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L782; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R783; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y784; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S785; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G786; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S787; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y,P, 또는 C로 치환된 S788; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A789; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A790; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L791; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E792; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R793; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I794; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R795; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S796; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F797; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S798; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P799; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L800; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K801; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E802; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P803; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L804; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T805; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I806; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q807; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V808; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L809; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T810; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V811; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G812; D, E, H, K, R,A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N813; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A814; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L815; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R816; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P817; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K818; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I819; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K820; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y821; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T822; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y823; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F824; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V825; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K826; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K827; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K828; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K829; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E830; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S831; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F832; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N833; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A834; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I835; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S,T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P836; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T837; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F838; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S839; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A840; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W841; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V842; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I843; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E844; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E845; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W846; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G847; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E848; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C849; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S850; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K851; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S852; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C853; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E854; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L855; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G856; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W857; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q858; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R859;D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R860; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L861; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V862; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E863; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C864; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R865; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D866; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I867; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N868; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G869; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q870; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P871; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A872; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S873; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E874; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C875; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A876; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K877; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E878; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V879; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K880; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P881; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A882; D, E, H, K,R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S883; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T884; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R885; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P886; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C887; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A888; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D889; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H890; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P891; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C892; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P893; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q894; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W895; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q896; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L897; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G898; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E899; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W900; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S901; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S902; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C903; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S904; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된K905; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T906; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C907; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q908; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K909; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G910; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y911; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K912; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K913; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R914; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S915; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L916; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K917; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C918; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L919; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S920; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H921; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D922; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G923; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G924; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V925; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L926; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S927; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H928; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E929; D,E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S930; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C931; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D932; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P933; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L934; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K935; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K936; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P937; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K938; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H939; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F940; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I941; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D942; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F943; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C944; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T945; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M946; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A947; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C, D, E, H, K, R, A, G, I, L로 치환된 E948; S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C949; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S950.
다음의 보존적 아미노산 치환 중 하나 이상을 보유한 METH2 폴리펩티드도 바람직하다: A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M1; W, 또는 Y로 치환된 F2; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A4; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A6; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A7; H, 또는 K로 치환된 R9; F, 또는 Y로 치환된 W10; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L11; W, 또는 Y로 치환된 F13; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L14; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L15; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L16; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L17; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L18; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L19; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L20; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L21; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L22; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L24; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A25; H, 또는 K로 치환된 R26; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G27; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A28; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A30; H, 또는 K로 치환된 R31; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A33; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A34; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G35; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G36; N으로 치환된 Q37; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A38; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S39; D로 치환된 E40; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L41; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V42; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V43; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T45; H, 또는 K로 치환된 R46; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L47; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G49; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S50; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A51; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G52; D로 치환된 E53; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L54; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A55; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L56; K, 또는 R로 치환된 H57; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L58; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S59; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A60; W, 또는 Y로 치환된 F61; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G62; H, 또는 R로 치환된 K63; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G64; W, 또는 Y로 치환된 F65; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V66; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L67; H, 또는 K로 치환된 R68; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L69; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A70; E로 치환된 D72; E로 치환된 D73; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S74; W, 또는 Y로 치환된 F75; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L76; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A77; D로 치환된 E79; W, 또는 Y로 치환된 F80; H, 또는 R로 치환된 K81; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I82; D로 치환된 E83; H, 또는 K로 치환된 R84; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L85; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G86; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G87; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S88; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G89; H, 또는 K로 치환된 R90; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A91; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T92; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G93; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G94; D로 치환된 E95; H, 또는 K로 치환된 R96; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G97; G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L98; H, 또는 K로 치환된 R99; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G100; W, 또는 Y로 치환된 F102; W, 또는 Y로 치환된 F103; A, G, I,L, T, M, 또는 V로 치환된 S104; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G105; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T106; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V107; Q로 치환된 N108; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G109; D로 치환된 E110; D로 치환된 E112; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S113; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L114; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A115; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A116; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V117; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S118; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L119; H, 또는 K로 치환된 R121; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G122; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L123; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S124; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G125; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S126; W, 또는 Y로 치환된 F127; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L128; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L129; E로 치환된 D130; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G131; D로 치환된 E132; D로 치환된 E133; W, 또는 Y로 치환된 F134; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T135; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I136; N으로 치환된 Q137; N으로 치환된 Q139; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G140; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A141; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G142; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G143; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S144; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L145; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A146; N으로 치환된 Q147; K, 또는 R로 치환된 H149; H, 또는 K로 치환된 R150; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L151; N으로 치환된 Q152; H, 또는 K로 치환된R153; F, 또는 Y로 치환된 W154; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G155; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A157; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G158; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A159; H, 또는 K로 치환된 R160; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L162; H, 또는 K로 치환된 R164; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G165; D로 치환된 E167; F, 또는 Y로 치환된 W168; D로 치환된 E169; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V170; D로 치환된 E171; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T172; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G173; D로 치환된 E174; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G175; N으로 치환된 Q176; H, 또는 K로 치환된 R177; N으로 치환된 Q178; D로 치환된 E179; H, 또는 K로 치환된 R180; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G181; E로 치환된 D182; K, 또는 R로 치환된 H183; N으로 치환된 Q184; D로 치환된 E185; E로 치환된 D186; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S187; D로 치환된 E188; D로 치환된 E189; D로 치환된 E190; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S191; N으로 치환된 Q192; D로 치환된 E193; D로 치환된 E194; D로 치환된 E195; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A196; D로 치환된 E197; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G198; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A199; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S200; D로 치환된 E201; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L206; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G207; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A208; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T209; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S210; H, 또는 K로 치환된 R211; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T212; H, 또는 R로 치환된 K213; H, 또는 K로 치환된 R214; W, 또는 Y로 치환된 F215; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V216; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S217; D로 치환된 E218; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A219; H, 또는 K로 치환된 R220; W, 또는 Y로 치환된 F221; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V222; D로 치환된 E223; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T224; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L225; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L226; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V227; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A228; E로 치환된 D229; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A230; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S231; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M232; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A233; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A234; W, 또는 Y로 치환된 F235; F, 또는 W로 치환된 Y236; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G237; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A238; E로 치환된 D239; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L240; N으로 치환된 Q241; Q로 치환된 N242; K, 또는 R로 치환된 H243; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I244; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L245; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T246; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L247; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M248; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S249; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V250; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A251; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A252; H, 또는 K로 치환된 R253; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I254; F, 또는 W로 치환된 Y255; H, 또는 R로 치환된 K256; K, 또는 R로 치환된 H257; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S259; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I260; H, 또는 R로 치환된 K261; Q로 치환된 N262; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S263; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I264; Q로 치환된 N265; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L266; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M267; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V268; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V269; H, 또는 R로 치환된 K270; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V271; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L272; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I273; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V274; D로 치환된 E275; E로 치환된 D276; D로 치환된 E277; H 또는 R로 치환된 K278; F, 또는 Y로 치환된 W279; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G280; D로 치환된 E282; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V283; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S284; E로 치환된 D285; Q로 치환된 N286; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G287; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G288; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L289; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T290; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L291; H, 또는 K로 치환된 R292; Q로 치환된 N293; W, 또는 Y로 치환된 F294; Q로 치환된 N296; F, 또는 Y로 치환된 W297; N으로 치환된 Q298; H, 또는 K로 치환된 R299; H, 또는 K로 치환된 R300; W, 또는 Y로 치환된 F301; Q로 치환된 N302; N으로 치환된 Q303; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S305; E로 치환된 D306; H, 또는 K로 치환된 R307; K, 또는 R로 치환된 H308; D로 치환된 E310; K, 또는 R로 치환된 H311; F, 또는 W로 치환된 Y312; E로 치환된 D313; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T314; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A315; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I316; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된L317; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L318; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T319; H, 또는 K로 치환된 R320; N으로 치환된 Q321; Q로 치환된 N322; W, 또는 Y로 치환된 F323; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G325; N으로 치환된 Q326; D로 치환된 E327; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G328; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L329; E로 치환된 D331; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T332; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L333; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G334; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V335; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A336; E로 치환된 D337; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I338; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G339; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T340; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I341; E로 치환된 D343; Q로 치환된 N345; H, 또는 R로 치환된 K346; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S347; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S349; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V350; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I351; D로 치환된 E352; E로 치환된 D353; D로 치환된 E354; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G355; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L356; N으로 치환된 Q357; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A358; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A359; K, 또는 R로 치환된 H360; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T361; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L362; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A363; K, 또는 R로 치환된 H364; D로 치환된 E365; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L366; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G367; K, 또는 R로 치환된 H368; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V369; A, G, I, S, T, M, 또는V로 치환된 L370; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S371; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M372; K, 또는 R로 치환된 H374; E로 치환된 D375; E로 치환된 D376; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S377; H, 또는 R로 치환된 K378; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T381; H, 또는 K로 치환된 R382; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L383; W, 또는 Y로 치환된 F384; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G385; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M387; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G388; H, 또는 R로 치환된 K389; K, 또는 R로 치환된 H390; K, 또는 R로 치환된 H391; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V392; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M393; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A394; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L396; W, 또는 Y로 치환된 F397; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V398; K, 또는 R로 치환된 H399; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L400; Q로 치환된 N401; N으로 치환된 Q402; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T403; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L404; F, 또는 Y로 치환된 W406; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S407; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S410; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A411; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M412; F, 또는 W로 치환된 Y413; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L414; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T415; D로 치환된 E416; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L417; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L418; E로 치환된 D419; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G420; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G421; K, 또는 R로 치환된 H422; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G423; E로 치환된 D424; A, G, I, S,T, M, 또는 V로 치환된 L426; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L427; E로 치환된 D428; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A429; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G431; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A432; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A433; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L434; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L436; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T438; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G439; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L440; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G442; H, 또는 K로 치환된 R443; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M444; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A445; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L446; F, 또는 W로 치환된 Y447; N으로 치환된 Q448; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L449; E로 치환된 D450; N으로 치환된 Q451; N으로 치환된 Q452; H, 또는 K로 치환된 R454; N으로 치환된 Q455; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I456; W, 또는 Y로 치환된 F457; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G458; E로 치환된 D460; W, 또는 Y로 치환된 F461; H, 또는 K로 치환된 R462; K, 또는 R로 치환된 H463; Q로 치환된 N466; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T467; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S468; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A469; N으로 치환된 Q470; E로 치환된 D471; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V472; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A474; N으로 치환된 Q475; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L476; F, 또는 Y로 치환된 W477; K, 또는 R로 치환된 H479; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T480; E로 치환된 D481; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G482; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A483; D로 치환된 E484; A, G,I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L486; K, 또는 R로 치환된 H488; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T489; H, 또는 R로 치환된 K490; Q로 치환된 N491; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G492; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S493; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L494; F, 또는 Y로 치환된 W496; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A497; E로 치환된 D498; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G499; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T500; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G503; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G505; K, 또는 R로 치환된 H506; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L507; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S509; D로 치환된 E510; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G511; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S512; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L514; D로 치환된 E516; D로 치환된 E517; D로 치환된 E518; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V519; D로 치환된 E520; H, 또는 K로 치환된 R521; H, 또는 R로 치환된 K523; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V525; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V526; E로 치환된 D527; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G528; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G529; F, 또는 Y로 치환된 W530; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A531; F, 또는 Y로 치환된 W533; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G534; F, 또는 Y로 치환된 W536; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G537; D로 치환된 E538; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S540; H, 또는 K로 치환된 R541; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T542; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G544; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G545; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G546; A, G, I, L,S, T, 또는 M으로 치환된 V547; N으로 치환된 Q548; W, 또는 Y로 치환된 F549; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S550; K, 또는 R로 치환된 H551; H, 또는 K로 치환된 R552; D로 치환된 E553; H, 또는 R로 치환된 K555; E로 치환된 D556; D로 치환된 E558; N으로 치환된 Q560; Q로 치환된 N561; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G562; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G563; H, 또는 K로 치환된 R564; F, 또는 W로 치환된 Y565; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L567; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G568; H, 또는 K로 치환된 R569; H, 또는 K로 치환된 R570; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A571; H, 또는 R로 치환된 K572; F, 또는 W로 치환된 Y573; N으로 치환된 Q574; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S575; K, 또는 R로 치환된 H577; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T578; D로 치환된 E579; D로 치환된 E580; E로 치환된 D584; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G585; H, 또는 R로 치환된 K586; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S587; W, 또는 Y로 치환된 F588; H, 또는 K로 치환된 R589; D로 치환된 E590; N으로 치환된 Q591; N으로 치환된 Q592; D로 치환된 E594; H, 또는 R로 치환된 K595; F, 또는 W로 치환된 Y596; Q로 치환된 N597; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A598; F, 또는 W로 치환된 Y599; Q로 치환된 N600; F 또는 W로 치환된 Y601; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T602; E로 치환된 D603; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M604; E로 치환된 D605; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G606; Q로 치환된 N607; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L608; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L609; N으로 치환된 Q610; F, 또는 Y로 치환된 W611; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된V612; H, 또는R로 치환된 K614; F, 또는 W로 치환된 Y615; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A616; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G617; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V618; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S619; H, 또는 K로 치환된 R621; E로 치환된 D622; H, 또는 K로 치환된 R623; H, 또는 R로 치환된 K625; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L626; W, 또는 Y로 치환된 F627; H, 또는 K로 치환된 R629; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A630; H, 또는 K로 치환된 R631; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G632; H, 또는 K로 치환된 R633; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S634; D로 치환된 E635; W, 또는 Y로 치환된 F636; H, 또는 R로 치환된 K637; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V638; W, 또는 Y로 치환된 F639; D로 치환된 E640; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A641; H, 또는 R로 치환된 K642; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V643; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I644; E로 치환된 D645; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G646; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T647; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L648; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G650; D로 치환된 E652; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T653; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L654; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A655; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I656; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V658; H, 또는 K로 치환된 R659; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G660; N으로 치환된 Q661; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V663; H, 또는 R로 치환된 K664; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A665; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G666; E로 치환된 D668; K, 또는 R로 치환된 H669; A, G,I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V670; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V671; E로 치환된 D672; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S673; H, 또는 K로 치환된 R675; H, 또는 R로 치환된 K676; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L677; E로 치환된 D678; H, 또는 R로 치환된 K679; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G681; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V682; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G684; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G685; H, 또는 R로 치환된 K686; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G687; Q로 치환된 N688; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S689; H, 또는 K로 치환된 R691; H, 또는 R로 치환된 K692; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V693; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S694; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G695; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S696; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L697; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T698; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T700; Q로 치환된 N701; F 또는 W로 치환된 Y702; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G703; F, 또는 W로 치환된 Y704; Q로 치환된 N705; E로 치환된 D706; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I707; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V708; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T709; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I710; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A712; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G713; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A714; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T715; Q로 치환된 N716; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I717; E로 치환된 D718; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V719; H, 또는 R로 치환된 K720; N으로 치환된 Q721; H, 또는 K로 치환된 R722; A, G, I,L, T, M, 또는 V로 치환된 S723; K, 또는 R로 치환된 H724; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G726; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V727; N으로 치환된 Q728; Q로 치환된 N729; E로 치환된 D730; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G731; Q로 치환된 N732; F, 또는 W로 치환된 N733; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L734; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A735; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L736; H, 또는 R로 치환된 K737; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T738; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A739; E로 치환된 D740; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G741; N으로 치환된 Q742; F, 또는 W로 치환된 Y743; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L744; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L745; Q로 치환된 N746; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G747; Q로 치환된 N748; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L749; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A750; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I751; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S752; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A753; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I754; D로 치환된 E755; N으로 치환된 Q756; E로 치환된 D757; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I758; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L759; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V760; H, 또는 R로 치환된 K761; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G762; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T763; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I764; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 I764; H, 또는 R로 치환된 K766; F, 또는 W로 치환된 Y767; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S768; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G769; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S770; A, G, L, S,T, M, 또는 V로 치환된 I771; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A772; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T773; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L774; D로 치환된 E775; H, 또는 K로 치환된 R776; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L777; N으로 치환된 L778; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S779; W, 또는 Y로 치환된 F780; H, 또는 K로 치환된 R781; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L783; D로 치환된 E785; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L787; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T788; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V789; N으로 치환된 Q790; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L791; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L792; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T793; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V794; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G796; D로 치환된 E797; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V798; W, 또는 Y로 치환된 F799; H, 또는 R로 치환된 K802; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V803; H, 또는 R로 치환된 K804; F, 또는 W로 치환된 Y805; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T806; W, 또는 Y로 치환된 F807; W, 또는 Y로 치환된 F808; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V809; Q로 치환된 N811; E로 치환된 D812; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V813; E로 치환된 D814; W, 또는 Y로 치환된 F815; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S816; A, G, I, L, S, T, 또는 V로 치환된 M817; N으로 치환된 Q818; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S819; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S820; H, 또는 R로 치환된 K821; D로 치환된 E822; H, 또는 K로 치환된 R823; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A824; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T825; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T826; Q로 치환된 N827; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I828; A, G, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 I829; N으로 치환된 Q830; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L832; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L833; K, 또는 R로 치환된 H834; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A835; N으로 치환된 Q836; F, 또는 Y로 치환된 W837; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V838; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L839; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G840; E로 치환된 D841; F, 또는 Y로 치환된 W842; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S843; D로 치환된 E844; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S846; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S847; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T848; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G850; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A851; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G852; F, 또는 Y로 치환된 W853; N으로 치환된 Q854; H, 또는 K로 치환된 R855; H, 또는 K로 치환된 R856; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T857; A, G, I, L, S, T, 또는 M으로 치환된 V858; D로 치환된 E859; H, 또는 K로 치환된 R861; E로 치환된 D862; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S864; A, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 G865; N으로 치환된 Q866; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A867; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S868; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A869; A, G, I, L, S, M, 또는 V로 치환된 T870; Q로 치환된 N872; H, 또는 R로 치환된 K873; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A874; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L875; H, 또는 R로 치환된 K876; D로 치환된 E878; E로 치환된 D879; G, I, L, S, T, M, 또는 V로 치환된 A880; H, 또는 R로 치환된 K881; D로 치환된E884; A, G, I, L, T, M, 또는 V로 치환된 S885; N으로 치환된 Q886; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L887; A, G, I, S, T, M, 또는 V로 치환된 L890.
다음 보존적 아미노산 치환 중 하나 이상을 갖는 METH2 폴리펩티드도 바람직하다: D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M1; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F2; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P3; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A4; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P5; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A6; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A7; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P8; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R9; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W10; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L11; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P12; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F13; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L14; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L15; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L16; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L17; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L18; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L19; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L20; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L21; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L22; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P23; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L24; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A25; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R26; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G27; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A28; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P29; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A30; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R31; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P32; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A33; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A34; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G35; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G36; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q37; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A38; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S39; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E40; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L41; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V42; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V43; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P44; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T45; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R46; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L47; D, E, H, K,R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P48; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G49; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S50; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A51; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G52; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E53; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L54; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A55; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L56; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H57; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L58; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S59; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A60; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F61; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G62; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K63; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G64; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F65; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V66; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L67; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R68; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L69; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A70; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P71; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D72; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N,Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D73; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S74; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F75; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L76; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A77; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P78; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E79; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F80; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K81; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I82; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E83; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R84; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L85; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G86; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G87; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S88; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G89; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R90; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A91; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T92; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G93; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G94; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E95; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R96; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G97; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된L98; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R99; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G100; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C101; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F102; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F103; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S104; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G105; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T106; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V107; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N108; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G109; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E110; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P111; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E112; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S113; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L114; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A115; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A116; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V117; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S118; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L119; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C120; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R121; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로치환된 G122; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L123; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S124; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G125; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S126; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F127; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L128; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L129; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D130; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G131; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E132; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E133; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F134; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T135; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I136; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q137; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P138; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q139; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G140; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A141; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G142; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G143; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S144; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L145; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A146; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y,P, 또는 C로 치환된 Q147; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P148; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H149; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R150; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L151; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q152; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R153; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W154; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G155; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P156; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A157; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G158; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A159; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R160; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P161; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L162; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P163; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R164; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G165; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P166; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E167; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W168; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E169; D, E, H, K, R, N, Q, F, W,Y, P, 또는 C로 치환된 V170; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E171; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T172; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G173; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E174; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G175; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q176; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R177; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q178; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E179; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R180; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G181; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D182; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H183; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q184; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E185; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D186; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S187; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E188; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E189; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E190; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S191; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q192; H,K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E193; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E194; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E195; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A196; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E197; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G198; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A199; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S200; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E201; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P202; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P203; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P204; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P205; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L206; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G207; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A208; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T209; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S210; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R211; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T212; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K213; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R214; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L,S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F215; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V216; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S217; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E218; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A219; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R220; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F221; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V222; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E223; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T224; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L225; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L226; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V227; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A228; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D229; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A230; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S231; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M232; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A233; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A234; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F235; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y236; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G237; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A238; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D239; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는C로 치환된 L240; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q241; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N242;D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H243; D, E, H, K, K N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I244; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L245; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T246; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L247; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M248; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S249; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V250; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A251; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A252; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R253; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I254; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y255; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K256; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H257; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P258; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S259; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I260; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K261; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N262; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S263; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I264; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S,T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N265; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L266; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M267; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V268; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V269; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K270; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V271; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L272; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I273; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V274; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E275; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D276; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E277; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K278; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W279; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G280; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P281; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E282; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V283; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S284; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D285; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N286; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G287; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G288; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는C로 치환된 L289; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T290; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L291; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R292; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N293; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F294; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C295; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N296; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W297; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q298; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R299; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R300; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F301; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N302; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q303; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P304; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S305; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D306; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R307; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H308; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P309; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E310; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N,Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H311; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y312; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D313; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T314; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A315; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I316; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L317; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L318; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T319; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R320; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q321; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N322; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F323; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C324; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G325; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q326; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E327; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G328; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L329; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C330; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D331; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T332; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L333; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된G334; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V335; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A336; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D337; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I338; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G339; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T340; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I341; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C342; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D343; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P344; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N345; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K346; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S347; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C348; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S349; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V350; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I351; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E352; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D353; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E354; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G355; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L356; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q357; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A358; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A359; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H360; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T361; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L362; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A363; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H364; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E365; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L366; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G367; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H368; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V369; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L370; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S371; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M372; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P373; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H374; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D375; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D376; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S377; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K378; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P379; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C380; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T381; D, E, A, G, I, L, S, T, M,V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R382; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L383; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F384; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G385; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P386; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M387; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G388; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K389; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H390; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H391; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V392; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M393; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A394; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P395; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L396; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F397; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V398; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H399; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L400; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N401; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q402; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T403; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L404; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P405; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I,L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W406; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S407; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P408; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C409; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S410; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A411; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M412; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y413; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L414; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T415; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E416; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L417; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L418; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D419; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G420; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G421; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H422; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G423; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D424; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C425; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L426; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L427; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D428; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A429; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P430; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G431; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A432; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A433; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L434; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P435; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L436; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P437; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T438; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G439; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L440; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P441; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G442; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R443; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M444; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A445; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L446; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y447; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q448; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L449; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D450; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q451; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q452; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C453; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된R454; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q455; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I456; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F457; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G458; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P459; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D460; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F461; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R462; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H463; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C464; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P465; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N466; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T467; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S468; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A469; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q470; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D471; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V472; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C473; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A474; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q475; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L476; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W477; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C478; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H479; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T480; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D481; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G482; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A483; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E484; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P485; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L486; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C487; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H488; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T489; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K490; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N491; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G492; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S493; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L494; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P495; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W496; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A497; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D498; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G499; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T500; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S,T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P501; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C502; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G503; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P504; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G505; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H506; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L507; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C508; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S509; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E510; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G511; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S512; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C513; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L514; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P515; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E516; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E517; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E518; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V519; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E520; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R521; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P522; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K523;D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P524; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V525; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V526; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D527; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G528; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G529; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W530; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A531; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P532; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W533; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G534; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P535; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W536; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G537; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E538; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C539; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S540; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R541; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T542; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C543; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G544; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G545; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G546; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V547;D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q548; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F549; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S550; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H551; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R552; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E553; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C554; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K555; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D556; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P557; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E558; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P559; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q560; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N561; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G562; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G563; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R564; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y565; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는P로 치환된 C566; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L567; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G568; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R569; D, E, A, G, I, L,S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R570; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A571; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K572; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y573; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q574; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S575; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C576; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H577; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T578; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E579; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E580; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C581; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P582; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P583; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D584; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G585; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K586; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S587; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F588; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R589; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E590; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q591; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T,M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q592; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C593; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E594; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K595; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y596; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N597; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A598; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y599; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N600; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y601; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T602; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D603; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M604; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D605; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G606; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N607; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L608; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L609; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q610; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W611; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V612; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P613; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K614; D, E, H, K, R, N,Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y615; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A616; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G617; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V618; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S619; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P620; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R621; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D622; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R623; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C624; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K625; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L626; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F627; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C628; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R629; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A630; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R631; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G632; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R633; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S634; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E635; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F636; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K637; D, E, H, K, R, N, Q, F, W,Y, P, 또는 C로 치환된 V638; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F639; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E640; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A641; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K642; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V643; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I644; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D645; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G646; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T647; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L648; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C649; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G650; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P651; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E652; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T653; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L654; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A655; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I656; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C657; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V658; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R659; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G660; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q661; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C662; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V663; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K664; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A665; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G666; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C667; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D668; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H669; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V670; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V671; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D672; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S673; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P674; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R675; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K676; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L677; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D678; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K679; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C680; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G681; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V682; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C683; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G684; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G685; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N,Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K686; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G687; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N688; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S689; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C690; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R691; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K692; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V693; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S694; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G695; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S696; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L697; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T698; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P699; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T700; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N701; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y702; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G703; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y704; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N705; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D706; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I707; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V708; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T709; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된I710; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P711; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A712; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G713; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A714; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T715; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N716; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I717; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D718; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V719; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K720; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q721; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R722; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S723; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H724; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P725; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G726; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V727; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q728; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N729; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D730; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G731; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N732; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y733; D, E, H, K, R, N, Q, F,W, Y, P, 또는 C로 치환된 L734; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A735; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L736; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K737; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T738; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A739; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D740; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G741; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q742; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y743; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L744; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L745; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N746; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G747; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N748; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L749; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A750; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I751; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S752; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A753; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I754; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E755; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q756; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D757; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I758; D, E, H, K, R,N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L759; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V760; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K761; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G762; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T763; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I764; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L765;D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K766; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y767; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S768; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G769; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S770; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I771; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A772; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T773; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L774; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E775; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R776; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L777; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q778; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S779; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F780; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R781; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P782; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L783; D, E, H, K, R,A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P784; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E785; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P786; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L787; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T788; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V789; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q790; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L791; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L792; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T793; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V794; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P795; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G796; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E797; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V798; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F799; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P800; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P801; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K802; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V803; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K804; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 Y805; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T806; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P,또는 C로 치환된 F807; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F808; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V809; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P810; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N811; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D812; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V813; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D814; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 F815; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S816; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 M817; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q818; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S819; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S820; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K821; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E822; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R823; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A824; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T825; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T826; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N827; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I828; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 I829; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q830; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T,M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P831; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L832; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L833; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 H834; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A835; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q836; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W837; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V838; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L839; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G840; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D841; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W842; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S843; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E844; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C845; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S846; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S847; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T848; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C849; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G850; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A851; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G852; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, 또는 C로 치환된 W853; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q854; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y,P, 또는 C로 치환된 R855; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R856; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T857; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 V858; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E859; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C860; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 R861; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D862; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P863; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S864; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 G865; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q866; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A867; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S868; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A869; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 T870; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C871; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 N872; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K873; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A874; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L875; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K876; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P877; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된E878; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 D879; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 A880; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 K881; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P882; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 P로 치환된 C883; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 E884; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 S885; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 Q886; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L887; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, y, 또는 P로 치환된 C888; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, 또는 C로 치환된 P889; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, 또는 C로 치환된 L890.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 ,7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 보존성 또는 비보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 또한, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 임의의 조합으로 보존성 또는 비보존성 치환을 포함할 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 ,7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 보존성 아미노산 치환과 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 ,7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 비보존성 아미노산 치환을 동일한 폴리펩티드 내에 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드는 10개의 보존성 아미노산 치환과 10개의 비보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한치환을 보유한 METH1 또는 METH2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 속한다.
치환은, 전길이 METH1 또는 METH2, 성숙 METH1 또는 METH2, 및 본 명세서에 개시된 임의의 다른 METH1 또는 METH2 변형체, 예컨대 N- 및/또는 C-말단 아미노산 결실이 있는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드; 하나 이상의 도메인이 결여된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드; 또는 하이브리드 METH1/METH2 분자에서 만들어질 수 있다.
기능에 필수적인 본 발명의 METH1 및 METH2 단백질 중 아미노산은, 부위 지정 돌연변이 유발법 또는 알라닌 주사 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법으로 확인할 수 있다(Cunningham and Wells,Science244:1081-1085(1989)). 알라닌 주사 돌연변이 유발법의 절차는 분자내 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그 다음 시험관내 또는 생체내 혈관형성 저해와 같은 생물학적 활성에 대해 생성된 돌연변이 분자를 시험한다. 혈관형성의 저해에 중요한 부위는 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화도 표지화 등의 구조 분석으로 결정할 수 있다(Smith 등, J.Mol.Biol. 224:899-904(1992) 및 de Vos et al.,Science255:306-312(1992)).
각 도메인의 경계(예를 들어, 메탈로프로테아제 도메인의 경계)에서 아미노산 치환된 폴리펩티드가 특히 바람직하다. 이들 경계에서의 아미노산은, 예컨대 절단을 막도록 단백질의 활성을 변경시키기 위해서 치환될 수 있다. 단백질의 활성에 영향을 주지 않는 아미노산 치환을 실시할 수 있다. 예를 들어, METH1에서 다음 아미노산을 하기의 아미노산으로 치환할 수 있다: L-19는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-20은 A, C, D, E, F,G, H, I, K, M, N, P, Q, K S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-21은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-22는 A, C, D, E, F, C, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-23은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-24는 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-25는 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-26은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-27은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-28은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; V-29는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-30은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; D-31은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-32는 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-33은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-34는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-35는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-36은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-37은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-38은 A, C, D, F, G, H,I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-39는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-225는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; T-226은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-227은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; T-228은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-229는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-230은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; I-231은 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-232는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; K-233은 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; K-234는 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-235는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; F-236은 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; V-237은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-238은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-239는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; H-240은 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-241은 A, C,D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; Y-242는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W로 치환될 수 있고; V-243은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-244는 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; T-245는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; K-449는 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-450은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; Q-451은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; N-452는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-453은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; I-454는 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; Q-455는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-456은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-457은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-458은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; D-459는 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-460은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-461은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-462는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; T-463은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-464는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; Y-465는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W로 치환될 수 있고; D-466은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-467은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; N-468은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-469는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-534는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; K-535는 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; H-536은 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; F-537은 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; D-538은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; T-539는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-540은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; F-541은 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; H-542는 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-543은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-544는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-545는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y로 치환될 수 있고; G-546은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; M-547은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-548은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y로 치환될 수 있고; G-549는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-550은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-551은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y로 치환될 수 있고; G-552는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; D-553은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-554는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-831은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; F-832는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; N-833은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-834는 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; I-835는 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-836은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; T-837은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; F-838은 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-839는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-840은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-841은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 Y로 치환될 수 있고; V-842는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y로 치환될 수 있고; I-843은 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-844는 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-845는 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-846은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y로 치환될 수 있고; G-847은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-848은 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; C-849는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-850은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; K-851은 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-885는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-886은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; C-887은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-888은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W 또는 Y로 치환될 수 있고; D-889는 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; H-890은 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-891은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; C-892는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-893은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; Q-894는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-895는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y로 치환될 수 있고; Q-896은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-897은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-898은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-899는 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-900은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y로 치환될 수 있고; S-901은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-902는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; C-903은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-904는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; 및/또는 K-905는 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있다.
또한, METH2에서 다음 아미노산을 하기의 아미노산으로 치환할 수 있다: L-14는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-15는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-16은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-17은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-18은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-19는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y로 치환될 수 있고; L-20은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-21은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-22는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-23은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-24는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-25는 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-26은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-27은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-28은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-29는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-30은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-31은 A, C,D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-32는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-33은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-34는 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-204는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-205는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-206은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-207은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-208은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; T-209는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-210은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-211은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; T-212는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; K-213은 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-214는 A, C, P, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; F-215는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; V-216은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-217은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-218은A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-219는 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-220은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; F-221은 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; V-222는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-223은 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; T-224는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-430은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-431은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-432는 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-433은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-434는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-435는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-436은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-437은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; T-438은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-439는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-440은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고;P-441은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-442는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-443은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; M-444는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-445는 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-446은 A, C, R, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; Y-447은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로 치환될 수 있고; Q-448은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-449는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; D-450은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-520은 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; R-521은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-522는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; K-523은 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-524는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; V-525는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y로 치환될 수 있고; V-526은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y로 치환될 수 있고; D-527은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될수 있고; G-528은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-529는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-530은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y로 치환될 수 있고; A-531은 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-532는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-533은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y로 치환될 수 있고; G-534는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-535는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-536은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 Y로 치환될 수 있고; G-537은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-538은 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; C-539는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-540은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; N-827은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; I-828은 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; I-829는 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; Q-830은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; P-831은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-832는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-833은 A, C, R, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; H-834는 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; A-835는 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; Q-836은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-837은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y로 치환될 수 있고; V-838은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y로 치환될 수 있고; L-839는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; G-840은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; D-841은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; W-842는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R5 S, T, V 또는 Y로 치환될 수 있고; S-843은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; E-844는 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; C-845는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; S-846은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있고; 및/또는 S-847은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로 치환될 수 있다.
치환, 결실 및/또는 첨가 변형체를 비롯하여 아미노산 치환을 포함하는METH1 또는 METH2 폴리펩티드 변형체에 대해, 본 명세서에 개시된 임의의 분석법, 예컨대 융모막 분석 또는 각막 포켓 분석으로 활성을 시험할 수 있다. 야생형 단백질의 모든 활성 및/또는 특성을 유지하거나; 또는 야생형 단백질과 비교하여 하나 이상의 증가된 활성 및/또는 특성을 보유하는 보존성 치환된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드가 바람직하다. 야생형 단백질의 활성 및/또는 특성이 결여되어 있지만 모든 다른 활성 및/또는 특성을 유지하거나; 야생형 단백질의 하나 이상의 활성이 결여된 비보존성 치환을 보유한 METH1 또는 METH2도 바람직하다.
예를 들어, 보존성 또는 비보존성 치환된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드에서 변경될 수 있는 METH1 또는 METH2의 활성 또는 특성의 비제한적인 예로는, 혈관형성 자극; 상피 세포 증식 자극; 항체 결합; 리간드 결합; 안정성; 용해성; 및/또는 정제에 영향을 주는 특성 등이 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 분리형으로 제공되는 것이 바람직하다. "분리된 폴리펩티드"란 자연 환경에서 제거된 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 재조합 숙주 세포 내에서 생성 및/또는 포함되는 폴리펩티드는 본 발명에 있어서 분리된 것으로 간주된다. 또한 재조합 숙주 세포 또는 천연원으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 폴리펩티드는 "분리된 폴리펩티드"로서 간주된다. 예를 들어, METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 재조합적으로 생성된 형태는 Smith 및 Johnson의 문헌[Gene, 67:31-40(1988)]에 개시된 1단계 방법으로 실질적으로 정제할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 리더를 포함하여 기탁된 cDNA가 암호화하는 METH1 폴리펩티드; 리더를 제외한 기탁된 cDNA가 암호화하는 성숙 METH1 폴리펩티드(즉,성숙 단백질); 서열 번호 2의 아미노산 약 1 내지 약 950를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 약 2 내지 약 950을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 약 29 내지 약 950을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 약 30 내지 약 950을 포함하는 폴리펩티드; METH1의 메탈로프로테아제 도메인인 서열 번호 2의 아미노산 235 내지 459를 포함하는 폴리펩티드; METH1의 디스인테그린(disintegrin) 도메인인 서열 번호 2의 아미노산 460 내지 544를 포함하는 폴리펩티드; METH1의 제1 TSP 유사 도메인, 서열 번호 2의 아미노산 545 내지 598을 포함하는 폴리펩티드; METH1의 제2 TSP 유사 도메인, 서열 번호 2의 아미노산 841 내지 894를 포함하는 폴리펩티드; METH1의 제3 TSP 유사 도메인, 서열 번호 2의 아미노산 895 내지 934를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 536 내지 613을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 아미노산 549 내지 563을 포함하는 폴리펩티드; 리더를 포함하여 기탁된 cDNA가 암호화하는 METH2 폴리펩티드; 리더를 제외한 기탁된 cDNA가 암호화하는 성숙 METH2 폴리펩티드(즉, 성숙 단백질); 서열 번호 4의 아미노산 약 1 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 약 2 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 약 24 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 약 112 내지 약 890을 포함하는 폴리펩티드; METH2의 메탈로프로테아제 도메인인 서열 번호 4의 아미노산 214 내지 439를 포함하는 폴리펩티드; METH2의 디스인테그린 도메인인 서열 번호 4의 아미노산 440 내지 529를 포함하는 폴리펩티드; METH2의 제1 TSP 유사 도메인, 서열 번호 4의 아미노산 530 내지 583을 포함하는 폴리펩티드; METH2의 제2TSP 유사 도메인, 서열 번호 4의 아미노산 837 내지 890을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 280 내지 606을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 아미노산 529 내지 548을 포함하는 폴리펩티드; 뿐 아니라 전술한 폴리펩티드와 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함하며, 30개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드의 일부도 포함한다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열과 예컨대 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 기준 아미노산 중 각 100개의 아미노산당 최대 5개의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 즉, 기준 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻기 위해서, 기준 서열 중 아미노산 잔기 중 5% 이하가 결실되거나 또는 다른 다미노산으로 치환될 수 있다. 또는 기준 서열 중 총 아미노산 잔기의 5% 이하의 많은 아미노산이 기준 서열에 첨가될 수 있다. 기준 서열의 이들 변경은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치, 또는 이들 말단 위치 사이의 어느 곳에서나 발생할 수 있으며, 기준 서열의 아미노산 잔기 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 연속 그룹의 잔기 사이에서 개별적으로 점재되어 있다.
실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩티드가, 예컨대 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%동일한 지 여부는, 베스트핏 프로그램(미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 시퀀스 어날리시스 패키지, 버젼 8)과 같은 기존의 컴퓨터 프로그램을 편리하게 사용하여 결정할 수 있다. 특정 서열이, 예컨대 본 발명의 기준 서열과 95% 동일한지를 결정하기 위해서 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용한 경우, 물론 기준 아미노산 서열의 전길이에 대해 동일성(%)을 계산하고 기준 서열 중 아미노산 잔기의 총수의 5% 이하의 상동성 차이가 허용되도록 파라미터를 설정한다.
의문 서열(본 발명의 서열)과 전역 서열 정렬로 불리우는 대상 서열 간의 최상의 전체 정합을 결정하는 바람직한 방법은, Brutlag 등[Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990)]의 알고리즘을 기초로 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 정렬에서, 의문 및 대상 서열은 모두 뉴클레오티드 서열이거나 또는 모두 아미노산 서열이다. 상기 전역 서열 정렬 결과는 동일성(%)이다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용된 바람직한 파라미터로는 행렬=PAM 0, k-튜플(tuple)=2, 부정합 벌점=1, 결합 벌점=20, 무작위화 그룹 길이=0, 컷오프 스코어=1, 갭 벌점=5, 갭 크기 벌점=0.05, 윈도우 크기=500 또는 대상 아미노산 서열 길이(어떤 것이나 더 짧은 것) 등이 있다.
내부 결실 때문이 아니라, N-말단 또는 C-말단 결실로 인하여 대상 서열이 의문 서열보다 짧은 경우, 결과에 대한 수동 보정을 실시해야 한다. 이는 FASTDB 프로그램이 전역 동일성(%)을 계산할 때 대상 서열의 N- 및 C-말단 절두를 설명할 수 없기 때문이다. N- 및 C-말단에서 절두된 대상 서열의 경우, 의문 서열과 비교하여, 동일성(%)은 상응하는 대상 잔기와 정합/정렬되지 않은 대상 서열의 N- 및 C-말단인 의문 서열의 잔기의 수를 의문 서열 중 총 잔기의 백분율로서 계산하여 보정한다. 잔기가 정합/정렬되는 지 여부는 FASTDB 서열 정렬 결과로서 결정한다. 그 다음 이 비율을 특정 파라미터를 사용하여 상기 FASTDB로 계산한 동일성(%)으로부터 제하여 최종 동일성(%) 스코어에 도달한다. 최종 동일성(%) 스코어가 본 발명에 사용된다. 동일성(%) 스코어를 수동 조정하기 위해서 의문 서열과 정합/정렬되지 않은 대상 서열의 N- 및 C-말단에 대한 잔기만이 고려된다. 즉, 대상 서열의 가장 원거리에 있는 N- 및 C-말단 잔기 외부의 의문 잔기 위치만을 고려한다.
예를 들어, 동일성(%)을 결정하기 위해서 90개의 아미노산 잔기 대상 서열은 100 개 잔기의 의문 서열과 정렬된다. 결실은 대상 서열의 N-말단에서 발생하므로, FASTDB 정렬은 N-말단에서의 처음 10개 잔기의 정합/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 않은 잔기는 서열의 10%를 나타내므로(정합되지 않은 N-말단 및 C-말단에서의 잔기 수/의문 서열의 총 수) 10%는 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성(%) 스코어에서 제해야 한다. 남아있는 90개의 잔기가 완전히 정합되면, 최종 동일성(%)은 90%이다. 또 다른 예로서 90개 잔기의 대상 서열을 100개 잔기의 의문 서열과 비교한다. 이 때 결실이 내부에 있고, 따라서 의문 서열과 정합/정렬되지 않은 대상 서열의 N- 또는 C-말단에서의 잔기는 없다. 이 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성(%)은 수동 보정하지 않는다. 다시 한번, 의문 서열과 정합/정렬되지 않은, FASTDB 정렬에 표시된 대상 서열의 N- 및 C- 말단 외부의 잔기 위치만이 수동 보정된다. 본 발명에 있어서, 다른 수동 보정은 없다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 SDS-PAGE 겔 또는 분자체 겔 여과 컬럼 상의 분자량 마커로서 유용하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프 보유 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드의 에피토프는 본 명세서에 개시된 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 전체 단백질이 면역원인 경우 항체 반응을 이끌어내는 단백질의 일부로서 정의된다. 한편, 항체가 결합하는 단백질 분자의 영역은 "항원성 에피토프"로서 정의된다. 단백질의 면역원 에피토프의 수는 일반적으로 항원성 에피토프의 수보다 작다. 예컨대, Geysen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002(1983) 참고.
항원성 에피토프를 보유하는(즉 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 함유하는) 펩티드 또는 폴리펩티드의 선택에 관하여, 단백질 서열의 일부를 모방하는 비교적 짧은 합성 펩티드는 대개 부분적으로 모방된 단백질과 반응하는 항혈청을 유발할 수 있다는 것이 알려져 있다. 예컨대 Sutcliffe, J.G. 등, "Antibodies that react with predetermined sites on proteins", Science 219:660-666(1983) 참조. 단백질 반응성 혈청을 유도할 수 있는 펩티드는 단백질의 1차 서열에 주로 제공되며, 간단한 화학적 규칙들로 특성 규명할 수 있고, 완전한 단백질의 면역우성 영역(즉, 면역원성 에피토프)에도, 아미노 또는 카르복시 말단에도 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 비롯한 항체들을 유발하는데유용하다. 예컨대 Wilson 등,Cell37:767-778(1984) at 777 참조.
본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열내에 포함된 바람직하게는 7개 이상, 더욱 바람직하게는 9개 이상, 가장 바람직하게는 약 15∼약 30개 아미노산을 포함한다.
본 발명의 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 임의의 종래 수단으로 제조할 수 있다. Houghten, R.A., "General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides; specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids",Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:5131-5135(1985). "동시 복수 펩티드 합성(SMPS)" 공정은 Houghten 등의 미국 특허 제4,631,211호(1986)에 추가로 개시되어 있다.
당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 전술한 본 발명의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드와 이의 에피토프 보유 단편을 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인의 일부와 혼합하여, 키메라 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이들 융합 단백질은 정제를 용이하게 하고, 증가된 생체내 반감기를 나타낸다. 예를 들어, 인간 CD4-폴리펩티드의 처음 2개의 도메인과 포유류 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변부의 각종 도메인으로 구성된 키메라 단백질의 경우, 이것이 확인되었다(EPA 394,827; Traunecker 등, Nature 331: 84-86(1988)). IgG 부분에 의한 이황화 결합된 이량체 구조를 보유한 융합 단백질은 단량체 METH1 또는 METH2 단백질 또는 단백질 단편 자체 보다 다른 분자와 결합하여 중화시키는데 더욱 효과적일 수 있다.
METH1 및 METH2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 단편
본 발명에서, "폴리뉴클레오티드 단편"은 기탁된 클론에 포함되거나 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 핵산 서열을 보유한 짧은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 짧은 뉴클레오티드 단편은 바람직하게는 약 15 nt 이상, 더욱 바람직하게는 약 20 nt 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 30 nt 이상, 더 더욱 바람직하게는 40 nt 이상의 길이이다. "20 nt 이상의 길이" 단편은, 예를 들어, 기탁된 클론에 포함된 cDNA 서열 또는 서열 번호 1이나 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열로부터 20개 이상의 연속 염기를 포함하는 것을 말한다. 이들 뉴클레오티드 단편은 본 명세서에 개시된 진단 프보르 및 프라이머로서 유용하다. 물론, 더 큰 단편(예, 50, 150, 500, 600, 2000 뉴클레오티드)가 바람직하다.
또한, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편의 대표적인 예로는, 기탁된 클론내에 포함된 cDNA, 또는 서열 번호 1이나 서열 번호 3의 대략적인 뉴클레오티드 번호 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 651-700, 701-750, 751-800, 800-850, 851-900, 901-950, 951-1000, 1001-1050, 1051-1100, 1101-1150, 1151-1200, 1201-1250, 1251-1300, 1301-1350, 1351-1400, 1401-1450, 1451-1500, 1501-1550, 1551-1600, 1601-1650, 1651-1700, 1701-1750, 1751-1800, 1801-1850, 1851-1900, 1901-1950, 1951-2000, 또는 2001 내지 말단의 서열을 보유한 단편들이 있다. 여기에서, "약"은 한쪽 말단 또는 양 말단에서 구체적으로 인용된 범위, 그 범위보다 수개(5, 4, 3, 2, 또는 1) 뉴클레오티드 많거나 작은 범위를 포함한다. 바람직하게는, 이들 단편은 생물학적 활성을 보유한 폴리펩티드를 암호화한다. 더욱 바람직하게는, 이들 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 논의된 바와 같이 프로브 또는 프라이머로서 사용할 수 있다.
본 발명에서, "폴리펩티드 단편"은 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 포함되거나 기탁된 클론내에 함유된 cDNA가 암호화하는 짧은 아미노산 서열을 의미한다. 단백질 단편은 "자립형(free-standing)"이거나, 또는 단편이 일부 또는 영역을 형성하는 더 큰 폴리펩티드내에 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 단일 연속 영역으로서 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 단편의 대표적인 예로는, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 대략 아미노산 번호 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100, 102-120, 121-140, 141-160, 161-180, 181-200, 201-220, 221-240, 241-260, 261-280, 또는 281 내지 암호 영역의 말단으로부터 유래한 단편들이 있다. 또한, 폴리펩티드 단편은 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 아미노산 길이일 수 있다. 여기서, "약"은 한쪽 극단 또는 양 극단에서 구체적으로 인용된 범위, 그 범위보다 수개(5, 4, 3, 2, 또는 1)의 뉴클레오티드 많거나 작은 범위를 포함한다.
바람직한 폴리펩티드 단편은 분비된 METH1 또는 METH2 단백질과 성숙형을 포함한다. 추가의 바람직한 폴리펩티드 단편은 아미노 또는 카르복시 말단 또는 양 말단으로부터 결실된 잔기의 연속물을 포함하는 분비된 METH1 또는 METH2 단백질 또는 성숙형을 포함한다. 예를 들어, 1-60 범위의 임의의 수의 아미노산이 분비된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 성숙형의 아미노 말단으로부터 결실될 수 있다. 유사하게, 1-30 범위의 임의의 수의 아미노산이 분비된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 성숙형의 카르복시 말단으로부터 결실될 수 있다. 또한, 상기 아미노 및 카르복시 말단 결실의 조합이 바람직하다. 유사하게, 이들 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편도 바람직하다.
특히, METH1 폴리펩티드의 N-말단 결실은 일반식 m-950으로 표시할 수 있는데, 여기서 m은 2 내지 949이고, m은 서열 번호 2에서 확인된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 서열 번호 2로 제시된 본 발명의 METH1 폴리펩티드의 N-말단 결실체는 다음과 같은 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드를 포함한다: 서열 번호 2의 G-2 내지 S-950; N-3 내지 S-950; A-4 내지 S-950; E-5 내지 S-950; R-6 내지 S-950; A-7 내지 S-950; P-8 내지 S-950; G-9 내지 S-950; S-10 내지 S-950; R-11 내지 S-950; S-12 내지 S-950; F-13 내지 S-950; G-14 내지 S; 950; P-15 내지 S-950; V-16 내지 S-950; P-17 내지 S-950; T-18 내지 S-950; L-19 내지 S-950; L-20 내지 S-950; L-21 내지 S-950; L-22 내지 S-950; A-23 내지 S-950; A-24 내지 S-950; A-25 내지 S-950; L-26 내지 S-950; L-27 내지 S-950; A-28 내지 S-950; V-29 내지 S-950; S-30 내지 S-950; D-31 내지 S-950; A-32 내지 S-950; L-33 내지 S-950; G-34 내지 S-950; R-35 내지 S-950; P-36 내지 S-950; S-37 내지 S-950; E-38 내지 S-950; E-39 내지 S-950; D-40 내지 S-950; E-41 내지 S-950; E-42 내지 S-950; L-43 내지 S-950; V-44 내지 S-950; V-45 내지 S-950; P-46 내지 S-950; E-47 내지 S-950; L-48 내지 S-950; E-49 내지 S-950; R-50 내지 S-950; A-51 내지 S-950; P-52 내지 S-950; G-53 내지 S-950; H-54 내지 S-950; G-55 내지 S-950; T-56 내지 S-950; T-57 내지 S-950; R-58 내지 S-950; L-59 내지 S-950; R-60 내지 S-950; L-61 내지 S-950; H-62 내지 S-950; A-63 내지 S-950; F-64 내지 S-950; D-65 내지 S-950; Q-66 내지 S-950; Q-67 내지 S-950; L-68 내지 S-950; D-69 내지 S-950; L-70 내지 S-950; E-71 내지 S-950; L-72 내지 S-950; R-73 내지 S-950; P-74 내지 S-950; D-75 내지 S-950; S-76 내지 S-950; S-77 내지 S-950; F-78 내지 S-950; L-79 내지 S-950; A-80 내지 S-950; P-81 내지 S-950; G-82 내지 S-950; F-83 내지 S-950; T-84 내지 S-950; L-85 내지 S-950; Q-86 내지 S-950; N-87 내지 S-950; V-88 내지 S-950; G-89 내지 S-950; R-90 내지 S-950; K-91 내지 S-950; S-92 내지 S-950; G-93 내지 S-950; S-94 내지 S-950; E-95 내지 S-950; T-96 내지 S-950; P-97 내지 S-950; L-98 내지 S-950; P-99 내지 S-950; E-100 내지 S-950; T-101 내지 S-950; D-102 내지 S-950; L-103 내지 S-950; A-104 내지 S-950; H-105 내지 S-950; C-106 내지 S-950; F-107 내지 S-950; Y-108 내지 S-950; S-109 내지 S-950; G-110 내지 S-950; T-111 내지 S-950; V-112 내지 S-950; N-113 내지 S-950; G-114 내지 S-950; D-115 내지 S-950; P-116 내지 S-950; S-117 내지 S-950; S-118 내지 S-950; A-119 내지 S-950; A-120 내지 S-950; A-121 내지 S-950; L-122 내지 S-950; S-123 내지 S-950; L-124 내지 S-950; C-125 내지 S-950; E-126 내지 S-950; G-127 내지 S-950; V-128 내지 S-950; R-129 내지 S-950; G-130 내지 S-950; A-131 내지 S-950; F-132 내지 S-950; Y-133 내지 S-950; L-134 내지 S-950; L-135 내지 S-950; G-136 내지 S-950; E-137 내지 S-950; A-138 내지 S-950; Y-139 내지 S-950; F-140 내지 S-950; I-141 내지 S-950; Q-142 내지 S-950; P-143 내지 S-950; L-144 내지 S-950; P-145 내지 S-950; A-146 내지 S-950; A-147 내지 S-950; S-148 내지 S-950; E-149 내지 S-950; R-150 내지 S-950; L-151 내지 S-950; A-152 내지 S-950; T-153 내지 S-950; A-154 내지 S-950; A-155 내지 S-950; P-156 내지 S-950; G-157 내지 S-950; E-158 내지 S-950; K-159 내지 S-950; P-160 내지 S-950; P-161 내지 S-950; A-162 내지 S-950; P-163 내지 S-950; L-164 내지 S-950; Q-165 내지 S-950; F-166 내지 S-950; H-167 내지 S-950; L-168 내지 S-950; L-169 내지 S-950; R-170 내지 S-950; R-171 내지 S-950; N-172 내지 S-950; R-173 내지 S-950; Q-174 내지 S-950; G-175 내지 S-950; D-176 내지 S-950; V-177 내지 S-950; G-178 내지 S-950; G-179 내지 S-950; T-180 내지 S-950; C-181 내지 S-950; G-182 내지 S-950; V-183 내지 S-950; V-184 내지 S-950; D-185 내지 S-950; D-186 내지 S-950; E-187 내지 S-950; P-188 내지 S-950; R-189 내지 S-950; P-190 내지 S-950; T-191 내지 S-950; G-192 내지 S-950; K-193 내지 S-950; A-194 내지 S-950; E-195 내지 S-950; T-196 내지 S-950; E-197 내지 S-950; D-198 내지 S-950; E-199 내지 S-950; D-200 내지 S-950; E-201 내지 S-950; G-202 내지 S-950; T-203 내지 S-950; E-204 내지 S-950; G-205 내지 S-950; E-206 내지 S-950; D-207 내지 S-950; E-208 내지 S-950; G-209 내지 S-950; P-210 내지 S-950; Q-211 내지 S-950; W-212 내지 S-950; S-213 내지 S-950; P-214 내지 S-950; Q-215 내지 S-950; D-216 내지 S-950; P-217 내지 S-950; A-218 내지 S-950; L-219 내지 S-950; Q-220 내지 S-950; G-221 내지 S-950; V-222 내지 S-950; G-223 내지 S-950; Q-224 내지 S-950; P-225 내지 S-950; T-226 내지 S-950; G-227 내지 S-950; T-228 내지 S-950; G-229 내지 S-950; S-230 내지 S-950; I-231 내지 S-950; R-232 내지 S-950; K-233 내지 S-950; K-234 내지 S-950; R-235 내지 S-950; F-236 내지 S-950; V-237 내지 S-950; S-238 내지 S-950; S-239 내지 S-950; H-240 내지 S-950; R-241 내지 S-950; Y-242 내지 S-950; V-243 내지 S-950; E-244 내지 S-950; T-245 내지 S-950; M-246 내지 S-950; L-247 내지 S-950; V-248 내지 S-950; 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Y-564 내지 S-950; T-565 내지 S-950; M-566 내지 S-950; R-567 내지 S-950; E-568 내지 S-950; C-569 내지 S-950; D-570 내지 S-950; N-571 내지 S-950; P-572 내지 S-950; V-573 내지 S-950; P-574 내지 S-950; K-575 내지 S-950; N-576 내지 S-950; G-577 내지 S-950; G-578 내지 S-950; K-579 내지 S-950; Y-580 내지 S-950; C-581 내지 S-950; E-582 내지 S-950; G-583 내지 S-950; K-584 내지 S-950; R-585 내지 S-950; V-586 내지 S-950; R-587 내지 S-950; Y-588 내지 S-950; R-589 내지 S-950; S-590 내지 S-950; C-591 내지 S-950; N-592 내지 S-950; L-593 내지 S-950; E-594 내지 S-950; D-595 내지 S-950; C-596 내지 S-950; P-597 내지 S-950; D-598 내지 S-950; N-599 내지 S-950; N-600 내지 S-950; G-601 내지 S-950; K-602 내지 S-950; T-603 내지 S-950; F-604 내지 S-950; R-605 내지 S-950; E-606 내지 S-950; E-607 내지 S-950; Q-608 내지 S-950; C-609 내지 S-950; E-610 내지 S-950; A-611 내지 S-950; H-612 내지 S-950; N-613 내지 S-950; E-614 내지 S-950; F-615 내지 S-950; S-616 내지 S-950; K-617 내지 S-950; A-618 내지 S-950; S-619 내지 S-950; F-620 내지 S-950; G-621 내지 S-950; S-622 내지 S-950; G-623 내지 S-950; P-624 내지 S-950; A-625 내지 S-950; V-626 내지 S-950; 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I-753 내지 S-950; K-754 내지 S-950; A-755 내지 S-950; A-756 내지 S-950; D-757 내지 S-950; G-758 내지 S-950; T-759 내지 S-950; Y-760 내지 S-950; I-761 내지 S-950; L-762 내지 S-950; N-763 내지 S-950; G-764 내지 S-950; D-765 내지 S-950; Y-766 내지 S-950; T-767 내지 S-950; L-768 내지 S-950; S-769 내지 S-950; T-770 내지 S-950; L-771 내지 S-950; E-772 내지 S-950; Q-773 내지 S-950; D-774 내지 S-950; I-775 내지 S-950; M-776 내지 S-950; Y-777 내지 S-950; K-778 내지 S-950; G-779 내지 S-950; V-780 내지 S-950; V-781 내지 S-950; L-782 내지 S-950; R-783 내지 S-950; Y-784 내지 S-950; S-785 내지 S-950; G-786 내지 S-950; S-787 내지 S-950; S-788 내지 S-950; A-789 내지 S-950; A-790 내지 S-950; L-791 내지 S-950; E-792 내지 S-950; R-793 내지 S-950; I-794 내지 S-950; R-795 내지 S-950; S-796 내지 S-950; F-797 내지 S-950; S-798 내지 S-950; P-799 내지 S-950; L-800 내지 S-950; K-801 내지 S-950; E-802 내지 S-950; P-803 내지 S-950; L-804 내지 S-950; T-805 내지 S-950; I-806 내지 S-950; Q-807 내지 S-950; V-808 내지 S-950; L-809 내지 S-950; T-810 내지 S-950; V-811 내지 S-950; G-812 내지 S-950; N-813 내지 S-950; A-814 내지 S-950; L-815 내지 S-950; R-816 내지 S-950; P-817 내지 S-950; K-818 내지 S-950; I-819 내지 S-950; K-820 내지 S-950; Y-821 내지 S-950; T-822 내지 S-950; Y-823 내지 S-950; F-824 내지 S-950; V-825 내지 S-950; K-826 내지 S-950; K-827내지 S-950; K-828 내지 S-950; K-829 내지 S-950; E-830 내지 S-950; S-831 내지 S-950; F-832 내지 S-950; N-833 내지 S-950; A-834 내지 S-950; I-835 내지 S-950; P-836 내지 S-950; T-837 내지 S-950; F-838 내지 S-950; S-839 내지 S-950; A-840 내지 S-950; W-841 내지 S-950; V-842 내지 S-950; I-843 내지 S-950; E-844 내지 S-950; E-845 내지 S-950; W-846 내지 S-950; G-847 내지 S-950; E-848 내지 S-950; C-849 내지 S-950; S-850 내지 S-950; K-851 내지 S-950; S-852 내지 S-950; C-853 내지 S-950; E-854 내지 S-950; L-855 내지 S-950; G-856 내지 S-950; W-857 내지 S-950; Q-858 내지 S-950; R-859 내지 S-950; R-860 내지 S-950; L-861 내지 S-950; V-862 내지 S-950; E-863 내지 S-950; C-864 내지 S-950; R-865 내지 S-950; D-866 내지 S-950; I-867 내지 S-950; N-868 내지 S-950; G-869 내지 S-950; Q-870 내지 S-950; P-871 내지 S-950; A-872 내지 S-950; S-873 내지 S-950; E-874 내지 S-950; C-875 내지 S-950; A-876 내지 S-950; K-877 내지 S-950; E-878 내지 S-950; V-879 내지 S-950; K-880 내지 S-950; P-881 내지 S-950; A-882 내지 S-950; S-883 내지 S-950; T-884 내지 S-950; R-885 내지 S-950; P-886 내지 S-950; C-887 내지 S-950; A-888 내지 S-950; D-889 내지 S-950; H-890 내지 S-950; P-891 내지 S-950; C-892 내지 S-950; P-893 내지 S-950; Q-894 내지 S-950; W-895 내지 S-950; Q-896 내지 S-950; L-897 내지 S-950; G-898 내지 S-950; E-899 내지 S-950; W-900 내지 S-950; S-901 내지 S-950; S-902 내지 S-950; C-903 내지 S-950; S-904 내지 S-950; K-905 내지 S-950; T-906 내지 S-950; C-907 내지 S-950; G-908 내지 S-950; K-909 내지 S-950; G-910 내지 S-950; Y-911 내지 S-950; K-912내지 S-950; K-913 내지 S-950; R-914 내지 S-950; S-915 내지 S-950; L-916 내지 S-950; K-917 내지 S-950; C-918 내지 S-950; L-919 내지 S-950; S-920 내지 S-950; H-921 내지 S-950; D-922 내지 S-950; G-923 내지 S-950; G-924 내지 S-950; V-925 내지 S-950; L-926 내지 S-950; S-927 내지 S-950; H-928 내지 S-950; E-929 내지 S-950; S-930 내지 S-950; C-931 내지 S-950; D-932 내지 S-950; P-933 내지 S-950; L-934 내지 S-950; K-935 내지 S-950; K-936 내지 S-950; P-937 내지 S-950; K-938 내지 S-950; H-939 내지 S-950; F-940 내지 S-950; I-941 내지 S-950; D-942 내지 S-950; F-943 내지 S-950; C-944 내지 S-950; T-945 내지 S-950.
또한, METH1 폴리펩티드의 C-말단 결실은 일반식 1-n1로 표시할 수 있는데, 여기서, n1은 2 내지 950의 정수이고, n은 서열 번호 2에서 확인된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 바람직하게는, 서열 번호 2로 제시된 본 발명의 METH1 폴리펩티드의 C-말단 결실체는 다음 잔기의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다: 서열 번호 2의 M-1 내지 C-949; M-1 내지 E-948; M-1 내지 A-947; M-1 내지 M-946; M-1 내지 T-945; M-1 내지 C-944; M-1 내지 F-943; M-1 내지 D-942; M-1 내지 I-941; M-1 내지 F-940; M-1 내지 H-939; M-1 내지 K-938; M-1 내지 P-937; M-1 내지 K-936; M-1 내지 K-935; M-1 내지 L-934; M-1 내지 P-933; M-1 내지 D-932; M-1 내지 C-931; M-1 내지 S-930; M-1 내지 E-929; M-1 내지 H-928; M-1 내지 S-927; M-1 내지 L-926; M-1 내지 V-925; M-1 내지 G-924; M-1 내지 G-923; M-1 내지 D-922; M-1 내지 H-921; M-1 내지 S-920; M-1 내지 L-919; M-1 내지 C-918; M-1 내지K-917; M-1 내지 L-916; M-1 내지 S-915; M-1 내지 R-914; M-1 내지 K-913; M-1 내지 K-912; M-1 내지 Y-911; M-1 내지 G-910; M-1 내지 K-909; M-1 내지 G-908; M-1 내지 C-907; M-1 내지 T-906; M-1 내지 K-905; M-1 내지 S-904; M-1 내지 C-903; M-1 내지 S-902; M-1 내지 S-901; M-1 내지 W-900; M-1 내지 E-899; M-1 내지 G-898; M-1 내지 L-897; M-1 내지 Q-896; M-1 내지 W-895; M-1 내지 Q-894; M-1 내지 P-893; M-1 내지 C-892; M-1 내지 P-891; M-1 내지 H-890; M-1 내지 D-889; M-1 내지 A-888; M-1 내지 C-887; M-1 내지 P-886; M-1 내지 R-885; M-1 내지 T-884; M-1 내지 S-883; M-1 내지 A-882; M-1 내지 P-881; M-1 내지 K-880; M-1 내지 V-879; M-1 내지 E-878; M-1 내지 K-877; M-1 내지 A-876; M-1 내지 C-875; M-1 내지 E-874; M-1 내지 S-873; M-1 내지 A-872; M-1 내지 P-871; M-1 내지 Q-870; M-1 내지 G-869; M-1 내지 N-868; M-1 내지 L867; M-1 내지 D-866; M-1 내지 R-865; M-1 내지 C-864; M-1 내지 E-863; M-1 내지 V-862; M-1 내지 L-861; M-1 내지 R-860; M-1 내지 R-859; M-1 내지 Q-858; M-1 내지 W-857; M-1 내지 G-856; M-1 내지 L-855; M-1 내지 E-854; M-1 내지 C-853; M-1 내지 S-852; M-1 내지 K-851; M-1 내지 S-850; M-1 내지 C-849; M-1 내지 E-848; M-1 내지 G-847; M-1 내지 W-846; M-1 내지 E-845; M-1 내지 E-844; M-1 내지 I-843; M-1 내지 V-842; M-1 내지 W-841; M-1 내지 A-840; M-1 내지 S-839; M-1 내지 F-838; M-1 내지 T-837; M-1 내지 P-836; M-1 내지 I-835; M-1 내지 A-834; M-1 내지 N-833; M-1 내지 F-832; M-1 내지 S-831; M-1 내지 E-830; M-1 내지 K-829; M-1 내지 K-828; M-1 내지 K-827; M-1 내지 K-826; M-1 내지 V-825; M-1 내지 F-824; M-1 내지 Y-823; M-1 내지 T-822; M-1 내지Y-821; M-1 내지 K-820; M-1 내지 I-819; M-1 내지 K-818; M-1 내지 P-817; M-1 내지 R-816; M-1 내지 L-815; M-1 내지 A-814; M-1 내지 N-813; M-1 내지 G-812; M-1 내지 V-811; M-1 내지 T-810; M-1 내지 L-809; M-1 내지 V-808; M-1 내지 Q-807; M-1 내지 I-806; M-1 내지 T-805; M-1 내지 L-804; M-1 내지 P-803; M-1 내지 E-802; M-1 내지 K-801; M-1 내지 L-800; M-1 내지 P-799; M-1 내지 S-798; M-1 내지 F-797; M-1 내지 S-796; M-1 내지 R-795; M-1 내지 I-794; M-1 내지 R-793; M-1 내지 E-792; M-1 내지 L-791; M-1 내지 A-790; M-1 내지 A-789; M-1 내지 S-788; M-1 내지 S-787; M-1 내지 G-786; M-1 내지 S-785; M-1 내지 Y-784; M-1 내지 R-783; M-1 내지 L-782; M-1 내지 V-781; M-1 내지 V-780; M-1 내지 G-779; M-1 내지 K-778; M-1 내지 Y-777; M-1 내지 M-776; M-1 내지 I-775; M-1 내지 D-774; M-1 내지 Q-773; M-1 내지 E-772; M-1 내지 L-771; M-1 내지 T-770; M-1 내지 S-769; M-1 내지 L-768; M-1 내지 T-767; M-1 내지 Y-766; M-1 내지 D-765; M-1 내지 G-764; M-1 내지 N-763; M-1 내지 L-762; M-1 내지 I-761; M-1 내지 Y-760; M-1 내지 T-759; M-1 내지 G-758; M-1 내지 D-757; M-1 내지 A-756; M-1 내지 A-755; M-1 내지 K-754; M-1 내지 I-753; M-1 내지 A-752; M-1 내지 L-751; M-1 내지 F-750; M-1 내지 S-749; M-1 내지 G-748; M-1 내지 N-747; M-1 내지 N-746; M-1 내지 R-745; M-1 내지 S-744; M-1 내지 G-743; M-1 내지 R-742; M-1 내지 Q-741; M-1 내지 N-740; M-1 내지 R-739; M-1 내지 Q-738; M-1 내지 K-737; M-1 내지 V-736; M-1 내지 E-735; M-1 내지 I-734; M-1 내지 N-733; M-1 내지 T-732; M-1 내지 A-731; M-1 내지 G-730; M-1 내지 T-729; M-1 내지 P-728; M-1 내지 I-727; M-1 내지 T-726; M-1 내지I-725; M-1 내지 I-724; M-1 내지 D-723; M-1 내지 H-722; M-1 내지 Y-721; M-1 내지 G-720; M-1 내지 P-719; M-1 내지 K-718; M-1 내지 A-717; M-1 내지 S-716; M-1 내지 T-715; M-1 내지 V-714; M-1 내지 S-713; M-1 내지 G-712; M-1 내지 S-711; M-1 내지 I-710; M-1 내지 K-709; M-1 내지 K-708; M-1 내지 C-707; M-1 내지 T-706; M-1 내지 S-705; M-1 내지 G-704; M-1 내지 N-703; M-1 내지 G-702; M-1 내지 G-701; M-1 내지 C-700; M-1 내지 V-699; M-1 내지 G-698; M-1 내지 C-697; M-1 내지 K-696; M-1 내지 D-695; M-1 내지 F-694; M-1 내지 K-693; M-1 내지 K-692; M-1 내지 K-691; M-1 내지 S-690; M-1 내지 D-689; M-1 내지 I-688; M-1 내지 I-687; M-1 내지 R-686; M-1 내지 D-685; M-1 내지 C-684; M-1 내지 G-683; M-1 내지 A-682; M-1 내지 K-681; M-1 내지 V-680; M-1 내지 C-679; M-1 내지 Q-678; M-1 내지 G-677; M-1 내지 Q-676; M-1 내지 V-675; M-1 내지 C-674; M-1 내지 V-673; M-1 내지 S-672; M-1 내지 T-671; M-1 내지 S-670; M-1 내지 D-669; M-1 내지 P-668; M-1 내지 S-667; M-1 내지 C-666; M-1 내지 P-665; M-1 내지 T-664; M-1 내지 G-663; M-1 t0 D-662; M-1 내지 V-661; M-1 내지 V-660; M-1 내지 K-659; M-1 내지 P-658; M-1 내지 Q-657; M-1 내지 L-656; M-1 내지 V-655; M-1 내지 F-654; M-1 내지 F-653; M-1 내지 Y-652; M-1 내지 G-651; M-1 내지 I-650; M-1 내지 G-649; M-1 내지 K-648; M-1 내지 A-647; M-1 내지 Q-646; M-1 내지 C-645; M-1 내지 I-644; M-1 내지 L-643; M-1 내지 K-642; M-1 내지 C-641; M-1 내지 R-640; M-1 내지 D-639; M-1 내지 K-638; M-1 내지 P-637; M-1 내지 S-636; M-1 내지 V-635; M-1 내지 G-634; M-1 내지 A-633; M-1 내지 Y-632; M-1 내지 K-631; M-1 내지 P-630; M-1 내지 I-629; M-1 내지 W-628; M-1 내지 E-627; M-1 내지 V-626; M-1 내지 A-625; M-1 내지 P-624; M-1 내지 G-623; M-1 내지 S-622; M-1 내지 G-621; M-1 내지 F-620; M-1 내지 S-619; M-1 내지 A-618; M-1 내지 K-617; M-1 내지 S-616; M-1 내지 F-615; M-1 내지 E-614; M-1 내지 N-613; M-1 내지 H-612; M-1 내지 A-611; M-1 내지 E-610; M-1 내지 C-609; M-1 내지 Q-608; M-1 내지 E-607; M-1 내지 E-606; M-1 내지 R-605; M-1 내지 F-604; M-1 내지 T-603; M-1 내지 K-602; M-1 내지 G-601; M-1 내지 N-600; M-1 내지 N-599; M-1 내지 D-598; M-1 내지 P-597; M-1 내지 C-596; M-1 내지 D-595; M-1 내지 E-594; M-1 내지 L-593; M-1 내지 N-592; M-1 내지 C-591; M-1 내지 S-590; M-1 내지 R-589; M-1 내지 Y-588; M-1 내지 R-587; M-1 내지 V-586; M-1 내지 R-585; M-1 내지 K-584; M-1 내지 G-583; M-1 내지 E-582; M-1 내지 C-581; M-1 내지 Y-580; M-1 내지 K-579; M-1 내지 G-578; M-1 내지 G-577; M-1 내지 N-576; M-1 내지 K-575; M-1 내지 P-574; M-1 내지 V-573; M-1 내지 P-572; M-1 내지 N-571; M-1 내지 D-570; M-1 내지 C-569; M-1 내지 E-568; M-1 내지 R-567; M-1 내지 M-566; M-1 내지 T-565; M-1 내지 Y-564; M-1 내지 Q-563; M-1 내지 V-562; M-1 내지 G-561; M-1 내지 G-560; M-1 내지 G-559; M-1 내지 C-558; M-1 내지 T-557; M-1 내지 R-556; M-1 내지 S-555; M-1 내지 C-554; M-1 내지 D-553; M-1 내지 G-552; M-1 내지 W-551; M-1 내지 P-550; M-1 내지 G-549; M-1 내지 W-548; M-1 내지 M-547; M-1 내지 G-546; M-1 내지 W-545; M-1 내지 S-544; M-1 내지 G-543; M-1 내지 H-542; M-1 내지 F-541; M-1 내지 P-540; M-1 내지 T-539; M-1 내지 D-538; M-1 내지 F-537; M-1 내지 H-536; M-1 내지 K-535; M-1 내지 R-534; M-1 내지 D-533; M-1 내지 T-532; M-1 내지 K-531; M-1 내지 N-530; M-1 내지 V-529; M-1 내지 C-528; M-1 내지 K-527; M-1 내지 G-526; M-1 내지 N-525; M-1 내지 I-524; M-1 내지 C-523; M-1 내지 W-522; M-1 내지 K-521; M-1 내지 G-520; M-1 내지 E-519; M-1 내지 G-518; M-1 내지 C-517; M-1 내지 S-516; M-1 내지 T-515; M-1 내지 G-514; M-1 내지 D-513; M-1 내지 A-512; M-1 내지 W-511; M-1 내지 P-510; M-1 내지 F-509; M-1 내지 H-508; M-1 내지 K-507; M-1 내지 T-506; M-1 내지 Q-505; M-1 내지 C-504; M-1 내지 V-503; M-1 내지 L-502; M-1 내지 V-501; M-1 내지 G-500; M-1 내지 G-499; M-1 내지 S-498; M-1 내지 T-497; M-1 내지 G-496; M-1 내지 T-495; M-1 내지 C-494; M-1 내지 W-493; M-1 내지 L-492; M-1 내지 T-491; M-1 내지 S-490; M-1 내지 C-489; M-1 내지 T-488; M-1 내지 S-487; M-1 내지 A-486; M-1 내지 A-485; M-1 내지 D-484; M-1 내지 P-483; M-1 내지 C-482; M-1 내지 H-481; M-1 내지 K-480; M-1 내지 S-479; M-1 내지 D-478; M-1 내지 E-477; M-1 내지 G-476; M-1 내지 F-475; M-1 내지 T-474; M-1 내지 F-473; M-1 내지 Q-472; M-1 내지 C-471; M-1 내지 Q-470; M-1 내지 R-469; M-1 내지 N-468; M-1 내지 A-467; M-1 내지 D-466; M-1 내지 Y-465; M-1 내지 S-464; M-1 내지 T-463; M-1 내지 G-462; M-1 내지 P-461; M-1 내지 L-460; M-1 내지 D-459; M-1 내지 G-458; M-1 내지 P-457; M-1 내지 L-456; M-1 내지 Q-455; M-1 내지 I-454; M-1 내지 P-453; M-1 내지 N-452; M-1 내지 Q-451; M-1 내지 P-450; M-1 내지 K-449; M-1 내지 D-448; M-1 내지 M-447; M-1 내지 L-446; M-1 내지 C-445; M-1 내지 E-444; M-1 내지 G-443; M-1 내지 H-442; M-1 내지 G-441; M-1 내지 N-440; M-1 내지 D-439; M-1 내지 L-438; M-1 내지 F-437; M-1 내지 S-436; M-1 내지 T-435; M-1 내지 I-434; M-1 내지 M-433; M-1 내지 Y432; M-1 내지 A-431; M-1 내지 S-430; M-1 내지 C-429; M-1 내지 P-428; M-1 내지 S-427; M-1 내지 W-426; M-1 내지 P-425; M-1 내지 Q-424; M-1 내지 S-423; M-1 내지 H-422; M-1 내지 D-421; M-1 내지 L-420; M-1 내지 N-419; M-1 내지 S-418; M-1 내지 L-417; M-1 내지 M-416; M-1 내지 S-415; M-1 내지 A-414; M-1 내지 M-413; M-1 내지 M-412; M-1 내지 H-411; M-1 내지 S-410; M-1 내지 D-409; M-1 내지 Q-408; M-1 내지 N-407; M-1 내지 V-406; M-1 내지 G-405; M-1 내지 N-404; M-1 내지 L-403; M-1 내지 S-402; M-1 내지 A-401; M-1 내지 C-400; M-1 내지 Q-399; M-1 내지 K-398; M-1 내지 A-397; M-1 내지 D-396; M-1 내지 D-395; M-1 내지 H-394; M-1 내지 P-393; M-1 내지 M-392; M-1 내지 N-391; M-1 내지 F-390; M-1 내지 V-389; M-1 내지 H-388; M-1 내지 G-387; M-1 내지 L-386; M-1 내지 E-385; M-1 내지 H-384; M-1 내지 A-383; M-1 내지 T-382; M-1 내지 T-381; M-1 내지 F-380; M-1 내지 A-379; M-1 내지 A-378; M-1 내지 Q-377; M-1 내지 L-376; M-1 내지 G-375; M-1 내지 D-374; M-1 내지 D-373; M-1 내지 E-372; M-1 내지 I-371; M-1 내지 V-370; M-1 내지 S-369; M-1 내지 C-368; M-1 내지 S-367; M-1 내지 R-366; M-1 내지 S-365; M-1 내지 P-364; M-1 내지 D-363; M-1 내지 C-362; M-1 내지 V-361; M-1 내지 T-360; M-1 내지 G-359; M-1 내지 V-358; M-1 내지 D-357; M-1 내지 A-356; M-1 내지 M-355; M-1 내지 G-354; M-1 내지 L-353; M-1 내지 T-352; M-1 내지 D-351; M-1 내지 C-350; M-1 내지 T-349; M-1 내지 Q-348; M-1 내지 S-347; M-1 내지 G-346; M-1 내지 C-345; M-1 내지 L-344; M-1 내지 D-343; M-1 내지 Q-342; M-1 내지 R-341; M-1 내지 T-340; M-1 내지 F-339; M-1 내지 L-338; M-1 내지 I-337; M-1 내지 A-336; M-1 내지 T-335; M-1 내지 D-334; M-1 내지 Y-333; M-1 내지 H-332; M-1 내지 E-331; M-1 내지 A-330; M-1 내지 D-329; M-1 내지 R-328; M-1 내지 D-327; M-1 내지 S-326; M-1 내지 P-325; M-1 내지 P-324; M-1 내지 N-323; M-1 내지 H-322; M-1 내지 Q-321; M-1 내지 K-320; M-1 내지 Q-319; M-1 내지 W-318; M-1 내지 N-317; M-1 내지 C-316; M-1 내지 F-315; M-1 내지 N-314; M-1 내지 R-313; M-1 내지 L-312; M-1 내지 T-311; M-1 내지 L-310; M-1 내지 A-309; M-1 내지 A-308; M-1 내지 N-307; M-1 내지 S-306; M-1 내지 T-305; M-1 내지 V-304; M-1 내지 E-303; M-1 내지 P-302; M-1 내지 G-301; M-1 내지 K-300; M-1 내지 Q-299; M-1 내지 E-298; M-1 내지 D-297; M-1 내지 H-296; M-1 내지 I-295; M-1 내지 V-294; M-1 내지 L-293; M-1 내지 I-292; M-1 내지 K-291; M-1 내지 V-290; M-1 내지 V-289; M-1 내지 V-288; M-1 내지 L-287; M-1 내지 S-286; M-1 내지 V-285; M-1 내지 S-284; M-1 내지 N-283; M-1 내지 R-282; M-1 내지 I-281; M-1 내지 S-280; M-1 내지 P-279; M-1 내지 H-278; M-1 내지 K-277; M-1 내지 Y-276; M-1 내지 L-275; M-1 내지 R-274; M-1 내지 A-273; M-1 내지 A-272; M-1 내지 V-271; M-1 내지 S-270; M-1 내지 F-269; M-1 내지 L-268; M-1 내지 T-267; M-1 내지 L-266; M-1 내지 L-265; M-1 내지 Y-264; M-1 내지 H-263; M-1 내지 K-262; M-1 내지 L-261; M-1 내지 G-260; M-1 내지 S-259; M-1 내지 G-258; M-1 내지 H-257; M-1 내지 F-256; M-1 내지 E-255; M-1 내지 A-254; M-1 내지 M-253; M-1 내지 S-252; M-1 내지 Q-251; M-1 내지 D-250; M-1 내지 A-249; M-1 내지 V-248; M-1 내지 L-247; M-1 내지 M-246; M-1 내지 T-245; M-1 내지 E-244; M-1 내지 V-243; M-1 내지 Y-242; M-1 내지 R-241; M-1 내지 H-240; M-1 내지 S-239; M-1 내지 S-238; M-1 내지 V-237; M-1 내지 F-236; M-1 내지 R-235; M-1 내지 K-234; M-1 내지 K-233; M-1 내지 R-232; M-1 내지 I-231; M-1 내지 S-230; M-1 내지 G-229; M-1 내지 T-228; M-1 내지 G-227; M-1 내지 T-226; M-1 내지 P-225; M-1 내지 Q-224; M-1 내지 G-223; M-1 내지 V-222; M-1 내지 G-221; M-1 내지 Q-220; M-1 내지 L-219; M-1 내지 A-218; M-1 내지 P-217; M-1 내지 D-216; M-1 내지 Q-215; M-1 내지 P-214; M-1 내지 S-213; M-1 내지 W-212; M-1 내지 Q-211; M-1 내지 P-210; M-1 내지 G-209; M-1 내지 E-208; M-1 내지 D-207; M-1 내지 E-206; M-1 내지 G-205; M-1 내지 E-204; M-1 내지 T-203; M-1 내지 G-202; M-1 내지 E-201; M-1 내지 D-200; M-1 내지 E-199; M-1 내지 D-198; M-1 내지 E-197; M-1 내지 T-196; M-1 내지 E-195; M-1 내지 A-194; M-1 내지 K-193; M-1 내지 G-192; M-1 내지 T-191; M-1 내지 P-190; M-1 내지 R-189; M-1 내지 P-188; M-1 내지 E-187; M-1 내지 D-186; M-1 내지 D-185; M-1 내지 V-184; M-1 내지 V-183; M-1 내지 G-182; M-1 내지 C-181; M-1 내지 T-180; M-1 내지 G-179; M-1 내지 G-178; M-1 내지 V-177; M-1 내지 D-176; M-1 내지 G-175; M-1 내지 Q-174; M-1 내지 R-173; M-1 내지 N-172; M-1 내지 R-171; M-1 내지 R-170; M-1 내지 L-169; M-1 내지 L-168; M-1 내지 H-167; M-1 내지 F-166; M-1 내지 Q-165; M-1 내지 L-164; M-1 내지 P-163; M-1 내지 A-162; M-1 내지 P-161; M-1 내지 P-160; M-1 내지 K-159; M-1 내지 E-158; M-1 내지 G-157; M-1 내지 P-156; M-1 내지 A-155; M-1 내지 A-154; M-1 내지 T-153; M-1 내지 A-152; M-1 내지 L-151; M-1 내지 R-150; M-1 내지 E-149; M-1 내지 S-148; M-1 내지 A-147; M-1 내지 A-146; M-1 내지 P-145; M-1 내지 L-144; M-1 내지 P-143; M-1 내지 Q-142; M-1 내지 I-141; M-1 내지 F-140; M-1 내지 Y-139; M-1 내지 A-138; M-1 내지 E-137; M-1 내지 G-136; M-1 내지 L-135; M-1 내지 L-134; M-1 내지 Y-133; M-1 내지 F-132; M-1 내지 A-131; M-1 내지 G-130; M-1 내지 R-129; M-1 내지 V-128; M-1 내지 G-127; M-1 내지 E-126; M-1 내지 C-125; M-1 내지 L-124; M-1 내지 S-123; M-1 내지 L-122; M-1 내지 A-121; M-1 내지 A-120; M-1 내지 A-119; M-1 내지 S-118; M-1 내지 S-117; M-1 내지 P-116; M-1 내지 D-115; M-1 내지 G-114; M-1 내지 N-113; M-1 내지 V-112; M-1 내지 T-111; M-1 내지 G-110; M-1 내지 S-109; M-1 내지 Y-108; M-1 내지 F-107; M-1 내지 C-106; M-1 내지 H-105; M-1 내지 A-104; M-1 내지 L-103; M-1 내지 D-102; M-1 내지 T-101; M-1 내지 E-100; M-1 내지 P-99; M-1 내지 L-98; M-1 내지 P-97; M-1 내지 T-96; M-1 내지 E-95; M-1 내지 S-94; M-1 내지 G-93; M-1 내지 S-92; M-1 내지 K-91; M-1 내지 R-90; M-1 내지 G-89; M-1 내지 V-88; M-1 내지 N-87; M-1 내지 Q-86; M-1 내지 L-85; M-1 내지 T-84; M-1 내지 F-83; M-1 내지 G-82; M-1 내지 P-81; M-1 내지 A-80; M-1 내지 L-79; M-1 내지 F-78; M-1 내지 S-77; M-1 내지 S-76; M-1 내지 D-75; M-1 내지 P-74; M-1 내지 R-73; M-1 내지 L-72; M-1 내지 E-71; M-1 내지 L-70; M-1 내지 D-69; M-1 내지 L-68; M-1 내지 Q-67; M-1 내지 Q-66; M-1 내지 D-65; M-1 내지 F-64; M-1 내지 A-63; M-1 내지 H-62; M-1 내지 L-61; M-1 내지 R-60; M-1 내지 L-59; M-1 내지 R-58; M-1 내지 T-57; M-1 내지 T-56; M-1 내지 G-55; M-1 내지 H-54; M-1 내지 G-53; M-1 내지 P-52; M-1 내지 A-51; M-1 내지 R-50; M-1 내지 E-49; M-1 내지 L-48; M-1 내지 E-47; M-1 내지 P-46; M-1 내지 V-45; M-1 내지 V-44; M-1 내지 L-43; M-1 내지 E-42; M-1 내지 E-41; M-1 내지 D-40; M-1 내지 E-39; M-1 내지 E-38; M-1 내지 S-37; M-1 내지 P-36; M-1 내지 R-35; M-1 내지 G-34; M-1 내지 L-33; M-1 내지 A-32; M-1 내지 D-31; M-1 내지 S-30; M-1 내지 V-29; M-1 내지 A-28; M-1 내지 L-27; M-1 내지 L-26; M-1 내지 A-25; M-1 내지 A-24; M-1 내지 A-23; M-1 내지 L-22; M-1 내지 L-21; M-1 내지 L-20; M-1 내지 L-19; M-1 내지 T-18; M-1 내지 P-17; M-1 내지 V-16; M-1 내지 P-15; M-1 내지 G-14; M-1 내지 F-13; M-1 내지 S-12; M-1 내지 R-11; M-1 내지 S-10; M-1 내지 G-9; M-1 내지 P-8; M-1 내지 A-7. 예를 들어, 상기 제시된 N-말단 또는 C-말단 결실 중 임의의 것을 조합하여 N- 및 C-말단 결실된 METH1 폴리펩티드를 산출할 수 있다. 서열 번호 2의 특히 바람직한 단편은 H542-Q894 및 K801-S950이다.
유사하게, 서열 번호 2로 제시된 본 발명의 폴리펩티드의 C-말단 결실체는 다음 잔기의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다: 서열 번호 2의 F-236 내지 S-950; F-236 내지 C-949; F-236 내지 E-948; F-236 내지 A-947; F-236 내지 M-946; F-236 내지 T-945; F-236 내지 C-944; F-236 내지 F-943; F-236 내지 D-942; F-236 내지 I-941; F-236 내지 F-940; F-236 내지 H-939; F-236 내지 K-938; F-236 내지 P-937; F-236 내지 K-936; F-236 내지 K-935; F-236 내지 L-934; F-236 내지 P-933; F-236 내지 D-932; F-236 내지 C-931; F-236 내지 S-930; F-236 내지 E-929; F-236 내지 H-928; F-236 내지 S-927; F-236 내지 L-926; F-236 내지V-925; F-236 내지 G-924; F-236 내지 G-923; F-236 내지 D-922; F-236 내지 H-921; F-236 내지 S-920; F-236 내지 L-919; F-236 내지 C-918; F-236 내지 K-917; F-236 내지 L-916; F-236 내지 S-915; F-236 내지 R-914; F-236 내지 K-913; F-236 내지 K-912; F-236 내지 Y-911; F-236 내지 G-910; F-236 내지 K-909; F-236 내지 G-908; F-236 내지 C-907; F-236 내지 T-906; F-236 내지 K-905; F-236 내지 S-904; F-236 내지 C-903; F-236 내지 S-902; F-236 내지 S-901; F-236 내지 W-900; F-236 내지 E-899; F-236 내지 G-898; F-236 내지 L-897; F-236 내지 Q-896; F-236 내지 W-895; F-236 내지 Q-894; F-236 내지 P-893; F-236 내지 C-892; F-236 내지 P-891; F-236 내지 H-890; F-236 내지 D-889; F-236 내지 A-888; F-236 내지 C-887; F-236 내지 P-886; F-236 내지 R-885; F-236 내지 T-884; F-236 내지 S-883; F-236 내지 A-882; F-236 내지 P-881; F-236 내지 K-880; F-236 내지 V-879; F-236 내지 E-878; F-236 내지 K-877; F-236 내지 A-876; F-236 내지 C-875; F-236 내지 E-874; F-236 내지 S-873; F-236 내지 A-872; F-236 내지 P-871; F-236 내지 Q-870; F-236 내지 G-869; F-236 내지 N-868; F-236 내지 I-867; F-236 내지 D-866; F-236 내지 R-865; F-236 내지 C-864; F-236 내지 E-863; F-236 내지 V-862; F-236 내지 L-861; F-236 내지 R-860; F-236 내지 R-859; F-236 내지 Q-858; F-236 내지 W-857; F-236 내지 G-856; F-236 내지 L-855; F-236 내지 E-854; F-236 내지 C-853; F-236 내지 S-852; F-236 내지 K-851; F-236 내지 S-850; F-236 내지 C-849; F-236 내지 E-848; F-236 내지 G-847; F-236 내지 W-846; F-236 내지 E-845; F-236 내지 E-844; F-236 내지 I-843; F-236 내지 V-842; F-236 내지 W-841; F-236 내지A-840; F-236 내지 S-839; F-236 내지 F-838; F-236 내지 T-837; F-236 내지 P-836; F-236 내지 I-835; F-236 내지 A-834; F-236 내지 N-833; F-236 내지 F-832; F-236 내지 S-831; F-236 내지 E-830; F-236 내지 K-829; F-236 내지 K-828; F-236 내지 K-827; F-236 내지 K-826; F-236 내지 V-825; F-236 내지 F-824; F-236 내지 Y-823; F-236 내지 T-822; F-236 내지 Y-821; F-236 내지 K-820; F-236 내지 I-819; F-236 내지 K-818; F-236 내지 P-817; F-236 내지 R-816; F-236 내지 L-815; F-236 내지 A-814; F-236 내지 N-813; F-236 내지 G-812; F-236 내지 V-811; F-236 내지 T-810; F-236 내지 L-809; F-236 내지 V-808; F-236 내지 Q-807; F-236 내지 I-806; F-236 내지 T-805; F-236 내지 L-804; F-236 내지 P-803; F-236 내지 E-802; F-236 내지 K-801; F-236 내지 L-800; F-236 내지 P-799; F-236 내지 S-798; F-236 내지 F-797; F-236 내지 S-796; F-236 내지 R-795; F-236 내지 I-794; F-236 내지 R-793; F-236 내지 E-792; F-236 내지 L-791; F-236 내지 A-790; F-236 내지 A-789; F-236 내지 S-788; F-236 내지 S-787; F-236 내지 G-786; F-236 내지 S-785; F-236 내지 Y-784; F-236 내지 R-783; F-236 내지 L-782; F-236 내지 V-781; F-236 내지 V-780; F-236 내지 G-779; F-236 내지 K-778; F-236 내지 Y-777; F-236 내지 M-776; F-236 내지 I-775; F-236 내지 D-774; F-236 내지 Q-773; F-236 내지 E-772; F-236 내지 L-771; F-236 내지 T-770; F-236 내지 S-769; F-236 내지 L-768; F-236 내지 T-767; F-236 내지 Y-766; F-236 내지 D-765; F-236 내지 G-764; F-236 내지 N-763; F-236 내지 L-762; F-236 내지 I-761; F-236 내지 Y-760; F-236 내지 T-759; F-236 내지 G-758; F-236 내지 D-757; F-236 내지 A-756; F-236내지 A-755; F-236 내지 K-754; F-236 내지 I-753; F-236 내지 A-752; F-236 내지 L-751; F-236 내지 F-750; F-236 내지 S-749; F-236 내지 G-748; F~236 내지 N-747; F-236 내지 N-746; F-236 내지 R-745; F-236 내지 S-744; F-236 내지 G-743; F-236 내지 R-742; F-236 내지 Q-741; F-236 내지 N-740; F-236 내지 R-739; F-236 내지 Q-738; F-236 내지 K-737; F-236 내지 V-736; F-236 내지 E-735; F-236 내지 I-734; F-236 내지 N-733; F-236 내지 T-732; F-236 내지 A-731; F-236 내지 G-730; F-236 내지 T-729; F-236 내지 P-728; F-236 내지 I-727; F-236 내지 T-726; F-236 내지 I-725; F-236 내지 I-724; F-236 내지 D-723; F-236 내지 H-722; F-236 내지 Y-721; F-236 내지 G-720; F-236 내지 P-719; F-236 내지 K-718; F-236 내지 A-717; F-236 내지 S-716; F-236 내지 T-715; F-236 내지 V-714; F-236 내지 S-713; F-236 내지 G-712; F-236 내지 S-711; F-236 내지 I-710; F-236 내지 K-709; F-236 내지 K-708; F-236 내지 C-707; F-236 내지 T-706; F-236 내지 S-705; F-236 내지 G-704; F-236 내지 N-703; F-236 내지 G-702; F-236 내지 G-701; F-236 내지 C-700; F-236 내지 V-699; F-236 내지 G-698; F-236 내지 C-697; F-236 내지 K-696; F-236 내지 D-695; F-236 내지 F-694; F-236 내지 K-693; F-236 내지 K-692; F-236 내지 K-691; F-236 내지 S-690; F-236 내지 D-689; F-236 내지 I-688; F-236 내지 I-687; F-236 내지 R-686; F-236 내지 D-685; F-236 내지 C-684; F-236 내지 G-683; F-236 내지 A-682; F-236 내지 K-681; F-236 내지 V-680; F-236 내지 C-679; F-236 내지 Q-678; F-236 내지 G-677; F-236 내지 Q-676; F-236 내지 V-675; F-236 내지 C-674; F-236 내지 V-673; F-236 내지 S-672; F-236 내지 T-671; F-236내지 S-670; F-236 내지 D-669; F-236 내지 P-668; F-236 내지 S-667; F-236 내지 C-666; F-236 내지 P-665; F-236 내지 T-664; F-236 내지 G-663; F-236 내지 D-662; F-236 내지 V-661; F-236 내지 V-660; F-236 내지 K-659; F-236 내지 P-658; F-236 내지 Q-657; F-236 내지 L-656; F-236 내지 V-655; F-236 내지 F-654; F-236 내지 F-653; F-236 내지 Y-652; F-236 내지 G-651; F-236 내지 I-650; F-236 내지 G-649; F-236 내지 K-648; F-236 내지 A-647; F-236 내지 Q-646; F-236 내지 C-645; F-236 내지 I-644; F-236 내지 L-643; F-236 내지 K-642; F-236 내지 C-641; F-236 내지 R-640; F-236 내지 D-639; F-236 내지 K-638; F-236 내지 P-637; F-236 내지 S-636; F-236 내지 V-635; F-236 내지 G-634; F-236 내지 A-633; F-236 내지 Y-632; F-236 내지 K-631; F-236 내지 P-630; F-236 내지 I-629; F-236 내지 W-628; F-236 내지 E-627; F-236 내지 V-626; F-236 내지 A-625; F-236 내지 P-624; F-236 내지 G-623; F-236 내지 S-622; F-236 내지 G-621; F-236 내지 F-620; F-236 내지 S-619; F-236 내지 A-618; F-236 내지 K-617; F-236 내지 S-616; F-236 내지 F-615; F-236 내지 E-614; F-236 내지 N-613; F-236 내지 H-612; F-236 내지 A-611; F-236 내지 E-610; F-236 내지 C-609; F-236 내지 Q-608; F-236 내지 E-607; F-236 내지 E-606; F-236 내지 R-605; F-236 내지 F-604; F-236 내지 T-603; F-236 내지 K-602; F-236 내지 G-601; F-236 내지 N-600; F-236 내지 N-599; F-236 내지 D-598; F-236 내지 P-597; F-236 내지 C-596; F-236 내지 D-595; F-236 내지 E-594; F-236 내지 L-593; F-236 내지 N-592; F-236 내지 C-591; F-236 내지 S-590; F-236 내지 R-589; F-236 내지 Y-588; F-236 내지 R-587; F-236 내지V-586; F-236 내지 R-585; F-236 내지 K-584; F-236 내지 G-583; F-236 내지 E-582; F-236 내지 C-581; F-236 내지 Y-580; F-236 내지 K-579; F-236 내지 G-578; 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F-236 내지 Q-451; F-236 내지 P-450; F-236 내지 K-449; F-236 내지 D-448; F-236 내지 M-447; F-236 내지 L-446; F-236 내지 C-445; F-236 내지 E-444; F-236 내지 G-443; F-236 내지 H-442; F-236 내지 G-441; F-236 내지 N-440; F-236 내지 D-439; F-236 내지 L-438; F-236 내지 F-437; F-236 내지 S-436; F-236 내지 T-435; F-236 내지 I-434; F-236 내지 M-433; F-236 내지 Y-432; F-236 내지 A-431; F-236 내지 S-430; F-236 내지 C-429; F-236 내지 P-428; F-236 내지 S-427; F-236 내지 W-426; F-236 내지 P-425; F-236 내지 Q-424; F-236 내지 S-423; F-236 내지 H-422; F-236 내지 D-421; F-236 내지 L-420; F-236 내지 N-419; F-236 내지 S-418; F-236 내지 L-417; F-236 내지M-416; F-236 내지 S-415; F-236 내지 A-414; F-236 내지 M-413; F-236 내지 M-412; F-236 내지 H-411; F-236 내지 S-410; F-236 내지 D-409; F-236 내지 Q-408; F-236 내지 N-407; F-236 내지 V-406; F-236 내지 G-405; F-236 내지 N-404; F-236 내지 L-403; F-236 내지 S-402; F-236 내지 A-401; F-236 내지 C-400; F-236 내지 Q-399; F-236 내지 K-398; F-236 내지 A-397; F-236 내지 D-396; F-236 내지 D-395; F-236 내지 H-394; F-236 내지 P-393; F-236 내지 M-392; F-236 내지 N-391; F-236 내지 F-390; F-236 내지 V-389; F-236 내지 H-388; F-236 내지 G-387; F-236 내지 L-386; F-236 내지 E-385; F-236 내지 H-384; F-236 내지 A-383; F-236 내지 T-382; F-236 내지 T-381; F-236 내지 F-380; F-236 내지 A-379; F-236 내지 A-378; F-236 내지 Q-377; F-236 내지 L-376; F-236 내지 G-375; F-236 내지 D-374; F-236 내지 D-373; F-236 내지 E-372; F-236 내지 I-371; F-236 내지 V-370; F-236 내지 S-369; F-236 내지 C-368; F-236 내지 S-367; F-236 내지 R-366; F-236 내지 S-365; F-236 내지 P-364; F-236 내지 D-363; F-236 내지 C-362; F-236 내지 V-361; F-236 내지 T-360; F-236 내지 G-359; F-236 내지 V-358; F-236 내지 D-357; F-236 내지 A-356; F-236 내지 M-355; F-236 내지 G-354; F-236 내지 L-353; F-236 내지 T-352; F-236 내지 D-351; F-236 내지 C-350; F-236 내지 T-349; F-236 내지 Q-348; F-236 내지 S-347; F-236 내지 G-346; F-236 내지 C-345; F-236 내지 L-344; F-236 내지 D-343; F-236 내지 Q-342; F-236 내지 R-341; F-236 내지 T-340; F-236 내지 F-339; F-236 내지 L-338; F-236 내지 I-337; F-236 내지 A-336; F-236 내지 T-335; F-236 내지 D-334; F-236 내지 Y-333; F-236 내지 H-332; F-236 내지 E-331; F-236 내지 A-330; F-236 내지 D-329; F-236 내지 R-328; F-236 내지 D-327; F-236 내지 S-326; F-236 내지 P-325; F-236 내지 P-324; F-236 내지 N-323; F-236 내지 H-322; F-236 내지 Q-321; F-236 내지 K-320; F-236 내지 Q-319; F-236 내지 W-318; F-236 내지 N-317; F-236 내지 C-316; F-236 내지 F-315; F-236 내지 N-314; F-236 내지 R-313; F-236 내지 L-312; F-236 내지 T-311; F-236 내지 L-310; F-236 내지 A-309; F-236 내지 A-308; F-236 내지 N-307; F-236 내지 S-306; F-236 내지 T-305; F-236 내지 V-304; F-236 내지 E-303; F-236 내지 P-302; F-236 내지 G-301; F-236 내지 K-300; F-236 내지 Q-299; F-236 내지 E-298; F-236 내지 D-297; F-236 내지 H-296; F-236 내지 I-295; F-236 내지 V-294; F-236 내지 L-293; F-236 내지 I-292; F-236 내지 K-291; F-236 내지 V-290; F-236 내지 V-289; F-236 내지 V-288; F-236 내지 L-287; F-236 내지 S-286; F-236 내지 V-285; F-236 내지 S-284; F-236 내지 N-283; F-236 내지 R-282; F-236 내지 I-281; F-236 내지 S-280; F-236 내지 P-279; F-236 내지 H-278; F-236 내지 K-277; F-236 내지 Y-276; F-236 내지 L-275; F-236 내지 R-274; F-236 내지 A-273; F-236 내지 A-272; F-236 내지 V-271; F-236 내지 S-270; F-236 내지 F-269; F-236 내지 L-268; F-236 내지 T-267; F-236 내지 L-266; F-236 내지 L-265; F-236 내지 Y-264; F-236 내지 H-263; F-236 내지 K-262; F-236 내지 L-261; F-236 내지 G-260; F-236 내지 S-259; F-236 내지 G-258; F-236 내지 H-257; F-236 내지 F-256; F-236 내지 E-255; F-236 내지 A-254; F-236 내지 M-253; F-236 내지 S-252; F-236 내지 Q-251; F-236 내지 D-250; F-236 내지 A-249; F-236 내지 V-248; F-236 내지 L-247; F-236 내지 M-246; F-236 내지 T-245; F-236 내지 E-244; F-236 내지 V-243; 및/또는 F-236 내지 Y-242.
유사하게, 서열 번호 2로 제시된 본 발명의 폴리펩티드의 C-말단 결실체는 다음 잔기의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다: 서열 번호 2의 L-33 내지 S-950; L-33 내지 C-949; L-33 내지 E-948; L-33 내지 A-947; L-33 내지 M-946; L-33 내지 T-945; L-33 내지 C-944; L-33 내지 F-943; L-33 내지 D-942; L-33 내지 I-941; L-33 내지 F-940; L-33 내지 H-939; L-33 내지 K-938; L-33 내지 P-937; L-33 내지 K-936; L-33 내지 K-935; L-33 내지 L-934; L-33 내지 P-933; L-33 내지 D-932; L-33 내지 C-931; L-33 내지 S-930; L-33 내지 E-929; L-33 내지 H-928; L-33 내지 S-927; L-33 내지 L-926; L-33 내지 V-925; L-33 내지 G-924; L-33 내지 G-923; L-33 내지 D-922; L-33 내지 H-921; L-33 내지 S-920; L-33 내지 L-919; L-33 내지 C-918; L-33 내지 K-917; L-33 내지 L-916; L-33 내지 S-915; L-33 내지 R-914; L-33 내지 K-913; L-33 내지 K-912; L-33 내지 Y-911; L-33 내지 G-910; L-33 내지 K-909; L-33 내지 G-908; L-33 내지 C-907; L-33 내지 T-906; L-33 내지 K-905; L-33 내지 S-904; L-33 내지 C-903; L-33 내지 S-902; L-33 내지 S-901; L-33 내지 W-900; L-33 내지 E-899; L-33 내지 G-898; L-33 내지 L-897; L-33 내지 Q-896; L-33 내지 W-895; L-33 내지 Q-894; L-33 내지 P-893; L-33 내지 C-892; L-33 내지 P-891; L-33 내지 H-890; L-33 내지 D-889; L-33 내지 A-888; L-33 내지 C-887; L-33 내지 P-886; L-33 내지 R-885; L-33 내지 T-884; L-33 내지 S-883; L-33 내지 A-882; L-33 내지 P-881; L-33 내지 K-880; L-33 내지 V-879; L-33 내지 E-878; L-33 내지 K-877; L-33 내지 A-876; L-33 내지 C-875; L-33 내지 E-874; L-33 내지 S-873; L-33 내지 A-872; L-33 내지 P-871; L-33 내지 Q-870; L-33 내지 G-869; L-33 내지 N-868; L-33 내지 I-867; L-33 내지 D-866; L-33 내지 R-865; L-33 내지 C-864; L-33 내지 E-863; L-33 내지 V-862; L-33 내지 L-861; L-33 내지 R-860; L-33 내지 R-859; L-33 내지 Q-858; L-33 내지 W-857; L-33 내지 G-856; L-33 내지 L-855; L-33 내지 E-854; L-33 내지 C-853; L-33 내지 S-852; L-33 내지 K-851; L-33 내지 S-850; L-33 내지 C-849; L-33 내지 E-848; L-33 내지 G-847; L-33 내지 W-846; L-33 내지 E-845; L-33 내지 E-844; L-33 내지 I-843; L-33 내지 V-842; L-33 내지 W-841; L-33 내지 A-840; L-33 내지 S-839; L-33 내지 F-838; L-33 내지 T-837; L-33 내지 P-836; L-33 내지 I-835; L-33 내지 A-834; L-33 내지 N-833; L-33 내지 F-832; L-33 내지 S-831; L-33 내지 E-830; LL33 내지 K-829; L-33 내지 K-828; L-33 내지 K-827; L-33 내지 K-826; L-33 내지 V-825; L-33 내지 F-824; L-33 내지 Y-823; L-33 내지 T-822; L-33 내지 Y-821; L-33 내지 K-820; L-33 내지 I-819; L-33 내지 K-818; L-33 내지 P-817; L-33 내지 R-816; L-33 내지 L-815; L-33 내지 A-814; L-33 내지 N-813; L-33 내지 G-812; L-33 내지 V-811; L-33 내지 T-810; L-33 내지 L-809; L-33 내지 V-808; L-33 내지 Q-807; L-33 내지 I-806; L-33 내지 T-805; L-33 내지 L-804; L-33 내지 P-803; L-33 내지 E-802; L-33 내지 K-801; L-33 내지 L-800; L-33 내지 P-799; L-33 내지 S-798; L-33 내지 F-797; L-33 내지 S-796; L-33 내지 R-795; L-33 내지 I-794; L-33 내지 R-793; L-33 내지 E-792; L-33 내지 L-791; L-33 내지 A-790; L-33 내지 A-789; L-33 내지 S-788; L-33 내지 S-787; L-33 내지 G-786; L-33 내지 S-785; L-33 내지 Y-784; L-33 내지 R-783; L-33 내지 L-782; L-33 내지 V-781; L-33 내지 V-780; L-33 내지 G-779; L-33 내지 K-778; L-33 내지 Y-777; L-33 내지 M-776; L-33 내지 I-775; L-33 내지 D-774; L-33 내지 Q-773; L-33 내지 E-772; L-33 내지 L-771; L-33 내지 T-770; L-33 내지 S-769; L-33 내지 L-768; L-33 내지 T-767; L-33 내지 Y-766; L-33 내지 D-765; L-33 내지 G-764; L-33 내지 N-763; L-33 내지 L-762; L-33 내지 I-761; L-33 내지 Y-760; L-33 내지 T-759; L-33 내지 G-758; L-33 내지 D-757; L-33 내지 A-756; L-33 내지 A-755; L-33 내지 K-754; L-33 내지 I-753; L-33 내지 A-752; L-33 내지 L-751; L-33 내지 F-750; L-33 내지 S-749; L-33 내지 G-748; L-33 내지 N-747; L-33 내지 N-746; L-33 내지 R-745; L-33 내지 S-744; L-33 내지 G-743; L-33 내지 R-742; L-33 내지 Q-741; L-33 내지 N-740; L-33 내지 R-739; L-33 내지 Q-738; L-33 내지 K-737; L-33 내지 V-736; L-33 내지 E-735; L-33 내지 I-734; L-33 내지 N-733; L-33 내지 T-732; L-33 내지 A-731; L-33 내지 G-730; L-33 내지 T-729; L-33 내지 P-728; L-33 내지 I-727; L-33 내지 T-726; L-33 내지 I-725; L-33 내지 I-724; L-33 내지 D-723; L-33 내지 H-722; L-33 내지 Y-721; L-33 내지 G-720; L-33 내지 P-719; L-33 내지 K-718; L-33 내지 A-717; L-33 내지 S-716; L-33 내지 T-715; L-33 내지 V-714; L-33 내지 S-713; L-33 내지 G-712; L-33 내지 S-711; L-33 내지 I-710; L-33 내지 K-709; L-33 내지 K-708; L-33 내지 C-707; L-33 내지 T-706; L-33 내지 S-705; L-33 내지 G-704; L-33 내지 N-703; L-33 내지 G-702; L-33 내지 G-701; L-33 내지 C-700; L-33 내지 V-699; L-33 내지 G-698; L-33 내지 C-697; L-33 내지 K-696; L-33 내지 D-695; L-33 내지 F-694; L-33 내지 K-693; L-33 내지 K-692; L-33 내지 K-691; L-33 내지 S-690; L-33 내지 D-689; L-33 내지 I-688; L-33 내지 I-687; L-33 내지 R-686; L-33 내지 D-685; L-33 내지 C-684; L-33 내지 G-683; L-33 내지 A-682; L-33 내지 K-681; L-33 내지 V-680; L-33 내지 C-679; L-33 내지 Q-678; L-33 내지 G-677; L-33 내지 Q-676; L-33 내지 V-675; L-33 내지 C-674; L-33 내지 V-673; L-33 내지 S-672; L-33 내지 T-671; L-33 내지 S-670; L-33 내지 D-669; L-33 내지 P-668; L-33 내지 S-667; L-33 내지 C-666; L-33 내지 P-665; L-33 내지 T-664; L-33 내지 G-663; L-33 내지 D-662; L-33 내지 V-661; L-33 내지 V-660; L-33 내지 K-659; L-33 내지 P-658; L-33 내지 Q-657; L-33 내지 L-656; L-33 내지 V-655; L-33 내지 F-654; L-33 내지 F-653; L-33 내지 Y-652; L-33 내지 G-651; L-33 내지 I-650; L-33 내지 G-649; L-33 내지 K-648; L-33 내지 A-647; L-33 내지 Q-646; L-33 내지 C-645; L-33 내지 I-644; L-33 내지 L-643; L-33 내지 K-642; L-33 내지 C-641; L-33 내지 R-640; L-33 내지 D-639; L-33 내지 K-638; L-33 내지 P-637; L-33 내지 S-636; L-33 내지 V-635; L-33 내지 G-634; L-33 내지 A-633; L-33 내지 Y-632; L-33 내지 K-631; L-33 내지 P-630; L-33 내지 I-629; L-33 내지 W-628; L-33 내지 E-627; L-33 내지 V-626; L-33 내지 A-625; L-33 내지 P-624; L-33 내지 G-623; L-33 내지 S-622; L-33 내지 G-621; L-33 내지 F-620; L-33 내지 S-619; L-33 내지 A-618; L-33 내지 K-617; L-33 내지 S-616; L-33 내지 F-615; L-33 내지 E-614; L-33 내지 N-613; L-33 내지 H-612; L-33 내지 A-611; L-33 내지 E-610; L-33 내지 C-609; L-33 내지 Q-608; L-33 내지 E-607; L-33 내지 E-606; L-33 내지 R-605; L-33 내지 F-604; L-33 내지 T-603; L-33 내지 K-602; L-33 내지 G-601; L-33 내지 N-600; L-33 내지 N-599; L-33 내지 D-598; L-33 내지 P-597; L-33 내지 C-596; L-33 내지 D-595; L-33 내지 E-594; L-33 내지 L-593; L-33 내지 N-592; L-33 내지 C-591; L-33 내지 S-590; L-33 내지 R-589; L-33 내지 Y-588; L-33 내지 R-587; L-33 내지 V-586; L-33 내지 R-585; L-33 내지 K-584; L-33 내지 G-583; L-33 내지 E-582; L-33 내지 C-581; L-33 내지 Y-580; L-33 내지 K-579; L-33 내지 G-578; L-33 내지 G-577; L-33 내지 N-576; L-33 내지 K-575; L-33 내지 P-574; L-33 내지 V-573; L-33 내지 P-572; L-33 내지 N-571; L-33 내지 D-570; L-33 내지 C-569; L-33 내지 E-568; L-33 내지 R-567; L-33 내지 M-566; L-33 내지 T-565; L-33 내지 Y-564; L-33 내지 Q-563; L-33 내지 V-562; L-33 내지 G-561; L-33 내지 G-560; L-33 내지 G-559; L-33 내지 C-558; L-33 내지 T-557; L-33 내지 R-556; L-33 내지 S-555; L-33 내지 C-554; L-33 내지 D-553; L-33 내지 G-552; L-33 내지 W-551; L-33 내지 P-550; L-33 내지 G-549; L-33 내지 W-548; L-33 내지 M-547; L-33 내지 G-546; L-33 내지 W-545; L-33 내지 S-544; L-33 내지 G-543; L-33 내지 H-542; L-33 내지 F-541; L-33 내지 P-540; L-33 내지 T-539; L-33 내지 D-538; L-33 내지 F-537; L-33 내지 H-536; L-33 내지 K-535; L-33 내지 R-534; L-33 내지 D-533; L-33 내지 T-532; L-33 내지 K-531; L-33 내지 N-530; L-33 내지 V-529; L-33 내지 C-528; L-33 내지 K-527; L-33 내지 G-526; L-33 내지 N-525; L-33 내지 I-524; L-33 내지 C-523; L-33 내지 W-522; L-33 내지 K-521; L-33 내지 G-520; L-33 내지 E-519; L-33 내지 G-518; L-33 내지 C-517; L-33 내지 S-516; L-33 내지 T-515; L-33 내지 G-514; L-33 내지 D-513; L-33 내지 A-512; L-33 내지 W-511; L-33 내지 P-510; L-33 내지 F-509; L-33 내지 H-508; L-33 내지 K-507; L-33 내지 T-506; L-33 내지 Q-505; L-33 내지 C-504; L-33 내지 V-503; L-33 내지 L-502; L-33 내지 V-501; L-33 내지 G-500; L-33 내지 G-499; L-33 내지 S-498; L-33 내지 T-497; L-33 내지 G-496; L-33 내지 T-495; L-33 내지 C-494; L-33 내지 W-493; L-33 내지 L-492; L-33 내지 T-491; L-33 내지 S-490; L-33 내지 C-489; L-33 내지 T-488; L-33 내지 S-487; L-33 내지 A-486; L-33 내지 A-485; L-33 내지 D-484; L-33 내지 P-483; L-33 내지 C-482; L-33 내지 H-481; L-33 내지 K-480; L-33 내지 S-479; L-33 내지 D-478; L-33 내지 E-477; L-33 내지 G-476; L-33 내지 F-475; L-33 내지 T-474; L-33 내지 F-473; L-33 내지 Q-472; L-33 내지 C-471; L-33 내지 Q-470; L-33 내지 R-469; L-33 내지 N-468; L-33 내지 A-467; L-33 내지 D-466; L-33 내지 Y-465; L-33 내지 S-464; L-33 내지 T-463; L-33 내지 G-462; L-33 내지 P-461; L-33 내지 L-460; L-33 내지 D-459; L-33 내지 G-458; L-33 내지 P-457; L-33 내지 L-456; L-33 내지 Q-455; L-33 내지 I-454; L-33 내지 P-453; L-33 내지 N-452; L-33 내지 Q-451; L-33 내지 P-450; L-33 내지 K-449; L-33 내지 D-448; L-33 내지 M-447; L-33 내지 L-446; L-33 내지 C-445; L-33 내지 E-444; L-33 내지 G-443; L-33 내지 H-442; L-33 내지 G-441; L-33 내지 N-440; L-33 내지 D-439; L733 내지 L-438; L-33 내지 F-437; L-33 내지 S-436; L-33 내지 T-435; L-33 내지 I-434; L-33 내지 M-433; L-33 내지 Y-432; L-33 내지 A-431; L-33 내지 S-430; L-33 내지 C-429; L-33 내지 P-428; L-33 내지 S-427; L-33 내지 W-426; L-33 내지 P-425; L-33 내지 Q-424; L-33 내지 S-423; L-33 내지 H-422; L-33 내지 D-421; L-33 내지 L-420; L-33 내지 N-419; L-33 내지 S-418; L-33 내지 L-417; L-33 내지 M-416; L-33 내지 S-415; L-33 내지 A-414; L-33 내지 M-413; L-33 내지 M-412; L-33 내지 H-411; L-33 내지 S-410; L-33 내지 D-409; L-33 내지 Q-408; L-33 내지 N-407; L-33 내지 V-406; L-33 내지 G-405; L-33 내지 N-404; L-33 내지 L-403; L-33 내지 S-402; L-33 내지 A-401; L-33 내지 C-400; L-33 내지 Q-399; L-33 내지 K-398; L-33 내지 A-397; L-33 내지 D-396; L-33 내지 D-395; L-33 내지 H-394; L-33 내지 P-393; L-33 내지 M-392; L-33 내지 N-391; L-33 내지 F-390; L-33 내지 V-389; L-33 내지 H-388; L-33 내지 G-387; L-33 내지 L-386; L-33 내지 E-385; L-33 내지 H-384; L-33 내지 A-383; L-33 내지 T-382; L-33 내지 T-381; L-33 내지 F-380; L-33 내지 A-379; L-33 내지 A-378; L-33 내지 Q-377; L-33 내지 L-376; L-33 내지 G-375; L-33 내지 D-374; L-33 내지 D-373; L-33 내지 E-372; L-33 내지 I-371; L-33 내지 V-370; L-33 내지 S-369; L-33 내지 C-368; L-33 내지 S-367; L-33 내지 R-366; L-33 내지 S-365; L-33 내지 P-364; L-33 내지 D-363; L-33 내지 C-362; L-33 내지 V-361; L-33 내지 T-360; L-33 내지 G-359; L-33 내지 V-358; L-33 내지 D-357; L-33 내지 A-356; L-33 내지 M-355; L-33 내지 G-354; L-33 내지 L-353; L-33 내지 T-352; L-33 내지 D-351; L-33 내지 C-350; L-33 내지 T-349; L-33 내지 Q-348; L-33 내지 S-347; L-33 내지 G-346; L-33 내지 C-345; L-33 내지 L-344; L-33 내지 D-343; L-33 내지 Q-342; L-33 내지 R-341; L-33 내지 T-340; L-33 내지 F-339; L-33 내지 L-338; L-33 내지 I-337; L-33 내지 A-336; L-33 내지 T-335; L-33 내지 D-334; L-33 내지 Y-333; L-33 내지 H-332; L-33 내지 E-331; L-33 내지 A-330; L-33 내지 D-329; L-33 내지 R-328; L-33 내지 D-327; L-33 내지 S-326; L-33 내지 P-325; L-33 내지 P-324; L-33 내지 N-323; L-33 내지 H-322; L-33 내지 Q-321; L-33 내지 K-320; L-33 내지 Q-319; L-33 내지 W-318; L-33 내지 N-317; L-33 내지 C-316; L-33 내지 F-315; L-33 내지 N-314; L-33 내지 R-313; L-33 내지 L-312; L-33 내지 T-311; L-33 내지 L-310; L-33 내지 A-309; L-33 내지 A-308; L-33 내지 N-307; L-33 내지 S-306; L-33 내지 T-305; L-33 내지 V-304; L-33 내지 E-303; L-33 내지 P-302; L-33 내지 G-301; L-33 내지 K-300; L-33 내지 Q-299; L-33 내지 E-298; L-33 내지 D-297; L-33 내지 H-296; L-33 내지 I-295; L-33 내지 V-294; L-33 내지 L-293; L-33 내지 I-292; Li33 내지 K-291; L-33 내지 V-290; L-33 내지 V-289; L-33 내지 V-288; L-33 내지 L-287; 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L-33 내지 L-219; L-33 내지 A-218; L-33 내지 P-217; L-33 내지 D-216; L-33 내지 Q-215; L-33 내지 P-214; L-33 내지 S-213; L-33 내지 W-212; L-33 내지 Q-211; L-33 내지 P-210; L-33 내지 G-209; L-33 내지 E-208; L-33 내지 D-207; L-33 내지 E-206; L-33 내지 G-205; L-33 내지 E-204; L-33 내지 T-203; L-33 내지 G-202; L-33 내지 E-201; L-33 내지 D-200; L-33 내지 E-199; L-33 내지 D-198; L-33 내지 E-197; L-33 내지 T-196; L-33 내지 E-195; L-33 내지 A-194; L-33 내지 K-193; L-33 내지 G-192; L-33 내지 T-191; L-33 내지 P-190; L-33 내지 R-189; L-33 내지 P-188; L-33 내지 E-187; L-33 내지 D-186; L-33 내지 D-185; L-33 내지 V-184; L-33 내지 V-183; L-33 내지 G-182; L-33 내지 C-181; L-33 내지 T-180; L-33 내지 G-179; L-33 내지 G-178; L-33 내지 V-177; L-33 내지 D-176; L-33 내지 G-175; L-33 내지 Q-174; L-33 내지 R-173; L-33 내지 N-172; L-33 내지 R-171; L-33 내지 R-170; L-33 내지 L-169; L-33 내지 L-168; L-33 내지 H-167; L-33 내지 F-166; L-33 내지 Q-165; L-33 내지 L-164; L-33 내지 P-163; L-33 내지 A-162; L-33 내지 P-161; L-33 내지 P-160; L-33 내지 K-159; L-33 내지 E-158; L-33 내지 G-157; L-33 내지 P-156; L-33 내지 A-155; L-33 내지 A-154; L-33 내지 T-153; L-33 내지 A-152; L-33 내지 L-151; L-33 내지 R-150; L-33 내지 E-149; L-33 내지 S-148; L-33 내지 A-147; L-33 내지 A-146; L-33 내지 P-145; L-33 내지 L-144; L-33 내지 P-143; L-33 내지 Q-142; L-33 내지 I-141; L-33 내지 F-140; L-33 내지 Y-139; L-33 내지 A-138; L-33 내지 E-137; L-33 내지 G-136; L-33 내지 L-135; L-33 내지 L-134; L-33 내지 Y-133; L-33 내지 F-132; L-33 내지 A-131; L-33 내지 G-130; L-33 내지 R-129; L-33 내지 V-128; L-33 내지 G-127; L-33 내지 E-126; L-33 내지 C-125; L-33 내지 L-124; L-33 내지 S-123; L-33 내지 L-122; L-33 내지 A-121; L-33 내지 A-120; L-33 내지 A-119; L-33 내지 S-118; L-33 내지 S-117; L-33 내지 P-116; L-33 내지 D-115; L-33 내지 G-114; L-33 내지 N-113; L-33 내지 V-112; L-33 내지 T-111; L-33 내지 G-110; L-33 내지 S-109; L-33 내지 Y-108; L-33 내지 F-107; L-33 내지 C-106; L-33 내지 H-105; L-33 내지 A-104; L-33 내지 L-103; L-33 내지 D-102; L-33 내지 T-101; L-33 내지 E-100; L-33 내지 P-99; L-33 내지 L-98; L-33 내지 P-97; L-33 내지 T-96; L-33 내지 E-95; L-33 내지 S-94; L-33 내지 G-93; L-33 내지 S-92; L-33 내지 K-91; L-33 내지 R-90; L-33 내지 G-89; L-33 내지 V-88; L-33 내지 N-87; L-33 내지 Q-86; L-33 내지 L-85; L-33 내지 T-84; L-33 내지 F-83; L-33 내지 G-82; L-33 내지 P-81; L-33 내지 A-80; L-33 내지 L-79; L-33 내지 F-78; L-33 내지 S-77; L-33 내지 S-76; L-33 내지 D-75; L-33 내지 P-74; L-33 내지 R-73; L-33 내지 L-72; L-33 내지 E-71; L-33 내지 L-70; L-33 내지 D-69; L-33 내지 L-68; L-33 내지 Q-67; L-33내지 Q-66; L-33 내지 D-65; L-33 내지 F-64; L-33 내지 A-63; L-33 내지 H-62; L-33 내지 L-61; L-33 내지 R-60; L-33 내지 L-59; L-33 내지 R-58; L-33 내지 T-57; L-33 내지 T-56; L-33 내지 G-55; L-33 내지 H-54; L-33 내지 G-53; L-33 내지 P-52; L-33 내지 A-51; L-33 내지 R-50; L-33 내지 E-49; L-33 내지 L-48; L-33 내지 E-47; L-33 내지 P-46; L-33 내지 V-45; L-33 내지 V-44; L-33 내지 L-43; L-33 내지 E-42; L-33 내지 E-41; L-33 내지 D-40; 및/또는 L-33 내지 E-39.
서열 번호 125에 개시된 부가 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 METH1의 결실 돌연변이를 만들 수 있다. 예를 들어, 결실 돌연변이의 예로는 다음과 같은 것들이 있다: Q-2 내지 S-967; R-3 내지 S-967; A-4 내지 S-967; V-5 내지 S-967; P-6 내지 S-967; E-7 내지 S-967; G-8 내지 S-967; F-9 내지 S-967; G-10 내지 S-967; R-11 내지 S-976; R-12 내지 S-967; K-13 내지 S-967; L-14 내지 S-967; G-15 내지 S-967; S-16 내지 S-967; D-17 내지 S-967; 및 M-18 내지 S-967.
또한, METH2 폴리펩티드의 N-말단 결실은 일반식 m2-890으로 기재할 수 있는데, 여기서 m2는 2 내지 889의 정수이고, m은 서열 번호 4에서 확인되는 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 서열 번호 4에 제시된 본 발명의 METH2 폴리펩티드의 N-말단 결실체는 다음과 같은 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: 서열 번호 4의 F-2 내지 L-890; P-3 내지 L-890; A-4 내지 L-890; P-5 내지 L-890; A-6 내지 L-890; A-7 내지 L-890; P-8 내지 L-890; R-9 내지 L-890; W-10 내지 L-890; L-11 내지 L-890; P-12 내지 L-890; F-13 내지 L-890; L-14 내지 L-890;L-15 내지 L-890; L-16 내지 L-890; L-17 내지 L-890; L-18 내지 L-890; L-19 내지 L-890; L-20 내지 L-890; L-21 내지 L-890; L-22 내지 L-890; P-23 내지 L-890; L-24 내지 L-890; A-25 내지 L-890; R-26 내지 L-890; G-27 내지 L-890; A-28 내지 L-890; P-29 내지 L-890; A-30 내지 L-890; R-31 내지 L-890; P-32 내지 L-890; A-33 내지 L-890; A-34 내지 L-890; G-35 내지 L-890; G-36 내지 L-890; Q-37 내지 L-890; A-38 내지 L-890; S-39 내지 L-890; E-40 내지 L-890; L-41 내지 L-890; V-42 내지 L-890; V-43 내지 L-890; P-44 내지 L-890; T-45 내지 L-890; R-46 내지 L-890; L-47 내지 L-890; P-48 내지 L-890; G-49 내지 L-890; S-50 내지 L-890; A-51 내지 L-890; G-52 내지 L-890; E-53 내지 L-890; L-54 내지 L-890; A-55 내지 L-890; L-56 내지 L-890; H-57 내지 L-890; L-58 내지 L-890; S-59 내지 L-890; A-60 내지 L-890; F-61 내지 L-890; G-62 내지 L-890; K-63 내지 L-890; G-64 내지 L-890; F-65 내지 L-890; V-66 내지 L-890; L-67 내지 L-890; R-68 내지 L-890; L-69 내지 L-890; A-70 내지 L-890; P-71 내지 L-890; D-72 내지 L-890; D-73 내지 L-890; S-74 내지 L-890; F-75 내지 L-890; L-76 내지 L-890; A-77 내지 L-890; P-78 내지 L-890; E-79 내지 L-890; F-80 내지 L-890; K-81 내지 L-890; L82 내지 L-890; E-83 내지 L-890; R-84 내지 L-890; L-85 내지 L-890; G-86 내지 L-890; G-87 내지 L-890; S-88 내지 L-890; G-89 내지 L-890; R-90 내지 L-890; A-91 내지 L-890; T-92 내지 L-890; G-93 내지 L-890; G-94 내지 L-890; E-95 내지 L-890; R-96 내지 L-890; G-97 내지 L-890; L-98 내지 L-890; R-99 내지 L-890; G-100 내지 L-890; C-101 내지 L-890; F-102 내지 L-890; F-103 내지 L-890; S-104 내지 L-890;G-105 내지 L-890; T-106 내지 L-890; V-107 내지 L-890; N-108 내지 L-890; G-109 내지 L-890; E-110 내지 L-890; P-111 내지 L-890; E-112 내지 L-890; S-113 내지 L-890; L-114 내지 L-890; A-115 내지 L-890; A-116 내지 L-890; V-117 내지 L-890; S-118 내지 L-890; L-119 내지 L-890; C-120 내지 L-890; R-121 내지 L-890; G-122 내지 L-890; L-123 내지 L-890; S-124 내지 L-890; G-125 내지 L-890; S-126 내지 L-890; F-127 내지 L-890; L-128 내지 L-890; L-129 내지 L-890; D-130 내지 L-890; G-131 내지 L-890; E-132 내지 L-890; E-133 내지 L-890; F-134 내지 L-890; T-135 내지 L-890; I-136 내지 L-890; Q-137 내지 L-890; P-138 내지 L-890; Q-139 내지 L-890; G-140 내지 L-890; A-141 내지 L-890; G-142 내지 L-890; G-143 내지 L-890; S-144 내지 L-890; L-145 내지 L-890; A-146 내지 L-890; Q-147 내지 L-890; P-148 내지 L-890; H-149 내지 L-890; R-150 내지 L-890; L-151 내지 L-890; Q-152 내지 L-890; R-153 내지 L-890; W-154 내지 L-890; G-155 내지 L-890; P-156 내지 L-890; A-157 내지 L-890; G-158 내지 L-890; A-159 내지 L-890; R-160 내지 L-890; P-161 내지 L-890; L-162 내지 L-890; P-163 내지 L-890; R-164 내지 L-890; G-165 내지 L-890; P-166 내지 L-890; E-167 내지 L-890; W-168 내지 L-890; E-169 내지 L-890; V-170 내지 L-890; E-171 내지 L-890; T-172 내지 L-890; G-173 내지 L-890; E-174 내지 L-890; G-175 내지 L-890; Q-176 내지 L-890; R-177 내지 L-890; Q-178 내지 L-890; E-179 내지 L-890; R-180 내지 L-890; G-181 내지 L-890; D-182 내지 L-890; H-183 내지 L-890; Q-184 내지 L-890; E-185 내지 L-890; D-186 내지 L-890; S-187 내지 L-890; E-188 내지 L-890; E-189 내지 L-890;E-190 내지 L-890; S-191 내지 L-890; Q-192 내지 L-890; E-193 내지 L-890; E-194 내지 L-890; E-195 내지 L-890; A-196 내지 L-890; E-197 내지 L-890; G-198 내지 L-890; A-199 내지 L-890; S-200 내지 L-890; E-201 내지 L-890; P-202 내지 L-890; P-203 내지 L-890; P-204 내지 L-890; P-205 내지 L-890; L-206 내지 L-890; G-207 내지 L-890; A-208 내지 L-890; T-209 내지 L-890; S-210 내지 L-890; R-211 내지 L-890; T-212 내지 L-890; K-213 내지 L-890; R-214 내지 L-890; F-215 내지 L-890; V-216 내지 L-890; S-217 내지 L-890; E-218 내지 L-890; A-219 내지 L-890; R-220 내지 L-890; F-221 내지 L-890; V-222 내지 L-890; E-223 내지 L-890; T-224 내지 L-890; L-225 내지 L-890; L-226 내지 L-890; V-227 내지 L-890; A-228 내지 L-890; D-229 내지 L-890; A-230 내지 L-890; S-231 내지 L-890; M-232 내지 L-890; A-233 내지 L-890; A-234 내지 L-890; F-235 내지 L-890; Y-236 내지 L-890; G-237 내지 L-890; A-238 내지 L-890; D-239 내지 L-890; L-240 내지 L-890; Q-241 내지 L-890; N-242 내지 L-890; H-243 내지 L-890; I-244 내지 L-890; L-245 내지 L-890; T-246 내지 L-890; L-247 내지 L-890; 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S-689 내지 L-890; C-690 내지 L-890; R-691 내지 L-890; K-692 내지 L-890; V-693 내지 L-890; S-694 내지 L-890; G-695 내지 L-890; S-696 내지 L-890; L-697 내지 L-890; T-698 내지 L-890; P-699 내지 L-890; T-700 내지 L-890; N-701 내지 L-890; Y-702 내지 L-890; G-703 내지 L-890; Y-704 내지 L-890; N-705 내지 L-890; D-706 내지 L-890; I-707 내지 L-890; V-708 내지 L-890; T-709 내지 L-890; I-710 내지 L-890; P-711 내지 L-890; A-712 내지 L-890; G-713 내지 L-890; A-714 내지 L-890; T-715 내지 L-890; N-716 내지 L-890; I-717 내지 L-890; D-718 내지 L-890; V-719 내지 L-890; K-720 내지 L-890; Q-721 내지 L-890; R-722 내지 L-890; S-723 내지 L-890; H-724 내지 L-890; P-725 내지 L-890; G-726 내지 L-890; V-727 내지 L-890; Q-728 내지 L-890; N-729 내지 L-890; D-730 내지 L-890; G-731 내지 L-890; N-732 내지 L-890; Y-733 내지 L-890; L-734 내지 L-890; A-735 내지 L-890; L-736 내지 L-890; K-737 내지 L-890; T-738 내지 L-890; A-739 내지 L-890; D-740 내지 L-890; G-741 내지 L-890; Q-742 내지 L-890; Y-743 내지 L-890; L-744 내지 L-890; L-745 내지 L-890; N-746 내지 L-890; G-747 내지 L-890; N-748 내지 L-890; L-749 내지 L-890; A-750 내지 L-890; I-751 내지 L-890; S-752 내지 L-890; A-753 내지 L-890; I-754 내지 L-890; E-755 내지 L-890; Q-756 내지 L-890; D-757 내지 L-890; I-758 내지 L-890; L-759 내지 L-890; V-760 내지 L-890; K-761 내지 L-890; G-762 내지 L-890; T-763 내지 L-890; I-764 내지 L-890; L-765 내지 L-890; K-766 내지 L-890; Y-767 내지 L-890; S-768 내지 L-890; G-769 내지 L-890; S-770 내지 L-890; I-771 내지 L-890; A-772 내지 L-890; T-773 내지 L-890; L-774 내지 L-890; E-775 내지 L-890; R-776 내지 L-890; L-777 내지 L-890; Q-778 내지 L-890; S-779 내지 L-890; F-780 내지 L-890; R-781 내지 L-890; P-782 내지 L-890; L-783 내지 L-890;P-784 내지 L-890; E-785 내지 L-890; P-786 내지 L-890; L-787 내지 L-890; T-788 내지 L-890; V-789 내지 L-890; Q-790 내지 L-890; L-791 내지 L-890; L-792 내지 L-890; T-793 내지 L-890; V-794 내지 L-890; P-795 내지 L-890; G-796 내지 L-890; E-797 내지 L-890; V-798 내지 L-890; F-799 내지 L-890; P-800 내지 L-890; P-801 내지 L-890; K-802 내지 L-890; V-803 내지 L-890; K-804 내지 L-890; Y-805 내지 L-890; T-806 내지 L-890; F-807 내지 L-890; F-808 내지 L-890; V-809 내지 L-890; P-810 내지 L-890; N-811 내지 L-890; D-812 내지 L-890; V-813 내지 L-890; D-814 내지 L-890; F-815 내지 L-890; S-816 내지 L-890; M-817 내지 L-890; Q-818 내지 L-890; S-819 내지 L-890; S-820 내지 L-890; K-821 내지 L-890; E-822 내지 L-890; R-823 내지 L-890; A-824 내지 L-890; T-825 내지 L-890; T-826 내지 L-890; N-827 내지 L-890; I-828 내지 L-890; I-829 내지 L-890; Q-830 내지 L-890; P-831 내지 L-890; L-832 내지 L-890; L-833 내지 L-890; H-834 내지 L-890; A-835 내지 L-890; Q-836 내지 L-890; W-837 내지 L-890; V-838 내지 L-890; L-839 내지 L-890; G-840 내지 L-890; D-841 내지 L-890; W-842 내지 L-890; S-843 내지 L-890; E-844 내지 L-890; C-845 내지 L-890; S-846 내지 L-890; S-847 내지 L-890; T-848 내지 L-890; C-849 내지 L-890; G-850 내지 L-890; A-851 내지 L-890; G-852 내지 L-890; W-853 내지 L-890; Q-854 내지 L-890; R-855 내지 L-890; R-856 내지 L-890; T-857 내지 L-890; V-858 내지 L-890; E-859 내지 L-890; C-860 내지 L-890; R-861 내지 L-890; D-862 내지 L-890; P-863 내지 L-890; S-864 내지 L~890; G-865 내지 L-890; Q-866 내지 L-890; A-867 내지 L-890; S-868 내지 L-890; A-869 내지 L-890; T-870 내지 L-890; C-871 내지 L-890; N-872 내지 L-890; K-873 내지 L-890; A-874 내지 L-890; L-875 내지 L-890; K-876 내지 L-890; P-877 내지 L-890; E-878 내지 L-890; D-879 내지 L-890; A-880 내지 L-890; K-881 내지 L-890; P-882 내지 L-890; C-883 내지 L-890; E-884 내지 L-890; S-885 내지 L-890.
또한, METH2 폴리펩티드의 C-말단 결실은 일반식 1-n2로 표시할 수 있는데, 여기서 n2는 2 내지 890의 정수이고, n은 서열 번호 4에서 확인된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 바람직하게는, 서열 번호 4로서 제시된 본 발명의 METH2 폴리펩티드의 C-말단 결실은 다음 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: 서열 번호 4의 M-1 내지 P-889; M-1 내지 C-888; M-1 내지 L-887; M-1 내지 Q-886; M-1 내지 S-885; M-1 내지 E-884; M-1 내지 C-883; M-1 내지 P-882; M-1 내지 K-881; M-1 내지 A-880; M-1 내지 D-879; M-1 내지 E-878; M-1 내지 P-877; M-1 내지 K-876; M-1 내지 L-875; M-1 내지 A-874; M-1 내지 K-873; M-1 내지 N-872; M-1 내지 C-871; M-1 내지 T-870; M-1 내지 A-869; M-1 내지 S-868; M-1 내지 A-867; M-1 내지 Q-866; M-1 내지 G-865; M-1 내지 S-864; M-1 내지 P-863; M-1 내지 D-862; M-1 내지 R-861; M-1 내지 C-860; M-1 내지 E-859; M-1 내지 V-858; M-1 내지 T-857; M-1 내지 R-856; M-1 내지 R-855; M-1 내지 Q-854; M-1 내지 W-853; M-1 내지 G-852; M-1 내지 A-851; M-1 내지 G-850; M-1 내지 C-849; M-1 내지 T-848; M-1 내지 S-847; M-1 내지 S-846; M-1 내지 C-845; M-1 내지 E-844; M-1 내지 S-843;M-1 내지 W-842; M-1 내지 D-841; M-1 내지 G-840; M-1 내지 L-839; M-1 내지 V-838; M-1 내지 W-837; M-1 내지 Q-836; M-1 내지 A-835; M-1 내지 H-834; M-1 내지 L-833; M-1 내지 L-832; M-1 내지 P-831; M-1 내지 Q-830; M-1 내지 I-829; M-1 내지 I-828; M-1 내지 N-827; M-1 내지 T-826; M-1 내지 T-825; M-1 내지 A-824; M-1 내지 R-823; M-1 내지 E-822; M-1 내지 K-821; M-1 내지 S-820; M-1 내지 S-819; M-1 내지 Q-818; M-1 내지 M-817; M-1 내지 S-816; M-1 내지 F-815; M-1 내지 D-814; M-1 내지 V-813; M-1 내지 D-812; M-1 내지 N-811; M-1 내지 P-810; M-1 내지 V-809; M-1 내지 F-808; M-1 내지 F-807; M-1 내지 T-806; M-1 내지 Y-805; M-1 내지 K-804; M-1 내지 V-803; M-1 내지 K-802; M-1 내지 P-801; M-1 내지 P-800; M-1 내지 F-799; M-1 내지 V-798; M-1 내지 E-797; M-1 내지 G-796; M-1 내지 P-795; M-1 내지 V-794; M-1 내지 T-793; M-1 내지 L-792; M-1 내지 L-791; M-1 내지 Q-790; M-1 내지 V-789; M-1 내지 T-788; M-1 내지 L-787; M-1 내지 P-786; M-1 내지 E-785; M-1 내지 P-784; M-1 내지 L-783; M-1 내지 P-782; M-1 내지 R-781; M-1 내지 F-780; M-1 내지 S-779; M-1 내지 Q-778; M-1 내지 L-777; M-1 내지 R-776; M-1 내지 E-775; M-1 내지 L-774; M-1 내지 T-773; M-1 내지 A-772; M-1 내지 I-771; M-1 내지 S-770; M-1 내지 G-769; M-1 내지 S-768; M-1 내지 Y-767; M-1 내지 K-766; M-1 내지 L-765; M-1 내지 I-764; M-1 내지 T-763; M-1 내지 G-762; M-1 내지 K-761; M-1 내지 V-760; M-1 내지 L-759; M-1 내지 I-758; M-1 내지 D-757; M-1 내지 Q-756; M-1 내지 E-755; M-1 내지 I-754; M-1 내지 A-753; M-1 내지 S-752; M-1 내지 I-751; M-1 내지 A-750; M-1 내지 L-749; M-1 내지 N-748; M-1 내지 G-747;M-1 내지 N-746; M-1 내지 L-745; M-1 내지 L-744; M-1 내지 Y-743; M-1 내지 Q-742; M-1 내지 G-741; M-1 내지 D-740; M-1 내지 A-739; M-1 내지 T-738; M-1 내지 K-737; M-1 내지 L-736; M-1 내지 A-735; M-1 내지 L-734; M-1 내지 Y-733; M-1 내지 N-732; M-1 내지 G-731; M-1 내지 D-730; M-1 내지 N-729; M-1 내지 Q-728; M-1 내지 V-727; M-1 내지 G-726; M-1 내지 P-725; M-1 내지 H-724; M-1 내지 S-723; M-1 내지 R-722; M-1 내지 Q-721; M-1 내지 K-720; M-1 내지 V-719; M-1 내지 D-718; M-1 내지 I-717; M-1 내지 N-716; M-1 내지 T-715; M-1 내지 A-714; M-1 내지 G-713; M-1 내지 A-712; M-1 내지 P-711; M-1 내지 I-710; M-1 내지 T-709; M-1 내지 V-708; M-1 내지 I-707; M-1 내지 D-706; M-1 내지 N-705; M-1 내지 Y-704; M-1 내지 G-703; M-1 내지 Y-702; M-1 내지 N-701; M-1 내지 T-700; M-1 내지 P-699; M-1 내지 T-698; M-1 내지 L-697; M-1 내지 S-696; M-1 내지 G-695; M-1 내지 S-694; M-1 내지 V-693; M-1 내지 K-692; M-1 내지 R-691; M-1 내지 C-690; M-1 내지 S-689; M-1 내지 N-688; M-1 내지 G-687; M-1 내지 K-686; M-1 내지 G-685; M-1 내지 G-684; M-1 내지 C-683; M-1 내지 V-682; M-1 내지 G-681; M-1 내지 C-680; M-1 내지 K-679; M-1 내지 D-678; M-1 내지 L-677; M-1 내지 K-676; M-1 내지 R-675; M-1 내지 P-674; M-1 내지 S-673; M-1 내지 D-672; M-1 내지 V-671; M-1 내지 V-670; M-1 내지 H-669; M-1 내지 D-668; M-1 내지 C-667; M-1 내지 G-666; M-1 내지 A-665; M-1 내지 K-664; M-1 내지 V-663; M-1 내지 C-662; M-1 내지 Q-661; M-1 내지 G-660; M-1 내지 R-659; M-1 내지 V-658; M-1 내지 C-657; M-1 내지 I-656; M-1 내지 A-655; M-1 내지 L-654; M-1 내지 T-653; M-1 내지 E-652; M-1 내지 P-651;M-1 내지 G-650; M-1 내지 C-649; M-1 내지 L-648; M-1 내지 T-647; M-1 내지 G-646; M-1 내지 D-645; M-1 내지 I-644; M-1 내지 V-643; M-1 내지 K-642; M-1 내지 A-641; M-1 내지 E-640; M-1 내지 F-639; M-1 내지 V-638; M-1 내지 K-637; M-1 내지 F-636; M-1 내지 E-635; M-1 내지 S-634; M-1 내지 R-633; M-1 내지 G-632; M-1 내지 R-631; M-1 내지 A-630; M-1 내지 R-629; M-1 내지 C-628; M-1 내지 F-627; M-1 내지 L-626; M-1 내지 K-625; M-1 내지 C-624; M-1 내지 R-623; M-1 내지 D-622; M-1 내지 R-621; M-1 내지 P-620; M-1 내지 S-619; M-1 내지 V-618; M-1 내지 G-617; M-1 내지 A-616; 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M-1 내지 C-543; M-1 내지 T-542; M-1 내지 R-541; M-1 내지 S-540; M-1 내지 C-539; M-1 내지 E-538; M-1 내지 G-537; M-1 내지 W-536; M-1 내지 P-535; M-1 내지 G-534; M-1 내지 W-533; M-1 내지 P-532; M-1 내지 A-531; M-1 내지 W-530; M-1 내지 G-529; M-1 내지 G-528; M-1 내지 D-527; M-1 내지 V-526; M-1 내지 V-525; M-1 내지 P-524; M-1 내지 K-523; M-1 내지 P-522; M-1 내지 R-521; M-1 내지 E-520; M-1 내지 V-519; M-1 내지 E-518; M-1 내지 E-517; M-1 내지 E-516; M-1 내지 P-515; M-1 내지 L-514; M-1 내지 C-513; M-1 내지 S-512; M-1 내지 G-511; M-1 내지 E-510; M-1 내지 S-509; M-1 내지 C-508; M-1 내지 L-507; M-1 내지 H-506; M-1 내지 G-505; M-1 내지 P-504; M-1 내지 G-503; M-1 내지 C-502; M-1 내지 P-501; M-1 내지 T-500; M-1 내지 G-499; M-1 내지 D-498; M-1 내지 A-497; M-1 내지 W-496; M-1 내지 P-495; M-1 내지 L-494; M-1 내지 S-493; M-1 내지 G-492; M-1 내지 N-491; M-1 내지 K-490; M-1 내지 T-489; M-1 내지 H-488; M-1 내지 C-487; M-1 내지 L-486; M-1 내지 P-485; M-1 내지 E-484; M-1 내지 A-483; M-1 내지 G-482; M-1 내지 D-481; M-1 내지 T-480; M-1 내지 H-479; M-1 내지 C-478; M-1 내지 W-477; M-1 내지 L-476; M-1 내지 Q-475; M-1 내지 A-474; M-1 내지 C-473; M-1 내지 V-472; M-1 내지 D-471; M-1 내지 Q-470; M-1 내지 A-469; M-1 내지 S-468; M-1 내지 T-467; M-1 내지 N-466; M-1 내지 P-465; M-1 내지 C-464; M-1 내지 H-463; M-1 내지 R-462; M-1 내지 F-461; M-1 내지 D-460; M-1 내지 P-459;M-1 내지 G-458; M-1 내지 F-457; M-1 내지 I-456; M-1 내지 Q-455; M-1 내지 R-454; M-1 내지 C-453; M-1 내지 Q-452; M-1 내지 Q-451; M-1 내지 D-450; M-1 내지 L-449; M-1 내지 Q-448; M-1 내지 Y-447; M-1 내지 L-446; M-1 내지 A-445; M-1 내지 M-444; M-1 내지 R-443; M-1 내지 G-442; M-1 내지 P-441; M-1 내지 L-440; M-1 내지 G-439; M-1 내지 T-438; M-1 내지 P-437; M-1 내지 L-436; M-1 내지 P-435; M-1 내지 L-434; M-1 내지 A-433; M-1 내지 A-432; M-1 내지 G-431; M-1 내지 P-430; M-1 내지 A-429; M-1 내지 D-428; M-1 내지 L-427; M-1 내지 L-426; M-1 내지 C-425; M-1 내지 D-424; M-1 내지 G-423; M-1 내지 H-422; M-1 내지 G-421; M-1 내지 G-420; M-1 내지 D-419; M-1 내지 L-418; M-1 내지 L-417; M-1 내지 E-416; M-1 내지 T-415; M-1 내지 L-414; M-1 내지 Y-413; M-1 내지 M-412; M-1 내지 A-411; M-1 내지 S-410; M-1 내지 C-409; M-1 내지 P-408; M-1 내지 S-407; M-1 내지 W-406; M-1 내지 P-405; M-1 내지 L-404; M-1 내지 T-403; M-1 내지 Q-402; M-1 내지 N-401; M-1 내지 L-400; M-1 내지 H-399; M-1 내지 V-398; M-1 내지 F-397; M-1 내지 L-396; M-1 내지 P-395; M-1 내지 A-394; M-1 내지 M-393; M-1 내지 V-392; M-1 내지 H-391; M-1 내지 H-390; M-1 내지 K-389; M-1 내지 G-388; M-1 내지 M-387; M-1 내지 P-386; M-1 내지 G-385; M-1 내지 F-384; M-1 내지 L-383; M-1 내지 R-382; M-1 내지 T-381; M-1 내지 C-380; M-1 내지 P-379; M-1 내지 K-378; M-1 내지 S-377; M-1 내지 D-376; M-1 내지 D-375; M-1 내지 H-374; M-1 내지 P-373; M-1 내지 M-372; M-1 내지 S-371; M-1 내지 L-370; M-1 내지 V-369; M-1 내지 H-368; M-1 내지 G-367; M-1 내지 L-366; M-1 내지 E-365; M-1 내지 H-364; M-1 내지 A-363;M-1 내지 L-362; M-1 내지 T-361; M-1 내지 H-360; M-1 내지 A-359; M-1 내지 A-358; M-1 내지 Q-357; M-1 내지 L-356; M-1 내지 G-355; M-1 내지 E-354; M-1 내지 D-353; M-1 내지 E-352; M-1 내지 I-351; M-1 내지 V-350; M-1 내지 S-349; M-1 내지 C-348; M-1 내지 S-347; M-1 내지 K-346; M-1 내지 N-345; M-1 내지 P-344; M-1 내지 D-343; M-1 내지 C-342; M-1 내지 I-341; M-1 내지 T-340; M-1 내지 G-339; M-1 내지 I-338; M-1 내지 D-337; M-1 내지 A-336; M-1 내지 V-335; M-1 내지 G-334; M-1 내지 L-333; M-1 내지 T-332; M-1 내지 D-331; M-1 내지 C-330; M-1 내지 L-329; M-1 내지 G-328; M-1 내지 E-327; M-1 내지 Q-326; M-1 내지 G-325; M-1 내지 C-324; M-1 내지 F-323; M-1 내지 N-322; M-1 내지 Q-321; M-1 내지 R-320; M-1 내지 T-319; M-1 내지 L-318; M-1 내지 L-317; M-1 내지 I-316; M-1 내지 A-315; M-1 내지 T-314; M-1 내지 D-313; M-1 내지 Y-312; M-1 내지 H-311; M-1 내지 E-310; M-1 내지 P-309; M-1 내지 H-308; M-1 내지 R-307; M-1 내지 D-306; M-1 내지 S-305; M-1 내지 P-304; M-1 내지 Q-303; M-1 내지 N-302; M-1 내지 F-301; M-1 내지 R-300; M-1 내지 R-299; M-1 내지 Q-298; M-1 내지 W-297; M-1 내지 N-296; M-1 내지 C-295; M-1 내지 F-294; M-1 내지 N-293; M-1 내지 R-292; M-1 내지 L-291; M-1 내지 T-290; M-1 내지 L-289; M-1 내지 G-288; M-1 내지 G-287; M-1 내지 N-286; M-1 내지 D-285; M-1 내지 S-284; M-1 내지 V-283; M-1 내지 E-282; M-1 내지 P-281; M-1 내지 G-280; M-1 내지 W-279; M-1 내지 K-278; M-1 내지 E-277; M-1 내지 D-276; M-1 내지 E-275; M-1 내지 V-274; M-1 내지 I-273; M-1 내지 L-272; M-1 내지 V-271; M-1 내지 K-270; M-1 내지 V-269; M-1 내지 V-268; M-1 내지 M-267;M-1 내지 L-266; M-1 내지 N-265; M-1 내지 I-264; M-1 내지 S-263; M-1 내지 N-262; M-1 내지 K-261; M-1 내지 I-260; M-1 내지 S-259; M-1 내지 P-258; M-1 내지 H-257; M-1 내지 K-256; M-1 내지 Y-255; M-1 내지 I-254; M-1 내지 R-253; M-1 내지 A-252; M-1 내지 A-251; M-1 내지 V-250; M-1 내지 S-249; M-1 내지 M-248; M-1 내지 L-247; M-1 내지 T-246; M-1 내지 L-245; M-1 내지 I-244; M-1 내지 H-243; M-1 내지 N-242; M-1 내지 Q-241; M-1 내지 L-240; M-1 내지 D-239; M-1 내지 A-238; M-1 내지 G-237; M-1 내지 Y-236; M-1 내지 F-235; M-1 내지 A-234; M-1 내지 A-233; M-1 내지 M-232; M-1 내지 S-231; M-1 내지 A-230; M-1 내지 D-229; M-1 내지 A-228; M-1 내지 V-227; M-1 내지 L-226; M-1 내지 L-225; M-1 내지 T-224; M-1 내지 E-223; M-1 내지 V-222; M-1 내지 F-221; M-1 내지 R-220; M-1 내지 A-219; M-1 내지 E-218; M-1 내지 S-217; M-1 내지 V-216; M-1 내지 F-215; M-1 내지 R-214; M-1 내지 K-213; M-1 내지 T-212; M-1 내지 R-211; M-1 내지 S-210; M-1 내지 T-209; M-1 내지 A-208; M-1 내지 G-207; M-1 내지 L-206; M-1 내지 P-205; M-1 내지 P-204; M-1 내지 P-203; M-1 내지 P-202; M-1 내지 E-201; M-1 내지 S-200; M-1 내지 A-199; M-1 내지 G-198; M-1 내지 E-197; M-1 내지 A-196; M-1 내지 E-195; M-1 내지 E-194; M-1 내지 E-193; M-1 내지 Q-192; M-1 내지 S-191; M-1 내지 E-190; M-1 내지 E-189; M-1 내지 E-188; M-1 내지 S-187; M-1 내지 D-186; M-1 내지 E-185; M-1 내지 Q-184; M-1 내지 H-183; M-1 내지 D-182; M-1 내지 G-181; M-1 내지 R-180; M-1 내지 E-179; M-1 내지 Q-178; M-1 내지 R-177; M-1 내지 Q-176; M-1 내지 G-175; M-1 내지 E-174; M-1 내지 G-173; M-1 내지 T-172; M-1 내지 E-171;M-1 내지 V-170; M-1 내지 E-169; M-1 내지 W-168; M-1 내지 E-167; M-1 내지 P-166; M-1 내지 G-165; M-1 내지 R-164; M-1 내지 P-163; M-1 내지 L-162; M-1 내지 P-161; M-1 내지 R-160; M-1 내지 A-159; M-1 내지 G-158; M-1 내지 A-157; M-1 내지 P-156; M-1 내지 G-155; M-1 내지 W-154; M-1 내지 R-153; M-1 내지 Q-152; M-1 내지 L-151; M-1 내지 R-150; M-1 내지 H-149; M-1 내지 P-148; M-1 내지 Q-147; M-1 내지 A-146; M-1 내지 L-145; M-1 내지 S-144; M-1 내지 G-143; M-1 내지 G-142; M-1 내지 A-141; M-1 내지 G-140; M-1 내지 Q-139; M-1 내지 P-138; M-1 내지 Q-137; M-1 내지 I-136; M-1 내지 T-135; M-1 내지 F-134; M-1 내지 E-133; M-1 내지 E-132; M-1 내지 G-131; M-1 내지 D-130; M-1 내지 L-129; M-1 내지 L-128; M-1 내지 F-127; M-1 내지 S-126; M-1 내지 G-125; M-1 내지 S-124; M-1 내지 L-123; M-1 내지 G-122; M-1 내지 R-121; M-1 내지 C-120; M-1 내지 L-119; M-1 내지 S-118; M-1 내지 V-117; M-1 내지 A-116; M-1 내지 A-115; M-1 내지 L-114; M-1 내지 S-113; M-1 내지 E-112; M-1 내지 P-111; M-1 내지 E-110; M-1 내지 G-109; M-1 내지 N-108; M-1 내지 V-107; M-1 내지 T-106; M-1 내지 G-105; M-1 내지 S-104; M-1 내지 F-103; M-1 내지 F-102; M-1 내지 C-101; M-1 내지 G-100; M-1 내지 R-99; M-1 내지 L-98; M-1 내지 G-97; M-1 내지 R-96; M-1 내지 E-95; M-1 내지 G-94; M-1 내지 G-93; M-1 내지 T-92; M-1 내지 A-91; M-1 내지 R-90; M-1 내지 G-89; M-1 내지 S-88; M-1 내지 G-87; M-1 내지 G-86; M-1 내지 L-85; M-1 내지 R-84; M-1 내지 E-83; M-1 내지 I-82; M-1 내지 K-81; M-1 내지 F-80; M-1 내지 E-79; M-1 내지 P-78; M-1 내지 A-77; M-1 내지 L-76; M-1 내지 F-75; M-1 내지 S-74; M-1 내지 D-73; M-1 내지 D-72; M-1 내지 P-71; M-1 내지 A-70; M-1 내지 L-69; M-1 내지 R-68; M-1 내지 L-67; M-1 내지 V-66; M-1 내지 F-65; M-1 내지 G-64; M-1 내지 K-63; M-1 내지 G-62; M-1 내지 F-61; M-1 내지 A-60; M-1 내지 S-59; M-1 내지 L-58; M-1 내지 H-57; M-1 내지 L-56; M-1 내지 A-55; M-1 내지 L-54; M-1 내지 E-53; M-1 내지 G-52; M-1 내지 A-51; M-1 내지 S-50; M-1 내지 G-49; M-1 내지 P-48; M-1 내지 L-47; M-1 내지 R-46; M-1 내지 T-45; M-1 내지 P-44; M-1 내지 V-43; M-1 내지 V-42; M-1 내지 L-41; M-1 내지 E-40; M-1 내지 S-39; M-1 내지 A-38; M-1 내지 Q-37; M-1 내지 G-36; M-1 내지 G-35; M-1 내지 A-34; M-1 내지 A-33; M-1 내지 P-32; M-1 내지 R-31; M-1 내지 A-30; M-1 내지 P-29; M-1 내지 A-28; M-1 내지 G-27; M-1 내지 R-26; M-1- 내지 A-25; M-1 내지 L-24; M-1 내지 P-23; M-1 내지 L-22; M-1 내지 L-21; M-1 내지 L-20; M-1 내지 L-19; M-1 내지 L-18; M-1 내지 L-17; M-1 내지 L-16; M-1 내지 L-15; M-1 내지 L-14; M-1 내지 F-13; M-1 내지 P-12; M-1 내지 L-11; M-1 내지 W-10; M-1 내지 R-9; M-1 내지 P-8; M-1 내지 A-7. 바람직하게는, 상기 제시한 임의의 N-말단 또는 C-말단 결실을 조합하여 N- 및 C-말단 결실된 METH2 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 아미노 말단과 카르복시 말단 둘다로부터 하나 이상의 아미노산이 결실된 폴리펩티드를 제공하며, 이들은 서열 번호 2의 m1-n1잔기 또는 서열 번호 4의 m2-n2잔기를 갖는 것으로 설명된다(m과 n은 전술한 바와 같이 정수이다).
본 발명은 또한 METH1의 메탈로프로테아제 도메인의 돌연변이를 제공하며,이들은 일반식 m3-n3으로 기재되며, 이때 m3은 205 내지 265의 정수이고 n3은 285 내지 950의 정수이며, m3과 n3은 서열 번호 2에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 본 발명은 추가로 METH1의 메탈로프로테아제 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m4-n4로 기재되며, 이때 m4은 1 내지 409의 정수이고 n4은 429 내지 489의 정수이며, m4와 n4는 서열 번호 2에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 또한 METH1의 디스인테그린 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m5-n5로 기재되며, 이때 m5는 430 내지 490의 정수이고 n5는 510 내지 950의 정수이며, m5와 n5는 서열 번호 2에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 추가로 METH1의 디스인테그린 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m6-n6으로 기재되며, 이때 m6은 1 내지 494의 정수이고 n6은 514 내지 574의 정수이며, m6과 n6은 서열 번호 2에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 추가로 METH1의 TSP1 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m7-n7로 기재되며, 이때 m7은 515 내지 575의 정수이고 n7은 595 내지 950의 정수이며, m7과 n7은 서열 번호 2에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 또한 METH1의 TSP1 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식m8-n8로 기재되며, 이때 m8은 1 내지 548의 정수이고 n8은 568 내지 628의 정수이며, m8과 n8은 서열 번호 2에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 또한 METH1의 TSP2 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m9-n9로 기재되며, 이때 m9는 801 내지 871의 정수이고 n9는 891 내지 950의 정수이며, m9와 n9는 서열 번호 2에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 또한 METH1의 TSP2 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m10-n10로 기재되며, 이때 m10은 1 내지 834의 정수이고 n10은 864 내지 924의 정수이며, m10과 n10은 서열 번호 2에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 또한 METH1의 TSP3 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m11-n11로 기재되며, 이때 m11은 865 내지 925의 정수이고 n11은 945 내지 950의 정수이며, m11과 n11은 서열 번호 2에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 본 발명은 또한 METH1의 TSP3 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m12-n12로 기재되며, 이때 m12는 1 내지 884의 정수이고 n12는 904 내지 950의 정수이며, m12와 n12는 서열 번호 2에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 또한 METH2의 메탈로프로테아제 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m13-n13으로 기재되며, 이때 m13은 184 내지 244의 정수이고 n13은 264내지 890의 정수이며, m13과 n13은 서열 번호 4에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 본 발명은 또한 METH2의 메탈로프로테아제 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m14-n14로 기재되며, 이때 m14는 1 내지 389의 정수이고 n14는 409 내지 469의 정수이며, m14와 n14는 서열 번호 4에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 또한 METH2의 디스인테그린 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m15-n15로 기재되며, 이때 m15는 400 내지 470의 정수이고 n15는 490 내지 890의 정수이며, m15와 n15는 서열 번호 4에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 본 발명은 또한 METH2의 디스인테그린 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m16-n16으로 기재되며, 이때 m16은 1 내지 479의 정수이고 n16은 499 내지 559의 정수이며, m16과 n16은 서열 번호 4에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 또한 METH2의 TSP1 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m17-n17로 기재되며, 이때 m17은 500 내지 560의 정수이고 n17은 580 내지 890의 정수이며, m17과 n17은 서열 번호 4에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 본 발명은 또한 METH2의 TSP1 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m18-n18로 기재되며, 이때 m18은 1 내지 533의 정수이고 n18은 553 내지 613의 정수이며, m18과 n18은 서열 번호 4에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
본 발명은 또한 METH2의 TSP2 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m19-n19로 기재되며, 이때 m19는 807 내지 867의 정수이고 n19는 887 내지 890의 정수이며, m19와 n19는 서열 번호 4에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 본 발명은 또한 METH2의 TSP2 도메인의 돌연변이를 제공하며, 이들은 일반식 m20-n20로 기재되며, 이때 m20은 1 내지 840의 정수이고 n20은 860 내지 890의 정수이며, m20과 n20은 서열 번호 4에 개시된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다.
구조적 도메인 또는 기능적 도메인에 의해 특징되는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드 단편 또한 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구체예는 알파-헬릭스와 알파-헬릭스 형성 영역("알파-영역"), 베타-시트와 베타-시트-형성 영역("베타-영역"), 턴(turn) 및 턴-형성 영역("턴-영역"), 코일 및 코일-형성 영역("코일-영역"), 친수성 영역, 소수성 영역, 알파 양극성 영역, 베타 양극성 영역, 가요성 영역, 표면-형성 영역, 기질 결합 영역, 및 고 항원성 지수 영역을 포함하는 단편을 포함한다. 도면에 나타난 바와 같이, 그러한 바람직한 영역은 가니어-롭슨(Garnier-Robson) 알파-영역, 베타-영역, 턴-영역, 및 코일-영역, 초우-파스만(Chow-Fasman) 알파-영역, 베타-영역, 및 턴-영역, 카이트-둘리틀(Kyte-Dolittle) 친수성 영역 및 소수성 영역, 아이젠버그(Eisenberg) 알파 및 베타 양극성 영역, 카플러스-슐츠(Karplus-Schulz) 가요성 영역, 에미니(Emini) 표면-형성 영역 및 제임슨-울프(Jameson-Wolf) 고 항원성 지수 영역을 포함한다. 보존된 도메인에 속하는 서열번호 2의 폴리펩티드 단편은 본 발명에 의해 특히 고려된다(도 10및 11과 표1 및 2 참고). 더욱이, 이들 도메인을 암호하는 폴리뉴클레오티드 단편 또한 고려된다.
다른 바람직한 단편은 생물학적 활성 METH1 또는 METH2 단편이다. 생물학적 활성 단편은 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 활성과 반드시 동일하지는 않으나 유사한 활성을 보이는 것들이다. 단편의 생물학적 활성은 개선된 바람직한 활성, 또는 감소된 비바람직한 활성을 포함한다. 하지만, EST 서열과 같은 많은 폴리뉴클레오티드 서열이 공지되어 있으며 서열 데이타베이스를 통해 접근가능하다. 이들 서열 중 일부는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 관련되며, 본 발명의 인식 이전에 공지되었을 수도 있다. 바람직하게는, 그러한 관련 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 범위로부터 배제된다. 모든 관련 서열을 나열하는 것은 성가실 것이다. 따라서, a-b 일반식(이때, a는 서열 번호 1의 1과 936 사이의 임의의 정수이고, b는 15 내지 950의 정수이며, 이때 a와 b 둘다 서열 번호 1에 나타난 뉴클레오티드 잔기의 위치에 해당하며, b는 +14이상임)으로 개시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 본 발명으로부터 제외되는 것이 바람직하다. 또한, a-b 일반식(이때, a는 서열 번호 3의 1과 876 사이의 임의의 정수이고, b는 15 내지 890의 정수이며, 이때 a와 b 둘다 서열 번호 3에 나타난 뉴클레오티드 잔기의 위치에 해당하며, b는 +14이상임)으로 개시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 본 발명으로부터 제외되는 것이 바람직하다.
전술한 단편들은 하기하는 바와 같은 Fc 또는 플래그(flag) 융합 단백질과 같은 융합 단백질의 제조에 사용될 수도 있다.
에피토프와 항체
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분을 포함하는 펩티드와 폴리펩티드를 제공한다. 이들 에피토프는 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 본 발명의 전체 폴리펩티드, 또는 그 단편이 면역원일 때 생체내에서 항체 반응을 유도하는 단백질의 부분으로 정의된다. 다른 한편으로는, 항체가 결합할 수 있는 폴리펩티드의 영역을 "항원성 결정인자" 또는 "항원성 에피토프"로 정의한다. 단백질의 생체내 면역원성 에피토프의 수는 일반적으로 항원성 에피토프의 수보다 적다. Geysen, et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81:3998-4002 참고. 하지만, 항체는 파지 디스플레이와 같은 방법을 이용하여, 면역원성 에피토프인가에 관계없이 항원성 에피토프에 대해 만들어질 수 있다. Petersen G.et al.(1995) Mol.Gen.Genet.249:425-431 참고. 따라서, 면역원성 에피토프와 항원성 에피토프 모두 본 발명에 포함된다.
면역원성 에피토프를 포함하는 예시된 아미노산 서열의 리스트가 표1과 표2에 기재된다. 표1과 표2는 단지 제임슨과 울프(1988) Comp.Appl.Biosci. 4:181-186(전체가 본원에 참고로 통합됨)의 알고리즘을 이용하여 가장 높은 항원성을 갖는 것으로 예측된 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기만을 열거한다. 제임슨-울프 항원성 분석은 디폴트(default) 파라미터를 이용하는 컴퓨터 프로그램 PROTEAN(Power MacIntosh, DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madison, WI 를 위한 버젼 3.11)을 이용하여 실행되었다. 표 1과 2 및 표1과 2에 나열되지 않은 폴리펩티드의 부분들은 비-면역원성인 것으로 간주되지 않는다. 표1과 2의 면역원성에피토프는 예시일 뿐이며, 완전한 리스트가 아니며, 이는 다른 면역원성 에피토프는 사용된 특정 알고리즘에 의해 인식되지 않았을 뿐이기 때문이다. 다른 면역원성 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기는 제임슨-울프 분석과 유사한 알고리즘을 사용하거나 당업계에 공지된 방법을 이용하여 항원성 반응에 대해 생체내 실험함으로써 결정될 수 있다. Geysen et al., 상기; 미국 특허 제4,708,781호; 5,194,392호; 4,433,092호; 및 5,480,971호 참고(참고로 본원에 통합됨).
본 발명의 항원성 에피토프-함유 펩티드와 폴리펩티드는 본 발명 폴리펩티드의 아미노산 서열에 함유된 적어도 7, 더욱 바람직하게는 적어도 9, 가장 바람직하게는 약 15 내지 약 30 아미노산의 서열을 함유하는 것이 바람직하다.
DNAstar 분석을 이용하여, 서열 번호 2는 아미노산 2-14, 32-44, 47-60, 66-78, 87-103, 109-118, 146-162, 168-180, 183-219, 223-243, 275-284, 296-306, 314-334, 341-354, 357-376, 392-399, 401-410, 418-429, 438-454, 456-471, 474-488, 510-522, 524-538, 550-561, 565-626, 630-643, 659-671, 679-721, 734-749, 784-804, 813-820, 825-832, 845-854, 860-894, 899-917, 919-924 및 928-939 에서 항원성으로 밝혀졌다.
DNAstar 분석을 이용하여, 서열 번호 4는 아미노산 26-38, 45-52, 69-76, 80-99, 105-113, 129-136, 138-217, 254-263, 273-289, 294-313, 321-331, 339-356, 371-383, 417-427, 438-443, 459-471, 479-505, 507-526, 535-546, 550-607, 615-640, 648-653, 660-667, 669-681, 683-704, 717-732, 737-743, 775-787, 797-804, 811-825, 840-867 및 870-884에서 항원성으로 밝혀졌다.
따라서, METH1 및/또는 METH2의 이들 영역은 METH1 및/또는 METH2-특이적 항체를 생성시키기 위해 이용될 수 있는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드의 비제한적 예이다.
표1과 2의 아미노산 서열이 면역원성 에피토프를 포함한다는 것이 특히 주목된다. 표1 과 2는 제임슨-울프 분석에 의해 결정된 면역원성 에피토프의 중요한 잔기들만을 나열한다. 따라서, N-말단, C-말단 또는 N- 및 C- 말단 상의 부가적인 인접(flanking) 잔기를 표1 과 2의 서열에 부가하여 본 발명의 에피토프-함유 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 따라서, 표1과 2의 면역원성 에피토프는 부가적인 N-말단 또는 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다. 부가적인 인접 아미노산 잔기는 본 발명의 폴리펩티드로부터의 연속하는 인접 N-말단 및/또는 C-말단 서열 또는 이종성 폴리펩티드 서열일 수도 있고, 또는 본 발명의 폴리펩티드로부터의 연속하는 인접 서열과 이종성 폴리펩티드 서열 둘다를 포함할 수도 있다.
면역원성 또는 항원성 에피토프를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 7개의 아미노산 길이이다. "적어도"는 면역원성 또는 항원성 에피토프를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드가 7개 아미노산 길이일 수도 있고 또는 7개 아미노산과 본 발명의 총길이 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 수 사이의 임의의 정수일 수도 있다. 면역원성 또는 항원성 에피토프를 포함하는 바람직한 폴리펩티드는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 아미노산 잔기 길이이다. 하지만, 7과 총 길이 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 수 사이의 각각 및 모든 정수가 본 발명에 포함된다.
면역원 및 항원성 에피토프-함유 단편은 전술한 바처럼, 연속하는 아미노산 잔기 수에 의해 특정되거나 또는 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열상의 이들 단편의 N-말단과 C-말단 위치에 의해 추가로 특정될 수도 있다. 적어도 7 또는 적어도 15 연속 아미노산 잔기 길이의 단편이 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열상에 차지할 수 있는 N-말단 및 C-말단 위치의 모든 조합이 본 발명에 포함된다. 다시, "적어도 7 연속 아미노산 잔기 길이"는 7 아미노산 잔기 길이 또는 7 아미노산과 본 발명의 총 길이 폴리펩티드의 아미노산 잔기 수 사이의 임의의 정수를 의미한다. 구체적으로, 7과 총 길이 폴리펩티드의 아미노산 잔기 수 사이의 각각 및 모든 정수가 본 발명에 포함된다.
본 발명의 면역원성 및 항원성 에피토프-함유 폴리펩티드는 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 만들거나, 본 발명의 폴리펩티드를 검출하기 위한 면역 분석에 유용하다. 예를 들어, 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 친화성 정제에 유용하다. 항체는 또한 당업계에 공지된 방법들을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 다양한 정량 또는 정성 면역분석에 일상적으로 이용될 수도 있다. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd Ed.1988) 참고.
본 발명의 에피토프-함유 폴리펩티드는 당업계에 공지된 합성 및 재조합 방법을 포함하는 통상적인 폴리펩티드 제조 수단에 의해 생산될 수도 있다. 예를 들어, 에피토프-함유 펩티드는 화학 합성의 공지된 방법을 이용하여 합성될 수도 있다. 예를 들어, 휴튼(Houghten)은 HA1 폴리펩티드의 단편의 1 아미노산 변이를 나타내는 248개의 각각 구별되는 13잔기 펩티드의 10-20 mgs 과 같은 많은 수의 펩티드의 합성을 위한 간단한 방법을 개시하였으며, 이들 모두 4주 이내에 제조되고 규명되었다(ELISA-유형 결합 연구에 의해)(Houghten, R.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135(1985)). 이 "동시 복수 펩티드 합성(SMPS)" 방법은 휴튼과 그 동료들에게 허여된 미국 특허 제4,631,211호에서 개시된다. 이 방법에서 다양한 펩티드의 고체상 합성을 위한 각각의 수지가 분리된 용매-투과성 패킷에 함유되어 고체상 방법에 관계된 많은 동일한 반복 단계를 적절히 이용할 수 있게 한다. 완전한 수동 방법은 500-1000 이상의 합성이 동시에 행해지도록 한다(Houghten et al.(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135)
본 발명은 서열 번호 2 및/또는 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 에피토프, 또는 ATCC 기탁번호 No.209581호 또는 209582호 또는 PTA 1478에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호되거나, 전술한 엄격한 하이브리드화 조건 또는 보다 낮은 엄격도의 하이브리드화 조건하에서 ATCC 기탁번호 209581호 또는 209582호 또는 PTA 1478호에 함유된 서열 또는 서열 번호 1 및/또는 3의 서열의 상보체에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 폴리펩티드 서열의 에피토프를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 서열의 에피토프를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열 번호 1 또는 3에 개시된 서열), 본 발명의 에피토프를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열의 상보성 쇄의 폴리뉴클레오티드 서열, 및 전술한 엄격한 하이브리드화 조건 또는 보다 낮은 엄격도 하이브리드화 조건하에서 상보성쇄에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 폴리펩티드의 부분을 말한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 에피토프를 포함하는 폴리펩티드와 이 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용된 "면역원성 에피토프"는 예를 들어 이하에 개시된 항체 생성 방법과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 때 동물에서 항체 반응을 유도하는 단백질의 부분을 말한다(Geysen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1983) 참고). 본원에서 사용된 "항원성 에피토프"는 본원에서 개시된 면역분석과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 때 항체가 그 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질의 부분을 말한다. 면역특이적 결합은 비특이적 결합을 배제하지만, 다른 항원과의 교차-반응성을 반드시 배제하지는 않는다. 항원성 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없다.
에피토프로 작용하는 단편은 임의의 통상적인 방법에 의해 생성될 수도 있다.(Houghten, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135(1985) 참고, 추가로 미국 특허 제4,631,211호에 개시됨)
본 발명에서, 항원성 에피토프는 바람직하게는 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7 아미노산의 서열, 더욱 바람직하게는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50 아미노산의 서열, 그리고 가장 바람직하게는 약 15와 약 30 사이의 아미노산의 서열을 함유하는 것이 바람직하다. 면역원성 또는항원성 에피토프를 포함하는 바람직한 폴리펩티드는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 아미노산 잔기 길이이다. 부가적으로 바람직한 METH1의 항원성 에피토프는 서열 번호 2의 M-1 내지 P-15; G-2 내지 V-16; N-3 내지 P-17; A-4 내지 T-18; E-5 내지 L-19; R-6 내지 L-20; A-7 내지 L-21; P-8 내지 L-22; G-9 내지 A-23; S-10 내지 A-24; R-11 내지 A-25; S-12 내지 L-26; F-13 내지 L-27; G-14 내지 A-28; P-15 내지 V-29; V-16 내지 S-30; P-17 내지 D-31; T-18 내지 A-32; L-19 내지 L-33; L-20 내지 G-34; L-21 내지 R-35; L-22 내지 P-36; A-23 내지 S-37; A-24 내지 E-38; A-25 내지 E-39; L-26 내지 D-40; L-27 내지 E-41; A-28 내지 E-42; V-29 내지 L-43; S-30 내지 V-44; D-31 내지 V-45; A-32 내지 P-46; L-33 내지 E-47; G-34 내지 L-48; R-35 내지 E-49; P-36 내지 R-50; S-37 내지 A-51; E-38 내지 P-52; E-39 내지 G-53; D-40 내지 H-54; E-41 내지 G-55; E-42 내지 T-56; L43 내지 T-57; V-44 내지 R-58; V-45 내지 L-59; P-46 내지 R-60; E-47 내지 L-61; L-48 내지 H-62; E-49 내지 A-63; R-50 내지 F-64; A-51 내지 D-65; P-52 내지 Q-66; G-53 내지 Q-67; H-54 내지 L-68; G-55 내지 D-69; T-56 내지 L-70; T-57 내지 E-71; R-58 내지 L-72; L-59 내지 R-73; R-60 내지 P-74; L-61 내지 D-75; H-62 내지 S-76; A-63 내지 S-77; F-64 내지 F-78; D-65 내지 L-79; Q-66 내지 A-80; Q-67 내지 P-81; L-68 내지 G-82; D-69 내지 F-83; L-70 내지 T-84; E-71 내지 L-85; L-72 내지 Q-86; R-73 내지 N-87; P-74 내지 V-88; D-75 내지 G-89; S-76 내지 R-90; S-77 내지 K-91; F-78 내지 S-92; L-79 내지 G-93; A-80 내지 S-94; P-81 내지 E-95; G-82 내지 T-96; F-83 내지 P-97; T-84내지 L-98; L-85 내지 P-99; Q-86 내지 E-100; N-87 내지 T-101; V-88 내지 D-102; G-89 내지 L-103; R-90 내지 A-104; K-91 내지 H-105; S-92 내지 C-106; G-93 내지 F-107;S-94 내지 Y-108; E-95 내지 S-109; T-96 내지 G-110; P-97 내지 T-111; L-98 내지 V-112; P-99 내지 N-113; E-100 내지 G-114; T-101 내지 D-115; D-102 내지 P-116; L-103 내지 S-117; A-104 내지 S-118; H-105 내지 A-119; C-106 내지 A-120; F-107 내지 A-121; Y-108 내지 L-122; S-109 내지 S-123; G-110 내지 L-124; T-111 내지 C-125; V-112 내지 E-126; N-113 내지 G-127; G-114 내지 V-128; D-115 내지 R-129; P-116 내지 G-130; S-117 내지 A-131; S-118 내지 F-132; A-119 내지 Y-133; A-120 내지 L-134; A-121 내지 L-135; L-122 내지 G-136; S-123 내지 E-137; L-124 내지 A-138; C-125 내지 Y-139; E-126 내지 F-140; G-127 내지 I-141; V-128 내지 Q-142; R-129 내지 P-143; G-130 내지 L-144; A-131 내지 P-145; F-132 내지 A-146; Y-133 내지 A-147; L-134 내지 S-148; L-135 내지 E-149; G-136 내지 R-150; E-137 내지 L-151; A-138 내지 A-152; Y-139 내지 T-153; F-140 내지 A-154; I-141 내지 A-155; Q-142 내지 P-156; P-143 내지 G-157; L-144 내지 E-158; P-145 내지 K-159; A-146 내지 P-160; A-147 내지 P-161; S-148 내지 A-162; E-149 내지 P-163; R-150 내지 L-164; L-151 내지 Q-165; A-152 내지 F-166; T-153 내지 H-167; A-154 내지 L-168; A-155 내지 L-169; P-156 내지 R-170; G-157 내지 R-171; E-158 내지 N-172; K-159 내지 R-173; P-160 내지 Q-174; P-161 내지 G-175; A-162 내지 D-176; P-163 내지 V-177; L-164 내지 G-178; Q-165 내지 G-179; F-166 내지 T-180; H-167 내지 C-181; L-168 내지 G-182; L-169 내지 V-183;R-170 내지 V-184; R-171 내지 D-185; N-172 내지 D-186; R-173 내지 E-187; Q-174 내지 P-188; G-175 내지 R-189; D-176 내지 P-190; V-177 내지 T-191; G-178 내지 G-192; G-179 내지 K-193; T-180 내지 A-194; C-181 내지 E-195; G-182 내지 T-196; V-183 내지 E-197; V-184 내지 D-198; D-185 내지 E-199; D-186 내지 D-200; E-187 내지 E-201; P-188 내지 G-202; R-189 내지 T-203; P-190 내지 E-204; T-191 내지 G-205; G-192 내지 E-206; K-193 내지 D-207; A-194 내지 E-208; E-195 내지 G-209; T-196 내지 P-210; E-197 내지 Q-211; D-198 내지 W-212; E-199 내지 S-213; D-200 내지 P-214; E-201 내지 Q-215; G-202 내지 D-216; T-203 내지 P-217; E-204 내지 A-218; G-205 내지 L-219; E-206 내지 Q-220; D-207 내지 G-221; E-208 내지 V-222; G-209 내지 G-223; P-210 내지 Q-224; Q-211 내지 P-225; W-212 내지 T-226; S-213 내지 G-227; P-214 내지 T-228; Q-215 내지 G-229; D-216 내지 S-230; P-217 내지 I-231; A-218 내지 R-232; L-219 내지 K-233; Q-220 내지 K-234; G-221 내지 R-235; V-222 내지 F-236; G-223 내지 V-237; Q-224 내지 S-238; P-225 내지 S-239; T-226 내지 H-240; G-227 내지 R-241; T-228 내지 Y-242; G-229 내지 V-243; S-230 내지 E-244; I-231 내지 T-245; R-232 내지 M-246; K-233 내지 L-247; K-234 내지 V-248; R-235 내지 A-249; F-236 내지 D-250; V-237 내지 Q-251; S-238 내지 S-252; S-239 내지 M-253; H-240 내지 A-254; R-241 내지 E-255; Y-242 내지 F-256; V-243 내지 H-257; E-244 내지 G-258; T-245 내지 S-259; M-246 내지 G-260; L-247 내지 L-261; V-248 내지 K-262; A-249 내지 H-263; D-250 내지 Y-264; Q-251 내지 L-265; S-252 내지 L-266; M-253 내지 T-267; A-254 내지 L-268;E-255 내지 F-269; F-256 내지 S-270; H-257 내지 V-271; G-258 내지 A-272; S-259 내지 A-273; G-260 내지 R-274; L-261 내지 L-275; K-262 내지 Y-276; H-263 내지 K-277; Y-264 내지 H-278; L-265 내지 P-279; L-266 내지 S-280; T-267 내지 I-281; L-268 내지 R-282; F-269 내지 N-283; S-270 내지 S-284; V-271 내지 V-285; A-272 내지 S-286; A-273 내지 L-287; R-274 내지 V-288; L-275 내지 V-289; Y-276 내지 V-290; K-277 내지 K-291; H-278 내지 I-292; P-279 내지 L-293; S-280 내지 V-294; I-281 내지 I-295; R-282 내지 H-296; N-283 내지 D-297; S-284 내지 E-298; V-285 내지 Q-299; S-286 내지 K-300; L-287 내지 G-301; V-288 내지 P-302; V-289 내지 E-303; V-290 내지 V-304; K-291 내지 T-305; I-292 내지 S-306; L-293 내지 N-307; V-294 내지 A-308; I-295 내지 A-309; H-296 내지 L-310; D-297 내지 T-311; E-298 내지 L-312; Q-299 내지 R-313; K-300 내지 N-314; G-301 내지 F-315; P-302 내지 C-316; E-303 내지 N-317; V-304 내지 W-318; T-305 내지 Q-319; S-306 내지 K-320; N-307 내지 Q-321; A-308 내지 H-322; A-309 내지 N-323; L-310 내지 P-324; T-311 내지 P-325; L-312 내지 S-326; R-313 내지 D-327; N-314 내지 R-328; F-315 내지 D-329; C-316 내지 A-330; N-317 내지 E-331; W-318 내지 H-332; Q-319 내지 Y-333; K-320 내지 D-334; Q-321 내지 T-335; H-322 내지 A-336; N-323 내지 I-337; P-324 내지 L-338; P-325 내지 F-339; S-326 내지 T-340; D-327 내지 R-341; R-328 내지 Q-342; D-329 내지 D-343; A-330 내지 L-344; E-331 내지 C-345; H-332 내지 G-346; Y-333 내지 S-347; D-334 내지 Q-348; T-335 내지 T-349; A-336 내지 C-350; I-337 내지 D-351; L-338 내지 T-352; F-339 내지 L-353;T-340 내지 G-354; R-341 내지 M-355; Q-342 내지 A-356; D-343 내지 D-357; L-344 내지 V-358; C-345 내지 G-359; G-346 내지 T-360; S-347 내지 V-361; Q-348 내지 C-362; T-349 내지 D-363; C-350 내지 P-364; D-351 내지 S-365; T-352 내지 R-366; L-353 내지 S-367; G-354 내지 C-368; M-355 내지 S-369; A-356 내지 V-370; D-357 내지 I-371; V-358 내지 E-372; G-359 내지 D-373; T-360 내지 D-374; V-361 내지 G-375; C-362 내지 L-376; D-363 내지 Q-377; P-364 내지 A-378; S-365 내지 A-379; 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L-492 내지 T-506; W-493 내지 K-507; C-494 내지 H-508; T-495 내지 F-509; G-496 내지 P-510; T-497 내지 W-511; S-498 내지 A-512; G-499 내지 D-513; G-500 내지 G-514; V-501 내지 T-515; L-502 내지 S-516; V-503 내지 C-517; C-504 내지 G-518; Q-505 내지 E-519; T-506 내지 G-520; K-507 내지 K-521; H-508 내지 W-522; F-509내지 C-523; P-510 내지 I-524; W-511 내지 N-525; A-512 내지 G-526; D-513 내지 K-527; G-514 내지 C-528; T-515 내지 V-529; S-516 내지 N-530; C-517 내지 K-531; G-518 내지 T-532; E-519 내지 D-533; G-520 내지 R-534; K-521 내지 K-535; W-522 내지 H-536; C-523 내지 F-537; I-524 내지 D-538; N-525 내지 T-539; G-526 내지 P-540; K-527 내지 F-541; C-528 내지 H-542; V-529 내지 G-543; N-530 내지 S-544; K-531 내지 W-545; T-532 내지 G-546; D-533 내지 M-547; R-534 내지 W-548; K-535 내지 G-549; H-536 내지 P-550; F-537 내지 W-551; D-538 내지 G-552; T-539 내지 D-553; P-540 내지 C-554; F-541 내지 S-555; H-542 내지 R-556; G-543 내지 T-557; S-544 내지 C-558; W-545 내지 G-559; G-546 내지 G-560; M-547 내지 G-561; W-548 내지 V-562; G-549 내지 Q-563; P-550 내지 Y-564; W-551 내지 T-565; G-552 내지 M-566; D-553 내지 R-567; C-554 내지 E-568; S-555 내지 C-569; R-556 내지 D-570; T-557 내지 N-571; C-558 내지 P-572; G-559 내지 V-573; G-560 내지 P-574; G-561 내지 K-575; V-562 내지 N-576; Q-563 내지 G-577; Y-564 내지 G-578; T-565 내지 K-579; M-566 내지 Y-580; R-567 내지 C-581; E-568 내지 E-582; C-569 내지 G-583; D-570 내지 K-584; N-571 내지 R-585; P-572 내지 V-586; V-573 내지 R-587; P-574 내지 Y-588; K-575 내지 R-589; N-576 내지 S-590; G-577 내지 C-591; G-578 내지 N-592; K-579 내지 L-593; Y-580 내지 E-594; C-581 내지 D-595; E-582 내지 C-596; G-583 내지 P-597; K-584 내지 D-598; R-585 내지 N-599; V-586 내지 N-600; R-587 내지 G-601; Y-588 내지 K-602; R-589 내지 T-603; S-590 내지 F-604; C-591 내지 R-605; N-592 내지 E-606; L-593 내지E-607; E-594 내지 Q-608; D-595 내지 C-609; C-596 내지 E-610; P-597 내지 A-611; D-598 내지 H-612; N-599 내지 N-613; N-600 내지 E-614; G-601 내지 F-615; K-602 내지 S-616; T-603 내지 K-617; F-604 내지 A-618; R-605 내지 S-619; E-606 내지 F-620; E-607 내지 G-621; Q-608 내지 S-622; C-609 내지 G-623; E-610 내지 P-624; A-611 내지 A-625; H-612 내지 V-626; N-613 내지 E-627; E-614 내지 W-628; F-615 내지 I-629; S-616 내지 P-630; K-617 내지 K-631; A-618 내지 Y-632; S-619 내지 A-633; F-620 내지 G-634; G-621 내지 V-635; S-622 내지 S-636; G-623 내지 P-637; P-624 내지 K-638; A-625 내지 D-639; V-626 내지 R-640; E-627 내지 C-641; W-628 내지 K-642; I-629 내지 L-643; P-630 내지 I-644; K-631 내지 C-645; Y-632 내지 Q-646; A-633 내지 A-647; G-634 내지 K-648; V-635 내지 G-649; S-636 내지 I-650; P-637 내지 G-651; K-638 내지 Y-652; D-639 내지 F-653; R-640 내지 F-654; C-641 내지 V-655; K-642 내지 L-656; L-643 내지 Q-657; I-644 내지 P-658; C-645 내지 K-659; Q-646 내지 V-660; A-647 내지 V-661; K-648 내지 D-662; G-649 내지 G-663; I-650 내지 T-664; G-651 내지 P-665; Y-652 내지 C-666; F-653 내지 S-667; F-654 내지 P-668; V-655 내지 D-669; L-656 내지 S-670; Q-657 내지 T-671; P-658 내지 S-672; K-659 내지 V-673; V-660 내지 C-674; V-661 내지 V-675; D-662 내지 Q-676; G-663 내지 G-677; T-664 내지 Q-678; P-665 내지 C-679; C-666 내지 V-680; S-667 내지 K-681; P-668 내지 A-682; D-669 내지 G-683; S-670 내지 C-684; T-671 내지 D-685; S-672 내지 R-686; V-673 내지 I-687; C-674 내지 I-688; V-675 내지 D-689; Q-676 내지 S-690; G-677 내지 K-691; Q-678 내지K-692; C-679 내지 K-693; V-680 내지 F-694; K-681 내지 D-695; A-682 내지 K-696; G-683 내지 C-697; C-684 내지 G-698; D-685 내지 V-699; R-686 내지 C-700; I-687 내지 G-701; I-688 내지 G-702; D-689 내지 N-703; S-690 내지 G-704; K-691 내지 S-705; K-692 내지 T-706; K-693 내지 C-707; F-694 내지 K-708; D-695 내지 K-709; K-696 내지 I-710; C-697 내지 S-711; G-698 내지 G-712; V-699 내지 S-713; C-700 내지 V-714; G-701 내지 T-715; G-702 내지 S-716; N-703 내지 A-717; G-704 내지 K-718; S-705 내지 P-719; T-706 내지 G-720; C-707 내지 Y-721; K-708 내지 H-722; K-709 내지 D-723; I-710 내지 I-724; S-711 내지 I-725; G-712 내지 T-726; S-713 내지 I-727; V-714 내지 P-728; T-715 내지 T-729; S-716 내지 G-730; A-717 내지 A-731; K-718 내지 T-732; P-719 내지 N-733; G-720 내지 I-734; Y-721 내지 E-735; H-722 내지 V-736; D-723 내지 K-737; I-724 내지 Q-738; I-725 내지 R-739; T-726 내지 N-740; I-727 내지 Q-741; P-728 내지 R-742; T-729 내지 G-743; G-730 내지 S-744; A-731 내지 R-745; T-732 내지 N-746; N-733 내지 N-747; I-734 내지 G-748; E-735 내지 S-749; V-736 내지 F-750; K-737 내지 L-751; Q-738 내지 A-752; R-739 내지 1-753; N-740 내지 K-754; Q-741 내지 A-755; R-742 내지 A-756; G-743 내지 D-757; S-744 내지 G-758; R-745 내지 T-759; N-746 내지 Y-760; N-747 내지 I-761; G-748 내지 L-762; S-749 내지 N-763; F-750 내지 G-764; L-751 내지 D-765; A-752 내지 Y-766; I-753 내지 T-767; K-754 내지 L-768; A-755 내지 S-769; A-756 내지 T-770; D-757 내지 L-771; G-758 내지 E-772; T-759 내지 Q-773; Y-760 내지 D-774; I-761 내지 I-775; L-762 내지 M-776; N-763 내지 Y-777; G-764 내지 K-778; D-765 내지 G-779; Y-766 내지 V-780; T-767 내지 V-781; L-768 내지 L-782; S-769 내지 R-783; T-770 내지 Y-784; L-771 내지 S-785; E-772 내지 G-786; Q-773 내지 S-787; D-774 내지 S-788; I-775 내지 A-789; M-776 내지 A-790; Y-777 내지 L-791; K-778 내지 E-792; G-779 내지 R-793; V-780 내지 I-794; V-781 내지 R-795; L-782 내지 S-796; R-783 내지 F-797; Y-784 내지 S-798; S-785 내지 P-799; G-786 내지 L-800; S-787 내지 K-801; S-788 내지 E-802; A-789 내지 P-803; A-790 내지 L-804; L-791 내지 T-805; E-792 내지 I-806; R-793 내지 Q-807; I-794 내지 V-808; R-795 내지 L-809; S-796 내지 T-810; F-797 내지 V-811; S-798 내지 G-812; P-799 내지 N-813; L-800 내지 A-814; K-801 내지 L-815; E-802 내지 R-816; P-803 내지 P-817; L-804 내지 K-818; T-805 내지 I-819; I-806 내지 K-820; Q-807 내지 Y-821; V-808 내지 T-822; L-809 내지 Y-823; T-810 내지 F-824; V-811 내지 V-825; G-812 내지 K-826; N-813 내지 K-827; A-814 내지 K-828; L-815 내지 K-829; R-816 내지 E-830; P-817 내지 S-831; K-818 내지 F-832; I-819 내지 N-833; K-820 내지 A-834; Y-821 내지 I-835; T-822 내지 P-836; Y-823 내지 T-837; F-824 내지 F-838; V-825 내지 S-839; K-826 내지 A-840; K-827 내지 W-841; K-828 내지 V-842; K-829 내지 I-843; E-830 내지 E-844; S-831 내지 E-845; F-832 내지 W-846; N-833 내지 G-847; A-834 내지 E-848; I-835 내지 C-849; P-836 내지 S-850; T-837 내지 K-851; F-838 내지 S-852; S-839 내지 C-853; A-840 내지 E-854; W-841 내지 L-855; V-842 내지 G-856; I-843 내지 W-857; E-844 내지 Q-858; E-845 내지 R-859; W-846 내지 R-860; G-847 내지 L-861; E-848 내지 V-862; C-849 내지 E-863; S-850 내지 C-864; K-851 내지 R-865; S-852 내지 D-866; C-853 내지 I-867; E-854 내지 N-868; L-855 내지 G-869; G-856 내지 Q-870; W-857 내지 P-871; Q-858 내지 A-872; R-859 내지 S-873; R-860 내지 E-874; L-861 내지 C-875; V-862 내지 A-876; E-863 내지 K-877; C-864 내지 E-878; R-865 내지 V-879; D-866 내지 K-880; I-867 내지 P-881; N-868 내지 A-882; G-869 내지 S-883; Q-870 내지 T-884; P-871 내지 R-885; A-872 내지 P-886; S-873 내지 C-887; E-874 내지 A-888; C-875 내지 D-889; A-876 내지 H-890; K-877 내지 P-891; E-878 내지 C-892; V-879 내지 P-893; K-880 내지 Q-894; P-881 내지 W-895; A-882 내지 Q-896; S-883 내지 L-897; T-884 내지 G-898; R-885 내지 E-899; P-886 내지 W-900; C-887 내지 S-901; A-888 내지 S-902; D-889 내지 C-903; H-890 내지 S-904; P-891 내지 K-905; C-892 내지 T-906; P-893 내지 C-907; Q-894 내지 G-908; W-895 내지 K-909; Q-896 내지 G-910; L-897 내지 Y-911; G-898 내지 K-912; E-899 내지 K-913; W-900 내지 R-914; S-901 내지 S-915; S-902 내지 L-916; C-903 내지 K-917; S-904 내지 C-918; K-905 내지 L-919; T-906 내지 S-920; C-907 내지 H-921; G-908 내지 D-922; K-909 내지 G-923; G-910 내지 G-924; Y-911 내지 V-925; K-912 내지 L-926; K-913 내지 S-927; R-914 내지 H-928; S-915 내지 E-929; L-916 내지 S-930; K-917 내지 C-931; C-918 내지 D-932; L-919 내지 P-933; S-920 내지 L-934; H-921 내지 K-935; D-922 내지 K-936; G-923 내지 P-937; G-924 내지 K-938; V-925 내지 H-939; L-926 내지 F-940; S-927 내지 I-941; H-928 내지 D-942; E-929 내지 F-943; S-930 내지 C-944; C-931 내지 T-945; D-932 내지 M-946; P-933 내지 A-947; L-934 내지 E-948; K-935 내지 C-949; 및/또는 K-936 내지 S-950 잔기의 아미노산 서열로 구성된다.
유사하게, METH2의 바람직한 항원성 에피토프는 서열 번호 4의 M-1 내지 L-15; F-2 내지 L-16; P-3 내지 L-17; A-4 내지 L-1 8; P-5 내지 L-19; A-6 내지 L-20; A-7 내지 L-21; P-8 내지 L-22; R-9 내지 P-23; W-10 내지 L-24; L-11 내지 A-25; P-12 내지 R-26; F-13 내지 G-27; L-14 내지 A-28; L-15 내지 P-29; L-16 내지 A-30; L-17 내지 R-31; L-18 내지 P-32; L-19 내지 A-33; L-20 내지 A-34; L-21 내지 G-35; L-22 내지 G-36; P-23 내지 Q-37; L-24 내지 A-38; A-25 내지 S-39; R-26 내지 E-40; G-27 내지 L-41; A-28 내지 V-42; P-29 내지 V-43; A-30 내지 P-44; R-31 내지 T-45; P-32 내지 R-46; A-33 내지 L-47; A-34 내지 P-48; G-35내지 G-49; G-36 내지 S-50; Q-37 내지 A-51; A-38 내지 G-52; S-39 내지 E-53; E-40 내지 L-54; L-41 내지 A-55; V-42 내지 L-56; V-43 내지 H-57; P-44 내지 L-58; T-45 내지 S-59; R-46 내지 A-60; L-47 내지 F-61; P-48 내지 G-62; G-49 내지 K-63; S-50 내지 G-64; A-51 내지 F-65; G-52 내지 V-66; E-53 내지 L-67; L-54 내지 R-68; A-55 내지 L-69; L-56 내지 A-70; H-57 내지 P-71; L-58 내지 D-72; S-59 내지 D-73; A-60 내지 S-74; F-61 내지 F-75; G-62 내지 L-76; K-63 내지 A-77; G-64 내지 P-78; F-65 내지 E-79; V-66 내지 F-80; L-67 내지 K-81; R-68 내지 I-82; L-69 내지 E-83; A-70 내지 R-84; P-71 내지 L-85; D-72 내지 G-86; D-73 내지 G-87; S-74 내지 S-88; F-75 내지 G-89; L-76 내지 R-90; A-77 내지 A-91; P-78 내지 T-92; E-79 내지 G-93; F-80 내지 G-94; K-81 내지 E-95; I-82 내지 R-96; E-83 내지 G-97; R-84내지 L-98; L-85 내지 R-99; G-86 내지 G-100; G-87 내지 C-101; S-88 내지 F-102; G-89 내지 F-103; R-90 내지 S-104; A-91 내지 G-105; T-92 내지 T-106; G-93 내지 V-107; G-94 내지 N-108; E-95 내지 G-109; R-96 내지 E-110; G-97 내지 P-111; L-98 내지 E-112; R-99 내지 S-113; G-100 내지 L-114; C-101 내지 A-115; F-102 내지 A-116; F-103 내지 V-117; S-104 내지 S-118; G-105 내지 L-119; T-106 내지 C-120; V-107 내지 R-121; N-108 내지 G-122; G-109 내지 L-123; E-110 내지 S-124; P-111 내지 G-125; E-112 내지 S-126; S-113 내지 F-127; L-114 내지 L-128; A-115 내지 L-129; A-116 내지 D-130; V-117 내지 G-131; S-118 내지 E-132; L-119 내지 E-133; C-120 내지 F-134; R-121 내지 T-135; G-122내지 I-136; L-123 내지 Q-137; S-124 내지 P-138; G-125 내지 Q-139; S-126 내지 G-140; F-127 내지 A-141; L-128 내지 G-142; L-129 내지 G-143; D-130 내지 S-144; G-131 내지 L-145; E-132 내지 A-146; E-133 내지 Q-147; F-134 내지 P-148; T-135 내지 H-149; I-136 내지 R-150; Q-137 내지 L-151; P-138 내지 Q-152; Q-139 내지 R-153; G-140 내지 W-154; A-141 내지 G-155; G-142 내지 P-156; G-143 내지 A-157; S-144 내지 G-158; L-145 내지 A-159; A-146 내지 R-160; Q-147 내지 P-161; P-148 내지 L-162; H-149 내지 P-163; R-150 내지 R-164; L-151 내지 G-165; Q-152 내지 P-166; R-153 내지 E-167; W-154 내지 W-168; G-155 내지 E-169; P-156 내지 V-170; A-157 내지 E-171; G-158 내지 T-172; A-159 내지 G-173; R-160 내지 E-174; P-161 내지 G-175; L-162 내지 Q-176; P-163 내지 R-177; R-164 내지 Q-178; G-165 내지 E-179; P-166 내지 R-180; E-167 내지 G-181; W-168 내지 D-182; E-169 내지 H-183; V-170 내지 Q-184; E-171 내지 E-185; T-172 내지 D-186; G-173 내지 S-187; E-174 내지 E-188; G-175 내지 E-189; Q-176 내지 E-190; R-177 내지 S-191; Q-178 내지 Q-192; E-179 내지 E-193; R-180 내지 E-194; G-181 내지 E-195; D-182 내지 A-196; H-183 내지 E-197; Q-184 내지 G-198; E-185 내지 A-199; D-186 내지 S-200; S-187 내지 E-201; E-188 내지 P-202; E-189 내지 P-203; E-190 내지 P-204; S-191 내지 P-205; Q-192 내지 L-206; E-193 내지 G-207; E-194 내지 A-208; E-195 내지 T-209; A-196 내지 S-210; E-197 내지 R-211; G-198 내지 T-212; A-199 내지 K-213; S-200 내지 R-214; E-201 내지 F-215;P-202내지 V-216; P-203 내지 S-217; P-204 내지 E-218; P-205 내지 A-219; L-206 내지 R-220; G-207 내지 F-221; A-208 내지 V-222; T-209 내지 E-223; S-210 내지 T-224; R-211 내지 L-225; T-212 내지 L-226; K-213 내지 V-227; R-214 내지 A-228; F-215 내지 D-229; V-216 내지 A-230; S-217 내지 S-231; E-218 내지 M-232; A-219 내지 A-233; R-220 내지 A-234; F-221 내지 F-235; V-222 내지 Y-236; E-223 내지 G-237; T-224 내지 A-238; L-225 내지 D-239; L-226 내지 L-240; V-227 내지 Q-241; A-228 내지 N-242; D-229 내지 H-243; A-230 내지 I-244; S-231 내지 L-245; M-232 내지 T-246; A-233 내지 L-247; A-234 내지 M-248; F-235 내지 S-249; Y-236 내지 V-250; G-237 내지 A-251; A-238 내지 A-252; D-239 내지 R-253; L-240 내지 I-254; Q-241 내지 Y-255; N-242 내지 K-256; H-243 내지 H-257; I-244 내지 P-258; L-245 내지 S-259; T-246 내지 I-260; L-247 내지 K-261; M-248 내지 N-262; S-249 내지 S-263; V-250 내지 I-264; A-251 내지 N-265; A-252 내지 L-266; R-253 내지 M-267; I-254 내지 V-268;Y-255 내지 V-269; K-256 내지 K-270; H-257 내지 V-271; P-258 내지 L-272; S-259 내지 I-273; I-260 내지 V-274; K-261 내지 E-275; N-262 내지 D-276; S-263 내지 E-277; I-264 내지 K-278; N-265 내지 W-279; L-266 내지 G-280; M-267 내지 P-281; V-268 내지 E-282; V-269 내지 V-283; K-270 내지 S-284; V-271 내지 D-285; L-272 내지 N-286; I-273 내지 G-287; V-274 내지 G-288; E-275 내지 L-289; D-276 내지 T-290; E-277 내지 L-291; K-278 내지 R-292; W-279 내지 N-293; G-280 내지 F-294; P-281 내지 C-295; E-282 내지 N-296; V-283 내지 W-297; S-284 내지 Q-298; D-285 내지 R-299; N-286 내지 R-300; G-287 내지 F-301; G-288 내지 N-302; L-289 내지 Q-303; T-290 내지 P-304; L-291 내지 S-305; R-292 내지 D-306; N-293 내지 R-307; F-294 내지 H-308; C-295 내지 P-309; N-296 내지 E-310; W-297 내지 H-311; Q-298 내지 Y-312; R-299 내지 D-313; R-300 내지 T-314; F-301 내지 A-315; N-302 내지 I-316; Q-303 내지 L-317; P-304 내지 L-318; S-305 내지 T-319; D-306 내지 R-320; R-307 내지 Q-321; H-308 내지 N-322; P-309 내지 F-323; E-310 내지 C-324; H-311 내지 G-325; Y-312 내지 Q-326; D-313 내지 E-327; T-314 내지 G-328; A-315 내지 L-329; I-316 내지 C-330; L-317 내지 D-331; L-318 내지 T-332; T-319 내지 L-333; R-320내지 G-334; Q-321 내지 V-335; N-322 내지 A-336; F-323 내지 D-337; C-324 내지 I-338; G-325 내지 G-339; Q-326 내지 T-340; E-327 내지 I-341; G-328 내지 C-342; L-329 내지 D-343; C-330 내지 P-344; D-331 내지 N-345; T-332 내지 K-346; L-333 내지 S-347; G-334 내지 C-348; V-335 내지 S-349; A-336 내지 V-350; D-337 내지 I-351; I-338 내지 E-352; G-339 내지 D-353;T-340 내지 E-354; I-341 내지 G-355; C-342 내지 L-356; D-343 내지 Q-357; P-344 내지 A-358; N-345 내지 A-359; K-346 내지 H-360; S-347 내지 T-361; C-348 내지 L-362; S-349 내지 A-363; V-350 내지 H-364; I-351 내지 E-365; E-352 내지 L-366; D-353 내지 G-367; E-354 내지 H-368; G-355 내지 V-369; L-356 내지 L-370; Q-357 내지 S-371; A-358 내지 M-372; A-359 내지 P-373; H-360 내지 H-374; T-361 내지 D-375; L-362 내지 D-376; A-363 내지 S-377; H-364 내지 K-378; E-365 내지 P-379; L-366 내지 C-380; G-367 내지 T-381; H-368 내지 R-382; V-369 내지 L-383; L-370 내지 F-384; S-371 내지 G-385; M-372 내지 P-386; P-373 내지 M-387; H-374 내지 G-388; D-375 내지 K-389; D-376 내지 H-390; S-377 내지 H-391; K-378 내지 V-392; P-379 내지 M-393; C-380 내지 A-394; T-381 내지 P-395; R-382 내지 L-396; L-383 내지 F-397; F-384 내지 V-398; G-385 내지 H-399; P-386 내지 L-400; M-387 내지 N-401; G-388 내지 Q-402; K-389 내지 T-403; H-390 내지 L-404; H-391 내지 P-405; V-392 내지 W-406; M-393 내지 S-407; A-394 내지 P-408; P-395 내지 C-409; L-396 내지 S-410; F-397 내지 A-411; V-398 내지 M-412; H-399 내지 Y-413; L-400 내지 L-414; N-401 내지 T-415; Q-402 내지 E-416; T-403 내지 L-417; L-404 내지 L-418; P-405 내지 D-419; W-406 내지 G-420; S-407 내지 G-421; P-408 내지 H-422; C-409 내지 G-423; S-410 내지 D-424; A-411 내지 C-425; M-412 내지 L-426; Y-413 내지 L-427; L-414 내지 D-428; T-415 내지 A-429; E-416 내지 P-430; L-417 내지 G-431; L-418 내지 A-432; D-419 내지 A-433; G-420 내지 L-434; G-421 내지 P-435; H-422 내지 L-436; G-423 내지 P-437; D-424내지 T-438; C-425 내지 G-439; L-426 내지 L-440; L-427 내지 P-441; D-428 내지 G-442; A-429 내지 R-443; P-430 내지 M-444; G-431 내지 A-445; A-432 내지 L-446; A-433 내지 Y-447; L-434 내지 Q-448; P-435 내지 L-449; L-436 내지 D-450; P-437 내지 Q-451; T-438 내지 Q-452; G-439 내지 C-453; L-440 내지 R-454; P-441 내지 Q-455; G-442 내지 1-456; R-443 내지 F-457; M-444 내지 G-458; A-445 내지 P-459; L-446 내지 D-460; Y-447 내지 F-461; Q-448 내지 R-462; L-449 내지 H-463; D-450 내지 C-464; Q-451 내지 P-465; Q-452 내지 N-466; C-453 내지 T-467; R-454 내지 S-468; Q-455 내지 A-469; I-456 내지 Q-470; F-457 내지 D-471; G-458 내지 V-472; P-459 내지 CA73; D-460 내지 A-474; F-461 내지 Q-475; R-462 내지 L-476; H-463 내지 W-477; C-464 내지 C-478; P-465 내지 H-479; N-466 내지 T-480; T-467 내지 D-481; S-468 내지 G-482; A-469 내지 A-483; Q-470 내지 E-484; D-471 내지 P-485; V-472 내지 L-486; C-473 내지 C-487; A-474 내지 H-488; Q-475 내지 T-489; L-476 내지 K-490; W-477 내지 N-491; C-478 내지 G-492; H-479 내지 S-493; T-480 내지 L-494; D-481 내지 P-495; G-482 내지 W-496; A-483 내지 A-497; E-484 내지 D-498; P-485 내지 G-499; L-486 내지 T-500; C-487 내지 P-501; H-488 내지 C-502; T-489 내지 G-503; K-490 내지 P-504; N-491 내지 G-505; G-492 내지 H-506; S-493 내지 L-507; L-494 내지 C-508; P-495 내지 S-509; W-496 내지 E-510; A-497 내지 G-511; D-498 내지 S-512; G-499 내지 C-513; T-500 내지 L-514; P-501 내지 P-515; C-502 내지 E-516; G-503 내지 E-517; P-504 내지 E-518; G-505 내지 V-519; H-506 내지 E-520; L-507 내지 R-521; C-508 내지 P-522; S-509내지 K-523; E-510 내지 P-524; G-511 내지 V-525; S-512 내지 V-526; C-513 내지 D-527; L-514 내지 G-528; P-515 내지 G-529; E-516 내지 W-530; E-517 내지 A-531; E-518 내지 P-532; V-519 내지 W-533; E-520 내지 G-534; R-521 내지 P-535; P-522 내지 W-536; K-523 내지 G-537; P-524 내지 E-538; V-525 내지 C-539; V-526 내지 S-540; D-527 내지 R-541; G-528 내지 T-542; G-529 내지 C-543; W-530 내지 G-544; A-531 내지 G-545; P-532 내지 G-546; W-533 내지 V-547; G-534 내지 Q-548; P-535 내지 F-549; W-536 내지 S-550; G-537 내지 H-551; E-538 내지 R-552; C-539 내지 E-553; S-540 내지 C-554; R-541 내지 K-555; T-542 내지 D-556; C-543 내지 P-557; G-544 내지 E-558; G-545 내지 P-559; G-546 내지 Q-560; V-547 내지 N-561; Q-548 내지 G-562; F-549 내지 G-563; S-550 내지 R-564; H-551 내지 Y-565; R-552 내지 C-566; E-553 내지 L-567; C-554 내지 G-568; K-555 내지 R-569; D-556 내지 R-570; P-557 내지 A-571; E-558 내지 K-572; P-559 내지 Y-573; Q-560 내지 Q-574; N-561 내지 S-575; G-562 내지 C-576; G-563 내지 H-577; R-564 내지 T-578; Y-565 내지 E-579; C-566 내지 E-580; L-567 내지 C-581; G-568 내지 P-582; R-569 내지 P-583; R-570 내지 D-584; A-571 내지 G-585; K-572 내지 K-586; Y-573 내지 S-587; Q-574 내지 F-588; S-575 내지 R-589; C-576 내지 E-590; H-577 내지 Q-591; T-578 내지 Q-592; E-579 내지 C-593; E-580 내지 E-594; C-581 내지 K-595; P-582 내지 Y-596; P-583 내지 N-597; D-584 내지 A-598; G-585 내지 Y-599; K-586 내지 N-600; S-587 내지 Y-601; F-588 내지 T-602; R-589 내지 D-603; E-590 내지 M-604; Q-591 내지 D-605; Q-592 내지 G-606; C-593 내지N-607; E-594 내지 L-608; K-595 내지 L-609; Y-596 내지 Q-610; N-597 내지 W-611; A-598 내지 V-612; Y-599 내지 P-613; N-600 내지 K-614; Y-601 내지 Y-615; T-602 내지 A-616; D-603 내지 G-617; M-604 내지 V-618; D-605 내지 S-619; G-606 내지 P-620; N-607 내지 R-621; L-608 내지 D-622; L-609 내지 R-623; Q-610 내지 C-624; W-611 내지 K-625; V-612 내지 L-626; P-613 내지 F-627; K-614 내지 C-628; Y-615 내지 R-629; A-616 내지 A-630; G-617 내지 R-631; V-618 내지 G-632; S-619 내지 R-633; P-620 내지 S-634; R-621 내지 E-635; D-622 내지 F-636; R-623 내지 K-637; C-624 내지 V-638; K-625 내지 F-639; L-626 내지 E-640; F-627 내지 A-641; C-628 내지 K-642; R-629 내지 V-643; A-630 내지 I-644; R-631 내지 D-645; G-632 내지 G-646; R-633 내지 T-647; S-634 내지 L-648; E-635 내지 C-649; F-636 내지 G-650; K-637 내지 P-651; V-638 내지 E-652; F-639 내지 T-653; E-640 내지 L-654; A-641 내지 A-655; K-642 내지 I-656; V-643 내지 C-657; I-644 내지 V-658; D-645 내지 R-659; G-646 내지 G-660; T-647 내지 Q-661; L-648 내지 C-662; C-649 내지 V-663; G-650 내지 K-664; P-651 내지 A-665; E-652 내지 G-666; T-653 내지 C-667; L-654 내지 D-668; A-655 내지 H-669; I-656 내지 V-670; C-657 내지 V-671; V-658 내지 D-672; R-659내지 S-673; G-660 내지 P-674; Q-661 내지 R-675; C-662 내지 K-676; V-663 내지 L-677; K-664 내지 D-678; A-665 내지 K-679; G-666 내지 C-680; C-667 내지 G-681; D-668 내지 V-682; H-669 내지 C-683; V-670 내지 G-684; V-671 내지 G-685; D-672 내지 K-686; S-673 내지 G-687; P-674 내지 N-688; R-675 내지 S-689; K-676 내지 C-690; L-677 내지 R-691; D-678 내지K-692; K-679 내지 V-693;C-680 내지 S-694; G-681 내지 G-695; V-682 내지 S-696; C-683 내지 L-697; G-684 내지 T-698; G-685 내지 P-699; K-686 내지 T-700; G-687 내지 N-701; N-688 내지 Y-702; S-689 내지 G-703; C-690 내지 Y-704; R-691 내지 N-705; K-692 내지 D-706; V-693 내지 I-707; S-694 내지 V-708; G-695 내지 T-709; S-696 내지 I-710; L-697 내지 P-711; T-698 내지 A-712; P-699 내지 G-713; T-700 내지 A-714; N-701 내지 T-715; Y-702 내지 N-716; G-703 내지 I-717; Y-704 내지 D-718; N-705 내지 V-719; D-706 내지 K-720; I-707 내지 Q-721; V-708 내지 R-722; T-709 내지 S-723; I-710 내지 H-724; P-711내지 P-725; A-712 내지 G-726; G-713 내지 V-727; A-714 내지 Q-728; T-715 내지 N-729; N-716 내지 D-730; I-717 내지 G-731; D-718 내지 N-732; V-719 내지 Y-733; K-720 내지 L-734; Q-721 내지 A-735; R-722 내지 L-736; S-723 내지 K-737; H-724 내지 T-738; P-725 내지 A-739; G-726 내지 D-740; V-727 내지 G-741; Q-728 내지 Q-742; N-729 내지 Y-743; D-730 내지 L-744; G-731 내지 L-745; N-732 내지 N-746; Y-733 내지 G-747; L-734 내지 N-748; A-735 내지 L-749; L-736 내지 A-750; K-737 내지 I-751; T-738 내지 S-752; A-739 내지 A-753; D-740 내지 I-754; G-741 내지 E-755; Q-742 내지 Q-756; Y-743 내지 D-757; L-744 내지 I-758; L-745 내지 L-759; N-746 내지 V-760; G-747 내지 K-761; N-748 내지 G-762; L-749 내지 T-763; A-750 내지 I-764; I-751 내지 L-765; S-752 내지 K-766; A-753 내지 Y-767; I-754 내지 S-768; E-755 내지 G-769; Q-756 내지 S-770; D-757 내지 I-771; I-758 내지 A-772; L-759 내지 T-773; V-760 내지 L-774; K-761 내지 E-775; G-762 내지 R-776; T-763 내지 L-777;I-764 내지 Q-778; L-765 내지 S-779; K-766 내지 F-780; Y-767 내지 R-781; S-768 내지 P-782; G-769 내지 L-783; S-770 내지 P-784; I-771 내지 E-785; A-772 내지 P-786; T-773 내지 L-787; L-774 내지 T-788; E-775 내지 V-789; R-776 내지 Q-790; L-777 내지 L-791; Q-778 내지 L-792; S-779 내지 T-793;F-780 내지 V-794; R-781 내지 P-795; P-782 내지 G-796; L-783 내지 E-797; P-784 내지 V-798; E-785 내지 F-799; P-786 내지 P-800; L-787 내지 P-801; T-788 내지 K-802; V-789 내지 V-803; Q-790 내지 K-804; L-791 내지 Y-805; L-792 내지 T-806; T-793 내지 F-807; V-794 내지 F-808; P-795 내지 V-809; G-796 내지 P-810; E-797 내지 N-811; V-798 내지 D-812; F-799 내지 V-813; P-800 내지 D-814; P-801 내지 F-815; K-802 내지 S-816; V-803 내지 M-817; K-804 내지 Q-818; Y-805 내지 S-819; T-806 내지 S-820; F-807 내지 K-821; F-808 내지 E-822; V-809 내지 R-823; P-810 내지 A-824; N-811 내지 T-825; D-812 내지 T-826; V-813 내지 N-827; D-814 내지 I-828; F-815 내지 I-829; S-816 내지 Q-830; M-817 내지 P-831; Q-818 내지 L-832; S-819 내지 L-833; S-820 내지 H-834; K-821 내지 A-835; E-822 내지 Q-836; R-823 내지 W-837; A-824 내지 V-838; T-825 내지 L-839; T-826 내지 G-840; N-827 내지 D-841; I-828 내지 W-842; I-829 내지 S-843; Q-830 내지 E-844; P-831 내지 C-845; L-832 내지 S-846; L-833 내지 S-847; H-834 내지 T-848; A-835 내지 C-849; Q-836 내지 G-850; W-837 내지 A-851; V-838 내지 G-852; L-839 내지 W-853; G-840 내지 Q-854; D-841 내지 R-855; W-842 내지 R-856; S-843 내지 T-857; E-844 내지 V-858; C-845 내지 E-859; S-846 내지 C-860; S-847 내지 R-861; T-848 내지 D-862;C-849 내지 P-863; G-850 내지 S-864; A-851 내지 G-865; G-852 내지 Q-866; W-853 내지 A-867; Q-854 내지 S-868; R-855 내지 A-869; R-856 내지 T-870; T-857 내지 C-871; V-858 내지 N-872; E-859 내지 K-873; C-860 내지 A-874; R-861 내지 L-875; D-862 내지 K-876; P-863 내지 P-877; S-864 내지 E-878; G-865 내지 D-879; Q-866 내지 A-880; A-867 내지 K-881; S-868 내지 P-882; A-869 내지 C-883; T-870 내지 E-884; C-871 내지 S-885; N-872 내지 Q-886; K-873 내지 L-887; A-874 내지 C-888; L-875 내지 P-889; 및/또는 K-876 to L-890 잔기의 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다.
이들 폴리펩티드 단편을 암호하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에 의해 포함된다.
부가의 비배타적인 바람직한 항원성 에피토프는 본원에 개시된 항원성 에피토프뿐만 아니라 그 부분들도 포함한다. 항원성 에피토프는 예를 들어 그 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 포함한 항체를 생성시키는데 유용하다. 바람직한 항원성 에피토프는 본원에 개시된 항원성 에피토프뿐만 아니라 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 이들 항원성 에피토프의 임의의 조합을 포함한다. 항원성 에피토프는 면역분석에서 표적 분자로 이용될 수 있다(예를 들어, Wilson et al., Cell 37:767-778(1984); Sutcliffe et al., Science 219:660-666(1983) 참고).
유사하게, 면역원성 에피토프는 예를 들어, 당업계에 공지된 방법에 따라 항체를 유도하기 위해 이용될 수 있다.(Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914; 및 Bittle et al.,J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985) 참고). 바람직한 면역원성 에피토프는 본원에 개시된 면역원성 에피토프를 포함하며, 이들 면역원성 에피토프의 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 임의의 조합을 포함한다. 하나 이상의 면역원성 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 알부민과 같은 담체 단백질과 함께 항체 반응을 유발하기 위해 동물 시스템(토끼 또는 마우스)에 제공되거나 또는 만일 그 폴리펩티드가 충분한 길이(적어도 약 25 아미노산)이면 그 폴리펩티드는 담체없이 제공될 수도 있다. 하지만, 8 내지 10의 적은 아미노산을 포함하는 면역원성 에피토프는 변성된 폴리펩티드(예, 웨스턴 블롯)의 최소한의 선형 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성시키기에 충분한 것으로 나타났다.
본 발명의 에피토프-함유 폴리펩티드는 생체내 면역화, 생체외 면역화 및 파아지 디스플레이 방법을 포함하며 이에 제한되지 않는 당업계의 공지된 방법에 따라 항체를 유도하는 데 이용될 수도 있다. Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914; 및 Bittle et al., J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985) 참고. 만일 생체내 면역화가 이용되면, 동물은 자유 펩티드로 면역화될 수도 있다. 하지만, 항-펩티드 항체 역가는 펩티드를 거대분자 담체(예, 키홀 림펫 헤마시아닌(keyhole limpet hemacyanin)(KLH) 또는 테타누스 독소)에 결합시켜 증가될 수도 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 함유하는 펩티드는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)와 같은 링커를 이용하여 담체에 결합될 수도 있으며, 다른 펩티드는 글루타르알데히드와 같은 보다 일반적인 연결제를 이용하여 담체에 결합될 수도 있다. 토끼, 쥐 및 마우스와 같은동물은 약 100㎍의 펩티드 또는 담체 단백질 및 프로인트 보조제 또는 면역 반응을 자극하는 것으로 알려진 임의의 다른 보조제를 함유하는 에멀젼을 복강 주사 및/또는 내피 주사하여 자유 또는 담체-결합된 펩티드로 면역된다. 몇몇 증강 주사는 예를 들어 고체 표면에 흡착되는 자유 펩티드를 이용하는 ELISA 분석에 의해 검출될 수 있는 항-펩티드 항체의 유용한 역가를 제공하기 위해 약 2주 간격으로 필요할 수도 있다. 면역된 동물의 혈청내의 항-펩티드 항체의 역가는 예를 들어 당업계에 공지된 방법에 따른 고체 지지체상의 펩티드에 대한 흡착 및 선별 항체를 용출시킴으로써 항-펩티드 항체의 선별에 의해 증가될 수도 있다.
당업자는 전술한 대로, 면역원성 또는 항원성 에피토프를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 면역글로불린(IgA, IgE, IgG, IgM)의 불변 도메인 또는 그들의 부분(CH1, CH2, CH3 또는 이들의 임의의 조합 및 그들의 부분)과 융합되어 키메라 폴리펩티드를 생성시킬 수도 있다. 그러한 융합 단백질은 정제를 촉진시킬 수도 있으며 생체내 반감기를 증가시킬 수도 있다. 이는 사람 CD4-폴리펩티드의 첫번 째 두 도메인과 포유동물 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 가변 도메인으로 구성된 키메라 단백질에서 보여졌다. EP 394,827호;Traunecker et al., Nature, 331:84-86(1988) 참고. 상피 장벽을 넘어 항원을 면역 시스템으로 전달시키는 능력의 증가는 IgG 또는 Fc 단편과 같은 FcRn 결합 파트너에 결합된 항원(예, 인슐린)에 대해 입증되었다(PCT 공보 WO96/22024 및 WO99/04813 참고). IgG 부분 이황화 결합에 기인하는 이황화-연결된 이량체 구조를 갖는 IgG 융합 단백질은 또한 다른 분자와의 결합 및 중화에 있어서 단량체 폴리펩티드 또는 그 단편 혼자보다 더 효율적인 것으로 밝혀졌다. Fountoulakis et al., J.Biochem., 270:3958-3964(1995) 참고. 상기 에피토프를 암호하는 핵산은 또한 발현된 폴리펩티드의 검출 및 정제를 돕기 위해 에피토프 태그(예, 헤마글루티닌(HA) 태그 또는 플래그(flag) 태그)로서 관심있는 유전자와 재조합될 수 있다. 예를 들어, Janknecht et al.에 의해 개시된 시스템은 사람 세포주에서 발현된 비변성 융합 단백질의 정제를 용이하게 한다(Janknecht et al., 1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972-897). 이 시스템에서, 관심의 대상인 유전자는 그 유전자의 오픈 리딩 프레임이 여섯 개의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노 말단 태그에 번역적으로 융합될 수 있도록 백시니아 재조합 플라스미드에 서브클론된다. 태그는 융합 단백질을 위한 매트릭스 결합 도메인으로 작용한다. 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 세포의 추출물을 Ni2+ 니트릴로아세트산-아가로즈 컬럼에 로딩하고 히스티딘-태그된 단백질은 이미다졸-함유 완충액으로 선택적으로 용출될 수 있다.
본 발명의 부가적인 융합 단백질은 유전자-셔플링(shuffling), 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링(총체적으로 "DNA 셔플링"으로 칭함)을 통해 생성될 수도 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 조절하도록 이용될 수 있으며, 그러한 방법은 변화된 활성을 가진 폴리펩티드 뿐만 아니라 그 폴리펩티드의 아고니스트 및 안타고니스를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로 미국 특허 제5,605,793호; 5,811,238호;5,830,721호;5,834,252호 및 5,837,458호 및 Patten et al., Curr.Opinion Biotechnol. 8:724-33(1997); Harayama, TrendsBiotechnol. 16(2):76-82(1998); Hansson, et al., J.Mol.Biol. 287:265-76(1999); 및 Lorenzo and Blasco, Biotechniques 24(2):308-13(1998)참고(이들 특허 및 문헌 각각은 전체가 참고로 본원에 통합됨). 하나의 구체예에서, 서열 번호 1 또는 3에 해당하는 폴리뉴클레오티드 및 이들 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 폴리펩티드의 변화는 DNA 셔플링에 의해 이루어질 수도 있다. DNA 셔플링은 폴리뉴클레오티드 서열에서의 변이를 생성시키기 위한 상동성 또는 부위-특이적 재조합에 의한 둘 또는 그 이상의 DNA 단편의 조합에 관계된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그 암호된 폴리펩티드는 에러가 쉬운(error-prone) PCR, 임의 뉴클레오티드 삽입 또는 재조합에 앞선 다른 방법에 의해 임의 돌연변이에 노출시킴으로써 변화될 수도 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편, 등은 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수도 있다.
IgG 부분에 기인하는 이황화-연결된 이량체 구조를 갖는 융합 단백질은 또한 다른 분자와 결합 및 중화하는 데 있어서 단량체 폴리펩티드 또는 그 단편 혼자보다 더욱 효율적이다. Fountoulakis et al.(1995) J.Biochem.270:3958-3964 참고. 상기 에피토프를 암호하는 핵산은 또한 발현된 폴리펩티드의 검출 및 정제를 돕기 위해 에피토프 태그로서 관심있는 유전자와 재조합될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체와 T-세포 항원 수용체(TCR) 에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 및IgG4 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, 또는 IgM 및 IgY를 포함한다. 본원에서 "항체"(Ab)는 단일쇄 전항체를 포함한 전항체, 및 그들의 항원-결합 단편을 포함하는 것을 의미한다. 가장 바람직하게는 항체는 Fab, Fab', 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fvs(scFv), 단일쇄 항체, 이황화-연결된 Fvs(sdFv) 및 VL또는 VH도메인을 포함하는 단편을 포함하며 이에 제한되지 않는 본 발명의 사람 항원 결합 항체 단편이다. 항체는 조류와 포유동물을 포함한 임의의 동물 기원일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 사람, 쥐, 토끼, 염소, 기니아피그, 낙타, 말, 또는 닭이다.
단일쇄 항체를 포함한 항원-결합 항체 단편은 변이 영역만을 또는 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 전체 또는 부분과 조합으로 포함할 수도 있다. 또한 변이 영역과 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 임의 조합이 본 발명에 포함된다. 본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 인간화 항체 및 사람 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 추가로 포함한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 항체에 대해 항-이디오타입인 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 단일특이적, 이특이적, 삼특이적 또는 그 이상의 다특이성일 수도 있다. 다특이적 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 다른 에피토프들에 대해 특이적일 수도 있고, 또는 본 발명의 폴리펩티드 뿐만 아니라 이종성 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질과 같은 이종성 조성물 둘다에 대해 특이적일 수도 있다. WO93/17715; WO92/08802; WO91/00360; WO92/05793; Tutt, A. et al.(1991)J.Immunol.147:60-69; 미국 특허 제5,573,920호, 4,474,893호, 5,601,819호, 4,714,681호, 4,925,648호; Kostelny, S.A.et al.(1992) J.Immunol.148:1547-1553 참고.
본 발명의 항체는 그 항체에 의해 인식되거나 특이적으로 결합되는 본 발명 폴리펩티드의 에피토프 또는 부분의 개념으로 설명되거나 특정될 수도 있다. 에피토프 또는 폴리펩티드 부분은 본원에서 개시된 대로 N-말단 및 C-말단 위치에 의해, 연속적인 아미노산 잔기의 크기에 의해 특정될 수도 있고, 표와 도면에 나열될 수도 있다. 본 발명의 임의의 에피토프 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 제외될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 이의 배제를 허용한다.
본 발명의 항체는 또한 그들의 교차-반응성의 개념으로 설명되거나 특정될 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 임의의 다른 유사체, 오르소로그, 또는 상동체에 결합하지 않는 항체가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만의 동일성(당업계에 공지되고 본원에서 개시된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 폴리펩티드와 결합하지 않는 항체 또한 본 발명에 포함된다. 엄격한 하이브리드화 조건(본원에서 개시됨)하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드에만 결합하는 항체가 추가로 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체는 또한 그들의 결합 친화성의 개념으로 설명되거나 특정될 수도 있다. 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-6M, 10-6M,5 X 10-7M, 10-7M,5 X 10-8M,10-8M,5 X 10-9M,10-9M,5 X 10-10M,10-10M,5 X 10-11M, 10-11M,5 X 10-12M, 10-12M,5 X 10-13M, 10-13M,5 X 10-14M, 10-14M,5 X 10-15M, 10-15M 미만의 해리 상수 즉 Kd를 갖는 것들을 포함한다.
본 발명의 항체는 생체외 및 생체내 진단 및 치료 방법을 포함한 본 발명의 폴리펩티드를 정제, 검출 및 표적화하기 위한 당업계에 공지된 방법을 포함하며 이에 제한되지 않는 용도를 갖는다. 예를 들어, 항체는 생물 시료내에 존재하는 본 발명 폴리펩티드의 농도를 정성적 및 정량적으로 측정하기 위한 면역분석에서의 용도를 갖는다. Harlow et al., ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988)(본원에 전체가 통합됨) 참고.
본 발명의 항체는 혼자 또는 다른 조성물과 조합으로 이용될 수도 있다. 항체는 추가로 N-말단 또는 C-말단에서 이종성 폴리펩티드에 재조합적으로 융합될 수도 있고 또는 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 연결될 수도 있다(공유적 및 비공유적 결합 포함). 예를 들어, 본 발명의 항체는 검출 분석에서 표지로서 유용한 분자 및 이종성 폴리펩티드, 약제, 또는 독소같은 효과 인자 분자에 재조합적으로 융합 또는 결합될 수도 있다. WO92/08495; WO91/14438;WO89/12624;미국 특허 제5,314,995호; 및 유럽 특허 제396,387호 참고.
본 발명의 항체는 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 제조될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 그들의 항원성 단편은 동물에 투여되어 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청을 생성시킬 수 있다. "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기법에 의해 생성되는 항체에 제한되지 않는다. "모노클로날 항체"는 진핵, 원핵, 또는 파아지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래되는 항체를 말하며, 그것이 생성되는 방법에 의해 한정되지 않는다. 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파아지 디스플레이 기법의 이용을 포함한 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 제조될 수 있다.
하이브리도마 기법은 당업계에 공지된 것과 Harlow et al., ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988);Hammerling, et al., in:MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMA 563-681(Elsevier, N.Y.1981)(이들 전체가 본원에 참고로 통합됨)에 개시된 것들을 포함한다. Fab 와 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편 생성을 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생성을 위해)과 같은 효소를 이용하여 단백질 절단에 의해 생성될 수도 있다.
다른 한편으로는, 본 발명의 항체는 재조합 DNA 및 파아지 디스플레이 기법의 적용에 의해 또는 당업계에 공지된 방법을 이용하는 합성 화학의 적용에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 파아지 디스플레이 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 그들을 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유한 파아지 입자의 표면상에 진열된다. 항원, 일반적으로 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원으로 직접 선별함으로써 원하는 결합 성능을 가진 파아지를 레파토리 또는 조합항체 라이브러리로부터 선별한다. 이 방법에서 이용되는 파아지는 일반적으로 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 이황화 안정화된 Fv 항체 도메인을 가진 fd 및 M13을 포함하는 필라멘트성 파아지이다. 본 발명의 항체를 만들기 위해 이용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는 Brinkman U.et al.(1995) J.Immunol.Methods 182:41-50;Ames, R.S. et al.(1995) J.Immunol.Methods 184:177-186; Kettleborough, C.A. et al.(1994) Eur.J.Immunolo.24:952-958; Persic, L.et al.(1997) Gene 187:9-18; Burton, D.R. et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280;PCT/GB91/01134;WO90/02890;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401; 및 미국 특허 제5,698,426호, 5,223,409호, 5,403,484호, 5,580,717호, 5,427,908호, 5,750,753호, 5,821,047호, 5,571,698호, 5,427,908호, 5,516,637호, 5,780,225호, 5,658,727호 및 5,733,743호에 개시된 것들을 포함한다(상기 문헌들은 전체가 본원에 참고로 통합됨).
상기 문헌들에서 개시된 바처럼, 파아지 선별 후, 파아지로부터의 항체 암호 영역은 분리되어 사람 항체를 포함한 전체 항체, 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 생성하기 위해 이용될 수 있으며, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함한 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하기 위한 기법이 또한 WO92/22324;Mullinax, R.L. et al.(1992) BioTechniques 12(6):864-869; 및 Sawai, H.et al.(1995) AJRI 34:26-34; 및 Better, M.et al.(1988) Science 240:1041-1043에 개시된 것들과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 사용될 수 있다.(상기 문헌들은 모두 전체가 본원에 참고로 통합됨).
본 발명의 추가의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 또는 서열 번호 2 및/또는 4의 변이체, 및/또는 에피토프에 면역특이적으로 결합하는(특이적 항체-항원 결합을 분석하는 당업계에 공지된 면역분석에 의해 결정될 때) 항체 및 T-세포 항원 수용체(TCR)에 관련된다. 본 발명의 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 다특이적, 사람, 인간화된 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성되는 단편, 항-이디오타입(항-Id) 항체(본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함), 및 전술한 것중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 항원과 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 말한다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 면역글로불린의 임의의 타입(예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 분류(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위분류일 수 있다.
가장 바람직한 항체는 본 발명의 사람 항원-결합 항체 단편이며, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fvs(scFv), 단일쇄 항체, 이황화 연결된 Fvs(sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 단일쇄 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편은 가변 영역만을 포함할 수도 있고 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인 전체 또는 일부와 조합으로 포함할 수도 있다. 가변 영역과 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 임의 조합을 포함하는 항원-결합 단편도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체는 조류와 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원일 수도 있다. 바람직하게는, 항체는 사람, 설치류(예, 마우스와 쥐), 당나귀, 배 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 또는 닭이다. 본원에서 사용되는 "사람" 항체는 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하며 사람 면역글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 사람 면역글로불린에 대해 트랜스제닉이고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물(하기에서 개시되며, 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호에서 Kucherlapati et al.에 의해 개시됨)로부터 분리된 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 단일특이적, 이특이적, 삼특이적 또는 그 이상의 다특이성일 수도 있다. 다특이적 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 다른 에피토프들에 대해 특이적일 수도 있고, 또는 본 발명의 폴리펩티드 뿐만 아니라 이종성 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질과 같은 이종성 에피토프 둘다에 대해 특이적일 수도 있다. PCT 공보 WO93/17715; WO92/08802; WO91/00360; WO92/05793; Tutt, A. et al.(1991) J.Immunol.147:60-69; 미국 특허 4,474,893호,4,714,681호, 4,925,648호, 제5,573,920호, 5,601,819호, ; Kostelny, S.A.et al.(1992) J.Immunol.148:1547-1553 참고.
본 발명의 항체는 그 항체에 의해 인식되거나 특이적으로 결합되는 본 발명 폴리펩티드의 에피토프 또는 부분의 개념으로 설명되거나 특정될 수도 있다. 에피토프 또는 폴리펩티드 부분은 본원에서 개시된 대로 N-말단 및 C-말단 위치에 의해, 연속적인 아미노산 잔기의 크기에 의해 특정될 수도 있고, 표와 도면에 나열될 수도 있다. 본 발명의 바람직한 에피토프는 서열 번호 2의 아미노산 2-14, 32-44, 47-60, 66-78, 87-103, 109-118, 146-162, 168-180, 183-219, 223-243, 275-284, 296-306, 314-334, 341-354, 357-376, 392-399, 401-410, 418-429, 438-454, 456-471, 474-488, 510-522, 524-538, 550-561, 565-626, 630-643, 659-671, 679-721, 734-749, 784-804, 813-820, 825-832, 845-854, 860-894, 899-917, 919-924 및 928-939 그리고 서열 번호 4의 아미노산 26-38, 45-52, 69-76, 80-99, 105-113, 129-136, 138-217, 254-263, 273-289, 294-313, 321-331, 339-356, 371-383, 417-427, 438-443, 459-471, 479-505, 507-526, 535-546, 550-607, 615-640, 648-653, 660-667, 669-681, 683-704, 717-732, 737-743, 775-787, 797-804, 811-825, 840-867 및 870-884뿐만 아니라 이들 에피토프를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 에피토프 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 제외될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 그들의 배제를 허용한다.
본 발명의 항체는 또한 그들의 교차-반응성의 개념으로 설명되거나 특정될 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 임의의 다른 유사체, 오르소로그, 또는 상동체에 결합하지 않는 항체가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만의 동일성(당업계에 공지되고 본원에서 개시된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 폴리펩티드와 결합하는 항체 또한 본 발명에 포함된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 사람 단백질의 설치류, 쥐 및/또는 토끼 상동체 및 그들의 상응하는 에피토프와 교차 반응한다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만의 동일성(당업계에 공지되고 본원에서 개시된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 폴리펩티드와 결합하지 않는 항체 또한 본 발명에 포함된다. 특정 구체예에서, 전술한 교차 반응성은 임의의 하나의 특이적 항원성 또는 면역원성 폴리펩티드, 또는 본원에서 개시된 특이적 항원성 및/또는 면역원성 폴리펩티드 2,3,4,5, 또는 그 이상의 조합에 대한 것이다. 엄격한 하이브리드화 조건(본원에서 개시됨)하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 폴리펩티드에 결합하는 항체가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체는 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 그들의 결합 친화성의 개념으로 설명되거나 특정될 수도 있다. 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-2M, 10-2M,5 X 10-3M, 10-3M,5 X 10-4M, 10-4M,5 X 10-5M, 10-5M,5 X 10-6M, 10-6M,5 X 10-7M, 10-7M,5 X 10-8M, 10-8M,5 X 10-9M,10-9M,5 X 10-10M, 10-10M,5 X 10-11M,10-11M,5 X 10-12M, 10-12M,5 X 10-13M, 10-13M,5 X 10-14M, 10-14M,5 X 10-15M, 10-15M 미만의 해리 상수 즉 Kd를 갖는 것들을 포함한다.
본 발명은 또한 당업계에 공지된 경쟁적 결합 결정 방법, 예를 들어 본원에 개시된 면역 분석에 의해 결정될 때 본 발명의 에피토프에 대한 항체의 결합을 결쟁적으로 저해하는 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%에 의해 에피토프에의 결합을 경쟁적으로 저해한다.
본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 아고니스트 또는 안타고니스트로 작용할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드와의 수용체/리간드 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 파괴하는 항체를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 본원에 개시된 항원성 에피토프, 또는 그 부분에 결합한다. 본 발명은 수용체-특이적 항체와 리간드-특이적 항체 둘다를 특징으로 한다. 본 발명은 또한 리간드 결합은 저해하지 않으나 수용체 활성화를 저해하는 수용체-특이적 항체를 특징으로 한다. 수용체 활성화(예, 시그날링)는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 기술에 의해 결정될 수도 있다. 예를 들어, 수용체 활성화는 면역침전 및 웨스턴 블롯 분석(예, 전술함)에 의해 수용체 또는 그 기질의 인산화를 검출함으로써 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 리간드 활성 또는 수용체 활성을 항체 부재시 활성의 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 저해한다.
본 발명은 또한 리간드 결합 및 수용체 활성화를 저해하는 수용체-특이적 항체뿐만 아니라 수용체-리간드 복합체를 인식하고, 바람직하게는 미결합 수용체 또는 미결합 리간드를 특이적으로 인식하지 않는 항체를 특징으로 한다. 유사하게, 리간드에 결합하고 리간드가 수용체에 결합하는 것을 저해하는 중화 항체뿐만 아니라 리간드에 결합하고 그래서 수용체 활성화를 저해하나, 리간드가 수용체에 결합하는 것은 저해하지 않는 항체가 본 발명에 포함된다. 수용체를 활성화시키는 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 이들 항체는 수용체 아고니스트로 작용할 수도 있는 바, 즉 수용체의 이량화를 유도하여 리간드-매개 수용체 활성화의 생물학적 활성 모두 또는 일부를 강화하거나 활성화시킬 수도 있다. 항체는 본원에 개시된 본 발명의 펩티드의 특이적 생물학적 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대한 아고니스트, 안타고니스트, 또는 역 아고니스트로 특정될 수도 있다. 상기 항체 아고니스트는 공지된 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. PCT 공보 WO96/40281;미국 특허 제5,811,097호;Deng et al.,Blood 92(6):1981-1988(1998);Chen et al.,Cancer Res.58(16):3668-3678(1998);Harrop et al.,J.Immunol.161(4):1786-1794(1998);Zhu et al.,Cancer Res.58(15):3209-3214(1998);Yoon et al.,J.Immunol.160(7):3170-3179(1998);Prat et al.,J.Cell.Sci.111(Pt2):237-247(1998);Pitard et al.,J.Immunol.Methods 205(2):177-190(1997);Liautard et al.,Cytokine 9(4):232-241(1997);Carlson et al.,J.Biol.Chem.272(17):11295-11301(1997);Taryman et al.,Neuron14(4):755-762(1995);Muller et al.,Structure 6(9):1153-1167(1998);Bartunek et al., Cytokine 8(1):14-20(1996)(본원에 참고로 전체가 통합됨).
본 발명의 항체는 예를 들어, 생체외 및 생체내 진단 및 치료 방법 둘다를 포함하여, 본 발명의 폴리펩티드를 정제, 검출 및 표적화하기 위해 이용될 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 항체는 생물학적 시료에서 본 발명의 폴리펩티드의 농도를 정성적 및 정량적으로 측정하기 위한 면역 분석에서 사용된다. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2nd ed.1988)참고(본원에 참고로 통합됨).
하기에서 더욱 자세히 설명되는 바처럼, 본 발명의 항체는 혼자 또는 다른 조성물과 조합으로 이용될 수도 있다. 항체는 추가로 N-말단 또는 C-말단에서 이종성 폴리펩티드에 재조합적으로 융합될 수도 있고 또는 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 연결될 수도 있다(공유적 및 비공유적 결합 포함). 예를 들어, 본 발명의 항체는 검출 분석에서 표지로서 유용한 분자 및 이종성 폴리펩티드, 약제, 라디오뉴클라이드 또는 독소같은 효과 인자 분자에 재조합적으로 융합 또는 결합될 수도 있다. PCT 공보 WO92/08495;WO91/14438;WO89/12624;미국 특허 제5,314,995호 및 유럽 특허 제396,387호를 참고.
본 발명의 항체는 공유적 부착이 항체가 항-이디오타입 반응을 생성하는 것을 저해하지 않도록 항체에 임의의 유형의 분자를 공유적으로 부착시켜 변형된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 항체 유도체는 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지 보호/차단 기에 의한 유도화, 단백질분해적 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 연결 등에 의해 변형된 항체를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 임의의 많은 화학적 변형이 특이적 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하며 이에 제한되지 않는 공지 기술에 의해 수행될 수도 있다. 부가적으로, 유도체는 하나 이상의 비 전형적 아미노산을 포함할 수도 있다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 생성될 수도 있다. 관심의 대상인 항원에 대한 폴리클로날 항체는 공지된 다양한 과정에 의해생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 토끼, 마우스, 쥐, 등을 포함하며 이에 제한되지 않는 다양한 숙주 동물에 투여되어 그 항원에 특이적인 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도할 수 있다. 다양한 보조제가 숙주의 종에 따라 면역학적 반응을 증가시키기 위해 이용될 수도 있으며, 프로인트(완전 및 불완전), 알루미늄 하이드록사이드와 같은 미네랄젤, 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 폴리안이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 사람 보조제(예, BCG(bacille Calmette-Guerin)와 Corynebacterium parvum)를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 그러한 보조제 역시 당업계에 공지이다.
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파아지 디스플레이 기법 또는 이들의 조합을 포함한 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 것과 Harlow et al., ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988);Hammerling, et al., in:MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMA 563-681(Elsevier, N.Y.1981)(이들 전체가 본원에 참고로 통합됨)에 개시된 것을 포함하는 하이브리도마 기법을 이용하여 생산될 수 있다. "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기법에 의해 생성되는 항체에 제한되지 않는다. "모노클로날 항체"는 진핵, 원핵, 또는 파아지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래되는 항체를 말하며, 그것이 생성되는 방법에 의해 한정되지 않는다.
하이브리도마 기법을 이용하여 특이적 항체를 생산하고 선별하는 방법은 일상적이며 당업계에 공지되어 있으며 실시예에서 상세히 설명된다. 비제한적인 예에서, 마우스는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그러한 펩티드를 발현하는 세포로 면역될 수 있다. 일단 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 항원에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되면, 마우스 비장을 수거하여 비장세포를 분리한다. 비장 세포를 공지 방법에 의해 임의의 적절한 골수종 세포(예, ATCC에서 구할 수 있는 세포주 SP20의 세포)에 융합시킨다. 하이브리도마를 제한 희석에 의해 선별 및 클로닝한다. 하이브리도마 클론을 이어서 공지 방법에 의해 본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 분석한다. 일반적으로 고농도의 항체를 함유하고 있는 복수액은 양성 하이브리도마 클론으로 마우스를 면역시켜 생성시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 모노클로날 항체를 생성시키는 방법과 그 방법에 의해 생성된 항체를 제공하며, 이 방법은 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양하는 것을 포함하며, 이때, 바람직하게는 하이브리도마는 본 발명의 항원으로 면역된 마우스로부터 분리된 비장 세포를 골수종 세포와 융합시키고 이어서 융합으로부터 생성된 하이브리도마를 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대해 선별함으로써 생산된다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지 방법에 의해 생성될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편 생성을 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생성을 위해)과 같은 효소를 이용하여 면역글로불린 분자의 단백질 분해적 절단에 의해 생성될 수도 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 또한 공지된 다양한 파아지 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 그들을 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유한 파아지 입자의 표면상에 진열된다. 특정 구체예에서, 그러한 파아지는 레파토리 또는 조합 항체 라이브러리(예, 사람 또는 설치류)로부터 발현되는 항원 결합 도메인을 제시하기 위해 이용될 수 있다. 관심의 대상인 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파아지는 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 선별하거나 동정될 수 있다. 이 방법에서 이용되는 파아지는 일반적으로 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 이황화 안정화된 Fv 항체 도메인을 가진 파아지로부터 발현되는 fd 및 M13 결합 도멘을 포함하는 필라멘트성 파아지이다. 본 발명의 항체를 만들기 위해 이용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는 Brinkman et al.(1995) J.Immunol.Methods 182:41-50;Ames, et al.(1995) J.Immunol.Methods 184:177-186; Kettleborough, et al.(1994) Eur.J.Immunol.24:952-958; Persic, et al.(1997) Gene 187:9-18; Burton, et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280;PCT/GB91/01134;WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401; 및 미국 특허 제5,698,426호, 5,223,409호, 5,403,484호, 5,580,717호, 5,427,908호, 5,750,753호, 5,821,047호, 5,571,698호, 5,427,908호, 5,516,637호, 5,780,225호, 5,658,727호 및 5,733,743호 및 5,969,108호에 개시된것들을 포함한다(상기 문헌들은 전체가 본원에 참고로 통합됨).
상기 문헌들에서 개시된 바처럼, 파아지 선별 후, 파아지로부터의 항체 암호 영역은 분리되어 사람 항체를 포함한 전체 항체, 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 생성하기 위해 이용될 수 있으며, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함한 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하기 위한 기법이 또한 WO92/22324;Mullinax, et al.(1992) BioTechniques 12(6):864-869; 및 Sawai, et al.(1995) AJRI 34:26-34; 및 Better, et al.(1988) Science 240:1041-1043에 개시된 것들과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 사용될 수 있다.(상기 문헌들은 모두 전체가 본원에 참고로 통합됨).
단일쇄 Fvs와 항체를 생성하기 위해 이용될 수 있는 기법의 예는 미국 특허 제4,946,778호와 5,258,498호;Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88(1991);Shu et al., PNAS 90:7995-7999(1993); 및 Skerra et al.,Science 240:1038-1040(1988)에 개시된 것들을 포함한다. 사람에서 항체의 생체내 용도와 생체외 검출 분석을 포함하여 일부 용도의 경우, 키메라, 인간화, 또는 사람 항체를 이용하는 것이 바람직할 수도 있다. 키메라 항체는 항체의 다른 부분이 다른 동물 종에서 유래된 분자로서, 예를 들어 쥐 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역 및 사람 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체가 있다. 키메라 항체를 생성하는 방법은 공지이다. Morrison, Science 229:1202(1985); Oi et al., BioTechniques 4:214(1986); Gillies et al.,(1989) J.Immunol.Methods 125:191-202;미국 특허제5,807,715호;4,816,567호;및 4,816,397호(이들 모두 전체가 본원에 참고로 통합됨) 참고. 인간화된 항체는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)과 사람 면역글로불린 분자로부터의 골격 영역을 갖는 소정의 항원에 결합하는 비인간 종 항체로부터의 항체 분자이다. 종종, 사람 골격 영역내의 골격 잔기는 CDR 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환되어 항원 결합을 바꾸거나 바람직하게는 개선시킬 것이다. 이들 골격 치환은 CDR과 골격 잔기의 상호작용을 모델링하여 항원 결합에 중요한 골격 잔기를 동정하고 서열을 비교하여 특정 위치에서의 비정상적인 골격 잔기를 동정하는 것과 같은 공지 방법에 의해 동정된다.(Queen et al., 미국 특허 제5,585,089호;Reichmann et al.,Nature 332:323(1988) 참고, 모두 본원에 참고로 통합됨) 항체는 예를 들어, CDR 이식(EP 239,400;PCT 공보 WO91/09967;미국 특허 제5,225,539호;5,530,101호; 및 5,585,089호), 브니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing)(EP 592,106;EP 519,596;Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991);Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814(1994);Roguska et al.,PNAS 91:969-973(1994)), 및 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332호)을 포함하는 공지의 다양한 기법을 이용하여 인간화될 수 있다.
완전한 사람 항체는 사람 환자의 치료를 위해 특히 바람직하다. 사람 항체는 사람 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 이용하는 전술한 파아지 디스플레이 방법을 포함한 다양한 공지 방법에 의해 만들어 질 수 있다. 미국 특허 제4,444,887호 및 4,716,111호; 및 PCT 공보 WO98/46645, WO98/50433, WO98/24893,WO98/16654, WO96/34096, WO96/33735, 및 WO91/10741 참고.(이들 각각은 전체가 참고로 본원에 통합됨)
사람 항체는 또한 기능성 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없으나 사람 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 사람 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 임의로 또는 상동성 재조합에 의해 마우스 배간세포내로 도입될 수도 있다. 다른 한편으로는, 사람 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역이 사람 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 마우스 배간세포에 도입될 수도 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의해 사람 면역글로불린 좌위(loci)의 도입과 별도로 또는 동시에 비기능성이 부여될 수도 있다. 특히, JH 영역의 동형접합체성 결실은 내인성 항체 생산을 막는다. 변형된 배간 세포는 확장되어 포배에 미세주사되어 키메라 마우스를 생성한다. 키메라 마우스는 이어서 사람 항체를 발현하는 동형접합체성 자손을 생산하기 위해 육종된다. 트랜스제닉 마우스는 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부와 같은 선별된 항원으로 일반적인 방식으로 면역된다. 항원에 대해 형성된 모노클로날 항체는 면역된 트랜스제닉 마우스로부터 통상의 하이브리도마 기술을 이용하여 얻어질 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 보유된 사람 면역글로불린 트랜스유전자는 B 세포 분화동안 재배열하며, 이어서 분류 변화 및 체세포 돌연변이를 거친다. 따라서, 그러한 기법을 이용하여, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 사람 항체를 생산하기 위한 이 기술의 개요를 위해서는, Lonberg and Huszar, Intl.Rev.Immunol.13:65-93(1995)를 참고한다. 사람 항체와 사람 모노클로날 항체를 생산하기 위한 이 기술과 그러한 항체 생산을 위한 프로토콜의 상세한 설명을 위해서는 PCT 공보 WO98/24893;WO92/01047;WO96/34096;WO96/33735;유럽 특허 제598,877호;미국 특허 제5,413,923호;5,625,126호;5,633,425호;5,569,825호;5,661,016호;5,545,806호;5,814,318호;5,885,793호;5,916,771호; 및 5,939,598호를 참고하며, 이들은 전체가 본원에 참고로 통합된다. 더욱이, 아브게닉스, 인크(Fremont,CA)와 GenPharm(San Jose, CA)같은 회사들은 전술한 것과 유사한 기술을 이용하여 선별된 항원에 대해 생성된 사람 항체를 제공하는데 관련될 수 있다.
선별된 에피토프를 인식하는 완전한 사람 항체는 "가이드된 선별"로 칭해지는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이 접근에서, 선별된 비사람 모노클로날 항체, 즉 마우스 항체는 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 사람 항체의 선별을 안내하기 위해 이용된다(Jespers et al., Bio/technology 12:899-903).
추가로, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 교대로 당업계에 공지된 기술을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 모방하는 항-이디오타입 항체를 생성시키기 위해 이용될 수 있다.(Greenspan & Bona, FASEB J.7(5):437-444;(1989) 및 Nissinoff, J.Immunol.147(8):2429-2438(1991)참고).예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하여 폴리펩티드 다량체화 및/또는 본 발명의 폴리펩티드의 리간드에의 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체는 폴리펩티드 다량체화 및/또는 결합 도메인을 모방하고, 그 결과, 폴리펩티드 및/또는 그 리간드에 결합하여 중화시키는 항-이디오타입을 생성시키기 위해 이용될 수 있다. 그러한 중화 항-이디오타입 또는 그러한 항-이디오타입의 Fab 단편은 폴리펩티드 리간드를 중화시키기 위한 치료 섭생에 이용될 수 있다. 예를 들어, 그러한 항-이디오타입 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하고/하거나 그 리간드/수용체에 결합하여 그 생물학적 활성을 차단하도록 이용될 수 있다.
단일쇄 Fvs와 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 4,946,778호 및 5,258,498호;Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88(1991);Shu et al., PNAS 90:7995-7999(1993); 및 Skerra et al.,Science 240:1038-1040(1988)에 개시된 것들을 포함한다. 사람에서 항체의 생체내 용도와 생체외 검출 분석을 포함하여 일부 용도의 경우, 키메라, 인간화, 또는 사람 항체를 이용하는 것이 바람직할 수도 있다. 키메라 항체를 생성하는 방법은 공지이다. Morrison, Science 229:1202(1985); Oi et al., BioTechniques 4:214(1986); Gillies et al.,(1989) J.Immunol.Methods 125:191-202;미국 특허 제5,807,715호(이들 모두 전체가 본원에 참고로 통합됨) 참고. 항체는 예를 들어, CDR 이식(EP 239,400;PCT 공보 WO91/09967;미국 특허 제5,225,539호;5,530,101호; 및 5,585,089호), 브니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing)(EP 592,106;EP 519,596;Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991);Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814(1994);Roguska et al.,PNAS 91:969-973(1994)), 및 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332호)을 포함하는 공지의 다양한 기법을 이용하여 인간화될 수 있다. 사람 항체는 전술한 파아지 디스플레이 방법을 포함한 당업계에 공지된 다양한 방법들에 의해 만들어질 수 있다. 또한, 미국 특허 4,444,887호, 4,716,111호, 5,545,806호 및 5,814,318호; 그리고 WO98/46645호 참고(상기 문헌들은 전체가 참고로 통합됨).
본 발명의 폴리펩티드에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 연결된(공유적 및 비공유적 연결 포함) 항체도 본 발명에 포함된다. 항체는 본 발명의 폴리펩티드외의 다른 항원에 대해 특이적일 수도 있다. 예를 들어, 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 특정 세포 표면 수용체에 대해 특이적인 항체에 융합 또는 연결시켜 생체외 또는 생체내에서 본 발명의 폴리펩티드를 특정 세포 유형에 표적화시키기 위해 이용될 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 항체는 또한 공지된 방법을 이용하는 생체외 면역분석 및 정제 방법에 이용될 수도 있다. 예를 들어 Harbor et al.(상기함) 및 WO93/21232;EP 439,095;Naramura, M. et al.(1994) Immunol.Lett.39:91-99;미국 특허 제5,474,981호;Gillies, S.O. et al.(1992) PNAS 89:1428-1432;Fell, H.P.et al.(1991) J.Immunol.146:2446-2452(상기 문헌들은 전체가 참고로 본원에 통합됨).
본 발명은 추가로 변이 영역외의 항체 도메인에 융합되거나 연결된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 항체 Fc 영역, 또는 그 부분에 융합되거나 연결될 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 항체 부분은 힌지 영역, CH1 도메인,CH2 도메인, 및 CH3 도메인 또는 전체 도메인 또는 그 부분의 임의의 조합을 포함할 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 상기 항체 부분에 융합되거나 연결되어 폴리펩티드의 생체내 반감기를 증가시키거나 공지된 방법을 이용한 면역분석에 이용될 수도 있다. 폴리펩티드는 또한 다량체를 형성하기 위하여 상기 항체 부분에 융합되거나 연결될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 Fc 부분은 Fc 부분사이의 이황화 결합을 통하여 이량체를 형성할 수 있다. 더 높은 다량화 형태는 폴리펩티드를 IgA 및 IgM의 부분에 융합시켜 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 항체 부분에 융합시키거나 연결시키는 방법은 당업계에 공지이다. 미국 특허 제5,336,603호, 5,622,929호, 5,359,046호, 5,349,053호, 5,447,851호, 5,112,946호;EP 307,434, EP 367,166;WO96/04388, WO91/06570; Ashkenazi, A. et al.(1991) PNAS 88:10535-10539;Zheng, X.X.et al.(1995) J.Immunol.154:5590-5600; 및 Vil, H. et al(1992) PNAS 89:11337-11341 참고(상기 문헌들은 전체가 참고로 본원에 통합됨).
본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드의 아고니스트 또는 안타고니스트로 작용하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드의 아고니스트 또는 안타고니스트로 작용하는 항체는 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드와 수용체/리간드 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 파괴하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 단백질이 다량화하는 능력을 파괴하는 항체를 포함한다. 다른 예에서는, 본 발명은 본 발명의 단백질이 다량화하는 것을 허용하되, 본 발명의 단백질이 하나 이상의 METH1 및/또는 METH2 수용체/리간드에 결합하는 능력을 파괴하는 항체를 포함한다. 또 다른 예에서는, 본 발명은 본 발명 단백질이 다량화하는 것을 허용하고 METH1 및/또는 METH2 수용체/리간드에 결합하나, METH1 및/또는 METH2/수용체/리간드 복합체와 관련된 생물학적 활성을 차단하는 항체를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드의 아고니스트 또는 안타고니스트로 작용하는 항체는또한 수용체-특이적 항체와 리간드-특이적 항체 둘다를 포함한다. 리간드 결합을 저해하지 않으나 수용체 활성화를 저해하는 수용체-특이적 항체가 포함된다. 수용체 활성화(예, 시그날링)는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 기술들에 의해 결정될 수도 있다. 리간드 결합 및 수용체 활성화를 저해하는 수용체-특이적 항체 또한 포함된다. 마찬가지로, 리간드에 결합하며 수용체에의 리간드 결합을 저해하는 중화 항체 뿐만 아니라, 리간드에 결합하여 수용체 활성화를 저해하나 리간드가 수용체에 결합하는 것을 저해하지 않는 항체가 포함된다. 수용체를 활성화시키는 항체가 추가로 포함된다. 이들 항체는 리간드-매개 수용체 활성화에 의해 영향받는 생물학적 활성의 모두 또는 그 미만에 대해 아고니스트로 작용할 수도 있다. 항체는 본원에 개시된 특이적 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대한 아고니스트 또는 안타고니스트로 특정될 수도 있다. 상기 항체 아고니스트는 공지 방법을 이용해 만들어질 수 있다. WO96/40281;미국 특허 제5,811,097호;Deng, B.et al., Blood 92(6):1981-1988(1998);Chen,Z.et al.,Cancer Res.58(16):3668-3678(1998);Harrop,J.A.et al.,J.Immunol.161(4):1786-1794(1998);Zhu,Z.et al.,Cancer Res.58(15):3209-3214(1998);Yoon,D.Y.et al.,J.Immunol.160(7):3170-3179(1998);Prat,M.et al.,J.Cell.Sci.111(Pt2):237-247(1998);Pitard,V.et al.,J.Immunol.Methods 205(2):177-190(1997);Liautard,J.et al.,Cytokine 9(4):233-241(1997);Carlson,N.G. et al., J.Biol.Chem.272(17):11295-11301(1997);Taryman,R.E. et al.,Neuron 14(4):755-762(1995);Muller,Y.A.et al.,Structure 6(9):1153-1167(1998);Bartunek,P.et al.,Cytokine8(1):14-20(1996)참고(상기 문헌들은 참고로 본원에 통합됨).
전술한 대로, 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 단백질에 대한 항체는 교대로 당업계에 공지된 기술을 이용하여 METH1 및/또는 METH2를 모방하는 항-이디오타입 항체를 생성하기 위해 이용될 수 있다.(Greenspan & Bona, FASEB J.7(5):437-444;(1989) 및 Nissinoff, J.Immunol.147(8):2429-2438(1991)참고) 예를 들어, METH1 및/또는 METH2에 결합하며 METH1 및/또는 METH2 다량체화 및/또는 리간드에의 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체는 METH1 및/또는 METH2 다량체화 및/또는 결합 도메인을 모방하며 그 결과 METH1 및/또는 METH2 및/또는 그 리간드에 결합하여 중화시키는 항-이디오타입을 생성하는 데 사용될 수 있다. 그러한 중화 항-이디오타입 또는 그러한 항-이디오타입의 Fab 단편은 METH1 및/또는 METH2 리간드를 중화시키기 위한 치료 섭생법에 이용될 수 있다. 예를 들어, 그러한 항-이디오타입 항체는 METH1 및/또는 METH2에 결합하거나, 또는 METH1 및/또는 METH2 리간드/수용체에 결합하여 METH1 및/또는 METH2 생물 활성을 차단하기 위해 이용될 수 있다.
항체를 암호하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 추가로 본 발명의 항체 및 그 단편을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 엄격하거나 보다 낮은 엄격도의 하이브리드화 조건(예, 상기에서 정의)하에서, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 서열 번호 2 및/또는 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 암호하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
공지된 임의의 방법에 의해 폴리뉴클레오티드가 얻어질 수 있으며, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 결정될 수 있다. 예를 들어, 만일 항체의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있으면, 그 항체를 암호하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드(예, Kutmeier et al,BioTechniques 17:242(1994))로부터 조립될 수도 있으며, 이는 요약하자면 그 항체를 암호하는 서열의 일부를 함유하는 중복되는 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링과 결찰, 및 결찰된 올리고뉴클레오티드의 PCR에 의한 증폭에 관련된다.
다른 한편으로는, 항체를 암호하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성될 수도 있다. 만일 특정 항체를 암호하는 핵산을 함유하는 클론이 이용가능하지 않으나 그 항체 분자의 서열이 공지이면, 그 서열의 3' 말단과 5' 말단에 하이브리드할 수 있는 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 또는 그 항체를 암호하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 동정하기 위한 특정 유전자 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 클로닝에 의해, 그 면역글로불린을 암호하는 핵산이 화학적으로 합성되거나 적절한 공급원(예, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 본 발명의 항체를 발현하도록 선별된 하이브리도마 세포와 같은 임의의 항체 발현 조직 또는 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 분리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA)으로부터 얻어질 수도 있다.PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터내로 클로닝될 수도 있다.
일단 그 항체의 핵산 서열과 상응하는 아미노산 서열이 결정되면, 항체의 뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA 기법, 부위 특이적 돌연변이, PCR, 등(예를 들어, Sambrook et al,1990,Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al.,eds.,1998,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY, 둘다 본원에 참고로 통합됨)과 같은 뉴클레오티드 서열 조작을 위해 공지된 방법들을 사용하여 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 형성시키는 것과 같은 다른 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성시키도록 조작될 수도 있다.
특정 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열 과변이성 영역을 결정하기 위하여 다른 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열과 비교하는 것과 같은 공지된 방법에 의해 상보성 결정 영역의 서열을 동정하기 위해 검사될 수도 있다. 일상적인 재조합 DNA 기법을 이용하여, 하나 이상의 CDR을 골격 영역, 예를 들어 사람 골격 영역내에 삽입시켜 비인간 항체를 인간화시킬 수도 있다. 골격 영역은 자연 발생하거나 컨센서스(consensus)한 골격 영역일 수도 있고, 바람직하게는 사람 골격 영역(예, 사람 골격 영역의 목록을 위한 Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998))일 수도 있다. 바람직하게는, 골격 영역과 CDR의 조합에 의해 생성되는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 암호한다. 바람직하게는, 전술한 바처럼, 하나 이상의 아미노산 치환을 골격 영역내에서 이룰 수도 있으며, 바람직하게는, 아미노산 치환은 항체의 항원에의 결합을 개선한다. 부가적으로, 그러한 방법은 쇄간 이황화 결합에 참여하고 있는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는결실을 만들어 하나 이상의 쇄간 이황화 결합이 부족한 항체 분자를 생성시키는 데 이용될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드에의 다른 변화가 본 발명에 포함되며 당업계의 상식내이다.
더욱이, 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적절한 생물학적 활성의 사람 항체 분자로부터의 유전자와 스플라이싱시킴으로써 "키메라 항체"를 생성하기 위해 개발된 기법들(Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855(1984);Neuberger et al.,Nature 312:604-608(1984);Takeda et al.,Nature 314:452-454(1985))이 이용될 수 있다. 전술한 대로, 키메라 항체는 다른 부분들이 다른 동물 종으로부터 유래되며, 예를 들어 쥐 mAb로부터 유래된 가변 영역과 사람 면역글로불린 불변 영역을 갖는 인간화 항체 같은 것들이 있다.
다른 한편으로는, 단일쇄 항체 생산을 위해 기술된 방법(미국 특허 제4,946,778호;Bird,Science 242:423-42(1988);Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988);및 Ward et al.,Nature 334:544-54(1989))이 단일쇄 항체를 생성하기 위해 적용될 수 있다. 단일쇄 항체는 아미노산 가교를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시켜 단일쇄 폴리펩티드를 생성시킴으로써 형성된다. E.coli에서 기능성 Fv 단편의 조립 기법이 또한 이용될 수도 있다(Skerra et al.,Science 242:1038-1041(1988)).
항체 생산 방법
본 발명의 항체는 항체 합성을 위한 임의의 공지 방법, 특히 화학적 합성 또는 바람직하게는 재조합 발현 기법에 의해 생산될 수 있다.
본 발명 항체, 또는 그들의 단편, 유도체 또는 유사체(예, 본 발명 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 본 발명의 단일쇄 항체)의 재조합 발현은 그 항체를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 작제를 요구한다. 일단 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그들의 부분을 암호하는 폴리뉴클레오티드가 얻어지면, 그 항체 분자의 생산을 위한 벡터는 공지된 기술을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수도 있다. 따라서, 항체 암호 뉴클레오티드 서열을 함유한 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 단백질을 제조하는 방법이 본원에서 개시된다. 항체 암호 서열과 적절한 전사 및 번역 조절 시그날을 함유하는 발현 벡터를 작제하기 위해 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 이 방법들은 예를 들어 생체외 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 본 발명은 따라서 프로모터에 작동적으로 연결되며 본 발명의 항체 분자, 또는 그들의 중쇄 또는 경쇄 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제성 벡터를 제공한다. 그러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 암호하는 뉴클레오티드 서열(예, PCT 공보 WO86/05807;PCT 공보 WO89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호 참고)을 포함할 수도 있으며 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 그러한 벡터에 클론될 수도 있다.
발현 벡터는 통상적인 기술에 의해 숙주 세포에 전달되며 형질감염된 세포는 이어서 통상적인 기술에 의해 배양되어 본 발명의 항체를 생산한다. 따라서, 본 발명은 이종성 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명의 항체, 그들의 중쇄 또는 경쇄, 또는 본 발명의 단일쇄 항체를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이중쇄 항체의 발현을 위한 바람직한 구체예에서, 중쇄와 경쇄 둘다를 암호하는 벡터는 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 하기와 같이 함께 발현될 수도 있다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템은 본 발명의 항체 분자를 발현시키기 위해 이용될 수도 있다. 그러한 숙주 발현 시스템은 관심의 암호 서열이 생성되어 정제될 수 있는 비히클을 나타내며, 또한 적절한 뉴클레오티드 암호 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 본 발명의 항체 분자를 인시추로 발현하는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예, 이.콜리, 비.서브틸리스)같은 미생물;항체 암호 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예, 사카로마이세스, 피치아);항체 암호 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템;재조합 바이러스 발현 벡터(예, 카울리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예, Ti 플라스미드)로 감염된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예, 메탈로치오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구조체를 가진 포유동물 세포 시스템(예, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 이 콜리같은 박테리아 세포,더욱 바람직하게는 진핵 세포 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현을 위해 이용된다. 예를 들어, 차이니즈 햄스터 오바리 세포(CHO)같은 포유동물 세포는 사람 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중기 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 항체를 위한 효과적인 발현 시스템이다.(Foecking et al.,Gene 45:101(1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2(1990)).
박테리아 시스템에서, 많은 발현 벡터가 발현될 항체 분자의 의도된 용도에 따라 유익하게 선택될 수도 있다. 예를 들어, 항체 분자의 약학 조성물의 생성을 위해 다량의 그러한 단백질이 생성되어야 할 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 산물이 고농도로 발현되도록 하는 벡터가 바람직하다. 그러한 벡터는 항체 암호 서열이 lacZ 암호 영역과 인프레임(in frame)으로 벡터내에 개별적으로 결찰되어 융합 단백질이 생성되도록 하는 이.콜리 발현 벡터 pUR278(Ruther et al.,EMBO J.2:1791(1983)); pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985);Van Heeke & Schuster, J.Bio.Chem.24:5503-5509(1989)) 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. pGEX 벡터는 또한 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)를 가진 융합 단백질로 외래 폴리펩티드를 발현하기 위해 이용될 수도 있다. 일반적으로, 그러한 융합 단백질은 가용성이며 흡착 및 매트릭스 글루타치온-아가로즈 비드에의 결합과 이어지는 자유 글루타치온 존재하에서의 용출에 의해 용해 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하여 클론된 표적 유전자 산물이 GST 부로부터 분리될 수 있도록 고안된다.
곤충 시스템에서, 오토그래파 캘리포니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)가 외래 유전자 발현을 위한 벡터로 이용된다. 이 바이러스는 스포도프테라 프루지페르다 세포에서 성장한다. 항체 암호 서열은 개별적으로 바이러스의 비-필수 영역(예를 들어 폴리헤드린 유전자)내로 클론되어 AcNPV 프로모터(예를 들어 폴리헤드린 프로모터)의 조절하에 놓일 수도 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 많은 바이러스계 발현 시스템이 이용될 수도 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 이용되는 경우, 관심의 항체 암호 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예, 후기 프로모터 및 삼부(tripartite) 리더 서열에 결찰될 수도 있다. 이 키메라 유전자는 이어서 생체외 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수도 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역에의 삽입(예, 영역 E1 또는 E3)은 생존력 있고 감염된 숙주에서 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 생성시킬 것이다.(예, Logan&Shenk, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355-359(1984)). 특이적 개시 시그날은 또한 삽입된 항체 암호 서열의 효과적인 번역에 요구될 수도 있다. 이들 시그날은 ATG 개시 코돈과 이웃한 서열을 포함한다. 더욱이, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위하여 원하는 암호 서열의 리딩 프레임과 인페이즈(in phase)여야 한다. 이들 외래 번역 조절 시그날과 개시 코돈은 다양한 기원일 수 있으며, 천연 및 합성일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 증가 요소, 전사 종결인자 등의 포함에 의해 증가될 수 있다(Bittner et al.,Methods in Enzymol.153:51-544(1987)).
더욱이, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포가 선택될 수도 있다. 단백질 산물의 그러한 변형(예, 글리코실화) 및 가공(예, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수도 있다. 다른 숙주 세포는 단백질과 유전자 산물의 번역후 가공 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 기작을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하도록 선택될 수 있다. 이를 위하여, 일차 전사물의 적절한 가공, 유전자 산물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 기구를 소유한 진핵 숙주 세포가 이용될 수도 있다. 그러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERA, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, 그리고 특히, 예를 들어 BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D와 같은 유방암 세포주, 및 예를 들어 CRL7030과 Hs578Bst같은 포유류 선(gland) 세포주를 포함하며 이에 제한되지 않는다.
재조합 단백질의 장기적인 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주는 조작될 수도 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 이용하기 보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소(예, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등)와 선별 표지에 의해 조절되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입에 이어, 조작된 세포는 풍부한 배지에서 1-2일동안 성장시킨 다음 선별 배지로 옮겨진다. 재조합 플라스미드의 선별 표지는 선별에 대한 내성을 부여하며 세포가 그 플라스미드를 그들의 염색체내로 안정적으로 통합시켜 성장하여 군락을 형성하도록 하며 이는 클론되어 세포주로 확장될 수 있다. 이 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하기 위해 이용될 수도 있다. 그러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접 또는간접적으로 상호작용하는 화합물의 검색 및 평가에 특히 유용할 수도 있다.
많은 선별 시스템이 이용될 수 있으며, 이는 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al.,Cell 11:223(1997)), 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al.,Cell 22:817(1980))유전자를 포함하며 이에 한정되지 않으며 이들은 tk-, hgprt-, aprt- 세포에서 각각 이용할 수 있다. 또한, 항대사물 내성이 다음 유전자들을 위한 선별의 기초로 이용될 수 있다:dhfr, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함(Wigler et al.,Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980);O'Hare et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981));gpt, 미코페놀산에 대한 내성을 부여함(Mulligan & Berg, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981));neo, 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여함(Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 12:488-505(1993);Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95(1991);Tlstoshev, Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993);Mulligan,Science 260:926-932(1993); 및 Morgan and Anderson, Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993);May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215); 및 hygro, 히그로마이신에 대한 내성 부여(Santerre et al.,Gene 30:147(1984)). 당업계에 흔히 알려진 재조합 DNA 기술 방법은 원하는 재조합 클론을 선별하기 위해 일상적으로 이용될 수 있으며, 그러한 방법은 예를 들어 Ausubel et al.(eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993);Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990);및 Chapter 12 and 13, Dracopoli et al.(eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY(1994);Colberre-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1(1981)(모두 참고로 본원에 통합됨)에 설명된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Vol3.(Academic Press, NY 1987)참고).항체를 발현하는 벡터 시스템내의 표지가 증폭가능할 때, 숙주 세포 배양물에 존재하는 억제제의 농도의 증가는 표지 유전자의 카피수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 관련되기 때문에, 항체의 생산 역시 증가될 것이다(Crouse et al.,Mol.Cell.Biol.3:257(1983))
숙주 세포는 본 발명의 두 개의 발현 벡터로 동시 형질감염될 수 있는바, 하나는 중쇄 유래 폴리펩티드 암호 벡터이고 다른 하나는 경쇄 유래 폴리펩티드 암호 벡터이다. 두 벡터는 중쇄와 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선별 표지를 함유할 수도 있다. 다른 한편으로는, 중쇄와 경쇄 폴리펩티드 둘다를 암호하며 발현할 수 있는 단일 벡터가 이용될 수도 있다. 그러한 상황에서, 과다한 독성 자유 중쇄를 피하기 위해 경쇄는 중쇄 앞에 놓여져야 한다(Proudfoot, Nature 322:52(1986);Kohler, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197(1980)). 중쇄와 경쇄를 위한 암호 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수도 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 동물에 의해 생산되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 재조합적으로 발현되면, 그것은 면역글로불린 분자의 정제를 위해 공지된임의의 방법에 의해 정제될 수 있으며, 예를 들어 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A를 따르는 특정 항원에 대한 친화성, 및 크기에 의한 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 분별 가용성, 또는 임의의 단백질 정제를 위한 표준 기법이 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 이종성 폴리펩티드 서열에 융합되어 정제를 촉진할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드(또는 그 부분, 바람직하게는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합적으로 융합되거나 또는 화학적으로 연결되어(공유적 및 비공유적 연결을 포함함) 융합 단백질을 형성하는 항체를 포함한다. 융합은 반드시 직접적일 필요는 없으며 링커 서열을 통하여 일어날 수도 있다. 항체는 본 발명의 폴리펩티드(또는 그 부분, 바람직하게는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 아미노산의 폴리펩티드)외의 항원에 대해 특이적일 수도 있다. 예를 들어, 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 특정 세포 표면 수용체에 대해 특이적인 항체에 융합 또는 연결시켜 생체외 또는 생체내에서 본 발명의 폴리펩티드를 특정 세포 유형에 표적화시키기 위해 이용될 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 항체는 또한 공지된 방법을 이용하는 생체외 면역분석 및 정제 방법에 이용될 수도 있다. 예를 들어 Harbor et al.(상기함) 및 WO93/21232;EP 439,095;Naramura, M. et al.(1994) Immunol.Lett.39:91-99;미국 특허 제5,474,981호;Gillies, S.O. et al.(1992) PNAS 89:1428-1432;Fell, et al.(1991) J.Immunol.146:2446-2452(상기 문헌들은 전체가 참고로 본원에 통합됨).
본 발명은 추가로 변이 영역외의 항체 도메인에 융합되거나 연결된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 항체 Fc 영역, 또는 그 부분에 융합되거나 연결될 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 항체 부분은 불변 영역, 힌지 영역, CH1 도메인,CH2 도메인, 및 CH3 도메인 또는 전체 도메인 또는 그 부분의 임의의 조합을 포함할 수도 있다. 폴리펩티드는 또한 다량체를 형성하기 위하여 상기 항체 부분에 융합되거나 연결될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 Fc 부분은 Fc 부분사이의 이황화 결합을 통하여 이량체를 형성할 수 있다. 더 높은 다량화 형태는 폴리펩티드를 IgA 및 IgM의 부분에 융합시켜 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 항체 부분에 융합시키거나 연결시키는 방법은 당업계에 공지이다. 미국 특허 제5,336,603호, 5,622,929호, 5,359,046호, 5,349,053호, 5,447,851호, 5,112,946호;EP 307,434, EP 367,166;WO96/04388, WO91/06570; Ashkenazi, A. et al.(1991) PNAS 88:10535-10539;Zheng, X.X.et al.(1995) J.Immunol.154:5590-5600; 및 Vil, H. et al(1992) PNAS 89:11337-11341 참고(상기 문헌들은 전체가 참고로 본원에 통합됨).
상술한 바처럼, 서열 번호 2 및/또는 4의 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 또는 변이체에 상응하는 폴리펩티드는 상기 항체 부분에 융합되거나 연결되어 폴리펩티드의 생체내 반감기를 증가시키거나 공지된 방법을 이용하는 면역분석에 이용될 수도 있다. 더욱이, 서열 번호 2 및/또는 4에 상응하는 폴리펩티드는 상기 항체 부분에 융합되거나 연결되어 정제를 촉진시킬 수도 있다. 이는 사람 CD4-폴리펩티드의 첫번 째 두 도메인과 포유동물 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 가변 도메인으로 구성된 키메라 단백질에서 보여졌다. EP 394,827호;Traunecker et al., Nature, 331:84-86(1988) 참고. 이황화-연결된 이량체 구조를 갖는 항체에 융합 또는 연결된 본 발명의 폴리펩티드는 또한 다른 분자와의 결합 및 중화에 있어서 단량체 분비 단백질 또는 그 단편 혼자보다 더 효율적인 것으로 밝혀졌다. Fountoulakis et al., J.Biochem., 270:3958-3964(1995) 참고. 많은 경우, 융합 단백질에서 Fc 부분은 치료 및 진단에서 유익하며, 따라서 예를 들어 개선된 약동력학적 특성을 낳을 수도 있다(EP A 232,262).다른 한편으로는, 융합 단백질이 발현, 검출, 및 정제된 후 Fc 부분을 결실시키는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, Fc 부분은 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로 이용되면 치료 및 진단을 방해할 수도 있다. 약제 발견에서, 예를 들어, hIL-5 수용체와 같은 사람 단백질은 hIL-5의 안타고니스트를 동정하기 위한 고수율 검색 분석의 목적을 위해 Fc 부분에 융합되었다.(Bennett et al.,J.Molecular Recognition 8:52-58(1995);Johanson et al.,J.Biol.Chem.270:9459-9471(1995) 참고)
더욱이, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 펩티드 같은 표지 서열에 융합되어 정제를 촉진할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표지 아미노산 서열은 pQE 벡터(QIAGEN Inc.,9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)에 제공되는 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩티드이며 다수가 시판된다. Gentz et al.PNAS 86:821-824(1989)에서 설명된 바처럼, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 "HA" 태그와 "플래그" 태그를 포함하며 이에 한정되지 않는다(Wilson et al.,Cell 37:767(1984))
본 발명은 추가로 진단 또는 치료 제제에 연결된 항체 또는 그 단편을 포함한다. 항체는 예를 들어 주어진 치료 섭생법의 효율을 결정하기 위한 임상 시험 과정의 일부로서 종양의 발전 또는 진전을 감시하기 위해 진단학적으로 이용될 수 있다. 검출은 항체를 검출가능한 물질에 연결시킴으로써 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보조기, 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질, 방사선 물질, 다양한 포지트론(positron) 방출 토모그래피를 이용하는 포지트론 방출 금속, 및 비방사성 파라마그네틱 금속 이온을 포함한다. 검출가능한 물질은 직접 항체(또는 그 단편)에 결합되거나 연결되거나, 또는 공지된 기술을 이용하여 중간체(예, 공지된 링커)를 통하여 간접적으로 연결될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 진단제로 사용하기 위한 항체에 연결될 수 있는 금속 이온을 위해서는 미국 특허 제4,741,900호 참고. 적절한 효소의 예는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알카라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하며; 적절한 보조기 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하며;적절한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오르세인, 플루오르세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오르세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하며;발광 물질의 예는 루미놀을 포함하며;생발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린, 및 애쿠오린을 포함하며; 적절한 방사성 물질의 예는125I,131I,111In 또는99Tc를포함한다.
더욱이, 항체 또는 그 단편은 세포 독소, 예, 세포증식 억제제 또는 살세포제같은 치료부, 치료제 또는 방사성 금속 이온(예, 213Bi와 같은 알파-방출제)에 연결될 수도 있다. 세포 독소 또는 세포독소제는 세포에 위해한 임의의 제제를 포함한다. 예로는 팍리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, l-디히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로케인, 테트라케인, 리도케인, 프로프라노롤, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 상동체가 있다. 치료제는 항대사물(예, 메토트렉세이트, 6-머켑토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜파란, 카르무스틴(BSNU)과 로무스틴(CCNU),시클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플래티늄(II)(DDP)시스플라틴), 안트라사이클린(예, 다우노루비신(이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예, 닥티노마이신(이전의 액티노마이신), 브레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열제(예, 빈크리스틴과 빈블라스틴)를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 연결체는 주어진 생물학적 반응을 변형시키기 위해 이용될 수 있으며, 치료제 또는 약제부는 전형적인 화학 치료제에 제한되도록 작제되지 않는다. 예를 들어, 약제부는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수도있다. 그러한 단백질은 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 독소; 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 어팝토시스제(예, TNF-α,TNF-β,AIMI(국제 공보 WO97/33899 참고), AIM II(국제 공보 WO97/34911 참고), Fas 리간드(Takahashi et al.,Int.Immunol.,6:1567-1574(1994)), VEGI(국제 공보 WO99/23105), 트롬보 제제 또는 항-혈관생성제(예,안지오스타틴 또는 엔도스타틴);또는 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-6(IL-6), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 또는 다른 성장 인자와 같은 생물 반응 변형제를 포함한다.
항체는 또한 고체 지지체에 부착될 수도 있으며, 이는 특히 표적 항원의 정제 또는 면역 분석에 유용하다. 그러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하며 이에 제한되지 않는다.
그러한 치료부를 항체에 연결시키는 기술은 공지이며, Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(eds),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery(2nd ed), Robinson et al.(eds),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",in Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications, Pinchera et al.(eds),pp.475-506(1985);"Analysis, Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985),and Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol.Rev.62:119-58(1982)를 참고한다.
한편, 항체는 세갈에 의해 미국 특허 제4,676,980호(참고로 본원에 전체가 통합됨)에 개시된 바처럼 항체 이종연결체를 형성하기 위하여 두번째 항체에 연결될 수 있다.
항체는 그에 연결된 치료부와 함께 또는 없이 혼자 투여되거나 또는 세포독성 인자 및/또는 사이토카인과 함께 투여되어 치료제로서 이용될 수 있다.
면역표현형 결정
본 발명의 항체는 세포주와 생물 시료의 면역표현형 결정에 이용될 수도 있다. 본 발명 유전자의 번역 산물은 세포 특이적 표지로서, 또는 더욱 구체적으로 특정 세포 유형의 분화 및/또는 성숙의 다양한 단계에서 다르게 발현되는 세포 표지로서 유용할 수도 있다. 특정 에피토프, 또는 에피토프의 조합에 대해 형성된 모노클론 항체는 그 표지를 발현하는 세포 집단의 검색을 가능하게 할 것이다. 표지를 발현하는 세포 집단을 검색하기 위해 모노클로날 항체를 이용하는 다양한 기법이 이용될 수 있으며, 항체-피복된 자석 비드를 이용한 자석 분리, 고체 매트릭스(예, 플레이트)에 부착된 항체에 의한 "패닝(panning)" 및 플로우 사이토미트리를포함한다(미국 특허 제5,985,660호; 및 Morrison et al.,Cell 96:737-49(1999) 참고).
이러한 기술들은 혈액 종양(예, 급성 백혈병 환자에서 최소 잔여 질병(MRD))에서 발견될 수도 있는 것과 같은 특정 세포 집단 및 그래프트-대-호스트 질병(GVHD)을 방지하기 위한 이식에서의 "비-자기"세포의 검색을 허용한다. 한편, 이들 기술은 사람 탯줄혈에서 발견될 수 있는 것과 같은, 증식 및/또는 분화를 진행할 수 있는 조혈 간세포 및 선구(progenitor) 세포의 검색을 허용한다.
항체 결합에 대한 분석
본 발명의 항체는 임의의 공지 방법에 의해 면역 특이적 결합에 대해 분석될 수도 있다. 이용될 수 있는 면역 분석은 웨스턴 블롯, 방사선면역분석, ELISA(효소 연결된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침강소 반응, 젤 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체-고정 분석, 면역복사계(immunoradiometric) 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석과 같은 기술을 이용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 그러한 분석은 일상적이며 업계에 잘 공지되어 있다(Ausubel et al.,eds.,1998,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY, 본원에 참고로 통합됨). 예시적인 면역분석은 하기에 간단히 소개된다(제한적인 의도는 아님).
면역침전 프로토콜은 일반적으로 세포 집단을 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 저해제(예, EDTA, PMSF, 아프로티닌, 소듐 바나데이트)로 보충된 RIPA 완충액(1% NP-40 또는 Triton X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.15MNaCl, 0.01M 소듐 포스페이트(pH 7.2), 1% Trasylol)같은 용해 완충액에서 용해시키고, 관심의 항체를 세포 용해액에 첨가하고, 4℃에서 일정 기간(예, 1-4 시간)동안 배양하고, 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로즈 비드를 세포 용해액에 첨가하고, 4℃에서 약 1시간 이상 항온처리하고, 용해 완충액중의 비드를 세척하고 그 비드를 SDS/시료 완충액에 재현탁시키는 것을 포함한다. 관심의 항체가 특정 항원을 면역침전시키는 능력은 예를 들어 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가될 수 있다. 당업자는 항원에의 항체 결합을 증가시키고 배경을 감소시키기 위해 변형될 수 있는 변수에 관해 알 것이다(예, 세파로즈 비드로 세포 용해액을 미리세정함). 면역침전 프로토콜에 관한 추가의 설명에 대해서는 Ausubel et al.,eds.,1998,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY의 10.16.1을 참고한다.
웨스턴 블롯 분석은 일반적으로 단백질 시료의 제조, 폴리아크릴아미드 젤(예, 항원의 분자량에 따라 8%-20% SDS-PAGE)에서의 단백질 시료의 전기영동, 폴리아크릴아미드 젤로부터 니트로셀룰로스, PVDF, 또는 나일론 같은 막으로의 시료의 이동, 차단 용액(예, 3% BSA를 가진 PBS 또는 탈지유)에서 막의 차단, 세척 완충액(예, PBS-Tween 20)에서 막의 세척, 차단 완충액에 희석된 일차 항체(관심의 대상인 항체)를 이용한 막의 차단, 세척 완충액에서 막의 세척, 효소적 기질(호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알카라인 포스파타제) 또는 방사성 분자(예,32P 또는125I)에 연결되고 차단 완충액에 희석된 이차 항체(일차 항체를 인식함, 항-인간 항체)에 의한 막의 차단, 세척 완충액에서 막의 세척, 및 항원 존재의 검출을 포함한다.당업자는 검출되는 시그날을 증가시키고 배경 잡음을 감소시키기 위해 변형될 수 있는 변수에 관해 알 것이다. 웨스턴 블롯에 대한 추가의 설명을 위해서는 Ausubel et al.,eds.,1998,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY 10.8.1을 참고한다.
ELISA는 항원 제조, 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰의 항원에 의한 피복, 효소적 기질(호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알카라인 포스파타제)과 같은 검출가능한 화합물에 연결된 관심 항체의 웰에의 첨가 및 일정 시간동안의 배양, 및 항원 존재의 검출을 포함한다. ELISA에서는 관심 항체는 검출가능한 화합물에 연결될 필요는 없다. 대신, 검출가능한 화합물에 연결된 두번째 항체(관심 항체를 인식함)가 웰에 첨가될 수도 있다. 더욱이, 웰을 항원으로 피복시키는 대신, 항체가 웰에 피복될 수도 있다. 이 경우, 검출가능한 화합물에 연결된 두번째 항체는 관심 항원을 피복된 웰에 첨가한 후 첨가할 수도 있다. 당업자는 검출되는 시그날을 증가시키기 위해 변형될 수 있는 변수와 ELISA의 다른 변이를 알 것이다. ELISA에 대한 추가의 설명을 위해서는 Ausubel et al.,eds.,1998,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY 11.2.1을 참고한다.
항체의 항원에 대한 결합 친화성과 항체-항원 상호작용의 분리율은 경쟁적 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 분석의 한 가지 예는 비표지 항원의 증가량 존재하에서 표지 항원을 관심 항체와 배양하고 표지 항원에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는 방사성 면역분석이다. 특정 항원에 대한 관심 항체의 친화성과 결합 분리율을 스캐차드 플롯 분석에 의해 자료로부터 결정할 수 있다.두 번째 항체와의 경쟁은 또한 방사성면역분석을 이용하여 결정될 수 있다. 이 경우, 항원은 비표지 두번째 항체의 증가량 존재하에서 표지 화합물(예,3H 또는125I)에 연결된 관심 항체와 배양된다.
본 발명 항체의 치료적 용도
본 발명은 또한 개시된 질병, 이상, 또는 상태 하나 이상을 치료하기 위해, 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 사람, 환자에게 본 발명 항체를 투여하는 것에 관련되는 항체-기초 치료에 관한 것이다. 본 발명의 치료 화합물은 본 발명의 항체(본원에 개시된 대로 그들의 단편, 유사체 및 유도체 포함) 및 본 발명의 항체(본원에 개시된 대로 그들의 단편, 유사체 및 유도체 그리고 항-이디오타입 항체 포함)를 암호하는 핵산을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는 본원에 개시된 질병, 이상, 상태 하나 이상을 포함하며 이에 제한되지 않는, 본 발명 폴리펩티드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 이상, 또는 상태를 치료, 억제 또는 방지하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명 폴리펩티드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 이상, 또는 상태의 치료, 및/또는 방지는 이들 질병, 이상 또는 상태와 관련된 증상을 완화시키는 것을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 약학적 허용 조성물로 제공될 수도 있다.
본 발명의 항체가 치료적으로 이용될 수도 있는 방법들의 개요는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 체내에서 국소적으로 또는 전신적으로 결합시키는 것 또는 보체(CDC) 또는 이펙터 세포(ADCC)에 의해 매개되는 것과 같은 항체의 직접적인 세포독성에 의한 것을 포함한다. 이들 접근법중 일부는 하기에 보다 상세히 설명된다. 본원에 개시된 기술들을 가지고, 당업자는 과도한 실험없이 본 발명의 항체를 진단, 감시 또는 치료 목적을 위해 어떻게 사용할 지 알 것이다.
본 발명의 항체는 다른 모노클로날 또는 키메라 항체와 함께, 또는 림포카인 또는 조혈 성장 인자(예, IL-2, IL-3 및 IL-7), 예를 들어 항체와 상호작용하는 이펙터 세포의 수 또는 활성을 증가시키기 위해 작용하는 것들과 함께 유익하게 이용될 수도 있다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 다른 치료 유형(예, 방사선 치료, 화학 치료, 호르몬 치료, 면역치료 및 항암제)과 함께 투여될 수도 있다. 일반적으로, 환자와 동일한 종 기원 또는 종 반응성(항체의 경우)의 산물의 투여가 바람직하다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 사람 항체, 단편 유도체, 유사체 또는 핵산이 치료 또는 예방을 위하여 사람 환자에 투여된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 고 친화성 및/또는 강력한 생체내 저해 및/또는 중화 항체 ,그들의 단편 또는 영역을 사용하는 것이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드(그 단편도 포함)에 관련된 질병의 치료 및 이에 대한 면역 분석 둘다에 바람직하다. 그러한 항체, 단편, 또는 영역은 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드(그 단편 포함)에 대한 친화성을 가질 것이다. 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-2M, 10-2M,5 X 10-3M, 10-3M,5 X10-4M, 10-4M,5 X 10-5M, 10-5M,5 X 10-6M, 10-6M,5 X 10-7M, 10-7M,5 X 10-8M, 10-8M,5 X 10-9M,10-9M,5 X 10-10M, 10-10M,5 X 10-11M,10-11M,5 X 10-12M, 10-12M,5 X 10-13M, 10-13M,5 X 10-14M, 10-14M,5 X 10-15M, 10-15M 미만의 해리 상수를 가질 것이다.
진단 및 영상화
관심 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 표지된 항체, 및 그 유도체와 상동체는 본 발명 폴리펩티드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 이상, 및/또는 상태를 검출, 진단 또는 감시하기 위한 진단 목적을 위해 이용될 수 있다. 본 발명은 (a)관심 폴리펩티드에 특이적인 항체 하나 이상을 이용하여 개인의 세포 또는 체액에서 관심 폴리펩티드의 발현을 분석하는 것과 (b) 표준 유전자 발현 수준과 유전자 발현 수준을 비교하며, 이때 표준 발현 수준과 비교하여 분석된 폴리펩티드 유전자 발현 수준의 감소 또는 증가가 이상 발현의 표시가 되는 것을 포함하는, 관심 폴리펩티드의 이상 발현의 검출을 제공한다.
본 발명은 (a)관심 폴리펩티드에 특이적인 항체 하나 이상을 이용하여 개인의 세포 또는 체액에서 관심 폴리펩티드의 발현을 분석하는 것과 (b) 표준 유전자 발현 수준과 유전자 발현 수준을 비교하며, 이때 표준 발현 수준과 비교하여 분석된 폴리펩티드 유전자 발현 수준의 감소 또는 증가가 특정 질병의 표시가 되는 것을 포함하는, 질병 진단을 위한 진단 분석을 제공한다. 암과 관련하여, 상대적으로 높은 양의 전사물이 개체로부터의 검시 조직에 존재하는 것은 질병의 발달을 위한 전조를 나타낼 수도 있고, 또는 실질적인 임상 증상의 출현에 앞서 질병을 검출하기 위한 수단을 제공할 수도 있다. 이러한 유형의 더욱 확실한 진단은 의료 전문가들이 예방적 수단 또는 공격적 치료를 보다 초기에 이용하여 암의 발달 또는 추가 진전을 방지할 수 있도록 한다.
본 발명의 항체는 당업자에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법을 이용하여 생물 시료에서 단백질 농도를 분석하기 위해 이용될 수 있다(Jalkanen, et al.,J.Cell.Biol.101:976-985(1985); J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987)).단백질 유전자 발현을 검출하는 데 유용한 다른 항체-기초 방법은 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)와 방사성 면역분석(RIA)와 같은 면역분석을 포함한다. 적절한 항체 분석 표지는 공지이며 글루코스 옥시다제;방사성 동위원소, 예 요오드(125I,121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(112In), 및 테크네튬(99Tc);루미놀 같은 발광 표지; 및 플루오르세인과 로다민 및 비오틴같은 형광 표지를 포함한다.
본 발명의 한 가지 양상은 동물, 바람직하게는 포유동물 및 가장 바람직하게는 사람에서 관심 폴리펩티드의 이상 발현과 관련된 질병 또는 증상의 검출 및 진단이다. 한 가지 구체예에서, 진단은 a)관심 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 표지된 분자 유효량을 환자에게 투여(예를 들어, 비경구적으로, 피하로, 또는 정맥내로)하는 것;b) 표지된 분자가 폴리펩티드가 발현되는 환자 내 위치에서 우선적으로 집중되도록(그리고 비결합 표지 분자가 배경 수준으로 제거되도록) 투여 후 일정 시간 간격동안 기다리는 것; c)배경 수준을 결정하는 것; 및 d)환자에서 표지 분자를 검출하여 배경 수준 이상의 표지 분자의 검출이 그 환자가 관심 폴리펩티드의이상 발현과 관련되는 특정 질병 또는 질환을 갖는다는 것을 나타내는 것을 포함한다. 배경 수준은 검출된 표지 분자의 양을 특정 시스템에 대해 미리 결정된 표준값과 비교하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
환자의 크기와 사용되는 영상화 시스템이 진단 영상을 생성하기 위해 필요한 영상화 부의 양을 결정할 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 방사성 동위원소 부의 경우, 사람 환자를 위해, 주사되는 방사성 동위원소의 양은 일반적으로 약 5 내지 약 20밀리큐리의99mTc범위일 것이다. 표지된 항체 또는 항체 단편은 이어서 우선적으로 특정 단백질을 함유한 세포 위치에서 축적될 것이다. 생체내 종양 영상화는 S.W.Burchiel et al.,"Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibiotics and Their Fragment"에 설명된다.(Chapter 13 in Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer, S.W.Burchiel and B.A.Rhodes,eds,Masson Publishing Inc.(1982)).
사용된 표지의 유형과 투여 형식을 포함한 몇 가지 변수에 의존하면서, 표지된 분자가 환자내 위치에서 집중되도록 하고 비결합 표지 분자가 배경 수준으로 제거되도록 하기 위한 투여 후의 시간 간격은 6 내지 48시간 또는 6 내지 24시간 또는 6 내지 12시간이다. 다른 구체예에서, 투여 후 시간 간격은 5 내지 20일 또는 5 내지 10일이다.
한 구체예에서, 질병 또는 질환의 감시는 예를 들어 초기 진단 후 1 개월, 초기 진단 후 6개월, 초기 진단 후 1년 등에 질병 또는 질환의 진단을 위한 방법을반복함으로써 수행된다.
표지된 분자의 존재는 생체내 스캐닝을 위한 공지 방법을 이용하여 환자에서 검출될 수 있다. 이들 방법은 사용된 표지의 유형에 의존한다. 당업자는 특정 표지의 검출을 위한 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단 방법에서 이용될 수 있는 방법과 장치는 컴퓨터 토모그래피(CT), 위치 방출 토모그래피와 같은 전신 스캔, 자기 공명 영상화(MRI), 및 소노그래피를 포함하며 이에 제한되지 않는다.
특정 구체예에서, 분자는 방사성 동위원소로 표지되며 방사선 반응성 외과 기구를 이용하여 환자에서 검출된다(Thurston et al.,미국 특허 제5,441,050호).다른 구체예에서, 분자는 형광 화합물로 표지되며 형광 반응성 스캐닝 기구를 이용하여 환자에서 검출된다. 다른 구체예에서, 분자는 포지트론 방출 금속으로 표지되며 포지트론 방출-토모그래피를 이용하여 환자에서 검출된다. 또 다른 구체예에서, 분자는 상자성체 표지로 표지되고 자기 공명 영상화(MRI)를 이용하여 환자에서 검출된다.
융합 단백질
임의의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 융합 단백질을 생성시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 두번째 단백질과 융합될 때, METH1 또는 METH2 폴리펩티드가 항원성 태그로 이용될 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 METH1 또는 METH2에 결합시킴으로써 두번째 단백질을 간접적으로 검출하기 위해 이용될 수 있다. 더욱이, 분비된 단백질은 트래피킹 시그날(traffickingsignal)에 기초하여 세포 위치를 표적화하므로, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 다른 단백질에 일단 융합되면 표적화 분자로 이용될 수 있다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 융합될 수 있는 도메인의 예는 이종성 시그날 서열뿐만 아니라, 다른 이종성 기능성 영역을 포함한다. 융합은 반드시 직접적일 필요는 없으며 링커 서열을 통해 일어날 수도 있다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 METH1 또는 METH2 단백질은 METH1 또는 METH2 폴리펩티드가 각각 전술한 m1-n1또는 m2-n2인 융합 단백질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 그 적용은 본원에서 설명된 특이적 N- 및 C- 말단 결실의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호하는 핵산 서열에 적어도 80%,85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%,98%, 또는 99% 동일한 핵산 분자에 대한 것이다.이들 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명에 의해 포함된다.
더욱이, 융합 단백질은 또한 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 특성을 개선시키기 위해 조작될 수도 있다. 예를 들어, 부가적인 아미노산, 특히 전하된 아미노산의 영역이 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 N-말단에 부가되어 숙주 세포로부터의 정제동안 또는 이어지는 조작과 저장동안 안정성과 지속성을 개선시킬 수도 있다. 또한, 펩티드 부는 정제를 촉진하기 위해 METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 부가될 수도 있다. 그러한 영역은 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 최종 제조에 앞서 제거될 수도 있다. 폴리펩티드의 조작을 촉진하기 위한 펩티드 부의 부가는 당업자에게는 친숙하며 통상적이다.
더욱이, 그 단편과 특이적인 에피토프를 포함하는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인의 부분과 결합되어 키메라 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 이들 융합 단백질은 정제를 촉진시키고 증가된 생체내 반감기를 보여준다. 이는 사람 CD4-폴리펩티드의 첫번 째 두 도메인과 포유동물 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 가변 도메인으로 구성된 키메라 단백질에서 보여졌다. EP 394,827호;Traunecker et al., Nature, 331:84-86(1988) 참고. 이황화-연결된 이량체 구조를 갖는 융합 단백질은 또한 다른 분자와의 결합 및 중화에 있어서 단량체 분비 단백질 또는 그 단편 혼자보다 더 효율적인 것으로 밝혀졌다. Fountoulakis et al., J.Biochem., 270:3958-3964(1995) 참고.
유사하게, EP-A-O 464 533(캐나다 대응 공보 2045869)는 면역글로불린 분자의 불변 영역의 다양한 부분과 다른 사람 단백질 또는 그 부분을 함께 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 많은 경우에, 융합 단백질에서 Fc 부분은 치료 및 진단에서 유익하며, 따라서 예를 들어 개선된 약동력학적 특성을 낳을 수도 있다(EP A 232,262).다른 한편으로는, 융합 단백질이 발현, 검출, 및 정제된 후 Fc 부분을 결실시키는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, Fc 부분은 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로 이용되면 치료 및 진단을 방해할 수도 있다. 약제 발견에서, 예를 들어, hIL-5 수용체와 같은 사람 단백질은 hIL-5의 안타고니스트를 동정하기 위한 고수율 검색 분석의 목적을 위해 Fc 부분에 융합되었다.(D.Bennett et al.,J.Molecular Recognition 8:52-58(1995);K.Johanson etal.,J.Biol.Chem.270:9459-9471(1995) 참고)
더욱이, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 펩티드 같은 표지 서열에 융합되어 정제를 촉진할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표지 아미노산 서열은 pQE 벡터(QIAGEN Inc.,9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)에 제공되는 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩티드이며 다수가 시판된다. Gentz et al.PNAS 86:821-824(1989)에서 설명된 바처럼, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 "HA" 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응한다.(Wilson et al.,Cell 37:767(1984))
따라서, 이들 상기 융합은 METH 1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 이용하여 조작될 수 있다.
METH1 및/또는 METH2의 생물학적 활성
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트(agonist) 또는 안타고니스트(antagonist)를 분석하여 하나 이상의 생물학적 활성을 시험할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트가 특정 분석에 있어서 활성을 나타낸다면, 이는 METH1 및/또는 METH2가 생물학적 활성 관련 질병에 관여될 수 있음을 시사하는 것이다. 따라서, METH1 및/또는 METH2를 생물학적 활성 관련 질병의 치료에 사용할 수 있을 것이다.
면역 활성
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 면역 세포의 증식, 분화 또는 가동(화학 주성)을 활성화시키거나 억제시킴으로써 면역계의 장애 또는 결함을 치료하는데 유용할 수 있다. 면역 세포는 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell)로부터 림프 세포(B 및 T 림프구) 및 골수양성 세포(혈소판, 적혈구, 호중구 및 마크로파지) 를 생성하는 조혈 과정을 통하여 발육된다. 상기 면역 결함 또는 장애의 병인은 유전적 원인, 신체적 원인, 예를 들어, (예를 들어, 화학 치료 또는 독성에 의하여) 얻어진 일부 자가면역 장애 또는 암, 또는 전염 등일 수 있다. 또한, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 특정 면역계 질병 또는 장애의 마커(marker) 또는 디텍터(detector)로 사용할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 조혈 세포의 결함 또는 장애를 검측 또는 치료하는데 유용할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 특정 (또는 많은) 유형의 조혈 세포 감소와 연관된 장애를 치료하는데 있어서 다능성 줄기 세포를 비롯한 조혈 세포의 분화 및 증식을 증대시키는데 사용할 수 있다. 면역 결핍증의 예로는 혈액 단백질 장애(blood protein disorder)(예. 무감마글로불린혈증, 이상감마글로불린혈증), 모세혈관확장성 운동실조증, 공통 가변성 면역부전증, 디조지 증후군(Digeorge Syndrome), HIV 감염증, HTLV-BLV 감염증, 백혈구 접착 결핍증(leukocyte adhesion deficiency syndrome), 림프구 감소증, 식세포 살균장애(phagocyte bactericidal dysfunction), 중증 복합성 면역결핍증(SCID), 위스콧-알드리치 장애(Wiskott-Aldrich Disorder), 빈혈증, 혈소판 감소증, 또는 헤모글로빈뇨증 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 지혈 작용(출혈을 멈추게 하는 것) 또는 혈전 용해 작용(응혈 형성)을 조정하는데 사용할 수도 있다. 예를 들어, 지혈 또는 혈전 용해 활성을 증대시킴으로써, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 혈액 응고 장애(예, 무피브리노겐혈증, 인자 결핍증), 혈액 혈소판 장애(예, 혈소판 감소증), 또는 외상, 수술 또는 기타 원인에 의해 생긴 상처를 치료하는데 사용할 수 있다. 한편, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 지혈 또는 혈전 용해 활성을 감소시킬 수 있어, 심근 경색(경색), 발작 또는 상처 치료에 중요한 혈액 응고 억제 또는 용해를 위하여 사용할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 자가면역 장애를 치료하거나 검측하는데도 유용할 수 있다. 많은 자가면역 장애는 면역 세포가 자기를 외래 물질로 부적절하게 인식함에 의하여 발생한다. 이러한 부적절한 인식은 숙주 조직의 파괴를 유도하는 면역 반응으로 귀결된다. 따라서, 면역 반응, 특히 T-세포의 증식, 분화 또는 화학 주성을 억제할 수 있는 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 자가면역 장애의 치료에 효과적일 수 있다.
치료 또는 검측될 수 있는 자가면역 장애의 예로는 애디슨병(Addison's Disease), 용혈성 빈혈증, 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 류마티스 관절염, 피부염, 알레르기성 뇌척수염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's Syndrome), 그라브스병(Graves' Disease), 다중 경화증, 중증 근무력증, 신경염, 안염, 수포성 유천포창, 유천포창, 다내분비 질환, 자반병, 라이터 증후군(Reiter's Disease), 스티프-만 증후군(Stiff-Man Syndrome), 자가면역 갑상선염, 전신성 홍반성 루푸스, 자가면역 폐염증, 귈랑-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome), 인슐린 의존성 당뇨병 및 자가면역 염증성 안질환 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
유사하게, 알레르기 반응 및 증상, 예를 들어 천식(특히 알레르기성 천식) 또는 기타 호흡기 질환을 또한 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트로 치료할 수 있다. 또한, 이들 분자는 과민증, 항원성 분자에 대한 과민증 또는 혈액 군 부적합성(blood group incompatibility)을 치료하는데 사용할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 기관 거부 반응 또는 이식편-대-숙주 질병(GVHD: graft-versus-host disease)을 치료 및/또는 예방하는데 사용할 수 있다. 기관 거부 반응은 면역 반응을 통한 이식 조직의 숙주 면역 세포 파괴에의하여 발생한다. 유사하게, 면역 반응은 또한 GVHD에 관여하나, 이 경우에 외래 이식 면역 세포는 숙주 조직을 파괴한다. 면역 반응, 특히 T-세포의 증식, 분화 또는 화학 주성을 억제하기 위한 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트의 투여는 기관 거부 반응 또는 GVHD 예방에 있어서 효과적인 치료법일 수 있다.
유사하게, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 염증을 조정하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 염증 반응에 관여하는 세포의 증식 및 부화를 억제할 수 있다. 이들 분자는 만성 및 급성 증상 양자 모두의 염증 증상을 치료하는데 사용할 수 있는데, 그러한 염증 증상의 예로는 감염 관련 염증(예, 패혈증성 쇼크, 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)), 허혈-재관류 손상, 내독소 치사, 관절염, 보체-매개 과민성 거부 반응, 신염, 사이토카인 또는 케모카인 유도 폐 손상, 염증성 장 질병, 크론병(Crohn's disease) 또는 사이토카인(예, TNF 또는 IL-1) 과생성으로 인한 증상 등을 들 수 있다.
과증식 장애(Hyperproliferative Disorders)
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 종양을 비롯한 과증식 장애를 치료 또는 검측하는데 사용할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 직접 또는 간접 상호 작용을 통하여 상기 장애의 과증식을 억제할 수 있다. 대안적으로, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 과증식 장애를 억제할 수 있는 기타 세포를 증식시킬 수 있다.
예를 들어, 과증식 장애의 면역 반응을 증대시킴에 의하여, 특히 항원성 질(antigenic quality)을 증대시킴에 의하여, 또는 T-세포의 증식, 분화 또는 가동화에 의하여, 과증식 장애를 치료할 수 있다. 이러한 면역 반응은 존재하는 면역 반응을 향상시키거나, 또는 새로운 면역 반응을 개시시킴으로써 증대시킬 수 있다. 대안적으로, 면역 반응는 화학 치료제와 같은 과증식 장애 치료 방법일 수도 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트로 치료하거나 검측할 수 있는 과증식 장애의 예로는 복부, 뼈, 가슴, 소화기계, 간, 췌장, 복막, 내분비 선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 머리 및 목, 신경(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 지라, 흉곽 및 비뇨기에 존재하는 종양을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
유사하게, 기타 과증식 장애도 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트로 치료하거나 검측할 수 있다. 그러한 과증식 장애의 예로는 전술한 기관계에 위치하는 종양외에, 감마글로불린혈증, 림프세포 증식성 장애, 이상단백혈증, 자반병, 유육종증, 세자리 증후군(Sezary Syndrome), 발덴스트론 마이크로글로불린혈증 (Waldenstron's Macroglobulinemia), 고셔병(Gaucher's Disease), 조직구증 및 기타 과증식 질병을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
심혈관 장애
METH1 및/또는 METH2를 암호화하는, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 말초 동맥 질병, 예를 들어 사지 빈혈을 비롯한 심혈관 장애를 치료하는데 사용할 수 있다.
심혈관 장애로는 심혈관 기형, 예를 들어, 동동맥루(arterio-arterial fistula), 동정맥루, 대뇌 동정맥 기형(cerebral arteriovenous malformation), 선천성 심장 결함, 폐 폐쇠증 및 시미타 증후군(Scimitar Syndrome) 등이 있다. 선천성 심장 결함으로는 대동맥 교착증, 삼방심, 관상 혈관 이상, 십자 심장(crisscross heart), 우심증, 동맥관 열림증, 에브스타인 이상(Ebstein's anomaly), 아이젠멘거 증후군(Eisenmenger complex), 좌심발육부전 증후군, 좌심증, 팔로증후증(tetralogy of fallot), 대혈관 착위증(transpositon of great vessel), 양대혈관우실기시증(double outlet right ventricle), 삼첨판 폐쇄증, 동맥간 존속증, 및 심중격 결손증, 예를 들어, 대동맥폐동맥 중격 결손증, 심내막 융기 결손증, 뤼탕바쉬에 증후군(Lutembacher's Syndrome), 팔로증후군, 심실의 심중격 결손증(ventricular heart septal defect) 등이 있다.
심혈관 장애로는 또한 심질환, 예를 들어, 부정맥, 카르시노이드심질환(carcinoid heart disease), 고심박출증(high cardiac output), 저심박출증, 심장탐폰(cardiac tamponade), 심내막염(세균성 포함), 심동맥류(heart aneurysm), 심박동 정지(cardiac arrest), 충혈성 심부전, 충혈성 심근증, 발작성 호흡곤란, 심인성 부종, 심비대증, 충혈성 심근증, 좌심실 비대증, 우심실 비대증, 경색형성 후 심장 파열(post-infarction heart rupture), 심실 중격 파열, 심장판 질환, 심근 질환, 심근 허혈, 심낭 삼출(pericardial effusion), 심막염(협착성 및 결행성 포함), 기심낭(pneumopericardium), 심막절개술후 증후군, 폐 심질환, 류마티즘성 심질환, 심실 기능부전, 충혈, 심혈관 임신 합병증(cardiovascular pregnancy complication), 쉬미터 증후군(Scimitar Syndrome), 심혈관 매독(cardiovascular syphilis), 및 심혈관 결핵(cardiovascular tuberculosis) 등이 있다.
부정맥으로는 동부정맥, 심방세동, 심방조동, 서맥, 기외수축, 아담스-스토크스병(Adams-Stokes Syndrome), 각블록(bundle-branch block), 동방블록, 장 QT 증후군(long QT syndrome), 수축동시성(parasystole), 로운-가농-레빈 증후군(Lown-Ganong-Levine Syndrome), 마하임-형 조기흥분 증후군(Mahaim-type pre-excitation syndrome), 월프-파킨슨-화이트 증후군(Wolff-Parkinson-White syndrome), 동기능 부전 증후군(sick sinus syndrome), 빈박(tachycardias), 및 심실 세동 등이 있다. 빈박에는 발작성 빈박, 심실상성 빈박, 가속된 심실고유 리듬(accelerated idioventricular rhythm), 방실 결절 재진입성 빈박(atrioventricular nodal reentry tachycardia), 이소성 심방성 빈박(ectopic atrial tachycardia), 이소성 접합부성 빈박, 동방 결절 재진입성 빈박,동빈박(sinus tachycardia), 토르사드 데 포인트(Torsades de Pointes), 및 심실성 빈박 등이 있다.
심장판막 질환으로는 대동맥 판막 기능부전, 대동맥 판막 협착증, 심잡음, 대동맥 판막 탈출증, 승모판 탈출증(mitral valve prolapse), 삼첨판 탈출증, 승모판 기능부전, 승모판 협착증, 폐 폐쇄증, 폐 판막 기능부전, 폐 판막 협착증, 삼첨 폐쇄증, 삼첨판 기능부전 및 삼첨판 협착증 등이 있다.
심근 질환으로는 알콜성 심근증, 울혈성 심근증, 비후성 심근증, 대동맥 판하부 협착증, 폐 판하부 협착증, 제한성 심근증, 샤가스 심근증(Chagas cardiomyopathy), 심내막 섬유탄성증, 심근내막 섬유증, 컨스 증후군(Kearns Syndrome), 심근 재관류 손상 및 심근염 등이 있다.
심근 허혈로는 관상 질환, 예를 들어 협심증, 관상 동맥류, 관상 동맥경화증, 관상 혈전증, 관상 혈관경련, 심근 경색 및 심근 졸도(myocardial stunning) 등이 있다.
심혈관 질환으로는 또한 혈관 질환, 예를 들어, 동맥류, 혈관 형성 이상, 혈관종, 세균성 혈관종, 힙펠-린도우병(Hippel-Lindau Disease), 클리펠-트렌오네이-웨버 증후군(Klippel-Trenaunay-Weber Syndrome), 스터지-웨버 증후군(Sturge-Weber Syndrome), 혈관신경성 부종, 대동맥 질환, 타카야쓰 동맥염(Takayasu's Arteritis), 대동맥염, 레리체 증후군(Leriche's Syndrome), 대동맥 폐쇄성 질환, 동맥염, 구관절염(enarteritis), 결절성 다발성 동맥염, 대뇌혈관 질환, 당뇨병성 맥관장애, 당뇨병성 망막증, 색전증(embolism), 혈전증, 피부홍통증, 치질, 간 정맥 폐색 질환, 고혈압, 저혈압, 허혈, 말초 혈관 질환, 정맥염, 폐 정맥 폐색 질환, 레이노드병(Raynaud's disease), CREST 증후군(CREST syndrome), 망막 정맥 폐색, 쉬미터 증후군(Scimitar Syndrome), 상대정맥 증후군(superior vena cava syndrome), 혈관확장증(telangiectaisia), 혈관확장성 운동실조증(atacia telangiectasia), 유전성 출혈성 혈관확장증(hereditary hemorrhagic telangiectasia), 정계정맥류(varicocele), 정맥류성 정맥, 정맥류성 궤양, 혈관염 및 정맥 기능 부전 등이 있다.
동맥류로는 해리성 동맥류(dissecting aneurysm), 가성 동맥류, 전염성 동맥류, 파열 동맥류(ruptured aneurysm), 대동맥류, 뇌동맥류, 관상 동맥류, 심장 동맥류 및 장골 동맥류 등이 있다.
동맥 폐색 질환으로는 동맥 경화증, 간헐성 파행, 경동맥 협착증, 섬유근성 이형성, 장간막 맥관 폐색증, 모야모야병(Moyamoya disease), 신장 동맥 폐색증, 망막 동맥 폐색증 및 폐색성 혈전 혈관염 등이 있다.
대뇌혈관 장애에는 경동맥 질환, 대뇌 아밀로이드 맥관장애, 뇌 동맥류, 대뇌 산소결핍증, 뇌동맥 경화증, 대뇌 동정맥 기형, 대뇌 동맥 질환, 뇌 색전증 및 혈전증, 경동맥 혈전증, 정맥동 혈전증, 발렌버그 증후군(Wallenberg's syndrome), 뇌출혈, 경막외 혈종, 경막하혈종, 거미막하 출혈(subaraxhnoid hemorrhage), 뇌경색, 대뇌 허혈(일시적인 것도 포함), 쇄골하동맥도류 증후군, 심실 주위 백색연화증(periventricular leukomalacia), 맥관 두통(vascular headache), 군발성 두통, 편두통 및 척골기저동맥 순환 부전 등이 있다.
색전증에는 공기 색전증, 양수 색전증, 콜레스테롤 색전증, 푸른 발가락 증후군(blue toe syndrome), 지방 색전증, 폐 색전증 및 혈전 색전증 등이 있다. 혈전으로는 관상 혈전증, 간정맥 혈전증, 망막 정맥 폐색, 경동맥 혈전증, 정맥동 혈전증, 발렌버그 증후군(Wallenberg's syndrome) 및 혈성 정맥염 등이 있다.
허혈에는 대뇌 허열, 허혈성 대장염, 소실 증후군(compartment syndrome), 전엽 소실 증후군(anterior compartment syndrome), 심근 허혈, 재관류 손상 및 말초성 사지 허혈 등이 있다. 맥관염에는 대동맥염, 동맥염, 버세트 증후군(Behcet's Syndrome), 처르그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss Syndrome), 피부점막 림프절 증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 과민성 혈관염, 쉐라인-헤노호 자반증(Schoenlein-Henoch purpura), 알레르기성 피부 맥관염 및 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis) 등이 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스는 중증 사지 허혈 및 관상 질환의 치료에 특히 효과적이다.
METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드는 송달 부위에의 직접 주사, 정맥내 주사, 국소 투여, 카테터 주입, 바이오리스틱 인젝터(biolistic injector), 입자 가속기, 겔포움 스폰지 데포우(gelfoam sponge depot), 기타 시판 데포우 물질, 삼투성 펌프, 경구 또는 좌제 고형 약학 제제, 수술 중 경사(decanting) 또는 국소 적용, 분무 송달 등(단, 이에 한정되는 것은 아님)을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 투여할 수 있다. 상기 방법들은 당업계에 공지되어 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드는 이하에서 더욱 자세히 설명하는 바와 같이 약학 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 송달하는 방법은 본 명세서에서 더욱 자세히 기술한다.
세포 수준에서의 질병
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트에 의해서 검출하거나 치료할 수 있는 세포 유도사(apoptosis)의 억제 또는 세포 생존 증가와 관련된 질병에는 암[예를 들어, 소포 림프종, p53 돌연변이를 갖는 암종, 및 호르몬-의존성 종양 등이 있으며, 이에는 예를 들어, 결장암, 심장 종양, 췌장암, 흑색종, 망막 세포종, 교모세포종, 폐암, 장 암, 고환 암, 위암, 신경세포종, 점액종, 근종, 림프종, 내피종, 골모세포종, 파골세포종, 골원성육종, 연골육종, 선종, 유방암, 전립선암, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 및 난소암 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아님]; 자가면역 장애[예를 들어, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군(Sjogren' syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 담즙성 간경변, 베세트 증후군(Behcet's disease), 크론병(Crohn's disease), 다발성근염, 전신성 루프스 홍반염 및 면역-관련 사구체신염 및 류마티스 관절염] 및 바이러스 감염(예를 들어, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스 및 아데노바이러스), 염증, 숙주에 대한 이식편 질환, 급성 이식편 거부 반응 및 만성 이식편 거부 반응 등이 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및/또는 안타고니스트를 사용하여 상기 특히 열거한 질병 중 암의 성장, 진행 및/또는전이(metasis)를 억제한다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트에 의하여 검출하거나 치료할 수 있는 질병으로서, 셀 생존 증가와 관련된 추가의 질병 또는 증상에는 악성 종양의 진행 및/또는 전이 및 관련 장애, 예를 들어, 백혈병[예를 들어, 급성 백혈병, 예컨대, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병(골수모세포성, 전골수세포성, 골수단핵세포성, 단구성 및 적백혈병 등) 및 만성 백혈병, 예컨대, 만성 척수낭종 (과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병 등], 진성 적혈구 증가증, 림프종[예를 들어, 호즈킨병(Hodgkin's disease) 및 비-호즈킨병(non-Hodgkin's disease)], 다발성 골수종, 발덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄병(heavy chain disease), 및 고형 종양(solid tumor), 예를 들어, 육종 및 암종, 예를 들어, 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골원성 육종, 척삭종, 맥관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 활막종, 중피종, 유윙종(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근 육종, 결장암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평상피암, 기저세포암, 선암, 땀샘 암종, 기름샘 암종, 유두암, 유두상선암종, 낭선암종, 수양암, 기관지암, 신세포암, 간암, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 태생기암, 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종(small cell lung carcinoma), 방광 암좀, 상피암종, 교종, 성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 혈관종(menangioma), 흑색종, 신경모세포종 및 망막세포종 등이 있으나,이에 한정되는 것은 아니다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트에 의하여 검출하거나 치료할 수 있는 질병으로서, 세포 유도사 증가와 관련된 질병에는 AIDS; 신경변성 장애[예를 들어, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 색소성 망막염(Retinitis pigmentosa), 소뇌 변성(Cerebellar degeneration) 및 뇌종양 또는 상기 관련 종양]; 자가면역 장애[예를 들어, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 담즙성 간경변, 베세트 증후군(Behcet's disease), 크론병(Crohn's disease), 다발성근염, 전신성 홍반성 루푸스 및 및 면역-관련 사구체신염 및 류마티스 관절염], 골수이형성 증후군(예를 들어, 재생불량성 빈혈), 숙주에 대한 이식편 질병, 허혈성 손상[예를 들어, 심근 경색증, 뇌졸중 및 재관류 손상에 의하여 유발되는 것], 간 손상[예를 들어, 간염 관련 간 손상, 허혈/재관류 손상, 담즙울체(cholestosis)(담관 손상) 및 간암]; 독소-유발 간질환(예를 들어, 알콜에 의해서 유발된 것), 폐혈성 쇼크, 악액질 및 거식증 등이 있다.
창상 치유 및 상피 세포 증식
본 발명의 또 다른 실시 태양에 따르면, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를, 예를 들어, 창상 치유 목적으로 상피 세포 증식 및 기초 케라티노사이트(basalkeratinocyte)를 자극하고, 피부 창상 치유 및 털주머니 생성을 자극하는 치료 목적으로 사용하는 방법이 제공된다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 외과적 창상, 절개 창상, 진피 및 표피 손상을 포함하는 깊은 창상, 눈 조직 창상, 치성 조직 창상, 구강 창상, 당뇨병성 궤양, 피부 궤양, 팔꿈치 궤양, 동맥성 궤양, 정맥성 울혈성 궤양, 열노출 또는 화학 약품에 의한 화상, 및 기타 비정상적 창상 치유 상태, 예를 들어, 요독증, 영양실조, 비타민 결핍증 및 스테로이드를 사용한 전신 요법과 관련한 합병증, 방사선 요법과 관련한 합병증, 항신생물제 약물과 관련한 합병증 및 항대사약과 관련한 합병증 등을 비롯한 창상 치유를 자극하는데 임상적으로 유용할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하여 피부 손실에 이은 피부 재생을 촉진할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하여 창상 부위에 피부 이식편의 부착을 증진시킬 수 있고, 창상 부위의 재-상피 생성을 자극할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하면, 자가이식편, 인공피부, 동종이식편 (allograft), 자가식피편, 자가표피 이식편, 무혈관 이식편, 블레어-브라운 이식편(Blair-Brown graft), 골이식편, 배태조직이식편, 피부이식편(cutis graft), 지연 이식편, 진피이식편(dermic graft), 표피이식편(epidermic graft), 근막이식편, 전층피부이식편, 이종이식편(heterologous graft), 이종이식편(xenograft), 동종이식편(homologous graft), 증식성 이식편, 층판 이식편, 망상 이식편, 점막 이식편, 올리에르-티르쉬 이식편(Ollier-Thiersch graft), 오멘팔 이식편(omenpal graft), 첩부 이식편, 경상 이식편, 관통 이식편, 부분층 피부 이식편, 박층 이식편(thick split graft) 등을 창상 부위에 접착시킬 때, 그 접착성을 증대시킬 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 피부 강화를 촉진시키고, 노화 피부의 외관을 개선시키는데 사용할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 대장, 소장, 위, 췌장, 유방 및 폐에서 상피 세포 증식, 및 간세포 증식에 있어서의 변화를 생성시킬 것이다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 피지낭(sebocyte), 모낭, 간세포, 타입 Ⅱ 폐포세포, 뮤신-생성 술잔세포, 및 기타 상피 세포 및 피부, 폐, 간 및 위장관 내에 포함되어 있는 그 선조 세포(progenitor)와 같은 상피 세포의 증식을 촉진시킬 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 내피 세포, 케라티노사이트 및 기초 케라티노사이트의 증식을 촉진시킬 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 방사선, 화학 요법 치료 또는 바이러스 감염에서 초래되는 소화관 독성의 부작용을 감소시키는데 사용할 수도 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 소장 점막층에 대한 세포 보호 (cytoprotective) 효과를 가질 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 화학 요법 및 바이러스 감염에서 초래되는 점막염(입 궤양)의 치유를 자극할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한, 화상 등의 완전 및 부분 두께 피부 결함에 있어서의 완전한 피부 재생(즉, 모낭, 한선 및 기름샘의 재증식), 건선과 같은 피부 결손의 치료에 사용할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 병소의 표피 재생을 촉진함으로써, 수포성 표피 박피증, 즉, 빈번하고, 열려있으며, 고통스러운 수포로 귀결되는 하부 진피에 대한 표피 부착 결함 증상을 치료하는데 사용할 수 있다. 또한, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하여, 보다 신속한 샘 점막(glandular mucosa) 및 십이지장 점막벽의 재생 및 점막벽 형성에 의해서 위궤양 및 십이지장 궤양을 치료하고 치유를 도울 수 있다. 염증성 장 질환, 예를 들어, 크롬병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염은 소장 또는 대장 각각의 점막 표면의 파괴를 초래하는 질병이다. 따라서, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하여 점막 표면의 재표면화를 촉진함으로써 보다 신속한 치유를 돕고, 염증성 장 질환의 진행을 막을 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용한 치료는 위장관을 통한 점액 생산에 상당한 효과를 갖는 것으로 기대되며, 상기는 섭취된 유해 물질 또는 후속 수술로부터 장관 점막을 보호하기 위하여 사용될 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 METH1 및/또는 METH2의 소 발현과 관련된 질병을 치료하는데 사용할 수 있다.
또한, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 다양한 병리학적 상태로 인한 폐 손상을 예방 및 치료하는데 사용할 수 있다. 성장 인자, 예를 들어, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 폐포 및 세기관지 상피 세포의 증식 및 분화를 자극하고, 손상 회복을 촉진함으로써 급성 또는 만성 폐 손상을 예방 또는 치료할 수 있다. 예를 들어, 폐포의 진행성 손실을 초래하는 기종, 및 세기관지 상피 세포 및 폐포 상피 세포의 괴사를 초래하는 화상 및 연기 흡입으로부터 귀결된 흡입 손상은 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하여 효과적으로 치료할 수 있다. 또한, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 미숙아에 있어서 기관지 폐 미성장(bronchopulmonary displasia) 및 영아 호흡 곤란 증후군과 같은 하이말린 막증과 같은 질병을 치료하거나 예방하는 것을 도울 수 있는 타입 Ⅱ 폐포세포의 증식 및 분화를 자극하는데 사용할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 간세포의 증식 및 분화를 자극할 수 있으므로, 독성 물질(즉, 아세트아미노펜, 카본 테트라홀로라이드 및 기타 당업계에 공지된 간독소) 및 바이러스 감염에 의하여 야기되는 간 손상, 경변증에 의하여 유발되는 전격성 간부전과 같은 병리 상태 및 간 질환을 경감시키거나 치료하기 위하여 사용할 수 있다.
또한, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 당뇨병의 발병을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다. 새로 진단된 타입 Ⅰ 및 타입 Ⅱ 당뇨병을 가진 환자에 있어서, 일부 소도(islet) 세포 기능이 남아 있는 경우에, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 질병의 영속 소견을 경감, 지연 또는 예방하기 위하여 소도 기능을 유지시키는데 사용할 수 있다. 또한, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 소도 세포 기능을 증대시키거나 촉진시키기 위한 소도 세포 이식에 있어서 보조제로서 사용할 수 있다.
감염증
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 감염성 병원체를 검출하거나 치료하기 위하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 증대시킴으로써, 특히 B 및/또는 T 세포의 증식 및 분화를 증대시킴으로써 감염증을 치료할 수 있다. 존재하는 면역 반응을 향상시키거나, 새로운 면역 반응을 개시킴으로써 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 면역 반응을 필수적으로 유도함없이, 감염성 병원체를 직접 억제할 수도 있다.
바이러스는 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트에 의하여 검출되고 치료될 수 있는 질병 또는 증상을 초래할 수 있는 감염성 병원체의 일례이다. 바이러스의 예에는 아르보바이러스, 아데노비리다에, 아레나비리디에, 아테리바이러스, 비르나비리다에, 버냐비리다에, 캘리시비리다에, 키르코비리다에, 코로나비리다에, 플라비비리다에, 헤파드나비리다에(간염), 헤르페스비리다에(예, 시토메갈로바이러스, 헤르페스 심플렉스, 헤르페스 조스터), 모노네가바이러스(예, 파라믹소비리다에, 모르빌리바이러스, 라브도비리다에), 오르토믹소비리다에(예, 인프루엔자), 파포바비리다에, 파보비리다에, 피코나비리다에, 폭스비리다에(예, 스몰폭스 또는 백시니아), 리오비리다에(예, 로타바이러스), 레트로비리다에(HTLV-Ⅰ, HTLV-Ⅱ, 렌티바이러스) 및 토가비리다에(예, 루비바이러스) 등이 있으나, 상기 DNA 및 RNA 바이러스 과(family)에 한정되는 것은 아니다. 상기 과(family)에 속하는 바이러스는 관절염, 세기관지염, 뇌염, 눈 감염(예, 결막염, 각막염), 만성 피로 증후군, 간염(A, B, C, E, 만성 활동성, 델타), 수막염, 기회 감염(예, AIDS), 폐렴, 버킷트 림프종(Burkitt's Lymphoma), 수두, 출혈열, 홍역, 볼거리, 파라인플루엔자, 광견병, 감기, 소아마비, 백혈병, 풍진, 성적 전파 질환, 피부 질환[예, 카포시(Kaposi's), 사마귀], 및 바이러스 혈종 등을 비롯한 다양한 질병 또는 증상을 유발할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 상기 증상 또는 질환 중 임의의 것을 검출하거나 치료하기 위하여 사용할 수 있다.
유사하게, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트에 의하여 검출하거나 치료할 수 있는, 질환 또는 증상을 일으킬 수 있는 박테이아 병원체 또는 곰팡이 병원체로는 하기의 것이 있으나, 하기의 그램-음성 및 그램-양성 박테리아과 및 곰팡이과에 한정되는 것은 아니다: 방선균(예, 코리네박테륨, 마이코박테륨, 노르카디아), 아스페르길로시스, 바실라세아에(예, 탄저, 클로스트리듐), 박테로이다세아에, 블라스토마이코시스, 보르데텔라, 보르렐리아, 브루셀로시스, 칸디디아시스, 캄필로박터, 코시디오이도마이코시스, 크립토코코시스, 더마토시코세스, 엔테로박테이라세아에(클레브시엘라, 살모넬라, 세라티아, 예르시니아), 에리시펠로트릭스, 헬리코박터, 레기오넬로시스, 렙토스피로시스, 리스테리아, 마이코플라스마탈레스, 나이세리아세아에(예, 아시네토박터, 고노르헤아, 메니고콕칼), 파스퇴렐라세아 감염(예, 안티노바실러스, 헤아모필러스, 파스퇴렐라), 슈도모나스, 리케치아세아에, 클라미디아세아에, 시필리스, 및 스타필로콕칼. 이들 박테리아 또는 곰팡이과는 다음과 같은 질병 또는 증상을 일으킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 균혈종, 심내막염, 눈 감염(결막염, 결핵, 포도막염), 치은염, 기회 감염(예, AIDS 관련 감염), 손발톱 주위염, 인공삽입물-관련 감염, 라이터병(Reiter's Disease), 기도 감염, 예를 들어, 백일해 또는 축농증, 패혈증, 라임 질환(Lyme Disease), 고양이-할퀴기 병(Cat-Scratch Disease), 이질, 파라장티프스, 식중독, 장티푸스, 폐렴, 임질, 수막염, 클라미디아(Chlamydia), 매독, 디프테리아, 나병, 파라결핵, 결핵, 루푸스, 보툴리누스중독, 괴저, 파상풍, 농가진, 류마티스성 열, 성홍열, 성적 전파 질환, 피부 질환[예, 봉와직염, 더마토사이코스(dermatocycoses)], 중독증, 요로 감염증, 창상 감염증. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 이들 증상 또는 질환 중 임의의 것을 검출 또는 치료하는데 사용할 수 있다.
또한, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트에 의하여 검출되거나 치료될 수 있는 질병 또는 증상을 유발하는 기생충 병원체로는 아메비아시스, 바베시오시스, 콕시디오시스, 크립토스포리디오시스, 디엔타모에비아시스, 듀린, 엑토파라시틱, 기아르디아시스, 헬민티아시스, 레이슈마니아시스, 타일레리아시스, 톡소플라스모시스, 트립파노소미아시스 및 트리코모나스 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 기생충은 옴, 쓰쓰가무시병, 눈 감염, 장 질환(예, 이질, 편모충증), 간 질환, 폐 질환, 기회 감염(예, AIDS 관련), 말라리아, 임신 합병증, 및 톡소플라스마증 등을 비롯한 다양한 질병 또는 증상을 유발할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 이들 증상 또는 질환 중 임의의 것을 검출하거나 치료하는데 사용할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용한 치료는 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드 유효량을 환자에게 투여하거나, 또는 환자로부터 세포를 제거하고, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 그 세포에 공급한 후, 그 조작된 세포를 환자에게 돌려보내는 것(예, 생체내 치료)이 바람직할 것이다.. 또한, METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 백신 중의 항원으로 사용함으로써 감염증에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
재생
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하여 세포를 분화, 증식 및 유인함으로써 조직 재생을 유도할 수 있다. [사이언스 276:59-87(1997) 참조]. 조직 재생을 이용하여 선천적 결함, 외상(창상, 화상, 절개 또는 궤양), 노화, 질병[예, 골다공증, 골관절염(asteocarthritis), 치주 질환, 간 기능부전(liver failure)], 성형 수술을 비롯한 수술, 섬유증, 재관류 손상 또는 전신성 사이토카인 손상에 의하여 손상된 조직을 회복, 치환 또는 보호할 수 있다.
본 발명을 이용해서 재생시킬 수 있는 조직으로는 기관(예, 췌장, 간, 장, 신장, 피부, 내피), 근육 조직(평활근, 골격근 또는 심근), 맥관 조직(혈관 및 림프관 포함), 신경 조직, 조혈 조직 및 골격 조직(뼈, 연골, 건 및 인대) 등이 있다. 재생은 반흔 없이 또는 반흔을 감소시키면서 일어나는 것이 바람직하다. 재생은 혈관 신생(angiogenesis)도 포함할 수 있다.
또한, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 치료하기 어려운 조직 재생을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 건/인대 재생을 향상시킴으로써 손상 후 재생 시간을 단축시킬 수 있다. 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 손상을 피하기 위한 예방 목적으로도 사용할 수 있다. 치료할 수 있는 특정 질병으로는 건염, 수근관 증후군, 기타 건 또는 인대 결함 등이 있다. 악성 창상(non-healing wound)의 조직 재생의 다른 예로는 궤양, 심혈관 기능부전 관련 궤양, 수술 창상 및 외상성 창상 등이 있다.
유사하게, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하여 신경 세포를 증식 및 분화시킴으로써 신경 조직 및 뇌 조직을 재생시킬 수 있다. 이러한 방법을 사용하여 치료할 수 있는 질병으로는 중추 신경계 및 말초 신경계 질병, 신경병증 또는 기계적 및 외상성 장애[예, 척수 장애, 두부 외상, 뇌혈관성 질환 및스토크(stoke)] 등이 있다. 특히, 말초신경 손상, 말초 신경병(예, 화학치료 또는 기타 의학적 치료로 인한 것), 국소 신경병, 및 중추신경계 질환[예, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅톤병 (Huntington's disease), 근위축성 측삭 경화증 및 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome)]과 관련한 질병은 모두 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하여 치료할 수 있다.
화학 주성
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 화학 주성 활성을 가질 수 있다. 화학 주성 분자는 세포[예, 단핵구, 섬유아세포, 호중구, T-세포, 비만 세포(mast cell), 호산구, 상피 및/또는 내피 세포]를 특정 신체 부위, 예를 들어, 염증 부위, 감염 부위 또는 과증식 부위로 유인 또는 가동화시킨다. 그 후, 가동화된 세포는 특정 외상 또는 이상과 싸우고/싸우거나 이를 치료할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 특정 세포의 화학 주성 활성을 향상시킬 수 있다. 그 후, 이러한 화학 주성 분자를 사용하여 신체의 특정 위치의 표적화 세포수를 증가시킴으로써 염증, 감염, 과증식 장애 또는 기타 면역계 장애를 치료할 수 있다. 예를 들어, 화학 주성 분자를 사용하여 손상 부위에 면역 세포를 유도함으로써 창상 및 조직에 대한 기타 외상을 치료할 수 있다. 화학 주성 분자로서, METH1 및/또는 METH2는 또한 창상을 치료하는데 사용할 수 있는 섬유아세포를 유도할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트가 화학 주성 활성을 억제할 수 있다는 것도 고려된다. 이들 분자를 사용하여 또한 장애들을 치료할 수 있다. 그래서, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 화학 주성 억제제로 사용할 수 있다.
결합 활성
METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드를 사용하여 METH1 및/또는 METH2에 결합하는 분자 또는 METH1 및/또는 METH2가 결합하는 분자를 스크리닝할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 및 상기 분자는 METH1 및/또는 METH2 또는 그 분자 결합의 활성을 활성화시키거나(아고니스트), 증대시키거나, 억제하거나(안타고니스트), 또는 감소시킬 수 있다. 그러한 분자들의 예로는 항체, 올리고뉴클레오티드, 단백질(예, 수용체) 또는 소형 분자 등이 있다.
상기 분자는 METH1 및/또는 METH2의 천연 리간드, 예컨대, 리간드의 단편, 또는 천연 기질, 리간드, 구조 또는 기능적 유사체(mimetic)와 친밀하게 관련되는 것이 바람직하다. [Coliganet al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5(1991) 참조]. 유사하게, 상기 분자는 METH1 및/또는 METH2가 결합하는 천연 수용체, 또는 적어도 METH1 및/또는 METH2(예, 활성 부위)가 결합될 수 있는 상기 수용체의 단편과 친밀하게 관련될 수 있다. 양자 어느 경우에도, 상기 분자는 공지 기술을 사용하여 합리적으로 디자인할 수 있다.
이들 분자에 대한 스크리닝은 분비 단백질로서 또는 세포막 상에서 METH1 및/또는 METH2를 발현시키는 적당한 세포를 생성시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 세포로는 포유 동물, 효모, 초파리 또는E. coli.로부터 수득한 세포 등이 있다. 그 후, 바람직하게, METH1 및/또는 METH2를 발현시키는 세포(또는 발현 폴리펩티드를 포함하는 세포막)를 상기 분자를 잠재적으로 포함하는 시험 화합물과 접촉시켜 METH1 및/또는 METH2 또는 상기 분자의 활성을 억제, 자극 또는 결합시키는 것을 관찰한다.
상기 분석은 표지된 경쟁 물질과의 경쟁을 포함하는 분석에서, 또는 표지에 의하여 결합이 검측되는 METH1 및/또는 METH2에 대한 후보 화합물의 단순한 결합 시험일 수 있다. 또한, 상기 분석은 후보 화합물이 METH1 및/또는 METH2에 결합함에 의하여 생성되는 신호를 초래하는가 여부를 시험할 수 있다.
대안적으로, 상기 분석은 세포-유리 제제(cell-free preparation), 고체 지지체에 부착된 폴리펩티드/분자, 화학 라이브러리, 또는 천연 생성 혼합물을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 분석은 단순히 후보 화합물을 METH1 및/또는 METH2를 포함하는 용액과 혼합하는 단계, METH1 및/또는 METH2 분자 활성 또는 결합을 측정하는 단계, 및 METH1 및/또는 METH2 활성 또는 결합을 표준 물질과 비교하는 단계를 포함할 수도 있다.
바람직하게, ELISA 분석은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 샘플(예, 생물학적 샘플) 중의 METH1 및/또는 METH2 농도 또는 활성을 측정할 수 있다. 상기 항체는 직접 또는 간접적으로 METH1 및/또는 METH2에 결합함에 의해서, 또는 기질에 대해서 METH1 및/또는 METH2와 경쟁함에 의해서 METH1 및/또는 METH2 농도 또는 활성을 측정할 수 있다.
대안적으로, METH1 및/또는 METH2가 결합하는 수용체는 당업자에게 공지되어 있는 다수의 방법에 의하여 동정할 수 있다. 그러한 방법의 예로는 리간드 패닝(ligand panning) 및 FACS 쏘팅(sorting)이 있다[Coligan,et al. Current Protocols in Immun., 1(2), Chapter 5, (1991)]. 예를 들어, 상기 폴리펩티드에 대하여 반응성인 세포, 예를 들어 FGF계 단백질에 대한 다중 수용체를 포함하는 것으로 공지되어 있는 NIH3T3 세포, 및 SC-3세포로부터 폴리아데닐화 RNA를 제조하고, 상기 RNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 풀(pool)로 분할하여 COS 세포 또는 상기 폴리펩티드에 반응성이 없는 기타 세포를 형질 전환시키는데 사용하는 발현 클로닝을 이용한다. 유리 슬라이드 상에서 성장된 형질 전환된 세포를 표지화한 후, 본 발명의 폴리펩티드에 노출시킨다. 부위-특이적 단백질 키나아제(site-specific protein kinase)에 대한 인식 자리를 봉입(inclusion) 또는 요오드화시키는 등의 다양한 수단에 의하여 상기 폴리펩티드를 표지화할 수 있다.
고정화 및 항온 처리 후, 상기 슬라이드를 오토-래디오그래프 분석(auto- radiographic analysis)하였다. 양성 풀(pool)을 동정하고, 서브-풀(sub-pool)을 제조하고, 반복 서브-풀링(sub-pooling) 및 재-스크리닝 방법을 사용하여 재-형질전환시켜, 추정 수용체를 암호화하는 단일 클론을 수득한다.
수용체 동정에 대한 대안적인 접근법으로서, 표지된 폴리펩티드가 수용체 분자를 발현시키는 추출물 제제 또는 세포막과 결합되는 광친화성(photoaffinity)일 수 있다. 가교 결합된 물질을 PAGE 분석법으로 분석하고, X-선 필름에 노출시킨다. 폴리펩티드의 수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절제하여 펩티드 단편으로 분해하고, 단백질 마이크로시퀀싱(microsequencing)한다. 마이크로시퀀싱에서 얻은 아미노산 서열을 사용하여 변성(degenerate) 올리고뉴클레오티드 프로브 셋트를 디자인하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 추정 수용체를 암호하는 유전자를 동정할 수 있다.
또한, 유전자-셔플링(gene-shuffling), 모티프-셔플링(motif-shuffling), 엑손-셔플링(exon-shuffling) 및/또는 코돈-셔플링(codon-shuffling)(총괄적으로 "DNA-셔플링"이라고 언급함)을 이용하여 METH1 또는 METH2의 활성을 조정함으로써 METH1 또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 효과적으로 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호, 제5,830,721호, 제5,834,252호 및 제5,837,458호; 및 문헌들[Patten, P.A.et al., Curr. Opinion Biotechol.8:724-733(1997); Harayama, S.Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson, L.O.et al., J. Mol. Biol. 287:265-276(1999); 및 Lorenzo, M.M. 및 Blasco, R.Biotechniques 24(2):308-313(1998)]을 참고하라. 상기 각 특허 문헌 및 기타 문헌들은 본원에 참고 문헌으로 포함된다. 하나의 실시 태양에 있어서, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드의 변형물 및 상응하는 폴리펩티드는 DNA 셔플링에 의해서 달성할 수 있다. DNA 셔플링은 동족의(homologous) 또는 부위-특이적인 재조합에 의하여 소정 METH1 또는 METH2 분자로의 2 이상의 DNA 단편의 어셈블리(assembly)를 포함한다.
다른 실시 태양에 있어서, METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 및 상응하는 폴리펩티드는 재조합 전에 에러-프론(error-prone) PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입(random nucleotide insertion), 또는 기타 방법으로 무작위 돌연변이를 유발시켜 변형시킬 수 있다. 다른 실시 태양에 있어서, 1종 이상의 성분, 모티프(motif), 섹션(section), 부분(part), 도메인(domain), 단편 등, 또는 METH1 또는 METH2를 1 종 이상의 이종 유래 분자의 1 종 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합시킬 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 이종 유래의 분자는 성장 인자, 예를 들어, 예컨대, 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGI-I), 형질 전환 성장 인자(TGF)-알파, 상피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), TGF-베타, 뼈 형태발생 단백질(BMP: bone morphogenetic protein)-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-6, BMP-7, 액티빈 A 및 B, 데카펜타플레직(dpp: decapentaplegic), 60A, OP-2, 도잘린(dorsalin), 성장 분화 인자(GDFs), 노달(nodal), MIS, 인히빈-알파(inhibin-alpha), TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타5, 및 글리알-유도 신경 인자(GDNF: glial-derived neutrophic factor)이다.
기타 바람직한 단편은 생물학적 활성 METH1 또는 METH2 단편이다. 생물학적 활성 단편은 METH1 또는 METH2 폴레펩티드의 활성과 유사한 활성을 나타내나, METH1 또는 METH2 폴리펩티드와 반드시 동일한 것은 아니다. 상기 단편의 생물학적 활성은 개선된 원하는 활성 또는 감소된 원하지 않는 활성을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 작용을 조정하는 것을 동정하는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 그러한 분석의 예는 포유 동물 섬유아세포, 본 발명의 폴리펩티드, 스크리닝되는 화합물 및 세포 배양 조건하의 3[H] 티미딘의 배합을 포함하는데, 여기에서 상기 섬유아세포는 정상적으로 증식할 것이다. 스크리닝할 화합물의 부재하에 대조군 분석을 수행한 후, 각 경우에 있어서의 3[H] 티미딘의 흡수를 측정함으로써 대조군 시험과 상기 화합물 존재하의 섬유아세포 증식의 양을 비교하여 상기 화합물이 증식을 자극하는지 여부를 측정한다. 섬유아세포 증식의 양은 3[H] 티미딘의 혼합을 측정하는 액체 섬광 크로마토그래피(liquid scintillation chromatogaphy)로 측정한다. 아고니스트 화합물과 안타고니스트 화합물 모두 이러한 과정으로 동정할 수 있다.
다른 방법에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 수용체를 발현시키는 막 제제 또는 포유 동물 세포를 상기 화합물의 존재하에 본 발명의 표지된 폴리펩티드와 항온 처리한다. 그 후, 이러한 상호 작용을 향상시키거나 차단하는 상기 화합물의 능력을 측정할 수 있다. 대안적으로, 스크리닝될 화합물과 METH1 및/또는 METH2 수용체의 상호 작용 후 공지된 제2 메신저 시스템(messenger system)의 응답을 측정하고, 상기 수용체에 결합하고 제2 메신저 응답을 유도하는 상기 화합물의 능력을 측정하여 상기 화합물이 잠재적 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부를 측정한다. 그러한 제2 메신저 시스템으로는 cAMP 구아닐레이트 시클라제, 이온 채널 또는 포스포이노사이티드 가수분해물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
전술한 분석법 모두는 진단 또는 예후 마커로 사용할 수 있다. 이들 분석법을 사용하여 발견한 분자들을 사용하여 METH1 및/또는 METH2 분자를 활성화시키거나 억제함으로써 환자에 있어서 특정 결과(예, 혈관 성장)를 유발하거나 질병을 치료할 수 있다. 또한, 상기 분석법을 이용하여, 적당히 조작된 세포 또는 조직으로부터 METH1 및/또는 METH2의 제조를 억제 또는 향상시킬 수 있는 병원체를 밝혀낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 METH1 및/또는 METH2에 결합되는 화합물을 동정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다: (a) METH1 및/또는 METH2와 후보 결합 화합물을 항온 처리하는 단계; 및 (b) 결합이 일어났는지 여부를 측정하는 단계. 또한, 본 발명은 아고니스트/안타고니스트를 동정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다: (a) METH1 및/또는 METH2와 후보 화합물을 항온 처리하는 단계, (b) 생물학적 활성을 분석하는 단계, 및 (c) METH1 및/또는 METH2의 생물학적 활성이 변경되었는지 여부를 측정하는 단계.
또한, 도 10 및 11 및 표 1 및 2에 공개된 베타-병풍 구조(beta-pleated sheet) 영역을 사용하여 실험적으로 METH1 및/또는 METH2와 결합하는 분자를 동정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 실시 태양은 도 10/표 1 및 도 11/표2에 공개된 각각의 베타 병풍 구조 영역의 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이들 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 실시 태양은 도 10/표 1 및 도 11/표 2에 공개된 모든 베타 병풍 구조 영역 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 또는 이들로 구성되는 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 바람직한 실시 태양은 도 10/표 1 및 도 11/표 2에 공개된 베타 병풍 구조 영역 각각의 METH1 및/또는 METH2 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이들 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 실시 태양은 도 10/표 1 및 도 11/표 2에 공개된 베타 병풍 구조 모두 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 또는 이들로 구성된 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드에 관한 것이다.
안티센스 및 라이보자임(안타고니스트)
특정 실시 태양에 있어서, 본 발명에 따른 안타고니스트는 SEQ ID NO: 1 또는 3에 포함되는 서열, 또는 그 상보성 스트랜드, 및/또는 부착 클론에 포함되는 뉴클레오티드 서열에 상응하는 핵산이다. 하나의 실시 태양에 있어서, 안티센스 서열은 유기체에 의하여 내부적으로 생성되고, 다른 실시 태양에 있어서, 안티센스 서열은 분리 투여된다[예를 들어, O'Connor, J.,Neurochem. 56:560(1990), Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)을 참조하라]. 안티센스 기술을 사용하여 안티센스 DNA 또는 RNA를 통하여, 또는 트리플-헬릭스 형성을 통하여 유전자 발현을 조절할 수 있다. 안티센스 기술에 대하여서는 다수의 문헌들[예, Okano, J.Neurochem. 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1998)]에서 논의되고 있다. 트리플 헬릭스 형성에 대하여서도 문헌들[예, Leeet al., Nucleic Acids Research 6:3073(1979); Cooneyet al., Science 241:456(1988); 및 Dervan et al., Science 251:1300(1991)]에서 논의되고 있다. 상기 방법들은 상보성 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합에 기초한 것이다.
예를 들어, 본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 코딩 부분을 사용하여 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드를 전사에 관여하는 유전자 영역에 상보성이 되도록 디자인함으로써 전사를 막고 수용체를 생성시킬 수 있다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 생체내에서 mRNA로 하이브리드화시키고, 수용체 폴리펩티드로의 mRNA 분자의 번역을 차단한다.
하나의 실시 태양에 있어서, 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터의 전사에 의하여 세포내적으로 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 안티센스 핵산(RNA)를 생성하는 벡터 또는 그 부분을 전사한다. 그러한 벡터는 METH1 및/또는 METH2 안티센스 핵산을 암호화하는 서열을 포함할 것이다. 그러한 벡터는 그것이 전사되어 소정 안티센스 RNA를 생성할 수 있는 한, 에피소말(episomal)로 유지되거나 염색체와 인테그레이트될 수 있다. 그러한 벡터는 당업계의 재조합 DNA 기술 표준 방법을 이용하여 구성할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 척추 동물 세포에서 복제 및 발현용으로 사용되는 당업계에 공지된 기타 벡터일 수 있다. METH1 및/또는 METH2 또는 그 단편을 암호화하는 서열의 발현은 척추 동물, 바람직하게 인간 세포에서 작용하는 당업계에 공지된 임의의 프로모터에 의할 수 있다. 그러한 프로모터는 유도되거나 구성될 수 있다. 그러한 프로모터로는 SV40 어얼리 프로모터 영역[Bernoist and Chambon, Nature 29:304-310(1981)], 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)의 3' 장쇄 터미날 반복 단위에 포함되는 프로모터[Yamamotoet al., Cell 22:787-797(1980)], 헤르페스 티미딘 프로모터[Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445(1981)], 메탈로티오닌(metallothionein) 유전자의 조절 서열[Brinster,et al., Nature 296:39-42(1982)] 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 안티센스 핵산은 METH1 및/또는 METH2 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부에 상보성인 서열을 포함한다. 그러나, 완전한 상보성이 요구되지는 않는다. 물론, 완전한 상보성이 바람직하다. 본 명세서에서 사용한 용어 "RNA의 적어도 일부에 상보성인" 서열은 RNA와 하이브리드화될 수 있는 충분한 상보성을 가지며, 안정한 듀플렉스(duplex)를 형성하는 서열을 의미한다; 따라서, 더블 스트랜드 METH1 및/또는 METH2 안티센스 핵산의 경우에는, 듀플렉스 DNA의 싱글 스트랜드가 시험되거나, 트리플렉스 형성이 분석될 것이다. 하이브리드화 능력은 안틴센스 핵산의 길이 및 상보성의 정도 양자 모두에 좌우될 것이다. 일반적으로, 더 큰 하이브리드화 핵산일수록 METH1 및/또는 METH2 RNA와 더 많은 염기 미스매치(mismatch)를 초래하고, 그것은 안정한 듀플렉스(경우에 따라 트리플렉스일 수 있음)를 함유할 수 있고, 또한 안정한 듀플렉스(경우에 따라 트리플렉스일 수 있음)를 형성할 수 있다. 당업자는 하이브리드화된 복합체의 융점을 측정하는 표준 과정을 이용하여 미스매치의 인용 가능한 정도를 확인할 수 있다.
메시지의 5' 말단(예를 들어, 5' 미번역 서열 이하 및 AUG 개시 코돈 포함)에 상보성인 올리고뉴클레오티드는 번역 억제 시에 가장 효율적으로 작용해야만 한다. 그러나, mRNA의 3' 미번역 서열에 상보성인 서열은 당연히 mRNA의 번역 억제시에 효과적으로 나타났다. 일반적으로 문헌(Wagner, R., 1994,Nature 372:333-335)을 참조하라. 따라서, 도 1에 나타낸 METH1 및/또는 METH2의 5'- 또는 3'-미번역 미-코딩 영역에 상보성인 올리고뉴클레오티드는 내인성 METH1 및/또는 METH2 mRNA의 번역을 억제하는 안티센스 접근법에 사용될 수 있다. mRNA의 5' 미번역 영역에 상보성인 올리고뉴클레오티드는 AUG 출발 코돈의 보체를 포함해야 한다. mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 보체는 번역의 덜 유효한 억제자이나, 본 발명에 따라 사용할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 mRNA의 5'-, 3- 또는 코딩 영역에 하이브리드화되도록 디자인되었는지에 관계없이, 안티센스 핵산은 길이가 6개 이상의 뉴클레오티드이어야 하며, 길이가 6 내지 약 50개의 뉴클레오티드 범위인 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 특정 양상에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 10개 이상의 뉴클레오티드, 17개 이상의 뉴클레오티드, 25개 이상의 뉴클레오티드 또는 50개 이상의 뉴클레오티드이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 또는 그의 키메라성(chimeric) 혼합물 또는 그 유도체 또는 변형물, 싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 염기 부분, 당부분, 또는 인산 주쇄 부분을 변형시켜, 예를 들어, 분자 안정성, 하이브리드화 등을 개선시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 기타 추가 그룹, 예를 들어 펩티드(예, 생체내 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위한 것), 또는 세포막 횡단 수송을 용이하게 하는 약제[예를 들어, 문헌들(Letsingeret al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitreet al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT 공개 번호 WO 88/09810, 1988. 12. 15. 공개)을 참조하라], 또는 혈뇌 장벽[예를 들어, 문헌(PCT공개 번호 WO 89/10134, 1988. 4. 25. 공개)을 참조하라], 하이브리드화-유발 개열제(hybridization-triggered cleavage agent)[예를 들어, 문헌(Krolet al., 1988,BioTechniques6:958-976)을 참조하라], 또는 개재제(intercalating agent)[예를 들어, 문헌(Zon, 1988,Pharm. Res. 5:539-549)을 참조하라] 등을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 그 말단에 다른 분자, 예를 들어, 펩티드, 하이브리드화 유발 가교제, 수송제, 하이브리드화 유발 개열제, 등의 다른 분자와 결합될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실큐에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함(단, 이에 한정되는 것은 아님)하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 개질 염기 부분을 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 크실루로스 및 헥소스를 포함(단, 이에 한정되는 것은 아님)하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 개질된 당 부분을 포함할 수도 있다.
또 다른 실시 태양에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미도티오에이트, 포스포아미데이트, 포스포디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르, 및 포름아세탈 또는 그의 유사체를 포함(단, 이에 한정되는 것은 아님)하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 개질된 인산 주쇄를 포함한다.
또 다른 실시 태양에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-아노머성 올리고뉴클레오티드(a-anomeric oligonucleotide)이다. 비-아노머성 올리고뉴클레오티드는 통상의 b-단위와 달리, 스트랜드가 서로 평행으로 주행하는 상보성 RNA와 특이적 더블-스트랜드 하이브리드를 형성한다(Gautier et al., 1987,Nucl. Acids Res. 15:6625-6641). 상기 올리고뉴클레오티드는 2'-0-메틸리보뉴클레오티드 (Inoue et al., 1987,Nucl. Acids Res. 15:6131-6148), 또는 키메라성 RNA-DNA 유사체(Inoue et al., 1987,FEBS Lett. 215:327-330)이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들어, 자동 DNA 합성기(예를 들어, Biosearch, Applied Biosystems 등에서 시판)를 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 Stein 등의 방법(1988, Nucl. Acids Res. 16:3209)에 의하여 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 제어 공극 유리 중합체 지지체(controlled poreglass polymer supports)(Sarinet al., 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451)를 사용하여 제조할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 코딩 영역 서열에 상보성인 안티센스 뉴클레오티드를 사용할 수 있지만, 전사 미번역 영역에 상보성인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 잠재성 안타고니스트로는 또한 촉매적 RNA 또는 라이보자임이 있다[예를 들어, 문헌(PCT 국제 공개 WO 90/11364, 1990. 10. 4. 공개; Sarveret al., Science 247:1222-1225(1990))을 참고하라]. 부위 특이적 인식 서열에서 mRNA를 개열시키는 라이보자임을 사용하여 METH1 및/또는 METH2 mRNA를 파괴시킬 수 있으나, 햄머헤드(hammerhead) 라이보자임이 바람직하다. 햄머헤드 라이보자임은 표적 mRNA와 상보성 염기쌍을 형성하는 영역의 측부 위치에서 mRNA를 개열시킨다. 유일한 요구 조건은 표적 mRNA가 하기 두 개의 염기 서열을 갖는다는 것이다: 5'-UG-3'. 햄머헤드 라이보자임의 생성 및 구성은 당업계에 주지되어 있으며, 문헌[Haseloff and GerlachNature 334:585-591(1988)]에 더욱 자세히 기술되어 있다. METH1 및/또는 METH2의 뉴클레오티드 서열내에는 다수의 잠재성 햄머헤드 라이보자임 개열 부위가 있다(도 1 및 2). 라이보자임을 조작하여 개열 인식 부위가 METH1 및/또는 METH2 mRNA의 5'말단 근처가 되도록 하는 것이 바람직하다; 즉, 비-작용성 mRNA 전사물의 세포내 축적을 최소화하고 효율을 증대시키는 것이 바람직하다.
안티센스 접근법에 있어서와 같이, 본 발명의 라이보자임은 개질(예를 들어, 안정성, 표적화 등의 개선)된 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 생체내에서METH1 및/또는 METH2를 발현시키는 세포로 유도되어야 한다. 라이보자임을 암호화하는 DNA 작제물은 DNA를 암호화하는 안티센스 도입과 관련하여 전술한 바와 동일한 방법으로 상기 세포내에 도입시킬 수 있다. 송달의 바람직한 방법은 강력한 구성 프로모터, 예를 들어, pol Ⅲ 또는 pol Ⅱ 프로모터의 제어하에 라이보자임을 "암호화"하는 DNA 작제물의 사용을 포함하는데, 이를 통하여 형질 전환된 세포는 내인성 METH1 및/또는 METH2 메시지를 파괴하고 번역을 억제하는 충분량의 라이보자임을 생성시킬 것이다. 안티센스 분자와 달리 라이보자임은 촉매이기 때문에, 효율을 위하여 보다 낮은 세포내 농도가 요구된다.
안타고니스트/아고니스트 화합물들을 사용하여 종양 세포 및 조직상에서 본 발명의 폴리펩티드의 증식 효과 및 세포 성장(즉, 종양의 혈관 신생 자극)을 억제할 수 있고, 따라서, 예를 들어 종양 형성 또는 성장에 있어서 비정상적인 세포 성장 및 증식을 지연시키거나 억제할 수 있다.
또한, 안타고니스트/아고니스트를 사용하여 고혈압을 예방할 수 있고, 포외 백내장 수술(extracapsular cataract surgery) 후, 상피 수정체(epithelial lens) 세포의 증식을 예방할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 분열 유발 활성 (mitogenic activity)의 방지는 또한 풍선 혈관 성형술 후, 재협착(restenosis)과 같은 경우에 바람직할 수 있다.
또한, 안타고니스트/아고니스트를 사용하여 창상 치료 중에 반흔 조직의 성장을 방지할 수 있다.
또한, 안타고니스트/아고니스트를 사용하여 본 명세서에 기술되어 있는 질병을 치료할 수 있다.
기타 활성
하기하는 바와 같이, METH1 및/또는 METH2는 ADAM 계의 일원과 구조 및 서열 상동성을 공유한다. ADAM 단백질은 TNF를 비롯한 막-결합(membrane-anchored) 단백질의 단백질 가수 분해 과정을 나타낸다[Blacket al. Nature 385:729(1997); Mosset al., Nature 385:733(1997)]. 따라서, METH1 및/또는 METH2는 막-결합 단백질의 단백질 가수 분해 과정에 유용할 수 있다. METH1 및/또는 METH2에 의하여 단백질 가수 분해될 수 있는 막-결합 단백질로는 사이토카인, 성장 인자, 사이토카인 수용체 및 성장 인자 수용체 등이 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 전술한 바에 더하여 조혈계(hematopoietic lineage) 배 줄기 세포(embryonic stem cell)의 분화 및 증식을 증대 또는 감소시킬 수도 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 포유 동물의 특성, 예를 들어, 신장, 체중, 머리 색, 눈 색, 피부, 지방 조직의 퍼센트, 색소 형성, 크기 및 모양을 조정하는데 사용할 수도 있다(예, 성형 수술). 유사하게, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 이화 작용, 동화 작용, 에너지 처리, 사용 및 저장에 영향을 미치는 포유동물 신진 대사를 조정하는데 사용할 수도 있다.
혈관 신생이 지방 조직을 지탱하는데 있어서 중요한 인자이기 때문에, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 개체의 체중을 조절하고, 체중을 감소시키며, 비만을 치료하고/하거나 지방 조직을 조절하는데 사용할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 바이오리듬, 주기 리듬, 우울(우울증 포함), 폭력성, 고통에 대한 내성, 재생산 능력(바람직하게, 액티빈 또는 인히빈-유사 활성에 의함), 호르몬 또는 내분비 농도, 식욕, 성욕, 기억력, 스트레스, 또는 기타 인식력에 영향을 끼침으로써 포유 동물의 정신 상태 또는 신체 상태를 변화시키는데 사용할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 METH1 및/또는 METH2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 음식물 첨가제 또는 예를 들어, 저장 능력을 증대 또는 감소시키는 방부제, 지방 함유물, 지질, 단백질, 탄수화물, 비타민, 무기질, 공동 인자 또는 기타 영양 성분으로서 사용할 수도 있다.
상기 언급한 적용례들은 다양한 숙주에서 이용할 수 있다. 그러한 숙주로는 인간, 쥐과 동물(murine), 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 마우스, 랫트, 햄스터, 피그, 마이크로-피그, 닭, 염소, 소, 양, 개, 고양이, 인간 이외의 영장류 및 인간 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시 태양에 있어서, 숙주는 마우스, 토끼, 염소, 기니아 피그, 닭, 랫트, 햄스터, 피그, 양, 개 또는 고양이이다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 숙주는 포유 동물이다. 가장 바람직한실시 태양에 있어서, 숙주는 인간이다.
항-혈관 신생
실시예 4 및 5에 나타낸 바와 같이, METH1 및 METH2는 혈관 신생을 억제한다. 따라서, 본 발명은 혈관 신생-관련 질병 및/또는 장애를 치료하는 방법으로서, 그 필요가 있는 개체에 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
예를 들어, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트는 암 또는 종양을 치료학적으로 치료하기 위한 다양한 추가적 방법에 사용할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트로 치료할 수 있는 암으로는 전립선암, 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 췌장암, 후두암, 식도암, 고환암, 간암, 이하선암, 담도암, 결장암, 직장암, 자궁 경부암, 자궁암, 자궁 속막암, 신장암, 방광암, 갑상선암 등의 충실성 종양; 원발 종양 및 전이; 흑색종; 교모세포종; 카포시 육종(Kaposis' sarcoma); 평활근 육종; 비-소형 세포 폐암(non-small cell lung cancer); 결장직장암; 악성암; 및 백혈병과 같은 혈액암 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트는 암, 예를 들어, 피부암, 머리 종양, 목 종양, 유방암, 및 카포시 육종을 치료하기 위하여 국소 송달될 수 있다. 또 다른 실시 태양에 있어서, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트를 예를 들어 방광내 투여함으로써 방광암의 표면 형태를 치료하는데 사용할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트를 주사 또는 카테터를 통해서 암 부위 근처로 또는 암으로 직접 송달할 수 있다. 물론, 당업자는 치료할 암에 따라 적절한 투여 모드가 변할 것임을 이해할 것이다. 기타 송달 모드는 본 명세서에서 논의한다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트는 혈관 신생을 포함하는 암 외에 기타 장애를 치료하는데도 유용할 수 있다. 이들 장애로는 양성 종양, 예를 들어, 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마, 및 화농성 육아종; 죽상판; 안구 혈관 신생 질병, 예를 들어, 당뇨병성 망막병증, 수정체후섬유증식증, 황반 변성, 각막 이식편 거부 반응, 신생혈관 녹내장, 수정체후부섬유 증식증, 피부조홍, 망막모세종, 눈의 포도막염(uvietis) 및 익상편(Pterygia) (비정상적 혈관 성장); 류마티스 관절염; 건선; 창상 치료 지연; 자궁내막증; 혈관 생성; 육아; 비후성 반흔(켈로이드); 비유합성 골절(nonunion fracture); 경피증; 트라코마; 혈관 접착; 심근 혈관 신생; 관상 부측삭(coronary collateral); 뇌 부측삭; 동정맥 기형; 허혈성 사지 혈관 신생; 오슬러-웨버 증후군(Osler-Webber Syndrome); 반 혈관신생(plaque neovascularization); 모세혈관 확장증; 혈우병성 관절(hemophiliac joint); 맥관섬유종; 섬유근성 이형성증; 창상 육아(wound granulation); 크론병(Crohn's disease); 및 죽상경화증 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 한 실시 태양에 있어서, 비후성 반흔 및 켈로이드 치료 방법으로서 비후성 반흔 또는 켈로이드에 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.본 발명의 한 실시 태양에서는 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트를 비후성 반흔 또는 켈로이드에 직접 주사함으로써 이러한 병변의 진행을 예방한다. 이러한 치료법은 비후성 반흔 및 켈로이드(예, 화상)의 진행으로 귀착되는 공지된 증상의 예방 처리에 특히 가치가 있으며, 또한 증식 상태가 진행된 후(최초 손상으로부터 약 14일 후), 그러나, 비후성 반흔 또는 켈로이드가 발생하기 전에 그러한 치료를 시작하는 것이 바람직하다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 또한 예를 들어, 각막 혈관 신생, 신생혈관 녹내장, 증식성 당뇨병 망막병증, 수정체후부섬유 증식증, 황반 변성, 및 기타 안구 염증 질환, 안구 종양 및 맥락막 또는 홍채 혈관 신생과 관련된 질환 등을 비롯한 눈의 신생혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 문헌[Waltmanet al., Am. J. Ophthal 85:704-710(1978) 및 Gartneret al., Surv. Ophthal. 22:291-312(1978)]을 참조하라.
따라서, 본 발명의 한 실시 태양에서는 각막 혈관 신생(각막 이식편 혈관 신생)과 같은 안구의 혈관 신생 질환을 치료하는 방법으로서, METH1 및/또는 METH2 화합물(전술한 바와 같은 화합물) 치료 유효량을 환자의 각막에 투여함으로써 혈관 신생을 억제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 간략하게, 각막은 정상적으로 혈관을 결하고 있는 조직이다. 그러나, 특정 병리학적 증상에 있어서, 모세혈관이 각막 주위의 혈관망 둘레로부터 각막으로 팽창될 수 있다. 각막에 혈관 신생되었을 때, 그것은 또한 탁하게 되어 환자의 시각적 예민성을 저하시키게 된다. 각막이 완전히 불투명하게되면 완전한 시각 손실이 일어날 수 있다.
다양한 장애가, 예를 들어, 각막 감염(예, 트라코마, 단순 포진 각막염, 리슈마니아증, 회선사상충증), 면역학적 과정[예, 이식편 거부 반응 및 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson's syndrome), 알칼리 화상, 외상, 염증(원인 불문), 독성 및 영양 결핍 상태, 및 콘택트 렌즈 착용 합병증 등을 비롯한 각막 혈관 신생으로 귀결될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시 태양에 있어서, METH1 및/또는 METH2를 염수중의 국소 투여용으로 제조(눈 제제 중에 통상 사용하는 방부제 및 항균제 중 임의의 것과 혼합함)하여, 눈물 형태로 투여할 수 있다. 순수한 형태의 용액 또는 현탁액을 제조하여 매일 수회 투여할 수 있다. 대안적으로, 전술한 바와 같이 제조한 항-혈관 신생 조성물을 각막에 직접 투여할 수도 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 항-혈관 신생 제제는 각막과 결합하는 점막-접착성 중합체와 함께 제조한다. 또 다른 실시 태양에 있어서, 항-혈관 신생 인자 또는 항-혈관 신생 조성물을 종래 스테로이드 치료법에 수반하여 사용할 수 있다.
국소 치료법은 또한 혈관 신생 반응을 유발할 가능성이 높은 것으로 공지된 각막 병변의 예방에 유용하다(예, 화학적 화상). 이러한 예에 있어서, 스테로이드와의 조합 치료는 후속 합병증 예방에 즉각적으로 도움을 줄 수 있다.
또 다른 실시 태양에 있어서, 안과 의사는 현미경적 안내하에 전술한 화합물들을 각막 스트로마(stroma)에 직접 주사할 수 있다. 바람직한 주사 부위는 개체의 병변 형태에 따라 변할 수 있으나, 투여 목적은 혈관의 진행성 전단에(즉, 혈관과 정상 각막 사이에) 조성물을 위치시키는 것이다. 대부분의 경우에 있어서, 이는 혈관 진행으로부터 각막을 "보호"하기 위한 변연계 근처(perilimbic) 각막 주사를 포함할 것이다. 이러한 방법을 각막 손상 후 즉시 사용하여 각막 혈관 신생을 예방할 수도 있다. 이러한 상황에 있어서, 상기 물질을 각막 병변과 원치않는 잠재적 변연계(limbic) 혈액 공급 사이에 산재된 변연계 근처 각막에 주사할 수 있다. 그러한 방법은 이식 각막의 모세관 침입을 예방하는데 유사하게 사용할 수도 있다. 서방형 형태에 있어서, 주사는 1년에 2 내지 3번 요구될 뿐이다. 또한, 스테로이드를 주사 용액에 첨가함으로써 주사 그 자체로부터 유발되는 염증을 감소시킬 수도 있다.
본 발명의 또 다른 실시 태양에 있어서, 신생 혈관 녹내장 치료 방법으로서, 혈관 신생을 억제하기 위해서 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트 치료 유효량을 환자의 눈에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 하나의 실시 태양에 있어서, 상기 화합물은 혈관 신생 녹내장의 조기 형성을 치료하기 위하여 눈에 국소적으로 투여될 수 있다. 다른 실시 태양에 있어서, 상기 화합물을 전방각 영역에 주사로 주입할 수 있다. 다른 실시 태양에 있어서, 상기 화합물을 그 화합물이 안구 방수(aqueous humor) 내로 계속적으로 방출되도록 하는 임의의 위치에 위치시킬 수도 있다.
본 발명의 또 다른 실시 태양에 있어서, 증식성 당뇨병 망막병증을 치료하는 방법으로서, 혈관 신생이 억제되도록 하기 위하여 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트 치료 유효량을 환자의 눈에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명의 특히 바람직한 실시 태양에 있어서, 망막내 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트의 국소 농도를 증가시키기 위하여, 이를 안구 방수 또는 유리체에 주사함으로써 증식성 당뇨병 망막병증을 치료할 수 있다. 이러한 치료는 광응고를 요하는 중증 질환의 획득 이전에 개시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 실시 태양에 있어서, 수정체후부섬유 증식증을 치료하는 방법으로서, 혈관 신생을 억제하기 위해서 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트 치료 유효량을 환자의 눈에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 상기 화합물은 유리체내 주사를 통하여, 및/또는 안내 주입(intraocular implant)을 통하여 국소적으로 투여할 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트를 사용하여 병리학적 결과로서 혈관 신생을 나타내는 질병을 치료할 수 있다. 그러한 질병으로서는 묘소병(Rochele minalia quintosa), 궤양(Helicobacter pylori), 바르토넬라증 및 간균성 혈관종증 등이 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트는 배아 착상을 위하여 요구되는 혈관 신생을 예방함으로써 수태 조절제(birth control agent)로서 사용할 수 있다. 수태 조절 방법의 한 실시 태양에 있어서, 배아 착상을 차단하는데 충분한 양의 상기 화합물을 성교 및 수정 전 또는 후에 투여함으로써 "후 모니터링"이 가능한 효과적인 수태 조절 방법을 제공한다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트는 또한 월경 조절에 사용할 수도 있고, 자궁내막증의 치료에 있어서 복막관류 또는복막주입으로서 투여할 수도 있다.
봉합 육아종을 예방하기 위하여 외과적 봉합 부분에 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트를 혼입시킬 수 있다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트는 다양한 외과적 과정에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시 태양에 있어서, METH1 및/또는 METH2 조성물을 (예를 들어, 분무 또는 필름 형태로) 사용하여 종양 제거 전 영역을 코팅 또는 분무함으로써 종양 조직 부근의 정상 조직을 분리하고/하거나 주위 조직에 질병이 전이되는 것을 막을 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시 태양에 있어서, METH1 및/또는 METH2 조성물을 내시경 과정을 거처 송달함으로써 종양을 코팅하거나, 원하는 장소에서 혈관 신생을 억제할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시 태양에 있어서, 본 발명의 항-혈관 신생 조성물로 코팅된 외과용 메쉬를 외과용 메쉬가 사용될 수 있는 임의의 과정에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시 태양에 있어서, 항-혈관 신생 조성물이 적재된 외과용 메쉬를 (결장 절제에 이은) 복부 암 절제 수술 중에 사용함으로써 구조를 지지할 수 있고, 또한 항-혈관 신생 인자 양을 방출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 태양에 있어서, 종양 절제 부위를 치료하는 방법으로서, 암의 국소적 재발 및 절제 부위의 혈관 신생을 억제하기 위하여 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트를 절제에 이은 종양 주위 절제부에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명의 한 실시 태양에 있어서, 항-혈관 신생 화합물을 종양 절제 부위에 직접 투입할 수 있다(예를들어, 종양 절제 주변 부위를 항-혈관 신생 화합물로 도포, 브러싱 또는 코팅함으로써 적용할 수 있다). 대안적으로, 항-혈관 신생 화합물을 투여전에 공지된 외과용 반죽에 혼합할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시 태양에 있어서, 간의 악성 종양 절제 후, 및 신경 수술 후에 적용한다.
본 발명의 한 실시 태양에 있어서, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트는 예를 들어, 유방암, 결장암, 뇌종양 및 간암을 비롯한 다양한 종양의 절제 주변부에 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시 태양에 있어서, 항-혈관 신생 화합물을 절제에 이은 신경학적 종양 부위에 투여함으로써 그 부위에서의 혈관 신생을 억제할 수 있다.
본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 아고니스트는 다른 항-혈관 신생 인자와 함께 투여할 수 있다. 다른 항-혈관 신생 인자의 대표적 예로는 항-침입 인자(Anti-Invasive Factor), 레티노산 및 그 유도체, 팍클리탁셀, 슈라민, 메탈로프로테이나제-1의 조직 억제제, 메탈로프로테이나제-2의 조직 억제제, 플라스미노겐 활성제 억제제-1, 플라스미노겐 활성제 억제제-2, 및 다양한 형태의 경 "d 그룹"(lighter "d group") 전이 금속 등이 있다.
경 "d 그룹" 전이 금속에는, 예를 들어, 바나듐, 몰리브덴, 텅스텐, 티타늄, 니오븀 및 탄탈륨 종 등이 있다. 그러한 전이 금속 종은 전이 금속 착물을 형성할 수 있다. 상기 언급한 전이 금속 종의 적당한 착물로는 옥소 전이 금속 착물이 있다.
바나듐 착물의 대표적 예로는 옥소 바나듐 착물, 예를 들어, 바나데이트 및바나딜 착물 등이 있다. 적당한 바나데이트 착물로는 메타바나데이트 및 오르토바나데이트 착물, 예를 들어, 암모늄 메타바나데이트, 소듐 메타바나데이트 및 소듐 오르토바나데이트 등이 있다. 적당한 바나딜 착물로는 예를 들어, 바나딜 아세틸아세토네이트 및 바나딜 설페이트 모노- 및 트리하이드레이트와 같은 바나딜 설페이트 하이드레이트를 비롯한 바나딜 설페이트 등이 있다.
또한, 텅스텐 및 몰리브덴 착물의 대표적 예로는 옥소 착물이 있다. 적당한 옥소 텅스텐 착물로는 텅스테이트 및 텅스텐 옥사이드 착물 등이 있다. 적당한 텅스테이트 착물로는 암모늄 텅스테이트, 칼슘 텅스테이트, 소듐 텅스테이트 디하이드레이트, 및 텅스트산 등이 있다. 적당한 텅스텐 옥사이드로는 텅스텐(Ⅳ) 옥사이드 및 텅스텐(Ⅵ) 옥사이드 등이 있다. 적당한 옥소 몰리브덴 착물로는 몰리브데이트, 몰리브데늄 옥사이드 및 몰리브데닐 착물 등이 있다. 적당한 몰리브데이트 착물로는 암모늄 몰리브데이트 및 그의 하이드레이트, 소듐 몰리브데이트 및 그의 하이드레이트, 및 포타슘 몰리브데이트 및 그의 하이드레이트 등이 있다. 적당한 몰리브데늄 옥사이드로는 몰리브데늄(Ⅵ) 옥사이드, 몰리브데늄(Ⅵ) 옥사이드, 및 몰리브드산 등이 있다. 적당한 몰리브데닐 착물로는 예를 들어, 몰리브데닐 아세틸아세토네이트 등이 있다. 기타 적당한 텅스텐 및 몰리브데늄 착물로는 예를 들어, 글리세롤, 타르타르산 및 설탕으로부터 유도된 하이드록소 유도체 등이 있다.
기타 다양한 항-혈관 신생 인자를 또한 본 발명에서 사용할 수 있다. 대표적인 예로는 혈소판 인자 4; 프로타민 설페이트; 설페이트화 키틴 유도체(여왕 게조개에서 제조)(Murataet al., Cancer Res. 51:22-26, 1991); 셀페이트화 폴리사카라이드 펩티도글리칸 복합체(SP-PG)(이 화합물의 기능은 에스트로겐 및 타목시펜 시트레이트 등의 스테로이드의 존재에 의해서 향상될 수 있다); 스타우로스포린; 예를 들어, 프롤린 유사체, 시스하이드록시프롤린, d,L-3,4-디하이드로프롤린, 티아프롤린, α, α-디피리딜, β-아미노프로피오니트릴 퓨마레이트; 4-프로필-5-(4-피리디닐)-2(3H)-옥사졸린을 비롯한 매트릭스 대사 조절제; 메토트렉세이트; 미토크산트론; 헤파린; 인터페론; 2 마크로글로불린-혈청; ChIMP-3(Pavloffet al., J. Bio. Chem. 267:17321-17326, 1992); 키모스타틴(Tomkinsonet al. Biochem J. 286:475-480, 1992); β-사이클로덱스트린 테트라데카설페이트; 에포네마이신; 캄프토테신; 푸마길린(Ingberet al., Nature 348:555-557, 1990); 골드 소듐 티오말레이트("GST"; Matsubara and Ziff,J. Clin. Invest. 79:1440-1446, 1987); β-1-안티콜라게나제-혈청; α2-안티플라스민(Holmeset al., J. Biol. Chem.262(4):1659-1664, 1987); 비산트렌(National Cancer Institute); 로벤자리트 디소듐 (N-(2)-카르복시페닐-4-클로로안트로닐산 디소듐 또는 "CCA"; Takeuchiet al., Agents Actions 36:312-316, 1992); 탈리도마이드; 아고스타틱 스테로이드; AGM-1470; 카르복신아미노이미다졸; 및 BB 94와 같은 메탈로프로테이나제 억제제 등이 있다.
진단 방법
본 발명은 또한 진단 시약 용도로서 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것에 관한 것이다. 기능 부전에 관여하는 METH1 또는 METH2 유전자의 돌연변이 형성을 검출하기 위한 진단 도구가 제공될 것인데, 이는 METH1 또는 METH2의 소-발현(under-expression), 과발현(overexpression) 또는 변형된 발현으로부터 초래되는 질병에 대한 감수성 또는 질병의 진단을 정의하거나 그에 부가될 수 있다. METH1 또는 METH2 유전자에 돌연 변이를 갖는 개체는 다양한 기술을 이용해서 DNA 수준에서 검출할 수 있다.
진단용 핵산은 피검체의 세포, 예를 들어, 혈액, 소변, 타액, 생체 조직 또는 검시 물질에서 얻을 수 있다. 게놈 DNA를 검측에 직접 사용하거나, 분석 전에 PCR 또는 기타 증폭 기술을 사용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. 또한, 유사한 방식으로 RNA 또는 cDNA를 사용할 수 있다. 증폭 생성물의 크기 변화를 정상 게놈 타입과 비교하여 삭제(deletion) 및 삽입(insertion)을 검측할 수 있다. 증폭된 DNA와 표지된 METH1 또는 METH2 뉴클레오타이드 서열을 하이브리드화시킴으로써 점 돌연변이를 동정할 수 있다. RNase 소화에 의하여 또는 용융 온도차에 의하여, 완전하게 매치된 서열을 미스매치된 듀플렉스와 구별할 수 있다. DNA 서열 차이는 또한 변성제(denaturing agent)를 사용하거나 사용하지 않는 전기 영동에 있어서, 겔 중의 DNA 단편의 전기 영동 이동성의 변화에 의하여 검출하거나, 또는 직접적인 DNA 시퀀싱에 의해서 검출할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Myerset al., Science 230:1242(1985)]을 참조하라. 특정 위치에 있어서의 서열 변화는 또한 뉴클레아제 보호 분석법, 예를 들어, RNase 및 S1 보호 또는 화학적 개열(cleavage) 방법에 의하여 드러날 수 있다. 문헌[Cottonet. al., Proc Natl Acad Sci USA 85:4397-4401(1985)]을 참조하라. 또 다른 실시 태양에 있어서, METH1 또는 METH2 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브의 어레이 (array)은 예를 들어, 유전적 돌연변이의 효율적 스크리닝을 통해서 구성할 수 있다. 어레이 기술 방법(array technology method)은 주지되어 있고, 일반적인 적용성을 가지고 있으며, 유전자 발현, 유전자 결합 및 유전자 변이성을 비롯한 분자 유전학에 있어서의 제문제들을 설명하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[M. Cheeet al., Science 274:610-613(1996)]을 참조하라.
진단 분석법은 기술된 방법에 의하여 METH1 또는 METH2 유전자에 있어서의 돌연변이 검출을 통한, 혈관 신생 질병[암, 암 전이, 만성 염증 장애, 류마티스 관절염, 죽상경화증(altherosclerosis), 황반 변성, 당뇨병성 망막병증], 재협착증, 알츠하이머병 및 조직 개편(tissue remodeling)에 대한 감수성을 진단 또는 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 혈관 신생 질병[암, 암 전이, 만성 염증 장애, 류마티스 관절염, 죽상경화증(altherosclerosis), 황반 변성, 당뇨병성 망막병증], 재협착증, 알츠하이머병 및 조직 개편(tissue remodeling)은 피검체에서 유래한 샘플에서 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 METH1 또는 METH2 mRNA 농도의 비정상적 감소 또는 증가를 검출하는 단계를 포함하는 방법으로 진단할 수 있다. 감소 또는 증가된 발현은 당업계에 주지된 임의의 폴리뉴클레오티드 정량 방법을 사용하여 RNA 농도로 측정할 수 있는데, 상기 방법의 예로는, 예를 들어, PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블롯팅(Northern blotting) 및 기타 하이브리드화 방법 등이 있다. 숙주에서 유래한 샘플 중의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드와 같은 단백질의 농도를 측정하는데 사용할 수 있는 분석 기법은 당업계에 주지되어 있다. 그러한 분석 방법으로는 방사면역 분석법, 경쟁-결합 분석법, 웨스턴 블롯 분석법(Western Blot analysis) 및 ELISA 분석법 등이 있다.
암 진단 및 예후
암에 걸린 포유 동물의 특정 조직은, 상응하는 "표준" 포유 동물, 즉, 암에 걸리지 않은 동종의 포유 동물과 비교하였을 때, METH1 또는 METH2 단백질을 암호화하는 mRNA 및 METH1 또는 METH2 단백질의 농도가 상당히 감소되어 있다고 믿어진다. 또한, METH1 또는 METH2 단백질의 감소된 농도는 암에 걸린 포유 동물에서 얻어진 일정 체액(예, 혈청, 혈장, 소변 및 척수액)을 암에 걸리지 않은 동종의 포유 동물에서 얻어진 혈청과 비교하여 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 종양 진단 과정 중에 유용한 진단 방법으로서, 포유 동물 세포 또는 체액 중의 METH1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 농도를 분석하고, 표준 METH1 유전자 발현 농도와 상기 유전자 발현 농도를 비교함에 의하여 상기 표준 이하로의 유전자 발현 농도의 감소는 특정 종양을 지시하는 것임을 나타내는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 종양 진단 과정 중에 유용한 진단 방법으로서, 포유 동물 세포 또는 체액 중의 METH2 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 농도를 분석하고, 표준 METH2 유전자 발현 농도와 상기 유전자 발현 농도를 비교함에 의하여 상기 표준 이하로의 유전자 발현 농도의 감소는 일정 종양을 지시하는 것임을 나타내는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
종래 방법에 따른 종양 진단이 이미 행해진 경우에, 본 발명은 예후 지시자로서 유용하다. 감소된 METH1 또는 METH2 유전자 발현을 나타내는 환자는 더 낮은 농도의 유전자를 발현시키는 환자에 비하여 더 나쁜 임상적 결과를 나타낼 것이다.
"METH1 또는 METH2 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 농도 분석"은 제1 생물학적 샘플 중의 METH1 또는 METH2 단백질의 농도, 또는 METH1 또는 METH2를 암호화하는 mRNA의 농도를 직접적으로(예, 완전 단백질 농도 또는 mRNA 농도를 측정 또는 평가함으로써) 또는 상대적으로(예, 제2 생물학적 샘플 중의 METH1 또는 METH2 단백질 농도 또는 mRNA 농도를 비교함으로써) 정성 또는 정량적으로 측정 또는 평가한다는 의도이다.
제1 생물학적 샘플 중의 METH1 또는 METH2 단백질의 농도 또는 mRNA의 농도를 측정 또는 평가하고, 암에 걸리지 않은 개체에서 얻은 제2 생물학적 샘플에서 취한 표준 METH1 또는 METH2 단백질의 농도 또는 mRNA의 농도와 비교하는 것이 바람직하다. 당업계에서 이해되고 있는 바와 같이, 일단 표준 METH1 또는 METH2 단백질의 농도 또는 mRNA의 농도가 공지되면, 그것은 비교에 대한 표준으로서 반복해서 사용할 수 있다.
"생물학적 샘플"이라는 용어는 개체, 세포주, 조직 배양물, 또는 METH1 또는 METH2 단백질 또는 mRNA를 함유하는 기타 소스에서 얻어진 임의의 생물학적 샘플을 의도하는 것이다. 생물학적 샘플에는 분비된 성숙 METH1 또는 METH2 단백질을 포함하는 포유 동물 체액(예를 들어, 혈청, 혈장, 소변, 윤활액 및 척수액), 및 부신 조직, 갑상선 조직, 위 조직, 뇌 조직, 심장 조직, 태반 조직, 폐 조직, 간 조직, 근육 조직, 신장 조직, 췌장 조직, 고환 조직 및 난소 조직(METH1에 대한 것임);및 전립선 조직, 소장 조직, 결장 조직, 뇌 조직 및 폐 조직(METH2에 대한 것임) 등이 있다.
본 발명은 포유 동물의 암을 검출하는데 유용하다. 특히, 본 발명은 포유 동물의 하기 유형의 암을 진단하는데 유용하다: 유방암, 난소암, 전립선암, 간암, 폐암, 췌장암, 결장암 및 고환암. 바람직한 포유 동물로는 멍키(monkey), 에이프(ape), 고양이, 개, 소, 피그, 말, 토끼 및 사람이 있다. 사람이 특히 바람직하다.
문헌[Chomczynski and Sacchi.Anal. Biochem. 162:156-159(1987)]에 기술되어 있는 단일-단계 구아니디늄-티오시아네이트-페놀-클로로포름 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 총 세포 RNA를 분리할 수 있다. 그 후, 적절한 임의의 방법을 사용하여 METH1 또는 METH2 단백질을 암호화하는 mRNA의 농도를 분석한다. 이에는 노던 블롯 분석법[Haradaet al., Cell 63:303-312(1990)], S1 뉴클레아제 맵핑[Fujitaet al., Cell 49:357-367(1987)], 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 폴리머라제 연쇄 반응과 조합된 역전사 반응(RT-PCR)[Makino et al., Technique 2:295-301(1990)], 및 리가아제 연쇄 반응과 조합된 역전사 반응(RT-LCR) 등이 있다.
생물학적 샘플 중의 METH1 또는 METH2 단백질 농도 분석은 항체-기초(antibody-based) 기술을 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 조직에서의 METH1 또는 METH2 단백질 발현은 전통적인 면역조직학적 방법으로 연구할 수 있다[Jalkanen, M.,et al., J. Cell. Biol. 101:976-985(1985); Jalkanen, M.,et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096(1987)].
METH1 또는 METH2 단백질 유전자 발현을 검출하기 위한 유용한 기타 항체-기초 방법으로는 면역 분석법, 예를 들어, 효소 결합 면역흡수제(immunosorbent) 분석법(ELISA) 및 방사면역분석법(RIA) 등이 있다.
적당한 표지는 당업계에 공지되어 있으며, 이에는 효소 표지, 예를 들어, 글루코스 옥시다아제, 및 방사성 동위 원소, 예를 들어, 요오드(125I,121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(112In), 및 테크네튬(99mTc), 및 형광 표지, 예를 들어, 플루오레세인 및 로다민, 비오틴 등이 있다.
백신
본 발명의 또 다른 실시 태양은 포유 동물의 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 혈관 신생 질병[암, 암 전이, 만성 염증 장애, 류마티스 관절염, 죽상경화증(altherosclerosis), 황반 변성, 당뇨병성 망막병증], 재협착증, 알츠하이머병 및 조직 개편(tissue remodeling) 등으로부터 포유 동물을 보호하기 위한 적절한 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 유도하기 위하여 상기 포유 동물에 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 그 단편을 접종하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 실시 태양은 포유 동물의 면역학적 반응을 유도하는 방법으로서, 질병으로부터 상기 포유 동물을 보호하기 위하여 항체를 생성시키는 면역학적 반응과 같은 반응을 유도하기 위하여 생체내에서 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 벡터를 경유하여 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 송달하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시 태양은, 포유 동물 호스트에 도입될 때, METH1 또는 METH2 폴리펩티드로 그 포유 동물의 면역 반응을 유도하는 면역학적/백신 제제(조성물)에 관한 것으로서, METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 METH1 또는 METH2 유전자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 백신 제제는 추가로 적당한 담체를 포함할 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 위에서 분해될 수 있기 때문에, 그것은 비경구적으로 투여(예, 피하 주사, 근육내 주사, 정맥내 주사, 피내 주사 등)되는 것이 바람직하다. 비경구적 투여를 위한 적당한 제제로는 항산화제, 완충액, 세균 발육 저지제 및 수령체(recipient)의 혈액과 등장의 제제로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 현탁제 또는 농조화제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액 등이 있다. 제제는 단일-투여 용기 또는 다중-투여 용기, 예를 들어, 밀봉 앰풀 및 바이알로 제공할 수 있고, 사용 직전에 단지 멸균 액체 담체를 첨가할 것만을 요하는 동결-건조 조건에서 저장할 수도 있다. 백신 제제는 또한 제제의 면역원성을 향상시키기 위한 보조 시스템, 예를 들어, 수중유 시스템 및 기타 당업계에 공지된 시스템을 포함할 수 있다. 투여량은 백신의 특이적 활성에 따라 달라질 것이나, 통상적인 실험에 의하여 용이하게 결정할 수 있다.
투여 모드
혈관 공급 증가가 종양 진행 및 전이에 있어서 중심적 역할을 하는 것으로 인식되어 있으며; 따라서, 혈관 신생 억제제는 암 환자에 대한 보조 치료제로서 유효한 것으로 입증될 수 있다. 현재 알려진 혈관 신생 억제자의 일부는 심각한 부작용으로 인하여 전신적 치료에 있어서 좋지 않은 후보자이다. 본 발명자들은 METH1 또는 METH2가 생체외 및 생체내 양자 모두에서 강력한 혈관 신생 억제제라는 것을 밝혀냈다. METH1 또는 METH2의 이점은 이들 억제제가 생리학적 혈관 신생 억제에 정상적으로 관여하고; 따라서, 이들은 다른 혈관 신생 억제제에 비하여 내피 특이성과 독성이 없다는 것이다. 또한, METH1 또는 METH2는 기관 특이성에 대한 가능한 이점을 제공하는 제한된 발현 패턴을 제공한다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 암을 치료하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 사용하여 비정상적 창상 치료, 염증, 류마티스 관절염, 건선, 자궁내막 출혈 장애, 당뇨병성 망막병증, 황반변성의 일정 형태, 혈관종 및 동정맥 기형을 비롯한 혈관 신생과 관련된 기타 장애를 가지고 있는 개체를 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명은 개체에 있어서 혈관 신생을 억제하는 방법으로서, 그러한 개체에 있어서 METH1 활성을 증가시키기에 유효한, 본 발명의 분리된 METH1 폴리펩티드 유효량을 포함하는 약학 조성물을 그러한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 개체에 있어서 혈관 신생을 억제하는 방법으로서, 그러한 개체에 있어서 METH2 활성을 증가시키기에 유효한, 본 발명의 분리된 METH2 폴리펩티드 유효량을 포함하는 약학 조성물을 그러한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
이러한 방법으로 혈관 신생을 억제하는데 사용할 수 있는 METH1 폴리펩티드로는 리더(leader)를 포함하는 부착 cDNA에 의하여 암호화되는 METH1 폴리펩티드;부착 cDNA 마이너스 리더에 의하여 암호화되는 성숙 METH1 폴리펩티드(즉, 성숙 단백질); SEQ ID NO:2에서 약 1 내지 약 950의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 약 2 내지 약 950의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 약 29 내지 약 950의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 약 30 내지 약 950의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 235 내지 459의 아미노산, METH1의 메탈로프로테아제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 460 내지 544의 아미노산, METH1의 디스인테그린 도메인(disintegrin domain)을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 545 내지 598의 아미노산, METH1의 제1 TSP-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 841 내지 894의 아미노산, METH1의 제2 TSP-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 895 내지 934의 아미노산, METH1의 제3 TSP-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 536 내지 613의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 549 내지 563의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2에서 542 내지 894의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; 및 SEQ ID NO:2에서 801 내지 950의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 등이 있다.
상기 방법으로 혈관 신생을 억제하는데 사용할 수 있는 METH2 폴리펩티드로는 리더(leader)를 포함하는 부착 cDNA에 의하여 암호화되는 METH2 폴리펩티드; 부착 cDNA 마이너스 리더에 의하여 암호화되는 성숙 METH2 폴리펩티드(즉, 성숙 단백질); SEQ ID NO:4에서 약 1 내지 약 890의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:4에서 약 2 내지 약 890의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:4에서 약 24 내지 약 890의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:4에서 약 112 내지 약 890의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:4에서 214 내지 439의 아미노산, METH2의 메탈로프로테아제 도메인을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:4에서 440 내지 529의 아미노산, METH2의 디스인테그린 도메인을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:4에서 530 내지 583의 아미노산, METH2의 제1 TSP-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:4에서 837 내지 890의 아미노산, METH2의 제2 TSP-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:4에서 280 내지 606의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; 및 SEQ ID NO:4에서 529 내지 548의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 등이 있다.
또한, TSP3 결핍 METH1 또는 METH2 단백질; TSP2 및 TSP3 결핍 METH1 또는 METH2 단백질; TSP3, TSP2 및 TSP1 결핍 METH1 또는 METH2 단백질; 시스테인-리치 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3 결핍 METH1 또는 METH2 단백질; 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인-리치 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3 결핍 METH1 또는 METH2 단백질; 및 프로도메인(prodomain), 메탈로프로테아제 도메인, 시스테인-리치 도메인, TSP1, TSP2 및 TSP3 결핍 METH1 또는 METH2 단백질 등도 포함된다. 마직막으로, 이들 도메인의 어떠한 조합도 바람직하다. 예를 들어, METH1의 시스테인-리치 도메인은 METH1의 1, 2 또는 3 TSP 도메인과 조합될 수 있다. METH2의 시스테인-리치 도메인은 METH2의 1, 2 또는 3 TSP 도메인과 조합될 수 있다. METH1의 시스테인-리치 도메인 및 메탈로프로테아제 도메인은 METH1의 1, 2 또는 3 TSP 도메인과 조합될 수 있다. METH2의 시스테인-리치 도메인 및 메탈로프로테아제 도메인은METH2의 1, 2 또는 3 TSP 도메인과 조합될 수 있다. METH1의 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인-리치 도메인은 METH1의 1, 2 또는 3 TSP 도메인과 조합될 수 있다. METH2의 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인-리치 도메인은 METH2의 1, 2 또는 3 TSP 도메인과 조합될 수 있다. METH1의 신호 서열(signal sequence), 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인-리치 도메인은 METH1의 1, 2 또는 3 TSP 도메인과 조합될 수 있다. METH2의 신호 서열, 프로도메인, 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인-리치 도메인은 METH2의 1, 2 또는 3 TSP 도메인과 조합될 수 있다.
일반적인 제안에 있어서, 투여량 당 비경구 투여되는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 총 약학 유효량은 환자 체중 당 약 1μ/kg/일 내지 10㎎/kg/일 범위일 것이다. 다만, 이는 치료 재량일 것이다. 상기 투여량은 0.01㎎/kg/일 이상인 것이 더욱 바람직하며, 인간에 대해서는 상기 폴리펩티드 약 0.01 내지 1㎎/kg/일인 것이 가장 바람직하다. 연속적으로 주어진다면, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 통상 1일당 1 내지 4번의 주사에 의하여 또는 예를 들어, 미니-펌프를 사용하는 연속 피하 주입에 의하여 약 1μ/kg/시간 내지 약 50μ/kg/시간의 투여량 비율로 투여될 것이다. 정맥내 백 용액(intravenous bag solution)을 사용할 수도 있다.
본 발명의 METH1 또는 METH2를 포함하는 약학 조성물은 경구 투여, 직장 투여, 비경구 투여, 조내(intracistemally) 투여, 초내(intravaginally) 투여, 복막내 투여, 국소 투여(예를 들어, 분말, 연고, 점적제 또는 경피 패치를 통하여), 구강(bucally) 투여, 경구 스프레이 투여 또는 비강 스프레이 투여할 수 있다. "약학적 허용 담체"는 물질 또는 제제화 보조제를 캡슐화하는 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충진제, 희석제 등을 의미한다. 본 명세서에서 사용한 "비경구"라는 용어는 정맥내, 근육내, 복막내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입 등을 포함하는 투여 모드를 의미한다.
유전자 치료 방법
본 발명의 또 다른 실시 태양은 장애, 질병 및 증상을 치료하기 위한 유전자 치료 방법에 관한 것이다. 유전자 치료 방법은 핵산(DNA, RNA 및 안티센스 DNA 또는 RNA) 서열을 동물에게 도입하여 본 발명의 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드의 발현을 달성하는 것에 관한 것이다. 상기 방법은 프로모터에 효과적으로 결합하는 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드 및 표적 조직에 의한 폴리펩티드 발현에 필요한 기타 유전 요소를 요한다. 그러한 유전자 치료 및 송달 기법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 WO 90/11092를 참조하라.
따라서, 예를 들어, 생체외에서 조작에 의해서 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드에 결합될 수 있는 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 사용하여 환자에게서 채취한 세포를 조작한 후, 그 조작된 세포를 상기 폴리펩티드로 치료할 환자에게 제공할 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고 문허으로 포함되어 있는 문헌들[Belldegrum, A.,et al., J. Natl. Cancer Inst. 85:207-216(1993)]; Ferrantini, M.et al., Cancer Research 53:1107-1112(1993); Ferrantini, M.et al., J. Immunology 153:4604-4615(1994); Kaido, T.,et al. Int. J. Cancer 60:221-229(1995); Ogura, H.,et al., Cancer Research 50:5102-5106(1990); Santodonato, L.,et al., Human Gene Therapy 7:1-10(1996); Santodonato, L.,et al., Gene Therapy 4:1246-1255(1997); 및 Zhang, J. F.et al., Cancer Gene Therapy 3:31-38(1996)]을 참조하라. 하나의 실시 태양에 있어서, 조작되는 세포들은 동맥 세포이다. 상기 동맥 세포는 동맥에 직접 주사하거나, 동맥 주위의 조직에 주사하거나, 또는 카테터 주사 등을 통하여 환자에게 재도입시킬 수 있다.
이하에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물은 동물 세포에게 주사 물질을 송달하는 임의의 방법, 예를 들어, 조직(심장, 근육, 피부, 폐, 간 등) 사이내 주사에 의하여 송달할 수 있다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물은 약학적 허용 액체 또는 수성 담체를 이용하여 송달할 수 있다.
하나의 실시 태양에 있어서, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 그대로(naked) 송달한다. 폴리뉴클레오티드, DNA 또는 RNA "그대로(naked)"라는 용어는 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포솜 제제, 리포펙틴 또는 침전제 등의 세포내 도입을 보조, 촉진 또는 용이화하는 작용을 하는 임의의 송달 비히클이 없는 서열을 의미한다. 그러나, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 주지된 방법에 따라 제조할 수 있는 리포솜 제제 및 리포펙틴 제제 등으로 송달할 수도 있다. 상기 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,593,972호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호에 기술되어 있는데, 이들 문헌은본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
유전자 치료 방법에서 사용되는 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 벡터 작제물은 숙주 게놈내로 인테그레이트되지 않으며, 그들이 복제할 수 있는 서열을 함유하고 있지 않은 작제물인 것이 바람직하다. 적당한 벡터로는 스트라타젠(Stratagene)에서 구입할 수 있는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 파마시아(Pharmacia)에서 구입할 수 있는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL; 및 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입할 수 있는 pEF1/V5, pcDNA3.1 및 pRc/CMV2 등이 있다. 기타 적당한 벡터는 당업자에게 매우 명백하다.
당업계에 공지되어 있는 임의의 강력한 프로모터를 사용하여 METH1 및/또는 METH2 DNA의 발현을 유도할 수 있다. 적당한 프로모터로는 아데노바이러스 프로모터, 예를 들어, 아데노바이러스 메이져 레이트 프로모터(adenoviral major late promoter); 또는 이종 프로모터, 예를 들어, 세포확대바이러스(CMV) 프로모터; 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 프로모터; 유도 프로모터, 예를 들어, MMT 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터; 열 쇼크 프로모터; 알부민 프로모터; 아포AI(ApoAI) 프로모터; 인간 글로빈 프로모터; 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나아제 프로모터; 레트로바이러스 LTRs; b-액틴 프로모터; 및 인간 성장 호르몬 프로모터 등이 있다. 프로모터는 METH1 및/또는 METH2에 대한 선천적 프로모터일 수도 있다.
다른 유전자 치료 방법과 달리, 표적 세포에 핵산 서열 그 자체를 도입할 때의 한 주요 이점은 그 세포의 폴리뉴클레오티드 합성의 일과성(transiatorynature)이다. 연구들은 비-복제 DNA 서열을 세포내로 도입시킴으로써 6개월 이하의 기간 동안 목적 폴리펩티드의 생성을 제공할 수 있음을 보여준다.
METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물은 동물 내 조직, 예를 들어, 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 지라, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담즙낭, 위, 장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 내분비선 및 결합 조직 등 사이의 공간으로 송달될 수 있다. 조직 사이의 공간은 세포내액, 기관 조직의 망상 섬유 중의 점다당질 매트릭스, 혈관 또는 챔버 벽의 탄성 섬유, 섬유상 조직의 콜라겐 섬유, 또는 골소강내 또는 근육 세포를 덮어싸는 결합 조직 내의 그와 동일한 매트릭스를 포함한다. 그것은 순환 혈장 및 림프 채널의 림프액에 의하여 유사하게 점유된 공간이다. 근육 조직 사이의 공간에 송달하는 것이 이하의 이유 때문에 바람직하다. 그들은 이들 세포를 포함하는 조직내로 주사에 의하여 편리하게 송달될 수 있다. 송달 및 발현이 미-분화 또는 덜 완전하게 분화된 세포, 예를 들어, 혈액 또는 피부 섬유 아세포의 줄기 세포에서 달성될 수 있지만, 그들은 분화된 비-분할 세포내로 바람직하게 송달되어 계속적으로 발현된다. 생체내에서 근육 세포는 폴리뉴클레오티드를 취해서 발현시킬 수 있는 능력이 특히 우수하다.
산 서열 그대로를 주사하는 경우에, DNA 또는 RNA의 유효 투여량은 약 0.05 mg/체중kg 내지 약 50mg/체중kg의 범위일 것이다. 바람직한 투여량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 20mg/kg이고, 더욱 바람직한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 5mg/kg이다. 물론, 당업자는 이러한 투여량이 주사하는 조직 부위에 따라 변할 것이라는 것을 이해할 것이다. 핵산 서열의 적당한 유효 투여량은 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 치료할 증상 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다.
바람직한 투여 경로는 조직 사이의 공간으로 주사하는 비경구 투여 경로이다. 그러나, 기타 비경구 경로, 예를 들어, 특히 폐 또는 기관지 조직, 목구멍 또는 코의 점막에 송달하기 위한 에어로졸 제제의 흡입 방법을 사용할 수도 있다. 또한, METH1 및/또는 METH2 DNA 작제물은 그 과정에서 사용하는 카테터에 의하여 혈관성형술 중에 동맥으로 송달될 수 있다.
그대로의 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 송달할 수 있는데, 그 방법에는 송달 부위에 직접 바늘로 주사하는 방법, 정맥내 주사 방법, 국소 투여 방법, 카테터 주입 방법, 및 소위 "유전자 총(gene gun)" 방법 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 송달 방법은 당업계에 공지되어 있다.
상기 작제물들은 예를 들어, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포솜 제제, 리포펙틴, 침전제 등과 같은 송달 비히클을 사용하여 송달할 수도 있다. 그러한 송달 방법은 당업계에 공지되어 있다.
특정 실시 태양에 있어서, METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물을 리포솜 제제와 복합체화 시킨다. 본 발명에서 사용하기 위한 리포솜 제제에는 양이온성, 음이온성 및 중성 제제가 있다. 그러나, 양이온성 리포솜이 특히 바람직하다. 이는 양이온성 리포솜과 폴리음이온성 핵산 사이에 단단한 하전 복합체가 형성될 수 있기 때문이다. 양이온성 리포솜은 기능적 형태로서, 플라스미드 DNA[Felgneret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1987) 84:7413-7416, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]; mRNA[Maloneet al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1989) 86:6077-6081, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]; 및 정제된 전사 인자[Debset al., J. Biol. Chem.(1990) 265: 10189-10192, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]의 세포내 송달을 매개하는 것으로 밝혀졌다.
양이온성 리포솜은 용이하게 구입할 수 있다. 예를 들어, N[1-2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리에틸암모늄 (DOTMA) 리포솜이 특히 유용하며, 이는 GIBCO BRL(Grand Island, N.Y.)에서 Lipofectin이라는 상표명으로 구입할 수 있다. [또한, Felgner et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416을 참조하라. 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]. 기타 시판되고 있는 리포솜으로는 트랜스펙타스(transfectace)(DDAB/DOPE) 및 DOTAP/DOPE(Boehringer)가 있다.
기타 양이온성 리포솜은 당업계에 주지된 기술을 사용하여 용이하게 입수할 수 있는 물질로부터 제조할 수 있다. 예를 들어, DOTAP(1,2-비스 (올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판) 리포솜의 합성 방법을 기술하고 있는 PCT 공개 No. WO 90/11092(이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)을 참조하라. DOTMA 리포솜의 제조 방법은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되어 있는 문헌[P. Felgneret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:7413-7417]에 기술되어 있다. 유사한 방법을 사용하여 기타 양이온성 지질 물질로부터 리포솜을 제조할 수 있다.
유사하게, 음이온성 리포솜 및 중성 리포솜은 Avanti Polar Lipids (Birmingham, Ala.)로 부터와 같이 용이하게 입수할 수 있으며, 또한 용이하게 입수할 수 있는 물질로부터 용이하게 제조할 수 있다. 그러한 물질로는 포스파티딜, 콜린, 콜레스테롤, 포스파티딜, 에탄올아민, 디올레오일포스파티딜 콜린(DOPC), 디올레오일포스파티딜 글리세롤(DOPG), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE) 등이 있다. 이들 물질은 또한, DOTMA 및 DOTAP 출발 물질과 적당한 비율로 혼합시킬 수도 있다. 이들 물질을 사용하여 리포솜을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, 시판 디올레오올포스파티딜 콜린(DOPC), 디올레오일포스파티딜 글리세롤(DOPG), 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE)을 다양한 조합으로 사용하여 (콜레스테롤을 첨가하거나 첨가하지 않고), 통상의 리포솜을 제조할 수 있다. 따라서, 예를 들어, DOPG/DOPC 비히클은 초음파 처리 바이알내 질소 가스의 스트림 하에서 DOPG 및 DOPC 각 50mg을 건조시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 샘플을 밤새도록 진공 펌핑하고, 그 다음날 탈이온수로 수화시킨다. 그 후, 배쓰 (bath)를 15EC로 순환시키면서 최고 셋팅에서 반대 컵(inverted cup)(배쓰 타입) 프로브가 장착된 가열 시스템 모델 350 초음파 처리기(Heat Systems model 350 sonicator)을 사용하여 캡이 있는 바이알에서 상기 샘플을 2시간 동안 초음파 처리한다. 대안적으로, 음전하 소포를 초음파 처리 없이 제조하여, 다층판(multilamellar) 소포를 생성시킬 수 있다. 또는, 음전하 소포를 핵공극(nucleopore) 막을 통하여 압출시켜 제조함으로써, 분리된 크기의 단위판(unilamellar) 소포를 제조할 수 있다. 기타 방법은 당업계에 공지되어 있고, 당업자가 이용할 수 있다.
리포솜은 다층판 소포(MLVs), 소형 단위판 소포(SUVs), 또는 대형 단위판 소포(LUVs)를 포함할 수 있고, SUVs를 포함하는 것이 바람직하다. 당업계에 공지된방법을 사용하여 다양한 리포솜-핵산 복합체를 제조한다. 예를 들어, 문헌[Straubingeret al., Methods of Immunology(1983), 101:512-527, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]을 참조하라. 예를 들어, 핵산을 포함하는 MLVs는 유리관의 벽에 인지질의 박막을 부착시킨 후, 캡슐화시킬 물질의 용액으로 수화시킴으로써 제조할 수 있다. MLVs의 연장된 초음파 처리에 의하여 SUVs를 제조하여 단위판 리포솜의 동종 집단을 생성시킨다. 취해질 물질을 미리 형성된 MLVs의 현탁액에 첨가한 후, 초음파 처리한다. 양이온성 지질을 포함하는 리포솜을 사용하는 경우에, 건조 지질 막을 멸균수와 같은 적당한 용액 또는 10 mM Tris/NaCl과 같은 등장 완충액에 재현탁시키고, 초음파 처리한 후, 미리 형성된 리포솜을 DNA와 직접 혼합한다. 양으로 하전된 리포솜이 양이온성 DNA에 결합하기 때문에, 리포솜과 DNA는 매우 안정한 복합체를 형성한다. SUVs는 소형 핵산 단편과 사용한다. LUVs는 당업계에 공지된 다수의 방법으로 제조한다. 통상 사용하는 방법에는 Ca2+-EDTA 킬레이트화법[Papahadjopouloset al., Biochim. Biophys. Acta(1975) 394:483; Wilsonet al., Cell(1979) 17:77); 에테르 주사법[Deamer, D. and Bangham, A.,Biochim. Biophys. Acta(1976) 443:629; Ostroet al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1977) 76:836; Fraleyet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1979) 76:3348]; 세제 투석법[Enoch, H. and Strittmatter, P.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1979) 76:145]; 및 역상(reverse-phase) 증발법(REV)[Fraleyet al., J. Biol. Chem.(1980) 255:10431; Szoka, F. and Papahadjopoulos, D.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1978) 75:145]; Schaefer-Ridderet al., Science(1982) 215:166] 등이 있다. 상기에서 언급된 문헌들은 모두 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
일반적으로, DNA 대 리포솜의 비율은 약 10:1 내지 약 1:10일 것이다. 상기 비율은 약 5:1 내지 약 1:5인 것이 바람직할 것이다. 상기 비율은 약 3:1 내지 약 1:3인 것이 더욱 바람직할 것이다. 상기 비율은 약 1:1인 것이 더욱 더 바람직할 것이다.
미국 특허 제5,676,954호(이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)는 양이온성 리포솜 담체와 복합체화된 유전 물질을 마우스에 주사하는 것에 대하여 보고하고 있다. 미국 특허 제4,897,355호, 제4,946,787호, 제5,049,386호, 제5,459,127호, 제5,589,466호, 제5,693,622호, 제5,580,859호, 제5,703,055호 및 국제 공제 No. WO 94/29469호(이들은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)는 DNA를 세포 및 포유 동물내로 형질 전환시키는데 사용하는 양이온성 지질에 대하여 공개한다. 미국 특허 제5,589,466호, 제5,693,622호, 제5,580,859호, 제5,703,055호, 및 국제 공개 No. WO 94/29469(이들은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)는 DNA-양이온성 지질 복합체를 포유 동물에 송달하는 방법을 제공한다.
특정 실시 태양에 있어서, METH1 및/또는 METH2를 암호화하는 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 레트로바이러스 입자를 사용하여 생체내 또는 생체외에서 세포를 조작한다. 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유도될 수 있는 레트로바이러스로는 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus), 지라 탈저 바이러스(spleen necrosis virus), 루스 육종 바이러스(Rous sarcoma Virus), 하비 육종 바이러스(Harvey Sacoma Virus), 조류 백혈증 바이러스(avian leukosis virus), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), 인간 면역결핍증 바이러스, 골수증식 육종 바이러스(Myeloproliferative Sarcoma Virus) 및 포유 동물 종양 바이러스 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
레트로바이러스 플라스미드 벡터를 사용하여 팩키징 세포주(packaging cell line)를 형질 도입함으로써 프로듀서 세포주(producer cell line)를 형성시킨다. 형질 전환될 수 있는 패키징 세포주의 예로는 PE501, PA317, R-2, R-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 및 Miller의 문헌[Human Gene Therapy1:5-14(1990), 이는 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]에 기재되어 있는 DAN 세포주 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해서 팩키징 세포를 형질 도입시킬 수 있다. 그러한 수단에는 전기 천공법(electroporation), 리포솜 사용법 및 CaPO4침전법 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대안적 실시 태양에 있어서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 리포솜내로 캡슐화되거나, 지질과 커플링된 후, 숙주에게 투여될 수 있다.
프로듀서 세포주는 METH1 및/또는 METH2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전염성 레트로바일스 벡터 입자를 생성한다. 그 후, 그러한 레트로바이러스 벡터 입자를 사용하여 진핵 세포를 생체내 또는 생체외에서 형질도입시킬 수있다. 형질 도입 진핵 세포는 METH1 및/또는 METH2를 발현시킬 것이다.
기타 특정 실시 태양에 있어서, 생체내 또는 생체외에서 세포들을 아데노바이러스 벡터내에 함유되어 있는 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드로 조작한다. 아데노바이러스는 METH1 및/또는 METH2를 암호화하고 발현시키도록 조작될 것이며, 동시에 정상 라이틱(lytic) 바이러스 생존 주기에서의 그 복제 능력이 불활성화된다. 숙주 세포 염색체 내로 바이러스 DNA를 인테그레이션시키지 않고 아데노바이러스를 발현시킴으로써, 삽입 혈관 신생에 대한 우려를 감소시킨다. 또한, 아데노바이러스는 다년간 탁월한 안정성 프로파일을 가지고 생존 장 백신(live enteric vaccine)으로 사용되어 왔다[Schwartz, A. R.et al.(1974)Am. Rev. Respir. Dis. 109:233-238]. 마직막으로, 아데노바이러스 매개 유전자 형질 전환은 코튼 랫트(cotton rat)의 폐에 알파-1-항트립신 및 CFTR을 형질 전환시키는 것을 비롯하여 다수의 예에서 증명되어 있다[Rosenfeld, M. A.et al. (1991)Science 252:431-434; Rosenfeldet al., (1992)Cell68:143-155]. 또한, 인간 암의 원인 병원체로서 아데노바이러스를 평가하려는 시도에 대한 광범위한 연구는 한결같이 부정적이었다[Green, M.et al. (1979)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:6606].
본 발명에 사용할 수 있는 적당한 아데노바이러스 벡터는 문헌들[예를 들어, Kozarsky and Wilson,Curr. Opin. Genet. Devel.3:499-503(1993); Rosenfeldet al., Cell 68:143-155(1992); Engelhardtet al., Human Genet. Ther. 4:759-769(1993); Yang et al., Nature Genet. 7:362-369(1994); Wilsonet al., Nature365:691-692(1993); 및 미국 특허 제5,652,224호, 이들은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]에 기술되어 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 Ad2가 유용하고, 인간 293 세포에서 성장시킬 수 있다. 이들 세포는 아데노바이러스의 E1 영역을 함유하며, 상기 벡터에서 삭제된 유전자 생성물을 제공함으로써 결핍 아데노바이러스를 보충하는 Ela 및 Elb를 구성적으로 발현시킨다. Ad2에 더하여, 기타 아데노바이러스의 변종들(예, Ad3, Ad5 및 Ad7)을 또한 본 발명에서 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 아데노바이러스는 복제 결핍인 것이 바람직하다. 복제 결핍 아데노바이러스는 감염 입자를 형성하기 위하여 헬퍼 바이러스(helper virus) 및/또는 팩키징 세포주의 도움을 요한다. 생성 바이러스는 세포를 감염시킬 수 있고, 프로모터에 작용적으로 결합되는 당해 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있으나, 대부분의 세포에서 복제할 수 없다. 복제 결핍 아데노바이러스는 다음 유전자 하나 이상이 전부 또는 부분적으로 삭제될 것이다: Ela, Elb, E3, E4, E2a 또는 L1 내지 L5.
특정 다른 실시 태양에 있어서, 아데노-회합 바이러스(AAV)를 사용하여 생체외 또는 생체내에서 세포를 조작한다. AAV는 감염 입자를 생성하기 위하여 헬퍼 바이러스를 요하는 천연 발생적 결핍 바이러스이다[Muzyczka, N.,Curr. Topics in Microbiol. Immunol. 158:97(1992)]. 그것은 또한 비-분할 세포내로 그의 DNA를 인테그레이트시킬 수 있는 몇몇 바이러스 중의 하나이다. AAV의 300 염기쌍만큼 작은 염기쌍을 함유하는 벡터는 팩키징될 수 있고, 인테그레이트될 수 있으나, 외인성 DNA에 대한 공간은 약 4.5kb로 제한된다. 그러한 AAV의 제조 방법 및 사용방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,139,941호, 제5,173,414호, 제5,354,678호, 제5,436,146호, 제5,474,935호, 제5,478,745호 및 제5,589,377호를 참조하라.
예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 적절한 AAV 벡터는 DNA 복제, 캡슐화 및 숙주-세포 인테그레이션에 필요한 모든 서열을 포함할 것이다. METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물은 표준 클로닝 방법, 예를 들어, 문헌[Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1989)]에 기재되어 있는 방법을 사용하여 AAV 벡터에 삽입시킨다. 그 후, 재조합 AAV 벡터를 임의의 표준 기법, 예를 들어, 리포펙션, 전기 천공법, 칼슘 포스페이트 침전법 등을 사용하여 헬퍼 바이러스로 감염된 팩키징 세포내로 형질 전환시킨다. 적당한 헬퍼 바이러스에는 아데노바이러스, 세포확대바이러스(cytomegalovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 또는 헤르페스 바이러스 등이 있다. 일단 팩키징 세포가 형질 전환되어 감염되면, 그들은 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 감염성 AAV 바이러스 입자를 제조할 것이다. 그 후, 이들 바이러스 입자를 사용하여 생체내 또는 생체외에서 진핵 세포에 형질 도입시킨다. 형질 도입된 세포는 그 게놈에 인테그레이트된 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함할 것이고, METH1 및/또는 METH2를 발현시킬 것이다.
유전자 치료법의 기타 방법에는 동종간의 재조합을 통하여 내인성 폴리뉴클레오티드 서열(예, METH1 및/또는 METH2를 암호화하는 것) 및 이종간의 제어 영역을 실시가능하게 회합시키는 것을 포함한다[예를 들어, 1997. 6. 24. 등록된 미국특허 제5,641,670호; 1996. 9. 26. 공개된 국제 공개 No. WO 96/29411; 1994. 8. 4. 공개된 국제 공개 No. WO 94/12650; Kolleret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); 및 Zijlstraet al., Nature 342:435-438(1989)를 참조하라]. 이 방법은 표적 세포에 존재하나 통상 그 세포에서 발현되지 않거나, 소정의 것보다 낮은 수준으로 발현되는 유전자의 활성화를 포함한다.
당업계의 표준 기법을 사용하여 프로모터 옆의 표적 서열을 갖는 프로모터를 함유하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 제조한다. 적당한 프로모터는 본 명세서에 기술되어 있다. 표적 서열은 내인성 서열에 충분히 상보적이어서 내인성 서열을 갖는 프로모터-표적 서열의 동종간의 재조합을 허용한다. 표적 서열은 METH1 및/또는 METH2 소정 내인성 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 충분히 근접해 있어서, 그 프로모터는 동종간 재조합시에 내인성 서열에 작동적으로 결합될 것이다.
프로모터 및 표적 서열은 PCR을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 증폭된 프로모터는 5' 및 3' 말단에 분리된 제한 효소 자리를 포함하는 것이 바람직하다. 제1 표적 서열의 3' 말단은 증폭된 프로모터의 5' 말단과 동일한 제한 효소 자리를 가지며, 제2 표적 서열의 5' 말단은 증폭된 프로모터의 3' 말단과 동일한 제한 효소 자리를 갖는다. 증폭된 프로모터 및 표적 서열은 소화되어 서로 라이게이트 (ligate)된다.
프로모터-표적 서열 작제물은 폴리뉴클레오티드 그 자체로 또는 형질 전환-용이화제, 예를 들어, 리포솜, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 전체 바이러스, 리포펙션, 침전제 등(상기에서 상세히 설명하였음)과 결합하여 세포내로 송달된다.상기 프로모터-표적 서열은 직접 주사법, 정맥 주사법, 국소 투여법, 카테터 주입법, 입자 촉진제법 등을 비롯한 임의의 방법을 사용하여 송달할 수 있다. 상기 방법은 이하에서 더욱 상세히 설명한다.
프로모터-표적 서열 작제물은 세포에 의하여 취해진다. 작제물과 내인성 서열 사이의 동종간 재조합은 프로모터의 제어하에 내인성 METH1 및/또는 METH2 서열이 위치되도록 일어난다. 그 후, 상기 프로모터는 내인성 METH1 및/또는 METH2 서열의 발현을 유도한다.
METH1 및/또는 METH2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 기타 단백질을 암호화하는 기타 폴리뉴클레오티드와 함께 투여할 수 있다. 그러한 단백질에는 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자, VEGF-1, VEGF-2, VEGF-3, VEGF-E, PIGF 1 및 2, 상피 성장 인자 알파 및 베타, 혈소판-유도 내피 세포 성장 인자, 혈소판-유도 성장 인자 알파 및 베타, 종양 탈저 인자 알파, 간세포 성장 인자, 인슐린류 성장 인자, 콜로니 자극 인자, 매크로파지 콜로니 자극 인자, 과립구/매크로파지 콜로니 자극 인자 및 산화 질소 신타제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
METH1 및/또는 METH2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단백질의 분비를 용이하게 하는 분비 신호 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 상기 신호 서열은 코딩 영역의 5' 말단쪽으로 또는 5' 말단에서 발현되는 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역에 위치한다. 상기 신호 서열은 당해 폴리뉴클레오티드와 동종성이거나 이종성일 수 있고, 형질 전환되는 세포와 동종성이거나 이종성일 수 있다. 또한, 상기 신호 서열은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
전술한 임의의 폴리뉴클레오티드 작제물의 투여 모드는 치료 효과를 제공하기에 충분한 양으로 1종 이상의 분자를 발현시키는 모드인한 사용할 수 있다. 이에는 직접 주사법, 전신 주사법, 카테터 주입법, 바이오리스틱 인젝터(biolistic injector)법, 입자 가속기법[즉, "유전자 총(gene gun)"법], 겔포움 스폰지 데포우(gelfoam sponge depot)법, 기타 시판 데포우 물질법, 삼투성 펌프법[예, 알자 미니펌프(Alza minipump), 경구 또는 좌제 고형 약학 제제법(정제 또는 환제), 수술 중 경사(decanting) 또는 국소 적용법 등이 있다. 예를 들어, 칼슘 포스페이트-침전 플라스미드 그 자체를 랫트의 간 및 랫트의 지라로 직접 주사하거나, 또는 단백질-코팅 플라스미드를 간문맥에 직접 주사함으로써 외래 유전자를 랫트의 간에서 발현시켰다[Kanedaet al., Science243:375(1989)].
바람직한 국소 투여 방법은 직접 주사법이다. 송달 비히클과 복합체화된 본 발명의 재조합 분자를 직접 주사 투여하거나, 동맥 영역내에 국소 투여하는 것이 바람직하다. 조성물을 동맥 영역내에 국소적으로 투여하는 것은 동맥내 센티미터에, 바람직하게는 밀리미터에 상기 조성물을 주사하는 것을 의미한다.
기타 국소 투여 방법은 수술 창상에 또는 그 주위에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 작제물을 접촉시키는 것이다. 예를 들어, 환자를 수술하고, 폴리뉴클레오티드 작제물을 창상 내부 조직의 표면에 코팅하거나, 또는 그 작제물을 창상 내부 조직의 영역내로 주사할 수 있다.
전신 투여에 유용한 치료 조성물은 본 발명의 표적 송달 비히클에 복합체화된 본발명의 재조합 분자를 포함한다. 전신성 투여를 이용하는 용도에 있어서 적당한 송달 비히클은 특정 부위에 비히클을 표적화하기 위한 리간드를 포함하는 리포솜을 포함한다.
바람직한 전신성 투여 방법에는 정맥내 주사, 에어로졸, 경구 및 피부(국소) 송달 등이 있다. 정맥내 주사는 당업계의 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 에어로졸 송달도 당업계의 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다[예를 들어, Striblinget al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281(1992)을 참조하라. 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되어 있다]. 경구 송달은 동물의 장에서 소화 효소에 의한 소화를 견딜 수 있는 담체에 본 발명의 폴리뉴클에오티드 작제물을 복합체화시킴으로써 수행할 수 있다. 그러한 담체의 예로는 당업계에 공지되어 있는 플라스틱 캡슐 또는 정제 등이 있다. 국소 송달은 피부내로 통과될 수 있는 친유성 시약(예, DMSO)과 본 발명의 폴리뉴클레오티드 작제물을 혼합함으로써 수행할 수 있다.
송달되는 물질의 유효량의 결정은 예를 들어, 그 물질의 화학 구조 및 생물학적 활성, 동물의 연령 및 체중, 및 치료를 요하는 정확한 증상 및 그 심각도 및 투여 경로을 비롯한 다수의 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 빈도는 다수의 인자, 예를 들어, 투여량 당 투여되는 폴리뉴클레오티드 작제물의 양, 및 피검체의 건강 및 병력에 따라 달라진다. 정확한 양, 투여 횟수 및 투여 시점은 내과 의사 또는 수의사가 결정할 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 임의의 동물, 바람직하게는 포유 동물 및 조류에게 투여할 수 있다. 바람직한 동물에는 인간, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 토끼, 양,소, 말 및 피그 등이 있고, 인간이 특히 바람직하다.
특정 실시 태양에 있어서, 유전자 치료법에 의하여 본 발명의 폴리펩티드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 장애를 치료, 억제 또는 예방하기 위하여 항체 또는 그의 기능성 유도체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 투여한다. 유전자 치료법은 발현된 또는 발현 가능한 핵산을 피검체에 투여함에 의하여 수행되는 치료법을 의미한다. 본 발명의 이러한 실시 태양에 있어서, 상기 핵산은 치료 효과를 매개하는 그의 암호화 단백질을 생성시킨다.
당업계에서 이용할 수 있는 유전자 치료에 대한 임의의 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 그러한 방법을 이하에 예시한다.
유전자 치료법의 일반적 검토를 위해서는 문헌들[Goldspielet al., Clinical Pharmacy 12:488-505(1993); Wu and Wu,Biotherapy 3:87-95(1991); Tolstoshev,Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596(1993); Mulligan,Science 260:926-932(1993); and Morgan and Anderson,Ann. Rev. Biochem. 62:191-217(1993); May,TIBTECH11(5):155-215(1993)]을 참고하라. 사용할 수 있는 재조합 DNA 기술로서 당업계에 공지되어 있는 방법들은 문헌들[Ausubelet al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기술되어 있다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 화합물은 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 적당한 숙주에서 항체 또는 그 단편 또는 키메릭 단백질또는 중쇄 또는 경쇄를 발현시키는 발현 벡터의 일부이다. 특히, 그러한 핵산 서열은 항체 코딩 영역에 작동적으로 결합되는 프로모터를 가지며, 그러한 프로모터는 유도성 또는 구성성이고, 임의로 조직-특이적이다. 다른 특정 실실 태양에 있어서, 항체 코딩 서열 및 기타 소정 서열이 게놈에 있어서 소정 부위에 동종간 재조합을 촉진하는 영역 옆에 위치하는 핵산 분자를 사용함으로써 핵산을 암호화하는 항체의 염색체내 발현을 제공할 수 있다[Koller and Smithies,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); Zijlstraet al., Nature 342:435-438(1989)]. 특정 실시 태양에 있어서, 발현된 항체 분자는 단일쇄 항체이고; 대안적으로, 핵산 서열은 항체의 중쇄 및 경쇄 양자를 암호화하하는 서열, 또는 그의 단편을 포함한다.
환자에 대한 핵산의 송달은 환자가 핵산 또는 핵산-운반 벡터에 직접 노출되는 경우에는 직접적으로, 또는 세포가 생체외에서 핵산으로 우선 형질 전환된 후, 환자에게 주입되는 경우에는 간접적으로 이루어질 수 있다. 이러한 두 가지 접근법은 생체내 또는 생체외 유전자 치료법으로서 각각 공지되어 있다.
특정 실시 태양에 있어서, 핵산 서열은 생체내에 직접 투여되며, 이 경우에 그것은 발현되어 암호화된 생성물을 생성한다. 이는 당업계에 공지된 다수의 방법 중 임의의 것, 예를 들어, 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 그들을 구성하고, 그것을 세포내로 투여하는 방법, 결핍 또는 약독화 레트로바이러스 또는 기타 바이러스 벡터를 사용하여 감염시키는 방법(미국 특허 제4,980,286호 참조), 또는 DNA 그 자체를 직접 주사하는 방법, 또는 마이크로입자 충격법을 사용하는 방법(예를 들어, 유전자 총, 바이오리스틱, 듀퐁), 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질 전환제로 코팅하는 방법, 리포솜, 마이크로 입자 또는 마이크로캡슐내에 캡슐화하는 방법, 핵 도입을 위하여 공지된 펩티드에 결합된 그들을 투입하는 방법, 또는 수용체-매개 세포 이물 흡수시킨 리간드에 그것을 결합시켜 투여하는 방법[예를 들어, Wu and Wu,J. Biol., Chem. 262:4429-4432(1987)](이는 수용체를 특이적으로 발현시키는 세포유형을 표적화하는 데 사용할 수 있다)에 의하여 달성될 수 있다. 다른 실시 태양에 있어서, 리간드가 엔도솜을 붕괴시키는 융합 유전자(fusogenic) 바이러스 펩티드를 포함하는 핵산-리간드 복합체를 형성시켜, 핵산이 라이소솜성(lysosomal) 변성되지 않도록할 수 있다. 또 다른 실시 태양에 있어서, 특이적 수용체를 표적화함으로써 세포 특이적 흡수 및 발현을 위하여 핵산을 생체내에서 표적화할 수 있다. 예를 들어, 문헌[PCT 공개 WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188, WO 93/20221]을 참조하라. 대안적으로, 핵산을 세포내로 도입하고 발현을 위하여 숙주 세포 DNA 내에 포함시킬 수 있다. 이때, 동종간 재조합을 이용할 수 있다. 문헌[Koller and Smithies,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); Zijlstraet al., Nature 342:435-438(1989)]을 참조하라.
특정 실시 태양에 있어서, 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터를 사용한다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다[Milleret al., Meth. Enzymol. 217:581-599(1993)을 참조하라]. 이들 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈을 정확하게 팩키징하고 숙주 세포 DNA에 인테그레이션되는데 필요한 필수 성분을 포함한다. 유전자 치료법에서 사용하는 항체를 암호화하는 핵산 서열을, 환자에게 유전자를 송달하는 것을 용이하게 하는 1종 이상의 벡터내로 클로닝한다. 레트로바이러스 벡터에 관한 더욱 자세한 설명은 문헌[Boesenet al., Biotherapy 6:291-302(1994)]을 참조하라. 상기 문헌에서는 조혈 줄기 세포가 화학 치료에 대하여 더 큰 내성을 갖도록 하기 위하여 그 줄기 세포에 mdr1 유전자를 송달하는 레트로바이러스 벡터의 사용에 대하여 기술하고 있다. 유전자 치료법에서 레트로바이러스 벡터를 사용하는 것을 설명한 기타 참고 문헌에는 Cloweset al., J. Clin. Invest. 93:644-651(1994); Kiemet al., Blood 83:1467-1473(1994); Salmons and Gunzberg,Human Gene Therapy 4:129-141(1993); 및 Grossman and Wilson,Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114(1993)] 등이 있다.
아데노바이러스는 유전자 치료법에 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 호흡기 상피에 유전자를 송달하기 위하여 특히 효과적인 비히클이다. 아데노바이러스는 본래 그들이 경증의 질병을 유발하는 호흡기 상피를 감염시킨다. 아데노바이러스-계 송달 시스템에 대한 기타 표적은 간, 중추 신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비-분할 세포를 감염시킬 수 있는 이점이 있다. 문헌[Kozarsky and Wilson,Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503(1993)]은 아데노바이러스-계 유전자 치료법을 제시한다. 문헌[Boutet al., Human Gene Therapy 5:3-10(1994)]에서는 레서스 원숭이의 호흡기 상피에 유전자를 전달하는 아데노바이러스 벡터의 사용을 설명하였다. 유전자 치료법에서의아데노바이러스 사용에 대한 기타 예는 문헌들[Rosenfeldet al., Science 252:431-434(1991); Rosenfeldet al., Cell 68:143-155(1992); Mastrangeliet al., J. Clin. Invest. 91:225-234(1993); PCT 공개 WO 94/12649; 및 Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783(1995)]에서 발견할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 아데노바이러스 벡터를 사용한다.
아데노-회합 바이러스(AAV)도 유전자 치료법에 사용하도록 제안되어 왔다[Walshet al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300(1993); 미국 특허 제5,436,146호].
유전자 치료법에 대한 기타 접근법은 전기 천공법, 리포펙틴, 칼슘 포스페이트 매개 형질 전환 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의하여 조직 배양물 중의 세포에 유전자를 도입시키는 것을 포함한다. 통상, 형질 전환 방법은 세포에 선택 마커(selectable marker)를 도입시키는 것을 포함한다. 그 후, 세포는 취해져서 형질 전환 유전자를 발현시키는 세포를 분리하기 위한 선택하에 놓여진다. 그 후, 이들 세포는 환자에게 송달된다.
이러한 실시 태양에 있어서, 핵산은 생성 재조합 세포의 생체내 투여 전에 세포내로 도입된다. 그러한 도입은 예를 들어, 형질 전환, 전기 천공법, 마이크로인젝션, 핵산 서열을 포함하는 박테이오파지 또는 바이러스 벡터를 이용한 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 도입, 마이크로셀-매개 유전자 도입, 스페로플라스트 융합 등(단, 이에 한정되는 것은 아니다)을 비롯한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 외래 유전자를 세포에 도입하기 위한 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 단, 수용 세포의 필요한 발육 및 생리학적 기능은 파괴되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Loeffler and Behr,Meth. Enzymol. 217:599-618(1993); Cohenet al., Meth. Enzymol. 217:618-644(1993); Cline,Pharmac. Ther. 29:69-92m(1985)]을 참조하라. 상기 기술은 세포에 핵산을 안정하게 도입시킴으로써 핵산을 세포에 의해 발현시켜야 하며, 바람직하게는 그 세포의 자손에 유전되어 발현될 수 있어야 한다.
생성 재조합 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 환자에게 송달될 수 있다. 재조합 혈액 세포(예, 조혈 줄기 또는 선조 세포)는 정맥내로 투여되는 것이 바람직하다. 세포의 사용 예상 양은 소망하는 효과, 환자의 상태에 따라 달라지며, 당업자가 결정할 수 있다.
핵산이 유전자 치료 목적으로 도입될 수 있는 세포는 임의의 소정 사용가능한 세포 유형을 포함하는데, 이에는 상피 세포, 내피 세포, 각질 형성 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포, 예를 들어, T-림프구, B-림프구, 단핵구, 매크로파지, 호중구, 호산구, 거대핵세포, 과립구; 다양한 줄기 세포 또는 선조 세포, 특히 조혈 줄기 또는 선조 세포, 예를 들어, 골수, 탯줄 혈액, 말초 혈액, 태아 간 등에서 얻어진 것 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 유전자 치료법에 사용되는 세포는 환자의 자가 조직에서 유래한 것이다.
유전자 치료법에서 재조합 세포를 사용하는 실시 태양에 있어서, 항체를 암호화하는 핵산 서열을 세포내에 도입함으로써 그들을 그 세포 또는 그 자손에의하여 발현시킨 후, 상기 재조합 세포를 치료 목적을 위하여 생체내로 도입시킬 수 있다. 특정 실시 태양에 있어서, 줄기 또는 선조 세포를 사용한다. 분리되어 생체외에서 유지될 수 있는 임의의 줄기 및/또는 선조 세포는 본 발명의 본 실시 태양에 따라 사용할 수 있다[예를 들어, PCT 공개 WO 94/08598; Stemple and Anderson,Cell 71:973-985(1992); Rheinwald,Meth. Cell Bio. 21A:229(1980); 및 Pittelkow and Scott,Mayo Clinic Proc. 61:771(1986)를 참조하라].
특정 실시 태양에 있어서, 유전자 치료 목적으로 도입되는 핵산에 코딩 영역에 작동적으로 결합되는 유도 프로모터를 포함시킴으로써 상기 핵산이 적당한 전사 유도자의 존재 또는 부재를 조절함에 의하여 제어될 수 있도록 한다.
본 발명의 화합물 또는 약학 조성물은 바람직하게 생체외에서 시험된 후, 인간에게 사용되기 전에 소정 치료 또는 예방 활성을 위하여 생체내에서 시험된다. 예를 들어, 화합물 또는 약학 조성물의 치료 또는 예방 효과를 입증하기 위한 생체외 분석법은 환자 조직 샘플 또는 세포주에 대한 화합물의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 화합물 또는 조성물의 효과는 로제트(rosette) 형성 분석법 및 세포 라이시스(lysis) 분석법 등(단, 이에 한정되는 것은 아님)을 비롯한 당업자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명에 따라, 특정 화합물의 투여가 요구되는가 여부를 결정하는데 사용할 수 있는 생체외 분석법에는 환자 조직 샘플을 배양물 중에서 성장시키고, 투여 화합물에 노출시키고, 조직 샘플에서 그러한 화합물의 효과를 관찰하는 세포외 세포 배양 분석법이 있다.
치료/예방 투여 및 조성물
본 발명은 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물, 바람직하게는 본 발명의 항체 유효량을 피검체에 투여함으로써 치료, 억제 및 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 화합물을 실질적으로 정제한다(예를 들어, 그 효과를 제한하거나 바람직하지 않은 부작용을 생성하는 물질을 실질적으로 제거하는 것). 피검체는 예를 들어, 소, 피그, 말, 닭, 고양이, 개 등과 같은 동물인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 포유 동물이 바람직하고, 인간이 가장 바람직하다.
화합물이 핵산 또는 면역글로불린을 포함하는 경우에 사용할 수 있는 투여 제제 및 투여 방법은 전술하였고; 추가의 적절한 투여 제제 및 투여 경로는 이하에 기술하는 것 중에서 선택할 수 있다.
다양한 송달 시스템이 공지되어 있으며, 이를 본 발명의 화합물을 투여하는데 사용할 수 있다. 상기 송달 시스템으로는 예를 들어, 레트로바이러스 또는 기타 벡터의 일부로서 핵산을 구성, 수용체-매개 세포 이물 흡수, 상기 화합물을 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 마이크로캡슐, 마이크로입자, 리포솜 중의 캡슐화 등을 들 수 있다. 예를 들어, 문헌[Wu and Wu,J. Biol. Chem. 262:4429-4432(1987)]을 참조하라. 도입 방법으로는 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막 및 경구 투여 방법 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 화합물 또는 조성물은 임의의 통상적 경로, 예를 들어, 주입 또는 거환 주사에 의하여, 상피 또는 점막피부 내층(예를 들어, 구강내 점막, 직장 및 장내 점막 등)을 통한 흡입에 의하여 투여할 수 있고, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여할수 있다. 전신적으로 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물 또는 화합물을 임의의 적당한 경로, 예를 들어, 심실내 및 경막내 주사를 통하여 중추 신경계로 도입하는 것이 바람직할 수 있다; 예를 들어, 옴마야(Ommaya) 저장기와 같은 저장기에 부착된 심실내 카테터에 의하여 용이하게 심실내 주사할 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 분무기를 사용하여, 그리고 에어로졸화제를 사용한 제제를 사용하여 폐 투여할 수도 있다.
특정 실시 태양에 있어서, 본 발명의 약학 조성물 또는 화합물을 치료를 요하는 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다; 이는 예를 들어, 수술 중의 국소 주입, 국소 적용(예를 들어, 수술 후 창상 드레싱과 함께)에 의하여, 주사에 의하여, 카테터 수단에 의하여, 좌제 수단에 의하여, 또는 이식 수단에 의하여 달성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 이식 수단은 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴 물질, 예를 들어, 막, 예컨대, 시알라스틱(sialastic) 막, 또는 섬유이다. 바람직하게, 본 발명의 항체를 비롯한 단백질을 투여하는 경우에, 치료는 단백질이 흡수되지 않는 물질을 사용하여 행하여야 한다.
다른 실시 태양에 있어서, 상기 화합물 또는 조성물은 비히클, 특히 리포솜 내에서 송달 할 수 있다[Langer, Science 249:1527-1533(1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp. 353-365(1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 각주를 참조하라].
또 다른 실시 태양에 있어서, 화합물 또는 조성물은 제어 방출 시스템으로송달할 수 있다. 한 실시 태양에 있어서, 펌프를 사용할 수 있다[Langer,supra; Sefton,CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987); Buchwaldet al., Surgery 88:507(1980); Saudeket al., N. Engl. J. Med. 321:574(1989)를 참조하라]. 다른 실시 태양에 있어서, 중합체 물질을 사용할 수 있다[Mecical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas,J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61(1983)을 참조하라; 또한 Levyet., Science 228:190(1985); Duringet al., Ann. Neurol. 25:351(1989); Howardet al., J. Neurosurg. 71:105(1989)를 참조하라]. 또 다른 실시 태양에 있어서, 제어 방출 시스템을 치료 표적, 즉, 뇌 부근에 위치시킴으로써 전신적 투여량의 일부만을 요할 수도 있다[예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,supra, vol. 2, pp. 115-138(1984)를 참고하라].
기타 제어 방출 시스템은 Langer의 논문[Science 249:1527-1533(1990)]에 논의되어 있다.
본 발명의 화합물이 단백질을 암호화하는 핵산인 특정 실시 태양에 있어서, 상기 핵산을 생체내 투여하여, 그 암호화된 단백질의 발현을 촉진시킬 수 있는 데, 이 때, 그것을 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로 구성하여, 그것을 세포내로 투여할 수 있고, 또는 레트로바이러스 벡터를 사용(미국 특허 제4,908,286호 참조)하거나, 직접 주사법을 사용하거나, 마이크로입자 충격법(예, 유전자 총; 바이오리스틱, 듀퐁)을 사용하거나, 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질 전환제로 코팅하거나, 핵을 도입하기 위해서 공지된 호메오박스(homeobox)-유사 펩티드와 그것을 결합시켜 투여하는 방법[예를 들어, Joliotet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868(1991)을 참조하라] 등을 이용할 수 있다. 대안적으로, 동종간 재조합에 의하여 핵산을 세포내 도입하고 발현을 위하여 숙주 세포 DNA내로 혼입시킬 수 있다.
본 발명은 또한 약학 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 화합물 치료 유효량 및 약학적 허용 담체를 포함한다. 특정 실시 태양에 있어서, 용어 "약학적 허용"은 연방 정부 또는 주정부의 규제 당국에 의하여 승인되었거나, 미국 약전에 열거되어 있거나, 동물 및 더욱 특히 인간에 사용하기 위하여 기타 통상의 약전에 기재되어 있는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제 투여시 사용하는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 그러한 약학 담체는 멸균 액체, 예를 들어, 물 및 오일, 예를 들어, 석유, 동물, 식물 또는 합성유, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광물유, 참기름 등일 수 있다. 약학 조성물을 정맥내 투여하는 경우에 물이 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수용성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 액체 담체로 사용할 수도 있는데, 특히 주사 용액으로 사용할 수 있다. 적당한 약학 부형제에는 녹말, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 있다. 조성물은 경우에 따라 습윤화제 또는 에멀션화제, 또는 pH 완충제 소량을 함유할 수도 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방형 제제 등의 형태일 수 있다. 상기 조성물은 트리글세라이드와 같은 종래의 담체 및 결합제를 사용하여 좌제로 제형화할 수 있다. 경구 제제는 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등의 약학적 등급의 담체와 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적당한 약학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin]에 기재되어 있다. 그러한 조성물은 화합물, 바람직하게는 정제 형태의 화합물 치료 유효량, 및 환자에 투여시 적당한 투여 형태를 제공하는 적당한 양의 담체를 포함할 것이다. 상기 제제는 투여 모드에 맞아야 한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 조성물을 인간 정맥내 투여에 적당한 약학 조성물로서 통상의 과정에 따라 제제화한다. 통상, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우에, 상기 조성물은 주사 부위의 고통을 완화시키는 리그노카인(lignocaine)과 같은 국소 마취제 및 용해제를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 분리 형태로 또는 제형에 혼합되어 제공된다. 상기 제형으로는 예를 들어, 건조 분말 또는 활성제의 양을 지시하는 사켓(sachette) 또는 앰플(ampoule)과 같은 밀봉 용기 중의 제습 농축물이 있다. 상기 조성물을 주입 방식으로 투여하는 경우에, 멸균 약학 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병에 그것을 넣을 수 있다. 상기 조성물을 주사 투여하는 경우에, 주사용 멸균수 또는 염수 앰플은 그 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
본 발명의 화합물은 중성 형태 또는 염 형태로 제제화할 수 있다. 약학적 허용염에는 음이온을 사용하여 형성된 것, 예를 들어, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 으로부터 유도된 것, 및 양이온을 사용하여 형성된 것, 예를 들어, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것이 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 장애의 치료, 억제 및 예방에 유효할 것인 본 발명의 화합물의 양은 표준 임상 기술에 의하여 결정할 수 있다. 또한, 최적 투여량 범위를 알아내기 위하여 생체외 분석법을 선택적으로 사용할 수 있다. 제제에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 질병 또는 장애의 심각도에 따라서 달라질 것이며, 실행자의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 투여량은 생체외 시험 또는 동물 모델 시험 시스템에서 유도된 투여량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
항체의 경우에, 환자에게 투여되는 투여량은 환자 체중의 통상 0.1mg/kg 내지 100mg/kg이다. 환자에게 투여되는 투여량은 환자 체중의 0.1mg/kg 내지 20mg/kg이 바람직하며, 환자 체중의 0.1mg/kg 내지 10mg/kg이 더욱 바람직하다. 일반적으로, 인간 항체는 다른 종에서 유래한 항체보다 인간 내부에서 더욱 긴 반감기를 갖는다. 이는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응 때문이다. 따라서, 인간 항체는 더욱 적은 투여량과 더욱 적은 빈도의 투여로도 가능하다. 또한, 본 발명의 항체의 투여량 및 투여 빈도는 예를 들어, 지질화 등 개질에 의하여 항체의 조직 흡수 및 침투(예, 뇌 내부로)를 향상시킴으로써 감소시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 약학 조성물의 1종 이상의 성분으로 충진된 1종 이상의 용기를 포함하는 약학 팩(pack) 또는 키트(kit)를 제공한다. 그러한 용기는 선택적으로 약제 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 부처에 의하여 규정된 형태의 고지로서, 인간 투여용으로의 제조, 사용 또는 판매의 승인을 반영하는 고지를 포함할 수 있다.
염색체 분석법
본 발명의 핵산 분자는 또한 염색체 동정을 위해서도 가치가 있다. 그 서열은 각 인간 염색체 상의 특정 위치에 특이적으로 표적화되어 하이브리드화될 수 있다. 본 발명에 따라 염색체에 대해 DNA를 맵핑(mapping)하는 것은 질병과 관련된 유전자를 갖는 서열을 서로 관련시키는 제1 단계에서 중요하다.
이와 관련한 특정 바람직한 실시 태양에 있어서, 본 명세서에 공개된 cDNA를 사용하여 METH1 또는 METH2 단백질 유전자의 게놈 DNA를 클로닝한다. 이는 당업계에 주지된 다양한 기술 및 일반적으로 시판되는 다양한 라이브러리를 사용하여 수행할 수 있다. 그 후, 게놈 DNA는 원위치에서 상기 목적을 위하여 주지된 기술을 사용하여 염색체 맵핑용으로 사용한다.
또한, 몇몇 경우에 있어서, cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게 15∼25 bp)를 제조함으로써 염색체에 대하여 서열을 맵핑할 수 있다. 유전자의 3' 미번역 영역의 컴퓨터 분석을 이용하여 게놈 DNA에서 하나 이상의 엑손을 연결(span)하지 않는 프라이머를 신속하게 선택함으로써 증폭 공정을 구성한다. 그 다음, 각 인간 염색체를 함유하는 체강 세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 상기 프라이머를 사용한다.
중기 염색체 스프레드에 대한 cDNA 클론의 원위치에서의 형광 하이브리드화("FISH")를 사용하여 한 단계로 정확한 염색체 위치를 제공할 수 있다. 이러한 기술에서는 50 또는 60 bp의 cDNA로부터의 프로브를 사용할 수 있다. 이러한 기술에 관하여, 문헌[Vermaet al., Human Chromosomes: A Manual Of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]을 참조하라.
염색체에 대한 맵에 유사하게 사용할 수 있는 기타 맵핑 전략에는 방사 하이브리드 맵핑, 표지된 흐름-분류 염색체(flow-sorted chromosome)를 사용한 예비스크리닝(prescreening) 및 염색체 특이적-cDNA 라이브러리를 구성하기 위한 하이브리드화에 의한 예비선택 등이 있다. 방사 하이브리드(RH) 맵핑은 X-선을 사용한 인간 염색체 단편화, 및 햄스터 A23 숙주 세포 중의 이들 무작위 단편의 보유에 좌우된다. RH 맵핑용 DNA는 리서치 제네틱스(USA)에 의해 제공된다. 올리고쌍은 80bp 내지 300bp의 생성물을 증폭시킬 EST 서열로부터 디자인한다. PCR은 93 인간/햄스터 하이브리드 DNA에서 수행하며, 그 결과를 프레임워크 맵과 비교하였다 [http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl; Gyapayet al., Human Molecular Genetics 5:39-346(1996)]. RH 맵핑은 FISH보다 더욱 큰 정확성을 제공하며, 유전자 클러스터 및 장소/유전자 상관 관계를 지시한다.
서열을 정확한 염색체 위치로 일단 맵핑하면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치는 유전자 맵 데이터와 상호 관련시킬 수 있다. 예를 들어, 그러한 데이터는 예를 들어, V. McKusick, Mendelian Inheritance In Man(이는 Johns HopkinsUniversity를 통하여 온라인으로 입수할 수 있음)에서 발견된다. 그 다음, 동일한 염색체 영역에 대하여 맵핑된 질병 및 유전자 사이의 상호 관계는 결합 분석법(linkage analysis)(물리적으로 근접한 유전자의 공동 유전)을 통하여 알아낸다.
다음에, 영향받은 개체와 영향받지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이를 측정하는 것이 필요하다. 정상 개체에서는 그렇지 아니하나, 영향받은 개체 일부 또는 전부에서 돌연변이가 관찰된다면, 그 돌연변이는 질병의 원인 인자(causative agent)로 될 수 있다.
21q21로서 번역하는 STS 마커 D21S1435 및 D21S1442 사이의 METH1 유전자를 맵핑한다. 이는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)과 유사한 염색체 위치이다. APP 및 METH1은 인간 게놈에서 대규모 간격이 아닌 약 3백만 염기 떨어져 있다. 상기 염색체 위치는 에테로키나제(그것을 트립신으로 전환시킴으로써 트립시노겐을 활성화시키는 효소)와 같은 중요 유전자 및 알츠하이머병에 책임이 있는 유전자를 포함한다.
METH1 유전자는 방사 하이브리드 맵핑용의 하기 올리고스를 사용하여 21q21에 대하여 맵핑할 수 있다:
5' 프라이머: ACTGTGTGTGATCCGAG (SEQ ID NO:126)
3' 프라이머: GTTGGAAAGCATTGACG (SEQ ID NO:127)
키트
본 발명은 전술한 방법들에 사용할 수 있는 키트들을 제공한다. 한 실시 태양에 있어서, 키트는 본 발명의 항체, 바람직하게 정제된 항체를 1종 이상의 용기에 포함한다. 특정 실시 태양에 있어서, 본 발명의 키트는 그 키트에 포함된 항체와 특이적으로 면역 반응하는 에피토프를 포함하는 실질적으로 분리된 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 키트는 또한 당해 폴리펩티드와 반응하지 않는 조절 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 또 다른 특정 실시 태양에 있어서, 본 발명의 키트는 당해 폴리펩티드에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함한다(예를 들어, 상기 항체는 검출 가능한 기질, 예를 들어, 형광 화합물, 효소 기질, 방사활성 화합물 또는 발광 화합물과 결합될 수 있고, 또는 검출 가능한 기질과 결합될 수 있는 제1 항체를 인식하는 제2항체와 결합될 수 있다).
본 발명의 또 다른 특정 실시 태양에 있어서, 키트는 증식 및/또는 암 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대하여 특이적인 항체를 함유하는 혈청을 스크리닝하는데 사용하기 위한 진단용 키트이다. 그러한 키트는 당해 폴리펩티드와 반응하지 않는 조절 항체를 포함할 수 있다. 그러한 키트는 1종 이상의 항-폴리펩티드 항원 항체와 특이적으로 면역반응하는 에피토프를 포함하는 실질적으로 분리된 폴리펩티드 항원을 포함할 수 있다. 또한, 그러한 키트는 항원에 대한 상기 항체의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함한다(예를 들어, 상기 항체는 흐름 세포 계산법에 의하여 검출할 수 있는 로다민 또는 플루오레세인과 같은 형광 화합물에 결합될 수 있다). 특정 실시 태양에 있어서, 키트는 재조합적으로 생성되거나 화학적으로 합성된 폴리펩티드 항원을 포함할 수 있다. 상기 키트의 폴리펩티드 항원은 고체 지지체에 부착시킬 수도 있다.
더욱 특이적인 실시 태양에 있어서, 전술한 키트의 검출 수단은 상기 폴리펩티드 항원이 부착되는 고체 지지체를 포함한다. 그러한 키트는 비-부착 리포터-표지 항-인간 항체를 포함할 수도 있다. 이러한 실시 태양에 있어서, 폴리펩티드 항원에 대한 항체의 결합은 상기 리포터-표지 항체의 결합에 의하여 검출할 수 있다.
추가의 실시 태양에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 항원을 포함하는 혈청을 스크리닝하는데 사용하기 위한 진단 키트를 포함한다. 상기 진단 키트는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 항원과 특이적으로 면역반응하는 실질적으로 분리된 항체, 및 상기 항체에 대한 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 항원의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함한다. 한 실시 태양에 있어서, 상기 항체는 고체 지지체에 부착된다. 특정 실시 태양에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 상기 키트의 검출 수단은 제2 표지된 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 검출 수단은 표지된 경쟁 항원을 포함할 수 있다.
하나의 진단 구성에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 표면-결합 항원을 갖는 고체 상 시약과 시험 혈청을 반응시킨다. 상기 시약에 특정 항원 항체를 결합시키고, 비결합 혈청 성분을 세척에 의하여 제거한 후, 상기 시약을 리포터-표지 항-인간 항체와 반응시킴으로써 상기 고체 지지체 상에 결합된 항-항원 항체 양에 비례하게 상기 시약을 리포터와 결합시킨다. 상기 시약을 다시 세척하여 비결합 표지 항체를 제거하고, 그 시약과 회합된 리포터의 양을 측정한다. 통상, 상기 리포터는 적당한 형광계, 발광계 또는 비색계 기재의 존재하에 고체상을 항온 처리함으로써 검측되는 효소이다(Sigma, St. Louis, MO).
상기 분석법에 있어서의 고체 표면 시약은 예를 들어, 중합체 비드, 딥 스틱(dip stick), 96-웰 플레이트 또는 필터 물질과 같은, 고체 지지체 물질에 단백질 물질을 부착시키기 위한 공지의 기술을 사용하여 제조한다. 이들 부착 방법은 통상적으로 활성 카복실, 하이드록실 또는 알데히드기와 같은 고체 지지체 상의 화학적 반응기에, 통상 자유 아민기를 통하여, 단백질을 공유 결합시키거나, 지지체에 단백질을 비-특이적으로 흡수시키는 것을 포함한다. 대안적으로, 스트렙트아비딘 코팅 플레이트를 비오티닐화 항원과 함께 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 이러한 진단 방법을 수행하기 위한 키트 또는 분석 시스템을 제공한다. 상기 키트는 일반적으로 표면-결합 항-항원 항체를 검출하기 위한 리포터-표지 항-인간 항체 및 표면-결합 재조합 항원을 갖는 지지체를 포함한다.
본 발명을 일반적으로 기술하였으며, 이하의 실시예를 참고하여 본 발명을 더욱 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 다만, 하기 실시예는 설명 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명을 한정하고자 의도된 것은 아니다.
발명의 요약
본 발명은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 또는 ATCC 기탁번호 209581(1998년 1월 15일)로 박테리아 숙주중에 기탁된 cDNA 클론에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 METH1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 분리물을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는 ATCC 기탁번호 209582(1998년 1월 15일) 또는 ATCC 기탁번호 PTA 1478(2000년 3월 14일)로 박테리아 숙주에 기탁된 cDNA 클론에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 분리물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자 분리물을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 상기 벡터 및 숙주 세포를 제조하는 방법 및 재조합 방법에 의하여 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 펩티드의 생성을 위하여 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본원에서 설명된 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 분리물을 추가로 제공한다.
본 발명은 암의 진단 또는 예후중에 유용한 진단 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 추가적 양태는 체내 METH1 또는 METH2 활성의 수준 상승이 필요한 개체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 이는 상기 개체에 본 발명의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 분리물 또는 이것의 길항제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시예 1: METH1 및 METH2의 동정 및 클로닝
TSP-유사 도메인을 갖는 신규 유전자를 찾기 위하여, TSP1의 제2 타입Ⅰ 반복 단위에 대하여 상동성인 서열에 대하여 약 900,000의 발현 서열 택(EST)으로 구성된 거대 인간 cDNA 데이터베이스를 스크리닝하였다. 몇몇 EST는 TSP-유사 도메인을 갖는 단백질을 암호화하는 것으로 예견되었다. 인간 심장 및 폐 라이브러리에서 유래한 두 개의 cDNA 클론을 추가로 시퀀싱하여 작용성 분석법용으로 선택하였다.
제조자의 지시에 따라 cDNA 말단(RACE) PCR 기술(Marathon cDNA 증폭 키트, Clontech)의 5' 신속 증폭을 사용하여 METH1의 아미노-터미날 말단을 수득하였다. METH2의 아미노-터미날 말단은 5'RACEPCR을 통하여 부분적으로 얻고, 후에 게놈 스크리닝에 의하여 확인하고 완결시켰다. 게놈 스크리닝을 위해서, BAC 클론(게놈 시스템)을 우선 PCR에 의하여 동정하였다. 150∼200bp의 서열을 포함하는 양성 BAC 클론을 소형 단편으로서 pGEM 벡터내로 순차적으로 서브클론하고 시퀀싱하였다.
GenBank, EMBL 및 SwissProt 데이터베이스를 사용한 유도 아미노산 서열의 분석 및 비교는 이들 유전자가 그 NH2-터미날 말단에 리프로리신과 상동성이 있으며, COOH-터미날 말단에 몇몇 TSP-유사 모티프(motif)가 있는 메탈로프로테아제의 신규 계열에 속한다는 것을 암시하였다. 상기 cDNA를 METH1 및 METH2라 한다: 이때, 메탈로프로테아제에 대해서 ME이고, 트롬보스폰딘에 대하여 TH이다. 마우스 상동성 METH1을 동정하고, ADAMTS1이라 명명한다[Kuno, K.,et al., J. Biol. Chem. 272:556-562(1997)]. 인간 및 마우스 서열의 직접 비교는 높은 수준의 보존을 드러냈다(83.4% 아미노산 동일). 따라서, 훨씬 상동성이 없는 METH2를 동정하였다.
흥미롭게, 최근 동정된 nNPI 단백질[프로콜라겐 Ⅰ N-프로테이나제; {Colidge, A.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2374-2379(1997)}]은 METH1및 METH2에 구조적 유사성 및 현저한 서열을 나타내었다(도 3). 신규 단백질에 대해 기술한 바와 같이, pNPI도 카르복시-터미날 말단에 TSP 도메인 및 메탈로프로테이나제(리프로라이신 아과)를 포함한다. pNPI에 대한 서열의 기원이 소임에도 불구하고, 서열 계열은 동종 구조 특성을 나타내었다. METH1 및 METH2 사이의 아미노산 유사성은 51.7%이었고, METH1 또는 METH2 및 pNPI 사이의 상동성은 각각 33.9% 이하 및 36.3% 이하였다.
서열 분석은 METH1 및 METH2의 ORF가 각각 950 및 890 아미노산의 단백질을 코딩하였다는 것을 나타내었다. 모두 3개의 단백질에 있어서, NH2터미날 말단은 친수성 플롯으로부터 유도된, 아미노산 300 근방의 다른 추정 트랜스멤브레인 도메인으로 이어지는 추정 신호 펩티드를 포함한다. 이들 단백질이 멤브레인으로 경계되는가 여부는 명확하지 않다. 그러나, 주어진 예비 데이터에 의하면, 상기 제2 트렌스멤브레인 도메인이 소수성 포켓으로 구성될 것이며, METH1, METH2 및 pNPI 는 사실상 분비 단백질일 가능성이 높다. 신호 펩티드를 지난 NH2터미날 말단은 징크 메탈로프로테아제의 아과와 상동성을 가지며, 프로도메인(prodomain), 메탈로프로테아제 도메인 및 시스테인-리치 영역으로 부분할될 수 있다.
프로도메인과 메탈로프로테아제 도메인 사이의 경계에 위치하는 도 3의 METH1(아미노산 232-235) 및 METH2(아미노산 211-214)에서 이중 선 서열은 퓨린과 같은 표유 동물의 서브틸리신(subtilisin)에 대한 잠재적 개열 부위이다(Barr, 1991). 단백질 가수분해 과정은 SVMP에서 일어나서, 가용성 메탈로프로테아제 및디스인테그린(disintegrin)을 제공하고[Bjarnason, J.B. & Fox, J.W.,Methods Enzymol. 248:345-368(1995)], 또한 몇몇 ADAM에서 검출되었다[Wolsberg, T.G. & White, J.M.,Developmental Biology 180:389-401(1996)]. 단백질 가수분해 과정은 METH1 및 2 모두에서 일어난다(이하를 참조하라). 또한, METH1 및 METH2는 양자 모두, 특정 기능적으로 중요한 아미노산의 보존으로 인하여 촉매적 활성이 된다고 추정되는 Zn2+-결합 자리(도 3의 점선 부위)를 제공한다[Rawlings, N.D. & Barrett, A.J.,Methods Enzymol. 248:183-228(1995)]. 이 때, 이들 단백질이 활성 프로테아제일 것임을 암시한다.
메탈로프로테아제 도메인 이후에, 두 개의 추정 디스인테그린 루프를 포함하는 시스테인-리치 영역이 있다[Wolsberg, T.G. & White, J.M.,Developmental Biology 180:389-401(1996)](도 3에서 화살표로 표시). 디스인테그린 도메인은 뱀 독액 메탈로프로테아제(SVMP) 및 ADAM(하나의 디스인테그린 및 하나의 메탈로프로테아제 도메인을 포함하는 포유동물 단백질) 중의 메탈로프로테아제 아과내에서 발견되며, SVMP 중의 그 리간드에 대한 인테그린의 결합을 억제할 수 있는 기능을 갖는다. 역으로, 막 결합 단백질(membrane anchored protein)의 부분으로서의 ADAM-디스인테그린-유사 영역은 세포-세포 상호 작용을 파괴하기 보다는 촉진시킬 것이다[Wolsberg, T.G. & White, J.M.,Developmental Biology 180:389-401(1996)]. TSP-유사 도메인은 METH1 및 METH2 단백질의 COOH-절반에 위치한다. METH1은 알려지지 않은 기능을 갖는 스페이서(spacer) 영역에 의하여 분리되는 두 개의 보존TSP 도메인, 및 상동성이 적은 서브도메인, 및 제2 항-혈관 신생 영역을 따르는 단지 5-시스테인을 포함한다. METH2는 스페이서 영역에 의하여 분리되는 두 개의 TSP 도메인을 포함한다. TSP1 및 TSP2의 그것을 갖는 METH1 및 METH2의 TSP-유사 도메인의 계열은 도 5에 나타낸다. 상동성은 모든 TSP 반복 단위 중 유사 아미노산 19.2% 내지 52% 사이에서 변화한다. 1 내지 6의 시스테인 및 별표된 트립토판은 고 보존된다.
인간 게놈 DNA의 써던 블롯(Southern blot)에 의하여 그 게놈 중의 METH1 및 METH2의 존재가 밝혀졌다. METH1 및 METH2 프로브는 그들이 상이한 유전자로부터 전사되었음을 암시하는 상이한 크기의 밴드를 나타내었다.
타입 Ⅰ 반복 단위에 대한 공통 서열은 완전하게 보존된 시스테인 6을 갖는 16 잔기를 포함한다. 통상, 헤파린에 결합한 것으로도 나타나는 서열 모티프 WSXWS(SEQ ID NO:82)로부터 시작된다[Guo, N.,et al., J. Biol. Chem. 267:19349-19355(1992)]. 이러한 영역의 헤파린에 대한 친화성은 TSP-1의 항-혈관 신생 활성 부분으로 제안되었다[Guo, N.,et al., J. Peptide Res. 49(1997)]. TSP 과 단백질의 5 멤버 중 단지 TSP-1 및 TSP-2 만이 혈관 신생을 억제하며, 타입 Ⅰ 반복 단위를 포함한다[Tolsma, S.S.,et al., J. Cell. Biol. 122:497-511(1993); Kyriakides, T.R.,et al., J. Cell Biol. 140:419-430(1998)]. 타입 Ⅰ 또는 프로퍼딘(properdin) 반복 단위는 아마도 5억 내지 9억년 이전에 엑손 셔플링(shuffling)에 의해서 TSP1 및 2의 전구체에 첨가되었을 것이다[Adams, J.,et al., The Thrombospondin Gene Family, 1Ed. Molecular Biology IntelligenceUnit(Springer, Ed.), R.G. Landes Company, Germany(1995)]. 이러한 도메인의 획득은 신생 혈관 형성의 조정과 같은 기능을 갖는 TSP1 및 TSP2의 전구체를 제공하였을 것이다. 최근에, p53에 의하여 조절되는 그 능력 때문에 뇌 라이브러리에서 분리된 단백질인 BAI-1(뇌 혈관 신생 억제자-1)이 또한 TSP-1의 타입Ⅰ 반복 단위를 포함하고, 상기 분자에 잠재적 항-혈관 신생력을 제공함이 밝혀졌다[Nishimori, H.,et al., Oncogen 15:2145-2150(1997)]. 그럼에도 불구하고, 추가 서열 또는 전후관계가 또한 중요한 것으로 보여지는데, 이는 타입Ⅰ반복 단위를 포함하는 다른 단백질이 프로퍼딘, F-스폰딘 및 기타 상보성 과의 일원과 같은 항-혈관 신생성을 명확하게 갖는 것이 아니라고 보여지기 때문이다.
그 항-혈관 신생성과 함께, METH1 및 METH2 중의 TSP-반복 단위의 존재 때문에, 이들 단백질은 본래 TSP 아과의 일원이라고 생각되었다. 그럼에도 불구하고, 그들은 다른 TSP와 추가의 상동성을 갖지 않으며, 사실상 TSP1 및 TSP2와의 유사성은 타입 I 반복 단위로 제한된다. 또한, 상기 단백질은 ADAM 과의 일원과 강한 서열 및 구조적 상동성도 갖는다. 이러한 특징들은 Kuno 및 그 동료들이 ADAMTS를 마우스 상동성 METH1으로 명명하도록 하였다[Kuno, K.,et al., J. Biol. Chem. 272:556-562(1997)]. pNPI 및 상기 단백질에 대한 그 현저한 서열 상동성의 최근 동정은 여기에서 이들 세 개의 모든 단백질이 메탈로스폰딘으로 명명되는 아과로 분류되도록 기술하였다. 이러한 점에서, pNIP가 항-혈관 신생성을 갖는지 여부 또는 METH1 및/또는 METH2가 αI(I) 프로콜라겐의 아미노 터미날 프로-펩티드의 개열에 참여하는지 여부가 명확하지 않다.
실시예 2: 노던 및 써던 블롯 분석
전술한 바와 같은 구아니디늄-이소티오시아네이트 추출에 의하여 세포로부터 총 RNA를 정제하였다[Chomczynski, P. & Sacchi, N.,Anal. Biochem. 162:156-159(1987)]. 제조자의 조건에 따라 베링거 맨하임(Boehringer Mannheim) (BMB, Indianapolis, IN) 키트를 사용하여 폴리(A)+RNA를 추출하였다. 기타 폴리(A)+RNA 블롯을 클론테크(Palo Alto, CA)에서 구입하였다. 42℃에서, 12 내지 18시간 동안, 50% 포름아미드, 6X SSPE, 1X 덴하츠 용액(Denhardt's solution), 0.1% SDS 및 100㎍/㎖의 열변성 연어 기름 DNA를 포함하는 용액 중에서, 예비-하이브리드화를 수행하였다. 표지된 cDNA 프로브를 사용한 하이브리드화를 동일한 용액에서 42℃에서, 12 내지 18시간 동안 진행시켰다. TSP1 및 METH1 프로브는 전체 인간 cDNA에 상응하였다. METH2 프로브는 인간 cDNA로부터의kpnI-EcoRI 단편에 상응하였다. 글리세르알데히드-3-포스페이트-디하이드로제나제(GPDH)의 1.3kb PstI 단편을 적하를 위한 표준화 및 효율 이동에 사용하였다. 막들을 Kodak Biomax MS 필름(Kodak, New Haven, CT)에 노출시켰다.
써던 블롯에 있어서, 프로메가(Madison, WI)에서 구입한 인간 게놈 DNA를 65℃에서 10분 동안 가열시키고, 37℃에서 밤새도록EcoRI 및PstI로 소화시켰다. 소화된 DNA 5㎍을 1% 아가로스 겔에서 분리하여, 니트란 막에 옮긴 후, 자외선으로 가교시켰다. cDNA 프로브, 및 예비하이브리드화 및 하이브리드화 조건은 노던 블롯에 대하여 기술한 바와 동일하였다. 블롯들은 매우 엄격하게 세척하였다(0.2X SSC, 0.2% SDS, 50℃).
성체 및 배조직에서 METH1 및 METH2의 발현 패턴을 조사하였다. 노던 블롯 분석은 인간 조직에서 유래한 폴리(A)+RNA를 포함하는 블롯을 사용하여 매우 엄격한 조건하에서 수행하였다. METH1 및 METH2 전사체는 각각 4.6 및 3.7Kb의 단일 밴드를 나타내었다. 풍부한 METH1 mRNA 발현은 부신, 심장, 태반, 그 다음, 골격 근육, 갑상선 및 위에서 관찰되었다. 배조직 분석에서, 신장이 METH1 mRNA의 가장 높은 발현을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 분석된 모든 조직에서 더 약한 METH1 mRNA 발현이 나타났다. METH2 mRNA의 분포는 더욱 제한되었으며, METH1의 그것 보다 약하였다. 가장 높은 발현은 배 및 성체 모두에서 폐에서 나타났다. 흥미롭게, METH1 및 METH2 발현은 중첩되지 않는 것으로 보인다. 조합에 있어서, 구조적 유사성 및 그 발현 패턴은 기능적 여분 그러나 상이한 전사 조절을 암시한다. 비교 목적으로, 동일한 블롯에서 TSP1 전사물의 발현 수준도 분석하였다. TSP1 mRNA 최고 발현은 성체 태반 및 분석된 모든 배조직에서 나타났다. METH1 및 METH2와는 달리, 조사된 다른 모든 조직에서 일정한 수준의 TSP1 전사물이 관찰되었다.
폴리(A)+RNA의 노던 분석법에 의하여 세포 타입 분배를 또한 연구하였다. METH1 mRNA는 피부 섬유아세포, 혈관 평활근, 자궁 내막 간질 세포, 및 두 개의 암 세포주, HeLa 및 G631, 선암 및 흑색종 각각에서 낮은 농도로도 검출할 수 있었다. METH2 mRNA는 단지 SW480, 콜론 암종 세포주 상에서만 검출되었으나, 분석된 다른 세포주 또는 주요 균주 중 어느 것에서도 발현이 나타나지 않았다.
혈관 신생 및 항-혈관 신생 그룹이 특정 기관에 있어서 혈관망 형성을 조절할 가능성은 종종 진실처럼 가정되어 왔으나, 아직 증명되지 않았다. 명백하게 별개이며, 거의 중첩되지 않는, METH1 및 METH2의 발현 패턴은 적어도 전체 수준에 대하여 수수께끼였다. TSP1 및 TSP2도 동일 구조, 높은 수준의 아미노산 유사성을 공유하나, 그들의 발현 패턴은 상당히 상이하다[Iruela-Arispe, M.L.,Dev. Dyn. 197:4056(1993)]. 차이점은, 이전에 암시되었던 것처럼, 상이한 조절 메카니즘 및 그 프로모터에서의 비유사한 시스-액팅 요소에 기초하는 것 같다. METH1 및 2에 대한 프로모터가 특징화되어 있지는 않지만, 그들이 각 유전자의 조절에 있어서 독특한 특징을 부여하는 것 같다. 그럼에도 불구하고, 증명된 항-혈관 신생성을 갖는, 하나의 모티프, 항-혈관 신생/타입 Ⅰ 반복 단위가 상이한 조직 특이성을 갖는 여러개의 단백질에 존재할 가능성은 호소력이 있다. 대안적으로, 동일 과의 매우 가까운 멤버 사이의 서열에 있어서의 작은 차이점은 기능적 여분을 넘어서는 중요성을 가질 것이다. TSP1 및 TSP2의 경우에 있어서, 현저한 구조적 유사성 및 아마도 보유할 기능적으로 공통하는 항-혈관 신생성과는 별개로, TSP1 및 TSP2는 그들의 유사한 관계에서 공유될 수 있을 것 같지 않은 그 자신의 기능을 나타내는 것으로 보여진다. 이는 이들 유전자에 대한 두 넉-아웃(knok-out)의 결과로 분명히 나타났다. TSP1이 없는 동물은 첫째로 폐 장애[Lawler, J., et al., J. Clin. Invest. 101:982-992(1998)], 둘째로 혈관 장애를 나타내었으나, 이는 단지 특정 병리학적 상태 또는 제한된 기관에서만 나타났다. 반면에, TSP2 넉-아웃 마우스는 피부, 건 및 뼈에 영향을 주는 예상치 못한 콜라겐 집합 장애를 나타내었다[Kyriakides, T.R.,et al., J. Cell Biol. 140:419-430(1998)]. 또한,이들 동물은 피부의 모세관 밀도가 전체적으로 증가하는 것으로도 나타났다. 메탈로스폰딘 과의 새롭게 기술된 멤버 사이의 닮음이 기능적으로 번역되는 방법이 이해되지 않는다. 명백하게, pNIP는 타입 I 프로콜라겐의 N-터미너스를 개열시킴으로써 활성 단백질 가수분해 활성을 나타내는 것으로 나타났다[Colidge, A.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2374-2379(1997)].
두 번째 기능적 관심 영역은 디스인케그린 도메인에 상응한다. 이 도메인은 αIIbβ3에 결합하며, 응고를 차단하는 혈소판 상호 작용을 억제하는 것으로 나타난 뱀 독액 메탈로프로테아제의 관련 멤버를 보다 완전한 특징으로 한다[Pfaff, M.,et al., Cell Adhes Commun. 2:491-501(1994); Usami, Y.,et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 201:331-339(1994)]. 상기 디스인테그린 모티프는 종종 아스파르트산의 위치에 음전하 잔기 또는 RGD를 포함하는 13 내지 15개의 도메인으로 구성된다. RGD 또는 등가물은 인테그린에 결합하고, 안타고니스트 또는 시그날링 리간드로서 기능한다[Wolsberg, T.G. & White, J.M.,Developmental Biology 180:389-401(1996)]. METH2(단, METH1은 아님)는 디스인테그린 도메인에 대하여 아미노-터미날 위치되는 RGD 서열을 갖는다. 또한, 양 분자 모두 디스인테그린 모티프 내에 시스테인의 보존 정도가 비교적 높게 존재한다(단, 완전한 것은 아니다). 이것은 인테그린과의 상호작용 능력과 이 영역의 3차 구조에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 또한, 이들 영역 중 일부는 기능적 접착 분자(특히, 트랜스멤브레인 영역을 갖는 것)로서 기능하는 것으로 나타났다[Wolsberg, T.G. & White, J.M.,Developmental Biology 180:389-401(1996)]. 이는 METH1 및 METH2의경우에는 그럴 것 같지 않은데, 이들 양 단백질은 분비되는 것같기 때문이다.
실시예 3: 재조합 단백질의 발현 및 정제
His-택(His-tagged) 융합 단백질의 발현을 위한 재조합 작제물을 박테리아 중의 발현을 위하여 제조하였다.BamHI 및PstI 위치를 포함하는 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의하여 METH1 nt 605-1839(ATG로부터)를 증폭시키고, pRSET 벡터내로 서브클론시켰다(Invitrogen, Carlsbad, CA). 상기 작제물을 시퀀싱하여 프레임 및 서열 충실도를 증명한 후, BL21;DE3E. Coli 균주내로 형질 전환시켰다(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Ni-NTA 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. PBS 중의 500mM 이미다졸을 사용하여 재조합 단백질을 용출시켰다. 재조합 단백질을 함유하는 분획물을 페놀-레드 없는 DMEM에 대하여 투석하고, 항혈청 생성을 위하여 사용하였다.
재조합 단백질(500㎍/㎖) 및 프로이드 보조제(Freud's adjuvant)의 1:1 혼합물의 근육내 주사에 의하여 항혈청을 생성시켰다. 5마리의 기니아 피그 및 3마리의 토끼를 포함하는 8마리의 동물에게 매 15일 마다 3 주기 동안 주사하였다. 3번의 주사 후, 항-METH1 항체의 존재에 대하여 혈청을 평가하였다. 기니아 피그 중 단지 2마리만이 상당한 역가를 나타내었다. 상기 항체는 웨스턴 블롯에서 재조합 단백질을 인식하였고, 세포 추출물로부터 METH1 단백질을 면역침전시키고 면역세포화학에 의하여 상기 단백질을 인식할 수 있었다. 예비-면역 혈청은 항상 대조군으로서 포함되었다. 기나아 피그 항체 중 하나는 METH2도 인식할 수 있었다.
포유 동물 발현에 있어서, 전장 METH1 및 METH2 cDNA를 pcDNA3.1 발현 벡터(인비트로젠)내로 클로닝시켰다. 상기 벡터는 CMV 프로모터의 조절 제어하에 있다. 작제물들이 그 자신의 종결 코돈을 함유하도록 클로닝을 수행하였다.
표준 칼슘 포스페이트 침전법을 이용하여 293 T 세포 중에서 발현 벡터의 일시적 형질 전환에 의하여 재조합 단백질을 얻었다. 형질 전환 시, 세포를 혈청-함유 배지에서 6 내지 16시간 동안 항온 처리한 후, 재조합 단백질 축적을 위하여 36시간 동안 혈청 없는 배지로 교체하였다. 대조군으로서, pcDNA3.1 벡터만을 평판에서 일시적으로 형질 전환시켰다. 단백질 정제는 30% 암모늄 설페이트 침전 후, HS 완충액상에서의 투석을 포함하였다(DB=10mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM CaCl2및 1mM MgSO4). 그 후, 샘플을 헤파린-친화성 크로마토그래피시켰다. 헤파린 컬럼으로부터의 용출은 550mM NaCl을 함유하는 HS 완충액을 사용하여 수행하였다. 그 후, 분획물을 5-30% 수크로스 농도 차등물에 적하하고, 48K에서 회전시켰다. 수크로스 농도 차등물에서의 분리는 웨스턴 블롯팅에 의하여 평가하였고, 순도는 코마시 블루(Commmassie blue) 및 실버 니트레이트 염색에 의하여 측정하였다.
재조합 단백질의 생성은 초기에 박테리아에서 수행하였다. 정제에 도움이 되는 아미노 터미날 His Tag을 포함하는 METH1 발현 벡터를 생성시켰다. 모든 METH1에 대하여 코팅되는 생성 단백질은 프로도메인 이외의 서열을 번역하였다. Ni++-비드 상의 친화성 크로마토그래피는 68kD의 독특한 밴드를 나타내었다. 분리 및 정제는 항상 비변성 조건하에서 수행하였고, 단백질을 다시 접으려는 시도는 덜 성공적이었는데, 아마도 이는 다량의 시스테인과 회합된 상당한 수의 세포내 디설파이드 결합 때문일 것이다. 그럼에도 불구하고, 상기 단백질을 사용하여 항체를 형성시켰다. 주사된 8마리의 동물 중에서, 단지 2마리만이 면역 반응을 개시할 수 있었고, 특이적 항체를 생성할 수 있었는데, 이는 고 보존 교차 종 때문일 것이다. 두 항체는 모두 Ni++컬럼 상에서의 정제전 및 정제후에 재조합 METH1 단백질을 인식하였다. 상기 항체는 또한 세포 라이세이트(lysate)의 웨스턴 블롯에서 단백질의 발현을 평가하는데 사용하였다. 약 105 내지 110 kD의 단일 밴드가 간질 섬유아세포 및 평활근 세포에서 검출되었다.
METH1 및 METH2가 혈관 신생의 조절자로서 기능할 수 있다는 가설을 시험하기 위하여, 재조합 전장 단백질을 포유 동물 세포에서 생성시켰다. 초기에, 생체외 번역에 의하여 정확한 리딩 프레임 및 분자량의 평가 시험을 수행하였다. METH-1 오픈 리딩 프레임의 번역은 cDNA 서열의 번역에 의하여 예견되는 크기보다 약간 큰 110kD 단백질로 드러났다. 전술한 바와 같이, 두 개의 추정 글리코실화 자리가 있고, 단백질의 더 큰 크기는 당 잔기의 첨가로 인한 것인 것 같다. 유사하게, METH2는 또한 98kD 단백질을 나타내어 그 예상 크기보다 약간 큰 것으로 나타났다.
본래의 조건하에서 293T 상청액에서 재조합 단백질을 분리하여 제2차 구조를 보호하였다. 유도된 아미노산 서열 및 쥐과 상동성 ADAMTS에 대한 공개된 정보의 분석으로부터, 두 단백질 모두 헤파린에 결합할 수 있음을 예견할 수 있었고, 정제를 위하여 친화성 크로마토그래피를 사용하였다. METH1, METH2 및 벡터 대조군으로 형질 전환된 293T 세포의 조절된 배지 및 두 세포 층을 사용하여 정제하였다. METH1 및 2의 분자량은 망상 적혈구 라이세이트로부터의 그것과 유사하였다. 예견하였던 바와 같이, 두 단백질 모두 분비되었다. 흥미롭게, 상기 배지는 전장(110kD) 및 두 개의 가공 형태, METH1에 대한 85 및 67kD 및 METH2에 대한 79 및 64kD를 포함한다. 85 및 79kD 분자량은, 공통 서브라이신(sublisin) 위치에서 개열 후, 양 단백질에 대하여 예견되었던 크기와 일치한다. 그러나, 제2 과정은 67 및 64kD 각각에서 관찰되는 가장 풍부한 단편을 생성하도록 일어나야만 한다. 이러한 형태는 프로테이나제 억제자의 부재에서 조차도 정제후에 안정하다. 정제를 위하여, 단백질을 우선 암모늄 설페이트 침전에 의하여 농축시킨 후, 투석하였다. 그 후, 생성 단백질 현탁액을 헤파린-세파로스 컬럼 처리하였다. 550mM NaCl을 함유하는 세척 완충액을 사용하여 재조합 METH1 및 METH2를 용출시켰다. 분획물은 프로-METH1 및 가공 형태 양자 모두를 포함하였다. 과정이 단백질의 기능에 비례하는지 여부가 불명료하였기 때문에, 두 형태를 슈크로스 농도 차등물 상에서 분리하였다. 전장 및 가공 형태 양자 모두를 사용하여 혈관 신생 분석을 실시하였다.
절단된 융합 단백질의 발현을 위한 재조합 작제는 다음과 같다: (1) pRSET-METH1-Type I:METH1 nt 1605-1839(출발 코돈으로부터)을 다음과 같은 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의하여 증폭시켰다: 5'-GCA TTT TGG ATC CGC CTT TTC ATG-3'(SEQ ID NO:78) 및 5'-GTT GTG TGC TGC AGA TTG TTC C-3'(SEQ ID NO:79). 그 후, 증폭된 단편은 pRSET 벡터의BamHI 및PstI 자리내로 서브클로닝시켰다; (2) pGEX-5X 벡터(Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ)의SmaI 자리내로 pRSET-METH1-TSP로부터의BamHI-EcoRI 단편을 블런트-엔트 라이게이션(blunt-end ligation)에 의하여 라이게이팅함으로써 pGEX-METH1-TSP를 생성시켰다; (3) pGEX-1.0-METH2:METH2 cDNA의 단편 nt 838-1818(출발 코돈으로부터)을 pGEM-2TK의BamHI-EcoRI 자리내로 라이게이트시켰다. 상기 METH2 단편은 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR에 의하여 증폭시켜BamHI 및EcoRI 제한 자리를 생성시켰다: 5'-GAAAAATGGGGATCCGAGGTG-3' (SEQ ID NO:80) 및 5'-GCAGGAGAATTCCGTCCATG-3' (SEQ ID NO:81); (4) pGEX-METH2-TSP:pGEX-1.0-METH2로부터 분리된 0.5KbXmaI-EcoRI 단편을 pGEX-2TK 벡터의EcoRI 자리 및XmaI 자리내로 서브클로닝시켰다. 모든 작제물을 시퀀싱하여 서열 충실도를 증명하고 오픈 리딩 프레임을 바로잡았다.
재조합 단백질은 플라스미드 pRSET-METH1-TSP로 발현된 재조합 단백질 6H-METH1, 플라스미드 pGEX-METH1-TSP로 발현된 단백질 GST-METH1, 및 플라스미드 pGEX-METH2-TSP로 발현된 단백질 GST-METH2로 명명되었다.
발현 플라스미드는 BL21:DE3E.coli균주(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)내로 형질 전환되었고, 융합 단백질은 제조자 권고 사항에 따라 유도되었다. 간략하게, 유도된 박테리아 펠렛을 PBS에서 재현탁시키고, 1분 동안 초음파 처리하였다. 이어서, 상기 현탁액을 1% 트리톤 X-100의 존재하에 20분 동안 실온에서 항온 처리하고, 4℃에서 원심 분리하였다. 그 후, 히스티딘 택 융합 단백질은 1㎖ 비드를 갖는 상청액 20㎖(50% 슬러리)를 4℃에서 2시간 동안 항온 처리함으로써 Ni-NTA 비드(Qiagen, Chatsworth, CA) 상에서 정제하였다. 상기 현탁액을 컬럼에 옮겨서, 10mM 이미다졸, 그 다음에는 50mM 이미다졸, 그리고 마직막으로는 100mM 이미다졸을 함유하는 PBS 10컬럼 부피로 세척하였다. PBS 중의 500mM 이미다졸로 단백질을 용출시켰다. 재조합 단백질을 함유하는 분획물을 페놀-레드 없는 DMEM에 대하여 투석시켰다. 샘플들을 4℃에서 30분 동안 원심 분리하였고, 단백질 부분은 가용성이 아니었고, 원심 분리 중에 소실되었다. 상기 상청액을 -70℃에서 저장하였고, 증식, 각막 포켓 및 융모막요막(CAM) 분석에 사용하였다.
GST-융합 단백질의 정제를 위하여, 추출물을 원심 분리로 깨끗하게 하고, GST-친화성 컬럼(파마시아)에 적용하였다. 상기 컬럼을 0.1mM 환원 글루타치온의 존재하에 PBS-1% 트리톤 X-100으로 세척하고, 이어서 0.5mM 환원 글루타치온의 존재하에 동일한 완충액으로 세척하였다. 50mM 트리스-HCl, pH 7.5 중의 10mM 환원 글루타치온으로 융합 단백질을 용출시켰다. 상기 단백질을 함유하는 분획물을 DMEM에 대하여 투석시키고, -70℃에서 저장하고, 증식, 각막 포켓 및 융모막 요막(CAM) 분석에 사용하였다.
쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색된 12.5% 또는 15% 아크릴아미드 겔 중에서 재조합 단백질의 순도 및 통합성을 분석하였다.
TSP의 첫 번째 두 타입 I 반복 단위를 포함하는 재조합 GST 융합 단백질을 또한 기능 분석에 사용하기 전에 DMEM에 대하여 투석시켰다. 전술한 바와 같이 그대로의 TSP1을 혈소판으로부터 정제하였다[Roberts, D.D.,et al., J. Tissue Cult. Methods 16:217-222(1994)].
METH1 및 METH2 TSP 도메인이 혈관 신생의 조절자로서 기능할 수 있다는 가정을 시험하기 위하여, 재조합 융합 단백질을 박테리아 중에서 생성시켰다. 그 작제물은 METH1 또는 METH2의 제1 TSP 도메인을 포함하였다. 이 도메인은 TSP1 의 제2 타입 I 반복 단위와 52% 아미노산 유사성이 있는 가장 보존된 것이다(이 도메인은 CD 36에 대한 추정 결합 자리를 포함한다). 가능한한 그 제2 구조를 보존하기 위하여 모든 재조합 단백질을 원래의 조건하에 분리하였다. 6H-METH 및 GST-METH1은 각각 GST 또는 히스티딘 택에 융합된 METH1의 제1 TSP-유사 도메인을 함유하였다. METH1 재조합 단백질은 정제 및 구조적 이점 때문에 두 개의 상이한 택을 사용하여 제조하였다. 크기의 차이는 택, 6KDa 히스티딘 및 27KDa GST의 크기 때문이다. GST-METH2는 또한 GST에 융합된 METH2의 제1 TSP 도메인을 함유하였다. 또한 GST에 융합된 TSP1의 마지막 두 개의 타입 I 반복 단위에 상응하는 단편, 및 혈소판으로부터 정제된 본래의 TSP1을 양성 대조군으로 사용하였다. 또한, GST 단독을 음성 대조군으로서 모든 실험에 포함시켰다.
실시예 4: METH1 및 METH2 중의 TSP 도메인의 생체내 혈관 신생 파괴
각막 포켓 분석
스위스 웹스터 암컷 및 수컷을 찰스 리버(Boston, MA)에서 구입하여, 8 내지 10주령의 것을 펠릿 이식용으로 이용하였다. 각막 포켓을 Kenyon 및 그 동료들에 의해서 기술된 바[Kenyon, B.M.,et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:1625-1632(1996)]와 같이 (약간의 변경만을 수반하여) 수행하였다. 간략하게, 재조합 bFGF 10㎍ 및 슈크랄페이트 5mg의 용액을 하이드론(에탄올 중 200mg/㎖; New Brunswick, NJ) 10㎕ 및 당해 재조합 단백질(2㎍)과 혼합하였다. 그 후, 현탁액을멸균 나일론 메쉬 스퀘어(기공 크기 500㎛; Tetko Inc., Briarcliff Manor, NY) 위에 도말한 후, 30분 동안 건조시켰다. 메쉬의 섬유를 잡아당겨서 펠릿 500μ㎥을 생성시키고, 이를 -20℃에서 저장하였다. 균일한 크기의 펠릿을 현미경 하에서 선택하여 분석용으로 사용하였다.
마우스를 아버틴으로 마취시켰다. 수술 칼과 니콘 SMZ-U 해부용 현미경을 사용하여 각막을 절개하였다. 단일 펠릿을 포켓에 주입하였다. 펠릿 주입 5일 후, 각막 혈관 신생을 평가하고, 촬영하였다.
CAM 분석
배 발생 12 내지 14일에 레곤 닭 배낭(SPAFAS, MA)에서 융모막 요막 분석을 수행하였다. 마트리겔(750㎍/㎖), VEGF(250ng/메쉬) 및 실험용 단백질 또는 펩티드를 혼합하여 나일론 메쉬(기공 크기 250㎛; Tetco Inc.)에 놓고, 이어서 37℃에서 30분 및 4℃에서 2시간 동안 항온 처리하여 중합 반응을 유도하였다. 양성(마트리겔 및 VEGF) 및 음성(VEGF 단독) 대조군을 또한 각 CAM을 위하여 제조하였다. 중합된 메쉬를 CAM의 세 번째 외부 영역에 놓고, 24시간 동안 항온 처리하였다. 용기를 시각화하기 위하여, 형광 이소티오시아네이트 덱스트린 400㎕(10mg/㎖, SIGMA)를 닭 혈류에 주사하였다. 항온 처리 5 내지 10분 후, 3.7% 포름알데히드를 사용하여 상기 닭을 5분 동안 국소적으로 고정시켰다. 그 후, 상기 메쉬를 절개하여 슬라이드 위에 놓았다. 컴퓨터 보조 영상 프로그램(NIH 영상 1.59)을 사용하여 형광 강도를 분석하였다.
이 분석에서 사용한 펩티드는 Chiron(Raleigh, NC)에서 합성하였다. 서열은아미노산: P-TSP1, 430-447; P-METH1, 549-563; P-METH2, 529-548에 상응하였다.
혈관 신생 또는 항-혈관 신생 반응의 평가는 상기 반응을 평가하는데 사용한 분석의 감도 및 특이성에 크게 좌우된다. 생체내에서 이들 단편의 항-혈관 신생 활성을 평가하기 위하여, 두 개의 통상적이며 잘 수용되는 혈관 신생 분석법을 사용하였다; 각막 포켓 및 융모막 요막. 각막의 시감도, 소통성 및 무혈관 상태는 매우 유리하며, 신경 혈관 반응의 가시화 및 시험 물질의 국소 적용을 용이하게 한다. 각막에 만들어진 포켓에 공지된 양의 혈관 신생 인자를 펠릿으로 주입한다. 혈관 신생 억제자를 시험하기 위하여, 상기 분자를 동일한 펠릿에 자극자(stimulator)와 함께 주입하고, 그 반응을 자극자 단독의 경우와 비교한다.
이 실험에 있어서, bFGF를 가시화 자극자로서 사용하였다. 재조합 단백질을 함유하는 펠릿을 마우스 각막에 이식하여 bFGF-유도 혈관 신생 반응을 억제하는 그 능력을 대조군의 그것과 비교하였다. GST를 함유하는 bFGF 펠릿을 이식한 경우에, 5일 이내에 새로운 모세 혈관이 각막 둘레로부터, 각막을 가로질러, 그리고 펠릿내에 성장하였다. 반면에, GST-METH1 또는 GST-METH2를 bFGF 펠릿에 첨가한 경우는 혈관 성장이 완전히 없어졌다. 표 4는 수행된 분석 41에서 얻어진 결과의 요약을 포함한다. GST-TSP1 및 혈소판에서 정제된 그대로의 TSP1을 양성 대조군으로 사용하였다. 모든 분석은 동일한 농도에서 수행하였고, METH1 및 METH2가 혈관 신생의 억제에 있어서 TSP1의 그것과 유사한 잠재성을 갖는다는 것을 암시하였다. 또한, 표준 농도의 절반을 사용하는 경우에, 용량-의존 효과를 나타내는 약하지만 두드러진 반응이 나타났다.
[표 4]
각막 포켓 분석에 있어서 METH1 및 METH2 재조합 단백질의 활성
| bFGF 펠릿 | 혈관 신생 각막/총 각막 |
| 비히클 | 5/5 |
| TSP1 | 0/5 |
| GST | 11/11 |
| GST-TSP1-TI | 1/4 |
| GST-METH1-TSP | 0/8 |
| GST-METH2-TSP | 0/8 |
CAM 분석에 있어서, 혈관 신생 성장 인자를 포함하는 매트릭스 중합체내에서 성장하는 혈관의 수를 측정함으로써 혈관 신생 반응을 분석한다. 재조합 METH1 및 METH2 단백질이 VEGF에 의하여 유도된 CAM 분석에 있어서 혈관 신생을 억제하였는가 여부를 측정하기 위하여, VEGF 및 상기 재조합 단백질을 함유하는 마트리겔 중합체를 CAM에 주입하였다. 처리당 세 개의 상이한 중합체를 포함하는 정량 분석 실험을 도 6A에 나타낸다. VEGF 및 5㎍의 GST-METH1 또는 GST-METH2를 함유하는 마트리겔 중합체는 혈관 성장에 있어서 80% 이상의 억제를 유도하였다. TSP1의 타입 I 반복 단위로부터 유도된 GST 재조합 단백질을 사용하여 유사한 잠재성을 밝혀내었다. 또한, 단백질 15㎍/㎖를 사용하는 경우에 METH1 및 METH2 중의 TSP 도메인의 항-혈관 신생 효과는 혈관 성장의 완전한 억제와 투여량-의존적이었다(도 6C 및 D). 동일한 농도에서 GST 단독은 VEGF-자극 혈관 신생에 대하여 상당한 영향은 없었다. METH1 및 METH2의 미가공 형태를 사용하여 수행한 CAM 분석은 가공 형태와 유사한 결과를 제공하였다. 기능을 위하여 가공이 필요한지 여부 또는 CAM 조직이 우리의 단백질의 가공을 유도하는지 여부는 불분명하였다. 따라서, CAM 조직을 사용하여 본래 대로의 단백질을 24시간 동안 항온 처리하였고, 웨스턴 블롯 상에서 그 단백질을 평가하였다. 그 결과는 CAM 조직이 68kD METH1 가공 단백질을 생성시킬 수 있음을 증명한다.
인간 TSP1의 제2 또는 제3 타입 I 반복 단위로부터의 합성 펩티드는 본래 대로의 TSP1의 항-혈관 신생 효과를 모방할 수 있다[Tolsma, S.S., et al., J. Cell. Bio. 122:497-511(1993)]. 사실상, 19-잔기 폴리펩티드는 랫트 각막에서 생체내 혈관신생을 차단하고 배양된 내피 세포의 bFGF-유도 이동을 억제하기에 충분한 것으로 나타났다[Vogel, T.,et al., J. Cell. Biochem. 53:74-84(1993); Tolsma, S.S.,et al., J. Cell. Biol. 122:497-511(1993)]. 동일한 것이 METH1 및 METH2 TSP 도메인에 대해서도 사실인지 여부를 시험하기 위하여, 동일한 영역에서 유도된 펩티드를 합성하였고, 그 항-혈관 신생 활성을 CAM 분석으로 평가하였다. 결과를 도 6B에 나타낸다. METH1 및 METH2의 TSP 도메인 양자 모두로부터 유도된 펩티드는 TSP1의 그것과 유사하게 VEGF-유도 혈관 신생을 차단하였다. 반면에, 스크램블 펩티드(scramble peptide)는 유의적인 효과를 나타내지 않았다.
실시예 5: 증식 분석
인간 피부 내피 세포(HEDC)를 분리하여, 15% 태아 송아지 혈청, 25㎍/㎖ cAMP 및 1㎍/㎖ 하이드로코르티손-21-아세테이트로 보충된 EBM(Clonetics, San Diego, CA) 중의 비트로겐(Vitrogen)TM코팅된 페트리-접시 상에서 성장시키고, 패시지 3 내지 6에 사용하였다. 0.2% BSA를 포함하는 페놀 레드-없는 EBM을 사용한 48시간 동안의 합류 분자막의 항온 처리에 의하여 세포들을 무활동 상태로 만들었다. 효소 분리에 의하여 신생아의 포피에서 인간 피부 섬유아세포를 분리하였다. 섬유아세포 및 평활근 세포 양자 모두를 10% 태아 송아지 혈청으로 보충한 DMEM 중에 유지시켰다. 인간 포유 동물 상피 세포(HMEC)를 클로네티스에서 구매하여 권고된 배지(포유 동물 상피 성장 배지, MEGM)에 유지시켰다.
재조합 단백질의 존재 또는 부재하에, 0.2% BSA, 0.1% 태아 송아지 혈청 및 1ng/㎖의 bFGF로 보충된 EBM 중의 비트로겐TM코팅 24-웰 판에 패시지 3 내지 6 사이의 무활동 인간 피부 내피 세포를 놓고, 37℃에서 48시간 동안 5% CO2에서 항온 처리하였다. 혈관 평활근(VSM) 및 섬유아세포 증식 분석을 위하여, 세포를 동일한 조건을 사용하여 그러나, EBM 대신에 DMEM을 사용하여 항온 처리하였다. 인간 포유 동물 상피 세포를 그 성장 배지에서 항온 처리하였다. 수확 전 마지막 4시간 동안 [3H]-티미딘(1μCi/㎕)의 펄스를 추가하였다. 세포들을 세척하고 10% TCA 중에 고정시켰다. [3H]-티미딘의 혼합은 문헌[Iruela-Arispe, M.L. & Sage, E.H.,J. Cell. Biochem. 52:414(1993)]에 기술된 바와 같은 섬광 계수법에 의하여 측정하였다.
맥킨토시용 In-Stat 소프트웨어(Graph Pad Software)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 정상 분포를 가정하여, 데이터를 원-웨이 ANOVA에 의하여 분석한 후, 그룹들 사이의 비교를 위한 T-테스트 듀네트 테스트(T-test Dunnett test) 또는 그룹사이의 다중 비교를 위한 스튜던트-뉴맨-클루스 테스트(student-Newman-Kleus test)에 의하여 분석하였다.
METH1 및 METH2가 혈관 신생을 억제하는 메카니즘을 관찰하기 위하여, 내피 세포 증식에 대한 정제된 재조합 융합 단백질의 직접적인 효과를 시험하였다. bFGF 및 FCS를 함유하는 성장 배지내에 혈청-결핍 내피 세포를 도말하였다. 재조합 단백질(3㎍/㎖)을 도말과 동시에 첨가하였다. GST 단독을 첨가하였을 때의 유의적이지 않은 효과에 달리, 40%(GST-METH1), 45%(6H-GST) 또는 36%(GST-METH2) 억제가 관찰되었다. TSP1의 타입 I 반복 단위로부터의 재조합 단백질은 유사한 억제 효과를 나타내었다(도 7A). 또한, METH1 또는 METH2에 의하여 매개되는 증식의 억제는 도 7E에 나타낸 바와 같이 용량-의존적이다. 상기 억제는 처리 1 일 후와 같이 초기에 관찰되었고, 억제 효과는 독성이 없었고, 가역적이지 않았는데, 이는 재조합 단백질의 제거에 이은 성장 인자 단독의 첨가가 내피 세포 증식의 회복을 유도하였기 때문이다.
다양한 비-내피 세포에 대한 추가의 증식 분석에 의하여 METH1 및 METH2의 내피 세포에 대한 항-증식 효과의 세포 특이성을 평가하였다. 섬유아세포 또는 평활근 세포 배양액에서는 유의적인 증식 억제가 관찰되지 않았다. 반면에, 이들 두 가지 세포 타입에 있어서 유의적이지는 않지만 재생 가능한 증식 자극이 관찰될 수 있었다. 이러한 결과는 재조합 단백질 제조에 있어서 세포 성장의 임의의 잠재적 비특이적 억제의 존재를 배제한다. 그러나, 포유 동물 상피 세포에 있어서, METH1 및 METH2는 내피 세포와 동일한 정도로 세포 증식을 억제하였다. 흥미롭게, TSP1은 또한 생체외 및 트랜스제닉 모델 양자 모두에서 포유 동물 상피 세포 증식을 억제한다.
METH1 및 METH2가 디스인테그린으로서 작용할 가능성은 그 항-혈관 신생 성과 일치한다. 항체를 사용한 αvβ3 및 β1의 명백한 차단은 종양의 발생 및 종양 양자 모두에 있어서 혈관 신생을 억제하는 것으로 나타났다[Brooks, P.C.,et al., Cell 85:683-693(1996); Brooks, P.C.,et al., Cell 92:391-400(1998); Senger, D.R.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13612-13617(1997)]. 인테그린은 증식 및 이주 신호 양자 모두의 매개를 위하여 필수적이다[Schwartz, M.A. & Ingber, D.E.,Mol. Biol. Cell 5:389-393(1994)]. 따라서, 이들 신호를 방해하는 것은 혈관 신생 과정에 매우 해로울 수 있다. METH1 및 METH2 중의 타입 I 반복 단위만을 함유하는 재조합 단백질을 사용하여 혈관 신생 기능 분석을 수행하였다.
그 혈관 신생-억제 활성에 관한 METH1 및 METH2의 작용 메카니즘은 공지되어 있지 않다. 본 발명자는 이러한 단백질이 분비되어 내피 세포에 결합된다는 증거를 가지고 있다. 또한, 연구는 수용체 및 신호 전달 메카니즘의 동정 쪽으로 안내된다. TSP1으로부터 얻은 사항으로부터 귀결되는 있음직한 가설은 METH1 및 METH2양자 모두가 CD36에 결합한다는 것이다. 최근에, 상기 제거제 수용체를 TSP-1이 그 항-혈관 신생 효과를 발휘하는 신호의 전달에 관련시켰다[Dawson, D.W.,et al., J. Cell. Biol. 138:707-717(1997)]. CSVTCG(SEQ ID NO:83)[Asch, A. S.,et al., Nature 262:1436-1439(1993); Catimel, B.,et al., Biochem. J. 284:231-236(1992)] 및 GCQXR(SEQ ID NO:84) 서열 양자 모두는 CD36에 대한 제1 결합 모티프로서 제안되었다[Dawso, D.W., et al., J. Cell. Biol. 138:707-717(1997)].METH1 및 METH2는 이들 영역 모두에서 거의 전부 보전된다. 보완적인 가능한 발생이 METH1 및 METH2가 bFGF에 결합하는 것이다. 헤파린 및 bFGF에 대한 결합은 TSP1의 항-혈관 신생 활성의 일부로서 제안되었다[Guo, N.,et al., J. Peptide Res. 49(1997)]. 이러한 성질은 WSXWS(SEQ ID NO:82) 모티프를 통하여 매개되며, METH1 및 METH2 중에 보존되는 것으로 보인다. 추가의 노력은 이들 신규한 단백질에 의하여 매개되는 항-혈관 신생 성질에 함축되는 신호 및 세포외 환경의 프로테아제로서의 그 잠재성에 대하여 모아질 것이다.
실시예 6: 기탁 샘플로부터의 METH1 또는 METH2 cDNA 클론의 분리
기탁 샘플로부터 METH1 또는 METH2를 분리하기 위하여 두 가지 접근법을 사용할 수 있다. 첫째, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 적당한 호스트[예를 들어, XL-1 블루(스트라타진)]에 상기 기탁 클론을 형질 전환시킨다. 상기 기탁 클론의 예로는 벡터 제공자에 의하여 제공되는 것, 또는 관련 공개 또는 환자에게서 얻은 것이 있다. 플레이트당 약 150 개의 형질 전환체(콜로니) 밀도로, 형질 전환체를 1.5% 아가 플레이트(적당한 선택 시약, 예를 들어, 앰피실린을 포함)에 도말한다. 그 후, 당업계에 주지된 핵산 분리 기술을 사용하여 DNA를 생성하는데에 하나의 단일 콜로니를 사용한다[예, Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edit., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press].
대안적으로, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3의 양 말단(즉, 클론의 5'NT 및 3'NT에 의하여 경계지워지는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3의 영역내)으로부터 유도되는 17-20 뉴클레오티드의 두 개의 프라이머를 합성하여, 주형으로서 기탁 cDNA플라스미드를 사용하는 METH1 또는 METH2 cDNA를 증폭시키는 데 사용한다. 통상의 조건, 예를 들어, 상기 cDNA 주형 0.5㎍을 포함하는 반응 혼합물 25㎕ 중에서 폴리머라제 연쇄 반응을 수행한다. 통상의 반응 혼합물은 MgCl21.5-5mM , 0.01%(w/v) 젤라틴, 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 20μM, 각 프라이머 15pmol 및 Taq 폴리머라제 0.25 Unit이다. 퍼킨-엘머 세터스 오토메이티드 써멀 싸이클러(Perkin-Elmer Cetus automated thermal cycler)를 사용하여 PCR 35 주기를 수행하였다(94℃에서 1 분 동안 변성: 55℃에서 1분 동안 어닐링: 72℃에서 1분 동안 신장). 아가로스 겔 전기 영동법을 사용하여 증폭된 생성물을 분석하고, 예측 분자를 갖는 DNA 밴드를 절제하여 정제한다. PCR 생성물은 DNA 생성물을 서브클로닝하고 시퀀싱함으로써 선택된 서열인 것으로 증명되었다.
몇몇 방법은 기탁 클론에 존재할 수 있는 METH1 또는 METH2 유전자의 5' 또는 3' 비-코팅 부분의 동정을 위하여 유용하다. 이러한 방법에는 필터 프로빙, 특정 프로브를 사용하는 클론 인리치먼트, 및 당업계에 주지되어 있는 5' 및 3' "RACE" 프로토콜과 동일하거나 유사한 프로토콜 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 5' RACE와 유사한 방법은 소정 전장 전사체의 소실 5' 말단을 생성시키는데 유용하다[Fromont-Racineet al., Nucleic Acids Res. 21(7):1683-1684(1993)].
간략하게, 특이적 RNA 올리고뉴클레오티드는 전장 유전자 RNA 전사체를 아마도 포함하는 RNA 집단의 5' 말단에 라이게이트된다. 당해 METH1 또는 METH2 유전자의 공지된 서열에 특이적인 프라이머 및 라이게이트된 RNA 올리고뉴클레오티드에 특이적인 프라이머를 함유하는 프라이머 셋트를 사용하여 METH1 또는 METH2 전장 유전자의 5' 부분을 PCR 증폭시킨다. 그 후, 이러한 증폭 생성물을 시퀀싱하여 전장 유전자를 생성하는데 사용한다.
폴리-A+RNA를 사용할 수 있지만, 상기 방법은 소정 원에서 분리된 총 RNA에서 시작한다. 그 후, RNA 제제를 필요에 따라 포스페이트로 처리하여 추후 RNA 리가제 단계를 방해할 수 있는 손상 RNA에 있어서 5' 포스페이트를 제거할 수 있다. 그 후, 상기 포스페이트를 불활성화시켜야 하고, 메신저 RNA의 5'말단에 존재하는 캡 구조를 제거하기 위하여 상기 RNA를 토바코 산 피로포스파타제로 처리한다. 이러한 반응은 그 후 T4 RNA 리가제를 사용하는 RNA 올리고뉴클레오티드에 라이게이트될 수 있는 캡 개열된 RNA의 5' 말단에 5' 포스페이트기를 남긴다.
이러한 개질 RNA 제제를 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하는 제1 스트랜드 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용한다. 제1 스트랜드 합성 반응은 당해 유전자의 공지 서열에 특이적인 프라이머 및 라이게이트된 RNA 올리고뉴클레오티드에 특이적인 프라이머를 사용하는 소정 5' 말단의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용한다. 그 후, 상기 반응 생성물을 시퀀싱하고 분석하여 5' 말단 서열이 METH1 또는 METH2 유전자에 속한다는 것을 확인한다.
실시예 7: METH1 또는 METH2의 박테리아 발현
실시예 5에서 언급된 바와 같이, DNA 서열의 5' 및 3' 말단에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 삽입 단편을 합성한다. cDNA 인서트(insert)를 증폭시키는데 사용하는 프라이머는 발현 벡터내로 증폭 생성물을 클로닝하기 위한 프라이머의 5' 말단에 제한 효소 자리(예를 들어, BamHI 및 XbaI)를 포함한다. 예를 들어, BamHI 및 XbaI는 박테리아 발현 벡터 pQE-9(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) 상의 제한 효소 자리에 상응한다. 이러한 플라스미드 벡터는 항생제 내성(Ampr), 박테리아의 복제 오리진(ori), IPTG-조절 가능 프로모터/오퍼레이터(P/O), 리보솜 결합 자리(RBS), 6-히스티딘 택(6-His), 및 제한 효소 클로닝 자리를 암호화한다. 상기 pQE-9 벡터는 BamHI 및 XbaI로 소화되며, 증폭 단편은 박테리아 RBS에서 개시되는 리딩 프레임을 유지하는 pQE-9 벡터 내로 라이게이트된다. 그 후, 라이게이션 혼합물을 사용하여 플라스미드 pREP4의 멀티 카피를 함유하는E. coli균주 M15/rep4(Qiagen, Inc.)를 형질 전환시키는데, 이 때, 상기 pREP4는 lacI 리프레서(repressor)를 발현시키며, 또한 카나마이신 내성(Kanr)을 부여한다. 형질전환체는 LB 플레이트상에서 성장할 수 있는 그들의 능력에 의해서 동정되며, 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니가 선택된다. 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 분석법에 의해서 확인한다.
Amp(100㎍/㎖) 및 Kan(25㎍/㎖)로 보충한 LB 배지 중의 액체 배양물 중에서 소정 작제물을 포함하는 클론을 밤새도록 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 거대 배양물을 접종시킨다. 세포들을 0.4 내지 0.6의 광학 밀도 600(O.D.600)로 성장시킨다. 그 후, IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드)를 최종 농도 1mM로 첨가한다. IPTG는 lacI 리프레서를 활성화시킴으로써 P/O 가 유전자 발현을 증가시키도록 유도한다.
세포들을 추가 3 내지 4 시간 동안 성장시킨다. 그 후, 원심 분리(6000Xg에서 20분)에 의하여 세포들을 수확한다. 상기 세포 펠릿을 카오트로프제 (chaotropic agent) 6 Molar 구아니딘 HCl 중에서 4℃에서 3 내지 4 시간 동안 교반함으로써 가용화시킨다. 세포 잔해는 원심 분리에 의해서 제거하고, 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 니켈-니트릴로-트리-아세트산("Ni-NTA") 친화성 수지 컬럼(전술한 QIAGEN, Inc.에서 구입할 수 있음)에 적하한다. 6 x His 택을 갖는 단백질을 고 친화력을 갖는 Ni-NTA 수지에 결합시키고, 단순 원-스텝 과정에서 정제할 수 있다[참조: QIAexpressionist(1995) QIAGEN, Inc.]. 간략하게, 상청액을 6M 구아니딘-HCl, pH8의 컬럼 상에 적하하고, 그 컬럼을 우선 6M 구아니딘-HCl, pH8의 10 부피로 세척한 후, 6M 구아니딘-HCl, pH6의 10 부피로 세척하고, 마지막으로 6M 구아니딘-HCl, pH5로 폴리펩티드를 용출시킨다.
그 다음, 정제된 METH1 또는 METH2 단백질을, 포스페이트-완충 염수(PBS) 또는 50mM Na-아세테이트, pH6 완충액 및 200mM NaCl에 대하여 투석함으로써 복원시킨다. 대안적으로, METH1 또는 METH2 단백질을 Ni-NTA 컬럼에 부동화시키면서 연속적으로 리폴드(refold)시킬 수 있다. 권고되는 조건은 다음과 같다: 프로테아제 억제자를 포함하는 20mM Tris/HCl pH7.4, 20% 글리세롤, 500mM NaCl 중의 선형 6M-1M 우레아 농도 차등물을 사용하여 리네이춰시킨다. 복원은 1.5 시간 이상의 기간에 걸처서 수행하여야 한다. 복원 후, 250mM 이미다졸을 첨가하여 단백질을 용출시킨다. PBS 또는 50mM 소듐 아세테이트 pH 6 완충액 및 200mM NaCl에 대한 최종 투석 단계에 의해 이미다졸을 제거한다. 정제된 METH1 또는 METH2 단백질을 4℃에서 저장하거나, -80℃에서 동결시킨다.
상기 발현 벡터에 부가하여, 본 발명은 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 파아지 작동유전자(operator) 및 프로모터 요소를 포함하는 발현 벡터를 더 포함하며, 이벡터는 pHE4a로 지칭된다(ATCC 수탁번호 제209645호, 1998. 2. 25. 기탁됨). 이 벡터는 1) 선별 마커로서 네오마이신포스포트랜스퍼라제 유전자, 2) 이.콜리 복제 기점, 3) T5 파아지 프로모터 서열, 4) 두개의 lac 작동유전자 서열, 5) Shine-Delgarno 서열 및 6) 락토즈 오페론 리프레서 유전자(lacIq)를 포함한다. 복제 기점(oriC)은 pUC19(LTI, Gaithersburg, MD)에서 유래된 것이다. 프로모터 서열 및 작동유전자 서열은 합성한다. DNA는 NdeI 및 XbaI, BamHI, XhoI, 또는 Asp718로 벡터를 제한효소 처리함으로써 pHEa안으로 삽입될 수 있으며, 젤 상에 제한효소 처리된 생성물을 전개하고 더 큰 단편을 분리한다(스터퍼 단편은 약 310 염기쌍이어야 한다). DNA 삽입체는 NdeI(5'프라이머) 및 XbaI, BamHI, XhoI, 또는 Asp718(3'프라이머)에 대한 제한 부위를 갖는 PCR 프라이머를 사용하여 실시예 5에 기술한 PCR 프로토콜에 따라 형성시킨다. PCR 삽입체를 젤로 정제하고 적절한 효소로 제한효소처리한다. 삽입체 및 벡터는 표준 프로토콜에 따라 연결한다.
조작된 벡터는 박테리아 시스템에서 단백질을 발현도록 상기 프로토콜에서 용이하게 치환될 수 있다.
실시예 8: 삽입체로부터 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 정제
하기 또다른 방법을 사용하여, 삽입체의 형태로 존재할 때 이.콜리에서 발현되는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 달리 특정하지 않는 한, 하기 단계는 모두 4-10℃에서 수행한다.
이.콜리 발효의 생산 단계가 완결되면, 세포 배양물을 4-10℃로 차게하고, 15,000rpm의 연속 원심분리(Heraeus Sepatech)에 의해 세포를 수집한다. 세포 페이스트의 단위 중량 당 단백질의 예상 수율 및 필요한 분리 단백질의 함량에 기초하여 적당한 함량(중량)의 세포 페이스트를 100mM 트리스, 50mM EDTA, pH7.4 함유 완충액에 현탁시킨다. 고전단 혼합기를 사용하여 균질한 현탁액으로 세포를 분산시킨다.
이어서, 세포를 4000-6000 psi에서 두번 미세유동화기(microfluidizer) (Microfuidics, Corp. 또는 APV Gaulin, Inc.)를 통해 용액을 통과시킴으로써 세포를 용해시킨다. 이어서, 균질액을 NaCl 용액과 혼합하여 최종 농도가 0.5M NaCl이 되게 한 후, 15분 동안 7000×g에서 원심분리한다. 결과물인 펠렛을 0.5M NaCl, 100mM 트리스, 50mM EDTA, pH7.4로 세척한다.
그 결과 세척된 삽입체를 1.5M 구아닌 염산염(GuHCl)으로 2-4시간동안 녹인다. 15분동안 7000×g 원심분리 이후, 펠렛을 버리고 폴리펩티드 함유 상청액을 4℃에서 밤새 항온배양하여 GuHCl을 더 추출한다.
고속의 원심분리(30,000×g)에 의해 불용성 입자들을 제거한 후, GuHCl 추출물을 20부피의 50mM 나트륨, pH4.5, 150mM NaCl, 2mM EDTA 함유 완충액과 격렬히교반하여 신속하게 혼합함으로써 GuHCl 용해된 단백질을 재폴딩시킨다. 재폴딩된 희석 단백질 용액을 12동안 혼합 없이 4℃에서 유지시킨 후 정제 단계를 더 수행한다.
재폴딩된 폴리펩티드 용액을 정화하기 위해, 적당한 표면적을 갖는 0.16㎛ 막 필터(예, Filtron)가 장착되고 40mM 나트륨 아세테이트, pH 6.0과 평형을 이룬 이전에 준비된 경사(tangential) 여과 유니트를 사용한다. 여과된 샘플을 양이온 교환 수지(예, Poros HS-50, Perseptive Biosystems) 상에 로딩시킨다. 컬럼을 40mM 나트륨 아세테이트, pH6.0으로 세척하고 동일한 완충액 내 250mM, 500mM, 1000mM 및 1500mM NaCl로 단계적으로 용출한다. 280㎚에서 유출물의 흡광도를 계속 모니터링한다. 분획물을 수집하고 SDS-PAGE로 더 분석한다.
이어서 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 함유하는 분획물을 모으고 4부피의 물과 혼합한다. 이어서 희석된 샘플을 강한 음이온(Poros HQ-50, Perseptive Biosystems) 및 약한 음이온(Poros CM-20, Perseptive Biosystems) 교환 수지의 직렬식 컬럼으로 미리 제작된 세트 상에 로딩한다. 컬럼을 40mM 나트륨 아세테이트, pH6.0과 평형을 이루게 한다. 양 컬럼을 40mM 나트륨 아세테이트, pH6.0, 200mM NaCl로 세척한다. 이어서, 0.2M NaCl, 50mM 나트륨 아세테이트, pH6.0 내지 1.0M NaCl, 50mM 나트륨 아세테이트, pH6.5 범위의 직선 구배의 10 컬럼부피를 사용하여 CM-20 컬럼을 용출한다. 유출물을 계속 A280모니터링하면서 분획물을 수집한다. 이어서, 폴리펩티드 함유 분획물(예를들면, 16% SDS-PAGE에 의해 측정됨)을 모은다.
형성된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 상기 재폴딩 및 정제 단계 이후 95% 이상의 순도를 나타내어야 한다. 5㎍의 정제된 단백질을 로딩할 때 쿠마시 블루로 염색된 16% SDS-PAGE 젤로부터 어떠한 주요 오염 밴드가 관찰되어서는 않된다. 정제된 METH1 또는 METH2 단백질을 내독소/LPS 오염에 대해 시험할 수 있으며, 통상 LPS 함량은 LAL 분석에 따르면 0.1ng/ml 이하이다.
실시예 9: 바큘로바이러스 발현 시스템에서 METH1 또는 METH2의 클로닝 및 발현
이 실시예에서, 플라스미드 셔틀 벡터 A2는 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 바큘로바이러스 안으로 삽입하여 METH1 또는 METH2를 발현하는데 사용된다. 이 발현 벡터는 오토그래파 캘리포르니카 핵 폴리헤드론형성(polyhedrosis) 바이러스(AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터와 그 뒤에 BamHI, XbaI 및 Asp718 같은 편리한 제한 부위를 함유한다. 원숭이 바이러스 40("SV40")의 폴리아데닐화 부위는 효과적인 폴리아데닐화를 위해 사용된다. 재조합 바이러스를 용이하게 선별하기 위해, 플라스미드는 이.콜리 유래의 베타-갈락토시다제 유전자를 동일 배향의 약한 초파리 프로모터의 제어하에 함유하며, 그 뒤에 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 신호를 함유한다. 삽입된 유전자들은 야생형 바이러스 DNA와의 세포 매개성 동종성 재조합을 위해 바이러스 서열에 의해 양 측면이 인접하여, 클로닝된 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 발현하는 생존력있는 바이러스를 형성한다.
구조체가 전사, 번역, 분비 등을 위해 적절하게 위치한 신호(필요한 신호 펩티드 및 프레임 내 AUG)를 제공하는 한, 당업자가 용이하게 인식할 수 있는pAc373, pVL941 및 pAcIM1 같은 다수의 기타 바큘로바이러스 벡터는 상기 벡터 대신에 사용할 수 있다. 이러한 벡터는 예를들면 문헌[Luckow et al., Virology 170:31-39(1989)]에 기재되어 있다.
특히, AUG 개시 코돈 및 임의의 천연적으로 관련된 리더 서열을 포함하는 기탁된 클론 안에 함유되어 있는 METH1 또는 METH2 cDNA 서열은 실시예 5에서 설명한 PCR 프로토콜을 사용하여 증폭시킨다. 천연 발생 신호 서열을 사용하여 분비성 단백질을 생산한다면, pA2 벡터는 제2 신호 펩티드를 필요로 하지 않는다. 별법으로, 문헌[Summers et al., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555(1987)]에 기재된 표준 방법으로 벡터를 변형하여(pA2 GP) 바큘로바이러스 리더 서열을 포함시킨다.
상업적으로 구입한 키트("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca)를 사용하여 증폭된 단편을 1% 아가로즈 젤로부터 분리한다. 이어서, 단편을 적절한 제한 효소로 소화하고 다시 1% 아가로즈 젤 상에서 정제한다.
플라스미드를 대응하는 제한 효소로 소화시키고, 임의적으로 당업계에 알려진 일상적인 공정으로 소 장 포스파타제를 사용하여 탈인산화시킬 수 있다. 이어서, 상업적으로 구입한 키트("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca)를 사용하여 DNA를 1% 아가로즈 젤로부터 분리한다.
단편 및 탈인산화된 플라스미드를 T4 DNA 리가제로 함께 연결한다. 이.콜리 HB101 또는 XL-1 BLUE(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) 세포와 같은 기타 적절한 이.콜리 숙주를 라이게이션 혼합물로 형질전환시키고, 배양 평판 상에 펼친다. 개별적인 콜로니로부터 DNA를 소화시키고 젤 전기영동으로 소화 생산물을 분석함으로써 플라스미드 함유 박테리아를 확인한다. 클로닝된 단편의 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인한다.
문헌[Felgner et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:7413-7417(1987)]에 기재된 리포펙션 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드 함유 플라스미드 5㎍을 상업적으로 구입가능한 직선형 바큘로바이러스 DNA("BaculoGoldabaculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA) 1.0㎍과 동시형질감염시킨다. BaculoGolda바이러스 DNA 1㎍과 플라스미드 5㎍을, 혈청-부재 그래이스(Grace) 배지(Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) 50㎕를 함유하는 미세역가 평판의 멸균 웰에서 혼합한다. 이후, 10㎕ 리포펙틴 + 90㎕ 그래이스 배지를 첨가하고, 혼합하고 실온에서 15분간 항온배양한다. 이어서, 혈청이 없는 그래이스 배지 1㎖를 갖는 35mm 조직 배양 평판에서 파종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 형질감염 혼합물을 적가한다. 이어서, 평판을 27℃에서 5시간동안 항온배양한다. 이어서, 형질감염 용액을 평판으로부터 제거하고, 10% 태아 송아지 혈청으로 보충된 그래이스 곤충 배지 1ml를 첨가한다. 이어서, 27℃에서 4일간 계속해서 배양한다.
4일 후, 상청액을 수집하고 문헌[Summers and Smith, 상기문헌]에 기술된 바와 같이 플라크 분석을 수행한다. "Blue Gal"(Life Technologies Inc., Gaithesburg)을 갖는 아가로즈 젤을 사용하면, 푸른색 염색된 플라크를 생산하는gal-발현 클론을 용이하게 확인 및 분리할 수 있다. (이 유형의 "플라크 분석"에 대한 자세한 설명은 Life Technologies Inc., Gaithersburg에 의해 배포된 곤충 세포 배양 및 바큘로바이러스학에 대한 사용자 안내서 p 9-10에서 확인할 수 있다.) 적절한 항온배양 후, 푸른색 염색된 플라크를 미세피펫(micropipettor)(예, Eppendorf) 끝으로 떼어낸다. 이어서, 재조합 바이러스 함유 아가를 그래이스 배지 200㎕를 함유하는 미세원심분리 튜브에 재현탁시키고 재조합 바큘로바이러스 함유 현탁액을 사용하여 35mm 접시에 파종한 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후 이 배양 접시의 상청액을 수집하고 이어서 4℃에서 저장한다.
폴리펩티드의 발현을 확인하기 위해, Sf9 세포를 10% 열-불활성화된 FBS로 보충된 그래이스 배지에서 성장시킨다. 약 2의 감염다중도("MOI")에서 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 바큘로바이러스로 세포를 감염시킨다. 방사선표지된 단백질이 바람직한 경우, 6시간 이후 배지를 제거하고 메티오닌 및 시스테인이 없는 SF900Ⅱ 배지(Life Technologies Inc., Rockville, MD)로 대체한다. 42시간 후, 5uCi35S-시스테인(Amersham에서 구입가능함)을 첨가한다. 세포를 16시간 동안 더 항온배양하고 이어서 원심분리에 의해 수집한다. 상청액 내 단백질 뿐만아니라 세포내 단백질을 SDS-PAGE 및 방사선 사진(방사선 표지된 경우)에 의해 분석한다.
정제된 단백질의 아미노 말단의 아미노산 서열을 미세서열분석하여 생산된 METH1 또는 METH2 단백질의 아미노 말단 서열을 확인할 수 있다.
실시예 10: 포유류 세포 내 METH1 또는 METH2의 발현
METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 포유류 세포내 발현시킬 수 있다. 통상적인 포유류 발현 벡터는 mRNA의 전사 개시를 매개하는 프로모터 요소, 단백질 암호화 서열 및 전사체의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 필요한 서열을 함유한다. 부가적인 요소로는 인헨서, Kozak 서열 및 RNA 스플라이싱의 공여체 및 수용체에 인접한 개재 서열을 포함한다. 고효율의 전사는 SV40의 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스(예, RSV, HTLV1, HIVI)의 긴 말단 반복서열(LTR), 및 사이토메갈로바이러스(CMV)의 초기 프로모터에 의해 성취된다. 그러나, 세포성 요소(예, 사람 액틴 프로모터)도 사용될 수 있다.
본 발명을 실시하는데 사용 적절한 발현 벡터는 예를들면, pSVL 및 pMSG(Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat(ATCC 37152), pSV2DHFR(ATCC 37146), pBC12MI(ATCC 67109), pCMVSport2.0, 및 pCMVSport3.0 같은 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포는 사람 헬라, 293, H9 및 주캇 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CU1, 메추라기 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다.
달리, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 염색체 내로 삽입된 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 함유하는 안정한 세포주에서 발현시킬 수 있다. DHFR, gpt, 네오마이신, 하이그로마이신 같은 선별 마커와 동시-형질감염시킴으로써 형질감염된 세포를 확인 및 분리시킬 수 있다.
형질감염된 METH1 또는 METH2 유전자는 증폭되어 다량의 암호화된 단백질을 발현시킬 수 있다. DHFR(디하이드로폴레이트 리덕타제) 마커는 관심있는 유전자를수백개 또는 수천개 카피로 운반하는 세포주를 발달시키는데 유용하다(예컨대, Alt, F.W., et al., J.Biol.Chem. 253: 1357-1370(1978); Hamlin, J.L. 및 Ma, C., Biochem. et Biophys, Acta 1097:107-143(1990); Page, M.J. and Sydenham, M.A., Biotechnology 9:64-68(1991) 참조.). 또다른 유용한 선별 마커는 효소 글루타민 신타제(GS)(Murphy et al., Biochem J. 227:277-279(1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175(1992))이다. 이들 마커를 사용하여, 포유류 세포를 선별 배지에서 성장시키고, 높은 내성을 갖는 세포를 선별한다. 이들 세포주는 염색체 내로 삽입된 증폭된 유전자(들)을 함유한다. 중국 햄스터 난소(CHO) 및 NSO 세포는 단백질 생산에 자주 사용한다.
플라스미드 pSV2-DHFR(ATCC 수탁 번호 제37146호), 발현벡터 pC4(ATCC 수탁번호 제209646) 및 pC6(ATCC 수탁번호 제209647호)의 유도체는 루우스 사르코마 바이러스의 강한 프로모터(LTR)(Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447(March, 1985) + CMV-인헨서의 단편(Boshart et al., Cell 41:521-530(1985)을 함유한다. 예컨대 제한 효소 절단 부위 BamHI, Xbal 및 Asp718을 갖는 다중 클로닝 부위는 METH1 또는 METH2의 클로닝을 용이하게 한다. 또한, 벡터는 3'인트론, 래트 프리프로인슐린 유전자의 폴리아델닐화 및 종결 신호, 및 SV40 초기 프로모터 제어하의 마우스 DHFR 유전자를 함유한다.
만일 천연 발생 신호 서열을 사용하여 분비성 단백질을 생산한다면, 벡터는 제2 신호 펩티드를 필요로 하지 않을 것이다. 달리, 천연 발생 신호 서열을 사용하지 않는 경우, 벡터를 변형시켜, 세포로부터 단백질을 분비시킬 노력으로 이질성신호 서열을 포함시킬 수 있다(예, WO 96/34891 참조).
이어서, 증폭된 단편을 적절한 제한 효소로 소화시키고, 상업적으로 구입가능한 키트("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca)를 사용하여 1% 아가로즈 젤 상에서 정제한다. 이어서, 분리된 단편 및 탈인산화된 벡터를 T4DNA 리가제로 연결한다. 이어서, 이.콜리 HB101 또는 XL-1 블루 세포를 형질전화시키고, 예를들면 제한 효소 분석을 사용하여 플라스미드 pC6 또는 pC4 안으로 삽입된 단편을 함유하는 박테리아를 확인한다.
활성 DHFR 유전자가 결여된 중국 햄스터 난소 세포를 형질감염에 사용한다. 리포펙틴을 사용하여 발현 플라스미드 pC6 또는 pC4 5㎍을 플라스미드 pSVneo 0.5㎍와 동시형질감염시킨다(Felgner et al., 상기문헌). 플라스미드 pSV2-neo는 우성 선별 마커인 Tn5 유래의 neo 유전자를 함유하며, neo 유전자는 G418을 포함하는 항생제 군에 내성을 부여하는 효소를 암호화한다. 1mg/ml의 G418로 보충된 알파 마이너스 MEM에서 세포를 파종한다. 2일 후, 세포를 트립신처리하고 10, 25 또는 50 ng/ml의 메토트렉세이트 + 1mg/ml의 G418로 보충된 알파 마이너스 MEM 내 하이브리도마 클론화 평판(Greiner, Germany)에서 파종한다. 약 10-14일 후, 단일 클론을 트립신처리하고 이어서 상이한 농도의 메토트렉세이트(50nM, 100nM, 200nM, 400nM, 800nM)를 사용하여 6-웰 패트리 접시 또는 10ml의 플라스크에서 파종한다. 가장 높은 농도의 메토트렉세이트에서 성장한 클론은 이어서 더 높은 농도의 메토트렉세이트(1uM, 2uM, 5uM, 10mm, 20mM)를 함유하는 새로운 6-웰 평판으로 옮긴다. 100-200 uM 농도에서 성장하는 클론을 수득할 때까지 동일한 공정을 반복한다. METH1 또는METH2 발현을 예를들면 SDS-PAGE 및 웨스턴블럿에 의해 또는 역상 HPLC 분석법에 의해 분석한다.
실시예 11: N-말단 및/또는 C-말단 결실 돌연변이체의 제조
하기 일반적인 접근법을 사용하여 N-말단 또는 C-말달 결실 METH1 또는 METH2 결실 돌연변이체를 클론할 수 있다. 일반적으로, 약 15-25개 뉴클레오티드의 두 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 중 원하는 5' 및 3' 위치로부터 유도한다. 프라이머의 5' 및 3' 위치는 원하는 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편에 기초하여 결정한다. 필요한 경우 개시 코돈 및 정지 코돈을 각각 5' 및 3' 프라이머에 첨가하여, 폴리뉴클레오티드 단편에 의해 암호화되는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편을 발현시킨다. 바람직한 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편은 명세서 중 "폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 단편" 섹션에서 전술한 N-말단 및 C-말단 결실 돌연변이체를 암호화하는 것이다.
원하는 벡터 내 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편의 클로닝을 용이하게하기 위한 제한 부위를 함유한 부가적인 뉴클레오티드 또한 5' 및 3' 프라이머 서열에 첨가할 수 있다. PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 전술한 조건 또는 당업계에 알려진 조건을 사용하여 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편을 지놈성 DNA 또는 기탁된 cDNA 클론으로부터 증폭한다. 본 발명의 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편에 의해 암호화된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편을 동일한 통상 방법으로 전길이 폴리펩티드로 발현 및 정제시키나, 특정 단편 및 전길이 폴리펩티드 사이의 화학적 및 물리적 특성상의 차이 때문에 일상적인 변형이 필요할 수있다.
본 발명을 비제한적으로 예시하는 방법으로서, METH1 폴리펩티드 단편 R-235 내지 L-934 또는 METH2 폴리펩티드 단편 R-214 내지 Q-836을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 다음과 같이 증폭 및 클로닝한다: R-235 또는 R-214 각각으로 시작하는 폴리펩티드 단편의 N-말단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 프레임 내 제한 효소 부위 및 이어서 개시 코돈을 포함하는 5' 프라이머를 형성시킨다. L-934 또는 Q-836 각각으로 종결되는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편의 C-말단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 프레임 내 제한 효소 부위 및 이어서 정지 코돈을 포함하는 상보적인 3' 프라이머를 형성시킨다.
증폭된 폴리뉴클레오티드 단편 및 발현 벡터를, 프라이머내 부위를 인식하는 제한 효소로 소화시킨다. 이어서, 소화된 폴리뉴클레오티드를 함께 연결시킨다. METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 단편을 제한된 발현 벡터 내로, 바람직하게는 프로모터의 하류에 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단편 암호화 영역을 배치하는 방식으로 삽입한다. 표준 공정을 사용하고 본 명세서의 실시예에 기술된 바와 같이 라이게이션 혼합물로 적격인 이.콜리 세포를 형질전환시킨다. 플라스미드 DNA를 내성이 있는 콜로니로부터 분리하고 제한분석, PCR 및 DNA 서열분석에 의해 클로닝한 DNA의 동일성을 확인한다.
실시예 12: METH1 또는 METH2의 단백질 융합
METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 다른 단백질과 융합시키는 것이 바람직하다. 이들 융합 단백질은 다양한 적용에 사용할 수 있다. 예를들면, METH1 또는 METH2폴리펩티드의 His-태그, HA-태그, 단백질 A, IgG 도메인 및 말토즈 결합 단백질과의 융합은 정제를 용이하게 한다(실시예 7 참조, 또한 EP A 394,827; Traunecker, et al., Nature 331:84-86(1988) 참조). 유사하게, IgG-1, IgG-3 및 알부민과의 융합 단백질은 생체내 반감기를 증가시킨다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드와 융합된 핵 국부화 신호는 단백질을 특정 하부 세포 국부화에 표적시키며, 공유결합된 헤테로이량체 또는 호모이량체는 융합 단백질의 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 또한, 융합 단백질은 하나이상의 기능을 보유한 키메라 분자를 형성시킬 수 있다. 마지막으로, 융합 단백질은 융합되지 않은 단백질와 비교하여 융합된 단백질의 용해도 및/또는 안정성을 증가시킬 수 있다. 전술한 모든 유형의 융합 단백질은 하기 프로토콜(IgG 분자와의 폴리펩티드 융합에 대한 설명), 또는 실시예 7에 기술된 프로토콜을 수정하여 제조될 수 있다.
요컨대, IgG 분자의 사람 Fc 부위는 하기 기술한 서열의 5' 단부 및 3' 단부에 걸친 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킬 수 있다. 또한, 이들 프라이머는 발현 벡터, 바람직하게는 포유류 발현 벡터 안으로 클로닝을 용이하게 하는 편리한 제한 효소 부위를 보유하여야 한다.
예를들면, pC4(수탁 번호 제209646호)를 사용하는 경우, 사람 Fc 부위를 BamHI 클로닝 부위 안으로 연결할 수 있다. 3' BamHI 부위는 파괴되어야 한다는 것에 유의하라. 다음, 사람 Fc 부위를 함유하는 벡터는 BamHI로 다시 제한효소 처리하여 벡터를 일직선화시키고 실시예 5에 기술된 PCR 프로토콜에 의해 분리한 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 이 BamHI 부위 내로 연결시킨다. 폴리뉴클레오티드를 정지 코돈 없이 클로닝하는 것에 유의하라. 그렇지 않으면 융합 단백질이 생산되지 않을 것이다.
천연 발생 신호 서열을 사용하여 분비성 단백질을 생산하는 경우, pC4는 제2 신호 펩티드를 필요로 하지 않는다. 달리, 천연 발생 신호 서열을 사용하지 않는 경우는 벡터를 변형하여 이질성 신호 서열(예, WO 96/34891 참조)을 포함할 수 있다.
사람 IgG Fc 영역:
GGGATCCGGA GCCCAAATCT TCTGACAAAA CTCACACATG CCCACCGTGC CCAGCACCTG AATTCGAGGG TGCACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC TCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT AAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA ACCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA TGAGCTGACC AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCAAGCGA CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC CGTGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG TAAATGAGTG CGACGGCCGC GACTCTAGAG GAT (서열번호 85)
실시예 13: 항체의 생산
a) 본 발명의 항체는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다(CurrentProtocols, Chapter 2 참조). 예컨대, METH1 또는 METH2를 발현하는 세포를 동물에 투여하여 다클론성 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도한다. 바람직한 방법에서, METH1 또는 METH2 단백질 제제를 제조 및 정제하여 실질적으로 천연 오염물질이 없게 한다. 이어서, 이러한 제제는 더 큰 특이 활성을 갖는 다클론성 항혈청을 생산하기 위해 동물 안으로 도입한다.
가장 바람직한 방법에서, 본 발명의 항체는 단클론성 항체(또는 이의 단백질 결합 단편)이다. 이러한 단클론성 항체는 하이브리도마 기법을 사용하여 준비할 수 있다(Kohler et al., Nature 256:495(1975); Kohler at al., Eur. J. Immunol. 6:511(1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292(1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.,pp.563-681(1981)). 통상. 이러한 절차는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드로, 더욱 바람직하게는 분비성 METH1 또는 METH2 폴리펩티드-발현 세포로 동물(바람직하게는 마우스)을 면역화시키는 단계를 포함한다. 이러한 세포는 임의의 적절한 조직 배양 배지에서 배양할 수 있으나; (약 56℃에서 불활성화된) 10% 태아 소 혈청으로 보충되고 약 10g/ℓ의 비필수 아미노산, 약 1,000U/ml의 페니실린 및 약 100ug/ml의 스트렙토마이신으로 보충된 Earle의 변형된 이글 배지에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
이러한 마우스의 비장 세포를 추출하고 적당한 골수종 세포주와 융합한다. 임의의 적당한 골수종 세포주를 본 발명에 따라 사용할 수 있다; 그러나, ATCC로부터 입수가능한 어버이 골수종 세포주(SP20)를 사용하는 것이 바람직하다. 융합 이후, 형성된 하이브리도마 세포는 선별적으로 HAT 배지에서 유지시키고, 이어서 Wands et al.(Gastroenterology 80:225-232(1981))에 의해 기술된 희석물을 제한함으로써 클로닝한다. 이어서 이러한 선별을 통해 수득된 하이브리도마 세포를 분석하여 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 확인한다.
달리, METH1 또는 METH2 폴리펩티드에 결합할 수 있는 부가적인 항체는 항-이디오타입의 항체를 사용하는 2단계 공정에서 생산할 수 있다. 이러한 방법은 항체 자체가 항원이고 따라서 제2차 항체에 결합하는 항체를 수득할 수 있다는 사실을 이용한다. 이 방법에 따라, 단백질 특이 항체를 사용하여 동물, 바람직하게는 마우스를 면역화시킨다. 이어서, 이러한 동물의 비장 세포를 사용하여 하이브리도마 세포를 생산하고, 하이브리도마 세포를 스크리닝하여 METH1 또는 METH2 단백질 특이 항체에 결합하는 능력이 METH1 또는 METH2에 의해 차단될 수 있는 항체를 생산하는 클론을 확인한다. 이러한 항체는 METH1 또는 METH2 단백질 특이 항체에 대한 항-이디오타입의 항체를 포함하고 동물을 면역화시키기 위해 사용하여 METH1 또는 METH2 단백질 특이 항체를 더 형성하도록 유도할 수 있다.
본 발명의 항체의 Fab 및 F(ab')2및 다른 단편을 본 명세서에 개시된 방법에 따라 사용할 수 있다고 이해될 수 있다. 통상 이러한 단편은 파파인(Fab 단편을 생산하기 위해) 또는 펩신(F(ab')2단편을 생산하기 위해)과 같은 효소를 사용하여 단백분해성 절단에 의해 생산된다. 달리, 분비성 METH1 또는 METH2 단백질 결합 단편은 재조합 DNA 기법을 적용함으로써 또는 합성 화학을 통해 생산될 수 있다.
사람에서 항체를 생체내 사용하는 경우, "인간화된" 키메라 단클론성 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체는 전술한 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 유래한 유전자 구조체를 사용하여 생산할 수 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있다(Morrisen, Science 229:1202(1985); Oi et al., BioTechniques 4:214(1986); Cabilly et al., 미국특허 제4,816,567호; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 8702671; Bouliane et al, Nature 312:643(1984); Neuberger et al., Nature 314:268(1985) 참조)
b) scFvs 라이브러리로부터 METH1 및/또는 METH2에 대한 항체 단편의 분리
사람 PBL로부터 분리된 천연 발행 V 유전자를, 공여체에 노출되거나 노출되지 아니한 METH1 및/또는 METH2에 대한 반응성을 함유하는 큰 라이브러리의 항체 단편들 안으로 작제한다(미국특허 제5,885,793호 참조, 본명세서에 전체로 인용되어 있음).
라이브러리의 구조.scFvs 라이브러리는 WO92/01047에 기재되어 있는 바와 같이 사람 PBL의 RNA로부터 작제된다. 항체 단편을 제시하는 파아지를 구조하기 위해, 파아지미드를 보유하는 대략 109개의 이.콜리를 사용하여 1% 글루코즈 및 앰피실린(2×TY-AMP-GLU) 100㎍/㎖을 함유하는 2×TY 50㎖을 접종시키고 교반하면서 O.D.=0.8까지 성장시킨다. 이 배양액 5㎖을 사용하여 2×TY-AMP-GLU 50㎖을 접종시키고, 델타 유전자 3 헬퍼(M13 델라 유전자 Ⅲ, WO92/01047 참조) 2×108TU를 첨가하고 배양액을 교반없이 45분동안 37℃에서 항온배양하고, 이어서 교반하면서 45분동안 37℃에서 항온배양한다. 배양액을 10분 동안 4000r.p.m으로 원심분리하고 앰피실린 100㎍/㎖ 및 카나마이신 50㎍/㎖를 함유하는 2×TY 2리터에 펠렛을 재현탁하고, 밤새 성장시킨다. 파아지는 WO92/01047에 기술된 바와 같이 준비한다.
M13 델타 유전자 Ⅲ은 다음과 같이 준비한다: M13 델타 유전자 Ⅲ 헬퍼 파아지는 유전자 Ⅲ 단백질을 암호화하지 않고, 따라서, 항체 단편을 제시하는 파아지(미드)는 항원과 더 잘 결합한다. 감염성 M13 델타 유전자 Ⅲ 입자는 파아지 형태형성 동안 야생형 유전자 Ⅲ 단백질을 제공하는 pUC19 유도체를 보유하는 세포에서 헬퍼 파아지를 성장시킴으로써 제조된다. 배양액은 1시간동안 37℃에서 진탕없이 항온배양하고 이어서 1시간동안 37℃에서 진탕하면서 항온배양한다. 세포를 회전시켜 가라앉히고(IEC-Centra 8,4000 revs/분, 10분간), 앰피실린 100㎍/㎖ 및 카나마이신 50㎍/㎖을 함유하는 2×TY 브로스 300㎖(2×TY-AMP-KAN)에 재현탁시키고, 37℃에서 진탕하면서 밤새 성장시킨다. 파아지 입자를 정제하고 2개의 PEG-침전물로 배양 배지로부터 농축하고(Sambrook et al., 1990), PBS 2㎖에 재현탁시키고 0.4㎛ 필터를 통과시켜(Minisart NML; Sartorius) 최종농도가 대략 1013형질도입 유니트/㎖(앰피실린-내성 클론)이 되도록 한다.
라이브러리의 패닝(panning)본 발명의 폴리펩티드 100㎍/㎖ 또는 10㎍/㎖를 4㎖ 보유하는 PBS에서 밤새 면역튜브(Nunc)를 피복한다. 튜브를 2% Marvel-PBS로 2시간동안 37℃에서 차단하고, 이어서 PBS에서 3번 세척한다. 대략 1013TU의 파아지를 튜브에 적용하고 실온에서 30분동안 상단 및 하단 회전대 상에서 뒤집혀 회전도록 하면서 항온배양하고, 이어서 1.5시간 더 정치하여 둔다. 튜브를 PBS 0.1% Tween-20으로 10번 세척하고 PBS로 10번 세척한다. 100mM 트리에틸아민 1㎖을 첨가하고 하단 및 상단 회전대 상에서 15분 회전시킴으로써 파아지를 용출하고, 이후 용액을 즉시 1.0M 트리스-HCl, pH7.4 0.5㎖로 중화시킨다. 이어서, 파아지를 사용하여 30분동안 37℃에서 박테리아와 함께 용출된 파아지를 항온배양함으로써 중간-log 이.콜리 TG1 10㎖을 감염시킨다. 이어서, 이.콜리는 1% 글루코오즈 및 100㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 TYE 평판 상에서 도포한다. 이어서, 형성된 박테리아 라이브러리를 전술한 바와 같이 델타 유전자 3 헬퍼 파아지로 구조하여 차후 선별단계를 위한 파아지를 준비한다. 이어서, 이 프로세스는 PBS로 20번, 0.1 Tween-20로 20번, 3회 및 4회의 경우 PBS로 20번으로 증가된 튜브 세척과 함께 총 4회의 친화성 정제를 반복한다.
결합제의 특성.3회 및 4회 선별로부터 용출된 파아지를 사용하여 이.콜리 HB2151을 감염시키고, 분석하기 위해 가용성 scFv를 단일 콜로니으로부터 생산한다(Marks, et al., 1991). 50mM 중탄산염 pH9.6 내 본 발명의 폴리펩티드 10pg/㎖로 피복한 미세역가 평판으로 ELISA를 수행한다. ELISA가 양성인 클론은 PCR 지문술(예, WO92/01047 참조) 및 이어서 서열분석에 의해 더 특성을 규명한다.
실시예 14: 고효율 스크리닝 분석을 위한 METH1 또는 METH2 단백질의 생산
하기 프로토콜은 시험하고자 하는 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 함유 상청액을 생산하다. 이 상청액은 이어서 실시예 16-23에 기술한 스크리닝 분석에 사용할 수 있다.
먼저, 50㎍/㎖의 작업 용액으로, PBS(칼슘 또는 마크네슘 17-516F Biowhittaker을 함유)내 폴리-D-리신(644 587 Boehringer-Mannheim) 저장 용액(PBS 내 1mg/ml)을 1:20 로 희석하라. 이 용액 200㎕를 각 웰(24웰 평판)에 첨가하고 20분간 실온에서 항온배양하라, 각 웰 상에 용액이 확실히 분배되도록하라(주의: 각각 다른 채널 상에 팁(tip)을 갖는 12 채널 피펫을 사용할 수 있다). 폴리-D-리신 용액을 흡입해 내고 1ml PBS(인산 완충 염수)로 세정하라. 세포를 도포하기 직전까지 PBS는 웰 내 유지되어야 하고, 평판은 최대 2주 동안 미리 폴리-리신으로 피복할 수 있다.
0.5ml DMEM(둘베코 변형 이글 배지)(4.5 G/L 글루코즈 및 L-글루타민(12-604F Biowhittaker))/10% 열 불활성화된 PBS(14-503F Biowhittaker)/1x Penstrep(17-602E Biowhittaker를 함유) 내 2x105세포/웰로 283T 세포를 도포하라(세포가 P+20을 초과하지 않게하라). 세포를 밤새 성장시켜라.
다음날, 멸균용액에서 바신: 300㎕ 리포펙트아민(18324-012 Gibco/BRL) 및 5ml의 옥티멤(Optimem) Ⅰ(3198500 Gibco/BRL)/96-웰 평판에서 함께 혼합하라. 실시예 10-12에서 기술한 방법에 의해 생산된 폴리뉴클레오티드 삽입체를 함유하는 약 2㎍의 발현 벡터를 소부피의 다중-채널 피펫으로 대략 표지된 96-웰 둥근 바닥평판 안으로 분취하라. 다중 채널 피펫으로 각 웰에 리포펙트아민/옥티멤 Ⅰ 혼합물 50㎕를 첨가하라. 피펫을 상하로 부드럽게 혼합시켜라. 실온에서 14-45분간 항온배양하라. 약 20분 후, 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 150㎕의 옵티멤 I를 첨가하라. 대조군으로, 삽입체를 결여한 벡터 DNA 평판 하나를 각 형질감염 세트로 형질감염시켜야 한다.
바람직하게는, 형질감염은 하기 작업을 태그-팀으로(tag-teaming) 수행하여야 한다. 태그-팀에 의해 실제 시간이 반으로 절감되고, 세포는 PBS 상에서 과도한 시간을 보내지 않는다. 먼저, 개인 A는 24웰 평판의 세포로부터 배지를 흡입해 내고 이어서 개인 B는 각 웰을 0.5ml PBS로 세정한다. 이어서, 개인 A는 PBS를 세정해 버리고, 개인 B는 각기 다른 채널 상에 팁을 갖는 12 패널 피펫을 사용하여 200ul의 DNA/리포펙트아민/옥티멤 I 복합체를 먼저 홀수 웰에 첨가하고 이어서 짝수 웰에 첨가하고 24-웰 평판 상의 각 줄에 첨가한다. 6시간동안 37℃에서 항온배양한다.
세포를 항온배양하는 동안, 1X 펜스트렙을 갖는 DMEM 내 1% BSA 또는, HGS CHO-5배지(116.6mg/L의 CaCl2(무수물); 0.00130mg/L CuSO4-5H2O; 0.050mg/L의 Fe(NO3)3-9H2O; 0.417mg/L의 FeSO4-7H2O; 311.80mg/L의 KCl; 28.64mg/L의 MgCl2; 48.84mg/L의 MgSO4; 6995.50mg/L의 NaCl; 2400.0mg/L의 NaHCO3; 62.50mg/L의 NaH2PO4-H2O; 71.02mg/L의 Na2HPO4; 0.4320mg/L의 ZnSO4-7H2O; 0.002mg/L의 아라키돈산; 1.022mg/L의 콜레스테롤; 0.70mg/L의 DL-알파-토코페롤-아세테이트;0.0520mg/L의 리놀레산; 0.010mg/L의 리놀렌산; 0.010mg/L의 미리스트산; 0.010mg/L의 올레산; 0.010mg/L의 팔미트르산; 0.010mg/L의 팔미트산; 100mg/L의 플루로닉 F-68; 0.010mg/L의 스테아르산; 2.20mg/L의 Tween 80; 4551mg/L의 D-글루코즈; 130.85mg/ml의 L-알라닌; 147.50mg/ml의 L-아르기닌-HCL; 7.50mg/ml의 L-아스파라긴-H2O; 6.65mg/ml의 L-아스파르트산; 29.56mg/ml의 L-시스테인-2HCL-H2O; 31.29mg/ml의 L-시스틴-2HCL; 7.35mg/ml의 L-글루탐산; 365.0mg/ml의 L-글루타민; 18.75mg/ml의 글리신; 52.48mg/ml의 L-히스티딘-HCL-H2O; 106.97mg/ml의 L-이소류신; 111.45mg/ml의 L-류신; 163.75mg/ml의 L-리신 HCL; 32.34mg/ml의 L-메티오닌; 68.48mg/ml의 L-페닐알라닌; 40.0mg/ml의 L-프롤린; 26.25mg/ml의 L-세린; 101.05mg/ml의 L-트레오닌; 19.22mg/ml의 L-트립토판; 91.79mg/ml의 L-티로신-2Na-2H2O; 및 99.65mg/ml의 L-발린; 0.0035mg/L의 비오틴; 3.24mg/L의 D-Ca 판토테네이트; 11.78mg/L의 콜린 클로라이드; 4.65mg/L의 폴산; 15.60mg/L의 i-이노시톨; 3.02mg/L의 니아신아미드; 3.00mg/L의 피리독살 HCL; 0.031mg/L의 피리독신 HCL; 0.319mg/L의 리보플라빈; 3.17mg/L의 티아민 HCL; 0.365mg/L의 티미민; 0.680mg/L의 비타민 B12; 25mM의 HEPES 완충액; 2.39mg/L의 Na 히포크산틴; 0.105mg/L의 리포산; 0.081mg/L의 나트륨 푸트레신-2HCL; 55.0mg/L의 나트륨 피루베이트; 0.0067mg/L의 나트륨 셀레니트; 20uM의 에탄올아민; 0.122mg/L의 페릭 시트레이트; 리놀레산과 복합체를 이룬 메틸-B-시클로덱스트린 41.70mg/L; 올레산과 복합체를 이룬 메틸-B-시클로덱스트린 33.33mg/L; 레티날 아세테이트와 복합체를 이룬 메틸-B-시클로덱스트린 10mg/L) 같은 적당한 배지를 준비한다. 2mm 글루타민 및 1x펜스트렙으로 옷몰농도를 327mOsm으로 조정하라. (10% BSA 저장 용액의 경우 1L DMEM 내 용해된 BSA(81-068-3 Bayer) 100gm). 배지를 여과하고 15ml 원뿔형 폴리스티렌 안에 내독소 분석을 위해 50㎕를 수집하라.
형질감염 반응은 바람직하게는 항온배양 기간 종점에서 바람직하게는 태그-팀에 의해 종결시킨다. 개인 A는 형질감염 배지를 흡입하면서, 개인 B는 각 웰에 1.5ml의 적당한 배지를 첨가한다. 37℃에서 사용된 배지에 따라 45시간 또는 72시간동안 항온배양하라: 45시간의 경우는 1% BSA 또는 72시간의 경우는 CHO-5.
4일째, 300㎕의 다중채널 피펫을 사용하여 하나의 1ml 깊이 웰 평판 내 600㎕를 분취하고 나머지 상청액은 2ml 깊이 웰 안으로 분취한다. 이어서, 각 웰에서 나온 상청액은 실시예 16-23에서 기술한 분석에 사용할 수 있다.
상청액을 사용한 하기 기술한 임의의 분석에서 활성이 나타날 때, 활성은 METH1 또는 METH2 폴리펩티드로부터 직접 유래되거나, 차후 상청액으로 분비되는 다른 단백질의 METH1 또는 METH2에 의한 유도성 발현에 의해 활성이 나타난다. 따러서, 본 발명은 특정 분석에서 활성에 의해 특성이 규명되는 상청액 내 단백질을 확인하는 방법을 제공한다.
실시예 15: GAS 리포터 구조체의 제작
세포의 분화 및 증식에 관여하는 하나의 단일 형질감염 경로는 Jaks-STATs 경로라고 지칭된다. Jaks-STATs 경로에서 활성화되는 단백질은 다수의 유전자의 프로모터에 위치해 있는 감마 활성화 부위 "GAS" 요소 또는 인터페론-민감성 반응 요소("ISRE")에 결합한다. 이들 요소에 단백질이 결합하면 관련된 유전자의 발현을 변경시킨다.
GAS 및 ISRE 요소는 신호 전달 인자 및 전사 활성인자 또는 "STATs"라 지칭되는 일 부류의 전자 인자에 의해 인식된다. STAT 패밀리에는 6개의 일원이 있다. Stat1 및 Stat3은, (IFN-알파에 대한 반응이 널리 퍼져 있는 바와 같이) Stat2와 같이 다수의 세포 유형에 존재한다. Stat4는 더 제한적이며, IL-12로 처리한 후 T 헬퍼 부류 I 세포에서 발견되지만 다수의 세포에 존재하지 않는다. Stat5는 원래 유선 성장 인자로 지칭되었으나, 골수 세포를 포함한 다른 세포에서 고농도로 발견되어왔다. 이것은 다수의 사이토킨에 의해 조직 배양 세포에서 활성화될 수 있다.
제누스 키나제("Jaks") 패밀리로 알려진 한 세트의 키나제들에 의해 티로신 인산화되면 STATs는 활성화되어 세포질로부터 핵으로 전위한다. Jaks는 독특한 패밀리의 가용성 티로신 키나제를 나타내며, Tyk2, Jak1, Jak2 및 Jak3를 포함한다. 이들 키나제는 상당한 서열 유사성을 나타내며, 통상 휴면 세포에서 촉매적으로 불활성이다.
Jaks는 하기 표에 요약되어 있는 광범위한 수용체에 의해 활성화된다(Schidler and Darnell, Ann. Rev. Biochem. 64:621-51(1995)의 논문으로부터 수정된 것임). Jaks를 활성화시킬 수 있는 사이토킨 수용체 패밀리는 2개의 군으로 분류된다: (a) 클래스 1은 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, Epo. PRL, GH, G-CSF, GM-CSF, LIF, CNTF 및 트롬보포이에틴에 대한 수용체를 포함하고; (b) 클래스 2는 INF-a, INF-g, 및 IL-10을 포함한다. 클래스 1수용체는 보존된 시스테인 모티프(4개의 보존된 시스테인 및 1개의 트립토판으로 구성된 세트) 및 WSXWS 모티프(Trp-Ser-Xxx-Trp-Ser(서열번호 82)를 암호화하는 막 인접 영역)을 공유한다.
따라서, 수용체에 리간드가 결합할 때, Jaks는 활성화되고, 차례로 STAT를 활성화시키고, 이어서 STAT는 전위되고 GAS 요소와 결합한다. 이러한 전체 프로세스는 Jaks-STATs 신호 전달 경로에 포함된다.
따라서, GAS 또는 ISRE 요소의 결합에 의해 반영되는 Jaks-STATs 경로의 활성화를 사용하여 세포의 증식 및 분화에 관여하는 단백질을 제시할 수 있다. 예를들면, 성장 인자 및 사이토킨은 Jaks-STATs 경로를 활성화시킨다고 알려져 있다. (하기 표 참조). 따라서, 수용체 분자에 연결된 GAS 요소를 사용함으로써, Jaks-STATs 경로의 활성인자를 확인할 수 있다.
| JAKs | STATS | GAS(요소) 또는 ISRE | ||||
| 리간드 | tyk2 | Jak 1 | Jak 2 | Jak 3 | ||
| IFN 패밀리 | ||||||
| IFN-a/BIFN-gIl-10 | ++ | ++? | -+? | ___ | 1,2,311,3 | ISREGAS(IRF1>Lys6>IFP) |
| gp130 패밀리 | ||||||
| IL-6(다면발현성)Il-11(다면발현성)OnM(다면발현성)LIF(다면발현성)CNTF(다면발현성)G-CSF(다면발현성)IL-12(다면발현성) | +???-/+?+ | ++++++- | +?+++?+ | ??????+ | 1,31,31,31,31,31,31,3 | GAS(IRF1>Lys6>IFP) |
| g-C 패밀리 | ||||||
| IL-2(림프구)IL-4(림프/골수성)IL-7(림프구)IL-9(림프구)IL-13(림프구)IL-15 | -----? | ++++++ | ----?? | ++++?+ | 1,3,565565 | GASGAS(IRF1=IFP>>Ly6)(IgH)GASGASGASGAS |
| gp140 패밀리 | ||||||
| IL-3(골수성)IL-5(골수성)GM-CSF(골수성) | --- | --- | +++ | --- | 555 | GAS(IRF1>IFP>>Ly6)GASGAS |
| 성장 호르몬 부류 | ||||||
| GHPRLEPO | ??? | -+/-- | +++ | --- | 51,3,55 | GAS(B-CAS>IRF1=IFP>>Ly6) |
| 수용체 티로신 키나제 | ||||||
| EGFPDGFCSF-1 | ??? | +++ | +++ | --- | 1,31,31,3 | GAS(IRF1)GAS(IRF1이 아님) |
실시예 16-17에 기술된 생물학적 분석에 사용되는 프로모터 요소를 함유하는 합성 GAS를 제작하기 위해, PCR에 기초한 전략을 사용하여 GAS-SV40 프로모터 서열을 형성시킨다. 5' 프라이머는 IRF1 프로모터에서 발견되고 이전에 일정 범위의 사이토킨으로 유도되면 STATs에 결합한다고 확인된 GAS 결합 부위를 직렬로 4 카피 포함하나(Rothman et al., Immunity 1:457-468(1994)), 다른 GAS 또는 ISRE 요소를 대신 사용할 수 있다. 또한, 5'프라이머는 SV40 초기 프로모터 서열에 상보적인 18bp 서열을 포함하고, XhoI 부위와 인접해 있다. 5'프라이머의 서열은 5':GCGCCTCGAG ATTTCCCCGA AATCTAGATT TCCCCGAAAT GATTTCCCCG AAATGATTTC CCCGAAATAT CTGCCATCTC AATTAG :3'(서열번호 86)이다.
하류 프라이머는 SV40 프로모터와 상보적이며 Hind III 부위와 인접해 있다: 5': GCGGCAAGCT TTTTGCAAAG CCTAGGC :3'(서열번호 87).
클론테크로부터 수득한 B-gal: 프로모터 플라스미드에 존재하는 SV40 프로모터 주형을 사용하여 PCR 증폭을 수행한다. 형성된 PCR 단편을 XhoI/HindIII로 소화시키고 BLSK2- 안으로 서브클로닝한다(Stratagene). 전방향 및 역방향 프라이머로 서열분석하여 삽입체가 하기 서열을 함유한다는 것을 확인한다: 5:CTCGAGATTT CCCCGAAATC TAGATTTCCC CGAAATGATT TCCCCGAAAT GATTTCCCCG AAATATCTGC CATCTCAATT AGTCAGCAAC CATAGTCCCG CCCCTAACTC CGCCCATCCC GCCCCTAACT CCGCCCAGTT CCGCCCATTC TCCGCCCCAT GGCTGACTAA TTTTTTTTAT TTATGCAGAG GCCGAGGCCG CCTCGGCCTC TGAGCTATTC CAGAAGTAGT GAGGAGGCTT TTTTGGAGGC CTAGGCTTTT GCAAAAAGCT T:3'(서열번호 88).
이 GAS 프로모터 요소가 SV40 프로모터에 연결된, GAS:SEAP2 리포터 구조체를 다음에 조작한다. 여기서, 리포터 분자는 분비성 알칼린 포스파타제 또는 "SEAP"이다. 그러나, 분명히 임의의 리포터 분자가 이 실시예 또는 임의의 다른 실시예에서 SEAP 대신 사용될 수 있다. SEAP 대신 사용될 수 있는 잘 알려진 리포터 분자는 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 알칼린 포스포타제, β-갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(GFP), 또는 항체에 의해 검출가능한 임의의 단백질을 포함한다.
상기 서열 확인된 합성 GAS-SV40 프로모터 요소는 HindIII 및 XhoI를 사용하여 클론테크로부터 얻은 pSEAP-프로모터 벡터 내로 서브클로닝하면, 효과적으로 SV40 프로모터가 증폭된 GAS:SV40 프로모터 요소로 치환되어 GAS-SEAP 벡터를 형성한다. 그러나 이 벡터는 네오마이신 내성 유전자를 함유하지 않고, 따라서, 포유류 발현 시스템으로 바람직하지 않다.
따라서, GAS-SEAP 리포터를 발현하는 안정한 포유류 세포주를 형성하기 위해, SalI 및 NotI를 사용하여 GAS-SEAP 카세트를 GAS-SEAP 벡터로부터 제거하고, 다중 클로닝 부위 내 이들 제한효소 부위들을 사용하여 pGFP-1(클론테크)과 같은 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 백본 벡터 내로 삽입시켜 GAS-SEAP/Neo 벡터를 형성한다. 일단 이 벡터가 포유류 세포 내로 형질감염되면, 실시예 16-17에서 기술한 바와 같은 GAS 결합에 대한 리포터 분자로 사용할 수 있다.
상기 설명내용을 사용하고 GAS를 다른 프로모터 서열로 치환하여 다른 구조체를 만들 수 있다. 예를들면, NFK-B 및 EGR 프로모터 서열을 함유하는 리포터 분자의 제작은 실시예 18 및 19에 기술되어 있다. 그러나, 이들 실시예에 기술된 프로토콜을 사용하여 다수의 다른 프로모터로 치환할 수 있다. 예를들면, SRE, IL-2, NFAT 또는 오스테오칼신 프로모터 단독 또는 조합으로 치환할 수 있다(예, GAS/NF-KB/EGR, GAS/NF-KB, Il-2/NFAT, 또는 NF-KB/GAS). 유사하게 다른 세포주를 사용하여 리포터 구조체 활성을 시험할 수 있으며, 그 예로, HELA(상피), HUVEC(내피), Reh(B-세포), Saos-2(조골세포), HUVAC(대동맥) 또는 심근세포(Cardiomyocyte)가 있다.
실시예 16: T-세포 활성의 고효율 스크리닝 분석
하기 프로토콜을 사용하여, METH1 또는 METH2 상청액이 T-세포를 증식 및/또는 분화시키지를 측정함으로써 METH1 또는 METH2의 T-세포 활성을 평가한다. 실시예 15에서 생산한 GAS/SEAP/Nejo 구조체를 사용하여 T-세포 활성을 평가한다. 따라서, SEAP 활성을 증가시키는 인자는 Jaks-STATs 신호 전달 경로를 활성화시키는 활성을 제시한다. 이 분석에 사용되는 T-세포는 주캇 T-세포(ATCC 수탁번호 TIB-152)이나, Molt-3 세포(ATCC 수탁번호 CRL-1552) 및 Molt-4세포(ATCC 수탁번호 CRL-1582)도 사용할 수 있다.
주캇 T-세포는 림프모세포성 CD4+ Th1 헬퍼 세포이다. 안정한 세포주를 형성하기 위해, DMRIE-C(라이프 테크놀로지)(하기에 기술된 형질감염 공정)를 사용하여 대략 2백만개의 주캇 세포를 GAS-SEAP/neo 벡터로 형질감염한다. 형질감염된 세포를 웰 당 대략 20,000 세포의 밀도로 파종하고, 1mg/ml 젠티신에 내성인 형질감염체를 선별한다. 내성 콜로니를 펴치고 증가되는 농도의 인터페론 감마에 대한 이들의 반응을 시험한다. 선별된 클론의 투여량 반응을 확인하다.
특히, 하기 프로토콜은 200㎕의 세포를 함유하는 75개 웰에 충분한 세포를 산출할 것이다. 따라서, 그 범위를 넓히거나 다중으로 수행하여 다중 96개 웰 평판에 충분한 세포를 형성시킨다. 주캇 세포를 RPMI + 1% Pen-Strep을 갖는 10% 혈청에서 유지시킨다. T25 플라스크 내에서 2.5mls의 OPTI-MEM(라이프 테크놀로지)과 10ug의 플라스미드 DNA를 배합한다. 50㎕의 DMRIE-C를 함유하는 2.5ml의 OPTI-MEM을 첨가하고 실온에서 15-45분 동안 항온배양한다.
항온배양 기간 동안, 세포 농도를 계산하고, 필요한 수의 세포(형질감염 당107개)를 회전하여 가라앉히고 OPTI-MEM에 재현탁하여 최종농도가 107세포/ml이 되도록 한다. 이어서, OPTI-MEM내 1X107세포 1ml을 T25 플라스크에 첨가하고 37℃에서 6시간동안 항온배양한다. 항온배양 후 10ml의 RPMI + 15% 혈청을 첨가한다.
주캇:GAS-SEAP 안정한 리포터 라인을 RPMI+10% 혈청, 1mg/ml 젠티신 및 1% Pen-Strep에서 유지시킨다. 실시예 14에 기술한 프로토콜에 의해 생성된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 또는 METH1 또는 METH2 유도성 폴리펩티드를 함유하는 상청액으로 이들 세포를 처리한다.
상청액으로 처리한 날, 세포를 세척하고 새로운 RPMI+10% 혈청에 재현탁시켜 500,000개 세포/ml의 밀도로 만들어야 한다. 필요한 세포의 정확한 수는 스크리닝하고자 하는 상청액의 수에 좌우될 것이다. 하나의 96개 웰 평판의 경우 대략 1억개 세포(10평판당, 10억개 세포)가 필요하다.
세포를 삼각형 저장 보트로 옮겨서, 12 채널 피펫을 사용하여 세포를 96 웰 접시 안으로 분배시킨다. 12 채널 피펫을 사용하여 200㎕의 세포를 각 웰 안으로 옮긴다(따라서, 100,000개 세포/웰을 첨가함).
모든 평판을 파종한 이후, 12 채널 피펫을 사용하여 상청액을 함유하는 96 웰 평판으로부터 각 웰 안으로 50㎕의 상청액을 직접 옮긴다. 게다가, 일정 투여량(0.1, 1.0, 10ng)의 외인성 인터페론 감마를 웰 H9, H10 및 H11에 첨가하여 분석을 위해 부가적인 양성 대조군으로 사용한다.
상청액으로 처리한 주캇 세포를 함유하는 96 웰 접시를 항온배양기 내에 48시간동안 정치한다(주의: 이 시간은 48-72시간으로 변화할 수 있다). 이어서, 12 채널 피펫을 사용하여 각 웰로부터 나온 35㎕의 샘플을 혼탁 96개 웰 평판으로 옮긴다. 혼탁 평판은 (셀로판 덮개를 사용하여) 덮개를 씌어야 하며, 실시예 20에 따라 SEAP 분석을 수행할 때까지 -20℃에서 저장시켜야 한다. 처리된 남은 세포를 함유하는 평판을 4℃에 정치하고 원하는 경우 특정 웰 상에서 분석을 반복하기 위한 물질 공급원으로 사용한다.
양성 대조군으로서, 주캇 T 세포를 활성화시키는 것으로 알려진 인터페론 감마 100 유니트/ml을 사용한다. 통상, 양성 대조군 웰에서 30배 이상의 유도가 관찰된다.
실시예 17: 골수성 활성을 확인하는 고효율의 스크리닝 분석
하기 프로토콜은 METH1 또는 METH2가 골수 세포를 증식 및/또는 분화시키는지를 측정함으로써 METH1 또는 METH2의 골수성 활성을 평가하는데 사용하다. 골수 세포 활성은 실시예 15에서 생산한 GAS/SEAP/Neo 구조체를 사용하여 평가한다. 따라서, SEAP 활성을 증가시키는 인자는 Jaks-STATs 신호 전달 경로를 활성화시키는 활성을 제시한다. 이 분석에 사용된 골수 세포는 U937, 프리-단핵구 세포주이나, TF-1, HL-60 또는 KG1도 사용할 수 있다.
실시예 15에서 생산한 GAS/SEAP/Neo 구조체로 U937 세포를 순간적으로 형질감염시키기 위해, DEAE-덱스트란 방법(Kharbanda et al., 1994, Cell Growth & Differentiation 5:259-265)을 사용한다. 먼저, 2x10e7U937세포를 수집하고 PBS로세척하라. 통상 U937 세포는 100 유니트/ml의 페니실린과 100 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청(FBS)를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 성장시킨다.
다음, 0.5mg/ml DEAE-덱스트란, 8ug GAS-SEAP2 플라스미드 DNA, 140mM NaCl, 5mM KCl, 375uM Na2HPO4·7H2O, 1mM MgCl2및 675uM CaCL2를 함유하는 20mM 트리스-HCl(pH 7.4) 완충액 1ml에 세포를 현탁시켜라. 37℃에서 45분 동안 항온배양하라.
10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지로 세포를 세척하고, 이어서 10ml 완전 배지에 재현탁하고, 37℃에서 36시간 동안 항온배양하라.
400ug/ml G418에서 세포를 성장시킴으로써 GAS-SEAP/U937 안정한 세포를 수득한다. G418-부재 배지를 사용하여 일상적으로 성장시키나 두달에 한번 세포는 쌍을 이루는 계대배양을 위해 400ug/ml G418에서 재성장시켜야 한다.
1x108 세포(이것은 10개의 96-웰 평판 분석에 충분함)를 수집함으로써 이들 세포를 시험하고 PBS로 세척한다. 전술한 성장 배지 200ml에서 세포를 현탁하여 최종 밀도가 5x105세포/ml이 되도록 하라. 96-웰 평판에 200㎕ 세포/웰(또는 1x105 세포/웰)로 도포하라.
실시예 14에 기술한 프로토콜에 의해 준비된 상청액 50㎕을 첨가하라. 37℃에서 48시간 내지 72시간 동안 항온배양하라. 양성 대조군으로서, U937 세포를 활성화시키는 것으로 알려진 인터페론 감마 100 유니트/ml을 사용할 수 있다. 통상 양성 대조군 웰에서는 30 배이상의 유도가 관찰된다. SEAP는 실시예 20에 기술한 프로토콜에 따라 상청액을 분석한다.
실시예 18: 뉴론 활성을 확인하는 고효율의 스크리닝 분석
세포가 분화 및 증식할 때, 일군의 유전자들이 다수의 상이한 신호 전달 경로에 의해 활성화된다. 이들 유전자 중 하나인, EGR1(초기 성장 반응 유전자 1)은 활성화될 때 다양한 조직 및 세포 유형에서 유도된다. EGR1의 프로모터는 이러한 유도에 반응할 수 있다. 리포터 분자에 연결된 EGR1 프로모터를 사용하여, METH1 또는 METH2에 의한 세포의 활성화를 분석할 수 있다.
특히, 하기 프로토콜을 사용하여 PC12 세포주에서의 뉴론 활성을 평가한다. PC12 세포(래트 크롬친화성종양 세포)는 TPA(테트라데카노일 포르볼 아세테이트), NGF(신경 성장 인자), 및 EGF(표피 성장 인자)와 같은 다수의 유사분열 물질에 의해 활성화됨으로써 증식 및/또는 분화되는 것으로 알려져 있다. EGR1 유전자 발현은 이 처리 동안 활성화된다. 따라서, SEAP 리포터에 연결된 EGR 프로모터를 함유한 구조체로 PC12 세포를 안정하게 형질감염시킴으로써 METH1 또는 METH2에 의한 PC12 세포의 활성화를 평가할 수 있다.
EGR/SEAP 리포터 구조체는 하기 프로토콜에 의해 조립될 수 있다. EGR-1 프로모터 서열(-633 내지 +1)(Sakamoto K et al., Oncogene 6:867-871 (1991))은 하기 프라이머를 사용하여 사람 지놈성 DNA으로부터 PCR 증폭될 수 있다:
5' GCGCTCGAGG GATGACAGCG ATAGAACCCC GG 3'(서열번호 89)
5' GCGAAGCTTC GCGACTCCCC GGATCCGCCT C 3'(서열번호 90).
이어서, 실시예 15에서 생산한 GAS:SEAP/Neo 벡터를 사용하여 EGR1 증폭 생산물을 이 벡터 내로 삽입할 수 있다. 제한 효소 XhoI/HindIII를 사용하여 GAS:SEAP/Neo 벡터를 직선화하고 GAS/SV40 스터퍼를 제거하라. EGR1 증폭 생산물을 동일한 효소로 제한처리하라. 벡터 및 EGR1 프로모터를 연결하라.
세포 배양을 위한 96 웰-평판을 준비하기 위해, 2ml의 피복 용액(30% 에탄올(멸균된 필터) 내 콜라겐 유형 I(Upstate Biotech Inc. Cat#08-115)의 1:30 희석액)을 하나의 10cm 평판에 첨가하거나, 50ml 피복용액을 96-웰 평판의 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 공기 건조시킨다.
사전피복된 10cm 조직 배양 접시 상에서 100유니트/ml의 페니실린 및 100ug/ml 스트렙토마이신으로 보충된 10% 말 혈청(JRH BIOSCIENCES, Cat. # 12449-78P), 5% 열-불활성화된 태아 소 혈청(FBS)를 함유하는 RPMI-1640 배지(Bio Whittaker)에서 PC12 세포를 일반적으로 성장시킨다. 3일 내지 4일 마다 1 내지 4개의 분할을 행한다. 찰과함으로써 평판으로부터 세포를 제거하고 15회 이상 상하로 피펫팅하여 재현탁한다.
실시예 14에 기술된 리포텍트아민 프로토콜을 사용하여 EGR/SEAP/Neo 구조체를 PC12안으로 형질감염시켜라. EGR-SEAP/PC12 안정한 세포는 300ug/ml G418 내에서 세포를 성장시킴으로써 얻는다. G418-부재 배지는 일상적인 성장을 위해 사용하나, 1 내지 2 개월마다 세포는 쌍을 이룬 계대배양을위해 300ug/ml G418에서 재성장시켜야 한다.
뉴론 활성을 분석하기 위해, 약 70 내지 80% 융합성의 세포를 갖는 10cm 평판은 오래된 배지를 제거함으로써 스크리닝한다. PBS(인산 완충 염수)로 한번 세포를세척한다. 이어서, 낮은 혈청 배지(항생제와 함께 1% 말 혈청 및 0.5% FBS를 함유하는 RPMI-1640)에서 세포를 밤새 절식시켜라.
다음날, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하라. 평판으로부터 세포를 찰과시켜버리고, 2ml의 낮은 혈청 배지에서 세포를 잘 현탁하라. 세포 수를 계산하고 더 낮은 혈청 배지를 첨가하여 최종 세포 밀도가 5x105세포/ml이 되도록 하라.
96-웰 평판의 각 웰에 세포 현탁액 200㎕를 첨가하라(1x105세포/웰에 해당함). 실시예 14에 의해 생산된 상청액 50㎕를 37℃에서 48시간 내지 72시간 동안 첨가하라. 양성 대조군으로서, EGR을 통해 PC12 세포를 활성화시킨다고 알려진 성장 인자, 예컨대, 50ng/ul의 뉴론 성장 인자(NGF)를 사용할 수 있다. 50배 이상의 SEAP의 유도가 통상 양성 대조군 웰에서 관찰된다. 실시예 20에 따라 상청액에 대해 SEAP 분석을 한다.
실시예 19: T-세포 활성에 대한 고효율 스크리닝 분석
NF-KB(핵 인자 KB)는, 염증성 사이토킨 IL-1 및 TNF, CD30 및 CD40, 림프독소-알파 및 림프독소-베타를 포함하는 광범위한 제제에 의해, LPS 또는 트롬빈에 노출됨으로써 그리고 특정 바이러스 유전자 산물이 발현됨으로써, 활성화되는 전자 인자이다. 전사 인자로서 NF-KB는 면역 세포 활성화, 아폽토시스의 제어(NF-KB는 아폽토시스로부터 세포를 보호해주는 것처럼 보인다), B 및 T-세포 발달, 항바이러스성 및 항미생물성 반응 및 다발성 스트레스 반응에 관여하는 유전자의 발현을 조절한다. 비자극 조건에서, NF-KB는 I-KB(억제제 KB)와 함께 세포질내에 보유된다.그러나, 자극시 I-KB는 인산화되고 분해되어 NF-KB가 핵으로 왕복하고 이로인해 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다. NF-KB에 의해 활성화되는 표적 유전자는 IL-2, IL-6, GM-CSF, ICAM-1 및 클래스 1 MHC를 포함한다.
일정 범위의 자극에 반응하는 주요 역할 및 능력 때문에, NF-KB 프로모터 요소를 사용하는 리포터 구조체를 사용하여 실시예 14에서 생산한 상청액을 스크리닝한다. NF-KB의 활성제 또는 억제제는 질환 치료에 유용하다. 예를들면, NF-KB의 억제제를 사용하여 류마티스성 관절염 같은 NF-KB의 급성 또는 만성 활성화와 관련이 있는 질환을 치료할 수 있다.
NF-KB 프로모터 요소를 함유하는 벡터를 제작하기 위해 PCR에 기초한 전략을 사용한다. 상류 프라이머는 NF-KB 결합 부위(GGGGACTTTC CC)(서열번호 91)로 구성된 4개의 직렬 카피, SV40 초기 프로모터 서열의 5'단부에 상보적이며 XhoI 부위와 인접해 있는 18bp 서열: 5': GCGGCCTCGA GGGGACTTTC CCGGGGACTT TCCGGGGACT TTCCGGGACT TTCCATCCTG CCATCTCAAT TAG :3'(서열번호 92)를 함유한다.
하류 프라이머는 SV40 프로모터의 3'단부에 상보적이며 Hid III 부위와 인접해 있다: 5" GCGGCAAGCT TTTTGCAAAG CCTAGGC :3'(서열번호 93).
클론테크로부터 구입한 pB:gal:프로모터 플라스미드에 존재하는 SV40 프로모터 주형을 사용하여 PCR 증폭을 수행한다. 형성된 PCR 단편은 XhoI 및 Hind III로 소화시키고 BLSK2-(Stratagene)로 서브클로닝한다. T17 및 T3 프라이머로 서열분석 하여 삽입체가 하기 서열을 함유한다는 것을 확인한다: 5': CTCGAGATTT CCCCGAAATC TAGATTTCCC CGAAATGATT TCCCCGAAAT GATTTCCCCG AAATATCTGC CATCTCAATT AGTCAGCAACCATAGTCCCG CCCCTAACTC CGCCCATCCC GCCCCTAACT CCGCCCAGTT CCGCCCATTC TCCGCCCCAT GGCTGACTAA TTTTTTTTAT TTATGCAGAG GCCGAGGCCG CCTCGGCCTC TGAGCTATTC CAGAAGTAGT GAGGAGGCTT TTTTGGAGGC CTAGGCTTTT GCAAAAAGCT T :3'(서열번호 88).
다음, pSEAP2-프로모터 플라스미드(클론테크)에 존재하는 SV40 최소 프로모터 요소를 XhoI 및 HindIII를 사용하여 상기 NF-KB/SV40 단편으로 치환하라. 그러나, 이 벡터는 네오마이신 내성 유전자를 함유하지 않기 때문에 포유류 발현 시스템으로 바람직하지 않다.
안정한 포유류 세포주를 형성하기 위해, 제한효소 SalI 및 NotI을 사용하여 NF-KB/SV40/SEAP 카세트를 상기 NF-KB/SEAP 벡터로부터 제거하고, 네오마이신 내성을 갖는 백터 내로 삽입한다. 특히, NF-KB/SV40/SEAP 카세트는 SalI 및 NotI로 pGFP-1를 제한효소 처리한 후, GFP 유전자를 대신하여 pGFP-1(클론테크)안으로 삽입하였다.
일단 NF-KB/SV40/SEAP/Neo 벡터를 형성시키면 안정한 주캇 T-세포가 형성되고 실시예 16에 기술된 프로토콜에 따라 유지된다. 유사하게, 상기 안정한 주캇 T-세포로 상청액을 분석하는 방법도 실시예 16에 기술되어 있다. 양성 대조군으로서, 외인성 TNF 알파(0.1, 1, 10ng)을 웰 H9, H10 및 H11에 첨가하면, 통상 5-10배 활성화가 관찰된다.
실시예 20: SEAP 활성 분석
실시예 16-19에 기술된 분석을 위한 리포터 분자로서, SEAP 활성을 일반적인 하기 공정에 따라 Tropix Phospho-light 키트(Cat. BP-400)를 사용하여 분석한다.Tropix Phospho-light 키트는 하기 사용되는 희석, 분석 및 반응 완충액을 제공한다.
2.5x 희석 완충액으로 디스펜서를 프라임하고 35㎕의 상청액을 함유하는 옵티플레이트(Optiplate) 안으로 2.5x희석 완충액 15㎕을 분배하라. 플라스틱 봉인기로 평판을 봉인하고 65℃에서 30분동안 항온배양하라. 불균일한 가열을 피하기 위해 옵티플레이트를 분리하라.
샘플을 실온으로 15분 동안 차갑게 하라. 디스펜서를 비우고 분석 완충액으로 프라임하라. 50ml의 분석 완충액을 첨가하고 실온에서 5분간 항온배양하라. 디스펜서를 비우고 반응 완충액(하기 표 참조)으로 프라임하라. 분석 완충액 50㎕를 첨가하고 실온에서 20분 동안 항온배양하라. 화학형광 신호의 강도가 시간에 의존하고, 형광계측기 상에서 5개 평판을 판독하기 위해서는 약 10분이 소요되기 때문에 각 시간에 5개 평판을 처리하고 10분 후에 제2 세트를 시작하라. 형광계측기에서 상대적인 광 유니트를 판독하라. 블랭크로서 H12를 설정하고 결과를 인쇄하라. 화학형광의 증가는 리포터 활성을 제시한다.
반응 완충액 제형
| 평판 # | 반응 완충 희석액(ml) | CSPD(ml) |
| 10 | 60 | 3 |
| 11 | 65 | 3.25 |
| 12 | 70 | 3.5 |
| 13 | 75 | 3.75 |
| 14 | 80 | 4 |
| 15 | 85 | 4.25 |
| 16 | 90 | 4.5 |
| 17 | 95 | 4.75 |
| 18 | 100 | 5 |
| 19 | 105 | 5.25 |
| 20 | 110 | 5.5 |
| 21 | 115 | 5.75 |
| 22 | 120 | 6 |
| 23 | 125 | 6.25 |
| 24 | 130 | 6.5 |
| 25 | 135 | 6.75 |
| 26 | 140 | 7 |
| 27 | 145 | 7.25 |
| 28 | 150 | 7.5 |
| 29 | 155 | 7.75 |
| 30 | 160 | 8 |
| 31 | 165 | 8.25 |
| 32 | 170 | 8.5 |
| 33 | 175 | 8.75 |
| 34 | 180 | 9 |
| 35 | 185 | 9.25 |
| 36 | 190 | 9.5 |
| 37 | 195 | 9.75 |
| 38 | 200 | 10 |
| 39 | 205 | 10.25 |
| 40 | 210 | 10.5 |
| 41 | 215 | 10.75 |
| 42 | 220 | 11 |
| 43 | 225 | 11.25 |
| 44 | 230 | 11.5 |
| 45 | 235 | 11.75 |
| 46 | 240 | 12 |
| 47 | 245 | 12.25 |
| 48 | 250 | 12.5 |
| 49 | 255 | 12.75 |
| 50 | 260 | 13 |
실시예 21: 소분자 농도 및 막 투과도에 있어서 변화를 확인하는 고효율 스크리닝 분석
수용체에 리간드가 결합하는 것은 칼슘, 칼륨, 나트륨 및 pH와 같은 소분자의 세포내 수준을 변화시킬 뿐만 아니라 막 전위를 변화시키는 것으로 알려져 있다. 이들 변화는 특정 세포의 수용체에 결합하는 상청액을 확인하는 분석에서 측정될 수 있다. 하기 프로토콜은 칼슘에 관한 분석을 기술하나 이러한 프로토콜은 칼륨, 나트륨, pH, 막 전위 또는 형광 프로브로 검출가능한 임의의 기타 소분자의 변화를 검출하고록 용이하게 수정할 수 있다.
하기 분석은 형광계측 영상 평판 판독기("FLIPR")을 사용하여, 소분자와 결합하는 형광 분자(Molecular Probes)의 변화를 측정한다. 확실히, 소분자를 검출하는 임의의 형광 분자는 여기서 사용된 칼슘 형광 분자, 플루오-3 대신에 사용할 수 있다.
부착 세포의 경우, 깨끗한 바닥을 갖는 Co-star 블랙 96-웰 평판에서 10,000-20,000 세포/웰로 세포를 파종하라. 평판은 CO2항온배양기에서 20시간동안 항온배양한다. HBSS(한스의 균형잡힌 염 용액) 200㎕로 Biotek 세척기에서 부착 세포를 2번 세척하고 최종 세척 후 완충액 100㎕가 남도록 하였다.
플루오-3 1mg/ml의 저장 용액을 10% 플루론산 DMSO에서 제조한다. 플루오-3으로 세포를 로딩하기 위해, 12ug/ml의 플루오-3 50㎕를 각 웰에 첨가한다. 평판을 37℃ CO2항온배양기에서 60분동안 항온배양한다. 평판을 HBSS를 갖는 Biotek 세척기에서 4번 세척하고 완충액 100㎕를 남긴다.
비부착 세포의 경우, 세포를 배양 배지로부터 회전하여 가라앉힌다. 50ml의 원뿔형 튜브내 HBSS를 갖는 2-5x106개 세포/ml로 세포를 재현탁한다. 10% 플루론산 DMSO내 1mg/ml의 플루오-3 용액 4㎕를 각 ml의 세포 현탁액에 첨가한다. 이어서,튜브를 37℃ 수조에서 30-60분 동안 정치한다. 세포를 HBSS로 2번 세척하고 1x106세포/ml로 재현탁하고 미세평판 100㎕/웰 로 분배한다. 평판을 1000rpm 에서 5분 동안 원심분리한다. 이어서, 평판을 Denley CellWash에서 200㎕로 한번 세척하고 흡입단계를 수행하여 최종 부피가 100㎕가 되도록 한다.
비세포계 분석의 경우, 각 웰은 플루오-3 같은 형광 분자를 함유한다. 상청액을 웰에 첨가하고 형광의 변화를 검출한다.
세포내 칼슘의 형광을 측정하기 위해 FLIPR은 하기 파마미터로 설정한다:(1) 시스템 게인은 300-800mW이고; (2) 노출 시간은 0.4초이며; (3) 카메라 F/스톱은 F/2이고; (4) 여기는 488nm이며; (5) 방사는 530nm이고; (6) 샘플 부가는 50㎕이다. 530nm에서의 증가된 방사는 그 결과 세포내 Ca++농도의 증가를 산출하는, METH1 또는 METH2, 또는 METH1 또는 METH2에 의해 유도된 분자에 의해 야기되는 세포외 신호전달 사건을 제시한다.
실시예 22: 티로신 키나제 활성을 확인하는 고효율 스크리닝 분석.
단백질 티로신 키나제(PTK)는 다양한 군의 막관통 키나제 및 세포질 키나제를 나타낸다. 수용체 단백질 티로신 키나제(RPTK)군에는 PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF 및 인슐린 수용체 하부패밀리를 포함하는 일정 범위의 유사분열 및 물질대사 성장 인자의 수용체가 있다. 게다가, 해당하는 리간드가 알려지지 않은 큰 패밀리의 RPTK가 있다. RPTK에 대한 리간드는 주로 분비성 소단백질을 포함하나, 막-결합 단백질 및 세포외 매트릭스 단백질도 포함한다.
리간드에 의한 RPTK의 활성화는 리간드 매개성 수용체 이량체화에 관여하며, 그 결과 수용체 서브유닛의 트랜스 인산화 및 세포질 티로신 키나제의 활성화를 산출한다. 세포질 티로신 키나제는 src-패밀리(예, src, yes, lck, lyn, fyn) 및 수용체와 연결되지 않은 세포질 단백질 키나제(예, Jak 패밀리)를 포함하며, Jak 패밀리의 일원은 사이토킨 수퍼패밀리의 수용체들(예, 인터류킨, 인터페론, GM-CSF, 및 렙틴)에 의해 촉발되는 신호 전달을 매개한다.
티로신 키나제 활성을 자극할 수 있는 공지의 인자가 광범위하기 때문에, METH1 또는 METH2, 또는 METH1 또는 METH2에 의해 유도되는 분자가 티로신 키나제 신호 전달 경로를 활성화시킬 수 있는지 여부를 확인하는 것이 관심사이다. 따라서, 하기 프로토콜을 고안하여 티로신 키나제 신호 전달 경로를 활성화할 수 있는 이러한 분자를 확인한다.
표적 세포(예, 제1차 각질형성세포)를 대략 25,000 세포/웰로 Nalge Nunc(Naperville, IL)로부터 구입한 96웰 Loprodyne Silent Screen Plates에 파종하라. 평판을 100% 에탄올을 갖는 2번의 30분 세정으로 소독하고 물로 세정하고, 밤새 건조시킨다. 몇몇 평판을 시그마 케미칼스(St. Louis, MO)에서 구입한 세포 배양 등급 유형 I 콜라겐(50mg/ml), 젤라틴(2%) 또는 폴리리신(50mg/ml), 또는 Becton Dickinson(Bedford, MA)에서 구입한 10% 마트리젤 또는 송아지 혈청 100ml으로 2시간동안 피복하고 PBS로 세정하고 4℃에서 저장한다. 이들 평판 상에서의 세포 성장은 성장 배지에서 5,000 세포/웰을 파종하고 48시간 후 제조업자 Alamar Biosciences, Inc(Sacramento, CA)에 의해 기술된 바와 같이, alamarBlue의 사용을통해 세포 수의 간접적인 정량화에 의해 분석한다. Becton Dickinson(Bedford, MA)로부터 구입한 Falcon 평판 덮개 #3071을 사용하여 Loprodyne Silent Screen Plate를 덮는다. Falcon Microtest III 세포 배양 평판을 몇몇 증폭 실험에서 사용할 수 있다.
추출물을 준비하기 위해, A431 세포를 Loprodyne 평판(20,000/200ml/웰)의 나일론 막 상으로 파종하고 완전 배지에서 밤새 배양한다. 24시간 동안 혈청 부재 기초 배지에서 항온배양함으로써 세포를 휴지시킨다. EGF(60ng/ml) 또는 실시예 14에서 생산한 상청액 50㎕으로 처리하고 5-20분 후, 배지를 제거하고, 100ml의 추출 완충액((20mM HEPES pH7.5, 0.15M NaCl, 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 2mM Na3VO4, 2mM Na4P2O7 및 Boehringer mannheim(Indianapolis, IN)에서 구입한 단백분해효소 억제제 칵테일(#1836170))을 각 웰에 첨가하고, 평판을 회전 진탕기 상에서 5분동안 4℃에서 진탕한다. 이어서, 평판을 진공 트랜스퍼 매니폴드(manifold)에 정치하고, 가정용 진공기를 사용하여 각 웰의 0.45mm 막 바닥을 통해 추출물을 여과한다. 진공 매니폴드의 바닥에 96-웰 캐치/분석 평판에서 추출물을 수집하고 얼음 상에 즉시 놓는다. 원심분리에 의해 맑아진 추추물을 수득하기 위해, 5분 동안 세제 용매화 후 각 웰의 내용물을 제거하고, 15분동안 4℃에서 16,000 x g로 원심분리한다.
여과된 추출물에 대해 티로신 키나제 활성의 수준을 시험하라. 티로신 키나제 활성을 검출하는 방법이 다수 알려져 있으나, 본 명세서에서는 한 방법만 기술한다.
통상, 상청액의 티로신 키나제 활성은 특정 기질(비오틴화된 펩티드) 상 티로신 잔기를 인산화할 수 있는 능력을 측정함으로써 평가된다. 이 목적을 위해 사용될 수 있는 비오틴화된 펩티드는 PSK1(세포 분열 키나제 cdc2-p34의 아미노산 6-20에 해당함) 및 PSK2(게스트린의 아미노산 1-17에 해당함)를 포함한다. 양 펩티드는 일정 범위의 티로신 키나제의 기질이고 Boehringer Mannheim에서 구입가능하다.
티로신 키나제 반응은 하기 성분을 순서대로 첨가함으로써 수행한다. 먼저, 5uM 비오틴화된 펩티드 10ul, 이어서 ATP/Mg+(5mM ATP/50mM MgCl2) 10ul, 이어서, 5x 분석 완충액(40mM 이미다졸 염산염, pH7.3, 40mM 베타-글리세로포스페이트, 1mM EGTA, 100mM MgCl2, 5mM MnCl2, 0.5mg/ml BSA) 10ul, 이어서, 나트륨 바나데이트(1mM) 그리고 이어서 물 5ul을 첨가한다. 성분을 온화하게 혼합하고 30℃에서 2분 동안 반응 혼합물을 미리항온배양한다. 대조군 효소 또는 여과된 상청액 10ul을 첨가함으로써 반응을 개시한다.
이어서, 티로신 키나제 분석 반응은 120mm의 EDTA를 첨가함으로써 종결하고 반응액을 얼음 위에 배치한다.
이어서 티로신 키나제 활성은 반응 혼합물 50㎕ 분취액을 미세역가 평판(MTP) 모듈로 옮기고 37℃에서 20분 동안 항온배양함으로써 결정한다. 이에 의해, 스트렙타바딘 피복된 96웰 평판은 비오틴화된 펩티드와 연결될 수 있다. 300ul/웰의 PBS로 4번 MTP 모듈을 세척하라. 다음, 서양 고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-포스포티로신 항체(항-P-Tyr-POD(0.5u/ml) 75㎕을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온배양하라. 상기와 같이 웰을 세척하라.
이어서, 퍼옥시다제 기질 용액(Boehringer Mannheim) 100ul을 첨가하고 실온에서 5분 이상(최대 30분 까지) 항온배양하라. ELISA 판독기를 사용하여 405nm에서 샘플의 흡광도를 측정하라. 결합된 퍼옥시다제 활성의 수준은 ELISA 판독기를 사용하여 정량화하고 티로신 키나제 활성의 수준으로 반영하라.
실시예 23: 인산화 활성을 확인하는 고효율 스크리닝 분석.
실시예 22에 기술된 단백질 티로신 키나제 활성 분석에 대한 잠재적인 대안 및/또는 보충으로서, 주요 세포내 신호 전달 중간물질의 활성화(인산화)를 검출하는 분석 또한 사용할 수 있다. 예를들면, 하기 기술된 바와 같이, 한 특정 분석은 Erk-1 및 Erk-2 키나제의 티로신 인산화를 검출할 수 있다. 그러나, Raf, JNK, p38MAP, Map 키나제 키나제(MEK), MEK 키나제, Src, 근육 특이 키나제(MuSK), IRAK, Tec, 및 Janus 같은 다른 분자의 인산화 뿐만아니라 임의의 기타 포스포세린, 포스포티로신 또는 포스포트레오닌 분자는 하기 분석에서 Erk-1 또는 Erk-2 대신 이들 분자로 치환함으로써 검출될 수 있다.
특히, 분석 평판은 96-웰 ELISA 평판의 웰을 0.1ml의 단백질 G(1ug/ml)로 2시간동안 실온(RT)에서 피복함으로써 제조된다. 이어서 평판을 PBS로 세척하고 3% BSA/PBS로 1시간 동안 RT에서 차단시킨다. 이어서, 단백질 G 평판을 Erk-1 및 Erk-2에 대한 2개의 상업적 단클론성 항체(100ng/웰)로 처리한다(1시간, 실온에서)(Santa Cruz Biotechnology). (다른 분자를 검출하기 위해 이 단계는 전술한 임의의 분자를 검출하는 단클론성 항체를 치환함으로써 용이하게 수정될 수있다.) PBS로 3-5번 세정한 후, 평판을 사용할 때까지 저장한다.
A431 세포를 96-웰 리프로딘 필터평판에서 20,000/웰로 파종하고 성장 배지에서 밤새 배양한다. 이어서, 세포를 기초 배지(DMEM)에서 48시간 동안 절식시키고, 이어서 EGF(6ng/웰) 또는 실시예 14에서 수득한 상청액 50㎕로 5-20분 동안 처리한다. 이어서 세포를 용해시키고 추출물을 분석 평판으로 직접 여과시킨다.
추출물과의 1시간 RT 항온배양 후, 웰을 다시 세정한다. 양성 대조군으로서, MAP 키나제(10ng/웰)의 상업적 제제를 A431 추출물 대신 사용한다. 이어서, Erk-1 및 Erk-2 키나제의 인산화된 에피토프를 특이적으로 인식하는 상업적인 다클론성 (토끼) 항체(1ug/ml)로 평판을 처리한다(1시간, RT). 이 항체는 표준 공정에 의해 비오틴화시킨다. 결합된 다클론성 항체는 이어서 Wallac DELFIA 기구에서 Europium-스트렙타비딘 및 Europium 형광 강화 반응제와 함께 계속 항온배양함으로써 정량화한다(시간- 분해된 형광). 백그라운드 이상의 증가된 형광 신호는 METH1 또는 METH2, 또는 METH1 또는 METH2에 의해 유도되는 분자에 의한 인산화를 제시한다.
실시예 24: METH1 또는 METH2 유전자에서의 변화를 결정하는 방법.
(질환과 같은) 관심있는 표현형을 나타내는 전체 가족들 또는 개별적인 환자로부터 분리되는 RNA를 분리한다. 이어서, 당업계에 알려진 프로토콜을 사용하여 이들 RNA 샘플로부터 cDNA를 형성시킨다(Sambrook 참조). 이어서, 서열번호 1에서 관심있는 영역을 둘러싸는 프라이머를 사용하면서 cDNA를 PCR의 주형을 사용한다. 제안되는 PCR 조건은 문헌[Sidransky, D. et al., Science 252:706(1991)]에 기재된 완충용액을 사용하여 95℃에서 30초; 52-58℃에서 60-120초; 및 70℃에서 60-120초로 35사이클 수행하는 것으로 구성되어 있다.
이어서, SequiTherm 폴리머라제(Epicentre Technologies)를 사용하고, T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 5'단부가 표지된 프라이머를 사용하여 PCR 생성물을 서열분석한다. 또한, METH1 또는 METH2의 선별된 엑손의 인트론-엑손 보더를 결정하고 지놈성 PCR 생성물을 분석하여 그 결과를 확인한다. 이어서, METH1 또는 METH2에 의심되는 돌연변이를 갖는 PCR 생성물을 클로닝하고 서열분석하여 직접 서열분석의 결과를 확인한다.
METH1 또는 METH2의 PCR 산물을 문헌[Holton, T.A. and Graham, M.W., Nucleic Acids Research 19:1156(1991)]에 기재된 바와 같은 T-꼬리를 가진 벡터 안으로 클로닝하고, T7 폴리머라제로 서열분석한다. 영향을 받은 개체는 영향을 받지 않은 개체에 존재하지 않는 METH1 또는 METH2의 돌연변이에 의해 확인된다.
또한, METH1 또는 METH2 유전자 내 변화를 결정하는 방법으로서 지놈성 재배열을 관찰한다. 분리된 지놈성 클론은 디곡시제닌데옥시-우리딘 5'-트리포스페이트(Boehringer Manheim)와 함께 틈(nick)-번역하고 문헌[Johnson, Cg. et al., Methods Cell Biol. 35:73-99(1991)]에 기술된 바와 같이 FISH를 수행한다. 표지된 프로브와의 하이브드화는 METH1 또는 METH2 지놈성 좌위와의 특이적인 하이브리드화의 경우 대량의 사람 cot-1 DNA를 사용하여 수행한다.
염색체는 4,6-디아미노-2-페닐리돌 및 프로피듐 요오드화물로 대조염색하여 C- 및 R-밴드의 조합물 생산한다. 정확한 지도화를 위한 정렬된 이미지는 차갑게한 전하-연결된 장치 카메라(Photometrics, Tucson, AZ) 및 다양한 여기 파장 필터(Johnson, Cv. et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 8:75(1991))와 병용하여 3개-밴드 필터 세트(Chroma Technology, Brattleboro, VT)를 사용하여 얻어진다. 이미지 수집, 분석 및 염색체 분획 길이 측정은 ISee Graphical Program System(Inovision Corporation, Durham, NC.)을 사용하여 수행한다. (프로브와 하이브리드화하는) METH1 또는 METH2의 지놈성 영역의 염색체 변화는 삽입, 결실 및 전위로서 확인된다. 이들 METH1 또는 METH2 변화는 관련된 질환의 진단 마커로서 사용된다.
실시예 25: 생물학적 샘플 내에서 METH1 또는 METH2의 비정상 수준을 검출하는 방법.
MEHT1 또는 METH2 폴리펩티드는 생물학적 샘플에서 검출될 수 있고, 만일 증가 또는 감소된 METH1 또는 METH2 수준이 검출되면 이 폴리펩티드는 특정 표현형의 마커이다. 검출 방법은 많으며, 따라서, 당업자는 그들의 특정 필요성에 맞추어 하기 분석법을 수정할 수 있다고 이해된다.
예를들면, 항체-샌드위치 ELISA를 사용하여 샘플 내, 바람직하게는 생물학적 샘플 내 METH1 또는 METH2를 검출한다. 미세역가 평판의 웰은 METH1 또는 METH2의 특이 항체로 최종 농도 0.2 내지 10ug/ml에서 피복한다. 이 항체는 단클론성 또는 다클론성이고, 실시예 13에 기술된 방법에 의해 생산된다. 웰을 차단하여 METH1 또는 METH2의 웰에 대한 비특이 결합을 감소시킨다.
이어서, 피복된 웰을 실온에서 2시간 이상 동안 METH1 또는 METH2를 함유하는 샘플과 함께 항온배양한다. 바람직하게는, 일련의 샘플 희석액을 사용하여 결과를 확인하여야한다. 이어서, 평판을 탈이온화수 또는 증류수로 3번 세척하여 결합하지 않은 METH1 또는 METH2를 제거한다.
다음, 특이 항체-알칼린 포스파타제 접합체 50㎕를 20-400ng의 농도로 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 항온배양한다. 평판을 다시 탈이온화수 또는 증류수로 3번 세척하여 결합되지 않은 접합체를 제거한다.
4-메틸움벨리퍼릴 포스페이트(MUP) 또는 p-니트로페닐 포스페이트(NPP) 기질 용액 75㎕를 각 웰에 첨가하고 1시간 실온에서 항온배양한다. 미세역가 평판 판독기로 반응을 측정하라. 일련의 대조 샘플 희석액을 사용하여 표준 곡선을 만들고, X-축에 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 농도(로그 스케일), Y-축에 형광 또는 흡광도(직선 스케일)를 플롯하라. 표준 곡선을 사용하여 샘플 내 METH1 또는 METH2의 농도를 내삽법에 의해 구하라.
실시예 26: 폴리펩티드의 제형화
METH1 또는 METH2 조성물을 제형화하고, 개별 환자의 임상적 상태(특히 METH1 또는 METH2 폴리펩티드 단독으로 처리한 경우 부작용), 운반 부위, 투여 방법, 투여 시간표 및 숙련자에게 알려진 기타 인자를 고려하여 양호한 의학적 실무와 일치하는 방식으로 투여한다. 따라서, 본 명세서의 목적에 맞는 "유효량"은 이러한 고려사항에 의해 결정된다.
일반적인 계획으로서, 단위 투여량으로 비경구적으로 투여되는 METH1 또는 METH2의 총 약학적 유효량은 환자 몸무게의 약 1ug/kg/일 내지 10mg/kg/일의 범위이나, 상기 언급한 바와 같이 이는 치료적 자유재량에 좌우될 것이다. 더욱 바람직하게는, 이 투여량은 0.01mg/kg/일 이상, 사람의 경우 가장 바람직하게는 호르몬에 대해 약 0.01 내지 1mg/kg/일이다. 계속 주어지는 경우, METH1 또는 METH2는 통상 일일 1-4회 주사에 의해 또는 예컨대 미니 펌프를 사용한 피하 주입에 의해 약 1ug/kg/시 내지 약 50ug/kg/시의 투여 속도로 투여된다. 또한 정맥 내 백 용액을 사용할 수 있다. 변화를 관찰하는데 필요한 치료 길이 및 반응이 발생하는 치료 간격은 원하는 효과에 따라 달라지는 것처럼 보인다.
METH1 또는 METH2를 함유하는 약학 조성물을 경구적으로, 직장으로, 비경구적으로, 시스템내로(intracistemally), 질내로 복강내로, 국소적으로(분말, 연고, 젤, 점적제 또는 경피 패치), 볼로(bucally), 또는 경구 또는 코 스프레이로서 투여한다. "약학적 허용 담체"는 비독성 고형, 반고형 또는 액상 충전제, 희석제, 캡슐화된 물질 또는 임의 유형의 제형 보조제를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "비경구" 용어는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하내 및 관절내 주사 및 주입을 지칭한다.
또한, METH1 또는 METH2는 서방성 방출 시스템에 의해 적절히 투여된다. 적절한 서방성 방출 조성물의 예는 필름 또는 미세캡슐 같이 일정 형태의 물품 형식인 반-투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방성 방출 매트릭스는 폴리액티드(U.S. Pat no. 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman, U.et al., Biopolymers 22:547-556(1983)), 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(R. Langer et al., J.Biomed. Mater. Res. 15:167-277(1981) 및 R. Langer, Chem.Tech. 12:98-105(1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트(R. Langer et al.) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988)을 포함한다. 서방성 방출 조성물을 또한 리포좀에 의해 포획된 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 포함한다. METH1 또는 METH2를 포함하는 리포좀은 본래 알려진 방법에 의해 준비된다: DE3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 82:3688-3692(1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034(1980); EP52,322; EP36,676; EP88,046; EP143,949; EP142,641; 일본특허출원 83-118008; U.S.Pat.Nos. 4,485,945 및 4,544,545; 및 EP102,324. 통상 리포좀은 작은(약 200-800 옹스트롱) 단일박막 유형으로 그 안에 지질 함량은 약 30몰% 이상의 콜레스테롤이고, 선별 비율은 최적 분비성 폴리펩티드 치료에 따라 조정된다.
비경구 투여의 경우, 일구체예에서, METH1 또는 METH2는 통상 바람직한 정도의 정제도로 단위 투여 주입 형식(용액, 서스펜젼, 또는 에멀젼)으로 약학적 허용 담체, 즉 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에게 비독성이고 다른 제형 성분과 혼화성이 있는 것과 함께 혼합함으로써 제형화된다. 예를들면, 바람직한 제형은 산화제 및 폴리펩티드에 해롭다고 알려진 기타 혼합물을 포함하지 않는다.
일반적으로, 제형은 METH1 또는 METH2을 균일하게 그리고 친밀하게 액상 담체 또는 미분된 고형 담체 또는 둘다와 접촉시킴으로써 준비된다. 이어서, 필요하다면, 생성물은 원하는 제형으로 형이 부여된다. 바람직하게는 담체는 비경구 담체, 더욱 바람직하게는 수용체의 혈액과 등장성인 용액이다. 이러한 담체 운반체의 예는 물, 염수, 링게르 용액 및 덱스트로즈 용액을 포함한다. 고정된 오일 및 에틸올리에이트 같은 비수성 운반체뿐만아니라 리포좀 또한 본 명세서에 유용하다.
적절하게 담체는 등장성 및 화학적 안정성을 강화하는 물질 같은 보조물을 소량 함유한다. 이러한 물질은 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트, 아세트산 및 기타 유기산 또는 그 염들과 같은 완충액; 아스코르브산 같은 항산화제; 저분자량(약 10개 잔기 이하) 폴리펩티드, 예, 폴리아르기닌 또는 트리펩티드; 단백질, 예 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌 같은 아미노산; 일당류, 이당류 및 기타 탄수화물(셀룰로오즈 또는 그 유도체, 글루코즈, 만노즈, 또는 덱스트린 포함); EDTA 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨 같은 당 알콜; 나트륨 같은 반대이온; 및/또는 폴리소르베이트, 폴록사머 또는 PEG 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
METH1 또는 METH2는 통상 약 3 내지 8의 pH에서 약 0.1mg/ml 내지 100mg/ml, 바람직하게는 1-10mg/ml의 농도로 상기 운반체 내에 제형화된다. 상기 부형제, 담체 또는 안정화제를 몇몇 사용하면 그 결과 폴리펩티드 염을 형성한다는 것으로 이해될 것이다.
치료 투여를 위해 사용하는 METH1 또는 METH2는 멸균될 수 있다. 멸균상태는 멸균 필터 막(예, 0.2 미크론 막)을 통해 여과시킴으로써 용이하게 얻을 수 있다. 치료 폴리펩티드 조성물은 통상 멸균 입구 포트를 갖는 용기, 예컨대 정맥내 용액 백 또는 피하주사 바늘에 의해 관통가능한 스토퍼를 갖는 바이알 안에 넣는다.
METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 통상 수용액으로 또는 환원용 얼림 건조된제형으로써 단위 투여 또는 다중-투여 용기(예, 봉입된 앰풀 또는 바이알)에 저장될 것이다. 얼림 건조된 제형의 예로서, 10ml의 바이알은 멸균-여과된 1%(w/v) METH1 또는 METH2 폴리펩티드 수용액 5ml로 충진시키고, 형성된 혼합물을 lyophilize한다. 주입액은 제균성 주사용 물을 사용하여 얼림 건조된 METH1 또는 METH2 폴립펩티드를 환원시킴으로써 준비된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물 중 하나이상의 성분으로 충진된 하나이상의 용기를 갖는 약학 키트 또는 팩을 제공한다. 제약 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 및 판매를 조절하는 정부 기관에 의해 정하여진 형식으로 경고는 이러한 용기(들)과 연관될 수 있으며, 이 경고는 사람 투여에 대한 제조, 사용 또는 판매와 관련된 기관에 의한 승인을 반영한다. 게다가, METH1 또는 METH2는 다른 치료 화합물과 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조합물과 병용하여 투여될 수 있는 치료제는 비제한적으로 TNF 패밀리의 다른 일원, 화학치료제, 항생제, 스테로이드성 및 비스테로이드성 항-염증제, 통상의 면역치료제, 사이토킨 및/또는 성장 인자를 포함한다. 조합물은 동시에(예 혼합물로서); 분리되나 동시 또는 병발적으로; 또는 일련적으로 투여될 수 있다. 이는 배합된 약제가 치료 혼합물로서 함께 투여되는 재현물(presentation)을 포함하며, 또한 배합된 약제들이 예컨대 동일 개체안으로 분리된 정맥내 라인을 통해, 분리되었으나 동시에 투여되는 공정을 포함한다. 나아가 "병용" 투여는 주어진 하나의 제1 화합물 또는 약제 이후 제2 화합물 또는 약제를 분리하여 투여하는 것을 포함한다.
일구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNF 패밀리의 다른 일원과 병용하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 TNF, TNF-관련 또는 TNF-유사 분자는 비제한적으로, 가용성 형태의 TNF-알파, 림포독소 알파(LT-알파, 또한 TNF-베타로도 알려져 있음), LT-베타(복합성 헤테로이량체 LT-알파2-베타로 발견됨), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-감마(국제공개 번호 WO 96/14328), AIM-I(국제공개번호 WO 97/33899), 엔도킨-알파(국제공개번호 WO 98/07880), TR6(국제공개번호 WO98/30698), OPG 및 뉴트로킨-알파(국제공개번호 WO98/18921), OX40 및 신경 성장 인자(NGF) 및 가용성 형태의 Fas, CD30, CD27, CD40 및 4-IBB, TR2(국제공개번호 WO 98/30693), TR3(국제공개번호 WO97/33904), TR4(국제공개번호 WO98/32856), TR5(국제공개번호 WO98/30693), TR6(국제공개번호 WO98/30694), TR7(국제공개번호 WO98/41629), TRANK, TR9(국제공개번호 WO98/56892), TR10(국제공개번호 WO98/54202), 312C2(국제공개번호 WO98/06842) 및 TR12, 그리고 가용성 형태의 CD154, CD70 및 CD153을 포함한다.
본 발명의 조성물과 병용하여 투여될 수 있는 일상적인 비특이 면역억제제는 비제한적으로 스테로이드, 시클로스포린, 시클로스포린 유사체, 아이클로포스파미드 메틸프레드니손, 프레드니손, 아자티오프린, FK-506, 15-데옥시스페르굴라인 및 반응하는 T 세포의 기능을 억제함으로써 작용하는 기타 면역억제제를 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 항생제와 병용하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 항생제는 비제한적으로 테트라시클린, 메트로니다졸, 아목시실린, 베타-락타마스류, 아미노글리코시드류, 마크롤리드류, 퀴놀론류, 플루오로퀴놀론류, 세파로스포린류, 에리트로마이신, 시프로플록사신 및 스트렙토마이신을 포함한다.
부가적인 구체예에서, 본 발명의 혼합물은 단독으로 또는 항염증제와 병용하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 항염증제는 비제한적으로 클루코코르티코이드류, 비스테로이드성 항염증제류, 아미노아릴카르복실산 유도체, 아릴아세트산 유도체, 아릴부티르산 유도체, 아릴카르복실산, 아릴프로피온산 유도체, 피라졸류, 피라졸론류, 살리실산 유도체, 티아진카르복사미드류, 에아세타미도카프로산, S-아데노실메티오닌, 3-아미노-4-히드록시부티르산, 아믹세트린, 벤다작, 벤지드아민, 부콜롬, 디펜피라미드, 디타졸, 에모르파존, 구아이줄렌, 나부메톤, 니메술리드, 오르고테인, 옥사세프롤, 파라닐린, 페릭속살, 피폭심, 프로퀴아존, 프록사졸 및 테니답을 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 화학치료제와 병용하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 화학치료제는 비제한적으로 항생제 유도체(예, 독소루비신, 블레오마이신, 다운오루비신 및 닥티노마이신); 항에스트로겐류(예, 타목시펜); 항대사물질(예, 플루오로우라실, 5-FU, 메토트렉세이트, 플록스우리딘, 인터페론 알파-2b, 글루탐산, 플리카마이신, 메르캅토푸린 및 6-티오구아닌); 세포독성제(예, 카르무스틴, BCNU, 로무스틴, CCNU, 사이토신 아라비노시드, 시클로포스파미드, 에스트라무스틴, 히드록시우레아, 프로카르바진, 미토마이신, 부술판, 시스-플라틴 및 빈크리스틴 술페이트); 호르몬(예, 메드록시프로게스테론, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨, 에테닐 에스트라디올, 에스트라디올, 메제스트롤 아세테이트, 메틸테스토스테론, 디에틸스틸베스트롤 디포스페이트, 클로로트리아니센, 및 테스토락톤); 질소 머스타드 유도체(예, 메팔렌, 코람부실, 메클로레타민(질소 머스타드) 및 티오테파); 스테로이드류 및 조합물(예, 베타메타손 나트륨 포스페이트); 및 기타(예, 디카르바진, 아스파라기나제, 미토탄, 빈크리스틴 술페이트, 빈블래스틴 술페이트 및 에토포시드)를 포함한다.
부가적인 구체예에서, 본 발명의 조성물은 사이토킨과 병용하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 사이토킨은 비제한적으로 IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, 항-CD40, CD40L, IFN-감마 및 TNF-알파를 포함한다.
부가적인 구체예에서, 본 발명의 조성물은 혈관형성 단백질과 병용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 혈관형성 단백질은 비제한적으로 유럽특허번호 EP-399816에 기재된 신경교종 유래 성장 인자(GDGF); 유럽특허번호 EP-682110에 기재된 혈소판 유래 성장 인자-A(PDGF-A); 유럽특허번호 EP-282317에 기재된 혈소판 유래 성장 인자-B(PDGF-B); 국제공개번호 WO92/06194에 기재된 태반 성장 인자(PlGF); 문헌[Hauser et al., Growth Factors, 4:259-268(1993)]에 기재된 태반 성장 인자-2(PlGF-2); 국제공개번호 WO90/13649에 기재된 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 유럽특허번호 EP-56477에 기재된 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF-A); 국제공개번호 WO96/39515에 기재된 혈관 내피 성장 인자-2(VEGF-2); 국제공개번호 WO96/26736에 기재된 혈관 내피 성장 인자 B-186(VEGF-B186); 국제공개번호 WO98/02543에 기재된 혈관 내피 성장 인자-D(VEGF-D); 국제공개번호WO98/07832에 기재된 혈관 내피 성장 인자-D(VEGF-D); 및 독일 특허 번호 DE19639601호에 기재된 혈관 내피 성장 인자-E(VEGF-E)를 포함한다. 상기 언급된 문헌은 본 명세서에 인용된다.
부가적인 구체예에서, 본 발명의 조성물은 섬유아세포 성장 인자들과 병용하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 섬유아세포 성장 인자는 비제한적으로 FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14 및 FGF-15를 포함한다.
부가적 구체예에서, 본 발명의 조성물은 예컨대 방사선 치료법과 같은 다른 치료 또는 예방 섭생법과 병용하여 투여된다.
실시예 27: 감소된 수준의 METH1 또는 METH2를 치료하는 방법
본 발명은 감소된 수준의 신체 내 METH1 또는 METH2 활성이 필요한 개체를 치료하는 방법에 관한 것으로 치료 유효량의 METH1 또는 METH2 길항제를 포함하는 조성물을 이러한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명에 사용되는 바람직한 길항제는 METH1 또는 METH2-특이 항체이다.
게다가, 개체 내 METH1 또는 METH2의 표준 또는 정상 발현 수준이 감소됨으로써 야기되는 상태는 METH1 또는 METH2를 바람직하게는 분비 형태로 투여함으로써 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 증가된 수준의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드가 필요한 개체의 치료방법을 제공하며 이 방법은 이러한 개체에게 일정량의 METH1 또는 METH2 함유 치료 조성물을 투여하여 이러한 개체에게서 METH1 또는 METH2의 활성 수준을 증가시키는 단계를 포함한다.
예를들면, 감소된 수준의 METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 갖는 환자는 6일동안 계속 상기 폴리펩티드를 0.1-100ug/kg 일일 투여량으로 받는다. 바람직하게는 폴리펩티드는 분비되는 형태이다. 투여 및 제형에 기초한 투여 계획의 정확한 상세설명은 실시예 26에 제공되어 있다.
실시예 28: 증가된 수준의 METH1 또는 METH2를 치료하는 방법.
본 발명은 또한 증가된 수준의 신체 내 METH1 또는 METH2 활성이 필요한 개체를 치료하는 방법에 관한 것으로 치료 유효량의 METH1 또는 METH2 또는 이의 작용제를 포함하는 조성물을 이러한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
안티센스 기법을 사용하여 METH1 또는 METH2의 생산을 억제한다. 이 기법은, 암과 같은 각종 병인 때문에 바람직하게는 분비되는 형태인 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 수준을 감소시키는 방법의 한 예이다.
예를들면, 비정상적으로 증가된 METH1 또는 METH2으로 진단된 환자는 정맥내로 안티센스 폴리뉴클레오티드를 21일동안 일일 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 및 3.0mg/kg로 투여한다. 만일 치료가 잘 용인된다며 7일 휴식 기간이후에 이 치료를 반복한다. 안티센스 폴리뉴클레오티드의 제형은 실시예 26에 제공되어 있다.
실시예 29: 유전자 요법을 사용한 치료 방법-탈체
유전자 요법의 한 방법은, METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 발현할 수 있는 섬유아세포를 환자에게 이식한다. 통상, 섬유아세포는 피부 생체 검사에 의해 피험체로부터 얻는다. 결과물인 조직은 조직 배양 배지에 놓고 작은 조각으로 분리한다. 작은 덩어리의 조직은 조직 배양 플래스크의 습윤 표면 상에 놓고, 대략 10 조각을 각 플래스크에 놓는다. 플라스크를 거꾸로 뒤집고 가깝게 밀집시키고 밤새 실온에 둔다. 실온에서 24시간 후, 플ㅏ스크를 뒤집고 조직 덩어리를 플래스크의 바닥에 고정시켜 두고, 새로운 배지(예, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 Ham의 F12 배지)를 첨가한다. 이어서, 플래스크를 대략 1주일 동안 37℃에서 항온배양한다.
이때, 새로운 배지를 첨가하고, 계속해서 수일마다 교환한다. 부가적인 2주동안 배양한 후, 단층의 섬유아세포가 나타난다. 단층을 트립신처리하고 벗겨 더 큰 플래스크로 옮긴다.
몰로니 쥐 육종 바이러스의 긴 말단 반복서열(LTR)에 인접한 pMV-7(Kirschmeier, P.T. et al., DNA 7:219-25(1988))을 EcoRI 및 Hind III으로 소화시키고, 이어서 송아지 장 포스파타제로 처리한다. 직선화된 벡터를 아가로즈 젤 상으로 분획하고 유리 비드를 사용하여 정제한다.
METH1 또는 METH2를 암호화하는 cDNA는, 실시예 5에 설명된 각 5' 및 3' 단부에 대응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭할 수 있다. 바람직하게는, 5'프라이머는 EcoRI 부위를 포함하고, 3' 프라이머는 Hind III 부위를 포함한다. 동일한 양의 몰로니 쥐 육종 바이러스의 직선형 백본 및 증폭된 EcoRI 및 HindIII 단편을 함께 T4DNA 리가제 존재하에 첨가한다. 형성된 혼합물은 두 단편의 연결에 적절한 조건하에 유지된다. 이어서 라이게이션 혼합물을 사용하여 박테리아 HB101을 형질전환하고, 이어서 벡터가 적절히 삽입된 METH1 또는 METH2를 함유하는지를 확인할 목적으로 카나마이신을 함유하는 아가 상으로 도포한다.
양쪽자극반응성(amphotropic) pA317 또는 GP+am12 패키징 세포를 조직 배양액에서 성장시키고, 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 둘베코 수정 이글 배지(DMEM)에서 융합성 밀도로 만든다. 이어서, METH1 또는 METH2 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 배지에 첨가하고 패키징 세포를 상기 벡터로 형질도입시킨다. 이제 패키징 세포는 METH1 또는 METH2 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 생산한다(패키징 세포는 이제 유기물 생성 세포로 지칭된다).
새로운 배지를 형질도입된 유기물 생성 세포에 첨가하고, 이어서 배지를 10cm 평판의 융합성 유기물 생성 세포로부터 수집한다. 감염성 바이러스 입자를 함유한 다 써버린 배지를 미공 필터를 통해 여과하여 부착된 유기물 생성 세포를 제거하고, 이어서 이 배지를 사용하여 섬유아세포를 감염시킨다. 배지를 섬유아세포의 서브-융합성 평판으로부터 제거하고, 재빨리 유기물 생성 세포로부터 나온 배지로 대체한다. 이 배지를 제거하고 새로운 배지로 대체한다. 만일, 바이러스 역가가 높으면, 사실상 모든 섬유아세포는 감염될 것이고, 어떠한 선별도 필요하지 않다. 만일 역가가 매우 낮으며, neo 또는 his 같은 선별가능한 마커를 갖는 레트로바이러스 벡터를 사용할 필요가 있다. 일단 섬유아세포가 효과적으로 감염되면, 섬유아세포를 분석하여, METH1 또는 METH2 단백질이 생산되는지는 결정한다.
이어서, 조작된 섬유아세포를, 단독으로 또는 cytodex 3 미세담체 비드 상의 융합체(confluence)로 성장시킨 후 숙주 상에 이식시킨다.
실시예 30: 유전자 요법을 사용한 치료 방법-생체내
본 발명의 또다른 일면은 장애, 질환 및 상태를 치료하기 위해 생체내 유전자 요법 방법을 사용하는 것이다. 유전자 요법은 나체 핵산(DNA, RNA 및 안티센스 DNA 또는 RNA) METH1 또는 METH2 서열을 동물내로 도입시켜 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 발현을 증가 또는 감소시키는 것과 관련이 있다. METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드를 프로모터 또는, 표적 조직에 의해 METH1 또는 METH2 폴리펩티드의 발현에 필요한 임의의 다른 유전자 요소에 작동가능하게 연결할 수 있다. 이러한 유전자 요법 및 전달 기법 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를들면, WO90/11092, WO98/11779; 미국특허번호 제5,693,622호, 제5,705,151호, 제5,580,859호; Tabata, H. et al.(1997) Cardiovasc. Res. 35(3):470-479, Chao, J. et al.(1997) Pharmacol. Res. 35(6):517-522, Wolff,J.A.(1997) Neuromuscul. Disord. 7(5):314-318, Schwartz, B. et al.(1996) Gene Ther. 3(5):405-411, Tsurumi, Y. et al.(1996) Circulation 94(12):3281-3290(본 명세서에 인용됨)이 있다.
METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 구조체는 동물 세포로 주입가능한 물질을 전달하는 임의의 방법, 예컨대 조직(심장, 근육, 피부, 폐, 간, 장 등)의 간질 공간으로 주입함에 의해 전달될 수 있다. METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 구조체는 약학적 허용 액상 또는 수성 담체 안에서 전달될 수 있다.
"나체" 폴리펩티드, DNA 또는 RNA는 세포 내로의 도입을 보조, 증진 또는 용이하게 작용하는 임의의 전달 운반체(예, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포좀 제형, 리포펙틴 또는 침전제 등 포함)가 없는 서열을 지칭한다. 그러나, METH1 또는 METH2 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있는 리포좀제형(Felgner, P.L. et al.(1995) Ann.NY Acad.Sci.772:126-139 and Abdallah, B. et al.(1995) Bio. Cell85(1):1-7에서 교시되는 바와 같은 것) 안에서 전달될 수 있다.
유전자 요법 방법에서 사용되는 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 벡터 구조체는 숙주 지놈 안으로 삽입되지도 않으며 복제할 수 있는 서열을 함유하지도 않은 구조체가 바람직하다. 당업자에게 알려진 임의의 강한 프로모터를 사용하여 DNA 발현을 구동시킬 수 있다. 다른 유전자 요법 기술과 달리, 나체 핵산 서열을 표적 세포내로 도입시키는 주요 장점 중 하나는 세포내에서 일시적으로 폴리뉴클레오티드를 합성하는 특성이다. 연구는 비복제성 DNA 서열이 세포내로 도입되어 최대 6개월의 기간동안 원하는 폴리펩티드를 생산할 수 있다는 것을 보여준다.
METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 구조체를 동물 내 조직의 간질 공간에 전달할 수 있으며, 상기 조직의 예로는 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 골격, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 선(gland) 및 연결 조직을 포함한다. 조직의 간질 공간은 기관 조직의 세망 섬유, 관 또는 챔버의 벽에 있는 신축 섬유, 섬유모양 조직의 콜라겐 섬유 사이의 세포내 액상, 뮤코-다당질 매트릭스, 또는 근육 세포를 초성(ensheathing)하는 연결 조직 내 또는 골격의 골소와 내 동일한 매트릭스로 구성되어 있다. 유사하게, 순환 혈장 및 림프 채널의 림프액에 의해 이 공간이 차지되어 있다. 근육 조직의 간질 공간으로의 전달은 하기 토의된 이유 때문에 바람직하다. 이들은 이들 세포를 구성하는 조직으로 도입됨으로써 용이하게 전달될 수 있다. 바람직하게 이들은 분화된 지속적인 비분열 세포에 전달되고 발현되나, 전달 및 발현은 비분화되거나 덜 완전하게 분화된 세포, 예컨대, 혈액의 간세포 또는 피부 섬유아세포에서 성취될 수 있다. 생체내 근육 세포는 폴리뉴클레오티드를 섭취 및 발현할 수 있는 능력에 있어서 특히 적격이다.
나체 MEHT1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 주입의 경우, 유효 투여량의 DNA 또는 RNA는 약 0.0005g/kg 몸무게 내지 약 50mg/kg 몸무게의 범위내에 있다. 바람직한 투여량은 약 0.005mg/kg 내지 약 20mg/kg이고 더욱 바람직하게는 약 0.05mg/kg 내지 약 5mg/kg이 될 것이다. 물론, 숙련자가 이해하는 바와 같이, 이 투여량은 주입하는 조직 부위에 따라 변할 것이다. 핵산 서열의 적절하고 효과적인 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 치료하고자 하는 상태 및 투여되는 경로에 좌우될 것이다. 바람직한 투여 경로는 조직의 간질 공간안으로 비경구적 경로로 주입하는 것이다. 그러나, 다른 비경구 경로도 또한 사용될 수 있으며, 그 예로는 특히 폐 또는 기관지 조직, 인후 또는 코의 점막으로 전달하기 위한 에어로졸 제형을 흡입하는 것이다. 게다가, 나체 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드 구조체는 공정에서 사용된 도뇨관에 의해 혈관성형 동안 동맥으로 전달될 수 있다.
생체내 근육으로 주입된 METH1 또는 METH2 폴리뉴클레오티드의 투여량 반응 효과는 다음과 같이 결정된다. METH1 또는 METH2 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA 생산을 위해 적당한 METH1 또는 METH2 주형 DNA를 표준 재조합 DNA 방법론에 따라 준비한다. 원형 또는 직선형일 수 있는 주형 DNA는 나체 DNA로서 또는 리포좀과 복합체를 이루면서 사용된다. 이어서, 마우스의 사두근 근육에 다양한 함량의 주형 DNA를 주입한다.
5 내지 6주령 암컷 및 수컷 Balb/C 마우스를 0.3ml의 2.5% 아베르틴의 복강내 주입으로 마취시킨다. 전면 대퇴부 상에 1.5cm 절개를 하고, 사두근을 직접 관찰한다. 27 게이지 바늘을 통해 근육의 말단 삽입 부위로부터 대략 0.5cm 떨어진 곳에서 약 0.2cm 깊이로 1분 이상 1cc 주입기를 사용하여 0.1ml의 담체로 METH1 또는 METH2 주형 DNA를 주입한다. 장래 국부화를 위한 삽입 부위 상에 봉합 수행하고 스텐레스 강철 클립으로 피부를 닫는다.
적절한 항온배양 시간(예, 7일) 후, 전체 사두근을 절개함으로써 근육 추출물은 준비한다. 각 사두근의 매 5번째 15um 횡단면마다 METH1 또는 METH2 단백질 발현에 대한 조직화학적인 염색을 수행한다. METH1 또는 METH2 단백질 발현을 위해 유사한 방식으로 시간을 경과시킬 수 있으나, 단 상이한 마우스로부터 나온 사두근는 상이한 시간에서 수집한다. 주입 이후 근육에서의 METH1 또는 METH2 DNA의 지속성은 주입된 마우스 및 대조군 마우스로부터 나온 총 세포성 DNA 및 HIRT 상청액을 준비한 이후 서던 블럿 분석에 의해 결정할 수 있다. 상기 마우스 내 실험의 결과를 사용하여 METH1 또는 METH2 나체형 DNA를 사용하는 다른 동물 및 사람에게서 적절한 투여량 및 기타 치료 파라미터를 추론할 수 있다.
실시예 31: 내인성 METH1 및/또는 METH2 유전자를 사용한 유전자 요법
본 발명에 따른 유전자 요법의 또다른 방법은 예컨대 문헌[미국특허 제5,641,670호, 1997. 6. 24. 발행; 국제공제번호 WO96/29411, 1996. 9. 26. 공개;국제공제번호 WO94/12650, 1994. 8. 4. 공개; Koller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:8932-8935(1989); 및 Zijlstra et al., Nature 342:435-438(1989)]에 기재된 바와 같이 동종성 재조합을 통해 내인성 METH1 및/또는 METH2 서열을 프로모터와 작동가능하게 연결시키는 것을 포함한다. 이 방법은 표적 세포에 존재하나 이 세포에서 발현되지 않거나 또는 원하는 것보다 낮은 수준으로 발현되는 유전자를 활성화시키는 것을 포함한다.
프로모터 및 표적화 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 구조체를 제조한다. 이 표적화 서열은 프로모터에 인접하는 내인성 METH1 및/또는 METH2의 5'비암호화 서열에 동종성이 있다. 표적화 서열은 충분히 METH1 및/또는 METH2의 5'단부 근처에 있어서 동종성 재조합 시 내인성 서열에 프로모터가 작동가능하게 연결될 것이다. 프로모터 및 표적화 서열은 PCR을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 바람직하게, 증폭된 프로모터는 5' 및 3' 단부에 독특한 제한 효소 부위를 함유한다. 바람직하게, 제1 표적화 서열의 3' 단부는 증폭된 프로모터의 5' 단부와 동일한 제한 효소 부위를 함유하고, 제2 표적화 서열의 5' 단부는 증폭된 프로모터의 3'단부와 동일한 제한 부위를 함유한다.
증폭된 프로모터 및 증폭된 표적화 서열을 적당한 제한 효소로 소화시키고, 이어서, 송아지 장 포스파타제로 처리한다. 소화된 프로모터 및 소화된 표적화 서열을 함께 T4DNA 리가제 존재하에 첨가한다. 형성된 혼합물은 두 단편의 연결에 적당한 조건하에 유지된다. 구조체를 아가로즈 젤 상에서 크기별로 분획화하고 이어서 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제한다.
이 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 구조체는 전기천공법을 통해 나체 폴리뉴클레오티드로서 투여된다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 구조체는 또한 리포좀, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 침전제 등과 같은 형질감염-촉진제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 전달 방법은 당업계에 알려져 있다.
일단 세포가 형질감염되면, 동종성 재조합이 일어나고, 그 결과 프로모터는 내인성 METH1 및/또는 METH2 서열에 작동가능하게 연결된다. 그 결과 METH1 및/또는 METH2가 세포에서 발현된다. 발현은 면역 염색법 또는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 피험체로부터 피부 생체검사를 통해 섬유아세포를 수득한다. 그 결과 형성된 조직을 DMEM +10% 태아 송아지 혈청에 배치한다. 지수함수로 성장하거나 초기 정지상의 섬유아세포는 트립신으로 처리하고 영양 배지로 플라스틱 표면으로부터 세정한다. 한 분취량의 세포 현탁액을 계산하기 위해 제거하고, 나머지 세포는 원심분리시킨다. 상청액을 흡입하고 펠렛을 5ml의 전기천공 완충액(20mM HEPES pH7.3, 137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mM Na2HPO4, 6mM 덱스트로즈)에 재현탁한다. 세포를 재원심분리하고, 상청액을 흡입하고, 세포를 1mg/ml의 아세틸화된 소 혈청 알부민을 함유하는 천기천공 완충액에 재현탁한다. 최종 세포 현탁액은 대략 3X106세포/ml을 함유한다. 전기천공은 재현탁 이후 즉시 수행하여야 한다.
플라스미드를 표준 기법에 따라 준비한다. 예를들면, METH1 및/또는 METH2 좌위에 표적화하고자 하는 플라스미드를 제작하기 위해 플라스미드 pUC18(MBI Fermentas, Amherst, NY)를 HindIII으로 소화시킨다. CMV 프로모터를 PCR에 의해증폭시키면서 5'단부에는 XbaI 부위를 3'단부에는 BamHI 부위를 갖도록 한다. 두개의 METH1 및/또는 METH2 비암호화 서열은 PCR을 통해 증폭시킨다: 하나의 METH1 및/또는 METH2 비암호화 서열(METH1 및/또는 METH2 단편 1)은 5'단부에 HindIII 부위를 3'단부에 Xba 부위를 갖도록 증폭시키고; 또다른 METH1 및/또는 METH2 비암호화 서열(METH1 및/또는 METH2 단편 2)은 5'단부에 BamHI 부위를 3'단부에 HindIII부위를 갖도록 증폭시킨다. CMV 프로모터 및 METH1 및/또는 METH2 단편들을 적당한 효소(CMV 프로모터-XbaI 및 BamHI; METH1 및/또는 METH2 단편 1 - XbaI; METH1 및/또는 METH2 단편 2-BamHI)로 소화시키고 함께 연결시킨다. 형성된 라이게이션 생성물을 HindIII로 소화하고 HindIII-소화된 pUC18 플라스미드와 연결한다.
0.4cm 전극 간격(Bio-Rad)로 플라스미드 DNA를 멸균 큐벳에 첨가한다. 최종 DNA 농도는 통상 120㎍/ml이상이다. 이어서, 0.5ml의 세포 현탁액(대략 1.5X106세포를 함유)을 큐벳에 첨가하고, 세포 현탁액 및 DNA 용액을 온화하게 혼합한다. Gene-Pulser 장치(Bio-Rad)로 전기천공을 수행한다. 정전용량 및 전압을 각각 960㎌ 및 250-300V로 설정한다. 전압을 증가시킴에 따라 세포 생존율이 감소되나 지놈 내로 도입된 DNA가 안정하게 삽입된 생존 세포의 퍼센트는 극적으로 증가한다. 주어진 이들 파라미터에서, 대략 14-20mSec의 펄스 시간이 관찰되어야 한다.
전기천공된 세포를 실온에서 대략 5분동안 유지하고, 이어서 큐벳의 내용물을 멸균 트랜스퍼 피펫으로 온화하게 제거한다. 세포를 10cm 접시에서 예열된 영양 배지(15% 송아지 혈청을 갖는 DMEM) 10ml에 직접 첨가하고, 37℃에서 항온배양한다. 다음날, 배지를 흡입하고 새로운 배지 10ml로 대체하고 16-24시간 더 항온배양한다.
이어서, 조작된 섬유아세포를 단독으로 또는 cytodex 3 미세담체 비드 상의 융합체(confluence)로 성장시킨 후 숙주 안으로 주입한다. 이제 섬유아세포는 단백질 생성물을 생성한다. 이어서, 섬유아세포는 전술한 바와 같이 환자에게 도입될 수 있다.
실시예 32: METH1 및/또는 METH2 트랜스제닉 동물
METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드는 또한 트랜스제닉 동물에서 발현될 수 있다. 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 마이크로-피그, 염소, 양, 소 및 비인간 유인원, 예컨대, 비비, 원숭이 및 침팬지를 비제한적으로 포함하는 임의의 종 동물을 트랜스제닉 동물을 형성하는데 사용할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 알려진 기법을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 유전자 요법 프로토콜의 일부로서 사람에서 발현시킨다.
당업계에 알려진 임의의 기법을 사용하여 트랜스유전자(즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드)를 동물 안으로 도입하여 트랜스제닉 동물의 시조 계(line)를 생산한다. 이러한 기법은 비제한적으로 전핵 미세주입법(Paterson et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:691-698(1994); Carver et al., biotechnology(NY)11:1263-1270(1993); Wright et al., Biotechnology(NY)9:830-834(1991); 및 Hoppe et al., 미국특허 제4,873,191호(1989)); 배선(Van der Putten et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6148-6152(1985)), 포배 또는 배아로의레트로바이러스 매개성 유전자 전이; 배아 간세포에서의 유전자 표적화(Thompson et al., Cell 56:313-321(1989)); 세포 또는 배아의 전기천공법(Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814(1983)); 유전자 총을 사용한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 도입(예컨대, Ulmer et al., Science 259:1745(1993) 참조); 다면발현성 배아 간세포로의 핵산 구조체 도입 및 포배로 간세포의 재전이; 및 정자 매개성 유전자 전이(Lavitrano et al., Cell 57:717-723(1989) 등을 포함한다. 이러한 기법을 검토하기 위해, 문헌[Gordon, "Transgenic Animal" Intl.Rev.Cyto. 115:171-229(1989), 본 명세서에 인용되어 있음]을 참조하라.
당업계에 알려진 임의의 기법을 사용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 트랜스제닉 클론을 생산할 수 있으며, 상기 기법의 예로 배양된 배아, 태아 또는 휴지하도록 유도된 성인 세포로부터 세포핵을 제거한 난모세포의 핵으로 핵 전이(Campell et al., Nature 380:64-66(1996); Wilmut et al., Nature 385:810-813(1997))가 있다.
본 발명은 모든 세포에 트랜스유전자를 운반하는 트랜스제닉 동물뿐만아니라, 전체 세포는 아니나 몇몇 세포에 트랜스유전자를 운반하는 동물, 예, 모자익 동물 또는 키메라을 제공한다. 트랜스유전자는 단일의 트랜스유전자로서 또는 동일지놈연쇄집합체(예, 헤드-투-헤드 직렬 또는 헤드-투-테일 직렬)와 같은 다중 카피로서 삽입될 수 있다. 또한, 트랜스유전자는 예컨대 문헌[Lasko et al, Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236(1992)]에서 교시하는 바에 따라 특정 세포 유형으로 선별적으로 도입되고 여기서 활성화될 수 있다. 이러한 세포-유형 특이 활성화에 필요한 조절성 서열은 관심있는 특정 세포 유형에 좌우될 것이며, 당업자에게 분명하다. 폴리뉴클레오티드 트랜스유전자가 내인성 유전자의 염색체 부위 안으로 삽입되는 것이 바람직한 때에는 유전자 표적화가 바람직하다.
요약컨대, 이러한 기법이 사용될 때, 내인성 유전자와 동종성이 있는 몇몇 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터는 염색체 서열과의 동종성 재조합에 의해 삽입시키고 내인성 유전자의 뉴클레오티드 서열의 기능을 파괴할 목적으로 고안한다. 트랜스유전자는 또한, 예컨대 문헌[Gu et al., Science 265:103-106(1994)]에 교시된 바에 따라 선별적으로 특정 세포 유형 안으로 도입되어 오직 그 세포 유형에 있는 내인성 유전자를 불활성시킬 수 있다. 이러한 세포 유형 특이 불활성화에 필요한 조절성 서열은 관심있는 특정 세포 유형에 좌우될 것이며, 당업자에게 분명할 것이다. 이 문단에 인용된 각 문헌의 내용은 전체로서 본 명세서에 인용된다.
일단 트랜스제닉 동물이 형성되면, 재조합 유전자의 발현은 표준 기법을 사용하여 분석할 수 있다. 초기 스크리닝은, 트랜스유전자의 삽입이 일어났는지는 확인하고자 동물 조직을 분석하기 위해 서던 블럿 분석 또는 PCR 기법에 의해 수행될 수 있다. 트랜스제닉 동물의 조직 내 트랜스유전자의 mRNA 발현 수준은 또한 비제한 적으로 동물로부터 얻은 조직 샘플의 노던 블럿 분석, 원위치 하이브리드화 분석 및 역전사효소-PCR(rt-PCR)을 포함하는 기법을 사용하여 분석할 수 있다. 트랜스제닉 유전자 발현 조직의 샘플은 또한 트랜스유전자 생성물에 특이적인 항체를 사용하여 면역세포화학적으로 또는 면역조직화학적으로 평가할 수 있다.
일단 시조 동물이 생성되면, 이 동물을 번식, 근친교배, 이계교배 또는 교차교배하여 특정 동물의 콜로니를 생성한다. 이러한 번식 전략의 예로는 비제한적으로 분리된 계를 설립하기 위해 하나이상의 삽입부위를 갖는 시조 동물들간의 이계교배; 각 트랜스유전자의 부가적인 발현 효과 때문에 고수준으로 트랜스유전자를 발현하는 군체 트랜스제닉 동물을 생산하기 위한 분리된 계의 근친교배; 발현을 강화하고 DNA 분석에 의해 동물을 스크리닝할 필요성을 제거하기 위해 주어진 삽입 부위에 대해 동형접합성인 동물을 생산하기 위한 이형접합성 트랜스제닉 동물의 교차 교배; 군체 이형접합성 또는 동형접합성 계를 생산하기 위한 분리된 동형접합성 계의 교차 교배; 및 관심있는 실험 모델에 적절한 구별되는 백그라운드 상에 트랜스유전자를 배치하기 위한 교배를 포함한다.
비제한적으로 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드의 생물학적 기능을 강화하는데 유용한 동물 모델 시스템을 포함하는 본 발명의 트랜스제닉 동물은 비정상적인 METH1 및/또는 METH2 발현과 관련이 있는 상태 및/또는 장애를 연구하고 이러한 상태 및/또는 장애를 개선하는데 유효한 화합물을 스크리닝하는데 사용한다.
실시예 33: METH1 및/또는 METH2 녹아웃 동물
내인성 METH1 및/또는 METH2 유전자 발현은 또한 표적화된 동종성 재조합을 사용하여 METH1 및/또는 METH2 유전자 및/또는 그 프로모터를 불활성 또는 "녹아웃"시킴으로써 감소될 수 있다(예, Smithies et al., Nature 317:230-234(1985); Thomas & Capecchi, Cell 51:503-512(1987); Thompson et al., cell 5:313-321(1989)을 참조, 각 문헌은 본 명세서에 인용되어 있음). 예를들면, 내인성 폴리뉴클레오티드 서열(유전자의 암호화 영역 또는 조절성 영역)과 상동성이 있는 DNA와 인접한 본 발명의 돌연변이된 비기능성 폴리뉴클레오티드 (또는 완전히 관련이 없는 DNA 서열)을 선별 마커 및/또는 음성 선별 마커의 존재 및 부재하에 사용하여 생체내 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포를 형질감염시킬 수 있다. 또다른 구체예에서, 당업계에 알려진 기법을 사용하여 관심있는 유전자를 함유하나 발현하지 않는 세포에서 녹아웃을 형성한다. 표적화된 동종성 재조합을 통한 DNA 구조체의 삽입은 그 결과 표적화된 유전자를 불활성시킨다. 이러한 접근법은 특히 배아 간세포에 수정을 가하여 불활성의 표적화된 유전자를 갖는 동물 자손을 형성시킬 수 있는 연구 및 농업 분야에 적절하다(예, Thomas & Capecchi 1987 and Thompson 1989, 상기문헌 참조). 그러나, 이러한 접근법은, 당업자에게 분명할 것인 적절한 바이러스 벡터를 사용하여 생체내 필요한 부위에 재조합 DNA 구조체를 직접 투여 또는 표적화한다면, 사람에서의 사용을 위해 일상적으로 조정할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 조작되거나 또는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하지 않도록 유전적으로 조작된(예, 녹아웃) 세포를 환자에게 생체내 투여한다. 이러한 세포는 환자(즉, 사람을 포함한 동물) 또는 MHC 접합성 공여자로부터 얻을 수 있으며, 비제한적으로 섬유아세포, 골수 세포, 혈액 세포(예, 림프구), 지방 세포, 근육 세포, 내피 세포 등을 포함할 수 있다. 세포는 통상 재조합 DNA 기법을 사용하여 유전적으로 시험관내 조작되어, 예컨대 (바이러스 벡터, 바람직하게는 세포 지놈 내로 트랜스유전자를 삽입하는 벡터를 사용한) 형질도입 또는 형질감염 공정(비제한적으로 플라스미드, 코스미드, YAC, 나체 DNA, 전기천공, 리포좀 등을 포함)에 의해, 세포 안으로 본 발명의 폴리펩티드의 암호화 서열을 도입하거나 또는 본 발명의 폴리펩티드와 관련된 암호화 서열 및/또는 내인성 조절성 서열을 파괴한다. 본 발명의 폴리펩티드의 암호화 서열을 강한 구성성 또는 유도성 프로모터 또는 프로모터/인헨서의 제어하에 배치하여, METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드를 발현, 및 바람직하게는 분비시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 발현, 및 바람직하게는 분비하는 조작된 세포를 전신적으로(예, 순환의 형식으로) 또는 복강내로 환자에게 도입시킬 수 있다.
별법으로, 세포를 매트릭스에 도입시키고 신체에 이식 시킬 수 있다: 예를들면, 유전적으로 조작된 섬유아세포를 피부 이식의 일부로서 이식할 수 있다; 유전적으로 조작된 내피 세포를 림프 또는 혈관 이식의 일부로서 이식할 수 있다. (예컨대, Anderson et al. 미국특허 제5,399,349호; 및 Mulligan & Wilson, 미국특허 제5,460,959호를 참조하라. 각 문헌은 본 명세서에 인용됨).
투여되는 세포가 비-자기유래성 또는 비-MHC 적합성 세포일 때, 도입되는 세포에 대한 숙주 면역 반응의 발달을 방해하는 잘 알려진 기법을 사용하여 상기 세포를 투여할 수 있다. 예를들면, 세포는 바로 이웃한 세포외 환경과 성분들을 교환하면서 도입된 세포가 숙주 면역계에 의해 인식되지 않도록 포획화된 형태로 도입될 수 있다.
비제한적으로 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드의 생물학적 기능을 강화하는데 유용한 동물 모델 시스템을 포함하는 본 발명의 녹아웃 동물은 비정상적인 METH1 및/또는 METH2 발현과 관련이 있는 상태 및/또는 장애를 연구하고 이러한 상태 및/또는 장애를 개선하는데 유효한 화합물을 스크리닝하는데 사용한다.
실시예 34: B 세포 증식 및 분화의 자극 또는 억제를 검출하는 방법.
기능적인 체액성 면역 반응의 형성에는 B-직계성 세포 및 이들의 미세환경 사이의 가용성 및 동계의 신호전달이 필요하다. 신호는 B-직계성 세포가 프로그램된 발달을 계속하게 하는 양성 자극을 부여하거나 또는 세포가 현재 발달 경로를 막도록 지시하는 음성 자극을 부여할 수 있다. 현재까지, 다수의 자극성 및 억제성 신호가 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IL-14 및 IL-15를 포함하는 B 세포 반응성에 영향을 준다는 것이 밝혀졌다. 흥미롭게도, 이들 신호는 스스로는 약한 효과인자이나 각종 보조-자극성 단백질과 조합하여 B 세포 집단 사이에서 활성화, 증식, 분화, 귀소, 관용 및 사멸을 유도한다.
B-세포 보조-자극성 단백질에 대해 가장 잘 연구된 부류의 하나는 TNF-수퍼패밀리이다. 이 패밀리 내에는, CD40, CD27 및 CD30과 이들 각각의 리간드 CD154, CD70 및 CD153는 다양한 면역 반응을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 이들 B-세포 집단 및 그 전구체의 증식 및 분화를 검출 및/또는 관찰하도록 하는 분석은, 증식 및 분화의 면에서 각종 단백질이 이들 B-세포 집단에 미치는 효과를 결정하는데 중요한 도구인다. B-세포 집단 및 그 전구체의 분화, 증식 또는 억제를 검출하도록 고안된 두 분석법이 하기 나열되어 있다.
시험관내 분석- 정제된 METH1 및/또는 METH2 단백질, 이의 끝이 절단된 형태는 B-세포 집단 및 그 전구체에 있어서 활성화, 증식, 분화 또는 억제 및/또는 사멸을 유도하는 능력에 대해 평가한다. 정제된 사람 편도선 B 세포 상 MEHT1 및/또는 METH2 단백질의 활성은 0.1 내지 10,000ng/mL의 투여량 범위에 걸쳐 정량적으로 측정하고, 하도제로서 포르말린-고정된 스타필로코커스 아우레우스 코웬 I(SAC) 또는 고정된 항-사람 IgM 항체의 존재하에 정제된 편도선 B세포를 배양하는 표준 B-림프구 보조-자극성 분석에서 평가한다. IL-2 및 IL-15와 같은 2차 신호는 SAC 및 IgM가 교차연결과 함께 시너지 효과를 나타내어 삼중수소화된 티미딘 혼입에 의해 측정되는 B 세포 증식을 유도한다. 새로운 시너지 제제는 이 분석을 사용하여 즉시 확인될 수 있다. 이 분석은 CD3-양성 세포의 자기 비드(MACS) 고갈에 의해 사람 편도선 B 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 형성된 세포 집단은 CD45R(B220)의 발현에 의해 평가된 바와 같이 95%이상의 B 세포이다.
총 부피 150㎕으로 배양 배지(10% FBS, 5X10-5M 2ME, 100U/ml 페니실린, 10㎍/ml의 스트렙토마이신 및 SAC의 10-5희석액을 함유하는 RPMI 1640)에 현탁된 105개 B-세포를 첨가한 96-웰 평판의 개별적인 웰에 각 샘플의 각종 희석액을 배치한다. 증식 또는 억제는 인자 부가하고 72시간 후에 시작하여 H-티미딘(6.7Ci/mM)로 20h 펄스(1μCi/웰)에 의해 정량화한다. 양성 및 음성 대조군은 각각 IL2 및 배지이다.
생체내 분석- BALB/c 마우스를 일일 2번 완충액 단독 또는 1mg/Kg의 METH1 및/또는 METH2 단백질 또는 이의 끝이 절단된 형태로 주입(i.p.)한다. 마우스는 이 치료는 4일 계속 받으며, 이때, 이들을 죽이고 각종 조직 및 혈청을 분석용으로 수집한다. 정상 및 METH1 및/또는 METH2 단백질 처리된 비장으로부터 나온 H&E 섹션을 비교함으로써 동맥주위림프 초(sheath)의 확산과 같은 비장 세포 상 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성, 및/또는 B-세포 집단의 분화 및 증식의 활성화를 나타낼 수 있는 적색 수질 영역의 유핵 세포형의 상당한 증가의 결과를 확인하다. B 세포 마커, 항-CD45R(B220)를 사용한 면역조직화학적 연구를 사용하여 비장 세포에서의 임의의 생리학적 변화, 예컨대 비장의 조직파괴가 확립된 T-세포 영역을 침윤하는 느슨하게 한정된 B-세포 대역 안에서의 증가된 B-세포 표현(representation)에 의한 것인지를 결정한다.
METH1 및/또는 METH2 단백질 처리된 마우스로부터 나온 비장의 유동 세포계측 분석을 사용하여 METH1 및/또는 METH2 단백질이 대조군 마우스에서 관측된 것 보다 ThB+, CD45R(B220) 둔한 B 세포의 비율을 특이적으로 증가시켰는지를 나타낸다.
유사하게, 증가된 성숙 B-세포 생체내 표현의 예상되는 결론은 혈청 Ig 역가의 상대적인 증가이다. 따라서, 혈청 IgM 및 IgA 수준을 완충액으로 처리한 마우스와 METH1 및/또는 METH2 단백질로 처리된 마우스 사이에서 비교한다.
이 실시예에 기술된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험한다. 그러나, 당업자는 용이하게 예시된 연구를 수정하여 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드의 활성(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작용제 및/또는 길항제를 시험할 수 있다.
실시예 35: T 세포 증식 분석
CD3-유도성 증식 분석은 PBMC상에서 수행되고,3H-티미딘 흡수에 의해 측정된다. 분석은 다음과 같이 수행한다. 96웰 평판을 CD3의 mAb(HIT3a, Pharmingen) 또는 이소타입-일치된 대조군 mAb 100㎕/웰로 밤새 4℃에서 피복하고(0.05M 이탄산염 완충액 pH9.5 중 1mg/ml), PBS로 3번 세척한다. 사람 말초 혈액으로부터 F/H 구배 원심분리함으로써 PBMC를 분리하고, 다양한 농도의 METH1 및/또는 METH2 단백질(총 부피 200㎕)의 존재하에 10% FCS 및 P/S를 함유하는 RPMI에서 mAb 피복된 평판의 4개 웰(5X104/웰)에 첨가한다. 관련 단백질 완충액 및 배지 단독은 대조군이다. 48시간 37℃에서 배양한 후, 평판을 2분동안 1000rpm으로 회전시키고, 100㎕의 상청액을 제거하고 -20℃에서 저장한 후, 증식 상의 효과가 관찰되는 경우 IL-2(또는 다른 사이토킨)를 측정한다. 0.5μCi의3H-티미틴을 함유하는 배지 100㎕로 웰을 보충하고 37℃에서 18-24시간동안 배양한다. 웰을 수집하고3H-티미딘의 혼입을 증식 측정용으로 사용한다. 항-CD3 단독은 증식에 대한 양성 대조군이다. 또한 IL-2(100U/ml)는 증식을 강화하는 대조군으로 사용된다. T 세포의 증식을 유도하지 않는 대조군 항체는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 효과에 대한 음성 대조군으로 사용된다.
이 실시예에 기술된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질에서의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자는 예시된 연구를 용이하게 수정하여 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드의 활성(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작용제 및/또는 길항제를 시험할 수 있다.
실시예 36: MHC 클래스 II, 동시 자극성 및 부작 분자의 발현 및 단핵세포및 단핵세포-유래성 사람 수상돌기 세포의 세포 분화 상 METH1 및/또는 METH2의 효과
수상돌기 세포는 말초 혈액에서 발견되는 증식하는 전구체의 확장에 의해 형성된다: 부착성 PBMC 또는 정화된(elutriated) 단핵세포 분획을 7-10일 동안 GM-CSF(50ng/ml) 및 IL-4(20ng/ml)과 함께 배양한다. 이들 수상돌기 세포는 미성숙 세포의 특징적인 표현형을 갖는다(CD1, CD80, CD86, CD40 및 MHC 클래스 II 항원의 발현). TNF-α와 같은 활성화 인자로 처리하면 표면 표현형에 신속한 변화를 야기한다(MHC 클래스 I 및 II, 동시자극성 및 부착 분자의 증가된 발현, FCγRII의 하향조절, CD83의 상향조절). 이들 변화는 증가된 항원 제시 성능과 관련이 있으며 수상돌기 세포의 기능상 성숙화와 관련이 있다.
표면 항원의 FACS 분석을 하기와 같이 수행한다. 세포를 증가되는 농도의 METH1 및/또는 MEHT2 또는 LPS(양성 대조군)로 1-3일 처리하고, 1% BSA 및 0.02mM 나트륨 아지드를 함유하는 PBS로 세척하고, 이어서 적절한 FITC- 또는 PE-표지된 단클론성 항체의 1:20 희석액과 함께 30분동안 4℃에서 항온배양한다. 부가적인 세척 후, 표지된 세포는 FACScan(Becton Dickinson)상에서 유동 세포계측에 의해 분석한다.
사이토킨 생산 상의 효과.수상돌기 세포에 의해 형성된 사이토킨, 특히 IL-12는 T세포 의존성 면역 반응의 개시에 중요하다. IL-12는 Th1 헬퍼 T-세포 면역 반응의 발달에 강한 영향을 주며, 세포독성 T 및 NK 세포 융합을 유도한다.ELISA를 사용하여 하기와 같이 IL-12 방출을 측정한다. 수상돌기 세포(106/ml)를 증가되는 농도의 METH1 및/또는 METH2로 24시간 동안 처리한다. LPS(100ng/ml)을 양성 대조군으로서 세포 배양액에 첨가한다. 이어서, 세포 배양액으로부터 나온 상청액을 수집하고 상업적인 ELISA 키트(예, R&D Systems(Minneapolis, MN))를 사용하여 IL-12 함량을 분석한다. 키트와 함께 제공되는 표준 프로토콜을 사용한다.
MHC 클래스 II, 동시자극성 및 부착 분자의 발현 상의 효과.세포 표면 항원의 3개 주요 패밀리는 단핵 세포 상에서 확인할 수 있다: 부착 분자, 항원 제시에 관여하는 분자 및 Fc 수용체. MHC 클래스 II 항원 및 B7 및, ICAM-1과 같은 기타 동시자극성 분자 발현의 조절은 그 결과 단핵 세포의 항원 제시 능력 및 T 세포 활성화 유도 능력에 변화를 일으킬 수 있다. Fc 수용체의 증가 발현은 향상된 단핵세포의 세포독성 활성, 사이토킨 방출 및 대식작용과 관련이 있을 수 있다.
FACS 분석을 사용하여 하기와 같인 표면 항원을 검사한다. 단핵 세포는 증가하는 농도의 METH1 및/또는 METH2 또는 LPS(양성 대조군)로 1-5일 처리하고, 1% BSA 및 0.02mM 나트륨 아지드를 함유하는 PBS로 세척하고 이어서 적절한 FITC- 또는 PE-표지된 단클론성 항체의 1:20 희석액과 함께 30분동안 4℃에서 항온배양한다. 부가적으로 세척한 후, 표지된 세포는 FACScan(Becton Dickinson)상에서 유동 세포계측에 의해 분석한다.
단핵 세포 활성화 및/또는 증가된 생존력. 단핵세포를 활성화(또는 달리 불활성화)시키고/시키거나 단핵 세포의 생존력을 증가(또는 달리 생존력을 감소)시키는 분자에 대한 분석은 당업계에 알려져 있으며, 본 발명의 분자가 단핵세포의 억제제 또는 활성화제로서 기능을 하는지 여부를 결정하는데 일상적으로 적용할 수 있다. METH1 및/또는 METH2, METH1 및/또는 METH2의 작용제 또는 길항제는 하기 기술된 3개의 분석을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 이들 분석 각각의 경우, 말초 혈액 단핵세포(PBMC)는 히스토파크 구배(Sigma)를 통해 원심분리에 의해 단일을 공여자 류코팩(leukopack)(American Red Cross, Baltimore, MD)로부터 정제한다. 단핵세포는 반대유동(counterflow) 원심분리 정화에 의해 PBMC로부터 분리한다.
1. 단핵세포 생존력 분석. 사람 말초 혈액 단핵 세포는 혈청 또는 다른 자극의 부재하에 배양될 때 생존 능력을 점진적으로 잃는다. 이들의 사멸은 내부적으로 조절되는 프로세스(아폽토시스)가 원인이다. TNF-알파와 같은 활성화 인자를 배양액에 첨가하면 극적으로 세포 생존력이 양상된고 DNA 단편화가 방해된다.
프로피듐 요오드화물(PI) 염색법을 사용하여 하기와 같이 아폽토시스를 측정한다. 단핵 세포는 혈청-부재 배지(양성 대조군) 하에, 100ng/ml TNF-알파(음성 대조군)의 존재하에, 그리고 다양한 농도의 시험 화합물의 존재하에 폴리프로필렌 튜브에서 48시간동안 배양한다. 세포를 2X106/ml의 농도로 PI를 함유하는 PBS에 최종 농도 5㎍/ml로 재현탁하고, 이어서 실온에서 5분 동안 항온배양한 후 FACScan 분석을 한다. PI 섭취는 이 실험 파라다임 안에서는 DNA 단편화와 관련이 있는 것으로 확인되었다.
2. 사이토킨 방출 상의 효과. 단핵세포/대식세포의 주요 기능은 자극 후 사이토킨 방출을 통해 면역계의 다른 세포 집단을 조절하는 활성이다. 사이토킨 방출을 측정하는 ELISA는 다음과 같이 수행한다: 사람 단핵세포를 5X105세포/ml의 밀도로 증가하는 농도의 METH1 및/또는 METH2와 함께, 그리고 METH1 및/또는 METH2가 부재하는 것을 제외하고는 동일한 조건하에 항온배양한다. IL-12 생산의 경우, METH1 및/또는 METH2의 존재하에 IFN(100U/ml)과 함께 밤새 세포를 프라이밍한다. 이어서, LPS(10ng/ml)를 첨가한다. 조건 배지를 24시간 후 수집하고 사용할 때까지 냉동시킨다. 이어서 상업적으로 구입가능한 ELISA 키트(예, R&D Systems(Minneapolis, MN))를 사용하고 키트와 함께 제공된 표준 프로토콜을 적용하여 TNF-알파, IL-10, MCP-1 및 IL-8을 측정한다.
3. 산화성 파열.정제된 단핵세포를 96w 평판에 2-1x105세포/웰로 도포한다. 증가되는 농도의 METH1 및/또는 METH2를 총 부피 0.2ml의 배양 배지(RPMI 1640 +10% FCS, 글루타민 및 항생제)에 있는 웰에 첨가한다. 3일 항온배양 후, 평판을 원심분리하고, 배지를 웰로부터 제거한다. 대식세포 단층에, 0.2ml/웰의 페놀 레드 용액(140mM NaCl, 10mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH7.0, 5.5mM 덱스트로즈, 0.56mM 페놀 레드 및 19U/ml의 HRPO)을 자극제(200 nM PMA)와 함께 첨가한다. 평판을 37℃에서 2시간동안 항온배양하고, 1N NaOH 20㎕/웰을 첨가하여 반응을 정지시킨다. 흡광도는 610nm에서 판독한다. 대식세포에서 생산된 H2O2의 양을 계산하기 위해, 공지 몰당량의 H2O2용액의 표준 곡선을 각 실험에 대해 수행한다.
이 실시예에서 기술한 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질에서의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자는 예시된 연구를 용이하게 수정하여 METH1 및/또는 METH2 폴리펩티드의 활성(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작용제 및/또는 길항제를 시험할 수 있다.
실시예 37: METH1 및/또는 METH2 생물학적 효과.
성상세포 및 뉴론 분석. 이.콜리에서 발현되고 전술한 바와 같이 정재된 재조합 METH1 및/또는 METH2는 생존력, 신경돌기 성장, 또는 피질성 뉴론 세포의 표현형 분화를 촉진하는 활성에 대해 시험하고 신경교 미소섬유 산성 단백질 면역양성 세포, 성상세포의 증식을 유도하는지를 시험할 수 있다. 생물학적 분석을 위한 피질성 세포의 선별은 피질 구조에서 FGF-1 및 FGF-2의 우세한 발현에 기초하고 FGF-2 처리의 결과로 피질성 뉴론 생존력이 강화된다는 이전의 보고에 기초한다. 예컨대, 티미딘 혼입 분석을 사용하여 이들 세포 상 METH1 및/또는 METH2의 활성을 입증할 수 있다.
게다가, 피질성 또는 해마 뉴론 상 FGF-2(기본 FGF)의 생체내 생물학적 효과를 기술하는 이전 보고에 의해 뉴론 생존력 및 신경돌기 성장 모두의 증가를 입증하였다(Walicke, P.et al., "Fibroblast growth factor promotes survival of dissociated hippocampal neurons and enhances neurite extension". Proc. Natl. Acad.Sci.USA 83:3012-3016(1986). 이 분석은 본 명세서에 인용되어 있음). 그러나, PC-12 세포 상에서 수행한 실험으로부터 나온 보고는 이들 두 반응이 필연적으로 같은 의미는 아니고 시험되는 FGF 종류 뿐만아니라 표적 세포 상에 발현되는 수용체(들)에 좌우될 수 있다는 것을 제시한다. 주요 피질성 뉴론 배양 파라다임을 사용하여, METH1 및/또는 METH2가 신경돌기 성장을 유도하는 능력을, 예컨대 티미딘 혼입 분석을 사용하여 FGF-2로 얻은 반응과 비교할 수 있다.
섬유아세포 및 내피 세포 분석. 사람 폐 섬유아세포를 Clonetics(San Diego, CA)에서 얻고 Clonetics에서 나온 성장 배지에서 유지시킨다. 피부 미세혈관 내피 세포는 Cell Applications(San Diego, CA)에서 얻는다. 증식 분석의 경우, 사람 폐 섬유아세포 및 피부 미세혈관 내피 세포는 5,000 세포/웰로 96-웰 평판에서 1일 동안 성장배지에서 배양할 수 있다. 이어서 1일동안 0.1% BSA 기초 배지에서 세포를 항온배양한다. 배지를 새로운 0.1% BSA 배지로 대체한 후, 세포를 시험 단백질과 함께 3일동안 항온배양한다. Alamar Blue(Alamar Biosciences, Sacramento, CA)를 각 웰에 최종 농도 10%로 첨가한다. 세포를 4시간도안 항온배양한다. 세포 생존 능력은 CytoFluor 형광 판독기에서 판독함으로써 측정한다. PGF2분석의 경우, 사람 폐 섬유아세포를 5,000세포/웰로 96-웰 평판에서 1일 동안 배양한다. 배지를 0.1% BSA 기초 배지로 교환한 후, 세포를 FGF-2 또는 METH1 및/또는 METH2와 함께 IL-1α존재 또는 부재하에 24시간동안 항온배양한다. 상청액을 수집하고 EIA키트(Cayman, Ann Arbor, MI)에의해 PGE2를 분석한다. IL-6 분석의 경우 사람 폐 섬유아세포를 5,000세포/웰로 96-웰 평판에서 1일 동안 배양한다. 배지를 0.1% BSA 기초 배지로 교화한 후, 세포를 FGF-2 또는 METH1 및/또는 METH2와 함께 IL-1α존재 또는 부재하에 24시간 동안 항온배양한다. 상청액을 수집하고 ELISA 키트(Endogen, Cambridge, MA)에 의해 IL-6에 대해 분석한다.
사람 폐 섬유아세포를 FGF-2 또는 METH1 및/또는 METH2와 함께 3일 동안 기초 배지에서 항온배양한 후 Alamar Blue를 첨가하여 섬유아세포의 성장에 대한 효과를 평가한다. FGF-2는 METH1 및/또는 METH2와의 자극을 비교하는데 사용할 수 있는 자극을 10-2500ng/ml에서 보여주어야 한다.
파킨슨 모델.파킨슨 질환에 있어서 운동 기능의 상실은 흑질선조체(nigrostriatal) 도파민성 돌기 뉴론의 퇴화의 결과 생기는 선조체(striatal) 도파민의 결여에 기인한다. 광범위하게 특징지워진 파킨스에 대한 동물 모델은 1-메틸-4-페닐1,2,3,6-테트라히드로피리딘(MPTP)의 전신성 투여를 포함한다. CNS에서, MPTP는 성상세포에 의해 섭취되고, 모노아민 산화효소 B에 의해 1-메틸-4-페닐피리딘(MPP+)으로 대사되어 방출된다. 이어서, MPP+는 도파민에 대한 고친화성 재섭취 전달체에 의해 도파민성 뉴론에 활발하게 축적된다. 이어서, MPP+는 전기화학 구배에 의해 미토콘드리아에서 농축되고 니코티드아미드 아데닌 디포스페이트를 선별적으로 억제한다: 유비퀴논 옥시도리덕타제(복합체 I). 따라서, 전자 전달을 방해하고 결국 산소 라티칼을 생성한다.
조직 배양 파라다임에서는, FGF-2(기본 FGF)가 흑질 도파민성 뉴론으로의 영양 활성을 갖는다고 확인되었다(Ferrari et al., Dev. Biol. 1989). 최근, Dr. Unsicker의 그룹은 선조체 안에 있는 젤 포옴 이식편으로 FGF-2를 투여한 결과 흑질 도파민성 뉴론을 MPTP 노출과 관련된 독성으로부터 거의 완전히 보호한다는 것을 확인하였다(Otto and Unsicker, J. Neuroscience, 1990).
FGF-2와 관련된 데이타에 기초하여, METH1 및/또는 METH2는 시험관내 도파민성 뉴론 생존력을 강화하는 FGF-2의 작용과 유사한 작용을 갖는지 여부를 결정하도록 평가할 수 있고, 또한 MPTP 처리와 관련된 손상으로부터 선조체 내 도파민성 뉴론의 생체내 보호를 시험할 수 있다. METH1 및/또는 METH2의 잠재적인 효과는 먼저 도파민성 뉴론 세포 배양 파라다임에서 시험관내 검사한다. 임신 14일 Wistar 래트 배아로부터 나온 중뇌 저판을 절단함으로써 배양액을 준비한다. 조직은 트립신으로 분리시키고, 폴리오르티닌-라미닌 피복된 유리 덮개슬립 상에 200,000세포/㎠의 밀도로 파종한다. 둘베코 수정 이글 배지 및 호르몬 보충물(N1)을 함유하는 F12 배지에서 세포를 유지시킨다. 8일 후 배양액을 파라포름알데이드로 시험관내 고정하고, 티로신 히드록실라제, 도파민성 뉴론에 대한 특이 마커, 면역조직화학적 염색에 대한 프로세스를 진행한다. 분리된 세포 배양액을 배아성 래트로부터 준비한다. 배양 배지는 3일마다 교환하고, 또한 이때 인자들을 첨가한다. 도파민성 뉴론은 도파민성 전구체 세포가 증식되는 단계를 지난 발달 기간인 임신 14일의 동물로부터 분리하기 때문에 티로신 히드록실라제 면역양성 뉴론 수의 증가는 시험관내 생존가능한 도파민성 뉴론의 수 증가를 나타낸다. 따라서, 만일 METH1 및/또는 METH2가 도파민성 뉴론의 생존을 연장시키는데 작용한다면, METH1 및/또는 METH2은 파킨슨 질환에 관여할 수 있다는 것을 암시한다.
이 실시예에서 기술한 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질에서의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자는 예시된 연구를 용이하게 수정하여 METH1 및/또는METH2 폴리펩티드의 활성(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작용제 및/또는 길항제를 시험할 수 있다.
실시예 38
혈관 내피 세포의 성장에 대한 METH1 및/또는 METH2의 효과
1 일째에, 4% 태아 소 혈청(FBS), 16 단위/㎖ 헤파린 및 50 단위/㎖ 내피 세포 증식 보충물(ECGS, 바이오테크니큐 인코포레이티드)를 함유하는 M199 배지 중에서 2∼5 ×104세포/35 mm 접시로 인간 탯줄 정맥 내피세포(HUVEC)를 접종한다. 2 일째에, 배지를 10% FBS, 8 단위/㎖ 헤파린을 함유하는 M199로 교체한다, 서열 번호 2의 METH1 및/또는 METH2 단백질, VEGF 및 기저 FGF(bFGF) 등의 양성 대조군을 각종 농도로 첨가한다. 4 및 6 일째에, 배지를 교체한다. 8 일째에, 쿨터(Coulter) 계수기로 세포수를 측정한다.
HUVEC 세포수의 증가는, METH1 및/또는 METH2가 혈관 내피 세포를 증식시킬 수 있음을 제시한다.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질에서의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 39
혈관 내피 세포의 증식에 대한 METH1 및/또는 METH2의 자극 효과
성장 인자의 분열촉진 활성의 평가를 위해서, 전자 커플링 시약 PMS(페나진 메토설페이트)를 이용한 MTS (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)2H-테트라졸리움) 비색 분석을 실시한다(CellTiter 96 AQ, 프로메가). 0.1 ㎖ 혈청 보충 배지 중에 96웰 평판(5,000 세포/웰)에 세포를 접종하고, 밤새 부착시켜 둔다. 0.5% FBS 중에 12시간 동안 혈청-기아 후에, 헤파린(8 U/㎖)의 유무하에 조절제(0.5% FBS 중 bFGF, VEGF165또는 METH1 및/또는 METH2)를 48시간 동안 웰에 첨가한다. 웰당 MTS/PMS 혼합물 20 ㎎(1:0.05)을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온 배양한 후 ELISA 평판 판독기에서 흡광도를 490 nm에서 측정한다. 대조군 웰(일부 배지, 세포 없음) 유래의 배경 흡광도를 빼고, 7개 웰을 각 조건에 대해 유사하게 수행한다. Leak 등, in vitro Cell. Dev. Biol. 30A:512-518(1994) 참조.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 40
PDGF 유도형 혈관 평활근 세포 증식 자극 효과의 억제
예를 들어 BrdUrd 도입으로 HAoSMC 증식을 측정할 수 있다. 간단히 요약하면, 4실 슬라이드 상에서 성장한 휴지 세포를 CRP 또는 FITC 표지된 AT2-3LP로 형질감염시킨다. 따라서, 10% 소혈청 및 6 ㎎/㎖ BrdUrd를 사용하여 세포에 펄스를 가한다. 24시간 후, BrdUrd 염색 키트(자임드 래보러터리지)를 사용하여 면역세포화학을 실시한다. 간단히 요약하면, 변성 용액에 노출시킨 후에 4℃에서 2시간 동안 비오티닐화된 마우스 항-BrdUrd 항체와 함께 세포를 항온배양하고, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 및 디아미노벤지딘과 항온배양한다. 헤마토실린으로 대조 염색한 후, 현미경 검사를 위해 세포를 두고, BrdUrd 양성 세포를 계수한다. BrdUrd 지수는 총 세포수에 대한 BrdUrd 양성 세포의 비율로 계산한다. 또한, BrdUrd 염색(핵)과 FITC 흡수(세포질)의 동시 검출은, 명시야 조명 및 암시야-UV 형광 조명을 함께 사용하여 개개 세포에 대해 수행한다. Hayashida 등, J.Biol.Chem. 6:271(36):21985-21992(1996) 참조.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 41
내피 세포 이동의 자극
본 실시예는 METH1 및/또는 METH2가 림프구 내피 세포 이동을 자극할 수 있는 가능성을 조사하는데 이용한다.
내피 세포 이동 분석은 48웰 미주화성(microchemotaxis)실(미국 매릴랜드주 캐빈 존에 소재하는 뉴로프로브 인코포레이티드; Falk, W. 등, J.ImmunologicalMethods 1980;33:239-247)을 사용하여 실시한다. 기공 크기가 8 ㎛인 폴리비닐피롤리돈 무함유 폴리카르보네이트 필터(미국 매사츄세츠주 캠브리지에 소재하는 뉴클레오포어 코포레이션)을 실온에서 6시간 이상 동안 0.1% 젤라틴으로 피복하고, 무균 공기하에 건조한다. 0.25% 소 혈청 알부민(BSA)으로 보충된 M199에서 시험 물질을 적절한 농도로 희석하고, 최종 희석액 25 ㎕를 변형된 보이덴 장치의 하부실에 둔다. 전면 성장하지 않은, 조기 계대 배양(2∼6) HUVEC 또는 BMEC 배양물을 세척하고, 세포 제거를 위해 필요한 최소 시간 동안 트립신 처리한다. 하부실 및 상부실 사이에 필터를 배치한 후, 1% FBS를 함유하는 50 ㎕의 M199에서 현탁시킨 2.5 ×105세포를 상부 구획에 접종한다. 그 다음 이 장치를 5% CO2의 가습실에서 37℃에서 5시간 동안 항온처리하여 세포를 이동시킨다. 항온배양 후에, 필터를 제거하고, 이동하지 않은 세포가 있는 필터의 상부면을 고무 폴리스맨으로 긁어낸다. 필터를 메탄올로 고정하고, 김사 용액(미국 일리노이주 맥그로우 파크 박스터에 소재하는 Diff-Quick)으로 염색한다.각 웰에서 3개의 무작위 고전력장(40×)의 세포를 계수하여 이동을 정량하고, 모든 그룹에서 4회 실험한다.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 42
내피 세포에 의한 산화질소 생성 자극
혈관 내피 세포에 의해 방출된 산화질소는 혈관 내피세포 이완의 매개인자인 것으로 보인다. 따라서, METH1 및/또는 METH2 활성은 METH1 및/또는 METH2에 반응하는 내피 세포에 의한 산화질소의 생성을 측정함으로써 분석할 수 있다.
산화질소는, 24시간 기아와 양성 대조군(예, VEGF-1)과 METH1 및/또는 METH2의 각종 레벨에 4시간 동안 노출시킨 후에 융합성(confluent) 미세혈관 내피 세포의 96웰 평판에서 측정한다. 배지 중 산화질소는 질산염 리덕타제에 의해 산화질소 유도된 질삼염의 환원 후에 총 아질산염을 측정하는 그리스 시약을 사용하여 측정한다. 산화질소 방출에 대한 METH1 및/또는 METH2의 영향은 HUVEC에서 검사한다.
간단히 요약하면, 배양된 HUVEC 단층으로부터의 NO 방출은 NO 측정기(Iso-NO, 월드 프리시젼 인스트루먼츠 인코포레이티드)(1049)에 연결된 NO-특이적 폴라로그래픽 전극으로 측정한다. NO 성분의 검정은 다음 식에 따라 실시한다.
2 KNO2+ 2 KI + 2 H2SO462 NO + I2+ 2 H2O + 2 K2SO4
표준 검정 곡선은 KNO2의 등급별 농도(0, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 및 500 nmol/㎖)를 KI 및 H2SO4를 함유하는 검정 용액으로 첨가함으로써 얻는다. Iso-NO 전극의 NO에 대한 특이성은 진정한 NO 가스로부터 NO를 측정하여 미리 결정한다(1050). 배양 배지를 제거하고, HUVEC를 듈베코 인산염 완충 염수로 2회 세척한다. 그 다음 6웰 플레이트 중 여과된 크랩스-헨셀라이트 용액 5 ㎖에 세포를 담가 세척하고, 세포 플레이트를 슬라이드 가온기(랩 라인 인스트루먼츠 인코포레이티드)에 두어 온도를 37℃로 유지한다. NO 센서 프로브를 웰에 수직으로 삽입하여, 전극의 팁을 용액의 표면 아래 2 mm에서 유지한 다음 상이한 조건을 가한다. S-니트로소 아세틸 페니실라민(SNAP)을 양성 대조군으로서 사용한다. 방출된 NO의 양은 1 ×106내피 세포당 피코미터로서 표시한다. 보고된 모든 값은 각 그룹에서 4∼6회 측정 결과의 평균이다(세포 배양 웰의 수). Leak 등, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 217:96-105(1995) 참조.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 43
혈관형성에 있어서 삭(索; cord) 형성에 대한 METH1 및/또는 METH2의 효과
혈관형성의 또 다른 단계는, 내피 세포의 분화에 의해 현저해지는 삭 형성이다. 이 생분석은 시험관내 배양시 미세혈관 내피 세포의 모세관 유사 구조(중공 구조)를 형성하는 능력을 측정한다.
CADMEC(미세혈관 내피 세포)는 셀 어플리케이션 인코포레이티드로부터 증식(계대 2) 세포로서 구입하고, 셀 어플리케이션즈의 CADMEC 성장 배지에서 배양하여 계대 배양 5회에 사용한다. 시험관내 혈관형성 분석을 위해서, 48웰 세포 배양 평판의 웰을 37℃에서 30분 동안 셀 어플리케이션즈의 부착 인자 배지(200 ㎖/웰)로피복한다. CADMEC를 피복된 웰에 7,500 세포/웰로 접종하고, 성장 배지에서 밤새 배양한다. 성장 배지를 대조군 완충액 또는 METH1 및/또는 METH2(0.1∼100 ng/㎖)를 함유하는 셀 어플리케이션즈 삭 형성 배지 300 ㎎으로 교체하고, 세포를 48시간 동안 더 배양한다. Boeckeler VIA-170 비디오 화상 분석기를 사용하여 모세관 유사 삭의 수 및 길이를 정량한다. 모든 분석은 3회 실시한다.
시판용(R&D) VEGF(50 ng/㎖)를 양성 대조군으로서 사용한다. b-에스트라디올(1 ng/㎖)이 음성 대조군으로서 사용된다.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 44
토끼 하지 모델에서의 허혈 구제
METH1 및/또는 METH2의 허혈에 대한 생체내 효과를 연구하기 위해서, 전술한 바와 같이 하나의 대퇴부 동맥을 수술로 제거하여 토끼 뒷다리 허혈 모델을 만든다(Takeshita, S 등, Am J. Pathol 147:1649-1660(1995)). 대퇴부 동맥을 절제하면 외부 장골 동맥의 폐색 및 혈전의 퇴행성 증식을 초래한다. 따라서, 허혈 사지로의 혈류는 내부 장골 동맥으로부터 기원하는 부행 혈관에 의존한다(Takeshita S 등, Am J. Pathol 147:1649-1660(1995)). 토끼의 수술 후 회복과 내인성 부행 혈관의 형성을 위해서 10일의 간격을 둔다. 수술 후 10 일째(0일), 기준선 혈관 조영사진을 수행한 후 허혈 사지의 내부 장골 동맥을, 개시된 바와 같이 하이브로겔 피복된 발룬 카테터를 사용하여 동맥 유전자 전달 기법으로 500 ㎎의 나출형 METH1 및/또는 METH2 발현 플라스미드로 형질감염시킨다(Riessen R 등, Hum Gene Ther. 4:749-758(1993); Leclerc, G 등 J.Clin. Invest. 90:936-944(1992)). METH1 및/또는 METH2가 이 치료에 사용되는 경우, 500 ㎎ METH1 및/또는 METH2 단백질 또는 대조군의 단일 환괴를 주입 카테터를 통해 허혈 사지의 내부 장골 동맥에 1분에 걸쳐 전달한다. 30 일째에, 각종 파라미터를 이들 토끼에서 측정한다: (a) BP 비율-허혈 사지의 수축기 혈압 대 정상 사지의 수축기 혈압의 비율; (b) 혈류 및 혈류 저장-휴지 FL: 비팽창 조건에서의 혈류, Max FL: 완전히 팽창된 조건하에서의 혈류(혈관양의 간접 지표), 혈류 저장은 최대 FL:휴지기 FL의 비율이 반영된다; (c) 혈관 조영 사진 스코어-이는 부행 혈관의 혈관 조영 사진으로 측정한다. 토끼 넓적다리 총 수 m으로 나눈 교차 불투명 동맥을 갖은 것을 상부에 있는 격자 중 원의 비율로 결정한다; (d) 모세관 밀도- 뒷다리로부터 취한 명현미경부에서 측정된 부행 모세관의 수.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 45
혈관확장에 대한 METH1 및/또는 METH2의 영향
혈관 내피세포의 확장이 혈압을 내리는데 중요하기 때문에, 자발적 고혈압 래트(SHR)에서 혈압에 영향을 주는 METH1 및/또는 METH2의 능력을 검사한다. METH1 및/또는 METH2의 용량을 증가시키면서(0, 10, 30, 100, 300 및 900 ㎎/kg) 13∼14 주령 자발적 고혈압 래트(SHR)에게 투여한다. 데이타는 평균 +/- SEM으로 표현한다. 통계적 분석은 페어드 t-테스트를 사용하여 실시하고, 통계학적 유의 수준은 완충제 단독에 대한 반응에 대하여 p<0.05로 정의한다.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 46
래트 허혈 피부판 모델
평가 파라미터는 피부 혈류, 피부 온도 및 인자 VIII 면역조직화학 또는 내피 세포 알카리 포스파타제 반응을 포함한다. 피부 허혈 과정에서 METH1 및/또는 METH2 발현은 동일계 하이브리드화를 이용하여 연구한다.
이 모델에서의 연구는 다음과 같이 3개의 부분으로 나눈다:
a) 허혈 피부
b) 허혈 피부 상처
c) 정상 상처
실험 프로토콜은 다음과 같다.
a) 3 ×4 cm, 단일-병절 완전 두께의 무작위 피부판(동물의 하부등에 있는 근피판) 준비.
b) 허혈 피부(피부판)에 절개 손상을 가함(4∼6 mm 직경).
c) 1∼100 ㎎의 각종 용량 범위에서 절개 상처(손상 후 0, 1, 2, 3, 4일)를 METH1 및/또는 METH2로 국소 치료.
d) 조직학적, 면역조직화학적, 및 동일계 연구를 위해 손상 후 3, 5, 7, 10, 14 및 21일째에 상처 조직 수거.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 47
말초 동맥 질병 모델
METH1 및/또는 METH2를 이용한 혈관형성 요법은 말초 동맥 질병의 경우 허혈 주변의 혈류 복원을 얻기 위한 신규 치료 방법이다. 실험 프로토콜은 다음과 같다.
a) 대퇴부 동맥의 한면을 결찰시켜 뒷다리의 허혈 근육을 만들고, 다른 쪽 다리는 대조군으로서 이용한다.
b) 20∼500 ㎎ 용량 범위의 METH1 및/또는 METH2 단백질을 2∼3주 동안 매주 3회(아마도 그 이상) 정맥내 및/또는 근육내 전달한다.
c) METH1 및/또는 METH2 발현 및 조직학 분석을 위해서 대퇴부 동맥 결찰 후1, 2 및 3주에 허혈 근육 조직을 수거한다. 또한, 반대측 뒷다리의 정상 근육의 다른 면에서 생검을 실시한다.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 48
허혈 심근 질환 모델
METH1 및/또는 METH2는 부행 혈관의 형성을 촉진하고, 관상 동맥 폐색 후에 신규 혈관을 재건할 수 있는 유효 분열촉진제로서 평가된다. METH1 및/또는 METH2 발현의 변경을 원위치에서 조사한다. 실험 프로토콜은 다음과 같다.
a) 래트에서 좌측 흉강 삽입술을 통해 심장을 노출시킨다. 즉시, 좌측 관상 동맥을 얇은 봉합사(6-0)로 폐색시키고 흉곽을 닫는다.
b) 20∼500 ㎎ 용량 범위의 METH1 및/또는 METH2 단백질을 2∼4주 동안 매주 3회(아마도 그 이상) 정맥내 및/또는 근육내 전달한다.
c) 수술 후 30 일째에, 형태 및 동일계 분석을 위해 심장을 분리하고 가로로 절단한다.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 49
래트 각막 상처 치유 모델
본 동물 모델은 METH1 및/또는 METH2의 신생혈관형성에 대한 효과를 보여준다. 실험 프로토콜은 다음과 같다.
a) 각막 중심으로부터 간질층으로 1∼1.5 mm 길이로 절개한다.
b) 안구의 외부 각막과 마주하는 절개 입구 아래에 스파튤라를 삽입한다.
c) 포켓을 만든다(이 포켓의 바닥은 안구 연부로부터 1∼1.5 mm에 있다).
d) 50 ng∼5 ㎍ METH1 및/또는 METH2를 함유하는 펠렛을 포켓 내에 둔다.
e) 20 ㎎∼500 ㎎(5일 동안 매일 처리) 용량 범위로 METH1 및/또는 METH2 처리를 각막 상처에 국소 적용할 수 있다.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 50
당뇨병 마우스 및 글루코코르티코이드 손상된 상처 치유 모델
A. 당뇨병
db+/db+
마우스 모델
METH1 및/또는 METH2가 치유 과정에 영향을 미치는 것을 입증하기 위해서, 유전자 조작된 상처 치유의 당뇨병 마우스 모델을 사용한다. db+/db+ 마우스에서의완전 두께 상처 치유 모델은 그 특성이 규명되어 있고, 임상적으로 적절하며, 손상된 상처 치유의 재현가능한 모델이다. 당뇨병 상처 치유는 수축보다는 과립화 조직의 형성과 재상피세포화에 의존한다(Gartner, M.H. 등,J.Surg.Res.52:389(1992); Greenhalgh, D.G. 등., Am.J.Pathol. 136:1235(1990)).
당뇨병 동물은 II형 진성 당뇨병에서 관찰되는 여러 특별한 특징을 보유한다. 동형접합성(db+/db+) 마우스는 한배에서 난 그의 짝(littermates)인 정상 이형접합성(db+/+m) 마우스와 비교하여 비대하다. 돌연변이 당뇨병 (db+/db+) 마우스는 염색체 4에서 단일의 상염색체 열성 돌연변이(db+)를 갖는다(Coleman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:283-289(1982)). 동물은 대식증, 다지증 및 다뇨증을 나타낸다. 돌연변이 당뇨병 마우스(db+/db+)는 혈당 상승, 증가 또는 정상의 인슐린 수치 및 억제된 세포 매개성 면역을 나타낸다(Mandel 등, J. Immunol. 120:1375(1978); Debray-Sachs, M 등, Clin. Exp. Immunol. 51(1):1-7(1983); Leiter 등, Am. J. of Pathol. 114:46-55(1985)). 말초 신경장애, 심근 합병증 및 미세혈관 병변, 기저막 비대 및 사구체 여과 비정상이 이들 동물에서 알려져 있다(Norido, F. 등, Exp.Neurol. 83(2):221-232(1984); Robertson 등, Diabetes 29(1):60-67 (1980); Giacomelli 등, Lab Invest. 40(4): 460-473(1979); Coleman, D.L., Diabetes 31(Suppl): 1-6(1982)). 이들 동형접합성 당뇨병 마우스는 인간 II형 당뇨병과 유사한 인슐린에 대해 내성이 있는 과혈당증을 형성한다(Mandel 등, J.Immunol. 120:1375-1377(1978)). 이들 동물에서 관찰되는 특성은 이 모델에서의 치유가 인간 당뇨병에서 관찰되는 치유와 유사할 수 있음을 제시한다(Greenhalgh등, Am.J.of Pathol. 136:1235-1246(1990)).
유전자 당뇨병 암컷 C57BL/KsJ(db+/db+) 마우스와 한배에서 난 그의 짝인 비당뇨병(db+/+m) 이형접합성 마우스를 이 연구에 사용한다(잭슨 래보러터리즈). 동물은 6주령에 구입하고 8주령에 연구를 개시한다. 동물을 각각 우리에 두고, 음식과 물을 임의로 먹을 수 있게 한다. 모든 조작은 무균 기법을 실시한다. 실험은 Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committe and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals의 규칙 및 지침에 따라 실시한다.
이미 보고된 방법에 따라서 상처를 입히는 프로토콜이 실시된다(Tsuboi, R 및 Rifkin, D.B., J.Exp.Med. 172:245-251(1990)). 간단히 요약하면, 상처를 입은 날에, 동물에게 탈이온수 중에 용해된 아버틴(0.01 ㎎/㎖), 2,2,2-트리브로모에탄올 및 2-메틸-2-부탄올을 복강내 주입하여 마취시킨다. 동물의 배부분을 면도하고, 70% 에탄올 용액 및 요오딘으로 피부를 세척한다. 상처를 입히기 전에 수술 부위를 멸균 거즈로 건조한다. 그 다음 8 mm 완전 두께 상처를 Keyes 조직 펀치를 사용하여 형성한다. 상처를 입힌 직후, 주변 피부를 살며시 잡아당겨 상처 팽창을 없앤다. 실험 기간 동안 상처를 개방한다. 상처를 입은 날로부터 연속 5일동안 국소적으로 치료한다. 치료 전에, 멸균 염수 및 거즈 스폰지로 상처를 살짝 닦는다.
상처를 시각적으로 검사하고, 수술 당일와 그 후 2일 간격으로 일정 거리에서 사진을 찍는다. 상처 봉합은 1∼5일 및 8일째에 매일 측정하여 검사한다. 보정된 제임슨 캘리퍼를 사용하여 수평 및 수직으로 상처를 측정한다. 과립화 조직이더 이상 보이지 않고 상처가 연속 상피세포로 덮히면 상처는 치유된 것으로 간주한다.
8일 동안 매일 상처당 부형제 중 METH1 및/또는 METH2 4∼500 ㎎의 상이한 용량을 이용하여 METH1 및/또는 METH2를 투여한다. 부형제 대조군은 부형제 용액 500 ㎖를 투여받았다.
동물은 나트륨 펜토바르비탈(300 ㎎/kg)을 복강내 주입하여 8일째 안락사시킨다. 상처 및 주변 피부는 조직학 및 면역조직화학을 위해 수거한다. 추가의 처리를 위해 생검 스폰지 사이의 조직 카세트 중 10% 중성 완충된 포르말린에 조직 표본을 둔다.
각 10마리의 동물로 구성된 3개의 군(5 마리의 당뇨병 동물과 5마리의 비당뇨병 대조군)을 평가한다. 1) 부형제 위약, 2) METH1 및/또는 3)METH2.
수직축 및 수평축에서의 면적을 측정하고 상처의 총 정사각형 면적을 얻어서 상처 봉합을 분석한다. 그 다음 초기 상처 면적(0일)과 치료 후의 면적(8일) 간의 차이를 정하여 수축을 추정한다. 1일째에 피부 펀치의 해당 크기인 상처 면적은 64 mm2였다. 다음 식을 사용하여 계산한다.
[8일째 개방 면적]-[1일째 개방 면적]/[1일째 개방 면적]
생검은 10% 완충된 포르말린에서 고정하고, 파라핀 매립된 블록은 상처 표면(5 mm)과 수직으로 분할하고, Reichert-Jung 마이크로톰을 사용하여 절단한다. 일반적인 헤마톡실린-에오신(H&A) 염색을 이분된 상처의 단면에서 수행한다. 상처의 조직학 검사를 이용하여 치유 과정과 복원된 피부의 형태학적 외관이 METH1 및/또는 METH2 처리로 변경되는지 여부를 결정한다. 이 평가는 세포 축적, 염증성 세포, 모세관, 섬유아세포, 재상피세포화 및 상피 성숙의 존재 증거를 포함한다(Greenhalgh, D.G. 등, Am.J.Pathol. 136:1235(1990)). 보정된 렌즈 마이크로미터를 블라인드 관찰자(blided obsever)가 사용한다.
ABC 엘리트 검출 시스템을 사용하여 폴리클론 토끼 항-인간 케라틴 항체로 면역조직화학적으로 조직 절편을 염색한다. 인간 피부는 양성 조직 대조군으로 사용하고, 비면역 IgG는 음성 대조군으로서 사용한다. 보정된 렌즈 마이크로미터를 사용하여 상처의 재상피화 범위를 평가함으로써 각질세포 증식을 측정하다.
피부 표본에서 증식하는 세포 핵 항원/사이클린(PCNA)은, ABC 엘리트 검출 시스템과 항-PCNA 항체(1:50)를 사용하여 입증한다. 인간 결장암은 양성 조직 대조군으로서, 인간 뇌 조직은 음성 조직 대조군으로서 사용한다. 각 표본은 1차 항체의 누락 및 비면역 마우스 IgG로의 치환된 절편을 포함한다. 이들 절편의 등급은 0∼8 스케일로 증식 정도에 따라 정한다. 스케일의 낮은 쪽은 약간 증식한 것으며, 높은 쪽은 강한 증식을 반영한 것이다.
실험 데이타는 언페어드 t 테스트를 사용하여 분석한다. <0.05의 p 값은 유의적인 것으로 간주한다.
B. 스테로이드 손상된 래트 모델
스테로이드에 의한 상처 치유 억제는 각종 시험관내 및 생체내 시스템에서 문서화되어 있다(Wahl, S.M. Glucocorticoids and Wound healing. In: AntiInflammatroy Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280-302(1989); Wahl, S.M. 등, J.Immunol. 115:476-481(1975); Werb Z. 등, J.Exp. Med. 147:1684-1694(1978)). 글루코코르티코이드는 혈관형성을 억제하고, 혈관 침투성(Ebert, R.H. 등, An. Intern. Med. 37:701-705(1952)), 섬유아세포 증식 및 콜라겐 합성(Beck, L.S. 등, Growth Factors. 5: 295-304(1991); Haynes, B.F. 등, J.Clin.Invest. 61:703-797(1978))을 감소시키고, 순환 단핵구의 일시적 감소를 초래하여(Haynes, B.F. 등, J.Clin.Invest. 61:703-797(1978); Wahl, S.M., "Glucocorticoids and wound healing", In: Antiinflammatroy Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp. 280-302 (1989)) 글루코코르티코이드가 상처 치유를 지연시킨다. 손상된 상처 치유계로의 스테로이드 전신 투여는 래트에서 잘 알려진 현상이다(Beck, L.S. 등, Growth Factors. 5:295-304(1991); Haynes, B.F., 등, J.Clin.Invest. 61:703-797(1978); Wahl, S.M., "Glucocorticoids and wound healing", In: Antiinflammatroy Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp 280-302(1989); Pierce, G.F. 등, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 86:2229-2233(1989)).
METH1 및/또는 METH2가 치유 과정에 영향을 미침을 입증하기 위해서, 치유가 메틸프레드니솔론의 전신 투여에 의해 손상된 래트에서의 전체 두께의 절제 피부 상처에 대한 METH1 및/또는 METH2의 수회 국소 투여의 효과를 평가한다.
체중이 250∼300 g인 젊은 성인 수컷 Sprague Dawley 래트(챨스 리버 래보러토리즈)를 본 실시예에 사용한다. 동물은 8주령에 구입하고, 9주령에 연구를 개시한다. 래트의 치유 반응은 상처를 입을 당시 메틸프레드니솔론(17 ㎎/kg/래트, 근육내)의 전신 투여로 손상시킨다. 동물은 개별적으로 우리에 넣고, 음식과 물을 자유롭게 수용하게 한다. 모든 조작은 무균 기법으로 실시한다. 이 연구는 Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committe and the Cuidelines for the Care and Use of Laboratory Animals의 규칙 및 지침에 따라 실시한다.
상처를 입히는 프로토콜은 상기 섹션 A에 따라 실시한다. 상처를 입힌 날, 케타민(50 ㎎/kg) 및 크실라진(5 ㎎/kg)의 근육내 주사로 동물을 마취시킨다. 동물의 배부분을 면도하고, 70% 에탄올 용액 및 요오딘 용액으로 피부를 세척한다. 상처를 입히기 전에 수술 부위를 멸균 거즈로 건조한다. 그 다음 8 mm 완전 두께 상처를 Keyes 조직 펀치를 사용하여 형성한다. 실험 기간 동안 상처를 개방한다. 상처를 입히고 메틸프레드니솔론을 투여한 날로부터 연속 7일 동안 1일 1회 국소적으로 시험 물질을 적용한다. 치료 전에, 멸균 염수 및 거즈 스폰지로 상처를 살짝 닦는다.
상처를 시각적으로 검사하고, 상처를 입은 날과 치료 끝에 일정 거리에서 사진촬영한다. 상처 봉합은 1∼5일 및 8일째에 매일 측정하여 결정한다. 보정된 제임슨 캘리퍼를 사용하여 수평 및 수직으로 상처를 측정한다. 과립화 조직이 더이상 보이지 않고 상처가 연속 상피세포로 덮히면 상처는 치유된 것으로 간주한다.
8일 동안 매일 상처당 부형제 중 METH1 및/또는 METH2 4∼500 ㎎의 상이한 용량을 이용하여 METH1 및/또는 METH2를 투여한다. 부형제 대조군은 부형제 용액500 ㎖를 투여받았다.
동물은 나트륨 펜토바르비탈(300 ㎎/kg)을 복강내 주입하여 8일째 안락사시킨다. 상처 및 주변 피부는 조직학을 위해 수거한다. 추가의 처리를 위해 생검 스폰지 사이의 조직 카세트 중 10% 중성 완충된 포르말린에 조직 표본을 둔다.
각 10마리의 동물로 구성된 4개의 군(메틸프레드니솔론을 투여한 동물 5마리와 투여하지 않은 동물 5마리)을 평가한다. 1) 미처리군, 2) 부형제 위약 대조군, 3) METH1 처리군 및 4)METH2 처리군.
수직축 및 수평축에서의 면적을 측정하고 상처의 총 면적을 얻어서 상처 봉합을 분석한다. 그 다음 초기 상처 면적(0일)과 치료 후의 면적(8일) 간의 차이를 정하여 봉합 정도를 추정한다. 1일째에 피부 펀치의 해당 크기인 상처 면적은 64 mm2였다. 다음 식을 사용하여 계산한다.
[8일째 개방 면적]-[1일째 개방 면적]/[1일째 개방 면적]
표본은 10% 완충된 포르말린에서 고정하고, 파라핀 매립된 블록은 상처 표면(5 mm)과 수직으로 분할하고, 올림푸스 마이크로톰을 사용하여 절단한다. 일반적인 헤마톡실린-에오신(H&A) 염색을 이분된 상처의 단면에서 수행한다. 상처의 조직학 검사를 이용하여 치유 과정과 복원된 피부의 형태학적 외관이 METH1 및/또는 METH2를 이용한 치료로 개선되는지 여부를 결정한다. 보정된 렌즈 마이크로미터를 블라인드 관찰자가 사용하여 상처 간극의 거리를 측정한다.
실험 데이타는 언페어드 t 테스트를 사용하여 분석한다. <0.05의 p 값은 유의적인 것으로 간주한다.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 51
림프부종 동물 모델
이 실험법의 목적은 래트 뒷 다리에서 림프 순환계의 재형성 및 림프관형성(lymphangiogenesis)에 있어서 METH1 및/또는 METH2의 치료 효과를 시험하는 적절하고 일관된 림프부종 모델을 형성하는 것이다. 영향을 받은 사지의 부피를 팽창시키고, 림프 맥관조직의 양 정량, 총 혈장 단백질 및 조직 병리학으로 효과를 결정한다. 급성 림프부종은 7∼10일 동안 관찰된다. 아마 더욱 중요한 것은, 부종의 만성 진행이 최대 3∼4주 동안 뒤따른다는 것이다.
수술을 시작하기 전에, 단백질 농도 분석을 위해 혈액 샘플을 채취한다. 체중이 약 ∼350 g인 수컷 래트에게 펜토바르비탈을 투여한다. 이어서, 우측 다리를 무릎부터 둔부까지 면도한다. 면도된 부분은 70% EtOH에 침지된 거즈로 소독한다. 혈청의 총 단백질 시험을 위해 채혈한다. 발에 염료를 주입하기 전에 2측정 수준을 만든 후에(발꿈치 0.5 cm 위, 안측 발의 중심), 외주 및 부피를 측정한다. 우측 및 좌측 발의 피내 배면에 1% 에반스 블루 0.05 ㎖를 주사한다. 염료를 발에 주사한 후에 외주 및 부피를 측정한다.
표지물로서 무릎 관절을 사용하여, 외주를 따라서 중간-다리 서혜부 절개하여 대퇴부 혈관을 위치시킨다. 겸자 및 지혈제를 사용하여 피부판을 절개 및 분리한다. 대퇴부 혈관을 배치한 후에, 혈관(들) 측면 및 하부를 따라 흐르는 림프구 혈관을 배치한다. 이 영역에서 주요 림프구 혈관을 전기적으로 응고시키고 봉합 결찰시킨다.
현미경을 사용하여, 다리 뒷부분의 근육(반건상(semitendinosis) 및 내전근 부근)을 무디게 자른다. 슬와부 림프절을 위치시킨다. 2개의 기부 및 2개의 말초부 림프관과 슬와부 절의 말초 혈액 공급하고 봉합하여 결찰시킨다. 슬와부 림프절과 임의의 수반하는 지방 조직은 결합 조직을 절단하여 제거한다.
이 절차로부터 생긴 어떠한 약간의 출혈도 제어하기 위해 주의한다. 림프관을 폐색한 후에, 액체 피부(Vetbond)(AJ Buck)를 사용하여 피부판을 밀봉한다. 분리된 피부 연부를 하부 근육 조직에 밀봉하고, 다리 주변에 ∼0.5 cm 갭을 둔다. 필요에 따라 하부 근육에 봉합하여 피부를 고정할 수 있다.
감염을 피하기 위해서, 동물을 각각 망이 있는 우리에 둔다(짚 없음). 회복하고 있는 동물을 최적 부종 피크를 통해 매일 검사하는데, 통상적으로 5∼7일에 발견된다. 그 다음 고평부 부종 피크를 관찰한다. 림프부종의 강도를 평가하기 위해서, 수술 전에 그리고 7일 동안 매일 각 발에서 2개의 지정된 장소의 외주와 부피를 측정한다. 림프부종에 대한 혈장 단백질의 영향을 결정하고, 단백질 분석이 유용한 시험 파라미터 인지도 조사한다. 대조군과 부종 사지의 중량은 2 장소에서 평가한다. 블라인드 방식으로 분석을 실시한다.
외주 측정
사지의 움직임을 막기 위해서 간단한 가스 마취 하에, 천 테이프를 사용하여 사지 외주를 측정한다. 2인의 다른 사람이 발목 뼈와 안측 발에서 측정하고 2회 읽어 평균을 낸다. 대조군 및 부종 사지로부터 측정한다.
부피 측정
수술 당일, 동물은 펜토바르비탈로 마취하고 수술 전에 시험한다. 매일 부피를 측정하기 위해서, 동물을 간단한 할로탄 마취 하에 두고(신속하게 움직이지 못하게 한 다음 빠르게 회복시킴), 양 다리를 면도하고, 다리에 방수 마커를 사용하여 양 다리를 동일하게 표지한다. 먼저 물에 다리를 침지한 다음, 각 표시된 레벨로 기구내로 침지한 다음 Buxco 부종 소프트웨어(Cehn/Victor)로 측정한다. 한 사림이 데이타를 기록하고, 다른 사람은 표시된 영역으로 사지를 침지시킨다.
혈장 단백질 측정
혈액을 취하고, 회전시켜, 수술 전에 혈청을 분리한 다음 총 단백질 및 Ca2+비교하여 결론을 내린다.
사지 중량 비교
혈액을 채취한 후에, 조직 수거를 위해 동물을 준비한다. 퀼리틴(quillitine)을 사용하여 사지를 잘라내고, 실험용 및 대조군 다리를 결찰점에서 자르고 체중을 잰다. 제2의 중량 측정은 경종골(tibiocacaneal) 관절을 탈구시킬 때 실시하고, 발의 중량을 측정한다.
조직학 제제
무릎(슬와부) 부위 뒤에 위치한 횡근을 절단하고, 금속 몰드에 배열한 다음, 냉동겔로 채우고, 차가운 메틸부탄에 침지한 다음, 분할시까지 표지된 샘플 백을 -80 ℃에 둔다. 분할시, 근육을 림프관용 형광 현미경 하에서 관찰한다.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 및/또는 METH2 단백질의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 52
METH1의 작제물 형성 및 발현
C-말단에서 전길이 METH1 유전자에 융합된 Flag 팹티드 서열 또는 인간 IgG1 Fc 도메인을 보유하는 2개의 작제물을, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 형성하였다. 작제물의 명칭은 pFlag-CMV-5a: METH1(ID 822) 및 pC4Fc:METH1(ID 821)로 하였다.
pFlag-CMV-5a:METH1 용으로 다음 프라이머를 사용하였다.
5': AAGAATGCGGCCGCAGCCACCATGGGGAACGCGGAGCGGGCTCC (서열 번호 128)
3': GATCGCGGTACCACTGCATTCTGCCATTGTGCAAAAGTCTATG (서열 번호 129)
METH1은 지정 프라이머를 사용하여 증폭하고 Asp718로 분해하였다. 벡터 pFLAGCMV-5a는 Asp718로 분해하였다. 생성된 제한 산물을 함께 결찰시켰다.
다음 프라이머를 pC4Fc:METH1을 위해 사용하였다.
5': GATCTATGATCAGCCACCATGGGGAACGCGGAGCGGGCTCC (서열 번호 130)
3': GACTGCTCTAGAACTGCATTCTGCCATTGTGCAAAAGTCTATG (서열 번호 131)
METH1은 지정 프라이머를 사용하여 증폭하고 BcII 및 Xba로 분해하였다. 벡터 pC4Fc도 BcII 및 Xba로 분해하였다. 생성된 제한 산물을 함께 결찰시켰다.
작제물 pA2gp: METH1(H542-Q894).Fc 및 pA2gp:METH1(H542-Q894)도 제조할 수 있다.
또한, pC4Fc:Meth1.M1-P799는 다음 프라이머를 사용하여 만들 수 있다.
5' 프라이머:
GATCTA TGATCA GCCACCATGGGGAACGCGGAGCGGGCTCC (서열 번호 132)
3' 프라이머:
GCGTGC TCTAGA AGGGCTAAAGCTGCGAATTC (서열 번호 133)
METH1은 지정 프라이머를 사용하여 증폭하고 BcII 및 Xba로 분해하였다. 벡터 pC4Fc도 BcII 및 Xba로 분해하고, 분해된 METH1 단편에 결찰시켰다.
pFLAG-CMV-1:Meth1.F236-E614는 다음 프라이머를 사용하여 제조할 수 있다.
5' 프라이머: GTACCC AAGCTT TTTGTGTCCAGTCACCGC (서열 번호 134)
3' 프라이머: GCGTGC TCTAGA TTACTCGTTGTGTGCTTCAC (서열 번호 135)
METH1은 지정 프라이머를 사용하여 증폭하고 HindIII 및 Xba로 분해하였다. 벡터 pFLAG-CMV-1도 HindIII 및 Xba로 분해하고, 분해된 METH1 단편에 결찰시킨다.
METH1의 항혈관형성 활성을 확인하기 위해서 작제물을 제조하였다. 전길이 METH1 유전자를 pC4Fc 및 pFlagCMV5a 벡터내로 PCR 클로닝하였다. pC4Fc:METH1과pFLAGCMV5a:METH1을 얻어서 서열 확인하였다.
293T 세포 상의 일시적인 형질감염은 리포펙타민 플러스(LTI) 시약을 사용하여 실시하고, 무혈청 조건 하에서 생성을 유지하였다. 항-huFc Ab 또는 항-Flag M2 Ab로 웨스턴 분석을 실시한다. METH1-Fc 조정 배지는 강도가 다양한 적어도 5개의 밴드를 나타내었다. 추정 분자량은 130∼140 kD(약함), 110∼120 kD(약함), 52 kDa(강함), 45∼48 kD(강함) 및 32∼35 kD(가장 강함)이다. 60 및 90 kD에서의 2개의 더 약한 밴드도 검출가능하였다. METH1-Flag 조정 배지는 동일한 강도의 3개의 주요 밴드를 나타냈다. 이들은 약 100∼110 kD, 70∼80 kD 및 22 kD이었다. 293T 세포에서 METH1-Fc의 일시적 형질 감염. METH1-Fc 단백질의 제2 배치는 전술한 바와 같이 1% 혈청을 보유한 배지에서 산출되었다.
일시적으로 형질감염된 세포로부터 얻은 5.5일 조정 배지를 프로테인A 컬럼에서 조작하고 용출시켰다. 단백질을 함유하는 분획은 환원 및 비환원 조건 하에 SDS-PAGE로 검사하고, 코싸미 블루로 염색하였다. N-말단 서열 분석에 대해 제2 겔을 제조하였다.
환원 조건하에 4개의 밴드를 나타낸 단백질 197 ㎍를 회수하였다. 이중 3개의 밴드는 강하고, 하나의 밴드는 약하였다. 밴드의 N-말단 서열 결정은 밴드 중 2개가 블록된 N-말단을 갖는 단백질을 포함함을 제시하였다. 서열을 제공하는 2개 밴드 중, 하나는 Fc-유도형 단편이고, 다른 하나는 L800에서 시작하는 METH1.Fc 융합체(토롬보스폰딘 유사 도메인 중 2개 함유)의 절단 산물이다. 이는 Fc 단편에 열결되어 있는 단지 C-말단 단편이 단백질 A 컬럼에서 정제되기 때문에 METH1이 2개이상의 절단 부위(가능하게는 그 이상)로 처리된다는 것을 보여준다.
형질감염된 293T 세포는 1% 투석된 저 IgG, 태아 소 혈청을 함유하는 배지에서 조정하여 재조합 분비 단백질의 단백질 분해를 감소시키고자 하였다. 정제 및 분석은 전술한 바와 같았다. 단백질의 수율은 제1 배치보다 상당히 높았으며, 이는 아마도 배지 내 혈청의 효과를 반영한 것일 것이다. 일부 처리가 혈청에 의해 늦추어질 수 있지만, 대다수의 단백질은 환원 겔 상에서 대략 31 kD으로 남아있었다.
환원 조건 하에 분해된 밴드의 N-말단 서열 결정으로 단백질이 950 잔기 METH1 orf 중 L800에서 처리되고, 다른 가능한 절단은 이 부위에 대한 N-말단에서 발생한다는 것을 제시한다. 관찰된 절단 부위는 비통상적인 것으로 간주되는데, 그 이유는 Pro가 그 뒤에 있기 때문이다. 총 197.4 ㎍의 단백질을 분리하였다(HG12100-D293T1). 웨스턴 블롯 상에서 3개 이상의 밴드(120, 97 및 21 Kd)로 구성된 flag 단백질(pFlag-CMV-5a:METH1)의 분석 결과, 단지 하나의 밴드(21 kD)만이 METH1으로 확인되고 다른 밴드들은 비-METH1 기원인 것들임을 확인하였다.
정제된 METH1 Fc 단백질의 서열 결정은 비통상적인 절단 부위를 나타내기 때문에, METH1 Fc의 제2 배치는 1% FBS에서 증식된 세포로 제조하여 바람직하지 않은 처리를 억제할 수 있다. 산물의 예비 평가는, 배지의 변화로 인한 처리 차이는 없지만 단백질 수율은 증가한다는 것을 제시한다.
실시된 초기 Fc 및 Flag 단백질 상청액의 기능 분석은 소 대동맥 내피세포(BAEC)를 사용하여 시험관내 삭 형성과 인간 미세혈관 내피세포(HMVEC)의 증식을 포함하였다. 증식 분석은 2가지 배양 상청액에 반응하는 HMVEC 증식의 속도증가를 제시하는데, 이는 조정 배지로부터 높은 배경 자극에 기인할 수 있다. Fc 및 Flag 상청액의 삭 형성 분석은 2개의 독립 실험에서 배지/콜라겐 대조군에 대한 삭 형성의 억제를 보여주었다.
실시예 53
METH1의 시험관내 활성
증식
HMVEC는, METH1 상청액이 EC 증식 억제에 의해 검출가능한 기능적 항-혈관형성 활성을 보유하는 지를 결정하기 위해서 알라마 블루 분석에 사용하였다 FGF-2는 증식용 1차 자극으로서 사용되며, 배양 상청액은 1:4 최종 희석율에서 사용하였다. 증식 분석 결과 2종의 배양 상청액에 반응하는 HMVEC 증식의 속도가 상당히 증가하였으며, 이는 조정 배지로부터 유래한 높은 배경 자극에 기인할 수 있음을 제시한다. 이 문제는 정제 단백질의 사용에 의해 감소 또는 제거되어야 한다.
삭 형성
가용성 I형 콜라겐을 내피세포 및 적절한 성장 인자에 첨가하면 내피 세포의 이동과 이들 구조에 속하지 않는 세포의 선택적 결실(고사)을 모두 포함하는 배양물 중 내피 세포의 관 유사 구조 또는 삭 형성을 유도한다. 소 대동맥 내피 세포(BAEC)를 사용하여 METH1-Fc 및 METH1-Flag 함유 배양 상청액과 1:4 희석율로 배양하여 안정한 삭 형성의 억제를 검출하였다. 삭 형성의 정량 분석은 콜라겐 처리 대조군과 비교하여 시험된 2가지 상청액을 이용한 억제를 나타내었다. 그러나, 비정합형 조정 배지 대조군도 삭 형성의 억제를 나타내었는데, 이는 비특이적 세포독성이 관찰된 억제에 기인할 수 있음을 제시한다.
본 실시예에 개시된 연구는 METH1 단백질에서의 활성을 시험하였다. 그러나, 당업자라면 예시된 연구를 쉽게 변형시켜 METH1 및/또는 METH2 폴리뉴클레오티드(예, 유전자 요법), METH1 및/또는 METH2의 작동제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
본 발명은 전술한 설명 및 실시예에 구체적으로 개시된 것 외로 실시될 수 있음은 명백하다.
상기 교시를 참조하여 본 발명의 각종 변형 및 변화가 가능하며, 따라서 첨부된 청구 범위 내에 포함된다.
본 명세서에 인용된 모든 공개문헌(예, 특허, 특허 출원, 간행물, 실험실 매뉴얼, 서적 또는 기타 문서)은 참고로 인용한다.
미국 특허 출원 08/845,496호(1997년 4월 24일 출원), 미국 특허 출원 제60/072,298호(1998년 1월 23일 출원), 미국 특허 출원 60/098,539호(1998년 8월 28일 출원), 미국 특허 출원 제09/235,810호(1999년 1월 22일 출원), 미국 출원 제09/318,208호(1999년 5월 25일 출원), 미국 가명세서 출원 제60/144,882호(1999년 7월 20일 출원), 미국 가명세서 출원 제60/147,823호(1999년 8월 10일 출원) 및 미국 출원 제09/373,658호(1999년 8월 13일 출원)의 전체 개시내용은 본 명세서에서 참고로 인용한다.
미생물 또는 기타 생물 재료에 관한 증명서(PCT Rule 13bis)
| A. 다음에 작성된 증명서는 명세서 3페이지의 10째줄에 언급된 미생물에 관한 것이다 | |
| B. 기탁의 확인추가 기탁물은 첨부한 용지에서 확인됨 | |
| 기탁 기관의 명칭:미국 모식균 배양 수집소 | |
| 기탁 기관의 주소(우편 번호와 국가명 포함):전주소 : 미국 매릴랜드주 20852 록빌 파크론 드라이브 12301미국 버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시트 볼레발드 10801 | |
| 기탁일: 1998. 1. 15 | 수탁 번호: 209581 |
| C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 용지에 계속됨 | |
| DNA 플라스미드 HOUCQ 17 | |
| D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우) | |
| E. 증명서의 별도 제공(불필요한 경우 공백으로 하시오) | |
| 아래에 제시된 증명서은 이후 국제 사무국에 제출될 것이다(증명서의 일반적인 종류를 구체화하시오, 예를 들어 "기탁의 수탁 번호") | |
| 수리 관청용 | 국제 사무국용 |
| 이 용지는 국제 출원과 함께 수리되었습니다 | 이 용지는 국제 수리 관청에 의해 수리되었습니다 |
| 권한을 가진 자 | 권한을 가진 자 |
미생물 또는 기타 생물 재료에 관한 증명서(PCT Rule 13bis)
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| 기탁 기관의 주소(우편 번호와 국가명 포함):전주소 : 미국 매릴랜드주 20852 록빌 파크론 드라이브 12301미국 버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시트 볼레발드 10801 | |
| 기탁일: 1998. 1. 15 | 수탁 번호: 209582 |
| C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 용지에 계속됨 | |
| DNA 플라스미드, HCE4D69 | |
| D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우) | |
| E. 증명서의 별도 제공(불필요한 경우 공백으로 하시오) | |
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| 수리 관청용 | 국제 사무국용 |
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| 권한을 가진 자 | 권한을 가진 자 |
미생물 또는 기타 생물 재료에 관한 증명서(PCT Rule 13bis)
| A. 다음에 작성된 증명서는 명세서 3 페이지의 10째줄에 언급된 미생물에 관한 것이다 | |
| B. 기탁의 확인추가 기탁물은 첨부한 용지에서 확인됨 | |
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| 기탁일: 2000. 3. 14 | 수탁 번호: PTA 1478 |
| C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 용지에 계속됨 | |
| DNA 플라스미드(Meth2 pCR2.1-TOPO) | |
| D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우) | |
| E. 증명서의 별도 제공(불필요한 경우 공백으로 하시오) | |
| 아래에 제시된 증명서은 이후 국제 사무국에 제출될 것이다(증명서의 일반적인 종류를 구체화하시오, 예를 들어 "기탁의 수탁 번호") | |
| 수리 관청용 | 국제 사무국용 |
| 이 용지는 국제 출원과 함께 수리되었습니다 | 이 용지는 국제 수리 관청에 의해 수리되었습니다 |
| 권한을 가진 자 | 권한을 가진 자 |
Claims (23)
- (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 950을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(b) 서열 번호 2의 아미노산 2 내지 950을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(c) 서열 번호 2의 아미노산 29 내지 950을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(d) 서열 번호 2의 아미노산 30 내지 950을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(e) ATCC 기탁 번호 209581호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 완전 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(f) ATCC 기탁 번호 209581호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 성숙 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(g) 서열 번호 125의 아미노산 1 내지 968을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(h) 서열 번호 2의 아미노산 235 내지 459를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(i) 서열 번호 2의 아미노산 460 내지 544를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(j) 서열 번호 2의 아미노산 545 내지 598을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(k) 서열 번호 2의 아미노산 841 내지 894를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(l) 서열 번호 2의 아미노산 895 내지 934를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(m) 서열 번호 2의 아미노산 536 내지 613을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및(n) 서열 번호 2의 아미노산 549 내지 563을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
- 제1항에 기재된 분리된 핵산 분자를 프로모터에 작동가능하게 연결하여 벡터 내로 삽입하는 단계를 포함하여 재조합 벡터를 제조하는 방법.
- 제2항에 기재된 방법으로 제조한 재조합 벡터.
- 제3항에 기재된 재조합 벡터를 숙주 세포로 도입하는 단계를 포함하여 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법.
- 제4항에 기재된 방법으로 제조한 재조합 숙주 세포.
- 폴리펩티드가 발현되도록 하는 조건 하에 제5항에 기재된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하여 폴리펩티드를 제조하는 재조합 방법.
- 서열 번호 1의 암호화 영역의 50개 연속 뉴클레오티드 또는 이의 보체를 포함하고, 서열 번호 14 내지 41 중 어느 하나의 서열도 포함하지 않는 분리된 핵산 분자.
- (a) 서열 번호 4의 아미노산 1 내지 890을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(b) 서열 번호 4의 아미노산 2 내지 890을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(c) 서열 번호 4의 아미노산 24 내지 890을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(d) 서열 번호 4의 아미노산 112 내지 890을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(e) ATCC 기탁 번호 209582호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 완전 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(f) ATCC 기탁 번호 209582호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 성숙 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(g) 서열 번호 4의 아미노산 214 내지 439를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(h) 서열 번호 4의 아미노산 440 내지 529를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(i) 서열 번호 4의 아미노산 530 내지 583을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(j) 서열 번호 4의 아미노산 837 내지 890을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;(k) 서열 번호 4의 아미노산 280 내지 606을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및(l) 서열 번호 4의 아미노산 529 내지 548을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
- 제8항에 기재된 분리된 핵산 분자를 프로모터에 작동가능하게 연결하여 벡터 내로 삽입하는 단계를 포함하여 재조합 벡터를 제조하는 방법.
- 제9항에 기재된 방법으로 제조한 재조합 벡터.
- 제10항에 기재된 재조합 벡터를 숙주 세포로 도입하는 단계를 포함하여 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법.
- 제11항에 기재된 방법으로 제조한 재조합 숙주 세포.
- 폴리펩티드가 발현되도록 하는 조건 하에 제12항에 기재된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하여 폴리펩티드를 제조하는 재조합 방법.
- 서열 번호 3의 암호화 영역의 50개 연속 뉴클레오티드 또는 이의 보체를 포함하고, 서열 번호 19 내지 22, 24 및 42 내지 77 중 어느 하나의 서열도 포함하지 않는 분리된 핵산 분자.
- (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 950;(b) 서열 번호 2의 아미노산 2 내지 950;(c) 서열 번호 2의 아미노산 29 내지 950;(d) 서열 번호 2의 아미노산 30 내지 950;(e) ATCC 기탁 번호 209581호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 완전 아미노산 서열;(f) ATCC 기탁 번호 209581호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 성숙 아미노산 서열;(g) 서열 번호 125의 아미노산 1 내지 968;(h) 서열 번호 2의 아미노산 235 내지 459;(i) 서열 번호 2의 아미노산 460 내지 544;(j) 서열 번호 2의 아미노산 545 내지 598;(k) 서열 번호 2의 아미노산 841 내지 894;(l) 서열 번호 2의 아미노산 895 내지 934;(m) 서열 번호 2의 아미노산 536 내지 613; 및(n) 서열 번호 2의 아미노산 549 내지 563으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- (a) 서열 번호 4의 아미노산 1 내지 890;(b) 서열 번호 4의 아미노산 2 내지 890;(c) 서열 번호 4의 아미노산 24 내지 890;(d) 서열 번호 4의 아미노산 112 내지 890;(e) ATCC 기탁 번호 209582호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 완전 아미노산 서열;(f) ATCC 기탁 번호 209582호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 성숙 아미노산 서열;(g) 서열 번호 4의 아미노산 214 내지 439;(h) 서열 번호 4의 아미노산 440 내지 529;(i) 서열 번호 4의 아미노산 530 내지 583;(j) 서열 번호 4의 아미노산 837 내지 890;(k) 서열 번호 4의 아미노산 280 내지 606; 및(l) 서열 번호 4의 아미노산 529 내지 548로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- 서열 번호 2의 아미노산 서열 m-n[여기서 m은 1 내지 950의 정수이고 n은 10 내지 950의 정수임]을 포함하는 폴리펩티드.
- 서열 번호 4의 아미노산 서열 m-n[여기서 m은 1 내지 890의 정수이고 n은 10 내지 890의 정수임]을 포함하는 폴리펩티드.
- METH1 또는 METH2의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 개체의 혈관형성을 억제하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 방법이 암, 양성 종양, 안구 혈관형성 질환, 류마티스성 관절염, 건선, 지연형 상처 치유, 핵내분열, 맥관형성, 과립화, 비후성 반흔, 유착결여 골절, 경피증, 트라코마, 혈관 유착, 심근 혈관형성, 관상 측지(coronarycollaterals), 대뇌 측지, 동정맥 기형, 허혈 사지 혈관형성, 오슬러 베버(Osler-Webber) 증후군, 플라크 혈관신생, 모세관 확장증, 혈유병자 관절, 맥관 섬유종, 섬유근성 형성장애증, 상처 과립화, 크론병 또는 아테롬성 경화증의 치료에 사용되는 것이 특징인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 방법이 산아 조절에 사용되는 것이 특징인 방법.
- 제19항에 있어서, 또 다른 혈관형성 화합물을 투여하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 METH1 또는 METH2는 세포 또는 유전자 요법 수단에 의해 투여되고, 상기 세포는 변형되어 METH1 또는 METH2를 생성 및 분비하는 것이 특징인 방법.
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