DE69822307T2

DE69822307T2 - Menschliches adamts-1 protein, gen , welches für dieses kodiert, pharmazeutische zusammensetzung und verfahrem zur immunologischen bestimmung von menschlichen adamts-1 proteinen

Info

Publication number: DE69822307T2
Application number: DE69822307T
Authority: DE
Inventors: Kunitaka Hirose; Eiji Tatebayashi-shi INOGUCHI; Michinori Kawaguchi-shi HAKOZAKI; Keiko Kodaira-shi ISHIOKA; Yukako Komae-shi ISHIDA; Kouji Matsudo-shi MATSUSHIMA; Koji Kanazawa-shi KUNO
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1997-06-03
Filing date: 1998-06-03
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2018-06-04
Also published as: EP1004674A4; US20020119167A1; DE69822307D1; WO1998055643A1; EP1004674A1; US6565858B2; US20030032168A1; EP1004674B1; US20030022352A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein humanes ADAMTS-1-Protein, ein dafür codierendes Gen, eine pharmazeutische Zusammensetzung und ein Verfahren zur immunologischen Analyse des humanen ADAMTS-1-Proteins.
STAND DER TECHNIK FÜR DIE ERFINDUNG
Ein Maus-ADAMTS(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)-1-Gen ist als cDNA von einer Mausdickdarmkrebszelle kloniert worden, die nach Transplantation in eine Maus eine Krebskachexie auslöst. Das von dem Gen codierte Maus-ADAMTS-1-Protein ist ein einzigartiges Protein, das eine Matrix-Metalloproteinase-Domäne, eine Disintegrin-Domäne und drei Thrombospondin-Domänen enthält [J. Biol. Chem., 272, 556-562 (1997)]. Über die physiologischen Funktionen des Maus-ADAMTS-1-Proteins ist noch nichts berichtet worden, jedoch über alle darin enthaltenen funktionellen Domänen.
So gehört beispielsweise ein Schlangengift-Disintegrin zu einer Familie von Proteinen, die reich an Cystein sind und eine gerinnungshemmende Wirkung besitzen [Semin. Hematol., 31, 289-300 (1994)].
Weiterhin ist beispielsweise eine ADAM(A disintegrin and metalloproteinase)-Familie als Proteinfamilie bekannt, die eine Matrix-Metalloproteinase-Domäne und eine Disintegrin-Domäne enthält [Nature, 377, 652-656 (1995); Nature Genet., 5, 151-157 (1993); Nature, 356, 248-252 (1992)]. Beispiele für bekannte Proteine der ADAM-Familie sind Fertilin, epidermales apikales Protein, Cyritestin, MDC (Metalloprotease-ähnliches, Disintegrin-ähnliches und Cystein-reiches Protein), Meltrin, MS2 und Metargidin [Nature, 377, 652-656 (1995); Nature Genet. 5, 151-157 (1993); Nature, 356, 248-252 (1992); Biochem. J., 286, 671-675 (1992); Dev. Growth. Differ., 36, 49-58 (1994); Int. Immunol., 2, 585-591 (1990); J. Biol. Chem., 271, 4593-4596 (1996)] .
Es wurde berichtet, dass Fertilin an einer durch Integrin vermittelten Spermazelle-Eizelle-Bindung [Nature, 356, 248-252 (1992)] und Meltrin an der Bildung der Muskelscheide beteiligt ist [Nature, 377, 652-656 (1995)]. MDC, das hauptsächlich im Zentralnervensystem exprimiert wird, ist ein Kandidat als Suppressor von humanem Brustkrebs [Nature Genet 5, 151-157 (1993)] und MS2 dient als Makrophagen-Antigen [Int. Immunol., 2, 585-591 (1990)]. Über die physiologische Rolle dieser Proteine der ADAM-Familie ist jedoch nur wenig bekannt.
Das Maus-ADAMTS-1-Protein enthält eine Matrix-Metalloproteinase-Domäne und eine Disintegrin-Domäne und gehört deshalb zur ADAM-Familie. Jedoch unterscheidet sich das Maus-ADAMTS-1-Protein von den anderen bekannten Proteinen der ADAM-Familie darin, dass es außerdem Thrombospondin-Domänen enthält.
Wie weiter oben erwähnt, haben die Proteine der ADAM-Familie verschiedene Wirkungen wie eine Beteiligung am Knochen- oder Muskelstoffwechsel, an der Unterdrückung des Krebswachstums oder an der Befruchtung, wobei Thrombospondin die Gefäßneubildung hemmt und Krebs unterdrückt. Deshalb wird erwartet, dass das Maus-ADAMTS-1- Protein einzigartige physiologische Funktionen aufweisen wird.
Von den Erfindern ist versucht worden, das entsprechende humane ADAMTS-1-Protein zu isolieren. Dementsprechend sind von den Erfindern verschiedene Sonden auf der Grundlage der Basensequenz des bekannten Maus-ADAMTS-1-Gens entworfen und hergestellt und Plaque-Hybridisierungen mit einer Menschennieren-cDNA-Bibliothek durchgeführt worden, um ein humanes ADAMTS-1-Gen zu erhalten, wobei jedoch das gewünschte Gen nicht erhalten wurde. Danach wurden von den Erfindern verschiedene Primer auf der Grundlage der Basensequenz des bekannten Maus-ADAMTS-1-Gens entworfen und hergestellt und PCRs unter Verwendung der MenschennierencDNA-Bibliothek als Template unter gewöhnlichen Bedingungen durchgeführt, um das gewünschte Gen zu erhalten, was jedoch nicht erfolgreich war.
Danach wurde von den Erfindern eine PCR der MenschennierencDNA-Bibliothek unter Verwendung derselben Primer, jedoch unter milderen Bedingungen als den üblicherweise angewendeten, durchgeführt, wobei insbesondere die Annealing-Temperatur niedriger als die übliche Temperatur eingestellt wurde, wonach von den Erfindern erfolgreich ein neues humanes ADAMTS-1-Gen erhalten wurde. Das erhaltene Gen wurde dann in E. coli exprimiert, und es wurden die biologischen Aktivitäten des rekombinanten humanen ADAMTS-1-Proteins untersucht. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das neue humane ADAMTS-1-Protein die Anzahl von Leukocyten und Blutplättchen senken und gleichzeitig die Anzahl der Erythrocyten erhöhen kann. Solche Wirkungen auf blutbildende Funktionen konnten von der Struktur des Maus-ADAMS-1-Gens, das als Grundlage für den Entwurf der Primer verwendet wurde, oder von den Funktionen der Domänen, die in dem humanen ADAMTS-1-Protein enthalten sind, nicht erwartet werden. Die Erfindung beruht auf diesen Feststellungen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Protein, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 enthält:
Die Erfindung betrifft weiterhin die Variation von Proteinen, die äquivalent zu dem Protein sind, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 enthält.
Die Erfindung betrifft ferner ein Protein, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Matrix-Metalloproteinase-Domäne, eine Disintegrin-Domäne und eine Thrombospondin-Domäne enthält, ausgenommen ein Maus-ADAMTS-1-Protein.
Die Erfindung betrifft auch ein Gen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es für die zuvor genannten neuen Proteine codiert.
Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er dieses Gen enthält.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus einen Transformator, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er von diesem Vektor transformiert worden ist.
Die Erfindung betrifft des Weiteren eine pharmazeutische Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie (1) das Protein, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 enthält, (2) die Variation, die dem Protein, das die Aminsoäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 enthält, funktionell äquivalent ist, oder (3) das Protein, das eine Matrix-Metalloproteinase-Domäne, eine Disintegrin-Domäne und eine Thrombospondin-Domäne enthält, umfasst.
Die Erfindung betrifft eine immunologisch wirksame Substanz (wie einen polyklonalen bzw. monoklonalen Antikörper, ein Antikörperfragment davon oder ein Antiserum), die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie in der Lage ist, mit den neuen Proteinen spezifisch zu reagieren.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur immunologischen Analyse des humanen ADAMTS-1-Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Probe mit der immunologisch wirksamen Substanz in Berührung gebracht und ein Komplex aus dem humanen ADAMTS-1-Protein und der immunologisch wirksamen Substanz nachgewiesen wird.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse der mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Probe mit einem Polynucleotid, das eine Basensequenz enthält, die zu derjenigen der mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins, das aus der Aminsoäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 besteht, komplementär ist, in Berührung gebracht und ein Komplex aus der mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins und dem Polynucleotid nachgewiesen wird.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum extrakorporalen Nachweis eines immunologischen Zustandes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das humane ADAMTS-1-Protein oder dessen mRNA analysiert wird.
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Analyse eines immunologischen Zustandes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die immunologisch wirksame Substanz enthält, die in der Lage ist, mit dem humanen ADAMTS-1-Protein oder dem Polynucleotid, das die zu derjenigen der mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins komplementäre Basensequenz enthält, immunologisch zu reagieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines durch PCR produzierten Flag.-1-DNA-Fragments.
2 zeigt die Homologie zwischen dem Maus-ADAMTS-1-Gen und dem Flag.-1-DNA-Fragment.
3 zeigt die Ergebnisse einer Dot-Hybridisierung des Flag.-1-DNA-Fragments.
4 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines durch RACE produzierten Flag.-2-DNA-Fragments.
5 zeigt die Homologie der Basensequenzen der Basen 1 bis 480 zwischen dem humanen ADAMTS-1-Gen und dem Maus-ADAMTS-1-Gen.
6 zeigt die Homologie der Basensequenzen der Basen 481 bis 960 zwischen dem humanen ADAMTS-1-Gen und dem Maus-ADAMTS-1-Gen.
7 zeigt die Homologie der Basensequenzen der Basen 961 bis 1 440 zwischen dem humanen ADAMTS-1-Gen und dem Maus-ADAMTS-1-Gen.
8 zeigt die Homologie der Basensequenzen der Basen 1 441 bis 1 920 zwischen dem humanen ADAMTS-1-Gen und dem Maus-ADAMTS-1-Gen.
9 zeigt die Homologie der Basensequenzen der Basen 1 921 bis 2 184 zwischen dem humanen ADAMTS-1-Gen und dem Maus-ADAMTS-1-Gen.
10 zeigt die Homologie der Aminosäuresequenzen der Aminosäuren 1 bis 240 zwischen dem humanen ADAMTS-1-Protein und dem Maus-ADAMTS-1-Protein.
11 zeigt die Homologie der Aminosäuresequenzen der Aminosäuren 241 bis 510 zwischen dem humanen ADAMTS-1-Protein und dem Maus-ADAMTS-1-Protein.
12 zeigt die Homologie der Aminosäuresequenzen der Aminosäuren 511 bis 727 zwischen dem humanen ADAMTS-1-Protein und dem Maus-ADAMTS-1-Protein.
13 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese der cDNA mit voller Länge des erfindungsgemäßen humanen ADAMTS-1-Gens, wobei die cDNA durch PCR produziert wurde.
14 veranschaulicht schematisch die Struktur von Plasmid pG/erfindungsgemäßem ADAMTS-1.
15 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines Transformanten, der von dem Plasmid pG/ADAMTS-1 transformiert wurde.
16 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese eines GSThumanen ADAMTS-1-Fusionsproteins.
17 zeigt Diagramme, in welchen der Einfluss auf die Anzahl Blutzellen veranschaulicht ist, nachdem das GSThumane ADAMTS-1-Fusionsprotein einer Maus mit einer Einzeldosis intravenös verabreicht wurde.
BESTE ERFINDUNGSGEMÄßE AUSFÜHRUNGSFORM
Die Erfindung wird anschließend näher erläutert.
Das erfindungsgemäße humane ADAMTS-1-Protein ist ein neues Protein, das aus 727 Aminosäureresten, d.h. aus der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1, besteht. Wie in den 10 bis 12 gezeigt, enthält das erfindungsgemäße humane ADAMTS-1-Protein eine Matrix-Metalloproteinase(anschließend mitunter mit "MMP" abgekürzt)Domäne, die aus dem 12. bis 230. Aminosäurerest, gezählt ab dem Nterminalen Aminosäurerest Methionin, besteht, eine Disintegrin-(anschließend mitunter mit "DI" abgekürzt)Domäne, die aus dem 235. bis 305. Aminosäurerest besteht, und drei Thrombospondin-(anschließend mitunter mit "TSP" abgekürzt)Domänen, die aus dem 322. bis 372., 618. bis 664. und 672. bis 727. Aminosäurerest bestehen. Das humane ADAMTS-1-Protein enthält in der C-terminalen Region viele Arginine und Lysine, die basische Aminosäuren sind. Daher wird angenommen, dass das humane ADAMTS-1-Protein mit sulfatierten Polysaccharidmolekülen wie Heparin- oder Heparansulfat im Blut wechselwirkt.
Das erfindungsgemäße neue Protein umfasst das Protein, das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthält, und eine Variation, die dem Protein, das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthält, funktionell gleichwertig ist (anschließend mitunter als "humane ADAMTS-1-Proteinvariation" bezeichnet). Dabei bedeutet die hier benutzte Bezeichnung "humane ADAMTS-1-Proteinvariation" ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, worin eine oder mehrere (insbesondere eine oder einige) Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des humanen ADAMTS-1-Proteins, d.h. der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1, deletiert, verändert oder insertiert worden sind, und welches Wirkungen des humanen ADAMTS-1-Proteins zeigt. Eine bevorzugte humane ADAMTS-1-Protein-Variation hat eine Homologie von 92 % oder mehr in der Aminosäuresequenz mit dem humanen ADAMTS-1-Protein. Die humane ADAMTS-1-Protein-Variation umfasst ein Fragment, das ein Teil des Proteins ist, das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthält, und die Wirkungen des humanen ADAMTS-1-Proteins zeigt, und ein Fragment, das ein Teil einer anderen humanen ADAMTS-1-Proteinvariation ist und die Wirkungen des humanen ADAMTS-1-Proteins zeigt.
Dabei bedeutet die hier benutzte Bezeichnung "humane ADAMTS-1-Wirkung" die Wirkung, die Anzahl von Leukocyten und Blutplättchen zu senken und gleichzeitig die Anzahl der Erythrocyten zu erhöhen.
Ferner umfasst das neue erfindungsgemäße Protein ein Protein, das eine Matrix-Metalloproteinase-Domäne, eine Disintegrin-Domäne und eine Thrombospondin-Domäne enthält (anschließend mitunter als "ADAMTS-Protein" bezeichnet). Jedoch umfasst das neue erfindungsgemäße Protein nicht das Maus-ADAMTS-1-Protein.
Die hier benutzte Bezeichnung "Matrix-Metalloproteinase-Domäne" bedeutet eine Domäne, die eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 50 % oder mehr (vorzugsweise 95 % oder mehr) mit der Aminosäuresequenz der Matrix-Metalloproteinase-Domäne im humanen ADAMTS-1-Protein, d.h. der Aminosäuresequenz von der 12. bis zur 230. Aminosäure in der Aminooäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1, enthält.
Die hier benutzte Bezeichnung "Disintegrin-Domäne" bedeutet eine Domäne, die eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 50 % oder mehr (vorzugsweise 93 % oder mehr) mit der Aminosäuresequenz der Disintegrin-Domäne im humanen ADAMTS-1-Protein, d.h. der Aminosäuresequenz von der 235. bis 305. Aminosäure in der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1, enthält.
Die hier benutzte Bezeichnung "Thrombospondin-Domäne" bedeutet eine Domäne, die eine Aminosäuresequenz, die eine Homologie von 50 % oder mehr mit mindestens einer der Aminosäuresequenzen der drei Disintegrin-Domänen in dem humanen ADAMTS-1-Protein besitzt, d.h.

(1) eine Domäne, die eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Homologie von 50 % oder mehr (vorzugsweise 99 % oder mehr) mit der Aminosäuresequenz der ersten Thrombospondin-Domäne (anschließend mitunter als "humane TSP-1-Domäne" bezeichnet) ab dem N-Terminus in dem humanen ADAMTS-1-Protein, d.h. der Aminosäuresequenz von der 322. bis zur 472. Aminosäure in der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1, besitzt,
(2) eine Domäne, die eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Homologie von 50 % oder mehr (vorzugsweise 88 % oder mehr) mit der Aminosäuresequenz der zweiten Thrombospondin-Domäne (anschließend mitunter als "humane TSP-2-Domäne" bezeichnet) ab dem N-Terminus in dem humanen ADAMTS-1-Protein, d.h. der Aminosäuresequenz von der 618. bis zur 664. Aminosäure in der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID
Nr. 1, besitzt, oder
(3) eine Domäne, die eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Homologie von 50 % oder mehr (vorzugsweise 88 % oder mehr) mit der Aminosäuresequenz der dritten Thrombospondin-Domäne (anschließend mitunter als "humane TSP-3-Domäne" bezeichnet) ab dem N-Terminus in dem humanen ADAMTS-1-Protein, d.h. der Aminosäuresequenz von der 672. bis zur 727. Aminsoäure in der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID
Nr. 1, besitzt, enthält.

Bei dem erfindungsgemäßen ADAMTS-1-Protein ist die Anzahl von Matrix-Metalloproteinase-Domäne, Disintegrin-Domäne bzw. Thrombospondin-Domäne und deren Sequenzreihenfolge nicht besonders beschränkt, sofern mindestens eine Matrix-Metalloproteinase-Domäne, mindestens eine Disintegrin-Domäne und mindestens eine Thrombospondin-Domäne gleichzeitig im ADAMTS-Protein vorhanden sind. Ein bevorzugtes ADAMTS-Protein enthält eine Matrix-Metalloproteinase-Domäne, eine Disintegrin-Domäne und drei Thrombospondin-Domänen. Weiterhin beginnt die Sequenzreihenfolge der Domänen ab dem N-Terminus bis zum C-Terminus vorzugsweise ab der Matrix-Metalloproteinase-Domäne, gefolgt von der Disintegrin-Domäne und danach der Thrombospondin-Domäne. Wenn drei Thrombospondin-Domänen enthalten sind, beginnt die Sequenzreihenfolge der Domänen ab dem N-Terminus bis zum C-Terminus vorzugsweise von der Matrix-Metalloproteinase-Domäne, gefolgt von der Disintegrin-Domäne und anschließend der ersten TSP-Domäne, der zweiten TSP-Domäne und der dritten TSP-Domäne.
Bei dem erfindungsgemäßen ADAMTS-Protein ist es bevorzugt, dass

(1) die Matrix-Metalloproteinase-Domäne eine Homologie von 95 % oder mehr in den Aminosäurensequenzen mit der Matrix- Metalloproteinase-Domäne in dem humanen ADAMTS-1-Protein besitzt,
(2) die Disintegrin-Domäne eine Homologie von 93 % oder mehr in den Aminosäuresequenzen mit der Disintegrin-Domäne in dem humanen ADAMTS-1-Protein besitzt und
(3) mindestens eine der Thrombospondin-Domänen eine Homologie von 99 % oder mehr in der Aminosäuresequenz mit der TSP-1-Domäne in dem humanen ADAMTS-1-Protein, eine Homologie von 88 % oder mehr in den Aminosäuresequenzen mit der TSP-2-Domäne in dem humanen ADAMTS-1-Protein oder eine Homologie von 88 % oder mehr in den Aminosäuresequenzen mit der TSP-3-Domäne in dem humanen ADAMTS-1-Protein besitzt.

Bei dem erfindungsgemäßen ADAMTS-Protein, das drei Thrombospondin-Domänen enthält, ist es bevorzugt, dass

(3-1) die erste Thrombospondin-Domäne ab dem N-Terminus eine Homologie von 99 % oder mehr in den Aminosäuresequenzen mit der TSP-1-Domäne in dem humanen ADAMTS-1-Protein besitzt,
(3-2) die zweite Thrombospondin-Domäne ab dem N-Terminus eine Homologie von 88 % oder mehr in den Aminosäuresequenzen mit der TSP-2-Domäne in dem humanen ADAMTS-1-Protein besitzt und
(3-3) die dritte Thrombospondin-Domäne ab dem N-Terminus eine Homologie von 88 % oder mehr in den Aminosäuresequenzen mit der TSP-3-Domäne in dem humanen ADAMTS-1-Protein besitzt.

Das erfindungsgemäße Protein kann durch verschiedene bekannte Verfahren hergestellt werden. So kann das erfindungsgemäße Protein beispielsweise durch ein bekanntes gentechnisches Veränderungsverfahren und durch das erfindungsgemäße Gen hergestellt werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Protein aus einer natürlich vorkommenden Quelle unter Anwendung eines bekannten proteinchemischen Verfahrens auf gereinigt werden.
Das erfindungsgemäße Gen umfasst ein Gen, das für das Protein, das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthält, insbesondere das humane ADAMTS-1-Protein, ein Gen, das für die humane ADAMTS-1-Protein-Variation und ein Gen, das für das ADAMTS-Protein (außer das Maus-ADAMTS-1-Protein) codiert. Das erfindungsgemäße Gen kann DNA oder RNA sein. Das Gen, das für das humane ADAMTS-1-Protein codiert, kann beispielsweise ein Gen sein, das aus der Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 2 besteht:
Das erfindungsgemäße Gen wie dasjenige, das aus der Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 2 besteht, kann beispielsweise durch folgendes Verfahren erhalten werden, das von den Erfindern angewendet worden war, als das erfindungsgemäße Gen zum ersten Mal erhalten wurde.
Verschiedene für eine PCR geeignete Primer wurden auf der Basis der Basensequenz des Maus-ADAMTS-1-Gens hergestellt. Es können DNA-Fragmente erhalten werden, indem eine PCR unter milderen Bedingungen als denjenigen für eine gewöhnliche PCR, d.h. bei einer Annealingtemperatur, die niedriger als die übliche Annealingtemperatur ist, unter Verwendung einer Menschennieren-cDNA-Bibliothek als Template durchgeführt wird. Es werden die Basensequenzen der erhaltenen DNA-Fragmente bestimmt und mit der Basensequenz des Maus-ADAMTS-1-Gens verglichen, um die erhaltenen DNA-Fragmente als die gewünschten Gene zu identifizieren. Abhängig von den in der PCR verwendeten Primern kann ein humanes ADAMTS-1-Gen in voller Länge oder eine partielle Basensequenz des humanen ADAMTS-1-Gens erhalten werden. Wird die partielle Basensequenz erhalten, kann die übrige Basensequenz des Gens durch ein RACE-(Rapid amplification of cDNA ends)Verfahren [Proc Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)] erhalten und können die partiellen Basensequenzen durch gentechnische Veränderung 1igiert werden, um die Basensequenz mit voller Länge zu erhalten.
Als von den Erfindern die Basensequenzen der Primer, die zur Erzeugung des Gens in dem zuvor beschriebenen Verfahren verwendet wurden, zum ersten Mal entworfen wurden, war die Basensequenz des humanen ADAMTS-1-Gens noch nicht bekannt. Deshalb war es fast unmöglich, die Basensequenzen mit vollständiger Homologie zwischen dem Maus-ADAMTS-1-Gen und dem humanen ADAMTS-1-Gen auszuwählen.
Von den Erfindern wurden Primer verwendet, die auf der Grundlage der Basensequenz des Maus-ADAMTS-1-Gens entworfen worden waren, um eine PCR bei gewöhnlicher Temperatur durchzuführen, wobei jedoch das gewünschte DNA-Fragment nicht erhalten werden konnte. Danach wurden von den Erfindern dieselben Primer verwendet und eine PCR unter Bedingungen durchgeführt, die milder als die einer gewöhnlichen PCR waren, d.h. die Annealingtemperatur wurde niedriger als die übliche Annealingtemperatur eingestellt, wodurch das gewünschte DNA-Fragment erhalten werden konnte. Ein Vergleich der Basensequenz des erhaltenen humanen ADAMTS-1-Gens mit den Basensequenzen der verwendeten Primer zeigte eine ungenügende Homologie.
Gegenwärtig wird die Basensequenz des humanen ADAMTS-1-Gens erfindungsgemäß bestimmt. Deshalb kann die Basensequenz des humanen ADAMTS-1-Gens verwendet werden, um Primer für eine PCR oder Sonden für eine Plaque-Hybridisierung zu konstruieren. Solche Primer oder Sonden können verwendet werden, um das erfindungsgemäße Gen durch ein bekanntes Verfahren zur Erzeugung eines Gens wie eine PCR unter gewöhnlichen Bedingungen oder Plaque-Hybridisierung anstatt durch das Verfahren zu erhalten, das von den Erfindern angewendet worden war, um das erfindungsgemäße Gen zum ersten Mal zu erhalten.
Von den Erfindern wurde versucht, ein unbekanntes humanes ADAMTS-1-Gen aus der Menschennieren-cDNA-Bibliothek durch Plaque-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die auf der Grundlage der Basensequenz des bekannten Maus-ADAMTS-1-Gens konstruiert worden waren, zu erhalten, wobei aber das gewünschte Gen nicht erhalten wurde. Einer der Gründe dafür war die unzureichende Homologie der verwendeten Sonden. Weiterhin wurde von den Erfindern eine Northern-Hybridisierung durchgeführt, um die mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins zu analysieren, wobei herausgefunden wurde, dass der Mißerfolg auch dadurch aufgetreten sein musste, da die mRNA mit einer sehr kleinen Menge exprimiert wurde und somit eine sehr kleine Anzahl der humanen ADAMTS-1-Gene in die cDNA-Bibliothek kopiert wurde.
Das erfindungsgemäße Gen kann durch Plaque-Hybridisierung erhalten werden, wobei Sonden verwendet werden, die auf der Grundlage der Basensequenz des humanen ADAMTS-1-Gens konstruiert sind.
Das resultierende erfindungsgemäße Gen kann beispielsweise in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Wirt exprimiert werden, um das erfindungsgemäße Protein zu produzieren.
Wird ein DNA-Fragment, das das gewünschte Gen enthält, direkt in eine Wirtszelle eingeführt, wird das Fragment nicht reproduziert. Jedoch kann ein in einer Zelle reproduzierbares extrachromosomales Gen wie ein Plasmid als Vektor zur Erzeugung eines Expressionsplasmids verwendet werden. Ein Vektor, der vorzugsweise verwendet werden kann und die genetischen Informationen enthält, die für die Replikation in einer Wirtszelle erforderlich sind, kann unabhängig repliziert werden, lässt sich leicht aus einer Wirtszelle isolieren und aufreinigen und enthält einen detektierbaren Marker.
Ein Expressionsvektor, der die erfindungsgemäße DNA enthält, kann entsprechend der Wirtszelle aus verschiedenen kommerziell erhältlichen Vektoren konstruiert werden. Das Verfahren zur Einführung der DNA in den Vektor ist bekannt.
Als prokaryontische Wirtszellen sind beispielsweise E.coli-Stämme wie XL1-Blue, HB101, JM109, HD5α, AG-1, K12-Stamm 294 (ATCC 31446), B, χ 1776 (ATCC 31537), C600 oder W3110 (F-, λ- und prototrophisch, ATCC 27375) zu nennen. Weiterhin können Bakterienstämme wie Bacillus subtilis, Darmbakterien wie Salmonella typhimurium bzw. Serratia marcescens oder Pseudomonas-Stämme verwendet werden.
Wird eine prokaryontische Wirtszelle verwendet, enthält ein Expressionsplasmid, das als Vektor verwendet werden kann, einen Promotor, eine SD-Basensequenz und eine für die Auslösung der Proteinsynthese erforderliche Basensequenz, d.h. ATG, stromaufwärts vom erfindungsgemäßen Gen, um das Gen zu exprimieren. Als Vektor für E.-coli-Stämme werden pUC19, pBR322 oder pBR327 im Allgemeinen und im großen Umfang eingesetzt.
Als Promotor kann beispielsweise der Triptophan-Promotor, P_L-Promotor, lac-Promotor, tac-Promotor, trc-Promotor, lpp-Promotor oder β-Lactamase-Promotor verwendet werden. Beispiele für das Markergen sind ein Ampicillin-Resistenz-Gen oder das Tetracyclin-Resistenz-Gen.
Als eukaryontische Wirtszelle wird im Allgemeinen und im großen Umfang eine Hefe verwendet. Von den Hefen kann Saccharomyces-Hefe vorteilhafterweise verwendet werden. Als Expressionsvektor für die eukaryontische Wirtszelle wie eine Hefe kann beispielsweise YRp7 verwendet werden.
Als Promotor des Expressionsvektors für die Hefe-Exprimierung kann beispielsweise Alkoholdehydrogenase (ADH), GAL10, 3-Phosphoglycerat-Kinase, Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase oder Hexokinase verwendet werden. Ein Beispiel für ein Markergen ist das trpl-Gen.
Als Replikationsursprung können ein Stop-Codon oder andere DNA-Sequenzen, die zur Kontrolle der Transkription oder Translation in einer Hefezelle benutzt werden, und übliche bekannte DNA-Sequenzen, die für die Hefezelle geeignet sind, verwendet werden.
Als Kulturwirtszellen von höheren Tieren sind beispielsweise Rhesusaffen-Nierenzellen, Moskitolarvenzellen, Nierenzellen vom African Green Monkey (COS-7 oder COS-1), Mausfötusfibroblasten, Eizellen von Goldhamstern oder ein an Dihydrofolatreduktase defizitärer Stamm davon, humane Zervixepithelzellen, humane Fötusnierenzellen, Motteneizellen, humane Myelomzellen oder Mausfibroblastenzellen zu nennen.
Der Vektor enthält im Allgemeinen funktionelle Sequenzen zum Exprimieren der erfindungsgemäßen DNA in einer Wirtszelle, beispielsweise einen Replikationsursprung, einen Promotor, der sich stromaufwärts von der erfindungsgemäßen DNA befinden sollte, eine Ribosomenbindungsstelle, eine polyadenylierte Stelle und/oder eine Transkriptionsterminationssequenz. Ein bevorzugter Promotor ist beispielsweise der Adenovirus-2-Main-Late-, SV40-Early- und SV40-Late-Promotor oder ein Promotor von Cytomegalovirus, Rous-Sarkom-Virus oder einem Eukaryonten-Gen wie ein Östrogen-induzierbares Hühnereieralbumin-Gen, Interferon-Gen, Glucocorticoidinduzierbares Throsin-Aminotransferase-Gen, Thymidin-Kinase-Gen, Main-Early- und Main-Late-Adenovirus-Gen, Phosphoglyceratkinase-Gen oder das α-Faktor-Gen.
Als Replikationsursprung kann ein Replikationsursprung von Adenovirus, SV40, Rinderpapillomavirus (BPV), vesikulärem Stomatitisvirus (VSV) oder ein davon abgeleiteter Vektor verwendet werden. In diesen Fällen kann beispielsweise ein Neomycinresistenzgen, ein Methotrexat-resistente Dihydrofolatreductase(DHR)-Gen oder ein Blasticidin-S-Resistenz-Gen als Markergen verwendet werden.
Als Insektenwirtszelle können beispielsweise BmN4-Zellen, Sf9-Zellen, Sf21-Zellen oder Eizellen von Trichoplusiani verwendet werden. Weiterhin können Seidenraupenlarven als Wirt verwendet werden. Die Genübertragung auf die Insektenzelle kann durch Coinfizieren der Insektenzelle mit Virus-DNA und einem Transfervektor, der das zu inkorporierende gewünschte Gen enthält, durchgeführt werden. Als Virus-DNA kann beispielsweise ein Bombyx-mori-Kernpolyhedrose-Virus oder ein Autographica-californicamehrkerniges Polyhedrosevirus verwendet werden. Als Transfervektor, der das zu insertierende gewünschte Gen enthält, kann beispielsweise ein Polyhedrin-Promotor oder p10-Promotor-Vektor verwendet werden. Dabei kann das gewünschte Gen stromabwärts von den Promotoren insertiert werden. Der Transfervektor kann in E. coli, aber nicht in einer Insektenzelle repliziert werden. Deshalb ist es bevorzugt, viele Vektoren in E. coli zu replizieren und sie anschließend in der Insektenzelle zu exprimieren. Entsprechend diesem Verfahren kann, im Vergleich mit einer Tierzelle, eine größere Menge an exprimierten Substanzen gewonnen werden.
Das resultierende Expressionsplasmid kann in eine geeignete Wirtszelle, beispielsweise eine Mikroorganismuszelle wie E. coli und Hefe, oder eine Tierzelle transfiziert werden, um den erfindungsgemäßen Transformanten zu produzieren. Dabei kann das Verfahren zur Transfektion der DNA beispielsweise ein Verfahren zur Verwendung einer mit Calciumchlorid behandelten kompetenten Zelle, ein Protoplastenverfahren, ein Calciumphosphat-Transfektions-Verfahren oder ein Elektroporationsverfahren sein.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfasst (1) das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthaltende Protein, insbesondere das humane ADAMTS-1-Protein, (2) die humane ADAMTS-1-Protein-Variation oder (3) das ADAMTS-Protein als Wirkstoff. In der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann der Wirkstoff das Maus-ADAMTS-1-Protein sein. Die Proteine, die als Wirkstoffe der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden können, haben Wirkungen, welche blutbildende Funktionen beeinflussen, beispielsweise, Wirkungen zur Senkung der Anzahl von Leukocyten und Blutplättchen und gleichzeitig zur Erhöhung der Anzahl von Erythrocyten, wenn sie in ein Blutgefäß verabreicht werden.
Es ist möglich, die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, d.h. das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthaltende Protein, insbesondere das humane ADAMTS-1-Protein, die humane ADAMTS-1-Protein-Variation oder das ADAMTS-Protein, allein oder vorzugsweise zusammen mit einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch geeigneten üblichen Träger einem Tier, vorzugsweise einem Säugetier, und insbesondere einem Menschen oral oder parenteral zu verabreichen. Dabei ist die Zubereitung nicht besonders beschränkt, sondern kann beispielsweise ein oral zu verabreichendes Medikament wie Pulver, mikronisiertes Pulver, Körnchen, Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Emulsionen, Sirupe, Extrakte oder Pillen oder ein parenteral zu verabreichendes Medikament wie Injektionen, Flüssigkeiten zur äußeren Anwendung, Salben, Zäpfchen, Cremes für topische Anwendung oder Augenlotionen sein.
Die oralen Medikamente können durch ein übliches Verfahren unter Verwendung von beispielsweise Füllstoffen, Bindemitteln, Sprengmitteln, Tensiden, Gleitmitteln, die Rieselfähigkeit verbessernden Mitteln, Verdünnungsmitteln, Konservierungsstoffen, Farbmitteln, Parfümen, Geschmacksstoffen, Stabilisatoren, Feuchthaltemitteln, Antiseptika und Antioxidantien wie Gelatine, Natriumalginat, Stärke, Maisstärke, Saccharose, Lactose, Glucose, Mannit, Carboxymethylcellulose, Dextrin, Polyvinylpyrrolidon, kristalline Cellulose, Sojalecithin, Sucrose, Fettsäureester (wie Glycerinfettsäureester, Sucrosefettsäureester, Sorbitanfettsäureester oder Propylenglykolfettsäureester), Talkum, Magnesiumstearat, Polyethylenglykol, Magnesiumsilicat, Kieselsäureanhydrid oder synthetisches Aluminiumsilicat hergestellt werden.
Für die parenterale Verabreichung kann beispielsweise eine Injektion wie eine subkutane oder intravenöse Injektion oder eine rektale Verabreichung angewendet werden. Von den parenteralen Zubereitungen wird die Injektion vorzugsweise angewendet.
Wenn Injektionen hergestellt werden, können beispielsweise wasserlösliche Lösungsmittel wie physiologische Kochsalzlösung oder Ringer-Lösung, wasserunlösliche Lösungsmittel wie Pflanzenöl oder Fettsäureester, isotonisch machende Mittel wie Glucose oder Natriumchlorid, solubilisierende Mittel, stabilisierende Mittel, Antiseptika, Suspendiermittel oder Emulgiermittel wahlweise zusätzlich zu dem Protein, das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthält, insbesondere dem humanen ADAMTS-1-Protein, der humanen ADAMTS-1-Protein-Variation oder dem ADAMTS-Protein, verwendet werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form eines Präparates mit verzögerter Freisetzung unter Verwendung von die Freisetzung verzögernden Polymeren verabreicht werden. So kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung beispielsweise in eine aus Ethylen-Vinylacetat-Polymeren hergestellte Tablette eingebaut und diese in das zu behandelnde Gewebe chirurgisch implantiert werden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthaltende Protein, insbesondere das humane ADAMTS-1-Protein, die humane ADAMTS-1-Protein-Variation oder das ADAMTS-Protein, mit einem Anteil, der aber nicht besonders begrenzt ist, von 0,0001 bis 99 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 80 Gew.-%, und besonders bevorzugt 0,01 bis 50 Gew.-% enthalten.
Wird die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verwendet, so ist ihre Dosis nicht besonders beschränkt, sondern variiert beispielsweise mit Art der Erkrankung, Alter, Geschlecht, Körpergewicht oder Symptomen des Lebewesens, und dem Verabreichungsverfahren. Das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthaltende Protein, insbesondere das humane ADAMTS-1-Protein, die humane ADAMTS-1-Protein-Variation oder das ADAMTS-Protein, kann oral oder parenteral mit einer Dosis von etwa 0,0001 bis 10 000 µg/kg, vorzugsweise 0,001 bis 1 000 µg/kg, und besonders bevorzugt 0,01 bis 100 µg/kg pro Tag einem Erwachsenen, üblicherweise auf einmal oder auf bis zu vier Dosen aufgeteilt, verabreicht werden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann nicht nur für pharmazeutische, sondern auch für andere Zwecke verwendet werden. D.h., dass das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthaltende Protein, insbesondere das humane ADAMTS-1-Protein, die humane ADAMTS-1-Protein-Variation oder das ADAMTS-Protein, in Form eines funktionellen oder diätetischen Lebensmittels zusammen mit einem herkömmlichen Nahrungsergänzungsmittel verabreicht oder einem Lebensmittel direkt als Nahrungsergänzungsmittel zugesetzt werden kann.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthaltende Protein, insbesondere das humane ADAMTS-1-Protein, die humane ADAMTS-1-Protein-Variation oder das ADAMTS-Protein, und ist somit nützlich als beispielsweise ein Mittel zur Verringerung der Anzahl von Leukocyten und Blutplättchen oder als ein Mittel zur Erhöhung der Anzahl von Erythrocyten.
Es ist allgemein bekannt, dass, wenn eine Entzündung auftritt, Leukocyten im Blut aktiviert werden, sich zur entzündeten Stelle bewegen, sich vermehren und/oder eine Erkrankung verursachen. Deshalb wird angenommen, dass das erfindungsgemäße humane ADAMTS-1-Protein bei der Behandlung verschiedener entzündlicher Erkrankungen wie rheumatische Arthritis, Schuppenflechte, Asthma, Hepatitis, Kawasaki-Syndrom, Gicht, akutes Lungenversagen (ARDS), Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Blutvergiftung oder Nierenentzündung wirksam sein wird. Weiterhin besitzt das erfindungsgemäße humane ADAMTS-1-Protein die Wirkung, die Anzahl von Leukocyten und Blutplättchen zu senken, weshalb es bei der Behandlung der echten Hypervolämie wirksam sein wird. Das erfindungsgemäße humane ADAMTS-1-Protein hat die Wirkung, die Anzahl der Blutplättchen zu senken. Deshalb wird angenommen, dass das erfindungsgemäße humane ADAMTS-1-Protein eine die Thrombose bekämpfende Wirkung hat und bei der Behandlung von Herzinfarkt, Gehirninfarkt oder multiplem Organversagen wirksam sein wird. Das erfindungsgemäße humane ADAMTS-1-Protein hat die Wirkung, dass es die Anzahl der Erythrocyten deutlich erhöht, weshalb es bei der Behandlung der Anämie als Erythropoetin wirksam sein wird.
Wenn Lipopolysaccharid (LPS), eine immunologisch stimulierende Substanz, einer Maus (beispielsweise 10 µg/Maus) verabreicht wird, wird die Exprimierung des Maus-ADAMTS-1-Gens in Herz und Niere überinduziert [J. Biol. Chem., 272, 556-562 (1997)]. Deshalb wird das Maus-ADAMTS-1-Protein möglicherweise eine Schutzfunktion für Herz und Niere nach einer akuten tödlichen Entzündung wie einem Endotoxinschock ausüben.
Thrombospondin (TSP) ist als ein Faktor zur Hemmung der Gefäßbildung, d.h. insbesondere zur Hemmung des Wachstums von Endothelzellen, bekannt [J. Cell. Biol., 111, 765-772 (1990)]. Weiterhin ist mitgeteilt worden, dass Vermehrung und Metastase von Krebszellen durch die Auslösung von TSP in Krebszellen gehemmt werden können [J. Cell. Biol., 111, 765-772 (1990)]. Deshalb wird das humane ADAMTS-1-Protein wahrscheinlich eine Funktion zur Hemmung von Krebs oder Metastasen aufweisen. Ferner ist in einem aktuellen Bericht festgestellt worden, dass TSP oder Disintegrin an der Knochenbildung beteiligt ist [Biochem. Biophy. Res. Commun., 213, 1017-1025 (1995)]. Deshalb könnte das humane ADAMTS-1-Protein für die Behandlung einer Knochenstoffwechselerkrankung wie Osteoporose verwendbar sein.
Die erfindungsgemäße immunologisch reaktive Substanz reagiert spezifisch mit dem die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 enthaltenden Protein, insbesondere dem humanen ADAMTS-1-Protein, der humanen ADAMTS-1-Protein-Variation oder dem ADAMTS-Protein. Die erfindungsgemäße immunologisch reaktive Substanz umfasst beispielsweise einen Antikörper (einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper), Fragmente des Antikörpers wie Fab, Fab', F(ab')₂ oder Fv und ein Antiserum. Die erfindungsgemäße immunologisch reaktive Substanz reagiert spezifisch mit dem humanen ADAMTS-1-Protein, weshalb sie für die immunologische Analyse des humanen ADAMTS-1-Proteins nützlich ist.
Dabei kann der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper durch ein bekanntes Verfahren, beispielsweise das folgende Verfahren, hergestellt werden.
Eine ein Antigen enthaltende physiologische Kochsalzlösung wird mit dem gleichen Volumen von komplettem Freundschem Adjuvans oder unvollständigem Freundschem Adjuvans oder einem Äquivalent davon wie Hunter's TiterMax^TM (Funakoshi, Kat.-Nr. YT001-001, Tokio, Japan) bis zum Emulgieren vermischt. Die erhaltene Emulsion wird subkutan, intraperitoneal, intravenös, intramuskulär oder intradermal einem Säugetier, beispielsweise einer Maus, Ratte, einem Kaninchen oder Hamster, insbesondere einer Maus wie einer BALB/c-Maus, die hinsichtlich Verträglichkeit auf herkömmliche Myelomzellen (Erstimmunisierung) ausgewählt worden ist, verabreicht. Danach wird dieselbe Prozedur in Abständen von zwei bis vier Wochen für einige Immunisierungen wiederholt, und die letzte Immunisierung wird nur unter Verwendung der Antigenlösung durchgeführt. Einige Tage nach der letzten Immunisierung wird die Milz aseptisch entfernt, und es werden Milzzellen hergestellt.
Die erhaltenen Milzzellen werden als Zellfusion verwendet. Die anderen für die Zellfusion verwendeten Stammzellen, d.h. die Myelomzellen, können bekannte Zelllinien sein, wie P3X63-Ag8(X63) [Nature, 256, 495-497 (1975)], P3X63-Rg8U1 (P3U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)] oder P3X63Ag8.653 (ATCC-Hinterlegungs-Nr. CRL-1580).
Die Zellfusion kann durch übliche Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise das Verfahren von Milstein et al. [Methods in Enzymology, 73, 3-47 (1981)]. Die erhaltenen Hybridome werden Säuretieren (beispielsweise Mäusen) verabreicht und die gewünschten monoklonalen Antikörper von Aszites der Säuretiere abgetrennt und aufgereinigt. Das angewendete Trenn- und Reinigungsverfahren kann ein bekanntes Verfahren wie die Dialyse- Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Affinitätssäulenchromatographie unter Verwendung von Protein-A- oder Protein-G-Bindungs-Polysaccharidträger oder einem Anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper-Bindungs-Polysaccharidträger, Dialyse oder Gefriertrocknung sein.
Der erfindungsgemäße polyklonale Antikörper kann durch ein bekanntes Verfahren wie anschließend beschrieben hergestellt werden. D.h. eine ein Antigen enthaltende physiologische Kochsalzlösung wird mit dem gleichen Volumen von komplettem Freundschem Adjuvans oder unvollständigem Freundschem Adjuvans oder einem Äquivalent davon wie Hunter's TiterMax^TM (Funakoshi, Kat.-Nr. YT001-00, Tokio, Japan) bis zum Emulgieren vermischt. Die erhaltene Emulsion wird subkutan, intraperitoneal oder intramuskulär einem Säugetier, beispielsweise einem Kaninchen oder eine Ziege (Erstimmunisierung) verabreicht. Danach wird dieselbe Prozedur in Abständen von zwei bis vier Wochen für einige Immunisierungen wiederholt. Ein oder zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wird der Halsschlagader oder dem Herzen des Säugetiers Blut entnommen und mit Ammoniumsulfat ausgesalzt, um ein Serum herzustellen.
Das erfindungsgemäße Antikörperfragment kann beispielsweise durch Verdauen des erfindungsgemäßen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers mit einer bekannten Protease durch ein herkömmliches Verfahren und anschließendes Isolieren und Auf reinigen durch ein herkömmliches Verfahren hergestellt werden.
Die Herstellung des humanen ADAMTS-1-Proteins wird erleichtert durch eine immunologisch stimulierende Substanz wie LPS, weshalb das humane ADAMTS-1-Protein als Diagnosemarker für einen immunologischen Zustand in einem Verfahren zur extrakorporalen Detektion des immunologischen Zustandes verwendet werden kann. Insbesondere kann das erfindungsgemäße extrakorporale Detektionsverfahren auf eine Probe angewendet werden, die von einem zu untersuchenden Lebewesen entnommen worden ist, um den immunologischen Zustand einer Immunfunktion des Lebewesens nachzuweisen, wenn diese Immunfunktion durch verschiedene Erkrankungen wie eine Entzündung, Krebs, Kachexie wie eine Krebskachexie oder eine mit einer infektiösen Erkrankung verbundene Kachexie, infektiöse Erkrankung oder Leukämie beeinträchtigt ist. Ist die Immunfunktion des Lebewesens normal, kann der der Immunfunktion entsprechende immunologische Zustand nachgewiesen werden.
Die Probe, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist nicht besonders beschränkt, solange es möglich ist, dass sie das humane ADAMTS-1-Protein enthält. Die Probe kann eine biologische Probe sein, die einem Menschen, insbesondere einem Patienten, entnommen worden ist, beispielsweise eine Körperflüssigkeit, Gewebe (beispielsweise Zellen) oder ein Extrakt davon, Blut wie Serum und Plasma, Urin oder Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit. Eine Probe, die für eine herkömmliche klinische Untersuchung genommen wird, kann erfindungsgemäße ohne Einschränkung verwendet werden.
Bei der Analyse des humanen ADAMTS-1-Proteins in der Probe wird diese zunächst mit der gegenüber dem humanen ADAMTS-1-Protein immunologisch reaktiven Substanz in Berührung gebracht. Enthält die Probe kein humanes ADAMTS-1-Protein, findet keine Reaktion mit der immunologisch reaktiven Substanz statt. Enthält die Probe das humane ADAMTS-1-Protein, bindet die immunologisch reaktive Substanz an das humane ADAMTS-1-Protein und es bildet sich ein Komplex aus der immunologisch reaktiven Substanz und dem humanen ADAMTS-1-Protein in einer Menge, die mit derjenigen des in der Probe vorhandenen humanen ADAMTS-1-Proteins korreliert. Der Komplex kann leicht durch ein bekanntes Verfahren detektiert werden, weshalb das Vorhandensein von humanem ADAMTS-1-Protein in der Probe durch Nachweis des Vorhandenseins des Komplexes detektiert oder der Anteil des humanen ADAMTS-1-Proteins in der Probe durch Messen der Menge des Komplexes bestimmt werden kann. Dabei kann das humane ADAMTS-1-Protein in einem Gewebe oder einer Zelle unter Verwendung eines Gewebeschnitts oder einer Zellprobe in einem Fluoreszenz-Antikörper-Verfahren oder einem Enzym-Antikörper-Verfahren gemessen werden.
Die immunologisch reaktive Substanz, die in der Lage ist, mit dem humanen ADAMTS-1-Protein immunologisch zu reagieren, umfasst ein antihumanes ADAMTS-1-Protein-Antiserum, einen antihumanen-polyklonalen ADAMTS-1-Protein-Antikörper, einen antihumanen monoklonalen ADAMTS-1-Protein-Antikörper oder ein Fragment davon. Dabei kann die immunologische reaktive Substanz allein oder in Kombination damit verwendet werden. Das Fragment umfasst beispielsweise Fab, Fab', F(ab')₂ oder Fv.
In dem Verfahren zur immunologischen Analyse des erfindungsgemäßen humanen ADAMTS-1-Proteins wird die Probe mit der immunologisch reaktiven Substanz in Berührung gebracht, die in der Lage ist, mit dem humanen ADAMTS-1-Protein immunologisch zu reagieren, wobei sich ein Komplex aus dem humanen ADAMTS-1-Protein und der immunologisch reaktiven Substanz bildet. Danach wird das humane ADAMTS-1-Protein, das an den Antikörper gebunden ist, detektiert und seine Menge durch ein immunochemisches Verfahren gemessen, wodurch der Gehalt an humanem ADAMTS-1-Protein in der Probe bestimmt wird.
Das immunochemische Verfahren kann prinzipiell beispielsweise ein herkömmlicher Immunoassay, beispielsweise EIA, ELISA und RIA sein. Die immunochemischen Verfahren werden im Allgemeinen wie folgt eingeteilt.
(1) Kompetitiver Assay
Eine Probe, die eine unbekannte Menge von Antigenen und eine gegebene Menge von markierten Antigenen enthält, wird kompetitiv mit einer gegebenen Menge von Antikörpern umgesetzt und anschließend die Wirksamkeit der an die Antikörper gebundenen markierten Antigene oder die Wirksamkeit der nicht an die Antikörper gebundenen markierten Antigene gemessen.
(2) Sandwich-Assay
Eine überschüssige Menge von auf Trägern immobilisierten Antikörpern wird zu einer Probe, die eine unbekannte Menge von Antigenen enthält, zugegeben und umgesetzt (erste Reaktion). Danach wird eine gegebene überschüssige Menge von markierten Antikörpern zugegeben und damit umgesetzt (zweite Reaktion). Die Wirksamkeit der markierten Antikörper auf den Trägern wird gemessen. Alternativ wird die Wirksamkeit der markierten Antikörper, die sich nicht auf den Trägern befinden, gemessen. Erste und zweite Reaktion können zeitgleich oder nacheinander durchgeführt werden.
Wenn das Markierungsmittel ein radioaktives Isotop ist, kann zur Messung ein Loch- oder Szintillationszähler verwendet werden. Ist das Markierungsmittel ein Enzym, kann die Enzymaktivität nach Zugabe eines Substrats und Stehenlassen kolorimetrisch oder fluorimetrisch gemessen werden. Ist das Markierungsmittel eine fluoreszierende oder lumineszierende Substanz, kann ein betreffendes bekanntes Verfahren angewendet werden.
Zusätzlich zu diesen Verfahren wird gegenwärtig ein Western-Blot-Verfahren angewendet, worin der Elektrophorese unterworfene Proteine auf einen Filter wie eine Nitrocellulosemembran übertragen werden und ein Zielprotein mit einem Antikörper detektiert wird. Das Western-Blot-Verfahren kann auch zur Detektion des erfindungsgemäßen humanen ADAMTS-1-Proteins angewendet werden.
Der in diesen Verfahren verwendete Antikörper kann mit einem geeigneten Marker markiert werden. Beispiele dafür sind ein radioaktives Isotop, ein Enzym, eine fluoreszierende oder lumineszierende Substanz in einem bekannten Verfahren zur Markierung von Antikörpern.
Das ratioaktive Isotop kann beispielsweise ¹²⁵I ¹³¹I ³H ¹⁴C oder ³⁵S sein.
Das verwendete Enzym ist vorzugsweise stabil und hat eine hohe spezifische Aktivität. Beispiele für das Enzym sind eine Glycosidase (wie (3-Galactosidase, (3-Glucosidase, β-Glucuronidase, β-Fructosidase, α-Galactosidase, α-Glucosidase oder α-Mannosidase), eine Amylase (wie α-Amylase, (3-Amylase, Isoamylase, Glucoamylase oder Takaamylase), eine Cellulase oder eine Carbohydrase wie Lysozym, eine Urease oder eine Amidase wie Asparaginase, eine Cholinesterase wie Acetylcholinesterase, eine Phosphatase wie eine alkalische Phosphatase, eine Sulfatase, eine Esterase wie eine Lipase, eine Nuclease wie Desoxyribonuclease oder Ribonuclease, ein Eisenporphyrinenzym wie Katalase, Peroxidase oder Cytochromoxidase, ein Kupferenzym wie eine Tyrosinase oder Ascorbatoxidase und eine Dehydrogenase wie eine Alkoholdehydrogenase, Malatdehydrogenase, Lactatdehydrogenase oder Isocitratdehydrogenase.
Die fluoreszierende Substanz kann beispielsweise Fluorescamin oder ein fluoreszierendes Isothiocyanat und die lumineszierende Substanz kann beispielsweise Luminol, ein Luminolderivat, Luciferin oder Lucigenin sein. Das Signal von diesen Markierungen kann durch bekannte Verfahren detektiert werden.
Das Markierungsmittel kann an die Antikörper durch ein beliebiges herkömmliches Verfahren wie das Chloramin-T-Verfahren [Nature, 194, 495-496 (1962)], Periodsäure-Verfahren [Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 22, 1084-1091 (1974)] oder Maleimid-Verfahren [Journal of Biochemistry, 79, 233-236 (1976)] gebunden werden.
Anschließend wird ein EIA-Verfahren als eines der zuvor genannten Messverfahren beschrieben. Zu den ersten antihumanen ADAMTS-1-Protein-Antikörpern, die auf einem Träger (wie einer Assay-Platte) immobilisiert sind, wird eine Probe gegeben, und die antihumanen ADAMTS-1-Protein-Antikörper werden an die humanen ADAMTS-1-Proteine gebunden, um Komplexe zu bilden. Zu diesen Komplexen werden die zweiten antihumanen ADAMTS-1-Protein-Antikörper, die mit einem Enzym (wie Peroxidase) markiert sind, gegeben, um sie mit den Komplexen umzusetzen, um "erste Antikörper/humanes ADAMTS-1-Protein/zweite Antikörper"-Komplexe zu bilden. Zu den resultierenden "erste Antikörper/humanes ADAMTS-1-Protein/zweiter Antikörper"-Komplexen wird ein Substrat für die Enzymmarkierung (wie Peroxidase) zugegeben und der Absorptionsgrad oder Fluoreszenzgrad von Produkten der enzymatischen Reaktion gemessen, wodurch die Enzymaktivitäten der Enzymmarkierungen, die an den "erster Antikörper/humanes ADAMTS-1-Protein/zweiter Antikörper"-Komplexen anhaften, gemessen werden. Dabei wird eine Reihe dieser Vorgänge mit einer Standardlösung, die einen bekannten Anteil an humanem ADAMTS-1-Protein enthält, im Voraus durchgeführt und eine Standardkurve, die auf der Beziehung zwischen dem humanen ADAMTS-1-Protein und dem Absorptionsgrad oder Fluoreszenzgrad beruht, aufgestellt. Danach wird ein Vergleich der Standardkurve mit dem Absorptionsgrad oder Fluoreszenzgrad einer Probe, die einen unbekannten Anteil an humanen ADAMTS-1-Proteinen enthält, durchgeführt und die Menge der humanen ADAMTS-1-Proteine in der Probe gemessen.
Anschließend wird ein weiteres EIA-Verfahren beschrieben. Es wird eine Probe mit einem Träger (wie einer Assay-Platte) in Berührung gebracht, um die humanen ADAMTS-1-Proteine in der Probe auf dem Träger zu immobilisieren. Danach werden die antihumanen ADAMTS-1-Protein-Antikörper (erste Antikörper) hinzugegeben, um Komplexe aus dem humanen ADAMTS-1-Protein und dem ersten Antikörper zu bilden. Zu den Komplexen werden anti-erste-Antikörper-Antikörper (zweite Antikörper), die mit Enzym (wie Peroxidase) markiert sind, zugegeben, um sie mit den Komplexen umzusetzen, um "humanes ADAMTS-1-Protein/erster Antikörper/zweiter Antikörper"-Komplexe zu bilden. Zu den resultierenden "humanes ADAMTS-1-Protein/erster Antikörper/zweiter Antikörper"-Komplexen wird ein Substrat für die Enzymmarkierung (wie Peroxidase) zugegeben und der Absorptionsgrad oder Fluoreszenzgrad von Produkten der enzymatischen Reaktion gemessen, wodurch die enzymatischen Aktivitäten der Enzymmarkierungen, die an den "humanes ADAMTS-1-Protein/erster Antikörper/zweiter Antikörper"-Komplexen befestigt sind, gemessen werden. Es wird eine Reihe dieser Vorgänge im Voraus für eine Standardlösung durchgeführt, die einen bekannten Anteil an dem humanen ADAMTS-1-Protein enthält, und eine Standardkurve, die auf der Beziehung zwischen dem humanen ADAMTS-1-Protein und dem Absorptionsgrad oder Fluoreszenzgrad basiert, aufgestellt. Es wird ein Vergleich zwischen der Standardkurve und dem Absorptionsgrad oder Fluoreszenzgrad für eine Probe durchgeführt, die eine unbekannte Menge an humanen ADAMTS-1-Proteinen enthält, und der Anteil der humanen ADAMTS-1-Proteine in der Probe gemessen.
Weiterhin wird anschließend ein RIA-Verfahren beschrieben. Zu den ersten antihumanen ADAMTS-1-Protein-Antikörpern, die auf einem Träger (wie einem Reagenzglas) immobilisiert sind, wird eine Probe zugegeben, und die antihumanen ADAMTS-1-Protein-Antikörper werden an die humanen ADAMTS-1-Proteine gebunden, um Komplexe zu bilden. Zu den Komplexen werden die zweiten antihumanen ADAMTS-1-Protein-Antikörper gegeben, die mit einem radioaktiven Isotop (wie ¹²⁵I) markiert sind, um sich mit den Komplexen umzusetzen, um "erster Antikörper/humanes ADAMTS-1-Protein/zweiter Antikörper"-Komplexe zu bilden. Die Radioaktivität der resultierenden "erster Antikörper/humanes ADAMTS-1-Protein/zweiter Antikörper"-Komplexe wird gemessen. Es wird eine Reihe dieser Vorgänge im Voraus mit einer Standardlösung durchgeführt, die einen bekannten Anteil an dem humanen ADAMTS-1-Protein enthält, und eine Standardkurve, die auf der Beziehung zwischen dem humanen ADAMTS-1-Protein und der Radioaktivität basiert, aufgestellt. Zwischen Standardkurve und Radioaktivität einer Probe, die einen unbekannten Anteil an den humanen ADAMTS-1-Proteinen enthält, wird ein Vergleich durchgeführt und der Anteil der humanen ADAMTS-1-Proteine in der Probe gemessen.
Anschließend wird ein weiteres RIA-Verfahren beschrieben. Eine Probe wird mit einem Träger (wie einem Reagenzglas) in Berührung gebracht, um die humanen ADAMTS-1-Proteine in der Probe auf dem Träger zu immobilisieren. Danach werden die antihumanen ADAMTS-1-Protein-Antikörper (ersten Antikörper) zugegeben, um Komplexe aus dem humanen ADAMTS-1-Protein und dem ersten Antikörper zu bilden. Zu den Komplexen werden anti-erste Antikörper-Antikörper (zweite Antikörper), die mit einem radioaktiven Isotop (wie ¹²⁵I) markiert sind, zugegeben, um sie mit den Komplexen umzusetzen, um "humanes ADAMTS-1-Protein/erster Antikörper/zweiter Antikörper"-Komplexe zu bilden. Die Radioaktivität der resultierenden "humanes ADAMTS-1-Protein/erster Antikörper/zweiter Antikörper"-Komplexe wird gemessen. Es wird eine Reihe dieser Vorgänge im Voraus mit einer Standardlösung durchgeführt, die einen bekannten Anteil an dem humanen ADAMTS-1-Protein enthält, und eine Standardkurve aufgestellt, die auf der Beziehung zwischen dem humanen ADAMTS-1-Protein und der Radioaktivität basiert. Zwischen der Standardkurve und der Radioaktivität einer Probe, die einen unbekannten Anteil der humanen ADAMTS-1-Proteine enthält, wird ein Vergleich durchgeführt und die Menge der humanen ADAMTS-1-Proteine in der Probe gemessen.
Bei dem Verfahren zur Analyse der mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins in einer Probe wird diese mit einem Polynucleotid umgesetzt, das eine Basensequenz enthält, die zu derjenigen der mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins komplementär ist, und der resultierende Komplex aus der mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins und dem Polynucleotid detektiert oder die Menge des Komplexes gemessen, um dadurch die mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins zu bestimmen.
Das Polynucleotid enthält eine Sequenz, die komplementär oder im Wesentlichen komplementär zu derjenigen eines Teils der mRNA ist, die von einem ausgewählten Gen (DNA) transkribiert wird, und bildet so einen Doppelstrang mit der vom Ziel-Gen transkribierten mRNA. Dabei wird angenommen, dass ein beliebiges Polynucleotid, das ausreichend komplementär ist, um einen stabilen Komplex mit einer Ziel-mRNA zu bilden, verwendet werden kann. Das Polynucleotid, das in der Lage ist, erfindungsgemäß verwendet zu werden, kann im Wesentlichen zu einer beliebigen Region in einer Ziel-mRNA komplementär sein. Dabei kann das Polynucleotid als eine DNA-Sonde zum Detektieren von Zu- oder Abnahme der Exprimierung der mRNA verwendet werden, die für das humane ADAMTS-1-Protein-Gen spezifisch ist. Das heißt, das Polynucleotid wird spezifisch an der mRNA des humanen ADAMTS-1-Ziel-Proteins befestigt und bildet einen molekularen Hybriden, wodurch der Exprimierungsgrad des humanen ADAMTS-1-Proteins in den Zellen detektiert werden kann.
Das Polynucleotid, das in der Lage ist, erfindungsgemäß verwendet zu werden, kann durch geeignete Auswahl einer Basensequenz, die komplementär zu einer bestimmten Basensequenz der mRNA des humanen ADAMTS-1-Ziel-Proteins ist, unter Verwendung eines bekannten DNA-Synthesators, eines bekannten PCR-Geräts oder einer Gen-KloNierung hergestellt werden. Es können verschieden lange Polynucleotide verwendet werden, wobei jedoch ein Polynucleotid mit 10 oder mehr Basen bevorzugt und mit 17 oder mehr Basen besonders bevorzugt ist.
Das Polynucleotid kann ein unmodifiziertes Polynucleotid oder ein Polynucleotidanaloges sein. Ein geeignetes Analoges kann beispielsweise ein Ethyl- oder Methylphosphat-Analoges oder ein phosphorothioatiertes Polydesoxynucleotid sein [Nucleic Acids Res., 14, 9081-9093 (1986), J. Am. Chem. Soc., 106, 6077-6079 (1984)], wobei eine aktuelle Verbesserung der Produktion von Polynucleotidanalogen, beispielsweise ein 2'-O-Methylribonucleotid [Nucleic Acids Res., 15, 6131-6148 (1987)] oder ein konjugiertes RNA-DNA-Analoges, d.h. ein Chimärenpolynucleotid [FEBS Lett., 215, 327-330 (1987)], verwendet werden kann.
Das ausgewählte Polynucleotid kann von beliebiger Art sein, beispielsweise kann es elektrisch geladen oder ungeladen sein. Das Polynucleotid kann mit einem bekannten Markierungsmittel wie einem radioaktiven Isotop oder einer fluoreszierenden Substanz durch ein herkömmliches Verfahren markiert werden, sodass der zuvor beschriebene Versuch in vitro oder in vivo durchgeführt werden kann. Das radioaktive Isotop kann beispielsweise ¹²⁵I ¹³¹I ³H ¹⁴C ³²P oder ³⁵S sein. Von diesen radioaktiven Isotopen ist es bevorzugt, das Polynucleotid mit ³²P durch ein randomprimer-Verfahren zu markieren [Anal. Biochem., 132, 6-13 (1983)]. Weiterhin kann ein ein Derivat bildender fluoreszierender Farbstoff als Markierungsmittel verwendet werden, da dadurch eine leichte Handhabung mit einem niedrigen Risikofaktor gewährleistet wird. Als fluoreszierender Farbstoff kann ein beliebiger Farbstoff verwendet werden, der in der Lage ist, an das Polynucleotid zu binden. So kann beispielsweise Fluorescein, Rhodamin, Texasrot, 4-Fluor-7-nitrobenzofurazan (NBD), Cumarin, Fluorescamin, Succinylfluorescein oder Dansyl vorzugsweise verwendet werden.
Die Menge einer mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins kann durch ein Northern-Blot-Verfahren unter Verwendung von cDNA des humanen ADAMTS-1-Proteins wie folgt gemessen werden: Die mRNA wird aus einer somatischen Zelle oder einem somatischen Gewebe extrahiert und isoliert und die isolierte mRNA einer Elektrophorese auf Agarosegel unterworfen und auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran übertragen und anschließend mit einer markierten humanen ADAMTS-1-Protein-cDNA-Sonde umgesetzt, um die Menge der mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins zu messen. Die verwendete humane ADAMTS-1-Protein-cDNA-Sonde ist eine DNA, die zu der humanen ADAMTS-1-Protein-mRNA komplementär ist und vorzugsweise 17 oder mehr Basen besitzt.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Analyse eines immunologischen Zustands enthält als Hauptbestandteil die immunologisch reaktive Substanz, die in der Lage ist, mit dem humanen ADAMTS-1-Protein immunologisch zu reagieren. Die immunologisch reaktive Substanz, die in der Lage ist, mit dem humanen ADAMTS-1-Protein immunologisch zu reagieren, kann beispielsweise ein antihumanes ADAMTS-1-Protein-Antiserum, ein antihumaner polyklonaler ADAMTS-1-Protein-Antikörper, ein antihumaner monoklonaler ADAMTS-1-Protein-Antikörper oder ein Fragment der Antikörper sein.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Analyse eines immunologischen Zustandes kann anstelle der immunologisch reaktiven Substanz als Hauptbestandteil das Polynucleotid umfassen, das die Basensequenz enthält, die zu derjenigen einer mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins komplementär ist.
Das humane ADAMTS-1-Protein per se oder eine mRNA des humanen ADAMTS-1-Proteins in einer Probe kann entsprechend den zuvor beschriebenen Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels zur Analyse eines immunologischen Zustandes analysiert werden, wobei der immunologische Zustand eines zu untersuchenden Lebewesens, dessen Immunfunktion von einer Erkrankung beeinträchtigt ist, aus dem Ergebnis beurteilt werden kann.
BEISPIELE
Die Erfindung wird anschließend anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1: Isolation der humanen ADAMTS-1-cDNA und Bestimmung ihrer Basensequenz
Als Primer für ein PCR-Verfahren wurden eine DNA [anschließend als "Vorwärtsprimer (1)" bezeichnet] mit der Basensequenz (d.h. der Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 4: AGAACCTGTG GTGGTGGAGT TCAATACACA), die einer Aminosäuresequenz entspricht (d.h. der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 3: Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Tyr Thr), die in der ersten Thrombospondin(TSP)-Domäne ab dem N-Terminus von den drei TSP-Domänen des Maus-ADAMTS-1-Proteins enthalten ist [J. Biol. Chem., 272, 556-562 (1997)], und eine DNA [anschließend als "Rückwärtsprimer (1)" bezeichnet] mit der Basensequenz (d.h. der Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 5: CCTCTTAACT GCACTGTGTC AGTGTGCAAA AG), die zu der Basensequenz, die für die Aminosäuresequenz im C-Terminus des Maus-ADAMTS-1-Proteins codiert, und der Basensequenz in den benachbarten Regionen (d.h. den Regionen stromaufwärts und stromabwärts vom C-Terminus) komplementär ist, chemisch synthetisiert.
Zu 99 µl einer Lösung, die 0,5 µM Vorwärtsprimer (1), 0,5 µM Rückwärtsprimer (1), 0,5 Einheit Taq-Polymerase (Ex-Taq-Polymerase, Takarashuzo, Kyoto, Japan) und 40 µM 4dNTP in einem PCR-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl] (Ex Taq-Puffer, Takarashuzo, Kyoto, Japan) enthielt, wurde 1 µl einer Menschennieren-cDNA-Bibliothek (Marathon-Ready cDNA, Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA, USA) als Templat-DNA gegeben. Bei einer Annealingtemperatur, die niedriger als diejenige war, die bei einem Standard-PCR-Verfahren angewendet wird, wurde ein F'CR-Verfahren durchgeführt. D.h. die PCR wurde durch Wiederholung eines Zyklus, der aus einer 30 Sekunden langen Denaturierung bei 94 °C, einem 30 Sekunden langen Annealinq bei 50 °C und einer zwei Minuten langen DNA-Synthese bei 72 °C bestand, d.h. 40 Mal, durchgeführt.
Aus dem erhaltenen Reaktionsgemisch wurde eine Probe (5 µl) entnommen und auf 1 % Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen. Wie in 1 gezeigt, wurde eine einzelne DNA-Bande von 1,2 Kb beobachtet. Der Rest des Reaktionsgemischs wurde einer Elektrophorese unterworfen und das DNA-Fragment mit 1,2 Kb (anschließend mitunter auch als "Flag.-1-DNA-Fragment" bezeichnet) von einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gewonnen. Danach wurde das Flag.-1-DNA-Fragment in einen pCR^TM-2.1-Vektor (Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA) kloniert.
Ein Teil (303 Bp) der Basensequenz des klonierten Flag.-1-DNA-Fragments wurde in einem automatischen DNA-Sequenzierer (DSQ1000, Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) bestimmt. Es wurde eine Homologie-Suche zwischen der Teilbasensequenz des klonierten Flag.-1-DNA-Fragments und der Basensequenz des Maus-ADAMTS-1 durchgeführt, wonach herausgefunden wurde, dass die Homologie der Basensequenzen 77,4 % betrug. Die Teilbasensequenz des Flag.-1-DNA-Fragments und eine Teilbasensequenz des Maus--ADAMTS-1-Gens mit einer Homologie dazu sind in 2 gezeigt. Dabei bedeutet das Symbol ":" in 2, dass eine Base im Flag.-1-DNA-Fragment mit der entsprechenden Base im Maus-ADAMTS-1-Gen identisch ist.
Weiterhin wurde eine Dot-Hybridisierung [Biochemistry, 16, 4743-4749 (1977)] durchgeführt, um festzustellen, dass eine Maus-ADAMTS-1-cDNA, die mit ³²P durch einen random primed DNA-labeling kit (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) markiert war, mit dem Flag.-1-DNA-Fragment hybridisiert war. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Ein pCR^TM-2.1-Vektor als Kontrolle wurde nicht mit der ³²P-markierten Maus-ADAMTS-1-cDNA hybridisiert, während die Maus-ADAMTS-1-cDNA und das Flag.-1-DNA-Fragment mit der ³²P-markierten Maus-ADAMTS-1-cDNA hybridisiert wurden.
Die Ergebnisse der Homologie-Suche und der Dot-Hybridisierung bedeuten, dass das Flag.-1-DNA-Fragment ein Teil des humanen ADAMTS-1 ist.
Um ein DNA-Fragment stromaufwärts von dem Flag.-1-DNA-Fragment zu erhalten, wurde eine schnelle Amplifizierung von cDNA-Enden (RACE) unter Verwendung eines Marathon cDNA Amplification kit (Clontech Lab., Inc., Palo Alto, CA, USA) wie folgt durchgeführt. Ein Rückwärtsprimer für die Basensequenz des Flag.-1-DNA-Fragments, ein DNA-Primer (anschließend mitunter auch als "GSP-1-Primer" bezeichnet) mit der Basensequenz (d.h. der Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 6: CCTCTTAACT GCACTGTGTC AGT), die komplementär zu der Basensequenz der 3'-Ende-Region des Flag.-1-DNA-Fragments war, und ein DNA-Primer (anschließend mitunter auch als "GSP-2-Primer" bezeichnet) mit der Basensequenz (d.h. der Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 7: CAGGCCCACT CCCAAAGGAA GCTT), die komplementär zu der Basenfrequenz der 5'-Ende-Region des Flag.-1-DNA-Fragments war, wurden chemisch synthetisiert. Als Vorwärtsprimer wurden ein AP1-Primer und ein AP2-Primer, die an dem zuvor beschriebenen Kit befestigt worden waren, verwendet. Der AP1-Primer hatte die Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 8: CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC und der AP2-Primer hatte die Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 9: ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC.
Nachdem 5 µl einer Menschennieren-cDNA-Bibliothek (Marathon-Ready cDNA, Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA, USA), 1 µl des AP1-Primers, 1 µl von 10 µM GSP-1-Primer, 1 µl einer Taq-Polymerase (0,5 Einheit, Ex-Taq-Polymerase), 1 µl eines Anti-Taq-Polymerase-Antikörpers (Taq Start Antibody, Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA, USA), 5 µl eines PCR-Puffers mit der 10fachen Konzentration [100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 500 mM KCl] (Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA, USA) und 36 µl destilliertes Wasser vermischt worden waren, wurde eine PCR durchgeführt. Die PCR wurde durchgeführt, indem ein Zyklus, der aus einer 30 Sekunden langen Stufe bei 94 °C und einer 4 Minuten langen Stufe bei 68 °C bestand, 35 Mal wiederholt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde auf das 50fache mit 10 mM Tricin-EDTA-Puffer (Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA, USA) verdünnt.
Danach wurden 5 µl der verdünnten Flüssigkeit, 1 µl eines AP2-Primers, 1 µl eines 10-µM-GSP-2-Primers, 1 µl einer Taq-Polymerase (0,5 Einheit, Ex-Taq-Polymerase), 1 µl eines Anti-Taq-Polymerase-Antikörpers (Taq Start Antibody), 5 µl einesPCR-Puffers mit der 10fachen Konzentration (Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA, USA) und 36 µl destilliertes Wasser vermischt, wonach eine PCR durchgeführt wurde. Die PCR wurde durchgeführt, indem ein Zyklus, der aus einer 30 Sekunden langen Stufe bei 94 °C und einer 4 Minuten langen Stufe bei 68 °C bestand, 20 Mal wiederholt wurde.
Es wurde eine Probe (5 µl) von dem erhaltenen Reaktionsgemisch entnommen und auf 1-%-Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen. Wie in 4 gezeigt, wurde eine einzelne DNA-Bande mit etwa 1,2 Kb beobachtet. Das DNA-Fragment (anschließend mitunter auch als "Flag.-2-DNA-Fragment" bezeichnet) wurde in einen pCR^TM-2.1-Vektor durch ein herkömmliches Verfahren kloniert und die Basensequenz des Flag.-2-DNA-Fragments mit voller Länge durch eine Dye Terminator Cycle Sequencing method (Perkin Elmer Japan, Urayasu, Japan) bestimmt.
Weiterhin wurde die Basensequenz mit voller Länge des Flag.-1-DNA-Fragments durch die Dye Terminator Cycle Sequencing method (Perkin Elmer Japan, Urayasu, Japan) bestimmt. Aus den erhaltenen Basensequenzen von Flag.-1-DNA-Fragment und Flag.-2-DNA-Fragment wurde die Basensequenz der humanen ADAMTS-1-cDNA mit voller Länge bestimmt. Die Basensequenz mit voller Länge (2 184 Bp, einschließlich eines Stop-Codons) ist in SEQ ID Nr. 2 gezeigt, und die Aminosäuresequenz (727 Aminosäurereste) des humanen ADAMTS-1-Proteins, die von dieser Basensequenz abgeleitet ist, ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Die Teilbasensequenz des Flag.-1-DNA-Fragments, wie in 2 gezeigt, enthält einige Basen, die nicht identisch sind mit der Basensequenz mit voller Länge der humanen ADAMTS-1-cDNA (SEQ ID Nr. 2). Jedoch war die Teilbasensequenz, wie in 2 gezeigt, eine Zwischensequenz, die in dem Verfahren zur Bestimmung der Basensequenz erhalten wurde. Die Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 2 ist die korrekte Basensequenz der humanen ADAMTS-1-cDNA, die am Ende bestimmt wurde.
Das humane ADAMTS-1-Protein ist reich an Cystein und enthält viele basische Aminosäuren wie Lysin und Arginin in der C-terminalen Region und zwei N-Glycosylierungsstellen (die 307. bis 309. Aminosäure und die 524. bis 526. Aminosäure).
Die Homologie zwischen den Basensequenzen des humanen ADAMTS-1-Gens und des Maus-ADAMTS-1-Gens ist in den 5 bis 9 gezeigt, und die Homologie in den Aminosäuresequenzen, die von den Basensequenzen abgeleitet wurden, ist in den 10 bis 12 gezeigt.
Dabei bedeutet in den 5 bis 9 das Symbol "*", dass eine Base des humanen ADAMTS-1-Gens mit der entsprechenden Base des Maus-ADAMTS-1-Gens identisch ist.
In den 10 bis 12 bedeutet das Symbol "*", dass ein Aminosäurerest des humanen ADAMTS-1-Proteins identisch ist mit dem entsprechenden Aminosäurerest des Maus-ADAMTS-1-Proteins. In den 10 bis 12 bedeutet "MMP-Domäne" eine Matrix-Metalloproteinase-Domäne, die Linie zwischen der 11. und der 12. Aminosäure zeigt die Startstelle der Matrix-Metalloproteinase-Domäne an, "DI-Domäne" bedeutet die Disintegrin-Domäne, die Linie zwischen der 234. und der 235. Aminosäure zeigt die Startstelle der Disintegrin-Domäne an, "TSP-Domäne" bedeutet die Thrombospondin-Domäne und die Aminosäuresequenzen in Kästchen (es kommen drei vor) bedeuten die Thrombospondin-Domäne.
Die Homologie der Basensequenzen zwischen dem humanen ADAMTS-1 und dem Maus-ADAMTS-1 betrug 85,5 % und diejenige der Aminosäuresequenzen 90,1 %. Die Ergebnisse zeigen, dass das ADAMTS-1 das Protein ist, von welchem zwischen Maus und Menschen sich die Sequenzen erhalten haben.
Beispiel 2: Herstellung des humanen ADAMTS-1-Fusionsproteins in E. coli
(1) Konstruktion eines Expressionsvektors für E. coli
Um eine SmaI-Stelle auf der 5'-Seite und eine NotI-Stelle auf der 3'-Seite in die DNA einzuführen, die für eine Teilregion stromabwärts von der MMP-Domäne in dem humanen ADAMTS-1-Protein mit voller Länge codiert, wurden ein Vorwärtsprimer (2) mit der Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 10: CACCCCGGGA GGAAGAAGCG ATTTGTGTCC AGCCCCCGTT ATG und ein Rückwärtsprimer (2) mit der Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 11: GTGGCGGCCG CCCTCTTAAC TGCACTGTGT CAGTGTGCAA AA chemisch synthetisiert.
Nachdem 5 µl des Vorwärtsprimers (2), 5 µl des Rückwärtsprimers (2), 1 µl einer Menschennieren-cDNA-Bibliothek (Marathon-Ready cDNA, Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA, USA), 1 µl einer Taq Polymerase (0,5 Einheit, Ex-Taq-Polymerase), 1 µl eines Anti-Taq-Polymerase-Antikörpers (Taq Start Antibody, Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA, USA), 10 µl eines PCR-Puffers mit der 10fachen Konzentration (Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA, USA), 8 µl eines 2,5 mM 4dNTP (Takarashuzo, Kyoto, Japan) und 69 µl destilliertes Wasser vermischt worden waren, wurde eine PCR durchgeführt. Diese wurde durchgeführt, indem ein Zyklus, der aus einer 1 Minute langen Stufe bei 94 °C, einer 45 Sekunden langen Stufe bei 55 °C und einer 2 Sekunden langen Stufe bei 72 °C bestand, 40 Mal wiederholt wurde.
Es wurde eine Probe (5 µl) von dem resultierenden Reaktionsgemisch entnommen und auf 1-%-Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen. Wie in 13 gezeigt, wurde eine einzelne DNA-Bande mit etwa 2,2 Kb erhalten. Das DNA-Fragment mit etwa 2,2 Kb wurde durch ein herkömmliches Verfahren in den pCR^TM-2.1-Vektor kloniert und eine große Menge der Plasmide produziert [Nucleic Acids Res., 9, 2989-2998 (1981)]. Die im großen Maßstab hergestellten Plasmide wurden mit den Restriktionsenzymen SmaI (Takarashuzo, Kyoto, Japan) und NotI (Takarashuzo, Kyoto, Japan) behandelt, um ein DNA-Fragment mit etwa 2,2 Kb zu erhalten. Das DNA-Fragment mit etwa 2,2 Kb wurde in die SmaI-NotI-Stelle eines Expressionsvektors für E. coli pGEX-5X-1 [Infect Immun., 58, 3909-3913 (1990)] (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) kloniert. Das resultierende Expressionsplasmid wurde als pG/ADAMTS-1 bezeichnet. Die Struktur von Plasmid pg/ADAMTS-1 ist schematisch in 14 dargestellt. Es wird angenommen, dass das ADAMTS-1-Protein in Form eines Fusionsproteins (Molekulargewicht = etwa 96 Kd) mit einer Glutathion-S-Transferase (anschließend mitunter auch als "GST" bezeichnet) (Molekulargewicht = etwa 26 Kd) exprimiert wird. In 14 bedeuten "Ort" den Replikationsursprung "Amp^R" ein Ampicillin-Resistenzgen und "laq Iq" einen laq-Repressor.
(2) Exprimierung des GST-humanen ADAMTS-1-Fusionsproteins in E. coli
Das Plasmid pG/ADAMTS-1 wurde in einen E.-coli-BL-21-Stamm mit niedriger Proteaseaktivität (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) durch ein herkömmliches Verfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110-2114 (1972)] eingeführt. E.coli-Klone, die das Plasmid enthielten, wurden als Ampicillin-resistente Stämme isoliert. Fünf Ampicillinresistente Stämme (anschließend als "Klon Nr. 1" bis "Klon Nr. 5" bezeichnet), die zufällig aus den Stämmen ausgewählt worden waren, wurden verwendet, um 2 ml 2xYT-Medium (hergestellt durch Lösen von 16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt und 5 g NaCl in 1 Liter destilliertem Wasser, pH 7,2) zu beimpfen, und über Nacht bei 37 °C kultiviert. Danach wurde ein Satz aus zwei Reagenzgläsern, die 1 800 µl eines LB-Kulturmediums enthielten, das Ampicillin (100 µ/ml) enthielt, für jeden Klon hergestellt. In jeweils ein Reagenzglas wurden 200 µl der über Nacht stehen gelassenen Kultur gefüllt. Danach wurde nach 2 Stunden langem Inkubieren bei 37 °C 20 µl (Endkonzentration = 1,0 mM) Isopropyl-(3-D-thiogalactopyranosid (IPTG) (Takarashuzo, Tokyo, Japan), ein Expressionsauslöser, zu einem der zwei Reagenzgläser gegeben. Danach wurden die Reagenzgläser 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Der Expressionsauslöser wurde nicht in das andere Reagenzglas gegeben, das als Kontrolle verwendet wurde.
Durch Zentrifugieren (14 000 U/min, 1 Minute) von 1 ml Kultur unter Verwendung einer Mikrozentrifuge wurden die Mikroorganismen geerntet und anschließend in 100 µl einer phosphatgepufferten Lösung (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ , 1, 8 mM KH₂PO₄ , pH 7 , 2 , anschließend als PBS bezeichnet) suspendiert und danach in 100 µl eines 2xProbe-Puffers (0,25 M Tris-HCl, 2 % SDS, 3 % Glycerin, 10 % (3-Mercaptoethanol, 0,01 % Bromphenolblau, pH 6,8) gelöst. Die erhaltene Lösung (10 µl) wurde einer Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel unterworfen (anschließend mitunter auch als "SDS-PAGE" bezeichnet) und die Auslösung der Exprimierung des gewünschten Proteins durch ein Coomassie-Anfärbeverfahren bestätigt.
Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt, worin "+"-Spuren die Ergebnisse der Elektrophorese von E. coli, die mit dem Expressionsauslöser IPTG inkubiert worden war, und "-"-Spuren die Ergebnisse der Elektrophorese von E. coli, die ohne den Expressionsauslöser IPTG inkubiert worden war, zeigen. In jeder "+"-Spur wurde ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 100 Kd beobachtet. Dies ist identisch mit dem erwarteten Molekulargewicht des GSThumanen ADAMTS-1-Fusionsproteins, d.h. etwa 96 Kd. In den "-"-Spuren wurden jedoch kein solches Protein beobachtet.
Von den fünf Klonen ("Klon Nr. 1" bis "Klon Nr. 5") zeigte der Klon Nr. 2 die höchste Exprimierung, weshalb er in den folgenden Beispielen verwendet wurde.
(3) Extraktion und Isolation des GST-humanen ADAMTS-1-Fusionsproteins
Nach Inkubation über Nacht wurde 1 ml der Kultur des Klons Nr. 2 zu 100 ml eines 2xYT-Kulturmediums, das 100 µ/ml Ampicillin enthielt, zugegeben und bei 37 °C inkubiert. Nachdem der Absorptionsgrad bei 600 nm etwa 0,5 erreicht hatte, wurde 1 ml von 100 mM IPTG zu der Kultur zugegeben und das Inkubieren 2 Stunden lang fortgesetzt.
E. coli wurde durch Zentrifugieren (3 000 U/min, 30 Minuten) von der Kultur geerntet und in 8 ml PBS suspendiert. Zu der Suspension wurden 1 ml 0,5 M EDTA-Lösung und 1 ml 25 mg/ml Lysozym-Lösung zugegeben, und das Ganze wurde auf Eis 30 Minuten lang stehen gelassen. Nachdem 110 µl Triton X-100 zugegeben worden waren, wurden die Mikroorganismen auf Eis durch ein Ultraschallgerät (TAITEC, Koshigaya, Japan) aufgerissen. Die Flüssigkeit nach dem Aufreißen wurde zentrifugiert (8 000 U/min, 4 °C, 10 Minuten) und danach das erhaltene Präzipitat in 30 ml PBS, die 1,0 % Triton X-100 enthielt, suspendiert und anschließend zentrifugiert (8 000 U/min, 4 °C, 10 Minuten).
Das erhaltene Präzipitat wurde in 2 ml einer 10 mM EDTA-Lösung suspendiert, wonach 50 ml eines 50 mM Tris-HCl-Puffers (pH 8,5), der 8 M Harnstoff und 1 % Mercaptoethanol enthielt, zugegeben wurden. Nach gründlichem Durchmischen wurde das Gemisch zentrifugiert (15 000 U/min, 4 °C, 5 Minuten). Der erhaltene Überstand wurde gegen 5 Liter eines 10 mM Tris-HCl-Puffers (pH 8,5) bei 4 °C dialysiert.
Die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert (15 000 U/min, 4 °C, 5 Minuten) und der erhaltene Überstand durch Anionenchromatographie (Econo-Pac High Q, Bio-Rad Lab., Hercules, CA, USA) adsorbiert. Fraktionen, die mit 0,2 bis 0,4 M NaCl eluiert worden waren, wurden gegen 3 Liter PBS dialysiert und anschließend an 1 ml Glutathion-Sepharose 4B (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) [Nucleic Acids Res., 9, 2989-2998 (1981)] adsorbiert.
Die Glutathion-Sepharose 4B wurde mit 50 ml PBS gewaschen und anschließend mit 8 ml 10 mM Glutathion-Lösung eluiert [Nucleic Acids Res., 9, 2989-2998 (1981)]. Fraktionen, die eine hohe GST-Aktivität zeigten, die durch einen GST-Detektierkit (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) nachgewiesen worden war, wurden zusammengefasst.
Ein Teil der Fraktionen wurde einer SDS-PAGE unterworfen, und es wurde eine Coomassie-Anfärbung durchgeführt. Wie in 16 gezeigt, wurde ein GST-humanes ADAMTS-1-Fusionsprotein aus dem Molekulargewicht bestätigt. Das gewünschte Protein (etwa 1 µg) wurde extrahiert und aus 100 ml E.-coli-Kultur auf gereinigt.
Das resultierende Fusionsprotein enthält eine Stelle, die mit einem Faktor Xa oder dergleichen zwischen der GST und dem humanen ADAMTS-1-Protein aufgebrochen werden kann, weshalb das humane ADAMTS-1-Protein durch Verdauen des Fusionsproteins mit Proteinase erhalten werden kann. Das humane ADAMTS-1-Protein kann als Antigen zur Herstellung eines Antikörpers verwendet werden.
Beispiel 3: Untersuchung des Einflusses des GST-humanen ADAMTS-1-Fusionsproteins auf blutbildende Funktionen
Zur Untersuchung der Wirkungen des GST-humanen ADAMTS-1-Fusionsproteins auf blutbildende Funktionen wurde eine Produktion des GST-humanen ADAMTS-1-Fusionsproteins entsprechend dem in Beispiel 2 (3) beschriebenen Verfahren im großen Maßstab durchgeführt und etwa 30 µg des gewünschten Proteins aus 3 Litern E.-coli-Kultur erhalten.
Die Funktionen, von denen angenommen wird, dass sie die Anzahl der Blutzellen beeinflussen, wie die Wirkungen auf blutbildende Funktionen, wurden durch eine einzelne Dosierung des GST-humanen ADAMTS-1-Fusionsproteins in die Schwanzvene einer Maus untersucht. Die Untersuchung kann mit einer kleinen Menge des betreffenden Proteins durchgeführt werden und ermöglicht eine schnelle Beurteilung der biologischen Wirkung. In einem Kontrollversuch wurde ein GST-Protein verwendet, das durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren aus E. coli, die mit einem Vektor pGEX-5X-1 transformiert worden war, extrahiert und auf gereinigt worden war.
Das GST-humane ADAMTS-1-Fusionsprotein (1 µg) wurde acht C57BL/6N-Mäusen (Charles river Japan, Yokohama, Japan) (männlich, 7 Wochen alt) in die Schwanzvene verabreicht. Die Anzahl der Leukocyten, Erythrocyten und Blutplättchen wurde 3 Stunden und 24 Stunden nach Verabreichung gezählt. Im Kontrollversuch wurde das GST-Protein (1 µg) acht C57BL/6N-Mäusen (Charles river Japan, Yokohama, Japan) (männlich, 7 Wochen alt) in die Schwanzvene verabreicht. Die Anzahl der Leukocyten, Erythrocyten und Blutplättchen wurde 3 Stunden und 24 Stunden nach Verabreichung gezählt.
Die Ergebnisse sind in 17 gezeigt. Dieser ist zu entnehmen, dass bei den Mäusen, denen das GST-humane ADAMTS-1-Fusionsprotein verabreicht worden war, verglichen mit den Kontrollversuchen, die Anzahl der Leukocyten und Blutplättchen signifikant abgenommen und die Anzahl der Erythrocyten signifikant zugenommen hatte.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Durch das erfindungsgemäße Protein können blutbildende Funktionen kontrolliert werden, so kann beispielsweise die Anzahl der Leukocyten und Blutplättchen gesenkt und gleichzeitig die Anzahl der Erythrocyten erhöht werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Ein Protein, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 enthält.
Ein Gen, das die Basensequenz, die das Protein nach Anspruch 1 codiert, enthält.
Ein Vektor, der das Gen nach Anspruch 2 enthält.
Ein Transfomator, der durch den Vektor nach Anspruch 3 transformiert wurde.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein umfasst, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 und einen in pharmazeutischer oder veterinärmedizinischer Hinsicht geeigneten Träger enthält. Die Verwendung von (1) einem Protein, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 enthält, oder (2) einer Variation mit einer zu diesem Protein gleichwertigen Funktionalität, welche die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 enthält, wobei diese Variation eine Aminosäuresequenz aufweist, worin eine oder mehrere Aminosäuren entfernt wurden, verändert wurden oder in die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 eingebracht wurden und welche Aktivitäten eines menschlichen ADAMTS-1 Proteins zeigt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von einer entzündlichen Krankheit, echter Hypervolämie, Herzinfarkt, Hirninfarkt, mehrfachem Organversagen oder Anämie.
Ein Nahrungsmittelzusatz, umfassend ein Protein, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 enthält.
Eine immunologisch wirksame Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass sie für das Protein nach Anspruch 1 eine spezifische Reaktivität aufweist.
Ein Verfahren zur immunologischen Analyse eines menschlichen ADAMTS-1 Proteins, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 enthält, worin eine Probe in Kontakt mit einer immunologisch wirksamen Substanz gebracht wird, die eine spezifische Reaktivität gegenüber diesem menschlichen ADAMTS-1 Protein aufweist, und ein Komplex dieses menschlichen ADAMTS-1 Proteins und diese immunologisch wirksame Substanz nachgewiesen werden.
Ein Verfahren zur Analyse einer mRNA eines menschlichen ADAMTS-1 Proteins, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 enthält, worin eine Probe in Kontakt mit einem Polynukleotid gebracht wird, das eine zu dieser mRNA dieses menschlichen ADAMTS-1 Proteins komplementäre Basensequenz enthält, und ein Komplex dieser mRNA des menschlichen ADAMTS-1 Proteins und dieses Polynukleotid nachgewiesen wird.