DE60029624T2

DE60029624T2 - Homologe enzyme der humanen heparanase sowie alternative spleissformen davon

Info

Publication number: DE60029624T2
Application number: DE60029624T
Authority: DE
Inventors: Alexander Edward MCKENZIE; Craig Alasdair STAMPS; Alexander Jonathan TERRETT; Louise Kerry TYSON
Original assignee: UCB SA
Current assignee: UCB SA
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: EP1240313B1; US20090246201A1; WO2001046392A3; DK1240313T3; CA2393855A1; ATE334194T1; AU2207801A; ES2269211T3; IL149889A0; US7273744B2; JP2003517835A; US20030083254A1; EP1240313A2; WO2001046392A2; DE60029624D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Heparanase-ähnliche Proteine sowie diese codierende Nukleotide.
Bei der Heparanase handelt es sich um ein Enzym, das Heparansulfat ebenso wie Heparin-Proteoglykane (HPG) und Heparansulfat-Proteoglykane (HSPG) abbauen kann. Die Heparanaseaktivität in Säugerzellen ist allgemein bekannt. Die Aktivität konnte in verschiedenen Melanomzellen (Nakajima, et al., Cancer Letters 31: 277–283, 1986), Säuger-Adenokarzinomzellen (Parish, et al., Int. J. Cancer, 40: 511–518, 1987), Leukämiezellen (Yahalom, et al., Leukemia Research 12: 711–717, 1988), Prostatakarzinomzellen (Kosir, et al., J. Surg. Res. 67: 98–105, 1997), Mastzellen (Ogren und Lindahl, J. Biol. Chem. 250: 2690–2697, 1975), Makrophagen (Savion, et al., J. Cell. Physiol. 130: 85–92, 1987), mononukleären Zellen (Sewell, et al., Biochem. J. 264: 777–783, 1989), Neutrophilen (Matzner, et al., 51: 519–524, 1992), T-Zellen (Vettel et al., Eur. J. Immunol. 21: 2247–2251, 1991), Blutplättchen (Haimovitz-Friedman, et al., Blood 78: 789–796, 1991), Endothelzellen (Godder, et al., J. Cell Physiol. 148: 274–280, 1991) sowie Plazenta-(Klein und von Figura, BBRC 73: 569, 1976) und B-Zellen identifiziert werden.
Eine erhöhte Heparanaseaktivität ist in mobilen, invasiven Zellen, wie beispielsweise metastatischen Tumorzellen, dokumentiert. Dazu gehören beispielsweise invasives Melanom (Nakajima et al. Science 220: 611 (1983)), Lymphom (Vlodavsky et al., Cancer Res. 43: 2704, (1983)), Fibrosarkom (Becker et al., J. Natl. Cancer Inst., 77: 417, (1986)), Rhabdomyosarkom (US-Patent Nr. 4,882,318), Mastozytom, Säuger-Adeno-karzinom, Leukämie und rheumatoide Fibroblasten. Heparanaseaktivität ist auch in nichtpathologischen Situationen, an denen die Wanderung von Lymphozyten, Neutrophilen, Makrophagen, Eosinophilen und Blutplättchen beteiligt ist, dokumentiert (Vlodavsky et al., Invasion Metasta sis 12: 112–127, 1992). Ebenso wird Heparanaseaktivität mit Entzündung (Hoogewerf J. Biol. Chem. 270: 3268–3277 (1995); WO97/11684), Wundheilung (Whitelock et al., J. Biol. Chem. 271: 10079–10086, (1996)), Angiogenese (US-Patent Nr. 5,567,417), entzündlichen Erkrankungen, wie z. B. Arthritis (einschließlich rheumatoider und Osteoarthritis), Asthma, Lupus erythematodes, Allotransplantaten, ebenso wie vaskulärer Restenose, Atherosklerose, Tumorwachstum und -progression, fibroproliferativen Erkrankungen, Morbus Alzheimer (McBubbin et al. Biochem. J. 256: 775–783 (1999); Snow et al., Neuron 12: 219–234 (1996)) und mehreren anderen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht. Allgemein läßt sich sagen, daß Heparanaseaktivität in mobilen invasiven Zellen bei verschiedenen pathologischen Zuständen vorhanden ist. Somit sind Heparanaseinhibitoren wahrscheinlich von großem Wert bei der Behandlung dieser Zustände.
Ferner würde die Hemmung des Heparansulfatabbaus die Freisetzung gebundener Wachstumsfaktoren und anderer Modifikatoren biologischer Reaktionen hemmen, die, falls freigesetzt, das Wachstum benachbarter Gewebe fördern und für eine unterstützende Umgebung für das Zellwachstum sorgen würden (Rapraeger et al., Science 252: 1705–1708, 1991).
WO99/11798, WO99/21975, WO99/40207 und WO99/43830 betreffen jeweils menschliche Heparanase codierende Nukleinsäuren ebenso wie von den Nukleinsäuren codierte Polypeptide.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung wurde ein menschliches Heparanase-ähnliches Protein identifiziert, das in wenigstens drei Spleißvarianten vorliegt.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid bereitgestellt, das

a) die in 1 (SEQ ID Nr. 2) dargestellte Aminosäuresequenz, beginnend mit dem Rest 1 oder dem Rest 11, umfaßt;
b) die in 2 (SEQ ID Nr. 4) dargestellte Aminosäuresequenz, beginnend mit dem Rest 1 oder dem Rest 11, umfaßt;
c) die in 3 (SEQ ID Nr. 6) dargestellte Aminosäuresequenz, beginnend mit dem Rest 1 oder dem Rest 11, umfaßt;
d) ein wenigstens 40 Aminosäuren langes Derivat mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen relativ zu einer Substanz mit der unter a), b) oder c) oben angegebenen Bedeutung ist, wobei das Derivat wenigstens 80% Identität zu einer Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist; oder
e) ein wenigstens 40 Aminosäuren langes Fragment eines Polypeptids mit der unter a), b) oder c) oben angegebenen Bedeutung oder ein wenigstens 50 Aminosäuren langes Fragment eines Polypeptids mit der unter d) oben angegebenen Bedeutung ist.

Von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung wurde ein menschliches Homolog der Heparanase gefunden, das in drei Spleißvarianten vorliegt. Dabei besteht eine beträchtliche Homologie zwischen den Spleißvarianten und der veröffentlichten Sequenz für menschliche Heparanase, wobei die erfindungsgemäßen Peptide eine für ein Heparanase-Enzym typische biochemische Aktivität zeigen können. Die neuartigen Polypeptide der vorliegenden Erfindung können eine zur Heparanaseaktivität ähnliche Aktivität zeigen. Alternativ oder zusätzlich kann das Homolog die Aktivität der endogenen Heparanaseaktivität modulieren (z. B. indem es heparanbindende Domänenfragmente aufweist).
Kurze Beschreibung der Figuren
In 1 sind die Nukleotidsequenz sowie vorhergesagte Aminosäuresequenz der größten Spleißvariante des Heparanase-ähnlichen Proteins der vorliegenden Erfindung, einschließlich 600 Nukleotiden des 5'-UTR und 260 Nukleotiden des 3'-UTR, dargestellt. Dabei ist das Spleißexon in fett gedruckter und unterstrichener Form dargestellt und die vermutliche Initiatorsequenz unterstrichen;
In 2 sind die Nukleotidsequenz sowie vorhergesagte Aminosäuresequenz der mittelgroßen Spleißvariante des Heparanase-ähnlichen Proteins der vorliegenden Erfindung, einschließlich 600 Nukleotiden des 5'-UTR und 260 Nukleotiden des 3'-UTR, dargestellt. Das Spleißexon ist in fett gedruckter und unterstrichener Form dargestellt;
In 3 sind die Nukleotidsequenz sowie vorhergesagte Aminosäuresequenz der kleinsten Spleißvariante des Heparanase-ähnlichen Proteins der vorliegenden Erfindung, einschließlich 600 Nukleotiden des 5'-UTR und 260 Nukleotiden des 3'-UTR, dargestellt. Bei den in kursiv dargestellten Nukleotiden handelt es sich um die neun zur Verlängerung der Sequenz verwendeten PCR-Primer: Für jeden Bereich sind jeweils zwei PCR-Primer dargestellt: hepa-vorwärts (F) oder -rückwärts (R)-Primer;
In 4 ist eine vergleichende Gegenüberstellung des veröffentlichten Heparanaseproteins ("heparanase") mit der kürzesten Spleißvariante des Heparanase-ähnlichen Proteins der vorliegenden Erfindung ("novel") dargestellt. dabei ist die translatierte Proteinsequenz gezeigt. * = Identität, : = stark ähnlich. . = schwach ähnlich und – = eingeführte Abstandshalter, um die beste Anpassung zu gestatten.
In 5 ist die zur Identifizierung der Heparanase-ähnlichen Proteine der vorliegenden Erfindung verwendete allgemeine Strategie dargestellt;
In 6 ist die Homologie zwischen den Sequenzen der Heparanase-ähnlichen Proteine der vorliegenden Erfindung und der Sequenz der menschlichen Heparanase dargestellt;
Bei 7 handelt es sich um einen Graphen, der die Expression von mRNA relativ zu cDNA für das Heparanase-ähnliche Protein der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Normal- und Tumorgeweben sowie Zellinien zeigt; und
In 8a ist eine vergleichende Gegenüberstellung der Aminosäuresequenz der Maus-Heparanase-ähnlichen Teilsequenz mit einem Teil der langen Form des menschlichen Heparanase-ähnlichen Proteins der vorliegenden Erfindung dargestellt. Identitäten sind dabei in Fettdruck gezeigt. In 8b ist eine vergleichende Gegenüberstellung der Nukleotidsequenz der Maus-Heparanase-ähnlichen Sequenz mit einem Teil der langen Form des menschlichen Heparanase-ähnlichen Proteins der vorliegenden Erfindung dargestellt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Proteine oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden als Hpa2 oder mit Hpa2 verwandte Proteine bezeichnet. Dabei bezieht sich Hpa2 auf ein Protein mit der Aminosäuresequenz in 1, 2 bzw. 3 (Seq. ID Nr. 2, 4 bzw. 6), beginnend mit dem Rest 1, 2, 11 oder 12. Bei mit Hpa2 verwandten Proteinen handelt es sich um Hpa2-Derivate, einschließlich Analogen, Orthologen und Homologen, Hpa2-Fusionsproteine, -Fragmente, -Isoformen, -Varianten oder um Fragmente eines der zuvor genannten Moleküle.
Der Fachmann ist in der Lage, zu bestimmen, ob ein beliebiges gegebenes Polypeptid die Aktivität einer Heparanase aufweist oder nicht, indem er beispielsweise einen beliebigen bekannten Test auf Heparanaseaktivität verwendet. Von Haimovitz-Friedman et al. (Blood 78: 789–796, 1991) wird ein Test auf Heparanaseaktivität beschrieben, bei dem Endothelzellen in radioaktiv markiertem ³⁵SO₄ kultiviert werden, so daß radioaktiv markierte Heparansulfat-Proteoglykane produziert werden. Die Zellen werden abgetrennt, so daß die extrazelluläre abgeschiedene Matrix übrig bleibt, die das ³⁵S-HSPG enthält, und nach Zugabe der putativen Heparanase wird Aktivität nachgewiesen, indem der Überstand von der radioaktiv markierten extrazellulären Matrix über eine Gelfiltrationssäule geleitet wird. Dabei deuten Änderungen in der Größe des radioaktiv markierten Materials darauf hin, daß ein HSPG-Abbau stattgefunden hat. Ein alternativer Test ist bei Nakajima et al. (Anal. Biochem. 196: 162–171, 1986) beschrieben. Bei diesem Test wird auf Melanom-Heparanaseaktivität getestet, indem Heparansulfat aus Rinderlunge mit [¹⁴C]-Acetanhydrid radioaktiv markiert wird. Freie Aminogruppen des [¹⁴C]-Heparansulfats werden acetyliert und die reduzierenden Enden aminiert. Das [¹⁴C]-Heparansulfat wird chemisch über die eingeführten Amingruppen an den reduzierenden Enden an einen Agaroseträger gekoppelt, wodurch ein Festphasensubstrat bereitgestellt wird. Ein indirekter Test auf Heparanaseaktivität nutzt die Fähigkeit von Heparin, die Farbentwicklung zwischen einem Protein und dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue zu stören (Khan & Newman, Anal. Biochem, 196: 373–376, 1991). Die Heparanaseaktivität wird dabei über den Verlust dieser Störung nachgewiesen. Ebenso ist in der WO99/43830 ein Test auf Heparanaseaktivität beschrieben.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in jeder beliebigen geeigneten Form vorliegen. Dabei können sie isoliert oder rekombinant oder an andere Gruppierungen fusioniert sein. Sie können in weitgehend reiner Form bereitgestellt werden. Somit kann ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung in einer Zusammensetzung bereitgestellt werden, in der es als Hauptbestandteil vorliegt (d. h. es liegt auf einem Niveau von wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 75%, wenigstens 90% oder wenigstens 95% vor, wobei die Bestimmung auf Gewichtsprozentgrundlage unter Ausschluß von Lösungsmitteln oder Trägern erfolgt).
Das HPa2- oder mit HPa2 verwandte Protein der vorliegenden Erfindung kann in Form von zwei Polypeptidketten existieren, von denen die eine genau oder ungefähr die Aminoterminalen 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13 kD des Vollängen-Hpa2- oder mit Hpa2 verwandten Proteins und die zweite Kette den verbliebenen Carboxyterminus des Proteins bildet. Gegebenenfalls können aus der zweiten, carboxyterminalen Polypeptidkette genau oder ungefähr 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 kD ihres Aminoterminus entfernt sein. Die beiden Polypeptidketten können getrennt oder von einem einzigen Transkript aus produziert werden. Werden sie von einem einzigen Transkript aus produziert, so wird das erhaltene Vollängen-Polypeptid weiter unter Erhalt der beiden Polypeptide prozessiert.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung sollen im Rahmen von a)–e) oben liegende Polypeptide nun ausführlicher erörtert werden.
Polypeptide im Rahmen von a), b) oder c)
Ein Polypeptid im Rahmen von a), b) oder c) kann aus der jeweiligen, in 1, 2 bzw. 3 angegebenen Aminosäuresequenz (Seq. ID Nr. 2, 4 bzw. 6) bestehen oder kann eine zusätzliche N-terminale und/oder eine zusätzliche C-terminale Aminosäuresequenz relativ zur in 1, 2 bzw. 3 angegebenen Sequenz (Seq. ID Nr. 2, 4 bzw. 6) aufweisen.
Der Begriff "Fusionsprotein", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Polypeptid, das (i) eine Aminosäuresequenz von Hpa2 oder eines mit Hpa2 verwandten Polypeptids sowie (ii) eine Aminosäuresequenz eines heterologen Polypeptids (d. h. eines Nicht-Hpa2-Polypeptids, eines nicht mit Hpa2 verwandten Polypeptids) umfaßt.
Zusätzliche N-terminale oder C-terminale Sequenzen können aus verschiedenen Gründen bereitgestellt werden. Die Techniken zur Bereitstellung derartiger Sequenzen sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Zusätzliche Sequenzen können bereitgestellt werden, um die Eigenschaften eines bestimmten Polypeptids zu verändern. Dies kann bei der Verbesserung der Expression oder Regulation der Expression in bestimmten Expressionssystemen sinnvoll sein. So kann beispielsweise eine zusätzliche Sequenz für einen gewissen Schutz gegen proteolytische Spaltung sorgen. Dies wurde für das Hormon Somatostatin durchgeführt, indem dieses an seinen N-Terminus mit einem Teil des β-Galactosidase-Enzyms fusioniert wurde (Itakwa et al., Science 198: 105–63 (1977)).
Zusätzliche Sequenzen können auch bei der Veränderung der Eigenschaften eines Polypeptids zur Hilfe bei der Identifizierung oder Reinigung sinnvoll sein. So kann beispielsweise ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, bei dem ein Polypeptid mit einer Gruppierung, die über Affinitätschromatographie isoliert werden kann, verknüpft ist. Bei der Gruppierung kann es sich um ein Antigen oder ein Epitop handeln, wobei die Affinitätssäule immobilisierte Antikörper oder immobilisierte Antikörperfragmente umfassen kann, die an das Antigen bzw. Epitop (wünschenswerterweise mit einem hohen Grad an Spezifität) binden. Das Fusionsprotein läßt sich üblicherweise von der Säule durch Zugabe eines entsprechenden Puffers eluieren.
Zusätzliche N-terminale oder C-terminale Sequenzen können allerdings einfach als Ergebnis einer bestimmten, zur Erhaltung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung verwendeten Technik vorhanden sein und brauchen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung keine besondere vorteilhafte Eigenschaft zu verleihen. Ein derartiges Polypeptid liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Gleichgültig, welche zusätzliche N-terminale oder C-terminale Sequenz vorhanden ist, ist es bevorzugt, daß das sich ergebende Polypeptid wenigstens einen wesentlichen Anteil der Aktivität des Polypeptids mit der in 1, 2 bzw. 3 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq. ID Nr. 2, 4 bzw. 6) aufweist. Der Begriff "wenigstens einen wesentlichen Anteil der Aktivität", wie er hier verwendet wird, bedeutet dabei wenigstens 50% der Aktivität einer gegebenen Substanz (vorzugsweise wenigstens 75% der Aktivität, stärker bevorzugt wenigstens 90% der Aktivität und am stärksten bevorzugt das gleiche oder ein größeres Aktivitätsniveau).
Ebenso liegen Isoformen im Rahmen von a), b) und c). Der Begriff "Isoform", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Varianten eines Polypeptids, die vom gleichen Gen codiert werden, die sich jedoch in ihrem pI-Wert oder MW oder in beiden Werten unterscheiden. Solche Isoformen können sich in ihrer Aminosäurezusammensetzung unterscheiden (z. B. als Ergebnis einer alternativen mRNA oder Prä-mRNA-Prozessierung, z. B. eines alternativen Spleißens oder einer limitierten Proteolyse) und können darüber hinaus oder als Alternative aus einer differentiellen posttranslationalen Modifikation (z. B. Glycosylierung, Acylierung, Phosphorylierung) hervorgehen.
Polypeptide im Rahmen von d)
Indem wir uns nun den in d) oben definierten Polypeptiden zuwenden, ist dem Fachmann ersichtlich, daß es sich bei diesen Polypeptiden um Analoge, Homologe, Orthologe und Varianten des in a), b) oder c) oben angegebenen Polypeptids handelt. Derartige Polypeptide können gegebenenfalls wenigstens einen wesentlichen Anteil der Aktivität des Polypeptids mit der in 1, 2 bzw. 3 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq. ID Nr. 2, 4 bzw. 6) aufweisen.
Der Begriff "Hpa2-Analog", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine ähnliche oder identische Funktion bzw. ähnliche oder identische Funktionen wie Hpa2 besitzt, aber nicht notwendigerweise eine Aminosäuresequenz zu umfassen braucht, die zur Aminosäuresequenz von Hpa2 ähnlich oder damit identisch ist, oder eine Struktur besitzt, die zu der von Hpa2 ähnlich oder damit identisch ist. Wie hier verwendet, ist eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids zu der von Hpa2 "ähnlich", wenn sie dem folgenden Kriterium genügt: das Polypeptid weist eine Aminosäuresequenz von wenigstens 40 Aminosäureresten, wenigstens 50 Aminosäureresten, wenigstens 60 Aminosäureresten, wenigstens 70 Aminosäureresten, wenigstens 80 Aminosäureresten, wenigstens 90 Aminosäureresten, wenigstens 100 Aminosäureresten, wenigstens 125 Aminosäureresten oder wenigstens 150 Aminosäureresten auf, die zu wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95% oder wenigstens 99% mit einer Aminosäuresequenz von Hpa2 identisch ist. Wie hier verwendet, bezieht sich ein Polypeptid mit einer "ähnlichen Struktur" zu der von Hpa2 auf ein Polypeptid, das eine ähnliche Sekundär-, Tertiär- oder Quartärstruktur wie die von Hpa2 aufweist. Dabei läßt sich die Struktur eines Polypeptids mit dem Fachmann bekannten Verfahren, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Röntgenkristallographie, Kernmagnetresonanz und kristallographischer Elektronenmikroskopie, bestimmen.
Der Begriff "Homolog", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine ähnliche Aminosäuresequenz wie die von Hpa2 umfaßt, jedoch nicht notwendigerweise eine ähnliche oder identische Funktion wie Hpa2 besitzt.
Der Begriff "Ortholog", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein nichtmenschliches Polypeptid, das (i) eine ähnliche Aminosäuresequenz wie die von Hpa2 umfaßt und (ii) eine ähnliche oder identische Funktion wie die von Hpa2 besitzt.
Die prozentuale Identität zweier Aminosäuresequenzen oder zweier Nukleinsäuresequenzen wird durch eine vergleichende Gegenüberstellung der Sequenzen für optimale Vergleichszwecke (z. B. können in die erste Sequenz für die beste Gegenüberstellung mit dieser Sequenz Lücken eingeführt werden) und Vergleichen der Aminosäurereste bzw. Nukleotide an entsprechenden Positionen bestimmt. Bei der "besten Gegenüberstellung" handelt es sich um eine Gegenüberstellung zweier Sequenzen, die zur höchsten prozentualen Identität führt. Die prozentuale Identität wird durch die Anzahl identischer Aminosäurereste bzw. Nukleotide in den miteinander verglichenen Sequenzen bestimmt (d. h. % Identität = Anzahl identischer Positionen/Gesamtanzahl der Positionen × 100).
Die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen läßt sich unter Verwendung eines dem Fachmann bekannten mathematischen Algorithmus bewerkstelligen. Ein Beispiel für einen mathematischen Algorithmus zum Vergleich zweier Sequenzen ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264–2268, modifiziert wie bei Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877. In die Programme NBLAST und XBLAST von Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410 wurde ein solcher Algorithmus eingebaut. Um zu einem erfindungsgemäßen Nukleinsäure molekül homologe Nukleotidsequenzen zu erhalten, lassen sich BLAST-Nukleotidsuchvorgänge mit dem Programm NBLAST, Score [Trefferzahl] = 100, Wordlength [Wortlänge] = 12, durchführen. Um zu einem erfindungsgemäßen Proteinmolekül homologe Aminosäuresequenzen zu erhalten, lassen sich BLAST-Proteinsuchvorgänge mit dem Programm XBLAST, Score = 50, Wordlength = 3, durchführen. Um Gegenüberstellungen mit Lücken für Vergleichszwecke zu erhalten, läßt sich das Programm Gapped BLAST nutzen, wie bei Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 beschrieben. Als Alternative kann zur Durchführung einer Suche mit Iteratin, bei der entfernte Verwandtschaften zwischen Molekülen nachgewiesen werden, das Programm PSI-Blast eingesetzt werden. Bei Nutzung der Programme BLAST, Gapped BLAST und PSI-Blast können die voreingestellten Parameter der jeweiligen Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Ein weiteres Beispiel für den Vergleich von Sequenzen mit mathematischem Algorithmus stellt der Algorithmus von Myers und Miller, CABIOS (1989), dar. In das Programm ALIGN (Version 2.0), das Teil des CGC-Softwarepakets zur Sequenzgegenüberstellung ist, ist ein solcher Algorithmus eingebaut. Weitere im Fachgebit bekannte Algorithmen zur Sequenzanalyse umfassen ADVANCE und ADAM, wie bei Torellis und Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10: 3–5, beschrieben; sowie FASTA, beschrieben bei Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444–8. In FASTA handelt es sich bei ktup um eine Kontrolloption, mit der die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Suche eingestellt wird.
Die vorliegende Erfindung richtet sich ebenso auf Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide innerhalb der oben ausführlich dargestellten Sequenzbeschränkungen. Solche Varianten weisen eine veränderte Aminosäuresequenz auf und können entweder als Agonisten (Mimetika) oder Antagonisten fungieren. Varianten lassen sich durch Mutagenese, z. B. diskrete Punktmutation oder Verkürzung, erzeugen. Dabei können bei einem Agonisten weitgehend die gleichen oder eine Teilmenge der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Proteins erhalten sein. Ein Antagonist eines Proteins kann eine oder mehrere der Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Proteins beispielsweise durch kompetitive Bindung an ein nachgeschaltetes oder vorgeschaltetes Mitglied einer zellulären Signalkaskade, die das interessierende Protein umfaßt, hemmen. Somit lassen sich durch Behandlung mit einer Variante mit beschränkter Funktion spezifische biologische Effekte hervorrufen. Die Behandlung eines Individuums mit einer Variante, die eine Teilmenge der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Proteins aufweist, kann in einem Individuum gegenüber der Behandlung mit der natürlich vorkommenden Form des Proteins weniger Nebenwirkungen haben.
Varianten eines erfindungsgemäßen Proteins, wie hier beschrieben, die entweder als Agonisten (Mimetika) oder als Antagonisten fungieren, lassen sich durch ein Screening kombinatorischer Bibliotheken von Mutanten, z. B. Verkürzungsmutanten, des erfindungsgemäßen Proteins auf Agonisten oder Antagonistenaktivität identifizieren. In einer Ausführungsform wird dabei eine variegierte Variantenbibliothek durch kombinatorische Mutagenese auf der Nukleinsäureebene erzeugt und von einer variegierten Genbibliothek codiert. Eine variegierte Variantenbibliothek läßt sich herstellen, indem man beispielsweise ein Gemisch synthetischer Oligonukleotide enzymatisch in Gensequenzen ligiert, so daß ein degenerierter Satz potentieller Proteinsequenzen in Form individueller Polypeptide oder alternativ in Form eines Satzes größerer Fusionsproteine (z. B. für Phagen-Display) exprimierbar ist. Dabei gibt es verschiedene Verfahren, die zur Herstellung von Bibliotheken potentieller Varianten der erfindungsgemäßen Polpeptide aus einer degenerierten Oligonukleotidse quenz verwendet werden können. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477).
Darüber hinaus lassen sich Bibliotheken von Fragmenten der codierenden Sequenz eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wie hier beschrieben, zur Erzeugung einer variierten Population von Polypeptiden zum Screening und zur nachfolgenden Selektion von Varianten einsetzen. So läßt sich beispielsweise eine Bibliothek codierender Sequenzfragmente durch Behandlung eines doppelsträngigen PCR-Fragments der interessierenden codierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, bei denen nur etwa einmal pro Molekül ein "Nicking" stattfindet, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, die Sense/Antisense-Paare aus unterschiedlichen "genickten" Produkten enthalten kann, Abtrennung von Einzelstranganteilen von wiedergebildeten Duplexen durch Behandlung mit S1-Nuklease und Ligieren der erhaltenen Fragmentbibliothek in einem Expressionsvektor erzeugen. Mit diesem Verfahren läßt sich eine Expressionsbibliothek herleiten, die für verschieden große N-terminale und interne Fragmente des interessierenden Proteins codiert.
Zum Screening von Genprodukten von durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellten kombinatorischen Bibliotheken sowie zum Screening von cDNA-Bibliotheken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft sind im Fachgebiet mehrere Techniken bekannt. Zu den am weitesten verbreiteten für das Screening großer Genbibliotheken verwendeten Techniken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz zugänglich sind, gehören die Klonierung der Genbibliothek in replizierbare Expressionsvektoren, das Transformieren entsprechender Zellen mit der erhaltenen Bibliothek von Vektoren sowie das Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, bei denen der Nachweis einer gewünschten Aktivität die Isolierung des für das Gen, dessen Produkt nachgewiesen wurde, codierenden Vektors erleichtert. REM (Recursive Ensemble Mutagenesis), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Bibliotheken erhöht, läßt sich zusammen mit den Screening-Tests zur Identifizierung von Varianten eines erfindungsgemäßen Proteins einsetzen (Arkin und Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811–7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327–331).
Es können Veränderungen in der Aminosäuresequenz eines Proteins auftreten, die die Funktion eines Proteins nicht beeinflussen. Dazu gehören Aminosäuredeletionen, -insertionen und -substitutionen, wobei diese Veränderungen durch alternatives Spleißen und/oder das Vorhandensein mehrerer Translationsstartstellen und -stoppstellen verursacht werden können. Dabei können als Ergebnis der Untreue des Translationsvorgangs Polymorphismen entstehen. Somit können Änderungen der Aminosäuresequenz toleriert werden, die die Funktion des Proteins nicht beeinflussen.
Dem Fachmann ist ersichtlich, daß an der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das eine bestimmte Aktivität besitzt, oftmals verschiedene Änderungen vorgenommen werden können, um Varianten (die gelegentlich als "Muteine" bekannt sind) zu produzieren, die wenigstens einen Anteil der Aktivität und vorzugsweise einen wesentlichen Anteil der Aktivität aufweisen. Derartige Varianten der in a), b) und c) oben beschriebenen Polypeptide liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung und werden nachfolgend ausführlicher erörtert. Dazu gehören allelische und nichtallelische Varianten.
Ein Beispiel für eine Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid mit der in a), b) oder c) oben angegebenen Bedeutung bis auf die Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren mit einer oder mehreren anderen Aminosäuren. Dem Fachmann ist dabei bewußt, daß verschiedene Aminosäuren ähnliche Eigenschaften aufweisen. Eine oder mehrere derartige Aminosäuren einer Substanz lassen sich häufig durch eine oder mehrere andere derartige Aminosäuren substituieren, ohne daß dabei eine gewünschte Aktivität dieser Substanz beseitigt wird.
Somit lassen sich die Aminosäuren Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin häufig gegeneinander austauschen (Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten). Unter diesen möglichen Substitutionen ist die Verwendung von Glycin und Alanin zur gegenseitigen Substitution (aufgrund ihrer relativ kurzen Seitenketten) sowie die Verwendung von Valin, Leucin und Isoleucin zur gegenseitigen Substitution (aufgrund ihrer größeren aliphatischen Seitenketten, die hydrophobisch sind) bevorzugt.
Zu weiteren Aminosäuren, die sich häufig gegeneinander austauschen lassen, gehören:

– Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan (Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten);
– Lysin, Arginin und Histidin (Aminosäuren mit basischen Seitenketten);
– Aspartat und Glutamat (Aminosäuren mit sauren Seitenketten);
– Asparagin und Glutamin (Aminosäuren mit Amidseitenketten); und
– Cystein und Methionin (Aminosäuren mit schwefelhaltigen Seitenketten).

Substitutionen dieser Art werden häufig als "konservative" oder "semi-konservative" Aminosäuresubstitutionen bezeichnet.
Ebenso können Aminosäuredeletionen oder -insertionen im Zusammenhang mit der in a), b) oder c) oben angegebenen Aminosäuresequenz durchgeführt werden. Somit können beispielsweise Aminosäuren, die keinen wesentlichen Effekt auf die Aktivität des Polypeptids haben oder die zumindest eine solche Aktivität nicht beseitigen, deletiert werden. Derartige Deletionen können vorteilhaft sein, da die Gesamtmenge und das Molekulargewicht eines Polypeptids unter Beibehaltung von Aktivität verringert werden können. Dadurch ist es möglich, die Menge an für einen bestimmten Zweck benötigtem Polypeptid zu verringern – beispielsweise lassen sich Dosierungsniveaus reduzieren.
Ebenso können Aminosäureinsertionen im Zusammenhang mit der in a), b) oder c) oben angegebenen Aminosäuresequenz durchgeführt werden. Dies kann zur Veränderung der Eigenschaften eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung erfolgen (z. B. zur Unterstützung bei der Identifizierung, Reinigung oder Expression, wie oben in Verbindung mit Fusionsproteinen erläutert).
Aminosäureänderungen im Zusammenhang mit der in a), b) oder c) oben angegebenen Sequenz lassen sich unter Verwendung einer beliebigen geeigneten Technik, beispielsweise durch Verwendung stellengerichteter Mutagenese, durchführen.
Dabei sollte ersichtlich sein, daß Aminosäuresubstitutionen oder -insertionen im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung natürlich vorkommender oder nicht natürlich vorkommender Aminosäuren durchgeführt werden können. Dabei ist es bevorzugt, daß lediglich L-Aminosäuren vorliegen, gleichgültig ob natürliche oder synthetische Aminosäuren verwendet werden.
Welche Aminosäureänderungen auch immer durchgeführt werden (ob mittels Substitution, Insertion oder Deletion), bevorzugte Polypeptide der vorliegenden Erfin dung weisen wenigstens 50% Sequenzidentität mit einem Polypeptid mit der in a), b) oder c) oben angegebenen Bedeutung auf, wobei der Sequenzidentitätsgrad stärker bevorzugt wenigstens 75% beträgt. Am stärksten bevorzugt sind Sequenzidentitäten von wenigstens 90% oder wenigstens 95%.
Der Begriff Identität läßt sich zur Beschreibung der Ähnlichkeit zwischen zwei Polypeptidsequenzen verwenden. Der Grad der Aminosäuresequenzidentität läßt sich mit einem Programm, wie z. B. "bestfit" (Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482–489 (1981)), berechnen, um das Segment mit der größten Ähnlichkeit zwischen zwei beliebigen Sequenzen zu finden. Die vergleichende Gegenüberstellung beruht auf der Maximierung des unter Verwendung einer Martrix von Aminosäureähnlichkeiten, wie z. B. der bei Schwarz und Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. O., Hrsg. S. 353–358 beschriebenen, erzielten "Score" [Punktwert].
Ein im Fachgebiet allgemein bekanntes Softwarepaket zur Durchführung dieses Verfahrens ist das Programm CLUSTAL. Dabei werden die Aminosäuresequenzen von zwei Polypeptiden verglichen und die optimale Gegenüberstellung durch das Einfügen von Abstandhaltern in einer der beiden Sequenzen je nach Gegebenheit ermittelt. Die Aminosäureidentität oder -ähnlichkeit (Identität plus Konservierung des Aminosäuretyps) für eine optimale Gegenüberstellung läßt sich auch unter Verwendung eines Softwarepakets, wie z. B. BLASTx berechnen. Dieses Programm führt eine vergleichende Gegenüberstellung des größten Abschnitts mit ähnlicher Sequenz durch und versieht die Anpassung mit einem Wert. Dabei können mehrere Ähnlichkeitsbereiche jeweils mit unterschiedlichem Score für jeden Vergleich von Mustern gefunden werden. Dem Fachmann ist ersichtlich, daß zwei Polypeptide unterschiedlicher Länge über die Gesamtlänge des längeren Fragments verglichen werden können. Als Alternative können kleine Bereiche verglichen werden. Zur Durchführung eines sinnvollen Vergleichs werden in der Regel Sequenzen der gleichen Länge verglichen.
Sind hohe Sequenzidentitätsgrade vorhanden, so gibt es relativ wenige Unterschiede in der Aminosäuresequenz. So können beispielsweise weniger als 20, weniger als 10 oder sogar weniger als 5 Unterschiede vorliegen.
Polypeptide im Rahmen von e)
Wie oben erörtert, ist es häufig vorteilhaft, die Länge eines Polypeptids zu reduzieren, vorausgesetzt, daß das dabei erhaltene Polypeptid mit reduzierter Länge noch eine gewünschte Aktivität aufweist oder zur Produktion geeigneter Antikörper führen kann. Das Merkmal e) der vorliegenden Erfindung deckt daher Fragmente der obigen Polypeptide a), b), c) oder d) ab.
Der Begriff "Fragment", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Peptid oder Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz von wenigstens 40 Aminosäureresten mit Bezug auf in a)–c) definierte Polypeptide, wenigstens 50 Aminosäurereste mit Bezug auf in d) definierte Polypeptide, oder wenigstens 60 Aminosäurereste, wenigstens 70 Aminosäurereste, wenigstens 80 Aminosäurereste, wenigstens 90 Aminosäurereste, wenigstens 100 Aminosäurereste, wenigstens 125 Aminosäurereste, wenigstens 150 Aminosäurereste, wenigstens 175 Aminosäurereste, wenigstens 200 Aminosäurereste oder wenigstens 250 Aminosäurereste) der Aminosäuresequenz eines zweiten Polypeptids. Dabei kann das Fragment von Hpa2 oder eines mit Hpa verwandten Peptids gegebenenfalls eine funktionelle Hpa2-Aktivität besitzen.
Der Fachmann kann unter Verwendung der oben offenbarten Techniken bestimmen, ob ein bestimmtes Fragment Aktivität aufweist oder nicht. Dabei weisen bevorzugte Fragmente eine Länge von wenigstens 10 Aminosäuren auf. Sie können wenigstens 20, wenigstens 50 oder wenigstens 100 Aminosäuren lang sein.
In einer Ausführungsform wird ein Protein, umfassend die in 1, 2 bzw. 3 dargestellte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2, 4 bzw. 6), beginnend entweder mit dem Rest 2 oder dem Rest 12, bereitgestellt.
In einer weiteren Ausführungsformen werden Polypeptide bereitgestellt, die mit dem Aminosäurerest 43 der jeweiligen in 1, 2 bzw. 3 dargestellten Sequenzen (SEQ ID Nr. 2, 4 bzw. 6) beginnen, wobei es sich bei dem ersten gezeigten Methioninrest um den Rest 1 handelt.
Therapeutische Polypeptide der vorliegenden Erfindung können bei der Behandlung eines Menschen oder nichtmenschlichen Tiers verwendet werden. Dabei kann es sich um eine prophylaktische Behandlung oder eine Behandlung in Bezug auf ein existierendes Leiden handeln. So können beispielsweise erfindungsgemäße Polypeptide bei der Behandlung einer beliebigen, durch ein Fehlen/einen Mangel von Heparanase verursachten Krankheit/Erkrankung verwendet werden. Darüber hinaus können sie zum Abbau von Heparin oder zur Blockierung der Antikoagulierungsaktivität von Heparin während oder nach einer Operation eingesetzt werden (siehe Freed et al., Ann. Biomed. Eng. 21: 67–76, 1993). Als Alternative können sie zur Modulatation der Aktivität endogener Heparanase reingesetzt werden.
Somit wird bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid des ersten erfindungsgemäßen Aspekts sowie einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, bereitgestellt. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer oder mehrerer der oben erwähnten Krankheiten/Erkrankungen verwendet werden.
Das Arzneimittel wird üblicherweise als teil einer sterilen, pharmazeutischen Zusammensetzung zugeführt, die in der Regel einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff enthält. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann dabei in jeder geeigneten Form (je nach dem gewünschten Verabreichungsverfahren dafür an einen Patienten) vorliegen.
Sie kann in Form einer Dosiseinheit sowie als Teil eines Kits bereitgestellt werden und wird im allgemeinen in einem geschlossenen Behälter bereitgestellt. Ein derartiger Kit würde in der Regel (doch nicht notwendigerweise) Gebrauchsanweisungen enthalten. Er kann mehrere der genannten Dosiseinheiten enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzung kann an die Verabreichung über einen beliebigen geeigneten Weg, beispielsweise über den oralen (einschließlich bukkalen oder sublingualen), rektalen, nasalen, topikalen (einschließlich bukkalen, sublingualen oder transdermalen), vaginalen oder parenteralen (einschließlich subkutanen, intramuskulären, intravenösen oder intradermalen) Weg, angepaßt werden. Derartige Zusammensetzungen können mit allen auf dem Fachgebiet der Pharmazie bekannten Verfahren, beispielsweise durch Vermischen des aktiven Inhaltsstoffs mit dem (den) Träger- oder Hilfsstoff(en) unter sterilen Bedingungen, hergestellt werden.
An die orale Verabreichung angepaßte pharmazeutische Zusammensetzung können in Form diskreter Einheiten, wie z. B. Kapseln oder Tabletten, als Pulver oder Granulate, als Lösungen, Sirupe oder Suspensionen (in wäßrigen oder nichtwäßrigen Flüssigkeiten; oder als eßbare Schäume oder Aufschäumungen; oder als Emulsionen) dargereicht werden.
Zu geeigneten Hilfsstoffen für Tabletten oder Hartgelatinekapseln gehören Lactose, Maisstärke oder Derivate davon, Stearinsäure oder deren Salze.
Zu geeigneten Hilfsstoffen für die Verwendung mit Weichgelatinekapseln gehören beispielsweise Pflanzenöle, Wachse, Fette, halbfeste oder flüssige Polyole usw.
Zu Hilfsstoffen, die für die Herstellung von Lösungen und Sirupen verwendet werden können, gehören beispielsweise Wasser, Polyole und Zucker. Bei der Herstellung von Suspensionen können zur Bereitstellung von Öl-in-Wasser- bzw. Wasser-in-Öl-Suspensionen Öle (z. B. Pflanzenöle) verwendet werden.
An die transdermale Verabreichung angepaßte pharmazeutische Zusammensetzungen können in Form diskreter Pflaster dargereicht werden, die dafür vorgesehen sind, mit der Epidermis des Empfängers über einen längeren Zeitraum in innigem Kontakt zu bleiben. So kann der aktive Inhaltsstoff beispielsweise aus dem Pflaster über eine Ontophorese, wie in Pharmaceutical Research, 3(6): 318 (1986) allgemein beschrieben, zugeführt werden.
An die topische Verabreichung angepaßte pharmazeutische Zusammensetzungen können in Form von Salben, Cremes, Suspensionen, Lotionen, Pulvern, Lösungen, Pasten, Gelen, Sprays, Aerosolen oder Ölen formuliert werden. Bei Infektionen des Auges oder anderer äußerer Gewebe, beispielsweise des Munds und der Haut, werden die Zusammensetzungen vorzugsweise in Form einer topischen Salbe oder Creme appliziert. Bei der Formulierung zu einer Salbe kann der aktive Inhaltsstoff entweder mit einem paraffinischen oder einem mit Wasser mischbaren Salbengrundstoff eingesetzt werden. Als Alternative kann der aktive Inhaltsstoff in einer Creme mit einem Öl-in-Wasser-Cremegrundstoff oder einem Wasser-in-Öl- Grundstoff formuliert werden. Zu den an die topische Verabreichung an das Auge angepaßten pharmazeutischen Zusammensetzungen gehören Augentropfen, wobei der aktive Inhaltsstoff in einem geeigneten Trägerstoff, vor allem einem wäßrigen Lösungsmittel, gelöst oder suspendiert ist. Zu den an die topische Verabreichung im Mund angepaßten pharmazeutischen Zusammensetzungen gehören Lutschtabletten, Pastillen und Mundwaschlösungen.
An die rektale Verabreichung angepaßte pharmazeutische Zusammensetzungen können in Form von Zäpfchen oder Klistieren dargereicht werden.
An die nasale Verabreichung angepaßte pharmazeutische Zusammensetzungen, bei denen der Träger in Form eines Feststoffs vorliegt, enthalten ein grobkörniges Pulver mit einer Teilchengröße beispielsweise im Bereich von 20 bis 500 μm, das in der gleichen Weise wie eine Prise Schnupftabak verabreicht wird, d. h. durch rasche Inhalation über die Nasenwege aus einem Behälter mit dem Pulver, der dicht an die Nase gehalten wird. Zur Verabreichung als Nasenspray oder Nasentropfen geeignete Zusammensetzungen, bei denen es sich bei dem Trägerstoff um eine Flüssigkeit handelt, umfassen wäßrige oder ölige Lösungen des aktiven Inhaltsstoffs.
An die Verabreichung durch Inhalation angepaßte pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen feinpartikuläre Stäube oder Nebel, die mittels verschiedener Arten von unter Druck stehenden Dosierspendern mit Aerosolen, Verneblern oder Insufflatoren erzeugt werden können.
An die vaginale Verabreichung angepaßte pharmazeutische Zusammensetzungen können in Form von Pessaren, Tampons, Cremes, Gelen, Pasten, Schäumen oder Sprayformulierungen dargereicht werden.
Zu den an die parenterale Verabreichung angepaßten pharmazeutischen Zusammensetzungen gehören wäßrige und nichtwäßrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und Solute, durch die die Formulierung weitgehend isotonisch mit dem Blut des zu behandelnden Empfängers gemacht wird, enthalten können; sowie wäßrige und nichtwäßrige sterile Suspensionen, die Suspensionen und Verdicker enthalten können. Zu den für induzierbare Lösungen verwendbaren Hilfsstoffen gehören beispielsweise Wasser, Alkohole, Polyole, Glycerin und Pflanzenöle. Die Zusammensetzungen können in Einzeldosis- oder Mehrfachdosisbehältern, beispielsweise verschlossenen Ampullen und Fläschchen dargereicht und in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, so daß nur die Zugabe der getragenen sterilen Flüssigkeit, beispielsweise Wasser für Injektionen, unmittelbar vor Gebrauch erforderlich ist. Rezepturmäßig hergestellte Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten hergestellt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können Konservierungsmittel, Lösungsvermittler, Stabilisierer, Benetzungsmittel, Emulgatoren, Süßstoffe, Farbstoffe, Geruchsstoffe, Salze (Substanzen der vorliegenden Erfindung können selbst in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes bereitgestellt werden) Puffer, Überzugsmittel oder Antioxidantien enthalten. Ebenso können sie therapeutisch wirksame Stoffe zusätzlich zur Substanz der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die Dosierungen der Substanz der vorliegenden Erfindung können innerhalb weiter Grenzen variieren, je nach der zu behandelnden Krankheit oder Erkrankung, dem Alter und Zustand des zu behandelnden Individuums, usw., wobei ein Arzt letztendlich die zu verwendenden geeigneten Dosierungen bestimmt. Diese Dosierung kann so oft wiederholt werden, wie es angemessen ist. Falls Neben wirkungen auftreten, kann die Dosierungsmenge und/oder -häufigkeit im Sinne der normalen klinischen Praxis reduziert werden.
Neben den oben in Verbindung mit Behandlungen erörterten Verwendungen lassen sich Polypeptide der vorliegenden Erfindung auch bei der Diagnose verwenden. So kann beispielsweise die Expression des Polypeptids mit einem Leiden oder einem erhöhten Risiko, sich ein Leiden zuzuziehen, assoziiert sein.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung lassen sich auch in der Forschung verwenden. So können sie beispielsweise beim Screening auf Stoffe, die die Aktivität der Polypeptide der vorliegenden Erfindung modulieren, verwendet werden.
Somit wird in einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt ein Verfahren zur Identifizierung eines Agens, das die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide moduliert, bereitgestellt, wobei man die Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids in Gegenwart eines Testagens mit der Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids in Abwesenheit des Testagens vergleicht.
Durch die Erfindung werden Verfahren zur Identifizierung von Agentien (z. B. Kandidatenverbindungen oder Testverbindungen), die an Hpa2 oder an ein mit Hpa2 verwandtes Protein binden oder eine stimulierende oder hemmende Wirkung auf die Expression oder Aktivität von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein ausüben, bereitgestellt. Zu den Agentien, Kandidatenverbindungen oder Testverbindungen gehören beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Nukleinsäuren (z. B. DNA und RNA), Kohlenhydrate, Lipide, Proteine, Peptide, Peptidomimetika, kleine Moleküle sowie andere Arzneistoffe. Agentien lassen sich unter Verwendung eines der zahlreichen Ansätze bei im Fachgebiet bekannten Verfahren mit kombinatorischen Bibliotheken erhalten, einschließlich: biologischer Bibliotheken; räumlich adressierbarer paralleler Festphasen- oder Lösungsphasen-Bibliotheken; Dekonvolution erfordernder Synthesebibliotheksverfahren; des "One-Bead One-Compound"-Bibliotheksverfahrens; und Synthesebibliotheksverfahren mit Affinitätschromatographieselektion. Der Ansatz mit biologischen Bibliotheken ist auf Peptidbibliotheken beschränkt, während die anderen vier Ansätze auf Peptid-, Nichtpeptidoligomer- oder Kleinmolekül-Bibliotheken von Verbindungen anwendbar sind (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145; US-Patent-Nr. 5,738,996; und US-Patent-Nr. 5,807,683, hiermit jeweils durch Bezugnahme vollinhaltlich aufgenommen).
Beispiele für Verfahren zur Synthese molekularer Bibliotheken lassen sich im Fachgebiet beispielsweise bei: DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al., 1993, Science 261: 1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; und Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233, hiermit jeweils durch Bezugnahme vollinhaltlich aufgenommen, finden.
Bibliotheken von Verbindungen können präsentiert werden, und zwar beispielsweise in Lösung (z. B. Houghten, 1992, Bio/Techniques 13: 412–421) oder auf Beads [Kügelchen] (Lam, 1991, Nature 354: 82–84), Chips (Fodor, 1993, Nature 364: 555–556), Bakterien (US-Patent Nr. 5,223,409), Sporen (Patente Nr. 5,571,698; 5,403,484; und 5,223,409), Plasmiden (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865–1869) oder Phagen (Scott und Smith, 1990, Science 249: 386–390; Devlin, 1990, Science 249: 404–406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378–6382; und Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222: 301–310), hiermit jeweils durch Bezugnahme vollinhaltlich aufgenommen.
In einer Ausführungsform werden Agentien, die mit Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein wechselwirken (daran binden), in einem Testsystem auf Zellbasis identifiziert. Gemäß dieser Ausführungsform werden Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein exprimierende Zellen mit einer Kandidatenverbindung oder einer Kontrollverbindung in Kontakt gebracht und die Fähigkeit der Kandidatenverbindung zur Wechselwirkung mit Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein bestimmt. Falls gewünscht, kann dieser Test zum Screening mehrerer (z. B. einer Bibliothek) von Kandidatenverbindungen verwendet werden. Die Zelle kann dabei beispielsweise prokaryontischen Ursprungs (z. B. E. coli) oder eukaryontischen Ursprungs (z. B. Hefe oder Säuger) sein. Ferner können die Zellen Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein entweder endogen exprimieren oder gentechnisch so konstruiert werden, daß sie Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein exprimieren. In bestimmten Fällen wird Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein oder die Kandidatenverbindung beispielsweise mit einer radioaktiven Markierung (wie z. B. ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I) oder einer Fluoreszenzmarkierung (wie z. B. Fluorescein-isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd oder Fluoreszamin) markiert, um den Nachweis einer Wechselwirkung zwischen Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein und einer Kandidatenverbindung zu ermöglichen. Die Fähigkeit der Kandidatenverbindung zur direkten oder indirekten Wechselwirkung mit Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein läßt sich mit dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmen. So kann beispielsweise die Wechselwirkung zwischen einer Kandidatenverbindung und Hpa2 bzw. einem mit Hpa2 verwandten Protein mittels Durchflußzytometrie, einem Szintillationstest, einer Immunpräzipitation oder einer Western-Blot-Analyse bestimmt werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden Agentien, die mit Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein wechselwirken (d. h. daran binden) in einem zellfreien Testsystem identifiziert. Gemäß dieser Ausführungsform wird ein natives oder rekombinantes Hpa2 oder ein Fragment davon bzw. ein natives oder rekombinantes mit Hpa2 verwandtes Polypeptid oder ein Fragment davon mit einer Kandidatenverbindung oder einer Kontrollverbindung in Kontakt gebracht und die Fähigkeit der Kandidatenverbindung zur Wechselwirkung mit Hpa2 oder dem mit Hpa2 verwandten Polypeptid bestimmt. Falls gewünscht, kann dieser Test zum Screening mehrerer (z. B. einer Bibliothek) von Kandidatenverbindungen verwendet werden. Vorzugsweise wird dabei Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein zunächst immobilisiert, indem beispielsweise Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein mit einem immobilisierten Antikörper, der das Polypeptid spezifisch erkennt und bindet, in Kontakt gebracht oder indem eine gereinigte Präparation von Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein mit einer für die Bindung von Proteinen vorgesehenen Oberfläche in Kontakt gebracht wird. Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein kann teilweise oder vollständig gereinigt (z. B. teilweise oder vollständig frei von anderen Polypeptiden sein) oder Teil eines Zellysats sein. Ferner kann es sich bei Hpa2 oder einen mit Hpa2 verwandten Protein um ein Fusionsprotein handeln, das das Hpa2 oder einen Teil davon oder das mit Hpa2 verwandte Polypeptid sowie eine Domäne, wie z. B. Glutathion-S-Transferase, umfaßt. Alternativ kann Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Techniken biotinyliert werden (z. B. Biotinylierungskit, Pierce Chemicals; Rockford, IL.). Die Fähigkeit der Kandidatenverbindung zur Wechselwirkung mit Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein läßt sich dann mit dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmen.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Testsystem auf Zellbasis zur Identifizierung von Agentien verwendet, die an ein Protein, wie z. B. ein Enzym, oder einen biologisch aktiven Teil davon binden oder dessen Aktivität modulieren, was für die Produktion oder den Abbau von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein oder für die posttranslationale Modifikation von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein verantwortlich ist. Dabei werden in einem primären Screening mehrere (z. B. eine Bibliothek von) Verbindengen mit Zellen in Kontakt gebracht, die folgendes natürlicherweise oder rekombinant exprimieren: (i) Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein oder ein biologisch aktives Fragment eines der zuvor genannten Moleküle, und (ii) ein Protein, das für die Prozessierung von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein verantwortlich ist, um Verbindungen zu identifizieren, die die Produktion, den Abbau oder die posttranslationale Modifikation von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein modulieren. Falls gewünscht, können im primären Screening identifizierte Verbindungen dann in einem sekundären Screening gegen Zellen, die das spezifische interessierende Hpa2 natürlicherweise oder rekombinant exprimieren, getestet werden. Die Fähigkeit der Kandidatenverbindung zur Modulation der Produktion, des Abbaus oder der posttranslationalen Modifikation von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein läßt sich mit dem Fachmann bekannten Verfahren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Durchflußzytometrie, einem Szintillationstest, einer Immunpräzipitation und einer Western-Blot-Analyse, bestimmen.
In einer weiteren Ausführungsform werden Agentien, die mit Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein wechselwirken (d. h. daran binden), in einem kompetitiven Bindungstest identifiziert. Gemäß dieser Ausführungsform werden Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein exprimierende Zellen mit einer Kandidatenverbindung sowie einer Verbindung, die bekanntermaßen mit Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein wechselwirkt, in Kontakt gebracht, wonach die Fähigkeit der Kandidatenverbindung zur kompetitiven Wechselwirkung mit Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein bestimmt wird. Als Alternative werden Agentien, die mit Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein kompetitiv wechselwirken (d. h. daran binden), in einem zellfreien Testsystem identifiziert, indem Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein mit einer Kandidatenverbindung sowie einer Verbindung, die bekanntermaßen mit dem Hpa2 oder dem mit Hpa2 verwandten Polypeptid wechselwirkt, in Kontakt gebracht wird. Wie oben angegeben, läßt sich die Fähigkeit der Kandidatenverbindung zur Wechselwirkung mit Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein mit dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmen. Diese Tests, und zwar sowohl Tests auf Zellbasis als auch zellfreie Tests, lassen sich zum Screening mehrerer (z. B. einer Bibliothek von) Kandidatenverbindungen verwenden.
In einer weiteren Ausführungsform werden Agentien, die die Expression von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein modulieren (herauf- oder herunterregulieren), identifiziert, indem Zellen (Zellen prokaryontischen Ursprungs oder eukaryontischen Ursprungs), die Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein exprimieren, mit einer Kandidatenverbindung oder einer Kontrollverbindung (z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung (phosphat buffered salinem, PBS)) in Kontakt gebracht werden und die Expression von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein, für Hpa2 codierender mRNA oder für das mit Hpa2 verwandte Polypeptid codierender mRNA bestimmt wird. Das Expressionsniveau eines ausgewählten Hpa2, mit Hpa2 verwandten Polypeptids, einer ausgewählten für Hpa2 codierenden mRNA oder für das mit Hpa2 verwandte Polypeptid codierenden mRNA in Gegenwart der Kandidatenverbindung wird mit dem Expressionsniveau von Hpa2, dem mit Hpa2 verwandten Polypeptid, der für Hpa2 codierenden mRNA oder der für das mit Hpa2 verwandte Polypeptid codierenden mRNA in Abwesenheit der Kandidatenverbindung (z. B. in Gegenwart einer Kontrollverbindung) verglichen. Die Kandidatenverbindung läßt sich dann als ein Modulator der Expression von Hpa2 oder dem mit Hpa2 verwandten Polypeptid auf Grundlage dieses Vergleichs identifizieren. Ist beispielsweise die Expression von Hpa2 bzw. der mRNA wesentlich höher in Gegenwart der Kandidatenverbindung als in Gegenwart ihrer Abwesenheit, so wird die Kandidatenverbindung als ein Stimulator der Expression von Hpa2 bzw. der mRNA identifiziert. Ist andererseits die Expression von Hpa2 bzw. der mRNA in Gegenwart der Kandidatenverbindung wesentlich niedriger als in ihrer Abwesenheit, so wird die Kandidatenverbindung als ein Inhibitor der Expression von Hpa2 bzw. der mRNA identifiziert. Das Expressionsniveau von Hpa2 bzw. der dafür codierenden mRNA läßt sich mit dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmen. So läßt sich beispielsweise die mRNA-Expression mittels Northern-Blot-Analyse oder RT-PCR beurteilen, und Proteinniveaus lassen sich mittels Western-Blot-Analyse beurteilen.
In einer weiteren Ausführungsform werden Agentien, die die Aktivität von Hpa2 oder eines mit Hpa2 verwandten Polypeptids modulieren, identifiziert, indem eine Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid enthaltende Präparation bzw. Zellen (z. B. prokaryontische oder eukaryontische Zellen), die Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid exprimieren, mit einer Testverbindung oder einer Kontrollverbindung in Kontakt gebracht wird und die Fähigkeit der Testverbindung zur Modulation (z. B. Stimulierung oder Hemmung) der Aktivität von Hpa2 oder eines mit Hpa2 verwandten Polypeptids bestimmt wird. Die Aktivität von Hpa2 oder eines mit Hpa2 verwandten Polypeptids läßt sich durch Nachweisen der enzymatischen Aktivität von Hpa2 oder des mit Hpa2 verwandten Proteins, des Ziels auf ein geeignetes Substrat, durch Nachweisen der Induktion eines Reportergens (z. B. eines Regulationselements, das auf Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid reagiert und mit einer einen nachweisbaren Marker, z. B. Luciferase, codierenden Nukleinsäure operativ verknüpft ist) oder durch Nachweisen einer Zellantwort, beispielsweise Zelldifferenzierung oder Zellproliferation, beurteilen. Auf der Grundlage der vorliegenden Beschreibung können dem Fachmann bekannte Techniken zur Messung dieser Aktivitäten verwendet werden. Die Kandidatenverbindung läßt sich dann als ein Modulator der Aktivität von Hpa2 oder dem mit Hpa2 verwandten Polypeptid identifizieren, indem die Wirkungen der Kandidatenverbindung mit der Kontrollverbindung verglichen werden. Zu geeigneten Kontrollverbindungen gehören phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und normale Kochsalzlösung (normal saline (NS)).
In einer weiteren Ausführungsform werden Agentien, die die Expression, Aktivität oder sowohl die Expression als auch die Aktivität von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Polypeptid modulieren (d. h. herauf- oder herunterregulieren), in einem Tiermodell identifiziert. Zu geeigneten Tieren gehören dabei beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Maus, Ratte, Kaninchen, Affe, Meerschweinchen, Hund und Katze. Gemäß dieser Ausführungsform wird die Testverbindung oder eine Kontrollverbindung einem geeigneten Tier verabreicht (z. B. oral, rektal oder parenteral, wie z. B. intraperitoneal oder intravenös) und die Wirkung auf die Expression, Aktivität oder sowohl die Expression als auch die Aktivität von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Polypeptid bestimmt. Änderungen der Expression von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Polypeptid lassen sich mit den oben skizzierten Verfahren beurteilen.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid als ein "Köderprotein" in einem Zwei-Hybrid-Assay oder Drei-Hybrid-Assay zur Identifizierung weiterer Proteine, die an Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid binden bzw. damit wechselwirken, eingesetzt (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223–232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046–12054; Bartel et al. (1993) Bio/Techniques 14: 920–924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693–1696; und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/10300). Wie dem Fachmann ersichtlich ist, sind derartige Bindungsproteine wahrscheinlich auch an der Fortpflanzung von Signalen durch erfindungsgemäßes Hpa2 oder mit Hpa2 verwandtes Protein beispielsweise als vorgeschaltete oder nachgeschaltete Elemente eines Signalwegs, an dem Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein beteiligt ist, beteiligt.
Wissenschaftliche Veröffentlichungen, in denen geeignete Tests zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Heparanaseaktivität beschrieben sind, sind hier aufgeführt.
Eine weitere Verwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung besteht in der Erzeugung oder Selektion von Antikörpern. Daher umfaßt die vorliegende Erfindung Antikörper, die an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder an ein Fragment eines solchen Polypeptids binden. Dabei binden bevorzugte Antikörper spezifisch an Polypeptide der vorliegenden Erfindung, so daß sie sich zur Reinigung und/oder zur Hemmung der Aktivität solcher Polypeptide einsetzen lassen. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein.
Ein Hpa2 oder mit Hpa2 verwandtes Protein kann als Immunogen zur Erzeugung von Antikörpern, die immunspezifisch an ein solches Immunogen binden, verwendet werden. Solche Immunogene lassen sich mit allen zweckmäßigen Mitteln, einschließlich den oben beschriebenen Verfahren, isolieren. Zu erfindungsgemäßen Antikörpern gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, polyklonale, monoklonale, bispezifische, humanisierte oder chimärische Antikörper, einkettige Antikörper, Fab- Fragmente und F(ab')-Fragmente, mittels einer Fab-Expressionsbibliothek produzierte Fragmente, anti-idiotypische (anti-Id-)Antikörper sowie epitopbindende Fragmente aller obigen Moleküle. Der Begriff "Antikörper" wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Immunglobulinmoleküle sowie auf immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, d. h. Moleküle, die eine antigenbindende Stelle, die spezifisch ein Antigen bindet, enthalten. Die erfindungsgemäßen Immunglobulinmoleküle können einer beliebigen Klasse (z. B. IgG, IgE, IgM, IgD und IgA) oder Unterklasse von Immunglobulinmolekülen angehören.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Antikörper gegen eine spezifische Domäne von Hpa2 oder eines mit Hpa2 verwandten Proteins produziert. In einer spezifischen Ausführungsform werden hydrophile Fragmente von Hpa2 oder eines mit Hpa2 verwandten Proteins als Immunogen für die Antikörperproduktion eingesetzt.
Bei der Produktion von Antikörpern läßt sich das Screening auf den gewünschten Antikörper mit im Fachgebiet bekannten Techniken, z. B. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), bewerkstelligen. So kann man beispielsweise zur Selektion von Antikörpern, die eine spezifische Domäne von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein erkennen, erzeugte Hybridome auf ein Produkt testen, das an eine solche Domäne enthaltendes Fragment von Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein bindet.
Bei polyklonalen Antikörpern, die in erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, handelt es sich um heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren immunisierter Tiere stammen. Ein nichtfraktioniertes Immunserum läßt sich ebenso verwenden. Im Fachgebiet sind verschiedene Verfahrensweisen bekannt, die für die Produktion polyklonaler Antikörper gegen Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein verwen det werden können. In einer besonderen Ausführungsform lassen sich polyklonale Antikörper aus Kaninchen gegen ein Epitop von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Polypeptid gewinnen. So lassen sich beispielsweise zur Produktion polyklonaler oder monoklonaler Antikörper verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit der nativen oder einer synthetischen (z. B. rekombinanten) Version von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Polypeptid oder einem Fragment eines mit Hpa2 verwandten Polypeptids immunisieren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Kaninchen, Maus, Ratte usw.
Zur Verbesserung der immunologischen Antwort lassen sich je nach der Wirtsspezies verschiedene Adjuvantien einsetzten, einschließlich, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, komplettes oder inkomplettes Freundsches Adjuvans, ein Mineralgel, wie z. B. Aluminiumhydroxid, eine oberflächenaktive Substanz, wie z. B. Lysolecithin, pluronisches Polyol, ein Polyanion, ein Peptid, eine Ölemulsion, KLH (keyhole limpet hemocyanin), Dinitrophenol sowie ein Adjuvans, wie z. B. BCG (bacille Calmette-Guerin) oder Corynebakterium parvum. Weiter Adjuvantien sind ebenso im Fachgebiet allgemein bekannt.
Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (mAbs), die gegen Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein, ein Fragment von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein gerichtet sind, lassen sich alle Techniken verwenden, die die Produktion von Antikörpermolekülen mittels kontinuierlicher Zellinien in Kultur vorsehen, beispielsweise die ursprünglich von Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495–497) entwickelte Hybridomzellen-Technik ebenso wie die Triomzellen-Technik, die Hybridomzellen-Technik mit menschlichen B-Zellen (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) sowie die EBV-Hybridomzellen-Technik zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96). Solche Antikörper können einer beliebigen Immunglobulinklasse, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, sowie einer beliebigen Unterklasse davon angehören. Die die erfindungsgemäßen mAbs produzierenden Hybridomzellen können in vitro oder in vivo kultiviert werden. In einer zusätzlichen erfindungsgemäßen Ausführungsform lassen sich monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren unter Nutzung bekannter Technologie produzieren (PCT/US90/02545, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen).
Zu den monoklonalen Antikörpern gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, menschliche monoklonale Antikörper und chimärische monoklonale Antikörper (z. B. Mensch-Maus-Chimären). Bei einem chimärischen Antikörper handelt es sich um ein Molekül, bei dem unterschiedliche Anteile aus unterschiedlichen Tierspezies stammen, wie z. B. solche mit einem konstanten Bereich aus menschlichem Immunglobulin und einem aus einem mAb der Maus stammendem variablen Bereich (siehe z. B. Cabilly et al., US-Patent Nr. 4,816,567; sowie Boss et al., US-Patent Nr. 4,816397, hiermit durch Bezugnahme vollinhaltlich aufgenommen). Bei humanisierten Antikörpern handelt es sich um Antikörpermoleküle aus nichtmenschlichen Spezies, die einen oder mehrere komplementaritätbestimmende Bereiche (complementarily determining regions, CDRs) aus der nichtmenschlichen Spezies sowie einen Gerüstbereich aus einem menschlichen Immunglobulinmolekül aufweisen (siehe z. B. Queen, US-Patent Nr. 5,585,089, hiermit durch Bezugnahme vollinhaltlich aufgenommen).
Chimärische und humanisierte monoklonale Antikörper lassen sich mittels im Fachgebiet bekannter rekombinanter DNA-Techniken, beispielsweise mit den in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/02671; der Europäischen Patentanmeldung 184,187; der Europäischen Patentanmeldung 171,496; der Europäischen Patentanmeldung 173,494; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/01533; dem US-Patent Nr. 4,816,567; der Europäischen Patentanmeldung 125,023; Better et al., 1988, Science 240: 1041–1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521–3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999–1005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446–449; und Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553–1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202–1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4: 214; dem US-Patent Nr. 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321: 552–525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; und Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4053–4060 beschriebenen Verfahren, produzieren.
Komplett menschliche Antikörper sind für die therapeutische Behandlung menschlicher Individuen besonders wünschenswert. Solche Antikörper lassen sich unter Verwendung transgener Mäuse produzieren, die zwar keine Gene der schweren und leichten Ketten der endogenen Immunglobuline, dafür aber die Gene der menschlichen schweren und leichten Ketten exprimieren können. Die transgenen Mäuse werden in der üblichen Weise mit einem ausgewählten Antigen, z. B. einem ganzen erfindungsgemäßen Hpa2 oder einem Teil davon, immunisiert. Gegen das Antigen gerichtete monoklonale Antikörper lassen sich mittels herkömmlicher Hybridomzellen-Technologie gewinnen. Die in den transgenen Mäusen vorhandenen menschlichen Immunglobulintransgene werden während der B-Zelldifferenzierung rearrangiert und durchlaufen anschließend einen Wechsel der Klasse sowie eine somatische Mutation. Somit ist es durch Verwendung einer solchen Technik möglich, therapeutisch geeignete IgG-, IgA-, IgM- und IgE-Antikörper zu produzieren. Für einen Überblick über diese Technologie zur Produktion menschlicher Antikörper, siehe Lonberg und Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65–93). Für eine ausführliche Erörterung dieser Technologie zur Produktion menschlicher Antikörper und menschlicher monoklonaler Antikörper sowie für Vorschriften zur Produktion sol cher Antikörper, siehe z. B. US-Patent Nr. 5,625,126; US-Patent 5,633,425; US-Patent 5,569,825; US-Patent 5,661,016; und US-Patent 5,545,806. Darüber hinaus kann man sich an Firmen, wie z. B. Abgenix, Inc. (Freemont, CA) und Genpharm (San Jose, CA) zur Bereitstellung gegen ein ausgewähltes Antigen gerichteter menschlicher Antikörper unter Verwendung einer ähnlichen Technologie wie oben beschrieben wenden.
Komplett menschliche Antikörper, die ein ausgewähltes Epitop erkennen, lassen sich mittels einer als "gesteuerte Selektion" ("guided selection") bezeichneten Technik erzeugen. Bei diesem Ansatz wird ein ausgewählter nichtmenschlicher monoklonaler Antikörper, z. B. ein Maus-Antikörper, dazu verwendet, die Selektion eines dasselbe Epitop erkennenden komplett menschlichen Antikörpers zu steuern (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12: 899–903).
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung lassen sich auch mit verschiedenen im Fachgebiet bekannten Phagen-Display-Verfahren erzeugen. Bei Phagen-Display-Verfahren werden funktionelle Antikörperdomänen auf der Oberfläche von Phagenpartikeln, die die diese Domänen codierenden Polynukleotidsequenzen tragen, präsentiert. Insbesondere läßt sich ein solcher Phage dazu verwenden, aus einer Repertoire- oder kombinatorischen Antikörperbibliothek (z. B. aus Mensch oder Maus) exprimierte antigenbindende Domänen zu präsentieren. Ein Phage, der eine das interessierende Antigen antigenbindende Domäne exprimiert, kann mit einem Antigen, z. B. unter Verwendung von markiertem Antigen oder auf einer festen Oberfläche oder Kügelchen gebundenem oder eingefangenem Antigen, selektioniert bzw. identifiziert werden. Bei dem in diesem Verfahren verwendeten Phagen handelt es sich typischerweise um filamentösen Phagen, einschließlich fd und M13-Bindungsdomänen, die aus Phagen mit Fab-, Fv- oder mit Disulfid stabilisierten Fv-Antikörperdomänen, die rekombinant mit dem Protein entweder des Phagengens III oder des Phagengens VIII fusioniert sind, exprimiert werden. Zu den Phagen-Display-Verfahren, die zur Herstellung der Antikörper der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, gehören die in Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41–50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177–186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952–958 (1994); Persic et al., Gene 187 9–18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191–280 (1994); der PCT-Anmeldung Nr. PCT/GB91/01134; den PCT-Veröffentlichungen WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; und den US-Patenten Nr. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 und 5,969,108, hiermit jeweils durch Bezugnahme vollinhaltlich aufgenommen, offenbarten Verfahren.
Wie in obigen Literaturangaben beschrieben, lassen sich die Antikörper-codierenden Bereiche nach Phagenselektion aus den Phagen isolieren und zur Erzeugung ganzer Antikörper, einschließlich menschlicher Antikörper, oder eines anderen gewünschten antigenbindenden Fragments verwenden, wobei sie in einem beliebigen gewünschten Wirt, einschließlich Säugerzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, Hefe und Bakterien, wie beispielsweise im folgenden ausführlich beschrieben, exprimiert werden können. So können beispielsweise Techniken zur rekombinanten Produktion von Fab-, Fab'- und F(ab')2-Fragmenten auch unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren, wie z. B. den in der PCT-Veröffentlichung WO 92/22324; in Mullinax et al., BioTechniques 12(6): 864–869 (1992); und Sawai et al., AJRI 34: 26–34 (1995); und Better et al., Science 240: 1041–1043 (1988) (die genannten Literaturangaben sind durch Bezugnahme vollinhaltlich aufgenommen) offenbarten, eingesetzt werden.
Zu den Techniken, die für die Produktion von einkettigen Fvs und Antikörpern verwendet werden können, gehören beispielsweise die in den US-Patenten Nr. 4,946,778 und 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203: 46–88 (1991); Shu et al., PNAS 90: 7995–7999 (1993); und Skerra et al., Science 240: 1038–1040 (1988) beschriebenen Techniken.
Die Erfindung sieht weiterhin die Verwendung bispezifischer Antikörper vor, die sich mit im Fachgebiet bekannten Verfahren herstellen lassen. Die klassische Produktion von bispezifischen Vollängen-Antikörpern beruht auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-schwere-Kette-/-leichte-Kette-Paaren, wobei die beiden Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Milstein et al., 1983, Nature 305: 537–539). Aufgrund der willkürlichen Zusammenstellung der schweren und leichten Immunglobulinketten produzieren diese Hybridomzellen (Quadromzellen) ein potentielles Gemisch aus zehn unterschiedlichen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die normalerweise über Affinitätschromatographieschritte erfolgt, ist ziemlich mühsam, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahrensweisen sind in der WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, sowie bei Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655–3659 offenbart.
Gemäß einem anderen und stärker bevorzugten Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) mit konstanten Immunglobulindomänensequenzen fusioniert. Die Fusion findet vorzugsweise mit einer konstanten Domäne der schweren Immunglobulinkette statt, die wenigstens einen Teil der flexiblen (hinge), CH2- und CH3-Bereiche umfaßt. Dabei sollte vorzugsweise zumindest in einer der Fusionen der erste konstante Bereich der schweren Kette (CHI), der die für die Bindung der leichten Kette benötigte Stelle enthält, vorhanden sein. DNAs, die für die Fusionen der schweren Immunglobulinkette und, falls gewünscht, die leichte Immunglobulinkette codieren, werden in getrennte Expressionsvektoren inseriert und in einen geeigneten Wirtsorganismus cotransfiziert. Dies sorgt für eine größere Flexibilität bei der Anpassung der jeweiligen Anteile der drei Polypeptidfragmente bei Ausführungsformen, bei denen ungleiche Verhältnisse der drei bei der Konstruktion verwendeten Polypeptidketten die besten Ausbeuten ergeben. Es ist jedoch möglich, die codierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen einzigen Expressionsvektor zu inserieren, wenn die Expression von wenigstens zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu hohen Ausbeuten führen oder wenn die Verhältnisse nicht besonders signifikant sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes setzen sich die bispezifischen Antikörper aus einer schweren Hybrid-Immunglobulinkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm sowie einem Hybrid-Immunglobulin-schwere-Kette-/-leiche-Kette-Paar (das eine zweite Bindungsspezifität liefert) im anderen Arm zusammen. Es stellte sich heraus, daß diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinketten-Kombinationen erleichtert, da das Vorhandensein einer leichten Immunglobulinkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für eine einfache Art der Trennung sorgt. Dieser Ansatz ist in der WO 94/04690, veröffentlicht am 3. März 1994, offenbart. Für weitere Einzelheiten zur Erzeugung bispezifischer Antikörper, siehe z. B. Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121: 210.
Durch die Erfindung werden funktionell aktive Fragmente, Derivate oder Analoge der Anti-Hpa2-Immunglobulinmoleküle bereitgestellt. Dabei bedeutet funktionell aktiv, daß das Fragment, Derivat bzw. Analog in der Lage ist, anti-anti-idiotypische Antikörper (d. h. tertiäre Antikörper) hervorzurufen, die dasselbe Antigen erkennen, das vom Antikörper, von dem das Fragment, Derivat oder Analog stammt, erkannt wird. Insbesondere kann in einer bevorzugten Ausführungsform die Antigenität des Idiotyps des Immunglobulinmoleküls durch die Deletion von Gerüst- und CDR-Sequenzen, die C-terminal zur der das Antigen spezifisch erkennenden CDR-Sequenz liegen, verstärkt werden. Um zu bestimmen, welche CDR-Sequenzen das Antigen binden, kann man synthetische Peptide, die die CDR-Sequenzen enthalten, in Bindungstests mit dem Antigen mittels eines beliebigen, im Fachgebiet bekannten Bindungstestverfahrens einsetzen.
Durch die vorliegende Erfindung werden Antikörperfragmente, wie beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, F(ab')₂-Fragmente und Fab-Fragmente, bereitgestellt. Antikörperfragmente, die spezifische Epitope erkennen, können mit bekannten Techniken erzeugt werden. F(ab')₂-Fragmente bestehen aus dem variablen Bereich, dem konstanten Bereich der leichten Kette sowie der CH1-Domäne der schweren Kette und werden durch Verdauung des Antikörpermoleküls mit Pepsin erzeugt. Fab-Fragmente werden durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente erzeugt. Durch die Erfindung werden auch schwere-Kette- und -leichte-Kette-Dimere der erfindungsgemäßen Antikörper oder ein beliebiges minimales Fragment davon, wie z. B. Fvs oder einkettige Antikörper (single chain antibodies, SCAs) (wie z. B. im US-Patent Nr. 4,946,778; bei Bird, 1988, Science 242: 423–42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883 und Ward et al., 1989, Nature 334: 544–54 beschrieben), oder ein beliebiges anderes Molekül mit der gleichen Spezifität wie der des erfindungsgemäßen Antikörpers, bereitgestellt. Einkettige Antikörper werden durch Verknüpfung der Fragmente des Fv-Bereichs der schweren und leichten Kette über eine Aminosäurebrücke, wodurch ein einkettiges Polypeptid entsteht, gebildet. Dabei können Techniken für den Zusammenbau funktioneller Fv-Fragmente in E. coli verwendet werden (Skerra et al., 1988, Science 242: 1038–1041).
In weiteren Ausführungsformen werden durch die Erfindung Fusionsproteine der erfindungsgemäßen Immunglobuline (oder funktionell aktiver Fragmente davon) bereitgestellt, beispielsweise solche, bei denen das Immunglobulin über eine kovalente Bindung (z. B. eine Peptidbindung) entweder am N-Terminus oder am C-Terminus mit einer Aminosäuresequenz eines anderen Proteins (oder eines Teils davon, vorzugsweise eines wenigstens 10, 20 oder 50 Aminosäuren langen Teils des Proteins), bei dem es sich nicht um das Immunglobulin handelt, fusioniert ist. Das Immunglobulin oder Fragment davon ist vorzugsweise mit dem anderen Protein am N-Terminus der konstanten Domäne kovalent verknüpft. Wie oben angegeben, können solche Fusionsproteine die Reinigung erleichtern, die Halbwertszeit in vivo erhöhen und die Zuführung eines Antigens an das Immunsystem über eine Epithelschranke hinweg verbessern.
Zu den erfindungsgemäß verwendeten Immunglobulinen gehören Analoge und Derivate, die jeweils modifiziert sind, d. h. durch die kovalente Anbindung einer beliebigen Art von Molekül, solange eine solche kovalente Anbindung nicht die immunspezifische Bindung beeinträchtigt. So gehören beispielsweise zu den Derivaten und Analogen der Immunglobuline, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, solche, die weiter modifiziert worden sind, z. B. durch Glycosylierung, Acetylierung, Pegylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisierung mit bekannten Schutz-/Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung, Verknüpfung mit einem zellulären Liganden oder einem anderen Protein usw. Alle der zahlreichen chemischen Modifikationen können mit bekannten Techniken einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, spezifischer chemischer Spaltung, Acetylierung, Formylierung usw., durchgeführt werden. Darüber hinaus kann das Analog oder Derivat eine oder mehrere nichtklassische Aminosäuren enthalten.
Die vorstehenden Antikörper lassen sich in im Fachgebiet bekannten Verfahren im Zusammenhang mit der Lokalisierung und Aktivität des erfindungsgemäßen Hpa2 einsetzen, beispielsweise bei der bildlichen Darstellung dieser Proteine beim Messen ihrer Niveaus in entsprechenden physiologischen Proben, bei diagnostischen Verfahren usw.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können mit allen im Fachgebiet für die Synthese von Antikörpern bekannten Verfahren, insbesondere mittels chemischer Synthese oder rekombinanter Expression, produziert werden, wobei die letztere Technik bevorzugt ist.
Die rekombinante Expression von Antikörpern oder Fragmenten, Derivaten oder Analogen davon erfordert die Konstruktion einer den Antikörper codierenden Nukleinsäure. Falls die Nukleotidsequenz für den Antikörper bekannt ist, kann man eine den Antikörper codierende Nukleinsäure aus chemisch synthetisierten Oligonukleotiden konstruieren (z. B. wie bei Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17: 242 beschrieben), wobei kurz gesagt die Synthese überlappender Oligonukleotide, die Teile der den Antikörper codierenden Sequenz enthalten, danach das Annealing und die Ligation dieser Oligonukleotide und dann die Amplifikation der ligierten Oligonukleotide mittels PCR erfolgen.
Als Alternative kann die den Antikörper codierende Nukleinsäure durch Klonierung des Antikörpers gewonnen werden. Falls ein die den jeweiligen Antikörper codierende Nukleinsäure enthaltender Klon nicht verfügbar ist, die Sequenz des Antikörpermoleküls jedoch bekannt ist, kann man eine den Antikörper codierende Nuklein säure aus einer geeigneten Quelle (z. B. einer Antikörper-cDNA-Bibliothek oder einer aus einem beliebigen Gewebe bzw. beliebigen Zellen, das bzw. die den Antikörper exprimiert bzw. exprimieren, erzeugte cDNA-Bibliothek) durch PCR-Amplifikation unter Verwendung synthetischer Primer, die an das 3'- und 5'-Ende der Sequenz hybridisieren können, oder durch Klonierung einer für die jeweilige Gensequenz spezifischen Oligonukleotidsonde, gewinnen.
Falls ein Antikörpermolekül, das ein bestimmtes Antigen spezifisch erkennt, (oder eine Quelle für eine cDNA-Bibliothek zur Klonierung einer einen solchen Antikörper codierenden Nukleinsäure) nicht zur Verfügung steht, können für ein bestimmtes Antigen spezifische Antikörper mit allen im Fachgebiet bekannten Verfahren, z. B. durch Immunisieren eines Tiers wie z. B. eines Kaninchens, zur Erzeugung polyklonaler Antikörper oder besonders bevorzugt durch Erzeugen monoklonaler Antikörper, erzeugt werden. Als Alternative läßt sich ein Klon, der zumindest den Fab-Teil des Antikörpers codiert, durch Screening von Fab-Expressionsbibliotheken (z. B. wie bei Huse et al., 1989, Science 246: 1275–1281 beschrieben) nach Klonen für Fab-Fragmente, die das spezifische Antigen binden, oder durch Screening von Antikörperbibliotheken (siehe z. B. Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937) gewinnen.
Sobald eine wenigstens die variable Domäne des Antikörpermoleküls codierende Nukleinsäure erhalten wurde, kann man diese in einen Vektor einführen, der die den konstanten Bereich des Antikörpermoleküls codierende Nukleotidsequenz enthält (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO 86/05807; PCT-Veröffentlichung WO 89/01036; und US-Patent Nr. 5,122,464). Vektoren, die die vollständige leichte oder schwere Kette zur Coexpression mit der Nukleinsäure enthalten, so daß die Expression eines vollständigen Antikörpermoleküls gestattet ist, stehen ebenso zur Verfügung. Anschließend läßt sich die den Antikörper codierende Nukleinsäure zur Einführung des (der) zur Substitution (bzw. Deletion) des einen Zysteinrests oder der mehreren Zysteinreste des variablen Bereichs, der bzw. die an einer Intraketten-Disulfidbindung beteilig ist bzw. sind, gegen einen Aminosäurerest der keine Sulfhydrylgruppe enthält, notwendigen Substitution(en) bzw. Deletion(en) einsetzen. Solche Modifikationen lassen sich mit allen im Fachgebiet für die Einführung spezifischer Mutationen oder Deletionen in einer Nukleotidsequenz bekannten Verfahren, beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, chemischer Mutagenese, stellengerichteter In-vitro-Mutagenese (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), auf PCT beruhenden Verfahren, usw., durchführen.
Darüber hinaus lassen sich für die Produktion "chimärischer Antikörper" entwicklte Techniken (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851–855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452–454), wobei Gene aus einem Maus-Antikörpermolekül mit geeigneter Antigenspezifität mit Genen aus einem menschlichen Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität zusammengespleißt werden, verwenden. Wie oben beschrieben, handelt es sich bei einem chimärischen Antikörper um ein Molekül, bei dem unterschiedliche Teile von unterschiedlichen Tierspezies stammen, wie z. B. solche mit einer aus einem Maus-mAb-stammenden variablen Bereich und einem konstanten Bereich eines menschlichen Antikörpers, z. B. humanisierte Antikörper.
Sobald eine ein erfindungsgemäßes Antikörpermolekül codierende Nukleinsäure erhalten wurde, kann der Vektor zur Produktion des Antikörpermoleküls mittels rekombinanter DNA-Technologie unter Verwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken hergestellt werden. Somit werden hier Verfahren zur Herstellung des erfin dungsgemäßen Proteins durch Expression von das Antikörpermolekül erhaltender Nukleinsäure beschrieben. Dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren lassen sich zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwenden, die für ein Antikörpermolekül codierende Sequenzen sowie entsprechende Transkriptions- und Translationskontrollsignale enthalten. Zu diesen Verfahren gehören beispielsweise rekombinante In-vitro-DNA-Techniken, Synthesetechniken sowie genetische Rekombination in vivo. Siehe beispielsweise die bei Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) und Ausubel et al. (Hrsg., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY) beschriebenen Techniken.
Der Expressionsvektor wird mittels herkömmlicher Techniken in eine Wirtszelle übertragen, und die transfizierten Zellen werden dann mittels herkömmlicher Techniken zur Produktion eines erfindungsgemäßen Antikörpers kultiviert.
Bei den zur Expression eines erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörpers verwendeten Wirtszellen kann es sich entweder um Bakterienzellen, wie z. B. Escherichia coli, oder vorzugsweise um eukaryontische Zellen, vor allem zur Expression eines ganzen rekombinanten Antikörpermoleküls, handeln. Insbesondere stellen Säugerzellen, wie z. B. CHO (Chinese Hamster Ovary-Zellen) in Verbindung mit einem Vektor, wie z. B. dem intermediären frühen HauptgenPromotorelement aus menschlichem Cytomegalovirus, ein wirkungsvolles Expressionsystem für Antikörper dar (Foecking et al., 198, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2).
Zur Expression eines erfindungsgemäßen Antikörpermoleküls können verschiedene Wirt/Expressionsvektor-Systeme benutzt werden. Solche Wirt/Expression-Systeme stellen Vehikel dar, mit denen die interessierenden codierenden Sequenzen hergestellt und anschließend gereinigt werden können, doch repräsentieren sie auch Zellen, die bei Transformation oder Transfektion mit den entsprechenden codierenden Nukleotidsequenzen das erfindungsgemäße Antikörpermolekül in situ exprimieren können. Zu diesen gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien (z. B. E. coli, B. subtilis), die mit Antikörper-codierende Sequenzen enthaltenden rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert sind; mit Antikörper-codierende Sequenzen enthaltenden rekombinanten Hefeexpressionsvektoren transformierte Hefe (z. B. Saccharomyces, Pichia); mit den Antikörper-codierende Sequenzen enthaltenden rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Baculovirus) infizierte Insektenzellsysteme; mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV (cauliflower mosaic virus); Tabakmosaikvirus, TMV) infizierte oder mit Antikörper-codierende Sequenzen enthaltenden rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid) transformierte Pflanzenzellsysteme; oder rekombinante Expressionskonstrukte mit aus dem Genom von Säugerzellen (z. B. Metallothionein-Promotor) oder aus Säugerviren (z. B. später Promotor aus Adenovirus; 7,5 k-Promotor aus Vacciniavirus) stammenden Promotoren enthaltende Säugerzellsysteme (z. B. COS-, CHO-, BHK-, 293-, 3T3-Zellen).
In bakteriellen Systemen können je nach der beabsichtigten Verwendung des exprimierten Antikörpermoleküls eine Reihe von Expressionsvektoren vorteilhaft ausgewählt werden. So können beispielsweise, falls eine große Menge eines solchen Proteins hergestellt werden soll, zur Erzeugung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die ein Antikörpermolekül umfassen, Vektoren, die hohe Expressionsniveaus von leicht zu reinigenden Fusionsproteinprodukten steuern, wünschenswert sein. Zu solchen Vektoren gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), bei dem die Antikörper-codierende Sequenz jeweils einzeln im Leseraster mit dem für lac Z codierenden Bereich in den Vektor ligiert werden kann, so daß ein Fusionsprotein produziert wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503–5509) und dergleichen. Ebenso können pGEX-Vektoren verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und lassen sich leicht aus lysierten Zellen durch Adsorption und Bindung an eine Matrix von Glutathion-Agarosekügelchen mit anschließender Elution in Gegenwart von freiem Glutathion aufreinigen. Die pGEX-Vektoren sind so konstruiert, daß sie Thrombin- bzw. Faktor-Xa-Protease-Spaltstellen enthalten, so daß das klonierte Zielgenprodukt von dem GST-Anteil befreit werden kann.
In einem Insektensystem wird als Vektor zur Expression von Fremgenen das nukleäre Polyhedrosis-Virus Autographa californica (AcNPV) verwendet. Dieses Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die Antikörper-codierende Sequenz kann jeweils einzeln in nichtessentielle Bereiche (z. B. das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (z. B. des Polyhedrin-Promotors) gestellt werden. In Säugerwirtszellen kann eine Reihe von Expressionssystemen auf Virusbasis (z. B. ein Adenovirus-Expressionssystem) genutzt werden.
Wie oben erörtert, kann man einen Wirtszellenstamm wählen, der die Expression der inserierten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der gewünschten spezifischen Weise modifiziert und prozessiert. Solche Modifikationen (z. B. Glycosylierung) und Prozessierung (z. B. Spaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins wichtig sein.
Für eine Langzeitproduktion von rekombinanten Antikörpern mit hohen Ausbeuten wird eine stabile Expression bevorzugt. So lassen sich beispielsweise Zellinien, die einen interessierenden Antikörper stabil exprimieren, herstellen, indem die Zellen mit einem Expressionsvektor, der die Nukleotidsequenz des Antikörpers sowie die Nukleotidsequenz eines selektionierbaren Stoffs (z. B. Neomycin oder Hygromycin) umfaßt, transfiziert und dann auf die Expression des selektionierbaren Markers selektioniert werden. Solche gentechnisch hergestellten Zellinien können insbesondere bei Screening und bei der Bewertung von Verbindungen, die direkt oder indirekt mit dem Antikörpermolekül wechselwirken, von Nutzen sein.
Die Expressionniveaus des Antikörpermoleküls lassen sich mittels Vektoramplifikation erhöhren (für eine Übersicht siehe Bebbington und Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Bd. 3. (Academic Press, New York, 1987)). Ist ein Marker in dem Antikörper exprimierenden Vektorsystem amplifizierbar, so wird durch den Anstieg des in der Kultur der Wirtszellen vorhandenen Inhibitorniveaus die Anzahl der Kopien des Markergens erhöht. Da der amplifizierte Bereich mit dem Antikörpergen assoziiert ist, wird die Produktion des Antikörpers ebenfalls erhöht (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).
Die Wirtszelle kann mit zwei erfindungsgemäßen Expressionsvektoren cotransfiziert werden, wobei der erste Vektor ein von der schweren Kette abgeleitetes Polypeptid und der zweite Vektor ein von der gleichen Kette abgeleitetes Polypeptid codiert. Die beiden Vektoren können identische selektionierbare Marker enthalten, durch die die gleiche Expression der Polypeptide der schweren und leichten Kette ermöglicht wird. Als Alternative kann man einen einzigen Vektor verwenden, der Polypeptide sowohl der schweren als auch der leichten Kette codiert. Bei derartigen Situationen sollte die leichte Kette vor der schweren Kette plaziert werden, um einen Überschuß an toxischer freier schwerer Kette zu vermeiden (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197). Die codierenden Sequenzen für die schwere und leichte Kette können cDNA oder genomische DNA umfassen.
Sobald das erfindungsgemäße Antikörpermolekül rekombinant exprimiert wurde, kann es nach einem beliebigen im Fachgebiet bekannten Verfahren zur Reinigung eines Antikörpermoleküls, z. B. mittels Chromatographie (z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, wie z. B. mit Protein A oder spezifischem Antigen, sowie nach Größe auftrennender Säulenchromatographie), Zentrifugation, differentieller Löslichkeit oder mit einer beliebigen anderen Standardtechnik zur Reinigung von Proteinen, gereinigt werden.
Als Alternative kann man ein beliebiges Fusionsprotein durch Verwendung eines für das exprimierte Fusionsprotein spezifischen Antikörpers leicht reinigen. So gestattet beispielsweise ein von Janknecht et al. beschriebenes System die leichte Reinigung nichtdenaturierter, in menschlichen Zellinien exprimierter Fusionsproteine (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972–897). In diesem System wird das interessierende Gen in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid subkloniert, so daß das offene Leseraster des Gens translational mit einem aus sechs Histidinresten bestehenden aminoterminalen Tag fusioniert wird. Das Tag dient dabei als eine matrixbindende Domäne für das Fusionsprotein. Extrakte von mit rekombinantem Vacciniavirus infizierten Zellen werden auf Ni²⁺-Nitriloessigsäure-Agarosesäulen geladen und Proteine mit Histidin-Tag werden selektiv mit imidazolhaltigen Puffern eluiert.
In einer bevorzugten Ausführungsformen werden Antikörper gegen Hpa2 oder gegen mit Hpa2 verwandtes Protein oder Fragmente davon mit einer diagnostischen oder therapeutischen Gruppierung konjugiert. Die Antikörper lassen sich zur Diagnose oder zur Bestimmung der Wirksamkeit eines gegebenen Behandlungsschemas verwenden. Der Nachweis kann durch Kopplung des Antikörpers an eine nachweisbare Substanz erleichtert werden. Zu nachweisbaren Substanzen gehören beispielsweise verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, Fluoreszenzmaterialien, Lumineszenzmaterialien, Biolumineszenzmaterialien, radioaktive Nuklide, positronenemittierende Metalle (zur Verwendung bei der Positron-Emissions-Tomographie) sowie nichtradioaktive paramagnetische Metallionen. Siehe allgemein US-Patent Nr. 4,741,900 hinsichtlich Metallionen, die mit Antikörpern zur Verwendung als Diagnostika gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert werden können. Zu geeigneten Enzymen gehören Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, beta-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; zu geeigneten prosthetische Gruppen gehören Streptavidin, Avidin und Biotin; zu geeigneten Fluoreszenzmaterialien gehören Umbelliferon, Fluorescein, Fluorescein-Isothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylamin Fluorescein, Dansylchlorid und Phycoerythrin; zu geeigneten Lumineszenzmaterialien gehört Luminol; zu geeigneten Biolumineszenzmaterialien gehören Luciferase, Luciferin und Aequorin; und zu geeigneten radioaktiven Nukliden gehören ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In und ⁹⁹Tc.
Antikörper gegen Hpa2 oder gegen mit Hpa2 verwandtes Protein oder Fragmente davon können mit einem Therapeutikum oder einer Arzneistoffgruppierung konjugiert werden, um eine gegebene biologische Antwort zu modifizieren. Dabei soll das Therapeutikum bzw. die Arzneistoffgruppierung nicht als auf klassische chemische Therapeutika beschränkt verstanden werden. So kann es sich beispielsweise bei der Arzneistoffgruppierung um ein Protein oder Polypeptid handeln, das eine gewünschte biologische Aktivität besitzt. Zu solchen Proteinen können beispielsweise ein Toxin, wie z. B. Abrin, Ricin A, Pseudomonas-Exotoxin oder Diphtherietoxin; ein Protein, wie z. B. Tumornekrosefaktor, α-Interferon, β-Interferon, Nervenwachstumsfaktor, aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor, Gewebe-Plasminogenaktivator, ein thrombotisches Mittel oder ein antiangiogenes Agens, z. B. Angiostatin oder Endostatin; oder eine eine biologische Antwort modifizierende Substanz, wie z. B. ein Lymphokin, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor (granulocyte colony stimulating factor G-CSF), Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF) oder ein anderer Wachstumsfaktor, gehören.
Techniken zur Konjugation einer solchen therapeutischen Gruppierung mit Antikörpern sind allgemein bekannt, siehe z. B. Arnon et al., "Monoklonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Hrsg.), S. 243–56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2. Aufl.), Robinson et al. (Hrsg.), S. 623–53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibodies Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (Hrsg.), S. 475–506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (Hrsg.), S. 303–16 (Academic Press 1985) und Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibodies-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119–58 (1982).
Als Alternative kann man einen Antikörper mit einem zweiten Antikörper unter Bildung eines Antikörper-Heterokonjugats konjugieren, wie von Segal im US-Patent Nr. 4,676,980 beschrieben.
Ein Antikörper mit oder ohne damit konjugierte therapeutische Gruppierung läßt sich als Therapeutikum, das allein oder in Kombination mit cytotoxischem Faktor bzw. cytotoxischen Faktoren und/oder Cytokin(en) verabreicht wird, verwenden.
Polyklonale Antikörper lassen sich durch Stimulierung ihrer Produktion in einem geeignetem Wirtstier (z. B. Huhn, Maus, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen, Schaf, Ziege oder Affe) erzeugen, wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung in das Tier induziert wird. Falls notwendig, kann dabei ein Adjuvans zusammen mit dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung verabreicht werden. Die Antikörper lassen sich dann über ihre Bindung an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung aufreinigen.
Monoklonale Antikörper können aus Hybridomzellen produziert werden. Diese können durch Fusion von Myelomzellen und Milzzellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, unter Bildung einer unsterblichen Zellinie gebildet werden. Dabei handelt es sich um die allgemein bekannte Technik von Köhler & Milstein (Nature 256 52–55 (1975)).
Techniken zur Produktion monoklonaler und polyklonaler Antikörper, die an ein bestimmtes Protein binden, haben sich inzwischen im Fachgebiet gut entwickelt. Sie werden in Standardlehrbüchern der Immunologie, beispielsweise in Roitt et al., Immunology, zweite Auflage (1989), Churchill Livingstone, London, behandelt.
Neben ganzen Antikörpern umfaßt die vorliegende Erfindung deren Derivate, die zur Bindung an Polypeptide der vorliegenden Erfindung fähig sind. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung Antikörperfragmente sowie synthetische Konstrukte. Beispiele für Antikörperfragmente und synthetische Konstrukte finden sich bei Dougall et al. in Tibtech 12 372–379 (September 1994).
Zu Antikörperfragmenten gehören beispielsweise Fab-, F(ab')₂ und Fv-Fragmente (siehe Roitt et al. [supra]). Fv-Fragmente lassen sich modifizieren, so daß ein synthetisches Konstrukt, das als einkettiges (single chain) Fv (scFv)-Molekül bekannt ist, produziert wird. Dieses umfaßt einen Peptid-Linker, mit dem V_h- und V_l-Bereiche, die zur Stabilität des Moleküls beitragen, kovalent verbunden sind.
Zu weiteren synthetischen Konstrukten gehören CDR-Peptide. Dabei handelt es sich um synthetische Peptide, die Antigenbindungsdeterminanten umfassen. Ebenso können Peptidmimetika verwendet werden. Bei diesen Molekülen handelt es sich üblicherweise um in ihrer Konfirmation eingeschränkte organische Ringe, die die Struktur eines CDR-Loop imitieren und mit Antigen wechselwirkende Seitenketten enthalten.
Zu synthetischen Konstrukten gehören chimärische Moleküle. So liegen beispielsweise humanisierte (oder primatisierte) Antikörper oder Derivate davon im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Ein humanisierter Antikörper ist beispielsweise ein Antikörper mit menschlichen Gerüstbereichen, aber hypervariablen Bereichen aus Nagern.
Zu synthetischen Konstrukten gehören ebenso Moleküle, die eine kovalent verknüpfte Gruppierung umfassen, welche das Molekül mit einer gewissen wünschenswerten Eigenschaft neben der Antigenbindung versieht. So kann es sich beispielsweise bei der Gruppierung um eine Markierung (z. B. eines Fluoreszenz- oder radioaktive Markierung) oder einen pharmazeutischen Wirkstoff handeln.
Die Antikörper oder Derivate davon der vorliegenden Erfindung weisen eine große Vielfalt von Verwendungen auf. So können sie bei der Reinigung und/oder Identifizierung der Substanzen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Somit können sie in der Diagnostik verwendet werden. Sie können in Form eines Kits zum Screening auf die Polypeptide der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. Ebenso wird durch die Erfindung die Verwendung eines derartigen Antikörpers bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von mit erhöhter Heparanaseaktivität assoziierten Leiden, wie z. B. Krebs (insbesondere Metastasen), Krankheiten des ZNS und neurodegenerative Krankheiten, Entzündung und bei Herz/Kreislauf-Erkrankungen, wie z. B. Restenose nach Angioplastie und Atherosklerose, bereitgestellt. Von den zur Verfügung stehenden Expresionsdaten (siehe 7) scheint es so zu sein, daß es sich bei Bauchspeicheldrüsenkrebs um ein Leiden handeln kann, das mit gegen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung erzeugten Antikörpern behandelt werden könnte.
Ebenso werden durch die vorliegende Erfindung Antigene/immunogene Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptide bereitgestellt. Derartige Fragmente sind beispielsweise:
Dabei können die Fragmente allein, in Form einer gereinigten oder isolierten Präparation oder als Teil eines Gemischs daraus bereitgestellt werden.
Ebenso werden durch die Erfindung eine ein oder mehrere derartige Fragmente umfassende Antigenzusammensetzung sowie ein Kit zur Verwendung beim Nachweis des Heparanase-ähnlichen Proteins der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, wobei der Kit ein oder mehrere derartige Fragmente umfaßt. Daneben lassen sich die Fragmente zur Induktion einer Immunantwort gegen das Heparanase-ähnlichen Proteins der vorliegenden Erfindung verwenden. Somit wird durch die Erfindung auch die Verwendung solcher Fragmente in der Medizin bereitgestellt.
Durch die vorliegende Erfindung wird ebenso eine Zusammensetzung, die zum Hervorrufen einer Immunantwort in einem Individuum fähig ist und die ein solches Fragment umfaßt, bereitgestellt. Geeigneterweise handelt es sich bei der Zusammensetzung um eine Impfstoffzusammensetzung, die gegebenenfalls ein oder mehrere geeignete Adjuvantien umfaßt. Bei einer solchen Impfstoffzusammensetzung kann es sich entweder um eine prophylaktische oder eine therapeutische Impfstoffzusammensetzung handeln. Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen können ein oder mehrere Adjuvantien enthalten. Zu im Fachgebiet allgemein bekannten Beispielen gehören anorganische Gele, wie z. B. Aluminiumhydroxid, sowie Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie z. B. inkomplettes Freundsches Adjuvans. Weitere geeignete Adjuvantien sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Ebenso werden durch die vorliegende Erfindung die Verwendung eines solchen Fragments bei der Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung, vorzugsweise eines Impfstoffs, sowie die Verwendung einer solchen immunogenen Zusammensetzung bei der Induktion einer Immunantwort in einem Individuum bereitgestellt.
Hpa2 oder mit Hpa2 verwandte Proteine lassen sich in einem Immuntest nachweisen. In einer Ausführungsform wird dabei ein Immuntest durchgeführt, indem man eine Probe aus einem zu testenden Individuum mit einem Anti-Hpa2-Antikörper unter solchen Bedingungen, daß eine immunspezifische Bindung stattfinden kann, wenn das Hpa2 vorhanden ist, in Kontakt bringt und die Menge der eventuellen immunspezifischen Bindung durch den Antikörper nachweist oder mißt. Anti-Hpa2-Antikörper lassen sich mit den hier gelehrten Verfahren und Techniken produzieren.
Hpa2 kann in geeigneten Tests, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, kompetitive und nichtkompetitive Testsysteme unter Verwendung von Techniken, wie z. B. Western-Blots sowie "Sandwich"-Immuntests unter Verwendung von Antikörpern gegen ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, wie hier beschrieben, gehören, sondieren.
In einer Ausführungsform kann die Bindung von Antikörper in Gewebeschnitten zum Nachweis einer anormalen Hpa2-Lokalisierung oder eines anormalen Hpa2-Niveaus verwendet werden. In einer spezifischen Ausführungsform läßt sich ein Antikörper gegen ein Hpa2 zum Testen einer Gewebeprobe aus einem Individuum auf das Niveau des Hpa2 verwenden, wobei ein anormales Hpa2-Niveau ein mit erhöhter Heparanaseaktivität assoziiertes Leiden, wie z. B. Krebs (insbesondere Metastasen), Krankheiten des ZNS und neurodegenerative Krankheiten, Entzündung sowie bei Herz/Kreislauf-Krankheiten, wie z. B. Restenose nach Angioplastie und Atherosklerose, anzeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Bauchspeicheldrüsenkrebs mit gegen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung erzeugten Antikörpern nachgewiesen. Unter einem "anormalen Niveau", wie es hier verwendet wird, versteht man ein Niveau, das im Vergleich mit dem Niveau in einem Individuum, das frei von dem betreffenden Krankheitszustand ist, oder einem Referenzniveau erhöht oder erniedrigt ist. Falls gewünscht, läßt sich der Vergleich mit einer passenden Probe aus dem gleichen Individuum, die einem Teil des Körpers, der von dem Leiden nicht betroffen ist, entnommen wurde, durchführen.
Es lassen sich alle geeigneten Immuntests verwenden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, kompetitiver und nichtkompetitiver Testsysteme unter Verwendung von Techniken, wie z. B. Western-Blots, Radioimmuntests, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), "Sandwich"-Immuntests, Immunpräzipitationstests, Präzipitinreaktionen, Geldiffusionspräzipitinreaktionen, Immundiffusionstests, Agglutinierungstests, Komplementfixierungstests, immunradiometrische Tests, Fluoreszenzimmuntests sowie Protein-A-Immuntests.
Beispielsweise läßt sich Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein in einer Flüssigkeitsprobe (z. B. Liquor, Blut, Urin oder Gewebehomogenisat) mittels eines aus zwei Schritten bestehenden Sandwich-Tests nachweisen. Dabei wird im ersten Schritt ein Einfangreagens (z. B. ein Anti-Hpa2-Antikörper) zum Einfangen des Hpa2 verwendet. Das Einfangreagens kann gegebenenfalls auf einer Festphase immobilisiert sein. Im zweiten Schritt wird ein direkt oder indirekt markiertes Nachweisreagens zum Nachweis des eingefangenen Hpa2 eingesetzt.
Falls gewünscht, können auch ein für ein Hpa2 codierendes Gen, ein verwandtes Gen oder verwandte Nukleinsäuresequenzen oder -teilsequenzen, einschließlich komplementäre Sequenzen in Hybridisierungstests eingesetzt werden. Dabei kann als Hybridisierungssonde ein für ein Hpa2 codierendes Nukleotid oder Teilsequenzen davon, die wenigstens acht Nukleotide, vorzugsweise wenigstens zwölf Nukleotide und am meisten bevorzugt wenigstens 15 Nukleotide umfassen, verwendet werden. Vorzugsweise wird dabei eine Sonde verwendet, die unter den gewählten Bedingungen nicht an Heparanase codierende Sequenzen hybridisiert. Hybridisierungstests lassen sich zum Nachweis, zur Prognose, Diagnose oder Überwachung von Leiden, Erkrankungen oder Krankheitszuständen, die mit der anormalen Expression von für Hpa2 codierenden Genen assoziiert sind, oder zur differentiellen Diagnose von Individuen mit Anzeichen oder Symptomen, die auf ein mit erhöhter Heparanaseaktivität assoziiertes Leiden schließen lassen, verwenden. Dabei läßt sich insbesondere ein solcher Hybridisierungstest mit einem Verfahren durchführen, bei dem eine nukleinsäurehaltige Probe eines Individuums mit einer Nukleinsäuresonde, die zur Hybridisierung an eine für ein Hpa2 codierende DNA oder RNA fähig ist, in Kontakt gebracht wird, und zwar unter solchen Bedingungen, daß eine Hybridisierung erfolgen kann, und eine sich eventuell ergebende Hybridisierung nachgewiesen oder gemessen wird. Nukleotide lassen sich zur Therapie von Individuen mit einem mit erhöhter Heparanaseaktivität assoziierten Leiden verwenden.
Ebenso werden durch die Erfindung einen Anti-Hpa2-Antikörper umfassende Kits bereitgestellt. Ein solcher Kit kann dabei zusätzlich gegebenenfalls einen oder mehrere der folgenden Bestandteile umfassen: (1) Anweisungen zur Verwendung des Anti-Hpa2-Antikörpers zur Diagnose, Prognose, therapeutischen Überwachung oder beliebigen Kombination dieser Anwendungen; (2) einen markierten Bindungspartner zum Antikörper; (3) eine Festphase (wie z. B. einen Reagensstreifen), auf dem der Anti-Hpa2-Antikörper immobilisiert ist; und (4) ein Etikett oder einen Beipackzettel, der die gesetzmäßige Zulassung für eine diagnostische, prognostische oder therapeutische Verwendung oder eine beliebige Kombination daraus anzeigt. Falls kein markierter Bindungspartner zum Antikörper bereitgestellt wird, kann der Anti-Hpa2-Antikörper selbst mit einem nachweisbaren Marker, z. B. einer Chemilumineszenz-, enzymatischen, Fluoreszenz- oder radioaktiven Gruppierung, markiert sein.
Ebenso wird durch die Erfindung ein eine Nukleinsäuresonde, die zur Hybridisierung an für ein Hpa2 codierende RNA fähig ist, umfassender Kit bereitgestellt. In einer spezifischen Ausführungsform umfaßt ein Kit in einem oder mehreren Behältern ein Primerpaar (z. B. jeweils im Größenbereich von 6–30 Nukleotiden, stärker bevorzugt 10–30 Nukleotiden und noch stärker bevorzugt 10–20 Nukleotiden), das unter entsprechenden Reaktionsbedingungen zu einem Priming der Amplifikation wenigstens eines Teils einer für ein Hpa2 codierenden Nukleinsäure, wie z. B. mittels Polymerasekettenreaktion (siehe z. B. Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), Ligasekettenreaktion (siehe EP 320,308 ), der Verwendung von Qβ-Replikase, der cyclischen Sondenreaktion oder anderer im Fachgebiet bekannter Verfahren, führen kann.
Ebenso werden Kits bereitgestellt, die den Nachweis mehrer Hpa2 oder mit Hpa2 verwandter Proteine oder mehrerer Nukleinsäuren, die jeweils für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein codieren, berücksichtigen. Ferner kann ein Kit gegebenenfalls eine vorbestimmte Menge eines isolierten Hpa2 oder einer für ein Hpa2 codierenden Nukleinsäure beispielsweise zur Verwendung als Standard oder Kontrolle umfassen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft isolierte oder rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen biologisch aktiven Teil davon codieren, ebenso wie Nukleinsäuremoleküle, die der Verwendung als Hybridisierungssonden genügen, um Nukleinsäuremoleküle, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren, sowie Fragmente solcher Nukleinsäuremoleküle, die sich zur Verwendung als PCR-Primer zur Amplifikation oder Mutation von Nukleinsäuremolekülen eignen, zu identifizieren. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül", wie er hier verwendet wird, soll dabei DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) sowie mit Nukleotidanalogen erzeugte Analoge der DNA bzw. RNA mit umfassen. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, liegt jedoch vorzugsweise als Doppelstrang-DNA vor.
In einem weiteren Aspekt wird durch die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, umfassend oder bestehend aus einer Sequenz, bei der es sich um:

(i) eine bei Rest 601 oder 631 bis 2376 in 1 (Seq. ID Nr. 1), Rest 601 oder 631 bis 2202 in 2 (Seq. ID Nr. 3), oder bei Rest 601 oder 631 bis 2040 in 3 (Seq. ID Nr. 5) gezeigte DNA-Sequenz oder ihr RNA-Äquivalent, unter Einschluß oder Ausschluß der gesamten 5' und/oder 3' dazu liegenden Sequenz oder eines Teils davon;
(ii) eine Sequenz, die zu einer der Sequenzen in (i) oder (iii) komplementär ist;
(iii) eine Sequenz, die für das gleiche Protein oder Polypeptid codiert wie die Sequenzen in a)–c), wie hier beschrieben;
(iv) eine in 1, 2 bzw. 3 (SEQ ID Nr. 1, 3 bzw. 5) gezeigte Sequenz handelt.

In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuren die in 1, 2 bzw. 3 (SEQ ID Nr. 1, 3 bzw. 5) dargestellten Nukleinsäuresequenzen oder bestehen daraus.
Bei einem "isolierten" Nukleinsäuremolekül handelt es sich um ein Nukleinsäuremolekül, das von anderen Nukleinsäuremolekülen, die in der natürlichen Quelle des Nukleinsäuremoleküls vorhanden sind, getrennt ist. Vorzugsweise ist dabei ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül frei von Sequenzen (vorzugsweise proteincodierenden Sequenzen), die in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, die Nukleinsäure natürlicherweise flankieren (d. h. am 5'- und 3'-Ende der Nukleinsäure lokalisierte Sequenzen). So kann beispielsweise in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kB, 4 kB, 3 kB, 2 kB, 1 kB, 0,5 kB oder 0,1 kB Nukleotidseqenzen, die das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren, enthalten. Zudem kann ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie z. B. ein cDNA-Molekül, weitgehend frei von anderem zellulären Material oder von Kulturmedium, wenn es mit rekombinanten Techniken hergestellt wurde, oder weitgehend frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde, sein. Dabei umfaßt der Begriff "isoliert", wie er hier verwendet wird, in Bezug auf ein Nukleinsäuremolekül nicht ein isoliertes Chromosom. Vorzugsweise liegen die isolierten Nukleotide der vorliegenden Erfindung nicht in einem Gel, (d. h. einem Polyacrylamid-Trenngel) oder einer anderen Matrix vor.
Spezifische Ausführungsformen für die Klonierng eines für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid codierenden Gens sind nachfolgend beispielhaft und ohne darauf beschränkt zu sein, aufgeführt.
Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung, einschließlich DNA und RNA, die eine für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid codierende Sequenz umfassen, können mit im Fachgebiet bekannten Verfahren, wie z. B. mit herkömmlichen chemischen Ansätzen oder der Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR), synthetisiert werden. Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung gestatten ebenso die Identifizierung und Klonierung des für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid codierenden Gens, beispielsweise durch Screening von cDNA-Bibliotheken, genomischen Bibliotheken oder Expressionsbibliotheken.
Für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid codierende Oligonukleotide können markiert und an cDNA- und genomische DNA-Bibliotheken enthaltende Filter hybridisiert werden. Dabei identifizieren Oligonukleotide für unterschiedliche Peptide aus den gleichen Proteinen häufig die gleichen Mitglieder der Bibliothek. Die cDNA- und genomischen DNA-Bibliotheken können aus einer beliebigen geeigneten oder gewünschten Säugerspezies, beispielsweise aus Mensch, gewonnen werden.
Eine für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid codierende Nukleotidsequenz umfassende Nukleotidsequenzen eignen sich aufgrund ihrer Fähigkeit zur selektiven Hybridisierung mit komplementären Abschnitten von andere mit Hpa2 verwandte Proteine codierenden Genen. Je nach Anwendung können verschiedene Hybridisierungsbedingungen eingesetzt werden, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die wenigstens 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder 99% identisch oder 100% identisch zur Sequenz eines für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid codierenden Nukleotids sind. Dabei kann die Ähnlichkeit einer gegebenen Sequenz zu Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Polypeptid über seine gesamte Länge oder über ein beliebiges Fragment davon bestimmt werden. Vorzugsweise besteht die Sequenz oder das Fragment davon aus wenigstens 10 Nukleotiden (stärker bevorzugt, aus wenigstens 15 Nukleotiden, aus wenigstens 20 Nukleotiden, aus wenigstens 25 Nukleotiden, aus wenigstens 40 Nukleotiden, aus wenigstens 50 Nukleotiden, aus wenigstens 60 Nukleotiden, aus wenigstens 70 Nukleotiden, aus wenigstens 80 Nukleotiden, aus wenigstens 90 Nukleotiden, aus wenigstens 100 Nukleotiden, aus wenigstens 125 Nukleotiden oder aus wenigstens 150 Nukleotiden).
Für einen hohen Selektivitätsgrad werden zur Ausbildung der Duplexe relativ stringente Bedingungen verwendet, wie beispielsweise Niedrigsalz- oder Hochtemperatur bedingungen. Unter "hochstringenten Bedingungen", wie hier verwendet, versteht man die Hybridisierung an filtergebundener DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C sowie Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C, (Ausubel F. M. et al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., New York, auf S. 2.10.3; hiermit durch Bezugnahme vollinhaltlich aufgenommen). Bei einigen Anwendungen werden für die Duplexbildung weniger stringente Bedingungen benötigt. Unter "mäßig stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, versteht man das Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel et al., 1989, supra). Hybridisierungsbedingungen können auch durch Zugabe steigender Mengen an Formamid zur Destabilisierung des Hybridduplexes stringenter gemacht werden. Somit lassen sich bestimmte Hybridisierungsbedingungen leicht manipulieren und werden allgemein je nach den gewünschten Ergebnissen gewählt. Im allgemeinen sind zweckmäßige Hybridisierungstemperaturen in Gegenwart von 50% Formamid: 42°C für eine Sonde, die 95 bis 100% identisch mit dem Fragment eines für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein codierenden Gens ist, 37°C für 90 bis 95% Identität sowie 32°C für 70 bis 90% Identität.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Hybridisierungsbedingungen wie folgt:

1. Sondenvollängen-Hpa2-cDNA, durch "Random Priming" radioaktiv markiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der Nukleinsäure, an die die Sonde hybridisiert wird, um RNA.
2. Eine Stunde Hybridisieren bei 68°C in ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech Laboratories, Inc., 1999). Dieser Schritt kann auch bei 64, 65, 66, 67°C über einen Zeitraum von 0,5, 1,5 oder 2 Stunden durchgeführt werden.
3. 40minütiges Waschen (2 ×) bei 20°C mit Waschlösung 1 (2 × SSC, 0,05% SDS). Dieser Schritt kann auch bei 19, 18, 17, 16°C oder Raumtemperatur über einen Zeitraum von 20, 30, 45, 60 oder 190 Minuten mit 2,5 × SSC oder 3 × SSC sowie 0,04%, 0,03% oder 0,02% SDS durchgeführt werden.
4. 40minütiges Waschen (2 ×) bei 50°C mit Waschlösung 2 (0,1 × SSC, 0,1% SDS). Dieser Schritt kann auch bei 40, 42, 45 oder 47°C über einen Zeitraum von 20, 30, 45, 60 oder 190 Minuten mit 0,15 × SSC oder 0,2 × SSC und 0,03%, 0,05% oder 0,07% SDS durchgeführt werden.

Bei der Herstellung genomischer Bibliotheken werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Protein insgesamt oder teilweise codieren. Dabei können alle für die Herstellung von DNA-Fragmenten geeigneten Verfahren in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. So kann die DNA beispielsweise an spezifischen Stellen mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten werden. Als Alternative kann man DNAse in Gegenwart von Mangan zur Fragmentierung der DNA verwenden, oder die DNA kann physikalisch geschert werden, wie beispielsweise durch Ultraschallbehandlung. Die DNA-Fragmente lassen sich dann nach ihrer Größe mit Standardtechniken, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Säulenchromatographie und Saccharosegradientenzentrifugation, trennen. Die DNA-Fragmente können dann in geeignete Vektoren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Plasmiden, Cosmiden, Bakteriophagen Lambda oder T₄ sowie YAC (yeast artificial chromosome), inseriert werden (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Glover, D. M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Bd. I, II; Ausubel F. M. et al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & sons, Inc., New York). Die genomische Bibliothek kann einem Screening durch Nukleinsäurehybridisierung an eine markierte Sonde unterzogen werden (Benton und Davis, 1977, Science 196: 180; Grunstein und Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961).
Auf Grundlage der vorliegenden Beschreibung können die genomischen Bibliotheken einem Screening mit markierten degenerierten Oligonukleotidsonden, die der Aminosäuresequenz eines beliebigen Peptids von Hpa2 oder einem mit Hpa2 verwandten Protein entsprechen, unterzogen werden, wobei im Fachgebiet allgemein bekannte optimale Ansätze verwendet werden. Dabei bestehen alle verwendeten Proben aus wenigstens 10 Nukleotiden, aus wenigstens 15 Nukleotiden, aus wenigstens 20 Nukleotiden, aus wenigstens 25 Nukleotiden, aus wenigstens 30 Nukleotiden, aus wenigstens 40 Nukleotiden, aus wenigstens 50 Nukleotiden, aus wenigstens 60 Nukleotiden, aus wenigstens 70 Nukleotiden, aus wenigstens 80 Nukleotiden oder aus wenigstens 100 Nukleotiden. Vorzugsweise weist eine Sonde ein Menge von 10 Nukleotiden oder mehr und stärker bevorzugt 15 Nukleotiden oder mehr auf.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Antisense-Nukleinsäuremoleküle, d. h. Moleküle, die zu einer für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden Sense-Nukleinsäure komplementär sind, beispielsweise zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder zu einer mRNA-Sequenz komplementär sind. dementsprechend kann eine Antisense-Nukleinsäure eine Wasserstoffbrückenbindung mit einer Sense-Nukleinsäure eingehen. Die Antisense-Nukleinsäure kann zu einem gesamten codierenden Strang oder lediglich zu einem Teil davon, z. B. dem gesamten proteincodierenden Bereich (oder offenen Leseraster) oder einem Teil davon, komplementär sein. Ein Antisense-Nukleinsäuremolekül kann "antisense" (gegensinnig) zu einem gesamten nichtcodierenden Bereich des codierenden Strangs einer für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden Nukleinsequenz oder zu einem Teil davon sein. Bei den nichtcodierenden Bereichen ("5'- und 3'-nichttranslatierte Bereiche") handelt es sich um die 5'- und 3'-Sequenzen, die den codierenden Bereich flankieren und nicht in Aminosäuren translatiert werden.
Ein Antisense-Oligonukleotid kann beispielsweise eine Menge von etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 oder mehr Nukleotiden aufweisen. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure läßt sich mit chemischen Synthese- und enzymatischen Ligationsreaktionen unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahrensweisen konstruieren. So läßt sich beispielsweise eine Antisense-Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) unter Verwendung natürlich vorkommender Nukleotide oder verschiedener modifizierter Nukleotide, die zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen der Antisense- und der Sense-Nukleinsäure ausgebildeten Duplexes vorgesehen sind, chemisch synthetisieren, wobei z. B. Phosphorothioatderivate und Acridin-substituierte Nukleotide eingesetzt werden können. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, umfassen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thio uracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (Acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Als Alternative kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors, in den einen Nukleinsäure in Antisense-Orientierung subkloniert wurde, produziert werden (d. h. von der inserierten Nukleinsäure transkribierte RNA liegt in einer Antisense-Orientierung zu einer interessierenden Zielnukleinsäure vor, wie im folgenden Unterabschnitt weiter beschrieben).
Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden typischerweise einem Individuum verabreicht oder in situ erzeugt, so daß sie mit einer ein ausgewähltes erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden zellulären mRNA und/oder genomischen DNA hybridisieren oder daran binden, um dadurch die Expression zu hemmen, beispielsweise durch Hemmung der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann über herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplexes oder beispielsweise im Fall eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, das an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix erfolgen. Ein Beispiel für einen Verabreichungsweg für erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremoleküle umfaßt die direkte Injektion an einer Gewebestelle. Als Alternative können Antisense-Nukleinsäuremoleküle zum Abzielen auf ausgewählte Zellen modifiziert und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung lassen sich Antisense-Moleküle beispielsweise so modifizieren, daß sie spezifisch an auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimierte Rezeptoren oder Antigene bindet, beispielsweise durch Verknüpfung der Antisense-Nukleinsäuremoleküle mit Peptiden oder Antikörpern, die an Zelloberflächenrezeptoren oder -antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle können auch unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren Zellen zugeführt werden. Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen der Antisense-Moleküle zu erzielen, sind Vektorkonstrukte bevorzugt, bei denen das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter die Kontrolle eines starken pol-II- oder pol-III-Promotors gestellt wird.
Bei einem erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremolekül kann es sich um ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül handeln. Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische Doppelstranghybride mit komplementärer RNA aus, bei denen im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625–6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimärisches RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215: 327–330) umfassen.
Die Erfindung umfaßt ebenso Ribozyme. Bei Ribozymen handelt es sich um katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die zur Spaltung einer Einzelstrang-Nukleinsäure, wie z. B. einer mRNA, zu der sie einen komplementären Bereich aufweisen, fähig sind. Somit lassen sich Ribozyme (z. B. "Hammerhead"-Ribozyme (beschrieben bei Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334: 585–591)) zur katalytischen Spaltung von mRNA-Transkripten einsetzen, um dadurch die Translation des von der mRNA codierten Proteins zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für ein ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierendes Nukleinsäuremolekül läßt sich auf Grundlage der Nukleotidsequenz einer hier offenbarten cDNA konstruieren. So läßt sich beispielsweise ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruieren, bei dem die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zur zu spaltenden Nukleotidsequenz in einem US-Patent Nr. 4,987,071 von Cech et al. und einem US-Patent Nr. 5,116,742 von Cech et al. ist. Als Alternative läßt sich eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierende mRNA zur Selektion einer katalytischen RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einer Ansammlung von RNA-Molekülen verwenden. Siehe z. B. Bartel und Szostak (1993) Science 261: 1411–1418.
Die Erfindung umfaßt ebenso Nukleinsäuremoleküle, die dreifach helikale Strukturen bilden. So läßt sich beispielsweise die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids durch Abzielen auf Nukleotidsequenz, die komplementär zum regulatorischen Bereich des das Polypeptid codierenden Gens (z. B. Promotor und/oder Enhancer) sind, unter Ausbildung von dreifachhelikalen Strukturen, die die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern, hemmen. Siehe allgemein Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569–84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27–36; und Maher (1992) Bioassays 14(12): 807–15.
In verschiedenen Ausführungsformen lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle an der Basengruppierung, der Zuckergruppierung oder dem Phosphatgrundgerüst zur Verbesserung beispielsweise der Stabilität, Hybridisierung oder Löslichkeit des Moleküls modifizieren. So läßt sich beispielsweise das Desoxyribosephosphatgrundgerüst der Nukleinsäuren zur Erzeugung von Peptidenukleinsäuren modifizieren (siehe Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5–23). Dabei beziehen sich die Begriffe "Peptidnukleinsäuren" bzw. "PNAs", wie sie hier verwendet werden, auf Nukleinsäureimitate, z. B. DNA-Imitate, bei denen das Desoxyribosephosphatgrundgerüst durch ein Pseudopeptidgrundgerüst ersetzt ist und lediglich die vier natürlichen Nukleobasen erhalten sind. Es konnte gezeigt werden, daß das neutrale Grundgerüst der PNAs die spezifische Hybridisierung an DNA und RNA unter Bedingungen niedriger Ionenstärke gestattet. Die Synthese von PNA-Oligomeren läßt sich unter Verwendung von Standardvorschriften der Festphasenpeptidsynthese, wie bei Hyrup et al. (1996), supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670–675 beschrieben, durchführen.
PNAs lassen sich bei therapeutischen und diagnostischen Anwendungen einsetzen. So können PNAs beispielsweise als Antisense- oder Antigen-Agentien für die sequenzspezifische Modulation der Genexpression, beispielsweise durch Induktion eines Transkriptions- oder Translationsstops oder durch Hemmung der Replikation, verwendet werden. PNAs lassen sich auch beispielsweise bei der Analyse einzelner Basenpaarmutationen in einem Gen durch beispielsweise PNA-gesteuertes "PCR clamping", als künstliche Restriktionsenzyme bei der Verwendung in Kombination mit anderen Enzymen, z. B. SI-Nukleasen (Hyrup (1996), supra, oder als Sonden oder Primer für die DNA-Sequenz und Hybridisierung (Hyrup (1996), supra; Per-y-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670–675) einsetzen.
In einer weiteren Ausführungsform können PNAs modifiziert werden, um beispielsweise ihre Stabilität oder Zellaufnahme zu verbessern, indem lipophile oder andere Helfergruppe an PNA gebunden werden, PNA-DNA-Chimären ausgebildet werden oder indem Liposomen oder andere im Fachgebiet bekannte Techniken zur Arzneistoffzuführung verwendet werden. So lassen sich beispielsweise PNA-DNA-Chimären erzeugen, in denen die vorteilhaften Eigenschaften von PNA und DNA vereinigt sind. Derartige Chimären gestatten die Wechselwirkung von DNA-Erkennungsenzymen, z. B. RNAse H und DNA-Polymerasen, mit dem DNA-Anteil, während der PNA-Anteil für eine hohe Bindungsaffinität und Spezifität sorgen würde. PNA-DNA-Chimären können unter Verwendung von Linkern entsprechender Länge, die hinsichtlich Basenstapelung, Anzahl der Bindungen zwischen den Nukleobasen und Orientierung ausgewählt werden, verknüpfen (Hyrup (1996), supra). Die Synthesie von PNA-DNA-Chimären läßt sich wie bei Hyrup (1996), supra, und Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17): 3357–63 beschrieben durchführen. So kann beispielsweise eine DNA-Kette auf einem festen Träger unter Verwendung der Standardchemie zur Phosphoramiditkupplung und modifizierter Nukleosidanaloge synthetisiert werden. Verbindungen wie beispielsweise 5'-(4-Methoxytrityl)amino-5'-desoxythymidinphosphoramidit können als Brücke zwischen der PNA und dem 5'-Ende der DNA eingesetzt werden (Mag et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 5973–88). PNA-Monomere werden dann schrittweise gekoppelt, wodurch ein chimärisches Molekül mit einem 5'-PNA-Segment und einem 3'-DNA-Segment produziert wird (Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17): 3357–63). Als Alternative lassen sich chimärische Moleküle mit einem 5'-DNA-Segment und einem 3'-PNA-Segment synthetisieren (Peterser et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119–11124).
In weiteren Ausführungsformen kann das Oligonukleotid andere angehängte Gruppen, wie z. B. Peptide (z. B. zum Abzielen auf Wirtszellrezeptoren in vivo), oder Agentien, die den Transport durch die Zellmembran (siehe z. B. Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553–6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648–652; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/09810) oder die Blut-Hirn-Schranke (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/10134) erleichtern, enthalten. Darüber hinaus können Oligonukleotide mit die Hybridisierung auslösenden Spaltungsagentien (siehe z. B. Krol et al. (1988) Bio/Techniques 6: 958–976) oder interkalierenden Agentien (siehe z. B. Zon (1988) Pharm. Res. 5: 539–549) modifiziert werden. Hierzu kann das Oligonukleotid an ein anderes Molekül, z. B. ein Peptid, einen die Hybridisierung auslösenden Quervernetzer, ein Transportagens, ein die Hybridisierung auslösendes Spaltungsagens usw., konjugiert werden.
In einer Ausführungsform wird ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine bei den Resten 727 bis 2376 in 1 (Seq. ID Nr. 1), den Resten 727 bis 2202 in 2 (Seq. ID Nr. 3) oder den Resten 727 bis 2040 in 3 (Seq. ID Nr. 5) gezeigte Sequenz umfaßt oder daraus besteht.
Der Begriff Identität läßt sich auch zur Beschreibung der Ähnlichkeit zwischen zwei individuellen DNA-Sequenzen verwenden. Dabei handelt es sich bei dem Programm "bestfit" (Smith und Waterman, Advances in applied Mathematics, 482–489 (1981)) um ein Beispiel einer Art von Computersoftware, die zum Auffinden des Segments mit der besten Ähnlichkeit zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen verwendet wird, während das Programm GAP die vergleichende Gegenüberstellung von Sequenzen entlang ihrer gesamten Länge ermöglicht und die optimale Gegenüberstellung durch Einfügen von Abstandhaltern in einer der Sequenzen je nach Gegebenheit findet. Dabei ist es bevorzugt, wenn Sequenzen, die eine weitgehende Identität mit einer der Sequenzen aus (i), (ii) und (iii) zeigen, beispielsweise wenigstens 50%, wenigstens 75% oder wenigstens 90% oder 95% Sequenzidentität aufweisen.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können von einer großen Vielfalt an Nukleinsäuremolekülen unter Berücksichtigung der allgemein bekannten Degeneriertheit des genetischen Codes codiert werden. Dabei liegen alle diese Moleküle im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Sie lassen sich in Vektoren inserieren und klonieren, so daß große Mengen an DNA oder RNA für weitere Untersuchungen bereitgestellt werden. Geeignete Vektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, um die Expression von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung mit dem Fachmann bekannten Techniken zu ermöglichen.
Der Begriff "RNA-Äquivalent" in der obigen Verwendung deutet an, daß ein gegebenes RNA-Molekül eine Sequenz aufweist, die zu der eines gegebenen DNA-Moleküls kom plementär ist, und zwar unter Berücksichtigung der Tatsache, daß in RNA im genetischen Code "T" durch "U" ersetzt ist. Das Nukleinsäuremolekül kann in isolierter, rekombinanter oder chemisch synthetisierter Form vorliegen.
Techniken zur Klonierung, Expression und Reinigung von Proteinen und Polypeptiden sind dem Fachmann allgemein bekannt. DNA-Konstrukte lassen sich leicht mit im Fachgebiet bekannten Verfahren erzeugen. Diese Techniken sind beispielsweise aus J. Sambrook et al., Molecular Cloning 2^nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989); in Old & Primrose [Principles of Gene Manipulation 5. Auflage, Blackwell Scientific Publications (1994)]; und in Stryer [Biochemistry 4. Auflage, W H Freeman and Company (1995)] bekannt. Modifikationen von DNA-Konstrukten und den exprimierten Proteinen, wie beispielsweise das Hinzufügen von Promotoren, Enhancern, Signalsequenzen, Leitsequenzen, Translationsstart- und -stopsignalen und Bereichen zur Steuerung der DNA-Stabilität bzw. das Hinzufügen von Fusionspartnern, können dann leichter durchgeführt werden.
In der Regel wird das DNA-Konstrukt in einen Vektor inseriert, der von einem Phagen oder Plasmid abgeleitet sein kann. Die Expression des Proteins wird durch die Transformation oder Transfektion des Vektors in eine Wirtszelle erreicht, die eukaryontischen oder prokaryontischen Ursprungs sein kann. Derartige Vektoren und geeignete Wirtszellen bilden noch weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung.
Die Kenntnis der Nukleinsäurestruktur läßt sich zur Erzeugung von Antikörpern und für die Gentherapie verwenden. Techniken dazu sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Durch Verwendung geeigneter Expressionssysteme können Polypeptide der vorliegenden Erfindung in glycosylierter oder nichtglycosylierter Form exprimiert werden. Nichtglycosylierte Formen können durch Expression in prokaryontischen Wirten, wie z. B. E. coli, produziert werden.
N-terminales Methionin umfassende Polypeptide können unter Verwendung bestimmter Expressionssysteme produziert werden, während bei anderen Systemen dem reifen Polypeptid dieser Rest fehlt. Bevorzugte Techniken zur Klonierung, Expression und Reinigung einer Substanz der vorliegenden Erfindung sind nachfolgend zusammengefaßt:
Polypeptide können native oder unter denaturierenden Bedingungen mit anschließender Rückfaltung hergestellt werden. Baculovirale Expressionsvektoren umfassen sekretorische Plasmide (wie z. B. pACGP67 von Pharmingen), die eine im Leseraster klonierte Epitop-Tag-Sequenz (z. B. myc, V5 oder His) aufweisen können, um den Nachweis zu unterstützen und die nachfolgende Reinigung des Proteins zu gestatten. Säugerexpressionsvektoren können pCDNA3 und pSecTag (jeweils von Invitrogen), und pREP9 und pCEP4 (Invitrogen) umfassen. Zu E. coli-Systemen gehören die pBad-Serie (mit His-Tag – Invitrogen) und die pGex-Serie (Pharamacia).
Neben für Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung codierenden Nukleinsäuremolekülen, die hier als "codierende" Nukleinsäuremoleküle bezeichnet werden, umfaßt die vorliegende Erfindung auch dazu komplementäre Nukleinsäuremoleküle. Somit liegen beispielsweise beide Stränge eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls im Rahmen der vorliegenden Erfindung (gleichgültig ob sie miteinander assoziiert sind oder nicht). Ebenso sind mRNA-Moleküle und komplementäre DNA-Moleküle (z. B. cDNA-Moleküle) umfaßt.
Nukleinsäuremoleküle, die an eines der oben diskutierten Nukleinsäuremoleküle hybridisieren können, werden ebenso durch die vorliegende Erfindung abgedeckt. Derartige Nukleinsäuremoleküle werden hier als "hybridisierende" Nukleinsäuremoleküle bezeichnet. Hybridisierende Nukleinsäuremoleküle können sich beispielsweise als Sonden oder Primer eignen.
Wünschenswerterweise weisen solche hybridisierenden Moleküle eine Länge von wenigstens 10 Nukleotiden und vorzugsweise von wenigstens 25 oder wenigstens 50 Nukleotiden auf. De hybridisierenden Nukleinsäuremoleküle hybridisieren vorzugsweise spezifisch an Nukleinsäuren im Rahmen von (i), (ii), (iii), (iv) oder (v) oben.
Dabei hybridisieren die hybridisierenden Moleküle wünschenswerterweise an solche Moleküle unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen besteht darin, daß die versuchte Hybridisierung bei einer Temperatur von etwa 35°C bis etwa 65°C unter Verwendung einer etwa 0,9 molaren Salzlösung durchgeführt wird. Allerdings ist es dem Fachmann möglich, derartige Bedingungen je nach Gegebenheit zu variieren, um Variablen, wie beispielsweise Sondenlänge, Basenzusammensetzung, Art der vorhandenen Ionen usw. zu berücksichtigen.
Bei der Manipulation das Protein codierender DNA handelt es sich um eine besonders leistungsfähige Technik sowohl zur Modifikation von Proteinen als auch zur Erzeugung großer Mengen an Protein für Reinigungszwecke. Dies kann die Verwendung von PCR-Techniken zur Amplifikation einer gewünschten Nukleinsäuresequenz beinhalten. Somit lassen sich die hier bereitgestellten Sequenzdaten zur Konstruktion von Primern zur Verwendung bei der PCR verwenden, so daß auf eine gewünschte Sequenz abgezielt werden kann, die dann stark amplifiziert wird.
Typischerweise sind Primer wenigstens fünf Nukleotide und im allgemeinen wenigstens zehn Nukleotide (z. B. 15 bis 25 Nukleotide) lang. In einigen Fällen können Primer mit einer Länge von wenigstens 30 oder wenigstens 35 Nukleotiden verwendet werden.
Als weitere Alternative kann die chemische Synthese eingesetzt werden, die automatisiert sein kann. Dabei können relativ kurze Sequenzen chemisch synthetisiert und zusammen ligiert werden, um so eine längere Sequenz bereitzustellen.
Durch die Erfindung werden die folgenden Nukleinsäuremoleküle (einzeln und in den angegebenen Paaren) bereitgestellt, die als Primer oder Sonden verwendet werden können:
Neben ihrer Verwendung als Primer und/oder Sonden können hybridisierende Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung als Antisense-Moleküle verwendet werden, um die Expression von Substanzen der vorliegenden Erfindung durch Bindung an komplementäre Nukleinsäuremoleküle zu verändern. Diese Technik läßt sich in der Antisense-Therapie einsetzen.
Ein hybridisierendes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann ein hohes Ausmaß an Sequenzidentität über seine gesamte Länge mit einem Nukleinsäuremolekül im Rahmen von (i)–(v) oben aufweisen (z. B. wenigstens 50%, wenigstens 75% oder wenigstens 90% oder 95% Sequenzidentität). Wie dem Fachmann ersichtlich ist, ist die Wahrscheinlichkeit, daß ein gegebenes einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül an ein Nukleinsäuremolekül, das zu einem anderen Nukleinsäuremolekül komplementär ist, unter entsprechenden Bedingungen hybridisiert, um so größer, je höher seine Sequenzidentität mit dem anderen Nukleinsäuremolekül ist.
Angesichts der vorhergehenden Beschreibung ist dem Fachmann ersichtlich, daß eine große Anzahl an Nukleinsäuren im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt. Dabei können Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, außer wenn der Zusammenhang etwas anderes andeutet, eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweisen:

1) es kann sich dabei um DNA oder RNA handeln;
2) sie können als Einzel- oder Doppelstrang vorliegen
3) sie können in rekombinanter Form, d. h. mit einer 5'- und/oder einer 3'-flankierenden Sequenz kovalent verknüpft, bereitgestellt werden, so daß damit ein Molekül, das nicht in der Natur vorkommt, bereitgestellt wird;
4) sie können ohne 5'- und/oder 3'-flankierende Sequenzen, die in der Regel in der Natur vorkommen, bereitgestellt werden;
5) sie können in weitgehend reiner Form bereitgestellt werden. So können sie in einer Form bereitgestellt werden, die weitgehend frei von verunreinigenden Proteinen und/oder von anderen Nukleinsäuren ist;
6) sie können mit Introns oder ohne Introns (z. B. als cDNA) bereitgestellt werden.

Ebenso wurde von den Erfindern ein Maus-Homolog des menschlichen Proteins gefunden.
Somit wird gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid bereitgestellt, das:

a) die in 8 gezeigte Aminosäuresequenz (Seq. ID Nr. 8) umfaßt;
b) ein Derivat mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder Insertionen gegenüber einer Substanz mit der in a) oben angegebenen Bedeutung darstellt; oder
c) ein Fragment einer Substanz mit der in a) angegebenen Bedeutung, das wenigstens fünf oder zehn Aminosäuren lang ist, darstellt
d) ein Analog, Fusionsprotein, Ortholog, Homolog, Fragment, Derivat, eine Isoform oder Variante der Sequenzen aus a), b) oder c) oder ein beliebiges Fragment davon darstellt.

In einem weiteren Aspekt wird durch die vorliegenden Erfindung ein Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, umfassend eine oder bestehend aus einer Sequenz, bei der es sich um:

(i) eine in 8b gezeigte DNA-Sequenz (Seq. ID Nr. 7) oder ihr RNA-Äquivalent;
(ii) eine Sequenz, die zu einer der Sequenzen aus (i) komplementär ist;
(iii) eine Sequenz, die für das gleiche Protein oder Polypeptid wie jene Sequenzen aus (i) oder (ii) codiert;
(iv) eine Sequenz, die weitgehende Identität mit einer der Sequenzen aus (i), (ii) und (iii) zeigt; oder
(v) eine Sequenz, die für eines der in a), b), c) oder d) oben beschriebenen Polypeptide codiert, einschließlich eines Derivats oder Fragments eines in 8b gezeigten Nukleinsäuremoleküls (Seq. ID Nr. 7), handelt.

Die für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Peptid codierende Nukleotidsequenz kann in einen entsprechenden Expressionsvektor, d. h. einen Vektor, der die für die Transkription und Translation der inserierten proteincodierenden Sequenz enthält, inseriert werden. Die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale lassen sich auch über das für das Hpa2 codierende Gen oder seine flankierenden Bereiche oder über das für das mit Hpa2 verwandte Polypeptid codierende native Gen oder seine flankierenden Bereiche bereitstellen. Zur Expression der proteincodierenden Sequenz können in der vorliegenden Erfindung verschiedene Wirt-Vektor-Systeme genutzt werden. Zu diesen gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, mit Virus (z. B. Vacciniavirus, Adenovirus usw.) infizierte Säugerzellsysteme; mit Virus (z. B. Baculovirus) infizierte Insektenzellsysteme; Mikroorganismen, wie z. B. Hefevektoren enthaltende Hefe; oder mit Bakteriophagen, DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformierte Bakterien. Dabei variieren die Expressionselemente von Vektoren in ihrer Stärke und Spezifität. Je nach dem benutzten Wirt-Vektor-System kann ein beliebiges aus einer Anzahl geeigneter Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden. In spezifischen Ausführungsformen wird eine für ein menschliches Gen codierende Nukleotidsequenz (oder eine für einen funktionell aktiven Teil eines menschlichen Hpa2 codierende Nukleotidsequenz) exprimiert. In noch einer weiteren Ausführungsform wird ein eine Domäne des Hpa2 umfassendes Fragment eines Hpa2 exprimiert.
Zur Konstruktion von Expressionsvektoren mit einem aus entsprechenden Transkriptions- und Translationskontrollsignal und den proteincodierenden Sequenzen bestehenden chimärischen Gen können alle zuvor beschriebenen Verfahren zur Insertion von DNA-Fragmenten in einem Vektor verwendet werden. Diese Verfahren können In-vitro-rekombinante-DNA- und -Synthesetechniken sowie In-vivo-rekombinante (genetische Rekombination) umfassen. Die Expression von für Hpa2 oder ein Fragment davon codierender Nukleinsäuresequenz kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz reguliert sein, so daß das Hpa2 oder Fragment in einem mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Wirt exprimiert wird. So kann beispielsweise die Expression eines Hpa2 durch ein beliebiges im Fachgebiet bekanntes Promotor- oder Enhancerelement kontrolliert werden. Zu Promotoren, die zur Kontrolle der Expression des für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid codierenden Gens verwendet werden könne, gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der frühe Promotorbereich des SV40 (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), der im 3'-LTR (Long Terminal Repeat) des Rous-Sarkom-Virus enthaltene Promotor (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787–797), der Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42), der Tetracyclin (Tet)-Promotor (Gossen et al., 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551); prokaryontische Expressionsvektoren, wie z. B. der b-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727–3731) oder der Tac-Promotor (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21–25; siehe auch "Useful proteins from rekombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94); Pflanzenexpressionsvektoren, umfassend den Nopalinsynthetase-Promotorbereich (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209–213) oder den 35S-RNA-Promotor aus Blumenkohlmosaikvirus (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871) sowie den Promotor des Photosyntheseenzyms Ribulosebisphosphat-Carboxylase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310: 115–120); Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen, wie z. B. der Gal-4-Promotor, der ADC (Alkoholdehydrogenase)-Promo tor, PGK (Phosphoglycerinkinase)-Promotor, der Promotor für alkalische Phosphatase, sowie die folgenden tierischen Transkriptionskontrollbereiche, die Gewebespezifität zeigen und in transgenen Tieren verwendet wurden: der Kontrollbereich des Elastase-I-Gens, der in pankreatischen Azinuszellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38: 639–646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399–409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425–515); der Kontrollbereich des Insulingens, der in pankreatischen beta-Zellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315: 115–122), der Kontrollbereich des Immunglobulingens, der in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647–658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533–538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444), der Kontrollbereich des MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus), der in testikulären, Brust-, lymphoiden und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45: 485–495), der Kontrollbereich des Albumingens, der in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268–276), der Kontrollbereich des alpha-Fetoprotein-Gens, der in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53–58; der Kontrollbereich des alpha-1-Antitrypsin-Gens, der in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161–171), der Kontrollbereich des beta-Globin-Gens, der in myeloiden Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338–340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89–94; der Kontrollbereich des MBP (Myelin Basic Protein)-Gens, der in Oligodendrozyten im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703–712); der Kontrollbereich des Gens für Myosin-leichte-Kette-2, der im Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314: 283–286); neuronenspezifische Enolase (NSE), die in neuronalen Zellen aktiv ist (Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80: 571–83); der Kontrollbereich des BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)-Gens, der in neuronalen zellen aktiv ist (Tabuchi et al., 1998, Biochem. Biophysic. Res. Corn. 253: 818–823); der GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein)-Promotor, der in Astrozyten aktiv ist (Gomes et al., 1999, Braz J. Med. Biol. Res. 32(5): 619–631; Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80: 571–83) und der Kontrollbereich des GRH (Gonadotropic Releasing Hormone)-Gens, der im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234: 1372–1378).
In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Vektor verwendet, der einen Promotor, der einen mit einer Hpa2 codierenden Nukleinsäure operativ verknüpft ist, einen oder mehrere Replikationsursprünge sowie gegebenenfalls einen oder mehrere selektionierbare Marker (z. B. ein Antibiotikaresistenzgen) umfaßt.
In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Expressionskonstrukt hergestellt, indem man eine für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid codierende Sequenz jeweils in die EcoRI-Restriktionsstelle der drei pGEX-Vektoren (Glutathion-S-Transferase-Expressionsvektoren; Smith und Johnson, 1988, Gene 7: 31–40) subkloniert. Dadurch wird die Expression des Hpa2-Produkts bzw. des mit Hpa2 verwandten Polypeptids von dem Subklon im korrekten Leseraster berücksichtigt.
In Säuger-Wirtszellen können eine Anzahl von Expressionssystemen auf Virusbasis genutzt werden. Dabei kann im Falle einer Verwendung eines Adenovirus als Expressionsvektor die für Hpa2 codierende Sequenz oder für ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid codierende Sequenz mit einem adenoviralen Transkriptions-/Translationskontrollkomplex, z. B. dem späten Promotor und der dreiteiligen Leitsequenz ligiert werden. Dieses chimärische Gen kann dann mittels In-vitro- oder In-vivo-Rekombination in das Adenovirusgenom inseriert werden. Die Insertion in einem nichtessentiellen Bereich des Virusgenoms (z. B. Bereich E1 oder E3) führt zu einem rekombinanten Virus, das lebensfähig ist und das Antikörpermolekül in infizierten Wirten exprimieren kann (z. B. siehe Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355–359). Für eine effiziente Translation inserierter Antikörper-codierender Sequenzen können auch spezifische Initiationssignale erforderlich sein. Diese Signale beinhalten das ATG-Initiationscodon sowie benachbarte Sequenzen. Weiterhin muß sich das Initiationscodon in Phase mit dem Leseraster der gewünschten codierenden Sequenz befinden, um die Translation der gesamten Insertion sicherzustellen. Diese exogenen Translationskontrollsignale und Initiationscodons können daher verschiedenen Ursprungs, und zwar sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs, sein. Die Effizienz der Expression kann durch den Einschluß geeigneter Transkriptionsenhancerelemente, Transkriptionsterminatoren usw. verbessert werden (siehe Bittner et al., 1987, Verfahren in Enzymol. 153: 51–544).
Insertionen eines für Hpa2 oder ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid codierenden Gens enthaltende Expressionsvektoren lassen sich über drei allgemeine Ansätze identifizieren: (a) Nukleinsäurehybridisierung, (b) Vorhandensein oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen und (c) Expression inserierter Sequenzen. Im ersten Ansatz läßt sich das Vorhandensein eines für ein Hpa2 codierenden und in einem Expressionsvektor inserierten Gens über Nukleinsäurehybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, welche zu einem für ein Hpa2 codierenden inserierten Gen homolog sind, nachweisen. Im zweiten Ansatz läßt sich das rekombinante Vektor/Wirt-System auf Grundlage des Vorhandenseins bzw. der Abwesenheit bestimmter "Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinaseaktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Transformationsphänotyp, Bildung von Okklusionskörperchen in Baculovirus usw.), verursacht durch die Insertion eines für ein Hpa2 codierenden Gens im Vektor, identifizieren und selektionieren. So lassen sich beispielsweise, falls das Hpa2 codierende Gen innerhalb der Marker-Genseqzuenz des Vektors inseriert ist, das für die Hpa2-Insertion codierende Gen enthaltende Rekombinanten über die Abwesenheit der Marker-Genfunktion identifizieren. Im dritten Ansatz lassen sich rekombinante Expressionsvektoren über die Durchführung eines Tests für das von dem rekombinante exprimierten Genprodukt (d. h. Hpa2) identifizieren. Derartige Tests können beispielsweise auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Hpa2 in In-vitro-Testsystems, z. B. Bindung mit Anti-Hpa2-Antikörper beruhen.
Darüber hinaus kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, der die Expression der inserierten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der gewünschten spezifischen Weise modifiziert und prozessiert. Die Expression von bestimmten Promotoren kann in Gegenwart bestimmter Induktoren erhöht werden; so kann die Expression des gentechnisch hergestellten Hpa2 oder mit Hpa2 verwandtes Polypeptids gesteuert werden. Weiterhin weisen unterschiedliche Wirtszellen charakteristische und spezifische Mechanismen für die translationale und posttranslationale Prozessierung und Modifikation (z. B. Glycosylierung, Phosphorylierung von Proteinen) auf. Dabei können entsprechende Zellinien oder Wirtssysteme gewählt werden, um die gewünschte Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins sicherzustellen. So erhält man beispielsweise durch Expression in einem bakteriellen System ein nichtglycosyliertes Produkt und durch die Expression in Hefe ein glycosyliertes Produkt. Es können eukaryontische Wirtszellen verwendet werden, wie die zelluläre Maschinerie für die korrekte Prozessierung des primären Transkripts, die Glycosylierung und Phosphorylierung des Genprodukts besitzen. Zu solchen Säugerwirtszellen gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 und insbesondere neuronale Zellinien, wie beispielsweise die menschlichen Neuroblastome SK-N-AS, SK-N-FI, SK-N-DZ (Sugimoto et al., 1984, J. Natl. Cancer Inst. 73: 51–57), das menschliche Neuroblastom SK-N-SH (Biochim. Biophys. Acta, 1982, 704: 450–460), das Daoy-Medulloblastom aus menschlichem Kleinhirn (He et al., 1992, Cancer Res. 52: 1144–1148), DBTRG-05MG-Glioblastomzellen (Kruse et al., 1992, In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 609–614), das menschliche Neuroblastom IMR-32 (Cancer Res., 1970, 30: 2110–2118), das menschliche Astrocytom 1321N1 (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1977, 74: 4816), das menschliche Astrocytom MOG-G-CCM (Br. J. Cancer, 1984, 49: 269), das menschliche Glioblastom-Astrocytom U87MG (Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968, 74: 465–486), das menschliche Glioblastom A172 (Olopade et al., 1992, Cancer Res. 52: 2523–2529), C6-Rattengliomzellen (Benda et al., 1968, Science 161: 370–371), das Maus-Neuroblastom Neuro-2a (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1970, 65: 129–136), das Maus-Neuroblastom NB41A3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1962, 48: 1184–1190), SCP (sheep choroid plexus) (Bolin et al., 1994, J. Virol. Verfahren 48: 211–221), die normalen Astrocyten G355-5, PG-4 aus Katze (Haapala et al., 1985, J. Virol. 53: 827–833), Mpf aus Frettchengehirn (Trowbridge et al., 1982, In Vitro 18: 952–960) sowie normale Zellinien, wie z. B. normale Ratten-Kortex-Hirnzellen CTX TNA2 (Radany et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6467–6471), wie z. B. CRL7030 und Hs578Bst. Weiterhin können unterschiedliche Vektor/Wirt-Expressionssysteme Prozessierungsreaktionen in unterschiedlichem Ausmaß beeinflussen.
Für eine Langzeitproduktion rekombinanter Proteine mit hoher Ausbeute ist eine stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zellinien, die das unterschiedlich exprimierte bzw. "Pathway Gene"-Protein stabil exprimieren, technisch hergestellt werden. Statt Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, zu verwenden, können Wirtszellen mit durch entspechende Expressionkontrollelemente (z. B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.) kontrollierter DNA und einem selektionierbaren Marker transformiert werden.
Nach der Einführung der Fremd-DNA kann man technisch hergestellte Zellen 1–2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen lassen und anschließen auf ein Selektionsmedium überwechseln. Der selektionierbare Marker im rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz gegen die Selektion und gestattet den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und unter Bildung von Foci zu wachsen, die wiederum kloniert und in Zellinien expandiert werden können. Dieses Verfahren kann vorteilhafterweise zur technischen Herstellung von Zellinien, die das differentiell exprimierte oder Pathway-Gen-Protein exprimieren, verwendet werden. Eine derartig technisch hergestellte Zellinie kann sich insbesondere zum Screening und zur Beurteilung von Verbindungen, die sich auf die endogene Aktivität des differentiell exprimierten oder Pathway-Gen-Proteins auswirken, eignen.
Es können eine Reihe von Selektionssystemen verwendet werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der Gene für Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (Wigler, et al., 1977, Cell 11: 223), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) bzw. Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817), die in tk^–, hgprt^– bzw. aprt^–-Zellen eingesetzt werden können. Ebenso kann eine Antimetabolitresistenz als Grundlage für die Selektion auf die Gene dhfr, wodurch eine Resistenz gegen Methotrexat verliehen wird (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, wodurch eine Resistenz gegen Mycophenolsäure verliehen wird (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, wodurch eine Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 verliehen wird (Colberre-GarHpa2n, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); und hygro, wodurch eine Resistenz gegen Hygromycin verliehen wird (Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147), verwendet werden.
In weiteren spezifischen Ausführungsformen kann das Hpa2, Fragment, Analog oder Derivat als eine Fusion oder ein chimärisches Proteinprodukt (umfassend das über eine Peptidbindung an eine heterologe Proteinsequenz gebundene Protein, Fragment, Analog oder Derivat) exprimiert werden. So können beispielsweise die Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit der konstanten Domäne von Immunglobulinen (IgA, IgE, IgG, IgM) oder Teilen davon (CH1, CH2, CH3 oder einer beliebigen Kombination davon und beliebigen Teilen davon) unter Erhalt chimärischer Polypeptide fusioniert werden. Derartige Fusionsproteine können die Reinigung erleichtern, die Halbwertszeit in vivo erhöhen und die Zuführung eines Antigens über eine Epithelschranke zum Immunsystem verbessern. Dabei konnte gezeigt werden, daß bei chimärischen Proteinen, die aus den ersten beiden Domänen des menschlichen CD4-Polypeptids und verschiedenen Domänen der konstanten Bereiche der schweren oder leichten Kette von Säuge-Immunglobulinen bestehen, die Halbwertszeit in vivo erhöht und die Reinigung erleichtert wird. Siehe z. B. EP 394,827 ; Traunecker et al., Nature, 331: 84–86 (1988). Eine verbesserte Zuführung eines Antigens durch die Epithelschranke zum Immunsystem konnte für Antigene (z. B. Insulin) demonstriert werden, die an einen FcRn-Bindungspartner, wie z. B. IgG- oder Fc-Fragmente, konjugiert waren (siehe z. B. PCT-Veröffentlichungen WO 96/22024 und WO 99/04813).
Für ein Hpa2, ein Fragment eines Hpa2, ein mit Hpa2 verwandtes Polypeptid oder ein Fragment eines mit Hpa2 verwandtes Polypeptids codierende Nukleinsäuren können an ein Epitop-Tag (z. B. das Hämagglutinin ("HA")-Tag oder Flag-Tag) fusioniert sein, um den Nachweis und die Reinigung des exprimierten Polypeptids zu unterstützen. So berücksichtigt beispielsweise ein von Janknecht et al. beschriebenes System die schnelle Reinigung nichtdenaturierter Fusionsproteine, die in menschlichen Zellinien exprimiert werden (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972–897).
Fusionsproteine lassen sich herstellen, indem die entsprechenden, für die gewünschten Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäuresequenzen aneinander mit im Fachgebiet bekannten Verfahren im korrekten Codierungsraster ligiert werden und das chimärische Produkt mit im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren exprimiert wird. Als Alternative kann ein Fusionsprotein mittels Proteinsynthesetechniken, z. B. durch Verwendung eines Peptidsyntheseautomaten, hergestellt werden.
Es können sowohl cDNA- als auch genomische Sequenzen kloniert und exprimiert werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft Wirtszellen, in die ein rekombinanter erfindungsgemäßer Expressionsvektor eingeführt wurde. Dabei werden die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" hier gegeneinander austauschbar verwendet. Dabei versteht sich, daß sich derartige Begriffe nicht nur auf die jeweilige betreffende Zelle, sondern auch auf die Nachkommenschaft oder potentielle Nachkommenschaft einer solchen Zelle beziehen. Da bestimmte Modifikationen in nachfolgenden Generationen aufgrund entweder einer Mutation oder von Umwelteinflüssen auftreten können, ist eine solche Nachkommenschaft tatsächlich nicht unbedingt mit der Elternzelle identisch, liegt aber dennoch im Rahmen des Begriffs, wie er hier verwendet wird.
Bei einer Wirtszelle kann es sich um eine beliebige prokaryontische (z. B. E. coli) oder eukaryontische Zelle (z. B. Insektenzellen, Hefe oder Säugerzellen) handeln.
Vektor-DNA läßt sich in prokaryontische oder eukaryontische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken einführen. Dabei sollen die Begriffe "Transformation" und "Transfektion", wie sie hier verwendet werden, sich auf verschiedene im Fachgebiet anerkannte Techniken zur Einführung von Fremdnukleinsäure in eine Wirtszelle beziehen, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchloridcopräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen finden sich bei Sambrook, et al. (supra) sowie anderen Laborhandbüchern.
Zur stabilen Transfektion von Säugerzellen ist bekannt, daß je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nur ein geringer Bruchteil von Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und selektionieren, wird im allgemeinen ein Gen, das einen selektionierbaren Marker (z. B. für Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingeführt. Zu bevorzugten selektionierbaren Markern gehören dabei solche, die eine Resistenz gegen Arzneistoffe, wie z. B. G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfizierte Zellen lassen sich dann durch Arzneistoffselektion identifizieren (z. B. Zellen, in denen das selektionierbare Markergen eingebaut ist, überleben, während die anderen Zellen absterben).
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher in den folgende, nichtlimitierenden Beispielen beschrieben.
Beispiel 1 – Identifizierung von Heparanase-ähnlichen Proteinsequenzen aus der Incyte LifeSeq-Datenbank
Die veröffentlichte Vollängen-Aminosäuresequenz von menschlicher Heparanase wurde mit den DNA-Sequenzdatenbanken GenBank und Incyte LifeSeq (veröffentlicht: Juli 1999) verglichen. Die Aminosäuresequenz wurde in das "Basic Local Alignment Search Tool"-Programm Gapped BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402, 1997) eingegeben, und man ließ das Programm mit den voreingestellten Parametern in der Version TBLASTN laufen, wobei die gesamte Datenbank elektronisch in sechs Leseraster translatiert und jede putative Translation mit der eingegebenen Sequenz verglichen wird. Dabei wurden in GenBank keine neuen homologen Sequenzen gefunden. Putative translatierte Sequenzen von drei bislang nicht identifizierten Sequenzen aus LifeSeq zeigten eine signifikante Homologie zu menschlicher Heparanase. Die Incyte-Identifikationsnummern für diese Sequenzen waren wie folgt: 139678.1; 273691.1; 117316.1, nachfolgend als EST1, EST2 bzw. EST3 bezeichnet. Die Homologie wurde gemäß den für das Suchprogramm gesetzten Parametern als signifikant angesehen, wobei die Gesamtähnlichkeit zwischen der veröffentlichten Sequenz und den ESTs nach unseren eigenen Beobachtungen 65%, 60% und 44% betrug, wobei Blöcke von fünf oder mehr zusammenhängenden identischen oder ähnlichen Aminosäuren in jeder vergleichenden Gegenüberstellung gefunden wurde. Konzeptionelle Translation mit anschließender elektronischer Sequenzgegenüberstellung zeigte eine Homologie zum veröffentlichten Heparanaseprotein, die mit einer Bewahrung der Proteinfunktion und einem gemeinsamen evolutionären Ursprung in Einklang steht (siehe 4 und 6). Weitere Suchen auf Grundlage des TBLASTN-Vergleichs von Bereichen mit der höchsten Sequenzerhaltung zeigten, daß kein anderes bekanntes menschliches Gen eine Homologie mit der Heparanasesequenz aufwies.
Beispiel 2 – PCR-Klonierung von Heparanase-ähnlicher cDNA und Identifizierung von Spleißvarianten
Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotidprimer wurden um die Sequenz aller drei EST-Sequenzen herum konstruiert (siehe 3). Dabei verbinden die Primer-Kombinationen Hepa2F1/Hepa3R1 die Ests 139678.1 und 273691.1 miteinander. Die Primerkombinationen Hepa4F1/Hepa2R1 verbinden die Ests 117316.1 und 139678.1 miteinander.
Es wurden PCR-Reaktionen mit den folgenden Bedingungen durchgeführt:
5 μl ""Marathon-ready" cDNA aus menschlicher Brustdrüse (Clontech), 1 μl Advantage 2 cDNA-Polymerase-Mix (Clontech) in einem Puffer mit 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, pH 8,3; jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP und 10 pmol Oligonukleotidprimer. Die Reaktionsansätze wurden routinemäßig auf ein Envolumen von 50 μl gebracht und die Amplifikation wurde in einem PE GeneAmpSystems 9700 PCR-Gerät mit den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: erste Denaturierung: 1 Minute bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von jeweils 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C. Die Reaktionsprodukte wurden mittels Standard-Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und mit SYBR Green (Molecular Probes, Oregon, USA) angefärbt. Zwischen den Ests 117316.1 und 139678.1 waren wenigstens drei Spleißvarianten auf den Gelen sichtbar, wobei diese Banden aus den Gelen ausgeschnitten und unter Verwendung des Kits zur schnellen Klonierung TOPO II (Invitrogen, Niederlande) kloniert. Dabei wurden drei übereinstimmende Sequenzen erhalten/siehe 1–3 und Seq. ID Nr. 1, 3, 5). Jede Sequenz weist zwei putative Startcodons auf, und zwar eines bei den Nukleotiden 601–603 (Methionin 1) und das andere bei den Nukleotiden 631–633 (Methionin 43).
Beispiel 2 – Erzeugung von Antikörpern
Die Antigenitätskartierung für das neue Protein (The Binding Site, UK) ergab drei potentielle Peptidsequenzen. Diese werden synthetisiert und zur Erzeugung von Antikörpern in Schafen verwendet. Dabei erzeugt jedes dieser Peptide Antikörper, die alle drei Spleißformen des neuen Proteins erkennen. Die drei Peptide sowie ihre Lokalisierung innerhalb neuen Proteins sind wie folgt:
Beispiel 4 – Strahlungshybridkartierung
Die chromosomale Lokalisierung der neuen Heparanase-ähnlichen Peptide wurde mit Strahlungshybridkartierung bestimmt, und zwar mit dem "GENEBRIDGE 4 Radiation Hybrid Mapping Panel" geringer Auflösung von 93 RH-Klonen des gesamten menschlichen Genoms (Research Genetics, Huntsville, AL, USA). Dabei handelt es sich um eine Teilmenge der in einer Zusammenarbeit zwischen den Labors von Peter Goodfellow und Jean Weissenbach entwickelten 199 Klontafeln. Die chromosomale Lokalisierung von Markern wurde durch Zugreifen auf den Server unter http://www.genome.wi.mit.edu/cgibin/contig/rhmapper.pl durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß das neue Protein auf Chromosom 10 bei 10q23-24 lokalisiert war. Dieser Bereich ist mit mehreren Krebsarten assoziiert. Das veröffentlichte Heparanasegen findet sich auf Chromosom 4.
Beispiel 5 – Expressionsprofil
Zur Untersuchung der relativen mRNA-Niveaus (exprimiert pro mg DNA) für das Heparanase-ähnliche Protein der vorliegenden Erfindung in einer Reihe unterschiedlicher Gewebe und Zellinien wurden quantitative Taqman-PCR-Standardtechniken verwendet. Dabei wurden zwei für das Heparanase-ähnliche Protein spezifische Primer verwendet, die nicht zwischen den unterschiedlichen Spleißformen differenzierten. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigen relativ hohe Niveaus der mRNA des Heparanase-ähnlichen Proteins in mehreren Geweben, einschließlich Gehirn, Brust, Testes, sowie in einer Pankreaskarzinom-Zellinie, wohingegen das Niveau in den meisten anderen Geweben gering ist (siehe 7).
Beispiel 6 – Identifizierung eines Homologs in Maus
Eine Maus-EST-Sequenz mit Homologie zur menschlichen Heparanase-Sequenz wurde mit einer BLAST-Suche erhalten: IMAGE Klon 1378452. Diese Sequenzen sind in einer vergleichenden Gegenüberstellung mit den Hpa2-Sequenzen in 8a & b gezeigt (Seq. ID Nr. 7 und 8). Dabei war eine signifikante Homologie zwischen der menschlichen Heparanase-ähnlichen Sequenz sowohl auf der Nukleotidebene als auch auf der codierten Aminosäureebene erkennbar.

Claims

Polypeptid, das (a) die Aminosäuresequenz der Seq. ID No 2 (1), beginnend mit dem Rest 1, 2, 11, 12 oder 43, umfaßt; (b) die Aminosäuresequenz der Seq. ID No 4 (2), beginnend mit dem Rest 1, 2, 11, 12 oder 43, umfaßt; (c) die Aminosäuresequenz der Seq. ID No 6 (3), beginnend mit dem Rest 1, 2, 11, 12 oder 43, umfaßt; oder (d) ein wenigstens 40 Aminosäuren langes Derivat mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen relativ zu einem Polypeptid mit der unter a), b) oder c) oben angegebenen Bedeutung ist, wobei das Derivat wenigstens 80% Identität zu einer Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist; oder (e) ein wenigstens 40 Aminosäuren langes Fragment eines Polypeptids mit der unter a), b) oder c) oben angegebenen Bedeutung oder ein wenigstens 50 Aminosäuren langes Fragment eines Polypeptids mit der unter d) oben angegebenen Bedeutung ist.
Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend die Sequenz:
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung bei der Behandlung eines Menschen oder nicht menschlichen Tiers oder zur Verwendung bei der Diagnostik.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 sowie einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff.
Kit, umfassend eine Zusammensetzung nach Anspruch 4, gegebenenfalls mit Anleitungen zur Verwendung der Zusammensetzung.
Antikörper oder Derivat davon, der bzw. das immunspezifisch an ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 bindet.
Antikörper nach Anspruch 6, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 6 oder 7 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Vorbeugung eines mit einer erhöhten Aktivität des Polypeptids nach Anspruch 1 assoziierten Leidens.
Nukleinsäuremolekül, umfassend oder bestehend aus: (i) eine bzw. einer Sequenz, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 codiert; oder (ii) eine bzw. einer Sequenz, die zu der Sequenz unter (i) komplementär ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9, umfassend eine oder bestehend aus einer Sequenz, bei der es sich um eine bei Rest 601, 604, 631, 634 oder 727 bis 2376 der Seq. ID No 1 (1), Rest 601, 604, 631, 634 oder 727 bis 2202 der Seq. ID No 3 (2) oder bei Rest 601, 604, 631, 634 oder 727 bis 2040 der Seq. ID No 5 (3) gezeigte DNA-Sequenz oder ihr RNA-Äquivalent handelt, unter Einschluß oder Ausschluß der gesamten 5' oder 3' dazu liegenden Sequenz oder eines Teils davon.
Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9 oder 10.
Vektor nach Anspruch 11, ferner umfassend Nukleinsäure, die für ein oder mehrere Mitglieder der folgenden Gruppe codiert: Promotoren, Enhancer, Signalsequenzen, Leitsequenzen, Translationsstart- und -stopsignale, DNA-Stabilität kontrollierende Bereiche oder einen Fusionspartner.
Verwendung eines Vektors nach Anspruch 11 oder 12 bei der Transformation oder Transfektion eines prokaryontischen oder eukaryontischen Wirts.
Wirtszelle, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 11 oder 12.
Verfahren zur Gewinnung eines Polypeptids nach Anspruch 1, wobei man einen Wirt nach Anspruch 14 unter zur Expression des Polypeptids führenden Bedingungen inkubiert und anschließend das Polypeptid aufreinigt.
Verfahren zur Identifizierung eines Agens, das die Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 1 moduliert, wobei man die Aktivität des Polypeptids in Gegenwart eines Testagens mit der Aktivität des Polypeptids in Abwesenheit des Testagens vergleicht.
Verwendung nach Anspruch 8, bei der das Leiden ausgewählt ist aus: Krebs, metastasierter Krebs, Krankheiten des ZNS und neurodegenerative Krankheiten, Entzündung und Herz/Kreislauf-Erkrankungen.