DE60123235T2 - Regulation einer nf-at interagierenden proteinvariante nip 45 - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen einer neuen, mit NF-AT wechselwirkenden Protein-NIP45-Variante und ihre Verwendung zur Diagnose und Therapie menschlicher Erkrankungen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Von zahlreichen immunologisch vermittelten klinischen Erkrankungen, einschließlich Autoimmunerkrankungen, allergischer Erkrankungen und infektiöser Erkrankungen, wird berichtet, dass sie für das Verhältnis zwischen CD4+-T-Helferzelltyp 1 (Th1) und CD4+-T-Helferzelltyp 2 (Th2) äußerst relevant sind (F.P. Heinzel et al., J. Exp. Med. 169, 59-72 (1989); E.J. Pearce et al., J. Exp. Med. 173, 159-166 (1991); G.M. Shearer & M. Clerici, Prog. Chem. Immunol. 54, 21-43 (1992)). Ein Ändern oder Regulieren der Verhältnisse zwischen Th1- und Th2-Zellen könnte daher einen Hinweis auf die mögliche Behandlung oder Prävention von immunologisch vermittelten Erkrankungen liefern.
  • Die Mechanismen, durch die das Th1/Th2-Verhältnis bestimmt wird, binden die Differenzierung von CD4-T-Helfervorläuferzellen (Thp) durch ihre Wahl, zu Th1- oder Th2-Effektorzellen zu werden, mit ein. Die Differenzierung wird teilweise durch Cytokine, wie z.B. IL-2, IL-4 und IL-12, reguliert, deren Expression durch Transkriptionsfaktoren induziert werden kann, von denen manche der wichtigsten Vertreter Proteine der NFAT- (Nuclear Factor of Activated T Cells) Familie sind. NFAT-Proteine werden in den meisten Immunzelltypen exprimiert und spielen eine wichtige Rolle bei der Transkription zahlreicher Cytokine, wie z.B. IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF, IFN-γ und TNF-α, sowie mehrerer anderer Gene, die in Immunzellantworten eingebunden sind. Die Konzentration selektierter Cytokine zu steigern oder zu senken ist eine Art, das Th1/Th2-Verhältnis zu regulieren.
  • Erst jüngst wurde ein Protein mit 45 kDa, abgeleitet von murinem Gewebe, das mit Elementen der NFAT-Proteinfamilie wechselwirkt, isoliert und als NIP45 bezeichnet (M.R. Hodge, H.J. Chun, J. Rengarajan, A. Alt, R. Lieberson, L.H. Glimcher. NF-AT-Driven interleukin-4 transcription potentiated by NIP45. Science 274(5294), 1903-1905 (13. Dez. 1996); M.R. Hodge et al., WO 97/39721, USP 5.858.711 und USP 5.958.671). Ferner offenbart die WO 99/21993 Polypeptid- und Polynucleotidsequenzen von menschlichem NIP45.
  • Für NIP45 wurde gezeigt, dass es mit NFATp wechselwirkt und die Transkription des IL-4-Gens, die durch die Bindung von NFATp an den IL-4-Genpromotor induziert wird, potenziert. Die Art dieser Wechselwirkung ist noch nicht geklärt, eine Möglichkeit wäre jedoch, dass NIP45 ein Hilfsprotein ist, das in den Transport von NFATp vom Zytoplasma in den Zellkern eingebunden ist, wo dieses sich an den IL-4-Genpromotor binden kann. In Abwesenheit eines solchen Hilfsproteins kann NFATp aufgrund seiner Unfähigkeit, selbst die Kernmembran zu durchdringen, inaktiv sein. Versuche mit NFATp-Knockout-Mäusen zeigten, dass NFATp-Defizienz zu Akkumulierung peripherer T-Zellen mit einem präaktivierten Phänotyp, zu erhöhten Immunantworten von T-Zellen nach sekundärer Stimulierung in vitro und zu schweren Defekten bei der geeigneten Festlegung von Antigenreaktionen führt (K. Schuh et al., Eur. J. Immunol. 28(8), 2456-2466 (1998)). Bei manchen dieser Mäuse entwickeln sich große Keimzentren in der Milz und in peripheren Lymphknoten, und es gibt eine ausgeprägte Verzögerung der Involution des Thymus.
  • Es gibt auf dem Gebiet der Erfindung Bedarf, zusätzliche Elemente der mit NFAT wechselwirkenden Proteinvariante zu identifizieren, deren Aktivität reguliert werden kann, um therapeutische Wirkungen zu erzielen, insbesondere im Fall von Leiden und Erkrankungen, die immunologisch vermittelte Reaktionen einbinden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Reagenzien und Verfahren zur Regulierung von mit NF-AT wechselwirkenden Proteinen. Dieses und andere Ziele der Er findung werden durch eine oder mehrere der nachstehend beschriebenen Ausführungsformen erreicht.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein NIP45V1-Polypeptid, das die in Seq.-ID Nr. 8 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, der bezogen auf das Volllängen-NIP45-Protein die Aminosäurereste 283 bis 367 fehlen.
  • Wiederum eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Mittel, die die Aktivität von NIP45V1 senken. Eine Testverbindung wird mit einem NIP45V1-Polypeptid, das die in Seq.-ID Nr. 8 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, der bezogen auf das Volllängen-NIP45-Protein die Aminosäurereste 283 bis 367 fehlen, kontaktiert.
  • Es wird Bindung zwischen der Testverbindung und dem NIP45V1-Polypeptid nachgewiesen. Eine Testverbindung, die sich an das NIP45V1-Polypeptid bindet, wird dadurch als ein potenzielles Mittel zur Senkung der Aktivität von NIP45V1 identifiziert.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Mittel, die die Aktivität von NIP45V1 senken. Eine Testverbindung wird mit einem Polynucleotid kontaktiert, das für ein NIP45V1-Polypeptid kodiert, worin das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, der jener Sequenzteil fehlt, der für die Aminosäurereste 283 bis 367 kodiert.
  • Es wird Bindung der Testverbindung an das Polynucleotid nachgewiesen. Eine Testverbindung, die sich an das Polynucleotid bindet, wird als ein potenzielles Mittel zur Senkung der Aktivität von NIP45V1 identifiziert. Das Mittel kann seine Wirkung durch Senken der Menge des NIP45V1 durch Wechselwirkung mit der NIP45V1-mRNA zeigen.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Mittel, die die Aktivität von NIP45V1 regulieren. Eine Testverbindung wird mit einem NIP45V1-Polypeptid kontaktiert, das die in Seq.-ID Nr. 8 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, der bezogen auf das Volllängen-NIP45-Protein die Aminosäurereste 283 bis 367 fehlen.
  • Es wird eine NIP45V1-Aktivität des Polypeptids nachgewiesen. Eine Testverbindung, die NIP45V1-Aktivität des Polypeptids bezogen auf NIP45V1-Aktivität in Abwesenheit der Testverbindung steigert, wird hierdurch als ein potenzielles Mittel zur Steigerung der Aktivität von NIP45V1 identifiziert. Eine Testverbindung, die NIP45V1-Aktivität des Polypeptids bezogen auf NIP45V1-Aktivität in Abwesenheit der Testverbindung senkt, wird hierdurch als ein potenzielles Mittel zur Senkung der Aktivität von NIP45V1 identifiziert.
  • Wiederum eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Mittel, die die Aktivität von NIP45V1 senken. Eine Testverbindung wird mit einem NIP45V1-Produkt eines Polynucleotids kontaktiert, das die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, der jener Sequenzteil fehlt, der für die Aminosäurereste 283 bis 367 kodiert.
  • Es wird Bindung der Testverbindung an das NIP45V1-Produkt nachgewiesen. Eine Testverbindung, die sich an das NIP45V1-Produkt bindet, wird hierdurch als ein potenzielles Mittel zur Senkung der Aktivität von NIP45V1 identifiziert.
  • Wiederum eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Reduktion der Aktivität von NIP45V1. Eine Zelle wird mit einem Reagens kontaktiert, das sich an ein Polynucleotid, das für ein NIP45V1-Polypeptid kodiert, oder das Produkt, für das das Polynucleotid kodiert, spezifisch bindet, worin das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, der jener Sequenzteil fehlt, der für die Aminosäurereste 283 bis 367 kodiert.
  • NIP45V1-Aktivität in der Zelle wird hierdurch gesenkt.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die für ein NIP45V1-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz.
  • 2 zeigt die für ein NIP45V1-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz (ORF).
  • 3 zeigt die für ein NIP45V2-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz.
  • 4 zeigt die für ein NIP45V3-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz.
  • 5 zeigt die für ein NIP45V4-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz.
  • 6 zeigt die für NIP45 kodierende DNA-Sequenz.
  • 7 zeigt die für NIP45 kodierende DNA-Sequenz (ORF).
  • 8 zeigt die von der DNA-Sequenz aus 2 abgeleitete Aminosäuresequenz.
  • 9 zeigt die von der DNA-Sequenz aus 3 abgeleitete Aminosäuresequenz.
  • 10 zeigt die von der DNA-Sequenz aus 4 abgeleitete Aminosäuresequenz.
  • 11 zeigt die von der DNA-Sequenz aus 5 abgeleitete Aminosäuresequenz.
  • 12 zeigt die von der DNA-Sequenz aus 6 abgeleitete Aminosäuresequenz.
  • 13 zeigt PCR-amplifizierte Banden von NIP45 und NIP45V in verschiedenen immunverwandten Geweben.
  • 14 zeigt den Abgleich von NIP 45 V (v1-, 2-, 3- und 4-Proteine) und NIP 45.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polynucleotid, das für ein NIP45V1-Polypeptid kodiert, das
    • a) die in Seq.-ID Nr. 8 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, der bezogen auf das Volllängen-NIP45-Protein die Aminosäurereste 283 bis 367 fehlen;
    • b) ein Polynucleotid umfasst, das die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Sequenz umfasst, der jener Sequenzteil fehlt, der für die Aminosäurereste 283 bis 367 kodiert.
  • Weiters wurde von den Anmeldern der vorliegenden Anmeldung erkannt, dass die Aktivität von NIP45-Spleißvarianten, insbesondere von menschlichen NIP45-Spleißvairanten, reguliert werden kann, um so Autoimmunerkrankungen, allergische Erkrankungen und Infektionskrankheiten sowie andere chronische Entzündungserkrankungen zu überwachen. Solche Erkrankungen umfassen Asthma, Rhinitis allergica, atopisches Ekzem, Nesselsucht, Konjunktivitis, vernalen Katarrh, chronischen Arthrorheumatismus, systemischen Lupus erythematodes, Erb-Goldflam-Krankheit, Psoriasis, diabrotische Kolitis, systemisches inflammatorisches Response-Syndrom (SIRS), lymphofollikuläre Thymitis, Sepsis, Polymyositis, Dermatomyositis, Polyarteriitis nodosa, Mischkollagenose (Sharp-Syndrom) („mixed connective tissue disease" (MCTD)), Sjörgen-Syndrom, Gicht und dergleichen.
  • NIP45 ist dafür bekannt, mit NFATp wechselzuwirken und die Transkription des IL-4-Gens, die durch die Bindung von NFATp an den IL-4-Genpromotor induziert wird, zu potenzieren. Die Art dieser Wechselwirkung ist noch nicht geklärt, eine Möglichkeit wäre jedoch, dass NIP45 ein Hilfsprotein ist, das in den Transport von NFATp vom Zytoplasma in den Zellkern eingebunden ist, wo dieses sich an den IL-4-Genpromotor binden kann. In Abwesenheit eines solchen Hilfsproteins kann NFATp aufgrund seiner Unfähigkeit, selbst die Kernmembran zu durchdringen, inaktiv sein. Versuche mit NFATp-Knockout-Mäusen zeigten, dass NFATp-Defizienz zur Akkumulierung peripherer T-Zellen mit einem präaktivierten Phänotyp, zu erhöhten Immunantworten von T-Zellen nach sekundärer Stimulierung in vitro und zu schweren Defekten bei der geeigneten Festlegung von Antigenreaktionen führt. Bei manchen dieser Mäuse entwickeln sich große Keimzentren in der Milz und in peripheren Lymphknoten, und es gibt eine ausgeprägte Verzögerung der Involution des Thymus.
  • Die Expression einer NIP45v1-Spleißvariante von NIP45 in Thymus, Milz und Lymphknoten kann eine wichtige Rolle bei der normalen Bildung von Keimzentren in diesen Lymphorganen spielen. Der NIP45v1-Spleißvariante fehlt ein großer Teil des Volllängen-NIP45-Proteins, von dem am signifikantesten die Homologieregionen zu Ubiquitin- und Sentrin-Molekülen sind. Ubiquitine sind in den regulierten Umsatz von Proteinen eingebunden, die zur Steuerung des Zellzyklusablaufs erforderlich sind. Sentrine sind kleine, Ubiquitin-ähnliche Proteine, von denen angenommen wird, dass sie an andere Proteine kovalent gebunden sind, um diese für den Transport in den Zellkern zu markieren. Ein Mangel der Ubiquitin-Homologiedomäne und eines Teils der Sentrin-Homologiedomäne kann NIP45v1 die Fähigkeit nehmen, NFATp in den Zellkern zu transportieren (T. Kamitani et al., J. Biol. Chem. 272 (22), 14001-14004 (1997); T. Okura et al., J. Immunol. 157(10), 4277-4281 (1996)). In ähnlicher Weise kann die Deletion in NIP45v1 die Wechselwirkung mit NFATp so verändern, dass die Coexpression von NIP45v1 und NFATp keine synergistische Wirkung mehr auf Transkription über den IL-4-Promotor zeigt. Die Wirkung von NIP45v1 in der Zelle kann daher sein, NFATp funktionsuntüchtig zu machen oder die Wechselwirkung zwischen NIP45 und NFATp zu blockieren und dadurch die Bildung von Keimzentren zu fördern, T-Zellen zu präaktivieren, sekundäre Immunantworten zu steigern und die Beendigung von Antigenreaktionen zu verzögern.
  • Andererseits kann die Deletion in NIP45v1 zwei Teile des NIP45-Moleküls zusammenbringen und so die Funktion von NIP45v1 auf solche Weise fördern, dass diese Wechselwirkung mit NFATp eine stärkere Steigerungswirkung auf IL-4-Transkription zeigt als jene des Volllängen-NIP45.
  • Die gesteigerte Bildung von Keimzentren im Thymus ist eine Eigenschaft menschlicher Patienten mit lymphofollikulärer Thymitis und steht häufig mit der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wie z.B. der Erb-Goldflam-Krankheit in Zusammenhang (H.K. Muller-Hermelink, A. Marx, T. Kirchner, Thymus and mediastinum, in: I. Damjanov, J. Linder (Hrsg.), Mosby-Year Book. Mosby, St. Louis, 1218-1243 (1996)). Darüber hinaus weisen NFATp-defiziente Mäuse eine starke Neigung zur Entwicklung von Th2-Typ-Immunantworten auf, mit einer paradoxerweise starken Steigerung der Transkription mehrerer Th2-Typ-Gene, einschließlich IL-4, IL-5 und IL-13 (A. Kiani et al., Immunity 7(6), 849-860 (1997)). Diese bevorzugte Entwicklung von Th2-Typ-Immunantworten kann zu übermäßigen allergischen Reaktionen und Th2-abhängigen Autoimmunerkrankungen und anderen Störungen führen.
  • Die alternative NIP45-Spleißvariante 1 kann als Target verwendet werden, um selektive Inhibitoren oder Aktivatoren zu entwickeln, die gegen die Variante gerichtet sind.
  • NIP45-V-Polypeptide
  • NIP45V1-Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die in Seq.-ID NR. 8 gezeigte Aminosäuresequenz (NIP 45 v1), der bezogen auf das Volllängen-NIP45-Protein die Aminosäurereste 283 bis 367 fehlen.
  • Biologisch aktive Varianten
  • Prozentuelle Identität zwischen einer mutmaßlichen NIP45-V-Variante und einer Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 8 wird unter Verwendung des Blast2-Abgleichungsprogramm bestimmt.
  • Variationen in der prozentuellen Identität können beispielsweise auf Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen zurückzuführen sein. Aminosäuresubstitutionen sind definiert als die Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere. Sie sind in ihrer Art konservativ, wenn die substituierte Aminosäure ähnliche strukturelle und/oder chemische Eigenschaften aufweist. Beispiele für konservative Ersetzungen sind Substitutionen eines Leucins durch ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat oder eines Threonins durch ein Serin.
  • Aminosäureinsertionen oder -deletionen sind Veränderungen an oder innerhalb einer Aminosäuresequenz. Sie fallen typischerweise in den Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren. Ein Leitfaden zur Bestimmung, welche Aminosäurereste substituiert, insertiert oder deletiert werden können, ohne die biologische oder immunologische Aktivität eines NIP45-V1-Polypeptids aufzuheben, kann unter Verwendung von Computerprogrammen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. DNASTAR-Software, ausfindig gemacht werden. Ob eine Aminosäureänderung zu einer biologisch aktiven NIP45-Polypeptidvariante führt oder nicht, kann leicht durch Testen auf NIP45-V1-Polypeptidaktivität, wie beispielsweise nachstehend in den spezifischen Beispielen beschrieben, bestimmt werden.
  • Fusionsproteine
  • Fusionsproteine können zumindest 5, 6, 8, 10, 25 oder 50 oder mehr zusammenhängende Aminosäuren einer in Seq.-ID Nr. 8 gezeigten Aminosäuresequenz umfassen. Fusionsproteine sind zur Bildung von Antikörpern gegen NIP45-V1-Polypeptid-Aminosäuresequenzen und zur Verwendung in verschiedenen Testsystemen nützlich. Fusionsproteine können beispielsweise verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die mit Teilen eines NIP45-V1-Polypeptids wechselwirken. Proteinaffinitätschromatographie oder Bibliotheks-basierte Tests für Protein-Protein-Wechselwirkungen wie z.B. die Hefe-Zwei-Hybrid- oder Phagendisplay-Systeme können für diesen Zweck verwendet werden. Solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und können auch als Arzneimittelscreens verwendet werden.
  • Ein NIP45-V1-Polypeptid-Fusionsprotein umfasst zwei Polypeptidsegmente, die mittels einer Peptidbindung aneinander fusioniert sind. Das erste Polypeptidsegment umfasst zumindest 5, 6, 8, 10, 25 oder 50 oder mehr zusammenhängende Aminosäuren aus Seq.-ID Nr. 8 oder einer biologisch aktiven Variante davon wie z.B. jener zuvor beschriebenen. Das erste Polypeptidsegment kann auch eine Volllängen-NIP45-Variante umfassen.
  • Das zweite Polypeptidsegment kann ein Volllängenprotein oder ein Proteinfragment sein. Proteine, die üblicherweise in der Fusionsproteinkonstruktion verwendet werden, umfassen β-Galactosidase, β-Glucuronidase, grün fluoreszierendes Protein (GFP), autofluoreszierende Proteine, umfassend blau fluoreszierendes Protein (BFP), Glutathion-S-Transferase (GST), Luciferase, Meerrettichperoxidase (HRP) und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT). Darüber hinaus werden Epitopmarkierungen in Fusionsproteinkonstruktionen verwendet, umfassend Histidin- (His-) Markierungen, FLAG-Markierungen, Influenza-Hämagglutinin- (HA-) Markierungen, Myc-Markierungen, VSV-G-Markierungen und Thioredoxin- (Trx-) Markierungen. Andere Fusionskonstruktionen können Maltosebindungsprotein- (MBP-), S-Markierung-, Lex-a-DNA-Bindungsdomänen- (DBD-) Fusionen, GAL4-DNA-Bindungsdomänenfu sionen und Herpes-simplex-Virus- (HSV-) BP16-Proteinfusionen umfassen. Ein Fusionsprotein kann gentechnisch auch so verändert werden, dass es eine Spaltungsstelle enthält, die zwischen der für NIP45-V1-Polypeptid kodierenden Sequenz und der heterologen Proteinsequenz angeordnet ist, sodass das NIP45-V1-Polypeptid gespalten und aus der heterologen Gruppierung gereinigt werden kann.
  • Ein Fusionsprotein kann, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, chemisch synthetisiert werden. Vorzugsweise wird ein Fusionsprotein durch kovalentes Binden von zwei Polypeptidsegmenten oder mittels Standardverfahren auf dem Gebiet der Molekularbiologie hergestellt. DNA-Rekombinationsverfahren können verwendet werden, um Fusionsproteine herzustellen, beispielsweise durch Herstellen eines DNA-Konstrukts, das Kodiersequenzen aus der aus Seq.-ID Nr. 2 bestehenden Gruppe umfasst, in korrektem Leseraster mit Nucleotiden, die für das zweite Polypeptidsegment kodieren, und Exprimieren des DNA-Konstrukts in einer Wirtszelle, wie es auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Zahlreiche Sets zur Konstruktion von Fusionsproteinen sind bei Unternehmen wie Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA) und Quantum Biotechnologies (Montreal, Kanada; 1-888-DNA-KITS) erhältlich.
  • Identifikation von Spezieshomologen
  • Spezieshomologe des NIP45-V1-Polypeptids können durch Verwenden von NIP45-V1-Polypeptidnucleotiden (nachstehend beschrieben), um geeignete Sonden oder Primer zum Screenen von cDNA-Expressionsbibliotheken aus anderen Spezies, wie z.B. Mäusen, Affen oder Hefe, herzustellen, Identifizieren von cDNAs, die für Homologe des NIP45-V1-Polypeptids kodieren, und Exprimieren der cDNAs, wie es auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, erhalten werden.
  • NIP45-V-Polynucleotide
  • Ein NIP45-ähnliches Polynucleotid kann einzel- oder doppelsträngig sein und eine Kodiersequenz oder das Komplement einer Kodiersequenz für ein NIP45-V1-Polypeptid umfassen. Die Kodiersequenz für menschliches NIP45-V1-Polypeptid ist in Seq.-ID Nr. 2 gezeigt.
  • Degenerierte Nucleotidsequenzen, die für menschliche NIP45-V1-Polypeptide kodieren, sowie homologe Nucleotidsequenzen, die zumindest zu etwa 50%, vorzugsweise zu etwa 75, 85, 90, 95, 96, 98 oder 99%, mit der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Nucleotidsequenz identisch sind, sind ebenfalls NIP45-V-Polynucleotide. Prozentuelle Sequenzidentität zwischen den Sequenzen von zwei Polynucleotiden wird unter Verwendung von Computerprogrammen wie z.B. ALIGN, die den FASTA-Algorithmus verwenden, unter Verwendung einer affine gap search mit einem gap open penalty von -12 und einem gap extension penalty von -2 bestimmt. Komplementär-DNA- (cDNA-) Moleküle, Spezieshomologe und Varianten von NIP45-V1-Polynucleotiden, die für biologisch aktive NIP45-V1-Polypeptide kodieren, sind ebenfalls NIP45-V1-Polynucleotide.
  • Identifikation von Varianten und Homologen von NIP45-V-Polynucleotiden
  • Varianten und Homologe der oben beschriebenen NIP45-V1-Polynucleotide sind ebenfalls NIP45-V1-Polynucleotide. Typischerweise können homologe NIP45-V1-Polynucleotidsequenzen durch Hybridisierung von Kandidatenpolynucleotiden an bekannte NIP45-V1-Polynucleotide unter stringenten Bedingungen identifiziert werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Beispielsweise können unter Verwendung der folgenden Waschbedingungen – 2x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,1% SDS, Raumtemperatur, zweimal, 30 min jeweils; dann 2x SSC, 0,1% SDS, 50 °C, einmal, 30 min lang; dann 2x SSC, Raumtemperatur, zweimal, 10 min jeweils – homologe Sequenzen identifiziert werden, die höchstens etwa 25-30% Basenpaarfehlpaarungen enthalten. Noch bevorzugter enthalten homöloge Nucleinsäurestränge 15-25% Basenpaarfehlpaarungen und noch bevorzugter 5- 15% Basenpaarfehlpaarungen.
  • Spezieshomologe der hierin offenbarten NIP45-V1-Polynucleotide können auch durch Herstellen geeigneter Sonden oder Primer und Screenen von cDNA-Expressionsbibliotheken aus anderen Spezies, wie z.B. Mäusen, Affen oder Hefe, identifiziert werden. Menschliche Varianten von NIP45V1-Polynucleotiden können beispielsweise durch Screenen menschlicher cDNA-Expressionsbibliotheken identifiziert werden. Es ist durchwegs bekannt, dass die Tm einer doppelsträngigen DNA mit jeder 1%igen Reduktion von Homologie um 1-1,5°C abnimmt (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973)). Varianten von menschlichen NIP45-V1-Polynucleotiden oder NIP45-V1-Polynucleotiden von anderen Spezies können daher durch Hybridisieren eines vermutlichen homologen NIP45-V1-Polynucleotids an ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 2 oder das Komplement davon zur Bildung eines Testhybrids identifiziert werden. Die Schmelztemperatur des Testhybrids wird mit der Schmelztemperatur eines Hybrids, das Transformylase-Polynucleotide mit perfekt komplementären Nucleotidsequenzen umfasst, verglichen, und die Anzahl oder Prozent an Basenpaarfehlpaarungen innerhalb der Testhybride wird bzw. werden berechnet.
  • Nucleotidsequenzen, die an Transformylase-Polynucleotide oder ihre Komplemente nach stringenten Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen hybridisieren, sind ebenfalls NIP45-V1-Polynucleotide. Stringente Waschbedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und verstanden und sind beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, 9.50-5.51 (1989), offenbart.
  • Typischerweise sollte für stringente Bedingungen eine Kombination aus Temperatur und Salzkonzentration ausgewählt werden, die etwa 12-20 °C unter der berechneten Tm des untersuchten Hybrids liegt. Die Tm eines Hybrids zwischen einem NIP45-V1-Polynucleotid mit einer in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Nucleotidsequenz oder dem Komplement davon und einer Polynucleotidsequenz, die zu zumindest etwa 50%, vor zugsweise zu etwa 75, 90, 96 oder 98%, mit einer dieser Nucleotidsequenzen identisch ist, kann beispielsweise unter Verwendung der Gleichung von Bolton & McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48, 1390 (1962), berechnet werden: Tm = 81,5 °C – 16,6(log10[Na+]) + 0,41(%G+ C) – 0,63(%Formamid) – 600/l,worin I = die Länge des Hybrids in Basenpaaren angibt.
  • Stringente Waschbedingungen umfassen beispielsweise 4x SSC bei 65 °C oder 50% Formamid, 4x SSC bei 42 °C oder 0,5x SSC, 0,1% SDS bei 65 °C. Hochstringente Waschbedingungen umfassen beispielsweise 0,2x SSC bei 65 °C.
  • Herstellung von NIP45-V-Polynucleotiden
  • Ein natürlich vorkommendes NIP45-V1-Polynucleotid kann frei von anderen Zellkomponenten wie z.B. Membrankomponenten, Proteinen und Lipiden isoliert werden. Polynucleotide können durch eine Zelle hergestellt und unter Verwendung von herkömmlichen Nucleinsäure-Reinigungsverfahren isoliert werden, oder sie können unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens, wie z.B. der Polymerasekettenreaktion (PCR), oder unter Verwendung eines automatischen Synthesegeräts synthetisiert werden. Verfahren zur Isolierung von Polynucleotiden sind Routineverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Jedes beliebige solcher Verfahren zum Erhalt eines Polynucleotids kann verwendet werden, um isolierte NIP45-V1-Polynucleotide zu erhalten. Restriktionsenzyme und Sonden können beispielsweise verwendet werden, um Polynucleotidfragmente zu isolieren, die NIP45-V1-Nucleotidsequenzen umfassen. Isolierte Polynucleotide sind in Präparaten vorhanden, die frei oder zumindest zu 70, 80 oder 90% frei von anderen Molekülen sind.
  • NIP45-V1-cDNA-Moleküle können mittels herkömmlicher molekularbiologischer Verfahren, unter Verwendung von NIP45-V1-mRNA als Matrix, hergestellt werden. NIP45-V1-cDNA-Moleküle können hiernach unter Verwendung molekularbiologischer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und in Handbüchern wie Sambrook et al. (1989) offenbart sind, repliziert werden. Ein Amplifikationsverfahren wie z.B. PCR kann verwendet werden, um zusätzliche Kopien von Polynucleotiden der Erfindung, entweder unter Verwendung von menschlicher genomischer DNA oder cDNA als Matrix, zu erhalten.
  • Alternativ dazu können Verfahren der Synthesechemie verwendet werden, um NIP45-V1-Polynucleotide zu synthetisieren. Die Degeneration des genetischen Codes ermöglicht es, alternative Nucleotidsequenzen zu synthetisieren, die für ein NIP45-V1-Polypeptid mit beispielsweise einer in Seq.-ID Nr. 8 gezeigten Aminosäuresequenz oder für eine biologisch aktive Variante davon kodieren.
  • Verlängerung von NIP45-V-Polynucleotiden
  • Verschiedene PCR-basierte Verfahren können verwendet werden, um die Nucleinsäuresequenzen, die für die offenbarten Abschnitte von menschlichem NIP45-V1-Polypeptid kodieren, zu verlängern, um Stromauf-Sequenzen wie z.B. Promotoren und Regulationselemente zu detektieren. Restriktionsstellen-PCR verwendet beispielsweise universelle Primer, um unbekannte Sequenzen zu finden, die neben einem bekannten Locus liegen (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318-322 (1993)). Genomische DNA wird zuerst in Gegenwart eines Primers zur Linkersequenz und eines Primers, der für die bekannte Region spezifisch ist, amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen werden anschließend einem zweiten PCR-Durchgang mit demselben Linkerprimer und einem anderen spezifischen Primer, der innerhalb des ersten liegt, unterzogen. Die Produkte aus jedem PCR-Durchgang werden mit einer geeigneten RNA-Polymerase transkribiert und unter Verwendung von reverser Transkriptase sequenziert.
  • Inverse PCR kann auch verwendet werden, um Sequenzen unter Verwendung divergierender Primer basierend auf einer bekannten Region zu amplifizieren oder zu verlängern (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 8186 (1988)). Primer können unter Verwendung von handelsüblicher Software, wie z.B. OLIGO 4.06 Primer Analysis-Software (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), so entworfen werden, dass sie 22-30 Nucleotide lang sind, einen GC-Gehalt von 50% oder mehr aufweisen und an die Targetsequenz bei Temperaturen von etwa 68-72 °C anellieren. Das Verfahren verwendet mehrere Restriktionsenzyme, um ein geeignetes Fragment in der bekannten Region eines Gens zu bilden. Das Fragment wird dann durch intramolekulare Ligation zirkularisiert und als PCR-Matrix verwendet.
  • Ein anderes Verfahren, das verwendet werden kann, ist Einfang-PCR, die PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten, die benachbart zu einer bekannten Sequenz in künstlicher menschlicher und Hefe-Chromosomen-DNA liegen, umfasst (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1, 111-119 (1991)). In diesem Verfahren können auch mehrfache Restriktionsenzymverdaue und -ligationen verwendet werden, um eine gentechnisch veränderte, doppelsträngige Sequenz in ein unbekanntes Fragment des DNA-Moleküls anzuordnen, bevor PCR durchgeführt wird.
  • Ein anderes Verfahren, das verwendet werden kann, um unbekannte Sequenzen zu finden, ist jenes von Parker et al., Nucleic Acids Res. 19, 3055-3060 (1991)). Darüber hinaus können PCR, verschachtelte Primer und PROMOTERFINDER-Bibliotheken (CLONTECH, Palo Alto, Kalif.) verwendet werden, um genomische DNA zu walken (CLONTECH, Palo Alto, Kalif.). Dieses Verfahren umgeht die Notwendigkeit, Bibliotheken zu screenen, und ist für das Erkennen von Intron/Exon-Junctions nützlich.
  • Wird auf Volllängen-cDNAs gescreent, so werden vorzugsweise Bibliotheken verwendet, die so der Größe nach selektiert wurden, dass sie größere cDNAs umfassen. Zufällig geprimte Bibliotheken sind darin vorzuziehen, dass sie mehr Sequenzen enthalten, die die 5'-Regionen von Genen enthalten. Die Verwendung einer zufällig geprimten Bibliothek kann besonders in Situationen bevorzugt sein, in denen eine Oligo-d(T)-Bibliothek keine Volllängen-cDNA ergibt. Genomische Bibliotheken können zur Sequenzverlängerung in 5'-nichttranskribierte Regulationsregionen nützlich sein.
  • Im Handel erhältliche Kapillarelektrophoresesysteme können verwendet werden, um die Größe zu analysieren oder die Nucleotidsequenz von PCR- oder Sequenzierungsprodukten zu bestätigen. Kapillarsequenzieren kann beispielsweise fließfähige Polymere für Elektrophoresetrennung, vier verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe (einen für jedes Nucleotid), die laseraktiviert werden, und Detektion der emittierten Wellenlängen durch eine ladungsgekoppelte Kamera verwenden. Leistung/Lichtintensität kann unter Verwendung einer geeigneten Software (z.B. GENOTYPER und Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer) zu einem elektrischen Signal umgesetzt werden, und das gesamte Verfahren vom Laden der Proben bis hin zur Computeranalyse und der elektronischen Datenanzeige kann computergesteuert sein. Kapillarelektrophorese ist insbesondere zum Sequenzieren kleiner Teile von DNA, die in limitierten Mengen in einer bestimmten Probe vorhanden sein können, vorzuziehen.
  • Erhalt von NIP45-V1-Polypepfiden
  • NIP45-V1-Polypeptide können beispielsweise durch Reinigung aus menschlichen Zellen, durch Expression von NIP45-V1-Polynucleotiden oder durch direkte chemische Synthese erhalten werden.
  • Proteinreinigung
  • NIP45-V1-Polypeptide können aus jeder beliebigen menschlichen Zelle, die das Protein exprimiert, einschließlich Wirtszellen, die mit NIP45-V1-Polynucleotiden transfiziert wurden, gereinigt werden. Thymus, Milz, Lymphknoten und andere mit dem Immunsystem zusammenhängende Gewebe sind besonders nützliche Quellen für NIP45-V1-Polypeptide. Ein gereinigtes NIP45-V1-Polypeptid wird von anderen Verbindungen, die normalerweise mit dem NIP45-V1-Polypeptid in der Zelle assoziieren, wie z.B. bestimmte Proteine, Kohlenhydrate oder Lipide, unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, getrennt. Solche Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Größenausschlusschromatographie, Ammoniumsulfatfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und präparative Gelelektrophorese.
  • Ein Präparat gereinigter NIP45-V1-Polypeptide ist zumindest zu 80% rein; vorzugsweise sind die Präparate zu 90%, 95% oder 99% rein. Die Reinheit der Präparate kann durch jegliches Mittel, das auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, wie z.B. mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bewertet werden.
  • Expression von NIP45-V-Polynucleotiden
  • Um ein NIP45-V1-Polypeptid zu exprimieren, kann ein NIP45-V1-Polynucleotid in einen Expressionsvektor insertiert werden, der die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der insertierten Kodiersequenz enthält. Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die Sequenzen, die für NIP45-V1-Polypeptide kodieren, und geeignete Transkriptions- und Translationssteuerungselemente enthalten. Diese Verfahren umfassen In-vitro-DNA-Rekombinationsverfahren und synthetische Verfahren sowie genetische Rekombination (in vivo). Solche Verfahren werden beispielsweise in Sambrook et al. (1989) und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1989), beschrieben.
  • Zahlreiche verschiedene Expressionsvektor/Wirtssysteme können verwendet werden, die Sequenzen enthalten und exprimieren, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodieren. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Mikroorganismen, wie z.B. mit rekombinantem Bakteriophagen-, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformierte Bakterien; mit Hefeexpressionsvektoren transformierte Hefe, mit Virusexpressionsvektoren infizierte Insektenzellsysteme (z.B. Baculovirus), mit Virusexpressionsvektoren transformierte Pflanzenzellsysteme (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit Bakterienexpressionsvketoren transformierte Pflanzenzellsysteme (z.B. Ti oder pBR322-Plasmide) oder auch Tierzellsysteme.
  • Die Steuerungselemente oder Regulationssequenzen sind jene untranslatierten Regionen des Vektors – Enhancer, Promotoren, 5'- und 3'-untranslatierte Regionen -, die mit Wirtszellproteinen wechselwirken und so Transkription und Translation ausführen. Solche Elemente können in ihrer Stärke und Spezifität variieren. Je nach verwendetem Vektorsystem und Wirt kann jegliche Anzahl an geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, verwendet werden. Erfolgt das Klonieren beispielsweise in Bakteriensystemen, so können induzierbare Promotoren wie z.B. der Hybrid-IacZ-Promotor des BLUESCRIPT-Phagemiden (Stratagene, LaJolla, Kalif.) oder des pSPORT1-Plasmids (Life Technologies) und dergleichen verwendet werden. Der Baculovirus-Polyhedrinpromotor kann in Insektenzellen verwendet werden. Promotoren oder Enhancer, die aus den Genomen von Pflanzenzellen stammen (z.B. Hitzeschock-, RUBISCO- und Speicherproteingene) oder aus Pflanzenviren (z.B. virale Promotoren oder Leadersequenzen) können in den Vektor kloniert werden. In Säugetierzellsystemen sind Promotoren aus Säugetiergenen oder aus Säugetierviren vorzuziehen. Ist es erforderlich, eine Zelllinie zu bilden, die Mehrfachkopien einer Nucleotidsequenz enthält, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodiert, so können Vektoren basierend auf SV40 oder EBV mit einem geeigneten selektierbaren Marker verwendet werden.
  • Bakterien- und Hefe-Expressionssysteme
  • In Bakteriensystemen können je nach der beabsichtigten Verwendung für das NIP45-V1-Polypeptid zahlreiche Expressionsvektoren selektiert werden. Ist beispielsweise eine große Menge an NIP45-V1-Polypeptid für die Induktion von Antikörpern erforderlich, so können Vektoren, die hochgradige Expression von leicht zu reinigenden Fusionsproteinen steuern, verwendet werden. Solche Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, multifunktionelle E.-coli-Klonierungs- und -Expressionsvektoren wie z.B. BLUESCRIPT (Stratagene). In einem BLUESCRIPT-Vektor kann eine Sequenz, die für das NIP45-V1-Polypeptid kodiert, in den Vektor in Raster mit Sequenzen für das aminoterminale Met und die darauf folgenden 7 Reste von β-Galactosidase ligiert werden, sodass ein hybrides Protein produziert wird. pIN-Vektoren (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509 (1989)) oder pGEX-Vektoren (Promega, Madison, Wis.) können auch verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht aus lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agaroseperlen, gefolgt von Elution in Gegenwart von freiem Glutathion, gereinigt werden. Proteine, die in solchen Systemen hergestellt werden, können so entworfen werden, dass sie Heparin-, Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltungsstellen umfassen, sodass das klonierte Polypeptid von Interesse nach Belieben aus der GST-Gruppierung freigesetzt werden kann.
  • In der Hefe Saccharomyces cerevisiae können zahlreiche Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren wie z.B. alpha-Faktor, Alkoholoxidase und PGH enthalten, verwendet werden. Berichte hierzu sind in Ausubel et al. (1989) und Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516-544 (1987), zu finden.
  • Pflanzen- und Insekten-Expressionssysteme
  • Werden Pflanzenexpressionsvektoren verwendet, so kann die Expression von Sequenzen, die für NIP45-V1-Polypeptide kodieren, durch jede beliebige Anzahl an Promotoren gesteuert werden. Viruspromotoren wie die 35S- und 19S-Promotoren von CaMV beispielsweise können alleine oder in Kombination mit der omega-Leadersequenz aus TMV verwendet werden (Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311 (1987)). Alternativ dazu können Pflanzenpromotoren wie z.B. die kleine Untereinheit von RUBISCO- oder Hitzeschockpromotoren verwendet werden (Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224, 838-843 (1984); Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105 (1991)). Diese Konstrukte können durch direkte DNA-Transformation oder durch Pathogen-vermittelte Transfektion in Pflanzenzellen eingeführt werden. Solche Verfahren werden in zahlreichen allgemein erhältlichen Berichten beschrieben (z.B. Hobbs oder Murray, in: MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., 191-196 (1992)).
  • Ein Insektensystem kann auch verwendet werden, um ein NIP45-V1-Polypeptid zu exprimieren. In einem solchen System wird beispielsweise „Autographa californica nuclear polyhedrosis virus" (AcNPV) als Vektor verwendet, um Fremdgene in Spo doptera-frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven zu exprimieren. Sequenzen, die für NIP45-ähnliche Polypeptide kodieren, können in eine nicht-essenzielle Region des Virus, wie z.B. das Polyhedrin-Gen, kloniert und unter die Steuerung des Polyhedrin-Promotors gestellt werden. Erfolgreiche Insertion von NIP45-V1-Polypeptiden macht das Polyhedrin-Gen inaktiv und produziert rekombinantes Virus, dem Hüllprotein fehlt. Die rekombinanten Viren können dann verwendet werden, um S.-frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven, in denen NIP45-V1-Polypeptide exprimiert werden können, zu infizieren (Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224-3227 (1994)).
  • Säugetier-Expressionssysteme
  • Zahlreiche virusbasierte Expressionssysteme können verwendet werden, um NIP45-V1-Polypeptide in Säugetierwirtszellen zu exprimieren. Wird beispielsweise ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet, so können Sequenzen, die für NIP45-V1-Polypeptide kodieren, in einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Komplex, der den späten Promotor und eine dreiteilige Leadersequenz umfasst, ligiert werden. Insertion in eine nicht-essenzielle E1- oder E3-Region des viralen Genoms kann verwendet werden, um ein lebensfähiges Virus zu erhalten, das in der Lage ist, ein NIP45-V1-Polypeptid in infizierten Wirtszellen zu exprimieren (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659 (1984)). Sofern erwünscht, können Transkriptionsenhancer wie z.B. der Rous-Sarkom-Virus- (RSV-) Enhancer verwendet werden, um die Expression in Säugetierwirtszellen zu steigern.
  • Menschliche künstliche Chromosomen (human artificial chromosomes, HACs) können auch verwendet werden, um größere DNA-Fragmente als die in einem Plasmid enthaltenen und exprimierten zu liefern. Es werden HACs mit 6 M bis 10 M konstruiert und Zellen über herkömmliche Zufuhrmethoden (z.B. über Liposomen, polykationische Aminopolymere oder Vesikel) zugeführt.
  • Spezifische Startsignale können verwendet werden, um effizientere Translation von Sequenzen, die für NIP45-V1-Polypeptide kodieren, zu erreichen. Solche Signale umfassen das ATG-Initiationscodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, in denen Sequenzen, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodieren, sein Initiationscodon und Stromauf-Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, sind möglicherweise keine zusätzlichen Transkriptions- oder Translationskontrollsignale mehr erforderlich. In Fällen, in denen nur eine Kodiersequenz oder ein Fragment davon insertiert werden, sollten jedoch exogene Translationskontrollsignale (einschließlich des ATG-Initiationscodons) bereitgestellt werden. Das Initiationscodon sollte im korrekten Leseraster sein, um Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Exogene Translationselemente und Initiationscodons können verschiedene Ursprünge, sowohl natürlicher als auch synthetischer Art, aufweisen. Die Expressionseffizienz kann durch die Einbindung von Enhancern, die für das bestimmte verwendete Zellsystem geeignet sind, gesteigert werden (siehe Schart et al., Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162 (1994)).
  • Wirtszellen
  • Ein Wirtszellenstamm kann aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt werden, die Expression der insertierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte NIP45-V1-Polypeptid in erwünschter Weise zu verarbeiten. Solche Modifikationen des Polypeptids umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Acetylierung, Carboxylierung, Glykosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Posttranslationale Verarbeitung, die eine "prepro"-Form des Polypeptids spaltet, kann ebenfalls verwendet werden, um korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion zu erleichtern. Verschiedene Wirtszellen, die spezifische zelluläre Vorgänge und charakteristische Mechanismen für posttranslationale Aktivitäten aufweisen, (z.B. CHO, HeLa, MDCK, HEK293, B-Lymphomzellen und W138) sind bei der American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) erhältlich und können ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Verarbeitung des Fremdproteins sicherzustellen.
  • Stabile Expression wird für langfristige Produktion rekombinanter Proteine bei hoher Ausbeute bevorzugt. Zelllinien beispielsweise, die NIP45-V1-Polypeptide stabil exprimieren, können unter Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, und/oder von endogenen Expressionselementen und einem selektierbaren Markergen am selben oder an einem separaten Vektor transformiert werden. Nach der Einführung des Vektors können Zellen 1-2 Tage lang in einem angereicherten Medium wachsen gelassen werden, bevor sie auf ein selektives Medium übertragen werden. Der Zweck des selektierbaren Markers ist, dass er Resistenz gegenüber Selektion verleiht, und seine Gegenwart ermöglicht Wachstum und Gewinnung von Zellen, die die eingeführten NIP45-V1-Sequenzen erfolgreich exprimieren. Resistente Klone von stabil transformierten Zellen können unter Verwendung von Kulturverfahren, die für den Zelltyp geeignet sind, proliferiert werden. Siehe beispielsweise ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney (Hrsg.) (1986).
  • Jede beliebige Anzahl an Selektionssystemen kann verwendet werden, um transformierte Zelllinien zu gewinnen. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase- (Wigler et al., Cell 11, 223-232 (1977)) und Adeninphosphoribosyltransferase- (Lowy et al., Cell 22, 817-823 (1980)) Gene, die in tk–- bzw. aprt–-Zellen verwendet werden können. Auch Antimetabolit-, Antibiotika- oder Herbizidresistenz können als Grundlage für die Selektion verwendet werden. dhfr beispielsweise verleiht Resistenz gegenüber Methotrexat (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-3570 (1980)), npt verleiht Resistenz gegen die Aminoglycoside, Neomycin und G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1-14 (1981)), und als und pat verleihen Resistenz gegenüber Chlorsulfuron- bzw. Phosphinotricinacetyltransferase (Murray (1992), s.o.). Zusätzliche selektierbare Gene wurden bereits beschrieben. trpB beispielsweise ermöglicht es Zellen, Indol anstelle von Tryptophan zu verwerten, was den Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwerten (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-8051 (1988)). Sichtbare Marker, wie z.B. Anthocyanine, β-Glucuronidase und ihr Substrat GUS und Luciferase und ihr Substrat Luciferin, können verwendet werden, um Transformanten zu identifizieren und die Menge von vorübergehender oder stabiler Proteinexpression, die einem spezifischen Vektorsystem zuzuschreiben ist, zu quantifizieren (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121-131 (1995)).
  • Detektion von Expression von NIP45-V1-Polypeptiden
  • Selbst wenn die Gegenwart von Markergenexpression darauf schließen lässt, dass das NIP45-V1-Polynucleotid auch vorhanden ist, kann seine Gegenwart und Expression bestätigt werden müssen. Wird beispielsweise eine Sequenz, die für ein NIP45-V1-Polynucleotid kodiert, innerhalb einer Markergensequenz insertiert, so können transformierte Zellen, die Sequenzen enthalten, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodieren, durch die Abwesenheit von Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ dazu kann ein Markergen mit einer Sequenz, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodiert, unter der Steuerung eines einzelnen Promotors im Tandem angeordnet werden. Expression des Markergens als Reaktion auf Induktion oder Selektion indiziert üblicherweise Expression des NIP45-V1-Polynucleotids.
  • Alternativ dazu können Wirtszellen, die ein NIP45-V1-Polynucleotid enthalten und die ein NIP45-V1-Polypeptid exprimieren, mittels zahlreicher verschiedener Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungen und Protein-Biotest- oder -Immuntestverfahren, die Membran- Lösungs- oder Chip-basierte Technologien zur Detektion und/oder Quantifizierung von Nucleinsäure oder Protein einbinden. Die Gegenwart einer Polynucleotidsequenz, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodiert, kann beispielsweise mittels DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder -Amplifikation unter Verwendung von Sonden oder Fragmenten oder Fragmenten von Polynucleotiden, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodieren, nachgewiesen werden. Auf Nucleinsäureamplifikation basierte Tests umfassen die Verwendung von Oligonucleotiden, die aus Sequenzen ausgewählt sind, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodieren, um Transformanten nachzuweisen, die ein NIP45-V1-Polynucleotid enthalten.
  • Zahlreiche verschiedene Arbeitsvorschriften zur Detektion und Messung der Expression eines NIP45-V1-Polypeptids unter Verwendung von entweder polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die für das Polypeptid spezifisch sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele hierfür umfassen enzymgekoppelte Immunad sorptionsbestimmung (ELISA), Radioimmuntest (RIA) und fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS). Ein monoklonal-basierter Zwei-Stellen-Immuntest unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die auf zwei sich gegenseitig nicht störende Epitope an einem NIP45-V1-Polypeptid reaktiv sind, kann verwendet werden, oder auch ein Konkurrenzbindungstest kann eingesetzt werden. Diese und andere Tests werden in Hampton et al., Serological Methods: A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Minn. (1990), und Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1216 (1983), beschrieben.
  • Zahlreiche verschiedene Markierungen und Konjugationsverfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können in verschiedenen Nucleinsäure- und Aminosäuretests verwendet werden. Mittel zur Herstellung markierter Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zur Detektion von Sequenzen; die mit Polynucleotiden verwandt sind, die für NIP45-V1-Polypeptid kodieren, umfassen Oligomarkierung, Nick-Translation, Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids. Alternativ dazu können Sequenzen, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodieren, zur Produktion einer mRNA-Sonde in einen Vektor kloniert werden. Solche Vektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, sind im Handel erhältlich und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch den Zusatz markierter Nucleotide und einer geeigneten RNA-Polymerase wie z.B. T7, T3 oder SP6 zu synthetisieren. Diese Verfahren können unter Verwendung zahlreicher verschiedener, im Handel erhältlicher Sets (Amersham Pharmacia Biotech, Promega und US Biochemical) durchgeführt werden. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen, die für leichtere Detektion verwendet werden können, umfassen Radionuclide, Enzyme und Fluoreszenz-, Chemolumineszenz- oder chromogene Mittel sowie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Teilchen und dergleichen.
  • Expression und Reinigung von NIP45-V1-Polypeptiden
  • Wirtszellen, die mit Nucleotidsequenzen, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodieren, transformiert sind, können unter Bedingungen, die für die Expression und Gewinnung des Proteins aus der Zellkultur geeignet sind, kultiviert werden. Das durch eine trans formierte Zelle produzierte Polypeptid kann je nach der Sequenz und/oder dem Vektor, die bzw. der verwendet wird, sekretiert werden oder intrazellulär enthalten sein. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wird verständlich sein, dass Expressionsvektoren, die Polynucleotide enthalten, die für NIP45-V1-Polypeptide kodieren, so entworfen werden können, dass sie Signalsequenzen enthalten, die die Sekretion löslicher NIP45-V1-Polypeptide durch eine prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran steuern oder die die Membraninsertion von membrangebundenem NIP45-V1-Polypeptid steuern.
  • Wie zuvor erläutert, können andere Konstruktionen verwendet werden, um eine Sequenz, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodiert, an eine Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptiddomäne kodiert, zu binden, was die Reinigung löslicher Proteine erleichtert. Solche die Reinigung erleichternden Domänen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Metallchelat bildende Peptide wie z.B. Histidintryptophanmodule, die die Reinigung an immobilisierten Metallen ermöglichen, Protein-A-Domänen, die die Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die in den FLAGS-Extensions/Affinitäts-Reinigungssystemen (Immunex Corp., Seattle, Wash.) verwendete Domäne. Die Einbindung spaltbarer Linkersequenzen wie z.B. jenen, die für Factor Xa oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA) spezifisch sind, zwischen der Reinigungsdomäne und dem NIP45-V1-Polypeptid kann auch verwendet werden, um Reinigung zu erleichtern. Ein solcher Expressionsvektor sorgt für die Expression eines Fusionsproteins, das ein NIP45-V1-Polypeptid und 6 Histidinreste, die einer Thioredoxin- oder einer Enterokinase-Spaltungsstelle vorangehen, enthält. Die Histidinreste erleichtern die Reinigung mittels IMAC (Affinitätschromatographie mittels immobilisierter Metallionen, wie sie in Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263-281 (1992), beschrieben wird), während die Enterokinase-Spaltungsstelle ein Mittel zur Reinigung des NIP45-V1-Polypeptids aus dem Fusionsprotein bereitstellt. Vektoren, die Fusionsproteine enthalten, sind in Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441-453 (1993), offenbart.
  • Chemische Synthese
  • Sequenzen, die für ein NIP45-V1-Polypeptid kodieren, können als Ganzes oder teilweise unter Verwendung von chemischen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, synthetisiert werden (siehe Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223 (1980); Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232 (1980)). Alternativ dazu kann ein NIP45-V1-Polypeptid selbst unter Verwendung chemischer Verfahren zur Synthese seiner Aminosäuresequenz, wie z.B. mittels direkter Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Roberge et al., Science 269, 202-204 (1995)), produziert werden. Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller Verfahren oder mittels Automation erfolgen. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung von „Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer" (Perkin Elmer) erreicht werden. Gegebenenfalls können Fragmente von NIP45-V1-Polypeptiden separat synthetisiert und unter Verwendung chemischer Verfahren kombiniert werden, um ein Volllängenmolekül zu produzieren.
  • Das neu synthetisierte Peptid kann durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (siehe z.B. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., New York, N.Y. (1983)) wesentlich gereinigt werden. Die Zusammensetzung eines synthetischen NIP45-V1-Polypeptids kann mittels Aminosäureanalyse oder Sequenzieren (z.B. durch das Edman-Abbauverfahren; siehe Creighton, s.o.) bestätigt werden. Darüber hinaus kann jeder beliebige Teil der Aminosäuresequenz des NIP45-V1-Polypeptids während direkter Synthese verändert und/oder unter Verwendung chemischer Verfahren mit Sequenzen aus anderen Proteinen kombiniert werden, um eine Polypeptidvariante oder ein Fusionsprotein zu bilden.
  • Herstellung veränderter NIP45-V-Polypeptide
  • Wie Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung verstehen werden, kann es von Vorteil sein, für NIP45-V1-Polypeptid kodierende Nucleotidsequenzen, die nicht natürlich vorkommende Codons besitzen, zu produzieren. Beispielsweise können Codons, die von einem bestimmten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt bevorzugt werden, selektiert werden, um das Proteinexpressionsniveau zu steigern oder um ein RNA-Transkript zu produzieren, das wünschenswerte Eigenschaften, wie z.B. eine Halbwertszeit, die länger als jene eines Transkripts ist, das aus der natürlich vorkommenden Sequenz gebildet wird, aufweist.
  • Die hierin offenbarten Nucleotidsequenzen können unter Verwendung von Verfahren, die im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung dafür bekannt sind, dass sie für NIP45-V1-Polypeptid kodierende Sequenzen aus mehreren verschiedenen Gründen verändern, gentechnisch verändert werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Veränderungen, die das Klonieren, Verarbeiten und/oder die Expression des Polypeptids oder mRNA-Produkts modifizieren. DNA-Neukombination durch zufällige Fragmentierung und PCR-Neuanordnung von Genfragmenten und synthetischen Oligonucleotiden kann verwendet werden, um die Nucleotidsequenzen gentechnisch zu verändern. Ortsgerichtete Mutagenese beispielsweise kann verwendet werden, um neue Restriktionsstellen zu insertieren, Glykosylierungsmuster zu verändern, Codonpräferenz zu ändern, Spleißvarianten zu produzieren, Mutationen einzuführen usw.
  • Antikörper
  • Jeder beliebige Typ von Antikörper, der auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann gebildet werden, um ihn spezifisch an ein Epitop eines NIP45-V1-Polypeptids zu binden. "Antikörper" wie hierin verwendet umfasst intakte Immunglobulinmoleküle sowie Fragmente davon, wie z.B. Fab, F(ab')2 und Fv, die in der Lage sind, ein Epitop eines NIP45-V1-Polypeptids zu binden. Typischerweise sind zumindest 6, 8, 10 oder 12 zusammenhängende Aminosäuren erforderlich, um ein Epitop zu bilden. Epitope, die nicht zusammenhängende Aminosäuren einbinden, können jedoch mehr, z.B. zumindest 15, 25 oder 50 Aminosäuren, erfordern.
  • Ein Antikörper, der sich spezifisch an ein Epitop eines NIP45-V1-Polypeptids bindet, kann therapeutisch sowie in immunchemischen Tests, wie z.B. Western-Blots, ELI-SAs, Radioimmuntests, immunhistochemischen Tests, Immunfällungen oder anderen immunchemischen Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden. Verschiedene Immuntests können verwendet werden, um Antikörper zu identifizieren, die die erwünschte Spezifität aufweisen. Zahlreiche Arbeitsvorschriften für kompetitive Bindung oder immunradiometrische Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Solche Immuntests umfassen typischerweise die Messung von Komplexbildung zwischen einem Immunogen und einem Antikörper, der sich spezifisch an das Immunogen bindet.
  • Typischerweise liefert ein Antikörper, der sich spezifisch an ein NIP45-V1-Polypeptid bindet, ein Detektionssignal, das zumindest um das 5-, 10- oder 20fache stärker ist als ein Detektionssignal, das mit anderen Proteinen bereitgestellt wird, wenn diese in einem immunchemischen Test verwendet werden. Vorzugsweise detektieren Antikörper, die sich spezifisch an NIP45-V-Polypeptide binden, keine anderen Proteine in immunchemischen Tests und können ein NIP45-V1-Polypeptid aus der Lösung immunfällen.
  • NIP45-V1-Polypeptide können verwendet werden, um ein Säugetier, wie z.B. eine Maus, Ratte, ein Kaninchen, Meerschweinchen, einen Affen oder Menschen, zu immunisieren, um polyklonale Antikörper zu produzieren. Sofern erwünscht, kann ein NIP45-V1-Polypeptid an ein Trägerprotein wie z.B. bovines Serumalbumin, Thyroglobulin und Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin konjugiert werden. Je nach Wirtsspezies können verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die immunologische Antwort zu steigern. Solche Adjuvanzien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Freundsches Adjuvans, Mineralgele (z.B. Aluminiumhydroxid) und oberflächenaktive Substanzen (z.B. Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und Dinitrophenol). Unter den bei Menschen verwendeten Adjuvanzien sind BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum besonders nützlich.
  • Monoklonale Antikörper, die sich spezifisch an ein NIP45-V1-Polypeptid binden, können unter Verwendung jedes beliebigen Verfahrens, das für die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur sorgt, hergestellt werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, das Hybridomverfahren, das Human-B-Zellen-Hybridomverfahren und das EBV-Hybridomverfahren (Kohler et al., Nature 256, 495-497 (1985); Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31-42 (1985); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030 (1983); Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109-120 (1984)).
  • Darüber hinaus können Verfahren, die zur Produktion von "chimären Antikörpern" entwickelt wurden, das Spleißen von Maus-Antikörper-Genen in menschliche Antikörper-Gene, um ein Molekül mit geeigneter Antigenspezifität und biologischer Aktivität zu erhalten, verwendet werden (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314, 452-454 (1985)). Monoklonale und andere Antikörper können auch "humanisiert" werden, um zu vermeiden, dass ein Patient gegen den Antikörper, wenn dieser therapeutisch verwendet wird, eine Immunantwort entwickelt. Solche Antikörper können in ihrer Sequenz menschlichen Antikörpern ausreichend ähnlich sein, um direkt in der Therapie verwendet zu werden, oder sie können Veränderungen von ein paar maßgeblichen Resten erfordern. Sequenzunterschiede zwischen Nagetier-Antikörpern und menschlichen Sequenzen können durch Ersetzen von Resten, die sich von jenen in den menschlichen Sequenzen unterscheiden, mittels ortsgerichteter Mutagenese einzelner Reste oder durch Grating gesamter komplementaritätsbestimmender Regionen minimiert werden. Alternativ dazu können humanisierte Antikörper unter Verwendung von Rekombinationsverfahren, wie sie in der GB 218 86 638 B beschrieben werden, produziert werden. Antikörper, die sich spezifisch an ein NIP45-V1-Polypeptid binden, können Antigenbindungsstellen enthalten, die entweder teilweise oder vollständig humanisiert sind, wie in der US 5.565.332 offenbart wurde.
  • Alternativ dazu können Verfahren, die für die Herstellung einkettiger Antikörper beschrieben werden, unter Verwendung von Vorgehensweisen, die auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben werden, angepasst werden, um einkettige Antikörper zu produzieren, die sich spezifisch an NIP45-V-Polypeptide binden. Antikörper mit verwandter Spezifität, jedoch mit unterschiedlicher idiotypischer Zusammensetzung, können durch Kettenneukombination von zufälligen kombinatorischen Immunglobulinbibliotheken gebildet werden (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-11123 (1991)).
  • Einkettige Antikörper können auch unter Verwendung eines DNA-Amplifikationsverfahrens, wie z.B. PCR, unter Verwendung von Hybridom-cDNA als Matrix konstruiert werden (Thirion et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-511 (1996)). Einkettige Antikörper können mono- oder bispezifisch sein und können zweiwertig oder vierwertig sein. Die Konstruktion vierwertiger bispezifischer einkettiger Antikörper wird beispielsweise in Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15, 159-163 (1997), erläutert. Die Konstruktion zweiwertiger bispezifischer einkettiger Antikörper wird in Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206 (1994), erläutert.
  • Eine Nucleotidsequenz, die für einen einkettigen Antikörper kodiert, kann unter Verwendung manueller oder automatisierter Nucleotidsynthese konstruiert, in ein Expressionskonstrukt unter Verwendung standardmäßiger DNA-Rekombinationsverfahren kloniert und in eine Zelle eingeführt werden, um die Kodiersequenz wie nachstehend beschrieben zu exprimieren. Alternativ dazu können einkettige Antikörper direkt unter Verwendung von beispielsweise filamentöser Phagen-Technologie produziert werden (Verhaar et al., Int. J. Cancer 61, 497-501 (1995); Nicholls et al., J. Immunol. Meth. 165, 81-91 (1993)).
  • Antikörper, die sich spezifisch an NIP45-V1-Polypeptide binden, können auch durch Induzieren von In-vivo-Produktion in der Lymphozytenpopulation oder durch Screenen von Immunglobulinbibliotheken oder Panels von hochspezifischen Bindungsreagenzien, wie in der Literatur offenbart (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833-3837 (1989); Winter et al., Nature 349, 293-299 (1991)), gebildet werden.
  • Auch andere Typen von Antikörpern können konstruiert und therapeutisch in Verfahren der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können chimäre Antikörper, wie in der WO93/03151 offenbart, konstruiert werden. Bindungsproteine, die von Immunglobulinen stammen und die mehrwertig und multispezifisch sind, wie z.B. die in der WO 94/13804 beschriebenen "Diabodies", können ebenfalls hergestellt werden.
  • Antikörper gemäß der Erfindung können mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, gereinigt werden. Beispielsweise können Antikörper mittels Passage über eine Säule, an die ein NIP45-V1-Polypeptid gebunden ist, affinitätsgereinigt werden. Die gebundenen Antikörper können dann unter Verwendung eines Puffers mit einer hohen Salzkonzentration aus der Säule eluiert werden.
  • Antisense-Oligonucleotide
  • Antisense-Oligonucleotide sind Nucleotidsequenzen, die zu einer spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz komplementär sind. Nachdem sie in eine Zelle eingeführt wurden, kombinieren sich die komplementären Nucleotide mit natürlichen Sequenzen, die von der Zelle produziert wurden, um Komplexe zu bilden und entweder Transkription oder Translation zu blockieren. Vorzugsweise weist ein Antisense-Oligonucleotid eine Länge von zumindest 11 Nucleotiden auf, kann jedoch zumindest 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 oder mehr Nucleotide lang sein. Auch längere Sequenzen können verwendet werden. Antisense-Oligonucleotidmoleküle können in einem DNA-Konstrukt bereitgestellt und in eine Zelle, wie oben beschrieben, eingeführt werden, um die Konzentration von NIP45-V1-Genprodukten in der Zelle zu reduzieren.
  • Antisense-Oligonucleotide können Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide oder eine Kombination aus beiden sein. Oligonucleotide können manuell oder mittels eines automatisierten Synthesegeräts, durch kovalentes Binden des 5'-Endes eines Nucleotids an das 3'-Ende eines anderen Nucleotids über Nicht-Phosphodiester-Internucleotidbindungen wie Alkylphosphonaten, Thiophosphaten, Dithiophosphaten, Alkylthiophosphonaten, Alkylphosphonaten, Phosphoramidaten, Phosphatestern, Carbamaten, Acetamidat, Carboxymethylestern, Carbonaten und Phosphattriestern synthetisiert werden. Siehe Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1-8 (1994); Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1-72 (1994); Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-583 (1990).
  • Modifikationen von NIP45-V1-Genexpression können durch Entwerfen von Antisense-Oligonucleotiden, die Duplices zu den Kontroll-, 5'- oder Regulationsregionen des NIP45-V1-Gens bilden, erhalten werden. Oligonucleotide, die aus der Transkriptionsinitiationsstelle, z.B. zwischen den Positionen –10 und +10 von der Startstelle, stammen, werden bevorzugt. In ähnlicher Weise kann Inhibierung unter Verwendung der "Tripelhelix"-Basenpaarungsmethodik erzielt werden. Tripelhelixpaarung ist nützlich, da sie die Inhibierung der Fähigkeit der Doppelhelix verursacht, sich für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder Chaperonen ausreichend zu öffnen. Therapeutische Fortschritte, die unter Verwendung von Triplex-DNA erzielt wurden, sind in der Literatur beschrieben (z.B. Gee et al., in: Huber & Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y. (1994)). Ein Antisense-Oligonucleotid kann auch entworfen werden, um Translation von mRNA durch Unterbinden von Bindung des Transkripts an Ribosomen zu blockieren.
  • Exakte Komplementarität ist für erfolgreiche Komplexbildung zwischen einem Antisense-Oligonucleotid und der komplementären Sequenz eines NIP45-V1-Polynucleotids nicht erforderlich. Antisense-Oligonucleotide, die beispielsweise 2, 3, 4 oder 5 oder mehr Abschnitte zusammenhängender Nucleotide umfassen, die exakt komplementär zu einem NIP45-V1-Polynucleotid sind und jeweils durch einen Abschnitt von zusammenhängenden Nucleotiden, die zu benachbarten NIP45-V1-Nucleotiden nicht komplementär sind, voneinander getrennt sind, können ausreichende Targeting-Spezifität für NIP45-V-mRNA bereitstellen. Vorzugsweise weist jeder Abschnitt komplementärer zusammenhängender Nucleotide eine Länge von zumindest 4, 5, 6, 7 oder 8 oder mehr Nucleotiden auf. Nicht-komplementäre, dazwischen liegende Sequenzen umfassen vorzugsweise 1, 2, 3 oder 4 Nucleotide. Fachleute können den berechneten Schmelzpunkt eines Antisense-Sense-Paars leicht verwenden, um den Fehlpaarungsgrad zu bestimmen, der zwischen einem bestimm ten Antisense-Oligonucleotid und einer bestimmten NIP45-V1-Polynucleotidsequenz toleriert wird.
  • Antisense-Oligonucleotide können modifiziert werden, ohne ihre Fähigkeit zu beeinflussen, an ein NIP45-V1-Polynucleotid zu hybridisieren. Diese Modifikationen können innerhalb oder an beiden Enden des Antisense-Moleküls liegen. Beispielsweise können Internucleosid-Phosphatbindungen durch Zusetzen von Cholesteryl- oder Diamingruppierungen mit variierenden Zahlen an Kohlenstoffresten zwischen den Aminogruppen und der terminalen Ribose modifiziert werden. Modifizierte Basen und/oder Zucker, wie z.B. Arabinose anstelle von Ribose, oder ein 3'-, 5'-substituiertes Oligonucleotid, in dem die 3'-Hydroxylgruppe oder die 5'-Phosphatgruppe substituiert ist, können in einem modifizierten Antisense-Oligonculeotid ebenfalls verwendet werden. Diese modifizierten Oligonucleotide können mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, hergestellt werden. Siehe z.B. Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152-158 (1992); Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-584 (1990); Uhlmann et al., Tetrahedron Lett. 215, 3539-3542 (1987).
  • Ribozyme
  • Ribozyme sind RNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität. Siehe z.B. Cech, Science 236, 1532-1539 (1987); Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543-568 (1990); Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605-609 (1992); Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515 (1996). Ribozyme können verwendet werden, um Genfunktion durch Spalten einer RNA-Sequenz, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, zu hemmen (siehe z.B. Haseloff et al., US-Patent Nr. 5.641.673). Der Mechanismus von Ribozymwirkung umfasst sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonukleolytischer Spaltung. Beispiele umfassen gentechnisch veränderte Hammerkopf-Ribozymmoleküle, die endonukleolytische Spaltung spezifischer Nucleotidsequenzen spezifisch und effizient katalysieren können.
  • Die Kodiersequenz eines NIP45-V1-Polynucleotids, wie z.B. der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Nucleotidsequenz, kann verwendet werden, um Ribozyme zu bilden, die sich spezifisch an mRNA binden, die aus dem NIP45-V-Polynucleotid transkribiert ist. Verfahren zum Entwerfen und Konstruieren von Ribozymen, die andere RNA-Moleküle in trans auf höchst sequenzspezifische Weise spalten können, wurden bereits entwickelt und auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben (siehe Haseloff et al., Nature 334, 585-591 (1988)). Die Spaltungsaktivität von Ribozymen kann beispielsweise durch Einarbeiten einer einzelnen "Hybridisierungs"-Region in das Ribozym auf spezifische RNAs gerichtet werden. Die Hybridisierungsregion enthält eine Sequenz, die zur Target-RNA komplementär ist, und hybridisiert somit spezifisch an das Target (siehe beispielsweise Gerlach et al., EP 321.201 ).
  • Spezifische Ribozymspaltungsstellen innerhalb eines NIP45-V1-RNA-Targets können durch Scannen des Targetmoleküls auf Ribozymspaltungsstellen, die die folgenden Sequenzen umfassen: GUA, GUU und GUC; identifiziert werden. Nachdem sie identifiziert wurden, können kurze RNA-Sequenzen mit zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, die der Region der Target-RNA, die die Spaltungsstelle enthält, entsprechen, aufgrund von sekundären Struktureigenschaften bewertet werden, die das Target funktionslos machen können. Die Eignung von Kandidaten-NIP45-V1-RNA-Targets kann auch durch Testen der Zugänglichkeit für Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden unter Verwendung von Ribonucleaseschutztests evaluiert werden. Die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Nucleotidsequenzen und ihre Komplemente liefern eine Quelle für geeignete Hybridisierungsregionsequenzen. Lange komplementäre Sequenzen können verwendet werden, um die Affinität der Hybridisierungssequenz zum Target zu steigern. Die Hybridisierungs- und Spaltungsregionen des Ribozyms können vollständig verbunden werden, sodass bei Hybridisierung an die Target-RNA über die komplementären Regionen die katalytische Region des Ribozyms das Target spalten kann.
  • Ribozyme können in Zellen als Teil eines DNA-Konstrukts eingeführt werden. Mechanische Verfahren, wie z.B. Mikroinjektion, Liposomen-vermittelte Transfektion, Elektroporation oder Calciumphosphatfällung, können verwendet werden, um ein Ri bozym-hältiges DNA-Konstrukt in Zellen einzuführen, in denen eine Reduktion von NIP45-V1-Expression erwünscht ist. Alternativ dazu kann das Konstrukt, sofern erwünscht ist, dass die Zellen das DNA-Konstrukt stabil zurückhalten, an einem Plasmid bereitgestellt und als ein separates Element oder integriert in das Genom der Zellen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, gehalten werden. Ein für ein Ribozym kodierendes DNA-Konstrukt kann Transkriptionsregulationselemente wie z.B. ein Promotorelement, ein Enhancer- oder UAS-Element und ein Transkriptionsterminationssignal zur Steuerung von Transkription von Ribozymen in den Zellen umfassen.
  • Wie in Haseloff et al., US-Patent Nr. 5.641.673, erläutert, können Ribozyme gentechnisch so verändert werden, dass Ribozymexpression als Reaktion auf Faktoren, die Expression eines Targetgens induzieren, eintritt. Ribozyme können auch gentechnisch so verändert werden, dass sie ein zusätzliches Regulationsniveau liefern, sodass die Zerstörung von mRNA nur eintritt, wenn sowohl ein Ribozym als auch ein Targetgen in den Zellen induziert werden.
  • Screening-Verfahren
  • Die Erfindung stellt Tests zum Screenen von Testverbindungen bereit, die sich an ein NIP45-V1-Polypeptid oder ein NIP45-V1-Polynucleotid binden oder dessen Aktivität modulieren. Eine Testverbindung bindet sich vorzugsweise an ein NIP45-V1-Polypeptid oder -Polynucleotid. Noch bevorzugter reduziert oder erhöht eine Testverbindung die Wirkung von NIP45 oder eines NIP45-Analogons, wie sie über menschliches NIP45-V1 vermittelt wird, um zumindest etwa 10%, vorzugsweise etwa 50%, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100%, bezogen auf Aktivität in Abwesenheit der Testverbindung.
  • Testverbindungen
  • Testverbindungen können pharmakologische Mittel sein, die auf dem Gebiet der Erfindung bereits bekannt sind, oder sie können Verbindungen sein, die bisher noch nicht dafür bekannt waren, pharmakologische Aktivität aufzuweisen. Die Verbindungen können natürlich vorkommen oder im Labor entworfen werden. Sie können aus Mikroorganismen, Tieren. oder Pflanzen isoliert werden und können rekombinant produziert oder mittels chemischer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, synthetisiert werden. Sofern erwünscht, können Testverbindungen unter Verwendung eines jeden beliebigen von zahlreichen kombinatorischen Bibliotheksverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, biologische Bibliotheken, räumlich adressierbare, parallele Festphasen- oder Lösungsphasenbibliotheken, synthetische Bibliotheksverfahren, die Dekonvolution erfordern, das Bibliotheksverfahren mit je einer Verbindung pro Perle und synthetische Bibliotheksverfahren unter Verwendung von Affinitätschromatographieselektion. Der Ansatz der biologischen Bibliothek ist auf Polypeptidbibliotheken eingeschränkt, während die anderen vier Ansätze auf Polypeptid-, Nicht-Peptid-Oligomer- oder Niedermolekular-Bibliotheken von Verbindungen anwendbar sind. Siehe Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145 (1997).
  • Verfahren zur Synthese molekularer Bibliotheken sind auf dem Gebiet durchwegs bekannt (siehe beispielsweise DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994); Cho et al., Science 261, 1303 (1993); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 33, 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994)). Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung (siehe z.B. Houghten, Biotechniques 13, 412-421 (1992)) oder an Perlen (Lam, Nature 354, 82-84 (1991)), Chips (Fodor, Nature 364, 555-556 (1993)), Bakterien oder Sporen (Ladner, US-Patent Nr. 5.223.409), Plasmiden (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865-1869 (1992)) oder Phagen (Scott & Smith, Science 249, 386-390 (1990); Devlin, Science 249, 404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991); und Ladner, US-Patent Nr. 5.223.409) präsentiert werden.
  • Hochdurchsatz-Screenen
  • Testverbindungen können auf die Fähigkeit, sich an NIP45-V1-Polypeptide oder -Polynucleotide zu binden oder NIP45-Vi-Aktivität oder NIP45-V1-Genexpression zu beeinflussen, unter Verwendung von Hochdurchsatz-Screenen gescreent werden. Unter Verwendung von Hochdurchsatz-Screenen können zahlreiche einzelne Verbindungen parallel getestet werden, sodass eine große Anzahl an Testverbindungen rasch gescreent werden kann. Die am häufigsten eingesetzten Verfahren verwenden 96-Well-Mikrotiterplatten. Die Wells der Mikrotiterplatten erfordern typischerweise Testvolumina, die im Bereich von 50 bis 500 μl liegen. Zusätzlich zu den Platten sind zahlreiche Instrumente, Materialien, Pipettierer, Robotertechniken, Plattenwascher und Plattenleser, die mit dem 96-Well-Format kompatibel sind, im Handel erhältlich.
  • Alternativ dazu können "Tests mit freiem Format" oder Tests, die keine physikalische Barriere zwischen den Proben aufweisen, verwendet werden. Ein Test, der Pigmentzellen (Melanozyten) in einem einfachen homogenen Test für kombinatorische Peptidbibliotheken einsetzt, wird beispielsweise von Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19, 1614-1618 (1994), beschrieben. Die Zellen werden in Petrischalen unter Agarose gegeben, und anschließend werden Perlen, die kombinatorische Verbindungen tragen, auf die Oberfläche der Agarose platziert. Die kombinatorischen Verbindungen werden teilweise von den Perlen freigesetzt. Aktive Verbindungen werden als dunkle Pigmentflächen sichtbar gemacht, da, wenn die Verbindungen lokal in die Gelmatrix diffundieren, die aktiven Verbindungen eine Farbveränderung in den Zellen hervorrufen.
  • Ein anderes Beispiel für einen Test mit freiem Format wird von Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", präsentiert bei der First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (7.-10. Nov. 1995), beschrieben. Chelsky platzierte einen einfachen homogenen Enzymtest für Carbonatdehydrase in ein Agarosegel, sodass das Enzym im Gel eine Farbveränderung im gesamten Gel hervorrufen würde. Hiernach wurden Perlen, die kombinatorische Verbindungen über einen Photolinker trugen, im Gel platziert, und die Verbindungen wurden durch UV-Licht teilweise freigesetzt. Verbindungen, die das Enzym inhibierten, wurden als lokale Inhibierungszonen mit geringerer Farbveränderung beobachtet.
  • Wiederum ein anderes Beispiel wird von Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996), beschrieben. In diesem Beispiel wurden kombinatorische Bibliotheken auf Verbindungen gescreent, die zytotoxische Wirkungen auf Krebszellen, die in Agar wuchsen, zeigten.
  • Ein anderes Hochdurchsatz-Screeningverfahren wird in Beutel et al., US-Patent Nr. 5.976.813, beschrieben. In diesem Verfahren werden Testproben in eine poröse Matrix gegeben. Eine oder mehrere Testkomponenten werden innerhalb, zuoberst oder zuunterst einer Matrix wie z.B. eines Gels, eines Kunststoffblattes, eines Filters oder einer anderen Form von leicht manipulierbarem, festem Träger platziert. Wenn die Proben in die poröse Matrix eingeführt werden, diffundieren sie ausreichend langsam, sodass die Tests durchgeführt werden können, ohne dass die Testproben ineinander verrinnen.
  • Bindungstests
  • Für Bindungstests ist die Testverbindung vorzugsweise ein kleines Molekül, das sich an die aktive Stelle des NIP45-V1-Polypeptids bindet und diese besetzt und dadurch die aktive Stelle für Substrat (z.B. NFATp) unzugänglich oder zugänglich macht, sodass die normale biologische Aktivität unterbunden wird. Beispiele für solche kleinen Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, kleine Peptide oder peptidähnliche Moleküle.
  • In Bindungstests kann entweder die Testverbindung oder das NIP45-V1-Polypeptid eine nachweisbare Markierung wie z.B. eine fluoreszierende, radioisotopische, chemolumineszierende oder enzymatische Markierung, wie z.B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase oder Luciferase, umfassen. Detektion einer Testverbindung, die an das NIP45-V1-Polypeptid gebunden ist, kann dann beispielsweise durch direk tes Zählen von Radioemission, durch Szintillationszählung oder durch Bestimmung von Umsetzung eines geeigneten Substrats zu einem nachweisbaren Produkt erfolgen.
  • Alternativ dazu kann Bindung einer Testverbindung an ein NIP45-V1-Polypeptid ohne Markieren eines der wechselwirkenden Elemente bestimmt werden. Beispielsweise kann ein Mikrophysiometer verwendet werden, um Bindung einer Testverbindung mit einem NIP45-V1-Polypeptid nachzuweisen. Ein Mikrophysiometer (z.B. CytosensorTM) ist ein analytisches Instrument, das unter Verwendung eines lichtadressierbaren potentiometrischen Sensors (LAPS) die Geschwindigkeit misst, mit der eine Zelle ihre Umgebung ansäuert. Veränderungen dieser Ansäuerungsgeschwindigkeit können als Indikator für die Wechselwirkung zwischen einer Testverbindung und einem NIP45-V1-Polypeptid verwendet werden (McConnell et al., Science 257, 1906-1912 (1992)).
  • Das Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, sich an ein NIP45-V1-Polypeptid zu binden, kann auch unter Verwendung einer Technologie wie z.B. der Echtzeit"Biomolecular Interaction Analysis" (BIA, biomolekulare Wechselwirkungsanalyse) (Sjolander & Urabniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345 (1991), und Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705 (1995)) erfolgen. BIA ist ein Verfahren zur Untersuchung biospezifischer Wechselwirkungen in Echtzeit ohne Markieren jeglicher der wechselwirkenden Elemente (z.B. BIAcoreTM). Veränderungen im optischen Phänomen der Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR) können als Indikator für Echtzeitreaktionen zwischen biologischen Molekülen herangezogen werden.
  • In wiederum einem anderen Aspekt der Erfindung kann ein NIP45-V1-Polypeptid als ein "Köderprotein" in einem Zwei-Hybrid-Test oder Drei-Hybrid-Test verwendet werden (siehe z.B. das US-Patent Nr. 5.283.317; Zervos et al., Cell 72, 223-232 (1993); Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054 (1993); Bartel et al., Biotechniques 14, 920-924 (1993); Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696 (1993); und Brent, WO 94/10300), um andere Proteine zu identifizieren, die sich an das NIP45-V-Polypeptid binden oder damit Wechselwirken und seine Aktivität modifizieren.
  • Das Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Beschaffenheit der meisten Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen bestehen. Kurz zusammengefasst verwendet der Test zwei verschiedene DNA-Konstrukte. In einem Konstrukt kann beispielsweise Polynucleotid, das für ein NIP45-V1-Polypeptid kodiert, an ein Polynucleotid, das für die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors (z.B. GAL-4) kodiert, fusioniert werden. Im anderen Konstrukt kann eine DNA-Sequenz, die für ein nicht identifiziertes Protein ("Beute" oder "Probe") kodiert, an ein Polynucleotid, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert, fusioniert werden. Sind die "Köder"- und "Beute"-Proteine in der Lage, in vivo wechselzuwirken, um einen proteinabhängigen Komplex zu bilden, so werden die DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors in große Nähe gebracht. Diese Nähe ermöglicht die Transkription eines Reportergens (z.B. LacZ), das operabel an eine Transkriptionsregulationsstelle gebunden ist, die auf den Transkriptionsfaktor reagiert. Expression des Reportergens kann nachgewiesen werden, und Zellkolonien, die den funktionellen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert und verwendet werden, um die für das Protein, das mit dem NIP45-V1-Polypeptid wechselwirkt, kodierende DNA-Sequenz zu erhalten.
  • Es kann wünschenswert sein, entweder das NIP45-V1-Polypeptid (oder -Polynucleotid) oder die Testverbindung zu immobilisieren, um die Trennung gebundener von ungebundenen Formen eines oder beider der wechselwirkenden Elemente zu erleichtern sowie alles auf die Automatisierung des Tests einzustellen. Somit kann entweder das NIP45-V1-Polypeptid (oder -Polynucleotid) oder die Testverbindung an einen festen Träger gebunden sein. Geeignete feste Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Glas- oder Kunststoffobjektträger, Gewebekulturplatten, Mikrotiterwells, Röhrchen, Siliciumchips oder Teilchen wie z.B. Perlen (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Latex-, Polystyrol- oder Glasperlen). Jegliches auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren kann verwendet werden, um das NIP45-V1-Polypeptid (oder -Polynucleotid) oder die Testverbindung an einen festen Träger zu binden, einschließlich der Verwendung von kovalenten und nicht-kovalenten Bindungen, passiver Absorption oder Paaren von Bindungsgruppierungen, die jeweils an das Polypeptid (oder Polynucleotid) oder die Testverbindung und den festen Träger gebunden sind. Testverbindungen sind vorzugsweise an den festen Träger gemäß einem Schema gebunden, sodass die Position einzelner Testverbindungen verfolgt werden kann. Die Bindung einer Testverbindung an ein NIP45-V1-Polypeptid (oder -Polynucleotid) kann in jedem beliebigen Gefäß, das zur Aufnahme der Reaktanten geeignet ist, erfolgen. Beispiele für solche Gefäße umfassen Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen.
  • In einer Ausführungsform ist das NIP45-V1-Polypeptid ein Fusionsprotein, das eine Domäne umfasst, die es ermöglicht, dass das NIP45-V1-Polypeptid an einen festen Träger gebunden wird. Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine beispielsweise können an Glutathionsepharoseperlen (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) oder Glutathion-derivatisierten Mikrotiterplatten, die anschließend mit der Testverbindung oder der Testverbindung und dem nicht-adsorbierten NIP45-V1-Polypeptid kombiniert werden, adsorbiert werden; das Gemisch wird dann unter Bedingungen, die zu Komplexbildung führen (z.B. unter physiologischen Bedingungen bezüglich Salz und pH), inkubiert. Nach der Inkubation werden die Perlen oder Mikrotiterplattenwells gewaschen, um jegliche ungebundenen Komponenten zu entfernen. Die Bindung der Wechselwirkungspartner kann entweder direkt oder indirekt, wie oben beschrieben, bestimmt werden. Alternativ dazu können die Komplexe vom festen Träger dissoziiert werden, bevor Bindung bestimmt wird.
  • Auch andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen oder Polynucleotiden an einem festen Träger können in Screeningtests der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann entweder ein NIP45-V1-Polypeptid (oder -Polynucleotid) oder eine Testverbindung unter Verwendung von Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinylierte NIP45-V1-Polypeptide (oder -Polynucleotide) oder Testverbindungen können aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind (z.B. Biotinylierungs-Set, Pierce Chemicals, Rockford, III.), hergestellt und in den Wells von mit Streptavidin beschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Alternativ dazu können Antikörper, die sich spezifisch an ein NIP45-V1-Polypeptid, – Polynucleotid oder eine Testverbindung binden, jedoch die jeweilige erwünschte Bindungsstelle, wie z.B. die aktive Stelle des NIP45-V1-Polypeptids, nicht stören, an die Wells der Platte derivatisiert werden. Ungebundenes Target oder Protein kann in den Wells mittels Antikörperkonjugation eingefangen werden.
  • Verfahren zur Detektion solcher Komplexe, zusätzlich zu jenen, die zuvor für die GST-immobilisierten Komplexe beschrieben wurden; umfassen Immundetektion von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, die sich spezifisch an das NIP45-V1-Polypeptid oder die Testverbindung binden, enzymgekoppelte Tests, die auf der Detektion einer Aktivität des NIP45-V1-Polypeptids beruhen, und SDS-Gelelektrophorese unter nicht reduzierenden Bedingungen.
  • Das Screenen auf Testverbindungen, die sich an ein NIP45-V1-Polypeptid oder -Polynucleotid binden, erfolgte auch in einer intakten Zelle. Jegliche Zelle, die ein NIP45-V-Polypeptid oder -Polynucleotid umfasst, kann in einem zellbasierten Testsystem verwendet werden. Ein NIP45-V-Polynucleotid kann auf natürliche Weise in der Zelle vorkommen oder kann mittels Verfahren wie jenen, die bereits oben beschrieben wurden, eingeführt werden. Bindung der Testverbindung an ein NIP45-V-Polypeptid oder -Polynucleotid wird wie oben beschrieben bestimmt.
  • Funktionelle Tests
  • Testverbindungen können auf die Fähigkeit getestet werden, eine biologische Wirkung eines NIP45-V1-Polypeptids zu steigern oder zu senken. Solche biologischen Wirkungen können unter Verwendung der in den nachstehenden spezifischen Beispielen beschriebenen, funktionellen Tests bestimmt werden. Funktionelle Tests können nach Kontaktieren entweder eines gereinigten NIP45-V1-Polypeptids, eines Zellmembranpräparats oder einer intakten Zelle mit einer Testverbindung durchgeführt werden. Eine Testverbindung, die eine funktionelle Aktivität eines NIP45-V1 um zumindest etwa 10%, vorzugsweise etwa 50%, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100%, senkt, wird als ein potenzielles Mittel zur Senkung von NIP45-V1-Aktivität identifiziert. Eine Testverbindung, die NIP45-V1-Aktivität um zumindest etwa 10%, vorzugsweise etwa 50%, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100%, steigert, wird als ein potenzielles Mittel zur Steigerung von NIP45-V1-Aktivität identifiziert.
  • Ein solches Screeningverfahren umfasst die Verwendung von B-Lymphomzellen, die transfiziert sind, um ein NIP45-V1-Polypeptid zu exprimieren. Ein solcher Test kann beispielsweise zum Screenen auf eine Verbindung verwendet werden, die die Aktivierung des Polypeptids durch Aussetzen der transfizierten B-Lymphomzellen, die das Polypeptid mit endogen wechselwirkenden Proteinen oder Substraten umfassen, gegenüber einer zu screenenden Testverbindung hemmt. Inhibierung der Aktivität des Polypeptids weist darauf hin, dass eine Testverbindung ein potenzieller Antagonist für das Polypeptid ist, d.h. die Funktion des Proteins inhibiert. Der Screen kann zur Identifikation einer Testverbindung, die das Protein aktiviert, durch Aussetzen solcher Zellen gegenüber zu screenenden Verbindungen und Bestimmen, ob jede Testverbindung das Protein aktiviert, verwendet werden.
  • Andere Screeningverfahren umfassen die Verwendung von Zellen, die ein menschliches NIP45-V1-Polypeptid exprimieren, (z.B. von transfizierten T-Zellen) in einem System, das Mengen sekretierter Proteine misst, die durch Polypeptidaktivierung gebildet wurden. Beispielsweise können Testverbindungen zu Zellen zugesetzt werden, die ein menschliches NIP45-V1-Polypeptid exprimieren, und die Expression eines Reportergens mit spezifischen Promotorsequenzen kann gemessen werden, um zu bestimmen, ob die Testverbindung das Protein aktiviert oder inhibiert.
  • Details zu funktionellen Tests, wie jenen, die gerade eben beschrieben wurden, werden in den nachstehenden spezifischen Beispielen bereitgestellt.
  • NIP45-V-Genexpression
  • In einer anderen Ausführungsform werden Testverbindungen, die NIP45-V1-Genexpression steigern oder senken, identifiziert. Ein NIP45-V1-Polynucleotid wird mit einer Testverbindung kontaktiert, und die Expression eines RNA- oder Polypeptidprodukts des NIP45-V1-Polynucleotids wird bestimmt. Das Expressionsniveau von ge eigneter mRNA oder Polypeptid in Gegenwart der Testverbindung wird mit dem Expressionsniveau von mRNA oder Polypeptid in Abwesenheit der Testverbindung verglichen. Die Testverbindung kann dann basierend auf diesem Vergleich als ein Modulator von Expression identifiziert werden. Ist Expression von mRNA oder Polypeptid beispielsweise in Gegenwart der Testverbindung höher als in Abwesenheit dieser, so wird die Testverbindung als ein Stimulator oder Enhancer der mRNA- oder Polypeptidexpression identifiziert. Alternativ dazu wird, wenn Expression der mRNA oder des Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung geringer als in deren Abwesenheit ist, die Testverbindung als ein Inhibitor der mRNA- oder Polypeptidexpression identifiziert.
  • Das Niveau von NIP45-V1-mRNA- oder -Polypeptidexpression in den Zellen kann durch Verfahren bestimmt werden, die auf dem Gebiet zur Detektion von mRNA oder Polypeptid bekannt sind. Es können entweder qualitative oder quantitative Verfahren verwendet werden. Die Gegenwart von Polypeptidprodukten eines NIP45-V1-Polynucleotids kann beispielsweise unter Verwendung zahlreicher verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, bestimmt werden, einschließlich immunchemischer Verfahren wie z.B. Radioimmuntest, Western-Blotting und Immunhistochemie. Alternativ dazu kann Polypeptidsynthese in vivo, in einer Zellkultur oder in einem In-vitro-Translationssystem durch Detektieren von Inkorporation markierter Aminosäuren in ein NIP45-V1-Polypeptid bestimmt werden.
  • Solches Screenen kann entweder in einem zellfreiem Testsystem oder in einer intakten Zelle durchgeführt werden. Jegliche Zelle, die ein NIP45-V1-Polynucleotid exprimiert, kann in einem zellbasierten Testsystem verwendet werden. Das NIP45-V1-Polynucleotid kann natürlich in der Zelle vorkommen oder kann unter Verwendung von Verfahren wie beispielsweise jenen, die oben beschrieben wurden, eingeführt werden. Entweder kann eine primäre Kultur oder eine erstellte Zelllinie, wie z.B. CHO- oder menschliche embryonale Nieren-293-Zellen, verwendet werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die einem Patienten verabreicht werden können, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können beispielsweise ein NIP45-V1-Polypeptid, NIP45-V1-Polynucleotid, Antikörper, die sich spezifisch an ein NIP45-V1-Polypeptid binden, oder Mimetika, Enhancer und Inhibitoren oder Inhibitoren einer NIP45-V1-Polypeptidaktivität umfassen. Die Zusammensetzungen können alleine oder in Kombination mit zumindest einem anderen Mittel, wie z.B. einer stabilisierenden Verbindung, verabreicht werden und können in jeglichem sterilen biokompatiblen pharmazeutischen Träger, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Kochsalzlösung, gepufferter Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser, verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können einem Patienten alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln, Arzneimitteln oder Hormonen verabreicht werden.
  • Zusätzlich zu den Wirkstoffen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger enthalten, die Arzneimittelträger und Hilfsmittel umfassen, die die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Präparaten, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können auf jedem beliebigen Weg verabreicht werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, orale, intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, transdermale, subkutane, intraperitoneale, intranasale, parenterale, topische, sublinguale oder rektale Verabreichung. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können unter Verwendung pharmazeutisch annehmbarer Träger, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, in zur oralen Verabreichung geeigneten Dosierungen formuliert werden. Solche Träger ermöglichen es, dass die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen zur Einnahme durch den Patienten formuliert werden.
  • Pharmazeutische Präparate zur oralen Verwendung können durch eine Kombination aktiver Verbindungen mit festem Arzneimittelträger, gegebenenfalls durch Zermahlen des resultierenden Gemischs, und durch Verarbeiten des Granulatgemischs nach dem Zusetzen geeigneter Hilfsmittel, sofern erwünscht, erhalten werden, um daraus Tabletten oder Drageekerne zu bilden. Geeignete Arzneimittelträger sind Kohlenhydrat- oder Proteinfüllstoffe, wie z.B. Zuckerarten, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Stärke aus Mais, Weizen, Reis, Kartoffeln oder anderen Pflanzen; Cellulose wie z.B. Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Natriumcarboxymethylcellulose; Gummen einschließlich Gummiarabikum und Tragantgummi; und Proteine wie z.B. Gelatine und Collagen. Sofern erwünscht, können abbauende oder solubisierende Mittel zugesetzt werden, wie z.B. das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, wie z.B. Natriumalginat.
  • Drageekerne können in Verbindung mit geeigneten Beschichtungen, wie z.B. konzentrierten Zuckerlösungen, die auch Gummiarabikum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglykol enthalten können, und/oder Titaniumdioxid, Lacklösungen und geeigneten organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, verwendet werden. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten- oder Drageebeschichtungen zur Produktidentifikation oder zur Markierung der Wirkstoffmenge, d.h. der Dosierung, zugesetzt werden.
  • Pharmazeutische Präparate, die oral verwendet werden können, umfassen Gelatine-Steckkapseln sowie weiche versiegelte Kapseln aus Gelatine und einer Beschichtung wie z.B. Glycerin oder Sorbit. Steckkapseln können Wirkstoffe, vermischt mit einem Füllstoff oder Bindemitteln, wie z.B. Lactose oder Stärken, Gleitmitteln, wie z.B. Talk oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren, enthalten. In Weichkapseln können die Wirkstoffe in geeigneten Flüssigkeiten, wie z.B. fetten Ölen, Flüssigkeit oder flüssigem Polyethylenglykol, mit oder ohne Stabilisatoren aufgelöst oder suspendiert sein.
  • Pharmazeutische Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, können in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern wie z.B. Hank-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologisch gepufferter Kochsalzlösung, formuliert werden. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension steigern, wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Darüber hinaus können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen fette Öle, wie z.B. Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie z.B. Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposomen. Polykationische Nicht-Lipid-Aminopolymere können auch zur Zufuhr verwendet werden. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen steigern, um die Herstellung hochkonzentrierter Lösungen zu ermöglichen. Zur topischen oder nasalen Verabreichung werden Penetrierungsmittel, die für die bestimmte, zu durchdringende Barriere geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Solche Penetrierungsmittel sind im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf eine Weise hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, z.B. durch herkömmliche Misch-, Auflösungs-, Granulations-, Dragee-Herstellungs-, Aufschlämmungs-, Emulgations-, Einkapselungs-, Einfang- oder Lyophilisierungsverfahren. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form eines Salzes bereitgestellt werden und kann mit zahlreichen Säuren, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure und dergleichen, gebildet werden. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechenden freien Basenformen. In anderen Fällen kann das bevorzugte Präparat ein lyophilisiertes Pulver sein, das jedes beliebige oder alle der folgenden Elemente enthalten kann: 1-50 mM Histidin, 0,1%-2% Saccharose und 2-7% Mannit, in einem pH-Bereich von 4,5 bis 5,5, das vor der Verwendung mit Puffer kombiniert wird.
  • Nähere Details bezüglich Verfahren zur Formulierung und Verabreichung sind in der letzten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.) zu finden. Nachdem pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt wurden, können sie in ein geeignetes Behältnis gegeben und für die Behandlung eines indizierten Leidens markiert werden. Solch eine Markierung würde Menge, Häufigkeit und Art der Verabreichung umfassen.
  • Therapeutische Indikationen und Verfahren
  • Die NIP45-Variante der vorliegenden Erfindung ist für zahlreiche biologische Funktionen, einschließlich zahlreicher Pathologien, verantwortlich. Folglich ist es wünschenswert, Verbindungen und Wirkstoffe zu finden, die die NIP45-Variante einerseits stimulieren und die die Funktion einer NIP45-Variante andererseits inhibieren können. Verbindungen, die die Funktion oder Expression von NIP45-Variante modulieren können, sind bei der Behandlung verschiedener allergischer Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Entzündungserkrankungen und Infektionserkrankungen, umfassend Asthma, Rhinitis allergica, atopisches Ekzem, Nesselsucht, Konjunktivitis, vernalen Katarrh, chronischen Arthrorheumatismus, systemischen Lupus erythematodes, Erb-Goldflam-Krankheit, Psoriasis, diabrotische Kolitis, systemisches inflammatorisches Response-Syndrom (SIRS), lymphofollikuläre Thymitis, Sepsis, Polymyositis, Dermatomyositis, Polyarteriitis nodosa, Mischkollagenose (Sharp-Syndrom) (MCTD), Sjörgen-Syndrom, Gicht und dergleichen, nützlich.
  • Diese Erfindung betrifft ferner die Verwendung neuer Mittel, die durch die oben beschriebenen Screeningtests identifiziert wurden. Folglich liegt es innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung, eine Testverbindung, die wie hierin beschrieben identifiziert wird, in einem geeigneten Tiermodell zu nutzen. Beispielsweise kann ein wie hierin beschrieben identifiziertes Mittel (z.B. ein Modulationsmittel, ein Antisense-Nucleinsäuremolekül, ein spezifischer Antikörper, Ribozym oder ein NIP45-V1-Polypeptid-Bindungsmolekül) in einem Tiermodell verwendet werden, um die Wirksamkeit, Toxizität oder Nebenwirkungen einer Behandlung mit solch einem Mittel zu bestimmen. Alternativ dazu kann ein wie hierin beschrieben identifiziertes Mittel in einem Tiermodell verwendet werden, um den Wirkungsmechanismus eines solchen Mittels zu bestimmen. Darüber hinaus betrifft diese Erfindung Verwendungen für neue Mittel, die mittels der oben beschriebenen Screeningtests identifiziert werden, für Behandlungen, wie sie hierin beschrieben werden.
  • Ein Reagens, das NIP45-Varianten-Aktivität beeinflusst, kann an eine menschliche Zelle, entweder in vitro oder in vivo, verabreicht werden, um NIP45-V1-ähnliche Aktivität zu reduzieren. Das Reagens bindet sich vorzugsweise an ein Expressionsprodukt eines menschlichen NIP45-Varianten-Gens. Ist das Expressionsprodukt ein Protein, so ist das Reagens vorzugsweise ein Antikörper. Zur Behandlung menschlicher Zellen ex vivo kann ein Antikörper zu einem Präparat von Stammzellen, die dem Körper entnommen wurden, zugesetzt werden. Die Zellen können in denselben oder in einen anderen menschlichen Körper, mit oder ohne klonale(r) Propagation, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, neuerlich eingeführt werden.
  • In einer Ausführungsform wird das Reagens unter Verwendung eines Liposoms zugeführt. Vorzugsweise ist das Liposom in dem Tier, in das es über einen Zeitraum von zumindest etwa 30 min, noch bevorzugter von zumindest etwa 1 h, und noch bevorzugter von zumindest etwa 24 h, verabreicht wurde, stabil. Ein Liposom umfasst eine Lipidzusammensetzung, die in der Lage ist, auf ein Reagens, insbesondere ein Polynucleotid, an einer bestimmten Stelle in einem Tier, wie z.B. einem Menschen, gerichtet zu werden. Vorzugsweise ist die Lipidzusammensetzung des Liposoms in der Lage, auf ein spezifisches Organ eines Tiers, wie z.B. Lunge, Leber, Milz, Herz, Gehirn, Lymphknoten und Haut, gerichtet zu werden.
  • Ein Liposom, das in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, umfasst eine Lipidzusammensetzung, die in der Lage ist, mit der Plasmamembran der Targetzelle zu fusionieren, um der Zelle ihren Inhalt zuzuführen. Vorzugsweise beträgt die Transfektionseffizienz eines Liposoms etwa 0,5 μg DNA pro 16 nmol Liposom, das etwa 106 Zellen zugeführt wird, noch bevorzugter etwa 1,0 μg DNA pro 16 nmol Liposom, das etwa 106 Zellen zugeführt wird, und sogar noch bevorzugter etwa 2,0 μg DNA pro 16 nmol Liposom, das etwa 106 Zellen zugeführt wird. Vorzugsweise weist ein Liposom einen Durchmesser von zwischen etwa 100 und 500 nm, noch bevorzugter zwi schen etwa 150 und 450 nm und noch bevorzugter zwischen etwa 200 und 400 nm, auf.
  • Geeignete Liposomen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen jene Liposomen, die standardmäßig beispielsweise in Genzufuhrverfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden. Die am meisten bevorzugten Liposomen umfassen Liposomen mit einer polykationischen Lipidzusammensetzung und/oder Liposomen mit einer Cholesterinhauptkette, die an Polyethylenglykol konjugiert ist. Gegebenenfalls umfasst ein Liposom eine Verbindung, die in der Lage ist, das Liposom auf eine Tumorzelle zu richten, wie z.B. einen Tumorzellliganden, der an der äußeren Oberfläche des Liposoms angeordnet ist.
  • Die Komplexbildung eines Liposoms mit einem Reagens wie z.B. einem Antisense-Oligonucleotid oder einem Ribozym kann unter Verwendung von Verfahren erreicht werden, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind (siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 5.705.151). Vorzugsweise werden etwa 0,1 μg bis etwa 10 μg Polynucleotid mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert, noch bevorzugter werden etwa 0,5 μg bis etwa 5 μg Polynucleotide mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert, und sogar noch bevorzugter werden etwa 1,0 μg Polynucleotide mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert.
  • In einer anderen Ausführungsform können Antikörper unter Verwendung von Proteinvermittelter, gerichteter Zufuhr in vivo zu spezifischen Geweben zugeführt werden. Protein-vermittelte DNA-Zufuhrverfahren werden beispielsweise in Findeis et al., Trends in Biotechnol. 11, 202-205 (1993); Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, Hrsg.) (1994); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-624 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 542-546 (1994); Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659 (1990); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 338-342 (1991), erläutert.
  • Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis
  • Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis liegt durchwegs im Bereich des Kompetenzbereiches von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung. Eine therapeutisch wirksame Menge bezieht sich auf jene Menge an Wirkstoff, die NIP45-V1-Aktivität bezogen auf die NIP45-V1-Aktivität, die in Abwesenheit der therapeutisch wirksamen Dosis auftritt, steigert oder senkt.
  • Für jegliche Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich entweder in Zellkulturtests oder in Tiermodellen, üblicherweise Mäusen, Kaninchen, Hunden oder Schweinen, berechnet werden. Das Tiermodell kann auch verwendet werden, um den geeigneten Konzentrationsbereich und die Art der Verabreichung zu bestimmen. Solche Informationen können anschließend verwendet werden, um nützliche Dosen und Verabreichungswege für den Menschen festzulegen.
  • Therapeutische Wirksamkeit und Toxizität, z.B. ED50 (die Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist) und LD50 (die Dosis, die bei 50% der Population letal ist), können mittels pharmazeutischer Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden. Das Dosisverhältnis von toxischen zu therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die große therapeutische Indices aufweisen, werden bevorzugt. Die aus Zellkulturtests und Tierstudien erhaltenen Daten werden bei der Formulierung eines Dosierungsbereichs für Menschen verwendet. Die in solchen Zusammensetzungen enthaltene Dosierung liegt vorzugsweise im Bereich zirkulierender Konzentrationen, die die ED50 mit geringer oder keiner Toxizität umfassen. Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereichs je nach der verwendeten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten und der Art der Verabreichung.
  • Die exakte Dosierung wird vom Arzt unter Berücksichtigung gewisser Faktoren im Zusammenhang mit dem zu behandelnden Individuum bestimmt. Dosierung und Verabreichung können so eingestellt werden, dass ausreichende Konzentrationen des Wirkstoffs bereitgestellt werden oder dass die erwünschte Wirkung aufrechterhalten wird. Faktoren, die hierbei berücksichtigt werden können, umfassen die Schwere des Erkrankungszustandes, den allgemeinen Gesundheitszustand des Individuums, Gewicht und Geschlecht des Individuums, Ernährung, Dauer und Häufigkeit der Verabreichung, Wirkstoffkombination(en), Reaktionsempfindlichkeiten und Toleranz/Antwort auf die Therapie. Langfristig wirkende pharmazeutische Zusammensetzungen können, je nach der Halbwertszeit und Clearance-Rate der bestimmten Formulierung, alle 3 bis 4 Tage, jede Woche oder einmal alle zwei Wochen verabreicht werden.
  • Normale Dosierungsmengen können, je nach Art der Verabreichung, von 0,1 bis 100.000 μg bis zu einer Gesamtdosis von etwa 1 g variieren. Richtlinien zu bestimmten Dosierungen und Zufuhrverfahren werden in der Literatur bereitgestellt und sind Ärzten auf dem Gebiet der Erfindung im Allgemeinen zugänglich. Fachleute verwenden für Nucleotide andere Formulierungen als für Proteine oder deren Inhibitoren. In ähnlicher Weise ist die Zufuhr von Polynucleotiden oder Polypeptiden auch für bestimmte Zellen, Erkrankungen, Körperstellen und dergleichen spezifisch.
  • Ist das Reagens ein einkettiger Antikörper, so können Polynucleotide, die für den Antikörper kodieren, konstruiert und in eine Zelle entweder ex vivo oder in vivo unter Verwendung durchwegs anerkannter Verfahren eingeführt werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Transferrin-Polykation-vermittelten DNA-Transfer, Transfektion mit nackten oder eingekapselten Nucleinsäuren, Liposomen-vermittelte Zellfusion, intrazellulären Transport von DNA-beschichteten Latexkügelchen, Protoplastenfusion, Virusinfektion, Elektroporation, "Genkanone" und DEAE- oder Calciumphosphat-vermittelte Transfektion.
  • Wirksame In-vivo-Dosierungen eines Antikörpers liegen im Bereich von etwa 5 μg bis etwa 50 μg/kg, von etwa 50 μg bis etwa 5 mg/kg, von etwa 100 μg bis etwa 500 μg/kg Patientenkörpergewicht und von etwa 200 bis etwa 250 μg/kg Patienten körpergewicht. Zur Verabreichung von Polynucleotiden, die für einkettige Antikörper kodieren, liegen wirksame In-vivo-Dosierungen im Bereich von etwa 100 ng bis etwa 200 ng, 500 ng bis etwa 50 mg, etwa 1 μg bis etwa 2 mg, etwa 5 μg bis etwa 500 μg und etwa 20 μg bis etwa 100 μg DNA.
  • Ist das Expressionsprodukt mRNA, so ist das Reagens vorzugsweise ein Antisense-Oligonucleotid oder ein Ribozym. Polynucleotide, die Antisense-Oligonucleotide oder Ribozyme exprimieren, können in Zellen mittels zahlreicher Verfahren, wie oben beschrieben, eingeführt werden.
  • Vorzugsweise reduziert ein Reagens die Expression eines NIP45-V1-Gens oder die Aktivität eines NIP45-V1-Polypeptids um zumindest etwa 10%, vorzugsweise etwa 50%, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100%, bezogen auf die Abwesenheit des Reagens. Die Wirksamkeit des ausgewählten Mechanismus zur Senkung des Expressionsniveaus eines NIP45-V1-Gens oder der Aktivität eines NIP45-V1-Polypeptids kann unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. Hybridisierung von Nucleotidsonden an NIP45-V1-spezifische mRNA, quantitativer RT-PCR, immunologischer Detektion eines NIP45-V1-Polypeptids oder Messung von NIP45-V1-Aktivität, bewertet werden.
  • In jeglicher der oben beschriebenen Ausführungsformen kann jede beliebige der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung in Kombination mit anderen geeigneten therapeutischen Mitteln verabreicht werden. Die Selektion der geeigneten Mittel zur Verwendung in Kombinationstherapie kann von Fachleuten gemäß herkömmlicher pharmazeutischer Prinzipien vorgenommen werden. Die Kombination von therapeutischen Mitteln kann synergistisch wirken und so die Behandlung oder Prävention der verschiedenen, oben beschriebenen Erkrankungen beeinflussen. Unter Verwendung dieses Ansatzes kann man in der Lage sein, therapeutische Wirksamkeit mit geringeren Dosierungen von jedem Mittel zu erzielen, wodurch das Risiko für das Auftreten negativer Nebenwirkungen reduziert wird.
  • Jedes beliebige der oben beschriebenen therapeutischen Verfahren kann an jedem beliebigen Individuum, das solch einer Therapie bedarf, angewandt werden, einschließlich beispielsweise Säugetieren wie z.B. Hunden, Katzen, Rindern, Pferden, Kaninchen, Affen und am meisten bevorzugt Menschen.
  • Diagnostische Verfahren
  • NIP45-Varianten können auch in diagnostischen Tests zur Detektion von Erkrankungen und Anomalien oder von Empfänglichkeit für Erkrankungen und Anomalien, die mit der Gegenwart von Mutationen in den Nucleinsäuresequenzen, die für eine NIP45-Variante kodieren, zusammenhängen, verwendet werden. Solche Erkrankungen hängen beispielsweise mit verschiedenen allergischen Erkrankungen, Autoimmunerkankungen, Entzündungserkrankungen und Infektionserkrankungen, umfassend Asthma, Rhinitis allergica, atopisches Ekzem, Nesselsucht, Konjunktivitis, vernalen Katarrh, chronischen Arthrorheumatismus, systemischen Lupus erythematodes, Erb-Goldflam-Krankheit, Psoriasis, diabrotische Kolitis, systemisches inflammatorisches Response-Syndrom (SIRS), lymphofollikuläre Thymitis, Sepsis, Polymyositis, Dermatomyositis, Polyarteriitis nodosa, Mischkollagenose (Sharp-Syndrom) (MCTD), Sjörgen-Syndrom, Gicht und dergleichen, zusammen.
  • Es können Unterschiede zwischen der cDNA oder genomischen Sequenz, die für eine NIP45-Variante kodiert, aus Individuen, die an einer Erkrankung leiden, und aus normalen (gesunden) Individuen bestimmt werden. Wird eine Mutation bei manchen oder allen der erkrankten Individuen, aber nicht in gesunden Individuen beobachtet, so ist die Mutation wahrscheinlich das auslösende Agens dieser Erkrankung.
  • Sequenzunterschiede zwischen einem Bezugsgen und einem Gen mit Mutationen können durch das direkte DNA-Sequenzierungsverfahren aufgezeigt werden. Darüber hinaus können klonierte DNA-Segmente als Sonden verwendet werden, um spezifische DNA-Segmente nachzuweisen. Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens wird umfassend erhöht, wenn es in Kombination mit PCR eingesetzt wird. Ein Sequenzierungsprimer kann beispielsweise mit einem doppelsträngigen PCR-Produkt oder einem einzelsträngigen Matrixmolekül, das mittels einer modifizierten PCR gebildet wurde, verwendet werden. Die Sequenzbestimmung erfolgt mittels herkömmlicher Verfahren unter Verwendung von radioaktiv markierten Nucleotiden oder durch automatische Sequenzierungsverfahren unter Verwendung von fluoreszierenden Markierungen.
  • Genetisches Testen, das auf DNA-Sequenzunterschieden basiert, kann durch Nachweisen von Veränderungen der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne Denaturierungsmittel(n) erfolgen. Kleine Sequenzdeletionen und -insertionen können sichtbar gemacht werden, beispielsweise durch Gelelektrophorese bei hoher Auflösung. DNA-Fragmente unterschiedlicher Sequenzen können an denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden, in denen die Mobilitäten verschiedener DNA-Fragmente im Gel an unterschiedlichen Positionen gemäß ihren spezifischen Schmelz- oder Teilschmelztemperaturen verzögert werden (siehe z.B. Myers et al., Science 230, 1242 (1985)). Sequenzveränderungen an spezifischen Positionen können auch durch Nucleaseschutztests, wie z.B. RNase- und S-1-Schutz oder das chemische Spaltungsverfahren (z.B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397-4401 (1985)), aufgezeigt werden. Somit kann die Detektion einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren wie z.B. Hybridisierung, RNase-Schutz, chemische Spaltung, direktes DNA-Sequenzieren oder die Verwendung von Restriktionsenzymen und Southern-Blotting genomischer DNA durchgeführt werden. Zusätzlich zu direkten Verfahren wie z.B. Gelelektrophorese und DNA-Sequenzieren können Mutationen auch durch In-situ-Analyse nachgewiesen werden.
  • Veränderte Konzentrationen einer NIP45-Variante können auch in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Tests, die verwendet werden, um Konzentrationen der Proteinpolypeptide in einer Körperprobe, wie z.B. Blut oder einer Gewebebiopsie, abgenommen aus einem Wirt, nachzuweisen, sind Fachleuten durchwegs bekannt und umfassen Radioimmuntests, Konkurrenzbindungstests, Western-Blot-Analyse und ELISA-Tests.
  • Die obige Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung im Allgemeinen. Ein vollständigeres Verständnis kann unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele gewonnen werden, die ausschließlich zur Veranschaulichung der Erfindung und keineswegs zur Einschränkung des Schutzumfangs dieser bereitgestellt werden.
  • BEISPIEL 1
  • Die murine NIP45-mRNA-Sequenz (GenBank-Zugriffsnummer U76759) wurde verwendet, um unter Verwendung des Computerprogramms BLAST 2.0 (National Center for Biotechnology Information) die EST-Untergruppe der "DNA DataBank of Japan" (DDBJ) auf homologe Sequenzen zu durchsuchen. Fünf Sequenzen wurden gefunden, die über 75% Nucleotidsequenzidentität mit der murinen NIP45-mRNA-Sequenz aufwiesen, und diese wurden als potenzielle Fragmente der menschlichen NIP45-mRNA-Sequenz ausgewählt. Die fünf Sequenzen trugen die GenBankZugriffsnummern AI954626, AA919081, AA063239, AA351060 und AA352196. Um weitere Sequenzinformation zur potenziellen menschlichen NIP45-mRNA-Sequenz zu gewinnen, wurden die fünf Sequenzen selbst verwendet, um die DDBJ auf homologe Sequenzen zu durchsuchen. Als Resultat der zweiten Suche wurde eine zusätzliche EST, GenBank-Zugriffsnummer T56384, identifiziert. Eine dritte Suche wurde mit der T56384-EST durchgeführt und identifizierte eine zusätzliche EST, GenBank-Zugriftsnummer W31117.
  • Klone, die vier der ESTs enthielten, wurden bei Genome Systems (St. Louis, MO, USA) zur weiteren Sequenzevaluierung erworben. Die vollständigen Inserts der EST-Klone AA919081, AA063239, T56384 und W31117 wurden an einem "ABI Prism 377 DNA-Sequenzierer" (PE Biosystems) gemäß den Standard-Sequenzierungsarbeitsvorschriften des Herstellers unter Verwendung von Primern, die zu den T3- und T7-Promotorregionen, die das Insert an jedem Vektor flankieren, komplementär sind, sequenziert. Nachdem vollständige Sequenzen erhalten worden waren, wurden die Sequenzen aller sieben ESTs unter Verwendung des Computerprogramms Seqencher (GeneCodes Corporation, Ann Arbor, MI, USA) abgeglichen, wobei eine zusammenhängende DNA-Sequenz gebildet wurde. Die Consensus-Sequenz dieses Contigs wurde als eine Repräsentation der menschlichen NIP45-mRNA-Sequenz betrachtet. Die Nucleotidsequenz von menschlichem NIP 45 ist in Seq.-ID Nr. 6 dargestellt. Der offene Leseraster des nativen menschlichen Homologs von NIP 45 setzt sich aus 1.260 Nucleotiden (Seq.-ID Nr. 7) zusammen.
  • BEISPIEL 2
  • Identifikation der alternativen Spleißvarianten von NIP45
  • Um auf Expression von NIP45 in verschiedenen Gewebetypen zu testen, wurde PCR-Amplifikation einer 368 Basenpaare umfassenden Region der menschlichen NIP45-cDNA unter Verwendung der Oligonucleotidprimer NIP-11 (cccgactcttcccactcaaaatcc, was den Positionen 797-820 der in Seq.-ID Nr. 6 abgebildeten Sequenz entspricht) und NIP12 (cagtcccatggcctcctcatagtg, was den Positionen 1141-1164 der in Seq.-ID Nr. 6 abgebildeten Sequenz entspricht) und des "Human Immune System Multiple Tissue cDNA Panel" (Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, USA) als Matrix durchgeführt. Amplifikation erfolgte mit AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer) unter den folgenden PCR-Zyklierbedingungen: Denaturierung von Matrix-DNA 9 min lang bei 96 °C, gefolgt von Zyklieren zwischen 96 °C, 15 s lang, und 66 °C, 30 s lang, bei 55 Wiederholungen. Wie in 13 gezeigt, ergab PCR-Amplifikation von NIP45-cDNA aus Knochenmark, fötaler Leber und peripheren Blutleukozyten das erwartete 368-Basenpaar-Produkt, während PCR-Amplifikation von NIP45-cDNA aus Lymphknoten und Thymus ein sehr viel kürzeres Produkt ergab und PCR-Amplifikation von NIP45-cDNA aus Milz sowohl das 368-Basenpaar-Produkt als auch das kürzere Produkt ergab.
  • Direktes Sequenzieren des kürzeren PCR-Produkts erfolgte an einem "ABI Prism 377 DNA-Sequenzierer" (PE Biosystems), wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Ausnahme der Verwendung der Primer NIP-11 und NIP12. Die kürzere Länge des Produkts war auf einen fehlenden Abschnitt von 255 Basenpaaren im Vergleich zur NIP45-DNA-Sequenz zurückzuführen. Ein Abgleich des kürzeren PCR-Produkts mit der NIP45-DNA-Sequenz und einem genomischen Sequenzfragment, das vom NIP45-Gen abstammte, wies darauf hin, dass die Grenzen der 255 bp umfassenden, deletierten Sequenz exakt den Grenzen von zwei Exonen entsprechen, die innerhalb des genomischen Sequenzfragments enthalten sind. Diese Spleißvariante wurde als NIP45v1 bezeichnet. Nucleotidsequenzen von cDNA, die aus mRNAs aus menschlichem NIP 45V1 hergestellt wird, sind in Seq.-ID Nr. 1 abgebildet.
  • Darauf folgende PCR-Amplifikation der vollständigen Kodierregion von NIP45 unter Verwendung von Milz-cDNA aus der oben genannten Gruppe als Matrix und der Oligonucleotidprimer NIP-L4 (aaagtgtgccatggcggagcctgt, was den Positionen 3-26 der in Seq.-ID Nr. 6 gezeigten Sequenz entspricht) und NIP-R4 (gggtgtcagccccagacctcaat, was den Positionen 1255-1277 von Seq.-ID Nr. 6 entspricht) produzierte mehrere Amplimere unterschiedlicher Länge. Die Amplimere wurden in den Klonierungsvektor pCRII-TOPO (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) kloniert und an einem "ABI Prism 377 DNA-Sequenzierer" (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert. Eine Analyse der erhaltenen Sequenzen zeigte drei zusätzliche alternative Spleißvarianten, die als NIP45v2, NIP45v3 bzw. NIP45v4 bezeichnet wurden.
  • Eigenschaften der NIP45v1-cDNA-Nucleotidseguenz (Seq.-ID Nr. 1 und 2)
    • 1. Deletion von 255 Basenpaaren entsprechend den Basen 847 bis 1101 der Kodiersequenz des Volllängen-NIP45-Transkripts.
    • 2. Deletierte Region entspricht exakt den zwei Exonen, wenn sie mit einer teilweisen genomischen Sequenz des NIP45-Gens (Klon RPCI-11-449D23, genomische Überblickssequenz, Zugriffsnummer AQ584348) verglichen wird, was darauf hinweist, dass die Deletion auf ein alternatives Spleißereignis zurückzuführen ist.
  • Eigenschaften der NIP45v1-Aminosäureseguenz (Seq.-ID Nr. 8)
    • 1. Konzeptionelle Translation ergibt ein Protein mit einer Länge von 334 Aminosäuren, das um 85 Aminosäurereste kürzer als das Volllängen-NIP45-Protein mit 419 Aminosäuren ist.
    • 2. Aminosäurereste, die in der konzeptionellen Translation von NIP45v1 fehlen, entsprechen den Aminosäureresten 283 bis 367 des Volllängen-NIP45-Proteins.
  • Eigenschaften der ausgespleißten Regionen
  • Die NIP45-Proteinsequenz weist signifikante Homologie zu UBL1 und SMT3H2, Ubiquitin-ähnlichen Proteinen, die auch als Sentrin und Sentrin2 bekannt sind, auf. Diese Sentrin-homologe Domäne von NIP45 erstreckt sich von Aminosäurerest 342 bis 418 und enthält 44 von 77 Resten (56%), die der SMT3H2-Sequenz ähnlich sind, von denen 28 von 77 Resten (36%) mit der SMT3H2-Sequenz identisch sind, wie durch die BLAST-Software zur Sequenzähnlichkeitssuche (National Center for Biotechnology Information) identifiziert wurde. NIP45 weist auch eine Homologieregion mit Ubiquitin von Aminosäurerest 274 bis 334 auf, die einen 84,7%igen Abgleich gegen eine positionsspezifische Bewertungsmatrix für Ubiquitinhomologe aus der "Conserved Domain Database" des "National Center for Biotechnology Information" aufzeigt. Die Sentrin-homologe Domäne ist in NIP45v1 teilweise deletiert. Die Ubiquitin-homologe Domäne ist in NIP45v1 zu 85% deletiert.
  • Gewebeverteilung von NIP45v1
  • Die Expression der NIP45v1-Spleißvariante von NIP45 wurde nur in Thymus, Milz und Lymphknoten erkannt, während NIP45-Expression in allen mit dem Immunsystem zusammenhängenden Geweben, die bis heute getestet wurden, einschließlich Knochenmark, fötaler Leber, Lymphknoten, peripherer Blutleukozyten, Milz, Thymus und Mandeln, gefunden wurde.
  • BEISPIEL 3
  • Funktionelle Charakterisierung
  • Die Funktionen von NIP45-Varianten werden über ihre Fähigkeit, mit NF-ATp in Säugetierzellen spezifisch wechselzuwirken, bewertet. Jedes der in Beispiel 2 erhaltenen NIP45-V-cDNA-Inserts (V1-V4) wird in einen Säugetier-Expressionsvektor, der die Kodierregion an eine Epitopmarkierung aus einem Influenza-Hämagglutinin- (HA-) Peptid fusioniert, Vektor pCEP4-HA (R.F. Herrscher et al., Genes Dev. 9, 3067-3082 (1995)), subkloniert, um den Expressionsvektor zu schaffen.
  • Der Vektor wird dann mit einem NF-ATp-Expressionsplasmid in HepG2-Zellen cotransfiziert, die geringe Konzentrationen an NF-ATp exprimieren. Als Kontrollen werden HepG2-Zellen auch mit NIP45-HA zusammen mit dem Expressionsvektor ohne das NF-ATp-Insert oder mit dem NF-ATp-Expressionsvektor zusammen mit einer Fusion von NIP45 außerhalb des Leserasters mit der Epitopmarkierung cotransfiziert. Lysate werden aus den transfizierten Zellen hergestellt und mit Anti-NF-ATp-Antikörper immungefällt. Western-Blot-Analyse wird anschließend am immungefällten Material entweder unter Verwendung von Anti-NF-ATp- oder von Anti-HA-Antikörpern durchgeführt, und es ist zu erkennen, dass NF-AT- und NIP45-Variante in vivo in Säugetierzellen physikalisch assoziieren.
  • BEISPIEL 4
  • Gewebeexpression von NIP45-V2-V4-mRNA
  • Quantitative Umkehrtranskription-Polymerasekettenreaktions- (RT-PCR) Analyse von RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben wird durchgeführt, um die Gewebeexpression von NIP45-V2-V4-mRNA zu untersuchen. 100 μg Gesamt-RNA aus verschiedenen Geweben (Human Total RNA Panel I-V, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) wird als Matrix verwendet, um Erststrang-cDNA unter Verwendung des "SUPERSCRIPTTM First-Strand Syntheswas System" für RT-PCR (Life Technologies, Rockville, MD, USA) zu synthetisieren. 10 ng der Erststrang-cDNA wird anschließend als Matrix in einer Polymerasekettenreaktion verwendet, um auf die Gegenwart des NIP45-V-mRNA-Transkripts zu testen. Die Polymerasekettenreaktion wird in einem LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) in Gegenwart des DNA-bindenden fluoreszierenden Farbstoffs SYBR Green I durchgeführt, der sich an die kleine Furche der DNA-Doppelhelix bindet, die nur produziert wird, wenn doppelsträngige DNA in der Reaktion erfolgreich synthetisiert wird, und bei stattfindender Bindung Licht emittiert, das quantitativ durch das LightCycler-Gerät gemessen werden kann. Die Polymerasekettenreaktion wird unter Verwendung von Oligonucleotidprimern durchgeführt, deren Zweck es ist, die Verbindung gespleißter Exone, die deletierte Regionen flankieren, zu überspannen, und Messungen der Intensität von emittiertem Licht werden nach jedem Reaktionszyklus abgenommen, wenn die Reaktion eine Temperatur von 86 °C erreicht hat. Die Intensitäten von emittiertem Licht werden durch Vergleich mit gleichzeitig umgesetzten Standards mit bekannter Konzentration zu Kopienzahlen des Gentranskripts pro ng Matrix-cDNA umgerechnet.
  • Um Unterschiede in den mRNA-Transkriptionsniveaus pro Zelle in den verschiedenen Gewebetypen zu korrigieren, wird ein Normalisierungsverfahren unter Verwendung berechneter Expressionsniveaus in den verschiedenen Geweben von fünf verschiedenen konstitutiven Genen durchgeführt: Glyceraldehyd-3-phosphatase (G3PHD), Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HPRT), β-Actin, Porphobilinogendeaminase (PBGD) und β-2-Mikroglobulin. Außer der Verwendung eines geringfügig unterschiedlichen Sets an konstitutiven Genen ist das Normalisierungsverfahren im Wesentlichen dasselbe wie jenes, das im "RNA Master Blot User Manual", Anhang C (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA), beschrieben wird.
  • BEISPIEL 5
  • Funktionelle Aktivität von NIP45-Varianten bei der Regulierung von Genexpression
  • Um auf eine funktionelle Rolle von NIP45-Varianten in NF-AT-gesteuerter Transkription zu testen, wurde jede der NIP45-Vs auf hohen Niveaus in HepG2-Zellen exprimiert. HepG2-Zellen exprimieren geringe Niveaus an endogenem NF-AT, und ektopische Expression von NF-AT-Familien-Proteinen erwies sich als ein Vorgang, der NF-AT-gesteuerte Transkription in dieser Zelllinie in Abwesenheit von exogener Stimulation transaktivierte (T. Hoey et al., Immunity 2, 461-472 (1995)). HepG2-Zellen werden mit einem 3X-NF-AT-CAT-Reportergen (L. Venkataraman et al., Immunity 1, 189-196 (1994)) und entweder Kontroll- oder Expressionsplasmiden für NIP45-Varianten und NF-AT-Familienmitgliedern (NF-ATp, NF-ATc, NF-AT3, NF-AT4) transfiziert. Dieses Reportergen enthält drei Tandemkopien der NF-AT-Bindungsstelle, abgeleitet aus dem IL-2-Gen. Alternativ dazu werden HepG2-Zellen mit einem IL-4-CAT-Reporterkonstrukt (das sich bis zu -732 bp des IL-4-Promotors erstreckt und einen nativen, NF-AT-abhängigen Promotor enthält) und Expressionsvektoren oder Kontrollen für NIP45-Varianten, NF-ATp und c-maf, transfiziert. HepG2-Zellen werden durch das DEAE-Dextran-Verfahren, wie in T. Hoey et al. (1995), s.o., beschrieben, transfiziert, und CAT-Tests werden gemäß Standardverfahren durchgeführt.
  • BEISPIEL 6
  • Endogene IL-4-Produktion
  • Die Expression von endogenem IL-4 durch Zellen, die normalerweise IL-4 nicht produzieren, wird untersucht, um zu sehen, ob die Kombination jeder beliebigen der NIP45-Varianten, NF-ATp und c-Maf, ausreichend ist, um die Expression zu induzieren. M12-B-Lymphomzellen werden vorübergehend mit Expressionsplasmiden für NF-ATp und c-Maf, zusammen mit NIP45- oder pCI-Vektorkontrolle, co-transfiziert. M12-Zellen werden durch Elektroporation, wie bereits zuvor beschrieben (I.C. Ho et al., Cell 85, 973-983 (1996)), vorübergehend transfiziert. Die Konzentrationen von IL-4 in den 72 h später geernteten Überständen werden mittels einer im Handel erhältlichen IL-4-ELISA (Pharmingen), die mit Ausnahme einer wie bereits beschriebenen Modifikation (I.C. Ho et al. (1996), s.o.) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt wurde, gemessen.
  • BEISPIEL 7
  • Identifikation einer Testverbindung, die sich an eine NIP45-Variante bindet
  • Das gereinigte NIP45-V1-Polypeptid, das ein Glutathion-S-Transferase-Protein umfasst und an Glutathion-derivatisierte Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten absorbiert ist, wird mit Testverbindungen aus einer Bibliothek kleiner Moleküle bei einem pH von 7,0 in einer Lösung eines physiologischen Puffers kontaktiert. NIP45-V1-Polypeptide umfassen jede beliebige der in Seq.-ID Nr. 8 gezeigten Aminosäuresequenz. Die Testverbindungen umfassen eine fluoreszierende Markierung. Die Proben werden 5 min lang bis 1 h lang inkubiert. Kontrollproben werden in Abwesenheit einer Testverbindung inkubiert.
  • Die die Testverbindungen enthaltende Pufferlösung wird von den Wells abgewaschen. Bindung einer Testverbindung an ein NIP45-V1-Polypeptid wird mittels Fluoreszenzmessungen des Inhalts der Wells nachgewiesen. Eine Testverbindung, die die Fluoreszenz in einem Well bezogen auf die Fluoreszenz eines Wells, in dem eine Testverbindung nicht inkubiert ist, um zumindest 15% steigert, wird als eine Verbindung identifiziert, die sich an ein NIP45-V1-Polypeptid bindet.
  • BEISPIEL 8
  • Identifikation einer Testverbindung, die NIP45-V1-Genexpression moduliert (steigert oder senkt)
  • Eine Testverbindung wird an eine Kultur menschlicher Lymphknotenzellen verabreicht und bei 37 °C 10 bis 45 min lang inkubiert. Eine Kultur desselben Zelltyps, die gleich lang ohne Testverbindung inkubiert wird, liefert eine Negativkontrolle.
  • RNA wird aus den zwei Kulturen, wie in Chirgwin et al., Biochem. 18, 5294-5299 (1979), beschrieben, isoliert. Northern-Blots werden unter Verwendung von 20 bis 30 μg Gesamt-RNA hergestellt und an eine 32P-markierte, NIP45-V1-spezifische Sonde bei 65 °C in Express-hyb (CLONTECH) hybridisiert. Die Sonde umfasst zumindest 11 zusammenhängende Nucleotide, die aus dem Komplement von Seq.-ID Nr. 1 oder 2 selektiert sind. Eine Testverbindung, die das NIP45-V1-spezifische Signal in Bezug auf das Signal, das in Abwesenheit der Testverbindung erhalten wird, moduliert, wird als ein Modulator von NIP45-V1-Genexpression identifiziert.
  • BEISPIEL 9
  • Screening auf eine Verbindung, die die Wechselwirkung zwischen NIP45-Variante und NF-AT moduliert, kann unter Verwendung von Hefe-Zwei-Hybrid-System(en) erfolgen.
  • BEISPIEL 10
  • Behandlung von mit dem Immunsystem zusammenhängenden Erkrankungen durch Modulieren der Funktion einer menschlichen NIP45-Variante.
  • Ein Polynucleotid, das eine menschliche NIP45-Variante exprimiert, oder eine Verbindung, die die Funktion einer NIP45-Variante moduliert, wird einem Patienten verabreicht. Das Ausmaß der Entzündung des Patienten wird gemildert. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (15)

  1. Isoliertes Polynucleotid, ausgewählt aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe: i) Polynucleotiden, die für ein Polypeptid kodieren, das eine in Seq.-ID Nr. 8 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, der im Vergleich mit dem Volllängen-NIP45-Protein die Aminosäurereste 283 bis 367 fehlen, die in der Lage sind, mit NFATp wechselzuwirken, um die Transkription des IL-4-Gens zu potenzieren; ii) Polynucleotiden, welche die Sequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfassen, welcher der Sequenzteil fehlt, der für die Aminosäurereste 283 bis 367 des Volllängen-NIP45-Proteins kodiert, worin die kodierten Proteine in der Lage sind, mit NFATp wechselzuwirken, um die Transkription des IL-4-Gens zu potenzieren.
  2. Expressionsvektor, der ein beliebiges Polynucleotid nach Anspruch 1 enthält.
  3. Wirtszelle, die einen Expressionsvektor nach Anspruch 2 enthält.
  4. Im Wesentlichen gereinigtes Polypeptid, für das ein Polynucleotid nach Anspruch 1 kodiert.
  5. Verfahren zur Produktion eines Polypeptids nach Anspruch 4, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a. das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 3 unter Bedingungen, die für die Expression eines Polypeptids nach Anspruch 4 geeignet sind; und b. das Gewinnen eines Polypeptids nach Anspruch 4 aus der Wirtszellenkultur.
  6. Verfahren zur Detektion eines Polynucleotids nach Anspruch 1 in einer biologischen Probe, die einem menschlichen Körper oder Tierkörper entnommen wurde, umfassend die folgenden Schritte: a. das Hybridisieren eines beliebigen Polynucleotids nach Anspruch 1 oder 2 an ein Nucleinsäurematerial einer biologischen Probe, die einem menschlichen Körper oder Tierkörper entnommen wurde, wodurch ein Hybridisierungskomplex gebildet wird; und b. das Detektieren des Hybridisierungskomplexes.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin vor der Hybridisierung das Nucleinsäurematerial der biologischen Probe amplifiziert wird.
  8. Verfahren zur Detektion eines Polypeptids nach Anspruch 4, umfassend die folgenden Schritte: a. das Kontaktieren einer biologischen Probe, die einem menschlichen Körper oder Tierkörper entnommen wurde, mit einem Antikörper, der mit dem Polypeptid spezifisch wechselwirkt; und b. das Detektieren der Wechselwirkung.
  9. Diagnoseset zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 6 bis B.
  10. Verfahren zum Screenen auf Mittel, welche die Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 4 senken, umfassend die folgenden Schritte: a. das Kontaktieren einer Testverbindung mit einem beliebigen Polypeptid, für das ein beliebiges Polynucleotid nach Anspruch 1 kodiert, oder mit einem beliebigen Polynucleotid nach Anspruch 1; b. das Detektieren von Bindung der Testverbindung an das Polypeptid, für das ein beliebiges Polynucleotid nach Anspruch 1 kodiert, oder an das Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei eine Testverbindung, die sich an das Polypeptid oder das Polynucleotid bindet, als potenzielles therapeutisches Mittel zur Senkung der Aktivität eines NIP45-Spleißvarianten-Polypeptids nach Anspruch 4 identifiziert wird.
  11. Verfahren zum Screenen auf Mittel, welche die Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 4 regulieren, umfassend die folgenden Schritte: a. das Kontaktieren einer Testverbindung mit einem Polypeptid, für das ein beliebiges Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert; und b. das Detektieren einer Aktivität des Polypeptids, wobei eine Testverbindung, welche die Aktivität steigert, als potenzielles therapeutisches Mittel zur Steigerung der Aktivität des Polypeptids identifiziert wird, und wobei eine Testverbindung, welche die Aktivität des Polypeptids senkt, als potenzielles therapeutisches Mittel zur Senkung der Aktivität des Polypeptids identifiziert wird.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Expressionsvektor nach Anspruch 2 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  13. Verwendung eines Expressionsvektors nach Anspruch 2 bei der Herstellung eines Medikaments zur Modulierung der Aktivität eines NIP45-Spleißvarianten-Polypeptids, dem im Vergleich mit dem Volllängen-NIP45-Protein die Aminosäurereste 283 bis 367 fehlen, im Falle einer Erkrankung.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, worin die Erkrankung eine Autoimmunerkrankung, allergische, infektiöse oder chronische Entzündungserkrankung ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, worin die Erkrankung Asthma ist.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002214005A1 (en) * 2000-10-10 2002-04-22 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of nf-at interacting protein nip 45 like protein

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0891425A2 (de) * 1996-04-23 1999-01-20 President And Fellows Of Harvard College Methode und zusammensetzungen für die regulierung von t-zelluntereinheiten durchdie modulation von der transkriptionsfaktoraktivität
GB9722388D0 (en) * 1997-10-24 1997-12-24 Zeneca Ltd NIP45 human homolog

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