DE60127102T2

DE60127102T2 - Regulation des menschliches lipoxin a4 rezeptor-ähnliches protein

Info

Publication number: DE60127102T2
Application number: DE60127102T
Authority: DE
Inventors: Shyam Brighton RAMAKRISHNAN
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2001-03-12
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2021-03-13
Also published as: ATE356208T1; EP1266005B1; WO2001068839A9; WO2001068839A3; ES2283403T3; DE60127102D1; EP1266005A2; WO2001068839A2; US20020058259A1; AU2001252181A1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft das Gebiet der G-Protein-gebundenen Rezeptoren. Im Besonderen betrifft sie das Gebiet von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteinen und ihre Anwendung beim Arzneimittel-Screening im Bereich von Entzündungserkrankungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
G-Protein-gebundene Rezeptoren
Viele medizinisch wichtige biologische Prozesse werden über Signaltransduktionswege vermittelt, an denen G-Proteine beteiligt sind (Lefkowitz, Nature 351, 353–354 (1991)). Die Familie der G-Protein-gebundenen Rezeptoren (GPCR) umfasst Rezeptoren für Hormone, Neurotransmitter, Wachstumsfaktoren und Viren. Spezifische Beispiele für GPCRs umfassen Rezeptoren für solch unterschiedliche Stoffe wie Dopamin, Calcitonin, adrenerge Hormone, Endothelin, cAMP, Adenosin, Acetylcholin, Serotonin, Histamin, Thrombin, Kinin, das follikelstimulierende Hormon, Opsine, das endotheliale Differenzierungsgen-1, Rhodopsine, Geruchsstoffe, Zytomegalie-Virus, G-Proteine selbst, Effektorproteine, wie z.B. Phospholipase C, Adenylcyclase und Phosphordiesterase, sowie Aktivierungsproteine wie Proteinkinase A und Proteinkinase C.
GPCRs besitzen sieben konservierte membrandurchdringende Domänen, die zumindest acht divergente hydrophile Schleifen verbinden. GPCRs (auch als 7TM-Rezeptoren bekannt) wurden charakterisiert als Elemente mit diesen sieben konservierten hydrophoben Ketten aus etwa 20 bis 30 Aminosäuren, die zumindest acht divergente hydrophile Schleifen verbinden. Die meisten GPCRs weisen einzelne konservierte Cysteinreste in jeder der ersten beiden extrazellulären Schleifen auf, welche Disulfidbindungen bilden, von denen angenommen wird, dass sie die Struktur des funktionellen Proteins stabilisieren. Die sieben Transmembranregionen werden als TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 und TM7 bezeichnet. TM3 wurde mit der Signaltransduktion in Verbindung gebracht.
Die Phosphorylierung und Lipidierung (Palmitylierung oder Farnesylierung) von Cysteinresten kann die Signaltransduktion von einigen GPCRs beeinflussen. Die meisten GPCRs enthalten mögliche Phosphorylierungsstellen in der dritten zytoplasmatischen Schleife und/oder im Carboxyterminus. Bei einigen GPCRs, wie z.B. dem β-Adrenorezeptor, vermittelt die Phosphorylierung durch Proteinkinase A und/oder spezifische Rezeptorkinasen eine Rezeptordesensibilisierung.
Bei einigen Rezeptoren wird angenommen, dass die Ligandenbindungsstellen von GPCRs hydrophile Sockel, die durch mehrere GPCR-Transmembrandomänen gebildet werden, umfassen. Die hydrophilen Sockel sind von hydrophoben Resten der GPCRs umgeben. Es wird davon ausgegangen, dass die hydrophile Seite der einzelnen GPCR-Transmembranhelices nach innen weist und eine polare Ligandenbindungsstelle bildet. Bei mehreren GPCRs wurde impliziert, dass TM3 eine Ligandenbindungsstelle aufweist, wie z.B. den TM3-Aspartatrest. TM5-Serine, ein TM6-Asparagin und TM6- oder TM7-Phenylalanine oder -Tyrosine sind ebenfalls an der Ligandenbindung beteiligt.
GPCRs sind innerhalb der Zelle durch heterotrimere G-Proteine an verschiedene intrazelluläre Enzyme, Ionenkanäle und Transporter gekuppelt (siehe Johnson et al., Endoc. Rev. 10, 217–331 (1989)). Unterschiedliche G-Protein-α-Untereinheiten stimulieren bevorzugt bestimmte Effektoren, um verschiedene biologische Funktionen in einer Zelle zu modulieren. Die Phosphorylierung von zytoplasmatischen Resten von GPCRs ist ein wichtiger Mechanismus für die Regulierung einiger GPCRs. Bei einer Form von Signaltransduktion ist die Auswirkung einer Hormonbindung beispielsweise die Aktivierung des Enzyms Adenylatcyclase innerhalb der Zelle. Die Enzymaktivierung durch Hormone hängt von der Gegenwart des Nucleotids GTP ab. GTP beeinflusst auch die Hormonbindung. Ein G-Protein verbindet den Hormonrezeptor mit Adenylatcyclase. Ein G-Protein tauscht GTP mit gebundenem GDP aus, wenn es durch einen Hormonrezeptor aktiviert wird. Die GTP tragende Form bindet dann an aktivierte Adenylatcyclase. Die Hydrolyse von GTP zu GDP, katalysiert durch das G-Protein selbst, führt das G-Protein in seine inaktive Grundform zurück. Somit hat das G-Protein eine Doppelrolle, als Zwischenglied, welches das Signal vom Rezeptor zum Effektor weiterleitet, und als Uhr, welche die Dauer des Signals steuert.
In den letzten 15 Jahren wurden fast 350 Therapeutika, die auf 7TM-Rezeptoren ausgerichtet sind, erfolgreich auf den Markt gebracht. Das zeigt, dass diese Rezeptoren eine etablierte, bewährte Vorgeschichte als Therapeutika haben. Natürlich besteht die Notwendigkeit, weitere Rezeptoren zu identifizieren und zu charakterisieren, die eine Rolle bei der Vorbeugung, Linderung und Behebung von Dysfunktionen oder Krankheiten spielen können, einschließlich, nicht aber eingeschränkt auf, Infektionen, wie z.B. Bakterien-, Pilz-, Protozoen- und Virusinfektionen, insbesondere solche, die durch HIV-Viren verursacht werden, Schmerz, Krebs, Anorexie, Bulimie, Asthma, Parkinson-Krankheit, akuten Herzversagens, Hypotension, Hypertension, Harnretention, Osteoporose, Angina pectoris, Myokardinfarkt, Geschwüren, Asthma, Allergien, benigner Prostatahypertrophie und psychotischer und neurologischer Störungen, einschließlich Angst, Schizophrenie, manischer Depression, Delirium, Demenz, verschiedener geistiger Behinderungen und Dyskinesien, wie z.B. Huntington-Krankheit und Tourette-Syndrom.
Lipoxin A₄
Lipoxine (Lipoxygenase-Wechselwirkungsprodukte) sind eine neue Reihe von von Arachidonsäure abgeleiteten Metaboliten (Serhan et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 18, 943–949 (1984); Serhan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5335–5339 (1984)). Das Unterscheidungsmerkmal eines Lipoxins ist die Gegenwart einer Tri-hydroxy-konjugierten Tetraenstruktur. Zumindest zwei biologisch aktive Lipoxine wurden bisher charakterisiert: Lipoxin A₄ [(5S,6R,15S)-5,6,15-Trihydroxy-7,9,13-trans-11-cis-eicosatetraensäure] und Lipoxin B₄ [(5S,14R,15S)-5,14,15-Trihydroxy- 6,10,12-trans-8-cis-eicosatetraensäure] (Serhan et al., J. Biol. Chem. 261, 16340–16345; Serhan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1983–1987 (1986)).
Es wurde nachgewiesen, dass Lipoxin A₄ die glatte Muskulatur der Lunge (Meerschweinchen-Lunge), nicht aber das Ileum oder die Trachea von Meerschweinchen kontrahiert und glatte Gefäßmuskeln bei Konzentrationen von weniger als 1 μM entspannt (erweitert) (Dahlen et al., Acta Physiol. Scand. 130, 643–647 (1987)). Die topische Anwendung von Lipoxin A₄ an Hamsterbackentaschen induziert eine ausgeprägte arterioläre Dilatation, verändert aber nicht den Durchmesser von Venolen (Dahlen et al., in: Adv. Exper. Med. Biol. 229, Kap. 9, 107–130 (1988)). Außerdem wurde nachgewiesen, dass Lipoxin A₄ Neutrophile dazu veranlasst, Superoxidreste zu produzieren, Elastase freizusetzen und Chemotaxis durch Leukozyten zu fördern (Serhan et al., in: Prostaglandins, Leukotrienes and Lipoxins, J.M. Bailey, Hrsg., Plenum, N.Y., USA, S. 3–16 (1985)).
Es wurde vorgeschlagen, Lipoxin A₄ zur Induktion der Entzündungsreaktion auf Neutrophile einzusetzen, um ein Versuchsmodell zur Bewertung der Wirksamkeit von Verbindungen, wie z.B. Lipoxin-B₄-Derivaten, bei der Verhinderung dieser Reaktion bereitzustellen (Samuelsson et al., US-Patent 4.560.514). Außerdem wurde vorgeschlagen, dass Lipoxin A₄ einen Teil seiner biologischen Wirkungen durch Bindung an den Lipoxin-D₄-Rezeptor ausüben könnte (Jacques et al., Br. J. Pharmacol. 95, 562–568 (1988)) und dass Lipoxin A₄ und LTD₄ sogar einen gemeinsamen Rezeptor teilen könnten (Lefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8340–8344 (1988)).
Untersuchungen an menschlichen Neutrophilen haben eine umgekehrte Beziehungen zwischen der Produktion von Lipoxinen und Leukotrienen aufgezeigt, nachdem diese Zellen 15-HETE und der Calcium-Ionophore A23187 ausgesetzt worden waren (Serhan, in: Advances in Prostaglandin, Thromboxane and Leukotriene Research, Bd. 18, B. Samuelsson et al., Hrsg., Raven Press, N.Y., USA). Außerdem zeigen neuere Ergebnisse auf, dass Mesangiumzellen Lipoxine aus exogenen Quellen von LTA₄ erzeugen können (Garrick et al., Kidney Int. Proceedings 21 st Annual Meeting of the American Society of Nephrology, Bd. 25, S. 292 (1989)), die durch aktivierte Leukotyzen bereitgestellt werden können (z.B. während des transzellulären Metabolismus). Somit können die lokalen Werte dieser Verbindungen nach der Infiltration von Leukozyten in den Glomerulus bestimmt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Wirkstoffe, welche die Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids regulieren kann. Eine Testverbindung wird mit einem Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid kontaktiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der aus Aminosäuresequenzen mit zumindest 90 % Identität mit der in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz und der in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Die Bindung der Testverbindung an das Polypeptid wird detektiert. Eine Testverbindung, die an das Polypeptid bindet, wird dadurch als möglicher Wirkstoff zur Regulierung der Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids identifiziert, der bei der Behandlung einer mit Entzündungsprozessen assoziierten Erkrankung von Nutzen ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Wirkstoffe, die bei der Behandlung einer mit Entzündungsprozessen assoziierten Erkrankung von Nutzen sind und welche die Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids verringern. Eine Testverbindung wird mit einer biologischen Zelle kontaktiert oder inkubiert, worin die biologische Zelle eine T-Zelle ist und/oder mit dem Polynucleotid transformiert wurde, worin das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz umfasst, die aus der aus Nucleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen an die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz hybridisieren, und der in Seq.-ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Die Bindung der Testverbindung an das Polynucleotid wird detektiert. Eine Testverbindung, die an das Polynucleotid bindet, wird als möglicher Wirkstoff zur Verringerung der Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids identifiziert. Der Wirkstoff kann arbeiten, indem er die Menge des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Elements durch Wechselwirkung mit der Lipoxin-A₄-rezeptorartigen mRNA verringert.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die DNA-Sequenz, die für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodiert.
2 zeigt die Aminosäuresequenz eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, eines isolierten Polynucleotids, das für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodiert und aus der aus folgenden Elementen bestehenden Gruppe ausgewählt ist:

a) einem Polynucleotid, das die Sequenz mit der Seq.-ID Nr. 1 umfasst;
b) einem Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen an ein Polynucleotid hybridisiert, das unter a) spezifiziert ist;
c) einem Polynucleotid, das ein Polynucleotid umfasst, wie es unter a) oder b) definiert ist.

Ein menschliches Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kann auch eingesetzt werden, um auf Lipoxin-A₄-rezeptorartige Agonisten und Antagonisten zu screenen, die bei der Behandlung einer mit Entzündungsprozessen assoziierten Erkrankung von Nutzen sind.
Die Aminosäuresequenz eines menschlichen Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids, das für die Erfindung, wie sie durch die Ansprüche definiert ist, von Nutzen ist, ist in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt oder weist zumindest 90 % Identität mit Seq.-ID Nr. 2 auf. Eine Nucleotidsequenz, die für Seq.-ID Nr. 2 kodiert, ist in Seq.-ID Nr. 1 dargestellt, wobei das Startcodon und Stoppcodon hervorgehoben sind.
Lipoxin A₄-rezeptorartige Polypeptide
Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide, die für die Erfindung, wie sie durch die Ansprüche definiert ist, von Nutzen sind, umfassen die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder weisen zumindest 90 % Identität mit Seq.-ID Nr. 2 auf. Ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid der Erfindung kann folglich ein Abschnitt eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Moleküls, ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Molekül voller Länge oder ein Fusionsproteins, welches das gesamte oder einen Teil des Lipoxin-A₄-rezeptorartige Moleküls umfasst, sein.
Vorzugsweise bindet ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid Lipoxin A₄ oder ein Lipoxin-A₄-Analogon. Die Bindung kann wie beispielsweise in den nachstehenden spezifischen Beispielen beschrieben bestimmt werden.
Biologisch aktive Varianten
Varianten von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden, die biologisch aktiv sind, d.h. die Fähigkeit zur Bindung von Lipoxin A₄ oder eines Lipoxin-A₄-Analogons beibehalten und/oder eine biologische Wirkung, wie z.B. die Bildung von zyklischem AMP, die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium oder Phosphinositid-Stoffwechsel, vermitteln, sind ebenfalls Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide. Die prozentuelle Identität zwischen einer möglichen Variante eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids und einer Aminosäuresequenz mit Seq.-ID Nr. 2 wird mithilfe des Blast2-Anordnungsprogramms bestimmt.
Schwankungen in der prozentuellen Identität können beispielsweise auf Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen zurückzuführen sein. Aminosäuresubstitutionen sind definiert als Aminosäureersetzungen. Sie sind konservativer Natur, wenn die substituierte Aminosäure ähnliche strukturelle und/oder chemische Eigenschaften aufweist. Beispiele für konservative Ersetzungen sind Substitutionen eines Leucins durch ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat oder eines Threonins durch ein Serin.
Aminosäureinsertionen oder -deletionen sind Änderungen an oder in einer Aminosäuresequenz. Sie betreffen typischerweise einen Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren. Unterstützung bei der Bestimmung, welche Aminosäurereste substituiert, insertiert oder deletiert werden können, ohne die biologische oder immunologische Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids aufzuheben, bieten Computerprogramme, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, wie z.B. die DNASTAR-Software. Ob eine Aminosäureänderung in einem biologisch aktiven Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid resultiert, kann leicht bestimmt werden, indem auf die Aktivität von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden getestet wird, wie beispielsweise in den nachstehenden spezifischen Beispielen beschrieben ist.
Fusionsproteine
Fusionsproteine sind zweckdienlich zur Bildung von Antikörpern gegen Aminosäuresequenzen von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden und zum Einsatz in verschiedenen Testsystemen. Fusionsproteine können beispielsweise eingesetzt werden, um Proteine zu identifizieren, die mit Abschnitten eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids wechselwirken. Proteinaffinitätschromatographie oder auf Bibliotheken basierende Tests für Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie z.B. das Hefe-Zwei-Hybrid- oder Phagendisplay-System, können für diesen Zweck eingesetzt werden. Solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und können zum Arzneimittel-Screenen verwendet werden.
Ein Fusionsprotein eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids umfasst zwei Polypeptidsegmente, die mithilfe einer Peptidbindung fusioniert sind. Zusammenhängende Aminosäuren zur Verwendung in einem Fusionsprotein können aus der in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder aus einer biologisch aktiven Variante solcher Sequenzen, wie sie oben beschrieben sind, ausgewählt werden. Das erste Polypeptidsegment kann auch ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid voller Länge umfassen.
Das zweite Polypeptidsegment kann ein Protein voller Länge oder ein Proteinfragment sein. Proteine, die herkömmlicherweise bei der Fusionsproteinkonstruktion eingesetzt werden, umfassen β-Galactosidase, β-Glucuronidase, grün fluoreszierendes Protein (GFP), autofluoreszierende Proteine, einschließlich blau fluoreszierendes Protein (BFP), Glutathion-S-transferase (GST), Luciferase, Meerrettichperoxidase (HRP) und Chloramphenicolacetyltransferase (CAT). Außerdem werden Epitopmarkierungen in Fusionsproteinkonstruktionen eingesetzt, einschließlich Histidin- (His-) Markierungen, Influenza-Hämagglutinin- (HA-) Markierungen, Myc-Markierungen, VSV-G-Markierungen und Thioredoxin- (Trx-) Markierungen. Andere Fusionskonstruktionen können ein Maltose-Bindungsprotein (MBP), eine S-Markierung, Lex-a-DNA-Bindedomänen- (DBD-) Fusionen, GAL4-DNA-Bindedomänen-Fusionen und Herpes-simplex-Virus- (HSV-) BP16-Proteinfusionen umfassen. Ein Fusionsprotein kann auch aufgebaut sein, dass es eine Spaltstelle zwischen der für Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierenden Sequenz und der heterologen Proteinsequenz enthält, sodass das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid gespalten und von der gereinigten heterologen Gruppierung entfernt werden kann.
Ein Fusionsprotein kann chemisch synthetisiert werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Vorzugsweise wird ein Fusionsprotein hergestellt, indem zwei Polypeptidsegmente kovalent gebunden werden, oder durch Standardverfahren im Bereich der Molekularbiologie. DNA-Rekombinationsverfahren können auch eingesetzt werden, um Fusionsproteine herzustellen, beispielsweise durch Bildung eines DNA-Konstrukts, das kodierende Sequenzen, die aus Seq.-ID Nr. 1 ausgewählt sind, im passenden Leseraster mit Nucleotiden umfasst, die für das zweite Polypeptidsegment kodieren und das DNA-Konstrukt in einer Wirtszelle exprimieren, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Zahlreiche Sets zur Bildung von Fusionsproteinen sind von Firmen wie Promega Corporation (Madison, WI, USA), Stratagene (La Jolla, CA, USA), CLONTECH (Mountain View, CA, USA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), MBL International Corporation (MIC, Watertown, MA, USA) und Quantum Biotechnologies (Montreal, Kanada; 1-888-DNA-KITS) erhältlich.
Identifikation von Spezies-Homologen
Spezies-Homologe eines menschlichen Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids können durch Verwendung von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid-Polynucleotiden (nachstehend beschrieben), um geeignete Sonden oder Primer zum Screenen von cDNA-Expressionsbibliotheken von anderen Spezies, wie z.B. von Mäusen, Affen oder Hefe, herzustellen, Identifikation von cDNAs, die für Homologe eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids kodieren, und Exprimieren der cDNAs in auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Weise erhalten werden.
Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polynucleotide
Ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid kann einzel- oder doppelsträngig sein und umfasst eine für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierende Sequenz oder das Komplement einer solchen kodierenden Sequenz. Eine für ein menschliches Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierende Sequenz ist in Seq.-ID Nr. 1 dargestellt.
Degenerierte Nucleotidsequenzen, die für menschliche Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide kodieren, sowie homologe Nucleotidsequenzen, die zumindest 50, vorzugsweise etwa 75, 90, 96 oder 98 % Identität mit der in Seq.-ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz aufweisen, sind ebenfalls Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polynucleotide. Die prozentuelle Sequenzidentität zwischen den Sequenzen von zwei Polynucleotiden wird mithilfe von Computer-Programmen bestimmt, wie z.B. ALIGN, bei dem der FASTA-Algorithmus eingesetzt wird, wobei eine affine Lückensuche mit einer „Gap Open Penalty" von -12 und einer „Gap Extension Penalty" von -2 durchgeführt wird. Komplementäre DNA- (cDNA-) Moleküle, Spezies-Homologe und Varianten von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotiden, die für biologisch aktive Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide kodieren, sind ebenfalls Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polynucleotide.
Identifikation von Varianten und Homologen von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid-Polynucleotiden
Varianten und Homologe der oben beschriebenen Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotide sind ebenfalls Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polynucleotide. Typischerweise können homologe Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polynucleotidsequenzen durch Hybridisierung von Kandidaten-Polynucleotiden an bekannte Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polynucleotide unter stringenten Bedingungen in auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Weise identifiziert werden. Unter Einsatz der folgenden Waschbedingungen – 2 × SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,1 % SDS, Raumtemperatur, zweimal, jeweils 30 min; dann 2 × SSC, 0,1 % SDS, 50°C, einmal, 30 min; dann 2 × SSC, Raumtemperatur, zweimal, jeweils 10 min – können homologe Sequenzen identifiziert werden, die höchstens etwa 25–30 % Basenpaar-Fehlpaarungen aufweisen. Noch bevorzugter enthalten homologe Nucleinsäurestränge 15–25 % Basenpaar-Fehlpaarungen, noch bevorzugter 5–15 % Basenpaar-Fehlpaarungen.
Spezies-Homologe der hierin geoffenbarten Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotide können auch identifiziert werden, indem geeignete Sonden oder Primer hergestellt und cDNA-Expressionsbibliotheken von anderen Spezies, wie z.B. Mäusen, Affen oder Hefe, gescreent werden. Menschliche Varianten von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotiden können beispielsweise identifiziert werden, indem menschliche cDNA-Expressionsbibliotheken gescreent werden. Es ist allgemein bekannt, dass die T_m einer doppelsträngigen DNA mit jeder 1%igen Verringerung der Homologie um 1–1,5°C abnimmt (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973)). Varianten von menschlichen Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotiden oder Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotiden von anderen Spezies können deshalb identifiziert werden, indem ein mögliches homologes Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid mit einem Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder dem Komplement davon hybridisiert wird, um eine Testhybride zu bilden. Die Schmelztemperatur der Testhybride wird mit der Schmelztemperatur einer Hybride verglichen, die Transformylase-Polynucleotid mit perfekt komplementären Nucleotidse quenzen umfasst, und die Anzahl oder der prozentuelle Anteil an Basenpaar-Fehlpaarungen in der Testhybride wird berechnet.
Nucleotidsequenzen, die nach einer stringenten Hybridisierung und/oder nach stringenten Waschbedingungen an Transformylase-Polynucleotide oder ihre Komplemente hybridisieren, sind ebenfalls Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polynucleotide. Stringente Waschbedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und sind beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. S. 9.50–9.51 (1989), geoffenbart.
Stringente Waschbedingungen umfassen beispielsweise 4 × SSC bei 65°C oder 50 % Formamid, 4 × SSC bei 42°C oder 0,5 × SSC, 0,1 % SDS bei 65°C. Hochstringente Waschbedingungen umfassen beispielsweise 0,2 × SSC bei 65°C.
Herstellung von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotiden
Ein natürlich vorkommendes Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid kann frei von anderen Zellkomponenten, wie z.B. Membrankomponenten, Proteinen und Lipiden, isoliert werden. Polynucleotide können durch eine Zelle hergestellt und unter Einsatz von herkömmlichen Nucleinsäure-Reinigungsverfahren isoliert werden, oder sie können unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens, wie z.B. der Polymerasekettenreaktion (PCR), oder unter Einsatz eines automatischen Synthesegeräts synthetisiert werden. Verfahren zur Isolation von Polynucleotiden gehören auf dem Gebiet der Erfindung zur Routine und sind allgemein bekannt. Jedes beliebige solche Verfahren zum Erhalt eines Polynucleotids kann eingesetzt werden, um isolierte Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polynucleotide zu erhalten. Beispielsweise können Restriktionsenzyme und Sonden verwendet werden, um Polynucleotid-Fragmente zu isolieren, die Lipoxin-A₄-rezeptorartige Nucleotidsequenzen enthalten. Isolierte Polynucleotide liegen in Präparaten vor, die frei oder zumindest zu 70, 80 oder 90 % frei von anderen Molekülen sind.
Lipoxin-A₄-rezeptorartige cDNA-Moleküle können mithilfe von herkömmlichen molekularbiologischen Verfahren unter Einsatz von Lipoxin-A₄-rezeptorartiger mRNA als Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Element hergestellt werden. Lipoxin-A₄-rezeptorartige cDNA-Moleküle können anschließend mithilfe von molekularbiologischen Verfahren repliziert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und in Handbüchern wie Sambrook et al. (1989) geoffenbart sind. Ein Amplifikationsverfahren, wie z.B. PCR, kann verwendet werden, um weitere Kopien von Polynucleotiden der Erfindung zu erhalten, wobei entweder menschliche genomische DNA oder cDNA als Matrize eingesetzt wird.
Alternativ dazu können chemische Syntheseverfahren eingesetzt werden, um Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polynucleotide zu synthetisieren. Die Degeneration des genetischen Codes erlaubt die Synthese von alternativen Nucleotidsequenzen, die für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid mit beispielsweise einer in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder für eine biologisch aktive Variante davon kodieren.
Erhalt von Lipoxin-A₄-rezeptorartipen Polypeptiden
Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide können beispielsweise durch Reinigung aus menschlichen Zellen, durch Expression von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotiden oder durch direkte chemische Synthese erhalten werden.
Proteinreinigung
Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide können aus jeder beliebigen menschlichen Zelle gereinigt werden, die den Rezeptor exprimiert, einschließlich jeder beliebigen Wirtszelle, die mit einem ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid exprimierenden Polynucleotid-Konstrukt transfiziert wurde. Ein gereinigtes Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid wird von anderen Verbindungen getrennt, die sich normalerweise mit dem Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid in der Zelle verbinden, wie z.B. bestimmte Proteine, Kohlenhydrate oder Lipide, wobei auf dem Gebiet der Erfindung allgemein be kannte Verfahren eingesetzt werden. Solche Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Größenausschlusschromatographie, Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und präparative Gelelektrophorese.
Ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid wird am besten als Komplex mit seinem assoziierten G-Protein isoliert. Verschiedene Lipoxin-A₄-rezeptorartige Analoga sind verfügbar und können als Liganden für die Rezeptorbindung eingesetzt werden. Biotinylierte Lipoxin-A₄-rezeptorartige Analoga sind für diesen Zweck besonders gut geeignet. Ein Präparat von gereinigten Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden ist zumindest zu 80 % rein; vorzugsweise sind die Präparate zu 90 %, 95 % oder 99 % rein. Die Reinheit der Präparate kann mithilfe jedes beliebigen, auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahrens bewertet werden, beispielsweise mithilfe von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
Expression von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotiden
Um ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid zu exprimieren, kann ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid in einen Expressionsvektor insertiert werden, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der insertierten kodierenden Sequenz enthält. Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, können eingesetzt werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die für Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide kodierende Sequenzen und geeignete Transkriptions- und Translationskontrollelemente enthalten. Diese Verfahren umfassen In-vitro-DNA-Rekombinationsverfahren, Syntheseverfahren und genetische In-vivo-Rekombination. Solche Verfahren sind beispielsweise in Sambrook et al. (1989) und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., USA (1989), beschrieben.
Verschiedene Expressionsvektoren/Wirtssysteme können eingesetzt werden, damit sie Sequenzen, die für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodieren, enthalten und exprimieren. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Mikroorga nismen, wie z.B. mit rekombinanten Bakteriophagen-, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformierte Bakterien; mit Hefeexpressionsvektoren transformierte Hefe, mit Virusexpressionsvektoren (z.B. Baculovirus) infizierte Insektenzellensysteme, mit Virusexpressionsvektoren (z.B. Karfiolmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z.B. Ti- oder pBR322-Plasmide) transformierte Pflanzenzellsysteme oder Tierzellsysteme.
Die Kontrollelemente oder Regulationssequenzen sind jene nichttranslatierten Regionen des Vektors-Enhancer, Promotoren, untranslatierte 5'- und 3'-Regionen-, die mit Wirtszellproteinen wechselwirken, um eine Transkription und Translation durchzuführen. Solche Elemente können in ihrer Stärke und Spezifität variieren. Je nach eingesetztem Vektorsystem und Wirt kann eine beliebige Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiven und induzierbaren Promotoren, eingesetzt werden. Wenn beispielsweise in bakteriellen Systemen kloniert wird, können induzierbare Promotoren, wie z.B. der Hybrid-lacZ-Promotor des BLUESCRIPT-Phagemids (Stratagene, LaJolla, CA, USA) oder pSPORT1-Plasmids (Life Technologies) und dergleichen, eingesetzt werden. Der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor kann in Insektenzellen verwendet werden. Promotoren oder Enhancer, die von Genomen von Pflanzenzellen (z.B. Hitzeschock-, RUBISCO- und Speicherproteingene) oder von Pflanzenviren (z.B. virale Promotoren oder Leader-Sequenzen) stammen, können in den Vektor kloniert werden. In Säugetier-Zellsystemen sind Promotoren von Säugetiergenen oder von Säugetierviren bevorzugt. Wenn es notwendig ist, eine Zelllinie herzustellen, die mehrere Kopien einer für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz enthält, können auf SV40 oder EBV basierende Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker eingesetzt werden.
Bakterien- und Hefe-Expressionssysteme
In Bakteriensystemen kann eine Reihe von Expressionsvektoren je nach beabsichtigter Verwendung des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids ausgewählt werden. Wenn beispielsweise eine große Menge Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid für die Induktion von Antikörpern notwendig ist, können Vektoren eingesetzt werden, welche eine starke Expression von Fusionsproteinen steuern, die leicht gereinigt werden können. Solche Vektoren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, multifunktionelle E.-coli-Klonierungs- und -Expressionsvektoren, wie z.B. BLUESCRIPT (Stratagene). In einem BLUESCRIPT-Vektor kann eine für das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid kodierende Sequenz im Leseraster mit Sequenzen für das aminoterminale Met und die nachfolgenden 7 Reste von β-Galactosidase in den Vektor ligiert werden, sodass ein Hybridprotein produziert wird. pIN-Vektoren (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503–5509 (1989)) oder pGEX-Vektoren (Promega, Madison, WI, USA) können ebenfalls verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutation-S-transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen, gefolgt von einer Elution in Gegenwart von freiem Glutathion aus lysierten Zellen gereinigt werden. Proteine, die in solchen Systemen hergestellt werden, können so aufgebaut sein, dass sie Heparin-, Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltstellen enthalten, sodass das klonierte Polypeptid von Interesse nach Wunsch von der GST-Gruppierung abgelöst werden kann.
In der Hefe Saccharomyces cerevisiae kann eine Reihe von Vektoren eingesetzt werden, die konstitutive oder induzierbare Promotoren, wie z.B. α-Faktor, Alkoholoxidase und PGH, enthalten. Für einen Überblick siehe Ausubel et al. (1989) und Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516–544 (1987).
Pflanzen- und Insekten-Expressionssysteme
Wenn Pflanzen-Expressionsvektoren eingesetzt werden, kann die Expression von für Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide kodierenden Sequenzen durch beliebige aus einer Reihe von Promotoren angetrieben werden. Beispielsweise können virale Promotoren, wie z.B. der 35S- und 19S-Promotor von CaMV, alleine oder in Kombination mit der Omega-Leader-Sequenz von TMV eingesetzt werden (Takamatsu EMBO J. 6, 307–311 (1987)). Alternativ dazu können auch Pflanzenpromotoren, wie z.B. die kleine Untereinheit von RUBISCO, oder Hitzeschockpromotoren eingesetzt werden (Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671–1680 (1984); Broglie et al., Science 224, 838–843 (1984); Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85–105 (1991)). Diese Konstrukte können durch direkte DNA-Transformation oder durch pathogenvermittelte Transfektion in Pflanzenzellen eingeführt werden. Solche Verfahren sind in einer Reihe von allgemein erhältlichen Dokumenten beschrieben (z.B. Hobbs oder Murry, in: McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, S. 191–196, McGRaw Hill, New York, N.Y., USA (1992)).
Ein Insektensystem kann ebenfalls eingesetzt werden, um ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid zu exprimieren. In einem solchen System wird beispielsweise ein Autographa-californica-Nuclear-Polyhedrosis-Virus (AcNPV) als Vektor eingesetzt, um fremde Gene in Spodoptera-frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven zu exprimieren. Sequenzen, die für Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide kodieren, können in eine nichtessentielle Region des Virus, z.B. das Polyhedrin-Gen, kloniert und unter Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gesetzt werden. Eine erfolgreiche Insertion von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden macht das Polyhedrin-Gen inaktiv und produziert ein rekombinantes Virus ohne Hüllprotein. Die rekombinanten Viren können dann eingesetzt werden, um S.-frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven zu infizieren, in denen Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide exprimiert werden können (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 3224–3227 (1994)).
Säugetier-Expressionssysteme
Eine Reihe von auf Viren basierenden Expressionssystemen können zur Expression von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden in Säugetier-Wirtszellen eingesetzt werden. Wenn beispielsweise ein Adenovirus als Expressionsvektor eingesetzt wird, können Sequenzen, die für Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide kodieren, in einen Adenovirus-Transkriptions-/Translationskomplex, der den späten Promotor und die dreiteilige Leader-Sequenz umfasst, ligiert werden. Die Insertion in eine nichtessentielle E1- oder E3-Region des viralen Genoms kann genutzt werden, um ein lebensfähiges Virus zu erhalten, das in der Lage ist, ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypep tid in infizierten Wirtszellen zu exprimieren (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655–3659 (1984)). Falls erwünscht können Transkriptions-Enhancer, wie z.B. der Rous-Sarkom-Virus- (RSV-) Enhancer, zur Steigerung der Expression in Säugetier-Wirtszellen eingesetzt werden.
Künstliche menschliche Chromosomen (HACs) können ebenfalls eingesetzt werden, um größere DNA-Fragmente als sie in einem Plasmid enthalten sein können und exprimiert werden können zuzuführen. HACs mit 6 M bis 10 M werden konstruiert und durch herkömmliche Zufuhrverfahren (z.B. Liposomen, polykationische Aminopolymere oder Vesikel) Zellen zugeführt.
Spezifische Startsignale können ebenfalls eingesetzt werden, um eine effizientere Translation von für Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide kodierenden Sequenzen zu erreichen. Solche Signale umfassen das ATG-Initiationsodon und angrenzende Sequenzen. In Fällen, in denen für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierende Sequenzen, ihr Initiationscodon und stromauf liegende Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, sind eventuell keine weiteren Transkriptions- oder Translationssteuersignale erforderlich. In Fällen, in denen nur eine kodierende Sequenz oder ein Fragment davon insertiert wird, sollten jedoch exogene Translationssteuersignale (einschließlich des ATG-Initiationscodons) bereitgestellt werden. Das Initiationscodon sollte im korrekten Leseraster vorliegen, um die Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Exogene Translationselemente und Initiationscodons können verschiedenen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, Ursprungs sein. Die Effizienz der Expression kann durch die Einbeziehung von Enhancern gesteigert werden, die für das jeweilige Zellsystem, das verwendet wird, geeignet sind (siehe Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20, 125–162 (1994)).
Wirtszellen
Ein Wirtszellstamm kann aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt werden, die Expression der insertierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid auf die gewünschte Weise zu verarbeiten. Solche Modifika tionen des Polypeptids umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Acetylierung, Carboxylierung, Glycosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Posttranslationale Reifung, wodurch eine „Präproform" des Polypeptids gespalten wird, kann ebenfalls eingesetzt werden, um die korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion zu erleichtern. Unterschiedliche Wirtszellen mit einer spezifischen zellulären Maschinerie und einem charakteristischen Mechanismus für posttranslationale Aktivitäten (z.B. CHO, HeLa, MDCK, HEK293 und W138) sind von der American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110–2209; USA) erhältlich und können so gewählt werden, dass die korrekte Modifikation und Verarbeitung des fremden Proteins sichergestellt wird.
Eine stabile Expression ist für eine langfristige Produktion von rekombinanten Proteinen in hoher Ausbeute bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien, die Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide stabil exprimieren, mithilfe von Expressionsvektoren transformiert werden, die virale Replikationsstartpunkte und/oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markierungsgen auf demselben oder einem anderen Vektor enthalten. Nach der Einführung des Vektors können die Zellen 1–2 Tage lang in einem angereicherten Medium wachsen gelassen werden, bevor sie in ein selektives Medium gewechselt werden. Der Zweck des selektierbaren Markers ist es, Resistenz gegen Selektion zu verleihen, und seine Gegenwart ermöglicht das Wachstum und die Gewinnung von Zellen, welche die eingeführten Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Sequenzen erfolgreich exprimieren. Resistente Klone von stabil transformierten Zellen können mithilfe von für den Zelltyp geeigneten Gewebekulturverfahren vermehrt werden. Siehe beispielsweise Animal Cell Cultire, R.I. Freshney (Hrsg.) (1986).
Jede beliebige Anzahl an Selektionssystemen kann verwendet werden, um transformierte Zelllinien zu gewinnen.
Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Herpex-simplex-Virus-Thymidinkinase- (Wigler et al., Cell 11, 112–32 (1977)) und Adenin-Phosphoribosyltransferase- (Lowy et al., Cell 22, 817–23 (1980)) Gene, die in t^–- bzw. aprt^–-Zellen eingesetzt werden können. Auch Antimetabolit-, Antibiotika- oder Herbizidresistenz können als Selektionsbasis dienen. Beispielsweise verlieht dhfr Resistenz gegen Methotrexat (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567–70 (1980)), npt verleiht Resistenz gegen die Aminoglycoside Neomycin und G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1–14 (1981)) und als und pat verleihen Resistenz gegen Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricinacetyltransferase (Murry, w.o. (1992)). Weitere selektierbare Gene wurden beschrieben. Beispielsweise erlaubt es trpB Zellen, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden, oder hisD erlaubt es Zellen, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047–51 (1988)). Sichtbare Marker, wie z.B. Anthocyanine, β-Glucuronidase und ihr Substrat GUS und Luciferase und ihr Substrat Luciferin, können verwendet werden, um Transformanten zu identifizieren und das Ausmaß an vorübergehender oder stabiler Proteinexpression zu quantifizieren, die auf ein spezifisches Vektorsystem zurückzuführen ist (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121–131 (1995)).
Defektion der Expression von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden
Obwohl das Vorhandensein von Markierungsgen-Expression vermuten lässt, dass auch das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid vorhanden ist, muss seine Gegenwart und Expression eventuell bestätigt werden. Wenn beispielsweise eine Sequenz, die für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodiert, in eine Markierungsgen-Sequenz insertiert wird, können transformierte Zellen, die für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierende Sequenzen enthalten, durch die Abwesenheit von Markierungsgen-Funktion identifiziert werden. Alternativ dazu kann ein Markierungsgen unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors in Tandemanordnung mit einer Sequenz angeordnet werden, die für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodiert. Die Expression des Markierungsgens als Reaktion auf eine Induktion oder Selektion zeigt üblicherweise die Expression des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotids an.
Alternativ dazu können Wirtszellen, die ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid enthalten und ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid exprimieren, mithilfe verschiedener Verfahren identifiziert werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungen und Protein-Biotest- oder Immuntest-Verfahren, die Membran-, Lösungs- oder auf Chips basierende Technologien zur Detektion und/oder Quantifizierung einer Nucleinsäure oder eines Proteins umfassen. Die Gegenwart einer Polynucleotidsequenz, die für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodiert, kann beispielsweise durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifikation unter Einsatz von Sonden oder Fragmenten oder Fragmenten von Polynucleotiden, die für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodieren, detektiert werden. Auf Nucleinsäure basierende Tests umfassen den Einsatz von Oligonucleotiden, die aus für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierenden Sequenzen ausgewählt sind, um Transformanten zu detektieren, die ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid enthalten.
Verschiedene Protokolle zur Detektion und Messung der Expression eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids, entweder unter Einsatz von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die für das Polypeptid spezifisch sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), Radioimmuntest (RIA) und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Ein Zweistellen-Immuntest auf monoklonaler Basis unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die auf zwei sich nicht beeinflussende Epitope auf einem Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid reagieren, kann eingesetzt werden, oder auch ein kompetitiver Bindungstest kann verwendet werden. Diese und andere Tests sind in Hampton et al., Serological Methods: A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Minn. (1990), und Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211–1216 (1983), beschrieben.
Verschiedenste Markierungen und Konjugationstechniken sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können in unterschiedlichen Nucleinsäure- und Aminosäure-Tests eingesetzt werden. Mittel zur Durchführung einer markierten Hybridisierung oder zur Herstellung von PCR-Sonden zur Detektion von Sequenzen, die mit Polynucleotiden verwandt sind, die für Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid kodieren, umfassen Oligomarkierung, Nick-Translation, Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Einsatz eines markierten Nucleotids. Alternativ dazu können Sequenzen, die für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodieren, in einen Vektor für die Herstellung einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, im Handel erhältlich und könne zur Synthese von RNA-Sonden in vitro durch die Hinzufügung von markierten Nucleotiden und einer geeigneten RNA-Polymerase, wie z.B. T7, T3 oder SP6, eingesetzt werden. Diese Verfahren können mithilfe verschiedener im Handel erhältlicher Sets (Amersham Pharmacia Biotech, Promega und US Biochemical) durchgeführt werden. Geeignete Reporter-Moleküle oder Markierungen, die zur Vereinfachung der Detektion eingesetzt werden können, umfassen Radionuclide, Enzyme und fluoreszierende, chemilumineszierende oder chromogene Mittel sowie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, Magnetteilchen und dergleichen.
Expression und Reinigung von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden
Mit für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenzen transformierte Wirtszellen können unter Bedingungen kultiviert werden, die für die Expression und Gewinnung des Proteins aus einer Zellkultur geeignet sind. Das durch eine transformierte Zelle hergestellte Polypeptid kann sekretiert oder intrazellulär enthalten sein, je nach verwendeter Sequenz und/oder verwendetem Vektor. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sein wird, können Expressionsvektoren, die für Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide kodierende Polynucleotide enthalten, so aufgebaut sein, dass sie Signalsequenzen enthalten, welche die Sekretion von löslichen Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden durch eine prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran steuern oder welche die Membraninsertion eines membrangebundenen Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids steuern.
Wie oben erläutert können andere Konstruktionen eingesetzt werden, um eine für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierende Sequenz an eine Nucleotidsequenz zu binden, die für eine Polypeptiddomäne kodiert, welche die Reinigung von löslichen Proteinen vereinfacht. Solche die Reinigung vereinfachenden Domänen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Metallchelatpeptide, wie z.B. Histidin-Tryptophan-Module, welche eine Reinigung auf immobilisierten Metallen erlauben, Protein-A-Domänen, welche eine Reinigung auf immobilisiertem Immunglobulin erlauben, und die Domäne, die im FLAGS-Extensions-/Affinitätsreinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, Wash., USA) verwendet wird. Die Aufnahme von spaltbaren Linker-Sequenzen, wie z.B. solchen, die für Faktor Xa oder Enterokinase spezifisch sind (Invitrogen, San Diego, CA, USA), zwischen der Reinigungsdomäne und dem Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid kann auch zur Vereinfachung der Reinigung dienen. Ein solcher Expressionsvektor ermöglicht die Expression eines Fusionsproteins, welches ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid und 6 Histidinreste vor einer Thioredoxin- oder einer Enterokinase-Spaltstelle umfasst. Die Histidinreste vereinfachen die Reinigung durch IMAC (immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie wie in Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263–281 (1992), beschrieben), während die Enterokinase-Spaltstelle ein Mittel zur Reinigung des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids von Fusionsprotein bereitstellt. Fusionsproteine enthaltende Vektoren sind in Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 442–453 (1993), geoffenbart.
Chemische Synthese
Sequenzen, die für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodieren, können als Ganzes oder zum Teil mithilfe von chemischen Verfahren synthetisiert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind (siehe Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215–223 (1980); Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225–232 (1980)). Alternativ dazu kann ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid selbst unter Verwendung von chemischen Verfahren zur Synthese seiner Aminosäuresequenz hergestellt werden, wie z.B. durch direkte Peptidsynthese unter Einsatz von Festphasenverfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963); Roberge et al., Science 269, 202–204 (1995)). Die Proteinsynthese kann unter Einsatz von manuellen Verfahren oder automatisiert durchgeführt werden. Eine automatisierte Synthese kann beispielsweise mithilfe der Peptid-Synthesevorrichtung Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer) erfolgen. Gegebenenfalls können Fragmente von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden separat synthetisiert und unter Einsatz von chemischen Verfahren kombiniert werden, um ein Vollängen-Molekül herzustellen.
Das neu synthetisierte Peptid kann durch präparative Hochleistungs-Flüssigchromatographie im Wesentlichen gereinigt werde (z.B. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., New York, N.Y., USA (1983)). Die Zusammensetzung eines synthetischen Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids kann durch Aminosäureanalyse oder Sequenzierung bestätigt werden (z.B. durch das Edman-Abbauverfahren; siehe Creighton, w.o.). Außerdem kann jeder beliebige Abschnitt der Aminosäuresequenz des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids während einer direkten Synthese verändert und/oder unter Einsatz von chemischen Verfahren mit Sequenzen von anderen Proteinen kombiniert werden, um eine Polypeptidvariante oder ein Fusionsprotein herzustellen.
Herstellung von veränderten Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptiden
Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sein wird, kann es von Vorteil sein, für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierende Nucleotidsequenzen herzustellen, die nicht natürlich vorkommenden Codons aufweisen. Beispielsweise können Codons ausgewählt werden, die von einem bestimmten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt bevorzugt werden, um die Geschwindigkeit der Proteinexpression zu erhöhen oder ein RNA-Transkript mit wünschenswerten Eigenschaften herzustellen, beispielsweise mit einer Halbwertszeit, die länger ist als die eines aus der natürlich vorkommenden Sequenz hergestellten Transkripts.
Die hierin geoffenbarten Nucleotidsequenzen können unter Einsatz von auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Verfahren gentechnisch verändert werden, um für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierende Sequenzen aus verschiedenen Gründen zu verändern, einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, Änderungen zur Modifikation der Klonierung, Reifung und/oder Expression des Polypeptids oder mRNA-Produkts. DNA-Shuffling durch zufällige Fragmentierung und PCR-Reassemblierung von Genfragmenten und synthetischen Oligonucleotiden kann verwendet werden, um die Nucleotidsequenzen gentechnisch zu verändern. Beispielsweise kann ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt werden, um neue Restriktionsstellen zu insertieren, Glycosylierungsmuster zu verändern, die Codonbevorzugung zu verändern, Spleißvarianten herzustellen, Mutationen einzuführen usw.
Antikörper
Jede beliebige Antikörperart, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann erzeugt werden, um spezifisch an ein Epitop oder ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid zu binden. „Antikörper" umfasst hierin intakte Immunglobulin-Moleküle sowie Fragmente davon, wie z.B. Fab, F(ab')₂ und Fv, die in der Lage sind, ein Epitop eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids zu binden. Typischerweise sind zumindest 6, 8, 10 oder 12 zusammenhängende Aminosäuren erforderlich, um ein Epitop zu bilden. Epitope, die nicht zusammenhängende Aminosäuren umfassen, können jedoch mehr, z.B. zumindest 15, 25 oder 50, Aminosäuren erfordern.
Ein Antikörper, der spezifisch an ein Epitop eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids bindet, kann therapeutisch sowie in immunchemischen Tests, wie z.B. Western-Blots, ELISAs, Radioimmuntests, immunhistochemischen Tests, Immunpräzipitationen oder anderen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten immunchemischen Tests, eingesetzt werden. Unterschiedliche Immuntests können eingesetzt werden, um Antikörper mit der gewünschten Spezifität zu identifizieren. Zahlreiche Protokolle für kompetitive Bindung oder immunradiometrische Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Solche Immuntests umfassen typischerweise die Messung der Komplexbildung zwischen einem Immunogen und einem Antikörper, der spezifisch an das Immunogen bindet.
Typischerweise stellt ein Antikörper, der spezifisch an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid bindet, ein Detektionssignal bereit, das zumindest 5-, 10- oder 20-mal stärker ist als das Detektionssignal, das bei anderen Proteinen bereitgestellt wird, wenn sie in einem immunchemischen Test eingesetzt werden. Vorzugsweise detektieren Antikörper, die spezifisch an Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide binden, an dere Proteine in immunchemischen Tests nicht und können ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid aus einer Lösung immunpräzipitieren.
Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide können verwendet werden, um ein Säugetier, wie z.B. eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Meerschweinchen, einen Affen oder einen Menschen, zu immunisieren, sodass diese polyklonale Antikörper produzieren. Falls erwünscht kann ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid an ein Trägerprotein, wie z.B. Rinderserumalbumin, Thyroglobulin und Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, konjugiert werden. Je nach Wirtsspezies können verschiedene Adjuvantien verwendet werden, um die immunologische Reaktion zu verstärken. Solche Adjuvantien umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Freundsches Adjuvans, Mineralgele (z.B. Aluminiumhydroxid) und Tenside (z.B. Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl-Emulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und Dinitrophenol). Von den beim Menschen eingesetzten Adjuvantien sind BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Cornyebacterium parvum besonders gut geeignet.
Monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid binden, können unter Einsatz jedes beliebigen Verfahrens hergestellt werden, das die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in einer Kultur ermöglichen. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, das Hybridom-Verfahren, das menschliche B-Zell-Hybridomverfahren und das EBV-Hybridom-Verfahren (Kohler et al., Nature 256, 495–497 (1985); Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31–42 (1985); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026–2030 (1983); Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109–120 (1984)).
Außerdem können Verfahren, die zur Produktion von „chimären Antikörpern" entwickelt wurden, das Spleißen von Maus-Antikörpergenen an menschliche Antikörpergene, um ein Molekül mit geeigneter Antigenspezifität und biologischer Aktivität zu erhalten, eingesetzt werden (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851–6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984); Takeda et al., Nature 314, 452–454 (1985)). Monoklonale und andere Antikörper können auch „humanisiert" werden, um zu verhindern, dass ein Patient eine Immunantwort gegen den Antikörper aufbaut, wenn dieser therapeutisch eingesetzt wird. Solche Antikörper können ausreichend Sequenzähnlichkeit zu menschlichen Antikörpern aufweisen, sodass sie direkt in einer Therapie eingesetzt werden können, oder sie können die Veränderung einiger weniger Schlüsselreste erfordern. Sequenzunterschiede zwischen Nagetier-Antikörpern und menschlichen Sequenzen können minimiert werden, indem Reste, die sich von jenen in den menschlichen Sequenzen unterscheiden, durch ortsgerichtete Mutagenese einzelner Reste ersetzt werden oder durch Entfernung von gesamten komplementaritätsbestimmenden Regionen. Alternativ dazu können humanisierte Antikörper unter Verwendung von Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wie in GB 2188638B beschrieben ist. Antikörper, die spezifisch an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid binden, können Antigenbindungsstellen enthalten, die entweder teilweise oder vollständig humanisiert sind, wie in U.S. 5.656.332 geoffenbart ist.
Alternativ dazu können Verfahren, die für die Produktion von einkettigen Antikörpern beschrieben wurden, mithilfe von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren angepasst werden, um einkettige Antikörper herzustellen, die spezifisch an Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide binden. Antikörper mit verwandter Spezifität aber anderer idiotyper Zusammensetzung können durch Neukombination von Ketten aus zufälligen kombinatorischen Immunglobin-Bibliotheken hergestellt werden (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120–23 (1991)).
Einkettige Antikörper könne auch mithilfe eines DNA-Amplifikationsverfahrens, wie z.B. PCR, unter Einsatz von Hybridom-cDNA als Matrize konstruiert werden (Thirion et al., Euro. J. Cancer Prev. 5, 507–11 (1996)). Einkettige Antikörper können mono- oder bispezifisch und zweiwertig oder vierwertig sein. Die Konstruktion von vierwertigen, bispezifischen Einketten-Antikörpern wird beispielsweise in Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15, 159–63 (1997), gelehrt. Die Konstruktion von zweiwertigen, bispezifischen Einketten-Antikörpern ist in Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199–206 (1994), gelehrt.
Eine Nucleotidsequenz, die für einen einkettigen Antikörper kodiert, kann mithilfe von manueller oder automatisierter Nucleotidsynthese konstruiert, mithilfe von Standard-DNA-Rekombinationsverfahren in ein Expressionskonstrukt kloniert und in eine Zelle eingeführt werden, um die kodierende Sequenz zu exprimieren, wie nachstehend beschrieben. Alternativ dazu können einkettige Antikörper direkt unter Einsatz von beispielsweise der Technik der filamentösen Phagen hergestellt werden (Verhaar et al., Int. J. Cancer 61, 497–501 (1995); Nicholls et al., J. Immunol. Meth. 165, 81–91 (1993)).
Antikörper, die spezifisch an Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide binden, können auch durch Induktion einer In-vivo-Produktion in der Lymphozytenpopulation oder durch Screening von Immunglobulin-Bibliotheken oder Gruppen von hochspezifischen Bindungsreagenzien produziert werden, wie in der Literatur beschrieben ist (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833–3837 (1989); Winter et al., Nature 349, 293–299 (1991)).
Auch andere Arten von Antikörpern können konstruiert und in Verfahren der Erfindung therapeutisch eingesetzt werden. Beispielsweise können chimäre Antikörper wie in der WO 93/03151 geoffenbart konstruiert werden. Bindeproteine, die von Immunglobulinen stammen und mehrwertig und multispezifisch sind, wie z.B. die in der WO 94/13804 beschriebenen „Diabodies", können ebenfalls hergestellt werden.
Antikörper gemäß der Erfindung können durch auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannte Verfahren gereinigt werden. Beispielsweise können Antikörper affinitätsgereinigt werden, indem sie über eine Säule geschickt werden, an die ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid gebunden ist. Die gebundenen Antikörper können dann unter Einsatz eines Puffers mit einer hohen Salzkonzentration aus der Säule eluiert werden.
Antisense-Oliponucleotide
Antisense-Oligonucleotide sind Nucleotidsequenzen, die zu einer spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz komplementär sind. Sobald sie einmal in eine Zelle eingeführt sind, vereinigen sich die komplementären Nucleotide mit natürlichen Sequenzen, die von der Zelle produziert werden, um Komplexe zu bilden und entweder die Transkription oder Translation zu blockieren. Vorzugsweise ist ein Antisense-Oligonucleotid zumindest 11 Nucleotide lang, es kann aber auch zumindest 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 oder mehr Nucleotide lang sein. Längere Sequenzen können ebenfalls eingesetzt werden. Antisense-Oligonucleotidmoleküle können in einem DNA-Konstrukt bereitgestellt und in eine Zelle eingeführt werden, wie oben beschrieben ist, um den Gehalt an Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteingenprodukten in der Zelle zu verringern.
Antisense-Oligonucleotide können Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide oder eine Kombination aus beiden sein. Oligonucleotide können manuell synthetisiert oder durch eine automatisierte Synthesevorrichtung synthetisiert sein, durch kovalente Bindung des 5'-Endes von einem Nucleotid an das 3'-Ende eines anderen Nucleotids mit Nicht-Phosphodiester-Internucleotidbindungen, wie z.B. Alkylphosphonaten, Thiophosphaten, Dithiophosphaten, Alkylthiophosphaten, Alkylphosphonaten, Phosphoramidaten, Phosphatestern, Carbamaten, Acetamidat, Carboxymethylestern, Carbonaten und Phosphattriestern. Siehe Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1–8 (1994); Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1–72 (1994); Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543–583 (1990).
Modifikationen der Expression von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteingenen können erreicht werden, indem Antisense-Oligonucleotide entworfen werden, die Duplexe an der Kontroll-, 5'- oder Regulationsregion des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteingens bilden. Oligonucleotide, die von der Transkriptionsinitiationsstelle stammen, z.B. zwischen den Positionen –10 und +10 von der Startstelle aus gesehen, sind bevorzugt. Auf ähnliche Weise kann eine Inhibierung unter Einsatz eines „Tripelhelix"-Basenpaarungsverfahrens erreicht werden. Die Tripelhelix-Paarung ist zweckdien lich, weil sie zur Inhibierung der Fähigkeit der Doppelhelix führt, sich ausreichend für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder Chaperonen zu öffnen. Therapeutische Fortschritte unter Verwendung von Triplex-DNA wurden in der Literatur beschrieben (z.B. Gee et al., in: Huber & Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., USA (1994)). Ein Antisense-Oligonucleotid kann auch so entworfen werden, dass es die Translation von mRNA blockiert, indem es verhindert, dass das Transkript an Ribosomen bindet.
Eine exakte Komplementarität ist für eine erfolgreiche Komplexbildung zwischen einem Antisense-Oligonucleotid und der komplementären Sequenz eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotids nicht erforderlich. Antisense-Oligonucleotide, die beispielsweise 2, 3, 4 oder 5 oder mehr Abschnitte von zusammenhängenden Nucleotiden umfassen, die exakt komplementär zu einem Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotid sind, jeweils durch einen Abschnitt aus zusammenhängenden Nucleotiden getrennt, die nicht komplementär zu benachbarten Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteinnucleotiden sind, können ausreichende Targeting-Spezifität für Lipoxin-A₄-rezeptorartige Protein-mRNA bereitstellen. Vorzugsweise ist jeder Abschnitt aus komplementären zusammenhängenden Nucleotiden zumindest 4, 5, 6, 7 oder 8 oder mehr Nucleotide lang. Nichtkomplementäre dazwischen liegende Sequenzen sind vorzugsweise 1, 2, 3 oder 4 Nucleotide lang. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können leicht den berechneten Schmelzpunkt eines Antisense-Sense-Paars zur Bestimmung des Grads an Fehlpaarung nutzen, der zwischen einem bestimmten Antisense-Oligonucleotid und einer bestimmten Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotidsequenz toleriert wird.
Antisense-Oligonucleotide können modifiziert werden, ohne dass ihre Fähigkeit, an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid zu hybridisieren, beeinträchtigt wird. Diese Modifikationen können intern oder an einem oder an beiden Enden des Antisense-Moleküls vorliegen. Inter-Nucleosid-Phosphatbindungen können beispielsweise modifiziert werden, indem Cholesteryl- oder Diamingruppierungen mit variierenden Zahlen an Kohlenstoffresten zwischen den Aminogruppen und einer terminalen Ribose addiert werden. Modifizierte Basen und/oder Zucker, wie z.B. Arabinose an stelle von Ribose, oder ein 3',5'-substituiertes Oligonucleotid, in dem die 3'-Hydroxylgruppe oder die 5'-Phosphatgruppe substituiert sind, können ebenfalls in einem modifizierten Antisense-Oligonucleotid verwendet werden. Diese modifizierten Oligonucleotide können durch auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden. Siehe z.B. Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152–158 (1992); Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543–584 (1990); Uhlmann et al., Tetrahedron Lett. 215, 3539–3542 (1987).
Ribozyme
Ribozyme sind RNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität. Siehe z.B. Cech, Science 236, 1532–1539 (1987); Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543–568 (1990); Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605–609 (1992); Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510–515 (1996). Ribozyme können verwendet werden, um eine Genfunktion durch Spaltung einer RNA-Sequenz zu hemmen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist (z.B. Haseloff et al., US-Patent 5.641.673). Der Mechanismus der Ribozymwirkung umfasst eine sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an eine komplementäre Target-RNA, gefolgt von einer endonucleolytischen Spaltung. Beispiele umfassen gentechnisch veränderte Hammerhead-Motiv-Ribozymmoleküle, die eine endonucleolytische Spaltung von spezifischen Nucleotidsequenzen spezifisch und effizient katalysieren können.
Die kodierende Sequenz eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotids kann verwendet werden, um Ribozyme zu erzeugen, die spezifisch an mRNA binden, die vom Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotid transkribiert wurde. Verfahren zum Entwerten und Konstruieren von Ribozymen, die andere RNA-Moleküle in trans auf äußerst sequenzspezifische Weise spalten können, wurden entwickelt und auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben (siehe Haseloff et al., Nature 334, 585–591 (1988)). Die Spaltungsaktivität von Ribozymen kann beispielsweise auf spezifische RNAs ausgerichtet werden, indem eine getrennte „Hybridisierungsregion" in das Ribozym eingebaut wird. Die Hybridisierungsregion enthält eine Sequenz, die komple mentär zur Target-RNA ist und somit spezifisch an das Target hybridisiert (siehe z.B. Gerlach et al., EP 321.201 ).
Spezifische Ribozym-Spaltstellen innerhalb eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Protein-RNA-Targets können identifiziert werden, indem das Target-Molekül auf Ribozym-Spaltstellen gescreent wird, die folgende Sequenzen enthalten: GUA, GUU und GUC. Sobald diese identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen aus zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, die der Region der Target-RNA entsprechen, welche die Spaltstelle enthält, auf sekundäre Strukturmerkmale beurteilt werden, welche das Target inoperabel machen. Die Eignung von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Kandidaten-Protein-RNA-Targets kann auch beurteilt werden, indem die Zugänglichkeit für eine Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden unter Einsatz eines Ribonuclease-Schutztests getestet wird. Die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenzen und ihre Komplemente stellen Quellen für geeignete Hybridisierungsregionssequenzen dar. Längere komplementäre Sequenzen können verwendet werden, um die Affinität der Hybridisierungssequenz für das Target zu erhöhen. Die Hybridisierungs- und Spaltregionen des Ribozyms können untrennbar zusammenhängen, sodass bei einer Hybridisierung an die Target-RNA durch die komplementären Regionen die katalytische Region des Ribozyms das Target spalten kann.
Ribozyme können in Zellen als Teil eines DNA-Konstrukts eingeführt werden. Mechanische Verfahren, wie beispielsweise Mikroinjektion, Liposomen-vermittelte Transfektion, Elektroporation oder Calciumphosphat-Präzipitation, können verwendet werden, um ein Ribozym enthaltendes DNA-Konstrukt in Zellen einzuführen, in denen es erwünscht ist, die Expression von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteinen zu senken. Alternativ dazu kann, wenn es erwünscht ist, dass die Zellen das DNA-Konstrukt stabil beibehalten, das Konstrukt auf einem Plasmid zugeführt werden und als getrenntes Element oder integriert in ein Genom der Zellen aufrechterhalten werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Ein für ein Ribozym kodierendes DNA-Konstrukt kann Transkriptionsregulationselemente, wie beispielsweise ein Promotorelement, einen Enhancer oder ein UAS-Element, und ein Transkripti onsterminationssignal zur Kontrolle der Transkription von Ribozymen in den Zellen enthalten.
Wie Haseloff et al., US-Patent 5.641.673, lehren, können Ribozyme so gentechnisch verändert werden, dass eine Ribozymexpression als Reaktion auf Faktoren stattfindet, welche die Expression eines Target-Gens induzieren. Ribozyme können auch so gentechnisch verändert werden, das ein weiterer Regulierungsgrad bereitgestellt wird, sodass die Zerstörung von mRNA nur dann stattfindet, wenn sowohl ein Ribozym als auch ein Target-Gen in den Zellen induziert werden.
Screening-Verfahren
Geoffenbart sind Verfahren zum Screening auf Testverbindungen, die an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid oder ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid binden oder seine Aktivität modulieren. Eine Testverbindung bindet vorzugsweise an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid oder Polynucleotid. Noch bevorzugter verringert oder steigert eine Testverbindung die Aktivität von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteinen eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids oder die Expression eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotids um zumindest etwa 10 %, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %, im Vergleich zur Abwesenheit der Testverbindung.
Testverbindungen
Testverbindungen können pharmakologische Wirkstoffe, die auf dem Gebiet der Erfindung schon bekannt sind, oder Verbindungen sein, von denen bisher nicht bekannt war, dass sie pharmakologische Aktivität aufweisen. Die Verbindungen können natürlich vorkommen oder im Labor entworfen sein. Sie können aus Mikroorganismen, Tieren oder Pflanzen isoliert sein und können rekombinant hergestellt oder durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte chemische Verfahren synthetisiert sein. Falls erwünscht können Testverbindungen unter Einsatz beliebiger der zahlreichen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten kombinatorischen Bibliotheksverfah ren erhalten werden, einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, biologischer Bibliotheken, räumlich ansteuerbarer paralleler Festphasen- oder Lösungsphasenbibliotheken, synthetischer Bibliothekenverfahren, die eine Dekonvulotion erfordern, des „Ein-Kügelchen-eine-Verbindung"-Bibliothekenverfahrens und synthetischer Bibliothekenverfahren unter Einsatz von affinitätschromatographischer Selektion. Der auf einer biologischen Bibliothek basierende Ansatz ist auf Polypeptid-Bibliotheken eingeschränkt, während die anderen vier Ansätze auf Polypeptid-, Nichtpeptid-Oligomer- oder Kleinmolekül-Bibliotheken von Verbindungen anwendbar sind. Siehe Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145 (1997).
Verfahren zur Synthese von molekularen Bibliotheken sein auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt (siehe z.B. DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994); Cho et al., Science 261, 1303 (1993); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994)). Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung (siehe z.B. Houghten, Biotechniques 13, 412–421 (1992)) oder auf Kügelchen (Lam, Nature, 354, 82–84 (1991)), Chips (Fodor, Nature 364, 555–556 (1993)), Bakterien oder Sporen (Ladner, US-Patent 5.223.409), Plasmiden (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865–1869 (1992)) oder Phagen (Scott & Smith, Science 249, 386–390 (1990); Devlin, Science 249, 404–406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378–6382 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222, 301–310 (1991); und Ladner, US-Patent 5.223.409) vorliegen.
Hochdurchsatz-Screening
Testverbindungen können durch Hochdurchsatz-Screening auf ihre Fähigkeit gescreent werden, an Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide oder Polynucleotide zu binden oder die Aktivität von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteinen oder die Expression von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteingenen zu beeinflussen. Mithilfe von Hochdurchsatz-Screening können viele einzelne Verbindungen parallel getestet werden, sodass eine große Anzahl an Testverbindungen rasch gescreent werden kann. Die am weitesten verbreiteten Verfahren nutzen 96-Well-Mikrotiterpaltten. Die Wells der Mikrotiterplatten erfordern typischerweise Test-Volumina im Bereich von 50 bis 500 l. Neben den Platten sind auch zahlreiche Instrumente, Materialien, Pipettoren, Roboter, Platten-Waschvorrichtungen und Platten-Lesegeräte im Handel erhältlich, die für das 96-Well-Format geeignet sind.
Alternativ dazu können auch „Freiformat-Tests" oder Tests durchgeführt werden, die keine physikalische Barriere zwischen Proben aufweisen. Ein Test unter Verwendung von Pigmentzellen (Melanozyten) in einem einfachen homogenen Test für kombinatorische Peptidbibliotheken wurde beispielsweise von Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19, 1614–18 (1994), beschrieben. Die Zellen werden unter Agarose in Petrischalen platziert, und dann werden Kügelchen, die kombinatorische Verbindungen tragen, an die Oberfläche der Agarose angelagert. Die kombinatorischen Verbindungen werden teilweise von den Verbindungen aus den Kügelchen freigesetzt. Aktive Verbindungen können als dunkle Pigmentbereiche sichtbar gemacht werden, da, wenn die Verbindungen lokal in die Gelmatrix diffundieren, die aktiven Verbindungen die Zellen dazu bringen, ihre Farbe zu ändern.
Ein weiteres Beispiel für einen Freiformat-Test wurde von Chelsky, „Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", vorgestellt auf der „First Annual Conference of the Society for Biomolecular Screening" in Philadelphia, Pa., USA (7.–10. Nov. 1995), beschrieben. Chelsky platzierte einen einfachen homogenen Enzym-Test für Carbonatdehydrase innerhalb eines Agarosegels, sodass das Enzym im Gel eine Farbänderung im gesamten Gel verursachen würde. Danach wurden Kügelchen, die kombinatorische Verbindungen über einen Photolinker trugen, im Gel platziert, und die Verbindungen wurde teilweise durch UV-Licht freigesetzt. Verbindungen, die das Enzym hemmten, waren als lokale Hemmzonen zu erkennen, in denen weniger Farbänderung auftrat.
Ein weiteres Beispiel ist in Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57–63 (1996), beschrieben. In diesem Beispiel wurden kombinatorische Bibliotheken auf Verbindun gen gescreent, die zytotoxische Auswirkungen auf Krebszellen hatten, die in Agar wuchsen.
Ein weiteres Hochdurchsatz-Screening-Verfahren ist in Beutel et al., US-Patent 5.976.813 beschrieben. In diesem Verfahren werden Testproben in eine poröse Matrix gegeben. Eine oder mehrere Test-Komponenten werden dann in, auf eine Matrix oder am unteren Ende einer Matrix, wie z.B. ein Gel, eine Kunststofffolie, einen Filter oder eine andere Form eines leicht manipulierbaren Trägermaterials, gegeben. Wenn Proben in die poröse Matrix eingeführt werden, diffundieren sie ausreichend langsam, sodass die Tests durchgeführt werden können, ohne dass die Testproben ineinander verlaufen.
Bindungstests
Bei Bindungstests ist die Testverbindung vorzugsweise ein kleines Molekül, das an die aktive Stelle des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids bindet und diese besetzt, wodurch die Ligandenbindungsstelle unzugänglich für ein Substrat gemacht wird, sodass eine normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele für solche kleinen Moleküle umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, kleine Peptide oder peptidartige Moleküle. Mögliche Liganden, die an ein Polypeptid der Erfindung binden, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die natürlichen Liganden von bekannten Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteinen und Analoga und Derivaten davon.
Bei Bindungstests kann entweder die Testverbindung oder das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid eine detektierbare Markierung umfassen, beispielsweise eine fluoreszierende, Radioisotop-, chemilumineszierende oder enzymatische Markierung, wie z.B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase oder Luciferase. Die Detektion einer Testverbindung, die an das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid gebunden ist, kann dann beispielsweise durch direktes Zählen der Radioemission, durch Szintillationszählung oder durch Bestimmung der Überführung eines geeigneten Substrats in ein detektierbares Produkt erfolgen.
Alternativ dazu kann die Bindung einer Testverbindung an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid ohne Markierung der Wechselwirkungselemente erfolgen. Beispielsweise kann ein Mikrophysiometer eingesetzt werden, um die Bindung einer Testverbindung mit einem Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid zu detektieren. Ein Mikrophysiometer (z.B. Cytosensor^TM) ist ein Analysegerät, das mithilfe eines lichtadressierbaren potentiometrischen Sensors (LAPS) die Geschwindigkeit misst, mit der eine Zelle zu einer Ansäuerung seiner Umgebung führt. Änderungen dieser Ansäuerungsgeschwindigkeit können als Indikator für die Wechselwirkung zwischen einer Testverbindung und einem Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid genutzt werden (McConnell et al., Science 257, 1906–1912 (1992)).
Die Bestimmung der Fähigkeit einer Testverbindung, an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid zu binden, kann auch mithilfe einer Technologie wie der bimolekularen Wechselwirkungsanalyse („Bimolecular Interaction Analysis", BIA) in Echtzeit erfolgen (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338–2345 (1991), und Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699–705 (1995)). BIA ist eine Technologie zur Untersuchung von biospezifischen Wechselwirkungen in Echtzeit, ohne dass die Wechselwirkungspartner markiert werden (z.B. BIAcore^TM). Änderungen im optischen Phänomen der Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR) können als Indikation von Echtzeitreaktionen zwischen biologischen Molekülen genutzt werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid als „Köderprotein" in einem Zwei-Hybrid-Test oder Drei-Hybrid-Test verwendet werden (siehe z.B. US-Patent 5.283.317; Zervos et al., Cell 72, 223–232 (1993); Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046–12054 (1993); Bartel et al., Biotechniges 14, 920–924 (1993); Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693–1696 (1993); und Brent, WO94/10300), um andere Proteine zu identifizieren, die an das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid binden oder damit wechselwirken oder seine Aktivität modulieren.
Das Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Beschaffenheit der meisten Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdo mänen bestehen. Kurz gesagt nutzt der Test zwei unterschiedliche DNA-Konstrukte. In einem Konstrukt kann beispielsweise ein für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid kodierendes Polynucleotid an ein Polynucleotid fusioniert werden, das für die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors (z.B. GAL-4) kodiert. Im anderen Konstrukt kann eine DNA-Sequenz, die für ein unidentifiziertes Protein („Beute" oder „Probe") kodiert, an ein Polynucleotid fusioniert werden, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert. Wenn die „Köder"- und „Beute"-Proteine in der Lage sind, in vivo zu wechselwirken und einen protein-abhängigen Komplex zu bilden, dann werden die DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors sehr nahe zueinander gebracht. Diese Nähe erlaubt die Transkription eines Reportergens (z.B. LacZ), das operabel an eine Transkriptionsregulationsstelle gebunden ist, die auf den Transkriptionsfaktor anspricht. Eine Expression des Reportergens kann detektiert werden, und Zellkolonien, die den funktionellen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert und zum Erhalt der DNA-Sequenz verwendet werden, die für das Protein kodiert, das mit dem Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid wechselwirkt.
Es kann wünschenswert sein, entweder das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid (oder Polynucleotid) oder die Testverbindung zu isolieren, um die Trennung der gebundenen von den ungebundenen Formen eines oder beider Wechselwirkungspartner zu vereinfachen sowie die Automatisierung des Tests zu ermöglichen. Somit kann entweder das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid (oder Polynucleotid) oder die Testverbindung an einen festen Träger gebunden sein. Geeignete feste Trägermaterialien umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Glas- oder Kunststoff-Objektträger, Gewebekulturplatten, Mikrotiterplatten, Röhrchen, Silicon-Chips oder Teilchen wie Kügelchen (einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, Latex-, Polystyrol- oder Glaskügelchen). Jedes beliebige auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren kann eingesetzt werden, um das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid (oder Polynucleotid) oder eine Testverbindung an ein festes Trägermaterial zu binden, einschließlich des Einsatzes von kovalenten und nichtkovalenten Bindungen, passiver Absorption oder Paaren von Bindungsgruppierungen, die jeweils an das Polypeptid (oder Polynucleotid) oder eine Testverbindung und das Trägermaterial ge bunden sind. Testverbindungen sind vorzugsweise in einem Array an das Trägermaterial gebunden, sodass die Position der einzelnen Testverbindungen ausgemacht werden kann. Die Bindung einer Testverbindung an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid (oder Polynucleotid) kann in jedem beliebigen Gefäß erfolgen, das dafür geeignet ist, solche Reaktanten aufzunehmen. Beispiele für solche Gefäße umfassen Mikrotiterplatten, Reagenzgläser und Mikrozentrifugengläser.
In einer Ausführungsform ist das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid ein Fusionsprotein, das eine Domäne umfasst, die es dem Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid erlaubt, an ein festes Trägermaterial gebunden zu werden. Beispielsweise können Glutathion-S-transferase-Fusionsproteine auf Gutathion-Sepharose-Kügelchen (Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA) oder Glutathion-derivatisierte Mikrotiterplatten absorbiert werden, die dann mit der Testverbindung oder mit der Testverbindung und dem nicht adsorbierten Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptid kombiniert werden; das Gemisch wird dann unter Bedingungen inkubiert, die für eine Komplexbildung förderlich sind (z.B. unter physiologischen Bedingungen für Salz und pH). Nach einer Inkubation werden die Kügelchen oder Mikrotiterplatten-Wells gewaschen, um ungebundene Komponenten zu entfernen. Die Bindung der Wechselwirkungspartner kann entweder direkt oder indirekt bestimmt werden, wie oben beschrieben ist. Alternativ dazu können Komplexe vom festen Trägermaterial abgetrennt werden, bevor die Bindung bestimmt wird.
Andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen oder Polynucleotiden auf einem festen Trägermaterial können ebenfalls in den Screening-Tests der Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise kann entweder ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid (oder Polynucleotid) oder eine Testverbindung unter Einsatz der Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinylierte Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide (oder Polynucleotide) oder Testverbindungen können aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Verfahren hergestellt (z.B. Biotinylierungsset, Pierce Chemicals, Rockford, III., USA) und in den Wells von mit Streptavidin beschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Alternativ dazu können Antikörper, die spezifisch an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid oder Polynucleotid oder eine Testverbindung binden, eine gewünschte Bindungsstelle, wie z.B. die aktive Stelle des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids, aber nicht stören, in die Wells der Platte derivatisiert werden. Ein ungebundenes Target oder Protein kann durch Antikörper-Konjugation in den Wells gefangen werden.
Verfahren zur Detektion solcher Komplexe umfassen neben den oben für GST-immobilisierte Komplexe beschriebenen auch die Immundetektion von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch an das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid oder die Testverbindung binden, enzymgekoppelte Tests, die von der Detektion einer Aktivität des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids abhängen, und SDS-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen.
Das Screening auf Testverbindungen, die an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid oder Polynucleotid binden, kann auch in einer intakten Zelle durchgeführt werden. Jede beliebige Zelle, die ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid oder Polynucleotid umfasst, kann in einem zellbasierten Test-System eingesetzt werden. Ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid kann natürlich in der Zelle vorkommen oder unter Einsatz von Verfahren, wie sie oben beschrieben sind, in die Zelle eingeführt werden. Die Bindung der Testverbindung an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid oder Polynucleotid wird wie oben beschrieben bestimmt.
Tests für Lipoxin-A₄-rezeptorartige Proteine
Testverbindungen können auf ihre Fähigkeit getestet werden, die durch ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid vermittelte Signaltransduktion zu steigern oder zu verringern. Funktionelle Tests umfassen die Verwendung von Zellen, die den G-Protein-gebundenen Rezeptor exprimieren (z.B. transfizierte CHO-Zellen), in einem System, das extrazelluläre pH-Änderungen misst, die durch Rezeptoraktivierung verursacht werden (siehe z.B. Science 246, 181–296 (1989)). Beispielsweise können Verbindungen mit einer Zelle kontaktiert werden, die das Rezeptor-Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimiert, und eine zweite Messenger-Antwort, z.B. Signaltrans duktion oder pH-Änderungen, kann gemessen werden, um zu bestimmen, ob die potentielle Verbindung den Rezeptor aktiviert oder hemmt. Funktionelle Tests können durchgeführt werden, nachdem entweder ein gereinigtes Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid, ein Zellmembran-Präparat oder ein intakte Zelle mit einer Testverbindung kontaktiert wurde. Eine Testverbindung, welche die Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins um zumindest etwa 10 %, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %, verringert, wird als möglicher Wirkstoff zur Verringerung der Aktivität des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins identifiziert. Eine Testverbindung, welche die Aktivität des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids um zumindest etwa 10 %, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %, steigert, wird als möglicher Wirkstoff zur Steigerung der Aktivität des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins identifiziert.
Ein weiteres Screening-Verfahren umfasst den Einsatz von Melanophoren, die transfiziert werden, um den G-Protein-gebundenen Rezeptor der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Solch ein Screening-Verfahren ist in der WO 92/01810 beschrieben. So kann beispielsweise ein Test zum Screenen auf eine Verbindung eingesetzt werden, welche die Aktivierung des Rezeptor-Polypeptids der vorliegenden Erfindung hemmt, indem die Melanophorzellen, die für den Rezeptor kodieren, mit sowohl dem Rezeptor-Liganden als auch einer zu screenenden Verbindung kontaktiert werden. Die Hemmung des durch den Liganden erzeugten Signals zeigt, dass eine Verbindung ein möglicher Antagonist für den Rezeptor ist, d.h. die Aktivierung des Rezeptors hemmt. Das Screening kann zur Identifikation einer Verbindung eingesetzt werden, die den Rezeptor aktiviert, indem solche Zellen mit zu screenenden Verbindungen kontaktiert werden und bestimmt wird, ob jede einzelne Verbindung ein Signal erzeugt, d.h. den Rezeptor aktiviert.
Ein weiteres solches Screening-Verfahren umfasst die Einführung von für einen G-Protein-gebundenen Rezeptor kodierender RNA in Xenopus-Eizellen, um den Rezeptor vorübergehend zu exprimieren. Die Rezeptor-Eizellen können dann mit dem Rezeptor-Liganden und einer zu screenenden Verbindung kontaktiert werden, gefolgt von der Detektion der Hemmung oder Aktivierung eines Calcium-Signals, wenn auf Verbindungen gescreent wird, die vermutlich die Aktivierung des Rezeptors hemmen.
Ein weiteres Screening-Verfahren umfasst die Expression des G-Protein-gebundenen Rezeptors in Zellen, in denen der Rezeptor an eine Phospholipase C oder D gebunden ist. Solche Zellen umfassen Endothelzellen, Zellen der glatten Muskulatur, embryonale Nierenzellen usw. Das Screening kann wie oben beschrieben erreicht werden, indem der Grad der Aktivierung des Rezeptors aufgrund von Änderungen in der Phospholipase-Aktivität quantifiziert wird.
Detaillierte Beispiele für funktionelle Tests, wie sie oben beschrieben sind, sind in den nachfolgenden spezifischen Beispielen angeführt.
Expression von Lipoxin-A₄-rezeptorartipen Genen
In einer weiteren Ausführungsform werden Testverbindungen identifiziert, welche die Expression von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteingenen verringert oder steigern. Ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid wird mit einer Testverbindung kontaktiert, und die Expression einer RNA oder eines Polypeptidprodukts des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotids wird bestimmt. Der Grad der Expression einer geeigneten mRNA oder eines geeigneten Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung wird mit dem Grad der Expression von mRNA oder eines Polypeptids in Abwesenheit der Testverbindung verglichen. Die Testverbindung kann dann auf Basis diese Vergleichs als Modulator der Expression identifiziert werden. Wenn beispielsweise die Expression von mRNA oder eines Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung stärker ist als in ihrer Abwesenheit, dann wird die Testverbindung als Stimulator oder Enhancer der mRNA- oder Polypeptid-Expression identifiziert. Alternativ dazu wird, wenn die Expression der mRNA oder des Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung schwächer ist als in ihrer Abwesenheit, die Testverbindung als Inhibitor der mRNA- oder Polypeptid-Expression identifiziert.
Der Grad der Expression von Lipoxin-A₄-rezeptorartiger mRNA oder Lipoxin-A₄-rezeptorartigem Polypeptid in Zellen kann durch Verfahren bestimmt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung für die Detektion von mRNA oder eines Polypeptids bekannt sind. Es können entweder qualitative oder quantitative Verfahren verwendet werden. Die Gegenwart von Polypeptidprodukten eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotids kann beispielsweise unter Verwendung zahlreicher verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich immunchemischer Verfahren, wie z.B. Radioimmuntest, Western-Blotting und Immunhistochemie, bestimmt werden. Alternativ dazu kann eine Polypeptidsynthese in vivo, in einer Zellkultur oder in einem In-vitro-Translationssystem bestimmt werden, indem die Inkorporation von markierten Aminosäuren in ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid detektiert wird.
Solch ein Screening kann entweder in einem zellfreien Test-System oder in einer intakten Zelle durchgeführt werden. Jede beliebige Zelle, die ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polynucleotid exprimiert, kann in einem zellbasierten Test-System verwendet werden. Das Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polynucleotid kann in der Zelle natürlich vorkommen oder unter Verwendung von Verfahren, wie sie oben beschrieben sind, eingeführt werden. Es kann entweder eine Primärkultur oder eine etablierte Zelllinie, wie beispielsweise CHO- oder menschliche embryonale Nieren-293-Zellen, verwendet werden.
Diagnostische und therapeutische Indikationen und Verfahren
GPCRs sind in Säugetieren, einschließlich Menschen, überall zu finden und für zahlreiche biologische Funktionen, einschließlich zahlreicher Pathologien, verantwortlich. Demgemäß ist es wünschenswert, Verbindungen und Arzneimittel zu finden, die GPCRs einerseits stimulieren und andererseits die Funktion von GPCRs hemmen können. Beispielsweise können Verbindungen, die einen GPCR aktivieren, zu therapeutischen Zwecken, wie beispielsweise zur Behandlung von Asthma, der Parkinson-Krankheit, von akutem Herzversagen, Harnretention und Osteoporose, eingesetzt werden. Im Speziellen sind Verbindungen, welche die Rezeptoren der vorlie genden Erfindung aktivieren, bei der Behandlung von verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen zweckdienlich, wie z.B. solchen, die durch mangelhafte Lungenblutzirkulation oder durch Hypertension verursacht werden. Darüber hinaus können diese Verbindungen bei der Behandlung verschiedener physiologischer Störungen im Zusammenhang mit anormaler Kontrolle von Flüssigkeits- und Elektrolythomöostase und bei Erkrankungen im Zusammenhang mit anormaler, Angiotensin-induzierter Aldosteronsekretion verwendet werden.
Im Allgemeinen können Verbindungen, welche die Aktivierung eines GPCR inhibieren, zu zahlreichen therapeutischen Zwecken verwendet werden, beispielsweise zur Behandlung von Hypotension und/oder Hypertension, Angina pectoris, Myokardinfarkt, Geschwüren, Asthma, Allergien, benigner Prostatahypertrophie und psychotischen und neurologischen Leiden einschließlich Schizophrenie, manischer Erregung, Depression, Delirium, Demenz oder schwerer geistiger Behinderungen, Dyskinesien, wie z.B. Huntington-Krankheit und Tourette-Syndrom, und dergleichen. Verbindungen, die GPCRs hemmen, haben sich auch bei der Umkehrung endogener Anorexie und bei der Überwachung von Bulimie als zweckdienlich herausgestellt. Im Speziellen sind Verbindungen, welche die Aktivierung der Rezeptoren der vorliegenden Erfindung hemmen, auch bei der Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Beschwerden zweckdienlich, wie beispielsweise solchen, die durch exzessive pulmonale Blutzirkulation oder durch Hypotension verursacht werden. Außerdem können diese Verbindungen bei der Behandlung verschiedener physiologischer Erkrankungen, die mit anormaler Steuerung von Flüssigkeits- und Elektrolythomöostase zusammenhängen, und von Krankheiten im Zusammenhang mit anormaler Angiotensininduzierter Aldosteronsekretion eingesetzt werden.
Die Modulation der Bindung von Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteinen an ihren natürlich vorkommenden Liganden kann beispielsweise bei der Steuerung von Homöostase, vaskulärer Reaktivität, insbesondere Vasokonstriktion, und anaphylaktischen und allergischen Reaktionen bei Säugetieren, vorzugsweise Menschen, eingesetzt werden (siehe US-Patent 5.079.261). Das Blockieren der Bindung des Liganden eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins an den Rezeptor kann beispielsweise einge setzt werden, um die Entzündungsreaktion von Neutrophilen zu verringern. Alternativ dazu können Agonisten eines menschlichen Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins verwendet werden, um diese Entzündungsreaktion zu induzieren oder zu steigern.
Neue Wirkstoffe, die durch die oben beschriebenen Screening-Tests identifiziert wurden, können zur Regulierung der Aktivität von menschlichem Lipoxin-A₄-rezeptorartigem Protein eingesetzt werden. Demgemäß wird die Verwendung einer wie hierin beschrieben identifizierten Verbindung in einem geeigneten Tiermodell geoffenbart. Beispielsweise kann ein wie hierin beschrieben identifizierter Wirkstoff (z.B. ein Modulator, ein Antisense-Nucleinsäuremolekül, ein spezifischer Antikörper, ein Ribozym oder ein Proteinbindungspartner) in einem Tiermodell eingesetzt werden, um die Wirksamkeit, Toxizität oder Nebenwirkungen einer Behandlung mit solch einem Wirkstoff zu bestimmen. Alternativ dazu kann ein wie hierin beschrieben identifizierter Wirkstoff in einem Tiermodell eingesetzt werden, um den Wirkungsmechanismus solch eines Wirkstoffs zu bestimmen.
Ein Reagens, das sich auf die Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins auswirkt, kann entweder in vitro oder in vivo an eine menschliche Zelle verabreicht werden, um die Aktivität des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins zu verringern. Das Reagens bindet vorzugsweise an ein Expressionsprodukt eines menschlichen Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteingens. Wenn das Expressionsprodukt ein Protein ist, ist das Reagens vorzugsweise ein Antikörper. Zur Behandlung von menschlichen Zellen ex vivo kann der Antikörper zu einem Präparat von Stammzellen zugesetzt werden, die aus dem Körper entnommen wurden. Die Zellen können dann wieder in den gleichen oder in einen anderen menschlichen Körper eingesetzt werden, mit oder ohne klonale(r) Vermehrung, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
Das Reagens kann unter Verwendung eines Liposoms zugeführt werden. Vorzugsweise ist das Liposom in dem Tier stabil, in das es zumindest etwa 30 min lang, noch bevorzugter zumindest etwa 1 h lang, und noch bevorzugter zumindest etwa 24 h lang, verabreicht wurde. Ein Liposom umfasst eine Lipidzusammensetzung, die in der Lage ist, auf ein Reagens, insbesondere ein Polynucleotid, an einer bestimmten Stelle in einem Tier, wie z.B. einem Menschen, abzuzielen. Vorzugsweise ist die Lipidzusammensetzung des Liposoms in der Lage, auf ein spezifisches Organ eines Tiers, wie z.B. Lunge, Leber, Milz, Herz, Gehirn, Lymphknoten und Haut, abzuzielen.
Ein zweckdienliches Liposom umfasst eine Lipidzusammensetzung, die in der Lage ist, mit der Plasmamembran der Target-Zelle zu fusionieren, um der Zelle ihre Inhalte zuzuführen. Vorzugsweise beträgt die Transfektionswirksamkeit eines Liposoms etwa 0,5 μg DNA pro 16 nmol Liposom, die etwa 10⁶ Zellen zugeführt werden, noch bevorzugter etwa 1,0 μg DNA pro 16 nmol Liposom, die etwa 10⁶ Zellen zugeführt werden, und sogar noch bevorzugter etwa 2,0 μg DNA pro 16 nmol Liposom, die etwa 10⁶ Zellen zugeführt werden. Vorzugsweise weist ein Liposom einen Durchmesser von zwischen etwa 100 und 500 nm, noch bevorzugter zwischen etwa 150 und 450 nm, und noch bevorzugter zwischen etwa 200 und 400 nm, auf.
Geeignete Liposomen umfassen jene Liposomen, die standardmäßig beispielsweise in Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Genzufuhrverfahren verwendet werden. Noch bevorzugtere Liposomen umfassen Liposomen mit einer polykationischen Lipidzusammensetzung und/oder Liposomen mit einer Cholesterin-Hauptkette, die an Polyethylenglykol konjugiert ist. Gegebenenfalls umfasst ein Liposom eine Verbindung, die in der Lage ist, das Liposom auf eine Tumorzelle auszurichten, wie z.B. ein Tumorzellligand, der an der äußeren Oberfläche des Liposoms exponiert ist.
Das Komplexieren eines Liposoms mit einem Reagens wie z.B. einem Antisense-Oligonucleotid oder einem Ribozym kann unter Verwendung von Verfahren erreicht werden, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind (siehe z.B. US-Patent Nr. 5.705.151). Vorzugsweise werden etwa 0,1 μg bis etwa 10 μg Polynucleotid mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert, noch bevorzugter werden etwa 0,5 μg bis etwa 5 μg Polynucleotide mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert, und sogar noch bevorzugter werden etwa 1,0 μg Polynucleotide mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert.
Antikörper können spezifischen Geweben in vivo unter Verwendung von Rezeptor-vermittelter gerichteter Zufuhr zugeführt werden. Rezeptor-vermittelte DNA-Zufuhrverfahren werden beispielsweise in Findeis et al., Trends in Biotechnol. 11, 202–205 (1993); Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff (Hrsg.) (1994); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263, 621–624 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 542–546 (1994); Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655–3659 (1990); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 338–342 (1991), erläutert.
Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis
Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis liegt durchwegs im Kompetenzbereich von Fachleuten. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf jene Menge eines Wirkbestandteils, welche die Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins in Bezug auf die Aktivität des Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins, die in Abwesenheit der therapeutisch wirksamen Dosis auftritt, erhöht oder verringert.
Für jede beliebige Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich entweder in Zellkultur-Tests oder in Tiermodellen, üblicherweise in Mäusen, Kaninchen, Hunden oder Schweinen, geschätzt werden. Das Tiermodell kann auch eingesetzt werden, um den geeigneten Konzentrationsbereich und den Verabreichungsweg zu bestimmen. Solche Information kann dann verwendet werden, um nützliche Dosen und Verabreichungswege für Menschen zu bestimmen.
Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität, z.B. ED₅₀ (die Dosis, die in 50 % der Population therapeutisch wirksam ist) und LD₅₀ (die Dosis, die für 50 % der Population letal ist), können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder in Versuchstieren bestimmt werden. Das Dosisverhältnis von toxischen zu therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index, der als das Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die große therapeutische Indices aufweisen, werden bevorzugt. Die aus den Zellkulturtests und den Tierstudien erhaltenen Daten werden zur Formulierung eines Dosierungsbereichs zur Verwendung an Menschen herangezogen. Die in solchen Zusammensetzungen enthaltene Dosierung liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von zirkulierenden Konzentrationen, welche die ED₅₀ mit wenig oder keiner Toxizität umfassen. Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereichs je nach der verwendeten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten und des Verabreichungswegs.
Die exakte Dosierung wird vom Arzt unter Berücksichtigung von Faktoren bestimmt, die mit dem Individuum, das der Behandlung bedarf, zusammenhängen. Dosierung und Verabreichung können so eingestellt werden, dass ausreichende Konzentrationen des aktiven Bestandteils bereitgestellt werden oder dass die erwünschte Wirkung aufrechterhalten wird. Faktoren, die berücksichtigt werden können, umfassen die Schwere des Erkrankungszustandes, den allgemeinen Gesundheitszustand des Individuums, Alter, Gewicht und Geschlecht des Individuums, Ernährung, Zeitpunkt und Häufigkeit der Verabreichung, Wirkstoffkombination(en), Reaktionsempfindlichkeiten und Toleranz bzw. Reaktion auf die Therapie. Langfristig wirkende pharmazeutische Zusammensetzungen können, je nach der Halbwertszeit und der Clearance-Rate der jeweiligen Formulierung, alle 3 bis 4 Tage, einmal wöchentlich oder einmal alle zwei Wochen verabreicht werden.
Normale Dosierungsmengen können, je nach Verabreichungsweg, von 0,1 bis 100.000 μg bis hin zu einer Gesamtdosis von etwa 1 g variieren. Leitfäden bezüglich der jeweiligen Dosierungen und Verfahren zur Verabreichung sind in der Literatur zu finden und auf dem Gebiet der Erfindung arbeitenden Ärzten zugänglich. Fachleute werden für Nucleotide andere Formulierungen verwenden als für Proteine oder ihre Inhibitoren. Auf ähnliche Weise erfolgt die Zufuhr von Polynucleotiden oder Polypeptiden spezifisch für bestimmte Zellen, Leiden, Körperstellen usw.
Ist das Reagens ein einkettiger Antikörper, so können Polynucleotide, die für den Antikörper kodieren, konstruiert und in eine Zelle entweder ex vivo oder in vivo unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren eingeführt werden, einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, Transferrin-Polykation-vermittelten DNA-Transfers, Trans fektion mit nackten oder eingekapselten Nucleinsäuren, Liposomen-vermittelter Zellfusion, intrazellulären Transports von DNA-beschichteten Latexkügelchen, Protoplastenfusion, Virusinfektion, Elektroporation, „Genkanone" und DEAE- oder Calciumphosphat-vermittelter Transfektion.
Wirksame In-vivo-Dosierung eines Antikörpers liegen im Bereich von etwa 5 μg bis etwa 50 μg/kg, etwa 50 μg bis etwa 5 mg/kg, etwa 100 μg bis etwa 500 μg/kg Körpergewicht des Individuums und etwa 200 bis etwa 250 μg/kg Körpergewicht des Individuums. Zur Verabreichung von Polynucleotiden, die für einkettige Antikörper kodieren, liegen wirksame In-vivo-Dosierungen im Bereich von etwa 100 ng bis etwa 200 ng, 500 ng bis etwa 50 mg, etwa 1 μg bis etwa 2 mg, etwa 5 μg bis etwa 500 μg und etwa 20 μg bis etwa 100 μg DNA.
Ist das Expressionsprodukt mRNA, so ist das Reagens vorzugsweise ein Antisense-Oligonucleotid oder ein Ribozym. Polynucleotide, die Antisense-Oligonucleotide oder Ribozyme exprimieren, können mithilfe verschiedenster Verfahren, wie sie oben beschrieben sind, in Zellen eingeführt werden.
Vorzugsweise reduziert ein Reagens die Expression eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteingens oder die Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids um zumindest etwa 10 %, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %, bezogen auf die Abwesenheit des Reagens. Die Wirksamkeit des Mechanismus, der ausgewählt wird, um das Expressionsausmaß eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteingens oder die Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids zu reduzieren, kann unter Verwendung von Verfahren bewertet werden, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, beispielsweise durch Hybridisierung von Nucleotidsonden an für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Protein spezifische mRNA, durch quantitative RT-PCR, durch immunologische Detektion eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids oder durch Messung der Aktivität eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins.
Jede beliebige der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung kann in Kombination mit anderen geeigneten therapeutischen Mitteln verabreicht werden. Die Auswahl der geeigneten Mittel zur Verwendung in einer Kombinationstherapie kann von durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Prinzipien vorgenommen werden. Die Kombination von therapeutischen Mitteln kann synergistisch wirken, was sich auf die Behandlung oder Prävention der verschiedenen oben beschriebenen Erkrankungen auswirkt. Mithilfe dieses Ansatzes kann es ermöglicht werden, therapeutische Wirksamkeit mit geringeren Dosierungen der einzelnen Mittel zu erreichen, wodurch die Möglichkeit negativer Nebenwirkungen reduziert wird.
Jedes beliebige der oben beschriebenen Therapieverfahren kann an jedem Individuum, das einer solchen Therapie bedarf, angewandt werden, einschließlich beispielsweise Säugetiere, wie z.B. Hunde, Katzen, Kühe, Pferde, Kaninchen, Affen und insbesondere Menschen.
BEISPIEL 1
Detektion von Lipoxin-A₄-rezeptorartiger Aktivität
Das Polynucleotid der Seq.-ID Nr. 1 wird in den Expressionsvektor pCEV4 insertiert, und das erhaltene Expressionsvektor-pCEV4-Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptid wird in menschliche embryonale Nieren-293-Zellen transfiziert. Die Zellen werden aus einem Kulturkolben in 5 ml Tris HCl, 5 mM EDTA, pH 7,5, geschabt und durch Beschallung lysiert. Zelllysate werden bei 1.000 U/min 5 min lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird bei 30.000 × g 20 min lang bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird in einen Bindungspuffer, der 50 mM Tris HCl, 5 mM MgSO₄, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,5, enthält und mit 0,1 % BSA, 2 μg/ml Aprotinin, 0,5 mg/ml Leupeptin und 10 μg/ml Phosphoramidon ergänzt ist, suspendiert. Optimale Membransuspensionsverdünnungen, die als Proteinkonzentration definiert sind, die erforderlich ist, um weniger als 10 % eines hinzugefügten Radioliganden, d.h. ¹²⁵I-markiertes Lipoxin A₄, zu binden, werden zu 96-Well-Polypropylen-Mikrotiterplatten, die einen Liganden, nicht-markierte Peptide und einen Bindungspuffer enthalten, zu einem Endvolumen von 250 μl zugesetzt.
In Gleichgewichts-Sättigungsbindungstests werden Membranpräparate in Gegenwart von steigenden Konzentrationen (0,1 nM bis 4 nM) eines ¹²⁵I-Liganden inkubiert.
Bindungsreaktionsgemische werden eine Stunde lang bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Filtration durch GF/B-Filter, die mit 0,5 % Polyethylenimin behandelt wurden, unter Verwendung eines Zellernters gestoppt. Radioaktivität wird durch Szintillationszählung gemessen, und die Daten werden durch ein computergesteuertes nichtlineares Regressionsprogramm analysiert. Eine nichtspezifische Bindung ist definiert als die Menge an Radioaktivität, die nach der Inkubation eines Membranproteins in Gegenwart von 100 nM unmarkiertem Peptid verbleibt. Die Proteinkonzentration wird mithilfe des Bradford-Verfahrens unter Verwendung eines Bio-Rad-Reagens mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Die Lipoxin-A₄-rezeptorartige Aktivität des Polypeptids, das die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst, wird gezeigt.
BEISPIEL 2
Radioliganden-Bindungstests
Menschliche embryonale Nieren-293-Zellen, die mit einem Polynucleotid transfiziert sind, das ein menschliches Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Protein exprimiert, werden aus einem Kulturkolben in 5 ml Tris HCl, 5 mM EDTA, pH 7,5, geschabt und durch Beschallung lysiert. Zelllysate werden bei 1.000 U/min 5 min lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird bei 30.000 × g 20 min lang bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird in einen Bindungspuffer, der 50 mM Tris HCl, 5 mM MgSO₄, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,5, enthält und mit 0,1 % BSA, 2 μg/ml Aprotinin, 0,5 mg/ml Leupeptin und 10 μg/ml Phosphoramidon ergänzt ist, suspendiert. Optimale Membransuspensionsverdünnungen, die als Proteinkonzentration definiert sind, die erforderlich ist, um weniger als 10 % eines hinzugefügten Radioliganden, d.h. ¹²⁵I-markiertes Lipoxin A₄, zu binden, werden zu 96-Well-Polypropylenmikrotiterplatten, die einen ¹²⁵I-markier ten Liganden oder eine Testverbindung, nicht-markierte Peptide und Bindungspuffer enthalten, zu einem Endvolumen von 250 μl zugesetzt.
In Gleichgewichts-Sättigungsbindungstests werden Membranpräparate in Gegenwart von steigenden Konzentrationen (0,1 nM bis 4 nM) eines ¹²⁵I-markierten Liganden oder einer Testverbindung (spezifische Aktivität 2.200 Ci/mmol) inkubiert. Die Bindungsaffinitäten verschiedener Testverbindungen werden in Gleichgewichts-Konkurrenzbindungstests unter Verwendung von 0,1 nM ¹²⁵I-Peptid in Gegenwart von zwölf verschiedenen Konzentrationen jeder Testverbindung bestimmt.
Bindungsreaktionsgemische werden eine Stunde lang bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Filtration durch GF/B-Filter, die mit 0,5 % Polyethylenimin behandelt wurden, unter Verwendung eines Zellernters gestoppt. Die Radioaktivität wird durch Szintillationszählung gemessen, und die Daten werden durch ein computergesteuertes nichtlineares Regressionsprogramm analysiert.
Nichtspezifische Bindung ist definiert als die Menge an Radioaktivität, die nach der Inkubation eines Membranproteins in Gegenwart von 100 nM unmarkiertem Peptid verbleibt. Die Proteinkonzentration wird mithilfe des Bradford-Verfahrens unter Verwendung eines Bio-Rad-Reagens mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Eine Testverbindung, welche die Radioaktivität des Membranproteins um zumindest 15 % in Bezug auf Radioaktivität eines Membranprotein, das nicht mit einer Testverbindung inkubiert wurde, steigert, wird als Verbindung identifiziert, die an ein menschliches Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid bindet.
BEISPIEL 3
Wirkung einer Testverbindung auf die durch ein menschliches Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Protein vermittelte zyklische AMP-Bildung
Eine rezeptorvermittelte Hemmung von cAMP-Bildung kann in LM(tk-)-Zellen getestet werden, die ein menschliches Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Protein exprimieren. Zellen werden in 96-Well-Platten ausplattiert und in Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 10 mM HEPES, 5 mM Theophyllin, 2 μg/ml Aprotinin, 0,5 mg/ml Leupeptin und 10 μg/ml Phosphoramidon, 20 min lang bei 37°C in 5 % CO₂ inkubiert. Eine Testverbindung wird zugesetzt und weitere 10 min lang bei 37°C inkubiert. Das Medium wird abgesaugt, und die Reaktion wird durch den Zusatz von 100 mM HCl gestoppt. Die Platten werden bei 4°C 15 min lang gelagert. Der cAMP-Gehalt in der Stopplösung wird mithilfe eines Radioimmuntests gemessen.
Die Radioaktivität wird unter Verwendung eines Gammazählers quantifiziert, der mit einer Datenreduktionssoftware ausgestattet ist. Eine Testverbindung, welche die Radioaktivität des Inhalts eines Wells in Bezug auf die Radioaktivität des Inhalts eines Wells in Abwesenheit der Testverbindung reduziert, wird als ein potenzieller Inhibitor von cAMP-Bildung identifiziert. Eine Testverbindung, welche die Radioaktivität des Inhalts eines Wells in Bezug auf Radioaktivität des Inhalts eines Wells in Abwesenheit der Testverbindung steigert, wird als ein potenzieller Enhancer von cAMP-Bildung identifiziert.
BEISPIEL 4
Wirkung einer Testverbindung auf die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium
Die intrazelluläre freie Calciumkonzentration kann durch Mikrospektralfluorometrie unter Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs Fura-2/AM gemessen werden (Bush et al., J. Neurochem. 57, 562–674 (1991)). Stabil transfizierte Zellen werden auf eine 35-mm-Kulturschale, die ein Deckglasinsert aus Glas enthält, geimpft. Die Zellen werden mit HBS gewaschen, mit einer Testverbindung inkubiert und mit 100 μl Fura-2/AM (10 μM) 20–40 min lang geladen. Nach dem Waschen mit HBS, um die Fura-2/AM-Lösung zu entfernen, werden die Zellen in HBS 10–20 min lang äquilibriert. Die Zellen werden dann unter dem 40fach-Objektiv eines Fluovert-FS-Mikroskops von Leitz sichtbar gemacht.
Die Fluoreszenzemission wird bei 510 nM bestimmt, wobei die Anregungswellenlängen zwischen 340 nM und 380 nM schwanken. Die unaufbereiteten Fluoreszenzdaten werden unter Verwendung von Standard-Calciumkonzentrationskurven und Software-Analyseverfahren in Calciumkonzentrationen umgewandelt. Eine Testverbindung, welche die Fluoreszenz um zumindest 15 % in Bezug auf die Fluoreszenz in Abwesenheit einer Testverbindung steigert, wird als eine Verbindung identifiziert, die intrazelluläres Calcium mobilisiert.
BEISPIEL 5
Wirkung einer Testverbindung auf den Phosphoinositid-Stoffwechsel
LM(tk-)-Zellen, die cDNA eines menschlichen Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins stabil exprimieren, werden in 96-Well-Platten ausplattiert und bis zur Konfluenz gezüchtet. Am Tag vor dem Test wird das Wachstumsmedium gegen 100 μl Medium, das 1 % Serum und 0,5 μCi ³H-Myoinositol enthält, getauscht. Die Platten werden über Nacht in einem CO₂-Inkubator (5 % CO₂ bei 37°C) inkubiert. Unmittelbar vor dem Test wird das Medium entfernt und durch 200 μl PBS mit 10 mM LiCl ausgetauscht, und die Zellen werden mit dem neuen Medium 20 min lang äquilibriert. Während dieses Intervalls werden die Zellen auch mit einem Antagonisten äquilibriert, der als eine 10-μl-Aliquote einer 20fach konzentrierten Lösung in PBS zugesetzt wird.
Die ³H-Inositolphosphat-Akkumulierung aus dem Inositolphospholipid-Stoffwechsel wird durch den Zusatz von 10 μl einer Lösung, die eine Testverbindung enthält, begonnen. Zum ersten Well werden 10 μl zugesetzt, um die Grundakkumulierung zu messen. Elf verschiedene Konzentrationen von Testverbindungen werden in den folgenden 11 Wells jeder Plattenreihe getestet. Alle Tests werden durch Wiederholen derselben Zusätze in zwei aufeinander folgenden Plattenreihen in zweifacher Ausführung durchgeführt.
Die Platten werden in einem CO₂-Inkubator eine Stunde lang inkubiert. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 15 μl 50 Vol.-% Trichloressigsäure (TCA) beendet, gefolgt von einer 40-minütigen Inkubation bei 4°C. Nach einer Neutralisierung von TCA mit 40 μl von 1 M Tris wird der Inhalt der Wells auf eine Multiscreen-HV-Filterplatte (Millipore), die Dowex AG1-X8 (200–400 Mesh, Formiatform) enthält, übertragen. Die Filterplatten werden durch den Zusatz von 200 μl Dowex-AG1-X8-Suspension (50 Vol.-%, Wasser:Harz) zu jedem Well vorbereitet. Dann werden die Filterplatten auf einem Vakuumverteiler platziert, um das Harzbett zu waschen oder zu eluieren. Jeder Well wird zweimal mit 200 μl Wasser gewaschen, gefolgt von 2 × 200 μl von 5 mM Natriumtetraborat/60 mM Ammoniumformiat.
Die ³H-IPs werden in leere 96-Well-Platten mit 200 μl 1,2 M Ammoniumformiat/0,1 Ameisensäure eluiert. Der Inhalt der Wells wird zu 3 ml einer Szintillations-Reagenzienmischung zugesetzt, und die Radioaktivität wird durch Flüssigkeitsszintillationsmessung bestimmt.
BEISPIEL 6
Rezeptorbindungsverfahren
Standard-Bindungstests. Bindungstests werden in einem Bindungspuffer durchgeführt, der 50 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 % BSA und 5 mM MgCl₂ enthält. Der Standardtest für einen Radioliganden (z.B. ¹²⁵I-Lipoxin A₄, ¹²⁵I-Lipoxin A₄, Analogon oder Testverbindung), der an Membranfragmente bindet, die Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide umfassen, wird wie folgt in 96-Well-Mikrotiterplatten (z.B. Dynatech-Immulon-II-Removawell-Platten) durchgeführt. Der Radioligand wird in Bindungspuffer + PMSF/Baci zu den erwünschten cpm pro 50 μl verdünnt, und dann werden 50-μl-Aliquoten zu den Wells zugesetzt. Für nichtspezifische Bindungsproben werden auch 5 μl von 40 μM kaltem Liganden pro Well zugesetzt. Die Bindung wird durch den Zusatz von 150 μl Membran pro Well, verdünnt auf die erwünschte Konzentration (10–30 μg Membranprotein/Well) in Bindungspuffer + PMSF/Baci, initiiert. Die Platten werden dann mit Linbro-Mylarplattenversiegler (Flow Labs) bedeckt und auf einen Dynatech Microshaker II gegeben. Die Bindungsbildung wird bei Raumtemperatur 1–2 h lang fortschreiten gelassen und durch Zentrifugieren der Platte 15 min lang bei 2.000 × g gestoppt. Die Überstände werden dekantiert, und die Membranpellets werden einmal durch den Zusatz von 200 μl eiskaltem Bindungspuffer, kurzes Schütteln und Rezentrifugieren gewaschen. Die einzelnen Wells werden in 12 × 75 mm-Röhrchen gegeben und in einem LKB-Gammamaster-Zähler (78 % Effizienz) gezählt. Die durch dieses Verfahren bestimmte spezifische Bindung ist mit jener identisch, die gemessen wird, wenn ein freier Ligand durch rasche Filtration (3–5 s) und Waschen auf Polyethylenimin-beschichteten Glasfaserfiltern entfernt wird.
Drei Varianten des Standard-Bindungstests werden ebenfalls verwendet.

1. Kompetitive Radioliganden-Bindungstests mit einem Konzentrationsbereich von kaltem Liganden gegenüber ¹²⁵I-markiertem Liganden werden wie oben beschrieben mit einer Modifikation durchgeführt. Alle Verdünnungen von getesteten Liganden werden in 40 × PMSF/Baci auf eine Konzentration von 40 × der Endkonzentration im Test hergestellt. Proben eines Peptids (je 5 μl) werden dann pro Mikrotiter-Well zugesetzt. Die Membranen und der Radioligand werden in einem Bindungspuffer ohne Proteaseinhibitoren verdünnt. Der Radioligand wird zugesetzt und mit dem kaltem Liganden vermischt, und anschließend wird die Bindung durch den Zusatz von Membranen initiiert.
2. Die chemische Vernetzung eines Radioliganden mit einem Rezeptor erfolgt nach einem Bindungsschritt, der mit jenem aus dem Standardtest identisch ist. Der Waschschritt erfolgt jedoch mit einem Bindungspuffer ohne BSA, um die Möglichkeit zu nichtspezifischer Vernetzung eines Radioliganden mit BSA zu verringern. Der Vernetzungsschritt wird wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
3. Großtechnische Bindungstests zur Gewinnung von Membranpellets für Untersuchungen der Solubilisierung eines Rezeptor:Ligand-Komplexes und zur Rezeptorreinigung werden ebenfalls durchgeführt. Diese sind mit den Standardtests identisch, mit der Ausnahme, dass (a) die Bindung an Polypropylenröhrchen in Volumina von 1–250 ml durchgeführt wird, (b) die Konzentration des Membranproteins stets 0,5 mg/ml beträgt und (c) zur Rezeptorreinigung die BSA-Konzentration im Bindungspuffer auf 0,25 % reduziert wird und der Waschschritt mit einem Bindungspuffer ohne BSA erfolgt, was die BSA-Verunreinigung des gereinigten Rezeptors reduziert.

BEISPIEL 7
Chemische Vernetzung eines Radioliganden an einen Rezeptor
Nach einem Radioliganden-Bindungsschritt, wie er oben beschrieben ist, werden Membranpellets in 200 μl eiskaltem Bindungspuffer ohne BSA pro Mikrotiterplatten-Well resuspendiert. Anschließend werden 5 μl pro Well von 4 mM N-5-Azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimid (ANB-NOS, Pierce) in DMSO zugesetzt und vermischt. Die Proben werden auf Eis gehalten und 10 min lang mit einer Mineralight-R-52G-Lampe (UVP Inc., San Gabriel, Kalifornien) bei einer Entfernung von 5–10 cm mit UV-Licht bestrahlt. Dann werden die Proben auf Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, die Membranen durch Zentrifugation pelletiert, Überstände entfernt und die Membranen in einem Laemmli-SDS-Probenpuffer für Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) solubilisiert. Eine PAGE wird wie nachstehend beschrieben durchgeführt. Radioaktiv markierte Proteine werden durch Autoradiographie der getrockneten Gele mit einem Kodak-XAR-Film und mit Dupont-Bildverstärkerfolien sichtbar gemacht.
BEISPIEL 8
Membransolubilisierung
Die Membransolubilisierung erfolgt in einem Puffer, der 25 mM Tris, pH 8, 10 % Glycerin (Gew./Vol.) und 0,2 mM CaCl₂ enthält (Solubilisierungspuffer). Die stark löslichen Detergenzien einschließlich Triton X-100, Desoxycholat, Desoxycholat:Lysolecithin, CHAPS und Zwittergent werden in einem Solubilisierungspuffer in 10%igen Konzentrationen vorbereitet und als gefrorene Aliquoten gelagert. Lysolecithin wird aufgrund seiner Unlöslichkeit durch Tiefkühlen und Auftauen frisch hergestellt, und Digitonin wird aufgrund seiner stärker eingeschränkten Löslichkeit in geringeren Konzentrationen frisch hergestellt.
Um die Membranen zu solubilisieren, werden gewaschene Pellets nach dem Bindungsschritt frei von sichtbaren Partikeln durch Pipettieren und Zentrifugieren in einem Solubilisierungspuffer bei 100.000 × g 30 min lang resuspendiert. Die Überstände werden entfernt und auf Eis gehalten, und die Pellets werden verworfen.
BEISPIEL 9
Test für solubilisierte Rezeptoren
Nach der Bindung von ¹²⁵I-Liganden und der Solubilisierung der Membranen mit einem Detergens kann der intakte R:L-Komplex mittels vier verschiedener Verfahren getestet werden. Alle werden auf Eis oder in einem kalten Raum bei 4–10°C durchgeführt.

1. Säulenchromatographie (Knuhtsen et al., Biochem. J. 254, 641–647 (1988)). Sephadex-G-50-Säulen (8 × 250 mm) werden mit einem Solubilisierungspuffer, der ein Detergens in der Konzentration, die verwendet wird, um Membranen zu solubilisieren, und 1 mg/ml Rinderserumalbumin enthält, äquilibriert. Proben von solubilisierten Membranen (0,2–0,5 ml) werden auf die Säulen aufgetragen und bei einer Durchflussgeschwindigkeit von etwa 0,7 ml/min eluiert. Proben (0,18 ml) werden abgenommen. Die Radioaktivität wird in einem Gammazähler bestimmt. Die Hohlraumvolumina der Säulen werden durch das Elutionsvolumen von Dextranblau bestimmt. Die Radioaktivität, die im Hohlraumvolumen eluiert, wird als an Protein gebunden betrachtet. Radioaktivität, die später beim selben Volumen wie freie ¹²⁵I-Liganden eluiert, wird als nicht gebunden betrachtet.
2. Polyethylenglykolfällung (Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 318–322 (1972)). Für eine 100-μl-Probe solubilisierter Membranen in einem 12 × 75mm-Polypropylenröhrchen werden 0,5 ml 1 % (Gew./Vol.) bovines Gammaglobulin (Sigma) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer zugesetzt, gefolgt vom Zusatz von 0,5 ml 25 (Gew./Vol.) Polyethylenglykol (Sigma) und Vermischen. Das Gemisch wird 15 min lang auf Eis gehalten. Dann werden 3 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, pro Probe zugesetzt. Die Proben werden rasch (1–3 s) über Whatman-GF/B-Glasfaserfilter filtriert und mit 4 ml Phosphatpuffer gewaschen. Der PEG-gefällte Rezeptor:¹²⁵I-Ligand-Komplex wird durch Gammazählung der Filter bestimmt.
3. GFB/PEI-Filterbindung (Bruns et al., Analytical Biochem. 132, 74–81 (1983)). Whatman-GF/B-Glasfaserfilter werden in 0,3 % Polyethylenimin (PEI, Sigma) 3 h lang eingeweicht. Proben von solubilisierten Membranen (25–100 μl) werden in 12 × 75mm-Polypropylenröhrchen gegeben. Dann werden 4 ml Solubilisierungspuffer ohne Detergens pro Probe zugesetzt, und die Proben werden unmittelbar durch die GFB/PEI-Filter (1–3 s) filtriert und mit 4 ml Solubilisierungspuffer gewaschen. Die CPM des an die Filter adsorbierten Rezeptor:¹²⁵I-Ligand-Komplexes wird durch Gammazählung bestimmt.
4. Aktivkohle/Dextran (Paul & Said, Peptides 7, Beilage 1, 147–149 (1986)). Dextran T70 (0,5 g, Pharmacia) wird in 1 l Wasser aufgelöst, dann werden 5 g Aktivkohle (Norit A, alkalisch; Fisher Scientific) zugesetzt. Die Suspension wird 10 min lang bei Raumtemperatur gerührt und dann bei 4°C bis zur Verwendung gelagert. Um den R:L-Komplex zu messen, werden 4 Volumsteile einer Suspension von Aktivkohle und Dextran zu 1 Volumsteil solubilisierter Membran zugesetzt. Die Proben werden vermischt und 2 min lang auf Eis gehalten und dann 2 min lang bei 11.000 × g in einer Beckman-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der freie Radioligand wird an Aktivkohle/Dextran adsorbiert und wird mit dem Pellet verworfen. Rezeptor:¹²⁵I-Ligand-Komplexe verbleiben im Überstand und werden mittels Gammazählung bestimmt.

BEISPIEL 10
Rezeptorreinigung
Die Bindung eines Biotinylrezeptors an GH₄-C1-Membranen erfolgt wie oben beschrieben. Die Inkubationen erfolgen 1 h lang bei Raumtemperatur. In der herkömmlichen Reinigungsarbeitsvorschrift enthalten die Bindungsinkubationen 10 nM Bio- S29. Ein ¹²⁵I-Ligand wird als eine Indikatorsubstanz in Mengen von 5.000–100.000 cpm pro mg Membranprotein zugesetzt. Kontrollinkubationen enthalten 10 μM kalten Liganden, um den Rezeptor mit nichtbiotinyliertem Liganden zu sättigen.
Eine Solubilisierung eines Rezeptor:Ligand-Komplexes wird ebenfalls wie oben beschrieben durchgeführt, mit 0,15 % Desoxycholat:Lysolecithin in einem Solubilisierungspuffer, der 0,2 mM MgCl₂ enthält, um 100.000-x-g-Überstände zu erhalten, die einen solubilisierten R:L-Komplex enthalten.
Immobilisiertes Streptavidin (Streptavidin, vernetzt mit 6%iger perlenförmiger Agarose, Pierce Chemical Co.; „SA-Agarose") wird in einem Solubilisierungspuffer gewaschen und zu den solubilisierten Membranen als 1/30 des Endvolumens zugesetzt. Dieses Gemisch wird unter konstantem Rühren durch Kopfüber-Rotation 4–5 h lang bei 4–10°C inkubiert. Dann wird das Gemisch auf eine Säule aufgetragen, und das nicht gebundene Material wird durchgewaschen. Die Bindung des Radioliganden an SA-Agarose wird durch Vergleichen der cpm im 100.000-x-g-Überstand mit jenen im Säulenabfluss nach Adsorption an SA-Agarose bestimmt. Schließlich wird die Säule mit 12–15 Säulenvolumina Solubilisierungspuffer + 0,15 % Desoxycholat:Lysolecithin + 1/500 (Vol./Vol.) 100 × 4pase gewaschen.
Die Streptavidinsäule wird mit Solubilisierungspuffer + 0,1 mM EDTA + 0,1 mM EGTA + 0,1 mM GTP-γ-S (Sigma) + 0,15 % (Gew./Vol.) Desoxycholat:Lysolecithin + 1/1.000 (Vol./Vol.) 100x 4pase eluiert. Zuerst wird ein Säulenvolumen an Elutionspuffer durch die Säule geführt, und der Durchfluss wird 20–30 min lang gestoppt. Dann werden 3–4 weitere Säulenvolumina an Elutionspuffer durchgeführt. Alle Eluate werden gesammelt.
Eluate aus der Streptavidinsäule werden über Nacht (12–15 h) mit immobilisiertem Weizenkeimagglutinin (WGA-Agarose, Vector Labs) inkubiert, um den Rezeptor über die Wechselwirkung von kovalent gebundenem Kohlenhydrat mit dem WGA-Lectin zu adsorbieren. Das Verhältnis (Vol./Vol.) von WGA-Agarose zu Streptavidinsäule neluat beträgt im Allgemeinen 1:400. Ein Bereich von 1:1.000 bis 1:200 kann ebenfalls verwendet werden. Nach dem Bindungsschritt wird das Harz durch Zentrifugation pelletiert, der Überstand wird entfernt und sichergestellt, und das Harz wird dreimal (jeweils etwa 2 min lang) in einem Puffer, der 50 mM HEPES, pH 8, 5 mM MgCl₂ und 0,15 % Desoxycholat:Lysolecithin enthält, gewaschen. Um den WGA-gebundenen Rezeptor zu eluieren, wird das Harz dreimal durch wiederholtes Vermischen (Zentrifugenmixer bei geringer Geschwindigkeit) über eine 15- bis 30-minütige Zeitspanne auf Eis mit jeweils 3 Harzsäulen von 10 mM N-N'-N''-Triacetylchitotriose im selben HEPES-Puffer, der verwendet wurde, um das Harz zu waschen, extrahiert. Nach jedem Elutionsschritt wird das Harz zentrifugiert, und der Überstand wird, frei von WGA-Agarosepellets, sorgfältig entfernt. Die drei gesammelten Eluate enthalten den endgültigen, gereinigten Rezeptor. Das nicht an WGA gebundene Material enthält G-Protein-Untereinheiten, die spezifisch aus den Streptavidinsäulen eluiert wurden, sowie nicht-spezifische Verunreinigungen. Alle diese Fraktionen werden tiefgefroren bei –90°C gelagert.
BEISPIEL 11
Identifikation von Testverbindungen, die an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid binden
Gereinigte Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide, die ein Glutathion-S-transferase-Protein enthalten und an Glutathion-derivatisierte Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten absorbiert sind, werden mit Testverbindungen aus einer Bibliothek kleiner Moleküle bei einem pH von 7,0 in einer physiologischen Pufferlösung kontaktiert. Lipoxin-A₄-rezeptorartige Polypeptide umfassen eine in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz. Die Testverbindungen umfassen eine fluoreszierende Markierung. Die Proben werden 5 min bis 1 h lang inkubiert. Kontrollproben werden in Abwesenheit einer Testverbindung inkubiert.
Die Pufferlösung, welche die Testverbindungen enthält, wird aus den Wells gewaschen. Die Bindung einer Testverbindung an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid wird durch Fluoreszenzmessungen der Inhalte der Wells nachgewiesen. Eine Testverbindung, welche die Fluoreszenz in einem Well in Bezug auf die Fluoreszenz in einem Well, in dem eine Testverbindung nicht inkubiert wurde, um zumindest 15 % steigert, wird als eine Verbindung identifiziert, die an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid bindet.
BEISPIEL 12
Identifikation einer Testverbindung, welche die Expression eines Lipoxin-A₄-rezeptorarrigen Proteingens verringert
Eine Testverbindung wird einer Kultur von CHO-Zellen verabreicht, die mit einem Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polynucleotid transfiziert wurden, und bei 37°C 10 bis 45 min lang inkubiert. Eine Kultur desselben Zelltyps, die gleich lang ohne Testverbindung inkubiert wurde, liefert eine negative Kontrolle.
RNA wird aus den zwei Kulturen wie in Chirgwin et al., Biochem. 18, 5294–5299 (1979), beschrieben isoliert. Northern-Blots werden unter Verwendung von 20 bis 30 μg Gesamt-RNA hergestellt und mit einer ³²P-markierten, für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Protein spezifischen Sonde bei 65°C in Express-hyb (CLONTECH) hybridisiert. Die Sonde umfasst zumindest 11 zusammenhängende Nucleotide, die aus dem Komplement von Seq.-ID Nr. 1 ausgewählt sind. Eine Testverbindung, die das für ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Protein spezifische Signal in Bezug auf das Signal, das in Abwesenheit der Testverbindung erhalten wird, senkt, wird als ein Inhibitor der Expression eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteingens identifiziert.
BEISPIEL 13
Behandlung von Entzündung mit einem Reagens, das sich spezifisch an ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Proteingenprodukt bindet
Synthese von Antisense-Oligonucleotiden eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Proteins, die zumindest 11 zusammenhängende Nucleotide, ausgewählt aus dem Komplement von Seq.-ID Nr. 1, umfassen, erfolgt an einem Synthesegerät der Serie „Phar macia Gene Assembler" unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens (Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 534–583 (1990)). Nach der Assemblierung und Entschützung werden die Oligonucleotide zweimal Ethanol-gefällt, getrocknet und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in der erwünschten Konzentration suspendiert. Reinheit dieser Oligonucleotide wird durch Kapillargelelektrophorese und Ionenaustausch-HPLC getestet. Endotoxin-Konzentrationen im Oligonucleotidpräparat werden unter Verwendung des leuchtenden Amöbozytentests („Luminous Amebocyte Assay") (Bang, Biol. Bull. (Woods Hole, Mass.) 105, 361–362 (1953)) bestimmt.
Die Antisense-Oligonucleotide werden direkt in entzündetes Gewebe injiziert, und zwar in einem wässrigen Medium (wässrige Zusammensetzung) in einer Konzentration von 0,1–100 M und mit einer Nadel. Die Nadel wird im Gewebe platziert und herausgezogen, während die wässrige Zusammensetzung im Gewebe herausgedrückt wird.
Das entzündete Gewebe wird über einen Zeitraum von einigen Tagen oder Wochen überwacht. Während dieses Zeitraums können weitere Injektionen der Antisense-Oligonucleotide verabreicht werden. Die Entzündung im Gewebe nimmt allmählich ab.
BEISPIEL 14
Gewebespezifische Expression eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids
Erstellung von Expressionsprofilen basiert auf einer quantitativen Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Analyse, auch kinetische Analyse genannt, die als erstes in Higuchi et al. (1992) und Higuchi et al. (1993) beschrieben wurde. Das Prinzip besteht darin, dass bei einem vorgegebenen Zyklus in der exponentiellen Phase der PCR die Produktmenge proportional zur anfänglichen Anzahl an Matrizenkopien ist. Mithilfe dieses Verfahrens werden die Expressionsgrade von bestimmten Genen, die von den Chromosomen als Messenger-RNA (mRNA) transkribiert werden, gemessen, indem zuerst eine DNA-Kopie (cDNA) der mRNA hergestellt und dann eine quantita tive PCR an der cDNA durchgeführt wird, ein Verfahren, das als quantitative Umkehrtranskriptions-Polymerasekettenreaktion (quantitative RT-PCR) bezeichnet wird.
Eine quantitative RT-PCR-Analyse von RNA von verschiedenen menschlichen Gewebearten wurde durchgeführt, um die Gewebeverteilung der mRNA eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids zu untersuchen. In den meisten Fällen wurden 25 μg Gesamt-RNA von verschiedenen Gewebearten (einschließlich Human Total RNA Panel I-V, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) als Matrize verwendet, um eine Erststrang-cDNA unter Einsatz des „SUPERSCRIPT^TM First-Strand Synthesis System" für RT-PCR (Life Technologies, Rockville, MD, USA) zu synthetisieren. Erststrang-cDNA-Synthese wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers unter Einsatz von Oligo(dT) durchgeführt, um an die 3'-Poly-A-Schwänze von mRNA zu hybridisieren und die Synthesereaktion zu primen. 10 ng der Erststrang-cDNA wurden dann als Matrize in einer Polymerasekettenreaktion eingesetzt. In anderen Fällen wurden 10 ng von im Handel erhältlichen cDNAs (Human Immune System MTC Panel und Human Blood Fractions MTC Panel, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) als Matrize in einer Polymerasekettenreaktion eingesetzt. Die Polymerasekettenreaktion wurde in einem LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) durchgeführt, und zwar in Gegenwart des DNA-bindenden fluoreszierenden Farbstoffs SYBR Green I, der an die kleine Furche der DNA-Doppelhelix bindet, die nur gebildet wird, wenn doppelsträngige DNA erfolgreich in der Reaktion synthetisiert wird (Morrison et al. (1998)). Bei der Bindung an doppelsträngige DNA emittiert SYBR Green I Licht, das mithilfe des LightCycler-Geräts quantitativ gemessen werden kann. Die Polymerasekettenreaktion wurde unter Einsatz der Oligonucleotid-Primer LBRI004-L4 (TCTGTGCCCAGTCCCTGTGATGAA) und LBRI004-R2 (TCTGTCTGCCCTGGGCTCTTTCAC) durchgeführt, und die Messungen der Intensität des emittierten Lichts wurden nach jedem Reaktionszyklus vorgenommen, wenn die Reaktion eine Temperatur von 91°C erreicht hatte. Die Intensitäten des emittierten Lichts wurden durch einen Vergleich mit gleichzeitig umgesetzten Standards mit bekannter Konzentration in Kopienanzahlen des Gentranskripts pro ng Matrizen-cDNA umgewandelt.
Um Unterschiede in den mRNA-Transkriptionswerten pro Zelle in den unterschiedlichen Gewebearten zu korrigieren, wurde unter Einsatz von auf ähnliche Weise berechneten Expressionswerten in den unterschiedlichen Geweben von fünf unterschiedlichen konstitutiven Genen ein Normalisierungsvorgang durchgeführt: Glyceraldehyd-3-Phosphatase (G3PDH), Hypoxanthin-Ganin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT), β-Actin, Phorphobilinogen-Desaminase (PBGD) und β-2-Mikroglobulin. Die Expressionsstärke des konstitutiven Gens wird für alle Gewebe als relativ konstant angesehen (Adams et al. (1993); Adams et al. (1995); Liew et al. (1994)) und kann deshalb als Eichmaß für die Approximation der relativen Anzahl an Zellen pro μg Gesamt-RNA verwendet werden, die im cDNA-Syntheseschritt eingesetzt wird. Mit Ausnahme der Verwendung einer leicht unterschiedlichen Gruppe von konstitutiven Genen und der Verwendung des LightCycler-Systems zur Messung der Expressionsstärken war das Normalisierungsverfahren im Grund dasselbe wie im „RNA Master Blot User Manual", Anhang C (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA (1997)) beschrieben. Kurz gesagt wurden die Expressionswerte der fünf konstitutiven Gene in allen Gewebeproben in drei unabhängigen Reaktionen pro Gen unter Verwendung des Light Cycler und einer konstanten Menge (25 μg) Ausgangs-RNA gemessen. Die berechnete Kopienanzahl für die einzelnen Gene, abgeleitet von einem Vergleich mit gleichzeitig umgesetzten Standards mit bekannten Konzentrationen, wurde aufgezeichnet und in einen Prozentsatz der Summe der Kopienzahlen der Gene in allen Gewebeproben umgewandelt. Dann wurde für jede Gewebeprobe die Summe der Prozentwerte für jedes Gen berechnet, und ein Normalisierungsfaktor wurde berechnet, indem der Prozentsummenwert für jedes Gewebe durch den Prozentsummenwert von einem der Gewebe, das zufällig als Standard ausgewählt wurde, dividiert wurde. Um einen experimentell erhaltenen Wert für die Expression eines bestimmten Gens in einer Gewebeprobe zu normalisieren, wurde der erhaltene Wert mit dem Normalisierungsfaktor für das getestete Gewebe multipliziert. Dieses Normalisierungsverfahren wurde für alle Gewebe verwendet, mit Ausnahme der vom „Human Blood Fractions MTC Panel" abgeleiteten, die starke Schwankungen in einigen konstitutiven Genen aufwiesen, je nachdem, ob das Gewebe aktiviert worden war oder nicht. In diesen Geweben wurde die Normalisierung mit einem einzigen konstitutiven Gen, β-2-Mikroglobulin, durchgeführt.
Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefasst, wobei die experimentell erhaltene Kopienzahl von mRNA pro 10 ng Erststrang-cDNA auf der linken und die normalisierten Werte auf der rechten Seite angegeben sind. Für die cDNA-Synthese verwendete RNAs sind zusammen mit ihrem Lieferanten und ihrer Katalognummer in Tabelle 1 und 2 angeführt. Erstellung von Expressionsprofilen von mRNA eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids, Ganzkörper-Screen
Erstellung eines Expressionsprofils von mRNA eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids, Blut/Lungen-Screen
Tabelle 1: Ganzkörper-Screen-Gewebe
Tabelle 2: Blut/Lungen-Screen-Gewebe
Zusammenfassend ist zu sagen, dass ein Lipoxin-A₄-rezeptorartiges Polypeptid in Uterus, Leber, Placenta und Verdauungssystem stark exprimiert wird, während in Milz, Thymus und Rückenmark niedrigere Expressionswerte gefunden wurden. Außerdem ist in Peripherblut-Leukozyten eine starke Expression zu beobachten, die hauptsächlich durch T- und B-Zellen erfolgt. Eine Mitogen-Aktivierung von CD8⁺-T-zellen und CD19⁺-B-Zellen scheint die Expression eines Lipoxin-A₄-rezeptorartigen Polypeptids herunterzuregulieren, während bei Mitogen-Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen die gegenteilige Wirkung, eine Hochregulierung, zu beobachten ist.
Literaturverzeichnis

Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., und Griffith, R., Simultaneous Amplification and Detection of Specific DNA Sequences, BioTechnology 10, 413–417 (1992).
Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., und Watson, R., Kinetic PCR Analysis: Real-Time Monitoring of DNA Amplification Reactions, BioTechnology 11, 1026–1030 (1993).
T. B. Morrison, J. J. Weis & C. T. Wittwer, Quantification of Low-Copy Transcripts by Continuous SYBR Green I Monitoring during Amplification, BioTechniques 24, 954–962 (1998).
Adams, M. D., Kerlavage, A. R., Fields, C., & Venter, C., 3,400 New Expressed Sequence Tags Identify Diversity of Transcripts in Human Brain, Nature Genet. 4, 256–265 (1993).
Adams, M. D., et al., Initial Assessment of Human Gene Diversity and Expression Patterns Based upon 83 Million Nucleotides of cDNA Sequence, Nature 377 Supp., 3–174 (1995).
Liew, C. C., Hwang, D. M., Fung, Y. W., Laurenson, C., Cukerman, E., Tsui, S., & Lee, C. Y., A Catalog of Genes in the Cardiovascular System as Identified by Expressed Sequence Tags, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10145–10649 (1994).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Polypeptids, das aus der aus folgenden Elementen bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (i) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zumindest 90 Identität mit der in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist; (ii) einem Polypeptid, das die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, und zwar im Screening auf Verbindungen, die bei der Behandlung einer Erkrankung, die mit Entzündungsprozessen assoziiert ist, von Nutzen sind, worin eine Testverbindung mit dem Polypeptid kontaktiert wird, die Bindung der Testverbindung an das Polypeptid gemessen wird und eine Testverbindung, die an das Polypeptid bindet, als eine bei der Behandlung einer mit Entzündungsprozessen assoziierten Erkrankung nützliche Verbindung ausgewählt wird.
Verwendung einer biologischen Zelle, die ein Polynucleotid umfasst, das aus der aus folgenden Elementen bestehenden Gruppe ausgewählt wurde: (i) dem Polynucleotid aus Seq.-ID Nr. 1; (ii) einem Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen an das Polynucleotid aus Seq.-ID Nr. 1 hybridisiert und für ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid kodiert, und zwar im Screening auf Verbindungen, die bei der Behandlung einer Erkrankung, die mit Entzündungsprozessen assoziiert ist, von Nutzen sind, worin die biologische Zelle eine T-Zelle ist und/oder mit dem Polynucleotid transformiert wurde und worin eine Testverbindung mit der biologischen Zelle kontaktiert wird, die Menge der tran skribierten mRNA oder des von dem Polynucleotid exprimierten Polypeptids gemessen wird und eine Testverbindung, die die Menge der transkribierten mRNA oder des von dem Polynucleotid exprimierten Polypeptids verändert, als eine Verbindung ausgewählt wird, die bei der Behandlung einer mit Entzündungsprozessen assoziierten Erkrankung nützlich ist.