-
TECHNISCHES
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung betrifft das Gebiet der G-Protein-gebundenen Rezeptoren.
Im Besonderen betrifft sie das Gebiet von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteinen und ihre Anwendung beim Arzneimittel-Screening im Bereich
von Entzündungserkrankungen.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
G-Protein-gebundene
Rezeptoren
-
Viele
medizinisch wichtige biologische Prozesse werden über Signaltransduktionswege
vermittelt, an denen G-Proteine beteiligt sind (Lefkowitz, Nature
351, 353–354
(1991)). Die Familie der G-Protein-gebundenen Rezeptoren (GPCR)
umfasst Rezeptoren für
Hormone, Neurotransmitter, Wachstumsfaktoren und Viren. Spezifische
Beispiele für
GPCRs umfassen Rezeptoren für
solch unterschiedliche Stoffe wie Dopamin, Calcitonin, adrenerge
Hormone, Endothelin, cAMP, Adenosin, Acetylcholin, Serotonin, Histamin,
Thrombin, Kinin, das follikelstimulierende Hormon, Opsine, das endotheliale
Differenzierungsgen-1, Rhodopsine, Geruchsstoffe, Zytomegalie-Virus,
G-Proteine selbst, Effektorproteine, wie z.B. Phospholipase C, Adenylcyclase
und Phosphordiesterase, sowie Aktivierungsproteine wie Proteinkinase
A und Proteinkinase C.
-
GPCRs
besitzen sieben konservierte membrandurchdringende Domänen, die
zumindest acht divergente hydrophile Schleifen verbinden. GPCRs
(auch als 7TM-Rezeptoren
bekannt) wurden charakterisiert als Elemente mit diesen sieben konservierten
hydrophoben Ketten aus etwa 20 bis 30 Aminosäuren, die zumindest acht divergente
hydrophile Schleifen verbinden. Die meisten GPCRs weisen einzelne
konservierte Cysteinreste in jeder der ersten beiden extrazellulären Schleifen
auf, welche Disulfidbindungen bilden, von denen angenommen wird,
dass sie die Struktur des funktionellen Proteins stabilisieren.
Die sieben Transmembranregionen werden als TM1, TM2, TM3, TM4, TM5,
TM6 und TM7 bezeichnet. TM3 wurde mit der Signaltransduktion in
Verbindung gebracht.
-
Die
Phosphorylierung und Lipidierung (Palmitylierung oder Farnesylierung)
von Cysteinresten kann die Signaltransduktion von einigen GPCRs
beeinflussen. Die meisten GPCRs enthalten mögliche Phosphorylierungsstellen
in der dritten zytoplasmatischen Schleife und/oder im Carboxyterminus.
Bei einigen GPCRs, wie z.B. dem β-Adrenorezeptor,
vermittelt die Phosphorylierung durch Proteinkinase A und/oder spezifische Rezeptorkinasen
eine Rezeptordesensibilisierung.
-
Bei
einigen Rezeptoren wird angenommen, dass die Ligandenbindungsstellen
von GPCRs hydrophile Sockel, die durch mehrere GPCR-Transmembrandomänen gebildet
werden, umfassen. Die hydrophilen Sockel sind von hydrophoben Resten
der GPCRs umgeben. Es wird davon ausgegangen, dass die hydrophile Seite
der einzelnen GPCR-Transmembranhelices nach innen weist und eine
polare Ligandenbindungsstelle bildet. Bei mehreren GPCRs wurde impliziert,
dass TM3 eine Ligandenbindungsstelle aufweist, wie z.B. den TM3-Aspartatrest.
TM5-Serine, ein TM6-Asparagin
und TM6- oder TM7-Phenylalanine oder -Tyrosine sind ebenfalls an
der Ligandenbindung beteiligt.
-
GPCRs
sind innerhalb der Zelle durch heterotrimere G-Proteine an verschiedene
intrazelluläre
Enzyme, Ionenkanäle
und Transporter gekuppelt (siehe Johnson et al., Endoc. Rev. 10,
217–331
(1989)). Unterschiedliche G-Protein-α-Untereinheiten stimulieren
bevorzugt bestimmte Effektoren, um verschiedene biologische Funktionen
in einer Zelle zu modulieren. Die Phosphorylierung von zytoplasmatischen
Resten von GPCRs ist ein wichtiger Mechanismus für die Regulierung einiger GPCRs.
Bei einer Form von Signaltransduktion ist die Auswirkung einer Hormonbindung
beispielsweise die Aktivierung des Enzyms Adenylatcyclase innerhalb
der Zelle. Die Enzymaktivierung durch Hormone hängt von der Gegenwart des Nucleotids
GTP ab. GTP beeinflusst auch die Hormonbindung. Ein G-Protein verbindet
den Hormonrezeptor mit Adenylatcyclase. Ein G-Protein tauscht GTP
mit gebundenem GDP aus, wenn es durch einen Hormonrezeptor aktiviert
wird. Die GTP tragende Form bindet dann an aktivierte Adenylatcyclase.
Die Hydrolyse von GTP zu GDP, katalysiert durch das G-Protein selbst,
führt das
G-Protein in seine inaktive Grundform zurück. Somit hat das G-Protein eine
Doppelrolle, als Zwischenglied, welches das Signal vom Rezeptor
zum Effektor weiterleitet, und als Uhr, welche die Dauer des Signals
steuert.
-
In
den letzten 15 Jahren wurden fast 350 Therapeutika, die auf 7TM-Rezeptoren
ausgerichtet sind, erfolgreich auf den Markt gebracht. Das zeigt,
dass diese Rezeptoren eine etablierte, bewährte Vorgeschichte als Therapeutika
haben. Natürlich
besteht die Notwendigkeit, weitere Rezeptoren zu identifizieren
und zu charakterisieren, die eine Rolle bei der Vorbeugung, Linderung
und Behebung von Dysfunktionen oder Krankheiten spielen können, einschließlich, nicht
aber eingeschränkt
auf, Infektionen, wie z.B. Bakterien-, Pilz-, Protozoen- und Virusinfektionen,
insbesondere solche, die durch HIV-Viren verursacht werden, Schmerz,
Krebs, Anorexie, Bulimie, Asthma, Parkinson-Krankheit, akuten Herzversagens,
Hypotension, Hypertension, Harnretention, Osteoporose, Angina pectoris,
Myokardinfarkt, Geschwüren,
Asthma, Allergien, benigner Prostatahypertrophie und psychotischer
und neurologischer Störungen,
einschließlich
Angst, Schizophrenie, manischer Depression, Delirium, Demenz, verschiedener
geistiger Behinderungen und Dyskinesien, wie z.B. Huntington-Krankheit und Tourette-Syndrom.
-
Lipoxin A4
-
Lipoxine
(Lipoxygenase-Wechselwirkungsprodukte) sind eine neue Reihe von
von Arachidonsäure abgeleiteten
Metaboliten (Serhan et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 18, 943–949 (1984);
Serhan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5335–5339 (1984)). Das Unterscheidungsmerkmal
eines Lipoxins ist die Gegenwart einer Tri-hydroxy-konjugierten Tetraenstruktur.
Zumindest zwei biologisch aktive Lipoxine wurden bisher charakterisiert:
Lipoxin A4 [(5S,6R,15S)-5,6,15-Trihydroxy-7,9,13-trans-11-cis-eicosatetraensäure] und
Lipoxin B4 [(5S,14R,15S)-5,14,15-Trihydroxy- 6,10,12-trans-8-cis-eicosatetraensäure] (Serhan
et al., J. Biol. Chem. 261, 16340–16345; Serhan et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83, 1983–1987
(1986)).
-
Es
wurde nachgewiesen, dass Lipoxin A4 die
glatte Muskulatur der Lunge (Meerschweinchen-Lunge), nicht aber
das Ileum oder die Trachea von Meerschweinchen kontrahiert und glatte
Gefäßmuskeln
bei Konzentrationen von weniger als 1 μM entspannt (erweitert) (Dahlen
et al., Acta Physiol. Scand. 130, 643–647 (1987)). Die topische
Anwendung von Lipoxin A4 an Hamsterbackentaschen
induziert eine ausgeprägte
arterioläre
Dilatation, verändert
aber nicht den Durchmesser von Venolen (Dahlen et al., in: Adv.
Exper. Med. Biol. 229, Kap. 9, 107–130 (1988)). Außerdem wurde
nachgewiesen, dass Lipoxin A4 Neutrophile
dazu veranlasst, Superoxidreste zu produzieren, Elastase freizusetzen
und Chemotaxis durch Leukozyten zu fördern (Serhan et al., in: Prostaglandins,
Leukotrienes and Lipoxins, J.M. Bailey, Hrsg., Plenum, N.Y., USA,
S. 3–16
(1985)).
-
Es
wurde vorgeschlagen, Lipoxin A4 zur Induktion
der Entzündungsreaktion
auf Neutrophile einzusetzen, um ein Versuchsmodell zur Bewertung
der Wirksamkeit von Verbindungen, wie z.B. Lipoxin-B4-Derivaten, bei
der Verhinderung dieser Reaktion bereitzustellen (Samuelsson et
al., US-Patent 4.560.514). Außerdem wurde
vorgeschlagen, dass Lipoxin A4 einen Teil
seiner biologischen Wirkungen durch Bindung an den Lipoxin-D4-Rezeptor ausüben könnte (Jacques et al., Br. J.
Pharmacol. 95, 562–568
(1988)) und dass Lipoxin A4 und LTD4 sogar einen gemeinsamen Rezeptor teilen
könnten
(Lefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8340–8344 (1988)).
-
Untersuchungen
an menschlichen Neutrophilen haben eine umgekehrte Beziehungen zwischen
der Produktion von Lipoxinen und Leukotrienen aufgezeigt, nachdem
diese Zellen 15-HETE und der Calcium-Ionophore A23187 ausgesetzt
worden waren (Serhan, in: Advances in Prostaglandin, Thromboxane
and Leukotriene Research, Bd. 18, B. Samuelsson et al., Hrsg., Raven
Press, N.Y., USA). Außerdem
zeigen neuere Ergebnisse auf, dass Mesangiumzellen Lipoxine aus
exogenen Quellen von LTA4 erzeugen können (Garrick
et al., Kidney Int. Proceedings 21 st Annual Meeting of the American
Society of Nephrology, Bd. 25, S. 292 (1989)), die durch aktivierte Leukotyzen
bereitgestellt werden können
(z.B. während
des transzellulären
Metabolismus). Somit können
die lokalen Werte dieser Verbindungen nach der Infiltration von
Leukozyten in den Glomerulus bestimmt werden.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Eine
Ausführungsform
der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Wirkstoffe, welche
die Aktivität
eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids
regulieren kann. Eine Testverbindung wird mit einem Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptid kontaktiert,
das eine Aminosäuresequenz
umfasst, die aus der aus Aminosäuresequenzen
mit zumindest 90 % Identität
mit der in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz und der in Seq.-ID
Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz
bestehenden Gruppe ausgewählt
ist. Die Bindung der Testverbindung an das Polypeptid wird detektiert.
Eine Testverbindung, die an das Polypeptid bindet, wird dadurch
als möglicher
Wirkstoff zur Regulierung der Aktivität eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids identifiziert, der bei der Behandlung einer mit Entzündungsprozessen
assoziierten Erkrankung von Nutzen ist.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Wirkstoffe, die
bei der Behandlung einer mit Entzündungsprozessen assoziierten
Erkrankung von Nutzen sind und welche die Aktivität eines
Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids verringern.
Eine Testverbindung wird mit einer biologischen Zelle kontaktiert
oder inkubiert, worin die biologische Zelle eine T-Zelle ist und/oder
mit dem Polynucleotid transformiert wurde, worin das Polynucleotid
eine Nucleotidsequenz umfasst, die aus der aus Nucleotidsequenzen,
die unter stringenten Bedingungen an die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte
Nucleotidsequenz hybridisieren, und der in Seq.-ID Nr. 1 dargestellten
Nucleotidsequenz bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Die Bindung der Testverbindung
an das Polynucleotid wird detektiert. Eine Testverbindung, die an
das Polynucleotid bindet, wird als möglicher Wirkstoff zur Verringerung
der Aktivität
eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids
identifiziert. Der Wirkstoff kann arbeiten, indem er die Menge des
Lipoxin-A4-rezeptorartigen Elements durch
Wechselwirkung mit der Lipoxin-A4-rezeptorartigen
mRNA verringert.
-
KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
1 zeigt
die DNA-Sequenz, die für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodiert.
-
2 zeigt
die Aminosäuresequenz
eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung betrifft die Verwendung, wie sie in den Ansprüchen definiert
ist, eines isolierten Polynucleotids, das für ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid kodiert und aus der aus folgenden Elementen bestehenden
Gruppe ausgewählt
ist:
- a) einem Polynucleotid, das die Sequenz
mit der Seq.-ID Nr. 1 umfasst;
- b) einem Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen an
ein Polynucleotid hybridisiert, das unter a) spezifiziert ist;
- c) einem Polynucleotid, das ein Polynucleotid umfasst, wie es
unter a) oder b) definiert ist.
-
Ein
menschliches Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid kann auch eingesetzt werden, um auf Lipoxin-A4-rezeptorartige Agonisten und Antagonisten
zu screenen, die bei der Behandlung einer mit Entzündungsprozessen
assoziierten Erkrankung von Nutzen sind.
-
Die
Aminosäuresequenz
eines menschlichen Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids, das für
die Erfindung, wie sie durch die Ansprüche definiert ist, von Nutzen
ist, ist in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt oder weist zumindest 90 %
Identität
mit Seq.-ID Nr. 2 auf. Eine Nucleotidsequenz, die für Seq.-ID
Nr. 2 kodiert, ist in Seq.-ID Nr. 1 dargestellt, wobei das Startcodon
und Stoppcodon hervorgehoben sind.
-
Lipoxin A4-rezeptorartige
Polypeptide
-
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide, die für die Erfindung,
wie sie durch die Ansprüche
definiert ist, von Nutzen sind, umfassen die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte
Aminosäuresequenz
oder weisen zumindest 90 % Identität mit Seq.-ID Nr. 2 auf. Ein
Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid der
Erfindung kann folglich ein Abschnitt eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Moleküls,
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Molekül voller
Länge oder
ein Fusionsproteins, welches das gesamte oder einen Teil des Lipoxin-A4-rezeptorartige
Moleküls
umfasst, sein.
-
Vorzugsweise
bindet ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
Lipoxin A4 oder ein Lipoxin-A4-Analogon.
Die Bindung kann wie beispielsweise in den nachstehenden spezifischen
Beispielen beschrieben bestimmt werden.
-
Biologisch
aktive Varianten
-
Varianten
von Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptiden,
die biologisch aktiv sind, d.h. die Fähigkeit zur Bindung von Lipoxin
A4 oder eines Lipoxin-A4-Analogons
beibehalten und/oder eine biologische Wirkung, wie z.B. die Bildung
von zyklischem AMP, die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium
oder Phosphinositid-Stoffwechsel, vermitteln, sind ebenfalls Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide. Die prozentuelle
Identität
zwischen einer möglichen
Variante eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids und einer Aminosäuresequenz
mit Seq.-ID Nr. 2 wird mithilfe des Blast2-Anordnungsprogramms bestimmt.
-
Schwankungen
in der prozentuellen Identität
können
beispielsweise auf Aminosäuresubstitutionen, -insertionen
oder -deletionen zurückzuführen sein.
Aminosäuresubstitutionen
sind definiert als Aminosäureersetzungen.
Sie sind konservativer Natur, wenn die substituierte Aminosäure ähnliche
strukturelle und/oder chemische Eigenschaften aufweist. Beispiele
für konservative
Ersetzungen sind Substitutionen eines Leucins durch ein Isoleucin
oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat oder eines Threonins
durch ein Serin.
-
Aminosäureinsertionen
oder -deletionen sind Änderungen
an oder in einer Aminosäuresequenz.
Sie betreffen typischerweise einen Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren. Unterstützung bei
der Bestimmung, welche Aminosäurereste
substituiert, insertiert oder deletiert werden können, ohne die biologische
oder immunologische Aktivität
eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids
aufzuheben, bieten Computerprogramme, die auf dem Gebiet der Erfindung
allgemein bekannt sind, wie z.B. die DNASTAR-Software. Ob eine Aminosäureänderung
in einem biologisch aktiven Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptid resultiert, kann leicht bestimmt werden, indem auf die
Aktivität
von Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptiden
getestet wird, wie beispielsweise in den nachstehenden spezifischen
Beispielen beschrieben ist.
-
Fusionsproteine
-
Fusionsproteine
sind zweckdienlich zur Bildung von Antikörpern gegen Aminosäuresequenzen
von Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptiden
und zum Einsatz in verschiedenen Testsystemen. Fusionsproteine können beispielsweise
eingesetzt werden, um Proteine zu identifizieren, die mit Abschnitten
eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids wechselwirken.
Proteinaffinitätschromatographie
oder auf Bibliotheken basierende Tests für Protein-Protein-Wechselwirkungen,
wie z.B. das Hefe-Zwei-Hybrid- oder Phagendisplay-System, können für diesen
Zweck eingesetzt werden. Solche Verfahren sind auf dem Gebiet der
Erfindung allgemein bekannt und können zum Arzneimittel-Screenen
verwendet werden.
-
Ein
Fusionsprotein eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids umfasst zwei Polypeptidsegmente, die mithilfe einer
Peptidbindung fusioniert sind. Zusammenhängende Aminosäuren zur
Verwendung in einem Fusionsprotein können aus der in Seq.-ID Nr.
2 dargestellten Aminosäuresequenz
oder aus einer biologisch aktiven Variante solcher Sequenzen, wie
sie oben beschrieben sind, ausgewählt werden. Das erste Polypeptidsegment
kann auch ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid voller Länge
umfassen.
-
Das
zweite Polypeptidsegment kann ein Protein voller Länge oder
ein Proteinfragment sein. Proteine, die herkömmlicherweise bei der Fusionsproteinkonstruktion
eingesetzt werden, umfassen β-Galactosidase, β-Glucuronidase,
grün fluoreszierendes
Protein (GFP), autofluoreszierende Proteine, einschließlich blau
fluoreszierendes Protein (BFP), Glutathion-S-transferase (GST),
Luciferase, Meerrettichperoxidase (HRP) und Chloramphenicolacetyltransferase
(CAT). Außerdem
werden Epitopmarkierungen in Fusionsproteinkonstruktionen eingesetzt,
einschließlich
Histidin- (His-) Markierungen, Influenza-Hämagglutinin- (HA-) Markierungen, Myc-Markierungen,
VSV-G-Markierungen und Thioredoxin- (Trx-) Markierungen. Andere
Fusionskonstruktionen können
ein Maltose-Bindungsprotein (MBP), eine S-Markierung, Lex-a-DNA-Bindedomänen- (DBD-)
Fusionen, GAL4-DNA-Bindedomänen-Fusionen
und Herpes-simplex-Virus- (HSV-) BP16-Proteinfusionen umfassen.
Ein Fusionsprotein kann auch aufgebaut sein, dass es eine Spaltstelle
zwischen der für
Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid kodierenden
Sequenz und der heterologen Proteinsequenz enthält, sodass das Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptid gespalten und
von der gereinigten heterologen Gruppierung entfernt werden kann.
-
Ein
Fusionsprotein kann chemisch synthetisiert werden, wie auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt ist. Vorzugsweise wird ein Fusionsprotein
hergestellt, indem zwei Polypeptidsegmente kovalent gebunden werden,
oder durch Standardverfahren im Bereich der Molekularbiologie. DNA-Rekombinationsverfahren
können auch
eingesetzt werden, um Fusionsproteine herzustellen, beispielsweise
durch Bildung eines DNA-Konstrukts, das kodierende Sequenzen, die
aus Seq.-ID Nr. 1 ausgewählt
sind, im passenden Leseraster mit Nucleotiden umfasst, die für das zweite
Polypeptidsegment kodieren und das DNA-Konstrukt in einer Wirtszelle exprimieren,
wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Zahlreiche Sets zur
Bildung von Fusionsproteinen sind von Firmen wie Promega Corporation
(Madison, WI, USA), Stratagene (La Jolla, CA, USA), CLONTECH (Mountain
View, CA, USA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA),
MBL International Corporation (MIC, Watertown, MA, USA) und Quantum
Biotechnologies (Montreal, Kanada; 1-888-DNA-KITS) erhältlich.
-
Identifikation
von Spezies-Homologen
-
Spezies-Homologe
eines menschlichen Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids können
durch Verwendung von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptid-Polynucleotiden (nachstehend beschrieben), um geeignete Sonden
oder Primer zum Screenen von cDNA-Expressionsbibliotheken von anderen
Spezies, wie z.B. von Mäusen,
Affen oder Hefe, herzustellen, Identifikation von cDNAs, die für Homologe
eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids kodieren, und
Exprimieren der cDNAs in auf dem Gebiet der Erfindung bekannter
Weise erhalten werden.
-
Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polynucleotide
-
Ein
Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polynucleotid
kann einzel- oder doppelsträngig
sein und umfasst eine für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodierende Sequenz oder das Komplement einer solchen kodierenden
Sequenz. Eine für
ein menschliches Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid kodierende Sequenz ist in Seq.-ID Nr. 1 dargestellt.
-
Degenerierte
Nucleotidsequenzen, die für
menschliche Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide
kodieren, sowie homologe Nucleotidsequenzen, die zumindest 50, vorzugsweise
etwa 75, 90, 96 oder 98 % Identität mit der in Seq.-ID Nr. 1
dargestellten Nucleotidsequenz aufweisen, sind ebenfalls Lipoxin-A4-rezeptorartige Polynucleotide. Die prozentuelle
Sequenzidentität
zwischen den Sequenzen von zwei Polynucleotiden wird mithilfe von
Computer-Programmen bestimmt, wie z.B. ALIGN, bei dem der FASTA-Algorithmus
eingesetzt wird, wobei eine affine Lückensuche mit einer „Gap Open
Penalty" von -12
und einer „Gap
Extension Penalty" von -2
durchgeführt
wird. Komplementäre
DNA- (cDNA-) Moleküle,
Spezies-Homologe und Varianten von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polynucleotiden, die für
biologisch aktive Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide
kodieren, sind ebenfalls Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polynucleotide.
-
Identifikation von Varianten
und Homologen von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptid-Polynucleotiden
-
Varianten
und Homologe der oben beschriebenen Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polynucleotide sind ebenfalls Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polynucleotide. Typischerweise können
homologe Lipoxin-A4-rezeptorartige Polynucleotidsequenzen
durch Hybridisierung von Kandidaten-Polynucleotiden an bekannte
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polynucleotide
unter stringenten Bedingungen in auf dem Gebiet der Erfindung bekannter
Weise identifiziert werden. Unter Einsatz der folgenden Waschbedingungen – 2 × SSC (0,3
M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,1 % SDS, Raumtemperatur,
zweimal, jeweils 30 min; dann 2 × SSC, 0,1 % SDS, 50°C, einmal, 30
min; dann 2 × SSC,
Raumtemperatur, zweimal, jeweils 10 min – können homologe Sequenzen identifiziert werden,
die höchstens
etwa 25–30
% Basenpaar-Fehlpaarungen aufweisen. Noch bevorzugter enthalten
homologe Nucleinsäurestränge 15–25 % Basenpaar-Fehlpaarungen,
noch bevorzugter 5–15
% Basenpaar-Fehlpaarungen.
-
Spezies-Homologe
der hierin geoffenbarten Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polynucleotide können
auch identifiziert werden, indem geeignete Sonden oder Primer hergestellt
und cDNA-Expressionsbibliotheken von anderen Spezies, wie z.B. Mäusen, Affen
oder Hefe, gescreent werden. Menschliche Varianten von Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polynucleotiden können beispielsweise
identifiziert werden, indem menschliche cDNA-Expressionsbibliotheken
gescreent werden. Es ist allgemein bekannt, dass die Tm einer
doppelsträngigen DNA
mit jeder 1%igen Verringerung der Homologie um 1–1,5°C abnimmt (Bonner et al., J.
Mol. Biol. 81, 123 (1973)). Varianten von menschlichen Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polynucleotiden oder Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polynucleotiden von anderen Spezies können deshalb identifiziert
werden, indem ein mögliches
homologes Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polynucleotid
mit einem Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr.
1 oder dem Komplement davon hybridisiert wird, um eine Testhybride
zu bilden. Die Schmelztemperatur der Testhybride wird mit der Schmelztemperatur
einer Hybride verglichen, die Transformylase-Polynucleotid mit perfekt
komplementären
Nucleotidse quenzen umfasst, und die Anzahl oder der prozentuelle
Anteil an Basenpaar-Fehlpaarungen
in der Testhybride wird berechnet.
-
Nucleotidsequenzen,
die nach einer stringenten Hybridisierung und/oder nach stringenten
Waschbedingungen an Transformylase-Polynucleotide oder ihre Komplemente
hybridisieren, sind ebenfalls Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polynucleotide. Stringente Waschbedingungen sind auf dem Gebiet
der Erfindung allgemein bekannt und sind beispielsweise in Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. S. 9.50–9.51 (1989),
geoffenbart.
-
Stringente
Waschbedingungen umfassen beispielsweise 4 × SSC bei 65°C oder 50
% Formamid, 4 × SSC
bei 42°C
oder 0,5 × SSC,
0,1 % SDS bei 65°C.
Hochstringente Waschbedingungen umfassen beispielsweise 0,2 × SSC bei
65°C.
-
Herstellung von Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polynucleotiden
-
Ein
natürlich
vorkommendes Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polynucleotid kann frei von anderen Zellkomponenten, wie z.B. Membrankomponenten,
Proteinen und Lipiden, isoliert werden. Polynucleotide können durch
eine Zelle hergestellt und unter Einsatz von herkömmlichen
Nucleinsäure-Reinigungsverfahren
isoliert werden, oder sie können
unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens, wie z.B. der Polymerasekettenreaktion
(PCR), oder unter Einsatz eines automatischen Synthesegeräts synthetisiert
werden. Verfahren zur Isolation von Polynucleotiden gehören auf
dem Gebiet der Erfindung zur Routine und sind allgemein bekannt.
Jedes beliebige solche Verfahren zum Erhalt eines Polynucleotids
kann eingesetzt werden, um isolierte Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polynucleotide zu erhalten. Beispielsweise können Restriktionsenzyme und
Sonden verwendet werden, um Polynucleotid-Fragmente zu isolieren,
die Lipoxin-A4-rezeptorartige Nucleotidsequenzen enthalten.
Isolierte Polynucleotide liegen in Präparaten vor, die frei oder
zumindest zu 70, 80 oder 90 % frei von anderen Molekülen sind.
-
Lipoxin-A4-rezeptorartige cDNA-Moleküle können mithilfe
von herkömmlichen
molekularbiologischen Verfahren unter Einsatz von Lipoxin-A4-rezeptorartiger mRNA als Lipoxin-A4-rezeptorartiges Element hergestellt werden.
Lipoxin-A4-rezeptorartige cDNA-Moleküle können anschließend mithilfe
von molekularbiologischen Verfahren repliziert werden, die auf dem
Gebiet der Erfindung bekannt und in Handbüchern wie Sambrook et al. (1989)
geoffenbart sind. Ein Amplifikationsverfahren, wie z.B. PCR, kann
verwendet werden, um weitere Kopien von Polynucleotiden der Erfindung
zu erhalten, wobei entweder menschliche genomische DNA oder cDNA
als Matrize eingesetzt wird.
-
Alternativ
dazu können
chemische Syntheseverfahren eingesetzt werden, um Lipoxin-A4-rezeptorartige Polynucleotide zu synthetisieren.
Die Degeneration des genetischen Codes erlaubt die Synthese von
alternativen Nucleotidsequenzen, die für ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid mit beispielsweise einer in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten
Aminosäuresequenz
oder für
eine biologisch aktive Variante davon kodieren.
-
Erhalt von Lipoxin-A4-rezeptorartipen Polypeptiden
-
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide können beispielsweise
durch Reinigung aus menschlichen Zellen, durch Expression von Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polynucleotiden oder durch
direkte chemische Synthese erhalten werden.
-
Proteinreinigung
-
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide können aus
jeder beliebigen menschlichen Zelle gereinigt werden, die den Rezeptor
exprimiert, einschließlich
jeder beliebigen Wirtszelle, die mit einem ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid exprimierenden
Polynucleotid-Konstrukt transfiziert wurde. Ein gereinigtes Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid wird von anderen
Verbindungen getrennt, die sich normalerweise mit dem Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptid in der Zelle
verbinden, wie z.B. bestimmte Proteine, Kohlenhydrate oder Lipide,
wobei auf dem Gebiet der Erfindung allgemein be kannte Verfahren
eingesetzt werden. Solche Verfahren umfassen, sind jedoch nicht
eingeschränkt
auf, Größenausschlusschromatographie,
Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie
und präparative
Gelelektrophorese.
-
Ein
Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid wird
am besten als Komplex mit seinem assoziierten G-Protein isoliert.
Verschiedene Lipoxin-A4-rezeptorartige Analoga
sind verfügbar
und können
als Liganden für
die Rezeptorbindung eingesetzt werden. Biotinylierte Lipoxin-A4-rezeptorartige Analoga sind für diesen
Zweck besonders gut geeignet. Ein Präparat von gereinigten Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptiden ist zumindest
zu 80 % rein; vorzugsweise sind die Präparate zu 90 %, 95 % oder 99
% rein. Die Reinheit der Präparate
kann mithilfe jedes beliebigen, auf dem Gebiet der Erfindung bekannten
Verfahrens bewertet werden, beispielsweise mithilfe von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
-
Expression von Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polynucleotiden
-
Um
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
zu exprimieren, kann ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polynucleotid
in einen Expressionsvektor insertiert werden, der die notwendigen
Elemente für
die Transkription und Translation der insertierten kodierenden Sequenz
enthält.
Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein
bekannt sind, können
eingesetzt werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die für Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide kodierende Sequenzen
und geeignete Transkriptions- und Translationskontrollelemente enthalten.
Diese Verfahren umfassen In-vitro-DNA-Rekombinationsverfahren, Syntheseverfahren
und genetische In-vivo-Rekombination. Solche Verfahren sind beispielsweise
in Sambrook et al. (1989) und in Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons,
New York, N.Y., USA (1989), beschrieben.
-
Verschiedene
Expressionsvektoren/Wirtssysteme können eingesetzt werden, damit
sie Sequenzen, die für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodieren, enthalten und exprimieren. Diese umfassen, sind jedoch
nicht eingeschränkt
auf, Mikroorga nismen, wie z.B. mit rekombinanten Bakteriophagen-,
Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren
transformierte Bakterien; mit Hefeexpressionsvektoren transformierte
Hefe, mit Virusexpressionsvektoren (z.B. Baculovirus) infizierte
Insektenzellensysteme, mit Virusexpressionsvektoren (z.B. Karfiolmosaikvirus,
CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z.B.
Ti- oder pBR322-Plasmide) transformierte Pflanzenzellsysteme oder
Tierzellsysteme.
-
Die
Kontrollelemente oder Regulationssequenzen sind jene nichttranslatierten
Regionen des Vektors-Enhancer, Promotoren, untranslatierte 5'- und 3'-Regionen-, die mit
Wirtszellproteinen wechselwirken, um eine Transkription und Translation
durchzuführen.
Solche Elemente können
in ihrer Stärke
und Spezifität
variieren. Je nach eingesetztem Vektorsystem und Wirt kann eine
beliebige Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen,
einschließlich
konstitutiven und induzierbaren Promotoren, eingesetzt werden. Wenn
beispielsweise in bakteriellen Systemen kloniert wird, können induzierbare
Promotoren, wie z.B. der Hybrid-lacZ-Promotor des BLUESCRIPT-Phagemids (Stratagene,
LaJolla, CA, USA) oder pSPORT1-Plasmids (Life Technologies) und
dergleichen, eingesetzt werden. Der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor
kann in Insektenzellen verwendet werden. Promotoren oder Enhancer,
die von Genomen von Pflanzenzellen (z.B. Hitzeschock-, RUBISCO-
und Speicherproteingene) oder von Pflanzenviren (z.B. virale Promotoren
oder Leader-Sequenzen) stammen, können in den Vektor kloniert
werden. In Säugetier-Zellsystemen
sind Promotoren von Säugetiergenen
oder von Säugetierviren
bevorzugt. Wenn es notwendig ist, eine Zelllinie herzustellen, die mehrere
Kopien einer für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodierenden Nucleotidsequenz enthält, können auf SV40 oder EBV basierende
Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker eingesetzt werden.
-
Bakterien-
und Hefe-Expressionssysteme
-
In
Bakteriensystemen kann eine Reihe von Expressionsvektoren je nach
beabsichtigter Verwendung des Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids ausgewählt
werden. Wenn beispielsweise eine große Menge Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid für
die Induktion von Antikörpern
notwendig ist, können
Vektoren eingesetzt werden, welche eine starke Expression von Fusionsproteinen
steuern, die leicht gereinigt werden können. Solche Vektoren umfassen,
sind jedoch nicht eingeschränkt
auf, multifunktionelle E.-coli-Klonierungs- und -Expressionsvektoren,
wie z.B. BLUESCRIPT (Stratagene). In einem BLUESCRIPT-Vektor kann
eine für
das Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptid
kodierende Sequenz im Leseraster mit Sequenzen für das aminoterminale Met und
die nachfolgenden 7 Reste von β-Galactosidase
in den Vektor ligiert werden, sodass ein Hybridprotein produziert
wird. pIN-Vektoren (Van Heeke & Schuster,
J. Biol. Chem. 264, 5503–5509
(1989)) oder pGEX-Vektoren (Promega, Madison, WI, USA) können ebenfalls
verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit
Glutation-S-transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind
solche Fusionsproteine löslich und
können
leicht durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen, gefolgt von einer
Elution in Gegenwart von freiem Glutathion aus lysierten Zellen
gereinigt werden. Proteine, die in solchen Systemen hergestellt
werden, können
so aufgebaut sein, dass sie Heparin-, Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltstellen
enthalten, sodass das klonierte Polypeptid von Interesse nach Wunsch
von der GST-Gruppierung abgelöst
werden kann.
-
In
der Hefe Saccharomyces cerevisiae kann eine Reihe von Vektoren eingesetzt
werden, die konstitutive oder induzierbare Promotoren, wie z.B. α-Faktor,
Alkoholoxidase und PGH, enthalten. Für einen Überblick siehe Ausubel et al.
(1989) und Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516–544 (1987).
-
Pflanzen-
und Insekten-Expressionssysteme
-
Wenn
Pflanzen-Expressionsvektoren eingesetzt werden, kann die Expression
von für
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide kodierenden
Sequenzen durch beliebige aus einer Reihe von Promotoren angetrieben
werden. Beispielsweise können
virale Promotoren, wie z.B. der 35S- und 19S-Promotor von CaMV,
alleine oder in Kombination mit der Omega-Leader-Sequenz von TMV
eingesetzt werden (Takamatsu EMBO J. 6, 307–311 (1987)). Alternativ dazu
können
auch Pflanzenpromotoren, wie z.B. die kleine Untereinheit von RUBISCO,
oder Hitzeschockpromotoren eingesetzt werden (Coruzzi et al., EMBO
J. 3, 1671–1680
(1984); Broglie et al., Science 224, 838–843 (1984); Winter et al.,
Results Probl. Cell Differ. 17, 85–105 (1991)). Diese Konstrukte
können
durch direkte DNA-Transformation oder durch pathogenvermittelte
Transfektion in Pflanzenzellen eingeführt werden. Solche Verfahren
sind in einer Reihe von allgemein erhältlichen Dokumenten beschrieben
(z.B. Hobbs oder Murry, in: McGraw Hill Yearbook of Science and
Technology, S. 191–196,
McGRaw Hill, New York, N.Y., USA (1992)).
-
Ein
Insektensystem kann ebenfalls eingesetzt werden, um ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid zu exprimieren.
In einem solchen System wird beispielsweise ein Autographa-californica-Nuclear-Polyhedrosis-Virus
(AcNPV) als Vektor eingesetzt, um fremde Gene in Spodoptera-frugiperda-Zellen
oder in Trichoplusia-Larven zu exprimieren. Sequenzen, die für Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide kodieren, können in
eine nichtessentielle Region des Virus, z.B. das Polyhedrin-Gen,
kloniert und unter Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gesetzt werden.
Eine erfolgreiche Insertion von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptiden macht das Polyhedrin-Gen inaktiv und produziert ein
rekombinantes Virus ohne Hüllprotein.
Die rekombinanten Viren können
dann eingesetzt werden, um S.-frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven zu infizieren,
in denen Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide
exprimiert werden können
(Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 3224–3227 (1994)).
-
Säugetier-Expressionssysteme
-
Eine
Reihe von auf Viren basierenden Expressionssystemen können zur
Expression von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptiden in Säugetier-Wirtszellen
eingesetzt werden. Wenn beispielsweise ein Adenovirus als Expressionsvektor
eingesetzt wird, können
Sequenzen, die für
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide kodieren,
in einen Adenovirus-Transkriptions-/Translationskomplex, der den
späten
Promotor und die dreiteilige Leader-Sequenz umfasst, ligiert werden.
Die Insertion in eine nichtessentielle E1- oder E3-Region des viralen
Genoms kann genutzt werden, um ein lebensfähiges Virus zu erhalten, das
in der Lage ist, ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypep tid in infizierten Wirtszellen zu exprimieren (Logan & Shenk, Proc.
Natl. Acad. Sci. 81, 3655–3659
(1984)). Falls erwünscht
können
Transkriptions-Enhancer, wie z.B. der Rous-Sarkom-Virus- (RSV-)
Enhancer, zur Steigerung der Expression in Säugetier-Wirtszellen eingesetzt
werden.
-
Künstliche
menschliche Chromosomen (HACs) können
ebenfalls eingesetzt werden, um größere DNA-Fragmente als sie
in einem Plasmid enthalten sein können und exprimiert werden
können
zuzuführen. HACs
mit 6 M bis 10 M werden konstruiert und durch herkömmliche
Zufuhrverfahren (z.B. Liposomen, polykationische Aminopolymere oder
Vesikel) Zellen zugeführt.
-
Spezifische
Startsignale können
ebenfalls eingesetzt werden, um eine effizientere Translation von
für Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide kodierenden
Sequenzen zu erreichen. Solche Signale umfassen das ATG-Initiationsodon
und angrenzende Sequenzen. In Fällen,
in denen für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodierende Sequenzen, ihr Initiationscodon und stromauf liegende
Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor insertiert werden,
sind eventuell keine weiteren Transkriptions- oder Translationssteuersignale erforderlich.
In Fällen,
in denen nur eine kodierende Sequenz oder ein Fragment davon insertiert
wird, sollten jedoch exogene Translationssteuersignale (einschließlich des
ATG-Initiationscodons) bereitgestellt werden. Das Initiationscodon
sollte im korrekten Leseraster vorliegen, um die Translation des
gesamten Inserts sicherzustellen. Exogene Translationselemente und
Initiationscodons können
verschiedenen, sowohl natürlichen
als auch synthetischen, Ursprungs sein. Die Effizienz der Expression
kann durch die Einbeziehung von Enhancern gesteigert werden, die
für das
jeweilige Zellsystem, das verwendet wird, geeignet sind (siehe Scharf
et al., Results Probl. Cell Differ. 20, 125–162 (1994)).
-
Wirtszellen
-
Ein
Wirtszellstamm kann aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt werden,
die Expression der insertierten Sequenzen zu modulieren oder das
exprimierte Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptid auf die gewünschte Weise
zu verarbeiten. Solche Modifika tionen des Polypeptids umfassen,
sind jedoch nicht eingeschränkt
auf, Acetylierung, Carboxylierung, Glycosylierung, Phosphorylierung,
Lipidierung und Acylierung. Posttranslationale Reifung, wodurch
eine „Präproform" des Polypeptids
gespalten wird, kann ebenfalls eingesetzt werden, um die korrekte
Insertion, Faltung und/oder Funktion zu erleichtern. Unterschiedliche
Wirtszellen mit einer spezifischen zellulären Maschinerie und einem charakteristischen
Mechanismus für
posttranslationale Aktivitäten (z.B.
CHO, HeLa, MDCK, HEK293 und W138) sind von der American Type Culture
Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110–2209; USA)
erhältlich
und können
so gewählt
werden, dass die korrekte Modifikation und Verarbeitung des fremden
Proteins sichergestellt wird.
-
Eine
stabile Expression ist für
eine langfristige Produktion von rekombinanten Proteinen in hoher
Ausbeute bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien, die Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polypeptide stabil exprimieren, mithilfe von Expressionsvektoren
transformiert werden, die virale Replikationsstartpunkte und/oder
endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markierungsgen
auf demselben oder einem anderen Vektor enthalten. Nach der Einführung des
Vektors können
die Zellen 1–2
Tage lang in einem angereicherten Medium wachsen gelassen werden,
bevor sie in ein selektives Medium gewechselt werden. Der Zweck
des selektierbaren Markers ist es, Resistenz gegen Selektion zu
verleihen, und seine Gegenwart ermöglicht das Wachstum und die
Gewinnung von Zellen, welche die eingeführten Lipoxin-A4-rezeptorartigen Sequenzen
erfolgreich exprimieren. Resistente Klone von stabil transformierten
Zellen können
mithilfe von für
den Zelltyp geeigneten Gewebekulturverfahren vermehrt werden. Siehe
beispielsweise Animal Cell Cultire, R.I. Freshney (Hrsg.) (1986).
-
Jede
beliebige Anzahl an Selektionssystemen kann verwendet werden, um
transformierte Zelllinien zu gewinnen.
-
Diese
umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Herpex-simplex-Virus-Thymidinkinase-
(Wigler et al., Cell 11, 112–32
(1977)) und Adenin-Phosphoribosyltransferase- (Lowy et al., Cell
22, 817–23
(1980)) Gene, die in t–- bzw. aprt–-Zellen eingesetzt
werden können.
Auch Antimetabolit-, Antibiotika- oder Herbizidresistenz können als
Selektionsbasis dienen. Beispielsweise verlieht dhfr Resistenz gegen
Methotrexat (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567–70 (1980)),
npt verleiht Resistenz gegen die Aminoglycoside Neomycin und G-418
(Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1–14 (1981)) und als und pat
verleihen Resistenz gegen Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricinacetyltransferase
(Murry, w.o. (1992)). Weitere selektierbare Gene wurden beschrieben.
Beispielsweise erlaubt es trpB Zellen, Indol anstelle von Tryptophan
zu verwenden, oder hisD erlaubt es Zellen, Histinol anstelle von
Histidin zu verwenden (Hartman & Mulligan,
Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047–51
(1988)). Sichtbare Marker, wie z.B. Anthocyanine, β-Glucuronidase
und ihr Substrat GUS und Luciferase und ihr Substrat Luciferin,
können
verwendet werden, um Transformanten zu identifizieren und das Ausmaß an vorübergehender
oder stabiler Proteinexpression zu quantifizieren, die auf ein spezifisches
Vektorsystem zurückzuführen ist
(Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121–131 (1995)).
-
Defektion der Expression
von Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptiden
-
Obwohl
das Vorhandensein von Markierungsgen-Expression vermuten lässt, dass
auch das Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptid
vorhanden ist, muss seine Gegenwart und Expression eventuell bestätigt werden.
Wenn beispielsweise eine Sequenz, die für ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid kodiert, in eine Markierungsgen-Sequenz insertiert wird,
können
transformierte Zellen, die für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodierende Sequenzen enthalten, durch die Abwesenheit von Markierungsgen-Funktion
identifiziert werden. Alternativ dazu kann ein Markierungsgen unter
der Kontrolle eines einzelnen Promotors in Tandemanordnung mit einer
Sequenz angeordnet werden, die für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodiert. Die Expression des Markierungsgens als Reaktion auf eine
Induktion oder Selektion zeigt üblicherweise
die Expression des Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polynucleotids an.
-
Alternativ
dazu können
Wirtszellen, die ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polynucleotid enthalten und ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid exprimieren, mithilfe verschiedener Verfahren identifiziert
werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungen und Protein-Biotest- oder
Immuntest-Verfahren,
die Membran-, Lösungs-
oder auf Chips basierende Technologien zur Detektion und/oder Quantifizierung
einer Nucleinsäure
oder eines Proteins umfassen. Die Gegenwart einer Polynucleotidsequenz,
die für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodiert, kann beispielsweise durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung
oder Amplifikation unter Einsatz von Sonden oder Fragmenten oder
Fragmenten von Polynucleotiden, die für ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid kodieren, detektiert werden. Auf Nucleinsäure basierende
Tests umfassen den Einsatz von Oligonucleotiden, die aus für ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid kodierenden Sequenzen
ausgewählt
sind, um Transformanten zu detektieren, die ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polynucleotid enthalten.
-
Verschiedene
Protokolle zur Detektion und Messung der Expression eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids,
entweder unter Einsatz von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die
für das
Polypeptid spezifisch sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Beispiele umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA),
Radioimmuntest (RIA) und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).
Ein Zweistellen-Immuntest auf monoklonaler Basis unter Verwendung
von monoklonalen Antikörpern,
die auf zwei sich nicht beeinflussende Epitope auf einem Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptid reagieren, kann
eingesetzt werden, oder auch ein kompetitiver Bindungstest kann
verwendet werden. Diese und andere Tests sind in Hampton et al.,
Serological Methods: A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Minn.
(1990), und Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211–1216 (1983),
beschrieben.
-
Verschiedenste
Markierungen und Konjugationstechniken sind Fachleuten auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt und können
in unterschiedlichen Nucleinsäure-
und Aminosäure-Tests
eingesetzt werden. Mittel zur Durchführung einer markierten Hybridisierung
oder zur Herstellung von PCR-Sonden zur Detektion von Sequenzen, die
mit Polynucleotiden verwandt sind, die für Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polypeptid kodieren, umfassen Oligomarkierung, Nick-Translation,
Endmarkierung oder PCR-Amplifikation
unter Einsatz eines markierten Nucleotids. Alternativ dazu können Sequenzen,
die für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodieren, in einen Vektor für
die Herstellung einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren
sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, im Handel erhältlich und
könne zur
Synthese von RNA-Sonden in vitro durch die Hinzufügung von
markierten Nucleotiden und einer geeigneten RNA-Polymerase, wie
z.B. T7, T3 oder SP6, eingesetzt werden. Diese Verfahren können mithilfe
verschiedener im Handel erhältlicher
Sets (Amersham Pharmacia Biotech, Promega und US Biochemical) durchgeführt werden.
Geeignete Reporter-Moleküle
oder Markierungen, die zur Vereinfachung der Detektion eingesetzt
werden können,
umfassen Radionuclide, Enzyme und fluoreszierende, chemilumineszierende
oder chromogene Mittel sowie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren,
Magnetteilchen und dergleichen.
-
Expression
und Reinigung von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptiden
-
Mit
für ein
Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid kodierenden
Nucleotidsequenzen transformierte Wirtszellen können unter Bedingungen kultiviert
werden, die für
die Expression und Gewinnung des Proteins aus einer Zellkultur geeignet
sind. Das durch eine transformierte Zelle hergestellte Polypeptid
kann sekretiert oder intrazellulär
enthalten sein, je nach verwendeter Sequenz und/oder verwendetem
Vektor. Wie für
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sein wird,
können
Expressionsvektoren, die für
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide kodierende
Polynucleotide enthalten, so aufgebaut sein, dass sie Signalsequenzen enthalten,
welche die Sekretion von löslichen
Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptiden
durch eine prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran steuern
oder welche die Membraninsertion eines membrangebundenen Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids steuern.
-
Wie
oben erläutert
können
andere Konstruktionen eingesetzt werden, um eine für ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid kodierende Sequenz
an eine Nucleotidsequenz zu binden, die für eine Polypeptiddomäne kodiert,
welche die Reinigung von löslichen
Proteinen vereinfacht. Solche die Reinigung vereinfachenden Domänen umfassen,
sind jedoch nicht eingeschränkt
auf, Metallchelatpeptide, wie z.B. Histidin-Tryptophan-Module, welche eine Reinigung
auf immobilisierten Metallen erlauben, Protein-A-Domänen, welche
eine Reinigung auf immobilisiertem Immunglobulin erlauben, und die
Domäne,
die im FLAGS-Extensions-/Affinitätsreinigungssystem
(Immunex Corp., Seattle, Wash., USA) verwendet wird. Die Aufnahme
von spaltbaren Linker-Sequenzen, wie z.B. solchen, die für Faktor
Xa oder Enterokinase spezifisch sind (Invitrogen, San Diego, CA,
USA), zwischen der Reinigungsdomäne
und dem Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptid
kann auch zur Vereinfachung der Reinigung dienen. Ein solcher Expressionsvektor
ermöglicht
die Expression eines Fusionsproteins, welches ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid und 6 Histidinreste
vor einer Thioredoxin- oder einer Enterokinase-Spaltstelle umfasst.
Die Histidinreste vereinfachen die Reinigung durch IMAC (immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie
wie in Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263–281 (1992), beschrieben), während die
Enterokinase-Spaltstelle ein Mittel zur Reinigung des Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids von Fusionsprotein bereitstellt. Fusionsproteine enthaltende
Vektoren sind in Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 442–453 (1993),
geoffenbart.
-
Chemische
Synthese
-
Sequenzen,
die für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodieren, können
als Ganzes oder zum Teil mithilfe von chemischen Verfahren synthetisiert
werden, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind
(siehe Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215–223 (1980);
Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225–232 (1980)). Alternativ dazu
kann ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
selbst unter Verwendung von chemischen Verfahren zur Synthese seiner
Aminosäuresequenz
hergestellt werden, wie z.B. durch direkte Peptidsynthese unter
Einsatz von Festphasenverfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963);
Roberge et al., Science 269, 202–204 (1995)). Die Proteinsynthese
kann unter Einsatz von manuellen Verfahren oder automatisiert durchgeführt werden.
Eine automatisierte Synthese kann beispielsweise mithilfe der Peptid-Synthesevorrichtung
Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer) erfolgen. Gegebenenfalls
können
Fragmente von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptiden separat synthetisiert und unter Einsatz von chemischen
Verfahren kombiniert werden, um ein Vollängen-Molekül herzustellen.
-
Das
neu synthetisierte Peptid kann durch präparative Hochleistungs-Flüssigchromatographie
im Wesentlichen gereinigt werde (z.B. Creighton, Proteins: Structures
and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., New York, N.Y.,
USA (1983)). Die Zusammensetzung eines synthetischen Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids kann durch
Aminosäureanalyse
oder Sequenzierung bestätigt
werden (z.B. durch das Edman-Abbauverfahren; siehe Creighton, w.o.).
Außerdem
kann jeder beliebige Abschnitt der Aminosäuresequenz des Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids während einer
direkten Synthese verändert
und/oder unter Einsatz von chemischen Verfahren mit Sequenzen von
anderen Proteinen kombiniert werden, um eine Polypeptidvariante oder
ein Fusionsprotein herzustellen.
-
Herstellung von veränderten
Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptiden
-
Wie
für Fachleute
auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sein wird, kann es von
Vorteil sein, für ein
Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid kodierende
Nucleotidsequenzen herzustellen, die nicht natürlich vorkommenden Codons aufweisen.
Beispielsweise können
Codons ausgewählt
werden, die von einem bestimmten prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirt bevorzugt werden, um die Geschwindigkeit der Proteinexpression
zu erhöhen
oder ein RNA-Transkript mit wünschenswerten
Eigenschaften herzustellen, beispielsweise mit einer Halbwertszeit,
die länger
ist als die eines aus der natürlich
vorkommenden Sequenz hergestellten Transkripts.
-
Die
hierin geoffenbarten Nucleotidsequenzen können unter Einsatz von auf
dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Verfahren gentechnisch
verändert
werden, um für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
kodierende Sequenzen aus verschiedenen Gründen zu verändern, einschließlich, nicht
jedoch eingeschränkt
auf, Änderungen
zur Modifikation der Klonierung, Reifung und/oder Expression des
Polypeptids oder mRNA-Produkts. DNA-Shuffling durch zufällige Fragmentierung
und PCR-Reassemblierung von Genfragmenten und synthetischen Oligonucleotiden kann
verwendet werden, um die Nucleotidsequenzen gentechnisch zu verändern. Beispielsweise
kann ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt werden, um neue Restriktionsstellen
zu insertieren, Glycosylierungsmuster zu verändern, die Codonbevorzugung
zu verändern,
Spleißvarianten
herzustellen, Mutationen einzuführen
usw.
-
Antikörper
-
Jede
beliebige Antikörperart,
die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann erzeugt werden,
um spezifisch an ein Epitop oder ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid zu binden. „Antikörper" umfasst hierin intakte
Immunglobulin-Moleküle
sowie Fragmente davon, wie z.B. Fab, F(ab')2 und Fv, die
in der Lage sind, ein Epitop eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids zu binden. Typischerweise sind zumindest 6, 8, 10 oder 12
zusammenhängende
Aminosäuren
erforderlich, um ein Epitop zu bilden. Epitope, die nicht zusammenhängende Aminosäuren umfassen,
können
jedoch mehr, z.B. zumindest 15, 25 oder 50, Aminosäuren erfordern.
-
Ein
Antikörper,
der spezifisch an ein Epitop eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids bindet, kann therapeutisch sowie in immunchemischen
Tests, wie z.B. Western-Blots, ELISAs, Radioimmuntests, immunhistochemischen
Tests, Immunpräzipitationen
oder anderen auf dem Gebiet der Erfindung bekannten immunchemischen
Tests, eingesetzt werden. Unterschiedliche Immuntests können eingesetzt
werden, um Antikörper mit
der gewünschten
Spezifität
zu identifizieren. Zahlreiche Protokolle für kompetitive Bindung oder
immunradiometrische Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein
bekannt. Solche Immuntests umfassen typischerweise die Messung der
Komplexbildung zwischen einem Immunogen und einem Antikörper, der
spezifisch an das Immunogen bindet.
-
Typischerweise
stellt ein Antikörper,
der spezifisch an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid bindet, ein Detektionssignal bereit, das zumindest 5-,
10- oder 20-mal stärker
ist als das Detektionssignal, das bei anderen Proteinen bereitgestellt
wird, wenn sie in einem immunchemischen Test eingesetzt werden.
Vorzugsweise detektieren Antikörper,
die spezifisch an Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polypeptide binden, an dere Proteine in immunchemischen Tests nicht
und können
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid aus einer
Lösung
immunpräzipitieren.
-
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide können verwendet
werden, um ein Säugetier,
wie z.B. eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Meerschweinchen,
einen Affen oder einen Menschen, zu immunisieren, sodass diese polyklonale
Antikörper
produzieren. Falls erwünscht
kann ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
an ein Trägerprotein,
wie z.B. Rinderserumalbumin, Thyroglobulin und Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin,
konjugiert werden. Je nach Wirtsspezies können verschiedene Adjuvantien
verwendet werden, um die immunologische Reaktion zu verstärken. Solche
Adjuvantien umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
Freundsches Adjuvans, Mineralgele (z.B. Aluminiumhydroxid) und Tenside
(z.B. Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl-Emulsionen,
Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin
und Dinitrophenol). Von den beim Menschen eingesetzten Adjuvantien
sind BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Cornyebacterium parvum besonders
gut geeignet.
-
Monoklonale
Antikörper,
die spezifisch an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid binden, können unter
Einsatz jedes beliebigen Verfahrens hergestellt werden, das die
Produktion von Antikörpermolekülen durch
kontinuierliche Zelllinien in einer Kultur ermöglichen. Diese Verfahren umfassen,
sind jedoch nicht eingeschränkt
auf, das Hybridom-Verfahren, das menschliche B-Zell-Hybridomverfahren
und das EBV-Hybridom-Verfahren
(Kohler et al., Nature 256, 495–497
(1985); Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31–42 (1985);
Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026–2030 (1983); Cole et al.,
Mol. Cell Biol. 62, 109–120
(1984)).
-
Außerdem können Verfahren,
die zur Produktion von „chimären Antikörpern" entwickelt wurden,
das Spleißen
von Maus-Antikörpergenen
an menschliche Antikörpergene,
um ein Molekül
mit geeigneter Antigenspezifität
und biologischer Aktivität
zu erhalten, eingesetzt werden (Morrison et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 81, 6851–6855
(1984); Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984); Takeda et al.,
Nature 314, 452–454
(1985)). Monoklonale und andere Antikörper können auch „humanisiert" werden, um zu verhindern,
dass ein Patient eine Immunantwort gegen den Antikörper aufbaut,
wenn dieser therapeutisch eingesetzt wird. Solche Antikörper können ausreichend
Sequenzähnlichkeit
zu menschlichen Antikörpern
aufweisen, sodass sie direkt in einer Therapie eingesetzt werden
können,
oder sie können
die Veränderung
einiger weniger Schlüsselreste
erfordern. Sequenzunterschiede zwischen Nagetier-Antikörpern und menschlichen Sequenzen
können
minimiert werden, indem Reste, die sich von jenen in den menschlichen
Sequenzen unterscheiden, durch ortsgerichtete Mutagenese einzelner
Reste ersetzt werden oder durch Entfernung von gesamten komplementaritätsbestimmenden
Regionen. Alternativ dazu können
humanisierte Antikörper
unter Verwendung von Rekombinationsverfahren hergestellt werden,
wie in
GB 2188638B beschrieben
ist. Antikörper,
die spezifisch an ein Lipoxin-A
4-rezeptorartiges Polypeptid
binden, können
Antigenbindungsstellen enthalten, die entweder teilweise oder vollständig humanisiert
sind, wie in
U.S. 5.656.332 geoffenbart
ist.
-
Alternativ
dazu können
Verfahren, die für
die Produktion von einkettigen Antikörpern beschrieben wurden, mithilfe
von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren angepasst werden,
um einkettige Antikörper
herzustellen, die spezifisch an Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polypeptide binden. Antikörper
mit verwandter Spezifität
aber anderer idiotyper Zusammensetzung können durch Neukombination von
Ketten aus zufälligen kombinatorischen
Immunglobin-Bibliotheken hergestellt werden (Burton, Proc. Natl.
Acad. Sci. 88, 11120–23 (1991)).
-
Einkettige
Antikörper
könne auch
mithilfe eines DNA-Amplifikationsverfahrens, wie z.B. PCR, unter Einsatz
von Hybridom-cDNA als Matrize konstruiert werden (Thirion et al.,
Euro. J. Cancer Prev. 5, 507–11 (1996)).
Einkettige Antikörper
können
mono- oder bispezifisch
und zweiwertig oder vierwertig sein. Die Konstruktion von vierwertigen,
bispezifischen Einketten-Antikörpern
wird beispielsweise in Coloma & Morrison, Nat.
Biotechnol. 15, 159–63
(1997), gelehrt. Die Konstruktion von zweiwertigen, bispezifischen
Einketten-Antikörpern
ist in Mallender & Voss,
J. Biol. Chem. 269, 199–206
(1994), gelehrt.
-
Eine
Nucleotidsequenz, die für
einen einkettigen Antikörper
kodiert, kann mithilfe von manueller oder automatisierter Nucleotidsynthese
konstruiert, mithilfe von Standard-DNA-Rekombinationsverfahren in ein Expressionskonstrukt
kloniert und in eine Zelle eingeführt werden, um die kodierende
Sequenz zu exprimieren, wie nachstehend beschrieben. Alternativ
dazu können
einkettige Antikörper
direkt unter Einsatz von beispielsweise der Technik der filamentösen Phagen
hergestellt werden (Verhaar et al., Int. J. Cancer 61, 497–501 (1995);
Nicholls et al., J. Immunol. Meth. 165, 81–91 (1993)).
-
Antikörper, die
spezifisch an Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polypeptide binden, können
auch durch Induktion einer In-vivo-Produktion in der Lymphozytenpopulation
oder durch Screening von Immunglobulin-Bibliotheken oder Gruppen
von hochspezifischen Bindungsreagenzien produziert werden, wie in
der Literatur beschrieben ist (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 86, 3833–3837
(1989); Winter et al., Nature 349, 293–299 (1991)).
-
Auch
andere Arten von Antikörpern
können
konstruiert und in Verfahren der Erfindung therapeutisch eingesetzt
werden. Beispielsweise können
chimäre
Antikörper
wie in der WO 93/03151 geoffenbart konstruiert werden. Bindeproteine,
die von Immunglobulinen stammen und mehrwertig und multispezifisch
sind, wie z.B. die in der WO 94/13804 beschriebenen „Diabodies", können ebenfalls
hergestellt werden.
-
Antikörper gemäß der Erfindung
können
durch auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannte Verfahren
gereinigt werden. Beispielsweise können Antikörper affinitätsgereinigt
werden, indem sie über
eine Säule
geschickt werden, an die ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid gebunden ist. Die gebundenen Antikörper können dann unter Einsatz eines
Puffers mit einer hohen Salzkonzentration aus der Säule eluiert
werden.
-
Antisense-Oliponucleotide
-
Antisense-Oligonucleotide
sind Nucleotidsequenzen, die zu einer spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz
komplementär
sind. Sobald sie einmal in eine Zelle eingeführt sind, vereinigen sich die
komplementären Nucleotide
mit natürlichen
Sequenzen, die von der Zelle produziert werden, um Komplexe zu bilden
und entweder die Transkription oder Translation zu blockieren. Vorzugsweise
ist ein Antisense-Oligonucleotid
zumindest 11 Nucleotide lang, es kann aber auch zumindest 12, 15,
20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 oder mehr Nucleotide lang sein. Längere Sequenzen
können
ebenfalls eingesetzt werden. Antisense-Oligonucleotidmoleküle können in
einem DNA-Konstrukt bereitgestellt und in eine Zelle eingeführt werden,
wie oben beschrieben ist, um den Gehalt an Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteingenprodukten in der Zelle zu verringern.
-
Antisense-Oligonucleotide
können
Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide oder eine Kombination aus beiden
sein. Oligonucleotide können
manuell synthetisiert oder durch eine automatisierte Synthesevorrichtung synthetisiert
sein, durch kovalente Bindung des 5'-Endes von einem Nucleotid an das 3'-Ende eines anderen Nucleotids
mit Nicht-Phosphodiester-Internucleotidbindungen, wie z.B. Alkylphosphonaten,
Thiophosphaten, Dithiophosphaten, Alkylthiophosphaten, Alkylphosphonaten,
Phosphoramidaten, Phosphatestern, Carbamaten, Acetamidat, Carboxymethylestern,
Carbonaten und Phosphattriestern. Siehe Brown, Meth. Mol. Biol.
20, 1–8
(1994); Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1–72 (1994); Uhlmann et al.,
Chem. Rev. 90, 543–583
(1990).
-
Modifikationen
der Expression von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteingenen können
erreicht werden, indem Antisense-Oligonucleotide entworfen werden,
die Duplexe an der Kontroll-, 5'-
oder Regulationsregion des Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteingens bilden. Oligonucleotide, die von der Transkriptionsinitiationsstelle stammen,
z.B. zwischen den Positionen –10
und +10 von der Startstelle aus gesehen, sind bevorzugt. Auf ähnliche
Weise kann eine Inhibierung unter Einsatz eines „Tripelhelix"-Basenpaarungsverfahrens erreicht werden. Die
Tripelhelix-Paarung ist zweckdien lich, weil sie zur Inhibierung
der Fähigkeit
der Doppelhelix führt,
sich ausreichend für
die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder Chaperonen
zu öffnen.
Therapeutische Fortschritte unter Verwendung von Triplex-DNA wurden
in der Literatur beschrieben (z.B. Gee et al., in: Huber & Carr, Molecular
and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.,
USA (1994)). Ein Antisense-Oligonucleotid
kann auch so entworfen werden, dass es die Translation von mRNA
blockiert, indem es verhindert, dass das Transkript an Ribosomen
bindet.
-
Eine
exakte Komplementarität
ist für
eine erfolgreiche Komplexbildung zwischen einem Antisense-Oligonucleotid
und der komplementären
Sequenz eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polynucleotids nicht
erforderlich. Antisense-Oligonucleotide, die beispielsweise 2, 3,
4 oder 5 oder mehr Abschnitte von zusammenhängenden Nucleotiden umfassen,
die exakt komplementär
zu einem Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polynucleotid
sind, jeweils durch einen Abschnitt aus zusammenhängenden
Nucleotiden getrennt, die nicht komplementär zu benachbarten Lipoxin-A4-rezeptorartigen Proteinnucleotiden sind,
können
ausreichende Targeting-Spezifität
für Lipoxin-A4-rezeptorartige
Protein-mRNA bereitstellen. Vorzugsweise ist jeder Abschnitt aus
komplementären zusammenhängenden
Nucleotiden zumindest 4, 5, 6, 7 oder 8 oder mehr Nucleotide lang.
Nichtkomplementäre
dazwischen liegende Sequenzen sind vorzugsweise 1, 2, 3 oder 4 Nucleotide
lang. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können leicht den berechneten
Schmelzpunkt eines Antisense-Sense-Paars zur Bestimmung des Grads
an Fehlpaarung nutzen, der zwischen einem bestimmten Antisense-Oligonucleotid
und einer bestimmten Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polynucleotidsequenz toleriert wird.
-
Antisense-Oligonucleotide
können
modifiziert werden, ohne dass ihre Fähigkeit, an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polynucleotid zu hybridisieren,
beeinträchtigt
wird. Diese Modifikationen können
intern oder an einem oder an beiden Enden des Antisense-Moleküls vorliegen.
Inter-Nucleosid-Phosphatbindungen können beispielsweise modifiziert
werden, indem Cholesteryl- oder Diamingruppierungen mit variierenden
Zahlen an Kohlenstoffresten zwischen den Aminogruppen und einer
terminalen Ribose addiert werden. Modifizierte Basen und/oder Zucker,
wie z.B. Arabinose an stelle von Ribose, oder ein 3',5'-substituiertes Oligonucleotid,
in dem die 3'-Hydroxylgruppe oder
die 5'-Phosphatgruppe
substituiert sind, können
ebenfalls in einem modifizierten Antisense-Oligonucleotid verwendet
werden. Diese modifizierten Oligonucleotide können durch auf dem Gebiet der
Erfindung allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden. Siehe
z.B. Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152–158 (1992); Uhlmann et al.,
Chem. Rev. 90, 543–584
(1990); Uhlmann et al., Tetrahedron Lett. 215, 3539–3542 (1987).
-
Ribozyme
-
Ribozyme
sind RNA-Moleküle
mit katalytischer Aktivität.
Siehe z.B. Cech, Science 236, 1532–1539 (1987); Cech, Ann. Rev.
Biochem. 59, 543–568
(1990); Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605–609 (1992); Couture & Stinchcomb, Trends
Genet. 12, 510–515
(1996). Ribozyme können
verwendet werden, um eine Genfunktion durch Spaltung einer RNA-Sequenz
zu hemmen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist (z.B. Haseloff
et al., US-Patent 5.641.673). Der Mechanismus der Ribozymwirkung
umfasst eine sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an eine
komplementäre
Target-RNA, gefolgt von einer endonucleolytischen Spaltung. Beispiele
umfassen gentechnisch veränderte
Hammerhead-Motiv-Ribozymmoleküle,
die eine endonucleolytische Spaltung von spezifischen Nucleotidsequenzen
spezifisch und effizient katalysieren können.
-
Die
kodierende Sequenz eines Lipoxin-A
4-rezeptorartigen
Polynucleotids kann verwendet werden, um Ribozyme zu erzeugen, die
spezifisch an mRNA binden, die vom Lipoxin-A
4-rezeptorartigen
Polynucleotid transkribiert wurde. Verfahren zum Entwerten und Konstruieren
von Ribozymen, die andere RNA-Moleküle in trans auf äußerst sequenzspezifische
Weise spalten können,
wurden entwickelt und auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben (siehe
Haseloff et al., Nature 334, 585–591 (1988)). Die Spaltungsaktivität von Ribozymen kann
beispielsweise auf spezifische RNAs ausgerichtet werden, indem eine
getrennte „Hybridisierungsregion" in das Ribozym eingebaut
wird. Die Hybridisierungsregion enthält eine Sequenz, die komple mentär zur Target-RNA
ist und somit spezifisch an das Target hybridisiert (siehe z.B.
Gerlach et al.,
EP 321.201 ).
-
Spezifische
Ribozym-Spaltstellen innerhalb eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Protein-RNA-Targets können identifiziert
werden, indem das Target-Molekül
auf Ribozym-Spaltstellen
gescreent wird, die folgende Sequenzen enthalten: GUA, GUU und GUC.
Sobald diese identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen aus
zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, die der Region der Target-RNA
entsprechen, welche die Spaltstelle enthält, auf sekundäre Strukturmerkmale
beurteilt werden, welche das Target inoperabel machen. Die Eignung von
Lipoxin-A4-rezeptorartigen Kandidaten-Protein-RNA-Targets
kann auch beurteilt werden, indem die Zugänglichkeit für eine Hybridisierung
mit komplementären
Oligonucleotiden unter Einsatz eines Ribonuclease-Schutztests getestet
wird. Die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenzen und
ihre Komplemente stellen Quellen für geeignete Hybridisierungsregionssequenzen
dar. Längere
komplementäre
Sequenzen können
verwendet werden, um die Affinität
der Hybridisierungssequenz für
das Target zu erhöhen.
Die Hybridisierungs- und Spaltregionen des Ribozyms können untrennbar
zusammenhängen,
sodass bei einer Hybridisierung an die Target-RNA durch die komplementären Regionen
die katalytische Region des Ribozyms das Target spalten kann.
-
Ribozyme
können
in Zellen als Teil eines DNA-Konstrukts eingeführt werden. Mechanische Verfahren, wie
beispielsweise Mikroinjektion, Liposomen-vermittelte Transfektion,
Elektroporation oder Calciumphosphat-Präzipitation, können verwendet
werden, um ein Ribozym enthaltendes DNA-Konstrukt in Zellen einzuführen, in
denen es erwünscht
ist, die Expression von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteinen zu senken. Alternativ dazu kann, wenn es erwünscht ist,
dass die Zellen das DNA-Konstrukt
stabil beibehalten, das Konstrukt auf einem Plasmid zugeführt werden
und als getrenntes Element oder integriert in ein Genom der Zellen
aufrechterhalten werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt
ist. Ein für
ein Ribozym kodierendes DNA-Konstrukt kann Transkriptionsregulationselemente,
wie beispielsweise ein Promotorelement, einen Enhancer oder ein
UAS-Element, und ein Transkripti onsterminationssignal zur Kontrolle
der Transkription von Ribozymen in den Zellen enthalten.
-
Wie
Haseloff et al., US-Patent 5.641.673, lehren, können Ribozyme so gentechnisch
verändert
werden, dass eine Ribozymexpression als Reaktion auf Faktoren stattfindet,
welche die Expression eines Target-Gens induzieren. Ribozyme können auch
so gentechnisch verändert
werden, das ein weiterer Regulierungsgrad bereitgestellt wird, sodass
die Zerstörung
von mRNA nur dann stattfindet, wenn sowohl ein Ribozym als auch
ein Target-Gen in den Zellen induziert werden.
-
Screening-Verfahren
-
Geoffenbart
sind Verfahren zum Screening auf Testverbindungen, die an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid oder ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polynucleotid binden oder
seine Aktivität
modulieren. Eine Testverbindung bindet vorzugsweise an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid oder Polynucleotid.
Noch bevorzugter verringert oder steigert eine Testverbindung die
Aktivität
von Lipoxin-A4-rezeptorartigen Proteinen eines
Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids oder
die Expression eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polynucleotids um zumindest etwa 10 %, vorzugsweise etwa 50, noch
bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %, im Vergleich zur Abwesenheit
der Testverbindung.
-
Testverbindungen
-
Testverbindungen
können
pharmakologische Wirkstoffe, die auf dem Gebiet der Erfindung schon
bekannt sind, oder Verbindungen sein, von denen bisher nicht bekannt
war, dass sie pharmakologische Aktivität aufweisen. Die Verbindungen
können
natürlich
vorkommen oder im Labor entworfen sein. Sie können aus Mikroorganismen, Tieren
oder Pflanzen isoliert sein und können rekombinant hergestellt
oder durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte chemische Verfahren
synthetisiert sein. Falls erwünscht
können
Testverbindungen unter Einsatz beliebiger der zahlreichen auf dem
Gebiet der Erfindung bekannten kombinatorischen Bibliotheksverfah ren
erhalten werden, einschließlich,
nicht jedoch eingeschränkt
auf, biologischer Bibliotheken, räumlich ansteuerbarer paralleler
Festphasen- oder Lösungsphasenbibliotheken,
synthetischer Bibliothekenverfahren, die eine Dekonvulotion erfordern,
des „Ein-Kügelchen-eine-Verbindung"-Bibliothekenverfahrens und
synthetischer Bibliothekenverfahren unter Einsatz von affinitätschromatographischer
Selektion. Der auf einer biologischen Bibliothek basierende Ansatz
ist auf Polypeptid-Bibliotheken eingeschränkt, während die anderen vier Ansätze auf
Polypeptid-, Nichtpeptid-Oligomer-
oder Kleinmolekül-Bibliotheken
von Verbindungen anwendbar sind. Siehe Lam, Anticancer Drug Des.
12, 145 (1997).
-
Verfahren
zur Synthese von molekularen Bibliotheken sein auf dem Gebiet der
Erfindung allgemein bekannt (siehe z.B. DeWitt et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90, 6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91, 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994);
Cho et al., Science 261, 1303 (1993); Carell et al., Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 33, 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994)).
Bibliotheken von Verbindungen können
in Lösung
(siehe z.B. Houghten, Biotechniques 13, 412–421 (1992)) oder auf Kügelchen
(Lam, Nature, 354, 82–84
(1991)), Chips (Fodor, Nature 364, 555–556 (1993)), Bakterien oder
Sporen (Ladner, US-Patent 5.223.409), Plasmiden (Cull et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865–1869
(1992)) oder Phagen (Scott & Smith,
Science 249, 386–390
(1990); Devlin, Science 249, 404–406 (1990); Cwirla et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378–6382 (1990);
Felici, J. Mol. Biol. 222, 301–310
(1991); und Ladner, US-Patent 5.223.409) vorliegen.
-
Hochdurchsatz-Screening
-
Testverbindungen
können
durch Hochdurchsatz-Screening auf ihre Fähigkeit gescreent werden, an
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide oder
Polynucleotide zu binden oder die Aktivität von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteinen oder die Expression von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteingenen zu beeinflussen. Mithilfe von Hochdurchsatz-Screening
können
viele einzelne Verbindungen parallel getestet werden, sodass eine
große
Anzahl an Testverbindungen rasch gescreent werden kann. Die am weitesten
verbreiteten Verfahren nutzen 96-Well-Mikrotiterpaltten. Die Wells
der Mikrotiterplatten erfordern typischerweise Test-Volumina im
Bereich von 50 bis 500 l. Neben den Platten sind auch zahlreiche
Instrumente, Materialien, Pipettoren, Roboter, Platten-Waschvorrichtungen
und Platten-Lesegeräte
im Handel erhältlich,
die für
das 96-Well-Format geeignet sind.
-
Alternativ
dazu können
auch „Freiformat-Tests" oder Tests durchgeführt werden,
die keine physikalische Barriere zwischen Proben aufweisen. Ein
Test unter Verwendung von Pigmentzellen (Melanozyten) in einem einfachen
homogenen Test für
kombinatorische Peptidbibliotheken wurde beispielsweise von Jayawickreme
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19, 1614–18 (1994), beschrieben. Die
Zellen werden unter Agarose in Petrischalen platziert, und dann
werden Kügelchen,
die kombinatorische Verbindungen tragen, an die Oberfläche der
Agarose angelagert. Die kombinatorischen Verbindungen werden teilweise
von den Verbindungen aus den Kügelchen
freigesetzt. Aktive Verbindungen können als dunkle Pigmentbereiche
sichtbar gemacht werden, da, wenn die Verbindungen lokal in die
Gelmatrix diffundieren, die aktiven Verbindungen die Zellen dazu
bringen, ihre Farbe zu ändern.
-
Ein
weiteres Beispiel für
einen Freiformat-Test wurde von Chelsky, „Strategies for Screening
Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", vorgestellt auf
der „First
Annual Conference of the Society for Biomolecular Screening" in Philadelphia,
Pa., USA (7.–10.
Nov. 1995), beschrieben. Chelsky platzierte einen einfachen homogenen
Enzym-Test für
Carbonatdehydrase innerhalb eines Agarosegels, sodass das Enzym
im Gel eine Farbänderung
im gesamten Gel verursachen würde.
Danach wurden Kügelchen,
die kombinatorische Verbindungen über einen Photolinker trugen,
im Gel platziert, und die Verbindungen wurde teilweise durch UV-Licht
freigesetzt. Verbindungen, die das Enzym hemmten, waren als lokale
Hemmzonen zu erkennen, in denen weniger Farbänderung auftrat.
-
Ein
weiteres Beispiel ist in Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57–63 (1996),
beschrieben. In diesem Beispiel wurden kombinatorische Bibliotheken
auf Verbindun gen gescreent, die zytotoxische Auswirkungen auf Krebszellen
hatten, die in Agar wuchsen.
-
Ein
weiteres Hochdurchsatz-Screening-Verfahren ist in Beutel et al.,
US-Patent 5.976.813 beschrieben. In diesem Verfahren werden Testproben
in eine poröse
Matrix gegeben. Eine oder mehrere Test-Komponenten werden dann in,
auf eine Matrix oder am unteren Ende einer Matrix, wie z.B. ein
Gel, eine Kunststofffolie, einen Filter oder eine andere Form eines
leicht manipulierbaren Trägermaterials,
gegeben. Wenn Proben in die poröse
Matrix eingeführt
werden, diffundieren sie ausreichend langsam, sodass die Tests durchgeführt werden
können,
ohne dass die Testproben ineinander verlaufen.
-
Bindungstests
-
Bei
Bindungstests ist die Testverbindung vorzugsweise ein kleines Molekül, das an
die aktive Stelle des Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids bindet und diese besetzt, wodurch die Ligandenbindungsstelle
unzugänglich
für ein
Substrat gemacht wird, sodass eine normale biologische Aktivität verhindert
wird. Beispiele für
solche kleinen Moleküle
umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, kleine Peptide oder
peptidartige Moleküle.
Mögliche
Liganden, die an ein Polypeptid der Erfindung binden, umfassen,
sind jedoch nicht eingeschränkt
auf, die natürlichen
Liganden von bekannten Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteinen und Analoga und Derivaten davon.
-
Bei
Bindungstests kann entweder die Testverbindung oder das Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptid eine detektierbare
Markierung umfassen, beispielsweise eine fluoreszierende, Radioisotop-,
chemilumineszierende oder enzymatische Markierung, wie z.B. Meerrettichperoxidase,
alkalische Phosphatase oder Luciferase. Die Detektion einer Testverbindung,
die an das Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptid
gebunden ist, kann dann beispielsweise durch direktes Zählen der
Radioemission, durch Szintillationszählung oder durch Bestimmung
der Überführung eines
geeigneten Substrats in ein detektierbares Produkt erfolgen.
-
Alternativ
dazu kann die Bindung einer Testverbindung an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid ohne Markierung
der Wechselwirkungselemente erfolgen. Beispielsweise kann ein Mikrophysiometer
eingesetzt werden, um die Bindung einer Testverbindung mit einem
Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptid zu
detektieren. Ein Mikrophysiometer (z.B. CytosensorTM)
ist ein Analysegerät,
das mithilfe eines lichtadressierbaren potentiometrischen Sensors
(LAPS) die Geschwindigkeit misst, mit der eine Zelle zu einer Ansäuerung seiner Umgebung
führt. Änderungen
dieser Ansäuerungsgeschwindigkeit
können
als Indikator für
die Wechselwirkung zwischen einer Testverbindung und einem Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptid genutzt werden
(McConnell et al., Science 257, 1906–1912 (1992)).
-
Die
Bestimmung der Fähigkeit
einer Testverbindung, an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid zu binden, kann auch mithilfe einer Technologie wie der
bimolekularen Wechselwirkungsanalyse („Bimolecular Interaction Analysis", BIA) in Echtzeit
erfolgen (Sjolander & Urbaniczky,
Anal. Chem. 63, 2338–2345
(1991), und Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699–705 (1995)).
BIA ist eine Technologie zur Untersuchung von biospezifischen Wechselwirkungen
in Echtzeit, ohne dass die Wechselwirkungspartner markiert werden
(z.B. BIAcoreTM). Änderungen im optischen Phänomen der
Oberflächen-Plasmonresonanz
(SPR) können
als Indikation von Echtzeitreaktionen zwischen biologischen Molekülen genutzt
werden.
-
In
einem weiteren Aspekt der Erfindung kann ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid als „Köderprotein" in einem Zwei-Hybrid-Test
oder Drei-Hybrid-Test verwendet werden (siehe z.B. US-Patent 5.283.317;
Zervos et al., Cell 72, 223–232
(1993); Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046–12054 (1993); Bartel et al.,
Biotechniges 14, 920–924
(1993); Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693–1696 (1993); und Brent, WO94/10300),
um andere Proteine zu identifizieren, die an das Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptid binden oder damit
wechselwirken oder seine Aktivität
modulieren.
-
Das
Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Beschaffenheit der
meisten Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Bindungs-
und -Aktivierungsdo mänen
bestehen. Kurz gesagt nutzt der Test zwei unterschiedliche DNA-Konstrukte.
In einem Konstrukt kann beispielsweise ein für ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid kodierendes Polynucleotid an ein Polynucleotid fusioniert
werden, das für
die DNA-Bindungsdomäne
eines bekannten Transkriptionsfaktors (z.B. GAL-4) kodiert. Im anderen
Konstrukt kann eine DNA-Sequenz, die für ein unidentifiziertes Protein
(„Beute" oder „Probe") kodiert, an ein
Polynucleotid fusioniert werden, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten
Transkriptionsfaktors kodiert. Wenn die „Köder"- und „Beute"-Proteine in der
Lage sind, in vivo zu wechselwirken und einen protein-abhängigen Komplex
zu bilden, dann werden die DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors
sehr nahe zueinander gebracht. Diese Nähe erlaubt die Transkription
eines Reportergens (z.B. LacZ), das operabel an eine Transkriptionsregulationsstelle
gebunden ist, die auf den Transkriptionsfaktor anspricht. Eine Expression
des Reportergens kann detektiert werden, und Zellkolonien, die den
funktionellen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert und zum Erhalt
der DNA-Sequenz verwendet werden, die für das Protein kodiert, das
mit dem Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptid
wechselwirkt.
-
Es
kann wünschenswert
sein, entweder das Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polypeptid (oder Polynucleotid) oder die Testverbindung zu isolieren,
um die Trennung der gebundenen von den ungebundenen Formen eines oder
beider Wechselwirkungspartner zu vereinfachen sowie die Automatisierung
des Tests zu ermöglichen. Somit
kann entweder das Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polypeptid (oder Polynucleotid) oder die Testverbindung an einen
festen Träger
gebunden sein. Geeignete feste Trägermaterialien umfassen, sind
jedoch nicht eingeschränkt
auf, Glas- oder Kunststoff-Objektträger, Gewebekulturplatten,
Mikrotiterplatten, Röhrchen,
Silicon-Chips oder Teilchen wie Kügelchen (einschließlich, nicht
jedoch eingeschränkt
auf, Latex-, Polystyrol- oder Glaskügelchen). Jedes beliebige auf
dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren kann eingesetzt werden, um
das Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptid
(oder Polynucleotid) oder eine Testverbindung an ein festes Trägermaterial
zu binden, einschließlich
des Einsatzes von kovalenten und nichtkovalenten Bindungen, passiver Absorption
oder Paaren von Bindungsgruppierungen, die jeweils an das Polypeptid
(oder Polynucleotid) oder eine Testverbindung und das Trägermaterial
ge bunden sind. Testverbindungen sind vorzugsweise in einem Array
an das Trägermaterial
gebunden, sodass die Position der einzelnen Testverbindungen ausgemacht
werden kann. Die Bindung einer Testverbindung an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid (oder Polynucleotid) kann
in jedem beliebigen Gefäß erfolgen,
das dafür
geeignet ist, solche Reaktanten aufzunehmen. Beispiele für solche
Gefäße umfassen
Mikrotiterplatten, Reagenzgläser
und Mikrozentrifugengläser.
-
In
einer Ausführungsform
ist das Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptid
ein Fusionsprotein, das eine Domäne
umfasst, die es dem Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptid erlaubt, an ein festes Trägermaterial gebunden zu werden.
Beispielsweise können
Glutathion-S-transferase-Fusionsproteine auf Gutathion-Sepharose-Kügelchen
(Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA) oder Glutathion-derivatisierte
Mikrotiterplatten absorbiert werden, die dann mit der Testverbindung
oder mit der Testverbindung und dem nicht adsorbierten Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptid kombiniert werden;
das Gemisch wird dann unter Bedingungen inkubiert, die für eine Komplexbildung
förderlich
sind (z.B. unter physiologischen Bedingungen für Salz und pH). Nach einer Inkubation
werden die Kügelchen
oder Mikrotiterplatten-Wells gewaschen, um ungebundene Komponenten
zu entfernen. Die Bindung der Wechselwirkungspartner kann entweder
direkt oder indirekt bestimmt werden, wie oben beschrieben ist.
Alternativ dazu können
Komplexe vom festen Trägermaterial
abgetrennt werden, bevor die Bindung bestimmt wird.
-
Andere
Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen oder Polynucleotiden
auf einem festen Trägermaterial
können
ebenfalls in den Screening-Tests der Erfindung eingesetzt werden.
Beispielsweise kann entweder ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid (oder Polynucleotid) oder eine Testverbindung unter Einsatz der
Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinylierte
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide (oder
Polynucleotide) oder Testverbindungen können aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid)
unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten
Verfahren hergestellt (z.B. Biotinylierungsset, Pierce Chemicals,
Rockford, III., USA) und in den Wells von mit Streptavidin beschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical)
immobilisiert werden. Alternativ dazu können Antikörper, die spezifisch an ein
Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid oder
Polynucleotid oder eine Testverbindung binden, eine gewünschte Bindungsstelle,
wie z.B. die aktive Stelle des Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids, aber nicht stören,
in die Wells der Platte derivatisiert werden. Ein ungebundenes Target
oder Protein kann durch Antikörper-Konjugation
in den Wells gefangen werden.
-
Verfahren
zur Detektion solcher Komplexe umfassen neben den oben für GST-immobilisierte Komplexe
beschriebenen auch die Immundetektion von Komplexen unter Verwendung
von Antikörpern,
die spezifisch an das Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polypeptid oder die Testverbindung binden, enzymgekoppelte Tests,
die von der Detektion einer Aktivität des Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids abhängen,
und SDS-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen.
-
Das
Screening auf Testverbindungen, die an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid oder Polynucleotid binden, kann auch in einer intakten
Zelle durchgeführt
werden. Jede beliebige Zelle, die ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid oder Polynucleotid umfasst, kann in einem zellbasierten
Test-System eingesetzt werden. Ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polynucleotid
kann natürlich
in der Zelle vorkommen oder unter Einsatz von Verfahren, wie sie
oben beschrieben sind, in die Zelle eingeführt werden. Die Bindung der
Testverbindung an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid oder Polynucleotid wird wie oben beschrieben bestimmt.
-
Tests für Lipoxin-A4-rezeptorartige Proteine
-
Testverbindungen
können
auf ihre Fähigkeit
getestet werden, die durch ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
vermittelte Signaltransduktion zu steigern oder zu verringern. Funktionelle
Tests umfassen die Verwendung von Zellen, die den G-Protein-gebundenen Rezeptor
exprimieren (z.B. transfizierte CHO-Zellen), in einem System, das
extrazelluläre
pH-Änderungen
misst, die durch Rezeptoraktivierung verursacht werden (siehe z.B.
Science 246, 181–296
(1989)). Beispielsweise können
Verbindungen mit einer Zelle kontaktiert werden, die das Rezeptor-Polypeptid
der vorliegenden Erfindung exprimiert, und eine zweite Messenger-Antwort,
z.B. Signaltrans duktion oder pH-Änderungen,
kann gemessen werden, um zu bestimmen, ob die potentielle Verbindung
den Rezeptor aktiviert oder hemmt. Funktionelle Tests können durchgeführt werden,
nachdem entweder ein gereinigtes Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid, ein Zellmembran-Präparat
oder ein intakte Zelle mit einer Testverbindung kontaktiert wurde.
Eine Testverbindung, welche die Aktivität eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Proteins
um zumindest etwa 10 %, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa
75, 90 oder 100 %, verringert, wird als möglicher Wirkstoff zur Verringerung
der Aktivität
des Lipoxin-A4-rezeptorartigen Proteins
identifiziert. Eine Testverbindung, welche die Aktivität des Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids um zumindest
etwa 10 %, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder
100 %, steigert, wird als möglicher
Wirkstoff zur Steigerung der Aktivität des Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteins identifiziert.
-
Ein
weiteres Screening-Verfahren umfasst den Einsatz von Melanophoren,
die transfiziert werden, um den G-Protein-gebundenen Rezeptor der
vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Solch ein Screening-Verfahren
ist in der WO 92/01810 beschrieben. So kann beispielsweise ein Test
zum Screenen auf eine Verbindung eingesetzt werden, welche die Aktivierung
des Rezeptor-Polypeptids der vorliegenden Erfindung hemmt, indem
die Melanophorzellen, die für
den Rezeptor kodieren, mit sowohl dem Rezeptor-Liganden als auch
einer zu screenenden Verbindung kontaktiert werden. Die Hemmung
des durch den Liganden erzeugten Signals zeigt, dass eine Verbindung
ein möglicher
Antagonist für
den Rezeptor ist, d.h. die Aktivierung des Rezeptors hemmt. Das
Screening kann zur Identifikation einer Verbindung eingesetzt werden,
die den Rezeptor aktiviert, indem solche Zellen mit zu screenenden
Verbindungen kontaktiert werden und bestimmt wird, ob jede einzelne Verbindung
ein Signal erzeugt, d.h. den Rezeptor aktiviert.
-
Ein
weiteres solches Screening-Verfahren umfasst die Einführung von
für einen
G-Protein-gebundenen
Rezeptor kodierender RNA in Xenopus-Eizellen, um den Rezeptor vorübergehend
zu exprimieren. Die Rezeptor-Eizellen können dann mit dem Rezeptor-Liganden
und einer zu screenenden Verbindung kontaktiert werden, gefolgt
von der Detektion der Hemmung oder Aktivierung eines Calcium-Signals,
wenn auf Verbindungen gescreent wird, die vermutlich die Aktivierung
des Rezeptors hemmen.
-
Ein
weiteres Screening-Verfahren umfasst die Expression des G-Protein-gebundenen Rezeptors
in Zellen, in denen der Rezeptor an eine Phospholipase C oder D
gebunden ist. Solche Zellen umfassen Endothelzellen, Zellen der
glatten Muskulatur, embryonale Nierenzellen usw. Das Screening kann
wie oben beschrieben erreicht werden, indem der Grad der Aktivierung
des Rezeptors aufgrund von Änderungen
in der Phospholipase-Aktivität
quantifiziert wird.
-
Detaillierte
Beispiele für
funktionelle Tests, wie sie oben beschrieben sind, sind in den nachfolgenden spezifischen
Beispielen angeführt.
-
Expression von Lipoxin-A4-rezeptorartipen Genen
-
In
einer weiteren Ausführungsform
werden Testverbindungen identifiziert, welche die Expression von Lipoxin-A4-rezeptorartigen Proteingenen verringert
oder steigern. Ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polynucleotid wird mit einer Testverbindung kontaktiert, und die
Expression einer RNA oder eines Polypeptidprodukts des Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polynucleotids wird bestimmt. Der Grad der Expression einer geeigneten
mRNA oder eines geeigneten Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung
wird mit dem Grad der Expression von mRNA oder eines Polypeptids
in Abwesenheit der Testverbindung verglichen. Die Testverbindung
kann dann auf Basis diese Vergleichs als Modulator der Expression
identifiziert werden. Wenn beispielsweise die Expression von mRNA
oder eines Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung stärker ist
als in ihrer Abwesenheit, dann wird die Testverbindung als Stimulator
oder Enhancer der mRNA- oder Polypeptid-Expression identifiziert.
Alternativ dazu wird, wenn die Expression der mRNA oder des Polypeptids
in Gegenwart der Testverbindung schwächer ist als in ihrer Abwesenheit,
die Testverbindung als Inhibitor der mRNA- oder Polypeptid-Expression
identifiziert.
-
Der
Grad der Expression von Lipoxin-A4-rezeptorartiger
mRNA oder Lipoxin-A4-rezeptorartigem Polypeptid in Zellen
kann durch Verfahren bestimmt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung
für die
Detektion von mRNA oder eines Polypeptids bekannt sind. Es können entweder
qualitative oder quantitative Verfahren verwendet werden. Die Gegenwart
von Polypeptidprodukten eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polynucleotids kann beispielsweise unter Verwendung zahlreicher
verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt
sind, einschließlich
immunchemischer Verfahren, wie z.B. Radioimmuntest, Western-Blotting
und Immunhistochemie, bestimmt werden. Alternativ dazu kann eine
Polypeptidsynthese in vivo, in einer Zellkultur oder in einem In-vitro-Translationssystem
bestimmt werden, indem die Inkorporation von markierten Aminosäuren in
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
detektiert wird.
-
Solch
ein Screening kann entweder in einem zellfreien Test-System oder
in einer intakten Zelle durchgeführt
werden. Jede beliebige Zelle, die ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polynucleotid
exprimiert, kann in einem zellbasierten Test-System verwendet werden.
Das Lipoxin-A4-rezeptorartige Polynucleotid
kann in der Zelle natürlich
vorkommen oder unter Verwendung von Verfahren, wie sie oben beschrieben
sind, eingeführt werden.
Es kann entweder eine Primärkultur
oder eine etablierte Zelllinie, wie beispielsweise CHO- oder menschliche
embryonale Nieren-293-Zellen, verwendet werden.
-
Diagnostische
und therapeutische Indikationen und Verfahren
-
GPCRs
sind in Säugetieren,
einschließlich
Menschen, überall
zu finden und für
zahlreiche biologische Funktionen, einschließlich zahlreicher Pathologien,
verantwortlich. Demgemäß ist es
wünschenswert,
Verbindungen und Arzneimittel zu finden, die GPCRs einerseits stimulieren
und andererseits die Funktion von GPCRs hemmen können. Beispielsweise können Verbindungen,
die einen GPCR aktivieren, zu therapeutischen Zwecken, wie beispielsweise
zur Behandlung von Asthma, der Parkinson-Krankheit, von akutem Herzversagen,
Harnretention und Osteoporose, eingesetzt werden. Im Speziellen
sind Verbindungen, welche die Rezeptoren der vorlie genden Erfindung
aktivieren, bei der Behandlung von verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen
zweckdienlich, wie z.B. solchen, die durch mangelhafte Lungenblutzirkulation
oder durch Hypertension verursacht werden. Darüber hinaus können diese
Verbindungen bei der Behandlung verschiedener physiologischer Störungen im
Zusammenhang mit anormaler Kontrolle von Flüssigkeits- und Elektrolythomöostase und
bei Erkrankungen im Zusammenhang mit anormaler, Angiotensin-induzierter
Aldosteronsekretion verwendet werden.
-
Im
Allgemeinen können
Verbindungen, welche die Aktivierung eines GPCR inhibieren, zu zahlreichen therapeutischen
Zwecken verwendet werden, beispielsweise zur Behandlung von Hypotension
und/oder Hypertension, Angina pectoris, Myokardinfarkt, Geschwüren, Asthma,
Allergien, benigner Prostatahypertrophie und psychotischen und neurologischen
Leiden einschließlich
Schizophrenie, manischer Erregung, Depression, Delirium, Demenz
oder schwerer geistiger Behinderungen, Dyskinesien, wie z.B. Huntington-Krankheit
und Tourette-Syndrom, und dergleichen. Verbindungen, die GPCRs hemmen,
haben sich auch bei der Umkehrung endogener Anorexie und bei der Überwachung
von Bulimie als zweckdienlich herausgestellt. Im Speziellen sind
Verbindungen, welche die Aktivierung der Rezeptoren der vorliegenden
Erfindung hemmen, auch bei der Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Beschwerden
zweckdienlich, wie beispielsweise solchen, die durch exzessive pulmonale
Blutzirkulation oder durch Hypotension verursacht werden. Außerdem können diese
Verbindungen bei der Behandlung verschiedener physiologischer Erkrankungen,
die mit anormaler Steuerung von Flüssigkeits- und Elektrolythomöostase zusammenhängen, und
von Krankheiten im Zusammenhang mit anormaler Angiotensininduzierter
Aldosteronsekretion eingesetzt werden.
-
Die
Modulation der Bindung von Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteinen an ihren natürlich
vorkommenden Liganden kann beispielsweise bei der Steuerung von
Homöostase,
vaskulärer
Reaktivität,
insbesondere Vasokonstriktion, und anaphylaktischen und allergischen
Reaktionen bei Säugetieren,
vorzugsweise Menschen, eingesetzt werden (siehe US-Patent 5.079.261).
Das Blockieren der Bindung des Liganden eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteins an den Rezeptor kann beispielsweise einge setzt werden,
um die Entzündungsreaktion
von Neutrophilen zu verringern. Alternativ dazu können Agonisten
eines menschlichen Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteins verwendet werden, um diese Entzündungsreaktion zu induzieren
oder zu steigern.
-
Neue
Wirkstoffe, die durch die oben beschriebenen Screening-Tests identifiziert
wurden, können
zur Regulierung der Aktivität
von menschlichem Lipoxin-A4-rezeptorartigem
Protein eingesetzt werden. Demgemäß wird die Verwendung einer
wie hierin beschrieben identifizierten Verbindung in einem geeigneten
Tiermodell geoffenbart. Beispielsweise kann ein wie hierin beschrieben
identifizierter Wirkstoff (z.B. ein Modulator, ein Antisense-Nucleinsäuremolekül, ein spezifischer
Antikörper,
ein Ribozym oder ein Proteinbindungspartner) in einem Tiermodell
eingesetzt werden, um die Wirksamkeit, Toxizität oder Nebenwirkungen einer
Behandlung mit solch einem Wirkstoff zu bestimmen. Alternativ dazu
kann ein wie hierin beschrieben identifizierter Wirkstoff in einem
Tiermodell eingesetzt werden, um den Wirkungsmechanismus solch eines
Wirkstoffs zu bestimmen.
-
Ein
Reagens, das sich auf die Aktivität eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteins auswirkt, kann entweder in vitro oder in vivo an eine menschliche
Zelle verabreicht werden, um die Aktivität des Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteins zu verringern. Das Reagens bindet vorzugsweise an ein Expressionsprodukt
eines menschlichen Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteingens. Wenn das Expressionsprodukt ein Protein ist, ist das Reagens
vorzugsweise ein Antikörper.
Zur Behandlung von menschlichen Zellen ex vivo kann der Antikörper zu
einem Präparat
von Stammzellen zugesetzt werden, die aus dem Körper entnommen wurden. Die
Zellen können
dann wieder in den gleichen oder in einen anderen menschlichen Körper eingesetzt
werden, mit oder ohne klonale(r) Vermehrung, wie auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt ist.
-
Das
Reagens kann unter Verwendung eines Liposoms zugeführt werden.
Vorzugsweise ist das Liposom in dem Tier stabil, in das es zumindest
etwa 30 min lang, noch bevorzugter zumindest etwa 1 h lang, und noch
bevorzugter zumindest etwa 24 h lang, verabreicht wurde. Ein Liposom
umfasst eine Lipidzusammensetzung, die in der Lage ist, auf ein
Reagens, insbesondere ein Polynucleotid, an einer bestimmten Stelle
in einem Tier, wie z.B. einem Menschen, abzuzielen. Vorzugsweise
ist die Lipidzusammensetzung des Liposoms in der Lage, auf ein spezifisches
Organ eines Tiers, wie z.B. Lunge, Leber, Milz, Herz, Gehirn, Lymphknoten
und Haut, abzuzielen.
-
Ein
zweckdienliches Liposom umfasst eine Lipidzusammensetzung, die in
der Lage ist, mit der Plasmamembran der Target-Zelle zu fusionieren,
um der Zelle ihre Inhalte zuzuführen.
Vorzugsweise beträgt
die Transfektionswirksamkeit eines Liposoms etwa 0,5 μg DNA pro
16 nmol Liposom, die etwa 106 Zellen zugeführt werden,
noch bevorzugter etwa 1,0 μg
DNA pro 16 nmol Liposom, die etwa 106 Zellen
zugeführt
werden, und sogar noch bevorzugter etwa 2,0 μg DNA pro 16 nmol Liposom, die
etwa 106 Zellen zugeführt werden. Vorzugsweise weist
ein Liposom einen Durchmesser von zwischen etwa 100 und 500 nm,
noch bevorzugter zwischen etwa 150 und 450 nm, und noch bevorzugter
zwischen etwa 200 und 400 nm, auf.
-
Geeignete
Liposomen umfassen jene Liposomen, die standardmäßig beispielsweise in Fachleuten
auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Genzufuhrverfahren verwendet
werden. Noch bevorzugtere Liposomen umfassen Liposomen mit einer
polykationischen Lipidzusammensetzung und/oder Liposomen mit einer
Cholesterin-Hauptkette,
die an Polyethylenglykol konjugiert ist. Gegebenenfalls umfasst
ein Liposom eine Verbindung, die in der Lage ist, das Liposom auf
eine Tumorzelle auszurichten, wie z.B. ein Tumorzellligand, der
an der äußeren Oberfläche des
Liposoms exponiert ist.
-
Das
Komplexieren eines Liposoms mit einem Reagens wie z.B. einem Antisense-Oligonucleotid oder einem
Ribozym kann unter Verwendung von Verfahren erreicht werden, die
auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind (siehe z.B. US-Patent
Nr. 5.705.151). Vorzugsweise werden etwa 0,1 μg bis etwa 10 μg Polynucleotid
mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert, noch bevorzugter werden etwa
0,5 μg bis
etwa 5 μg
Polynucleotide mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert, und sogar noch
bevorzugter werden etwa 1,0 μg
Polynucleotide mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert.
-
Antikörper können spezifischen
Geweben in vivo unter Verwendung von Rezeptor-vermittelter gerichteter Zufuhr zugeführt werden.
Rezeptor-vermittelte DNA-Zufuhrverfahren werden beispielsweise in
Findeis et al., Trends in Biotechnol. 11, 202–205 (1993); Chiou et al.,
Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer,
J.A. Wolff (Hrsg.) (1994); Wu & Wu,
J. Biol. Chem. 263, 621–624
(1988); Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 542–546 (1994); Zenke et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655–3659 (1990); Wu et al., J. Biol.
Chem. 266, 338–342
(1991), erläutert.
-
Bestimmung
einer therapeutisch wirksamen Dosis
-
Die
Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis liegt durchwegs im
Kompetenzbereich von Fachleuten. Eine therapeutisch wirksame Dosis
bezieht sich auf jene Menge eines Wirkbestandteils, welche die Aktivität eines
Lipoxin-A4-rezeptorartigen Proteins in Bezug
auf die Aktivität
des Lipoxin-A4-rezeptorartigen Proteins,
die in Abwesenheit der therapeutisch wirksamen Dosis auftritt, erhöht oder
verringert.
-
Für jede beliebige
Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich entweder
in Zellkultur-Tests oder in Tiermodellen, üblicherweise in Mäusen, Kaninchen,
Hunden oder Schweinen, geschätzt
werden. Das Tiermodell kann auch eingesetzt werden, um den geeigneten
Konzentrationsbereich und den Verabreichungsweg zu bestimmen. Solche
Information kann dann verwendet werden, um nützliche Dosen und Verabreichungswege
für Menschen
zu bestimmen.
-
Die
therapeutische Wirksamkeit und Toxizität, z.B. ED50 (die
Dosis, die in 50 % der Population therapeutisch wirksam ist) und
LD50 (die Dosis, die für 50 % der Population letal
ist), können
durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder in
Versuchstieren bestimmt werden. Das Dosisverhältnis von toxischen zu therapeutischen
Wirkungen ist der therapeutische Index, der als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden
kann.
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die große
therapeutische Indices aufweisen, werden bevorzugt. Die aus den
Zellkulturtests und den Tierstudien erhaltenen Daten werden zur
Formulierung eines Dosierungsbereichs zur Verwendung an Menschen
herangezogen. Die in solchen Zusammensetzungen enthaltene Dosierung
liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von zirkulierenden Konzentrationen,
welche die ED50 mit wenig oder keiner Toxizität umfassen.
Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereichs je nach der verwendeten
Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten und des Verabreichungswegs.
-
Die
exakte Dosierung wird vom Arzt unter Berücksichtigung von Faktoren bestimmt,
die mit dem Individuum, das der Behandlung bedarf, zusammenhängen. Dosierung
und Verabreichung können
so eingestellt werden, dass ausreichende Konzentrationen des aktiven
Bestandteils bereitgestellt werden oder dass die erwünschte Wirkung
aufrechterhalten wird. Faktoren, die berücksichtigt werden können, umfassen
die Schwere des Erkrankungszustandes, den allgemeinen Gesundheitszustand
des Individuums, Alter, Gewicht und Geschlecht des Individuums,
Ernährung,
Zeitpunkt und Häufigkeit
der Verabreichung, Wirkstoffkombination(en), Reaktionsempfindlichkeiten
und Toleranz bzw. Reaktion auf die Therapie. Langfristig wirkende
pharmazeutische Zusammensetzungen können, je nach der Halbwertszeit
und der Clearance-Rate der jeweiligen Formulierung, alle 3 bis 4
Tage, einmal wöchentlich
oder einmal alle zwei Wochen verabreicht werden.
-
Normale
Dosierungsmengen können,
je nach Verabreichungsweg, von 0,1 bis 100.000 μg bis hin zu einer Gesamtdosis
von etwa 1 g variieren. Leitfäden
bezüglich
der jeweiligen Dosierungen und Verfahren zur Verabreichung sind
in der Literatur zu finden und auf dem Gebiet der Erfindung arbeitenden Ärzten zugänglich. Fachleute
werden für
Nucleotide andere Formulierungen verwenden als für Proteine oder ihre Inhibitoren.
Auf ähnliche
Weise erfolgt die Zufuhr von Polynucleotiden oder Polypeptiden spezifisch
für bestimmte
Zellen, Leiden, Körperstellen
usw.
-
Ist
das Reagens ein einkettiger Antikörper, so können Polynucleotide, die für den Antikörper kodieren, konstruiert
und in eine Zelle entweder ex vivo oder in vivo unter Verwendung
allgemein bekannter Verfahren eingeführt werden, einschließlich, nicht
jedoch eingeschränkt
auf, Transferrin-Polykation-vermittelten DNA-Transfers, Trans fektion
mit nackten oder eingekapselten Nucleinsäuren, Liposomen-vermittelter
Zellfusion, intrazellulären
Transports von DNA-beschichteten Latexkügelchen, Protoplastenfusion,
Virusinfektion, Elektroporation, „Genkanone" und DEAE- oder Calciumphosphat-vermittelter
Transfektion.
-
Wirksame
In-vivo-Dosierung eines Antikörpers
liegen im Bereich von etwa 5 μg
bis etwa 50 μg/kg, etwa
50 μg bis
etwa 5 mg/kg, etwa 100 μg
bis etwa 500 μg/kg
Körpergewicht
des Individuums und etwa 200 bis etwa 250 μg/kg Körpergewicht des Individuums.
Zur Verabreichung von Polynucleotiden, die für einkettige Antikörper kodieren,
liegen wirksame In-vivo-Dosierungen im Bereich von etwa 100 ng bis
etwa 200 ng, 500 ng bis etwa 50 mg, etwa 1 μg bis etwa 2 mg, etwa 5 μg bis etwa
500 μg und
etwa 20 μg
bis etwa 100 μg
DNA.
-
Ist
das Expressionsprodukt mRNA, so ist das Reagens vorzugsweise ein
Antisense-Oligonucleotid oder
ein Ribozym. Polynucleotide, die Antisense-Oligonucleotide oder
Ribozyme exprimieren, können
mithilfe verschiedenster Verfahren, wie sie oben beschrieben sind,
in Zellen eingeführt
werden.
-
Vorzugsweise
reduziert ein Reagens die Expression eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteingens oder die Aktivität
eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids
um zumindest etwa 10 %, vorzugsweise etwa 50, noch bevorzugter etwa
75, 90 oder 100 %, bezogen auf die Abwesenheit des Reagens. Die
Wirksamkeit des Mechanismus, der ausgewählt wird, um das Expressionsausmaß eines
Lipoxin-A4-rezeptorartigen Proteingens oder die
Aktivität
eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids
zu reduzieren, kann unter Verwendung von Verfahren bewertet werden,
die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, beispielsweise durch
Hybridisierung von Nucleotidsonden an für ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Protein spezifische mRNA, durch quantitative RT-PCR, durch immunologische
Detektion eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids oder durch Messung der Aktivität eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteins.
-
Jede
beliebige der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung kann
in Kombination mit anderen geeigneten therapeutischen Mitteln verabreicht
werden. Die Auswahl der geeigneten Mittel zur Verwendung in einer
Kombinationstherapie kann von durchschnittlichen Fachleuten auf
dem Gebiet der Erfindung gemäß herkömmlichen
pharmazeutischen Prinzipien vorgenommen werden. Die Kombination
von therapeutischen Mitteln kann synergistisch wirken, was sich
auf die Behandlung oder Prävention
der verschiedenen oben beschriebenen Erkrankungen auswirkt. Mithilfe
dieses Ansatzes kann es ermöglicht
werden, therapeutische Wirksamkeit mit geringeren Dosierungen der
einzelnen Mittel zu erreichen, wodurch die Möglichkeit negativer Nebenwirkungen
reduziert wird.
-
Jedes
beliebige der oben beschriebenen Therapieverfahren kann an jedem
Individuum, das einer solchen Therapie bedarf, angewandt werden,
einschließlich
beispielsweise Säugetiere,
wie z.B. Hunde, Katzen, Kühe,
Pferde, Kaninchen, Affen und insbesondere Menschen.
-
BEISPIEL 1
-
Detektion von Lipoxin-A4-rezeptorartiger Aktivität
-
Das
Polynucleotid der Seq.-ID Nr. 1 wird in den Expressionsvektor pCEV4
insertiert, und das erhaltene Expressionsvektor-pCEV4-Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptid wird in menschliche
embryonale Nieren-293-Zellen transfiziert. Die Zellen werden aus
einem Kulturkolben in 5 ml Tris HCl, 5 mM EDTA, pH 7,5, geschabt
und durch Beschallung lysiert. Zelllysate werden bei 1.000 U/min
5 min lang bei 4°C
zentrifugiert. Der Überstand
wird bei 30.000 × g
20 min lang bei 4°C
zentrifugiert. Das Pellet wird in einen Bindungspuffer, der 50 mM
Tris HCl, 5 mM MgSO4, 1 mM EDTA, 100 mM
NaCl, pH 7,5, enthält
und mit 0,1 % BSA, 2 μg/ml
Aprotinin, 0,5 mg/ml Leupeptin und 10 μg/ml Phosphoramidon ergänzt ist,
suspendiert. Optimale Membransuspensionsverdünnungen, die als Proteinkonzentration
definiert sind, die erforderlich ist, um weniger als 10 % eines hinzugefügten Radioliganden,
d.h. 125I-markiertes Lipoxin A4,
zu binden, werden zu 96-Well-Polypropylen-Mikrotiterplatten, die
einen Liganden, nicht-markierte Peptide und einen Bindungspuffer
enthalten, zu einem Endvolumen von 250 μl zugesetzt.
-
In
Gleichgewichts-Sättigungsbindungstests
werden Membranpräparate
in Gegenwart von steigenden Konzentrationen (0,1 nM bis 4 nM) eines 125I-Liganden inkubiert.
-
Bindungsreaktionsgemische
werden eine Stunde lang bei 30°C
inkubiert. Die Reaktion wird durch Filtration durch GF/B-Filter,
die mit 0,5 % Polyethylenimin behandelt wurden, unter Verwendung
eines Zellernters gestoppt. Radioaktivität wird durch Szintillationszählung gemessen,
und die Daten werden durch ein computergesteuertes nichtlineares
Regressionsprogramm analysiert. Eine nichtspezifische Bindung ist
definiert als die Menge an Radioaktivität, die nach der Inkubation
eines Membranproteins in Gegenwart von 100 nM unmarkiertem Peptid
verbleibt. Die Proteinkonzentration wird mithilfe des Bradford-Verfahrens
unter Verwendung eines Bio-Rad-Reagens
mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Die Lipoxin-A4-rezeptorartige Aktivität des Polypeptids, das die
Aminosäuresequenz
der Seq.-ID Nr. 2 umfasst, wird gezeigt.
-
BEISPIEL 2
-
Radioliganden-Bindungstests
-
Menschliche
embryonale Nieren-293-Zellen, die mit einem Polynucleotid transfiziert
sind, das ein menschliches Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Protein exprimiert, werden aus einem Kulturkolben in 5 ml Tris HCl, 5
mM EDTA, pH 7,5, geschabt und durch Beschallung lysiert. Zelllysate
werden bei 1.000 U/min 5 min lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand
wird bei 30.000 × g
20 min lang bei 4°C
zentrifugiert. Das Pellet wird in einen Bindungspuffer, der 50 mM
Tris HCl, 5 mM MgSO4, 1 mM EDTA, 100 mM
NaCl, pH 7,5, enthält
und mit 0,1 % BSA, 2 μg/ml
Aprotinin, 0,5 mg/ml Leupeptin und 10 μg/ml Phosphoramidon ergänzt ist,
suspendiert. Optimale Membransuspensionsverdünnungen, die als Proteinkonzentration
definiert sind, die erforderlich ist, um weniger als 10 % eines
hinzugefügten
Radioliganden, d.h. 125I-markiertes Lipoxin
A4, zu binden, werden zu 96-Well-Polypropylenmikrotiterplatten,
die einen 125I-markier ten Liganden oder
eine Testverbindung, nicht-markierte Peptide und Bindungspuffer
enthalten, zu einem Endvolumen von 250 μl zugesetzt.
-
In
Gleichgewichts-Sättigungsbindungstests
werden Membranpräparate
in Gegenwart von steigenden Konzentrationen (0,1 nM bis 4 nM) eines 125I-markierten Liganden oder einer Testverbindung
(spezifische Aktivität
2.200 Ci/mmol) inkubiert. Die Bindungsaffinitäten verschiedener Testverbindungen
werden in Gleichgewichts-Konkurrenzbindungstests unter Verwendung
von 0,1 nM 125I-Peptid in Gegenwart von
zwölf verschiedenen
Konzentrationen jeder Testverbindung bestimmt.
-
Bindungsreaktionsgemische
werden eine Stunde lang bei 30°C
inkubiert. Die Reaktion wird durch Filtration durch GF/B-Filter,
die mit 0,5 % Polyethylenimin behandelt wurden, unter Verwendung
eines Zellernters gestoppt. Die Radioaktivität wird durch Szintillationszählung gemessen,
und die Daten werden durch ein computergesteuertes nichtlineares
Regressionsprogramm analysiert.
-
Nichtspezifische
Bindung ist definiert als die Menge an Radioaktivität, die nach
der Inkubation eines Membranproteins in Gegenwart von 100 nM unmarkiertem
Peptid verbleibt. Die Proteinkonzentration wird mithilfe des Bradford-Verfahrens
unter Verwendung eines Bio-Rad-Reagens mit Rinderserumalbumin als
Standard gemessen. Eine Testverbindung, welche die Radioaktivität des Membranproteins
um zumindest 15 % in Bezug auf Radioaktivität eines Membranprotein, das
nicht mit einer Testverbindung inkubiert wurde, steigert, wird als
Verbindung identifiziert, die an ein menschliches Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid bindet.
-
BEISPIEL 3
-
Wirkung einer Testverbindung
auf die durch ein menschliches Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Protein vermittelte zyklische AMP-Bildung
-
Eine
rezeptorvermittelte Hemmung von cAMP-Bildung kann in LM(tk-)-Zellen
getestet werden, die ein menschliches Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Protein exprimieren. Zellen werden in 96-Well-Platten ausplattiert und
in Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS),
ergänzt
mit 10 mM HEPES, 5 mM Theophyllin, 2 μg/ml Aprotinin, 0,5 mg/ml Leupeptin
und 10 μg/ml
Phosphoramidon, 20 min lang bei 37°C in 5 % CO2 inkubiert.
Eine Testverbindung wird zugesetzt und weitere 10 min lang bei 37°C inkubiert.
Das Medium wird abgesaugt, und die Reaktion wird durch den Zusatz
von 100 mM HCl gestoppt. Die Platten werden bei 4°C 15 min lang
gelagert. Der cAMP-Gehalt in der Stopplösung wird mithilfe eines Radioimmuntests
gemessen.
-
Die
Radioaktivität
wird unter Verwendung eines Gammazählers quantifiziert, der mit
einer Datenreduktionssoftware ausgestattet ist. Eine Testverbindung,
welche die Radioaktivität
des Inhalts eines Wells in Bezug auf die Radioaktivität des Inhalts
eines Wells in Abwesenheit der Testverbindung reduziert, wird als
ein potenzieller Inhibitor von cAMP-Bildung identifiziert. Eine
Testverbindung, welche die Radioaktivität des Inhalts eines Wells in
Bezug auf Radioaktivität
des Inhalts eines Wells in Abwesenheit der Testverbindung steigert,
wird als ein potenzieller Enhancer von cAMP-Bildung identifiziert.
-
BEISPIEL 4
-
Wirkung einer
Testverbindung auf die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium
-
Die
intrazelluläre
freie Calciumkonzentration kann durch Mikrospektralfluorometrie
unter Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs Fura-2/AM gemessen
werden (Bush et al., J. Neurochem. 57, 562–674 (1991)). Stabil transfizierte
Zellen werden auf eine 35-mm-Kulturschale, die ein Deckglasinsert
aus Glas enthält,
geimpft. Die Zellen werden mit HBS gewaschen, mit einer Testverbindung
inkubiert und mit 100 μl
Fura-2/AM (10 μM)
20–40
min lang geladen. Nach dem Waschen mit HBS, um die Fura-2/AM-Lösung zu
entfernen, werden die Zellen in HBS 10–20 min lang äquilibriert.
Die Zellen werden dann unter dem 40fach-Objektiv eines Fluovert-FS-Mikroskops von Leitz
sichtbar gemacht.
-
Die
Fluoreszenzemission wird bei 510 nM bestimmt, wobei die Anregungswellenlängen zwischen
340 nM und 380 nM schwanken. Die unaufbereiteten Fluoreszenzdaten
werden unter Verwendung von Standard-Calciumkonzentrationskurven
und Software-Analyseverfahren in Calciumkonzentrationen umgewandelt. Eine
Testverbindung, welche die Fluoreszenz um zumindest 15 % in Bezug
auf die Fluoreszenz in Abwesenheit einer Testverbindung steigert,
wird als eine Verbindung identifiziert, die intrazelluläres Calcium
mobilisiert.
-
BEISPIEL 5
-
Wirkung einer
Testverbindung auf den Phosphoinositid-Stoffwechsel
-
LM(tk-)-Zellen,
die cDNA eines menschlichen Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteins stabil exprimieren, werden in 96-Well-Platten ausplattiert
und bis zur Konfluenz gezüchtet.
Am Tag vor dem Test wird das Wachstumsmedium gegen 100 μl Medium,
das 1 % Serum und 0,5 μCi 3H-Myoinositol enthält, getauscht. Die Platten werden über Nacht
in einem CO2-Inkubator (5 % CO2 bei
37°C) inkubiert.
Unmittelbar vor dem Test wird das Medium entfernt und durch 200 μl PBS mit
10 mM LiCl ausgetauscht, und die Zellen werden mit dem neuen Medium
20 min lang äquilibriert.
Während
dieses Intervalls werden die Zellen auch mit einem Antagonisten äquilibriert,
der als eine 10-μl-Aliquote
einer 20fach konzentrierten Lösung
in PBS zugesetzt wird.
-
Die 3H-Inositolphosphat-Akkumulierung aus dem
Inositolphospholipid-Stoffwechsel wird durch den Zusatz von 10 μl einer Lösung, die
eine Testverbindung enthält,
begonnen. Zum ersten Well werden 10 μl zugesetzt, um die Grundakkumulierung
zu messen. Elf verschiedene Konzentrationen von Testverbindungen
werden in den folgenden 11 Wells jeder Plattenreihe getestet. Alle
Tests werden durch Wiederholen derselben Zusätze in zwei aufeinander folgenden
Plattenreihen in zweifacher Ausführung
durchgeführt.
-
Die
Platten werden in einem CO2-Inkubator eine
Stunde lang inkubiert. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 15 μl 50 Vol.-%
Trichloressigsäure
(TCA) beendet, gefolgt von einer 40-minütigen Inkubation bei 4°C. Nach einer
Neutralisierung von TCA mit 40 μl
von 1 M Tris wird der Inhalt der Wells auf eine Multiscreen-HV-Filterplatte
(Millipore), die Dowex AG1-X8 (200–400 Mesh, Formiatform) enthält, übertragen.
Die Filterplatten werden durch den Zusatz von 200 μl Dowex-AG1-X8-Suspension
(50 Vol.-%, Wasser:Harz)
zu jedem Well vorbereitet. Dann werden die Filterplatten auf einem
Vakuumverteiler platziert, um das Harzbett zu waschen oder zu eluieren.
Jeder Well wird zweimal mit 200 μl
Wasser gewaschen, gefolgt von 2 × 200 μl von 5 mM Natriumtetraborat/60
mM Ammoniumformiat.
-
Die 3H-IPs werden in leere 96-Well-Platten mit
200 μl 1,2
M Ammoniumformiat/0,1 Ameisensäure
eluiert. Der Inhalt der Wells wird zu 3 ml einer Szintillations-Reagenzienmischung
zugesetzt, und die Radioaktivität
wird durch Flüssigkeitsszintillationsmessung
bestimmt.
-
BEISPIEL 6
-
Rezeptorbindungsverfahren
-
Standard-Bindungstests.
Bindungstests werden in einem Bindungspuffer durchgeführt, der
50 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 % BSA und 5 mM MgCl2 enthält. Der
Standardtest für
einen Radioliganden (z.B. 125I-Lipoxin A4, 125I-Lipoxin A4, Analogon oder Testverbindung), der an
Membranfragmente bindet, die Lipoxin-A4-rezeptorartige
Polypeptide umfassen, wird wie folgt in 96-Well-Mikrotiterplatten
(z.B. Dynatech-Immulon-II-Removawell-Platten)
durchgeführt.
Der Radioligand wird in Bindungspuffer + PMSF/Baci zu den erwünschten cpm
pro 50 μl
verdünnt,
und dann werden 50-μl-Aliquoten
zu den Wells zugesetzt. Für
nichtspezifische Bindungsproben werden auch 5 μl von 40 μM kaltem Liganden pro Well zugesetzt.
Die Bindung wird durch den Zusatz von 150 μl Membran pro Well, verdünnt auf
die erwünschte
Konzentration (10–30 μg Membranprotein/Well)
in Bindungspuffer + PMSF/Baci, initiiert. Die Platten werden dann
mit Linbro-Mylarplattenversiegler (Flow Labs) bedeckt und auf einen
Dynatech Microshaker II gegeben. Die Bindungsbildung wird bei Raumtemperatur
1–2 h
lang fortschreiten gelassen und durch Zentrifugieren der Platte
15 min lang bei 2.000 × g
gestoppt. Die Überstände werden
dekantiert, und die Membranpellets werden einmal durch den Zusatz
von 200 μl
eiskaltem Bindungspuffer, kurzes Schütteln und Rezentrifugieren
gewaschen. Die einzelnen Wells werden in 12 × 75 mm-Röhrchen gegeben und in einem
LKB-Gammamaster-Zähler
(78 % Effizienz) gezählt.
Die durch dieses Verfahren bestimmte spezifische Bindung ist mit
jener identisch, die gemessen wird, wenn ein freier Ligand durch
rasche Filtration (3–5
s) und Waschen auf Polyethylenimin-beschichteten Glasfaserfiltern
entfernt wird.
-
Drei
Varianten des Standard-Bindungstests werden ebenfalls verwendet.
- 1. Kompetitive Radioliganden-Bindungstests
mit einem Konzentrationsbereich von kaltem Liganden gegenüber 125I-markiertem Liganden werden wie oben
beschrieben mit einer Modifikation durchgeführt. Alle Verdünnungen
von getesteten Liganden werden in 40 × PMSF/Baci auf eine Konzentration
von 40 × der
Endkonzentration im Test hergestellt. Proben eines Peptids (je 5 μl) werden
dann pro Mikrotiter-Well zugesetzt. Die Membranen und der Radioligand
werden in einem Bindungspuffer ohne Proteaseinhibitoren verdünnt. Der
Radioligand wird zugesetzt und mit dem kaltem Liganden vermischt,
und anschließend
wird die Bindung durch den Zusatz von Membranen initiiert.
- 2. Die chemische Vernetzung eines Radioliganden mit einem Rezeptor
erfolgt nach einem Bindungsschritt, der mit jenem aus dem Standardtest
identisch ist. Der Waschschritt erfolgt jedoch mit einem Bindungspuffer ohne
BSA, um die Möglichkeit
zu nichtspezifischer Vernetzung eines Radioliganden mit BSA zu verringern. Der
Vernetzungsschritt wird wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
- 3. Großtechnische
Bindungstests zur Gewinnung von Membranpellets für Untersuchungen der Solubilisierung
eines Rezeptor:Ligand-Komplexes und zur Rezeptorreinigung werden
ebenfalls durchgeführt.
Diese sind mit den Standardtests identisch, mit der Ausnahme, dass
(a) die Bindung an Polypropylenröhrchen
in Volumina von 1–250
ml durchgeführt
wird, (b) die Konzentration des Membranproteins stets 0,5 mg/ml
beträgt
und (c) zur Rezeptorreinigung die BSA-Konzentration im Bindungspuffer
auf 0,25 % reduziert wird und der Waschschritt mit einem Bindungspuffer
ohne BSA erfolgt, was die BSA-Verunreinigung des gereinigten Rezeptors
reduziert.
-
BEISPIEL 7
-
Chemische
Vernetzung eines Radioliganden an einen Rezeptor
-
Nach
einem Radioliganden-Bindungsschritt, wie er oben beschrieben ist,
werden Membranpellets in 200 μl
eiskaltem Bindungspuffer ohne BSA pro Mikrotiterplatten-Well resuspendiert.
Anschließend
werden 5 μl
pro Well von 4 mM N-5-Azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimid
(ANB-NOS, Pierce) in DMSO zugesetzt und vermischt. Die Proben werden
auf Eis gehalten und 10 min lang mit einer Mineralight-R-52G-Lampe (UVP Inc., San
Gabriel, Kalifornien) bei einer Entfernung von 5–10 cm mit UV-Licht bestrahlt.
Dann werden die Proben auf Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen,
die Membranen durch Zentrifugation pelletiert, Überstände entfernt und die Membranen
in einem Laemmli-SDS-Probenpuffer für Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE)
solubilisiert. Eine PAGE wird wie nachstehend beschrieben durchgeführt. Radioaktiv
markierte Proteine werden durch Autoradiographie der getrockneten
Gele mit einem Kodak-XAR-Film und mit Dupont-Bildverstärkerfolien
sichtbar gemacht.
-
BEISPIEL 8
-
Membransolubilisierung
-
Die
Membransolubilisierung erfolgt in einem Puffer, der 25 mM Tris,
pH 8, 10 % Glycerin (Gew./Vol.) und 0,2 mM CaCl2 enthält (Solubilisierungspuffer).
Die stark löslichen
Detergenzien einschließlich
Triton X-100, Desoxycholat, Desoxycholat:Lysolecithin, CHAPS und
Zwittergent werden in einem Solubilisierungspuffer in 10%igen Konzentrationen
vorbereitet und als gefrorene Aliquoten gelagert. Lysolecithin wird
aufgrund seiner Unlöslichkeit
durch Tiefkühlen
und Auftauen frisch hergestellt, und Digitonin wird aufgrund seiner
stärker eingeschränkten Löslichkeit
in geringeren Konzentrationen frisch hergestellt.
-
Um
die Membranen zu solubilisieren, werden gewaschene Pellets nach
dem Bindungsschritt frei von sichtbaren Partikeln durch Pipettieren
und Zentrifugieren in einem Solubilisierungspuffer bei 100.000 × g 30 min
lang resuspendiert. Die Überstände werden
entfernt und auf Eis gehalten, und die Pellets werden verworfen.
-
BEISPIEL 9
-
Test für solubilisierte
Rezeptoren
-
Nach
der Bindung von 125I-Liganden und der Solubilisierung
der Membranen mit einem Detergens kann der intakte R:L-Komplex mittels
vier verschiedener Verfahren getestet werden. Alle werden auf Eis
oder in einem kalten Raum bei 4–10°C durchgeführt.
- 1. Säulenchromatographie
(Knuhtsen et al., Biochem. J. 254, 641–647 (1988)). Sephadex-G-50-Säulen (8 × 250 mm)
werden mit einem Solubilisierungspuffer, der ein Detergens in der
Konzentration, die verwendet wird, um Membranen zu solubilisieren,
und 1 mg/ml Rinderserumalbumin enthält, äquilibriert. Proben von solubilisierten
Membranen (0,2–0,5
ml) werden auf die Säulen
aufgetragen und bei einer Durchflussgeschwindigkeit von etwa 0,7
ml/min eluiert. Proben (0,18 ml) werden abgenommen. Die Radioaktivität wird in
einem Gammazähler
bestimmt. Die Hohlraumvolumina der Säulen werden durch das Elutionsvolumen von
Dextranblau bestimmt. Die Radioaktivität, die im Hohlraumvolumen eluiert,
wird als an Protein gebunden betrachtet. Radioaktivität, die später beim
selben Volumen wie freie 125I-Liganden eluiert,
wird als nicht gebunden betrachtet.
- 2. Polyethylenglykolfällung
(Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 318–322 (1972)). Für eine 100-μl-Probe solubilisierter
Membranen in einem 12 × 75mm-Polypropylenröhrchen werden
0,5 ml 1 % (Gew./Vol.) bovines Gammaglobulin (Sigma) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer
zugesetzt, gefolgt vom Zusatz von 0,5 ml 25 (Gew./Vol.) Polyethylenglykol
(Sigma) und Vermischen. Das Gemisch wird 15 min lang auf Eis gehalten.
Dann werden 3 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, pro Probe zugesetzt.
Die Proben werden rasch (1–3
s) über
Whatman-GF/B-Glasfaserfilter filtriert und mit 4 ml Phosphatpuffer
gewaschen. Der PEG-gefällte
Rezeptor:125I-Ligand-Komplex wird durch Gammazählung der
Filter bestimmt.
- 3. GFB/PEI-Filterbindung (Bruns et al., Analytical Biochem.
132, 74–81
(1983)). Whatman-GF/B-Glasfaserfilter werden in 0,3 % Polyethylenimin
(PEI, Sigma) 3 h lang eingeweicht. Proben von solubilisierten Membranen
(25–100 μl) werden
in 12 × 75mm-Polypropylenröhrchen gegeben.
Dann werden 4 ml Solubilisierungspuffer ohne Detergens pro Probe
zugesetzt, und die Proben werden unmittelbar durch die GFB/PEI-Filter
(1–3 s)
filtriert und mit 4 ml Solubilisierungspuffer gewaschen. Die CPM
des an die Filter adsorbierten Rezeptor:125I-Ligand-Komplexes
wird durch Gammazählung
bestimmt.
- 4. Aktivkohle/Dextran (Paul & Said,
Peptides 7, Beilage 1, 147–149
(1986)). Dextran T70 (0,5 g, Pharmacia) wird in 1 l Wasser aufgelöst, dann
werden 5 g Aktivkohle (Norit A, alkalisch; Fisher Scientific) zugesetzt.
Die Suspension wird 10 min lang bei Raumtemperatur gerührt und
dann bei 4°C
bis zur Verwendung gelagert. Um den R:L-Komplex zu messen, werden
4 Volumsteile einer Suspension von Aktivkohle und Dextran zu 1 Volumsteil
solubilisierter Membran zugesetzt. Die Proben werden vermischt und
2 min lang auf Eis gehalten und dann 2 min lang bei 11.000 × g in einer
Beckman-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der freie Radioligand wird
an Aktivkohle/Dextran adsorbiert und wird mit dem Pellet verworfen.
Rezeptor:125I-Ligand-Komplexe verbleiben im Überstand
und werden mittels Gammazählung
bestimmt.
-
BEISPIEL 10
-
Rezeptorreinigung
-
Die
Bindung eines Biotinylrezeptors an GH4-C1-Membranen
erfolgt wie oben beschrieben. Die Inkubationen erfolgen 1 h lang
bei Raumtemperatur. In der herkömmlichen
Reinigungsarbeitsvorschrift enthalten die Bindungsinkubationen 10
nM Bio- S29. Ein 125I-Ligand wird als eine Indikatorsubstanz
in Mengen von 5.000–100.000
cpm pro mg Membranprotein zugesetzt. Kontrollinkubationen enthalten
10 μM kalten
Liganden, um den Rezeptor mit nichtbiotinyliertem Liganden zu sättigen.
-
Eine
Solubilisierung eines Rezeptor:Ligand-Komplexes wird ebenfalls wie
oben beschrieben durchgeführt,
mit 0,15 % Desoxycholat:Lysolecithin in einem Solubilisierungspuffer,
der 0,2 mM MgCl2 enthält, um 100.000-x-g-Überstände zu erhalten,
die einen solubilisierten R:L-Komplex enthalten.
-
Immobilisiertes
Streptavidin (Streptavidin, vernetzt mit 6%iger perlenförmiger Agarose,
Pierce Chemical Co.; „SA-Agarose") wird in einem Solubilisierungspuffer
gewaschen und zu den solubilisierten Membranen als 1/30 des Endvolumens
zugesetzt. Dieses Gemisch wird unter konstantem Rühren durch
Kopfüber-Rotation 4–5 h lang
bei 4–10°C inkubiert.
Dann wird das Gemisch auf eine Säule
aufgetragen, und das nicht gebundene Material wird durchgewaschen.
Die Bindung des Radioliganden an SA-Agarose wird durch Vergleichen
der cpm im 100.000-x-g-Überstand
mit jenen im Säulenabfluss
nach Adsorption an SA-Agarose bestimmt. Schließlich wird die Säule mit
12–15
Säulenvolumina
Solubilisierungspuffer + 0,15 % Desoxycholat:Lysolecithin + 1/500
(Vol./Vol.) 100 × 4pase
gewaschen.
-
Die
Streptavidinsäule
wird mit Solubilisierungspuffer + 0,1 mM EDTA + 0,1 mM EGTA + 0,1
mM GTP-γ-S
(Sigma) + 0,15 % (Gew./Vol.) Desoxycholat:Lysolecithin + 1/1.000
(Vol./Vol.) 100x 4pase eluiert. Zuerst wird ein Säulenvolumen
an Elutionspuffer durch die Säule
geführt,
und der Durchfluss wird 20–30
min lang gestoppt. Dann werden 3–4 weitere Säulenvolumina
an Elutionspuffer durchgeführt.
Alle Eluate werden gesammelt.
-
Eluate
aus der Streptavidinsäule
werden über
Nacht (12–15
h) mit immobilisiertem Weizenkeimagglutinin (WGA-Agarose, Vector
Labs) inkubiert, um den Rezeptor über die Wechselwirkung von
kovalent gebundenem Kohlenhydrat mit dem WGA-Lectin zu adsorbieren.
Das Verhältnis
(Vol./Vol.) von WGA-Agarose zu Streptavidinsäule neluat beträgt im Allgemeinen
1:400. Ein Bereich von 1:1.000 bis 1:200 kann ebenfalls verwendet
werden. Nach dem Bindungsschritt wird das Harz durch Zentrifugation
pelletiert, der Überstand
wird entfernt und sichergestellt, und das Harz wird dreimal (jeweils
etwa 2 min lang) in einem Puffer, der 50 mM HEPES, pH 8, 5 mM MgCl2 und 0,15 % Desoxycholat:Lysolecithin enthält, gewaschen.
Um den WGA-gebundenen
Rezeptor zu eluieren, wird das Harz dreimal durch wiederholtes Vermischen
(Zentrifugenmixer bei geringer Geschwindigkeit) über eine 15- bis 30-minütige Zeitspanne
auf Eis mit jeweils 3 Harzsäulen
von 10 mM N-N'-N''-Triacetylchitotriose im selben HEPES-Puffer,
der verwendet wurde, um das Harz zu waschen, extrahiert. Nach jedem
Elutionsschritt wird das Harz zentrifugiert, und der Überstand
wird, frei von WGA-Agarosepellets, sorgfältig entfernt. Die drei gesammelten
Eluate enthalten den endgültigen,
gereinigten Rezeptor. Das nicht an WGA gebundene Material enthält G-Protein-Untereinheiten,
die spezifisch aus den Streptavidinsäulen eluiert wurden, sowie
nicht-spezifische Verunreinigungen. Alle diese Fraktionen werden
tiefgefroren bei –90°C gelagert.
-
BEISPIEL 11
-
Identifikation von Testverbindungen,
die an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
binden
-
Gereinigte
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide, die
ein Glutathion-S-transferase-Protein
enthalten und an Glutathion-derivatisierte Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten
absorbiert sind, werden mit Testverbindungen aus einer Bibliothek
kleiner Moleküle
bei einem pH von 7,0 in einer physiologischen Pufferlösung kontaktiert.
Lipoxin-A4-rezeptorartige Polypeptide umfassen
eine in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz. Die Testverbindungen
umfassen eine fluoreszierende Markierung. Die Proben werden 5 min
bis 1 h lang inkubiert. Kontrollproben werden in Abwesenheit einer
Testverbindung inkubiert.
-
Die
Pufferlösung,
welche die Testverbindungen enthält,
wird aus den Wells gewaschen. Die Bindung einer Testverbindung an
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Polypeptid
wird durch Fluoreszenzmessungen der Inhalte der Wells nachgewiesen.
Eine Testverbindung, welche die Fluoreszenz in einem Well in Bezug
auf die Fluoreszenz in einem Well, in dem eine Testverbindung nicht
inkubiert wurde, um zumindest 15 % steigert, wird als eine Verbindung
identifiziert, die an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid bindet.
-
BEISPIEL 12
-
Identifikation einer Testverbindung,
welche die Expression eines Lipoxin-A4-rezeptorarrigen
Proteingens verringert
-
Eine
Testverbindung wird einer Kultur von CHO-Zellen verabreicht, die
mit einem Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polynucleotid
transfiziert wurden, und bei 37°C
10 bis 45 min lang inkubiert. Eine Kultur desselben Zelltyps, die
gleich lang ohne Testverbindung inkubiert wurde, liefert eine negative
Kontrolle.
-
RNA
wird aus den zwei Kulturen wie in Chirgwin et al., Biochem. 18,
5294–5299
(1979), beschrieben isoliert. Northern-Blots werden unter Verwendung
von 20 bis 30 μg
Gesamt-RNA hergestellt und mit einer 32P-markierten,
für ein
Lipoxin-A4-rezeptorartiges Protein spezifischen
Sonde bei 65°C
in Express-hyb (CLONTECH) hybridisiert. Die Sonde umfasst zumindest
11 zusammenhängende
Nucleotide, die aus dem Komplement von Seq.-ID Nr. 1 ausgewählt sind.
Eine Testverbindung, die das für
ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges Protein spezifische
Signal in Bezug auf das Signal, das in Abwesenheit der Testverbindung
erhalten wird, senkt, wird als ein Inhibitor der Expression eines
Lipoxin-A4-rezeptorartigen Proteingens identifiziert.
-
BEISPIEL 13
-
Behandlung von Entzündung mit
einem Reagens, das sich spezifisch an ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Proteingenprodukt bindet
-
Synthese
von Antisense-Oligonucleotiden eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Proteins, die zumindest 11 zusammenhängende Nucleotide, ausgewählt aus
dem Komplement von Seq.-ID Nr. 1, umfassen, erfolgt an einem Synthesegerät der Serie „Phar macia
Gene Assembler" unter
Verwendung des Phosphoramiditverfahrens (Uhlmann et al., Chem. Rev.
90, 534–583
(1990)). Nach der Assemblierung und Entschützung werden die Oligonucleotide
zweimal Ethanol-gefällt,
getrocknet und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in der erwünschten
Konzentration suspendiert. Reinheit dieser Oligonucleotide wird
durch Kapillargelelektrophorese und Ionenaustausch-HPLC getestet.
Endotoxin-Konzentrationen im Oligonucleotidpräparat werden unter Verwendung
des leuchtenden Amöbozytentests
(„Luminous
Amebocyte Assay")
(Bang, Biol. Bull. (Woods Hole, Mass.) 105, 361–362 (1953)) bestimmt.
-
Die
Antisense-Oligonucleotide werden direkt in entzündetes Gewebe injiziert, und
zwar in einem wässrigen
Medium (wässrige
Zusammensetzung) in einer Konzentration von 0,1–100 M und mit einer Nadel.
Die Nadel wird im Gewebe platziert und herausgezogen, während die
wässrige
Zusammensetzung im Gewebe herausgedrückt wird.
-
Das
entzündete
Gewebe wird über
einen Zeitraum von einigen Tagen oder Wochen überwacht. Während dieses Zeitraums können weitere
Injektionen der Antisense-Oligonucleotide
verabreicht werden. Die Entzündung
im Gewebe nimmt allmählich
ab.
-
BEISPIEL 14
-
Gewebespezifische Expression
eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids
-
Erstellung
von Expressionsprofilen basiert auf einer quantitativen Polymerasekettenreaktions-
(PCR-) Analyse, auch kinetische Analyse genannt, die als erstes
in Higuchi et al. (1992) und Higuchi et al. (1993) beschrieben wurde.
Das Prinzip besteht darin, dass bei einem vorgegebenen Zyklus in
der exponentiellen Phase der PCR die Produktmenge proportional zur
anfänglichen
Anzahl an Matrizenkopien ist. Mithilfe dieses Verfahrens werden
die Expressionsgrade von bestimmten Genen, die von den Chromosomen
als Messenger-RNA (mRNA) transkribiert werden, gemessen, indem zuerst
eine DNA-Kopie (cDNA) der mRNA hergestellt und dann eine quantita tive
PCR an der cDNA durchgeführt
wird, ein Verfahren, das als quantitative Umkehrtranskriptions-Polymerasekettenreaktion
(quantitative RT-PCR) bezeichnet wird.
-
Eine
quantitative RT-PCR-Analyse von RNA von verschiedenen menschlichen
Gewebearten wurde durchgeführt,
um die Gewebeverteilung der mRNA eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen
Polypeptids zu untersuchen. In den meisten Fällen wurden 25 μg Gesamt-RNA
von verschiedenen Gewebearten (einschließlich Human Total RNA Panel
I-V, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) als Matrize verwendet,
um eine Erststrang-cDNA unter Einsatz des „SUPERSCRIPTTM First-Strand
Synthesis System" für RT-PCR
(Life Technologies, Rockville, MD, USA) zu synthetisieren. Erststrang-cDNA-Synthese
wurde gemäß den Anleitungen
des Herstellers unter Einsatz von Oligo(dT) durchgeführt, um
an die 3'-Poly-A-Schwänze von
mRNA zu hybridisieren und die Synthesereaktion zu primen. 10 ng
der Erststrang-cDNA wurden dann als Matrize in einer Polymerasekettenreaktion
eingesetzt. In anderen Fällen
wurden 10 ng von im Handel erhältlichen
cDNAs (Human Immune System MTC Panel und Human Blood Fractions MTC
Panel, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) als Matrize in
einer Polymerasekettenreaktion eingesetzt. Die Polymerasekettenreaktion
wurde in einem LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis,
IN, USA) durchgeführt,
und zwar in Gegenwart des DNA-bindenden fluoreszierenden Farbstoffs
SYBR Green I, der an die kleine Furche der DNA-Doppelhelix bindet,
die nur gebildet wird, wenn doppelsträngige DNA erfolgreich in der
Reaktion synthetisiert wird (Morrison et al. (1998)). Bei der Bindung
an doppelsträngige
DNA emittiert SYBR Green I Licht, das mithilfe des LightCycler-Geräts quantitativ
gemessen werden kann. Die Polymerasekettenreaktion wurde unter Einsatz
der Oligonucleotid-Primer LBRI004-L4 (TCTGTGCCCAGTCCCTGTGATGAA)
und LBRI004-R2 (TCTGTCTGCCCTGGGCTCTTTCAC) durchgeführt, und
die Messungen der Intensität
des emittierten Lichts wurden nach jedem Reaktionszyklus vorgenommen,
wenn die Reaktion eine Temperatur von 91°C erreicht hatte. Die Intensitäten des
emittierten Lichts wurden durch einen Vergleich mit gleichzeitig
umgesetzten Standards mit bekannter Konzentration in Kopienanzahlen
des Gentranskripts pro ng Matrizen-cDNA umgewandelt.
-
Um
Unterschiede in den mRNA-Transkriptionswerten pro Zelle in den unterschiedlichen
Gewebearten zu korrigieren, wurde unter Einsatz von auf ähnliche
Weise berechneten Expressionswerten in den unterschiedlichen Geweben
von fünf
unterschiedlichen konstitutiven Genen ein Normalisierungsvorgang
durchgeführt:
Glyceraldehyd-3-Phosphatase (G3PDH), Hypoxanthin-Ganin-Phosphoribosyl-Transferase
(HPRT), β-Actin,
Phorphobilinogen-Desaminase (PBGD) und β-2-Mikroglobulin. Die Expressionsstärke des
konstitutiven Gens wird für
alle Gewebe als relativ konstant angesehen (Adams et al. (1993);
Adams et al. (1995); Liew et al. (1994)) und kann deshalb als Eichmaß für die Approximation
der relativen Anzahl an Zellen pro μg Gesamt-RNA verwendet werden,
die im cDNA-Syntheseschritt eingesetzt wird. Mit Ausnahme der Verwendung einer
leicht unterschiedlichen Gruppe von konstitutiven Genen und der
Verwendung des LightCycler-Systems zur Messung der Expressionsstärken war
das Normalisierungsverfahren im Grund dasselbe wie im „RNA Master
Blot User Manual",
Anhang C (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA (1997)) beschrieben.
Kurz gesagt wurden die Expressionswerte der fünf konstitutiven Gene in allen
Gewebeproben in drei unabhängigen
Reaktionen pro Gen unter Verwendung des Light Cycler und einer konstanten
Menge (25 μg)
Ausgangs-RNA gemessen. Die berechnete Kopienanzahl für die einzelnen
Gene, abgeleitet von einem Vergleich mit gleichzeitig umgesetzten
Standards mit bekannten Konzentrationen, wurde aufgezeichnet und
in einen Prozentsatz der Summe der Kopienzahlen der Gene in allen
Gewebeproben umgewandelt. Dann wurde für jede Gewebeprobe die Summe
der Prozentwerte für
jedes Gen berechnet, und ein Normalisierungsfaktor wurde berechnet,
indem der Prozentsummenwert für
jedes Gewebe durch den Prozentsummenwert von einem der Gewebe, das
zufällig
als Standard ausgewählt
wurde, dividiert wurde. Um einen experimentell erhaltenen Wert für die Expression eines
bestimmten Gens in einer Gewebeprobe zu normalisieren, wurde der
erhaltene Wert mit dem Normalisierungsfaktor für das getestete Gewebe multipliziert.
Dieses Normalisierungsverfahren wurde für alle Gewebe verwendet, mit
Ausnahme der vom „Human
Blood Fractions MTC Panel" abgeleiteten,
die starke Schwankungen in einigen konstitutiven Genen aufwiesen,
je nachdem, ob das Gewebe aktiviert worden war oder nicht. In diesen
Geweben wurde die Normalisierung mit einem einzigen konstitutiven
Gen, β-2-Mikroglobulin,
durchgeführt.
-
Die
Ergebnisse sind nachstehend zusammengefasst, wobei die experimentell
erhaltene Kopienzahl von mRNA pro 10 ng Erststrang-cDNA auf der
linken und die normalisierten Werte auf der rechten Seite angegeben
sind. Für
die cDNA-Synthese verwendete RNAs sind zusammen mit ihrem Lieferanten
und ihrer Katalognummer in Tabelle 1 und 2 angeführt. Erstellung
von Expressionsprofilen von mRNA eines Lipoxin-A
4-rezeptorartigen
Polypeptids, Ganzkörper-Screen
Erstellung
eines Expressionsprofils von mRNA eines Lipoxin-A
4-rezeptorartigen
Polypeptids, Blut/Lungen-Screen
Tabelle
1: Ganzkörper-Screen-Gewebe
Tabelle
2: Blut/Lungen-Screen-Gewebe
-
Zusammenfassend
ist zu sagen, dass ein Lipoxin-A4-rezeptorartiges
Polypeptid in Uterus, Leber, Placenta und Verdauungssystem stark
exprimiert wird, während
in Milz, Thymus und Rückenmark
niedrigere Expressionswerte gefunden wurden. Außerdem ist in Peripherblut-Leukozyten
eine starke Expression zu beobachten, die hauptsächlich durch T- und B-Zellen
erfolgt. Eine Mitogen-Aktivierung von CD8+-T-zellen und CD19+-B-Zellen scheint die Expression eines Lipoxin-A4-rezeptorartigen Polypeptids herunterzuregulieren, während bei
Mitogen-Aktivierung von CD4+-T-Zellen die gegenteilige
Wirkung, eine Hochregulierung, zu beobachten ist.
-
Literaturverzeichnis
-
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., und Griffith,
R., Simultaneous Amplification and Detection of Specific DNA Sequences,
BioTechnology 10, 413–417
(1992).
- Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., und Watson, R., Kinetic
PCR Analysis: Real-Time
Monitoring of DNA Amplification Reactions, BioTechnology 11, 1026–1030 (1993).
- T. B. Morrison, J. J. Weis & C.
T. Wittwer, Quantification of Low-Copy Transcripts by Continuous
SYBR Green I Monitoring during Amplification, BioTechniques 24,
954–962
(1998).
- Adams, M. D., Kerlavage, A. R., Fields, C., & Venter, C., 3,400 New Expressed
Sequence Tags Identify Diversity of Transcripts in Human Brain,
Nature Genet. 4, 256–265
(1993).
- Adams, M. D., et al., Initial Assessment of Human Gene Diversity
and Expression Patterns Based upon 83 Million Nucleotides of cDNA
Sequence, Nature 377 Supp., 3–174
(1995).
- Liew, C. C., Hwang, D. M., Fung, Y. W., Laurenson, C., Cukerman,
E., Tsui, S., & Lee,
C. Y., A Catalog of Genes in the Cardiovascular System as Identified
by Expressed Sequence Tags, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10145–10649 (1994).
-
-
-