DE60125169T2 - Regulation eines menschlichen dopamine-ähnlichen g-protein gekoppelten rezeptor. - Google Patents

Regulation eines menschlichen dopamine-ähnlichen g-protein gekoppelten rezeptor. Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der G-Protein-gekoppelten bzw. G-Protein-gebundenen Rezeptoren. Insbesondere betrifft sie den Bereich des menschlichen dopaminähnlichen G-Protein-gebundenen Rezeptors und dessen Regulation.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • G-Protein-gebundene Rezeptoren
  • Viele medizinisch signifikante biologische Prozesse werden über Signaltransduktionswege, an denen G-Proteine beteiligt sind, vermittelt [Lefkowitz, Nature 351, 353-354 (1991)]. Die Familie der G-Protein-gebundenen Rezeptoren (GPCR) umfasst Rezeptoren für Hormone, Neurotransmitter, Wachstumsfaktoren und Viren. Spezielle Beispiele für GPCRs umfassen Rezeptoren für so verschiedenartige Mittel wie Calcitonin, adrenerge Hormone, Endothelin, cAMP, Adenosin, Acetylcholin, Serotonin, Dopamin, Histamin, Thrombin, Kinin, follikelstimulierendes Hormon, Opsine, Endothelzellendifferenzierungsgen-1, Rhodopsine, Geruchsstoffe, Zytomegalie-Virus, G-Proteine selbst, Effektorproteine wie z.B. Phospholipase C, Adenylcyclase und Phosphodiesterase und Aktuatorproteine, wie z.B. Proteinkinase A und Proteinkinase C.
  • Die GPCR-Protein-Überfamilie enthält nun über 250 Arten von Paralogen, d.h. Rezeptoren, die für Varianten stehen, die durch Genduplikationen (oder andere Prozesse) erzeugt werden, im Gegensatz zu Orthologen, derselbe Rezeptor von anderen Spezies. Die Überfamilie kann in fünf Familien unterteilt werden: Familie 1, Rezeptoren, die durch Rhodopsin und den β-adrenergen Rezeptor charakterisiert und derzeit durch über 200 einzigartige Mitglieder vertreten sind [von Dohlman et al., Ann. Rev. Biochem. 60, 653-688 (1991), rezensiert, siehe auch die darin angeführten Literaturverweise]; Familie II, die vor kurzem beschriebene Parathormon/Calcitonin/Sekretin-Rezeptorfamilie [Juppner et al., Science 254, 1024-1026 (1991); Lin et al., Science 254, 1022-1024 (1991)]; Familie III, metabotrope Glutamatrezeptorfamilie bei Säuge- tieren [Nakanishi, Science 258, 597-603 (1992)]; Familie IV, die cAMP-Rezeptorfamilie, wichtig für die Chemotaxis und Entwicklung von D. discoideum [Klein et al., Science 241, 1467-1472 (1998)] und Familie V, „Fingal Mating"-Pheromonrezeptoren, wie z.B. STE2 [rezensiert von Kurjan, Ann. Rev. Biochem. 61, 1097-1129 (1992)].
  • GPCRs besitzen sieben konservierte membranumspannende Domänen, die zumindest acht divergierende hydrophile Schleifen verbinden. Es ist beschrieben worden, dass GPCRs (auch als 7TM-Rezeptoren bekannt) diese sieben konservierten hydrophoben Abschnitte von etwa 20 bis 30 Aminosäuren umfassen, die zumindest acht divergierende hydrophile Schleifen verbinden. Die meisten GPCRs haben in jeder der ersten beiden extrazellulären Schleifen einzelne konservierte Cysteinreste, die Disulfid-Bindungen bilden, von denen angenommen wird, dass sie die funktionelle Proteinstruktur stabilisieren. Die sieben Transmembranregionen werden TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 und TM7 genannt. TM3 ist Teil der Signaltransduktion.
  • Phosphorylierung und Lipidierung (Palmitylierung oder Farnesylierung) von Cystein-Resten kann die Signaltransduktion einiger GPCRs beeinflussen. Die meisten GPCRs enthalten potenzielle Phosphorylierungsstellen innerhalb der dritten zytoplasmatischen Schleife und/oder dem Carboxy-Terminus. Für einige GPCRs, wie z.B. den β-adrenergen Rezeptor, vermittelt Phosphorylierung durch Proteinkinase A und/oder spezielle Rezeptorkinasen Rezeptordesensibilisierung.
  • Es wird davon ausgegangen, dass für einige Rezeptoren die ligandenbindenden Stellen der GPCRs hydrophile Sockel umfassen, die durch verschiedene GPCR-Transmembrandomänen gebildet werden. Diese hydrophilen Sockel sind von hydrophoben Resten der GPCRs umgeben. Die hydrophile Seite jeder GPCR-Transmembranhelix wird so postuliert, dass sie nach innen gerichtet ist und eine polare Ligandenbindungsstelle ausformt. TM3 wurde mit einigen GPCRs in Verbindung gebracht, da sie eine Ligandenbindungsstelle aufweist, wie z.B. den TM3-Aspartatrest. Auch TM5-Serine, TM6-Asparagin und TM6- oder TM7-Phenylalanine oder -Tyrosine sind mit der Ligandenbindung in Verbindung gebracht worden.
  • GPCRs sind innerhalb der Zelle mithilfe von heterotrimeren G-Proteinen an verschiedene intrazelluläre Enzyme, Ionenkanäle und Transporter gekoppelt [siehe Johnson et al., Endoc. Rev. 10, 317-331 (1989)]. Verschiedene G-Protein-alpha-Untereinheiten stimulieren bevorzugt spezielle Effektoren, um verschiedene biologische Funktionen einer Zelle zu modulieren. Die Phosphorylierung von zytoplasmatischen Resten von GPCRs ist ein wichtiger Mechanismus zur Regulierung mancher GPCRs. Bei einer Form der Signaltransduktion ist die Wirkung der Hormonbindung zum Beispiel die Aktivierung innerhalb der Zelle des Enzyms, Adenylatcyclase. Die Enzymaktivierung durch Hormone ist abhängig von der Gegenwart des Nucleotids GTP. GTP beeinflusst auch die Hormonbindung. Ein G-Protein verbindet den Hormonrezeptor mit Adenylatcyclase. G-Protein tauscht GTP durch gebundenes GDP aus, wenn es durch einen Hormonrezeptor aktiviert wird. Die GTP-tragende Form bindet sich dann an aktivierte Adenylatcyclase. Hydrolyse von GTP zu GDP, katalysiert durch das G-Protein selbst, bringt das Protein wieder in seine Grund-, inaktive Form. Daher erfüllt das G-Protein eine Doppelrolle, als Vermittler, der das Signal des Rezeptors an den Effektor überträgt, und als Uhr, welche die Dauer des Signals kontrolliert.
  • Im Verlauf der letzten 15 Jahre sind fast 350 therapeutische Mittel, die auf GPCR-Rezeptoren abzielen, erfolgreich auf den Markt gebracht worden. Das zeigt, dass diese Rezeptoren eine etablierte, belegte Geschichte als therapeutische Ziele haben. Natürlich besteht ständiger Bedarf an der Identifizierung und Charakterisierung weiterer GPCRs, die eine Rolle in der Prävention, Verbesserung oder Korrektur von Fehlfunktionen oder Erkrankungen spielen können, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Infektionen, wie z.B. bakterielle Infektionen, Pilz- und Protozoeninfektionen und Vireninfektionen, insbesondere jene, die durch HIV-Viren verursacht werden, Schmerzen, Krebs, Anorexie, Bulimie, Asthma, Parkinson-Syndrom, akutes Herzversagen, Hypotonie, Hypertonie, Harnretention, Osteoporose, Angina Pectoris, Myokardinfarkt, Geschwüre, Asthma, Allergien, gutartige Prostatahypertrophie und psychotische und neurologische Störungen, einschließlich Angst, Schizophrenie, manische Depression, Delirium, Demenz, verschiedene Formen geistiger Zurückgebliebenheit und Dyskinesien, wie z.B. Huntington-Erkrankung und Tourett-Syndrom.
  • Dopamin und Dopaminrezeptoren
  • Dopamin ist ein Neurotransmitter, der in einer Reihe verschiedener Funktionen, die durch das Nervensystem vermittelt werden, einschließlich Sehvermögen, Bewegung und Verhalten, mitwirkt [siehe US-Patent 5.883.226 und Cooper et al., THE BIOCHEMICAL BASIS OF NEUROPHARMACOLOGY, 3. Auflage, Oxford University Press, New York, 161-195 (1978)]. Die verschiedenen physiologischen Wirkungen von Dopamin werden hingegen durch seine Wechselwirkung mit zwei der Grundformen von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, D1 und D2, vermittelt, die das Enzym Adenylatcyclase stimulieren bzw. hemmen [Kebabian & Calne, Nature 277, 93-96 (1979)]. Veränderungen der Zahl oder Aktivität dieser Rezeptoren können zu Krankheitszuständen, wie z.B. Parkinson-Syndrom (einer Bewegungsstörung) und Schizophrenie (einer Verhaltensstörung), beitragen.
  • Über die Biochemie von D1- und D2-Dopaminrezeptoren sind große Informationsmengen gesammelt worden, und es sind Verfahren entwickelt worden, um diese Rezeptorproteine löslich zu machen und zu reinigen [siehe Senogles et al., Biochemistry 25, 749-753 (1986); Sengoles et al., J. Biol. Chem. 263, 18996-19002 (1988); Gingrich et al., Biochemistry 27, 3907-3912 (1988)]. Der D1-Dopaminrezeptor verschiedener Gewebe scheint ein glycosyliertes Membranprotein von etwa 72 kD zu sein [Amlaiky et al., Mol. Pharmacol. 31, 129-134 (1987), Ninik et al., Biochemistry 27, 7594-7599 (1988)]. Es ist vorgeschlagen worden, dass der D2-Rezeptor ein höheres Molekulargewicht von etwa 90-150 kD aufweist [Amlaiky & Caron, J. Biol. Chem. 260, 1983-1986 (1985); Amlaiky & Caron, J. Neurochem. 47, 196-204 (1986); Jarvie et al., Mol. Pharmacol. 34, 91-97 (1988)]. Viel weniger ist über den vor kurzem entdeckten zusätzlichen Dopaminrezeptor bekannt, der D3 genannt wird [Sokoloff et al., Nature 347, 146-151 (1990)].
  • Dopaminrezeptoren sind in der klinischen Behandlung von psychomotorischen Störungen, wie z.B. Parkinson-Syndrom und affektiven Störungen, wie z.B. Schizophrenie, primäre Ziele [Seeman et al., Neuropsychopharm. 1, 5-15 (1987); Seeman, Synapse 1, 152-333 (1987)]. Die drei verschiedenen Dopaminrezeptoren (D1, D2, D3) sind als Folge einer Nucleotidsequenzhomologie, die zwischen diesen Rezeptorgenen besteht, kloniert worden [Bunzow et al., Nature 336, 783-787 (1988); Grandy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9762-9766 (1989); Dal Toso et al., EMBO J. 8, 4025-4034 (1989); Zhou et al., Nature 346, 76-80 (1990); Sunahara et al., Nature 346, 80-83 (1990); Sokoloff et al., Nature 347, 146-151 (1990)].
  • Das Antipsychotikum Clozapin ist für sozial zurückgezogene und behandlungsresistente Schizophrene von Nutzen [siehe Kane et al., Nature 347, 146-151 (1990)], anders als andere Antipsychotika verursacht Clozapin aber nicht Dyskinesia tarda [siehe Casey, Psychopharmacology 99, 547-553 (1989)]. Clozapin hat jedoch Dissoziationskonstanten für D2 und D3, die 3- bis 30fach höher sind als die therapiefreie Konzentration von Clozapin im Plasmawasser [Ackenheil et al., Arzneim-Forsch 26, 1156-1158 (1976); Sandoz Canada, Inc.; Clozaril: Summary of preclinical and clinical data (1990)]. Dies schlägt das Vorhandensein von Dopaminrezeptoren vor, die empfindlicher auf das Antipsychotikum Clozapin reagieren als die bisher nach dem Stand der Technik bekannten.
  • Aufgrund der verschiedenen biologischen Wirkungen von Dopamin besteht im Fachgebiet der Bedarf, zusätzliche Mitglieder der Dopamin-GCPR-Familie zu identifizieren, deren Aktivität reguliert werden kann, um therapeutische Wirkungen bereitzustellen.
  • WO 0022131 offenbart einen menschlichen Orphan-GPCR, hRUP3 genannt, wobei dessen Nucleotid und Aminosäuresequenz mit den Seq.-ID Nr. 1 und 2 identisch sind.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf Mitteln, die zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit zweckdienlich sind. Eine Testverbindung wird mit einem dopaminähnlichen GPCR-Polypeptid kontaktiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der aus:
    Aminosäuresequenzen, die zumindest 90 % Identität mit der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen, und
    der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2
    bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Es wird eine dopaminähnliche GPCR-Aktivität des Polypeptids detektiert. Eine Testverbindung, welche die dopaminähnliche GPCR-Aktivität des Polypeptids im Vergleich zur dopaminähnlichen GPCR-Aktivität bei Fehlen der Testverbindung senkt, wird auf diese Art und Weise als potentielles Mittel zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit identifiziert.
  • Die Erfindung stellt daher einen menschlichen dopaminähnlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptor bereit, der dazu eingesetzt werden kann, Testverbindungen zu identifizieren, welche als Antagonisten an der Rezeptorstelle wirken können und zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit zweckdienlich sind. Menschlicher dopaminähnlicher G-Protein-gekoppelter Rezeptor und Fragmente davon sind auch nützlich, um spezielle Antikörper zu züchten, welche den Rezeptor blockieren und Ligandenbindung effektiv vermeiden können und welche zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit zweckdienlich sind.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die DNA-Sequenz, welche für ein dopaminähnliches GPCR-Polypeptid kodiert.
  • 2 zeigt die von der DNA-Sequenz der 1 abgeleitete Aminosäuresequenz.
  • 3 zeigt die Aminosäuresequenz eines Proteins, das mit SwissProt Zugriffsnummer P41596 identifiziert wurde.
  • 4 zeigt die BLASTX-Angleichung des dopaminähnlichen GPCR-Polypeptids der 2 mit SwissProt Zugriffsnr. P41596 der 3.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist vom Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckt worden, dass ein dopaminrezeptorähnlicher GPCR (DA-ähnlicher GPCR), insbesondere ein menschlicher dopaminrezeptorähnlicher GPCR, in therapeutischen Verfahren und in Screeningverfahren zur Identifikation von Antagonisten eingesetzt werden kann, die zur Behandlung von Erkrankungen, wie z.B. Alzheimer-Krankheit, zweckdienlich sind. Menschliche DA-ähnliche GPCR können auch zum Screenen auf menschliche DA-ähnliche GPCR-Antagonisten eingesetzt werden, die zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit zweckdienlich sind.
  • Menschlicher DA-ähnlicher GPCR ist über 350 Aminosäuren hinweg zu 30 % mit dem D.-melanogaster-Protein identisch, das mit SwissProt Zugriffsnummer P41596 identifiziert und Dopamin-1-Rezeptor-Vorläufer genannt wurde. Daher wird davon ausgegangen, dass menschlicher DA-ähnlicher GPCR für dieselben Zwecke nützlich ist wie zuvor identifizierte Dopaminrezeptoren. Zum Beispiel kann menschlicher DA-ähnlicher GPCR, der gemäß der vorliegenden Erfindung aus klonierten Genen hergestellt wird, dazu eingesetzt werden, Verbindungen auf DA-ähnliche GPCR-Aktivität zu untersuchen oder die Menge eines dopaminergen Arzneimittels in einer Lösung (z.B. Blutplasma oder Serum) zu bestimmen. Wirtszellen, die mit Expressionsvektoren transformiert sind, die menschliche DA-ähnliche Polynucleotide umfassen, können verwendet werden, um Verbindungen auf DA-ähnliche GPCR-Bindungsaktivität zu testen. Es sind kompetitive Bindungstests bekannt, im Zuge welcher solche Verfahren durchgeführt werden, wie unten stehend in den Beispielen dargelegt ist. Durch die Auswahl von Wirtszellen, die einen Dopaminrezeptor normalerweise nicht exprimieren, können Formulierungen frei von D1A-Rezeptoren, D2-Rezeptoren und anderen Dopaminrezeptorunterarten erhalten werden. Außerdem können menschliche DA-ähnliche GPCR-Agonisten und -Antagonisten identifiziert werden, indem Wirtszellen, die Adenylylcyclase exprimieren, mit Expressionsvektoren der vorliegen den Erfindung transformiert werden. Die aus solchen Zellen erhaltenen Membranen können in biochemischen Studien, worin die Aktivität der Adenylylcyclase überwacht wird, verwendet werden. DA-ähnliche GPCR-Agonisten stimulieren die Adenylylcyclase. Diese Zellen müssen den DA-ähnlichen GPCR operativ mit der Adenylylcyclase assoziieren können, d.h. in den Zellmembranen muss auch G-Protein vorliegen. Verfahren zur Durchführung von Tests wie diesen sind in den folgenden Beispielen auch detaillierter beschrieben.
  • Isolierte und gereinigte DA-ähnliche GPCRs der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannten Verfahren, einschließlich Säulenchromatographie (z.B. Ionenaustausch-, Gelfiltration, Elektrophorese, Affinitätschromatographie etc.), gegebenenfalls gefolgt von Kristallisation, aus Zellmembranen oder lysierten Zellfraktionen, welche den Rezeptor enthalten, gereinigt werden, wie unten beschrieben [siehe allgemein „Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology 22, 233-577 (1977)].
  • Polypeptide
  • DA-ähnliche GPCR-Polypeptide umfassen zumindest 20, 30, 40, 50, 53, 78, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 oder 350 zusammenhängende Aminosäuren, die aus der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 oder einer biologisch aktiven Variante davon, wie unten defininiert, ausgewählt sind. Ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kann daher ein Teil eines DA-ähnlichen GPCR-Proteins sein, ein DA-ähnliches GPCR-Protein voller Länge oder ein Fusionsprotein sein, das das gesamte oder einen Teil eines DA-ähnlichen GPCR-Proteins umfasst. Eine kodierende Sequenz für Seq.-ID Nr. 2 ist in Seq.-ID Nr. 1 dargestellt.
  • Biologisch aktive Varianten
  • DA-ähnliche GPCR-Polypeptidvarianten, die biologisch aktiv sind, d.h. welche die Fähigkeit behalten, ein Dopamin oder einen Dopamin-ähnlichen Liganden zu binden, um eine biologische Wirkung zu produzieren, wie z.B. zyklische AMP-Bildung, Mobi lisierung intrazellulären Kalziums oder Phosphoinositid-Metabolismus, sind auch DA-ähnliche GPCR-Polypeptide. Bevorzugt weisen natürlich oder nicht-natürlich auftretende DA-ähnliche GPCR-Polypeptidvarianten Aminosäuresequenzen auf, die zumindest 90 % Identität mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 aufweisen. Der Prozentsatz der Identität zwischen einer vermeintlichen DA-ähnlichen GPCR-Polypeptidvariante und einer Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 wird mithilfe des Blast2-Angleichungsprogramms bestimmt (Blosum62, Expect10, genetische Standardcodes).
  • Variationen im Prozentsatz der Identität können zum Beispiel auf Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen zurückgeführt werden. Aminosäuresubstitutionen sind als 1:1-Aminosäureersetzungen definiert worden. Sie sind von konservativer Natur, wenn die substituierte Aminosäure ähnliche strukturelle und/oder chemische Eigenschaften aufweist. Beispiele für konservative Ersetzungen sind Substitutionen von Leucin durch ein Isoleucin oder Valin, von Aspartat durch ein Glutamat oder von Threonin durch Serin.
  • Aminosäureinsertionen oder -deletionen sind Veränderungen einer Aminosäuresequenz oder Veränderungen innerhalb dieser Aminosäuresequenz. Diese spielen sich üblicherweise im Rahmen von etwa 1 bis 5 Aminosäuren ab. Anleitungen zur Bestimmung, welche Aminosäurereste substituiert, insertiert oder deletiert werden können, ohne die biologische oder immunologische Aktivität eines DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids zu zerstören, können mittels fachbekannter Computerprogramme, wie z.B. DNASTAR-Software, gefunden werden. Ob die Veränderung einer Aminosäure zu einem biologisch aktiven DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid führt, kann einfach bestimmt werden, indem auf die Bindung an einen Liganden getestet wird oder ein Funktionstest durchgeführt wird, wie z.B. in den nachstehenden speziellen Beispielen beschrieben.
  • Fusionsproteine
  • Fusionsproteine sind zur Erzeugung von Antikörpern gegen DA-ähnliche GPCR-Polypeptidaminosäuresequenzen und zur Verwendung in verschiedenen Testsystemen zweckdienlich. Zum Beispiel können Fusionsproteine eingesetzt werden, um Proteine zu identifizieren, die mit Teilen eines DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids wechselwirken. Die Proteinaffinitätschromatographie oder bibliothekbasierte Tests auf Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie z.B. Hefe-2-Hybrid- oder Phagendisplaysysteme, können für diesen Zweck eingesetzt werden. Diese Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können auch als Tests auf Arzneimittel eingesetzt werden.
  • Ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid-Fusionsprotein umfasst zwei Polypeptidsegmente, die über eine Peptidbindung aneinander fusioniert sind. Das erste Polypeptidsegment umfasst zumindest 20, 30, 40, 50, 53, 78, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 oder 350 zusammenhängende Aminosäuren von Seq.-ID Nr. 2 oder von einer biologisch aktiven Variante, wie z.B. die oben beschriebenen. Das erste Polypeptidsegment kann auch ein DA-ähnliches GPCR-Protein voller Länge umfassen. Das zweite Polypeptidsegment kann ein Protein voller Länge oder ein Proteinfragment sein. Proteine, die üblicherweise zur Herstellung von Fusionsproteinen verwendet werden, umfassen β-Galactosidase, β-Glucuronidase, grünfluoreszierendes Protein (GFP), autofluoreszierende Proteine, einschließlich blaufluoreszierendes Protein (BFP), Glutathion-S-Transferase (GST), Luciferase, Meerrettichperoxidase (HRP) und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT). Zusätzlich werden Epitopmarkierungen zur Herstellung von Fusionsproteinen verwendet, einschließlich Histidin-(His-)Markierungen, FLAG-Markierungen, Influenza-Hämagglutinin-(HA-)Markierungen, Myc-Markierungen, VSV-G-Markierungen und Thioredoxin-(Trx-)Markierungen. Andere Fusionskonstruktionen können maltosebindendes Protein (MBP) umfassen, S-Markierungen, Lex-a-DNA-Bindedomänen-(DBD-)Fusionen, GAL4-DNA-Bindedomänenfusionen und Herpes-Simplex-Virus-(HSV-)BP16-Proteinfusionen. Ein Fusionsprotein kann auch erzeugt werden, um eine Spaltstelle zwischen der für DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodierenden Sequenz und der heterologen Proteinse quenz zu enthalten, sodass das DA-ähnliche GPCR-Polypeptid gespalten und von der heterologen Gruppierung weg gereinigt werden kann.
  • Ein Fusionsprotein kann, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, chemisch synthetisiert werden. Bevorzugt wird ein Fusionsprotein durch kovalente Bindung zweier Polypeptidsegmente oder durch Standardverfahren der Molekularbiologie produziert. DNA-Rekombinationsverfahren können eingesetzt werden, um Fusionsproteine herzustellen, zum Beispiel indem ein DNA-Konstrukt geschaffen wird, welches kodierende Sequenzen, ausgewählt aus Seq.-ID Nr. 1, in einem geeigneten Leseraster mit Nucleotiden umfasst, die für das zweite Polypeptidsegment kodieren, und das DNA-Konstrukt in einer Wirtszelle exprimiert wird, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Von Unternehmen wie z.B. Promega Corporation (Madison, Wisconsin), Stratagene (La Jolla, Kalifornien), CLONTECH (Mountain View, Kalifornien), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornien), MBL International Corporation (MIC, Watertown, Massachusetts) und Quantum Biotechnologies (Montreal, Kanada, 1-888-DNA-KITS) können viele Sets zur Herstellung von Fusionsproteinen bezogen werden.
  • Identifizierung von Spezieshomologen
  • Spezieshomologe von menschlichem DA-ähnlichem GPCR-Polypeptid können unter Einsatz von DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid-Polynucleotiden (siehe unten), um geeignete Sonden oder Primer zum Screenen von cDNA-Expressionsbibliotheken anderer Spezies, wie z.B. Mäusen, Affen oder Hefe, zu schaffen, Identifizieren von cDNAs, die für Homologe des DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids kodieren, und Exprimieren der cDNAs auf fachbekannte Weise erhalten werden.
  • Identifizierung von Polynucleotidvarianten und -homologen
  • Varianten und Homologe der oben beschriebenen DA-GPCR-Polynucleotide sind auch DA-ähnliche GPCR-Polynucleotide. Typischerweise können homologe DA-ähnliche GPCR-Polynucleotidsequenzen mittels Hybridisierung von Kandidatenpoly nucleotiden an bekannte DA-ähnliche GPCR-Polynucleotide unter stringenten Bedingungen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, identifiziert werden. Zum Beispiel können homologe Sequenzen, die höchstens etwa 25-30 % Basenpaarfehlpaarungen enthalten, unter Einsatz der folgenden Waschbedingungen – 2X SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, pH 7,0); 0,1 % SDS, zweimal Raumtemperatur, 30 Minuten jeweils, dann 2X SSC, 0,1 % SDS, 50 °C einmal, 30 Minuten, dann 2X SSC, zweimal Raumtemperatur, 10 Minuten jeweils – identifiziert werden. Bevorzugter enthalten homologe Nucleinsäurestämme 15-25 % Basenpaarfehlpaarungen, noch bevorzugter 5-15 % Basenpaarfehlpaarungen.
  • Spezieshomologe der hierin offenbarten DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotide können auch identfiziert werden, indem geeignete Sonden oder Primer hergestellt werden und die cDNA-Expressionsbibliotheken anderer Spezies, wie z.B. Mäuse, Affen oder Hefe, untersucht werden. Humane Varianten der DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotide können beispielsweise durch Screenen humaner cDNA-Expressionsbibliotheken identifiziert werden. Es ist wohlbekannt, dass die Tm einer doppelsträngigen DNA bei jedem 1-%-Rückgang der Homologie um 1-1,5 °C abnimmt [Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973)]. Varianten menschlicher DA-ähnlicher GPCR-Polynucleotide oder DA-GPCR-Polynucleotide anderer Spezies können daher mittels Hybridisierung eines vermeintlich homologen DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotids an ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder dem Komplement davon identifiziert werden, um ein Testhybrid herzustellen. Die Schmelztemperatur des Testhybrids wird mit der Schmelztemperatur eines Hybrids, das Polynucleotide umfasst, die perfekt komplementäre Nucleotidsequenzen aufweisen, verglichen, und die Zahl oder der Prozentsatz von Basenpaarfehlpaarungen innerhalb des Testhybrids werden berechnet.
  • Nucleotidsequenzen, welche nach stringenter Hybridisierung und/oder stringenten Waschbedingungen an DA-ähnliche GPCR-Polynucleotide oder deren Komplemente hybridisieren, sind ebenfalls DA-ähnliche GPCR-Polynucleotide. Stringente Waschbedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und von Fachleuten ver standen und sind zum Beispiel in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, 9.50-9.51 (1989), offenbart.
  • Typischerweise sollte für stringente Hybridisierungsbedingungen eine Kombination aus Temperatur und Salzkonzentration gewählt werden, die etwa 12-20 °C unter der berechneten Tm des studierten Hybrids liegt. Die Tm eines Hybrids zwischen einem DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotid mit einer in Seq.-ID Nr. 1 gezeigten Nucleotidsequenz oder dem Komplement davon und einer Polynucleotidsequenz, die zumindest zu etwa 50 %, bevorzugt 75, 90, 96 oder 98 %, identisch mit einer dieser Nucleotidsequenzen ist, kann zum Beispiel unter Einsatz der Gleichung von Bolton und Mc-Carthy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48, 1390 (1962), berechnet werden: Tm = 81,5 °C – 16,6(log10[Na+]) + 0,41 (% G + C) – 0,63 (% Formamid) – 600/l), worinl = Länge des Hybrids in Baasenpaaren ist.
  • Stringente Waschbedingungen umfassen zum Beispiel 4X SSC bei 65°C oder 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C oder 0,5X SSC, 0,1 % SDS bei 65°C. Höchst stringente Waschbedingungen umfassen zum Beispiel 0,2X SSC bei 65°C.
  • Herstellung von Polynucleotiden
  • Ein natürlich vorkommendes DA-ähnliches GPCR-Polynucleotid kann frei von anderen Zellkomponenten wie z.B. Membrankomponenten, Proteinen und Lipiden, isoliert werden. Polynucleotide können mithilfe einer Zelle hergestellt werden und unter Einsatz von Standard-Nucleinsäurereinigungsverfahren isoliert oder mithilfe von Amplifikationsverfahren, wie z.B. Polymerasekettenreaktion (PCR), oder unter Verwendung eines automatischen Synthesegeräts synthetisiert werden. Verfahren zur Isolation von Polynucleotiden sind routinemäßige und fachbekannte Verfahren. Jedes dieser Verfahren, das verwendet wird, um ein Polynucleotid zu erhalten, kann dazu eingesetzt werden, isolierte DA-ähnliche GPCR-Polynucleotide zu erhalten. Zum Beispiel können Restriktionsenzyme und Sonden verwendet werden, um Polynucleotidfragmente zu isolieren, welche DA-ähnliche GPCR-Nucleotidsequenzen umfassen. Iso lierte Polynucleotide liegen in Formulierungen vor, die frei sind oder zumindest zu 70, 80 oder 90 % frei von anderen Molekülen sind.
  • DA-ähnliche-GPCR-cDNA-Moleküle können mittels molekularbiologischen Standard-Verfahren unter Einsatz von DA-ähnlicher-GPCR-mRNA als Matrize hergestellt werden. DA-ähnliche GPCR-cDNA-Moleküle können danach unter Einsatz von molekularbiologischen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und in Handbüchern wie Sambrook et al. (1989) offenbart sind, repliziert werden. Ein Amplifikationsverfahren, wie z.B. PCR, kann eingesetzt werden, um unter Verwendung von menschlicher genomischer DNA oder cDNA als Matrize zusätzliche Kopien von Polynucleotiden der Erfindung zu erhalten.
  • Alternativ dazu können Verfahren der synthetischen Chemie verwendet werden, um DA-GPCR-Polynucleotide zu synthetisieren. Die Degeneration des genetischen Codes ermöglicht die Synthese von alternierenden Nucleotidsequenzen, welche für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid mit z.B. einer Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 oder eine biologisch aktive Variante davon kodieren.
  • Verlängern von Polynucleotiden
  • Verschiedene PCR-basierte Verfahren können zur Verlängerung der hierin offenbarten Nucleinsäuresequenzen verwendet werden, um Stromauf-Sequenzen, wie z.B. Promotoren und Regulationselemente, zu detektieren. Zum Beispiel verwendet die Restriktionsstellen-PCR Universalprimer, um unbekannte, an einen bekannten Lokus angrenzende Sequenzen zu erhalten (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318-322 (1993)]. Genomische DNA wird zuerst in Gegenwart eines Primers an eine Linkersequenz und an einen für die bekannte Region spezifischen Primer amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen werden dann einer zweiten PCR-Runde mit demselben Linkerprimer und einem anderen speziellen Primer innerhalb des ersten Primers unterworfen. Produkte jeder PCR-Runde werden mit einer geeigneten RNA-Polymerase transkribiert und unter Einsatz reverser Transkriptase sequenziert.
  • Inverse PCR kann auch dazu verwendet werden, Sequenzen unter Einsatz divergierender Primer basierend auf einer bekannten Region zu amplifizieren oder zu verlängern [Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 8186 (1988)]. Primer können unter Einsatz handelsüblicher Software, wie z.B. OLIGO 4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences Inc., Plymouth, Minnesota), konstruiert werden, die eine Länge von 22-30 Nucleotiden aufweisen, die einen GC-Gehalt von 50 % oder mehr aufweisen und sich bei Temperaturen von etwa 68-72°C an die Target-Sequenz anellieren. Das Verfahren verwendet verschiedene Restriktionsenzyme, um in der bekannten Region eines Gens ein geeignetes Fragment zu schaffen. Das Fragment wird dann mittels intramolekularer Ligation zirkularisiert und als PCR-Matrize verwendet.
  • Ein anderes Verfahren, das verwendet werden kann, ist die Einfang-PCR, welche die PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten umfasst, die an eine bekannte Sequenz in der künstlichen menschlichen oder Hefe-Chromosomen-DNA angrenzen [Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1, 111-119 (1991)]. In diesem Verfahren können auch multiple Restriktionsenzymverdaue und Ligationen verwendet werden, um eine gentechnisch veränderte doppelsträngige Sequenz in ein unbekanntes Fragment des DNA-Moleküls zu platzieren, bevor PCR durchgeführt wird.
  • Ein weiteres Verfahren, das eingesetzt werden kann, um unbekannte Sequenzen zu erhalten, ist jenes von Parker et al., Nucleic Acids Res. 19, 3055-3060 (1991). Außerdem können PCR, verschachtelte Primer und PROMOTORFINDER-Bibliotheken (CLONTECH, Palo Alto, Kalifornien) verwendet werden, um genomische DNA zu walken (CLONTECH, Palo Alto, Kalifornien). Dieser Prozess vermeidet die Notwendigkeit, Bibliotheken zu screenen, und dient dazu, Intron-Exon-Übergangsstellen aufzuspüren.
  • Beim Screenen auf cDNAs voller Länge ist es bevorzugt, Bibliotheken zu verwenden, die größenselektiert sind, um größere cDNAs aufzunehmen. Zufallsgeprimte Bibliotheken sind dahingehend bevorzugt, da sie mehr Sequenzen enthalten, die 5'-Regionen von Genen enthalten. Die Verwendung einer zufallsgeprimten Bibliothek kann besonders für Fälle bevorzugt sein, in welchen eine Oligo-d(T)-Bibliothek keine cDNA voller Länge ergibt. Genomische Bibliotheken können zur Verlängerung der Sequenz in 5'-nichttranskribierte Regulationsregionen zweckdienlich sein.
  • Handelsübliche Kapillarelektrophoresesysteme können verwendet werden, um die Größe oder die Nucleotidsequenz von PCR- oder Sequenzierungsprodukten zu analysieren oder zu bestätigen. Zum Beispiel kann Kapillarsequenzierung fließfähige Polymere zur elektrophoretischen Trennung, vier verschiedene laseraktivierte Fluoreszenzfarbstoffe (einer pro Nucleotid) und Detektion emittierter Wellenlängen unter Einsatz einer ladungsgekoppelten Kamera verwenden. Der Output bzw. die Lichtintensität kann unter Einsatz einer geeigneten Software (z.B. GENOYTPER und Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer) in ein elektrisches Signal konvertiert werden, und der gesamte Prozess vom Laden von Proben bis hin zur Computeranalyse und elektronischen Datenanzeige können computergesteuert sein. Für die Sequenzierung kleiner DNA-Stücke, die in eingeschränkten Mengen in einer besonderen Probe vorliegen können, ist Kapillarelektrophorese besonders bevorzugt.
  • Gewinnung von Polypeptiden
  • DA-ähnliche GPCR-Polypeptide können z.B. durch Reinigung aus menschlichen Zellen, durch Expression DA-ähnlicher GPCR-Polynucleotide oder durch direkte chemische Synthese gewonnen werden.
  • Proteinreinigung
  • DA-ähnliche GPCR-Polypeptide können aus jeder beliebigen menschlichen Zelle, die den Rezeptor exprimiert, gewonnen werden, einschließlich Wirtszellen, die mit DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotiden transfiziert worden sind. Melanozyten, das Herz eines Fötus und der Uterus sind besonders zweckdienliche Quellen für DA-ähnliche GPCR-Polypeptide. Ein gereinigtes DA-ähnliches GPCR-Polypeptid wird unter Einsatz fachbekannter Verfahren von anderen Verbindungen, die normalerweise mit dem DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid in der Zelle assoziieren, wie z.B. bestimmten Proteinen, Kohlenhydraten oder Lipiden, getrennt. Diese Verfahren umfassen Grö ßenausschlusschromatographie, Amoniumsulfatfraktionierung, Ionenaustausch-chromatographie, Affinitätschromatographie und präparative Gelelektrophorese, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • Ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kann wie in den speziellen Beispielen beschrieben, s.u., auf geeignete Art und Weise als Komplex mit seinem assoziierten G-Protein isoliert werden. Eine Formulierung gereinigter DA-ähnlicher GPCR-Polypeptide ist zu zumindest 80 % rein, bevorzugt sind die Formulierungen zu 90 %, 95 % oder 99 % rein. Die Reinheit der Formulierungen kann mithilfe jedes beliebigen fachbekannten Mittels, wie z.B. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, beurteilt werden.
  • Expression von Polynucleotiden
  • Zur Expression eines DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotids kann das Polynucleotid in einen Expressionsvektor insertiert werden, welcher die zur Transkription und Translation der insertierten kodierenden Sequenz notwendigen Elemente enthält. Fachbekannte Verfahren können dazu verwendet werden, um Expressionsvektoren herzustellen, die Sequenzen enthalten, die für DA-ähnliche GPCR-Polypeptide und geeignete Transkriptions- und Translationssteuerelemente kodieren. Diese Verfahren umfassen In-vitro-DNA-Rekombinationsverfahren, synthetische Techniken und genetische In-vivo-Rekombination. Diese Techniken sind z.B. in Sambrook et al. (1989) und in Ausubel et al., CURRENT PROTCOOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1989), beschrieben.
  • Eine Vielfalt an Expressionsvektor/Wirtsystemen kann verwendet werden, um Sequenzen zu enthalten und zu exprimieren, die für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodieren. Diese umfassen Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert sind; Hefe, die mit Hefe-Expressionsvektoren transformiert ist; Insektenzellsysteme, die mit Virusexpressionsvektoren (z.B. Baculovirus) infiziert sind; Pflanzenzellsysteme, die mit Virusexpressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV, Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z.B. Ti oder pBR322- Plasmiden) transformiert sind, oder Tierzellsysteme, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • Die Kontrollelemente oder Regulationssequenzen sind jene nicht-translatierten Regionen des Vektors – Enhancer, Promotoren, 5'- und 3'-Regionen –, welche mit Wirtszellproteinen wechselwirken, um Transkription und Translation durchzuführen. Diese Elemente können in ihrer Größe und Spezifität variieren. Abhängig vom verwendeten Vektorsystem und Wirt kann jede beliebige Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, verwendet werden. Zum Beispiel können beim Klonieren in bakteriellen Systemen induzierbare Promotoren, wie z.B. der Hybrid-IacZ-Promotor des BLUESCRIPT-Phagemids (Stratagene, LaJolla, Kalifornien) oder pSPORT1-Plasmid (Life Technologies) und dergleichen, verwendet werden. Der Promotor von Baculovirus-Polyhedrin kann in Insektenzellen verwendet werden. Promotoren oder Enhancer, die von den Genomen von Pflanzenzellen (z.B. Hitzeschock-, RUBISCO- und Speicherproteingene) oder Pflanzenviren (z.B. Virenpromotoren oder Leader-Sequenzen) abstammen, können in den Vektor kloniert werden. In Säugetierzellsystemen sind Promotoren von Säugetiergenen oder Säugetierviren bevorzugt. Wenn es notwendig ist, eine Zelllinie zu erzeugen, die multiple Kopien einer Nucleotidsequenz enthält, die für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodieren, können Vektoren basierend auf SV40 oder EBV mit einem geeigneten selektierbaren Marker verwendet werden.
  • Bakterien- und Hefe-Expressionssysteme
  • In Bakteriensystemen kann eine Reihe von Expressionsvektoren, abhängig vom für das DA-ähnliche GPCR-Polypeptid vorgesehenen Verwendungszweck, ausgewählt werden. Zum Beispiel können, wenn zur Induktion von Antikörpern eine große Menge eines DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids nötig ist, Vektoren verwendet werden, welche die hochgradige Expression von Fusionsproteinen lenken, die einfach gereinigt werden. Diese Vektoren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, multifunktionale E.-coli-Klonierung und Expressionsvektoren, wie z.B. BLUESCRIPT (Stratagene). Bei einem BLUESCRIPT-Vektor kann eine Sequenz, die für das DA-ähnliche GPCR-Polypetid kodiert, in Raster mit Sequenzen für das Amino-terminale Met und die folgenden 7 Reste von β-Galactosidase in den Vektor ligiert werden, sodass ein Hybridprotein produziert wird. pIN-Vektoren [Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509 (1989)] oder pGEX-Vektoren (Promega, Madison, Wisconsin) können auch dazu eingesetzt werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können einfach mittels Adsorption an Glutathion-Agarose-Perlen gefolgt von Elution in Gegenwart von freiem Glutathion von lysierten Zellen gereinigt werden. Proteine, die in solchen Systemen hergestellt werden, können so konstruiert werden, dass sie Heparin-, Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltstellen umfassen, sodass das klonierte Polypeptid von Interesse nach Belieben von der GST-Gruppierung befreit werden kann.
  • In der Hefe Saccharomyces cerevisiae kann eine Reihe von Vektoren verwendet werden, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, wie z.B. Alphafaktor, Alkoholoxidase und PGH. Für Überblicksartikel siehe Ausubel et al. (1989) und Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516-544 (1987).
  • Pflanzen- und Insektenexpressionssysteme
  • Wenn Pflanzenexpressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression von Sequenzen, die für DA-ähnliche GPCR-Polypeptide kodieren, durch jede beliebige Anzahl von Promotoren angetrieben werden. Zum Beispiel können Virenpromotoren, wie 35S- und 19S-Promotoren von CaMV, alleine oder in Kombination mit der Omega-Leader-Sequenz von TMV verwendet werden [Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311 (1987)]. Alternativ dazu können Pflanzenpromotoren, wie z.B. die kleine Untereinheit von RUBISCO oder Hitzeschockpromotoren, verwendet werden [Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224, 838-843 (1984); Winter et al., Results Probt. Cell Differ. 17, 85-105 (1991)]. Diese Konstrukte können mithilfe direkter DNA-Transformation oder pathogenvermittelter Transfektion in Pflanzenzellen eingeführt werden. Diese Techniken sind in einer Vielzahl allgemein verfügbarer Überblicksartikel beschrieben [z.B. Hobbs oder Murray, in MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., 191-196 (1992)].
  • Ein Insektensystem kann auch dazu verwendet werden, ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid zu exprimieren. Zum Beispiel wird in einem solchen System Autographacalifornica-Kernpolyedervirus (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder Gene in Spodoptera-frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven verwendet. Sequenzen, die für DA-ähnliche GPCR-Polypeptide kodieren, können in eine nicht-essentielle Region des Virus, wie z.B. das Polyhedrin-Gen, kloniert werden und unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gebracht werden. Die erfolgreiche Insertion von DA-ähnlichen GPCR-Polypeptiden macht das Polyhedrin-Gen inaktiv und produziert ein rekombinantes Virus, dem ein Hüllprotein fehlt. Die rekombinanten Viren können dann verwendet werden, um S.-frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven zu infizieren, in welchen DA-ähnliche GPCR-Polypeptide exprimiert werden können [Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224-3227 (1994)].
  • Säugetierexpressionssysteme
  • Eine Reihe virenbasierter Expressionssysteme kann dazu eingesetzt werden, DA-ähnliche GPCR-Polypeptide in Säugetierwirtszellen zu exprimieren. Zum Beispiel können Sequenzen, die für DA-ähnliche GPCR-Polypeptide kodieren, wenn ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird in einen Adenovirus-Transkription/Translation-Komplex ligiert werden, der den späten Promotor und die dreiteilige Leader-Sequenz umfasst. Insertion in eine nicht-essentielle E1- oder E3-Region des Virusgenoms kann verwendet werden, um ein lebensfähiges Virus zu erhalten, das bei infizierten Wirtszellen ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid exprimieren kann [Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659 (1984)]. Wenn gewünscht können Transkriptionsverstärker, wie z.B. der Rous-Sarkom-Virus-(RSV-)Enhancer, verwendet werden, um die Expression in Säugetierwirtszellen zu verstärken.
  • Menschliche künstliche Chromosome (HACs) können auch verwendet werden, um größere DNA-Fragmente zu liefern als in einem Plasmid enthalten sein und expri miert werden können. HACs von 6M bis 10M werden konstruiert und über herkömmliche Abgabeverfahren (z.B. Liposomen, Polykation-Aminopolymere oder Vesikel) zu Zellen geliefert.
  • Spezielle Initiationssignale können auch dazu eingesetzt werden, eine effizientere Translation von Sequenzen, die für DA-ähnliche GPCR-Polypeptide kodieren, zu erreichen. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In Fällen, in welchen Sequenzen für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodieren, werden sein Initiationscodon und Stromauf-Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor insertiert, es sind keine zusätzlichen Transkriptions- oder Translationskontrollsignale nötig. Jedoch sollten in Fällen, in denen nur eine kodierende Sequenz oder ein Fragment davon insertiert wird, exogene Translationskontrollsignale (einschließlich ATG-Initiationscodon) bereitgestellt werden. Das Initiationscodon sollte in dem korrekten Leseraster liegen, um die Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Exogene Translationselemente und Initiationscodone können verschiedenen Ursprungs sein, sowohl natürlichen als auch synthetischen. Die Wirksamkeit der Expression kann durch die Eingliederung von Enhancern, die für das eingesetzte spezielle Zellsystem geeignet sind, verstärkt werden [siehe Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162 (1994)].
  • Wirtszellen
  • Ein Wirtszellenstamm kann aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt werden, die Expression der insertierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte DA-ähnliche GPCR-Polypeptid auf gewünschte Art und Weise zu verarbeiten. Solche Modifikationen des Polypeptids umfassen Acetylierung, Carboxylierung, Glycosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Post-Translationsverarbeitung, durch welche eine „Präpro"-Form des Polypeptids gespalten wird, kann auch dazu eingesetzt werden, eine korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion zu erleichtern. Verschiedene Wirtszellen, die einen speziellen zellulären Mechanismus und charakteristische Mechanismen für Posttranslationsaktivitäten aufweisen (z.B. CHO, HeLa, MDCK, HEK293 und WI38), sind von der Ameri can Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) zu beziehen und können ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Verarbeitung des Fremdproteins sicherzustellen.
  • Eine stabile Expression ist für die langfristige Produktion rekombinanter Proteine mit hoher Ausbeute bevorzugt. Zum Beispiel können Zelllinien, die DA-ähnliche GPCR-Polypeptide stabil exprimieren, unter Einsatz von Expressionsvektoren transformiert werden, welche virale Replikationsursprünge und/oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markergen auf demselben oder einem separaten Vektor enthalten können. Nach der Einführung des Vektors können Zellen 1-2 Tage lang in einem angereicherten Medium wachsen, bevor sie in ein Selektivmedium gegeben werden. Der Zweck des selektierbaren Markers ist es, der Selektion Resistenz zu verleihen, und seine Anwesenheit ermöglicht das Wachstum und die Gewinnung von Zellen, die erfolgreich die eingeführten DA-ähnlichen GPCR-Sequenzen exprimieren. Resistente Klone stabil transformierter Zellen können unter Einsatz von Gewebskulturtechniken, die für jeden Zelltyp geeignet sind, proliferiert werden. Siehe z.B. ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney, Hrsg., (1986).
  • Jede beliebige Anzahl von Selektionssystemen kann eingesetzt werden, um transformierte Zelllinien zurückzugewinnen.
  • Diese umfassen die Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase [Wigler et al., Cell 11, 223-232 (1977)] und Adeninphosphoribosyltransferase-Gene [Lowy et al., Cell 22, 817-823 (1980)], welche in tk–- oder aprt–-Zellen verwendet werden können, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Es kann auch Antimetabolit-, Anitibiotika- oder Herbizidresistenz als Selektionskriterium verwendet werden. Zum Beispiel verleiht dhfr Resistenz gegen Methotrexat (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-3570 (1980)], npt verleiht Resistenz gegen Aminoglycoside, Neomycin und G-418 [Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1-14 (1981)] und als und pat verleihen Resistenz gegen Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricinacetyltransferase [Murray (1992), siehe oben]. Es sind weitere selektierbare Gene beschrieben worden. Zum Beispiel ermöglicht trpB Zellen, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden, oder hisD, Histinol an stelle von Histidin zu verwenden [Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-8051 (1988)]. Sichtbare Marker, wie z.B. Anthocyanine, β-Glucuronidase und ihr Substrat GUS und Luciferase und ihr Substrat Luciferin, können eingesetzt werden, um Transformanten zu identifizieren und die Menge vorübergehender oder stabiler Proteinexpression zu quantifizieren, die einem speziellen Vektorsystem zuzuschreiben ist [Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121-131 (1995)].
  • Detektion von Expression
  • Obwohl die Gegenwart von Markergenexpression darauf schließen lässt, dass auch das DA-ähnliche GPCR-Polynucleotid gegenwärtig ist, muss seine Gegenwart und Expression nachgewiesen werden. Wenn eine Sequenz, die für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodiert, innerhalb einer Markergensequenz insertiert wird, können zum Beispiel transformierte Zellen, die Sequenzen enthalten, welche für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodieren, durch das Fehlen von Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ dazu kann ein Markergen in Tandem mit einer Sequenz platziert werden, die für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors. Die Expression des Markergens als Reaktion auf Induktion oder Selektion gibt üblicherweise die Expression des DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotids an.
  • Alternativ dazu können Wirtszellen, welche ein DA-ähnliches Polynucleotid enthalten und ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid exprimieren, mithilfe einer Reihe fachbekannter Verfahren identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungen und Protein-Bioassay oder -Immunoassayverfahren, die Membran-, Lösungs- oder Chip-basierte Technologien zur Detektion und/oder Quantifizierung von Nucleinsäure oder Protein umfassen. Zum Beispiel kann die Gegenwart einer Polynucleotidsequenz, welche für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodiert, durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifikation unter Einsatz von Sonden oder Fragmenten oder Fragmenten von Polynucleotiden detektiert werden, welche für ein DA-ähnliches Polypeptid kodieren. Nucleinsäure-Amplifikation-basierte Tests umfassen die Verwendung von Oligonucleotiden, die aus Sequenzen ausgewählt sind, die für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodieren, um Transformanten zu detektieren, welche ein DA-ähnliches GPCR-Polynucleotid umfassen.
  • Es ist eine Reihe von Arbeitsvorschriften zur Detektion und Messung der Expression eines DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids unter Einsatz von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die für ein Polypeptid spezifisch sind, fachbekannt. Beispiele umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), Radioimmunoassay (RIA) und fluroeszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Es kann ein zweiseitiger monoklonal basierter Immunoassay unter Einsatz von monoklonalen Antikörpern, die auf zwei nicht-interferierende Epitope auf einem DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid reagieren, oder ein kompetitiver Bindungstest verwendet werden. Diese und andere Tests werden in Hampton et al., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minnesota (1990), und Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1216 (1983), beschrieben.
  • Fachleuten ist eine große Vielfalt an Markierungen und Konjugationstechniken bekannt, und diese können in verschiedenen Nucleinsäure- und Aminosäuretests verwendet werden. Mittel zur Produktion markierter Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zur Detektion von zu Polynucleotiden gehörenden Sequenzen, die für DA-ähnliche GPCR-Polypeptide kodieren, umfassen Oligomarkierung, Nick-Translation, Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Einsatz eines markierten Nucleotids. Alternativ dazu können Sequenzen, die für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodieren, zur Produktion einer mRNA-Sonde in einen Vektor kloniert werden. Diese Vektoren sind fachbekannt, handelsüblich und können verwendet werden, um durch die Hinzufügung von markierten Nucleotiden und einer geeigneten RNA-Polymerase, wie z.B. T7, T3 oder SP6, RNA-Sonden in vitro zu synthetisieren. Diese Verfahren können unter Einsatz einer Reihe handelsüblicher Sets ausgeführt werden (Amersham Pharmacia Biotech, Promega und US Biochemical). Geeignete Reportermoleküle oder -markierungen, welche zur Erleichterung der Detektion eingesetzt werden können, umfassen Radionuclide, Enzyme und Fluoreszenzmittel, chemilumineszierende oder chromogene Mittel sowie auch Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Teilchen und dergleichen.
  • Expression und Reinigung von Polypeptiden
  • Wirtszellen, welche mit Nucleotidsequenzen transformiert werden, die für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodieren, können unter Bedingungen gezüchtet werden, die zur Expression und Gewinnung des Proteins aus der Zellkultur geeignet sind. Das durch eine transformierte Zelle produzierte Polypeptid kann sekretiert werden oder intrazellulär enthalten sein, abhängig von der verwendeten Sequenz und/oder dem Vektor. Wie Fachleute wissen, können Expressionsvektoren konstruiert werden, welche Polynucleotide enthalten, die für DA-ähnliche GPCR-Polypeptide kodieren, um Signalsequenzen zu erhalten, welche die direkte Sekretion von löslichen DA-ähnlichen GPCR-Polypeptiden durch eine prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran oder die Membraninsertion eines membrangebundenen DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids lenken.
  • Wie oben beschrieben können andere Konstruktionen verwendet werden, um eine Sequenz, die für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodiert, an eine Nucleotidsequenz zu binden, die für eine Polypeptiddomäne kodiert, die die Reinigung löslicher Proteine erleichtert. Diese Domänen, welche die Reinigung erleichtern, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Metallchelatpeptide, wie z.B. Histidin-Tryptophan-Moleküle, welche Reinigung auf immobilisierten Metallen ermöglichen, Protein-A-Domänen, welche Reinigung auf immobilisiertem Immunoglobulin ermöglichen, und die Domäne, welche im FLAGS-Extensions/Affinitätsreinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, Washington) verwendet wird. Die Aufnahme von spaltbaren Linkersequenzen, wie z.B. die für einen Faktor Xa oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, Kalifornien) spezifischen, zwischen die Reinigungsdomäne und das DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid kann auch verwendet werden, um die Reinigung zu erleichtern. Ein solcher Expressionsvektor stellt die Expression eines Fusionsproteins bereit, welches ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid und 6 Histidinreste umfasst, die einer Thioredoxin- oder einer Enterokinase-Spaltstelle vorangehen. Die Histidinreste er leichtern die Reinigung durch IMAC [immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie, wie in Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263-281 (1992), beschrieben], während die Enterokinasespaltstelle ein Mittel zur Reinigung des DA-ähnlichen FPCR-Polypeptids aus dem Fusionsprotein bereitstellt. Vektoren, welche Fusionsproteine enthalten, sind in Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441-453 (1993), offenbart.
  • Chemische Synthese
  • Sequenzen, welche für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodieren, können unter Einsatz fachbekannter chemischer Verfahren als Ganzes oder teilweise synthetisiert werden [siehe Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser., 215-223 (1980); Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser., 225-232 (1980)]. Alternativ dazu kann unter Einsatz chemischer Verfahren ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid zur Synthetisierung seiner Aminosäuresequenz produziert werden, wie z.B. durch direkte Peptidsynthese unter Einsatz von Festphasentechniken [Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963); Roberge et al., Science 269, 202-204 (1995)]. Proteinsynthese kann unter Einsatz manueller Techniken oder durch Automatisierung ausgeführt werden. Automatisierte Synthese kann zum Beispiel unter Einsatz des Applied-Biosystems-431A-Peptidsynthesegeräts (Perkin Elmer) erreicht werden. Gegebenenfalls können Fragmente von DA-ähnlichen GPCR-Polypeptiden separat synthetisiert und unter Einsatz chemischer Verfahren kombiniert werden, um ein Molekül voller Länge zu produzieren.
  • Das neu synthetisierte Peptid kann mithilfe präparativer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie [z.B. Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co.., New York, N.Y. (1983)] wesentlich gereinigt werden. Die Zusammensetzung eines synthetischen DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids kann durch Aminosäureanalyse oder -Sequenzierung (z.B. Edman-Abbauverfahren, siehe Creighton, s.o.) nachgewiesen werden. Außerdem kann jeder Abschnitt einer Aminosäuresequenz des DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids während der direkten Synthese verändert werden und/oder unter Einsatz chemischer Verfahren mit Sequenzen anderer Proteine kombiniert werden, um ein Variantenpolypeptid oder ein Fusionsprotein zu produzieren.
  • Produktion veränderter Polypeptide
  • Wie Fachleute wissen, kann es vorteilhaft sein, DA-ähnliche GPCR-Polypeptidkodierende Nucleotidsequenzen zu produzieren, welche nicht-natürlich auftretende Codone besitzen. Zum Beispiel können Codone, die von einem bestimmten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt bevorzugt werden, ausgewählt werden, um die Geschwindigkeit der Proteinexpression zu erhöhen oder ein RNA-Transkript zu produzieren, welches die gewünschten Eigenschaften besitzt, wie z.B. eine Halbwertszeit, welche länger ist als jene eines Transkripts, das aus der natürlich auftretenden Sequenz erzeugt wird.
  • Die hierin offenbarten Nucleotidsequenzen können unter Einsatz allgemein fachbekannter Verfahren zur Änderung von DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid-kodierenden Sequenzen aus einer Reihe von Gründen erzeugt werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Änderungen, welche die Klonierung, Verabreitung und/oder Expression des Polypeptids oder mRNA-Produkts modifizieren. Die DNA-Shuffling durch zufällige Fragmentierung und die PCR-Neuassemblierung von Genfragmenten und synthetischen Oligonucleotiden können eingesetzt werden, um die Nucleotidsequenzen herzustellen. Zum Beispiel kann ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt werden, um neue Restriktionsstellen zu insertieren, Glykosylierungsmuster zu ändern, Codon-Präferenz zu ändern, Spleißvarianten zu produzieren, Mutation einzuführen und dergleichen.
  • Antikörper
  • Es kann jede beliebige Art fachbekannter Antikörper erzeugt werden, um ihn spezifisch an ein Epitop eines DA-ähnlichen GPCT-Polypeptids zu binden. Der Begriff „Antikörper" umfasst wie hierin verwendet intakte Immunglobulinmoleküle wie auch Fragmente davon, wie z.B. Fab, F(ab')2 und Fv, welche ein Epitop eines DA- ähnlichen GPCR-Polypeptids binden können. Typischerweise sind zumindest 6, 8, 10 oder 12 zusammenhängende Aminosäuren erforderlich, um ein Epitop zu bilden. Jedoch können Epitope, welche nicht zusammenhängende Aminosäuren umfassen, mehr, z.B. zumindest 15, 25 oder 50 Aminosäuren, erfordern.
  • Ein Antikörper, welcher spezifisch an ein Epitop eines DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids bindet, kann therapeutisch wie auch in immunchemischen Tests, z.B. Western-Blots, ELISA, Radioimmunoassays, immunhistochemischen Tests, Immunpräzipitationen oder anderen fachbekannten immunchemischen Tests, verwendet werden. Verschiedene Immuntests können eingesetzt werden, um Antikörper zu identifizieren, welche über die gewünschte Spezifität verfügen. Es sind zahlreiche Protokolle zur kompetitiven Bindung oder immunradiometrische Tests fachbekannt. Solche Immuntests umfassen typischerweise die Messung einer Komplexbildung zwischen einem Immunogen und einem Antikörper, der sich spezifisch an das Immunogen bindet.
  • Typischerweise stellt ein Antikörper, welcher sich spezifisch an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid bindet, ein zumindest 5-, 10- oder 20fach höheres Detektionssignal bereit als jenes Detektionssignal, das mit anderen Proteinen in einem immunchemischen Test bereitgestellt wird. Vorzugsweise detektieren Antikörper, welche sich spezifisch an DA-ähnliche GPCR-Polypeptide binden, in immunchemischen Tests keine anderen Proteine und können ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid aus Lösung immunpräzipitieren.
  • DA-ähnliche GPCR-Polypeptide können eingesetzt werden, um ein Säugetier, wie z.B. eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Meerschweinchen, einen Affen oder einen Menschen, zu immunisieren, um polyklonale Antikörper zu produzieren. Wenn gewünscht kann ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid an ein Trägerprotein, z.B. bovines Serumalbumin, Thyroglobulin und Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, konjugiert werden. Abhängig von den Wirtsspezies können verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die Immunreaktion zu erhöhen. Solche Adjuvanzien umfassen Freundsches Adjuvans, Mineralgele (z.B. Aluminiumhydroxid) und oberflä chenaktive Substanzen (z.B. Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und Dinitrophenol), sind aber nicht auf diese beschränkt. Von jenen Adjuvanzien, die bei Menschen eingesetzt werden, sind BCG (bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum besonders zweckdienlich.
  • Monoklonale Antikörper, welche spezifisch an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid binden, können mithilfe jeder beliebigen Technik hergestellt werden, welche die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur bereitstellt. Diese Techniken umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Hybridomtechnik, die menschliche B-Zellen-Hybridomtechnik und die EBV-Hybridomtechnik [Kohler et al., Nature 256, 495-497, (1985); Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31-42 (1985); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030 (1983); Cole et al., Mol. Cell. Biol. 62, 109-120 (1984)].
  • Außerdem können Techniken eingesetzt werden, welche zur Produktion von „chimären Antikörpern", zum Spleißen von Mausantikörpergenen in menschliche Antikörpergene zur Gewinnung eines Moleküls mit geeigneter Antigenspezifität und biologischer Aktivität entwickelt wurden [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314, 452-454 (1985)]. Monoklonale und andere Antikörper können ebenfalls „humanisiert" werden, um zu vermeiden, dass ein Patient eine Immunreaktion gegen den Antikörper entwickelt, wenn dieser therapeutisch verwendet wird. Diese Antikörper können gegenüber menschlichen Antikörpern ausreichende Sequenzähnlichkeit aufweisen, um in der Therapie direkt eingesetzt zu werden, oder sie können Änderungen einiger Schlüsselreste erfordern. Sequenzunterschiede zwischen Nagetierantikörpern und menschlichen Sequenzen können minimiert werden, indem Reste ersetzt werden, welche sich von den Resten in den menschlichen Sequenzen unterscheiden, und zwar durch ortsspezifische Mutagenese einzelner Reste oder durch „Grating" von ganzen komplementaritätsbestimmenden Regionen. Alternativ dazu können unter Einsatz von rekombinanten Verfahren wie in GB 2188638 B beschrieben humanisierte Antikörper produziert werden. Antikörper, welche spezifisch an ein DA- ähnliches GPCR-Polypeptid binden, können antigenbindende Stellen enthalten, welche entweder teilweise oder vollständig humanisiert sind, wie in US 5.565.332 offenbart.
  • Alternativ dazu können zur Herstellung von einkettigen Antikörpern beschriebene Verfahren unter Einsatz fachbekannter Verfahren adaptiert werden, um einkettige Antikörper zu produzieren, welche spezifisch an DA-ähnliche GPCR-Polypeptide binden. Antikörper mit verwandter Spezifität, aber von unterschiedlicher idiotypischer Zusammensetzung können durch Ketten-Shuffling aus zufälligen kombinatorischen Immunglobulinbibliotheken erzeugt werden [Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-23 (1991)].
  • Einkettige Antikörper können auch unter Einsatz eines DNA-Amplifikationsverfahrens, wie z.B. PCR, unter Einsatz von Hybridom-cDNA als Matrize hergestellt werden [Thirion et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-511 (1996)]. Einkettige Antikörper können mono- oder bispezifisch und bivalent oder tetravalent sein. Die Schaffung von tetravelanten bispezifischen einkettigen Antikörpern wird z.B. in Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15, 159-163 (1997), gelehrt. Die Herstellung von bivalenten, bispezifischen einkettigen Antikörpern wird in Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206 (1994), gelehrt.
  • Eine Nucleotidsequenz, die für einen einkettigen Antikörper kodiert, kann unter Einsatz manueller oder automatisierter Nucleotidsynthese hergestellt, unter Einsatz von Standard-DNA-Rekombinationsverfahren in ein Expressionskonstrukt kloniert und in eine Zelle eingeführt werden, um die kodierende Sequenz wie oben beschrieben zu exprimieren. Alternativ dazu können einkettige Antikörper, z.B. unter Einsatz filamentöser Phagentechnologie [Verhaar et al., Int. J. Cancer 61, 497-501 (1995); Nicholls et al., J. Immunol. Meth. 165, 81-91 (1993)] direkt produziert werden.
  • Es können ebenfalls Antikörper produziert werden, welche spezifisch an DA-ähnliche GPCR-Polypeptide binden, indem in der Lymphozytenpopulation In-vivo-Produktion induziert wird oder indem Immunglobulinbibliotheken oder Gruppen höchst spezifi scher Bindungsreagenzien wie in der Literatur offenbart gescreent werden [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833-3837 (1998), Winter et al., Nature 349, 293-299 (1991)].
  • Andere Typen von Antikörpern können hergestellt und in den Verfahren der Erfindung therapeutisch eingesetzt werden. Zum Beispiel können chimäre Antikörper wie in WO 93/03151 offenbart hergestellt werden. Es können ebenfalls Bindungsproteine hergestellt werden, die von Immunglobulinen abstammen und multivalent und multispezifisch sind, wie z.B. die in WO 94/13804 beschriebenen „Diabodies".
  • Antikörper gemäß der Erfindung können mithilfe fachbekannter Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel können Antikörper durch Passage über eine Säule, an welche ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid gebunden ist, affinitätsgereinigt werden. Die gebundenen Antikörper können dann unter Einsatz eines Puffers mit hoher Salzkonzentration aus der Säule eluiert werden.
  • Antisense-Oligonucleotide
  • Antisense-Oligonculeotide sind Nucleotidsequenzen, welche zu einer spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz komplementär sind. Sobald sie in eine Zelle eingeführt sind, verbinden sich die komplementären Nucleotide mit natürlichen Sequenzen, welche von der Zelle produziert werden, um Komplexe zu bilden und entweder Transkription oder Translation zu blockieren. Bevorzugt umfasst ein Antisense-Oligonucleotid zumindest 11 Nucleotide in der Länge, kann aber zumindest 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 oder mehr Nucleotide lang sein. Es können auch längere Sequenzen eingesetzt werden. Antisense-Oligonucleotidmoleküle können wie oben beschrieben in einem DNA-Konstrukt bereitgestellt werden und in eine Zelle eingeführt werden, um die Menge der DA-ähnlichen GPCR-Genprodukte in der Zelle zu verringern.
  • Antisense-Oligonucleotide können Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide oder eine Kombination beider sein. Oligonucleotide können manuell oder mithilfe eines auto matischen Synthesegeräts synthetisiert werden, indem das 5'-Ende eines Nucleotids mit dem 3'-Ende eines anderen Nucleotids mit Nicht-Phosphodiester-Internucleotidverbindungen, wie z.B. Alkylphosphonaten, Thiophosphaten, Dithiophosphaten, Alkylthiophosphonaten, Alkylphosphonaten, Phosphoramidaten, Phosphatestern, Carbamaten, Acetamidaten, Carboxymethylestern, Carbonaten und Phosphattriestern, kovalent verbunden wird. Siehe Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1-8 (1994); Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1-72 (1994), Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-583 (1990).
  • Es können Modifikationen DA-ähnlicher GPCR-Genexpression erhalten werden, indem Antisense-Oligonucleotide geschaffen werden, welche Duplexe zu Kontroll-, 5'- oder Regulationsregionen des DA-ähnlichen GPCR-Gens ausformen. Es sind Oligonucleotide bevorzugt, die von Transkriptionsinitiationsstellen abstammen, z.B. zwischen den Positionen –10 und +10 ausgehend von der Startstelle. Auf ähnliche Art und Weise kann Inhibition erreicht werden, indem Tripelhelix-Basenpaarungsverfahren eingesetzt werden. Tripelhelixpaarung ist zweckdienlich, weil sie die Inhibition jener Fähigkeit der Doppelhelix verursacht, sich zur Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder Chaperons ausreichend zu öffnen. Therapeutische Fortschritte, die Triplex-DNA verwenden, sind in der Literatur beschrieben worden [z.B. Gee et al., in Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y. (1994)]. Es kann auch ein Antisense-Oligonucleotid zur Blockierung der Translation konstruiert werden, indem verhindert wird, dass das Transkript sich an Ribosome bindet.
  • Für eine erfolgreiche Komplexbildung zwischen einem Antisense-Oligonucleotid und der komplementären Sequenz eines DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotids ist keine präzise Komplementarität erforderlich. Antisense-Oligonucleotide, welche z.B. 2, 3, 4 oder 5 oder mehr Abschnitte zusammenhängender Nucleotide umfassen, die zu einem DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotid exakt komplementär sind, wobei jedes durch einen Abschnitt zusammenhängender Nucleotide getrennt ist, die nicht zu angrenzenden DA-ähnlichen GPCR-Nucleotiden komplementär sind, können eine ausreichende Targeting-Spezifität für DA-ähnliche GPCR-mRNA bereitstellen. Bevorzugt umfasst jeder Abschnitt komplementärer zusammenhängender Nucleotide in der Länge zumindest 4, 5, 6, 7, 8 oder mehr Nucleotide. Nicht-komplementäre dazwischen liegende Sequenzen sind bevorzugt 1, 2, 3 oder 4 Nucleotide lang. Fachleute können einfach den berechneten Schmelzpunkt eines Antisense-Sense-Paares verwenden, um den Grad der Fehlpaarung zu bestimmen, welcher zwischen einem speziellen Antisense-Oligonucleotid und einer speziellen DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotidsequenz toleriert wird.
  • Antisense-Oligonucleotide können modifiziert werden, ohne deren Fähigkeit zu beeinflussen, an ein DA-ähnliches GPCR-Polynucleotid zu hybridisieren. Diese Modifikationen können intern oder an einem oder beiden Enden des Antisense-Moleküls erfolgen. Zum Beispiel können Internucleosidphosphatverbindungen modifiziert werden, indem Cholesteryl- oder Diamingruppierungen mit variierenden Anzahlen von Kohlenstoffresten zwischen den Aminogruppen und terminaler Ribose hinzugefügt werden. In einem modifizierten Antisense-Oligonucleotid können auch modifizierte Basen und/oder Zucker, wie z.B. Arabinose anstelle von Ribose, oder ein 3',5'-substituiertes Oligonucleotid, in welchem die 3'-Hydroxylgruppe oder die 5'-Phosphatgruppe substituiert wird, verwendet werden. Diese modifizierten Oligonucleotide können mithilfe fachbekannter Verfahren hergestellt werden. Siehe z.B. Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152-158 (1992); Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-584 (1990); Uhlmann et al., Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542 (1987).
  • Ribozyme
  • Ribozyme sind RNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität. Siehe z.B. Cech, Science 236, 1532-1539 (1987); Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543-568 (1990); Cech, Curr. Opin. Struc. Biol. 2, 605-609 (1992); Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515 (1996). Ribozyme können verwendet werden, um durch Spaltung einer RNA-Sequenz auf fachbekannte Weise die Genfunktion zu hemmen (z.B. Haseloff et al., U.S. Patent-Nr. 5.641.673). Der Mechanismus der Ribozymwirkung umfasst die sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonukleolytischer Spaltung. Beispiele umfassen gentechnisch hergestellte Hammerkopf-Motiv-Ribozymmoleküle, die spezifisch und wirksam endonukleolytische Spaltung spezifischer Nucleotidsequenzen katalysieren.
  • Die kodierende Sequenz eines DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotids, wie z.B. der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1, kann verwendet werden, um Ribozyme zu erzeugen, die spezifisch an mRNA, welche aus einem DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotid transkribiert ist, binden. Es sind Verfahren zum Konstruieren und Schaffen von Ribozymen entwickelt und im auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben worden [siehe Haseloff et al., Nature 334, 585-591 (1988)], welche auf eine höchst sequenzspezifische Art und Weise andere RNA-Moleküle in trans spalten. Zum Beispiel kann die Spaltungsaktivitität von Ribozymen auf spezifische RNAs ausgerichtet werden, indem im Ribozym eine diskrete „Hybridisierungs"-Region erzeugt wird. Die Hybridisierungsregion enthält eine Sequenz, die zur Target-RNA komplementär ist und folglich mit dem Target spezifisch hyridisiert [siehe z.B. Gerlach et al., EP 321.201 ].
  • Spezifische Ribozymspaltstellen in einem DA-ähnlichen GPCR-RNA-Target können identifiziert werden, indem das Targetmolekül auf Ribozymspaltstellen gescannt wird, welche folgende Sequenzen umfassen: GUA, GUU und GUC. Sobald diese identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen von zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, die jener Region der Target-RNA entsprechen, welche die Spaltstelle enthält, auf sekundäre strukturelle Eigenschaften, welche das Target inoperabel machen können, getestet werden. Es kann auch die Eignung der Kandidaten-DA-ähnlichen GPCR-RNA-Targets evaluiert werden, indem die Zugänglichkeit zu Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden unter Einsatz von Ribonuclease-Schutztests getestet wird. Die Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 und ihr Komplement stellen eine Quelle für geeignete Hybridisierungsregionsequenzen bereit. Es können längere komplementäre Sequenzen verwendet werden, um die Affinität der Hybridisierungssequenz für das Target zu erhöhen. Die Hybridisierungs- und Spaltregionen des Ribozyms können integral verbunden werden, sodass die katalytische Region des Ribozyms bei Hybridisierung an die Target-RNA über die komplementären Regionen das Target spalten kann.
  • Ribozyme können als Teil eines DNA-Konstrukts in Zellen eingeführt werden. Mechanische Verfahren, wie z.B. Mikroinjektion, liposomvermittelte Transfektion, Elektroporation oder Kalziumphosphatfällung, können eingesetzt werden, um ein ribozymenthaltendes DNA-Konstrukt in Zellen einzuführen, bei welchen es erwünscht ist, DA-ähnliche GPCR-Expression zu verringern. Alternativ dazu kann das Konstrukt einem Plasmid bereitgestellt und als separates Element erhalten oder in das Genom der Zellen integriert werden, wenn gewünscht ist, dass die Zellen das DNA-Konstrukt stabil erhalten, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Ein ribozymkodierendes DNA-Konstrukt kann regulierende Transkriptionselemente umfassen, wie z.B. ein Promotorelement, einen Enhancer oder ein UAS-Element, und ein Transkriptionsterminatorsignal zur Kontrolle der Transkription von Ribozymen in den Zellen.
  • Wie aus Haseloff et al., U.S. Patent Nr. 5.641.673, zu entnehmen, können Ribozyme gentechnisch so verändert werden, dass die Ribozymexpression als Reaktion auf Faktoren eintritt, welche die Expression eines Targetgens induzieren. Ribozyme können auch gentechnisch hergestellt werden, um einen zusätzlichen Regulierungsgrad bereitzustellen, sodass die Zerstörung von mRNA nur dann eintritt, wenn in den Zellen sowohl ein Ribozym als auch ein Targetgen induziert werden.
  • Screening-Verfahren
  • Die Erfindung stellt Tests zum Screenen von Testverbindungen bereit, welche an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid oder DA-ähnliches GPCR-Polynucleotid binden oder deren Aktivität modulieren. Eine Testverbindung bindet bevorzugt an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid oder -Polynucleotid. Bevorzugter verringert oder erhöht eine Testverbindung die Wirkungen von Dopamin oder einem Dopaminanalogon, wie durch menschliche DA-ähnliche GPCR vermittelt wird, um zumindest etwa 10, bevorzugt etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 % im Vergleich zum Fehlen der Testverbindung.
  • Testverbindungen
  • Testverbindungen können schon fachbekannte pharmakologische Mittel oder Verbindungen sein, von denen nicht bekannt ist, ob sie pharmakologische Aktivität aufweisen. Die Verbindungen können natürlich auftreten oder im Labor hergestellt werden. Sie können aus Mikroorganismen, Tieren oder Pflanzen isoliert und rekombinant produziert werden oder mithilfe fachbekannter chemischer Verfahren synthetisiert werden. Wenn gewünscht können unter Einsatz jedes beliebigen der zahlreichen Kombinationsbibliothekverfahren, welche biologische Bibliotheken, räumlich adressierbare parallele Festphasen- oder Lösungsphasenbibliotheken, synthetische Bibliothekverfahren, die Dekonvolution erfordern, „ein-Perlen-eine-Verbindung"-Bibliothekverfahren und synthetische Bibiotheksverfahren unter Einsatz von Affinitätschromatographieselektion umfassen, aber nicht auf diese beschränkt sind, Testverbindungen erhalten werden. Der Ansatz einer biologischen Bibliothek ist auf Polypeptidbibliotheken beschränkt, während die anderen vier Ansätze auf Polypeptid, Nicht-Peptid-Oligomer oder Kleinmolekülbibliotheken von Verbindungen anwendbar sind. Siehe Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145 (1997).
  • Es sind Verfahren zur Synthese molekularer Bibliotheken fachbekannt (siehe z.B. DeWitt et al., Proc., Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994); Cho et al., Science 261, 1303 (1993); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994)). Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung [siehe z.B. Houghten, BioTechniques 13, 412-421 (1992)] oder auf Perlen [Lam, Nature 354, 82-84 (1991)], Chips [Fodor, Nature 364, 555-556 (1993)]; Bakterien oder Sporen (Ladner, US-Patent 5.223.409), Plasmiden [Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865-1869 (1992)] oder Phagen [Scott & Smith, Science 249, 386-390 (1990); Devlin Science 249, 404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991); und Ladner, US-Patent 5.223.409] präsentiert werden.
  • Hochdurchsatz-Screening
  • Testverbindungen können auf die Fähigkeit, an DA-ähnliche GPCR-Polypeptide oder -Polynucleotide zu binden oder die DA-ähnliche GPCR-Aktivität oder DA-ähnliche GPCR-Genexpression zu beeinflussen, unter Einsatz eines Hochdurchsatzscreenings getestet werden. Unter Einsatz eines Hochdurchsatzscreenings können viele diskrete Verbindungen parallel getestet werden, sodass große Anzahlen von Testverbindungen schnell gescreent werden können. Die am weitgehendsten etablierten Techniken verwenden 96-Well-Mikrotiterplatten. Die Wells der Mikrotiterplatten erfordern typischerweise Testvolumina, die von 50 bis 500 μl reichen. Zusätzlich zu den Platten sind viele Instrumente, Materialien, Pipettoren, Robotertechniken, Plattenreiniger und Plattenlesegeräte am Markt erhältlich, um dem 96-Well-Format zu entsprechen.
  • Alternativ dazu können „Tests mit freiem Format" oder Tests, die zwischen den Proben keine physische Barriere aufweisen, verwendet werden. Zum Beispiel ist von Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19, 1614-1618 (1994), ein Test beschrieben, der in einem einfachen homogenen Test auf kombinatorische Peptidbibliotheken Pigmentzellen (Melanozyten) verwendet. Die Zellen werden in Petrischalen unter Agarose gestellt, daraufhin werden Perlen, welche kombinatorische Verbindungen tragen, auf die Oberfläche der Agarose platziert. Die kombinatorischen Verbindungen werden teilweise von den Perlen freigesetzt. Aktive Verbindungen können als dunkle Pigmentbereiche visualisiert werden, weil die aktiven Verbindungen lokal in die Gelmatrix diffundieren und die aktiven Verbindungen eine Farbänderung der Zellen verursachen.
  • Ein anderes Beispiel für einen Test mit freiem Format ist von Chelsky, „Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", berichtet bei der „First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening" in Philadelphia, Pennsylvania, (7.–10. November 1995) beschrieben. Chelsky positionierte einen einfachen homogenen Enzymtest auf Kohlenstoffanhydrase in einem Agarose-Gel, sodass das Enzym im Gel eine Farbänderung im gesamten Gel verursachte.
  • Danach wurden Perlen, die kombinatorische Verbindungen trugen, über einen Photolinker in das Gel positioniert und die Verbindungen teilweise durch UV-Licht freigesetzt. Verbindungen, welche das Enzym hemmten, wurden als lokale Inhibitionszonen beobachtet, die geringere Farbänderung aufwiesen.
  • Ein wiederum anderes Beispiel ist von Samon et al., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996), beschrieben. Bei diesem Beispiel wurden kombinatorische Bibliotheken auf Verbindungen gescreent, welche zytotoxische Wirkungen auf Krebszellen zeigten, die in Agar gezüchtet wurden.
  • Ein weiteres Hochdurchsatzverfahren ist in Beutel et al., US-Patent 5.976.813, beschrieben. Bei diesem Verfahren werden Testproben in eine poröse Matrix positioniert. Eine oder mehrere Testkomponenten werden dann in, auf oder auf den Grund einer Matrix, wie z.B. auf ein Gel, einen Kunststofffilm, einen Filter oder eine andere Form eines einfach zu manipulierenden festen Trägers, platziert. Wenn Proben in die poröse Matrix eingeführt werden, diffundieren sie ausreichend langsam, sodass Tests durchgeführt werden können, ohne dass die Testproben zusammenlaufen.
  • Bindungstests
  • Für Bindungstests ist die Testverbindung bevorzugt ein kleines Molekül, das sich an die aktive Stelle des DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids bindet und diese besetzt, wodurch die Ligandenbindungsstelle dem Substrat unzugänglich gemacht wird, sodass normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele für solch kleine Moleküle umfassen kleine Peptide oder peptidartige Moleküle, sind aber nicht auf diese beschränkt. Potenzielle Liganden, welche an ein Polypeptid der Erfindung binden, umfassen die natürlichen Liganden bekannter DA-ähnlicher GPCRs und Analoga oder Derivate davon, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • In Bindungstests kann entweder die Testverbindung oder das DA-ähnliche GPCR-Polypeptid eine detektierbare Markierung, wie z.B. eine fluoreszierende, Radioisotop-, chemilumineszierende oder enzymatische Markierung, wie z.B. Meerrettichpe roxidase, alkalische Phosphatase oder Luciferase, umfassen. Dann kann, z.B. durch direkte Zählung der Radioemission, durch Szintillationszählung oder durch Bestimmung der Umsetzung eines geeigneten Substrats in ein detektierbares Produkt, eine Testverbindung, welche an das DA-ähnliche GPCR-Polypeptid gebunden ist, detektiert werden.
  • Alternativ dazu kann die Bindung einer Testverbindung an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid bestimmt werden, ohne einen der wechselwirkenden Stoffe zu markieren. Zum Beispiel kann ein Mikrophysiometer verwendet werden, um die Bindung einer Testverbindung mit einem DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid zu detektieren. Ein Mikrophysiometer (z.B. CytosensorTM) ist ein analytisches Instrument, das unter Einsatz eines lichtadressierbaren potentiometrischen Sensors (LAPS) die Geschwindigkeit misst, mit welcher eine Zelle ihre Umgebung ansäuert. Veränderungen dieser Ansäuerungsrate können als Anzeichen für die Wechselwirkung zwischen einer Testverbindung und einem DA-ähnlichen GPCR Polypeptid verwendet werden [Mc-Connell et al., Science 257, 1906-1912 (1992)].
  • Die Fähigkeit einer Testverbindung, an DA-ähnliches GPCR-Polypeptid zu binden, kann auch unter Einsatz einer Technologie, wie z.B. bimolekulare Interaktionsanalyse (BIA) in Echtzeit [Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345 (1991), Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705 (1995)], bestimmt werden. BIA ist eine Technologie zum Studium biospezifischer Wechselwirkungen in Echtzeit, ohne irgendeinen Interaktanten zu markieren (z.B. BIAcorTM). Änderungen des optischen Phänomens Oberflächenplasmonresonanz (SPR, „surface plasmon resonance") können als Anzeichen für Echtzeitreaktionen zwischen biologischen Molekülen eingesetzt werden.
  • In einem wiederum anderen Aspekt der Erfindung kann ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid in einem Zwei-Hybrid-Test oder Drei-Hybrid-Test [siehe z.B. US-Patent 5.283.317; Zervos et al., Cell 72, 223-232 (1993); Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054 (1993); Bartel et al., BioTechniques 14, 920-924 (1993); Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696 (1993), und Brent WO 94/10300] als „Köderprotein" ver wendet werden, um andere Proteine zu identifizieren, welche an das DA-GPCR-Polypeptid binden oder damit wechselwirken und seine Aktivität modulieren.
  • Das Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Natur der meisten Transkriptionsfaktoren, welche aus separierbaren DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen bestehen. Kurz gesagt verwendet der Test zwei verschiedene DNA-Konstrukte. Zum Beispiel kann in einem Konstrukt ein Polynucleotid, das für ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodiert, an ein Polynucleotid fusioniert werden, das für eine DNA-bindende Domäne eines bekannten Transkriptionsfaktors (z.B. GAL-4) kodiert. Im anderen Konstrukt kann eine DNA-Sequenz, welche für ein unidentifiziertes Protein („Beute" oder „Probe") kodiert, an ein Polynucleotid, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert, fusioniert werden. Wenn die „Köder"- und „Beute"-Proteine in vivo wechselwirken können, um einen proteinabhängigen Komplex auszuformen, werden die DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors in enge Nähe gebracht. Diese Nähe ermöglicht die Transkription eines Reportergens (z.B. LacZ), das operabel mit einer Transkriptionsregulationsstelle verbunden ist, welche auf den Transkriptionsfaktor reagiert. Es kann die Expression des Reportergens detektiert werden, und Zellkolonien, welche den funktionellen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert und dazu verwendet werden, jene DNA-Sequenz zu erhalten, die für das Protein kodiert, welches mit dem DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid wechselwirkt.
  • Es kann wünschenswert sein, entweder das DA-ähnliche GPCR-Polypeptid (oder -Polynucleotid) oder die Testverbindung zu immobilisieren, um die Trennung der gebundenen von ungebundenen Formen eines oder beider Interaktanten zu erleichtern, wie auch die Automatisierung des Tests anzupassen. Daher kann entweder das DA-ähnliche GPCR-Polypeptid (oder -Polynucleotid) oder die Testverbindung an einen festen Träger gebunden werden. Geeignete feste Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Glas oder Kunsttoffobjektträger, Gewebekulturplatten, Mikrotiter-Wells, Röhrchen, Siliciumchips oder Teilchen, wie z.B. Perlen (einschließlich aber nicht ausschließlich Latex-, Polystyrol- oder Glasperlen). Jedes beliebige fachbekannte Verfahren kann eingesetzt werden, um das DA-ähnliche GPCR-Polypeptid (oder -Polynucleotid) oder die Testverbindung an einen festen Träger zu binden, einschließlich der Verwendung von kovalenten und nicht-kovalenten Bindungen, passiver Absorption oder Paaren von Bindungsgruppierungen, die an das Polypeptid (oder Polynucleotid) beziehungsweise an die Testverbindung und den festen Träger gebunden sind. Testverbindungen sind bevorzugt in einer solchen Anordnung an den festen Träger gebunden, die ermöglicht, die Stelle der einzelnen Testverbindungen aufzuspüren. Die Bindung einer Testverbindung an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid (oder -Polynucleotid) kann in jedem beliebigen Gefäß erreicht werden, das dazu geeignet ist, die Reagenzien zu enthalten. Beispiele für solche Gefäße umfassen Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen.
  • In einer Ausführungsform ist das DA-ähnliche GPCR-Polypeptid ein Fusionsprotein, das eine Domäne umfasst, die dem DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid ermöglicht, an einen festen Träger gebunden zu werden. Zum Beispiel können Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine auf Glutathion-Sepharose-Perlen (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) oder Glutathion-derivatisierten Mikrotiterplatten adsorbiert werden, welche dann mit der Testverbindung oder der Testverbindung und dem nicht-adsorbierten DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid kombiniert werden. Das Gemisch wird dann unter Bedingungen inkubiert, die zur Komplexbildung beitragen (z.B. unter physiologischen Bedingungen für Salz und pH). Nach der Inkubation werden die Perlen oder Mikrotiterplattenwells gewaschen, um jede beliebige ungebundene Komponente zu entfernen. Die Bindung von Interaktanten kann entweder direkt oder indirekt wie oben beschrieben bestimmt werden. Alternativ dazu können die Komplexe vom festen Träger entfernt werden, bevor die Bindung bestimmt wird.
  • In den Screeningtests der Erfindung können auch andere Techniken zur Immobilisierung von Proteinen oder Polynucleotiden auf einem festen Träger verwendet werden. Zum Beispiel können entweder ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid (oder -Polynucleotid) oder eine Testverbindung unter Einsatz der Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Unter Einsatz fachbekannter Techniken (z.B. Biotinylierungsset, Pierce Chemicals, Rockford, Illinois) können biotinylierte DA-ähnliche GPCR-Polypeptide (oder -Polynucleotide) oder Testverbindungen aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) hergestellt und in den Wells von mit Streptavidin überzogenen 96-Well-Platten (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Alternativ dazu können Antikörper, welche spezifisch an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid, -Polynucleotid oder eine Testverbindung binden, welche jedoch eine gewünschte Bindungsstelle, wie z.B. die aktive Stelle des DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids, nicht stören, auf die Wells der Platte derivatisiert werden. Ein ungebundenes Target oder Protein kann mittels Antikörperkonjugation in den Wells gefangen werden.
  • Verfahren zur Detektion solcher Komplexe umfassen zusätzlich zu den für GST-immobilisierte Komplexe zuvor beschriebenen Verfahren die Immundetektion von Komplexen unter Einsatz von, Antikörpern, welche spezifisch an das DA-ähnliche GCPR-Polypeptid oder die Testverbindung binden, enzymgekoppelte Tests, die auf der Detektion einer Aktivität des DA-ähnlichen GPRC-Polypeptids basieren, und SDS-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen. Das Screening auf Testverbindungen, welche an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid oder -Polynucleotid binden, kann auch in einer intakten Zelle durchgeführt werden. In einem zellbasierten Testsystem kann jede beliebige Zelle, die ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid oder -Polynucleotid umfasst, verwendet werden. Ein DA-ähnliches GPCR-Polynucleotid kann in der Zelle natürlich auftreten oder beispielsweise unter Einsatz der oben beschriebenen Verfahren eingeführt werden. Die Bindung der Testverbindung an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid oder -Polynucleotid wird wie oben beschrieben bestimmt.
  • Funktionstests
  • Testverbindungen können auf die Fähigkeit getestet werden, eine biologische Wirkung eines DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids zu steigern oder zu senken. Diese biologischen Wirkungen können unter Einsatz von Funktionstests bestimmt werden, die in den spezifischen Beispielen, siehe unten, beschrieben sind. Funktionstests können nach dem Kontaktieren eines gereinigten DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids, einer Zellmembranformulierung oder einer intakten Zelle mit einer Testverbindung durchgeführt werden. Eine Testverbindung, welche eine funktionelle Aktivität eines DA-ähnlichen GPCR um zumindest etwa 10 %, bevorzugt etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %, verringert, wird als potenzielles Mittel zur Senkung der Aktivität des DA-ähnlichen GPCR identifiziert. Eine Testverbindung, welche die Aktivität des DA-ähnlichen GPCR um zumindest etwa 10 %, bevorzugt etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %, steigert, wird als potenzielles Mittel zur Steigerung der Aktivität des DA-GPCR identifiziert.
  • Ein solches Screeningverfahren umfasst die Verwendung von Melanophoren, welche transfiziert sind, um ein DA-GPCR-Polypeptid zu exprimieren. Eine solche Screeningtechnik ist in WO 92/01810, veröffentlicht am 6. Februar 1992, beschrieben. Daher kann ein solcher Test z.B. zum Screenen auf eine Verbindung eingesetzt werden, welche durch das Kontaktieren der Melanophorenzellen, welche den Rezeptor sowohl mit dem Rezeptorliganden (z.B. Dopamin oder einem Dompaminanalogon) als auch einer zu screenenden Testverbindung umfasst, die Aktivierung des Rezeptorpolypeptids hemmt. Die Inhibition des vom Liganden erzeugten Signals zeigt, dass eine Testverbindung ein potenzieller Antagonist für den Rezeptor ist, d.h. die Aktivierung des Rezeptors hemmt. Das Screenen kann zur Identifikation einer Testverbindung eingesetzt werden, welche durch Kontaktieren solcher Zellen mit zu screenenden Verbindungen und durch die Bestimmung, ob die Testverbindung ein Signal erzeugt, d.h. den Rezeptor aktiviert, den Rezeptor aktiviert.
  • Andere Screening-Techniken umfassen die Verwendung von Zellen (z.B. transfizierten CHO-Zellen), welche in einem System, welches extrazelluläre pH-Veränderungen misst, die durch Rezeptorenaktivierung [siehe z.B. Science 246, 181-296 (1989)] verursacht sind, ein menschliches DA-ähnliches GPCR-Polypeptid exprimieren. Zum Beispiel können Testverbindungen mit einer Zelle kontaktiert werden, welche ein menschliches DA-ähnliches GPCR-Polypeptid exprimiert, und eine zweite Messenger-Reaktion, z.B. Signaltransduktion oder pH-Veränderungen, kann gemessen werden, um zu bestimmen, ob die Testverbindung den Rezeptor aktiviert oder hemmt.
  • Eine andere Screening-Technik umfasst die Einführung von RNA, welche für ein menschliches DA-ähnliches GPCR-Polypeptid kodiert, in Xenopus oocytes, um den Rezeptor vorübergehend zu exprimieren. Die transfizierten Oozyten können dann mit dem Rezeptorliganden und einer zu screenenden Testverbindung kontaktiert werden, gefolgt von der Detektion der Hemmung oder Aktivierung eines Kalziumsignals im Fall des Screenings auf Testverbindungen, von welchen erwartet wird, dass sie die Aktivierung des Rezeptors hemmen.
  • Ein anderes Screeningverfahren umfasst die Expression eines menschlichen DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids in Zellen, in welchen der Rezeptor an eine Phospholipase C oder D gebunden ist. Diese Zellen umfassen Endothelzellen, Zellen glatter Muskulatur, embryonale Nierenzellen etc. Das Screening kann wie oben beschrieben durch Quantifizierung des Grads der Aktivierung des Rezeptors durch Änderungen der Phospholipase-Aktivität erreicht werden.
  • In den nachstehenden spezifischen Beispielen sind Details über Funktionstests, wie die oben beschriebenen, bereitgestellt.
  • Genexpression
  • In einer anderen Ausführungsform werden Testverbindungen identifiziert, welche DA-ähnliche GPCR-Genexpression erhöhen oder verringern. Ein DA-ähnliches GPCR-Polynucleotid wird mit einer Testverbindung kontaktiert, und es wird die Expression einer RNA oder eines Polypeptid-Produkts des DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotids bestimmt. Das Ausmaß der Expression einer geeigneten mRNA oder eines geeigneten Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung ist mit dem Grad der Expression von mRNA oder des Polypeptids bei Fehlen der Testverbindung verglichen worden. Die Testverbindung kann dann basierend auf diesem Vergleich als Expressionsmodulator identifiziert werden. Wenn die Expression der mRNA oder des Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung größer ist als bei deren Fehlen, wird die Testverbindung als Stimulator oder Enhancer der mRNA oder der Polypeptidexpression identifiziert. Alternativ dazu wird die Testverbindung als Inhibitor der mRNA- oder der Polypeptidexpression identifiziert, wenn die Expression von mRNA oder Polypeptid in Gegenwart der Testverbindung geringer ist als bei deren Fehlen.
  • Der Grad der DA-ähnlichen GPCR-mRNA- oder -Polypeptidexpression in den Zellen kann mithilfe von Verfahren, die auf dem Gebiet der Detektion von mRNA oder Polypeptid bekannt sind, bestimmt werden. Qualitative oder quantitative Verfahren können verwendet werden. Die Gegenwart von Polypeptidprodukten eines DA-ähnlichen GPCR-Polynucleotids kann bestimmt werden, beispielsweise unter Verwendung verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich immunchemischen Verfahren, wie z.B. Radioimmunoassay, Western-Blotting und Immunhistochemie. Alternativ dazu kann Polypeptidsynthese in vivo, in einer Zellkultur oder in einem In-vitro-Translationssystem durch die Detektion der Inkorporation markierter Aminosäuren in ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid bestimmt werden.
  • Dieses Screening kann entweder in einem zellfreien Testsystem oder in einer intakten Zelle durchgeführt werden. In einem zellbasierten System kann jede beliebige Zelle, welche DA-ähnliches GPCR-Polynucleotid exprimiert, verwendet werden. Das DA-ähnliche GPCR-Polynucleotid kann in der Zelle natürlich auftreten oder mithilfe von Verfahren, wie z.B. den oben beschriebenen, eingeführt werden. Es können entweder eine Primärkultur oder eine etablierte Zelllinie, wie z.B. CHO- oder menschliche embryonale Nieren-293-Zellen, verwendet werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche einem Patienten verabreicht werden können, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können z.B. ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid, DA-ähnliches GPCR-Polynucleotid, Antikörper, welche spezifisch an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid binden, oder Mimetika, Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren einer DA-ähnlichen GPCR-Polypeptid-Aktivität sein. Die Zusammensetzungen können alleine oder in Kombination mit zumindest einem anderen Mittel, wie z.B. einer stabilisierenden Verbindung, verabreicht werden, welche in jedem beliebigen sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger, einschließlich aber nicht ausschließlich, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose und Wasser, verabreicht werden kann. Die Zusammensetzungen können einem Pa tienten alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln, Arzneimitteln oder Hormonen verabreicht werden.
  • Zusätzlich zu den aktiven Bestandteilen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger enthalten, die Arzneimittelträger und Hilfsmittel umfassen, welche die Verarbeitung aktiver Verbindungen zu Formulierungen vereinfachen, die pharmazeutisch eingesetzt werden können. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können über jede beliebige Anzahl von Verabreichungswegen, einschließlich aber nicht ausschließlich orale, intravenöse, intramuskuläre, intra-arterielle, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, transdermale, subkutane, intraperitoneale, intranasale, parenterale, topische, sublinguale, oder rektale Mittel, verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können unter Einsatz von pharmazeutisch annehmbaren fachbekannten Trägern in Dosierungen formuliert werden, die zur oralen Verabreichung geeignet sind. Solche Träger ermöglichen, dass pharmazeutische Zusammensetzungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen zur Ingestion durch den Patienten formuliert sein können.
  • Pharmazeutische Formulierungen zur oralen Verwendung können durch Kombination aktiver Verbindungen mit einem festen Exzipienten erhalten werden, gegebenenfalls durch Vermahlen eines resultierenden Gemischs und Verarbeiten des Gemischs zu Granulat, nachdem geeignete Hilfsmittel zugefügt wurden, falls erwünscht, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Arzneimittelträger sind Kohlenhydrat- oder Proteinfüllstoffe, wie z.B. Zucker, einschließlich Laktose, Saccharose, Mannit oder Sorbit, Stärke aus Mais, Weizen, Reis, Kartoffel oder anderen Pflanzen, Cellulose, wie z.B. Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Natriumcarboxymethylcellulose, Gummen, einschließlich Gummiarabicum, Tragantgummi, und Proteine, wie z.B. Gelatine und Collagen. Wenn gewünscht können zersetzende oder solubilisierende Mittel hinzugefügt werden, wie z.B. das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, wie z.B. Natriumalginat.
  • Drageekerne können gemeinsam mit geeigneten Beschichtungen, wie z.B. konzentrierten Zuckerlösungen, verwendet werden, die auch Gummiarabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsgemische enthalten können. Den Tabletten- oder Drageebeschichtungen können Farbstoffe oder Pigmente zur Produktidentifikation hinzugefügt werden oder um die Quantität der aktiven Verbindung, d.h. die Dosierung, zu charakterisieren.
  • Pharmazeutische Formulierungen, die oral verwendet werden können, umfassen Gelatine-Steckkapseln wie auch weiche, versiegelte Kapseln aus Gelatine und einer Beschichtung, wie z.B. Glycerin oder Sorbit. Steckkapseln können aktive Inhaltsstoffe umfassen, die mit einem Füllstoff oder Bindemitteln, wie z.B. Laktose oder Stärke, Gleitmitteln, wie z.B. Talk oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls mit Stabilisatoren gemischt sind. Die aktiven Verbindungen können in weichen Kapseln in geeigneten Flüssigkeiten wie z.B. Fettölen, Flüssigkeiten oder flüssigem Polyethylenglykol mit oder ohne Stabilisatoren gelöst oder suspendiert sein.
  • Pharmazeutische Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, können in wässrigen Lösungen formuliert werden, bevorzugt in physiologisch kompatiblen Puffern, wie z.B. Hanks-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologisch gepufferter Salzlösung. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Fettöle, wie z.B. Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie z.B. Ethyloleat oder Triglizeride, oder Liposomen. Zur Zufuhr können auch nicht-lipide Polykationaminopolymere verwendet werden. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel umfassen, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung höchst konzentrierter Lösungen zu ermöglichen. Für die topische oder nasale Verabreichung werden in der Formulierung Penetrierungsmittel verwendet, die für die spezielle Barriere geeignet sind, sodass diese durchdrungen werden kann. Diese Penetrierungsmittel sind im Allgemeinen fachbekannt.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf eine Art und Weise hergestellt werden, die fachbekannt ist, d.h. durch konventionelle Misch-, Lösungs-, Granulations-, Dragee-Herstellungs-, Pulverisierungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einschluss- oder Gefriertrocknungsverfahren. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können als Salz bereitgestellt werden und mit vielen Säuren gebildet werden, einschließlich aber nicht ausschließlich Salz-, Schwefel-, Essig-, Milch-, Wein-, Apfel-, Bernsteinsäure etc. Salze tendieren dazu, in wässrigen oder anderen erotischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechenden freien Basenformen. In anderen Fällen kann die bevorzugte Formulierung ein gefriergetrocknetes Pulver sein, welches ein beliebiges der folgenden Mittel oder alle umfassen kann: 1-50 mM Histidin, 0,1 %-2 % Saccharose und 2-7 % Mannit, bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5, das vor der Verwendung mit Puffer kombiniert wird.
  • Weitere Details über Verfahren zur Formulierung und Verabreichung sind in der neuesten Auflage von REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pennsylvania) zu finden. Nachdem pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert worden sind, können sie in einen geeigneten Container platziert werden und zur Behandlung einer indizierten Erkrankung markiert werden. Eine solche Markierung umfasst Menge, Häufigkeit und Verabreichungsverfahren.
  • Therapeutische Indikationen und Verfahren
  • GPCRs sind beim Säugetierwirt allgegenwärtig und für viele biologische Funktionen, einschließlich vieler Pathologien, verantwortlich. Demzufolge ist es wünschenswert, Verbindungen und Arzneimittel zu finden, welche einen GPCR einerseits stimulieren und die Funktion eines GPCR andererseits hemmen können. Zum Beispiel können Verbindungen, welche einen GPCR aktivieren, für therapeutische Zwecke eingesetzt werden, z.B. zur Behandlung von Asthma, Parkinson-Krankheit, akutem Herzversagen, Harnretention und Osteoporose. Insbesondere sind Verbindungen, welche GPCRs aktivieren, bei der Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Leiden, wie z.B. jenen, die durch das Fehlen des pulmonalen Blutflusses oder Hypertonie verursacht sind, zweckdienlich. Zusätzlich dazu können diese Verbindungen auch zur Behandlung verschiedener physiologischer Erkrankungen eingesetzt werden, die mit der abnormen Kontrolle der Fluid- und Elektrolythomöostase in Zusammenhang stehen, wie auch zur Behandlung von Erkrankungen, die mit abnormer Angiotensininduzierter Aldosteron-Sekretion assoziiert sind.
  • Im Allgemeinen können Verbindungen, welche die Aktivierung eines GPCR hemmen, für eine Vielzahl therapeutischer Zwecke eingesetzt werden, z.B. zur Behandlung von Hypotonie und/oder Hypertonie, Angina Pectoris, Myokardinfarkt, Geschwüren, Asthma, Allergien, gutartiger Prostatahypertrophie und psychotischen und neurologischen Erkrankungen, einschließlich Schizophrenie, manische Aufregung, Depression, Delirium, Demenz oder schwerer geistiger Zurückgebliebenheit, Dyskinesien, wie z.B. unter anderem Huntington-Krankheit oder Tourett-Syndrom, neben vielen anderen. Verbindungen, welche GPCRs hemmen, sind auch zur Umkehr endogener Anorexie, zur Kontrolle von Bulimie und zur Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Leiden wie jener, die durch exzessiven pulmonalen Blutfluss oder Hypotonie verursacht sind, zweckdienlich. Insbesondere kann die Regulation des DA-ähnlichen GPCR dazu verwendet werden, Alzheimer-Krankheit zu behandeln.
  • Diese Erfindung betrifft außerdem die Verwendung neuer Mittel, die mithilfe der oben beschriebenen Screeningtests identifiziert worden sind. Demzufolge liegt es im Schutzumfang der Erfindung, eine Testverbindung zu verwenden, die wie hierin beschrieben in einem geeigneten Tiermodell identifiziert wird. Zum Beispiel kann ein wie hierin beschrieben identifiziertes Mittel (z.B. ein Modulationsmittel, ein Antisense-Nucleinsäuremolekül, ein spezifischer Antikörper, ein Ribozym oder ein Molekül, das ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid bindet) in einem Tiermodell verwendet werden, um die Wirksamkeit, Toxizität oder Nebenwirkungen der Behandlung mit einem solchen Mittel zu bestimmen. Alternativ dazu kann ein wie hierin beschreiben identifiziertes Mittel in einem Tiermodell verwendet werden, um den Wirkmechanismus eines solchen Mittels zu bestimmen. Weiters betrifft diese Erfindung die Verwen dungsarten neuer Mittel, die mithilfe der oben beschriebenen Screeningtests für die hierin beschriebene Behandlungen identifiziert worden sind.
  • Ein Reagens, welches die Aktivität des DA-ähnlichen GPCRs beeinflusst, kann einer menschlichen Zelle entweder in vitro oder in vivo verabreicht werden, um die Aktivität des DA-ähnlichen GPCR zu reduzieren. Das Reagens bindet bevorzugt an ein Expressionsprodukt eines menschlichen DA-ähnlichen GPCR-Gens. Wenn das Expressionsprodukt ein Protein ist, ist das Reagens bevorzugt ein Antikörper. Zur Ex-vivo-Behandlung menschlicher Zellen kann zu einer Formulierung aus Stammzellen, mit Ausnahme menschlicher embryonaler Stammzellen, die aus dem Körper entfernt wurden, ein Antikörper hinzugefügt werden. Die Zellen können dann im selben oder einem anderen menschlichen Körper ersetzt werden, mit oder ohne fachbekannter) Klonvermehrung, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
  • In einer Ausführungsform wird das Reagens unter Einsatz eines Liposoms zugeführt. Bevorzugt ist das Liposom bei jenem Tier, dem es verabreicht worden ist, zumindest etwa 30 Minuten lang stabil, bevorzugter zumindest etwa 1 Stunde und noch bevorzugter zumindest etwa 24 Stunden. Ein Liposom umfasst eine Lipidzusammensetzung, die in der Lage ist, ein Reagens, insbesondere ein Polynucleotid, auf eine bestimmte Stelle in einem Tier, beispielsweise einem Menschen, abzuzielen. Die Lipidzusammensetzung des Liposoms kann bevorzugt auf ein spezielles Organ eines Tiers, wie z.B. die Lunge, Leber, Milz, Herz, Gehirn, Lymphknoten und Haut, abzielen.
  • Ein in der vorliegenden Erfindung nützliches Liposom umfasst eine Lipidzusammensetzung, die mit der Plasmamembran der Target-Zelle fusionieren kann, um seine Inhalte der Zelle zuzuführen. Bevorzugt beträgt die Transfektionseffizienz eines Liposoms etwa 0,5 μg DNA pro 16 nmol des Liposoms, die etwa 106 Zellen zugeführt werden, bevorzugter etwa 1,0 μg DNA pro 16 nmol des Liposoms, die etwa 106 Zellen zugeführt werden, und noch bevorzugter etwa 2,0 μg DNA pro 16 nmol des Liposoms, die etwa 106 Zellen zugeführt werden. Bevorzugt weist ein Liposom einen Durchmesser zwischen etwa 100 und 500 nm, bevorzugter zwischen etwa 150 und 450 nm und noch bevorzugter zwischen etwa 200 und 400 nm, auf.
  • Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Liposomen umfassen jene, die standardmäßig in z.B. fachbekannten Genzufuhrverfahren verwendet werden. Bevorzugtere Liposomen umfassen Liposomen, die über eine Polykationlipidzusammensetzung verfügen, und/oder Liposomen, die ein Cholesterinrückgrat besitzen, das an Polyethylenglykol konjugiert ist. Gegebenenfalls umfasst ein Liposom eine Verbindung, die das Liposom gezielt in eine Tumorzelle einbauen kann, wie z.B. einen Tumorzellenliganden, der auf der äußeren Oberfläche des Liposoms freigelegt werden kann.
  • Unter Einsatz fachbekannter Standard-Verfahren kann die Komplexierung eines Liposoms mit einem Reagens, wie z.B. einem Antisense-Oligonucleotid oder Ribozym, erreicht werden (siehe z. B. US-Patent 5.705.151). Bevorzugt werden etwa 0,1 μg bis etwa 10 μg des Polynucleotids mit etwa 8 nmol der Liposomen kombiniert, bevorzugter werden etwa 0,5 μg bis etwa 5 μg der Polynucleotide mit etwa 8 nmol der Liposomen kombiniert, noch bevorzugter werden etwa 1,0 μg der Polynucleotide mit etwa 8 nmol der Liposomen kombiniert.
  • In einer anderen Ausführungsform können unter Einsatz rezeptorvermittelter Target-Zufuhr speziellem Gewebe in vivo Antikörper zugeführt werden. Rezeptor-vermittelte DNA-Zufuhrtechniken werden z.B. in Findeis et al., Trends in Biotechnol. 11, 202-205 (1993); Chiou et al., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J.A. Wolff, Hrsg.) (1994); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-624 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 542-546 (1994); Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659 (1990); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 338-342 (1991), gelehrt.
  • Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis
  • Es ist Fachleuten möglich, eine therapeutisch wirksame Dosis zu bestimmen. Eine therapeutisch wirksame Dosis betrifft die Menge des aktiven Inhaltsstoffes, welcher die Aktivität des DA-ähnlichen GPCR im Vergleich zur Aktivität des DA-ähnlichen GPCR, die in Abwesenheit der therapeutisch wirksamen Dosis auftritt, erhöht oder senkt.
  • Für jede beliebige Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich entweder in Zellkulturtests oder in Tiermodellen, normalerweise bei Mäusen, Kaninchen, Hunden oder Schweinen, bestimmt werden. Das Tiermodell kann auch verwendet werden, um den geeigneten Konzentrationsbereich und Verabreichungsweg zu bestimmen. Diese Informationen können dann verwendet werden, um für Menschen nützliche Dosen und Verabreichungswege zu bestimmen.
  • Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität, z.B. ED50 (die für 50 % der Population therapeutisch wirksame Dosis) und LD50 (die für 50 % der Population tödliche Dosis), können mittels pharmazeutischer Standard-Verfahren in Zellkulturen oder an Versuchstieren bestimmt werden. Das Dosisverhältnis von toxischen zu therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden.
  • Es werden pharmazeutische Zusammensetzungen bevorzugt, welche große therapeutische Indizes aufweisen. Die aus Zellkulturtests und Tierversuchen erhaltenen Daten werden zur Formulierung einer Reihe von Dosierungen zur Anwendung am Menschen verwendet. Die in solchen Zusammensetzungen enthaltene Dosierung liegt bevorzugt im Bereich zirkulierender Konzentrationen, die ED50 mit geringer oder keiner Toxizität umfassen. Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereichs, abhängig von der verwendeten Dosierungsform, Empfindlichkeit des Patienten und dem Verabreichungsweg.
  • Die exakte Dosierung wird angesichts der Faktoren, die in Zusammenhang mit dem Subjekt stehen, das eine Behandlung benötigt, vom Arzt bestimmt. Dosierung und Verabreichung werden angepasst, um ausreichende Spiegel des aktiven Inhaltsstoffs bereitzustellen oder die gewünschte Wirkung aufrechtzuerhalten. Faktoren, die berücksichtigt werden können, umfassen die Schwere der Erkrankung, allgemeine Gesundheit der Person, das Alter, Gewicht und Geschlecht des Subjekts, die Ernährung, Zeit und Häufigkeit der Verabreichung, Arzneimittelkombination(en), Reaktionsempfindlichkeiten und Toleranz/Reaktion auf Therapie. Langwirkende pharmazeutische Zusammensetzungen können abhängig von der Halbwertszeit und Clearancerate der speziellen Formulierung alle 3 bis 4 Tage, jede Woche oder einmal alle zwei Wochen verabreicht werden.
  • Normale Dosismengen können von 0,1 bis 100.000 Mikrogramm bis zu einer Gesamtdosis von etwa 1 g variieren, abhängig vom Verabreichungsweg. Anleitungen zu bestimmten Dosierungen und Zufuhrverfahren sind in der Literatur bereitgestellt und Fachleuten allgemein zugänglich. Fachleute verwenden für Nucleotide andere Formulierungen als für Proteine oder deren Inhibitoren. Auf ähnliche Weise ist die Zufuhr von Polynucleotiden oder Polypeptiden für spezielle Zellen, Erkrankungen, Stellen etc. spezifisch.
  • Wenn das Reagens ein einkettiger Antikörper ist, können Polynucleotide, die für einen Antikörper kodieren, hergestellt und unter Einsatz gut etablierter Techniken, einschließlich aber nicht ausschließlich Transferrin-Polykation-vermitteltem DNA-Transfer, Transfektion mit nackten oder eingekapselten Nucleinsäuren, liposomvermittelter Zellfusion, intrazellulärem Transport von DNA-beschichteten Latexperlen, Protoplastenfusion, Vireninfektion, Elektroporation, „Genkanone" und DEAE- oder kalziumphosphatvermittelter Transfektion, entweder ex vivo oder in vivo in eine Zelle eingeführt werden.
  • Effektive In-vivo-Dosierungen eines Antikörpers liegen im Bereich von etwa 5 μg bis etwa 50 μg/kg, etwa 50 μg bis etwa 5 mg/kg, etwa 100 μg bis etwa 500 μg/kg Körper gewicht des Patienten und etwa 200 bis etwa 250 μg/kg Körpergewicht des Patienten. Zur Verabreichung von Polynucleotiden, die für einkettige Antikörper kodieren, liegen effektive In-vivo-Dosierungen im Bereich von etwa 100 ng bis etwa 200 ng, 500 ng bis etwa 50 mg, etwa 1 μg bis etwa 2 mg, etwa 5 μg bis etwa 500 μg und etwa 20 μg bis etwa 100 μg DNA vor.
  • Wenn das Expressionsprodukt mRNA ist, ist das Reagens bevorzugt ein Antisense-Oligonucleotid oder ein Ribozym. Polynucleotide, welche Antisense-Oligonucleotide oder Ribozyme exprimieren, können wie oben beschrieben mithilfe einer Reihe von Verfahren in Zellen eingeführt werden.
  • Ein Reagens reduziert bevorzugt die Expression eines DA-ähnlichen GPCR-Gens oder die Aktivität eines DA-GCPR-Polypeptids um zumindest etwa 10 %, bevorzugt etwa 50, noch bevorzugter etwa 75, 90 oder 100 %, im Vergleich zum Fehlen des Reagens. Die Wirksamkeit des zur Senkung des Expressionswerts eines DA-ähnlichen GPCR-Gens oder der Aktivität des DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids gewählten Mechanismus kann unter Einsatz fachbekannter Verfahren, wie z.B. Hybridisierung von Nucleotidsonden an DA-ähnliche GPCR-spezifische mRNA, quantitativer RT-PCR, immunologischer Detektion eines DA-ähnlichen GPCR-Polypeptids oder Messung der Aktivität eines DA-ähnlichen GPCR, beurteilt werden.
  • In jeder beliebigen der oben beschriebenen Ausführungsformen kann jede beliebige pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung in Kombination mit anderen geeigneten therapeutischen Mitteln verabreicht werden. Die Auswahl der geeigneten Mittel zur Anwendung in Kombinationstherapie kann von jedem beliebigen Fachmann gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Prinzipien durchgeführt werden. Die Kombination therapeutischer Mittel kann synergistisch wirken, um die Behandlung oder Prävention der verschiedenen zuvor beschriebenen Erkrankungen durchzuführen. Unter Verwendung dieses Ansatzes kann mit geringeren Dosierungen jedes Mittels therapeutische Wirksamkeit erreicht werden, wodurch das Potenzial für negative Nebenwirkungen verringert wird.
  • Jedes beliebige der oben erwähnten therapeutischen Verfahren kann an jedem beliebigen Subjekt, das eine Behandlung benötigt, angewendet werden, einschließlich z.B. Säugetiere wie Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Kaninchen, Affen und am bevorzugtesten Menschen.
  • Diagnostische Verfahren
  • GPCRs können auch in diagnostischen Tests zur Detektion von Erkrankungen und Anomalien oder der Empfindlichkeit für Erkrankungen und Anomalien in Zusammenhang mit der Gegenwart von Mutationen in Nucleinsäuresequenzen, die für einen GPCR kodieren, verwendet werden. Solche Erkrankungen betreffen beispielsweise Zelltransformationen, wie z.B. Tumoren und Krebs, und verschiedene kardiovaskuläre Erkrankungen, einschließlich Hypertonie und Hypotonie, wie auch Erkrankungen, die aus abnormen Blutfluss hervorgehen, abnorme angiotensininduzierte Aldosteronsekretion und eine andere abnorme Kontrolle der Fluid- und Elektrolyt-Homöostase.
  • Es können bei Subjekten, die von einer Erkrankung betroffen sind, wie auch bei gesunden Subjekten Unterschiede zwischen der cDNA oder der genomischen Sequenz, die für einen GPCR kodiert, bestimmt werden. Wenn bei einigen oder allen betroffenen Subjekten, jedoch nicht bei gesunden Personen, eine Mutation beobachtet wird, ist die Mutation vermutlich der Verursacher der Erkrankung.
  • Sequenzunterschiede zwischen einem Referenzgen und einem Gen, das über Mutationen verfügt, können durch ein direktes DNA-Sequenzierungsverfahren offenbart werden. Zusätzlich können klonierte DNA-Segmente als Sonden verwendet werden, um spezifische DNA-Segmente zu detektieren. Die Empfindlichkeit für dieses Verfahren wird stark verstärkt, wenn es mit PCR kombiniert wird. Zum Beispiel kann ein Sequenzierungsprimer mit einem doppelsträngigen PCR-Produkt oder einem einsträngigen Matrizenmolekül, welches durch eine modifizierte PCR erzeugt wird, verwendet werden. Die Sequenzbestimmung wird mittels konventioneller Verfahren unter Einsatz radiomarkierter Nucleotide oder mittels automatischer Sequenzierungsverfahren unter Einsatz von Fluoreszenzmarkierungen durchgeführt.
  • Genetisches Testen basierend auf DNA-Sequenzunterschieden kann mittels Detektion von Änderungen der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne Denaturierungsmitteln durchgeführt werden. Kleine Sequenzdeletionen und -insertionen können z.B. mittels hochauflösender Gelelektrophorese veranschaulicht werden. DNA-Fragmente verschiedener Sequenzen können auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen, in welchen die Mobilitäten verschiedener DNA-Fragmente retardiert werden, an verschiedenen Positionen im Gel gemäß ihren spezifischen oder partiellen Schmelztemperaturen unterschieden werden [siehe z.B. Myers et al., Science 230, 1242 (1985)]. Sequenzänderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nucleaseschutztests, wie z.B. RNase- und S1-Schutzverfahren oder das chemische Spaltverfahren [z.B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397-4401 (1985)] gezeigt werden. Daher kann eine spezifische DNA-Sequenz mittels Verfahren, wie z.B. Hybridisierung, RNase-Schutz, chemischer Spaltung, direkter DNA-Sequenzierung oder mithilfe der Verwendung von Restriktionsenzymen und Southern-Blotting von genomischer DNA, detektiert werden. Zusätzlich zu direkten Verfahren, wie z.B. Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung, können Mutation auch mittels In-situ-Analyse detektiert werden.
  • Geänderte GPCR-Spiegel können auch in verschiedensten Geweben detektiert werden. Tests, die verwendet werden, um Mengen der Rezeptorpolypeptide in einer Probe eines Körpers, wie z.B. Blut oder einer Gewebsbiopsie, zu detektieren, welche von einem Wirt stammt, sind Fachleuten bekannt und umfassen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western-Blotting und ELISA-Tests.
  • Alle in dieser Offenbarung zitierten Patente und Patentanmeldungen sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen. Die obige Offenbarung beschreibt im Allgemeinen die vorliegende Erfindung. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Verweis auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden, die nur zum Zwecke der Illustration bereitgestellt sind und nicht den Schutzumfang der Erfindung einschränken sollen.
  • BEISPIEL 1
  • Detekfion der Aktivität des dopaminähnlichen GPCR
  • Das Polynucleotid der Seq.-ID Nr. 1 wird in den Expressionsvektor pCEV4 insertiert, und der erhaltene Expressionsvektor pCEV4-dopaminähnliches-GPCR-Polypeptid wird in menschliche embryonale Nieren-293-Zellen transfiziert. Die Zellen werden von einer Kulturflasche in 5 ml Tris HCl, 5 mM EDTA, pH 7,5 geschabt und mittels Beschallung lysiert. Zelllysate werden bei 1000 U/min 5 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird bei 30.000 × g 20 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wird in einem Bindungspuffer suspendiert, der 50 mM Tris HCl, 5 mM MgSO4, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,5, ergänzt mit 0,1 % BSA, 2 μg/ml Aprotinin, 0,5 mg/ml Leupeptin und 10 μg/ml Phosphoramidon, enthält. Optimale Membransuspensionsverdünnungen, definiert als die Proteinkonzentration, die erforderlich ist, um weniger als 10 % eines hinzugefügten Radioliganden zu binden, d.h. 125I-markiertes Dopamin, werden zu 96-Well-Polypropylen-Mikrotiterplatten hinzugefügt, die einen Liganden, nicht-markierte Peptide und Bindungspuffer bis zu einem Endvolumen von 250 μl enthalten.
  • In Gleichgewichtssättigungsbindungstests werden Membranformulierungen in Gegenwart zunehmender Konzentrationen (0,1 nM bis 4 nM) eines 125I-Liganden inkubiert.
  • Bindungsreaktionsgemische werden eine Stunde lang bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch Filtration mithilfe von GF/B-Filtern, die mit 0,5 % Polyethylenimin behandelt sind, unter Einsatz eines Zellerntegeräts gestoppt. Radioaktivität wird mittels Szintillationszählung gemessen, und die Daten werden mithilfe eines computerisierten nicht-linearen Regressionsprogramms analysiert. Die nicht-spezifische Bindung wird als jene Menge an Radioaktivität definiert, die nach Inkubation des Membranproteins in Gegenwart von 100 nM eines unmarkierten Peptids übrigbleibt. Die Proteinkonzentration wird mithilfe des Bradford-Verfahrens unter Einsatz eines Bio-Rad-Reagens mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Es wird die Aktivität des dopaminähnlichen GPCR des Polypeptids demonstriert, welches die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
  • BEISPIEL 2
  • Radioligand-Bindungstests
  • Menschliche embryonale Nieren-293-Zellen, die mit einem Polynucleotid transfiziert sind, welches menschliches DA-ähnliches GPCR exprimiert, werden von einer Kulturflasche in 5 ml Tris HCl, 5 mM EDTA, pH 7,5 geschabt und durch Beschallung lysiert. Zelllysate werden bei 1000 U/min 5 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird bei 30.000 × g 20 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wird in einem Bindungspuffer suspendiert, der 50 mM Tris HCl, 5 mM MgSO4, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,5, ergänzt mit 0,1 % BSA, 2 μg/ml Aprotinin, 0,5 mg/ml Leupeptin und 10 μg/ml Phosphoramidon, enthält. Optimale Membransuspensionsverdünnungen, die als jene Proteinkonzentration definiert sind, die erforderlich ist, um weniger als 10 % des hinzugefügten Radioliganden, d.h. Dopamin, zu binden, werden zu 96-Well-Mikrotiterplatten hinzugefügt, die einen 125I-markierten Liganden oder eine 125I-markierte Testverbindung, nicht-markierte Peptide und Bindungspuffer bis zu einem Endvolumen von 250 μl enthalten.
  • In Gleichgewichtssättigungsbindungstests werden Membranformulierungen in Gegenwart zunehmender Konzentrationen (0,1 nM bis 4 nM) eines 125I-markierten Liganden oder einer 125I-markierten Testverbindung (spezifische Aktivität 2200 Ci/mmol) inkubiert. Die Bindungsaffinitäten verschiedener Testverbindungen werden unter Einsatz von 0,1 nM 125I-Peptid in Gegenwart von 12 verschiedenen Konzentrationen jeder Testverbindung in Gleichgewichtskonkurrenzbindungstests bestimmt.
  • Bindungsreaktionsgemische werden eine Stunde lang bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch Filtration über GF/B-Filter, die mit 0,5 % Polyethylenimin behandelt sind, unter Einsatz eines Zellerntegeräts gestoppt. Die Radioaktivität wird mittels Szintillationszählung gemessen und die Daten mit einem computerisierten nichtlinearen Regressionsprogramm analysiert.
  • Eine nicht-spezifische Bindung wird als jene Menge an Radioaktivitat definiert, die nach Inkubation des Membranproteins in Gegenwart von 100 nM des unmarkierten Peptids übrigbleibt. Die Proteinkonzentration wird mittels Bradford-Verfahren unter Einsatz eines Bio-Rad-Reagens mit einem Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Eine Testverbindung, welche die Radioaktivität eines Membranproteins um zumindest 15 % im Vergleich zur Radioaktivität des Membranproteins, das nicht mit einer Testverbindung inkubiert wurde, erhöht, wird als Verbindung identifiziert, welche an ein menschliches DA-ähnliches GPCR-Polypeptid bindet.
  • BEISPIEL 3
  • Wirkung einer Testverbindung auf menschliche DA-ähnliche GPCR-vermittelte zyklische AMP-Bildung
  • In Wirtszellen, welche menschliches DA-ähnliches GPCR exprimieren, kann die rezeptorvermittelte Inhibition der cAMP-Bildung getestet werden. Zellen werden auf 96-Well-Platten ausplattiert und in Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), ergänzt mit 10 mM HEPES, 5 mM Theophyllin, 2 μg/ml Aprotinin, 0,5 mg/ml Leupeptin und 10 μg/ml Phosphoramidon, 20 Minuten lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert. Eine Testverbindung wird hinzugefügt und weitere 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Das Medium wird abgesaugt und die Reaktion durch Hinzufügung von 100 mM HCl gestoppt. Die Platten werden bei 4 °C 15 Minuten lang aufbewahrt. Mittels Radioimmuntest wird der cAMP-Inhalt in der Stopplösung gemessen.
  • Die Radioaktivität wird unter Einsatz eines Gammazählers, der mit einer Datenreduktionssoftware ausgerüstet ist, quantifiziert. Eine Testverbindung, welche die Radioaktivität der Inhalte eines Wells im Vergleich zur Radioaktivität der Inhalte eines Wells in Abwesenheit der Testverbindung senkt, wird als potenzieller Inhibitor der cAMP-Bildung identifiziert. Eine Testverbindung, welche die Radioaktivität der Inhalte eines Wells im Vergleich zur Radioaktivität der Inhalte eines Wells in Abwesenheit der Testverbindung erhöht, wird als potenzieller Enhancer der cAMP-Bildung identifiziert.
  • BEISPIEL 4
  • Wirkung einer Testverbindung auf die Mobilisierung intrazellulären Kalziums
  • Die intrazelluläre freie Kalziumkonzentration kann mithilfe der Mikrospektralfluorimetrie unter Einsatz des Fluoreszenzindikatorfarbstoffes Fura-2/AM [Bush et al. J. Neurochem. 57, 562-574 (1991)] gemessen werden. Stabil transfizierte Zellen werden auf eine 35-mm-Kulturplatte geimpft, die ein Glasdeckinsert enthält. Die Zellen werden mit HBS gewaschen, mit einer Testverbindung inkubiert und mit 100 μl von Fura-2/AM (10 μM) 20-40 Minuten lang beladen. Nach Waschung mit HBS zur Entfernung der Fura-2/AM-Lösung wurden die Zellen 10-20 Minuten lang in HBS äquilibriert. Die Zellen werden dann unter dem 40X-Objektiv eines Leitz-Fluovert-FS-Mikroskops sichtbar gemacht.
  • Die Fluoreszenzemission wird mit Anregungswellenlängen, die zwischen 340 nm und 380 nm variieren, bei 510 nm bestimmt. Rohe Fluoreszenzdaten werden unter Einsatz standardisierter Kalziumkonzentrationskurven und Software-Analyseverfahren in Kalziumkonzentrationen konvertiert. Eine Testverbindung, welche die Fluoreszenz im Vergleich zur Fluoreszenz in Abwesenheit einer Testverbindung um zumindest 15 % erhöht, wird als Verbindung identifiziert, die intrazelluläres Kalzium mobilisiert.
  • BEISPIEL 5
  • Wirkung einer Testverbindung auf den Phosphoinositid-Metabolismus
  • Zellen, die menschliche DA-ähnliche GPCR-cDNA stabil exprimieren, werden auf 96-Well-Platten ausplattiert und bis zur Konfluenz gezüchtet. Am Tag vor dem Test wird das Wachstumsmedium auf 100 μl des Mediums, welches 1 % Serum und 0,5 βCi 3H-Myinositol, geändert. Die Platten werden über Nacht in einem CO2- Inkubator (5 % CO2 bei 37 °C) inkubiert. Kurz vor dem Test wird das Medium entfernt und durch 200 μl PBS ersetzt, welches 10 mM LiCl enthält, und die Zellen werden mit dem neuen Medium 20 Minuten lang äquilibriert. In diesem Intervall werden die Zellen auch mit einem Antagonisten äquilibriert, der als 10-μl-Aliquote einer 20fach konzentrierten Lösung in PBS hinzugefügt wird.
  • Die 3H-Inositolphosphatakkumulierung aus dem Inositolphospholipidmetabolismus wird durch Hinzufügung von 10 μl einer Lösung, die eine Testverbindung enthält, begonnen. Zu dem ersten Well werden 10 μl hinzugefügt, um die basale Akkumulierung zu messen. In den folgenden 11 Wells jeder Plattenreihe werden 11 verschiedene Konzentrationen der Testverbindung getestet. Alle Tests werden doppelt ausgeführt, indem in zwei aufeinander folgenden Plattenreihen dieselben Hinzufügungen wiederholt werden.
  • Die Platten werden eine Stunde lang in einem CO2-Inkubator inkubiert. Die Reaktion wird durch die Hinzufügung von 15 μl von 50 Vol.-% Trichloressigsäure (TCA) beendet, gefolgt von einer 40-minütigen Inkubation bei 4 °C. Nach der Neutralisierung von TCA mit 40 μl von 1 M Tris wird der Inhalt der Wells auf eine Multiscreen-HV-Filterplatte (Millipore), welche Dowex AG1-X8 (200-400 Mesh, Formiatform) enthält, transferriert. Die Filterplatten werden hergestellt, indem zu jedem Well 200 μl Dowex-AG1-X8-Suspension (50 Vol.-%, Wasser:Harz) hinzugefügt werden. Die Filterplatten werden auf einen Vakuumkollektor platziert, um das Harzbett zu waschen oder zu eluieren. Jeder Well wird zweimal mit 200 μl Wasser gewaschen, gefolgt von 2 × 200 μl von 5 mM Natriumtetraborat/60 mM Ammoniumformiat.
  • Die 3H-IPs werden in leere 96-Well-Platten mit 200 μl 1,2 M Ammoniumformiat/0,1 Ameisensäure eluiert. Zu 3 ml Szintillationscocktail wird der Inhalt der Wells hinzugefügt, und mittels Flüssigkeitszintillationsmessung wird die Radioaktivität bestimmt.
  • BEISPIEL 6
  • Rezeptorbindende Verfahren
  • Standard-Bindungstests. Bindungstests werden in einem Bindungspuffer durchgeführt, der 50 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 % BSA und 5 mM MgCl2 enthält. Der Standardtest auf Radioligandenbindung an Membranfragmente, die DA-ähnliche GPCR-Polypeptide umfassen, wird wie folgt in 96-Well-Mikrotiterplatten (z.B. „Dynatech Immulon II Removawell"-Platten) durchgeführt. Der Radioligand wird in Bindungspuffer + PMSF/Baci auf die gewünschten cpm pro 50 μl verdünnt, dann werden den Wells 50-μl-Aliquoten hinzugefügt. Für nicht-spezifische Bindungsproben werden zu jedem Well 5 μl von 40 μM eines kalten Liganden hinzugefügt. Die Bindung wird durch die Hinzufügung von 150 μl Membran pro Well initiiert, die in Bindungspuffer + PMSF/Baci auf die gewünschte Konzentration verdünnt ist (10-30 μg Membranprotein/Well). Die Platten werden dann mit Linbro-Mylarplattenversiegler (Flow Labs) bedeckt und auf einen „Dynatech Microshaker II" platziert. Die Bindung kann 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur erfolgen und wird durch 15-minütige Zentrifugation der Platte bei 2.000 × g gestoppt. Die Überstände werden dekantiert und die Membranpellets durch Hinzufügung von 200 μl eiskaltem Bindungspuffer, kurzes Schütteln und Rezentrifugation einmal gewaschen. Die einzelnen Wells werden in 12 × 75-mm-Röhrchen platziert und in einem LKB-Gammamaster-Zähler (78 % Wirksamkeit) gezählt. Die spezifische Bindung durch dieses Verfahren ist identisch mit jener, die gemessen wird, wenn ein freier Ligand durch rasche Filtration (3-5 Sekunden) und Waschung auf polyethyleniminüberzogenen Glasfaserfiltern entfernt wird.
  • Es werden drei Variationen des Standard-Bindungstests verwendet.
    • 1. Kompetitiver Radioligandenbindungstests mit einem Konzentrationsbereich kalter Ligand zu 125I-markiertem Ligand werden wie oben beschrieben mit einer Modifikation durchgeführt. Alle Verdünnungen von zu testenden Liganden werden in 40X PMSF/Baci bei einer 40fachen Konzentration der Endkonzentration des Tests durchgeführt. Zu jedem Mikrotiter-Well werden Peptidproben (5 μl jeweils) hinzugefügt. Die Membranen und der Radioligand werden in Bindungspuffer ohne Proteaseinhibitoren verdünnt. Der Radioligand wird hinzugefügt und mit dem kalten Liganden gemischt, und dann wird durch Hinzufügung von Membranen die Bindung initiiert.
    • 2. Nach einem Bindungsschritt, der mit dem Standardtest identisch ist, wird die chemische Vernetzung des Radioliganden mit dem Rezeptor ausgeführt. Jedoch wird der Waschschritt mit Bindungspuffer minus BSA durchgeführt, um die Möglichkeit nicht-spezifischer Vernetzung des Radioliganden mit BSA zu reduzieren. Der Vernetzungsschritt wird wie nachstehend beschrieben ausgeführt.
    • 3. Es werden auch Bindungstests im großen Maßstab zur Erhaltung von Membranpellets für Studien über die Solubilisierung des Rezeptor:Ligand-Komplexes und zur Rezeptorreinigung durchgeführt. Diese sind identisch mit Standardtests, mit der Ausnahme, dass (a) die Bindung in Polypropylenröhrchen mit Volumina von 1-250 ml ausgeführt wird, (b) die Konzentration des Membranproteins immer 0,5 mg/ml beträgt und (c) zur Rezeptorreinigung die BSA-Konzentration im Bindungspuffer auf 0,25 % reduziert wird, und der Waschschritt wird mit Bindungspuffer ohne BSA ausgeführt, was die BSA-Kontamination des gereinigten Rezeptors reduziert.
  • BEISPIEL 7
  • Chemische Vernetzung von Radioligand und Rezeptor
  • Nach einem wie oben beschriebenen Radioligandenbindungsschritt werden die Membranpellets pro Mikrotiterplattenwell in 200 μl eines eiskalten Bindungspuffers ohne BSA resuspendiert. Danach werden zu jedem Well 5 μl von 4 mM N-5-Azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimid (ANB-NOS, Pierce) in DSMO hinzugefügt und gemischt. Die Proben werden auf Eis aufbewahrt und mit UV-Licht 10 Minuten lang in einem Abstand von 5-10 cm mit einer „Mineralight R-52G"-Lampe bestrahlt (UVP, Inc., San Gabriel, Kalifornien). Danach werden die Proben auf Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen transferiert, die Membranen mittels Zentrifugation pelletiert, die Überstände entfernt und die Membranen in Laemmli-SDS-Probenpuffer für Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) solubilisiert. PAGE wird wie unten beschrieben ausgeführt. Radiomarkierte Proteine werden mittels Autoradiographie der getrockneten Gele mit Kodak-XAR-Film und DuPont-Bildverstärkerbildschirmen sichtbar gemacht.
  • BEISPIEL 8
  • Membransolubilisierung
  • Die Membransolubilisierung wird in einem Puffer ausgeführt, der 25 mM Tris, pH 8, 10 % (Gew./Vol.) Glycerin und 0,2 mM CaCl2 (Solubilisierungspuffer) enthält. Die höchst löslichen Detergenzien, einschließlich Triton X-100, Desoxycholat, Desoxycholat:Lysolecithin, CHAPS und Zwittergent, werden in 10-%-Konzentrationen hergestellt und als gefrorene Aliquoten aufbewahrt. Lysolecithin wird aufgrund der Unlöslichkeit nach Frieren und Tauen frisch hergestellt, und Digitonin wird aufgrund seiner eingeschränkten Löslichkeit in geringeren Konzentrationen frisch hergestellt.
  • Zur Solubilisierung von Membranen werden Pellets nach dem Bindungsschritt frei von sichtbaren Teilchen durch Pipettierung und Vortexing in einem Solubilisierungspuffer bei 100.000 × g 30 Minuten lang resuspendiert. Die Überstände werden entfernt und auf Eis aufbewahrt und die Pellets verworfen.
  • BEISPIEL 9
  • Test auf solubilisierte Rezeptoren
  • Nach Bindung von 125I-Liganden und Solubilisierung der Membranen mit dem Detergens kann der intakte R:L-Komplex mithilfe von vier verschiedenen Verfahren getestet werden. Alle werden auf Eis oder bei 4-10 °C in einem kalten Raum durchgeführt.
    • 1. Säulenchromatographie [Knuhtsen et al., Biochem. J. 254, 641-647 (1988)]. Sephadex-G-50-Säulen (8 × 250 mm) werden mit einem Solubilisierungspuffer äquilibriert, der ein Detergens mit einer Konzentration, die verwendet wird, um Membranen zu solubilisieren, wie auch 1 mg/ml Rinderserumalbumin enthält. Proben solubilisierter Membranen (0,2-0,5 ml) werden auf Säulen aufgetragen und mit einer Durchflussgeschwindigkeit von etwa 0,7 ml/Minute eluiert. Es werden Proben (0,18 ml) entnommen. In einem Gammazähler wird die Radioaktivität bestimmt. Die Hohlraumvolumina der Säulen werden mithilfe des Elutionsvolumens von Dextranblau bestimmt. Die Radioaktivität, welche im Hohlraumvolumen eluiert, wird als an Protein gebundene Radioaktivität angesehen. Radioaktivität, welche später im selben Volumen wie freie 125-I-Liganden eluiert, wird als nicht-gebunden angesehen.
    • 2. Polyethylenglykolpräzipitation [Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 318-322 (1972)]. Für eine 100-μl-Probe solubilisierter Membranen in einem 12×75-mm-Polypropylenröhrchen werden 0,5 ml von 1 % (Gew./Vol.) Rindergammaglobulin (Sigma) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer hinzugefügt, gefolgt von 0,5 ml von 25 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol (Sigma) und Mischen. Das Gemisch wird 15 Minuten lang auf Eis aufbewahrt. Dann werden pro Probe 3 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, hinzugefügt. Die Proben werden rasch (1-3 Sekunden) über Whatman-GF/B-Glassfaserfilter filtriert und mit 4 ml Phosphatpuffer gewaschen. PEG-ausgefällter Rezeptor: 125I-Ligand-Komplex wird mittels Gammazählung der Filter bestimmt.
    • 3. GFB/PEI-Filterbindung [Bruns et al., Analytical Biochem. 132, 74-81 (1983)]. Whatman-GF/B-Glassfaserfilter werden 3 Stunden lang in 0,3 % Polyethylenimin (PEI, Sigma) getränkt. Proben solubilisierter Membranen (25-100 μl) werden in 12×75-mm-Polypropylenröhrchen ersetzt. Dann werden pro Probe 4 ml Solubilisierungspuffer ohne Detergens hinzugefügt und die Proben sofort durch den GFB/PEI-Filter (1-3 Sekunden) filtriert und mit 4 ml Solubilisierungspuffer gewaschen. Die CPM des auf Filter adsorbierten Rezeptor: 125I-Ligandkomplexes wird durch Gammazählung bestimmt.
    • 4. Aktivkohle/Dextran [Paul und Said, Peptides 7 [Suppl. 1], 147-149 (1986)]. Dextran T70 (0,5 g, Pharmacia) wird in 1 Liter Wasser gelöst, dann werden 5 g Aktivkohle hinzugefügt (Norit A, alkalisch, Fisher Scientific). Die Suspension wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und dann bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahrt. Um den R:L-Komplex zu messen, werden zu einem Volumsteil solubilisierter Membran 4 Volumsteile Aktivkohle/Dextransuspension hinzugefügt. Die Proben werden gemischt und 2 Minuten lang auf Eis aufbewahrt und dann in einer Beckman-Mikrozentrifuge 2 Minuten lang bei 11.000 × g zentrifugiert. Ein freier Radioligand wird an Aktivkohle/Dextran adsorbiert und mit dem Pellet verworfen. Rezeptor: 125I-Ligand-Komplexe bleiben im Überstand und werden mittels Gammazählung bestimmt.
  • BEISPIEL 10
  • Rezeptorenreinigung
  • Die Bindung eines Biotinyl-Rezeptors an GH4-C1-Membranen wird wie oben beschrieben ausgeführt. Die Inkubationen werden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur ausgeführt. Im Standardreinigungsprotokoll enthalten die Bindungsinkubationen 10 nM Bio-S29. 125I-Ligand wird als Tracer bei Spiegeln von 5.000-100.000 cpm pro mg Membranprotein hinzugefügt. Kontrollinkubationen enthalten 10 μM eines kalten Liganden, um den Rezeptor mit einem nicht-biotinyliertem Liganden zu sättigen.
  • Die Solubilisierung des Rezeptor:Ligand-Komplexes wird ebenfalls wie oben beschrieben mit 0,15 % Desoxycholat:Lysolecithin in einem Solubilisierungspuffer ausgeführt, der 0,2 mM MgCl2 enthält, um 100.000-×-g-Überstände zu erhalten, die einen solubilisierten R:L-Komplex enthalten.
  • Immobilisiertes Streptavidin (Streptavidin vernetzt mit 6 % geperlter Agarose, Pierce Chemical Co., „SA-Agarose") wird in einem Solubilisierungspuffer gewaschen und zu solubilisierten Membranen als 1/30 des Endvolumens hinzugefügt. Dieses Gemisch wird unter konstantem Rühren mittels End-über-End-Rotation 4-5 Stunden lang bei 4-10 °C inkubiert. Dann wird das Gemisch auf eine Säule aufgetragen und das nicht-gebundene Material durchgewaschen. Die Bindung des Radioliganden an SA-Agarose wird durch den Vergleich von cpm im 100.000-×-g-Überstand mit dem in der Säule nach Adsorption an SA-Agarose ausfließenden bestimmt. Letztendlich wird die Säule mit 12-15 Säulenvolumina von Solubilisierungspuffer + 0,15 % Desoxycholat-Lysolecithin + 1/500 (Vol/Vol.) 100 × 4pase gewaschen.
  • Die Streptavidinsäule wird mit Solubilisierungspuffer + 0,1 mM EDTA + 0,1 mM EGTA + 0,1 mM GTP-Gamma-S (Sigma) + 0,15 % (Gew./Vol.) Desoxycholat:Lysolecithin + 1/1000 (Vol./Vol.) 100-mal 4pase eluiert. Zuerst wird ein Säulenvolumen des Elutionspuffers durch die Säule geleitet und der Durchfluss für 20-30 Minuten unterbrochen. Danach werden 3-4 weitere Säulenvolumina eines Elutionspuffers durchgeleitet. Alle Eluate werden gepoolt.
  • Eluate der Streptavidinsäule werden über Nacht mit immobilisiertem Weizenkeimagglutinin (WGA-Agarose, Vector Labs) inkubiert (12-15 Stunden), um den Rezeptor über die Wechselwirkung von kovalent gebundenem Kohlenhydrat mit dem WGA-Lectin zu adsorbieren. Das Verhältnis (Vol.Vol.) von WGA-Agarose zum Streptavidinsäuleneluat ist im Allgemeinen 1:400. Es kann ebenfalls ein Verhältnis im Bereich von 1:1000 bis 1:200 eingesetzt werden. Nach dem Bindungsschritt wird das Harz durch Zentrifugation pelletiert, der Überstand entfernt und gespeichert und das Harz dreimal (etwa 2 Minuten jeweils) in einem Puffer, der 50 mM HEPES, pH 8, 5 mM MgCl2 und 0,15 % Desoxycholat:Lysolecithin enthält, gewaschen. Zur Elution des WGA-gebundenen Rezeptors wird das Harz dreimal durch wiederholte Mischung (Vortexmischgerät mit geringer Geschwindigkeit) über einen Zeitraum von 15-30 Minuten auf Eis extrahiert, jedes Mal mit 3 Harzsäulen von 10 mM N-N'-N''-Triacetylchitotriose im gleichen HEPES-Puffer, der verwendet wird, um das Harz zu waschen. Nach jedem Elutionsschritt wird das Harz hinunter zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt, frei von WGA-Agarose-Pellets. Die drei in einem Pool zusammengefassten Eluate enthalten den gereinigten Endrezeptor. Das nicht an WGA gebundene Material enthält G-Protein-Untereinheiten, die spezifisch von der Strepatividinsäule eluiert werden, wie auch nicht-spezifische Verunreinigungen. All diese Fraktionen werden bei –90 °C in gefrorenem Zustand aufbewahrt.
  • BEISPIEL 11
  • Identifikation von Testverbindungen, die an DA-ähnliche GPCR-Polypeptide binden
  • Gereinigte DA-GPCR-Polypeptide, welche ein Glutathion-S-Transferaseprotein umfassen und auf glutathionderivatisierte Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten absorbiert werden, werden bei einem pH-Wert von 7,0 in einer physiologischen Pufferlösung mit Testverbindungen einer kleinen Molekülbibliothek kontaktiert. DA-GPCR-Polypeptide umfassen eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2. Die Testverbindungen umfassen eine Fluoreszenzmarkierung. Die Proben werden 5 Minuten lang bis zu einer Stunde inkubiert. Kontrollproben werden in Abwesenheit einer Testverbindung inkubiert.
  • Die Pufferlösung, welche die Testverbindungen enthält, wird aus den Wells gewaschen. Die Bindung einer Testverbindung an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid wird mittels Fluoreszenzmessungen der Inhalte der Wells detektiert. Eine Testverbindung, welche die Fluoreszenz in einem Well im Vergleich zur Fluoreszenz eines Wells, in welchem eine Testverbindung nicht inkubiert wird, um zumindest 15 % erhöht, wird als Verbindung identifiziert, die an ein DA-ähnliches GPCR-Polypeptid bindet.
  • BEISPIEL 12
  • Identifikation einer Testverbindung, welche die DA-ähnliche GPCR-Genexpression senkt
  • Einer Kultur menschlicher Magenzellen wird eine Testverbindung verabreicht und bei 37 °C 10 bis 45 Minuten lang inkubiert. Eine Kultur derselben Art von Zellen, die über denselben Zeitraum inkubiert werden, ohne Testverbindung stellt eine negative Kontrolle bereit.
  • RNA wird wie in Chirgwin et al., Biochem. 18, 5294-5299 (1979), beschrieben aus den beiden Kulturen isoliert. Northern-Blots werden unter Einsatz von 20 bis 30 μg Gesamt-RNA hergestellt und mit einer 32P-markierten DA-ähnlichen GPCR-spezifischen Sonde bei 65 °C in Express-hyb (CLONTECH) inkubiert. Die Sonde umfasst zumindest 11 zusammenhängende Nucleotide, die aus dem Komplement von Seq.-ID Nr. 1 ausgewählt sind. Eine Testverbindung, welche das DA-ähnliche GPCR-spezifische Signal im Vergleich zu jenem Signal senkt, das in Abwesenheit der Testverbindung erhalten wird, wird als Inhibitor der DA-ähnlichen GPCR-Genexpression identifiziert.
  • BEISPIEL 13
  • Behandlung von Schizophrenie mit einem Reagens, welches spezifisch an ein DA-ähnliches GPCR-Genprodukt bindet
  • Die Synthese von DA-ähnlichen Antisense-GPCR-Oligonucleotiden, umfassend zumindest 11 zusammenhängende Nucleotide, ausgewählt aus dem Komplement von Seq.-ID Nr. 1, wird auf einem „Pharmacia Gene Assembler series"-Synthesegerät unter Einsatz des Phosphoramiditverfahrens durchgeführt [Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 534-583 (1990)]. Nach Anordnung und Entschützung werden Oligonucleotide zweimal mit Ethanol ausgefällt, getrocknet und in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in der gewünschten Konzentration suspendiert. Die Reinheit dieser Oligonucleotide wird mittels Kapillargelelektrophoresen und Ionenaustausch-HPLC getestet. Endotoxinspiegel in der Oligonucleotidformulierung werden unter Einsatz eines Limulus-Amöbozyttests bestimmt [Bang, Biol. Bull. (Woods Hole, Massachusetts) 105, 361-362 (1953)].
  • Die Antisense-Oligonucleotide werden einem Patienten mit Schizophrenie verabreicht. Die Schwere der Schizophrenie des Patienten wird dadurch gemindert.
  • BEISPIEL 14
  • Ligandbindungsanalyse
  • COS-7-Zellen werden 48 bis 72 Stunden nach Transfektion mit menschlichen DA-ähnlichen GPCR-Expressionskonstrukten geerntet. Die in den Kulturflaschen (75 cm2) enthaltenen Zellen werden mit 5 ml Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7,4) gespült. Die Zellen werden dann abgeschabt und 15 Sekunden lang unter Einsatz eines Brinkman-Homogenisators in Lysepuffer homogenisiert. Die Membranen werden bei 50.000 × g 20 Minuten lang zentrifugiert und das Pellet in einem Bindungspuffer (50 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,4) resuspendiert. Die Sättigungsbindungsstudien werden mit zunehmenden Konzentrationen von [125I]SCH 23982 (2200 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq) durchgeführt. Konkurrenzkurven werden mit sich erhöhenden Konzentrationen unmarkierter Arzneimittel unter Beobachtung gegen eine konstante Konzentration von [125I]SCH 233982 (etwa 0,20 nM) durchgeführt. Die Reaktion wird durch Hinzufügung von 100 μl der Membranen (etwa 0,45 μg Protein) initiiert und das Testgemisch in einem Endvolumen von 200 μl 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Testgemische werden dann durch Whatman-GF/C-Glasfaserfilter vakuumfiltriert und dreimal mit 5 ml eines kalten Waschpuffers (50 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, pH 7,2) gewaschen. Die gesamte und nichtspezifische Bindung werden in Abwesenheit und in Gegenwart von 10 μM Cis-Flupentixol dargestellt. Jede Bestimmung wird dreifach ausgeführt. Die gebundene Radioaktivität wird unter Einsatz eines Gammazählers (LKB Instruments) mit einer Effizienz von 75 % gemessen. Bindungskurven werden unter Einsatz von Programmen der nichtlinearen multiplen Regression analysiert. Siehe DeLean et al., Mol. Pharmacol. 21, 5-16 (1982); McPherson, J. Pharmacol. Methods 14, 213-228 (1985).
  • Cis-Flupentixol, Cis-Piflutixol, Cis-Teflutixol können von Lundbeck (Dänemark) bezogen werden. Fluperlapin kann von Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dänemark) erhalten werden. SCH 23388 und SCH 23390 können von Schering Plough (Bloomfield, New Jersey) bezogen werden. Apomorphin, (+)Butaclamol, Dopaminhydrochlorid, Haloperidol, R(–)-Propylnorapomorphin (NPA) und Spiperon können von Research Bioche mical Industries (RBI) bezogen werden. Fenoldopam und SKF 38393 können von Smith, Kline & French erhalten werden. [125I]SCH 23982 war von New England Nuclear Boston, Massachusetts.
  • BEISPIEL 15
  • Gewebsspezifische Expression von dopaminähnlichem GPCR
  • Das Expressionsprofiling des dopaminähnlichen GPCR mittels quantitativer PCR in Echtzeit mit RNA-Proben aus menschlichem Gewebe verleiht dem dopaminähnlichen GPCR eine Rolle bei Erkrankungen des Menschen. Die Gruppe umfasst die Gesamt-RNA des Gehirns, des gesamten Alzheimergehirns, des fötalen Gehirns, des Kleinhirns, des Rückenmarks, des Herzens, des fötalen Herzens, des Perikards, der Zellen des glatten Herzmuskels, der Schilddrüse, des Schilddrüsentumors, der Milz, der Milz (von Patenten mit Leberzirrhose), des Thymus, des Knochenmarks, der Lunge, der fötalen Lunge, des Lungentumors, der Leber, der fötalen Leber, der Leber (von Patienten mit Leberzirrhose), der Bauchspeicheldrüse, der Bauchspeicheldrüse (von Patienten mit Leberzirrhose), des Magens, des Dünndarms, des Dickdarms, des Dickdarmtumors, der Niere, des Skelettmuskels, der HeLa-Zellen, des Brusttumors, der Brustdrüse, der MDA-MB-231-Zellen, des Hodens, der Luftröhre, der Nebenniere, der Speicheldrüse, der Blase, der Prostata, der Plazenta, des Uterus, des adipösen Gewebes. Eine Entwicklung der kinetischen Analyse von PCR ist in Higuchi et al., BioTechnology 10, 413-417 (1992), und Higuchi et al., Biotechnology 11, 1026-1030 (1993), beschrieben. Deren Prinzip ist es, dass bei jedem beliebigen Zyklus innerhalb der Exponentialphase der PCR die Menge des Produkts proportional zur anfänglichen Zahl der Matrizenkopien ist.
  • Die PCR-Amplifikation wird in Gegenwart einer Oligonucleotidsonde (TaqMan-Sonde), die zur Target-Sequenz komplementär ist und mit einem Fluoreszenzreporterfarbstoff und einem Quencherfarbstoff markiert ist, ausgeführt. In der Extensionsphase der PCR wird die Sonde durch 5'-3'-Endonuclease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase gespalten, wodurch der Fluorophor von der Wirkung des Quenching- Farbstoffs freigesetzt wird [Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7276-7280 (1991)]. Da die Fluoreszenzemission direkt proportional zur Menge des spezifischen amplifizierten Produkts steigt, kann die exponentielle Wachstumsphase des PCR-Produkts detektiert und dazu verwendet werden, die anfängliche Matrizenkonzentration zu bestimmen (Heid et al., Genome Res. 6, 986-994 (1996), und Gibson et al., Genome Res. 6, 995-1001 (1996)].
  • Unter Einsatz eines ABI-Prism-7700-Sequenzdetektors wird quantitative PCR in Echtzeit ausgeführt. Der CT-Wert für jede Reaktion wird verwendet, um durch Interpolation von einer universellen Standardkurve die anfängliche Matrizenkonzentration (Kopienzahl) zu bestimmen. In jeder Probe wird der Expressionsgrad des Target-Gens im Vergleich zur Probe mit der geringsten Genexpression kalkuliert.
  • RNA-Extraktion und cDNA-Herstellung. Die Gesamt-RNA aus jeder der oben angeführten Zelltypen wurde unter Einsatz des „Qiagen's RNeasy"-Systems gemäß der Arbeitsvorschrift der Hersteller (Crawley, West Sussex, Vereinigtes Königreich) isoliert. Die Konzentration gereinigter RNA wird unter Einsatz eines RiboGreen-RNA-Quantifizierungssets (Molecular Probes Europe, Niederlande) bestimmt. Zur Herstellung von cDNA wird unter Einsatz von 200 U von SUPERSCRIPTTM-RNase-H–-reverser-Transkriptase (Life Technologies, Paisley, Vereinigtes Königreich), 10 mM Dithiothreit, 0,5 mM jedes dNTP und 5 μM zufälliger Hexamere (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, Vereinigtes Königreich) gemäß dem Protokoll des Herstellers 1 μg der Gesamt-RNA in einem Endvolumen von 20 μl revers transkribiert.
  • Quantitative TaqMan-Analyse. Spezifische Primer und Sonden wurden gemäß den Empfehlungen von PE Applied Biosystems konstruiert, es wird eine FAM (6-Carboxy-Fluorescein-) markierte Sonde verwendet. Eine Quantifikations-PCR wird mit 5 ng von revers transkribierter RNA aus jeder Probe durchgeführt. Jede Bestimmung wird doppelt durchgeführt.
  • Die Testreaktionsmischung ist wie folgt: 1 × endgültige „TaqMan Universal PCR Master Mix" (aus 2× Stammlösung) (PE Applied Biosystems, CA), 900 nM Vorwärtsprimer, 900 nM Rückwärtsprimer, 200 nM Sonde, 5 ng cDNA und Wasser auf 25 μl.
  • Jeder der folgenden Schritte wurde einmal ausgeführt, Prä-PCR 2 Minuten lang bei 50 °C und 10 Minuten lang bei 95 °C. Die folgenden Schritte werden 40-mal ausgeführt: Denaturierung, 15 Sekunden lang bei 95 °C, Annealing/Extension, 1 Minute bei 60 °C.
  • Alle Experimente wurden unter Einsatz eines ABI-Prism-7700-Sequenzdetektors (PE Applied Biosystems, CA) durchgeführt. Am Ende des Durchgangs wurden die Fluoreszenzdaten, die während der PCR erhalten wurden, wie im ABI-Prism-7700-Benutzerhandbuch beschrieben verarbeitet, um eine bessere Hintergrundsubtraktion wie auch Signallinearität mit der anfänglichen Target-Menge zu erreichen.
  • Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse des Expressionsprofiling für dopaminähnlichen GPCR unter Einsatz der indizierten Zell- und Gewebsproben. Das Ergebnis ist in 5 graphisch dargestellt. Eine relativ hohe Expression wird verglichen mit einem normalen Gehirn im Alzheimer-Gehirn detektiert wie auch im Krebsgewebe verglichen mit dem entsprechenden normalen Gewebe. Tabelle 1:
    Figure 00740001
    Sequenzprotokoll
    Figure 00750001
    Figure 00760001
    Figure 00770001
    Figure 00780001
    Figure 00790001

Claims (1)

  1. Verfahren zum Screenen auf Mittel, die zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit zweckdienlich sind und die Aktivität eines dopaminähnlichen GPCR-Polypeptids regeln, umfassend: (a) das Kontaktieren einer Testverbindung mit einem dopaminähnlichen GPCR-Polypeptid, umfassend: i. eine Aminosäuresequenz, die Seq.-ID Nr. 2 umfasst, oder ii. eine Aminosäuresequenz, die zumindest 90 % Identität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist; und (b) das Detektieren einer dopaminähnlichen GPCR-Aktivität des Polypeptids, worin eine Testverbindung, welche die dopaminähnliche GPCR-Aktivität verringert, als mögliches Therapeutikum zur Verringerung der Aktivität des dopaminähnlichen GPCR-Polypeptids identifiziert wird.
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