PT1287133E - Regulação do receptor acoplado à proteína g tipo dopamina humano - Google Patents

Description

ΡΕ1287133 1 DESCRIÇÃO "REGULAÇÃO DO RECEPTOR ACOPLADO À PROTEÍNA G TIPO DOPAMINA HUMANO"

CAMPO TÉCNICO DO INVENTO O invento está relacionado com a área dos receptores acoplados à proteína G. Mais particularmente, está relacionado com a área do receptor acoplado à proteína G do tipo dopamina humano e sua regulação.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Receptores acoplados à proteína G

Muitos processos biológicos medicamente importantes são mediados por vias de transdução de sinal que envolvem proteínas G (Lefkowitz, Nature 351, 353-354, 1991). A família dos receptores acoplados à proteína G (GPCR) incluem receptores de hormonas, neurotransmissores, factores de crescimento e vírus. Exemplos específicos de GPCRs incluem receptores de agentes tão diversos como calcitonina, hormonas adrenérgicas, endotelina, cAMP, ade-nosina, acetilcolina, serotonina, dopamina, histamina, trombina, cinina, hormona estimuladora dos folículos, opsinas, gene-1 da diferenciação endotelial, rodopsinas, 2 ΡΕ1287133 odores, citomegalovírus, as próprias proteínas G, proteínas efectoras tais como fosfolipase C, adenil ciclase e fosfodiesterase e proteínas accionadoras tais como proteína cinase A e proteína cinase C. A superfamília de proteínas GPCR possui agora cerca de 250 tipo de paralogos, receptores que representam variantes gerados por duplicações de genes (ou outros processos), em oposição a ortólogos, do mesmo receptor de diferentes espécies. A superfamília pode ser dividida em cinco famílias: Família I, receptores tipificados pela rodopsina e o receptor β-adrenérgico e actualmente repre- sentado por cerca de 200 membros únicos (revisto por Dohlman et al., Ann. Ver. Biochem. 60, 653 -88, 1991 e referências aí incluídas); Família II, a família de receptores da hormona paratiróide/calcitonina/secretina recentemente caracterizada (Juppner et al., Science 254, 1024-26, 1991; Lin et al., Science 254, 1022-24, 1991); Família III, a família de receptores de glutamato metabo-trópicos em mamíferos (Nakanishi, Science 258, 597-603, 1992); Família IV, a família de receptores do cAMP, importantes na quimiotaxia e desenvolvimento de D. discoideum (Klein et al., Science 241, 1467-72, 1988; e

Família V, os receptores da feromona de conjugação de fungos tais como STE2 (revisto por Kurjan, Ann. Rev. Biochem. 61, 1097-1129, 1992) . GPCRs possuem sete domínios conservados que atravessam a membrana, ligando pelo menos oito ansas hidro- 3 ΡΕ1287133 fílicas divergentes. GPCRs (também conhecidos como recep-tores 7TM) foram caracterizados como incluindo este sete segmentos hidrofóbicos conservados de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos, ligando pelo menos oito ansas hidrofílicas divergentes. A maio parte dos GPCRs possuem resíduos cisteína isolados conservados em cada uma das duas primeiras ansas extracelulares, os quais formam pontes dissulfureto que se pensa estabilizarem a estrutura da proteína funcional. As sete regiões transmembranares são designadas como TM1, TM2,TM3, TM4, TM5, TM6 e TM7. TM3 tem sido implicada na transdução de sinal. A fosforilação e a lipidação (palmitoilação ou farnesilação) de resíduos cisteína podem influenciar a transdução de sinal de alguns GPCRs. A maior parte dos GPCRs possui potenciais locais de fosforilação dentro da ansa citoplasmática e/ou extremo carboxilo. Para vários GPCRs, tais como o receptor β-adrenérgico, a fosforilação pela proteína cinase A e/ou cinases de receptores específicos medeia a dessensibilização dos receptores.

Para alguns receptores, pensa-se que os locais de ligação de ligandos de GPCRs compreendam cavidades hidrofílicos formados por vários domínios transmembranares GPCR. As cavidades hidrofílicas estão rodeadas por resíduos hidrofóbicos dos GPCRs. O lado hidrofílico de cada hélice transmembranar GPCR é postulada como estando virada para dentro e formando um local de ligação de ligandos polares. TM3 tem sido implicado em vários GPCRs como tendo um local 4 ΡΕ1287133 de ligação a ligandos, como seja o resíduo aspartato de TM3. As serinas de TM5, uma asparagina de TM6 e as f enilalaninas ou tirosinas de TM6 ou TM7 também estão implicadas na ligação de ligandos. GPCRs são acoplados dentro da célula, através de proteínas G heterodiméricas, a várias enzimas intracelulares, canais iónicos e transportadores (ver Johnson et al., Endoc. Ver. 10, 317-331, 1989). Diferentes subunidades alfa de proteínas G preferencialmente estimulam efectores particulares no sentido de modular várias funções biológicas numa célula. A fosforilação de resíduos citoplasmáticos de GPCRs é um mecanismo importante para a regulação de alguns GPCRs. Por exemplo, numa forma de transdução de sinal, o efeito da ligação da hormona é a activação dentro da célula da enzima adenilato ciclase. A activação de enzimas por hormonas está dependente da presença do nucleótido GTP. GTP também influencia a ligação de hormonas. Uma proteína G liga o receptor de hormonas a adenilato ciclase. A proteína G troca GDP ligado por GTP quando activada por um receptor de hormonas. A forma portadora de GTP liga-se então a adenilato ciclase. A hidrólise de GTP para GDP, catalisada pela própria proteína G, transforma a proteína G na sua forma basal inactiva. Assim, a proteína G tem um duplo papel, como um intermediário que transforma o sinal do receptor em efector e como um relógio que controla a duração do sinal. cerca de 350

Ao longo dos últimos 15 anos, 5 ΡΕ1287133 agentes terapêuticos tendo como alvo receptores GPCRs têm sido introduzidos no mercado com êxito. Isto indica que estes receptores possuem uma história demonstradamente estabelecida como alvos terapêuticos. Claramente, existe ainda a necessidade de identificação e caracterização de outros GPCRs que possam desempenhar um papel na prevenção, melhoria ou correcção de disfunções ou doenças incluindo mas não estando limitadas a infecções tais como infecções por bactérias, fungos, protozoários e virus, particularmente as causadas pelos virus HIV, dor, cancros, anorexia, bulimia, asma, doença de Parkinson, falência cardíaca aguda, hipotensão, hipertensão, retenção urinária, osteo-porose, angina pectoris, enfarte do miocárdio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna e alterações psicóticas e neurológicas, incluindo ansiedade, esquizofrenia, depressão maníaca, delírio, demência, vários atrasos mentais e discinésias, tais como doença de Huntington e síndroma de Tourett.

Dopamina e receptores de dopamina A dopamina é um neurotransmissor que participa numa variedade de funções diferentes mediadas pelo sistema nervoso, incluindo visão, movimento e comportamento (ver Patente U.S. 5883226 e Cooper et al., 1978, The Biochemical Basis of Neuropharmacology, 3d ed., Oxford University Press, New York, pp, 161-195). As diferentes acções fisiológicas da dopamina são por sua vez mediadas pela sua interacção com dois dos tipos básicos de receptores 6 ΡΕ1287133 acoplados a proteína G, Dl e D2, que respectivamente estimulam e inibem a enzima adenilil ciclase (Kebabian & Calne, 1979, Nature 277, 93-96). Alterações no número ou actividade destes receptores podem ser um factor que contribui para os estados de doença tais como doença de Parkinson (uma alteração do movimento) e esquizofrenia (uma alteração do comportamento).

Foi acumulada uma grande quantidade de informação sobre a bioquímica dos receptores da dopamina Dl e D2 e foram desenvolvidos métodos para solubilizar e purificar estes receptores proteicos (ver Senogles et al., 1986,

Biochemistry 25, 749-753; Sengoles et al., 1988, J. Blol. Chem. 263, 18996-19002; Gingrich et al., 1988, Biochemistry 27, 3907-3912). Em vários tecidos, o receptor da dopamina Dl parece ser uma proteína de membrana glicosilada com cerca de 72 KD (Amlaiky et al., 1987, Mol. Pharmacol. 31, 129-134; Ninik et al., 1988, Biochemistry 27, 7594-7599).

Foi sugerido que o receptor D2 possui um peso molecular de aproximadamente 90-150 KD (Amlaiky & Caron, 1985, J. Biol. Chem. 260, 1983-1986; Amlaiky & Caron, 1986, J. Neurochem. 47, 196-204; Jarvie et al., 1988, Mol. Pharmacol. 34, 91-97) . Sabe-se muito menos sobre um receptor de dopamina adicional recentemente descoberto, designado D3 (Sokoloff et al.,1990, Nature 347, 146-151).

Os receptores da dopamina são alvos importantes no tratamento de alterações psicomotoras tais como doença de Parkinson e perturbações afectivas tais como esqui- 7 ΡΕ1287133 zofrenia (Seeman et al., 1987, Neuropsychopharm. 1, 5-15; Seeman, 1987, Synapse 1, 152-333) . Os três receptores de dopamina diferentes (Dl, D2, D3) foram clonados como resultado da homologia de sequências que existe entre os genes destes receptores (Bunzow et ai., Nature 336, 783-787; Grandy et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 9762-9766; Dal Toso et al., 1989, EMBO J. 8, 4025-4034; Zhou et al., 1990, Nature 346, 76-80; Sunahara et al., 1990, Nature 346, 80-83; Sokoloff et al., 1990, Nature 347, 146-151). A clozapina antipsicótica é útil para esquizofrénicos socialmente afastados e resistentes ao tratamento (ver Kane et al., 1990, Nature 347, 146-151), mas ao contrário das outras drogas antipsicóticas, a clozapina não causa discinésia lenta (ver Casey, 1989, Psychopharmacology 99, 547-553). No entanto, a clozapina tem constantes de dissociação para D2 e D3 que são 3 a 30 vezes superiores à concentração terapêutica livre de clozapina no plasma (Ackenheil et al., 1976, Arzneim-Forsch 26, 1156-58; Sandoz Canada, Inc., 1990, Clorazil: Summary of preclinical and clinicai data). Isto sugere a existência de receptores de dopamina mais sensíveis à clozapina antipsicótica do que os até agora conhecidos.

Devido aos diversos efeitos biológicos da dopamina, existe a necessidade de identificar novos membros da família GCPR de dopamina cuja actividade possa ser regulada para proporcionar efeitos terapêuticos. ΡΕ1287133 WO 00 22131 descreve um GPCR órfão humano designado hRUP3 com a sua sequência de nucleótidos e amino-ácidos idêntica a SEQ ID NOS: 1 e 2.

SUMÁRIO DO INVENTO

Uma outra realização do invento é um método de rastreio de agentes úteis no tratamento da doença de Alzheimer. Um composto a testar é posto em contacto com um polipeptideo GPCR tipo dopamina compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em:

Sequências de aminoácidos que são pelo menos 90% idênticas à sequência de aminoácidos em SEQ ID NO:2; e a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:2.

Foi detectada uma actividade GPCR tipo dopamina no polipeptideo. Um composto a testar que diminui a actividade de GPCR tipo dopamina do polipeptideo relativamente à actividade GPCR tipo dopamina na ausência do composto a testar foi assim identificado como um potencial agente para o tratamento da doença de Alzheimer. O invento proporciona assim um receptor acoplado a proteína G tipo dopamina humano que pode ser usado para identificar compostos a testar que podem actuar como antagonistas no local do receptor e que são úteis no tratamento da doença de Alzheimer. O receptor acoplado a 9 ΡΕ1287133 proteína G tipo dopamina humano e seus fragmentos são igualmente úteis na indução de anticorpos que podem bloquear o receptor e eficazmente prevenir a ligação do ligando, e que são úteis no tratamento da doença de Alzheimer.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1 mostra a sequência de DNA codificadora de um polipeptídeo GPCR tipo dopamina.

Fig. 2 mostra a sequência de aminoácidos deduzida da sequência de DNA da Fig. 1.

Fig. 3 mostra a sequência de aminoácidos de uma proteína identificada com o N° de Acesso SwissProt P41596.

Fig. 4 mostra o alinhamento BLASTX do polipeptídeo GPCR tipo dopamina da Fig. 2 com o N° de Acesso SwissProt P41596 da Fig. 3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Foi descoberto pelo presente requerente que um GPCR tipo receptor de dopamina (GPCR tipo DA), particularmente um GPCR tipo receptor de dopamina humano, pode ser usado em métodos terapêuticos e em métodos de rastreio para identificação de antagonistas úteis para tratar alterações tais como doença de Alzheimer. GPCR tipo DA humano pode 10 ΡΕ1287133 também ser usado para testar antagonistas de GPCR tipo DA humano, úteis para o tratamento de doença de Alzheimer. GPCR tipo DA humano é 30% idêntico ao longo de 350 aminoácidos à proteína de D. melanogaster identificada com o N° de Acesso SwissProt P41596 e anotada como precursor do receptor de dopamina 1. Assim, espera-se que GPCR tipo DA humano seja útil para os mesmos fins dos receptores de dopamina anteriormente identificados. Por exemplo, GPCR tipo DA humano produzido a partir de genes clonados de acordo com o presente invento pode ser usado para o rastreio de compostos com actividade de GPCR tipo DA ou para a determinação da quantidade de um fármaco dopa-minérgico numa solução (e.g., plasma sanguíneo ou soro). AS células hospedeiras transformadas com vectores de expressão compreendendo polinucleótidos tipo DA humano podem ser usadas para o rastreio de compostos com actividade de ligação a GPCR tipo DA. Os ensaios de ligação competitivos em que tais procedimentos podem ser realizados são bem conhecidos, conforme ilustrado nos exemplos específicos abaixo. Através da selecção das células hospedeiras que normalmente não expressam um receptor de dopamina, podem ser obtidas preparações de receptores DlA, receptores D2 e outros subtipos de receptores de dopamina. Ainda, podem ser identificados agonistas e antagonistas de GPCR tipo DA humano através da transformação de células hospedeiras que expressam adenilil ciclase com vectores de expressão do presente invento. As membranas obtidas a partir de tais células podem ser usadas em estudos bioquímicos em que a 11 ΡΕ1287133 actividade de adenilil ciclase é controlada. Agonistas de GPCR tipo DA estimularão a adenilil ciclase. Tais células deverão ser capazes de associarem operacionalmente GPCR tipo DA com a adenilil ciclase, i.e., a proteína G deverá estar presente nas membranas celulares. Procedimentos para a realização de ensaios como estes estão igualmente descritos detalhadamente nos exemplos que se seguem. GPCRs tipo DA isolados e purificados do presente invento podem ser purificados a partir de membranas celulares ou de fracções de lisados celulares contendo o re-ceptor, como descrito abaixo, de acordo com procedimentos conhecidos, incluindo cromatografia em coluna (e.g., permuta iónica, filtração em gel, electroforese, cromatografia de afinidade, etc.), facultativamente seguido de cristalização (Ver genericamente "Enzyme Purification and Related Techniques, "Methods in Enzymology 22, 233-577, 1977).

Polipeptídeos

Os polipeptídeos GPCR tipo DA compreendem pelo menos 20, 30, 40 50, 53, 78, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 ou 350 aminoácidos contíguos, seleccionados da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO.2 ou uma sua variante biologicamente activa, como definido abaixo. Um polipeptídeo GPCR tipo DA pode, portanto, ser uma porção de uma proteína GPCR tipo da, uma proteína GPCR tipo DA de tamanho completo ou uma proteína de fusão compreendendo a totalidade ou uma porção de uma proteína GPCR tipo DA. Uma 12 ΡΕ1287133 sequência codificadora para SEQ ID NO:2 está apresentada em SEQ ID NO:1.

Variantes biologicamente activas

Variantes do polipeptideo GPCR tipo DA que são biologicamente activas, i.e., retêm a capacidade de se ligar a uma dopamina ou a um ligando tipo dopamina para produzir um efeito biológico, como seja a formação de AMP cíclico, mobilização de cálcio intracelular ou metabolismo de fosfoinositido, são também polipeptídeos GPCR tipo da. De preferência, variantes do polipeptideo GPCR tipo DA naturais ou não naturais possuem sequências de aminoácidos que são pelo menos 90% idênticas à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO.2. A percentagem de identidade entre uma variante putativa do polipeptideo GPCR tipo DA e uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.2 é determinada usando o programa de alinhamento Blast2 (Blosum62, Expect 10, códigos genéticos convencionais).

As variações da percentagem de identidade podem ser devidas, por exemplo, a substituições de aminoácidos, inserções ou deleções. As substituições de aminoácidos são definidas como substituições de um aminoácido por outro. São de natureza conservada quando o aminoácido substituído tem propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes. Exemplos de substituições conservadas são substituição de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato ou uma treonina com uma serina. 13 ΡΕ1287133

Inserções ou deleções de aminoácidos são alterações de ou dentro de uma sequência de aminoácidos. Tipicamente caem dentro da gama de 1 a 5 aminoácidos. A orientação na determinação dos residuos de aminoácidos que podem ser substituídos, inseridos ou eliminados sem abolir a actividade biológica ou imunológica de um polipeptídeo GPCR tipo DA pode ser encontrada usando programas de computador bem conhecidos na área, como seja o programa DNASTAR. Se a alteração de um aminoácido resulta num polipeptídeo GPCR tipo DA biologicamente activo pode ser facilmente determinado testando a ligação a um ligando ou através da realização de um ensaio funcional, como descrito por exemplo, nos Exemplos específicos abaixo.

Proteínas de fusão

As proteínas de fusão são úteis para a geração de anticorpos contra as sequências de aminoácidos do polipeptídeo GPCR tipo DA e para usar em vários sistemas de ensaio. Por exemplo, as proteínas de fusão podem ser usadas para identificar proteínas que interagem com porções de um polipeptídeo GPCR tipo DA. A cromatografia de afinidade ou ensaios baseados em bibliotecas para as interacções proteína-proteína, tais como os sistemas de duplo híbrido de levedura ou de apresentação fágica, podem ser usados para este fim. Tais métodos são bem conhecidos na área e podem também ser usados como rastreio de fármacos. 14 ΡΕ1287133

Uma proteína de fusão polipeptídeo GPCR tipo DA compreende dois segmentos polipeptídicos fundidos um com o outro por meio de uma ligação peptídica. 0 primeiro segmento polipeptídico compreende pelo menos 20, 30, 40, 50, 53, 78, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 ou 350 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO.2 ou de uma sua variante biologicamente activa, como sejam as descritas atrás. O primeiro segmento polipeptídico pode também compreender proteína GPCR tipo DA de tamanho completo. O segundo segmento polipeptídico pode ser uma proteína de tamanho completo ou um fragmento proteico. As proteínas normalmente usadas na construção de proteínas de fusão incluem β-galactosidase, β-glucuronidase, proteína fluorescente verde (GFP), proteínas autofluorescentes, incluindo proteína fluorescente azul (BFP), glutationa-S-transferase (GST), luciferase, peroxidase de rábano silvestre (HRP) e cloranfenicol acetiltransferase (CAT). Ainda, são usadas marcas de epitopos nas construções de proteínas de fusão, incluindo caudas de histidina (His), marcas FLAG, marcas de hemaglutinina da gripe (HA), marcas Myc, marcas VSV-G e marcas de tio-redoxina (Trx). Outras construções de fusão podem incluir proteína de ligação a maltose (MBP), cauda S, fusões do domínio de ligação a DNA (DBD) de Lex a, fusões do domínio de ligação a DNA de GAL4 e fusões da proteína BP16 do vírus herpes simples (HSV). Uma proteína de fusão pode também ser manipulada de forma a conter um local de clivagem situado entre a sequência codificadora do polipeptídeo GPCR tipo DA e a sequência da proteína heteróloga, de forma a que o polipeptídeo GPCR tipo DA possa ser clivado e purificado com remoção da parte heteróloga. 15 ΡΕ1287133

Uma proteína de fusão pode ser sintetizada quimicamente, como é conhecido na área. De preferência, uma proteína de fusão é produzida através da ligação covalente de dois segmentos polipeptídicos ou através de processos convencionais da área da biologia molecular. Os métodos de DNA recombinante podem ser usados para preparar proteínas de fusão, por exemplo, através de preparação de uma construção de DNA que compreende sequências codificadoras seleccionadas a partir de SEQ ID N0:1 na grelha de leitura correcta com nucleótidos codificadores do segundo segmento polipeptídico e expressão da construção de DNA numa célula hospedeira, como é conhecido na área. Existem muitos kits para a construção de proteínas de fusão que podem ser adquiridos a empresas tais como Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation(MIC; Watertown, MA) e Quantum Biotechnologies (Montreal, Canada; 1-888-DNA-KITS).

Identificação de homólogos de espécies

Homólogos de espécies do polipeptídeo GPCR tipo DA humano podem ser obtidos usando polinucleótidos do polipeptídeo GPCR tipo DA (descrito abaixo) para preparar sondas ou sequências iniciadoras adequadas para o rastreio de bibliotecas de expressão de cDNA derivadas de outras espécies, tais como ratinho, macacos ou leveduras, identificação de cDNAs que codificam homólogos do polipeptídeo 16 ΡΕ1287133 GPCR tipo DA e expressão de cDNAs como é do conhecimento na área.

Identificação de variantes e homólogos polinu-cleotídicos

Variantes e homólogos dos polinucleótidos DA-GPCR atrás descritos são também polinucleotídeos GPCR tipo DA. Tipicamente, as sequências polinucleotidicas GPCR tipo DA homólogas podem ser identificadas por hibridação de polinucleótidos candidatos com polinucleótidos GPCR tipo DA em condições restringentes, como é conhecido na área. Por exemplo, usando as condições de lavagem que se seguem - 2X SSC (NaCl 0,3M, citrato de sódio 0,03M, pH 7,0), 0,1% SDS, temperatura ambiente duas vezes, 30 minutos cada; depois 2X SSC, 0,1% SDS, 50°C uma vez, 30 minutos; seguido de 2X SSC, temperatura ambiente duas vezes, 10 minutos cada - podem ser identificadas sequências homólogas contendo no máximo 15-25% de desemparelhamentos de pares de bases, mesmo mais de preferência 5-15% de desemparelhamentos de pares de bases.

Espécies homólogas de polinucleótidos GPCR tipo DA aqui descritos podem também ser identificados preparando sondas ou sequências iniciadoras adequadas e fazendo o rastreio de bibliotecas de expressão de cDNA de outras espécies, tais como ratinho, macacos ou leveduras. Variantes humanas de polinucleótidos GPCR tipo DA podem ser identificados, por exemplo, através do rastreio de biblio- 17 ΡΕ1287133 tecas de expressão de cDNA humano. É bem conhecido que a Tm de um DNA de cadeia dupla diminui em 1-1,5 °C com cada decréscimo de 1% na homologia (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973). As variantes de polinucleótidos GPCR tipo DA humano ou polinucleótidos DA-GPCR de outras espécies podem portanto ser identificadas por hibridação de um polinucleótido GPCR tipo DA homólogo putativo com um polinucleótido tendo uma sequência nucleotidica de SEQ id N0.1 ou o seu complemento para formar um hibrido com interesse. A temperatura de fusão do hibrido com interesse é comparada com a temperatura de fusão de um hibrido compreendendo polinucleótidos tendo sequências nucleotí-dicas perfeitamente complementares e calculado o número ou percentagem de desemparelhamentos de pares de bases dentro do hibrido com interesse.

As sequências nucleotidicas que hibridam com polinucleótidos GPCR tipo DA ou seus complementos após condições restringentes de hibridação e/ou lavagem são também polinucleótidos GPCR tipo DA. As condições de lavagem restringentes são bem conhecidas e compreendidas na área e estão descritas, por exemplo, em Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d., 1989, nas páginas 9.50-9.51.

Tipicamente, para condições de hibridação restringentes deverá ser escolhida uma combinação de temperatura e concentração salina que é aproximadamente 12-20°C abaixo da Tm calculada do hibrido em estudo. A Tm de um 18 ΡΕ1287133 híbrido entre um polinucleótido GPCR tipo DA tendo uma sequência nucleotídica mostrada em SEQ ID N0.1 ou o seu complemento e uma sequência polinucleotídica que é pelo menos cerca de 50, de preferência cerca de 75, 90, 96 ou 98% idêntica a uma das sequências nucleotídicas pode ser calculada, por exemplo, usando a equação de Bolton e McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 48, 1390 (1962):

Tm=81,5°C-16,6(logio [Na+])+0, 41(%G+C)-0,63(%formamida)-600/1), em que 1 = o comprimento do híbrido em pares de bases.

Condições de lavagem restringentes incluem, por exemplo, 4X SSC a 65°C, ou 50% formamida, 4X SSC a 42°C ou 0,5XSSC, 0,1% SDS a 65°C. Condições de lavagem altamente restringentes incluem, por exemplo, 0,2X SSC a 65°C.

Preparação de polinucleótidos

Um polinucleótido GPCR tipo DA natural pode ser isolado sem outros componentes celulares, tais como componentes de membranas, proteínas e lípidos. Os polinucleótidos podem ser produzidos por uma célula e isolados usando técnicas convencionais de purificação de ácidos nucleicos ou sintetizados usando uma técnica de amplificação, como seja a reacção em cadeia com polimerase (PCR) ou usando um sintetizador automático. Métodos para isolamento de polinucleótidos são de rotina e são bem conhecidos na área. Qualquer uma dessas técnicas para obtenção de um polinucleótido pode ser usada para obter polinucleótidos 19 ΡΕ1287133 GPCR tipo DA isolados. Por exemplo, as enzimas de restrição e sondas podem ser usadas para isolar fragmentos polinucleotidicos que compreendem sequências nucleotidicas GPCR tipo DA. Os polinucleótidos usados existem em preparações que não possuem ou estão 70, 80 ou 90% isentos de outras moléculas.

Moléculas de cDNA de GPCR tipo DA podem ser preparadas segundo técnicas convencionais de biologia molecular usando mRNA de GPCR tipo DA como matriz. As moléculas de cDNA de GPCR tipo da podem assim ser replicadas usando técnicas de biologia molecular conhecidas e descritas em manuais tais como Sambrook et al. (1989). Uma técnica de amplificação, como seja PCR, pode ser usada para se obter cópias adicionais de polinucleótidos do invento, usando DNA ou cDNA genómico humano como molde.

Como alternativa, técnicas de síntese química podem ser usadas para sintetizar polinucleótidos DA-GPCR. A degenerescência do código genético permite que sejam sintetizadas sequências nucleotidicas alternativas as quais codificarão um polipeptídeo GPCR tipo DA tendo, por exemplo, uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO.2 ou uma sua variante biologicamente activa.

Extensão de polinucleótidos

Podem ser usados vários métodos baseados em PCR para prolongar as sequências de ácido nucleico a montante 20 ΡΕ1287133 tais como promotores e elementos reguladores. Por exemplo, PCR com locais de restrição utiliza sequências iniciadoras para recuperar uma sequência desconhecida adjacente de um locus conhecido (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318-322, 1993). O DNA genómico é primeiro amplificado na presença de uma sequência iniciadora para uma sequência adaptadora e de uma sequência iniciadora especifica da região conhecida. As sequências amplificadas são então sujeitas a uma segunda reacção de PCR com a mesma sequência iniciadora do adaptador e uma outra sequência iniciadora especifica interna relativamente à primeira. Os produtos de cada uma das reacções de PCR são transcritos com uma RNA polimerase adequada e sequenciados usando transcriptase reversa. PCR inverso pode também ser usado para amplificar ou prolongar sequências usando sequências iniciadoras divergentes baseado numa região conhecida (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 8186, 1988). Podem ser projectadas sequências iniciadoras usando programas comerciais, tais como OLIGO 4.06 Primer Analysis (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), para terem 22-30 nucleótidos de comprimento, para possuírem um teor GC de 50% ou mais e para emparelhar com a sequência alvo a temperaturas de aproximadamente 68-72°C. O método utiliza várias enzimas de restrição para gerar um fragmento adequado na região conhecida de um gene. O fragmento é então circularizado por ligação intramolecular e usado como um molde de PCR.

Um outro método que pode ser usado em PCR de 21 ΡΕ1287133 captura, que envolve a amplificação por PCR de fragmentos de DNA adjacentes a uma sequência conhecida em DNA cromossómico artificial humano e de levedura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1, 111-119, 1991). Neste método, múltiplas digestões com enzimas de restrição e ligações podem também ser usadas para colocar uma sequência de cadeia dupla manipulada num fragmento desconhecido da molécula de DNA antes da realização de PCR.

Um outro método que pode ser usado para recuperar sequências desconhecidas é o de Parker et al., Nucleic Acids Res. 19, 3055-3060, 1991). Ainda, PCR, sequências iniciadoras externas e internas e bibliotecas PROMO-TERFINDER (CLONTECH, Paio Alto, Calif.) podem ser usadas para andar ao longo de DNA genómico (CLONTECH, Paio Alto, Calif.). Este processo evita a necessidade de testar bibliotecas e é útil para encontrar junções de intrão/exão.

Quando da pesquisa de cDNA de tamanho completo, é preferível usar bibliotecas que foram seleccionadas de acordo com o tamanho, de forma a incluir cDNAs maiores. São preferidas as bibliotecas iniciadas ao acaso, por conterem mais sequências 5' dos genes. A utilização de uma biblioteca iniciada ao acaso pode ser especialmente preferida para situações em que uma biblioteca de oligo d(T) não dá um cDNA de tamanho completo. As bibliotecas genómicas podem ser úteis para a extensão da sequência para as regiões reguladoras 5' não transcritas. 22 ΡΕ1287133

Podem ser usados sistemas comerciais de electro-forese capilar para analisar o tamanho ou confirmar a sequência de nucleótidos dos produtos de PCR ou sequen-ciação. Por exemplo, a sequenciação capilar pode empregar polímeros fluíveis para a separação electroforética, quatro corantes fluorescentes diferentes (um para cada nucleótido) que são activados com laser e detecção dos comprimentos de onda emitidos por uma câmara com um dispositivo de carga acoplado. A intensidade de saída/luz pode ser convertida em sinal eléctrico usando programas adequados (e.g. GENOTYPER e Sequence navigator, Perkin Elmer) e a totalidade do processo desde a aplicação das amostras até à análise computacional e apresentação dos dados electrónicos pode ser controlado por computador. A electroforese capilar é especialmente preferida para a sequenciação de pequenos fragmentos de DNA que deverão estar presentes em quantidades limitadas numa amostra particular.

Obtenção de polipeptídeos

Polipeptídeos GPCR tipo DA podem ser obtidos, por exemplo, através da purificação a partir de células humanas, pela expressão de polinucleótidos GPCR tipo DA ou por síntese química directa.

Purificação de proteínas

Polipeptídeos GPCR tipo DA podem ser purificados a partir de qualquer célula humana que expresse o receptor, 23 ΡΕ1287133 incluindo células hospedeiras que tenham sido transfectadas com polinucleótidos GPCR tipo DA. Melanócitos, coração fetal e útero são fontes particularmente úteis de poli-peptideos GPCR tipo DA. 0 polipeptídeo GPCR tipo DA purificado é separado de outros compostos que normalmente se associam ao polipeptídeo GPCR tipo DA, como sejam certas proteínas, açúcares ou lípidos, usando métodos bem conhecidos na área. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a cromatografia de exclusão por tamanho, fraccionamento com sulfato de amónio, cromatografia de permuta iónica, cromatograf ia de afinidade e electroforese em gel preparativa. 0 polipeptídeo GPCR tipo DA pode ser convenientemente isolado como um complexo com a sua proteína G associada, como descrito nos exemplos específicos abaixo. Uma preparação de polipeptídeos GPCR tipo DA purificados é pelo menos 80% pura; de preferência, as preparações são 90%, 95% ou 99% puras. A pureza das preparações pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na área, como seja electroforese em gel de SDS-poliacrilamida.

Expressão de polinucleótidos

Para expressar um polinucleótido GPCR tipo DA, o polinucleótido pode ser inserido num vector de expressão que contem os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência codificadora inserida. Métodos que são conhecidos dos familiarizados com a matéria podem ser usados para construir vectores de expressão contendo 24 ΡΕ1287133 sequências codificadoras de polipeptideos GPCR tipo DA e elementos de controlo da transcrição e tradução adequados. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas de síntese e recombinação qenética in vivo. Tais técnicas estão descritas, por exemplo, em Sambrook et al.f (1989) e em Ausubel et al.f CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons. New York, N.Y., 1989.

Uma variedade de sistemas de vector/hospedeiro de expressão pode ser utilizada de forma a conter e expressar sequências codificadoras de um polipeptídeo GPCR tipo DA. Estes incluem, mas não estão limitados a microrganismos tais como bactérias transformadas com vectores de expressão de DNA de bacteriófago, plasmídeo ou cosmídeo recombinante; a levedura transformada com vectores de expressão de levedura, sistemas de células de insecto infectadas com vectores de expressão virais (e.g., baculovírus), sistemas de células vegetais transformadas com vectores de expressão virais (e.g., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou com vectores de expressão bacterianos (e.g., plasmídeos Ti ou pBR322) ou sistemas de células animais.

Os elementos de controlo ou sequências reguladoras são as regiões não traduzidas do vector - poten-ciadores, promotores, regiões 5' e 3' não traduzidas - que interagem com proteínas da célula hospedeira para efectuar a transcrição e tradução. Tais elementos podem variar na sua força e especificidade. Dependendo do sistema vector e 25 ΡΕ1287133 hospedeiro utilizado, pode ser usado qualquer número de elementos de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzidos. Por exemplo, quando da clonagem em sistemas bacterianos, podem ser usados os promotores induzidos tais como o promotor híbrido lacZ do fagemideo BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) ou do plasmideo pSPORTl (Life Technologies) e similares. 0 promotor da poliedrina de baculovirus pode ser usado em células de insecto. Promotores e potenciadores derivados dos genomas de células vegetais (e.g., genes de choque térmico, RUBISCO e genes de proteinas de reserva) ou de virus de plantas (e.g., promotores virais ou sequências lider) podem ser clonados no vector. Em sistemas de células de mamifero, são preferidos os promotores dos genes de mamifero ou de virus de mamíferos. Caso seja necessário gerar uma linha celular que contenha múltiplas cópias de uma sequência nucleotídica codificadora de um polipeptídeo GPCR tipo da, vectores baseados em SV40 ou ebv podem ser usados com uma marca seleccionável adequada.

Sistemas de expressão bacterianos e de levedura

Em sistemas bacterianos, pode ser seleccionada uma série de vectores de expressão dependendo da utilização pretendida para o polipeptídeo GPCR tipo DA. Por exemplo, quando é necessário uma grande quantidade de polipeptídeo GPCR tipo DA para a indução de anticorpos, podem ser usados vectores que dirigem um nível de expressão elevado mas não estão limitados a vectores de clonagem e expressão 26 ΡΕ1287133 multifuncionais de E. coli, tais como BLUESCRIPT (Stra-tagene) . Num vector BLUESCRIPT, uma sequência codificadora do polipeptídeo GPCR tipo DA pode ser ligada ao vector na mesma grelha de leitura das sequências da Met amino-terminal e dos 7 resíduos subsequentes da β-galactosidase de forma a ser produzida a proteína híbrida. Os vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509, 1989) ou pGEX (Promega, Madison, Wis.) podem ser igualmente usados para expressarem polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). De um modo geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas, a partir de células lisadas, por adsorção a esferas de glutationa-agarose seguido de eluição na presença de glutationa livre. As proteínas produzidas em tais sistemas podem ser projectadas para incluírem locais de clivagem por heparina, trombina ou factor Xa, de forma a que o polipeptídeo clonado com interesse possa ser libertado da parte de GST, caso se pretenda.

Na levedura Saccharomyces cerevisiae, pode ser usada uma série de vectores contendo promotores constitutivos ou induzidos tais como o factor alfa, álcool oxidase e PGH. Para revisões, ver Ausubel et al. (1989) e Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516-544, 1987.

Sistemas de expressão de plantas e de insectos

Caso sejam usados vectores de expressão de plantas, a expressão de sequências codificadoras dos 27 ΡΕ1287133 polipeptídeos GPCR tipo DA pode ser dirigida por uma série de promotores. Por exemplo, os promotores virais tais como os promotores 35S e 19S de CaMV podem ser usados sozinhos ou em combinação com a sequência lider ómega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311, 1987) . Como alternativa, podem ser usados promotores de plantas tais como os promotores da subunidade pequena de RUBISCO ou de choque térmico (Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671-1680, 1984; Broglie et al., Science 224, 838-843, 1984; Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991). Estas construções podem ser introduzidas nas células vegetais por transformação directa de DNA ou por transfecção mediada por um agente patogénico. Tais técnicas estão descritas numa série de revisões disponíveis (e.g., Hobbs ou Murray, in MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., pp. 191-196, 1992).

Um sistema de insectos pode também ser usado para expressar um polipeptideo GPCR tipo DA. Por exemplo, num desses sistemas o virus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é usado como vector para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. Sequências codificadoras de polipeptídeos GPCR tipo DA podem ser clonados numa região não essencial do virus, como seja o gene da poliedrina e colocadas sob o controlo do promotor da poliedrina. A inserção com êxito de polipeptídeos GPCR tipo DA tornará inactivo o gene da poliedrina e produzirá vírus recom-binante sem a proteína da cápside. Os vírus recombinantes 28 ΡΕ1287133 pode ser então usados para infectar células de S. fru-giperda ou de larvas de Trichoplusia em que os polipeptí-deos GPCR tipo DA podem ser expressos (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 91, 3224-3227, 1994).

Sistemas de expressão de mamíferos

Uma série de sistemas de expressão baseados em virus pode ser usada para expressar polipeptideos GPCR tipo DA em células hospedeiras de mamifero. Por exemplo, se se usar um adenovirus como vector de expressão, sequências codificadoras dos polipeptideos GPCR tipo DA podem ser ligadas a um complexo de transcrição/tradução de adenovirus compreendendo o promotor tardio e a sequência lider tripartida. A inserção numa região não essencial El ou E3 do genoma virai pode ser usada para se obter um virus viável que é capaz de expressar um polipeptideo GPCR tipo DA nas células hospedeiras infectadas (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. 81, 3655-3659, 1984). Caso se pretenda, os potenciadores da transcrição, tais como o potenciador do virus do sarcoma de Rous (RSV), podem ser usados para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamifero.

Os cromossomas artificiais humanos (HACs) podem também ser usados para introduzir fragmentos de DNA maiores que podem ser combinados e expressos num plasmideo. HACs de 6M a 10M são construídos e introduzidos nas células através de métodos de introdução convencionais (e.g., lipossomas, polímeros policatiónicos amino ou vesículas). 29 ΡΕ1287133

Podem ser igualmente usados sinais de iniciação específicos para se conseguir tradução mais eficiente das sequências codificadoras dos polipeptideos GPCR tipo DA. Tais sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Nos casos em que as sequências codificadoras de um polipeptideo GPCR tipo DA, o seu codão de iniciação e sequências a montante são inseridas no vector de expressão adequado, pode não ser necessário sinais de controlo da transcrição ou tradução adicionais. No entanto, nos casos em que apenas a sequência codificadora ou um seu fragmento, é inserido, deverão ser fornecidos sinais de controlo da tradução exógenos (incluindo o codão de iniciação ATG). 0 codão de iniciação deverá estar na grelha de leitura correcta para assegurar a tradução da totalidade do inserto. Os elementos da tradução exógenos e os codões de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais como sintéticos. A eficiência da expressão pode ser aumentada através da inclusão de potenciadores que são adequados ao sistema celular particular que é usado (ver Scharf et ai., Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162, 1994). Células hospedeiras

Uma estirpe de célula hospedeira pode ser escolhida pela sua capacidade para modular a expressão das sequências inseridas ou para processar o polipeptideo GPCR tipo DA expresso na forma pretendida. Tais modificações do polipeptideo incluem, mas não estão limitadas a acetilação, 30 ΡΕ1287133 carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. O processamento pós-tradução que corta a forma "prepro" do polipeptídeo pode também ser usado para facilitar a inserção, enrolamento e/ou função correctas. Diferentes células hospedeiras que possuem maquinaria celular especifica e mecanismos característicos para as actividades pós-tradução (e.g., CHO, HeLa, MDCK, HEK293; e WI38) estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) e podem ser escolhidos para assegurar a modificação e processamento correctos da proteína estranha. A expressão estável é preferida para a produção a longo prazo com elevado rendimento das proteínas recombi-nantes. Por exemplo, as linhas celulares que expressam estavelmente polipeptídeos GPCR tipo DA podem ser transformadas usando vectores de expressão que podem conter origens de replicação e/ou elementos de expressão virais e um gene de marca seleccionável no mesmo vector ou num vector separado. Após a introdução do vector, as células podem ser deixadas a crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido antes de serem mudadas para um meio selectivo. A finalidade da marca seleccionável é conferir resistência à selecção e a sua presença permite crescimento e recuperação das células que com êxito expressam as sequências GPCR tipo DA introduzidas. Os clones resistentes das células estavelmente transformadas podem ser proliferados usando técnicas de cultura de tecidos adequadas ao tipo celular, ver, por exemplo, animal CELL CULTURE, R.l. Freshney, ed., 1986. 31 ΡΕ1287133

Pode ser usado qualquer um de vários sistemas de selecção para recuperar as linhas celulares transformadas.

Estes incluem, mas não estão limitados aos genes da timidina cinase do vírus herpes simples (Wigler et ai., Cell 11, 223-32, 1977) e adenina fosfo-ribosiltransferase (Lowy et al., Cell 22, 817-23, 1980) que podem ser empregues em células tk~ ou aprt~, respectivamente. Igualmente, pode ser usado como base de selecção resistência a antimetabolitos, antibióticos ou herbicidas. Por exemplo, dhfr confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 77, 3567-70, 1980), npt confere resistência aos aminoglicósidos, neomicina e G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1-14, 1981) e ais e pat conferem resistência a clorsulfurona e fosfi-notricina acetiltransferase, respectivamente (Murray, 1992, supra). Foram descritos genes seleccionáveis adicionais. Por exemplo, trpB permite que as células utilizem índole em vez de triptofano ou hisD que permite às células usem histinol em lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei. 85, 8047-51, 1988). Marcas visíveis tais como antocianinas, β-glucuronidase e o seu substrato GUS e luciferase e o seu substrato luciferina, podem ser usados para identificar transformantes e para quantificar a quantidade de expressão proteica transitória ou estável atribuível a um sistema vector específico (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995). 32 ΡΕ1287133

Detecção da expressão

Se bem que a presença da expressão da marca genética sugira que o polinucleótido GPCR tipo DA também esteja presente, a sua presença e expressão devem ser confirmadas. Por exemplo, se uma sequência codificadora de um polipeptideo GPCR tipo DA for inserida numa sequência do gene de uma marca, as células transformadas contendo as sequências que codificam um polipeptideo GPCR tipo DA podem ser identificadas pela ausência de função da marca. Como alternativa, o gene de uma marca pode ser colocado em tandem com uma sequência codificadora de um polipeptideo GPCR tipo DA sob o controlo de um único promotor. A expressão do gene da marca como resposta à indução ou selecção geralmente indica expressão do polinucleótido GPCR tipo DA.

Como alternativa, as células hospedeiras que possuem um polinucleótido GPCR tipo DA e que expressam um polipeptideo GPCR tipo DA podem também ser identificadas por uma variedade de procedimentos conhecidos dos familiarizados com a matéria. Estes procedimentos incluem, mas não estão limitados a hibridações de DNA-DNA ou DNA-RNA e técnicas de bioensaio ou imunoensaio proteico que incluem tecnologias baseadas em membranas, solução ou microplacas ("chips") para a detecção e/ou quantificação de ácido nucleico ou proteina. Por exemplo, a presença de uma sequência polinucleotidica codificadora de um polipeptideo GPCR tipo DA pode ser detectada por hibridação de DNA-DNA 33 ΡΕ1287133 ou DNA-RNA ou amplificação usando sondas ou fragmentos ou fragmentos de polinucleótidos codificadores de um polipeptideo GPCR tipo DA. Os ensaios baseados na amplificação de ácido nucleico envolvem a utilização de oligonucleótidos seleccionados a partir de sequências codificadoras de um polipeptideo GPCR tipo DA para detectar transformantes que possuem um polinucleótido GPCR tipo DA.

Uma variedade de protocolos para a detecção e medição da expressão de um polipeptideo tipo DA, usando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos do polipeptideo, são conhecidos na área. Exemplos incluem ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radio-imunoensaio (RIA) e separação de células activada por fluorescência (FACS) . Pode ser usado um imunoensaio de duplo local baseado em monoclonais usando anticorpos monoclonais reactivos com dois epitopos não interferentes num polipeptideo GPCR tipo DA ou um ensaio de ligação competitivo. Estes e outros ensaios estão descritos em Hampton et ãl.r SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn., 1990) e Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1216, 1983).

Uma larga variedade de marcas e técnicas de conjugação são conhecidas dos familiarizados com a matéria e podem ser usadas em vários ensaios de ácidos nucleicos e aminoácidos. Meios para a produção de sondas de hibridação ou de PCR marcadas, para a detecção de sequências relacionadas com polinucleótidos codificadores de polipe- 34 ΡΕ1287133 ptídeos GPCR tipo DA, incluem oligomarcação, translação de corte ("nick-translation") ou amplificação por PCR usando um nucleótido marcado. Como alternativa, sequências codificadoras de um polipeptideo GPCR tipo DA podem ser clonadas num vector para a produção de uma sonda de mRNA. Tais vectores são conhecidos na área, podem ser comprados e podem ser usados para sintetizar sondas de RNA in vitro através da adição de nucleótidos marcados e uma RNA polimerase adequada como seja T7, T3 ou SP6. Estes procedimentos podem ser efectuados usando uma variedade de kits comerciais (Amersham Pharmacia Biotech, Promega e US Biochemical).

Moléculas repórter ou marcas adequadas que podem ser usadas para facilitar a detecção incluem radionuclidos, enzimas e agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogénicos, assim como substratos, cofactores, inibi-dores, partículas magnéticas e similares.

Expressão e purificação de polipeptídeos Células hospedeiras transformadas com sequências nucleotídicas codificadoras de um polipeptideo GPCR tipo DA podem ser cultivadas em condições adequadas à expressão e recuperação da proteína a partir da cultura de células. 0 polipeptideo produzido por uma célula transformada pode ser secretado ou mantido dentro da célula, dependendo da sequência e/ou vector usado. Conforme será entendido pelos familiarizados com a área, vectores de expressão contendo 35 ΡΕ1287133 polinucleótidos que codificam polipeptideos GPCR tipo DA podem ser projectados de forma a conterem sequências sinal que dirigem a secreção de polipeptideos GPCR tipo DA solúveis através de uma membrana de célula procariótica ou eucariótica ou que dirigem a inserção na membrana do polipeptideo GPCR tipo DA.

Conforme discutido atrás, outras construções podem ser usadas para ligar uma sequência codificadora de um polipeptideo GPCR tipo DA a uma sequência nucleotídica codificadora de um domínio polipeptídico que facilitará a purificação de proteínas solúveis. Tais domínios facili-tadores da purificação incluem, mas não estão limitados a peptídeos quelatores de metais, tais como módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação em imunoglobulina imobilizada e o domínio utilizado no sistema FLAGS de extensão/purificação por afinidade (Immunex Corp., Seattle, Wash.). A inclusão de sequências adaptadoras cliváveis tais como as específicas do Factor Xa ou enterocinase (Invitrogen, San Diego, CA) entre o domínio de purificação e o polipeptideo GPCR tipo DA pode também ser usado para facilitar a purificação. Um desses vectores de expressão proporciona a expressão de uma proteína de fusão contendo um polipeptideo GPCR tipo DA e 6 resíduos de histidina precedendo um local de corte por tio-redoxina ou enterocinase. Os resíduos de histidina facilitam a purificação por IMAC (cromatografia de afinidade com iões metálicos imobilizados, como descrito em Porath et 36 ΡΕ1287133 al., Prot. Exp. Purifi. 3, 263-281, 1992), enquanto que o local de clivagem por enterocinase proporciona um meio de purificação do polipeptideo GPCR tipo DA. Os vectores que contêm proteínas de fusão estão descritos em Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441-453, 1993. Síntese química

Sequências codificadoras de um polipeptideo GPCR tipo DA podem ser sintetizadas, na totalidade ou em parte, usando métodos químicos bem conhecidos na área (ver Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980). Como alternativa, um polipeptideo GPCR tipo DA pode ser produzido usando métodos químicos para sintetizar a sua sequência de aminoácidos, como seja por síntese directa de peptídeos usando técnicas de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge et al., Science 269, 202-204, 1995). A síntese proteica pode ser realizada usando técnicas manuais ou automáticas. A síntese automática pode ser conseguida, por exemplo, usando um sintetizador de peptídeos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Facultativamente, fragmentos de polipeptídeos GPCR tipo DA podem ser sintetizados separadamente e combinados usando métodos químicos para produzir uma molécula de tamanho completo. O novo peptídeo sintetizado pode ser substancialmente purificado por cromatografia líquida de alta 37 ΡΕ1287133 resolução preparativa {e.g., Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983). A composição de um polipeptideo GPCR tipo DA sintético pode ser confirmada por análise de aminoácidos ou sequenciação (e.g., o processo de degradação de Edman; ver Creighton, supra). Ainda, qualquer porção da sequência de aminoácidos do polipeptideo GPCR tipo DA pode ser alterada durante a síntese directa e/ou combinada usando métodos químicos com sequências de outras proteínas para produzir um polipeptideo variante ou uma proteína de fusão.

Produção de polipeptídeos alterados

Como será compreendido pelos familiarizados com a matéria, poderá ser vantajoso produzir sequências nucleo-tídicas codificadoras de polipeptideo GPCR tipo DA possuindo codões não naturais. Por exemplo, codões preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico particular podem ser seleccionados para aumentar a taxa de expressão proteica ou para produzir um transcrito de RNA tendo as propriedades pretendidas, como seja uma semi-vida que é superior à do transcrito gerado a partir da sequência natural.

As sequências nucleotidicas aqui descritas podem ser manipuladas usando métodos conhecidos para alterar as sequências codificadoras do polipeptideo GPCR tipo DA devido a uma variedade de razões, incluindo mas não estando 38 ΡΕ1287133 limitado a alterações que modificam a clonagem, processamento e/ou expressão do polipeptídeo ou produto de mRNA. "DNA shuffling", por fragmentação ao acaso e PCR seguido de montagem por PCR dos fragmentos de gene e de oligonu-cleótidos sintéticos, pode ser usado para manipular as sequências nucleotidicas. Por exemplo, a mutagénese dirigida pode ser usada para inserir novos locais de restrição, alterar os padrões de glicosilação, alterar a preferência de codões, produzir variantes de "splicing", introduzir mutações, etc.

Anticorpos

Qualquer tipo de anticorpo conhecido na área pode ser produzido para se ligar especificamente a um epitopo de um polipeptídeo GPCR tipo DA. "Anticorpo" como aqui é usado inclui moléculas de imunoglobulina intactas, assim como seus fragmentos, tais como Fab, (F(ab')2 e Fv, que são capazes de se ligar a um epitopo de um polipeptídeo GPCR tipo DA. Tipicamente, pelo menos 6, 8, 10 ou 12 aminoácidos contíguos são necessários para formar um epitopo. No entanto, os epitopos que envolvem aminoácidos não contíguos podem necessitar de mais aminoácidos, e.g., pelo menos 15, 25 ou 50. radioimunoensaios

Um anticorpo que se liga especif icamente a um epitopo de um polipeptídeo GPCR tipo da poder ser usado terapeuticamente, assim como em ensaios imunoquímicos, tais como transferências Western, ELISAs, 39 ΡΕ1287133 ensaios imuno-histoquímicos, imunoprecipitações ou outros ensaios imunoquímicos conhecidos. Vários imunoensaios podem ser usados para identificar anticorpos tendo a especificidade pretendida. São conhecidos numerosos protocolos para ensaios de ligação competitiva ou imuno-radiométricos. Tais imunoensaios tipicamente envolvem a medição da formação de complexos entre um imunogénio e um anticorpo que especi-ficamente se liga ao imunogénio.

Tipicamente, um anticorpo que especificamente se liga a um polipeptideo GPCR tipo da proporciona um sinal de detecção pelo menos 5, 10 ou 20 vezes superior a um sinal de detecção proporcionado por outras proteínas quando usado num ensaio imunoquímico. De preferência, os anticorpo que especificamente se ligam a polipeptídeos GPCR tipo DA não detectam outras proteínas em ensaios imunoquímicos e podem imunoprecipitar um polipeptideo GPCR tipo DA a partir de uma solução.

Os polipeptídeos GPCR tipo DA podem ser usados para imunizar um mamífero, como seja um ratinho, rato, coelho, cobaio, macaco ou humano, para produzir anticorpos monoclonais. Caso se pretenda, um polipeptideo GPCR tipo DA pode ser conjugado com uma proteína veículo, como seja albumina sérica bovina, tiroglobulina e hemocianina de lapa. Dependendo da espécie hospedeira, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica. Tais adjuvantes incluem, mas não estão limitados a adjuvante de Freund, géis minerais (e.g., hidróxido de alumínio) e 40 ΡΕ1287133 substâncias tensioactivas (e.g., lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina de lapa e dinitrofenol). Entre os adjuvantes usados, BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum são especialmente úteis.

Os anticorpos monoclonais que especificamente se ligam a um polipeptideo GPCR tipo DA podem ser preparados usando qualquer técnica que proporciona a produção de moléculas de anticorpo por linhas celulares continuas em cultura. Estas técnicas incluem, mas não estão limitadas à técnica de hibridomas, técnica de hibridomas de células B humanas e técnica de EBV-hibridomas (Kohler et al., Nature 256, 495-497, 1985; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 80, 2026-2030, 1983; Cole et al., Mol. Cell Blol. 62, 109-120, 1984) .

Ainda, podem ser usadas técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos", o "splicing" de genes de anticorpos de ratinho com genes de anticorpos humanos para se obter uma molécula com a especificidade antigénica e actividade biológica adequada (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312, 604-608, 1984 ; Takeda et al., Nature 314, 452-454, 1985. Anticorpos monoclonais e outros podem também ser "humanizados" para evitar que um doente monte uma resposta imune contra o anticorpo usado terapeuti-camente. Tais anticorpos podem ser suficientemente seme- 41 ΡΕ1287133 lhantes em sequência a anticorpos humanos para serem usados directamente em terapia ou podem necessitar de alteração de alguns resíduos chave. Diferenças de sequência entre anticorpos de roedores e sequências humanas podem ser minimizadas por substituição de resíduos que diferem dos das sequências humanas através de mutagénese dirigida de resíduos individuais ou por substituição de regiões determinantes de complementaridade completas. Como alternativa, anticorpos humanizados podem ser produzidos usando métodos recombinantes, como descrito em GB2188638. Os anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo GPCR tipo DA podem conter locais de ligação a antigénio que estão parcial ou totalmente humanizados, como descrito em U.S. 5565332.

Como alternativa, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples podem ser adaptadas, usando métodos conhecidos na área para produzir anticorpos de cadeia simples que se ligam especificamente a polipeptídeos GPCR tipo DA. Os anticorpos com especificidade relacionada mas com composição idiotípica distinta, podem ser gerados por "shuffling" de cadeia a partir de bibliotecas combinatórias de imunogobulinas ao acaso (Burton, Proc. Natl. Acad. Sei. 88, 11120-23, 1991).

Os anticorpos de cadeia simples podem também ser construídos usando um método de amplificação de dna, como seja PCR, usando cDNA de hibridomas como molde (Thirion et al., 1996, Eur. J. Câncer Prev. 5, 507-11). Os anticorpos 42 ΡΕ1287133 de cadeia simples podem ser mono ou bispecificos e podem ser bivalentes ou tetravalentes. A construção de anticorpos de cadeia simples bispecificos é ensinada, por exemplo, em Coloma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63. A construção de anticorpos de cadeia simples bivalentes bispecificos está ensinada em Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206.

Uma sequência nucleotidica codificadora de um anticorpo de cadeia simples pode ser construída usando síntese de nucleótidos manual ou automática, clonada numa construção de expressão usando métodos de DNA recombinante convencionais e introduzida numa célula para expressar a sequência codificadora, como descrito abaixo. Como alternativa, os anticorpos de cadeia simples podem ser produzidos directamente usando, por exemplo, tecnologia de fagos filamentosos (Verhaar et al., 1995, Int. J. Câncer 61, 497-501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91).

Os anticorpos que se ligam especificamente a polipeptídeos GPCR tipo DA podem ser produzidos através da indução da produção in vivo na população de linfócitos ou por rastreio de bibliotecas de imunoglobulinas ou painéis de reagentes de ligação altamente específicos como descrito na literatura (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 86, 3833-3837, 1989; Winter et al., Nature 349, 293-299, 1991).

Outros tipos de anticorpos podem ser construídos e usados terapeuticamente em métodos do invento. Por 43 ΡΕ1287133 exemplo, anticorpos quiméricos podem ser construídos como descrito em WO 93/03151. As proteínas de ligação que derivam de imunoglublinas e que são multivalentes e multi-específicas, tais como "diacorpos" descritas em WO 94/13804, podem ser igualmente preparadas.

Anticorpos de acordo com o invento podem ser purificados por métodos bem conhecidos na área. Por exemplo, os anticorpos podem ser purificados por afinidade através da passagem numa coluna à qual está ligado um polipeptídeo GPCR tipo da. Os anticorpos ligados podem então ser eluídos da coluna usando um tampão com uma concentração salina elevada.

Oligonucleótidos "antisense"

Os oligonucleótidos "antisense" são sequências nucleotídicas complementares de uma sequência específica de DNA ou RNA. Uma vez introduzido numa célula, um oligonu-cleótido "antisense" tem pelo menos 11 nucleótidos de comprimento, mas pode ter pelo menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 ou mais nucleótidos de comprimento. Podem ser igualmente usadas sequências mais longas. As moléculas de oligonucleótidos "antisense" podem ser proporcionadas numa construção de DNA e introduzidas numa célula como descrito atrás para baixar o nível de produtos do gene GPCR tipo DA na célula.

Os oligonucleótidos "antisense" podem ser deso- 44 ΡΕ1287133 xirribonucleótidos, ribonucleótidos ou uma combinação de ambos. Os oligonucleótidos podem ser sintetizados manualmente ou através de um sintetizador automático, por ligação covalente do extremo 5' de um nucleótido ao extremo 3' de um outro nucleótido com ligações internucleótidos não fosfodiéster, tais como arilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres de fosfato, carbamatos, acetami-dato, ésteres carboximetilicos, carbonatos e triésteres de fosfato. Ver Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1-71, 1994 ; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-583, 1990.

As modificações da expressão do gene GPCR tipo DA podem ser obtidas projectando oligonucleótidos "antisense" que formarão uma cadeia dupla com regiões de controlo 5' ou reguladoras do gene GPCR tipo DA. São preferidos os oligonucleótidos derivados do local de iniciação da transcrição, e.g., entre as posições -10 e +10 a partir do local de inicição. De forma semelhante, a inibição pode ser conseguida usando metodologia de emparelhamento de bases de "tripla hélice". O emparelhamento de tripla hélice é útil por causar inibição da capacidade da dupla hélice abrir suficientemente para a ligação de polimerases, factores de transcrição ou chaperones. Os avanços terapêuticos usando DNA triplex foram descritos na literatura (e.g., Gee et al., em Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994). Um oligonucleótido "antisense" pode também ser projectado de 45 ΡΕ1287133 forma a bloquear a tradução do mRNA, através da prevenção da ligação do transcrito aos ribossomas. Não é necessária complementaridade precisa para a formação com êxito de um complexo entre um oligonucleótido "antisense" e a sequência complementar de um polinucleótido GPCR tipo DA. Os oligonucleótidos "antisense" e a sequência complementar que compreende, por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 ou mais segmentos de nucleótidos contíguos que são exactamente complementares de um polinucleótido GPCR tipo DA, cada um deles separado por um segmento de nucleótidos contíguos que não são complementares dos nucleótidos GPCR tipo DA adjacentes, podem proporcionar especificidade para mRNA GPCR tipo DA. De preferência, cada segmento de nucleótidos contíguos complementares tem pelo menos 4, 5, 6, 7 ou 8 ou mais nucleótidos de comprimento. As sequências intervenientes não complementares têm de preferência 1, 2, 3 ou 4 nucleótidos de comprimento. Os familiarizados com a matéria podem facilmente usar o ponto de fusão calculado para o "antisense-sense" para determinar o grau de desem-parelhamento que será tolerado entre um oligonucleótido "antisense" particular e uma sequência do plinucleótido GPCR tipo DA particular.

Os oligonucleótidos "antisense" podem ser modificados sem afectar a sua capacidade para hibridar com um polinucleótido GPCR tipo DA. Estas modificações podem ser internas ou num ou em ambos os extremos da molécula "antisense". Por exemplo, as ligações fosfato internucleó- 46 ΡΕ1287133 sido podem ser modificadas através da adição de grupos colesteril ou diamina com números variáveis de residuos de carbono entre os grupos amina e a ribose terminal. Bases modificadas e/ou açúcares, tais como arabinose em vez de ribose ou um oligonucleótido substituído em 3' ou 5' em que o grupo hidroxilo 3' ou o grupo fosfato 5' são substituídos, podem ser também empregues num oligonucleótido "antisense" modificado. Estes oligonucleótidos modificados podem ser preparados por métodos bem conhecidos na área. Ver, e.g., Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-584, 1990; Uhlmann et al., Tetrahedron Lett. 215, 3539-3542, 1987.

Ribozimas

Ribozimas são moléculas de RNA com actividade catalítica. Ver, e.g., Cech, Science 236, 1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543-568; 1990, Cech, Curr.

Opin. Struct. Biol. 2, 605-609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515, 1996. As ribozimas podem ser usadas para inibir a função dos genes através da clivagem de uma sequência de RNA, como é conhecido na área (e.g., Haseloff et al., Patente U.S. 5641673). O mecanismo da acção das ribozimas envolve a hibridação específica de sequência da molécula de ribozima com RNA alvo complementar, seguido de clivagem endonucleotídica. Exemplos incluem moléculas de ribozima com motivo em cabeça de martelo que podem especificamente e eficientemente catalisar a clivagem endonucleolítica de sequências nucleotídicas específicas. 47 ΡΕ1287133 A sequência codificadora de um polinucleótido GPCR tipo DA, como seja a sequência nucleotidica mostrada em SEQ ID N0.1, pode ser usada para gerar ribozimas que se ligarão especificamente a mRNA transcrito a partir do polinucleótido GPCR tipo DA. Métodos de projecção e construção de ribozimas que podem clivar outras moléculas de RNA em trans, numa forma altamente especifica de sequência, foram desenvolvidas e descritas na área (ver Haseloff et al. Nature 334, 585-591, 1988). Por exemplo, a actividade de clivagem das ribozimas pode ser dirigida para RNAs específicos através da manipulação de uma região de "hibridação" discreta na ribozima. A região de hibridação contem uma sequência complementar do RNA alvo e assim híbrida especificamente com o alvo (ver, por exemplo, Gerlach et al., EP 321201).

Locais de clivagem por ribozimas específicas dentro de um alvo de RNA GPCR tipo DA podem ser identificados através do varrimento da molécula alvo relativamente a locais de clivagem pela ribozima que incluem as seguintes sequências: GUA, GUU e GUC. Uma vez identificados, pequenas sequências de RNA entre 15 e 20 ribonucleótidos, correspondendo à região do RNA alvo contendo o local de clivagem, podem ser avaliadas relativamente a características estruturais secundárias que podem tornar inoperacional o alvo. A adequação dos alvos de RNA GPCR tipo DA candidatos também pode ser avaliada testando a acessibilidade à hibridação com oligoucleótidos comple- 48 ΡΕ1287133 mentares usando ensaios de protecção de ribonucleases. A sequência nucleotidica mostrada em SEQ ID N0.1 e o seu complemento proporcionam uma fonte de sequências da região de hibridação adequadas. Sequências complementares mais longas podem ser usadas para aumentar a afinidade da sequência de hibridação para o alvo. As regiões de hibridação e clivagem da ribozima podem estar integralmente relacionadas de forma que, quando da hibridação com o RNA alvo através das regiões complementares, a região catalítica da ribozima pode clivar o alvo. AS ribozimas podem ser introduzidas nas células como parte de uma construção de DNA. Métodos mecânicos, tais como microinjecção, transfecção mediada por liposso-mas, electroporação ou precipitação com fosfato de cálcio, podem ser usados para introduzir uma construção de DNA contendo ribozima nas células para baixar a expressão de GPCR tipo DA. Como alternativa, caso se pretenda que as células mantenham estavelmente a construção de DNA, a construção pode ser fornecida num plasmídeo e mantida como um elemento separado ou integrado no genoma das células, como é conhecido na área. Uma construção de DNA codificadora da ribozima pode incluir elementos reguladores da transcrição, tais como um elemento promotor, um potenciador ou elemento UAS e um sinal terminador da transcrição, para o controlo da transcrição de ribozimas nas células. Conforme descrito em Hasekoff et al.r Patente U.S. 5641673, as ribozimas podem ser manipuladas de forma a que a expressão da ribozima ocorra em resposta a factores que 49 ΡΕ1287133 induzem a expressão de um gene alvo. As ribozimas podem também ser manipuladas para proporcionar um nível adicional da regulação, de forma a que a destruição do mRNA ocorra apenas quando uma ribozima e um gene alvo são induzidos nas células. Métodos de rastreio 0 invento proporciona ensaios para o rastreio de compostos que se liguem ou modulem a actividade de um polipeptídeo GPCR tipo DA ou de um polinucleótido GPCR tipo DA. Um composto a testar de preferência liga-se a um polipeptídeo ou polinucleótido GPCR tipo DA. Mais de preferência, um composto a testar diminui ou aumenta o efeito da dopamina ou de um análogo da dopamina conforme mediado via GPCR tipo DA humano pelo menos cerca de 10, de preferência cerca de 50, mais de preferência cerca de 75, 90 ou 100% relativamente à ausência do composto a testar.

Compostos a testar

Os compostos a testar podem ser agentes farmacológicos conhecidos na área ou podem ser compostos que se desconhecia terem actividade farmacológica. Os compostos podem ser naturais ou projectados em laboratório. Podem ser isolados a partir de microrganismos, animais ou plantas e podem ser produzidos por via recombinante ou sintetizados por métodos químicos conhecidos na área. Caso se pretenda, os compostos a testar podem ser obtidos usando qualquer um 50 ΡΕ1287133 dos numerosos métodos conhecidos, incluindo mas não estando limitado a bibliotecas biológicas, bibliotecas em fase sólida ou em solução paralelas espacialmente abordáveis, métodos de bibliotecas sintéticas necessitando de descon-volução, o método da biblioteca "uma esfera - um composto" e os métodos de bibliotecas sintéticas usando selecção por cromatografia de afinidade. A biblioteca biológica está limitada a bibliotecas de polipeptídeos, enquanto que as outras quatro abordagens são aplicáveis a polipeptídeos, oligómeros não peptidicos ou bibliotecas de pequenas moléculas de compostos. Ver Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997.

Os métodos para a síntese de bibliotecas moleculares são bem conhecidos na área (ver, por exemplo, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 90, 6909, 1993; Erb et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 26 78, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993 ; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061 ; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994). As bibliotecas dos compostos podem existir em solução (ver e.g., Houghten, BioTechniques 13, 412-421 1992), ou em esferas (Lam, Nature 354, 82-84, 1991) microplacas (" chips") (Fodor, N ature 364, 555-556, 1993) bactérias ou esporos (Ladner, Patente U.S. 5223409) plasmídeos (Cull et al ., Proc. , Natl. Acad. Sei. U.S.A 89 1865-869, 1992) ou fagos (Scott & Smith, Science 249, 386— 390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla et 51 ΡΕ1287133 al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 91, 6378-6382, 1990;

Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; e Ladner, Patente U.S. 5223409).

Rastreío de elevado número de amostras

Os compostos a testar podem ser analisados quanto à capacidade para se ligarem a polipeptideos ou polinucleótidos GPCR tipo Da ou para afectar a actividade GPCR tipo DA ou a expressão do gene GPCR tipo DA usando rastreío de elevado número de amostras. Com o rastreio de elevado número de amostras, muitos compostos individuais podem ser testados em paralelo de forma a que grandes números dos compostos a testar possam ser rapidamente analisados. As técnicas mais largamente estabelecidas utilizam placas de microtitulação de 96 alvéolos. Os alvéolos das placas de microtitulação tipicamente requerem volumes de ensaio que variam entre 50 e 500 μΐ. Para além das placas, podem ser adquiridos muitos instrumentos, materiais, pipetadores, robótica, lavadores de placas e leitores de placas que se adaptam ao formato de 96 alvéolos.

Como alternativa, podem ser usados os "ensaios sem formato" ou ensaios que não têm barreiras físicas entre amostras. Por exemplo, um ensaio que usa células com pigmentos (melanócitos) num ensaio homogéneo simples para bibliotecas combinatórias de peptídeos está descrito por Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Scl. U.S.A 19, 1614- 52 ΡΕ1287133 18 (1994) . As células são colocadas sob agarose em placas de petri, depois as esferas contendo compostos combinatórios são colocadas na superfície da agarose. Os compostos combinatórios são parcialmente libertados das esferas. Os compostos activos podem ser visualizados como áreas de pigmentos escuros porque, como os compostos se difundem localmente na matriz do gel, os compostos activos fazem com que as células mudem de cor.

Um outro exemplo de um ensaio de formato livre está descrito por Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", apresentado na Primeira Conferência Anual da Society for Biomolecular Scrrening em Philadelphia, Pa. (Nov. 7-10, 1995) . Chelsky colocou um simples ensaio homogéneo de enzima para anidrase carbónica dentro de um gel de agarose de forma a que o enzima no gel causasse mudança de cor ao longo do gel. Depois, esferas portadoras de compostos combinatórios através um foto-adaptador foram colocadas dentro do gel e os compostos foram parcialmente libertados por luz UV. Os compostos que inibiram a enzima foram observados como zonas localizadas de inibição tendo menos mudança de cor. Ainda, um outro exemplo está descrito por Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996). Neste exemplo, bibliotecas combinatórias foram testadas relativamente a compostos que tinham efeitos tóxicos sobre células de cancro a crescer em agar.

Um outro método de rastreio de elevado número de 53 ΡΕ1287133 amostras está descrito em Beutel et al., Patente U.S. 5976813. Neste método, as amostras a testar são colocadas numa matriz porosa. Um ou mais componentes do ensaio são então colocados dentro, no topo ou no fundo de uma matriz como seja um gel, folha de plástico ou outra forma de suporte sólido facilmente manipulada. Quando as amostras são introduzidas na matriz porosa, elas difundem-se de forma suficientemente lenta, de modo a que os ensaios possam ser realizados sem que as amostras corram simultaneamente.

Ensaios de ligação

Para os ensaios de ligação, o composto a testar é, de preferência, uma pequena molécula que se liga e ocupa o local activo do polipeptideo GPCR tipo DA, tornando assim o local de ligação do ligando inacessível ao substrato de forma a que a actividade biológica normal seja inibida. Exemplos de tais moléculas pequenas incluem mas não estão limitadas a pequenos peptídeos ou moléculas do tipo peptídeo. Ligandos potenciais que se ligam a um polipeptideo do invento incluem mas não estão limitados a ligandos naturais de GPCRs tipo DA e seus análogos ou derivados.

Nos ensaios de ligação, o composto a testar ou o polipeptideo GPCR tipo DA pode compreender uma marca detectável, como seja uma marca fluorescente, radio-isotópica, quimioluminescente ou enzimática, como seja 54 ΡΕ1287133 peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina ou luciferase. A detecção de um composto a testar que está ligado a um polipeptideo GPCR tipo DA pode então ser conseguida, por exemplo, por contagem directa da emissão radioactiva, por contagem de cintilação ou por determinação da conversão de um substrato adequado num produto detectável.

Como alternativa, a ligação de um composto a testar a um polipeptideo GPCR tipo DA pode ser determinada sem marcação de qualquer um dos elementos interactuantes. Por exemplo pode ser usado um microfisiómetro para detectar a ligação de um composto a testar com um polipeptideo GPCR tipo DA. Um microfisiómetro (e.g., Cytosensor™) é um instrumento analítico que mede a velocidade a que a célula acidifica o seu ambiente usando um sensor potenciométrico sensível à luz (LAPS). As alterações nesta velocidade de acidificação podem ser usadas como um indicador da interacção entre um composto a testar e um polipeptideo GPCR tipo DA (McConnell et al., Science 257, 1906-1912, 1992) . A determinação da capacidade de um composto a testar para se ligar a um polipeptideo GPCR tipo DA também pode ser conseguida usando tecnologia como a Análise de Interacção Bimolecular (BIA) em tempo real (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991, e Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995). BIA é uma tecnologia para o estudo das interacções biospecíficas em 55 ΡΕ1287133 tempo real, sem marcação de qualquer um dos elementos interactuantes (e.g., BlAcore™) . As alterações no fenómeno óptico da ressonância dos plasmões de superfície (SPR) podem ser usadas como uma indicação das reacções em tempo real entre moléculas biológicas.

Ainda noutro aspecto do invento, um polipeptídeo GPCR tipo DA pode ser usado como uma "proteína isca" num ensaio de duplo híbrido ou num ensaio de triplo híbrido (ver, e.g., Patente U.S. 5283317; Zervos et al., Cell 72, 223-232, 1993; Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920-924, 1993 ; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696, 1993 ; e Brent W094/10300), de forma a identificar outras proteínas que se ligam ou que interagem com o polipeptídeo DA-GPCR e modulam a sua actividade. O sistema de duplo híbrido baseia-se na natureza modular da maior parte dos factores de transcrição, que consiste em domínios separáveis de ligação a DNA e activação. Resumidamente, o ensaio utiliza duas construções de DNA diferentes. Por exemplo, numa construção, o polinucleótido codificador de um polipeptídeo GPCR tipo DA pode ser fundido com um polinucleótido codificador do domínio de ligação a DNA de um factor de transcrição conhecido (e.g., GAL-4). Na outra construção uma sequência de DNA que codifica uma proteína não identificada ("presa" ou "amostra") pode ser fundida com um polinucleótido que codifica o domínio de activação do factor de transcrição 56 ΡΕ1287133 conhecido. Se as proteínas "isca" e "presa" foram capazes de interagir in vivo para formar um complexo dependente de proteína, os domínios de ligação a DNA e activação do factor de transcrição são colocados em estreita proximidade. Esta proximidade permite a transcrição de um gene repórter (e.g., LacZ), que está operacionalmente ligado a um local regulador da transcrição que responde ao factor de transcrição. A expressão do gene repórter pode ser detectada e as colónias celulares contendo o factor de transcrição funcional podem ser isoladas e usadas para obter a sequência de DNA codificadora da proteína que interage com o polipeptídeo GPCR tipo DA.

Pode ser desejável imobilizar o polipeptídeo GPCR tipo DA (ou polinuclótido) ou o composto a testar para facilitar a separação das formas ligada e não ligada de um ou de ambos os elementos que interagem, assim como para acomodar a automatização do ensaio. Assim, o polipeptídeo GPCR tipo DA (ou polinucleótido) ou o composto a testar pode ser ligado a um suporte sólido. Os suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a lâminas de vidro ou de plástico, placas de cultura de tecidos, alvéolos de microtitulação, tubos, microplacas ("chips") de silicone ou partículas tais como esferas (incluindo mas não estando limitado a esferas de latex, polistireno ou vidro). Qualquer método conhecido na área pode ser usado para ligar o polipeptídeo GPCR tipo DA (ou polinucleótido) ou o composto a testar a um suporte sólido, incluindo a utilização de ligações covalentes ou não covalentes, 57 ΡΕ1287133 absorção passiva ou pares de grupos de ligação ligados respectivamente ao polinucleótido (ou polinucleótido) ou composto a testar e ao suporte sólido. Os compostos a testar são, de preferência, ligados ao suporte sólido num arranjo, de forma a que a localização dos compostos s testar individuais possa ser seguida. A ligação de um composto a testar a um polipeptideo GPCR tipo DA (ou polinucleótido) pode ser conseguida em qualquer recipiente adequado para conter os reagentes. Exemplos de tais vasos incluem placas de microtitulação, tubos de ensaio e tubos de microcentrifuga.

Numa realização, o polipeptideo GPCR tipo DA é uma proteina de fusão compreendendo um domínio que permite ao polipeptideo GPCR tipo DA ser ligado a um suporte sólido. Por exemplo, as proteínas de fusão com glutationa-S-transferase podem ser adsorvidas a esferas de glutationa-sefarose (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) ou placas de microtitulação derivatizadas com glutationa, as quais são então combinadas com o composto a testar ou com o composto a testar e o polipeptideo GPCR tipo DA; a mistura é então incubada em condições que levam à formação do complexo (e.g., em condições fisiológicas de concentração salina e pH) . Após incubação, as esferas ou alvéolos das placas de microtitulação são lavados para remover quaisquer componentes não ligados. A ligação dos elementos interactuantes pode ser determinada directa ou indirectamente, como descrito atrás. Como alternativa, os complexos podem ser dissociados do suporte sólido antes de ser determinada a ligação. 58 ΡΕ1287133

Outras técnicas para imobilização de proteínas ou plinucleótidos num suporte sólido também podem ser usadas em ensaios de rastreio do invento. Por exemplo, um polipeptideo GPCR tipo DA (ou polinucleótido) ou um composto a testar pode ser imobilizado utilizando a conjugação de biotina e estreptavidina. Os polipeptideos GPCR tipo DA (ou polinucleótidos) ou compostos a testar podem ser preparados a partir de biotina-NHS(N-hidroxi-succinimida) usando técnicas bem conhecidas (e.g., kit de biotinilação, Pierce Chemicals, Rockford, 111.) e imobilizados nos alvéolos de placas de 96 alvéolos revestidas com estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, os anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptideo GPCR tipo DA, polinucleótido ou um composto a testar, mas que não interferem com um local de ligação pretendido, como seja o centro activo do polipeptideo GPCR tipo DA, podem ser derivatizados nos alvéolos da placa. 0 alvo ou proteína não ligado pode ser fixado aos alvéolos pela conjugação de anticorpos. Métodos para a detecção de tais complexos, para além dos descritos atrás para os complexos GST-imobilizados, incluem imunodetecção de complexos usando anticorpos que se ligam especificamente ao polipeptideo GPCR tipo DA ou composto a testar, ensaios associados a enzimas que se baseiam na detecção de uma actividade do polipeptideo GPCR tipo DA e electroforese em gel de SDS em condições não redutoras. 59 ΡΕ1287133 0 rastreio dos compostos a testar que se ligam a um polipeptídeo GPCR tipo DA ou polinucleótido também pode ser realizado numa célula intacta. Qualquer célula que compreenda um polipeptídeo ou polinucleótido GPCR tipo DA pode ser usado num sistema de ensaio baseado em células. Um polipeptídeo GPCR tipo DA pode ser natural na célula ou pode ser introduzido usando técnicas tais como as descritas atrás. A ligação do composto a testar a um polipeptídeo ou polinucleótido GPCR tipo DA é determinado como descrito atrás.

Ensaios funcionais

Os compostos a testar podem ser testados quanto à capacidade para aumentar ou diminuir um efeito biológico de um polipeptídeo GPCR tipo DA. Tais efeitos biológicos podem ser determinados usando ensaios funcionais descritos nos exemplos específicos, abaixo. Os ensaios funcionais podem ser realizados após contacto de um polipeptídeo GPCR tipo DA, uma preparação de membranas celulares ou uma célula intacta com um composto a testar. Um composto a testar que diminui uma actividade funcional de um GPCR tipo DA em pelo menos 10, de preferência cerca de 50, mais de preferência cerca de 75, 90 ou 100% é identificado como um potencial agente para o decréscimo da actividade de GPCR tipo DA. Um composto a testar que aumenta a actividade GPCR tipo da em pelo menos cerca de 10, de preferências cerca de 50, mais de preferência cerca de 75, 90 ou 100%, é identificado como 60 ΡΕ1287133 um agente potencial para aumentar a actividade GPCR tipo DA.

Um desses processos de rastreio envolve a utilização de malanóforos que são transfectados para expressarem um polipeptideo DA-GPCR. Tal técnica de rastreio está descrita em WO 92/01810 publicado em 6 de Fev, 1992. Assim, por exemplo, tal ensaio pode ser empregue para o rastreio de um composto que inibe a activação do polipeptideo receptor através do contacto das células de melanóforo que apresentam o receptor com o ligando do receptor (e.g., dopamina ou um análogo de dopamina) e um composto a testar para ser detectado. A inibição do sinal gerado pelo ligando indica que um composto a testar é um antagonista potencial do receptor, í.e., inibe a activação do receptor. O rastreio pode ser empregue na identificação de um composto a testar que activa o receptor pelo contacto de tais células com compostos a serem testados e determinação se cada composto a testar gera um sinal, í.e., activa o receptor.

Outras técnicas de rastreio incluem a utilização de células que expressam um polipeptideo GPCR tipo DA (por exemplo, células CHO transfectadas) num sistema que mede alterações do pH extracelular causadas por activação de receptores (ver, e.g., Science 246, 181-296, 1989). Por exemplo, os compostos a testar podem ser colocados em contacto com uma célula que expresse um polipeptideo GPCR 61 ΡΕ1287133 tipo DA e uma resposta de mensageiro secundário, e.g., transdução de sinal ou alterações de pH, pode ser medida para determinar se o composto a testar activa ou inibe o receptor.

Uma outra técnica de rastreio envolve a introdução de RNA codificador de um polipeptideo GPCR tipo DA humano em oócitos de Xenopus para expressar transitoriamente o receptor. Os oócitos transfectados podem ser então colocados em contacto com o ligando do receptor e um composto a testar a ser detectado, seguido da detecção da inibição ou activação de um sinal de cálcio no caso do rastreio dos compostos a testar que se pensa inibirem a activação do receptor.

Uma outra técnica de rastreio envolve a expressão de um polipeptideo GPCR tipo DA nas células em que o receptor está ligado a uma fosfolipase C ou D. Tais células incluem células endoteliais, células de músculo liso, células de rim embrionário, etc. 0 rastreio pode ser conseguido como descrito atrás, através da quantificação do grau de activação do receptor a partir das alterações na actividade de fosfolipase.

Os detalhes dos ensaios funcionais tais como os descritos atrás são proporcionados nos exemplos específicos abaixo. ΡΕ1287133 62

Expressão de genes

Numa outra realização, são identificados os compostos a testar que aumentam ou diminuem a expressão do gene GPCR tipo da. um polipeptídeo GPCR tipo da é colocado em contacto com um composto a testar e detectada a expressão de um mRNA ou produto polipeptídico do polinucleótido GPCR tipo DA. 0 nível de expressão do mRNA ou polipeptídeo adequado na presença do composto a testar é comparado com o nível de expressão do mRNA ou polipeptídeo na ausência do composto a testar. 0 composto a testar pode então ser identificado como um modulador da expressão baseada nesta comparação. Por exemplo, quando a expressão de mRNA ou polipeptídeo é superior na presença do composto a testar do que na sua ausência, o composto a testar é identificado como um estimulador ou potenciador da expressão de mRNA ou polipeptídeo. Como alternativa, quando a expressão do mRNA ou polipeptídeo é inferior na presença do composto a testar do que na sua ausência, o composto a testar é identificado como um inibidor da expressão do mRNA ou polipeptídeo. 0 nível do mRNA ou polipeptídeo GPCR tipo DA nas células pode ser determinado pelos métodos conhecidos para a detecção de mRNA ou polipeptídeo. Podem ser usados métodos qualitativos ou quantitativos. A presença dos produtos polipeptídicos de um polinucleótido GPCR tipo DA pode ser determinada, por exemplo, usando uma variedade de técnicas conhecidas, incluindo métodos imunoquímicos tais 63 ΡΕ1287133 como radioimunoensaio, transferência Western e imuno-histoquímica. Como alternativa, a síntese de polipeptídeos pode ser determinada in vivo, numa cultura celular, ou num sistema de tradução in vitro através da detecção da incorporação de aminoácidos marcados num polipeptídeo GPCR tipo DA.

Tal rastreio pode ser realizado num sistema de ensaio acelular ou numa célula intacta. Qualquer célula que expresse um polinucleótido GPCR tipo DA pode ser usada num sistema de ensaio baseado em células. 0 polinucleótido GPCR tipo DA pode ser natural na célula ou pode ser introduzido usando técnicas tais como as descritas atrás. Pode ser usada uma cultura primária ou uma linha celular estabelecida, como seja CHO ou células de rim embrionário humano 293.

Composições farmacêuticas 0 invento também proporciona composições farmacêuticas que podem ser administradas a um doente para se conseguir um efeito terapêutico. AS composições farmacêuticas do invento podem compreender, por exemplo, um polipeptídeo GPCR tipo DA, polinucleótido GPCR tipo DA, anticorpos que se liguem especificamente a um polipeptídeo GPCR tipo DA, ou mimetizadores, agonistas, antagonistas ou inibidores de uma actividade do polipeptídeo GPCR tipo da. As composições podem ser administradas sozinhas ou em combinação com pelo menos um outro agente, como seja um 64 ΡΕ1287133 composto estabilizador, que pode ser administrado em qualquer veiculo farmacêutico estéril biocompativel, incluindo mas não estando limitado a soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, dextrose e água. As composições podem ser administradas a um doente por si sós ou em combinação com outros agentes, drogas ou hormonas.

Para além dos ingredientes activos, estas composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuti-camente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que facilitem o processamento dos compostos activos nas preparações que podem ser usadas como fármacos. As composições farmacêuticas do invento podem ser administradas por qualquer uma de várias vias incluindo mas não estando limitados à via oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópica, sublingual ou rectal. As composições farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas usando veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na área em dosagens adequadas para a administração oral. Tais veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidas, géis, xaropes, pastas, suspensões e similares, para ingestão pelo doente.

As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas através da combinação de compostos activos com excipiente sólido, facultativamente trituração de uma 65 ΡΕ1287133 mistura resultante e processamento da mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, caso se pretenda, para se obter comprimidos ou núcleos de drageias. São exci-pientes adequados açúcares ou agentes de enchimento proteicos adequados, tais como açúcares, incluindo lactose, sucrose, manitol ou sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata ou outras plantas; celulose, como seja metil-celulose, hidroxipropilmetilcelulose ou carboximetilcelu-lose sódica; gomas incluindo arábica e tragacanta; e proteínas tais como gelatina e colagénio. Caso se pretenda, podem ser adicionados agentes desintegrantes ou solubi-lizantes, tais como polivinilpirrolidona com ligações cruzadas, agar, ácido algínico ou um seu sal, como seja alginato sódico.

Os núcleos de drageias podem ser usados conjuntamente com revestimentos adequados, como sejam soluções concentradas de açúcar, que também podem conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de lacas e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drageias, para a identificação de produtos ou para caracterizar a quantidade do composto activo, í.e., dosagem.

As preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas de encaixe preparadas com gelatina, assim como cápsulas moles seladas feitas de 66 ΡΕ1287133 gelatina e um revestimento, como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter ingredientes activos misturados com uma agente de enchimento ou de ligação, como sejam lactose ou amidos, lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, facultativamente, estabilizantes. Nas cápsulas moles, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, líquidos ou polietilenoglicol líquido com ou sem estabilizantes.

Formulações farmacêuticas adequadas para administração parenteral podem ser formuladas em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hanks, solução de Ringer ou soro fisiológico tamponado. As suspensões aquosas para injecção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose sódica, sorbitol ou dextrano. Ainda, as suspensões dos compostos activos podem ser preparadas como suspensões para injecção oleosas adequadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos de ácidos gordos, tais como óleo de sésamo ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, tais como oleato de etilo ou triglicéridos ou lipossomas. Os polímeros amino policatiónicos não lípidos podem também ser usados na formulação. Facultativamente, a suspensão também pode conter estabilizadores adequados ou agentes que aumentem a solubilidade dos compostos, para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Para a administração tópica ou nasal, são usados na formulação penetrantes 67 ΡΕ1287133 adequados à barreira particular a ser permeada. Tais penetrantes são de um modo geral conhecidos na área.

As composições farmacêuticas do presente invento podem ser produzidas de forma conhecida na área, e.g., por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, preparação de drageias, levigação, emulsio-nação, encapsulação, retenção ou liofilização. A composição farmacêutica pode ser proporcionada como um sal e pode ser formulada com muitos ácido, incluindo mas não estando limitado a clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartá-rico, málico, succinico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros solventes protónicos do que as correspondentes formas de base livre. Noutros casos, a preparação preferida pode ser um pó liofilizado que pode conter qualquer um dos seguintes: histidina 1-50 mM, 0,l%-2% de sucrose e 2-7% de manitol numa gama de 4,5 a 5,5, que é combinado com tampão antes de ser usado.

Outros detalhes sobre técnicas para a formulação e administração podem ser encontrados na última edição de REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishinig Co., Easton, Pa.) Após preparadas as composições farmacêuticas, estas podem ser colocadas num recipiente adequado e marcado para o tratamento de uma condição indicada. Tal marcação incluirá a quantidade, frequência e método de administração . 68 ΡΕ1287133

Indicações e métodos terapêuticos GPCRs são ubíquos no hospedeiro mamífero e são responsáveis por muitas funções biológicas, incluindo muitas patologias. Assim, é desejável encontrar compostos e drogas que estimulem um GPCR por um lado e que possam inibir a função de um GPCR por outro. Por exemplo, os compostos que activam um GPCR podem ser empregues para fins terapêuticos, tais como o tratamento de asma doença de Parkinson, falência cardíaca aguda, retenção urinária e osteoporose. Em particular, os compostos que activam GPCRs são úteis no tratamento de várias doenças cardiovasculares tais como as causadas pela ausência de fluxo sanguíneo pulmonar ou hipertensão. Ainda, estes compostos podem também ser usados no tratamento de várias alterações fisiológicas relacionadas com o controlo anormal de fluídos e homeostasia de electrólitos e em doenças associadas com secreção anormal de aldosterona induzida por angiotensina.

Em geral, os compostos que inibem a activação de um GPCR podem ser usados para uma variedade de fins terapêuticos, por exemplo, para o tratamento de hipotensão e/ou angina pectoris, enfarte do miocárdio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna e alterações psicóticas e neurológicas incluindo esquizofrenia, excitação maníaca, depressão, delírio, demência ou atraso mental grave, discinésia, como seja doença de Huntington ou síndroma de Tourett, entre outros. Compostos que inibem GPCRs são também úteis na reversão de anorexia endógena, no 69 ΡΕ1287133 controlo de bulimia e no tratamento de várias doenças cardiovasculares tais como as causadas pelo fluxo sanguíneo pulmonar excessivo. Em particular, a regulação de GPCR tipo DA pode ser usada para tratar doença de Alzheimer.

Este invento ainda está relacionado com a utilização de novos agentes identificados pelos ensaios de rastreio atrás descritos. Assim, está dentro do âmbito deste invento usar um composto a testar identificado como aqui descrito num modelo animal adequado. Por exemplo, um agente identificado como aqui descrito (e.g., um agente de modulação, uma molécula de ácido nucleico "antisense", um anticorpo específico, ribozima ou uma molécula de ligação ao polipeptídeo GPCR tipo DA) pode ser usado num modelo animal para determinar a eficácia, toxicidade ou efeitos secundários do tratamento com tal agente. Como alternativa, um agente identificado como aqui descrito pode ser usado num modelo animal para determinar o mecanismo de acção de tal agente. Ainda, este invento diz respeito a utilizações de novos agentes identificados pelos ensaios de rastreio atrás descritos para tratamentos como aqui descrito.

Um reagente que afecta a actividade GPCR tipo DA pode ser administrado a uma célula humana, in vitro ou in vivo, para reduzir a actividade GPCR tipo DA. 0 reagente, de preferência, liga-se a um produto de expressão de um gene GPCR tipo da humano. Se o produto de expressão for uma proteína, o reagente é, de preferência, um anticorpo. Para o tratamento de células humanas ex vivo, um anticorpo pode 70 ΡΕ1287133 ser adicionado a uma preparação de células estaminais, excepto células estaminais embrionárias humanas, que foram removidas do corpo. As células podem ser então substituídas no mesmo corpo humano ou noutro, com ou sem propagação clonal, como é conhecido na área.

Numa realização, o reagente é introduzido num lipossoma. De preferência, o lipossoma é estável no animal em que é administrado durante pelo menos cerca de 30 minutos, mais de preferência durante pelo menos 1 hora, e mesmo mais de preferência durante pelo menos cerca de 24 horas. Um lipossoma consiste numa composição lipídica que seja capaz de direccionar um reagente, particularmente um polinucleótido, para um local particular num animal, como seja um ser humano. De preferência, a composição lipídica do lipossoma é capaz de direccionar para um órgão específico de um animal, como o pulmão, fígado, baço, coração, cérebro, nódulos linfáticos e pele.

Um lipossoma útil no presente invento compreende uma composição lipídica que seja capaz de se fundir com a membrana plasmática da célula alvo para introduzir o seu conteúdo na célula. De preferência, a eficiência da transfecção de um lipossoma é cerca de 0,5 μρ de DNA por 16 nmoles de lipossoma aplicado a cerca de 106 células, mais de preferência cerca de 1,0 pg de DNA por 16 nmoles de lipossoma aplicado a cerca de 106 células e mesmo mais de preferência cerca de 2,0 pg de DNA por 16 nmoles de lipossoma aplicado a cerca de 106 células. De preferência, 71 ΡΕ1287133 um lipossoma tem entre cerca de 100 e cerca de 500 nm, mais de preferência entre cerca de 150 e 450 nm; e mesmo mais de preferência entre cerca de 200 e 400 nm de diâmetro.

Lipossomas adequados para usar no presente invento incluem os lipossomas normalmente usados, por exemplo, em métodos de introdução de genes conhecidos dos familiarizados com a matéria. Lipossomas mais preferidos incluem lipossomas tendo uma composição lipidica polica-tiónica e/ou lipossomas tendo um esqueleto de colesterol conjugado com polietilenoglicol. Facultativamente, um lipossoma compreende um composto capaz de direccionar o lipossoma para uma célula tumoral, como seja um ligando de células tumorais exposto na superfície externa do lipossoma. A complexação de um lipossoma com um reagente como seja um oligonucleótido "antinsense" ou ribozima pode ser conseguido usando métodos que são convencionais na área (ver, por exemplo, Patente U.S. 5705151). De preferência, entre cerca de 0,1 hg e cerca de 10 hg de polinucleótido é combinado com cerca de 8 nmol de lipossomas, mais de preferência entre cerca de 0,5 h5 e cerca de 5 h9 dos polinucleótidos são combinados com cerca de 8 nmol de lipossomas e mesmo mais de preferência cerca de 1,0 h9 de polinucleótidos é combinado com cerca de 8 nmol de lipossomas.

Numa outra realização, os anticorpos podem ser 72 ΡΕ1287133

introduzidos em tecidos específicos in vivo usando libertação direccionada mediada por receptores. As técnicas de libertação de DNA mediada por receptores estão descritas, por exemplo, em Findeis et al., Trends in Biotechnol. 11, 202-05 (1993); Chiouet al., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-24 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 542-46 (1994) ; Zenke et al., Proc. Natl Acad. Sei. U.S.A. 87, 3655-59 (1990); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 338-42 (1991) .

Determinação de uma dose terapeuticamente eficaz A determinação de uma dose terapeuticamente eficaz está dentro da capacidade dos familiarizados com a matéria. Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade do ingrediente activo que aumenta ou diminui a actividade GPCR tipo DA relativamente à actividade GPCR tipo DA que ocorre na ausência da dose terapeuticamente eficaz.

Para qualquer composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de culturas celulares ou em modelos animais, geralmente ratinhos, coelhos, cães ou porcos. O modelo animal pode também ser usado para determinar a gama de concentrações e via de administração. Tal informação pode ser então usada 73 ΡΕ1287133 para determinar doses e vias de administração úteis em humanos. A eficácia terapêutica e toxicidade, e.g., ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população), podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos convencionais em culturas celulares ou animais experimentais. A razão entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o indice terapêutico e pode ser expresso como a razão LD50/ED50. São preferidas as composições farmacêuticas que apresentam grandes indices terapêuticos. Os dados obtidos a partir de ensaios de culturas celulares e dos estudos animais são usados na formulação de uma gama de dosagem para uso humano. A dosagem contida em tais composições está de preferência dentro da gama de concentrações circulantes, que incluem a ed50, com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro desta gama dependendo da forma de dosagem empregue, sensibilidade do doente e via de administração. A dosagem exacta será determinada pelo médico assistente, face aos factores relacionados com o indivíduo necessitado de tratamento. A dosagem e administração são ajustados para proporcionarem níveis suficientes do ingrediente activo ou para manter o efeito pretendido. Os factores que podem ser considerados incluem a gravidade da doença, estado de saúde geral do indivíduo, idade, peso e 74 ΡΕ1287133 género do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, combinação de fármacos, sensibilidades de reacção e tolerância/resposta à terapia. Composições farmacêuticas de longa actuação podem ser administradas cada 3 ou 4 dias, semanalmente, ou uma vez em cada duas semanas dependendo da semi-vida e velocidade de eliminação da formulação particular.

As quantidades de dosagem normal podem variar entre 0,1 e 100000 microgramas, até uma dose total de cerca de 1 g, dependendo da via de administração. Orientações relativas às dosagens e métodos de administração são proporcionadas na literatura e, de um modo geral, acessíveis aos médicos assistentes. Os familiarizados com a matéria empregarão diferentes formulações para nucleótidos relativamente às das proteínas ou seus inibidores. De forma semelhante, a administração de polinucleótidos ou poli-peptídeos será específica de células, condições, localizações, etc. particulares.

Se o reagente for um anticorpo de cadeia simples, polinucleótidos codificadores do anticorpo podem ser construídos e introduzidos numa célula ex vivo ou in vivo usando técnicas bem conhecidas incluindo, mas não estando limitadas a transferência de DNA mediada por transferrina-policatiões, transfecção com ácidos nucleicos nus ou encapsulados, fusão celular mediada por lipossomas, transporte intracelular de esferas de latex revestidas com DNA, fusão de protoplastos, infecção virai, electroporação, 75 ΡΕ1287133 "pistola de genes" e transfecção mediada por DEAE ou fosfato de cálcio.

Dosagens eficazes in vivo de um anticorpo estão na gama de cerca de 5 μg a cerca de 50 μρ/Kg, cerca de 50 μg a cerca de 5 mg/Kg, cerca de 100 μρ a cerca de 500 μg/Kg de peso do corpo do doente e cerca de 200 a cerca de 250 μρ/Kg de peso do corpo do doente. Para a administração de polinucleótidos codificadores de anticorpos de cadeia simples, dosagens eficazes in vivo estão na gama de cerca de 100 ng a cerca de 200 ng, 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 μρ a cerca de 2 mg, cerca de 5 μρ a cerca de 500 μg e cerca de 20 μg a cerca de 100 μς de DNA.

Se o produto de expressão for mRNA, o reagente é de preferência um oligonucleótido "antisense" ou uma ribozima. Os polinucleótidos que expressam oligonucleótidos "antisense" ou ribozimas podem ser introduzidos nas células por uma variedade de métodos, como descrito atrás.

De preferência, um reagente reduz a expressão de um gene GPCR tipo DA ou a actividade de um polipeptídeo DA-GPCR em pelo menos cerca de 10, de preferência cerca de 50, mais de preferência cerca de 75, 90 ou 100% relativamente à ausência do reagente. A eficácia do mecanismo escolhido para baixar o nivel de expressão de um gene GPCR tipo DA ou a actividade de um polipeptídeo GPCR tipo DA pode ser avaliada usando métodos bem conhecidos na área, como sejam a hibridação de sondas nucleotídicas contra mRNA específico 76 ΡΕ1287133 de GPCR tipo DA, detecção imunológica de um polipeptídeo GPCR tipo DA ou medição de actividade GPCR tipo DA.

Em qualquer uma das realizações atrás descritas, qualquer uma das composições farmacêuticas do invento pode ser administrada em combinação com outros agentes terapêuticos adequados. A selecção dos agentes adequados para usar em terapia de combinação pode ser feita pelos especialistas na área, de acordo com princípios farmacêuticos convencionais. A combinação de agentes terapêuticos pode actuar sinergistiamente para efectuar o tratamento ou prevenção de várias alterações descritas atrás. Usando esta abordagem, pode-se conseguir uma eficácia terapêutica com dosagens mais baixas de cada agente, reduzindo assim o potencial de efeitos secundários adversos.

Qualquer um dos métodos terapêuticos descritos atrás pode ser aplicado a qualquer indivíduo necessitado de tal terapia, incluindo, por exemplo, mamíferos tais como cães, gatos, vacas, cavalos, coelhos, macacos e, mais de preferência seres humanos. Métodos de diagnóstico GPCRs podem ser igualmente usados em ensaios de diagnóstico para a detecção de doenças e anormalidades ou susceptibilidade relacionada com a presença de mutações nas sequências de ácidos nucleicos que codificam um GPCR. Tais 77 ΡΕ1287133 doenças, como exemplo, estão relacionadas com a transformação celular, como sejam tumores e cancros, e várias alterações cardiovasculares, incluindo hipertensão e hipotensão, assim como doenças que surgem devido ao fluxo sanguíneo anormal, à secreção de aldosterona anormal induzida por angiotensina e ao controlo anormal de fluidos e homeostasia de electrólitos .

As diferenças podem ser determinadas entre o CDNA ou sequência genómica codificadora de um GPCR em indivíduos atingidos por uma doença e em indivíduos normais. Caso se observe uma mutação nalgum ou na totalidade dos indivíduos atingidos mas não nos indivíduos normais, então a mutação provavelmente será o agente causador da doença.

As diferenças entre um gene referência e um gene tendo mutações podem ser reveladas pelo método de sequenciação directa. Ainda, os segmentos de DNA clonados podem ser empregues como sondas para detectar segmentos de DNA específicos. A sensibilidade deste método é grandemente aumentada quando combinado com PCR. Por exemplo, uma sequência iniciadora para sequenciação pode ser usada com o produto de PCR de cadeia dupla ou com uma molécula molde de cadeia simples gerada por um PCR modificado. A determinação da sequência é realizada por procedimentos convencionais usando nucleótidos marcados radioactivamente ou por processo de sequenciação automática usando marcas fluorescentes. 78 ΡΕ1287133

Os testes genéticos baseados em diferenças de sequências de DNA podem ser realizados através da detecção da alteração na mobilidade electroforética dos fragmentos de DNA em géis, com ou sem agentes desnaturantes. Pequenas deleções e inserções na sequência podem ser visualizadas, por exemplo, por electroforese em gel de alta resolução. Os fragmentos de DNA de sequências diferentes podem ser distinguidos em géis de gradiente de formamida desnaturantes, em que as mobilidades dos diferentes fragmentos de DNA são retardadas no gel em diferentes posições de acordo com as suas temperaturas de fusão específica ou de fusão parcial (ver, e.g., Myers et al., Science 230, 1242, 1985). Alterações na sequência em localizações específicas podem ser também reveladas por ensaios de protecção de nucleases, tais como protecção da Rnase e de SI ou pelo método da clivagem química (e.g., Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 4397-4401, 1985). Assim, a detecção de uma sequência de DNA específica pode ser realizada por métodos tais como hibridação, protecção de RNase, clivagem química, sequenciação directa de DNA ou a utilização de enzimas de restrição e transferência Southern do DNA genómico. Para além dos métodos directos, tais como electroforese em gel e sequenciação de DNA, as mutações podem ser igualmente detectadas por análise in situ. Níveis alterados de um GPCR podem ser detectados em vários tecidos. Os ensaios usados para detectar níveis dos polipeptídeos receptores numa amostra do corpo, como seja sangue ou uma biópsia de tecido, derivado de um 79 ΡΕ1287133 hospedeiro são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria e incluem radioimunoensaios, ensaios de ligação competitiva, análise de transferências Western e ensaios de ELISA.

Todas as patentes e pedidos de patentes referidos nesta divulgação são expressamente aqui incorporados pela referência. A descrição feita descreve de um modo geral o presente invento. Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência aos exemplos específicos que se seguem, os quais são proporcionados com fins ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o âmbito do invento. EXEMPLO 1

Detecção de actividade GPCR tipo dopamina 0 polinucleótido de SEQ ID N0:1 é inserido no vector de expressão pCEV4 e o vector de expressão pCEV4-polipeptideo GPCR tipo dopamina obtido é transfectado para células de rim embrionário humanas 293. As células foram raspadas de um frasco de cultura para 5 ml de Tris HC1, EDTA 5mM, pH 7,5 e lisadas por sonicação. Os lisados celulares foram centrifugados a 1000 rpm durante 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi centrifugado a 30000 xg durante 20 minutos a 4°C. O sedimento foi suspenso em tampão de ligação contendo Tris HC1 50 mM, MgS04 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5, suplementado com 0,1% BSA, 2 pg/m de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina e 10 pg/ml de 80 ΡΕ1287133 fosforamideto. As diluições óptimas da suspensão de membranas, definidas como a concentração proteica necessária para ligar menos de 10% de um ligando radioactivo 1 o c adicionado, i.e. dopamina marcada com I, foram adicionadas a placas de microtitulação de 96 alvéolos e polipropileno contendo ligando, peptideos não marcados e tampão de ligação para um volume final de 250 μΐ.

Os ensaios de ligação no equilíbrio de saturação, preparações de membrana foram incubados na presença de concentrações crescentes (0,1 nM a 4 nM) de ligando marcado

1 ? S com I.

As misturas de reacção da ligação foram incubadas durante uma hora a 30°C. A reacção foi parada por filtração através de filtros GF/B tratados com 0,5% de poli-etileneimina, usando um colector de células. A radioactivi-dade foi medida por contagem de cintilação e os dados foram analisados com um programa de regressão não linear computadorizado. A ligação não especifica é definida como a quantidade de radioactividade que permanece após incubação da proteína membranar na presença de 100 nM de peptídeo não marcado. A concentração proteica foi medida pelo método de Bradford usando Reagente Bio-Rad, com albumina séria bovina como padrão. A actividade de GPCR tipo dopamina do poli-peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 foi demonstrada. ΡΕ1287133 81 EXEMPLO 2

Ensaios de ligaçao de ligandos radioactivos Células de rim embrionário humano 293 trans-fectadas com um polinucleótido que expressam GPCR tipo DA humano foram raspadas do frasco de cultura para 5 ml de Tris HC1, EDTA 5mM, pH 7,5 e lisadas por sonicação. Os lisados celulares foram centrifugados a 1000 rpm durante 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi centrifugado a 30000 xg durante 20 minutos a 4°C. O sedimento foi suspenso em tampão de ligação contendo Tris HC1 50 mM, MgS04 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5, suplementado com 0,1% BSA, 2 pg/m de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina e 10 pg/ml de fosforamideto. As diluições óptimas da suspensão de membranas definidas como as concentrações proteicas necessárias para ligar menos de 10% de um ligando radioactivo adicionado, i.e. dopamina, foram adicionadas a placas de micro-titulação de 96 alvéolos e polipropileno contendo ligando marcado com 125i ou composto a testar, peptideos não marcados e tampão de ligação para um volume final de 250 μΐ. I-peptídeo 0,1 nM na

Nos ensaios de ligação no equilíbrio de saturação, preparações de membrana foram incubados na presença de concentrações crescentes (0,1 nM a 4 nM) de ligando marcado com I ou de composto a testar (actividade especifica 2200 Ci/mmol). As afinidades de ligação dos diferentes compostos a testar foram determinadas em ensaios de ligação por competição em equilíbrio, usando 125 82 ΡΕ1287133 presença de doze concentrações diferentes de cada composto a testar.

As misturas de reacção da ligação foram incubadas durante uma hora a 30°C. A reacção foi parada por filtração através de filtros GF/B tratados com 0,5% de poli-etileneimina, usando um colector de células. A radioacti-vidade foi medida por contagem de cintilação e os dados foram analisados com um programa de regressão não linear computarizado. A ligação não específica é definida como a quantidade de radioactividade que permanece após incubação da proteína membranar na presença de 100 nM de peptídeo não marcado. A concentração proteica foi medida pelo método de Bradford usando Reagente Bio-Rad, com albumina séria bovina como padrão. Um composto a testar que aumenta a radioactividade da proteína membranar em pelo menos 15%, relativamente à radioactividade da proteína membranar que não foi incubada com um composto a testar, foi identificado como um composto que se liga a um polipeptídeo GPCR tipo DA. EXEMPLO 3

Efeito de um composto a testar na formação de AMP cíclico mediada por GPCR tipo DA humano A inibição mediada por receptor da formação de cAMP pode ser testada em células hospedeiras que expressam 83 ΡΕ1287133 GPCR tipo DA. As células foram semeadas em placas de 96 alvéolos e incubadas em soro fisiológico tamponado com fos-fatos (PBS) de Dulbecco suplementado com HEPES 10 mM, teo-filina 5 mM, 2 pg/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina e 10 μg/ml de fosforamidon durante 20 minutos a 37°C em 5% CO2. Um composto a testar foi adicionado e incubado durante mais 10 minutos a 37°C. O meio foi aspirado e a reacção parada pela adição de HC1 100 mM. As placas foram guardadas a 4°C durante 15 minutos. O teor em cAMP na solução de paragem foi medido por radioimunoensaio. A radioactividade foi quantificada usando um contador gama equipado com programas de redução de dados. Um composto a testar que diminui a radioactividade do conteúdo de um alvéolo, relativamente à radioactividade do conteúdo de um alvéolo na ausência do composto a testar, foi identificado como um potencial inibidor da formação de cAMP. Um composto a testar que aumenta a radioactividade do conteúdo de um alvéolo, relativamente à radioactividade do conteúdo de um alvéolo na ausência do composto a testar, foi identificado como potencial estimulador da formação de CAMP. EXEMPLO 4

Efeito de um composto a testar na mobilização de cálcio intracelular A concentração de cálcio livre intracelular pode 84 ΡΕ1287133 ser medida por microespectrofluorometria usando o corante indicador fluorescente Fura-2/ΑΜ (Bush et al., J. Neu-rochem. 57, 562-74, 1991) . Células estavelmente transfec-tadas foram semeadas numa placa de cultura de 35 mm contendo uma lamela de vidro. As células foram lavadas com HBS, incubadas com um composto a testar, e colocadas em 100 μΐ de Fura-2/ΑΜ (10 μΜ) durante 20-40 minutos. Após lavagem com HBS para remover a solução de Fura-2/ΑΜ, as células foram equilibradas em HBS durante 10-20 minutos. As células foram então visualizadas sob uma objectiva de 40X de um microscópio Leitz Fluovert FS. A emissão de fluorescência foi determinada a 510 nM, com comprimentos de onda de excitação alternando entre 340 nM e 380 nM. Os dados de fluorescência foram convertidos em concentrações de cálcio usando curvas padrão de concentração de cálcio e técnicas de análise de programas. Um composto a testar que aumenta a fluorescência em pelo menos 15%, relativamente à fluorescência na ausência de um composto a testar, foi identificado como um composto que mobiliza cálcio intracelular. EXEMPLO 5

Efeito de um composto a testar no metabolismo de fosfoinositido

As células que estavelmente expressam cDNA de GPCR tipo DA humano foram semeadas em placas de 96 alvéolos 85 ΡΕ1287133 e crescidas até à confluência. No dia antes do ensaio, o meio de crescimento foi mudado para 100 μΐ de meio contendo 1% de soro e 0,5 pCi e 3H-minositol. As placas foram incubadas durante a noite numa estufa de C02 (5% C02 a 37°C). Imediatamente antes do ensaio, o meio foi removido e substituído por 200 μΐ de PBS contendo LiCl 10 mM e as células foram equilibradas com novo meio durante 20 minutos . Durante este intervalo, as células foram também equilibradas com antagonista, adicionadas como uma aliquota de uma solução 20 vezes concentrada em PBS. A acumulação de fosfato de 3H-inositol a partir do metabolismo do fosfolipido inositol foi iniciada pela adição de 10 μΐ de uma solução contendo um composto a testar. Ao primeiro alvéolo foram adicionados 10 μΐ para medir a acumulação basal. Onze concentrações diferentes do composto a testar foram testadas nos 11 alvéolos seguintes de cada fila da placa. Todos os ensaios foram realizados em duplicado repetindo as mesmas adições em duas filas consecutivas da placa.

As placas foram incubadas numa estufa de C02 durante uma hora. A reacção foi parada pela adição de 15 μΐ de 50% v/v de ácido tricloroacético (TCA), seguido de uma incubação de 40 minutos a 4°C. Após neutralização do TCA com 40 μΐ de Tris 1M, o conteúdo dos alvéolos foi transferido para uma placa de filtros Multiscreen hv (Millipore) contendo Dowex AG1-X8 (200-400 mesh, forma de formato). As placas com filtro foram preparadas pela adição 86 ΡΕ1287133 de 200 μΐ de suspensão Dowex AG1-X8 (50% v/v, águarresina) a cada alvéolo. As placas com filtro foram colocadas num sistema de vácuo para lavar ou eluir a cama de resina. Cada alvéolo foi lavado 2 vezes com 200 μΐ de água, seguido de 2 x 200 μΐ de tetraborato de sódio 5 mM/formato de amónio 60 mM.

Os 3h-ips foram eluídos para placas de 96 alvéolos vazias com 200 μΐ de formato de amónio l,2M/ácido fórmico 0,1M. O conteúdo dos alvéolos foi adicionado a 3 ml de líquido de cintilação e a radioactividade foi determinada por contagem de cintilação líquida. EXEMPLO 6 Métodos de ligação ao receptor

Ensaios de ligação convencionais. Os ensaios de ligação foram realizados num tampão de ligação contendo HEPES 50 mM, pH 7,4, 0,5% de BSA e MgCl2 5 mM. O ensaio

convencional para a ligação de ligandos radioactivos a fragmentos de membranas compreendendo polipeptideo GPCR tipo DA foi realizado como se segue em placas de micro-titulação de 96 alvéolos (e.g., Dynatech Immulon II

Removawell). O ligando radioactivo foi diluído em tampão de ligação + PMSF/Baci para os cpm pretendidos por 50 μΐ, depois alíquotas de 50 μΐ foram adicionadas aos alvéolos. Para as amostras de ligação não específica, 5 μΐ de ligando frio 40 μΜ foram também adicionados por alvéolo. A ligação 87 ΡΕ1287133 foi iniciada pela adição de 150 μΐ por alvéolo de membranas diluidas para a concentração pretendida (10-30 μρ de proteína membranar/alvéolo) em tampão de ligação + PMSF/Baci. As placas foram então cobertas com membrana Limbro para selar as placas (Flow Labs) e colocadas num Dynatech Microshaker II. A ligação decorreu à temperatura ambiente durante 1-2 horas e foi parada por centrifugação da placa durante 15 minutos a 2000 xg. Os sobrenadantes foram decantados e os sedimentos de membranas foram lavados uma vez pela adição de 200 μΐ de tampão de ligação arrefecido em gelo, agitação rápida e nova centrifugação. Os alvéolos individuais foram colocados em tubos de 12 x 75 mm e contados num contador Gammamaster LKB (78% de eficiência). A ligação especifica por este método é idêntica à medida quando o ligando livre é removido por filtração rápida (3-5 segundos) e lavagem em filtros de fibra de vidro revestidos com polietileneimina.

Foram também usadas três variações do ensaio de ligação convencional. 1. Ensaios de ligação competitivos com ligandos radio-activos com uma gama de concentração de ligando frio vs. ligando marcado com 125I foram realizados como descrito atrás com uma modificação. Todas as diluições dos ligandos a serem testados foram feitas em 40x PMSF/Baci para uma concentração de 40X a concentração final no ensaio. As amostras de peptideo (5 μΐ de cada) foram então adicionadas a ΡΕ1287133 cada alvéolo de microtitulação. As membranas e ligandos radioactivos foram diluídos em tampão de ligação sem inibidores de proteases. 0 ligando radioactivo foi adicionado e misturado com ligando frio e depois a ligação foi iniciada pela adição de membranas. 2. A ligação química cruzada de ligando radioactivo ao receptor foi realizada após um passo de ligação idêntico ao do ensaio convencional. No entanto, o passo de lavagem foi realizado com tampão de ligação sem BSA para reduzir a possibilidade de ligação cruzada não específica do ligando radioactivo a BSA. 0 passo de ligação cruzada foi realizado como descrito abaixo. 3. Os ensaios de ligação em escala maior para obtenção de sedimentos de membranas para estudos sobre solubilização do complexo receptor:ligando e para a purificação do receptor foram igualmente realizados. Estes são idênticos aos ensaios convencionais excepto (a) a ligação ser efectuada em tubos de polipropileno em volumes de 1-250 ml, (b) a concentração da proteína membranar ser sempre 0,5 mg/ml e (c) para a purificação do receptor, a concentração de BSA no tampão de ligação ser reduzida para 0,25% e o passo de lavagem ser feito com tampão de ligação sem BSA, o que reduz a contaminação com BSA do receptor purificado. ΡΕ1287133 89 EXEMPLO 7

Ligação química cruzada de ligando radioactivo ao receptor

Após um passo de ligação de ligando radioactivo como descrito atrás, os sedimentos de membranas foram ressuspensos em 200 μΐ de microtitulação de tampão de ligação, arrefecido em gelo, sem BSA, por alvéolo de placa. Em seguida, adicionou-se 5 μΐ por alvéolo de N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOS, Pierce)4 mM em DMSO e misturou-se. As amostras foram mantidas em gelo e irradiadas com UV durante 10 minutos com uma lâmpada Mineralight R-52G (UVP Inc., San Gabriel, Calif.) a uma distância de 5-10 cm. Em seguida, as amostras foram transferidas para tubos de microcentrífuga Eppendorf, as membranas sedimentadas por centrifugação, os sobrenadantes removidos e as membranas solubilizadas em tampão de amostra de Laemmli com SDS para electroforese em poliacrilamida (PAGE). Realizou-se PAGE como descrito abaixo. As proteínas marcadas radioactivamente foram visualizadas por autorra-diografia dos géis secos com filme Kodak XAR e écrans intensificadores de imagens DuPont. EXEMPLO 8

Solubilizaçao de membranas A solubilização de membranas foi realizada em tampão contendo Tris 25 mM, pH 8, 10% glicerl (p/v) e CaCl2 90 ΡΕ1287133 0,2 mM (tampão de solubilização). Os detergentes altamente solúveis incluindo Triton X-100, desoxicolato, desoxico-lato:lisolecitina, CHAPS, e zuitergente foram preparados em tampão de solubilização em concentrações de 10% e guardados como aliquotas congeladas. A lisolecitina foi preparada de fresco devido à insolubilidade quando da congelação-descongelação e a digitonina foi preparada de fresco em concentrações mais baixas devido à sua solubilidade mais limitada.

Para solubilizar membranas, os sedimentos lavados após o passo de ligação foram suspensos, sem partículas visíveis por pipetagem e vortex, em tampão de solubilização a 100000 xg durante 30 minutos. Os sobrenadantes foram removidos e mantidos em gelo e os sedimentos foram rejeitados . EXEMPLO 9

Ensaio de receptores solubilizados

Após ligação dos ligandos marcados com 125I e solubilização das membranas com detergente, o complexo intacto R:L pode ser testado por quatro métodos diferentes. Todos foram realizados em gelo ou numa câmara fria a 4-10°C). 1. Cromatografia em coluna (Knuhtsen et al., Biochem. J. 254, 641-647, 1988). Colunas Sephadex G-50 (8 x 250 mm) foram equilibradas com tampão de solu- 91 ΡΕ1287133 bilização contendo detergente na concentração usada para solubilizar membranas e 1 mg/ml de albumina sérica bovina. Amostras de membranas solubilizadas (0,2-0,5 ml) foram aplicadas nas colunas e eluídas num fluxo de aproximadamente 0,7 ml/minuto. As amostras (0,18 ml) foram colhidas. A radioac-tividade foi determinada num contador gama. Os volumes vazios das colunas foram determinados pelo volume de eluição de azul dextrano. A radioacti-vidade que eluiu no volume vazio é considerada ligada a proteína. A radioactividade que eluiu mais tarde, no mesmo volume dos ligandos livres marcados com 125I, é considerada não ligada. 2. Precipitação com polietilenoglicol (Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 318-322, 1972). Para uma amostra de 100 μΐ de membranas solubilizadas num tubo de polipropileno de 12 x 75 mm, adicionou-se 0,5 ml de gama globulina bovina a 1% (p/v) (Sigma) em tampão de fosfato de sódio 0,1M, seguido de 0,5 ml de polietilenoglicol a 25% (p/v) (Sigma) e mistura. A mistura foi mantida em gelo durante 15 minutos. Depois adicionou-se 3 ml de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,4, por amostra. As amostras foram rapidamente (1-3 segundos) filtradas através de filtros de fibra de vidro Whatman GF/B e lavados com 4 ml de tampão de fosfatos. O complexo receptor precipitado com PEG:ligando marcado com 125I foi determinado por contagem gama dos filtros. 92 ΡΕ1287133 3. Ligação a filtros GFB/PEI (Bruns et al., Analytical Biochem. 132, 74-81, 1983). Os filtros de fibra de vidro Whatman GF/B foram embebidos em 0,3% de polietleneimina (PEI, Sigma) durante 3 horas. Amostras de membranas solubilizadas (25-100 μΐ) foram novamente colocadas em tubos de polipropileno de 12x75 mm. Em seguida adicionou-se, por amostra, 4 ml de tampão de solubilização sem detergente e as amostras foram imediatamente filtradas através de filtros GFB/pei (1-3 segundos) e lavadas com 4 ml de tampão de solubilização. Os CPMs do complexo receptor: ligando marcado com 125I adsorvido a filtros foram determinados por contagem gama. 4. Carvão/Dextrano (Paul and Said, Peptides 7 [Suppl. 1], 147-149, 1986). Dextran T70 (0,5 g Pharmacia) foi dissolvido em 1 litro de água, depois adicionou-se 5 g de carvão activado (Norit A, alcalino; Fisher Scientific). A suspensão foi agitada durante 10 minutos à temperatura ambiente e depois guardada a 4°C até ser usado. Para medir o complexo R:L, 4 partes por volume de suspensão carvão/dextrano foram adicionados a 1 parte por volume de membrana solubilizada. As amostras foram misturadas e mantidas em gelo durante 2 minutos e depois centrifu-gadas durante 2 minutos a 11000 xg numa microcen-trífuga Beckman. O ligando marcado radioactivamente livre foi adsorvido a carvão/dextrano e rejeitado 93 ΡΕ1287133 com o sedimento. Os complexos receptor:ligando 1 p c marcado com I permaneceram no sobrenadante e foram determinados por contagem gama. EXEMPLO 10

Purificação de receptores A ligação de biotinil-receptor a membranas GH4 Cl foi realizada como descrito atrás. As incubações são durante 1 hora à temperatura ambiente. No protocolo de purificação convencional, as incubações de ligação possuem Bio-S29 10 nM. O ligando marcado com 125I foi adicionado como um marcador em niveis de 5000-100000 cpm por mg de proteina membranar. As incubações controlo contêm ligando frio 10 μΜ para saturar o receptor com ligando não biotinilado. A solubilização do complexo receptor:ligando também é realizada como descrito atrás, com 0,15% de desoxi-colato:lisolecitina em tampão de solubilização contendo MgCl2 0,2mM, para se obter sobrenadantes de 100000 xg contendo o complexo R:L solubilizado. A estreptavidina imobilizada (estreptavidina ligada de forma cruzada a 6% de esferas de agarose, Pierce Chemical Co.; "AS-agarose") foi lavada em tampão de solubilização e adicionada a membranas solubilizadas como 1/30 do volume final. Esta mistura foi incubada com agitação 94 ΡΕ1287133 constante por rotação de extremo a extremo durante 4-5 horas a 4-10°C. Em seguida a mistura foi aplicada numa coluna e o material não ligado foi lavado. A ligação de ligando radioactivo a AS-agarose foi determinada por comparação dos cpm no sobrenadante de 100000 xg como os do efluente da coluna após adsorção a AS-agarose. Finalmente, a coluna foi lavada com 12-15 volumes da coluna de tampão de solubilização + 0,15% de desoxicolato:lisolecitina + 1/500 (vol/vol) 100 x 4 pase. A coluna de estreptavidina foi eluida com tampão de solubilização + EDTA 0,1 mM + EGTA 0,1 mM + GTP-gama-S 0,1 mM (Sigma) + 0,15% (p/v) desoxicolato:lisolecitina + 1/1000 (v/v) 100 vezes 4pase. Primeiro, um volume da coluna de tampão de eluição foi passado através da coluna e o fluxo parado durante 20-30 minutos. Em seguida 3-4 vezes mais volumes da coluna de tampão de eluição foram passados através da mesma. Todos os eluatos foram reunidos.

Os eluatos da coluna de estreptavidina foram incubados durante a noite (12-15 horas) com aglutinina de gérmen de trigo imobilizada (WGA agarose, Vector Labs) para adsorver o receptor via interacção do açúcar ligado covalentemente com a lectina WGA. A proporção (v/v) de WGA-agarose relativamente ao eluato da coluna de estreptavidina é de um modo geral 1:400. Uma gama de 1:1000 a 1:200 também pode ser usada. Após o passo de ligação, a resina foi sedimentada por centrifugação, o sobrenadante foi removido e guardado e a resina foi lavada 3 vezes (cerca de 2 95 ΡΕ1287133 minutos cada) em tampão contendo 50 mM HEPES, pH 8, MgCl2 5 mM e 0,15% de desoxicolaro:lisolecitina. Para eluir o receptor ligado a WGA, a resina foi extraída três vezes misturando repetidamente (mistura com vortex a baixa velocidade) durante um período de 15-30 minutos em gelo, com 3 volumes da coluna de resina de cada vez de Ν-Ν'-Ν''-triacetilquitotriose 10 mM no mesmo tampão HEPES usado para lavar a resina. Após cada passo de eluição, a resina foi centrifugada e o sobrenadante foi cuidadosamente removido sem sedimentos de WGA-agarose. Os três eluatos reunidos contêm o receptor final purificado. O material não ligado a WGA contendo subunidades de proteína G eluiu especifi-camente da coluna de estreptavidina, assim como os contaminantes não específicos. Todas as fracções foram guardadas congeladas a -90°C. EXEMPLO 11

Identificação dos compostos a testar que se ligam a polipeptídeos GPCR tipo DA

Os polipeptídeo DA-GPCR purificados compreendendo uma proteína glutationa-S-transferase e adsorvidos a placas de microtitulação de 96 alvéolos derivatizados com gluta-tiona foram colocados em contacto com os compostos a testar derivados de uma biblioteca de pequenas moléculas a pH 7,0 numa solução tampão fisiológico. Os polipeptídeos DA-GPCR compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO.2. Os compostos a testar compreendem uma marca fluores- 96 ΡΕ1287133 cente. As amostras foram incubadas durante 5 minutos a uma hora. AS amostras de controlo foram incubadas na ausência de um composto a testar. A solução tampão contendo os compostos a testar foi lavada dos alvéolos. A ligação do composto a testar a um polipeptideo GPCR tipo DA foi detectada medindo a fluorescência dos conteúdos dos alvéolos. Um composto a testar que aumenta a fluorescência num alvéolo em pelo menos 15%, relativamente à fluorescência de um alvéolo em que um composto a testar não é incubado, foi identificado como um composto que se liga a um polipeptideo GPCR tipo DA. EXEMPLO 12

Identificação de um composto a testar que diminui a expressão do gene GPCR tipo DA

Um composto a testar foi administrado a uma cultura de células gástricas humanas e incubado a 37°C durante 10 a 45 minutos. Uma cultura do mesmo tipo de células incubada durante o mesmo tempo sem o composto a testar proporciona um controlo negativo.

Foi isolado RNA a partir de duas culturas como descrito em Chirgwin et al., Biochem. 18, 5294-99, 1979). As transferências Northern foram preparadas usando 20 a 30 μρ de RNA total e hibridadas com uma sonda específica de GPCR tipo DA marcada com 32P a 65 °C em Express-hyb (CLONTECH). A sonda compreende pelo menos 11 nucleótidos 97 ΡΕ1287133 contíguos seleccionados do complemento de SEQ ID N0.1. Um composto a testar que diminui o sinal específico de GPCR tipo DA, relativamente ao sinal obtido na ausência do composto a testar, é identificado como um inibidor da expressão do gene GPCR tipo DA. EXEMPLO 13

Tratamento de esquizofrenia com um reagente que especificamente se liga a um produto do gene GPCR tipo DA A síntese de oligonucleótidos GPCR tipo DA compreendendo pelo menos 11 nucleótidos contíguos seleccionados do complemento de SEQ ID N0.1 é realizada num sintetizador da série Pharmacia Gene Assembler usando o método de fosforamideto (Uhlmann et al.r Chem. Ver. 90, 534-83, 1990). Após montagem e desprotecção, os oligonucleótidos são precipitados duas vezes com etanol, secos e suspensos em soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS) na concentração pretendida. A pureza destes oligonucleótidos foi testada por electroforese em gel em capilares e HPLC de permuta iónica. Os níveis de endotoxina na preparação de oligonucleótidos foram determinados usando o Ensaio de Amebócitos de Limulus (Bang, Biol. Buli. (Woods Role, Mass.) 105, 361-362, 1953).

Os oligonucleótidos "antisense" foram administrados a um doente com esquizofrenia. A gravidade da da esquizofrenia do doente foi minorada. ΡΕ1287133 98 EXEMPLO 14

Análise de ligação do ligando Células COS-7 foram colhidas 48 a 72 horas após transfecção com construções de expressão de GPCR tipo DA humano. As células contidas em frascos de cultura (75 cm2) foram lavadas com 5 ml de tampão de lise (Tris-HCl 10 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4). As células foram então raspadas e homogeneizadas em tampão de lise durante 15 segundos usando um homogeneizador Brinkman. As membranas foram centri-fugadas a 50000 xg durante 20 minutos e o sedimento foi ressuspenso em tampão de ligação (Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4). Os estudos de ligação em saturação foram realizados com concentrações crescentes de [125I]SCH 23982 (2200 Ci/mmol; 1 Ci=37 GBq). As curvas de competição foram realizadas com concentrações crescentes da droga não marcada em estudo contra uma concentração constante de [125I]SCH 23982 (aproximadamente 0,20 nM) . A reacção foi iniciada pela adição de 100 μΐ de membranas (aproximadamente 0,45 pg de proteína) e a mistura de ensaio foi incubada num volume final de 200 μΐ durante 1 hora à temperatura ambiente. As misturas de ensaio foram então filtradas sob vácuo através de filtros de fibra de vidro Whatman GF/C e lavados 3 vezes com 5 ml de tampão de lavagem frio (Tris HC1 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,2). A ligação total e a não específica foram delineadas na ausência e na presença de cis-flupentixol 10 μΜ. Cada uma das 99 ΡΕ1287133 determinações foi feita em triplicado. A radioactividade ligada foi medida com uma eficiência de 75% usando um contador gama (instrumentos LKB). As curvas de ligação foram analisadas usando programas de regressão não linear múltipla. Ver DeLean et al., Mo. Pharmacol. 21, 5-16 (1982); McPherson, J. Pharmacol. Methods 14, 213-228 (1985) .

Cis-flupentixol, cis-piflutixol, cis-teflutixol podem ser adquiridos a Lundbeck (Denmark). Fluperlapina pode ser adquirida a Novo Nordisk (Bagsvaerd, Denmark). SCH 23388 and SCH 23390 podem ser adquiridos à Schering Plough (Bloomfield, N.J.) Apomorfina, ((+)butaclamol, cloreto de dopamina, haloperidol, R(-)-propilnorapomorfina (NPA) e espirenona podem ser comprados à Research Biochemical Insdustries (RBI). Fenoldopam e SKF 38393 podem ser obtidos da Smith, Kline & French. [125I]SCH 23982 foi da New England Nuclear Boston, Mass.). EXEMPLO 15

Expressão específica de tecido de GPCR tipo

Dopamina O perfil de expressão de GPCR tipo Dopamina por PCR quantitativo em tempo real com amostras de RNA derivadas de tecido estabelece um papel para GPCR tipo Dopamina em doença humana. O painel consiste em RNA total derivado de cérebro, cérebro de Alzheimer total, cérebro fetal, 100 ΡΕ1287133 cerebelo, espinal medula, coração, coração fetal, pericárdio, células do músculo liso das coronárias, tiróide, tumor da tiróide, baço, baço (de um doente com cirrose do fígado), timo, medula óssea, pulmão, pulmão fetal, tumor do pulmão, fígado, fígado fetal, fígado (de doente com cirrose do fígado), pâncreas, pâncreas (de doente com cirrose do fígado! ), estômago, intestino delgado, cólon, tumor do cólon, rim, músculo esquelético, células HeLa, tumor da mama, glândula mamária, células MDA MB 231, testículo, traqueia, glândula supra-renal, glândula salivar, bexiga, próstata, placenta, úteo, tecido adiposo. Um desenvolvimento da análise cinética de PCR está descrito em Higuchi et al., BioTechnology 10, 413-17, 1992 e Higuchi et ai., BioTechnology 11, 1026-30, 1993. O princípio é que em qualquer ciclo determinado dentro da fase exponencial do PCR, a quantidade de produto é proporcional ao número inicial ao número inicial de cópias de molde. A amplificação por PCR é realizada na presença de uma sonda oligonucleotídica (sonda TaqMan) que é complementar da sequência alvo e marcada com um corante repórter fluorescente e de um corante abafador. Durante a fase de extensão do PCR, a sonda é clivada pela actividade de endonuclease 5'-3' da DNA polimerase Taq, libertando o fluoróforo do efeito do corante abafador (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 88, 7276-80, 1991). Devido à emissão de fluorescência aumentar na proporção directa da quantidade de produto amplificado específico, a fase de crescimento exponencial do produto de PCR pode ser 101 ΡΕ1287133 detectada e usada para determinar a concentração de molde inicial (Heid et al., Genome Res. 6, 986-94, 1996 e Gibson et al., Genome Res. 6, 995-1001, 1996). PCR em tempo real quantitativo foi realizado usando um detector de sequências ABI Prism 7700. O valor Ct gerado para cada reacção é usado para determinar a concentração de molde inicial (número de cópias) por interpolação a partir de uma curva padrão universal. O nível de expressão do gene alvo em cada amostra é calculado relativamente à amostra com a expressão mais baixa do gene.

Extracção de RNA e preparação de cDNA. O RNA total de cada um dos tipos celulares apresentados atrás foi isolado usando o sistema Qiagen's Rneasy de acordo com o protocolo do fabricante (Crawley, West Sussex, UK). A concentração de RNA purificado foi determinada usando um kit de quantificação de RNA RiboGreen (Molecular Probes Europe, The Netherlands) . Para a preparação de cDNA, 1 pg de RNA total foi sujeito a transcrição reversa num volume final de 20 μΐ, usando 200 U de SUPERSCRIPT™ RNase H-Reverse Transcriptase (Life Technologies, Paisley, UK), ditiotreitol 10 mM, 0,5 mM de cada dNTP e hexâmeros ao acaso 5 μΜ (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, UK) de acordo com o protocolo do fabricante.

Análise quantitativa de TaqMan. Sequências iniciadoras e sonda específicas foram projectadas de acordo com as recomendações de PE Applied Biosystems; usou-se uma 102 ΡΕ1287133 sonda marcada com FAM (6-carboxi-fluoresceína) . O PCR de quantificação foi realizado com 5 ng de RNA sujeito a transcrição reversa a partir de cada uma das amostras. Cada uma das determinações foi feita em duplicado. A mistura de reacção do ensaio foi como se segue: TaqMan Universal PCR Master Mix lx final (a parir de uma solução padrão 2X) (PE Applied Biosystems, CA); sequência iniciadora directa 900 nM, sequência iniciadora reversa 900 nM, ; sonda 200 nM, 5 ng de cDNA; e água para 25 μΐ.

Cada um dos passos que se segue foi realizadoo uma vez: pré-PCR, 2 minutos a 50°C e 10 minutos a 95°C. Os passos que seguem foram realizados 40 vezes: desnaturação, 15 segundos a 95°C, emparelhamento/extensão, 1 minuto a 60°C.

Todas as experiências foram realizadas usando um detector de sequências ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, CA) . No final da corrida, os dados de fluorescência adquiridos durante o PCR foram processados como descrito no manual de utilizador ABI Prism 7700 para se conseguir uma melhor subtracção do fundo, assim como linearidade de sinal, com a quantidade de partida do alvo. A Tabela 1 mostra os resultados do perfil de expressão de GPCR tipo Dopamina usando a célula indicada e as amostras de tecido. O resultado está apresentado graficamente na Fig. 5. Foi detectada expressão relativa elevada no cérebro de Alzheimer comparado com cérebro 103 ΡΕ1287133 normal e em tecido de cancro comparado com o tecido correspondente normal.

Tabela 1: tecido Ex rei tecido Ex rei 1. cérebro 0,00 22. pâncreas 240,57 2. Cérebro de Alzheimer total 379,60 23. Pâncreas cirrose do fígado 14, 47 3. Cérebro fetal 13,39 24. Estômago 160,85 4. Cerebelo 0,00 25. Intestino delgado 234,24 5. Espinal medula 2,52 26. Cólon 56,98 6. Coração 0,00 27. Tumor do cólon 200,85 7. Coração fetal 1,14 28. Rim 38,63 8. Pericárdio 16,24 29. Músculo esquelético 144,79 9. Células do músculo liso coronário 578,70 30. Células HeLa 1,96 10. Tiróide 0,00 31. Tumor da mama 300,25 11. Tumor da tiróide 7,34 32. Glândula mamária 17, 44 12. Baço 199,84 33. Células MDA MB 231 34,54 13. Baço cirrose do fígado 1,00 34. Testículo 124,01 14. Timo 0,00 35. Traqueia 0,00 15. Medula óssea 0,00 36. Glândula supra-renal 0,00 16. Pulmão 62,50 37. Glândula salivar 0,00 17. Pulmão fetal 10,18 38. Bexiga 0,00 18. Tumor do pulmão 393,89 39. Próstata 10,37 19. Fígado 60,83 40. Placenta 0,00 20. Fígado fetal 636,96 41. Útero 2499,15 21. Fígado cirrose do fígado 628,89 42. Adiposo 11,00 ΡΕ1287133 104

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Bayer AG

<120> REGULAÇÃO DO RECEPTOR ACOPLADO A PROTEÍNA G TIPO DOPAMINA HUMANO <130> REGULAÇÃO DO TIPO DOPAMINA HUMANA <140> < 141 > <150> 60/205,195 <151> 2000-05-18 <160> 3 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1

< 211> 108 <212> DNA <213> Humano <400> 1 «tggaafcca* ctttcfecâtt tgçagigstc çtfcgctgtsc tggcctccct cafecattgct €0 aciaacacac tagtggctgt ggctgtgctg ctgttgatcc acaagaafcga tgçtgfccagt 120 ctctgcttca ccttgaatct ggetgfcggct gacaeettga ttggtgtggc catcfcctggc 180 ctactcacag aceagctctc oagcccttct cggcccaeac agaagaccct gtgcagcotg 240 cgíjátggcât ttgtcaettc etccgeagct gcctetgtcc teaeggtcat gctgatcâec 300 ttfegacaggt acçttgcóâfe ea&geagecc ttccgctaet tgaagatcat gagtgggttc 360 gfcggccgggg cctgcattgc cgggctgtçg ttagtgtctt acctcattgg cttcctccca 429 ctcggaatcc ceatgttcoa gcagactgcc taoaaagggc agfcgeaçctt ctttgctgta 480 tttcacccic acttcgtgct gsecetctcc tgegttggct tctfccccagc catgctcetc 540 tttgtcttct tcfcactgcga c&tgctcaag afctgcctcca tgcacagcca gcagattçga 600 aagstgçaas atgcaggagç catggctgga ggttafccgat ixccacggac tcccagcgac 660 ttcaaagctc tccgfcactgt gfcctgttctc attgçgagcfc ttgctctatc ctggaccccc 720 tteettatea ctggcattgt gcaggtggcc tgccagçagt gtcacctcta eetagtgetg 780 gaacggtacc tgtggctgcr cggcgtgggc aactccctgc tcaacecact catctabgsc 840 tatfcggcaga aggaggtgcg actgcagcrtc taeeacatgg ccctaggagt gaagaaggtg 900 ctcaccfccet tcctcctcbt tóccteggcc aggaattgtg gcccagagag gcccsagggaa 960 açttcctgtc acatcgtçaç tatctccagc tcagagrtttg atggctaa 1008 < 210 > 2 <211> 335 <212> PRT <213> Humano 105 ΡΕ1287133 < 4 0 0 > 2

Mst <àl\j Ser Ser Phe Ser Phe Gly Vai Ile Leu Ma Vai Leu Ala Ser 1 5 10 15

Lee Ile II* Ala Thr Asn Thr leu Vsl Ma Vai Ala Vai Leu Leu Leu 20 25 30

Ile His Lys As» Asp Sly Vai Ser Leu Cys Phe Thr Leu Asn Leu Ma 35 4Q: 45

Vai Ma Asp Thx Leu Ile Sly Vai Ala Ile Ser Sly Leu Leu Thr Asp 50 55 60 61 n Leu Ser Ser Pr<s Ser Arg Pro Thr Gin Lys Thr Leu Cys Ser Leu 65 70 75 m

Arç Met Ma Phe Vai Tfer Ser Ser Ala Ala Ala Ser Vai Leu Thr Vai SS 90 95

Mefc Leu Ile Thr Phe Asp Arg Tyr Leu Ala lie Lys Gin Pró Ph$ ftrg 100 105 110

Tyr leu Lys Ile ttet Ser Gly ?he Vai Ala Gly Ma Cys Ile Ma Gly 115 120 J25

Leu Trp Leu Vai Ser Tyr Leu Ile Gly Phe Leu Pro leu Gly Ile Pro 130 135 140

Mefc Phe Gin Gin Thr Ma Tyr Lys Gly Gin Cys Ser Phe Phe Ma Vai 145 150 155 150

Phe Pis Pro His Phe Vai .Leu Thr Leu Ser Cys Vai Gly Phe Phe Pr© 165 170 175

Ala Mefc Len Leu Phe Vai Phe Phe Tyr Cys Asp Met Leu Lys ile Ala 180 185 190

Sei Met His Ser Gin Sln Ile Arg Lys Met Glu His Ala Sly Ma Met 195 200 205

Ala Gly Sly Tyr Arg Ser Pro Arg Thr Pro Ser Asp Phe Lys Ala Lea 210 215 220

Arg Thr Vai Ser Vai Lea tle Gly Ser Pàs Ala teu Ser Trp Thr Pro 225 230 235 240

Phe Le» Ile Thr 6ly Ile Vai Sl» Vai Ala Cys Gin Glu Cys His Leu 245 250 255 106 ΡΕ1287133

Tyr leu Vai Leu €1» Arg Tyr Leu Txp Leu Leu Sly Vai Sly Asa Ssr 260 26$ 270 lea L«u Aâft Pro Leu Jla fvx Ma Tyr fzp Gin Lys Glu Vai Arg Leu 275 250 285

Gin Leu Tyr Ris Met Ala Leu çjy Vai Lys lys Vai Leu Thr Ser Phe 290 295 3ãá

Leu Leu Phe Leu Ser Ala Arç Asn Cys Gly Pro Glu Arg Pro Arg Glu 305 310 315 320

Ser Ser Cys Bis Xle Vai Thr Ile Ser Ser Ser Glu Pbe Asp Gly 325 330 335 <210> 3 <211> 451 <212 > PRT <213> Humano < 4 0 0 > 3

Met Tyr Thr Pr© Bis Pro Çhe Gly Phe Leu Ile 11a Leu Vai Pro Met 1 5 10 15

Thr Ass Ala Met Arg Ala Ile Ala Ala Jle Ala Ala Gly Vai Gly Ser 20 25 30

Vai Ala Ala Thr Vai Ala Thr Ser Thr Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ser 35 40 45

Thr Thr Ile Ile Asa Thr Ser Ser Ala Thr Thr Ile Gly Gly Asn Kis 50 55 60

Thr Ser Gly Ser Thr Gly Phe Ser Thr Asa Ser Thr Leu Leu Asp Ais. 5$ 70 75 80

Asp His Leu Pro Leu Gin Leu Thr Thr Ala Lys Vai Asp Leu Asp Ile 85 90 35

Glu ile Asp lie Gin Leu Leu Thr As» Sty tyr Asp Gly Th* Th* heu. 100 105 110

Thr Ser Phe Tyr Asa Glu Ser Ser Trp Thr Asn Ms Ser Glu Met Asp 1,15 120 125

Thr Ile Vai Gly Glu Glu Pro Glu Pro Leu Ser Leu Vai Ser Ila Vai 107 ΡΕ1287133

Vai Vai Giy Xle irhe Leu Ser Vai Leu Ile Phe Leu $er Vai Ala Sly

145 150 155 ISO

Aso lie Leu Vai Cy* Leu Ala Lis Tyr Thr Asp Gly Ser Leu Pro Arg lfiS 170 175 11« Sly Asn Leu Phô Leu Ala Ser Leu Ala Ile Ala Asp Leu p.h© Vai 180 185 190

Ala Sex Leu Vai Met Thr Fhs Ala Gly vai Aso Asp Leu Leu Gly Tyr 195 200 205 T:rp Ile Phe Gly Ala Gin Ffee Cys Asp Thr Vrp Vai Ala Phe Asp Vai 210 215 220

Mei Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Ala jjç Ser Met Asp 225 230 235 240

Arg Tyr Ile Ris Ile Lys Asp Pro Leu Arg fyr Sly Arg Trp Vai Thr 245 250 255

Arg Arg Vai Ala Vai Ile T.h.r Ile Ala Ala 11« Trp Leu Leu Ale .Ale 250 255 270

Phe Vai Ser Phe Vai Pro Ile Ser Leu Sly Ile Eis Arg Pro Asp <3l» 27S 280 285

Pro Leu Ile Phe Slu Asp Asn Sly Ly« Lys Tyr Pro Thr Cye Ala Leu 290 2S5 300

Asp Leu Thr Pro Thr Tyr Ala Vai Vai Ser Ser Cys Ile Ser Phe Tyr 305 310 315 320

Phe Pro Cys Vai Vai Ket 11« Sly 11® Tyr Cys Axg Leu Tyr Cys Tyr 325 330 335

Ala Gin Lys His Vai Lya Ser 11« Lys Ala Vai Thr Arg Pro Gly Glu 340 345 350

Vai Ala 01« Lys Gin Arg Tyr Lys Ser 11« Arg Arg Pro Lys Asn Gin 355 3 50 385

Pro Lys Lys Phe Lys Vai Arg Asn Leu His Thr Eis Ser Ser Pro Tyr 370 375 380

Ris Vai Ser Asp His Lys Ala Ala Vai Thr Vai Sly Vai Ile Het Gly 108 ΡΕ1287133

Vai Leu lia Cys Trp Vai Pro Pfce Pfce Cys Vai Ãsn Ile fhx Ala 405 410 415

Ala Phe Cys Lys Ser Asp Arg Phe Ile Thr Asp Tyr Ala Ma Lys Mn 420 425 430 vai

Vai Vai 435

Met Asn.

Gly Ãxg S? 440

Ser Ala 3

Lu Lâu Glu Glii Vai 445

Ser Ala Ile 450

Lisboa, 27 de Fevereiro de 2007

Claims (1)

1. ΡΕ1287133 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de rastreio de agentes úteis no tratamento de doença de Alzheimer, os quais regulam a acti-vidade de um polipeptideo GPCR tipo dopamina compreendendo (a) contacto de um composto a testar com um polpeptideo GPCR tipo dopamina compreendendo i. uma sequência de aminoácidos contendo SEQ ID NO:2, ou ii. uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 2; e (b) detecção de actividade GPCR tipo dopamina do polipeptideo, em que um composto a testar que baixa a actividade GPCR tipo dopamina é identificado como um potencial agente terapêutico para o decréscimo da actividade do polipeptideo GPCR tipo dopamina. Lisboa, 27 de Fevereiro de 2007