ES2278755T3 - Regulacion del receptor acoplado a proteinas g de tipo dopamina humano. - Google Patents

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ES2278755T3 ES01945139T ES01945139T ES2278755T3 ES 2278755 T3 ES2278755 T3 ES 2278755T3 ES 01945139 T ES01945139 T ES 01945139T ES 01945139 T ES01945139 T ES 01945139T ES 2278755 T3 ES2278755 T3 ES 2278755T3
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Abstract

Procedimiento de selección para determinar agentes útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que regulan la actividad de un polipéptido GPCR de tipo dopamina que comprende (a) poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido GPCR de tipo dopamina que comprende i. una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO:2, o ii. una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 90% con respecto a la SEQ ID NO:2; y (b) detectar una actividad de GPCR de tipo dopamina del polipéptido, en el que un compuesto de prueba, que disminuye la actividad de GPCR de tipo dopamina, se identifica como un posible agente terapéutico para disminuir la actividad del polipéptido GPCR de tipo dopamina. 78

Description

Regulación del receptor acoplado a proteínas G de tipo dopamina humano.
Campo técnico de la invención
La invención se refiere al área de los receptores acoplados a proteínas G. Más particularmente, se refiere al área del receptor acoplado a proteínas G de tipo dopamina humano y su regulación.
Antecedentes de la invención Receptores acoplados a proteínas G
Muchos procesos biológicos médicamente significativos están mediados mediante rutas de transducción de señales que implican proteínas G (Lefkowitz, Nature 351, 353-354, 1991). La familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) incluye receptores de hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento y virus. Ejemplos específicos de los GPCR incluyen receptores de agentes diversos tales como calcitonina, hormonas adrenérgicas, endotelina, AMPc, adenosina, acetilcolina, serotonina, dopamina, histamina, trombina, cinina, hormona estimulante de folículos, opsinas, gen-1 de la diferenciación endotelial, rodopsinas, receptores olfativos, citomegalovirus, proteínas G en sí, proteínas efectoras tales como fosfolipasa C, adenilciclasa, y fosfodiesterasa, y proteínas activadoras tales como proteína cinasa A y proteína cinasa C.
La superfamilia de proteínas GPCR contiene ahora aproximadamente 250 tipos de parálogos, receptores que representan variantes generadas mediante duplicaciones génicas (u otros procesos), al contrario que los ortólogos, del mismo receptor de diferentes especies. La superfamilia puede dividirse en cinco familias: la familia I, receptores tipificados mediante rodopsina y el receptor \beta-adrenérgico y habitualmente representada por aproximadamente 200 miembros únicos (publicado por Dohlman et al., Ann. Rev. Biochem. 60, 653-88, 1991, y referencias en el mismo); la familia II, la familia de receptores de hormona paratiroide/calcitonina/secretina recientemente caracterizados (Juppner et al., Science 254, 1024-26, 1991; Lin et al., Science 254, 1022-24, 1991); la familia III, la familia de receptores de glutamato metabotrópicos en mamíferos (Nakanishi, Science 258, 597-603, 1992); la familia IV, la familia de receptores AMPc, importante en la quimiotaxis y desarrollo de D. discoideum (Klein et al., Science 241, 1467-72, 1988; y la familia V, los receptores de feromonas de apareamiento fúngico tales como STE2 (publicado por Kurjan, Ann. Rev. Biochem. 61, 1097-1129, 1992).
Los GPCR tienen siete dominios de expansión de membrana conservados que conectan al menos ocho bucles hidrófilos divergentes. Los GPCR (también conocidos como receptores 7TM) se han caracterizado por incluir estos siete tramos hidrófobos conservados de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos, que conectan al menos ocho bucles hidrófilos divergentes. La mayor parte de los GPCR tienen residuos de una única cisteína conservada en cada uno de los primeros dos bucles extracelulares, que forman enlaces disulfuro que se piensa que estabilizan la estructura de la proteína funcional. Las siete regiones transmembrana se designan como TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, y TM7. TM3 está implicada en la transducción de señal.
La fosforilación y lipidación (palmitilización o farnesilación) de los residuos de cisteína pueden influenciar la transducción de señal de algunos GPCR. La mayor parte de los GPCR contienen posibles sitios de fosforilación dentro del tercer bucle citoplasmático y/o el extremo terminal carboxilo. Para varios GPCR, tales como el receptor \beta-adrenérgico, la fosforilación mediante la proteína cinasa A y/o cinasas de receptores específicas, media la desensibilización del receptor.
Para algunos receptores, se piensa que los sitios de unión a ligandos de los GPCR comprenden cavidades hidrófilas formadas por varios dominios transmembrana de GPCR. Las cavidades hidrófilas están rodeadas por residuos hidrófobos de los GPCR. Se presupone que el lado hidrófilo de cada hélice transmembrana de GPCR se orienta hacia dentro y forma un sitio de unión a ligando polar. TM3 está implicado en varios GPCR ya que tiene un sitio de unión a ligandos, tal como el residuo de aspartato de TM3. Las serinas de TM5, una asparagina de TM6 y fenilalaninas o tirosinas de TM6 o TM7, también están implicadas en la unión a ligandos.
Los GPCR están acoplados en el interior de la célula mediante proteínas G heterotriméricas a varias enzimas intracelulares, canales iónicos, y transportadores (véase Johnson et al., Endoc. Rev. 10, 317-331, 1989). Las diferentes subunidades alfa de las proteínas G estimulan preferentemente efectores particulares para modular diversas funciones biológicas en una célula. La fosforilación de residuos citoplasmáticos de GPCR es un mecanismo importante para la regulación de algunos GPCR. Por ejemplo, en una forma de transducción de señal, el efecto de la unión de hormonas es la activación en el interior de la célula de la enzima adenilatociclasa. La activación enzimática mediante hormonas depende de la presencia del nucleótido de GTP. GTP influye también en la unión de hormonas. Una proteína G conecta el receptor de las hormonas a la adenilatociclasa. La proteína G intercambia GTP por GDP unido, cuando se activa mediante un receptor de hormonas. Entonces, la forma que porta GTP se une a la adenilatociclasa activada. La hidrólisis de GTP o GDP, catalizada por la propia proteína G, devuelve la proteína a su forma inactiva, basal. Por tanto, la proteína G ofrece un papel doble, como un intermedio que transmite la señal desde el receptor hasta el efector, y como un reloj que controla la duración de la señal.
Durante los últimos 15 años, se han introducido con éxito en el mercado cerca de 350 agentes terapéuticos que seleccionan como diana a receptores GPCR. Esto indica que estos receptores tienen un historial probado, establecido como dianas terapéuticas. Claramente, existe una necesidad en curso de identificar y caracterizar GPCR adicionales, que pueden desempeñar un papel en la prevención, mejora o corrección de las disfunciones o enfermedades incluyendo, pero sin limitarse a, infecciones tales como infecciones bacterianas, fúngicas, por protozoos, y virales, particularmente aquellas ocasionadas por el virus VIH, dolor, cánceres, anorexia, bulimia, asma, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardiaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención urinaria, osteoporosis, angina de pecho, infarto de miocardio, ulceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna, y trastornos neurológicos y psicóticos, que incluyen ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca, delirio, demencia, varios retrasos mentales, y discinesias, tales como la enfermedad de Huntington y el síndrome de Tourett.
Dopamina y receptores de dopamina
La dopamina es un neurotransmisor que participa en una variedad de diferentes funciones mediadas por el sistema nervioso, incluyendo visión, movimiento, y comportamiento (véase la patente de los EE.UU. 5.883.226 y Cooper et al., 1978, THE BIOCHEMICAL BASIS OF NEUROPHARMACOLOGY, 3ª ed., Oxford University Press, Nueva York, pág, 161-195). Las diversas acciones fisiológicas de dopamina están a su vez mediadas por su interacción con dos de los tipos básicos de receptores acoplados a proteínas G, D1 y D2, que estimulan e inhiben respectivamente la enzima adenililciclasa (Kebabian & Calne, 1979, Nature 277, 93-96). Las alteraciones en el número o actividad de estos receptores pueden ser un factor contribuyente en estados patológicos tales como la enfermedad de Parkinson (un trastorno del movimiento) y esquizofrenia (un trastorno del comportamiento).
Se ha acumulado una gran cantidad de información sobre la bioquímica de los receptores de dopamina D1 y D2, y se han desarrollado procedimientos para solubilizar y purificar estas proteínas receptoras (véase Senogles et al., 1986, Biochemistry 25, 749-753; Sengoles et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 18996-19002; Gingrich et al., 1988, Biochemistry 27, 3907-3912). El receptor de dopamina D1 en varios tejidos parece que es una proteína de membrana glucosilada de aproximadamente 72 kD (Amlaiky et al., 1987, Mol. Pharmacol. 31, 129-134; Ninik et al., 1988, Biochemistry 27, 7594-7599). Se ha sugerido que el receptor D2 tiene un peso molecular superior de aproximadamente 90-150 kD (Amlaiky & Caron, 1985, J. Biol. Chem. 260, 1983-1986; Amlaiky & Caron, 1986, J. Neurochem. 47, 196-204; Jarvie et al., 1988, Mol. Pharmacol. 34, 91-97). Se conoce mucho menos sobre un receptor de dopamina adicional recientemente descubierto, denominado D3 (Sokoloff et al., 1990, Nature 347, 146-
151).
Los receptores de dopamina son dianas primarias en el tratamiento clínico de trastornos psicomotores tales como la enfermedad de Parkinson y trastornos afectivos tales como esquizofrenia (Seeman et al., 1987, Neuropsychopharm. 1, 5-15; Seeman, 1987, Synapse 1, 152-333). Se han clonado los tres receptores de dopamina diferentes (D1, D2, D3) como resultado de la homología de la secuencia de nucleótidos que existe entre estos genes de receptores (Bunzow et al., 1988, Nature 336, 783-787; Grandy et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9762-9766; Dal Toso et al., 1989, EMBO J. 8, 4025-4034; Zhou et al., 1990, Nature 346, 76-80; Sunahara et al., 1990, Nature 346, 80-83; Sokoloff et al., 1990, Nature 347, 146-151).
La clozapina antipsicótica es útil para esquizofrénicos socialmente aislados y resistentes a tratamiento (véase Kane et al., 1990, Nature 347, 146-151), pero a diferencia de otros fármacos antipsicóticos, la clozapina no provoca discinesia tardía (véase Casey, 1989, Psychopharmacology 99, 547-553). Sin embargo, la clozapina tiene constantes de disociación para D2 y D3 que son de 3 a 30 veces superiores a la concentración libre terapéutica de clozapina en agua plasmática (Ackenheil et al., 1976, Arzneim-Forsch 26, 1156-58; Sandoz Canada, Inc., 1990, Clozaril: Summary of preclinical and clinical data). Esto sugiere la existencia de receptores de dopamina más sensibles a la clozapina antipsicótica que los conocidos hasta el momento en la técnica anterior.
Debido a los diversos efectos biológicos de la dopamina, existe una necesidad en la técnica de identificar miembros adicionales de la familia de GPCR de dopamina, cuya actividad puede regularse para proporcionar efectos terapéuticos.
El documento WO 0022131 describe un GPCR humano huérfano denominado nRUP3 siendo su secuencia de nucleótidos y aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 1 y 2.
Sumario de la invención
Otra realización de la invención es un procedimiento de selección para determinar agentes útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Un compuesto de prueba se pone en contacto con un polipéptido GPCR de tipo dopamina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
secuencias de aminoácidos que son al menos idénticas en un 90% a la secuencia de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO. 2; y
la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2.
Se detecta la actividad de GPCR de tipo dopamina del polipéptido. Un compuesto de prueba que disminuye la actividad de GPCR de tipo dopamina del polipéptido en comparación con la actividad de GPCR de tipo dopamina en ausencia del compuesto de prueba se identifica por tanto como un posible agente para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Por tanto, la invención proporciona un receptor acoplado a proteínas G de tipo dopamina humano, que puede utilizarse para identificar compuestos de prueba que pueden actuar como antagonistas en el sitio del receptor y que son útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. El receptor acoplado a proteínas G de tipo dopamina humano y fragmentos del mismo también son útiles en la obtención de anticuerpos específicos que pueden bloquear el receptor y evitar de manera eficaz la unión a ligandos, y que son útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la secuencia de ADN que codifica para un polipéptido GPCR de tipo dopamina.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN de la figura 1.
La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína identificada con número de acceso SwissProt P41596.
La figura 4 muestra la alineación BLASTX del polipéptido GPCR de tipo dopamina de la figura 2 con número de acceso SwissProt P41596 de la figura 3.
Descripción detallada de la invención
Se ha descubierto por el presente solicitante que un GPCR de tipo receptor de dopamina (GPCR de tipo DA), particularmente un GPCR de tipo receptor de dopamina humano, puede utilizarse en procedimientos terapéuticos y en procedimientos de selección para la identificación de antagonistas útiles para tratar trastornos tales como la enfermedad de Alzheimer. También puede utilizarse el GPCR de tipo DA humano para seleccionar antagonistas de GPCR de tipo DA humano, útiles para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
El GPCR de tipo DA humano es idéntico en un 30% a lo largo de los 350 aminoácidos a la proteína de D. melanogaster identificada con el número de acceso SwissProt P41596 y anotada como precursor del receptor 1 de dopamina. Por tanto, se espera que el GPCR de tipo DA humano sea útil para los mismos fines que los receptores de dopamina identificados previamente. Por ejemplo, el GPCR de tipo DA humano producido a partir de genes clonados según la presente invención, puede utilizarse para seleccionar compuestos para determinar la actividad de GPCR de tipo DA o para determinar la cantidad de un fármaco dopaminérgico en una disolución (por ejemplo, plasma o suero sanguíneo). Pueden utilizarse células huésped transformadas con vectores de expresión que comprenden polinucleótidos de tipo DA humanos, para seleccionar compuestos para determinar la actividad de unión a GPCR de tipo DA. Se conocen bien ensayos de unión competitivos en los que pueden llevarse a cabo tales procedimientos, tal como se ilustran mediante los ejemplos específicos a continuación. Seleccionando las células huésped que no expresan ordinariamente un receptor de dopamina, pueden obtenerse preparaciones libres de receptores D1A, receptores D2 y otros subtipos de receptores de dopamina. Además, pueden identificarse los agonistas y antagonistas de GPCR de tipo DA humano, transformando las células huésped que expresan adenililciclasa con vectores de expresión de la presente invención. Las membranas obtenidas a partir de tales células pueden utilizarse en estudios bioquímicos en los que se monitoriza la actividad de la adenililciclasa. Los agonistas de GPCR de tipo DA estimularán la adenililciclasa. Tales células deben poder asociar operativamente el GPCR de tipo DA con la adenililciclasa, es decir, la proteína G también debe estar presente en las membranas celulares. Los procedimientos para llevar a cabo ensayos tales como estos, también se describen en mayor detalle en los ejemplos siguientes.
Los GPCR de tipo DA purificados y aislados de la presente invención, también es GPCR de tipo DA, pueden purificarse a partir de las membranas celulares o fracciones de células lisadas que contienen el receptor, tal como se describe a continuación, según los procedimientos conocidos, incluyendo cromatografía en columna (por ejemplo, intercambio iónico, filtración en gel, eletroforesis, cromatografía de afinidad, etc.), opcionalmente seguida de cristalización (véase generalmente "Enzyme Purification and Related techniques", Methods in Enzymology 22, 233-577, 1977).
Polipéptidos
Los polipéptidos GPCR de tipo DA comprenden al menos 20, 30, 40, 50, 53, 78, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, ó 350 aminoácidos contiguos seleccionados de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 o una variante biológicamente activa de la misma, tal como se define a continuación. Por tanto, un polipéptido GPCR de tipo DA puede ser una parte de una proteína GPCR de tipo DA, una proteína GPCR de tipo DA de longitud completa, o una proteína de fusión que comprende toda o una parte de una proteína GPCR de tipo DA. Una secuencia codificante para SEQ ID NO. 2 se muestra en SEQ ID NO. 1.
Variantes biológicamente activas
Las variantes de polipéptidos GPCR de tipo DA que son biológicamente activas, es decir, conservan la capacidad de unirse a una dopamina o un ligando de tipo dopamina para producir un efecto biológico, tal como la formación de AMP cíclico, la movilización del calcio intracelular, o el metabolismo de fosfoinositido, también son polipéptidos GPCR de tipo DA. Preferiblemente, las variantes de polipéptidos GPCR de tipo DA que se producen de manera natural o no natural, tienen secuencias de aminoácidos que son al menos idénticas en un 90% a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2. El porcentaje de identidad entre una supuesta variante de polipéptido GPCR de tipo DA y una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, se determina utilizando el programa de alineación Blast2 (Blosum62, Expect 10, códigos genéticos convencionales).
Variaciones en el porcentaje de identidad pueden deberse, por ejemplo, a sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se definen como reemplazos de un aminoácido por otro. Son de naturaleza conservativa cuando el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales y/o químicas similares. Ejemplos de reemplazos conservativos son la sustitución de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, o una treonina por una serina.
Las inserciones o deleciones de aminoácidos son cambios en o dentro de una secuencia de aminoácidos. Normalmente se encuentran en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La orientación en determinar qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin suprimir la actividad biológica o inmunológica de un polipéptido GPCR de tipo DA, puede encontrarse utilizando programas informáticos bien conocidos en la técnica, tales como software DNASTAR. Si un cambio de aminoácidos da como resultado un polipéptido GPCR de tipo DA biológicamente activo, puede determinarse fácilmente sometiendo a ensayo para determinar la unión a un ligando o conduciendo un ensayo funcional, tal como se describe por ejemplo, en los ejemplos específicos a continuación.
Proteínas de fusión
Las proteínas de fusión son útiles para generar anticuerpos frente a secuencias de aminoácidos del polipéptido GPCR de tipo DA y para su uso en diversos sistemas de ensayo. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden utilizarse para identificar proteínas que interaccionan con partes de un polipéptido GPCR de tipo DA. Pueden utilizarse para este fin la cromatografía de afinidad de proteínas o ensayos basados en bibliotecas para determinar las interacciones proteína-proteína, tales como los sistemas de presentación en fago o dos híbridos de levaduras. Tales procedimientos se conocen bien en la técnica y también pueden utilizarse como selecciones de fármacos.
Una proteína de fusión del polipéptido GPCR de tipo DA comprende dos segmentos polipeptídicos unidos juntos por medio de un enlace peptídico. El primer segmento polipeptídico comprende al menos 20, 30, 40, 50, 53, 78, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO. 2 o de una variante biológicamente activa, tales como aquellas descritas anteriormente. El primer segmento polipeptídico también puede comprender la proteína GPCR de tipo DA de longitud completa.
El segundo fragmento polipeptídico puede ser un proteína de longitud completa o un fragmento de proteína. Las proteínas comúnmente usadas en la construcción de proteínas de fusión incluyen \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, proteína de fluorescencia verde (GFP), proteínas autofluorescentes, incluyendo la proteína de fluorescencia azul (BFP), la glutatión-S-transferasa (GST), la luciferasa, la peroxidasa de rábano (HRP), y la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Adicionalmente, las etiquetas de epítopos se usan en las construcciones de proteínas de fusión, incluyendo etiquetas de histidina (His), etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina (HA) de influenza, etiquetas Myc, etiquetas VSV-G, y etiquetas tioredoxina (Trx). Otras construcciones de fusión pueden incluir proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones de dominios de unión a ADN (DBD) de Lex, fusiones de dominios de unión de ADN de GAL4, y fusiones de proteínas BP16 del virus herpes simple (VHS). Una proteína de fusión también puede modificarse mediante ingeniería genética para contener un sitio de escisión ubicado entre la secuencia que codifica para el polipéptido GPCR de tipo DA y la secuencia de proteína heteróloga, de tal modo que el polipéptido GPCR de tipo DA puede escindirse y separarse mediante purificación del resto heterólogo.
Una proteína de fusión puede sintetizarse químicamente, tal como se conoce en la técnica. Preferiblemente, una proteína de fusión se produce enlazando covalentemente dos segmentos polipeptídicos o mediante procedimientos convencionales en la técnica de biología molecular. Pueden utilizarse procedimientos de ADN recombinante para preparar proteínas de fusión, por ejemplo, produciendo un constructo de ADN que comprende las secuencias codificantes seleccionadas de SEQ ID NO. 1 en un marco de lectura apropiado con nucleótidos que codifican para el segundo segmento polipeptídico y que expresan el constructo de ADN en una célula huésped, tal como se conoce en la técnica. Muchos kits para la construcción de proteínas de fusión están disponibles de compañías tales como Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (la Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa cruz, CA), MBL Internacional Corporation (MIC; Watertown, MA), y Quantum Biotechnologies (Montreal, Canadá; 1-888-DNA-KITS).
Identificación de homólogos de especie
Los homólogos de especie del polipéptido GPCR de tipo DA humano pueden obtenerse utilizando polinucleótidos de polipéptido GPCR de tipo DA (descritos a continuación) para producir sondas o cebadores adecuados para examinar bibliotecas de expresión de ADNc de otras especies, tales como ratones, monos, o levaduras, identificar ADNc que codifican para homólogos del polipéptido GPCR de tipo DA, y expresar los ADNc tal como se conoce en la técnica.
Identificación de variantes y homólogos de polinucleótidos
Las variantes y homólogos de los polinucleótidos de GPCR-DA descritos anteriormente también son polinucleótidos de GPCR de tipo DA. Normalmente, las secuencias de polinucleótidos de GPCR de tipo DA homólogas pueden identificarse mediante la hibridación de polinucleótidos candidatos con polinucleótidos de GPCR de tipo DA conocidos en condiciones restrictivas, tal como se conoce en la técnica. Por ejemplo, utilizando las siguientes condiciones de lavado (2 X SSC (NaCl 0,3 M, citrato de sodio 0,03 M, pH 7,0), SDS al 0,1%, temperatura ambiente, dos veces, durante 30 minutos cada vez; después 2 X SSC, SDS al 0,1%, 50ºC una vez, durante 30 minutos; después 2 X SSC, temperatura ambiente dos veces, durante 10 minutos cada vez) pueden identificarse secuencias homólogas que contienen como máximo aproximadamente el 25-30% de apareamientos erróneos de pares de bases. Más preferiblemente, las cadenas de ácidos nucleicos homólogas contienen el 15-25% de apareamientos erróneos de pares de bases, incluso más preferiblemente el 5-15% de apareamientos erróneos de pares de bases.
Los homólogos de especie de polinucleótidos de GPCR de tipo DA descritos en el presente documento también pueden identificarse produciendo sondas o cebadores adecuados y examinando bibliotecas de expresión de ADNc a partir de otras especies, tales como ratones, monos, o levaduras. Las variantes humanas de los polinucleótidos de GPCR de tipo DA pueden identificarse, por ejemplo, examinando bibliotecas de expresión de ADNc humano. Se conoce bien que la T_{m} de un ADN de cadena doble disminuye en 1-1,5ºC con cada disminución del 1% en la homología (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973)). Por tanto, las variantes de polinucleótidos de GPCR de tipo DA humano o polinucleótidos de GPCR-DA de otras especies pueden identificarse mediante la hibridación de un supuesto polinucleótido de GPCR de tipo DA homólogo con un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 1 o el complemento del mismo para formar un híbrido de prueba. La temperatura de fusión del híbrido de prueba se compara con la temperatura de fusión de un híbrido que comprende polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos perfectamente complementarias, y se calcula el número o porcentaje de apareamientos erróneos de pares de bases dentro del híbrido de prueba.
Las secuencias de nucleótidos que se hibridan con los polinucleótidos de GPCR de tipo DA o sus complementos siguiendo las condiciones de lavado y/o hibridación restrictivas también son polinucleótidos de GPCR de tipo DA. Las condiciones de lavado restrictivas se conocen y se entienden bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª ed., 1989, en las páginas 9.50-9.51.
Normalmente, para determinar las condiciones de hibridación restrictivas debe elegirse una combinación de temperatura y concentración de sal que está aproximadamente 12-20ºC por debajo de la T_{m} calculada del híbrido en estudio. Puede calcularse la T_{m} de un híbrido entre un polinucleótido de GPCR de tipo DA que tiene una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ IID NO. 1 o el complemento de la misma y una secuencia de polinucleótidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 50, de manera preferible aproximadamente un 75, 90, 96 ó 98% a una de las secuencias de nucleótidos, por ejemplo utilizando la ecuación de Bolton y McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48, 1390 (1962):
T_{m}= 81,5^{o}C - 16,6(log_{10}[Na^{+}]) + 0,41 \ (%G + C) - 0,63 \ (% \ formamida) - 600/l),
en la que l = es la longitud del híbrido en pares de bases
Las condiciones de lavado restrictivas incluyen, por ejemplo, 4 X SSC a 65ºC, o formamida al 50%, 4 X SSC a 42ºC, o 0,5 X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Las condiciones de lavado sumamente restrictivas incluyen por ejemplo, 0,2 X SSC a 65ºC.
Preparación de polinucleótidos
Un polinucleótido de GPCR de tipo DA que se produce de manera natural puede aislarse libre de otros componentes celulares tales como componentes de membrana, proteínas, y lípidos. Los polinucleótidos pueden producirse por una célula y aislarse utilizando las técnicas de purificación de ácidos nucleicos convencionales, o sintetizarse utilizando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o utilizando un sintetizador automático. Los procedimientos para aislar polinucleótidos son de rutina y se conocen bien en la técnica. Cualquier técnica de este tipo para obtener un polinucleótido puede utilizarse para obtener polinucleótidos de GPCR de tipo DA aislados. Por ejemplo, pueden utilizarse enzimas de restricción y sondas para aislar fragmentos de polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos de GPCR de tipo DA. Los polinucleótidos aislados están en preparaciones que están libres o al menos un 70, 80, ó 90% libres de otras moléculas.
Pueden producirse las moléculas de ADNc de GPCR de tipo DA con técnicas de biología molecular convencionales, utilizando ARNm de GPCR de tipo DA como molde. Después de esto pueden replicarse las moléculas de ADNc de GPCR de tipo DA utilizando técnicas de biología molecular conocidas en la técnica y descritas en manuales tales como Sambrook et al. (1989). Una técnica de amplificación, tal como PCR, puede utilizarse para obtener copias adicionales de polinucleótidos de la invención, utilizando o bien ADNc o bien ADN genómico humano como molde.
Alternativamente, pueden utilizarse técnicas de química sintética para sintetizar polinucleótidos de GPCR de tipo DA. La degeneración del código genético permite sintetizar secuencias de nucleótidos alternas que codificarán para un polipéptido GPCR de tipo DA que tiene, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 o una variante biológicamente activa de la misma.
Extensión de polinucleótidos
Pueden utilizarse diversos procedimientos basados en PCR para extender las secuencias de ácidos nucleicos descritas en el presente documento para detectar secuencias en el sentido de 5' tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, la PCR del sitio de restricción utiliza cebadores universales para recuperar la secuencia desconocida adyacente a un locus conocido (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318-322, 1993). En primer lugar se amplifica el ADN genómico en presencia de un cebador para una secuencia de ligador y un cebador específico para la región conocida. Entonces se someten a un segundo ciclo de PCR las secuencias amplificadas con el mismo cebador de ligador y otro cebador específico interno para el primero. Los productos de cada ciclo de PCR se transcriben con una ARN polimerasa adecuada y se secuencian utilizando la transcriptasa inversa.
También puede utilizarse la PCR inversa para amplificar o extender secuencias utilizando cebadores divergentes basados en una región conocida (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 8186, 1988). Los cebadores pueden diseñarse utilizando un software disponible comercialmente, tal como el software OLIGO 4.06 Primer Analysis (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), para ser de 22-30 nucleótidos de longitud, para tener un contenido en GC del 50% o más, y para aparearse a la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68-72ºC. El procedimiento utiliza varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gen. Entonces se circulariza el fragmento mediante ligación intramolecular y se utiliza como molde de PCR.
Otro procedimiento que puede utilizarse es la PCR de captura, que implica la amplificación por PCR de fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en ADN cromosómico artificial de levaduras y humano (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1, 111-119, 1991). En este procedimiento, también puede utilizarse múltiples ligaciones y digestiones con enzimas de restricción para colocar una secuencia de cadena doble modificada mediante ingeniería genética en un fragmento desconocido de la molécula de ADN antes de realizar la PCR.
Otro procedimiento que puede utilizarse para recuperar secuencias desconocidas es el de Parker et al., Nucleic Acids Res. 19, 3055-3060, 1991). Adicionalmente, pueden utilizarse cebadores anidados, de PCR y bibliotecas PROMOTERFINDER (CLONTECH, Palo Alto, Calif.) para recorrer el ADN genómico (CLONTECH, Palo Alto, Calif.). Este procedimiento evita la necesidad de examinar bibliotecas y es útil para encontrar uniones intrón/exón.
Cuando se examina para determinar ADNc de longitud completa, se prefiere utilizar bibliotecas que se han seleccionado por tamaño para incluir ADNc más grandes. Se prefieren bibliotecas cebadas al azar, porque contendrán más secuencias que contengan las regiones 5' de los genes. El uso de una biblioteca cebada al azar puede ser especialmente preferible para determinar las situaciones en las que una biblioteca de oligo d(T) no da un ADNc de longitud completa. Las bibliotecas genómicas pueden ser útiles para determinar la extensión de la secuencia en regiones reguladoras no transcritas en 5'.
Pueden utilizarse sistemas de electroforesis capilar disponibles comercialmente, para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de los productos de PCR o de secuenciación. Por ejemplo, la secuenciación capilar puede emplear polímeros de flujo para la separación electroforética, cuatro colorantes fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido) que se activan por láser, y la detección de las longitudes de onda emitidas mediante una cámara de dispositivo acoplada a la carga. La intensidad de luz/salida puede convertirse en señal eléctrica utilizando un software apropiado (por ejemplo, GENOTYPER y Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer), y puede controlarse por ordenador el procedimiento entero desde la carga de muestras hasta el análisis informático y la presentación de datos electrónicos. La electroforesis capilar se prefiere especialmente para la secuenciación de piezas pequeña de ADN que pueden estar presentes en cantidades limitadas en una muestra particular.
Obtención de polipéptidos
Los polipéptidos GPCR de tipo DA pueden obtenerse, por ejemplo, mediante purificación a partir de células humanas, mediante la expresión de polinucleótidos de GPCR de tipo DA, o mediante síntesis química directa.
Purificación de proteínas
Los polipéptidos GPCR de tipo DA pueden purificarse a partir de cualquier célula humana que expresa el receptor, incluyendo las células huésped que se han transfectado con polinucleótidos de GPCR de tipo DA. Los melanocitos, corazón fetal, y el útero son fuentes particularmente útiles de polipéptidos GPCR de tipo DA. Un polipéptido GPCR de tipo DA purificado se separa de otros compuestos que normalmente se asocian con el polipéptido GPCR de tipo DA en la célula, tales como ciertas proteínas, hidratos de carbono o lípidos, utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión por tamaño, fraccionamiento con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y electroforesis en gel preparativa.
El polipéptido GPCR de tipo DA puede aislarse convenientemente como un complejo con su proteína G asociada, tal como se describe en los ejemplos específicos, a continuación. Una preparación de polipéptidos GPCR de tipo DA purificados es pura al menos en un 80%; preferiblemente, las preparaciones son puras en un 90%, 95%, ó 99%. La pureza de las preparaciones puede evaluarse por cualquier medio conocido en la técnica, tales como electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Expresión de polinucleótidos
Para expresar un polipéptido de GPCR de tipo DA, el polinucleótido puede insertarse en un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Pueden utilizarse procedimientos que se conocen bien por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican para polipéptidos GPCR de tipo DA y elementos de control traduccional y transcripcional apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) y en Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y.,
1989.
Pueden utilizarse diversos sistemas de vector de expresión/huésped para contener y expresar secuencias que codifican para un polipéptido GPCR de tipo DA. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, vectores de expresión de ADN de plásmido o cósmido, levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus), sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, VMC; virus del mosaico del tabaco, VMT) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322), o sistemas de células animales.
Los elementos de control o secuencias reguladoras son las regiones no traducidas del vector (potenciador, promotor, regiones no traducidas en 5' y 3') que interaccionan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Tales elementos pueden variar en su intensidad y especificidad. Dependiendo del sistema vector y del huésped utilizados, puede utilizarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo los promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden utilizarse los promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) o el plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares. El promotor de polihedrina de baculovirus puede utilizarse en células de insectos. Los promotores o potenciadores derivados de los genomas de las células vegetales (por ejemplo, genes de la proteína de choque térmico, RUBISCO, y de la proteína de almacenamiento) o de virus vegetales (por ejemplo, promotores virales o secuencias líderes) pueden clonarse en el vector. En sistemas de células de mamíferos, son preferibles los de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar un línea celular que contenga múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido GPCR de tipo DA, pueden utilizarse vectores a base de SV40 o VEB con un marcador apropiado que puede seleccionarse.
Sistemas de expresión bacterianos y de levaduras
En sistemas bacterianos, puede seleccionarse varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para el polipéptido GPCR de tipo DA. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de un polipéptido GPCR de tipo DA, para la inducción de anticuerpos, pueden utilizarse vectores que dirigen un alto nivel de expresión de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión y clonación de E. coli multifuncionales, tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT, puede ligarse una secuencia que codifica para el polipéptido GPCR de tipo DA, en el vector en marco con secuencias para determinar la Met amino-terminal y los 7 residuos posteriores de \beta-galactosidasa, de tal modo que se produce una proteína híbrida. Los vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509, 1989) o vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) también pueden utilizarse para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con la glutatión-S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción a perlas de glutatión - agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas producidas en tales sistemas pueden diseñarse para incluir sitios de escisión de proteasa del factor Xa, trombina o heparina, de tal modo que el polipéptido clonado de interés puede liberarse del resto de GST a
voluntad.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden utilizarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, véase Ausubel et al. (1989) y Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516-544, 1987.
Sistemas de expresión vegetales y de insectos
Si se utilizan vectores de expresión vegetales, la expresión de secuencias que codifican para polipéptidos GPCR de tipo DA pueden dirigirse mediante cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, los promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de VMC, pueden utilizarse solos o en combinación con la secuencia líder omega del VMT (Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311, 1987). Alternativamente, pueden utilizarse promotores vegetales tales como la subunidad menor de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671-1680, 1984; Broglie et al., Science 224, 838-843, 1984; Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991). Estos constructos pueden introducirse en células vegetales mediante transformación directa de ADN o mediante transfección mediada por patógeno. Tales técnicas se describen en varias publicaciones disponibles generalmente (por ejemplo, Hobbs o Murray, en McGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, Nueva York, N.Y., págs. 191-196, 1992).
También puede utilizarse un sistema de insectos para expresar un polipéptido GPCR de tipo DA. Por ejemplo, en un sistema de este tipo se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (VPNAc) como vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican para los polipéptidos GPCR de tipo DA pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción satisfactoria de polipéptidos GPCR de tipo DA convertirá al gen de polihedrina en inactivo y producirá el virus recombinante que carece de proteína de recubrimiento. Entonces, los virus recombinantes pueden utilizarse para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que pueden expresarse los polipéptidos GPCR de tipo DA (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 3224-3227, 1994).
Sistemas de expresión de mamíferos
Varios sistemas de expresión a base de virus pueden utilizarse para expresar polipéptidos GPCR de tipo DA en células huésped de mamíferos. Por ejemplo, si se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, pueden ligarse las secuencias que codifican para polipéptidos GPCR de tipo DA en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que comprende el promotor tardío y la secuencia líder triparental. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral puede utilizarse para obtener un virus viable que puede expresar un polipéptido GPCR de tipo DA en células huésped infectadas (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659, 1984). Si se desea, pueden utilizarse potenciadores de transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (VSR), para aumentar la expresión en células huésped de mamíferos.
También pueden utilizarse los cromosomas artificiales humanos (HAC) para administrar fragmentos más grandes de ADN que pueden estar contenidos y expresarse en un plásmido. HAC de 6 M a 10 M se construyen y se administran a las células por medio de procedimientos de administración convencionales (por ejemplo, liposomas, aminopolímeros policatiónicos, o vesículas).
También pueden utilizarse las señales de iniciación específicas para conseguir una traducción más eficaz de las secuencias que codifican para polipéptidos GPCR de tipo DA. Tales señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En casos en los que las secuencias que codifican para un polipéptido GPCR de tipo DA, su codón de iniciación, y las secuencias en el sentido de 5' se insertan en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control transcripcionales o traduccionales adicionales. Sin embargo, en casos en los que sólo la secuencia codificante, o un fragmento de la misma, se inserta, deben proporcionarse señales de control traduccionales exógenas (que incluyen el codón de iniciación ATG). El codón de iniciación debe estar en el marco de lectura correcto para garantizar la traducción del inserto entero. Los elementos traduccionales exógenos y los codones de iniciación pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores que son apropiados para el sistema celular particular que se utiliza (véase, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162, 1994).
Células huésped
Una cepa de células huésped puede seleccionarse por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el polipéptido GPCR de tipo DA expresado en el modo deseado. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. También puede utilizarse para facilitar la inserción, plegamiento y/o función correctas, el procesamiento post-traduccional que escinde una forma "prepro" del polipéptido. Diferentes células huésped que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para actividades post-traduccionales (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38), están disponibles de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC (American Type Culture Collection); 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) y pueden seleccionarse para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína foránea.
Se prefiere la expresión estable para la producción de alto rendimiento y de larga duración de las proteínas recombinantes. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable los polipéptidos GPCR de tipo DA, pueden transformarse utilizando vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación virales y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador que puede seleccionarse en el mismo vector o en uno separado. Tras la introducción del vector, se dejan crecer las células durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El fin del marcador que puede seleccionarse es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de las células que expresan satisfactoriamente las secuencias de GPCR de tipo DA introducidas. Los clones resistentes de las células transformadas de manera estable, pueden hacerse proliferar utilizando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo de célula. Véase, por ejemplo, ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney, ed., 1986.
Cualquier número de sistemas de selección puede utilizarse para recuperar las líneas celulares transformadas.
Éstos incluyen, pero no se limitan a, los genes de la timidina cinasa del virus de herpes simple (Wigler et al., Cell 11, 223-32, 1977) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22, 817-23, 1980) que pueden emplearse en las células tk^{-} o aprt^{-}, respectivamente. También, puede utilizarse como la base de selección la resistencia a herbicidas, a antibióticos o a antimetabolitos. Por ejemplo, dhfr confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-70, 1980), npt confiere resistencia a los aminoglucósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1-14, 1981), y als y pat confieren resistencia a clorsulfurona y fosfinotricin acetiltransferasa, respectivamente (Murray, 1992, anteriormente). Se han descrito genes adicionales que pueden seleccionarse. Por ejemplo, trpB permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-51, 1988). Los marcadores visibles tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, pueden utilizarse para identificar transformantes y para cuantificar la cantidad de expresión de proteína estable o transitoria atribuible a un sistema de vectores específico (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995).
Expresión de detección
Aunque la presencia de expresión del gen marcador sugiere que también está presente el polinucleótido GPCR de tipo DA, puede necesitarse la confirmación de su presencia y expresión. Por ejemplo, si una secuencia que codifica para un polipéptido GPCR de tipo DA se inserta en una secuencia de gen marcador, pueden identificarse las células transformadas que contienen secuencias que codifican para un polipéptido GPCR de tipo DA mediante la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, puede colocarse un gen marcador en tándem con una secuencia que codifica para un polipéptido GPCR de tipo DA bajo el control de un único promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección indica normalmente la expresión del polinucleótido de GPCR de tipo DA.
Alternativamente, las células huésped que contienen un polinucleótido de GPCR de tipo DA y que expresa un polipéptido GPCR de tipo DA, pueden identificarse mediante diversos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de inmunoensayo o bioensayo de proteínas que incluyen tecnologías basadas en chip, disolución o membrana para la detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, puede detectarse la presencia de una secuencia de polinucleótidos que codifica para un polipéptido GPCR de tipo DA mediante amplificación o hibridación ADN-ADN o ADN-ARN utilizando sondas o fragmentos o fragmentos de polinucleótidos que codifican para un polipéptido GPCR de tipo DA. Los ensayos basados en la amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de oligonucleótidos seleccionados de secuencias que codifican para un polipéptido GPCR de tipo DA para detectar transformantes que contienen un polinucleótido GPCR de tipo DA.
Se conocen en la técnica diversos protocolos para detectar y medir la expresión de un polipéptido GPCR de tipo DA, utilizando anticuerpos o bien policlonales o bien monoclonales específicos para el polipéptido. Los ejemplos incluyen el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y la separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Puede utilizarse un inmunoensayo basado en monoclonales de dos sitios utilizando anticuerpos monoclonales reactivos frente a dos epítopos no interferentes en un polipéptido GPCR de tipo DA, o puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Estos y otros ensayos se describen en Hampton et al., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn., 1990) y Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1216, 1983).
Una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación se conocen por los expertos en la técnica y pueden utilizarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir la hibridación marcada o sondas de PCR para detectar las secuencias relacionadas con los polinucleótidos que codifican para polipéptidos GPCR de tipo DA, incluyen oligomarcado, traslado de mella, marcado de extremo, o amplificación PCR utilizando un nucleótido marcado. Alternativamente, las secuencias que codifican para un polipéptido GPCR de tipo DA pueden clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Tales vectores se conocen en la técnica, están disponibles comercialmente, y pueden utilizarse para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de nucleótidos marcados y una ARN polimerasa apropiada tales como T7, T3 o SP6. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo utilizando una variedad de kits disponibles comercialmente (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, y US Biochemical).
Marcadores o moléculas indicadoras adecuados que pueden utilizarse para facilitar la detección, incluyen radionúclidos, enzimas, y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.
Expresión y purificación de polipéptidos
Las células huésped transformadas con secuencias de nucleótidos que codifican para un polipéptido GPCR de tipo DA pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. El polipéptido producido mediante una célula transformada puede secretarse o estar contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector utilizado. Tal como se entenderá por los expertos en la técnica, pueden diseñarse vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican para polipéptidos GPCR de tipo DA, para contener secuencias señal que dirigen la secreción de polipéptidos GPCR de tipo DA solubles a través de una membrana celular eucariota o procariota o que dirigen la inserción de membrana del polipéptido GPCR de tipo DA unido a la membrana.
Tal como se trató anteriormente, pueden utilizarse otras construcciones para unir una secuencia que codifica para un polipéptido GPCR de tipo DA a una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de proteínas solubles. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metal tales como los módulos triptófano - histidina que permiten la purificación sobre los metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre la inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por afinidad/extensión FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). También puede utilizarse para facilitar la purificación la inclusión de secuencias de ligador que pueden escindirse, tales como aquellos específicos para el factor Xa o enterocinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido GPCR de tipo DA. Un vector de expresión de este tipo proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido GPCR de tipo DA y 6 residuos de histidina que preceden a una tiorredoxina o a un sitio de escisión de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación mediante IMAC ("immobilized metal ion affinity chromatography", cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado, tal como se describe en Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263-281, 1992), mientras que el sitio de escisión de enterocinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido GPCR de tipo DA de la proteína de fusión. Los vectores que contienen las proteínas de fusión se describen en Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441-453, 1993.
Síntesis química
Las secuencias que codifican para un polipéptido GPCR de tipo DA pueden sintetizarse, completas o en parte, utilizando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica (véase, Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Hom et al. Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980). Alternativamente, puede producirse un propio polipéptido GPCR de tipo DA, utilizando procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tales como mediante síntesis de péptidos directa utilizando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge et al., Science 269, 202-204, 1995). La síntesis de proteínas puede realizarse utilizando técnicas manuales o mediante automatización. Las síntesis automatizadas pueden conseguirse, por ejemplo, utilizando el sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Opcionalmente, los fragmentos de polipéptidos GPCR de tipo DA pueden sintetizarse por separado y combinarse utilizando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.
El péptido recientemente sintetizado puede purificarse sustancialmente mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa (por ejemplo, Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co., Nueva York, N.Y., 1983). La composición de un polipéptido GPCR de tipo DA puede confirmarse mediante la secuenciación o análisis de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación Edman; véase Creighton, anteriormente). Adicionalmente, cualquier parte de la secuencia de aminoácidos del polipéptido GPCR de tipo DA puede alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse utilizando procedimientos químicos con secuencias de otras proteínas para producir un polipéptido variante o una proteína de fusión.
Producción de polipéptidos alterados
Tal como se entenderá por los expertos en la técnica, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos GPCR de tipo DA que tienen codones que se producen de manera no natural. Por ejemplo, pueden seleccionarse codones preferidos por un huésped eucariota o procariota particular para aumentar la tasa de expresión de proteínas o para producir un transcrito de ARN que tiene propiedades deseables, tales como una semivida que es superior a la de un transcrito generado a partir de la secuencia que se produce de manera natural.
Las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento pueden modificarse mediante ingeniería genética, utilizando procedimientos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican para polipéptidos GPCR de tipo DA por una variedad de razones, incluyendo pero no limitándose a, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento y/o expresión del polipéptido o producto de ARNm. El intercambio (shuffling) de ADN mediante fragmentación al azar y el reensamblaje por PCR de los fragmentos de genes y oligonucleótidos sintéticos pueden utilizarse para modificar mediante ingeniería genética las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio puede utilizarse para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar la preferencia a codones, producir variantes de corte y empalme, introducir mutaciones, etcétera.
Anticuerpos
Puede generarse cualquier tipo de anticuerpo conocido en la técnica para unirse específicamente a un epítopo de un polipéptido GPCR de tipo DA. "Anticuerpo" tal como se utiliza en el presente documento incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')_{2}, y Fv, que pueden unirse a un epítopo de un polipéptido GPCR de tipo DA. Normalmente, se requieren al menos 6, 8, 10 ó 12 aminoácidos contiguos para formar un epítopo. Sin embargo, los epítopos que implican aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25 ó 50 aminoácidos.
Un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de un polipéptido GPCR de tipo DA puede utilizarse terapéuticamente, así como en ensayos inmunoquímicos, tales como inmunotransferencias de tipo Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la técnica. Pueden utilizarse diversos inmunoensayos para identificar anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Se conocen bien en la técnica numerosos protocolos para los ensayos inmunorradiométricos o de unión competitiva. Tales inmunoensayos normalmente implican la medición de formación de complejos entre un inmunógeno y un anticuerpo que se une específicamente al inmunógeno.
Normalmente, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido GPCR de tipo DA proporciona una señal de detección al menos 5, 10 ó 20 veces superior a una señal de detección provista de otras proteínas cuando se utiliza en un ensayo inmunoquímico. Preferiblemente, los anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos GPCR de tipo DA no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar un polipéptido GPCR de tipo DA de una disolución.
Los polipéptidos GPCR de tipo DA pueden utilizarse para inmunizar a un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobaya, mono o ser humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, un polipéptido GPCR de tipo DA puede conjugarse con una proteína portadora, tales como albúmina sérica bovina, tiroglobulina y hemocianina de lapa californiana. Dependiendo de la especie huésped, pueden utilizarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y sustancias tensioactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol). Entre los adyuvantes utilizados en seres humanos, BCG (bacilli Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son especialmente útiles.
Anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido GPCR de tipo DA pueden preparase utilizando cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de células B humanas, y la técnica de hibridoma del VEB (Kohler et al., Nature 256, 495-497, 1985; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030, 1983; Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984).
Además, pueden utilizarse las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte y empalme de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con especificidad de antígeno apropiada y actividad biológica (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312, 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314, 452-454, 1985). Los anticuerpos monoclonales y otros también pueden "humanizarse" para evitar que un paciente forme una respuesta inmunitaria frente al anticuerpo cuando se utiliza terapéuticamente. Tales anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a anticuerpos humanos que van a utilizarse directamente en terapia o pueden requerir alteración de unos pocos residuos clave. Las diferencias de secuencia entre anticuerpos de roedores y secuencias humanas pueden minimizarse sustituyendo residuos que difieren de aquellos en las secuencias humanas mediante mutagénesis dirigida al sitio de residuos individuales o mediante injertos de regiones enteras determinantes de la complementariedad. Alternativamente, los anticuerpos humanizados pueden producirse utilizando procedimientos recombinantes, tal como se describe en el documento GB2188638B. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido GPCR de tipo DA puede contener sitios de unión a antígenos que se humanizan o bien parcial o bien completamente, tal como se describe en el documento U.S. 5.565.332.
Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única pueden adaptarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica para producir anticuerpos de cadena única que se unen específicamente a polipéptidos GPCR de tipo DA. Los anticuerpos con especificidad afín, pero de composición idiotípica distinta, pueden generarse mediante el intercambio de cadenas de bibliotecas de inmunoglobulinas combinatorias al azar (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-23, 1991).
Los anticuerpos de cadena única también pueden construirse utilizando un procedimiento de amplificación de ADN, tal como PCR, utilizando ADNc de hibridoma como molde (Thirion et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Los anticuerpos de cadena única pueden ser mono o biespecíficos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos de cadena única biespecíficos, tetravalentes se enseña, por ejemplo, en Coloma & Morrison, 1997, Natl. Biotechnol. 15, 159-63. La construcción de anticuerpos de cadena única biespecíficos, bivalentes se enseña en Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206.
Una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo de cadena única puede construirse utilizando la síntesis de nucleótidos manual o automatizado, clonarse en un constructo de expresión utilizando procedimientos de ADN recombinante convencional, e introducirse en una célula para expresar la secuencia codificante, tal como se describe a continuación. Alternativamente, los anticuerpos de cadena única pueden producirse directamente utilizando, por ejemplo, tecnología de fago filamentoso (Verhaar et al., 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91).
Los anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos GPCR de tipo DA también pueden producirse induciendo la producción in vivo en la población linfocitaria o examinando bibliotecas de inmunoglobulina o paneles de reactivos de unión altamente específica tal como se describe en la bibliografía (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad Sci. 86, 3833-3837, 1989; Winter et al., Nature 349, 293-299, 1991).
Otros tipos de anticuerpos pueden construirse y utilizarse terapéuticamente en procedimientos de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos pueden construirse tal como se describe en el documento WO 93/03151. También pueden prepararse las proteínas de unión que se derivan de las inmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespecíficas, tales como los "diacuerpos" descritos en el documento WO 94/13804.
Los anticuerpos según la invención pueden purificarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse por afinidad pasando a lo largo de una columna a la que se une un polipéptido GPCR de tipo DA. Entonces, los anticuerpos unidos pueden eluirse de la columna que utiliza un tampón con una alta concentración de sal.
Oligonucleótidos antisentido
Los oligonucleótidos antisentido son secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de ADN o ARN específica. Una vez que se introducen en una célula, los nucleótidos complementarios se combinan con las secuencias naturales producidas por la célula para formar complejos y bloquear o bien la transcripción o bien la traducción. Preferiblemente, un oligonucleótido antisentido es al menos de 11 nucleótidos de longitud, pero puede ser de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 o más nucleótidos de longitud. También pueden utilizarse secuencias más largas. Las moléculas de oligonucleótidos antisentido pueden proporcionarse en un constructo de ADN e introducirse en una célula tal como se describió anteriormente para disminuir el nivel de los productos del gen de GPCR de tipo DA en la célula.
Los oligonucleótidos antisentido pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o una combinación de ambos. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse manualmente o mediante un sintetizador automatizado, uniendo covalentemente el extremo 5' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido con uniones internucleotidas no de tipo fosfodiéster tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres de fosfato, carbamatos, acetamidato, ésteres carboximetílicos, carbonatos, y triésteres de fosfato. Véase Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1-72, 1994; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-583, 1990.
Pueden obtenerse las modificaciones de la expresión del gen de GPCR de tipo DA diseñando oligonucleótidos antisentido que formarán dúplex para el control, en 5', o regiones reguladoras del gen de GPCR de tipo DA. Se prefieren los oligonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 del sitio de inicio. De manera similar, puede conseguirse la inhibición utilizando la metodología de apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de triple hélice es útil debido a que provoca la inhibición de la capacidad de la doble hélice de abrirse suficientemente para la unión de las polimerasas, factores de transcripción, o chaperonas. Se han descrito los avances terapéuticos que utilizan ADN triple en la bibliografía (por ejemplo, Gee et al., in Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994). También puede diseñarse un oligonucleótido antisentido para bloquear la traducción de ARNm, evitando que el transcrito se una a los ribosomas.
No se requiere la complementariedad precisa para obtener la formación de complejo satisfactoria entre un oligonucleótido antisentido y la secuencia complementaria de un polinucleótido GPCR de tipo DA. Los oligonucleótidos antisentido que comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5 o más tramos de nucleótidos contiguos que son complementarios de manera precisa a un polinucleótido GPCR de tipo DA, cada uno separado por un tramo de nucleótidos contiguos que no son complementarios a nucleótidos de GPCR de tipo DA adyacentes, pueden proporcionar suficiente especificidad de selección como diana para ARNm de GPCR de tipo DA. Preferiblemente, cada tramo de nucleótidos contiguos complementarios es al menos de 4, 5, 6, 7 u 8 o más nucleótidos de longitud. Las secuencias que intervienen no complementarias son preferiblemente de 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos de longitud. Un experto en la técnica puede utilizar fácilmente el punto de fusión calculado de un par de antisentido - sentido para determinar el grado de apareamiento erróneo que se tolerará entre un oligonucleótido antisentido particular y una secuencia de polinucleótidos de GPCR de tipo DA particular.
Los oligonucleótidos antisentido pueden modificarse sin afectar a su capacidad de hibridar un polinucleótido de GPCR de tipo DA. Estas modificaciones pueden ser internas o en uno o ambos extremos de la molécula antisentido. Por ejemplo, las uniones fosfato internucleósidas pueden modificarse añadiendo restos de diamina o colesterilo con cantidades variables de residuos de carbono que varían entre los grupos amino y ribosa terminal. Los azúcares y/o bases modificadas, tales como arabinosa en vez de ribosa, o un oligonucleótido 3', 5'-sustituido en el que el grupo hidroxilo en 3' o el grupo fosfato en 5' se sustituyen, también pueden emplearse en un oligonucleótido antisentido modificado. Estos oligonucleótidos modificados pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-584, 1990; Uhlmann et al., Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542, 1987.
Ribozimas
Los ribozimas son moléculas de ARN con actividad catalítica. Véase por ejemplo, Cech, Science 236, 1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543-568; 1990, Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605-609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515, 1996. Los ribozimas pueden utilizarse para inhibir la función génica, escindiendo una secuencia de ARN, tal como se conoce en la técnica (por ejemplo, Haseloff et al., patente de los EE.UU. 5.641.673). El mecanismo de acción del ribozima implica la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima al ARN diana complementario, seguido de escisión endonucleolítica. Los ejemplos incluyen moléculas de ribozima de motivo de cabeza de martillo modificadas mediante ingeniería genética que pueden catalizar eficaz y específicamente la escisión endonucleolítica de las secuencias de nucleótidos específicas.
La secuencia codificante de un polinucleótido de GPCR de tipo DA, tal como la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 1, puede utilizarse para generar ribozimas que se unirán específicamente a ARNm transcrito a partir del polinucleótido de GPCR de tipo DA. Los procedimientos de diseño y construcción de ribozimas, que pueden escindir otras moléculas de ARN en trans de manera altamente específica de secuencia, se han desarrollado y descrito en la técnica (véase Haseloff et al. Nature 334, 585-591, 1988). Por ejemplo, la actividad de escisión de los ribozimas puede seleccionarse como diana a ARN específicos, modificando mediante ingeniería genética una región de "hibridación" discreta en el ribozima. La región de hibridación contiene una secuencia complementaria al ARN diana y por tanto se hibrida específicamente con la diana (véase, por ejemplo, Gerlach et al., documento EP 321.201).
Los sitios de escisión del ribozima específicos dentro de una diana de ARN de GPCR de tipo DA, pueden identificarse explorando la molécula diana para determinar los sitios de escisión del ribozima que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC. Una vez que se han identificado, pueden evaluarse secuencias cortas de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del ARN diana que contiene el sitio de escisión, para determinar características estructurales secundarias que pueden volver inoperativa a la diana. También puede evaluarse la idoneidad de las dianas de ARN de GPCR de tipo DA candidatas, sometiendo a prueba la accesibilidad para la hibridación con oligonucleótidos complementarios utilizando ensayos de protección de la ribonucleasa. La secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 1 y su complemento, proporcionan una fuente de secuencias de región de hibridación adecuadas. Pueden utilizarse las secuencias complementarias más largas para aumentar la afinidad de la secuencia de hibridación por la diana. Las regiones de hibridación y escisión del ribozima pueden ser integralmente afines de tal modo que en la hibridación para el ARN diana a través de las regiones complementarias, la región catalítica del ribozima puede escindir la diana.
Los ribozimas pueden introducirse en las células como parte de un constructo de ADN. Pueden utilizarse procedimientos mecánicos, tales como la microinyección, transfección mediada por liposomas, electroporación o precipitación con fosfato de calcio, para introducir un constructo de ADN que contiene ribozimas en las células en las que se desea disminuir la expresión de GPCR de tipo DA. Alternativamente, si se desea que las células retengan de manera estable el constructo de ADN, el constructo puede suministrarse en un plásmido y mantenerse como un elemento separado o integrado en el genoma de las células, tal como se conoce en la técnica. Un constructo de ADN que codifica para ribozimas puede incluir elementos reguladores transcripcionales, tales como un elemento promotor, un potenciador o elemento de UAS, y una señal de finalización transcripcional, para controlar la transcripción de ribozimas en las células.
Tal como se enseña en Haseloff et al., patente de los EE.UU. 5.641.673, los ribozimas pueden modificarse mediante ingeniería genética de tal modo que la expresión de ribozimas se producirá en respuesta a factores que inducen la expresión de un gen diana. Los ribozimas también pueden modificarse mediante ingeniería genética para proporcionar un nivel adicional de regulación, de tal modo que la destrucción de ARNm se produce sólo cuando tanto un ribozima como un gen diana se inducen en las células.
Procedimientos de selección
La invención proporciona ensayos para la selección de compuestos de prueba que se unen a o modulan la actividad de un polipéptido GPCR de tipo DA o un polinucleótido de GPCR de tipo DA. Un compuesto de prueba se une preferiblemente a un polinucleótido de o polipéptido GPCR de tipo DA. Más preferiblemente, un compuesto de prueba disminuye o aumenta el efecto de dopamina o un análogo a dopamina mediado por GPCR de tipo DA humano mediante al menos aproximadamente el 10, de manera preferible aproximadamente el 50, de manera más preferible aproximadamente el 75, 90 ó 100% con respecto a la ausencia del compuesto de prueba.
Compuestos de prueba
Los compuestos de prueba pueden ser agentes farmacológicos ya conocidos en la técnica o pueden ser compuestos desconocidos previamente que tienen cualquier actividad farmacológica. Los compuestos pueden producirse de manera natural o diseñarse en el laboratorio. Pueden aislarse a partir de microorganismos, animales o plantas y pueden producirse de manera recombinante o sintetizarse mediante procedimientos químicos conocidos en la técnica. Si se desea, los compuestos de prueba pueden obtenerse utilizando cualquiera de los numerosos procedimientos de bibliotecas combinatorios conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitándose a, bibliotecas biológicas, bibliotecas en fase de disolución o en fase sólida paralelas espacialmente direccionables, procedimientos de bibliotecas sintéticas que requieren deconvolución, el procedimiento de biblioteca de "una perla un compuesto" y procedimientos de biblioteca sintéticas utilizando la selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de biblioteca biológica se limita a bibliotecas de polipéptidos, mientras que los otros cuatro enfoques pueden aplicarse a bibliotecas de polipéptidos, de oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas de compuestos. Veáse Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997.
Los procedimientos para la síntesis de bibliotecas moleculares se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994). Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en disolución (véase, por ejemplo, Houghten, BioTechniques 13, 412-421, 1992), o en perlas (Lam, Nature 354, 82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364, 555-556, 1993), bacterias o esporas (Ladner, patente de los EE.UU. 5.223.409), plásmidos (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992), o fagos (Scott & Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; y Ladner, patente de los EE.UU 5.223.409).
Selección de alto rendimiento
Los compuestos de prueba pueden seleccionarse para determinar la capacidad de unión a polipéptidos o polinucleótidos de GPCR de tipo DA o de afectar la actividad de GPCR de tipo DA o la expresión génica de GPCR de tipo DA utilizando la selección de alto rendimiento. Utilizando la selección de alto rendimiento pueden someterse a prueba muchos compuestos discretos en paralelo, de tal modo que pueden seleccionarse rápidamente grandes números de compuestos de prueba. Las técnicas establecidas más ampliamente utilizan placas de microtitulación de 96 pocillos. Los pocillos de las placas de microtitulación requieren normalmente volúmenes de ensayo que oscilan desde 50 hasta 500 \mul. Además de las placas, muchos instrumentos, materiales, pipeteadores automáticos, dispositivos robóticos, dispositivos de lavado de placas, y lectores de placas están disponibles comercialmente para equipar el formato de 96 pocillos.
Alternativamente, pueden utilizarse "ensayos de formato libre", o ensayos que no tienen barrera física entre las muestras. Por ejemplo, se describe un ensayo que utiliza células de pigmentos (melanocitos) en un ensayo homogéneo sencillo para determinar bibliotecas de péptidos combinatorios, por Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19, 1614-18 (1994). Las células se colocan en agarosa en placas petri, después se colocan las perlas que portan compuestos combinatorios sobre la superficie de la agarosa. Los compuestos combinatorios se desprenden parcialmente de los compuestos de las perlas. Los compuestos activos pueden visualizarse como áreas de pigmento oscuro debido a que, a medida que los compuestos se difunden localmente en la matriz de gel, los compuestos activos hacen que las células cambien de color.
Otro ejemplo de ensayo de formato libre se describe por Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", publicado en First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa (primera conferencia anual de la sociedad para la selección biomolecular en Filadelfia) (Nov. 7-10, 1995). Chelsky realizó un ensayo enzimático homogéneo sencillo para determinar la anhidrasa carbónica dentro de un gel de agarosa de tal modo que la enzima en el gel ocasionaría un cambio de color en todo el gel. Después de esto, se colocaron las perlas que portan los compuestos combinatorios por medio de un fotoligador dentro del gel y los compuestos se desprendieron parcialmente mediante luz UV. Se observaron los compuestos que inhibían la enzima como zonas locales de inhibición que tienen menor cambio de color.
Todavía otro ejemplo se describe por Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996). En este ejemplo, se seleccionaron las bibliotecas combinatorias para determinar compuestos que tenían efectos citotóxicos sobre las células cancerígenas que crecían en agar.
Otro procedimiento de selección de alto rendimiento se describe en Beutel et al., patente de los EE.UU. 5.976.813. En este procedimiento, las muestras de prueba se colocan en una matriz porosa. Uno o más componentes de ensayo se colocan entonces dentro, en la parte superior o en la parte inferior de una matriz tal como un gel, una lámina de plástico, un filtro, u otra forma de soporte sólido que se manipule fácilmente. Cuando se introducen las muestras en la matriz porosa, se difunden lo suficientemente despacio, de tal modo que los ensayos pueden realizarse sin que las muestras de prueba se ejecuten a la vez.
Ensayos de unión
Para los ensayos de unión, el compuesto de prueba es preferiblemente una molécula pequeña que se une a y ocupa el sitio activo del polipéptido GPCR de tipo DA, produciendo así que el sitio de unión a ligandos sea inaccesible para el sustrato de tal modo que se evita la actividad biológica normal. Ejemplos de tales moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos o moléculas de tipo péptido pequeños. Posibles ligandos que se unen a un polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, ligandos naturales de GPCR de tipo DA conocidos y análogos o derivados de los mismos.
En ensayos de unión, o bien el compuesto de prueba o bien el polipéptido GPCR de tipo DA puede comprender un marcador que puede detectarse, tal como un marcador fluorescente, radioisotópico, quimioluminiscente o enzimático, tal como la peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina o luciferasa. Entonces, puede llevarse a cabo la detección de un compuesto de prueba que está unido al polipéptido GPCR de tipo DA, por ejemplo, mediante recuento directo de radioemisión, mediante recuento por centelleo, o mediante la determinación de la conversión de un sustrato apropiado en un producto que puede detectarse.
Alternativamente, la unión de un compuesto de prueba a un polipéptido GPCR de tipo DA puede determinarse sin marcar ninguno de los interactores. Por ejemplo, puede utilizarse un microfisiómetro para detectar la unión de un compuesto de prueba con un polipéptido GPCR de tipo DA. Un microfisiómetro (por ejemplo, Cytosensor™) es un instrumento analítico que mide la tasa a la que una célula acidifica su entorno utilizando un sensor potenciométrico direccionable con la luz (LAPS). Pueden utilizarse los cambios en esta tasa de acidificación como un indicador de la interacción entre un compuesto de prueba y un polipéptido GPCR de tipo DA (McConnell et al., Science 257, 1906-1912, 1992).
La determinación de la capacidad de un compuesto de prueba de unirse a un polipéptido GPCR de tipo DA también puede llevarse a cabo utilizando una tecnología tal como análisis de interacción biomolecular en tiempo real (BIA Bimolecular Interaction Analysis) (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991, y Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995). BIA es una tecnología para el estudio de las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactores (por ejemplo, BIAcore™). Pueden utilizarse los cambios en la resonancia de plasmón de superficie (SPR) de fenómeno óptico como una indicación de las reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas.
En todavía otro aspecto de la invención, puede utilizarse un polipéptido GPCR de tipo DA como una "proteína de cebo" en un ensayo de dos híbridos o ensayo de tres híbridos (véase por ejemplo, la patente de los EE.UU. 5.283.317; Zervos et al., Cell 72, 223-232, 1993; Madura et al., J Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696, 1993; y Brent documento W094/10300), para identificar otras proteínas que se unen a o interaccionan con el polipéptido GPCR de tipo DA y modulan su actividad.
El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayor parte de los factores de transcripción, que consiste en dominios de activación y de unión a ADN que pueden separarse. Brevemente, el ensayo utiliza dos constructos de ADN diferentes. Por ejemplo, en un constructo, el polinucleótido que codifica para un polipéptido GPCR de tipo DA puede unirse a un polinucleótido que codifica para el dominio de unión de ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En el otro constructo, una secuencia de ADN que codifica para una proteína no identificada ("presa" o "muestra") puede unirse a un polipéptido que codifica para el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" pueden interaccionar in vivo para formar un complejo dependiente de proteínas, los dominios de activación y de unión a ADN del factor de transcripción se dejan en proximidad cercana. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ), que se une funcionalmente a un sitio regulador transcripcional responsable del factor de transcripción. La expresión del gen indicador puede detectarse, y pueden aislarse las colonias celulares que contienen el factor de transcripción funcional y utilizarse para obtener la secuencia de ADN que codifica para la proteína que interacciona con el polipéptido GPCR de tipo DA.
Puede desearse inmovilizar o bien el polipéptido (o polinucleótido de) GPCR de tipo DA o bien el compuesto de prueba para facilitar la separación de las formas unidas y no unidas de uno o los dos interactores, así como para adaptar la automatización del ensayo. Por tanto, o bien el polipéptido (o polinucleótido de) GPCR de tipo DA o bien el compuesto de prueba puede unirse a un soporte sólido. Soportes sólidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, portaobjetos de plástico o vidrio, placas de cultivo tisular, pocillos de microtitulación, tubos, pastillas de silicio, o partículas tales como perlas (incluyendo, pero no limitándose a, perlas de látex, de poliestireno o de vidrio). Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para unir el polipéptido (o polinucleótido de) GPCR de tipo DA o compuesto de prueba a un soporte sólido, incluyendo el uso de uniones covalentes y no covalentes, absorción pasiva, o pares de restos de unión unidos respectivamente al polipéptido (o polinucleótido de) o el compuesto de prueba y el soporte sólido. Los compuestos de prueba están unidos preferiblemente al soporte sólido en una matriz, de tal modo que puede localizarse la ubicación de los compuestos de prueba individuales. La unión de un compuesto de prueba a un polipéptido (o polinucleótido de) GPCR de tipo DA puede llevarse a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrifuga.
En una realización, el polipéptido GPCR de tipo DA es una proteína de fusión que comprende un dominio que permite que el polipéptido GPCR de tipo DA se una a un soporte sólido. Por ejemplo, las proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa pueden adsorberse en perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) o en placas de microtitulación derivadas de glutatión, que se combinan entonces con el compuesto de prueba o el compuesto de prueba y el polipéptido GPCR de tipo DA no adsorbido; entonces se incuba la mezcla en condiciones conductoras para la formación de complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH). Tras la incubación, se lavan las perlas o los pocillos de la placa de microtitulación para eliminar cualquier componente que no se haya unido. La unión de los interactores puede determinarse o bien directa o bien indirectamente, tal como se describe a continuación. Alternativamente, los complejos pueden disociarse del soporte sólido antes de determinar la unión.
Otras técnicas para inmovilizar las proteínas o polinucleótidos sobre un soporte sólido, también pueden utilizarse en los ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, puede inmovilizarse o bien un polipéptido (o polinucleótido de) GPCR de tipo DA o un compuesto de prueba, utilizando la conjugación de biotina y streptavidina. Los polipéptidos (o polinucleótidos de) GPCR de tipo DA o compuesto de prueba biotinilados pueden prepararse a partir de biotin-NHS(N-hidroxisuccinimida) utilizando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilización, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.) e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas de streptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido, polinucleótido GPCR de tipo DA, o un compuesto de prueba, pero que no interfieren con un sitio de unión deseado, tal como el sitio activo del polipéptido GPCR de tipo DA, pueden derivarse a los pocillos de la placa. La proteína o diana que no se haya unido puede atraparse en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos.
Los procedimientos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido GPCR de tipo DA o compuesto de prueba, ensayos de unión a enzimas que se basan en detectar una actividad del polipéptido GPCR de tipo DA, y electroforesis en gel SDS en condiciones no reductoras.
La selección para determinar compuestos de prueba que se unen a un polipéptido o polinucleótido GPCR de tipo DA también pueden llevarse a cabo en una célula intacta. Cualquier célula que comprende un polipéptido o polinucleótido GPCR de tipo DA puede utilizarse en un sistema de ensayo basado en células. Un polinucleótido de GPCR de tipo DA puede producirse de manera natural en las células o puede introducirse utilizando técnicas tales como las descritas anteriormente. La unión del compuesto de prueba a un polipéptido o polinucleótido GPCR de tipo DA se determina tal como se describió anteriormente.
Ensayos funcionales
Los compuestos de prueba pueden someterse a prueba para determinar la capacidad de aumentar o disminuir un efecto biológico de un polipéptido GPCR de tipo DA. Tales efectos biológicos pueden determinarse utilizando los ensayos funcionales descritos en los ejemplos específicos, a continuación. Los ensayos funcionales pueden llevarse a cabo tras poner en contacto o bien un polipéptido GPCR de tipo DA purificado, una preparación de membrana celular, o bien una célula intacta con un compuesto de prueba. Un compuesto de prueba que disminuye una actividad funcional de un GPCR de tipo DA en al menos aproximadamente el 10, de manera preferible aproximadamente el 50, de manera más preferible aproximadamente el 75, 90 ó 100%, se identifica como un posible agente para disminuir la actividad de GPCR de tipo DA. Un compuesto de prueba que aumenta la actividad de GPCR de tipo DA en al menos aproximadamente el 10, de manera preferible aproximadamente el 50, de manera más preferible aproximadamente el 75, 90 ó 100%, se identifica como un posible agente para aumentar la actividad de GPCR-DA.
Un procedimiento de selección de este tipo implica el uso de melanoforos que se transfectan para expresar un polipéptido GPCR-DA. Una técnica de selección de este tipo se describe en el documento WO 92/01810 publicado el 6 de febrero de 1992. Por tanto, por ejemplo, un ensayo de este tipo puede emplearse para la selección para determinar un compuesto que inhibe la activación del polipéptido receptor poniendo en contacto las células de melanoforo que comprenden el receptor con tanto el ligando receptor (por ejemplo, dopamina o un análogo de dopamina) como un compuesto de prueba que va a seleccionarse. La inhibición de la señal generada mediante el ligando indica que un compuesto de prueba es un posible antagonista para el receptor, es decir, inhibe la activación del receptor. La selección puede emplearse para identificar un compuesto de prueba que activa el receptor poniendo en contacto tales células con compuestos que van a seleccionarse y determinando si cada compuesto de prueba genera una señal, es decir activa el receptor.
Otras técnicas de selección incluyen el uso de células que expresan un polipéptido GPCR de tipo DA humano (por ejemplo, células CHO transfectadas) en un sistema que mide los cambios de pH extracelular provocados por la activación del receptor (véase, por ejemplo, Science 246, 181-296, 1989). Por ejemplo, pueden ponerse en contacto compuestos de prueba con una célula que expresa un polipéptido GPCR de tipo DA humano y puede medirse una respuesta del segundo mensajero, por ejemplo, una transducción de señal o cambios de pH, para determinar si el compuesto de prueba activa o inhibe al receptor.
Otra técnica de selección de este tipo implica introducir ARN que codifica para un polipéptido GPCR de tipo DA humano dentro de ovocitos de Xenopus para expresar transitoriamente el receptor. Entonces pueden ponerse en contacto los ovocitos transfectados con el ligando del receptor y puede seleccionarse un compuesto de prueba, seguido por la detección de la inhibición o la activación de una señal de calcio en el caso de selección para compuestos de prueba que se cree que inhiben la activación del receptor.
Otra técnica de selección implica expresar un polipéptido GPCR de tipo DA humano en células en las que el receptor está unido a fosfolipasa C o D. Tales células incluyen células endoteliales, células de músculo liso, células de riñón embrionario, etc. La selección puede lograrse tal como se describió anteriormente cuantificando el grado de activación del receptor a partir de cambios en la actividad fosfolipasa.
En los ejemplos específicos a continuación se proporcionan detalles de los ensayos funcionales tales como los descritos anteriormente.
Expresión de genes
En otra realización, se identifican compuestos de prueba que aumentan o disminuyen la expresión de genes de GPCR de tipo DA. Se pone en contacto un polinucleótido de GPCR de tipo DA con un compuesto de prueba, y se determina la expresión de un ARN o producto polipeptídico del polinucleótido de GPCR de tipo DA. Se compara el nivel de expresión de ARNm o polipéptido apropiado en presencia del compuesto de prueba con el nivel de expresión de ARNm o polipéptido en ausencia del compuesto de prueba. Entonces puede identificarse el compuesto de prueba como un modulador de la expresión basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de ARNm o polipéptido es superior en presencia del compuesto de prueba que en ausencia del mismo, se identifica el compuesto de prueba como estimulador o potenciador de la expresión de ARNm o polipéptido. Alternativamente, cuando la expresión del ARNm o polipéptido es inferior en presencia del compuesto de prueba que en ausencia del mismo, el compuesto de prueba se identifica como inhibidor de la expresión de ARNm o polipéptido.
El nivel de expresión de ARNm o polipéptido de GPCR de tipo DA en las células puede determinarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica para detectar ARNm o polipéptido. Pueden usarse procedimientos o bien cualitativos o bien cuantitativos. Puede determinarse la presencia de productos polipeptídicos de un polinucleótido de GPCR de tipo DA, por ejemplo, usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo procedimientos inmunoquímicos tales como radioinmunoensayo, inmunotransferencia de tipo Western e inmunohistoquímica. Alternativamente, puede determinarse la síntesis de polipéptido in vivo, en un cultivo celular, o en un sistema de traducción in vitro detectando la incorporación de aminoácidos marcados dentro de un polipéptido GPCR de tipo DA.
Tal selección puede llevarse a cabo o bien en un sistema de ensayo libre de células o bien en una célula intacta. Puede usarse cualquier célula que exprese un polinucleótido de GPCR de tipo DA en un sistema de ensayo basado en células. El polinucleótido de GPCR de tipo DA puede producirse de manera natural en la célula o puede introducirse usando técnicas tales como las descritas anteriormente. Puede usarse o bien un cultivo primario o bien una línea celular establecida, tal como células CHO o células 293 de riñón embrionario humano.
Composiciones farmacéuticas
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que pueden administrarse a un paciente para lograr un efecto terapéutico. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender, por ejemplo, un polipéptido GPCR de tipo DA, polinucleótido de GPCR de tipo DA, anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido GPCR de tipo DA, o compuestos miméticos, agonistas, antagonistas o inhibidores de una actividad de polipéptido GPCR de tipo DA. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con al menos otro agente, tal como compuesto estabilizante, que puede administrarse en cualquier vehículo estéril, farmacéutico y biocompatible, incluyendo, pero sin limitarse a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones pueden administrarse a un paciente solas, o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.
Además de los principios activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y compuestos auxiliares que facilitan el tratamiento de los principios activos para dar preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse mediante varias vías que incluyen, pero no se limitan a, medios orales, intravenosos, intramusculares, intraarteriales, intramedulares, intratecales, intraventriculares, transdérmcios, subcutáneos, intraperitoneales, intranasales, parenterales, tópicos, sublinguales, o rectales. Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden formularse usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para la administración oral. Tales vehículos permiten a las composiciones farmacéuticas formularse como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones acuosas, suspensiones y similares, para su ingestión por un paciente.
Pueden obtenerse preparaciones farmacéuticas para su uso oral mediante la combinación de principios activos con excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante, y tratando la mezcla de gránulos, tras añadir compuestos auxiliares adecuados, si se desea, para obtener núcleos de grageas o comprimidos. Excipientes adecuados son cargas de proteínas o hidratos de carbono, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa de sodio; gomas incluyendo arábiga y tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico, o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.
Pueden usarse núcleos de grageas junto con recubrimientos adecuados, tales como disoluciones de azúcar concentradas, que también contienen goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse materias colorantes o pigmentos a los recubrimientos de grageas o comprimidos para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de principio activo, es decir, la dosificación.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas de gelatina y un recubrimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener principios activos mezclados con una carga o aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los principios activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquido, o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden formularse en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como disolución de Hanks, disolución de Ringer, o solución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los principios activos como suspensiones de inyección grasas apropiadas. Los vehículos o disolventes lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. También pueden usarse aminopolímeros policatiónicos no lipídicos para la administración. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones sumamente concentradas. Para la administración tópica o nasal, se usan compuestos penetrantes en la formulación apropiados para la barrera particular que hay que penetrar. Tales compuestos penetrantes se conocen generalmente en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de una manera que se conoce en la técnica, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. La composición farmacéutica puede proporcionarse como una sal y puede formarse con muchos ácidos, incluyendo, pero sin limitarse a, clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos o protónicos de otro tipo de lo que lo son las formas de base libre correspondientes. En otros casos, la preparación preferida pueden ser polvos liofilizados que pueden contener cualquiera o todos los siguientes: histidina 1-50 mM, sacarosa al 0,1%-2%, y manitol al 2-7%, a intervalos de pH de 4,5 a 5,5, que se combinan con tampón antes de su
uso.
Pueden encontrare detalles adicionales de las técnicas para la formulación y administración en la última edición de REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). Tras haber preparado las composiciones farmacéuticas, pueden colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de un estado indicado. Un etiquetado de este tipo incluiría la cantidad, frecuencia y procedimiento de administración.
Procedimientos e indicaciones terapéuticas
GPCR están omnipresentes en el huésped mamífero y son responsables de muchas funciones biológicas, incluyendo muchas patologías. En consecuencia, es deseable encontrar compuestos y fármacos que por una parte estimulen un GPCR y que por otra parte puedan inhibir la función de un GPCR. Por ejemplo, pueden emplearse compuestos que activan un GPCR para fines terapéuticos, tales como el tratamiento de asma, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardiaca aguda, retención urinaria y osteoporosis. En particular, los compuestos que activan los GPCR son útiles para tratar diversas dolencias cardiovasculares tales como las provocadas por la carencia de flujo sanguíneo a los pulmones o hipertensión. Además, estos compuestos también pueden usarse para tratar diversos trastornos fisiológicos relativos al control anómalo de la homeostasia de electrolitos y fluido y en enfermedades asociadas con la secreción anómala de aldosterona inducida por angiotensina.
En general, los compuestos que inhiben la activación de un GPCR pueden usarse para una variedad de fines terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento de la hipotensión y/o hipertensión, angina de pecho, infarto de miocardio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia de próstata benigna, y trastornos psicóticos y neurológicos incluyendo esquizofrenia, excitación maníaca, depresión, delirio, demencia o retraso mental grave, discinesias, tales como enfermedad de Huntington o síndrome de Tourett, entre otras. Los compuestos que inhiben los GPCR también son útiles para invertir la anorexia endógena, el control de la bulimia, y para tratar diversas dolencias cardiovasculares tales como las provocadas por un flujo sanguíneo excesivo al pulmón o hipotensión. En particular, puede usarse la regulación de GPCR de tipo DA para tratar la enfermedad de Alzheimer.
Esta invención se refiere adicionalmente al uso de agentes novedosos identificados mediante ensayos de selección descritos anteriormente. En consecuencia, está dentro del alcance de esta invención el uso de un compuesto de prueba identificado tal como se describe en el presente documento en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, puede usarse un agente identificado tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un agente modulador, una molécula de ácido nucleico antisentido, un anticuerpo específico, una ribozima, o una molécula de unión a polipéptido GPCR de tipo DA) en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con un agente de este tipo. Alternativamente, puede usarse un agente identificado tal como se describe en el presente documento en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de un agente de este tipo. Además, esta invención se refiere a los usos de agentes novedosos identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente para los tratamientos tal como se describe en el presente documento.
Puede administrarse un reactivo que afecta a la actividad de GPCR de tipo DA a una célula humana, o bien in vitro o bien in vivo, para reducir la actividad de GPCR de tipo DA. El reactivo se une preferiblemente a un producto de expresión de un gen de GPCR de tipo DA humano. Si el producto de expresión es una proteína, el reactivo es preferiblemente un anticuerpo. Para el tratamiento de células humanas ex vivo, puede añadirse un anticuerpo a la preparación de células madre, excepto células madre embrionarias humanas, que se han extraído del cuerpo. Entonces pueden sustituirse las células en el mismo cuerpo humano o en otro, con o sin propagación clonal, tal como se conoce en la técnica.
En una realización, el reactivo se administra usando un liposoma. Preferiblemente, el liposoma es estable en el animal en el que se ha administrado durante al menos 30 minutos, más preferiblemente durante al menos 1 hora, e incluso más preferiblemente durante al menos 24 horas. Un liposoma comprende una composición lipídica que puede dirigir un reactivo, particularmente un polinucleótido, a un sitio particular en un animal, tal como un ser humano. Preferiblemente, la composición lipídica del liposoma puede seleccionar como diana un órgano específico de un animal, tal como el pulmón, hígado, bazo, corazón, cerebro, ganglios linfáticos, y piel.
Un liposoma útil en la presente invención comprende una composición lipídica que puede fusionarse con la membrana plasmática de la célula seleccionada como diana para administrar su contenido a la célula. Preferiblemente, la eficacia de transfección de un liposoma es de aproximadamente 0,5 \mug de ADN por 16 nmoles de liposoma administrado a aproximadamente 10^{6} células, más preferiblemente de aproximadamente 1,0 \mug de ADN por 16 nmoles de liposoma administrado a aproximadamente 10^{6} células, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 2,0 \mug de ADN por 16 nmoles de liposoma administrado a aproximadamente 10^{6} células. Preferiblemente, un liposoma tiene un diámetro de entre aproximadamente 100 y 500 nm, más preferiblemente de entre aproximadamente 150 y 450 nm, e incluso más preferiblemente de entre 200 y 400 nm.
Los liposomas adecuados para su uso en la presente invención incluyen los liposomas usados habitualmente, por ejemplo, en procedimientos de administración de genes conocidos por los expertos en la técnica. Liposomas más preferidos incluyen liposomas que tienen una composición lipídica policatiónica y/o liposomas que tienen un esqueleto de colesterol conjugado con polietilenglicol. Opcionalmente, un liposoma comprende un compuesto que puede dirigir el liposoma a una célula tumoral, tal como un ligando de célula tumoral expuesto sobre la superficie exterior del liposoma.
Puede conseguirse complejar un liposoma con un reactivo tal como una ribozima u oligonucleótido antisentido usando procedimientos que son habituales en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. 5.705.151). Preferiblemente, se combinan desde aproximadamente 0,1 \mug hasta aproximadamente 10 \mug de polinucleótido con aproximadamente 8 nmoles de liposomas, más preferiblemente desde aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 5 \mug de polinucleótidos con aproximadamente 8 nmoles de liposomas, e incluso más preferiblemente se combinan aproximadamente 1,0 \mug de polinucleótidos con aproximadamente 8 nmoles de liposomas.
En otra realización, pueden administrarse anticuerpos a tejidos específicos in vivo usando administración dirigida mediada por receptor. Se enseñan técnicas de administración de ADN mediada por receptor, por ejemplo, en Findeis et al. Trends in Biotechnol. 11, 202-05 (1993); Chiou et al., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-24 (1988); Wu et al., J Biol. Chem. 269, 542-46 (1994); Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3655-59 (1990); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 338-42 (1991).
Determinación de una dosis terapéuticamente eficaz
La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz está dentro de las posibilidades de los expertos en la técnica. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad de principio activo que aumenta o disminuye la actividad de GPCR de tipo DA con respecto a la actividad de GPCR de tipo DA que se produce en ausencia de la dosis terapéuticamente eficaz.
Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente o bien en ensayos de cultivo celular o bien en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros o cerdos. También puede usarse el modelo animal para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Entonces puede usarse tal información para determinar las dosis útiles y vías de administración en seres humanos.
Pueden determinarse la toxicidad y eficacia terapéutica, por ejemplo, DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población), mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales experimentales. La razón de dosis de efectos tóxico frente a terapéutico es el índice terapéutico, y puede expresarse como la razón DL_{50}/DE_{50}.
Se prefieren las composiciones farmacéuticas que muestran grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de ensayos en cultivo celular y estudios en animales se usan para formular un intervalo de dosificación para uso humano. La dosificación contenida en tales composiciones está preferiblemente dentro del intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada, la sensibilidad del paciente, y la vía de administración.
Se determinará la dosificación exacta por el médico, en vista de los factores relacionados con el sujeto que requiere el tratamiento. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del principio activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado patológico, la salud general del sujeto, edad, peso, y género del sujeto, dieta, hora y frecuencia de la administración, combinación (combinaciones) farmacéutica(s), reacciones alérgicas, y tolerancia/respuesta al tratamiento. Las composiciones farmacéuticas de larga duración pueden administrarse cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y velocidad de aclaramiento de la formulación particular.
Las cantidades de dosificación normales pueden variar desde 0,1 hasta 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la vía de administración. Se proporciona una guía de los procedimientos de administración y dosificaciones particulares en la bibliografía y está generalmente disponible para los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica emplearan diferentes formulaciones para nucleótidos que para proteínas o sus inhibidores. Igualmente, la administración de polinucleótidos o polipéptidos será específica para células particulares, estados, ubicaciones, etc.
Si el reactivo es un anticuerpo de cadena sencilla, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo pueden construirse e introducirse en una célula o bien ex vivo o bien in vivo usando técnicas bien establecidas, pero no limitadas a, transferencia de ADN mediada por transferrina-policatión, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposoma, transporte intracelular de perlas de látex recubiertas de ADN, fusión de protoplastos, infección viral, electroporación, "pistola génica" ("gene gun"), y transfección mediada por fosfato de calcio o DEAE.
Las dosificaciones eficaces in vivo de un anticuerpo están en el intervalo de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 50 \mug/kg, de aproximadamente 50 \mug a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 500 \mug/kg de peso corporal del paciente, y de aproximadamente 200 a aproximadamente 250 \mug/kg de peso corporal del paciente. Para la administración de polinucleótidos que codifican para anticuerpos de cadena sencilla, las dosificaciones eficaces in vivo están en el intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 ng, de 500 ng a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 500 \mug, y de aproximadamente 20 \mug a aproximadamente 100 \mug de ADN.
Si el producto de expresión es ARNm, el reactivo es preferiblemente una ribozima o un oligonucleótido antisentido. Pueden introducirse polinucleótidos que expresan ribozimas u oligonucleótidos antisentido en células mediante una variedad de procedimientos, tal como se describió anteriormente.
Preferiblemente, un reactivo reduce la expresión de un gen de GPCR de tipo DA o la actividad de un polipéptido DA-GPCR en al menos aproximadamente un 10, preferiblemente aproximadamente un 50, más preferiblemente aproximadamente un 75, 90 ó 100% con respecto a la ausencia del reactivo. La eficacia del mecanismo seleccionado para disminuir el nivel de expresión de un gen de GPCR de tipo DA o la actividad de un polipéptido GPCR de tipo DA puede evaluarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica tales como hibridación de sondas de nucleótidos frente a ARNm específico de GPCR de tipo DA, RT-PCR cuantitativa, detección inmunológica de un polipéptido GPCR de tipo DA, o medición de la actividad de GPCR de tipo DA.
En cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la invención puede administrarse en combinación con agentes terapéuticos apropiados. La selección de agentes apropiados para su uso en terapia de combinación puede realizarse por un experto en la técnica, según principios farmacéuticos convencionales. La combinación de agentes terapéuticos puede actuar de manera sinérgica para llevar a cabo el tratamiento o la prevención de los diversos trastornos descritos anteriormente. Usando este enfoque, puede alcanzarse la eficacia terapéutica con dosificaciones inferiores de cada agente, reduciendo así la posibilidad de efectos secundarios adversos.
Cualquiera de los procedimientos terapéuticos descritos anteriormente pueden aplicarse a cualquier sujeto que necesite un tratamiento de este tipo, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y lo más preferiblemente, seres humanos.
Procedimientos diagnóstico
También pueden usarse GPCR en ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades y anomalías o sensibilidad a enfermedades y anomalías relacionadas con la presencia de mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para GPCR. Tales enfermedades, a modo de ejemplo, están relacionadas con la transformación celular, tales como tumores y cánceres, y diversos trastornos cardiovasculares, incluyendo hipertensión e hipotensión, así como enfermedades que surgen del flujo sanguíneo anómalo, secreción anómala de aldosterona inducida por angiotensina, y otros control anómalo de homeostasia de electrolitos y fluidos.
Pueden determinarse diferencias entre la secuencia genómica o de ADNc que codifica para GPCR en individuos afectados por una enfermedad e individuos normales. Si se observa una mutación en alguno o todos los individuos afectados pero no en los individuos normales, entonces es posible que la mutación sea el agente que causa la enfermedad.
Las diferencias de secuencia entre un gen de referencia y un gen que tiene mutaciones pueden demostrarse mediante el procedimiento de secuenciación de ADN directa. Además, pueden emplearse los segmentos de ADN clonado como sondas para detectar segmentos específicos de ADN. La sensibilidad de este procedimiento se potencia mucho cuando se combina con PCR. Por ejemplo, puede utilizarse un cebador de secuenciación con un producto de PCR de cadena doble o una molécula molde de cadena única generada mediante una PCR modificada. La determinación de la secuencia se realiza mediante procedimientos convencionales utilizando nucleótidos radiomarcados o mediante procedimientos de secuenciación automática utilizando etiquetas fluorescentes.
Las diferencias de secuencia de ADN basadas en pruebas genéticas pueden llevarse a cabo mediante detección o alteración en la movilidad electroforética de los fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Pueden visualizarse pequeñas inserciones y deleciones de secuencia, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de alta resolución. Pueden distinguirse fragmentos de ADN de las secuencias diferentes sobre geles de gradiente de formamida desnaturalizados en el que las movilidades de los diferentes fragmentos de ADN se retardan en el gel en posiciones diferentes según sus temperaturas de fusión parcial o de fusión específica (véase, por ejemplo, Myers et al., Science 230, 1242, 1985). También pueden demostrarse los cambios de secuencia en ubicaciones específicas mediante ensayos de protección de la nucleasa, tales como protección de la RNasa y S1 o el procedimiento de escisión química (por ejemplo, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397-4401, 1985). Por tanto, la detección de una secuencia de ADN específica puede realizarse mediante procedimientos tales como la hibridación, la protección de la RNasa, la escisión química, la secuenciación de ADN directa o el uso de enzimas de restricción e inmunotransferencia de tipo Southern del ADN genómico. Además de los procedimientos directos tales como la electroforesis en gel y la secuenciación de ADN, las mutaciones también pueden detectarse mediante análisis in situ.
También pueden detectarse los niveles alterados de un GPCR en varios tejidos. Los ensayos utilizados para detectar niveles de los polipéptidos receptores en una muestra del cuerpo humano, tal como sangre o biopsia tisular, derivadas de un huésped, se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de inmunotransferencia de tipo Western, y ensayos ELISA.
Todas las patentes y solicitudes de patentes citadas en esta descripción se incorporan expresamente por referencia en el presente documento. Generalmente la descripción anterior describe la presente invención. Un entendimiento más completo puede obtenerse haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan para fines de ilustración solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Detección de la actividad de GPCR de tipo dopamina
El polinucleótido de SEQ ID NO. 1 se inserta en el vector de expresión pCEV4 y el vector de expresión pCEV4 - polipéptido GPCR de tipo dopamina obtenido se transfecta en células 293 de riñón embrionario humano. Las células se rascan de un matraz de cultivo y se pasan a 5 ml de Tris HCl, EDTA 5 mM, pH 7,5, y se lisan mediante sonicación. Los lisados celulares se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se centrifuga a 30.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El sedimento se suspende en tampón de unión que contiene Tris HCl 50 mM, MgSO_{4} 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5, complementado con BSA al 0,1%, aprotinina 2 \mug/ml, leupeptina 0,5 mg/ml, y fosforamidón 10 \mug/ml. Las diluciones de suspensión de membrana óptimas, definidas como la concentración de proteína requerida para unir menos del 10% del radioligando añadido, es decir, dopamina marcada con ^{125}I, se añaden a placas de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos que contienen ligando, péptidos no marcados y tampón de unión, hasta un volumen final de 250 \mul.
En ensayos de unión de saturación en equilibrio, las preparaciones de membrana se incuban en presencia de concentraciones crecientes (de 0,1 nM a 4 nM) del ligando marcado con ^{125}I.
Las mezclas de la reacción de unión se incuban durante una hora a 30ºC. La reacción se para mediante filtración a través de filtros GF/B tratados con polietilenimina al 0,5%, utilizando un colector de células. La radiactividad se mide mediante recuento por centelleo y los datos se analizan mediante un programa de regresión no lineal informatizado. La unión no específica se define como la cantidad de radiactividad que queda tras la incubación de la proteína de membrana en presencia de 100 nM de péptido no marcado. La concentración de la proteína se mide mediante el método de Bradford utilizando el reactivo de Bio-Rad, con albúmina sérica bovina como patrón. Se demuestra la actividad de GPCR de tipo dopamina del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2.
Ejemplo 2 Ensayos de unión a radioligando
Las células 293 de riñón embrionario humano transfectadas con un polinucleótido que expresa GPCR de tipo DA humano, se rascan de un matraz de cultivo y se pasan a 5 ml de Tris HCl, EDTA 5 mM, pH 7,5, y se lisan mediante sonicación. Los lisados celulares se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se centrifuga a 30,000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El sedimento se suspende en tampón de unión que contiene Tris HCl 50 mM, MgSO_{4} 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5, complementado con BSA al 0,1%, aprotinina 2 \mug/ml, leupeptina 0,5 mg/ml, y fosforamidón 10 \mug/ml. Las diluciones de suspensión de membrana óptimas, definidas como la concentración de proteína requerida para unir menos del 10% del radioligando añadido, es decir, dopamina, se añaden a placas de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos que contienen ligando marcado con ^{125}I o compuesto de prueba, péptidos no marcados y tampón de unión, hasta un volumen final de 250 \mul.
En ensayos de unión de saturación en equilibrio, las preparaciones de membrana se incuban en presencia de concentraciones crecientes (de 0,1 nM a 4 nM) del ligando marcado con ^{125}I o compuesto de prueba (actividad específica de 2200 Ci/mmol). Las afinidades de unión de los diferentes compuestos de prueba se determinan en ensayos de unión de competencia en equilibrio, utilizando el péptido marcado con ^{125}I 0,1 nM en presencia de doce concentraciones diferentes de cada compuesto de prueba.
Las mezclas de la reacción de unión se incuban durante una hora a 30ºC. La reacción se para mediante filtración a través de filtros GF/B tratados con polietilenimina al 0,5%, utilizando un colector de células. La radiactividad se mide mediante recuento por centelleo y los datos se analizan mediante un programa de regresión no lineal informatizado.
La unión no específica se define como la cantidad de radiactividad que queda tras la incubación de la proteína de membrana en presencia de 100 nM de péptido no marcado. La concentración de la proteína se mide mediante el método de Bradford utilizando el reactivo de Bio-Rad, con albúmina sérica bovina como patrón. Un compuesto de prueba que aumenta la radiactividad de la proteína de membrana en al menos el 15% con respecto a la radiactividad de la proteína de membrana que no se incubó con el compuesto de prueba, se identifica como un compuesto que se une a un polipéptido GPCR de tipo DA.
Ejemplo 3 Efecto de un compuesto de prueba sobre la formación de AMP cíclico mediada por GPCR de tipo DA
La inhibición mediada por receptor de la formación de AMPc puede someterse a ensayo en células huésped que expresan GPCR de tipo DA humano. Las células se siembran en placas de 96 pocillos y se incuban en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco complementada con HEPES 10 mM, teofilina 5 mM, aprotinina 2 \mug/ml, leupeptina 0,5 mg/ml, y fosforamidón 10 \mug/ml durante 20 minutos a 37ºC en 5% de CO_{2}. Se añade un compuesto de prueba y se incuba durante 10 minutos adicionales a 37ºC. El medio se aspira y la reacción se para mediante la adición de HCl 100 mM. Las placas se almacenan a 4ºC durante 15 minutos. El contenido de AMPc en la disolución de parada se mide mediante radioinmunoensayo.
La radiactividad se cuantifica utilizando un contador gamma equipado con un software de reducción de datos. Un compuesto de prueba que disminuye la radiactiva del contenido de un pocillo con respecto a la radiactividad del contenido de un pocillo en ausencia del compuesto de prueba, se identifica como un posible inhibidor de la formación de AMPc. Un compuesto de prueba que aumenta la radiactividad del contenido de un pocillo con respecto a la radiactividad del contenido de un pocillo en ausencia del compuesto de prueba, se identifica como un posible potenciador de la formación de AMPc.
Ejemplo 4 Efecto de un compuesto de prueba sobre la movilización del calcio intracelular
La concentración de calcio libre intracelular puede medirse mediante microespectrofluorometría utilizando el colorante indicador fluorescente Fura-2/AM (Bush et al., J. Neurochem. 57, 562-74, 1991). Las células transfectadas establemente se siembran en una placa de cultivo de 35 mm que contiene un inserto de cubreobjetos de vidrio. Las células se lavan con HBS, se incuban con un compuesto de prueba, y se cargan con 100 \mul de Fura-2/AM (10 \muM) durante 20-40 minutos. Tras el lavado con HBS para eliminar la disolución de Fura-2/AM, las células se equilibran en HBS durante 10-20 minutos. Las células se visualizan entonces bajo el objetivo 40X de un microscopio Leitz Fluovert FS.
La emisión de fluorescencia se determina a 510 nm, alternando las longitudes de onda de excitación entre 340 nm y 380 nm. Los datos de fluorescencia sin tratar se convierten en concentraciones de calcio utilizando técnicas de análisis de software y curvas de concentración de calcio patrón. Un compuesto de prueba que aumenta la fluorescencia en al menos el 15% con respecto a la fluorescencia en ausencia de un compuesto de prueba, se identifica como un compuesto que moviliza el calcio intracelular.
Ejemplo 5 Efecto de un compuesto de prueba sobre el metabolismo de fosfoinosítido
Células que expresan establemente ADNc de GPCR de tipo DA humano se siembran en placas de 96 pocillos y se hacen crecer hasta la confluencia. El día antes del ensayo, el medio de crecimiento se cambia por 100 \mul de medio que contiene el 1% de suero y 0,5 \betaCi de ^{3}H-mioinositol. Las placas se incuban durante la noche en un incubador de CO_{2} (5% de CO_{2} a 37ºC). Inmediatamente antes del ensayo, el medio se extrae y se sustituye por 200 \mul de PBS que contiene LiCl 10 mM, y las células se equilibran con el nuevo medio durante 20 minutos. Durante este intervalo, las células también se equilibran con antagonista, añadido como una alícuota de 10 \mul de una disolución concentrada 20 veces en PBS.
La acumulación de ^{3}H-inositol fosfato a partir del metabolismo del fosfolípido inositol se inicia añadiendo 10 \mul de una disolución que contiene un compuesto de prueba. Al primer pocillo se añaden 10 \mul para medir la acumulación basal. En los siguientes 11 pocillos de cada fila de la placa, se someten a ensayo once concentraciones diferentes del compuesto de prueba. Todos los ensayos se realizan por duplicado repitiendo las mismas adiciones en dos filas consecutivas de la placa.
Las placas se incuban en un incubador de CO_{2} durante una hora. La reacción se termina añadiendo 15 \mul de ácido tricloroacético (TCA) al 50% v/v, seguido por una incubación de 40 minutos a 4ºC. Tras neutralizar el TCA con 40 \mul de Tris 1 M, el contenido de los pocillos se transfiere a una placa filtrante Multiscreen HV (Millipore) que contiene Dowex AG1-X8 (200-400 de malla, forma de formiato). Las placas filtrantes se preparan añadiendo 200 \mul de suspensión de Dowex AG1-X8 (50% v/v, agua:resina) a cada pocillo. Las placas filtrantes se colocan en un distribuidor de vacío para lavar o eluir el lecho de resina. Cada pocillo se lava 2 veces con 200 \mul de agua, seguido por 2 x 200 \mul de tetraborato de sodio 5 mM/formiato de amonio 60 mM.
Los ^{3}H-IP se eluyen a placas de 96 pocillos vacías con 200 \mul de formiato de amonio 1,2 M/ácido fórmico 0,1. El contenido de los pocillos se añade a 3 ml de cóctel de centelleo y se determina la radiactividad mediante recuento por centelleo líquido.
Ejemplo 6 Procedimiento de unión al receptor
Ensayos de unión convencionales. Los ensayos de unión se llevan a cabo en un tampón de unión que contiene HEPES 50 mM, pH 7,4, BSA al 0,5% y MgCl_{2} 5 mM. El ensayo convencional para la unión de radioligando a fragmentos de membrana que comprenden polipéptidos GPCR de tipo DA se lleva a cabo tal como sigue en placas de microtitulación de 96 pocillos (por ejemplo, placas Immulon II Removawell de Dynatech). El radioligando se diluye en tampón de unión + PMSF/Baci hasta las cpm deseadas por 50 \mul, después se añaden alícuotas de 50 \mul a los pocillos. Para las muestras de unión no específica, también se añaden 5 \mul de ligando frío 40 \muM por pocillo. La unión se inicia añadiendo 150 \mul por pocillo de membrana diluida hasta la concentración deseada (10-30 \mug de proteína de membrana/pocillo) en tampón de unión + PMSF/Baci. Las placas se cubren entonces con selladores de placas de Mylar Linbro (Flow Labs) y se colocan en un dispositivo de agitación Microshaker II de Dynatech. Se permite que la unión continúe a temperatura ambiente durante 1-2 horas y se detiene mediante la centrifugación de la placa durante 15 minutos a 2.000 x g. Los sobrenadantes se decantan y los sedimentos de membrana se lavan una vez mediante la adición de 200 \mul de tampón de unión enfriado en hielo, la agitación breve y la centrifugación de nuevo. Los pocillos individuales se colocan en tubos de 12 x 75 mm y se someten a recuento en un contador Gammamaster de LKB (78% de eficacia). La unión específica mediante este procedimiento es idéntica a la medida cuando el ligando libre se elimina mediante filtración rápida (3-5 segundos) y lavado sobre filtros de fibra de vidrio recubiertos con polietilenimina.
También se utilizan tres variaciones del ensayo de unión convencional.
1.
Ensayos de unión de radioligando competitivos con un intervalo de concentración de ligando frío frente a ligando marcado con ^{125}I se llevan a cabo tal como se describió anteriormente con una modificación. Todas las diluciones de ligandos que se someten a ensayo se preparan en 40X PMSF/Baci hasta una concentración 40X la concentración final en el ensayo. Entonces se añaden las muestras de péptido (5 \mul cada una) por pocillo de microtitulación. Las membranas y el radioligando se diluyen en tampón de unión sin inhibidores de proteasas. El radioligando se añade y se mezcla con ligando frío, y después se inicia la unión mediante la adición de las membranas.
2.
La reticulación química del radioligando con receptor se realiza tras una etapa de unión idéntica al ensayo convencional. Sin embargo, la etapa de lavado se realiza con tampón de unión menos BSA para reducir la posibilidad de reticulación no específica del radioligando con BSA. La etapa de reticulación se lleva a cabo tal como se describe más adelante.
3.
También se llevan a cabo ensayos de unión a mayor escala para obtener sedimentos de membrana para estudios sobre la solubilización del complejo receptor : ligando y para la purificación del receptor. Éstos son idénticos a los ensayos convencionales, excepto en que (a) la unión se lleva a cabo en tubos de polipropileno en volúmenes de 1 - 250 ml, (b) la concentración de la proteína de membrana siempre es de 0,5 mg/ml, y (c) para la purificación del receptor, se reduce la concentración de BSA en el tampón de unión hasta el 0,25%, y la etapa de lavado se realiza con tampón de unión sin BSA, lo que reduce la contaminación por BSA del receptor purificado.
Ejemplo 7 Reticulación química de radioligando a receptor
Tras una etapa de unión a radioligando tal como se describió anteriormente, los sedimentos de membrana se resuspenden en 200 \mul por pocillo de placa de microtitulación de tampón de unión enfriado en hielo sin BSA. Entonces se añaden 5 \mul por pocillo de N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida 4 mM (ANB-NOS, Pierce) en DMSO y se mezclan. Las muestras se mantienen en hielo y se irradian con UV durante 10 minutos con una lámpara Mineralight R-52G (UVP Inc., San Gabriel, Calif.) a una distancia de 5-10 cm. Entonces, las muestras se transfieren a tubos de microcentrífuga Eppendorf, las membranas se sedimentan mediante centrifugación y los sobrenadantes se extraen, y las membranas se solubilizan en tampón de muestra de SDS de Laemmli para electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). La PAGE se lleva a cabo tal como se describe más adelante. Las proteínas radiomarcadas se visualizan mediante autorradiografía de los geles secados con película XAR de Kodak y pantallas de intensificador de imagen de DuPont.
Ejemplo 8 Solubilización de membranas
La solubilización de membranas se lleva a cabo en tampón que contiene Tris 25 mM, pH 8, glicerol al 10% (p/v) y CaCl_{2} 0,2 mM (tampón de solubilización). Los detergentes altamente solubles incluyendo Tritón X-100, desoxicolato, lisolecitina : desoxicolato, CHAPS, y detergente zwitteriónico se preparan en tampón de solubilización a concentraciones del 10% y se almacenan como alícuotas congeladas. La lisolecitina se prepara reciente debido a la insolubilidad con la congelación - descongelación y la digitonina se prepara reciente a concentraciones inferiores debido a su solubilidad más limitada.
Para solubilizar las membranas, los sedimentos lavados tras la etapa de unión se resuspenden libres de partículas visibles pipeteando y agitando con vórtex en tampón de solubilización a 100.000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se extraen y se mantienen en hielo y los sedimentos se desechan.
Ejemplo 9 Ensayos de receptores solubilizados
Tras la unión de ligandos marcados con ^{125}I y la solubilización de las membranas con detergente, el complejo R:L intacto puede someterse a ensayo mediante cuatro procedimientos diferentes. Todos se llevan a cabo en hielo o en una sala fría a 4-10ºC.).
1.
Cromatografía en columna (Knuhtsen et al., Biochem. J. 254, 641-647, 1988). Se equilibran columnas Sephadex G-50 (8 x 250 mm) con tampón de solubilización que contiene detergente a la concentración utilizada para solubilizar membranas y albúmina sérica bovina 1 mg/ml. Las muestras de membranas solubilizadas (0,2 - 0,5 ml) se aplican a las columnas y se eluyen a una velocidad de flujo de aproximadamente 0,7 ml/minuto. Se recogen muestras (0,18 ml). La radiactividad se determina en un contador gamma. Los volúmenes iniciales de las columnas se determinan mediante el volumen de elución del dextrano azul. La radiactividad que eluye en el volumen inicial se considera unida a la proteína. La radiactividad que eluye más tarde, en el mismo volumen como ligandos marcados con ^{125}I, se considera no unida.
2.
Precipitación en polietilenglicol (Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 318-322, 1972). Para una muestra de 100 \mul de membranas solubilizadas en un tubo de polipropileno de 12 x 75 mm, se añaden 0,5 ml de gamma-globulina bovina al 1% (p/v) (Sigma) en tampón fosfato de sodio 0,1 M, seguido por 0,5 ml de polietilenglicol al 25% (p/v) (Sigma) y se mezclan. La mezcla se mantiene en hielo durante 15 minutos. A continuación se añaden 3 ml de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,4, por muestra. Las muestras se filtran rápidamente (1 - 3 segundos) sobre filtros de fibra de vidrio Whatman GF/B y se lavan con 4 ml del tampón fosfato. El complejo receptor : ligando marcado con ^{125}I precipitado con PEG se determina mediante el recuento gamma de los filtros.
3.
Unión al filtro GFB/PEI (Bruns et al., Analytical Biochem. 132, 74-81, 1983). Los filtros de fibra de vidrio Whatman GF/B se empapan con polietilenimina al 0,3% (PEI, Sigma) durante 3 horas. Las muestras de membranas solubilizadas (25 - 100 \mul) se vuelven a poner en tubos de polipropileno de 12 x 75 mm. Entonces, se añaden 4 ml de tampón de solubilización sin detergente por muestra y las muestras se filtran inmediatamente a través de filtros GFB/PEI (1 - 3 segundos) y se lavan con 4 ml de tampón de solubilización. Las CPM del complejo receptor : ligando marcado con ^{125}I adsorbido a los filtros se determinan mediante recuento gamma.
4.
Carbón/dextrano (Paul y Said, Peptides 7 [Supl. 1], 147-149, 1986). Se disuelve dextrano T70 (0,5 g, Pharmacia) en 1 litro de agua, después se añaden 5 g de carbón activado (Norit A, alcalino; Fisher Scientific). La suspensión se agita durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se almacena a 4ºC hasta su uso. Para medir el complejo R:L, se añaden 4 partes en volumen de suspensión de carbón/dextrano a 1 parte en volumen de la membrana solubilizada. Las muestras se mezclan y se mantienen en hielo durante 2 minutos y después se centrifugan durante 2 minutos a 11,000 x g en una microcentrífuga Beckman. El radioligando libre se adsorbe al carbón/dextrano y se desecha con el sedimento. Los complejos de recep- tor : ligando marcado con ^{125}I permanecen en el sobrenadante y se determinan mediante recuento gamma.
Ejemplo 10 Purificación del receptor
La unión de biotinil-receptor a membranas de GH_{4} C1 se lleva a cabo tal como se describió anteriormente. Las incubaciones se realizan durante 1 hora a temperatura ambiente. En el protocolo de purificación convencional, las incubaciones de unión contienen Bio-S29 10 nM. El ligando marcado con ^{125}I se añade como un indicador a niveles de 5.000-100.000 cpm por mg de proteína de membrana. Las incubaciones control contienen ligando frío 10 \muM para saturar el receptor con ligando no biotinilado.
La solubilización del complejo receptor : ligando también se lleva a cabo tal como se describió anteriormente, con lisolecitina: desoxicolato al 0,15% en tampón de solubilización que contiene MgCl_{2} 0,2 mM, para obtener sobrenadantes de 100.000 x g que contienen el complejo R:L solubilizado.
La estreptavidina inmovilizada (estreptavidina reticulada a agarosa en perlas al 6%, Pierce Chemical Co.; "SA-agarosa") se lava en tampón de solubilización y se añade a las membranas solubilizadas como 1/30 del volumen final. Esta mezcla se incuba con agitación constante mediante rotación continua ("end-over-end") durante 4 - 5 horas a 4 - 10ºC. Entonces, la mezcla se aplica a una columna y el material no unido se elimina por lavado. La unión del radioligando a SA-agarosa se determina comparando las cpm en el sobrenadante de 100.000 x g con las del efluente de la columna tras la adsorción a SA-agarosa. Finalmente, la columna se lava con 12 - 15 volúmenes de columna del tampón de solubilización + lisolecitina: desoxicolato al 0,15% + 1/500 (vol/vol) de 100 x 4 pase.
La columna de estreptavidina se eluye con tampón de solubilización + EDTA 0,1 mM + EGTA 0,1 mM + GTP-gamma-S 0,1 mM (Sigma) + lisolecitina : desoxicolato al 0,15% (p/vol) + 1/1000 (vol/vol) de 100.times.4pase. En primer lugar, se hace pasar un volumen de la columna de tampón de elución a través de la columna y el flujo se detiene durante 20 - 30 minutos. Entonces, se hacen pasar a su través 3 - 4 volúmenes de la columna más de tampón de elución. Se reúnen todos los eluatos.
Los eluatos de la columna de estreptavidina se incuban durante la noche (12 - 15 horas) con aglutinina de germen de trigo inmovilizada (WGA-agarosa, Vector Labs) para adsorber el receptor mediante la interacción de los hidratos de carbono unidos covalentemente con WGA-lecitina. La razón (vol/vol) de eluato de la columna de WGA-agarosa con respecto al de estreptavidina generalmente es de 1:400. También puede utilizarse un intervalo de 1:1000 a 1:200. Tras la etapa de unión, la resina se sedimenta mediante centrifugación, el sobrenadante se extrae y se guarda y la resina se lava 3 veces (aproximadamente 2 minutos cada una) con tampón que contiene HEPES 50 mM, pH 8, MgCl_{2} 5 mM, y lisolecitina : desoxicolato al 0,15%. Para eluir el receptor unido a WGA, la resina se extrae tres veces mediante mezclado repetido (mezclador de vórtex a velocidad baja) durante un periodo de tiempo de 15 - 30 minutos en hielo, con 3 columnas de resina cada vez, de N-N'-N''-triacetilquitotriosa 10 mM en el mismo tampón HEPES usado para lavar la resina. Tras cada etapa de elución, la resina se centrifuga y el sobrenadante se extrae cuidadosamente, libre de sedimentos de WGA-agarosa. Los tres eluatos reunidos contienen el receptor final purificado. El material no unido a WGA contiene subunidades de proteínas G eluidas específicamente de la columna de estreptavidina, así como contaminantes no específicos. Todas estas fracciones se almacenan congeladas a -90ºC.
Ejemplo 11 Identificación de los compuestos de prueba que se unen a los polipéptidos GPCR de tipo DA
Los polipéptidos DA-GPCR purificados que comprenden una proteína de glutatión-S-transferasa y absorbidos en pocillos derivatizados con glutatión de placas de microtitulación de 96 pocillos se ponen en contacto con compuestos de prueba de una pequeña biblioteca de moléculas a pH 7,0 en una disolución tampón fisiológica. Los polipéptidos DA-GPCR comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2. Los compuestos de prueba comprenden una etiqueta fluorescente. Las muestras se incuban durante de 5 minutos a una hora. Las muestras control se incuban en ausencia de un compuesto de prueba.
La disolución tampón que contiene los compuestos de prueba se lava de los pocillos. La unión de un compuesto de prueba a un polipéptido GPCR de tipo DA se detecta mediante mediciones de fluorescencia del contenido de los pocillos. Un compuesto de prueba que aumenta la fluorescencia en un pocillo en al menos el 15% con relación a la fluorescencia de un pocillo en el que no se incuba un compuesto de prueba, se identifica como un compuesto que se une a un polipéptido GPCR de tipo DA.
Ejemplo 12 Identificación de un compuesto de prueba que disminuye la expresión génica de GPCR de tipo DA
Se administra un compuesto de prueba a un cultivo de células gástricas humanas y se incuba a 37ºC durante de 10 a 45 minutos. Un cultivo del mismo tipo de células incubado durante el mismo tiempo sin el compuesto de prueba proporciona un control negativo.
Se aísla el ARN de los dos cultivos tal como se describe en Chirgwin et al., Biochem. 18, 5294-99, 1979). Se preparan inmunotransferencias de tipo Northern blot utilizando de 20 a 30 \mug de ARN total y se hibridan con una sonda específica de GPCR de tipo DA marcada con ^{32}P a 65ºC en Express-hyb (CLONTECH). La sonda comprende al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados del complemento de SEQ ID NO. 1. Un compuesto de prueba que disminuye la señal específica de GPCR de tipo DA con respecto a la señal obtenida en ausencia del compuesto de prueba, se identifica como un inhibidor de la expresión génica de GPCR de tipo DA.
Ejemplo 13 Tratamiento de la esquizofrenia con un reactivo que se une específicamente a un producto del gen de GPCR de tipo DA
Se lleva a cabo la síntesis de oligonucleótidos antisentido de GPCR de tipo DA que comprenden al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados del complemento de SEQ ID NO. 1, en un sintetizador de la serie de Gene Assembler de Pharmacia utilizando el procedimiento de la fosforamidita (Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 534-83, 1990). Tras el ensamblaje y la desprotección, los oligonucleótidos se precipitan en etanol dos veces, se secan y se suspenden en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración deseada. La pureza de estos oligonucleótidos se prueba mediante electroforesis capilares en gel y HPLC de intercambio iónico. Los niveles de endotoxina en la preparación de oligonucleótidos se determinan utilizando en ensayo de amebocitos de Limulus (Bang, Biol. Bull. (Woods Hole, Mass.) 105, 361-362, 1953).
Los oligonucleótidos antisentido se administran a un paciente con esquizofrenia. Disminuye la gravedad de la esquizofrenia del paciente.
Ejemplo 14 Análisis de unión a ligando
Se recogen células COS-7 de 48 a 72 h tras la transfección con constructos de expresión de GPCR de tipo DA humano. Las células contenidas en los matraces de cultivo (75 cm^{2}) se enjuagan con 5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4). Las células se rascan entonces y se homogeneizan en tampón de lisis durante 15 segundos utilizando un homogenizador Brinkman.
Las membranas se centrifugan a 50.000 x g durante 20 minutos, y el sedimento se resuspende en tampón de unión (Tris HCl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4). Se llevan a cabo estudios de unión de saturación con concentraciones crecientes de [^{125}I]SCH 23982 (2200 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq). Se realizan curvas de competencia con concentraciones crecientes del fármaco no marcado en estudio frente a una concentración constante de [^{125}I]SCH 233982 (aproximadamente 0,20 nM). La reacción se inicia añadiendo 100 \mul de membranas (aproximadamente 0,45 \mug de proteína), y la mezcla de ensayo se incuba en un volumen final de 200 \mul durante 1 hora a temperatura ambiente. Las mezclas de ensayo se filtran entonces a vacío a través de filtros de fibra de vidrio Whatman GF/C y se lavan 3 veces con 5 ml de tampón de lavado frío (Tris HCl 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,2). La unión total y no específica se definen en ausencia y presencia de cis-flupentixol 10 \muM. Cada determinación se realiza por triplicado. La radiactividad unida se mide a una eficacia del 75% utilizando un contador gamma (LKB instruments). Las curvas de unión se analizan utilizando programas de regresión múltiple no lineal. Véase DeLean et al., Mol. Pharmacol. 21, 5-16 (1982); McPherson, J. Pharmacol. Methods 14, 213-228 (1985).
Cis-flupentixol, cis-piflutixol y cis-teflutixol pueden obtenerse de Lundbeck (Dinarmarca). Fluperlapina puede obtenerse de Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dinamarca). SCH 23388 y SCH 23390 pueden obtenerse de Schering Plough (Bloomfield, N.J.). Apomorfina, (+)butaclamol, clorhidrato de dopamina, haloperidol, R(-)-propilnorapomorfina (NPA) y espiperona pueden adquirirse de Research Biochemical Industries (RBI). Fenoldopam y SKF 38393 pueden obtenerse de Smith, Kline & French. [^{125}I]SCH 23982 procedía de New England Nuclear Boston, Mass.).
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Ejemplo 15 Expresión específica de tejido de GPCR de tipo dopamina
El perfil de expresión de GPCR de tipo dopamina mediante PCR cuantitativa en tiempo real con muestras de ARN de tejido humano establece un papel para el GPCR de tipo dopamina en la enfermedad humana. El panel consiste en ARN total de cerebro, cerebro con Alzheimer total, cerebro fetal, cerebelo, médula espinal, corazón, corazón fetal, pericardio, células del músculo liso coronario, glándula tiroidea, tumor de glándula tiroidea, bazo, bazo (de paciente con cirrosis hepática), timo, médula ósea, pulmón, pulmón fetal, tumor de pulmón, hígado, hígado fetal, hígado (de paciente con cirrosis hepática), páncreas, páncreas (de paciente con cirrosis hepática), estómago, intestino delgado, colon, tumor de colon, riñón, músculo esquelético, células HeLa, tumor de mama, glándula mamaria, células MDA MB 231, testículos, tráquea, glándula suprarrenal, glándula salivar, vejiga, próstata, placenta, útero, tejido adiposo. Un desarrollo del análisis cinético de PCR se describe en Higuchi et al., BioTechnology 10, 413-17, 1992, y Higuchi et al., BioTechnology 11, 1026-30, 1993. El principio es que en cualquier ciclo dado dentro de la fase exponencial de la PCR, la cantidad de producto es proporcional al número inicial de copias de molde.
La amplificación por PCR se realiza en presencia de una sonda de oligonucleótido (sonda TaqMan) que es complementaria a la secuencia diana y se marca con un colorante indicador fluorescente y un colorante de extinción. Durante la fase extensión de la PCR, la sonda se escinde mediante la actividad de la endonucleasa 5'-3' de la Taq ADN polimerasa, liberando al fluoróforo del efecto del colorante de extinción (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7276-80, 1991). Dado que la emisión de fluorescencia aumenta en proporción directa con la cantidad del producto amplificado específico, puede detectarse y utilizarse la fase de crecimiento exponencial del producto de la PCR para determinar la concentración inicial del molde (Heid et al., Genome Res. 6, 986-94, 1996, y Gibson et al., Genome Res. 6, 995-1001, 1996).
Se lleva a cabo una PCR cuantitativa en tiempo real utilizando un detector de secuencias ABI Prism 7700.
El valor de C_{T} generado por cada reacción se utiliza para determinar la concentración inicial del molde (número de copias) mediante la interpolación a partir de una curva patrón universal. El nivel de expresión del gen diana en cada muestra se calcula con respecto a la muestra con la menor expresión del gen.
Extracción de ARN y preparación de ADNc. El ARN total de cada uno de los tipos celulares enumerados anteriormente se aisló utilizando el sistema RNeasy de Qiagen según el protocolo del fabricante (Crawley, West Sussex, RU). La concentración de ARN purificado se determina utilizando un kit de cuantificación de ARN RiboGreen (Molecular Probes Europe, Países Bajos). Para la preparación del ADNc, se somete 1 \mug de ARN total a transcripción inversa en un volumen final de 20 \mul, utilizando 200 U de transcriptasa inversa ARNasa H^{-} de SUPERSCRIPT™ (Life Technologies, Paisley, RU), ditiotreitol 10 mM, 0,5 mM de cada dNTP y 5 \muM de hexámeros aleatorios (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, RU) según el protocolo del fabricante.
Análisis cuantitativo de TaqMan. Se diseñaron cebadores y sondas específicos según las recomendaciones de PE Applied Biosystems; se utiliza una sonda FAM marcada con (6-carboxifluoresceína). La PCR de cuantificación se realiza con 5 ng de ARN sometido a transcripción inversa de cada muestra. Cada determinación se realiza por duplicado.
La mezcla de reacción del ensayo es tal como sigue: 1X TaqMan Universal PCR Master Mix final (a partir de 2X disolución madre) (PE Applied Biosystems, CA); cebador directo 900 nM; cebador inverso 900 nM; sonda 200 nM; 5 ng de ADNc; y agua hasta 25 \mul.
Cada una de las siguientes etapas se llevó a cabo una vez: pre PCR, 2 minutos a 50ºC, y 10 minutos a 95ºC. Las siguientes etapas se llevan a cabo 40 veces: desnaturalización, 15 segundos a 95ºC, hibridación/extensión, 1 minuto a 60ºC.
Todos los experimentos se llevaron a cabo utilizando un detector de secuencias ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, CA). Al final de la ejecución, se procesaron los datos de fluorescencia adquiridos durante la PCR, tal como se describe en el manual del usuario de ABI Prism 7700 para lograr una mejor sustracción del fondo, así como una linealidad de la señal con la cantidad objetivo de partida.
La tabla 1 muestra los resultados del perfil de expresión para GPCR de tipo dopamina utilizando las muestras tisulares y celulares indicadas. El resultado se muestra gráficamente en la figura 5. Se detecta alta expresión relativa en el cerebro con Alzheimer en comparación con el cerebro normal y en el tejido con cáncer en comparación con el tejido normal correspondiente.
TABLA 1
1
2
<110> Bayer AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> REGULACIÓN DEL RECEPTOR ACOPLADO A PROTEÍNAS G DE TIPO DOPAMINA HUMANO
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<130> REGULACIÓN DE TIPO DOPAMINA HUMANO
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<140>
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<141>
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<150> 60/205,195
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<151> 2000-05-18
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<160> 3
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 1008
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<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 1
3 
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<210> 2
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<211> 335
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<212> PRT
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<213> Humano
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<400> 2
4
5 
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<210> 3
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<211> 451
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<212> PRT
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<213> Humano
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<400> 3
6
7
8

Claims (1)

1. Procedimiento de selección para determinar agentes útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que regulan la actividad de un polipéptido GPCR de tipo dopamina que comprende
(a)
poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido GPCR de tipo dopamina que comprende
i.
una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, o
ii.
una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 90% con respecto a la SEQ ID NO: 2;
y
(b)
detectar una actividad de GPCR de tipo dopamina del polipéptido, en el que un compuesto de prueba, que disminuye la actividad de GPCR de tipo dopamina, se identifica como un posible agente terapéutico para disminuir la actividad del polipéptido GPCR de tipo dopamina.
ES01945139T 2000-05-18 2001-05-16 Regulacion del receptor acoplado a proteinas g de tipo dopamina humano. Expired - Lifetime ES2278755T3 (es)

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