ES2305229T3 - Receptor acoplado a la proteina g humana. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la detección de un polinucleótido que codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G en una muestra biológica que comprende las siguientes etapas: I) hibridar un polinucleótido seleccionado entre el grupo constituido por: a) un polinucleótido que codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: i. secuencias de aminoácidos que son al menos un 50% idénticas a las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 2; y ii. las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 2, b) a polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1; c) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido especificado en (a) y (b) y codifica un Polipéptido del receptor acoplado a la proteína G; d) un polinucleótido cuya secuencia se deriva las secuencias de polinucleótido especificadas en (a) a (c) debido a la generación del código genético y codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G; y e) un polinucleótido que representa un fragmento o o variación alélica de una secuencia de polinucleótidos especificada en (a) a (d) y codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G a un material de ácido nucleico de una muestra biológica, formando de esta forma un complejo de hibridación; y II) detectar dicho complejo de hibridación.
Description
Receptor acoplado a la proteína G humana.
Esta solicitud reivindica el beneficio de, e
incorpora por referencia, (en tramitación con la presente, la
solicitud provisional Nº de serie 60/274.233 presentada el 9 marzo
de 2001).
La invención se refiere al área de los
receptores acoplados a la proteína G humana. Más particularmente,
se refiere al área del receptor acoplado a la proteína G humana y su
regulación.
Muchos procesos biológicos médicamente
significativos están mediados por rutas de transducción de señal que
implican a las proteínas G (Lefkowitz, Nature 351,
353-354, 1991). La familia de los receptores
acoplados a la proteína G (GPCR) incluye receptores para hormonas,
neurotransmisores, factores de crecimiento, y virus. Los ejemplos
específicos de los GPCR incluyen los receptores de para tales
ejemplos diversos como calcitonina, hormonas adrenérgicas,
endotelina, AMPc, adenosina, acetilcolina, serotonina, dopamina,
histamina, trombina, quinina, hormona estimulante de folículos,
opsinas, gen 1 de diferenciación endotelial, rodopsinas, odorantes,
citomegalovirus, las propias proteínas G, proteínas efectoras tales
como fosfolipasa C, adenil ciclasa, y fosfodiesterasa, y proteínas
actuadoras tales como proteína quinasa A y proteína quinasa C.
La superfamilia de la proteína GPCR contiene
ahora por encima de 250 tipos de paralogos, receptores que
representan variantes generadas por duplicaciones de genes (u otros
procesos), como opuestos a ortólogos, el mismo receptor de
diferentes especies. La superfamilia se puede descomponer en cinco
familias: la familia I, receptores tipificados por rodopsina y
actualmente representada por encima de 200 únicos miembros (revisión
por Dohlman et al., Ann. Rev. Biochem. 60,
653-88, 1991, y las referencias en dicho documento);
la familia II, la familia recientemente caracterizada hormona
paratiroides/calcitonina/receptor de secretina (Juppner et
al., Science 254, 1024-26, 1991; Lin et
al., Science 254, 1022-24, 1991); la familia
III, la familia del receptor de glutamato metabotrópico en
mamíferos (Nakanishi, Science 258, 597-603, 1992);
la familia IV, la familia del receptor de AMPc, importante En la
quimiotaxis y desarrollo de D. discoideum (Klein et al.,
Science 241, 1467-72, 1988; y la familia V, los
receptores de feromonas de emparejamiento fúngico tal como STE2
(revisión por Kurjan, Ann. Rev. Biochem. 61,
1097-1129, 1992).
El documento WO 00/64942 describe el receptor
AXOR-27 acoplado a la proteína g que tiene similitud
estructural con el receptor de serotonina 5-HT6 y
los procedimientos para el aislamiento de agonistas y/o antagonistas
a ellos.
Los GPCR poseen siete dominios de extensión
sobre la membrana conservados que conectan al menos ocho bucles
hidrófilos divergentes. Los GPCRs (también conocidos como receptores
7TM) se han caracterizado por incluir estos siete tramos hidrófobos
conservados de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos, que conectan al
menos bucles hidrófilos divergentes. La mayoría de GPCR tienen
restos de cisteína conservados individuales en cada uno de los
primeros bucles extracelulares, que forman enlaces disulfuro que se
cree que estabilizan la estructura de la proteína funcional. Las
siete regiones transmembrana se designan como TM1, TM2, TM3, TM4,
TM5, TM6, y TM7. TM3 ha estado implicado en la transducción de
señal.
La fosforilación y lipidación (palmitilación o
farnesilación) de restos de cisteína pueden influenciar la señal de
transducción de algunos GPCR. La mayoría de los GPCR contienen
sitios de fosforilación potenciales dentro del tercer bucle
citoplásmico y/o el extremo carboxi. Para varios GPCR, la
fosforilación por la proteína quinasa A y/o quinasas receptoras
específicas media la desensibilización del receptor.
Para algunos receptores, los sitios de unión de
ligandos de los GPCR se cree que comprenden huecos hidrófilos
formados por varios dominios de transmembrana de GPCR. Los grupos
hidrófilos están rodeados de restos hidrófilos de los GPCR. El lado
hidrófilo de cada hélice de transmembrana de GPCR se postula que
está orientado hacia el interior y forma un sitio de unión de
ligando polar. TM3 ha estado implicado en varios GPCR por tener un
sitio de unión de ligando, tal como el resto aspartato de TM3
aspartato. Las serinas de TM5, una asparagina de TM6, y
fenilalaninas o tirosinas de TM6 o TM7 están también implicadas en
unión de ligando.
Los GPCR están acoplados en el interior de la
célula por proteínas G heterotriméricos a varias enzimas
intracelulares, canales de ion, y transportadores (véase Johnson
et al., Endoc. Rev. 10, 317-331, 1989).
Diferentes subunidades alfa de proteína G estimulan preferentemente
efectores particulares para modular diversas funciones biológicas
en una célula. La fosforilación de restos citoplásmicos de los GPCR
es un mecanismo importante para la regulación de algunos GPCR. Por
ejemplo, en una forma de transducción de señal, el efecto de la
unión de hormonas es la activación dentro de la célula de la
enzima, adenilato ciclasa. La activación de la enzima por las
hormonas depende de la presencia del nucleótido GTP. GTP también
influye en la unión de la hormona. Una proteína G conecta el
receptor de la hormona a la adenilato ciclasa. La proteína G cambia
GTP por GDP unido cuando se active por un receptor de hormona. La
forma que lleva GTP después se une a la adenilato ciclasa activada.
La hidrólisis de GTP a GDP, catalizar por la propia proteína G, hace
que la proteína g regrese a su forma basal, inactiva. De este modo,
la proteína G hace un papel dual, como un intermedio que transmite
la señal del receptor al efector, y como un reloj que controla la
duración de la señal.
Durante los pasados 15 años, aproximadamente 350
agentes terapéuticos que dirigen los receptores de GPCR se han
presentado con éxito en el mercado. Esto indica que estos receptores
tienen una historia establecida, probada como dianas terapéuticas.
Claramente, existe una necesidad progresiva para la identificación y
caracterización de GPCR adicionales que pueden jugar un papel en la
prevención, mejora, o disfunciones o enfermedades correspondientes
que incluyen, pero no se limitan a, infecciones tales como
infecciones bacterianas, fúngicas, protozoarias, y virales,
particularmente las provocadas por virus de VIH, dolor, cánceres,
anorexia, bulimia, asma, enfermedades de Parkinson, insuficiencia
cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención urinaria,
osteoporosis, angina de pecho, infarto de miocardio, úlceras, asma,
alergias, hipertrofia prostática benigna, y trastornos psicóticos y
neurológicos, incluyendo ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca,
delirio, demencia, retraso mental severo, y discinesias, tales como
enfermedad de Huntington y síndrome de Tourett.
Debido a los diversos efectos biológicos, existe
la necesidad en la técnica de identificar GPCR adicionales cuya
actividad se puede regular para proporcionar efectos
terapéuticos.
Un objeto de la invención es proporcionar
reactivos y procedimientos de regulación de un GPCR humano. Éste y
otros objetos de la invención se proporcionan por uno o más de las
realizaciones descritas a continuación. En el presente documento se
describe un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado entre el grupo
constituido por:
Las secuencias de aminoácidos que son al menos
aproximadamente 50% idénticas a
La secuencia de aminoácidos mostradas en la SEQ
ID NO: 2 y;
La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ
ID NO: 2;
\vskip1.000000\baselineskip
Todavía otra realización de la invención es un
procedimiento de selección de agentes que disminuyen la degradación
de la matriz nuclear. Un compuesto de ensayo se pone en contacto con
un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G que comprende
una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido
por:
Las secuencias de aminoácidos que son al menos
aproximadamente 50% idénticas a
La secuencia de aminoácidos mostradas en la SEQ
ID NO: 2 y;
La secuencia de aminoácidos mostradas en la SEQ
ID NO: 2;
\vskip1.000000\baselineskip
La unión entre el compuesto de ensayo y el
polipéptido del receptor acoplado a la proteína G se detecta. Un
compuesto de ensayo que se une al polipéptido del receptor acoplado
a la proteína G se identifica por lo tanto como un agente potencial
para la disminución de la degradación de la matriz extracelular. El
agente puede actuar mediante la disminución de la actividad del
receptor acoplado a la proteína G.
Otra realización de la invención es un
procedimiento de selección de agentes que disminuyen la degradación
de la matriz extracelular. Un compuesto de ensayo se pone en
contacto con un polinucleótido que codifica un polinucleótido del
receptor acoplado a la proteína G, en el que el polinucleótido
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionado entre el grupo
constituido por:
Las secuencias de nucleótidos que son al menos
un 50% idénticas a
La secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ
ID NO: 1 y;
La secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ
ID NO: 1;
\vskip1.000000\baselineskip
Se detecta a unión del compuesto de ensayo al
polinucleótido. Un compuesto de ensayo que se une al polinucleótido
se identifica como un agente potencial para la disminución de la
degradación de la matriz extracelular. El agente puede actuar
mediante la disminución de la cantidad del receptor acoplado a la
proteína G mediante la interacción el ARNm del receptor acoplado a
la proteína G.
Otra realización de la invención es un
procedimiento de selección de agentes que regulan la secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por.
Las secuencias de aminoácidos que son al menos
aproximadamente 50% idénticas a
La secuencia de aminoácidos mostradas en la SEQ
ID NO: 2 y;
La secuencia de aminoácidos mostradas en la SEQ
ID NO: 2;
\vskip1.000000\baselineskip
Se detecta una actividad del receptor acoplado a
la proteína G del polipéptido. Un compuesto de ensayo que
incrementa la actividad del receptor acoplado a la proteína G del
polipéptido con relación a la actividad del receptor acoplado a la
proteína G en la ausencia del compuesto de ensayo se identifica por
lo tanto como un agente potencial para incrementar la degradación
de la matriz extracelular. Un compuesto de ensayo que disminuye la
actividad del receptor acoplado a la proteína G del polipéptido con
relación a la actividad del receptor acoplado a la proteína G en la
ausencia del compuesto de ensayo se identifica por lo tanto como un
agente potencial para la disminución de la degradación de la matriz
extracelular.
Incluso otra realización de la invención es un
procedimiento de selección de agentes que disminuyen la degradación
de la matriz extracelular. Un compuesto de ensayo se pone en
contacto con un receptor acoplado a la proteína G de un
polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada entre el grupo constituido por:
Las secuencias de nucleótidos que son al menos
un 50% idénticas a
La secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ
ID NO: 1 y;
La secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ
ID NO: 1;
\vskip1.000000\baselineskip
Se detecta la unión del compuesto de ensayo al
receptor acoplado a la proteína G. Un compuesto de ensayo que se une
al receptor acoplado a la proteína G se identifica por lo tanto como
un agente potencial para la disminución de la degradación de la
matriz extracelular.
Todavía otra realización de la invención es un
procedimiento de reducción de la degradación de la matriz
extracelular. Una célula se pone en contacto con un reactivo que se
une de manera específica al polinucleótido que codifica un
polipéptido del receptor acoplado a la proteína G o al producto
codificado por el polinucleótido, en el que el polinucleótido
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo
constituido por:
Las secuencias de nucleótidos que son al menos
un 50% idénticas a
La secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ
ID NO: 1 y;
La secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ
ID NO: 1;
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto disminuye en la célula la actividad
del receptor acoplado a la proteína G.
De este modo la invención proporciona un GPCR
humano que se puede usar para identificar los compuestos de ensayo
que pueden actuar como agonistas o antagonistas en el sitio del
receptor. El GPCR humano y los fragmentos del mismo son también
útiles en en la inducción de anticuerpos específicos que pueden
bloquear el receptor y evitar de manera eficaz la unión del
ligando.
La Fig. 1 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G (SEQ
ID NO: 1).
La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos
deducida de la secuencia de ADN de la Fig. 1 (SEQ ID NO: 2).
La Fig. 3 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G (SEQ
ID NO: 3).
La Fig. 4 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G (SEQ
ID NO: 4).
La Fig. 5 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G (SEQ
ID NO: 5).
La Fig. 6 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G (SEQ
ID NO: 6).
La Fig. 7 muestra la alineación BLASTP de 413
(SEQ ID NO: 2) contra la seq del gen de |Y06411|Y06411 del homólogo
del receptor Humano EDG-7.
La Fig. 8 muestra la alineación HMMPFAM de 413
(SEQ ID NO: 2) contra el receptor transmembrana
pfam|hmm|7tm_17 (familia rodopsina).
pfam|hmm|7tm_17 (familia rodopsina).
La Fig. 9 muestra el análisis del gen wise.
La Fig. 10 La secuencia de aminoácidos de los
dominios transmembrana de GPCR está subrayada, y el patrón de
consenso de Prosite se muestra en negrita.
La Fig. 11 muestra el perfil de Expresión
profile.
La Fig. 12 muestra el perfil de Expresión
profile.
La Fig. 13 muestra el perfil de Expresión
profile.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere a un polinucleótido
aislado a partir del grupo constituido por:
a) un polinucleótido que codifica un polipéptido
del receptor acoplado a la proteína G que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionado entre el grupo constituido por:
Las secuencias de aminoácidos que son al menos
aproximadamente 50% idénticas a
La secuencia de aminoácidos mostradas en la SEQ
ID NO: 2 y;
La secuencia de aminoácidos mostradas en la SEQ
ID NO: 2;
b) un polinucleótido que comprende la secuencia
de la SEQ ID NO: 1;
c) un polinucleótido que se híbrida en
condiciones rigurosas a un polinucleótido especificado en (a) y (b)
y codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G;
d) una secuencia de polinucleótidos de la que se
desvía a partir de las secuencias de polinucleótidos especificadas
en (a) a (c) debido a la degeneración del código genético y codifica
un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G; y
e) un polinucleótido que representa un
fragmento, derivado o variación alélica de una secuencia de
polinucleótidos especificada en (a) a (d) y codifica un polipéptido
del receptor acoplado a la proteína G.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se ha descubierto por el presente
solicitante un nuevo GPCR, particularmente un GPCR humano, se puede
usar en los procedimientos terapéuticos para tratar COPD, un
trastorno cardiovascular, cáncer, un trastorno urinario, obesidad,
diabetes, un trastorno del CNS, un trastorno del hígado, un
trastorno del riñón, un trastorno de los órganos secretores, asma,
una enfermedad metabólica o un trastorno hematológico que comprende
las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 2 se ha
identificado. Una secuencia que codifica GPCR humano se muestra en
la SEQ ID NO: 1. Esta secuencia secuencia se localiza en el
cromosoma 2. La secuencia codificante para la SEQ ID NO: 2 se
ensambló para la secuencia genómica identificada con el Nº de acceso
AC055884 del GenBank, usando geneid y genewise. Las alineaciones se
proporcionan en las Figs. 1 y 2.
La SEQ ID NO: 2 contiene siete dominios
transmembrana y actúa sobre varios GPCR conocidos con buen valor de
e. La SEQ ID NO: 2 es aproximadamente 30% idéntica a varios
receptores de EDG, con aproximadamente 25% de identidad a varios
receptores de histaminas humanas H2,
beta-adrenérgicos y liberadores de tirotropina
(TRH). Se infirió estructura de tres dimensiones mediante la
homología no probable a partir de los restos 4 a 178 en
1F88-B (rodopsina). El patrón de consenso de Prosite
se destaca en la Fig. 4. Los EST relacionados (SEQ ID NOS:
3-6) se expresan en neuroblastoma, células B,
leucemia linfática crónica, cerebro, y próstata normal.
El GPCR humano de la invención se puede usar en
procedimientos terapéuticos para tratar trastornos tales como COPD,
trastornos cardiovasculares, cáncer, trastornos urinarios, obesidad,
diabetes, trastornos del CNS, trastornos del hígado, trastornos del
riñón, trastornos de los órganos secretores, asma y trastorno
hematológicos. El GPCR humano también se puede usar para
seleccionar activadores e inhibidores de GPCR humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos de GPCR de acuerdo con la
invención comprenden al menos 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100,
125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, ó 330 aminoácidos
contiguos seleccionados entre la secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEQ ID NO: 2 o su variante biológicamente activo, como se
describe más adelante. Un polipéptido de GPCR de la invención por
lo tanto puede ser una parte de una proteína de GPCR, una proteína
de GPCR de longitud completa, o una proteína de fusión que comprende
toda o una parte de la proteína de GPCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes del polipéptido de GPCR que son
biológicamente activos, es decir, mantienen la capacidad de unirse
a un ligando para producir un efecto biológico, tal como la
formación de AMP cíclico, movilización de calcio intracelular, o
metabolismo de fosfoinosítido, también son polipéptidos de GPCR.
Preferiblemente, las variantes de polipéptidos de GPCR de origen
natural o no natural tienen secuencias de aminoácidos que son al
menos aproximadamente 50, preferiblemente al menos aproximadamente
55, 65, 70, 75, 90, 96, ó 98% idénticas a la secuencia de
aminoácidos secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2 o su fragmento. El
porcentaje de identidad entre una variante del polipéptido de GPCR
supuesto y una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 se
determina usando el programa de alineación de Blast2 (Blosum62,
Expect 10, códigos genéticos patrones).
Las variaciones en el porcentaje de identidad se
pueden deber, por ejemplo, a sustituciones, inserciones, o
supresiones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácido se
definen como reemplazos de aminoácidos uno por uno. Son de
naturaleza conservadora cuando el aminoácido sustituido tiene
estructura y/o propiedades químicas similares. Los ejemplos de los
reemplazos conservadores son sustitución de una leucina con
isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina
con una serina.
Las inserciones o supresiones de aminoácidos son
cambios a o dentro de una secuencia de aminoácidos. Típicamente
caen en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La guía
en la determinación de qué restos de aminoácidos pueden estar
sustituidos, insertados, o suprimidos sin eliminar la actividad
biológica o inmunológica de un polipéptido de GPCR se puede
encontrar usando programas de ordenador bien conocidos en la
técnica, tales como el software DNASTAR. Si un cambio de aminoácido
da como resultado un polipéptido de GPCR biológicamente activo se
puede determinar fácilmente para la unión a un ligando p llevando a
cabo un ensayo funcional, como se describe por ejemplo, en los
ejemplos específicos, más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas de fusión son útiles para generar
anticuerpos contra las secuencias de aminoácidos del polipéptido de
GPCR y para uso en diversos sistemas de ensayo. Por ejemplo, las
proteínas de fusión se pueden usar para identificar proteínas que
interactúan con partes de un polipéptido de GPCR. Se pueden usar
para este propósito ensayos de cromatografía de afinidad de
proteína o basados en genotecas para las interacciones
proteína-proteína, tales como, los sistemas de dos
híbridos de lavadura o despliegue del fago.
Tales procedimientos se conocen bien en la
técnica y también se pueden usar como tamices de fármacos.
Una proteína de fusión del polipéptido de GPCR
comprende dos segmentos de polipéptidos condensados conjuntamente
por medio de un enlace de péptido. El primer segmento de polipéptido
comprende al menos 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150,
175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, ó 330 aminoácidos contiguos de la
SEQ ID NO: 2 o un variante biológicamente activo, tales como los
descritos anteriormente. El primer segmento del polipéptido también
puede comprender la proteína de GPCR de longitud completa.
El segundo segmento del polipéptido puede ser
una proteína de longitud completa o un fragmento de proteína. Las
proteínas usadas de manera común. En la construcción de proteína de
fusión incluyen \beta-galactosidasa,
\beta-glucuronidasa, proteína fluorescente verde
(GFP), proteínas autofluorescentes, incluyendo la proteína
fluorescente azul (BFP),
glutatión-S-transferasa (GST),
luciferasa, peroxidasa de rábano picante (HRP), y cloramfenicol
acetiltransferasa (CAT). De manera adicional, se usan etiquetas de
epítope en las construcciones de las proteínas de fusión, incluyendo
etiquetas de histidina (His), etiquetas de FLAG, etiquetas de
hematoglutinina (HA) de la gripe, etiquetas de Myc, etiquetas de
VSV-G, y etiquetas de tioredoxina (Trx). Otras
construcciones de fusión pueden incluir fusiones de proteína de
unión a maltosa (MBP), etiqueta S, Lex un dominio de unión a ADN
(DBD), fusiones de unión de unión a ADN de GAL4, y fusiones de
proteína BP16 del virus de herpes simples (HSV). Una proteína de
fusión también se puede modificar por ingeniería genética para que
contenga un sitio de escisión localizado entre la secuencia que
codifica el polipéptido de GPCR y la secuencia de se proteína
heteróloga, de manera que el polipéptido de GPCR también se puede
escindir y purificar a partir del resto heterólogo.
Se puede sintetizar una proteína de fusión de
manera química, como se muestra en la técnica. Preferiblemente, se
produce una proteína de fusión mediante la unión de manera covalente
a dos segmentos de polipéptidos o mediante procedimientos
convencionales en la técnica de biología molecular. Los
procedimientos de ADN recombinante se pueden usar para preparar
proteínas de fusión, por ejemplo, preparando una construcción de ADN
que comprende secuencias de codificación seleccionadas entre la SEQ
ID NO: 1 en un marco de lectura apropiado con nucleótidos que
codifican el segundo segmento de polipéptido y que expresa la
construcción de ADN en una célula huésped, como se conoce en la
técnica. Están disponibles muchos kits para la construcción de las
proteínas de fusión a partir de compañías tales como Promega
Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH
(Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL
International Corporation (MIC; Watertown, MA), y Quantum
Biotechnologies (Montreal, Canada;
1-888-DNA-KITS).
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Homólogos de especies de polipéptido de GPCR
humano se puede obtener usando polinucleótidos de polipéptido de
GPCR (descritos más adelante) para preparar sondas o cebadores
adecuados para seleccionar genotecas de expresión de ADNc a partir
de otras especies, tales como ratones, monos, o levaduras, que
identifican los ADNc que codifican los homólogos de polipéptido de
GPCR, y que expresan los ADNc como se conoce en la técnica.
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Un polinucleótido de GPCR puede ser de cadena
individual o doble y comprende una secuencia de codificación o el
complemento de una secuencia de codificación de un polipéptido de
GPCR. Una secuencia de codificación de GPCR humano se muestra en la
SEQ ID NO: 1.
Las secuencias de nucleótidos degenerados que
codifican los polipéptidos de GPCR humanos, así como las secuencias
de nucleótidos homólogos que son al menos 50, preferiblemente
aproximadamente 75, 90, 96, o 98% idénticos a la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 también son polinucleótidos
de GPCR. El porcentaje de identidad de secuencia entre las
secuencias de dos polinucleótidos se determina usando programas de
ordenador tal como ALIGN que emplea el algoritmo FASTA, usando una
investigación de hueco afín con una penalización amplia de hueco de
-12 y una penalización de extensión de hueco de -2. Las moléculas de
ADN complementario (ADNc), homólogos de especies, y variantes de
polinucleótidos de GPCR que codifican los polipéptidos de GPCR
biológicamente activos también son polinucleótidos de GPCR. Los
fragmentos de polinucleótidos que comprenden al menos 8, 9, 10, 11,
12, 15, 20, ó 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o su
complemento son también polinucleótidos de GPCR. Estos fragmentos
se pueden usar, por ejemplo, como sondas de hibridación o como
oligonucleótidos no codificantes.
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Las variantes y homólogos de los polinucleótidos
de GPCR descritos anteriormente son también polinucleótidos de
GPCR. Típicamente, las secuencias de polinucleótidos de GPCR
homólogos se pueden identificar mediante la hibridación de
polinucleótidos candidatos para conocer los polinucleótidos de GPCR
en condiciones rigurosas, como se conoce en la técnica. Por
ejemplo, usando las siguientes condiciones de lavado 2X SSC (0,3 M
NaCl, 0,03 M citrato de sodio, pH 7,0), 0,1% SDS, temperatura
ambiente dos veces, 30 minutos cada una; después 2X SSC, 0,1% SDS,
50ºC una vez, 30 minutos; después 2X SSC, temperatura ambiente dos
veces, 10 minutos cada secuencia de homólogos se puede identificar
que contiene al menos aproximadamente 25-30% de
discordancias de pares de bases. Más preferiblemente, las hebras de
ácidos nucleicos contienen 15-25% de discordancias
de pares de bases, incluso más preferiblemente 5-15%
de discordancias de pares de bases.
Los homólogos de especies de los polinucleótidos
de GPCR descritos en el presente documento también se pueden
identificar preparando sondas o cebadores adecuados y selección de
la expresión del ADNc a partir de otras especies, tales como
ratones, monos, o levaduras. Las variantes humanas de los
polinucleótidos de GPCR se pueden identificar, por ejemplo,
mediante la selección de las genotecas de expresión de ADNc humano.
Se conoce bien en la técnica que la T_{m} de un ADN de cadena
doble disminuía en 1-1,5ºC con una disminución de
un 1% cada una de homología (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81,
123 (1973). Las variantes de los polinucleótidos de GPCR humano o
polinucleótidos de GPCR de otras especies se pueden identificar por
lo tanto mediante hibridación de un polinucleótido de GPCR con un
polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID
NO: 1 o su complemento para formar un híbrido de ensayo. La
temperatura de fusión de del híbrido de ensayo se compara con la
temperatura de fusión de un híbrido que comprende polinucleótidos
que tienen secuencias perfectamente complementarias, y se calcula
el número o porcentaje de las discordancias de pares de bases con el
híbrido de ensayo.
Las secuencias de nucleótidos que se hibridan a
los polinucleótidos de GPCR o sus complementos después de
hibridación rigurosa y/o condiciones de lavado también son
polinucleótidos de GPCR. Las condiciones de lavado rigurosas se
conocen y se entienden bien en la técnica y se describen, por
ejemplo, en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL, 2ª ed., 1989, en las páginas 9.50-9.51.
Típicamente, para las condiciones de hibridación
rigurosas una combinación de temperatura y concentraciones de sal
se debe elegir que sea aproximadamente 12-20ºC por
debajo de la T_{m} calculada de bajo estudio. Se puede calcular
la T_{m} de un híbrido entre un polinucleótido de GPCR que tiene
una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o su
complemento y una secuencia de polinucleótidos que es al menos
aproximadamente 50, preferiblemente aproximadamente 75, 90, 96, o
98% idéntica a las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, usando
la ecuación de Bolton y McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48,
1390 (1962):
T_{m} =
81,5ºC – 16,6(log_{10}[Na^{+}]) + 0,41(%G + C) –
0,63(%formamida) –
600/l),
en la que l = la longitud del
híbrido en pares de
bases.
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Las condiciones de lavado rigurosas incluyen,
por ejemplo, 4 X SSC a 65ºC, o 50% de formamida, 4X SSC a 42ºC, o
0,5X SSC, 0,1% de SDS a 65ºC. Las condiciones de lavado altamente
rigurosas incluyen, por ejemplo, 0,2 X SSC a 65ºC.
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Un polinucleótido de GPCR de origen natural sin
otros componentes celulares tales como componentes de membrana,
proteínas, y lípidos. Los polinucleótidos se pueden preparar
mediante una célula y aislar usando técnicas de purificación de
ácidos nucleicos convencionales, o sintetizarse usando una técnica
de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), o mediante el uso de un sintetizador automático. Los
procedimientos para aislar polinucleótidos son rutinarios y se
conocen en la técnica. Cualquiera de tales técnicas para obtener
para obtener un polinucleótido se puede usar para obtener
polinucleótidos de GPCR aislados. Por ejemplo, enzimas de
restricción y sondas se pueden usar para aislar fragmentos de
polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos de GPCR.
Los polinucleótidos aislados están en las preparaciones que están
sin o al menos 70, 80, o 90% sin otras
moléculas.
moléculas.
Las moléculas de ADNc de GPCR se pueden preparar
con técnicas de biología molecular convencionales, usando ARNm de
GPCR como molde. Las moléculas de ADNc de GPCR se pueden por lo
tanto replicar usando técnicas de biología molecular conocidas en
la técnica y descritas en los manuales tales como Sambrook et
al. (1989). Una técnica de amplificación, tal como PCR, se
puede usar para obtener copias adicionales de polinucleótidos de la
invención, usando o bien ADN genómico humano o ADNc como molde.
Como alternativa, se puede usar técnicas de
química sintética para sintetizar polinucleótidos de GPCR. La
degeneración del código genético permite que las secuencias de
nucleótidos alternativas a sintetizar que codifican un polipéptido
de GPCR que tiene, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEQ ID NO: 2 o su variante biológicamente activa.
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Se pueden usar diversos procedimientos basados
en la PCR para extender las secuencias de ácidos nucleicos
descritas en el presente documento para detectar cadena abajo las
secuencias tales como promotores y elementos reguladores. Por
ejemplo, la PCR de sitio de restricción usa cebadores universales
para recuperar el adyacente a la secuencia desconocida a un locus
conocido (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318-322,
1993). El ADN genómico se amplifica primero en presencia de un
cebador para una secuencia de engarce y un cebador específico para
la región conocida. Las secuencias amplificadas se someten después a
una segunda ronda de PCR con el mismo cebador de engarce y otro
cebador específico interno al primero. Los productos de cada ronda
de la de la PCR se transcriben con una ARN polimerasa apropiada
usando la transcriptasa inversa.
La PCR inversa también se puede usar para
amplificar o extender secuencias usando cebadores divergentes
basándose en una región (Triglia et al., Nucleic Acids Res.
16, 8186, 1988). Se pueden diseñar cebadores usando un software
comercialmente disponible, tal como el sofware de análisis de
cebador OUGO 4.06 (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), que
sean de 22-30 nucleótidos de longitud, que tengan un
contenido de GC de 50% o más, y para hibridarse a la secuencia
diana a temperaturas aproximadamente 68-72ºC. El
procedimiento usa varias enzimas de restricción para generar un
fragmento adecuado en la región conocida de un gen. Después el
fragmento se hace circular mediante ligamiento intramolecular y se
usa como un molde de PCR.
Otro procedimiento que se puede usar es la PCR
de captura, que implica la amplificación de PCR de fragmentos de
ADN adyacentes a una secuencia conocida en el ADN de cromosoma
humano y artificial de levadura (Lagerstrom et al., PCR
Methods Applic. 1, 111-119, 1991). En este
procedimiento, también se pueden usar digestiones y ligamientos de
enzima de restricción múltiples para colocar una secuencia de doble
hebra modificada por ingeniería genética en un fragmento
desconocido de la molécula de ADN antes de la realización de la
PCR.
Otro procedimiento que se puede usar para
recuperar secuencias desconocidas es el de Parker et al.,
Nucleic Acids Res. 19, 3055-3060, 1991). De manera
adicional, se pueden usar PCR, cebadores jerarquizados, y genotecas
de PROMOTERFINDER (CLONTECH, Palo Alto, Calif.) (CLONTECH, Palo
Alto, Calif.) para silenciar el ADN genómico. Este procedimiento
evita la necesidad de seleccionar genotecas y es útil en el hallazgo
de unión de intrón/exón.
Cuando se seleccionan los ADNc de longitud
completas, es preferible usar genotecas que se hayan seleccionado
por tamaño para que incluyan ADNc mayores. Son preferibles las
genotecas cebadas al azar, ya que contendrá más secuencias que
contienen las regiones 5' de los genes. Puede ser especialmente
preferible el uso de una genoteca cebada al azar para situaciones
en las que un oligo d(T) no produzca un ADNc de longitud
completa. Las genotecas genómicas pueden ser útiles para la
extensión de las secuencias de en las regiones reguladoras no
transcritas de 5'.
Los sistemas de electroforesis capilar
comercialmente disponibles se pueden usar para analizar el tamaño o
confirmar la secuencia de nucleótidos de la PCR o productos de
secuenciación. Por ejemplo, la secuenciación capilar puede emplear
polímeros de flujo libre para la separación electroforética, cuatro
diferentes tintes fluorescentes (uno para cada nucleótido) que
están activados por láser, y detección de las longitudes de onda
emitidas por una cámara con dispositivo acoplado de carga. La
intensidad de salida/luz se puede convertir en una señal eléctrica
usando un software apropiado (por ejemplo GENOTYPER y Sequence
NAVIGATOR, Perkin Elmer), y el procedimiento completo para la carga
de muestras a un análisis de ordenador y exposición de datos
electrónicos se puede controlar por ordenador. La electroforesis
capilar es especialmente preferible para la secuenciación de partes
pequeñas de ADN que pudieran estar presentes en cantidades limitadas
en una muestra particular.
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Los polipéptidos de GPCR se pueden obtener, por
ejemplo, mediante purificación a parir de células humanas, mediante
la expresión de polinucleótidos de GPCR, o mediante síntesis química
directa.
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Los polipéptidos de GPCR se pueden purificar a
partir de cualquier célula humana que expresa el receptor,
incluyendo células huésped que se han transfectado con los
polinucleótidos de GPCR. Un polipéptido de GPCR purificado se
separa a partir de otros compuestos que normalmente están asociados
con el polipéptido de GPCR en la célula, tales como ciertas
proteínas, carbohidratos, o lípidos, usando los procedimientos bien
conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero no se
limitan a, cromatografía de exclusión de tamaño, fraccionamiento de
sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de afinidad, y electroforesis en gel preparativa.
El polipéptido de GPCR se puede aislar
convenientemente en forma de un complejo con una proteína G
asociada, como se describe en los ejemplos específicos, más
adelante. Una preparación de los polipéptidos de GPCR purificados
tiene al menos de un 80% de pureza; preferiblemente, las
preparaciones tienen al menos un 90%, 95%, ó 99% de pureza. La
pureza de las preparaciones se puede determinar mediante cualquier
procedimiento conocido en la técnica, tal como electroforesis en gel
de poliacrilamida SDS.
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Para expresar un polinucleótido de GPCR, el
polinucleótido se puede insertar en un vector de expresión que
contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción
de la secuencia codificante insertada. Los procedimientos que son
bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para
construir vectores de expresión que contienen las secuencias que
codifican polipéptidos de GPCR y elementos de control de la
transcripción y traducción apropiados. Estos procedimientos incluyen
técnicas de ADN recombinante, técnicas sintéticas, y recombinación
genética in vivo. Tales técnicas se describen, por ejemplo,
en Sambrook et al. (1989) y en Ausubel et al.,
CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New
York, N.Y., 1989.
Una diversidad de los sistemas de expresión de
vector/huésped se pueden utilizar para que contengan y expresen las
secuencias que codifican un polipéptido de GPCR.
Éstos incluyen, pero no se limitan a,
microorganismos, tales como bacterias transformadas con
bacteriófagos, plásmido, o vectores de expresión de ADN de cósmido;
las levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras,
sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión
de virus (por ejemplo, baculovirus), sistemas de células de plantas
transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus
del mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico del tabaco, TMV) o
con vectores de expresión de bacterias (por ejemplo, Ti o pBR322
plásmidos), o sistemas de células animales.
Los elementos de control o secuencias
reguladoras son las regiones no traducidas de los potenciadores,
promotores de vector, regiones no traducidas en 5' y 3' - que
interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a
cabo la transcripción y traducción. Tales elementos pueden variar en
su intensidad y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y
huésped utilizado, se pueden usar cualesquiera elementos de
transcripción y traducción adecuados, que incluyen promotores
constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clonan en
sistemas bacterianos, promotores inducibles tales como el promoter
lacZ híbrido del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.)
o plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares se pueden usar.
Se puede usar el promotor de polihedrina de baculovirus en células
de insecto. Los promotores o potenciadores derivados de los genomas
de células de plantas (por ejemplo, choque térmico, RUBISCO, y genes
de proteínas de almacenamiento) o de virus de plantas (por ejemplo,
promotores virales o secuencias guías) se pueden clonar en el
vector. En sistemas de células de mamíferos, los promotores de
genes de mamíferos o de virus de mamíferos son preferibles. Si es
necesario generar una línea celular que contiene copias múltiples de
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GPCR,
los vectores basados en SV40 o EBV se pueden usar con un marcador
seleccionable adecuado.
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En sistemas bacterianos, se puede seleccionar un
número de vectores de expresión dependiendo del uso propuesto para
el polipéptido de GPCR. Por ejemplo, cuando se necesita una gran
cantidad de polipéptido de GPCR para la inducción de anticuerpos,
se pueden usar los vectores que dirigen la expresión a lato nivel de
las proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores
incluyen, pero no se limitan a, clonación de E, coli
multifunctional y vectores de expresión tal BLUESCRIPT (Stratagene).
En un vector BLUESCRIPT, una secuencia que codifica el polipéptido
de GPCR se puede ligar en el vector en fase con las secuencias para
los restos Met N terminal y los siete siguientes de
\beta-galactosidasa de manera que se produce una
proteína híbrida. También se pueden usar los vectores pIN (Van
Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509,
1989) o vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) para expresar
polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión
S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de
fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de
células lisadas mediante la adsorción a perlas de
glutatión-agarosa seguido de elución en la presencia
de glutatión libre. Las proteínas hechas en tales sistemas se
pueden diseñar para que incluyan heparina, trombina, o sitios de
escisión de proteasa del factor Xa de manera que el polipéptido
clonado de interés se pueda liberar del resto GST si se quiere.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae,
se pueden usar un número de vectores que contienen promotores
constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa,
y PGH. Para revisiones, véase Ausubel et al. (1989) y Grant
et al., Methods Enzymol. 153, 516-544,
1987.
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Si se usan vectores de expresión de plantas, la
expresión de secuencias que codifican los polipéptidos de GPCR se
pueden dirigir mediante cualquiera de un número de promotores. Por
ejemplo, se pueden usar promotores virales tales como los
promotores 35S y 19S de CaMV solos o en combinación con la secuencia
guía omega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311,
1987). Como alternativa, se pueden usar promotores de plantas tales
como la subuniadd pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico
(Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671-1680, 1984;
Broglie et al., Science 224, 838-843, 1984;
Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17,
85-105, 1991). Estas construcciones se pueden
introducir en células de plantas mediante transformación directa de
ADN o mediante transfección mediada por patógenos. Tales técnicas se
describen en un número de revisiones disponibles en general (por
ejemplo, Hobbs o Murray, en MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE y
TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York. N.Y., p. 191-196,
1992).
También se puede usar un sistema de insectos
para expresar un polipéptido de GPCR. Por ejemplo, en uno de tales
sistemas se usa virus de la polihedrosis nuclear de Autographa
californica (AcNPV) como un vector para expresar genes foráneos
en células de Spodoptera frugiperda o en Trichoplusia
larvae. Las secuencias que codifican polipéptidos de GPCR se
pueden clonar en una región no esencial del virus, tal como el gen
de la polihedrina, y se colocan bajo control del promotor de la
polihedrina. La inserción útil de los polipéptidos de GPCR harán
que el gen de la polihedrina inactivo y producirá virus recombinante
que carece de proteína de revestimiento. Los virus recombinantes
después se pueden usar para infectar células de S. frugiperda
o larvas de Trichoplusia en las que los polipéptidos de GPCR
se pueden expresar (Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci.
91, 3224-3227, 1994).
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Se puede usar un número de sistemas de expresión
basados en virus para expresar polipéptidos de GPCR en células
huésped de mamíferos. Por ejemplo, si se usa un adenovirus como un
vector de expresión, las secuencias que codifican los polipéptidos
de GPCR se pueden ligar en un complejo de adenovirus de
transcripción/traducción que comprende el último promotor y la
secuencia guía tripartita. La inserción en una región no esencial E1
o E3 del genoma viral se puede usar para obtener un virus viable
que es capaz de expresar un polipéptido de GPCR en células huésped
infectadas (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81,
3655-3659, 1984). Si se desea, los potenciadores de
transcripción, tales como el virus de sarcoma de Rous (RSV), se
puede usar para incrementar la expresión en células huésped de
mamíferos.
También se pueden usar cromosomas artificiales
humanos (HAC) para distribuir fragmentos mayores de AND que se
pueden contener y expresar en un plásmido. Los HAC de 6M a 10M se
construyen y se distribuyen a las células mediante procedimientos
de distribución convencionales (por ejemplo, liposomas, polímeros de
amino policatiónicos, o vesículas).
\newpage
También se pueden usar señales de inicio
específicas para lograr la traducción más eficaz de secuencias que
codifican los polipéptidos de GPCR. Tales señales incluyen el codón
de inicio ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en los que
las secuencias que codifican un polipéptido de GPCR, su codón de
inicio, y las secuencias cadena arriba se insertan en el vector de
expresión apropiado, pueden ser no ser necesarias señales de control
de transcripción o traducción adicionales. Sin embargo, en los que
la secuencia de codificación, o su fragmento, se inserta se deben
proporcionar señales de control de traducción exógenas (incluyendo
el codón de inicio ATG ). El codón de inicio debe estar en el marco
de lectura correcto para asegurar la traducción de la inserción
completa. Los elementos de traducción exógenos y codones de inicio
pueden ser de diversos orígenes, tanto natural como sintético. La
eficacia de la expresión se puede potenciar mediante la inclusión de
potenciadotes que son apropiados para el sistema de células
particulares que se usa (véase Scharf et al., Results Probl.
Cell Differ. 20, 125-162, 1994).
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Se puede elegir una célula huésped por su
capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o
para procesar el polipéptido de GPCR expresado de la forma deseada.
Tales codificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan
a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación,
lipidación, y acilación. El procesamiento después de la traducción
que escinde una forma "prepro" del polipéptido también se
pueden usar para facilitar la inserción correcta, plegamiento y 7 o
función. Estás disponibles células huésped diferentes que tienen
maquinaria celular específica y mecanismos característicos para las
actividades después de la traducción (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK,
HEK293, y WI38), a partir de La Colección Americana de Cultivos Tipo
(ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209) y y se pueden elegir para asegurar la
correcta modificación y procesamiento de la proteína foránea.
Se prefiere la expresión estable para la
producción a largo plazo con alto rendimiento de proteínas
recombinantes. Por ejemplo, líneas celulares que expresan de manera
estable los polipéptidos de GPCR se pueden transformar usando
vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de
elementos de replicación y/o de expresión y un gen marcador
seleccionable sobre el mismo o sobre un vector separado. Después de
la introducción del vector del vector, se puede dejar que las
células se desarrollen durante 1-2 días en un medio
enriquecido antes que se cambien a un medio selectivo. El propósito
del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección,
y su presencia permite el desarrollo y recuperación de las células
que se expresan de manera exitosa las secuencias de GPCR
introducidas. Se pueden hacer proliferar clones resistentes de
células transformadas usando técnicas de cultivo de tejidos
apropiadas para el tipo de célula. Véase, por ejemplo, ANIMAL CELL
CULTURE, R.I. Freshney, ed., 1986.
Se puede usar cualquier número de sistemas de
selección para recuperar las líneas celulares transformadas.
Éstos incluyen, pero no e limitan a, los genes
de timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler et al.,
Cell 11, 223-32, 1977) y adenina
fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22,
817-23, 1980) que se pueden emplear en las células
tk o aprt, respectivamente. También, se puede usar
resistencia contra los metabolitos, antibióticos, o herbicidas como
la base para la selección. Por ejemplo, dhfr confiere resistencia a
metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77,
3567-70, 1980), npt confiere resistencia a
aminoglicósidos, neomicina y G-418
(Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150,
1-14, 1981), y las y pat confieren resistencia a
clorosulfuron y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente
(Murray, 1992, anteriormente). Se han descrito genes seleccionables
adicionales. Por ejemplo, trpB permite que las células utilicen
indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las
células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman &
Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-51, 1988).
Se pueden usar marcadores visibles tales como antocianinas,
\beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y
luciferasa y su sustrato luciferina, para identificar transformantes
y para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria
o estable que se puede atribuir a un sistema de vector específico
(Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55,
121-131, 1995).
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Aunque la presencia de la expresión del gen
marcador sugiere que el polinucleótido de GPCR también está
presente, su presencia y expresión puede ser necesario que se
confirme. Por ejemplo, si una secuencia que codifica un polipéptido
de GPCR se inserta dentro de una secuencia de gen marcador, las
células transformadas que contienen secuencias que codifican un
polipéptido de GPCR se puede identificar mediante la ausencia de la
función del gen marcador. Como alternativa, se puede colocar un gen
marcador en tándem con una secuencia que codifica un polipéptido de
GPCR bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen
marcador en la respuesta de inducción o selección usualmente indica
la expresión del polinucleótido de GPCR.
Como alternativa, las células huésped que
contienen un polinucleótido de GPCR y que expresan un polipéptido
de GPCR se puede identificar mediante una diversidad de
procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos
procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones
ADN-ADN o ADN-ARN y bioensayo de
proteínas o técnicas de inmunoensayo que incluyen tecnologías de
membrana, solución, o basadas en procesador para la detección y/o
cuantificación de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, la
presencia de una secuencia de polinucleótidos que codifica un
polipéptido de GPCR se puede detectar mediante hibridación de
ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación
que usa sondas o fragmentos de polinucleótidos que codifican un
polipéptido de GPCR. Los ensayos basados en la amplificación de
ácido nucleico implican el uso de oligonucleótidos seleccionados
entre las secuencias que codifican un polinucleótido de GPCR.
Se conocen en la técnica una diversidad de
protocolos para detectar y medir la expresión de un polipéptido de
GPCR, usando o bien anticuerpos policlonales o monoclonales
específicos para el polipéptido. Los ejemplos incluyen ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmnoensayo (RIA), y
aislamiento de células en citofluorímetro (FACS). Se puede usar un
inmunoensayo en base monoclonal de dos sitios que usa anticuerpos
monoclonales reactivo a dos epítopes que no interfieren en un
polipéptido de GPCR, o se puede emplear un ensayo de unión
competitiva. Éstos y otros ensayos se describen en Hampton et
al., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St.
Paul, Minn., 1990) y Maddox et al., J. Exp. Med. 158,
1211-1216, 1983).
Los expertos en la técnica conocen una amplia
diversidad de etiquetas y y técnicas de conjugación y se pueden
usar en diversos ensayos de ácido nucleico y aminoácido. Los medios
para producir hibridación marcada o sondas de PCR para detector las
secuencias relacionadas con los polinucleótidos que codifican los
polipéptidos de GPCR incluyen el oligo etiquetado, traducción nick,
etiquetado del extremo o amplificación por la PCR usando un
nucleótido etiquetado. Como alternativa, las secuencias que
codifican un polipéptido de GPCR se puede clonar en un vector para
la producción de una sonda de ARNm. Se conocen en la técnica tales
vectores, están comercialmente disponibles, y se pueden usar para
sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de
nucleótidos etiquetados y una ARN polimerasa apropiada tal como T7,
T3, o SP6. Estos procedimientos se pueden llevar a cabo usando una
diversidad de kits comercialmente disponibles (Amersham Pharmacia
Biotech, Promega, y US Biochemical). Las moléculas o etiquetas
indicadoras adecuadas que se pueden usar para la fácil detección de
incluyen radionúclidos, enzimas, y agentes fluorescentes,
quimilominiscenets, o cromogénicos, así como sustratos, cofactores,
inhibidores, partículas magnéticas, y similares.
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Se pueden cultivar células huésped transformadas
con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de GPCR
en las condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la
proteína a partir del cultivo celular. El polipéptido producido
mediante por una célula transformada se puede secretar o contener
intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado.
Como entenderán los expertos en la técnica, se pueden diseñar
vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican
los polipéptidos de GPCR para que contengan secuencias de señal que
dirigen la secreción de los polipéptidos de GPCR a través de una
membrana celular procariótica o eucariótica o que dirigen la
inserción de membrana del polipéptido de GPCR unido a membrana.
Como se ha descrito anteriormente, se pueden
usar otras construcciones para acoplar una secuencia que codifica
un polipéptido de GPCR a una secuencia de nucleótidos que codifica
un dominio de polipéptido que facilitará la purificación de las
proteínas solubles. Tal purificación que facilita los dominios
incluye, pero no se limita a, péptidos de quelación de metales
tales como módulos de histidina-triptófano que
permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de
la proteína A que permiten la purificación de sobre inmunoglobulina
modificada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de
extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). La
inclusión de las secuencias de engarce que se pueden escindir tales
como las específicas para el Factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen,
San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido de
GPCR también se pueden usar para facilitar la purificación. Uno de
tales vectores de expresión proporciona la expresión de una
proteína de fusión que contiene un polipéptido de GPCR y 6 restos de
histidina que preceden a tioredoxina o un sitio de escisión de
enteroquinasa. Los restos de histidina facilitan la purificación
mediante IMAC (cromatografía de afinidad de ion metálico
inmovilizado, como se describe en Porath et al., Prot. Exp.
Purif. 3, 263-281, 1992), mientras que el sitio de
escisión de enteroquinasa proporciona un medio para purificar el
polipéptido de GPCR a partir de la proteína de fusión. Los vectores
que contienen proteína de fusión se describen en Kroll et
al., ADN Cell Biol. 12, 441-453, 1993.
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Las secuencias que codifican un polipéptido de
GPCR se puede sintetizar en su totalidad o en parte, usando
procedimientos químicos bien conocidos o en la química (véase,
Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser.
215-223, 1980; Horn et al. Nucl. Acids Res.
Symp. Ser. 225-232, 1980). Como alternativa, se
puede producer un mismo polipéptido de GPCR usando procedimientos
químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tal como
mediante la síntesis directa de péptido usando técnicas de fase
sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85,
2149-2154, 1963; Roberge et al., Science 269,
202-204, 1995). Se puede realizar la síntesis de
proteína usando técnicas manuales o mediante automatización. La
síntesis automática se puede lograr, por ejemplo, usando Applied
Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Opcionalmente,
los fragmentos de polipéptidos de GPCR se pueden sintetizar de
manera separada y combinar usando procedimientos químicos para
producir una molécula de longitud completa.
El péptido sintetizado recientemente se puede
purificar sustancialmente mediante cromatografía líquida de alto
rendimiento (por ejemplo, Creighton, PROTEINS: STRUCTURES y
MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman y Co., New York, N.Y., 1983). La
composición de un polipéptido de GPCR sintético se puede se puede
confirmar mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por
ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton,
anteriormente). De manera adicional, cualquier porción de la
secuencia de aminoácidos del polipéptido de GPCR se puede alterar
durante la síntesis directa y/o combinada usando procedimientos
químicos directos con secuencias de otras proteínas para producir un
polipéptido variante o una proteína de fusión.
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Como se entenderá por los expertos en la
técnica, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que
codifican polipéptidos de GPCR que poseen codones de origen no
natural. Por ejemplo, los codones preferidos por un huésped
procariótico o eucariótico particular se puede seleccionar para
incrementar la velocidad de la expresión de proteína o para
producir una transcripción de ARN que tiene las propiedades
deseables, tales como una semivida que es más larga que la de una
transcripción generada a partir de la secuencia de origen
natural.
Las secuencias de nucleótidos descritas en el
presente documento se pueden modificar por ingeniería genética
usando procedimientos conocidos en general en la técnica para
alterar las secuencias que codifican el polipéptido de GPCR por una
diversidad de razones, que incluyen pero no se limitan a,
alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, y/o
expresión del polipéptido o producto de ARNm. La mezcla de ADN por
fragmentación al azar y ensamblaje de nuevo por PCR de los
fragmentos del gen y oligonucleótidos sintéticos se puede usar para
modificar por ingeniería genética las secuencias de nucleótidos.
Por ejemplo, se puede usar la mutagénesis dirigida al sitio para
insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de
glicosilación, cambiar la preferencia del codón, producir variantes
de ayuste, introducir mutaciones, y así sucesivamente.
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Cualquier tipo de anticuerpo conocido en la
técnica se puede generar para que se una específicamente a un
epítope de un polipéptido de GPCR. "Anticuerpo" como se usa en
el presente documento incluye moléculas de inmunoglobulinas
intactas, así como sus fragmentos, tales como Fab, F(ab')2, y
Fv, que son capaces de unirse a un epítope de un polipéptido de
GPCR. Típicamente, al menos 6, 8, 10, ó 12 aminoácidos contiguos se
requieren para formar un epítope. Sin embargo, los epítopes que
implican aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo,
al menos 15, 25, ó 50 aminoácidos.
Un anticuerpo que específicamente se une a un
epítope de un polipéptido de GPCR se puede usar terapéuticamente,
así como en ensayos de inmunoquímicos, tales como transferencia de
Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos,
inmunopercipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en
la técnica. Se pueden usar diversos inmunoensayos para identificar
anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Numerosos
protocolos para la unión competitiva o ensayos inmunorradiométricos
se conocen bien en la técnica. Tales inmunoensayos típicamente
implican la medición de la formación de complejo entre un inmunógeno
y un anticuerpo que específicamente se une al inmunógeno.
Típicamente, un anticuerpo que específicamente
se une a un polipéptido de GPCR proporciona una señal de detección
al menos 5-, 10-, ó 20- veces mayor que una señal de detección
proporcionada con otras proteínas cuando se usan en un ensayo
inmunoquímico. Preferiblemente, los anticuerpos que específicamente
se unen a polipéptidos de GPCR no detectan otras proteínas en
ensayos inmunológicos y puede inmunoprecipitar un polipéptido de
GPCR en solución.
Los polipéptidos de GPCR se pueden usar para
inmunizar un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobaya,
mono, o ser humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se
desea, un polipéptido de GPCR se puede conjugar a una proteína
vehículo, tal como albúmina sérica bovina, tiroglobulina, y
hemocianina de lapa de ojo de cerradura. Dependiendo de la especie
huésped, se pueden usar diversos adyuvantes para incrementar la
respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se
limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo,
hidróxido de aluminio), y sustancias tensioactivas (por ejemplo,
lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos,
emulsiones oleosas, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, y
dinitrofenol). Entre los adyuvantes usados en seres humanos, BCG
(bacilli Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum son especialmente útiles.
Los anticuerpos monoclonales que se unen de
manera específica a un polipéptido de GPCR se pueden preparar
usando cualquier técnica que proporcione la proporción de moléculas
de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas
técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma, la
técnica de hibridoma de células b humanas, y la técnica de
hibridoma de EBV (Kohler et al., Nature 256,
495-497, 1985; Kozbor et al., J. Immunol.
Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030, 1983; Cole et
al., Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984).
Además, las técnicas desarrolladas para la
producción de "anticuerpos quiméricos", se puede usar el ayuste
de los genes de anticuerpo de ratones a genes de anticuerpos
humanos para obtener una molécula con especificidad de antígeno
apropiada y actividad biológica, (Morrison et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger
et al., Nature 312, 604-608, 1984; Takeda
et al., Nature 314, 452-454, 1985). Los
anticuerpos monoclonales y otros también pueden estar
"humanizados" para prevenir a un paciente acumule una respuesta
inmune contra el anticuerpo cuando se usa de manera terapéutica.
Tales anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia
a anticuerpos humanos a usar directamente en terapia o pueden
requerir alteración de unos pocos restos clave. Las diferencias de
secuencia entre anticuerpos de roedores y secuencias de seres
humanos se pueden minimizar reemplazando restos que difieren de
aquellos en las secuencias de seres humanos mediante mutagénesis
dirigida al sitio de restos individuales o mediante enrejado de las
regiones determinantes complementarias completas. Como alternativa,
se pueden producir anticuerpos humanizados usando procedimientos de
recombinación, como se describe en el documento GB2188638B. Los
anticuerpos que específicamente se unen a un polipéptido de GPCR
pueden contener sitios de unión a antígeno que están totalmente o
parcialmente humanizados como se describe en el documento U.S.
5.565.332.
Como alternativa, las técnicas descritas para la
producción de anticuerpos de una sola cadena se pueden adaptar
usando procedimientos conocidos en la técnica para producir
anticuerpos de una sola cadena que se unen específicamente a
polipéptidos de GPCR. Los anticuerpos con especificidad relacionada,
pero de distinta composición idiotípica, se pueden generar mediante
mezcla de cadenas de a partir de las genotecas de combinación al
azar (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-23,
1991).
Los anticuerpos de una sola cadena también se
pueden construir usando un procedimiento de amplificación de ADN,
tal como PCR, usando ADNc como molde (Thirion et al., 1996,
Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Los anticuerpos de
una sola cadena pueden ser mono- o biespecíficos, y pueden ser
bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos de una
sola cadena tetravalentes, biespecíficos se enseña, por ejemplo, en
Coloma y Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15,
159-63. La construcción de anticuerpos de una sola
cadena biespecíficas, bivalentes se enseñan en Mallender & Voss,
1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206.
Una secuencia de nucleótidos que codifica un
anticuerpo de una sola cadena se puede construir usando la síntesis
de nucleótidos manual o automática, clonarse en una construcción de
expresión que usa procedimientos de ADN recombinante
convencionales, y se introducen en una célula para expresar la
secuencia de codificación, como se describe más adelante. Como
alternativa, los anticuerpos de una sola cadena se pueden producir
directamente usando, por ejemplo, tecnología de fago filamentoso
(Verhaar et al., 1995, Int. J. Cancer 61,
497-501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol.
Meth. 165, 81-91).
Los anticuerpos que específicamente se unen a
polipéptidos de GPCR también se pueden producir mediante la
inducción in vivo de la producción en la población de
linfocitos o mediante la selección de genotecas de inmunoglobulina
o paneles de reactivos de unión altamente específicos como se
describe en la bibliografía (Orlandi et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 86, 3833-3837, 1989; Winter et
al., Nature 349, 293-299, 1991).
Otros tipos de anticuerpos se pueden construir y
usar de manera terapéutica en los procedimientos de la invención.
Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos se pueden construir como se
describe en el documento WO 93/03151. También se pueden preparar
las proteínas de unión que se derivan de immunoglobulinas y que son
multivalentes y multiespecíficas, tales como los "diacuerpos"
descritos en el documento WO 94/13804.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención se
pueden purificar mediante procedimientos bien conocidos en la
técnica. Por ejemplo, anticuerpos se pueden purificar por afinidad
mediante subcultivo sobre una columna a la que se une un
polipéptido de GPCR. Después se pueden eluir los anticuerpos unidos
de la columna usando un tampón con una alta concentración de
sal.
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Los oligonucleótidos no codificantes son
secuencias de nucleótidos que son complementarios a una secuencia
de ADN o ARN específica. Una vez introducidos en una célula, los
nucleótidos complementarios se combinan con secuencias naturales
producidas por la célula para formar complejos y bloquear o bien la
transcripción o traducción. Preferiblemente, un oligonucleótidos no
codificante tiene al menos 11 nucleótidos de longitud, pero puede
tener al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ó 50 o más
nucleótidos de longitud. También se pueden usar secuencias más
largas. Las moléculas de oligonucleótidos no codificantes se pueden
proporcionar en una construcción de ADN e introducirse en una
célula como se ha descrito anteriormente para disminuir el nivel de
los productos génicos en la célula.
Los oligonucleótidos no codificantes pueden ser
deoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de ambos.
Se pueden sintetizar los oligonucleótidos manualmente o mediante un
sintetizador automático, mediante unión de manera covalente al
extremo 5' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido con
enlaces entre nucleótidos no fosfodiéster tales como
alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos,
alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforoamidatos, fosfato
ésteres, carbamatos, acetamidato, carboximetil ésteres, carbonatos,
y fosfato triésteres. Véase, Brown, Meth. Mol. Biol. 20,
1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26,
1-72, 1994; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90,
543-583, 1990.
Las modificaciones de la expresión del gen de
GPCR se puede obtener mediante el diseño de los oligonucleótidos no
codificantes que formarán complejos dúplex para el control, 5', o
regiones reguladoras del gen GPCR. Se prefieren los
oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de la transcripción,
por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 desde el sitio de
comienzo. De manera similar, se puede lograr la inhibición usando
la metodología de apareamiento de "triple hélice". El
apareamiento de triple hélice es útil debido a que provoca la
inhibición de la capacidad de la doble hélice para abrir de manera
suficiente la unión de polimerasas, factores de transcripción, o
chaperones.
Se han descrito en la bibliografía avances
terapéuticos que usan ADN triplex (por ejemplo, Gee et al.,
in Huber y Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura
Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994). También se puede diseñar un
oligonucleótido no codificante para bloquear la traducción de ARNm
mediante la prevención de la transcripción de unión a los
ribosomas.
No se requiere complementariedad precisa para la
formación de complejos exitosa entre un oligonucleótido no
codificante y la secuencia complementaria de un polinucleótido de
GPCR. Los oligonucleótidos no codificantes que comprenden, por
ejemplo, 2, 3, 4, ó 5 o más tramos de nucleótidos contiguos que son
de manera precisa complementarios al polinucleótido de GPCR, cada
uno separado por un tramo de nucleótidos contiguos que no son
complementarios a los nucleótidos de GPCR, pueden proporcionar
suficiente especificidad de dirección para el ARNm de GPCR.
Preferiblemente, cada tramo de nucleótidos contiguos complementarios
es al menos 4, 5, 6, 7, ó 8 o más nucleótidos de longitud. Las
secuencias que no intervienen no complementarias son preferiblemente
de 1, 2, 3, ó 4 nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica
pueden usar fácilmente el punto de fusión calculado de un par no
codificante-codificante para determinar el grado de
discordancia que se tolerará entre un oligonucleótido no
codificante y una secuencia del polinucleótido de GPCR
particular.
Los oligonucleótidos no codificante se pueden
modificar sin afectar a su capacidad de hibridarse a un
polinucleótido de GPCR. Estas modificaciones pueden ser internas o
en cualquiera de o ambos extremos de la molécula no codificante.
Por ejemplo, los enlaces de fosfatos de internucleósidos se pueden
modificar mediante la adición de restos de colesterilo o diamina
con variación en los números de los restos de carbono entre los
grupos amino y la ribosa terminal. También se pueden emplear bases
modificadas y/o azúcares, tales como arabinosa en lugar de ribosa,
o un oligonucleótido sustituido en 3', 5'- en el que el grupo 3'
hidroxilo o el grupo 5' fosfato están sustituidos en un
oligonucleótido no codificante modificante. Estos oligonucleótidos
modificados se pueden preparar mediante procedimientos bien
conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Agrawal et al.,
Trends Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann et
al., Chem. Rev. 90, 543-584, 1990; Uhlmann et
al., Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542,
1987.
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Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad
catalítica. Véase, por ejemplo, Cech, Science 236,
1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem. 59,
543-568; 1990, Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2,
605-609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends
Genet. 12, 510-515, 1996. Las ribozimas se pueden
usar para inhibir la función génica mediante la escisión de una
secuencia de ARN, como se conoce en la técnica (por ejemplo,
Haseloff et al., Patente de Estados Unidos Nº 5,641.673). El
mecanismo de la acción de la ribozima implica la hibridación
específica de la secuencia de la molécula de ribozima al ARN diana
complementario, seguido de la escisión endonucleólítica. Los
ejemplos incluyen las moléculas de ribozima del motivo de pez
martillo modificado por ingeniería genética que pueden catalizar de
manera específica y de manera eficaz catalizar la escisión
endonucleica de secuencias de nucleótidos específicas.
La secuencia de codificación de un
polinucleótido de GPCR se puede usar para generar ribozimas que se
unirán de manera específica al ARNm que se ha trascrito a partir
del polinucleótido de GPCR. Los procedimientos de diseño y
construcción de ribozimas que pueden escindir otras moléculas de ARN
en trans de una manera altamente específica de la secuencia se han
desarrollado y descrito en la técnica (véase Haseloff et al.
Nature 334, 585-591, 1988). Por ejemplo, la
actividad de la escisión de las ribozimas se puede dirigir a ARN
específicos mediante ingeniería genética de una región de
"hibridación" discreta en la ribozima. La región de
hibridación contiene una secuencia complementaria al ARN Diana y de
esta manera se hibrida de manera específica a la diana (véase, por
ejemplo, Gerlach et al., documento EP 321,201).
Los sitios de escisión de ribozima específicos
dentro de una diana de ARN de GPCR se pueden identificar mediante
barrido de la molécula diana para los sitios de escisión de ribozima
que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU, y GUC. Una vez
identificadas, las secuencias cortas de ARN de entre 15 y 20
ribonucleótidos correspondientes a la región del ARN diana que
contiene el sitio de escisión se pueden evaluar para determinar las
características estructurales secundarias que pueden hacer
inoperable la diana. La idoneidad de las dianas de ARN de GPCR
candidatas también se pueden evaluar ensayando la accesibilidad a la
hibridación con los oligonucleótidos complementarios usando ensayos
de protección de ribonucleasa. Las secuencias complementarias más
largas se pueden usar para incrementar la afinidad de la secuencia
de hibridación para la diana. Las regiones de hibridación y
escisión de la ribozima pueden estar relacionadas integralmente de
manera que tras la hibridación al ARN diana mediante las regiones
complementarias, la región catalítica de la ribozima puede escindir
la Diana.
Las ribozimas se pueden introducir en las
células como parte de una construcción de ADN. Se pueden usar
procedimientos mecánicos, tales como microinyección, transfección
mediada por liposomas, electroporación, o precipitación con fosfato
de calcio, para introducir una construcción de ADN que contiene
ribozima en las células en las que se desea que disminuya la
expresión de GPCR. Como alternativa, si se desea que las células
retengan de manera estable la construcción de ADN, la construcción
se puede suministrar sobre un plásmido y mantener como un elemento
separado o integrarse en el genoma de las células, como se conoce en
la técnica. Una construcción de ADN que codifica ribozima puede
incluir elementos reguladores de transcripción, tales como un
elemento promotor, un potenciador o un elemento UAS, y una señal
del terminador de la transcripción, para controlar la transcripción
de las ribozimas en las células.
Como se enseña por Haseloff et al. en la
patente de estados Unidos Nº 5.641.673, las ribozimas se pueden
modificar por ingeniería genética de manera que la expresión de la
ribozima se producirá en respuesta a los factores que inducen la
expresión de un gen diana. Las ribozimas también se pueden modificar
por ingeniería genética para proporcionar un nivel adicional de
regulación, de manera que la destrucción del ARNm se produce
solamente cuando tanto una ribozima como un gen diana se inducen en
las células.
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En el presente documento se describen
procedimientos para la identificación de genes cuyos productos
interactúan con GPCR humano. Tales genes pueden representar genes
que se expresan de manera diferencial en trastornos, incluyendo,
pero sin limitación a COPD, trastornos cardiovasculares, cáncer,
trastornos urinarios, obesidad, diabetes, trastornos del CNS,
trastornos del hígado, trastornos del riñón, trastornos de los
órganos secretores, asma y trastorno hematológicos. Además, tales
genes pueden representar genes que se diferencian de manera regular
en respuesta a las manipulaciones relevantes a la progresión o
tratamiento de tales enfermedades. De manera adicional, tales genes
pueden tener una expresión modulada temporalmente, incrementada o
disminuida a diferentes fases de tejido o desarrollo del organismo.
Un gen expresado de manera diferencial también puede tener su
expresión modulada bajo control frente a las condiciones
ambientales. Además, el gen de GPCR humano o producto génico se
puede ensayar él mismo para evaluar la expresión diferencial.
El grado en el que la expresión se diferencia un
estado normal de un estado patológico necesita solamente ser lo
suficientemente grande para que se visualice mediante técnicas de
caracterización convencionales tales como técnicas de despliegue
diferencial. Otras de tales técnicas de caracterización
convencionales mediante las que se pueden visualizar la expresión
incluyen, pero no se limitan a, RT (transcriptasa inversa)
cuantitativa, PCR, y análisis de Northern.
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Para identificar los genes expresados de manera
diferencial ARN total o preferiblemente, ARNm se aísla a partir de
tejidos de interés. Por ejemplo, muestras de ARN se obtienen a
partir de tejidos de sujetos experimentales y a partir de tejidos
correspondientes de sujetos control. Cualquier técnica de
aislamiento de ARN que no se selecciona contra el aislamiento de
ARNm se puede utilizar para la purificación de tales muestras de
ARN. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed., CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. New
York, 1987-1993. Se pueden procesar fácilmente
grandes números de muestras de tejidos usando las técnicas bien
conocidas por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo,
el procedimiento de aislamiento de ARN de una sola etapa de
Chomczynski, Patente de Estados Unidos nº 4.843.155.
Las transcripciones dentro de las muestras de
ARN recogidas que representan el ARN producido mediante los genes
expresados de manera diferencial se identifican mediante
procedimientos bien conocidos en la técnica. Incluyen, por ejemplo,
selección diferencial (Tedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 85, 208-12, 1988), hibridación sustractiva
(Hedrick et al., Nature 308, 149-53; Lee
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2825, 1984),
despliegue diferencial (Liang y Pardee, Science 257,
967-71, 1992; Patente de Estados Unidos Nº
5.262.311), y análisis de microensayos.
La información de expresión diferencial puede
ella misma sugerir procedimientos relevantes para el tratamiento de
trastornos que imp0lican el GPCR humano. Por ejemplo, el tratamiento
puede incluir una modulación de la expresión de los genes
expresados de manera diferencial y/o el gen que codifica el GPCR
humano. La información de expresión diferencial puede indicar si la
expresión o actividad del gen de expresión de manera diferencial o
producto génico o el gen de GPCR humano o producto génico están
regulados hacia arriba o regulados hacia abajo.
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La invención proporciona ensayos para
seleccionar compuestos de ensayo que se unen a o modulan la
actividad de un polipéptido de GPCR o un polinucleótido de GPCR
polinucleótido. Un compuesto de ensayo preferiblemente se une a un
polipéptido de GPCR o polinucleótido. Más preferiblemente, un
compuesto de ensayo disminuye o aumenta el efecto biológico de un
ligando sobre el receptor mediante al menos aproximadamente 10,
preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente
aproximadamente 75, 90, ó 100% con relación a la ausencia del
compuesto de ensayo.
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Los compuestos de ensayo pueden ser agentes
farmacológicos ya conocidos en la técnica o pueden ser compuestos n
conocidos previamente que tienen cualquier actividad farmacológica.
Los compuestos pueden ser de origen natural o diseñarse en el
laboratorio. Se pueden aislar a partir de microorganismos, animales,
o plantas, y se pueden producir de manera recombinante, o
sintetizarse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Si se
desea, los compuestos de ensayo se pueden obtener usando
cualesquiera de los numerosos procedimientos de genotecas de
combinación conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se
limitan a, genotecas biológicas genotecas de fase sólida o de fase
en solución paralelas que se pueden dirigir espacialmente,
procedimientos de genoteca sintética que requieren desconvolución,
el procedimiento de genoteca de "una perla-un
compuesto", y procedimientos de genoteca sintética que usan
selección por cromatografía de afinidad. El planteamiento de
genoteca biológica se limita a genotecas de polipéptidos, mientras
que los otro cuatro planteamientos son aplicables a polipéptido,
oligómero no peptídico, librerías de moléculas pequeñas de
compuestos. Véase Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997.
Los procedimientos para la síntesis de genotecas
moleculares se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo,
DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993;
Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994;
Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et
al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem.
37, 1233, 1994). Las genotecas de los compuestos se pueden presentar
en solución (véase, por ejemplo, Houghten, BioTechniques 13,
412-421, 1992), o en perlas (Lam, Nature 354,
82-84, 1991), escamas (Fodor, Nature 364,
555-556, 1993), bacterias o esporas (Ladner, Patente
de Estados Unidos Nº 5.223.409), plásmidos (Cull et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992),
o fago (Scott & Smith, Science 249, 386-390,
1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382,
1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; y
Ladner, Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409).
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de ensayo se pueden seleccionar
por su capacidad de unirse a polipéptidos o polinucleótidos de GPCR
o para afectar a la actividad de GPCR o expresión del gen de GPCR
usando la selección de alto rendimiento. El uso de la selección de
alto rendimiento, muchos compuestos discretos se pueden ensayar en
paralelo de manera que se pueden seleccionar rápidamente grandes
cantidades de compuestos de ensayo. Las técnicas más ampliamente
establecidas utilizan placas de microvaloración de 96 pocillos. Los
pocillos de las placas de microvaloración típicamente requieren
volúmenes de ensayo que varían entre 50 y 500 \mul. Además de las
placas, muchos instrumentos, materiales, pipetas, robótica,
lavadores de placas, y lectores de placas están comercialmente
disponibles para adaptarse al formato de 96 pocillos.
Como alternativa, se pueden usar "ensayos sin
formato," o ensayos que no tienen ninguna barrera física entre
las muestras. Por ejemplo, un ensayo que usa células de pigmento
(melanocitos) en un ensayo simple homogéneo para las genotecas de
péptidos de combinación se describe por Jayawickreme et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19, 1614-18 (1994).
Las células se colocan en placas Petri de agarosa, después se
colocan las perlas que llevan los compuestos de combinación sobre
la superficie de la agarosa. Los compuestos de combinación se
liberan parcialmente de las perlas. Los compuestos activos se pueden
visualizar como áreas de pigmento oscuras, ya que los compuestos se
difunden localmente en la matriz del gel, los compuestos activos
provocan que las células cambien de color.
Otro ejemplo de ensayo sin formato libre se
describe por Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial
Libraries: Novel y Traditional Approaches", reseñado en la
primera Conferencia Annual de la Sociedad para la selección
Biomolecular en Filadelfia, Pa. (7-10 de nov
de1995). Chelsky colocó un ensayo de enzima homogéneo simple para
la carbónico anhidrasa dentro de un gel de agarosa de manera que la
enzima en el gel provocaría un cambio de color a lo largo de todo
el gel. Después de esto, las perlas que llevan los compuestos de
combinación mediante un fotoengarce se colocaron dentro del gel y
los compuestos se liberaron parcialmente mediante luz UV. Los
compuestos que inhibían la enzima se observaron en forma de zonas
locales de inhibición que tiene menos cambio de color.
Todavía otro ejemplo se describe por Salmon
et al., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996).
En este ejemplo, las genotecas de combinación se seleccionan para
los compuestos que tenían efectos citotóxicos sobre las células
cancerosas que se desarrollan en agar.
Otro procedimiento de selección de alto
rendimiento se escribe en Beutel et al., Patente de Estados
Unidos Nº 5.976.813. En este procedimiento, las muestras de ensayo
se colocan en matriz porosa. Uno o más componentes de ensayo se
colocan después dentro, sobre la parte superior, o en el fondo de
una matriz tal como un gel, una hoja de plástico, un filtro, u otra
forma de soporte sólido fácilmente manipulada. Cuando las muestras
se introducen en la matriz porosa se difunden suficientemente
lentos, de manera que los ensayos se pueden realizar sin que las
muestras de ensayo se desarrollen conjuntamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los ensayos de unión, el compuesto de
ensayo es preferiblemente una molécula pequeña que se une a y ocupa
el sitio activo del polipéptido de GPCR, haciendo por lo tanto que
el sitio de unión del ligando sea inaccesible al sustrato de manera
que la actividad biológica normal se evite. Los ejemplos de tales
moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos
pequeños o moléculas de tipo péptido. Los ligandos potenciales que
se unen a un polipéptido de la invención incluyen, pero no se
limitan a, los ligandos naturales de los GPCR conocidos y los
análogos o derivados de los mismos.
\newpage
En los ensayos de unión, o bien el compuesto de
ensayo o el polipéptido de GPCR pueden comprender una etiqueta
detectable, tal como una etiqueta fluorescente, de radioisótopo,
quimioluminiscente, o enzimática, tal como peroxidasa de rábano
picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa. La detección de un
compuesto de ensayo que está inido al polipéptido de GPCR se puede
después llevar a cabo, por ejemplo, mediante conteo directo de la
radioemisión, mediante conteo de centelleo, o mediante la
determinación de la conversión de un sustrato apropiado en un
producto detectable.
Como alternativa, la unión de un compuesto de
ensayo a un polipéptido de GPCR se puede determinar sin el
etiquetado de cualquiera de los que interactúan. Por ejemplo, se
puede usar un microfisiómetro para detectar la unión de un
compuesto de ensayo con un polipéptido de GPCR. Un microfisiómetro
(por ejemplo, Cytosensor^{TM}) es un instrumento analítico que
mide la velocidad a la que una célula acidifica su ambiente usando
un sensor potenciométrica dirigible por la luz (LAPS). Los cambios
en esta velocidad de acidificación se pueden usar como un indicador
de la interacción entre un compuesto de ensayo y un polipéptido de
GPCR (McConnell et al., Science 257,
1906-1912, 1992).
La determinación de la capacidad de un compuesto
de ensayo de unirse a un polipéptido de GPCR también se puede
llevar a cabo usando una tecnología tal como en Análisis de
Interacción Biomolecular a tiempo real (BIA) (Sjolander &
Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991, y Szabo
et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705,
1995). BIA es una tecnología para estudiar las interacciones
bioespecíficas en tiempo real, sin etiquetar cualquiera de los que
interactúan (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Los cambios en la
resonancia de plasmón de superficie del fenómeno óptico (SPR) se
puede usar como una indicación de las reacciones de tiempo real
entre las moléculas biológicas.
En todavía otro aspecto de la invención, un
polipéptido de GPCR se puede usar como una "proteína de cebo"
en un ensayos de dos híbridos o ensayo de tres híbridos (véase, por
ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.283.317; Zervos et
al., Cell 72, 223-232, 1993; Madura et
al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993;
Bartel et al., BioTechniques 14, 920-924,
1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696,
1993; y Brent documento W094/10300), para identificar otras
proteínas que se unen a o interactúan con el polipéptido de GPCR y
modular su actividad.
El sistema de dos híbridos se basa en la
naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción,
que constan de unión de dominios de unión de ADN y de activación
separables. En resumen, el ensayo utiliza dos construcciones
diferentes de ADN. Por ejemplo, en una construcción, el
polinucleótido que codifica un polipéptido de GPCR se puede
condensar a un polinucleótido que codifica el dominio de unión de
ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo,
GAL-4). En la otra construcción de una secuencia de
AND que codifica una proteína no identificada ("presa" o
"muestra") se puede condensar a un polinucleótido que codifica
el dominio de activación del factor de transcripción conocida. Si
las proteínas de "cebo" y la "presa" son capaces de de
interactuar in vivo para formar un complejo dependiente de
proteína, los dominios de unión de ADN de activación del factor de
transcripción se encuentran en estrecha proximidad. Esta proximidad
permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ),
que se une de manera operativa a un sitio regulador de la
transcripción para el factor de transcripción. La expresión del gen
indicador se puede detector, y las colonias de las células que
contienen el factor de transcripción funcional se puede aislar y
usar para obtener la secuencia de ADN que codifica la proteína que
interactúa con el polipéptido de GPCR.
Puede ser deseable inmovilizar o bien el
polipéptido de GPCR (o polinucleótido) o el compuesto de ensayo para
facilitar la separación de formas unidas de las no unidas de uno o
ambos de los que interactúan, así como acomodar la automatización
del ensayo. De este modo, el polipéptido de GPCR (o polinucleótido)
o el compuesto de ensayo pueden estar unidos a un soporte sólido.
Los soportes sólidos adecuados incluyen, pero no se limitan a,
portaobjetos de vidrio o plástico, placas de cultivo de tejidos,
pocillos de microtitulación, virutas de silicona, o partículas
tales como perlas (que incluye, pero no se limita a, látex, perlas
de poliestireno o de vidrio) Cualquier procedimiento conocido en la
técnica se puede usar para unir el polipéptido de GPCR (o poli
nucleótido) o compuesto de ensayo a un soporte sólido, que incluye
el uso de enlaces de covalente y no covalente, absorción pasiva, o
pares de restos de unión unidos respectivamente al polipéptido (o
polinucleótido) o compuesto de ensayo y el soporte sólido. Los
compuestos de ensayo están preferiblemente unidos al soporte sólido
en una disposición, de manera que la localización de los compuestos
de ensayo individuales se puedan rastrear. La unión de un compuesto
de ensayo a un polipéptido de GPCR (o polinucleótido) se puede
llevar a cabo en un recipiente adecuado para que contenga los
reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de
microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga.
En una realización, el polipéptido de GPCR es
una proteína de fusión que comprende un dominio que permite que el
polipéptido de GPCR se una a un soporte sólido. Por ejemplo, se
pueden adsorber las proteínas de fusión de
glutatión-S-transferasa en perlas de
glutatión sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) o placas de
microtitulación derivatizadas de glutatión, que después se combinan
con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y el
polipéptido de GPCR no absorbido; la mezcla después se incuba en
conducciones conductivas para la formación del complejo (por
ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH). Después de la
incubación, las perlas o pocillos de placa de microtitulación se
lavan para retirar cualesquiera componentes no unidos. La unión de
los que interactúan se pueden determinar o bien directa o
indirectamente, como se ha descrito anteriormente. Como
alternativa, los complejos se pueden disociar a partir del soporte
sólido antes de que se determine la unión.
Otras técnicas para la inmovilización de las
proteínas o polinucleótidos sobre un soporte sólido también se
pueden usar en los ensayos de selección de la invención. Por
ejemplo, o bien un polipéptido de GPCR (o polinucleótido) o un
compuesto de ensayo se puede inmovilizar utilizando la conjugación
de biotina y estreptavidina. Los polipéptidos de GPCR biotinilados
(o polinucleótidos) o compuestos de ensayo se pueden preparar a
partir de
biotina-NHS(N-hidroxisuccinimida)
usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de
biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.) e inmovilizados en
los pocillos de placas de 96 pocillos revestidos con estreptavidina
(Pierce Chemical). Como alternativa, los anticuerpos que se unen de
manera específica a un polipéptido de GPCR, polinucleótido, o un
compuesto de ensayo, pero que no interfiere con un sitio de unión
deseado, tal como el sitio activo del polipéptido de GPCR, se puede
derivatizar a los pocillos de la placa. La diana o proteína no
unida se puede atrapar en los pocillos mediante conjugación de
anticuerpos.
Los procedimientos para detectar tales
complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos
inmovilizados de GST, incluyen la inmunodetección de los complejos
que usan anticuerpos que se unen de manera específica al
polipéptido de GPCR o compuesto de ensayo, ensayos ligados a enzimas
que dependen de la detección de una actividad del polipéptido de
GPCR, y electroforesis de gel de SDS en condiciones no
reductoras.
La selección de los compuestos de ensayo que se
unen a un polipéptido o polinucleótido de GPCR también se pueden
llevar a cabo en células intactas. Cualquier célula que comprende un
polipéptido o polinucleótido de GPCR se puede usar en un sistema de
ensayo basado en células. Un polinucleótido de GPCR puede ser de
origen natural en la célula o se puede introducir usando las
técnicas tales como las descritas anteriormente. La unión del
compuesto de ensayo a un polipéptido o polinucleótido de GPCR se
determina como se ha descrito anteriormente.
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Los compuestos de ensayo se pueden ensayar por
la capacidad de incrementar o disminuir un efecto biológico de un
polipéptido de GPCR. Tales efectos biológicos se pueden determinar
usando los ensayos funcionales descritos en los ejemplos
específicos, más adelante. Los ensayos funcionales se pueden llevar
a cabo después de poner en contacto o bien un polipéptido de GPCR
purificado, una preparación de membrana celular, o una célula
intacta con un compuesto de ensayo. Un compuesto de ensayo que
disminuye una actividad funcional de un GPCR mediante al menos
aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más
preferiblemente aproximadamente 75, 90, o 100% se identifica como
un agente potencial para disminuir la actividad de GPCR. Un
compuesto de ensayo que incrementa la actividad de GPCR mediante al
menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más
preferiblemente aproximadamente 75, 90, o 100% se identifica como un
agente para incrementar la actividad de GPCR.
Uno de tales procedimientos de selección implica
el uso de melanóforos que se transfectan para expresar un
polipéptido de GPCR.. Tal técnica de selección se describe en el
documento WO 92/01810 publicado el 6 de febrero de 1992. De este
modo, por ejemplo, tal ensayo se puede emplear para seleccionar un
compuesto que inhibe la activación del polipéptido receptor
poniendo en contacto las células de melanóforo que comprenden el
receptor con tanto el ligando del receptor como un compuesto de
ensayo a seleccionar. La inhibición de la señal generada por el
ligandos indica que un compuesto de ensayo a seleccionar. La
inhibición de la señal generada por el ligando indica que un
compuesto de ensayo es un antagonista potencial para el receptor, es
decir, inhibe la activación del receptor. La selección se puede
emplear para identificar un compuesto de ensayo que activa el
receptor poniendo en contacto tales células con los compuestos a
seleccionar y determinar si cada compuesto de ensayo genera una
señal, es decir, activa el receptor.
Otras técnicas de selección incluyen el uso de
células que expresan un polipéptido de GPCR humano (por ejemplo,
células transfectadas CHO) en un sistema que mide los cambios de pH
extracelular provocadas por la activación del receptor (véase, por
ejemplo, Science 246, 181-296, 1989). Por ejemplo,
los compuestos de ensayo se pueden poner en contacto con una célula
que expresa un polipéptido de GPCR humano y una segunda respuesta
de mensajero, por ejemplo, transducción de señal o cambios de pH, se
pueden medir para determinar si el compuesto de ensayo activa o
inhibe el receptor.
Otra tal técnica de selección implica la
introducción de ARN que codifica un polipéptido de GPCR humano en
oocitos de Xenopus para expresar de manera transitoria el
receptor. Los oocitos transfectados se pueden después poner en
contacto con el ligandos del receptor y un compuesto de ensayo a
seleccionar, seguido de la detección de la inhibición o activación
de una señal de calcio en el caso de la selección de los compuestos
de ensayo que se cree que inhiben la activación del receptor.
Otra técnica de selección implica la expresión
de un polipéptido de GPCR humano en las células en las que el
receptor está ligado a una fosfolipasa C o D. Tales células incluyen
células endoteliales, células del músculo liso, células del riñón
embrionarias, etc. La selección se puede llevar a cabo como se ha
descrito anteriormente mediante la cuantificación del grado de
activación del receptor a partir de los cambios en la actividad
fosfolipasa.
Los detalles de los ensayos funcionales tales
como los descritos anteriormente se proporcionan en los ejemplos
específicos, más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, se identifican los
compuestos de ensayo que incrementan o disminuyen la expresión del
gen GPCR. Un polinucleótido de GPCR se pone en contacto con un
compuesto de ensayo, y se determina la expresión de un ARN o
producto de polipéptido del polinucleótido de GPCR. El nivel de
expresión de un ARNm apropiado o polipéptido en la presencia del
compuesto de ensayo se compara con el nivel de expresión de ARNm o
polipéptido en la ausencia del compuesto de ensayo. Después el
compuesto de ensayo se puede identificar como un modulador de la
expresión basándose en esta composición. Por ejemplo, cuando la
expresión de ARNm o polipéptido es mayor en la presencia del
compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se
identifica como un estimulador o potenciador de la expresión de
ARNm o polipéptido. Como alternativa, cuando la expresión del ARNm
o polipéptido es menos en la presencia del compuesto de ensayo que
en su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica como un
inhibidor de la expresión del ARNm o polipéptido.
El nivel de la expresión de ARNm de GPCR o
polipéptido en las células se puede determinar mediante los
procedimientos bien conocidos en la técnica para detectar ARNm o
polipéptido. Se pueden usar procedimientos o bien cualitativos o
cuantitativos. La presencia de los productos de polipéptidos de un
polinucleótido de GPCR se puede determinar, por ejemplo, usando una
diversidad de técnicas conocidas en la técnica, que incluye
procedimientos inmunológicos tales como radioinmunoensayo,
transferencia de Western, e inmunohistoquímica. Como alternativa, la
síntesis de polipéptidos se puede determinar in vivo, en un
cultivo de células, o en un sistema de traducción in vitro
mediante la detección de la incorporación de los aminoácidos
etiquetados en un polipéptido de GPCR.
Tal selección se puede llevar a cabo o bien en
un sistema de ensayo sin células o en una célula intacta. Cualquier
célula que expresa un polinucleótido de GPCR se puede usar en un
sistema de ensayo basado en células. El polinucleótido de GPCR
puede ser de origen natural en la célula o se puede introducir
usando las técnicas tales como las descritas anteriormente. Se
puede usar o bien un cultivo primario o una línea celular
establecida, tal como CHO o las células 293 de riñón
embrionario.
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La invención también proporciona composiciones
farmacéuticas que se pueden administrar a un paciente para lograr
un efecto terapéutico. Las composiciones farmacéuticas de la
invención pueden comprender, por ejemplo, un polipéptido de GPCR,
polinucleótido de GPCR, anticuerpos que se unen de manera específica
a un polipéptido de GPCR, o miméticos, agonistas, antagonistas, o
inhibidores de la actividad de un polipéptido de GPCR. Las
composiciones se pueden administrar solas o en combinación con al
menos otro agente, tal como un compuesto de estabilización, que se
puede administrar en cualquier vehículo estéril, biocompatible
farmacéutico, que incluye, pero no se limita a, solución salina
tamponada, dextrosa, y agua. Las composiciones se pueden administrar
a un paciente solo, o en combinación con otros agentes, fármacos u
hormonas.
Además de los ingredientes activos, estas
composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos
farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y
auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos
en las preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Las
composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar
mediante cualquier número de vías, incluyendo, pero sin limitación
a, oral, intravenosa, intramuscular,
intra-arterial, intramedular, intratecal,
intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal,
intranasal, parenteral, tópica, sublingual, o rectal. Las
composiciones farmacéuticas para la administración oral se pueden
formular usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien
conocidos en la técnica en las dosificaciones adecuadas para la
administración oral. Tales vehículos permiten que las composiciones
farmacéuticas se formulen en forma de comprimidos, píldoras,
grageas, cápsulas, líquidos, ges, jarabes, lechadas, suspensiones, y
similares, para ingestión por el
paciente.
paciente.
Las preparaciones farmacéuticas para el uso oral
se pueden obtener mediante la combinación de los compuestos activos
con excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante,
y procesando la mezcla de los gránulos, después de la adición de
auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o
núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son cargas de
carbohidratos o de proteína., tales como azúcares, incluyendo
lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; almidón de maíz, trigo,
arroz, patata, u otras plantas; celulosa, tales como metil
celulosa,, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa de
sodio; gomas incluyendo goma arábiga y de tragacanto; y proteínas
tales gelatina y colágeno. Si se desea, se pueden añadir agentes
disgregantes o solubilizantes, tales como polivinil pirrolidona
reticulada, agar, ácido algínico, o una sal de los mismos, tal como
alginato de sodio.
Se pueden usar núcleos de grageas junto con
revestimientos adecuados, tales como soluciones concentradas de
azúcar, que también contienen goma arábiga, talco,
polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido
de titanio, soluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados p
mezclas de disolventes. Materias colorantes o pigmentos se pueden
añadir a los comprimidos o revestimientos de grageas para la
identificación del producto o para caracterizar la cantidad del
compuesto activo, es decir, dosificación.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden
usar por vía oral incluyen cápsulas de ajuste por empuje hechas de
gelatina, así como blandas, cápsulas selladas hechas de gelatina y
un revestimiento tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de
ajuste por empuje pueden contener ingredientes activos mezclados con
una carga o aglutinantes, tales como lactosa o almidones,
lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y,
opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los
compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos
adecuados, tales como aceites grasos, líquido, o polietilenglicol
líquido con o sin estabilizantes.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para
la administración parenteral se pueden formular en soluciones
acuosas preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles
tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o solución salina
tamponada fisiológicamente. Las suspensiones de inyección acuosa
pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la
suspensión, tales como carboximetil celulosa de sodio, sorbitol, o
dextrano. De manera adicional, las suspensiones de los compuestos
activos se pueden prepara en forma de suspensiones oleosas de
inyección apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos
adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o
ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como etil oleato o
triglicéridos, o liposomas. Los polímeros de amino policatiónicos
no lípidicos también se pueden usar para administración.
Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o
agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos
para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Para la administración tópica o nasal, se usan en la formulación
penetrantes
apropiados para que sean perneados por la barrera particular. Tales penetrantes se conocen en general en la técnica.
apropiados para que sean perneados por la barrera particular. Tales penetrantes se conocen en general en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se pueden fabricar de una manera que se conoce en la
técnica, por ejemplo, mediante mezcla, disolución, granulación,
formación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación,
atrapamiento, o procedimientos de liofilización convencionales. La
composición farmacéutica se puede proporcionar en forma de una sal
y se pueden formar con muchos ácidos, que incluyen, pero no se
limitan a, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico,
tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más
solubles en disolventes acuosos u otros protónicos que son las
formas de base libre correspondientes. En otros casos, la
preparación preferida puede ser un polvo liofilizado que puede
contener cualquiera o todos de los siguientes: 1-50
mM de histidina, 0,1%-2% de sacarosa, y 2-7% de
manitol, a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que se combina con
tampón antes de uso.
Se pueden encontrar detalles adicionales para la
formulación y administración en la última edición de REMINGTON'S
PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). Después
de que las composiciones farmacéuticas se hayan preparado, se
pueden colocar en un recipiente adecuado y etiquetarse para
tratamiento de una afección indicada. Tal etiquetado incluiría
cantidad, frecuencia, y procedimiento de administración.
\vskip1.000000\baselineskip
Los GPCR son ubicuos en el huésped de mamífero y
son responsables de muchas funciones biológicas, que incluyen
muchas patologías. De acuerdo con lo anterior, es deseable encontrar
los compuestos y fármacos que estimulan un GPCR por una parte. Por
ejemplo, los compuestos que activan un GPCR se pueden emplear para
propósitos terapéuticos, tales como el tratamiento de COPD,
trastornos cardiovasculares, cáncer, trastornos urinarios,
obesidad, diabetes, trastornos del CNS, trastornos del hígado,
trastornos del riñón, trastornos de los órganos secretores, asma y
trastorno hematológicos. En particular, los compuestos que activan
los GPCR son útiles en el tratamiento de diversas dolencias
cardiovasculares tales como las provocadas por la carencia de flujo
de sangre pulmonar o hipertensión. Además estos compuestos también
se pueden usar en el tratamiento de diversos tratamientos
fisiológicos con relación al control anormal de fluido homeostasis
de electrolitos y en las enfermedades asociadas a la secreción de
aldosterona inducida por angiotensina anormal.
En general, los compuestos que inhiben la
activación de un GPCR se puede usar para una diversidad de
propósitos terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento de
hipotensión y/o hipertensión, angina de pecho, infarto de
miocardio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna,
y trastornos psicóticos y neurológicos incluyendo esquizofrenia,
excitación maníaca, depresión, delirio, demencia o retraso mental
severo, discinesias, tal como una enfermedad de Huntington o
síndrome de Tourett entre otros. Los compuestos que inhiben los GPCR
también son útiles en la reversión de la anorexia endógena, en el
control de la bulimia, y en el tratamiento de diversas dolencias
cardiovasculares tales como las provocadas por excesivo flujo de
sangre pulmonar o hipotensión. En particular, la regulación de GPCR
se puede usar para tratar ansiedad, depresión, hipertensión,
migraña, trastornos compulsivos, esquizofrenia, autismo, trastornos
neurodegenerativos, tales como enfermedad de Alzheimer,
Parkinsonismo, y corea de Huntington, y vómitos inducidos por la
quimioterapia de cáncer, así como trastornos del sueño y de la
alimentación, control del dolor, trastornos que implican la
regulación de la temperatura corporal y presión sanguínea.
\vskip1.000000\baselineskip
Este gen, proteínas traducidas y agentes que
modulan este gen o porciones del gen o sus productos son útiles
para tratar obesidad, sobrepeso, anorexia, caquexia, trastornos de
desnutrición, supresión del apetito, aumento de apetito, incremento
o disminución de la saciedad, modulación del peso corporal, y/u
otros trastornos de alimentación tal como bulimia. Obesidad y
sobrepeso se definen como un exceso de grasa corporal con relación
a la masa corporal magra. Un incremento en la ingesta calórica o
disminución del gasto de energía o ambos pueden hacer que este
desequilibrio que conduce a un exceso de energía que produce un
almacenamiento de grasa. La obesidad está asociada a importantes
morbosidades médicas y un incremento en la mortalidad. Las causas
de obesidad se entienden escasamente y se puede deber a factores
genéticos, factores ambientales o una combinación de los dos que
provocan un equilibrio de energía positiva. Por el contrario, la
anorexia y caquexia se caracterizan por un desequilibrio en la toma
de energía frente al gasto de energía que conduce a un equilibrio de
energía negativo y pérdida de peso. Los agentes que o bien
incrementan el gasto de energía y/o disminución de la toma de
energía, absorción o almacenamiento sería útil para tratar obesidad,
sobrepeso, y comorbidades asociadas. Los agentes que o bien
incrementan la toma de energía y/o disminuyen el gasto de energía o
incremento de la cantidad de tejido magro sería útil para el
tratamiento de caquexia, anorexia y trastornos de desnutrición.
Este gen, proteínas traducidas y agentes que
modulan este gen o partes del gen o su producto también son útiles
para tratar obesidad/comorbidades asociadas a sobrepeso incluyendo
hipertensión, diabetes de tipo 2, enfermedad arterial coronaria,
hiperlipidemia, accidente cerebrovascular, enfermedad de la vesícula
biliar, gota, osteoartritis, apnea del sueño y problemas
respiratorios, algunos tipos de cáncer incluyendo cáncer de
endometrio, de mama, de próstata y de colon, enfermedad trombótica,
síndrome de ovario poliquístico; fertilidad reducida,
complicaciones de embarazo, irregularidades menstruales, hirsutismo,
ésteres, incontinencia, y depresión.
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Los GPCR humanos proporcionan una Diana
potencial para el tratamiento de cáncer. El cáncer es una enfermedad
provocada fundamentalmente por la transformación celular
oncogénica. Existen varios sellos de células transformadas que las
distinguen de sus homólogos normales y son el fundamento de la
patopsicología de cáncer. Éstos incluyen proliferación celular no
controlada, falta de respuesta a las señales que inducen la muerte
(inmortalización), incremento de la mortalidad celular e
invasividad, aumento de la capacidad de reclutar suministro de
sangre mediante la introducción de la formación de nuevos vasos
sanguíneos y (angiogénesis), inestabilidad genética y desregulación
de la expresión génica. Diversas combinaciones de estas fisiologías
aberrantes junto con la adquisición de la resistencia a fármacos
conducen frecuentemente a un estado patológico intratable en el que
se produce el fallo orgánico y muerte del paciente.
La mayoría de las terapias de cáncer
convencionales dirigen la proliferación celular y dependen de las
capacidades proliferativas diferenciales entre las células
transformadas y normales para su eficacia. Este planteamiento está
dificultado por el hecho de que varios tipos de células normales son
también altamente proliferativos y que las células cancerosas
frecuentemente se hacen resistentes a estos agentes. De este modo,
los índices terapéuticos de las terapias anticáncer raramente
exceden de 2.0.
El advenimiento de la identificación de la diana
molecular dirigida por el genoma ha abierto la posibilidad de
identificación de nuevas dianas específicas de cáncer para la
intervención terapéutica que proporcionará tratamientos más
seguros, más eficaces para los pacientes de cáncer. De este modo,
los genes asociados a tumores recientemente descubiertos y sus
productos se pueden ensayar para determinar su(s)
papel(es) en la enfermedad y usarse como herramientas para
descubrir y desarrollar terapias innovadoras. Los genes que juegan
papeles importantes en cualesquiera de los procesos fisiológicos
indicados anteriormente se pueden caracterizar como dianas de
cáncer.
Los genes o fragmentos de genes identificados
mediante el genoma se pueden fácilmente expresar en uno o más
sistemas de expresión heterólogos para producir proteínas
recombinantes funcionales. Estas proteínas se caracterizan in
vitro por sus propiedades biológicas y después usarse como
herramientas en los programas de selección de alto rendimiento para
identificar los moduladores químicos de sus actividades bioquímicas.
Los agonistas y/o antagonistas de la actividad de la proteína diana
se pueden identificar de esta manera y posteriormente ensayarse en
modelos celulares y de enfermedad in vivo para la actividad
anticáncer. La optimización de los compuestos líder con ensayo
iterativo en los modelos biológicos y farmacocinética detallada y
análisis toxicológicos forman la base para el desarrollo de
fármacos y posterior ensayo en seres humanos.
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La diabetes también se puede tratar
potencialmente mediante la regulación de la actividad de GPCR
humano. La. Diabetes mellitus es un trastorno metabólico común
caracterizado por una elevación anormal de la glucosa en sangre,
alteraciones en lípidos y anormalidades (complicaciones) en le
sistema cardiovascular, ojo, riñón y sistema nervioso. La diabetes
se divide en dos enfermedades separadas: diabetes de tipo 1
(aparición juvenil) que se produce por una pérdida de células que
fabrican y secretan insulina, y diabetes de tipo 2 (aparición en
adultos) que se provoca por un defecto en la secreción de insulina y
un defecto en la acción de insulina.
La diabetes de tipo I se inicia por una reacción
autoinmune que ataca a las células que secretan insulina (células
beta) en los islotes pancreáticos. Los agentes que previenen que
esta reacción aparezca o que detiene la reacción antes de la
destrucción de las células beta se han llevado a cabo son terapias
potenciales para esta enfermedad. Otros agentes que inducen la
proliferación de las células beta y regeneración son también
terapias potenciales.
La diabetes de tipo II es la más común d las dos
afecciones diabéticas (6% de la producción). El defecto en la
secreción de insulina es una causa importante de la afección
diabética y se propuse por su incapacidad de la célula beta en
detectar y responder de manera apropiada a los incrementos de los
niveles en sangre con liberación de insulina. Las terapias que
incrementan la respuesta por la célula beta a la glucosa ofrecerían
un importante tratamiento nuevo para esta enfermedad.
El defecto de la acción de insulina en sujetos
con diabetes de tipo II es otra diana para la intervención
terapéutica. Los agentes que incrementan la actividad del receptor
de insulina en músculo, hígado y grasa provocará una disminución de
la glucosa en sangre y una normalización de lípidos en plasma. La
actividad del receptor se puede aumentar por los agentes que
estimulan directamente el receptor o que incrementa las señales
intracelulares del receptor. Otras terapias pueden activar
directamente el proceso del fin celular, es decir el transporte de
glucosa o diversos sistemas de enzimas, para generar un efecto de
tipo insulina y por lo tanto produce un resultado beneficioso.
Debido al que los sujetos con sobrepeso tienen una mayor
susceptibilidad a la diabetes de tipo II, cualquier agente que
reduce el peso corporal es una posible terapia.
Tanto la diabetes de tipo I como de tipo se
pueden tratar con agentes que imitan la acción de la insulina o que
tratan las complicaciones diabéticas mediante la reducción de los
niveles de glucosa en sangre. De manera similar que reduce el
crecimiento de nuevos vasos sanguíneos se pueden usar para tratar
las complicaciones oculares que se desarrollan en ambos casos.
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La enfermedad pulmonar (o de las vías
respiratorias) obstructiva crónica (COPD) es una afección definida
fisiológicamente como obstrucción del flujo de aire que en general
se produce a partir de una mezcla de enfisema y obstrucción de las
vías respiratorias periféricas debido a la bronquitis crónica
(Senior y Shapiro, Pulmonary Diseases y Disorders, 3ª ed., New
York, McGraw-Hill, 1998, p. 659-681,
1998; Barnes, Chest 117, 10S-14S, 2000). El
enfisema se caracteriza por la destrucción de las paredes alveolares
que conduce al ensanche de los espacios aéreos del pulmón. La
bronquitis crónica se define clínicamente como la presencia de tos
productiva crónica durante tres meses en cada uno de los dos años
sucesivos. En COPD, la obstrucción de las vías respiratorias es
usualmente progresiva y es solamente en parte reversible. Con mucho
el factor de riesgo más importante para el desarrollo de COPD es el
fumar cigarrillos, aunque la enfermedad no se produce en los no
fumadores.
La inflamación crónica de las vía respiratorias
es una característica patológica clave de COPD (Senior &
Shapiro, 1998). La población de células de células inflamatorias
comprende números crecientes de macrófagos, neutrófilos, y
linfocitos CD8+. Los irritantes inhalados, tal como el fumar
cigarrillos, macrófagos activados que son residentes en le tracto
respiratorio, así como las células epiteliales que conducen a la
liberación de quimioquinas (por ejemplo,
interleuquina-8) y otros factores quimiotácticos.
Estos factores quimiotácticos actúan para incrementar el tráfico de
neutrófilos/monocitos desde la sangre en el tejido pulmonar y vías
respiratorias. Los neutrófilos y monocitos reclutados en las vías
respiratorias pueden liberar una diversidad de mediadores
potencialmente perjudiciales tales como enzimas proteolíticas y
especies de oxígeno reactivas. La degradación de matriz y enfisema,
junto con el engrosamiento de la pared de las vías respiratorias,
disfunción de tensioactivos, e hipersecreción de moco, son todas
secuelas potenciales de esta respuesta inflamatoria que conducen a
la alteración de las vías respiratorias e intercambio de gas.
Han estado implicados varios GPCR en la
patología de COPD. Por ejemplo, la quimioquina IL-8
actúa mediante CXCR1 y CXCR2, y antagonistas para estos receptores
están bajo investigación como agentes terapéuticos para COPD. Los
miembros de la familia de P2Y de receptores metabotrópicos pueden
jugar papeles claves en la función pulmonar normal. En particular,
el receptor P2Y_{2} se cree que está implicado en la regulación de
los mecanismos de eliminación de eliminación en el pulmón, y los
agonistas de este receptor pueden estimular la eliminación del moco
de las vías respiratorias en pacientes con bronquitis crónica (Yerxa
Johnson, Drugs of the Future 24, 759-769, 1999).
Por lo tanto los GPCR, son dianas terapéuticas para COPD, y la
identificación de miembros adicionales de las familias existentes
de GPCR o de GPCR novedosos conduciría a dianas atractivas
adicionales.
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Las enfermedades cardiovasculares incluyen los
siguientes trastornos del corazón e insuficiencia cardiaca
congestiva sistémica vascular, infarto de miocardio, enfermedades
isquémicas, del corazón, todos los tipos de arritmias atriales y
ventriculares, enfermedades vasculares hipertensivas, y enfermedades
vasculares periféricas.
La insuficiencia cardiaca se define como un
estado patogénico en el que una anormalidad de la función cardíaca
es responsable de la insuficiencia cardíaca para bombear sangre a
una velocidad conmensurable con el requerimiento del tejido
metabolizante. Incluye todas las formas de insuficiencia en el
bombeo, tal como alto rendimiento y bajo rendimiento, aguda y
crónica, del lado derecho y del lado izquierdo, sistólico o
diastólico, independiente de la causa subyacente.
El infarto de miocardio (MI) está en general
provocado por una disminución abrupta en el flujo de sangre
coronario (que sigue a una oclusión trombótica de una arteria
coronaria que se ha estrechado previamente por la arteriosclerosis.
Se incluye la profilaxis de MI (prevención primaria y secundaria),
así como el tratamiento agudo de MI y la prevención de las
complicaciones.
Las enfermedades isquémicas son condiciones en
las que el flujo coronario está restringido que da como resultado
una perfusión que es inadecuada para reunir el requerimiento
miocardio de oxígeno. Este grupo de enfermedades incluye angina
estable, angina inestable, e isquemia asintomática.
Las arritmias incluyen todas las formas de una
taquiarritmias atriales y ventriculares (taquicardia atrial,
palpitación atrial, fibrilación atrial, taquicardia reentrante atrio
ventricular, síndrome de excitación previa, taquicardia
ventricular, palpitación ventricular, y fibrilación ventricular),
así como formas braquicárdicas de arritmias.
Las enfermedades vasculares incluyen
hipertensión arterial primaria así como todos los tipos secundarios
(renal, endocrino, neurogénico, otros). El gen descrito y su
producto se puede usar como dianas de fármaco para el tratamiento
de hipertensión así como para la prevención de todas las
complicaciones. Las enfermedades periféricas vasculares se definen
como enfermedades vasculares en las que el flujo arterial y/o venoso
se reduce dando como resultado un desequilibrio entre el suministro
de sangre y demanda de oxígeno de tejidos. Incluye la enfermedad
arterial oclusiva periférica crónica (PAOD), trombosis arterial
aguda y embolia, trastornos vasculares inflamatorios, fenómeno de
Raynaud, y trastornos venosos.
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Los trastornos del sistema nervioso central y
periférico también se pueden tratar, como trastornos primarios y
secundarios después de la lesión de cerebro, los trastornos de
humor, trastornos de ansiedad, trastornos de pensamiento y
voluntad, trastornos de sueño y del completo despertar, enfermedades
de la unidad motora, tales como trastornos neurogénicos y
miopáticos trastornos neurodegenerativos tales como enfermedad de
Alzheimer y de Parkinson, y procesos de dolor periférico y
crónico.
El dolor que está asociado a los trastornos de
SNC también se puede tratar mediante la regulación de la actividad
de GPCR humano. El dolor que se puede tratar incluye el asociado a
trastornos del sistema nervioso central, tales como esclerosis
múltiple, lesión de la médula espinal, ciática, síndrome de l fallo
de la cirugía de la espalda, lesión cerebral traumática, epilepsia,
enfermedad de Parkinson, post-apoplejía, y lesiones
vasculares en el cerebro y médula espinal (por ejemplo, infarto,
hemorragia, malformación vascular). El dolor neuropático no central
incluye el asociado con el dolor después de la mastectomía,
distrofia simpática refleja (RSD), neuralgiadioculopatía
trigeminal, dolor después de la cirugía, dolor relacionado con
VIH/SIDA, dolor de cáncer, neuropatía (por ejemplo, neuropatía
diabética, neuropatía vasculítica secundaria al la enfermedad de
tejido conectivo), polineuropatía para neoplásica asociada, por
ejemplo, a carcinoma de pulmón, o leucemia, o linfoma, o carcinoma
de próstata, colon o estómago, neuralgia trigeminal, neuralgia
craneal, y neuralgia post-herpética. El dolor
asociado a cáncer y tratamiento de cáncer también se pueden tratar,
como puede ser dolor de cefalea (por ejemplo, migraña con aura,
migraña sin aura, y otros trastornos de migraña), cefalea de tipo
tensión episódica y crónica, cefalea de tipo tensión, cefalea de
racimos, y hemicrania paroxismal crónica.
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La alergia es un proceso complejo en el que los
antígenos ambientales inducen reacciones clínicamente adversas. La
inducción de antígenos, llamados alérgenos, típicamente inducen una
respuesta específica de IgE y, aunque en la mayoría de los casos
los propios alérgenos tienen poca o ninguna toxicidad intrínseca,
inducen patología cuando la respuesta de IgE a su vez induce una
reacción de hipersensibilidad dependiente de IgE o dependientes de
las células T. Las reacciones de hipersensibilidad pueden ser
locales o sistémicas y se producen típicamente en unos minutos de
exposición alérgeno en individuos que se han sensibilizado
previamente a un alérgeno. La reacción de hipersensibilidad de
alergia se desarrolla cuando el alérgeno se reconoce por los
anticuerpos de IgE unidos a los receptores específicos sobre la
superficie de las células efectoras, tales como mastocitos,
basófilos, o eosinófilo, que provoca la activación de las células
efectoras y la liberación de mediadores que producen los signos y
síntomas agudos de las reacciones. Las enfermedades alérgicas
incluyen asma, rinitis alérgica (fiebre del heno), dermatitis
atópica, y anafilaxis.
El asma se piensa que surge como resultado de
interacciones entre factores genéticos y ambientales múltiples y se
caracteriza por tres características principales: 1) obstrucción de
las vías intermitente y reversible provocada por la
broncoconstricción, aumento de la producción de moco, y
engrosamiento de las paredes de las vías respiratorias que conduce
a un estrechamiento de las vías respiratorias, 2) hipersensibilidad
de las vías respiratorias provocada por una disminución del control
del calibre de las vías respiratorias, y 3) inflamación de las vías
respiratorias. Ciertas células son críticas para la reacción
inflamatorias de asma e incluyen las células T y células que
presentan antígeno, células B que producen IgE, y mastocitos,
basófilos, eosinófilos, y otras células que se unen a IgE. Estas
células efectoras se acumulan en el sitio de la reacción alérgica
en las vías respiratorias y liberan productos tóxicos que
contribuyen a la patología aguda y eventualmente a la destrucción
de tejidos relacionada con el trastorno. Otras células residentes,
tales como células del músculo liso, células epiteliales de pulmón,
células que producen moco, y células nerviosas también pueden ser
anormales en individuos con asma y pueden contribuir a la patología.
Mientras que la obstrucción de las vías respiratorias de asma, que
se presentan clínicamente como una respiración intermitente y
brevedad en la respiración, es en general el síntoma de mayor
presión de la enfermedad que requiere tratamiento inmediato, la
inflamación y destrucción de tejidos asociado a la enfermedad puede
conducir a cambios irreversibles que eventualmente producen asma un
trastorno incapacitante crónico que requiere la dirección a largo
plazo.
A pesar de los avances recientes importantes en
nuestra comprensión de la patofisiología de de asma, la enfermedad
parece que se incrementa en la frecuencia y gravedad (Gergen y
Weiss, Am. Rev. Respir. Dis. 146, 823-24, 1992). Se
estima que entre 30-40% de la población padece
alergia atópica, y un 15% de niños y un 5% de adultos de la
población padece asma (Gergen y Weiss, 1992). De este modo, se
coloca una enorme carga en nuestros recursos de atención sanitaria.
Sin embargo, tanto la diagnosis como tratamiento de asma son
difíciles. La gravedad de la inflamación de los tejidos de pulmón no
es fácil de medir y los síntomas de la enfermedad a menudo son
indistinguibles de las infecciones respiratorias, trastornos
inflamatorios respiratorios crónicos, rinitis alérgica, u otros
trastornos respiratorios. A menudo, el alérgeno incitante no se
puede determinar, realizando la eliminación del difícil agente
ambiental. Los tratamientos farmacológicos actuales padecen su
propio establecimiento de desventajas. Los agentes terapéuticos
comúnmente usados, tales como agonistas beta, pueden actuar como
supresores del síntoma para mejorar la función pulmonar, pero no
afectan al la inflamación subyacente. Los agentes que pueden
reducir la inflamación subyacente, tales como esteroides
antiinflamatorias, pueden tener inconvenientes principales que se
extienden desde la inmunosupresión de la pérdida ósea (Goodman y
Gilman's THE PHARMACOLOGIC BASIS OF THERAPEUTICS, séptima edición,
MacMillan Publishing Company, NY, USA, 1985). Además, muchas de las
terapias actuales, tales como corticosteroides inhalados, son de
corta duración, inconvenientes de uso, y se deben usar a menudo en
base regular, en algunos casos para la vida, que hace que fracase
que los pacientes cumplan con el tratamiento de un problema
principal y por lo tanto reduciendo su eficacia como un
tratamiento.
Debido a los problemas asociados a las terapias
convencionales, se han evaluado estrategias de tratamiento
alternativos. La glicoforina A (Chu y Sharom, Cell. Immunol. 145,
223-39, 1992), ciclosporina (Alexander et
al., Lancet 339, 324-28, 1992), y un fragmento
nonapeptídico de IL-2 (Zav'yalov et al.,
Immunol. Lett. 31, 285-88, 1992) inhiben todos la
proliferación de linfocitos T dependientes de
interleuquina-2; sin embargo se conoce que tienen
otros muchos efectos. Por ejemplo, la ciclosporina se usa como un
inmunosupresor después del trasplante de órganos. Mientras estos
agentes pueden representar alternativas a los esteroides en el
tratamiento de asmáticos. Inhiben los linfocitos T dependientes de
la interleuquina-2 y potencialmente las funciones
inmunes críticas asociadas a homeostasis. Otros tratamientos que
bloquean la liberación o actividad de los mediadores de la
broncoconstricción, tales como cromosomas o antileucotrienos, se han
introducido recientemente para el tratamiento de se asma suave,
pero son caros y no son eficaces en todos los pacientes y no está
claro si tienen algún efecto sobre los cambios crónicos asociados
la inflamación asmática. Los que se necesita en la técnica es la
identificación de un tratamiento que puede actuar en las rutas
críticas para el desarrollo de asma que tanto bloquee los ataques
episódicos del trastorno como preferentemente diluye la respuesta
inmunógena alérgica hiperactiva sin un compromiso inmune del
paciente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los receptores acoplados a la proteína de unión
de guanina-nucleótido - (G-) (GPCRs) están
implicados en diversos procesos hematopoyéticos, por ejemplo
proliferación, diferenciación, supervivencia, migración y
direccionamiento de las células precursoras a los tejidos
hematopoyéticos y linfoides. La disfunción de los GPCR puede
conducir a una producción inapropiada de las células sanguíneas que
dan como resultado enfermedades de tipo anemia, leucopenia,
trombocitopenia o formas diferentes de leucemia.
Los GPCR también juegan un papel en las diversas
funciones de los glóbulos blancos circulantes por ejemplo,
activación de la respuesta inmune en linfocitos, producción de
citoquinas por los monocitos y quimiotaxis de granulocitos. La
función de los GPCR puede contribuir a la función inmune
comprometida, alergia y otras afecciones patológicas del sistema de
defensa del huésped.
En las plaquetas circulantes los GPCRs median la
activación que da como resultado la agregación y secreción de
plaquetas de los mediadores que eventualmente conducen a hemostasis.
La modulación de la función de los GPCR en las plaquetas mediante
procedimientos farmacológicos o de genética molecular han demostrado
papeles clave de los GPCR en enfermedades trombóticas y en los
trastornos hemorrágicos que proporcionan de esta manera que los GPCR
representen dianas de fármacos terapéuticos apropiados.
Los GPCR se activan mediante la unión de
diversas clases de ligandos que varían entre moléculas pequeñas de
tipo serotonina y péptidos moleculares de alto peso molecular de
tipo quimioquinas. Algunos de los GPCR están activados mediante
escisión proteolítica, por ejemplo trombina. Tras la unión del
ligando, las señales de los GPCR están mediadas mediante proteínas
G heterotriméricas con la clase de la subunidad \alpha que
determina la la transducción de la señal de la ruta adicional.
Se puede concebir que los genes que codifican
los GPCR "no convencionales" con los ligandos no identificados
o rutas de transducción de señal intracelular desconocidas (por
ejemplo, proteínas G novedosas) o los de los GPCR de las clases ya
que todavía no están asociados a los sistemas hemhetatopoyéticos y
homeostáticos se identificarán. Por lo tanto es razonable asumir
que los GPCR expresados específicamente en el precursor
hematopoyético o células sanguíneas circulantes representan buenas
dianas para las intervenciones terapéuticas de las disfunciones de
hematopoyesis y hemostasis. Yang M.,Srikaiatkhachom A, Antony M.,
Chong B.H.; Blood Coagul. Fibrinolysis 1996,
127-33; Arai H., Tsou C.L., Charo I.F.; Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94, 14495-14499, 1997; Aragay A.M.,
Quick M.W.; J. Biol. Chem. 274, 4807-4815, 1999;
Davignon I., Catalina M.D., Smith D., Montgomery J., Croy J.,
Siegelman M., Wilkie T.M.; Mol. Cell. Biol. 20,
797-804, 2000; Wiesmann A., Spangrude G.J.; Exp.
Hematol. 27, 946-955, 1999; Van Brocklyn J.R, Graler
M.H., Bernhardt G., Hobson J.P., Lipp M., Spiegel S.; Blood 95,
2624-2629, 2000; Brass L.F.; J. Clin. Invest. 104,
1663-1665, 1999; Coughlin S.R; Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 96, 11023-11027, 1999.
\vskip1.000000\baselineskip
Incontinencia urinaria. La incontinencia
urinaria (UI) es la pérdida involuntaria de orina. La incontinencia
urinaria de urgencia (UUI) es uno de los tipos más comunes de UI
conjuntamente con la incontinencia urinaria de estrés (SUI), que
está normalmente provocada por un defecto en el mecanismo de cierre
uretral, UUI está a menudo asociada a trastornos o enfermedades
neurológicos que provocan daños neuronal, tal como demencia,
enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, apoplejía, y diabetes,
aunque también se produce en individuos con tales trastornos. Una
de las causas usuales de UUI es la vejiga hiperactiva (OAB), que es
una afección médica que se refiere a los síntomas de frecuencia y
urgencia derivadas de las contracciones anormales e inestabilidad
del músculo detrusor.
Existen varias medicaciones para la
incontinencia urinaria en el mercado hoy, principalmente para ayudar
al tratamiento de UUI. La terapia para OAB se centra en los
fármacos que afectan a los mecanismos de control neural periféricos
de los que actúan directamente sobre la contracción del músculo liso
del detrusor de la vejiga, con un mayor énfasis en el desarrollo de
agentes anticolinérgicos. Estos agentes pueden inhibir los nervios
parasimpáticos, que controlan el vaciado de la vejiga, o pueden
ejercer un efecto espasmódico directo sobre el músculo detrusor de
la vejiga. Esto da como resultado una disminución de la presión
intravesicular, un incremento en la capacidad, y una reducción en
la frecuencia de la contracción de la vejiga. Los fármacos
anticolinérgicos activos por vía oral, tal como propantelina
(ProBanthine), tolterodina tartrato (Detrol), y oxibutirina
(Ditropan), son los fármacos más comúnmente prescritos. Sin embargo,
sus inconvenientes más serios son los efectos secundarios
inadecuados, tales como boca seca, visiones anormales,
estreñimiento, y alteraciones del sistema nervioso central. Estos
efectos secundarios conducen a un escaso cumplimiento. Los síntomas
de boca seca solos son responsables de un 70% de tasa de no
cumplimiento con oxibutirina. Las fastas de adecuación de las
presentes terapias destacan la necesidad de fármacos novedosos,
eficaces, seguros, disponibles por vía oral que tienen menos efectos
secundarios.
\vskip1.000000\baselineskip
La hiperplasia prostática benigna (BPH) es la
hiperplasia benigna nodular de la glándula de la próstata
periuretral que se observa de manera común en los hombres por
encima de la edad de 50 años. El exceso de crecimiento se produce
en el área central de la llamada la zona de transición, que envuelve
la uretra. La BHP provoca grados variables de obstrucción de la
salida de la vejiga, dando resultado síndromes del tracto urinario
inferior progresivos (LUTS) caracterizados por frecuencia urinaria,
urgencia, y nocturna debida al vaciado incompleto y rellenado
rápido de la vejiga. La causa actual de BHP es desconocida pero
puede implicar alteraciones relacionadas con la edad en el
equilibrio de hormonas sexuales esteroides.
Los antagonistas selectivos del
\alpha1-adrenoceptor, tales como prazosina,
indoramina, y tamsulosina, se usan como un auxiliar en el
tratamiento sintomático de la obstrucción urinaria provocada por
BHP, aunque no afectan a la causa subyacente BPH. En BPH, el
incremento del tono simpatico exacerba el grado de obstrucción de
la uretra mediante la contracción del músculo liso prostático y
uretral. Estos compuestos inhiben la actividad simpático, relajando
por lo tanto el músculo liso del tracto urinario. Se deben
desarrollar para el tratamiento antagonistas \alpha1 y
antagonistas \alpha1 con alta selectividad de tejido para el
músculo liso del tracto urinario inferior que no provoquen efectos
secundarios hipotensivos.
Se han usado fármacos que bloquean dihidrato
esterona para reducir el tamaño de la próstata. Los inhibidores de
la 5\alpha-reductasa tales como finasterida se
prescriben para BPH. Estos agentes inhiben selectivamente la
5\alpha-reductasa que media la conversión de la
testosterona a dihidrotestosterona, reduciendo por lo tanto los
niveles de dihidrotestosterona en plasma y, de este modo, el
desarrollo de la próstata. Los inhibidores de la
5a-reductasa no se unen a los receptores de
andrógeno y no afectan a los niveles de testosterona, ni poseen
efectos secundarios feminizantes.
Los antagonistas de los receptores de andrógenos
se usan para el tratamiento de hiperplasia prostática debida a la
excesiva acción o producción de la testosterona, Están bajo
investigación diversos antagonistas para BPH incluyendo derivados
de clomadiona sin actividad estrogénica, inhibidores de la aromatasa
activos por vía oral, y los análogos de la hormona que libera la
hormona luteinizante (LHRH).
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las enfermedades hepáticas crónicas
provocan el desarrollo de fibrosis en el hígado. La fibrosis es una
respuesta a la curación de herida uniforme programada. Las
enfermedades hepáticas crónicas más importantes son hepatitis B y C
viral y enfermedad hepática inducida por el alcohol. Entre 10 y 30%
de los pacientes afectados desarrollan cirrosis como una
complicación posterior. La cirrosis hepática tiene una tasa de
supervivencia del 50% en cinco años. Las muestres por cirrosis
hepática se produce e una edad promedio de solamente 60 años. Es la
9ª causa mayor de muerte en los Estados Unidos.
El daño o lesión tóxico provocado por las
proteínas foráneas provocan la deposición de la matriz extracelular
tal como colágeno fibronectina y laminina. El mecanismo común es la
activación y transformación de las células estrelladas hepáticas
que almacenan la vitamina A (células Ito) en los miofibroblastos que
producen la matriz. Éstas proliferan y llenan el espacio
extracelular de Disse con la matriz extracelular. Este proceso
contiene las etapas de activación para- y autocrinas, que provocan
que se lleguen a perpetuar, si el proceso de lesión se sostiene
durante un largo período de tiempo. Provoca una desviación
progresivamente lenta, que reduce la barrera de difusión mediante
una pérdida de la fenestración en el endotelio sinusoidal. Esto
colabora a la pérdida de la función. La hipertensión portal con la
frecuente complicación de la hemorragia esofágica.
Causas de muerte.
30% de coma hepático
30% de hemorragia esofágica
30% de carcinoma hepático primario
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden tratar la fibrosis y cirrosis hepática
provocadas por enfermedades degenerativas crónicas del hígado tales
como hepatitis viral, hepatitis alcohólica, hepatitis autoinmunes,
cirrosis biliar primaria, fibrosis quística, hematocromatosis,
enfermedad de Wilso, hepatitis no alcohólica y otras. Otras posibles
indicaciones son esclerosis sistémica, fibrosis pulmonar, fibrosis
pancreática, fibrosis miocárdica, y fibrosis prostática.
La patogénesis de la fibrosis hepática implica
la proliferación alterada y expresión génica de múltiples tipos de
células tales como células estrelladas hepáticas y colangiocito.
Estos cambios provocan alteración del contenido en colágeno y
alteración de la deposición del tejido conectivo, retención de agua,
coleresis, etc. Muchos procesos de interacción ligando - receptor
están implicados en estos cambios. Entre los ligandos están
vasopresina, secretina, péptido intestinal vasoactivo, etc., usando
todas rutas de transducción de señal mediada por el receptor
acoplado a la proteína G. Endotelina, bradiquinina, angiotensinas y
purinas, todas señalización mediante los receptores acoplados a la
proteína G, se ha demostrado que tienen el potencial de modular la
fibrosis quística y sobrevenir complicaciones tales como
hipertensión portal, desregulación cardiovascular y electrolítica.
Se puede asumir que se pueden detectar receptores novedosas de esta
clase. El receptor acoplado a la proteína G es una clase diana
probada para muchos indicadores. Por lo tanto receptores acoplados a
la proteína G novedosa serán buenas dianas para la intervenciójn
terapéutica de fibrosis hepática. Kojima et al., J Hepatol
enero de 2000; 32 (1): 43-50; Pinzani et al.,
Semin Liver Dis 1999; 19 (4): 397-410; Cai et
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septiembre de 1994 Sep; 44_(9): 655-61;
Hidalgo et al., J. Autonom. Pharmacol. 18 (1) (1998):
31-37.
Esta invención además pertenece al uso de
agentes novedosos identificados por los ensayos de selección
descritos anteriormente. De acuerdo con lo anterior, está dentro
del alcance de esta invención usar un compuesto de ensayo
identificado como se ha descrito en el presente documento en un
modelo animal apropiado. Por ejemplo, un agente identificado como
se describe en el presente documento (por ejemplo, un agente
modulador, una molécula de ácido nucleico no codificante, un
anticuerpo específico, ribozima, o una molécula de unión del
polipéptido de GPCR) se puede usar en un modelo animal para
determinar la eficacia, toxicidad, o efectos secundarios de
tratamiento con tal agente. Como alternativa, una gente identificado
como se ha descrito en el presente documento se puede usar en un
modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente.
Además, esta invención pertenece a los usos de agentes novedosos
identificados por los ensayos de selección descritos anteriormente
para los tratamientos como se ha descrito en el presente
documento.
Un reactivo que afecta a la actividad de GPCR se
puede administrar a una célula humana, o bien in vitro o
in vivo, para reducir la actividad de GPCR. El reactivo
preferiblemente se une a un producto de expresión de un gen de GPCR
humano. Si el producto de expresión es una proteína, es reactivo es
preferiblemente un anticuerpo. Para el tratamiento de las células
humanas ex vivo, se puede añadir un anticuerpo a una
preparación de células troncales distintas de las células
embrionarias humanas que se han eliminado del cuerpo. Después las
células se pueden reemplazar en el mismo u otro cuerpo humano, con o
sin propagación clonal, como se conoce en la técnica. En una
realización, el reactivo se administra usando un liposoma.
Preferiblemente, el liposoma es estable en el animal en el que se
ha administrado durante al menos aproximadamente 30 minutos, más
preferiblemente durante al menos aproximadamente 1 hora, e incluso
más preferiblemente durante al menos aproximadamente 24 horas. Un
liposoma comprende una composición lipídica que es capaz de dirigir
yb reactivo, particularmente un polinucleótido, a un sitio
particular en un animal, tal como un ser humano. Preferiblemente, la
composición lipídica del liposoma es capaz de dirigir un órgano
específico de un animal, tal como el pulmón, hígado, bazo, corazón,
cerebro, ganglios linfáticos, y piel.
Un liposoma útil en la presente invención
comprende una composición lipídica que es caapz de condensarse con
la membrana plasmática de la célula dirigida para administrar su
contenido a la célula. Preferiblemente, la eficiencia de la
transfección de un liposoma es aproximadamente 0,5 \mug de ADN por
16 nmole de liposoma administrado a aproximadamente 10^{6}
células, más preferiblemente aproximadamente 1,0 \mug de ADN por
16 nmoles de liposoma administrado a 10^{6} células, e incluso más
preferiblemente aproximadamente 2,0 \mug de ADN por 16 nmol de
liposoma administrado a aproximadamente 10^{6} células.
Preferiblemente, un liposoma está entre aproximadamente 100 y 500
nm, más preferiblemente entre aproximadamente 150 y 450 nm, e
incluso más preferiblemente entre aproximadamente 200 y 400 nm de
diámetro.
Los liposomas adecuados para uso en la presente
invención incluyen los liposomas usados de manera convencional, por
ejemplo, procedimientos de administración génica conocidos por los
expertos en la técnica. Los liposomas más preferidos incluyen
liposomas que tienen una composición lipídica policariónica y/o
liposomas que tienen una estructura central de colesterol conjugada
a polietilen gicol. Opcionalmente, un liposoma comprende un
compuesto capaz de dirigir el liposoma a una célula tumoral, tal
como un ligando de célula tumoral expuesto sobre la superficie
externa del liposoma.
La formación de complejos de un liposoma con un
reactivo tal como un oligonucleótido no codificante o ribozima se
puede logar usando los procedimientos que son convencionales en la
técnica (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
5.705.151). Preferiblemente, entre aproximadamente 0,1 \mug y
aproximadamente 10 \mug de polinucleótido se combina con
aproximadamente 8 nmol de liposomas, más preferiblemente entre
aproximadamente 0,5 \mug y aproximadamente 5 \mug de
polinucleótidos se combinan con aproximadamente 8 nmol de liposomas,
e incluso más preferiblemente aproximadamente 1,0 \mug de
polinucleótidos se combina con aproximadamente 8 nmol de
liposomas.
En otra realización, los anticuerpos se pueden
administrar a tejidos específicos in vivo usando la
administración dirigida mediada por receptor. Las técnicas de
administración de ADN mediada por receptor se enseñan, por ejemplo,
en Findeis et al. Trends in Biotechnol. 11,
202-05 (1993); Chiou et al., GENE
THERAPEUTICS: METHODS y APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J.A.
Wolff, ed.) (1994); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263,
621-24 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem.
269, 542-46 (1994); Zenke et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 87, 3655-59 (1990); Wu et
al., J. Biol. Chem. 266, 338-42 (1991).
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de una dosis terapéuticamente
eficaz está también dentro de la capacidad de los expertos en la
técnica. Una dosis terapéuticamente eficaz a la de la cantidad de
ingrediente eficaz que incrementa o disminuye la actividad de GPCR
con relación a la actividad de GPCR que se produce en la ausencia de
la dosis terapéuticamente eficaz.
Para cualquier compuesto, la dosis
terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente o bien en
ensayos de cultivo celular o en modelos animales, usualmente
ratones, conejos, perros, o cerdos. El modelo animal también se
puede usar para determinar el intervalo de concentración apropiada y
vía de administración. Después tal información se puede usar para
determinar las dosis útiles y vías para la administración a seres
humanos.
Para cualquier compuesto, la dosis
terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente o bien en los
ensayos de cultivo celular o en modelos animales, usualmente
ratones, conejos, perros, o credos. El modelo animal también se
puede usar para determinar el intervalo de concentración apropiado y
vía de administración. Tal información después se puede usar para
determinar las dosis útiles y vías de administración en seres
humanos.
La eficacia y toxicidad terapéutica, por
ejemplo, DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50% de
la población) y la DL_{50} (la dosis letal al 50% de la
población), se puede determinar mediante procedimientos
farmacéuticos convencionales en los cultivos celulares o animales
experimentales. La relación de dosis de toxicidad para los efectos
terapéuticos es en índice terapéutico, y se puede expresar como la
relación DL_{50}/DE_{50}.
Se prefieren las composiciones farmacéuticas que
muestran grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir
de los ensayos de los cultivos de células y estudios animales se
usan en la formulación de un intervalo de la dosificación para uso
humano. La dosificación contenida en tales composiciones es
preferible dentro de un intervalo de concentraciones circulantes
que incluyen la D_{50} con poca o ninguna toxicidad. La
dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma
de dosificación empleada, sensibilidad del paciente, y la vía de
administración.
La dosificación exacta se determinará por el
facultativo, a la luz de los factores relacionados con el sujeto
que requiere tratamiento. La dosificación y administración se
ajustan para proporcionar los niveles suficientes del ingrediente
activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden
tener en cuanta incluyen la gravedad del estado patológico, salud
general del sujeto, edad, peso, y género del sujeto, dieta, tiempo
y frecuencia de administración, combinación(es) de fármacos,
sensibilidades de reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia.
Composiciones farmacéuticas de larga duración se pueden administrar
cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo
de la tasa de semivida y eliminación de la formulación
particular.
Las cantidades de dosificación normales pueden
variar entre 0,1 y 100,000 microgramos, hasta una dosis total de
aproximadamente 1 g, dependiendo de la vía de administración. La
guía para dosificaciones particulares y procedimientos de
administración se proporcionan en la bibliografía y en general están
disponibles para los facultativos en la técnica. Los expertos en la
técnica emplearán diferentes formulaciones para los nucleótidos que
para las proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la
administración de polinucleótidos o polipéptidos serán específicos
para las células, condiciones, localizaciones, particulares etc.
Si el reactivo es un anticuerpo de una sola
cadena, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo se pueden
construir e introducir en una célula o bien ex vivo o in
vivo usando las técnicas bien establecidas que incluyen, pero
no se limitan a, transferencia de ADN mediada por policationes de
transferían, transfección con ácidos nucleicos desnudos o
encapsulados, fusión celular mediada por liposomas, transporte
intracelular de perlas de látex revestidos con ADN, fusión de
protoplastos, infección viral, electroporación "pistola de
genes" y transfección mediada por DEAE o fosfato de calcio.
Las dosificaciones eficaces in vivo de un
anticuerpo están en el intervalo de aproximadamente 5 \mug y
aproximadamente 50 \mug/kg, aproximadamente 50 \mug y
aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 100 \mug y
aproximadamente 500 \mug/kg de peso corporal del paciente, y
aproximadamente 200 y aproximadamente 250 \mug/kg de peso
corporal del paciente. Para la administración de los polinucleótidos
que codifican anticuerpos de una sola cadena, las dosificaciones
eficaces in vivo están en el intervalo de aproximadamente
100 ng y aproximadamente 200 ng, 500 ng y aproximadamente 50 mg,
aproximadamente 1 \mug y aproximadamente 2 mg, aproximadamente 5
\mug y aproximadamente 500 \mug, y aproximadamente 20 \mug y
aproximadamente 100 \mug de ADN.
Si el producto de expresión es ARNm, el reactivo
es preferiblemente un oligonucleótido no codificante o una
ribozima. Los polinucleótidos que expresan oligonucleótidos no
codificantes o ribozimas se pueden introducir en las células
mediante una diversidad de procedimientos, como se ha descrito.
Preferiblemente, un reactivo reduce la expresión
de un gen de GPCR o la actividad de un polipéptido de GPCR mediante
al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más
preferiblemente aproximadamente 75, 90, o 100% con relación a la
ausencia del reactivo. La eficacia del mecanismo elegido para
disminuir el nivel de expresión de un gen de GPCR o la actividad de
un polipéptido de GPCR se puede determinar usando procedimientos
bien conocidos en la técnica, tales como hibridación de las sondas
nucleótidos para el ARNm específico de GPCR, RT-PCR
cuantitativa, detección inmunológica de un polipéptido de GPCR, o
medición de la actividad de GPCR.
En cualquiera de las reivindicaciones descritas
anteriormente, cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la
invención se puede administrar en combinación con otros agentes
terapéuticos adecuados. La selección de los agentes apropiados para
uso en la terapia de la combinación se puede preparar por los
expertos en la técnica, de acuerdo con los principios farmacéuticos
convencionales. La combinación de los agentes terapéuticos puede
actuar de manera sinérgica para efectuar el tratamiento o prevención
de las diversas enfermedades descritas anteriormente. Usando este
planteamiento, se puede ser capaz de lograr eficacia terapéutica con
dosificaciones inferiores de cada agente, reduciendo de esta manera
el potencial para los efectos secundarios adversos.
Cualquiera de los procedimientos terapéuticos
descritos anteriormente se pueden aplicar a cualquier sujeto en
necesidad de tal terapia, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales
como as perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y lo más
preferiblemente, seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los GPCR también se pueden usar en ensayos
diagnósticos para detectar enfermedades y anormalidades o
susceptibilidad a enfermedades y anormalidades relacionadas con la
presencia de mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos que
codifican un GPCR. Tales enfermedades, a modo de ejemplo, están
relacionadas con la transformación de células, tales como tumores y
cánceres, y diversos trastornos cardiovasculares, incluyendo
hipertensión e hipotensión, así como enfermedades que surgen del
flujo de sangre anormal, secreción de aldosterona inducida por
angiotensina, y otro control anormal de fluido y homeostasis de
electrolitos.
Se pueden determinar diferencias entre la
secuencia de ADNc o genómica que codifica un GPCR en los individuos
aquejados pero no en los individuos normales, después la mutación es
probablemente el agente causante de la enfermedad.
La diferencia de secuencias entre un gen de
referencia que tiene mutaciones se pueden revelar mediante el
procedimiento de secuenciación de ADN directa. Además, los segmentos
de ADN clonados se pueden emplear como sondas para detectar los
segmentos específicos de ADN. La sensibilidad de este procedimiento
se potencia en gran medida cuando se combina con PCR. Por ejemplo,
se puede usar un cebador de con un producto de PCR de doble cadena
o una molécula de molde de una sola cadena generada por una PCR
modificada. La determinación de la secuencia se realiza mediante
procedimientos convencionales usando nucleótidos marcados
radiactivamente o mediante procedimientos de secuenciación
automática que usan etiquetas fluorescentes.
Los ensayos genéticos basados en las diferencias
de secuencia de ADN se pueden llevar a cabo mediante la detección
de la alteración en la movilidad electroforética de los fragmentos
de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Las pequeñas
supresiones e inserciones de las secuencias se pueden visualizar,
por ejemplo, mediante electroforesis en gel de alta resolución. Los
fragmentos de ADN de diferentes secuencias se pueden distinguir
sobre geles de gradientes de desnaturalizante en los que las
movilidades de los diferentes fragmentos de ADN se retrasan en el
gel en diferentes posiciones de acuerdo con sus temperaturas de
fusión específica o de fusión parcial (véase, por ejemplo, Myers
et al., Science 230, 1242, 1985). Los cambios de secuencias
en las localizaciones específicas también se pueden revelar mediante
ensayos de protección de nucleasa, tales como ARNasa y protección
S1 o el procedimiento de escisión química (por ejemplo, Cotton et
al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 85, 4397-4401,
1985). De este modo, la detección de una secuencia de ADN específica
se puede realizar mediante procedimientos tales como hibridación,
protección de ARNasa, escisión química, escisión química,
secuenciación de ADN directa o el uso de enzimas de restricción y
transferencia de Western de ADN genómico. Además de los
procedimientos directos tales como electroforesis en gel y
secuenciación de ADN, las mutaciones también se pueden detectar
mediante análisis in situ.
La alteración de los niveles de un GPCR también
se pueden detectar en diversos tejidos. Los ensayos usados para
detectar los niveles de los polipéptidos receptores en una muestra
de tejido, tal como sangre o biopsia de tejidos, derivados de un
huésped son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen
radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de
transferencia de W, y ensayos de ELISA.
Todas las patentes y solicitudes de patente
citadas en esta descripción se incorporan expresamente en el
presente documento por referencia. La descripción anterior en
general describe la presente invención. Un entendimiento más
completo se puede obtener mediante referencia de los ejemplos
específicos que se proporcionan para los propósitos de ilustración
solamente y no se pretende que limiten el alcance de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 se inserta
en el vector de expresión pCEV4 y el polipéptido de tipo receptor
de raíz dorsal del vector de expresión pCEV4 de GPCR obtenido se
transfecta en las células 233 de riñón embrionario humano. Las
células se retiran del matraz de cultivo en 5 ml de Tris HCl, 5 mM
EDTA, pH 7,5, y se lisan mediante sonicación. Los lisados de
células se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos 4ºC. El
sobrenadante se centrifuga a 30,000 x g durante 20 minutos a 4ºC.
El sedimento se suspende en tampón de unión que contiene 50 mM Tris
HCl, 5 mM MgSO_{4}, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,5, suplementado
con 0,1% BSA, 2 mg/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina, y 10
mg/ml de fosforamidon. Las diluciones de suspensión de membrana
óptimas, definidas como la concentración de proteína requerida para
unirse menos del 10% y un radioligando se añaden a placas de
microtitulación de polipropileno de 96 pocillos que contienen
ligando, péptidos no marcados, y tampón de unión hasta un volumen
final de 250 ml.
En los ensayos de saturación de equilibrio, las
preparaciones de membrana se incuban en presencia de concentraciones
crecientes (0,1 nM a 4 nM) de ligando 125I.
Las mezclas de reacción de unión se incuban
durante 1 hora a 30ºC. La reacción se detiene mediante filtración a
través de filtros de GF/B tratados con 0,5% de polietilenimina,
usando un recolector de células. La radiactividad se mide mediante
conteo de centelleo y los datos se analizan mediante un programa de
regresión no lineal computarizado. La unión no específica se define
como la cantidad de radiactividad remanente después de incubación de
la proteína de la membrana en presencia de 100 nM de péptido no
marcado. La concentración de proteína se mide mediante el
procedimiento de Bradford usando reactivo Bio-Rad,
con albúmina sérica bovina como estándar. Se demuestra la actividad
de CPCR de tipo receptor de la raíz dorsal del polipéptido que
comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Células 293 de riñón embrionario humano
transfectadas con un polinucleótido que expresa GOCR humano se
retiran de un matraz de cultivo en 5 ml de Tris HCl, 5 mM EDTA, pH
7,5, y se lisan mediante sonicación. Los lisados de células se
centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se
centrifuga a 30.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El sedimento se
suspende en tampón de unión que contiene 50 mM Tris HCl, 5 mM MgSO4,
1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,5, suplementado con 0,1% de BSA, 2
\mug/ml aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina, y 10 \mug/ml
fosforamidón. Las diluciones de suspensiones de membranas óptimas,
definidas como la concentración de proteína requerida para unirse
menos del 10% del radioligando añadido, se añaden a placas de
microtitulación de polietileno de 96 pocillos que contienen ligando
marcado con ^{125}I o compuesto de ensayo, péptidos no marcados, y
tampón de unión hasta un volumen final de 250 \mul.
En los ensayos de unión de de saturación de
equilibrio, las preparaciones de membrana se incuban en presencia
de concentraciones crecientes (0,1 nM a 4 nM) de ligando marcado con
^{125}I o compuesto de ensayo (actividad específica 2200
Ci/mmol). Las afinidades de unión de los diferentes compuestos de
ensayo se determinan en ensayos de unión de competición de
equilibrio, usando 0,1 nM de péptido ^{125}I en presencia de doce
concentraciones diferentes de cada compuesto de ensayo.
Las mezclas re reacción de unión se incuban
durante una hora a 30ºC. la reacción se detiene mediante filtración
a través de filtros de GF/B tratados con 0,5% de poloietilenimina,
usando un recolector de de células. La radiactividad se mide
mediante recuento de centelleo y los datos se analizan mediante un
programa de regresión no lineal computarizado.
La unión no específica se define como la
cantidad de radiactividad remanente de la proteína de membrana en
presencia de 100 nM de péptido no marcado. La concentración de
proteína se mide mediante el procedimiento de Bradford usando
reactivo Bio-Rad, con albúmina sérica bovina como
estándar. Un compuesto de ensayo que incrementa la radiactividad de
la proteína de membrana en al menos 15% con relación a la
radiactividad de la proteína de membrana que no se incubó con un
compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que se une a un
polipéptido de GPCR humano.
La inhibición de AMPc mediada por receptor se
puede ensayar en las células huésped que expresan GPCR humano. Las
células se siembran en placas de 96 `pocillos y se incuban en
solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS)
suplementada con 10 mM de HEPES, 5 mM de teofilina, 2 \mug/ml de
aprotinina, 0,5 mg/ml leupeptina, y 10 \mug/ml de fosforamidón
durante 20 minutos a 37ºC en 5% CO_{2}. Un compuesto de ensayo y
se incuba durante 10 minutos adicionales a 37ºC. El medio se
aspira, y la reacción se detiene mediante la adición de 100 mM de
HCl. Las placas se almacenan a 4ºC durante 15 minutos. El contenido
de AMPc en la solución de paradese se mide mediante
radioinmunoensayo.
La radiactividad se cuantifica usando un
contador gamma equipado con el software sw reducción de datos. Un
compuesto de ensayo que disminuye la radiactividad del contenido de
un pocillo con relación a la radiactividad del contenido de un
pocillo en la ausencia de los compuestos de ensayo se identifica
como un inhibidor potencial de la formación de AMPc.
La concentración de calcio libre intracelular se
puede medir mediante microespectrofluorometría usando el tinte
indicador fluorescente Fura-2/AM (Bush et
al., J. Neurochem. 57, 562-74, 1991). Las
células transfectadas de manera estable se siembran rn una placa de
cultivo de 35 mm que contiene una de inserción de cubre objetos de
vidrio. Las células se lavan con HBS, se incuban con un compuesto de
ensayo y se cargan con 100 \mul de Fura-2/AM (10
\muM) durante 20-40 minutos. Después de lavar con
HBS para retirar la solución de Fura-2/AM, se
equilibran las células en HBS surante 10-20 minutos.
Después las células se visualizan bajo el objetivo 40 X de un
microscopio Leitz Fluovert FS.
La emisión de fluorescencia se determina a 510
nM, con longitudes de onda de excitación que alternan entre 340 nM
y 380 nM. Los datos de fluorescencia brutos se convierten en
concentraciones de calcio usando de concentración de calcio
convencionales y técnicas de análisis de software. Un compuesto de
ensayo que aumenta la fluorescencia en al menos un 15% con relación
a la fluorescencia en la ausencia de un compuesto de ensayo se
identifica un compuesto que moviliza el calcio intracelular.
Células que expresan de manera estable el ADNc
de GPCR humano se siembran en placas de 96 pocillos y medio de
crecimiento hasta confluencia. El día antes del ensayo, se cambia el
medio de crecimiento a 100 \mul de medio que contiene 1% de suero
y 0,5 \mu Ci de ^{3}H-miinositol. Las placas se
incuban durante toda una noche en un incubador de CO_{2} (5%
CO_{2} a 37ºC). Inmediatamente antes del ensayo, se retira el
medio y se reemplaza por 200 \mul de PBS que contiene 10 mM de
LiCl, y las células se equilibran con el nuevo medio durante 20
minutos. Durante este intervalo, se equilibran también las células
con, antagonista, se añade como una alícuota de 10 \mul de una
solución concentrada 20 veces en PBS.
La acumulación de fosfato de
^{3}H-inositol a partir del metabolismo de
inositol fosfolípido se comienza mediante la adición de 10 \mul
de una solución que contiene un compuesto de ensayo. Al primer
pocillo se añaden 10 \mul de una solución que contiene un
compuesto de ensayo. Al primer pocillo se añaden 10 \mul para
medir la acumulación basal. Se ensayan once concentraciones
diferentes de compuesto de ensayo en los siguientes 11 pocillos de
cada fila de placas. Todos los ensayos se realizan por duplicado
mediante repetición de las mismas adiciones en dos filas de placas
consecutivas.
Las placas se incuban en un incubador de
CO_{2} durante una hora. La reacción se termina mediante la
adición de 15 \mul de 50% v/v de ácido tricloroacético TCA),
seguido de una incubación de 40 minutos a 4ºC. Después de
neutralizar TCA con 40 \mul de 1 M Tris, el contenido de los
pocillos se transfiere a una placa de filtro de Multiscreen HV
(Millipore) que contiene Dowex AG1-X8 (maya de
200-400, forma de formiato). Las plaacs de filtro
se preparan mediante la adición de 200 \mul de suspensión de Dowex
AG1-X8 (50% v/v, agua: resina) a cada pocillo. Las
placas de filtro se conocen en un tubo múltiple a vacío para lavar o
eluir el lecho de resina. Cada pocillo se lava 2 veces con 200
\mul de agua, seguido de 2 x 200 \mul de 5 mM de tetraborato de
sodio/60 mM de formiato de amina.
Los ^{3}H-IP se eluyen en
placas vacías de 96 pocillos con 200 \mul de 1,2 M de formiato de
amonio/0,1 ácido fórmico. El contenido de los pocillos se añade a a
3 ml de cóctel de centelleo, y se determina la radiactividad
mediante conteo de líquido de centelleo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayos de unión convencionales. Los ensayos de
unión se llevan a cabo en un tampón de unión que contiene 50 mM
HEPES, pH 7,4, 0,5% de BSA, y 5 mM de MgCl_{2}. El ensayo
convencional para la unión de radioligando a fragmentos de membrana
que comprende polipéptidos de GPCR se lleva a cabo como sigue en
placas de 96 pocillos (por ejemplo, placas de Dynatech Immulon II
Removawell). Se diluye el radioligando en tampón de union +
PMSF/Baci hasta las cpm deseadas por 50 \mul, después las
alícuotas de 50 \mul se añaden a los pocillos. Para las muestras
de unión no específicas alícuotas de 5 \mul de 40 \muM de
ligando frío se añade también por pocillo. La uniones se inician
mediante la adición de 150 \mul por pocillo de membrana diluidos
hasta la concentración deseada (10-30 \mug de
proteína de membrana/pocillo) en tampón de unión + PMSF/Baci.
Después las placas se cubren con selladores de placa Linbro mylar
(Flow Labs) y se colocan en un Dynatech Microshaker II. Se deja que
la unión proceda a temperatura ambiente durante1-2
horas y se detiene centrifugando la placa durante 15 minutos a
2.000 x g. Se decantan los sobrenadantes, y los sedimentos de
membrana se lavan una vez mediante la adición de 200 \mul de
tampón de unión enfriado con hielo, agitación breve y
recentrifugación. Los pocillos individuales se colocan en tubos de
12 x 75 mm y se cuentan en un contador LKB Gammamaster (78% de
eficacia). La unión específica mediante este procedimiento es
identical a la medida cuando el ligandos libre se retira mediante
filtración rápida (3-5 segundos) y lavando sobre
filtros de fibra de vidrio revestidos con polietilenimina.
También se usan tres variaciones del ensayo de
unión convencional:
- 1.
- Los ensayos de unión de radioligandos competitivos con un intervalo de concentración de ligandos frío frente a ligando marcado con ^{125}I se llevan a cabo como se ha descrito anteriormente con una modificación. Todas las diluciones de ligandos que se ensayan se realizan en 40 X PMSF/Baci hasta una concentración de 40 X de concentración final en el ensayo. Las muestras de péptido (5 \mul cada una) después se añaden por pocillo de microtitulación. Las membranas y radioligandos se diluyen en tampón de unión sin inhibidores de proteasa. El radioligando se añade y se mezcla con ligando frío, y después se inicia la unión mediante la adición de membranas.
- 2.
- La reticulación química del radioligando con el receptor se realiza después de una etapa de unión idéntica al ensayo estándar. Sin embargo la etapa de lavado se realiza con tampón de unión menos BSA para reducir la posibilidad de reticulación no específica de radioligando con BSA. La etapa de reticulación se lleva a cabo como se describe más adelante.
- 3.
- También se llevan a cabo los ensayos de unión a mayor escala para obtener sedimentos de membrana para los estudios sobre la solubilización del complejo receptor: ligando y para la purificación del receptor. Éstos son idénticos a los ensayos convencionales excepto que (a) la unión se lleva a cabo en tubos de polipropileno en volúmenes entre 1-250 ml, (b) concentración de proteína de membrana es siempre 0,5 mg/ml, y (c) para la purificación del receptor, la concentración de BSA en el tampón de unión se reduce hasta 0,25%, y la etapa de lavado se realiza con tampón de unión sin BSA, que reduce la contaminación de BSA del receptor purificado.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de una etapa de unión de radioligando
como se ha descrito anteriormente, se vuelven a suspender los
sedimentos de membrana en 200 \mul por pocillo de placa de
microtitulación de tampón de unión enfriado con hielo sin BSA.
Después se añaden 5 \mul de por posciclo de 4 mM de
N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida
(ANB-NOS, Pierce) en DMSO y se mezclan. Las
muestras se mantienen en hielo y se irradian con UV durante 10
minutos con una lámpara Mineralight R-52G (UVP Inc.,
San Gabriel, Calif.) a una distancia 5 de -10 cm. Después las
muestras se transfieren a tubos de microcentrifucación Eppendorf,
las membranas sedimentadas por centrifugación, se retiran los
sobrenadantes ¡, y se solubilizan las membranas en muestra de
tampón de muestra Laemmli SDS para electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE). PAGE se lleva a cabo como se describe más
adelante. Las proteínas radiomarcaads s visualizan mediante
autorradiografía sobre los ges secos con película Kodak XAR y
DuPont tamices de intensificados de imágenes Du pont.
La solubilización de membranas se lleva a cabo
en tampón que contiene 25 mM Tris, pH 8, 10% glicerol (p/v) y 0,2
mM de CaCl_{2} (tampón de solubilización). Los detergentes
altamente solubles incluyen Triton X-100,
desoxicolato, desoxicolato:lisolecitina, CHAPS, y agentes dipolares
se preparan en tapón de solubilización a concentraciones del 10% y
se almacenan como alícuotas congeladas. La lisolecitina se prepara
reciente debido a la insolubilidad después de la
congelación-descongelación y la digitonina se
prepara reciente a concentraciones inferiores debido a su
solubilidad más limitada.
Para solubilizar las membranas, los sedimentos
lavados después de la etapa de unión se vuelven a suspender sin
partículas visibles mediante pipeteado y agitación en aparato Vortex
en tampón de solubilización a 100.000 x g durante 30 minutos. Los
sobrenadantes se retiran y se mantienen sobre hielo y los gránulos
se eliminan.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la unión de los ^{125}I y
solubilización de las membranas con detergente, el complejo intacto
de R : L se puede ensayar cuatro procedimientos diferentes. Todos se
llevan a cabo en hielo o en una habitación fría a
4-10ºC.).
1. Cromatografía en columna (Knuhtsen et
al., Biochem. J. 254, 641-647, 1988). Columnas
de Sephadex G-50 (8 x 250 mm) se equilibrant con
tampón de solubilización que contiene detergente a la concentración
usada para solubilizar las membranas y 1 mg/ml de albúmina sérica
bovina. Las muestras de membranas solubilizadas
(0,2-0,5 ml) se aplican a las columnas y se eluyen a
un caudal de aproximadamente 0,7 ml/minuto. Se recogen las muestras
(0,18 ml). Se determina la radiactividad en un contados gamma. Los
volúmenes nulos de las columnas se determinan mediante el volumen
de elución de dextrano azul. La radiactividad que eluye en el
volumen nulo se considera unido a proteína. La radiactividad que
eluye más tarde, al mismo volumen que los ^{125}I libres, se
considera no unido.
2. Precipitación con polietilenglicol
(Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,
318-322, 1972). Para una muestra de 100 \mul de
membranas solubilizadas en un tubo de polipropileno de 12 x 75 mm,
se añaden 0,5 ml de 1% (p/v) de globulina gamma bovina (Sigma) en
0,1 M tampón de fosfato de sodio, seguido de 0,5 ml de 25% (p/v) de
polietilenglicol (Sigma) y se mezcla. La mezcla se mantiene en hielo
durante 15 minutos. Después se añaden por muestra 3 ml de 0,1 M de
fosfato de sodio, pH 7,4,. Las muestras se filtran rápidamente
(1-3 segundos) se filtran sobre filtros de fibra de
vidrio Whatman GF/B y se lavan con 4 ml del tampón fosfato. El
complejo receptor precipitado por PEG: ligando de ^{125}I se
determina mediante conteo gamma de los filtros.
3. La union de filtro GFB/PEI (Bruns et
al., Analytical Biochem. 132, 74-81, 1983). Los
filtros de fibra de vidrio Whatman GF/B se sumergen en 0,3% de
polietilenimina (PEI, Sigma) durante 3 horas. Las muestras de las
membranas solubilizadas (25-100 \mul) se
reemplazan en tubos de polipropileno de 12 x 75 mm. Después se
añaden por muestra 4 ml de tampón de solubilización sin detergente y
las muestras se filtran inmediatamente a través de los filtros
GFB/PEI (1-3 segundos) y y se lavan con 4 ml de
tampón de solubilización. Las CPM del complejo receptor: ligandos
^{125}I adsorbido a los filtros se determinan mediante conteo
gamma.
4. Carbón/Dextrano (Paul y Said, Peptides 7
[Supl. 1], 147-149, 1986). Dextrano T70 (0,5 g,
Pharmacia) se disuelve en 1 litro de agua, después se añaden 5 g de
carbón actibado (Norit A, alcalino; Fisher Scientific). La
suspensión se agita durante 10 minutos a temperatura ambiente y
después se almacena a 4ºC. hasta uso. Para medir el complejo R:L, 4
partes por volumen se suspensión de carbón/dextrano se añaden a 1
parte por volumen de membrana solubilizada. Las muestras se mezclan
y se almacenan durante 2 minutos y después se centrifugan durante 2
minutos a 11.000 x g en un tubo de microcentrífuga Beckman. El
radioligando libre se adsorbe en carbón/dextrano y se desecha con
el sedimento.
Los complejos de receptor: ligandos ^{125}I permanecen en el sobrenadante y se determinan mediante conteo gamma.
Los complejos de receptor: ligandos ^{125}I permanecen en el sobrenadante y se determinan mediante conteo gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
La unión del receptor de biotinilo a las
membranas GH4 Cl se lleva a cabo como se ha descrito anteriormente.
Las incubaciones son durante 1 hora a temperatura ambiente. En el
protocolo de purificación convencional, las incubaciones de unión
contienen 10 nM de Bio-S29. Se añade el ligando
^{125}I como un trazador a niveles de
5.000-100.000 cpm por mg de proteína de membrana.
Las incubaciones de control contienen 10 \muM de ligando frío para
saturar el receptor con ligando no biotinilado.
La solubilización del complejo receptor:ligando
también se lleva a cabo como se ha descrito anteriormente, con
0,15% de desoxicolato: lisolecitina en tampón de solubilización que
contiene 0,2 mM de MgCl_{2}, obteniendo sobrenadantes de 100.000 x
g que contenían el complejo R:L.
La estreptavidina inmovilizada (estreptavidina
reticulada a 6% de perlas de agarose, Pierce Chemical Co.;
"SA-agarosa") se lava en tampón de
solubilización y se añade a las membranas solubilizadas como 1/30
del volumen final. Esta mezcla se incuba con agitación constante
mediante rotación por volteo durante 4-5 horas a
4-10ºC. Después la mezcla se aplica a una columna y
el material no unido se lava a su través. La unión de radioligando
a SA-agarosa se determina comparando las cpm en el
sobrenadante de 100.000 x g con la del efluente de columna después
de la adsorción a SA-agarosa. Finalmente, la columna
se lava con 12-15 volúmenes de columna de tampón de
solubilización + 0,15% desoxicolato:lisolecitina +1/500 (vol/vol)
100 x 4pasa.
La columna de la estreptavidina se eluye con
tampón de solubilización +0,1 mM EDTA+0,1 mM EGTA+O.L mM
GTP-gamma-S (Sigma) + 0,15% (p/vol)
desoxicolato:lisolecitina +1/1000 (vol/vol) 100.veces.4pasa.
Primero, un volumen de columna de tampón de elución se pasa a
través de la columna y se detiene el flujo durante
20-30 minutos. Después 3-4 más
volúmenes de columna de tampón de elución se pasan a su través. Se
combinan todos los eluatos.
Los eluatos de la columna de estreptavidina se
incuban durante toda una noche (12-15 horas) con
aglutinina de germen de trigo inmovilizado (WGA agarosa, Labs
Vector) para adsorber el receptor mediante de carbohidrato unido de
manera covalente con lecitina WGA. La relación (vol/vol) de agarosa
de WGA a eluato de columna de estreptavidina es generalmente 1:400.
Un intervalo entre 1:1000 a 1:200 también se puede usar. Después de
la etapa de conservación, la resina se sedimenta mediante
centrifugación, el sobrenadante se retira y se guarda, y después la
resina se lava 3 veces (aproximadamente 2 minutos cada una) en
tampón que contiene 50 mM HEPES, pH 8, 5 mM MgCl_{2}, y 0,15%
desoxicolato:lisolecitina. Para eluir el receptor unido a WGA, la
resina se extrae mediante mezcla repetida (mezclador Vortex a baja
velocidad) durante un período de 15-30 minutos en
hielo, con 3 columnas de resina cada vez, de 10 mM
N-N'-N''-triacetilquitotriosa
en el mismo tampón de HEPES usado para lavar la resina. Después de
la etapa de elución, se centrifuga la resina y el sobrenadante se
retira cuidadosamente, sin sedimentos de
WGA-agarosa. Los tres eluatos combinados contienen
el receptor final, purificado. El material no unido a WGA contienen
subunidades de proteína G eluidas específicamente de la columna de
estreptavidina, así como contaminantes no específicas. Todas estas
fracciones se almacenan congeladas a -90ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos de GPCR pruricados que
comprenden una proteína
glutatión-S-transferasa y absorbidos
en pocillos derivatizados de glutatión de placas de microtitulación
de 96 pocillos se ponen en contacto con los compuestos de ensayo a
partir de una genoteca de moléculas pequeñas a pH 7,0 en una
solución de tampón fisiológico. Los polipéptidos de GPCR comprenden
una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. Los
compuestos de ensayo comprenden una etiqueta fluorescente. Las
muestras se incuban durante 5 minutos a una hora. Las muestras de
control se incuban en la ausencia de un compuesto de ensayo.
La solución de tampón que contiene los
compuestos de ensayo se lava de los pocillos. La unión de un
compuesto de ensayo a un polipéptido de GPCR se detecta mediante
mediciones de fluorescencia del contenido de los pocillos. Un
compuesto de ensayo que incrementa la fluorescencia en un pocillo en
al menos 15% con relación a la fluorescencia de un pocillo en el
que un compuesto de ensayo no incubado se identifica como un
compuesto que se une a un polipéptido de GPCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Un compuesto de ensayo se administra a un
cultivo de células gástricas humanas y se incuban a 37ºC durante 10
a 45 minutos. Un cultivo del mismo tipo de células incubado durante
el mismo tiempo sin el compuesto de ensayo proporciona un control
negativo.
Se aísla en ARN de los dos cultivos como se ha
descrito en Chirgwin et al., Biochem. 18,
5294-99, 1979). Se preparan transferencia de
Northern usando 20 a 30 \mug de ARN total y se hibridan con una
sonda específica de GPCR marcada con ^{32}P a 65ºC en
Express-hyb (CLONTECH). La sonda comprende al menos
11 nucleótidos compuestos seleccionados entre el complemento de la
SEQ ID NO: 1. Un compuesto de ensayo que disminuye la señal
específica de GPCR con relación a la señal obtenida en la ausencia
del compuesto de ensayo se identifica como un inhibidor de la
expresión del gen de GPCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfieren las células de manera estable con
el receptor relevante y con una construcción de luciferasa de CRE
inducible. Las células se desarrollan en 50% de medio de Eagle
modificado de Dulbecco/50% de F12 (DMEM/F12) suplementado con 10%
de FBS, a 37ºC en una atmósfera humidificada con 10% de CO_{2} y
se dividen de manera rutinaria a una relación de 1:10 cada 2 ó 3
días. Los cultivos de ensayo se siembran en placas de 384 pocillos
a una densidad apropiada (por ejemplo, 2000 células/pocillo en 35
\mul de medio de cultivo celular) en DMEM/F12 con FBS, y se hacen
crecer durante 48 horas (intervalo: \sim 24-60
horas, dependiendo de la línea celular). El medio de crecimiento
después se cambia con medio sin suero (SFM; por ejemplo,
Ultra-CHO), que contiene 0,1% de BSA. Los compuestos
de ensayo disueltos en DMSO se diluyen en SFM y se transfieren a
los cultivos de ensayo (concentración final máxima 10 \mumolar),
seguido de la adición de forskolina (\sim 1 \mumolar,
concentración final.) en SFM + 0,1% BSA 10 minutos más tarde. En el
caso de la selección de antagonistas se añaden tanto, una
concentración apropiada de agonista como de forskolina. Las placas
se incuban a 37ºC en 10% de CO_{2} durante 3 horas. Después se
retira el sobrenadante, se lisan las células con reactivo de lisis
(25 mmolar de tampón fosfato, pH 7,8, que contiene 2 mmolar de DDT,
10% de glicerol y 3% de Triton X100). La reacción de luciferasa se
comienza mediante la adición de tampón de sustrato (por ejemplo,
reactivo de ensayo de luciferasa, Promega) y luminiscencia se
determina inmediatamente (por ejemplo, luminómetro Berthold o
sistema de cámara Hamamatzu).
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectan de manera estable con el receptor
relevante y con una construcción de luciferasa de CRE inducible. Se
hacen crecer las células en 50% de medio de Eagle modificada por
Dulbecco/50% de F12 (DMEM/F12) suplementado con 10% de FBS, a 37ºC
en una atmósfera humidificada con 10% de CO_{2} y se dividen de
manera rutinaria a una relación de 1:10 cada 2 ó 3 días. Los
cultivos de ensayo se siembran en placas de 384 pocillos a una
densidad apropiada (por ejemplo, 1000 ó 2000 células/pocillo en 35
\mul de medio de cultivo celular) en DMEM/F12 con FBS, y se hacen
crecer durante 48 horas (intervalo: \sim 24-60
horas, dependiendo de la línea celular). El ensayo se comienza
mediante la adición de los compuestos de ensayo en medio sin (SFM;
por ejemplo, Ultra-CHO), que contiene 0,1% de BSA.
Los compuestos de ensayo disueltos en DMSO se diluyen en SFM y se
transfieren a los cultivos de ensayo (concentración final máxima 10
\mumolar, DMSO concentración < 0,6%). En el caso de la
selección de antagonistas se añade una concentración apropiada
durante 5-10 minutos más tarde. Las placas se
incuban a 37ºC en 10% de CO_{2} durante 3 horas. Después se lisan
las células 10 \mul de reactivo de lisis por pocillo (25 mmolar
de tampón fosfato, pH 7,8, que contiene 2 mmolar de DDT, 10% de
glicerol y 3% de Triton X100) y la reacción de luciferasa se
comienza mediante la adición de tampón de 20 \mul de tampón de
sustrato (por ejemplo, reactivo de ensayo de luciferasa, Promega).
La medición de
luminiscencia se comienza inmediatamente (por ejemplo, luminómetro Berthold o sistema de cámara Hamamatzu).
luminiscencia se comienza inmediatamente (por ejemplo, luminómetro Berthold o sistema de cámara Hamamatzu).
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfieren de manera estable células con el
receptor relevante. Las células que expresan la proteína del
receptor funcional se hacen crecer en 50% de medio de Eagle
modificada por Dulbecco/50% de F12 (DMEM/F12) suplementado con 10%
de FBS, a 37ºC en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2} y se
dividen de manera rutinaria a una relación dependiente de la línea
celular cada 3 ó 4 días. Los cultivos de ensayo se siembran en
placas de 384 pocillos a una densidad apropiada (por ejemplo, 2000
células/pocillo en 35 \mul de medio de cultivo celular) en
DMEM/F12 con FBS, y se hacen crecer durante 48 horas (intervalo:
\sim 24-60 horas, dependiendo de la línea
celular). El medio de crecimiento después se cambia con solución
salina fisiológica (por ejemplo, solución de Tyrode). Los
compuestos de ensayo disueltos en DMSO se diluyen en solución de
Tyrode que contiene 0,1% de BSA y se transpiren a los cultivos de
de ensayo (concentración final máxima 10 \mumolar). Después de la
adición del agonista específico del receptor el incremento del
calcio intracelular mediado por Gp resultante se mide usando
sistemas de lectura apropiados (por ejemplo, tintes sensibles a
calcio).
\vskip1.000000\baselineskip
Este ensayo no tumoral mide la capacidad de un
compuesto de reducir o bien el nivel endógeno de una hormona
circulante o el nivel de la hormona producida en respuesta a un
estímulo biológico. A los roedores se les administra compuesto de
ensayo (p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c.). A un tiempo predeterminado
después de la administración del compuesto de ensayo, se recoge
plasma de sangre. Se ensaya el plasma para determinar los niveles
en plasma de la hormona de interés. Si los niveles circulantes de la
hormona son demasiado bajos y/o variables proporcionan resultados
consistentes, el nivel de la hormona se puede elevar mediante un
pretratamiento con un estímulo biológico (es decir, LHRH se puede
inyectar i.m. en ratones a una dosificación de 30 ng/ratón para
inducir una explosión de la síntesis de testosterona). La
programación de la recogida de plasma se debería ajustar para que
coincidiera con el máximo de la respuesta de la hormona inducida.
Los efectos del compuesto se comparan con un grupo de control
tratado con vehículo. Se realiza un ensayo F para determinar si la
varianza es igual o desigual seguido de un ensayo de la t de
Student. La significación es un valor de p \leq 0,05 comparado
con el grupo de control del vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon fibras huecas con la(s)
línea(s) celulares y se implantaron por vía intraperitoneal
y/o por vía subcutánea en roedores. Los compuestos se administran
p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. Las fibras se recogen de acuerdo con
el protocolo de ensayo de lectura, se pueden incluir ensayos para la
expresión génica (bADN, PCR, o Taqman), o una actividad bioquímica
específica (es decir, niveles de AMPcLos resultados se analizan
mediante el ensayo de t de Student o ensayo después la varianza
entre grupos, se compara mediante el ensayo F con significación a p
\leq 0,05 cuando se compara con el grupo de control del
vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Éste es otro ensayo no tumoral que mide la
capacidad de un compuesto de reducir la masa de de un tejido
dependiente de la hormona (es decir, vesículas seminales en machos y
útero en hembras). Se administra a los roedores compuesto de ensayo
(p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c.) de acuerdo con un programa
predeterminado y durante una duración predeterminada (es decir, 1
semana). A la terminación del estudio, se pesan los animales, se
escinde el órgano diana, cualquier fluido se expresa, y se registra
el peso del órgano. También se puede recoger plasma de sangre. El
plasma se puede ensayar para determinar los niveles de una hormona
de interés o para los niveles del agente de ensayo. Los pesos de
los órganos se pueden directamente comparar o se pueden normalizar
para el peso corporal del animal. Los efectos de los compuestos se
comparan con un grupo de control tratado con vehículo. Se realiza
un ensayo F para determinar si la varianza es igual o diferente
seguido de un ensayo de Student. La significación es el valor de p
\leq 0,05 comparado con el grupo de control del vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan fibras huecas con al línea(s)
celular(s) deseada(s) y se implantan por vía
intraperitoneal y/o subcutánea en roedores. Los compuestos se
administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. Se recogen las fibras de
acuerdo con el protocolo de ensayo de lectura específico. Se
determina la proliferación de células mediante la medida de un
marcador de número de células (es decir, MTT o LDH). El número de
células y cambio en el número de células del inóculo de partida se
analizan mediante el ensayo de t de Student o ensayo de Rank Sum
después la varianza entre grupos se compara mediante un ensayo de F,
con significación a p \leq 0,05 comparado con el grupo de control
de vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Gránulos de Hidron con o sin factores de
crecimiento o células se implantan en un microbolsillo creado
quirúrgicamente en córnea de roedores. La administración de
compuesto puede ser sistémica o local (compuesto mezclado con
factores de crecimiento en el sedimento de hidron). Se recogen las
corneas a los 7 días después del implante inmediatamente después de
la infusión intracardíaca de carbono coloidal y se fijan en 10% de
formalina. La lectura es de puntuación y/o análisis de imagen
cualitativa. Las puntuaciones cualitativas se comparan mediante el
ensayo de Rank Sum. Los datos de análisis de imágenes se evalúan
mediante la medición del área de neovascularización (en pixels) y
los promedios de los grupos se comparan mediante el ensayo de t de
Student (2 colas). La significación es p \leq 0,05 cuando se
compara con el grupo de factor de crecimiento o células
solamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Matrigel, que contiene células o factores de
crecimiento, se inyecta de manera simultánea por vía subcutánea.
Los compuestos se administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. se
recogen obturadores de matrigel en un(os) momento(s)
y se preparan para lectura. La lectura es un ensayo basado en ELISA
para la concentración de hemoglobina y/o examen histológico (es
decir, recuento de recipiente, tinción especial para los marcadores
de superficie endotelial: CD31, factor-8). Se
analizan las lecturas mediante ensayo de t de Student, después la
varianza entre los grupos se compara mediante ensayo de F, con una
significación determinada a p \leq 0,05 cuando se compara con el
grupo de control de vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células o fragmentos tumorales se implantan
por vía subcutánea el día 0. El vehículo y/o compuestos se
administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con el
programa determinado comenzando en un momento, usualmente el día 1,
antes de la posibilidad d medir la carga tumoral. Se registran los
pesos corporales y mediciones de tumores 2-3 veces
cada semana. Los pesos medios de cuerpo y tumor netos se calculan
para cada día de recogida de datos. La eficacia antitumoral se
puede determinar inicialmente comparando el tamaño de tumores
tratados (T) y control© un día dado mediante un ensayo de t de
Student, después la varianza entre grupos se compara mediante un
ensayo F, con significación determinada a p \leq 0,05. El
experimento también se puede continuar pasado el fin de la
dosificación en cuyo caso las mediciones de tumor continuarían
registrándose para controlar el retraso del crecimiento de tumor.
Los retrasos del crecimiento del tumor se expresan como la
diferencia en el tiempo medio para los grupos tratados y de control
para alcanzar un tamaño predeterminado dividido por el tiempo medio
para el grupo de control para alcanzar el tamaño. Los retrasos de
crecimiento se comparan mediante la generación de las curvas
Kaplan-Meier a partir de los tiempos para que los
tumores individuales alcancen el tamaño de evaluación. La
significación es p \leq 0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectan células tumorales por vía
intraperitoneal o por vía intracranial el día 0. Se administran los
compuestos p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con el programa
predeterminado comenzando el día 1. Se registran las observaciones
de morbilidad y/o mortalidad dos veces al día. Los datos de
morbilidad/mortalidad se expresan en términos del tiempo medio de
supervivencia y el número de supervivientes a largo plazo se indica
de manera separada. Los tiempos de supervivencia se usan para las
curvas de Kaplan-Meier. La significación es p
\leq 0,05 mediante un ensayo de grado logarítmico comparado con el
grupo control en el experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se implantan células o fragmentos tumorales por
vía subcutánea y se hacen crecer hasta el tamaño deseado para el
tratamiento que se va a comenzar. Una vez que intervalo de tamaño se
ha determinado, los ratones se distribuyen al azar en los grupos de
tratamiento. Los compuestos se administran p.o., i.p., i.v., i.m., o
s.c. de acuerdo con un programa predeterminado. Se miden los pesos
de tumor y de cuerpo y se registran 2-3 veces a la
semana. Los pesos medios de tumores de todos los grupos durante los
días después de la inoculación se representan gráficamente para
comparación. Se realiza un ensayo F para determinar si la varianza
es igual o diferente seguido de un ensayo de t de Student para
comparar los tamaños de tumores en los grupos tratados y de control
al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 cuando
se compara con el grupo de control. Las mediciones de tumores se
pueden registrar después de que la dosificación se haya parado para
controlar el retraso del crecimiento de tumor. Los retrasos de
crecimiento de tumor se expresan como la diferencia en el tiempo
medio para que los grupos tratados y de control alcancen un tamaño
predeterminado dividido por el tiempo medio para que el grupo de
control alcance ese tamaño. Los retrasos de crecimiento se comparan
mediante la generación de las curvas Kaplan-Meier a
partir de los tiempos para que los tumores individuales alcancen el
tamaño de evaluación. La significación es valor de p \leq 0,05
comparado con el grupo de control de vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se implantan directamente células o fragmentos
tumorales, de origen de adenocarcinoma mamario, en una almohadilla
de grasa mamaria expuesta y reflejada quirúrgicamente en roedores.
La almohadilla de grasa se vuelve a colocar en su posición original
y el sitio quirúrgico se cierra. También se pueden administrar
hormonas a los roedores para apoyar el crecimiento de los tumores.
Los compuestos se administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de
acuerdo con un programa predeterminado. Se miden los pesos de tumor
y cuerpo y se registran 2-3 veces a la semana. Los
pesos medios de tumores de todos los grupos durante los días después
de la inoculación se representan gráficamente para comparación. Se
realiza un ensayo F para determinar si la varianza es igual o
diferente seguido de un ensayo de t de Student para comparar los
tamaños de tumor en los grupos tratados y de control al final del
tratamiento. La significación es p \leq 0,05 cuando se compara con
el grupo de control.
Las mediciones de tumores se pueden registrar
después de que se haya parado la dosificación para control del
retraso de crecimiento tumoral. Los retrasos del crecimiento tumoral
se expresan como la diferencia en el tiempo medio para los grupos
tratados y de control para lograr un tamaño predeterminado dividido
por el tiempo medio para que el grupo de control alcance ese
tamaño. Los retrasos de crecimiento se comparan mediante generación
de las curvas Kaplan-Meier a partir de los tiempos
para que los tumores individuales alcancen el tamaño de evaluación.
La significación es valor de p \leq 0.,05 comparado con el grupo
de control del vehículo. Además, este modelo proporciona una
oportunidad para incrementar la velocidad de metástasis espontánea
de este tipo de tumor. La metástasis se puede determinar a la
terminación del estudio mediante recuento del número de focos
visibles por órgano diana, o midiendo el peso del órgano diana. Los
medios de estos puntos finales se comparan mediante el ensayo de t
de Student después de llevar
a cabo un ensato F, con la significación determinada a p \leq 0,05 comparado con el grupo del experimento de control.
a cabo un ensato F, con la significación determinada a p \leq 0,05 comparado con el grupo del experimento de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se implantan directamente células o fragmentos
tumorales, de adenocarcinoma prostático en un lóbulo dorsal de la
próstata en roedores. La próstata se hace externo mediante una
incisión abdominal de manera que el tumor se pueda implantar de
manera específica en el lóbulo dorsal mientras se verifica que el
implante no entra en las vesículas seminales. La próstata inoculada
con éxito se reemplaza en el abdomen y se cierra la incisión a
través del abdomen y la piel. vuelve a colocar en su posición
original y el sitio quirúrgico se cierra. Los compuestos se
administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con un
programa predeterminado. Se miden los pesos de tumor y cuerpo y se
registran 2-3 veces a la semana. En un momento
predeterminado, el experimento terminó y se diseccionó el animal.
El tamaño del tumor primario se mide en tres dimensiones usando o
bien un calibre o un micrómetro ocular unido a un campo de
disección. Se realiza un ensayo F para determinar si la varianza es
igual o diferente seguido de un ensayo de t de Student para comparar
los tamaños de tumor en los grupos tratados y de control al final
del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 cuando se
compara con el grupo de control. Este modelo proporciona una
oportunidad para incrementar la velocidad de metástasis espontánea
de este tipo de tumor. La metástasis se puede determinar a la
terminación del estudio mediante recuento del número de focos
visibles por órgano diana, (es decir, los pulmones), o midiendo el
peso del órgano diana (es decir, los ganglios linfáticos
regionales). Las medias de estos puntos finales se comparan
mediante ensayo de t de Student después de llevar a cabo un ensato
F, con la significación determinada a p \leq 0,05 comparado con el
grupo en el experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden implantar células tumorales de origen
pulmonar por vía intrabronquial realizando una incisión a través de
la piel y exposición de la tráquea. La tráquea se perfora con el
extremo biselado de una aguja de 25 de calibre y las células
tumorales se inoculan en el bronquio principal usando una aguja de
calibre 27 con borde plano con una curvatura de 90º. Los compuestos
se administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con un
programa predeterminado. Se miden los pesos de tumor y cuerpo y se
registran 2-3 veces a la semana. En un momento
predeterminado, el experimento terminó y se diseccionó el animal. El
tamaño del tumor primario se mide en tres dimensiones usando o bien
un calibre o un micrómetro ocular unido a un campo de disección. Se
realiza un ensayo F para determinar si la varianza es igual o
diferente seguido de un ensayo de t de Student para comparar los
tamaños de tumor en los grupos tratados y de control al final del
tratamiento. La significación es p \leq 0,05 cuando se compara
con el grupo de control. Este modelo proporciona una oportunidad
para incrementar la velocidad de metástasis espontánea de este tipo
de tumor. La metástasis se puede determinar a la terminación del
estudio mediante recuento del número de focos visibles por órgano
diana, (es decir, el pulmón contralateral), o midiendo el peso del
órgano diana. Las medias de estos puntos finales se comparan
mediante ensayo de t de Student después de llevar a cabo un ensato
F, con la significación determinada a p \leq 0,05 comparado con el
grupo en el experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden implantar células tumorales de origen
gastrointestinal por vía intratecal realizando una incisión
abdominal a través de la piel y externalización del intestino. Se
inoculan células tumorales en la pared cecal sin penetración del
lumen del intestino usando una aguja de calibre 27 ó 30. Los
compuestos se administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo
con un programa predeterminado. Se miden los pesos de tumor y cuerpo
y se registran 2-3 veces a la semana. En un momento
predeterminado, el experimento terminó y se diseccionó el animal.
El tamaño del tumor primario se mide en tres dimensiones usando o
bien un calibre o un micrómetro ocular unido a un campo de
disección. Se realiza un ensayo F para determinar si la varianza es
igual o diferente seguido de un ensayo de t de Student para
comparar los tamaños de tumor en los grupos tratados y de control
al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 cuando
se compara con el grupo de control. Este modelo proporciona una
oportunidad para incrementar la velocidad de metástasis espontánea
de este tipo de tumor. La metástasis se puede determinar a la
terminación del estudio mediante recuento del número de focos
visibles por órgano diana, (es decir, el hígado), o midiendo el peso
del órgano diana. Las medias de estos puntos finales se comparan
mediante ensayo de t de Student después de llevar a cabo un ensato
F, con la significación determinada a p \leq 0,05 comparado con el
grupo en el experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculan células tumorales s.c. y se deja que
los tumores se desarrollen hasta un intervalo predeterminado para
los estudios de metástasis espontáneos para el pulmón o hígado.
Después estos tumores primarios se escinden. Los compuestos se
administran p.o., i.p., i.v., i.m., o s.c. de acuerdo con un
programa predeterminado que puede incluir el período que conduce a
la escisión del tumor primario para evaluar las terapias dirigidas
a la inhibición de las fases tempranas de la metástasis de tumores.
Las observaciones se morbilidad y/o se registran diariamente. Los
pesos corporales se miden y y se registran dos veces a la semana.
Los puntos finales potenciales incluyen tiempo de supervivencia,
números de focos visibles por órgano diana, o peso de órgano diana.
Cuando el tiempo de supervivencia se usa como el punto final los
otros valores no están determinados. Los datos supervivencia se
usan para generar curvas de Kaplan-Meier. La
significación es p \leq 0,05 mediante un ensayo de grado
logarítmico comparado con el grupo control en el experimento. El
número medio de focos de tumores visibles, como se determina en un
microscopio de disección, y los pesos medios de los órganos diana
se comparan mediante ensayo de t de Student después de llevar a cabo
un ensayo F, con una significación determinada a p \leq 0,05
comparado con el grupo de control en el experimento para ambos de
estos puntos finales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectan células tumorales en la vena de la
cola, o el ventrículo izquierdo del corazón en los estudios de
metástasis experimentales (forzados) de pulmón, hígado, y de hueso,
respectivamente. Los compuestos se administran p.o., i.p., i.v.,
i.m., o s.c. de acuerdo con un programa predeterminado. Las
observaciones de morbilidad y/o mortalidad se registran en base
diaria. Se miden los pesos corporales y se registran dos veces a la
semana. Los puntos finales potenciales incluyen tiempo de
supervivencia, número de focos visibles por órgano diana, o peso de
órgano diana. Cuando el tiempo de supervivencia se usa como el punto
final de los otros valores no están determinados. Los datos
supervivencia se usan para generar curvas de
Kaplan-Meier. La significación es p \leq 0,05
mediante un ensayo de grado logarítmico comparado con el grupo
control en el experimento. El número medio de focos de tumores
visibles, como se determina en un microscopio de disección, y los
pesos medios de los órganos diana se comparan mediante ensayo de t
de Student después de llevar a cabo un ensayo F, con una
significación determinada a p \leq 0,05 comparado con el grupo de
control en el experimento para ambos de estos puntos finales.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular usada para ensayar es la línea
celular HCT116 de cáncer de colon humano. Se cultivan las células
en RPMI-1640 con 10-15% de suero de
ternera fetal a una concentración de 10.000 células por mililitro
en un volumen de 0,5 ml y se mantiene a 37ºC en una atmósfera de 95%
de aire/5% de CO_{2}.
Los oligoribonucleótidos de fosforotioatos se
sintetizan en un sintetizador de ADN Biosystems Model 380B usando
química de fosforoamidita. Una secuencia de 24 bases complementarias
a los nucleótidos en la posición 1 a 24 de SEQ ID NO: 1 se usa como
el oligonucleótido de ensayo. Como control, se usa otra secuencia
(aleatoria): 5'-TCA ACT GAC TAG ATG TAC ATG
GAC-3'. Después del ensamblaje y desprotección, los
oligonucleótidos se precipitan dos veces con etanol, se secan, y se
suspenden en solución salina tamponada con fosfato a la
concentración deseada. Se ensaya la pureza de los oligonucleótidos
es mediante electroforesis en gel de sílice y HPLC de intercambio
iónico. Los oligonucleótidos purificados se añaden al medio de
cultivo a una concentración de 10 \muM una vez al día durante
siete días.
La adición del oligonucleótido de ensayo durante
siete días da como resultado una reducción en la expresión
significativa de GPCR humano como se determina mediante
transferencia de Western. Este efecto no se observa con el
oligonucleótido de control. Después de 3 a 7 días, se cuenta el
número de células en los cultivos usando un contador de células
automático. El número de células en los cultivos se trata con el
oligonucleótido de ensayo (expresado como 100%) se compara con el
número de células en los cultivos tratados con el oligonucleótido
de control no es más de 30% del control, que indica que la
inhibición del GPCR humano tiene un efecto antiproliferativo sobre
las células cancerosas.
\vskip1.000000\baselineskip
La sobreproducción de glucosa por el hígado,
debido a una tasa potenciada de gluconeogénesis, es la principal
causa de la hiperglucemia en ayunas en diabetes. Las ratas o ratones
en ayunas durante toda una noche tienen tasas elevadas de
gluconeogénesis como las ratas o ratones diabéticos inducidos por
estreptozotocina con alimentación a voluntad. Las ratas se hacen
diabéticas con una sola inyección de 40 mg/kg de estreptozotocina
mientras a los ratones C57BL/KsJ se les proporciona
40-60 mg/kg i.p. durante cinco días consecutivos. Se
mide la glucosa en sangre a partir de la sangre de la punta de la
cola y después los compuestos se administran mediante mediante vías
diferentes (p.o., i.p., i.v., s.c.). Se recoge sangre en diversos
momentos después y se mide la glucosa. Como alternativa, se
administran los compuestos durante varios días, después los animales
de dejan en ayunas durante toda una noche, se recoge la sangre y se
mide la glucosa en sangre. Los compuestos que inhiben la producción
de glucosa disminuirán los niveles de glucosa en plasma comparados
con el grupo de control tratado con vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones tanto ob/ob como db/db así como ratas
Zucker diabéticas son hiperglicémicos, hiperinsulinémicos y
resistentes a insulina. Se toman muestra de los animales
previamente, se miden sus niveles de glucosa, y se agrupan de
manera que el nivel medio de glucosa sea el mismo para cada grupo.
Los compuestos de administran diariamente cada día o dos veces al
día mediante vías diferentes (p.o., i.p., s.c.) durante
7-28 días. Se recoge sangre en diversos momentos y
se determinan los niveles de glucosa e insulina en plasma. Los
compuestos que mejoran la sensibilidad a insulina en estos modelos
disminuirán los niveles tanto de glucosa como insulina en plasma
cuando se compara con el grupo de control tratado con vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos que potencian la secreción de
insulina a partir del páncreas incrementarán los niveles de insulina
en plasma y mejorarán la desaparición de glucosa en plasma después
de la administración de una carga de glucosa. Cuando se miden los
niveles de insulina, se administran los compuestos mediante vías
diferentes (p.o., i.p., s.c. o i.v.) a ratas o ratones normales en
ayunas durante toda una noche. En el momento apropiado se
proporciona una carga de glucosa intravenosa (0,4 g/kg), se recoge
sangre un minuto más tarde. Se determinan los niveles de insulina
en plasma. Los compuestos que potencian la secreción de insulina
incrementarán los niveles de insulina en plasma comparado con los
animales a los que solo se les ha proporcionado solamente glucosa.
Cuando se mide la desaparición de glucosa, se toma muestra de la
sangre de los animales en el momento apropiado después de la
administración del compuesto, después se proporciona una carga de
glucosa o bien oral o por vía intraperitoneal (1 g/kg), se toma
muestra de sangre de nuevo después de 15, 30, 60 y 90 minutos y se
determinan los niveles de glucosa en sangre. Los compuestos que
incrementan los niveles de insulina disminuirán los niveles de
glucosa y el área bajo la curva de glucosa cuando se compara con el
grupo tratado con vehículo al que se proporciona solamente
glucosa.
Los compuestos que potencian la secreción de
insulina a partir del páncreas incrementarán los niveles de insulina
en plasma y mejorarán la desaparición de glucosa en plasma después
de la administración de una carga de glucosa. Cuando se miden los
niveles de insulina, los compuestos que regulan GPCR se administran
mediante diferentes vías (p.o., i.p., s.c., o i.v.) a ratas o
ratones normales en ayunas durante toda la noche. En el momento
apropiado se administra una carga de glucosa intravenosa (0,4 g/kg),
se recoge sangre un minuto más tarde. Se determinan los niveles de
insulina. Los compuestos de ensayo que potencian la secreción d
insulina incrementarán los niveles de insulina en plasma comparados
con los animales a los que se les proporciona solamente glucosa.
Cuando se mide la desaparición de glucosa, se toma muestra de sangre
de los animales en el momento adecuado después de la administración
del compuesto, después se proporciona una carga de glucosa o bien
oral o intraperitoneal (1 g/kg), se toma muestra de sangre de nuevo
después de 15, 30, 60, y 90 minutos y se determinan los niveles de
glucosa en plasma. Los compuestos de ensayo que incrementan los
niveles de insulina disminuirán los niveles de glucosa y el área
bajo la curva de glucosa cuando se compara con el grupo tratado con
vehículo al que se proporciona solamente glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La sobreproducción de glucosa por el hígado,
debido a una tasa potenciada de gluconeogénesis, es la causa
principal de hiperglicemia en ayunas en diabetes. Las ratas o
ratones en ayunas durante toda la noche tienen tasas elevadas de
gluconeogénesis como las ratas o ratones diabéticos inducidos por
estreptozotocina alimentados a voluntad. Las ratas se hacen
diabéticas con una sola inyección intravenosa de 40 mg/kg de
estreptozotocina mientras a los ratones C57BL/KsJ se les
proporciona 40-60 mg/kg i.p. durante 5 días
consecutivos. La glucosa en sangre se mide a partir de sangre de la
punta de la cola y se administran los compuestos mediante vías
diferentes (p.o., i.p., i.v., s.c.). Se recoge la sangre en
diferentes momentos después de esto y se mide la glucosa. Como
alternativa, se administra los compuestos durante varios días,
después los animales se dejan en ayunas durante toda una noche, se
recoge sangre y se mide la glucosa en plasma. Los compuestos que
inhiben la producción de glucosa disminuirán los niveles de glucosa
en plasma comparado con el grupo de control tratado con
vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones tanto ob/ob como db/db así como ratas
Zucker diabéticas son hiperglicémicos, hiperinsulinémicos y
resistentes a insulina. Se toman muestra de los animales
previamente, se miden sus niveles de glucosa, y se agrupan de
manera que el nivel medio de glucosa sea el mismo para cada grupo.
Los compuestos de administran diariamente cada día o dos veces al
día mediante vías diferentes (p.o., i.p., s.c.) durante
7-28 días. Se recoge sangre en diversos momentos y
se determinan los niveles de glucosa e insulina en plasma. Los
compuestos que mejoran la sensibilidad a insulina en estos modelos
disminuirán los niveles tanto de glucosa como insulina en plasma
cuando se compara con el grupo de control tratado con vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos que potencian la secreción de
insulina a partir del páncreas incrementarán los niveles de insulina
en plasma y mejorarán la desaparición de glucosa en plasma después
de la administración de una carga de glucosa. Cuando se miden los
niveles de insulina, se administran los compuestos mediante vías
diferentes (p.o., i.p., s.c. o i.v.) a ratas o ratones normales en
ayunas durante toda una noche. En el momento apropiado se
proporciona una carga de glucosa intravenosa (0,4 g/kg), se recoge
sangre un minuto más tarde. Se determinan los niveles de insulina
en plasma. Los compuestos que potencian la secreción de insulina
incrementarán los niveles de insulina en plasma comparado con los
animales a los que solo se les ha proporcionado solamente glucosa.
Cuando se mide la desaparición de glucosa, se toma muestra de la
sangre de los animales en el momento apropiado después de la
administración del compuesto, después se proporciona una carga de
glucosa o bien oral o por vía intraperitoneal (1 g/kg), se toma
muestra de sangre de nuevo después de 15, 30, 60 y 90 minutos y se
determinan los niveles de glucosa en sangre. Los compuestos que
incrementan los niveles de insulina disminuirán los niveles de
glucosa y el área bajo la curva de glucosa cuando se compara con el
grupo tratado con vehículo al que se proporciona solamente
glucosa.
glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mide el dolor agudo sobre una placa caliente
principalmente en ratas. Se usan dos variantes de ensayo en placa
caliente: en la variante clásica los animales se colocan en una
superficie caliente (52 a 56ºC) y el tiempo de latencia se mide
hasta que los animales muestran un comportamiento nocifensivo, tal
como el escalón o lamedura de pata. La otra variante es una placa
de temperatura creciente donde los animales experimentales se
colocan sobre una superficie de temperatura neutra. Posteriormente
esta superficie se calienta de manera lenta pero constante hasta
que los animales comienzan a lamer una pata posterior. La
temperatura que se alcanza cuando comienza la lamedura de la pata
posterior es una medida del umbral del dolor.
Se ensayan los compuestos contra un grupo de
control tratado con vehículo. La aplicación de la sustancia se
realiza en diferentes momentos mediante diferentes vías de
aplicación (i.v., i.p., p.o., i.t., i.c.v., s.c., intradérmica,
transdérmica) antes del ensayo de dolor.
\vskip1.000000\baselineskip
El dolor persistente se mide con el ensayo de
formalina o capsaicina, principalmente en ratas. Una solución de
formalina al 1 a 5% o 10 a 100 \mug de capsaicina se inyecta en
una pata trasera del animal experimental. Después de la aplicación
de formalina o capsaicina los animales muestran reacciones
nocifensivas de tipo retroceso, lamido y golpeado de la pata
afectada. El número de reacciones nocifensivas dentro de un marco de
tiempo de hasta 90 minutos es una medida de al intensidad de
dolor.
Los compuestos se ensayan contra un grupo de
control tratado con vehículo. La aplicación de sustancias se
realiza en momentos de tiempo diferentes mediante vías de aplicación
diferentes (i. v., i. p., p. o., i. t., i. c. v., s. c.,
intradérmica, transdérmica) antes de la administración de formalina
o capsaicina.
\vskip1.000000\baselineskip
El dolor neuropático se induce mediante
variantes diferentes de lesión de nervio ciático unilateral
principalmente en ratas. La operación se realiza bajo anestesia. La
primera variante de lesión de nervio ciático se produce colocando
ligaduras constrictoras holgadas alrededor del nervio ciático común.
La segunda variante es al ligadura estrecha de aproximadamente la
mitad del diámetro del nervio ciático común. En la siguiente
variante, se usa un grupo de modelos en el que las ligaduras o
secciones transversales se hacen de los nervios espinales o bien L5
y L6, o el nervio espinal L% solamente. La cuarta variante implica
una axotomia de las tres ramas terminales del nervio ciático
(nervios tibial y común perineales) que dejan el nervio sural
restante intacto mientras que la última variante comprende la
axotomía de solamente la rama tibial que deja los nervios sural y
común sin lesionar. Los animales de control se tratan con una
operación fingida.
Después de la operación, los animales lesionados
en los nervios desarrollan una alodinia mecánica crónica, alodinia
fría, así como una hiperalgesia térmica. La alodinia mecánica se
mide por medio de un transductor de presión (anestesiómetro
electrónico de von Frey, IITC Inc. - Life Science Instruments,
Woodland Hills, S. A, Estados Unidos; sistema electrónico von Frey,
Somedic sales AB, Orbi, Suecia). La hiperalgesia térmica se mide
por medio de una fuente de calor radiante (ensayo Plantar, Ugo
Basile, Comerio, Italia), o por medio de una placa fría de 5 a 10ºC
donde las reacciones nocifensivas de la pata trasera afectada se
cuentan como una medida de la intensidad de dolor. Un ensayo
adicional para el dolor inducido por frío es el recuento de
reacciones nocifensivas, o duración de respuestas nocifensivas
después de la administración plantar de acetona al miembro
posterior afectado. El dolor crónico en general se determina
registrando el ritmo circadiano en actividad (Surjo y Arndt,
Universidad de Colonia, Colonia, Alemania), y puntuando diferencias
en el andar (foots print patterns; programa FOOTPRINTS, Klapdor y
col., 1997. A low cost method to analyse footprint patterns. J.
Neurosci. Methods 75, 49-54).
Los compuestos se ensayan contra los grupos de
control operados fingidamente o tratado con vehículo. La aplicación
de sustancia se realiza en momentos de tipo diferentes mediante las
vías de aplicación diferentes (i. v., i. p., p. o., i. t., i. c.
v., s. c., intradérmica, transdérmica) antes del ensayo de
dolor.
\vskip1.000000\baselineskip
El dolor inflamatorio se induce principalmente
en ratas mediante la inyección de 0,75 mg de carragenano o
adyuvante de Freund en una pata trasera. Los animales desarrollan un
edema con alodinia mecánica así como hiperalgesia térmica. La
alodinia mecánica se mide por medio de un transductor de presión
(anastesiómetro electrónico de von Frey, IITC Inc. - Life Science
Instruments, Woodland Hills, SA, Estados Unidos). La hiperalgesia
térmica se mide por medio de una fuente de calor radiante (ensayo
Plantar, Ugo Basile, Comerio, Italia, estimulador térmico de la
pata, G. Ozaki, Universidad de California, Estados Unidos). Para la
medición de edema se están usando dos procedimientos. En el primer
procedimiento, los animales se sacrifican y las patas traseras
afectadas se seccionan y se pesan. El segundo procedimiento
comprende diferencias en el volumen de la pata midiendo el
desplazamiento de agua en un pletismómetro (Ugo Basile, Comerio,
Italia).
Los compuestos se ensayan contra grupos de
control inflamados así como tratados con vehículo. La aplicación de
sustancia se realiza en momentos de tipo diferentes mediante las
vías de aplicación diferentes (i. v., i. p., p. o., i. t., i. c.
v., s. c., intradérmica, transdérmica) antes del ensayo de
dolor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratas tratadas con una sola inyección
intraperitoneal de 50 a 80 mg/kg de estreptozotocina desarrollan una
hiperglucemia profunda y aloidinia mecánica dentro de 1 a 3
semanas. La aloidinia mecánica se mide por medio de un transductor
de presión (anestesiómetro electrónico de von Frey, IITC Inc. - Life
Science Instruments, Woodland Hills, S. A, Estados Unidos.
Los compuestos se ensayan contra grupos de
control tratados con vehículo diabéticos y no diabéticos. La
aplicación de sustancia se realiza en momentos de tipo diferentes
mediante las vías de aplicación diferentes (i. v., i. p., p. o., i.
t., i. c. v., s. c., intradérmica, transdérmica) antes del ensayo de
dolor.
\vskip1.000000\baselineskip
La degeneración de las rutas nigroestriada y
estratopalidal dopaminérgica es el episodio patológico central en
la enfermedad de Parkinson. Este trastorno de ha imitado
experimentalmente en ratas usando inyecciones estereotáxicos
unilaterales individuales/secuenciales de
6-OH-DA en el haz prosencefálico
medio (MFB).
Se usan machos de ratas Wistar (Harlan
Winkelmann, Alemania), que pesan 200 \pm 250 g en el comienzo del
experimento. Las ratas se mantienen en un ambiente controlado de
temperatura y humedad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con
el acceso libre a alimento y agua cuando no están en condiciones
experimentales. Los siguientes protocolos in vivo están
aprobados por las autoridades gubernamentales. Se hacen todos los
esfuerzos para minimizar que el animal sufra, para reducir el
número de animales usados, y para utilizar técnicas alternativas
in vivo.
A los animales se les administra pargilina el
día de la cirugía (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos; 50 mg/kg i.
p.) con el fin de inhibir el metabolismo de 6-OHDA
por la monoamino oxidasa y desmetilimipramina HCl (Sigma; 25 mg/kg
i. p.) con el fin de evitar la ingesta de 6-OHDA por
terminales noradrenérgicos. Treinta minutos más tarde las ratas de
anestesian con pentobarbital de sodio (50 mg/kg) y se colocan en una
estructura estereotáxica. Con el fin de lesionar la ruta DA
nigroestriada se inyectan 4 \mul de ácido ascórbico al
0,01%-solución salina que contiene 8 \mug de
6-OHDA HBr (Sigma) en el haz prosencefálico medio
izquierdo a una velocidad de 1 \mul/min (2,4 mm anterior, 1,49 mm
lateral, -2,7 mm ventral a Bregma y a superficie del cráneo). Se
deja la aguja en lugar 5 minutos adicionales para permitir que se
produzca la difusión.
\newpage
La aquinesia del miembro anterior se determina
tres semanas después del establecimiento de la lesión usando un
protocolo de ensayo por etapas modificado. En resumen, los animales
son mantenidos por el experimentador con una mano fijando los
miembros traseros y elevando ligeramente la parte del miembro por
encima de la superficie. Una pata está tocando la mesa, y después
de mueve lentamente oblicuamente (5 s durante 1 m), primero en la
dirección delantera y después en la trasera. El número de etapas de
ajuste se cuenta para ambas patas en la dirección delantera y
trasera de movimiento. La secuencia de ensayo es posición delantera
y trasera de la para derecha ajustando el escalón, seguido de
direcciones delantera y trasera de la pata izquierda. El ensayo se
repite tres veces tres días consecutivos, después de un período
inicial de entrenamiento de tres días antes de del primer ensayo.
El escalón ajustado delantero no revela diferencias consistentes
entre animales lesionados y de control sanos. Por lo tanto el
análisis de restringe a escalón ajustado de la parte de atrás.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ajustes de equilibrio después del desafío
postural también se miden durante las sesiones de ensayo de
escalón. Las ratas se mantienen en la misma posición como se
describe en el ensayo de escalón y, en lugar de moverse
lateralmente, se inclina por el experimentador hacia el lado de la
para que toca la pata. Esta maniobra da como resultado la pérdida
de equilibrio y la capacidad de las ratas de recuperar el equilibrio
mediante movimientos de de la pata delantera se puntúa en una
escala que varía entre 0 y 3. La puntuación 0 se proporciona para
una colocación normal de la parte delantera. Cuando el movimiento de
la parte delantera se retrasa pero se del equilibrio postural
detectado, se proporciona la puntuación 1. La puntuación 2
representa una reacción de la pata delantera, clara, todavía
insuficiente, como se evidencia mediante la contracción muscular,
pero que carece de éxito cuando recupera el equilibrio, y al
puntuación 3 se proporciona para ninguna reacción de movimiento. El
ensayo se repite tres veces al día en cada lado durante tres días
consecutivos después de un período de entrenamiento inicial de tres
días antes del primer ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Una versión modificada del ensayo de la escalera
se usa para la evaluación del comportamiento de estiramiento de la
pata tres semanas después del establecimiento de la lesión primaria
y secundaria. Se usan cajas de ensayo de plexiglás con una
plataforma central y escalera removible sobre cada lado. El aparato
de diseña de tal manera que solamente la pata sobre el mismo lado
en cada escalera se puede usar, proporcionando de esta manera una
medida de uso del miembro delantero independiente. Para cada ensayo
los animales se dejan en las cajas de ensayo durante 15 minutos. La
escalera doble se llena con gránulos 7 x 3 de pienso (gránulos de
alimento de precisión, fórmula: P, dieta de roedor purificada,
tamaño 45 mg; Sandown Scientific) en cada lado. Después de cada
ensayo se cuentan separadamente el número de gránulos comidos
(gránulos recuperados con éxito) y el número de gránulos tomados
(tocados pero abandonados) para cada pata y la tasa de éxito
(gránulos comidos/gránulos tomados). Después de tres días de
privación de alimento (12 g por animal al día) los animales se
ensayan durante 11 días. Se lleva a cabo un análisis completo
solamente durante los últimos cinco días.
\vskip1.000000\baselineskip
La neurotoxina
1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
(MPTP) provoca degeneración de neuronas dopaminérgicas
mesencefálicas (DAergica) en roedores, primates no humanos, y se res
humanos y, haciendo de esta manera, reproduce muchos de los
síntomas de la enfermedad de Parkinson. MPTP conduce a un marcado
descenso en los niveles de dopamina y sus metabolitos, y en el
número de terminales dopaminérgicos en el estriado así como pérdida
grave de los cuerpos celulares de tirosina hidrolasa (TH)-
inmunorreactivos en al sustancia negra, pars compacta.
Con el fin de obtener lesiones graves y de larga
duración, y reducir la mortalidad, los animales reciben inyecciones
individuales de MPTP, y después de ensayan para evaluar la gravedad
de la lesión 7-10 días después. Las inyecciones
sucesivas de MPTP se administran los días 1, 2, y 3. Los animales
reciben la aplicación de 4 mg/kg de clorhidrato de MPTP (Sigma) en
solución salina una vez al día. Todas las inyecciones son
intraperitoneales (i. p.) y la solución madre de MPTP se congela
entre inyecciones. Los animales se decapitan el día 11.
\vskip1.000000\baselineskip
A la finalización de los experimentos de
comportamiento, todos los animales se anestesian con 3 ml de
tiopental (1 g/40 ml i. p., Tyrol Pharma). Los ratones se prefunden
transcardialmente con PBS 0,01 M (pH 7,4) durante 2 minutos,
seguido de paraformaldehído al 4% (Merck) en PBS durante 15 minutos.
Se retiran los cerebros y se colocan en paraformaldehído al 4%
durante 24 horas a 4ºC. Para deshidratación se transfieren después a
una solución de sacarosa al 20% (Meck) en PBS 0,1 M a 4ºC hasta que
se humedecen. Los cerebros se congelan en metilbutano a -20ºC
durante 2 minutos y se almacenan a -70ºC. Usando un microtomo de
arrastre (mod. 3800 - Frigocut, Leica), se toman secciones de 25
\mum del gen del cuerpo calloso (AP 1,7 mm) al hipocampo (AP 21,8
mm) y de AP 24,16 a AP 26,72. Se cortan 46 secciones y se almacenan
en clasificadores en tampón Tris 0,25 M (pH 7,4) para
inmunohistoquímica.
Se procesa una serie de secciones para evaluar
la inmunohistoquímica de la tirosina hidrolasa sin flotar (TH).
Después de tres enjuagues en PBS 0,1 M, la actividad de la
peroxidasa se inactiva durante 10 minutos en H_{2}O_{2} al 0,3%
\pm PBS. Después de enjuagar en PBS, se preincuban secciones en
suero bovino normal al 10% (Sigma) durante 5 minutos como agente de
bloqueo y se transfieren a cualquier antisuero de conejo
anti-rata TH primario (dilución 1:2000).
Después de la incubación durante toda una noche
a temperatura ambiente, se enjuagan secciones para
inmunorreactividad TH en PBS (2 x 10 minutos) y se incuban en
inmunoglobulina G anti-conejo biotinilada enjuagada
en cabra (dilución 1:200) (Vector) durante 90 minutos, se enjuga
repetidamente y se transfiere a solución de Vectastaína ABC
(Vector) durante 1 hora. El clorhidrato de
3,3'-diaminobencidina (DAB; Sigma) en PBS 0,1 M,
suplementado con H_{2}O_{2} al 0,005%, sirve como cromógeno en
la reacción posterior de visualización. Se montan secciones sobre
portaobjetos revestidos de gelatina, se dejan durante toda una
noche, se tiñen por contraste con hematoxilina deshidratada en
concentraciones crecientes de alcohol y se limpian en butilacetato.
Los cubreobjetos se montan en entellan.
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Los inventores usan una modificación del
procedimiento descrito por Rozas y Labendaira-García
(1997), con un sistema Rotamex CR-1 (Columbus
Instruments, Columbus, OH) que comprende un ordenador personal
IBM-compatible, una carta de adquisición de datos
CIO-24, una unidad de control, y una unidad de
varilla rotatoria de cuatro bandas. La unidad de varilla rotatoria
consta de un eje rotante (diámetro 7,3 cm) y compartimientos
individuales para cada ratón. El software del sistema permite la
programación previa de los protocolos de sesión con velocidades
rotacionales variantes (0-80 rpm). Se usan rayos
infrarrojos para detectar un ratón que cae en la rejilla de base
debajo de la varilla rotatoria. El sistema registra la caída como el
final del experimento para ese ratón, y el tiempo total de la
varilla rotatoria, así como, así como el tiempo de caída y todos los
parámetros de establecimiento se registran. El sistema también
permite que una corriente débil pase a través de la rejilla de base,
para ayudar el entrenamiento.
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La tarea de reconocimiento de objetos se ha
diseñado para determinar los efectos de las manipulaciones
experimentales del comportamiento cognitivo de roedores. Una rata
se coloca en un campo abierto, en el que están presentes dos
objetos idénticos. Las ratas inspeccionan ambos objetos durante la
primera prueba de la tarea de reconocimiento de objetos. En una
segunda prueba, después de un intervalo de retención de por ejemplo
24, horas, uno de los dos objetos usados en esta prueba inicial, el
objeto "familiar", y un objeto novedoso se colocan en el campo
abierto. El tiempo de inspección en cada uno de los objetos se
registra. Las medidas básicas en la tarea OR es el tiempo gastado
por una rata que explora los dos objetos de la segunda prueba. La
buena retención se refleja por unos tiempos de exploración más altos
hacia el objeto novedoso que el objeto "familiar".
La administración del potenciador de cognición
supuesto a la primera prueba predominantemente permite la
determinación de los efectos tras la adquisición, y eventualmente
tras los procedimientos de consolidación. La administración del
compuesto de ensayo después de la primera prueba permite la
determinación de los efectos taras los procedimientos de
consolidación, mientras que la administración antes de la segunda
prueba permite medir los efectos tras los procedimientos de
recuperación.
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La tarea de evitación pasiva determina el
comportamiento de memoria en ratas y ratones. El aparato de
anulación inhibidora consta de una caja de dos compartimientos con
un compartimiento luminoso y un compartimiento oscuro. Los dos
compartimientos están separados por una puerta de guillotina que
puede operar el experimentador. Un umbral de 2 cm separa los dos
compartimientos cuando la puerta de guillotina se levanta. Cuando la
puerta está abierta, la iluminación en el compartimiento oscuro es
aproximadamente 2 lux. La intensidad de la luz es aproximadamente
500 lux en el centro del suelo del compartimiento luminoso.
Se proporcionan dos sesiones de habituación, una
sesión de choque, y una sesión de retención, separadas por
intervalos Inter.-sesión de 24 horas. En las sesiones de habituación
y la sesión de retención la rata se deja se deja explorar el
aparato durante 300 segundos. La rata se coloca en el compartimiento
luminoso, en frente de la pared opuesta de la puerta de guillotina.
Después de un período de acomodación de 15 segundos, se abre al
puerta de guillotina de manera que todas las partes del aparato se
puedan visitar libremente. Las ratas normalmente evitan las áreas
de luz brillante y entrarán dentro del compartimiento oscuro en unos
pocos segundos.
En la sesión de choque la puerta de guillotina
entre los compartimientos se reduce tan pronto como la rata ha
entrado en el compartimiento oscuro con sus cuatro patas, y se
administra un choque en las patas de 1 mA de alerta se administra
durante 2 segundos. La rata se retira del aparato y se vuelve a
colocar en su jaula de alojamiento. El procedimiento durante la
sesión de retención es idéntica a la de las sesiones de
habituaciones.
La latencia a través de la etapa, que es la
primera latencia de entrada en el compartimiento oscuro (en
segundos) durante la sesión de retención es un índice del
comportamiento de memoria del animal; cuanto más larga es al
latencia para entrar al compartimiento oscuro, mejor es la
retención. Un compuesto de ensayo se proporciona una hora y media
antes de la sesión de choque, junto con 1 mg/kg de escopolamina. La
escopolamina altera el comportamiento de la memoria durante la
sesión de retención 24 horas después. Si el compuesto de ensayo
aumenta la latencia de entrada comparado con los controles tratados
con escopolamina, es probable que posean potencial que eleva la
cognición.
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La tarea de escape de Morris mide la orientación
espacial de aprendizaje de roedores. Es un sistema de ensayo que se
ha usado en gran medida para investigar los efectos de los agentes
terapéuticos supuestos sobre las funciones cognitivas de ratas y
ratones. El comportamiento de un animal se determina en un tanque de
agua circular con una plataforma de escape que se sumerge
aproximadamente 1 cm por debajo de la superficie del agua. La
plataforma de escape no es visible para un animal que nada en el
tanque de agua. Se proporcionan señales extra laberinto abundantes
por los muebles en la habitación, incluyendo escritorios, equipo de
ordenador, un segundo tanque de agua, la presencia del
experimentador, y por un radio de una repisa que esta jugando
suavemente.
Los animales reciben cuatro pruebas durante
cinco sesiones de adquisición. Una prueba se comienza colocando un
animal en el estanque, enfrente de la pared del tanque. Cada una de
las cuatro posiciones de partida en los cuadrantes norte, este,
sur, y oeste se usa una vez en una serie de cuatro pruebas; su orden
está distribuido al azar. La plataforma de escape está siempre en
la misma posición. Se termina una prueba tan pronto como el animal
había subido sobre la plataforma de escape o cuando habían
transcurrido 90 segundos, cualquiera de los casos sucede primero.
El animal de deja estar sobre al plataforma durante 30 segundos.
Después se saca de la plataforma y se comienza la siguiente prueba.
Si un animal no encuentra la plataforma en 90 segundos lo pone
sobre la plataforma el experimentador y se deja estar durante 30
segundos. Después de la cuarta prueba del quinto sesión diaria, se
proporciona una prueba adicional como una prueba de sonda: la
plataforma se retira, y el tiempo que el animal pasa en los cuatro
cuadrantes de mide durante 30 ó 60 segundos. En la prueba dé sonda,
todos los animales comienzan desde la misma posición de partida,
opuesto al cuadrante donde la plataforma de escape se había
posicionado durante la adquisición.
Se toman cuatro mediadas diferentes para evaluar
el comportamiento de un animal durante el entrenamiento de
adquisición; latencia de escape, distancia viajada, distancia a la
plataforma, y velocidad de natación. Las siguientes medidas se
evalúan para la prueba de sonda: tiempo(s) en cuadrantes y
distancia viajada (cm) en los cuatro cuadrantes. La prueba de sonda
proporciona información adicional sobre cómo de bien un animal
aprende la posición de la plataforma de escape. Si un animal gasta
más tiempo y nada una distancia más larga en el cuadrante donde la
plataforma se ha posicionado durante las sesiones de adquisición que
en cualquier otro cuadrante, se concluye que la posición de la
plataforma se ha aprendido bien.
Con el fin de determinar los efectos de los
compuestos potenciadores de cognición supuestos, se usan ratas o
ratones con lesiones de cerebro específicas que alteran las
funciones cognitivas, o animales tratados con compuestos tales como
escopolamina o MK-801, que interfieren con el
aprendizaje normal, o animales viejos que padecen déficits
cognitivos.
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La tarea de alternación espontánea de laberinto
T (TeMCAT) determina el comportamiento de memoria espacial en
ratones. El brazo de partida y los dos brazos de objetivo del
laberinto en T se proporcionan con puertas de guillotina que se
pueden operar manualmente por el experimentador. Un ratón se pone en
el brazo de partida en el comienzo del entrenamiento. Se cierra la
puerta de guillotina. Al final de la prueba, la "prueba
forzada", se bloquea el brazo objetivo a o bien izquierdo o
derecho bajando la puerta de guillotina. Después de que el ratón se
ha liberado del brazo de partida, negociará el laberinto,
eventualmente entra en el brazo objetivo abierto, u regresa a la
posición de partida, donde se confinará durante 5 segundos,
reduciendo la puerta de guillotina. Después, el animal puede elegir
libremente entre el brazo objetivo izquierdo y derecho (todas las
puertas de guillotina abiertas) durante las 14 pruebas "de
elección libre". Tan pronto como el ratón ha entrado ha entrado
en el brazo objetivo, se cierra la otra. El ratón eventualmente
regresa al brazo de partida y es libre de visitar cualquiera de los
brazos objetivo si lo desea después de que se ha confinado el en
brazo de partida durante 5 segundos. Después de la finalización de
las 14 pruebas de elección libre en una sesión, se retira el animal
del laberinto, el animal nunca está manipulado.
Se calcula el porcentaje de alteraciones de las
14 pruebas. Este porcentaje y el tiempo total necesario para
completar la primera prueba forzada y las posteriores 14 pruebas de
elección libre/en s) se analiza. Los déficits cognitivos se inducen
usualmente por una inyección de escopolamina, 30 minutos antes del
comienzo de la sesión de entrenamiento. La escopolamina reducía el
porcentaje de alteraciones que cambia o reduce el nivel. Un
potenciador de cognición, que está ya administrado antes de la
sesión de entrenamiento, antagonizará, al menos parcialmente la
reducción inducida por escopolamina en la tasa de alternancia
espontánea.
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El vector de expresión de Pichia pastoris
pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) se usa para producir grandes
cantidades de los polipéptidos de GPCR humano recombinante en
levadura. La secuencia de ADN que codifica GPCR se deriva de la SEQ
ID Nº 1. Antes de la inserción en el vector pPICZB, la secuencia de
ADN se modifica mediante procedimientos bien conocidos de tal forma
que contiene en su extremo 5' un codón de inicio y en su extremo 3'
un sitio de escisión de enteroquinasa, y una marca indicadora His6 y
un codón de terminación. Además, en ambas secuencias de
reconocimiento de los extremos para las endonucleasas de restricción
se añaden y después de la digestión del sitio de clonación múltiple
de pPICZ B con las correspondientes enzimas de restricción la
secuencia de ADN modificada se liga en pPICZB. El vector de
expresión se diseña para la expresión inducible en Pichia
pastoris, conducida por un promotor de levadura. El vector
pPICZ/md-His6 resultante se usa para transformar la
levadura.
La levadura se cultiva en condiciones usuales en
matraces de 5 litros y la proteína producida de manera recombinante
se aísla del cultivo mediante cromatografía de afinidad (resina
Ni-NTA) en presencia de urea 8 M. El polipéptido
unido se eluye con tampón, pH 3,5, y se neutraliza. La separación
del polipéptido de la marca indicadora His6 se realiza mediante
proteolisis específica del sitio usando enteroquinasa (Invitrogen,
San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se
obtiene el polipéptido de GPCR humano purificado.
El patrón de expresión cualitativo de GPCR en
diversos tejidos se determina mediante Reacción en cadena de la
Polimerasa de Transcripción Inversa (RT-PCR).
Para demostrar que GPCR está implicado en el
proceso patológico de COPD, el panel de expresión inicial consta de
muestras de ARN de tejidos respiratorios y células inflamatorias
relevantes a COPD: pulmón (adulto y fetal), tráquea, células de
tipo II alveolar cultivadas y aisladas, células epiteliales
bronquiales humanas cultivadas, células epiteliales de las vías
respiratorias pequeñas cultivadas, células de músculo liso
bronquiales cultivadas, células H441 (de tipo Clara), neutrófilos y
monocitos aislados de recientemente, y monocitos cultivados (de
tipo macrófago). También se lleva a cabo el perfil del mapa
corporal, usando paneles de ARN total comprados en Clontech. Los
tejidos son glándula adrenal, médula ósea, cerebro, colon, corazón,
riñón, hígado, glándula mamaria, páncreas, próstata, glándula
salivar, músculo esquelético, intestino delgado, bazo, estómago,
testículos, timo, tráquea, tiroides, y útero.
Para demostrar que GPCR está implicado en
cáncer, se determina la expresión en los siguientes tejidos:
glándula adrenal, médula ósea, cerebro, cerebelo, colon, cerebro
fetal, hígado fetal, riñón, hígado, pulmón, glándula mamaria,
páncreas, placenta, próstata, glándula salivar, músculo
esquelético,, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago,
testículos, timo, tiroides, tráquea, útero, y linfocitos de la
sangre periférica. También se determina la expresión en las
siguientes líneas celulares: DU-145 (próstata),
NCI-H125 (pulmón), HT-29 (colon),
COLO-205 (colon), A-549 (pulmón),
NCI-H460 (pulmón), HT-116 (colon),
DLD-1 (colon),
MDA-MD-_231 (mama), LS174T (colon),
ZF-75 (mama),
MDA-MN-435 (mama),
HT-1080, MCF-7 (mama), y U87.
También se analizan los pares coincidentes de tejido maligno y
normal del mismo paciente.
Para demostrar que el GPCR está implicado en
proceso patológico de obesidad, se determina la expresión en los
siguientes tejidos: tejido adiposo subcutáneo, tejido adiposo
mesentérico, glándula adrenal, médula ósea, cerebro (cerebelo,
médula espinal, córtex cerebral, caudato, médula, sustancia nigra, y
putamen), colon, cerebro fetal, corazón, riñón, hígado, pulmón,
glándula mamaria, páncreas, placenta, próstata, glándula salivar,
músculo esquelético, intestino delgado, bazo, estómago, testículos,
timo, tiroides, tráquea, y útero. También se ensayas líneas
celulares de neuroblastoma SK-Nr-Be
(2), Hr, Sk-N-As,
HTB-10, IMR-32,
SNSY-5Y, T3,
SK-N-D2, D283, DAOY,
CHP-2, U87MG, BE(2)C, T986, KANTS,
MO59K, CHP234, C6 (rat), SK-N-F1,
SK-PU-DW, PFSK-1,
BE(2) M17, y MCIXC para la expresión de GPCR. Como etapa
final, se compara la expresión de GPCR en las células derivadas de
individuos normales con la expresión de células derivadas de
individuos obesos.
Para demostrar que GPCR está implicado en el
proceso patológico de diabetes, se selecciona el siguiente panel
del cuerpo entero que muestra expresión predominante o altamente
relativa: tejido subcutáneo y mesentérico, glándula adrenal, médula
ósea, cerebro, colon, cerebro fetal, corazón, hipotálamo, riñón,
hígado, pulmón, glándula mamaria, páncreas, placenta, próstata,
glándula salivar, músculo esquelético, intestino delgado, bazo,
estómago, testículos, timo, tiroides, tráquea, y útero. Se ensayan
células de islotes humanos y una genoteca de células de islotes.
Como etapa final, se compara la expresión de GPCR en las células
derivadas de individuos normales con la expresión de las células
derivadas de individuos derivados.
Para demostrar que GPCR está implicado en los
trastornos de SNC, se seleccionan los siguientes tejidos: cerebro
fetal y adulto, músculo, corazón, pulmón, riñón, hígado, timo,
tesctículos, colon, placenta, tráquea, páncreas, riñón, mucosa
gástrica, colon, hígado, cerebelo, piel, cortex (de Alzheimer y
normal), hipotálamo, córtex, amígdala, cerebelo, hipocampo, plexo
coroide, tálamo, y médula espinal.
Para demostrar que el GPCR está implicado en el
proceso patológico de asma, se selecciona el siguiente panel del
cuerpo entero que muestra expresión predominante o altamente
relativa en pulmón o tejidos inmunes: cerebro, corazón, riñón,
hígado, pulmón, tráquea, médula ósea, colon, intestino delgado,
bazo, estómago, timo, glándula mamaria, músculo esquelético,
próstata, tesctículos, útero, cerebelo, cerebro fetal, hígado fetal,
médula espinal, placenta, glándula adrenal, páncreas, glándula
salivar, tiroides, leucocitos de sangre periférica, ganglio
linfático, y amígdala. Una vez que se establece, las células de
pulmón y sistema inmune se seleccionan para localizar la expresión
a susbconjuntos de células particulares: pulmón células endoteliales
microvasculares, células bronquiales/de tráquea, células del
músculo liso bronquiales/de tráquea, fibroblastos de pulmón,
células T (subconjunto 1 de auxiliares T, subconjunto 2 de
auxiliares T, subconjunto de células NKT, y linfocitos t
citotóxicos), células B, células mononucleares (monocitos y
macrófagso), mastocitos, eosinófilos, neutrófilos, y células
dendríticas. Como etapa final, se compara la expresión de GPCR en
las células derivadas de individuos normales con la expresión de las
células derivadas de individuos asmáticos.
Perfil de expresión cuantitativa. El
perfil de expresión cuantitativa se realiza en la forma de análisis
cuantitativo de PCR llamado "análisis cinética" discreto en
primer lugar en Higuchi et al., BioTechnology 10,
413-17, 1992, y Higuchi et al., BioTechnology
11, 1026-30, 1993. El principio es que cualquier
ciclo dado dentro de la fase exponencial de la PCR, la cantidad de
producto es proporcional al número inicial de copias del molde.
Si la amplificación se realiza en la presencia
de un oligonucleótido fluorescentes inactivado de manera interna
(sonda Taqman) complementario con la secuencia diana, la sonda se
escinde mediante la actividad de la endonucleasa
5'-3' de Taq ADN polimerasa y un tinte fluorescente
liberado en el medio (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 88, 727 6-80, 1991). Debido a la emisión de
fluorescencia se incrementará en proporción directa con la cantidad
del producto amplificado específico, se puede detectar la fase de
crecimiento exponencial del producto de PCR y usarse para
determinar la concentración del molde inicial (Heid et al.,
Genome Res. 6, 986-94, 1996, y Gibson et al.,
Genome Res. 6, 995-1001, 1996).
La amplificación de un control endógeno se puede
realizar para estandarizar la cantidad de ARN de muestra añdida a
una reacción. En este tipo de experimento, el control de elección es
el ARN ribosómico 18S. Debido a que los tintes indicadores con
diferentes espectros de emisión están disponibles, la diana y el
control endógeno se puede cuantificar de manera independiente en el
mismo tubo si se usan las sondas se etiquetan con diferentes
tipos.
Todas las mediciones de "PCR de tiempo
real" de fluorescencia se realizan en ABI Prism 7700.
Extracción de ARN y preparación de ADNc.
ARN total de los tejidos enumerados anteriormente se usan para la
cuantificación de la expresión. Los ARN marcados "de autopsia"
se extrajeron a partir de tejidos autópcticos con el reactivo
TRIzol (Life Technologies, MD) de acuerdo con el protocolo de del
fabricante.
Cincuenta \mug de cada ARN se trataron con
ADNasa I durante 1 hora a 37ºC in en la siguiente mezcla de
reacción: 0,2 U/\mul sin ARNasa I (Roche Diagnostics, Alemania);
0,4 U/\mul de inhibidor de la ARNasa (PE Applied Biosystems, CA);
10 mM Tris-HCl pH 7,9; 10 mM MgCl_{2}; 50 mM NaCl;
y 1 mM DTT.
Después de la incubación, se extrae el ARN una
vez con 1 volumen de fenol:cloroformo: alcohol isoamílico (24:24:1)
y una vez con cloroformo, y se precipitó con 1/10 volúmenes de 3 M
de acetato de sodio, pH 5,2, y 2 volúmenes de etanol.
Cincuenta \mug de cada ARN de los tejidos
autópcticos se trataron con el kit sin ADNasathe comprado en Ambion
(Ambion, TX). Después de la resuspensión y cuantificación
espectrofotométrica de cada muestra se transcribe de manera inversa
con los reactivos de Transcripción inversa de TaqMan (PE Applied
Biosystems, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La
concentración final de ARN en la mezcla de reacción es 200
ng/\mul. La transcripción inversa se lleva a cabo con 2,5 \muM
de cebadores de hexámeros al azar.
Análisis cuantitativo de TaqMan. Se
diseñan cebadores y sonda específicos de acuerdo con las
recomendaciones de PE Applied Biosystems; la sonda se puede
etiquetar en el extremo de 5' con FAM
(6-carboxi-fluoresceína) y en el
extremo 3' con TAMRA (6-carboxi
tetrametil-rodamina). Los experimentos de
cuantificación se realizan sobre 10 ng de ARN transcrito de manera
inversa a partir de cada muestra. Cada determinación se realiza por
triplicado.
El contenido de ADNc total se normaliza con la
cuantificación simultánea (multiplex PCR) del ARN ribosómico 18S
usando los reactivos del ensayo TaqMan desarrollados previamente
(PDAR) kit de control (PE Applied Biosystems, CA).
La mezcla de reacción de ensayo es como sigue:
1X final TaqMan Universal PCR Master Mix (a partir de solución
solución madre 2 X) (PE Applied Biosystems, CA); 1 X PDAR
control-ARN 18S (a partir de solución madre 20 X);
300 nM de cebador directo; 900 nM de cebador inverso; 200 nM de
sonda; 10 ng de ADNc; y agua hasta 25 \mul.
Se llevan a cabo cada una de las siguientes
etapas una vez: pre PCR, 2 minutos a 50ºC, y 10 minutos a 95ºC. Se
llevan a cabo las siguientes etapas 40 veces: desnaturalización, 15
segundos a 95ºC, hibridación/extensión, 1 minuto a 60ºC.
El experimento se realiza sobre un detector de
secuencia ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, CA). Al final del
experimento, los datos de fluorescencia adquiridos durante la PCR se
procesan como se describe en el manual de usuarios de ABI Prism
7700 in con el fin de lograr mejor sustracción del fondo así como
linealidad de señal con la cantidad diana de partida.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ARN celular total a partir de células
mediante uno de dos procedimientos estándar: (1) centrifugación en
gradiente de densidad de isotiocianato de guanidina/cloruro de cesio
o (2) el protocolo reactivo Tri de acuerdo con las especificaciones
del fabricante (Molecular Research Center, Inc., Cincinatti, Ohio).
El ARN total preparado mediante del reactivo Tri se trató con
ADNasa I para reatirar la contaminación de ADN genómico. Se aisló
ARN a partir de las siguientes fuentes: células de músculo liso
coronario; cerebro, tesctículos, páncreas, estómago, cerebelo,
tráquea, glándula adrenal, músculo esquelético, glándula salivar,
intestino delgado, próstata, hígado fetal, placenta, cerebro fetal,
útero, glándula mamaria, corazón, bazo, pulmón, células HeLa,
hígado, riñón, timo, médula ósea, tiroides, colon, vejiga, médula
espinal, sangre periférica, hígado, cirrosis hepática, páncreas,
cirrosis hepática, bazo, cirrosis hepática, cerebro total de
Alzheimer, pulmón fetal, tumor de mama, tumor de colon, tumor de
pulmón, células HEK 293, adiposo, pericardio, corazón fetal, tumor
de tiroides, células MDA MB 231, células HEP G2, células HUVEC,
riñón fetal, mama, células Jurkat T, córtex del cerebro de
Alzheimer, cerviz, esófago, tálamo, circunvolución precentral,
hipocampo, lóbulo occipital, pedúnculos cerebrales, circunvolución
postcentral, lóbulo temporal, lóbulo parietal, cerebelo (derecho),
cerebelo (izquierdo), amígdala de cerebelo, meninges cerebrales,
protuberancias, lóbulo frontal, córtex cerebral, cuerpo calloso,
vermix del cerebelo, lóbulo frontal del cerebro de Alzheimer, septo
interventricular, atrio del corazón (derecho), atrio del corazón
(izquierdo), y ventrículo del corazón (izquierdo).
Para la cuantificación relative de la
distribución de ARNm de GPCR humano, ARN total de cada fuente de
célula o de tejido se transcribió primero de manera inversa.
Ochenta y cinco \mug de ARN total RNA se transcribió de manera
inversa 1 \mumole de cebadores de hexámero aleatorios, 0,5 mM de
cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP (Qiagen, Hilden, Germany),
3000 U RnaseQut (Invitrogen, Groningen, Netherlands) en un volumen
final de 680 \mul. El tampon de síntesis de la primera hebra y
Omniscript (2 u/\mul) de transcriptasa inversa eran de (Qiagen,
Hilden, Alemania). La reacción se incubó a 37ºC durante 90 minutos y
se enfrió en hielo. El volumen se ajustó hasta 6800 \mul con
agua, produciendo una concentración final de 12.5 ng/\mul de ARN
de partida.
Para la cuantificación relativa de la
distribución de ARNm de GPCR humano en las células y tejidos se usó
el sistema de detección de secuencias Perkin Elmer ABI Prism®. 7700
o Biorad iCycler de acuerdo con las especificaciones y protocolos
del fabricante. Las reacciones de PCR se establecieron para el GPCR
humano cuantitativo y la administración de los genes HPRT, GAPDH,
beta-actina, y otros. Los cebadores directos e
inversos y sinda para el GPCR se diseñaron usando el software
Perkin Elmer ABI Piimer Express^{TM} y se sintetizaron mediante
TibMolBiol (Berlin, Alemania). La secuencia del cebador directo X
era: GGGTTACTGGTCCTGCCTCC. La secuencia del cebador inverso X era
AGAGGTTGGCAAGCAGGGA. La sonda fluorogénica, marcada con FAM como el
tinte indicador y TAMRA como inactivador, es
CGTCTACTTGGCTCCCAACTTCTCCTTCC.
Se establecieron las siguientes reacciones en un
volumen final de 25 \mul: tampón A 1X TaqMan A, 5,5 mM de
MgCl_{2}, 200 nM de cada uno def dATP, dCTP, dGTP, y dUTP, 0.025
U/\mul de AmpliTaq Oro.TM., 0,01 de U/\mul de AmpErase UNG® y
sonda 1X, cebadores directos e inversos de GPCR humano cada uno a
200 nM, 200 nM de sonda marcada con FAM/TAMRA de GPCR humano, y 5
\mul de ADNc de molde. Los parámetros del ciclo térmico eran 2
min HOLD a 50ºC, 10 min HOLD a 95ºC, seguido de una fusión a 95ºC
durante 15 sec e hibridación/extensión a 60ºC durante 1 min para
cada uno de los 40 ciclos.
\vskip1.000000\baselineskip
El valor de CT se calcula como se ha descrito
anteriormente. El valor de CF se calcula como sigue:
1. Se establecieron las reacciones de PCR para
cuantificar la administración de los genes (HKG) para cada muestra
de ADNc.
2. Los valores de CTHKG se calcularon como se ha
descrito anteriormente.
3. Se calculan los valores medios de CT se todos
los HKG para cada ADNc (n = número de HKG):
(Valor de CT _{HKG1} + Valor de CT _{HKG2} +
Valor de CT _{HKG-X}) / n = valores medios de CT
_{ADNc-X}
(n = número de los ADNc)
\newpage
4.
(Valor medio de CT _{ADNc-1} +
Valor medio de CT _{ADNc-X}) / y = valor medio de
CT _{panel}
(y = número de los ADNc)
\vskip1.000000\baselineskip
5.
(Valor medio de CT _{panel1} - Valor medio de
CT _{ADNc-X} = CF _{ADNc-X}
\vskip1.000000\baselineskip
6.
CT _{ADNc-X} + CF
_{ADNc-X} = CT
_{cor-ADNc-X}
\vskip1.000000\baselineskip
Definición:
La más alta CT
_{cor-ADNc-X \neq 40} se define
como CT _{cor-ADNc-X} [alto]
Expresión relativa = 2e(CT
_{cor-ADNc-X} [alto] - CT
_{cor-ADNc-Y})
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la cuantificación de ARNm
(perfil de expresión) is se muestra en las Figs.
11-13.
El ARNm de GPCR humano se expresa en diferentes
tejidos humanos. Se expresa en gran medida en la circunvolución
postcentral, meninges cerebrales, corazón (atrio: izquierdo +
derecho), sangre periférica, pulmón tumor, hígado fetal, hígado
(cirrosis), estómago, intestino delgado, colon, riñón, riñón fetal,
tumor de mama, glándula mamaria, tráquea, placenta.
El ARNm de GPCR humano se expresa en gran medida
en tejidos de cerebro como circunvolución postcentral y meninges
cerebrales. Los expresión en los tejidos anteriormente mencionados
sugiere una asociación entre GPCR humano y enfermedades periféricas
y del sistema nervioso central.
El ARNm de GPCR humano se expresa en gran medida
en tumor de pulmón y tumor de mama. La expresión en los tejidos
anteriormente mencionados sugiere una asociación entre GPCR humano y
cáncer.
El ARNm de GPCR humano se expresa en gran medida
en hígado, hígado (cirrosis hepática), riñón, riñón fetal. La
expresión en los tejidos anteriormente mencionados sugiere una
asociación entre GPCR humano y enfermedades del hígado y riñón.
El ARNm de GPCR humano se expresa en gran medida
en placenta. La expresión en los tejidos anteriormente mencionados
sugiere una asociación entre GPCR humano y enfermedades genito
urinarias.
El ARNm de GPCR humano se expresa en gran medida
en glándula mamaria. La expresión en los tejidos anteriormente
mencionados sugiere una asociación entre GPCR humano y enfermedades
de los órganos secretores.
El ARNm de GPCR humano se expresa en gran medida
en la sangre periférica. La expresión en los tejidos anteriormente
mencionados sugiere una asociación entre GPCR humano y hematología,
asma y COPD.
El ARNm de GPCR humano se expresa en gran medida
en corazón. La expresión en los tejidos anteriormente mencionados
sugiere una asociación entre GPCR humano y enfermedades
cardiovasculares.
<110> Bayer AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> REGULACIÓN DEL RECEPTOR ACOPLADO A
LA PROTEÍNA G HUMANA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Lio 302
\vskip0.400000\baselineskip
<150> USSN 60/269,410
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-02-20
\vskip0.400000\baselineskip
<150> USSN 60/323,809
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-09-21
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 990
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 456
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 434
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (391)..(392)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a, t, g o c
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Un procedimiento para la detección de un
polinucleótido que codifica un polipéptido del receptor acoplado a
la proteína G en una muestra biológica que comprende las siguientes
etapas:
I) hibridar un polinucleótido seleccionado entre
el grupo constituido por:
- a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por:
- i.
- secuencias de aminoácidos que son al menos un 50% idénticas a las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 2; y
- ii.
- las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 2.
- b)
- a polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1;
- c)
- un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido especificado en (a) y (b) y codifica un Polipéptido del receptor acoplado a la proteína G;
- d)
- un polinucleótido cuya secuencia se deriva las secuencias de polinucleótido especificadas en (a) a (c) debido a la generación del código genético y codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G; y
- e)
- un polinucleótido que representa un fragmento o o variación alélica de una secuencia de polinucleótidos especificada en (a) a (d) y codifica un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G a un material de ácido nucleico de una muestra biológica, formando de esta forma un complejo de hibridación; y
II) detectar dicho complejo de hibridación.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que antes de la hibridación, se amplifica el material de ácido
nucleico de la muestra biológica.
3. Un procedimiento para la detección de un
polinucleótido de la reivindicación 1 o un polipéptido del receptor
acoplado a la proteína G codificado por tal polinucleótido que
comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra biológica con
un oligonucleótido que interactúa de manera específica con el
polinucleótido o con el anticuerpo que interactúa de manera
específica con el polipéptido del receptor acoplado a la proteína G
y
b) detectar la interacción.
4. Un procedimiento de selección de agentes
útiles para el tratamiento de cáncer de mama o de pulmón que
disminuye la actividad de un polipéptido del receptor acoplado a la
proteína G, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto un compuesto de ensayo con
cualquier polipéptido del receptor acoplado a la proteína G
codificado por un polinucleótido de la reivindicación 1:
b) detectar la unión del compuesto de ensayo al
polipéptido del receptor acoplado a la proteína G, en el que un
compuesto de ensayo que se une al polipéptido se identifica como un
agente terapéutico potencial para disminuir la actividad de un
polipéptido del receptor acoplado a la proteína G.
5. Un procedimiento de selección de agentes
útiles para el tratamiento de cáncer de colon que incrementa la
actividad de un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G,
que comprende las etapas de:
a) poner en contacto un compuesto de ensayo con
un polipéptido del receptor acoplado a la proteína G codificado por
un polinucleótido de la reivindicación 1; y
b) detectar una actividad del receptor acoplado
a la proteína G del polipéptido, en el que un compuesto de ensayo
que incrementa la actividad del receptor acoplado a la proteína G se
identifica como un agente terapéutico potencial para el tratamiento
de cáncer de colon.
6. Un procedimiento de selección de agentes
útiles para el tratamiento de cáncer de pulmón o de mama que
disminuye la actividad del polipéptido del receptor acoplado a la
proteína G, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto un compuesto de ensayo con
cualquier polinucleótido de la reivindicación 1; y
\newpage
b) detectar la unión del compuesto de ensayo al
polinucleótido, en el que un compuesto de ensayo que se une al
polinucleótido se identifica como un agente terapéutico potencial
para disminuir la actividad de un polipéptido del receptor acoplado
a la proteína G.
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