KR20010080882A - 구성적으로 활성화된 비내생성 인간 ｇ 단백질 결합형수용체 - Google Patents

구성적으로 활성화된 비내생성 인간 ｇ 단백질 결합형수용체 Download PDF

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리처드 피. 버군 쥬니어
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Abstract

본 특허 명세서에 개시된 본 발명은 막횡단 수용체, 더욱 특별하게는 내생성 리간드가 알려지지 않은 ("고아 GPCR 수용체") 인간 G 단백질 결합형 수용체에 관한 것이며, 가장 특별하게는 구성적 활성을 부여하기 위해 돌연변이된 (비내생성) 형태의 인간 GPCR에 관한 것이다.

Description

구성적으로 활성화된 비내생성 인간 Ｇ 단백질 결합형 수용체 {Non-Endogenous, Constitutively Activated Human G Protein-Coupled Receptors}
인간에게 있어서 많은 유형의 수용체가 존재하지만, 가장 풍부하며 치료적으로 관련되는 것으로는 G 단백질 결합형 수용체(GPCR) 유형이 대표적이다. 인간 게놈 내에는 수십만개의 유전자가 있으며, 이들 중 대략 2% 또는 2,000개의 유전자가 GPCR을 코딩하는 것으로 추정된다. GPCR를 포함하여 내생성 리간드가 동정된 수용체는 "공지" 수용체로 지칭하며, 내생성 리간드가 동정되지 않은 수용체는 "고아(orphan)" 수용체로 지칭한다. GPCR은 약학 제품의 개발을 위한 중요한 영역을 제시하며, 모든 처방 의약의 60%가 100개의 공지 GPCR 중 대략 20개로부터 개발되었다.
GPCR은 공통의 구조적 모티프를 공유한다. 이들 수용체 모두는 22 내지 24개의 소수성 아미노산이 7번 연속되어 7개의 알파 헬릭스를 형성하며, 이들 헬릭스 각각은 세포막을 가로지른다 (세포막에 걸친 부분 각각은 번호로, 즉 막횡단부-1 (TM-1), 막횡단부-2 (TM-2) 등으로 식별된다). 막횡단 헬릭스는 세포막의 외부 또는 "세포외" 측에서 막횡단부-2와 막횡단부-3 사이, 막횡단부-4와 막횡단부-5 사이, 및 막횡단부-6과 막횡단부-7 사이의 아미노산 스트랜드(이들은 각각 세포외 부위 1, 2 및 3 (EC-1, EC-2 및 EC-3)으로 지칭됨)에 의해 연결된다. 막횡단 헬릭스는 또한 세포막의 내부 또는 "세포내" 측에서 막횡단부-1과 막횡단부-2 사이, 막횡단부-3과 막횡단부-4 사이, 및 막횡단부-5와 막횡단부-6 사이의 아미노산 스트신호 전달 2 및 3 (IC-1, IC-2 및 IC-3)으로 지칭됨)에 의해 연결된다. 수용체의 카르복시 ("C") 말단은 세포안의 세포내 공간에 놓이고, 수용체의 아미노 ("N") 말단은 세포밖의 세포외 공간에 놓인다.
일반적으로, 내생성 리간드가 수용체와 결합하는 경우 (종종, 수용체의 "활성화"로 지칭), 세포내 부위의 형태가 변화하여 세포내 부위와 세포내 "G-단백질" 사이에 결합이 일어난다. GPCR은 G 단백질과 관련하여 "무차별성 (promiscuous)"이라는, 즉 하나 이상의 G 단백질과 상호작용할 수 있다는 것으로 보고되었다 ([Kenakin, T., 43 Life Sciences 1095 (1988)] 참조). 다른 G 단백질도 존재하지만, 현재 Gq, Gs, Gi, Gz 및 Go가 동정된 G 단백질이다. 내생성 리간드에 의해 활성화된 GPCR과 G-단백질의 결합은 신호를 보내는 일련의 연속 반응 ("신호 전달"로 칭함)을 개시한다. 정상 조건 하에서, 신호 전달은 궁극적으로 세포 활성화 또는 세포 억제를 초래한다. 수용체의 IC-3 루프 뿐만 아니라 카르복시 말단이 G 단백질과 상호작용한다고 생각된다.
생리적 조건하에서, GPCR은 "불활성" 상태 및 "활성" 상태라는 두 상이한 형태가 평형을 이루면서 세포막에 존재한다. 불활성 상태의 수용체는 세포내 신호 전달 경로에 연계되어 생물학적 반응을 이끌어낼 수 없다. 활성 상태로 수용체 형태가 변화하면 전달 경로로의 연결 (G-단백질을 통해)이 허용되어 생물학적 반응을 이끌어낸다.
수용체는 내생성 리간드 또는 약물과 같은 화합물에 의해 활성 상태로 안정화될 수 있다. 제한되지는 않지만 수용체의 아미노산 서열의 변형을 포함하는 최근의 발견으로 수용체를 활성 상태 형태로 촉진하고, 안정화하는 데 내생성 리간드 또는 약물 이외의 수단이 제공된다. 이러한 수단은 수용체에 결합하는 내생성 리간드 효과를 모사함으로써 수용체를 활성 상태로 효과적으로 안정화한다. 이러한 리간드-독립적 수단에 의한 안정화가 "구성적 수용체 활성화"로 명명된다.
<발명의 요약>
비내생성 형태의 내생성 인간 GPCR 및 그의 용도가 본원에 개시된다.
본 출원은 1998년 10월 13일 미국 특허청에 출원된 미국 특허 출원 제09/170,496호를 우선권 주장하는 부분 계속출원이다. 또한, 본 출원은 하기 지정된 일자에 미국 특허청에 미국 특급우편으로 제출된 가출원을 우선권 주장한다. 1998년 11월 27일 출원된 미국 가출원 제60/110,060호; 1999년 2월 16일 출원된 미국 가출원 제60/120,416호; 1998년 11월 20일 출원된 미국 가출원 제60/109,213호를 우선권 주장하며 1999년 2월 26일 출원된 미국 가출원 제60/121,852호; 1999년 3월 12일 출원된 미국 가출원 제60/123,944호; 1999년 3월 12일 출원된 미국 가출원 제60/123,945호; 1999년 3월 12일 출원된 미국 가출원 제60/123,948호; 1999년 3월 12일 출원된 미국 가출원 제60/123,951호; 1999년 3월 12일 출원된 미국 가출원 제60/123,946호; 1999년 3월 12일 출원된 미국 가출원 제60/123,949호; 1999년 8월 27일 출원된 미국 가출원 제60/151,114호 및 1998년 11월 12일 출원된 미국 가출원 제60/108,029호를 우선권 주장하며 1999년 9월 3일 출원된 미국 가출원 제60/152,524호; 1999년 5월 28일 출원된 미국 가출원 제60/136,436호; 1999년 5월 28일 출원된 미국 가출원 제60/136,439호; 1999년 5월 28일 출원된 미국 가출원 제60/136,567호; 1999년 5월 28일 출원된 미국 가출원 제60/137,127호; 1999년 5월28일 출원된 미국 가출원 제60/137,131호; 1999년 5월 28일 출원된 미국 가출원 제60/136,437호를 우선권 주장하며 1999년 6월 29일 출원된 미국 가출원 제60/141,448호; 1999년 9월 29일 출원된 미국 가출원 제60/156,633호; 1999년 9월 29일 출원된 미국 가출원 제60/156,555호; 1999년 9월 29일 출원된 미국 가출원 (아레나 파마슈티칼스, 인크(Arena Pharmaceuticals, Inc.), 서류번호: CHN10-1); 1999년 10월 1일 출원된 미국 가출원 (아레나 파마슈티칼스, 인크, 서류번호: RUP6-1); 1999년 10월 1일 출원된 미국 가출원 (아레나 파마슈티칼스, 인크, 서류번호: RUP7-1); 1999년 10월 1일 출원된 미국 가출원 (아레나 파마슈티칼스, 인크, 서류번호: CHN6-1); 1999년 10월 1일 출원된 미국 가출원 (아레나 파마슈티칼스, 인크, 서류번호: RUP5-1) 및 1999년 10월 1일 출원된 미국 가출원 (아레나 파마슈티칼스, 인크, 서류번호: CHN9-1). 본 출원은 또한 함께 계류중인 1999년 10월 12일 출원된 (특급우편편) 미국 특허 출원 (우드콕, 워시번, 쿠르츠, 마키윅즈 앤 노리스, 엘엘피 서류번호 AREN-0050) 및 1999년 7월 30일 출원된 미국 특허 출원 제09/364,425호에 관한 것으로, 이들 모두가 본원에 참고로 도입된다. 본 출원은 또한 본원에 그 전체가 참고로 도입되는 1999년 10월 12일 출원된 (특급우편편) 미국 특허 출원 (우드콕, 워시번, 쿠르츠, 마키윅즈 앤 노리스, 엘엘피 서류번호 AREN-0054)을 우선권 주장한다. 상기 출원들은 각각 본원에 그 전체를 참고로 도입된다.
본 특허 명세서에 개시된 발명은 막횡단 수용체, 더욱 특별하게는 인간 G 단백질 결합형 수용체(GPCR)에 관한 것으로, 구체적으로는 수용체의 구성적 활성을구축하거나 강화하도록 변형된 GPCR에 관한 것이다. 바람직하게는 변형된 GPCR은 후보 화합물을 치료제로서의 잠재적인 용도를 갖는 수용체 효능제, 역효능제 또는 부분 효능제로 직접 동정하는 데 사용된다.
도 1은 8XCRE-Luc 리포터 플라스미드를 나타내는 도면 (실시예 4(c)3 참조).
도 2a 및 도 2b는 내생성 TDAG8에 대한 ATP 및 ADP 결합 결과 (도 2a) 및 혈청 및 무-혈청 배지에서의 비교 (도 2b)를 나타내는 그래프.
도 3은 CMV 대 GPCR 융합 단백질 H9(F236K):Gsα의 비교 신호 결과를 나타내는 그래프.
수용체에 관련된 과학 문헌은 수용체에 대한 다양한 효과를 갖는 리간드를 언급하기 위하여 많은 용어를 채택한다. 명확성과 일관성을 위하여, 하기 정의가 본 특허 명세서 전반에 사용된다. 이러한 정의가 이들 용어의 다른 정의와 상충될 때 하기 정의가 적용된다.
"효능제"는 이들이 수용체에 결합할 때 세포내 반응을 활성화시키거나, 또는 막에 대한 GTP 결합을 강화하는 물질 (예, 리간드, 후보 화합물)을 의미한다.
본원에서 사용된 아미노산 약어를 하기 표 A에 기재한다.
"부분 효능제"는 이들이 수용체에 결합할 때 세포내 반응을 효능제에 비해 더 낮은 수준/정도로 활성화시키거나, 또는 막에 대한 GTP 결합을 효능제에 비해 더 낮은 수준/정도로 강화하는 물질 (예, 리간드, 후보 화합물)을 의미한다.
"길항제"는 효능제와 동일한 부위에서 수용체에 경쟁적으로 결합하지만 수용체의 활성형태에 의해 개시되는 세포내 반응을 활성화시키지 않으며, 효능제 또는 부분 효능제에 의한 세포내 반응을 억제할 수 있는 물질 (예를 들면, 리간드, 후보 화합물)을 의미한다. 길항제는 효능제 또는 부분 효능제 부재시의 세포내 반응 기준값을 감소시키지는 않는다.
"후보 화합물"은 스크리닝 기술을 적용할 수 있는 분자 (예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만 화합물)를 의미한다. 바람직하게는, "후보 화합물"이라는 용어는 이미 간접적인 동정 방법으로 판정하여 수용체에 대한 역효능제, 효능제 또는 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 화합물로 공지된 화합물 (간접적으로 동정된 화합물)을 포함하지 않으며, 더욱 바람직하게는 이미 1종 이상의 포유류에서 치료 효능을 갖는 것으로 판정된 간접적으로 동정된 화합물, 가장 바람직하게는 이미 인간에 있어서 치료적 유용성을 갖는 것으로 판정된 간접적으로 동정된 화합물을 포함하지 않는다.
"조성물"은 하나 이상의 성분을 포함하는 물질로, "제약 조성물"은 조성물의 일례이다.
"화합물 효능"은 수용체 결합 친화도와 대립되는 것으로 수용체 작용성을 억제하거나 또는 자극할 수 있는 화합물의 능력의 측정치를 의미한다. 화합물 효능을 검출하는 예시적인 수단은 본 특허 명세서의 실시예 부분에 개시된다.
"코돈"은 일반적으로 인산기에 결합된 뉴클레오시드 (아데노신 (A), 구아노신 (G), 사이티딘 (C), 우리딘 (U) 및 티미딘 (T))를 포함하며, 번역될 때 아미노산을 코딩하는 세 개의 연속하는 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드 균등물)를 의미한다.
"구성적으로 활성화된 수용체"는 구성적 수용체 활성화가 수행된 수용체를 의미한다. 구성적으로 활성화된 수용체는 내생성 또는 비내생성일 수 있다.
"구성적 수용체 활성화"는 수용체와 그에 대한 내생성 리간드 또는 그의 화학적 균등물과의 결합 이외의 수단에 의해 활성화 상태로 수용체를 안정화하는 것을 의미한다.
"접촉 또는 접촉함"은 시험관내 시스템 또는 생체내 시스템에서 둘 이상의잔기를 함께 모으는 것을 의미한다.
"후보 화합물"과 관련하여 "직접 동정" 또는 "직접적으로 동정된"은 구성적으로 활성화된 수용체, 바람직하게는 구성적으로 활성화된 고아 수용체, 가장 바람직하게는 구성적으로 활성화된 G 단백질 결합형 세포 표면 고아 수용체에 대해 후보 화합물을 스크리닝하여 이러한 화합물의 화합물 효능을 평가하는 것을 의미한다. 이 용어가 "간접 동정" 또는 "간접적으로 동정된"이라는 용어를 포함하거나 반대로 거기에 포함되는 것으로 해석되거나 이해되는 것은 결코 아니다.
"내생성"은 포유류가 자연적으로 생산하는 물질을 의미한다. 예를 들어 제한되는 것은 아니지만 용어 "수용체"와 관련하여 "내생성"은 포유류 (예를 들면, 제한되는 것은 아니지만 인간) 또는 바이러스에 의하여 자연적으로 생산되는 것을 의미한다. 대조적으로, 이러한 문맥에서 용어 "비내생성"은 포유류 (예를 들면, 제한되는 것은 아니지만 인간) 또는 바이러스에 의하여 자연적으로 생산되지 않는 것을 의미한다. 예를 들면, 내생성 형태로는 구성적으로 활성이 아니지만 조작되어 구성적으로 활성이 된 수용체를 본 명세서에서는 가장 바람직하게는 "구성적으로 활성화된 비내생성 수용체"로 지칭한다. 이들 두 가지 용어 모두는 "생체내" 및 "시험관내" 시스템 모두를 설명하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 제한되는 것은 아니지만, 스크리닝 접근에서, 내생성 또는 비내생성 수용체는 시험관내 스크리닝 시스템과 관련될 수 있다. 또 다른 예로서 제한되는 것은 아니지만, 포유류의 게놈이 구성적으로 활성화된 비내생성 수용체를 포함하도록 조작되는 경우, 생체내 시스템을 사용하여 후보 화합물을 스크리닝하는 것도 가능하다.
본원에 개시된 본 발명의 내용에서 "G 단백질 결합형 수용체 융합 단백질" 및 "GPCR 융합 단백질" 각각은 하나 이상의 G 단백질, 가장 바람직하게는 이러한 G 단백질의 알파 (α) 서브유닛 (이 서브유닛이 GTP에 결합하는 것임)에 융합된 구성적으로 활성화된 내생성 GPCR 또는 구성적으로 활성화된 비내생성 GPCR을 포함하며, 바람직하게는 상기 G 단백질이 내생성 고아 GPCR과 자연적으로 결합하는 G 단백질과 동일한 유형인, 비내생성 단백질을 의미한다. 예를 들면 제한되는 것은 아니지만, 내생성 상태에서 G 단백질 "Gsα"가 GPCR과 결합하는 지배적인 G 단백질이라면, 특정 GPCR을 기재로 한 GPCR 융합 단백질은 Gsα에 융합된 이 GPCR을 포함하는 비내생성 단백질일 것이며, 하기에 기재되는 것처럼 어떤 경우에는 비지배적인 G 단백질이 GPCR에 융합될 수 있다. G 단백질은 구성적으로 활성인 GPCR의 c-말단에 직접 융합되거나, 둘 사이에 스페이서 (spacer)가 존재할 수 있다.
"숙주 세포"는 그 안에 플라스미드 및(또는) 벡터가 도입될 수 있는 세포를 의미한다. 원핵 숙주세포의 경우, 플라스미드는 통상적으로 숙주 세포가 복제될 때 자율적으로 복제되고 (일반적으로, 그 후 플라스미드는 진핵 숙주 세포로 도입되기 위하여 단리됨); 진핵 숙주세포의 경우 플라스미드는 진핵 숙주세포가 복제할 때 플라스미드가 복제되도록 숙주 세포의 세포내 DNA에 통합된다. 바람직하게는 본원에 개시된 본 발명의 목적상, 숙주 세포는 진핵, 더욱 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 293, 293T 및 COS-7 세포로 이루어지는 군에서 선택된다.
"간접 동정" 또는 "간접적으로 동정된"은 내생성 수용체에 특이적인 내생성 리간드의 동정, 리간드-수용체 상호작용을 방해하고(거나) 경쟁하는 후보 화합물을결정하기 위한 수용체에 대한 후보 화합물의 스크리닝, 및 활성화된 수용체와 관련된 하나 이상의 2차 메신저 경로에 영향을 미치는 화합물의 효능을 평가하는 것을 포함하는 약물 전달 과정에 대한 전통적인 접근법을 의미한다.
용어 "반응"과 관련하여 "억제하다" 또는 "억제"는 화합물이 존재하지 않을 때와 달리 존재하는 경우 반응이 감소되거나 또는 방지되는 것을 의미한다.
"역효능제"는 내생성 형태의 수용체 또는 구성적으로 활성화된 형태의 수용체에 결합하여 활성 형태의 수용체에 의하여 개시되는 세포내 반응의 기준값을 효능제 또는 부분 효능제의 부재하에서 관찰되는 활성의 정상 기준 수준 미만으로 억제하거나 막에 대한 GTP 결합을 감소시키는 물질 (예를 들면, 리간드, 후보 화합물)을 의미한다. 바람직하게는 세포내 반응 기준값은 역효능제의 부재하에서의 반응 기준값과 비교하였을 때 역효능제의 존재하에서 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상 억제된다.
"공지 수용체"는 그 수용체에 특이적인 내생성 리간드가 동정된 내생성 수용체를 의미한다.
"리간드"는 자연적으로 발생하는 내생성 수용체에 특이적인, 자연적으로 발생하는 분자를 의미한다.
내생성 수용체의 핵산 및(또는) 아미노산 서열과 관련하여 "돌연변이체" 또는 "돌연변이"는 구성적으로 활성화되지 않은 내생성 수용체의 돌연변이된 형태가 수용체의 구성적 활성화를 나타내도록 하는 그러한 서열의 특정 변화 또는 변화들을 의미한다. 특정 서열에 대한 균등물로서, (a) 인간 수용체의 후속의 돌연변이된 형태의 구성적 활성화 수준이 수용체의 제1 돌연변이에 의하여 증거되는 것과 실질적으로 동일하고, (b) 수용체의 후속 돌연변이 형태와 수용체의 제1 돌연변이 사이의 서열 상동성 (아미노산 및(또는) 핵산) 백분율이 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이라면, 인간 수용체의 후속의 돌변변이된 형태도 인간 수용체의 제1 돌연변이와 동일한 것으로 고려된다. 이상적으로, 구성적 활성화를 달성하기 위하여 본원에 개시된 가장 바람직한 카세트의 경우 GPCR의 내생성 형태와 비내생성 형태 사이에 단 하나의 아미노산 및(또는) 코돈 변화만이 있다는 사실을 볼 때 서열 상동성 백분율은 98% 이상이어야 한다.
"비고아 수용체"는 수용체에 대한 리간드의 결합이 세포내 신호전달 경로를 활성화하는 자연적으로 발생하는, 내생성 리간드에 특이적인 자연적으로 발생하는 내생성 분자를 의미한다.
"고아 수용체"는 그 수용체에 특이적인 내생성 리간드가 동정되지 않았거나 공지되지 않은 내생성 수용체를 의미한다.
"제약 조성물"은 하나 이상의 활성 성분을 포함하여, 포유류 (예를 들면, 제한되는 것은 아니지만 인간)에서 특정된 유효한 결과가 조사될 수 있는 조성물을 의미한다. 당업자는 활성 성분이 당업자의 필요를 기초로 하여 목적하는 유효한 결과를 갖는지를 결정하기 위한 적합한 기술을 이해하며 인식할 것이다.
"플라스미드"는 벡터와 cDNA의 조합물을 의미한다. 일반적으로, 플라스미드는 cDNA의 복제 및(또는) 단백질로의 발현을 목적으로 숙주 세포에 도입된다.
용어 "반응"과 관련하여 "자극" 또는 "자극하는"은 그 화합물이 없을 때와달리 존재하에서 반응이 증가함을 의미한다.
cDNA와 관련하여 "벡터"는 하나 이상의 cDNA를 도입할 수 있고, 숙주 세포에 도입할 수 있는 환상의 DNA를 의미한다.
하기 서술 방식은 설명상의 편의를 위한 것이며, 본원의 개시내용이나 하기 특허청구의 범위에 대한 제한을 의도하거나 그렇게 해석되는 것은 아니다.
A. 서론
수용체에 관한 전통적인 연구는 항상 내생성 리간드가 먼저 동정된 후에야 그 수용체에 영향을 미칠 수 있는 길항제 및 다른 분자를 발견하는 것이 진행될 수 있다는 우선적인 가정 (역사적 근거)으로부터 수행되었다. 길항제가 먼저 알려질 수도 있을 것 같은 경우에도, 연구는 즉시 내생성 리간드를 찾는 데로 확장되어 왔다. 구성적으로 활성화된 수용체의 발견 후에도 수용체 연구에서 이러한 사고 방식은 견지되었다. 수용체의 활성 상태가 그 수용체의 효능제, 부분 효능제 및 역효능제의 발견에 가장 유용하다는 것을 지금까지는 인식하지 못했다. 과활성 수용체 또는 저활성 수용체로부터 초래되는 질환의 경우, 치료적 약물에서 요구되는 것은 수용체의 활성 상태를 감소시키거나 또는 수용체의 활성을 강화시키는 작용을 하는 화합물로, 내생성 리간드에 대한 길항제인 약물이 필수적이지는 않다. 이것은 활성 수용체 상태의 활성을 감소시키거나 또는 강화시키는 화합물이 내생성 리간드와 동일한 부위에 결합할 필요는 없기 때문이다. 따라서, 본 발명의 방법에 교시된 것처럼, 치료적 화합물에 대한 모든 연구는 리간드-독립적 활성 상태에 대하여 화합물을 스크리닝하는 것으로부터 출발해야 한다.
B. 인간 GPCR의 동정
인간 게놈 프로젝트의 수행으로 인간 게놈 내에 위치한 핵산 서열과 관련하여 많은 정보가 동정되었으며, 이러한 노력으로 임의의 특정 게놈 서열이 인간 단백질로 번역되는 개방해독틀 정보를 함유하거나 함유할 수 있는 지에 대한 이해나 인식없이 유전 서열 정보가 이용가능하게 되었다. 인간 게놈 내의 핵산 서열을 동정하는 여러 방법은 당 분야의 숙련자의 이해할 수 있는 범위 내에 있다. 예를 들면, 제한되는 것은 아니지만, GeneBank(등록상표) 데이터베이스를 조사함으로써 본원에서 개시된 다양한 인간 GPCR이 발견되었고, 다른 GPCR은 아미 서열이 밝혀진 GPCR의 핵산 서열을 이용하여 EST 데이터베이스의 BLAST(등록상표) 조사를 수행하여 발견되었다. 하기 표 B는 본 발명자들이 발견한 여러 내생성 GPCR을 GPCR 각각의 상동성 수용체와 함께 열거한다.
수용체 상동성은 인체 내에서의 수용체의 역할에 대한 이해를 얻는 데 있어서 유용하다. 본 특허 명세서가 전개됨에 따라, 본 발명자들은 이들 수용체의 구성적으로 활성화된 비내생성 형태를 구축하기 위한 이들 수용체의 돌연변이 기술을 개시할 것이다.
본원에서 개시된 기술은 본 특허 문헌의 전개에 따라 명백해지는 것처럼 당 분야에 공지된 다른 인간 고아 GPCR에 또한 적용되었다.
C. 수용체 스크리닝
본원에 개시된 인간 GPCR의 구성적으로 활성화된 비내생성 형태에 대한 후보 화합물의 스크리닝으로 수용체의 내생성 리간드의 사용을 필요로 하지 않으면서 이러한 세포 표면 수용체에 작용하는 후보 화합물을 직접 동정할 수 있다. 본원에 개시된 인간 GPCR의 내생성 형태가 발현되고(거나) 과발현되는 신체 내의 부위를 결정함으로써 수용체의 발현 및(또는) 과발현과 관련된 관련 질환/장애를 결정하는 것이 가능하며, 이러한 접근법이 본 특허 명세서에 개시된다.
본원에 개시된 인간 GPCR의 구성적 활성화를 나타낼 수 있는 돌연변이는 GPCR의 TM6 내에 위치되는 것으로 생각되는 프롤린 잔기로부터의 거리를 기초로 하며, 이러한 연산 기술은 함께 계류중이며, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 출원 제09/170,496호에 개시된다. 상기 연산 기술은 통상적인 서열 "정렬"에 입각한 것이 아니라 상기 언급된 TM6 프롤린 잔기로부터의 특정 거리에 바탕한 것이다. 사익 잔기로부터 16 아미노산 잔기만큼 떨어져 위치한 아미노산 잔기 (수용체의 IC3 부위에 위치할 것으로 예상됨)를, 가장 바람직하게는 리신 잔기로 돌연변이함으로써 이러한 활성화가 얻어질 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위하여 이 위치에서의 돌연변이에 다른 아미노산 잔기가 유용할 수 있다.
D. 질환/장애 동정 및(또는) 선별
하기에서 더욱 자세하게 설명되는 것처럼, 가장 바람직하게는 구성적으로 활성화된 비내생성 GPCR에 대한 역효능제가 본 발명의 방법에 의하여 동정될 수 있다. 이러한 역효능제가 이러한 수용체와 관련된 질환을 치료하기 위한 약물 개발 프로그램에서의 선도 화합물로의 이상적인 후보이다. GPCR에 대한 역효능제를 직접 동정하여 제약 조성물을 개발할 수 있기 때문에 GPCR과 관련된 질환 및 장애에 대한 연구는 관련된다. 예를 들면, 이제 GPCR 존재에 대하여 질병 및 정상 조직 시료 모두를 검사하는 것은 학술적인 실험 또는 특정 GPCR에 대한 내생성 리간드를 동정하는 경로에 따라 추구될 수 있는 것 이상이 되었다. 조직 검사는 다양한 건강 및 질환 조직에 걸쳐 수행될 수 있다. 이러한 조직 검사는 질환 및(또는) 장애를 특정 수용체와 연관시키는 데 있어 바람직한 첫 번째 단계를 제공한다 (예를 들면, 본원에 개시된 여러 GPCR의 예시적인 도트 블로팅 및 RT-PCR의 결과는 함께 계류중인 출원 (서류번호 ARE-0050)참조).
바람직하게는 인간 GPCR의 DNA 서열이 (a) 조직-mRNA에 대한 도트 블로팅 분석, 및(또는) (b) 조직 시료에서의 수용체 발현의 RT-PCR 동정을 위한 프로브를 제조하기 위하여 사용된다. 조직원 또는 질환 조직에서의 수용체의 존재, 또는 정상 조직에 비교하여 질환 조직에서의 증가된 농도의 수용체의 존재가, 예를 들면 이에 제한되지는 않지만 상기 질환과 관련된 질환을 포함하여 치료 처방과의 상관관계를동정하기 위하여 바람직하게 이용될 수 있다. 이러한 기술에 의해 수용체가 편재하는 기관 부위를 알아낼 수도 있다. 수용체가 편재하는 특정 조직의 공지된 기능을 기초로 하여, 수용체의 잠정적인 기능적 역할이 추론될 수 있다.
E. 후보 화합물의 스크리닝
1. 일반 GPCR 스크리닝 분석법
G 단백질 수용체가 구성적으로 활성이 될 때, 이것은 G 단백질 (예를 들면, Gq, Gs, Gi, Gz, Go)에 결합하여 G 단백질에 대한 GTP의 결합을 자극한다. 그 후, G 단백질은 GTPase로 작용하여, GTP를 GDP로 서서히 가수분해함으로써 정상적인 조건하에서는 수용체가 불활성화된다. 그러나, 구성적으로 활성화된 수용체는 GDP를 GTP로 교환하는 것을 계속한다. GTP의 비가수분해성 유사체 [35S]GTPγS를 사용하여, 구성적으로 활성화된 수용체를 발현하는 세포막에 대한 강화된 결합을 모니터할 수 있다. [35S]GTPγS를 이용하여 리간드의 부재 및 존재하에서 막에 대한 G 단백질 결합을 모니터할 수 있다고 보고되어 있다. 당업자에게 이용될 수 있으며 잘 공지된 예 중에서, 이러한 모니터의 예가 트레이너 및 나오르스키에 의해 1995년에 보고되었다. 이러한 분석 시스템은 이 시스템이 수용체의 세포내 영역과 상호작용하는 특정 G 단백질과 관계없이 모든 G 단백질 결합형 수용체에 일반적으로 적용될 수 있기 때문에 후보 화합물의 초기 스크리닝에 바람직하게 사용된다.
2. 특정 GPCR 스크리닝 분석법
"일반" G 단백질 결합형 수용체 분석법 (즉, 효능제, 부분 효능제, 또는 역효능제인 화합물을 선별하기 위한 분석법)을 사용하여 후보 화합물이 동정되면, 그 화합물들이 수용체 부위에서 상호작용했다는 것을 확인하기 위하여 추가로 스크리닝하는 것이 바람직하다. 예를 들면, "일반" 분석에 의하여 동정된 화합물이 수용체에 결합하지 않고 단지 세포내 도메인으로부터 G 단백질을 "분리"시킬 수도 있다.
a. Gs, Gz 및 Gi
Gs는 효소 아데닐릴 사이클라제를 자극한다. 반면, Gi (및 Gz 및 Go)는 이 효소를 억제한다. 아데닐릴 사이클라제는 ATP에서 cAMP로의 전환을 촉매하며, 따라서 Gs 단백질에 결합하는 구성적으로 활성화된 GPCR은 cAMP의 세포내 농도 증가와 관련된다. 반면, Gi (또는 Gz, Go) 단백질과 결합하는 구성적으로 활성화된 GPCR은 cAMP의 세포내 농도 감소와 관련된다 (일반적으로 ["Indirect Mechanism of Synaptic Transmission," Chpt. 8, From Neuron To Brain (3rd Ed.) Nichols, J.G. 등 eds. Sinauer Associates, Inc. (1992)] 참조). 따라서, cAMP를 검출하는 분석법은 후보 화합물이 예를 들면 수용체에 대한 역효능제인지를 결정하기 위하여 이용될 수 있다 (즉, 그러한 화합물은 cAMP 농도를 감소시킬 것이다). cAMP를 측정하기 위하여 당 분야에 공지된 다양한 접근법이 이용될 수 있으며, 가장 바람직한 접근법은 ELISA-기초 포맷에서의 항-cAMP 항체의 사용에 있다. 이용될 수 있는 또 다른 유형의 분석법은 전세포 2차 메신저 리포터 시스템 분석법이다. 유전자 상의 프로모터는 특정 유전자가 코딩하는 단백질의 발현을 추진시킨다. 사이클릭 AMP는 cAMP 반응 요소로 불리우는 특정 부위에서 프로모터에 결합하여 유전자 발현을 추진시키는 cAMP-반응성 DNA 결합 단백질 또는 전사 인자 (CREB)의 결합을 촉진함으로써 유전자 발현을 추진시킨다. 리포터 유전자, 예를 들면 β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제 앞에 여러 개의 cAMP 반응 요소를 함유하는 프로모터를 갖는 리포터 시스템이 구축될 수 있다. 따라서, 구성적으로 활성화된 Gs-연결 수용체는 cAMP의 축적을 야기하고, 축적된 cAMP는 유전자 및 리포터 단백질의 발현을 활성화한다. 그 후, β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제와 같은 리포터 단백질은 표준 생화학 분석법 (Chen 등, 1995)를 사용하여 검출할 수 있다.
b. Go 및 Gq
Gq 및 Go는 효소 포스포리파제 C의 활성화와 관련있으며, 포스포리파제 C는 포스포리피드 PIP2를 가수분해하여 2개의 세포내 메신저, 디아시클로글리세롤 (DAG) 및 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 (IP3)을 방출한다. IP3축적의 증가는 Gq- 및 Go-관련 수용체의 활성화와 관련 있다 (일반적으로 ["Indirect Mechanism of Synaptic Transmission," Chpt. 8, From Neuron To Brain (3rd Ed.) Nichols, J.G. 등 eds. Sinauer Associates, Inc. (1992)] 참조). IP3축적을 검출하는 분석법은 후보 화합물이 예를 들면 Gq- 또는 Go- 관련 수용체에 대하여 역효능제인지를 결정하기 위하여 이용될 수 있다 (즉, 그러한 화합물은 IP3농도를 감소시킬 것이다). 또한, Gq 관련 수용체는 AP1 리포터 분석법을 사용하여 조사할 수 있는데, 이는 Gq-의존적 포스포리파제 C가 AP1 요소를 함유하는 유전자를 활성화시키므로 활성화된 Gq-관련 수용체는 그러한 유전자 발현의 증가를 가져오고, 그에 대한 역효능제는 그러한 발현의 감소를 가져오며, 효능제는 그러한 발현의 증가를 가져올 것이기 때문이다. 그러한 검출을 위하여 상업적으로 이용가능한 분석법이 이용가능하다.
3. GPCR 융합 단백질
역효능제, 효능제 및 부분 효능제의 직접 동정을 위한 후보 화합물의 스크리닝에 사용하기 위한 구성적으로 활성화된 내생성 고아 GPCR 또는 구성적으로 활성화된 비내생성 고아 GPCR의 사용은 정의상 이러한 수용체가 결합된 내생성 리간드의 부재하에서조차 활성이라는 점에서 유의한 스크리닝 해법을 제공한다. 따라서, 예를 들면 후보 화합물의 존재하에서의 비내생성 수용체와 그러한 화합물의 부재하에서의 비내생성 수용체를 구별하여 그러한 화합물이 역효능제, 효능제, 부분 효능제일 수 있는지, 또는 그러한 수용체에 영향을 미치지 않는지에 대한 이해를 얻을 목적으로 그러한 구별을 강화할 수 있는 접근법을 이용하는 것이 바람직하다. 바람직한 접근법은 GPCR 융합 단백질을 사용하는 것이다.
일반적으로, 상기 기재된 분석법 (및 다른 방법)을 사용하여 비내생성 고아 GPCR이 구성적으로 활성화되었다고 판정되면, 내생성 GPCR과 결합되는 지배적인 G 단백질을 결정하는 것이 가능하다. GPCR에 대한 G 단백질의 결합은 평가될 수 있는 신호전달 경로를 제공한다. 스크리닝은 포유류 발현 시스템을 사용하여 수행되는 것이 가장 바람직하기 때문에, 이러한 시스템은 그 내에 내생성 G 단백질을 갖는 것이 기대된다. 따라서, 정의상, 이러한 시스템에서 구성적으로 활성화된 비내생성 고아 GPCR은 지속적으로 신호를 보낼 것이다. 이러한 면에서, 이러한 신호는 예를 들면 수용체에 대한 역효능제의 존재시 특히 스크리닝면에서 역효능제와 접촉할 때의 수용체를 더욱 용이하게 구별할 수 있도록 강화되는 것이 바람직하다.
GPCR 융합 단백질은 비내생성 GPCR과 결합하는 G 단백질의 효능을 강화하는 것이 의도된다. 구성적으로 활성화된 비내생성 GPCR을 사용한 스크리닝에서 이러한 접근법이 이러한 스크리닝 기술에서 가장 바람직하게 이용되는 신호를 증가시키기 때문에 GPCR 융합 단백질이 바람직하다. 이것은 유의한 "신호 대 잡음" 비율을 쉽게 얻는 데 중요하며, 이러한 유의한 비율은 본원에서 개시된 후보 화합물의 스크리닝을 위하여 바람직한 의미를 갖는다.
GPCR 융합 단백질의 발현에 유용한 구조물(construct)의 제작은 당업자의 영역 내에 있다. 상업적으로 이용가능한 발현 벡터 및 시스템이 조사자의 특정 필요를 충족시킬 수 있는 다양한 접근법을 제공한다. 그러한 GPCR 융합 단백질 구조물의 중요한 기준은 내생성 GPCR 서열과 G 단백질 서열의 프레임이 합치되며 (바람직하게는 내생성 GPCR의 서열이 G 단백질 서열의 상류에 있으며), GPCR의 발현시 G 단백질이 또한 발현될 수 있도록 GPCR의 정지 코돈이 결실되거나 또는 치환된 것이다. GPCR은 G 단백질에 직접 연결되거나 둘 사이에 스페이서 잔기 (바람직하게는, 약 12 이하로, 이 수는 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있음)가 존재할 수 있다. 본 발명자들은 사용되지 않은 몇몇 제한효소 부위가 발현시 효과적으로 스페이서가 될 수 있어 스페이서의 사용을 (편의성 면에서) 선호한다. 가장 바람직하게는, 비내생성 GPCR에 결합되는 G 단백질은 GPCR 융합 단백질 구조물의 제작 이전에 동정된 것이다. 단지 소수의 G 단백질이 동정되었기 때문에, G 단백질 서열을 포함하는 구조물 (즉, 일반 G 단백질 구조물)이 그 안에 내생성 GPCR 서열을 삽입하기 위하여 이용할 수 있는 것이 바람직하며, 이렇게 되면 상이한 서열을 갖는 다양한 상이한 내생성 GPCR의 대규모 스크리닝의 면에서 효율을 기할 수 있다.
상기 논의한 것처럼, Gi, Gz 및 Go에 결합되는 구성적으로 활성화된 GPCR은 cAMP의 형성을 억제하여 이런 유형의 GPCR을 기초로 한 분석법을 흥미롭게 만들 것으로 기대된다 (즉, cAMP 신호는 활성화에 따라 감소하여 예를 들면 역효능제 (이 신호를 더 감소시킬 수 있음)의 직접 동정을 유의하게 함). 본원에서 설명되는 것처럼, 이들 유형의 수용체의 경우 존립할 수 있는 사이클라제 기초 분석법을 구축하기 위한 노력에서 내생성 GPCR의 내생성 G 단백질을 기재로 하지 않는 GPCR 융합 단백질을 제작하는 것이 가능하다는 것을 확인하였다. 따라서, 예를 들면 H9와 같은 Gz 결합 수용체에 대해 GPCR 융합 단백질이 Gs 융합 단백질을 이용하여 구축될 수 있으며, 이러한 융합 구조물은 발현시 비내생성 GPCR이 예를 들면 "자연적인" Gz 단백질보다는 Gs와 결합하도록 "추진"시키거나 또는 "강제"하여 사이클라제 기초 분석법이 구축될 수 있다고 생각된다. 따라서, Gi, Gz 및 Go 결합형 수용체의 경우, GPCR 융합 단백질이 사용되고 분석법이 아데닐 사이클라제 활성의 검출을 기초로 하는 경우, 융합 구조물은 Gs (또는 효소 아데닐릴 사이클라제의 형성을 자극하는 균등한 G 단백질)로 구축되는 것이 선호된다.
F. 의약 화학
항상 그렇지는 않지만 일반적으로 후보 화합물의 직접 동정은 바람직하게는 분석용으로 수천개의 화합물이 무작위적으로 제조되는 조합 화학 기술을 통하여 생성된 화합물과 함께 수행되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 그러한 스크리닝의결과는 독특한 코아 구조를 갖는 화합물이며, 그 후 이들 화합물은 바람직하게는 바람직한 코아 구조 주변에 추가의 화학적 변형이 수행되어 의약 특성이 더욱 강화된다. 이러한 기술은 당분야에 공지되어 있으며 본 특허 명세서에서는 상세하게 설명하지 않는다.
G. 제약 조성물
추가의 개발을 위하여 선택된 후보 화합물을 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 제약 조성물로 제형한다. 적합한 제약상 허용되는 담체가 당 분야에서 이용가능하며, 예를 들면 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, 1980, Mack Publishing Co., (Oslo 등, eds.)]이 참조된다.
H. 기타 용도
본원에 개시된 비내생성 형태의 인간 GPCR의 바람직한 용도는 역효능제, 효능제 또는 부분 효능제로서 (바람직하게는 제약 제제로서 사용하기 위한)의 후보 화합물의 직접 동정을 위한 것이지만 이들 형태의 인간 GPCR은 또한 연구 환경에 이용될 수 있다. 예를 들면, 이들 수용체가 정상 및 질환 모두의 인체 조건에서 작용하는 역할을 밝혀내고 이해하기 위한 것뿐만 아니라 신호 전달과정의 이해와 관련하여 구성적 활성화의 역할을 이해하기 위하여 GPCR이 도입되는 시험관내 및 생체내 시스템이 이용될 수 있다. 비내생성 인간 GPCR의 가치는 그들의 독특한 특성 때문에 비내생성 인간 GPCR이 그들의 내생성 리간드가 동정되기 전에 인체에서의 이들 수용체의 역할을 이해하는 데 사용될 수 있다는 점에서 연구 도구로서의 유용성이 강화된다는 것이다. 개시된 수용체의 다른 용도는 특히 본 특허 명세서의 개관을 기초로 하여 당업자에게 명백해질 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니라 설명하기 위하여 제시된다. 본원에 특정 핵산 및 아미노산 서열이 개시되었지만, 당업자는 하기 보고된 것과 동일한 또는 유사한 결과를 달성하면서 이들 서열에 대한 사소한 변형을 이룰 수 있다. 한 서열로부터 또 다른 서열 (예를 들면, 쥐 수용체에서 인간 수용체, 또는 인간 수용체 A에서 인간 수용체 B)에 대한 서열 카세트의 적용 또는 이해에 대한 전통적인 접근법은 일반적으로 공통 영역을 결정하기 위해 서열들을 정렬하는 서열 정렬 기술에 근거한 것이다. 본원에 개시된 돌연변이 접근법은 이러한 접근법에 의존하는 것 대신에 연산 접근법 및 인간 GPCR의 TM6 부위내에 위치한 보존된 프롤린 잔기로부터의 위치 거리를 기초로 한다. 이러한 접근법이 확보되면, 당업자는 본원에 개시된 것과 실질적으로 동일한 결과 (즉, 구성적 활성화)를 달성하기 위하여 거기에 사소한 변형을 가할 수 있다. 이러한 변형된 접근법도 본 개시의 내용 내에 있는 것으로 고려된다.
<실시예 1>
내생성 인간 GPCR
1. 인간 GPCR의 동정
본원에 개시된 내생성 인간 GPCR 중 일부는 GeneBank(등록상표) 데이터베이스 정보를 기초로 하여 동정되었다. 데이터베이스를 조사하면서 하기 cDNA 클론을 하기 표시된 것처럼 동정하였다 (표 C).
조회서열로서 하기 EST 클론을 사용하여 EST 데이터베이스(dbest)에 대한 BLAST(등록상표) 조사를 수행하여 본원에 개시된 내생성 인간 GPCR 중 다른 일부를 동정하였다. 동정된 하기 EST 클론을 프로브로 사용하여 인간 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다 (표 D).
2. 전체 길이 클로닝
a. 인간 G2A
생쥐 EST 클론 1179426을 사용하여 3 아미노산을 제외하고는 G2A 코딩 서열 전부를 함유하는 인간 게놈 클론을 수득하였다. 5' RACE를 이용하여 이 코딩 서열의 5'을 수득하였으며, PCR에 대한 주형은 클론테크의 인간 비장 Marathon-Ready(등록상표) cDNA였다. 개시된 인간 G2A를 제1 및 제2 라운드 PCR에 하기 서열 41 및 서열 42로 나타낸 G2A cDNA 특이 프라이머를 사용하는 PCR로 증폭하였다.
5'-CTGTGTACAGCAGTTCGCAGAGTG-3' (서열 41; 제1 라운드 PCR)
5'-GAGTGCCAGGCAGAGCAGGTAGAC-3' (서열 42; 제2 라운드 PCR)
PCR은 어드밴티지 GC 폴리머라제 키트 (클론테크, 제조자 지시를 따름)를 사용하여 94℃에서 30초, 이어서 94℃에서 5초 및 72℃에서 4분의 5 주기, 및 94℃에서 5초 및 70℃에서 4분의 30 주기로 수행하였다. 대략 1.3 Kb의 PCR 단편을 아가로스 겔로 정제하고, HindIII 및 XbaI으로 절단하고 발현 벡터 pRC/CMV2 (인비트로겐)에 클로닝하였다. 클론된 삽입물을 T7 Sequenase(등록상표) 키트 (USB 아머샴, 제조자 지시를 따름)를 사용하여 서열분석하고, 그 서열을 제시된 서열과 비교하였다. 인간 G2A의 발현을 P32-표지 단편을 사용하여 RNA 도트 블롯 (클론텍, 제조자 지시를 따름)을 탐색하여 검출하였다.
b. CHN9
EST 클론 1541536의 서열 분석은 CHN9가 하나의 개시 코돈만을 갖는, 즉 종결 코돈이 손실된 부분 cDNA 클론인 것을 나타내었다. CHN9를 사용하여 데이터베이스 (nr)에 대입하였을 때, CHN9의 3' 서열은 루코트리엔 B4 수용체 cDNA의 5' 미번역 부위와 100% 상동성이었으며, 프레임에 CHN9 코딩 서열과 함께 종결 코돈을함유하였다. LTB4R cDNA의 5' 미번역 부위가 CHN9의 3' 서열인지를 결정하기 위하여, CHN9에서 발견되는 개시 코돈과 연접하는 5' 서열 및 LTB4R 5' 미번역 부위에서 발견되는 종결 코돈 주위의 3' 서열을 기초로 한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 사용된 5' 프라이머 서열은 다음과 같다.
5'-CCCGAATTCCTGCTTGCTCCCAGCTTGGCCC-3' (서열 43; 센스) 및
5'-TGTGGATCCTGCTGTCAAAGGTCCCATTCCGG-3' (서열 44; 안티센스).
PCR은 제조자에 의하여 제공된 완충계와 함께 주형으로서 흉선 cDNA 및 rTth 폴리머라제 (퍼킨 엘머)와 0.25 μM의 각 프라이머 및 각 0.2 mM의 4 뉴클레오티드를 사용하여 수행하였다. 주기 조건은 94℃에서 1분, 65℃에서 1분 및 72℃에서 1분 10초의 30 주기였다. PCR로부터 예견된 크기에 부합하는 1.1 kb 단편을 얻었다. 이러한 PCR 단편을 pCMV (하기 참조)에 서브클로닝하고, 서열 분석하였다 (서열 35 참조).
c. RUP4
주형으로서 하기 인간 뇌 cDNA (클론테크)를 사용한 RT-PCR에 의하여 전체 길이의 RUP4를 클로닝하였다.
5'-TCACAATGCTAGGTGTGGTC-3' (서열 45; 센스) 및
5'-TGCATAGACAATGGGATTACAG-3' (서열 46; 안티센스).
PCR은 94℃에서 2분, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초 및 72℃에서 10분의 주기로 TaqPlus Precision(등록상표) 폴리머라제 (스트라타겐, 제조자의 지시를 따름)를 사용하여 수행하였다. 주기 2 내지 4를 30회 반복하였다.
PCR 산물을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 500 bp의 PCR 단편을 단리한 후 pCRII-TOPO(등록상표) 벡터 (인비트로겐)에 클로닝하고, T7DNA Sequenase(등록상표) 키트 (암샴) 및 SP6/T7 프라이머 (스트라타겐)을 사용하여 서열 분석하였다. 서열 분석은 PCR 단편이 다른 GPCR과 유사한 연속 오픈 리딩 프레임을 갖는 AI307658의 달리 스플라이싱된 형태라는 것을 가리킨다. 이러한 PCR 단편의 완성된 서열은 다음과 같다.
5'-TCACAATGCTAGGTGTGGTCTGGCTGGTGGCAGTCATCGTAGGATCACCCATGTGGCAC GTGCAACAACTTGAGATCAAATATGACTTCCTATATGAAAAGGAACACATCTGCTGCTTAAGA GTGGACCAGCCCTGTGCACCAGAAGATCTACACCACCTTCATCCTTGTCATCCTCTTCCTCCTGC CTCTTATGGTGATGCTTATTCTGTACGTAAAATTGGTTATGAACTTTGGATAAAGAAAAGAGTT GGGGATGGTTCAGTGCTTCGAACTATTCATGGAAAAGAAATGTCCAAAATAGCCAGGAAGAAG AAACGAGCTGTCATTATGATGGTGACAGTGGTGGCTCTCTTTGCTGTGTGCTGGGCACCATTCC ATGTTGTCCATATGATGATTGAATACAGTAATTTTGAAAAGGAATATGATGATGTCACAATCAA GATGATTTTTGCTATCGTGCAAATTATTGGATTTTCCAACTCCATCTGTAATCCCATTGTCTATGCA-3' (서열 47)
상기 서열을 기초로, 하기 서열 48 및 49의 두 센스 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 하기 서열 50 및 51의 두 안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 주형인 인간 뇌 Marathon-Ready(등록상표) cDNA (클론테크, Cat#7400-1)와 함께 제조자의 지시에 따라 3'- 및 5'-RACE PCR에 사용하였다.
5'-CTGCTTAGAAGAGTGGACCAG-3' (서열 48; 올리고 1),
5'-CTGTGCACCAGAAGATCTACAC-3' (서열 49; 올리고 2);
5'-CAAGGATGAAGGTGGTGTAGA-3' (서열 50; 올리고 3),
5'-GTGTAGATCTTCTGGTGCACAGG-3' (서열 51; 올리고 4).
RACE PCR에 의해 생성된 DNA 단편을 pCRII-TOPO(등록상표) 벡터 (인비트로겐)에 클로닝하고, SP6/T7 프라이머 (스트라타겐) 및 몇몇 내부 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 3' RACE 산물은 폴리(A) 꼬리 및 TAA 정지 코돈으로 끝나는 완전한 오픈 리딩 프레임을 함유하였다. 5' RACE 산물은 불완전한 5' 말단을 함유하였다. 즉 ATG 개시 코돈이 존재하지 않았다.
새로운 5' 서열을 기초로 하여, 올리고 3과 하기 서열 52의 프라이머를 5' RACE PCR의 제2 라운드에 사용하고, 상기에서처럼 PCR 산물을 분석하였다.
5'-GCAATGCAGGTCATAGTGAGC-3' (서열 52; 올리고 5)
하기 서열 53 및 54의 안티센스 프라이머를 사용하여 5' RACE PCR의 제3 라운드를 수행하였다.
5'-TGGAGCATGGTGACGGGAATGCAGAAG-3' (서열 53; 올리고 6) 및
5'-GTGATGAGCAGGTCACTGAGCGCCAAG-3' (서열 54; 올리고 7).
5' RACE PCR 산물의 서열은 개시 코돈 ATG가 존재함을 나타내며, 5' RACE PCR의 추가 라운드는 더 이상의 5' 서열을 생성하지 않았다. 완전한 5' 서열을 프라이머로서 하기 서열 55의 센스 프라이머 및 올리고 4를 사용하는 RT-PCR과 인간 뇌 및 심장 cDNA 주형 (클론테크, Cat#7404-1)으로부터 생성된 650 bp PCR 산물의 서열 분석으로 확인하였다.
5'-GCAATGCAGGCGCTTAACATTAC-3' (서열 55; 올리고 8)
완전한 3' 서열은 하기 서열 56의 안티센스 프라이머와 올리고 2를 사용하는 RT-PCR과 인간 뇌 및 심장 cDNA 주형 (클론테크, Cat#7404-1)으로부터 생성된 670 bp PCR 산물의 서열 분석으로 확인하였다.
5'-TTGGGTTACAATCTGAAGGGCA-3' (서열 56; 올리고 9)
d. RUP5
하기 나타낸 ATG, 개시 코돈으로부터의 상류쪽 센스 프라이머 (서열 57)와 정지 코돈으로서 TCA를 함유하는 안티센스 프라이머 (서열 58)와 주형으로서 인간 말초 백혈구 cDNA (클론테크)를 사용하는 RT-PCR로 전체 길이의 RUP를 클로닝하였다.
5'-ACTCCGTGTCCAGCAGGACTCTG-3' (서열 57)
5'-TGCGTGTTCCTGGACCCTCACGTG-3' (서열 58)
어드밴티지(등록상표) cDNA 폴리머라제 (클론테크)를 사용하여 94℃에서 30초, 94℃에서 15초, 69℃에서 40초, 72℃에서 3분 및 72℃에서 6분의 주기로 단계 2 내지 단계 4를 30회 반복하여 50 ㎕ 반응물로 증폭하였다. 1.4 kb PCR 단편을 단리하고, pCRII-TOPO(등록상표) 벡터 (인비트로겐)을 사용하여 클론하고, T7 DNA Sequenase(등록상표) 키트 (암샴)을 사용하여 완전히 서열분석하였다 (서열 9 참조).
e. RUP6
하기 서열 59 및 60의 프라이머 및 주형으로서 인간 흉선 Marathon-Ready(등록상표) cDNA (클론테크)를 사용하는 RT-PCR로 전체 길이의 RUP6을 클로닝하였다.
5'-CAGGCCTTGGATTTTAATGTCAGGGATGG-3' (서열 59) 및
5'-GGAGAGTCAGCTCTGAAAGAATTCAGG-3' (서열 60)
어드밴티지(등록상표) cDNA 폴리머라제 (클론테크, 제조자의 지시에 따름)를 사용하여 94℃에서 30초, 94℃에서 5초, 66℃에서 40초, 72℃에서 2.5초 및 72℃에서 7분의 주기로 50 ㎕ 반응물로 증폭하였다. 주기 2 내지 4를 30회 반복하였다. 1.3 kb PCR 단편을 단리하고, pCRII-TOPO(등록상표) 벡터 (인비트로겐)을 사용하여 클로닝하고, ABI Big Dye Terminator(등록상표) 키트 (P.E. 바이오시스템)을 사용하여 완전히 서열분석하였다 (서열 11 참조).
f. RUP7
하기 서열 61 및 62의 프라이머 및 주형으로서 인간 말초 백혈구 cDNA (클론테크)를 사용하는 RT-PCR로 전체 길이의 RUP7을 클로닝하였다.
5'-TGATGTGATGCCAGATACTAATAGCAC-3' (서열 61; 센스) 및
5'-CCTGATTCATTTAGGTGAGATTGAGAC-3' (서열 62; 안티센스)
어드밴티지(등록상표) cDNA 폴리머라제 (클론테크)를 사용하여 94℃에서 2분, 94℃에서 15초, 60℃에서 20초, 72℃에서 2분 및 72℃에서 10분의 주기로 단계 2 내지 4를 30회 반복하여 50 ㎕ 반응물로 증폭하였다. 1.25 kb PCR 단편을 단리하고, pCRII-TOPO(등록상표) 벡터 (인비트로겐)로 사용하여 클로닝하고, ABI Big Dye Terminator(등록상표) 키트 (P.E. 바이오시스템)을 사용하여 완전히 서열분석하였다 (서열 13 참조).
3. 안지오텐신 II 유형 1 수용체 ("AT1")
제조자에 의해 제공된 완충계와 함께 주형으로서 게놈 DNA 및 rTth 폴리머라제 (퍼킨 엘머), 0.25 μM의 각 프라이머 및 각 0.2 mM의 4 뉴클레오티드를 사용하는 PCR에 의해 내생성 인간 안지오텐신 II 유형 1 수용체 ("AT1")을 수득하였다. 주기 조건은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1.5분의 30 주기였다. 5' PCR 프라이머는 하기 서열 63에 나타낸 것으로, HindIII 부위를 가지며, 3' 프라이머는 하기 서열 64에 나타낸 것으로, BamHI 부위를 갖는다.
5'-CCCAAGCTTCCCCAGGTGTATTTGAT-3' (서열 63)
5'-GTTGGATCCACATAATGCATTTTCTC-3' (서열 64)
생성된 1.3 kb의 PCR 단편을 HindIII 및 BamHI으로 절단하고, pCMV 발현 벡터의 HindIII-BamHI 부위에 클로닝하였다. cDNA 클론을 완전히 서열분석하였다. 그 후, 인간 AT1에 대한 핵산 (서열 65) 및 아미노산 (서열 66) 서열을 결정하고 확인하였다.
4. GPR38
GPR38을 얻기 위해, 제조자에 의해 제공된 완충계와 함께 주형으로서 인간 게놈 DNA 및 rTth 폴리머라제 (퍼킨 엘머), 0.25 μM의 각 프라이머 및 각 0.2 mM의 4 뉴클레오티드를 사용하여 두 PCR 단편을 결합함으로써 PCR을 수행하였다. 각 PCR 반응의 주기 조건은 94℃에서 1분, 62℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 30 주기였다.
제1 단편을 말단에 하기 서열 67을 함유하는 5' PCR 프라이머와 하기 서열68을 갖는 3' 프라이머를 사용하여 증폭하였다.
5'-ACCATGGGCAGCCCCTGGAACGGCAGC-3' (서열 67)
5'-AGAACCACCACCAGCAGGACGCGGACGGTCTGCCGGTGG-3' (서열 68)
제2 PCR 단편을 하기 서열 69를 갖는 5' 프라이머와 BamHI 부위를 함유하고 하기 서열 70을 갖는 3' 프라이머를 사용하여 증폭하였다.
5'-GTCCGCGTCCTGCTGGTGGTGGTTCTGGCATTTATAATT-3' (서열 69)
5'-CCTGGATCCTTATCCCATCGTCTTCACGTTAGC-3' (서열 70)
두 단편을 주형으로 사용하고 서열 67 및 서열 70을 프라이머로 사용하여 GPR38을 증폭하였다 (상기 언급된 주기 조건을 사용). 생성된 1.44 kb PCR 단편을 BamHI으로 절단하고, pCMV 발현 벡터의 Blunt-BamHI 부위에 클로닝하였다.
5. MC4
MC4를 얻기 위하여, 제조자에 의해 제공된 완충계와 주형으로서 인간 게놈 cDNA 및 rTth 폴리머라제 (퍼킨 엘머), 0.25 μM의 각 프라이머 및 각 0.2 mM의 4 뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하였다. 각 PCR 반응의 주기 조건은 94℃에서 1분, 54℃에서 1분 및 72℃에서 1.5분의 30 주기였다.
5' PCR 프라이머는 하기 서열 71에 나타낸 것으로, EcoRI 부위를 함유하며, 3' 프라이머는 하기 서열 72에 나타낸 것으로, BamHI 부위를 함유하였다.
5'-CTGGAATTCTCCTGCCAGCATGGTGA-3' (서열 71)
5'-GCAGGATCCTATATTGCGTGCTCTGTCCCC-3' (서열 72)
1.0 kb PCR 단편을 EcoRI 및 BamHI으로 절단하고, pCMV 발현 벡터의 EcoRI-BamHI 부위에 클로닝하였다. 그 후, 인간 MC4에 대한 핵산 (서열 73) 및 아미노산 (서열 74) 서열을 결정하였다.
6. CCKB
CCKB를 얻기 위하여, 제조자에 의해 제공된 완충계와 주형으로서 인간 위 cDNA 및 rTth 폴리머라제 (퍼킨 엘머), 0.25 μM의 각 프라이머 및 각 0.2 mM의 4 뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하였다. 각 PCR 반응의 주기 조건은 94℃에서 1분, 65℃에서 1분 및 72℃에서 1분 30초의 30 주기였다.
5' PCR은 하기 서열 75에 나타낸 것으로, HindIII 부위를 함유하며, 3' 프라이머는 하기 서열 76에 나타낸 것으로, EcoRI 부위를 함유하였다.
5'-CCGAAGCTTCGAGCTGAGTAAGGCGGCGGGCT-3' (서열 75)
5'-GTGGAATTCATTTGCCCTGCCTCAACCCCCA-3' (서열 76)
생성된 1.44 kb PCR 단편을 HindIII 및 EcoRI으로 절단하고, pCMV 발현 벡터의 HindIII-EcoRI 부위에 클로닝하였다. 그 후, 인간 CCKB에 대한 핵산 (서열 77) 및 아미노산 (서열 78) 서열을 결정하였다.
7. TDAG8
TDAG8을 얻기 위하여, 제조자에 의해 제공된 완충계와 주형으로서 게놈 DNA 및 rTth 폴리머라제 (퍼킨 엘머), 0.25 μM의 각 프라이머 및 각 0.2 mM의 4 뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하였다. 주기 조건은 94℃에서 1분, 56℃에서 1분 및 72℃에서 1분 20초의 30 주기였다. 5' PCR 프라이머는 하기 서열 79에 나타낸 것으로, HindIII 부위를 함유하며, 3' 프라이머는 하기 서열 80에 나타낸 것으로,BamHI 부위를 함유하였다.
5'-TGCAAGCTTAAAAAGGAAAAAATGAACAGC-3' (서열 79)
5'-TAAGGATCCCTTCCCTTCAAAACATCCTTG-3' (서열 80)
생성된 1.1 kb PCR 단편을 HindIII 및 BamHI으로 절단하고, pCMV 발현 벡터의 HindIII-BamHI 부위에 클로닝하였다. 서열분석된 생성된 세 클론은 아미노산 43이 Pro에서 Ala, 아미노산 97이 Lys에서 Asn, 및 아미노산 130이 Ile에서 Phe로의 변경을 포함하는 3개의 가능한 다형을 함유하였다. 그 후, 인간 TDAG8에 대한 핵산 (서열 81) 및 아미노산 (서열 82) 서열을 결정하였다.
8. H9
H9를 얻기 위하여, 제조자에 의해 제공된 완충계와 주형으로서 뇌하수체 cDNA 및 rTth 폴리머라제 (퍼킨 엘머), 0.25 μM의 각 프라이머 및 각 0.2 mM의 4 뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하였다. 주기 조건은 94℃에서 1분, 62℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 30 주기였다. 5' PCR 프라이머는 하기 서열 15에 나타낸 것으로, HindIII 부위를 함유하며, 3' 프라이머는 하기 서열 16에 나타낸 것으로, BamHI 부위를 함유하였다.
5'-GGAAAGCTTAACGATCCCCAGGAGCAACAT-3' (서열 15)
5'-CTGGGATCCTACGAGAGCATTTTTCACACAG-3' (서열 16)
생성된 1.9 kb PCR 단편을 HindIII 및 BamHI으로 절단하고, pCMV 발현 벡터의 HindIII-BamHI 부위에 클로닝하였다. H9는 아미노산 P320S, S493N 및 아미노산 G448A의 변경을 포함하는 3개의 가능한 다형을 함유하였다. 그 후, 인간 H9에 대한 핵산 (서열 139) 및 아미노산 (서열 140) 서열을 결정하고 확인하였다.
<실시예 2>
구성적으로 활성화된 비내생성 GPCR의 제조
당 분야의 숙련자는 핵산 서열의 돌연변이를 선별하기 위한 능력을 갖고 있다. 상기 개시된 인간 GPCR의 여러 비내생성 형태를 만들기 위하여 이용되는 접근법이 하기에 제시된다. 하기 개시된 돌연변이는 연산 접근법을 기초로 한 것으로 보존된 프롤린 잔기 (GPCR의 TM6/IC3 계면 근처의 TM6 부위에 위치)로부터 16번째 아미노산 (GPCR의 IC3 부위에 위치)이 가장 바람직하게는 리신 아미노산 잔기로 돌연변이된다.
1. Transformer Site-Directed(등록상표) 돌연변이
비내생성 인간 GPCR의 제조는 Transformer Site-Directed(등록상표) 돌연변이 키트 (클론테크)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 인간 GPCR에서 수행될 수 있다. 두 돌연변이 프라이머, 가장 바람직하게는 리신 돌연변이를 생성하는 리신 돌연변이 올리고뉴클레오티드, 및 선별 마커 올리고뉴클레오티드가 이용된다. 편의상, 인간 GPCR에 도입되는 코돈 돌연변이를 또한 표준 형태로 표시하였다 (표 E).
상기 방법에 따라 지정된 서열 프라이머 (표 F)를 사용하여 하기 GPCR은 돌연변이되었다.
이어서, 비내생성 인간 GPCR을 서열분석하고, 유도되고 확인된 핵산 및 아미노산 서열을 본 특허 명세서에 첨부된 서열 목록에 열거하였으며, 하기 표 G에 요약하였다.
2. 비내생성 인간 GPCR의 생성을 위한 별법
a. AT1
1)F239K 돌연변이
구성적으로 활성화된 비내생성 인간 AT1 수용체의 제조는 F239K 돌연변이를 생성함으로써 달성되었다 (핵산 서열의 경우 서열 89 및 아미노산 서열의 경우 서열 90 참조). 돌연변이는 Transformer Site-Directed Mutagenesis(등록상표) 키트 (클론테크)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 하기에 나타낸 두 돌연변이 프라이머, 리신 돌연변이 올리고뉴클레오티드 (서열 91)와 선별 마커 올리고뉴클레오티드 (서열 92)를 사용하였다.
5'-CCAAGAAATGATGATATTAAAAAGATAATTATGGC-3' (서열 91)
5'-CTCCTTCGGTCCTCCTATCGTTGTCAGAAGT-3' (서열 92)
2)N111A 돌연변이
비내생성 인간 AT1 수용체의 제조는 또한 N111A 돌연변이를 생성함으로써 달성하였다 (핵산 서열의 경우 서열 93 및 아미노산 서열의 경우 서열 94 참조).10% DMSO가 보충된 제조자에 의하여 제공된 완충계와 pfu 폴리머라제 (스트라타겐), 0.25 μM의 각 프라이머, 및 0.5 mM의 각 4 뉴클레오티드를 사용하여 두 PCR 반응을 수행하였다. 사용된 5' PCR 센스 프라이머는 하기 서열 95를 가지며, 안티센스 프라이머는 하기 서열 96을 가졌다.
5'-CCCAAGCTTCCCCAGGTGTATTTGAT-3' (서열 95)
5'-CCTGCAGGCGAAACTGACTCTGGCTGAAG-3' (서열 96)
생성된 400 bp의 PCR 단편을 HindIII 부위에서 절단하고, pCMV 벡터의 HindIII-SmaI 부위에 서브클로닝하였다 (5' 구조물). 사용된 3' PCR 센스 프라이머는 하기 서열 97을 갖고, 안티센스 프라이머는 하기 서열 98을 갖는다.
5'-CTGTACGCTAGTGTGTTTCTACTCACGTGTCTCAGCATTGAT-3' (서열 97)
5'-GTTGGATCCACATAATGCATTTTCTC-3' (서열 98)
생성된 880 bp의 PCR 단편을 BamHI으로 절단하고, 5' 구조물의 Pst (T4 폴리머라제에 의해 블런트됨) 및 BamHI 부위에 삽입하여 전체 길이의 N111A 구조물을 생성하였다. 주기 조건은 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 1분 (5' PCR) 또는 1.5분 (3' PCR)의 25 주기였다.
3. AT2K255IC3 돌연변이
구성적으로 활성화된 비내생성 인간 AT1의 제조는 AT2K255IC3 "도메인 교환 (domain swap)" 돌연변이를 생성함으로써 달성하였다 (핵산 서열의 경우 서열 99, 및 아미노산 서열의 경우 서열 100 참조). AT1의 IC3 옆의 제한 부위를 생성하여 안지오텐신 II 유형 2 수용체 (AT2)로부터의 해당 IC3으로 IC3을 대체하는 것을 촉진하였다. 이것은 두 PCR 반응을 수행하여 달성하였다. 센스 프라이머로 서열 63을, 안티센스 프라이머로 하기 서열 101을 이용하여 5' 미번역된 부위로부터 IC3의 시작부를 코딩하는 5' PCR 단편 (단편 A)를 생성하였다.
5'-TCCGAATTCCAAAATAACTTGTAAGAATGATCAGAAA-3' (서열 101)
센스 프라이머로 하기 서열 102와 안티센스 프라이머로 서열 64를 이용하여 IC3의 말단으로부터 3' 미번역된 부위를 코딩하는 3' PCR 단편 (단편 B)를 생성하였다.
5'-AGATCTTAAGAAGATAATTATGGCAATTGTGCT-3' (서열 102)
PCR 조건은 10%의 DMSO가 보충된 제조자에 의하여 제공된 완충계와 함께 주형으로서 내생성 AT1 cDNA 클론과 pfu 폴리머라제 (스트라타겐), 0.25 μM의 각 프라이머 및 0.5 mM의 각 4 뉴클레오티드를 사용하여 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1.5분의 30 주기였다. 단편 A (720 bp)를 HindIII 및 EcoRI으로 절단하고 서브클로닝하였다. 단편 B를 BamHI으로 절단하고 클로닝된 PCR 단편에 EcoRI 부위 5'로 pCMV 벡터에 서브클로닝하였다.
하기 서열 103 및 104를 갖는 2개의 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 L255K 돌연변이를 갖는 AT2의 IC3을 코딩하며 5'에 EcoRI 점착성 말단 및 3'에 AflII 점착성 말단을 함유하는 DNA 단편 (단편 C)을 생성하였다.
5'-AATTCGAAAACACTTACTGAAGACGAATAGCTATGGGAAGAACAGGATAACCCGTGACCAAG-3' (서열 103)
5'-TTAACTTGGTCACGGGTTATCCTGTTCTTCCCATAGCTATTCGTCTTCAGTAAGTGTTTTCG-3' (서열 104)
단편 C를 EcoRI 및 AflII 부위를 통하여 단편 B의 앞에 삽입하였다. 생성된 클론을 EcoRI 부위를 통하여 단편 A와 라이게이션하여 AT2K255IC3을 갖는 AT1을 생성하였다.
4. A243+ 돌연변이
비내생성 인간 AT1 수용체의 제조는 A243+ 돌연변이를 생성함으로써 달성하였다 (핵산 서열의 경우 서열 105, 및 아미노산 서열의 경우 서열 106 참조). 하기 PCR 기본 전략을 사용하여 A243+ 돌연변이를 구축하였다. 10%의 DMSO가 보충된 제조자에 의하여 제공된 완충계와 함께 pfu 폴리머라제 (스트라타겐), 0.25 μM의 각 프라이머 및 0.5 mM의 각 4 뉴클레오티드를 사용하여 두 PCR 반응을 수행하였다. 이용된 5' PCR 센스 프라이머는 하기 서열 107을 가지며, 안티센스 프라이머는 하기 서열 108을 갖는다.
5'-CCCAAGCTTCCCCAGGTGTATTTGAT-3' (서열 107)
5'-AAGCACAATTGCTGCATAATTATCTTAAAAATATCATC-3' (서열 108)
이용된 3' PCR 센스 프라이머는 Ala 삽입물을 함유하는 하기 서열 109 및 하기 서열 110의 안티센스 프라이머를 갖는다.
5'-AAGATAATTATGGCAGCAATTGTGCTTTTCTTTTTCTTT-3' (서열 109)
5'-GTTGGATCCACATAATGCATTTTCTC-3' (서열 110)
주기 조건은 94℃에서 1분, 54℃에서 1분 및 72℃에서 1.5분의 25 주기였다. 그 후, 5' 및 3' PCR의 할당량을 공주형으로서 사용하고 5' PCR 센스 프라이머 및3' PCR 안티센스 프라이머를 사용하는 2차 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 연장 시간이 2.5분인 것을 제외하고는 1차 PCR과 동일하였다. 생성된 PCR 단편을 HindIII 및 BamHI으로 절단하고 pCMV 벡터에 서브클로닝하였다 (서열 105 참조).
4. CCKB
구성적으로 활성화된 비내생성 인간 CCKB 수용체의 제조는 V322K 돌연변이를 생성하여 달성하였다 (핵산 서열의 경우 서열 111 및 아미노산 서열의 경우 서열 112 참조). 돌연변이는 실시예 1의 야생형 CCKB를 사용하는 증폭을 통한 PCR로 수행하였다.
제1 PCR 단편 (1 kb)는 서열 75 및 V322K 돌연변이를 포함하는 하기 서열 113의 안티센스 프라이머를 사용하여 증폭하였다.
5'-CAGCAGCATGCGCTTCACGCGCTTCTTAGCCCAG-3' (서열 113)
제2 PCR 단편 (0.44 kb)은 V322K 돌연변이를 포함하는 하기 서열 114 및 서열 76의 센스 프라이머를 사용하여 증폭하였다.
5'-AGAAGCGCGTGAAGCGCATGCTGCTGGTGATCGTT-3' (서열 114)
그 후, 두 생성된 PCR 단편을 주형으로 사용하고, 상기 언급된 시스템 및 조건과 서열 75 및 서열 76을 사용하여 V332K를 포함하는 CCKB를 증폭하였다. V332K 돌연변이를 함유하는 생성된 1.44 kb PCR 단편을 HindIII 및 EcoRI으로 절단하고, pCMV 발현 벡터의 HindIII-EcoRI 부위에 클로닝하였다 (서열 111 참조).
3. QuikChange(등록상표) Site-Directed(등록상표) 돌연변이
비내생성 인간 GPCR의 제조는 또한 QuikChange(등록상표) Site-Directed(등록상표) 돌연변이 키트 (스트라타겐, 제조자의 지시에 따름)를 사용하여 달성할 수 있다. 내생성 GPCR은 바람직하게는 주형으로 사용되고, 두 돌연변이 프라이머, 가장 바람직하게는 리신 돌연변이 올리고뉴클레오티드 및 선별 마커 올리고뉴클레오티드 (키트에 포함됨)가 이용된다. 편의상, 인간 GPCR에 도입된 코돈 돌연변이와 각각의 올리고뉴클레오티드가 표준 형태로 표시된다 (표 H).
<실시예 3>
수용체 발현
단백질 발현을 위하여 다양한 세포가 당분야에 이용될 수 있지만, 포유류 세포를 이용하는 것이 가장 바람직하다. 이에 대한 기본적인 이유는 실무상 예를 들면 GPCR의 발현을 위한 효모 세포의 이용은 가능하지만 포유류 시스템에서 진화된 수용체 결합의 유전 기작 및 분비 경로를 포함할 수 없는 (정말로, 효모의 경우 포함하지 않음) 비포유류 세포를 절차에 도입하며, 따라서 비포유류 세포에서 수득된 결과는 가능한 사용이지만 포유류 세포에서 얻은 결과만큼 바람직하지 못하다. 이용되는 특정의 포유류 세포가 당업자의 특정 필요에 따라 단정될 수 있지만 포유류 세포 중에서 COS-7, 293 및 293T 세포가 특히 바람직하다.
1일 째, 150 mm 플레이트당 1×107293T 세포를 플레이팅하였다. 2일 째, 다음과 같은 두 반응관을 준비하였다 (각 관에 대한 할당비는 플레이트 비임). 관 A는 1.2 ㎖의 무-혈청 DMEM (어빙 사이언티픽, 캘리포니아주 어빙) 중에 20 ㎍ DNA (예를 들면, pCMV 벡터, 수용체 cDNA를 갖는 pCMV 벡터, 등)를 혼합하여 제조하고, 관 B는 1.2 ㎖의 무-혈청 DMEM 중에 120 ㎕의 리포펙타민 (깁코 BRL)을 혼합하여 제조하였다. 관 A 및 B를 뒤집어 혼합하고 (수회), 이어서 실온에서 30 내지 45분 동안 배양하였다. 혼합물을 "형질감염 혼합물"로 간주하였다. 플레이팅된 293T 세포를 1×PBS로 세척하고, 이어서 10 ㎖의 무-혈청 DMEM을 첨가하였다. 2.4 ㎖의 형질감염 혼합물을 세포에 첨가하고, 이어서 4시간 동안 37℃/5% CO2에서 배양하였다. 형질감염 혼합물을 흡인하여 제거하고, 이어서 25 ㎖의 DMEM/10% 소태아 혈청을 첨가하였다. 세포를 37℃/5% CO2에서 배양하였다. 72시간의 배양 후, 세포를 수확하여 분석에 이용하였다.
<실시예 4>
비내생성 GPCR의 구성적 활성의 결정을 위한 분석법
비내생성 인간 GPCR의 구성적 활성을 평가하기 위하여 다양한 접근법이 이용가능하다. 하기 내용은 예시적인 것이며, 당업자에게는 당업자의 필요에 우선적으로 유익한 기술을 결정할 수 있는 능력이 있다고 생각된다.
1. 막 결합 분석: [ 35 S]GTPγS 분석
G 단백질 결합형 수용체가 리간드 결합 또는 구성적 활성화의 결과로 활성 상태인 경우, 수용체는 G 단백질에 결합되어 GDP의 방출과 후속적인 G 단백질에 대한 GTP의 결합을 자극한다. G 단백질-수용체 복합체의 알파 서브유닛은 GTPase로 작용하며, GTP를 GDP로 서서히 가수분해하며, 이때 수용체는 정상적으로는 불활성화된다. 구성적으로 활성화된 수용체는 GDP를 GTP로 계속 교환한다. 비가수분해성 GTP 유사체 [35S]GTPγS를 이용하여 구성적으로 활성화된 수용체를 발현하는 막에 [35S]GTPγS의 강화된 결합을 입증할 수 있다. 구성적 활성화를 측정하기 위하여 [35S]GTPγS 결합을 사용하는 이점은 (a) 일반적으로 모든 G 단백질 결합형 수용체에 적용할 수 있으며, (b) 세포내 작업에 영향을 미치는 분자를 선별하도록 하지 않는 막 표면에 가깝다는 것이다.
상기 분석은 관련 수용체를 발현하는 막에 대한 [35S]GTPγS의 결합을 자극하는 G 단백질 결합형 수용체의 능력을 이용한다. 따라서, 본 분석은 공지의, 고아 및 구성적으로 활성화된 G 단백질 결합형 수용체에 대한 후보 화합물의 스크리닝을 위한 직접 동정 방법에 사용될 수 있다. 본 분석은 일반적이며, 모든 G 단백질 결합형 수용체에서 약물 발견에 대해 적용된다.
[35S]GTPγS 분석은 20 mM HEPES와 1 내지 약 20 mM의 MgCl2(20 mM이 바람직할 수 있지만 이 양은 최적 결과를 위하여 조정될 수 있음), pH 7.4, 약 0.3 내지 약 1.2 nM의 [35S]GTPγS (1.2가 바람직할 수 있지만 이 양은 최적 결과를 위하여 조정될 수 있음) 및 12.5 내지 75 ㎍의 막 단백질 (예를 들면, 수용체를 발현하는 COS-7 세포, 75 ㎍이 바람직할 수 있지만 이 양은 최적 결과를 위하여 조정될 수 있음) 및 1 μM의 GDP (이 양은 최적화를 위하여 변경될 수 있음)를 갖는 결합 완충액 중에서 1시간 동안 배양한다. 그 후, 맥아 어글루티닌 비드 (25 ㎕; 아머샴)을 첨가하고, 그 혼합물을 추가 30분 동안 실온에서 배양한다. 이어서, 관을 실온에서 1500 ×g로 5분 동안 원심분리하고, 신틸레이션 계수기로 계수한다.
대규모 스크리닝의 필요에 부응하며, 비용이 덜 들지만 동일하게 적용할 수 있는 별법이 동정되었다. 높은 처리량의 [35S]GTPγS 결합 분석을 구성하기 위하여 Flash plate(등록상표) 및 Wallac scintistrips(등록상표)가 이용될 수 있다. 더욱이, 이러한 기술을 사용하여 상기 분석은 [35S]GTPγS 결합을 통한 효능을 모니터하는 동시에 수용체에 대한 트리튬화된 리간드 결합을 동시에 모니터하기 위하여 공지의 GPCR에 이용될 수 있다. 이것은 Wallac 베타 계수기가 트리튬 및35S-표지된 프로브를 동시에 조사하도록 에너지 창을 변환시킬 수 있기 때문에 가능하다. 또한, 이러한 분석은 수용체 활성화를 초래하는 다른 유형의 막 활성화 사건을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 분석은 다양한 수용체 (G 단백질 결합형 및 티로신 키나제 수용체 모두)의32P 인산화를 모니터하는데 사용될 수 있다.막이 웰의 바닥에 원심분리되면, 결합된 [35S]GTPγS 또는32P-인산화된 수용체는 웰에 피복된 신실런트를 활성화시킨다. Scinti(등록상표) 스트립 (Wallac)을 사용하여 이러한 원리를 입증하였다. 이외에, 상기 분석은 또한 방사성 표지된 리간드를 사용하여 수용체에 대한 리간드 결합을 측정하는 데 이용된다. 유사한 방식으로, 방사성 표지된 결합된 리간드가 웰의 바닥에 원심분리되면, 신티스트림 표지가 활성화 및 검출을 초래하는 방사성 표지된 리간드 근처에 이르게 된다.
2. 아데닐릴 사이클라제
세포 기초 분석을 위하여 고안된 Flash Plate(등록상표) 아데닐릴 사이클라제 키트 (뉴 잉글랜드 뉴클리어, Cat. No. SMP004A)를 변형하여 조 세포질막에 사용하였다. Flash Plate 웰은 cAMP를 인식하는 특이 항체를 함유하는 신실런트 피복물을 함유한다. 웰에서 생성된 cAMP를 cAMP 항체에 방사성 cAMP 추적자의 결합에 대한 직접 경쟁법으로 정량하였다. 수용체를 발현하는 막에서 cAMP 수준의 변화를 측정하기 위한 요약된 절차를 하기에 제공한다.
형질감염 대략 3일 후에 형질감염된 세포를 수확하였다. 20 mM HEPES, pH 7.4 및 10 mM MgCl2를 함유하는 완충액에 현탁된 세포를 균질화하여 막을 제조하였다. 균질화는 Brinkman Polytron(등록상표)를 사용하여 대략 10초 동안 얼음 상에서 수행한다. 생성된 균질물을 4℃에서 49,000 ×g로 15분 동안 원심분리하였다. 그 후, 생성된 펠렛을 20 mM HEPES, pH 7.4 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 완충액에 재현탁하고, 10초 동안 균질화하고, 이어서 4℃에서 49,000 ×g로 15분 동안 원심분리하였다. 생성된 펠렛은 이용전까지 -80℃에서 보관할 수 있다. 측정하는 날, 막을 실온에서 서서히 해동하고, 20 mM HEPES, pH 7.4 및 10 mM MgCl2를 함유하는 완충액 (이들 양은 본원에 열거된 값이 바람직하지만 최적화될 수 있음)에 재현탁하여 0.60 ㎎/㎖의 최종 단백질 농도를 생성하였다 (재현탁된 막은 사용 전까지 얼음 상에 위치시킨다).
제조자의 지시에 따라 cAMP 표준물 및 검출 완충액 (11 ㎖의 검출 완충액에 2 μCi의 추적자 [125I cAMP 100 ㎕]를 포함)을 제조하고, 유지하였다. 분석 완충액은 스크리닝을 위하여 새로 제조하였으며 20 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 20 mM (시그마), 0.1 unit/㎖ 크레아틴 포스포키나제 (시그마), 50 μM GTP (시그마), 및 0.2 mM ATP (시그마)를 함유하며, 분석 완충액은 이용 전까지 얼음 상에서 저장할 수 있다. 분석은 NEN Flash Plate에 50 ㎕의 분석 완충액을 첨가하고 이어서 50 ㎕의 막 현탁액을 첨가함으로써 시작되었다. 생성된 분석 혼합물을 60분 동안 실온에서 반응시키고, 이어서 100 ㎕의 검출 완충액을 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 추가 2 내지 4시간 동안 반응시키고, 이어서 Wallac MicroBeta(등록상표) 신틸레이션 계수기에서 계수하였다. 각 분석 플레이트 내에 함유된 표준 cAMP 곡선으로부터 cAMP/웰의 값을 조사하였다.
C. 리포터 활용 분석
1. CREB 리포터 분석 (Gs-관련 수용체)
Gs 자극을 검출하는 방법은 cAMP-의존적 방식으로 활성화되는 전사 인자CREB의 공지된 특성에 의존한다. 293 또는 293T 세포에서의 Gs 결합된 활성을 분석하기 위하여 PathDetect(등록상표) CREB trans-Reporting System (스트라타겐, Cat. #219010)을 이용할 수 있다. 세포를 포유류 형질감염 키트 (스트라타겐, Cat. #200285)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 상기 시스템의 플라스미드 성분 및 내생성 또는 돌연변이 수용체를 코딩하는 지시된 발현 플라스미드로 형질감염시킨다. 요약하면, 400 ng의 pFR-Luc (Gal4 인식 서열을 함유하는 루시퍼라제 리포터 플라스미드), 40 ng의 pFA2-CREB (Gal4 DNA-결합 영역을 함유하는 Gal4-CREB 융합 단백질), 80 ng의 pCMV-수용체 발현 플라스미드 (수용체 포함) 및 20 ng의 CMV-SEAP (분비된 알칼리 포스파타제 발현 플라스미드, 알칼리 포스파타제 활성은 시료 사이의 형질감염 효능의 변화를 조절하기 위하여 형질감염된 세포의 매질에서 측정)을 키트의 지시에 따라 칼슘 포스페이트 침전물에서 배합한다. 침전물의 반을 96웰 플레이트의 3웰에 균등하게 분배하고 밤새 세포를 방치한 후, 다음날 아침 새로운 배지로 대체한다. 형질감염 시작 48시간 후에, 세포를 처리하고 예를 들면 루시퍼라제 활성에 대해 분석한다.
2. AP1 리포터 분석 (Gq-관련 수용체)
Gq 자극을 검출하기 위한 방법은 그 프로모터에 AP1 요소를 함유하는 유전자의 활성화를 일으키는 Gq-의존적 포스포리파제 C의 공지된 특성에 따른다. 칼슘 포스페이트 침전물의 성분이 410 ng의 pAP1-Luc, 80 ng의 pCMV-수용체 발현 플라스미드 및 20 ng의 CMV-SEAP인 것을 제외하고는 CREB 리포터 분석과 관련하여 상기 기재된 절차에 따라 Pathdetect(등록상표) AP-1 cis-Reporting System (스트라타겐, Cat. #219073)이 이용될 수 있다.
3. CRE-LUC 리포터 분석
293 및 293T 세포를 96웰 플레이트에 웰당 2×104세포의 밀도로 플레이팅하고, 제조자의 지시에 따라 다음날 리포펙타민 시약 (BRL)을 사용하여 형질감염시켰다. 각 6-웰 형질감염을 위하여 다음과 같이 DNA/지질 혼합물을 제조하였다. 100 ㎕의 DMEM 중의 260 ng의 플라스미드 DNA를 100 ㎕의 DMEM 중의 2 ㎕의 지질과 온화하게 혼합하였다 (260 ng의 플라스미드 DNA는 200 ng의 8xCRE-Luc 리포터 플라스미드 (하기 및 플라스미드의 부분을 나타내는 도 1 참조), 내생성 수용체 또는 비내생성 수용체를 포함하거나, 또는 pCMV 단독인 50 ng의 pCMV, 및 10 ng의 GPRS 발현 플라스미드 (pcDNA3 (인비트로겐) 중의 GPRS로 이루어진다). 8xCRE-Luc 리포터 플라스미드는 다음과 같이 제조하였다. 벡터 SRIF-β-gal은 쥐 소마토스타틴 프로모터 (-71/+51)을 pβgal-Basic 벡터 (클론테크)의 BglV-HindIII 부위에 클로닝하여 수득하였다. 아데노바이러스 주형 AdpCF126CCRE8 (7 Human Gene Therapy 1883 (1996) 참조)로부터 PCR에 의해 cAMP 반응 요소의 8개 카피를 수득하고 SRIF-β-gal 벡터의 Kpn-BglV 부위에 클로닝하여 8xCRE-β-gal 리포터 벡터를 생성하였다. 8xCRE-β-gal 리포터 벡터에서의 베타-갈락토시다제 유전자를 HindIII-BamHI 부위에서 pGL3-basic 벡터 (프로메가)로부터 얻은 루시퍼라제 유전자로 대체하여 8xCRE-Luc 리포터 플라스미드를 생성하였다. 실온에서 30분 배양 후에, DNA/지질 혼합물을 400 ㎕의 DMEM으로 희석하고 희석된 혼합물 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 세포 배양기에서 4시간 배양 후에 10%의 FCS를 갖는 100 ㎕의 DMEM을 각 웰에첨가하였다. 다음날 형질감염된 세포를 10% FCS를 갖는 200 ㎕/웰의 DMEM을 사용하여 변경하였다. 8시간 후, PBS로 1회 세척한 후 페놀 레드 없는 100 ㎕/웰의 DMEM으로 웰을 변경하였다. 다음날 LucLite(등록상표) 리포터 유전자 분석 키트 (패커드)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 루시퍼라제 활성을 측정하고 1450 MicroBeta(등록상표) 신틸레이션 및 형광 계수기 (Wallac) 상에서 값을 기록하였다.
4. SRF-LUC 리포터 분석
Gq 자극을 검출하기 위한 한 방법은 프로모터에 혈청 반응 인자를 함유하는 유전자의 활성을 초래하는 Gq-의존적 포스포리파제 C의 공지된 특성에 의존하는 것이다. Pathdetect(등록상표) SRF-Luc-Reporting System을 이용하여, 예를 들면 COS7 세포에서 Gq 결합된 활성을 분석할 수 있다. 포유류 형질감염(등록상표) 키트 (스트라타겐, Cat. #200285)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 시스템의 플라스미드 성분 및 내생성 또는 비내생성 GPCR을 코딩하는 지정된 발현 플라스미드로 세포를 형질감염시킨다. 요약하면, 410 ng의 SRF-Luc, 80 ng의 pCMV-수용체 발현 플라스미드 및 20 ng의 CMV-SEAP (분비된 알칼리 포스파타제 발현 플라스미드, 알칼리 포스파타제 활성은 시료 사이의 형질감염 효능의 변화를 조절하기 위하여 형질감염된 세포의 배지에서 측정)을 제조자의 지시에 따라 칼슘 포스페이트 침전물에서 배합한다. 침전물의 반을 96웰 플레이트의 3웰에 균등하게 분배하고 24시간 동안 무-혈청 배지에서 세포를 유지한다. 마지막 5시간에 세포를 1 μM의 안지오텐신과 반응시킨다. 이어서 세포를 용혈시키고 Luclite(등록상표) 키트 (패커드,Cat. #6016911) 및 "Trilux 1450 Microbeta" 액체 신틸레이션 및 형광 계수기 (Wallac)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 루시퍼라제 활성에 대해 분석한다. 데이터는 GraphPad Prism(등록상표) 2.0a (그래프패드 소프트웨어 인크.)를 사용하여 분석할 수 있다.
5. 세포내 IP 3 축적 분석
1일 째, 수용체 (내생성 및(또는) 비내생성)를 포함하는 세포를 24웰 플레이트에 일반적으로 1×105세포/웰 (이 수는 최적화될 수 있음)로 플레이팅할 수 있다. 2일 째, 세포를 먼저 50 ㎕의 무-혈청 DMEM/웰의 0.25 ㎍ DNA 및 50 ㎕의 무-혈청 DMEM/웰의 2 ㎕ 리포펙타민을 혼합하여 형질감염시킬 수 있다. 상기 용액을 온화하게 혼합하고 실온에서 15 내지 30분 동안 배양한다. 세포를 0.5 ㎖의 PBS로 세척하고 400 ㎕의 무-혈청 배지를 형질감염 배지와 혼합하여 세포에 첨가한다. 그 후, 세포를 37℃/5% CO2에서 3 내지 4시간 동안 배양한 후 형질감염 배지를 제거하고 1 ㎖/웰의 조절 성장 배지로 대체한다. 3일 째, 세포를3H-미오-이노시톨로 표지한다. 요약하면, 배지를 제거하고, 세포를 0.5 ㎖의 PBS로 세척한다. 그 후, 0.5 ㎖의 무-이노시톨/무-혈청 배지 (깁코 BRL)을 0.25 μCi의3H-미오-이노시톨과 함께 웰에 첨가하고 세포를 37℃/5% CO2에서 16 내지 18시간 동안 배양한다. 4일 째, 세포를 0.5 ㎖의 PBS로 세척하고, 10 μM 파길린과 10 mM 리튬 클로라이드의 무-이노시톨/무-혈청 배지를 함유하는 분석 배지 0.45 ㎖ 또는 0.4 ㎖의 분석 배지및 50 ㎕의 10×케탄세린(ket)를 최종 농도 10 μM로 첨가한다. 그 후 세포를 37℃에서 30분 동안 배양한다. 그 후 세포를 0.5 ㎖의 PBS로 세척하고 200 ㎕의 새로운/빙냉의 정지 용액 (1 M의 KOH, 18 mM의 Na-보레이트, 3.8 mM의 EDTA)를 웰에 첨가한다. 용액을 5 내지 10분 동안 또는 세포가 용혈될 때까지 얼음에 두고 그 후 200 ㎕의 새로운/빙냉의 중화 용액 (7.5%의 HCl)으로 중화시켰다. 그 후, 용혈물을 1.5 ㎖의 에펜도르프 튜브에 옮기고 튜브당 1 ㎖의 클로로포름/메탄올 (1:2)을 첨가한다. 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 상층 상을 바이오래드 AG1-X8(등록상표) 음이온 교환 수지 (100-200 메쉬)에 적용한다. 먼저, 수지를 물로 1:1.25 W/V로 세척하고, 0.9 ㎖의 상층상을 컬럼 상에 부과한다. 컬럼을 10 ㎖의 5 mM 미오-이노시톨 및 10 ㎖의 5 mM Na-보레이트/60 mM Na-포름에이트로 세척한다. 이노시톨 트리스 포스페이트를 2 ㎖의 0.1 M 포름산/1 M 암모늄 포름에이트와 함께 10 ㎖의 신틸레이션 칵테일을 함유하는 신틸레이션 바이알에 용출시킨다. 10 ㎖의 0.1 M 포름산/3 M 암모늄 포름에이트로 세척하고, dd H2O로 2회 헹구어 컬럼을 재생하고 4℃에서 물 중에 보관한다.
예시적인 결과를 하기 표 I에 제시한다.
C. 세포 기초 검출 분석법 (실시예-TDAG8)
293 세포를 플레이트당 1.3×107세포의 밀도로 150 ㎜ 플레이트에 플레이팅하고, 플레이트당 12 ㎍의 각 DNA 및 60 ㎕의 리포펙타민 시약 (BRL)을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 형질감염 24시간 후에 수행되는 분석을 위하여 혈청 함유 배지에서 생장시켰다. 형질감염 48시간 후에 수행되는 검출 분석을 위하여 (혈청 및 무-혈청 배지를 비교한 분석, 참조 도 3), 초기 배지를 혈청 또는 무-혈청 배질로 변경하였다. 무-혈청 배지는 단지 둘베코의 변형 이글스 (DME) 고 글루코스 배지 (어빙 사이언티픽 #9024)만으로 구성되었다. 상기 DME 배지에 더하여 혈청이 있는 배지는 10% 소태아 혈청 (하이클론 #SH30071.03), 1%의 100 mM 나트륨 피루베이트 (어빙 사이언티픽 #9334), 1%의 20 mM L-글루타민 (어빙 사이언티픽 #9317) 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신 용액 (어빙 사이언티픽 #9366)을 함유하였다.
96웰 아데닐릴 사이클라제 활성화 FlashPlate(등록상표)를 사용하였다 (NEN: #SMP004A). 먼저, 50 ㎕의 분석용 표준물을 웰 당 50 pmol 내지 0 pmol의 cAMP의농도 범위로 중복하여 플레이트에 첨가하였다. 표준 cAMP (NEN: #SMP004A)를 물에 재구성하고, 1×PBS (어빙 사이언티픽 #9240)를 사용하여 멸균 희석액을 제조하였다. 이어서, 50 ㎕의 자극 완충액 (NEN: #SMP004A)를 모든 웰에 첨가하였다. cAMP의 활성화 또는 불활성화를 측정하기 위하여 화합물을 사용하는 경우, 물에 희석된 각 화합물 10 ㎕를 삼중복으로 각각의 웰에 첨가하였다. 사용된 다양한 최종 농도는 1 μM 내지 1 mM의 범위였다. 아데노신 5'-트리포스페이트, ATP (리서치 바이오케미칼스 인터내셔날: #A-141) 및 아데노신 5'-디포스페이트, ADP (시그마: #A2754)를 본 분석에 사용하였다. 이어서, 각각의 cDNA (CMV 또는 TDAG8)로 형질감염된 293 세포를 형질감염 24시간 (혈청 배지에서의 분석 검출) 또는 48시간 (혈청 및 무-혈청 배지를 비교하는 분석 검출) 후에 수확하였다. 배지를 흡인하고, 세포를 1×PBS로 1회 세척하였다. 이어서, 5 ㎖의 1×PBS를 3 ㎖의 세포 해리 완충액 (시그마: #C-1544)와 함께 세포에 첨가하였다. 분리된 세포를 원심분리관에 옮기고, 실온에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 적절한 양의 1×PBS에 재현탁하여 ㎖당 2×106세포의 최종 농도를 얻었다. 화합물을 함유하는 웰에 1×PBS 중의 세포 50 ㎕ (1×105세포/웰)를 첨가하였다. 플레이트를 진탕기에서 실온으로 15분 동안 배양하였다. 추적자 cAMP를 함유하는 검출 완충액을 제조하였다. 11 ㎖의 검출 완충액 (NEN: #SMP004A)에 50 ㎕ (1 μCi와 동일)의 [125I]cAMP (NEN: #SMP004A)를 첨가하였다. 배양 후, 추적자 cAMP를 함유하는 이 검출 완충액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 진탕기에 두고 실온에서2시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 플레이트의 웰로부터 용액을 흡인하고, Wallac MicroBeta(등록상표) 신틸레이션 계수기를 사용하여 플래쉬플레이트를 계수하였다.
도 2a에서, ATP 및 ADP는 내생성 TDAG8에 결합하여 cAMP를 각각 약 59% 및 약 55% 증가시켰다. 도 2b는 내생성 TDAG8을 형질감염시키고 혈청 및 무-혈청 배지에서 생장시켰을 때 내생성 TDAG8에 대한 ATP 및 ADP의 결합을 증거한다. 혈청 배지에서 생장한 내생성 TDAG8에 대한 ATP의 결합은 화합물없는 내생성 TDAG8과 비교하였을 때 cAMP를 약 65% 증가시키며, 무-혈청 배지에서는 약 68% 증가시켰다. 혈청에서의 내생성 TDAG8에 대한 ADP 결합은 약 61% 증가한 반면, 무-혈청 ADP 결합은 약 62% 증가시켰다. ATP 및 ADP는 내생성 TDAG8과 각각 139.8 μM 및 120.5 μM의 EC50 값으로 결합한다 (데이터는 나타내지 않음).
도 2b에 나타낸 결과가 혈청 및 무-혈청 배지에서 비교하였을 때와 실질적으로 동일한 결과를 가리키지만, 본 발명자들은 혈청 기재 배지를 선택하여 사용하였으며, 또한 무-혈청 배지도 사용될 수 있다.
<실시예 6>
GPCR 융합 단백질 제조
구성적으로 활성화된 GPCR-G 단백질 융합 구조물의 고안은 다음과 같이 달성되었다: 쥐 G 단백질 Gsα (긴 형태, Itoh, H. 등, 83 PNAS 3776 (1986))의 5' 및 3' 말단 모두를 HindIII 서열 (5'-AAGCTT-3')을 포함하도록 가공하였다. 올바른 서열을 확인한 후 (측면의 HindIII 서열 포함), 벡터의 HindIII 제한효소 부위를사용하여 서브클로닝하여 pcDNA3.1(-) (인비트로겐, Cat. #V795-20)에 전체 서열을 삽입하였다. Gsα 서열에 대한 올바른 배향은 pcDNA3.1(-)에 서브클로닝한 후 측정하였다. HindIII 서열에서 쥐 Gsα 유전자를 함유하는 변형된 pcDNA3.1(-)를 확인한 후, 이 벡터를 "일반" Gsα 단백질 벡터로 이용하였다. pcDNA3.1(-) 벡터는 HindIII 부위 상류에 다양한 공지된 제한효소 부위를 함유하며, 따라서 이롭게는 Gs 단백질의 상류에 구성적으로 활성화된 내생성 GPCR의 코딩 서열을 삽입할 수 있는 능력을 제공한다. 다른 "일반" G 단백질 벡터를 만들기 위하여 이러한 동일한 접근법이 이용될 수 있으며, 물론 당업자에게 공지된 상업적으로 이용가능하거나 독점적인 벡터가 이용될 수 있고, 이 때 중요한 기준은 GPCR에 대한 서열이 G 단백질의 상류 및 동일한 프레임에 있어야 한다는 것이다.
TDAG8은 Gs를 통하여 결합되며, H9는 Gz을 통하여 결합된다. 하기 예시적인 GPCR 융합 단백질에서, Gsα에 대한 융합이 달성되었다.
TDAG8 (I225K)-Gsα 융합 단백질 구조물은 다음과 같이 제조되었다. 프라이머는 하기와 같이 고안되었다.
5'-gatcTCTAGAATGAACAGCACATGTATTGAAG-3' (서열 125; 센스)
5'-ctagGGTACCCGCTCAAGGACCTCTAATTCCATAG-3' (서열 126; 안티센스)
작은 대문자로 표시된 뉴클레오티드는 G 단백질과 TDAG8 사이의 제한효소 부위에 스페이서로 포함되는 것이다. 센스 및 안티센스 프라이머는 각각 XbaI 및 KpnI의 제한효소 부위를 포함하였다.
상기 개시된 Gsα 일반적인 벡터 내의 융합을 위한 각각의 수용체 서열을 보장하도록 각각 하기 절차를 사용하는 PCR을 이용하였다. TDAG8에 대한 100 ng의 cDNA를 각 프라이머 2 ㎕ (센스 및 안티센스), 3 ㎕의 10 mM dNTP, 10 ㎕의 10x TaqPlus(등록상표) Precision 완충액, 1 ㎕의 TaqPlus(등록상표) Precision 폴리머라제 (스트라타겐, #600211) 및 80 ㎕의 물을 함유하는 분리 튜브에 첨가하였다. TDAG8의 경우 반응 온도 및 주기 시간은 다음과 같다. 초기 변성 단계는 94℃에서 5분 동안 수행하였고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분의 주기였다. 최종 연장 시간은 72 ℃에서 10분 동안 수행하였다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 적용한 후 정제하였다 (데이터는 나타내지 않음). 정제된 산물을 XbaI 및 KpnI (뉴 잉글랜드 바이오랩)으로 절단하고, 소망되는 삽입물을 정제한 후 각각의 제한효소 부위에서 Gs의 일반 벡터에 라이게이션하였다. 형질전환 후에 양성 클론을 단리하고, 제한효소 절단으로 결정하였다. 293 세포를 사용한 발현은 상기 기재된 절차에 따라 달성하였다. TDAG8:Gs-융합 단백질에 대한 각 양성 클론을 서열분석하여 정확성을 확인하였다.
구성적으로 활성화된 비내생성 TDAG8 (I225K)를 포함하는 GPCR 융합 단백질을 상기에서처럼 분석하고 구성적 활성화에 대하여 확인하였다.
H9 (F236K)-Gsα 융합 단백질 구조물은 다음과 같이 제조되었다. 프라이머는 하기와 같이 고안되었다.
5'-TTAgatatcGGGGCCCACCCTAGCGGT-3' (서열 145; 센스)
5'-ggtaccCCCACAGCCATTTCATCAGGATC-3' (서열 146; 안티센스)
작은 대문자로 표시된 뉴클레오티드는 G 단백질과 H9 사이의 제한효소 부위에 스페이서로 포함되는 것이다. 센스 및 안티센스 프라이머는 G 단백질 및 H9 사이에 스페이서가 존재하도록 각각 EcoRV 및 KpnI의 제한효소 부위를 포함하였다.
상기 개시된 Gsα 일반 벡터 내의 융합을 위한 각각의 수용체 서열을 보장하기 위하여 각각에 대하여 하기 절차를 사용하는 PCR을 이용하였다. H9에 대한 80 ng의 cDNA를 각 프라이머 (센스 및 안티센스) 100 ng 및 45 ㎕의 PCR Supermix(등록상표) (깁코-Brl, 라이프 테크) (50㎕의 총 반응부피)를 함유하는 분리 튜브에 첨가하였다. H9의 경우 반응 온도 및 주기 시간은 다음과 같다. 초기 변성 단계는 94℃에서 1분 동안 수행하였고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분의 주기였다. 최종 연장 시간은 72℃에서 7분 동안 수행하였다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 적용한 후 정제하였다 (데이터는 나타내지 않음). 정제된 산물을 pCRII-TOPO(등록상표) 시스템에 클로닝한 후 양성 클론을 동정하였다. 양성 클론을 단리하고, EcoRV 및 KpnI (뉴 잉글랜드 바이오랩)으로 절단하고, 목적의 삽입물을 단리하고, 정제한 후, 각 제한효소 부위에서 Gs 일반 벡터에 라이게이션하였다. 양성 클론을 형질전환한 후에 단리하고, 제한효소 절단으로 판정하였다. 293 세포를 사용한 발현은 상기 기재된 절차에 따라 달성하였다. H9(F236K):Gs-융합 단백질에 대한 각 양성 클론을 서열분석하여 정확성을 확인하였다. 막은 이용전까지 동결 (-80℃)하였다.
Gs 단백질에 의하여 매개되는 cAMP 반응을 측정하는 능력을 확인하기 위하여 (H9가 Gz과 결합할 지라도), NEN 아데닐릴 사이클라제 활성화 Flahplate(등록상표) 분석 키트 (96웰 형태)를 기초로 하는 하기 cAMP 막 분석을 이용하였다. "결합 완충액"은 10 mM HEPES, 100 mM NaCl 및 10 mM MgCl (pH 7.4)로 이루어졌다. "재생 완충액"은 결합 완충액에서 제조되었으며, 20 mM 포스포크레아틴, 20 U 크레아틴 포스포키나제, 20 μM GTP, 0.2 mM ATP 및 0.6 mM IBMX로 구성되었다. "cAMP 표준물"은 다음과 같이 결합 완충액에서 제조하였다.
동결 막 (대조군으로서의 pCMV 및 비내생성 H (-Gs 융합 단백질) 모두)을 해동하였다 (용액이 될 때까지 실온에서 얼음상으로). 현탁액이 될 때까지 (2×15초) 막을 폴리트론으로 균질화하였다.
브래드포드 분석 절차 (상기 참조)를 사용하여 막 단백질 농도를 측정하였다. 막 단백질 농도를 재생 완충액에 0.5 ㎎/㎖ (최종 분석 농도 25 ㎍/웰)로 희석하였다. 그 후, 50 ㎕의 결합 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 대조군의 경우, 50 ㎕/웰의 cAMP 표준물을 웰 11 및 12 A-G (96웰 형태)를 첨가하고 결합 완충액만을 12H에 첨가하였다. 그 후, 단백질을 50 ㎍/웰로 웰에 첨가하고 실온에서 60분 동안 (진탕기) 반응시켰다. 검출 완충액 (상기 참조) 중의 [125I]cAMP 100 ㎕ (상기 참조)를 각 웰에 첨가하였다 (검출 완충액 11 ㎖에 최종 50 ㎕의 [125I]cAMP). 이들을 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 플레이트를 8 채널의 분기관으로 흡인하고플레이트 덮개로 밀봉하였다. 결과 (결합된 pmole의 cAMP)를 Wallac(등록상표) 1450 (prot #15)로 기록하였다. 결과를 도 3에 제시하였다.
도 3에 제시된 결과는 Gs 결합된 융합이 H9 (F236K)의 구성적 활성화의 측정이 가능하도록 사이클라제 반응을 작동시킬 수 있다는 것을 가리킨다. 이러한 결과를 기초로, 사이클라제 기초 분석법을 사용하여 역효능제, 효능제 및 부분 효능제인 후보 화합물의 직접 동정이 가능하다.
<실시예 6>
절차: [ 35 S]GTPγS를 사용한 역효능제 및 효능제의 직접 동정
본 발명자들은 예를 들면 역효능제로서 후보 화합물을 직접 동정하기 위하여 내생성 구성적 활성화된 GPCR을 이용하였지만, 모두 이해될 수 없는 이유로 내부 분석 변화가 격화될 수 있다. 바람직하게는, 상기에서 개시된 GPCR 융합 단백질은 구성적으로 활성화된 비내생성 GPCR에 이용된다. 본 발명자들은 이러한 단백질이 사용될 때 내부 분석 변화가 실질적으로 안정화되고, 이에 따라 효과적인 신호 대 잡음 비율이 수득됨을 확인하였다. 이것은 후보 화합물의 더욱 강한 동정을 허용하는 이로운 결과를 갖는다. 따라서, 직접 동정의 경우, GPCR 융합 단백질을 사용하고, 이용될 때 하기 분석 절차가 이용되는 것이 바람직하다.
막 제조
유의한 구성적으로 활성화된 비내생성 고아 GPCR 융합 단백질을 포함하며, 역효능제, 효능제 또는 부분 효능제로서의 후보 화합물의 직접 동정에 사용되는 막은 바람직하게는 다음과 같이 제조된다.
a. 재료
"막 스크레이프(scrape) 완충액"은 20 mM HEPES 및 10 mM EDTA, pH 7.4로 구성되고, "막 세척 완충액"은 20 mM HEPES 및 0.1 mM EDTA, pH 7.4로 구성되며, "결합 완충액은 20 mM HEPES, 100 mM NaCl 및 10 mM MgCl2, pH 7.4로 구성된다.
b. 절차
모든 재료는 절차 전반에 걸쳐 얼음하에 유지하였다. 먼저, 세포의 콘플루언트 단층으로부터 배지를 흡인하고, 10 ㎖의 차가운 PBS로 헹구고, 흡인하였다. 그 후, 5 ㎖의 막 스크레이프 완충액을 첨가하여 세포를 벗겨내었다. 이어서 세포 추출물을 50 ㎖의 원심분리관으로 옮겼다 (4℃에서 20000 rpm으로 17분간 원심분리). 그 후, 상층액을 흡인하고, 펠렛을 30 ㎖의 막 세척 완충액에 재현탁하고 4℃에서 20,000 rpm으로 17분간 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 흡인하고, 펠렛을 결합 완충액에 재현탁하였다. 이것을 Brinkman polytron(등록상표) 호모게나이저를 사용하여 균질화하였다 (모든 재료가 현탁액이 될 때까지 15 내지 20초간 일시적으로). 이것을 본원에서 "막 단백질"로 칭한다.
브래드포드 단백질 분석법
균질화한 후, 브래드포드 단백질 분석법을 이용하여 막의 단백질 농도를 측정하였다 (단백질을 약 1.5 ㎎/㎖로 희석하고, 할당하여, 후에 사용하기 위하여 동결 (-80℃)하였다. 동결하였을 경우, 사용 절차는 다음과 같다. 분석 당일날, 동결된 막 단백질을 실온에서 해동한 후, 볼텍싱하고 폴리트론으로 약 12×1,000 rpm으로 약 5 내지 10초간 균질화한다. 다중 제조의 경우, 호모게나이저는 상이한 제조물의 균질화 사이에 완전히 세정하여야 한다는 것에 주의한다).
a. 재료
결합 완충액 (상기), 브래드포드 염료 시약, 브래드포드 단백질 표준물 (바이오래드 Cat. #500-0006)이 제조자의 지시에 따라 이용된다.
b. 절차
하나는 막을 포함하고, 다른 하나는 대조군으로 "블랭크"인 두 관을 준비한다. 각각은 800 ㎕의 결합 완충액을 함유하였다. 그 후, 10 ㎕의 브래드포드 단백질 표준물 (1 ㎎/㎖)을 각 관에 첨가하고, 막 단백질 10 ㎕를 단지 하나의 관에만 첨가한다 (블랭크에는 첨가하지 않음). 그 후, 200 ㎕의 브래드포드 염료 시약을 각 튜브에 첨가하고, 각각을 볼텍싱한다. 5분 후에, 각 관을 재볼텍싱하고, 그 안의 재료를 큐벳으로 옮긴다. 이어서, CECIL 3041 분광광도계를 사용하여 파장 595 nm에서 큐벳을 읽는다.
직접 동정 분석
a. 재료
GDP 완충액은 37.5 ㎖의 결합 완충액 및 2 ㎎의 GDP (시그마, Cat. #G-7127)로 이루어지며, 결합 완충액의 일련의 희석에 의해 0.2 μM GDP를 수득한다 (각 웰에서의 GDP의 최종 농도는 0.1 μM GDP). 후보 화합물을 포함하는 각 웰은 100 ㎕의 GDP 완충액 (최종 농도, 0.1 μM GDP), 결합 완충액 중의 막 단백질 50 ㎕, 및 결합 완충액 중의 [35S]GTPγS (0.6 nM) 50 ㎕ (결합 완충액 10 ㎖ 중 [35S]GTPγS 2.5 ㎕)로 이루어진 200 ㎕의 최종 부피를 갖는다.
b. 절차
후보 화합물은 바람직하게는 96웰 플레이트 형태를 사용하여 스크리닝한다 (이들은 -80℃에서 동결할 수 있다). 막 단백질 (또는 대조군으로서 GPCR 융합 반백질을 배제한 발현 벡터를 갖는 막)을 현탁액이 될 때까지 짧게 균질화한다. 그 후, 상기 기재한 것처럼 브래드포드 단백질 분석법을 사용하여 단백질 농도를 측정한다. 막 단백질 (및 대조군)을 결합 완충액으로 0.25 ㎎/㎖로 희석한다 (최종 분석 농도 12.5 ㎍/웰). 그 후, 100 ㎕의 GDP 완충액을 Wallac Scintistrip(등록상표) (왈락)의 각 웰에 첨가한다. 5 ㎕의 핀-도구를 사용하여 5 ㎕의 후보 화합물을 각 웰에 옮긴다 (즉, 200 ㎕의 총 분석 부피 중에서 5 ㎕는 후보 화합물의 최종 스크리닝 농도가 10 μM이 되도록 하는 1:40의 비임). 또한, 오염을 피하기 위하여, 각 전달 단계후에 핀 도구는 물 (1×), 에탄올 (1×) 및 물 (2×)를 포함하는 세 용기에서 헹구어야 하며, 각 헹굼 후에는 과량의 액체로 도구를 진탕하고, 종이 및 킴스 와이프 등으로 건조한다. 그 후, 50 ㎕의 막 단백질을 각 웰에 첨가하고 (또한 GPCR 융합 단백질이 없는 막을 포함하는 대조군 웰도 이용함), 실온에서 5 내지 10분 동안 예비 반응시킨다. 그 후, 결합 완충액 중의 50 ㎕의 [35S]GTPγS (0.6 nM)를 각 웰에 첨가하고 60분 동안 실온에서 진탕기 상에 반응시킨다 (또한, 본 실시예에서 플레이트를 호일로 덮는다), 플레이트를 22℃에서 4000 rpm으로 15분 동안 회전하여 분석을 정지한다. 그 후, 플레이트를 8 채널 분기관으로 흡인하고 플레이트 덮개로 밀봉한다. 이어서, 플레이트를 "Prot. #37"을 사용하여 제조자의 지시에 따라 Wallacc 1450 상에서 읽는다.
<실시예 7>
절차: 확인 분석
상기 기재된 것처럼 직접 동정된 후보 화합물을 확인하기 위하여 비의존적 분석 접근법을 사용하는 경우 확인 분석법을 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 경우, 바람직한 확인 분석법은 사이클라제 기초 분석법이다.
구성적으로 활성화된 비내생성 고아 GPCR에 대한 역효능제 및 효능제로서 직접 동정된 후보 화합물을 확인하기 위하여 하기 절차에 따라 변형된 Flash Plate(등록상표) 아데닐릴 사이클라제 키트 (뉴 잉글랜드 뉴클리어, Cat. #SMP004A)가 바람직하게 이용된다.
형질감염된 세포를 대략 형질감염 3일 후에 수확한다. 20 mM HEPES, pH 7.4 및 10 mM MgCl2를 함유하는 완충액에 현탁된 세포를 균질화하여 막을 제조한다. 균질화는 대략 10초 동안 Brinkman Polytron(등록상표)를 사용하여 얼음 상에서 수행한다. 생성된 균질물을 4℃에서 49,000×g로 15분 동안 원심분리한다. 생성된 펠렛을 20 mM HEPES, pH 7.4 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 완충액에 재현탁하고, 10초 동안 균질화한 후, 4℃에서 49,000×g로 15분 동안 원심분리한다. 생성된 펠렛은 사용전까지 -80℃에서 보관할 수 있다. 직접 동정 스크리닝을 하는 날, 막 펠렛을 실온에서 서서히 해동하고, 20 mM HEPES, pH 7.4 및 10 mM MgCl2를 함유하는 완충액에 재현탁하여 0.60 ㎎/㎖의 최종 단백질 농도를 얻는다 (재현탁된 막을 사용시까지 얼음 위에 둔다).
cAMP 표준물 및 검출 완충액 (11 ㎖의 검출 완충액에 2 μCi의 추적자 [125I cAMP (100 ㎕)] 포함)을 제조하고, 제조자의 지시에 따라 유지한다. 분석 완충액은 스크리닝을 위하여 새로 제조하며 20 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 20 mM 포스포크레아틴 (시그마), 0.1 Unit/㎖ 크레아틴 포스포키나제 (시그마), 50 μM GTP (시그마), 및 0.2 mM ATP (시그마)를 함유하며, 분석 완충액은 이용 전까지 얼음 상에서 저장할 수 있다.
상기에서처럼 동정된 후보 화합물 (동결되었다면, 실온에서 해동함)을 바람직하게는 96웰 플레이트 웰에 40 ㎕의 막 단백질 (30 ㎍/웰) 및 50 ㎕의 분석 완충액과 함께 첨가한다 (3 ㎕/웰, 12 μM의 최종 분석 농도). 이러한 혼합물을 실온에서 온화하게 진탕하면서 30분 동안 반응시킨다.
반응 후, 각 웰에 100 ㎕의 검출 완충액을 첨가하고, 이어서 2 내지 24시간 동안 반응시킨다. 플레이트를 "Prot. #31"을 사용하는 Wallac MicroBeta(등록상표) 플레이트 기록기에서 제조자의 지시에 따라 계수한다.
본 특허 명세서에서 언급된 특허, 특허 출원 및 인쇄 간행물 각각은 그 전체가 본원에 참고로 도입된다.
당분야의 숙련자들이 인식하는 것처럼, 본 발명의 취지를 벗어남 없이 본 발명의 바람직한 구현예에서 많은 변화 및 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형도 본 발명의 범위내에 있는 것이다.
내생성 및 비내생성 인간 GPCR 모두에 이용할 목적으로 당업자에게는 다양한발현 벡터가 이용될 수 있지만, 이용되는 벡터가 pCMV인 것이 가장 바람직하다. 이러한 벡터는 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정 하에 1998년 10월 13일 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC) (미국 20110-2209 버지니아주 매나서스 유니버시티 블러버드 10801)에 기탁되었다. DNA는 ATCC에 의하여 시험되었으며 측정되었다. ATCC는 pCMV에 ATCC#203351의 기탁번호를 부여하였다.

Claims (80)

  1. hARE-3 (F313K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  2. 제1항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  3. 벡터 및 제1항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  4. 제3항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  5. hARE-4 (V233K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  6. 제5항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  7. 벡터 및 제5항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  8. 제7항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  9. hARE-5 (A240K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  10. 제9항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  11. 벡터 및 제5항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  12. 제11항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  13. hGPCR14 (L257K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  14. 제13항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  15. 벡터 및 제13항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  16. 제15항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  17. hGPCR27 (C283K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  18. 제17항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  19. 벡터 및 제17항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  20. 제19항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  21. hARE-1 (E232K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  22. 제21항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  23. 벡터 및 제21항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  24. 제23항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  25. hARE-2 (G285K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  26. 제25항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  27. 벡터 및 제25항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  28. 제27항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  29. hPPR1 (L239K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  30. 제29항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  31. 벡터 및 제29항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  32. 제31항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  33. hG2A (K232A)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  34. 제33항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  35. 벡터 및 제33항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  36. 제35항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  37. hRUP3 (L224K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  38. 제37항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  39. 벡터 및 제37항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  40. 제39항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  41. hRUP5 (A236K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  42. 제41항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  43. 벡터 및 제41항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  44. 제42항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  45. hRUP6 (N267K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  46. 제45항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  47. 벡터 및 제45항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  48. 제47항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  49. hRUP7 (A302K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  50. 제49항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  51. 벡터 및 제49항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  52. 제51항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  53. hCHN4 (V236K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  54. 제53항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  55. 벡터 및 제53항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  56. 제55항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  57. hMC4 (A244K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  58. 제57항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  59. 벡터 및 제57항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  60. 제60항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  61. hCHN3 (S284K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  62. 제61항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  63. 벡터 및 제61항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  64. 제63항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  65. hCHN6 (L352K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  66. 제65항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  67. 벡터 및 제65항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  68. 제67항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  69. hCHN8 (N235K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  70. 제69항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  71. 벡터 및 제69항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  72. 제71항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  73. hH9 (F236K)를 포함하는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체를 코딩하는 cDNA.
  74. 제73항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  75. 벡터 및 제73항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  76. 제74항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  77. hAT1 (F239K), hAT1 (N111A), hAT1 (AT2K255IC3) 및 hAT1 (A243+)로 이루어지는 군에서 선택되는 구성적으로 활성화된 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 AT1 수용체를 코딩하는 cDNA.
  78. 제77항의 cDNA에 의해 코딩되는 비내생성 형태의 인간 G 단백질 결합형 수용체.
  79. 벡터 및 제77항의 cDNA를 포함하는 플라스미드.
  80. 제79항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
KR1020017004630A 1998-10-13 1999-10-13 구성적으로 활성화된 비내생성 인간 ｇ 단백질 결합형수용체 KR20010080882A (ko)

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