JP2003225088A - ヒト・ロイコトリエンｂ４第二受容体及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規タンパク質、それをコードする新規ＤＮ
Ａ、そのＤＮＡを含むプラスミド、そのプラスミドを含
む形質転換体、前記新規タンパク質の製造方法、前記新
規タンパク質を含有する細胞又はその細胞膜画分、前記
新規タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニスト
のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット、前
記新規タンパク質に対するアゴニスト及びアンタゴニス
ト、並びに前記新規タンパク質に対する抗体又はそのフ
ラグメントを提供する。 【解決手段】 前記新規タンパク質は、ヒト・ロイコト
リエンＢ₄の新規受容体又はその機能的等価改変体であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規タンパク質
（特にはヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体）、それ
をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含むプラスミド、そ
のプラスミドを含む形質転換体、前記新規タンパク質の
製造方法、前記新規タンパク質を含有する細胞又はその
細胞膜画分、前記新規タンパク質（特にはヒト・ロイコ
トリエンＢ₄第二受容体）に対するアゴニスト又はアン
タゴニストのスクリーニング方法及びスクリーニング用
キット、前記新規タンパク質（特にはヒト・ロイコトリ
エンＢ ₄第二受容体）に対するアゴニスト及びアンタゴ
ニスト、並びに前記新規タンパク質に対する抗体又はそ
のフラグメントに関する。

【０００２】

【従来の技術】ロイコトリエンＢ₄は、天然に存在する
物質の中で最も強力な白血球遊走物質であり、また、白
血球活性化因子である。ロイコトリエンＢ₄は白血球で
作られ、種々の病態（例えば、感染症、免疫不全、潰瘍
性大腸炎、クローン病、心筋梗塞再灌流後の壊死拡大、
乾癬、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、急性呼吸逼迫症
候群、遅発性神経細胞死、クモ膜下出血後の血管攣縮、
又は臓器移植後の灌流障害）の形成に関与していると考
えられている。ロイコトリエンＢ₄は、Ｇタンパク質共
役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）を介して種々の細胞機能を
営むと考えられており、既にその第一受容体は単離さ
れ、構造が決定されている［Ｙｏｋｏｍｉｚｏら，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３８７，第６２０頁〜第６２４頁（１９９
７）］。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来、種々のロイコト
リエンＢ₄受容体拮抗薬が開発されており、これらは主
として、前記第一受容体を対象とするものであった。し
かし、これらの拮抗薬は、それ単独では、充分な治療効
果が得られないことが知られており、より強力な治療薬
又は治療方法が求められていた。本発明者は、このよう
な現状に鑑み、鋭意探求したところ、全く新規の受容体
を見つけ、その構造を決定し、更に、これがロイコトリ
エンＢ₄の低親和性第二受容体であることを見いだした
のである。この第二受容体の発見により、より強力な
（例えば、第一受容体及び第二受容体の両方を阻害す
る）新たな拮抗薬の開発、あるいは、抗体などを用いた
治療の開発が期待される。本発明はこのような知見に基
づくものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列表の配列
番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又はそ
の機能的等価改変体（以下、併せて、「本発明による新
規タンパク質」と称することがある）に関する。また、
本発明は、前記タンパク質又はその機能的等価改変体を
コードするＤＮＡに関する。また、本発明は、前記ＤＮ
Ａを含むプラスミドに関する。また、本発明は、前記プ
ラスミドを含む形質転換体に関する。また、本発明は、
前記形質転換体を培養することを特徴とする、前記タン
パク質又はその機能的等価改変体の製造方法に関する。

【０００５】また、本発明は、前記タンパク質又はその
機能的等価改変体を含有する細胞又はその細胞膜画分に
関する。また、本発明は、前記タンパク質若しくはその
機能的等価改変体、又はそれを含有する前記細胞若しく
はその細胞膜画分を用いることを特徴とする、前記タン
パク質又はその機能的等価改変体に対するアゴニスト又
はアンタゴニストのスクリーニング方法及びスクリーニ
ング用キットに関する。また、本発明は、前記タンパク
質又はその機能的等価改変体に対するアゴニスト及びア
ンタゴニストに関する。更に、本発明は、前記タンパク
質又はその機能的等価改変体に特異的に反応することを
特徴とする、抗体又はそのフラグメントに関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明によるヒト・ロイコトリエ
ンＢ₄第二受容体は、配列表の配列番号２で表されるア
ミノ酸配列からなる新規タンパク質である。公知のヒト
・ロイコトリエンＢ₄第一受容体のアミノ酸配列が全長
で３５２個のアミノ酸残基からなるのに対して、本発明
による前記ヒト・ロイコトリエンＢ ₄第二受容体のアミ
ノ酸配列（すなわち、配列表の配列番号２で表されるア
ミノ酸配列）は３５８個のアミノ酸残基からなり、公知
の前記ヒト・ロイコトリエンＢ₄第一受容体のアミノ酸
配列と全長で４５．２％のアミノ酸同一性を有してい
る。また、本発明によるヒト・ロイコトリエンＢ₄第二
受容体の前記アミノ酸配列は、これまで多数報告されて
いるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に共通する
アミノ酸を複数個保持していたことから、ＧＰＣＲであ
ることが推定された。本発明によるヒト・ロイコトリエ
ンＢ₄第二受容体の前記アミノ酸配列は、国際的な遺伝
子データベースであるＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａ
ｎｋデータベースにもその配列が登録されておらず、こ
れまで知られていなかった新規の受容体である。

【０００７】本発明による新規タンパク質には、配列表
の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク
質、及びその機能的に等価な改変体（機能的等価改変
体）が含まれ、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸
配列からなるタンパク質（すなわち、ヒト・ロイコトリ
エンＢ₄第二受容体）又はその機能的等価改変体である
ことが好ましい。なお、本明細書において「タンパク
質」には、タンパク質の塩が含まれ、更には、糖鎖を有
しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。

【０００８】本明細書において、「機能的等価改変体」
とは、そのアミノ酸配列が、元となるタンパク質のアミ
ノ酸配列において１以上（特には１又は数個）のアミノ
酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であっ
て、しかも、ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体と実
質的に同じ活性（例えば、ロイコトリエンＢ₄との結合
能）を有するタンパク質を意味する。

【０００９】従って、これらの条件を満たす限り、前記
機能的等価改変体の起源はヒトに限定されない。例え
ば、ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体のヒトにおけ
る変異体（例えば、ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容
体遺伝子の対立遺伝子によりコードされるタンパク質）
が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物［例えば、非ヒ
ト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又
はイヌ）］由来のロイコトリエンＢ₄第二受容体若しく
はその変異体が含まれる。更には、それらの天然タンパ
ク質（すなわち、ヒト由来の変異体、又はヒト以外の生
物由来のロイコトリエンＢ₄第二受容体若しくはその変
異体）又はヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体を元に
して遺伝子工学的に人為的に改変したタンパク質などが
含まれる。なお、本明細書において「変異体」とは、
「ｖａｒｉａｔｉｏｎ」、すなわち、同一種内の同一タ
ンパク質にみられる個体差、あるいは、数種間の相同タ
ンパク質にみられる差異を意味する。

【００１０】ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体のヒ
トにおける変異体、又はヒト以外の生物由来のロイコト
リエンＢ₄第二受容体若しくはその変異体は、当業者で
あれば、ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体遺伝子の
塩基配列（すなわち、配列表の配列番号１で表される塩
基配列）の情報を基にして、取得することができる。例
えば、ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体遺伝子の塩
基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブ
を設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする
生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラッ
ト、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総
ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、
又はファージライブラリー）とを用いてＰＣＲ法又はハ
イブリダイゼーション法を実施することにより、目的タ
ンパク質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系
を用いて発現させることにより、所望のタンパク質を調
製することができる。

【００１１】また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変
したタンパク質は、常法、例えば、部位特異的突然変異
誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）により調製することができる。

【００１２】配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配
列を含む前記タンパク質としては、例えば、配列表の配
列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
と、融合用パートナーとの融合タンパク質を挙げること
ができる。前記融合タンパク質においては、配列表の配
列番号２で表されるアミノ酸配列からなる前記タンパク
質のＮ末端及び／又はＣ末端に、前記融合用パートナー
を結合させることができる。前記融合用パートナーとし
ては、例えば、精製用タンパク質［例えば、グルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一
部］、検出用タンパク質［例えば、ヘムアグルチニン又
はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺα）の全
部又は一部］、又は発現用タンパク質（例えば、シグナ
ル配列）を用いることができる。更に、前記融合タンパ
ク質においては、配列表の配列番号２で表されるアミノ
酸配列からなる前記タンパク質と前記融合用パートナー
との間に、限定分解するタンパク質分解酵素（例えば、
トロンビン又はファクターＸａ）で切断することができ
るアミノ酸配列を適宜導入することもできる。

【００１３】本発明によるこれらの新規タンパク質は、
種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、本
発明によるＤＮＡを用いて公知の遺伝子工学的手法によ
り調製することができる。より具体的には、後述する本
発明による形質転換体（すなわち、本発明による新規タ
ンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する
形質転換体）を、前記新規タンパク質の発現が可能な条
件下で培養し、タンパク質の分離及び精製に一般的に用
いられる方法により、その培養物から目的タンパク質を
分離及び精製することにより調製することができる。前
記の分離及び精製方法としては、例えば、硫安塩析、イ
オン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマト
グラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマト
グラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カ
ラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げ
ることができる。

【００１４】本発明によるＤＮＡは、本発明による新規
タンパク質をコードする限り、特に限定されるものでは
なく、例えば、配列表の配列番号１で表される塩基配列
からなるＤＮＡを挙げることができる。配列表の配列番
号１で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、配列表
の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒト・ロ
イコトリエンＢ₄第二受容体をコードする。

【００１５】本発明によるプラスミドは、本発明による
前記ＤＮＡを含む限り、特に限定されるものではなく、
例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発
現ベクターに、本発明による前記ＤＮＡを挿入すること
により得られるプラスミドを挙げることができる。ま
た、本発明の形質転換体も、本発明による前記プラスミ
ドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、
本発明による前記プラスミドにより、所望の宿主細胞を
形質転換することにより得られる形質転換体を挙げるこ
とができる。

【００１６】前記宿主細胞としては、例えば、通常使用
される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ある
いは、公知の培養細胞、例えば、動物細胞（例えば、Ｃ
ＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は
昆虫細胞（例えば、ＢｍＮ４細胞）を挙げることができ
る。

【００１７】また、公知の前記発現ベクターとしては、
例えば、大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥ
Ｘ、ｐＫＫ、又はｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、
ｐＥＭＢＬＹ又はｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞に対しては
ｐｃＤＮＡ３又はｐＭＡＭｎｅｏを；ＨＥＫ−２９３細
胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＣＯＳ細胞に対してはｐ
ｃＤＮＡ３を；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角
体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター
を有するベクター（例えば、ｐＢＫ２８３）を挙げるこ
とができる。

【００１８】本発明による新規タンパク質を含有する本
発明による細胞は、例えば、本発明による前記形質転換
体を、前記タンパク質の発現が可能な条件下で培養する
ことにより得ることができる。また、本発明による新規
タンパク質を含有する本発明による細胞膜画分は、例え
ば、本発明による前記細胞を破砕した後、細胞膜が多く
含まれる画分を分離することにより得ることができる。
細胞の破砕方法としては、例えば、ホモジナイザー（例
えば、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザ
ー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダー又は
ポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、
超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加
圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる
破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方
法としては、例えば、遠心力による分画法、例えば、分
画遠心分離法又は密度勾配遠心分離法を挙げることがで
きる。

【００１９】本発明による新規タンパク質（特にはヒト
・ロイコトリエンＢ₄第二受容体）に対する、本発明に
よるアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方
法では、本発明による前記新規タンパク質（すなわち、
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタン
パク質又はその機能的等価改変体）、又は本発明による
前記細胞若しくは前記細胞膜画分（すなわち、配列表の
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又
はその機能的等価改変体を含有する細胞又はその細胞膜
画分）を用いる。より詳細には、被検試料不在下及び被
検試料存在下の各条件下において、本発明による前記新
規タンパク質又は本発明による前記細胞若しくは前記細
胞膜画分と、ロイコトリエンＢ₄とを接触させ、前記条
件下における本発明による前記新規タンパク質又は前記
細胞若しくは前記細胞膜画分に対する前記ロイコトリエ
ンＢ₄の特異的結合量、あるいは、前記条件下における
前記ロイコトリエンＢ₄の各細胞刺激活性（例えば、細
胞内カルシウム濃度の上昇、アデニル酸シクラーゼの活
性抑制、細胞遊走活性の促進、又はマイトジェン活性化
キナーゼの活性化）を比較することにより、本発明によ
る新規タンパク質（特にはヒト・ロイコトリエンＢ₄第
二受容体）に対するアゴニスト又はアンタゴニストをス
クリーニングすることができる。

【００２０】本発明のスクリーニング方法において、本
発明による前記新規タンパク質又は前記細胞若しくは前
記細胞膜画分に対する前記ロイコトリエンＢ₄の特異的
結合量を比較する場合には、前記ロイコトリエンＢ₄と
して、標識したロイコトリエンＢ₄を用いることができ
る。前記標識としては、例えば、放射性同位元素、例え
ば、［³Ｈ］又は［¹⁴Ｃ］を用いることができる。

【００２１】本発明のスクリーニング法において、本発
明による前記新規タンパク質又は前記細胞若しくは前記
細胞膜画分に結合して、これらとロイコトリエンＢ₄と
の結合を阻害する化合物を、本発明による新規タンパク
質（特にはヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体）に対
するアゴニスト又はアンタゴニストとして選択すること
ができる。更に、本発明のスクリーニング法において、
ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体に結合し、この受
容体を介して細胞刺激活性を有する化合物を、本発明に
よる新規タンパク質（特にはヒト・ロイコトリエンＢ₄
第二受容体）に対するアゴニストとして選択することが
できる。一方、本発明のスクリーニング法において、本
発明による前記新規タンパク質又は前記細胞若しくは前
記細胞膜画分とロイコトリエンＢ₄との結合を阻害する
ものの、前記細胞刺激活性を有しない化合物を、本発明
による新規タンパク質（特にはヒト・ロイコトリエンＢ
₄第二受容体）に対するアンタゴニストとして選択する
ことができる。

【００２２】本発明による新規タンパク質（特にはヒト
・ロイコトリエンＢ₄第二受容体）に対するアゴニスト
は、例えば、感染症又は免疫不全などの治療又は予防剤
として有用である。一方、本発明による新規タンパク質
（特にはヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体）に対す
るアンタゴニストは、例えば、感染症、免疫不全潰瘍性
大腸炎、クローン病、心筋梗塞再灌流後の壊死拡大、乾
癬、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、急性呼吸逼迫症候
群、遅発性神経細胞死、クモ膜下出血後の血管攣縮、又
は臓器移植後の灌流障害などの治療又は予防剤として有
用である。

【００２３】本発明のスクリーニング法に用いることの
できる被検試料としては、特に限定されるものではない
が、例えば、天然若しくは合成化合物（例えば、脂質、
タンパク質、又はペプチド）、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、又は動物組織抽出液などを挙げること
ができる。

【００２４】本発明のスクリーニングキットは、本発明
による前記新規タンパク質（すなわち、配列表の配列番
号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又はその
機能的等価改変体）、又は本発明による前記細胞若しく
は前記細胞膜画分（すなわち、配列表の配列番号２で表
されるアミノ酸配列を含むタンパク質又はその機能的等
価改変体を含有する細胞又はその細胞膜画分）を含む。
本発明のスクリーニングキットは、所望により、種々の
試薬、例えば、標識したロイコトリエンＢ₄、非標識の
ロイコトリエンＢ₄、結合反応用緩衝液、及び／又は洗
浄用緩衝液を更に含むことができる。

【００２５】本発明のスクリーニングキットにおいて
は、本発明による前記新規タンパク質又は本発明による
前記細胞若しくは前記細胞膜画分を少なくとも含む限
り、前記の種々の試薬を適宜組み合わせて構成すること
ができる。本発明のスクリーニングキットの好適な具体
的構成としては、例えば、本発明による前記新規タンパ
ク質又は本発明による前記細胞若しくは前記細胞膜画
分、標識したロイコトリエンＢ₄（特には［³Ｈ］標識ロ
イコトリエンＢ₄）、非標識のロイコトリエンＢ₄、及び
結合反応用緩衝液の組み合わせを挙げることができる。

【００２６】本発明による抗体には、モノクローナル抗
体及びポリクローナル抗体が含まれる。本発明によるモ
ノクローナル抗体は、免疫用抗原及びスクリーニング用
抗原として、本発明による新規タンパク質（特にはヒト
・ロイコトリエンＢ₄第二受容体）又はそれらの部分断
片を用いることを除いて、それ自体公知の手段により得
ることができる。例えば、前記免疫用抗原を用いてマウ
スを免疫し、そのマウスから取得した脾臓細胞と、マウ
ス骨髄腫細胞とを、Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１
９７５）に記載の細胞融合法、あるいは、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，１００，１８１−１８９（１９
８７）に記載の電気細胞融合法を用いて細胞融合し、前
記スクリーニング用抗原を用いてスクリーニングするこ
とにより、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを得ることができる。

【００２７】前記ハイブリドーマを培養する培地として
は、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、
好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄ
ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｅａｇｌ
ｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄ
ｉｕｍ）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビ
ン酸、及び抗生物質（ペニシリンＧ及びストレプトマイ
シン）を含む培地が用いられる。前記ハイブリドーマの
培養は、培地中で行なう場合には、５％ＣＯ₂濃度且つ
３７℃の条件下で約３日間で行なうことができる。ま
た、マウスの腹腔内で培養する場合には、約１４日間で
行なうことができる。

【００２８】このようにして得られた培養液又はマウス
の腹水から、タンパク質の分離及び精製に一般的に用い
られる方法により、前記モノクローナル抗体を分離及び
精製することが可能である。このような方法としては、
例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる
分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多
糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、
又は凍結乾燥等を挙げることができる。

【００２９】また、本発明のポリクローナル抗体も、免
疫用抗原及びスクリーニング用抗原として、本発明によ
るヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体若しくはその機
能的等価改変体、又はそれらの部分断片を用いることを
除いて、それ自体公知の方法、例えば、以下に示す方法
により調製することができる。すなわち、抗原を含む生
理食塩水を等量のフロイント氏完全アジュバンド若しく
は不完全アジュバンド、又はその等価物、例えば、Ｈｕ
ｎｔｅｒ’ｓ ＴｉｔｅｒＭａｘ^TM（フナコシ；Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．ＹＴ００１−００，東京，日本）と乳化混合
して、哺乳動物（特にはウサギ又はヤギ等）の皮下、腹
腔内、又は筋肉内などのいずれかに投与する（初回免
疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行い、数
回免疫する。最終免疫から１〜２週間後に哺乳動物の頚
動脈又は心臓から血液を採取して血清を硫酸アンモニウ
ムによって塩析することにより調製することができる。

【００３０】本発明による抗体フラグメントは、本発明
の抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を
含む）の部分断片であって、しかも、元の抗体と同じ反
応特異性を有する限り、特に限定されるものではない。
本発明による抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂ 、又はＦｖを挙げること
ができる。本発明の抗体フラグメントは、例えば、本発
明のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を常法
によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タ
ンパク質の分離及び精製の常法に従って得ることができ
る。

【００３１】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。なお、以下の各実施例において、大腸菌を用いた遺
伝子操作法は、特に断わらない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，（１９８９年）］に記載されている方法に従った。

【００３２】

【実施例１】《ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体を
コードするＤＮＡのクローニング》市販のヒトゲノムラ
イブラリー（Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｇｅ
ｎｏｍｉｃ Ｌｉｂｒａｒｙ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
製）のファージを大腸菌（ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ
株）に感染させた後、軟寒天プレート上に約５×１０⁴
プラークずつまき、３７℃で一晩インキュベートしてプ
ラークを形成させた。プラークを２０枚のナイロンフィ
ルター上に移した後、変性溶液（０．５Ｎ水酸化ナトリ
ウム，及び１．５Ｍ塩化ナトリウム）、中和溶液（０．
５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０），及び１．５Ｍ塩化ナ
トリウム）、及び洗浄溶液［０．２Ｍトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．５），２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３Ｍ塩化ナト
リウム，０．３Ｍクエン酸ナトリウム）］で順次処理
し、風乾した後、８０℃で２時間焼き付けを行ない、フ
ァージＤＮＡをナイロンフィルター上に固定した。

【００３３】一方、プローブとして用いるために、公知
のヒト・ロイコトリエンＢ₄第一受容体ｃＤＮＡ［Ｙｏ
ｋｏｍｉｚｏら，Ｎａｔｕｒｅ，３８７，第６２０頁〜
第６２４頁（１９９７）］の発現ベクターであるｐＬＴ
ＢＲ１から、タンパク質翻訳領域に相当するＤＮＡ断片
を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切り出し、グラ
スビーズを用いて精製した。このＤＮＡ断片を、ランダ
ムプライマー、［³²Ｐ］−ｄＣＴＰ、及びクレノー（Ｋ
ｌｅｎｏｗ）酵素を用いたランダムプライミング法によ
って標識した。ファージＤＮＡを固定した前記フィルタ
ーを、この標識プローブを含むハイブリダイゼーション
用緩衝液（６×ＳＳＣ，１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ
液，０．５％ＳＤＳ，及び１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ
精子ＤＮＡ）中、６５℃でハイブリダイゼーションを行
なった。フィルターを最終的に０．１×ＳＳＣ及び０．
１％ＳＤＳ液中、６５℃で洗浄した後、オートラジオグ
ラムをとってプローブとハイブリダイゼーションするプ
ラークを検索した。

【００３４】この方法により得られたファージクローン
（λＮＯＫ）からファージＤＮＡを抽出した後、制限酵
素ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化してＤＮＡ断片を切り
出し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIのＳａｌＩ
−ＢａｍＨＩ部位に挿入してプラスミドｐＮＯＫ２−２
を得た。挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を通常の
方法で決定し、国際的な遺伝子データベースであるＤＤ
ＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを用いて
ホモロジー検索を実施したところ、このＤＮＡ断片の中
に、公知のヒト・ロイコトリエンＢ₄第一受容体と相同
性を有する新規ＤＮＡが含まれていることが判明した。
後述する実施例４で示すように、この新規ＤＮＡにより
コードされる新規タンパク質は、ロイコトリエンＢ₄と
結合する性質を有することが確認されたため、「ヒト・
ロイコトリエンＢ₄第二受容体」と命名した。

【００３５】

【実施例２】《ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体及
びその融合タンパク質の発現プラスミドの構築》前記実
施例１で得られたヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体
をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＮＯＫ２−
２から、以下の手順により、２種類の発現プラスミド、
すなわち、ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体の発現
プラスミドｐｈＢＬＴ２と、ヘムアグルチニンタグ（Ｈ
Ａタグ）をＮ末端側に付加したＨＡ−ヒト・ロイコトリ
エンＢ₄第二受容体融合タンパク質の発現プラスミドｐ
ＨＡ−ｈＢＬＴ２とを作製した。

【００３６】まず、ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容
体用のセンスプライマーとして、配列： 5'-CGGGATCCCGCCATGTCGGTCTGCTACCGT-3' からなるプライマーを合成し、以下、同様に、ＨＡ−ヒ
ト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体融合タンパク質用の
センスプライマーとして、配列： 5'-CGGGATCCCGCCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTCGGT
CTGCTACCGTCC-3' からなるプライマーを、両者兼用のアンチセンスプライ
マーとして、配列： 5'-GGAATTCAAAGGTCCCATTCCGG-3' からなるプライマーをそれぞれ合成した。

【００３７】これらのプライマーを用いて、前記実施例
１で得られたプラスミドｐＮＯＫ２−２を鋳型にＰＣＲ
反応を行なった。増幅された断片を、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＢａｍＨＩで切断し、１％アガロースゲル中で電
気泳動した後、アガロースゲルから切り出し、グラスビ
ーズを用いて精製した。このＤＮＡ断片を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐｃＤＮＡ
３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入することにより、２
種類の発現プラスミド、すなわち、ヒト・ロイコトリエ
ンＢ₄第二受容体の発現プラスミドｐｈＢＬＴ２、及び
ＨＡ−ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体融合タンパ
ク質の発現プラスミドｐＨＡ−ｈＢＬＴ２を得た。導入
後のプラスミドにおける受容体翻訳領域の塩基配列を通
常の方法で決定し、ＰＣＲ法による不用意なミスマッチ
がないことを確認した。

【００３８】

【実施例３】《ＨＡ−ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受
容体融合タンパク質のＣＨＯ−Ｋ１細胞での発現》ＣＨ
Ｏ−Ｋ１細胞（５×１０⁵細胞）を、直径１０ｃｍのシ
ャーレを用いて、１０％ウシ胎児血清を含むハムＦ１２
培地中で、３７℃且つ９５％空気（ａｉｒ）／５％ＣＯ
₂条件下で２４時間培養した。この細胞に、前記実施例
２で得られたＨＡ−ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容
体融合タンパク質の発現プラスミド（ｐＨＡ−ｈＢＬＴ
２）１５μｇを用いてリポフェクション法でトランスフ
ェクションを行なった。トランスフェクションを実施し
てから３日後に、選択薬剤であるＧ４１８（１ｇ／リッ
トル）と１０％ウシ胎児血清とを含むハムＦ１２培地に
培地交換し、前記発現プラスミドが染色体に組み込まれ
た細胞１８クローンを選択した。選択された細胞のコロ
ニーを限界希釈法によって単一細胞からクローニングし
た。抗ＨＡ抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメ
ーターにより、高発現の細胞３クローンを選択した。以
降、Ｇ４１８（０．３ｇ／リットル）及び１０％ウシ胎
児血清を含むハムＦ１２培地で細胞を継代した。

【００３９】

【実施例４】《ヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受容体の
ＨＥＫ−２９３細胞での発現と結合実験》ＨＥＫ−２９
３細胞を１５ｃｍプレートにまき、１０％ウシ胎児血清
を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃且つ９５％空気／
５％ＣＯ₂条件下で２４時間培養した。この細胞に、前
記実施例２で得られたヒト・ロイコトリエンＢ₄第二受
容体の発現プラスミド（ｐｈＢＬＴ２）２０μｇを用い
てリポフェクション法でトランスフェクションを行なっ
た。トランスフェクションを実施してから３日後に、細
胞を回収し、超音波で破砕した後に、細胞膜画分（Ｍｉ
ｃｒｏｓｏｍｅ画分）を回収して結合実験を行なった。

【００４０】［³Ｈ］ロイコトリエンＢ₄（ＬＴＢ₄）に
対する結合実験は以下のようにして行なった。結合測定
用緩衝液［５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４），１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂，１０ｍＭ−ＮａＣｌ，及
び０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］０．１ｍ
ｌ中で、種々の濃度（０．２５〜４０ｎＭ）の［³Ｈ］
ＬＴＢ₄と、タンパク質２０μｇを含む細胞膜画分とを
２５℃で１時間結合させた後、素早くグラスファイバー
フィルターを通過させて、細胞膜画分とそれに結合した
［³Ｈ］ＬＴＢ₄とをグラスファイバーフィルターに吸着
させた。結合測定用緩衝液０．２ｍｌで１０回洗浄した
後、５０℃でグラスファイバーフィルターを乾燥させ
た。グラスファイバーフィルターに液体シンチレーター
を加えて放射活性を測定した。また、結合反応時に１０
００倍濃度の非標識ＬＴＢ₄を加えること以外は、前記
操作を繰り返し、得られた値を非特異的結合量とした。

【００４１】結果を、図１及び図２に示す。図１は、［
³Ｈ］ＬＴＢ₄の濃度と、細胞膜画分への［³Ｈ］ＬＴＢ₄
の結合量との関係を示すグラフである。図１において、
「白抜き四角」は総結合量を表わし、「白丸」は非特異
的結合量を表わし、「黒丸」は特異的結合量を表わす。
図２は、図１に示す結果に基づいて行なったスキャッチ
ャード解析の結果を示すグラフである。図２において、
「Ｂ」は、結合した（Ｂｏｕｎｄ）［³Ｈ］ＬＴＢ₄の量
を意味し、「Ｂ／Ｆ」は、結合した（Ｂｏｕｎｄ）［³
Ｈ］ＬＴＢ₄の量と、結合しなかった（Ｆｒｅｅ）
［³Ｈ］ＬＴＢ₄の濃度との比を意味する。

【００４２】

【発明の効果】本発明の新規タンパク質又はそれを含有
する本発明の細胞若しくはその細胞膜画分によれば、本
発明の新規タンパク質（特にはヒト・ロイコトリエンＢ
₄第二受容体）に対するアゴニスト又はアンタゴニスト
を効率良くスクリーニングすることができる。前記スク
リーニングによれば、例えば、ヒト・ロイコトリエンＢ
₄第一受容体を対象とする公知のロイコトリエンＢ₄受容
体拮抗薬よりも強力な新たな拮抗薬の開発が期待され
る。

【００４３】

【配列表】 <110> Meiji Seika Kaisha, Ltd. <110> Japan Health Sciences Foundation <120> Human Leukotriene B4 Second Receptor and Novel DNA Encoding the Sa me <130> MEJ99001P <160> 2 <210> 1 <211> 1077 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atg tcg gtc tgc tac cgt ccc cca ggg aac gag aca ctg ctg agc tgg 48 Met Ser Val Cys Tyr Arg Pro Pro Gly Asn Glu Thr Leu Leu Ser Trp 1 5 10 15 aag act tcg cgg gcc aca ggc aca gcc ttc ctg ctg ctg gcg gcg ctg 96 Lys Thr Ser Arg Ala Thr Gly Thr Ala Phe Leu Leu Leu Ala Ala Leu 20 25 30 ctg ggg ctg cct ggc aac ggc ttc gtg gtg tgg agc ttg gcg ggc tgg 144 Leu Gly Leu Pro Gly Asn Gly Phe Val Val Trp Ser Leu Ala Gly Trp 35 40 45 cgg cct gca cgg ggg cga ccg ctg gcg gcc acg ctt gtg ctg cac ctg 192 Arg Pro Ala Arg Gly Arg Pro Leu Ala Ala Thr Leu Val Leu His Leu 50 55 60 gcg ctg gcc gac ggc gcg gtg ctg ctg ctc acg ccg ctc ttt gtg gcc 240 Ala Leu Ala Asp Gly Ala Val Leu Leu Leu Thr Pro Leu Phe Val Ala 65 70 75 80 ttc ctg acc cgg cag gcc tgg ccg ctg ggc cag gcg ggc tgc aag gcg 288 Phe Leu Thr Arg Gln Ala Trp Pro Leu Gly Gln Ala Gly Cys Lys Ala 85 90 95 gtg tac tac gtg tgc gcg ctc agc atg tac gcc agc gtg ctg ctc acc 336 Val Tyr Tyr Val Cys Ala Leu Ser Met Tyr Ala Ser Val Leu Leu Thr 100 105 110 ggc ctg ctc agc ctg cag cgc tgc ctc gca gtc acc cgc ccc ttc ctg 384 Gly Leu Leu Ser Leu Gln Arg Cys Leu Ala Val Thr Arg Pro Phe Leu 115 120 125 gcg cct cgg ctg cgc agc ccg gcc ctg gcc cgc cgc ctg ctg ctg gcg 432 Ala Pro Arg Leu Arg Ser Pro Ala Leu Ala Arg Arg Leu Leu Leu Ala 130 135 140 gtc tgg ctg gcc gcc ctg ttg ctc gcc gtc ccg gcc gcc gtc tac cgc 480 Val Trp Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Val Pro Ala Ala Val Tyr Arg 145 150 155 160 cac ctg tgg agg gac cgc gta tgc cag ctg tgc cac ccg tcg ccg gtc 528 His Leu Trp Arg Asp Arg Val Cys Gln Leu Cys His Pro Ser Pro Val 165 170 175 cac gcc gcc gcc cac ctg agc ctg gag act ctg acc gct ttc gtg ctt 576 His Ala Ala Ala His Leu Ser Leu Glu Thr Leu Thr Ala Phe Val Leu 180 185 190 cct ttc ggg ctg atg ctc ggc tgc tac agc gtg acg ctg gca cgg ctg 624 Pro Phe Gly Leu Met Leu Gly Cys Tyr Ser Val Thr Leu Ala Arg Leu 195 200 205 cgg ggc gcc cgc tgg ggc tcc ggg cgg cac ggg gcg cgg gtg ggc cgg 672 Arg Gly Ala Arg Trp Gly Ser Gly Arg His Gly Ala Arg Val Gly Arg 210 215 220 ctg gtg agc gcc atc gtg ctt gcc ttc ggc ttg ctc tgg gcc ccc tac 720 Leu Val Ser Ala Ile Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Trp Ala Pro Tyr 225 230 235 240 cac gca gtc aac ctt ctg cag gcg gtc gca gcg ctg gct cca ccg gaa 768 His Ala Val Asn Leu Leu Gln Ala Val Ala Ala Leu Ala Pro Pro Glu 245 250 255 ggg gcc ttg gcg aag ctg ggc gga gcc ggc cag gcg gcg cga gcg gga 816 Gly Ala Leu Ala Lys Leu Gly Gly Ala Gly Gln Ala Ala Arg Ala Gly 260 265 270 act acg gcc ttg gcc ttc ttc agt tct agc gtc aac ccg gtg ctc tac 864 Thr Thr Ala Leu Ala Phe Phe Ser Ser Ser Val Asn Pro Val Leu Tyr 275 280 285 gtc ttc acc gct gga gat ctg ctg ccc cgg gca ggt ccc cgt ttc ctc 912 Val Phe Thr Ala Gly Asp Leu Leu Pro Arg Ala Gly Pro Arg Phe Leu 290 295 300 acg cgg ctc ttc gaa ggc tct ggg gag gcc cga ggg ggc ggc cgc tct 960 Thr Arg Leu Phe Glu Gly Ser Gly Glu Ala Arg Gly Gly Gly Arg Ser 305 310 315 320 agg gaa ggg acc atg gag ctc cga act acc cct cag ctg aaa gtg gtg 1008 Arg Glu Gly Thr Met Glu Leu Arg Thr Thr Pro Gln Leu Lys Val Val 325 330 335 ggg cag ggc cgc ggc aat gga gac ccg ggg ggt ggg atg gag aag gac 1056 Gly Gln Gly Arg Gly Asn Gly Asp Pro Gly Gly Gly Met Glu Lys Asp 340 345 350 ggt ccg gaa tgg gac ctt tga 1077 Gly Pro Glu Trp Asp Leu 355 <210> 2 <211> 358 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Val Cys Tyr Arg Pro Pro Gly Asn Glu Thr Leu Leu Ser Trp 1 5 10 15 Lys Thr Ser Arg Ala Thr Gly Thr Ala Phe Leu Leu Leu Ala Ala Leu 20 25 30 Leu Gly Leu Pro Gly Asn Gly Phe Val Val Trp Ser Leu Ala Gly Trp 35 40 45 Arg Pro Ala Arg Gly Arg Pro Leu Ala Ala Thr Leu Val Leu His Leu 50 55 60 Ala Leu Ala Asp Gly Ala Val Leu Leu Leu Thr Pro Leu Phe Val Ala 65 70 75 80 Phe Leu Thr Arg Gln Ala Trp Pro Leu Gly Gln Ala Gly Cys Lys Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Val Cys Ala Leu Ser Met Tyr Ala Ser Val Leu Leu Thr 100 105 110 Gly Leu Leu Ser Leu Gln Arg Cys Leu Ala Val Thr Arg Pro Phe Leu 115 120 125 Ala Pro Arg Leu Arg Ser Pro Ala Leu Ala Arg Arg Leu Leu Leu Ala 130 135 140 Val Trp Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Val Pro Ala Ala Val Tyr Arg 145 150 155 160 His Leu Trp Arg Asp Arg Val Cys Gln Leu Cys His Pro Ser Pro Val 165 170 175 His Ala Ala Ala His Leu Ser Leu Glu Thr Leu Thr Ala Phe Val Leu 180 185 190 Pro Phe Gly Leu Met Leu Gly Cys Tyr Ser Val Thr Leu Ala Arg Leu 195 200 205 Arg Gly Ala Arg Trp Gly Ser Gly Arg His Gly Ala Arg Val Gly Arg 210 215 220 Leu Val Ser Ala Ile Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Trp Ala Pro Tyr 225 230 235 240 His Ala Val Asn Leu Leu Gln Ala Val Ala Ala Leu Ala Pro Pro Glu 245 250 255 Gly Ala Leu Ala Lys Leu Gly Gly Ala Gly Gln Ala Ala Arg Ala Gly ２６０ ２６５
２７０ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｙｒ ２７５ ２８０
２８５ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ ２９０ ２９５
３００ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ ３２５
３３０ ３３５ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ ３４０ ３４５
３５０ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｌｅｕ ３５５

【図面の簡単な説明】

【図１】［³Ｈ］ＬＴＢ₄の濃度と、細胞膜画分への［³
Ｈ］ＬＴＢ₄の結合量との関係を示すグラフである。

【図２】図１に示す結果に基づいて行なったスキャッチ
ャード解析の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 横溝 岳彦 埼玉県越谷市東大沢４−19−７ (72)発明者 清水 孝雄 東京都文京区本駒込２−18−２−103 Ｆターム(参考） 2G045 BB20 BB51 DA36 FB02 FB03 FB07 FB09 4B024 AA01 BA44 BA63 GA27 4B065 AA90X AA93Y BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA51 DA75 EA22 EA29 FA74

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸
   配列を含むタンパク質又はその機能的等価改変体。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のタンパク質又はその機
   能的等価改変体をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１で表される塩基配列
   からなる、請求項２に記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２又は３に記載のＤＮＡを含むプ
   ラスミド。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のプラスミドを含む形質
   転換体。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の形質転換体を培養する
   ことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質又はそ
   の機能的等価改変体の製造方法。
7. 【請求項７】 請求項１に記載のタンパク質又はその機
   能的等価改変体を含有する細胞又はその細胞膜画分。
8. 【請求項８】 請求項１に記載のタンパク質若しくはそ
   の機能的等価改変体、又は請求項７に記載の細胞若しく
   はその細胞膜画分を用いることを特徴とする、請求項１
   に記載のタンパク質又はその機能的等価改変体に対する
   アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
9. 【請求項９】 請求項１に記載のタンパク質若しくはそ
   の機能的等価改変体、又は請求項７に記載の細胞若しく
   はその細胞膜画分を含むことを特徴とする、請求項１に
   記載のタンパク質又はその機能的等価改変体に対するア
   ゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング用キッ
   ト。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載のタンパク質又はその
    機能的等価改変体に対するアゴニスト。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載のタンパク質又はその
    機能的等価改変体に対するアンタゴニスト。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載のタンパク質又はその
    機能的等価改変体に特異的に反応することを特徴とす
    る、抗体又はそのフラグメント。