WO2004005510A1 - 新規Nogo受容体様ポリペプチドおよびそのＤＮＡ - Google Patents

Abstract

糖尿病モデルラットであるＺｕｃｋｅｒ　ｆａｔｔｙラットにおいて、食餌制限と運動により骨格筋で発現が増大するタンパク質としてＮｏｇｏ受容体様新規ポリペプチドを見出した。また、それに対応するヒトホモローグタンパク質を見出した。　本発明のポリペプチドは、糖尿病マーカーおよび糖尿病治療薬として有用である。さらに、本発明のポリペプチドは、脳内の大脳皮質で最も強く発現していることからアルツハイマー病などの神経変性疾患マーカーおよび神経変性疾患治療薬としても有用である。

Description

明細書 新規 Nogo受容体様ポリぺプチ .ドおよびその D N A 技術分野

本発明は、 No go受容体と類似構造を有する、糖尿病発症および神経再生に関与する新 規ポリぺプチド、該ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドに対 する相補的ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターで形質転換 された形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドのリガンドおよび該ポ リぺプチドを利用した物質のスクリ一二ング方法、並びに該ポリぺプチドおよび該ポリヌク レオチドの神経疾患および糖尿病マーカーとしての用途に関する。 背景技術

食事による血中グルコース濃度の上昇は、 その大部分がインスリン作用による肝臓、骨格 筋および脂肪細胞でのグルコース取り込み活性の増加によって処理される。糖尿病は、 イン スリン分祕障害や作用が不足して血糖値が上昇した病態であるが、その原因の一つに、 ィン スリン感受性の低下がある。 すなわち、 ィンスリンは適当量存在するが、 骨格筋および脂肪 細胞が十分な応答ができずグルコースが取り込まれない、ィンスリン抵抗性を示す状態であ る。 また、 過食と運動不足がインスリン抵抗性の原因としてあげられており、適度な運動に より骨格筋におけるグルコースの取り込み能が増大して血糖値が改善されることが知られ ている （Mo l e cu l ar' Me d i c i ne, 38, 165 (2001) . ) 。 インス リンが、 骨格筋に作用すると、 細胞質内の小胞に局在しているグルコース輸送体（G 1 u t 4)が細胞膜に移行してグルコースが取り込まれることが知られている （J ourna l of B i o l o gi cal Chemi s t ry, 268, 14523 (1993) . ) 。 また、 運動により、 Glut 4の発現量と細胞膜への移行量の増大が認められる （Mo l e c u l ar Med i c i ne, 38, 165 (2001) . ) 。

神絰再生に関与している No go (別名 vp 20)が Glut 4と同じ分铋小胞に存在し ていることが明らかになつている他、 Gl ut 4の細胞膜への移行に関与している分子は不 明である (B i o chimi c a e t B i o phys i c a Ac t a, 1450, 6 8— 76 (1999) . ) 。 したがって、 インスリンが作用してから G 1 u t 4が細胞膜に 移行するまでのシグナル伝達機能を解明することは、糖尿病治療薬の開発にとって重要であ るが、 その機構に関しては詳細な解析がされておらず、 その解明が待望されていた。 一方、損傷を受けた哺乳動物の中枢神経の修復再生は起こらないとされてきたが、最近に なり、 神経幹細胞が存在し神経も再生しうることが報告されつつあり、 外傷、 虚血、 あ.るい はアルヅハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症など神経変性疾患におけ る応用が期待される。神経変性疾患とは、神経細胞を中心とするさまざまな種類の退行性の 変化であり、 血管障害、感染、 中毒のような明らかな原因がつかめない一群の神経疾患とし て定義されており、 代表的な疾患としては、 大脳皮質を犯すアルツハイマー病がある （実験 医学、 19、 2256 (2001 ) . ) 。 これまで、 神経細胞の再生や軸索の進展に関与す る分子は、 いくつか報告されているが、 その中でも、 No g 0および No g o受容体が重要 な機能を有している （Nat ure, 18， 409 (2001) . ) 。 すなわち、 No go が N o g o受容体と結合することにより神経細胞の軸索の伸長が阻害されているため、成人 では再生が起こりにく く、胎児期では、 No goおよび No go受容体の発現が弱いため再 生が起こりやすくなつているというものである （Neuron， 30, 1 1 (2001) . )。 しかし、 これらの分子の機能も含めて、神経細胞の再生の分子機能に関しては詳細な解析が されておらず、 その解明が待望されていた。 発明の開示

本発明は、神経疾患および糖尿病等の疾患の検出に有用な新規ポリぺプチドおよびポリヌ クレオチドの提供を課題とする。 さらに、 当該ポリペプチド、作動薬およびその阻害剤を用 いた、 糖尿病および神経疾患の治療薬を提供する。 本発明者らは、骨格筋におけるインスリン抵抗性に関与する新規遺伝子を単離することを 目的として、 鋭意研究を行なった結果、 No go受容体様新規ポリぺプチド （3 9 C 7) を コードする新規な遺伝子を見出した。更に研究を進めた結果、 当該遺伝子の発現がインスリ ン抵抗性モデルラットの骨格筋において食餌制限と運動により発現が増大すること、ヒト組 織において脳と骨格筋に特異的に発現していること、および脳内では大脳皮質で最も強く発 現していることを見出し本発明のポリぺプチドおよびポリヌクレオチドが糖尿病および神 絰変性疾患の検出および治療に有用であることを確認し本発明を完成させた。 すなわち、 本発明は、

( 1) 配列番号 2の 22位の Gl yから 441位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含 有するポリペプチドまたはその塩；

(2) 配列番号 2の 1位の Me tから 44 1位の Ar gで表わされるアミノ酸配列を含有 する （ 1) 記載のポリペプチドまたはその塩；

(3) 配列番号 4の 22位の S e rから 445位の Ar gで表わされるアミノ酸配列を含 有するポリぺプチドまたはその塩；

(4) 配列番号 4の 1位の Me tから 445位の Ar gで表わされるアミノ酸配列を含有 する （3) 記載のポリペプチドまたはその塩；

(5) 上記 （1 ) から （4) のいずれか記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個の アミノ酸が欠失、置換または付加から選択される少なくとも 1つの変異を有するアミノ酸配 列からなるポリペプチドまたはその塩；

(6) 糖尿病マーカ一、 神経変性疾患マーカー、 糖尿病治療薬、 あるいは神経変性疾患治 療薬として用いることを特徴とする上記 （ 1) から （5) のいずれか記載のポリペプチド；

(7) 上記 （ 1 ) から （6) のいずれか記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有す るポリヌクレオチド ；

(8) 配列番号 1の 1 Ί 4番目の Gから 1 43 3番目の Cで表わされる塩基配列を含有す る上記 （ 7 ) 記載のポリヌクレオチド ；

(9) 配列番号 1の 1 1 1番目の Aから 1 43 3番目の Cで表わされる塩基配列を含有す る上記 （ 7 ) 記載のポリヌクレオチド ； ( 1 0) 配列番号 3の 1 Ί 0番目の Aから 144 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有 する上記 （7) 記載のポリヌクレオチド ；

(1 1 ) 配列番号 3の 1 0 7番目の Aから 144 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有 する上記 （7) 記載のポリヌクレオチド ；

( 1 2) 上記（7) から （ 1 1 ) のいずれか記載のポリヌクレオチドとストリンジェント な条件でハイプリダイズするポリヌクレオチド ；

(1 3) 上記（7) から （ 1 2) のいずれか記載のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列 を有するポリヌクレオチド ；

(1 4) 糖尿病マーカー、 神絰変性疾患マーカー、糖尿病治療薬あるいは神経変性疾患治 療薬として用いることを特徴とする上記 （7) から （ 1 1) および （ 1 3) のいずれか記載 のポリヌクレオチド ；

(1 5) 配列番号 1または 3記載の塩基配列中の連続した 5から 6 0塩基と同一配列を有 するオリゴヌクレオチド、該ォリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチ ドおよびそれらの誘導体ォリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチド ； (1 6) 上記（7) から （ 1 3) のいずれか記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべ クタ一；

(1 7) 上記 （ 1 6 ) 記載の組換えべクタ一で形質転換させた形質転換体；

(1 8) 上記 （ 1 7 ) 記載の形質転換体を培養する工程、 および産生された上記 （ 1 ) か ら （5) のいずれか記載のポリペプチドを培養液から回収する工程、 を含有する該ポリぺプ チドまたはその塩の製造法；

( 1 9) 上記 （ 1) から （5) のいずれか記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体； (2 0) 下記の工程を含む、 上記 （ 1 9) 記載の抗体を用いることを特徴とする、 上記 （ 1) から （5) のいずれか記載のポリペプチドの検出または定量方法、

(a) ポリペプチドと該抗体とを接触させる工程および、

(b) ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程；

(2 1 ) 上記（20)記載の方法を用いることを特徴とする、 請求項 1から 5のいずれか に記載のポリぺプチドが閧連する糖尿病または神経変性疾患の検出方法。 (22) 上記（20)記載の方法を用いることを特徴とする糖尿病または神経変性疾患の 検出用キット ；

(23) 下記の工程を含む上記 （7) から （13) または （15) のいずれか記載のポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上記 （1) から （5) のいずれか記載のポリぺプ チドの mRN Aの検出または定量方法、

(a) mRN Aと該ポリヌクレオチドを接触させる工程および、

(b) mRNAと該ポリヌクレオチドの結合を検出する工程。

(24) 上記 （23) 記載の方法を用いることを特徴とする、 （1) から （5) のいずれ か記載のポリぺプチドが関連する糖尿病または神経変性疾患の検出方法；

(25) 上記（23)記載の方法を用いることを特徴とする、 糖尿病または神経変性疾患 の検出用キット ；

(26) 上記 （23) 記載の方法を用いることを特徴とする、 上記 （1) から （5) 記載 のポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現量の測定方法；

(27) 上記 （23) 記載の方法を用いることを特徴とする、 上記 （1) から （5) 記載 のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量の測定キット ；

(28) 上記 （7) から （ 13) または （ 15) のいずれか記載のポリヌクレオチドを用 いることを特徴とする、 上記 （ 1) から （5) のいずれか記載のポリペプチドをコードする DN Aの転写または mRN Aの翻訳を促進または抑制する方法，·

(29) 下記の工程を含む、 上記 （1) から （5) のいずれか記載のポリペプチドの結合 物質のスクリ一ニング方法、

(a)上記 （1)から （5) のいずれか記載のポリペプチドと被検物質とを接触させる工程 および、

(b) 該ポリペプチドと被検物質との結合を検出する工程；

(30) 上記 （1) から （5)のいずれか記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、 該ポ リぺプチドの結合物質のスクリ一二ング用キット ；

(31) 上記（29)記載の結合物質のスクリーニング方法により得られることを特徴と する、 結合物質； (3 2 ) 下記の工程を含む、 上記 （3 1 ) 記載の結合物質と上記 （ 1 ) から （5 ) のいず れか記載のポリぺプチドとの結合活性調節物質のスクリーニング方法、

(a) 被検物質の存在下または非存在下、 上記 （1 ) から （5 ) のいずれかに記載のポリぺプ チドと上記 （3 1 ) 記載の結合物質を接触させる工程および、

(b) 該ポリぺプチドと該結合物質の結合活性を、 被検物質の存在下と非存在下で比較する工程

(3 3 ) 上記 （ 1 ) から （5 ) のいずれかに記載のポリペプチドおよび上記 （3 0) 記載 の結合物質を含むことを特徴とする、 結合活性調節物質のスクリーニング用キット ； (3 4) 上記 （3 3 ) 記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、 結合活 性調節物質；

(3 5 ) 下記の工程を含む、 上記 （ 1 ) から （ 5 ) のいずれか記載のポリぺプチドの発現調節 物質のスクリーニング方法、

(a) 上記 （1) から （5) のいずれかに記載のポリペプチドを発現しうる細胞と被検物質を接 触させる工程おょぴ、

(b) 該ポリペプチドの発現量の変化を、 上記 （20) または （23) のいずれか記載の方法を 用いて検出する工程；

(3 6 ) ±IB (35) 記載の方法を用いることを特徴とする、 上記 （1) から （5) のいずれ か記載のポリぺプチドの発現調節物質のスクリ一二ング用キヅト ；

(3 7) 上記 （35) 記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、 上記（1 ) から （ 5 ) のいずれか記載のポリぺプチドの発現調節物質；

(3 8) 上記 （ 1 ) から （5 ) のいずれか記載のポリペプチドをコードする DN Aを欠損 または変異させた非ヒトノックァゥト動物；

(3 9 ) 上記 （ 1 ) から （5 ) のいずれか記載のポリペプチドをコードする DN Aを発現 または変異させた非ヒト トランスジエニック動物；

(4 0 ) 上記 （ 1 9 ) 記載の抗体， （3 1 ) 記載の結合物質、 （34) 記載の結合活性調 節物質または （3 7) 記載の発現調節物質を含有してなる医薬組成物 ,·

(4 1 ) 上記 （1 ) から （5 ) のいずれか記載のポリペプチドから選ばれる少なくとも 1 つを含有してなる医薬組成物；

(42) 上記 （7) から （1 3) および （15) のいずれか記載のポリヌクレオチドから 選ばれる少なくとも 1つを含有してなる医薬組成物；

(43) 神経変性疾患または糖尿病の治療剤である上記 （40) から （42)記載の医薬 組成物；

(44) 上記 （40) から （43) のいずれか記載の医薬組成物を投与することを特徴と する神経変性疾患または糖尿病の治療方法；

に関する。 図面の簡単な説明

図 1 ヒト 39 C 7ポリペプチドの構造を表した模式図である。

ァミノ配列の第 1位から第 21位が、 予想されるシグナルぺプチド領域（SP； S i gn a 1 Pept i de)、第 22位から第 305位が No g o受容体のロイシンリッチリピ 一ト領域 (LRR； Leuc i ne-r i ch r e eat doma in) と類似'注を 有する 9つの領域で、 ァミノ末端側から順に、 LRRNT (L e c i ne r i ch r e pea N-t ermi na丄 domai n)、 LRR— 1、 LRR— 2、 LRR— 3、 LRR— 4、 LRR— 5、 LRR— 6、 LRR— 7、 および LRRCT (Lec i ne r i c h r e p e a C-t ermi nal doma i n) で表している。 また、 414 位から 441位には、 グルコシルホスファチジルイノシト一ルアン力一 (GPIアンカー） 蛋白質と予想される構造を有している。 図 2 ヒト正常組織における 39 c 7ポリぺプチド mRNAの発現量を表している。 図 3 ヒト脳における 39 c 7ポリペプチド mRNAの発現量を表している。ヒト脳内の種 々の領域におけるノーザンプロヅト解析を行い、全脳での 39 c 7ポリペプチド mRNAの 発現量を 1とした相対的な発現量で示している。 図 4 運動および食餌制限による r 3 9 c - 7の発現変動を示す図である。 インス リン抵抗性モデルラヅ ト骨格筋における 3 9 c 7ポリペプチド m R N Aの発現変動の結果 を示した図である。 T a q— M A Nを用いた定量 P C R解析を行い、ィンスリン抵抗性を示 すモデルラヅ トでの 3 9 c 7ポリぺプチド m R N Aの発現量を 1とした相対的発現量で示 している。 図 5 h39C7 強制発現細胞のゥエスタンブロッ トの結果を示す図である。 図 6 h39C 7 強制発現細胞でのグルコース取り こみ能を示す図である。 縦軸に CCPM/ DNA (ng)、 横軸にイ ンシュ リ ン濃度（nM)を示す。 発明を実施するための最良の形態

本発明のポリぺプチドは、 「配列番号 2に記載の 2 2位の G 1 yから 4 4 1位の A r gで 表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」および「配列番号 2に記載 の 1位の M e tから 4 4 1位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリぺプチド またはその塩」である。 また、 「配列番号 4に記載の 2 2位の S e rから 4 4 5位の A r g で表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」および「配列番号 4に記 載の 1位の M e tから 4 4 5位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリぺプチ ドまたはその塩」 も包含する。 「塩」 としては、 酸または塩基との生理学的に許容される塩 が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例 えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸などの無機酸との塩、 または酢酸、 ギ酸、 プロピオ ン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが用いられる。 本発明のポリぺプチドは、 「配列番号 2または 4のいずれかに記載されるアミノ酸配列に おいて、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換または付加からなる群より選択される少な くとも 1つの変異を有するァミノ酸配列からなり、神経変性疾患マーカーあるいは糖尿病マ 一力一であるポリぺプチドまたはその塩」も包含する。このポリぺプチドは神経変性疾患マ 一力一あるいは糖尿病マーカーである。 1若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘 ■ 発法などにより欠失、置換または付加することができる程度の数のアミノ酸であり、 5 0個 以下、 好ましくは 3 0個以下、 より好ましくは 2 0個以下、 さらに好ましくは 1 0個以下の アミノ酸残基を意味している。 さらに、 本発明のポリペプチドは、 欠失、 置換または付加に よっても生物学的活性を有しており、神経変性疾患マーカーあるいは糖尿病マーカーとして の機能を有するポリペプチドであり、配列番号 2または配列番号 4で表わされるアミノ酸配 列と少なくとも 6 0 %以上の相同性を有するポリぺプチド、好ましくは 8 0 %以上の相同性 を有するポリペプチド、 さらに好ましくは、 9 5 %以上の相同性を有するポリペプチドを挙 げることができる。 本明細書において 「神経変性疾患マーカー」 とは、神経変性疾患を検出するに使用される 物質である。ある種の m R N Aまたはタンパク質が、神経変性疾患においてその発現が増加 または減少する場合に、 「神経変性疾患マーカ一」 となりえる。 「神経変性疾患」 とは、 神 絰細胞を中心とするさまざまな種類の退行性の変化であり、 血管障害、感染、 中毒のような 明らかな原因のつかめない一群の神経疾患である。 「神経変性疾患」 としては、 アルヅハイ マー病、 パーキンソン病、 および筋萎縮性側索硬化症などが例示される。 「神絰変性疾患マ 一力一」は神経変性疾患を検出することができる物質であればよく、本発明のポリヌレクォ チド、 ポリペプチドおよび抗体などを使用することができる。 「糖尿病マーカー」 とは、 糖 尿病を検出するのに使用される物質である。ある種の m R N Aまたはタンパク質が、糖尿病 においてその発現が増加または減少する場合に、 「糖尿病マーカー」 となりえる。 本明細書において 「神経変性疾患治療薬」 とは、 神経変性疾患を治療するのに用いられる 物質である。本発明のポリペプチドが脳で大量に発現していることから、本発明のポリぺプ チド、ポリヌクレオチドおよび抗体などは各種神経変性疾患の治療に有用であると考えられ る。 「糖尿病治療薬」 とは、 糖尿病を治療するのに用いられる物質である。本発明のポリぺ プチドが骨格筋で発現しており、運動および食餌制限により発現変動していることから、本 発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体などは糖尿病性疾患の治療に有用である と考えられる。 本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする DNAであり、本発明 のポリヌクレオチドとしては「配列番号 1の 1 74番目の Gから 1 43 3番目の Cで表わさ れる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」、 「配列番号 1の 1 1 1番目の Aから 1 433 番目の Cで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」、 「配列番号 3の 1 Ί 0番目 の Aから 1 4 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」または「配 列番号 3の 1 0 7番目の Aから 144 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有するポリヌ クレオチド」 が例示される。 また、 本発明のポリヌクレオチドには、 「本発明のポリヌクレ ォチドとストリンジヱントな条件でハィブリダイズし、神絰変性疾患マーカ一であるか糖尿 病マーカーであるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド」も包含される。本発明のポ リヌクレオチドは、好ましくは「配列番号 1の 1 74番目の Aから 1 43 3番目の Cで表わ される塩基配列を含有するポリヌクレオチド」または「配列番号 3の 1 Ί 0番目の Aから 1 44 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」 である。 ここで、 「ストリンジェントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド」 とは、 本発 明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、当該分野にお いて周知慣用な手法、 例えば、 コロニーハイブリダィゼーシヨン法、 プラークハイブリダィ ゼ一シヨン法あるいはサザンプロヅトハイブリダィゼーシヨン法などを用いることにより 得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来のポリヌ クレオチドを固定化したメンブランを用いて、 0. 7〜 1. OMのNa C l存在下、 6 5 °C でハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1 ~ 2倍濃度の S S C (S a 1 i n e S o d i um C i t r at e ; 1 5 0 mM 塩化ナトリウム、 1 5 mM クェン酸ナトリウム） 溶液を用い、 65°Cでメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味 する。ハイブリダィゼーシヨンは、 M o 1 e c u 1 a r C l on i ng : A Lab o r a t o r y Manua l, S e c o nd Ed i t i o n ( 1 9 8 9) (Co l d S p r i ng Harbor Labo r at o ry Pre s s)、 Cur r ent P r o t o c o l s i n Mo l e cu l ar B i o l o gy (1994) (Wi l ey— I nt e r s c i enc e)、 DNA C l oni ng 1 ： C o r e Te chn i que s、 A Prac t i c al Appr o ach, S e c ond Ed i t i on (1 99 5 ) (O f or d Univer s i t y P r e s s ) などに記載されている方法に準 じて行うことができる。 ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダィズする配列からは 、 好ましくは、 アデニン （A) またはチミン （T) のみのからなる配列は除外される。 本明細書において「ハイプリダイズするポリヌクレオチド」 とは、 上記ハイプリダイズ条 件で別のポリヌクレオチドにハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドをいう。そ のようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号 1または配列番号 3で表されるァ ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配列と少なくとも 60%以上 の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは、 80 %以上の相同性を有するポリヌクレ ォチド、更に好ましくは、 95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることがで きる。 ここで、 相同性は、 例えば、 Al t s c hu 1ら （The J ourna l o f Mo l e cu l ar B i o l o y, 215, 403 - 410 (1990) . ) の開発し たアルゴリズムを使用した検索プログラム B LAS Tを用いることにより、スコアで類似度 が示される。 本発明のポリヌクレオチドは、 「配列番号 1または 3に記載の塩基配列中の連続した 5か ら 60塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド」を包含する。その様なポリヌクレオチ ドは、 配列番号 1または 3のいずれかに記載の塩基配列中の連続した塩基で、例えば、 5個 、 8個、 10個、 12個、 15個、 20個、 25個、 30個、 40個、 50個、 60個など からなる塩基配列と同一配列のオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドと相補的 な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびその誘導体オリゴヌクレオチドも包含される。 「 誘導体オリゴヌクレオチド」 としては、例えば、 オリゴヌクレオチド中のりん酸ジエステル 結合がホスホロチォエート結合または Ν 3，一 Ρ 5，ホスホアミダイ ト結合などに変換され た誘導体ォリゴヌクレオチド、リボースとりん酸ジエステル結合がぺプチド結合に変換され た誘導オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5プロピオニルゥラシ ルまたは C一 5チアゾ一ルゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、オリゴヌクレ ォチド中のシトシンが C一 5プロピオニルシトシンまたはフエノキサジン修飾シトシンな ど置換された誘導体オリゴヌクレオチド、 DN A中のリボースが 2，一0—プロピルリボー スまたは 2 '―メトキシェトキシリボースなどで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなど を挙げることができる。 その様なポリヌクレオチドは、 例えば、 遺伝子マ一カー、 PCR用 のプライマー、 ハイプリダイゼーシヨン用のプローブとして有用である。 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだべクター、該ベクターにより形質転換 された形質転換体、 該形質転換体を用いた本発明ポリペプチドの製造法が含まれる。 また、 ノックァゥト動物やトランスジエニック動物も本発明により提供される。これら改変動物は 、 ヒトを除く哺乳類であれば、 いずれの動物でもよく、 好ましくはマウス、 ラット、 ハムス 夕一、 モルモットなどの齧歯類が例示される。 本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、 当該分野で通常用いら れる意味で用いられる。 以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。

本明細書において 「抗体」 とは、 当該分野で通常使用される意味で用いられ、 抗体の全部 またはその断片、 誘導体、 結合体、 修飾体なども包含される。 好ましくは、 本発明のポリぺ プチドを認識する抗体であり、 より好ましくは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する 抗体であり、 さらに好ましくは単一特異的に認識する抗体である。そのような抗体はポリク ローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。 本発明のポリぺプチドの「検出または定量」は、 免疫学的測定方法を含む適切な方法を用 いて達成することができる。 そのような方法としては、 えば、 EL I SA (Enzyme L i nked I mm u n o S o rb ent As s ay)法、 RlA (Rad i o I mmun o A s s a y )法、 蛍光抗体法、 ゥヱスタンプロット法、 免疫組織染色法など が挙げられる。

本発明の抗体を用いて、糖尿病または神経変性疾患を検出することができる。本発明のポ リベプチドは糖尿病のマーカーおよび神経変性疾患マーカーとなり得ることから、前述のポ リぺプチドの検出または定量と同様に、適切な免疫学的測定方法を用いることにより達成す ることができる。

本発明はまた、本発明の抗体を含むことを特徴とする糖尿病および/または神経変性疾患 の検出用キットに関する。このキットは、少なくとも本発明の抗体および標準試薬として本 発明のポリペプチドを含む。 本発明のポリペプチドの m R N Aの「検出または定量」は、 m R N Aの測定を行う分子生 物学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いることにより達成することができる。そのよ うな方法としては、 例えば、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨン法、 ドットプロット法、 R T — P 法などが挙げられる。

本発明のポリぺプチドの m R N Aを測定することにより、糖尿病および/または神経変性 疾患を検出することができる。本発明のポリぺプチドは糖尿病マ一カーおよび神経変性疾患 マーカーとなり得ることから、前述の m R N Aの検出または定量と同様な分子生物学的測定 方法を含む任意の適切な方法を用いることにより達成することができ、ノーザンプロヅト法 、 ドットブロット法または P C R法などが例示される。

本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部または全部を標準 試薬として含む、糖尿病および/または神経変性疾患の検出用キヅトに関する。本発明のポ リヌクレオチドは、糖尿病マーカーおよび zまたは神経変性疾患となり得ることから、前述 の糖尿病または神経変性疾患の検出方法に基づき、ポリヌクレオチドを分子生物学的に測定 することができる。 本発明のポリぺプチドの m R N Aを測定することにより、本発明のポリぺプチドをコ一ド する遺伝子の発現量を測定することができる。遺伝子が発現して、 m R N Aに翻訳されるこ とから、前述の m R N Aの検出または定量と同様な分子生物学的測定方法を含む任意の適切 な方法を用いることにより達成することができ、 ノーザンブロット法、 ドットブロヅト法ま たは P C R法などが例示される。

本発明は、本発明のポリペプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの一部または全部を標準 試薬として含む、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量測定キットに関する。 本発明のポリぺプチドの m R N Aは本発明のポリぺプチドをコードする遺伝子が翻訳され ることにより発現することから、前述の m H N Aの検出または定量方法に基づいて m R N A を分子生物学的に測定することができる。 本発明のポリヌクレオチドを用いて、； D N Aの転写または m R N Aの翻訳を抑制すること ができる。本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、本発 明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチド の塩基配列中の連続した 5から 6 0個の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと相補的な 配列を有するオリゴヌクレオチドおよび誘導体オリゴヌクレオチドなどを適宜調製し、当該 分野で周知なアンチセンス R N A/D N A技術を用いて、このポリぺプチドの D N Aの転写 または m R N Aの翻訳を抑制する方法を提供することができる。 本発明はまた、 本発明のポリペプチドの結合物質に関する。 「結合物質」 とは本発明のポ リぺプチドまたはポリヌクレオチドに結合する任意の物質をいう。このような結合物質とし ては、 例えば、 低分子物質、 ポリヌクレオチド、 ポリペプチドなどが挙げられる。

本発明の 「結合物質のスクリーニング方法」は、 当技術分野で公知となっている技術を適 宜適応することにより行うことができ、バイオアツセィおよび結合ァッセィなどが例示.され る。

本発明の「結合物質のスクリーニング用キット」 には、 少なくとも本発明のポリぺプチド またはその一部、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部が含まれる。このキットを用い て、 前述の本発明の結合物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。 本発明はさらに、 「結合活性調節物質」 に関する。 「結合活性調節」 とは、 本発明のポリ ぺプチドと本発明の結合物質との結合活性を増強あるいは減少させることを意味し、 「結合 活性」 は、 P er c ent Maximum B i n d i n g (P MB ) により評価される 。 「結合活性調節物質」 とは、 本発明のポリペプチドと本発明の結合物質との結合活性を増 強あるいは減少させる物質であり、 このような物質としては、 例えば、 低分子物質、 ポリヌ クレオチド、 ポリペプチドなどが挙げられる。

本発明の「結合活性調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術 を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリーニング方法により本発 明の結合活性調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオ アツセィおよび結合ァッセィなどが例示される。

本発明の「結合活性調節物質のスクリーニングキット」には少なくとも本発明のポリぺプ チドまたはその一部、 ポリヌクレオチドまたはその一部などが含まれてる。本発明のキヅト を用いて、前述の結合活性調節物質をスクリーニング方法に基づき、結合活性調節物質を生 化学的手法によりスクリーニングすることができる。 また、 本発明は、 「発現調節物質」 に関する。 発現量とは、 目的の細胞などにおいて、 本 発明のタンパク質または mRN Aが発現される量を意味する。発現量は、本発明の抗体を用 いた、 例えば、 EL I SA法、 RIA法、 蛍光抗体法、 免疫組織染色法方法などの免疫学的 測定方法などを含む適切な方法により本発明のタンパク質を測定することまたは本発明の mRN A測定方法、 例えば、 ノ一ザンブロヅトハイプリダイゼーション法、 ドヅトプロヅ ト 法、 RT— P CR法などの分子生物学的測定方法により本発明のポリべプチドの mRNAを 測定することにより評価することができる。 「発現調節」 とは、 上記の免疫学的測定方法ま たは分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリぺプチ ドのタンパク質または mRN Aレベルでの発現量を増加または減少させることを意味する。 「発現調節物質」とは上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切 な方法により評価される、本発明のポリぺプチドのタンパク質または mRNAレベルでの発 現量を増加または減少させる物質であり、 このような物質としては、 例えば、 低分子物質、 ポリヌクレオチド、 ポリぺプチドなどが例示される。 本発明の「発現調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術を適 宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリーニング方法により本発明の 結合活性調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアツ セィおよび結合ァッセィなどが例示される。

本発明の「発現調節物質のスクリーニングキット」には少なくとも本発明のポリぺプチド またはその一部、 ポリヌクレオチドまたはその一部などが含まれてる。本発明のキットを用 いて、前述の発現調節物質をスクリーニング方法に基づき、発現調節物質を生化学的手法に よりスクリーニングすることができる。 本発明の 「医薬組成物」 とは、 少なくとも、 本発明のポリペプチド、 ポリヌクレオチド、 抗体、 結合物質、 結合活性調節物質または発現調節物質を含有していればよく、 特定の疾患 、 例えば、 神経変性疾患、 糖尿病などの予防または治療に用い得る。

本発明の「治療方法」 とは、 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドが関連する特 定の疾患、 例えば、 神経変性疾患、 糖尿病などを治療するための方法であって、 本発明の医 薬組成物を投与することによって治療することができる。 以下に本発明ポリヌクレオチドの調製、 本発明ポリペプチドの調製、 組換えベクター、形 質転換体、 製造方法、 抗体、 本発明ポリペプチドの定量方法、 免疫学的検出方法、 m R N A の定量方法、 m R N Aの翻訳抑制方法、 結合物質、 結合物質スクリーニング方法、 結合活性 調節物質、 結合活性調節物質スクリーニング方法、 発現調節物質、 発現調節物質スクリー二 ング方法、 スクリーニング用キット、 ノックアウト動物、 トランスジエニック動物、 神経変 性疾患または/および糖尿病の検出方法、遺伝子検出用キヅト、医薬組成物について説明す る。本明細書において、 特に指示のない限り、 当該分野で公知である遺伝子組換え技術、 動 物細胞、 昆虫細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技術、 発現タンパク質の 分離精製法、 分析法および免疫学的手法が採用される。

( 1 ) 本発明のポリヌクレオチドの取得 脳および骨格筋由来のラット組織、 または、 脳および骨格筋のヒト組織より、 常法により cDNAライブラリーを作製する。

cDNAライブラリ一作製法としては、 Mo 1 e cu 1 ar Cl oni ng rA La bo rat ory Manua l, S e c ond Ed i t i on (1989) (Co l d S r i ng Harbor Laborat ory Pr e s s)や Cur r ent Pr o t o c o l s i n Mo l e cu l ar B i o l o gy (1994) (Gr e e n Pub l i s hi ng As s o c i at e s and Wi l ey— I nt er s c i enc e) 、 DNA C l on i n 1 ： C o r e Techni que s、 A P r a c t i c a l Appr o ac h, S e c ond Ed i t i on (1995) (O f o rd Uni ver s i t y P r e s s )などに記載された方法、 あるいは市販のキ ヅト、例え ίま、 Sup ers c r i pt P l a smi d S s t em f o r c D N A Synt he s i s and P l a smi d C 1 o n i n g (インビトロジェン社 製） や ZAP— cDNA Synt he s i s K i t s (ストラタジーン社製） などを用 いる方法が挙げられる。

本発明の DNAの両末端に E c o R Iリンカ一を付与した後、 クローニングベクター、 例えば、 pSport 1 (インビトロジェン社製） の E c o R Iサイ トに揷入する。 本発 明のプラスミ ドを用い、 E. c o l i Elect r oMAX DH10B (インビトロジェ ン社製） を形質転換して c D N Aライブラリーを作製する。作製した c D N Aライブラリ一 より目的とする DNAを含むクローンを以下の方法で選択する。

上記で作製した cDNAライブラリ一より、 常法または市販のキット、 例えば、 QIAG EN P l a smi d Max i K i t (キアゲン社製）などを用いた方法によりプラス ミ ドを調製する。

上記で調製した cDNAライブラリーから No g oのアミノ酸配列と相同性を有するァ ミノ酸配列をコードする DN A断片を有するプラスミ ドを選択する。そのような DN A断片 は、各 No go受容体のアミノ酸配列がよく保存されている領域を 2ケ所以上見出し、該領 域のアミノ酸配列をコードする DNA配列に対応する縮重プライマーを設計し、 P o 1 ym er a s e Chai n R e a c t i o n ( P C R) 法により増幅することで得られる。 縮重プライマーの作製方法は、 P CR P r ime r： A Lab o rat o ry Man ua l (1 995) (Co l d S r i n Harbor Laborat o ry P r e s s) 、 ザ 'プロトコールシリーズ 「cDNAクローニング」 （ 1996 ) (井上純一 郎、 仙波憲太郎編；羊土社） および S c i enc e, 241, 42 (19.88) . などに記 載の方法が挙げられる。 P CR法は Mo 1 e c u 1 a r Cl oni ng :A Labo r a t o r y Manua l, S e c ond Ed i t i on (1989) (Co l d S p r i ng Harb or Labo r at o ry Pre s s)および PCR Pro t o c o l s ( 1989 ) (Ac ademi c P r e s s ) などに記載の方法が挙げられる。 このようにして P CR法で増幅した DNA断片を適当なプラスミ ドに揷入し、サブクロー ニングする。サブクローニングは、増幅した D N A断片をそのままあるいは制限酵素や D N Aポリメラーゼで処理した後、常法によりプラスミ ドベクターに組み込むことにより行うこ とができる。 そのようなベクターとしては、 pB lue s c r ipt I I SK (十） 、 pB lue s cr i pt I I SK-, pPCR-S c r i pt Amp (ストラ夕ジ一 ン社製） pD I RECT (Nuc r e i c Ac i d s Re s e ar ch, 18, 60 69 ( 1990 ) . ) pT 7 B 1 u e (ノバゲン社製） 、 p CRI I (インビトロジェン 社製） 、 p CR— TRAP (ジーンハンター社製） 、 pNoTAT7 (Eppendor f 5 pr ime社製） などが例示できる。

サブクローン化された P CR増幅断片の塩基配列をスクリーニングすることにより、既知 の N o g o受容体のアミノ酸配列とホモロジ一を有するが、完全には一致しないアミノ酸配 列をコードする D N A断片を選択することができる。塩基配列は、通常用いられる塩基配列 解析方法、 例えば、 サンガーらのジデォキシ法（P r o c e e d i n g s of t he Nat i onal Academy of S c i enc e s USA, 74, 5463 ( 1977 ) . )あるいは 373 A DN Aシークェンサ一（アプライ ドバイォシステムズ社 製）などの塩基配列分析装置で解析することができる。このようにして選択した DN A断片 をプローブとし、上記で作製した cDNAライブラリーに対して、コロニーハイブリダィゼ —シヨンやプラークハイブリダィゼ一シヨンなどのハイブリダィゼーション解析を行うこ とにより、既知の No g o受容体とホモロジ一を有するポリぺプチドをコードする cDNA を取得することができる。 プローブは、 該 DNA断片を³² Pなどの放射性同位体、 ジゴキ シゲニン （d i gox i genin)、 西洋ヮサビペルォキシダーゼなどの酵素などで標識 したものを使用することができる。ハイブリダィゼーシヨンは、 通常用いられる方法、 例え ば、 Mo l e cu l ar C l on i ng :A Lab orat o ry Manual, S e c ond Ed i t i on (1989) (Co l d Spr ing Harb o r La bo rat o ry Pr e s s) などに記載の方法で行うことができる。

ハイプリダイゼーシヨンにより取得された cDNA断片をそのままあるいは適当な制限 酵素で消化した後、常法によりプラスミ ドベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解 析方法、例えばサンガーらのジデォキシ法（P r o c c e e d i n g s o f t he N at i ona l Ac ademy o f S c i enc e s USA, 74, 5463 (1 977 ) . ) あるいは 373 ADNAシークェンサ一（アプライ ドバイォシステムズ社製） などの塩基配列分析装置を用いて塩基配列を分析することで目的とする DNAを取得する ことができる。 このようにして取得される DNAとして、例えば、配列番号 2で表されるポリべプチドを コードする DNAなどが挙げられ、具体的には、配列番号 1で表される塩基配列を有する D N Aを挙げることができる。配列番号 1の DN Aを含むプラスミ ドとしては、例えば、後述 の実施例に記載したプラスミ ドをあげることができる。

得られた DNAを適当な発現ベクターに組み込み発現プラスミ ドを構築し、該発現べクタ 一を適した宿主に導入することにより形質転換体を得ることができる。該発現べクタ一とし ては、該 c DNAを組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいずれでもよく、そ のようなベクターとして p c DNA 1. 1、 pcDNAl . 1/Amp、 pCDM8、 pR E P (インビトロジェン社製） 、 pHM6、 pHB 6 (ロシュダイァグノスティヅクス社製 ) 、 pKK223— 3、 pGEX (アマシャムバイオテク社製） 、 pET— 3、 pET- 1 l、 pB lue s c r i pt I I SK ( + ) , pB lue s cr i pt l l SK (—） (ストラ夕ジーン社製） 、 pUC 1 9、 pTrxFus (インビトロジェン社製） 、 pUC 1 18、 p S T V 28 (宝酒造社製） 、 pMAL—c2X (New England Bio Labs社製） 、 pAGE 107 (Cy t ot e c hno l o gy, 3 (2) , 133— 1

40 ( 1990) . ;特開平 3— 22979) 、 p AGE 1 03 (The Journa l o f B i o c hemi s t ry, 10 1 (5 ) , 1307 - 13 10 ( 1987 ) . ) 、 p AMo、 p AMo A (T h e J ourna l o f B i o l o gyca l Che mi s t r y, 268 (30) , 22782-22787 (1993) . ) 、 pAMoPR

5 A (特開平 5— 336963) 、 p AS 3 - 3 (特開平 2— 227075)などを用いる ことができる。 該発現べクタ一の宿主への導入方法としては; DN Aを導入する方法であればいずれの方 法も用いることができる。宿主が動物細胞である場合、 エレクトロポレーシヨン法（Cy t o t e chno l ogy, 3 (2) ， 133 - 140 (1990) . ) 、 リン酸カルシウム 法 （特開平 2— 227075 ) 、 リポフエクシヨン法 （P r o c e e d i n g s of t he Nat i o na l Ac ad emy of S c i enc e s USA, 84, 74 13 ( 1987 ) . ； Vi l o l o gy, 52, 456 (1973) . ) に記載の方法が例 示される。

宿主としては発現ベクターに対応する適当な細胞または組織を用いることが可能で、例え ば、 動物細胞などが挙げられる。 宿主に用いる動物細胞としては、 ヒト由来株細胞の Nama lwa (バーキットリンパ腫、 ATCC： CRL— 1432) およびそのサブライン Nama lwaKJM— l、 HCT— 15 (ヒト大腸癌細胞、 ATCC : CCL— 225)、 サル由来株 細胞の C 0 S— 1 (アフリカミドリザル腎細胞 (SV40形質転換細胞） 、 ATCC : CRL— 1650) および CO S— 7 (アフリカミドリザル腎細胞 （SV40形質転換細胞） 、 ATCC ： CRL- 1651) 、 ハムスター由来株細胞の CHO— K 1 (チャイニーズハムスター卵巣細 胞、 ATCC : CCL— 61)および HBT 5637 (特開昭 63 - 299 ) などが例示され る。 本発明の形質転換体は、当該分野において周知慣用の常法により培養する。形質転換した 宿主に適した培地を用いて行うことができ、培養に使用される培地としては液体培地が適当 である。 具体的には、 MEM培地 （S c i enc e, 130, 432 (1959) . ) 、 D 一 MEM培地 （Vi r o l o gy, 8, 396 ( 1 959 ) . ：) 、 RPMI 1640培地 （ The J ourna l o f t he Ame r i c an Me d i c a l As s o c i at i on, 199 , 5 1 9 (1 967) · ) 、 YT培地、 B EM培地などが用いられ る。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際の培地としては、 例えば、 MEM培地、 D-ME M培地、 R P I M培地などにゥシ胎児血清 （ F C S ) を適量添加したものなどが用 いられる。必要により発現ベクターのプロモーターの転写活性を高めるために、転写活性を 促進する物質を含んでいてもよく、例えば、イソプロピル一 1—チオー^一 D—ガラクトピ ラノシン （I PTG) などを用いることができる。

培地には形質転換体が生育するのに必要な栄養素、 例えば、 グルコース、 アミノ酸、 ぺプ トン、 ビタミン類、 ホルモン類、 血清、 好ましくは、 FCS、 塩化カルシウム、 塩化マグネ シゥムなどが含有されており、その様な培地であればどのような組成の培地でも用いること ができ、 市販されている培地も用いることができる。 培養は pH 6. 0~ 8. 0、 25〜4 0°C、 5% C0₂存在下などの条件で行う。 所望の DN Aは No g o受容体が有する神経細胞の軸索伸展活性を指標にし、該形質転換 体によって産生されたタンパク質をスクリーニングすることによって選択することができ る。神経細胞の軸索伸展活性とは、神経細胞の軸索の成長円錐の形態変化をもたらし、 該細 胞の軸索の伸展を抑制させる活性を指す。該活性は、 例えば、 顕微鏡による神経細胞の形態 学的観察や、 成長円錐の分化マーカー、 例えば、 GAP 43 (CELL, 83， 269 -2 78 (1995) .、 S c i enc e, 199, 542-544 (1978) . ) の発現量 を測定することにより検出することが可能である。 以上のようにして、 脳および骨格筋由来のラット組織、 または、 脳およ骨格筋由来のヒ ト組織より、神経細胞の軸索伸展に関与する No g o受容体活性を有する新規ポリぺプチド をコードする DN Aを取得することができる。 また、上記方法で取得した； DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズする： DNA を選択することにより、配列番号 2記載のァミノ酸配列と比較して、 1若しくは数個のァミ ノ酸が欠失、置換若しくは付加から選ばれる少なくとも 1つの変異を有するアミノ酸配列か らなるポリぺプチドをコードする DNAを取得することができる。即ち、 非ヒト動物、 例え ば、 マウス、 ラヅト、 ゥシ、 サルなど由来の c D NAライブラリーに対してストリンジェン トな条件でハイブリダイズする D N Aを選択することにより、目的の DNAを取得すること ができる。

スクリーニングされた新規] Sf o go受容体ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、該ポ リぺプチドをコードする DN Aを化学合成することによつても目的の DN Aを調製するこ とができる。 DN Aの化学合成はりん酸トリエステル法、 ホスホロアミダイ ト法、 ホスホン 酸エステル法などの方法により行うことができが AB I 392 (アプライ ドバイオシステ ムズ社製） などの市販の市販の合成機器を用いて行うこともできる。

また、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマ一およびアンチセンスプライマーとし て用い、これら DN Aに相補的な mRN Aを発現している細胞の mRN Aから調製した c D NAを錶型として、 P CRを行うことによつても、 目的とする DNAを調製することができ る。

(2)本発明のポリペプチドの製造 本発明のポリペプチドは、 Mo 1 e c u 1 a r C I

0 n i n g : A Lab orat ory Manua l, S e c ond Ed i t i on ( 1989) (Co l d Spr ing Harb or Laborat o ry Pre s s

)や Cur r ent Pro t o c o l s i n Mo l e cul ar B i o l ogy (

1994) (Wi l e y-I nt er s c i enc e) などに記載された方法を用い、 本発 明のポリヌクレオチドを宿主細胞中で発現させ、 製造することができる。

本発明のポリぺプチドをコードする全長 DNAを基に、必要に応じて、該ポリぺプチドを コードする部分を含む適当な長さの： DNA断片を調製する。また、該ポリぺプチドをコ一ド する部分の塩基配列は、宿主の発現に最適なコドンとなるようにしたものを調製する。該 D N Aは該ポリぺプチドの生産率を向上させるうえで有用である。該 DN A断片または全長: D NAは適当な発現ベクターのプロモーターの制御下に揷入し、組換え体 DNA (組換えべク ター） を作製する。該組換えベクターはそれに適合した宿主に導入することにより、 本発明 のポリペプチドを産生する形質転換体を得ることができる。

宿主としては、 大腸菌属などの原核生物、 酵母などの単細胞真核生物、 動物細胞、 昆虫細 胞、植物細胞などの多細胞真核生物など目的とする遗伝子を発現できるものであればいずれ も用いることができる。 また、 動物個体や植物個体を用いることができる。発現ベクターは 、宿主において自立複製または染色体中への組込みが可能で、新規 No g o受容体遺伝子の 転写に適した位置にプロモ一夕一を含有しているものが用いられる。 (i) 原核生物を宿主として用いる場合

新規 No g o受容体遺伝子の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に 、 プロモーター、 リボソーム結合配列、 新規 No go受容体遺伝子、 転写終結配列、 より構 成されていることが好ましい。プロモータ一を制御する遺伝子が含まれていてもよい。発現 ベクタ一としては、 例えば、 pHM6、 pHB 6 (ロシュダイァグノスティヅクス社製) 、 pKK223— 3、 p GEX (アマシャムバイオテク社製） 、 pSE280、 p T r x F u s、 pUC 19 (インビトロジェン社製） 、 pB lue s c r ipt I I SK (十） 、 pB l ue s c r ipt I I SK 、一)、 pET Expre s s i on S ys t e m (ストラタジーン社製） 、 pGEMEX— 1 (プロメガ社製） 、 pQE— 8 (キアゲン社 製） 、 pMAL— c 2 X (N e w Engl and B i o 1 a b s社製） 、 p K Y P 1 0 (特開昭 58— 1 10600 )、 pKYP 200 (Agr i c au 1 t u r a 1 B i o l ogyc a l Chemi s t ry, 45， 669 ( 1984) . ) _N p L S A 1 (A g r i c au l t ur a l B i o l o gyc a l Chemi s t ry, 53, 277 (1 9 89) . ) 、 pGEL l (Pr o c e ed i ngs o f t he Nat i ona l A cad emy o f S c i enc e s USA, 82, 4306 (1985) . ) , pE G400 (J ourna l o f Bac t er i o l o gy, 172, 2392 (1 99 0 ) . ) , p T e r m2 (特開平 3— 22979) 、 p P A 1 (特開昭 63— 233798 ) pTr s 30 (FERM B P - 5407 )、 p T r s 32 ( F E RM BP— 540 8) 、 p GHA2 (F E M BP— 400) 、 p GKA2 (FERM B - 6798) な どを例示することができる。 プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば 、 t r pプロモータ一 （P t r p) 、 1 a cプロモー夕一 （ P 1 a c；) 、 PLプロモーター 、 PRプロモーター、 P S Eプロモーターなどの大腸菌やファージに由来するプロモーター 、 SP01プロモーター、 SP02プロモーター、 p e nPプロモーターなどを挙げること ができる。 また、 Pt r>pを 2つ直列させた P t r x 2プロモーター、 t a cプロモ一夕 一、 l acT 7、 1 e tプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターなども 用いることができる。

リポソーム結合配列であるシャイン ·ダルガーノ （SD : Shi ne Da l garno )配列と開始コドンとの間を適当な距離、 例えば 6~18塩基、 に調節したプラスミ ドを用 いることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドの発現には転写終結配列は必ずしも必要で はないが、 構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。 宿主としては、 例えは *、 E s c h e r i c h i a属、 S e r r a t i a属、 B a c i 11 u s属、 Brevibact er iu m属、 Corynebact eri m属、 Mi c r o b a ct er ium属、 P s e ud omo n a s属などの原核生物が挙げられる。 Escheri c hia属として、 E. c o 1 iの XL 1— B lue株、 XL2— Blue株、 DH1株、 MC 1 000株、 KY3276株、 W1485株、 JM109株、 HB 101株、 No. 49株、 W3 110株、 NY49株、 BL21 (DE3)株、 B L 21 (DE 3) pLy s S株、 HMS 17 4 (DE 3)株および HMS 174 (D E 3 ) pLysS株などが、 S e r r a t i a属として 、 S . f i car ia株、 S. f ont i cola株、 S. 1 i q u e f a c i e n s株、 S . ma r c e s c e n s株などが、 B a c i 11 u s属として、 B. subt i l i s株、 B. a my 1 o 1 i q u e f a c i e n s株などカ、 B r e v i b a c t e r i um属として、 B. a mm oniagene s株、 B . I mm ariophi l um (AT C C： 14068)株、 B . s ac charo lyt icum (AT C C： 14066)株などが、 Corynebact e r i um属として、 C. g l ut ami cum (ATCC : 1 30 32) 株、 C. g l ut a mi c um (AT CC ： 140 67) 株、 C. gu l ut ami c um (ATCC ： 1 38 6 9 ) 株、 C. a c e t o a c i d o p hi l um (AT CC : 1 387 0) 株などが、 Mi c r o b a c t e r i um属として、 M. a mm o ni aph i l um (ATCC ： 1 5 3 54) 株な どが、 P s eud omo nas属として、 S . m e p h i t i c a株などが例示される。 組換えベクターの導入方法としては、宿主へ DN Aを導入する方法であればいずれも用い ることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法（Nu c 1 e i c A c i d s R e s e a r c h， 1 6 , 6 1 2 7 ( 1 9 8 8) . ) 、 りん酸カルシウム法 （P r o c e e d i n g s o f t h e Na t i o n a l A c a d em o f S c i e n c e s U SA， 6 9 , 2 1 1 0 ( 1 9 7 2) . ) 、 プロトプラスト法 （特開昭 6 3 - 24 8 3 9 42 ) 、 G e n e, 1 7 , 1 0 7 ( 1 9 8 2) . や M o l e c u l a r & G e n e r a l G e n e t i c s , 1 6 8 , 1 1 1 ( 1 9 7 9 ) . に記載の方法などがあげられる。

( i i ) 酵母を宿主として用いる場合

宿主として酵母を用いる場合、 発現ベクターとして、 例えば、 YE p 1 3 (AT C C ： 3 7 1 1 5) 、 YE p 24 (AT C C : 3 7 0 5 1) 、 YCp 5 0 (AT C C ： 3 7 4 1 9 ) 、 pH S 1 9、 p HS 1 5などが挙げられる。

プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいずれのものでもよく、例えば 、 ADH 1 (アルコールデヒドロゲナーゼ） プロモーター、 PH05 (酸性フォスファタ一ゼ） プロモーター、 PGK 1 (ホスホグリセリン酸キナーゼ） プロモーター、 GAPDH (グリセル アルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ) プロモーター、 GAL 1 (ガラキトースキナ一ゼ) プ 口モーター、 GAL 1 0 (UDPガラクトース 4—ェピメラーゼ） プロモーター、 MFa 1 (a フェロモン） プロモーター、 CUP 1 (メタ口チォネイン） プロモ一夕一などが挙げられる。 宿主としては、 例えば、 S a c c h a r o my c e s属、 S . c e r e v i s i a e種、 S c h i z o s a c c h a r omy c e s属、 S . p omb e種、 K l u yv e r omy c e s属、 K . l ac t i s種、 T r i c h o s p o r o n属、 T . pu l lu l ans種、 S c hwanni omyc e s属、 S . a l luvius種および P i c hi a属、 P. p a s t o r i s種などが挙げられる。

組換えべク夕一の導入方法としては、宿主に DN Aを導入する方法であればいずれも用い ることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法（Me t ho d s i n Enzymo l o , 194, 182 (1 990) . ) 、 スフエロプラスト法 （Pr o c e e d i ng s o f t he Nat i ona l Ac ad emy o f S c i e nc e s US A, 84， 1929 (1978) . ) 、 酢酸リチウム法 （J our na l of Bac t er i o l o gy, 153, 1 63 ( 1983 ) . および P r o c e ed i ngs o f t he Nat i ona l Acad emy of S c i enc e s USA, 75, 1 929 ( 1978) . ) 記載の方法などが挙げられる。

(i i i) 動物細胞を宿主として用いる場合

宿主として動物細胞を用いる場合、 発現ベクターとして、 例えば、 p c DNA 1/Amp 、 p cDNA3、 pCDM8、 pRE P 4 (インビトロジェン社製） 、 AGE 107 (C yt o t e c hno l o gy, 3, 1 33 (1990) . ) 、 p AGE 1 03 (The J o u r n a 1 o f B i o c hemi s t ry, 101, 1307 (1 987) . ) 、 p AMo, p AMo A (p AMo PR S A) (The Journa l o f B i o l o g y c a 1 Chemi s t r , 268, 22782-22787 ( 1993) . ) , p C LXSN, p CLNCX (IMGENE X社） 、 p A S 3 - 3 (特開平 2— 22705) な どを用いることができる。

プロモータ一としては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例 えば、 ヒトサイ トメガロウィルス （hCMV) の I E (Ime d i at e— ear ly)遺 伝子のプロモーター、 S V 40の初期プロモーター、 モロニ一 ' ミュリン 'ロイケミア .ゥ イ レス （Mo l oney Mur i ne Leu l emi a Vi ru s)のロング.夕一 ミナル ' リピート 'プロモーター（L o n g Te rmina l Re e at Pr om o t e r)、 レトロウィルスのプロモーター、 H S Pプロモーター、 SR αプロモーターお よびメ夕ロチォネィンのプロモーターなどを挙げることができる。また、 ヒト CMVの I E 遺伝子のェンハンサ一をプロモーターと共に用いてもよい。 宿主に用いる動物細胞としては、 ヒト由来株細胞の HEK293 (ヒト胎児腎細胞、 ATCC ： CRL— 1573) 、 HeLa (子宮頸部癌細胞、 ATCC : CCL— 2) HBT5637 ( 白血病細胞、 特開昭 63— 299)、 BALL- 1 (白血病細胞） および H CT— 15 (大腸癌 細胞） 、 マウス由来株細胞の S p 2/0— Ag 14 (マウス骨髄種細胞、 ATCC : CRL— 1 581) および N S 0 (マウス骨髄種細胞） 、 サル由来株細胞の C 0 S— 1 (ァフリカミドリザ ル腎細胞 （SV40形質転換細胞） 、 ATCC： CRL - 1650) および COS— 7 (ァフリ カミドリザル腎細胞 （SV40形質転換細胞） 、 ATCC： CRL- 1651) 、 ハムスター由 来株細胞の CHO— K 1 (チャイニーズハムスター卵巣細胞、 ATCC： CCL-61)および BHK-21 (C- 13) (シシリアンハムスター仔腎細胞、 ATCC： CCL- 10) 、 ラヅ ト由来株細胞の PC 12 (副腎褐色細胞腫、 ATCC： CRL- 1721) および YB 2/0 ( ラヅト骨髄種細胞、 ATCC： CRL- 1662) などを例示することができる。

組換えベクターの導入方法としては、宿主に DNAを導入する方法であればいずれも用い ることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 （Cy t o't e c hno 1 o gy, 3 , 133, (1990) . ) 、 リン酸カルシウム法 （特開平 2— 22705 ) , リポフエクシ ヨン法 (Pr o c ee d ings o f t he Nat i ona l Ac adem o f S c i enc e s, USA, 84, 7413 ( 1987) . 、 Vi l o l o gy, 52 , 456 (1973) . ) 。

(i v) 昆虫細胞を宿主として用いる場合

宿主として昆虫細胞を用いる場合、 トランスファーベクターとしては、 例えば、 pVL l 392、 pVL 1393、 pB lueBac I I I (インビトロジェン社製） などが、 感染 用ウィルスとしては、 例えば、 ョトウガ科昆虫に感染するバキュロウィルス （Va cu 1 o vi rus)Aut o grapha Ca l i f orni a nuc l ear p o 1 y h edr o s i s vi rus (AcMNPV) Bac-N-B lue DNAなどが挙げら れる。 昆虫細胞の形質転換の方法は、 例えば、 Baculovirus Expre s s io n Vect or ： A Laborat ory Manual (1992) (W. H . Free man and Company) _Λ Mo lecul ar Cloning： A L a b o r a t o r y Manua l, Se cond Edit i on (1989) (Co ld S p r i n g Harbor Laborat ory Pres s) 、 Current Prot oc o l s in Mo lecular Biol ogy (1994) (Wi l ey— Int ers c i ence) 、 Bi oTechno l ogy, 6， 47 (1988) . などに記載の方法が用い れる。

昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含むトランスファーベクターおよび昆虫細胞への感染用 のバキュロウィルス DN Aを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウィル スが昆虫細胞に感染することによりポリぺプチドを発現することができる。 宿主に用いる昆虫細胞としては、 Spodopt era f r u g i p e r d a (ョトウガ） 由来株細胞、 Tri choplus ia ni (イラクサキンゥヮバ） 由来株細胞などが挙げら れ、 具体的には、 S. ： rug i per da由来細胞としては、 Sf 9 (ATCC： CRL- 1 711、 卵巣細胞） 、 S f 21 (卵巣細胞） などが、 T . n i由来細胞株としては、 Hi gh

Five, BT I -TN-5 B 1-4 (卵細胞） （インビトロジェン社製） などが例示される 組換えベクターの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いること ができ、 例えば、 リン酸カルシウム法 （特開平 2— 22705 )、 リポフエクシヨン法 （P r o c ee d i ngs o f t e Nat i o na l Ac a c emy o i S c i ence s USA, 84, 7413 (1987) . ) などを挙げることができる。 また 、 動物細胞と同様に、 エレクト口ポレーシヨン法 （Cyt ot e chno l ogy, 3, 1 33 ( 1990 ) . ) なども用いることができる。

(V) 植物細胞を宿主細胞として用いる場合

宿主として植物細胞または植物個体を用いる場合、 公知の方法 （組織培養， 20 (1 99 4) . 、 組織培養， 2 1 (1995) .、 Trends i n B i ot e chno l o g y， 15、 45 ( 1997) . ) に準じてポリペプチドを生産することができる。 発現べク 夕一としては、 例えば、 Tiプラスミ ド、 タバコモザイクウィルスベクターなどを挙げるこ とができる。遗伝子発現に用いるプロモータ一としては、植物細胞中で発現できるものであ ればいずれも用いることができ、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス （CaMV) の 3 5 Sプロモーター、 ィネアクチン 1プロモーターなどを挙げることができる。 また、 プロモ 一ターと発現させる遺伝子の間に、トゥモロコシのアルコール脱氷素酵素遺伝子のィントロ ン 1などを揷入することにより、 遺伝子の発現効率をあげることもできる。 宿主としては、 ポテト、 タバコ、 トウモロコシ、 イネ、 アブラナ、 大豆、 トマト、 ニンジ ン、 小麦、 大麦、 ライ麦、 アルフアルファ、 亜麻などの植物細胞が例示される。

組換えベクターの導入方法としては、宿主に DN Aを導入する方法であればいずれも用い ることができ、 例えば、 ァグロパクテリゥム （Ag r o b a c t e r i um)を用いる方法 (特開昭 59— 140885、 特開昭 60— 70080、 WO 94/00977)、 エレク トロポレーシヨン法 （特開昭 60— 251887 ) 、 パーティクルガン （遺伝子銃） 法 （特 許第 2606856号、 特許第 2517813号） などを挙げることができる。

(vi) 培養方法

本発明のポリぺプチドをコードする DNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形 質転換体が、 大腸菌、 酵母、 動物細胞あるいは植物細胞などの細胞の場合、 各種宿主に適し た通常の培養方法に従って培養し、 該ポリペプチドを産生 '蓄積させ、形質転換体または培 養液より該ポリぺプチドを回収することにより、 該ポリぺプチドを製造することができる。 形質転換体が、動物個体または植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って 飼育または栽培し、 該ポリペプチドを産生 '蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該ポ リペプチドを回収することにより、 該ポリペプチドを製造することができる。 ' 宿主が動物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する非ヒト トランスジ エニック動物を飼育し、該組換え体 D N Aのコードする新規 N o g o受容体活性を有するポ リペプチドを該動物中に産生 ·蓄積させ、該動物個体中から該ポリペプチドを回収すること により、新規 N o g o受容体活性を有するポリぺプチドを製造することができる。動物個体 中の産生 ·蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク、 唾液、 卵などを挙げることができ る。 宿主が植物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有するトランスジェニッ ク植物を栽培し、該組換え体 D N Aのコードする新規 N o g o受容体活性を有するポリぺプ チドを該植物個体中に産生 ·蓄積させ、植物個体中から該ポリぺプチドを回収することによ り、 新規 N o g o受容体活性を有するポリペプチドを製造することができる。

宿主が大腸菌などの原核生物または酵母などの真核生物である場合、例えば、本発明のポ リヌクレオチドを保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体 D N Aのコードする新 規 N o g o受容体活性を有するポリペプチドを培養液に産生 '蓄積させ、該培養液から該ポ リペプチドを回収することにより、 本発明のポリぺプチドを製造することができる。

本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従つ て行うことができる。 形質転換体が大腸菌などの原核生物あるいは酵母などの真核生物である場合、得られた形 質転換体を培養する培地としては、 宿主が資化し得る炭素源、 窒素源、無機塩類などを含有 し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いて もよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、 バクト トリ プトン、 ィーストェクストラクトおよび塩化ナトリゥムを含む Y T培地が好ましい。

炭素源としては、 それそれの宿主が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラクト ース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分解物などの炭 水化物、 酢酸、 プロピオン酸などの有機酸、 エタノール、 プロパノールなどのアルコール類 を用いることができる。

窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム 、 リン酸アンモニゥムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニゥム塩、 その他含窒素物質、 並 びに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチープリカー、 カゼイン加水分解物、 大 豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体およびその消化物などを用いることができる。 無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシウム、 硫酸 マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウムなど を用いることができる。 培養方法は、 振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件で行う。培養温度、 培養 時間および培養液の p Hは、 各種宿主に適した範囲に設定し、 通常 15~40°C、 5時間〜 7日間、 pH3. 0〜9. 0で培養を行う。 pHの調整は、 無機あるいは有機の酸、 アル力 リ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行うことができる。 また、 必要に 応じて、 アンピシリンゃテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。プロモ 一ターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養す るときには、 必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、 l a cプロモ 一夕一を用いた発現べクタ一で形質転換した宿主を培養する場合、イソプロピル一^— D— チォガラクトビラノシドなどを、 t r pプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した 宿主を培養する場合、 インドールァクリル酸などを培地に添加してもよい。 形質転換体が植物細胞や組織である場合、ジャーファーメンターを用いて大量培養するこ とができる。 培養する培地としては、 一般に使用されているムラシゲ .アンド .スク一グ （ MS)培地、 Wh i t e培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイ トカイニンなどの植物 ホルモンを添加した培地を用いることができる。 形質転換体が動物細胞や組織である場合、培養する培地としては、一般に使用されている RPM I 1 640培地（T h e J ourna l of t he Ame r i c an Me d i c a 1 As s o c i at i on, 199, 5 19 (1967) . ) 、 MEM培地 （S c i enc e， 130, 432 ( 1959) . ) _s D-ME M培地 （Vi r o l o gy, 8 ， 396 (1959) . ) 、 199培地 （Pro c ee d i ngs of t he S o c i e t y f or t he B i o l o gi ca l Med i c i ne, 73, 1 (1 95 0) . ) またはこれら培地に牛胎児血清 （FCS) などを添加した培地などが用いられる。 培養は、 通常 pH6〜8、 25~40°C、 5% C 0₂存在下などの条件で 1〜 7日間行 う。 また培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ぺニシリン、 ストレプトマイシンなどの抗生 物質を培地に添加してもよい。

形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されている TNM - F H培地 （ファーミンジェン社製） 、 Sf — 900 I I S F M培地 （インビトロジェン 社製） 、 ExCe l l 400、 ExCe l l 405 ( J R Hバイオサイエンシーズ社製） 、 Gr a c e' s I ns e c tMed i um (Nat ure, 195， 788 ( 1962 ) . ) などを用いることができる。

(v i i) 製造方法

本発明のポリぺプチドは、形質転換体を培養し、培養液から本発明のポリぺプチドを単離 •精製することにより製造することができる。 本発明のポリぺプチドの単離 ·精製方法は、 当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、例えば、 酵素の単離.精製方法や S a n d 1 e rらの糖転移酵素の精製方法（Me t ho d s in Enz ymo l o gy , 83， 458) を用いることができる。

本発明のポリぺプチドが溶解性ポリペプチドとして産生 ·蓄積される場合、上記のように 形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離などの方法で細胞または菌体と培地に分 離する。本発明のポリべプチドが宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞または菌体を S TE溶液などの適当な緩衝液で洗浄した後、 超音波、 フレンチプレス、 マントンガウリンホ モジナイザー、ダイノミルなどで細胞または菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶 液として得ることができる。 本発明のポリぺプチドの分離 .精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていても よく、 例えば、 ラウリル硫酸ナトリウム (S D S)や N—ラウロイルサルコシンナトリゥム (サルコシル） などを含んでいてもよい。

得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離 ·精製方法は自体公知の各種分離 ·精 製方法を組合わせて行うことができる。 これらの公知の方法としては、例えば、 溶媒抽出法 、 硫酸アンモウニゥムなどによる塩析法、 透析法、 有機溶媒による沈殿法、 限外濾過法、 ゲ ル濾過、 ジェチルアミノエチル （DEAE) —セファロースクロマトグラフィー、 D I AI ON HP A- 75 (三菱化学社製）などのリジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーや イオン交換クロマトグラフィ一、 S— S ephar o s e FF (フアルマシア社製） など のリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、プチルセファロースなどの疎水性クロマト グラフィーゃァフィ二ティークロマトグラフィ一などの各種ク口マトグラフィ一法、 S D S -ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法などの各種電気泳動などが例示さ れる。ァフィ二ティークロマトグラフィーは、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる ことによつても行うことができる。 本発明のポリベプチドが不溶性ポリぺプチドとして産生 ·蓄積される場合、上記同様に細 胞または菌体を分離し、 適当な方法により破碎後、 該ポリペプチドを含む分画を回収する。 回収した試料は、 ラウリル硫酸ナトリウム (SD S)や N—ラウロイルサルコシンナトリウ ム （サルコシル） などの界面活性剤などの可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、 可溶化剤 を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈または透析し、該ポリべプチドを正常な立体構 造に構成させた後、 上記と同様の分離 ·精製方法により精製標品を得ることができる。 また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合し たタンパク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを利用して 精製することもできる （山川彰夫， 実験医学， 13, 469— 474 (1995) . ) 。 融 合タンパク質に使用する付加タンパク質としてはプロティン A、： F LAGなどが例示される (.Pr o c e ed i ngs o f t he Nat i ona l Ac ad emy o f S c i enc e s USA, 86, 8227 ( 1989 ) .、 Gene sDeve l opm ent， 4, 1288 (1990) . 、 特開平 5— 336963、 特開平 6— 823021 ) 。 プロティン Aを使用する場合、 本発明のポリぺプチドとプロティン Aの融合タンパク質 を生産し、ィムノグロプリン Gを用いてァフィ二ティークロマトグラフィーを行うことによ り精製することができる。 FLAGぺプチドを使用する場合、本発明のポリペプチドとと F LAGの融合タンパク質を生産し、抗 FLAG抗体を用いてァフィ二ティーク口マトグラフ ィーを行うことにより精製することができる。 本発明のポリペプチドは、 公知の方法に準じて、 i n V i t r o転写 ·翻訳系を用いて を生産することができる （ J o u r n a 1 o f B i omo l e c u l ar NM , 6 , 1 2 9 - 1 34 ( 1 9 95) . 、 S c i e nc e, 242 , 1 1 6 2 - 1 1 64 ( 1 9 8 8) . 、 The J o u rna l o f B i o c hemi s t r y, 1 1 0, 1 6 6— 1 68 ( 1 99 1) . ) 。

本発明のポリペプチドは、 そのアミノ酸配列を基に、 Fmo c法 （フルォレニルメチルォ キシカルボニル法） 、 t B o c法 （ t一ブチルォキシカルポニル法) などの化学合成法ゃ巿 販されているペプチド合成機器、 例えば、 APEX 39 6 (アドバンストケムテック社製） 、 43 3 A (アプライ ドバイォシステムズ社製）、 P S 3 (プロテインテクノロジ一ズ社製 ) 、 9 0 5 0 (パーセプティブ社製） 、 P S SM- 8 (島津製作所製） などのぺプチド合成 機器をにより化学合成することができる。 本発明のポリペプチドの構造解析は、 蛋白質化学で通常用いられる方法、 例えば、遺伝子 クローニングのためのタンパク質構造解析 （平野久著、 東京化学同人発行、 1 9 93年） に 記載の方法により実施可能である。本発明のポリぺプチドの N o g o受容体活性は、公知の 測定法 (The J o u rna l o f B i o l o gyc a l Chemi s t ry, 2 58, 9893 - 98 9 8 ( 1 98 3) . , The J our na l o f B i o 1 o g y c a 1 Chemi s t r y, 2 6 2, 1 5649 - 1 5 6 58 ( 1 987) . 、 Th e J o urna l o f B i o l o gy c a l Ch emi s t r y, 2 73 , 58— 6 5 ( 1 9 98) .、 The J our na l o f B i o l o gy c a l Chemi s t r y, 273, 43 3 -440 ( 1 99 8) . , The J our na l o f B i o l o gyc a l Chemi s t r y, 2 73, 1 27 70 - 1 2 7 78 ( 1 9 98) . 、 Ar chive s o f B i o c hemi s t ry and B i ophys i c s, 2 70, 630-646 (1989) . . Ar chive s o f B i o chemi s t r y and B i ophys i c s, 274, 14-25 (1 989) . , 特開平 6— 18 1759) に準じて測定することができる。

( 3 ) 変異型ポリぺプチドの作製方法

本発明ポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位 特異的変異誘発法により実施することができる。 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若 しくは付力 Πは、 M o 1 e c u 1 a r Cl oni ng :A Lab orat ory Man ua l, S e c ond Ed i t i on (1989) (Co l d S r i n H a r b o r Labor at o ry Pr e s s. )、 Cur rent Pro t oc o l s i n Mo l e cu l ar B i o l o gy (1994) (Wi l ey— I nt er s c i e nc e) 、 Nuc l e i c Ac i d s Re s e ar c h, 10, 6487 ( 1 982 ) .、 Pro c ee d i ngs of t he Nat i ona l Academ o f S c i enc e s USA, 79， 6409 (1 982) . 、 Gene, 34， 3 15 ( 1 985) .、 Nu c l e i c Ac i ds re s ear c h, 13, 4431 (1985 ) .、 Pr o c e e d i ngs o f the Nat i ona l Ac ademy o f S c i enc e s USA, 82, 488 (1985) . , Pro c e edi ngs o f t he Nat i ona l Ac ademy o f S c i enc e s USA，81 , 5662 ( 1984) . 、 S c i e nc e, 224, 143 1 (1984) . 、 WO 8 5/00817、 Nat ur e, 3 1 6, 601 ( 1985 ) . などに記載の方法に準じて 調製することができる。

(4) 本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製

(i) ポリクローナル抗体の作製

本発明のポリぺプチドの全長、その部分ぺプチドもしくはその部分ぺプチド含むポリぺプ チドを抗原として哺乳動物に投与することで抗体を作製することができる。抗原は、それ自 体でもよいが、 担体、 例えば、 ゥシ血清アルブミン （B SA) 、 スカシガイのへモシァニン (ke yho l e l imp e t h e m o c y a n i n； K L H)ゃ牛チログロブリン （ BTG) などに結合したものを用いてもよい。 また、 抗原による免疫反応を高めるために、 例えば、 フロイントの完全アジュバント （CFA) および不完全アジュバント （I FA) を 投与してもよい。 免疫に用いられる哺乳動物としてはマウス、 ラット、 ゥサギ、 ャギ、 ハム スターなどを用いることができる。 ポリクローナル抗体は、 例えば、 レーンらの方法 （Ant i b o d i e s : A L a b o r a t o r y Manua l, S e c o nd E d i t i o n (1 989) (C o l d S p r i n g H a r b e r Lab o r a t o r y P r e s s ) )などに従って作製する ことができる。

哺乳動物に抗原を 1回目の投与後、 1~2週間毎に 3~1 0回投与することで免疫された 哺乳動物を得て、 それらの哺乳動物から血清を採取し、 精製することで作製できる。 該抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜 2週間おきに 3〜 1 0回行う。該抗原の投与量は 1回当たり動物 1匹に対し、 5 0~1 0 が好ましい。ペプチドを用いる場合は、 適当 な担体に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするぺプチドは、遺伝子ェ 学的手法ゃぺプチド合成機で合成することができる。各投与後、 3〜 7日目に眼底静脈叢よ り採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法（酵素免疫測定法 （ EL I SA法） ：医学書院刊 （ 1 976年） 、 An t i b o d i e s ： A Lab o r a t o r y Ma nu a 1 , S e c ond E d i t i on ( 1 989) (C o l d S p r i n g Ha r o r L ab o r at o r y P r e s s )などに記載の方法で確認するこ とができる。 免疫された哺乳動物から採血し、抗体価を測定する。十分な抗体価が得られるまでに免疫 された時点で採血し、 血清を調製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。 ポリクローナル抗体の分離、 精製方法としては、 遠心分離、 硫酸アンモニゥムによる塩析、 力プリル酸沈殿（An t i b o d i e s : A Laborat ory Manua l, S e c o n d Ed i t i on (1989) (Co l d S r i n Harb o r Lab orat ory Pr e s s)または DEAE—セファロ一スカラム、陰イオン交換カラム 、 プロティン Aカラム、 G—カラムあるいはゲル濾過カラムなどの各種クロマトグラフィー を単独または組み合わせることで行うことができる。

( i i ) モノクローナル抗体の作製

(a) 抗体産性細胞の調製

モノクローナル抗体は、 （i)で十分な抗体価が得られたのち、 それらの哺乳動物から脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞 と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマを得ることができる。骨 髄種細胞としては、マウスまたはラットから樹立した細胞株を用いる。細胞融合の方法は既 知の方法で行うことができ、 例えば、 ケーラーとミルスタインの方法 (Nat ur e, 25 6, 495 - 497 ( 1975) . ) に従って作製することができる。

本発明のポリぺプチド、その部分ぺプチドもしくはその部分ぺプチドを含むポリぺプチド を投与して、十分な抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後 3〜 7日目に、抗体 産生細胞として脾臓を摘出する。該脾臓を MEM培地（日水製薬社製） 中で細断し、 ピンセ ヅトでほく、し、 1, 200 r pmで 5分間遠心分離した後、 沈殿分画を得る。得られた沈殿 画分の脾細胞を Tr i s—塩化アンモニゥム緩衝液 （pH7. 65)で 1~2分間処理し赤 血球を除去した後、 MEM培地で 3回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる

(b) 骨髄腫細胞の調製

骨髄腫細胞としては、 マウスまたはラッ卜から由来の株化細胞を使用し、そのような細胞 として、 例えば、 8—ァザグァニン耐性マウス （B ALB/c由来） 骨髄腫細胞 P 3— X 6 3 A g 8— U 1株 （以下、 P 3— U 1と略す） （Cu r r e n t Top i c s M i c r ob i o l o gyc a l Immuno l o gy, 81， 1 ( 1978) .、 Europ i an J o u r na l o f I mmuno l o gy, 6， 5 1 1 ( 1 9 7 6) . ) 、 S P 2/0— A g 1 4株 （以下、 S P— 2と略す） （Nat ur e, 27 6、 2 6 9 ( 1 9 7 8 ) . ) 、 P 3— X 63— Ag865 3株 （以下、 6 5 3と略す） （J o u r na l o f I mmuno 1 o gy, 123 , 1 548 ( 1 9 7 9) . ) 、 P 3 -X 6 3 -A 8 (以下 、 X 6 3と略す） （Nat ur e, 2 5 6 , 49 5 ( 1 975) . ) などが用いることがで きる。 これらの細胞株は、 8—ァザグァニン培地（ 1 5 g/ml 8—ァザグァニンを含 む正常培地 （ 1. 5 mM グルタミン、 5 X 1 0 -⁵ M 2一メルカプトエタノール、 1 0 g/m 1 ジェン夕マイシンおよび 1 0 % F C S (CS L社製）を含む RPMI 1 64 0培地） ） で継代し、 細胞融合を行う 3〜4日前に正常培地で培養する。 細胞融合には、 そ のようにして調製した細胞を 2 X 1 0⁷個以上用いる。

(c) ハイプリ ドーマの作製

(a) で調製した抗体産生細胞と （b) で調製した骨髄腫細胞を MEM培地または PB S ( 1 リットル当たり ； 1. 83 gリン酸ニナトリウム、 0. 2 1 gリン酸一力リウム、 7. 6 5 gNa C 1, pH 7. 2) で洗浄し、 骨髄腫細胞の細胞数に対し抗体産生細胞 5〜 1 0 倍になるよう混合し、 1 , 20 0 r pmで 5分間遠心分離した後、 沈殿分画を得る。得られ た沈澱画分の細胞群をよくほぐし、 該細胞群に対し抗体産生細胞 1 0⁸当たり、 ポリエチレ ングリコール溶液 （2 g ポリエチレングリコール一 1 0 0 0 (PE G— 1 00 0)、 2m 1 MEM培地、 0. 7ml ジメチルスルホキシド （DMSO) ) を 0. 2〜： 1 m 1を 3 7 °Cで攪拌しながら添加し、更に 1〜 2分間毎に M E M培地 1 ~ 2 m 1を数回添加する。 M EM培地で全量を 5 0mlになるように調製し、 9 00 r p mで 5分間遠心分離した後、沈 殿分画を得る。 沈殿分画に HAT培地 （正常培地、 10— ⁴M ヒポキサンチン、 1. 5 X 1 0 -⁵M チミジンおよび 4 X 1 0— ⁷M アミノプテリンを含む） 1 0 0mlを添加し、 ゆるやかにほく、し懸濁する。

該懸濁液を 9 6穴培養用プレートの各六に 1 0 0 1穴ずつ分注し、 3 7 °C、 5 % CO ₂存在下で？〜 14日間培養する。 酵素免疫測定法 （Ant i b o d i e s ： A L ab o r a t o r y Manu a l, S e c o nd E d i t i o n (1 989) (C o l d S pr i ng Harbo r Lab o r at or y Pre s s) ) などに言 3載の方法で、 培養上清に産生された抗体のうち、本発明のポリペプチドに特異的に反応する抗体を産生す るハイプリ ドーマを選択する。 (5) 本発明ポリペプチドの免疫学的検出方法

本発明ポリぺプチドの免疫学的検出方法としては、該ポリぺプチドまたはその部分ぺプチ ドに対する抗体を直接または間接的に酵素、 蛍光物質、放射性同位体、 ラテックスなどに結 合した標識体を用いることにより該ポリぺプチドまたはその部分ぺプチドを測定する方法 が挙げられる。 そのような測定方法として、 例えば、 西洋ヮサビペルォキシダーゼやアル力 リフォスファタ一ゼなどの酵素標識により検出する EL I S A法や化学発光法、ルミノール や GFP (Gre en F luor e s c enc e P r o t e i n )などの蛍光標識を検 出する F I TC法、 ¹²⁵ Iなどの放射性同位体標識を検出する R I A法、 ラテックスに結合 したラテックス凝集法などが例示される。

また、そのような測定方法として、 ウエスタンブロット法および免疫組織染色なども例示 される。

さらに、そのような測定方法を用いることにより本発明のポリぺプチドまたはその部分ぺ プチドを定量することもできる。

(6) mRNAの定量方法

本発明のポリヌクレオチドより調製したォリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダ ィゼーシヨン法または RT— P CR法により mRNAを定量することで本発明のポリぺプ チドをコ一ドする： DNAの発現量を定量することができる。

正常あるいは疾患モデル動物、 例えば、 マウス、 ラヅト、 ゥサギ、 ヒヅジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなどで mRNAを定量する場合、 必要によってグルコースを投与し、 一定 時間経過後に、 骨格筋、 脳、 血液、 胃、 腎臓などの臓器または組織を単離し、 細胞を調製す る。得られた細胞から当該分野で周知慣用の常法により mRNAを抽出し、 RT— P CR法 やノーザンプロヅトハイブリダィゼーシヨン法などで mRNAを定量'解析することができ る。

本発明のポリぺプチドもしくはその部分ぺプチドを発現する形質転換体からの mRNA を定量する場合も、 該形質転換体から当該分野で周知慣用の常法により mRNAを抽出し、 RT— P CR法やノーザンプロヅトハイブリダィゼ一シヨン法などで mRN Aを定量'解析 することができる。

(7) 遺伝子構造の同定

現在、多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録されている。 した がって、本発明のポリヌクレオチド配列と、データベースに登録されてるヒト染色体遺伝子 の配列とを比較することにより、本発明のポリペプチドをコードするヒト染色体遺伝子を同 定し、該遺伝子の構造を明らかにできる可能性がある。 cDNAの配列と一致する染色体遺 伝子配列が登録されていれば、 cDN Aの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより 、本発明のポリぺプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、ェクソンおよびィ ントロン構造をスクリーニングすることができる。本発明のポリヌクレオチドをプローブと して、 当該分野において周知慣用の常法（東京大学医科学研究所制癌研究部編、 新細胞工学 実験プロトコール、 秀潤社 （1993年） . ） を用いて、 該遺伝子のプロモーター領域を取 得することができる。

プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードする遺伝 子の転写に関与するすベてのプロモータ一領域が挙げられる。

(8) 糖尿病の検出方法

糖尿病検出方法としては、本発明のポリぺプチドの免疫学的検出方法により、本発明のポ リぺプチドと反応する異なるェピトープを認識する 2種類の抗体のうち一方を直接または 間接的に酵素で標識したものを用いるサンドィツチ E L I S A法や¹²⁵ Iなどの放射性同 位体で標識した本発明のポリぺプチドと該ぺプチドを認識する抗体を用いる競合 R I A法 などを挙げることができる。本発明のポリぺプチドは、糖尿病モデルラヅトの骨格筋におい てその発現が低下しており、食事制限と運動により病態が改善されると、骨格筋における発 現が回復することから、 この検出法は糖尿病の検出に利用することができる。 また、 本遺伝子の多型を調べることにより、 糖尿病の検出や予後の予測に利用できる。 さらに、 本遗伝子の多型と、 本遗伝子が発現している臓器 （脳、 骨格筋） における疾患と の関連を調べることにより、 他の疾患の検出にも利用できる。本遺伝子の多型解析は、 本遺 伝子の遺伝子配列情報を用いて行うことができる。具体的には、 サザンプロヅト法、 ダイレ クトシークェンス法、 P CR法、 DNAチップ法などを用いて遺伝子多型を解析することが できる （臨床検査， 42， 1507— 1517 (1998) . 、 臨床検査， 42, 1565 一 1570 (1998) . ) 。 (9) 神経変性疾患検出方法

神経変性疾患検出方法としては、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法により、本発 明のポリペプチドと反応する異なるェピトープを認識する 2種類の抗体のうち一方を直接 または間接的に酵素で標識したものを用いるサンドィツチ EL I S A法や¹²⁵ Iなどの放 射性同位体で標識した本発明のポリぺプチドと該ぺプチドを認識する抗体を用いる競合 R I A法などを挙げることができる。本発明のポリペプチドは、 アルツハイマー病、 パーキン ソン病、 筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の検出に利用することができる。

本発明のポリぺプチドは、脳で発現が上昇していること、本遺伝子の多型を調べることに より、 神経変性疾患の検出や予後の予測に利用できる。 (10) 検出用キット

本発明のポリヌクレオチドは、ノーザンハイプリダイゼーション法または P C R法を用い たそれら神絰変性疾患および糖尿病の検出に利用することが可能である。また、本発明の抗 体を用いて免疫学的手法によっても神経変性疾患および糖尿病の検出を行なうことができ る。従って、 ポリヌクレオチドを用いた検出の場合には、 キット中には標識された本発明の ポリヌクレオチドが含まれる。 また、 抗体を用いた検出の場合には、 本発明の抗体の他に、 標準抗原として本発明のポリペプチドが含まれる。更にキット中には標準曲線が含まれてい てもよい。 (11) DNAの転写抑制および mRNAの翻訳抑制方法

本発明のポリヌクレオチドを投与することにより、本発明のポリぺプチドの生産を抑制す ることができる。即ち、 本発明のポリヌクレオチドを用いて、 本発明のポリぺプチドをコ一 ドする DNAの転写の抑制、本発明のポリぺプチドをコードする mRNAの翻訳の抑制を行 うことが可能である。

(12) 結合物質のスクリーニング方法

本発明のポリぺプチドまたはその部分ぺプチドは、本発明のポリぺプチドに結合するタン パク質や低分子物質などを探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。す なわち、本発明は、本発明のポリぺプチドもしくはその塩または本発明の部分ぺプチドもし くはその塩と被検物質とを接触させることを特徴とする本発明のポリぺプチドに対する結 合物質のスクリーニング方法を提供する。 被検物質としては、 低分子化合物、 タンパク質、 ヒトまたはマウス、 ラット、 ブ夕、 ゥシ、 ヒヅジ、 サルなどの哺乳動物の組織抽出物、 細胞 培養上清などが用いられる。 これらの被検物質を本発明のポリペプチドに添加し、結合活性 などを測定しながら分画し、 最終的に単一のリガンドを得ることができる。

具体的には、本発明の結合物質のスクリーニング方法は、本発明のポリぺプチドもしくは その部分ぺプチドを用いるか、組換え型ポリぺプチドの発現系を構築し、該発現系を用いた 結合アツセィ系を用いるか、 または本発明のポリぺプチドに結合して細胞刺激活性、例えば 、 GAP 43 (Ce l l, 83, 269 - 278 ( 1995 ) . ) や神経細胞を用いた軸策 伸展などを測定してスクリーニングすることができる。 まず、結合物質のスクリーニング方法に用いるポリぺプチドとしては、上記した本発明の ポリペプチドまたは本発明の部分ペプチドを含有するものであれば何れのものであっても よいが、動物細胞を用いて大量発現させたポリペプチドが適している。本発明のポリぺプチ ドを製造するには、前述の発現方法が用いられるが、該ポリぺプチドをコードする DNAを 哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするタンパク 質部分をコードする DN A断片には、 通常、 相補: DNAが用いられるが、 必ずしもこれに制 約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成 DN Aを用いてもよい。本発明のポリべ プチドをコードする; DN A断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるため には、該 DNA断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （n u c 1 e a r p o l yhedro s i s v i r u s ; N P V)のポリヘドリンプロモー ター、 S V 40由来のプロモーター、 レトロウィルスのプロモーター、 メタ口チォネインプ 口モーター、 ヒトヒ一トショヅクプロモーター、 サイ トメガロウィルスプロモー夕—、 s R aプロモ一夕一などの下流に組み込むのが好ましい。発現したポリペプチドの量と質の検査 はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、 T h e Journa l o f B i o l o gi c a l Chemi s t ry, 267， 19555〜； L 9559 (1 992) . に記載の方法に従って行うことができる。

従って、本発明の結合物質スクリーニング方法において、本発明のポリぺプチドもしくは その部分ぺプチドを含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したポリぺプ チドもしくはその部分ぺプチドであってもよいし、該ポリべプチドを含有する細胞またはそ の細胞上清を用いてもよい。本発明の結合物質のスクリーニング方法において、本発明のポ リペプチドを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで 固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。本発明 のポリぺプチドを含有する細胞としては、本発明のポリぺプチドを発現した宿主細胞をいう が、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。 細胞上清画分としては、 細胞の培養上清に含まれる画分のことをいう。

本発明のポリペプチドまたはその塩に対する結合物質をスクリーニングするためには、適 当なポリべプチド画分と、標識した被験物質が必要である。ポリぺプチド画分としては、 天 然型のポリぺプチド画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ポリぺプチド画分な どが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用 などを示す。 標識した被験物質としては、 ³H、 ¹²⁵ I, ¹⁴C、 ³⁵Sなどで標識したタン パク質や低分子化合物などを挙げることができる。 具体的には、本発明のポリペプチドまたはその塩に対する結合物質のスクリーニング方法 を行なうには、 まず本発明のポリぺプチドを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリー ニング方法に適したバヅファーに懸濁することによりポリペプチド標品を調製する。バヅフ ァ一には、 pH4〜： 10、 好ましくは pH6〜8のリン酸緩衝液、 Tr i s— HC 1緩衝液 などのリガンドとポリペプチドとの結合を阻害しない緩衝液であればいずれでもよい。また 、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Tween— 80 (花王—アトラス社） 、 ジギトニン、デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンゃゼラチンなどの 各種夕ンパク質を緩衝液に加えるもよい。さらに、 プロテアーゼによる結合物質の分解を抑 制する目的で PMSF、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなど のプロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 ◦ . 01〜 1 0mlの該ポリペプチド溶液 に、 一定量、 好ましくは、 5000 c pm〜 500000 c pmの³ H、 ¹²⁵ I、 ¹⁴C、 ^{3 5} Sなどで標識した被験物質を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰 の未標識の被験物質を加えた反応チューブも用意する。反応は 0°Cから 50°C、好ましくは4°Cから 37°Cで、 20分から 24時間、 好ましくは 30分から 3時間で行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙などで濾過し、適量の同緩衝液で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放 射活性を液体シンチレ一シヨンカウン夕一あるいはァ—カウンターで計測する。全結合量 （ B) から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （B— NSB)が 0 c pmを越える被 験物質を本発明のポリぺプチドまたはその塩に対する結合物質として選択することができ る。 本発明のポリペプチドに対する結合物質をスクリーニングするためには、該ポリペプチド を介する細胞刺激活性、例えば、 GAP 43や神経細胞を用いた軸策伸展などを公知の方法 または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、 まず、 ポリぺプチ ドを含有する細胞をマルチウヱルプレートなどに培養する。結合物質のスクリーニングを行 なうにあたっては前もつて新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な緩衝液に交換 し、被験物質などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を 回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物 質、 例えば、 GAP 43などの生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は 、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 ( 1 3) 結合物質スクリーニング用キヅト

本発明のポリぺプチドまたはその塩に結合する結合物質スクリーニング用キットは、本発 明のポリぺプチドもしくはその塩、本発明の部分べプチドもしくはその塩、本発明のポリぺ プチドを含有する細胞、または本発明のポリぺプチドを含有する細胞沈殿画分などを含有す るものである。本発明の結合物質スクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げら れる。

(i) 結合物質スクリーニング用試薬

スクリーニング溶液および洗浄溶液として Hank' s B a l anc e d S a l t S o l ut i o n (インビトロジェン社製） に 0. 05%のゥシ血清アルブミン （シグマァ ルドリッチ社製） を加えたものを孔径 0. 45〃mのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保存 したものまたは用時調製したもの。

(a) 本発明のポリペプチドを発現させた C HO細胞を、 1 2穴プレートに 5 X 1 0⁵個 Z 穴で継代し、 3 7°C、 s 5% C〇₂で 2日間培養したもの。

(b) 標識被検物質

市販の³ H、 ¹²⁵ I、 ¹⁴C；、 ³⁵ Sなどで標識した被検物質した溶液を 4°Cあるいは一 20°Cに て保存し、 測定用緩衝液にて 1 zMに希釈するして用時調製する。 水に難溶性を示す被検物質に ついては、 ジメチルホルムアミド、 DMSO、 メタノールなどに溶解する。

(c) 非標識被検物質

標識物質と同じものを 100~1000倍濃度で調製したもの。 ( i i ) 測定法

(a) 12六組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現 C HO細胞を、 測定用 緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各 に加える。 ( b ) 標識被検物質を 5 Ad l加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を測定ためには 非標識被検物質を 5 1加える。

( c ) 反応液を除去し、 1 m 1の洗浄溶液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識被検物質を 0 . 2 M N a O H ( 1 % S D Sを含む） で溶解し、 4 m 1の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製 ) と混合する。

( d ) 液体シンチレーシヨンカウンター （ペックマンコール夕一社製） を用いて放射活性を測定 する。

( 1 4 ) 結合活性調節物質のスクリ一二ング方法

本発明のポリべプチドまたはその部分ペプチドは、本発明のポリぺプチドに結合する物質 の結合活性を調節する物質を探索し、またはスクリーニングするための試薬として有用であ る。 すなわち、 本発明は、 本発明のポリペプチドもしくはその塩とその結合物質との結合活性 を調節する物質と被験物質とを接触させることを特徴とする本発明のポリぺプチドとそれに対す る結合物質の結合活性を調節する結合活性調節物質のスクリ一二ング方法を提供する。

被験物質としては、 例えば、 ヒトまたは哺乳動物、 例えば、 マウス、 ラヅト、 ブ夕、 ゥシ、 ヒ ヅジ、 サルなどの組織抽出物、 細胞培養上清ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性物質、 合成物 質、 発酵生産物などが用いられる。 これらの被験物質を本発明のポリペプチドおよびその結合物 質と共に添加し、 結合活性などを測定しながら分画し、 最終的に単一の結合活性調節物質を得る ことができる。 本発明のポリぺプチドまたは該ポリぺプチドを発現する組換え体発現系を構築し、 バイオアツ セィ系または結合ァヅセィ系を用いることによって、 結合物質と本発明のポリぺプチドとの結合 性を変化させる物質、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性物質、 合成物質、 発酵生産 物などまたはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。 このような物質には、 （a ) 結合物質と本発明のポリぺプチドとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、 G A P 4 3や神絰細 胞を用いた軸策伸展を促進する活性または抑制する活性などの増強あるいは減少させる物質、 （ b ) 結合物質と本発明のポリぺプチドとの結合力を増強する物質あるいは減少させる物質が挙げ られる。

すなわち、 本発明は、 （i ) 本発明のポリペプチド、 その部分ペプチドまたはそれらの塩と結 合物質を接触させた場合および （i i ) 本発明のポリペプチド、 その部分ペプチドまたはそれら の塩と結合物質および被検物質とを接触させた場合の結合物質の結合量を比較することを特徴と する結合物質と本発明のポリべプチド、 その部分ペプチドまたはそれらの塩との結合活性調節物 質のスクリーニング方法を提供する。

本発明の結合活性調節物質のスクリ一ニング方法は、 （ i ) および （ i i ) の場合における、 例えば、 細胞刺激活性あるいは該ポリペプチドと結合物質との結合量などを測定して、 比較する ことを特徴とする。 具体的には、 （a ) 標識した結合物質を本発明のポリペプチドなどに接触させた場合と、 標識 した結合物質および被検物質を本発明のポリぺプチドなど接触させた場合における、 該ポリぺプ チドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、 比較することを特徴とする結合物質と本発明 のポリペプチドなどとの結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、 （b ) 標識した結合物 質を、 本発明のポリぺプチドなどを含有する細胞または細胞培養液と接触させた場合および標識 結合物質および被検物質を本発明のポリぺプチドなどを含有する細胞または本発明の細胞の沈殿 画分に接触させた場合における、 標識結合物質の本発明の細胞またはその沈殿分画に対する結合 量を測定し、 比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリぺプチドなどとの結合性を変化 させる結合活性調節物質のスクリーニング方法、 （c ) 本発明のポリヌクレオチドなどを含有す る形質転換体を培養することによって細胞培養液に分泌したポリぺプチドなどと標識結合物質を 接触させた場合および標識結合物質ならびに被検物質を接触させた場合における、 該ポリぺプチ ドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、 比較することを特徴とする結合物質と本発明の ポリぺプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリ一二ング方法などが挙げら れる。

( 1 5 ) 結合活性調節物質のスクリ一二ング用キット

結合物質と本発明のポリぺプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリー二 ング用キットは、 本発明のポリペプチド、 本発明のポリペプチドを含有する細胞または本発明の ポリペプチドなどを含有する細胞培養液を含有するものなどである。 本発明のスクリーニング用 キットの例としては、 次のものが挙げられる。

( i ) 結合活性調節物質のスクリ一二ング用試薬

スクリーニング用溶液および洗浄用溶液として Hank' s Balanced Salt So lut ion (インビトロジェン社製） に、 0. 05%のゥシ血清アルブミン （シグマアル ドリツチ社製） を加えたものを孔径 0. 45〃mのフィル夕一で濾過滅菌したものを、 4°Cで保 存したものまたは用時調製したもの。

(a) 本発明のポリペプチド

本発明のポリペプチドを発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 10⁵個/^:で継代し 、 37°C、 5% C0₂、 で 2日間培養したもの。

(b)標識結合物質

市販の³ H、 ¹²⁵I、 ¹⁴C、 ³⁵ Sなどで標識した結合物質の溶液を 4°Cあるいは一 20°Cにて 保存し、 測定用緩衝液で希釈して 1 ΛίΜとなるよう用時調製する。

(c) 結合物質

標準結合物質を 0. 1 %ゥシ血清アルブミン （シグマアルドリヅチ社製） を含む P B Sで 1 m Mとなるように溶解し、 一20°Cで保存する。

(d)被験物質

水溶液状態のものを 4°Cあるいは— 2 CTCにて保存し、 測定用緩衝液で希釈して 1〃 Mとなる よう用時調製する。 水に難溶性を示す被検物質については、 ジメチルホルムアミド、 DMSO、 メ夕ノールなどに溶解する。

( i i ) 測定法

(a) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現 CHO細胞を、 測定用 緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490〃 1の測定用緩衝液を各穴に加える。

(b) 1 0— ³~1 0_^{1 ()} の被検物質を5〃1加ぇた後、 標識結合物質を 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を測定するためには被験物質に代えて非標識結合物質を 5 1加えて同様の反応を行う。

( c ) 反応液を除去し、 1 m lの洗浄溶液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識結合物質を 0 . 2 M N a O H ( 1 % S D Sを含む） で溶解し、 4 m 1の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製 ) と混合する。

( d ) 液体シンチレ一シヨンカウンター （ベックマンコールター社製） を用いて放射活性を 測定する。

( 1 6 ) 発現調節物質のスクリ一二ング方法

本発明のポリヌクレオチドおよび抗体は本発明のポリぺプチドの発現を調節する低分子化合物 やタンパク質などの物質をスクリーニングするための試薬として有用であり、 免疫学的測定方法 または分子生物学的測定方法に用いることができる。 すなわち、 本発明は、 本発明のポリぺプチ ドを発現する細胞または組織と被験物質を接触させ、 本発明のポリペプチドの m R N A量ある tヽ はタンパク質量を測定することで本発明のポリぺプチドの発現の増加または減少を測定すること を特徴とする本発明のポリぺプチドまたは/および本発明のポリヌクレオチドの発現量を変化さ せる物質に対するスクリーニング方法を提供する。 被験物質としては、 例えば、 ペプチド、 タン パク質、 非ペプチド性物質、 合成物質、 発酵生産物などが用いられる。 これらの被験物質を、 本 発明のポリペプチドを発現する細胞または組織、 例えば、 動物由来の血液、 臓器、 臓器から単離 した組織もしくは細胞、 本発明のポリペプチドを発現する組み換え体発現系を構築し、 得られる 形質転換体などの培養液に添加し、 本発明のポリペプチドの m R N A量あるいはタンパク質量を 測定しながら分画し、 最終的に単一な発現調節物質を得ることができる。

( 1 7 ) 発現調節物質のスクリーニング用キット

本発明のポリぺプチドの発現調節物質またはその塩のスクリーニング用キットは、 本発明 のポリペプチド、 本発明のポリペプチドを含有する細胞、 または本発明のポリペプチドを含有す る細胞の沈殿分画などを含有するものである。 本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。 ( 1 8 ) 免疫学的定量方法に基づくスクリーニング用キット

本発明のポリぺプチドの免疫学的定量方法としては、 液相中で本発明のポリぺプチドに反応し ェピトープが異なる 2種類の単一特異的な抗体を用いたサンドイッチ E L I S A法、 本発明のポ リぺプチドに特異的な抗体と^{1 2 6} Iなどの放射性同位体で標識した本発明のポリぺプチドを用い たラジオィムノアヅセィ法などが例示される。 このような免疫学的定量方法に基づいたスクリー ニング用キットは発現調節物質のスクリーニング用キットとして有用であり、 キット中には、 本 発明の抗体の他に、 標準抗原として本発明のポリペプチドが含まれる。 更にキット中には標準曲 線が含まれていてもよい。 ( 1 9 ) 分子生物学的定量方法に基づくスクリーニング用キット

本発明のポリヌクレオチドの分子生物学的定量方法としては、 本発明のポリヌクレオチドある いはそれから調製したォリゴヌクレオチドを用いたノーザンハイブリダイゼーション法、 P C R 法などが例示され、 それらの方法により本発明のポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現量を m R N Aレベルで定量することができる。 このような分子生物学的定量方法に基づいたスクリ一二 ング用キヅトは発現調節物質のスクリーニングに有用であり、 キット中に本発明のポリヌクレオ チドぁるいはそれらから調製したォリゴヌクレオチドなどが含まれる。 具体的には、 （ i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物、 例えば、 マウス、 ラヅ ト、 ゥサ ギ、 ヒヅジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなどに対して、 薬剤、 例えば、 抗糖尿病薬などなど を投与し、 一定時間経過した後、 血液、 特定の臓器、 例えば、 脳、 胃、 腎臓など、 あるいは臓器 から単離した組織または細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発明のポリペプチドまたはその 部分ペプチドの mRN Aは、 例えば、 当該分野において周知の抽出方法により mR N Aを抽出し 、 例えば、 T a q M a n P C Rなどの手法を用いることにより定量することができ、 公知の手段 によりノザンプロヅト法を用いることにより解析することもできる。 （i i ) 本発明のポリぺプ チドもしくはその部分ぺプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従い作製し、 該形質転換体 に含まれる本発明のポリべプチドまたはその部分ペプチドの m R N Aを同様にして定量、 解析す ることができる。 さらに、 本発明のポリヌクレオチドを用いて、 ノザンハイプリダイゼ一シヨン 法や P CR法などにより本発明のポリぺプチドの mRNA発現量の定量を行うことができる。 ま た、 ポリヌクレオチドを用いた検出の場合には、 キット中には標識された本発明のポリヌクレオ チドが含まれる。 (i) スクリーニング用試薬

(a) スクリーニング用溶液および洗浄用溶液として Hank' s Balanced Sal t So lut ion (インビトロジェン社製） に、 0. 05 %のゥシ血清アルブミン （シグマ アルドリッチ社製） を加えたものを孔径 0. 45〃mのフィルターで濾過滅菌したものを、 4°C で保存したものまたは用時調製したもの。

(a) 本発明のポリペプチドを発現する細胞

本発明のポリペプチドを発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X I 0⁵個/穴で維代し 、 37°C、 5% C0₂、 で 2曰間培養したもの。 ，

(b) プライマー

本発明のポリヌクレオチドを特異的に増幅するセンスプライマーおよびァンチセンスプラィマ 一をそれそれ設計し、 DNA合成機 （アプライドバイオシステムズ社製） で合成する。

(c)被験物質

水溶液状態のものを 4 °Cあるいは一 20°Cにて保存し、 測定用緩衝液で希釈して 1〃Mとなる よう用時調製する。 水に難溶性を示す被検物質については、 ジメチルホルムアミド、 DMSO、 メタノールなどに溶解する。

( i i ) 測定法

(a) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現 CHO細胞を、 測定用 緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加える。

(b) 10— ³〜10— ¹⁽⁾Mの被検物質を 5〃1加え、 室温にて 1時間反応させる。 被験物質によ らない発現量を測定するためには被験物質を加えていないもので同様の反応を行う。

(c) 反応液を除去し、 1mlの洗浄溶液で沈殿を 3回洗浄する。 細胞から mRN Aを抽出し、 プライマ一を用いて TaqManPCR (アプライドバイォシステムズ社製） により mRNA発 現量を定量する。

(20) 非ヒトノックァゥトおよび非ヒトトランスジェニヅク動物の作製

本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを用い、 目的とする非ヒト動物、 例えばゥシ、 ヒヅ ジ、 ャギ、 ブ夕、 ゥマ、 ニヮトリ、 マウス、 ラヅ トなどの胚性幹細胞 （embryoni c s t emc e 11)において染色体上の本発明のポリペプチドをコードする DNAを、 例えば、 Na t ur e, 326 (6110) ， 295 (1987) .、 Ce l l, 51 (3) , 503 (19 87) . などに記載の公知の相同組換えの手法により、 Nature、 350 (6315) , 2 43 (1991) . などに記載のような不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成 することができる。

このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、 非ヒト動物の受精卵の胚盤胞 （bias t c s t) への注入キメラ法または集合キメラ法などの手法により胚性幹細胞クローンと正常 細胞からなるキヌラ個体を作成することができる。 該キメラ個体と正常個体の掛け合わせにより 、 全身の細胞の染色体上の本発明のポリペプチドをコードする DNAに任意の変異を有する個体 を得ることができ、 さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、 ホモ 個体を得ることができる。

このようにして動物個体において、 染色体上の本発明のポリペプチドをコードする D N Aの任 意の位置へ変異の導入が可能である。例えば、 染色体上の本発明のポリペプチドをコードする D N Aの翻訳領域中への塩基の置換、 欠失、 揷入などの変異を導入することにより、 その産物の活 性を変化させることができる。

また、 その発現制御領域への同様な変異の導入により、 発現の程度、 時期、 組織特異性などを 改変させることも可能である。 さらに、 Cr e— 1 oxP系との組合せにより、 より積極的に発 現時期、 発現部位、 発現量等を制御することも可能である。 このような例として、 脳のある特定 の領域で発現されるプロモータを利用して、 該領域での目的遺伝子欠失 （Cel l, 87 (7) ， 1317 (1996) . )や C reを発現するアデノウイルスを用いて、 目的の時期に臓器特 異的な目的遗伝子欠失 （Sci ence, 278, 5335 (1997) . ) などが知られてい る。 従つて染色体上の本発明のポリペプチドをコードする DNAについてもこのように任意の時 期や組織で発現を制御または任意の欠失、 置換、 付加をその翻訳領域や、 発現制御領域に有する 非ヒトノックアウトまたは非ヒトトランスジエニック動物を作製することが可能である。

このようなノックァゥトおよびトランスジヱニック非ヒト動物は任意の時期、 任意の程度また は任意の部位で、 本発明のポリべプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。 従って、 本発明のノックアウトおよびトランスジヱニック非ヒト動物は、 本発明のポリペプチド に起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。 特にその治療薬、 予防薬などの評価用モデルとして非常に有用である。

( 2 1 ) 医薬

本発明の抗体、 結合物質、 結合調節物質または発現調節物質を含有する医薬は、 治療薬として 該物質単独で投与することも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以 上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医 薬製剤として提供するのが望ましい。

投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投与、 または口腔 内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。 投与形 態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テ ープ剤などが挙げられる。

経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等があ げられる。 例えば、 乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖などの糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコールなどのグリコール類、 ごま油 、 ォリーブ油、 大豆油などの油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、 スト口べ リーフレーバー、 ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。 カプ セル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤などは、 乳糖、 プドウ糖、 ショ糖、 マンニトールなどの賦形剤、 デ ンプン、 アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、 ステアリン酸マグネシウム、 タルクなどの滑沢剤 、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチンなどの結合剤、 旨肪酸エス テルなどの界面活性剤、 グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。 非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤などが挙げられる。 例えば、 注射剤 は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製する。 座剤は カカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。 また、 噴霧剤は該物質 そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、 かつ該物質を微細な粒子として分 散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製する。担体として具体的には、 乳糖、 グリセリ ンなどが例示される。 該物質および用いる担体の性質により、 エアロゾル、 ドライパウダーなど の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を 添加することもできる。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質またはその 塩とは、 結合物質、 結合活性調節物質および発現調節物質であり、 具体的には、 （ a ) 結合物質 と本発明のポリペプチドとの結合を介する細胞刺激活性、 例えば、 G A P 4 3や神経細胞を用 いた軸策伸展を増強あるいは減少させる物質、 （b )結合物質と本発明のポリペプチドとの結合 活性を増強あるいは減少させる物質、 あるいは （c ) 本発明のポリペプチドの発現量を増強ある いは減少させる物質である。 該物質としては、 低分子化合物、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性物質、 合成物質、 発酵生 産物などが挙げられ、 これら物質は新規な物質であってもよいし、 公知の物質であってもよく、 天然物質または非天然物質の何れでもよい。 本発明のポリペプチドなどに対するァゴニストは、 本発明のポリペプチドなどに対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該結合物質活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。 本発明のポリぺプチドなどに対 するアンタゴニストは、 本発明のポリぺプチドなどに対するリガンドが有する生理活性を抑制す ることができるので、 該結合物質活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。 リガン ドと本発明のポリぺプチドとの結合力を増強する物質は、 本発明のポリぺプチドなどに対するリ ガンドが有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。 リガンドと本 発明のポリぺプチドとの結合力を減少させる物質は、 本発明のポリぺプチドなどに対するリガン ドが有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。 また、 本発明のポリぺプチドの発現量を変化させる物質を含有する各種疾病の予防および/ま たは治療剤本発明のポリべプチドは前述のとおり、 例えば、 糖代謝や神経再生など生体内で何ら かの重要な役割を果たしていると考えられる。従って、 本発明のポリペプチドまたはその部分ぺ プチドの発現量を変化させる発現調節物質は、 本発明のポリペプチドの機能不全に関連する疾患 の予防および/または治療剤として用いることができる。 該物質を本発明のポリぺプチドの機能 不全に関連する疾患の予防および/または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤 化することができる。 例えば、 該物質は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキ シル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容 し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該物質を生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合 剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製 造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られる ようにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチン、 コーンス ターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セルロースのような賦形剤、 コーン スターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑 剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリー のような香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料 にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用水の ようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸 濁させるなどの通常の製剤 l¾Sに従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例え ば、 生理食塩水、 ブドウ糖や補助薬を含む D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウ ムなどの等張液などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 エタノール、 プロピレングリコー ルゃポリエチレングリコ一ルなどのアルコール類、 ポリソルベート 8 0や H C O— 5 0など非ィ オン性界面活性剤などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用い られ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 上記予防 '治療剤は、 例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなどの無痛化剤、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレング リコールなどの安定剤、 ベンジルアルコール、 フエノールなどの保存剤、 酸化防止剤などと配合 してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる 製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃラヅト、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 プ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなどの哺乳動物に対して投与することができる。 該物質またはその塩の 1回の 投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 例 えば体重 60k の糖尿病患者ゃ神絰変性症患者においては、 一般に一日につき約 0 · 1 ~ 1 00 mg、 好ましくは約 1. 0~50mg、 より好ましくは約 1. 0〜 20 m gであり、 非経口的に 投与、例えば、 注射剤の場合は、 例えば体重 60kgの糖尿病患者や神経変性症患者においては、 一般に一日につき約 0. 0 1~3 Omg程度、 好ましくは約 0. l~20mg程度、 より好まし くは約 0. 1~1 Omg程度を静脈注射により投与する。 他の動物の場合も、 体重 kg当たりに 換算した量を投与することができる。投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重などにより異なるが、通常成人 1日当たり 10〃g〜8mg/kgである。 実施例

以下実施例を示す。遺伝子操作的手法として、特に断らない限り Mo l e cu l ar C 1 o n i n g： A Lab o r at o ry Manua丄, S e c o nd Ed i t i o n (1 989) (C o l d S p r i ng Har b o r L ab o r a t o ry P r e s s) に記載された方法を用いた。 実施例 1

DNAチップを用いた Z u c ke r F a t t yラヅトの遺伝子発現解析

Z u cke r F a t 七 yラヅトの脳、骨格筋および肺から、 T R I z o 1 R e a ge nt (インビトロジェン社製） を用い、 添付のマニュアルに従って全 RNAを調製し、 全 R NA 300〃gを得た。得られた全 RNAを Qu i ckPr ep Mi c r o mRNA Pur i f i c at i on Ki t (アマシャムバイオサイエンス社製） を用い、 添付のマ ニュアルにしたがってポリ （A) +RNAを調製した。 Superscript Cho i c e Syst em (インビトロジェン社製） を用いてポリ （A) + R N Aからクローニング用 c DN A断片を調製した。

ポリ （A) +RNA5〃gを 01 igo (dT) 丄 ₂ i ₈ P r i me rおよび S u p e r S c r i p t I I RTを用いてファーストストランド c DNAを合成し、 E. col i DNA p o 1 yme r a s eおよび E . c o 1 i RNas e Hを用いてセカンドストランド c D N Aを合成した。 得られた cDNAを T4 DNA P o 1 ym e r a s eで処理し、 平滑末端を もつ cDNAを生成した後、 E c oR I (Not I ) A d a p t e rを T 4 DNA 1 i gas eを用いて 5' および 3' 両末端に付加した。 アダプターを付加した c DNAは T 4 p o lynuc leot ide kinas eを用いて 5 ' 末端をりん酸ィ匕した後、 S i z e S e p 400 S un Co lmns (アマシャムバイオサイエンス社製） で約 40 Obp以 上の cDNA断片を回収した。 ベクター p 1 a smi d p S p o r t 1 (インビトロジェン 社製） を制限酵素 E c o R I (宝酒造社製） で処理し、 T4 polynucleot ide kinaseを用いて 5， 末端をリン酸化した後、 T4 DNA L i gas eを用いて得ら 'れた cDNA断片を組み込んだ。 得られた組換えプラスミド DNAをエタノール沈殿後、 TE緩 衝液 （10mM Tr i s-HCl, pH8. 0, 1 raM E D T A) 20〃 1に溶解し、 エレ クトロポーレーシヨン法 （Nu c 1 e i c Ac id Res earch, 16， 6127 ( 1 988) . ) により E 1 e c t r oMAX D H 10 B (インビトロジェン社製） に導入し形質 転換体を作製した。 形質転換体を S . 0. C . 培地 （インビトロジェン社製） 1 m 1中、 37 °Cで 1時間培養し、 10 O ^g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布し、 37 °Cでー晚培養した。 その結 果、 cDN Aライプラリーとして約 1000万個 （揷入率 95%) のアンピシリン耐性を示す形 質転換体を取得した。 得られた形質転換体のコ口ニー約 20000個から P C R法により c D N A断片を調製した。 得られた cDNA断片は: DYEnami c ET Dye Termina t or Ki t (Me gaBACE) (アマシャムバイオサイエンス社製） を用い、 添付のマ ニュアルに従って、 Me gaBACE 500 DNA Analys i s Sys t em (ァ マシャムバイオサイエンス社製） により cDNA断片の全塩基配列を決定した。 cDNAの配 列情報は CHI PSpac e (日立ソフトウェアエンジニアリング社製） を用いて解析するこ とにより重複のない 5000種類の cDN Aクローンを選択した。 これらのクローンを D N Aチ ップ作製システム M i c r o a r r a y S ys t em Gene r at i o n I I I Sp ot t er (Mo l e cul ar Dynami c s社製） を用いて、 T y p e 7ス ライドグラス （アマシャムバイオサイエンス社製） にスポットして DNAチップを作製した。 この DN Aチヅプを用いて、 肥満を伴うインスリン抵抗性モデルラヅトである Zucker Fat tyラヅ ト （Journal of He r e d, 52, 275 -278 (1961) . ) での遺伝子発現変動解析を実施した。 食餌制限 （30%摂餌量制限処理） および運動 （週 5日 間のトレヅドミル処置） を実施した Zucker Fat tyラヅトより骨格筋を摘出して T R I z o 1 Rea gent (インビトロジェン社製） を用い、 添付のマニュアルに従って全 RNAを調製した。得られた全 RNAを Qu i c kP r e p Mi c ro mRNA P u r i f i c at i on Kit (アマシャムバイオサイエンス社製） を用い、 添付のマニュ アルにしたがって po l y (A) +RNAを調製した。精製した RNAを用いてプローブを作 製した。 po l y (A) +RN A 0. 5〃gをサンプルとし、 Random 9me r、 o 1 i g o (d T) p r i me rをァニールさせた後、 S u p e r S c r i p t I I R T (インビトロジェン社製）を用いて C y— 3 (1〇 ？または〇 ー5 dCTP (アマシ ャムバイオサイエンス社製）を取り込ませ cDN Aを蛍光標識した。さらに GFX P CR DNA and Ge l Band Pur i f i c at i on Ki t (アマシャムバ ィォサイエンス社製) を用いて標識 c DN Aを精製し、 プローブとして用いた。 プローブは 、 Aut omat ed Slide P r o c e s s o r (アマシャムバイオサイエンス社製） を用いて DNAチップとのハイブリダィゼ一シヨンを実施した。 ハイプリダイゼーシヨンは Ty p e 7スライドのプロトコールに従い、 前処理の後にプローブと 48 °Cで 12時間行った。 ノ ヅファーには Hyb r i d i z a t o n Buf f er Ve r . 2 (アマシャムパイォサイン ス社製） を用いた。 洗浄後、 Mi c r o ar r ay Sys t em Gene rat i o n I I I S c anner (Mo l e cu l ar D y n a m i c s社製）により読み取り を行い、解析コンピューターソフト A r r a y Vi s i on (Mo l e cu l ar D y nam i c s社製） および G ene Spr i ng (シリコンジエネテックス社製） を用いてデ —夕解析を実施した。 その結果、 コントロ一ルラヅトと比較して食事制限および運動によりィン スリン抵抗性が改善しているラヅトにおいて発現の上昇が認められたクローンとして 39C7を 見出した。 実施例 2

o g o受容体と相同性を有する新規ポリべプチド（39 C 7 )をコ一ドする G D N Aのク ローニング

実施例 1で得られた 39 C7 cDNA断片を含むプラスミドを制限酵素 E c oR I (宝酒造 社製） で消化し、 QIAqui ck Ge l Ext ract ion Kit (キアゲン社製） を用い添付のマニュアルにしたがって cDNA断片を得た。 該 cDNA断片 5 Ongを Red i rimer I I DNA Labe l l ing S y s t em (アマシャムノ ィォサイェン ス社製） を用い添付のマニュアルに従って、 [α— ³² P]dCTP (6000 Ci/mmo l, 2 OmC i/ml) (NEN社製） で³² Pで標識した。 ³² P標識した c D N A断片をプローブと して用いコロニーハイプリダイゼーシヨン解析を行った。 ヒト脳 cDN Aライブラリー （クロン テック社製） あるいはラット脳 cDNAライブラリー （クロンテック社製） を 50枚の LBプレ ートにプレート当たり約 1 X 10⁴コロニーとなるように塗布し、 37 °Cでー晚培養してコロ ニーを形成させた。そのようにして得られたコロニーを； DNAプロヅティング用ナイロン膜 Hyb ond— N (アマシャムバイオサイエンス社製） に転写した後、 溶解溶液 （10% SDS) 、 変性溶液 （0. 5N NaOH、 1. 5M N a C 1 ) 、 中和溶液 （ 0. 5M T r i s— HC1、 pH7. 0 (1. 5M N a C 1を含む） ) および 2 x S S Cで順次処理し、 風 乾した。 転写した DNAは該ナイロン膜に紫外線照射することにより膜上に固定した。 上記で調製した標識プローブを Exp r> e s s Hy b Hybridi zat ion So l ut i on (クロンテック社製） に添加し、 該溶液に DNAを固定したナイロン膜を浸し、 65 °Cで 16時間ハイプリダイゼーションを行なった。 ハイプリダイゼーション後のナイ口ン膜を 2 XSSC (20 X S S C： 3M NaCl、 0. 3M クェン酸ナトリゥム、 pH7. 0) で室 温にて 5分、 1 X S S Cで 50°Cにて 30分、 0. 5 x S S Cで室温にて 5分洗浄後、 風乾した 。 次いで、 このナイロン膜をイメージングプレート （富士写真フィルム社製） 共にイメージング プレートカセット （富士写真フィルム社製） に装着し、 オートラジオグラフィーを行った後、 ィ メージアナライザ一 FLA3000 G (富士写真フィルム社製） で画像解析を行った。 シグナル が検出されたコロニーについて単一クローンが得られるまでコロニーハイブリダィゼーシヨンを 繰り返し行った。 得られた単一クローンコロニーから QIAprep S in Minipr ep K i t (キアゲン社製） を用いてプラスミド DNAを調製し、 ； DYEnami c ET D e Terminat or Kit (Me gaB ACE) (アマシャムバイオサイエンス社 製） を用い、 添付のマニュアルに従って、 Me gaB ACE 500 DNA Ana 1 s i s System (アマシャムバイオサイエンス社製） により全塩基配列を決定した。 その結果、 ヒト cDNAライブラリ一より 441個のアミノ酸よりなるポリペプチド（配 列番号 2 ；以下、 h39 C7) をコードする c DNA断片 （配列番号 1 ) を含む cDNAを 得た。またラヅト cDNAライブラリーより 445個のアミノ酸よりなるポリペプチド （配 列番号 4；以下、 r 39 C 7) をコードする cDNA断片 （配列番号 3 ) を含む cDNAを 得た。 ヒトとラットの cDN Aは塩基レベルで 86%、アミノ酸レベルで 86%の類似性を 有していた。 h39 C7はアミノ酸配列の第 1位から第 21位力 予想されるシグナルぺプ チド領域 （SP ; S i gna l Pept i de)、 第 23位から第 305位が N o g o受 容体のロイシンリツチリピ一ト領域（LRR ;Leuc ine— r i ch re peat domain) と類似性を有する 9つの領域で、 ァミノ末端側から順に、 LRRNT (L e c i ne r i ch r ep e at N-t e rminal doma i n) 、 L R R— 1 、 LRR—2、 LRR - 3、 LRR— 4、 LRR— 5、 LRR - 6、 LRR— 7、 および L RRCT (Le c ine r i c h re eat C-t e rmi nal doma i n ) で表しており、 カルボキシ末端は GP I (ダルコシルホスファチジルイノシトール） アン カーモチーフ構造を有していた （図 1) 。 LRRは蛋白質間相互作用に関与する機能がある (Journa l o f Mo l e c ul ar B i o l o gy, 277, 51 9, (1 9 98) . ) 。 また、 GP Iアンカーモチーフ構造は細胞膜上で、 細胞膜との結合に関与する 機能がある （蛋白質 '核酸 .酵素， 44, 1321 (1 999) . ) 。 以上のことから、 h 39 C 7は細胞膜受容体として機能していると推定される。既知の遺伝子との類似性を検討 したところ、 ヒトの N o g o受容体と 41 %の相同性を有していた。 No go受容体とのァ ミノ酸配列比較のための至適ァラインメントは、 遺伝子情報処理ソフトウェアである GENET YX (ソフトウエア社製） を用いて、 Lipman— Pear so n法 （Sc ience, 22 7, 1435- 1441 (1985) . ) により実施した。 実施例 3

ヒト正常組織における 39 C 7mRNAの発現

実施例 2で得られた h 39 C 7をコードする cDNAを含むプラスミドを制限酵素 E c oR I (宝酒造社製） で消化し、 Q I Aqu i ck Ge l Extract ion K i t (キア ゲン社製） を用い添付のマニュアルにしたがって h 39 C7を含む cDNA断片を得た。 得られ た cDNA断片 5 Ongを Red ipr ime I I DNA Label l ing Sys t em (アマシャムフアルマシアバイオテク社製） を用い添付のマニュアルに従って、 [α— ³² P] dCTP (6000 Ci/mmol, 20mCi/ml) (NEN社製） で³² Pで標識した。 このようにして調製した³² P標識 c D N A断片をプローブとして用いノーザンプロット解析を 行った。

上記で調製した標識プローブを Exp r e s s Hyb Hybridizat ion So l ut i on (クロンテツク社製） に添加し、 該溶液に MT Nプロヅトメンブレン （クロンテヅク 社製） を浸潰し、 65°Cで 16時間ハイブリダィゼーシヨンを行なった。 ハイブリダィゼ一ショ ン後のナイロン膜を 2XSSC (20XSSC： 3M NaC l、 0. 3M クェン酸ナトリウ ム、 pH7. 0) で室温にて 5分、 1 33〇で50°〇にて30分、 0. 5XSSCで室温にて 5分洗浄後、 風乾した。 次いで、 このナイロン膜をイメージングプレート （富士写真フィルム社 製） 共にイメージングプレートカセット （富士写真フィルム社製） に装着し、 オートラジオグラ フィーを行った後、 イメージアナライザー FLA 3000 Gで画像解析を行た。

その結果、 h 39 C 7の mRNAは、 約 5 kbの大きさで、 脳および骨格筋での発現が観 察された （図 2) 。 実施例 4

ヒト脳における 39 C 7 mRNAの発現

ヒト脳において発現が高いことから、脳内領域における当該遺伝子の発現量の違いについて 、 Human Mu l t ip l e T i s sue Expr e s s i on Array (ク ロンテック社） を用いて解析した。 このドット 'プロット膜はヒト脳の種々の領域に由来す るポリ A— RNAをナイロン膜にスポットしたものである。 このナイロン膜を、 0. 5M りん酸バッファー （pH 7. 2) 、 1 % ゥシ血清アルブミン （B S A) 、 で 1時間、 予備 ハイプリダイゼ一シヨンを行った。次に、 実施例 3で取得した h 39 C 7 cDNA断片 （配 列番号： 1) 50 ngを、 [ひ—³² P]dCTP ( 6000 C i/mmo 1 , 20 mC i/m 1) (NEN社） を用いて R e d i p r i me I I DNA Labe l l i ng S y s t em (アマシャムパイォサイエンス社製) を使用して、 その処方に従い³² P標識した 。 ³² P標識当該遺伝子 cDNA断片をプローブとして同パヅファーに加えた液にナイロン 膜を移し、 65°〇で1 6時間ハイブリダィゼーシヨンを行った。引続きこのナイロン膜を 2 X S S Cで室温で 5分濯いだ後、 1 X S S Cで 50°Cで 30分、 0. 5 330で50°( で 30分洗浄した。風乾後このナイ口ン膜をフジ写真フィルム社のイメージング 'プレートに 密着させ、 同社イメージ 'アナライザー F L A3000 Gで画像解析を行った。各シグナル の強度を解析し定量化した。その結果、脳において高度な精神機能に関与している大脳皮質 (側頭葉、 頭頂葉など） において強い発現が観察された （図 3) 。 また、 図中グラフの縦軸 は、 全脳の発現量を 1とした相対量を示している。 実施例 5

Zucker Fat tyラヅトにおける r 39 C 7 mRNAの発現

インスリン抵抗性を有する Zucker Fatt yラットでの遗伝子発現変動解析を実施し た。 食餌制限と運動を実施したラヅトより骨格筋を摘出して、 T R I _Z o 1試薬 （インビトロ ジェン社） を用いて、 その処方に従い全 RNAを抽出し、 5 0〃 gの全 RNAを得た。 この RNA 1 gを用いて、 Advant age R T f o r Ρ CR k i t (クロンテヅ ク社製） を用いて cDN Aを合成した。次に、 実施例 1で取得した r 3 9 C 7 cDNA断片 (配列番号： 3) を基に、 プライマー設計ソフトウェア P r i me r Expr e s s (ァ プライ ドバイォシステムズ社製）を用いて、 T a qMa nプライマーおよびプライマーを設 計し、アプライ ドバイォシステムズ社に合成を依頼した。作製した T a q M a nプライマー およびプローブを用いて、合成した c DNAを铸型として P 01反応を行ぃ^111 量を定 量した。 P C R反応試薬には P 1 a t i num Quant i t ave P GR S u p e rMix— UDG (インビトロジェン社製） を用いて、 50°Cで 2分、 9 5°Cで 2分の反応 サイクルを 1回行った後、 9 5°Cで 2分および 6 0°Cで 1分の反応サイクルを 40回行った。 その結果、 Zu c ke r F a t t yラヅト骨格筋において、食餌制限および運動によりィ ンスリン抵抗性が改善されると r 3 9 C 7の mRNA発現が増大した （図 4) 。 実施例 6

h 3 9 C7発現細胞株の樹立

実施例 2で得られた h 3 9 C 7の完全長 c DNA を p3xFLAG-CMV-7.1 ベクター (シグマ社） へ揷入し発現ベクターとした。 この発現ベクターを L6 細胞に導入し、 h 3 9 C7を安定的に発現する細胞を取得した。 発現ベクターを導入した細胞におけ る h 3 9 C7の発現は抗 F LAG抗体を用いたゥヱスタンプロヅ ト法により検出した (図 5 )。全細胞抽出液を S D S— PAGEした後、 Immobilm Transfer Membranes ( MILLIPORE 社） に転写した。 このメンブランを 5 %スキムミルク、 PB S中で室 温、 1時間ブロッキング処理しすこ後、 Peroxidase-conjugated Anti-FLAG 抗体 （シグ マ社） を加え、 さらに 1時間室温でインキュベート した。 インキュベート後、 メンブ ランを 0. 1 %Tween-PBSで洗浄し ECL+plus Western Blotting Detection System ( Amersham Biosciences 社)を用いて発色、 Hy er film ECL (Amersham Biosciences 社）に露光した。 実施例 Ί

h 3 9 C 7発現細胞株におけるグルコース取りこみ活性の測定

実施例 6により得られた h 3 9 C 7発現細胞株を用いてグルコース取り こみ活性の 測定を行った。 CytoStar-T plate ( Amersham Biosciences 社 ） に細胞を 2 X 10⁴ cells/wellで捲いた後、 C0₂インキュベターで 37°C、 ー晚培養した。 この細胞を 300 i lの PBS(-)で 3回 wash した後、 80〃 1の HEPES-Krebs buffer ( 119 mM NaCl, 4.75 mM KC1, 5 mM NaHC0₃, 2.54 mM CaCl₂ · 2H₂0, 1.2 mM MgS0₄₎ 20 mM HEPES . 7H₂0 ( pH 7.4 ) )を添加した。 続いて 3 /l M の insulinを 10〃 1、 及び 2-DEOXY-D- [U-¹⁴C] Glucose溶液（Amersham Biosciences 社） を 10〃1添カロ 後、 軽く混和して、 C0₂イ ンキュベターで 37°C、 20 分間イ ンキュベート した。 インキュベート後、 100〃M の Cytochalasin B を 10〃1添加し、 1450 MICRO BETA TRILUX ( Perkin Elmer社） で測定した （図 6 ) 。 この結果、 h 3 9 C 7強制発現細胞では、 コントロール細胞と比較してインスリン濃度非依存的にグルコ ース取りこみ量が増大していることが観察された。 ァヅセィに使用したサンプルは、 CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes社）により測定した D N A量で補正し、 その結果を図 6 に示した。

なお、 細胞の培養につ いては、 1 0 % fetal bovine serum と 1 x Antibiotic-Antimycotic(Iiivitrogen社製） 加えた α-ΜΕΜを培地として使用し、 7 0— 8 0 %コンフルェン トに達した時点で ト リプシンを使用して細胞を回収、 1/10-20希釈して継代する条件で行なった。 その結果、 図に示すように、 h 3 9 C 7の強制発現により、 グルコース取り込 み能が亢進することがわかった。 したがって、 h 3 9 C 7の発現の低下が、 糖尿 病の病態に関連することが示唆された。 産業上の利用可能性 本発明により、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 および筋萎縮性側索硬化症などの神 絰変性疾患のマーカーおよび糖尿病マーカー、ならびに神経変性疾患および糖尿病治療薬で ある N o g o受容体様新規ポリぺプチド、該ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、 該 D N Aが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該 ポリぺプチドの製造法、該ポリべプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリぺプ チドの定量法および免疫学的検出法、該抗体を含む糖尿病または神経変性疾患検出用キット、 該ポリぺプチドの m R N Aの定量法、該ポリぺプチドに対するリガンドのスクリーニング法、 該ポリべプチドとリガンドとの結合性を変化させる物質のスクリーニング法、該ポリべプチ ドの発現を変動させる物質のスクリーニング法、 ノックアウト動物、 トランスジエニック動 物、 本発明の抗体、 リガンド、 リガンドとの結合性を変化させる物質、 または発現を変動さ せる物質を含有する医薬が提供される。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 2の 2 2位の G l yから 4 4 1位の A r gで表わされるアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩。

2. 配列番号 2の 1位の M e tから 44 1位の A r gで表わされるァミ ノ 酸配列を含有する請求の範囲第 1項記載のポリぺプチドまたはその塩。

3. 配列番号 4の 2 2位の S e rから 4 4 5位の A r gで表わされるァミ ノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩。

4. 配列番号 4の 1位の M e tから 44 5位の A r gで表わされるァミ ノ 酸配列を含有する請求の範囲第 3項記載のポリペプチドまたはその塩。

5. 請求の範囲第 1項から第 4項のいずれか記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換または付加から選択きれる少な く とも 1 つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチ ドまたはその塩。

6. 糖尿病マーカ一、 神経変性疾患マーカー、 糖尿病治療薬、 あるいは神経 変性疾患治療薬として用いることを特徴とする請求の範囲第 1項から第 5項のい ずれか記載のポリぺプチド。

7. 請求の範囲第 1項から第 6項のいずれか記載のポリペプチ ドをコー ド する塩基配列を有するポリヌクレオ ド。

8. 配列番号 1の 1 7 4番目の Gから 1 4 3 3番目の Cで表わされる塩基 配列を含有する請求の範囲第 7項記載のポリ ヌクレオチド。

9. 配列番号 1の 1 1 1番目の Aから 1 4 3 3番目の Cで表わされる塩基 配列を含有する請求の範囲第 7項記載のポリ ヌクレオチド。

1 0. 配列番号 3の 1 7 0番目の Aから 1 44 1番目の Cで表わされる塩 基配列を含有する請求の範囲第 7項記載のポリ ヌクレオチ ド。

1 1. 配列番号 3の 1 0 7番目の Aから 1 44 1番目の Cで表わされる塩 基配列を含有する請求の範囲第 7項記載のポリ ヌクレオチ ド。

1 2. 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか記載のポリ ヌク レオチ ド とス ト リ ンジェン トな条件でハイ プリダイズするポリヌクレオチ ド。

1 3 . 請求の範囲第 7項から第 1 2項のいずれか記載のポリ ヌク レオチ ド に相補的な塩基配列を有するポリ ヌク レオチ ド。

1 4 . 糖尿病マーカー、 神絰変性疾患マーカー、 糖尿病治療薬あるいは神経 変性疾患治療薬として用いることを特徴とする請求の範囲第 7項から第 1 1項お よび第 1 3項のいずれか記載のポリヌクレオチ ド。

1 5 . 配列番号 1 または第 3項記載の塩基配列中の連続した 5から 6 0塩 基と同一配列を有するオリゴヌク レオチド、 該オリゴヌクレオチドと相補的な配 列を有するオリ ゴヌクレオチ ドおよびそれらの誘導体オリゴヌクレオチ ドからな る群より選ばれるポリ ヌクレオチ ド。

1 6 . 請求の範囲第 7項から第 1 3項のいずれか記載のポリ ヌク レオチ ド を含有する組換えベクター。

1 7 . 請求の範囲第 1 6項記載の組換えベクターで形質転換させた形質転 換体。

1 8 . 請求の範囲第 1 7項記載の形質転換体を培養する工程、および産生さ れた請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチ ドを培養液から回 収する工程、 を含有する該ポリぺプチ ドまたはその塩の製造法。

1 9 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチ ドを特異 的に認識する抗体。

2 0 . 下記の工程を含む、請求の範囲第 1 9項記載の抗体を用いることを特 徴とする、 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドの検出ま たは定量方法、

( a ) ポリペプチドと該抗体とを接触させる工程および、

( b ) ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程。

2 1 . 請求の範囲第 2 0項記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範 囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドが関連する糖尿病または神経 変性疾患の検出方法。

2 2. 請求の範囲第 2 0項記載の方法を用いるこ とを特徴とする糖尿病ま たは神経変性疾患の検出用キッ ト。

2 3. 下記の工程を含む請求の範囲第 7項から第 1 3項および第 1 5項の いずれか記載のポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とする、 請求の範囲第 1項 から第 5項のいずれか記載のポリぺプチ ドの mR N Aの検出または定量方法、

( a ) mR NAと該ポリ ヌク レオチ ドとを接触させる工程および、

( b ) mR N Aと該ポリヌク レオチドとの結合を検出する工程。

2 4. 請求の範囲第 2 3項記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範 囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドが関連する糖尿病または神経 変性疾患の検出方法。

2 5. 請求の範囲第 2 3項記載の方法を用いるこ とを特徴とする、糖尿病ま たは神経変性疾患の検出用キッ ト。

2 6. 請求の範囲第 2 3項記載の方法を用いるこ とを特徴とする、請求の範 囲第 1項から第 5項記載のポリぺプチ ドをコ一ドする遺伝子の発現量の測定方法 o

2 7. 請求の範囲第 2 3項記載の方法を用いるこ とを特徴とする、請求の範 囲第 1項から第 5項記載のポリペプチ ドをコードする遺伝子の発現量の測定キッ 卜。

2 8. 請求の範囲第 Ί項から第 1 3および第 1 5項のいずれか記載のポリ ヌクレオチ ドを用いるこ とを特徴とする、 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれ か記載のポリぺプチ ドをコードする！） N Aの転写または m R N Aの翻訳を促進ま たは抑制する方法。

2 9. 下記の工程を含む、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポ リぺプチドの結合物質のスク リーニング方法、

( a ) 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチドと被検物質を 接触させる工程および、

(b ) 該ポリペプチ ドと被検物質の結合を検出する工程。

3 0 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドを含むこと を特徴とする、 該ポリぺプチドの結合物質のスクリ一二ング用キヅ ト。

3 1 . 請求の範囲第 2 9項記載の結合物質のスク リーニング方法によ り得 られることを特徴とする、 結合物質。

3 2 . 下記の工程を含む、請求の範囲第 3 1項記載の結合物質と請求の範囲 第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチ ドとの結合活性調節物質のスク リ 一二ング方法、

( a ) 被検物質の存在下または非存在下、 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか 記載のポリぺプチ ドと請求の範囲第 3 1項記載の結合物質を接触させる工程およ び、

( b ) 該ポリペプチドと該結合物質の結合活性を、 被検物質の存在下と非存在下で比 較する工程。

3 3 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチ ドおよび 請求の範囲第 3 0項記載の結合物質を含むことを特徴とする、 結合活性調節物質 のスク リーニング用キッ ト。

3 4 . 請求の範囲第 3 3項記載のスクリーニング方法により得られることを特 徴とする、 結合活性調節物質。

3 5 . 下記の工程を含む、 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリ ぺプチドの発現調節物質のスクリーニング方法、

( a )請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドを発現しうる細胞 と被検物質を接触させる工程および、

( b ) 該ポリぺプチドの発現量の変化を、 請求の範囲第 2 0項または第 2 3項のいず れか記載の方法を用いて検出する工程。

3 6 . 請求の範囲第 3 5項記載の方法を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項から第 5項のいずれか記載のポリべプチドの発現調節物質のスクリーニング用 キッ ト。

3 7 . 請求の範囲第 3 5項記載のスクリーエング方法により得られることを特 徴とする、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドの発現調節物 質。

3 8 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチ ドをコー ドする D N Aを欠損または変異させた非ヒ トノ ックアウ ト動物。

3 9 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチ ドをコー ドする D N Aを発現または変異させた非ヒ ト トランスジヱニック動物。

4 0 . 請求の範西第 1 9項記載の抗体、 第 3 1項記載の結合物質、 第 3 4項 記載の結合活性調節物質または第 3 7項記載の発現調節物質を含有してなる医薬 組成物。

4 1 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチ ドから選 ばれる少なく とも 1 つを含有してなる医薬組成物。

4 2 . 請求の範囲第 7項から第 1 3項および第 1 5項のいずれか記載のポ リヌクレオチ ドから選ばれる少なく とも 1つを含有してなる医薬組成物。

4 3 . 神経変性疾患または糖尿病の治療剤である請求の範囲第 4 0項から 第 4 2項のいずれか記載の医薬組成物。

4 4 . 請求の範囲第 4 0項から第 4 3項のいずれか記載の医薬組成物を投与 することを特徴とする神経変性疾患または糖尿病の治療方法。