WO2004005510A1

WO2004005510A1 - 新規Nogo受容体様ポリペプチドおよびそのＤＮＡ

Info

Publication number: WO2004005510A1
Application number: PCT/JP2003/008469
Authority: WO
Inventors: Satoshi Orita; Atsuyuki Shimazaki; Toru Yanagimoto; Masatoshi Nakajima; Takeo Oshima
Original assignee: Shionogi & Co., Ltd.
Priority date: 2002-07-05
Filing date: 2003-07-03
Publication date: 2004-01-15
Also published as: JPWO2004005510A1; AU2003246254A1

Abstract

糖尿病モデルラットであるＺｕｃｋｅｒ　ｆａｔｔｙラットにおいて、食餌制限と運動により骨格筋で発現が増大するタンパク質としてＮｏｇｏ受容体様新規ポリペプチドを見出した。また、それに対応するヒトホモローグタンパク質を見出した。　本発明のポリペプチドは、糖尿病マーカーおよび糖尿病治療薬として有用である。さらに、本発明のポリペプチドは、脳内の大脳皮質で最も強く発現していることからアルツハイマー病などの神経変性疾患マーカーおよび神経変性疾患治療薬としても有用である。

Description

明細書新規 Nogo受容体様ポリぺプチ .ドおよびその D N A 技術分野

本発明は、 No go受容体と類似構造を有する、糖尿病発症および神経再生に関与する新規ポリぺプチド、該ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドに対する相補的ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドのリガンドおよび該ポリぺプチドを利用した物質のスクリ一二ング方法、並びに該ポリぺプチドおよび該ポリヌクレオチドの神経疾患および糖尿病マーカーとしての用途に関する。背景技術

食事による血中グルコース濃度の上昇は、その大部分がインスリン作用による肝臓、骨格筋および脂肪細胞でのグルコース取り込み活性の増加によって処理される。糖尿病は、インスリン分祕障害や作用が不足して血糖値が上昇した病態であるが、その原因の一つに、ィンスリン感受性の低下がある。すなわち、ィンスリンは適当量存在するが、骨格筋および脂肪細胞が十分な応答ができずグルコースが取り込まれない、ィンスリン抵抗性を示す状態である。また、過食と運動不足がインスリン抵抗性の原因としてあげられており、適度な運動により骨格筋におけるグルコースの取り込み能が増大して血糖値が改善されることが知られている（Mo l e cu l ar' Me d i c i ne, 38, 165 (2001) . ) 。インスリンが、骨格筋に作用すると、細胞質内の小胞に局在しているグルコース輸送体（G 1 u t 4)が細胞膜に移行してグルコースが取り込まれることが知られている（J ourna l of B i o l o gi cal Chemi s t ry, 268, 14523 (1993) . ) 。また、運動により、 Glut 4の発現量と細胞膜への移行量の増大が認められる（Mo l e c u l ar Med i c i ne, 38, 165 (2001) . ) 。

神絰再生に関与している No go (別名 vp 20)が Glut 4と同じ分铋小胞に存在していることが明らかになつている他、 Gl ut 4の細胞膜への移行に関与している分子は不明である (B i o chimi c a e t B i o phys i c a Ac t a, 1450, 6 8— 76 (1999) . ) 。したがって、インスリンが作用してから G 1 u t 4が細胞膜に移行するまでのシグナル伝達機能を解明することは、糖尿病治療薬の開発にとって重要であるが、その機構に関しては詳細な解析がされておらず、その解明が待望されていた。一方、損傷を受けた哺乳動物の中枢神経の修復再生は起こらないとされてきたが、最近になり、神経幹細胞が存在し神経も再生しうることが報告されつつあり、外傷、虚血、あ.るいはアルヅハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症など神経変性疾患における応用が期待される。神経変性疾患とは、神経細胞を中心とするさまざまな種類の退行性の変化であり、血管障害、感染、中毒のような明らかな原因がつかめない一群の神経疾患として定義されており、代表的な疾患としては、大脳皮質を犯すアルツハイマー病がある（実験医学、 19、 2256 (2001 ) . ) 。これまで、神経細胞の再生や軸索の進展に関与する分子は、いくつか報告されているが、その中でも、 No g 0および No g o受容体が重要な機能を有している（Nat ure, 18， 409 (2001) . ) 。すなわち、 No go が N o g o受容体と結合することにより神経細胞の軸索の伸長が阻害されているため、成人では再生が起こりにくく、胎児期では、 No goおよび No go受容体の発現が弱いため再生が起こりやすくなつているというものである（Neuron， 30, 1 1 (2001) . )。しかし、これらの分子の機能も含めて、神経細胞の再生の分子機能に関しては詳細な解析がされておらず、その解明が待望されていた。発明の開示

本発明は、神経疾患および糖尿病等の疾患の検出に有用な新規ポリぺプチドおよびポリヌクレオチドの提供を課題とする。さらに、当該ポリペプチド、作動薬およびその阻害剤を用いた、糖尿病および神経疾患の治療薬を提供する。本発明者らは、骨格筋におけるインスリン抵抗性に関与する新規遺伝子を単離することを目的として、鋭意研究を行なった結果、 No go受容体様新規ポリぺプチド（3 9 C 7) をコードする新規な遺伝子を見出した。更に研究を進めた結果、当該遺伝子の発現がインスリン抵抗性モデルラットの骨格筋において食餌制限と運動により発現が増大すること、ヒト組織において脳と骨格筋に特異的に発現していること、および脳内では大脳皮質で最も強く発現していることを見出し本発明のポリぺプチドおよびポリヌクレオチドが糖尿病および神絰変性疾患の検出および治療に有用であることを確認し本発明を完成させた。すなわち、本発明は、

( 1) 配列番号 2の 22位の Gl yから 441位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩；

(2) 配列番号 2の 1位の Me tから 44 1位の Ar gで表わされるアミノ酸配列を含有する（ 1) 記載のポリペプチドまたはその塩；

(3) 配列番号 4の 22位の S e rから 445位の Ar gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩；

(4) 配列番号 4の 1位の Me tから 445位の Ar gで表わされるアミノ酸配列を含有する（3) 記載のポリペプチドまたはその塩；

(5) 上記（1 ) から（4) のいずれか記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加から選択される少なくとも 1つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩；

(6) 糖尿病マーカ一、神経変性疾患マーカー、糖尿病治療薬、あるいは神経変性疾患治療薬として用いることを特徴とする上記（ 1) から（5) のいずれか記載のポリペプチド；

(7) 上記（ 1 ) から（6) のいずれか記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；

(8) 配列番号 1の 1 Ί 4番目の Gから 1 43 3番目の Cで表わされる塩基配列を含有する上記（ 7 ) 記載のポリヌクレオチド；

(9) 配列番号 1の 1 1 1番目の Aから 1 43 3番目の Cで表わされる塩基配列を含有する上記（ 7 ) 記載のポリヌクレオチド； ( 1 0) 配列番号 3の 1 Ί 0番目の Aから 144 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有する上記（7) 記載のポリヌクレオチド；

(1 1 ) 配列番号 3の 1 0 7番目の Aから 144 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有する上記（7) 記載のポリヌクレオチド；

( 1 2) 上記（7) から（ 1 1 ) のいずれか記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイプリダイズするポリヌクレオチド；

(1 3) 上記（7) から（ 1 2) のいずれか記載のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド；

(1 4) 糖尿病マーカー、神絰変性疾患マーカー、糖尿病治療薬あるいは神経変性疾患治療薬として用いることを特徴とする上記（7) から（ 1 1) および（ 1 3) のいずれか記載のポリヌクレオチド；

(1 5) 配列番号 1または 3記載の塩基配列中の連続した 5から 6 0塩基と同一配列を有するオリゴヌクレオチド、該ォリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびそれらの誘導体ォリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチド； (1 6) 上記（7) から（ 1 3) のいずれか記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一；

(1 7) 上記（ 1 6 ) 記載の組換えべクタ一で形質転換させた形質転換体；

(1 8) 上記（ 1 7 ) 記載の形質転換体を培養する工程、および産生された上記（ 1 ) から（5) のいずれか記載のポリペプチドを培養液から回収する工程、を含有する該ポリぺプチドまたはその塩の製造法；

( 1 9) 上記（ 1) から（5) のいずれか記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体； (2 0) 下記の工程を含む、上記（ 1 9) 記載の抗体を用いることを特徴とする、上記（ 1) から（5) のいずれか記載のポリペプチドの検出または定量方法、

(a) ポリペプチドと該抗体とを接触させる工程および、

(b) ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程；

(2 1 ) 上記（20)記載の方法を用いることを特徴とする、請求項 1から 5のいずれかに記載のポリぺプチドが閧連する糖尿病または神経変性疾患の検出方法。 (22) 上記（20)記載の方法を用いることを特徴とする糖尿病または神経変性疾患の検出用キット；

(23) 下記の工程を含む上記（7) から（13) または（15) のいずれか記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（1) から（5) のいずれか記載のポリぺプチドの mRN Aの検出または定量方法、

(a) mRN Aと該ポリヌクレオチドを接触させる工程および、

(b) mRNAと該ポリヌクレオチドの結合を検出する工程。

(24) 上記（23) 記載の方法を用いることを特徴とする、（1) から（5) のいずれか記載のポリぺプチドが関連する糖尿病または神経変性疾患の検出方法；

(25) 上記（23)記載の方法を用いることを特徴とする、糖尿病または神経変性疾患の検出用キット；

(26) 上記（23) 記載の方法を用いることを特徴とする、上記（1) から（5) 記載のポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現量の測定方法；

(27) 上記（23) 記載の方法を用いることを特徴とする、上記（1) から（5) 記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量の測定キット；

(28) 上記（7) から（ 13) または（ 15) のいずれか記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（ 1) から（5) のいずれか記載のポリペプチドをコードする DN Aの転写または mRN Aの翻訳を促進または抑制する方法，·

(29) 下記の工程を含む、上記（1) から（5) のいずれか記載のポリペプチドの結合物質のスクリ一ニング方法、

(a)上記（1)から（5) のいずれか記載のポリペプチドと被検物質とを接触させる工程および、

(b) 該ポリペプチドと被検物質との結合を検出する工程；

(30) 上記（1) から（5)のいずれか記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、該ポリぺプチドの結合物質のスクリ一二ング用キット；

(31) 上記（29)記載の結合物質のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合物質； (3 2 ) 下記の工程を含む、上記（3 1 ) 記載の結合物質と上記（ 1 ) から（5 ) のいずれか記載のポリぺプチドとの結合活性調節物質のスクリーニング方法、

(a) 被検物質の存在下または非存在下、上記（1 ) から（5 ) のいずれかに記載のポリぺプチドと上記（3 1 ) 記載の結合物質を接触させる工程および、

(b) 該ポリぺプチドと該結合物質の結合活性を、被検物質の存在下と非存在下で比較する工程

(3 3 ) 上記（ 1 ) から（5 ) のいずれかに記載のポリペプチドおよび上記（3 0) 記載の結合物質を含むことを特徴とする、結合活性調節物質のスクリーニング用キット； (3 4) 上記（3 3 ) 記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合活性調節物質；

(3 5 ) 下記の工程を含む、上記（ 1 ) から（ 5 ) のいずれか記載のポリぺプチドの発現調節物質のスクリーニング方法、

(a) 上記（1) から（5) のいずれかに記載のポリペプチドを発現しうる細胞と被検物質を接触させる工程おょぴ、

(b) 該ポリペプチドの発現量の変化を、上記（20) または（23) のいずれか記載の方法を用いて検出する工程；

(3 6 ) ±IB (35) 記載の方法を用いることを特徴とする、上記（1) から（5) のいずれか記載のポリぺプチドの発現調節物質のスクリ一二ング用キヅト；

(3 7) 上記（35) 記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、上記（1 ) から（ 5 ) のいずれか記載のポリぺプチドの発現調節物質；

(3 8) 上記（ 1 ) から（5 ) のいずれか記載のポリペプチドをコードする DN Aを欠損または変異させた非ヒトノックァゥト動物；

(3 9 ) 上記（ 1 ) から（5 ) のいずれか記載のポリペプチドをコードする DN Aを発現または変異させた非ヒトトランスジエニック動物；

(4 0 ) 上記（ 1 9 ) 記載の抗体，（3 1 ) 記載の結合物質、（34) 記載の結合活性調節物質または（3 7) 記載の発現調節物質を含有してなる医薬組成物 ,·

(4 1 ) 上記（1 ) から（5 ) のいずれか記載のポリペプチドから選ばれる少なくとも 1 つを含有してなる医薬組成物；

(42) 上記（7) から（1 3) および（15) のいずれか記載のポリヌクレオチドから選ばれる少なくとも 1つを含有してなる医薬組成物；

(43) 神経変性疾患または糖尿病の治療剤である上記（40) から（42)記載の医薬組成物；

(44) 上記（40) から（43) のいずれか記載の医薬組成物を投与することを特徴とする神経変性疾患または糖尿病の治療方法；

に関する。図面の簡単な説明

図 1 ヒト 39 C 7ポリペプチドの構造を表した模式図である。

ァミノ配列の第 1位から第 21位が、予想されるシグナルぺプチド領域（SP； S i gn a 1 Pept i de)、第 22位から第 305位が No g o受容体のロイシンリッチリピ一ト領域 (LRR； Leuc i ne-r i ch r e eat doma in) と類似'注を有する 9つの領域で、ァミノ末端側から順に、 LRRNT (L e c i ne r i ch r e pea N-t ermi na丄 domai n)、 LRR— 1、 LRR— 2、 LRR— 3、 LRR— 4、 LRR— 5、 LRR— 6、 LRR— 7、および LRRCT (Lec i ne r i c h r e p e a C-t ermi nal doma i n) で表している。また、 414 位から 441位には、グルコシルホスファチジルイノシト一ルアン力一 (GPIアンカー）蛋白質と予想される構造を有している。図 2 ヒト正常組織における 39 c 7ポリぺプチド mRNAの発現量を表している。図 3 ヒト脳における 39 c 7ポリペプチド mRNAの発現量を表している。ヒト脳内の種々の領域におけるノーザンプロヅト解析を行い、全脳での 39 c 7ポリペプチド mRNAの発現量を 1とした相対的な発現量で示している。図 4 運動および食餌制限による r 3 9 c - 7の発現変動を示す図である。インスリン抵抗性モデルラヅト骨格筋における 3 9 c 7ポリペプチド m R N Aの発現変動の結果を示した図である。 T a q— M A Nを用いた定量 P C R解析を行い、ィンスリン抵抗性を示すモデルラヅトでの 3 9 c 7ポリぺプチド m R N Aの発現量を 1とした相対的発現量で示している。図 5 h39C7 強制発現細胞のゥエスタンブロットの結果を示す図である。図 6 h39C 7 強制発現細胞でのグルコース取りこみ能を示す図である。縦軸に CCPM/ DNA (ng)、横軸にインシュリン濃度（nM)を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明のポリぺプチドは、「配列番号 2に記載の 2 2位の G 1 yから 4 4 1位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」および「配列番号 2に記載の 1位の M e tから 4 4 1位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩」である。また、「配列番号 4に記載の 2 2位の S e rから 4 4 5位の A r g で表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」および「配列番号 4に記載の 1位の M e tから 4 4 5位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩」も包含する。「塩」としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、または酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが用いられる。本発明のポリぺプチドは、「配列番号 2または 4のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換または付加からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有するァミノ酸配列からなり、神経変性疾患マーカーあるいは糖尿病マ一力一であるポリぺプチドまたはその塩」も包含する。このポリぺプチドは神経変性疾患マ一力一あるいは糖尿病マーカーである。 1若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘 ■ 発法などにより欠失、置換または付加することができる程度の数のアミノ酸であり、 5 0個以下、好ましくは 3 0個以下、より好ましくは 2 0個以下、さらに好ましくは 1 0個以下のアミノ酸残基を意味している。さらに、本発明のポリペプチドは、欠失、置換または付加によっても生物学的活性を有しており、神経変性疾患マーカーあるいは糖尿病マーカーとしての機能を有するポリペプチドであり、配列番号 2または配列番号 4で表わされるアミノ酸配列と少なくとも 6 0 %以上の相同性を有するポリぺプチド、好ましくは 8 0 %以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは、 9 5 %以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。本明細書において「神経変性疾患マーカー」とは、神経変性疾患を検出するに使用される物質である。ある種の m R N Aまたはタンパク質が、神経変性疾患においてその発現が増加または減少する場合に、「神経変性疾患マーカ一」となりえる。「神経変性疾患」とは、神絰細胞を中心とするさまざまな種類の退行性の変化であり、血管障害、感染、中毒のような明らかな原因のつかめない一群の神経疾患である。「神経変性疾患」としては、アルヅハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症などが例示される。「神絰変性疾患マ一力一」は神経変性疾患を検出することができる物質であればよく、本発明のポリヌレクォチド、ポリペプチドおよび抗体などを使用することができる。「糖尿病マーカー」とは、糖尿病を検出するのに使用される物質である。ある種の m R N Aまたはタンパク質が、糖尿病においてその発現が増加または減少する場合に、「糖尿病マーカー」となりえる。本明細書において「神経変性疾患治療薬」とは、神経変性疾患を治療するのに用いられる物質である。本発明のポリペプチドが脳で大量に発現していることから、本発明のポリぺプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体などは各種神経変性疾患の治療に有用であると考えられる。「糖尿病治療薬」とは、糖尿病を治療するのに用いられる物質である。本発明のポリぺプチドが骨格筋で発現しており、運動および食餌制限により発現変動していることから、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体などは糖尿病性疾患の治療に有用であると考えられる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする DNAであり、本発明のポリヌクレオチドとしては「配列番号 1の 1 74番目の Gから 1 43 3番目の Cで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」、「配列番号 1の 1 1 1番目の Aから 1 433 番目の Cで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」、「配列番号 3の 1 Ί 0番目の Aから 1 4 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」または「配列番号 3の 1 0 7番目の Aから 144 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」が例示される。また、本発明のポリヌクレオチドには、「本発明のポリヌクレォチドとストリンジヱントな条件でハィブリダイズし、神絰変性疾患マーカ一であるか糖尿病マーカーであるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド」も包含される。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは「配列番号 1の 1 74番目の Aから 1 43 3番目の Cで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」または「配列番号 3の 1 Ί 0番目の Aから 1 44 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」である。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド」とは、本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダィゼーシヨン法、プラークハイブリダィゼ一シヨン法あるいはサザンプロヅトハイブリダィゼーシヨン法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、 0. 7〜 1. OMのNa C l存在下、 6 5 °C でハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1 ~ 2倍濃度の S S C (S a 1 i n e S o d i um C i t r at e ; 1 5 0 mM 塩化ナトリウム、 1 5 mM クェン酸ナトリウム）溶液を用い、 65°Cでメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダィゼーシヨンは、 M o 1 e c u 1 a r C l on i ng : A Lab o r a t o r y Manua l, S e c o nd Ed i t i o n ( 1 9 8 9) (Co l d S p r i ng Harbor Labo r at o ry Pre s s)、 Cur r ent P r o t o c o l s i n Mo l e cu l ar B i o l o gy (1994) (Wi l ey— I nt e r s c i enc e)、 DNA C l oni ng 1 ： C o r e Te chn i que s、 A Prac t i c al Appr o ach, S e c ond Ed i t i on (1 99 5 ) (O f or d Univer s i t y P r e s s ) などに記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダィズする配列からは、好ましくは、アデニン（A) またはチミン（T) のみのからなる配列は除外される。本明細書において「ハイプリダイズするポリヌクレオチド」とは、上記ハイプリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号 1または配列番号 3で表されるァミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは、 80 %以上の相同性を有するポリヌクレォチド、更に好ましくは、 95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。ここで、相同性は、例えば、 Al t s c hu 1ら（The J ourna l o f Mo l e cu l ar B i o l o y, 215, 403 - 410 (1990) . ) の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラム B LAS Tを用いることにより、スコアで類似度が示される。本発明のポリヌクレオチドは、「配列番号 1または 3に記載の塩基配列中の連続した 5から 60塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド」を包含する。その様なポリヌクレオチドは、配列番号 1または 3のいずれかに記載の塩基配列中の連続した塩基で、例えば、 5個、 8個、 10個、 12個、 15個、 20個、 25個、 30個、 40個、 50個、 60個などからなる塩基配列と同一配列のオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびその誘導体オリゴヌクレオチドも包含される。「誘導体オリゴヌクレオチド」としては、例えば、オリゴヌクレオチド中のりん酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合または Ν 3，一 Ρ 5，ホスホアミダイト結合などに変換された誘導体ォリゴヌクレオチド、リボースとりん酸ジエステル結合がぺプチド結合に変換された誘導オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5プロピオニルゥラシルまたは C一 5チアゾ一ルゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、オリゴヌクレォチド中のシトシンが C一 5プロピオニルシトシンまたはフエノキサジン修飾シトシンなど置換された誘導体オリゴヌクレオチド、 DN A中のリボースが 2，一0—プロピルリボースまたは 2 '―メトキシェトキシリボースなどで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどを挙げることができる。その様なポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子マ一カー、 PCR用のプライマー、ハイプリダイゼーシヨン用のプローブとして有用である。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだべクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体、該形質転換体を用いた本発明ポリペプチドの製造法が含まれる。また、ノックァゥト動物やトランスジエニック動物も本発明により提供される。これら改変動物は、ヒトを除く哺乳類であれば、いずれの動物でもよく、好ましくはマウス、ラット、ハムス夕一、モルモットなどの齧歯類が例示される。本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。

本明細書において「抗体」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、抗体の全部またはその断片、誘導体、結合体、修飾体なども包含される。好ましくは、本発明のポリぺプチドを認識する抗体であり、より好ましくは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体であり、さらに好ましくは単一特異的に認識する抗体である。そのような抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。本発明のポリぺプチドの「検出または定量」は、免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成することができる。そのような方法としては、えば、 EL I SA (Enzyme L i nked I mm u n o S o rb ent As s ay)法、 RlA (Rad i o I mmun o A s s a y )法、蛍光抗体法、ゥヱスタンプロット法、免疫組織染色法などが挙げられる。

本発明の抗体を用いて、糖尿病または神経変性疾患を検出することができる。本発明のポリベプチドは糖尿病のマーカーおよび神経変性疾患マーカーとなり得ることから、前述のポリぺプチドの検出または定量と同様に、適切な免疫学的測定方法を用いることにより達成することができる。

本発明はまた、本発明の抗体を含むことを特徴とする糖尿病および/または神経変性疾患の検出用キットに関する。このキットは、少なくとも本発明の抗体および標準試薬として本発明のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの m R N Aの「検出または定量」は、 m R N Aの測定を行う分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いることにより達成することができる。そのような方法としては、例えば、ノーザンハイブリダィゼ一シヨン法、ドットプロット法、 R T — P 法などが挙げられる。

本発明のポリぺプチドの m R N Aを測定することにより、糖尿病および/または神経変性疾患を検出することができる。本発明のポリぺプチドは糖尿病マ一カーおよび神経変性疾患マーカーとなり得ることから、前述の m R N Aの検出または定量と同様な分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いることにより達成することができ、ノーザンプロヅト法、ドットブロット法または P C R法などが例示される。

本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部または全部を標準試薬として含む、糖尿病および/または神経変性疾患の検出用キヅトに関する。本発明のポリヌクレオチドは、糖尿病マーカーおよび zまたは神経変性疾患となり得ることから、前述の糖尿病または神経変性疾患の検出方法に基づき、ポリヌクレオチドを分子生物学的に測定することができる。本発明のポリぺプチドの m R N Aを測定することにより、本発明のポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現量を測定することができる。遺伝子が発現して、 m R N Aに翻訳されることから、前述の m R N Aの検出または定量と同様な分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いることにより達成することができ、ノーザンブロット法、ドットブロヅト法または P C R法などが例示される。

本発明は、本発明のポリペプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの一部または全部を標準試薬として含む、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量測定キットに関する。本発明のポリぺプチドの m R N Aは本発明のポリぺプチドをコードする遺伝子が翻訳されることにより発現することから、前述の m H N Aの検出または定量方法に基づいて m R N A を分子生物学的に測定することができる。本発明のポリヌクレオチドを用いて、； D N Aの転写または m R N Aの翻訳を抑制することができる。本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列中の連続した 5から 6 0個の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよび誘導体オリゴヌクレオチドなどを適宜調製し、当該分野で周知なアンチセンス R N A/D N A技術を用いて、このポリぺプチドの D N Aの転写または m R N Aの翻訳を抑制する方法を提供することができる。本発明はまた、本発明のポリペプチドの結合物質に関する。「結合物質」とは本発明のポリぺプチドまたはポリヌクレオチドに結合する任意の物質をいう。このような結合物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが挙げられる。

本発明の「結合物質のスクリーニング方法」は、当技術分野で公知となっている技術を適宜適応することにより行うことができ、バイオアツセィおよび結合ァッセィなどが例示.される。

本発明の「結合物質のスクリーニング用キット」には、少なくとも本発明のポリぺプチドまたはその一部、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部が含まれる。このキットを用いて、前述の本発明の結合物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。本発明はさらに、「結合活性調節物質」に関する。「結合活性調節」とは、本発明のポリぺプチドと本発明の結合物質との結合活性を増強あるいは減少させることを意味し、「結合活性」は、 P er c ent Maximum B i n d i n g (P MB ) により評価される。「結合活性調節物質」とは、本発明のポリペプチドと本発明の結合物質との結合活性を増強あるいは減少させる物質であり、このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが挙げられる。

本発明の「結合活性調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリーニング方法により本発明の結合活性調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアツセィおよび結合ァッセィなどが例示される。

本発明の「結合活性調節物質のスクリーニングキット」には少なくとも本発明のポリぺプチドまたはその一部、ポリヌクレオチドまたはその一部などが含まれてる。本発明のキヅトを用いて、前述の結合活性調節物質をスクリーニング方法に基づき、結合活性調節物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。また、本発明は、「発現調節物質」に関する。発現量とは、目的の細胞などにおいて、本発明のタンパク質または mRN Aが発現される量を意味する。発現量は、本発明の抗体を用いた、例えば、 EL I SA法、 RIA法、蛍光抗体法、免疫組織染色法方法などの免疫学的測定方法などを含む適切な方法により本発明のタンパク質を測定することまたは本発明の mRN A測定方法、例えば、ノ一ザンブロヅトハイプリダイゼーション法、ドヅトプロヅト法、 RT— P CR法などの分子生物学的測定方法により本発明のポリべプチドの mRNAを測定することにより評価することができる。「発現調節」とは、上記の免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリぺプチドのタンパク質または mRN Aレベルでの発現量を増加または減少させることを意味する。「発現調節物質」とは上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される、本発明のポリぺプチドのタンパク質または mRNAレベルでの発現量を増加または減少させる物質であり、このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリぺプチドなどが例示される。本発明の「発現調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリーニング方法により本発明の結合活性調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアツセィおよび結合ァッセィなどが例示される。

本発明の「発現調節物質のスクリーニングキット」には少なくとも本発明のポリぺプチドまたはその一部、ポリヌクレオチドまたはその一部などが含まれてる。本発明のキットを用いて、前述の発現調節物質をスクリーニング方法に基づき、発現調節物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。本発明の「医薬組成物」とは、少なくとも、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、結合物質、結合活性調節物質または発現調節物質を含有していればよく、特定の疾患、例えば、神経変性疾患、糖尿病などの予防または治療に用い得る。

本発明の「治療方法」とは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドが関連する特定の疾患、例えば、神経変性疾患、糖尿病などを治療するための方法であって、本発明の医薬組成物を投与することによって治療することができる。以下に本発明ポリヌクレオチドの調製、本発明ポリペプチドの調製、組換えベクター、形質転換体、製造方法、抗体、本発明ポリペプチドの定量方法、免疫学的検出方法、 m R N A の定量方法、 m R N Aの翻訳抑制方法、結合物質、結合物質スクリーニング方法、結合活性調節物質、結合活性調節物質スクリーニング方法、発現調節物質、発現調節物質スクリー二ング方法、スクリーニング用キット、ノックアウト動物、トランスジエニック動物、神経変性疾患または/および糖尿病の検出方法、遺伝子検出用キヅト、医薬組成物について説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技術、発現タンパク質の分離精製法、分析法および免疫学的手法が採用される。

( 1 ) 本発明のポリヌクレオチドの取得脳および骨格筋由来のラット組織、または、脳および骨格筋のヒト組織より、常法により cDNAライブラリーを作製する。

cDNAライブラリ一作製法としては、 Mo 1 e cu 1 ar Cl oni ng rA La bo rat ory Manua l, S e c ond Ed i t i on (1989) (Co l d S r i ng Harbor Laborat ory Pr e s s)や Cur r ent Pr o t o c o l s i n Mo l e cu l ar B i o l o gy (1994) (Gr e e n Pub l i s hi ng As s o c i at e s and Wi l ey— I nt er s c i enc e) 、 DNA C l on i n 1 ： C o r e Techni que s、 A P r a c t i c a l Appr o ac h, S e c ond Ed i t i on (1995) (O f o rd Uni ver s i t y P r e s s )などに記載された方法、あるいは市販のキヅト、例え ίま、 Sup ers c r i pt P l a smi d S s t em f o r c D N A Synt he s i s and P l a smi d C 1 o n i n g (インビトロジェン社製）や ZAP— cDNA Synt he s i s K i t s (ストラタジーン社製）などを用いる方法が挙げられる。

本発明の DNAの両末端に E c o R Iリンカ一を付与した後、クローニングベクター、例えば、 pSport 1 (インビトロジェン社製）の E c o R Iサイトに揷入する。本発明のプラスミドを用い、 E. c o l i Elect r oMAX DH10B (インビトロジェン社製）を形質転換して c D N Aライブラリーを作製する。作製した c D N Aライブラリ一より目的とする DNAを含むクローンを以下の方法で選択する。

上記で作製した cDNAライブラリ一より、常法または市販のキット、例えば、 QIAG EN P l a smi d Max i K i t (キアゲン社製）などを用いた方法によりプラスミドを調製する。

上記で調製した cDNAライブラリーから No g oのアミノ酸配列と相同性を有するァミノ酸配列をコードする DN A断片を有するプラスミドを選択する。そのような DN A断片は、各 No go受容体のアミノ酸配列がよく保存されている領域を 2ケ所以上見出し、該領域のアミノ酸配列をコードする DNA配列に対応する縮重プライマーを設計し、 P o 1 ym er a s e Chai n R e a c t i o n ( P C R) 法により増幅することで得られる。縮重プライマーの作製方法は、 P CR P r ime r： A Lab o rat o ry Man ua l (1 995) (Co l d S r i n Harbor Laborat o ry P r e s s) 、ザ 'プロトコールシリーズ「cDNAクローニング」（ 1996 ) (井上純一郎、仙波憲太郎編；羊土社）および S c i enc e, 241, 42 (19.88) . などに記載の方法が挙げられる。 P CR法は Mo 1 e c u 1 a r Cl oni ng :A Labo r a t o r y Manua l, S e c ond Ed i t i on (1989) (Co l d S p r i ng Harb or Labo r at o ry Pre s s)および PCR Pro t o c o l s ( 1989 ) (Ac ademi c P r e s s ) などに記載の方法が挙げられる。このようにして P CR法で増幅した DNA断片を適当なプラスミドに揷入し、サブクローニングする。サブクローニングは、増幅した D N A断片をそのままあるいは制限酵素や D N Aポリメラーゼで処理した後、常法によりプラスミドベクターに組み込むことにより行うことができる。そのようなベクターとしては、 pB lue s c r ipt I I SK (十）、 pB lue s cr i pt I I SK-, pPCR-S c r i pt Amp (ストラ夕ジ一ン社製） pD I RECT (Nuc r e i c Ac i d s Re s e ar ch, 18, 60 69 ( 1990 ) . ) pT 7 B 1 u e (ノバゲン社製）、 p CRI I (インビトロジェン社製）、 p CR— TRAP (ジーンハンター社製）、 pNoTAT7 (Eppendor f 5 pr ime社製）などが例示できる。

サブクローン化された P CR増幅断片の塩基配列をスクリーニングすることにより、既知の N o g o受容体のアミノ酸配列とホモロジ一を有するが、完全には一致しないアミノ酸配列をコードする D N A断片を選択することができる。塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガーらのジデォキシ法（P r o c e e d i n g s of t he Nat i onal Academy of S c i enc e s USA, 74, 5463 ( 1977 ) . )あるいは 373 A DN Aシークェンサ一（アプライドバイォシステムズ社製）などの塩基配列分析装置で解析することができる。このようにして選択した DN A断片をプローブとし、上記で作製した cDNAライブラリーに対して、コロニーハイブリダィゼ —シヨンやプラークハイブリダィゼ一シヨンなどのハイブリダィゼーション解析を行うことにより、既知の No g o受容体とホモロジ一を有するポリぺプチドをコードする cDNA を取得することができる。プローブは、該 DNA断片を³² Pなどの放射性同位体、ジゴキシゲニン（d i gox i genin)、西洋ヮサビペルォキシダーゼなどの酵素などで標識したものを使用することができる。ハイブリダィゼーシヨンは、通常用いられる方法、例えば、 Mo l e cu l ar C l on i ng :A Lab orat o ry Manual, S e c ond Ed i t i on (1989) (Co l d Spr ing Harb o r La bo rat o ry Pr e s s) などに記載の方法で行うことができる。

ハイプリダイゼーシヨンにより取得された cDNA断片をそのままあるいは適当な制限酵素で消化した後、常法によりプラスミドベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガーらのジデォキシ法（P r o c c e e d i n g s o f t he N at i ona l Ac ademy o f S c i enc e s USA, 74, 5463 (1 977 ) . ) あるいは 373 ADNAシークェンサ一（アプライドバイォシステムズ社製）などの塩基配列分析装置を用いて塩基配列を分析することで目的とする DNAを取得することができる。このようにして取得される DNAとして、例えば、配列番号 2で表されるポリべプチドをコードする DNAなどが挙げられ、具体的には、配列番号 1で表される塩基配列を有する D N Aを挙げることができる。配列番号 1の DN Aを含むプラスミドとしては、例えば、後述の実施例に記載したプラスミドをあげることができる。

得られた DNAを適当な発現ベクターに組み込み発現プラスミドを構築し、該発現べクタ一を適した宿主に導入することにより形質転換体を得ることができる。該発現べクタ一としては、該 c DNAを組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいずれでもよく、そのようなベクターとして p c DNA 1. 1、 pcDNAl . 1/Amp、 pCDM8、 pR E P (インビトロジェン社製）、 pHM6、 pHB 6 (ロシュダイァグノスティヅクス社製 ) 、 pKK223— 3、 pGEX (アマシャムバイオテク社製）、 pET— 3、 pET- 1 l、 pB lue s c r i pt I I SK ( + ) , pB lue s cr i pt l l SK (—） (ストラ夕ジーン社製）、 pUC 1 9、 pTrxFus (インビトロジェン社製）、 pUC 1 18、 p S T V 28 (宝酒造社製）、 pMAL—c2X (New England Bio Labs社製）、 pAGE 107 (Cy t ot e c hno l o gy, 3 (2) , 133— 1

40 ( 1990) . ;特開平 3— 22979) 、 p AGE 1 03 (The Journa l o f B i o c hemi s t ry, 10 1 (5 ) , 1307 - 13 10 ( 1987 ) . ) 、 p AMo、 p AMo A (T h e J ourna l o f B i o l o gyca l Che mi s t r y, 268 (30) , 22782-22787 (1993) . ) 、 pAMoPR

5 A (特開平 5— 336963) 、 p AS 3 - 3 (特開平 2— 227075)などを用いることができる。該発現べクタ一の宿主への導入方法としては; DN Aを導入する方法であればいずれの方法も用いることができる。宿主が動物細胞である場合、エレクトロポレーシヨン法（Cy t o t e chno l ogy, 3 (2) ， 133 - 140 (1990) . ) 、リン酸カルシウム法（特開平 2— 227075 ) 、リポフエクシヨン法（P r o c e e d i n g s of t he Nat i o na l Ac ad emy of S c i enc e s USA, 84, 74 13 ( 1987 ) . ； Vi l o l o gy, 52, 456 (1973) . ) に記載の方法が例示される。

宿主としては発現ベクターに対応する適当な細胞または組織を用いることが可能で、例えば、動物細胞などが挙げられる。宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞の Nama lwa (バーキットリンパ腫、 ATCC： CRL— 1432) およびそのサブライン Nama lwaKJM— l、 HCT— 15 (ヒト大腸癌細胞、 ATCC : CCL— 225)、サル由来株細胞の C 0 S— 1 (アフリカミドリザル腎細胞 (SV40形質転換細胞）、 ATCC : CRL— 1650) および CO S— 7 (アフリカミドリザル腎細胞（SV40形質転換細胞）、 ATCC ： CRL- 1651) 、ハムスター由来株細胞の CHO— K 1 (チャイニーズハムスター卵巣細胞、 ATCC : CCL— 61)および HBT 5637 (特開昭 63 - 299 ) などが例示される。本発明の形質転換体は、当該分野において周知慣用の常法により培養する。形質転換した宿主に適した培地を用いて行うことができ、培養に使用される培地としては液体培地が適当である。具体的には、 MEM培地（S c i enc e, 130, 432 (1959) . ) 、 D 一 MEM培地（Vi r o l o gy, 8, 396 ( 1 959 ) . ：) 、 RPMI 1640培地（ The J ourna l o f t he Ame r i c an Me d i c a l As s o c i at i on, 199 , 5 1 9 (1 967) · ) 、 YT培地、 B EM培地などが用いられる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、 MEM培地、 D-ME M培地、 R P I M培地などにゥシ胎児血清（ F C S ) を適量添加したものなどが用いられる。必要により発現ベクターのプロモーターの転写活性を高めるために、転写活性を促進する物質を含んでいてもよく、例えば、イソプロピル一 1—チオー^一 D—ガラクトピラノシン（I PTG) などを用いることができる。

培地には形質転換体が生育するのに必要な栄養素、例えば、グルコース、アミノ酸、ぺプトン、ビタミン類、ホルモン類、血清、好ましくは、 FCS、塩化カルシウム、塩化マグネシゥムなどが含有されており、その様な培地であればどのような組成の培地でも用いることができ、市販されている培地も用いることができる。培養は pH 6. 0~ 8. 0、 25〜4 0°C、 5% C0₂存在下などの条件で行う。所望の DN Aは No g o受容体が有する神経細胞の軸索伸展活性を指標にし、該形質転換体によって産生されたタンパク質をスクリーニングすることによって選択することができる。神経細胞の軸索伸展活性とは、神経細胞の軸索の成長円錐の形態変化をもたらし、該細胞の軸索の伸展を抑制させる活性を指す。該活性は、例えば、顕微鏡による神経細胞の形態学的観察や、成長円錐の分化マーカー、例えば、 GAP 43 (CELL, 83， 269 -2 78 (1995) .、 S c i enc e, 199, 542-544 (1978) . ) の発現量を測定することにより検出することが可能である。以上のようにして、脳および骨格筋由来のラット組織、または、脳およ骨格筋由来のヒト組織より、神経細胞の軸索伸展に関与する No g o受容体活性を有する新規ポリぺプチドをコードする DN Aを取得することができる。また、上記方法で取得した； DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズする： DNA を選択することにより、配列番号 2記載のァミノ酸配列と比較して、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加から選ばれる少なくとも 1つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードする DNAを取得することができる。即ち、非ヒト動物、例えば、マウス、ラヅト、ゥシ、サルなど由来の c D NAライブラリーに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする D N Aを選択することにより、目的の DNAを取得することができる。

スクリーニングされた新規] Sf o go受容体ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、該ポリぺプチドをコードする DN Aを化学合成することによつても目的の DN Aを調製することができる。 DN Aの化学合成はりん酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、ホスホン酸エステル法などの方法により行うことができが AB I 392 (アプライドバイオシステムズ社製）などの市販の市販の合成機器を用いて行うこともできる。

また、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマ一およびアンチセンスプライマーとして用い、これら DN Aに相補的な mRN Aを発現している細胞の mRN Aから調製した c D NAを錶型として、 P CRを行うことによつても、目的とする DNAを調製することができる。

(2)本発明のポリペプチドの製造本発明のポリペプチドは、 Mo 1 e c u 1 a r C I

0 n i n g : A Lab orat ory Manua l, S e c ond Ed i t i on ( 1989) (Co l d Spr ing Harb or Laborat o ry Pre s s

)や Cur r ent Pro t o c o l s i n Mo l e cul ar B i o l ogy (

1994) (Wi l e y-I nt er s c i enc e) などに記載された方法を用い、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞中で発現させ、製造することができる。

本発明のポリぺプチドをコードする全長 DNAを基に、必要に応じて、該ポリぺプチドをコードする部分を含む適当な長さの： DNA断片を調製する。また、該ポリぺプチドをコ一ドする部分の塩基配列は、宿主の発現に最適なコドンとなるようにしたものを調製する。該 D N Aは該ポリぺプチドの生産率を向上させるうえで有用である。該 DN A断片または全長: D NAは適当な発現ベクターのプロモーターの制御下に揷入し、組換え体 DNA (組換えべクター）を作製する。該組換えベクターはそれに適合した宿主に導入することにより、本発明のポリペプチドを産生する形質転換体を得ることができる。

宿主としては、大腸菌属などの原核生物、酵母などの単細胞真核生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などの多細胞真核生物など目的とする遗伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。発現ベクターは、宿主において自立複製または染色体中への組込みが可能で、新規 No g o受容体遺伝子の転写に適した位置にプロモ一夕一を含有しているものが用いられる。 (i) 原核生物を宿主として用いる場合

新規 No g o受容体遺伝子の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、新規 No go受容体遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモータ一を制御する遺伝子が含まれていてもよい。発現ベクタ一としては、例えば、 pHM6、 pHB 6 (ロシュダイァグノスティヅクス社製) 、 pKK223— 3、 p GEX (アマシャムバイオテク社製）、 pSE280、 p T r x F u s、 pUC 19 (インビトロジェン社製）、 pB lue s c r ipt I I SK (十）、 pB l ue s c r ipt I I SK 、一)、 pET Expre s s i on S ys t e m (ストラタジーン社製）、 pGEMEX— 1 (プロメガ社製）、 pQE— 8 (キアゲン社製）、 pMAL— c 2 X (N e w Engl and B i o 1 a b s社製）、 p K Y P 1 0 (特開昭 58— 1 10600 )、 pKYP 200 (Agr i c au 1 t u r a 1 B i o l ogyc a l Chemi s t ry, 45， 669 ( 1984) . ) _N p L S A 1 (A g r i c au l t ur a l B i o l o gyc a l Chemi s t ry, 53, 277 (1 9 89) . ) 、 pGEL l (Pr o c e ed i ngs o f t he Nat i ona l A cad emy o f S c i enc e s USA, 82, 4306 (1985) . ) , pE G400 (J ourna l o f Bac t er i o l o gy, 172, 2392 (1 99 0 ) . ) , p T e r m2 (特開平 3— 22979) 、 p P A 1 (特開昭 63— 233798 ) pTr s 30 (FERM B P - 5407 )、 p T r s 32 ( F E RM BP— 540 8) 、 p GHA2 (F E M BP— 400) 、 p GKA2 (FERM B - 6798) などを例示することができる。プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、 t r pプロモータ一（P t r p) 、 1 a cプロモー夕一（ P 1 a c；) 、 PLプロモーター、 PRプロモーター、 P S Eプロモーターなどの大腸菌やファージに由来するプロモーター、 SP01プロモーター、 SP02プロモーター、 p e nPプロモーターなどを挙げることができる。また、 Pt r>pを 2つ直列させた P t r x 2プロモーター、 t a cプロモ一夕一、 l acT 7、 1 e tプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。

リポソーム結合配列であるシャイン ·ダルガーノ（SD : Shi ne Da l garno )配列と開始コドンとの間を適当な距離、例えば 6~18塩基、に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。宿主としては、例えは *、 E s c h e r i c h i a属、 S e r r a t i a属、 B a c i 11 u s属、 Brevibact er iu m属、 Corynebact eri m属、 Mi c r o b a ct er ium属、 P s e ud omo n a s属などの原核生物が挙げられる。 Escheri c hia属として、 E. c o 1 iの XL 1— B lue株、 XL2— Blue株、 DH1株、 MC 1 000株、 KY3276株、 W1485株、 JM109株、 HB 101株、 No. 49株、 W3 110株、 NY49株、 BL21 (DE3)株、 B L 21 (DE 3) pLy s S株、 HMS 17 4 (DE 3)株および HMS 174 (D E 3 ) pLysS株などが、 S e r r a t i a属として、 S . f i car ia株、 S. f ont i cola株、 S. 1 i q u e f a c i e n s株、 S . ma r c e s c e n s株などが、 B a c i 11 u s属として、 B. subt i l i s株、 B. a my 1 o 1 i q u e f a c i e n s株などカ、 B r e v i b a c t e r i um属として、 B. a mm oniagene s株、 B . I mm ariophi l um (AT C C： 14068)株、 B . s ac charo lyt icum (AT C C： 14066)株などが、 Corynebact e r i um属として、 C. g l ut ami cum (ATCC : 1 30 32) 株、 C. g l ut a mi c um (AT CC ： 140 67) 株、 C. gu l ut ami c um (ATCC ： 1 38 6 9 ) 株、 C. a c e t o a c i d o p hi l um (AT CC : 1 387 0) 株などが、 Mi c r o b a c t e r i um属として、 M. a mm o ni aph i l um (ATCC ： 1 5 3 54) 株などが、 P s eud omo nas属として、 S . m e p h i t i c a株などが例示される。組換えベクターの導入方法としては、宿主へ DN Aを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法（Nu c 1 e i c A c i d s R e s e a r c h， 1 6 , 6 1 2 7 ( 1 9 8 8) . ) 、りん酸カルシウム法（P r o c e e d i n g s o f t h e Na t i o n a l A c a d em o f S c i e n c e s U SA， 6 9 , 2 1 1 0 ( 1 9 7 2) . ) 、プロトプラスト法（特開昭 6 3 - 24 8 3 9 42 ) 、 G e n e, 1 7 , 1 0 7 ( 1 9 8 2) . や M o l e c u l a r & G e n e r a l G e n e t i c s , 1 6 8 , 1 1 1 ( 1 9 7 9 ) . に記載の方法などがあげられる。

( i i ) 酵母を宿主として用いる場合

宿主として酵母を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、 YE p 1 3 (AT C C ： 3 7 1 1 5) 、 YE p 24 (AT C C : 3 7 0 5 1) 、 YCp 5 0 (AT C C ： 3 7 4 1 9 ) 、 pH S 1 9、 p HS 1 5などが挙げられる。

プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいずれのものでもよく、例えば、 ADH 1 (アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、 PH05 (酸性フォスファタ一ゼ）プロモーター、 PGK 1 (ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、 GAPDH (グリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ) プロモーター、 GAL 1 (ガラキトースキナ一ゼ) プ口モーター、 GAL 1 0 (UDPガラクトース 4—ェピメラーゼ）プロモーター、 MFa 1 (a フェロモン）プロモーター、 CUP 1 (メタ口チォネイン）プロモ一夕一などが挙げられる。宿主としては、例えば、 S a c c h a r o my c e s属、 S . c e r e v i s i a e種、 S c h i z o s a c c h a r omy c e s属、 S . p omb e種、 K l u yv e r omy c e s属、 K . l ac t i s種、 T r i c h o s p o r o n属、 T . pu l lu l ans種、 S c hwanni omyc e s属、 S . a l luvius種および P i c hi a属、 P. p a s t o r i s種などが挙げられる。

組換えべク夕一の導入方法としては、宿主に DN Aを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法（Me t ho d s i n Enzymo l o , 194, 182 (1 990) . ) 、スフエロプラスト法（Pr o c e e d i ng s o f t he Nat i ona l Ac ad emy o f S c i e nc e s US A, 84， 1929 (1978) . ) 、酢酸リチウム法（J our na l of Bac t er i o l o gy, 153, 1 63 ( 1983 ) . および P r o c e ed i ngs o f t he Nat i ona l Acad emy of S c i enc e s USA, 75, 1 929 ( 1978) . ) 記載の方法などが挙げられる。

(i i i) 動物細胞を宿主として用いる場合

宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、 p c DNA 1/Amp 、 p cDNA3、 pCDM8、 pRE P 4 (インビトロジェン社製）、 AGE 107 (C yt o t e c hno l o gy, 3, 1 33 (1990) . ) 、 p AGE 1 03 (The J o u r n a 1 o f B i o c hemi s t ry, 101, 1307 (1 987) . ) 、 p AMo, p AMo A (p AMo PR S A) (The Journa l o f B i o l o g y c a 1 Chemi s t r , 268, 22782-22787 ( 1993) . ) , p C LXSN, p CLNCX (IMGENE X社）、 p A S 3 - 3 (特開平 2— 22705) などを用いることができる。

プロモータ一としては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウィルス（hCMV) の I E (Ime d i at e— ear ly)遺伝子のプロモーター、 S V 40の初期プロモーター、モロニ一 ' ミュリン 'ロイケミア .ゥイレス（Mo l oney Mur i ne Leu l emi a Vi ru s)のロング.夕一ミナル ' リピート 'プロモーター（L o n g Te rmina l Re e at Pr om o t e r)、レトロウィルスのプロモーター、 H S Pプロモーター、 SR αプロモーターおよびメ夕ロチォネィンのプロモーターなどを挙げることができる。また、ヒト CMVの I E 遺伝子のェンハンサ一をプロモーターと共に用いてもよい。宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞の HEK293 (ヒト胎児腎細胞、 ATCC ： CRL— 1573) 、 HeLa (子宮頸部癌細胞、 ATCC : CCL— 2) HBT5637 ( 白血病細胞、特開昭 63— 299)、 BALL- 1 (白血病細胞）および H CT— 15 (大腸癌細胞）、マウス由来株細胞の S p 2/0— Ag 14 (マウス骨髄種細胞、 ATCC : CRL— 1 581) および N S 0 (マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞の C 0 S— 1 (ァフリカミドリザル腎細胞（SV40形質転換細胞）、 ATCC： CRL - 1650) および COS— 7 (ァフリカミドリザル腎細胞（SV40形質転換細胞）、 ATCC： CRL- 1651) 、ハムスター由来株細胞の CHO— K 1 (チャイニーズハムスター卵巣細胞、 ATCC： CCL-61)および BHK-21 (C- 13) (シシリアンハムスター仔腎細胞、 ATCC： CCL- 10) 、ラヅト由来株細胞の PC 12 (副腎褐色細胞腫、 ATCC： CRL- 1721) および YB 2/0 ( ラヅト骨髄種細胞、 ATCC： CRL- 1662) などを例示することができる。

組換えベクターの導入方法としては、宿主に DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法（Cy t o't e c hno 1 o gy, 3 , 133, (1990) . ) 、リン酸カルシウム法（特開平 2— 22705 ) , リポフエクシヨン法 (Pr o c ee d ings o f t he Nat i ona l Ac adem o f S c i enc e s, USA, 84, 7413 ( 1987) . 、 Vi l o l o gy, 52 , 456 (1973) . ) 。

(i v) 昆虫細胞を宿主として用いる場合

宿主として昆虫細胞を用いる場合、トランスファーベクターとしては、例えば、 pVL l 392、 pVL 1393、 pB lueBac I I I (インビトロジェン社製）などが、感染用ウィルスとしては、例えば、ョトウガ科昆虫に感染するバキュロウィルス（Va cu 1 o vi rus)Aut o grapha Ca l i f orni a nuc l ear p o 1 y h edr o s i s vi rus (AcMNPV) Bac-N-B lue DNAなどが挙げられる。昆虫細胞の形質転換の方法は、例えば、 Baculovirus Expre s s io n Vect or ： A Laborat ory Manual (1992) (W. H . Free man and Company) _Λ Mo lecul ar Cloning： A L a b o r a t o r y Manua l, Se cond Edit i on (1989) (Co ld S p r i n g Harbor Laborat ory Pres s) 、 Current Prot oc o l s in Mo lecular Biol ogy (1994) (Wi l ey— Int ers c i ence) 、 Bi oTechno l ogy, 6， 47 (1988) . などに記載の方法が用いれる。

昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含むトランスファーベクターおよび昆虫細胞への感染用のバキュロウィルス DN Aを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウィルスが昆虫細胞に感染することによりポリぺプチドを発現することができる。宿主に用いる昆虫細胞としては、 Spodopt era f r u g i p e r d a (ョトウガ）由来株細胞、 Tri choplus ia ni (イラクサキンゥヮバ）由来株細胞などが挙げられ、具体的には、 S. ： rug i per da由来細胞としては、 Sf 9 (ATCC： CRL- 1 711、卵巣細胞）、 S f 21 (卵巣細胞）などが、 T . n i由来細胞株としては、 Hi gh

Five, BT I -TN-5 B 1-4 (卵細胞）（インビトロジェン社製）などが例示される組換えベクターの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法（特開平 2— 22705 )、リポフエクシヨン法（P r o c ee d i ngs o f t e Nat i o na l Ac a c emy o i S c i ence s USA, 84, 7413 (1987) . ) などを挙げることができる。また、動物細胞と同様に、エレクト口ポレーシヨン法（Cyt ot e chno l ogy, 3, 1 33 ( 1990 ) . ) なども用いることができる。

(V) 植物細胞を宿主細胞として用いる場合

宿主として植物細胞または植物個体を用いる場合、公知の方法（組織培養， 20 (1 99 4) . 、組織培養， 2 1 (1995) .、 Trends i n B i ot e chno l o g y， 15、 45 ( 1997) . ) に準じてポリペプチドを生産することができる。発現べク夕一としては、例えば、 Tiプラスミド、タバコモザイクウィルスベクターなどを挙げることができる。遗伝子発現に用いるプロモータ一としては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV) の 3 5 Sプロモーター、ィネアクチン 1プロモーターなどを挙げることができる。また、プロモ一ターと発現させる遺伝子の間に、トゥモロコシのアルコール脱氷素酵素遺伝子のィントロン 1などを揷入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。宿主としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルフアルファ、亜麻などの植物細胞が例示される。

組換えベクターの導入方法としては、宿主に DN Aを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム（Ag r o b a c t e r i um)を用いる方法 (特開昭 59— 140885、特開昭 60— 70080、 WO 94/00977)、エレクトロポレーシヨン法（特開昭 60— 251887 ) 、パーティクルガン（遺伝子銃）法（特許第 2606856号、特許第 2517813号）などを挙げることができる。

(vi) 培養方法

本発明のポリぺプチドをコードする DNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞などの細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを産生 '蓄積させ、形質転換体または培養液より該ポリぺプチドを回収することにより、該ポリぺプチドを製造することができる。形質転換体が、動物個体または植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育または栽培し、該ポリペプチドを産生 '蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。 ' 宿主が動物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する非ヒトトランスジエニック動物を飼育し、該組換え体 D N Aのコードする新規 N o g o受容体活性を有するポリペプチドを該動物中に産生 ·蓄積させ、該動物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、新規 N o g o受容体活性を有するポリぺプチドを製造することができる。動物個体中の産生 ·蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵などを挙げることができる。宿主が植物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体 D N Aのコードする新規 N o g o受容体活性を有するポリぺプチドを該植物個体中に産生 ·蓄積させ、植物個体中から該ポリぺプチドを回収することにより、新規 N o g o受容体活性を有するポリペプチドを製造することができる。

宿主が大腸菌などの原核生物または酵母などの真核生物である場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体 D N Aのコードする新規 N o g o受容体活性を有するポリペプチドを培養液に産生 '蓄積させ、該培養液から該ポリペプチドを回収することにより、本発明のポリぺプチドを製造することができる。

本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従つて行うことができる。形質転換体が大腸菌などの原核生物あるいは酵母などの真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、ィーストェクストラクトおよび塩化ナトリゥムを含む Y T培地が好ましい。

炭素源としては、それそれの宿主が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物などの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニゥム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などを用いることができる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。培養方法は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件で行う。培養温度、培養時間および培養液の p Hは、各種宿主に適した範囲に設定し、通常 15~40°C、 5時間〜 7日間、 pH3. 0〜9. 0で培養を行う。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アル力リ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行うことができる。また、必要に応じて、アンピシリンゃテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。プロモ一ターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、 l a cプロモ一夕一を用いた発現べクタ一で形質転換した宿主を培養する場合、イソプロピル一^— D— チォガラクトビラノシドなどを、 t r pプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主を培養する場合、インドールァクリル酸などを培地に添加してもよい。形質転換体が植物細胞や組織である場合、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ .アンド .スク一グ（ MS)培地、 Wh i t e培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニンなどの植物ホルモンを添加した培地を用いることができる。形質転換体が動物細胞や組織である場合、培養する培地としては、一般に使用されている RPM I 1 640培地（T h e J ourna l of t he Ame r i c an Me d i c a 1 As s o c i at i on, 199, 5 19 (1967) . ) 、 MEM培地（S c i enc e， 130, 432 ( 1959) . ) _s D-ME M培地（Vi r o l o gy, 8 ， 396 (1959) . ) 、 199培地（Pro c ee d i ngs of t he S o c i e t y f or t he B i o l o gi ca l Med i c i ne, 73, 1 (1 95 0) . ) またはこれら培地に牛胎児血清（FCS) などを添加した培地などが用いられる。培養は、通常 pH6〜8、 25~40°C、 5% C 0₂存在下などの条件で 1〜 7日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ぺニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。

形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されている TNM - F H培地（ファーミンジェン社製）、 Sf — 900 I I S F M培地（インビトロジェン社製）、 ExCe l l 400、 ExCe l l 405 ( J R Hバイオサイエンシーズ社製）、 Gr a c e' s I ns e c tMed i um (Nat ure, 195， 788 ( 1962 ) . ) などを用いることができる。

(v i i) 製造方法

本発明のポリぺプチドは、形質転換体を培養し、培養液から本発明のポリぺプチドを単離 •精製することにより製造することができる。本発明のポリぺプチドの単離 ·精製方法は、当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、例えば、酵素の単離.精製方法や S a n d 1 e rらの糖転移酵素の精製方法（Me t ho d s in Enz ymo l o gy , 83， 458) を用いることができる。

本発明のポリぺプチドが溶解性ポリペプチドとして産生 ·蓄積される場合、上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離などの方法で細胞または菌体と培地に分離する。本発明のポリべプチドが宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞または菌体を S TE溶液などの適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミルなどで細胞または菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶液として得ることができる。本発明のポリぺプチドの分離 .精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム (S D S)や N—ラウロイルサルコシンナトリゥム (サルコシル）などを含んでいてもよい。

得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離 ·精製方法は自体公知の各種分離 ·精製方法を組合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸アンモウニゥムなどによる塩析法、透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過、ジェチルアミノエチル（DEAE) —セファロースクロマトグラフィー、 D I AI ON HP A- 75 (三菱化学社製）などのリジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィ一、 S— S ephar o s e FF (フアルマシア社製）などのリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、プチルセファロースなどの疎水性クロマトグラフィーゃァフィ二ティークロマトグラフィ一などの各種ク口マトグラフィ一法、 S D S -ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法などの各種電気泳動などが例示される。ァフィ二ティークロマトグラフィーは、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いることによつても行うことができる。本発明のポリベプチドが不溶性ポリぺプチドとして産生 ·蓄積される場合、上記同様に細胞または菌体を分離し、適当な方法により破碎後、該ポリペプチドを含む分画を回収する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム (SD S)や N—ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）などの界面活性剤などの可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈または透析し、該ポリべプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の分離 ·精製方法により精製標品を得ることができる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学， 13, 469— 474 (1995) . ) 。融合タンパク質に使用する付加タンパク質としてはプロティン A、： F LAGなどが例示される (.Pr o c e ed i ngs o f t he Nat i ona l Ac ad emy o f S c i enc e s USA, 86, 8227 ( 1989 ) .、 Gene sDeve l opm ent， 4, 1288 (1990) . 、特開平 5— 336963、特開平 6— 823021 ) 。プロティン Aを使用する場合、本発明のポリぺプチドとプロティン Aの融合タンパク質を生産し、ィムノグロプリン Gを用いてァフィ二ティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。 FLAGぺプチドを使用する場合、本発明のポリペプチドとと F LAGの融合タンパク質を生産し、抗 FLAG抗体を用いてァフィ二ティーク口マトグラフィーを行うことにより精製することができる。本発明のポリペプチドは、公知の方法に準じて、 i n V i t r o転写 ·翻訳系を用いてを生産することができる（ J o u r n a 1 o f B i omo l e c u l ar NM , 6 , 1 2 9 - 1 34 ( 1 9 95) . 、 S c i e nc e, 242 , 1 1 6 2 - 1 1 64 ( 1 9 8 8) . 、 The J o u rna l o f B i o c hemi s t r y, 1 1 0, 1 6 6— 1 68 ( 1 99 1) . ) 。

本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列を基に、 Fmo c法（フルォレニルメチルォキシカルボニル法）、 t B o c法（ t一ブチルォキシカルポニル法) などの化学合成法ゃ巿販されているペプチド合成機器、例えば、 APEX 39 6 (アドバンストケムテック社製）、 43 3 A (アプライドバイォシステムズ社製）、 P S 3 (プロテインテクノロジ一ズ社製 ) 、 9 0 5 0 (パーセプティブ社製）、 P S SM- 8 (島津製作所製）などのぺプチド合成機器をにより化学合成することができる。本発明のポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば、遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、 1 9 93年）に記載の方法により実施可能である。本発明のポリぺプチドの N o g o受容体活性は、公知の測定法 (The J o u rna l o f B i o l o gyc a l Chemi s t ry, 2 58, 9893 - 98 9 8 ( 1 98 3) . , The J our na l o f B i o 1 o g y c a 1 Chemi s t r y, 2 6 2, 1 5649 - 1 5 6 58 ( 1 987) . 、 Th e J o urna l o f B i o l o gy c a l Ch emi s t r y, 2 73 , 58— 6 5 ( 1 9 98) .、 The J our na l o f B i o l o gy c a l Chemi s t r y, 273, 43 3 -440 ( 1 99 8) . , The J our na l o f B i o l o gyc a l Chemi s t r y, 2 73, 1 27 70 - 1 2 7 78 ( 1 9 98) . 、 Ar chive s o f B i o c hemi s t ry and B i ophys i c s, 2 70, 630-646 (1989) . . Ar chive s o f B i o chemi s t r y and B i ophys i c s, 274, 14-25 (1 989) . , 特開平 6— 18 1759) に準じて測定することができる。

( 3 ) 変異型ポリぺプチドの作製方法

本発明ポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付力 Πは、 M o 1 e c u 1 a r Cl oni ng :A Lab orat ory Man ua l, S e c ond Ed i t i on (1989) (Co l d S r i n H a r b o r Labor at o ry Pr e s s. )、 Cur rent Pro t oc o l s i n Mo l e cu l ar B i o l o gy (1994) (Wi l ey— I nt er s c i e nc e) 、 Nuc l e i c Ac i d s Re s e ar c h, 10, 6487 ( 1 982 ) .、 Pro c ee d i ngs of t he Nat i ona l Academ o f S c i enc e s USA, 79， 6409 (1 982) . 、 Gene, 34， 3 15 ( 1 985) .、 Nu c l e i c Ac i ds re s ear c h, 13, 4431 (1985 ) .、 Pr o c e e d i ngs o f the Nat i ona l Ac ademy o f S c i enc e s USA, 82, 488 (1985) . , Pro c e edi ngs o f t he Nat i ona l Ac ademy o f S c i enc e s USA，81 , 5662 ( 1984) . 、 S c i e nc e, 224, 143 1 (1984) . 、 WO 8 5/00817、 Nat ur e, 3 1 6, 601 ( 1985 ) . などに記載の方法に準じて調製することができる。

(4) 本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製

(i) ポリクローナル抗体の作製

本発明のポリぺプチドの全長、その部分ぺプチドもしくはその部分ぺプチド含むポリぺプチドを抗原として哺乳動物に投与することで抗体を作製することができる。抗原は、それ自体でもよいが、担体、例えば、ゥシ血清アルブミン（B SA) 、スカシガイのへモシァニン (ke yho l e l imp e t h e m o c y a n i n； K L H)ゃ牛チログロブリン（ BTG) などに結合したものを用いてもよい。また、抗原による免疫反応を高めるために、例えば、フロイントの完全アジュバント（CFA) および不完全アジュバント（I FA) を投与してもよい。免疫に用いられる哺乳動物としてはマウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ハムスターなどを用いることができる。ポリクローナル抗体は、例えば、レーンらの方法（Ant i b o d i e s : A L a b o r a t o r y Manua l, S e c o nd E d i t i o n (1 989) (C o l d S p r i n g H a r b e r Lab o r a t o r y P r e s s ) )などに従って作製することができる。

哺乳動物に抗原を 1回目の投与後、 1~2週間毎に 3~1 0回投与することで免疫された哺乳動物を得て、それらの哺乳動物から血清を採取し、精製することで作製できる。該抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜 2週間おきに 3〜 1 0回行う。該抗原の投与量は 1回当たり動物 1匹に対し、 5 0~1 0 が好ましい。ペプチドを用いる場合は、適当な担体に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするぺプチドは、遺伝子ェ学的手法ゃぺプチド合成機で合成することができる。各投与後、 3〜 7日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法（酵素免疫測定法（ EL I SA法）：医学書院刊（ 1 976年）、 An t i b o d i e s ： A Lab o r a t o r y Ma nu a 1 , S e c ond E d i t i on ( 1 989) (C o l d S p r i n g Ha r o r L ab o r at o r y P r e s s )などに記載の方法で確認することができる。免疫された哺乳動物から採血し、抗体価を測定する。十分な抗体価が得られるまでに免疫された時点で採血し、血清を調製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。ポリクローナル抗体の分離、精製方法としては、遠心分離、硫酸アンモニゥムによる塩析、力プリル酸沈殿（An t i b o d i e s : A Laborat ory Manua l, S e c o n d Ed i t i on (1989) (Co l d S r i n Harb o r Lab orat ory Pr e s s)または DEAE—セファロ一スカラム、陰イオン交換カラム、プロティン Aカラム、 G—カラムあるいはゲル濾過カラムなどの各種クロマトグラフィーを単独または組み合わせることで行うことができる。

( i i ) モノクローナル抗体の作製

(a) 抗体産性細胞の調製

モノクローナル抗体は、（i)で十分な抗体価が得られたのち、それらの哺乳動物から脾臓またはリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。骨髄種細胞としては、マウスまたはラットから樹立した細胞株を用いる。細胞融合の方法は既知の方法で行うことができ、例えば、ケーラーとミルスタインの方法 (Nat ur e, 25 6, 495 - 497 ( 1975) . ) に従って作製することができる。

本発明のポリぺプチド、その部分ぺプチドもしくはその部分ぺプチドを含むポリぺプチドを投与して、十分な抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後 3〜 7日目に、抗体産生細胞として脾臓を摘出する。該脾臓を MEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセヅトでほく、し、 1, 200 r pmで 5分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈殿画分の脾細胞を Tr i s—塩化アンモニゥム緩衝液（pH7. 65)で 1~2分間処理し赤血球を除去した後、 MEM培地で 3回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる

(b) 骨髄腫細胞の調製

骨髄腫細胞としては、マウスまたはラッ卜から由来の株化細胞を使用し、そのような細胞として、例えば、 8—ァザグァニン耐性マウス（B ALB/c由来）骨髄腫細胞 P 3— X 6 3 A g 8— U 1株（以下、 P 3— U 1と略す）（Cu r r e n t Top i c s M i c r ob i o l o gyc a l Immuno l o gy, 81， 1 ( 1978) .、 Europ i an J o u r na l o f I mmuno l o gy, 6， 5 1 1 ( 1 9 7 6) . ) 、 S P 2/0— A g 1 4株（以下、 S P— 2と略す）（Nat ur e, 27 6、 2 6 9 ( 1 9 7 8 ) . ) 、 P 3— X 63— Ag865 3株（以下、 6 5 3と略す）（J o u r na l o f I mmuno 1 o gy, 123 , 1 548 ( 1 9 7 9) . ) 、 P 3 -X 6 3 -A 8 (以下、 X 6 3と略す）（Nat ur e, 2 5 6 , 49 5 ( 1 975) . ) などが用いることができる。これらの細胞株は、 8—ァザグァニン培地（ 1 5 g/ml 8—ァザグァニンを含む正常培地（ 1. 5 mM グルタミン、 5 X 1 0 -⁵ M 2一メルカプトエタノール、 1 0 g/m 1 ジェン夕マイシンおよび 1 0 % F C S (CS L社製）を含む RPMI 1 64 0培地））で継代し、細胞融合を行う 3〜4日前に正常培地で培養する。細胞融合には、そのようにして調製した細胞を 2 X 1 0⁷個以上用いる。

(c) ハイプリドーマの作製

(a) で調製した抗体産生細胞と（b) で調製した骨髄腫細胞を MEM培地または PB S ( 1 リットル当たり； 1. 83 gリン酸ニナトリウム、 0. 2 1 gリン酸一力リウム、 7. 6 5 gNa C 1, pH 7. 2) で洗浄し、骨髄腫細胞の細胞数に対し抗体産生細胞 5〜 1 0 倍になるよう混合し、 1 , 20 0 r pmで 5分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に対し抗体産生細胞 1 0⁸当たり、ポリエチレングリコール溶液（2 g ポリエチレングリコール一 1 0 0 0 (PE G— 1 00 0)、 2m 1 MEM培地、 0. 7ml ジメチルスルホキシド（DMSO) ) を 0. 2〜： 1 m 1を 3 7 °Cで攪拌しながら添加し、更に 1〜 2分間毎に M E M培地 1 ~ 2 m 1を数回添加する。 M EM培地で全量を 5 0mlになるように調製し、 9 00 r p mで 5分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。沈殿分画に HAT培地（正常培地、 10— ⁴M ヒポキサンチン、 1. 5 X 1 0 -⁵M チミジンおよび 4 X 1 0— ⁷M アミノプテリンを含む） 1 0 0mlを添加し、ゆるやかにほく、し懸濁する。

該懸濁液を 9 6穴培養用プレートの各六に 1 0 0 1穴ずつ分注し、 3 7 °C、 5 % CO ₂存在下で？〜 14日間培養する。酵素免疫測定法（Ant i b o d i e s ： A L ab o r a t o r y Manu a l, S e c o nd E d i t i o n (1 989) (C o l d S pr i ng Harbo r Lab o r at or y Pre s s) ) などに言 3載の方法で、培養上清に産生された抗体のうち、本発明のポリペプチドに特異的に反応する抗体を産生するハイプリドーマを選択する。 (5) 本発明ポリペプチドの免疫学的検出方法

本発明ポリぺプチドの免疫学的検出方法としては、該ポリぺプチドまたはその部分ぺプチドに対する抗体を直接または間接的に酵素、蛍光物質、放射性同位体、ラテックスなどに結合した標識体を用いることにより該ポリぺプチドまたはその部分ぺプチドを測定する方法が挙げられる。そのような測定方法として、例えば、西洋ヮサビペルォキシダーゼやアル力リフォスファタ一ゼなどの酵素標識により検出する EL I S A法や化学発光法、ルミノールや GFP (Gre en F luor e s c enc e P r o t e i n )などの蛍光標識を検出する F I TC法、 ¹²⁵ Iなどの放射性同位体標識を検出する R I A法、ラテックスに結合したラテックス凝集法などが例示される。

また、そのような測定方法として、ウエスタンブロット法および免疫組織染色なども例示される。

さらに、そのような測定方法を用いることにより本発明のポリぺプチドまたはその部分ぺプチドを定量することもできる。

(6) mRNAの定量方法

本発明のポリヌクレオチドより調製したォリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法または RT— P CR法により mRNAを定量することで本発明のポリぺプチドをコ一ドする： DNAの発現量を定量することができる。

正常あるいは疾患モデル動物、例えば、マウス、ラヅト、ゥサギ、ヒヅジ、ブ夕、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなどで mRNAを定量する場合、必要によってグルコースを投与し、一定時間経過後に、骨格筋、脳、血液、胃、腎臓などの臓器または組織を単離し、細胞を調製する。得られた細胞から当該分野で周知慣用の常法により mRNAを抽出し、 RT— P CR法やノーザンプロヅトハイブリダィゼーシヨン法などで mRNAを定量'解析することができる。

本発明のポリぺプチドもしくはその部分ぺプチドを発現する形質転換体からの mRNA を定量する場合も、該形質転換体から当該分野で周知慣用の常法により mRNAを抽出し、 RT— P CR法やノーザンプロヅトハイブリダィゼ一シヨン法などで mRN Aを定量'解析することができる。

(7) 遺伝子構造の同定

現在、多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録されている。したがって、本発明のポリヌクレオチド配列と、データベースに登録されてるヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、本発明のポリペプチドをコードするヒト染色体遺伝子を同定し、該遺伝子の構造を明らかにできる可能性がある。 cDNAの配列と一致する染色体遺伝子配列が登録されていれば、 cDN Aの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、本発明のポリぺプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、ェクソンおよびィントロン構造をスクリーニングすることができる。本発明のポリヌクレオチドをプローブとして、当該分野において周知慣用の常法（東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（1993年） . ）を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得することができる。

プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するすベてのプロモータ一領域が挙げられる。

(8) 糖尿病の検出方法

糖尿病検出方法としては、本発明のポリぺプチドの免疫学的検出方法により、本発明のポリぺプチドと反応する異なるェピトープを認識する 2種類の抗体のうち一方を直接または間接的に酵素で標識したものを用いるサンドィツチ E L I S A法や¹²⁵ Iなどの放射性同位体で標識した本発明のポリぺプチドと該ぺプチドを認識する抗体を用いる競合 R I A法などを挙げることができる。本発明のポリぺプチドは、糖尿病モデルラヅトの骨格筋においてその発現が低下しており、食事制限と運動により病態が改善されると、骨格筋における発現が回復することから、この検出法は糖尿病の検出に利用することができる。また、本遺伝子の多型を調べることにより、糖尿病の検出や予後の予測に利用できる。さらに、本遗伝子の多型と、本遗伝子が発現している臓器（脳、骨格筋）における疾患との関連を調べることにより、他の疾患の検出にも利用できる。本遺伝子の多型解析は、本遺伝子の遺伝子配列情報を用いて行うことができる。具体的には、サザンプロヅト法、ダイレクトシークェンス法、 P CR法、 DNAチップ法などを用いて遺伝子多型を解析することができる（臨床検査， 42， 1507— 1517 (1998) . 、臨床検査， 42, 1565 一 1570 (1998) . ) 。 (9) 神経変性疾患検出方法

神経変性疾患検出方法としては、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法により、本発明のポリペプチドと反応する異なるェピトープを認識する 2種類の抗体のうち一方を直接または間接的に酵素で標識したものを用いるサンドィツチ EL I S A法や¹²⁵ Iなどの放射性同位体で標識した本発明のポリぺプチドと該ぺプチドを認識する抗体を用いる競合 R I A法などを挙げることができる。本発明のポリペプチドは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の検出に利用することができる。

本発明のポリぺプチドは、脳で発現が上昇していること、本遺伝子の多型を調べることにより、神経変性疾患の検出や予後の予測に利用できる。 (10) 検出用キット

本発明のポリヌクレオチドは、ノーザンハイプリダイゼーション法または P C R法を用いたそれら神絰変性疾患および糖尿病の検出に利用することが可能である。また、本発明の抗体を用いて免疫学的手法によっても神経変性疾患および糖尿病の検出を行なうことができる。従って、ポリヌクレオチドを用いた検出の場合には、キット中には標識された本発明のポリヌクレオチドが含まれる。また、抗体を用いた検出の場合には、本発明の抗体の他に、標準抗原として本発明のポリペプチドが含まれる。更にキット中には標準曲線が含まれていてもよい。 (11) DNAの転写抑制および mRNAの翻訳抑制方法

本発明のポリヌクレオチドを投与することにより、本発明のポリぺプチドの生産を抑制することができる。即ち、本発明のポリヌクレオチドを用いて、本発明のポリぺプチドをコ一ドする DNAの転写の抑制、本発明のポリぺプチドをコードする mRNAの翻訳の抑制を行うことが可能である。

(12) 結合物質のスクリーニング方法

本発明のポリぺプチドまたはその部分ぺプチドは、本発明のポリぺプチドに結合するタンパク質や低分子物質などを探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリぺプチドもしくはその塩または本発明の部分ぺプチドもしくはその塩と被検物質とを接触させることを特徴とする本発明のポリぺプチドに対する結合物質のスクリーニング方法を提供する。被検物質としては、低分子化合物、タンパク質、ヒトまたはマウス、ラット、ブ夕、ゥシ、ヒヅジ、サルなどの哺乳動物の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。これらの被検物質を本発明のポリペプチドに添加し、結合活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。

具体的には、本発明の結合物質のスクリーニング方法は、本発明のポリぺプチドもしくはその部分ぺプチドを用いるか、組換え型ポリぺプチドの発現系を構築し、該発現系を用いた結合アツセィ系を用いるか、または本発明のポリぺプチドに結合して細胞刺激活性、例えば、 GAP 43 (Ce l l, 83, 269 - 278 ( 1995 ) . ) や神経細胞を用いた軸策伸展などを測定してスクリーニングすることができる。まず、結合物質のスクリーニング方法に用いるポリぺプチドとしては、上記した本発明のポリペプチドまたは本発明の部分ペプチドを含有するものであれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させたポリペプチドが適している。本発明のポリぺプチドを製造するには、前述の発現方法が用いられるが、該ポリぺプチドをコードする DNAを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部分をコードする DN A断片には、通常、相補: DNAが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成 DN Aを用いてもよい。本発明のポリべプチドをコードする; DN A断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該 DNA断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス（n u c 1 e a r p o l yhedro s i s v i r u s ; N P V)のポリヘドリンプロモーター、 S V 40由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、メタ口チォネインプ口モーター、ヒトヒ一トショヅクプロモーター、サイトメガロウィルスプロモー夕—、 s R aプロモ一夕一などの下流に組み込むのが好ましい。発現したポリペプチドの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、 T h e Journa l o f B i o l o gi c a l Chemi s t ry, 267， 19555〜； L 9559 (1 992) . に記載の方法に従って行うことができる。

従って、本発明の結合物質スクリーニング方法において、本発明のポリぺプチドもしくはその部分ぺプチドを含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したポリぺプチドもしくはその部分ぺプチドであってもよいし、該ポリべプチドを含有する細胞またはその細胞上清を用いてもよい。本発明の結合物質のスクリーニング方法において、本発明のポリペプチドを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。本発明のポリぺプチドを含有する細胞としては、本発明のポリぺプチドを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。細胞上清画分としては、細胞の培養上清に含まれる画分のことをいう。

本発明のポリペプチドまたはその塩に対する結合物質をスクリーニングするためには、適当なポリべプチド画分と、標識した被験物質が必要である。ポリぺプチド画分としては、天然型のポリぺプチド画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ポリぺプチド画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識した被験物質としては、 ³H、 ¹²⁵ I, ¹⁴C、 ³⁵Sなどで標識したタンパク質や低分子化合物などを挙げることができる。具体的には、本発明のポリペプチドまたはその塩に対する結合物質のスクリーニング方法を行なうには、まず本発明のポリぺプチドを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニング方法に適したバヅファーに懸濁することによりポリペプチド標品を調製する。バヅファ一には、 pH4〜： 10、好ましくは pH6〜8のリン酸緩衝液、 Tr i s— HC 1緩衝液などのリガンドとポリペプチドとの結合を阻害しない緩衝液であればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Tween— 80 (花王—アトラス社）、ジギトニン、デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンゃゼラチンなどの各種夕ンパク質を緩衝液に加えるもよい。さらに、プロテアーゼによる結合物質の分解を抑制する目的で PMSF、ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製）、ぺプス夕チンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 ◦ . 01〜 1 0mlの該ポリペプチド溶液に、一定量、好ましくは、 5000 c pm〜 500000 c pmの³ H、 ¹²⁵ I、 ¹⁴C、 ³ ⁵ Sなどで標識した被験物質を共存させる。非特異的結合量（NSB) を知るために大過剰の未標識の被験物質を加えた反応チューブも用意する。反応は 0°Cから 50°C、好ましくは4°Cから 37°Cで、 20分から 24時間、好ましくは 30分から 3時間で行なう。反応後、ガラス繊維濾紙などで濾過し、適量の同緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレ一シヨンカウン夕一あるいはァ—カウンターで計測する。全結合量（ B) から非特異的結合量（NSB) を引いたカウント（B— NSB)が 0 c pmを越える被験物質を本発明のポリぺプチドまたはその塩に対する結合物質として選択することができる。本発明のポリペプチドに対する結合物質をスクリーニングするためには、該ポリペプチドを介する細胞刺激活性、例えば、 GAP 43や神経細胞を用いた軸策伸展などを公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ポリぺプチドを含有する細胞をマルチウヱルプレートなどに培養する。結合物質のスクリーニングを行なうにあたっては前もつて新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な緩衝液に交換し、被験物質などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質、例えば、 GAP 43などの生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 ( 1 3) 結合物質スクリーニング用キヅト

本発明のポリぺプチドまたはその塩に結合する結合物質スクリーニング用キットは、本発明のポリぺプチドもしくはその塩、本発明の部分べプチドもしくはその塩、本発明のポリぺプチドを含有する細胞、または本発明のポリぺプチドを含有する細胞沈殿画分などを含有するものである。本発明の結合物質スクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。

(i) 結合物質スクリーニング用試薬

スクリーニング溶液および洗浄溶液として Hank' s B a l anc e d S a l t S o l ut i o n (インビトロジェン社製）に 0. 05%のゥシ血清アルブミン（シグマァルドリッチ社製）を加えたものを孔径 0. 45〃mのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保存したものまたは用時調製したもの。

(a) 本発明のポリペプチドを発現させた C HO細胞を、 1 2穴プレートに 5 X 1 0⁵個 Z 穴で継代し、 3 7°C、 s 5% C〇₂で 2日間培養したもの。

(b) 標識被検物質

市販の³ H、 ¹²⁵ I、 ¹⁴C；、 ³⁵ Sなどで標識した被検物質した溶液を 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、測定用緩衝液にて 1 zMに希釈するして用時調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、 DMSO、メタノールなどに溶解する。

(c) 非標識被検物質

標識物質と同じものを 100~1000倍濃度で調製したもの。 ( i i ) 測定法

(a) 12六組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現 C HO細胞を、測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各に加える。 ( b ) 標識被検物質を 5 Ad l加え、室温にて 1時間反応させる。非特異的結合量を測定ためには非標識被検物質を 5 1加える。

( c ) 反応液を除去し、 1 m 1の洗浄溶液で 3回洗浄する。細胞に結合した標識被検物質を 0 . 2 M N a O H ( 1 % S D Sを含む）で溶解し、 4 m 1の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製 ) と混合する。

( d ) 液体シンチレーシヨンカウンター（ペックマンコール夕一社製）を用いて放射活性を測定する。

( 1 4 ) 結合活性調節物質のスクリ一二ング方法

本発明のポリべプチドまたはその部分ペプチドは、本発明のポリぺプチドに結合する物質の結合活性を調節する物質を探索し、またはスクリーニングするための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチドもしくはその塩とその結合物質との結合活性を調節する物質と被験物質とを接触させることを特徴とする本発明のポリぺプチドとそれに対する結合物質の結合活性を調節する結合活性調節物質のスクリ一二ング方法を提供する。

被験物質としては、例えば、ヒトまたは哺乳動物、例えば、マウス、ラヅト、ブ夕、ゥシ、ヒヅジ、サルなどの組織抽出物、細胞培養上清ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などが用いられる。これらの被験物質を本発明のポリペプチドおよびその結合物質と共に添加し、結合活性などを測定しながら分画し、最終的に単一の結合活性調節物質を得ることができる。本発明のポリぺプチドまたは該ポリぺプチドを発現する組換え体発現系を構築し、バイオアツセィ系または結合ァヅセィ系を用いることによって、結合物質と本発明のポリぺプチドとの結合性を変化させる物質、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などまたはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。このような物質には、（a ) 結合物質と本発明のポリぺプチドとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、 G A P 4 3や神絰細胞を用いた軸策伸展を促進する活性または抑制する活性などの増強あるいは減少させる物質、（ b ) 結合物質と本発明のポリぺプチドとの結合力を増強する物質あるいは減少させる物質が挙げられる。

すなわち、本発明は、（i ) 本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたはそれらの塩と結合物質を接触させた場合および（i i ) 本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたはそれらの塩と結合物質および被検物質とを接触させた場合の結合物質の結合量を比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリべプチド、その部分ペプチドまたはそれらの塩との結合活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。

本発明の結合活性調節物質のスクリ一ニング方法は、（ i ) および（ i i ) の場合における、例えば、細胞刺激活性あるいは該ポリペプチドと結合物質との結合量などを測定して、比較することを特徴とする。具体的には、（a ) 標識した結合物質を本発明のポリペプチドなどに接触させた場合と、標識した結合物質および被検物質を本発明のポリぺプチドなど接触させた場合における、該ポリぺプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチドなどとの結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、（b ) 標識した結合物質を、本発明のポリぺプチドなどを含有する細胞または細胞培養液と接触させた場合および標識結合物質および被検物質を本発明のポリぺプチドなどを含有する細胞または本発明の細胞の沈殿画分に接触させた場合における、標識結合物質の本発明の細胞またはその沈殿分画に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリぺプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法、（c ) 本発明のポリヌクレオチドなどを含有する形質転換体を培養することによって細胞培養液に分泌したポリぺプチドなどと標識結合物質を接触させた場合および標識結合物質ならびに被検物質を接触させた場合における、該ポリぺプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリぺプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリ一二ング方法などが挙げられる。

( 1 5 ) 結合活性調節物質のスクリ一二ング用キット

結合物質と本発明のポリぺプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリー二ング用キットは、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドを含有する細胞または本発明のポリペプチドなどを含有する細胞培養液を含有するものなどである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。

( i ) 結合活性調節物質のスクリ一二ング用試薬

スクリーニング用溶液および洗浄用溶液として Hank' s Balanced Salt So lut ion (インビトロジェン社製）に、 0. 05%のゥシ血清アルブミン（シグマアルドリツチ社製）を加えたものを孔径 0. 45〃mのフィル夕一で濾過滅菌したものを、 4°Cで保存したものまたは用時調製したもの。

(a) 本発明のポリペプチド

本発明のポリペプチドを発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 10⁵個/^:で継代し、 37°C、 5% C0₂、で 2日間培養したもの。

(b)標識結合物質

市販の³ H、 ¹²⁵I、 ¹⁴C、 ³⁵ Sなどで標識した結合物質の溶液を 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、測定用緩衝液で希釈して 1 ΛίΜとなるよう用時調製する。

(c) 結合物質

標準結合物質を 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（シグマアルドリヅチ社製）を含む P B Sで 1 m Mとなるように溶解し、一20°Cで保存する。

(d)被験物質

水溶液状態のものを 4°Cあるいは— 2 CTCにて保存し、測定用緩衝液で希釈して 1〃 Mとなるよう用時調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、 DMSO、メ夕ノールなどに溶解する。

( i i ) 測定法

(a) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現 CHO細胞を、測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490〃 1の測定用緩衝液を各穴に加える。

(b) 1 0— ³~1 0_^{1 ()} の被検物質を5〃1加ぇた後、標識結合物質を 5 1加え、室温にて 1時間反応させる。非特異的結合量を測定するためには被験物質に代えて非標識結合物質を 5 1加えて同様の反応を行う。

( c ) 反応液を除去し、 1 m lの洗浄溶液で 3回洗浄する。細胞に結合した標識結合物質を 0 . 2 M N a O H ( 1 % S D Sを含む）で溶解し、 4 m 1の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製 ) と混合する。

( d ) 液体シンチレ一シヨンカウンター（ベックマンコールター社製）を用いて放射活性を測定する。

( 1 6 ) 発現調節物質のスクリ一二ング方法

本発明のポリヌクレオチドおよび抗体は本発明のポリぺプチドの発現を調節する低分子化合物やタンパク質などの物質をスクリーニングするための試薬として有用であり、免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法に用いることができる。すなわち、本発明は、本発明のポリぺプチドを発現する細胞または組織と被験物質を接触させ、本発明のポリペプチドの m R N A量ある tヽはタンパク質量を測定することで本発明のポリぺプチドの発現の増加または減少を測定することを特徴とする本発明のポリぺプチドまたは/および本発明のポリヌクレオチドの発現量を変化させる物質に対するスクリーニング方法を提供する。被験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などが用いられる。これらの被験物質を、本発明のポリペプチドを発現する細胞または組織、例えば、動物由来の血液、臓器、臓器から単離した組織もしくは細胞、本発明のポリペプチドを発現する組み換え体発現系を構築し、得られる形質転換体などの培養液に添加し、本発明のポリペプチドの m R N A量あるいはタンパク質量を測定しながら分画し、最終的に単一な発現調節物質を得ることができる。

( 1 7 ) 発現調節物質のスクリーニング用キット

本発明のポリぺプチドの発現調節物質またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドを含有する細胞、または本発明のポリペプチドを含有する細胞の沈殿分画などを含有するものである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。 ( 1 8 ) 免疫学的定量方法に基づくスクリーニング用キット

本発明のポリぺプチドの免疫学的定量方法としては、液相中で本発明のポリぺプチドに反応しェピトープが異なる 2種類の単一特異的な抗体を用いたサンドイッチ E L I S A法、本発明のポリぺプチドに特異的な抗体と^{1 2 6} Iなどの放射性同位体で標識した本発明のポリぺプチドを用いたラジオィムノアヅセィ法などが例示される。このような免疫学的定量方法に基づいたスクリーニング用キットは発現調節物質のスクリーニング用キットとして有用であり、キット中には、本発明の抗体の他に、標準抗原として本発明のポリペプチドが含まれる。更にキット中には標準曲線が含まれていてもよい。 ( 1 9 ) 分子生物学的定量方法に基づくスクリーニング用キット

本発明のポリヌクレオチドの分子生物学的定量方法としては、本発明のポリヌクレオチドあるいはそれから調製したォリゴヌクレオチドを用いたノーザンハイブリダイゼーション法、 P C R 法などが例示され、それらの方法により本発明のポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現量を m R N Aレベルで定量することができる。このような分子生物学的定量方法に基づいたスクリ一二ング用キヅトは発現調節物質のスクリーニングに有用であり、キット中に本発明のポリヌクレオチドぁるいはそれらから調製したォリゴヌクレオチドなどが含まれる。具体的には、（ i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラヅト、ゥサギ、ヒヅジ、ブ夕、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなどに対して、薬剤、例えば、抗糖尿病薬などなどを投与し、一定時間経過した後、血液、特定の臓器、例えば、脳、胃、腎臓など、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドの mRN Aは、例えば、当該分野において周知の抽出方法により mR N Aを抽出し、例えば、 T a q M a n P C Rなどの手法を用いることにより定量することができ、公知の手段によりノザンプロヅト法を用いることにより解析することもできる。（i i ) 本発明のポリぺプチドもしくはその部分ぺプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれる本発明のポリべプチドまたはその部分ペプチドの m R N Aを同様にして定量、解析することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドを用いて、ノザンハイプリダイゼ一シヨン法や P CR法などにより本発明のポリぺプチドの mRNA発現量の定量を行うことができる。また、ポリヌクレオチドを用いた検出の場合には、キット中には標識された本発明のポリヌクレオチドが含まれる。 (i) スクリーニング用試薬

(a) スクリーニング用溶液および洗浄用溶液として Hank' s Balanced Sal t So lut ion (インビトロジェン社製）に、 0. 05 %のゥシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製）を加えたものを孔径 0. 45〃mのフィルターで濾過滅菌したものを、 4°C で保存したものまたは用時調製したもの。

(a) 本発明のポリペプチドを発現する細胞

本発明のポリペプチドを発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X I 0⁵個/穴で維代し、 37°C、 5% C0₂、で 2曰間培養したもの。，

(b) プライマー

本発明のポリヌクレオチドを特異的に増幅するセンスプライマーおよびァンチセンスプラィマ一をそれそれ設計し、 DNA合成機（アプライドバイオシステムズ社製）で合成する。

(c)被験物質

水溶液状態のものを 4 °Cあるいは一 20°Cにて保存し、測定用緩衝液で希釈して 1〃Mとなるよう用時調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、 DMSO、メタノールなどに溶解する。

( i i ) 測定法

(a) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現 CHO細胞を、測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加える。

(b) 10— ³〜10— ¹⁽⁾Mの被検物質を 5〃1加え、室温にて 1時間反応させる。被験物質によらない発現量を測定するためには被験物質を加えていないもので同様の反応を行う。

(c) 反応液を除去し、 1mlの洗浄溶液で沈殿を 3回洗浄する。細胞から mRN Aを抽出し、プライマ一を用いて TaqManPCR (アプライドバイォシステムズ社製）により mRNA発現量を定量する。

(20) 非ヒトノックァゥトおよび非ヒトトランスジェニヅク動物の作製

本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを用い、目的とする非ヒト動物、例えばゥシ、ヒヅジ、ャギ、ブ夕、ゥマ、ニヮトリ、マウス、ラヅトなどの胚性幹細胞（embryoni c s t emc e 11)において染色体上の本発明のポリペプチドをコードする DNAを、例えば、 Na t ur e, 326 (6110) ， 295 (1987) .、 Ce l l, 51 (3) , 503 (19 87) . などに記載の公知の相同組換えの手法により、 Nature、 350 (6315) , 2 43 (1991) . などに記載のような不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる。

このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、非ヒト動物の受精卵の胚盤胞（bias t c s t) への注入キメラ法または集合キメラ法などの手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキヌラ個体を作成することができる。該キメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上の本発明のポリペプチドをコードする DNAに任意の変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体を得ることができる。

このようにして動物個体において、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする D N Aの任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする D N Aの翻訳領域中への塩基の置換、欠失、揷入などの変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。

また、その発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性などを改変させることも可能である。さらに、 Cr e— 1 oxP系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。このような例として、脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、該領域での目的遺伝子欠失（Cel l, 87 (7) ， 1317 (1996) . )や C reを発現するアデノウイルスを用いて、目的の時期に臓器特異的な目的遗伝子欠失（Sci ence, 278, 5335 (1997) . ) などが知られている。従つて染色体上の本発明のポリペプチドをコードする DNAについてもこのように任意の時期や組織で発現を制御または任意の欠失、置換、付加をその翻訳領域や、発現制御領域に有する非ヒトノックアウトまたは非ヒトトランスジエニック動物を作製することが可能である。

このようなノックァゥトおよびトランスジヱニック非ヒト動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、本発明のポリべプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。従って、本発明のノックアウトおよびトランスジヱニック非ヒト動物は、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬などの評価用モデルとして非常に有用である。

( 2 1 ) 医薬

本発明の抗体、結合物質、結合調節物質または発現調節物質を含有する医薬は、治療薬として該物質単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などが挙げられる。

経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば、乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、ォリーブ油、大豆油などの油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、スト口べリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、プドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、旨肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などが挙げられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該物質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製する。担体として具体的には、乳糖、グリセリンなどが例示される。該物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質またはその塩とは、結合物質、結合活性調節物質および発現調節物質であり、具体的には、（ a ) 結合物質と本発明のポリペプチドとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、 G A P 4 3や神経細胞を用いた軸策伸展を増強あるいは減少させる物質、（b )結合物質と本発明のポリペプチドとの結合活性を増強あるいは減少させる物質、あるいは（c ) 本発明のポリペプチドの発現量を増強あるいは減少させる物質である。該物質としては、低分子化合物、ペプチド、タンパク、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよく、天然物質または非天然物質の何れでもよい。本発明のポリペプチドなどに対するァゴニストは、本発明のポリペプチドなどに対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、該結合物質活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。本発明のポリぺプチドなどに対するアンタゴニストは、本発明のポリぺプチドなどに対するリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、該結合物質活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。リガンドと本発明のポリぺプチドとの結合力を増強する物質は、本発明のポリぺプチドなどに対するリガンドが有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。リガンドと本発明のポリぺプチドとの結合力を減少させる物質は、本発明のポリぺプチドなどに対するリガンドが有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。また、本発明のポリぺプチドの発現量を変化させる物質を含有する各種疾病の予防および/または治療剤本発明のポリべプチドは前述のとおり、例えば、糖代謝や神経再生など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。従って、本発明のポリペプチドまたはその部分ぺプチドの発現量を変化させる発現調節物質は、本発明のポリペプチドの機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤として用いることができる。該物質を本発明のポリぺプチドの機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該物質は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該物質を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤 l¾Sに従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖や補助薬を含む D—ソルビトール、 D—マンニトール、塩化ナトリウムなどの等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール、プロピレングリコールゃポリエチレングリコ一ルなどのアルコール類、ポリソルベート 8 0や H C O— 5 0など非ィオン性界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、上記予防 '治療剤は、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロ力インなどの無痛化剤、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなどの安定剤、ベンジルアルコール、フエノールなどの保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトゃラヅト、マウス、ゥサギ、ヒッジ、プ夕、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなどの哺乳動物に対して投与することができる。該物質またはその塩の 1回の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば体重 60k の糖尿病患者ゃ神絰変性症患者においては、一般に一日につき約 0 · 1 ~ 1 00 mg、好ましくは約 1. 0~50mg、より好ましくは約 1. 0〜 20 m gであり、非経口的に投与、例えば、注射剤の場合は、例えば体重 60kgの糖尿病患者や神経変性症患者においては、一般に一日につき約 0. 0 1~3 Omg程度、好ましくは約 0. l~20mg程度、より好ましくは約 0. 1~1 Omg程度を静脈注射により投与する。他の動物の場合も、体重 kg当たりに換算した量を投与することができる。投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人 1日当たり 10〃g〜8mg/kgである。実施例

以下実施例を示す。遺伝子操作的手法として、特に断らない限り Mo l e cu l ar C 1 o n i n g： A Lab o r at o ry Manua丄, S e c o nd Ed i t i o n (1 989) (C o l d S p r i ng Har b o r L ab o r a t o ry P r e s s) に記載された方法を用いた。実施例 1

DNAチップを用いた Z u c ke r F a t t yラヅトの遺伝子発現解析

Z u cke r F a t 七 yラヅトの脳、骨格筋および肺から、 T R I z o 1 R e a ge nt (インビトロジェン社製）を用い、添付のマニュアルに従って全 RNAを調製し、全 R NA 300〃gを得た。得られた全 RNAを Qu i ckPr ep Mi c r o mRNA Pur i f i c at i on Ki t (アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のマニュアルにしたがってポリ（A) +RNAを調製した。 Superscript Cho i c e Syst em (インビトロジェン社製）を用いてポリ（A) + R N Aからクローニング用 c DN A断片を調製した。

ポリ（A) +RNA5〃gを 01 igo (dT) 丄 ₂ i ₈ P r i me rおよび S u p e r S c r i p t I I RTを用いてファーストストランド c DNAを合成し、 E. col i DNA p o 1 yme r a s eおよび E . c o 1 i RNas e Hを用いてセカンドストランド c D N Aを合成した。得られた cDNAを T4 DNA P o 1 ym e r a s eで処理し、平滑末端をもつ cDNAを生成した後、 E c oR I (Not I ) A d a p t e rを T 4 DNA 1 i gas eを用いて 5' および 3' 両末端に付加した。アダプターを付加した c DNAは T 4 p o lynuc leot ide kinas eを用いて 5 ' 末端をりん酸ィ匕した後、 S i z e S e p 400 S un Co lmns (アマシャムバイオサイエンス社製）で約 40 Obp以上の cDNA断片を回収した。ベクター p 1 a smi d p S p o r t 1 (インビトロジェン社製）を制限酵素 E c o R I (宝酒造社製）で処理し、 T4 polynucleot ide kinaseを用いて 5，末端をリン酸化した後、 T4 DNA L i gas eを用いて得ら 'れた cDNA断片を組み込んだ。得られた組換えプラスミド DNAをエタノール沈殿後、 TE緩衝液（10mM Tr i s-HCl, pH8. 0, 1 raM E D T A) 20〃 1に溶解し、エレクトロポーレーシヨン法（Nu c 1 e i c Ac id Res earch, 16， 6127 ( 1 988) . ) により E 1 e c t r oMAX D H 10 B (インビトロジェン社製）に導入し形質転換体を作製した。形質転換体を S . 0. C . 培地（インビトロジェン社製） 1 m 1中、 37 °Cで 1時間培養し、 10 O ^g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布し、 37 °Cでー晚培養した。その結果、 cDN Aライプラリーとして約 1000万個（揷入率 95%) のアンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。得られた形質転換体のコ口ニー約 20000個から P C R法により c D N A断片を調製した。得られた cDNA断片は: DYEnami c ET Dye Termina t or Ki t (Me gaBACE) (アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のマニュアルに従って、 Me gaBACE 500 DNA Analys i s Sys t em (ァマシャムバイオサイエンス社製）により cDNA断片の全塩基配列を決定した。 cDNAの配列情報は CHI PSpac e (日立ソフトウェアエンジニアリング社製）を用いて解析することにより重複のない 5000種類の cDN Aクローンを選択した。これらのクローンを D N Aチップ作製システム M i c r o a r r a y S ys t em Gene r at i o n I I I Sp ot t er (Mo l e cul ar Dynami c s社製）を用いて、 T y p e 7スライドグラス（アマシャムバイオサイエンス社製）にスポットして DNAチップを作製した。この DN Aチヅプを用いて、肥満を伴うインスリン抵抗性モデルラヅトである Zucker Fat tyラヅト（Journal of He r e d, 52, 275 -278 (1961) . ) での遺伝子発現変動解析を実施した。食餌制限（30%摂餌量制限処理）および運動（週 5日間のトレヅドミル処置）を実施した Zucker Fat tyラヅトより骨格筋を摘出して T R I z o 1 Rea gent (インビトロジェン社製）を用い、添付のマニュアルに従って全 RNAを調製した。得られた全 RNAを Qu i c kP r e p Mi c ro mRNA P u r i f i c at i on Kit (アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のマニュアルにしたがって po l y (A) +RNAを調製した。精製した RNAを用いてプローブを作製した。 po l y (A) +RN A 0. 5〃gをサンプルとし、 Random 9me r、 o 1 i g o (d T) p r i me rをァニールさせた後、 S u p e r S c r i p t I I R T (インビトロジェン社製）を用いて C y— 3 (1〇？または〇ー5 dCTP (アマシャムバイオサイエンス社製）を取り込ませ cDN Aを蛍光標識した。さらに GFX P CR DNA and Ge l Band Pur i f i c at i on Ki t (アマシャムバィォサイエンス社製) を用いて標識 c DN Aを精製し、プローブとして用いた。プローブは、 Aut omat ed Slide P r o c e s s o r (アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて DNAチップとのハイブリダィゼ一シヨンを実施した。ハイプリダイゼーシヨンは Ty p e 7スライドのプロトコールに従い、前処理の後にプローブと 48 °Cで 12時間行った。ノヅファーには Hyb r i d i z a t o n Buf f er Ve r . 2 (アマシャムパイォサインス社製）を用いた。洗浄後、 Mi c r o ar r ay Sys t em Gene rat i o n I I I S c anner (Mo l e cu l ar D y n a m i c s社製）により読み取りを行い、解析コンピューターソフト A r r a y Vi s i on (Mo l e cu l ar D y nam i c s社製）および G ene Spr i ng (シリコンジエネテックス社製）を用いてデ —夕解析を実施した。その結果、コントロ一ルラヅトと比較して食事制限および運動によりィンスリン抵抗性が改善しているラヅトにおいて発現の上昇が認められたクローンとして 39C7を見出した。実施例 2

o g o受容体と相同性を有する新規ポリべプチド（39 C 7 )をコ一ドする G D N Aのクローニング

実施例 1で得られた 39 C7 cDNA断片を含むプラスミドを制限酵素 E c oR I (宝酒造社製）で消化し、 QIAqui ck Ge l Ext ract ion Kit (キアゲン社製）を用い添付のマニュアルにしたがって cDNA断片を得た。該 cDNA断片 5 Ongを Red i rimer I I DNA Labe l l ing S y s t em (アマシャムノィォサイェンス社製）を用い添付のマニュアルに従って、 [α— ³² P]dCTP (6000 Ci/mmo l, 2 OmC i/ml) (NEN社製）で³² Pで標識した。 ³² P標識した c D N A断片をプローブとして用いコロニーハイプリダイゼーシヨン解析を行った。ヒト脳 cDN Aライブラリー（クロンテック社製）あるいはラット脳 cDNAライブラリー（クロンテック社製）を 50枚の LBプレートにプレート当たり約 1 X 10⁴コロニーとなるように塗布し、 37 °Cでー晚培養してコロニーを形成させた。そのようにして得られたコロニーを； DNAプロヅティング用ナイロン膜 Hyb ond— N (アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した後、溶解溶液（10% SDS) 、変性溶液（0. 5N NaOH、 1. 5M N a C 1 ) 、中和溶液（ 0. 5M T r i s— HC1、 pH7. 0 (1. 5M N a C 1を含む） ) および 2 x S S Cで順次処理し、風乾した。転写した DNAは該ナイロン膜に紫外線照射することにより膜上に固定した。上記で調製した標識プローブを Exp r> e s s Hy b Hybridi zat ion So l ut i on (クロンテック社製）に添加し、該溶液に DNAを固定したナイロン膜を浸し、 65 °Cで 16時間ハイプリダイゼーションを行なった。ハイプリダイゼーション後のナイ口ン膜を 2 XSSC (20 X S S C： 3M NaCl、 0. 3M クェン酸ナトリゥム、 pH7. 0) で室温にて 5分、 1 X S S Cで 50°Cにて 30分、 0. 5 x S S Cで室温にて 5分洗浄後、風乾した。次いで、このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フィルム社製）共にイメージングプレートカセット（富士写真フィルム社製）に装着し、オートラジオグラフィーを行った後、ィメージアナライザ一 FLA3000 G (富士写真フィルム社製）で画像解析を行った。シグナルが検出されたコロニーについて単一クローンが得られるまでコロニーハイブリダィゼーシヨンを繰り返し行った。得られた単一クローンコロニーから QIAprep S in Minipr ep K i t (キアゲン社製）を用いてプラスミド DNAを調製し、； DYEnami c ET D e Terminat or Kit (Me gaB ACE) (アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のマニュアルに従って、 Me gaB ACE 500 DNA Ana 1 s i s System (アマシャムバイオサイエンス社製）により全塩基配列を決定した。その結果、ヒト cDNAライブラリ一より 441個のアミノ酸よりなるポリペプチド（配列番号 2 ；以下、 h39 C7) をコードする c DNA断片（配列番号 1 ) を含む cDNAを得た。またラヅト cDNAライブラリーより 445個のアミノ酸よりなるポリペプチド（配列番号 4；以下、 r 39 C 7) をコードする cDNA断片（配列番号 3 ) を含む cDNAを得た。ヒトとラットの cDN Aは塩基レベルで 86%、アミノ酸レベルで 86%の類似性を有していた。 h39 C7はアミノ酸配列の第 1位から第 21位力予想されるシグナルぺプチド領域（SP ; S i gna l Pept i de)、第 23位から第 305位が N o g o受容体のロイシンリツチリピ一ト領域（LRR ;Leuc ine— r i ch re peat domain) と類似性を有する 9つの領域で、ァミノ末端側から順に、 LRRNT (L e c i ne r i ch r ep e at N-t e rminal doma i n) 、 L R R— 1 、 LRR—2、 LRR - 3、 LRR— 4、 LRR— 5、 LRR - 6、 LRR— 7、および L RRCT (Le c ine r i c h re eat C-t e rmi nal doma i n ) で表しており、カルボキシ末端は GP I (ダルコシルホスファチジルイノシトール）アンカーモチーフ構造を有していた（図 1) 。 LRRは蛋白質間相互作用に関与する機能がある (Journa l o f Mo l e c ul ar B i o l o gy, 277, 51 9, (1 9 98) . ) 。また、 GP Iアンカーモチーフ構造は細胞膜上で、細胞膜との結合に関与する機能がある（蛋白質 '核酸 .酵素， 44, 1321 (1 999) . ) 。以上のことから、 h 39 C 7は細胞膜受容体として機能していると推定される。既知の遺伝子との類似性を検討したところ、ヒトの N o g o受容体と 41 %の相同性を有していた。 No go受容体とのァミノ酸配列比較のための至適ァラインメントは、遺伝子情報処理ソフトウェアである GENET YX (ソフトウエア社製）を用いて、 Lipman— Pear so n法（Sc ience, 22 7, 1435- 1441 (1985) . ) により実施した。実施例 3

ヒト正常組織における 39 C 7mRNAの発現

実施例 2で得られた h 39 C 7をコードする cDNAを含むプラスミドを制限酵素 E c oR I (宝酒造社製）で消化し、 Q I Aqu i ck Ge l Extract ion K i t (キアゲン社製）を用い添付のマニュアルにしたがって h 39 C7を含む cDNA断片を得た。得られた cDNA断片 5 Ongを Red ipr ime I I DNA Label l ing Sys t em (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用い添付のマニュアルに従って、 [α— ³² P] dCTP (6000 Ci/mmol, 20mCi/ml) (NEN社製）で³² Pで標識した。このようにして調製した³² P標識 c D N A断片をプローブとして用いノーザンプロット解析を行った。

上記で調製した標識プローブを Exp r e s s Hyb Hybridizat ion So l ut i on (クロンテツク社製）に添加し、該溶液に MT Nプロヅトメンブレン（クロンテヅク社製）を浸潰し、 65°Cで 16時間ハイブリダィゼーシヨンを行なった。ハイブリダィゼ一ション後のナイロン膜を 2XSSC (20XSSC： 3M NaC l、 0. 3M クェン酸ナトリウム、 pH7. 0) で室温にて 5分、 1 33〇で50°〇にて30分、 0. 5XSSCで室温にて 5分洗浄後、風乾した。次いで、このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フィルム社製）共にイメージングプレートカセット（富士写真フィルム社製）に装着し、オートラジオグラフィーを行った後、イメージアナライザー FLA 3000 Gで画像解析を行た。

その結果、 h 39 C 7の mRNAは、約 5 kbの大きさで、脳および骨格筋での発現が観察された（図 2) 。実施例 4

ヒト脳における 39 C 7 mRNAの発現

ヒト脳において発現が高いことから、脳内領域における当該遺伝子の発現量の違いについて、 Human Mu l t ip l e T i s sue Expr e s s i on Array (クロンテック社）を用いて解析した。このドット 'プロット膜はヒト脳の種々の領域に由来するポリ A— RNAをナイロン膜にスポットしたものである。このナイロン膜を、 0. 5M りん酸バッファー（pH 7. 2) 、 1 % ゥシ血清アルブミン（B S A) 、で 1時間、予備ハイプリダイゼ一シヨンを行った。次に、実施例 3で取得した h 39 C 7 cDNA断片（配列番号： 1) 50 ngを、 [ひ—³² P]dCTP ( 6000 C i/mmo 1 , 20 mC i/m 1) (NEN社）を用いて R e d i p r i me I I DNA Labe l l i ng S y s t em (アマシャムパイォサイエンス社製) を使用して、その処方に従い³² P標識した。 ³² P標識当該遺伝子 cDNA断片をプローブとして同パヅファーに加えた液にナイロン膜を移し、 65°〇で1 6時間ハイブリダィゼーシヨンを行った。引続きこのナイロン膜を 2 X S S Cで室温で 5分濯いだ後、 1 X S S Cで 50°Cで 30分、 0. 5 330で50°( で 30分洗浄した。風乾後このナイ口ン膜をフジ写真フィルム社のイメージング 'プレートに密着させ、同社イメージ 'アナライザー F L A3000 Gで画像解析を行った。各シグナルの強度を解析し定量化した。その結果、脳において高度な精神機能に関与している大脳皮質 (側頭葉、頭頂葉など）において強い発現が観察された（図 3) 。また、図中グラフの縦軸は、全脳の発現量を 1とした相対量を示している。実施例 5

Zucker Fat tyラヅトにおける r 39 C 7 mRNAの発現

インスリン抵抗性を有する Zucker Fatt yラットでの遗伝子発現変動解析を実施した。食餌制限と運動を実施したラヅトより骨格筋を摘出して、 T R I _Z o 1試薬（インビトロジェン社）を用いて、その処方に従い全 RNAを抽出し、 5 0〃 gの全 RNAを得た。この RNA 1 gを用いて、 Advant age R T f o r Ρ CR k i t (クロンテヅク社製）を用いて cDN Aを合成した。次に、実施例 1で取得した r 3 9 C 7 cDNA断片 (配列番号： 3) を基に、プライマー設計ソフトウェア P r i me r Expr e s s (ァプライドバイォシステムズ社製）を用いて、 T a qMa nプライマーおよびプライマーを設計し、アプライドバイォシステムズ社に合成を依頼した。作製した T a q M a nプライマーおよびプローブを用いて、合成した c DNAを铸型として P 01反応を行ぃ^111 量を定量した。 P C R反応試薬には P 1 a t i num Quant i t ave P GR S u p e rMix— UDG (インビトロジェン社製）を用いて、 50°Cで 2分、 9 5°Cで 2分の反応サイクルを 1回行った後、 9 5°Cで 2分および 6 0°Cで 1分の反応サイクルを 40回行った。その結果、 Zu c ke r F a t t yラヅト骨格筋において、食餌制限および運動によりィンスリン抵抗性が改善されると r 3 9 C 7の mRNA発現が増大した（図 4) 。実施例 6

h 3 9 C7発現細胞株の樹立

実施例 2で得られた h 3 9 C 7の完全長 c DNA を p3xFLAG-CMV-7.1 ベクター (シグマ社）へ揷入し発現ベクターとした。この発現ベクターを L6 細胞に導入し、 h 3 9 C7を安定的に発現する細胞を取得した。発現ベクターを導入した細胞における h 3 9 C7の発現は抗 F LAG抗体を用いたゥヱスタンプロヅト法により検出した (図 5 )。全細胞抽出液を S D S— PAGEした後、 Immobilm Transfer Membranes ( MILLIPORE 社）に転写した。このメンブランを 5 %スキムミルク、 PB S中で室温、 1時間ブロッキング処理しすこ後、 Peroxidase-conjugated Anti-FLAG 抗体（シグマ社）を加え、さらに 1時間室温でインキュベートした。インキュベート後、メンブランを 0. 1 %Tween-PBSで洗浄し ECL+plus Western Blotting Detection System ( Amersham Biosciences 社)を用いて発色、 Hy er film ECL (Amersham Biosciences 社）に露光した。実施例 Ί

h 3 9 C 7発現細胞株におけるグルコース取りこみ活性の測定

実施例 6により得られた h 3 9 C 7発現細胞株を用いてグルコース取りこみ活性の測定を行った。 CytoStar-T plate ( Amersham Biosciences 社）に細胞を 2 X 10⁴ cells/wellで捲いた後、 C0₂インキュベターで 37°C、ー晚培養した。この細胞を 300 i lの PBS(-)で 3回 wash した後、 80〃 1の HEPES-Krebs buffer ( 119 mM NaCl, 4.75 mM KC1, 5 mM NaHC0₃, 2.54 mM CaCl₂ · 2H₂0, 1.2 mM MgS0₄₎ 20 mM HEPES . 7H₂0 ( pH 7.4 ) )を添加した。続いて 3 /l M の insulinを 10〃 1、及び 2-DEOXY-D- [U-¹⁴C] Glucose溶液（Amersham Biosciences 社）を 10〃1添カロ後、軽く混和して、 C0₂インキュベターで 37°C、 20 分間インキュベートした。インキュベート後、 100〃M の Cytochalasin B を 10〃1添加し、 1450 MICRO BETA TRILUX ( Perkin Elmer社）で測定した（図 6 ) 。この結果、 h 3 9 C 7強制発現細胞では、コントロール細胞と比較してインスリン濃度非依存的にグルコース取りこみ量が増大していることが観察された。ァヅセィに使用したサンプルは、 CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes社）により測定した D N A量で補正し、その結果を図 6 に示した。

なお、細胞の培養については、 1 0 % fetal bovine serum と 1 x Antibiotic-Antimycotic(Iiivitrogen社製）加えた α-ΜΕΜを培地として使用し、 7 0— 8 0 %コンフルェントに達した時点でトリプシンを使用して細胞を回収、 1/10-20希釈して継代する条件で行なった。その結果、図に示すように、 h 3 9 C 7の強制発現により、グルコース取り込み能が亢進することがわかった。したがって、 h 3 9 C 7の発現の低下が、糖尿病の病態に関連することが示唆された。産業上の利用可能性本発明により、アルツハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症などの神絰変性疾患のマーカーおよび糖尿病マーカー、ならびに神経変性疾患および糖尿病治療薬である N o g o受容体様新規ポリぺプチド、該ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、該 D N Aが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリぺプチドの製造法、該ポリべプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリぺプチドの定量法および免疫学的検出法、該抗体を含む糖尿病または神経変性疾患検出用キット、該ポリぺプチドの m R N Aの定量法、該ポリぺプチドに対するリガンドのスクリーニング法、該ポリべプチドとリガンドとの結合性を変化させる物質のスクリーニング法、該ポリべプチドの発現を変動させる物質のスクリーニング法、ノックアウト動物、トランスジエニック動物、本発明の抗体、リガンド、リガンドとの結合性を変化させる物質、または発現を変動させる物質を含有する医薬が提供される。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 2の 2 2位の G l yから 4 4 1位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩。

2. 配列番号 2の 1位の M e tから 44 1位の A r gで表わされるァミノ酸配列を含有する請求の範囲第 1項記載のポリぺプチドまたはその塩。

3. 配列番号 4の 2 2位の S e rから 4 4 5位の A r gで表わされるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩。

4. 配列番号 4の 1位の M e tから 44 5位の A r gで表わされるァミノ酸配列を含有する請求の範囲第 3項記載のポリペプチドまたはその塩。

5. 請求の範囲第 1項から第 4項のいずれか記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換または付加から選択きれる少なくとも 1 つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩。

6. 糖尿病マーカ一、神経変性疾患マーカー、糖尿病治療薬、あるいは神経変性疾患治療薬として用いることを特徴とする請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチド。

7. 請求の範囲第 1項から第 6項のいずれか記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオド。

8. 配列番号 1の 1 7 4番目の Gから 1 4 3 3番目の Cで表わされる塩基配列を含有する請求の範囲第 7項記載のポリヌクレオチド。

9. 配列番号 1の 1 1 1番目の Aから 1 4 3 3番目の Cで表わされる塩基配列を含有する請求の範囲第 7項記載のポリヌクレオチド。

1 0. 配列番号 3の 1 7 0番目の Aから 1 44 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有する請求の範囲第 7項記載のポリヌクレオチド。

1 1. 配列番号 3の 1 0 7番目の Aから 1 44 1番目の Cで表わされる塩基配列を含有する請求の範囲第 7項記載のポリヌクレオチド。

1 2. 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイプリダイズするポリヌクレオチド。

1 3 . 請求の範囲第 7項から第 1 2項のいずれか記載のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。

1 4 . 糖尿病マーカー、神絰変性疾患マーカー、糖尿病治療薬あるいは神経変性疾患治療薬として用いることを特徴とする請求の範囲第 7項から第 1 1項および第 1 3項のいずれか記載のポリヌクレオチド。

1 5 . 配列番号 1 または第 3項記載の塩基配列中の連続した 5から 6 0塩基と同一配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびそれらの誘導体オリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチド。

1 6 . 請求の範囲第 7項から第 1 3項のいずれか記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。

1 7 . 請求の範囲第 1 6項記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。

1 8 . 請求の範囲第 1 7項記載の形質転換体を培養する工程、および産生された請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドを培養液から回収する工程、を含有する該ポリぺプチドまたはその塩の製造法。

1 9 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。

2 0 . 下記の工程を含む、請求の範囲第 1 9項記載の抗体を用いることを特徴とする、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドの検出または定量方法、

( a ) ポリペプチドと該抗体とを接触させる工程および、

( b ) ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程。

2 1 . 請求の範囲第 2 0項記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドが関連する糖尿病または神経変性疾患の検出方法。

2 2. 請求の範囲第 2 0項記載の方法を用いることを特徴とする糖尿病または神経変性疾患の検出用キット。

2 3. 下記の工程を含む請求の範囲第 7項から第 1 3項および第 1 5項のいずれか記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドの mR N Aの検出または定量方法、

( a ) mR NAと該ポリヌクレオチドとを接触させる工程および、

( b ) mR N Aと該ポリヌクレオチドとの結合を検出する工程。

2 4. 請求の範囲第 2 3項記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドが関連する糖尿病または神経変性疾患の検出方法。

2 5. 請求の範囲第 2 3項記載の方法を用いることを特徴とする、糖尿病または神経変性疾患の検出用キット。

2 6. 請求の範囲第 2 3項記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲第 1項から第 5項記載のポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現量の測定方法 o

2 7. 請求の範囲第 2 3項記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲第 1項から第 5項記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量の測定キッ卜。

2 8. 請求の範囲第 Ί項から第 1 3および第 1 5項のいずれか記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドをコードする！） N Aの転写または m R N Aの翻訳を促進または抑制する方法。

2 9. 下記の工程を含む、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドの結合物質のスクリーニング方法、

( a ) 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチドと被検物質を接触させる工程および、

(b ) 該ポリペプチドと被検物質の結合を検出する工程。

3 0 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドを含むことを特徴とする、該ポリぺプチドの結合物質のスクリ一二ング用キヅト。

3 1 . 請求の範囲第 2 9項記載の結合物質のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合物質。

3 2 . 下記の工程を含む、請求の範囲第 3 1項記載の結合物質と請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチドとの結合活性調節物質のスクリ一二ング方法、

( a ) 被検物質の存在下または非存在下、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドと請求の範囲第 3 1項記載の結合物質を接触させる工程および、

( b ) 該ポリペプチドと該結合物質の結合活性を、被検物質の存在下と非存在下で比較する工程。

3 3 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチドおよび請求の範囲第 3 0項記載の結合物質を含むことを特徴とする、結合活性調節物質のスクリーニング用キット。

3 4 . 請求の範囲第 3 3項記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合活性調節物質。

3 5 . 下記の工程を含む、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドの発現調節物質のスクリーニング方法、

( a )請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドを発現しうる細胞と被検物質を接触させる工程および、

( b ) 該ポリぺプチドの発現量の変化を、請求の範囲第 2 0項または第 2 3項のいずれか記載の方法を用いて検出する工程。

3 6 . 請求の範囲第 3 5項記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリべプチドの発現調節物質のスクリーニング用キット。

3 7 . 請求の範囲第 3 5項記載のスクリーエング方法により得られることを特徴とする、請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリぺプチドの発現調節物質。

3 8 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチドをコードする D N Aを欠損または変異させた非ヒトノックアウト動物。

3 9 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチドをコードする D N Aを発現または変異させた非ヒトトランスジヱニック動物。

4 0 . 請求の範西第 1 9項記載の抗体、第 3 1項記載の結合物質、第 3 4項記載の結合活性調節物質または第 3 7項記載の発現調節物質を含有してなる医薬組成物。

4 1 . 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれか記載のポリペプチドから選ばれる少なくとも 1 つを含有してなる医薬組成物。

4 2 . 請求の範囲第 7項から第 1 3項および第 1 5項のいずれか記載のポリヌクレオチドから選ばれる少なくとも 1つを含有してなる医薬組成物。

4 3 . 神経変性疾患または糖尿病の治療剤である請求の範囲第 4 0項から第 4 2項のいずれか記載の医薬組成物。

4 4 . 請求の範囲第 4 0項から第 4 3項のいずれか記載の医薬組成物を投与することを特徴とする神経変性疾患または糖尿病の治療方法。