JP4984160B2 - 抗体の作製方法 - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
Description
Sakaguchi,S.等,J.Immunol.,1995年,155巻,1151−1164頁 Shimizu,J.等,J.Immunol.,1999年,163巻,5211−18頁 Sakaguchi,S.等,Immunol.Rev.,2001年,182巻,18−32頁 Nocentini,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.,1997年,USA.,94巻,9216−9221頁 June,Shimizu等,Nature,Immunol.,2002年,3巻(2),135−142頁 Reinhold,F等,B.B.R.C.,1993年,196巻(3),1496−1503頁 E.,Rothermel等,Scand.J.Imminol.,2000年,52巻,401−410頁 鎌田宣夫等,第26回日本分子生物学会年会講演要旨集,2003年,1PC−162 山田良樹等,第26回日本分子生物学会年会講演要旨集,2003年,1PC−163 大友俊彦等,第26回日本分子生物学会年会講演要旨集,2003年,1PC−164
免疫寛容を抑制する方法としては、例えば、GITRアゴニストを投与することにより免疫寛容を抑制する方法、抗IL−2受容体抗体を投与することにより免疫寛容担当細胞であるCD25+CD4+T細胞を除去する方法等が挙げられるが、本発明においては、GITRアゴニストを投与することにより免疫寛容を抑制する。
本発明において、GITRは、膜蛋白質であり、TNFα−NGFレセプター遺伝子スーパーファミリーに属する蛋白質である(以下、GITR蛋白質とする)。マウスにおけるGITRのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子配列はGenBank番号(NM_021985、NM_009400)に開示されている。
本発明において、GITR蛋白質とは、全長蛋白質及びその断片の両方を意味する。GITR蛋白質の断片とは、任意の領域を含む部分ポリペプチドであり、天然のGITR蛋白質の機能を有していなくてもよい。
本発明において、TNFSF18は、TNFスーパーファミリーに属する蛋白質でマウスアミノ酸配列及び遺伝子配列はGenBank番号(NM_183391)に開示されている。
なお、GITRアゴニスト作用を有しているか否かは、Takahashi等の方法に従って行うことが可能である(Takahashi,et al.,Int.Immunol.,1969−80(1998))。具体的には、GITRアゴニストをT細胞増殖測定系へ添加した後に、CD25+CD4+T細胞による他のT細胞への増殖抑制作用解除効果を検定することによって検出する。
まず、GITR蛋白質を動物に投与することにより抗GITR抗体を作製する。
本発明で用いられる抗GITR抗体(その断片も含む。)は、免疫寛容を抑制させる動物のGITR蛋白質に結合するだけでなく、GITRに対しアゴニスト(作動)活性を有することが必要である。抗GITR抗体の由来、種類(モノクローナル、ポリクローナル)及び形状等を問わない。
ハイブリドーマは、モノクローナル抗GITR抗体を産生するものが好ましい。当該ハイブリドーマは、GITR蛋白質を抗原として使用し、通常の免疫方法に従って免疫細胞を得、得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、さらに、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングして作製される。
(i)免疫細胞の採取
まず、抗GITR抗体を作製するための抗原として使用するGITR蛋白質を、GenBank番号(NM_021985、NM_009400)に開示されたGITR遺伝子/アミノ酸配列を発現することによって得る。GITR蛋白質をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後(Jun Shimizu et al.,Nature Immunol.,3(2),135−42,2002)、その宿主細胞中又は培養上清中から目的のGITR蛋白質を公知の方法で精製する。
GITR蛋白質の由来は、特に限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット等ゲッ歯類動物由来のGITR蛋白質が好ましく、マウスGITR蛋白質又はラットGITR蛋白質がより好ましい。
また、GITR蛋白質の断片である部分ペプチドは、GITR蛋白質のアミノ酸配列に基づく化学合成、またGITR遺伝子の一部の発現ベクターへの組込み、さらに天然のGITR蛋白質を蛋白質分解酵素による分解等によって得ることができる。部分ペプチドとして用いるGITR蛋白質のアミノ酸配列の部分及び大きさは限られない。
具体的には、GITR蛋白質の抗原をPBS(Phosphate−Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに、通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、ホ乳動物に4〜21日毎に数回投与する。
前記採取された免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ケーラーとミルステイン等の方法(Kohler.G.and Milstein,C.、Methods Enzymol.(1981)73,3−46)等に準じて行うことができる。
ハイブリドーマ以外の細胞(非融合細胞)が死滅後、ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗GITR抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
抗GITR抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識二次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。抗GITR抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
前記ハイブリドーマからモノクローナル抗GITR抗体を産生する方法として、上記で得られたハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から抗GITR抗体を採取する方法、又は上記で得られたハイブリドーマをこれと適合性があるホ乳動物に投与して増殖させ、その腹水として抗GITR抗体を得る方法等が挙げられる。前者の方法は、高純度の抗GITR抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗GITR抗体の大量生産に適している。
目的とするそれぞれの抗体のV領域をコードするDNAを得たのち、これを、所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAを含有する発現ベクターへ組み込む。
このとき、抗GITR抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖(H鎖)又は軽鎖(L鎖)をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、或いはH鎖及びL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい(WO 94/11523号公報参照)。
抗GITR抗体を発現する遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から抗GITR抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される抗GITR抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699−702)。
好ましくは、ホ乳類細胞、例えばCHO、COS、ミエローマ、BHK、Vero、HeLa細胞が挙げられる。
上記の産生された抗GITR抗体を、通常の蛋白質の分離、精製法により、細胞や宿主動物から分離、精製する。
蛋白質の分離、精製法として、例えば、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー(GPC)、限外濾過膜、塩析、透析等の適宜選択、組み合わせが挙げられる(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。このとき、抗GITR抗体の検出は、抗原エライザ法、UV検出等を用いることができる。
抗GITR抗体を特異的に分離、精製することができるアフィニティーカラムクロマトグラフィーが好ましく、アフィニティーカラムクロマトグラフィーとして、例えば、プロテインAカラムとして、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia製)等が挙げられる。
本発明において、GITRアゴニストの投与等により免疫動物の免疫寛容を抑制し、所望の抗原を当該免疫動物に投与する。
なお、所望の抗原を免疫動物に投与し、GITRアゴニストの投与等により免疫動物の免疫寛容を抑制して、当該抗原に対する抗体を作製してもよい。
このことによって、免疫寛容を抑制した免疫動物が所望の抗原に感作されて、所望の抗原に対する抗体を作製することができる。
なお、GITRアゴニスト投与との抗原を投与することが好ましく、それぞれを順次交互に繰り返し投与する操作がより好ましく、それぞれインターバルをおいて投与する操作がさらに好ましい。
また、繰り返し投与する操作の回数、インターバル(投与間隔)及び全投与期間は、例えば、マウスやラットでは、繰り返し投与する操作の回数は2回以上が好ましく、3回〜8回がより好ましく、このときの投与間隔は、3日以上間隔が好ましく、5日〜9日間隔がより好ましく、全投与期間は、3週間以上が好ましく、5週間以上がより好ましく、7週間〜11週間がさらに好ましい。
ここで、本発明において高い相同性とは、通常アミノ酸配列において70%以上の相同性、好ましくは90%以上の相同性、さらに95%以上の相同性である。この相同性の決定は、Wilbur,W.J.及びLipman D.J.が記載したアルゴリズムによる(Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80,726−730)。
なお、所望の抗原を免疫寛容が破られた(又は阻害された)免疫動物に投与して得られた所望の抗原に対する抗体を分離、精製するには、上記のアフィニティーカラムクロマトグラフィー等を用いて行うことができる。
[Edg1の抗原の調製:(1)Edg1−Flag発現バキュロウイルス(BV)の作製]
ヒトEdg1遺伝子を発現するBVは、pBlueBac−TOPO cloning kit(Invitrogen社製)を用いてC末端にFlagタグが挿入されるようにデザインした。
具体的にはプライマーpEdg1−F(配列番号1)とプライマーC−FLAG(配列番号2)を用いてpBlueBac−His−Edg1を鋳型に用いてPCRで増幅したヒトEdg1遺伝子(GenBank番号NM_001400)をクローニングして、pBlueBac expression kitのマニュアルに従って組換えBVを作製した。
[Edg1の抗原の調製:(2)精製Edg1Flagの調製]
精製Edg1抗原は、Edg1Flag発現BV感染細胞の膜画分を調製し、さらにアフィニティーカラムクロマトにて精製して免疫用の感作抗原とした。
具体的には、Edg1Flag発現BVを感染モイ5にて2x106 cells/mLの細胞密度のSf9細胞に感染させて27℃にて3日間培養したものを1500rpmの低速遠心により細胞と培養上清を分離した。細胞は一度PBSで洗浄した後、必要時まで−80℃のフリーザーにて凍結保存した。
[Edg1の抗原の調製:(3)Edg1FlagのBVの調製]
BVの調製は、以下のようにして行った。
感染MOI(multiplicity of infection)5でEdg1FlagBVを感染したSf9細胞は感染3日目に回収し、1500rpmで15分遠心操作を行い、培養上清を得た。さらに得られた培養上清を30,000xGで2時間Beckman HP−25にて遠心操作を行い、BVを沈殿として回収した。PBSを加えて4℃で一晩静置して均一に懸濁された状態になったら1500xGで15分間遠心操作を行い、細胞の残渣を沈殿として除き、上清部分をさらに45,000xGで30分間遠心操作を行ってPBS/1mM EDTAに溶かして免疫用のBV標品とした。BSAをスタンダードとしてDC protein assay kit(Bio Rad社製)により蛋白定量を行い、免疫に用いる抗原量を計算した。
[抗Edg1モノクローナル抗体の作製:(1)免疫:マウス免疫A群]
gp64トランスジェニックマウスを用いてマウスの免疫を行った。
マウス免疫A群(3匹数)は、抗原免疫と抗GITR抗体の投与とを1週間間隔で交互に実施する方法で行った。このときの全投与期間は、9週間で、繰り返し回数は5回であった。一定間隔ごとに下記の実施例6の抗血清の評価を行った。
初回免疫(7週齢、平均体重50g)は、FCA(フロイント・コンプリート・アジュバント)と100ngの百日咳毒素とともに精製Edg1Flag抗原(抗原)100μLを腹腔に投与して免疫した。抗GITR抗体投与の際には100μgを尾静脈より投与した。また感作抗原の免疫は、二回目以降は皮下にEdg1Flag BVを0.25mg、腹腔に精製Edg1Flag抗原50μLをFICA(フロイント・インコンプリート・アジュバント)50μLと共に免疫した。最終免疫は、Edg1Flag BV 0.125mgを皮下より免疫し、精製Edg1Flag抗原25μLを腹腔に免疫した。
[抗Edg1モノクローナル抗体の作製:(1)免疫:マウス免疫B群]
実施例5は、実施例4と同様の手順で、マウス免疫B群(3匹)に感作抗原免疫と抗GITR抗体投与を毎週実施し、感作抗原は抗GITR抗体投与から3日後に免疫する方法でマウスの免疫を行った。このときの全投与期間は5週間で、繰り返し回数は5回であった。5回免疫後の6週間後に6回目の免疫を行い最終免疫とした。
抗GITR抗体を投与せず、実施例4と同様の手順で、マウス免疫コントロール群(3匹)に感作抗原免疫と抗GITR抗体の投与なしの通常の免疫方法でマウス免疫を行った。このときの全投与期間は、初回から5回免疫までに5週間、その6週間後に最終免疫し、投与回数は合計6回であった。
[抗Edg1モノクローナル抗体の作製:(2)抗血清の評価]
マウス免疫A群(実施例4)、マウス免疫B群(実施例5)、マウス免疫コントロール群(比較例1)の免疫マウスの抗血清の評価は、精製Edg1Flag抗原を用いたウエスタンブロットとEdg1/CHO細胞とvector/CHO細胞を用いたFACS、精製Edg1Flag抗原でのELISAで行った。Edg1/CHO細胞はマウスのEdg1遺伝子のN末端にFlagタグがC末端にHAタグが付加された遺伝子を発現する細胞である(文献 TAKAYUKI KOHNO et al.The FASEB Journal.2002;16:983−992)。FACSPBS/1mM EDTA処理することで培養ディッシュから剥離させた細胞をFACS buffer(1%BSA/PBS/0.1% NaN3)に懸濁して細胞が50μL中に100,000個ずつ入るように96well plate(Falcon353910)に分注し、そこにマウス免疫各群のマウス抗血清を1μL加えて反応をみた。4℃で一時間反応させた後に、1500rpmで5分間遠心操作を行い、細胞を沈殿させた後に上清を除き、200μL FACS bufferを加えて懸濁後に1500rpmで5分間遠心して細胞を洗浄した。再び上清を除いた後に100倍にFACS bufferで希釈したFITC AffiniPure F(ab’)2 Frag Goat Anti−Mouse IgG,F(ab’)2 specific(Jackson Immuno Research社)を4℃で30分間反応させた。
[抗Edg1モノクローナル抗体の作製:(3)ハイブリドーマの作製]
マウスの脾臓を摘出し、ミエローマ細胞との細胞融合を実施した。マウス免疫A群のマウスNo.3075及びNo.3083の脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞NS−1とを、ケーラーとミルステインの方法(Koheler.G and Milstein.C.;Methods Enzymol.,1981,73,3−46)を用いて細胞融合させた。すなわち、前記脾臓細胞とNS−1を細胞数10:1の割合で混合し、400xG10で分間遠心した後、培養上清を除去し、細胞ペレットに50%(w/v)ポリエチレングリコール(PEG)1500(ロッシュダイアグノスティクス社)(PEG)を添加してよく混合することによって、融合細胞を形成させた。続いて、15% FBS(Sigma社)添加RPMI1640(Sigma社)10mLを逐次加える事によって融合反応をストップさせ、400xGで10分間遠心してPEGを含む培養上清を除去した。ハイブリドーマを含むペレットに、前記の培養液を逐次加えて細胞を縣濁し、0.5x107cells/mLとなるよう調製し、96穴培養プレートに100μLずつまき込んだ。ハイブリドーマはHAT培養液(ICN社)で選択培養を行い、細胞融合後8日目には、融合細胞以外の細胞は死滅し、融合細胞が複数の良好なコロニーを形成していることが確認された。この8日目の培養上清をサンプリングし、スクリーニングを実施した。
マウス免疫A群の脾臓に代えて比較例1のマウス免疫コントロール群のNO.3083を実施例7と同様の手順で、ミエローマ細胞との細胞融合を実施した。
[抗Edg1モノクローナル抗体の作製:(4)スクリーニング]
ハイブリドーマのスクリーニングはBV−ELISA、FACS、精製抗原のELISA,FMATにより進めた。BV−ELISAは前述の調製法に調製したBVを4μg/wellで96well plateにコーティングしてハイブリドーマの上清10μLと振とうして1時間反応させ、30,000倍に希釈したHRP rabbit anti−mouse IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch社)反応させてTMB(Sigma社)を基質にして吸光度A450を測定した。
精製Edg1Flagとの反応性とコントロールにおいたGPCRFlagの反応性を比較し、A450の測定値の比が1.5以上のものと測定値の差の大きい上位10個を二次スクリーニングに進めた。
WB解析では、精製Edg1Flag抗原を2% SDS−ポリアクリルアミドゲルを用いて分離後、10倍希釈したハイブリドーマの上清と反応させた(図1)。
FMAT解析では、His−Edg1,His−Edg3発現BVを感染させたSf9細胞を用いて8200CDS(ABI社)で解析を行った(表2)。
マウス免疫A群のマウスにおいてEdg1Flag抗原に相当する大きさのバンドを染色できることを明らかにした。すなわち、抗Edg1Flag抗体を得ることができた。
図2が示すように両者は94%といった高い相同性を示すGPCRである。このことから、相同性が高く免疫寛容が成立しやすい抗原(比較例1のようなEdg1抗原)であっても、当該免疫マウス(gp64トランスジェニックマウス)に一定間隔をおいて交互にGITRアゴニスト及び当該抗原を投与して当該抗原に対する抗体(抗Edg1抗体)を得ることができることを明らかにした。
また、表2に示すレーン番号19,37,40,46は、His−Edg1に反応し、His−Edg3に反応しない、クローンB6011A,B6011B,B6011C,B6012Aを得た。
このことから、マウス免疫A群のマウスNo.3075及びNo.3083の脾臓細胞を用いて、Edg1抗原に対する抗体をモノクローナルに産生するハイブリドーマを得ることができた。
Claims (7)
- GITRアゴニスト活性を有する抗GITR抗体を免疫動物に投与して当該免疫動物生体内の免疫寛容を抑制し、当該免疫動物に当該免疫動物で免疫寛容が成立しやすいペプチド又は蛋白質からなる抗原を投与する当該抗原に対する抗体の作製方法であって、当該GITRアゴニスト活性を有する抗GITR抗体を投与し次いで当該抗原を投与する操作を一定間隔で繰り返し2回以上行うことを特徴とする当該抗原に対する抗体の作製方法。
- 前記GITRアゴニスト活性を有する抗GITR抗体を投与し次いで前記抗原を投与する操作を、5〜9日間隔で3〜8回繰り返し行う請求項1記載の抗体の作製方法。
- 前記免疫動物に前記抗原を投与後、前記免疫動物の免疫細胞を用いて作製したハイブリドーマで当該感作抗原に対する抗体を産生する、請求項1又は2に記載の抗体の作製方法。
- 前記抗原が、前記免疫動物に存在するペプチド又は蛋白質と高い相同性を有するものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体の作製方法。
- 前記抗原が、血球系・血管系において多く存在するペプチド又は蛋白質である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体の作製方法。
- 前記ペプチド又は蛋白質が、細胞接着因子、GPCR又はそれらの断片である、請求項5に記載の抗体の作製方法。
- 前記GPCRがケモカイン受容体である、請求項6に記載の抗体の作製方法。
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