JP4059404B2 - 甲状腺機能を刺激する活性を持つ抗体 - Google Patents

Description

本発明は、自己免疫疾患の患者が持つ自己抗体の可変領域遺伝子のクローニングに関するものである。具体的には、サイロトロピン受容体に結合して甲状腺刺激活性を示す自己抗体の可変領域遺伝子に関するものである。

自己免疫疾患によって発症する甲状腺機能障害の存在が広く知られている。このような患者の血中にはサイロトロピン（甲状腺刺激ホルモン、以下ＴＳＨと省略する）の受容体（以下ＴＲと省略する）に結合する抗体（自己抗体）が存在する。

更にこの自己抗体には、ＴＲに結合してＴＳＨが結合したときと同じ甲状腺刺激活性を示す抗体と、この抗体とは逆にＴＲに結合してＴＳＨのＴＲに対する刺激活性を阻害する抗体の、少なくとも２種類の異なった活性を持つ抗体が存在していることが報告されている。

同じＴＲに対する自己抗体でありながら、その症状は前者では甲状腺機能の亢進として現れ、後者では甲状腺機能の低下につながる。このような背景から、前者の抗体を甲状腺刺激抗体（以下ＴＳＡＢと省略する）、後者の抗体を甲状腺刺激阻害抗体（以下ＴＳＢＡＢと省略する）と呼んでいる。このＴＳＡＢ活性は、ＴＲを備えた生細胞の自己抗体による刺激に対するｃＡＭＰ産生量を指標として確認することができる

なお、甲状腺の代表的な疾患であるバセドウ病は、ＴＲに対する自己抗体が原因となって発症するとされている。特にＴＳＡＢはＴＳＨよりも長い時間にわたって甲状腺を刺激し、甲状腺ホルモンを過剰分泌させる（非特許文献１）。

自己抗体の一般的な検出方法は、検出すべき自己抗体が認識する組織や抗原決定基のアミノ酸配列を再現した合成ペプチドを抗原として用い、これに対して結合性の抗体を検出することによって行われている。

甲状腺機能障害においても同じようなアプローチに基づいて自己抗体の検出が行われている。たとえば、ブタのＴＲへのＴＳＨの結合を阻害する抗体を検出することによって自己免疫症状を診断する技術が知られている。なお、このような活性を持つ抗体は、ＴＳＨ結合阻害抗体（以下ＴＢＩＩと省略する）と呼ばれている。

この方法では、単にＴＲに対する結合活性を見ているだけなのでＴＳＡＢとＴＳＢＡＢを区別して検出する事はできない。この理由としては、ＴＳＡＢにしろ、ＴＳＢＡＢにしろ、いずれもＴＲへの結合活性を持つ抗体であることには変わりは無いためである。

一方、ＴＳＡＢを特異的に測定する方法としては、スティミュレーションアッセイが知られている（非特許文献２）。この方法ではラットの甲状腺細胞株ＦＲＴＬ−５を用いている。ＦＲＴＬ−５は、ＴＲを細胞膜上に発現したラット甲状腺培養株で、その生育にはＴＳＨを要求する。ＴＳＡＢがＦＲＴＬ−５のＴＳＨ受容体と結合することによって細胞中ではアデニレートシクラーゼが活性化され、培養系にｃＡＭＰが産生される。すなわち、培養物中のｃＡＭＰ濃度を比較すれば、ＴＳＡＢ活性を特異的に測定することができる。

この方法は確かにＴＳＡＢ活性の特異的な測定を可能とする。しかし単純な免疫反応だけで構成される方法に比べて、細胞の培養操作を要求されるため操作が複雑で、しかも結果を得るまでに時間がかかるという特徴が有る。また細胞の培養条件を常に一定に保たなければ必要な精度は期待できないので、高度な培養技術が要求される分析方法といえる。

更に、活性比較の標準とすべき抗体もＴＳＡＢの測定にあたって問題となる。自己免疫疾患の患者の血液を標準としたのでは、均一な品質を維持することが難しいし、量的にも安定供給は期待できない。ヒトや動物のＴＲを免疫原としてＴＲを認識する動物抗体を得る方法が考えられる。ヒトのＴＲをコードする遺伝子は既にクローニングされているので（特許文献１）、そのポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を得ることが可能である。

しかし、このような方法で得た抗体は、あくまでもヒト以外の動物の免疫システムが認識した抗原決定基に対する反応性を持っている。したがってその抗体が、ヒトの自己抗体と同じ反応性を示しているのかどうかが問題となる。ましてＴＳＡＢという特殊な活性を持つ抗体を安定して得ることは困難といえよう。特に標準として用いるには、できるだけヒトの自己抗体に近い反応性を持つものを使うべきであるから、たとえ刺激活性を指標にモノクローナル抗体を確立するとしても、ヒトの自己抗体と親和性やエピトープの面で等価な抗体を得られるとは限らない。

このような問題点を解消するためには、実際の自己免疫疾患を持つ患者の抗体産生細胞を形質転換して株化する方法が有効である。実際に本発明者らをはじめとしてＴＳＡＢについてもこの方法を試み、エプスタインバールウイルス（以下ＥＢＶと省略する）によって形質転換したＴＳＡＢ産生細胞株を樹立している（非特許文献３）。しかしこの細胞株は、大量培養が困難で標準や試薬原料としての抗体を産生させるには好ましい材料とは言えなかった。

この他にも患者から誘導された抗体産生細胞についての報告は有る。しかしこの報告はヒト−マウスヘテロハイブリドーマを利用したものである（非特許文献４）。ヘテロハイブリドーマでは染色体の脱落が生じやすく、結果としてハイブリドーマの抗体産生能が消失する現象がしばしば観察される。なお、ＴＳＡＢを得るためのこれまでのアプローチは抗体をコードする遺伝子のクローニングを目的としているわけではない。

この状況下で自己免疫疾患の研究を遺伝子レベルで発展させるためには、抗体遺伝子についてもクローニングしておく必要が有る。遺伝子工学的手法による抗体産生、あるいはその活性に変異を加えた抗体の開発において、遺伝子のクローニングとアミノ酸配列を含めた構造の解明が必要である。例えば抗体の親和性を改良する目的で抗体可変領域のアミノ酸を置換することがヒト化抗体作製等の過程で広く行われている。

その中でもＣＤＲ（相補性決定領域）のＤＮＡ塩基配列、そしてアミノ酸配列の解明は特に重要である。ＣＤＲは抗体可変領域の中の４つのフレームワーク（ＦＲ）に連結された状態で存在する領域である。ＦＲの構造が抗体の間でよく保存されているのに対してＣＤＲの変異性は大きく、抗体の特異性が可変領域の中でもＣＤＲという特定の領域によって決定されることが明らかにされている。

しかし、たとえ自己抗体の産生細胞を得ることができ、更にそれを株化することが可能であっても、抗体遺伝子をクローニングすることは必ずしも容易なことではない。抗体分子は極めて多様性に富んでいるため、遺伝子のクローニングに大きな威力を発揮するＰＣＲ法を適用し難い。ＰＣＲ法は、あくまでも塩基配列がわかっている遺伝子の増幅に有効な技術である。増幅すべき遺伝子の末端部分に相補的なプライマーを用意しなければならないという性格上、この特性は避けることができない。

その他にも、具体的な遺伝子の配列を予想できない場合であっても、クローニングを可能とする技術は知られているが、ＰＣＲ法に比べて効率が悪く抗体のような多様性に富む遺伝子のクローニングを行うには不向きである。

マウスなどの非ヒト動物では、イムノグロブリンの遺伝子に関する研究が進み、その可変領域に対しても偏りの生じ難いプライマーの配列が報告されている。しかし現段階ではマウスよりもはるかに少ない情報しか得られていないヒトのイムノグロブリン遺伝子については、未だに完全にその遺伝子を増幅することは容易でないと考えられている。しかも実験動物であるマウスの遺伝子は、系統が管理されているので均一性が高く比較的取り扱いやすいといえる。

一方、遺伝的な制御を受けていないヒトの遺伝子は、遺伝的には多様性に富み実験は容易ではない。すなわち、プライマーが全ての遺伝子に対してアニールするとは限らないため、たとえスタートマテリアルがＥＢＶでトランスフォームしたクローンであったとしても、そのクローンが産生する抗体遺伝子の情報が未知である以上、その抗体遺伝子をクローニングする作業は困難をきわめるといわざるを得ない。

特表平５−５０３８４９公報 ＢＩＯｍｅｄｉｃａ Ｖｏｌ．１、３、ｐｐ２３９−２４３；１９８６ Ｅｎｄｏｃｌｉｎ．Ｖｏｌ．１２５、Ｎｏ．１、ｐｐ４１０−、１９８５ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．２０７、Ｎｏ．３、ｐｐ９８５−９９３、１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．７９、ｐｐ６６８０−６６８４、１９８２

本発明は、ＴＳＡＢの可変領域をコードする遺伝子の提供を課題としている。本発明はまた、このＴＳＡＢをコードする遺伝子の発現産物の試薬や標準物質としての応用についての提案を行う。

本発明の課題は、新たにクローニングされ配列決定した以下の抗体可変領域遺伝子、あるいはその変異体によって解決される。すなわち本発明は、ＴＲに結合して甲状腺機能を刺激する活性を持ち、かつ配列１または配列３に示す遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいはその部分配列から選択したアミノ酸配列を含むイムノグロブリン重鎖可変領域である。

本発明はまた、ＴＲに結合して甲状腺機能を刺激する活性を持ち、かつ配列２または配列４に示す遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいはその部分配列から選択したアミノ酸配列を含むイムノグロブリン軽鎖可変領域である。

本発明は、これらアミノ酸配列の中からＣＤＲのアミノ酸配列を与える。

更に本発明は、これらイムノグロブリン可変領域（またはその変異体）を構成するアミノ酸配列（配列１７−配列２０）をコードするＤＮＡ、そのクローニング方法、そしてこれらのＤＮＡによって得られるイムノグロブリン可変領域の組み換え体の応用を提案するものである。なお本明細書において、アミノ酸は次のように省略した。

アラニン Ａ ｏｒ Ａｌａ
アルギニン Ｒ ｏｒ Ａｒｇ
アスパラギン Ｎ ｏｒ Ａｓｎ
アスパラギン酸 Ｄ ｏｒ Ａｓｐ
システイン Ｃ ｏｒ Ｃｙｓ
グルタミン Ｑ ｏｒ Ｇｌｎ
グルタミン酸 Ｅ ｏｒ Ｇｌｕ
グリシン Ｇ ｏｒ Ｇｌｙ
ヒスチジン Ｈ ｏｒ Ｈｉｓ
イソロイシン Ｉ ｏｒ Ｉｌｅ
ロイシン Ｌ ｏｒ Ｌｅｕ
リジン Ｋ ｏｒ Ｌｙｓ
メチオニン Ｍ ｏｒ Ｍｅｔ
フェニルアラニン Ｆ ｏｒ Ｐｈｅ
プロリン Ｐ ｏｒ Ｐｒｏ
セリン Ｓ ｏｒ Ｓｅｒ
トレオニン Ｔ ｏｒ Ｔｈｒ
トリプトファン Ｗ ｏｒ Ｔｒｐ
チロシン Ｙ ｏｒ Ｔｙｒ
バリン Ｖ ｏｒ Ｖａｌ

配列１−４で示したＤＮＡは、バセドウ病患者の末梢血リンパ球からＥＢＶトランスフォームによって樹立した抗体産生細胞株に由来するものである。すなわち、配列１と配列２がＴＳＡＢ活性を持つＩｇＧクラスのヒト・モノクローナル抗体を産生するＢ６Ｂ７に、そして配列３と配列４が同じくＴＳＡＢ活性を持つＩｇＭクラスのヒト・モノクローナル抗体を産生する１０１−２に由来している。

本発明によって、ＴＳＡＢの可変領域をコードする遺伝子配列が提供される。この遺伝子配列をもとに、遺伝子操作によって標準や試薬に必要な抗体を安定して供給することが可能となる。遺伝子操作によって得られる抗体を生産する形質転換細胞は、ＥＢ−Ｖトランスフォーマントやヘテロハイブリドーマのような公知の抗体産生細胞に比べて形質がきわめて安定している。

本発明によって提供されるクローニングした遺伝子は、同じ形質転換体を高い再現性で容易に得る事を可能とする。このような本発明の特徴は、ＴＳＡＢを試薬や標準に用いるために商業的な供給を考えるときにたいへん有利な条件となる。これに対して公知の抗体産生細胞は、きわめて規模の大きい細胞集団の中から必要な抗体を産生する細胞をクローン化することによって得られたものなので、同じ抗体産生細胞を再び得る事は容易ではない。

本発明が提供するＴＳＡＢの可変領域をコードする遺伝子は、自己免疫による甲状腺機能障害の遺伝子レベルでの研究に貢献する。本発明で明らかにされたイムノグロブリンの可変領域遺伝子の配列を基に、患者のイムノグロブリン遺伝子の解析を進めることが容易となり、結果として自己免疫症状を遺伝子レベルでとらえることが可能となる。このような遺伝子レベルでの解析は、イムノグロブリンの可変領域遺伝子の配列を明らかにすることによって初めて可能となる。

配列１〜配列４に示すＤＮＡは、これらの抗体産生細胞株のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを合成し、更にこのｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法によりイムノグロブリンの可変領域をコードする遺伝子のライブラリーを得、これをクローニングすることによって単離されたものである。ｃＤＮＡの合成にはヒトイムノグロブリン遺伝子をできるだけ漏れ無く拾うために、イムノグロブリン遺伝子の間で高度に保存されている領域を逆転写酵素のためのプライマーとして用いた。

またイムノグロブリンの可変領域をコードするＤＮＡのＰＣＲ法による増幅にあたっては、多様性に富む可変領域をできるだけ偏りなく増幅するためにアダプターと、可変領域をコードするＤＮＡの中でも高度に保存されている領域を組み合わせてプライマーとした。アダプターとは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドで配列中にはクローニングサイトに組み込むための制限酵素の認識配列を含むものである。すなわち、クローニング用のベクターのサイトに合わせた配列を備えた任意のオリゴヌクレオチドを用いることができる。

アダプターは、ｃＤＮＡライブラリーの５’側にライゲーションすることによって導入される。こうして得られたアダプター付加ｃＤＮＡを鋳型として、可変領域遺伝子の上流側については重鎖、軽鎖ともに前記アダプター配列をプライマーとし、一方下流側は公知のＪＨ領域（重鎖）、あるいはＪκ領域（軽鎖）の配列から保存性の高い配列を選んでプライマーとすることで、イムノグロブリンの可変領域をコードするＤＮＡを増幅する。

ＰＣＲ法による増幅産物を制限酵素で消化し、本出願人によるイムノグロブリン遺伝子クローニングベクターｐＳＲＨ（重鎖用）、ならびにｐＳＲＬ−ｎｅｏ（軽鎖用）の対応するサイトに組み込んでクローニング後、配列決定したのが配列１−配列４の塩基配列である。またこの塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したのが配列１７−配列２０に示すアミノ酸配列である。

イムノグロブリン重鎖のアミノ酸配列を示す配列１７と配列１９においては、Ｎ末端に１９ｍｅｒからなるリーダー配列（「−；マイナス」表示した）が存在し、実際のイムノグロブリン可変領域を構成するのは１番からはじまるアミノ酸配列である。同じく軽鎖（配列１８と配列２０）においては２０ｍｅｒからなるリーダー配列が存在し、やはり１番からはじまるアミノ酸配列で実際のイムノグロブリン可変領域が構成される。

配列１７−配列２０のアミノ酸配列を持つイムノグロブリンの可変領域は、配列１−配列４に示した塩基配列を備えたＤＮＡを公知の発現系を利用して翻訳することで得ることができる。イムノグロブリン可変領域の発現については多くの報告が有るが、たとえば本出願人の報告したベクター（特開平７−１３５９７８公報）を利用すれば簡単に可変領域遺伝子を発現ベクターに組み込むことができる。

このベクターを用いれば、重鎖と軽鎖とをそれぞれが定常領域と可変領域とを備えた完全なイムノグロブリン遺伝子として１本のベクターに連結することができる。マウスミエローマ細胞株等の適当な動物細胞をこのベクターで形質転換すれば、定常領域と可変領域とを備え、しかもＳＳ結合によって２量体構造を取った完全なイムノグロブリン分子として再構成することができるのである。宿主に動物細胞を利用しているので、糖鎖構造についても天然のイムノグロブリンに近い状態にあることが期待できる。

本発明のイムノグロブリン重鎖は、ヒト定常領域をコードする遺伝子と融合させた完全な重鎖分子であってもよい。更に軽鎖の可変領域や、更に軽鎖の定常領域をも備えた完全なイムノグロブリン分子として構成することも可能である。クローニングされた可変領域遺伝子をもとに、完全な重鎖分子やイムノグロブリンを再構成する技術は既に公知である。なお、軽鎖の可変領域遺伝子としては、イムノグロブリンの抗原結合活性の大部分を重鎖可変領域が決定していることから、任意の抗原結合活性を備えたものを利用することができる。

しかしより完全な特異性を得るためには、軽鎖可変領域もＴＳＡＢ活性を備えたものを用いるのが好ましい。このような軽鎖可変領域として、前記配列２または配列４のＤＮＡによってコードされる配列１８、または配列２０のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域を示すことができる。

配列１および配列２は、ＩｇＧクラスのイムノグロブリンに由来するものであり、病原性に強く関与しているものと思われる。一方配列３および配列４はＩｇＭクラスに由来している。しかしイムノグロブリンのクラスを決定しているのは定常領域であるから、本発明による可変領域遺伝子はその由来にかかわらず融合させる定常領域の遺伝子を選択することによって任意のクラスのイムノグロブリンとして構成することが可能である。このようなイムノグロブリンのクラスの変更はクラススイッチと呼ばれ、たとえば本出願人らの開示した技術（特開平７−１３５９７８公報）によって実施できる。

本発明において、可変領域が持つべきＴＳＡＢ活性は公知の技術によって確認すれば良い。すなわち、アミノ酸の変異を導入した遺伝子の発現産物について、たとえば先に紹介したスティミュレーションアッセイ（非特許文献２）によってＴＳＡＢ活性を確認し本発明による変異体をスクリーニングすることが可能である。本発明に含まれるＴＳＡＢは、ＴＳＡＢ活性を持つことによってのみ特徴づけられるものであって、ＴＢＩＩ活性の有無は問わない。

本発明はＴＳＡＢの可変領域におけるＣＤＲを構成するアミノ酸配列を提供する。すなわち配列５−配列１６に示したのが、本発明によって明らかにされたＴＳＡＢの可変領域を構成するアミノ酸配列をもとに、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．らによって既に知られている抗体のアミノ酸配列データと照合して決定したＣＤＲのアミノ酸配列である。

各ＣＤＲはそれをコードするＤＮＡを与えるが、特に好ましいＤＮＡの塩基配列は配列１−配列４の塩基配列の中からこれらＣＤＲに対応する部分を切り出した塩基配列である。本発明が明らかにしたＴＳＡＢの可変領域における３つのＣＤＲの位置について、以下にまとめる。各位置は、アミノ酸配列については配列１７−配列２０に示したアミノ酸配列に付した番号に、また塩基配列については配列１−配列４に示した塩基配列に付した番号に基づいて特定した。

ｒＢ６Ｂ７重鎖（アミノ酸配列：配列１７、塩基配列：配列１）
ＣＤＲ１；３１−３５番アミノ酸／１４８−１６２番塩基
ＣＤＲ２；５０−６５番アミノ酸／２０５−２５２番塩基
ＣＤＲ３；９８−１１２番アミノ酸／３４９−３９３番塩基
ｒＢ６Ｂ７軽鎖（アミノ酸配列：配列１８、塩基配列：配列２）
ＣＤＲ１；２４−３４番アミノ酸／１３０−１６２番塩基
ＣＤＲ２；５０−５６番アミノ酸／２０８−２２８番塩基
ＣＤＲ３；８９−９６番アミノ酸／３２５−３４５番塩基

ｒ１０１−２重鎖（アミノ酸配列：配列１９、塩基配列：配列３）
ＣＤＲ１；３１−３５番アミノ酸／１４８−１６２番塩基
ＣＤＲ２；５０−６６番アミノ酸／２０５−２５５番塩基
ＣＤＲ３；９９−１０６番アミノ酸／３５２−３７５番塩基
ｒ１０１−２軽鎖（アミノ酸配列：配列２０、塩基配列：配列４）
ＣＤＲ１；２４−３５番アミノ酸／１３０−１６５番塩基
ＣＤＲ２；５１−５７番アミノ酸／２０１−２３１番塩基
ＣＤＲ３；９０−９８番アミノ酸／３２８−３５４番塩基

本発明が提供するＣＤＲはＴＳＡＢの結合活性を決定する重要な領域である。また、本発明によって提供されるＴＳＡＢ活性を持つイムノグロブリンの可変領域、または更にこれらを定常領域と融合させることによって得られるイムノグロブリンの完全な分子は、たとえば次のような利用分野において有用である。

利用分野１：免疫分析
本発明のイムノグロブリン可変領域は、実際の患者組織に由来するものであるので病原性に深く関与する抗体に近い反応性を備えているものと推測できる。このような抗体は、競合法やインヒビションアッセイによる免疫分析に有用である。臨床的に分析意義の大きいと思われる病原性に関連する抗体に反応性が近いので、これらの抗体を高い精度で分析することが可能となるためである。

実施例に示したように、抗体のＴＳＡＢ活性はクラススイッチによって変化する場合がある。すなわち、抗原との結合特異性を決定するのが可変領域だとしても、抗体全体の生理活性に及ぼす定常領域の役割は決して無視することはできないと考えられる。したがってイムノグロブリンを可変領域のみならず定常領域を備えた完全な分子として供給できるということは、ＴＳＡＢという特殊な活性を持つ抗体の免疫分析において重要である。可変領域のみでは実際の試料中に存在する抗体と等価な活性を示すとは限らないためである。

アッセイフォーマットにかかわらず、本発明による免疫分析の反応原理は次のようにまとめられる。すなわち、ＴＲに対する本発明のＴＳＡＢの結合が試料中の検出すべきＴＳＡＢによって阻害される程度を測定すれば良いのである。競合法であれば試薬として供給したＴＳＡＢが検出すべきＴＳＡＢとともにＴＲに結合し、その結合部位に対して競合することによって定量反応が成立する。

一方、インヒビションアッセイでは、検出すべきＴＳＡＢがＴＲに対して先に結合することで、試薬として供給したＴＳＡＢが結合すべき部位をブロックしてしまうことによって定量系が成立する。配列１７〜配列２０で示したアミノ酸配列で特徴づけられる可変領域を備えたイムノグロブリンはＴＳＡＢ活性を持つので、このような単純な反応系によって特異的にＴＳＡＢの定量を行うことができる。

ＴＲに結合したＴＳＡＢは、試薬として用いる本発明のＴＳＡＢを公知の標識技術によってあらかじめ標識しておけば容易に決定することが可能である。標識には、放射性同位元素、酵素、発光物質、あるいは蛍光物質等を用いることができる。ＴＲに結合したＴＳＡＢと、結合を阻害されたＴＳＡＢは、ＴＲを固相上に固定しておけば洗浄によって簡単に分離できる。あるいはまた、遠心操作によって分離しても良い。ＴＲのＴＳＡＢの認識部位以外に結合する第二抗体によって、第二抗体（固相）−ＴＲ−ＴＳＡＢというサンドイッチ構造を形成させることによって分離することもできる。

本発明による免疫分析において必要となる試薬成分、すなわち標識ＴＳＡＢとＴＲ抗原は、ＴＳＡＢの免疫分析用試薬として商業的に供給することができる。本発明による試薬の具体的な形態の例として、ポリスチレンビーズに固定したＴＲ抗原と、酵素やラジオアイソトープ等で標識したＴＳＡＢの組み合わせを示すことができる。ポリスチレンビーズへのＴＲのような蛋白質の固定は、物理吸着や化学結合によって行われる。またＴＳＡＢの認識する部位とは異なる位置の抗原決定基を認識する抗体や、ＴＲの糖蛋白部分と結合するレクチンを結合したポリスチレンビーズでＴＲを捕捉することによって固相化することもできる。

このような間接的な捕捉方法を採用するのであれば、ＴＲは液状で供給し、ＴＳＡＢとの反応後にこれらの固相化試薬で捕捉するという形態の試薬も実現できる。このような試薬ではＴＲとＴＳＡＢとがいずれも液状なので反応を早く進められる。一方酵素やラジオアイソトープによってイムノグロブリンを標識する技術も公知である。イムノグロブリンは直接標識されていても良いし、アビジン−ビオチンシステムを利用して間接的に標識することもできる。

本発明が提供するＴＳＡＢの免疫学的な分析方法、あるいは分析用試薬に用いるＴＲは、動物組織や株化した培養細胞等から抽出したもの、あるいはＴＲをコードする遺伝子の発現産物等を利用することができる。動物組織としてはラットやブタの甲状腺、ＴＲを備えた脂肪組織等を用いることができる。

他方、培養細胞には、先に説明したＦＲＴＬ−５細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０５）が有用である。ただ本発明に用いるＴＲは単に抗原として用いているので、たとえばスティミュレーションアッセイに用いる場合のように生物学的な活性は必ずしも要求されない。また、一般的にいって配列１７−配列２０のように一定のアミノ酸配列で特徴づけられるイムノグロブリンの可変領域は、抗原分子の中でもごく限られた範囲の構造を認識しているだけなので、この抗原構造を人為的に模倣した合成化合物によってＴＲとすることも可能である。更に後に述べる抗イディオタイプ抗体もＴＳＡＢの抗原として利用できる。

利用分野２：標準物質
本発明のイムノグロブリン可変領域は、遺伝子操作によって高度に安定な品質を実現するので、標準物質として有用である。利用分野１に説明した免疫分析において、正確な定量を行うためには安定した標準物質が不可欠である。本発明はこのような要求を満足する。

あるいは、前述のスティミュレーションアッセイのような生物学的な検定方法において、標準物質として用いるにはヒトの自己抗体と共通の活性を持つことが求められる。本発明のイムノグロブリン可変領域はこのような生物学的な検定用の標準物質としても利用することが可能である。

今後ＴＳＡＢの臨床的な研究を進めるためには、ヒトの自己抗体の標準物質として利用できる均質なイムノグロブリンの安定供給が求められる。遺伝子操作によって量的にも、質的にも安定したイムノグロブリンの供給を可能にした本発明のイムノグロブリンは、このような要求を満たすものである。本発明が提供するＴＳＡＢを含む各種分析のための標準物質は、それ単独で流通させても良いし、あるいは他の試薬類と組み合わせてキット化することもできる。

利用分野３：甲状腺機能低下症状の改善
本発明のＴＳＡＢは、甲状腺機能低下症状を改善するために用いることができる。ヒトのリンパ球に由来する本発明のイムノグロブリン可変領域は、ヒトに投与した場合でも異物として認識されにくいため、免疫システムで排除されることなく確実にＴＲへ到達できる。

利用分野４：ＴＳＨのシグナル伝達モデル
本発明のＴＳＡＢは、ＴＲに対してＴＳＨと同じ甲状腺刺激活性を持っている。したがってＴＲにおけるシグナル伝達のモデル系の構成に有用である。ＴＳＨ分子と、本発明によるＴＳＡＢの分子構造を比較する事により、シグナル伝達に必要な構造の解析が期待できる。

利用分野５：ＴＳＡＢに起因する自己免疫疾患治療用の拮抗剤スクリーニング
本発明のＴＳＡＢは、患者の体内に存在する病原性の自己抗体と同様の反応性を持っているものと推定される。したがって、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）におけるＴＳＡＢ阻害剤のスクリーニングに有用である。ＴＲ発現細胞を利用してＴＳＡＢ活性を決定する技術は知られているので、スクリーニングすべき候補化合物と本発明のＴＳＡＢの存在下でＴＲ発現細胞を培養し、ＴＳＡＢのみの存在下で培養したものと比較すれば、ＴＳＡＢ阻害活性を指標とするスクリーニングを容易に行う事が可能である。

利用分野６：ＴＳＡＢの抗イディオタイプ抗体
本発明によって得られるＴＳＡＢの可変領域は、抗イディオタイプ抗体を得るための免疫原として有用である。抗体の可変領域を認識する抗体は、免疫原として作用させた抗体のリガンドの立体構造を模倣していると言われている。こうして得られた抗体に対する抗体は、抗イディオタイプ抗体と呼ばれている。本発明においては抗イディオタイプ抗体の可変領域はＴＳＡＢのリガンドであるＴＲの構造を模倣するものと考えられるから、様々な利用用途が考えられる。まずＴＳＡＢの検出のための抗原として有用である。このような用途に用いるときには、抗イディオタイプ抗体を生体外でしか利用しないため、その由来はヒトに限定されない。

抗イディオタイプ抗体は、抗原としての構造のみならず細胞障害活性等の抗体としての特徴も備えていることから、治療目的にも有用である。すなわち、ＴＳＡＢ産生細胞を攻撃してその抗体産生を抑制するための医薬品としての用途が期待できる。このような用途に用いるときには、生体内に抗イディオタイプ抗体を導入しなければならないので、少なくともその定常領域はヒト由来のものとすべきである。
あるいは抗イディオタイプ抗体のＣＤＲのみをヒト型の抗体のＣＤＲと置換した、いわゆるヒト化抗体を用いれば、更に安全性の高い治療薬とすることができる。生体内に導入されたＴＳＡＢの抗イディオタイプ抗体は、血液中のＴＳＡＢを中和するばかりでなくＴＳＡＢを産生する抗体産生細胞の表面に露出したＴＳＡＢの可変領域に結合することによって細胞障害作用を発揮し、結果として病原性のＴＳＡＢ産生を抑制する。

１．ｃＤＮＡの合成とＰＣＲ
バセドウ病患者の末梢血リンパ球から樹立したＴＳＡＢ産生Ｂ６Ｂ７株および１０１−２株から、ＰＣＲ法によって抗体の可変領域をコードする遺伝子ライブラリーを調製した。Ｂ６Ｂ７はＩｇＧタイプの抗体を、１０１−２はＩｇＭタイプの抗体を産生するクローンで、いずれの抗体もＴＳＡＢ活性を備えている。

また、１０１−２株は、ＴＢＩＩ活性を持つことが明らかな患者に由来するものであるが、産生する抗体はＴＳＡＢとなっている。これらのトランスフォーマントが産生するモノクローナル抗体の特性を表１にまとめた。表中のＴＳＡＢ活性は、後に述べる方法によって決定したものである。なお一連の操作は公知の抗体可変領域遺伝子のクローニング技術を応用し、その概要を図１に示した。

５×１０^６の細胞から市販のｍＲＮＡ分離用キット（Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｎｇｅｎ Ｃｏｒｐ．製）を用い、指示書にしたがってｃＤＮＡを合成した。Ｃγ、Ｃμ、およびＣκに対して、それぞれ次の配列を持つ合成ヌクレオチドをプライマーに用いた。ｃＤＮＡの合成には市販のｃＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．製）を用いた。得られたｃＤＮＡに対し以下に示すアダプター配列をライゲーションし、更にＥｃｏＲＩで消化してＰＣＲ法による増幅のためのテンプレートとした。

プライマーの配列
Ｃγ：5'- GAGAGAGAGAGAGAGAGCGCCTGAATTCCACGACACCGTCACCG-3'
Ｃμ：5'-AACGGCCACGCTGCTCGTATC-3'
Ｃκ：5'- GAGAGAGAGAGAGAGAGAATTCTGTAGGTGCTGTCCTTGCTGTCCTG-3'
アダプター：5'-CGATAAGCTTGGATCCTCGAG-3'
アダプター：5'-CTCGAGGATCCAAG-3'

ＰＣＲ反応は、上流側は重鎖、軽鎖ともに前記アダプター配列をプライマーとし、下流側は公知のＪＨ領域（重鎖）、あるいはＪκ領域（軽鎖）の配列から保存性の高い配列を選んでプライマーとした。具体的な配列は以下に示した。

ＪＨプライマー：5'-GGCGAATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACC-3'
Ｊκプライマー：5'-GGCGAATTCTTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3'

変性：９５℃／１分、アニール：５２℃／２分、伸長：７２℃／２分（最初のサイクルの時のみ７分）というサイクルを、重鎖、軽鎖の遺伝子に対してそれぞれ３０サイクル行った。このＰＣＲ反応によってイムノグロブリンの可変領域をコードする遺伝子のライブラリーを得ることができる。

イムノグロブリン重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子のＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片（重鎖遺伝子約５００ｂｐ、軽鎖遺伝子約４５０ｂｐ）を、公知のヒトイムノグロブリンの定常領域Ｃγ1（重鎖）を含むベクターｐＳＲＨ、およびＣκ（軽鎖）を含むベクターｐＳＲＬ−ｎｅｏの対応するサイトに挿入した。

この操作によって、得られたいくつかのクローンのうち、重鎖、軽鎖それぞれについて少なくとも３つの異なるクローンを次のプライマーを使いジデオキシシークエンシングキットＰＲＩＳＭ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ（アプライド社製）によって配列決定した。なお５’側のプライマーはＳＲαのプライマーサイトであり、３’側のプライマーにはＪ−Ｃイントロン部分の配列を利用した。

５’配列決定用プライマー：5'-CATGAATTCTGTTCTGCGCCGTTACAG-3'
３’配列決定用プライマー：5'-TCAGAATGGAATGTGCAG-3'

更にそれぞれのベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトのサイトでライゲーションして、最終的に重鎖と軽鎖を備えた完全なイムノグロブリン分子を発現する１本のベクターとした。このベクターをＳＶ４０のＬａｒｇｅ Ｔ抗原を産生しているＣｏｓ７細胞へエレクトロポーレーションにより導入すると、形質転換からおよそ４８時間後にはアッセイ可能な量のイムノグロブリンを分泌する。この培養上清のＩｇＧ濃度を指標としてスクリーニングし、ＩｇＧクラスのイムノグロブリンを分泌するクローンｒＢ６Ｂ７、およびｒ１０１−２を樹立した。

２．イムノグロブリン遺伝子の再構築
再構築したイムノグロブリン全分子をコードするＤＮＡを含むベクターｐＳＲＩＧ−ｎｅｏ（２０μｇ）でマウス・ミエローマＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３を形質転換し、１０％のウシ胎児血清および１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。Ｇ４１８耐性細胞をサブクローニングしＩｇＧの産生を指標としてスクリーニングして、高い濃度でＩｇＧを分泌するものについてＴＲＡＢ活性を測定した。

３．ＴＲＡＢ組み換え体の精製とＴＳＡＢ検定
２．で得たＴＲに結合する抗体ＴＲＡＢ（ｒＢ６Ｂ７およびｒ１０１−２）を精製し、更にその甲状腺刺激活性を分析（ＴＳＡＢ検定）した。イムノグロブリン発現ベクターで形質転換した細胞を無血清培地Ｓ−ＣｌｏｎｅＳＦ−Ｂ（三光純薬工業製、商品名）で培養し上清を集めた。１５０ｍＬの培養上清を２ｍＬのプロテインＡセファロース４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア製）で精製し、ポリエチレングリコールで濃縮した。これを改変ハンクス培地に対して透析し、得られた精製抗体についてＴＳＡＢ活性、ＴＢＩＩ活性を分析した。

ＴＳＡＢ活性は公知の方法によって分析した。４５μＬのバセドウ病患者血清、あるいは精製抗体を、ＦＲＴＬ−５細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０５）とインキュベートした。培養上清のｃＡＭＰレベルを市販のＲＩＡキットで測定し、改変ハンクス培地を対照とするｃＡＭＰレベルのパーセンテージでＴＳＡＢ活性を決定した。ＩｇＧ非産生クローンやＩｇＧ産生環境に無い培地をコントロールとした時、正常範囲は１５０％以下である。

一方ＴＢＩＩ活性には市販のＴＳＨレセプターアッセイキット（コスミック製、商品名）を利用した。このキットは、１２５^Ｉ標識ＴＳＨの可溶化ブタ甲状腺組織に対する結合の抗体による阻害活性を測定するためのものである。正常範囲は、同じく陰性コントロールに対して１０％以内である。測定は３回行った。結果は表２および図２に示した。

ｒＢ６Ｂ７、ｒ１０１−２いずれのクローンから得た遺伝子産物も高いＴＳＡＢ活性を示した。なお、表２および図２中に示した１９６−１４は、異なるｃＤＮＡライブラリーをもとに、同じ操作で得られた形質転換体による発現産物である。このクローンはｒＢ６Ｂ７と同じ軽鎖遺伝子を持つが重鎖の遺伝子はＴＲＡＢとは無関係なマウス由来の可変領域からなっている。

ｒＢ６Ｂ７とｒ１０１−２のＴＳＡＢ活性は、それぞれ最大で１８６−３０２％、あるいは１８１−２３９％にも及んだ。ｒＢ６Ｂ７のＴＳＡＢ活性は、スタートマテリアルであるトランスフォーマントが産生していたモノクローナル抗体のみならず、このトランスフォーマントを得た患者血清のＴＳＡＢ活性とも近い値を示した。これらのことから、ｒＢ６Ｂ７は実際の患者血液中に存在する自己抗体の反応性を忠実に反映しているものと推測された。

一方ＩｇＭクラスのイムノグロブリンを産生していたトランスフォーマントからクローニングした遺伝子の産物であるｒ１０１−２は、遺伝子の再構築に伴うＩｇＧクラスへのクラススイッチによってＴＳＡＢ活性が３３４%から１８１−２３９%に下がった。また表２や図２に示したようにＴＳＡＢ活性はＩｇＧ濃度にともなって上昇する傾向を示すが、一定の濃度を越えると値が低下している。またいずれの濃度でも明らかなＴＳＡＢ活性を示すのに対して、有意なＴＢＩＩ活性は観察されなかった。

本発明による可変領域遺伝子の単離とイムノグロブリン遺伝子の構築のアウトラインを示す。図中、ＵＴは非翻訳領域、Ｌはリーダー、Ｖはｖａｒｉａｂｌｅ、Ｄはｄｉｖｅｒｓｅ、Ｊはｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ、Ｃはｃｏｎｓｔａｎｔ、ＡＡＡＡはポリＡテール、ＳＲαはＳＲαプロモーター、太線はエクソン、ＥはＥｃｏＲＩ、ＢはＢａｍＨＩ、ＨはＨｉｎｄＩＩＩ、ＸはＸｈｏＩである。 遺伝子組み換えによって得られたＴＳＡＢのＴＳＡＢ活性を示すグラフ。縦軸はＴＳＡＢ活性（％）、横軸はＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。

Claims (6)

1. 次の工程1)-4)で構成されるサイロトロピン受容体に結合する物質を免疫学的に検出する方法であって、サイロトロピン受容体と結合する標識抗体として甲状腺機能を刺激する活性を持つ可変領域が配列番号１７に示すアミノ酸配列の重鎖および配列番号１８に示すアミノ酸配列の軽鎖の両方を具備するｒＢ６Ｂ７、若しくは可変領域が配列番号１９に示すアミノ酸配列の重鎖および配列番号２０に示すアミノ酸配列の軽鎖の両方を具備するｒ１０１−２を用いる検出方法
   1)サイロトロピン受容体抗原を用意する工程
   2)サイロトロピン受容体と結合する物質を検出すべき試料を1)の抗原と接触させる工程
   3)更にサイロトロピン受容体と結合する標識抗体を接触させる工程
   4)抗原と結合した標識抗体、または結合しなかった標識抗体に由来する標識を測定し、サイロトロピン受容体と結合する物質を検出する工程
2. 次の工程1)-3)で構成されるサイロトロピン受容体に結合する物質を免疫学的に検出する方法であって、サイロトロピン受容体と結合する標識抗体として甲状腺機能を刺激する活性を持つ可変領域が配列番号１７に示すアミノ酸配列の重鎖および配列番号１８に示すアミノ酸配列の軽鎖の両方を具備するｒＢ６Ｂ７、若しくは可変領域が配列番号１９に示すアミノ酸配列の重鎖および配列番号２０に示すアミノ酸配列の軽鎖の両方を具備するｒ１０１−２を用いる検出方法
   1)サイロトロピン受容体抗原を用意する工程
   2) サイロトロピン受容体に結合する物質を検出すべき試料と、サイロトロピン受容体と結合する標識抗体を同時に1)の抗原と接触させる工程
   3)抗原と結合した標識抗体、または結合しなかった標識抗体に由来する標識を測定し、サイロトロピン受容体に結合する物質を検出する工程
3. 前記サイロトロピン受容体と結合する物質成分が、サイロトロピン受容体に結合して甲状腺機能を刺激する活性を持つ自己抗体またはサイロトロピン受容体を刺激する自己抗体の拮抗物質である、請求項１または２記載の方法
4. 標識抗体として、配列番号１に示す塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むイムノグロブリン重鎖可変領域および配列番号２に示す塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むイムノグロブリン軽鎖可変領域の両方を具備するｒＢ６Ｂ７、若しくは配列番号３に示す塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むイムノグロブリン重鎖可変領域および配列番号４に示す塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むイムノグロブリン軽鎖可変領域の両方を具備するｒ１０１−２を用いる請求項１〜３記載の検出方法
5. 重鎖および軽鎖の両方を具備する標識抗体のイムノグロブリン重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）および軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）が、
   ＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）、ＣＤＲ３（配列番号７）からなる配列番号１７に示すｒＢ６Ｂ７重鎖可変領域
   および
   ＣＤＲ１（配列番号８）、ＣＤＲ２（配列番号９）、ＣＤＲ３（配列番号１０）からなる配列番号１８に示すｒＢ６Ｂ７軽鎖可変領域
   若しくは
   ＣＤＲ１（配列番号１１）、ＣＤＲ２（配列番号１２）、ＣＤＲ３（配列番号１３）からなる配列番号１９に示すｒ１０１−２重鎖可変領域
   および
   ＣＤＲ１（配列番号１４）、ＣＤＲ２（配列番号１５）、ＣＤＲ３（配列番号１６）からなる配列番号２０に示すｒ１０１−２軽鎖可変領域
   である請求項１〜４記載の検出方法
6. 請求項１〜５記載のサイロトロピン受容体に結合する物質を免疫学的に検出する方法の標準物質であって、サイロトロピン受容体と結合する標識抗体として甲状腺機能を刺激する活性を持つ、配列番号１および配列番号２、若しくは配列番号３および配列番号４に示す塩基配列を発現させることによって得られる重鎖および軽鎖の両方を具備する組み換え体を含む標準物質

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